El potencial terapéutico y anti inflamatorio del Genipin en un modelo de infección corneal
Autor: Huertas Bello, Marcela
Asesor: Ávila Castañeda, Marcel Yecid
Fecha: 2021-02-16
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Oftalmología
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Propósito:  Investigar la efectividad de la reticulación de colágeno corneal con Genipin (GEN) para el tratamiento de la queratitis bacteriana, en un modelo de infección corneal ex vivo con córneas porcinas.

Métodos: Se descontaminaron parejas de botones corneales y posteriormente se infectaron con Staphylococcus aureus (ATCC 25923) o Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) según el grupo. Treinta minutos después de la inoculación bacteriana; un ojo se trató con solución salina y el ojo contralateral se trató con GEN (n = 6 pares para cada microorganismo). También se realizó un control de esterilidad con corneas no expuestas a bacterias. Después de 24 h de incubación, la mitad de cada córnea se homogenizo y la se realizaron diluciones seriadas de la suspensión resultante, posteriormente se sembraron en placas de agar para recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) / córnea. La otra mitad de cada cornea se sometió a examen histológico.

Resultados: Macroscópicamente las corneas infectadas tratadas con Solución Salina (SSN) mostraron más turbidez y ulceración corneal versus las tratadas con GEN. Histológicamente, las tinciones de H-E y Gram confirmaron una infiltración bacteriana extensa en toda la córnea. El número de UFC disminuyó significativamente en las córneas tratadas con GEN vs las tratadas con SSN (p &lt;0,05). Las córneas de control de esterilidad no evidenciaron ninguna infección.

Conclusiones: El entrecruzamiento corneal con GEN podría servir como una opción terapéutica novedosa para el tratamiento de la queratitis bacteriana. Se necesitan más estudios para esclarecer la actividad antibacteriana y el mecanismo de acción de GEN.

Palabras clave: crosslinking, queratitis infecciosa, queratitis bacteriana, infección corneal por Staphylococcus aureus, infección corneal por Pseudomonas aeruginosa, Genipin, modelo de infección corneal ex vivo.

“El potencial terapéutico y
antiinflamatorio del Genipin en un
modelo de infección corneal”
Yinna Marcela Huertas Bello
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía
Unidad de Oftalmología
Bogotá, Colombia
Año 2021II El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de infección
corneal“El potencial terapéutico y
antiinflamatorio del Genipin en un
modelo de infección corneal”
Yinna Marcela Huertas Bello
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
.
Director (a):
Dr. Marcel Yecid Ávila Castañeda
Codirector (a):
Elena Koudouna, PhD.
Línea de Investigación:
Ciencias Básicas en Oftalmología
Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía
Unidad de Oftalmología
Bogotá, Colombia
Año 2021La familia es el comienzo y el fin porque con la
familia caminado de la mano, no hay nada
imposible, en cambio, todo es posible
A mis padres y hermanas: mi apoyo
incondicional, compañía y guía en la
construcción de mis sueños.
.Declaración de obra original
Yo declaro lo siguiente:
He leído el Acuerdo 035 de 2003 del Consejo Académico de la Universidad Nacional.
«Reglamento sobre propiedad intelectual» y la Normatividad Nacional relacionada al
respeto de los derechos de autor. Esta disertación representa mi trabajo original, excepto
donde he reconocido las ideas, las palabras, o materiales de otros autores.
Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación, he
realizado su respectivo reconocimiento aplicando correctamente los esquemas de citas y
referencias bibliográficas en el estilo requerido.
He obtenido el permiso del autor o editor para incluir cualquier material con derechos de
autor (por ejemplo, tablas, figuras, instrumentos de encuesta o grandes porciones de
texto).
Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica, definida
por la universidad.
Fecha 2/12/2020Agradecimientos
A mis padres, por su amor incondicional, apoyo, paciencia y dedicación.
A mis hermanas, que son el mejor regalo de la vida, gracias por transitar este camino
conmigo y hoy ser parte de este éxito.
A Dios presente en mi vida.
A la Dra. Elena Koudouna por ser mi mentora, por compartir su conocimiento. Admiro su
dedicación, sencillez y gran calidad humana. Estoy infinitamente agradecida además por
su amistad.
Al proyecto Horizon 2020 de la Unión Europea, Grant 793328 Marie Curie, gracias al cual
se financió este trabajo.
Al Dr. Marcel Ávila que con su curiosidad por la investigación hace de sus estudiantes
profesionales inquietos, creativos y apasionados por la ciencia.
Al departamento de Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional
de Colombia y a la Dra Miriam Navarrete por proporcionar acceso a laboratorio y a los
materiales necesarios para llevar a cabo este trabajo.
A Cristian Nicolas Rodríguez, Bacteriólogo por la asesoría en la metodología y su
acompañamiento permanente en el desarrollo del protocolo. A la Dra Sandra Henao,
Bacterióloga por su asesoría científica en la metodología.
Al grupo de laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de Colombia, María
Clemencia Cortés Rueda y a la Histotecnóloga Jaydi Acosta Álvarez por el apoyo técnico
en este trabajo.
Al Dr. Fabio Aurelio Rivas Muñoz por su ayuda en el análisis estadístico de los datos.
A Natalia Ramírez Pachón por las ilustraciones (https://www.behance.net/nataliaramrez).Resumen y Abstract IX
Resumen
Propósito: Investigar la efectividad de la reticulación de colágeno corneal con Genipin
(GEN) para el tratamiento de la queratitis bacteriana, en un modelo de infección corneal
ex vivo con córneas porcinas.
Métodos: Se descontaminaron parejas de botones corneales y posteriormente se
infectaron con Staphylococcus aureus (ATCC 25923) o Pseudomonas aeruginosa (ATCC
27853) según el grupo. Treinta minutos después de la inoculación bacteriana; un ojo se
trató con solución salina y el ojo contralateral se trató con GEN (n = 6 pares para cada
microorganismo). También se realizó un control de esterilidad con corneas no expuestas
a bacterias. Después de 24 h de incubación, la mitad de cada córnea se homogenizo y la
se realizaron diluciones seriadas de la suspensión resultante, posteriormente se
sembraron en placas de agar para recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) /
córnea. La otra mitad de cada cornea se sometió a examen histológico.
Resultados: Macroscópicamente las corneas infectadas tratadas con Solución Salina
(SSN) mostraron más turbidez y ulceración corneal versus las tratadas con GEN.
Histológicamente, las tinciones de H-E y Gram confirmaron una infiltración bacteriana
extensa en toda la córnea. El número de UFC disminuyó significativamente en las córneas
tratadas con GEN vs las tratadas con SSN (p <0,05). Las córneas de control de esterilidad
no evidenciaron ninguna infección.
Conclusiones: El entrecruzamiento corneal con GEN podría servir como una opción
terapéutica novedosa para el tratamiento de la queratitis bacteriana. Se necesitan más
estudios para esclarecer la actividad antibacteriana y el mecanismo de acción de GEN.
Palabras clave: crosslinking, queratitis infecciosa, queratitis bacteriana, infección corneal
por Staphylococcus aureus, infección corneal por Pseudomonas aeruginosa, Genipin,
modelo de infección corneal ex vivo.X El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de infección
corneal
Abstract
Purpose: To investigate the effectiveness of corneal collagen crosslinking with Genipin
(GEN) for the treatment of bacterial keratitis, in an ex vivo corneal infection model with
porcine corneas.
Methods: Previously decontaminated pairs of corneal buttons were infected with
Staphylococcus aureus (ATCC 25923) or Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853). Thirty
minutes after bacterial inoculation; one eye was treated with saline solution and the
contralateral eye was treated with GEN (n = 6 pairs for each microorganism). A sterility
control was also carried out. After 24 h of incubation, half of each cornea was homogenized
and serial dilutions of the resulting suspension were made, later they were seeded on agar
plates for the count of colony forming units (CFU) / cornea. The other half of each cornea
underwent histological examination.
Results: Macroscopically, infected corneas treated with Saline Solution (SSN) showed
more turbidity and corneal ulceration versus corneas with GEN treatment. Histologically,
H&E and Gram stains confirmed extensive bacterial infiltration throughout the cornea. The
number of CFUs decreased significantly in corneas treated with GEN vs those treated with
SSN (p <0.05). The sterility control corneas did not show any infection.
Conclusions: Corneal crosslinking with GEN could serve as a novel therapeutic option for
the treatment of bacterial keratitis. More studies are needed to clarify the antibacterial
activity and mechanism of action of GEN.
Keywords: corneal crosslinking, infectious keratitis, bacterial keratitis, Staphylococcus
aureus corneal infection, Pseudomonas aeruginosa corneal infection, Genipin, Keratitis ex
vivo animal model.Contenido XI
Contenido
Pág.
Resumen ........................................................................................................................ IX
Lista de figuras ............................................................................................................. XII
Lista de tablas ............................................................................................................. XIII
Lista de Símbolos y abreviaturas ............................................................................... XIV
Introducción .................................................................................................................. 15
1. Marco Teórico ......................................................................................................... 17
2. Justificación ........................................................................................................... 25
3. Objetivos ................................................................................................................. 26
4. Consideraciones Éticas ......................................................................................... 27
5. Metodología ............................................................................................................ 29
6. Resultados .............................................................................................................. 33
7. Discusión ................................................................................................................ 37
8. Conclusiones .......................................................................................................... 39
Bibliografía .................................................................................................................... 41Contenido XII
Lista de figuras
Pág.
Figura 1: Aproximación a la clasificación de Microorganismos con tinción de Gram. 22
Figura 2: Esquema ilustrativo de los grupos experimentales ................................. 29
Figura 3: Esquema ilustrativo del protocolo experimental . .................................... 31
Figura 4: Resultados de la prueba de susceptibilidad bacteriana .......................... 33
Figura 5: Análisis macroscópico de la infección corneal ........................................ 34
Figura 6: Análisis histológico de la infección corneal ............................................. 35
Figura 7: Análisis cuantitativo de la infección corneal ............................................ 36
Figura 8: Gráficas del Análisis estadístico ............................................................. 36Contenido XIII
Lista de tablas
Pág.
Tabla-1: Esquemas terapéuticos para tratamiento de la queratitis bacteriana. 20
Tabla-2 : Error estandar y promedio de los grupos experimentales ............................. 36Contenido XIV
Lista de Símbolos y abreviaturas
GEN Genipin
UFC Unidades Formadoras de Colonias.
S. aureus Staphylococcus aureus
P. aeruginosa Pseudomonas aeruginosa
Crosslinking Entrecruzamiento del Colágeno corneal.
PACK-CXL Photoactivated Chromophore Crosslinking
BHI Brain-Heart Infusion
DMSO Dimethyl Sulfoxide
DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium
SSN Solución Salina Normal estéril
H-E Hematoxilina EosinaIntroducción
La queratitis infecciosa es una entidad que causa alta morbilidad y es una causa de
ceguera importante a nivel mundial [1], reportándose 1.5-2-0 millones de nuevos casos de
ceguera cada año [2,3], la queratitis infecciosa puede ser causada por hongos, virus,
parásitos y más frecuentemente por bacterias en 90% de los casos, siendo los
microorganismos más frecuentemente reportados el Staphylococcus aureus y la
Pseudomonas aeruginosa [4-7]. Los factores de riesgo mas frecuentemente encontrados
en pacientes con queratitis infecciosa incluyen el uso de lentes de contacto, enfermedad
de la superficie ocular y trauma [8,7]. Su manejo requiere instauración rápida de
tratamiento ya que es una condición que puede tener complicaciones nefastas como
cicatrización corneal, perforación ocular, endoftalmitis y perdida del globo ocular con
consecuente pérdida visual irreversible en los casos más avanzados [9,10].
El tratamiento estándar comprende el uso de medicamentos antimicrobianos, los cuales
en ocasiones no son fácilmente accesibles para los pacientes, principalmente en países
subdesarrollados [3, 11, 12]. Además, el incremento de la resistencia bacteriana a nivel
mundial para los medicamentos de primera línea, e inclusive para quinolonas de tercera y
cuarta generación [13-16], sumado a los malos resultados visuales de esta enfermedad
per se [13-15], hacen que el control de esta infección sean un desafío. Teniendo que acudir
como última alternativa en casos avanzados, a las queratoplastias tectónicas que tienen
pobres resultados visuales, pueden generar aumento de presión intraocular y presentan
una alta tasa de rechazo injerto contra huésped [17-19]. Ante este panorama es necesario
buscar otras alternativas de tratamiento para estos pacientes.
El entrecruzamiento corneal nace como una alternativa ante esta problemática [20-25], con
la hipótesis que una córnea que se endurece mediante el entrecruzamiento de sus fibras
de colágeno es más resistente a la digestión de proteasas y colagenasas [26-29]. Además,
la exposición a radicales libres de UVA necesario para realizar este procedimiento, se
piensa que daña el ADN de los microrganismos, reduciendo la proliferación de estos. El2 Introducción
uso del PACK-CXL termino dado al crosslinking realizado en keratitis infecciosa, se reportó
inicialmente con los agentes usados tradicionalmente en el crosslinking convencional:
Rivoflabina y UVA [30-34]. Sin embargo, se han encontrado algunas limitaciones para su
uso, entre ellas la presencia de opacidades o cicatrices corneales que podrían limitar la
penetración de la riboflavina y la luz UV [33,34]. Por otra parte, se ha contraindicado su
uso en corneas con espesor menor de 400 micras (condición frecuente en pacientes con
queratitis infecciosa), antecedente de queratitis herpética y enfermedades autoinmunes
[29-33]. Las inquietudes que surgen con esta terapia incluyen el riesgo de daño y perdida
endotelial [35-38], el riesgo de reactivación de queratitis virales herpéticas, la penetración
incompleta y no homogénea en las ulceras corneales [39] y además es un tratamiento que
requiere poseer equipos especiales que no están fácilmente disponibles en países como
el nuestro [3,9, 10].
En los últimos años se ha reportado que el Genipin (GEN), una molécula natural, derivada
de la planta gardenia jazminoides y del Genipa americano, tiene propiedades que generan
entrecruzamiento corneal, con baja toxicidad, excelente biocompatibilidad y seguridad [40-
46] en estudios ex vivo e in vivo [47-49]. GEN además posee propiedades antiinflamatorias
[50-55], antioxidantes [56, 57], antimicrobianas [58].
En este trabajo se estudió el efecto antibacteriano de GEN contra S. aureus y P.
aeruginosa en un modelo de queratitis bacterianal ex vivo en corneas de cerdo,
proponiendo que el entrecruzamiento corneal con GEN podría ser un tratamiento
novedoso, con baja toxicidad y sin requerimiento de equipos sofisticados de emisión de luz
UV, cuyos resultados sin duda alguna contribuirán al desarrollo de nuevas terapias para el
manejo de las queratitis infecciosas.Marco Teórico
1.1. Anatomía corneal.
La córnea además de ser la principal estructura refractiva del ojo proporciona estabilidad
mecánica y es una barrera de protección para el segmento anterior del ojo. Es
transparente, avascular, y está compuesta por varias capas: El epitelio se encuentra en la
parte anterior. La lamina de Bowman es el límite entre en epitelio y el estroma. El estroma
constituye el 90% del espesor corneal, y el endotelio es la capa más interna [59]. La córnea
está compuesta en su mayoría por colágeno I, proteoglicanos no fibrilares; redes de
fibrilina; y glicoproteínas [59]. Las células presentes en la córnea comprenden: células
madre presentes en el limbo corneoescleral. Células dendríticas, un tipo de células
presentadoras de antígeno específicas, encargadas de la respuesta inmune y que tienen
un papel importante en la cicatrización corneal [59]. Los queratocitos, otro tipo celular muy
predominante, desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la transparencia
y homeostasis corneal a través de la producción de colágeno, proteoglicanos y cristalinas
[60]. Se ha encontrado que la apoptosis de los queratocitos inducida por trauma e infección
y su remplazo por fibroblastos, alteran la organización de la matriz estromal, llevando a
turbidez corneal, neovascularización y perdida de la visión [59,60].
1.2. Queratitis Bacteriana
1.2.1. Epidemiología y factores de riesgo
La queratitis bacteriana representa aproximadamente el 90% de todos los casos de
queratitis a nivel mundial [6,2,12]. Siendo las bacterias más prevalentes: S. aureus y
P. aeruginosa (microorganismo más común en todo el mundo) [6]. Las infecciones
corneales o queratitis se asocian comúnmente al uso de lentes de contacto, las
enfermedades de superficie ocular que causan defectos epiteliales, trauma y cirugía
ocular previa [2-4].4 El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de Título de la tesis o trabajo de investigación
infección corneal
1.2.2. Fisiopatología
Las bacterias generan infección al adherirse a las células del epitelio córneal
mediante adhesinas que reconocen carbohidratos y proteínas específicas de la
superficie. La adherencia de P. aeruginosa y S. aureus es significativamente mayor
al epitelio corneal dañado, en comparación con otras bacterias, lo que explica su
aislamiento frecuente en casos de queratitis [6]. Posterior a la adhesión se genera un
proceso de invasión microbiana, facilitada por proteasas y exotoxinas que llevan a
degradación del colágeno, necrosis estromal y en estadios más avanzados melting
corneal, así mismo hay activación de metaloproteinasas y de la respuesta inmune
que genera más daño por la liberación de especies reactivas de oxígeno. Durante la
multiplicación y colonización bacteriana se liberan constitutivamente exotoxinas y
proteasas bacterianas de forma prolongada, que causan destrucción continua del
estroma [6].
P. aeruginosa es capaz de secretar al menos 7 proteasas diferentes incluyendo
elastasa A y B, elastasa modificada, proteasa alcalina, proteasa IV, proteasa
pequeña de P. aeruginosa y exoproteasa grande, responsables de su gran facilidad
para escindir el colágeno y evasión de la respuesta inmune [6,10]. S. aureus produce
alfa-toxina, una citotoxina lítica formadora de poros en la membrana, causante de
destrucción de los tejidos de la córnea [6,5]. El lipopolisacárido (LPS), presente en la
membrana de los microrganismos gram negativos, media la adhesión a la córnea y
lentes de contacto, la internalización bacteriana y la supervivencia dentro de las
células epiteliales corneales [6,10,5],
1.2.3. Manifestaciones clínicas y Diagnóstico
Las características clínicas no son patognomónicas de ningún agente infeccioso [10-
12], y la presentación clínica resulta de múltiples variables como: la virulencia del
organismo u organismos infectantes, el método de inoculación, el tiempo transcurrido
desde la inoculación, el estado previo de la córnea, los antimicrobianos y
corticosteroides previos y/o actuales, y otros factores del huésped [61]. Los síntomas
más frecuentes son el dolor que aumenta con el parpadeo, disminución de la agudeza
visual, fotofobia, blefaroespasmo y lagrimeo. En cuanto a los signos clínicos, esCapítulo 1 5
frecuente encontrar secreción purulenta, hiperemia conjuntival, quemosis, reacción
papilar, edema palpebral, reacción inflamatoria en la cámara anterior. En casos más
avanzados hipopión, disminución del espesor corneal (Melting), descemetocele y
perforación corneal . Pero sin duda alguna el signo mas distintivo de la queratitis es la
presencia de una úlcera corneal, con erosión epitelial e infiltrados estromales
subyacentes [61].
El Gold estándar para el diagnóstico en queratitis bacteriana son el cultivo y las
tinciones, el gram y Giemsa son las más utilizadas [12]. La microscopía confocal in
vivo puede ser un complemento clínico útil, pero depende en gran medida del
observador y a menudo carece de resolución suficiente para obtener buenos
resultados diagnósticos. Se han desarrollado nuevos métodos moleculares para
complementar los métodos tradicionales de diagnóstico, como PCR, sin embargo
siguen siendo de difícil acceso [12].
1.2.4. Tratamiento
La queratitis microbiana puede causar daños irreversibles a la córnea, lo que lleva a
pérdida de la visión. El deterioro puede ser rápido y generalmente es mucho más
rápido que el tiempo necesario para obtener los resultados del cultivo, por lo que
generalmente se inicia un tratamiento empírico que puede modificarse con la evolución
clínica y los resultados de identificación y susceptibilidad antimicrobiana [12].
Los agentes antimicrobianos se pueden clasificar según la estructura química y
mecanismo de acción propuesto. Los antibióticos tópicos en colirio son capaces de
alcanzar niveles altos en los tejidos y son el método de tratamiento preferido en la
mayoría de los casos, los antibióticos subconjuntivales pueden ser útiles cuando existe
una diseminación o perforación escleral inminente o en los casos en que el
cumplimiento del régimen de tratamiento es cuestionable. La terapia sistémica puede
ser útil en casos de extensión de la infección escleral, intraocular o infección sistémica.
[12,62].
Algunos de los regímenes recomendados, adaptados, según recomendaciones de la
academia americana de oftalmología se resumen en la (Tabla 1.)6 El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de Título de la tesis o trabajo de investigación
infección corneal
Tabla 1. Resumen adaptado de esquemas terapéuticos para tratamiento de la
queratitis bacteriana.
Concetración
Microoganismo Antibiótico Dosis subconjuntival
Tópica
No Tobramicina 9-14 mg/ml 20mg en 0.5 ml
identificado/Multiples Fluoroquinolonas Varios
Cefazolina 50 mg/ml 100 mg en 0.5ml
Cocos Gram Positivos Vancomicina 10-50 mg/ml 25 mg en 0.5 ml
Fluoroquinolonas Varios
Tobramicina 9-14 mg/ml 20mg en 0.5 ml
Bacilos Gram
Ceftazidime 50mg/ml 100 mg en 0.5ml
Negativos
Quinolonas Varios
Es una preocupación a nivel mundial el aumento de la resistencia bacteriana [10-14].,
inclusive en nuestro país se han reportado tasas de resistencia a quinolonas de tercera
y cuarta generación [16]. Un estudio de más de 3200 aislamientos oculares
recolectados entre 2009 y 2013 encontró resistencia a la meticilina en el 42% de los
aislamientos de Stafilococos, con una alta resistencia concurrente a las
fluoroquinolonas [62].; En el sur de la India, ha habido un fuerte aumento en la
resistencia de Pseudomonas aeruginosa a la moxifloxacina, del 19% en 2007 al 52%
en 2009 [62,10. Por lo tanto se están buscando alternativas de tratamiento para
sobrellevar esta problemática.
1.2.5. PACK-CXL
La reticulación corneal o crosslinking (CXL) es una técnica que se desarrolló
inicialmente para detener la progresión del queratocono. La técnica emplea gotas de
riboflavina de forma tópica y una luz ultravioleta A (UVA) de 365 nm, en el que se
liberan radicales libres creando nuevos enlaces en las fibras de colágeno, aumentando
la fuerza biomecánica de la córnea [20,34]. El CXL también demostró ser capaz de
destruir células y organismos vivos, incluidos queratocitos y patógenos. Así surgió un
concepto nuevo e innovador de tratamiento para la queratitis infecciosa el PACK-CXL,
término acuñado en el noveno congreso de CXL en Dublín [20,34]. La combinación deCapítulo 1 7
radiación ultravioleta y el efecto de reticulación puede proteger la córnea contra la
degradación enzimática, evitando una mayor destrucción de los tejidos [32-35]. Sin
embargo, los estudios in vitro e in vivo han demostrado resultados mixtos [36,28,33] y
se necesitan urgentemente más estudios para determinar completamente el perfil
terapéutico de PACK-CXL.
1.2.6. Terapias Novedosas
Recientemente, se han publicado estudios proponiendo el uso de rosa de Bengala
como fotosensibilizador para realizar terapia fotodinámica en casos de queratitis
severas [63-65]. Sin embargo, existen algunas limitaciones con respecto a los
aspectos prácticos, ya que se requiere un sistema de luz UVA que no está disponible
a nivel global.
1.3. Genipin (GEN)
El Genipin es una molécula derivada de la planta gardenia jazminoides y del árbol
American Genipa [64]. Genipin ha surgido como un nuevo agente de reticulación natural
con excelente biocompatibilidad y baja toxicidad [47,48,49]. Se han aislado y caracterizado
varios componentes químicos de G. jasminoides, incluidos iridoides, glucosidos iridoides,
triterpenoides, ácidos orgánicos y compuestos volátiles [64]. Estudios en la esclera también
han confirmado su efecto como entrecruzador y una biocompatibilidad satisfactoria en
ratas [66], moscas de árbol [67], cerdos [68, 69] y conejos [70], planteando el
entrecruzamiento con genipin para el tratamiento del glaucoma y la miopía. Además, GEN
exhibe varias propiedades farmacológicas que incluyen actividad antiinflamatoria [50-54],
antioxidante [56-57,71], anti angiogénica [72] y anti metastásica [73,74]. También se han
descrito propiedades antimicrobianas: GEN limitó el crecimiento bacteriano de E. coli y L.
monocytogenes en carnes frescas de cerdo [58].
1.4. Modelo Experimental de Infección Corneal.
Las córneas de conejo y cerdo se han utilizado en la investigación científica debido a su
similitud estructural con la córnea humana [75]. El modelo que se creó en este trabajo se
basó en el modelo de infección corneal descrito por Pinnock y colegas [76].8 El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de Título de la tesis o trabajo de investigación
infección corneal
1.5. Conceptos y Métodos Bacteriológicos.
1.5.1. Tinción de Gram
Una de las técnicas de tinción más importantes en bacteriología. Se utiliza para poder
realizar una primera aproximación en la diferenciación bacteriana. Se nombran los
microorganismos según su forma redonda (Cocos) o en forma de bastón (Bacilos). El
principio básico de la tinción de Gram implica la capacidad de la pared celular bacteriana
para retener el colorante violeta cristal durante el tratamiento con solvente. Los
microorganismos grampositivos tienen mayor contenido de peptidoglicano, mientras que
los gramnegativos tienen mayor contenido de lípidos. Los grampositivos serán los que se
tiñen de marrón púrpura y gramnegativos los que se visualizan rosa- rojos al microscopio
[77].
Figura 1. Aproximación a la clasificación de Microorganismos con tinción de Gram.
GRAM
Positivo Negativo
Cocos Bacilos Cocos Bacilos
Coagulasa Anaerobios
Aerobios Anaerobios
Positiva Facultativos
Stafilococo aureus Pseudomonas aeruginosa
1.5.2. Método de Micro dilución en placa
Una de las técnicas más utilizadas para más utilizadas para determinar la concentración
inhibitoria mínima (CMI) de agentes antimicrobianos y sustancias con actividad bactericida,
bacteriostática.[78]. El objetivo de los métodos de microdilución en placa y agar es
determinar la concentración más baja del agente antimicrobiano que, en condiciones de
definidas debe inhibir el crecimiento visible de la bacteria que se está investigando. Implica
la realización de diluciones de diferentes concentraciones de la sustancia antimicrobiana
en una placa de micro titulación de 96 pozos, luego, inoculación bacteriana en estas celdas
y sembrado posterior en un medio de agar nutritivo. El crecimiento bacteriano se evalúa
después de la incubación durante un período de tiempo definido (16-20 h) posterior al cual
se pueden registrar los resultados [78].1. Justificación
Las queratitis infecciosas catalogadas por la Organización Mundial de la Salud como la
segunda causa de perdida visual irreversible [3,12]. Representan un desafío terapéutico,
llevan a inflamación y cicatrización con secuelas visuales nefastas [9]. Las guías de manejo
para la queratitis bacteriana comprenden el uso de antibióticos, queratoplastia tectónica y
recubrimiento conjuntival. Alternativas con malos resultados visuales y además a nivel
mundial la disponibilidad de tejido corneal para trasplantar es escaso [17-19]. También, el
aumento de la tasa de resistencia bacteriana es una preocupación mundial, por lo que se
hace necesario desarrollar alternativas terapéuticas [17].
Se ha reportado el uso de agentes de entrecruzamiento de colágeno como Riboflavina y
Rosa de Bengala como una opción de tratamiento, con la hipótesis de que una córnea con
fibras de colágeno más fuertes es más resistente a la digestión de proteasas y colagenasas
[20,21,63]. Pero desafortunadamente, en estos protocolos se requiere el uso de radiación
UV y están contraindicados en corneas delgadas, condición muy frecuente en pacientes
con queratitis [35-38].
El Genipin, una molécula de origen natural [84]., ha sido objeto de estudio en los últimos
años por su efecto reticulador de las fibras de colágeno, Estudios de Ávila et al,
demostraron la utilidad del tratamiento con Genipin en el manejo de ectasias corneales con
la ventaja de no requerir radiación y su baja toxicidad [47-49].
Esta investigación busca determinar los efectos del tratamiento con Genipin a nivel
macroscópico y microscópico, en un modelo de infección corneal ex-vivo. Los resultados
de este estudio ayudaran a esclarecer el efecto terapéutico del genipin en el control de las
infecciones bacterianas corneal, crucial en la búsqueda de nuevas estrategias terapéuticas
en las enfermedades corneales infecciosas.2. Objetivos
3.1 Objetivo General:
Evaluar los efectos terapéuticos del Genipin en un modelo ex vivo de infección corneal.
3.2. Objetivos Específicos:
▪ Desarrollar un modelo de queratitis ex vivo reproducible.
▪ Cuantificar el efecto del entrecruzamiento corneal con genipin mediante análisis
macroscópico y microscópico de las corneas.
▪ Hallar la concentración de genipin necesaria para inhibir el crecimiento bacteriano.
▪ Comparar la Respuesta de las corneas del modelo de infección tratadas con genipin
con respecto a los controles.3. Consideraciones Éticas
El estudio involucra el uso de corneas porcinas en un modelo Ex Vivo, es decir no se
utilizaron animales vivos. Las corneas se obtuvieron frescas directamente de los sitios de
sacrificio de animales en Bogotá, las cuales son descartadas como desechos y
subproductos de la producción y comercialización de porcinos, siguiendo los principios
internacionales recomendados por “The Asocciation for research in Vision and
Ophthalmology” (ARVO): reemplazo, reducción y refinamiento, para realizar protocolos
científicos de alta calidad.
Las bacterias que se utilizaron en este estudio corresponden al grupo II dentro de la
clasificación de riesgo biológico y se manejaron de acuerdo con los protocolos establecidos
dentro del laboratorio de microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad
Nacional de Colombia.
Se obtuvo aprobación por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la Universidad
Nacional de Colombia, Bogotá (Acta: 004-039-19).
Así mismo este protocolo fue aprobado por la UE (Unión Europea) dentro del marco de
cooperación del proyecto 2020 CORLINK www.cordis.europa.eu/project/rcn/214454/es,
mediante el cual se financió, dentro de los lineamientos del Acuerdo suscrito entre la
Universidad de Cardiff y la Universidad Nacional de Colombia
4.1 Declaración de Conflicto de Interés
Se declara que no existen conflictos de interés por parte de los investigadores en el
desarrollo de este estudio.4. Metodología
4.1 Tipo y Diseño del Estudio
Estudio experimental en un modelo de infección corneal ex vivo.
4.2 Grupos Experimentales
Se definieron 3 Grupos experimentales de forma aleatoria, de la siguiente forma:
1. Grupo de córneas infectadas tratadas con Genipin
2. Grupo de córneas infectadas a las que se les aplico Solución Salina (SSN) como
tratamiento
3. Grupo de control de esterilidad del proceso (De otra Cabeza de cerdo)
Los grupos de tratamiento (Genipin o solución Salina) debían pertenecer a la misma
cabeza del Cerdo (Figura 2), y se utilizó un n=6..
Figura 2. Esquema ilustrativo de los grupos experimentales.
Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3
Bacteria Bacteria Control
+ + esterilidad
Genipin SSN
(Solo SSN)16 El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de Título de la tesis o trabajo de investigación
infección corneal
5. Procedimientos
5.1.1 Cultivo de Bacterias
Se utilizaron cepas de S. aureus (ATCC 25923) y P. aeruginosa (ATCC 27853) de la
American Type Culture Collection (Labcare de Colombia Ltda, Cota, Colombia), se
cultivaron en agar infusión cerebro-corazón (BHI) (Suministros Clínicos ISLA S.A.S,
Bogotá, Colombia) a 37 °C por 12 horas y posteriormente se mantuvieron a 4°C. El día
anterior al procedimiento experimental se tomó una colonia del cultivo previo y nuevamente
se realizó cultivo en agar BHI fresco con incubación a 37°C. El día de la infección corneal
se preparó una suspensión Bacteriana con un valor de 0.5 en la escala de McFarland,
correspondiente a una concentración de 1,5 x 108 unidades formadoras de colonias por ml
(UFC / ml).
5.1.2 Test de Susceptibilidad al Genipin
Mediante el método de micro dilución en placa se determinó la susceptibilidad in vitro de
S. aureus y P. aeruginosa. Se preparo Genipin (Challenge Bioproducts Co., Taiwán) en
dimetilsulfóxido (DMSO, Sigma Aldrich) a una concentración de 25 mg / ml y tomando esta
solución se realizaron diluciones seriadas con solución salina en una placa estéril con 96
pozos a las que se inoculó una suspensión bacteriana con una concentración de 1 x 105
UFC / ml y posteriormente estas diluciones se cultivaron en agar Mueller-Hinton (Químirel
Quimicos y Reactivos SAS, Bogotá, Colombia) a 37 ° C durante 24 horas, con el fin de
hallar la concentración bactericida mínima del Genipin para cada una de las bacterias. Por
otra parte, se realizaron controles de calidad del proceso, para lo cual se cultivaron
diluciones de la Bacterias en los medios nutritivos, se verificó el crecimiento con el
disolvente del Genipin (DMSO) a diferentes concentraciones, y además se probó la
inhibición del crecimiento bacteriano con antibióticos comerciales: para S. aureus
(vancomicina 5 μg / ml) y para P. aeruginosa, (tobramicina 3 mg/ml) (Tecnoquímicas S.A.,
Cali, Colombia). La concentración bactericida mínima hallada se utilizó para tratar las
corneas infectadas en el modelo ex vivoEl Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de
infección corneal
5.1.3 Disección y Desinfección de las córneas
Se obtuvieron pares de ojos enucleados, de la misma cabeza del cerdo, del frigorífico local
(BLE, Ltda., Bogotá, Colombia), con un periodo de sacrificio menor a 2 horas.
Manteniéndolos en parejas, estos se transportaron al laboratorio en una nevera portátil, se
realizó lavado inicial con SSN estéril y disección de los músculos y conjuntiva,
posteriormente se llevó a cabo un proceso de descontaminación mediante lavados
seriados con yodopovidona al 5% (Tecnoquimicas, Ltd, Cali, Colombia), solución salina
estéril, ácido hipocloroso al 0.046% (Neutroderm, Aquilabs S.A., Bogotá, Colombia).
Subsiguientemente se realizaron incisiones corneales con una hoja de bisturí estéril # 15
(3 cortes horizontales y 3 cortes verticales), según el protocolo descrito previamente por
Pinnock, et al [76]. A continuación, se disecaron los botones corneales, los cuales se
colocaron en platos estériles de 35mm y nuevamente se efectuó desinfección de estos
utilizando el protocolo con Yodopovidona al 5%, SSN y ácido hipocloroso.
5.1.4 Infección corneal y tratamiento con Genipin
Los grupos experimentales se definieron según lo enunciado en el apartado 5.2. En la
Figura 3. Se ilustra el protocolo experimental realizado. Los botones corneales se
orientaron con en lado epitelial hacia arriba y se inyecto una alícuota de 100 μl que contenía
1 x 105 UFC de S. aureus o P. aeruginosa a los grupos 1 y 2, que luego se incubaron a
37°C durante 30 minutos para permitir el asentamiento bacteriano. Luego de los 30 minutos
el grupo 1 fue tratado con una solución de 100 µl de Genipin según la concentración
bactericida mínima hallada previamente para S. aureus y P. aeruginosa. El grupo 2 fue
tratado con 100 µl de SSN estéril. Posteriormente se adiciono medio Eagle modificado de
Dulbecco (DMEM; MERCK, Bogotá, Colombia) a las cajas de cultivo que contenían las
corneas y estas se incubaron a 37°C durante 24 horas. A las corneas del grupo 3 se les
inyecto solución salina, se adiciono DMEM al plato y se llevaron directamente a incubación
a 37°C durante 24 horas. En este estudio se utilizaron seis pares de córneas para cada
cepa bacteriana (excluyendo las córneas utilizadas para los controles de esterilidad).
Figura 3. Esquema ilustrativo del protocolo experimental
Dia 1 24hr Dia 2
30 min
Infección Tratamiento UFC
GEN ó SSN Examen Histológico18 El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de Título de la tesis o trabajo de investigación
infección corneal
5.1.5 Análisis del crecimiento Bacteriano y análisis
Histológico
Luego de 24 horas de incubación, se secciono cada córnea por la mitad con una hoja de
bisturí estéril #20 y se utilizó una de estas partes para el recuento de unidades formadoras
de colonias (UFC) y la otra mitad para procesamiento histológico.
Las corneas usadas para recuento de UFC se homogenizaron y se realizaron diez
diluciones seriadas en solución salina, posteriormente se tomaron 100 µl de cada dilución
y se sembraron para cultivo en platos con agar BHI a 37 °C durante 24 horas. El recuento
de las UFC se llevó a cabo 24 horas después y se diligenció una tabla de resultados.
Las córneas para procesamiento histológico se fijaron en formaldehido al 10% y
consecutivamente se realizaron bloques de parafina, corte con microtomo y se prepararon
laminas histológicas con tinciones de Gram y Hematoxilina Eosina (H-E) para cada
muestra. El análisis y documentación fotográfica se hizo con un microscopio Olympus y
una cámara fotográfica Canon EOS T4i Rebel®.
5.1.6 Análisis estadístico
Los resultados obtenidos de las UFC se analizaron mediante el software SigmaPlot Versión
12.0. Además, se realizó t de student pareada y una prueba de normalidad de Shapiro-
Wilk. Se tomo una p ≤ 0,05 para hablar de significancia estadística.El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de
infección corneal
6. Resultados
La prueba de susceptibilidad bacteriana al Genipin, demostró una actividad bactericida
significativa contra las bacterias gram positivas y gram negativas que más frecuentemente
causan queratitis a nivel mundial []. Se determinó la concentración mínima inhibitoria, es
decir la concentración de genipin a la que no hay crecimiento del 99% de bacterias, siendo
de 3,12 mg / ml para S. aureus y de 1,56 mg / ml para P. aeruginosa respectivamente. Así
mismo se descartó un efecto bactericida del disolvente del Genipin (DMSO). (Figura 4).
Figura 4. Resultados de la prueba de susceptibilidad bacteriana.20 El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de Título de la tesis o trabajo de investigación
infección corneal
Se logro desarrollar un modelo de infección corneal reproducible, Se comprobó la infección
corneal mediante varios métodos. En primer lugar en el análisis macroscópico las córneas
infectadas por S.aureus presentaron ulceración y la formación de microcolonias fue
evidente. En cuanto a las corneas a las que se inyectó P. aeruginosa presentaron haze y
melting corneal severo más significativos en las corneas tratadas con SSN comparado con
las corneas tratadas con genipin. Las corneas del grupo control, que no fueron inoculados
se conservaron transparentes sin cambios en su morfología (Figura 5).
Figura 5. Análisis macroscópico de la infección cornealEl Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de
infección corneal
En segundo lugar, para confirmar la infección bacteriana estromal, se llevó a cabo análisis
histológico con tinciones de Gram y H&E, encontrando que hubo colonización exclusiva de
S. aureus y de P. aeruginosa en sus grupos respectivos. Por otra parte, se confirmó la
ausencia de crecimiento bacteriano en los grupos de control de esterilidad (Figura 6).
Figura 6. Análisis histológico de la infección corneal, tinciones de H-E Y Gram
H-E H-E
Gram Gram
En tercer lugar, se realizó un análisis cuantitativo del efecto del Genipin sobre el modelo
de infección corneal mediante conteo de las UFC presentes en las diluciones de cada
muestra, luego de 24 horas de incubación. (Figura 7). Los datos obtenidos demostraron
que en los grupos tratados con Genipin presentaron un numero de UFC por cornea
significativamente menor tanto para S. aureus (promedio, log 9,67 ± 1,33 UFC / córnea, n
= 6) en comparación con las corneas tratadas con SSN (promedio, log 6,42 ± 0,59 UFC /
córnea, n = 6, p = 0,026; Tabla 2, Figura 8) y para P. aeruginosa promedió log 9,37 ± 0,33
UFC / córnea (n = 6) en comparación con el grupo tratado con vehículo, que promedió log
6,72 ± 0,41 UFC / córnea (n = 6, p = 0,011, Tabla 2, Figura 8).22 El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de Título de la tesis o trabajo de investigación
infección corneal
Figura 7. Análisis cuantitativo de la infección corneal
Tabla 2. Error promedio y estándar del log10 UFC de los grupos experimentales
Microorganismo log CFU/cornea ± DE
10
S. aureus + SSN S. aureus + Genipin
S. aureus
9.67 ± 1.33 6.42 ± 0.59*
P. aeruginosa + SSN P. aeruginosa + Genipin
P. aeruginosa
9.37 ± 0.33 6.72 ± 0.41*
*Estadisticamente significativo, p < 0.05
Figura 8. Gráficas del Análisis estadísticoEl Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de
infección corneal
7. Discusión
Las infecciones corneales son un desafío para los oftalmólogos de todo el mundo debido
a la rápida progresión, las secuelas visuales nefastas, el aumento de la resistencia a los
antibióticos y las pocas alternativas terapéuticas en los casos avanzados.
La iniciativa mundial "Visión 2020", la Organización Mundial de la Salud hace hincapié en
la necesidad de enfoques terapéuticos novedosos e innovadores, para el tratamiento de la
queratitis infecciosa corneal [79]. La reticulación corneal podría tener un papel importante
en la fisiopatología de la queratitis infecciosa al proporcionar una barrera física contra la
acción de las enzimas que generan destrucción tisular. Sin embargo, los protocolos
tradicionales de reticulación con U.V. la luz y la riboflavina requieren la eliminación del
epitelio y están contraindicadas en córneas delgadas. Y la fusión y el adelgazamiento de
la córnea son condiciones frecuentes en las úlceras infecciosas, así que en los últimos
años se ha investigado la aplicación de moléculas naturales como agentes de
entrecruzamiento [80-82]. Genipin ha sido de especial interés en oftalmología debido a sus
propiedades de reticulación [44-49], antiinflamatorias, antioxidantes y antimicrobianas [51-
57].
Los datos obtenidos en este estudio confirman que Genipin tiene un efecto bactericida
contra S. aureus y P. aeruginosa, y se encontró que la concentración bactericida mínima
de Genipin para gram negativos fue menor, lo cual es de gran relevancia ya que las
queratitis bacterianas por gram negativos son mas severas, progresan más rápidamente y
son intrínsecamente más resistentes a los antibióticos. La acción bactericida de cualquier
régimen de tratamiento es de suma importancia clínica ya que, al contrarrestarse el
crecimiento bacteriano, se lograría una resolución temprana de la enfermedad, mejores
resultados clínicos y menor resistencia bacteriana [83].
El mecanismo de acción exacto del Genipin todavía no se ha dilucidado, sin embargo, es
probable que su actividad antimicrobiana sea multifactorial: En primer lugar podría
atribuirse a las propiedades de reticulación [40, 84, 85] no solo del colágeno, sino además
de la reticulación de proteínas de la membrana celular de los patógenos, como el
peptidoglicano, el ácido lipoteicoico y el lipopolisacárido (LPS) [86-88], interfiriendo con
procesos de división, crecimiento celular, alteración de la permeabilidad de la membrana24 El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de Título de la tesis o trabajo de investigación
infección corneal
celular, limitando la replicación bacteriana [86-88]. En segundo lugar, Genipin podría
interferir en los procesos de invasión y colonización bacteriana al restringir la adhesión
bacteriana. En tercer lugar, se ha evidenciado que las corneas tratadas con genipin son
más resistentes a la digestion enzimática [46-49] proceso sin ecuánime en la infección
corneal, y, por último, Genipin ha demostrado tener propiedades antinflamatorias, según
lo reportado por Chang et al. (2017), quienes demostraron que genipin inhibe la secreción
de citocinas proinflamatorias IFN-γ e IL-8, así como el estrés oxidativo inducido por LPS
en la infección por Helicobacter pylori [89], un mecanismo importante en la fisiopatología
de la infección por gram negativos que al estimular la respuesta inflamatoria, provocan un
daño citotóxico en la córnea.
En cuanto a la seguridad del Genipin, se han informado efectos citotóxicos mínimos no
solo en el endotelio corneal, sino también en los nervios corneales y queratocitos [44-46].
En este protocolo se desarrolló un modelo de infección corneal exitoso, el cual sin duda
será de gran ayuda en el estudio de la queratitis infecciosa. Sin embargo, hacen falta
estudios adicionales para indagar los efectos del Genipin en la respuesta inflamatoria in
vivo, y que evalúen la relación dosis/efecto y la seguridad a largo plazo.El Potencial terapéutico y antiinflamatorio del Genipin en un modelo de
infección corneal
8. Conclusiones
▪ Se evaluó el potencial antimicrobiano de Genipin en un modelo ex vivo reproducible.
▪ Genipin tiene actividad antibacteriana contra S. aureus y P. aeruginosa
▪ El entrecruzamiento corneal con Genipin constituye un enfoque terapéutico novedoso
e innovador para el tratamiento y manejo de la queratitis bacteriana.
▪ Se requieren más estudios para dilucidar los mecanismos de acción del Genipin sobre
la muerte bacteriana en modelos de infección corneal.
▪ Los resultados de este estudio son prometedores en la búsqueda de nuevos agentes
terapéuticos, necesarios a nivel mundial por el incremento de la resistencia bacteriana.
8.1 Recomendaciones
Se requiere ampliar los resultados de este estudio en modelos in vivo para evaluar la
acción del genipin en la respuesta inflamatoria corneal ante la infección, de hecho en el
momento se cuenta con aval del comité de ética para desarrollar este protocolo, por parte
de los autores de este trabajo.Bibliografía
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