Análisis de macromoléculas de sangre canina mediante Espectroscopías Infrarroja y  Uv-Visible
Autor: Montenegro Moreno, Giselle Alejandra
Asesor: Vargas Hernández, Carlos
Fecha: 2020
Programa: Manizales - Ciencias Exactas y Naturales - Ingeniería Física
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Con la tecnología disponible, los protocolos y las metodologías para el diagnóstico clínico en caninos, aún no se dispone de criterios definitivos en las etapas tempranas de formación de algunas enfermedades como cáncer, diabetes, daño hepático, etc que permitan a los especialistas tomar decisiones al respecto. Aún se continúa usando como método definitivo y acertado para la evaluación de enfermedades métodos clínicos de tipo invasivo como las biopsias con las respectivas dificultades en el diagnóstico, que sumado a la experticia y experiencia del patólogo; posibilita el incremento de error en el proceso. Los resultados de este trabajo mediante Espectroscopias Infrarroja y UV-Visible muestran que las técnicas de caracterización estudiadas son viables para el análisis de macromoléculas presentes en tejido sanguíneo, lo que permitió obtener un protocolo mediante el pico de control asociado a hemoglobina en espectroscopía UV-Visible y a degradación de proteínas en espectroscopía Infrarroja.

Adicional a esto, con el fin de estudiar los efectos de materiales nanoestructurados en la caracterización de este tejido, se produjeron y añadieron a las muestras nanopartículas de plata formando complejos que fueron obtenidas por dos métodos de síntesis, el primer tipo preparada con síntesis asistida por microondas y la segunda utilizando el método tradicional de Creighton en donde se usa un agente reductor (borohidruro de sodio) para producir nanopartículas esféricas mono-dispersas. De forma más general, en el trabajo se discute la posibilidad de diagnosticar el daño hepático en caninos mediante el protocolo del pico de control, discusión basada en los resultados obtenidos y reportes de la literatura.

An´alisis de macromol´eculas de sangre
canina mediante Espectroscop´ıas
Infrarroja y Uv-Visible
Infrared and UV-Visible spectroscopy analysis of
entire canine blood macromolecules
Giselle Alejandra Montenegro Moreno
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de F´ısica y Qu´ımica
Manizales, Colombia
2020An´alisis de macromol´eculas de sangre
canina mediante Espectroscop´ıas
Infrarroja y Uv-Visible
Giselle Alejandra Montenegro Moreno
Informe final de trabajo de grado presentado como requisito para optar al t´ıtulo de:
Ingeniera F´ısica
Director:
Ph.D Carlos Vargas Hern´andez
Asesor:
M.V.Alejandro Clavijo Maldonado
L´ınea de Investigacio´n:
Biof´ısica
Grupo de Investigaci´on:
´
Propiedades Opticas de Materiales (POM)
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Ciencias Exactas y Naturales
Departamento de F´ısica y Qu´ımica
Manizales, Colombia
2020A mis padres por su apoyo incondicional,
a mi hermano por estar siempre conmigo.Agradecimientos
AgradezcoalaUniversidadNacionaldeColombia,alprofesorCarlosVargasHerna´ndez
a cargo del laboratorio propiedades ´opticas de los materiales (POM) por su tiempo,
compromiso y colaboracio´n junto con el estudiante de maestr´ıa Alejandro Clavijo
Maldonado; al laboratorio de f´ısica del plasma a cargo de la profesora Elizabeth
Restrepo por toda la colaboracio´n prestada para hacer el uso de todos los equipos
necesarios para lograr el objetivo del proyecto y que junto a todas las personas que
pertenecen a cada uno de estos laboratorios hayan hecho que se de un aprendizaje
mayor sobre la investigacio´n realizada. Agradezco tambi´en a la oficina de relaciones
internacionales ORI que junto a la Universidad Auto´noma de Chiapas y el Instituto
Tecnol´ogico de Tuxtla Guti´errez me facilitaron sus estancias para avanzar en mi
proyecto de investigacio´n.Resumen
Conlatecnolog´ıadisponible,losprotocolosylasmetodolog´ıasparaeldiagn´ostico
cl´ınico en caninos, au´n no se dispone de criterios definitivos en las etapas tempranas
deformacio´ndealgunasenfermedadescomoc´ancer,diabetes,dan˜ohep´atico,etcque
permitanalosespecialistastomardecisionesalrespecto.Au´nsecontinu´ausandoco-
mom´etododefinitivoyacertadoparalaevaluaci´ondeenfermedadesm´etodoscl´ınicos
de tipo invasivo como las biopsias con las respectivas dificultades en el diagn´osti-
co, que sumado a la experticia y experiencia del pato´logo; posibilita el incremento
de error en el proceso. Los resultados de este trabajo mediante Espectroscopias In-
frarroja y UV-Visible muestran que las t´ecnicas de caracterizaci´on estudiadas son
viables para el ana´lisis de macromol´eculas presentes en tejido sangu´ıneo, lo que per-
mitio´ obtener un protocolo mediante el pico de control asociado a hemoglobina en
espectroscop´ıaUV-Visibleyadegradacio´ndeprote´ınasenespectroscop´ıaInfrarroja.
Adicional a esto, con el fin de estudiar los efectos de materiales nanoestructura-
dos en la caracterizacio´n de este tejido, se produjeron y an˜adieron a las muestras
nanopart´ıculas de plata formando complejos que fueron obtenidas por dos m´etodos
de s´ıntesis, el primer tipo preparada con s´ıntesis asistida por microondas y la segun-
da utilizando el m´etodo tradicional de Creighton en donde se usa un agente reductor
(borohidruro de sodio) para producir nanopart´ıculas esf´ericas mono-dispersas. De
forma m´as general, en el trabajo se discute la posibilidad de diagnosticar el dan˜o
hepa´tico en caninos mediante el protocolo del pico de control, discusio´n basada en
los resultados obtenidos y reportes de la literatura.
Palabras clave: Espectroscop´ıa Infrarroja, Espectrofotometr´ıa UV-Visible,
sangre canina, nanopart´ıculas, biomarcadores, macromol´eculas, hemoglobina.Abstract
Spectroscopy techniques have been used to provide information. In order to eva-
luate changes on the chemical components in biological samples like blood tissue,
this techniques can be used as an important clinical tool for in vivo diagnosis, where
spectral peaks can be related such as biological markers. In the present study, we
present canine blood samples analysis, methodology and protocol using non-invasive
optical techniques like Infrared and UV-Visible spectroscopy for monitoring and
identification of possible diseases. As a case study canine blood tissue samples from
three patients were obtained on preprandial and postprandial state and analyzed
under power conditions that do not cause any modification. On the other hand, in
order to study how nanostructures enhance the signal tissue, we synthesized silver
nanoparticles by two methods: synthesis microwave-assisted and Creighton synthe-
sis method that was added to blood samples. The software tool Origin was used
to determinate representative peaks in each spectrum. Evaluating areas under the
curve and radio analysis were realized considering that absorption bands represent
a group of macromolecules. The results show that methodologies used are viable
for blood macromolecules tissue evaluation due to differences presented. In general,
we discuss canine liver damage diagnosis possibility based on results obtained and
literature reports.
Key words: Infrared Spectroscopy, UV-Visible Spectroscopy, blood canine
tissue, nanoparticles, macromolecules, hemoglobin.Contenido
Agradecimientos
IV
Resumen
V
Abstract
VI
Lista de S´ımbolos 1
1. Introduccio´n 3
2. Conceptos y definiciones 7
2.1. Qu´ımica Sangu´ınea . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.2. Biopsia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
2.3. Biomarcadores . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.4. Macromol´eculas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.4.1. Prote´ınas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
2.4.2. Carbohidratos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
2.4.3. L´ıpidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.5. Espectroscop´ıa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
2.6. Espectroscop´ıa en biofluidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.7. Espectroscop´ıa Ultravioleta-Visible . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
2.8. Espectroscop´ıa Infrarroja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
2.9. Nanopart´ıculas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
3. Trabajos relacionados 13
4. Materiales y M´etodos 17
4.1. Criterios de Inclusi´on . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.2. Recoleccio´n de muestras de sangre entera canina . . . . . . . . . . . . 17
4.3. S´ıntesis de nanopart´ıculas de plata . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4.4. Caracterizacio´n de nanopart´ıculas de Plata . . . . . . . . . . . . . . . 18
4.4.1. Centrigugacio´n . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4.4.2. Espectroscop´ıa UV-Vis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4.4.3. Preparaci´on de muestras de sangre con nanopart´ıculas . . . . 19
4.5. Ana´lisis de tejido sangu´ıneo por Espectroscop´ıa Infrarroja y UV-Visible 19
vii5. Resultados 21
5.1. Caracterizacio´n de nanopart´ıculas de Plata . . . . . . . . . . . . . . . 21
5.2. Ana´lisis de sangre entera canina por espectroscop´ıa UV-Visible . . . . 23
5.3. Ana´lisis de sangre entera canina por espectroscop´ıa Infrarroja . . . . 25
5.4. Ana´lisis de sangre entera canina con NPs . . . . . . . . . . . . . . . . 28
6. Conclusiones 33
7. Anexos 35
Bibliograf´ıa 41Lista de S´ımbolos
S´ımbolos con letras latinas
S´ımbolo T´ermino
A Absorbancia
I Intensidad de luz incidente
o
I Intensidad de luz transmitida
Sub´ındices
Sub´ındice T´ermino
o Estado de referencia
ac Acuoso
s So´lido
g Fase gaseosa
Abreviaturas
Abreviatura T´ermino
IR Espectroscop´ıa Infrarroja
UV −Vis Espectroscop´ıa Ultravioleta y Visible
NPs Nanopart´ıculas
Ag Plata
AgNO Nitrato de Plata
3
NaBH Borohidruro de Sodio
4
SERS Surface-enhanced Raman scatteringCap´ıtulo 1
Introduccio´n
La evaluacio´n cl´ınica, es un proceso que permite cuantificar el grado de enferme-
dad que presenta un paciente. En el caso de pacientes caninos, entre m´as ra´pido y
ma´s informaci´on proporcionen las t´ecnicas de diagn´ostico, el proceso de evaluaci´on
sera´ ma´s eficiente. Sin embargo, las t´ecnicas usadas hasta el momento para conocer
el grado de enfermedad de un paciente, o simplemente como medio de seguimiento
de evoluci´on de las mismas, se utilizan m´etodos cl´ınicos convencionales como an´alisis
por rayos X, escaneo por resonancia magn´etica, o ultrasonido [1] que ofrecen limita-
da informacio´n de la regio´n escaneada sin garantizar evidencia suficiente del grado
de gravedad de la enfermedad [2]. As´ı, la habilidad de los veterinarios para dar un
diagno´stico cl´ınico completo est´a limitado por la falta de t´ecnicas de diagn´ostico
que permitan tener informaci´on completa del grado de enfermedad. Claramente, las
t´ecnicas mencionadas anteriormente no son o´ptimas para detectar etapas tempra-
nas de formacio´n [2, 3]. Como alternativa, se han usado los exa´menes histolo´gicos
usando biopsias. Aunque sirven para tener mayor conocimiento del estado de malig-
nidadresultanser invasivas,puestoquerequierentomar muestra detejido,necesitan
mucho tiempo, son costosas y dependen adema´s de la experiencia del pato´logo [1].
Otras t´ecnicas de rutina como qu´ımica sangu´ınea, cuadro hema´tico, etc. se realizan
de forma manual haciendo que el ana´lisis sea subjetivo y dependa de la experiencia
de la persona que analiza la muestra. As´ı, estos procedimientos tampoco son los
ma´s eficientes a la hora de proporcionar informacio´n sobre ciertas caracter´ısticas.
Adicional, son ex´amenes individuales y en su mayor´ıa manuales lo que incrementa
la posibilidad de error [4]. Es por ello que en los u´ltimos an˜os se ha intentado im-
plementar t´ecnicas alternativas basadas en f´ısica y an´alisis de materiales que no son
invasivas, nos permiten obtener informaci´on de relevancia para lograr un diagn´ostico
apropiado y, se reduce la subjetividad del error humano [2].
La espectroscop´ıa, es una t´ecnica que ha sido utilizada para analizar mol´ecu-
las biolo´gicas [5, 6] en tejido biolo´gico como sangre [7] dando informacio´n sobre su
estructura y cambios [8, 9]—informacio´n relevante debido a la presencia de biomar-
cadores biolo´gicos asignados a diagn´ostico de enfermedad [8] en estos tejidos. El
tejido biolo´gico es sensible a radiacio´n Infrarroja (IR), Ultravioleta (UV) y Visible
(Vis). De aqu´ı, la importancia de las t´ecnicas de espectroscop´ıa ya que es posible
buscarcambiosestructuralescomorespuestadeltejidoalaradiacio´n[10]—evidencia
3que tiene soporte al hacer una comparacio´n con t´ecnicas convencionales. Entre estas
alternativas no invasivas se destacan t´ecnicas de espectrometr´ıa tales como UV-
Visible e Infrarroja que han ganado mucha importancia como herramientas para el
ana´lisis cuantitativo de materiales biolo´gicos ya que esta´n dispuestas para ana´lisis
“ in-vivo ” [11] debido a que la potencia y la longitud de onda de los l´aseres usados
no causan ningu´n tipo de dan˜o a las muestras analizadas [2]. As´ı pues, estas t´ecnicas
de dispersi´on tan prometedoras permiten analizar la concentracio´n de sustancias en
medio biolo´gico de forma r´apida y segura mediante la interacci´on foto´n-mol´ecula [4],
en donde el estado del tejido es representado por un espectro de absorcio´n u´nico.
Sin embargo, estas t´ecnicas pueden estar limitadas ya que hay macromol´eculas que
emiten sen˜ales muy d´ebiles, lo que causa que la reaccio´n del tejido a la radiacio´n
Infrarroja y UV-Visible sea tambi´en d´ebil obteniendo un espectro dif´ıcil de analizar.
As´ı, en aras de mejorar la deteccio´n molecular a bajos niveles de concentracio´n,
algunas investigaciones se han dedicado a buscar t´ecnicas complementarias para
amplificar la sen˜al del espectro de absorcio´n. Bonifacioet al. [12] y Tanet al. [13]
estudiaron como nanopart´ıculas de diferentes metales son capaces de interactuar
con muestras biolo´gicas permitiendo una amplificacio´n de la sen˜al emitida por ca-
da uno de sus componentes a nivel at´omico debido a sus propiedades o´pticas [13],
obteniendo un espectro m´as fa´cil de analizar. La amplificaci´on de la sen˜al se da
principalmente por el efecto plasmo´nico [14] o resonancia entre la part´ıcula y la on-
da electromagn´etica incidente. Lo ma´s importante, es que estas propiedades o´pticas
pueden ser moduladas mediante la morfolog´ıa de las nanoestructuras permitiendo
optimizar la amplificaci´on de la sen˜al emitida [12, 13]
En esta investigacio´n pongo a prueba este m´etodo de amplificacio´n de la sen˜al
buscando avanzar el estado del arte en t´ecnicas de diagn´ostico cl´ınico no invasivo.
La metodolog´ıa seguida busca servir de base para establecer un protocolo de an´ali-
sis de tejido sangu´ıneo mediante espectroscop´ıa Infrarroja y UV-Visible in vivo [2]
que puede ser usado como complemento a t´ecnicas de diagno´stico tradicionales.
Co´mo primera aproximacio´n, se desarrolla un caso de estudio con pacientes caninos.
Al realizar an´alisis de sangre canina usando t´ecnicas de espectroscop´ıa, fue posible
determinar cambios estructurales en el tejido sangu´ıneo; fen´omeno asociado a varia-
cio´n en la concentraci´on de hemoglobina y cambios en otras macromol´eculas como
prote´ınas, carbohidratos y l´ıpidos. Los resultados fueron utilizados para realizar un
diagno´stico mediante la comparacio´n entre los datos obtenidos con la informaci´on
recolectada por t´ecnicas convencionales. A pesar de que nuestro caso estudio es
limitado y el nu´mero de pacientes y muestras debe ser ma´s amplio antes de sacar
conclusionesma´sgenerales,ennuestroexperimentoseobtuvieronbuenosresultados,
que sugieren que las t´ecnicas de espectroscop´ıa empleadas pueden ser estandariza-
das y usadas para el an´alisis de tejido biolo´gico incrementando la eficiencia de la
evaluaci´on cl´ınica. En particular, consideramos que el protocolo que proponemos es
u´til para entender como la espectroscop´ıa puede ser usada como complemento a las
t´ecnicas usadas actualmente.
Nuestro trabajo de investigaci´on est´a organizado de la siguiente manera: En la
seccio´n 2 se introducen algunos conceptos y definiciones, en la seccio´n 3 se haceun resumen de los apuntes tomados de otros trabajos de investigaci´on relacionados
con el nuestro, en la seccio´n 4 se trata la metodolog´ıa que seguimos, es decir, los
materiales empleados y el m´etodo que seguimos en cada proceso de la investigaci´on.
En la seccio´n 5 presentamos los resultados y la discusio´n de resultados y finalmente,
en la seccio´n 6, las conclusiones.Cap´ıtulo 2
Conceptos y definiciones
En esta seccio´n, se hara´ una breve contextualizaci´on de algunos conceptos y de-
finiciones u´tiles para entender el objetivo del proyecto de investigacio´n. Primero se
habla de algunas t´ecnicas convencionales, luego se define que es un biomarcador y
el papel de las macromol´eculas como biomarcadores. A continuacio´n se da carac-
ter´ısticas generales de cada macromol´ecula a considerar en la investigaci´on. Luego,
explica en qu´e consiste la espectrocop´ıa y qu´e tecnicas se van a usar. Finalmente, se
define que es una nanopart´ıcula y su sintesis.
2.1. Qu´ımica Sangu´ınea
Es una t´ecnica de diagno´stico que se realiza para conocer los componentes qu´ımi-
cos disueltos en la sangre con el fin de evaluar el metabolismo del paciente. En
animales, ha incrementado el uso de esta t´ecnica ya que proporciona al veterinario
informacio´n adicional sobre la cantidad de macromol´eculas que le ayudan a reali-
zar un diagno´stico m´as preciso que conllevar´a a recibir un mejor tratamiento. Los
resultados de este tipo de ex´amenes se interpretan como una comparaci´on entre los
valores que se obtienen del paciente con los de un grupo referencia (animales sanos).
Adicional, se debe tener en cuenta como la enfermedad altera la concentraci´on de
cada macromol´ecula [15].
2.2. Biopsia
Es un procedimiento que se utiliza para tener un mayor conocimiento del estado
de la enfermedad. Consiste en la extracci´on de una muestra de tejido para ser ana-
lizado en el laboratorio [1].
72.3. Biomarcadores
Unbiomarcador,esunindicadordeestadobiol´ogicoquesemideyevalu´aalhacer
una comparacio´n entre procesos normales y procesos patog´enicos o como respuesta
a un determinado f´armaco [16], es decir, permite determinar cambios qu´ımicos o
morfolo´gicos. Segu´n Mathewet al., los biomarcadores son de gran importancia para
el manejo del paciente, en especial cuando presentan riesgo de enfermedad o etapas
tempranas de formacio´n, permitiendo un diagno´stico y monitoreo ma´s eficiente [8].
As´ı se plantea como v´ıa prometedora la detecci´on de biomarcadores (concentraci´on
de macromol´eculas) en biofluidos como la sangre. Este fluido, es fa´cil de recolectar,
lo que da la posibilidad de repetir la prueba tantas veces como sea necesario para
monitorearetapastempranasoprogresio´ndeenfermedadyrespuestaaltratamiento.
2.4. Macromol´eculas
Las macromol´eculas est´an formadas principalmente de carbono, son mol´eculas
de gran taman˜o y organizacio´n molecular que se encargan de formar la estructura
y actividades de las c´elulas en nuestro cuerpo. Segu´n Iwasa y Marshall [17], las
macromol´eculas se pueden dividir principalmente en cuatro categor´ıas: prote´ınas,
a´cidos nucleicos, polisaca´ridos y ciertos l´ıpidos.
2.4.1. Prote´ınas
Las prote´ınas, figura 1, son mol´eculas largas y complejas. Esta´n formadas por
mol´eculas m´as pequen˜as a las que se conoce como aminoa´cido, durante la s´ıntesis de
prote´ınas, cada aminoa´cido se une con otros dos amino´acidos formando un pol´ımero
largo, continuo y no ramificado. Los aminoa´cidos est´an compuestos por carbono,
ox´ıgeno, hidr´ogeno y nitro´geno principalmente. La piel, el cabello, las un˜as y los
mu´sculos est´an compuestos por prote´ınas el igual que el tejido conectivo y la mem-
brana celular de cada c´elula de nuestro cuerpo. Por nombrar algunas funciones, el
cola´geno, es la principal prote´ına en la piel, es la encargada de proteger el interior
del cuerpo de la entrada de sustancias extran˜as, es una barrera de proteccio´n. Las
prote´ınasledanformaysolidezanuestrocuerpoatrav´esdelosmu´sculos.Tendones,
ligamento y cart´ılago que hacen parte del tejido conectivo, gracias a las prote´ınas,
forman o´rganos internos y los mantienen en su sitio. Prote´ınas en la membrana celu-
larseencargandedeterminarquesustanciasentranosalendelac´elula.Enlasangre,
nuestro tejido de estudio, tambi´en encontramos prote´ınas como la hemoglobina que
se encargan de llevar ox´ıgeno a las c´elulas y remover el di´oxido de carbono [18].
Hemoglobina
La hemoglobina es una prote´ına globular formada por cuatro subunidades pro-
te´ıcas. Cada subunidad llamada cadena de hemoglobina se conforma por una cadena
polipept´ıdica llamada globina unida de modo no covalente a un grupo hemo, figu-
ra 2. La funcio´n de la hemoglobina es transportar el ox´ıgeno desde los pulmonesFigura 1: Prote´ına [17]
hasta los tejidos y el dio´xido de carbono desde ´estos a los pulmones donde se da su
eliminacio´n [19].
Figura 2: Grupo hemo
2.4.2. Carbohidratos
Los carbohidratos pueden ser monosac´aridos (azu´cares simples), disac´aridos (dos
unidades de azu´car), oligosac´aridos (oligo = poco ) y polisaca´ridos (largas cadenas
de azu´car). La uni´on entre azu´cares para formar mol´eculas m´as grandes se da me-
diante enlaces glucos´ıdicos [17].
Nuestro cuerpo se encarga de descomponer los carbohidratos en monosac´ari-
dos (glucosa - figura 3) con el fin de convertir las calor´ıas ingeridas en energ´ıa.
Sin embargo, no todas las calor´ıas se transforman en energ´ıa, sino que el h´ıgado y
los mu´sculos almacenan la glucosa en forma de un polisac´arido llamado gluc´ogeno(pol´ımero de unidades de azu´car unidos por enlaces glucos´ıdicos) para ser utilizado
posteriormente [18].
Por otro lado, los disac´aridos son reservas de energ´ıa ra´pida como la lactosa
(presente en la leche) y sacarosa (azu´car de mesa). Los oligosac´aridos frecuente-
mente se unen de forma covalente con l´ıpidos y prote´ınas formando glucol´ıpidos y
glucoprot´ınas, respectivamente, cuya funcio´n destaca en su habilidad para distinguir
diferencias entre c´elulas ayudando as´ı a mediar interacciones con su entorno [17].
Figura 3: Glucosa [17]
2.4.3. L´ıpidos
Los l´ıpidos son mol´eculas no polares, es decir que son incapaces de disolverse en
agua, pero si pueden mezclarse con solventes org´anicos como cloroformo o benceno.
Entre los l´ıpidos de mayor importancia est´an las grasas (triglic´eridos), los fosfol´ıpi-
dos y los esteroides. Para esta investigacio´n so´lo se va a considerar el colesterol,
figura 4, uno de los esteroides m´as importantes por su importancia para la s´ıntesis
de hormonas como la testosterona, la progesterona y el estro´geno.
2.5. Espectroscop´ıa
Las t´ecnicas que emplean espectroscop´ıa, se caracterizan por ser altamente sen-
sibles. Son t´ecnicas que no son destructivas y que necesitan pequen˜as cantidades de
material para realizar un ana´lisis. El objetivo principal, es medir la interaccio´n de
las mol´eculas con la radiaci´on electromagn´etica. El principio f´ısico, se basa en utili-
zar la energ´ıa de la luz para que los electrones de la muestra cambien de estado, es
decir, pasen de estado fundamental (en reposo) a un estado excitado. Mediante este
proceso se puede obtener un espectro u´nico de absorcio´n de la luz en funcio´n de la
frecuencia o longitud de onda. El espectro que se obtiene depende directamente de la
concentracio´n de la muestra y de la interaccio´n entre las longitudes de onda inciden-
tes( ultravioleta ( < 400 nm), visible (entre 400-800nm ) e infrarrojo ( > 750 nm))Figura 4: Colesterol [17]
con las mol´eculas que componen la muestra [20]. El equipo para detectar la canti-
dad de luz que pasa a trav´es de la muestra se denomina espectrofot´ometro [8, 21].
2.6. Espectroscop´ıa en biofluidos
Las t´ecnicas de espectroscop´ıa usadas en el ana´lisis de fluidos como la sangre
pueden proporcionar un diagno´stico ideal debido a que al igual que las c´elulas y
tejidos, los fluidos tienen espectros con bandas caracter´ısticas que reflejan su com-
posici´on biomolecular. Existen grandes avances que muestran que el desarrollo de
la espectroscop´ıa en biofluidos permiten detectar etapas tempranas de enfermedad
debido a la existencia de biomarcadores previos a la aparicio´n de s´ıntomas. Adema´s,
es una t´ecnica no invasiva, no destructiva y de uso libre [8].
2.7. Espectroscop´ıa Ultravioleta-Visible
La espectrofotometr´ıa de absorcio´n en la zona ultravioleta y visible del espectro
electromagn´etico se ha utilizado desde hace muchos an˜os y, posiblemente, es una de
las espectroscop´ıas ma´s utilizada en la pra´ctica del an´alisis cuantitativo [22]. Las
mediciones se pueden realizar en un espectrofot´ometro UV-Visible el cual tiene co-
mo base la ley de Lambert- Beer, ecuaci´on 1, que relaciona la absorci´on de la
radiacio´n con la concentracio´n de un compuesto en disolucio´n [20].
(cid:16) I (cid:17)
A = -log (1)
I
oLos espectrofoto´metros UV-Vis son equipos de laboratorio est´andar que esta´n
compuestos de dos fuentes de luz: una la´mpara de deuterio, que emite luz en la
regio´n UV y una la´mpara de tungsteno para la regio´n visible. Esta luz despu´es de
pasar por un monocromador (filtro o´ptico) es enfocada en una cubeta, para luego
detectar por medio de un fotodiodo la cantidad de luz que pasa a trav´es de la mues-
tra [8].
2.8. Espectroscop´ıa Infrarroja
Las mol´eculas presentes en el tejido biol´ogico son sensibles a la radiaci´on com-
prendida en el rango de microondas e infrarrojo. Cuando la muestra interactu´a
con radiacio´n en el rango mencionado, la mol´eculas pueden producir vibraciones o
rotaciones de los grupos moleculares, lo que produce la activacio´n o inactivaci´on
de lo que se conoce como modos normales de vibracio´n que son los que permiten
diferenciar unos materiales de otros [8, 20]. La espectroscop´ıa infrarroja por trans-
formada de Fourier (FT-IR) es una de las t´ecnicas ma´s prometedoras debido a su
ra´pida, simple y confiable [23] deteccio´n de cambios estructurales como interacci´on
de enlaces de hidr´ogeno, etc [24] sin el uso de reactivos [7]. As´ı, al analizar tejido
sangu´ıneo, tambi´en se genera un espectro u´nico de absorci´on como una “huella dac-
tilar” permitiendo la determinacio´n con gran precisio´n de composicio´n de la sangre
como glucosa, prote´ınas totales, urea, triglic´eridos y colesterol en una cantidad muy
pequen˜a [7, 25].
2.9. Nanopart´ıculas
La nanociencia se basa principalmente en el control de las propiedades fisico-
qu´ımicas de un material a nivel microsco´pico—taman˜o y forma de superficie para
mejorar o buscar aplicaciones en ´areas como informa´tica, electro´nica y biomedici-
na [26, 27]. Entre los objetivos de la nanociencia, encontramos el estudio de nano-
materiales que son aquellos que comprenden un rango entre 1 y 100nm. Las nano-
part´ıculas, uno de los nanomateriales ma´s estudiados, se definen como part´ıculas de
menos de 100nm cuya s´ıntesis se puede realizar por varios m´etodos [28]—m´etodo de
Creighton y s´ıntesis con el uso de radiaci´on microondas [26, 29] En nuestro estu-
dio, para la s´ıntesis de nanopart´ıculas de plata se usaron los m´etodos mencionados
anteriormente. El m´etodo de Creighton consiste en la reduccio´n de nitrato de plata
( AgNO ) con borohidruro de sodio ( NaBH ), este procedimiento es el ma´s popular
3 4
en la actualidad y da lugar a la obtenci´on de nanopart´ıculas de plata de aproxima-
damente 10 nm y con una distribuci´on estrecha de taman˜o (monodispersas) [26].
La s´ıntesis con el uso de radiacio´n microondas permite obtener nanoestructuras
estables de distribucio´n uniforme ya que el calentamiento de manera homog´enea
favorece la nucleacio´n de las part´ıculas reduciendo el tiempo de reacci´on [28].Cap´ıtulo 3
Trabajos relacionados
En esta secci´on, se van a mencionar algunas de las investigaciones ma´s relevan-
tes que contribuyeron al desarrollo y resultados de este trabajo. Cada investigacio´n
tiene como fundamento de estudio la interacci´on entre tejido biolo´gico con la radia-
cio´n UV-Vis e IR. Este resumen est´a dividido en cuatro partes: en la primer parte
revisamos estudios que utilizan plasma sangu´ıneo como muestra biolo´gica; luego, se
nombran algunos trabajos en los cuales se usa suero sangu´ıneo; despu´es, se hace
una revisi´on de investigaciones en las que se usa sangre entera como tejido biolo´gico
teniendo en cuenta la metodolog´ıa que ellos siguen; y, al final de la secci´on, se de-
talla como influyen los nanomateriales en el an´alisis de tejido sangu´ıneo. Antes de
describir los trabajos en los cuales nos basamos, es importante destacar que durante
nuestra investigacio´n se recolectaron los consentimientos informados para todos los
pacientes que participaron en el estudio. Nuestra investigacio´n fue aprobada por un
comit´e de ´etica siguiendo el trabajo de Parlinskaet al. [30].
En la literatura, la espectroscop´ıa UV-Vis e IR ha sido ampliamente utilizada
en el ana´lisis de tejido biolo´gico para deteccio´n de enfermedades. Por ejemplo, Peti-
boiset al., Januset al. y Zeliget al. [31, 6, 7] notaron cambios qu´ımicos en el tejido
que analizaban, que posteriormente, lo atribuyeron a enfermedades como diabetes,
ca´ncer de mama, etc. Los autores presentan ciertas diferencias en las macromol´ecu-
las que estudian y no es clara la comparacio´n que hacen entre investigaciones. En
muchos casos [32, 30, 33, 34], los autores se enfocan en caracterizar el espectro obte-
nido. Sin embargo, el objetivo de esta investigacio´n es proporcionar una metodolog´ıa
clara que permita obtener, preparar y analizar la muestra biol´ogica.
El uso de plasma es muy comu´n en varios autores para identificar y caracterizar
enfermedades. Por ejemplo, Zeliget al. [7] sugiere que cuando la absorcio´n IR de
picos asociados a l´ıpidos y prote´ınas aumenta, el incremento en la concentraci´on
de estas macromol´eculas puede ser indicativo de ca´ncer de mama. Los resultados
de sus experimentos muestran que el incremento de absorci´on IR est´a asociado con
el incremento de prote´ınas como albu´mina y globulina. Petiboiset al. [31] asocia el
incremento en la absorcio´n IR con la alta concentraci´on de colesterol, triglic´eridos
y aminoa´cidos. Las muestras de plasma de los pacientes que mostraron alteraciones
en la concentraci´on de macromol´eculas, se asociaron a condicio´n diab´etica.
13En general todos los autores [7, 25, 31, 35] muestran una metodolog´ıa similar.
Ellos toman una muestra sangu´ınea entre 2 y 7ml y la depositan en tubos EDTA
(tubos BD Vacutainer tapa lavanda). Los tubos son centrifugados entre 10 y 15 min
entre 3000 y 4000g para separar los eritrocitos (glo´bulos rojos) del plasma. Se ex-
trae inmediatamente el l´ıquido sobrenadante (plasma) con la ayuda de una pipeta
Pasteur y se ubica en un tubo de polipropileno de laboratorio. Luego, las muestras
son almacenadas a −20°C antes del ana´lisis. Posteriormente, se usa espectroscop´ıa
Infrarroja para identificar cambios estructurales y bioqu´ımicos en las muestras. El
rango que se usa para el ana´lisis esta´ entre 400 a 4000cm−1.
De manera similar a los estudios que involucran plasma, el suero sangu´ıneo tam-
bi´en ha sido utilizado para diagnosticar enfermedades. Autores como Backhauset
al. [32] sugieren la posibilidad de dar un diagn´ostico temprano de ca´ncer usando
espectroscop´ıa IR en suero. En su investigacio´n, se estudia el cambio en el espectro
al hacer una comparacio´n entre pacientes con c´ancer y pacientes sanos; los cambios
se atribuyen a vibraciones de la ribosa y fosfol´ıpidos. Adicional, se hacen compa-
raciones entre pacientes con c´ancer de mama y pacientes con otras enfermedades
como Alzheimer, Hepatitis C o con carcinoma en el P´ancreas, Bronquios y Recto.
A pesar de que en su estudio no logran detectar etapas tempranas de formaci´on
de ca´ncer de mama, si pudieron detectar tumores de 2mm de dia´metro, lo que
implica un tratamiento en estado no tan cr´ıtico. Elmiet al. [11] estudio´ la misma
enfermedad que Backhauset al. [32]. Ellos midieron la concentraci´on de prote´ınas,
colesterol, glucosa y urea encontrando diferencias espectrales entre pacientes sanos
y enfermos, especialmente en las zonas relacionadas con prote´ınas y l´ıpidos. En sus
resultados, se analizo´ un incremento en l´ıpidos y prote´ınas, lo que posteriormente se
atribuyo´ a apostosis (muerte celular), la cual es la principal caracter´ıstica de ca´ncer.
Srividyaet al. [33] estudio´ niveles anormales de glucosa en suero. En su trabajo, ana-
lizaron las diferencias espectrales de suero sangu´ıneo de pacientes sanos y diab´eticos.
Adicional, se realizo´ una investigaci´on en pacientes antes y despu´es de recibir tra-
tamiento para la diabetes. Entre los resultados, se encontro´ la espectroscop´ıa IR
como una herramienta prometedora para pacientes con esta enfermedad. Parlins-
kaet al. [30] estudio´ bajas concentraciones de fosfol´ıpidos y prote´ınas en suero. En
su investigaci´on, muestra que las bajas intensidades en los picos relacionados con es-
tasmacromol´eculasseatribuyenaunaenfermedadmentalconocidacomodepresio´n.
Al igual que plasma, autores [32, 11, 33, 30, 35, 34] siguieron una metodolog´ıa
similar al usar suero. Algunas diferencias fueron los tubos de recolecci´on y la tem-
peratura de almacenamiento. As´ı, muestras de sangre fueron depositadas en tubos
sin EDTA (tubos BD Vacutainer tapa roja) y almacenadas entre −20 y −85°C. En
ambos ana´lisis, tanto para plasma como para suero sangu´ıneo se hizo correccio´n de
linea base y normalizacio´n de los datos.
Por otro lado, la literatura que involucra ana´lisis de tejido usando espectroscop´ıa
UV-Visible, no es muy comu´n. Sin embargo, es nuestra investigaci´on consideramos
esta t´ecnica relevante como complemento para la validaci´on de resultados obtenidosmediante espectroscop´ıa IR y m´etodos cl´ınicos convencionales. La metodolog´ıa con
mayor similitud a la empleada en esta investigaci´on fue la de Gonza´les-Dom´ınguezet
al. [36] y la de Alvarado-Noguezet al. [37]. Cabe aclarar, que ellos emplearon espec-
troscop´ıa foto-acu´stica para ana´lisis de sangre y nosotros empleamos espectroscop´ıa
UV-Vis. Decidimos tomar como base estas investigaciones ya que el rango analiza-
do y el fen´omeno f´ısico empleado es similar. Gonza´les-Dom´ınguezet al. [36] estudio´
el radio de picos relacionados con la hemoglobina de una poblaci´on masculina de
diferentes edades usando espectroscop´ıa foto-acu´stica. Alvarado-Noguezet al. [37]
estudio´ la misma metodolog´ıa, pero con el uso de sangre de rata de tres tipos: ratas
sanas, con dan˜o hepa´tico y ratas que recib´ıan tratamiento para la enfermedad. As´ı,
siguiendo la misma metodolog´ıa, pero con espectroscop´ıa UV-Vis, obtuvimos resul-
tados similares, en los cuales se observa en el espectro los picos α, β y γ relacionados
con los grupos funcionales que hacen parte de la hemoglobina.
Autores como Limaet al. [35] y Gajjaret al. [38] hicieron una comparacio´n entre
suero y plasma sangu´ıneo para identificar cual es la mejor muestra biol´ogica para
identificar enfermedades. Sin embargo, para obtener suero o plasma sangu´ıneo se
necesitan preparaciones adicionales como centrifugar las muestras y almacenarlas a
temperaturasmuybajas.Esporello,quenosotrosproponemossangreentera,queno
requiere ninguna preparacio´n, excepto almacenar las muestras en tubos con EDTA
para evitar coagulacio´n de la sangre. As´ı, el enfoque de nuestra investigacio´n est´a
basado en este fluido a pesar de la poca literatura relacionada con tejido sangu´ıneo
ya que es un fluido muy espeso. En nuestra investigaci´on se obtuvieron buenos resul-
tados en los cuales el espectro mostro´ picos principales relacionados con prote´ınas,
l´ıpidos y carbohidratos. Algunos picos relacionados con estas macromol´eculas ten´ıan
baja intensidad de absorci´on y, adema´s, el agua mostro´ fuertes efectos en la mues-
tra [39] debido al grupo O-H presente [39] entre 3600 y 3100cm−1, y H-O-H en
1645cm−1 [10]. As´ı, en busca de una soluci´on para amplificar la intensidad de los
picos, durante la investigacio´n, encontramos a autores como L. Allain and T. Vo-
Dinh [40] y Bonifacioet al. [12] quienes usaron espectroscop´ıa Raman con superficie
mejorada (SERS), para obtener amplificaci´on en el espectro. Tratando de replicar
esta t´ecnica y aprovechar la amplificacio´n del campo electromagn´etico con ayuda
de nanoestructuras meta´licas [41] pero usando espectroscop´ıa IR e UV-Vis, usamos
nanopart´ıculas de plata.
La falta de informacio´n en la metodolog´ıa empleada, no fue una limitante, ya
que se siguio´ de forma similar los experimentos de Bonifacioet al. [12] adapta´ndolos
a nuestras t´ecnicas de an´alisis. Tuvimos algunas diferencias en el m´etodo de s´ıntesis
de nanopart´ıculas y los rangos de ana´lisis. Nosotros no usamos el m´etodo de s´ıntesis
de AgNPs Lee-Meisel con la reduccio´n de citrato, si no que usamos s´ıntesis por
m´etodo Creighton con reducci´on de sales de plata, con la ayuda de borohidruro de
sodio [42]. Para la caracterizacio´n de nanopart´ıculas usamos espectroscop´ıa UV-Vis,
y para el an´alisis de la mezcla de AgNPs con tejido biol´ogico usamos espectroscop´ıa
IR e UV-Vis y no espectroscop´ıa Raman.Cap´ıtulo 4
Materiales y M´etodos
En esta seccio´n se hara´ una descripcio´n de los materiales empleados y la descrip-
cio´n paso a paso de la metodolog´ıa empleada para nuestra investigaci´on. Primero, se
introduce los criterios de inclusio´n; segundo, el proceso de recoleccio´n de las mues-
tras;despu´es,semuestraelprocesodes´ıntesisdenanopart´ıculas;luego,comosehizo
la caracterizacio´n de las mismas; finalmente, la preparaci´on del tejido sangu´ıneo con
las nanopart´ıculas para su posterior ana´lisis por espectroscop´ıa IR e UV-Vis.
4.1. Criterios de Inclusio´n
La investigaci´on se llevo´ a cabo en Manizales, departamento de Caldas adop-
tando las consideraciones bio´eticas de investigaci´on en salud para humanos segu´n
lo pactado en la Declaracio´n del Helsinki (2002) [2, 25] “Declaraci´on de Helsinki de
la Asociacio´n M´edica Mundial, Principios ´eticos para las investigaciones m´edicas en
seres humanos”, la Resoluci´on No. 008430 de octubre de 1993 de la Repu´blica de
Colombia – Ministerio de Salud “Por la cual se establecen las normas cient´ıficas,
t´ecnicas y administrativas para la investigaci´on en salud”, espec´ıficamente en Titulo
V “La Investigaci´on Biom´edica con Animales” y obedeciendo a la Ley 576 de 2000
´
“Co´digo de Etica para el ejercicio profesional de la medicina veterinaria, la medicina
veterinaria y zootecnia y zootecnia”. Se pide autorizaci´on y posterior aprobaci´on del
´
Comit´e de Etica para Experimentaci´on con Animales (CEEA) de la Vicerrector´ıa
de Investigaciones y Postgrados de la Universidad de Caldas, y, se expide el consen-
timiento informado a los propietarios para la posterior toma de muestras.
4.2. Recolecci´on de muestras de sangre entera ca-
nina
Por cada uno de los pacientes analizados, se tomaron dos muestras de 3 a 4ml
de sangre mediante puncio´n intravenosa as´eptica. La primera muestra se recolecto´
entre las 07:30h y 08:30h, despu´es de un periodo de 12 horas de ayuno. Cada mues-
tra se deposita en tubos EDTA (tubos BD Vacutainer tapa lavanda) haciendo la
17respectiva rotulaci´on teniendo en cuenta la fecha y un co´digo de trabajo para cada
individuo [43]. El proceso se repite una hora despu´es de haber suministrado ali-
mento al paciente para posteriormente realizar comparaciones. Las muestras fueron
transportadas en un medio refrigerado, evitando vibraciones fuertes y ciclos de con-
gelacio´n y descongelaci´on. Las muestras se conservan el menor tiempo posible para
evitar degradacio´n de macromol´eculas a 4°C en una nevera convencional antes del
ana´lisis por espectroscop´ıa IR e UV-Vis.
4.3. S´ıntesis de nanopart´ıculas de plata
Nanopart´ıculas de plata fueron sintetizadas mediante el m´etodo de Creighton
y con la ayuda de radiacio´n microondas. Para el primer m´edoto de s´ıntesis, en
un Erlenmeyer se adicionan 25ml de borohidruro de sodio (NaBH ). Se ubica el
4
Erlenmeyer dentro de un recipiente con hielo para luego ubicar el conjunto sobre
una placa calefactora. Aplicando agitacio´n magn´etica constante, se agregaron gota
a gota 10ml de nitrato de plata (AgNO ). El proceso se realiz´o variando las con-
3
centraciones de los componentes. Primero, se dejo´ constante AgNO a 0.001M y se
3
var´ıa NaBH (0.002m, 0.004m, 0.006m), respectivamente. Luego, se deja constan-
4
te NaBH a 0.002m variando AgNO (0.001m, 0.003m, 0.006m), respectivamente.
4 3
Para la s´ıntesis de nanopart´ıculas con la ayuda de radiacio´n microondas, se repite el
proceso anterior, pero sin dejar la mezcla en reposo se irradia la muestra a diferentes
tiempos (30s, 45s, 2m´ın) a 2.54 Ghz. Finalmente, se mide el pH de cada soluci´on
y se deja en reposo para revisi´on constante durante 1 semana.
4.4. Caracterizacio´n de nanopart´ıculas de Plata
4.4.1. Centrigugacio´n
Se colecta 4ml de la soluci´on preparada en tubos de ensayo que se centrifugan
durante 5 min a 5000g. Una vez las nanopart´ıculas se ubican en el fondo, se realizo´
el lavado de las mismas. Para ello, se retira el exceso de soluci´on y se an˜ade agua
destilada en una relacio´n 1:2 y se centrifuga de nuevo.
4.4.2. Espectroscop´ıa UV-Vis
Para realizar la caracterizaci´on de las nanopart´ıculas, se ubican 2ml de soluci´on
obtenida anteriormente en la cubeta de cuarzo del espectro´metro UV-Vis. El espec-
tro se colecta a temperatura ambiente (21°C) entre 300 y 700nm.4.4.3. Preparacio´n de muestras de sangre con nanopart´ıcu-
las
Con la ayuda de un gotero de pla´stico, sangre entera canina tomada en ayunas
fue depositada en 3 crioviales (criovial Termo Fisher de 1.8ml tapa azul), 15 gotas
en cada uno. Luego, se an˜aden 2 gotas de la solucio´n que contiene nanopart´ıculas
y se mezclan suavemente. El proceso se repite por cada paciente, para muestras
de sangre tomada en ayunas y muestras tomadas despu´es de ingerir alimento. En
total se tienen 6 muestras diferentes por cada paciente, las dos primeras: muestras
tomadas en ayunas y luego de ingerir alimento sin NPs, otras dos muestras con NPs
sintetizadas por m´etodo Creighton y las u´ltimas dos, muestras con NPs sintetizadas
con ayuda de microondas.
4.5. An´alisis de tejido sangu´ıneo por Espectros-
cop´ıa Infrarroja y UV-Visible
Se hace medici´on de sangre entera canina con y sin nanopart´ıculas en el equipo
de espectroscop´ıa Infrarroja monitorizada en la regio´n entre 4000 y 500cm−1 y, en el
equipo de espectroscop´ıa UV-Visible EvolutionTM 300 de Thermo Scientificen en la
regio´n ente 200 y 700nm, obteniendo los respectivos espectros para luego identificar
cada uno de los picos ma´s representativos e ubicar los grupos funcionales teniendo
en cuenta la estructura qu´ımica de los componentes de cada muestra segu´n reportes
de la literatura.Cap´ıtulo 5
Resultados
En esta seccio´n, se presentan los resultados y el an´alisis de los mismos. En la
primer seccio´n se describe la caracterizacio´n de las nanopart´ıculas de Plata; despu´es,
se realiza el ana´lisis de sangre entera canina por espectroscop´ıa UV-Visible; luego, se
hace el ana´lisis de sangre entera canina por espectroscop´ıa infrarroja y, finalmente,
se analiza el efecto de las nanopart´ıculas en las muestras de sangre.
5.1. Caracterizacio´n de nanopart´ıculas de Plata
La reacci´on entre el borohidruro de sodio y el nitrato de plata (reaccio´n de oxido-
reduccio´n) se llevo´ a cabo en medio acuoso, dando lugar a la produccio´n de nano-
part´ıculas de plata suspendidas en solucio´n junto con el nitrato de sodio (NaNO )
3
mediante la reaccio´n descrita en la ecuacio´n 1. El nitrato de sodio, es un compuesto
soluble en agua, razo´n por la que se realiza un lavado de las nanopart´ıculas con la
ayuda de agua destilada y centrifugacio´n para eliminar este compuesto.
1 1
AgNO +NaBH →Ag0 + B H + H +NaNO (1)
3(ac) 4(ac) (s) 2 2 6(g) 2 2(g) 3(ac)
El borohidruro de sodio (agente reductor) actu´a como donador de electrones a
la plata para que esta pase de un estado de oxidacio´n de +1 a 0, form´andose nano-
part´ıculas de plata que en la pra´ctica se observa cambio de coloraci´on (transparente
a amarillo), figura 1.
Una vez realizada la s´ıntesis de nanopart´ıculas variando la concentraci´on de cada
reactivo se obtiene que el exceso de plata no genera buenos resultados ya que se pre-
senta aglomeracio´n de nanopart´ıculas y cuando hay exceso de borohidruro se nota
cambio de coloraci´on muy leve lo que implica que no haya formaci´on de nanopart´ıcu-
las. As´ı, se obtuvo que la mejor relaci´on como base para s´ıntesis de nanopart´ıculas
por m´etodo Creighton y con ayuda de microondas es [NaBH ]/[AgNO ]= 2. Para la
4 3
s´ıntesis de NPs asistida por microondas, la muestra que presento´ mejores resultados
fue la sometida a radiacio´n microondas durante 45s ya que con 30s y 2 min se
obtuvieron algunas aglomeraciones.
21Figura 1: Nanopart´ıculas de plata formadas a partir de NaBH y AgNO con con-
4 3
centraciones de 0.006m-0.001m; 0.004m-0.001m; 0.002m-0.001m; 0.002m-0.003m;
0.002m-0.006m; respectivamente
Antes de realizar la caracterizacio´n de las nanopart´ıculas mediante espectros-
cop´ıa UV-Vis, se midio´ el pH de cada soluci´on obteniendo los siguientes resultados,
tabla 1.
Muestra Concentracio´n Concentracio´n pH
AgNO [M] NaBH [M]
3 4
1 0.006 0.002 7
2 0.003 0.002 7
3 0.001 0.002 7
4 0.001 0.004 9
5 0.001 0.006 10
Tabla 1: pH de soluciones con nanopart´ıculas de plata va-
riando la concentraci´on de reactivos
Al hacer la caracterizacio´n de nanopart´ıculas se obtiene que las nanopart´ıculas sin-
tetizadas por m´etodo Creighton tiene un pico en 426nm, figura 2, y la s´ıntesis de
nanopart´ıculas a 45s de exposici´on a radiacio´n microondas tiene un pico 393nm co-
mo se muestra en la misma figura, correspondiente a la resonancia de plasmo´n de las
AgNPs, lo que concuerda con lo reportado segu´n zeliget al. [7], en donde los valores
medios de absorbancia ma´xima obtenidos para cada s´ıntesis de nanopart´ıculas de
plata se encuentran entre 350 y 450nm [44, 45].Figura 2: Espectograma UV-Visible de nanopart´ıculas de Plata
5.2. An´alisis de sangre entera canina por espec-
troscop´ıa UV-Visible
Se midi´o agua destilada obteniendo un pico caracter´ıstico en 974nm. Dicho pico,
nosetieneencuentayaquealrealizarmedicionesdesangreconysinnanopart´ıculas
so´lo aparecen picos entre 350 y 650nm tal como se reporta segu´n Soretet al. [46].
Se hace correcci´on de l´ınea base para que todos los picos queden a un mismo nivel
para hacer una mejor comparacio´n entre los espectros. Al analizar cada espectro,
se obtuvieron los siguientes picos de absorcio´n: α en 576nm, β en un rango de 540-
543nm y γ entre 515-517nm en ayunas y posprandial similares a los reportados en
la literatura [46].
Pico Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3
Ayunas
α 576.753±0,276 576.649±0,324 576.769±0,242
λ(nm) β 542.838±0,387 543.037±0,458 540.823±0,375
γ 416.590±0,104 417.662±0,156 416.686±0,113
Posprandial
α 576.691±0,339 576.575±0,459 576.535±0,353
λ(nm) β 542.849±0,477 542.669±0,632 542.717±0,494
γ 415.785±0,099 415.395±0,113 416.601±0,134
Tabla 2: Longitud de onda de picos α, β, y γ en muestras de sangre
La tabla 2 muestra la longitud de onda de cada pico de absorci´on que apareceFigura 3: Espectrograma UV-Visible de muestras de sangre canina en ayunas y
posprandial
en el espectro as´ı como en la figura 3. Los picos de absorcio´n α y β se deben
a la presencia de distintos anillos feno´licos y γ al hierro presente en la muestra
analizada[36],permitiendotenerunacorrelacio´ndelaconcentracio´ndehemoglobina
de cada muestra [37] con los valores de las razones de absorci´on de los picos γ/β y
γ/α [36] como se muestra en la tabla 3.
Radio Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3
Ayunas
γ/α 3.167±0,092 2.405±0,087 3.459±0,093
γ/β 3.722±0,108 2.846±0,103 4.399±0,221
Posprandial
γ/α 3.911±0,138 4.559±0,211 3.069±0,119
γ/β 4.621±0,164 5.259±0,239 3.557±0,136
Tabla 3: Radio de picos γ/α y γ/β en muestras de sangre
La hemoglobina es la encargada del transporte de ox´ıgeno en la sangre. Cuando
se ingiere alimento, se da inicio a actividades metab´olicas. Es decir, la concentracio´n
de hemoglobina incrementa debido a que hay mayor gasto cardiaco y por tanto, ma-
yor necesidad de ox´ıgeno en un paciente con diagno´stico normal. As´ı, si se considera
que entre mayor sea la raz´on de los picos hay menor concentraci´on de hemoglobina,
tenemosquelospacientes1y3tienenrazonescercanas,peroelpaciente2representa
la menor razo´n, lo que significa que tiene la mayor concentracio´n de hemoglobina.
Sin embargo, al hacer el ana´lisis una vez el paciente ha ingerido alimento tenemosque en el caso del paciente 3 la razo´n se reduce, lo que significa que la concentra-
cio´n de hemoglobina aumenta, como lo esperado. A pesar de que los paciente 1 y
Figura 4: Comparacio´n entre la razo´n de absorbancia de picos obtenidos por espec-
troscop´ıa UV-Vis
2 incrementan su razo´n, es decir, sus niveles de hemoglobina decrecen; el paciente
2 disminuye su concentracio´n de hemoglobina dr´asticamente una vez a consumido
alimento (figura 4) lo que implica a nivel fisiol´ogico que hay alta degradaci´on de
c´elulas de alto reemplazo tales como gl´obulos rojos y algunos glo´bulos blancos y a
nivel celular dan˜o hepa´tico que concuerda con el reporte previo del canino, ya que
era una canino en condici´on de calle que inger´ıa excremento de paloma
5.3. An´alisis de sangre entera canina por espec-
troscop´ıa Infrarroja
Al analizar completamente los espectros entre 4000 y 500cm−1 no se logran ver
claramente todos los picos presentados ya que el pico del agua es muy grande en
comparacio´n a los dema´s presentando apantallamiento de la sen˜al. Por esta razo´n, se
divide el espectro en 4 regiones. La primer regio´n corresponde a las absorci´on entre
4000 y 2700cm−1 que no se tuvo en cuenta ya que en todas las muestras aparece un
so´lo pico de absorcio´n correspondiente al agua con centro entre 3600 y 3200cm−1; la
segunda regio´n correspondiente a 2700 y 1900cm−1 tambi´en fue omitida ya que no
presenta bandas de absorci´on significativas. Sin embargo, en la tercera regio´n corres-
pondiente a 1900 y 1300cm−1 como se muestra en la figura 5 en ambos espectros,
ayunas y posprandial hay tres bandas de absorci´on principales, la ma´s grande aso-
ciada a agua y las otras dos asignadas a modos de vibraci´on de prote´ınas. De los
picos asociados a prote´ınas, el m´as intenso corresponde a amida II, con centro en
1548cm−1 con modos de estiramiento C−N como indicativo de estructura secun-
daria de prote´ına [47, 48]. La segunda banda se presenta en 1398cm−1 relacionada
a = C−N de prote´ınas (amida III) [49, 50].Figura 5: Espectrograma Infrarrojo regi´on 1300 a 1900cm−1
Enlacuartaregio´n,figura 6,entre1300y1000cm−1,lasprincipalescaracter´ısti-
cas espectrales son las vibraciones de fosfol´ıpidos debido a modos de estiramiento
asim´etrico de PO entre 1215 y 1245cm−1 y modos de estiramiento sim´etrico entre
2
1082 y 1092cm−1, respectivamente [51]. Vibraciones de CO debidos a residuos de
glucosa se presentan entre 1240 y 920cm−1 [34].
Figura 6: Espectrograma Infrarrojo regi´on entre 1000 y 1300cm−1Absorcio´ndepicosentre1127y1130cm−1 yentre1164y1170cm−1 corresponden
a C−O y C−C relacionados con vibraciones de carbohidratos [50]. Todos los picos
detectados se encuentran en la tabla 4 en la que las asignaciones bioqu´ımicas se
basan en diferentes trabajos [37, 46, 48, 49, 50, 52].
Pico Banda de Absorcio´n Grupo Asignaci´on
(cm−1)
δ 3200-3600 O−H Agua
(cid:15) 1630-1650 H−O−H Agua
ζ 1548 N−H Amida II
η 1398 = C−N Amida III
θ 1233-1243 PO Fosfol´ıpido
2
ι 1164-1170 C−O Polisaca´rido
κ 1127-1130 C−C Polisaca´rido
µ 1082-1092 PO Fosfol´ıpido
2
Tabla 4: Principales picos en Infrarrojo identificados
Siguiendoelana´lisissugeridoporBachmannet al.[51],y,considerandoquecadapico
de absorci´on esta´ relacionado con algu´n grupo de macromol´eculas, el radio de ab-
sorcio´n fue calculado teniendo en cuenta estas relaciones. Bandas de absorci´on como
ζ y η corresponden a prote´ınas, θ y µ esta´ asignada a fosfol´ıpidos y ι y κ se relacio-
na con polisac´aridos. As´ı, se calculo´ las razones entre macromol´eculas de muestras
tomadas en ayunas y posprandial, lo que se muestra mejor en la tabla 5, en donde
dichas razones se correlacionan con el nivel de degradaci´on de macromol´eculas [51].
Radio Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3
Ayunas
η/ζ 0.141±0,013 0.125±0,015 0.108±0,016
µ/θ 1.813±0,024 1.526±1,197 1.643±0,260
κ/ι 3.299±0,337 2.182±0,380 2.361±0,368
Postprandial
η/ζ 0.137±0,013 0.121±0,014 0.118±0,014
θ/µ 1.133±0,213 1.038±0,509 1.043±0,178
κ/ι 10.00±2,800 2.093±1,076 2.857±0,571
Tabla 5: Radio de picos η/ζ, θ/µ y κ/ι en muestras de sangreFigura 7: Comparacio´n entre la razo´n de absorbancia de picos obtenidos por espec-
troscop´ıa IR
Al hacer una correlaci´on entre la razo´n de absorcio´n de picos asociados a prote´ınas,
fosfol´ıpidos y polisaca´ridos, figura 7, podemos notar que hay diferencia entre las
muestras en ayunas y posprandial, que esta´n relacionas con procesos metabo´licos
por la ingesta de comida. La degradaci´on de prote´ınas ha disminuido levemente en
el primer y segundo paciente; pero en el tercero, se incremento´ un poco la degrada-
cio´n, lo que significa que el canino tiene ma´s prote´ınas que los dem´as y por tanto un
metabolismo ma´s ra´pido. Los niveles de degradaci´on de fosfol´ıpidos en el paciente
dos esta´n entre los niveles de los pacientes sanos en ayunas, pero, en estado pos-
prandial los niveles de degradaci´on son ma´s bajos que los dema´s, lo que significa
que hay una alta concentracio´n de fosfol´ıpidos, lo que da indicios de enfermedad
en rin˜ones. La afirmacio´n est´a en concordancia con el ana´lisis UV-Visible debido a
que este paciente presenta dan˜o hep´atico [53]. Por otro lado, en el mismo paciente,
el nivel de polisaca´ridos es menor que el del resto de pacientes en ambos estados
atribuidos al mismo problema [54]. En el paciente 1, es necesario verificar el nivel de
polisac´aridos en estado posprandial para descartar error de procedimiento porque
este paciente no tiene ningu´n problema segu´n los ex´amenes tradicionales y no se
puede dar una buena interpretacio´n de los resultados obtenidos.
5.4. An´alisis de sangre entera canina con NPs
Unavezsemezclanlasnanopart´ıculasdeplatasintetizadasporelm´etodoCreigh-
ton o con ayuda de radiaci´on microondas con sangre entera canina, al hacer el an´ali-
sis por t´ecnicas de espectroscop´ıa, se observ´o espectros con un mismo patro´n, sin
importar si las muestras ten´ıan o no NPs. Sin embargo, algunos picos o incluso el es-
pectro completo fue amplificado completamente en algunas muestras como se puedeobservar en la figura8.
Figura8: EspectroUV-Visibledemuestrasdesangresinnanopart´ıculasymuestras
de sangre con nanopart´ıculas (Tener en cuenta que la escala de la tercer imagen es
diferente)
Para entender el feno´meno de amplificaci´on es necesario considerar tres condi-
ciones a la hora de hacer la mezcla. Una de ellas es tener nanopart´ıculas con taman˜o
uniforme y que est´en uniformemente distribuidas en la muestra que ser´ıa lo ideal,
el segundo modelo es tener un taman˜o uniforme de nanopart´ıculas pero que no est´e
totalmente distribuido de manera uniforme en la muestra form´andose algunas aglo-
meraciones en diferentes regiones que apantallan la sen˜al. En el u´ltimo caso en el
que no se tiene ni un taman˜o uniforme de nanopart´ıcula ni tampoco esta´ distribuida
en la muestra de manera homog´enea no se obtiene ningu´n cambio sino al contrario
disminuye la intensidad de la sen˜al por el apantallamiento que generan las nano-
part´ıculas actuando como una barrera que impide el paso de la longitud de onda
incidida.
Alrealizarmedicionesdelasmuestrasdesangreenteracaninaconnanopart´ıculas
sintetizadas por el m´etodo de microondas y m´etodo Creighton mediante espectros-
cop´ıaUV-Vis,seobtienequenohaypicosadicionalescomoseesperabainicialmente.
Sin embargo, teniendo en cuenta la relaci´on normalizada entre a´reas bajo la curva
de γ / (α+β), se nota amplificacio´n en la sen˜al de absorci´on de algunos picos en
algunas muestras como se muestra en la tabla 6. Es importante considerar que una
razo´n pequen˜a significa mayor amplificaci´on.Radio de Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3
Areas
Ayunas
γ / (α+β)
Normal 3.052±0,114 2.206±0,101 4.239±0,187
Microondas 3.191±0,131 6.660±0,538 3.065±0,154
M´etodo Creighton 3.426±0,138 1.394±0,044 3.906±0,152
Postprandial
γ / (α+β)
Normal 3.388±0,153 3.837±0,226 2.821±0,138
Microondas 4.326±0,165 1.337±0,029 1.179±0,015
M´etodo Creighton 4.708±0,262 3.726±0,151 4.046±0,157
Tabla 6: Radio de picos γ/α y γ/β en muestras de sangre
Figura 9: Comparaci´on entre el ´area bajo la curva del espectro con y sin nano-
part´ıculas de Plata por espectroscop´ıa UV-Visible
A pesar de que con los resultados obtenidos al realizar an´alisis por espectros-
cop´ıa UV-Visible no es posible tener certeza de cual metodolog´ıa de s´ıntesis de
nanopart´ıculas es mejor para mezclar con las muestras de sangre, se obtuvo espec-
tros de amplificacio´n importantes que deben ser considerados con otras condicionesexperimentales como tiempo de radiacio´n, concentracio´n, etc. En la figura 9, se
observa mejor las diferencias entre muestras con y sin NPs.
Radio de Paciente 1 Paciente 2 Paciente 3
Areas
Ayunas
(δ+(cid:15)) / ζ
Normal 55.689±2,283 55.343±2,734 59.811±2,864
Microondas 66.907±3,318 59.322±2,838 65.445±3,366
M´etodo Creighton 65.928±3,369 63.570±3,156 34.249±1,196
Postprandial
(δ+(cid:15)) / ζ
Normal 44.502±1,738 53.701±2,516 58.383±2,662
Microondas 66.392±3,472 60.517±2,824 66.687±3,702
M´etodo Creighton 14.943±0,267 49.146±1,795 67.258±3,555
´
Tabla 7: Area bajo la curva del espectro con y sin nanopart´ıculas de Plata por espec-
troscop´ıa Infrarroja
Para espectroscop´ıa Infrarroja se tuvieron en cuenta los 3 picos ma´s significa-
tivos correspondientes a δ, (cid:15) y ζ; en donde se sumo´ el ´area bajo la curva de los
picos correspondientes a la banda de agua δ, (cid:15) para hallar su relaci´on con respecto
a ζ y observar el cambio al aplicar nanopart´ıculas, tabla 7. De forma similar a
los resultados obtenidos por espectroscop´ıa UV-Vis, se obtuvo que algunos picos se
amplificaron, pero no en todos los espectros, figura 10.
De manera general, se nota amplificaci´on de la sen˜al sin importar el m´etodo de
s´ıntesis ya que hay algunas muestras que presentan mayor amplificacio´n con nano-
part´ıculas sintetizadas por m´etodo Creighton y otras que presentan mayor absorcio´n
con nanopart´ıculas sintetizadas con ayuda de radiacio´n microondas. Es decir, no se
obtuvo un patr´on espec´ıfico de absorcio´n con las nanopart´ıculas sintetizadas por lo
que se recomienda a trabajo futuro tener un mayor control sobre la s´ıntesis.Figura 10: Comparaci´on entre el a´rea bajo la curva del espectro con y sin nano-
part´ıculas de Plata por espectroscop´ıa InfrarrojaCap´ıtulo 6
Conclusiones
La t´ecnica de UV-Visible, adema´s de ser una t´ecnica no invasiva, nos permi-
te obtener el contenido relativo de una sustancia a partir de la absorbancia
presentada por las mol´eculas generando un protocolo con un pico de control
mediante el cual se establece una correlacio´n con la informacio´n cl´ınica. De las
a´reas normalizadas de los picos reportados en los espectros hallamos la concen-
tracio´n de hemoglobina que nos da indicios de su asociacio´n con enfermedades
en caninos tal como dan˜o hepa´tico.
Las t´ecnicas de espectroscop´ıa usadas, nos ofrecen informacio´n de los efectos
metabo´licosqueocurrenenelpacientedespu´esdelaingestaalimenticia,loque
a futuro nos lleva a generar un patro´n de como cambian las macromol´eculas
como prote´ınas, l´ıpidos y glucosa que nos dan indicios de enfermedades que
afectan al paciente con tan s´olo una muestra de sangre que no causa ningu´n
trauma en el canino.
Es importante mencionar que para este tipo de estudios se debe conocer pre-
viamente el estado de salud y antecedentes de cada canino, de manera tal que
estos se puedan tomar como patro´n para as´ı comparar resultados anormales
en las pruebas de espectroscop´ıa UV-Visible e Infrarrojo que lleven a generar
un diagn´ostico acertado.
Apesardequesenotaelefectodelasnanopart´ıculascomointermediariospara
amplificar la sen˜al para posteriores estudios se debe tener un mejor control de
la s´ıntesis de las mismas para que el efecto de amplificacio´n sea igual en todas
las muestras.
33Cap´ıtulo 7
Anexos
En esta secci´on se presentan algunos formatos u´tiles para llevar a cabo nuestra
investigaci´on. Entre los documentos se presenta:
Anexo1.Solicituddeaprobaci´onalcomit´ede´eticaparausarmuestrasbiolo´gi-
cas
Anexo 2. Solicitud de autorizacio´n de revisio´n de historias cl´ınicas de caninos
Anexo 3. Historia cl´ınica resumida
Anexo 4. Consentimiento informado a propietarios
35Anexo 1. Solicitud de aprobaci´on al comit´e de ´etica para usar muestras bi´ologicas
Manizales, xx de xxxx de 2019
Doctor:
Miembro del comit´e de ´etica para experimentaci´on con animales
Asunto: Solicitud permiso toma de muestras de sangre canina para caracterizacio´n
en el marco de procesos acad´emicos.
Cordial saludo,
La presente es para solicitar el permiso de acceso a muestras de sangre de cani-
nos a fin de poder llevar a cabo el proyecto de investigacio´n titulado “An´alisis de
macromol´eculas de sangre canina mediante Espectroscop´ıas Infrarroja y
UV-Visible”.
La toma de muestras y el aislamiento del DNA de las mismas no tiene como
fin la manipulaci´on de la informaci´on gen´etica, ni su uso o modificacio´n con fines
comerciales u otros, so´lo se utilizara´ con prop´ositos acad´emicos con eventual aplica-
cio´n diagnostica m´edica.
Cordialmente,Anexo 2. Solicitud de autorizaci´on de revisi´on de historias cl´ınicas de caninos
Manizales, xx de xxxx de 2019
Entidad xxxxxxxxxxxxx
Asunto: Solicitud de autorizaci´on de revisi´on de historias cl´ınicas de caninos.
Cordial saludo,
En el marco del proyecto en Ingenier´ıa F´ısica de la Universidad Nacional de Co-
lombia titulado “An´alisis de macromol´eculas de sangre canina mediante
Espectroscop´ıas Infrarroja y UV-Visible”, el cual pretende analizar sangre en-
tera canina, nos remitimos a ustedes a fin de solicitar el acceso a la informaci´on a
las historias cl´ınicas con el fin de recolectar informaci´on de pacientes que podr´ıan
ser incluidos en el estudio.
El equipo investigador del proyecto se compromete:
Con la institucio´n:
1. Suministro de la informacio´n sobre el proyecto en caso de que ustedes lo re-
quieran.
2. El aseguramiento y confidencialidad de los datos.
Con los propietarios:
1. Contacto con los propietarios y/o tenedores siempre y cuando sea autorizado
por ustedes.
2. Consentimiento firmado.
3. Participaci´on y retiro voluntario del propietario y del paciente.
Con los pacientes:
1. M´ınima invasi´on en la integridad del paciente al solo requerirse sangre perif´eri-
ca la cual sera´ tomada mediante puncio´n venosa de manera as´eptica.
2. Guardar total confidencialidad de los datos de las pacientes y de los propieta-
rios y/o tenedor.
Agradecemos la atenci´on prestada,
Cordialmente,Anexo 3. Historia cl´ınica resumida
CONTROL CL´INICO
HOSPITAL VETERINARIO Fecha:
Historia Cl´ınica:
Propietario C´edula
Direccio´n T´elefono
Resen˜a Paciente
Nombre Raza Color
Sexo Edad Peso
Procedencia
Enfermedades anteriores
Condicio´n cl´ınica
Investigaci´on con aprobaci´on del Comit´e de E´tica para la Experimentaci´on con
Animales (CEEA) avalada el 28 de marzo de 2019, con adaptaci´on a la Declaraci´on
de Helsinki y sus enmiendasAnexo 4. Consentimiento informado a propietarios
Formato de consentimiento informado
El presente proyecto pretende analizar sangre entera en pacientes caninos mediante
Espectroscop´ıa Infrarroja por Transformada de Fourier y Espectrofotometr´ıa UV-
Visible. El presente Consentimiento Informado es para que usted y su mascota
participen en una investigacio´n para poder conocer sobre la din´amica de la sangre
mediante las t´ecnicas nombradas anteriomente.
Su participaci´on es absolutamente voluntaria.
Procedimientos del estudio Si usted acepta participar, a su mascota se le to-
mara´ dos muestras de sangre de 4 ml cada una, lo que equivale a una jeringa llena
de taman˜o pequen˜o.
Beneficios La informaci´on obtenida en este estudio podr´ıa ayudarnos en el futu-
ro amejorar el control y laprevencio´n de algunasenfermedades paraotros pacientes.
Riesgos La toma de la muestra de sangre se hara´ bajo condiciones de estricta
limpieza para minimizar el riesgo de una infeccio´n posterior. En el procedimiento
puede producirse un poco de dolor y quedar un pequen˜o morado que se resolver´a
sin tratamiento en las pro´ximas dos semanas. La cantidad total de sangre necesita-
da es similar a la necesitada en las pruebas de laboratorio en sangre usuales y no
representa un riesgo importante para la salud.
Responsabilidades del propietario Usted debe permitir la toma de muestra
de sangre y comunicar alguna variacio´n o alteracio´n que observe en su mascota.
Confidencialidad So´lo su m´edico veterinario de cabecera y sus colaboradores
sabra´n que usted est´a participando en el estudio. Los registros que se hagan se har´an
identifica´ndolo s´olo con un c´odigo y no con el nombre; sin embargo, representantes
autorizados de las autoridades reguladores podra´n revisar sus registros como parte
de su actividad de supervisi´on del estudio. Si los resultados de este estudio son pu-
blicados, ni usted ni su mascota no ser´an identificados por el nombre.
Compensaci´on Usted no tendra´ que incurrir en ningu´n gasto por participar en
este estudio. Las jeringas as´ı como el recipiente de coleccio´n y almacenamiento de
la sangre, adema´s de las pruebas son cubiertas completamente por el estudio.
Terminaci´on del estudio Usted entiende que su participacio´n en el estudio
con su mascota es VOLUNTARIA. En cualquier momento usted puede retirar su
consentimiento a participar en el estudio.Anexo 4. Consentimiento informado a propietarios
Autorizaci´on para uso de las muestras y datos obtenidos en este estu-
dio
Se le solicita la autorizacio´n al participante para que las muestras y datos obte-
nidos en este estudio, puedan ser utilizados en otros estudios.
Aceptaci´on
NOTA: SU FIRMA (O HUELLA DIGITAL) INDICA QUE USTED HA DE-
CIDIDO PARTICIPAR VOLUNTARIAMENTE CON SU MASCOTA EN ESTE
´ ´
ESTUDIO HABIENDO LEIDO (O ESCUCHADO) LA INFORMACION ANTE-
RIOR.
Fechadefirmadoestedocumento:
Nombredelpaciente:
Nombre del propietario o tendedor:
CC.
Firma:
Tel´efonofijo: Tel´efonocelular:
Direccio´n:
Nombre y firma de alguno de los delegados del proyecto:
Tel´efono:Bibliograf´ıa
[1] M. Ernst and J. Roukema, “Diagnosis of non-palpable breast cancer: a review,”
The Breast, vol. 11, no. 1, pp. 13–22, 2002.
[2] J. Pichardo-Molina et al., “Raman spectroscopy and multivariate analysis of
serum samples from breast cancer patients,” Lasers in Medical Science, vol. 22,
no. 4, pp. 229–36, 2007.
[3] D. Panciera, “Conditions associated with canine hypothyroidism,” Veterinary
Clinics of North America: Small Animal Practice, vol. 31, no. 5, pp. 935–50,
2001.
[4] A. Enejder et al., “Blood analysis by Raman spectroscopy,” Optics Letters,
vol. 27, no. 22, pp. 2004–06, 2002.
[5] H. Gremlich and B. Yan, Infrared and raman spectroscopy of biological mate-
rials. New York: M. Dekker: Practical spectroscopy, 2001.
[6] S. Olsztyn´ska-Janus et al., “Spectroscopic techniques in the study of human
tissues and their components. part I: IR spectroscopy,” Acta of Bioengineering
and Biomechanics, vol. 14, no. 3, pp. 101–15, 2012.
[7] U.Zeliget al.,“Earlydetectionofbreastcancerusingtotalbiochemicalanalysis
of peripheral blood components: A preliminary study,” BMC Cancer, vol. 15,
no. 408, 2015.
[8] M. Baker et al., “Developing and understanding biofluid vibrational spectros-
copy: a critical review,” Chem Soc Rev, vol. 45, no. 7, pp. 1803–18, 2016.
[9] M. Paraskevaidi et al., “Differential diagnosis of alzheimer’s disease using spec-
trochemicalanalysisofblood,”Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America, vol. 114, no. 38, pp. 7929–38, 2017.
[10] C. Berthomieu and R. Hienerwadel, “Fourier transform infrared (FTIR) spec-
troscopy,” Photosynthesis Research, vol. 101, pp. 157–70, 2009.
[11] F. Elmi et al., “Application of FTIR spectroscopy on breast cancer serum
analysis,” Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectros-
copy, vol. 187, pp. 87–91, 2017.
41[12] A. Bonifacio et al., “Surface-enhanced raman spectroscopy of blood plasma
and serum using Ag and Au nanoparticles: A systematic study,” Analytical
and Bioanalytical Chemistry, vol. 406, pp. 2355–65, 2014.
[13] Y. Tan et al., “Surface-enhanced raman spectroscopy of blood serum based
on gold nanoparticles for the diagnosis of the oral squamous cell carcinoma,”
Lipids in Health and Disease, vol. 16, no. 73, 2017.
[14] K. A. El-Nour et al., “Synthesis and applications of silver nanoparticles,” Ara-
bian Journal of Chemistry, vol. 3, no. 3, pp. 135–40, 2010.
[15] W. Zapata-Builes and H. Fajardo-Rincon, “Manual de qu´ımica sangu´ınea ve-
terinaria.”
[16] W. Colburn, “Biomarkers in drug discovery and development: From target
identification through drug marketing,” The Journal of Clinical Pharmacology,
vol. 43, no. 4, pp. 329–41, 2013.
[17] J. Iwasa and W. Marshall, Karp. Biolog´ıa celular y molecular: conceptos y ex-
perimentos. McGraw-Hill Interamericana, 2019.
[18] M. Clinic et al., Encyclopedia of foods: a guide to healthy nutrition. San Diego,
California: Academic Press, 2002.
[19] A. Fuentes, Bioqu´ımica cl´ınica y patolog´ıa molecular. II, Reverte, Ed., 1998.
[20] N. Allewell et al., Molecular Biophysics for the Life Sciences, S. S. . B. Media,
Ed., 2013.
[21] P. Lasch and J. Kneipp, Biomedical vibrational Spectroscopy, J. W. . Sons, Ed.,
2018.
[22] J. Henao-Mar´ın, “Implementaci´on de una metodolog´ıa por espectrofotometr´ıa
UV-Visible, para el ana´lisis de qu´ımica sangu´ınea en el centro integral de
diagno´stico agropecuario de Risaralda (CIDAR), dependencia de la secretar´ıa
dedesarrolloagropecuariodelagobernacio´nderisaralda,”Master’sthesis,Uni-
versidad Tecnolo´gica de Pereira. Facultad de Tecnolog´ıas, Pereira, Colombia,
2015.
[23] G. Bellisola and C.Sorio, “Infrared spectroscopy and microscopy in cancer re-
search and diagnosis,” American Journal of Cancer Research, vol. 2, no. 1,
2012.
[24] C. Berthomieu and R. Hienerwadel, “Fourier transform infrared (FTIR) spec-
troscopy,” vol. 101, 2009, pp. 157–70.
[25] C. Petibois et al., “Plasma protein contents determined by Fourier-transform
infrared spectrometry,” Clinical Chemistry, vol. 47, no. 4, pp. 730–38, 2001.[26] V. Escobar-Falcon´ı, “S´ıntesis y caracterizaci´on de nanopart´ıculas de plata por
espectroscopia de infrarrojos (FTIR), UV-Vis, absorcio´n ato´mica de llama
(FAAS) y microscop´ıa de barrido electr´onico (SEM),” Master’s thesis, Pontifi-
ciaUniversidadCat´olicadelEcuador.FacultaddeCienciasExactasyNaturales,
Ecuador, 2015.
[27] C. Flores, “Nanopart´ıculas de plata con potenciales aplicaciones en materiales
implantables: s´ıntesis, caracterizaci´on fisicoqu´ımica y actividad bactericida,”
Ph.D. dissertation, Universidad Nacional de La Plata, Argentina, 2014.
[28] M. S´anchez, “Trabajo de fin de m´aster. ma´ster universitario en ciencia y tecno-
log´ıa qu´ımica. especialidad de qu´ımica inorg´anica e ingenier´ıa qu´ımica,” Mas-
ter’s thesis, Universidad Nacional de Educacio´n a Distancia. Facultad de Cien-
cias. Departamento de Qu´ımica Inorg´anica y Qu´ımica T´ecnica, Espan˜a, 2017.
[29] G.Kahrilas et al., “Microwave-assisted green synthesis of silver nanoparticles
using orange peel extract,” vol. 2, no. 3, pp. 367–76, 2014.
[30] J. Depciuch and M. Parlinska-Wojtan, “Comparing dried and liquid blood se-
rum samples of depressed patients: An analysis by Raman and infrared spec-
troscopy methods,” Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, vol.
150, pp. 80–6, 2018.
[31] C. Petibois et al., “Differentiation of populations with different physiologic pro-
files by plasma fourier-transform infrared spectra classification,” Journal of La-
boratory and Clinical Medicine, vol. 137, no. 3, pp. 184–90, 2001.
[32] J. Backhaus et al., “Diagnosis of breast cancer with infrared spectroscopy from
serum samples,” Vibrational Spectroscopy, vol. 52, no. 2, pp. 173–7, 2010.
[33] P. Srividya et al., “FTIR spectral study on diabetic blood samples-
monotherapy and combination therapy,” OJP, vol. 4, no. 1, pp. 17–26, 2012.
[34] A. Mukunthan and S. Sudha, “FTIR spectroscopic features of blood serum of
diseased and healthy subjects (animals),” International Journal of Innovative
Research in Science, Engineering and Technology, vol. 2, 2013.
[35] K. Lima et al., “Segregation of ovarian cancer stage exploiting spectral biomar-
kers derived from blood plasma or serum analysis: ATR-FTIR spectroscopy
coupledwithvariableselectionmethods,”Biotechnology Progress,vol.31,no.3,
pp. 832–9, 2015.
[36] J. Gonza´lez-Dom´ınguez et al., “Absorption peaks: α, β, γ and their covariance
with age and hemoglobin in human blood samples using photoacoustic spec-
troscopy,” International Journal of Thermophysics, vol. 33, pp. 1827–33, 2012.
[37] M. Alvarado-Noguez et al., “Obtaining and analysis of optical absorption spec-
trum of fisher rat blood with hepatic damage by photoacoustic spectroscopy,”
Revista mexicana de ingenier´ıa biom´edica, vol. 38, no. 1, pp. 357–62, 2016.[38] K. Gajjar et al., “Fourier-transform infrared spectroscopy coupled with a clas-
sification machine for the analysis of blood plasma or serum: a novel diagnostic
approach for ovarian cancer,” The Analyst, no. 138, pp. 3917–26, 2013.
[39] A.Bunaciuet al.,“Cancerdiagnosisby FTIRspectrophotometry,”Revue Rou-
maine de Chimie, vol. 60, pp. 415–26, 2015.
[40] L. Allain and T. Vo-Dinh, “Surface-enhanced Raman scattering detection of
the breast cancer susceptibility gene brca1 using a silver-coated microarray
platform,” Analytica Chimica Acta, vol. 469, pp. 149–54, 2002.
[41] P.Gaoet al.,“Theclinicalapplicationof RamanSpectroscopyforbreastcancer
detection,” Journal of Spectroscopy, 2017.
[42] Y. Krutyakov et al., “Synthesis and properties of silver nanoparticles: advances
and prospects,” Russian Chemical Reviews, vol. 77, no. 3, 2008.
[43] A.Bergeret al.,“Multicomponentbloodanalysisbynear-infraredRamanspec-
troscopy,” Applied Optics, vol. 38, no. 13, pp. 2916–26, 1999.
[44] K. Aslan et al., “Rapid deposition of triangular silver nanoplates on planar
surfaces: application to metal-enhanced fluorescence,” The Journal of Physical
Chemistry B, vol. 109, no. 13, pp. 6247–51, 2005.
[45] J. Gallo-Ram´ırez and C. Ossa-Orozco, “Fabricacio´n y caracterizacio´n de na-
nopart´ıculas de plata con potencial uso en el tratamiento del ca´ncer de piel,”
Revista Cient´ıfica Ingenier´ıa y Desarrollo, vol. 37, no. 1, pp. 88–104, 2019.
[46] J. Soret, “Analyse spectrale: Sur le spectre d’absorption du sang dans la partie
violette et ultra-violette,” Comptes rendus de l’Acad´emie des sciences, vol. 97,
pp. 1269–70, 1883.
[47] Wiley-Liss, Infrared of Spectroscopy of Biomolecules, H. Mantsch and D. Chap-
man, Eds. New York, NY, USA: Wiley-Liss, 1996.
[48] A. Barth and C. Zscherp, “What vibrations tell us about proteins,” Quarterly
Reviews of Biophysics, vol. 35, no. 4, pp. 369–430, 2002.
[49] B. Schrader, Infrared and Raman spectroscopy: methods and applications. New
York, NY, USA: VCH, 1995.
[50] J. Larkin, Infrared and Raman spectroscopy: principles and spectral interpreta-
tion, 2nd ed. Amsterdam, Netherlands: Elseiver, 2018.
[51] L. Mosta¸co-Guidolin and L. Bachmann, “Application of FTIR spectroscopy
for identification of blood and leukemia biomarkers: A review over the past 15
years,” Applied Spectroscopy Reviews, vol. 46, no. 5, pp. 388–404, 2011.
[52] M. Cohenford et al., “Infrared spectroscopy of normal and abnormal cervi-
cal smears: Evaluation by principal component analysis,” Gynecolic Oncology,
vol. 66, pp. 59–65, 1997.[53] S. Cohn et al., “Dietary phospholipids, hepatic lipid metabolism and cardiovas-
cular disease(cid:41)(cid:41), current opinion in lipidology,” Current Opinion in Lipidology,
vol. 19, pp. 257–62, 2008.
[54] M. Aceves-Martins, “Cuidado nutricional de pacientes con cirrosis hepa´tica,”
Nutrici´on Hospitalaria, vol. 29, no. 2, pp. 246–58, 2014.