Determinación de perfiles inmunofenotípicos por citometría de flujo de leucemia linfoblástica aguda en niños y su valor en la detección de enfermedad mínima residual
Autor: Medina Medina, Edwin Abraham
Asesor: Andrade Pérez, Rafael Enrique (Thesis advisor)
Fecha: 2010
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: La Citometría de Flujo (CF) es una herramienta útil en diagnóstico y seguimiento de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) en niños y los niveles de Enfermedad Mínima Residual (EMR) correlacionan con aparición de eventos adversos. Se realizó un estudio retrospectivo en los niños atendidos entre 2005-2009 en la Fundación HOMI Hospital La Misericordia, con diagnóstico por CF de LLA en la Fundación Santa Fe de Bogotá, tratando de identificar los perfiles inmunofenotípicos de la enfermedad y su utilidad en la detección de Enfermedad Mínima Residual (EMR). Se identificó preponderancia de LLA prepreB, sobre otros diagnósticos. La alteración fenotípica más reconocida fue la infraexpresión de CD45. Se estableció un perfil inmunofenotípico relacionado con recaída hematológica (expresión aberrante de CD33 y ausencia de CD34 y CD38) y se calculó su rendimiento operativo como posible prueba pronóstica (Valor Predictivo Negativo ~90%). Se evidenció la utilidad en detección de EMR del estudio de inmunofenotipo por CF alcanzando niveles de discriminación del orden de 10-4 y 10-5; hay correlación estadísticamente significativa entre valores de blastos mayores que 10-2 (1%) y recaída y se observó que ningún caso con blastos menores a 10-4 (0,01%) recayó.  La concordancia y reproducibilidad de la metodología fue probada y alcanzó valores satisfactorios (índice de kappa moderado). Se reconoció que el estudio de inmunofenotipo puede ser una herramienta no sólo de importancia diagnóstica sino también pronóstica; sin embargo, futuros estudios con seguimiento clínico se requieren para validar estos resultados. / Abstract. Flow cytometry (FC) is a useful tool for diagnosis and follow-up of children with Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) and Minimal Residual Disease (MRD) levels are related to occurrence of adverse events.  A retrospective study was performed on children treated during 5 years (2005-2009) at the Fundacion HOMI Hospital La Misericordia, diagnosed by FC with ALL at the Fundacion Santa Fe de Bogota, looking for disease immunoprofiles and their utility in order to detect Minimal Residual Disease (MRD). PrepreB ALL predominance was identified. CD45 infraexpression was the most remarkable phenotypic alteration. An immunoprofile related to hematologic relapse was established (Aberrant expression of CD33 and lack of expression of CD34 and CD38) and its operative performance as possible diagnostic tool was calculated (Negative Predictive Value ~90%). The FC-immunophenotype utility on MRD detection was evidenced reaching discrimination levels around 10-4 and 10-5; there was statistical correlation among blast levels above 10-2 (1%) and relapse and no relapses were detected with blast levels below 10-4 (0,01%). Concordance and reproducibility of methods was challenged and satisfactory results were obtained (kappa index moderate). We realized that immunoprofile studies could be a useful diagnostic and prognostic tool; however, further studies with clinical follow-up are required in order to validate these results.

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22001100DETERMINACIÓN DE PERFILES INMUNOFENOTÍPICOS POR CITOMETRÍA
DE FLUJO DE LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA EN NIÑOS Y SU VALOR
EN LA DETECCIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL
EDWIN ABRAHAM MEDINA MEDINA
CÓDIGO 05-597608
Trabajo presentado para optar al título de especialista en Patología Anatómica y
Clínica
DIRIGIDO POR
RAFAEL ENRIQUE ANDRADE PÉREZ
ADRIANA LINARES BALLESTEROS
CARLOS SAAVEDRA ANDRADE
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA
ESPECIALIDAD EN PATOLOGÍA ANATÓMICA Y CLÍNICA
BOGOTÁ D.C.
2010AGRADECIMIENTOS
A la sección de Oncohematología Pediátrica de la Fundación HOMI Hospital La
Misericordia quienes atendieron los pacientes que fueron considerados para la
ejecución de este estudio.
A la sección de Inmunoquímica del Laboratorio Clínico de la Fundación Santa Fe
de Bogotá quienes hicieron las adquisiciones de los casos analizados y prestaron
toda su colaboración en la recolección de los registros electrónicos.
A Fredi Alexander Díaz Quijano MD, MSc, PhD(c), por su análisis estadístico de
los datos y sus aportes conceptuales para comprender mejor la epidemiología
inmersa en este trabajo.
A mis directores quienes con su constante consejo permitieron llevar a feliz
término esta actividad.
Edwin Medina MDCONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN 12
1. MARCO TEÓRICO 14
1.1 LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA 14
1.1.1 Definición 14
1.1.2 Epidemiología 15
1.1.3 Etiopatogenia 15
1.1.4 Manifestaciones Clínicas 17
1.1.4.1 Leucemia Linfoblástica B 17
1.1.4.2 Leucemia Linfoblástica T 17
1.1.5 Diagnóstico 18
1.1.5.1 Leucemia Linfoblástica B 19
1.1.5.1.1 Morfología 19
1.1.5.1.2 Citoquímica 19
1.1.5.1.3 Inmunofenotipo 19
1.1.5.1.4 Genética 20
1.1.5.1.5 Diagnóstico diferencial 21
1.1.5.2 Leucemia Linfoblástica T 21
1.1.5.2.1 Morfología 22
1.1.5.2.2 Citoquímica 22
1.1.5.2.3 Inmunofenotipo 22
1.1.5.2.4 Genética 23
1.1.5.2.5 Diagnóstico diferencial 23
1.1.6 Estratificación de riesgo y establecimiento de pronóstico 23
1.1.6.1 Leucemia Linfoblástica B 24
1.1.6.2 Leucemia Linfoblástica T 25
1.1.7 Tratamiento 25
1.1.7.1 Inducción 28
1.1.7.2 Terapia preventiva del Sistema Nervioso Central 28
1.1.7.3 Intensificación 28
1.1.7.4 Terapia de continuación 29
1.1.7.5 Tratamiento de pacientes de muy alto riesgo en primera
remisión completa 29
1.1.7.6 Tratamiento de la recurrencia 29
1.1.7.7 Transplante alogénico de células madre hematopoyéticas 30
1.1.7.8 Complicaciones del tratamiento 30
1.1.7.9 Nuevas perspectivas terapéuticas 32
1.1.8 Polimorfismo enzimático 32
1.2 BIOPSIA DE MÉDULA ÓSEA 34
1.2.1 Morfología y maduración normal de médula ósea 34
1.2.1.1 Células Madres Hematopoyéticas 34
1.2.1.2 Línea mieloide/monocítica 35
1.2.1.3 Línea eritroide 36
1.2.1.4 Línea megacariocítica 37Pág.
1.2.1.5 Línea linfoide B 37
1.2.2 Patrones morfocitométricos clínicamente relevantes 38
1.2.3 Técnicas moleculares de estudio de médula ósea 41
1.3 ESTUDIO DE SANGRE PERIFÉRICA 41
1.4 MEDICIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL 41
1.4.1 Definición 42
1.4.2 Técnicas de medición 43
1.4.3 Periodicidad de la medición 45
1.5 PAPEL DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO EN
EL ESTUDIO DE ENFERMEDAD RESIDUAL MÍNIMA 50
1.5.1 Descripción de la técnica 50
1.5.1.1 Anticuerpos 51
1.5.1.2 Antígenos 52
1.5.1.3 Reacción antígeno-anticuerpo 52
1.5.1.4 Inmunofenotipificación 53
1.5.1.5 Consideraciones generales de la aplicación clínica
del estudio de inmunofenotipo por Citometría de Flujo 54
1.5.2 Detección inmunofenotípica de Enfermedad
Mínima Residual 60
1.5.3 Fenotipos asociados a leucemia 63
1.5.3.1 Expresión cruzada de antígenos 64
1.5.3.2 Expresión asincrónica de antígenos 65
1.5.3.3 Sobreexpresión de antígenos 65
1.5.3.4 Fenotipos ectópicos 66
1.5.3.5 Patrones anormales de dispersión de luz 66
1.5.3.6 Vías anormales de maduración 66
1.5.4 Cambios fenotípicos 66
1.5.5 Sensibilidad del inmunofenotipo por citometría
para la detección de Enfermedad Mínima Residual 67
1.5.6 Valor clínico del inmunofenotipo en la investigación
de Enfermedad Mínima Residual 67
1.6 DETERMINACIÓN DE PLOIDIA POR CITOMETRÍA
DE FLUJO 68
1.6.1 Descripción de la técnica 68
1.6.2 Estudios realizados 69
2. JUSTIFICACIÓN 71
3. OBJETIVOS 73
3.1 OBJETIVO GENERAL 73
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 73
4. MATERIALES 74
4.1 DISEÑO 74
4.2 UNIVERSO 74
4.3 MUESTRA 74
4.4 SELECCIÓN DE CASOS 74Pág.
4.5 CRITERIOS DE INCLUSIÓN 74
4.6 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN 75
4.7 SEGUIMIENTO DE PACIENTES 75
4.8 RESULTADOS PRIMARIOS 75
4.9 RESULTADOS SECUNDARIOS Y SUBROGADOS 75
4.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO 75
4.11 FUENTES DE ERROR PREDECIBLES 75
4.12 DIFUSIÓN DE RESULTADOS 76
5. MÉTODOS 77
5.1 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS 77
5.1.1 Diagnóstico Clínico de Leucemia Linfoblástica Aguda
en niños 77
5.1.2 Diagnóstico Hematopatológico de Leucemia
Linfoblástica Aguda en niños 77
5.2 MÉTODOS TERAPÉUTICOS 80
5.3 MÉTODOS DE SEGUIMIENTO 80
5.4 MÉTODOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS PARA
EJECUCIÓN DEL TRABAJO DE INVESTIGACIÓN 81
6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES 83
7. CONSIDERACIONES ÉTICAS E IMPACTO AMBIENTAL 84
8. PROPIEDAD INTELECTUAL 86
9. PRESUPUESTO 87
10. RESULTADOS 88
10.1 PERFILES INMUNOFENOTIPOS POR CITOMETRÍA DE
FLUJO EN LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA
EN NIÑOS 88
10.2 UTILIDAD DEL ESTUDIO DE INMUNOFENOTIPO
POR CITOMETRÍA DE FLUJO PARA LA
DETECCIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL 95
10.3 PARÁMETROS DE ALTERACIONES FENOTÍPICAS
ÚTILES PARA LA APROXIMACIÓN DIAGNÓSTICA
Y DE SEGUIMIENTO EN LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA
AGUDA EN NIÑOS 96
10.4 CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR Y
REPRODUCIBILIDAD METODOLÓGICA 99
10.5 DISCUSIÓN DE RESULTADOS 101
11. CONCLUSIONES 104
REFERENCIAS 106
ANEXOS 114INDICE DE TABLAS
Pág.
Tabla 1.1 Síntomas de presentación de LLA por grupos de edad 18
Tabla 1.2 Caracterización de LLA acorde a morfología 18
Tabla 1.3 Caracterización de pronóstico en LLA acorde a
variables clínicas 25
Tabla 1.4 Medicamentos empleados en terapéutica de LLA 27
Tabla 1.5 Anticuerpos monoclonales de importancia terapéutica 32
Tabla 1.6 Metodologías útiles en detección de Enfermedad
Mínima Residual 44
Tabla 1.7 Calendario de evaluación de médula ósea para
detección de EMR 45
Tabla 1.8 Inmunofenotipo básico de líneas hematológicas
normales 54
Tabla 1.9 Problemas comunes de la citometría de flujo 60
Tabla 1.10 Aberraciones fenotípicas de mayor utilidad en
detección de EMR 64
Tabla 6.1 Cronograma (años 2006-2010) 83
Tabla 9.1 Presupuesto global (en miles de $) 87
Tabla 9.2 Descripción de los equipos por adquirir (en miles de $) 87
Tabla 9.3 Servicios Técnicos (en miles de $) 87
Tabla 9.4 Publicaciones y Patentes (en miles de $) 87
Tabla 10.1 Caracterización de niños con Leucemia Linfoblástica
Aguda 2005-2009 88
Tabla 10.2 Distribución de antígenos en LLA de fenotipo B 89
Tabla 10.3 Distribución de antígenos en LLA de fenotipo T 89
Tabla 10.4 Perfil de antígenos infrecuentes en Leucemia
Linfoblástica Aguda de niños 2005-2009 91
Tabla 10.5 Caracterización de los pacientes con LLA 2005-2009
que presentaron eventos adversos 92
Tabla 10.6 Caracterización de los pacientes con LLA 2005-2009
que presentaron eventos adversos acorde a
la presencia de alteraciones fenotípicas 93
Tabla 10.7 Antígenos asociados con la aparición de eventos sobre
el total de pacientes 93
Tabla 10.8 Antígenos asociados con la aparición de eventos en
niños con Leucemia Linfoblástica Aguda prepreB 94
Tabla 10.9 Características operativas de definiciones de fenotipo
según la presencia de antígenos infrecuentes (LLA
general) 94
Tabla 10.10 Características operativas de definiciones de fenotipo
según la presencia de antígenos infrecuentes (LLA
prepreB) 95
Tabla 10.11 Niveles de detección de Enfermedad Mínima Residual
asociados a eventos 96Pág.
Tabla 10.12 Distribución de alteraciones fenotípicas útiles para la
aproximación diagnóstica y de seguimiento de
Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 97
Tabla 10.13 Distribución de infraexpresión de antígenos en
Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 97
Tabla 10.14 Distribución de sobreexpresión de antígenos en
Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 98
Tabla 10.15 Distribución de expresión cruzada de antígenos en
Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 98
Tabla 10.16 Distribución de expresión asincrónica de antígenos en
Leucemia Linfoblástica Aguda en niños 98
Tabla 10.17 Concordancia interobservadores en la detección de
blastos en estudios de seguimiento por citometría de
flujo en niños con LLA 100INDICE DE GRÁFICAS
Pág.
Gráfica 10.1 Niveles de detección de blastos en estudios de
seguimiento de niños con Leucemia Linfoblástica
Aguda atendidos en el Hospital La Misericordia
2005-2009 96
Gráfica 10.2 Regresión logística de acuerdo entre datos reportados
y observados de estudios de seguimiento por
citometría de flujo en niños con LLA 99INTRODUCCIÓN
Las neoplasias hematolinfoides son un gran grupo de enfermedades que
constituyen una de las principales causas de morbimortalidad en niños y adultos.
En el grupo pediátrico generan más de 3000 nuevos casos anuales de
enfermedad en los Estados Unidos, acarreando costos en tratamiento superiores a
cien mil dólares paciente/año, sin contar el impacto afectivo que genera en los
pacientes y sus familiares, y en la comunidad, en la que usualmente se
promueven movimientos en pro de la salud de los menores. Los padres, por lo
general organizados en sociedades de lucha contra el cáncer, buscan todos los
medios para brindar al menor las condiciones que le permitan llevar de la mejor
forma posible las penurias y dolencias de su enfermedad.
A pesar de los esfuerzos en estudiar e investigar sobre neoplasias infantiles, sólo
hasta los últimos años, en los cuales el análisis a nivel molecular de las
enfermedades ha logrado un sitial importante, su conocimiento era bastante
escaso; sin embargo, ya se conocen genes relacionados con gran cantidad de
neoplasias y los factores que desencadenan los cambios celulares necesarios
para el desarrollo de un gran número de enfermedades. Igualmente, existe gran
interés por establecer las alteraciones del microambiente uterino que predisponen
al desarrollo de cáncer posnatal, así como el desarrollo de neoplasias in-útero.
En general, el estudio del cáncer en niños es un área de interés creciente y sobre
el cual queda aún mucho por decir. En lo particular de las neoplasias
hematolinfoides, se ha avanzado mucho con el conocimiento del proceso de
maduración en múltiples pasos y se ha comprendido mejor las alteraciones que
ocurren para el desarrollo de leucemias. Específicamente, el desarrollo de
técnicas moleculares y el estudio de inmunofenotipo ha cambiado por completo los
enfoques diagnóstico, terapéutico y pronóstico de las leucemias, y se ha
incrementado el interés por establecer los niveles de enfermedad mínima residual.
Sin embargo, nuestro conocimiento sobre enfermedad mínima residual es escaso,
y nuestro medio carece de estudios propios en los cuales se haya demostrado la
real utilidad de estas técnicas en lo concerniente a rendimiento operativo y
correlación clínica. Esta coyuntura abre un espacio para la investigación clínica
con orientación básica como la que se quiere desarrollar con el presente estudio.
El presente trabajo se articula sobre una somera revisión sobre los tópicos más
relevantes en la comprensión de leucemia linfoblástica, su estudio diagnóstico y
pronóstico, técnicas de estudio de enfermedad residual y brevemente algunos
conceptos de terapéutica. Se hace especial énfasis en el estudio de
inmunofenotipo por citometría de flujo y su utilidad en medición de enfermedad
mínima residual, debido a que es el enfoque especial del trabajo. Continúa con ladescripción de los puntos más importantes del diseño de la propuesta de
investigación y finaliza con los resultados esperados.
Se espera que los resultados del presente trabajo permitan a nuestra comunidad
médica mejorar los estándares de tratamiento y establecer nuestra definición de
riesgo, aplicable a los pacientes, para orientar la terapéutica con base en éste.1. MARCO TEÓRICO
La siguiente revisión engloba los elementos más relevantes para comprender la
enfermedad objeto de nuestro estudio. No se busca agotar el tema, puesto que es
excesivamente extenso, y resultaría inoficioso recoger la totalidad de conceptos
expresados en relación con la enfermedad. Considerando lo anterior, la revisión se
orienta a comprender la enfermedad, cómo afecta a la población y cuáles son los
puntos básicos en los cuales se presentan las alteraciones que desencadenan el
desarrollo de la neoplasia, con una brevísima revisión de los conceptos actuales
de terapia y pronóstico basados en el riesgo.
1.1 LEUCEMIA LINFOBLÁSTICA AGUDA
Las neoplasias hematolinfoides han sido consideradas históricamente como un
gran grupo de enfermedades que comparten entre sí el compromiso de médula
ósea, y otros órganos, por la expansión clonal y desordenada de una, o varias,
líneas celulares originadas de una célula alterada. Desde las clasificaciones más
antiguas, pasando por FAB y REAL, y la actual clasificación de OMS, se ha
demostrado la dificultad que plantean estas neoplasias en su comprensión y el
incremento en la información disponible para su diagnóstico, pronóstico y
tratamiento.
Algunos de los avances más significativos en la terapia de leucemias en los
últimos veinte años han ocurrido con las leucemias linfoblásticas agudas B y T. La
“tasa de cura”, o períodos libres de enfermedad a cinco años, supera para algunas
leucemias B el 80%. Sin embargo, algunos tipos están relacionados con bajas
tasas de remisión y altas tasas de recurrencia. Los perfiles citogenéticos, el
genotipo y el inmunofenotipo de las células malignas han tenido considerable
impacto en el reconocimiento de la estratificación de riesgo con el reconocimiento
de grupos de bajo y alto riesgos. Esta estratificación ha permitido el desarrollo de
regímenes terapéuticos más específicos, logrando tasas de remisión más altas en
grupos de alto riesgo, y reduciendo la toxicidad en los grupos de bajo riesgo.
(Brunning 2001, Campana 2004, Pui 2000)
1.1.1 Definición. La Leucemia Linfoblástica de precursores B (LLA-B), así como el
linfoma linfoblástico, es una neoplasia que compromete el linaje de células B,
compuesto de células blásticas de tamaño pequeño a mediano, con escaso
citoplasma, cromatinas dispersas o moderadamente condensadas y nucléolos
mínimos, que involucra la médula ósea y la sangre. Similar descripción cobija a las
neoplasias de precursores T. (Brunning 2001)
La Leucemia Linfoblástica y el Linfoma Linfoblástico comparten la misma unidad
biológica, por lo que en muchos pacientes la diferenciación entre ellos no se
realiza, o se basa simplemente en el compromiso preferente de médula ósea(leucemia) o ganglios linfáticos (linfoma). Cuando al momento de la presentación
el paciente presenta masa o blastos de menos del 25% en médula ósea, se
prefiere el término de linfoma. (Brunning 2001)
1.1.2 Epidemiología. La leucemia linfoblástica aguda es la forma más frecuente
de neoplasia en niños y jóvenes, representando el 32% de las neoplasias en
menores de 15 años y 26% en menores de 20 años. (Ravindranath 2003) El pico
de incidencia ocurre entre los 2 y 5 años de edad y es más común en varones
blancos, situación que se ha incrementado en las últimas 2 décadas. (Chan 2002)
El riesgo de leucemia es más alto en países industrializados como se observa en
EEUU, Italia, Australia, Suiza y Japón, y más bajo en África y Asia. (Redaelli 2005)
La leucemia representa cerca de la tercera parte de las neoplasias en niños,
correspondiendo hasta el 80% a leucemia linfoblástica B, 17% a leucemia mieloide
aguda, y el porcentaje restante a leucemias agudas y crónicas poco frecuentes.
(Ziegler 2005)
La leucemia linfoblástica (LLA) es una enfermedad principalmente de niños y
adolescentes, sin embargo un segundo pico más pequeño se observa en mayores
de 70 años. (Redaelli 2005) Se estima una incidencia anual en EEUU de 3200
casos, de los cuales el 80-85% corresponde a precursores de fenotipo B, y sólo
15% de precursores T. (Brunning 2001, Ravindranath 2003) Ajustado por edad el
riesgo de desarrollo de leucemia en EEUU para el 2000 es de 1.4 por 100000
habitantes en población general, y se eleva a 3 por 100000 en menores de 19
años. (Redaelli 2005) El 75% de las LLA de precursores B se presenta en niños
menores de 6 años, sin predominio de ningún género. Por el contrario, las LLA de
precursores T se presentan con mayor frecuencia en adolescentes y niños
mayores, con predominio de género masculino. (Brunning 2001) En relación con la
raza, la LLA es más frecuente en población blanca que negra con razón 10:6, y en
los EEUU se observa con mayor frecuencia entre los latinos de Los Ángeles.
(Redaelli 2005)
Las leucemias linfoblásticas presentan tasas de curación de hasta el 80%,
mientras que su contraparte mieloide alcanza escasamente el 40-50% de éxito.
(Ravindranath 2003) La mortalidad ha sido calculada en 0.5 por 100000 habitantes
ajustado por edad, con ligero incrementó en el género masculino con 0.6 por
100000. La tendencia de incidencia se mantiene para la mortalidad en lo
concerniente a raza. (Redaelli 2005)
1.1.3 Etiopatogenia. La etiología de las leucemias linfoblásticas es aún poco
conocida, pero se ha postulado que el interjuego de las regulaciones a la baja de
genes supresores de tumor y a la alta de oncogenes sumado a un
desencadenante medioambiental generan el cambio neoplásico en las células.
(Redaelli 2005) Hay evidencia que sugiere un factor genético en algunos casos
(Brunning 2001), y otras que están relacionadas con enfermedades específicascomo el síndrome de Down o la anemia de Fanconi, pero ellos cuentan sólo para
la minoría de casos. (Ziegler 2005, Chan 2002)
Aparentemente, la leucemia se inicia con un evento in-utero, el cual se ha
demostrado por análisis molecular de células mononucleares de muestras de
sangre de cordón luego del nacimiento; dichas alteraciones, luego de varios años,
son expresadas de igual modo en el fenotipo neoplásico. (Ziegler 2005, Rubnitz
2003, Ravindranath 2003)
Se ha establecido que el uso por la gestante de ciertas sustancias como
marihuana, antihistamínicos, anfetaminas, entre otras, pueden incrementar el
riesgo en el hijo de presentar leucemia en la niñez, mientras que el uso
sistemático de folato durante el embarazo ha reducido hasta en 60% los casos de
neoplasia. (Ziegler 2005) No se ha podido establecer el papel de factores
medioambientales tales como campos electromagnéticos, exposición a radón,
pesticidas y tabaquismo materno en el desarrollo de la enfermedad. (Chan 2002)
Otros factores posiblemente implicados incluyen exposición nuclear residencial u
ocupacional en los niños o los padres, radiaciones no ionizantes, pesticidas,
benceno, vitamina K, aceite de hígado de bacalao, inhibidores de la
topoisomerasa II naturales y manufacturados, nitratos de la dieta (“hot dogs”) y el
consumo de agua contaminada con tricloroetilieno. (Redaelli 2005)
El estudio por técnicas de citogenética de sangre de cordón ha demostrado
translocaciones específicas de leucemia t(12;21) ó la fusión TEL-AML1 hasta en el
1% de los recién nacidos. Se ha reportado similar presentación de lesiones
premalignas del neuroblastoma y tumor de Wilms, con lo que se sugiere que la
mayoría de las neoplasias infantiles se origina in-utero, pero tienen baja
penetrancia (<1%). Acorde a la tasa de presentación de casos, se requiere que el
1% de los niños con dichas alteraciones sufran un segundo golpe durante su
infancia para que se desarrolle en ellos leucemia. Este segundo golpe se puede
presentar en cualquier momento luego del parto, sin que exista un período de
latencia establecido pero que puede llegar a ser hasta de 15 años (Rubnitz 2003,
Ravindranath 2003). Igualmente, se han detectado rearreglos de IgH en los casos
de hiperploidía de leucemias linfoblásticas, t(4;11) en sangre de cordón, lo que ha
demostrado que la no disyunción cromosómica como causa de las hiperploidías se
produce in-utero. (Ravindranath 2003)
Entre los posibles factores que pueden producir el segundo golpe se estudian
químicos (pesticidas) e infecciones. El análisis del segundo golpe se suscitó a
partir del reconocimiento de niños con síndrome de Down que padecían de
desorden mieloproliferativo transitorio (presente hasta en el 10% de ellos) y
desarrollaron leucemia megacarioblástica aguda, en los cuales se encontró
mutación del gen GATA1, esencial para el desarrollo de líneas eritroide y
megacarioblástica. Sin embargo, otro golpe desconocido aún debe ocurrir para
permitir la progresión. (Ziegler 2005)Otra teoría que ha tomado importancia a raíz de la demostración del potencial
oncogénico de ciertas infecciones, corresponde a la infección tardía. Contrario a lo
que ocurre en la mayoría de secuencias infección-oncogénesis, en el caso de la
leucemia linfoblástica, la carencia de una infección temprana en la infancia
retrasaría la maduración del sistema inmune que se da con el cambio de fenotipo
Th2 a Th1, el cual es esencial en la respuesta mediada por interferón gamma, con
lo que se desarrollaría la neoplasia; esta apreciación se respalda con el hallazgo
de susceptibilidad a citotoxicidad y heterofagia por células NK y T que se presenta
en casos de leucemia linfoblástica TEL-AML1. (Ravindranath 2003)
La enfermedad compromete principalmente médula ósea y sangre. El compromiso
extramedular es frecuente con predilección particular por el sistema nervioso
central, ganglios linfáticos, bazo, hígado y gónadas. (Brunning 2001)
La presentación de linfoma linfoblástico B compromete principalmente piel, hueso,
tejidos blandos y ganglios linfáticos, siendo infrecuente las masas mediastinales.
Por el contrario, el linfoma linfoblástico T debuta con masa mediastinal hasta en el
50% de los casos, pero compromete también ganglios linfáticos, piel, hígado,
bazo, anillo de Waldeyer, sistema nervioso central y gónadas. (Brunning 2001)
1.1.4 Manifestaciones Clínicas. A partir de este aparte se consideran por
separado las leucemias de precursores B y T. Sin embargo, comparten los dos
tipos de enfermedad que sus síntomas son larvados y son manifestación de la
falla de hematopoyesis e infiltración de órganos por la expansión clonal de las
células tumorales, y que los síntomas pueden estar ausentes hasta en dos
terceras partes de los pacientes. (Chan 2002)
1.1.4.1 Leucemia Linfoblástica B. La mayoría de los pacientes se presentan con
falla medular: trombocitopenia, anemia y/o neutropenia. El conteo de leucocitos
puede estar disminuido, normal o marcadamente elevado, pero sólo el 50% de los
pacientes tienen conteos de blancos mayores de 10000/µl (Chan 2002). Son
frecuentes las linfadenopatías y hepatoesplenomegalia. Los dolores óseos y las
artralgias pueden ser síntomas cardinales. (Brunning 2001)
1.1.4.2 Leucemia Linfoblástica T. Típicamente se presenta con altos conteos de
leucocitos y, frecuentemente, con masa mediastinal o en otros tejidos. Para un
conteo de leucocitos y un compromiso tumoral dado, la hematopoyesis puede
estar respetada comparada con su contraparte B. (Brunning 2001)
La siguiente tabla presenta las frecuencias relativas de los síntomas a la
presentación de la enfermedad. Se compara con la población adulta.Tabla 1.1 Síntomas de presentación de LLA por grupos de edad
Niños (%) Adultos (%)
Fiebre 57 33-56
Fatiga 50 -
Sangrado 43 33
Dolor osteoarticular 25 25
Linfadenopatía 70 49
Hepatomegalia 66 35
Esplenomegalia 59 44
Masa mediastinal 8 15
Compromiso del SNC 3 2-10
Compromiso testicular 1 0,3
Tomado de Redaelli 2005.
1.1.5 Diagnóstico. Las consideraciones diagnósticas más relevantes son
enunciadas a continuación. Se mantiene la separación metodológica de linaje B y
T. Tener en cuenta que se presentan alteraciones en los paraclínicos que son
comunes a ambos linajes que incluyen leucocitosis con neutropenia, anemia y
trombocitopenia variables, elevaciones de LDH, ácido úrico, creatinina, calcio y
fosfato, con disminución del nivel de inmunoglobulinas circulantes. (Redaelli 2005)
Durante los años anteriores se empleaba la clasificación de la cooperación Franco
Americano Británica (FAB), que separaba en 3 grupos pronósticos basados en
morfología celular (L1 a L3), donde L2 tenía el peor pronóstico antes de
intensificar las terapias, fue remplazada por la clasificación de OMS, que incluye
otros parámetros que se exponen en los siguientes apartes. (Chan 2002) La
clasificación de FAB se puede resumir con la siguiente tabla.
Tabla 1.2 Caracterización de LLA acorde a morfología
L1 L2 L3
Frecuencia 80% 17% 3%
Blastos grandes
Linfoblastos Células más
homogéneos con
pequeños con grandes,
cromatinas finas,
escaso citoplasma, heterogéneas, con
Características nucléolos
sin nucléolos ni más citoplasma y
prominentes, citosol
vacuolas nucléolos, sin
basofílico con
prominentes. vacuolas.
vacuolas.
Inmunofenotipo Células B maduras
Precursor B ó T Precursor B ó T
asociado (Burkitt)
Tomado de Redaelli 2005.1.1.5.1 Leucemia Linfoblástica B. Se consideran cuatro apartes diagnósticos
(morfología, citoquímica, inmunofenotipo y genética) y un quinto aparte de
diagnóstico diferencial.
1.1.5.1.1 Morfología. Los linfoblastos en frotis y extendidos varían desde blastos
pequeños con escaso citoplasma, cromatina nuclear condensada, y nucléolo
mínimo, hasta células más grandes con cantidad moderada de citoplasma azul
claro-gris azulado, ocasionalmente vacuolado, cromatina nuclear dispersa, y
nucléolos prominentes múltiples variables. Gránulos azurófilos dispersos están
presentes en algunos linfoblastos en aproximadamente 10% de los casos. Estos
hallazgos se pueden correlacionar con anormalidades genéticas
t(9;22)(q34;q11.2). En algunos casos, los linfoblastos tienen pseudópodos
citoplasmáticos (células en espejo de mano). (Brunning 2001)
En biopsias de médula ósea, los linfoblastos son relativamente uniformes en
apariencia, con núcleos redondos, ovales o, indentados y algunas veces
convolutos. Los nucléolos variablemente son prominentes, aunque usualmente
mínimos o indistintos. La cromatina está finamente dispersa. El número de figuras
mitóticas usualmente varía, y son menos numerosas que en su contraparte T.
(Brunning 2001)
Su presentación en linfoma está generalmente caracterizada por un patrón de
compromiso ganglionar difuso, o de otros tejidos, en algunos casos con
compromiso parcial del infiltrado linfoblástico en el área paracortical con respeto
de los centros germinales. Los linfoblastos son homogéneos en apariencia con
núcleos redondos a ovales los cuales pueden manifestar grados variables de
convolución en la membrana nuclear. La cromatina nuclear es finamente
punteada; los nucléolos son generalmente mínimos. En la mayoría de los casos,
las figuras mitóticas son numerosas y en algunos casos puede haber un patrón
focal de “cielo estrellado”. Su contraparte T es indistinguible morfológicamente.
(Brunning 2001)
1.1.5.1.2 Citoquímica. Los linfoblastos son negativos para mieloperoxidasa y
carecen de reactividad tipo mieloide con Sudán Negro B (SBB). Los gránulos
linfoblásticos pueden teñir gris claro con la tinción SBB pero menos intenso que
los mieloblastos. Los linfoblastos pueden mostrar positividad PAS, siendo en
algunos casos el núcleo parcialmente rodeado por un anillo de reactividad PAS.
Los linfoblastos pueden reaccionar con esterasa inespecífica con punteado
multifocal o patrón de aparato de Golgi con inhibición variable con fluoruro de
sodio. (Brunning 2001)
1.1.5.1.3 Inmunofenotipo. Los linfoblastos son deoxinucleotidiltransferasa terminal
(TdT) positivos, HLA-DR positivos, y casi siempre positivos para CD19, CD79a
citoplásmica y CD38. Son positivos para CD10 y CD24 en la mayoría de casos; en
casos t(4;11)(q21;q23) son usualmente CD10 negativos y frecuentemente CD24negativos. Hay expresión variable de CD20 y CD22. CD45 puede estar ausente.
La expresión citoplásmica de CD22 es considerada específica de linaje. Los
antígenos mieloides CD13 y CD33 pueden ser de expresión aberrante. (Brunning
2001)
El grado de diferenciación de los linfoblastos del linaje B tiene correlación clínica y
genética. En el estado más temprano -precursor temprano-, los blastos expresan
CD19, CD79a y CD22 citoplásmicos, y TdT nuclear, y en el estado intermedio -
común-, los blastos expresan CD10. Estos dos estados representan la mayoría de
casos de leucemia (50-70%). Entre 20-30% de los casos corresponden con el
estado de diferenciación más maduro -preB-, los blastos expresan cadenas mu
citoplásmica (cyt-µ). Es característica la ausencia de inmunoglobulina de
superficie, pero su presencia no excluye el diagnóstico de LLA-B, puesto que entre
el 2-3% de estas neoplasias presentan esta característica y son CD20+. (Chan
2002, Brunning 2001)
1.1.5.1.4 Genética. Las alteraciones genéticas son marcadores pronósticos
importantes, detectándose hasta en el 75% de las leucemias linfoblásticas.
(Rubnitz 2003) Las alteraciones citogenéticas en neoplasias de precursores B se
consideran en varios grupos: hipoploidías, hipodiploidías <50, hiperdiploidías >50,
translocaciones y pseudodiploidías: (Brunning 2001, Chan 2002)
LLA- t(9;22)(q34;q11.2); BCR/ABL
LLA- (v;11q23); rearreglo MLL
LLA- t(12;21)(p13;q22); TEL/AML1
LLA- t(1;19)(q23;p13.3); PBX/E2A
LLA- hipodiploide
LLA- hiperdiploide >50
Estos hallazgos son de importancia pronóstica y son usados para modificar
tratamientos en enfermedad pediátrica. Con los tratamientos actuales, los grupos
de buen pronóstico son: hiperploidía entre 51 y 65 cromosomas, correspondiente a
DI (contenido de DNA) por citometría de flujo de 1.16 a 1.6; y t(12;21)(p12;q22), la
cual es resultado de la fusión del gene TEL en 12p13 con el gen del factor
codificante de transcripción AML1 en 21q22. Los hallazgos relacionados con pobre
pronóstico son: 1) t(9;22), la cual resulta de la fusión de BCR en 22q11.2 y el gen
de tirosina quinasa citoplásmica ABL en 9q34, y produce una proteína de fusión en
niños p190kd BCR/ABL y en la mitad de casos de adultos p210kd y los restantes
p190 (predomina en LMC). 2) LLA de precursores B en estados tempranos de
diferenciación pueden tener t(4;11) con fusión del gen MLL en 11q23 que codifica
una proteína putativa que liga DNA y AF4 en 4q21; otra translocación en 11q23
resulta de la fusión del locus MLL con otras parejas de genes. LLA con
anormalidades 11q23 pueden surgir también relacionadas a la terapia de leucemia
secundaria a etopósido. 3) t(1;19), encontrada en el 25% de las LLA-B de niños
con expresión citoplásmica de mu, fusiona el gen que codifica el factor de
transcripción E2A en 19p13.3 con PBX en 1q23, asociado con pobre pronóstico. 4)Hipodiploidía está asociada con pobre pronóstico. Otras anormalidades (del(6q),
del(9p), del(12p), hiperploidías <51, triploidía cercana y tetraploidía cercana) se
asocian con pronóstico intermedio. (Brunning 2001)
Algunas entidades genéticamente definidas tienen inmunofenotipos
característicos. Leucemias con rearreglos de MLL son característicamente CD10-,
y frecuentemente CD24- y CD15+. LLA-B t(1;19) es CD10+, CD34-, y CD20- o
débil y usualmente mu citoplásmica positivas; este fenotipo se relaciona con alta
tasa de recurrencia con protocolos basados en edad y conteo de blancos, pero
con intensificación de terapia se ha logrado mejorar el panorama (Chan 2002).
LLA-B t(12;21) muestra alta densidad de expresión de CD10 y HLA-DR con CD19
y CD20 usualmente negativos. (Brunning 2001)
Otras traslocaciones de importancia reconocidas por técnicas moleculares no
detectadas por citogenética incluyen la t(12;22) críptica, que confiere buen
pronóstico. (Chan 2002)
1.1.5.1.5 Diagnóstico diferencial. Los diagnósticos diferenciales de leucemia
linfoblástica B incluyen LLA-T, LMA con mínima diferenciación, y médula ósea
reactiva con incremento de hematogonias. Las dos primeras son diferenciables
por inmunofenotipo. (Brunning 2001)
Las hematogonias se pueden incrementar en niños y en adultos mayores con
desórdenes tales como anemia ferropénica, neuroblastoma y púrpura
trombocitopénica idiopática, o posterior a terapia citotóxica. Estas células tienen
una relación núcleo/citoplasma muy alta y una cromatina nuclear homogénea; los
núcleos muestran indentación o hendiduras. No se identifican usualmente
nucléolos, son indistinguibles. Estas células no se observan en sangre periférica.
En biopsias de médula ósea las hematogonias son distribuidas uniformemente en
el intersticio. La cromatina nuclear es muy agrupada; nucléolos y figuras mitóticas
son raramente observados. (Brunning 2001)
Las hematogonias son difíciles de diferenciar de linfoblastos puesto que expresan
en forma similar CD10 y TdT. Sin embargo, en análisis con citometría de flujo de
parámetros múltiples, las hematogonias muestran la secuencia de diferenciación
normal que incluye CD10, CD19, CD20, CD34 y CD45, observándose predominio
de estados intermedio (CD10+, CD19+, TdT- y sIg-) y tardío (CD19+, CD20+,
sIg+). Por el contrario, sumado a las aberraciones fenotípicas, los linfoblastos
predominan estados inmaduros (TdT+, CD19+, CD20-, sIg-) y reducción de
células maduras. (Brunning 2001)
1.1.5.2 Leucemia Linfoblástica T. Se consideran cuatro apartes diagnósticos
(morfología, citoquímica, inmunofenotipo y genética) y un quinto aparte de
diagnóstico diferencial.1.1.5.2.1 Morfología. Los linfoblastos T son similares a los B. En frotis las células
son de tamaño medio con alta razón núcleo/citoplasma, pudiendo existir un amplio
rango de tamaño desde linfoblastos pequeños con cromatina nuclear muy
condensada y sin nucléolos evidentes hasta blastos más grandes con cromatina
finamente dispersa y nucléolos relativamente prominentes. Se pueden observar
vacuolas citoplásmicas. En cortes de médula ósea los linfoblastos tienen una gran
relación núcleo/citoplasma, cromatina finamente punteada y nucléolos mínimos. El
conteo mitótico se ha reportado alto. (Brunning 2001)
El compromiso ganglionar se manifiesta por completo borramiento de la
arquitectura habitual, comprometiendo la cápsula. Se puede presentar patrón de
“cielo estrellado”. Se puede observar compromiso parcial en localización
paracortical con respeto de centros germinales. En algunos casos la población
predominante de blastos tiene núcleo convoluto; se pueden observar abundantes
figuras mitóticas. (Brunning 2001)
Un pequeño número de pacientes con LLA-T, eosinofilia e hiperplasia mieloide
han sido descritos. En algunos casos se han asociado anormalidades genéticas
en células de médula ósea t(8;13)(p11.2;q11.22). Varios de esos casos
desarrollaron neoplasias mieloides tanto leucemias mieloides agudas como
síndromes mielodisplásicos o sarcoma mieloide, siendo más frecuentes en
varones. (Brunning 2001)
1.1.5.2.2 Citoquímica. Los linfoblastos T muestran actividad focal de fosfatasa
ácida en frotis y extendidos. (Brunning 2001)
1.1.5.2.3 Inmunofenotipo. Los linfoblastos en LLA-T expresan TdT y niveles
variables de CD1a, CD2, CD3, CD4, CD5, CD7 y CD8. De éstos, CD7 y CD3
citoplásmico son más frecuentemente positivas, y sólo CD3 es considerado
específico de linaje. CD4 y CD8 son frecuentemente coexpresados en blastos, y
CD10 puede ser positivo. Se ha observado expresión en algunos casos de CD79a.
Es frecuente encontrar expresión aberrante de antígenos mieloides CD13 y/o
CD33, y en raras ocasiones CD117 (c-kit), sin que su presencia excluya el
diagnóstico. Los linfoblastos T pueden mostrar rearreglos del gen del receptor T
(TCR), pero esto no es específico de linaje. (Brunning 2001)
Estas neoplasias pueden ser estratificadas acordes a los diferentes estados de
diferenciación intratímica (CD3 citoplásmico, CD2 y CD7 son tempranamente
expresados, seguidos por CD5 y CD1a, seguido por CD3 de membrana). Algunos
estudios han correlacionados esos estados de diferenciación con pronóstico, pero
no se ha logrado establecer las alteraciones genéticas específicas. Otros
marcadores de inmadurez como HLA-DR y CD38 son usualmente expresados.
(Brunning 2001, Chan 2002)1.1.5.2.4 Genética. Hasta en un tercio de las neoplasias se han detectado
translocaciones en locus del receptor T delta y alfa en 14q11.2, locus beta en
7q35, y locus gamma en 7p14.15, con una variedad de genes emparentados. Los
genes incluyen los factores de transcripción MYC (8q24.1), TAL1 (1p32), RBTN1
(11p15), RBTN2 (11p13) y HOX11 (10q24) y la tirosina quinasa citoplásmica LCK
(1p34.3). En la mayoría de casos esas translocaciones conducen a una
desregulación de la transcripción de los genes emparentados por yuxtaposición
con la región reguladora del locus del receptor de células T. En cerca del 25% de
casos de LLA-T el locus TAL1 es desregulado por una deleción en su región
regulatoria 5’ más que por translocación. La deleción 9p, resultante en la pérdida
del gen supresor tumoral CDKN2A (inhibidor de la CDK4), ocurre con más
frecuencia en LLA-T. (Brunning 2001)
1.1.5.2.5 Diagnóstico diferencial. Corresponde básicamente a los antes descritos
para LLA-B. Especialmente señalar, que a diferencia de las hematogonias, los
linfoblastos T muestran en todos los casos expresión de antígenos de células T.
(Brunning 2001)
1.1.6 Estratificación de riesgo y establecimiento de pronóstico. La
estratificación de riesgo se basa en características clínicas, inmunológicas y
citogenéticas para predecir el desenlace de la enfermedad y brindar una terapia
óptima. Para tal fin se han definido tres estratos de riesgo: estándar, medio y alto,
denominados por algunos como bajo, estándar y alto, aunque la mayoría de
centros sólo emplea los dos últimos, e incluyen un estrato de altísimo riesgo. En
general, los de bajo riesgo tienen mejor desenlace, requieren terapia menos
intensiva y tienen menos probabilidad de recurrencia. Anteriormente, se
consideraban los criterios clínicos y morfológicos de máxima importancia, pero
actualmente han sido complementados por factores genéticos e inmunológicos.
(Redaelli 2005, Ravindranath 2003)
El grupo BFM popularizó la respuesta a 1 semana de prednisona con metotrexate
intratecal como determinante del riesgo asociado a parámetros como edad y
conteo de blancos, mientras que el grupo de oncología pediátrica estableció el
cariotipo como un indicador básico para establecer el resultado en LLA preB. Los
blastos de niños con LLA menores de 1.5 años fueron resistente a prednisona,
asparaginasa, y tenopósido, pero más sensible a citarabina. Las LLA CD10- son
más resistentes a glucocorticoides, asparaginasa, tiopurinas, antraciclinas e
ifosfamide pero más sensible a citarabina comparado a LLA preB. Células de
niños mayores de 10 años fueron más resistentes a prednisona, dexametasona,
asparaginasa, idarubicina y 6-mercaptopurina. LLA-T con fuerte resistencia a
prednisona, asparaginasa, y vincristina y todas las otras drogas excepto tiopurina
y tenipósido. El pronóstico favorable de la hiperploidía se relaciona con
susceptibilidad mayor a antimetabolitos como metotrexate, 6-mercaptopurina, y
asparaginasa. Estudios in-vitro de resistencia a quimioterapia se correlacionaron
con respuesta y período libre de enfermedad, y predijeron EMR al final de lainducción (prednisona). Se sugiere que la terapia se debe individualizar acorde a
la resistencia: usar citarabina en niños pequeños, asparaginasa en TEL-AML1.
TEL-AML1 es un factor pronóstico favorable relacionado con la terapia intensiva
con asparaginasa y la aparición de nuevas líneas tumorales diferentes. Los niños
menores de 1 año tienen pésimo pronóstico, relacionado con 11q23 o rearreglo
del gen de leucemia de linaje mixto (MLL), fenotipo preB con DR+ CD10-, con
marcador mieloide, tiene sensibilidad por citarabina. Se ha asociado polimorfismo
NQO1 con rearreglo MLL t(4;11). Los rearreglos MLL se asocian con pobre
pronóstico a cualquier edad. En niños mayores de 1 año son de pobre pronóstico
t(4;11) y t(9;11) más que 11q23. (Ravindranath 2003)
En los últimos años la terapéutica ha mejorado alcanzando tasas de supervivencia
a 5 años sin recurrencia de hasta 70%. (Rubnitz 2003) Sin embargo, pese a los
esfuerzos, hasta el 20% de los niños recurren y fallecen, y los sobrevivientes
presentan serios problemas de salud por los efectos adversos del tratamiento.
(Ziegler 2005) Varios trabajos se han publicado al respecto encontrando remisión
completa en grupos de riesgo del 99% en bajo, intermedio 98-99% y alto 88-97%.
Las tasas de sobrevida a 5 años libres de enfermedad se encuentran en 68%,
63% y 62%, respectivamente. (Redaelli 2005)
1.1.6.1 Leucemia Linfoblástica B. Son generalmente leucemias de buen
pronóstico. En el grupo pediátrico la tasa de remisión completa es del 95%, y en
adultos entre 60-85%. La tasa de sobrevida libre de eventos es del 70% en niños;
aproximadamente, el 80% de los niños aparentan curación. (Brunning 2001)
Los grupos de riesgos pediátricos de LLA-B se basan en perfiles citogenéticos,
edad, conteo de leucocitos, sexo y respuesta a la terapia inicial. Hay una alta
asociación en niños con traslocaciones que involucran el gen MLL en 11q23 con
pobre pronóstico independiente de la edad. En edad pediátrica, más del 50% de
los pacientes tienen buen pronóstico relacionado con cariotipos de hiperploidías o
cambios genéticos t(12;21) con supervivencia a largo plazo del 85-90%. En
adultos se carece de estratos de riesgo, aunque las alteraciones citogenéticas
presentan un panorama diferente respecto a los niños. (Brunning 2001)
Las características genéticas son importantes pero resultan heterogéneas si se
tienen en cuenta otros factores. Es conocido que el cromosoma Philadelphia es de
pobre pronóstico; sin embargo, la mayoría de niños entre 1-9 años, Ph+, son
curados con quimioterapia sola. La t(4;11) es de pobre pronóstico en niños
menores de 1 año, no así en mayores de esta edad. (Rubnitz 2003)
Factores predictivos para remisión durable y supervivencia prolongada son edad
entre 4 y 10 años, hiperploidías (54-62 cromosomas) con trisomías 4, 10 y/o 17,
t(12;21)(p13;q22) y conteo normal o bajo de leucocitos al diagnóstico. (Brunning
2001, Rubnitz 2003) Factores adversos incluyen edad <1 año, t(9;22)(q34;q11.2) y
t(4;11)(q21;q23). (Brunning 2001) Las hipoploidías presentan relacióndirectamente proporcional con el pronóstico: a menor número de cromosomas,
menor supervivencia. (Rubnitz 2003). Clásicamente se ha considerado como
factores pronósticos los que se muestran en la siguiente tabla:
Tabla 1.3 Caracterización de pronóstico en LLA acorde a variables clínicas
Favorable Desfavorable
Edad 1-9 años <1 y >10 años
Conteo de blancos <50000/µL >50000/µL*
Sexo Femenino Masculino
Raza Blanco Negro, hispano
Enfermedad “sólida” Ausente Presente
Leucemia extramedular Ausente Presente
Morfología (FAB) L1 L2, L3
Inmunofenotipo Precursor B B y T
Hipodiploidia (<45
t(12;21)
cromosomas)
Citogenética Hiperdiploidía (54-68
Cromosoma Philadelphia
cromosomas)
11q23*
Respuesta temprana a
Rápido Lento*
tratamiento (7 a 14 días)
* Modificable por el tratamiento.
Tomado de Chan 2002.
1.1.6.2 Leucemia Linfoblástica T. En protocolos pediátricos de LLA-T, se trata
como enfermedad de alto riesgo, y en adultos el manejo es similar a otros tipos de
LLA. Previo al advenimiento de los actuales protocolos terapéuticos el pronóstico
fue desfavorable, pero con los actuales es comparable con LLA-B. (Brunning
2001)
Se han establecido 4 alteraciones citogenéticas de importancia pronóstica, siendo
favorable el gen de fusión MLL-ENL y la expresión de HOX11, mientras que la
activación de TAL1 y LYL1 confieren mal pronóstico, así como la expresión de
HOX11L2. (Rubnitz 2003)
1.1.7 Tratamiento. El tratamiento inmediato de la LLA requiere manejo efectivo de
los efectos colaterales de la enfermedad, destrucción de las células tumorales, y
manejo apropiado de los efectos adversos del tratamiento. (Redaelli 2005)
Durante muchos años se ha considerado que la terapia de leucemia linfoblástica
aguda debe ser diseñada acorde al riesgo. En años anteriores se había
establecido que los principales factores de riesgo comprendían la edad y el conteo
de blancos; sin embargo, estudios recientes han demostrado que la terapia en sí
es el factor pronóstico individual de mayor impacto, y que la intensificación deterapia acorde a respuesta medida a los 7, 14 y 28 días, lo que ha llegado a ser
práctica estándar. (Chan 2002)
Acorde a lo concluido por el seminario del Instituto Nacional del Cáncer en 1993,
se consideraba que los niños con edades entre 1 y 9 años con conteos de blancos
menores a 50000/µL estaban en riesgo estándar, mientras que los que no
pertenecían a este grupo eran de alto riesgo. Los primeros correspondían a los 2/3
de los pacientes y presentaban períodos libres de enfermedad a 5 años del 80%,
mientras que los segundos recaían incluso durante la inducción. (Chan 2002) En
relación con la población adolescente, se ha demostrado que responde mejor a
esquemas de tratamiento pediátricos que adultos (64-67%/38-41%), pero se
requiere de manejo individualizado para ese grupo de pacientes. (Ziegler 2005)
Establecido el grupo de riesgo al que pertenece el paciente se diseña la terapia.
En el grupo de bajo riesgo (40%) se emplean antimetabolitos estándar. El
tratamiento de intensificación es útil en pacientes con riesgo estándar y alto riesgo
empleando medicamentos más fuertes evitando la aparición de resistencias. 51%
son pacientes de riesgo estándar que requieren poliquimioterapia de
intensificación. Los pacientes de más alto riesgo (9%) son candidatos a trasplante
de células madre luego de la primera remisión. (Redaelli 2005)
Determinado el riesgo, se establece el tratamiento buscando inducir la remisión,
prevenir la infiltración leucémica al sistema nervioso central, y ofrecer terapia de
mantenimiento prolongada (2 a 3 años). Estos conceptos han permanecido sin
cambios durante más de 30 años, con pequeñas modificaciones que han
significado ligeras mejorías en el manejo. Actualmente se ha incrementado el
interés en la intensificación de la terapia en el estado postremisión temprana
buscando reducir la tasa de resistencia de las células leucémicas. (Chan 2002) El
pronóstico se ve modificado por el tipo de terapia instaurado, siendo mejor el
resultado con inducción con L-asparaginasa. Los niños mayores presentan menor
respuesta a prednisolona y L-asparaginasa, pero responden mejor a citarabina; las
células hiperploides T responden mejor al metotrexate. (Rubnitz 2003)
A pesar de los adelantos logrados en aras a mejorar los índices de riesgo, los
indicadores actuales fallan en establecer el riesgo plenamente puesto que un
número significativo de pacientes en bajo riesgo pueden llegar a recurrir (10-30%),
así como muchos pacientes son sometidos a terapias altamente tóxicas sin ser del
todo necesarias. (Campana 2002, Mandrell 2006, Tzortzatou 2001)
Un resumen de los fármacos empleados en el tratamiento de leucemia junto con
sus efectos adversos se presenta en la tabla a continuación.
Por último, es válido anotar que las recurrencias se correlacionan con dosis
inadecuadas más que resistencia tumoral, por lo que la individualización de la
terapia ha generado mejores resultados. Sin embargo, la resistencia es unproblema en ciertos casos. La resistencia de novo puede ser analizada in vitro por
ensayo de citotoxicidad con metil-tiozol-tetrazolio, in vivo por el tiempo a la
depuración de blastos, y la medición de EMR determina la emergencia de nuevas
resistencias. (Ravindranath 2003) Los anticonvulsivantes que inducen el
metabolismo producen pobre respuesta, mientras que los azoles antifúngicos y
macrólidos reducen la toxicidad e incrementan la respuesta. (Rubnitz 2003)
Tabla 1.4 Medicamentos empleados en terapéutica de LLA
Tratamiento Tipo Efectos adversos
Hiperglicemia, hipertensión, cambios del
Prednisona Glucocorticoides ánimo, acné, ganancia de peso,
Dexametasona sintéticos hepatomegalia, necrosis avascular del
hueso, osteoporosis
Náusea/vómito (NV), disfunción hepática,
Análogo del mielosupresión, fotosensibilidad,
Metotrexate folato, leucoencefalopatía, osteoporosis.
antimetabolito Administración intratecal: cefalea, fiebre,
convulsiones
Neuropatía periférica, constipación,
Vincristina Alcaloide convulsiones, pérdida de peso, celulitis
química
NV, pérdida de peso, mucositis,
Doxorrubicina
Antraciclina mielosupresión, celulitis química,
Daunorrubicina
cardiomiopatía
NV, reacciones alérgicas, hiperglicemia,
L-asparaginasa Enzima pancreatitis, disfunción hepática, trombosis
y encefalopatía
NV, mucositis, mielosupresión,
Análogo de
6’mercaptopurina fotosensibilidad, disfunción hepática,
purinas
osteoporosis
NV, pérdida de peso, mucositis,
Etopósido Epipodofilotoxina
mielosupresión, reacciones alérgicas, LMA
NV, fiebre, rash, mucositis, mielosupresión,
Citarabina Antimetabolito
disfunción hepática, conjuntivitis, infertilidad
NV, cistitis hemorrágica, mielosupresión,
Agente
Ciclofosfamida SIADH, pérdida de peso, cáncer de vejiga,
alquilante
LMA, infertilidad
Pérdida de peso, somnolencia
postratramiento, convulsiones, disfunción
Radiación SNC Radiación
neurológica y endocrina, pérdida de peso,
osteoporosis, tumores cerebrales
Tomado de Redaelli 2005.1.1.7.1 Inducción. Casi la totalidad de niños tratados con glucocorticoides,
vincristina y L-asparaginasa con o sin daunorrubicina, alcanzan remisión
morfológica a las 4 semanas, que se define como la presencia de <5% de blastos
en médula ósea (Redaelli 2005). La determinación de blastos circulantes en
sangre periférica o en médula ósea, tiene mejor predicción en las primeras 2
semanas que al final de la inducción. Un estudio de Schrappe mostró que los
pacientes con blastos mayores de 1000/mL a la semana de inducción presentaron
supervivencia libre de enfermedad 43% menos que la de los respondedores
tempranos; igualmente, presencia de blastos >25% en médula ósea se relaciona
con sobrevida a 5 años de sólo 42%. Estos estudios indicaron la necesidad de
modificar las terapias acorde a la respuesta temprana. (Chan 2002; Rubnitz 2003)
1.1.7.2 Terapia preventiva del Sistema Nervioso Central. El tratamiento dirigido
contra las células neoplásicas presente en SNC inmediatamente después de la
remisión ha mejorado la sobrevida. La irradiación preventiva temprana del SNC es
efectiva pero produce efectos adversos al neurodesarrollo y secuelas endocrinas.
La reducción de la dosis de radiación no redujo los efectos adversos, como si lo
logró la quimioterapia intratecal, con igual respuesta terapéutica. También se
demostró que la respuesta se relaciona con los niveles de quimioterapia sistémica
que alcanza el SNC, situación que se demostró con el uso de dexametasona en
lugar de prednisona, la cual penetra mejor a SNC y tiene vida media más larga
logrando mejor protección contra la recurrencia en SNC. La irradiación sólo quedó
para casos seleccionados de pacientes con compromiso del SNC al momento del
diagnóstico u otros factores de alto riesgo (hiperleucocitosis extrema, cromosoma
Ph+, respuesta lenta a terapia inicial); actualmente, la recurrencia de SNC es
menor a 5%. La definición de compromiso del SNC se determina con más de 5
células/µL de LCR con presencia de blastos. La combinación de terapia sistémica
y radiación dejó al compromiso inicial de SNC fuera de los factores adversos de
riesgo. (Chan 2002, Rubnitz 2003, Redaelli 2005, Ziegler 2005)
1.1.7.3 Intensificación. Estudios previos han demostrado que dar uno o más
cursos de quimioterapia rotacional multiagente que puede incluir metotrexate y 6-
mercaptopurina, L-asparaginasa, dexametasona, vincristina, doxorrubicina,
tioguanina y ciclofosfamida, y una epipodofilotoxina y citarabina (Redaelli 2005),
durante los primeros 6 a 8 meses del diagnóstico reduce significativamente el
riesgo de recurrencia. Estos hallazgos se demostraron primero en pacientes de
alto riesgo, pero subsecuentemente se reconoció su utilidad en pacientes incluso
con riesgo estándar y altas probabilidades de curación. Hay amplia variación entre
los protocolos sobre la elección de drogas, la intensidad de dosis y el tiempo de
intensificación. Algunos protocolos la incluyen inmediatamente posterior a la
inducción (consolidación), mientras que otros la proponen luego de un período de
profilaxis del SNC y terapia de mantenimiento oral (intensificación tardía), sin
embargo, no hay evidencia que uno sea superior al otro. Un enfoque adicional con
tratamiento intensivo luego de 9 a 10 meses ha sido empleado para pacientes dealto riesgo como adolescentes y respondedores lentos a la terapia inicial. (Chan
2002, Rubnitz 2003)
1.1.7.4 Terapia de continuación. Se ha definido que las terapias deben ser
mantenidas por dos años para niñas, y en niños por tres años para alcanzar
similares respuestas. Los esfuerzos por reducir los períodos de terapia han sido
infructuosos, así como es inútil la aplicación de terapias por más de 3 años.
(Redaelli 2005) Los medicamentos empleados son los antimetabolitos a bajas
dosis. La terapia efectiva se determina con subrogados como el conteo de
neutrófilos entre 750 y 1500/µL, debido a que la biodisponibilidad de los
medicamentos orales es errática. El uso de una dosis de vincristina adicional y el
de 5 días de esteroides mensuales mejora los resultados, situación que no se
produce con 6-mercaptopurina o metotrexate. (Chan 2002, Rubnitz 2003)
1.1.7.5 Tratamiento de pacientes de muy alto riesgo en primera remisión completa.
Se considera de muy alto riesgo el grupo de pacientes que presenta una
expectativa de vida a 5 años libre de recurrencia menor del 40%, aun con los
tratamientos actuales. Por ejemplo, el uso de trasplante alogénico de células
madre ha mostrado utilidad en pacientes con LLA y cromosoma Philadelphia;
además, es importante tener en cuenta que ciertos estudios han mostrado que
este tipo de pacientes pueden sufrir más enfermedad injerto contra huésped. La
intensificación de la terapia no ha demostrado utilidad mayor en pacientes con
rearreglos del gen de la leucemia de linaje mixto (MLL) asociado frecuentemente
con t(4;11). Otros grupos de alto riesgo comprenden pacientes que alcanzan
remisión en más de 4 a 6 semanas, y con anormalidades citogenéticas cercanas a
la haploidía; el trasplante de células madre se ha probado con limitado éxito en
este grupo de pacientes, y se ha incrementado el interés por el uso en trasplantes
de células de sangre de cordón umbilical y otras células no idénticas de donantes
no relacionados. (Chan 2002, Rubnitz 2003, Redaelli 2005, Ziegler 2005)
1.1.7.6 Tratamiento de la recurrencia. Actualmente el número de recurrencias es
comparable con la incidencia de tumores cerebrales, por lo que sigue siendo un
problema en oncología pediátrica. Debido a que los quimioterapéuticos más
efectivos son administrados durante el primer tratamiento, estos no pueden ser
empleados en la recurrencia. Los predictores de duración de la segunda
recurrencia incluyen la duración de la primera remisión, la intensidad de la terapia
original y el sitio de recurrencia. La recurrencia en médula ósea es indicativa de
falla terapéutica, así como la presencia de enfermedad 18 meses después del
diagnóstico, y las que se presentan en los 3 primeros años alcanzan sobrevida a 5
años libre de recurrencias menor al 30%. Las recurrencias medulares y
extramedulares combinadas presentan un panorama menos sombrío. Las
recurrencias extramedulares (SNC, testículo y ojo) presentes hasta el 30% de los
pacientes, poseen un mejor pronóstico, pero algunos pueden ser seguidos de
enfermedad sistémica, y el pronóstico empeora si se presenta en los primeros 18meses. La recurrencia testicular es de lejos la de mejor pronóstico con
supervivencias de hasta 60% a 5 años. (Chan 2002, Rubnitz 2003)
1.1.7.7 Trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas. El trasplante
alogénico de células madre hematopoyéticas es fundamentado en 3 objetivos
básicos que incluyen el reacondicionamiento medular luego de terapia citotóxica
intensiva, la provisión de una fuente limpia de células madre no contaminada con
blastos leucémicos, y la capacidad de algunas células donantes de generar
respuesta injerto contra huésped y eliminar los blastos residuales. (Goulden 2002)
El trasplante no es recomendado en pacientes durante la primera remisión,
excepto en los grupos ya mencionados. Si la recurrencia se presenta, el
pronóstico cambia radicalmente con la utilización de quimioradioterapia a altas
dosis seguido de trasplante debido a que reduce la probabilidad de recurrencia. La
respuesta es mejor en pacientes que reciben trasplantes de hermanos, pero su
utilidad se reduce cuando la recurrencia se presenta luego de 6 meses de
descontinuación de la terapia; para estos pacientes, sólo se indica el trasplante si
la respuesta a la quimioterapia es muy lenta. Los riesgos del trasplante de médula
ósea se relacionan con la toxicidad del régimen terapéutico de preparación y la
enfermedad de injerto contra huésped. La última se relaciona más con trasplantes
no idénticos, y esta situación ha generado preocupación sobre el verdadero papel
del trasplante en el tratamiento de la recurrencia de LLA. Otra estrategia es la
utilización de células madre hematopoyéticas del paciente durante la remisión con
purga de la recolección con agentes quimioterapéuticos o anticuerpos contra
antígenos relacionados con leucemia para reducir la contaminación con células
tumorales, reduciendo la morbimortalidad. Sin embargo, la evidencia no ha podido
demostrar aún la eficacia del procedimiento. (Chan 2002, Ziegler 2005)
1.1.7.8 Complicaciones del tratamiento. Las complicaciones pueden ser agudas o
de inicio tardío. El manejo de soporte ha mejorado significativamente la
morbimortalidad, incluyendo el uso de concentrados de plaquetas y eritrocitos
irradiados, para reducir el riesgo de enfermedad injerto contra huésped, mientras
que otras intervenciones como la administración de factor estimulante de colonias
de granulocitos no ha demostrado mayor utilidad. (Chan 2002)
El desarreglo metabólico es frecuente en pacientes con hiperleucocitosis
(<100000/µL), linfadenopatía mediastinal masiva, y enfermedad de células T ó B.
La urato oxidasa ha demostrado utilidad en la reducción de los niveles de ácido
úrico disminuyendo el riesgo de nefrotoxicidad; sin embargo, la diálisis puede
llegar a ser necesaria. Estos desórdenes metabólicos no deben retardar una
terapia de inducción oportuna. (Chan 2002) Igualmente, la cardiotoxicidad inducida
por antraciclinas se ha reducido con el uso de quelantes del hierro como la
dexrazoxane que ha demostrado cierta utilidad en adultos y niños. (Ziegler 2005)
Las infecciones son la principal causa de muerte en niños en remisión y se puede
presentar durante las fases de inducción e intensificación. La administracióntemprana de antibióticos es esencial en el manejo de pacientes con neutropenia
febril (<500/µL). Durante la fase de consolidación el riesgo de neumonía por
pnemocystis jiroveci puede ser limitado por el uso profiláctico de trimetroprim-
sulfametoxazol durante 3 días secuenciales por semana. La varicela diseminada
puede ser evitada con la administración de inmunoglobulina zóster entre las 72-96
horas después de la exposición, y el uso de aciclovir en caso que se instaure la
infección. (Chan 2002)
La aparición de segundas neoplasias en niños sobrevivientes a LLA se ha
establecido en 1.6% a 15 años, asociado a predisposición y los fármacos usados
para tratar la primera neoplasia. (Zielger 2005) Estas neoplasias comprenden dos
grupos: segundas leucemias y tumores sólidos, teniendo en general las primeras
latencias cortas y las segundas largas. (Hoelzer 2002) Un grupo de pacientes
sometidos a irradiación de SNC desarrollarán tumores cerebrales con latencia de
9 años para glioma de alto grado y 19 años para meningioma. Se puede
desarrollar LMA secundaria al uso de inhibidores de topoisomerasa II
(epipodofilotoxina) o agentes alquilantes, relacionado a la programación de la
terapéutica y el uso concomitante de otros fármacos; el pronóstico de estas
leucemias es muy pobre y sólo parecen responder a trasplante. (Chan 2002,
Hoelzer 2002) Otras neoplasias de riesgo incrementado en pacientes
sobrevivientes a LLA son tumores parotídeos, tiroideos, sarcomas de tejidos
blandos, linfomas no Hodgkin y su incidencia se incrementa entre 7 y 14 veces
respecto al grupo control en varias series publicadas con más de 15 mil pacientes
en total. (Hoelzer 2002)
El desarrollo neurocognitivo es inferior en estos pacientes especialmente en
pacientes irradiados antes de los 5 años, existiendo una relación inversa entre
dosis de radiación y coeficiente intelectual. Al contrario, no se ha demostrado
deterioro en pacientes con altas dosis de metotrexate sistémico e intratecal. Del
mismo modo, se ha descrito un síndrome de disfunción pituitaria en pacientes
irradiados caracterizado por estatura corta, obesidad y pubertad precoz
predominante en mujeres. (Chan 2002, Ziegler 2005)
Aunque la mayoría de pacientes no muestran deterioro gonadal, algunos sufren
cierto daño relacionado con dosis escaladas de ciclofosfamida. No se ha
demostrado mayor riesgo de alteraciones congénitas en hijos de pacientes con
leucemia. (Chan 2002)
La necrosis avascular del hueso con destrucción de las articulaciones que
soportan peso se ha relacionado con el uso de esteroides (altas dosis de
dexametasona), afectando a niñas mayores de 10 años. El diagnóstico se realiza
con uso de MRi. Se ha observado disminución de densidad mineral ósea y
osteoporosis en cualquier momento hasta por 20 años después de la terapia. Esto
conduce a dolor musculoesquelético, fracturas por compresión, cifosis y lordosis.
(Chan 2002)1.1.7.9 Nuevas perspectivas terapéuticas. Con el incremento en la información
disponible y el estudio sistemático de las condiciones de peor pronóstico en LLA,
se ha logrado establecer nuevas intervenciones terapéuticas específicas para
determinadas alteraciones de mal pronóstico, así como la terapia con anticuerpos
específicos que se abre camino como estrategia de tratamiento de pacientes de
alto riesgo.
En pacientes con cromosoma Philadelphia, se ha estudiado la utilidad de un
fármaco dirigido contra la tirosina quinasa Abl (STI571, Imatinib, Gleevec®), el
cual, aparte de cierto disconfort gástrico no ha demostrado mayores efectos
adversos, y ha logrado reducir selectivamente las células que expresan este
producto de fusión génico alcanzando remisión completa hasta en el 29% de los
pacientes. Sin embargo, a pesar de lo prometedor del fármaco, todavía se
requieren estudios adicionales grandes para demostrar su real utilidad. (Hoelzer
2002)
Debido a que los blastos leucémicos expresan una serie de antígenos de
superficie, ellos pueden llegar a ser blancos de terapia con anticuerpos
monoclonales. Se ha descrito que la utilidad de dichos anticuerpos se determina
sólo si el antígeno está presente en más del 20% de los blastos. Algunos de los
anticuerpos desarrollados se enumeran en la siguiente tabla. A pesar de lo
alentador del adelanto científico, se requiere que la evidencia soporte su utilidad
clínica. (Hoelzer 2002)
Tabla 1.5 Anticuerpos monoclonales de importancia terapéutica
Expresión Anticuerpo de Estadio n^ Régimen¬ Resultado°
significativa* aplicación clínica
95% precursor B 14 QT RC 43% d14
AntiCD19+PAP de novo
14 AB+QT RC 93% d14
CD19 Sin efecto en
94% células B AntiCD19+Ricin de novo 46 AB+QT
EMR
AntiCD19+Genistein Recurrencia 15 AB 2 RC, 2 RP
41% precursor B RC 93%
CD20 Rituximab de novo 19 AB+QT Supervivencia
86% células B
1 año 86%
CD52 66% linaje B y T Campath Recurrencia 5 AB Sin respuesta
* Se considera significativa la expresión del antígeno en más del 20% de los blastos.
^ número de pacientes tratados.
¬ QT: quimioterapia sola, AB+QT: anticuerpo + quimioterapia, AB: anticuerpo solo.
° RC: remisión completa, RP: remisión parcial.
Tomado de Hoelzer 2002.
1.1.8 Polimorfismo enzimático. Mucho se ha estudiado en lo concerniente a la
definición individual del riesgo con base en los hallazgos asociados a la
enfermedad y relacionados con la terapia, pero en los últimos años ha crecido el
interés por entender mejor la respuesta de cada paciente con base en las enzimasmetabólicas tanto en la historia natural de la enfermedad como en las reacciones
adversas y la probabilidad de desarrollar segundas neoplasias. La evidencia ha
demostrado el papel del polimorfismo en la generación de las neoplasias y la
respuesta al tratamiento por el metabolismo diferencial. (Ravindranath 2003)
El análisis de las respuestas individuales a los fármacos por variaciones genéticas
ha ayudado a dilucidar el papel de enzimas como tiopurina metiltransferasa en el
metabolismo de 6-mercaptopurina la cual incrementa la respuesta en
heterocigotos para la mutación y aumenta la toxicidad en homocigotos, además
los homocigotos presentan mayor neurotoxicidad cuando son sometidos a
irradiación. La metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) reduce folato y
homocisteína; su reducción polimórfica incrementa el riesgo de toxicidad por
metotrexato incluyendo mucositis oral, que puede responder a leucovorin. Las
mutaciones de MTHFR 677C>T protege del desarrollo de leucemias, con menor
incidencia de rearreglos MLL y 1298A>C con hiperploidías, aparentemente
mediado por mayor fidelidad en la síntesis de ADN. (Rubnitz 2003) La
comprensión de la toxicidad de medicamentos ha mejorado la supervivencia en
fases de seguimiento reduciendo la neutropenia. (Ziegler 2005)
La glutatión S-transferasa (GST) metaboliza los quimioterapéuticos y su
polimorfismo mejora la respuesta al tratamiento pero también incrementa la
toxicidad; tumores con altos niveles de GST pueden presentar resistencia; en
LMA, pacientes GST-null presentan mayor toxicidad y muerte durante la remisión.
(Rubnitz 2003) También GSTM1 y GSTT se asocian con riesgo incrementado para
LMA/síndrome mielodisplásico, en particular LMA M3, pero ninguno asociado con
incremento del riesgo de LLA. (Ravindranath 2003)
El sistema enzimático CYP450 activa las epipodofilotoxinas e inactiva la
vincristina. La variante alélica CYP3A4*1B reduce el riesgo de toxicidad en LMA,
mientras que CYP1A1 tiene pobre pronóstico en niños con MLH1 Ile219 (variante
de reparador de ADN). CYP2E1*5 y CYP1A1*2A presentan mayor riesgo de LLA
de novo, mientras que CYPA1*4A parece proteger (Ravindranath 2003). Los
polimorfismos de NAD(P)H: quinona oxireductasa (NQO1) que convierte
benzoquinona a compuestos hidroxilo, NQO1*2 y NQO1*3 incrementa la toxicidad
de los bencenos y ciertas drogas quimioterapéuticas como los inhibidores
flavonoides de topoisomerasa II; (Rubnitz 2003) además se correlaciona con el
desarrollo de LMA. (Ravindranath 2003)
Mutaciones en los receptores de las drogas reducen su efecto como es el caso de
la timidilato sintasa, blanco del metotrexato, esto en niños porque en adulto son de
bajo riesgo sumado a mutaciones de serina hidroximetiltransferasa. Los
transportadores de membrana también son importantes incluida la familia de
ligadoras de ATP que incluye las P-glicoproteínas (PGP) y las proteínas asociadas
a multirresistencia de drogas (MRP) que parecen generar resistencia a
quimioterapia, pero su papel real es desconocido. (Rubnitz 2003)1.2 BIOPSIA DE MÉDULA ÓSEA
El estudio citomorfológico de especímenes obtenidos por biopsia ósea se ha
constituido en el estándar diagnóstico de neoplasias hematolinfoides. Gran parte
de los conocimientos actuales de maduración normal de líneas hematológicas ha
surgido por el estudio de leucemias, y de igual manera ha mejorado la
comprensión de las neoplasias facilitando, además, su seguimiento buscando
enfermedad residual. En este aparte se presenta una breve descripción de los
elementos básicos a tener en cuenta en el estudio de médula ósea de un paciente,
prestando especial atención a los patrones normales de maduración, que de su
comprensión depende el poder entender las alteraciones que se expresan con el
desarrollo de las neoplasias.
1.2.1 Morfología y maduración normal de médula ósea. La hematopoyesis es
un proceso continuo que finaliza con la generación de células altamente
especializadas con períodos vitales que varían desde horas, incluso hasta años.
Este proceso se fundamenta sobre una base de células pluripotenciales que se
autorrenuevan, y modifican su velocidad de diferenciación e incrementan ciertas
líneas acorde a las necesidades propias del organismo. Por ejemplo, se produce
generación horaria de 1010 eritrocitos y 4 X 108 leucocitos. (Moore 2001)
El conocimiento acerca de los procesos finos de diferenciación es aún precario, y
se fundamenta en el análisis de la función de ciertos productos génicos,
citoquinas, quimioquinas, factores de crecimiento hematopoyético y
modificaciones microambientales que producen las condiciones necesarias para el
desarrollo de las diferentes poblaciones. (Moore 2001)
En general, se reconocen 3 niveles celulares o compartimentos de diferenciación.
El primero constituido por células pluripotenciales autosostenibles, el segundo por
células progenitoras con grados variados de restricción de linaje y con mínima
capacidad de autorenovación y, el último constituido por células maduras con
actividad mitótica o postmitótica que conforman las poblaciones de granulocitos,
eritrocitos y plaquetas. El equilibrio en la diferenciación de las líneas depende de
la homeostasis corporal y las necesidad transitorias del organismo ante
situaciones de estrés. (Moore 2001)
1.2.1.1 Células Madres Hematopoyéticas. Desde mediados de los años 60 se ha
reconocido gracias a estudios en roedores, la presencia de células con capacidad
de formar colonias hematopoyéticas luego de ablación medular y esplénica. Estas
células en humanos demostraron la presencia de antígenos CD34, y en sangre de
cordón umbilical representan hasta el 2% de la población celular, y presentan
capacidad regenerativa estromal y vascular (expresión de VEGFR). Igualmente,
estas células expresan en escasa cantidad antígenos de maduración terminal, o
también pueden estar ausentes. (Moore 2001)La regulación de las células madre pluripotenciales y su diferenciación está
definida por el interjuego de factores de crecimiento hematopoyético y receptores
celulares. La presencia de determinados factores favorece la diferenciación
ulterior, mientras que la ausencia de receptores conduce a apoptosis. Existe cierta
variedad en la población de células madres en lo referente a la velocidad de
crecimiento y diferenciación, encontrándose células CD34+ CD38- con alta
velocidad de crecimiento y bajo potencial de proliferación, esto presuntamente
definido por división asimétrica con formación de células hijas muy parecidas a la
madre y otras de estado avanzado de maduración. Estos procesos se hallan
regulados por genes maestros de las familias Notch y HOX, demostrando la
conservación ontogénica de los mismos. Los últimos se encuentran ubicados en
los cromosomas 7p14-7p15 (HOXA), 17q21-17q22 (HOXB), 12q12-12q13 (HOXC)
y 2q31-2q37 (HOXD), y tienen relación específica de linaje mielomonocitos
(HOXA), mielomonocitos y eritroides (HOXB) y linfoides (HOXC). Igualmente, se
ha reconocido funciones específicas a determinados genes como incremento de la
producción de IL-3 con incremento de células madre autorrenovadas (HOXB8),
incremento numérico de células madres más de 50 veces (HOXB4) e incremento
de los progenitores y megacariocitos (HOXA10). (Moore 2001)
La capacidad de migración de las células madre CD34 es una capacidad
importante desde el desarrollo in-utero, y en el período posnatal para predecir la
liberación de estos precursores en sangre periférica en donde se encuentran en
proporciones de 40 en 105 células, y se incrementa después del estímulo con
factores de crecimiento hematopoyéticos hasta 1%. El mecanismo de salida y
regreso de los precursores CD34 está regulado por citoquinas que se liberan de
sitios específicos en los cuales los precursores hacen “homing”, y los movimientos
se realizan por modificaciones de la forma citoplásmica (pseudópodos). El homing
se genera por la interacción de proteínas de adhesión celular como L y E-
selectinas, especialmente el VCAM-1. (Moore 2001)
Durante la diferenciación se genera también acortamiento de los telómeros que
está relacionado con el envejecimiento celular y apoptosis, y se observa en las
células CD34 la presencia de telomerasa, sin embargo, en ellos se reconoce
también acortamiento de telómeros que se explica por la incapacidad de la enzima
de mantener la longitud de los tándem. (Moore 2001)
1.2.1.2 Línea mieloide/monocítica. Los precursores se disponen adyacentes a las
trabéculas óseas o alrededor de las arteriolas. Los precursores de la línea
mieloide reconocidos más tempranamente son los mieloblastos, los cuales
maduran por diversos estados (promielocito, mielocito, metamielocito) hasta llegar
a las formas juveniles y maduras en médula que luego son liberados a la
circulación. Las divisiones celulares se producen hasta el estado de mielocito,
pero no en células más maduras. Los mieloblastos son células de 10-20µ de
diámetro, con núcleos grandes redondeados con cromatina finamente dispersa ydos a cinco nucléolos, con citoplasma no granular y basófilo. Los promielocitos
son más grandes que sus precursores y contienen gránulos que tiñen (basófilo,
eosinófilo) y de ahí deriva su nombre (los neutrófilos poseen tinción inespecífica),
cromatinas ligeramente apiñadas y nucléolos prominentes. Los mielocitos poseen
pequeños gránulos con características tincionales similares a sus precursores,
pero sus núcleos son ovales o indentados, excéntricos, con cromatinas apiñadas y
nucléolos indistintos, con mayor cantidad de citoplasma frente a sus precursores
reduciéndose su basofilia por la disminución de RNA citoplásmico. Las formas
juveniles poseen núcleos en forma de C con citoplasma acidófilo y gránulos con
características tincionales. Las formas más maduras presentan segmentación
adicional del núcleo. (Wickramasinghe 1997)
Los estados de maduración de la línea monocítica son monoblastos,
promonocitos, monocitos medulares y monocitos circulantes. Estos últimos
pueden presentar maduración adicional en tejidos periféricos a macrófagos. Los
monoblastos son similares a los mieloblastos con ligera indentación nuclear y poca
cantidad de citoplasma basófilo agranular. Los promonocitos son más grandes que
sus precursores con relación núcleo-citoplasma mayor, citoplasma menos basófilo
y ligeramente granular azurófilo; el núcleo es redondeado, grande, lobulado o
hendido con cromatina en apariencia de red fina con nucléolos variables. Los
monocitos medulares tienen un radio N/C <1, citoplasma menos basófilo y más
gránulos azurófilos que sus precursores. El citoplasma es azul grisáceo de
aspecto vítreo y puede contener vacuolas. El núcleo es excéntrico con su
característica forma arriñonada con cromatina laxa. (Wickramasinghe 1997)
1.2.1.3 Línea eritroide. Los precursores se disponen en una o dos capas que
rodean a uno o dos macrófagos centrales, mientras que los estados más tardíos
de maduración se ubican cerca de sinusoides. La maduración eritroide sigue los
siguientes pasos: pronormoblasto (eritroblasto), normoblasto basófilo, normoblasto
policromatófilo temprano, normoblasto policromatófilo tardío, reticulocito medular y
reticulocito circulante. Sólo los primeros estadios presentan división celular. Los
pronormoblastos son células grandes con diámetros de 12-20µ, núcleo
redondeado y moderadas cantidades de citoplasma agranular que tiñe
intensamente basófilo. La cromatina nuclear tiene apariencia reticular fina con uno
o dos nucléolos prominentes. En el estadio normoblasto basófilo la cromatina se
tiende a condensar dando apariencia granular al núcleo. Los normoblastos
policromatófilos tempranos son más pequeños con menor relación núcleo-
citoplasma; el citoplasma es policromatófilo y agranular y el núcleo contiene
condensaciones de cromatina periféricas. La policromatofilia resulta de la
presencia de RNA (basófilo) y hemoglobina (acidófilo). Posteriormente, se hacen
más pequeños, ortocromáticos, con menor relación N/C y mayor apiñamiento de
cromatina (normoblasto policromatófilo tardío) y luego estrujan su núcleo, el cual
es rápidamente fagocitado (reticulocito medular) (Wickramasinghe 1997)1.2.1.4 Línea megacariocítica. Los precursores se ubican próximos a los
sinusoides y presentan proyecciones citoplásmicas que protruyen hacia el lumen
los cuales descargan plaquetas directamente dentro de la microcirculación. La
mayoría de las células de esta línea son mucho más grandes que las otras líneas
y son poliploides. Los precursores más tempranos reconocibles son los
megacarioblastos. Estos son grandes entre 20-30µ de diámetro y tiene un núcleo
grande lobulado o arriñonado con un citoplasma escaso intensamente basófilo y
agranular; el núcleo contiene muchos nucléolos. Los megacarioblastos
(megacariocitos grupo I) maduran en promegacariocitos (megacariocitos tipo II) y
estos en megacariocitos granulares (megacariocitos grupo III). Los
promegacariocitos son más grandes que sus precursores con mayor volumen de
citoplasma; ellos poseen un núcleo multilobulado arriñonado; el citoplasma es
menos basófilo y presenta gránulos azurófilos que predominan en la concavidad
formada por el núcleo. Los megacariocitos granulares son mayores a 100µ en
diámetro y poseen abundante citoplasma pálido que contiene abundantes
gránulos azurófilos. Los núcleos tienen múltiples lobulaciones y apariencia
apiñada su cromatina. Las plaquetas resultan de la fragmentación de los procesos
citoplásmicos. Estas últimas miden entre 2 y 3 micras en diámetro y son
irregulares, el citoplasma tiñe azul pálido con algunos gránulos azurófilos en el
centro. Cerca del 40% de los megacarioblastos, 20% de los megacariocitos y 2%
de los megacariocitos granulares sintetizan DNA, sin embargo la división celular
no se observa en esta línea celular, de ahí que se observe polipliodía (hasta 64n).
(Wickramasinghe 1997)
1.2.1.5 Línea linfoide B. En secciones de médula ósea teñidos con HE, se
reconocen los precursores linfoplasmocitarios dispuestos en pequeños nódulos
junto con linfocitos pequeños y algunos agregados linfoides. Cerca del 20% de
dichos agregados son irregulares y mal circunscritos mientras que el 80% restante
constituyen verdaderos folículos linfoides y en el 5% se reconocen centros
germinales bien desarrollados. En dichos folículos se identifica incremento de
reticulina. (Wickramasinghe 1997)
Los linfocitos B se originan de células pluripontenciales medulares que maduran a
lo largo de una serie de estadios sin respuesta a antígenos específicos; los
linfocitos T sufren dicho proceso en el timo. Ambas líneas sufren una maduración
final en respuesta al antígeno específico en los folículos linfoides de la médula o
de los ganglios linfáticos o tejido linfoide asociado a mucosas. Los precursores
linfoides son indistinguibles morfológicamente en linajes, y presentan positividad
granular citoplasmática perinuclear con PAS. Las esterasas generan resultados
variables. Los plasmocitos exhiben cambios en la tinción citoplásmica y
granularidad (cuerpos de Russell) y mayor tamaño comparado con los linfocitos;
igualmente, las características nucleares en “rueda de carreta” son específicas.
(Wickramasinghe 1997)1.2.2 Patrones morfocitométricos clínicamente relevantes. El conocimiento del
proceso de maduración de las líneas celulares en médula ósea ha resultado del
estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo usualmente empleado cuando se
sospecha hematopoyesis anormal. Este estudio permite la identificación,
evaluación de frecuencia y caracterización adicional de las líneas celulares. (van
Lochem 2004)
Normalmente, la médula ósea contiene gran cantidad de células de diversas
líneas en variados estados de diferenciación, las cuales pueden ser identificadas
por técnicas de morfología citológica e inmunofenotipo, y su reconocimiento facilita
la comprensión de procesos anormales. La hematopoyesis anormal puede resultar
de diversos procesos entre los que se puede incluir la detención de la
diferenciación del precursor B, la regeneración de la médula ósea después de
terapia inmunosupresora o como respuesta a la infección, la displasia de una ó
más líneas mieloides, el incremento del recambio celular causado por depleción
periférica de células y, la expansión no regulada de células neoplásicas
hematopoyéticas. (van Lochem 2004)
Las alteraciones hematopoyéticas se manifiestan en la médula ósea como
modificaciones significativas de varias líneas celulares o sutiles cambios en sólo
una. En el caso de las células B las lesiones neoplásicas mostrarán precursores
incrementados sin encontrarse formas maduras, y en las reactivas a terapia
inmunosupresora se incrementan las inmaduras pero se halla un buen número de
células maduras. Las neoplasias (LLA, LMA) comprometen la casi totalidad de la
médula y reducen significativamente las otras líneas; además, poseen un fenotipo
anómalo que no es frecuente en médula ósea. (van Lochem 2004)
El uso del citómetro de cuatro colores, los anticuerpos monoclonales, y la
comprensión de la expresión de los antígenos en las diversas líneas y estados de
maduración normal y anómala ha permitido profundizar el estudio de la médula
ósea. Van Lochem y colaboradores desarrollaron un trabajo para definir la
maduración de las líneas que tienen lugar en médula ósea; se excluyen células T
y NK debido a que estas maduran fuera de la médula. (van Lochem 2004)
El trabajo buscaba diseñar un sistema de 6 paneles de anticuerpos que
permitieran el reconocimiento de las células empleando el citómetro de 4 colores.
La selección de los paneles se basa en las propiedades de anticuerpos, antígenos
y fluorocromos. Varios clones del mismo CD reconocen diferentes epítopes o el
mismo epítope con diferente afinidad (CD15 reconoce sialilado y no sialilado) y
CD34 (I, II y III reconocen diferentes epítopes con sensibilidad variable por la
enzima). El background generado por ligandos específicos del receptor Fc se
puede minimizar seleccionando anticuerpos monoclonales específico de subclase
de inmunoglobulina. La mayoría de anticuerpos son asequibles con diferentes
fluorocromos y su selección depende de la expresión del antígeno. Ficoeritrina
(PE) y aloficocianina (APC), por su alta fluorescencia son empleados para marcarantígenos de baja expresión. CD13 y CD19 con SSC son útiles para reconocer
linaje granulocito/monocito y células B. CD45 se expresa diferencialmente en las
líneas celulares: alto en linfocitos y monocitos, y medio en granulocitos,
precursores B, granulocíticos y eritroides; los eritrocitos maduros son negativos.
CD34 marca precursores de todas las líneas. Los antígenos de desarrollo y
diferenciación son útiles en la definición de maduración (CD10/20 linfoides y 13/16
mieloides). (van Lochem 2004)
Diferenciación células B: las células CD19 poseen 4 estados de diferenciación
basado en análisis CD10/CD20 dado por la pérdida del primero y ganancia del
segundo; las células plasmáticas a este nivel son CD10-/CD20- y se emplean
fluorocromos tipo APC y PE. En la subpoblación CD10 brillante el marcador TdT
ofrece mayor información de la maduración al perderse; la demora que presenta la
tinción citoplasmática del TdT se compensa con la mayor información ofrecida. La
expresión CD10+ con TdT- marca los precursores B; la razón
CD10+TdT+/CD10+TdT- puede indicar regeneración medular inducida por drogas.
(van Lochem 2004)
Dentro de las células CD19 se distingue toda la maduración B, observando las
CD10+TdT+ correspondientes con las CD22+CD34+CD45débil, y se incrementa
con la maduración la expresión de CD45 y CD22; las células CD10-CD20+
maduras se corresponden con las CD45fuertesCD22fuertes; se puede observar
una diferenciación adicional CD34+CD22+CD19- de células proB. En niños
menores de 4 años predominan las células CD10+ y en los adultos las células
CD10-CD20+, y en los mayores de 75 años una gran población de CD10-CD20-
plasmáticas; luego de terapia de supresión se incrementan las CD10+TdT+ sobre
las CD10+TdT- y es mayor a medida de la mayor supresión. Las expresiones
aberrantes se corresponden con alteraciones neoplásicas en su mayoría. CD22
puede ser más útil que CD19 para reconocer toda la línea B, aunque su expresión
variable y la expresión en basófilos pueden dificultar su interpretación. Otros
antígenos de maduración B pueden resultar útiles (IgMcyt, IgMs, SIgM). (van
Lochem 2004)
Diferenciación monocítica: para su estudio se debe evitar anticuerpos
monoclonales IgG2a porque se une inespecíficamente a FcRs (CD64). CD13 y
CD33 son antígenos granulocíticos y monocíticos. La discriminación inicial se
logra con CD45 y SSC; mieloblastos, monoblastos, precursores B y eritroblastos
son CD45débiles. CD34 se expresa en todos los precursores y CD13.33 y CD117
en los granulocíticos/monocíticos. CD117 (CD13.33+CD34débil) se expresa en
algunos promielocitos, en poblaciones menores de células B y en altos niveles en
mastocitos. Las células CD34+CD117+CD13.33+CD45débil son mieloblastos y
monoblastos, mientras que las CD34+CD117-CD13.33-CD45débil son precursores
linfoides B. El paso de monoblasto a promocito se evidencia por la pérdida de
CD34 y la ganancia de CD33. Los promonocitos CD34-
CD33fuerteCD45intermedio tienen bajos niveles de CD15. CD45 se gana con laganancia de CD14. HLA-DR está presente en todas las fases de maduración de
los monocitos. Los niveles de subpoblaciones varían con las neoplasias (M5a,
M5b); marcaciones aberrantes asincrónicas como coexpresión de CD11b/CD34,
CD34/CD15, expresión cruzada de CD19, CD2, CD7, e intensidades variables se
correlacionan con el pronóstico. Los niveles de monocitos se pueden incrementar
o desaparecer en Síndromes Mielodisplásicos. CD36 y CD4débil preceden a
CD14 en células CD34+ neoplásicas. CD68 marca el estado final de diferenciación
monocítica (macrófago) que tienen alto FSC y SSC. CD15 puede indicar
diferenciación monocítica temprana en células neoplásicas CD34+ y marca la
maduración de blastos CD34+CD15- a promielocitos CD34-CD15fuerte. (van
Lochem 2004)
Diferenciación granulocítica: los promielocitos son
CD34débilCD117+CD13.33fuerte con SSC alto. CD45/CD13 sumado a la
dispersión de luz es útil para definir poblaciones mieloides. CD13 se expresa en
precursores mieloblastos y monocitos y decae en expresión en mielocitos para
volver a ganar expresión con la segmentación; sumarlo con CD16 y CD11b
permite reconocer 4 estadios de maduración (II-V), aumentando estos últimos en
los 2 estadios finales. Los mielomonoblastos son CD16-CD13+CD11b-
CD45intermedio con SSC intermedio y FSC bajo que corresponden a
CD34+CD117+CD45intermedioCD13.33+. El SSC se incrementa con el paso a
promielocito y aparece CD15. En la maduración subsecuente se gana CD11b
seguido por CD16. En LMC-acelerada se puede observar incremento de basófilos
y eosinófilos. En FSC/SSC los eosinófilos tienen más SSC con menor FSC que los
granulocitos. Expresión de CD16, CD11b y CD13 es menor que los neutrófilos,
siendo CD45 mayor. Los basófilos tienen SSC menor que los otros granulocitos, y
es difícil de diferenciar de los linfocitos y monocitos, aunque CD13 es menor que
en los monocitos y mayor que en los linfocitos con CD45intermedio, también
expresan CD22. La variación en la granulación se puede observar en el SSC.
Incrementos en CD13/CD33 y baja expresión de CD11b y CD16 es una expresión
aberrante de Síndrome Mielodisplásico. CD13/CD33 puede ser expresado hasta
en el 60% de los pacientes con LLA. CD65 es un marcador panmieloide. CD15 no
es mieloide específico y se puede observar con baja expresión en promocitos;
CD66b precede a CD11b como el CD16 y se expresa en (pro) mielocitos. CD16 y
CD11b son una buena pareja para establecer maduración granulocítica, así como
otros antígenos inespecíficos como CD64 o CD35 son útiles para definir
maduración en combinación con CD13 y/o CD33. (van Lochem 2004)
Diferenciación eritroide: la lisis por cloruro de amonio mantiene sólo las células
eritroides nucleadas. Las células eritroides a medida que maduran pierden CD45;
sólo los precursores CD117+CD71+ marcan CD45débil; durante la maduración se
intensifica CD71 y luego se expresa CD235a (glicoforina A); luego, con la pérdida
del núcleo, se pierde CD71. El 50% de las células en MO luego de lisis pueden
corresponder a eritroides incluyendo reticulocitos y son CD45-CD71+CD235a+; las
anemias y SMD pueden alterar el patrón de expresión. (van Lochem 2004)1.2.3 Técnicas moleculares de estudio de médula ósea. Las muestras de
médula ósea han sido empleadas satisfactoriamente para análisis genético por
técnicas moleculares. Metodologías como PCR, PCR anidado, PCR en tiempo
real, RT-PCR, qPCR, FISH, southern blot, western blot, dot blot, por mencionar
sólo algunas, han sido evaluadas y han demostrado utilidad en la detección de
aberraciones génicas y productos de fusión génica presente en enfermedades
hematolinfoides. Dichas estrategias de análisis han sido también evaluadas para
establecer la presencia de Enfermedad Mínima Residual alcanzando en
condiciones óptimas niveles de detección de 1 en 105. Actualmente la metodología
más empleada y de mayor aceptación por gran número de centros es la detección
de rearreglos de IgH en las zonas VDJ y del receptor de células T por técnicas de
RqPCR, detectando rearreglos en el 95% de los casos de LLA. (Cazzaniga 2005)
1.3 ESTUDIO DE SANGRE PERIFÉRICA
La respuesta al tratamiento citotóxico ha sido evaluada por la presencia de
enfermedad residual en muestras de médula ósea. Sin embargo, esta metodología
no es del todo práctica, debida al disconfort que genera en los pacientes la
realización de las aspiraciones óseas. Pocos autores han demostrado interés en
estudios de enfermedad residual en sangre periférica, y sus estudios,
lamentablemente, han carecido de poder estadístico que logre demostrar los
resultados planteados en sus trabajos. Sin embargo, la escasa información ha
señalado que los niveles de detección están 10 veces por debajo de muestras
paralelas de médula ósea. Sin embargo, no se descarta la utilidad potencial del
estudio de EMR en sangre periférica específicamente en 2 situaciones básicas:
LLA-T, cuyo origen es timo y sitios periféricos y la migración es hacia médula, por
lo que la detección de precursores en sangre podría preceder a la detección en
médula, y en los casos de LLA-B, donde podría demostrar la migración de blastos
desde médula ósea, situación que tiene gran interés en remisión temprana, y
conferiría mayor riesgo de enfermedad extramedular. (Constan-Smith 2002,
Goulden 2001) Campana realizó un estudio sobre 747 pares de muestra de
sangre periférica y médula ósea encontrando correlación del 100% en LLA-T,
mientras que en LLA-B sólo 37 muestras de sangre periférica fueron positivas de
104 médulas óseas que demostraron niveles de EMR. Los casos negativos en
médula ósea fueron negativos en sangre periférica también. (Campana 2004)
1.4 MEDICIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL
Los avances en terapéutica dirigida contra riesgo han mejorado las perspectivas
de manejo de la enfermedad. Sin embargo, como ya se mencionó, es fundamental
identificar el comportamiento de la enfermedad a lo largo del tratamiento y
reconocer tempranamente la persistencia de enfermedad residual y modificar
eficazmente el protocolo terapéutica buscando prevenir la recurrencia. Datos
previos han demostrado que los niveles de EMR por debajo de 10-5 no parecentener utilidad clínica al no predecir recurrencia, pero los niveles superiores si
tienen riesgo incrementado con la presencia de recurrencia, correlacionándose
niveles de 10-3 con riesgo de recurrencia a 3 años de 56% y 10-2 con 78%. (Pui
2000) Las técnicas de citometría de flujo (que enumera las células con antígenos
relacionados a leucemia) y de reacción en cadena de la polimerasa (que
determina los rearreglos genéticos específicos del receptor de células T e
inmunoglobulinas) han sido empleadas para este fin, pues logran detectar una
célula entre 104-105 células, siendo significativamente inferior a los límites de
remisión. Cave reportó que niveles de EMR mayores a 1% al final de la inducción
incrementaba en 16 el riesgo de recurrencia que en pacientes sin ese hallazgo;
después de la consolidación el límite de EMR es 0,1%. (Chan 2002)
1.4.1 Definición. Actualmente se consideran curables la mayoría de
enfermedades hematológicas proliferativas con las estrategias terapéuticas,
considerando curación sinónimo de remisión morfológica. Sin embargo, en
muchas de ellas persiste cierto número de células neoplásicas a lo que se ha
denominado enfermedad residual, y esta condición predispone a la presencia de
recurrencias. Muchas veces el nivel de células es indectable por métodos
morfológicos y citoquímicos convencionales, situación conocida como enfermedad
mínima residual (EMR). (Orfao 2000) Este marcador se ha constituido en un factor
de riesgo independiente. (Ziegler 2005, Goulden 2001)
La EMR es definida como medición molecular de la leucemia que es capaz de
detectar células anormales más allá de la capacidad del estudio morfológico. Se
considera que el paciente al momento del diagnóstico puede llegar a tener 1012
células malignas. Se considera en remisión con <5% blastos en el estudio
morfológico de médula ósea, lo que equivale a 1010 células no detectables o EMR
del 1%. Sin embargo, el estudio de EMR puede detectar 1 célula maligna en
10000 células normales o más, lo que cuantitativamente es 100 veces más
sensible que técnicas usuales. (Mandrell 2006, Pui 2000)
En aras de erradicar las células leucemias residuales los pacientes son sometidos
a consolidación, mantenimiento, y/o protocolos de trasplante de médula ósea con
base en la estratificación de riesgo para reducir el sobre o subtratamiento. La
determinación del riesgo y de la respuesta al tratamiento requiere de métodos de
detección muy sensibles que permitan reconocer la menor cantidad de células
persistentes. Este último punto es también útil para el diagnóstico temprano de
pacientes con cáncer hematológico, la evaluación del compromiso de leucemia en
órganos específicos (sangre periférica o médula ósea comprometida en linfomas
no Hodgkin) y el control de la efectividad de la quimioterapia in-vivo o in-vitro para
ser usada después de trasplante autólogo. (Orfao 2000)
Los puntos fundamentales del estudio que lo hacen de alta utilidad son, entre
otros: (Goulden 2001)
1. La definición de riesgo por EMR es más preciso que por clínica.2. Mayor sensibilidad en el establecimiento de grupo de alto riesgo, llegando al
punto que la terapia de intensificación se justificaba en estos niños.
3. La depuración rápida de EMR definió una cohorte más grande de bajo riesgo
que el definido por los métodos previos.
4. El sistema EMR es muy seguro.
1.4.2 Técnicas de medición. Cualquiera sea la metodología para detectar
Enfermedad Mínima Residual debe cumplir con algunos criterios mínimos: (Izraeli
2004)
1. Capacidad de discriminar entre células normales y malignas; y esto es
importante dado que la leucemia se origina de una alteración puntual del
desarrollo de las células normales, de ahí su similitud.
2. Sensibilidad mayor que las técnicas morfológicas microscópicas, es decir
sensibilidad superior a 1 en 103, pero preferible entre 104-106.
3. Cuantificación clara y precisa de EMR.
4. Persistencia de los antígenos tumorales en las células; sin embargo, dada la
inestabilidad de las células tumorales, muchos de los antígenos presentes al
momento del diagnóstico se pierden durante la evolución de la enfermedad, de ahí
que buscar un marcador que se haya perdido puede resultar en falsos negativos.
5. Reproducibilidad de la técnica en el mismo laboratorio y entre laboratorios que
permitan la realización de grandes estudios multicéntricos.
6. Rapidez en la ejecución de la técnica que permita entregar resultados rápidos
para tomar decisiones terapéuticas oportunas.
7. Costo-efectividad.
Se ha desarrollado un número importante de técnicas útiles en la detección de
enfermedad mínima residual, cada una de ellas con ventajas y desventajas, pero
todas claramente útiles en la determinación de la clonalidad de las células que
generan el proceso mórbido, así como la definición del riesgo de recurrencia con
base en los hallazgos de la técnica. Las estrategias actuales de determinación de
enfermedad mínima residual se basan en el establecimiento de características
fenotípicas al diagnóstico que puedan ser útiles para la posterior identificación de
éstas en una población mayor de células normales que no pueden ser
discriminadas por técnicas morfológicas solas. (Orfao 2000)
Con base en las características de la célula explorada, las técnicas de la
enfermedad mínima residual son clasificadas en varios grupos entre los que
sobresalen:
1. Métodos basados en morfología.
2. Técnicas de cultivos celulares.
3. Aproximaciones citogenéticas basadas en cariotipo convencional, técnicas
moleculares, o análisis de cromosomas por citometría de flujo.
4. Análisis de citometría de flujo del contenido total de DNA de la célula.
5. Técnicas de biología molecular.6. Inmunofenotipo empleando múltiples tinciones analizadas por citometría de flujo
y/o microscopía de fluorescencia.
La siguiente tabla compara las características de estás aproximaciones.
Tabla 1.6 Metodologías útiles en detección de Enfermedad Mínima Residual
Especificidad Sensibilidad Simpleza Reproducibilidad Velocidad
Morfología Intermedia Baja Alta Baja Baja
Cultivo celular Alta Baja Baja ¿? Baja
Estudios citogenéticas
Cariotipo
Alta Baja Baja Intermedia Baja
convencional
Cariotipo por flujo ¿? ¿? Baja ¿? Baja
FISH Alta Baja Intermedia Alta Baja
Contenido de DNA
Alta Alta** Alta Alta Alta
por CF *
Inmunofenotipo Alta Alta Alta Alta Alta
Técnicas moleculares
Southern/Northern Alta Baja Baja Alta Baja
PCR Alta Alta Alta Alta Baja
PCR, Reacción en cadena de polimerasa; FISH, Hibridación In Situ Fluorescente; CF, Citometría
de flujo.
* Baja aplicabilidad.
** Si se confirma con marcadores inmunológicos.
Tomado de Orfao 2000.
De la tabla anterior se deduce que el uso de PCR para la detección de secuencias
específicas de DNA que corresponden a los genes de receptores B ó T y regiones
de fusión de translocaciones cromosómicas y la identificación de fenotipos
asociados a leucemia basados en el uso combinado de múltiples tinciones y
citometría de flujo han emergido como las más atractivas (Orfao 2000).
Otros autores consideran valores de utilidad diferentes para las técnicas. Moppett
compara la citometría de flujo de 3 y 4 colores, con el estudio con sondas
específicas de alelos y el rastreo fluorescente de genes asignándole un logaritmo
mayor a la capacidad de detección a la técnica PCR frente al inmunofenotipo con
4 colores y 2 logaritmos con el de 3 colores, y le confiere un índice de aplicabilidad
mayor al 98% a la técnica molecular mientras que a la técnica inmunológica sólo le
da índice mayor al 90%; aunque en precio las técnicas inmunológicas no alcanza
a ser la mitad del valor del estudio molecular. (Moppett 2003) Sin embargo, cada
una de las técnicas tiene sus promotores y contradictores.
En general, se acepta que la Citometría de Flujo detecta perfiles
inmunofenotípicos anormales usando marcadores que no son usuales en los
linajes de médula ósea y sangre y pueden detectar células anormales 1 en 10000.
Este nivel de sensibilidad se obtiene en el 90% de las LLA. Por su lado, PCR
detecta EMR con amplificación del receptor de antígenos o de la fusión detranscritos. El análisis se debe realizar con la muestra al momento del diagnóstico
y establecer las mutaciones del receptor o las modificaciones de las cadenas IgH y
con base en dichas alteraciones hacer los análisis en las muestras de
seguimiento, buscando la misma alteración. Sólo el 40% de LLA tiene rearreglos
conocidos. Hay correlación entre las dos técnicas y son de utilidad marcada en
combinación detectando la casi totalidad de los casos. (Mandrell 2006, Campana
1999) Otra ventaja aparente de la citometría de flujo sobre las técnicas
moleculares, es que la primera puede determinar la viabilidad de las células,
eliminando células muertas o detritus de ácidos nucléicos que pueden dar
positivos con las segundas. Sin embargo, esta característica se pierde si las
células sufren artefactos por la conservación y el transporte y se pueden eliminar
células que son viables in-vivo y no así in-vitro. Además, el análisis PCR
usualmente es dicotómico mientras que el análisis con citometría de flujo requiere
mayor elaboración y experiencia del analista. (Campana 2004)
1.4.3 Periodicidad de la medición. Demostrada la utilidad del estudio de
enfermedad residual en el seguimiento de pacientes con leucemia linfoblástica,
resta por determinar los puntos clave en los cuales resulta más útil hacer las
mediciones.
Campana nos ofrece una primera aproximación de la utilidad del estudio de
Enfermedad Mínima Residual en el manejo de la leucemia aguda como se
muestra en la siguiente tabla.
Tabla 1.7 Calendario de evaluación de médula ósea para detección de EMR
Momento del estudio Objetivo
Medición de la respuesta temprana al
Durante la inducción de la remisión
tratamiento
Finalización de la inducción, temprano Identificación de pacientes en un riesgo
en la continuación más alto de recurrencia
Detección de amenaza de recurrencia
A lo largo del tratamiento Identificación de células leucémicas en
sitios extramedulares (v.g. SNC)
Detección de células leucémicas
Antes del trasplante autólogo de células contaminantes
madre Evaluación de la eficacia de técnicas de
“purga”
Tomado de Campana 1999.
Algunas observaciones han establecido que los análisis de sangre periférica a la
semana y de médula entre la 1-3 semana de tratamiento son indicadores fieles de
pronóstico. Cualquier blasto a las 3 semanas en MO es de mal pronóstico. La
mayoría de los autores concuerdan en afirmar que el punto de corte para
considerar una muestra de médula ósea positiva para enfermedad mínima residuales de 1 célula en 10000 ó 100000. Sin embargo, persiste aún controversia sobre
el momento preciso de mayor costo-efectividad en la predicción de la EMR.
Van Wering hizo su estudio para determinar EMR en pacientes con LLA,
realizando medición de la presencia de blastos en médula ósea para las semanas
5, 14, 24, 34, 46, 59, 72, 84, 94, 102, 116, 130, 143, 157, 168, 181, 195 y 207, con
lo que logró observar disminución de células CD34/TdT frente al incremento de
células CD10/CD19, definiendo las primeras como blastos leucémicos residuales y
los últimos como hematogonias de médula en regeneración. (van Wering 2000)
Kwan realizó su estudio midiendo la presencia de EMR el día 35 del tratamiento, al
final de la inducción, logrando establecer en un pequeño número de pacientes la
presencia de blastos leucémicos y su cuantificación por técnicas de PCR en
tiempo real. Sin embargo, su estudio careció de análisis pronóstico pues no se
hizo seguimiento de dichos pacientes. (Kwan 2000)
Pui correlacionó la detección de niveles de EMR <10-4 en la semana 7
postremisión con mejor pronóstico que la detección de EMR en niveles más altos.
Además, más de la mitad de los pacientes no tuvieron niveles detectables de EMR
en la segunda semana de inducción, y fue detectada en el 25% de los pacientes
(semana 6) y en 13% durante la semana 14 del tratamiento de continuación y sólo
el 4% en la semana 32. Todos los pacientes con EMR en el último punto
recurrieron, mientras que los que fueron positivos en la semana 14 pero negativos
en la 32 tuvieron un riesgo de recurrencia a 3 años de 14%. (Pui 2000)
Rubnitz presenta en su trabajo que detectar EMR a la semana 14 predecía
recurrencia en el 70% de los casos, mientras que la negatividad del estudio en el
día 19 se correlacionaba con recurrencia del 6%. Estos hallazgos fueron
determinados con el uso de citometría de flujo y reacción en cadena de la
polimerasa. (Rubnitz 2003)
Goulden plantea en su trabajo que es de alta utilidad el análisis de muestras de
médula ósea de pacientes en tratamiento para definir enfermedad residual
precisando como puntos de corte a los 7 días del inicio de la terapia, al mes y a los
3 meses, o en cualquier momento durante los primeros 6 meses garantizando 2
mediciones. La no detección de enfermedad mínima residual durante estos lapsos
es altamente predictivo de no recurrencia. Igualmente, precisa que la detección de
EMR antes de trasplante de médula ósea obliga a intensificar la terapia para
minimizar el riesgo de recurrencia luego del trasplante. (Goulden 2001)
Campana demostró en su trabajo que la detección de EMR >0,01% en médula
ósea en la remisión post-inducción se correlaciona con altas tasas de recurrencia,
y si dicha EMR es >1% el pronóstico es especialmente pobre. Igual hallazgo se
observó con niveles de EMR >0,1% en la semana 14 de terapia continua. La EMR
fue detectada con más facilidad al final de la primera inducción (68%) que a lasemana 14 (7%), pero la persistencia de EMR hasta la semana 32 se correlacionó
con pobre pronóstico. (Campana 2002) Un estudio previo del mismo autor había
demostrado que los resultados obtenidos el día 19 son más fidedignos, puesto que
la detección de EMR se correlacionaba con recurrencia en el 28.4% a 3 años,
mientras que en ausencia de EMR en este punto la recurrencia era del orden de
1.9%. (Campana 2004)
Campana en un estudio previo demostró presencia de células tumorales
residuales al final de la inducción (6 semanas) en 23%, número que iba cayendo
con el paso de las semanas alcanzando 17% en la 14, 5% en la 32, 4% en la 52, y
ninguna al final de la terapia en la semana 120. A su vez, la detección de
enfermedad mínima residual se correlacionó con desarrollo de recurrencia en el
32.5% contra 7.5% en el grupo negativo al final de la inducción, y en la semana 14
de 42.2% Vs. 6.6% (Campana 1999)
Estudios subsecuentes de Campana mostraron que encontrar Enfermedad Mínima
Residual en el día 19 de la terapia de inducción, al final de la misma, y en las
semanas 14, 32 y 56, se correlacionaba con tasas más altas de recurrencia,
teniendo pobre pronóstico los niveles de EMR ≥1% al final de la inducción y ≥0.1%
en la semana 14. (Campana 2004) Igualmente, logró concluir que los pacientes
con negativización de EMR en la semana 14 tenían igual riesgo de recurrencia
que los que nunca tuvieron EMR después de completar la terapia de inducción,
mientras que los que persistían con EMR durante la terapia de continuación
incrementaba el riesgo de recurrencia a medida que pasaba del tiempo; de ahí,
que considere que los pacientes con EMR al final de la inducción se benefician de
la medición periódica de EMR. (Campana 2001)
Mandrell en su revisión sobre el tema presenta el resultado de algunos estudios
sobre la utilidad del estudio de EMR. Concuerda en afirmar que EMR >1% al final
de la inducción es indicador de mal pronóstico. Presenta un estudio del Hospital
de St. Jude donde se hace medición de EMR al fin de la terapia de inducción y en
3 momentos durante la terapia de mantenimiento; en éste se encontró correlación
entre EMR con altas tasas de recurrencia; la persistencia de EMR al final de la
inducción predecía recurrencia en el 43% de los casos contra 10% en los niños sin
EMR; el riesgo de recurrencia se incrementaba al 68% si persistía EMR en la
semana 14 contra el 7% de los negativos. A la semana 32 EMR fue altamente
predictiva. Se estableció 1% como el punto de corte de EMR al final de la
inducción. El mismo estudio permitió reconocer que EMR se asocia
frecuentemente a edad desfavorable, cromosoma Ph+, y sensibilidad del blasto a
la quimioterapia. (Mandrell 2006)
Tzortzatou publicó en 2001 un informe del resultado de su investigación donde
plantea de alta utilidad realizar la medición de EMR en el día 22 y cada 2 meses
luego de la remisión usando técnicas de PCR para detectar rearreglos de IgH
alcanzando niveles de detección de hasta 104. (Tzortzatou 2001)Moppett presenta en su revisión la utilidad del análisis del día 29 (final de la
inducción), momento en el cual detectar EMR >0,01% significaba riesgo de
recurrencia en 7 años del 52%. El estudio en la semana 14 mostraba que niveles
de EMR >0,01% implicaba riesgo de recurrencia en 3 años de 42,1% frente al
6,6% de los pacientes sin EMR, en un primer reporte, y en un segundo reporte los
valores se incrementaron a 68% de recurrencia en grupo EMR positivo, y en 10%
en el grupo negativo. También anota que detectar niveles absolutos de >10
blastos/µl en el día 33 y >1 blasto/µl en la semana 12 se asoció con recurrencia
del 100% comparado con el 6% en pacientes con estudio negativo. En relación
con el trasplante de células madre señala que la detección de EMR >10-3 se
correlaciona con recurrencia general, mientras que EMR entre 10-3-10-5 se
relaciona con recurrencia de 27%. Igualmente, anota que gran parte de las
controversias surgidas entre los autores radican en las diferencias propias de las
técnicas y el momento de la realización del estudio; cuando el estudio es realizado
al final de la inducción, diferencias sutiles en la sensibilidad de la prueba (v.g. 10-4
Vs. 10-4.3) pueden significar diferencias porcentuales de detección de pacientes del
40 al 60%. (Moppett 2003)
Sievers publicó en su artículo que la detección de EMR a los 1, 3 y 5 meses en
pacientes con recurrencia fue de 82%, 60% y 42%, respectivamente, mientras que
en los pacientes que no recurrieron se detectaron niveles de EMR en 32%, 10% y
0%, respectivamente. Igualmente, pacientes con niveles de EMR mayores de 1%
al final de la inducción, mayores de 0,1% en la semana 14 son marcadores de alto
riesgo y requieren intensificación de la terapéutica. (Sievers 2000, Izraeli 2004)
Sandlund estudió la utilidad del análisis de EMR en médula ósea en los días 15 y
22-25 de la terapia. Encontró que la persistencia de >1% de linfoblastos en el día
15 tenían menos remisión completa al día 43 (89%) que los pacientes sin esa
condición (99%), y que la presencia del mismo nivel de linfoblastos entre los días
22-25, la remisión completa era del 59%. La supervivencia sin eventos a 5 años en
pacientes con y sin EMR>1% al día 15 fue de 40% y 78%, respectivamente, y en
los días 22-25 fue de 4% y 76%, respectivamente. En conclusión, el riesgo de
recurrencia se consideró entre 3 y 10 veces superior en presencia de EMR a los
días 15 y 22-25, respectivamente. (Sandlund 2002)
zur Stadt analizó una serie de pacientes al final de la inducción para determinar
EMR encontrando niveles de 10-4 en 21% de los pacientes, 10-2-10-3 en 36.8%, y
>10-2 en 26.3%, y el estudio fue negativo en 15.8% de los pacientes. Estos datos
se obtuvieron por técnicas moleculares y se compararon con los resultados
obtenidos por otros autores. (zur Stadt 2001)
Seeger trató de identificar la utilidad del estudio de EMR por técnicas moleculares
en pacientes de alto riesgo quienes presentan el producto de fusión génica TEL-
AML1. Estudió para tal fin muestras de médula ósea al momento del diagnóstico,durante la inducción (días 15 y 33) y antes de la reintensificación (día 148). El
estudio se negativizó en el 35% de los pacientes el día 15, en el 78% después de
la inducción (día 33); sólo el 6% de los pacientes siguieron siendo positivos luego
de la consolidación. Los pacientes que fueron negativos siguieron siendo
negativos por el resto del seguimiento. El papel pronóstico del estudio de EMR en
pacientes de alto riesgo no es tan fundamental como en pacientes de riesgo bajo,
puesto que en los primeros los otros factores que les imprimen alto riesgo son más
ominosos que la misma detección de EMR. (Seeger 2001)
Luego de recaída, detectar EMR es también de importancia pronóstica. En la
segunda remisión al final de la inducción, 46% fueron EMR negativos, mientras
que 54% fueron >0,01%. Se estableció recurrencia de 70,2% en los niños con
EMR en la segunda remisión contra el 18,2% de casos negativos, excluyendo las
recurrencias extramedulares. El riesgo de recurrencia luego de recurrencia-
remisión con EMR fue de 49,1% a 2 años contra 0 en los negativos. En este
estudio se estableció que la recurrencia en sí misma constituye un factor de mal
pronóstico más fuerte que la detección de EMR. Detectar EMR al final de la
segunda remisión es indicativa de trasplante autólogo y EMR negativa al final de la
segunda remisión es de buen pronóstico. (Mandrell 2006)
Pui y Campana han tratado de establecer el concepto de remisión a partir de
EMR, sin embargo, es difícil debido a que no a todos los niños se les realiza el
estudio durante la terapia y que falta por establecer un nivel estándar de EMR.
Antes se había descrito que niños con >1% al final de la inducción ó >0,1%
posteriormente, tenían altísimo riesgo de recurrencia. Otro estudio encontró que
EMR >0,01% al día 19, al final de la inducción, y a las semanas 14, 32 y 56 tenían
alto riesgo de recurrencia, así como niveles >1% postinducción ó >0,1% a la
semana 14 como de pobre resultado. Además, se demostró que en las primeras 2
semanas el 50% de los estudios son EMR negativos, así como el 75% al final de
la inducción; de igual modo, los resultados para las semanas 14 y 32 donde
seguían positivos 13 y 4%, respectivamente. Todos los EMR a la semana 32
recurrieron. Se podría intuir que niveles de EMR <10-4 al completar la inducción
son favorables, mientras que EMR >10-2 tienen alto riesgo de recurrir. (Mandrell
2006)
La detección de Enfermedad Mínima Residual es también de importancia en la
monitorización del trasplante autólogo. Goulden estudió la utilidad del análisis a los
1, 3, 6, 12, 18 y 24 meses luego del trasplante, pero encontró limitaciones pues la
enfermedad fue detectada en el nivel más bajo. En caso de recurrencia, también
se analizó la utilidad del estudio en los primeros 2 meses donde se encontró que
todas las recurrencias habían sido precedidos por al menos un estudio de EMR
positivo. (Goulden 2002)1.5 PAPEL DE LA CITOMETRÍA DE FLUJO EN EL ESTUDIO DE
ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL
La citometría de flujo es una herramienta útil para el estudio de Enfermedad
Mínima Residual pues permite identificar las células neoplásicas entre poblaciones
grandes de médulas óseas en regeneración o postrasplante. En condiciones
óptimas, los niveles de detección son similares a las técnicas moleculares, sin
embargo, en términos reales dichos niveles no son alcanzables puesto que los
volúmenes de células obtenidos por punción de médula ósea son del orden de
106, y se requieren entre 10 y 20 eventos para que la técnica de citometría tenga
capacidad de diferenciar los grupos de eventos adecuadamente, por lo que la
sensibilidad alcanzable es del orden cercano a 105 en los mejores escenarios. Sin
embargo, debido a los cambios sufridos por la población celular por el efecto de la
terapéutica, los niveles de EMR detectables por citometría de flujo se consideran
ligeramente superiores a 104. (Campana 2004)
Las ventajas principales del uso del inmunofenotipo para la detección de
enfermedad mínima residual se resumen en: (Izraeli 2004)
1. Adecuada sensibilidad de la técnica (detección de 1 célula en 104).
2. El análisis se realiza con equipos que ya están siendo usados rutinariamente
para tipificar leucemias.
3. Capacidad de distinción entre células muertas y vivas.
4. Método rápido y relativamente barato.
Algunas de las desventajas anotadas a la técnica incluyen: (Izraeli 2004)
1. El análisis es complejo y depende de la experticia del operador.
2. Es difícil distinguir entre precursores de médula ósea en regeneración de
blastos leucémicos pre-B (el tipo más común de leucemia).
3. El análisis debe ser realizado sobre muestras frescas por lo que se requiere
cercanía entre el centro de tratamiento y el centro de estudio de las muestras.
4. Inestabilidad en la expresión de antígenos en células leucémicas (cambio de
linaje, pérdida de antígenos) durante o posterior al tratamiento.
Sin embargo, ya existen algunas luces para resolver algunas de dichas
desventajas. Para el ítem 2, van Wering en su estudio presenta los resultados del
análisis de múltiples muestras que detectadas por inmunofenotipo y comparadas
con los resultados de estudios moleculares logra identificar las células tumorales
residuales por su expresión aumentada de CD34 y TdT, frente a la expresión baja
de estos antígenos en precursores normales, los cuales son predominantemente
CD10 y CD19. (van Wering 2000)
1.5.1 Descripción de la técnica. La citometría de flujo es una técnica descrita
hace más de 30 años que permite realizar una evaluación cuantitativas de las
propiedades celulares basado en sus propiedades de dispersión de la luz ycaracterísticas fenotípicas que pueden ser determinadas usando marcadores
fluorescentes.
Inicialmente, la técnica fue desarrollada con fines de investigación y los primeros
instrumentos eran muy grandes, costosos y requerían alta especialización por
parte de sus operarios.
Diez años después, hacia el inicio de la década del 80, se introdujo en el
laboratorio clínico la técnica gracias al desarrollo de anticuerpos monoclonales
más baratos, instrumentos más pequeños, asequibles y operables.
La técnica se basa en la determinación del inmunofenotipo celular por medio del
uso de anticuerpos conjugados con fluorocromos específicos para proteínas
expresadas por las células. Para comprender mejor la técnica es útil recordar los
conceptos de antígeno, anticuerpo y su interacción.
1.5.1.1 Anticuerpos. Los anticuerpos pertenecen a la clase de proteínas globulares
conocidas como inmunoglobulinas (Ig). Su estructura básica se compone por dos
cadenas pesadas (55kD) atadas entre sí por puentes disulfuro; a su vez, cada una
de estas cadenas está atada a una cadena ligera (25kD) por medio de puentes
disulfuro. En el humano se han identificado 5 isotipos de Ig (G, M, A, D, E) acorde
a su respectiva cadena pesada (gamma, mu, alpha, delta y épsilon), y pueden ser
individualizadas por análisis electroforético. A su vez, se han identificado 4
subclases de IgG, dos de IgA, y de las restantes uno, que tiene importancia en
investigación, y recientemente su interés se ha incrementado en el estudio de
desórdenes de la respuesta inmune. Las cadenas livianas, denominadas kappa y
lambda, nunca se presentan simultáneamente en la misma inmunoglobulina, pero
sí tienen normalmente expresión policlonal, es decir, se identifican las dos en
moléculas distintas del mismo isotipo de Ig. (Stewart 2000)
Las inmunoglobulinas al ser expuestas a la papaína, se dividen en un fragmento
Fc (cristaliza a 4°C) y dos fragmentos Fab (unión a anticuerpo); si se digiere con
pepsina se produce ruptura a nivel de los puentes disulfuro y se genera un
fragmento con dos fracciones (F(ab’) ) aún unidas y pequeños fragmentos de Fc.
2
(Stewart 2000)
IgG es la gammaglobulina más abundante en el organismo y se encuentra
circulando en plasma. Tiene un peso molecular 154kD y vida media de 23 días;
cuando es clivada por la pepsina genera un fragmento F(ab’) . (Stewart 2000)
2
IgM se encuentra en tejidos y circulando y representa el 5-10% de las Ig. Posee un
peso molecular de 900kD y vida media de 5 días. Su digestión genera cinco
fragmentos F(ab’) . (Stewart 2000)
2
IgA ejerce su función en epitelios mucosos, aunque también se encuentra
circulando. Tiene peso molecular de 160kD y vida media de 6 días. Se constituyecomo un tetrámero o dímero unido a un componente secretorio producido por las
células epiteliales que modifica su función. (Stewart 2000)
IgE se encuentra ligado al receptor Fc de mastocitos y eosinófilos (anticuerpo
reagínico). Pesa 190kD y su vida media es 2-3 días. En mastocitos se encuentra
un receptor Fc de alta afinidad (FcΣR1), y en eosinófilos, algunos linfocitos B y
plaquetas expresan un receptor de afinidad baja (FcΣR2 ó CD23). (Stewart 2000)
IgD es una proteína transmembrana en células B maduras sin mayor componente
circulante y confiere especificidad de antígenos a células B de memoria. Pesa
185kD y su vida media es de 2-3 días. (Stewart 2000)
1.5.1.2 Antígenos. Los anticuerpos en los mamíferos se forman cuando una
sustancia que entran al organismo y cumple con poseer una estructura química
reconocida como extraña al sistema inmune, que dicha estructura sea compleja o
diversa y mayor a 100kD. Estas sustancias son conocidas como inmunógenos.
Las estructuras químicas contra las cuales se generan los anticuerpos son los
antígenos; todos los inmunógenos son antígenos, pero no todos los antígenos son
inmunógenos. (Stewart 2000)
Las pequeñas áreas o estructuras de bajo peso molecular contra las cuales se
dirigen los anticuerpos se denominan epítopes, que en sí mismos son incapaces
de desencadenar la producción de anticuerpos, pero cuando forma parte de
grandes moléculas con múltiples epítopes, si se establece la respuesta inmune.
Existen otras moléculas menos complejas con suficiente tamaño y heterogeneidad
estructural que pueden desencadenar reacciones inmunes que se denominan
haptenos. (Stewart 2000)
1.5.1.3 Reacción antígeno-anticuerpo. Al inmunizar a un animal con un
inmunógeno se producen anticuerpos para cada epítope específicos de clones de
células B que maduran en células plasmáticas con diversa afinidad y capacidad de
producción de múltiples isotipos de Ig y cadenas ligeras variadas, con lo que se
establece una respuesta policlonal. Cada uno de los clones celulares en
expansión responde a un solo isotipo de Ig y una sola cadena ligera (respuesta
monoclonal), y la suma de todas ellas constituye la respuesta policlonal. Estas
células plasmáticas se pueden fusionar con células de mieloma murino generando
híbridos inmortales monoclonales (hibridoma). (Stewart 2000)
Dada la heterogeneidad interespecie e intraespecie de las proteínas, los epítopes
son diferentes y pueden desencadenar respuesta inmune. (Stewart 2000)
Se ha establecido y normalizado un sistema de denominación de los principales
antígenos y anticuerpos de importancia médica que se conoce como CD (cluster
of differentiation) ó grupo de diferenciación. Cada grupo es identificado por unnúmero que describe el anticuerpo dirigido a un antígeno celular, y no a un epítope
en el antígeno. Por ejemplo, CD11a se refiere a todos los anticuerpos que ligan a
cualquiera de los epítopes en la cadena alfa de LFA1. El antígeno es
explícitamente nombrado, y el anticuerpo contra esa proteína es dado el número
CD. La nomenclatura describe el antígeno más que el epítope, puesto que cada
investigador produce su propio anticuerpo contra diferentes epítopes del mismo
antígeno. (Stewart 2000)
1.5.1.4 Inmunofenotipificación. Para el estudio de inmunofenotipo existen
marcadores buenos y malos, y la dificultad radica en escoger los buenos, y saber
cómo interpretar los resultados de los malos cuando no hay otros disponibles. Los
buenos anticuerpos se caracterizan por tener altas especificidad y afinidad de
ligado por sus epítopes. En general, los anticuerpos monoclonales poseen menor
afinidad que los policlonales por su proceso de selección en producción masiva.
Para la producción de anticuerpos policlonales de alta especificidad se requiere
del uso de animales con largos períodos de inmunización y reinmunizados para
lograr la mayor afinidad. (Stewart 2000)
La fijación de anticuerpos se realiza por dos mecanismos básicos: unión por la
región Fab o la fracción Fc. Estos dos mecanismos son saturables a bajas
concentraciones de anticuerpos, así que el incremento en la concentración de éste
conduce a unión inespecífica eléctrica con otros grupos proteicos contra los cuales
no está diseñado. Igualmente, dentro del mismo grupo de receptores, o antígenos,
se presentan diferentes niveles de afinidad con el anticuerpo, y puede que dicha
especificidad sea tan marcada que anticuerpos del mismo isotipo se liguen en
forma diferencial a los receptores (Fc), como es el caso de IgG2, la cual no se une
a FcRI (CD64) como si lo hace IgG1 e IgG3, y en menor medida IgG4. (Stewart
2000)
Las células hematopoyéticas exhiben un repertorio único de receptores Fc, que
permite su diferenciación. Al combinar estas características con la capacidad de
dispersión de luz (side scatter), se logran diferenciar todos los elementos de la
sangre. La siguiente tabla muestra una aproximación a este enfoque.
Los anticuerpos monoclonales son seleccionados por su reacción con el antígeno
(receptor) y no se analiza la capacidad de unión inespecífica a las proteínas de la
superficie celular y del ambiente intracelular. Muchos anticuerpos resultan “malos”
para inmunofenotipificación por esta razón. Sin embargo, los fabricantes han
incrementado su interés por establecer la unión inespecífica y mejorar la afinidad
de los anticuerpos. Existen múltiples pruebas que permiten identificar los
anticuerpos con unión inespecífica pero se escapan al objetivo de ésta revisión.
Basta con concluir, que la experiencia de trabajo es la que permite identificar los
“mejores” anticuerpos. (Stewart 2000)Tabla 1.8 Inmunofenotipo básico de líneas hematológicas normales
FcRI (CD64) FcRII (CD32) FcRIII (CD16) Side scatter
Eritrocitos - - - Baja
Granulocitos
Basófilos ++ ++ 0 Baja
Eosinófilos +/- ++ 0 Alta
Neutrófilos ++ ++ * Alta
Linfocitos
Células B - + - Baja
Células NK + - - Baja
Células T - - - Baja
Monocitos * ++ + Intermedio
Plaquetas - ++ - Intermedio
*Nulo en células en reposo, pero reguladas al aumento en forma variable durante la inflamación.
(Tomado de Stewart 2000)
1.5.1.5 Consideraciones generales de la aplicación clínica del estudio de
inmunofenotipo por Citometría de Flujo. El desarrollo de mejores fluorocromos,
equipos de medición y software analítico, y en general, con una mayor
comprensión del papel del inmunofenotipo en la maduración hematológica, se ha
popularizado el uso de esta técnica en estudios variados para distinguir
condiciones neoplásicas de condiciones benignas, diagnóstico y clasificación de
linfomas y leucemias, evaluación de otros desórdenes neoplásicos y pre-
neoplásicos tales como las discrasias de células plasmáticas y síndromes
mielodisplásicos y detección de enfermedad mínima residual en pacientes con
leucemias aguda y crónica. (Nguyen 2003)
El estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo ha sido reconocido de gran
utilidad por sus altas sensibilidad, especificidad y reproducibilidad, incluso
superando la morfología, que ha permitido el reconocimiento de características
diagnósticas y pronósticas que se escapaban anteriormente por estudios
morfológicos solos. Con base en esta apreciación, actualmente se recomienda la
combinación de múltiples técnicas diagnósticas (morfología, inmunofenotipo y
biología molecular), más que el uso separado de alguno. (Nguyen 2003)
La metodología usual de análisis de poblaciones por citometría de flujo busca
establecer el porcentaje de células positivas que expresan de determinado
antígeno. Para tal fin, se seleccionan las células por dispersión de luz y se
analizan los patrones de fluorescencia por histogramas de uno o múltiples
parámetros (fluorocromos); en el histograma se ubica el cursor para seleccionar
las células que presenten positividad superior al límite del control, establecido por
medición de fluorescencia de un fluorocromo irrelevante, y se reportan los
resultados como positividad de células para cada fluorocromo. Este análisisnumérico puede ser empleado como índice para definir razones poblacionales
(v.g. CD4/CD8). (Nguyen 2003)
A pesar de la utilidad del análisis numérico de positividad de antígenos, en ciertas
ocasiones es difícil determinar el punto de corte en la mayoría de células puesto
que todas tienen diferentes niveles de expresión de antígenos, y resulta más útil
determinar sólo la presencia del antígeno, sin expresarlo numéricamente, puesto
que esa cuantificación puede resultar ambigua. Por tanto, la definición
multiparámetrica (varios fluorocromos) de una población y su cuantificación es
más útil que generar porcentajes de cada antígeno. (Nguyen 2003)
La estrategia de selección (gated) es empleada con alta frecuencia para
establecer clonalidad. Sin embargo, muchas células con características similares
pueden quedar incluidas en el área de selección y modificar los porcentajes de
expresión del grupo celular que realmente representa interés. La estrategia de
selección es útil para determinar clonalidad y coexpresión de otros antígenos en
células B, y caracterizar blastos leucémicos en células CD45. Para lograr estos
propósitos es fundamental contar con herramientas de diagnóstico con al menos 2
colores, que sumado al FSC y SSC son herramientas básicas para determinar
poblaciones. (Nguyen 2003)
El diagnóstico inmunofenotípico debe ser correlacionado con los hallazgos
establecidos por otras técnicas, y de esa forma construir un diagnóstico total que
sirva al clínico en el establecimiento de terapéutica y pronóstico. Igualmente, se
deben eliminar las incongruencias que se puedan presentar entre los diversos
métodos, así como emplear los métodos más costo-efectivos que se realicen en el
menor tiempo posible. (Nguyen 2003)
Otras aplicaciones de la citometría de flujo diferente a su utilidad diagnóstica, es la
utilidad pronóstica en detección de enfermedad mínima residual. Ya se determinó
su capacidad de establecer ploidía por medición de DNA en fase S en LLA, siendo
este índice de alto valor pronóstico. Así mismo, de la mano con las técnicas
moleculares con PCR, constituyen dos estrategias no excluyentes que permiten
lograr niveles de detección de hasta 1 célula anormal en 104-105 células normales.
(Nguyen 2003)
Usualmente se han caracterizado los marcadores celulares empleados
relacionados con líneas hematológicas en las siguientes categorías: células B,
células T, células NK, mieloide/monocítico, eritroide, y antígenos no asociados a
linaje (v.g. antígenos de activación CD38 y HLA-DR). Estos antígenos se
establecieron con base en estudios de diferenciación y maduración, donde se
determinó la presencia de CD34 en precursores, así como la ganancia progresiva
con maduración de CD38 y HLA-DR, en precursores linfoides TdT. (Nguyen 2003)El linaje B inicia con CD22 citoplásmico, el cual es positivo incluso antes que los
rearreglos de inmunoglobulinas, con posterior expresión de CD10 y CD19.
Prosigue con reducción de CD10 y ganancia concomitante de CD20, con posterior
expresión de inmunoglobulina de superficie y silenciamiento de antígenos
inmaduros (CD34 y TdT) en células maduras. Las células circulantes muestran
inmunoglobulina de superficie junto con CD20 y CD22; la diferenciación ulterior se
produce en ganglios linfáticos. (Nguyen 2003)
El linaje T se identifica con CD3 de citoplasma, el cual aparece desde los estados
tímicos más tempranos, así como CD2 y CD7, sufriendo rearreglo del receptor T
durante la maduración (usualmente heterodímeros αβ siendo γδ menos del 5%)
acompañado de expresión de otros antígenos asociados al linaje T (CD4, CD8,
CD5). Las células γδ migran del timo fetal para ubicarse en piel y mucosas, siendo
la mayoría CD4-/CD8-, y sólo la tercera parte CD8+. La determinación de células T
maduras es por la carencia de expresión de antígenos inmaduros (TdT, CD1) y
sobreexpresión de CD3. (Nguyen 2003)
El linaje mieloide es determinado por la identificación de CD13, CD33 y CD117. La
maduración a promielocitos se marca por la pérdida de CD34 y HLA-DR con
expresión de CD15, CD11b y CD16 en estados mielocitos y metamielocitos. CD14
intenso es característico de monocitos, y la intensidad de expresión de CD33 y
CD64 es también característica frente a otras células de la línea mieloide. (Nguyen
2003)
La serie eritroide regula a la baja CD45 y sobreexpresa CD71. La glicoforina es
característica de células menos maduras reconocidas como eritroblastos. (Nguyen
2003)
Ciertos antígenos considerados específicos de linaje pueden ser expresados por
células neoplásicas (CD15 en LLA y CD7 en LMA). De este modo el “marcador de
linaje” debe ser considerado con precaución, además por la expresión compartida
de antígenos (CD11b, CD15 y CD16 no se deben considerar específicos de linaje
mieloide). (Nguyen 2003)
Otros antígenos no específicos de linaje se han considerado de importancia, como
lo es CD56 presente en células NK y neoplasia plasmática, así como en tumores
neuroendocrinos y LMA. Igualmente, las células NK se establecen por el análisis
combinado de antígenos T y “NK” (CD56, CD57 y CD16). (Nguyen 2003)
Aseguramiento de la calidad. Como todos los procesos en el laboratorio clínico,
el estudio de una muestra hematológica por citometría de flujo se compone de
fases pre-analítica (toma y manejo de la muestra), analítica (corrida en el
instrumento) y post-analítica (análisis de datos y entrega de resultado). Si bien,
mantener los instrumentos de medición en condiciones óptimas a través desistemas de aseguramiento de calidad es de importancia capital, se hace
fundamental el manejo adecuado de las muestras desde su toma hasta que son
analizados por los equipos. La toma de la muestra, su adecuada manipulación,
transporte y disposición, generan las condiciones necesarias para garantizar
obtener resultados óptimos en los análisis. Se hace indispensable que los
responsables de los laboratorios de citometría de flujo generen protocolos de
manejos de muestra que sean distribuidos a los sitios donde se originan las
muestras. (Nguyen 2003)
Toma de muestras. La sangre periférica puede ser recogida en EDTA o heparina,
prefiriendo la primera por su mejor preservación morfológica; se recomienda
volumen de 10 mL al menos, y enviar láminas y hemograma para evitar los
artefactos de preservación. La médula ósea se prefiere en EDTA y contar con
láminas e improntas de la biopsia para evaluación morfológica. Algunos métodos
para mejorar la obtención de células han sido descritos para ser realizadas al lado
del paciente y obtener células inmaduras que suelen estar adyacentes a las
trabéculas óseas. (Nguyen 2003)
Los especímenes sólidos son enviados frescos en solución salina fría u otro
preservante vital, y cortados para obtener fragmentos intercalados para las
técnicas diagnósticas que sean necesarias (biología molecular, citometría de flujo,
inmunohistoquímica, entre otras). Se recomienda obtener improntas para
evaluación de morfología citológica y marcación de ser necesaria. (Nguyen 2003)
Procesamiento de muestras. Las muestras son procesadas para eliminar las
células no nucleadas con sustancias lisantes como cloruro de amonio, y las
células restantes se pueden eliminar electrónicamente con anticuerpos específicos
o “gated”. Es importante evitar la excesiva selección puesto que pueden resultar
removidas células claves, como las neoplásicas que no manifiestan las mismas
características de las células normales, y esta pérdida puede resultar crítica ante
bajos conteos. (Nguyen 2003)
La citometría también ayuda a determinar la vitalidad celular por la marcación del
DNA con tinciones tales como yoduro de propidio o 7-amino-actinomicina D que
son afines a células muertas. Otra metodología empleada es exclusión con azul de
tripán. También es útil recordar que las poblaciones heterogéneas donde las
células neoplásicas constituyen grupos celulares grandes susceptibles a daño por
el procesamiento, lavados y centrifugación, y que los tejidos suelen presentar
menor viabilidad que los líquidos, sin embargo, no existe un umbral de viabilidad
para establecer cuales muestran resultarán útiles para estudio en citometría de
flujo. (Nguyen 2003)
Las muestras deben ser procesadas tan pronto como la lisis ha sido completada.
Demoras en este procesamiento inducirán modificación de la viabilidad celular y
en el resultado de la prueba. La tinción se realiza con fluorocromos estándarescomercialmente asequibles, bajo rutinas de procedimiento normalizadas que
permiten garantizar la adecuada interacción de los antígenos con los anticuerpos.
La metodología para antígenos de superficie es más sencilla que la necesaria para
anticuerpos intracelulares, esta última requiriendo fijación y permeación celular, y
a la vez que evite la agregación de la muestra. Cuando se requiere tinción de
superficie e intracelular, primero se tiñe superficie, luego se fija y se tiñe
internamente. Se prefiere emplear fluorocromos de tamaño pequeño para las
tinciones intracelulares como el FITC. (Nguyen 2003)
La marcación de DNA es una técnica empleada con frecuencia por ciertos
laboratorios en casos de linfomas y leucemias agudas, junto con otros antígenos
intracelulares o de superficie útiles para seleccionar las células a estudiar, o
simplemente con propiedades de dispersión de luz. La tinción se realiza en células
frescas tan pronto como se concluya la lisis para evitar la lesión de DNA, que en
últimas modificaría la relación estequiométrica con el fluorocromo. El estudio sobre
material fijado incrementa falsamente los índices de DNA. El yoduro de propidio,
por su capacidad de intercalarse con el DNA es el fluorocromo de elección para la
metodología. Se puede preservar bien el material en etanol, con lo que pierde sus
características de tinción superficial, o en paraformaldehído, con lo que puede
formar puentes cruzados que incrementan el CV de las muestras. Igualmente, se
puede establecer los puntos de corte de picos modales de índices de DNA
corriendo muestras patrón. (Nguyen 2003)
Control de calidad. Periódicamente se debe realizar calibración de los equipos
con ajustes de color usando fluorocromos de importancia que sean mutuamente
excluyentes (CD4, CD8, CD20 en FITC, PE y PerCP) para determinar la ganancia
necesaria que debe presentar los tubos fotomultiplicadores. Cuando se corren las
muestras, existen varias aproximaciones de adquisición; una es ingresar todos los
eventos sin eliminar ni detritus ni células no viables y completar conteos altos
(entre 30 y 70 mil), también se puede ingresar eventos que cumplan ciertas
características definidas como “gated” y completar conteos menores en esos
grupos, garantizando así un número suficiente de células para análisis. Luego de
este proceso, se puede eliminar por selección los eventos carentes de
importancia. (Nguyen 2003)
Diseño de paneles. Los anticuerpos a utilizar deben ser seleccionados con base
en una exhaustiva búsqueda tratando de obtener el mejor desempeño de las
combinaciones de colores, así como la selección de fluorocromos como
policlonales frente a monoclonales. Es importante recordar que, dada la
variabilidad de ciertos antígenos, es recomendable usar anticuerpos policlonales
no selectivos de cadena ligera, a menos que sea ella la que se quiere determinar.
Por ejemplo, para determinar población B se recomienda emplear combinaciones
de coloraciones que incluyan gamma-FITC/CD19-PE, lambda-FITC/CD19PE,
gamma-FITC/CD20PE, lambda-FITC/CD20-PE, más que las populares
combinaciones kappa-FITC/lambda-PE. (Nguyen 2003)La selección de paneles de anticuerpos busca maximizar la información obtenida
de corridas simples, encontrando información adicional concerniente con líneas de
diferenciación, y en general la ganancia y pérdida de expresión de los antígenos
de interés. Igualmente, es importante definir el tipo de fluorocromo concerniente a
los niveles de emisión de luz para evitar el silenciamiento que pueda resultar de la
interacción de diferentes fluorocromos que emitan en la misma longitud de onda.
Algunos autores prefieren usar fluorocromos simples (FITC, PE, APC y PerCP)
más que constructos más complejos (PE-Texas Red ó PE-Cy5). Sin embargo, se
recomienda contar con más de un fluorocromo para determinados antígenos de
importancia para aprovechar la capacidad de detección de múltiples colores y
mejorar la discriminación. (Nguyen 2003)
Al diseñar los paneles se busca alcanzar diversos objetivos que incluyen
determinar el linaje de las células de interés, su estado de maduración, la
clonalidad (si existe), el subtipo específico de alteración hematopoyética y el
estado de los elementos normales. Los paneles se diseñan tratando de interpretar
las enfermedades o acorde al tejido de origen, generándose así paneles estándar
que se aplican a todas las muestras acorde al enfoque que se les dé. Una
aproximación más lógica establece que se deben examinar morfológicamente las
lesiones y aproximarse al diagnóstico, y orientar la marcación con el diagnóstico
probable. Otra aproximación es generar pequeños paneles de determinados
anticuerpos que buscan reconocer determinadas características que presenta la
población celular. Los resultados son presentados como gráficos de puntos donde
se ubican los eventos en dos ejes, y se realiza una valoración numérica de la
fluorescencia en escala simple o logarítmica, prefiriéndose la última al normalizar
los comportamientos de las poblaciones. (Nguyen 2003)
Estrategia de análisis. El estudio de Enfermedad Mínima Residual busca
establecer la presencia de células neoplásicas sobre un fondo de células
normales, luego la técnica debe ser altamente sensible y específica. Una de las
necesidades del estudio es establecer las características fenotípicas al momento
del diagnóstico para hacer seguimiento a dichas características. Contando con
dichas características, se puede hacer una adquisición piloto con 10 a 15 mil
eventos y seleccionar dos ventanas: una que identifique las características
fenotípicas del diagnóstico, y la otra que evidencia las características de
dispersión de luz de las células anormales. Con esta información seleccionada en
el citómetro, se adquiere entre 300 y 500 mil eventos guardando la información de
los eventos que cumplan con esas características. (Campana 1999)
Limitaciones y posibles fuentes de error. El estudio de inmunofenotipo plantea
limitaciones dado el proceso manual que se requiere para preparar las células que
van a ser analizadas por el citómetro. Dichos artefactos pueden inducir tanto
falsos positivos como falsos negativos. La siguiente tabla resume algunos de
dichos artefactos y la forma de evitarlos.Tabla 1.9 Problemas comunes de la citometría de flujo
Problema Resultado Prevención/solución
Contaminación de la Falso Marcación y manejo cuidadoso de la
muestra positivo muestra
Filtración rutinaria y monitorización de la
Impurezas en buffer de
Falso pureza de los buffer
lavado y sistemas de
positivo Limpieza de los sistemas de flujo del
flujos
citómetro
Saturación de receptores Fc
Titulación cuidadosa de los anticuerpos
Ligado inespecífico de Falso Uso de anticuerpos de control específicos
anticuerpos positivo de isotipo
Uso de anticuerpos en la forma de
fragmentos F(ab´) (no es esencial)
2
Almacenaje ordenado y lógico de los
anticuerpos
Contaminación o mala Falsos
Marcación clara de los tubos de muestras
colocación del positivo o
Uso de cócteles de anticuerpos
anticuerpo negativo
premezclados
Entorno de trabajo sin distracciones
Cambios en el lote del Análisis frecuente de muestras normales
Falsos
anticuerpo y/o
positivo o Pruebas periódicas de configuración del
inestabilidad del
negativo equipo
instrumento
Muestras de sitios Biopsia de médula ósea de varios sitios*
negativos (distribución Falso
heterogénea de negativo Estudios de sangre periférica*
leucemia)
Cambios Falso Uso de múltiples combinaciones de
inmunofenotípicos negativo anticuerpo
* Estudios no evaluados formalmente.
Tomado de Campana 1999.
1.5.2 Detección inmunofenotípica de Enfermedad Mínima Residual. Existe un
especial interés en el estudio de EMR por citometría de flujo dada su velocidad y
simplicidad, y la combinación de múltiples antígenos en citometría que ha
incrementado la sensibilidad y reproducibilidad del método permitiendo analizar
simultáneamente varios parámetros con base en una sola célula, evaluar
cuantitativamente la expresión de antígenos, permitir el estudio y almacenamiento
de información de un mayor número de células dentro de un corto período de
tiempo y, combinar la detección de antígenos de superficie e intracelulares. En
contraposición, los principales dos defectos de la técnica son que, contadas
excepciones, las células leucémicas no muestran antígenos específicos lo que
podría afectar su especificidad y aplicabilidad y que, varios grupos han reportadola existencia de cambios fenotípicos en la recurrencia que podrían impedir el uso
de inmunofenotipo para la detección de EMR debido a la existencia de una
proporción incrementada de resultados falsos negativos. El primer punto cuestiona
la existencia de fenotipos específicos de leucemia, mientras que el segundo
plantea la necesidad de establecer características fenotípicas anormales que
permanezcan sin cambios durante el seguimiento. (Orfao 2000)
Los parámetros biológicos (inmunofenotipo, ploidía, anormalidades cromosómicas
y rearreglo de genes) y parámetros clínicos (edad, conteo de blancos) son usados
para predecir comportamiento pero no son exactos, existiendo pacientes de buen
riesgo que recurren y otros que se someten a tratamientos muy tóxicos
innecesariamente. La variabilidad existente responde a la farmacocinética y
farmacogenética que modifica el resultado, además de la susceptibilidad de las
células tumorales al tratamiento. Así, el estudio de EMR en médula durante el
tratamiento es útil para modular la terapia, y para predecir el riesgo de recurrencia.
(Campana 2002)
La citometría de flujo es el mejor método inmunofenotípico para detectar EMR,
además permite establecer otros parámetros como tamaño, granularidad e
intensidad de expresión, sumado a la velocidad de la adquisición de células, la
posibilidad de seleccionar células para FISH, o la medición de DNA son útiles para
estudiar EMR. Los citómetros con doble láser (FACSCalibur) están equipados con
láser argón a 488nM (FITC 495nM, PE 480/565nM, PerCP 488nM) y 655nM diodo
rojo (APC 650nM). Los analizadores de 1 láser, 3 colores, son menos eficientes;
los nuevos citómetros equipados con láser UV-tinciones tal como Hoechst 33342,
DAPI e Indo-1, pueden mejorar la capacidad de detección de EMR. (Campana
2002)
La habilidad de detección depende de la diferenciación fenotípica y morfológica
entre las células blanco y las normales, y el número de células analizadas.
Adquiriendo 10000000 de células la sensibilidad de la técnica es similar al PCR,
sin embargo las condiciones de estudio no son ideales y sólo se logra tener
adquisiciones con 100000 o menos células logrando límites de detección máximos
de 1 en 100000. Los estudios han demostrado detectar hasta 3 células en 100000,
con concentraciones mayores la prueba puede presentar mayores variaciones,
pero siempre detectará células neoplásicas. Es fundamental contar con el fenotipo
de la leucemia para poder determinar EMR, puesto que lo contrario llevaría a la
necesidad de usar múltiples antígenos para establecer el fenotipo residual
resultando muy caro. El uso del método de separación de mononucleares de Ficoll
mejora la sensibilidad al reducir el background inducido por PMN y plaquetas. El
estudio se realiza usando los fluorocromos FITC, PE, PerCP y APC, bien sea
manteniendo un marcador en cada tubo o empleando combinaciones de antígenos
positivos con negativos (células T CD3/TdT CD33/HLA-DR/CD19). Se recomienda
realizar un análisis a 10000 células y luego seleccionar sólo células que presentenel fenotipo esperado para reducir el tamaño de los archivos electrónicos.
(Campana 2004, Campana 2002)
La capacidad de detección de CF es 10000, útil en la mayoría de estudios, pero en
ocasiones se desearía mayor definición; además, los marcadores con los que se
hace seguimiento pueden variar con el tiempo generando falsos negativos,
igualmente, cuando la enfermedad se manifiesta en parches o luego de terapia se
requiere de límites de detección superiores. (Campana 2002)
La utilidad de CF en EMR se basa en la precisión por medición directa, mientras
que PCR requiere análisis indirecto de la amplificación, además pudiendo discernir
tamaño y granularidad celular logrando separar células viables de dañadas por
quimioterapia. (Campana 2002)
Se requiere evitar al máximo los artefactos que pueden surgir del buffer, del
transporte, errores de pipeteo, contaminaciones, etc. (Campana 2002)
Consideremos ahora los linajes celulares. El estudio de células T se basa en
encontrar fenotipos tímicos fuera de esa localización (CD3/TdT, CD5/TdT). Los
precursores B (hematogonias) son abundantes en pacientes jóvenes, luego de
quimioterapia o trasplante y se pueden observar en sangre periférica. El objetivo
es encontrar fenotipos tumorales ausentes en células normales; en neoplasias con
alteraciones conocidas como BCR-ABL, E2A-PBX1, MLL-AF4 y TEL-AML1 es
lógico buscar anticuerpos contra receptores que representen dichas alteraciones,
sin embargo, no es fácil el desarrollo de dichas sustancias. (Campana 1999) El
anticuerpo 7.1 reconoce células con alteración 11q23, ausente en células
normales y está relacionado con leucemias de fenotipo proB (CD10 negativas);
igualmente hubo gran interés por el marcador KOR-SA3544 que mostraba
marcación para células con rearreglos de BCR-ABL y sumado a otros antígenos
linfoides específicos resultaba de interés en el estudio de EMR, sin embargo su
uso ha decaído significativamente en los últimos años. (Campana 1999)
Otros antígenos aberrantes son observados. CD66c marca hasta 1/3 de las
células neoplásicas B, ausente en las normales. CD21 se puede observar en
células neoplásicas CD34+CD19+ lo cual no se expresa en progenitores
normales. CD19, 10 y 34 se pueden sobreexpresar en casos de leucemia y CD45
y CD38 pueden reducirse. Expresión aberrante de CD45RA, CD11a y CD44 se ha
mencionado. El estudio por DNAc de arreglos de oligonucleótidos ha permitido
establecer la presencia de moléculas que se sobreexpresan identificando 7
proteínas (CD58, creatinkinasa B, ninjurina 1, Ref1, calpastatin, HDJ-2, annexina
VI) que se expresan más en células tumorales que en células normales; CD58 se
sobreexpresa también en MO con EMR y se correlaciona su análisis por CF y
amplificación de rearreglos por PCR, aumentando la sensibilidad del estudio.
(Campana 2004, Campana 2002, Campana 1999, Chen 2001)La combinación de anticuerpos para leucemia T comprende uso de TdT nuclear,
CD3 ó CD5 citoplasmático o membrana, cuando es negativo TdT se puede usar
CD34, y la presencia de CD19/CD33/HLA-DR se usa como exclusión. (Campana
1999)
En neoplasias B la expresión de CD19/CD10/CD34/TdT que logra detectar entre
30-50% de la EMR, como otros antígenos CD38, CD45, CD22 y el recientemente
identificado CD58. Las diferencias cualitativas se pueden establecer con antígenos
mieloides, NK o antígenos maduros B; dos adicionales son CD66c y anticuerpo
7.1 (NG2); el 90% de los casos se puede estudiar con niveles de detección 10000.
(Campana 2004, Campana 2002, Campana 1999)
La acción concertada europea BIOMED-I propuso en el 2001 la utilización
protocolaria de 5 paneles de triple tinción constituidos por TdT/CD10/CD19,
CD10/CD20/CD19, CD34/CD38/CD19, CD34/CD22/CD19 y CD19/CD34/CD45
con los cuales se logra identificar fenotipos aberrantes en el 98% de los casos de
leucemia linfoblástica B, a través de la identificación de células que ocupan los
espacios vacíos que surgen del conocimiento de la vía normal de maduración
obtenido de la comparación de 2 fluorocromos en los ejes x/y. La identificación de
dichas aberraciones es de utilidad en la determinación posterior de EMR. (Lucio
2001) Bajo igual metodología se propusieron los paneles CD7/CD5/CD3,
CD7/CD4/CD8, CD7/CD2/CD3, CD7/CD38/CD34 y TdT/CD7/CD3 citoplásmico o
de superficie para identificar las aberrancias en leucemia de linaje T logrando
identificar más del 91% de los pacientes. (Porwit-MacDonald 2000)
1.5.3 Fenotipos asociados a leucemia. Sólo unos pocos antígenos específicos
de leucemia han sido identificados resultados de la fusión de genes como el
bcr/abl. Reactivos que permitan identificar sin posibilidad de error todos los casos
aún no son asequibles. Sin embargo, en años recientes se han realizado estudios
comparativos entre las características fenotípicas de individuos sanos y pacientes
con leucemia con lo que se evidenció la existencia de múltiples aberraciones
antigénicas en estos últimos. Los fenotipos que no se identifican en
hematopoyesis normal bien sea por bajo conteo o inexistencia, se consideran
asociados a leucemia. Esos fenotipos aberrantes usualmente resultan de
expresión cruzada de antígenos (antígenos de otro linaje), expresión asincrónica
de antígenos (coexpresión de antígenos de diversos estados de maduración) o,
sobreexpresión de antígenos (expresión exagerada de un antígeno). La detección
de estas alteraciones es obligatoria al diagnóstico para orientar la búsqueda de
Enfermedad Mínima Residual al establecerse la remisión morfológica. (Orfao
2000)
Existen otras situaciones en las cuales se puede determinar la presencia de
Enfermedad Mínima Residual como la detección ectópica de ciertos fenotipos
restringidos a tejidos, la existencia de patrones anormales de dispersión de luz y,la existencia de una proporción aumentada de células inmaduras con patrones de
maduración anormales. (Orfao 2000)
La aplicabilidad del inmunofenotipo en la detección de Enfermedad Mínima
Residual se fundamenta no sólo en la existencia de fenotipos anormales, sino en
la frecuencia de éstos en una muestra biológica. En la literatura existe distribución
de niveles de variabilidad en la incidencia de fenotipos asociados a leucemia. Esas
discrepancias obedecen a fallas técnicas tales como el uso de diferentes
conjugados de fluorocromos, clones de anticuerpos monoclonales, combinaciones
de reactivos de múltiples tinciones, también como diferentes protocolos de
preparación de muestras y diferentes muestras control. En general, a pesar de las
diferencias, se ha demostrado una mejor discriminación de células por la técnica
de citometría de flujo, y se ha mejorado el acceso a la técnica para el uso clínico.
(Orfao 2000)
La incidencia de fenotipos asociados a leucemia varía en cada uno de los subtipos
de enfermedad, pero en general es de alta frecuencia que muestra utilidad
diagnóstica. Una aproximación a estas proporciones se muestra en la tabla.
Tabla 1.10 Aberraciones fenotípicas de mayor utilidad en detección de EMR
Tipo de aberración LLA-B LLA-T LMA (%) LLC-B MM (%)
(%) (%) (%)
Expresión cruzada de
75 60 27 - -
antígenos
Expresión asincrónica de
39 38 80 86 49
antígenos
Sobreexpresión de
35 - 9 32 74
antígenos
Fenotipos ectópicos - 70 30 - -
Dispersión anormal de luz - - 28 - 60
Total (al menos una
85 100 88 95 87
aberración)
LLA, Leucemia Linfoblástica Aguda; LMA, Leucemia Mieloide Aguda; LLC, Leucemia Linfocítica
Crónica; MM, Mieloma Múltiple
Tomado de Orfao 2000
1.5.3.1 Expresión cruzada de antígenos. La presencia de varios antígenos
leucocitarios ha sido asociada con líneas hematopoyéticas celulares específicas
que pueden estar presentes o ausentes con muy bajas frecuencias y/o
intensidades en otras células. Desde los primeros diseños de paneles de
anticuerpos conjugados con fluorocromos, hace mucho tiempo, se demostró la
expresión de antígenos leucocitarios en células tumorales de líneas no
relacionadas. El conocimiento actual ha demostrado la expresión de antígenos
mieloides CD13 y CD33 en linfocitos B CD19, que puede ser normal, pero a
niveles muy bajos (<10-3). El estudio de estos antígenos en células leucémicas hademostrado variabilidad; en el caso de las leucemias linfoblásticas se ha
detectado presencia de CD13 y CD33 con proporción de 7-54%, y en el caso de
las leucemias mieloides la presencia de CD7 entre 4-60%. Esta variabilidad puede
estar relacionada con modificaciones de la técnica entre los investigadores.
Estudios recientes han demostrado la presencia de estos antígenos, usando
fluorocromos de alta sensibilidad, en LLA-B (63%) y LLA-T (56%), coexpresando
CD13 y CD33, hallazgo que se mantenía en las muestras recolectadas luego de la
remisión morfológica en células tumorales residuales. (Orfao 2000)
En los trastornos linfoproliferativos crónicos la correlación con antígenos
aberrantes es menor, pero en casos de LLC-B se ha determinado la presencia de
CD14, CD13 y CD15 en proporciones entre 15-23%, y en casos de mieloma
múltiple las células tumorales expresan CD13 (28%) y CD33 (24%). (Orfao 2000)
Otros antígenos útiles son CD65, CD66c, CD21 que sumados a CD19/CD34/CD10
ofrecen aplicabilidad en detección del orden de 4%, 31% y 6%, respectivamente.
(Campana 2004)
1.5.3.2 Expresión asincrónica de antígenos. En la maduración hematopoyética
normal, la expresión de antígenos está finamente regulada de tal forma que la
expresión de antígenos está precedida por la regulación a la baja de otros, con lo
que determinados antígenos se hacen específicos de cada estado de maduración.
Igualmente, la secuencia de expresión y silenciamiento de antígenos está
establecida para cada línea celular. El estudio con múltiples marcadores
antigénicos de específicos de diferentes estadios de diferenciación, permitió
establecer que las células leucémicas expresan antígenos asincrónicamente. Para
reconocer estos patrones es esencial el conocimiento de la secuencia de
expresión de antígenos durante la diferenciación normal y el uso de marcadores
de alta sensibilidad. Estudios previos habían demostrado la coexpresión anormal
de CD34 y CD22 en linfocitos B, puesto que este último se expresa tarde en la
maduración; sin embargo, estudios recientes con marcadores más sensibles ha
demostrado la coexpresión en células tempranas CD34/CD19, de CD22 de
superficie. (Orfao 2000)
La expresión asincrónica de antígenos es uno de los fenotipos aberrantes
asociados a leucemia más comúnmente detectado encontrándose hasta el 80%
en LMA y 30% en LLA, también en LLC (85%) y mieloma múltiple (62%). (Orfao
2000)
1.5.3.3 Sobreexpresión de antígenos. Es un hallazgo poco común la presencia de
antígenos, que aunque presentes en células normales, se expresan en niveles
inusitadamente altos, fenómeno conocido como sobreexpresión de antígenos. El
ejemplo más claro de este fenómeno es en LLA-B con CD10 reportado hasta en el
39% de los casos. Otros antígenos han sido también reconocidos en
sobreexpresión como son CD34 en LLA (5%), y en LMA CD34 (2%), HLA-DR(2%), CD33 (2%), y CD117 (1%). En general la sobreexpresión de antígenos se
manifiesta en el 35% de las LLA-B y en el 10% de las LMA. En mieloma múltiple
se ha reportado sobreexpresión de CD56 (62%) y CD28 (16%). En LLC no se ha
reconocido tan claro el fenómeno, encontrando sólo el 1% de sobreexpresión de
CD5, pero de escasa utilidad en EMR puesto que las células normales también
pueden sobreexpresar este antígeno. (Orfao 2000)
1.5.3.4 Fenotipos ectópicos. La presencia de células hematopoyéticas inmaduras
fuera de la médula ósea se considera indicativo de leucemia. Esta observación ha
sido útil en el estudio de recurrencia en sistema nervioso central al buscar en LLA
células TdT+ en muestras de LCR. Igualmente, la detección de células inmaduras
tímicas en médula ósea es indicativa de EMR de LLA-T (90%). De manera similar,
la presencia en sangre periférica de células B CD10+ ó CD22 débiles representa
fenotipos ectópicos en LLC. (Orfao 2000)
1.5.3.5 Patrones anormales de dispersión de luz. La Citometría de Flujo es una
técnica que combina las propiedades de medición de fluorescencia y de dispersión
de luz. Esta propiedad se establece en ángulos bajos (dispersión de luz frontal ó
FSC) y ángulos de 90° (dispersión de luz lateral). La primera, FSC, se correlaciona
con el tamaño e índice de refractariedad, y la segunda, SSC, con la
homogeneidad relativa de los componentes celulares que reflejan la luz láser tales
como gránulos citoplásmicos y membranas celulares. Junto con los cambios
fenotípicos, también existe un SSC/FSC específico de cada estado de
maduración. Se ha reportado que las células leucémicas y de mieloma múltiple
muestran patrones de dispersión de luz alterada que puede ser útil para
identificarlas. Sin embargo, no existen estudios que hayan demostrado con poder
estadístico el valor de esta alteración excepto en LMA (32%). (Orfao 2000)
1.5.3.6 Vías anormales de maduración. La citometría de flujo de multiparámetros
crea un espacio multidimensional en que las células normales muestran una
posición estable. En médula ósea se genera una vía de maduración en la cual se
mueven las células en diferentes estadios. Con presencia de células leucémicas
en médula se presenta una alteración en esta vía de maduración con presencia de
células en áreas “vacías” o incremento de celularidad en un estadio. Este punto se
relaciona con el hallazgo de EMR en LMA en casos de incremento en la razón
precursores CD34 mieloides/linfoides. (Orfao 2000)
1.5.4 Cambios fenotípicos. Acorde a lo expuesto, la detección de EMR se
relaciona con la determinación de fenotipos anormales en muestra de médula
ósea en remisión morfológica detectados al diagnóstico, pero estos suelen
cambiar. Sin embargo, la mayoría de estos cambios se relacionan con antígenos
asociados a diferenciación, mientras que los fenotipos aberrantes cambian con
menor frecuencia (LMA 16% y LLA 18%). Se ha detectado en estudios previos que
al presentarse aberraciones fenotípicas, al menos una de ellas permanecerá sin
cambios, por lo que todas las aberraciones detectadas al diagnóstico deben serestudiadas para determinar EMR, evitando de esta forma los falsos negativos.
(Orfao 2000) En el momento del diagnóstico, pueden existir diversas
modificaciones fenotípicas en grupos minoritarios, los cuales han demostrado ser
responsables de la recurrencia y de ese modo mostrar los cambios fenotípicos
cuando no se han tenido en cuenta los fenotipos minoritarios. La presencia de
variados fenotipos se ha demostrado en LMA (80%), LLA-T (41%), LLA-B (24%), y
en menor proporción en LLC. Además, un tercio de las alteraciones fenotípicas en
LLA estuvieron relacionadas con variaciones técnicas y de reactivos, al
diagnóstico y posteriormente. Por tanto, al elegir el fenotipo de seguimiento es
fundamental no sólo tener en cuenta el clon predominante, sino las
subpoblaciones relacionadas. (Orfao 2000, Campana 1999) Por otra parte, ciertos
cambios fenotípicos no pueden ser detectados por métodos inmunocitométricos en
el estudio de enfermedad residual ni pueden ser predecidos al momento del
diagnóstico. Esta limitación puede ser superada por métodos moleculares de
detección de rearreglos de IgH por PCR que pueden predecir precozmente la
aparición de recurrencias. (Campana 1999)
1.5.5 Sensibilidad del inmunofenotipo por citometría para la detección de
Enfermedad Mínima Residual. Ya se reconoce la utilidad en investigación de la
citometría de flujo para la detección de EMR, pero se requiere definir su utilidad
clínica donde los niveles de células anormales son inferiores al orden de 10-3,
entre poblaciones de células normales. Ya la citometría había demostrado su
utilidad en detectar poblaciones minoritarias en estudios de precursores CD34 pre-
trasplante en médula ósea y sangre periférica, así como detectando células
minoritarias como mastocitos y células dendríticas. Los resultados de
discriminación en detección de EMR han sido obtenidos de estudios dilucionales,
donde se demostró sensibilidades de detección de niveles hasta 10-6 células. Sin
embargo, se estableció que los niveles de detección dependen de las aberrancias
y los fluorocromos empleados en el estudio, y se determinó un rango de detección
entre 10-3 y 10-6. (Orfao 2000)
1.5.6 Valor clínico del inmunofenotipo en la investigación de Enfermedad Mínima
Residual. A la fecha se han realizado variados estudios para determinar el valor
clínico de la determinación de Enfermedad Mínima Residual principalmente para
LLA y LMA, no así para LLC y mieloma, usando el inmunofenotipo para establecer
la predicción de recurrencia. Los estudios iniciales usando microscopía de
fluorescencia con dos marcaciones fueron útiles para demostrar la presencia del
incremento en la expresión de fenotipos aberrantes como predictores de
recurrencia, y que su ausencia indicaban la persistencia en remisión morfológica.
Los estudios con citometría de flujo han sido útiles para demostrar las mismas
características, inicialmente los niveles de 0.2% se correlacionaron con
recurrencia en LMA, y se demostró también su utilidad en LLA tanto en niños
como en adultos. Igualmente, se ha correlacionado la probabilidad de recurrencia
con los niveles de células con fenotipo aberrante a determinados puntos de la
terapia de la enfermedad como el final de la inducción, mantenimiento y al salir deltratamiento. En ese sentido, algunos estudios han demostrado una mayor
incidencia de recurrencia con niveles mayores a 0,5% de células anormales al final
de la inducción y mayor de 0,2% después de la intensificación; la persistencia de
niveles de enfermedad mínima residual se considera factor pronóstico
independiente para período libre de enfermedad y recurrencia. Los estudios
realizados a finales de los noventa, permitieron establecer que niveles de células
neoplásicas residuales mayores de 0,1% eran predictoras de recurrencia. Si bien,
la técnica es útil para seguimiento requiere de personal altamente entrenado en la
determinación de los fenotipos aberrantes, uso de amplios paneles de anticuerpos
monoclonales, además de contar con una muestra al momento del diagnóstico.
Otros enfoques han sido propuesto para tratar de reducir el impacto de la carencia
de los factores anteriores, y ha buscado reconocer alteraciones en la maduración
(“espacios vacíos”) de muestras en momentos diferentes al diagnóstico, así como
alteraciones de la relación precursores CD34 mieloides/linfoides en LMA, y,
además, el incremento en células CD34/CD19 ó CD34/CD22/CD20 en período
posterior a la finalización de la inducción. En los últimos años se ha buscado
reconocer marcadores de persistencia de células leucémicas por métodos
diferentes a los actuales que permitan hacer seguimiento, aun sin poseer
muestras al momento de diagnóstico. (Orfao 2000)
1.6 DETERMINACIÓN DE PLOIDIA POR CITOMETRÍA DE FLUJO
Ya desde años atrás se ha considerado de utilidad pronóstica la medición de
contenido de DNA en células leucémicas y se estableció como de buen pronóstico
los índices de ploidía entre 1.16 y 1.6. (Brunning 2001)
Esta estrategia de trabajo se utiliza extensamente en gran cantidad de laboratorios
como herramienta de diagnóstico y es de alta reproducibilidad empleando
metodologías de citometría de flujo. Otras técnicas han sido también empleadas
pero con mayor dificultad en su ejecución y sin brindar la información con la
precisión que lo hace la citometría.
1.6.1 Descripción de la técnica. El propósito del análisis de DNA es establecer el
contenido de DNA (nivel de ploidía) en una población de interés y su tasa de
crecimiento (el número de células en cada fase del ciclo celular). El ciclo celular es
determinado por la presencia de células 2N (G0 y G1), mezcla de células 2N y
2N+ (S), y células 4N (G2 y M). El análisis de DNA se realiza comparando la
distribución FSC contra la fluorescencia del marcador de DNA en la gráfica de 2
ejes y estableciendo los comportamientos modales de la distribución. La ploidía se
establece comparando los picos relativos G0/G1 de la muestra frente al pico de las
células diploides. Cuando las muestra es aneuploide se logran definir dos picos en
el trazado, pero esa capacidad de discriminación depende del número de células y
el CV del análisis de DNA. A menor número de células aneuploides se requiere de
un CV más preciso para lograr discriminar correctamente las poblaciones. Del
mismo modo, cuando la población aneuploide es muy pequeña respecto a unagran población diploide, resulta útil emplear otros marcadores fenotípicos que
permitan definir con más precisión los grupos de interés para el análisis. Emplear
antígenos como TdT, CD10, u otros de precursores o específicos del clon maligno,
permite identificar con claridad las células malignas y realizar el análisis sobre este
subgrupo y no sobre toda la población. (Nguyen 2003)
En LLA, establecer un índice de ploidía mayor de 1.16, que corresponde con un
cariotipo de 53 ó más cromosomas, se asocia con remisión prolongada. Sin
embargo, aunque el estudio de contenido de DNA por citometría de flujo resulta
preciso y equiparable generalmente con los estudios citogéneticos, pequeñas
deleciones o traslocaciones balanceadas que resultan en pseudodiploidías no son
detectables por la primera técnica. (Nguyen 2003)
El análisis de contenido de DNA por citometría de flujo requiere de la
descomposición del histograma en compartimentos G0/G1, S y G2/M. Resulta
técnicamente difícil separa con claridad las células en fase S temprana de su
predecesora, así como las de fase S tardía con sus fases subsiguientes; sin
embargo, la utilización de software especializado ha permitido conocer con
claridad las distribuciones y realizar los cálculos de poblaciones como razones.
Cuando el análisis parece más sencillo con una fase S claramente definida y
escasos debris, una estrategia de análisis en rectángulo es suficiente. Sin
embargo, debido a que las muestras analizadas poseen un gran número de
células normales, este grupo de células debe ser sustraído del total, y esto se
puede lograr marcando las células tumorales con anticuerpos para otros
antígenos, o seleccionándolas por sus características de dispersión de luz, o
realizando estudios de inmunohistoquímica sobre la muestra para establecer
índices de proliferación (PCNA, Ki67). (Nguyen 2003)
1.6.2 Estudios realizados. Pérez-Vera y su grupo de trabajo en México realizaron
un estudio donde comparó la utilidad de las técnicas citogenéticas convencionales
en detección de aneuploidías con el análisis del contenido de DNA por citometría
de flujo, usando FISH para resolver las inconsistencias, con lo que logró
establecer niveles de concordancia del 86% y usó este índice como predictor de
recurrencia. (Pérez-Vera 2004)
Un estudio previo de Finn había demostrado la utilidad del análisis del contenido
de DNA por citometría de flujo en el diagnóstico de leucemia linfoblástica y, al
compararlo con la inmunofenotipificación por citometría de flujo, alcanzaba niveles
útiles de concordancia hasta del 99% con promedio de 68%. La sensibilidad,
especificidad y valores predictivos positivos y negativos se calcularon como 53%,
84%, 78% y 63%, respectivamente. (Finn 2004)
Recientemente Zwick publicó un estudio donde comparó la utilidad del estudio de
inmunofenotipo por citometría de flujo con la determinación de la ploidía por
citometría de flujo e incluso la hibridación in situ fluorescente, logrando niveles deconcordancia del 81%, principalmente debido a los cambios fenotípicos asociados
a leucemia y la baja sensibilidad de las técnicas moleculares empleadas. (Zwick
2006)2. JUSTIFICACIÓN
Desde hace más de 15 años se ha difundido el uso de la inmunofenotipificación
para el diagnóstico de neoplasias hematolinfoides, y se ha estimulado el empleo
de la técnica en la detección de enfermedad mínima residual como una forma de
establecer pronóstico y definir el riesgo de recurrencia en cada paciente. Sin
embargo, a pesar de la difusión de dicha metodología en nuestro medio, se ha
adolecido por la carencia de estudios propios que permitan definir si los criterios
de riesgo definidos en otras latitudes del mundo son igualmente válidos para
nuestros pacientes.
Por otra parte, en el país se cuenta con instituciones de salud de alta complejidad
que trabajan en cooperación para el diagnóstico y seguimiento de neoplasias
hematolinfoides. Especial interés despierta el convenio Fundación Santa Fe de
Bogotá – Fundación HOMI Hospital La Misericordia en Bogotá. La primera
institución, centro de referencia nacional en diagnóstico de enfermedades
hematolinfoides, cuenta con un staff de patólogos con formación en
hematopatología y citometría de flujo, que ha permitido la adecuación de técnicas
diagnósticas que han sido aplicadas en el diagnóstico y seguimiento de pacientes
desde hace más de 5 años, a través de las cuales se establecieron niveles de
enfermedad mínima residual acorde a los criterios publicados por varios centros,
con especial referencia a los trabajos del doctor Alberto Orfao y colaboradores de
la Universidad de Salamanca.
La segunda institución, es un centro de referencia distrital y regional en
diagnóstico y tratamiento de cáncer en niños, con un grupo de oncohematología
pediátrica en continuo perfeccionamiento y con seguimiento de criterios
terapéuticos claros fortalecido por un programa de postgrado en dicha área.
Unidas las dos instituciones, garantizan un flujo de trabajo y un ejercicio
diagnóstico, pronóstico y terapéutico que genera confianza en la comunidad
médica y la población general.
Hace un par de años se inició la ejecución de un trabajo de investigación que
busca reconocer la correlación entre los desenlaces y la detección de Enfermedad
Mínima Residual y se encuentra actualmente en ejecución entre estas dos
instituciones (Chaparro, 2005). Dicho trabajo tiene una cohorte de pacientes que
se incrementa cada año, y no precisa en sus objetivos el análisis de la citometría
como tal, su desempeño analítico y su capacidad diagnóstica, sino que evalúa los
criterios clínicos de desenlace y los analiza a la luz de la detección de EMR como
única información de la citometría de flujo. Sobre esta información de
inmunofenotipo se construye este trabajo para precisar los perfiles
epidemiológicos del inmunofenotipo de leucemia linfoblástica aguda e identificar
los principales cambios en inmunotipificación en el seguimiento de los pacientes
con LLA. Esta información también ayudará a optimizar el estudio de citometría deflujo en el laboratorio y comprender mejor los cambios fenotípicos surgidos en los
blastos leucémicos como respuesta al tratamiento y la historia natural de la
enfermedad.3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar los perfiles inmunofenotípicos por citometría de flujo de leucemia
linfoblástica aguda en niños y su valor en la detección de enfermedad mínima
residual.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Establecer el perfil inmunofenotípico de las leucemias linfoblásticas agudas en
niños de la Fundación HOMI Hospital La Misericordia durante los años 2005 a
2009 y correlacionarlos con eventos adversos (leucemia persistente y recaída
hematológica).
2. Determinar los niveles de detección de Enfermedad Mínima Residual por
citometría de flujo de muestras de médula ósea en niños con Leucemia
Linfoblástica Aguda en la Fundación HOMI Hospital La Misericordia.
3. Identificar los parámetros de aproximación diagnóstica del estudio de
Enfermedad Mínima Residual por citometría de flujo de mayor utilidad en el
diagnóstico y seguimiento de niños con Leucemia Linfoblástica Aguda de la
Fundación HOMI Hospital La Misericordia.
4. Definir la concordancia interobservador y la reproducibilidad del estudio de
inmunofenotipo por citometría de flujo para identificar blastos residuales en
estudios de médula ósea.4. MATERIALES
En este capítulo se incluye todos los parámetros técnicos tenidos en cuenta para
el diseño y ejecución de este trabajo. Cabe recordar que en todos los apartes
siguientes se habla de niños, sin embargo, el estudio no tiene injerencia directa
sobre los pacientes sino sobre los archivos electrónicos del laboratorio de
hematopatología.
4.1 DISEÑO
El presente es un estudio observacional, analítico, de corte longitudinal,
bidireccional (retrospectivo predominantemente), sobre una cohorte de base
hospitalaria monocéntrica.
4.2 UNIVERSO
Niños con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda con inmunofenotipo por
citometría de flujo de aspirados de médula ósea realizados en el Departamento de
Patología y Laboratorios de la Fundación Santa Fe de Bogotá.
4.3 MUESTRA
Niños con Leucemia Linfoblástica Aguda atendidos en la Fundación HOMI
Hospital La Misericordia durante los años 2005 a 2009 con inmunofenotipos por
citometría de flujo realizados en el Laboratorio de Patología de la Fundación Santa
Fe de Bogotá con estudios de seguimiento realizados en el mismo laboratorio.
4.4 SELECCIÓN DE CASOS
Se revisa los inmunofenotipos por citometría de flujo de LLA en niños identificados
en la base de datos del laboratorio de Patología de la Fundación Santa Fe de
Bogotá identificados como sitio de procedencia Fundación HOMI Hospital La
Misericordia. Se busca los casos que tuvieran estudios de seguimiento.
4.5 CRITERIOS DE INCLUSIÓN
Niños de ambos sexos con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda cuyo
aspirado de médula ósea inicial fue estudiado en el Laboratorio de Patología de la
Fundación Santa Fe de Bogotá desde el año 2005 a 2009 con realización de
inmunofenotipificación por Citometría de Flujo, con posteriores estudios de
aspirado de médula ósea para detección de Enfermedad Mínima Residual por
inmunofenotipo en Citometría de Flujo, con tratamiento realizado en la Fundación
HOMI Hospital La Misericordia con terapia ajustada al riesgo.4.6 CRITERIOS DE EXCLUSIÓN
Pacientes con estudios de seguimiento sin inmunofenotipo inicial.
4.7 SEGUIMIENTO DE PACIENTES
Se determina por los estudios de médula ósea enviados periódicamente al
Laboratorio de Patología de la Fundación Santa Fe de Bogotá desde la Fundación
HOMI Hospital La Misericordia.
4.8 RESULTADOS PRIMARIOS
Se establece como resultado primario la presencia de Enfermedad Residual
durante el seguimiento (nivel de blastos en médula ósea <5%) o niveles de blastos
en médula ósea detectados por citometría de flujo mayor o igual a 5% en estudios
de seguimiento posteriores al período de inducción. Se debe establecer con
claridad el tiempo transcurrido desde el diagnóstico a la presentación del evento.
4.9 RESULTADOS SECUNDARIOS Y SUBROGADOS
Se considera resultados secundarios los cambios fenotípicos presentados durante
el seguimiento y las modificaciones en la expresión de antígenos detectados por
citometría de flujo.
4.10 ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los datos obtenidos del seguimiento de los pacientes son almacenados en bases
de datos diseñadas sobre plataformas Excel y se genera tablas para cada una de
las variables de análisis. Los desenlaces adversos se definen con base en análisis
de Kaplan-Meier. Los resultados obtenidos se cruzan para establecer relaciones
entre las diferentes variables y se trata de identificar el peso de cada variable en
los desenlaces. Los análisis incluyen tratamiento estadístico para significación
estableciendo p<0,05. Se emplean las pruebas de Cox, ji cuadrado, T de Student,
regresiones logísticas, entre otras, donde sea más adecuado acorde a los
resultados obtenidos. Se emplean paquetes estadísticos apropiados para la
finalidad. Para dicho análisis se cuenta con la colaboración de MSc epidemiólogo
clínico PhD candidato en Salud Pública área de investigación epidemiología.
4.11 FUENTES DE ERROR PREDECIBLES
Como es conocido, la realización de estudios retrospectivos limita los resultados
debido a la carencia de algunos datos por la toma de ciertos registros de historia
clínica. Esto condiciona que cierta cantidad de resultados va a carecer de
información para ciertas variables y limitará de igual forma el análisis estadístico y
el establecimiento de diferencias. Sin embargo, dado el número significativo depacientes que se encuentra en este período, es probable que el efecto de dicha
carencia de información se diluya con registros completos de muchos pacientes.
4.12 DIFUSIÓN DE RESULTADOS
Los resultados obtenidos del presente estudio se publican en revistas científicas
de circulación nacional e internacional de impacto en las áreas de medicina y
patología, así como en un congreso de patología de impacto internacional
(USCAP Annual Meeting 2010).5. MÉTODOS
En el presente capítulo se consigna la metodología estandarizada que se emplea
en cada uno de los procesos diagnósticos y pronósticos pertinentes al estudio.
Dado que el estudio es en esencia retrospectivo, dichos procedimientos
corresponden a las metodologías aceptadas y empleadas durante años por las
instituciones donde se realiza el estudio, por lo que, al ser documentos
confidenciales, no son pormenorizados sino considerados en una forma muy
global.
5.1 MÉTODOS DIAGNÓSTICOS
Los métodos diagnósticos incluyen los procedimientos empleados para hacer el
acercamiento preliminar ante la sospecha clínica de Leucemia Linfoblástica Aguda
en niños. Las características clínicas, los estudios de laboratorio básicos y la
terapéutica inicial sintomática se incluyen dentro de este aparte. De la misma
forma, el manejo de los estudios de médula ósea, ganglio o sangre periférica
realizados para alcanzar el diagnóstico definitivo se anotan dentro del protocolo
diagnóstico.
5.1.1 Diagnóstico Clínico de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños. Las
neoplasias hematolinfoides son diagnosticadas con base en las alteraciones
clínicas que presentan los niños y son enumeradas en el primer capítulo de este
trabajo. Usualmente, el médico general o pediatra que conoce inicialmente el caso
ordena una serie de paraclínicos donde logra demostrar alteraciones en el cuadro
hemático que es la alteración más llamativa en la mayoría de los casos. Los casos
sospechosos son analizados por el oncohematólogo pediatra y añade a la batería
de paraclínicos otros estudios que incluyen biopsia de médula ósea, estudio de
líquido cefalorraquídeo, pruebas de función hepática y renal, así como otras
pruebas diseñadas para predecir el comportamiento del paciente frente a la
terapéutica, pero en este punto se desconoce la respuesta de la enfermedad a la
terapéutica y usualmente se predice con base en los datos clínicos y paraclínicos
que se propusieron en el primer capítulo.
5.1.2 Diagnóstico Hematopatológico de Leucemia Linfoblástica Aguda en
niños. Ante la sospecha clínica de Leucemia Linfoblástica Aguda en niños, el
estudio necesario para definir el diagnóstico es aspirado/biopsia de médula ósea;
sin embargo, los estudios de sangre periférica y lesión sólida (ganglionar o
mediastínica) puede ofrecer información útil cuando son realizables.
Al completarse los estudios clínicos y paraclínicos básicos anotados en el aparte
anterior, es fundamental para tener certeza diagnóstica la realización de análisis
morfológicos por parte de patólogos expertos en muestras de médula ósea,
sangre periférica, masas presentes y líquido cefalorraquídeo.Antes del procedimiento, el niño es valorado por anestesiólogo quien define el
riesgo quirúrgico y se establece la fecha del procedimiento y los requerimientos
especiales para el mismo. Se busca tomar todas las biopsias necesarias durante
el mismo acto quirúrgico (médula ósea y masas) y recolectar el líquido
cefalorraquídeo. La toma de las muestras es realizada por el oncohematólogo
pediatra a cargo del caso, y de ser necesaria toma de biopsias de masas cuenta
con la colaboración del cirujano pediatra.
Se dispone del equipo necesario para toma de biopsias. Para estudios de médula
ósea se requiere de trocar óseo para muestras de biopsias con diámetro interno
promedio de 1-2 mm y se selecciona el área de la punción. El sitio favorito es la
espina iliaca posterosuperior, pero puede usarse la espinas iliacas anteriores,
esternón, u otra área que se considere adecuada por la persona que realiza el
procedimiento. Las biopsias de masas se realizan por punción con aguja tru-cut o
por biopsia abierta, lo que incrementa los riesgos de infección posterior al
procedimiento.
Siempre se busca obtener material adecuado para estudio histopatológico, así
como, material para análisis de inmunofenotipo por citometría de flujo, y en casos
necesarios otros estudios moleculares (cariotipo, determinación de rearreglos
génicos, etc.).
La obtención del líquido cefalorraquídeo se logra por punción estándar entre L4-
L5, preferiblemente, y se prepara para estudio de inmunofenotipo (búsqueda de
linfoblastos neoplásicos).
Las muestras obtenidas por estos procedimientos se embalan adecuadamente en
frascos de boca ancha o tubos de ensayo con preservantes adecuados acorde a
la muestra y el estudio a realizar:
• Tubo vacutainer con EDTA (también se puede emplear heparina): sangre
periférica o médula ósea para estudio de inmunofenotipo. Es importante anotar
que se requiere realizar improntas de las muestras en el sitio de la toma debido
a la alteración morfológica que produce el preservante sobre las células
problema. Estos tubos son también útiles para análisis moleculares pero se
pueden usar también tubos secos para tal fin.
• Tubo seco: líquido cefalorraquídeo útil para cualquier análisis (citoquímico,
inmunofenotipo, bacteriológico, etc.).
• Frasco con formol tamponado: biopsia de médula ósea o masa para análisis de
microscopia de luz (hematoxilina y eosina y tinciones especiales). Importante
tomar improntas y hacer extendidos antes de sumergirlo en el preservante-
fijador.
• Frasco con fijador B5: biopsia de médula ósea o masa para análisis de
microscopia de luz (sólo hematoxilina y eosina). Este fijador mejora el detalle
morfológico especialmente definiendo núcleos.• Frasco con solución salina: biopsia de masas para estudios de inmunofenotipo
o estudios moleculares. De estas muestras se pueden obtener adecuadas
improntas y extendidos en el laboratorio, pero tienen un período útil muy corto.
El transporte de las muestras se hace por mensajería especializada contratada por
las instituciones para garantizar el adecuado manejo de los especímenes en lo
concerniente a condiciones de transporte y tiempos de entrega. De esta forma se
minimiza el riesgo de pérdida, deterioro o mezcla de muestras y se garantiza la
viabilidad de las células en el momento del montaje de las pruebas.
Una vez las muestras son dispuestas en el laboratorio toman destinos diferentes.
Los tubos son remitidos al laboratorio clínico, específicamente la sección de
hematología y los frascos son trasladados a patología.
Las improntas y extendidos, que usualmente acompañan a los tubos, son
coloreados con tinción hematológica (Diff Quick®) y analizados por la bacterióloga
entrenada en hematología especial con el fin de obtener los conteos diferenciales
a 100 células (sangre periférica) ó 300 células (médula ósea). Completado este
análisis, las láminas y sus respectivos conteos son trasladadas a patología para
que el hematopatólogo las examine y determine los paneles de anticuerpos
necesarios para el estudio de inmunofenotipo. Los tubos son trasladados
directamente a la sección de inmunoquímica para la preparación de las células
para el montaje de la técnica de inmunofenotipo.
Cuando el patólogo determina el panel más adecuado para el caso en estudio le
informa a la bacterióloga encargada del citómetro de flujo para que proceda al
montaje. La bacterióloga realiza una serie de lavados de las células para reducir
las impurezas y mejorar la exposición antigénica en la superficie celular y procede
a incubar las células con los fluoromarcadores. La adquisición inicial se realiza
sobre 30000 eventos. De dicho montaje se obtiene un reporte preliminar el cual es
impreso y remitido al patólogo para análisis inicial. El patólogo completa el análisis
ya sea en la versión impresa o directamente en el programa del citómetro de flujo
y determina la necesidad de fluoromarcadores adicionales, los cuales se
completan lo más pronto posible y se realiza el análisis final por parte del patólogo.
El informe se libera con los resultados obtenidos y se reporta el marcador
empleado, el porcentaje de células positivas (puede ser absoluto o relativo a una
población específica) y la intensidad de fluoromarcación (débil, intermedia, fuerte y
variable); se complementa con el conteo realizado por la bacterióloga de
hematología y se genera un diagnóstico con base en criterios de la Organización
Mundial de la Salud adaptados al laboratorio.
Los frascos remitidos al laboratorio de patología son segregados acorde a la
muestra y fijador. Las biopsias de médula ósea fijadas en formol y B5 son
sometidas a decalcificación por efecto de ácido nítrico y posteriormente
procesadas para embeberlos en parafina. Antes de teñirlos con hematoxilina yeosina, los bloques obtenidos de muestras fijadas en B5 son sometidos a
“dezenkerización”, es decir, eliminación de los residuos de cobre presentes en el
B5. Las biopsias son teñidas con hematoxilina y eosina, y se preparan cortes
adicionales de los bloques obtenidos de material fijado en formol para tinciones
especiales (PAS, retículo y hierro) y niveles para inmunohistoquímica (si se
consideran necesarios).
Las biopsias de masas pueden venir fijadas en formol, B5 o solución salina. Si
vienen en las dos primeras sustancias, se procesa similar a las biopsias de
médula ósea, obviando el paso de decalcificación y no se realizan tinciones
especiales, pero se guardan niveles para inmunohistoquímica. Las biopsias
enviadas en solución salina se procesan para realizar improntas y extendidos que
se fijan en alcohol y se tiñen con hematoxilina y eosina o se secan al aire y se
tiñen con coloraciones hematológicas. Luego se separa material para
inmunofenotipificación que se traslada inmediatamente a la sección de
inmunoquímica. El material restante se fija con formol y B5, de haber suficiente
muestra, y se realiza proceso estándar.
Con base en las improntas y extendidos el patólogo determina el panel de
fluoromarcadores a utilizar para el análisis de la muestra y le informa a la
bacterióloga encargada del proceso. El proceso continua de la misma forma que
con los aspirados para la generación de los reportes. Una vez completado el
análisis, el resultado es liberado de la forma descrita anteriormente. Suele
reconocerse o dejarse un perfil inmunofenotípico básico que será utilizado como
marcador de seguimiento. Se archiva copia del reporte impreso y se guarda
registro electrónico analizable con el software propio del equipo.
5.2 MÉTODOS TERAPÉUTICOS
Antes de iniciar la terapéutica de los pacientes es esencial establecer el riesgo
biológico de la lesión tumoral definido por características clínicas, de laboratorio, y
marcadores blásticos definidos por el inmunofenotipo y la biopsia. Con estos datos
se prepara un régimen terapéutico acorde a las necesidades buscando alcanzar
remisión temprana y mínima toxicidad. Usualmente para tal fin se utilizan las
propuestas de trabajo diseñadas con base en estudios realizados en otras
latitudes y los grupos que tienen la vanguardia en esta tarea son americanos
(sobresale St. Jude en Memphis, TN) y la cooperación europea (BFM). No se
pretende presentar dichos protocolos acá, simplemente mencionar que los
protocolos ajustados y empleados en la Fundación HOMI Hospital La Misericordia,
se ajustan a los estándares internacionales.
5.3 MÉTODOS DE SEGUIMIENTO
Para establecer con claridad la respuesta terapéutica y la posibilidad de
recurrencia es esencial hacer seguimiento de variables clínicas y paraclínicas delos pacientes. Dichas mediciones se basan en conteos de blastos circulantes y en
médula ósea, así como otros parámetros bioquímicos que expresan la reducción
de células tumorales y el comportamiento del organismo del paciente a los
agentes quimioterapéuticos. Una vez reconocida alguna alteración significativa a
los resultados esperados en el menor se deben modificar las estrategias buscando
reducir las células blásticas y minimizar la toxicidad.
El seguimiento clínico se basa en el análisis de variables clínicas (estado de salud)
y paraclínicos que incluyen hemograma, química sanguínea, pruebas de función
renal y hepática, citoquímico de líquido cefalorraquídeo, enzimas séricas y
aspirado/biopsia de médula ósea.
La evaluación de médula ósea, o en algunos casos sangre periférica, para la
detección de linfoblastos leucémicas residuales requiere de un proceso similar al
realizado durante la etapa diagnóstica. La muestra se obtiene de las mismas
fuentes y se maneja de la misma forma durante la fase preanalítica. La fase
analítica presenta algunas modificaciones dado que no se da tanta importancia a
los extendidos en lámina, sino que se revisa el reporte inicial, donde se estableció
el perfil inmunofenotípico de seguimiento, y se realiza una preparación con dichos
fluoromarcadores buscando establecer la presencia del mismo perfil en los blastos
residuales y definiendo cuantitativamente la proporción de blastos leucémicos en
la muestra. El montaje exige por lo menos 300000 eventos adquiridos para
garantizar un mínimo de detección de 0.01%. El reporte se genera expresando los
conteos diferenciales definidos en extendido y en inmunofenotipo y se guarda
copia del reporte escrito y del registro electrónico para ser analizado en consultas
posteriores.
5.4 MÉTODOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS PARA EJECUCIÓN DEL
TRABAJO DE INVESTIGACIÓN
Se realizó una revisión exhaustiva de los archivos físicos y electrónicos de
reportes de estudios de inmunofenotipo por Citometría de Flujo de muestras
recibidas en el Laboratorio de Patología de la Fundación Santa Fe de Bogotá en el
período comprendido entre el 2 de enero de 2005 y el 30 de junio de 2009,
buscando los casos correspondientes a menores de 20 años. El registro completo
de citometrías durante este período fueron 10219 informes dentro de los cuales se
identificaron 2871 registros de menores de 20 años; de este último grupo se tomó
información referente a número de identificación de la citometría de flujo, nombre,
edad, género, procedencia (cuando estaba disponible), diagnóstico, conteo de
blastos y presencia o ausencia de cada uno de los antígenos evaluados, así como
el nombre del patólogo que había firmado el caso. Con esta información se
construyó una base de datos en Microsoft Excel® versión 2003.
Una vez completada la base de datos, se filtraron los datos buscando los casos de
menores correspondientes a la Fundación HOMI Hospital La Misericordia. Alidentificarlos se procedió a marcar con color amarillo los registros agrupados y se
eliminó el filtro inicial para ordenar los registros por nombre primero y luego por
número de identificación, tratando de esta forma de encontrar todos los registros
que fueron erróneamente ingresados bajo otra procedencia o simplemente no se
ingresó ninguna información en esa casilla, con lo que se logró identificar en total
987 registros. Posteriormente, se buscó dentro de esta población los registros de
niños con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA), reduciéndose a 810
el número de registros. Acá se incluyeron 530 registros correspondientes a 170
niños que tenían diagnóstico entre 2005 y 2009 y por lo menos un estudio de
seguimiento.
Se identificó un grupo de niños con desenlaces adversos (persistencia y recaída
hematológica), los cuales fueron cotejados contra un listado de la Fundación
HOMI Hospital La Misericordia. Sin embargo, no hay forma de garantizar que la
totalidad de niños incluidos correspondan al total de niños atendidos en la
Fundación HOMI Hospital La Misericordia durante ese período, ni que sean sólo
niños de esta institución de salud y no de otros centros, debido a la gran cantidad
de niños y que los registros están en construcción y por tanto incompletos. Hay
que considerar además una cantidad importantes de niños perdidos durante el
tratamiento, así como traslados y con otros problemas administrativos que limita
también la precisión de los datos consignados.
Sobre la muestra de 530 registros se realizó agrupamiento de tal forma que los
casos de cada paciente quedaran incluidos bajo una misma denominación y se
establecieron dos desenlaces paraclínicos de importancia: Desenlace adverso,
definido como 5% o más de blastos identificados en inmunofenotipo por citometría
de flujo en aspirados de médula ósea posteriores a la inducción, que incluían
recaídas hematológicas y leucemia persistente y, presencia de Enfermedad
Mínima Residual, definida como la detección de menos de 5% de blastos pero
más de 1% (10-2), en estudios posteriores al diagnóstico, y posteriormente niveles
de 0,1% (10-3) y 0,01% (10-4). A pesar de encontrarse algunos reportes con
presencia de blastos entre 0,001% (10-5) o menos y 0,01% (10-4), no se creó una
categoría específica para estos casos pues no estaban muy bien caracterizados
en el reporte de la citometría y usualmente eran precedidos por la frase “probables
blastos del…”. Este último grupo se dejó incluido con el grupo de 0,01% (10-4).
De esta población se seleccionó un grupo de 38 niños diagnosticados entre 2008 y
2009 y de ellos se obtuvo el archivo electrónico de la citometría de flujo. En total
fueron 82 registros que se analizaron con el software Infinicyt®. Se definieron los
parámetros de aproximación diagnóstica y los niveles de blastos detectados en los
estudios de seguimiento. Se estableció por último la concordancia
interobservadores y la reproducibilidad de la estrategia diagnóstica.6. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
Para la ejecución de este trabajo se cuenta con 4 años, que son los mismos de
duración de la especialidad en Patología Anatómica y Clínica de la Universidad
Nacional de Colombia, los cuales han sido divididos en trimestres para facilitar la
planeación y evaluación de progresos de las tareas a ejecutar.
Tabla 6.1 Cronograma (año 2006-2010)
AÑO I II III IV
TRIMESTRE 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16
Revisión de
X X X X
literatura
Diseño del
X X X X
trabajo
Preparación
X X X X X X X
BD FSFB
Prueba piloto X
Ajustes X X
Revisión de
X X
citometrías
Consolidación
X
de datos
Análisis de
bases de X
datos
Preparación
de X
publicación7. CONSIDERACIONES ÉTICAS E IMPACTO AMBIENTAL
Este proyecto busca identificar los perfiles inmunofenotípicos de los pacientes con
Leucemia Linfoblástica Aguda y reconocer su valor en la detección de Enfermedad
Mínima Residual. Igualmente, sumado a variables clínicas y otros exámenes
paraclínicos, busca reconocer el riesgo de recurrencia y mortalidad por la
enfermedad en niños de la Fundación HOMI Hospital La Misericordia de Bogotá
de mano del trabajo en ejecución de EMR de la misma institución.
La ejecución del presente trabajo está enmarcada dentro de lo dispuesto en la
resolución 008430 de 1993 del Ministerio de Salud dado que está encaminada al
reconocimiento de procesos biológicos de los seres humanos (artículo 4 literal a),
el control de los problemas de salud (artículo 4 literal c) y al estudio de las técnicas
y métodos recomendados o empleados en la prestación de servicios de salud
(artículo 4 literal e).
La evaluación a que son objeto los pacientes en este trabajo es meramente clínica
verificando las manifestaciones de su enfermedad y a través de estudio
paraclínicos definir otras variables de riesgo. Son sometidos a procedimientos
aceptados por la comunidad científica y empleados durante muchos años en la
práctica médica. No se exponen a riesgos innecesarios ni se tratan, en lo posible,
modificar los tratamientos sustancialmente. Se cuenta siempre con la expresa
colaboración de los pacientes y sus cuidadores con la comprensión y firma del
consentimiento informado, cuando es posible (Título II Capítulo I).
Este estudio es clasificado como de riesgo mayor que el mínimo debido a que las
muestras de médula ósea sólo son obtenibles a través de aspirados, y estás
quedan catalogadas en este grupo. Sin embargo, dichos aspirados son tomados
como parte de la evaluación integral de su enfermedad y no se incrementa en
número o frecuencia por la ejecución del presente trabajo, es decir, un paciente
fuera del estudio está expuesto al mismo riesgo que un participante (artículo 11).
El diseño, firma y cumplimiento del consentimiento informado está acorde a lo
dispuesto en la norma (artículos 14, 15 y 16). El modelo de dicho consentimiento
se encuentra anexo al protocolo del estudio de EMR de HOMI (Estupiñán, 2005).
Sin embargo, debido a que este diseño es meramente retrospectivo, se considera
que dicho consentimiento será obtenible sólo en escasos casos y en otros ya fue
firmado para el estudio precedente.
La Leucemia Linfoblástica Aguda es una condición de alta prevalencia en menores
de edad y se han realizado previamente en otras latitudes estudios que han
demostrado la utilidad de la técnica para la solución de problemas y el mínimo
riesgo a que se exponen los pacientes en este tipo de investigaciones (Título II
Capítulo III). De igual manera, se solicitará consentimiento en su participación delos niños y en los casos donde sea posible se realizará valoración psicológica del
menor (artículo 25).
Este estudio fue presentado para su aprobación por parte del comité de ética tanto
de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia como de la
Fundación HOMI Hospital La Misericordia y se cumplió con los parámetros
señalados en la norma (Título III Capítulo I).
Igualmente, se manejó las muestras teniendo presente las normas de
bioseguridad y se dispondrá los desechos acorde a los manuales vigentes en el
laboratorio de la Fundación Santa Fe de Bogotá.8. PROPIEDAD INTELECTUAL
La generación de conocimiento que se obtiene con este trabajo es para beneficio
de la comunidad científica y a través de ésta, la comunidad general con elementos
diagnósticos y de seguimiento, más sólidos y mejor estructurados.
Los documentos que genere son propiedad de sus autores y de la institución para
la cual estos desarrollan su quehacer académico que en este caso es la
Universidad Nacional de Colombia. No se espera obtener desarrollo de nuevas
herramientas de trabajo o la generación de innovaciones técnicas mayores. El
objeto del trabajo es esencialmente la adaptación de procedimientos técnicos
mundialmente aceptados para su utilización masiva en nuestro medio.9. PRESUPUESTO
Para la ejecución del trabajo se plantean varios rubros financieros que se
especifican en las siguientes tablas.
Tabla 9.1 Presupuesto global (en miles de $)
ÍTEM TOTAL
PERSONAL 0
EQUIPOS 2.500
SOFTWARE 0
MATERIALES 0
SALIDAS DE CAMPO 0
MATERIAL BIBLIOGRÁFICO 0
PUBLICACIONES Y PATENTES 3.000
SERVICIOS TÉCNICOS 4.500
VIAJES 00
CONSTRUCCIONES 0
MANTENIMIENTO 0
TOTAL 10.000
Tabla 9.2 Descripción de los equipos por adquirir (en miles de $)
EQUIPO JUSTIFICACIÓN TOTAL
Monitor LCD Pantalla de 32” que facilite el análisis de citometría 2.500
TOTAL 2.500
Tabla 9.3 Servicios Técnicos (en miles de $)
TIPO DE SERVICIO JUSTIFICACIÓN TOTAL
Asesoría epidemiológica Análisis de datos 4.500
TOTAL 4.500
Tabla 9.4 Publicaciones y Patentes (en miles de $)
ÍTEM JUSTIFICACIÓN TOTAL
Preparación de artículo científico Publicación de resultados del 500
para revista estudio
Preparación de póster para congreso Publicación de resultados del 2.500
(incluye viaje) estudio
TOTAL 3.00010. RESULTADOS
10.1 PERFILES INMUNOFENOTIPOS POR CITOMETRÍA DE FLUJO EN
LEUCEMIA LINFOBLASTICA AGUDA EN NIÑOS
Se identificaron 170 niños con diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda que
tenían al menos una citometría de seguimiento, pero usualmente dos o más. La
distribución de las variables disponibles se resume en la tabla 10.1.
Tabla 10.1 Caracterización de niños con Leucemia Linfoblástica Aguda 2005-
2009 (n=170)
Variable No. (%)
Sexo masculino 95 (55,88)
Edad (Media±Desviación estándar) 7,13 ± 4,54
Fenotipos
LLA prepreB 139 (81,76)
151
LLA proB 9 (5,29)
(88,81)
LLA preB 3 (1,76)
LLA T intermedia 15 (8,38)
19
LLA T temprano 3 (1,68)
(11,19)
LLA T tardío 1 (0,56)
Porcentaje de blastos (Media±Desviación estándar) 78,11 ± 23,99
Como se observa en la tabla 10.1, hubo una representación mayor en la muestra
de varones con una razón niño a niña de 1,27:1. La edad promedio al diagnóstico
fue de 7,13 años, con una desviación estándar de 4,54 años y un rango desde 10
días hasta 17 años. En relación con los fenotipos diagnósticos de Leucemia
Linfoblástica Aguda se identificó una representación mayor de fenotipo B (81,76%)
en relación con el fenotipo T (11,19%).
Considerando sólo el linaje B, la distribución de frecuencias mostró que la
Leucemia Linfoblástica Aguda de fenotipo B más frecuente es la prepreB o
también denominada fenotipo común (92,05%), seguido por los fenotipos proB
(5,96%) y preB (1,99%), estos últimos escasamente representados.
En relación con el linaje T, la distribución obtenida de las frecuencias de
diagnóstico de Leucemia Linfoblástica Aguda mostró predominio del fenotipo Ttímico cortical o intermedio (78,95%), seguido por los fenotipos T temprano
(15,79%) y T tardío (5,26%).
El porcentaje de blastos reportado al momento del diagnóstico tuvo una amplitud
de rango considerable que se estableció desde 20% hasta 100%, con una media
de 78%, pero con una desviación estándar de 24%.
Posteriormente, se trató de establecer la frecuencia de los anticuerpos detectados
en cada uno de los aspirados de médula ósea empleados para diagnóstico en la
muestra de estudio. La tabla 10.2 resume la distribución de antígenos en cada
uno de los fenotipos B anotados anteriormente, y la tabla 10.3 muestra la
información correspondiente a los fenotipos T.
Tabla 10.2 Distribución de antígenos en LLA de fenotipo B (n=151)
CD (Cluster of Differentiation)
HLA -
Fenotipo IgMcyt
7 10 13 19 20 33 34 38 45 DR
LLA proB 1 0 0 9 2 1 6 9 0 10 0
LLA prepreB 3 139 36 138 58 24 114 131 0 136 0
LLA preB 0 3 0 3 0 0 3 3 0 3 3
Panel empleado: CD7, CD10, CD13, CD19, CD20, CD33, CD34, CD38, CD45, HLA-DR, IgMcyt.
En casos especiales se utilizó 7.1 (positivo en 2 casos de LLA proB), mieloperoxidasa (MPO),
CD79a, CD22cyt, CD3 y TdT.
Esta distribución muestra que existen antígenos expresados con alta frecuencia en
fenotipo B como son CD10, CD19, CD34, CD38 y HLA-DR, antígenos
frecuentemente ausentes o de expresión débil como CD7 y CD45 y otros de
aparición ocasional como CD13, CD33 y CD20.
Tabla 10.3 Distribución de antígenos en LLA de fenotipo T (n=19)
CD (Cluster of Differentiation) HLA-
Fenotipo TdT MPO
1a 2 3sup 3cyt 4 5 7 8 10 13 19 33 34 38 45 DR
LLA T
0 1 2 3 0 1 3 0 1 1 0 0 3 3 3 1 1 0
temprano
LLA T
13 12 11 15 8 15 15 12 2 0 0 0 15 8* 15 0 10* 1
intermedio
LLA T
0 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 1 1 1 0 1 0
tardío
* No hay datos disponibles en la totalidad de casos. Todos los casos que tienen información para
estos antígenos tienen expresión de los mismos.
Panel empleado: CD1a, CD2, CD3sup, CD3cyt, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD13, CD19, CD20,
CD33, CD34, CD38, CD45, HLA-DR, IgMcyt y TdT. Ocasionalmente se incluye CD79a y
mieloperoxidasa (MPO).
La distribución antigénica en LLA de fenotipo T muestra expresión bastante
preservada de antígenos, con ocasional expresión aberrante (cruzada) de
antígenos mieloides (CD13) y ausencia de antígenos B. CD1a es un antígeno queindica diagnóstico de fenotipo T intermedio, por tanto su expresión exclusiva en
este fenotipo.
El fenotipo de Leucemia Linfoblástica Aguda de precursores B considerado
anteriormente en la tabla 10.2, muestra que hay ciertos antígenos que se
expresan frecuentemente en estas leucemias y son CD10, CD19, CD34, CD38 y
HLA-DR y otros que están ausentes como CD7, CD13, CD33 y CD45. El fenotipo
expresado en este párrafo se puede considerar desde el punto de vista estadístico
como fenotipo frecuente o “usual”. Adicional a los antígenos antes mencionados,
CD20 fue un antígeno de expresión variable presente en algo más que la tercera
parte de ellas, por lo que por frecuencias no podría ser considerado
completamente frecuente ni totalmente infrecuente; por tanto, se considerará
como un antígeno aparte y se incluirá en el análisis de forma independiente.
El fenotipo del linaje T plasmado en la tabla 10.3 se aparta un poco del fenotipo
antes mencionado y en él la expresión de los antígenos CD2, CD3 de citoplasma,
CD5, CD7, CD34, CD38, CD45, HLA-DR y TdT y la ausencia o infraexpresión de
CD3 de superficie, CD10, CD13, CD19, CD20, CD33, IgM de citoplasma y
mieloperoxidasa son el fenotipo frecuente. CD1a es marcador de LLA T
intermedia, mientras que CD4 y CD8 están ausentes en LLA T temprana.
Como se observa en la tabla 10.4 se incluye una categoría relacionada con CD10.
Por un lado, incluye casos CD10 negativos en linaje B (excluyendo fenotipo proB
en el cual es un hallazgo usual y distintivo) y por otra parte, casos CD10 positivos
en linaje T, considerando lo presentado en la tabla 10.3 que 11 de 15 casos fueron
CD10 negativos. Sin embargo, sólo se encontraron casos de este último grupo en
los datos consignados. La expresión de IgM de citoplasma, la cual por definición
es diagnóstica de fenotipo preB o Burkitt, se eliminó de la tabla y de la
consideración de fenotipo infrecuente. Para antígenos que frecuentemente están
expresados en las leucemias agudas como CD34, CD38 y HLA-DR y en linaje B
como CD19, se consideró aberrante no sólo la ausencia del antígeno (positividad
del antígeno presente en menos que el 10% de la población celular) sino una
expresión disminuida en proporción (positividad del antígeno presente en menos
que la mitad de la población celular positiva para los otros marcadores) o en
intensidad (nivel logarítmico de expresión del antígeno menor que el usualmente
observado), definiendo las anteriores alteraciones como ausencia parcial o
infraexpresión, respectivamente.
De acuerdo con esos resultados la definición de fenotipo infrecuente se consideró
de la siguiente forma: expresión de CD13, CD33 y mieloperoxidasa y ausencia de
CD34, CD38 y HLA-DR. Además de los antígenos antes mencionados, para linaje
B se consideró infrecuente la expresión de CD7 y la ausencia o infraexpresión de
CD19. Para fenotipo T se consideró, además, infrecuente la expresión de CD10.
En total, se identificaron 85 niños con alguna alteración de las antes mencionadas,
con lo que se hace notar que un mismo caso puede tener más de una alteración.Tabla 10.4 Perfil de antígenos infrecuentes en Leucemia Linfoblástica Aguda
de niños 2005-2009
Global No.(%) Linaje B No.(%) Linaje T No.(%)
Alteración
(n=170) (n=151) (n=19)
Expresión de CD7# 4 (2,36) 4 (2,65) -
Ausencia/expresión de CD10* 4 (2,36) 0 4 (21,05)
Expresión de CD13 37 (21,76) 36 (23,84) 1 (5,26)
Ausencia/infraexpresión de CD19 1 (0,59) 1 (0,66) -
Expresión de CD20° 60 (35,29) 60 (39,74) 0
Expresión de CD33 25 (14,70) 25 (16,56) 0
Ausencia/infraexpresión de CD34 28 (16,47) 28 (18,54) 0
Ausencia/infraexpresión de CD38 7 (3,91) 7 (4,64) 0
Ausencia/infraexpresión de HLA-DR 8 (4,71) 7 (4,64) 1 (5,26)
Expresión de 7.1 2 (1,18) 2 (1,32) 0
Expresión de mieloperoxidasa 1 (0,59) 0 1 (5,26)
# Expresión cruzada de CD7 en leucemias de linaje B.
* Incluye casos con ausencia de CD10 en fenotipo B (diferentes a fenotipo proB, el cual es CD10
negativo, por definición) y con expresión de CD10 en casos con fenotipo T.
° No considerado para definición de fenotipo inusual.
En estos pacientes se utilizó la expresión aberrante de antígenos para diseñar los
tubos de fluoromarcadores que fueron empleados para el seguimiento, y se
detectaron 25 casos con eventos adversos que incluían recaídas y persistencia.
Sin embargo, no se pudo establecer la utilidad del fenotipo infrecuente o la
aberrancia de antígenos en el seguimiento pues, en la mayoría de informes, sólo
aparecía el nivel de blastos detectados y el tubo utilizado, pero no se especificaba
la expresión de cada uno de los antígenos identificados. Este objetivo se revisará
nuevamente en la parte final de los resultados cuando se analizan los parámetros
de aproximación diagnóstica por citometría de flujo.
Se evaluó la relación existente entre la aparición de fenotipo infrecuente al
momento del diagnóstico y la presencia de eventos adversos posteriores a la
inducción (enfermedad persistente y recaída). Con base en los hallazgos
obtenidos de la base de datos relacionados con la aparición de más de 5% de
blastos en estudios posteriores a la inducción, se definieron dos grupos: “con
eventos” en la que los pacientes presentaron un porcentaje de blastos de 5% o
más en alguno de sus estudios de seguimiento y otro “sin eventos”. Las
características de los grupos se resumen en la tabla 10.5.
De esta descripción simple presentada en la tabla 10.5 se observa una serie de
tendencias no estadísticamente significativas que incluyen mayor riesgo de
presencia de eventos adversos en varones, de edad ligeramente mayor, con
fenotipo diagnóstico prepreB y T intermedio y de tipo infrecuente. Sin embargo,cabe mencionar que estas características son las más frecuentes en el grupo de
estudio y los resultados ser reflejo de esa frecuencia incrementada.
Tabla 10.5 Caracterización de los pacientes con LLA 2005-2009 que
presentaron eventos adversos
Con eventos No.(%) Sin eventos No.(%) Valor
Variable
n=25 (14,7%) n=145 (75,3%) p
Sexo masculino 15 (60) 80 (55,17) 0,83
Edad (Media±desviación estándar) 8,06 ± 4,51 6,97 ± 4,54 0,27
Categorización fenotípica*
Fenotipo B frecuente 7 (28) 65 (44,83)
0,17
Fenotipo B infrecuente 15 (60) 64 (44,14)
Fenotipo T frecuente 2 (8) 11 (7,59)
0,54
Fenotipo T infrecuente 1 (4) 5 (3,45)
* La totalidad de eventos se presentó en LLA prepreB (22) y LLA T intermedia (3).
Valor p: prueba exacta de Fischer para variables categóricas y T de Student para las continuas.
En relación con el fenotipo infrecuente, que es la intención de esta sección de los
resultados, tratar de establecer su existencia y caracterizar los antígenos de mayor
impacto en la aparición de eventos, es necesario reconocer mejor la distribución
de las alteraciones tanto en el grupo de eventos como en su ausencia. La tabla
10.6 resume los hallazgos obtenidos del análisis.
Como se observa en el análisis bivariado presentado en la tabla 10.6, sólo la
ausencia, infraexpresión o expresión parcial de CD38 es un hallazgo
estadísticamente significativo relacionado con la aparición de eventos adversos
(recaída o persistencia). Otras alteraciones como ausencia, expresión parcial o
infraexpresión de CD34 y HLA-DR, así como la expresión cruzada de CD33,
marcador mieloide, tuvieron relación con la aparición de eventos con valores de p
menores a 0,25.
Como se cuenta con dos o más citometrías de los pacientes considerados en este
grupo, existe un lapso de tiempo entre cada uno de ellas, el cual es conocido. Por
tanto, aunque no es un seguimiento clínico óptimo controlado como debe ser la
fuente de información de estudios actuariales o de sobrevida, se trató de
establecer el tiempo transcurrido desde el momento del diagnóstico hasta la
aparición del evento adverso o hasta el momento en que se obtuvo la última
citometría y se estableció, entonces, un modelo de sobrevida libre de enfermedad
que sirviera de base para realizar un análisis multivariado con estos antígenos
antes mencionados que podrían tener algún valor en la aparición de eventos
adverso. Por tanto, se generó el análisis multivariado considerando para estetodas las alteraciones fenotípicas obtenidas en el análisis bivariado mostrado en la
tabla 10.6 que tuvieran un valor p menor de 0.25. Este mismo análisis se realizó
para el grupo completo de 170 menores, como para el subgrupo con diagnóstico
de fenotipo B común, dado que es el mayoritario. Estos resultados se consignan
en la tabla 10.7 y 10.8, respectivamente.
Tabla 10.6 Caracterización de los pacientes con LLA 2005-2009 que
presentaron eventos adversos acorde a la presencia de alteraciones
fenotípicas
Con eventos No.(%) Sin eventos No.(%)
Alteración Valor p
n=25 (14,7%) n=145 (75,3%)
Expresión de CD7 1 (4) 3 (2,07) 0,47
Expresión de CD10* 1 (4) 3 (2,07) 0,47
Expresión de CD13 4 (16) 33 (22,76) 0,6
Ausencia/expresión parcial CD19 0 1 (0,69) 1
Expresión de CD20° 9 (36) 51 (35,17) 1
Expresión de CD33 6 (24) 19 (13,1) 0,22
Ausencia/ expresión parcial CD34 7 (28) 21 (14,48) 0,14
Ausencia/ expresión parcial CD38 6 (24) 2 (1,38) <0,001
Ausencia/ expresión parcial HLADR 2 (8) 2 (1,38) 0,1
Expresión de 7.1 0 2 (1,38) 1
Expresión de mieloperoxidasa 0 1 (0,69) 1
# Expresión cruzada de CD7 en leucemias de linaje B.
* Incluye casos con expresión de CD10 en fenotipo T.
° No considerado para definición de fenotipo inusual.
Valor de p: prueba exacta de Fischer para variables categóricas y T de Student para las continuas.
Tabla 10.7 Antígenos asociados con la aparición de eventos sobre el total de
pacientes (n=170, 25 eventos, tiempo de riesgo 1490,5 meses)
Variable HR (IC95%) Valor p
Expresión de CD33 5 1,83 – 13,69 0,002
Ausencia/infraexpresión de CD38 6,21 2,34 – 16,48 <0,001
HR: Hazard Ratio.
Método multivariado empleando la regresión de Cox.
Tanto la expresión cruzada de CD33 como la infraexpresión, ausencia o expresión
parcial de CD38 muestran una correlación estadísticamente significativa con laaparición de eventos adversos en los niños con LLA, considerando para tal fin, el
tiempo transcurrido desde el momento del diagnóstico hasta la aparición de la
recurrencia.
Al considerar sólo el fenotipo prepreB, por ser el más frecuente, el análisis
multivariado muestra relación con los mismos antígenos antes mencionados, pero
también aparece la infraexpresión, expresión parcial o ausencia de CD34 como
marcador útil en pacientes con aparición de blastos >5% en médula ósea posterior
a la inducción. Ver tabla 10.8.
Tabla 10.8 Antígenos asociados con la aparición de eventos en niños con
Leucemia Linfoblástica Aguda prepreB [fenotipo común] (n=139, 22 eventos,
tiempo de riesgo 1253 meses)
Variable HR (IC95%) Valor p
Expresión de CD33 6,77 2,22 – 20,58 0,001
Ausencia/infraexpresión de CD34 2,72 1,01 – 7,33 0,047
Ausencia/infraexpresión de CD38 7,17 2,56 – 20,11 <0,001
HR: Hazard Ratio.
Método multivariado empleando la regresión de Cox.
Queda claro que hay una correlación entre ciertos antígenos detectados en el
momento del diagnóstico y la aparición posterior de blastos en estudios de
seguimiento en médula ósea. Por tanto, se quiso anticipar el uso de las
definiciones de fenotipo infrecuente, fenotipo infrecuente considerando la
expresión de CD20 como una anormalidad adicional y usando los anticuerpos
identificados como de alta utilidad en el análisis multivariado, como una prueba
diagnóstica para predecir el comportamiento de la Leucemia Linfoblástica Aguda
en general, y estos mismos conceptos aplicados a la Leucemia Linfoblástica
Aguda de fenotipo prepreB. El rendimiento operativo de cada uno de los modelos
se resume en las tablas 10.9 y 10.10.
Tabla 10.9 Características operativas de definiciones de fenotipo según la
presencia de antígenos infrecuentes (LLA general)
Definición Sensibilidad Especificidad VPP VPN Valor p
Infrecuente 64 52,41 18,82 89,41 <0,001
Infrecuente+CD20 76 32,41 16,24 88,68 <0,001
HR MV* 44 86,21 35,48 89,93 <0,001
*HR MV= Expresión de CD33 y/o ausencia, infraexpresión o expresión parcial de CD38
VPP= Valor Predictivo Positivo.
VPN= Valor Predictivo Negativo.Tabla 10.10 Características operativas de definiciones de fenotipo según la
presencia de antígenos infrecuentes (LLA prepreB)
Valor
Definición Sensibilidad Especificidad VPP VPN
p
Infrecuente 68,18 52,14 21,13 89,71 <0,001
Infrecuente+CD20 81,82 28,21 17,65 89,19 <0,001
HR MV* 68,18 70,09 30 92,13 <0,001
*HR MV= Expresión de CD33 y/o ausencia, infraexpresión o expresión parcial de CD34 y/o CD38
VPP= Valor Predictivo Positivo.
VPN= Valor Predictivo Negativo.
Las tablas muestran que la sensibilidad del fenotipo infrecuente con y sin incluir
CD20 son medianamente útiles para detectar niños con LLA que pueden recaer y,
por otro lado, la ausencia de alteraciones en CD33, CD34 y CD38 útil para
anticipar un comportamiento favorable.
10.2 UTILIDAD DEL ESTUDIO DE INMUNOFENOTIPO POR CITOMETRÍA DE
FLUJO PARA LA DETECCIÓN DE ENFERMEDAD MÍNIMA RESIDUAL
Para el establecimiento del nivel de detección de blastos por citometría de flujo se
consideraron los siguientes grupos:
• Primer grupo, de 5% o más de blastos que incluye grupo diagnóstico
(blastos >20%), de recaída (blasto≥s5 % luego de haber alca nzado la
remisión morfológica), de enfermedad persistente (blastos ≥5% sin haberse
registrado remisión morfológica luego de la inducción) y otros;
• el segundo grupo de Enfermedad Residual mayor que 10-2 (blastos >1% y
<5%);
• el tercero, Enfermedad Residual mayor que 10-3 (blastos >0,1% y <1%);
• el cuarto, Enfermedad Residual menor que 10-3 (blastos <0,1%), incluyendo
registros con niveles de detección de 10-4 y 10-5, y;
• el quinto y último sin detección de blastos.
El rendimiento del estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo para
detectar niveles de blastos se resume en la gráfica 10.1.
Los resultados mostrados en la gráfica 10.1, si bien resaltan la alta cantidad de
muestras recibidas informadas con más de 5% de blastos (diagnóstico, recaída,
persistencia, entre otras situaciones) también indica que un gran número de casos
es informado con niveles de blastos por debajo del nivel de detección de 10-3 y
10-4 (97 registros correspondiente a 18,3%).
De igual forma se estableció la correlación entre los niveles de detección de
blastos residuales en aspirados de médula ósea y la aparición de recurrencia. Este
análisis se muestra en la tabla 10.11.Gráfica 10.1 Niveles de detección de blastos en estudios de seguimiento de
niños con Leucemia Linfoblástica Aguda atendidos en 2005-2009 (n=530)
250 43,5%
34,8%
200
150
100 15,3%
50
3,7%
2,7%
0
No detección <0,1% 0,1% a 1% >1% ^ <5% ≥5%
Tabla 10.11 Niveles de detección de Enfermedad Mínima Residual asociados
a eventos adversos
Nivel máximo de detección EMR Eventos HR (IC95%) Valor p
>10-2 44% 15,49 (5,31-45,27) <0,001
<10-2 ^ >10-3 20% 1,52 (0,5-4,82) 0,53
<10-3 ^ >10-4 36% 3,67 (0,2-66,12) 0,63
<10-4 0% - -
Se muestra en la tabla que niveles de blastos mayores que 10-2 en estudios de
seguimiento (>1%) tienen una correlación estadísticamente significativa con la
aparición de eventos adversos en estudios de seguimiento (recaída hematológica);
sin embargo, valores inferiores no tienen dicha correlación, y si representaron el
56% del total de eventos adversos.
10.3 PARÁMETROS DE ALTERACIONES FENOTÍPICAS ÚTILES PARA LA
APROXIMACIÓN DIAGNÓSTICA Y DE SEGUIMIENTO EN LEUCEMIA
LINFOBLÁSTICA AGUDA EN NIÑOS
Se quiso establecer cual alteración antigénica posee mayor relevancia diagnóstica
dado que permitiera identificar fácil y rápidamente los casos de Leucemia
Linfoblástica Aguda de pacientes con otras enfermedades. No se pudo realizar el
análisis sobre la totalidad de 170 pacientes por carecerse de los archivoselectrónicos de citometrías previos a 2008. Por tanto, se revisó sólo un grupo de
registros electrónicos con diagnósticos posteriores a 2008 disponibles (n=38)
buscando identificar los siguientes parámetros: infraexpresión de antígenos,
sobreexpresión de antígenos, expresión asincrónica de antígenos, expresión
cruzada de antígenos y otras alteraciones. Los datos identificados se presentan en
la tabla 10.12.
Tabla 10.12 Distribución de alteraciones fenotípicas útiles para la
aproximación diagnóstica y de seguimiento de Leucemia Linfoblástica
Aguda en niños
Alteración No. (%)
Infraexpresión de antígenos 38 (100)
Sobreexpresión de antígenos 23 (60,5)
Expresión asincrónica de antígenos 12 (31,6)
Expresión cruzada de antígenos 9 (23,68)
Otra alteración 1 (2,63)
Como se observa en la tabla 10.12, todas las leucemias presentaban
infraexpresión de alguno de sus antígenos. Al revisar que antígenos se
encontraban alterados se obtuvieron los datos que se plasman en la tabla 10.13.
CD45 estaba ausente o débil en 35 de 35 Leucemias Linfoblásticas Agudas de
fenotipo B (100%) y CD3 de superficie estaba débilmente expresado en 3 de 3
Leucemias Linfoblásticas Agudas de fenotipo T. CD34 presenta disminución en
menor proporción y otros antígenos son infraexpresados en forma anecdótica.
Tabla 10.13 Distribución de infraexpresión de antígenos en Leucemia
Linfoblástica Aguda en niños
Infraexpresión (n=38) No. (%)
CD45 ausente 13 (34,2)
CD45 débil 22 (57,9)
CD34 negativo 3 (7,9)
CD3* superficie débil 3 (7,9)
CD2*, CD34 débil 1 (2,6)
CD2*, CD5*, CD7*, CD10 ausente 1 (2,6)
* En fenotipo T.En relación con la sobreexpresión de antígenos la tabla 10.14 resume los
hallazgos. Nótese la alta frecuencia de sobreexpresión de CD10 en las Leucemias
Linfoblásticas Agudas de fenotipo prepreB.
Tabla 10.14 Distribución de sobreexpresión de antígenos en Leucemia
Linfoblástica Aguda en niños
Sobreexpresión (n=23) No. (%)
CD10 19 (50)
CD34 5 (13,2)
CD19 3 (7,9)
Más de un antígeno podía estar sobreexpresado en un mismo caso.
Expresión asincrónica y cruzada de antígenos también se observó y se resume los
hallazgos en las tablas siguientes. Los casos de expresión de CD33 se
relacionaban en 4 de 5 con expresión de CD13, similar a lo observado al inicio de
estos resultados en el grupo de trabajo. La otra alteración identificada fue
expresión de 7.1 (proteína de la alteración 11q23); sin embargo, esta expresión no
fue útil para seguimiento pues se perdió en los blastos en estudios subsecuentes.
Estos resultados se plasman en las tablas 10.15 y 10.16.
Tabla 10.15 Distribución de expresión cruzada de antígenos en Leucemia
Linfoblástica Aguda en niños
Cruzada (n=9) No. (%)
CD13 8 (21,1)
CD33 5 (13,2)
Más de un antígeno podía tener expresión cruzada en un mismo caso.
Tabla 10.16 Distribución de expresión asincrónica de antígenos en Leucemia
Linfoblástica Aguda en niños
Asincrónico(n=12) No. (%)
CD20* 11 (28,9)
CD4, CD8 1 (2,6)
* Sólo en un caso estuvo relacionada la expresión de CD20 con ausencia de CD34.
Las alteraciones antigénicas mencionadas con anterioridad se usaron para diseñar
los tubos de seguimiento y se observó una alta preservación del perfil antigénico
durante el seguimiento. Se registró pérdida de expresión del anticuerpo 7.1 como
se anotó anteriormente y un caso con pérdida de expresión de CD13. Sinembargo, los otros antígenos mantuvieron su expresión idéntica al diagnóstico lo
que facilitó la detección de los blastos en estudios de seguimiento.
10.4 CONCORDANCIA INTEROBSERVADOR Y REPRODUCIBILIDAD
METODOLÓGICA
Se obtuvo una cantidad importante de archivos *.fcs (flow cytometry standard file)
desde el año 2008 hasta el 2009. Se seleccionaron 121 registros correspondientes
a 38 niños de los cuales se tenía al menos tres estudios (diagnóstico y 2 de
seguimiento). En total, los estudios de seguimiento fueron 82. Con base en estos
datos se comparó el nivel de detección de Enfermedad Mínima Residual reportado
a través de los años por el personal entrenado que regularmente realiza estos
estudios utilizando el software Paint-a-gate, contra la medición realizada por el
estudiante de postgrado que desarrollaba su tesis, empleando el software
Infinicyt® 1.3. La gráfica 10.2 presenta la regresión logística correspondiente.
Gráfica 10.2 Regresión logística de acuerdo entre datos reportados y
observados de estudios de seguimiento por citometría de flujo en niños con
LLA
8.
6.
odatroper
4.
2.
0
0 .2 .4 .6 .8 1
observado
Reportado corresponde a los datos anotados en el registro electrónico del archivo de la fundación
Santa Fe de Bogotá. Observado corresponde a los datos obtenidos por el estudiante de postgrado
en su análisis individual de casos.Como se observa en la gráfica, la concordancia es alta. La correlación obtenida
fue de 98,81%, con un coeficiente de correlación de concordancia de 0,987 (IC
95%= 0,981-0,992). Los límites de acuerdo Bland y Altman fueron -0,033 a 0,039
(promedio de diferencia de 0,003) [Lin, L. I-K. 1989. A concordance correlation
coefficient to evaluate reproducibility. Biometrics 45: 255-68. ________. 2000. A
note on the concordance correlation coefficient. Biometrics 56: 324-25].
Si bien, la concordancia global fue más que satisfactoria, se exploró la correlación
entre dos observadores definiendo grupos acorde a los puntos de corte de
detección de blastos aceptados en la literatura. Considerando los puntos de corte
clínicos de Enfermedad Residual, se verificó el nivel de acuerdo empleando un
índice kappa. Se estratificó en los siguientes niveles de detección tanto el grupo
de reportado (Paint-a-gate) como el de observado (Infinicyt): <0,1% (<10-3), 0,1%-
1% (10-3-10-2), >1% y <5% (>10-2) y >5%. La tabla 10.17 muestra los datos
obtenidos de esa concordancia.
Tabla 10.17 Concordancia interobservadores en la detección de blastos en
estudios de seguimiento por citometría de flujo en niños con LLA
Observado latoT
1 2 3 4
1 31 11 5 0 47
odatropeR
2 3 9 0 0 12
3 0 3 7 0 10
4 0 1 1 11 13
Total 34 24 13 11 8822
Reportado corresponde a los datos anotados en el registro electrónico del archivo de la Fundación
Santa Fe de Bogotá. Observado corresponde a los datos obtenidos por el estudiante de postgrado
en su análisis individual de casos.
Categoría 1= blastos <0,1%, categoría 2= blastos 0,1-1%, categoría 3= blastos >1% y <5% y
categoría 4= blastos ≥5%.
Acorde a estos cálculos, el nivel de acuerdo fue 70,73% y el índice kappa 0,5689
(acuerdo moderado), resultados con significancia estadística. Cabe anotar que
muchos valores limítrofes quedaron en categorías diferentes a pesar de tener
diferencias numéricas menores; es decir, algún valor que se reportó originalmente
como 0,09% de blastos (observado) quedó registrado en categoría 1 y en el
análisis del estudiante de postgrado (reportado) tuvo un valor de 0,1%, por lo cual
quedaría incluido en categoría 2, generando discrepancia de categorías, pero que
en el acuerdo general numérico no es tan significativo.Estos datos sugieren que los resultados reportados, indiferentes del momento,
software y operario, son similares y se mantienen constantes. Cabe recalcar, que
puede llegar a ser importante incluir un margen de error del porcentaje de blastos
detectados considerando los puntos de corte y lo estricto que pueda llegar a ser la
consideración del clínico que maneja cada caso.
10.5 DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Las características generales del grupo estudiado, como son mayor proporción de
género masculino, edad promedio de 7,13 años y distribución de fenotipos con
predominio B son similares a los resultados presentados en estudios previamente
publicados. (Ravindranath 2003, Chan 2002) Este predominio de leucemias de
fenotipo B se ha atribuido a una mayor tasa de maduración de esta línea celular y
consecuente mayor riesgo de desarrollo de aberraciones genéticas que,
acompañados por un daño en la maquinaria de preservación genómica, facilita la
aparición de clones tumorales y la consecuente enfermedad hematológica.
(Ziegler 2005, Brunning 2001)
En relación con el conteo de blastos, se estableció que en promedio los pacientes
diagnosticados con LLA suelen tener altos porcentajes de células tumorales. Sin
embargo, se observó una desviación estándar muy amplia que puede estar
relacionado con alteraciones del aspirado de médula ósea que incluyen en
algunas ocasiones dilución con sangre periférica, en otros casos presencia de lisis
tumoral parcial, lo cual limita la cuantificación de blastos al deberse eliminar gran
cantidad de eventos de la citometría; además, los blastos tienen un
comportamiento biológico diferente a las otras células del aspirado por lo que su
supervivencia se puede modificar diferencialmente en relación con la población
celular total, situación que también altera el porcentaje de blastos.
Cuando se revisa la expresión antigénica en las leucemias linfoblásticas agudas
se identifica una serie de hallazgos importantes para considerar. La distribución de
antígenos para linaje B (expresión de CD10, CD19, CD34, CD38, HLA-DR y
ausencia de CD7, CD13, CD20, CD33 y mieloperoxidasa) y linaje T (expresión de
CD2, CD3 de citoplasma, CD5, CD7, CD34, CD38, CD45, HLA-DR y TdT y
ausencia de CD10, CD13, CD19, CD20, CD33) mostró la existencia de un fenotipo
frecuente de Leucemia Linfoblástica Aguda, similar a lo publicado previamente
(Brunning 2001). De la misma forma, se consideró que de existir un fenotipo
frecuente existiría uno no frecuente que se podría definir como la ausencia de
antígenos usualmente expresados como CD10, CD34, CD38 y HLA-DR, o la
presencia de antígenos no reconocidos con frecuencia como CD7 (en fenotipos
B), CD13, CD33 e IgM de citoplasma. Es importante anotar que CD10 fue un
marcador que presentó una variabilidad especial en el análisis. En el caso de las
LLA de fenotipo B se consideró su ausencia como algo infrecuente, pero se
excluyó de este concepto las 9 LLA proB (que tienen por definición ser CD10
negativas). Por el contrario, en LLA de fenotipo T CD10 sólo estuvo presente en 4de 15 casos, por tanto se consideró infrecuente su expresión. Sin embargo, otros
estudios han mostrado que CD10 es un marcador comúnmente observado en LLA
sin importar su fenotipo. (Brunning 2001) Este hallazgo de nuestro estudio puede
estar señalando que nuestra forma de definir la expresión de este antígeno puede
ser diferente a lo realizado en otros centros o que simplemente nuestras
leucemias T son realmente diferentes a las antes reportadas.
La detección de antígenos inusuales es una herramienta útil para confeccionar
tubos de fluoromarcadores más cortos y altamente sensibles y específicos para el
seguimiento de los pacientes con leucemia. Este hallazgo ha sido presentado en
varias ocasiones por el grupo de Saint Jude (Pui 2008, Pui 2004, Pui 2001) y se
siguió como derrotero para las actividades del servicio de patología de la
Fundación Santa Fe de Bogotá en las muestras analizadas para este estudio.
Se planteó la hipótesis que si alguno de estos antígenos de expresión infrecuente
tenía relación con aparición de blastos en médula ósea mayor o igual a 5% en
estudios de seguimiento posteriores a la inducción (persistencia y recaída
hematológica) o Enfermedad Mínima Residual, como se definió previamente. Los
resultados de este análisis mostraron que hay una serie de antígenos que tiene
una relación más estrecha con la aparición de los desenlaces adversos que
incluyeron expresión de CD33 y ausencia, infraexpresión o expresión parcial de
CD34 y/o CD38. Si consideramos que CD13 comúnmente se coexpresa con
CD33, sería esperable que la expresión del primero estuviera también relacionada.
Sin embargo, los casos CD13 positivos tenían períodos más cortos entre sus
estudios citométricos por lo que no se halló relación estadística. No se encontró
correlación con detección de niveles de EMR y fenotipo diagnóstico. Los datos no
se muestran en los resultados.
Previamente los inmunofenotipos habían sido analizados por el grupo de Saint
Jude quienes identificaron que la expresión de CD10, CD34 y CD19 eran
antígenos relacionados con desenlaces favorables (Coustan-Smith 2006, Pui
1993), hallazgo similar al observado en nuestro trabajo. Por otra parte, este mismo
grupo había observado previamente que la expresión cruzada de marcadores
mieloides carecía de valor pronóstico en LLA, dato que contradice nuestro
hallazgo relacionado con CD33. (Pui 1990) En relación con CD33 queda pendiente
definir si realmente el mayor riesgo de recurrir observado en nuestro estudio es
debido a la correlación que tiene su coexpresión con CD13 en pacientes con
cromosoma Philadelphia y, por ende, alto riesgo de recurrencia. (Tabernero 2001)
CD38 no había sido mencionado previamente en la literatura como un marcador
de importancia pronóstico y análisis adicionales deben ser realizados para definir
su verdadera importancia como aberrancia.
El análisis de los niveles de detección de blastos mostró que el estudio de
citometría de flujo es una herramienta útil para detectar células en niveles tan
bajos como 10-4. Sin embargo, los niveles de detección realmente útiles sonvalores mayores a 10-2 (1%) que tiene una alta correlación con aparición de
eventos adversos y los niveles inferiores a 10-4 (0,01%) que no presentaron
recaídas. Estos datos se parecen en cierta medida a los reportados por el grupo
de Saint Jude; sin embargo, la correlación de ese grupo es mucho mayor debido al
seguimiento clínico estricto que tienen de esos pacientes. (Pui 2000)
La consideración de los parámetros de aproximación diagnóstica mostró que la
infraexpresión es el parámetro más constantemente alterado en leucemias y
particularmente representado por CD45 en linaje B y CD3 de superficie en linaje T;
sin embargo, no había sido considerado en los reportes publicados por Orfao
(Orfao 2000), pero sí en los trabajos previos realizados por Borowitz. (Borowitz
1993) Seguramente el grupo español considera sólo las expresiones aberrantes
para sus análisis, y siendo infraexpresión tan frecuente puede ser considerada
más como un marcador leucémico que aberrancia antigénica. (Borowitz 1993)
Sobreexpresión de antígenos y expresión cruzada es menor en nuestro estudio
que lo reportado previamente. (Orfao 2000) Este fenómeno puede ocurrir debido
diferencias en la forma de establecer la positividad de los antígenos entre los
diferentes grupos.
Es de mencionar que sólo se encontró expresión de anticuerpo 7.1 en un caso, y
la expresión del mismo se perdió durante el seguimiento, por lo que la utilidad
teórica de este tipo de anticuerpos no pudo ser demostrada en este estudio.
Recordar que el anticuerpo 7.1 reconoce la proteína de fusión de la translocación
4;11, la cual se relaciona a su vez con un fenotipo CD10 negativo. (Campana
1999)
Se analizó la concordancia y reproducibilidad del estudio de citometría para la
detección de blastos en estudios de seguimiento. Los datos demostraron la alta
reproducibilidad del método a pesar de cambiar de software, operario y momento
de ejecución de la medición. Además, quedó demostrada la sencillez del método
pues permite valorar una gran cantidad de muestras en un corto período con alta
precisión; en este caso, el observador gastó entre 5 y 8 minutos analizando cada
caso (datos no mostrados). Consideraciones adicionales deben ser tenidas en
cuenta al analizar estos datos debido a los diferentes momentos históricos en que
se realizaron los estudios y el grado de entrenamiento del operario más que la
metodología y el software empleados.
Estos resultados muestran ciertas tendencias que deben ser validados con
estudios más grandes y con seguimiento clínico estricto, en particular, lo
relacionado con la correlación entre expresiones antigénicas y desenlaces
adversos.11. CONCLUSIONES
La Leucemia Linfoblástica Aguda es la neoplasia más frecuente en la población
pediátrica y su fenotipo diagnóstico más frecuente corresponde al prepreB o
común. Se reconoció la expresión frecuente de CD10, CD19, CD34, CD38 y HLA-
DR en leucemias de linaje B y CD2, CD5, CD7, CD34, CD45 y HLA-DR en el linaje
T. Igualmente, CD13 y CD33 estuvieron frecuentemente ausentes en este tipo de
neoplasia.
Los fenotipos infrecuentes se relacionaron con desenlaces adversos, pero sólo la
expresión de CD33, ausencia o expresión parcial de CD34 y CD38 demostraron
diferencias estadísticamente significativas en recaídas de Leucemia Linfoblástica
Aguda prepreB.
La citometría de flujo es una herramienta útil para detectar blastos en estudios de
seguimiento alcanzando niveles hasta de 10-4 y 10-5. Además, hay correlación
entre Enfermedad Residual >1% (10-2) al final de la inducción, o en cualquier
estudio de seguimiento posterior, con la aparición de recaídas, y niveles de blastos
<0,01% (10-4) en el mismo momento con ausencia de recaídas.
La infraexpresión de antígenos es el parámetro de aproximación diagnóstica más
frecuentemente observado en detección de Leucemia Linfoblástica Aguda,
particularmente la expresión débil o ausencia de expresión de CD45 en LLA de
linaje B y la infraexpresión de CD3 de superficie en LLA de fenotipo T. Este
hallazgo es además útil en la detección de Enfermedad Mínima Residual. Otras
alteraciones como sobreexpresión, expresión cruzada y asincrónica son de
ocasional aparición, pero también útiles a la hora de describir alteraciones y
durante el seguimiento paraclínico de los pacientes.
El estudio de inmunofenotipo por citometría de flujo es altamente reproducible
como queda demostrado en este estudio. Al emplearse una nueva plataforma
informática, un nuevo operador y un momento histórico diferente, los resultados
son similares a los reportados en su momento con niveles de concordancia altos y
bastante satisfactorios.
Como se observa en los enunciados anteriores, el estudio de inmunofenotipo por
citometría de flujo es una herramienta diagnóstica y de seguimiento altamente útil
en Leucemia Linfoblástica Aguda y el uso de fenotipo diagnóstico en la predicción
de aparición de blastos en estudios de seguimiento con niveles superiores o
iguales a 5% es una propuesta que surge de este trabajo pero requiere de
estudios de validación prospectivos con seguimiento clínico apropiados. Esta
utilidad del fenotipo muy seguramente está relacionada con alteraciones genéticas
y moleculares que son de aplicación y accesibilidad aún limitada en nuestro
medio, por lo que seguirán siendo desconocidas por algún tiempo. Sin embargo, elestudio de inmunofenotipo podría ayudar como un sustituto de los estudios
moleculares para ayudar a definir grupos de riesgo.
Quedan planteados muchos interrogantes sobre la verdadera utilidad de estos
datos y el valor que el fenotipo tenga realmente en estudios de mayor validez
externa que el actual. Se espera que este sea el germen de nuevos trabajos que
busque validar estos resultados en espacios clínicos más controlados.REFERENCIAS
Borowitz MJ, Guenther KL, Shults KE, Stelzer GT. (1993) Immunophenotyping
of acute leukemia by flow cytometric analysis. Use of CD45 and right-angle light
scatter to gate on leukemic blasts in three-color analysis. Am J Clin Pathol; 100:
534-40
Brunning RD, Borowitz M, Matutes E, Head D, Flandrin G, Swerdlow SH,
Bennett JM. (2001) Chapter 5: Precursor B-Cell and T-Cell Neoplasms. En:
Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW (Eds.): World Health Organization
Clasification of Tumours. Pathology and Genetics of Tumours of
Haematopoietic and Lymphoid Tissues. IARC Press: Lyon. p 109-17
Campana D, Coustan-Smith E. (2004) Minimal Residual Disease Studies by
Flow Cytometry in Acute Leukemia. Acta Haematol; 112: 8-15
Campana D, Coustan-Smith E. (2002) Advances in the Immunological
monitoring of Childhood Acute Lymphoblastic Leukaemia. Best Pract Res Clin
Haematol; 15: 1-19
Campana D, Neale GAM, Coustan-Smith E, Pui CH. (2001) Detection of
Minimal Residual Disease in Acute Lymphoblastic Leukemia: the St Jude
Experience. Leukemia; 15: 278-9
Campana D, Coustan-Smith E. (1999) Detection of Minimal Residual Disease
in Acute Leukemia by Flow Cytometry. Cytometry (Comm Clin Cytometry); 38:
139-52
Campana D, Pui CH. (1995) Detection of Minimal Residual Disease in Acute
Leukemia: Methodologic Advances and Clinical Significance. Blood; 85: 1416-
34
Cavé H, van der Werff ten Bosch J, Suciu S, Guidal C, Waterkeyn C, Otten J,
Bakkus M, Thielemans K, Grandchamp B, Vilmer E. (1998) Clinical Significance
of Minimal Residual Disease in Childhood Acute Lymphoblastic Leukemia. N
Engl J Med; 339: 591-8
Cazzaniga G, Bondi A. (2005) Molecular Monitoring of Childhood Acute
Lymphoblastic Leukemia using Antigen Receptor Gene Rearragements and
Quantitative Polimerase Chain Reaction Technology. Haematologica; 90: 382-
90Cazzaniga G, d’Aniello E, Corral L, Biondi A. (2003) Results of Minimal
Residual Disease (MRD) Evaluation and MRD-based Treatment Stratification in
Childhood ALL. Best Pract Res Clin Haematol; 15: 623-38
Cazzaniga G, Rossi V, Bondi A. (2002) Monitoring Minimal Residual Disease
using Chromosomal Translocations in Childhood ALL. Best Pract Res Clin
Haematol; 15: 21-35
Coustan-Smith E, Ribeiro RC, Stow P, Zhou Y, Pui CH, Rivera GK, Pedrosa F,
Campana D. (2006) A simplified flow cytometric assay identifies children with
acute lymphoblastic leukemia who have superior clinical outcome. Blood; 108:
97-102
Coustan-Smith E, Sancho J, Hancock ML, Razzouk BI, Ribeiro RC, Rivera GK,
Rubnitz JE, Sandlund JT, Pui CH, Campana D. (2002) Use of Peripheral Blood
instead of Bone Marrow to Monitor Residual Disease in Children with Acute
Lymphoblastic Leukemia. Blood; 100: 2399-402
Coustan-Smith E, Behm FG, Sánchez J, Boyett JM, Hancock ML, Raimondi
SC, Rubnitz JE, Rivera GK, Sandlund JT, Pui CH, Campana D. (1998)
Immunological Detection of Minimal Residual Disease in Children with Acute
Lymphoblastic Leukaemia. Lancet; 351: 550-4
Chan KW. (2002) Acute Lymphoblastic Leukemia. Curr Probl Pediatr; 32: 40-9
Chaparro-Alzogaray M, Estupiñán-Peñaloza FM. (2005) Importancia Clínica de
la Enfermedad Mínima Residual en niños con Leucemia Linfoide Aguda del
Hospital de la Misericordia (Tesis de grado) Universidad Nacional de Colombia,
Facultad de Medicina, Unidad de Oncohematología Pediátrica, Bogota DC.
Chen JS, Coustan-Smith E, Suzuki T, Neale GA, Mihara K, Pui CH, Campana
D. (2001) Identification of Novel Markers for Monitoring Minimal Residual
Disease in Acute Lymphoblastic Leukemia. Blood; 97: 2115-20
Davis BH, Holden JT, Bene MC, Borowitz MJ, Braylan RC, Cornfield D,
Gorczyca W, Lee R, Maiese R, Orfao A, Wells D, Wood BL, Stetler-Stevenson
M (2007). 2006 Bethesda International Consensus Recommendations on the
Flow cytometric Immunophenotypic Analysis of Hematolymphoid Neoplasia:
Medical Indications. Cytometry Part B (Clinical Cytometry); 72B: S5-S13
Estrov Z, Freedman MH. (1999) Detection of Residual Disease in Acute
Lymphoblastic Leukemia of Childhood. Leuk Lymphoma; 33: 47-52
Finn LS, Hawkins DS, Rutledge JC, Patterson K. (2004) Evaluation of early
marrow response in childhood aneuploid Acute Lymphoblastic Leukemia: FlowCytometric DNA analysis versus estándar morphology. Pediatr Dev Pathol; 7:
39-47
Foroni L, Harrison CJ, Hoffbrand AV, Potter MN. (1999) Investigation of Minimal
Residual Disease in Childhood and Adult Acute Lymphoblastic Leukaemia by
Molecular Analysis. Br J Haematol; 105: 7-24
Gaynon PS. (2005) Childhood Acute Lymphoblastic Leukaemia and Relapse.
Br J Haematol; 131: 579-87
Gaynon PS, Desai AA, Bostrom BC, Hutchinson RJ, Lange BJ, Nachman JB,
Reaman GH, Sather HN, Steinherz PG, Trigg ME, Tubergen DG, Uckun FM.
(1997) Early Response to Therapy and Outcome in Childhood Acute
Lymphoblastic Leukemia. Cancer; 80: 1717-26
Goulden N, Oakhill A, Steward C. (2001) Practical Application of Minimal
Residual Disease assessment in Childhood Acute Lymphoblastic Leukaemia.
Br J Haematol; 112: 275-281
Goulden N. (2002) Clinical Relevance of MRD in Children undergoing Allogenic
Stem Cell Transplantation for ALL. Best Pract Res Clin Haematol; 15: 59-70
Greig B, Oldaker T, Warzynski M, Wood B. (2007) 2006 Bethesda International
Consensus Recommendations on the Immunophenotypic Analysis of
Hematolymphoid Neoplasia by Flow Cytometry: Recommendations for Training
and Education to Perform Clinical Flow Cytometry. Cytometry Part B (Clinical
Cytometry); 72B: S23-S33
Hahn T, Wall D, Camitta B, Davies S, Dillon H, Gaynon P, Larson RA, Parsons
S, Seidenfeld J, Weisdorf D, McCarthy PL Jr. (2005) The Role of Cytotoxic
Therapy with Hematopoietic Stem Cell Transplantation in the Therapy of Acute
Lymphoblastic Leukemia in Children: An Evidence-Based Review. Biol Blood
Marrow Transplant; 11: 823-61
Hoelzer D, Gökbuget N, Ottmann O, Pui CH, Relling MV, Appelbaum FR, van
Dongen JJM, Szczepański T. (2002) Acute Lymphoblastic Leukemia.
Hematology Am Soc Hematol Educ Program: 162-92
Izraeli S, Waldman D. (2004) Minimal Residual Disease in Childhood Acute
Lymphoblastic Leukemia: Current Status and Challenges. Acta Haematol; 112:
34-9
Kwan E, Norris MD, Zhu L, Ferrara D, Marshall GM, Haber M. (2000)
Simultaneous Detection and Quantification of Minimal Residual Disease inChildhood Acute Lymphoblastic Leukaemia using Real-Time Polymerase Chain
Reaction. Br J Haematol; 109: 430-4
Lúcio P, Gaipa G, van Lochem EG, van Wering ER, Porwit-MacDonald A, Faria
T, Björklund E, Biondi A, van den Beemd MWM, Baars E, Vidriales B, Parreira
A, van Dongen JJM, San Miguel JF, Orfao A. (2001) BIOMED-I Concerted
Action Report: Flow Cytometry Immunophenotyping of Precursor B-ALL with
Standardized Triple-Stainings. Leukemia; 15: 1185-92
Lúcio P, Parreira A, van den Beemd MWM, van Lochem EG, van Wering ER,
Baars E, Porwit-MacDonald A, Björklund E, Gaipa G, Biondi A, Orfao A,
Janossy G, van Dongen JJM, San Miguel JF. (1999) Flow Cytometric Analysis
of Normal B cell Differentiation: A Frame of Reference for the Detection of
Minimal Residual Disease in Precursor B-ALL. Leukemia; 13: 419-27
Macedo A, Orfao A, Ciudad J, González M, Vidriales B, López-Berges MC,
Martínez A, Landolfi C, Cañizo C, San Miguel JF. (1995) Phenotypic análisis of
CD34 Subpopulations in Normal Human Bone Marrow and its Application for
the Detection of Minimal residual Disease. Leukemia; 9: 1896-901
Mandrell BN, Pritchard M. (2006) Understanding the Clinical Implications of
Minimal Residual Disease in Childhood Anemia. J Pediatr Oncol Nurs; 23: 38-
44
Moore MAS. (2001) Chapter 1: The Hematopoietic System and Hematopoiesis.
En Knowles DM (Ed): Neoplastic Hematopathology, 2nd edition. Lippincott
Williams & Wilkins, Philadelphia. p 1-42
Moppett J, Burke GAA, Steward CG, Oakhill A, Goulden NJ. (2003) The Clinical
Relevance of Detection of Minimal Residual Disease in Childhood Acute
Lymphoblastic Leukaemia. J Clin Pathol; 56: 249-53
Nachman JB, Sather HN, Sensel MG, Trigg ME, Cherlow JM, Lukens JN, Wolff
L, Uckun FM, Gaynon PS. (1998) Augmented Post-Induction Therapy for
Children with High-Risk Acute Lymphoblastic Leukemia and a Slow Response
to Initial Therapy. N Engl J Med; 338: 1663-71
Nagler A, Condiotti R, Rabinowitz R, Schlesinger M, Nguyen M, Terstappen
LWMM. (1999) Detection of Minimal Residual Disease (MRD) after Bone
Marrow Transplantation (BMT) by Multi-Parameter Flow Cytometry (MPFC).
Med Oncol; 16: 177-87
Nguyen DT, Diamond LW, Braylan RC. (2003) Flow Cytometry in
Hematopathology: A Visual Approach to Data Analysis and Interpretation.
Humana Press Inc., Totowa, New Jersey.Orfao A, Ciudad J, Almeida J, San Miguel JF. (2000) Chapter 10: Residual
Disease Detection of Leukemia. En Stewart CC, Nicholson JKA (Eds):
Immunophenotyping. Willey-Liss Inc., New York. p 239-59
Pérez-Vera P, Frias S, Carnevale A, Betancourt M, Mujica M, Rivera-Luna R,
Ortíz R. (2004) A strategy to detect chromosomal abnormalities in children with
Acute Lymphoblastic Leukemia. J Pediatr Hematol Oncol; 26: 294-300
Porwit-MacDonald A, Björklund E, Lucio P, van Lochem EG, Mazur I, Parreira
A, van den Beemd MWM, van Wering ER, Baars E, Gaipa G, Biondi A, Ciudad
J, van Dongen JJM, San Miguel JF, Orfao A. (2000) BIOMED-I Concerted
Action Report: Flow Cytometric Characterization of CD7+ cell subsets in
Normal Bone Marrow as a Basis for the Diagnosis and Follow-up of T cell Acute
Lymphoblastic Leukemia (T-ALL). Leukemia; 14: 816-25
Pui CH, Robinson LL, Look AT. Acute lymphoblastic leukaemia. (2008) Lancet;
371: 1030-43
Pui CH, Relling MV, Downing JR. Acute lymphoblastic leukemia. (2004) N Engl
J Med; 350: 1535-48
Pui CH, Schrappe M, Ribeiro RC, Niemeyer CM. (2004) Childhood and
Adolescent Lymphoid and Myeloid Leukemia. Hematology Am Soc Hematol
Educ Program: 118-45
Pui CH, Campana D, Evans WE. (2001) Childhood Acute Lymphoblastic
Leukaemia – Current Status and Future Perspectives. Lancet Oncol; 2: 597-
607
Pui CH. (2000) Acute Lymphoblastic Leukemia in Children. Curr Opin Oncol;
12: 3-12
Pui CH, Campana D. (2000) New Definition of Remission in Childhood Acute
Lymphoblastic Leukemia. Leukemia; 14: 783-5
Pui CH, Hancock ML, Head DR, Rivera GK, Look AT, Sandlund JT, Behm FG.
(1993) Clinical significance of CD34 experssion in childhood acute
lymphoblastic leukemia. Blood; 82: 889-94
Pui CH, Behm FG, Singh B, Rivera GK, Schell MJ, Roberts WM, Crist WM,
Mirro J Jr. (1990) Blood; 75: 198-202
Ravindranath Y. (2003) Recent Advances in Pediatric acute Lymphoblastic and
Myeloid Leukemia. Curr Opin Oncol; 15: 23-35Redaelli A, Laskin BL, Stephens JM, Botteman MF, Pashos CL. (2005) A
systematic Literature Review of the Clinical and Epidemiological Burden of
Acute lymphoblastic Leukaemia (ALL). Eur J Cancer Care (Engl); 14: 53-62
Roberts WM, Estrov Z, Ouspenskaia MV, Johnston DA, McClain KL, Zipf TF.
(1997) Measurement of Residual Leukemia during Remission in Childhood
Acute Lymphoblastic Leukemia. N Engl J Med; 336: 317-23
Rubnitz JE, Pui CH (2003). Recent Advances in the Treatment and
Understanding of Childhood Acute Lymphoblastic Leukaemia. Cancer Treat
Rev; 29: 31-44
Sandlund JT, Harrison PL, Rivera G, Behm FG, Head D, Boyett J, Rubnitz JE,
Gajjar A, Raimondi S, Ribeiro R, Hudson M, Relling M, Evans W, Pui CH.
(2002) Persistence of Lymphoblasts in Bone Marrow on day 15 and days 22 to
25 of Remission Induction Predicts a Dismal Treatment Outcome in Children
with Acute Lymphoblastic Leukemia. Blood; 100: 43-7
Schrappe M, Beier R, Bürger B. (2003) New Treatment Strategies in Childhood
Acute Lymphoblastic Leukaemia. Best Pract Res Clin Haematol; 15: 729-40
Seeger K, Viehmann S, Buchwald D, Harbott J, Schrappe M, Stary J, Henze G,
Trka J. (2001) Treatment Response and Residual-Disease Monitoring in Initial
and Relapsed TEL-AML1 Positive Childhood ALL. Leukemia; 15: 280-2
Sievers EL, Radich JP. (2000) Detection of Minimal Residual Disease in Acute
Leukemia. Curr Opin Hematol; 7: 212-6
Silverman LB, Sallan SE. (2003) Newly Diagnosed Childhood Acute
Lymphoblastic Leukemia: update on Prognostic Factors and Treatment. Curr
Opin Hematol; 10: 290-6
Silverman LB, Gelber RD, Young ML, Dalton VK, Barr RD, Sallan SE. (1999)
Induction Failure in Acute Lymphoblastic Leukemia of Childhood. Cancer; 85:
1935-404
Stewart CC, Mayers GL (2000). Chapter 1: Kinetics of Antibody Binding to
Cells. En Stewart CC, Nicholson JKA (Eds): Immunophenotyping. Willey-Liss
Inc., New York. p 1-11
Szczepański T, Flohr T, van der Velden VHJ, Bartram CR, van Dongen JJM.
(2002) Molecular Monitoring of Residual Disease using Antigen Receptor
Genes in Childhood Acute Lymphoblastic Leukaemia. Best Pract Res Clin
Haematol; 15: 37-57Tabernero MD, Bortoluci AM, Alaejos I, Rasillo A, García-Sanz R, García M,
Sayagués JM, González M, Mateo G, San Miguel JF, Orfao A. Adult precursor
B-ALL with BCR/ABL gene rearrangements displays a unique
immunophenotype based on the pattern of CD10, CD34, CD33 and CD38
expression. Leukemia; 15: 1671-2
Tzortzatou-Stathopoulou F, Papadopoulou AL, Moschovi M, Botsonis A,
Tsangaris GT. (2001) Low Relapse Rate in Children With Acute Lymphoblastic
Leukemia After Risk-Directed Therapy. J Pediatr Hemat Oncol; 23: 591-7
van Dongen JJM, Seriu T, Panzer-Grümayer ER, Biondi A, Pongers-Willemse
MJ, Corral L, Stolz F, Schrappe M, Masera G, Kamps WA, Gadner H, van
Wering ER, Ludwig WD, Basso G, de Bruijn MAC, Cazzaniga G, Hettinger K,
van der Does-van den Berg A, Hop WCJ, Riehm H, Bartram CR. (1998)
Prognostic Value of Minimal Residual Disease in Acute Lymphoblastic
Leukaemia in Childhood. Lancet; 352: 1731-38
van Lochem EG, van der Velden VHJ, Wind HJ, te Marvelde JG, Westerdaal
NAC, van Dongen JJM. (2004) Immunophenotypic Differentiation Patterns of
Normal Hematopoyesis in Human Bone Marrow: Referente Patterns for Age-
Related Changes and Disease-Induced Shifts. Cytometry Part B (Clinical
Cytometry); 60B: 1–13
van Wering ER, van der Linden-Schrever BEM, Szczepański T, Williemse MJ,
Baars EA, van Wijngaarde-Schmitz HM, Kamps WA, van Dongen JJM. (2000)
Regenerating normal B-cell Precursors during and after Treatment of Acute
Lymphoblastic Leukaemia: Implications for Monitoring of Minimal Residual
Disease. Br J Haematol; 110: 139-46
Wickramasinghe SN. (1997) Chapter 31: Bone Marrow. En: Sternberg SS (Ed.):
Histology for Pathologists 2nd edition. Lippincott-Raven Publishers,
Philadelphia. p. 707-42
Weir EG, Cowan K, LeBeau P, Borowitz MJ. (1999) A Limited Antibody Panel
can distinguish B-Precursor Acute Lymphoblastic Leukemia from Normal B
Precursors with Four Color Flow Cytometry: Implications for Residual Disease
Detection. Leukemia; 13: 558-67
Wood BL, Arroz M, Barnett D, DiGiuseppe J, Greig B, Kussick SJ, Oldaker T,
Shenkin M, Stone E, Wallace P. (2007) 2006 Bethesda International
Consensus Recommendations of the Immunophenotypic Analysis of
Hematolymphoid Neoplasia by Flow Cytometry: Optimal Reagents and
Reporting for the Flow Cytometric Diagnosis of Hematopoietic Neoplasia.
Cytometry Part B (Clinical Cytometry); 72B: S14-S22Ziegler DS, Dalla Pozza L, Waters KD, Marshall GM. (2005) Advances in
Childhood Leukaemia: Successful Clinical-trials Research leads to
individualized therapy. Med J Aust; 182: 78-81
zur Stadt U, Harms DO, Schlüter S, Schrappe M, Goebel U, Spaar H, Janka G,
Kabisch H. (2001) MRD at the end of Induction Therapy in Childhood Acute
Lymphoblastic Leukemia: Outcome Prediction strongly depends on the
Therapeutic Regimen. Leukemia; 15: 283-85
Zwick D, Cooley L, Hetherington M. (2006) Minimal Residual Disease testing of
Acute Lekemia by Flow Cytometry Immunophenotyping: a retrospective
comparison of detection rates with Flow Cytometry DNA ploidy or FISH-based
methods. Lab Hematol; 12: 75-81ANEXOCONSENTIMIENTO INFORMADO
(Artículos 14,15 y 16 de la Resolución 8430 de 1993)
Yo _________________________________ , identificado con ____________________________
En representación legal de ______________________________ manifiesto haber sido informado
sobre el objetivo de la recolección de una muestra de sangre de medula ósea (tomada durante los
procedimientos de medula ósea (MO) programados dentro del protocolo) y de sangre periférica (la
muestra se toma durante la misma punción del cuadro hemático) para evaluar probables
marcadores de enfermedad residual no evidente con los exámenes usuales como las biopsias y
citologías de medula ósea y hemogramas realizados durante el tratamiento.
Las muestras tienen como fin ser evaluadas para unos marcadores que buscan evaluar si hay
enfermedad leucémica residual NO evidente con los estudios que se hacen a la fecha.
Dado que de los resultados de esta búsqueda aún no sabemos su real utilidad y lo que
pretendemos es aclarar si los hallazgos tienen o no relación con el comportamiento futuro de la
enfermedad, por ahora estos resultados no serán tenidos en cuenta sino que se verificaran al final
del tratamiento buscando si se asociaron a eventos como recaída o persistencia de enfermedad.
Seré informado de los resultados en el momento en que yo lo solicite, también podré solicitar
información adicional de la evolución del conocimiento y su impacto en estos resultados, podré
rehusarme a autorizar que se lleven a cabo los estudios en las muestras posteriores (se han
programado entre 2 y 3 muestras), estos procedimientos no representarán riesgo adicional dado
que se realizarán en el mismo tiempo anestésico de la quimioterapia intratecal programada dentro
de su protocolo de tratamiento.. No se tomaran biopsias de médula ósea ni cuadros hemáíicos
adicionales con miras a realizar única y exclusivamente estos marcadores.
Podré retirar mi consentimiento para continuar con esta evaluación en el momento que lo
considere pertinente.
Los resultados de esta evaluación NO tendrán por ahora ningún impacto sobre el tratamiento
propuesto a mi hijo.
No habrá perjuicio para el paciente en caso de retirar mi consentimiento para continuar con esta
evaluación.
En constancia de lo anterior y sin dudas o aclaraciones adicionales firmo:
__________________________ ____________________________
c.c. c.c.
Dirección Dirección
En calidad de: Testigo:
__________________________
c.c.
Dirección
Testigo
Tomado de Chaparro-Alzogaray M, Estupiñán-Peñaloza FM. (2005) Importancia Clínica de la
Enfermedad Mínima Residual en niños con Leucemia Linfoide Aguda del Hospital de la
Misericordia (Tesis de grado) Universidad Nacional de Colombia, Facultad de Medicina, Unidad de
Oncohematología Pediátrica, Bogota DC