Inmovilización de pectinasas y/o celulasas y determinación de algunos de sus efectos en el jugo de guayaba
Autor: Ríos Alzate, Luis Rolando
Asesor: Giraldo Gómez, Gloria Inés (Thesis advisor)
Fecha: 2002
Programa: Bogotá - Medicina -Fisioterapia
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Muchos factores influencian el procedimiento de inmovilización por enlace covalente sobre quitina, pero a su vez son susceptibles de ser optimizados en función de obtener una alta actividad catalítica. Es así como mediante la utilización de un diseño factorial, se alcanzó la relación entre temperatura (45ºC), concentración de activante (4% de ácido acético) y volumen de brazo espaciador (1.6 mL de glutaraldehido); para obtener un protocolo viable y reproducible de inmovilización de pectinasas y celulasas a partir de un cóctel enzimático comercial (Naturalzyme 200 XL). Las características cinéticas y los parámetros de temperatura y pH, fueron determinados para la enzima libre y la inmovilizada evaluando las ventajas y desventajas con su consecuente aplicación en la reducción de viscosidad de un jugo de guayaba. Es así como se abre una posibilidad de aplicación en la industria de jugos, apartir de la simulación de operación de un reactor PFR, además se realizaron varios seguimientos sobre la influencia del brazo espaciador en la superficie del soporte y sus efectos en el proceso general de inmovilización mediante microscopía de barrido electrónico (ESEM). / Abstract: Many factors influence the immobilization procedure for covalent bound on chitin, but in turn they are susceptible of being optimized in function of obtaining a high catalytic activity. It is as well as by means of the use of a factorial design, the relationship was reached among temperature (45ºC), activer concentration (4% of acetic acid) and volume of space arm (1.6 glutaraldehyde mL); to obtain a viable protocol and reproducible of pectinase and celulase immobilization to leave from a commercial enzymatic cocktail (Naturalzyme 200 XL). The kinetic characteristics and the parameters of temperature and pH, they were determined for the free enzyme and the immobilized, evaluating the advantages and disadvantages with their consequent application in the reduction of viscosity of a guava juice. It is as well as an application possibility opens up in the industry of juices, to leave of the simulation of operation of a PFR reactor, was also carried out several pursuits on the influence of the space arm in the surface of the support and its effects in the general process of immobilization by means of scanning electron microscopy (ESEM).

INMOVILIZACION DE PECTINASAS Y/O CELULASAS Y
DETERMINACION DE ALGUNOS DE SUS EFECTOS
EN EL JUGO DE GUAYABA
LUIS ROLANDO RIOS ALZATE
FRANCISCO JAVIER ARIAS VARGAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA
INGENIERIA QUÍMICA
2002
1INMOVILIZACION DE PECTINASAS Y/O CELULASAS Y
DETERMINACION DE ALGUNOS DE SUS EFECTOS
EN EL JUGO DE GUAYABA
LUIS ROLANDO RIOS ALZATE
Código 394515
Linea de profundizacion: Alimentos
FRANCISCO JAVIER ARIAS VARGAS
Código 394519
Linea de profundizacion: Alimentos
Trabajo para optar al título de
Ingeniero Químico
MODALIDAD: TRABAJO DE GRADO
DIRECTORA:
GLORIA GIRALDO
TECNÓLOGA QUÍMICA
ESPECIALISTA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
ADMINISTRADORA DE EMPRESAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA
INGENIERIA QUÍMICA
2002
2Nota de aceptación
Presidente del Jurado
Jurado
Jurado
Manizales, día mes año
3A Edelmira, Carolina, Rosalba y en especial
A mi hermana Liliana por su apoyo
Incondicional y constante
Luis Rolando.
A Floralba, Julio y Ana Maria por su
dedicación, sacrificio y apoyo.
Francisco Javier.
4AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a:
Proenzimas S.A y en especial a Rodrigo Mejía Gómez, por su valiosa ayuda y
constante apoyo a todo nivel.
Folcol Ltda. y en especial a su Gerente Adán Cruz, por su generosa colaboración
para con el proyecto.
Joürgen Schneider Subdirector de la División Biotecnológica de la Worthington
Biochemical Corporation, por sus aportes bibliográficos.
Jean Dornier Investigador del CIRAD , por la colaboración prestada.
Gloria Inés Giraldo, Directora del trabajo de grado, por su irrestricto y diligente
apoyo.
Al personal Humano que conforma los Laboratorios de Química de la Universidad
Nacional de Colombia por su colaboración constante y oportuna.
5RESUMEN
Muchos factores influencian el procedimiento de inmovilización por enlace
covalente sobre quitina, pero a su vez son susceptibles de ser optimizados en
función de obtener una alta actividad catalítica. Es así como mediante la utilización
de un diseño factorial, se alcanzó la relación entre temperatura (45ºC),
concentración de activante (4% de ácido acético) y volumen de brazo espaciador
(1.6 mL de glutaraldehido); para obtener un protocolo viable y reproducible de
inmovilización de pectinasas y celulasas a partir de un cóctel enzimático comercial
(Naturalzyme 200 XL).
Las características cinéticas y los parámetros de temperatura y pH, fueron
determinados para la enzima libre y la inmovilizada evaluando las ventajas y
desventajas con su consecuente aplicación en la reducción de viscosidad de un
jugo de guayaba. Es así como se abre una posibilidad de aplicación en la industria
de jugos, apartir de la simulación de operación de un reactor PFR, además se
realizaron varios seguimientos sobre la influencia del brazo espaciador en la
superficie del soporte y sus efectos en el proceso general de inmovilización
mediante microscopía de barrido electrónico (ESEM).
ABSTRACT
Many factors influence the immobilization procedure for covalent bound on chitin,
but in turn they are susceptible of being optimized in function of obtaining a high
catalytic activity. It is as well as by means of the use of a factorial design, the
relationship was reached among temperature (45ºC), activer concentration (4% of
acetic acid) and volume of space arm (1.6 glutaraldehyde mL); to obtain a viable
protocol and reproducible of pectinase and celulase immobilization to leave from a
commercial enzymatic cocktail (Naturalzyme 200 XL).
The kinetic characteristics and the parameters of temperature and pH, they were
determined for the free enzyme and the immobilized, evaluating the advantages
and disadvantages with their consequent application in the reduction of viscosity of
a guava juice. It is as well as an application possibility opens up in the industry of
juices, to leave of the simulation of operation of a PFR reactor, was also carried out
several pursuits on the influence of the space arm in the surface of the support and
its effects in the general process of immobilization by means of scanning electron
microscopy (ESEM).
6TABLA DE CONTENIDO
Página
INTRODUCCIÓN
1. OBJETIVOS 16
1.1 OBJETIVO GENERAL 16
1.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS 16
2 REVISIÓN BIBLIOGRAFICA 17
2.1 PARED CELULAR DE LAS FRUTAS 17
2.1.1 La pectina 17
2.1.1.1 Las enzimas pecticas 19
2.1.1.2 Enzimas saponificadoras 19
2.1.1.3 Enzimas depolimerizadoras 20
2.1.1.4 La pectin-liasa 21
2.1.2 La celulosa 22
2.1.2.1 Las enzimas celulíticas 22
2.2 ZUMOS DE FRUTAS TROPICALES 24
2.3 GUAYABA 24
2.4 PROCESOS GENERALES DE INMOVILIZACION DE ENZIMAS 27
2.4.1 Escogencia del soporte y el método 27
2.4.2 Métodos de inmovilización de enzimas 29
2.4.3 Inmovilización por adsorción 29
2.4.3.1 Principales ventajas del método 29
2.4.3.2 Principales desventajas 30
2.4.4 Enlace covalente 30
2.4.5 Atrapamiento 35
2.4.6 Encapsulación 36
2.4.7 Reticulación 37
2.4.8 Soportes para la inmovilización de enzimas 39
2.4.8.1 La quitina 40
2.4.9 Inmovilización sobre quitina 41
2.5 PROPIEDADES CINÉTICAS 44
2.5.1 Velocidad de reacción 44
2.5.2 Determinación de las constantes cinéticas 46
2.5.3 Efectos de la temperatura y el pH 47
2.6 ESTABILIDAD OPERACIONAL DEL CONJUNTO ENZIMA SOPORTE 49
3 MATERIALES Y MÉTODOS 52
3.1 MATERIALES 52
3.2 ENZIMA UTILIZADA 52
3.3 EQUIPOS DE ANALISIS 52
3.4 EQUIPOS DE PROCESO 52
3.5 MÉTODOS 53
3.5.1 Preparación del soporte 53
3.5.2 Preparación y caracterización de la pulpa 54
3.5.3 Preparación del jugo 54
3.5.4 Curvas patrón 55
3.5.5 Caracterización de la enzima 55
3.5.6 Ensayos preliminares 55
3.5.7 Diseño 2n 57
3.5.8 Ecuación del sistema de inmovilización 58
3.5.9 Respuesta de la pectinasa frente a diferentes parámetros 59
3.5.9.1 Respuesta frente al pH (pectinasa libre e inmovilizada) 59
73.5.9.2 Actividad pectinasa (libre e inmovilizada) frente a la temperatura 59
3.5.9.3 Actividad pectinasa (libre e inmovilizada) frente a la concentración 59
3.5.10 Respuesta de la celulasa frente a diferentes parámetros 59
3.5.11 Reducción en la viscosidad del jugo de guayaba 60
3.5.12 Efecto de la enzima libre e inmovilizada en los azucares reductores. 60
3.5.13 Determinación de la estabilidad operacional 61
3.5.14 Visualización de algunos efectos en el proceso de inmovilización 61
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 62
4.1 CARACTERIZACION DE LA PULPA 62
4.2 CURVAS PATRON 62
4.2.1 Curva patrón de proteína 62
4.2.2 Curva patrón de azucares reductores 63
4.3 ENSAYOS PRELIMINARES 64
4.4 IDENTIFICACIÓN DE LOS PARÁMETROS A OPTIMIZAR 65
4.5 ECUACIONES DEL COMPORTAMIENTO DEL SISTEMA BASADO EN LA 67
ACTIVIDAD CATALÍTICA Y EN LA CANTIDAD DE PROTEÍNA
4.6 PROTOCOLO DE INMOVILIZACIÓN PARA PECTINASAS 68
4.7 RESPUESTA DE LA PECTINASA FRENTE A DIVERSOS PARAMETROS 69
4.7.1 Respuesta frente al pH (pectinasa libre e inmovilizada) 69
4.7.2 Actividad pectinasa (libre e inmovilizada) frente a la temperatura 70
4.7.3 Actividad pectinasa libre e inmovilizada frente a la concentración de 71
sustrato
4.7.4 Lineweaber burk para pectinliasa libre e inmovilizada 72
4.8 RESPUESTA DE LA CELULASA FRENTE A DIFERENTES PARÁMETROS 73
4.8.1 Actividad celulasa libre e inmovilizada frente al pH 73
4.8.2 Actividad celulasa libre e inmovilizada frente a la concentración de sustrato 74
4.8.3 Lineweaber burk para celulasa libre e inmovilizada 75
4.8.4 Actividad celulasa libre e inmovilizada frente a la temperatura 77
4.9 ESTABILIDAD OPERACIONAL DEL CONJUNTO INMOVILIZADO 78
4.10 EFECTO ENZIMATICO DE LA ENZIMA LIBRE E INMOVILIZADA SOBRE 79
EL JUGO DE GUAYABA
4.10.1 Reducción en la viscosidad del jugo de guayaba 79
4.10.2 Efecto de la enzima libre e inmovilizada en los azucares reductores. 83
4.11 VISUALIZACIÓN DE LA INMOVILIZACIÓN Y EL EFECTO DEL BRAZO 84
ESPACIADOR .
4.11.1 Poro de quitina antes y después de la inmovilización 84
4.11.2 Inmovilización con y sin brazo espaciador 85
4.11.3 Influencia del brazo espaciador en el efecto conformacional 86
4.12 COSTOS DE PREPARACIÓN DEL SOPORTE 88
5 CONCLUSIONES 89
6 RECOMENDACIONES 92
7 BIBLIOGRAFÍA 93
8LISTA DE SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
AE. Amino etil
Batch: Reactor por lotes.
ºC: Grado Centígrado
C1: Exo-β-Glucanasa a la celulosa
CMC: Carboxi Metil Celulosa
CSTR: Reactor de tanque agitado.
Cx: Endo-(1,4)-β-Gluconasa
DEAE Dietil amino etil
DNS: Ácido Dinitro Salicílico
FBR: Reactor de lecho fluidizado
HEC Hidroxi etil celulosa
Glu: Glutaraldehido.
Kw: Kilowatio
K : Constante de Michaelis Menten
M
mL: Mililitro
ME Molécula espaciadora
Nm: Nanómetro
NAG n-acetil-glucosamina
PFR Reactor de lecho empacado
PL: Pectin-Liasa
PE: Pectin-esterasa
SEM: Microscopia de barrido electrónico
Torr: Torricelli.
t Vida media
1/2
µL: Microlitro
µm: Micrómetro
UI: Unidades internacionales
UV: Ultra violeta visible
V Velocidad máxima de reacción
max
9LISTA DE TABLAS
Página
Tabla 1. Producción mundial estimada de puré de guayaba (1987-1988) 27
Tabla 2. Consideraciones fundamentales en la selección del soporte y el método de 28
Inmovilización.
Tabla 3 Porcentaje de reactividad relativa de residuos de aminoácidos 34
Tabla 4. Número de reacciones en las que cada aminoácido participa 34
Tabla 5. Resumen de algunas propiedades para las diferentes clases de 39
Inmovilización
Tabla 6 Materiales empleados 52
Tabla 7. Listado de métodos usados para la caracterización de la pulpa 54
Tabla 8. Listado de métodos usados para la caracterización de la enzima 55
Tabla 9. Datos para la inmovilización de pectinasa sobre quitosano sin molécula 56
espaciadora
Tabla 10. Inmovilización de pectinasa sobre quitosano usando molécula espaciadora 56
Tabla 11. Condiciones del protocolo de inmovilización. 58
Tabla 12. Niveles máximos(+) y mínimos(–) de las variables del plan 58
Tabla 13. Matriz de experiencia para el plan 23 58
Tabla 14 Caracterización de la pulpa de guayaba obtenida 62
Tabla 15. Datos para la obtención de la curva de proteína (Método de Biuret) 62
Tabla 16. Datos para la obtención de la curva patrón de Azucares reductores (DNS) 63
Tabla 17. Resumen sobre los resultados obtenidos mediante los protocolos 64
especificados las tablas 9 y 10 (Pruebas realizadas por triplicado)
Tabla 18. Condiciones del protocolo de inmovilización 65
Tabla 19. Niveles máximos(+) y mínimos(–) de las variables del plan 66
Tabla 20. Matriz de experiencia para el plan 23 66
Tabla 21. Respuestas Obtenidas del Plan (Pruebas por Duplicado) 66
Tabla 22. Parámetros de la proteína inmovilizada 67
Tabla 23. Parámetros para la actividad de la pectinasa inmovilizada 67
Tabla 24 Datos para generar la curva de Pectinasa libre Vs pH A4
Tabla 25. Datos para generar la curva de la pectinasa inmovilizada vs pH A4
Tabla 26. Datos para generar la curva Pectinasa libre Vs Temperatura A4
Tabla 27. Datos para generar la curva de la pectinasa inmovilizada frente a la A4
temperatura
Tabla 28. Datos para generar la curva de pectinasa libre Vs Concentración de A4
Sustrato
Tabla 29. Datos para generar la curva Pectinasa Inmovilizada frente a la A4
concentración de sustrato
Tabla 30. Doble recíprocos para generar la grafica de lineweaber (pectinasa libre) A4
Tabla 31. Dobles recíprocos para generar lineweaber de la pectinasa inmovilizada A4
Tabla 32. Datos obtenidos para generar la curva celulasa libre frente al pH A4
Tabla 33. Datos para generar la curva de Celulasa inmovilizada frente al pH A4
Tabla 34. Datos obtenidos para generar la curva Actividad Celulasa Libre frente a la A4
concentración de Sustrato
Tabla 35. Datos obtenidos para generar la curva Actividad Celulasa A4
Inmovilizada frente a la concentración de Sustrato
Tabla 36. Datos lineweaber para celulasa libre A4
Tabla 37. Datos lineweaber para celulasa inmovilizada A4
10Tabla 38. Datos de estabilidad operacional A4
Tabla 39. Datos para la reducción de viscosidad jugo guayaba (enzima libre) A4
Tabla 40. Datos para la reducción de viscosidad jugo guayaba (enzima inmovilizada) A4
Tabla 41. Comparación en la Reducción de la viscosidad del Jugo de Guayaba 81
Tabla 42. Datos de Estabilidad Operacional (Batch) para un Jugo de Guayaba 82
Tabla 43. Costo por paso en el proceso de inmovilización (costo por gramo) 88
11LISTA DE FIGURAS
Página
Fig.1 Porción de una molécula de pectina 17
Fig. 2 Ácido α-D-Galacturónico 18
Fig. 3 Gráfico de zonas cabelludas 18
Fig.4 Acción de la Depolimerasa sobre la pectina 19
Fig.5 Acción de la Pectinesterasa sobre la Pectina 19
Fig.6 Enzimas Depolimerizadoras 20
Fig. 7 Reacción Vía Endomecanismo 20
Fig.8 Reacción Vía Exomecanismo 21
Fig.9 Acción de la Pectin-liasa 21
Fig. 10 Porción de una molécula de celulosa 22
Fig. 11 Ataque de la Endo-β-Glucanasa a la celulosa 23
Fig. 12 Ataque de la Exo-β-Glucanasa a la celulosa 23
Fig. 13 Psidium Guajaba (Guayaba Común) 25
Fig. 14 Interior de la guayaba 26
Fig. 15 inmovilización por adsorción 29
Fig. 16 Inmovilización por Enlace Covalente 31
Fig. 17 Microarquitectura de algunos soportes de material usados para la 32
Inmovilización de enzimas
Fig. 18 Inmovilización por atrapamiento 36
Fig. 19 Inmovilización por Encapsulación 37
Fig. 20 Inmovilización por Reticulación 38
Fig. 21 Resumen sobre los métodos de inmovilizacion 38
Fig. 22 Estructura de la Química de la Quitina 40
Fig.23 Estructura Química del Quitosano 41
Fig.24 Proceso General de Inmovilización sobre Quitosano 43
Fig. 25 Efecto de la concentración de reactante en la velocidad de una reacción 46
catalizada Por una enzima.
Fig. 26 Grafico de dobles recíprocos 47
Fig.27 Efecto de la temperatura en la actividad enzimática (esta respuesta es 48
esperable típicamente en un rango de 0 a 100 ºC)
Fig.28 Relación entre la actividad enzimática y el pH 49
Fig. 29 Estabilidad operacional de una enzima inmovilizada 50
Fig. 30 Gráfico de la estabilidad operacional 51
Fig.31 Materia prima empleada en la elaboración de la pulpa 54
Fig.32 Reactor de lecho empacado utilizado 61
Fig. 33 Curva patrón de Proteína 63
Fig.34 Curva Patrón de Azucares Reductores 64
Fig.35 Hojuelas con enzima inmovilizada 69
Fig.36 Respuesta de la Pectinasa libre frente al pH 69
Fig.37 Respuesta de la Pectinasa Inmovilizada frente al pH 70
Fig.38 Respuesta de la pectinasa libre frente a la temperatura 70
Fig.39 Respuesta de la pectinasa inmovilizada frente a la temperatura 71
Fig. 40 Respuesta de la pectinasa libre frente a la concentración de sustrato 71
Fig 41 Respuesta de la pectinasa inmovilizada frente a la concentración de 72
sustrato
Fig 42 Curva de Lineweaber para la pectinasa libre 72
Fig. 43 Grafico de lineweaber para la pectinasa inmovilizada 73
Fig. 44 Actividad celulasa libre frente al pH 74
Fig. 45 Actividad celulasa Inmovilizada frente al pH 74
Fig. 46 Respuesta de la celulasa libre frente a la concentración de sustrato 75
Fig. 47 Respuesta de la celulasa inmovilizada frente a la concentración de sustrato 75
12Fig. 48 Grafico de lineweaber para la celulasa libre 76
Fig. 49 Gráfico de lineweaber para celulasa inmovilizada 76
Fig. 50 Respuesta de la celulasa libre frente a la temperatura 77
Fig. 51 Respuesta de la celulasa inmovilizada frente a la temperatura 78
Fig. 52 Estabilidad operacional del conjunto inmovilizado 78
Fig. 53 Linealización de la estabilidad operacional 79
Fig. 54 Efecto de la Enzima libre sobre la viscosidad en el jugo de guayaba 80
Fig. 55 Linealización del efecto de la enzima libre sobre la viscosidad el jugo de 80
guayaba
Fig. 56 Efecto de la enzima inmovilizada sobre la viscosidad el jugo de guayaba 81
Fig. 57 Linealización del efecto de la enzima inmovilizada sobre la viscosidad el 81
jugo de guayaba
Fig. 58 Aumento de azucares reductores en la guayaba (celulasa libre) 83
Fig. 59 Aumento de azucares reductores en la guayaba (inmovilizada) 83
Fig. 60 Poro de quitosano antes de la inmovilización 84
Fig. 61 Poro de quitosano después del proceso de inmovilización 85
Fig. 62 Inmovilización sin brazo espaciador 86
Fig. 63 Inmovilización con brazo espaciador 86
Fig. 64 Acercamiento a una estructura de proteína sin brazo espaciador 87
Fig. 65 Acercamiento a una estructura de proteína con brazo espaciador 87
13LISTA DE ANEXOS
ANEXO 1 METODO DE BIURET
ANEXO 2 METODO DEL DNS PARA LA DETERMINACION DE AZUCARES REDUCTORES
ANEXO 3 DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD CATALITICA PECTINASA Y CELULASA
ANEXO 4 TABLAS DE RESULTADOS
ANEXO 5 FICHA TECNICA DE LA ENZIMA
14INTRODUCCION
Con el auge de la biotecnología, las enzimas son los catalizadores mas estudiados
actualmente frente a los demás; pues presentan una mayor selectividad frente al
sustrato o reactivo, mayor rendimiento, hacen la conversión de reactivo a producto
más rápido y con una ventaja que supera a todas la anteriores y es que se
presentan con abundancia en la naturaleza lo que hace muy fácil su acceso.
Las preparaciones enzimáticas (cócteles) son ampliamente utilizadas en la
industria de procesamiento de jugos por sus efectos en el proceso, por ejemplo la
reducción de la viscosidad y la licuefacción de la pared celular. Esta última
requiere una cantidad y presencia de varias enzimas como son pectinasas y
celulasas para obtener un sinergismo entre ambas. Inmovilizando estas enzimas
en un soporte sólido, se puede tener la posibilidad de la reutilización de la
actividad catalítica, el control de la reacción y el posible diseño de un bioreactor
con el consecuente beneficio de poder llevar un proceso de tipo batch a continuo.
La inmovilización de pectinasas y celulasas ha sido ampliamente estudiada en la
industria de alimentos y la industria del papel. El uso de estas enzimas
inmovilizadas en la industria de jugos, requiere varias condiciones como son
soportes baratos y accesibles que contengan grupos reactivos que permitan una
activación fácil y que a su vez no sean tóxicos, a su vez que permitan una
estabilidad adecuada en la industria alimenticia. La quitina, cumple con estos
requerimientos; ella ha sido ampliamente utilizada en alimentos y en la industria
farmacéutica.
Con este trabajo se inmovilizaron pectinasas a partir del cóctel enzimático
Naturalzyme 200 XL (Ver anexo 5) en un soporte de quitina, al mismo tiempo que
se obtuvo un protocolo de inmovilización para tal enzima con base en un plan de
experiencia factorial (2n) el cual proporciono un modelo matemático que relaciona
las tres variables principales en la inmovilización como son la temperatura de
activación, concentración de activante y concentración del brazo espaciador. Así
mismo, se compararon las posibilidades de la inmovilización sobre quitina y se
evaluaron algunos parámetros propios de la catálisis enzimática tales como la
constante de Michaelis-Menten (K ), velocidad máxima (V ) y tiempo de vida
m m
media (t ), así como su efecto en la reducción de la viscosidad de un jugo de
1/2
guayaba y su evaluación en la producción de azucares reductores.
151. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Inmovilizar pectinasas y/o celulasas sobre quitina
1.2 Objetivos específicos:
(cid:153) Obtener un protocolo de inmovilización de pectinasas sobre quitina.
(cid:153) Obtener una ecuación matemática que describa el fenómeno de la
inmovilización en términos de las variables de proceso con base en el plan de
diseño factorial.
(cid:153) Establecer las condiciones más adecuadas para inmovilizar la enzima sobre la
superficie de quitina utilizando modelos matemático-estadísticos para definir el
diseño experimental.
(cid:153) Establecer la conveniencia de la utilización de un brazo espaciador como el
glutaraldehido en el proceso de inmovilización.
(cid:153) Comparar algunos parámetros de las propiedades de la enzima libre frente a la
inmovilizada tales como la constante de Michaelis-Menten (K ) y la velocidad
m
máxima de reacción (V ), las cuales se obtendrán experimentalmente.
max
162. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA
2.1 PARED CELULAR DE LAS FRUTAS
Por lo general la composición porcentual de los polisacáridos de la pared celular
de las frutas, no presenta mayores diferencias teniendo la siguiente distribución:
Pectina 35%
Celulosa 30%
Hemicelulosa 30%
Proteína en Plantas dicotiledóneas 5%
Casi todos los modelos de la pared celular, sugieren micro-fibrillas celulósicas
incrustadas en una matriz de polisacáridos no celulósicos y proteína. Estos
coloides son responsables de la viscosidad en el proceso de tratamiento de la
pulpa de las frutas; por lo cual su importancia en el estudio de la clarificación y
procesamiento de jugos [8].
2.1.1 LA PECTINA.
Las sustancias pécticas están constituidas por un gran numero de compuestos,
dependiendo del grado y tipo de acción enzimática. El compuesto primario en el
tejido intacto y maduro es la protopectina, una sustancia insoluble que sirve para
mantener unidas las células de la pared celular. La protopectina puede ser
insoluble debido a su tamaño o por su unión con cationes bivalentes o con otros
polisacáridos.
En la pectina o polimetil-galacturonato (Fig. 1), el 75% de los grupos carboxilo de
las unidades de galacturonato se encuentran esterificadas con metanol. En el
ácido péctico (Ácido Poligalacturónico) han sido removidos todos los grupos
metoxi.
Fig.1 Porción de una molécula de pectina
Los Rhamno-Galacturonatos son los principales constituyentes de las sustancias
pecticas. Las cadenas primarias consisten principalmente de unidades α-D-
Galacturonato con 2 a 4% de unidades de L-Rhamnosa (Cada una con alrededor
de 25 unidades de Galacturonato).
17Los restos de Ácido α-D-Galacturónicos están unidos por enlaces α-(1,4) tal y
como se muestra en la figura 2.
Fig. 2 Ácido α-D-Galacturónico
Fuente: Lehninger [12]
Se ha encontrado que los residuos de rhamnosa en el esqueleto
homogalacturónico sirve de unión de la arabinosa y galactosa a los lados de la
cadena, lo cual conforma las zonas cabelludas (Fig.3) donde generalmente estas
zonas rhamnogalacturónicas no son susceptibles a la degradación por pectinasas
[8].
Fig. 3 Gráfico de zonas cabelludas
Fuente: Cirad [7]
182.1.1.1 Las Enzimas Pécticas: las enzimas que actúan sobre las sustancias
pécticas, están divididas en dos categorías; las enzimas depolimerizadoras (Fig.4)
y las saponificadoras o pectin-esterasas (Fig. 5).
Fig.4 Acción de la Depolimerasa sobre la pectina
Fig.5 Acción de la Pectinesterasa sobre la Pectina
Fuente: Cirad [7]
2.1.1.2 Enzimas Saponificadoras: una enzima saponificadora, es
específicamente una pectin-metil-esterasa la cual libera un grupo metil-ester del
ácido Poligalacturónico y a la que se conoce como pectin-esterasa o PE o Pectin-
pectil-hidrolasa.
192.1.1.3 Enzimas Depolimerizadoras: las enzimas depolimerizadoras, son
clasificadas de acuerdo al criterio de si son hidrolíticas sobre los enlaces (1,4)
Glicosídicos del esqueleto poligalacturónico como la poligalacturonasa o
transeliminativas como la pectatoliasa y la pectinliasa (Fig. 6).
Fig.6 : Enzimas Depolimerizadoras
Así mismo dichas enzimas se clasifican de acuerdo al sitio de ataque con respecto
al sustrato; así, si atacan a la pectina fraccionándola en unidades de más de dos
moléculas de ácido galacturónico se le conoce como de endomecanismo (Fig. 7),
en cambio si ataca y fracciona la pectina por sus extremos se le conoce como de
exo-mecanismo (Fig. 8).
Fig. 7 Reacción Vía Endomecanismo
20Fig.8 Reacción Vía Exomecanismo
La principal enzima pectinolítica utilizada en la industria es la PL debido al mayor
contenido de pectina en el material insoluble de los jugos. Otras enzimas tales
como la PE, son evitadas en los procesos debido a subproductos que alteran las
propiedades organolépticas del jugo y producen material toxico para el consumo
humano como lo es en este caso el metanol.
2.1.1.4 Pectin-liasa: las pectin-liasas llevan a cabo la ruptura del puente
glicosídico por un mecanismo de β-eliminación sobre pectinas con alto grado de
esterificación, produciendo un doble enlace sobre los carbonos 4 y 5 del ácido
galacturónico como se muestra en la figura 9.
Fig.9 Acción de la Pectin-liasa
212.1.2 LA CELULOSA.
Es un polisacárido que determina y forma la estructura de las membranas
celulares de la especies vegetales y se puede encontrar asociada a otros
compuestos como hemicelulosas y ligninas.
La celulosa es un β-glucósido de cadena lineal. La configuración β permite a la
celulosa formar cadenas muy largas y rectas (Fig. 10). La cadena recta formada
por este tipo de uniones es óptima para construir fibras por una elevada fuerza
tensil [8].
Fig. 10 Porción de una molécula de celulosa
La hidrólisis completa de este polisacárido con ácido concentrado produce
únicamente D-glucosa, pero la hidrólisis parcial rinde el disacárido reductor
celobiosa, cuyo enlace entre las unidades de D-glucosa es β-(1,4) [8]. Se ha
encontrado que la celulosa esta asociada con una mono-capa de hemicelulosa, la
cual esta constituida principalmente por xiloglucano, que es una cadena
glucosidica lineal β-(1,4); La cadena contiene xilosa, galactosa y fructuosa que
están unidas al carbono 6 del residuo glucosídico del esqueleto glucan en forma
de intervalos regulares.
2.1.2.1 Las Enzimas Celulíticas: de igual manera que la pectina es atacada por
enzimas que la degradan, la celulosa es atacada por enzimas celulíticas que
pueden ser solo de dos tipos:
(cid:153) Endo-β-Glucanasa: también llamada Cx; hidroliza los enlaces β-(1,4)-
Glicosídicos así como se muestra la figura 11. No ataca la celobiosa pero
hidroliza las celodextrinas y celulosas sustituidas como CMC (Carboximetil
celulosa) y HEC (Hidroxi-etil-celulosa). Algunas Endo-glucanasas también
actúan sobre celulosa cristalina, la especificidad de esta enzima no es muy
alta, porque ataca celulosas altamente sustituidas [7]
22Fig. 11 Ataque de la Endo-β-Glucanasa a la celulosa
(cid:153) Exo-β-Glucanasa: también llamada C1, ataca las partes terminales de la
cadena obteniéndose glucosa (Fig. 12).
Fig. 12 Ataque de la Exo-β-Glucanasa a la celulosa
Las celulasas son encontradas en plantas, también son producidas por bacterias y
hongos. Las preparaciones ricas en actividad celulítica son obtenida
principalmente a partir de la especie tricoderma.
232.2 ZUMOS DE FRUTAS TROPICALES
Son los recién llegados al mercado de zumos y bebidas a base de frutas. Con la
excepción del zumo de piña los demás se han establecido en ese sector muy
recientemente y tienen todavía mucho espacio para desarrollarse. Desde 1932, se
comercializa el zumo de piña y el avance de los demás zumos tropicales ha sido
mucho más reciente, por lo que el mercado para ellos esta poco introducido en
Europa y especialmente en Norteamérica.
La expansión de la demanda fue estimulada, sin duda, por la diversidad de frutas
tropicales que son asequibles desde los años 80, primero se vendieron en tiendas
de comunidades étnicas y ahora se les encuentra en los mayores supermercados
de Europa y Norteamérica. Este interés da lugar al empleo de métodos de
producción más sofisticados, así como de selección y envasado, con lo que se
consigue mayor calidad y aspecto más atractivo de fruta fresca, lo que a su vez,
aumenta la demanda. El resultado ha sido un mayor conocimiento del público en
torno a las frutas tropicales y creciente interés por los zumos y bebidas elaboradas
a base de dichas frutas, lo que se ha visto fomentado por la propaganda de los
principales distribuidores.
A parte de la piña, los principales zumos con cierta popularidad en Europa, son la
Guayaba, el mango, Fruta de la pasión (Maracuyá) y algunos otros de menos
importancia. Con la excepción de la piña, los zumos tropicales no se beben como
tales y se encuentran como néctares o bebidas a base de zumo o como un
ingrediente en bebidas mezcla de varias frutas, que son las que han llegado a ser
más habituales en los últimos años.
Cuando se hace referencia al grado de concentración, este se expresa en grados
Brix y no en volumen. La razón para esto es doble: Primero, no hay criterio oficial
para grado Brix o contenido en sólidos de zumos sin concentrar de frutas
tropícales o purés y segundo, los sólidos naturalmente presentes en diversas
frutas varían considerablemente según su origen, variedad y el momento en que
han sido cosechados. [1]
2.3 GUAYABA
La guayaba, psidium guajaba L. (Ver Fig. 13); pertenece a la familia de la
Myrtaceae que incluye el conocido mirto mediterráneo de tanto importancia
mitológica para los griegos y romanos, el eucalipto y los brotes secos de Syzygium
Aromaticum conocidos como clavos, los únicos frutos comestibles de dicha familia
son las guayabas, las cuales se transforman industrialmente, aunque hay otras
frutas como las cerezas brasileñas y los tambis, que se venden en mayor parte
como fruta fresca a nivel local [1].
24Fig. 13 Psidium Guajaba (Guayaba Común)
Se cree que las guayabas son originarias de las zonas tropicales y de
Sudamérica, pero crecieron muy bien en Asia a principios del siglo XVII y ahora
son conocidas en muchas zonas tropicales y subtropicales del mundo.
La planta crece espontáneamente y se adapta bien a distintas condiciones tanto
en regiones tropicales como subtropicales, las zonas más importantes de
producción, incluyen Florida, California y Hawai, América Central y Sudamérica,
India, Sudeste de Asia, Australia y las islas del mar del sur y las regiones norte y
sur de África. [1]
El fruto tiene un tamaño aproximado de un limón, puede ser redondo o en forma
de pera y crecen arbolitos o arbustos que dan fruto a los tres años y están en
completo rendimiento a los seis años. Las plantaciones tienen una densidad de
250 árboles por hectárea y en plena producción se consigue 35 toneladas de fruta
por hectárea, es fácil la multiplicación por semillas, creciendo en forma silvestre y
extendiéndose en algunas áreas como Florida, casi como las malas hierbas. El
fruto tiene la corteza amarilla y el interior se parece al tomate, presentando gran
cantidad de pequeños semillas afiladas (Fig. 14).
Hay muchas variedades diferentes, demasiado numerosas para enunciarlas todas;
y estas se han desarrollado en distintas zonas así como una gran variedad de tipo
silvestre de baja calidad. Para la industria que fabrica el zumo, es conveniente
dividir los diferentes tipos en un sentido amplio como los de pulpa blanca o pulpa
rosada, de las cuales la variedad Beaumont es, posiblemente, la que mejor se
conoce.
25Fig. 14 Interior de la guayaba
El zumo y el puré de la guayaba tienen un alto valor nutritivo y unas características
olfato-gustativas peculiares. El total de sólidos solubles tiende a ser bajo con
valores medio de 9 ºBrix y la relación Brix / Ácido se sitúa entre 6 y 20 así como el
pH varia entre 3.2 y 4.2.
Para producir el puré de guayaba, el método usual es aplastar la fruta y pasarla a
través de tamices o filtros para separar las semillas y el material fibroso de las
cortezas. El rendimiento en zumo es bajo, alrededor del 25 al 30 % del peso de
fruta utilizada y se han usado varios métodos en las que se incluye la cocción y la
congelación para romper las estructuras celulares y aumentar el rendimiento. Las
cocciones se realizan a 100ºC durante 30 minutos, pero altera las características
olfato-gustativas y la congelación es cara.
Recientemente, algunos fabricantes han usado el tratamiento con enzimas para
obtener mayores rendimientos. La mayor dificultad de la fabricación se debe a las
semillas y sus fragmentos, porque son muy afiladas y duras y en el puré dan lugar
a una textura desagradable y arenosa. Además, causan excesivo desgaste y
roturas en la maquinaria, especialmente en las zonas recubiertas de goma del
equipo de llenado [1].
La producción mundial de puré estimada en áreas escogidas se muestra en la
tabla 1.
26Tabla 1. Producción mundial estimada de puré de guayaba (1987-1988)
País Toneladas
EE UU 5500-6000
Brasil 4000
Sudáfrica 800-1000
Australia 600-1000
India 1500
Pakistán 100-200
Taiwán 100-200
Otros 400-600
Fuente: Producción y Envasado de Zumos y Bebidas de Frutas sin Gas.. Ed Acribia
S.A 1995.
2.4 PROCESOS GENERALES DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
La tecnología para la inmovilización de células y enzimas se ha desarrollado y
tiene alrededor de 25 años de existencia, pero es en años recientes que se ha
puesto a nivel y no se observa declinación. Toda vez que la expansión en
biotecnología y los desarrollo esperados crecen con los avances en tecnología
genética, se ha revitalizado el entusiasmo para la inmovilización de enzimas y
células. Los trabajos de investigación y desarrollo han provisto materiales y
métodos para la inmovilización. Mucha de esta expansión puede ser atribuida a
los desarrollos y aplicaciones específicas. Sorpresivamente esto ha dado un
estudio detallado y comprensivo de los métodos y soportes en la inmovilización.
Toda vez, que no se cuenta con un material y método ideal para la inmovilización
se ha provisto un método estándar para cada tipo de inmovilización.
Un gran número de aspectos prácticos, pueden ser considerados antes de
embarcarse en un trabajo experimental que conduzca finalmente a una enzima
inmovilizada, es por esto que el trabajo debe ser planeado con un propósito y a
una efectividad optima. [3]
2.4.1 ESCOGENCIA DEL SOPORTE Y EL MÉTODO
En solución, las moléculas de enzima están verdaderamente dispersas en el
medio y tienen un movimiento completamente libre. La inmovilización de una
enzima, es una técnica especialmente designada en la cual hay una gran
restricción del movimiento libre de la misma. Esta primera consideración es lo que
decide el material de soporte, lo que a su vez determina la aplicación.
Muchos de los puntos a considerar cuando se va a tomar una decisión para este
trabajo se resumen en la tabla 2, mostrando como diferentes métodos de
27inmovilización pueden influir en la actividad y en la vida útil del complejo
inmovilizado.
Tabla 2: Consideraciones fundamentales en la selección del soporte y el método de
Inmovilización.
Propiedad Puntos a considerar
Fuerza, No compresión de partículas, Área de superficie válida,
Física Forma (Lecho/fibras/hojuelas), Grado de porosidad, Volumen del
poro, Permeabilidad, Densidad, Espacio para el incremento de
biomasa, Velocidad de flujo y caída de presión.
Hidrofilidad (agua enlazada con el soporte), Inertes hacia la enzima,
Química Grupo funcionales validos para la modificación y regeneración,
Reutilización del soporte
Almacenamiento, Actividad residual enzimática, Productividad
celular, Regeneración de la actividad enzimática, Mantenimiento de
Estabilidad la viabilidad celular, Estabilidad mecánica del material de soporte
Ataque por bacterias u hongos, Disrupción por químicos, pH,
Resistencia Temperatura, Solventes orgánicos, Proteasas y mecanismos de
defensa celular.
Biocompatibilidad (Envuelve una respuesta inmune), toxicidad de los
Seguridad reactivos componentes, Salud y seguridad para los trabajadores en
el proceso y los usuarios, Especificación de la preparación
inmovilizada (Lista aprobada por la FDA) para alimentos,
farmacéutico y aplicaciones médicas.
Viabilidad y costos del soporte, Químicos, Equipo especial,
Reactivos, Habilidad técnica requerida, Impacto ambiental,
Económica Preparación a escala industrial, Posibilidad para el escalado,
Proceso continuo, Vida útil, Recuperabilidad del soporte, Cero
contaminación (Producto libre de enzimas o celulas)
Velocidad de flujo, Carga de la enzima y productividad catalítica,
cinética de la reacción, sitio de la reacción.
Reacción Enzima o sistemas múltiples: Batch, CSTR, FBR, PBR, ALR y otros
más; Limitaciones en los cofactores de transferencia de masa,
sustratos y productos.
Fuente: Inmmobilization of Enzymes and Cells [3]
282.4.2 MÉTODOS DE INMOVILIZACIÓN DE ENZIMAS
La actividad o funcionalidad de las enzimas esta ligada al mantenimiento de la
integridad de la conformación ternaria en particular de su sitio activo. Los procesos
de inmovilización deben por consiguiente, ser métodos suaves, bien regulados,
que respeten la estructura nativa de la proteína, además que los enlaces que se
crean entre la enzima y el soporte excluyan los aminoácidos involucrados
directamente en la reacción catalítica [3].
2.4.3 INMOVILIZACION POR ADSORCION
La inmovilización por adsorción (Fig. 15), Es un método simple e involucra
interacciones de superficie reversibles entre la enzima y el material del soporte.
Las fuerzas involucradas son principalmente electrostáticas tales como fuerzas de
Vander Walls, Iónicas e Interacciones de puentes de hidrógeno, además de las
fuerzas hidrofóbicas que pueden ser significativas. Estas fuerzas son
verdaderamente débiles, pero sustancialmente grandes en número para ser una
limitante considerable para el proceso de adsorción. Por ejemplo, es conocido que
células de levadura tienen una superficie química que esta normalmente cargada
negativamente, así que el uso de un soporte cargado positivamente, hace posible
la inmovilización. Existiendo una interfase química entre la enzima y el soporte
utilizado, no es requerida la activación química y por ende hay pequeños daños en
la integridad de las células y/o enzimas por este método de inmovilización. El
procedimiento consiste en mezclar juntos los componentes biológicos y el soporte
con propiedades adsortivas bajo condiciones deseables de pH, fuerza iónica y así
mismo por periodos de incubación, seguidos por una recolección del material
inmovilizado y un lavado extensivo para remover los componentes biológicos no
enlazados [3].
Fig. 15 inmovilización por adsorción
2.4.3.1 Principales ventajas del método
• Pocos daños a la enzima.
• Simple, económico y rápido para obtener la inmovilización.
• No hay cambios químicos entre la enzima y el soporte.
• Regeneración reversible con enzima fresca.
292.4.3.2 Principales desventajas
• Goteo de enzimas partiendo del soporte, contaminación del producto.
• Enlaces no específicos.
• Carga excesiva del soporte.
• Impedimento estérico por el soporte.
La desventaja más significativa es el goteo del biocatalizador partiendo del
soporte, la desorción puede ocurrir bajo muchas circunstancias y cambios
ambientales en pH, Temperatura y fuerza iónica que pueden promover la
desorción. Algunas veces la enzima, firmemente adsorbida, es realmente
desorbida durante la reacción como resultado de una limitación de sustrato.
Limitaciones de contaminante presente en el sustrato o en la producción de
producto y en otras condiciones conllevan a un cambio en la conformación de la
proteína. Factores físicos como la velocidad de flujo, burbujeo, abrasión partícula-
partícula y efecto de escamación de material particulado sobre las paredes del
recipiente, pueden conllevar a desorción. La desorción puede convertirse en una
ventaja si la regeneración del soporte se produce dentro de un régimen
operacional que permita una expulsión rápida del catalizador biológico agotado y
un reemplazo con biocatalizador fresco.
Limitaciones no especificadas pueden convertirse en un problema si el sustrato,
producto y/o contaminantes residuales son cargados e interactúan con el soporte.
Esto puede conducir a limitaciones de difusión y problemas en la cinética de la
reacción, con la consecuente alteración en los parámetros de V y K . Además,
max m
limitaciones por protones en el material de soporte pueden resultar en alteraciones
de pH del micro ambiente alrededor del soporte con consecuentes cambios en el
pH óptimo (1-2 unidades de pH), esto puede ser muy importante para las enzimas
con requerimientos de pH precisos. A menos que cuidadosamente se controle la
sobrecarga del soporte puede conducir a una actividad catalítica y a la ausencia
de espacios deseables entre la molécula de la enzima y el soporte produciendo
problemas relacionados con impedimentos estéricos [3].
2.4.4 ENLACE COVALENTE
Este Método de inmovilización (Fig. 16), involucra la formación de un enlace
covalente entre la enzima y el material de soporte, el enlace es normalmente
formado entre el grupo funcional presente sobre la superficie del soporte y el
grupo funcional perteneciente al aminoácido residual sobre la superficie de la
enzima. Un número de aminoácidos del grupo funcional son deseables para la
participación del enlace covalente. Los más involucrados son los del grupo amino
(NH ) de la lisina o arginina, el grupo carboxilo (CO H) del ácido aspártico o el
2 2
ácido glutámico, el grupo hidroxilo (OH) de la serina o treonina, y el grupo
sulfhidrilo (SH) de la cisteína.
30Fig.16 Inmovilización por enlace covalente
La gran variedad de materiales de soporte que están disponibles, reflejan el hecho
que no existe un soporte ideal. De esta forma, las ventajas y desventajas de un
soporte, deben ser tomadas en cuenta cuando se consideran procedimientos
posibles para conllevar una inmovilización de una enzima. Muchos factores tienen
influencia en la selección de un soporte particular, y un trabajo de búsqueda
muestra que la hidrofilicidad es el factor más importante para el mantenimiento de
la actividad celular en el ambiente del soporte. Consecuentemente polímeros de
polisacáridos que presentan esta propiedad, son los materiales de soporte más
populares para la inmovilización de enzimas. Por ejemplo, celulosa, sephadex,
almidón y agarosa (sefarosa) son usadas para la inmovilización de enzimas. Los
azucares residuales en estos polímeros tienen grupos hidroxilos, los cuales son
grupos funcionales ideales para la activación química y proveen la formación del
enlace covalente. Así mismo, los grupos hidroxilos forman puentes de hidrógeno
con las moléculas de agua, por eso se crea un ambiente acuoso (hidrofílico) con el
soporte. Los soportes de polisacáridos son susceptibles de desintegración
microbiana o fúngica, y solventes orgánicos pueden causar un encogimiento del
gel en los soportes usualmente utilizados para formar estos lechos.
Otros soportes utilizados para la inmovilización de enzimas son la sílica y el vidrio
poroso, la microarquitectura de esta se muestra en la figura 17. La sílica porosa
consiste en pequeñas partículas esféricas de sílica fusionadas entre ellas, lo cual
conlleva a formar microcavidades y pequeños canales. El soporte es normalmente
sólido y el lecho formado es muy fuerte y durable. El vidrio de boro silicato
sinterizado puede ser termostatado para formar un sistema uniforme de canales.
El diámetro de los canales depende de las condiciones de temperatura. Los poros
en el vidrio son también durables y resistentes a la desintegración microbial o
distorsión por solventes. Toda vez, que estos dos soportes tienen baja
hidrofilicidad; sin embargo estos dos soportes son menos hidrofílicos que los
materiales polisacáridos. Hay muchos procedimientos de reacción para el
acoplamiento del soporte por enlace covalente. Sin embargo, muchas reacciones
caben dentro de las siguientes categorías:
31• Formación de unión isourea
• Formación de unión diazo
• Formación de un enlace peptídico
• Reacción de alquilación.
Esto es importante para la escogencia del método que no inactivará la enzima por
reacción con los aminoácidos del sitio activo. Así, si se emplea una enzima con un
grupo carboxilo en el sitio activo para la participación en la catálisis, es deseable
escoger una reacción que involucre grupos amino de enlace covalente con el
soporte. Básicamente dos pasos están involucrados en la formación del enlace
covalente de la enzima hacia el material de soporte.
Primeramente, los grupos funcionales del material de soporte deben ser activados
por un reactivo específico y segundo, la enzima es adicionada en una reacción de
acoplamiento con el material de soporte; normalmente la reacción de activación
permite que los grupos funcionales sobre el soporte fuertemente electrofílico
(Deficiencia de electrones), se activen para llegar a la reacción de acoplamiento.
Estos grupos reaccionaran con nucleófilos fuertes (Donación de electrones), como
los grupos funcionales amino (NH ) de ciertos aminoácidos, sobre la superficie de
2
la enzima, para formar el enlace covalente [3].
Fig. 17 microarquitectura de algunos soportes de material usados para la inmovilización
de enzimas
Fuente: Bickerstaff [3]
32El bromo cianuro (BrCN) ha sido ampliamente utilizado como activante del grupo
funcional hidroxilo en soportes de materiales polisacáridos. En este método, la
enzima y el soporte están unidos por medio de un enlace isourea. En el caso de la
activación de la carbodiimida, el material de soporte puede tener un grupo
funcional carboxilo (CO H), y la enzima y el soporte están unidos por medio de un
2
enlace peptídico. Si el material de soporte contiene un grupo funcional amino
aromático, puede ser diazotizado usando ácido nítrico. Seguidamente, la adición
de pequeñas cantidades de enzima conducen a la formación del enlace diazo
entre el grupo reactivo diazo sobre el soporte y el anillo de la estructura de un
aminoácido aromático, como la tirosina. [3]
Es importante reconocer que no todos los métodos de inmovilización están
restringidos a un tipo particular de material de soporte, y hay un numero
sumamente grande de permutaciones posibles entre los métodos de
inmovilización y el material de soporte. Esto es posible por la modificación química
de los grupos funcionales normales sobre el material de soporte para producir un
rango de derivados, conteniendo diferentes grupos funcionales. Por ejemplo, el
grupo funcional normal en la celulosa es el grupo hidroxilo, y la modificación
química de esta se ha producido en el rango de los derivados de la celulosa, como
es la AE-Celulosa (Amino-etil), CM-Celulosa (Carboxi metil), y DEAE-Celulosa
(Dietil amino etil). Así, estas modificaciones químicas, incrementan el rango de los
métodos de inmovilización que pueden ser usados para obtener un material de
soporte. La derivatización puede ser así mismo usada para modificar las cargas en
la superficie del material para promover el enlace del biocatalizador [3]. En el caso
de las enzimas, estos biocatalizadores contienen un grupo grande de aminoácidos
o grupos funcionales, los cuales son deseables para la formación del enlace con el
soporte. La tabla 3 muestra algunos aminoácidos envueltos en la formación de
enlaces entre molécula y soporte. Los aminoácidos con grupos amida (L-glutamina
y L-asparagina), con cadenas hidrocarbonadas y sitios en la cadena como (L-
alanina, L-eusina, L-isoleucina, L-valina, L-fenilalanina y L-prolina) y glicina; están
ausentes en la tabla 3, ya que relativamente su baja concentración como sitios
expuestos en la superficie de la proteína se debe a su naturaleza hidrofóbica y
consecuentemente un sitio no reactivo en la cadena. La relación amino-
composición y número de proteínas, tomándolo desde el punto de vista de
reactividad relativa de residuos se muestra en la tabla 3. [11]
33Tabla 3. Porcentaje de reactividad relativa de residuos de aminoácidos
Residuo Reactividad Relativa (%)
Serina 7.8
Lisina 7
Treonina 6.5
Asparagina 4.8
Glutamina 4.8
Arginina 3.8
Tirosina 3.4
Cisteina 3.4
Histidina 2.2
Metionina 1.6
Triptofano 1.2
Fuente: Immobilized Enzymes and Cells [11]
Una interesante comparación del número de reacciones en la cual cada
aminoácido puede participar se muestra en la tabla 4 [11].
Tabla 4. Número de reacciones en las que cada aminoácido participa
Residuo Numero de Reacciones
Cisteina 31
Lisina 27
Tirosina 16
Histidina 13
Metionina 7
Triptofano 7
Arginina 6
Glutamina 4
Asparagina 4
Serina 0*
Treonina 0*
Fuente: Inmmobilized Enzyme and Cells [11]
*Normalmente considerado sitio no reactivo para este uso.
342.4.5 ATRAPAMIENTO
La inmovilización por atrapamiento (Fig. 18), difiere de la adsorción y del enlace
covalente, en que las moléculas de enzima se encuentran libres en la solución,
pero restringida en su movimiento por los espacios del gel. La porosidad de los
espacios del gel es controlada para asegurar que la estructura este lo
suficientemente firme para prevenir el rompimiento de la enzima, pero a su vez se
permite el libre movimiento del sustrato y del producto. Inevitablemente, el soporte
conlleva a actuar como una barrera para la transferencia de masa, y así mismo
esto puede tener serias implicaciones para la cinética de la reacción y puede tener
desventajas desagradables para las proteínas previniendo de esta forma que
haya interacción con el biocatalizador inmovilizado.
Los siguientes son los principales métodos de atrapamiento:
• Gelación ionotrópica de macromoléculas con cationes multivalentes
(Alginato)
• Gelación inducida por temperatura (Gelatina, agarosa)
• Polimerización orgánica por reacción química o fotoquímica
(Poliacrilamida)
• Precipitación partiendo de un solvente inmiscible (Poli estireno)
El atrapamiento puede ser finalizado por mezclado de la enzima con el material
del polímero polionico y así se pueden formar mallas del polímero con los cationes
multivalentes y se forma una reacción de intercambio iónico para formar los
espacios de la estructura que atrapa la enzima (gelación ionotrópica). El cambio
con temperatura es un método simple de gelación por transición de fase usando
alrededor de 1-4% de soluciones de agarosa o gelatina. Sin embargo, los geles
formados son suaves e inestables. Un desarrollo significativo en esta área es la
introducción de polímeros de k-carragenato que pueden formar geles por gelación
ionotrópica y por transiciones de fase inducidas por temperatura, así ha sido
introducido un grado grande de flexibilidad en la gelación en los sistemas para la
inmovilización.
Alternativamente, es posible mezclar la enzima con monómeros químicos que a su
vez se polimerizan para formar la red de enlaces poliméricos cruzados y el
atrapamiento de la enzima en los espacios intersticiales. El ultimo método se usa
muy ampliamente y un número de monómeros acrílicos están disponibles para la
formación de copolimeros hidrofílicos. Por ejemplo, el monómero de acrilamida es
polimerizado a la forma de poliacrilamida y el metilacrilato es polimerizado a la
forma de polimetacrilato. En adición al monómero el agente cruzador se adiciona
durante la polimerización para la formación de enlaces cruzados ayudando a crear
los espacios de la red tridimensional. El tamaño del poro del gel y sus propiedades
mecánicas están determinadas por las cantidades relativas del monómero y el
35agente cruzador. Es por consiguiente posible variar estas concentraciones para
influir en la estructura de los intersticios. El polímero formado puede ser roto en
partículas de un tamaño deseado o la polimerización puede ser ordenada en
forma de lechos de partícula definida. La precipitación ocurre más por separación
de fase que por reacción química, pero las enzimas y células entran en contacto
con un solvente orgánico miscible en agua, aún más, las enzimas y células no son
tolerantes a muchos solventes. Este método está limitado a una alta estabilización
previa de enzimas y células [3].
Fig. 18 Inmovilización por atrapamiento
2.4.6 ENCAPSULACION
La Encapsulación de enzimas y/o células (Ver Fig. 19), puede ser llevada a cabo
envolviendo los componentes biológicos con varias membranas semipermeables.
Esto es similar al atrapamiento de enzimas o células teniéndolas libres en
solución, pero restringida en el espacio. Proteínas grandes y enzimas no pueden
pasar dentro o fuera de la cápsula, pero pequeños sustratos y productos pueden
pasar libremente a través de la membrana semipermeable. Muchos materiales han
sido usados para construir las microcápsulas, variando de 10 a 100 µm; por
ejemplo, el nylon y nitrato de celulosa han demostrado ser muy populares. Los
problemas asociados con la difusión han sido mucho más agudos y pueden
resultar en la ruptura de la membrana si los productos que vienen de la reacción
se acumulan rápidamente. Un problema más allá de la inmovilización de la
partícula de enzima o célula, tiene que ver con la densidad justamente similar al
de su alrededor, con el problema consiguiente en la configuración del reactor, así
mismo la dinámica de flujo. Esto hace así mismo el uso posible de células
biológicas como cápsulas y un notable ejemplo de esto es el uso de eritrocitos
(Glóbulos rojos). La membrana del eritrocito es normalmente permeable a
pequeñas moléculas, sin embargo, cuando el eritrocito es colocado en una
solución hipotónica, ellas se inflan, estirando la membrana celular y
sustancialmente incrementando la permeabilidad. En estas condiciones, las
36proteínas del eritrocito difunden fuera de la célula y las enzimas pueden difundir
dentro de la célula. Retornando los eritrocitos inflados a una solución isotónica, se
habilita la membrana celular a retornar a su estado normal, y las enzimas
atrapadas dentro de la célula no pueden traspasar hacia fuera. Una ventaja
distintiva de este método es la co-inmobilización. Celulas y/o enzimas pueden ser
inmobilizadas en cualquier combinación deseada para una aplicación particular [3].
Fig. 19 Inmovilización por Encapsulación
2.4.7 RETICULACION
Este tipo de inmovilización (Véase Fig. 20), se realiza en un soporte libre y
envuelve la unión de células o enzimas para formar una larga estructura compleja
tridimensional y puede ser llevada a cabo por métodos físicos o químicos.
Los métodos químicos para la Reticulación, normalmente involucran la formación
de un enlace covalente entre las células por medio de reactivos bi o
multifuncionales como el glutaraldehido y el diisocianato de tolueno. Sin embargo,
la toxicidad de tales reactivos es un factor limitante para aplicar este método a
células vivientes y muchas enzimas. La albúmina y la gelatina se han usado para
proporcionar a las moléculas de la proteína espaciadores adicionales con el fin de
minimizar los problemas que pueden causarse por el enlace cruzado de una sola
enzima.
El entrecruzamiento físico de células por floculación, es muy conocido en la
industria biotecnológica y se obtienen altas densidades de células. Los agentes
floculantes, como son poliaminas, polietileniminas, sulfonatos de poliestireno y
varios fosfatos han sido ampliamente utilizados. El entrecruzamiento es raramente
usado como un camino de inmovilización a causa de la ausencia de propiedades
mecánicas y la estabilidad del poro causando limitaciones severas. El
entrecruzamiento es menos usado que los otros métodos de inmovilización [3].
37Fig. 20 Inmovilización por Reticulación
Un resumen sobre los métodos de inmovilización y algunas propiedades se listan
en la figura 21 y tabla 5
Fig. 21 Resumen sobre métodos de inmovilización [10]
Fuente: Inmobilized Enzymes and Cells [11]
38Tabla 5. Resumen de algunas propiedades para las diferentes clases de Inmovilización
Propiedad Enlace Adsorción Enlace Quelación Enlace Atrapamiento
Cruzado Física Iónico Covalente
Preparación Intermedio Simple Simple Simple Difícil Difícil
Fuerza del Fuerte Débil Intermedio Intermedio Fuerte Intermedia
Enlace
Actividad Bajo Intermedio Alto Alto Alta Bajo
Enzimática
Regeneración Imposible Posible Posible Intermedio Alta Intermedio
del Soporte
Costo de la Intermedio Bajo Bajo Intermedio Alta Intermedia
Inmovilización
Estabilidad Alto Bajo Intermedio Intermedio Alta Alto
Protección de
la enzima Algunas No No No No Si
contraataque Veces
microbiano
Fuente: Inmobilized Enzymes and Cells [11]
2.4.8 SOPORTES PARA LA INMOVILIZACION DE ENZIMAS
Existen tantos soportes para inmovilización de enzimas como polimeros y
materiales insolubles existen, la utilización o no de un soporte depende de varios
factores como la afinidad de este por las proteínas, disponibilidad de grupos
funcionales o grupos reactivos que se enlacen a la proteína y/o facilidad para
transformarlos en estos [3]. Si el método de inmovilización es físico, el soporte
debe adsorber muy fácilmente la proteína, pero debe ser liberada por el soporte
muy lentamente. El soporte debe ser muy fácil de preparar o de fácil acceso, a la
vez que se debe presentar varias formas físicas con el objeto de utilizarlo en
reactores industriales . Otro factor de mucha importancia es que el soporte no
debe ser tóxico, ni debe alterar las propiedades organolépticas del jugo, además
que debe ser de bajo costo.
Diversos autores han experimentado con varios tipos de soportes de origen
orgánico e inorgánico, tales como la quitina, quitosan, gel agarosa, polimetacrilato,
poliestireno, polietileno, vidrio poroso, celulosa, alúmina, nylon, etc.
La mayoría de soportes de origen vegetal o animal, presentan el inconveniente
que alteran las propiedades del jugo, caso que no se presenta con los soportes
poliméricos fabricados por el hombre. Estos presentan el inconveniente de que
son costosos y en ocasiones no son muy afines para con las proteínas, llegando al
punto de no fijarse covalentemente sino por adsorción.
392.4.8.1 La quitina: Es un polímero de origen natural y posee la gran cualidad de
ser biodegradable .Es el segundo químico orgánico natural más abundante en la
naturaleza , después de la celulosa se clasifica como biopolímero por estar
constituido de largas cadenas de monómeros de azúcar unidos por enlaces
glucosídicos β(1→4). La gran abundancia de la quitina en la naturaleza, se debe al
hecho que se haya en todos los seres que habitan el planeta: pétalos de las
plantas, algas y hongos, insectos y crustáceos. Es producida biológicamente en la
tierra a un volumen anual estimado en 100 billones de toneladas. En Colombia se
arrojan al mar un volumen anual de mas de 5000 toneladas de desechos de
crustáceos según el Departamento Nacional de Planeación (DNP) y el
Departamento Nacional de Pesca Artesanal (INPA). El quitosano que es la forma
desacetilada de la quitina (Ver Fig. 23), presenta propiedades físicas, químicas y
biológicas muy particulares debido a sus iones catiónicos. Esta carga positiva
atraen todo elemento cercano que tenga iones de carga negativa. Esta condición
singular permite aplicarla en un extenso abanico de aplicaciones que va desde los
usos industriales y ambientales hasta su empleo en la medicina.
Para obtener un material con las propiedades anteriormente mencionadas se hace
necesario desarrollar un proceso de limpieza, trituración, separación de proteínas,
lavado, desmineralización y secado. [2]
Un procedimiento industrial a partir de caparazones y patas de jaiba consiste en
someter este material a maceración en alcohol (30% v/v) para separar grasa y
proteína, después se decanta y el material se somete a la acción del ácido
clorhídrico diluido y frió para disolver el carbonato de calcio. Después de esto se
decanta nuevamente y se sitúa el material con ácido clorhídrico concentrado y en
ebullición. Por concentración y enfriamiento del líquido anterior se obtiene cristales
de quitosano.
El proceso anterior se repite varias veces hasta obtener la mayor cantidad de
quitosano posible. La disolución obtenida se trata con carbón activado, después se
filtra, enfría y cristaliza para obtener el quitosano. [2]
Fig. 22 Estructura Química de la Quitina
40El quitosano es la forma desacetilada de la quitina (Fig.23)
Fig.23 Estructura Química del Quitosano
2.4.9 INMOVILIZACIÓN SOBRE QUITINA
Algunos soportes como celulosa, poliacrílicos, poliestirenos y poliamidas (Como el
nylon); permiten la unión directa de los grupos NH de la enzima con sus
2
respectivos grupos funcionales previa activación de los mismos. La quitina al igual
que otras clases de soportes como el vidrio poroso, las dextranas, agarosas,
silicatos de aluminio y óxidos metálicos requieren de una molécula espaciadora
(ME).
La metodología de inmovilización sobre quitosano (Ver Fig.24), puede conllevar
dos o tres etapas y son:
• Activación de la superficie.
• Adición del brazo espaciador a la superficie
• Inmovilización de la enzima.
Un brazo espaciador es una molécula bifuncional, la cual puede enlazarse en un
extremo a la superficie activada, quedando por el otro extremo restante activa a
enlazarse a la enzima o cualquier tipo de molécula a fin. Es así como las
moléculas más utilizadas con estos propósitos son las diaminas, diácidos,
dialdehídos y aminoácidos [4].
Debido a que las enzimas son moléculas grandes comparadas con el tamaño
normal de los átomos, se presenta una repulsión estérica alta cuando las enzimas
son enlazadas directamente al soporte, lo cual se puede ver reflejado en una
perdida de actividad catalítica del conjunto, siendo así extremadamente
desventajoso inmovilizar la enzima, pues la gran mayoría de ella perderá su
actividad catalítica. Cuando se introduce el brazo espaciador, este problema es
minimizado pues el costo introducido al sistema en algún otro reactivo, es
superado al final debido a que se presenta una retención de la actividad catalítica
por el conjunto inmovilizado. [4]
41Los brazos espaciadores hipotéticamente tienen la capacidad de aumentar la
superficie de contacto en el momento de la inmovilización de la enzima sobre el
soporte, debido a que existe una mayor área superficial entre el soporte y la
enzima. Lo anterior se puede asegurar que es realmente valido para soportes de
forma esférica o semiesférica. La forma mas practica de llegar a estas
condiciones, es la reducción en el tamaño de partícula, sin embargo en este
trabajo la reducción implica un aumento significativo en la caída de presión
durante la operación del reactor PFR, haciéndose necesario la utilización de un
sistema especial de bombeo a la entrada y salida del reactor el cual no estaba
disponible. Para evitar este problema se trabajó con hojuelas de quitina las cuales
tenían un tamaño promedio de 75 mm (ver Fig. 35).
Después de haber explorado los principales métodos de inmovilización, se opto
por inmovilizar covalentemente a pesar de la alta perdida de actividad catalítica
que presenta este procedimiento, sin embargo la resistencia física final del
conjunto enzima soporte, hace que este método sea atractivo ya que el conjunto
inmovilizado va a ser sometido a un proceso mecánico de fricción, durante la
operación en el reactor PFR. Los otros métodos de inmovilización permiten el
goteo de enzima, la perdida de la misma y problemas tales como la presencia de
enzima en el producto final bajo las condiciones anteriormente descritas.
Se analizaron el nylon y de la quitina como soportes; el primero con ventajas
comparativas frente al segundo como la no biodegradabilidad y la posibilidad de
hacer arreglos en diferentes disposiciones (mallas, tejidos, pellets, etc.) pero se
descarto pues el activante (dimetil sulfato), es de difícil adquisición en el mercado
nacional, ya que es un precursor en la creación de materiales explosivos. Además
debido a su toxicidad podría generarse algún tipo de residualidad, lo cual no es
compatible con las normas técnicas de seguridad en la industria alimentaría. Por lo
anterior se opto por la quitina, material que presenta buenas propiedades
mecánicas y a pesar de su biodegradabilidad, su implementación en la industria
de jugos no presenta problemas debido a que normalmente se trabaja bajo
condiciones de asepsia que limitan este fenómeno.
42Fig.24 Proceso General de Inmovilización sobre Quitosano
432.5. PROPIEDADES CINÉTICAS
Al estudiar la aplicabilidad comercial de un catalizador enzimático existen tres
puntos principales que deben ser tenidos en cuenta [9]:
• La velocidad de reacción (Actividad Catalítica)
• La extensión de la reacción (Constante de equilibrio)
• La duración de la actividad (Estabilidad)
2.5.1 VELOCIDAD DE REACCION
Las enzimas, como catalizadores que son, aceleran las reacciones químicas, pero
ellas mismas no resultan irreversiblemente modificadas. El aumento de la
velocidad se atribuye al descenso de la energía de activación de la reacción, en
términos simples, esto se explica por la unión física del reactante a la enzima en
un sitio activo, formando un complejo meta estable. La energía de activación para
la rotura de este complejo es considerablemente menor que para la rotura del
reactante solo. Partiendo de este sencillo concepto, se puede proponer el
esquema de reacción siguiente:
Enzima + Reactante Complejo Enzima + Producto (2.1)
[E] [R] [ER] [E] [P]
La etapa del complejo se considera reversible, ya que el mismo tiene un estado
energético semejante a la mezcla enzimática. La rotura subsiguiente del complejo
para rendir los productos se considera exotérmica, esta etapa puede ser
prácticamente irreversible en muchos casos. La expresión de velocidad para este
tipo de reacción se obtiene usualmente utilizando una hipótesis de estado
estacionario, esto es, la concentración del complejo permanece constante.
k k
1 2
[E] + [R] [ER] [E] + [P] (2.2)
k
-1
Aceptando la hipótesis de estado estacionario,
Formación rotura
d[ER] = k [E][R] – (k + k )[ER] = 0 (2.3)
1 -1 2
dt
Por lo tanto,
k [E][R] = (k + k ) [ER] (2.4)
1 -1 2
44Para que esta hipótesis sea valida, la velocidad de reacción debe ser lineal, por lo
tanto se determina usualmente tan próxima al tiempo cero como sea posible,
antes de que la concentración cambie apreciablemente (Velocidad inicial).
La ecuación anterior puede ser reordenada para dar:
[E] [R] = (k + k ) = K (2.5)
-1 2 m
[ER] k
1
Donde K es la constante de Michaelis-Menten.
m
La ley de conservación de la masa requiere que la concentración de enzima [E ]
0
no cambie.
[ E ] = [ER] + [E] (2.6)
0
Por lo tanto,
[E] = [ER] - [ E ] (2.7)
0
Sustituyendo (2.7) en la ecuación (2.5) y reordenando queda:
[ER] = [ E ] [R] (2.8)
0
k + R
m
Las dimensiones de esta expresión son unidades de concentración. La constante
de velocidad k es de primer orden y tiene unidades de tiempo-1. Multiplicando
2
ambos miembros de la ecuación (2.8) por k se obtendrá la velocidad de cambio
2
de la concentración de producto con el tiempo en función de la velocidad máxima
posible, la constante de Michaelis y la concentración de reactante [9].
dP = [ER ] k = [ E ] [R] k (2.9)
2 0 2
dt k + R
m
Que usualmente se escribe como
ν = V [R] La ecuación de (2.10)
max
k + [R] Michaelis-Menten
m
Para predecir el comportamiento de un sistema enzimático es necesario
determinar V y K para la enzima particular empleada. Esto puede realizarse
max m
midiendo la velocidad inicial de reacción en un rango de concentraciones de
reactante (ver figura 25). Se puede demostrar algebraicamente que cuando la
concentración de reactante es igual a K , se obtiene una velocidad neta mitad de
m
45la velocidad máxima V . La ecuación (2.10) muestra que a valores de [R] mucho
max
menores que K la expresión puede simplificarse a:
m
ν = V [R] primer orden, ya que K + [R] ≈ K (2.11)
max m m
k
m
Fig. 25 Efecto de la concentración de reactante en la velocidad de una reacción catalizada
Por una enzima.
A valores de [R] mucho mayores que k , la ecuación anterior se aproxima a
m
ν = V [R] orden cero (2.12)
max
[R]
2.5.2 DETERMINACION DE LAS CONSTANTES CINETICAS
La naturaleza hiperbólica de la curva de ν frente a [R] hace difícil la determinación
de las constantes a partir de este sencillo gráfico. Existe una tendencia invariable
a subestimar el valor de la V ; sin embargo sirve para demostrar la importancia
max
de emplear un rango de concentraciones por encima y por debajo de k , para
m
evitar obtener datos sólo de la región de primer orden o de orden cero. El método
gráfico más ampliamente usado es la representación de dobles recíprocos, donde
se toman los inversos de cada miembro de la ecuación 10 para obtener:
1 = k 1 + 1 (2.13)
m
ν V [R] V
max max
Representando 1/ν frente a 1/[R] se obtiene una relación lineal permitiendo la
determinación de ambas constantes por regresión lineal. Sin embargo al tomar los
inversos se atribuye la mayor significación a las velocidades obtenidas a baja
concentración de reactivos, que están sujetas al mayor error experimental (Fig. 26)
46Fig. 26 Grafico de dobles recíprocos
2.5.3 EFECTOS DE LA TEMPERATURA Y pH
La ecuación de Michaelis-Menten muestra que la velocidad de una reacción
enzimática es
K [ER] (2.14)
2
Por lo tanto, la velocidad de la reacción dependerá de la concentración de [ER] y
el valor de k . En un esquema simplificado, la variación de la velocidad de la
2
reacción enzimática con la temperatura puede ser descrita en términos de
cambios en el valor de k . Como en las reacciones químicas sencillas, esta puede
2
ser descrita por la relación de Arrhenius [9].
K = A. exp. (-E/RT) (2.15)
2
Donde:
A = La constante de Arrhenius
E = La energía de activación
R = La constante de los gases
T = La temperatura
Si se han determinado A y E, k puede ser calculado para una temperatura dada.
2
Alternativamente, si se mide V en idénticas condiciones a dos temperaturas, las
max
constantes A y E pueden ser determinadas.
Tomando logaritmos en la ecuación 2.15
Ln k = ln A - E (2.16)
2
RT
47Por lo tanto
Ln V 2 = ln A - E (2.17)
max
RT2
Ln V 1 = Ln A - E (2.18)
max
RT1
Restando las ecuaciones 2.17 y 2.18
Ln V 2 = Ln k 2 [E ] = - E T1 – T2 (2.19)
max 2 0
V 1 k 1 [E ] R T1T2
max 2 0
En la práctica, es más preciso realizar experimentos en un rango de temperaturas
y representar Ln(V ) frente a 1/T. En el caso de las enzimas la relación de
max
Arrhenius se mantiene sólo en un rango restringido de temperatura. La limitada
estabilidad térmica de las enzimas resulta en su inactivación a elevadas
temperaturas y un gráfico de V frente a la temperatura será de la forma
max
mostrada en la figura 27. Debe ser tenido en cuenta que la forma de este gráfico
no implica la existencia de una única temperatura óptima. La elección de las
condiciones de operación debe surgir siempre del balance de una alta velocidad
con la necesidad de una estabilidad aceptable.
Fig.27 Efecto de la temperatura en la actividad enzimática
(esta respuesta es esperable típicamente en un rango de 0 a 100 ºC)
Aunque la hipótesis simplificada del efecto de la temperatura sobre la V
max
presentado aquí es útil en muchos casos, el examen de la ecuación 2.5, muestra
que existe una relación entre k y k . A partir de esta expresión, esta claro que las
m 2
enzimas donde la magnitud de k es semejante a k , K también mostrará una
-1 2 m
dependencia con la temperatura.
48Los efectos del pH en la actividad enzimática establecen el enriquecimiento de
que grupos críticos del centro activo, deben estar en el estado de ionización
correcto para que la reacción transcurra. Un requerimiento semejante es aplicable
a la ionización del reactante. Deberá realizarse normalmente un gráfico de V
max
frente al pH para determinar el pH óptimo dela enzima (Fig. 28). La constante de
Michaelis, k y por lo tanto la velocidad inicial, no tienen que presentar
m
necesariamente la misma variación con el pH [9].
Fig.28 Relación entre la actividad enzimática y el pH
2.6 ESTABILIDAD OPERACIONALDEL CONJUNTO ENZIMA SOPORTE
La estabilidad operacional de un biocatalizador inmovilizado, se ve afectado por
varios factores, entre ellos se incluye la inhibición irreversible por sustancias que
estén presentes en el sustrato, o bien que se produzcan endogenamente mediante
desnaturalización por el pH, la temperatura, o un cambio en la fuerza iónica,
rozamientos mecánicos, ataque microbiano, acumulación en la columna de
sustancias extrañas o algún escape de enzima del soporte, la disolución o
fragmentación del soporte o que exista un contacto entre la enzima y el sustrato
poco eficaz.
La pérdida de actividad enzimática se puede considerar como un caso especial de
inhibición enzimática que pudiera ocurrir de forma homogénea en la totalidad de la
partícula y progresando hacia el interior. La disminución de la actividad aumenta al
aumentar la cantidad del agente desnaturalizante presente, lo que consiste en un
efecto de primer orden con respecto al tiempo. No obstante, cuando la reacción
está limitada por la difusión, como ocurre normalmente, la disminución de la
actividad es lineal en el tiempo, hasta que la actividad del biocatalizador se reduce
a un nivel en el que la reacción ya no está limitada por la difusión. En las curvas
experimentales que se obtienen en la desactivación de enzimas, las que tienen
forma cóncava aparecen cuando existe eliminación de la enzima durante el uso
del reactor, mientras que las convexas indican inhibición acumulativa o
desnaturalización de la enzima [18].
49La figura 29 representa la estabilidad operacional de una enzima inmovilizada con
respecto al tiempo de operación, donde se observa un periodo durante el cual
aparentemente no se pierde actividad y después ocurre un decaimiento
exponencial de la misma.
Fig. 29 Estabilidad operacional de una enzima inmovilizada
Un parámetro que muestra la efectividad del conjunto inmovilizado, es la constante
de desactivación de la enzima, la cual se obtiene asumiendo que el proceso de
desactivación de la enzima, sigue una función exponencial de pendiente negativa.
E = E .e-k´t (2.20)
o
Donde:
E : Actividad en el Tiempo t
E : Actividad Inicial
o
K´: Constante de desactivación de la enzima
t : Tiempo
Tomando Logaritmos a ambos lados:
Ln(E) =Ln( E .e-k´t) (2.21)
o
Obtenemos:
Ln (E / E) = k´.t (2.22)
o
50Graficando Ln(% de Actividad) Vs Tiempo de operación, se obtiene la figura 30,
donde la pendiente de la recta es la constante de desactivación de la enzima. Para
obtener la vida media de la enzima, se realiza el siguiente procedimiento:
E = E / 2 (2.23)
o
Ln (E / E) = K´t (2.24)
o
Ln (2.E / E ) = k´t (2.25)
o o
Vida Media = t = Ln (2) / K´ (2.26)
1/2
Fig. 30 Grafico linealización estabilidad operacional
513. MATERIALES Y METODOS
3.1 MATERIALES
Tabla 6 Materiales empleados
Quitina Obtenida de la caparazón de Jaiba
Ácido Acético Carlo Erba 99%
Glutaraldehido Exro 748 al 50% (v/v)
Ácetato de sodio Merck 99.9%
Ácido Dinitrosalicílico Carlo Erba grado reactivo
Albúmina de suero bovino Merck al 98%
Glucosa Carlo Erba al 99.9%
Carboximetil celulosa Sigma grado reactivo
Pectina Sigma grado reactivo
Sulfato de cobre Carlo Erba grado reactivo
Hidróxido de sodio Carlo Erba grado reactivo
3.2 ENZIMA UTILIZADA
Se uso el cóctel enzimático Naturalzyme 200 XL producido por Proenzimas,
proveniente de una cepa de aspergillus niger compuesto principalmente de
pectinasa y en grado menor celulasa, con las siguientes características:
Actividad: 0.045 UI/mg (específica para pectinasa) a pH 4.0 y 40ºC
Forma: Líquido Ámbar Oscuro
Solubilidad: Completamente soluble en agua
Densidad : 1.1-1.2 g/mL
Kosher: Producto Certificado
Proteína: 322.84 mg / mL
3.3 EQUIPOS DE ANALISIS
(cid:153) Espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 20 (Rango 200-1100 nm)
(cid:153) Viscosímetro Schoot Visco-Easy (Precisión 1 cP)
(cid:153) pH-metro Schoot Handy Lab 1 (Precisión 0.1 unidades de pH)
(cid:153) Refractómetro Extrech, escala 0 – 32 °Brix
(cid:153) Microscopio de barrido electrónico ambiental(ESEM) Phillips XL-30
3.4 EQUIPOS DE PROCESO
(cid:153) Balanza Analítica Kern (Presición 0.1 mg)
(cid:153) Baño Termostático Eterna con control PID (Rango 0-200°C y precisión 0.1°C)
(cid:153) Bomba Peristáltica Pulsatron 0 - 1.6 (galones/hora)
(cid:153) Nevera Icasa
523.5 METODOS
3.5 .1 PREPARACION DEL SOPORTE
El quitosano, es obtenido por desacetilación mediante un tratamiento alcalino
drástico de la quitina, el cual es el principal componente de los exoesqueletos de
muchos crustáceos e insectos. Así mismo, hace parte de la pared celular de
muchos hongos [6].
Se obtiene la quitina proveniente de la caparazón de jaiba, a la cual se le hace el
siguiente tratamiento descrito por Vaillant [22].
Caparazón de jaiba
Esterilización en autoclave
(121ºC / 30 min)
Lavado Alcalino
(NaOH 0.1N / 30ºC /2 h)
Lavado Ácido
(HCl 6N / 30 ºC / 24 h)
Tratamiento Alcalino en Autoclave
(NaOH 5N / 121ºC /3h)
Incubación en ácido acético (1% v/v)
Y solución de NaCl al 1% (w/v)
Secado
Hojuelas de Quitina
533.5.2 PREPARACION Y CARACTERIZACION DE LA PULPA DE GUAYABA
A partir de guayabas en estado de maduración adecuada (ver Fig.31), se obtuvo
una pulpa sin tratamiento térmico a la cual se le realizaron los ensayos mostrados
en la tabla 7:
Fig. 31 Materia prima empleada para la elaboración de la pulpa
Tabla 7. Listado de métodos usados para la caracterización de la pulpa
Parámetro Método
º Brix Refractometría
PH Potenciometría
Densidad 20/20 (g/mL) Picnometría
Acidez libre expresada como Ácido Cítrico Titulación
Proteína Soluble (en 100 g de muestra) Biuret
Azucares Reductores (en 100 g de muestra) DNS
Viscosidad (cP) Viscosimetría
3.5.3 PREPARACIÓN DEL JUGO
A partir de la pulpa obtenida, se preparó un jugo con base en la norma NTC 404 a
8º Brix [10].
543.5.4 CURVAS PATRON
Una enzima ante todo es una proteína y como tal debe ser caracterizada por
medio de un método analítico. En este caso al tratarse de una enzima soluble se
escogió el método de Biuret, en el cual el contenido de proteína se estandarizo por
medio de un patrón de albúmina de suero bovino (ANEXO 1)
Como uno de los subproductos del ataque enzimático son los azucares
reductores, se estandarizo una curva por el método del DNS (ANEXO 2)
3.5.5 CARACTERIZACION DE LA ENZIMA
La actividad catalítica de una enzima se mide por la propiedad de generar un
subproducto el cual puede ser cuantificable con el tiempo, en el caso de la
pectinasa la generación de un doble enlace debido a la acción de la pectinasa
hace posible la determinación de la actividad y para la celulasa la producción de
azucares reductores.
Tabla 8. Listado de métodos usados para la caracterización de la enzima
Parámetro Método
Proteína Biuret (anexo 1 )
Actividad Catalítica (Pectinasa y Celulasa) UV-Visible (anexo 3)
3.5.6 ENSAYOS PRELIMINARES DE INMOVILIZACION
Los ensayos preeliminares se hacen con el objeto de mirar la reproducibilidad del
método, ya que si este no es lo suficientemente reproducible, indica que los
factores que influyen en el proceso no se mantienen constantes, por ende no
puede realizarse un plan de experiencia.
Por las razones expuestas anteriormente, antes de que un método se pueda
declarar como un protocolo viable para un proceso, se debe estar seguro de la
respuesta en el comportamiento del producto. Para poder comprobar la
reproducibilidad en el proceso de inmovilización, se realizaron experiencias sin
molécula espaciadora a temperatura ambiente y en baño térmico, como también
experiencias con molécula espaciadora (Glutaraldehido), con activación a
temperatura ambiente y baño térmico para diferentes concentraciones de ácido
acético. Estas pruebas además de demostrar la reproducibilidad del proceso de
inmovilización en las condiciones descritas, muestra el valor de la actividad del
conjunto enzima soporte, lo cual ayuda a tomar una decisión de que tipo de
condiciones son mejores para el protocolo de inmovilización.
Para realizar lo anterior, se deben de aclarar los pasos que se deben de seguir
para una inmovilización:
55(cid:153) Paso 1: Activación de la superficie (quitosano), con ácido acético
(cid:153) Paso 2: Adición de la molécula espaciadora a la superficie (glutaraldehido)
(cid:153) Paso 3: Inmovilización de la enzima.
De acuerdo a lo anterior, tenemos:
Tabla 9: Datos para la inmovilización de pectinasa sobre quitosano sin molécula
espaciadora
Temperatura
Ensayo Activación Parámetro Valor Volumen de Activación Tiempo
del Soporte (mL) (ºC) (min)
PS1 Concentración 4 12.5 T 30
ambiente
PS2 Paso 1 de Ácido Acético 4 12.5 50 30
PS3 (%) 8 12.5 T 30
ambiente
PS4 8 12.5 50 30
Fijación de Temperatura
la Enzima Parámetro Valor Buffer de Incubación Tiempo
pH (h)
PS1 Actividad 4.0 5 ºC 15
PS2 Paso 2 pectinasa A 4.0 5 ºC 15
PS3 ofrecida encontrar 4.0 5 ºC 15
PS4 (UI/g) 4.0 5 ºC 15
Tabla 10: Inmovilización de pectinasa sobre quitosano usando molécula espaciadora
Temperatura
Ensayo Paso 1 Parámetro Valor Volumen de Activación Tiempo
(mL) (ºC) (min)
PC1 Concentración 4 12.5 T 30
ambiente
Activación del de Ácido Acético
PC2 4 12.5 50 30
Soporte (%)
PC3 8 12.5 T 30
ambiente
PC4 8 12.5 50 30
Temperatura
Paso 2 Parámetro Valor Volumen de Fijación Tiempo
(mL) (ºC) (min)
PC1 0.8 4.0 40 24
Fijación del Volumen de
PC2 0.8 4.0 40 24
Glutaraldehido Glutaraldehido
PC3 1.6 4.0 40 24
PC4 1.6 4.0 40 24
Temperatura
Paso 3 Parámetro Valor pH de Incubación Tiempo
(h)
PC1 4.0 5 ºC 15
Fijación de la Actividad PL A
PC2 4.0 5 ºC 15
Enzima ofrecida encontrar
PC3 4.0 5 ºC 15
(UI/g)
PC4 4.0 5 ºC 15
563.5.7 DISEÑO 2n
Una vez se este seguro que se puede inmovilizar reproduciblemente enzimas
sobre la quitina, el paso a seguir es encontrar las condiciones en las cuales dichas
enzimas se inmovilizan en mayor cantidad pero teniendo en cuenta que lo mas
interesante en estos casos son aquellas condiciones donde se presenta mayor
actividad catalítica.
Comúnmente para optimizar un protocolo que posee distintas variables, se emplea
un método lógico; el cual consiste en mantener constantes n-1 variables y cambiar
paulatinamente a la variable restante hasta encontrar un punto donde su
comportamiento sea el mas alto (optimo). Este método no es recomendable a
casos como el aquí expuesto, ya que no tiene en cuenta las interacciones
conjuntas de las variables, las cuales se presentan muy a menudo en experiencias
que posee pocas variables y experiencias donde unas variables dependen de
otras [17].
Para tener en cuenta interacciones se hace uso de modelos matemático-
estadísticos conocidos como planes de experiencia factorial.
Los diseños factoriales 2n o también conocidos como planes de experiencia son
ampliamente utilizados en experimentos donde se quiere encontrar los valores
óptimos de un grupo de variables, las cuales están determinadas por un rango de
valores, estos conocidos como niveles de la variable. Estos niveles pueden ser
cuantitativos cuando se trata de niveles numéricos o cualitativos cuando se trata la
ausencia o presencia de un factor.
El diseño factorial que maneja dos niveles de diseño 2n presenta entonces un nivel
inferior y un nivel superior respectivamente, los cuales pueden ser denotados
como (+) para el nivel superior y (-) para el nivel inferior.
Esta metodología tiene la ventaja de no desperdicio de reactivos, poco tiempo de
análisis, tiene en cuenta las interacciones bifactoriales, trifactoriales, etc; También
posee la ventaja de que una vez realizado el plan de experiencia se obtiene una
ecuación que describe el comportamiento del sistema dentro de los rangos
predichos.
Los diferentes parámetros para el protocolo se muestran en la tabla 11
57Tabla 11. Condiciones del protocolo de inmovilización.
Paso Parámetro Tipo Rango
Concentración de Ácido Acético (%) Variable A determinar
Activación del
Temperatura (T ) ºC Variable A determinar
1
soporte
Tiempo (t ) min Constante
1
Volumen de Glu (mL/ g de soporte) Variable A determinar
Fijación del
Temperatura (T ) ºC Constante
2
glutaraldehido
pH Constante
(Glu) 1
Tiempo (t ) h Constante
2
Actividad de PL ofrecida (PL UI/g) A determinar A determinar
Fijación de la
pH Constante
2
enzima
Temperatura(T ) ºC Constante
3
Tiempo (t ) h Constante
3
De la tabla anterior se establecen los niveles máximos y mínimos (ver tabla 12)
Tabla 12. Niveles máximos(+) y mínimos(–) de las variables del plan
Nombre de la variable Convención Nivel inferior Nivel superior
Concentración de Ácido Acético (%) A - +
Temperatura de Activación (ºC) B - +
Volumen de Glu (mL/ g de soporte) C - +
La matriz de ensayos que indica los niveles en los cuales se deben realizar las
experiencias se construye con tres variables asi:
Tabla 13. Matriz de experiencia para el plan 23
CORRIDA A B C COMBINACIÓN DEL
TRATAMIENTO
1 - - + I
2 + - + a
3 - + + b
4 + + + ab
5 - - - c
6 + - - ac
7 - + - bc
8 + + - abc
3.5.8 Ecuación del sistema de inmovilización
Para encontrar la ecuación que describe el comportamiento del sistema [17], se
hace uso de los valores de respuesta obtenidos del plan, lo cual se hace
calculando el valor de los parámetros I,B,C,AB,AC,BC,ABC. Las ecuaciones que
muestran los efectos A, B, C y sus combinaciones son:
58A = 1/4n [a+ab+ac+abc-i-a-c-bc] (2.27)
B = 1/4n [b+ab+bc+abc-I-a-c-ac] (2.28)
C = 1/4n[c+ac+bc+abc-I-a-b-ab] (2.29)
AB = abc+ab+c+(1) - bc+b+ac+a (2.30)
4n 4n
AC = 1/4n [(1)-a+b-ab-c+ac-bc+abc] (2.31)
BC = 1/4n [(1)+a-b-ab-c-ac+bc+abc] (2.32)
ABC = 1/4n [abc-bc-ac+c-ab+b+a-(1)] (2.33)
La ecuación general del proceso será entonces [17]:
Y = I + AX +BX +ABX X +CX +ACX X +ABCX X X (2.34)
1 2 1 2 3 1 3 1 2 3
3.5.9 Respuesta de la pectinasa frente a diversos parámetros
Se realizaron varias pruebas para evaluar el comportamiento de las enzimas libres
e inmovilizada frente a diversos factores como pH, temperatura y concentración de
sustrato para determinar los máximos niveles de actividad catalítica (Pectinasa y
Celulasa) y así encontrar los rangos óptimos de trabajo.
3.5.9.1 Respuesta frente al pH (pectinasa libre e inmovilizada): la evaluación
de la respuesta del pH de la enzima libre e inmovilizada se hace necesaria para
determinar el pH en el cual se presenta el máximo de actividad catalítica, para
lograr esto se hacen varias corridas bajo condiciones de temperatura y
concentración de enzima y sustrato fijas, haciendo variar solamente el pH
mediante buffers.
3.5.9.2 Actividad pectinasa (libre e inmovilizada) frente a la temperatura: La
evaluación de la respuesta de la temperatura de la enzima libre e inmovilizada se
hace necesaria para determinar la temperatura en la cual se presenta el máximo
de actividad catalítica, para lograr esto se hacen varias corridas bajo condiciones
de pH constante, concentración de enzima y sustrato fijas haciendo variar
solamente la temperatura mediante un baño termostático con control PID.
3.5.9.3 Actividad pectinasa libre e inmovilizada frente a la
concentración de sustrato: Habiendo determinado el pH y la temperatura donde
se presenta la máxima actividad catalítica, se procede con estos dos parámetros
controlados a evaluar las constantes cinéticas; para ello se recurre al proceso de
59saturación de los sitios activos manteniendo una concentración constante de
enzima frente a una concentración variable y creciente de sustrato
3.5.10 Respuesta de la celulasa frente a diferentes parámetros
Aunque la optimización del proceso de inmovilización se realizo para la pectinasa;
el cóctel Naturalzyme 200 XL esta compuesto por una mezcla de enzimas, lo que
permite que haya la posibilidad de que se inmovilicen otras a parte de la
pectinasa, la cual se encuentra en mayor porcentaje.
No se descarta la posibilidad que se inmovilice la celulasa, la cual tiene un papel
importante en la industria de jugos para romper paredes de celulosa
convirtiéndolas en glucosa.
Con base en lo anterior, también se determinó la respuesta de la celulasa frente a
diferentes parámetros como pH, temperatura y concentración de sustrato, con
miras a obtener los rangos óptimos y los parámetros cinéticos, tal y como se anoto
anteriormente.
3.5.11 Reducción en la viscosidad del jugo de guayaba
Uno de los parámetros más importantes a determinar en el presente trabajo, es la
reducción de viscosidad en el jugo de guayaba, ya que esta propiedad esta
determinada por el alto contenido de pectina en la fruta. Para este análisis se
realiza en laboratorio una simulación de reactor batch para el jugo de guayaba,
midiendo la reducción de viscosidad del jugo tanto para la enzima libre como para
la inmovilizada.
En ambos casos (libre e inmovilizada), se tomaron 100 gramos de jugo. Para el
caso de la libre 10µL de Naturalzyme 200 XL y para la inmovilizada 0.3979
gramos del conjunto inmovilizado.
3.5.12 Efecto de la enzima libre e inmovilizada en los azucares reductores.
En el punto anterior, se analizó la disminución en la viscosidad del jugo de
guayaba; esto nos da información sobre el ataque de la pectinasa a la pectina
presente en el jugo, pero no involucra la celulasa; por lo anterior, se realizo un
seguimiento en los dos procesos de la cantidad de azúcares reductores generados
en la muestra. La cantidad de azúcares reductores al inicio de las pruebas debe
ser menor que el obtenido al final, ya que no se ha iniciado el ataque de la
celulasa.
603.5.13 Determinación de la estabilidad operacional
Para la determinación de la estabilidad operacional, se construyo un reactor de
lecho empacado (ver Fig. 32) con las siguientes características:
(cid:153) Volumen: 38.27 cm3
(cid:153) Peso del conjunto inmovilizado: 2.8598 gramos.
(cid:153) Temperatura: 30ºC (Controlada por el baño termostático PID)
(cid:153) Flujo: 1.50 mL / min (Controlado por una bomba peristáltica)
(cid:153) Alimento: Solución de pectina al 1% en buffer pH 4.0
Fig. 32 Reactor de lecho empacado utilizado
3.5.14 Visualización de algunos efectos de superficie en el proceso de
inmovilización
Durante el proceso de inmovilización pueden ocurrir cambios en la apariencia
física del soporte (color y textura), que hacen suponer la existencia de cierta
cantidad de enzima fijada al soporte. Para comprobar si hubo o no inmovilización,
se sometieron varias muestras de soporte a un minucioso análisis de la superficie
mediante un microscopio de barrido electrónico (ESEM).
614. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 CARACTERIZACION DE LA PULPA
Los siguientes son los resultados de la caracterización de la pulpa de guayaba,
obtenida por los métodos enumerados en la tabla 7. Se requieren conocer los
valores iniciales, ya que al someterse el jugo a la acción de las enzimas algunos
parámetros tales como azucares reductores, Brix, viscosidad y proteína van a
resultar afectados.
Tabla 14. Caracterización de la Pulpa de Guayaba Obtenida
Parámetro Resultado
º Brix 7.0
pH 3.77
Densidad 20/20 (g/mL) 1.042
Acidez libre expresada como Ácido Cítrico 0.1939 g Ac. / g de muestra
Proteína Soluble (en 100 g de muestra) 0.02515 g
Azucares Reductores (en 100 g de muestra) 0.4395 g
Viscosidad (cP) 2610
4.2 CURVAS PATRON
4.2.1 Curva patrón de proteína
Esta curva se realizó preparando varios patrones de albúmina disueltos en agua
destilada como se indica en la tabla 15 (Anexo 1), por el método de Biuret. Los
resultados del patronamiento de la curva se muestran a continuación.
Tabla 15. Datos para la obtención de la curva de proteína (Método de Biuret)
Longitud de Onda (nm) Concentración (mg/mL) Absorbancia
540 0.1005 0.0347
540 0.2512 0.1253
540 0.5025 0.2289
540 0.7538 0.3508
540 1.0050 0.4486
62La gráfica obtenida se muestra en la Fig. 33 :
Fig.33 Curva patrón de proteína
Curva de proteina (Metodo de Biuret)
0,5
0,4
0,3
aicnabrosbA
0,2
0,1
y = 5,877729e-04+4,536782e-01 * x
R2 = 0,998300
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Concentración de Proteína (mg/mL)
4.2.2 Curva patrón de azucares reductores
Esta curva se realizó preparando varios patrones de glucosa disueltos en agua
destilada como se indica a continuación en la tabla 16, por el método del ácido
dinitrosalicílico (DNS) (Anexo 2).
Tabla 16. Datos para la obtención de la curva patrón de Azucares reductores (DNS)
Longitud de Onda (nm) Concentración (mg/L) Absorbancia
540 41.666 0.0051
540 83.333 0.0619
540 125.00 0.1506
540 166.66 0.2110
540 208.33 0.2453
540 250.00 0.3338
63Fig.34 Curva patrón de azucares reductores
Curva de Azucares Reductores
(Metodo DNS)
0,4
0,3 y = 0,0015x - 0,0575 aicnabrosbA
R2 = 0,9943
0,2
0,1
0
50 100 150 200 250
Concentracion de Glucosa mg/L
4.3 ENSAYOS PRELIMINARES
Los ensayos preliminares propuestos en las tabla 9 y 10, permitieron encontrar los
rangos máximos y mínimos para las variables los cuales se muestran en la tabla
17.
Tabla 17: Resumen sobre los resultados obtenidos mediante los protocolos especificados
l en las tablas 9 y 10 (Pruebas realizadas por triplicado)
Características Valores encontrados
Peso Temperatura Concentración Volumen Proteína Actividad
Ensayo de de Activación de ácido de Glu inmovilizada pectinasa
Quitina (ºC) acético (mL) (mg de Prot./ g (UI/g de
(g) (%) de Quitina) Quitina)
PS1 0.4985 Ambiente 4 0 13.5987 0.3036
PS2 0.50135 50 4 0 18.49315 0.3172
PS3 0.4949 Ambiente 8 0 16.6779 0.3036
PS4 0.5363 50 8 0 11.4247 0.2800
PC1 0.5003 Ambiente 4 0.8 6.4128 0.4451
PC2 0.5020 50 4 0.8 7.4070 0.4287
PC3 0.5010 Ambiente 8 1.6 4.4577 0.5316
PC4 0.5024 50 8 1.6 10.1895 0.6337
En general, de la tabla 17 se observa que la no presencia de molécula
espaciadora disminuye significativamente la actividad catalítica (en promedio
0.3011 UI/g de quitina), en comparación con la que si la posee (en promedio 0.501
UI/g de quitina); bajo las mismas condiciones de temperatura, concentración y
64ácido acético. En el caso de la adición de molécula espaciadora, se observa un
aumento constante de la actividad catalítica, por ende se decide optimizar este
parámetro; bajo los diferentes valores de temperatura y concentración de ácido
acético.
En un proceso de inmovilización, la retención de actividad catalítica es más
importante que la misma cantidad de proteína inmovilizada, esto se observa
apartir de la tabla 17 donde el ensayo (PS2) presenta más cantidad de proteína
inmovilizada, pero la actividad no es tan alta como la del ensayo (PC3) donde hay
menor cantidad de enzima inmovilizada pero hay más retención de actividad. Esto
se explica por la aparición de los efectos estéricos como consecuencia de que
algunas moléculas son inmovilizadas en una posición relativa a la superficie del
soporte, tal que el sitio activo resulta relativamente inaccesible a las moléculas de
sustrato [17]. Así podemos notar que el principal efecto de la molécula
espaciadora es precisamente la reducción del efecto estérico.
4.4 IDENTIFICACIÓN DE LOS PARÁMETROS DEL PROCESO A OPTIMIZAR
Después de haber asegurado que el proceso de inmovilización es reproducible
bajo las diferentes condiciones anteriormente descritas, se seleccionaron las
siguientes condiciones de trabajo:
1. Concentración de ácido acético entre 4-8 %
2. Temperatura de activación entre 45-55 ºC
3. brazo espaciador (Volumen de Glutaraldehido 0.8-1.6 mL).
Los diferentes pasos, tipos de variable y rangos de la misma; se resumen en la
tabla 18.
Tabla 18. Condiciones del protocolo de inmovilización.
Paso Parámetro Tipo Rango
Concentración de Ácido Acético (%) Variable 4-8
Activación del
Temperatura (T ) ºC Variable 45-55
1
soporte
Tiempo (t ) min Constante 30
1
Volumen de Glu (mL/ g de soporte) Variable 1.6-3.2
Fijación del
Temperatura (T ) ºC Constante 40
2
glutaraldehido
pH Constante 4.0
(Glu) 1
Tiempo (t ) h Constante 24
2
Actividad de PL ofrecida (PL UI/g) A determinar A determinar
Fijación de la
pH Constante 4.0
2
enzima
Temperatura(T ) ºC Constante 5
3
Tiempo (t ) h Constante 15
3
65Teniendo en cuenta los rangos de las variables, se determinaron los niveles
máximos y mínimos
Tabla 19. Niveles máximos(+) y mínimos(–) de las variables del plan
Nombre de la variable Convención Nivel inferior Nivel superior
Concentración de Ácido Acético (%) A 4 8
Temperatura de Activación (ºC) B 45 55
Volumen de Glu (mL/ g de soporte) C 0.8 1.6
La matriz de experiencia o matriz que indica los niveles en los cuales se deben
realizar las experiencias se construye con las tres variables así:
Tabla 20. Matriz de experiencia para el plan 23
Corrida A B C Combinación del tratamiento
1 4 45 0.8 I
2 8 45 0.8 a
3 4 55 0.8 b
4 8 55 0.8 ab
5 4 45 1.6 c
6 8 45 1.6 ac
7 4 55 1.6 bc
8 8 55 1.6 abc
Esta matriz indica como se combinan los niveles en cada variable dentro de cada
experiencia. Así en la corrida numero 1 se trabajo con las variables A,B,C, en el
nivel inferior, esto quiere decir que la variable A (Concentración de Ácido Acético)
toma el valor de 4%, la variable B (Temperatura de activación) toma el valor de 45
ºC y la variable C (volumen de Glutaraldehido) toma el valor de 0.8 mL. Con las
combinaciones de los tratamientos descritos en la tabla 18, se obtuvieron los
valores para las variables de salida las cuales se muestran en la tabla 21.
Tabla 21: Respuestas Obtenidas del Plan (Pruebas por Duplicado)
Experiencia Proteína inmovilizada Actividad pectinasa
(mg Prot. /g de Quitina) (UI/g de Quitina)
1 (1) 32.55 0.2429
2 a 32.30 0.2513
3 b 31.01 0.2348
4 ab 32.40 0.2221
5 c 31.67 0.2982
6 ac 31.36 0.2597
7 bc 32.87 0.3070
8 abc 45.88 0.2080
664.5 ECUACIONES DEL COMPORTAMIENTO DEL SISTEMA BASADO EN LA
ACTIVIDAD CATALÍTICA Y EN LA CANTIDAD DE PROTEÍNA
De la tabla 21 se calculan los parámetros I, A, B, C, AB, AC y ABC los cuales
permiten encontrar la ecuación característica a partir de la ecuación general [17] :
Tabla 22: Parámetros para la proteína inmovilizada
Desviación
Parámetro Valor Respecto a S Conclusión
I (%)
I 33.755 0 71.21
A 1.73 5.125 0.1871 8 % de Ácido Acético
B 1.785 5.288 0.1991 Temperatura de Activación
55 ºC
AB 1.87 5.540 0.2186
C 1.7275 5.117 0.1865 Volumen de Glutaraldehido
1.6 mL
AC 1.445 4.281 0.1305
BC 2.145 6.355 0.2876
ABC 1.46 4.325 0.1332
Tabla 23: Parámetros para la actividad de la pectinasa inmovilizada.
Desviación
Parámetro Valor Respecto a S Conclusión
I (%)
I 0.2530 0 0.0040
A -0.01772 7.0039 1.962 e-5 4 % de Ácido Acético
B -0.010025 3.9624 6.2812 e-6 Temperatura de Activación
45 ºC
AB 0.0102 4.0316 6.5025 e-6
C 0.015225 6.0177 1.4487 e-5 1.6 mL de Glutaraldehido
AC 0.0111125 1.2152 7.718 e-6
BC -0.0007 0.2766 3.06 e-8
ABC 0.004925 1.9466 1.5159 e-6
Las ecuaciones que describen el comportamiento del sistema de inmovilización
con respecto a la cantidad de proteína inmovilizada y la actividad pectinasa son:
(cid:153) Proteína Inmovilizada = 33.755 + 1.73X + 1.785X + 1.87X X + 1.7275X +
1 2 1 2 3
1.445X X + 2.145X X + 1.46X X X (mg de proteína / gramos de quitina)
1 3 2 3 1 2 3
(cid:153) Actividad Pectinasa = 0.2530 - 0.01772X – 0.010025X + 0.0102X X + 0.015225X
1 2 1 2 3
+ 0.0111125X X – 0.0007X X +0.004925X X X (UI / gramo de quitina)
1 3 2 3 1 2 3
674.6 PROTOCOLO DE INMOVILIZACIÓN PARA PECTINASAS
Según los resultados obtenidos en el diseño experimental y teniendo en cuenta
que el criterio más importante para trabajar con una enzima no es la cantidad de
proteína inmovilizada sino la actividad catalítica, se pueden aplicar para las tres
variables en estudio, las condiciones que le son más favorables para que el
conjunto enzima-soporte retenga la mayor actividad; estas son:
• Concentración de Ácido Acético: 4%
• Temperatura de Activación del soporte: 45 ºC
• Volumen de Glutaraldehido: 1.6 mL
El procedimiento para inmovilizar la pectinasa será entonces:
a. A un peso de 0.5 g de Quitina, se adicionan 12.5 mL de ácido acético al
4%. Se incuba a 45 ºC por 30 minutos, posteriormente se lava la quitina con
agua deionizada hasta eliminar el olor a ácido acético.
b. Se suspende la superficie activada en 5 mL de ácido acético al 4% y se
adicionan 1.6 mL de solución de Glutaraldehido (50%) y se deja
debidamente tapado por 24 horas a 40ºC.
c. Transcurrido este tiempo, se lava con buffer acetato pH 4.0, 0.1M y se
adiciona 11 mL del buffer más 1mL de Naturalzyme 200 XL. Se incuba a
5ºC durante 15 horas.
d. Se filtra y se lava el sólido con buffer acetato pH 4.0, 0.1M y NaCl 0.02M
hasta un volumen cercano a 75 mL (Este filtrado se guarda para análisis de
proteína).
e. Por último se cubre de nuevo el conjunto enzima-soporte con el buffer y se
guarda en la nevera.
La figura 35 muestra el resultado del proceso de inmovilización de pectinasas
sobre las hojuelas de quitina bajo las condiciones anteriormente descritas.
68Fig. 35 Hojuelas con enzima inmovilizada
Tamaño promedio de partícula 75 mm
4.7 RESPUESTA DE LA PECTINASA FRENTE A DIVERSOS PARAMETROS
4.7.1 Respuesta frente al pH (pectinasa libre e inmovilizada)
La variación de la actividad catalítica frente al pH para la enzima libre e
inmovilizada se muestran en las figuras 36 y 37.
Fig.36 Respuesta de la Pectinasa libre frente al pH (ver tabla 22)
100
dadivitcA
80
60 ed
%
40
2 3 4 5 6 7 8
pH
69Fig.37 Respuesta de la Pectinasa Inmovilizada frente al pH (ver tabla 23)
100
dadivitcA
80
60
ed
40
%
20
2 3 4 5 6 7 8
pH
Se puede observar apartir de las figuras 36 y 37, que el pH óptimo de la enzima
libre es de 3.7, mientras que el de la enzima inmovilizada es de 5.0; lo que
muestra un desplazamiento del pH hacia la zona básica cuando se inmovilizan la
pectinasa sobre quitina, lo cual es desfavorable para el proceso de catálisis en un
jugo de guayaba, ya que el pH de la pulpa se encuentra alrededor de 3.77;
4.7.2 Actividad pectinasa (libre e inmovilizada) frente a la temperatura.
Siendo la temperatura un factor de peso en la actividad catalítica ya que modifica
la energía cinética del sustrato hacia la enzima, se determinó la temperatura de
trabajo por medio de las siguientes figuras:
Fig.38 Respuesta de la pectinasa libre frente a la temperatura (ver tabla 24)
100
dadivitcA
80
60
40
ed
20
%
0
10 20 30 40 50 60
Temperatura (ºC)
70Fig.39 Respuesta de la pectinasa inmovilizada frente a la temperatura (ver tabla 25)
100
dadivitcA
80
60
40
ed
20
%
0
10 20 30 40 50 60 70
Temperatura (ºC)
A partir de las figuras 38 y 39, la temperatura óptima para la enzima libre se
encuentra en 37 ºC y para la enzima inmovilizada 40ºC, observando que el óptimo
se desplaza en 3ºC.
4.7.3 Actividad pectinasa libre e inmovilizada frente a la concentración de
sustrato
La saturación del sitio activo de la enzima por el sustrato juega un factor
importante en la cinética química, lo anterior se muestra en las figuras 40 y 41.
Fig.40 Respuesta de la pectinasa libre frente a la concentración de sustrato (ver tabla 26)
100
dadivitcA
90
80
70
ed
60
%
50
0 0,2 0,4 0,6
Concentración de Sustrato (w/v)
71Fig.41 Respuesta de la pectinasa inmovilizada frente a la concentración de sustrato
(ver tabla 27)
100
dadivitcA
80
60
40
ed
20
%
0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Concentración de Sustrato (w/v)
4.7.4 Lineweaber-burk para pectinliasa libre e inmovilizada
Una vez obtenida la relación entre el aumento de concentración de sustrato y
actividad catalítica, se procede a la linealización de los gráficos anteriores para
obtener de estos los parámetros cinéticos.
Fig.42 Curva de Lineweaber para la pectinasa libre (ver tabla 28)
dadivitcA
14
11
y = 0,3068x + 9,3258 al
R2 = 0,9230 ed
8 Vmax =0,1071 UI/mg osrevnI
Km = 0,0328673 g/mL
5
0 5 10 15 20 25
Inverso de la Concentración de Sustrato
72Fig.43 Grafico de lineweaber para la pectinasa inmovilizada (ver tabla 29)
1000
dadivitcA
800
600
al
y = 67,753x + 117,8 400 ed
R2 = 0,932 osrevnI
200 Vmax = 0,00848896 U/mg
Km = 0,5751 g/mL
0
0246810
Inverso de la Concentración de Sustrato
A partir de las figuras 42 y 43, se determina que la velocidad máxima de reacción
de la enzima libre encontrada es 0.1071 UI/mg y comparada con la de la pectinasa
inmovilizada (0.00848896 UI/mg) es cien veces mayor, lo cual muestra que la
enzima libre actúa mucho más rápido que la enzima inmovilizada.
En el caso de la constante de Michaelis-Menten para la pectinasa libre (0.0328673
g/mL) en comparación con la inmovilizada (0.5751g/mL), el que se obtenga un
valor más grande para la inmovilizada, indica que para llegar a una velocidad de
reacción máxima se necesita una alta concentración de sustrato o dicho de otra
manera, como a la enzima inmovilizada se le ha restringido su movimiento, el
sustrato no puede acceder a ella tan fácilmente como en el caso de libre en la cual
se requiere solamente pequeñas cantidades de sustrato para ser saturada y el
máximo de velocidad es alcanzado a bajas concentraciones de sustrato [23].
4.8 RESPUESTA DE LA CELULASA FRENTE A DIFERENTES PARÁMETROS
4.8.1 Actividad celulasa libre e inmovilizada frente al pH.
Como se puede observar de las figuras 44 y 45, la máxima actividad de la
celulasa (libre e inmovilizada), se presento en un rango estrecho de pH (4.2-4.5) lo
que muestra que este factor no incide directamente en la inmovilización de
celulasa. Es de aclarar que el protocolo esta especificado para inmovilizar
preferencialmente pectinasas, ya que la actividad celulasa inmovilizada es casi
nula en comparación con la libre.
73Fig. 44 Actividad celulasa libre frente al pH (ver tabla 30)
100
dadivitcA
90
80
70
ed
60
%
50
2 3 4 5 6 7 8
pH
Fig. 45 Actividad celulasa Inmovilizada frente al pH (ver tabla 31)
110
dadivitcA
100
90
80
70
60 ed
50
%
40
2 3 4 5 6 7
pH
4.8.2 Actividad celulasa libre e inmovilizada frente a la concentración de
sustrato
Habiendo determinado el pH y la temperatura donde se presenta la máxima
actividad catalítica para la pectinasa bajo estos mismos parámetros se evaluó la
respuesta de la celulasa frente a la concentración de CMC (ver Fig. 46 y 47).
74Fig. 46 Respuesta de la celulasa libre frente a la concentración de sustrato (ver tabla 32)
100
dadivitcA
90
80
ed
%
70
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Concentración de Sustrato (w/v)
Fig. 47 Respuesta de la celulasa inmovilizada frente a la concentración de sustrato
(ver tabla 33)
120
100
80 dadivitcA
60
40
20
ed
0
%
-20 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06
Concentración de Sustrato (w/v)
4.8.3 Lineweaber-burk para celulasa libre e inmovilizada
Linealizando las gráficas anteriores, se obtienen los parámetros cinéticos de la
celulasa los cuales se relacionan en las figuras 48 y 49.
75Fig. 48 Grafico de lineweaber para la celulasa libre (ver tabla 34)
21
20,5 dadivitcA
20
19,5
19
y = 1,307761x + 16,326035
18,5
al
R2 = 0,9755
18 ed
Vmax=0,0612 U/mg
17,5
osrevnI
Km=0,08 g/mL
17
1 1,5 2 2,5 3 3,5
Inverso de la Concentracion de Sustrato
Fig. 49 Gráfico de lineweaber para celulasa inmovilizada (ver tabla 35)
18000
dadivitcA
15000
12000
9000 al
y = 157,93x - 1130,86
ed
R2 = 0,9966
6000 osrevnI
Vmax=8,8428 e-4
Km = 0,1396
3000
0
0 50 100 150
Inverso de la Concentración CMC
Las figuras 48 y 49 representan la actividad de la enzima frente al cambio de la
concentración de sustrato, donde se puede ver que la saturación de los sitios
activos de la enzima se produce una vez esta actúa a su velocidad máxima de
catálisis, así para la enzima libre la velocidad de reacción (0.0612 UI/mg) es
mucho mayor que para la enzima inmovilizada (8.8424e-4 UI/mg). De igual
manera que para el caso de la pectinasa inmovilizada, la celulasa inmovilizada
presenta una constante de Michaelis mayor (0.1396 g/mL) que para la enzima libre
(0.08 g/mL), lo cual significa que la enzima inmovilizada es saturada a
76concentraciones más bajas que la enzima libre, debido a la dificultad para el
acceso del sustrato a los sitios activos. Además para el caso de la celulasa
pueden estar comprometidos algunos aminoácidos del sitio activo en la
inmovilización. Esto se manifiesta por la baja actividad catalítica presentada.
De lo anterior se deduce que 133.09 mg de proteína inmovilizada tienen el mismo
efecto que 1 mg de proteína libre. El resultado anterior se debe a que el proceso
de inmovilización no fue especificado para la inmovilización de celulasa.
4.8.4 ACTIVIDAD CELULASA LIBRE E INMOVILIZADA FRENTE A LA
TEMPERATURA
De acuerdo a los resultados obtenidos en las figuras 50 y 51, se observa que para
la celulasa la temperatura optima de la enzima inmovilizada se desplaza 5ºC, al
igual que la pectinasa en el proceso de inmovilización ha tenido un efecto de
estabilidad adicional a la enzima.
La enzima se ha estabilizado de tal manera que se debe de tener una temperatura
superior en el caso de la inmovilizada frente a la libre para que el sustrato posea
una mayor movilidad y pueda este acceder al sitio activo.
Fig. 50 Respuesta de la celulasa libre frente a la temperatura (ver tabla 36)
100
90 dadivitcA
80
ed
70 %
10 20 30 40 50 60
Temperatura (ºC)
77Fig. 51 Respuesta de la celulasa inmovilizada frente a la temperatura ( ver tabla 37)
100
80
dadivitcA
60
40
20
ed
0
%
10 20 30 40 50 60 70
Temperatura (ºC)
4.9 ESTABILIDAD OPERACIONAL DEL CONJUNTO INMOVILIZADO
La prueba se realizo en el reactor de lecho empacado por un tiempo total de 771
minutos, recolectándose un total de 105 datos, los cuales se encuentran
ordenados en la tabla 38 (Anexo 3) y a apartir de los cuales se obtuvo la siguiente
gráfica:
Fig. 52 Estabilidad operacional del conjunto inmovilizado (ver tabla 38)
100
80
dadivitcA
60
40
20
ed
0
%
0 200 400 600 800
Tiempo (min)
A partir de la gráfica anterior y linealizando el porcentaje de actividad frente al
tiempo se obtiene la constante de desactivación y el tiempo de vida media del
conjunto enzima-soporte, tal y como se muestra en la figura 53:
78Fig. 53 Linealización de la estabilidad operacional
5
)dadivitcA
4
3
y = -0,002074x + 3,6137
2
R2 = 0,7768
ed
1 K´= 0,002074 min-1
%(
t(1/2) = 334,15 min
0
nL
0 200 400 600 800
Tiempo (min)
En la figura 52 donde se muestra la actividad frente al tiempo de operación, se
observa que la gráfica presenta una forma de tendencia cuasi-exponencial de
pendiente negativa, lo que representa que la actividad del soporte decae con el
tiempo de operación; teniendo que en aproximadamente 771 minutos, la actividad
pectinasa del soporte ha decaído notablemente. Además en los primeros 334
minutos de operación del reactor, la caída en la actividad es lenta y se sitúa
alrededor del 30% de actividad residual. Hallando el intercepto de la linea de
tendencia mostrada en la figura 53, la actividad nula se presenta en 29.03 horas
de operación.
4.10 EFECTO ENZIMATICO DE LA ENZIMA LIBRE E INMOVILIZADA SOBRE
EL JUGO DE GUAYABA
4.10.1 Reducción en la viscosidad del jugo de guayaba
Uno de los objetivos principales del presente trabajo es cuantificar el efecto de la
inmovilización en la reducción de la viscosidad del jugo de guayaba. Los
resultados se muestran en las figuras 54 y 55:
79Fig 54. Efecto de la Enzima libre sobre la viscosidad en el jugo de guayaba (ver tabla 39)
100 dadisocsiV
80
al
60
ed
nóicunimsiD
40
20
0 ed
%
0 20 40 60 80 100
Tiempo (min)
Fig. 55 Linealización del efecto de la enzima libre sobre la viscosidad el jugo de guayaba
5
al
4 ed
nóiccuder )dadisocsiV
3
y = -0,0212x + 4,6127
2 R2 = 0,9850
k´=0,0212 %(
1
Vida Media = 32,81 min
nL
0
0 50 100 150
Tiempo (min)
80Fig. 56 Efecto de la enzima inmovilizada sobre la viscosidad el jugo de guayaba (ver tabla
40)
dadisocsiV
100
80
60 ed
nóiccuder
40
20
ed
0
%
0 50 100 150 200 250 300
Tiempo (min)
Fig. 57 Linealización del efecto de la enzima inmovilizada sobre la viscosidad el jugo de
guayaba
5
4 ed
nóiccuder
3 )dadisocsiV
y = -0,0065x + 4,255
2
R2 = -0,9482
ed
k´=6,450970 e-3
1
Vida Media = 107,44 min %(
0 nL
0 100 200 300
Tiempo (min)
81Tabla 41. Comparación en la Reducción de la viscosidad del Jugo de Guayaba
Enzima % Reducción de Enzima Actividad Específica Tiempo
la Viscosidad Utilizada (UI / mg de Proteína) (horas)
(UI)
Libre 92.34 3.22 0.045 2
Inmovilizada 76.47 0.58 1.046 2
La tabla anterior muestra que como era de esperarse, la enzima libre presenta una
mayor efectividad en la reducción de la viscosidad para un mismo tiempo. Esto se
debe a la movilidad que presenta el sustrato frente a la enzima en comparación
con la inmovilizada.
Para la enzima inmovilizada se observó que después de 2 horas se obtuvo una
reducción del 76.47%; lo que indica que después de transcurrido este tiempo, el
conjunto inmovilizado, no es tan efectivo con respecto a la enzima libre. Si se
desea obtener el mismo porcentaje de reducción de viscosidad que en el caso de
la libre; se debe utilizar un peso de conjunto inmovilizado mayor. Esta decisión se
hará en términos de un análisis económico entre tiempo de residencia o peso de
conjunto inmovilizado con respecto al factor económico.
Tabla 42: Datos de Estabilidad Operacional (Batch) para un Jugo de Guayaba
Constante de Tiempo de Vida Tiempo de
Tipo Desactivación de la enzima Media (min) Desactivación
(min-1) (t ) (min)
1/2
(k´)
Libre 0.0212 32.81 217.58
Inmovilizada 6.45097e-3 107.44 654.62
Aunque de la tabla anterior se puede concluir que la constante de desactivación
de la enzima inmovilizada con respecto a la libre es pequeña como era de
esperarse (por las razones anteriormente expuestas), este decaimiento de la
enzima se ve compensado por el tiempo de desactivación total del conjunto
inmovilizado que es tres veces mayor con respecto a la libre. Por lo tanto si en un
proceso industrial, se desea un tiempo menor o equiparable de utilización de
enzima inmovilizada en comparación con la libre; se debe recurrir a un sistema de
reactores en cascada con el fin de evitar un tamaño excesivo en el
dimensionamiento del tamaño del reactor.
824.10.2 Efecto de la enzima libre e inmovilizada en los azucares reductores.
Fig. 58 Aumento de azucares reductores en la guayaba (ver tabla 39)
)L/gm(
4000
3000 serotcudeR
2000
1000 seracuzA
0
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (min)
Fig. 59 Aumento de azucares reductores en la guayaba inmovilizada (ver tabla 40)
1900
)L/gm(
1700
serotcudeR
1500
1300
1100
seracuzA
900
700
0 50 100 150 200
Tiempo (min)
A pesar de que el protocolo de inmovilización no nos garantiza la mayor
inmovilización de la Endo-celulasa presente en el cóctel enzimático, hay algún
porcentaje de esta que se inmovilizo. La forma de mostrar la aseveración anterior
es el efecto en el aumento de azúcares reductores a lo largo del tiempo de pérdida
de viscosidad de los ensayos anteriores. Como se observa de las gráficas 58 y 59,
el aumento de azucares reductores para ambos casos, muestra una tendencia
83exponencial de crecimiento en la concentración de azucares reductores con un
tiempo de estabilización a medida que la viscosidad se acerca a un valor estable.
4.11 VISUALIZACION DE LA INMOVILIZACION Y EL EFECTO DEL BRAZO
ESPACIADOR .
4.11.1 Poro de quitina antes y después de la inmovilización
Para iguales condiciones controladas de vacío (1.2 Torr) y potencia del haz de
electrones (15 Kw), se observa la cavidad del poro (5µm) con un aumento de 3826
veces. Estas mismas condiciones, se aplicaron al mismo poro pero con la enzima
fijada producto del proceso de inmovilización como se puede observar en la figura
63, donde los cúmulos adheridos al poro permiten visualizar el conjunto enzima-
soporte.
Fig. 60 Poro de quitosano antes de la inmovilización
84Fig. 61 Poro de quitosano después del proceso de inmovilización
4.11.2 Inmovilización con y sin brazo espaciador
Como uno de los objetivos era evaluar la conveniencia del uso de un brazo
espaciador (glutaraldehido), las gráficas siguientes nos permiten visualizar bajo las
mismas condiciones como los nódulos mostrados en la figura 62 son dispersos y
achatados. En el caso del uso de brazo espaciador (Fig. 63), se pueden observar
también nódulos en mayor densidad, con formación de racimos y mucho más
redondeada; lo que nos demuestra que el uso del brazo espaciador promueve una
mejor fijación.
85Fig. 62 Inmovilización sin brazo espaciador
Fig. 63 Inmovilización con brazo espaciador
4.11.3 Influencia del brazo espaciador en el efecto conformacional
Los efectos conformacionales se deben a la modificación química de la proteína
enzimática durante el proceso de inmovilización. Estos efectos pueden ser
86especialmente dramáticos sobre la actividad cuando se toman restos de
aminoácidos en la inmovilización que forman parte del sitio activo o que son
importantes para el mantenimiento de la estructura terciaria de la proteína. Es así
como cuando no se utiliza brazo espaciador, la forma globular de la enzima fijada
al soporte tiende a ser achatada lo que indica que el área superficial de fijación es
grande lo que conlleva a la perdida de actividad catalítica (Fig. 64), en
comparación con los racimos y nódulos bien formados cuando se utiliza brazo
espaciador con áreas de fijación menores (Fig. 65). Estas dos figuras, son los
correspondientes aumentos de las figuras 64 y 65 (6826 aumentos contra 45542
respectivamente).
Fig. 64 Acercamiento a una estructura de proteína sin brazo espaciador
Fig. 65 Acercamiento a una estructura de proteína con brazo espaciador
874.12 COSTOS DE PREPARACIÓN DEL SOPORTE
El costo total de inmovilización de pectinasa y celulasa sobre 0.3979 gramos de
quitina para obtener una reducción en viscosidad del 76.47% por un tiempo de dos
horas en 100 mL de jugo de guayaba es de $800,52. Para obtener una reducción
de 92.354% por medio de la enzima libre en el mismo lapso de tiempo, el costo
fue de $8.05. De lo anterior se deduce que es más barato la utilización de la
enzima libre en comparación de la inmovilizada, pero como la actividad catalítica
de la enzima-soporte se puede reutilizar hace posible que lo costos de
procesamiento se reduzcan.
Algunos autores reportan la utilización del conjunto inmovilizado bajo condiciones
similares hasta 60 veces [22] y en nuestro caso la simulación del PFR se encontró
que la mayor parte de la actividad catalítica, se estabilizo en alrededor de 10.2
horas con un flujo total alimentado de 830 mL de solución de pectina al 1%
simulando el jugo, lo que demuestra la reutilización del conjunto enzima-soporte.
Un análisis más detallado de los costos se muestran en la tabla 43.
Tabla 43. Costo por paso en el proceso de inmovilización (costo por gramo de quitina)
Paso Material Costo en pesos
colombianos
Costos de preparación Hidróxido de sodio 82.844
para la quitina Ácido clorhídrico 116.928
Ácido acético 13.457
Cloruro de sodio 0.3866
Activación del soporte Ácido acético 91.71
Fijación del brazo Glutaraldehido 63.99
espaciador
Incubación Buffer 33.29
Enzima 1609.29
TOTAL COSTOS $ 2011.90
885. CONCLUSIONES
La quitina mostró propiedades que hacen plausible su utilización como soporte
adecuado para la inmovilización de enzimas por medio de enlace covalente, previa
activación por medio del ácido acético; lo que hace que estas condiciones no sean
muy severas con todo el potencial para la utilización en la industria alimenticia.
Con la realización de este trabajo se comprobaron las propiedades que poseen las
enzimas inmovilizadas sobre quitina (pectinasas y celulasas) y la posible
utilización en el proceso de la industria de jugos para la disminución en viscosidad
y licuefacción de la pared celular de la guayaba.
Se demostró la importancia de la utilización de un brazo espaciador como el
glutaraldehido y sus repercusiones en el aumento significativo de la actividad
catalítica del conjunto inmovilizado, lo que permite que la superficie de reacción
sea extensa y a su vez disminuya los impedimentos estéricos y conformacionales
lo que asegura que exista una alta probabilidad de unión de las enzimas sobre la
superficie y que el sustrato pueda acceder a esta de una forma más efectiva.
El protocolo de inmovilización obtenido mediante el diseño factorial, da las mejores
condiciones para la inmovilización de pectinasa sobre quitosano. Las condiciones
óptimas de inmovilización para la pectinasa obtenidas por medio del plan pueden
variar de acuerdo a la necesidad. Si se desea una mayor cantidad de proteína
inmovilizada el protocolo permite obtener esas condiciones y si lo que se desea es
una mayor efectividad catalítica del soporte también se pueden obtener por medio
de las ecuaciones matemáticas encontradas. Para el presente caso las
condiciones encontradas por medio del diseño 23 para un peso de quitina de 0.5
gramos son: concentración de ácido acético (4%), temperatura de activación del
soporte (45ºC) y volumen de glutaraldehido (1.6 mL).
A través de las graficas comparativas de la enzima libre versus inmovilizada se
observa que el proceso de inmovilización para la pectinasa y la celulasa
proporciona una estabilidad extra a las enzimas, ya que se observa de estos
gráficos una estabilización de la actividad catalítica en rangos muy amplios de pH
(3 - 5) y temperatura (35 - 45 ºC) en comparación con los picos de la libre (pH 3.7
y temperatura de 37ºC). Lo anterior indica que el uso del conjunto inmovilizado
sobre un jugo de guayaba debe ser más prolongado que el uso de la enzima libre.
Diversos autores han tratado de explicar el comportamiento del pH de las enzimas
inmovilizadas, así, se atribuyen los cambios directamente al micro ambiente. Se
encuentra que este fenómeno es el resultado de una desigual distribución de los
89iones hidrógeno e hidroxilo y la carga de los sustratos. La concentración local de
iones hidrógeno en las cercanías del soporte-enzima, depende de la carga del
soporte, si este, esta cargado negativamente ocurrirá una acumulación de iones
hidrógeno en su superficie; si su carga es positiva, se acumularan iones hidroxilo.
Por ello, en la superficie del soporte donde la enzima esta localizada, el pH será
mayor o menor que en el seno de la solución, creando un aparente cambio en el
perfil del pH [18]. Aunque para algunos casos de inmovilización, la explicación
anterior se cumple, el desplazamiento del pH una vez ocurra la inmovilización,
depende principalmente de la carga del conjunto enzima soporte. Aún más, si la
enzima esta ligada al soporte directamente, dicha carga afectará la carga neta del
conjunto inmovilizado, haciendo que el desplazamiento del pH no sea el esperado.
Como de antemano se sabe, la quitina es positiva, una vez es activada la
superficie con el ácido acético, se esperaría que el desplazamiento del pH fuera
hacia un pH ácido por lo anteriormente expuesto, cosa que no ocurre debido a que
tal vez la carga neta del conjunto enzima soporte es negativa [2]. Como se
observa en la figura 36, el lado izquierdo del incremento del pH hasta llegar al
óptimo muestra una pendiente alta, lo que indica que este se alcanza iniciando
con una baja actividad hasta llegar a la actividad máxima [23] (fase de activación
de la enzima). Lo mismo para el lado derecho de la curva que corresponde a la
desnaturalización de la enzima, en el caso de la figura 37, se observa que esta
curva no es tan pronunciada, lo que produce un incremento en el rango de trabajo
para el pH; ya que se observa que un rango de pH entre 4 y 5, no se difiere en
más de un 10% con respecto al óptimo, debido a esto la utilización del conjunto
inmovilizado a escala industrial es adecuado debido a que los cambios de pH que
puedan ocurrir en el proceso, no van a afectar tanto la actividad, como si ocurriría
con la libre.
La dependencia del pH se debe a los cambios en los estados de ionización de los
aminoácidos del sitio activo de la enzima [12], lo que provoca el desplazamiento
de la gráfica de la enzima inmovilizada con respecto a la enzima libre. Esto
permite que las enzimas inmovilizadas puedan ser utilizadas por un largo tiempo
bajo condiciones más severas que en las que normalmente ellas trabajan.
En cuanto a la actividad de la pectinasa libre e inmovilizada frente a la temperatura
la estabilización que se observa en el caso de la inmovilizada se debe a que el
proceso de inmovilización ha tenido un efecto de estabilidad adicional a la enzima.
La proteína se ha estabilizado de tal manera que se debe de tener una
temperatura superior en el caso de la inmovilizada frente a la libre para que el
sustrato posea una mayor movilidad y pueda así acceder al sitio activo. La
inmovilización permite a su vez obtener un rango de trabajo mucho más amplio
(35 – 45 ºC) con un promedio de actividad del 85%; en comparación con un óptimo
puntual para 37 ºC en la libre. Este beneficio implica una ganancia en la posible
operación de un reactor a nivel industrial donde se tiene variaciones de
temperatura permanentes.
90Las enzimas pectinasa y celulasa inmovilizadas cumplen al igual que las enzimas
libres con una cinética michaeliana, lo cual demuestra que la afinidad que poseen
dichas enzimas por el sustrato no se pierde totalmente en el proceso de
inmovilización. La pérdida de actividad enzimática después de una inmovilización
depende del método utilizado, en este caso comparando las actividades máximas
de la enzima libre y de la inmovilizada; se puede deducir que 14.4168 mg de
proteína inmovilizada equivalen o actúan con la misma eficiencia que 1 mg de
enzima libre. El resultado anterior puede mostrar que la pectinasa inmovilizada
sobre quitina, no posee una actividad catalítica alta, sin embargo esta se ve
compensada en el sentido que la enzima inmovilizada, se puede reutilizar lo que
no ocurre con la libre.
En el caso de la estabilidad operacional Vaillant [22] reporta una vida media para
el conjunto quitina-pectinasa de 407 horas, bajo condiciones operacionales muy
similares al del presente trabajo pero con una diferencia muy significativa, el
tamaño de partícula; que para el caso de Vaillant lo sitúa en un rango de 10-50
µm, mientras que en el presente trabajo el tamaño de partícula promedio oscila
entre 50 y 100 mm. Esta diferencia en el tamaño de partícula incide directamente
en las restricciones difusionales, que aparecen cuando el sustrato debe difundir
hacia la enzima inmovilizada. Estos dos efectos son llamados efecto difusional
externo e interno, los cuales se pueden disminuir pero no evitar; el primero se
hace pequeño, aumentando la velocidad de flujo en un reactor tubular; mientras
que la limitación difusional interna surge a raíz del tamaño pequeño y tortuoso de
los poros del soporte, que impide que el flujo de fluido pase al interior de los poros
o gránulos, lo que da lugar a una disminución localizada del coeficiente de
difusión. Para disminuir estas restricciones difusionales internas en la mayoría de
los casos, se utiliza un sustrato de bajo peso molecular, una concentración de
biocatalizador baja o como en el caso más general; partículas de soporte muy
pequeñas y muy porosas en la que los poros sean grandes, no tortuosos e
interconectados lo más posible [18]. La baja estabilidad operacional (tiempo),
encontrada en este trabajo se atribuye a las restricciones difusionales internas
explicadas anteriormente; sin embargo la tendencia de los gráficos de estabilidad
operacional se asemejan en su comportamiento con los reportados en la literatura.
Debido a la disponibilidad actual de equipos como el ESEM, se pudo realizar el
seguimiento de un parámetro tan importante como la utilización del brazo
espaciador en el proceso general de inmovilización y la importancia que este tiene
en el efecto conformacional de las enzimas y la comprobación practica en el
laboratorio de la disminución de actividad catalítica.
916. RECOMENDACIONES
A partir de un analisis comparativo de los resultados encontrados en este trabajo y
los hallados en la literatura, el comportamiento general de las curvas
principalmente para la estabilidad operacional es el mismo diferenciándose en los
valores cuantitativos, por lo que se sugiere disminuir el tamaño de partícula ya que
este factor incide directamente sobre el proceso de inmovilización haciendo que la
actividad catalítica permanezca durante un tiempo mayor. Se decidió trabajar con
un tamaño de partícula mayor, ya que no cuenta actualmente con el montaje que
haga posible el manejo de las caídas de presión en el caso de la simulación del
reactor PFR, al utilizar un tamaño de partícula en alrededor de 10 y 50 µm como lo
sugiere la literatura.
Con la metodología mostrada en este trabajo, en especial la utilización del plan de
experiencia factorial para encontrar las mejores condiciones de inmovilización y
con la posible disminución del tamaño de partícula al rango recomendado, se
sugiere la búsqueda de parámetros cinéticos que permitan con todo lo anterior
realizar un modelamiento matemático del mismo, además de la posible
configuración de uno o dos reactores en serie, paralelo o combinados; que
permitan optimizar la actividad catalítica del conjunto inmovilizado en una posible
aplicación de un reactor para la industria de jugos.
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22. Vaillant,F “Co-immobilized pectinlyase and endocellulase on chitin an nylon
supports”, Elsevier Process Biochemistry (2000) 989-996
23. Whitaker, J “Microbial Pectinolytic Enzymes”, Microbial Enzymes and
Biotechnology, Elsevier Applied Science, London, 1990, 113-169
24. Worthigton Von, Worthington Enzyme Manual. Worthington Biochemical
Corporation, Lakewood NJ USA.
94ANEXO 1
MÉTODO DE BIURET
Los compuestos que tienen dos o más enlaces peptídicos, dan un color rosado o
lila característico, cuando se tratan con sulfato de cobre en solución alcalina. El
color es debido al complejo de coordinación del ión cúprico con cuatro átomos de
hidrógeno, provenientes de los enlaces peptídicos, dos de cada péptido. Los
espectros de absorción de los complejos de cobre formados por diferentes
proteínas son similares y por consiguiente es posible utilizar una proteína
cualquiera como patrón de coloración.
La técnica de análisis cuantitativo basada en la espectroscopia y absorción se
conoce como Espectrofotometría y se basa en la ley de Lambert-Beer la cual
establece que la energía absorbida por una sustancia (absorbancia) a cualquier
longitud de onda, depende de la concentración de material absorbente y del
espesor de la disolución atravesada por la luz o paso óptico1.
Preparación de la solución de Biuret1
Se disuelven 1,5 g de CuSO , 0,5 g de H O y 6,0 g de NaKC H O en 500 mL de
4 2 4 4 6
agua destilada. Luego se adiciona 300 mL al 10% de NaOH con agitación
constante. Diluya 1 a 1 con agua destilada y deje en reposo en una botella de
polietileno.[25]
Procedimiento para curva de calibración:
Para la determinación de las proteínas del líquido, se realiza una curva de
calibración utilizando soluciones de albúmina de diferente concentración obtenidas
de una solución patrón de albúmina de 6,00 mg/mL.
Tabla 10: Diseño para la curva de calibración.
Muestra/Tubo Blanco 1 2 3 4 5
Patrón de Albúmina 0,20 0,4 0,6 0,8 1,00
Agua destilada 2,00 1,80 1,6 1,4 1,2 1,00
Biuret 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00 4,00
Se rotulan 6 tubos de ensayo y se dejan en reposo por 30 minutos a temperatura
ambiente o por 10 minutos a 30°C para el desarrollo del color, del complejo
cuproprotéico.
95Leer en cada tubo el porcentaje de transmitancia a 540 nm, usando el blanco para
ajustar el 100% de la transmitancia. El porcentaje de transmitancia debe leerse
con una cifra decimal.
Ya hecha la curva de calibración se puede correr la muestra problema y de esta
forma determinar la concentración de proteína presente en la muestra.
Absorbancia = A = Log (I /I) (1)
0
(medida de la energía absorbida)
A = abC Ley de Lambert-Beer (2)
Donde A = Coeficiente de extinción
En un experimento dado a y b son constantes de tal manera que
A = KC (3)
El valor de K puede determinarse con patrones de concentración conocida
midiendo la absorbancia correspondiente a diferentes concentraciones y construir
una grafica que generalmente es una recta de pendiente K. Para medir la
concentración de la solución desconocida, basta con medir la absorbancia y/o
calcular C interpolando en la recta ( C = A/K )
1
The Food Chemistry Laboratory, CRC Press 1992 Pág. 58
96ANEXO 2
MÉTODO DEL DNS PARA DETERMINACION
DE AZUCARES REDUCTORES
El ácido dinitrosalicílico, es un reactivo desarrollado por Sumner y se utiliza para
la determinación de azucares reductores, esta compuesto de ácido dinitrosalicílico,
tartrato de sodio y potasio, fenol, bisulfito de sodio e hidróxido de sodio.
El tartrato de sodio y potasio es introducida para prevenir que el reactivo disuelva
oxígeno, el fenol incrementa el color producido; el bisulfito estabiliza el coor
obtenido en presencia del fenol. La alcalinidad es requerida para producir la
reducción de la glucosa y de esta forma tener un mayor efecto del ácido
dinitrosalicílico.
La química en la prueba del DNS, es la reducción que sufre este por la glucosa; el
ácido 3,5 dinitrosalicílico es reducido al compuesto 3-amino-5-nitrosalicílico a
causa del grupo aldehído que se oxida a su vez a grupo carboxilo.
Preparación del reactivo:
(cid:153) Solución A: Hidróxido de sodio 13,5 g en 300 mL de agua destilada
(cid:153) Solución B: Se disuelven 8,8 g de DNS, con 32,5 g de tartrato de sodio y
potasio tetrahidratado en 800 mL de agua destilada.
(cid:153) Solución C: Mezcla de las soluciones A y B
(cid:153) Solución D: Se pesa 2.2 g de NaOH, con 10m g de fenol en cristales en 100
mL de agua destilada.
(cid:153) Solución de bisulfito de sodio: Se disuelve 5 g de NaHSO en 25 mL de agua
3
destilada.
(cid:153) El reactivo DNS es preparado adicionando a la solución C 69 mL de la solución
D y 23.2 mL de solución de bisulfito de sodio
Preparación de la curva2 :
Se prepara una curva patrón de glucosa entre 0 y 250 mg/mL. Por ejemplo para el
primer patrón se toman 0.5 mL de la solución de glucosa y se adiciona 1.5 mL de
reactivo DNS y se lleva a un baño en ebullición por 5 minutos para que genere la
reacción de color, inmediatamente después la muestra se lleva a un baño de agua
hielo por otros 5 minutos. Después se adicionan 9.5 mL de agua deionizada y 0.5
mL; se espera30 minutos con el fin de que haya estabilización de la reacción.
97Una vez transcurrido este tiempo, se lleva a la lectura del espectrofotómetro a 540
nm.
2
Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of Reducing Sugar, Gail Miller Analitical
Chemistry Vol 31 No 3 Marzo de 1959.
98ANEXO 3
DETERMINACION DE LA ACTIVIDAD CATALITICA
( PECTINASA Y CELULASA)
Actividad de pectinasa
La pectinliasa corta la pectina por β-eliminación. La reacción produce azucares
que presentan un enlace doble C -C , los cuales presentan un máximo de
3 5
absorción entre 232 y 235 nm, debido al doble enlace. El valor del coeficiente de
extinción molar del compuesto insaturado (5500 M-1cm-1), que varia con el pH y el
grado de metilación de la pectina. En condiciones estándares, la medida de la
actividad pectinasa se hace a pH 4 y una temperatura de 40°C, sobre una solución
de pectina altamente metilada.
Preparación del buffer Acetato pH 4.0, 0.1 M
41 mL de solución de ácido acético 0.2 M y 9 mL de acetato de sodio 0.2M, se
introducen en un balón volumétrico de 100 mL y se afora con agua destilada.
Preparación del sustrato
Se introducen en un balón volumétrico de 200 mL, un gramo de pectina comercial
y 1.16 gramos de cloruro de sodio en 150 mL de buffer acetato pH 4.0, 0.1M y se
afora hasta 200 mL. Esto se hace para tener una referencia conocida en cuanto a
cantidad de pectina para poder estandarizar el método
En cuanto al jugo de guayaba se acondicionará en cuanto a características físicas
y se ejecutara el mismo procedimiento anterior para observar el efecto de las
pectinasas inmovilizadas y libres en el jugo.
Determinación de la actividad pectinasa libre
Dentro de un tubo de ensayo de 10 mL de capacidad, adicionar 2 mL de substrato
(0.5% w/ Volumen de pectina) y 2 mL de buffer acetato pH 4.0, 0.1 M e incubara
40°C en baño termostático durante 10 minutos. Al tiempo cero añadir 1 mL de
solución de la preparación enzimática en buffer, agitar inmediatamente y leer a
235 nm en el espectrofotómetro (Ao). Devolver la solución de nuevo al baño
termostático y 15 minutos después añadir la preparación enzimática, leer en el
espectrofotómetro 235 nm (Am) [24]
La actividad se calcula mediante la siguiente ecuación:
Actividad Pectinasa = (Am – Ao)*0.0606/mg Prot (UI/mg)
99Determinación de la actividad de la pectinasa inmovilizada
En un Beaker de 50 mL agregar 10 mL de substrato y 15mL de buffer acetato pH
4.0, 0.1 M e incubar a 40°C en baño termostático durante 10 minutos (en
agitación). Leer a 235 nm (Ao). Al tiempo cero añadir el conjunto inmovilizado y 15
minutos después leer en el espectrofotómetro, después de filtrar (Am), el sólido se
seca y pesa (w) [24].
La actividad se calcula mediante la siguiente ecuación:
Actividad PL = (Am-Ao)*0.303/w (UI/g)
Actividad de la celulasa
La enzima es incubada en presencia de una solución de Carboximetil celulosa
(CMC). El resultado de la hidrólisis se evalúa por la cantidad de azucares
reductores formados en el curso de la reacción con la ayuda del reactivo Ácido
Dinitro Salicílico (DNS) [24].
El sustrato es una solución de CMC 22.5 mg/mL en buffer acetato pH 4.0
Determinación de la actividad celulasa libre
En un tubo de ensayo de capacidad 15 mL, se adiciona 0.5 mL de sustrato CMC
que se incuba en baño termostático a 39°C durante 10 min. Adicionar al tubo 0.5
mL de la preparación enzimática e incubar por una hora. Adicionar 0.5 mL de
NaOH 1M para detener la reacción. Adicionar al tubo 1.5 mL de DNS y llevar a un
baño en ebullición durante 5 min. Enfriar el tubo en un baño de agua–hielo y
adicionar 9.5 mL de agua destilada y leer en el espectrofotómetro a 540 nm en
celdas de vidrio (Am) frente a un blanco preparado a condiciones similares (Ao).
La actividad celulasa de la enzima se realiza por extrapolación de una curva
patrón de azucares reductores preparada a partir de glucosa entre 0 y 250 mg/mL
Actividad CX libre = (Am-Ao)*0.07535/mg de proteína
Determinación de la actividad celulasa inmovilizada
En un tubo de ensayo de capacidad 15 mL, se adiciona 0.5 mL de sustrato CMC y
4.5 mL de buffer acetato pH 4.0. Se incuba en baño termostático a 39°C durante
10 minutos. Se adiciona al tubo 0.05 g del conjunto enzima soporte y se incuba
por una hora. Adicionar 0.5 mL de NaOH 1M para detener la reacción. Adicionar al
tubo 1.5 mL de DNS y llevar a un baño en ebullición durante 5 minutos. Enfriar el
100tubo en un baño de agua hielo y adicionar 9.5 mL de agua destilada y leer en el
espectrofotómetro a 540 nm (Am) frente a un blanco preparado a condiciones
similares (Ao) [24].
Actividad CX inmovilizada = (Am-Ao)*0.37675/w
Donde w es el peso del conjunto inmovilizado
101ANEXO 4
TABLAS DE RESULTADOS
Tabla 22: Datos para generar la curva de Pectinasa libre Vs pH
pH Absorbancia Absorbancia Actividad (UI/mg) % de
Final Inicial Actividad
2.6 3.5656 3.1002 0.02820324 51.26
3.0 3.7793 3.1504 0.03811134 69.27
3.2 3.7994 3.1632 0.03855372 70.08
3.5 3.8717 3.1468 0.04392894 79.85
3.7 3.9966 3.0888 0.05501268 100.00
4.0 3.8661 3.1277 0.04474707 81.33
4.5 3.7936 3.0681 0.0439653 79.91
5.0 3.6961 3.1389 0.03928092 71.40
5.5 3.7845 3.1485 0.03854 70.05
6.0 3.7871 3.0851 0.0370266 67.30
7.0 3.6823 3.1819 0.030324 55.12
Tabla 23: Datos para generar la curva de la pectinasa inmovilizada vs pH
pH ∆Absorbancia Gramos de Actividad Porcentaje de
Quitina (U / g de quitina) Actividad
3.0 0.4532 0.1333 1.0301545 62.55
3.7 0.4700 0.1005 1.4170149 86.05
4.0 0.5330 0.1102 1.4655081 88.99
4.2 0.4826 0.0997 1.466678 89.06
4.5 0.4211 0.0852 1.4975739 90.94
5.0 0.3663 0.0664 1.6467195 100
5.5 0.2515 0.0712 1.0702879 64.99
6.0 0.2649 0.0788 1.0185875 61.85
6.5 0.4017 0.1203 1.011763 61.44
7.0 0.2605 0.1407 0.5609914 34.06
Tabla 24 Datos para generar la curva Pectinasa libre Vs Temperatura
T ºC Absorbancia Absorbancia Actividad (UI/mg) % Actividad
Final Inicial
20 3.4561 3.2297 0.01371984 14.00
25 3.5521 3.0847 0.02832444 29.20
30 3.8323 3.0764 0.04580754 47.22
35 3.9413 3.0397 0.05463696 56.33
37 4.7221 3.1215 0.0969936 100.0
40 3.6476 2.9414 0.04279572 44.20
45 3.6658 3.0069 0.03992934 41.16
50 3.7751 3.1425 0.03833556 39.52
55 4.0055 3.7876 0.01320474 13.61
102Tabla 25. Datos para generar la curva de la pectinasa inmovilizada frente a la
temperatura
Peso de
Temperatura ∆ absorbancia Quitina Actividad % Actividad
(ºC) (g) (UI/mg)
20 0.1064 0.1456 0.000221423 60.54
25 0.1440 0.1703 0.0002562066 70.06
30 0.107 0.1317 0.000246173 67.31
35 0.910 0.0832 0.0003314062 90.62
40 0.1330 0.1102 0.0003656896 100
45 0.1544 0.1455 0.000321534 87.92
50 0.0661 0.0669 0.0002898451 79.25
55 0.0228 0.0346 0.0001996647 54.59
60 0.0349 0.0943 0.0001121389 30.66
65 0.0742 0.1778 0.000127164 34.77
70 0.0028 0.0594 0.0000142828 3.90
Tabla 26: Datos para generar la curva de pectinasa libre Vs Concentración de Sustrato
Concentración ∆ absorbancia Actividad (UI/mg) % de Actividad
(w/v)
0.05 1.1065 0.0670539 59.04
0.1 1.2681 0.07684686 67.67
0.2 1.3305 0.0806283 71.00
0.3 1.5847 0.09603282 84.56
0.4 1.6740 0.1014444 89.33
0.5 1.7316 0.10493496 92.40
0.6 1.8739 0.11355834 100.00
Tabla 27. Datos para generar la curva Pectinasa Inmovilizada frente a la
concentración de sustrato
Pectina ∆Absorbancia Gramos de Actividad % de Actividad
% (w/v) Quitina (UI / g )
0.1 0.4686 0.1105 1.2849393 16.35
0.2 0.6919 0.0921 2.2762833 28.97
0.3 0.8712 0.1101 2.3975830 30.52
0.4 1.3727 0.1280 3.2494382 41.36
0.5 1.5963 0.1411 3.4279156 43.63
0.6 1.5326 0.1282 3.6222917 46.11
0.7 1.7678 0.0784 6.8321862 86.97
0.8 2.7740 0.1070 7.8553457 100
103Tabla 28 Doble recíprocos para generar la grafica de lineweaber
(pectinasa libre)
Inverso de la Concentración Inverso de la Actividad ( mg/UI )
20 14.9133
10 13.0128
5 12.4025
3.3333 10.4131
2.5 9.8576
2 9.5297
1.6666 8.8060
Tabla 29. Dobles recíprocos para generar lineweaber de la pectinasa inmovilizada
Inverso de la Concentración Inverso de la Actividad
10 778.246
5 439.312
3.3333 417.087
2.5 307.745
2 291.7224
1.6666 276.068
1.4285 146.366
1.25 127.301
Tabla 30. Datos obtenidos para generar la curva celulasa libre frente al pH
pH A -A Actividad (UI/mg) % de Actividad
m 0
2.6 0.5094 0.03838329 61.19
3.0 0.7200 0.05425200 86.49
3.2 0.7747 0.0583736 93.07
3.5 0.8119 0.0611766 97.53
3.7 0.8048 0.0606416 96.68
4.0 0.7959 0.0599710 95.61
4.5 0.8324 0.0627200 100
5.0 0.7776 0.0584716 93.22
5.2 0.6723 0.0506578 80.76
5.5 0.6403 0.0482466 76.92
6.0 0.6303 0.0474931 75.72
6.5 0.5717 0.0430775 68.68
7.0 0.5091 0.0383606 61.16
104Tabla 31. Datos para generar la curva de Celulasa inmovilizada frente al pH
pH ∆ Absorbancia Quitina (g) Actividad (UI/mg) % de Actividad
3.0 0.0096 0.0948 0.0000381518 79.90
3.7 0.0056 0.0516 0.0000408875 85.63
4.0 0.0102 0.0806 0.0000476774 99.85
4.2 0.0073 0.0576 0.0000477465 100
4.5 0.0070 0.0553 0.0000476889 99.87
5.0 0.0084 0.0727 0.0000435309 91.17
5.5 0.0097 0.1127 0.0000325249 68.11
6.5 0.0063 0.0753 0.0000315205 66.01
7.0 0.0097 0.1201 0.0000307249 64.45
Tabla 32. Datos obtenidos para generar la curva Actividad Celulasa Libre
frente a la concentración de Sustrato
Concentración de A -A Actividad % de Actividad
m 0
Sustrato (mg/mL) (UI/mg de proteína)
0.1 0.6145 0.04645328 79.68
0.2 0.6476 0.04879666 83.70
0.3 0.65055 0.04901189 84.07
0.4 0.66895 0.05040538 86.46
0.5 0.6882 0.05185587 88.94
0.6 0.7187 0.05410884 92.81
0.7 0.7265 0.05474178 93.89
0.8 0.7442 0.05607547 96.18
0.9 0.7557 0.05694200 97.67
1.0 0.7737 0.05829820 100
Tabla 33. Datos obtenidos para generar la curva Actividad Celulasa
Inmovilizada frente a la concentración de Sustrato
Concentración de ∆ Quitina Actividad (UI/mg)
Sustrato (mg/mL) Absorbancia (g) % de Actividad
0.01 0.0267 0.1487 0.0000676476 15.44
0.02 0.0130 0.0646 0.0000758157 17.30
0.03 0.1419 0.1791 0.0002984969 68.14
0.04 0.0783 0.0916 0.0003220469 73.52
0.05 0.4360 0.0365 0.0004380346 100
105Tabla 34. Datos lineweaber para celulasa libre
Inverso de la Concentración Inverso de la Actividad
10 21.52
5 20.49
3.33 20.40
2.5 19.83
2 19.28
1.66 18.48
1.42 18.26
1.25 17.83
1.11 17.56
1 17.15
Tabla 35. Datos lineweaber para celulasa inmovilizada
Inverso de la Concentración Inverso de la Actividad
100 14782.49
50 13189.88
33.33 3350.11
25 3105.13
20 2282.92
Tabla 36. Datos obtenidos para generar la curva Actividad Celulasa
libre frente a la Temperatura
T ºC A -A Actividad (UI/mg) % de Actividad
m 0
20 0.4031 0.03037359 80.42
30 0.4833 0.03641666 96.42
35 0.5012 0.03776542 100
37 0.4493 0.03385476 89.64
40 0.4277 0.0322272 85.33
45 0.4244 0.03197854 84.67
55 0.3943 0.02971051 78.67
106Tabla 37. Datos obtenidos para generar la curva Actividad Celulasa
Inmovilizada frente a la Temperatura.
Temperatura ∆ Absorbancia Quitina (g) Actividad (UI/mg) % de
(ºC) Actividad
20 0.0029 0.0618 0.000017679 37.87
25 0.0046 0.0712 0.0000243398 52.14
30 0.0128 0.1107 0.0000435627 93.32
35 0.0111 0.0948 0.0000441128 94.49
40 0.0099 0.0799 0.0000466808 100
45 0.0066 0.0606 0.0000410313 87.89
50 0.0113 0.1131 0.000037641 80.63
55 0.0033 0.0594 0.0000209292 44.83
60 0.0007 0.0468 0.0000056346 12.07
65 0.0002 0.576 0.0000013072 2.80
Tabla 38. Estabilidad Operacional
Tiempo (min) Actividad (U/g) % de Actividad Ln (% de Actividad)
0 0.136687 100 4.6051
7 0.110645 80.94 4.3937
13 0.060721 44.42 3.7937
16 0.068243 49.92 3.9004
20 0.049871 36.48 3.5967
41 0.0437791 32.02 3.4663
48 0.036690 26.89 3.2898
58 0.034455 25.20 3.2268
63 0.04225 30.91 3.4310
67 0.0365426 26.73 3.2857
72 0.032728 23.94 3.1755
81 0.0348792 25.51 3.2391
90 0.0373796 27.34 3.3084
98 0.0362354 26.5 3.2771
105 0.0384709 28.12 3.3364
113 0.0371253 27.16 3.3017
118 0.0353877 25.88 3.2534
126 0.0334806 24.49 3.1983
134 0.0354725 25.95 3.2562
142 0.0321880 23.54 3.1587
150 0.0430268 31.47 3.4490
159 0.0368499 26.95 3.2939
168 0.0358115 26.19 3.2653
171 0.0357480 26.15 3.2638
178 0.0315629 23.09 3.1394
185 0.03080 22.53 3.1148
107191 0.0312768 22.88 3.1303
199 0.0314669 23.01 3.1359
207 0.0354195 25.91 3.2546
214 0.0295074 21.58 3.0717
223 0.03187 23.31 3.1488
232 0.0316582 23.16 3.1425
240 0.0352394 25.78 3.2495
247 0.0326436 23.88 3.1730
256 0.0345189 25.25 3.2288
266 0.0314887 23.02 3.1367
273 0.0306729 22.44 3.1108
280 0.0296240 21.67 3.0759
284 0.0260216 19.03 2.9460
291 0.027028 1977 2.9841
Tiempo (min) Actividad (U/g) % de Actividad Ln (% de Actividad)
299 0.0227477 16.64 2.8118
305 0.0246019 17.99 2.9952
311 0.0342541 25.06 3.2212
320 0.0270811 19.81 2.9861
324 0.0252588 18.47 2.9161
329 0.0256720 18.78 2.9327
336 0.0246125 18 2.8903
343 0.0372525 27.25 3.3051
349 0.0276851 20.25 3.0081
356 0.02651 19.4 2.9652
362 0.0231715 16.95 2.8303
368 0.0230868 17.05 2.8362
372 0.0227265 16.02 2.8106
377 0.0326648 23.89 3.1734
383 0.0267951 19.6 2.9755
398 0.0231609 16.94 2.8296
404 0.0192489 16.93 2.8290
408 0.019142 16.93 2.8290
414 0.0192725 15 2.7081
424 0.018128 14.09 2.6454
436 0.01813 13.26 2.5847
445 0.0182 13.27 2.5855
449 0.017471 13.31 2.5885
453 0.017206 12.78 2.5478
459 0.017376 12.58 2.5321
466 0.026445 12.71 2.5423
473 0.01882 19.34 2.9621
480 0.0253224 13.77 2.6225
487 0.0160516 18.50 2.9188
495 0.0247608 11.74 2.4630
501 0.028935 18.11 2.8964
506 0.027695 21.16 3.0521
108512 0.02648 20.26 3.0086
518 0.027997 19.37 2.9637
524 0.0260852 20.48 3.0194
530 0.02660 19.08 2.9486
536 0.02733 19.46 2.9683
542 0.02396 19.99 2.9952
547 0.01765 17.53 2.8639
553 0.01505 11.01 2.3988
559 0.01479 13.82 2.3814
Tiempo (min) Actividad (U/g) % de Actividad Ln (% de Actividad)
565 0.01738 12.71 2.5424
571 0.02476 18.04 2.8926
579 0.01496 10.94 2.3924
588 0.0238476 17.44 2.8587
596 0.01811 13.25 2.5839
605 0.0167615 12.33 2.5120
612 0.0096 12.26 2.5063
622 0.0010054 7.08 1.9572
631 0.009652 7.35 1.9947
641 0.009323 7.06 1.9544
652 0.009175 6.82 1.9198
662 0.008317 6.71 1.9035
670 0.008052 6.08 1.8050
674 0.007967 5.82 1.7613
679 0.006633 4.86 1.5810
685 0.006452 4.72 1.5518
693 0.008062 5.69 1.7733
698 0.006961 5.09 1.6272
703 0.005415 5.09 1.6272
709 0.0004661 0.34 1.6171
715 0.0001440 0.1
721 0.0001218 0.087
724 0.0003496 0.2557
771 0.00347 0.2557
109Tabla 39. Datos para la reducción de viscosidad jugo guayaba (enzima libre)
Tiempo (min) Viscosidad (cP) % Reducción de Azucares
Viscosidad Reductores
(mg/L)
0 2610 100 846.56
17 1840 70.49 856.39
23 1380 52.87 997.99
33 1160 44.44 1248.4
43 1130 43.30 1431.4
53 900 34.48 1662
63 840 32.18 1901
73 760 29.11 2407
85 380 14.55 2874.4
95 310 11.87 3025.7
113 210 8.00 3026.9
123 200 7.66 3027.2
Tabla 40. Datos para la reducción de viscosidad jugo guayaba
(enzima inmovilizada)
Tiempo (min) Viscosidad (cP) % Reducción de Azucares
viscosidad Reductores
(mg/L)
0 2820 100 878.22
12 2640 93.61 1148.9
32 1240 43.97 1225.6
47 1230 43.61 1272.3
62 1200 42.55 1340.3
82 1010 35.81 1345.2
102 980 34.75 1576.9
127 720 25.53 1589.6
157 690 24.46 1610.3
187 600 21.27 1611.7
217 550 19.50 1611.9
247 400 14.18 1612.0
277 390 13.82 1612.0
110Naturalzyme 200 XL Proenzimas
Pectinasa para el procesamiento de fruta Cll 56 N 5N-65
Bodega 4 La Flora Industrial
Cali-Colombia
Naturalzyme 200 XL es un cóctel enzimático grado alimenticio proveniente de una cepa
seleccionada de Aspergillius Níger.
Naturalzyme 200 XL depolimeriza y baja la viscosidad de la pulpa tratada.
• Actividad: 200.000 AJDU
• Contenido: Pectinasa
• Kosher: Producto certificado
• Proteína: 32.04 mg/mL
Un AJDU (Apple Juice Depectinit Unit) es una unidad degradadora de pectina
estandarizada sobre un sustrato definido (Jugo de manzana).
Dosis: 10-40 mL de cóctel por tonelada de fruta
Inactivación: Naturalzyme 200 XL se inactiva fácilmente a pH 7.0 o condiciones de
temperatura de 70°C por 10 minutos.