Efecto de la vitamina D3 en la producción de resolvina E1 por células mononucleares de sangre periférica de pacientes con periodontitis crónica.
Autor: Salinas Herrera, Viviana
Asesor: Rodríguez, Luz Stella (Thesis advisor)
Fecha: 2017-12-12
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Antecedentes: Las enfermedades periodontales comprenden una amplia gama de  afecciones inflamatorias que afectan las estructuras de soporte de los dientes y  contribuyen a mantener una inflamación sistémica de baja magnitud (low grade  inflammation) (1). Según el IV Estudio Nacional de Salud Bucal- ENSAB IV, la  mayor parte de la población (61.8%) presenta periodontitis en sus diferentes grados  de severidad (2). Recientes investigaciones han propuesto el uso de mediadores  lipídicos pro resolutorios como la Resolvina E1 (RvE1) con el objetivo de devolverle  la salud a los tejidos periodontales; estos agonistas de las vías de resolución  reducen el número de neutrófilos en el exudado inflamatorio entre otras funciones  (17). La vitamina D3 [1,25 (OH) 2D3], regula la homeostasis del calcio y el fosfato  en el organismo, y adicionalmente ejerce importantes funciones  inmunomoduladoras, favoreciendo así un ambiente adecuado para la resolución del  daño (8).  Se ha evidenciado que la RvE1 y la vitamina D3 pueden reducir la expresión del  factor nuclear kappa B (NF-B), por lo que se ha considerado la opción de  investigar sí la vitamina D3 podría incrementar la producción de RvE1 (10)(11).  Basados en lo anterior, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la  vitamina D3, en la inflamación mediada por la producción de anti inflamatorios  naturales en células mononucleares de sangre periférica extraídas de pacientes  sistémicamente sanos con y sin enfermedad periodontal.  Materiales y Métodos: Se analizaron células mononucleares de sangre periférica  (CMSP) de 8 pacientes adultos voluntarios sistémicamente sanos, entre 30 y 50  años de edad, de los cuales 4 pacientes presentaban periodontitis crónica y 4 eran  periodontalmente sanos o con gingivitis. Las CMSP fueron estimuladas por 24  horas con lipopolisacárido (LPS) de Porphyromonas gingivalis, en ausencia y  presencia de Vitamina D3. Finalmente se midieron los niveles de resolvina E1  (RvE1) mediante ELISA en el sobrenadante del cultivo.  Resultados: Se encontró que las CMSP de pacientes con periodontitis, activadas  con LPS de Porphyromonas gingivalis producen mayor cantidad de RvE1 que las  células de pacientes periodontalmente sanos, bajo el efecto del mismo activador.  Las CMSP de pacientes con periodontitis crónica activadas con LPS en presencia  de VD3, mostraron un incremento en la producción de RvE1 al ser comparadas con  las células obtenidas de controles sanos activadas bajo iguales condiciones (LPS  + VD3). Sin embargo, no hubo diferencias estadísticamente significativas cuando  se compararon los niveles de producción de RvE1 por CMSP de pacientes con  periodontitis crónica y pacientes sanos activadas solo con VD3.  Conclusiones: El LPS de P. gingivalis aumenta significativamente la producción  de RvE1 por CMSP, tanto en pacientes sanos como en pacientes con periodontitis  crónica. La producción es significativamente mayor en el paciente afectado.  La VD3, no aumenta de manera significativa la producción de RvE1 por CMSP,  previamente activadas con LPS de P. gingivalis, independientemente del  diagnóstico periodontal. A pesar de la ausencia de significancia, se observa una  tendencia al aumento de producción de RvE1 en las células activadas con VD3  tanto en presencia como en ausencia del activador.

¨Efecto de la vitamina D3 en la producción de resolvina
E1 por células mononucleares de sangre periférica de
pacientes con periodontitis crónica¨
Rodrigo Alberto Torrez Velasco
Viviana Salinas Herrera
DIRECTORA TRABAJO FINAL
Dra. Lina Suarez Londoño
Universidad Nacional de Colombia - Facultad de Odontología
Posgrado de Periodoncia
Bogotá, Colombia
2017¨Efecto de la vitamina D3 en la producción de resolvina
E1 por células mononucleares de sangre periférica de
pacientes con periodontitis crónica¨
Rodrigo Alberto Torrez Velasco
Viviana Salinas Herrera
Trabajo final para optar al título de: Especialista en Periodoncia
Directora: Dra. Lina Suarez Londoño
Codirectora: Dra. Luz Stella Rodríguez
Codirectora: Dra. Sindy Maryuri Muñoz
Grupo de investigación: Gerodontología
Línea de investigación: Inmunopatogenesis de la enfermedad
periodontalDEDICATORIA
Dedicamos de manera especial este trabajo a nuestros pacientes, ya que por ellos
tenemos la responsabilidad de investigar e innovar nuevas opciones terapéuticas
para así brindarles la mejor opción de tratamiento y por consiguiente limitar las
consecuencias que trae la enfermedad periodontal a sus vidas.AGRADECIMIENTOS
Nuestros agradecimientos van dirigidos a Dios quien suplió cada necesidad,
haciendo posible la realización de este proyecto. Gracias a nuestros maravillosos
padres por su amor incondicional y apoyo en esta etapa importante de nuestra
carrera. A la directora del proyecto, Dra. Lina Suárez por guiarnos en el desarrollo
del mismo y motivarnos a buscar la excelencia, a las co-directoras Dra. Luz Stella
Rodríguez por su colaboración y dedicación al trabajo científico, Dra. Sindy Muñoz
quien nos brindó dirección en cada paso de la realización del proyecto. Por último
a los pacientes quienes colaboraron de manera desinteresada, sin ellos este trabajo
no hubiera sido posible. Siempre estaremos agradecidos con cada uno de ustedes.RESUMEN
Antecedentes: Las enfermedades periodontales comprenden una amplia gama de
afecciones inflamatorias que afectan las estructuras de soporte de los dientes y
contribuyen a mantener una inflamación sistémica de baja magnitud (low grade
inflammation) (1). Según el IV Estudio Nacional de Salud Bucal- ENSAB IV, la
mayor parte de la población (61.8%) presenta periodontitis en sus diferentes grados
de severidad (2). Recientes investigaciones han propuesto el uso de mediadores
lipídicos pro resolutorios como la Resolvina E1 (RvE1) con el objetivo de devolverle
la salud a los tejidos periodontales; estos agonistas de las vías de resolución
reducen el número de neutrófilos en el exudado inflamatorio entre otras funciones
(17). La vitamina D3 [1,25 (OH) 2D3], regula la homeostasis del calcio y el fosfato
en el organismo, y adicionalmente ejerce importantes funciones
inmunomoduladoras, favoreciendo así un ambiente adecuado para la resolución del
daño (8).
Se ha evidenciado que la RvE1 y la vitamina D3 pueden reducir la expresión del
factor nuclear kappa B (NF-B), por lo que se ha considerado la opción de
investigar sí la vitamina D3 podría incrementar la producción de RvE1 (10)(11).
Basados en lo anterior, el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la
vitamina D3, en la inflamación mediada por la producción de anti inflamatorios
naturales en células mononucleares de sangre periférica extraídas de pacientes
sistémicamente sanos con y sin enfermedad periodontal.
Materiales y Métodos: Se analizaron células mononucleares de sangre periférica
(CMSP) de 8 pacientes adultos voluntarios sistémicamente sanos, entre 30 y 50
años de edad, de los cuales 4 pacientes presentaban periodontitis crónica y 4 eran
periodontalmente sanos o con gingivitis. Las CMSP fueron estimuladas por 24
horas con lipopolisacárido (LPS) de Porphyromonas gingivalis, en ausencia ypresencia de Vitamina D3. Finalmente se midieron los niveles de resolvina E1
(RvE1) mediante ELISA en el sobrenadante del cultivo.
Resultados: Se encontró que las CMSP de pacientes con periodontitis, activadas
con LPS de Porphyromonas gingivalis producen mayor cantidad de RvE1 que las
células de pacientes periodontalmente sanos, bajo el efecto del mismo activador.
Las CMSP de pacientes con periodontitis crónica activadas con LPS en presencia
de VD3, mostraron un incremento en la producción de RvE1 al ser comparadas con
las células obtenidas de controles sanos activadas bajo iguales condiciones (LPS
+ VD3). Sin embargo, no hubo diferencias estadísticamente significativas cuando
se compararon los niveles de producción de RvE1 por CMSP de pacientes con
periodontitis crónica y pacientes sanos activadas solo con VD3.
Conclusiones: El LPS de P. gingivalis aumenta significativamente la producción
de RvE1 por CMSP, tanto en pacientes sanos como en pacientes con periodontitis
crónica. La producción es significativamente mayor en el paciente afectado.
La VD3, no aumenta de manera significativa la producción de RvE1 por CMSP,
previamente activadas con LPS de P. gingivalis, independientemente del
diagnóstico periodontal. A pesar de la ausencia de significancia, se observa una
tendencia al aumento de producción de RvE1 en las células activadas con VD3
tanto en presencia como en ausencia del activador.
Palabras clave:
Resolvina E1, Enfermedad periodontal, Vitamina D3, Inmunomodulación.Abstract: Periodontitis is a dysbiotic inflammatory disease with an adverse impact
on systemic health. The use of resolutive lipid mediators such as Resolvin E1
(RvE1) has been proposed with the aim of restoring health to periodontal tissues
through an early resolution of the acute inflammatory process. On the other hand,
vitamin D3 (VD3) is responsible for the regulation of calcium homeostasis in the
body and also has a role as an immunomodulator. Evidence has shown that it plays
an important role in the response against infections. This study evaluated the effect
of VD3 on the production of RvE1 by peripheral blood mononuclear cells (CMSP) of
patients with chronic periodontitis. The CMSP were stimulated with
lipopolysaccharide (LPS) of Porphyromonas gingivalis, in the absence and
presence of VD3.
We conclude the LPS of P. gingivalis significantly increases the production of RvE1
by PBMC, both in healthy patients and in patients with chronic periodontitis and VD3
does not significantly increase the production of RvE1 by PBMC, previously
activated with LPS of P. gingivalis, independently of the periodontal diagnosis.
Background:
Periodontal diseases comprise a wide range of inflammatory conditions that affect
the supporting structures of the teeth and contribute to maintaining a low-grade
systemic inflammation (1). According to the IV National Study of Oral Health -
ENSAB IV, the majority of the population (61.8%) presents periodontitis in its
different degrees of severity (2). Recent researches has proposed the use of
resolutive lipid mediators such as Resolvin E1 (RvE1) with the aim of restoring
health to periodontal tissues; These agonists of the resolution pathways reduce the
number of neutrophils in the inflammatory exudate among other functions (17).
Vitamin D3 [1,25 (OH) 2D3], regulates the homeostasis of calcium and phosphate
in the body, but exerts important immunomodulatory functions, thus favoring a
favorable environment for the resolution of damage (8).It has been shown that RvE1 and vitamin D3 can reduce the expression of nuclear
factor kappa B (NF-B), so the option of investigating whether vitamin D3 could
increase the production of RvE1 (10) has been considered (11).
Based on the above, the objective of this work was to determine the effect of vitamin
D3 on inflammation mediated by the production of natural anti-inflammatory in
peripheral blood mononuclear cells extracted from systemically healthy patients with
and without periodontal disease.
Materials and Methods: Peripheral blood mononuclear cells CMSP were analyzed
from 8 systemically healthy adult patients, between 30 and 50 years of age, of which
4 patients had chronic periodontitis and 4 were periodontally healthy or with
gingivitis. The PBMC were stimulated for 24 hours with LPS of Porphyromonas
gingivalis, in the absence and presence of Vitamin D3. Finally, the levels of RvE1
were measured by ELISA in the culture supernatant.
Results: We found that the (peripheal blood mononuclear cells) PBMCs of patients
with periodontitis, activated with LPS of Porphyromonas gingivalis produce a higher
amount of RvE1 in compare with cells of periodontally healthy patients, under the
effect of the same activator. The CMSP of patients with chronic periodontitis
activated with LPS in the presence of VD3, showed an increase in the production of
RvE1 when compared with the cells obtained from healthy controls activated under
the same conditions (LPS + VD3). However, there were no statistically significant
differences when the production levels of RvE1 were compared by PBMC of patients
with chronic periodontitis and healthy patients activated only with VD3.
Conclusions: The LPS of P. gingivalis significantly increases the production of
RvE1 by PBMC, both in healthy patients and in patients with chronic periodontitis.
The production is significantly higher in the affected patient.
VD3 does not significantly increase the production of RvE1 by PBMC, previouslyactivated with LPS of P. gingivalis, independently of the periodontal diagnosis.
Despite the absence of significance, there is a tendency to increase the production
of RvE1 in the cells activated with VD3 both in the presence and absence of the
activator.
Key words:
Resolvin E1, Periodontal disease, Vitamin D3, Immunomodulation.CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………3
2. MARCO TEÓRICO………………………………………………............6
2.1. Etiopatogenia de la enfermedad periodontal…………………….6
3.1.2. El proceso inflamatorio en la Periodontitis……………….6
2.2. El origen infeccioso de la enfermedades periodontales………13
2.2.1. Porphyromonas gingivalis………………………………...14
2.2.2. Factores de virulencia……………………………………..15
2.2.3 Rol del lipopolisacárido como inductor de la enfermedad
periodontal………………………………………………………….16
2.3 Agentes pro-resolutorios………………………………………….19
2.3.1 Resolvina E1.
2.4 Vitamina D3…………………………………………………..22
3. METODOLOGÍA………………………………………………………...31
3.1. Objetivo general…………………………………………………..31
3.1.1 Objetivos específicos…………………………………………...313.2 Población y Muestra………………………………………………32
3.3 Criterios de inclusión y exclusión………………………………...32
3.4 Obtención de células mononucleares de sangre periférica…..33
3.5 Medición de Resolvina E1…………………………….………….34
3.6 Análisis estadístico………………………………………………..35
4. RESULTADOS………………………………………………………...35
4.1 Evaluación clínica de los pacientes…………………………..35
4.1.1 Análisis de parámetros periodontales……………………..35
4.2 Análisis de la producción de resolvina………………………37
5. DISCUSIÓN…………………………………………………………….42
6. CONCLUSIONES……………………………………………………..45
7. RECOMENDACIONES………………………………………………46
8. BIBLIOGRAFÍA……………………………………………………….46LISTAS ESPECIALES
Tabla 1. CARACTERÍSTICAS CLÍNICAS PERIODONTALES.
Gráfica 1. EFECTO DE LA ESTIMULACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES
DE SANGRE PERIFERICA CON LPS EN LA PRODUCCIÓN DE RESOLVINA E1.
Gráfica 2. EFECTO DE LA ESTIMULACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES
DE SANGRE PERIFERICA CON LPS Y CON LPS + VITAMINA D3 EN LA
PRODUCCIÓN DE RESOLVINA E1.
Gráfica 3. EFECTO DE LA ESTIMULACIÓN DE CÉLULAS MONONUCLEARES
DE SANGRE PERIFERICA CON VITAMINA D3 EN LA PRODUCCIÓN DE
RESOLVINA E1.
Gráfica 4. EFECTO DE LA ESTIMULACION DE CELULAS MONONUCLEARES
DE SANGRE PERIFERICA CON VITAMINA D3 Y CON VITAMINA D3 + LPS EN
LA PRODUCCIÓN DE RESOLVINA E1.GLOSARIO
EICOSANOIDES: Son moléculas de señalización producto de la oxidación
enzimática de ácido araquidónico u otros ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs)
(13).
ENDOTOXINA: Componente de la pared celular de las bacterias gramnegativas,
también llamado lipopolisacárido (LPS), que se libera de las bacterias muertas y
estimula muchas respuestas inmunitarias innatas, como la secreción de citocinas,
la inducción de actividades microbicidas de los macrófagos y la expresión de
moléculas de adhesión del leucocito en el endotelio. La endotoxina contiene
componentes lipídicos y glucídicos (polisacáridos) (12). Consiste en tres
subunidades: Lípido A, core o núcleo polisacárido y cadena de polisacárido O.
Posee un gran número de actividades biológicas, por ejemplo la activación del
sistema del complemento (15).
FACTOR NUCLEAR B (NF-B): Una familia de factores de transcripción
compuestos de homodímeros o heterodímeros de proteínas homólogos a la
proteína c-Rel. Las proteínas NF-B son necesarias para la transcripción inducible
de genes los cuales codifican para citocinas como IL-6, IL-1β, IL-1 α., TNF-α
principalmente (90).
RECEPTOR DEL FACTOR NUCLEAR KAPPA B - RANK: Proteína de membrana
perteneciente a la familia de receptores del factor de necrosis tumoral, una vez
unido a su ligando (RANKL) promueven la diferenciación de precursores de
osteoclastos y la activación y supervivencia de estos. Se encuentra en células
precursoras de osteoclastos y osteoclastos maduros (16).LIGANDO DEL RECEPTOR DEL FACTOR NUCLEAR KAPPA B RANKL:
Ligando del RANK, el cual una vez unido al receptor ambos son capaces de
promover la diferenciación, activación de osteoclastos (16).
OSTEOPROTEGERINA (OPG): También conocida como factor inhibitorio de la
osteoclastogénesis, es la proteína perteneciente a la superfamilia de receptores de
factor de necrosis tumoral. Esta es producida por células estromales de la medula
ósea, osteoblastos y fibroblastos del ligamento periodontal, dentro de sus funciones
principales está inhibir la diferenciación y activación de osteoclastos mediante la
unión competitiva con el RANKL (16).
LIPOXINAS: Moléculas naturales producidas a partir de ácidos grasos endógenos.
Derivadas del ácido araquidónico, tienen potentes propiedades antiinflamatorias y
acciones de resolución. Su síntesis se da a través de tres vías. En la primera vía,
en tejidos mucosos humanos, como el tejido gastrointestinal, vías respiratorias y la
cavidad oral. En la segunda vía, en los vasos sanguíneos, la 5-lipoxigenasa
biosintetiza la lipoxina A4 y la 12-lipoxigenasaen las plaquetas produce la lipoxina
B4. La lipoxina A4 regula las funciones celulares mediante la activación de
receptores específicos expresados por neutrófilos y monocitos. Una tercera vía
sintética es activada por la aspirina (17).
MARESINAS: Se identifican como moléculas producidas por macrófagos con
propiedades homeostáticas. La fagocitosis realizada por macrófagos de las células
apoptóticas desencadena la biosíntesis de maresina-1, esta estimula eficazmente
la eferocitosis en células humanas y también tiene funciones regenerativas (17).
PROTECTINAS: Moléculas derivadas del ácido ecosapentaenoico, biosintetizadas
a través de la vía de la lipooxigenasa. Su nombre explica las acciones protectoras
observadas en los tejidos neuronales y dentro del sistema inmunológico. Las
protectinas reducen la transmigración de los polimorfonucleares neutrófilos a travésdel endotelio y mejoran la fagocitosis realizada por macrófagos de células
apoptóticas (17).
RESOLVINAS: Moléculas que se biosintetizan a partir de dos ácidos grasos
poliinsaturados: ácido eicosapentaenoico y ácido docosahexaenoico, derivados de
la dieta. Los dos grupos principales de la familia de las resolvinas tienen estructuras
químicas distintas: serie E, derivada del ácido eicosapentaenoico; y la serie D,
derivada del ácido decosahexaenoico. Incluyen la resolvina D1 (RvD1 7S,8R,17S-
trihidroxi-4Z,9E,11E,13Z,15E,19Z- ácido decosahexaenóico) y la resolvina E1
(RvE1, 5S,12R, 18R-trihidroxi-6Z,8E,10E,14Z,16E-ácido eicosapentaenóico).
Promueven la resolución de la inflamación, entre otros, reduciendo el número de
neutrófilos en el exudado inflamatorio (17).1. INTRODUCCION
La enfermedad periodontal es una entidad inflamatoria, la cual se caracteriza por la
destrucción de los tejidos de soporte del diente; es importante destacar que la
periodontitis es actualmente un problema de salud pública en Colombia y a nivel
mundial, con múltiples consecuencias, entre ellas, la pérdida de dientes (21).
Algunos estudios epidemiológicos respaldan la idea planteada anteriormente; tal es
el caso del ENSAB IV (Estudio Nacional de Salud Bucal, 2014), el cual concluyó
que personas mayores de 18 años presentan periodontitis en un 61,8% en sus
diferentes grados de severidad, siendo la más frecuente la periodontitis moderada
(2).
La destrucción observada en la enfermedad periodontal, es iniciada por la respuesta
inmunitaria del huésped contra el biofilm microbiano (1), sin embargo, su desarrollo
no solo depende de la presencia e interacciones con un biofilm, si no de la influencia
de factores de riesgo ambientales, de comportamiento, genéticos y efectos
epigenéticos que alteren la respuesta a la infección (23). La respuesta inflamatoria
en el periodonto se caracteriza, de acuerdo a los estadios de progresión de la
enfermedad, por la infiltración de neutrófilos, macrófagos y linfocitos en los tejidos,
los cuales tienen la capacidad de generar una alta concentración local de citocinas,
eicosanoides y otros mediadores, que en el proceso de mantener la salud, actúan
como promotores de la defensa del huésped (40) (45); sin embargo por ser
producidas de una manera indiscriminada en el contexto de la enfermedad,
promueven la destrucción de los tejidos periodontales (18) (87).
Los mediadores químicos que son producidos durante los procesos infecciosos e
inflamatorios, reflejan una pérdida de regulación de la respuesta dando como
resultado la alteración del metabolismo y una pérdida de la homeostasis en los
tejidos periodontales blandos y duros, lo que conlleva a la destrucción de los
mismos. Adicionalmente se han descrito alteraciones de la función de fagocitos,
especialmente neutrófilos, los cuales o bien son incapaces de controlar la presencia
3de microorganismos o tienen un fenotipo caracterizado por una hiper respuesta
inflamatoria, que puede relacionarse con el avance de la enfermedad (22).
Uno de los principales activadores de la respuesta inflamatoria en la enfermedad
periodontal, basados en su actividad biológica es el lipopolisacárido (LPS). Este es
un importante factor patogénico de muchas bacterias periodontopáticas. Varias
investigaciones han revelado la capacidad de dicho componente de la membrana
externa para activar las respuestas inflamatorias del huésped (25) (26). Como
ejemplos de ello tenemos, la producción de citocinas proinflamatorias como IL-1β,
IL-6 e IL-8, inhibición de la diferenciación osteoblástica de las células madre del
ligamento periodontal y estimulación de la migración de monocitos, macrófagos y
neutrófilos, influyendo así en la respuesta inmune a la infección (25) (27).
Basados en los mecanismos etiopatogénicos de la periodontitis, la alternativa
terapéutica clásica para la enfermedad periodontal es la remoción mecánica de la
placa dentobacteriana (28). Sin embargo, la estrategia para el tratamiento
periodontal, debería reenfocarse, debido a que no todos los pacientes responden
favorablemente al tratamiento convencional (29) (30), esto ha sido observado
especialmente en aquellos individuos con diagnóstico de periodontitis agresiva (31).
Por lo mencionado anteriormente y teniendo en cuenta el entendimiento de la
patogénesis y los resultados poco exitosos en el tratamiento de la enfermedad
periodontal, los cuales se quedan en el ámbito de la reparación de los tejidos,
recientes investigaciones han propuesto el uso de moléculas denominadas
mediadores lipídicos de la inflamación (17), con el objetivo de devolverle la salud a
los tejidos periodontales, mediante una resolución temprana del proceso
inflamatorio agudo (28) (32).
Dentro del grupo de estos mediadores se encuentran las denominadas protectinas,
lipoxinas, resolvinas y maresinas (17). Dichas moléculas son producidas por células
4pertenecientes al sistema inmune, principalmente por monocitos, macrófagos (17),
células dendríticas, neutrófilos, linfocitos T y células de la microglia (33) (34).
Las resolvinas en particular, actúan como agentes anti inflamatorios y como pro-
resolutivos reduciendo la destrucción de los tejidos y estabilizando la respuesta
inflamatoria sin suprimir el sistema inmune (34) (35). Dentro de este grupo
encontramos la resolvina D1 (RvD1) y la resolvina E1 (RvE1) las cuales
adicionalmente participan en otros procesos como la disminución en el infiltrado de
células inflamatorias, la activación de la fagocitosis de células apoptóticas y la
inhibición de la activación del factor de transcripción NF-B (33). La resolvina E1,
es derivada del omega 3, ácido eicosapentaenoico, el cual es un ácido graso
poliinsaturado. Para esta resolvina, se han descrito funciones específicas como la
disminución de eicosanoides proinflamatorios, citocinas, especies reactivas del
oxígeno y expresión de moléculas de adhesión como la P-selectina en modelos
animales y VCAM-1 en estudios in vitro (91) (92). En modelos animales con
enfermedad periodontal inducida, se ha demostrado que la aplicación de RvE1 tiene
impacto en la reducción de la pérdida ósea e incluso induce a la regeneración de
los tejidos periodontales (32) (36) (37).
Por otra parte, la vitamina D3, es la encargada de la regulación de la homeostasis
del calcio en el organismo y también posee un rol como inmunomodulador. Esta
evidencia surge de múltiples investigaciones en las que se ha demostrado que
cumple un papel importante en la respuesta contra la infección mediada por
monocito-macrófago, la estimulación de la diferenciación de precursores de células
mononucleares en células maduras y la inducción de la producción de citocinas anti
inflamatorias como la IL-10 y el TGF-β (8).
En contexto, se ha evidenciado que la RvE1 y la vitamina D3 pueden atenuar la
expresión del factor nuclear kappa B (NF-B) (1) (11), lo cual indica que podría
5activar vías de señalización celular similares, por lo que se sugiere que la vitamina
D3 podría incrementar la producción de RvE1 o RvD1 y/o potenciar su acción.
Por lo tanto el objetivo de este trabajo fue determinar el efecto de la vitamina D3, en
la inflamación mediada por la producción de anti inflamatorios naturales en células
mononucleares de sangre periférica (CMSP) extraídas de pacientes sistémicamente
sanos con y sin enfermedad periodontal.
2. MARCO TEÓRICO
2.1. Etiopatogenia de la enfermedad periodontal
2.1.2. El proceso inflamatorio en la Periodontitis
El periodonto es definido como aquellas estructuras que soportan y rodean al
diente, está compuesto por cemento en la porción de la raíz, tejido óseo que
rodea a la estructura radicular, un tejido conectivo altamente especializado
denominado ligamento periodontal ubicado en la interfase del cemento y el hueso
y por la unión dentogingival la cual está compuesta por la lámina propia que se
encuentra rodeada por un epitelio. Cada uno de estos componentes del
periodonto es una estructura altamente especializada que interactúa con las otras
para mantener su propia integridad y homeostasis (16). Estos tejidos pueden ser
afectados por diversas bacterias y sus productos, las cuales son capaces de
interactuar con el epitelio que une al diente con la lámina propia, el epitelio de
unión y penetrar al tejido conectivo subyacente llegando a producir un proceso
inflamatorio que afecta a los tejidos del periodonto y conduce a la pérdida de la
homeostasis lo que causa enfermedad (31). De esta manera podemos afirmar
que la enfermedad periodontal incluye un grupo de lesiones que afectan los
tejidos circundantes que soportan al diente en sus alveolos (6), esta patología
que incluye a la gingivitis y periodontitis constituye un verdadero problema de
6salud pública a nivel mundial (21) y Colombia no es la excepción, así lo
demuestra el último Estudio Nacional de Salud Bucal (ENSAB IV 2014) el cual
revela los siguientes datos: personas mayores a 18 años presentan periodontitis
en un 61,8% en sus diferentes grados de severidad, siendo más frecuente la
periodontitis moderada la cual está presente en 43,46%, seguida por la
periodontitis avanzada con una tasa igual al 38,20% (2).
Diversos autores han descrito el desarrollo de la enfermedad periodontal con el
objetivo de comprender de mejor manera cada una de las etapas del proceso
inflamatorio en el periodonto, así Page y Schroeder en 1976, fueron los primeros
en formular un concepto de la patogénesis de la enfermedad periodontal, ellos
establecieron cuatro fases o estadios de la enfermedad; el mismo es un esquema
que divide cada uno de estas etapas de acuerdo al tiempo, presencia de grupos
celulares y características histológicas. Estas etapas serán descritas a
continuación (38):
- Lesión inicial: Se observan una gran cantidad de leucocitos en el epitelio de
unión, en el plexo sub epitelial se observan pequeñas cantidades de linfocitos
y células plasmáticas, presencia de infiltrado inflamatorio agudo. La lesión
inicial es localizada en la región del surco gingival, se observan vasos
dilatados, presencia de polimorfonucleares y pocos linfocitos. El colágeno
perivascular desaparece y se llena de proteínas de tipo inflamatorio.
- Lesión temprana: No hay una división clara con la lesión previa, esta
comienza de 4 a 7 días después de la acumulación de placa bacteriana, las
células linfoides ocupan casi el 75 % de la población infiltrada, la mayoría de
fibroblastos parecen estar alterados debido a que se observan fibroblastos 3
veces más grandes de lo normal, además se observa exudado inflamatorio
agudo en el líquido crevicular, presencia de micro abscesos y una gran
cantidad de neutrófilos y leucocitos como infiltrado mononuclear.
7- Lesión establecida: Se distinguen una gran cantidad de células plasmáticas
que afectan al tejido conectivo, esta lesión comienza de 2 a 3 semanas
posterior a la acumulación de placa bacteriana, esta se caracteriza por la
presencia predominante de células plasmáticas, además se observan
clusters formados alrededor de los vasos sanguíneos y fibras de colágeno.
Se evidencia cantidades significativas de inmunoglobulinas: IgG, IgM e IgA,
adicionalmente se observan complejos antígeno anticuerpo. Esta lesión
puede durar muchas semanas incluso mantenerse en este estadio.
- Lesión avanzada: Las características de este estadio se han descrito en
relación a las características clínicas, estas incluyen la formación de una
bolsa periodontal la cual muestra ulceración del epitelio de unión, fibrosis,
destrucción del hueso alveolar y el ligamento periodontal. Esta lesión puede
ocurrir en varias semanas o meses. Las características histológicas son
similares a la lesión establecida, con infiltrado denso de células plasmáticas,
linfocitos, macrófagos con formación de clusters de células plasmáticas,
adicionalmente se observa tejido conectivo con zonas de fibrosis e intento de
reparación de tejidos.
Varios años más tarde Kornmann, Page y Tonetti 1999, describieron
características de la enfermedad periodontal de una manera más detallada,
evidenciando la presencia de mediadores moleculares involucrados en este
proceso patológico, dando un panorama más claro y complejo de las alteraciones
de los tejidos periodontales los cuales han sido sometidos a un proceso infeccioso
inflamatorio (31) (85). Estos autores dividieron en escenas el proceso patológico
de la enfermedad periodontal para un mejor entendimiento del lector:
- Escena 1: Se caracteriza por la presencia de patógenos e inflamación de los
tejidos pero no se observan manifestaciones clínicas. El epitelio de unión se
8encuentra intacto, se evidencian grandes cantidades de fluido crevicular y de
saliva que proveen aglutininas y anticuerpos contra los microorganismos
presentes, se observa activación del sistema del complemento y presencia
de poblaciones de células B que se acumulan en la pared del surco gingival.
Los leucocitos se caracterizan por la producción de PGE2, IL-1 y MMPs,
también se evidencia histamina producida por los mastocitos. En cuanto al
epitelio de unión posee una función protectora, presenta un recambio rápido
y constante de las células evitando la colonización de los microorganismos.
- Escena 2: Se observa un incremento de 1 o 2 % de infiltrado celular, en el
cual se observa un aproximado de 30 mil neutrófilos por minuto, también se
evidencian linfocitos, células de Langerhans y células apoptóticas. En cuanto
a los mediadores químicos se ha evidenciado la presencia de moléculas de
adhesión como ICAM-1 y citocinas en grandes cantidades principalmente IL-
8 y IL-1β.
- Escena 3: Se observa predominio de linfocitos T y B y células plasmáticas,
también se evidencia la presencia de IL-1β y PGE-2, TNF-α e IFN- . En
cuanto al fluido crevicular se observa la presencia de anticuerpos tipo IgG,
además de la presencia de otros mediadores anti inflamatorios como TGF-β
y proteínas del complemento C3a y C5a.
- Escena 4: Se cree que el desafío microbiano altera de gran manera la
respuesta del huésped causando la destrucción de los tejidos periodontales.
Las células más afectadas podrían ser los neutrófilos, esta alteración es una
de las causantes de la destrucción severa de los tejidos periodontales. El
fenotipo celular en esta escena se observa por un predominio de células B y
una diminución de fibroblastos productores de MMPs, además de la
presencia de macrófagos.
9La presencia de citocinas y otras moléculas proinflamatorias dan como resultado
una modificación del metabolismo del tejido óseo, pérdida de la homeostasis del
tejido conectivo y la alteración de la respuesta inmune del huésped generando así
la destrucción de los tejidos periodontales.
Existen una variedad de moléculas relacionadas con el desarrollo de la
enfermedad periodontal, entre las cuales figuran citocinas, quimiocinas
proinflamatorias y metaloproteinasas de la matriz (MMPs); estas últimas son
encargadas de la regulación y el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos,
sin embargo en la enfermedad periodontal existe una alteración de la regulación
en la producción y función de estas moléculas, lo anterior se ha descrito en
múltiples ocasiones; por ejemplo Hughes en 1995 mencionó que estos mediadores
químicos son fundamentales en el proceso inflamatorio de la enfermedad
periodontal (39), adicionalmente la susceptibilidad del huésped en respuesta al
biofilm bacteriano juegan un rol fundamental en este proceso. Todo esto será
explicado a continuación (40).
Toda respuesta inflamatoria se caracteriza por la infiltración de células de defensa,
entre las cuales se destacan los neutrófilos, macrófagos y linfocitos, los cuales son
capaces de generar una alta concentración local de citocinas, eicosanoides y otros
mediadores destructivos como metaloproteinasas de la matriz (MMPs) (40).
Las citocinas son proteínas solubles que se unen a receptores específicos de
células blanco y desencadenan cascadas de señalización intracelular, lo cual
resulta en cambios fenotípicos y funcionales en las células alterando la regulación
de diversos genes. Algunas de estas funciones han sido descritas anteriormente,
por ejemplo Dewhirst en 1985 mencionó que la IL-1β es la citocina que posee la
mayor capacidad de activación osteoclástica, posteriormente Birkedal-Hansen en
1993 confirmó que la IL-1β es un potente inductor de la resorción ósea y
degradación del tejido conectivo mediante la activación de MMPs las cuales
10degradan el colágeno. Se ha mencionado también que el TNF y la PGE-2 son
capaces de promover la destrucción del tejido óseo por actividad osteoclástica (39)
(41) (42). Además se ha mencionado que dentro de la diversidad de citocinas y
mediadores químicos producidos en la enfermedad periodontal las más
representativas de este proceso son; IL-1, IL-1, IL-6 e IL-8, TNF-, PGE-2,
MMPs (9)(31)(40)(42)(7)(44). Todas estas moléculas provocan un vínculo entre la
inflamación y el proceso de destrucción ósea y de tejido blando, ya que también
son capaces de actuar en la maduración de células precursoras de osteoclastos
modulando el sistema RANK-RANKL y osteoprotegerina (OPG). Este sistema
juega un rol esencial en la regulación del metabolismo óseo, debido a que es crítico
para el desarrollo y función de osteoclastos (45) (46). Muchas citocinas conducen
al incremento de la expresión del RANKL, como la IL-1β la cual estimula la
liberación de PGE-2 de células como fibroblastos y osteoblastos lo cual a su vez
estimula la expresión de RANKL y la disminución de OPG, la cual es reguladora
negativa del proceso ya que se une al RANKL evitando así que este se una con
su receptor RANK en las células precursoras de osteoclastos (40). Walsh en 2005
mencionó que las acciones del RANKL, TNF-α, IL-1 y PGE-2 son las principales
responsables de la resorción ósea en la enfermedad periodontal, sin embargo,
existe un mecanismo que trata de contrarrestar esta destrucción, este tiene como
objetivo devolver la homeostasis y promover los procesos reparativos y
regenerativos en los tejidos, dicho mecanismo es llevado a cabo por lo general por
moléculas antiresortivas y factores de crecimiento como el factor de crecimiento
transformante β, (TGF-β), proteínas morfogenéticas óseas (BMPs), factor de
crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), factor de crecimiento epidermoide
(EGF), IL-12 y IL-18, entre otros (47) (48).
Por otro lado las metaloproteinasas de la matriz (MMPs), son un grupo importante
de enzimas que pertenecen al grupo de las endopeptidasas, estas son
dependientes de calcio y zinc para su funcionamiento y son producidas por una
gran variedad de células del huésped entre ellas, leucocitos, fibroblastos,
11macrófagos, células epiteliales, osteoclastos, osteoblastos y células endoteliales.
Estas proteasas están involucradas en un gran número de eventos fisiológicos
como el desarrollo embriológico, involución del útero post-parto, remodelación de
los tejidos y morfogénesis dental y de glándulas salivales. También han sido
relacionadas con procesos patológicos como cáncer, artritis, ateroesclerosis,
diabetes, osteoporosis y enfermedad periodontal (18). Las MMPs juegan un rol
crítico en la degradación de la matriz extracelular y membrana basal. Los
neutrófilos y macrófagos son la mayor fuente de MMPs, además se ha observado
que fibroblastos gingivales y del ligamento periodontal así como queratinocitos,
células endoteliales, osteoblastos y osteoclastos incrementan la producción en la
enfermedad periodontal (46); además citocinas proinflamatorias como TNF-α entre
otras, han demostrado cierta capacidad de incrementar la producción de MMPs.
Al ser incrementadas estas moléculas son capaces de contribuir a la destrucción
del tejido conectivo periodontal (18) (47).
Para que se desencadene la liberación de todos estos mediadores químicos de la
inflamación en grandes cantidades, las células deben estar sometidas a un
estímulo constante, por lo general este está dado por los microorganismos que
son capaces de formar un biofilm que desencadena dicha liberación; una de las
estructuras responsables de que ocurra este proceso es el lipopolisacárido
bacteriano (LPS) de Porphyromonas gingivalis; además existe evidencia de que
los niveles de LPS de Porphyromonas gingivalis están incrementados hasta 4
veces a nivel sistémico en pacientes con periodontitis agresiva localizada (LAP)
comparados con pacientes periodontalmente sanos, esto se debe a que la
destrucción local es perpetuada por la presencia de mediadores pro inflamatorios
activos como TNF-α, IL-1β, IL-2 e INF- (24).
2.2. El origen infeccioso de las enfermedades periodontales
12La enfermedad periodontal se inicia con la presencia de una comunidad compleja
microbiana también llamada biofilm el cual suele tener cientos de especies
bacterianas. Este biofilm a su vez puede expresar un mecanismo bastante
sofisticado de comunicación intraespecie y/o entre especies bacterianas, el cual
está basado en la expresión de diversos genes y vías de señalización; de esta
manera facilitan una coordinada respuesta ante sus diversas necesidades (38) (44)
(49). Estas especies bacterianas han sido clasificadas como colonizadores
primarios o iniciales, los cuales son predominantemente anaerobios facultativos
Gram positivos como Streptoccocus y colonizadores tardíos que en su mayoría son
anaerobios Gram negativos. Socransky en 1998, dividió estas bacterias en
complejos asignados con un color el cual representa la relación que tiene con la
enfermedad de esta manera: complejo amarillo: especies de Streptococcus orales,
con capacidad para coagregarse entre especies del mismo género, complejo
púrpura: Actinomyces odontolyticus y Veillonella parvula (único gram-negativo y
anaerobio entre los colonizadores primarios), complejo azul: todas las especies
de Actinomyces excepto A. viscosus, complejo verde: bacilos Gram-negativos
anaerobios facultativos, complejo naranja: complejo puente. Primeros colonizadores
secundarios. Todos anaerobios y mayormente gram-negativos
(excepto Streptococcus constellatus, Peptostreptococcus micros y Eubacterium
nodatum, que son gram-positivos) y por último complejo rojo el cual es el más
relacionado con el desarrollo de la enfermedad, dicho complejo está formado por
Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola y Bacteroides forsythus, a este
último actualmente se le asignó el nombre de Tannerella forshytia (50) (44) (86).
Estas tres bacterias representan los tres principales periodonto patógenos.
2.2.1. Porphyromonas gingivalis
Porphyromonas gingivalis es una bacteria perteneciente al reino: Eubacterias,
clase: Bacteriodes, género: Porphyromonas y especie: gingivalis. Anteriormente
se llamaba Bacteroides gingivalis antes de su reclasificación como nuevo género,
13Porphyromonas (Nisengard y Newman, 1994) (25). Esta bacteria Gram-negativa,
es un cocobacilo no-móvil, asacarolítico, mide aproximadamente 0.5 - 0.8 µm x 1
- 3.5 µm, no formador de esporas y anaerobio estricto. Tiene un requisito absoluto
para el hierro en su crecimiento. El nombre Porphyromonas viene del adjetivo
griego porphyreos que significa púrpura y el sustantivo griego monas que significa
unidad, ya que forma colonias negro pigmentadas sobre agar sangre. Una serie
de estudios han intentado clasificar a P. gingivalis en grupos serotípicos basados
en antisueros que se unen a la cápsula, fimbrias o antígenos de la membrana
externa de la bacteria. Dichos grupos son: (W5O, W83, HG184, A7A1-28 (ATCC
53977), ATCC 49417, HG1690, HG1691, 381, 2561 (ATCC 33277), FAY19m-1. 9-
14K1) (25) (27). P. gingivalis es el principal agente etiológico en el desarrollo y
progresión de la periodontitis crónica, incluyendo la destrucción de tejidos blandos
y óseo (25) (51). Este colonizador secundario expresa muchos de factores de
virulencia involucrados en la colonización de la placa subgingival y la modulación
de respuestas inmunes por parte de las células del huésped. Con el fin de
aumentar su supervivencia dentro del huésped, P. gingivalis es capaz de invadir
localmente el tejido periodontal evitando la vigilancia inmunológica (25).
Es importante resaltar que la enfermedad periodontal no es el resultado de una
única bacteria. Por lo tanto, P. gingivalis actúa en conjunto con otros
microorganismos presentes en la microbiota oral para inducir una condición
inflamatoria dentro de la bolsa periodontal (25). El hábitat principal de P. gingivalis
es el surco gingival de la cavidad oral humana. Se basa en la fermentación de
aminoácidos para la producción de energía, es un colonizador secundario del
biofilm bacteriano, se adhiere a colonizadores primarios como Streptococcus
gordonii y P. intermedia (25).
Se ha demostrado que el número de P. gingivalis aumenta sustancialmente en
sitios con periodontitis, donde puede alcanzar un porcentaje muy significativo
dentro de la microbiota y es bajo o no detectable en sitios con salud periodontal o
14gingivitis (52) (53). Se encuentra en aproximadamente el 40-100% de los pacientes
adultos con periodontitis (25).
2.2.2. Factores de virulencia
P. gingivalis produce un repertorio de factores de virulencia que pueden penetrar
los tejidos gingivales y causar su destrucción directa o indirecta por inducción de
inflamación. Los factores de virulencia pueden definirse como constituyentes o
metabolitos de un organismo que son esenciales en varias etapas del ciclo de vida
para causar daño en el huésped. La capacidad de un organismo de colonizar y
evadir mecanismos de defensa anti-bacteriana del huésped, así como para
producir sustancias que podrían iniciar la destrucción tisular son características
integrales de un patógeno exitoso (25).
Para que un factor de virulencia ejerza sus efectos en un huésped, la bacteria debe
encontrar primero un nicho ecológico apropiado dentro de ese huésped (o sitio de
actividad), establecerse y eventualmente crecer y multiplicarse. Este
establecimiento dentro de un sitio adecuado es esencial para la supervivencia de
la bacteria y la producción de la actividad biológica máxima dentro de ese micro
ambiente (52). La colonización de los tejidos del huésped por parte de P. gingivalis
sólo podría ocurrir en presencia de factores de virulencia tales como fimbrias,
cápsula, lipopolisacárido (LPS), ácidos lipoteicoicos, hemaglutininas, gingipainas,
proteínas y vesículas de la membrana externa.
2.2.3 Rol del lipopolisacárido como inductor de la enfermedad periodontal
El lipopolisacárido es la macromolécula principal encontrada en la superficie
externa de bacterias Gram-negativas. El sello de una bacteria Gram-negativa es
su pared, que consta de dos membranas (una membrana interna y una externa)
con un espacio periplásmico intermedio. Cada membrana es una bicapa lipídica.
15La membrana interna, que rodea el citoplasma, se compone de fosfolípidos. La
membrana externa es una bicapa asimétrica que consiste en fosfolípidos y en el
lípido dominio de anclaje del lipopolisacárido, el lípido A (26).
El lipopolisacárido es una gran molécula, con estimaciones de tamaño que van
desde 10 kDa (52), consiste en un polisacárido distal o antígeno O (componente
exterior del LPS, variable y altamente inmunogénico), un oligosacárido no
repetitivo "core" (conecta el antígeno O al extremo hidrófobo de la molécula o lípido
A) y un dominio hidrófobo conocido como lípido A o endotoxina (componente más
interno del LPS) (25). El lípido A, es la región activa biológica del LPS que causa
alteraciones del sistema inmune innato de los mamíferos al interactuar con
receptores Toll 2 y 4 (25). En las bacterias Gram-negativas, el LPS juega un papel
importante en el mantenimiento de la integridad celular y estructural, así como un
control de la entrada de moléculas hidrófobas y químicos tóxicos. De hecho, el
plegado y la inserción de proteína de membrana no podrían tener lugar en
ausencia de LPS. Conociendo estas importantes funciones del LPS, no es
sorprendente afirmar que el lipopolisacárido es esencial para la supervivencia de
casi todas las bacterias Gram-negativas (26).
Basado en su actividad biológica el LPS es un importante factor patogénico de
muchas bacterias periodontopáticas. Varias investigaciones han revelado la
capacidad de este componente de la membrana externa para activar las
respuestas inflamatorias del huésped y alterar el proceso de remodelación ósea
ya que es reconocido por el huésped humano como una molécula extraña,
provocando una respuesta que está diseñada para la eliminación del intruso (25)
(26). Un posible papel del LPS en P. gingivalis es interrumpir la vigilancia innata
del huésped al interferir con la distribución de los leucocitos en la zona de la
colonización bacteriana. De hecho, el LPS de P. gingivalis es mal reconocido por
la defensa innata del huésped comparado con el LPS de otras especies Gram-
negativas como Escherichia coli. Aparte de eso, la capacidad de las células
16epiteliales gingivales para secretar IL-8 se altera, y la activación de neutrófilos,
eosinófilos y basófilos se afecta. Este fenómeno, conocido como parálisis de
quimiocinas resulta en la resistencia a la muerte causada por explosión oxidativa
de los neutrófilos. En ausencia de una respuesta inmune innata eficaz, el número
de bacterias podría aumentar notablemente, este aumento de la población
bacteriana en la zona, además del fracaso del sistema de defensa del huésped
para eliminarla es la etiología observada de la enfermedad periodontal. Además
de inducir la síntesis de citocinas proinflamatorias por parte de diversas células.
Fibroblastos gingivales humanos secretan citocinas proinflamatorias como IL-1β,
IL-6 e IL-8 como respuesta a la acción del LPS. Se ha demostrado que el lípido A
es el componente más activo en provocar la producción de IL-6 por parte de
fibroblastos y macrófagos. El LPS de P. gingivalis inhibe la diferenciación
osteoblástica de las células madre del ligamento periodontal que participan en la
regeneración del tejido periodontal. Aparte de esto, el LPS estimula la producción
de trombospondina-1, una proteína de la matriz extracelular secretada por
monocitos humanos que estimula la migración de macrófagos y modula la
respuesta inflamatoria del huésped (25) (27).
Aunque el Lípido A puede encontrarse en todas las bacterias Gramnegativas, el
de P. gingivalis es único ya que exhibe heterogeneidad estructural. Se han
identificado cuatro subgrupos de lípido A estructuralmente distintos que pueden
ser estimulantes, inertes o antagónicos con respecto a la interacción con los
receptores Toll 4 (26). Ahora bien la interacción del LPS con los receptores Toll es
un proceso complejo y de bastante interés dentro de la patogénesis de la
enfermedad periodontal, el cual será descrito a continuación.
En los últimas décadas se han descubierto receptores capaces de desencadenar
una serie de respuestas del huésped, a estos se los ha denominado receptores
Toll (TLR). El descubrimiento de estos receptores fue a mediados del año 1990,
esto demostró que los patógenos podían ser reconocidos por el sistema inmune
17innato de forma específica, este sistema era dependiente de unos receptores de
reconocimiento codificados de manera específica. Se evidenció que estos
receptores estaban involucrados en la detección de componentes moleculares de
distintos patógenos, a los que se ha denominado; patrones moleculares asociados
con patógenos (PAMPs).
Los PAMPs reconocidos por los (TLRs) incluyen; lípidos, lipoproteínas, proteínas y
ácidos nucleicos estos son derivados de una amplia variedad de microorganismos,
como bacterias, parásitos y hongos. Los TLRs han sido divididos en dos
subgrupos, los cuales son dependientes de su localización a nivel celular y por sus
ligandos en este caso los PAMPs. Los receptores Toll han sido clasificados con
una numeración de acuerdo a su ligando y su ubicación ya sea esta intracelular o
extracelular, estos son: TLR1, TLR2, TLR4, TLR5, TLR6 y TLR11 los cuales son
expresados sobre la superficie celular y reconocen principalmente componentes
de la membrana de microorganismos, como lípidos, lipoproteínas y proteínas. Por
otro lado, los TLR3, TLR7, TLR8 y TLR9 son expresados exclusivamente en
vesículas intracelulares, así como vesículas del retículo endoplásmico,
endosomas, lisosomas y endolisosomas, además de ácidos nucleicos microbianos
(54)(55).
Uno de los receptores Toll de mayor importancia en nuestra área es el TLR4
debido a que es capaz de responder al lipopolisacárido bacteriano de P. gingivalis.
Este depende de la formación de un homodímero con una proteína denominada
MD2 (factor de diferenciación mieloide 2), estos dos forman un complejo sobre la
superficie celular, que al estar en contacto con LPS desencadena una cascada de
señalización dependiente de la proteína Myd88 a través de la cual se activa el
factor de transcripción (NF-B) , lo que genera el correspondiente proceso de
transcripción y traducción de proteínas, en este caso de citocinas proinflamatorias
como TNF-α, IL-1, IL-6 e IFN- entre otras (54) (56)(57).
182.3 Agentes pro-resolutorios
Publicaciones recientes han descrito un nuevo género denominado mediadores
lipídicos endógenos relacionados con la resolución de la inflamación (17). Estos
pertenecen a una gran familia de mediadores bioactivos, los cuales hacen parte de
los llamados eicosanoides y a su vez estos están involucrados en todos los
procesos fisiológicos incluyendo aquellos asociados con la defensa del huésped y
la inflamación.
Estos mediadores lipídicos derivan del ácido araquidónico el cual es un precursor
endógeno común para la biosíntesis de eicosanoides ubicados en la posición sn-2
de la membrana celular fosfolipídica y son activados a través de la acción de la
enzima fosfolipasa A2, la cual produce ácido araquidónico; este es producido
también por la mayoría de células fagocíticas del sistema inmune y es rápidamente
metabolizado en varios mediadores lipídicos, como ciclooxigenasa, lipooxigenasa o
epoxigenasa, para dar origen a prostaglandinas, leucotrienos y endoperoxidasas.
Sin embargo estos mediadores lipídicos son solo sintetizados cuando las células
son estimuladas por situaciones como trauma y presencia de otras citocinas, por lo
tanto su excesiva producción está íntimamente relacionada con la progresión de
una inflamación aguda a una inflamación crónica así como ocurre en muchas
enfermedades; sin embargo hoy se sabe que esto favorece la autolimitación de los
procesos inflamatorios, lo cual implica la existencia de vías pro resolutivas y
antiinflamatorias endógenas capaces de regular la respuesta inflamatoria del
huésped (17).
Estos mediadores lipídicos se han clasificado de la siguiente manera: Lipoxinas,
Maresinas, Protectinas y Resolvinas, todas derivadas de ácidos grasos de la dieta
excepto las lipoxinas las cuales derivan directamente del ácido araquidónico. Las
resolvinas son las moléculas de interés de este estudio y serán explicadas más
adelante de manera detallada.
19Las lipoxinas son producidas por ácidos grasos endógenos derivados del ácido
araquidónico, estas poseen una gran capacidad antiinflamatoria y acción resolutiva
(17). Estas moléculas son capaces de disminuir el infiltrado de células
polimorfonucleares y estimular la función de macrófagos (fagocitosis de neutrófilos
que ya cumplieron su función en el sitio de la lesión para facilitar el proceso de
reparación de los tejidos) (32) (37), actúan inhibiendo la producción de IL-6, IL-8, IL-
1 y MMP-3 por parte de células epiteliales en respuesta al TNF-. Adicionalmente
se ha descrito su capacidad de estimular la producción de IL-4 la cual se ha
demostrado que posee propiedades anti-angiogénicas en modelos in vivo (58). La
síntesis de lipoxinas puede ser desencadenada por la aspirina (59).
El segundo grupo de moléculas son las Maresinas, llamadas mediadores de
macrófagos encargadas de la resolución de la inflamación, estas son moléculas
primordiales recientemente identificadas, producidas por macrófagos las cuales
poseen funciones hemostáticas (17)(33). La biosíntesis de estas moléculas esta
mediada por la acción de la enzima 14-lipooxigensa. La vía de la 14-lipooxigensa
rápidamente convierte a este compuesto en una molécula bioactiva con capacidad
funcional lo cual ocurre dentro de los macrófagos. Dentro de sus funciones podemos
mencionar la estimulación de la eferocitosis inclusive más potente que la de la
resolvina D1, también se ha descrito su potencial regenerativo (17). Adicionalmente
Serhan et al. en el año 2012 observaron que la Maresina-1 reduce dramáticamente
el dolor neuropático iniciado por la vincristina (fármaco usado como medicación en
quimioterapias para diferentes tipos de leucemia), demostrando así que esta
molécula posee un potente efecto analgésico, además de coadyuvar con la
resolución y control de la inflamación local en modelos in vivo e in vitro (43).
La protectina D1-neuroprotectina o 10R, 17S- Ácido dihidroxidocosa-4Z, 7Z, 11E,
13, E, 15Z, 19Z- hexaenoico (10,17S-dihidroxidocosatieno) es un importante
mediador lipídico en el sistema nervioso el cual es producido principalmente por
células neurales, sin embargo, también se ha descrito que puede ser producida por
20células mononucleares de sangre periférica como células T helper 2 (Th2) (33). Esta
molécula pertenece a una familia de productos bioactivos generados a partir del
ácido decosahexaenico (33) (60) (61). Dentro de sus funciones principales, se han
descrito la capacidad antiinflamatoria y su potente rol en la protección neural,
además de poseer funciones relacionadas con el bloqueo de la migración de células
T in vivo, la reducción en la secreción de TNF- e IFN-, así como la inducción de
apoptosis de células en desuso (33)(62). Adicionalmente en el año 2006 se
demostró que son capaces de atenuar la transmigración de neutrófilos hasta en un
50% en modelos in vitro (61). Esta molécula es generada durante la fase resolutiva
de una respuesta inflamatoria aguda específica. Otros autores han mencionado que
la protectina D1 interviene en la reparación de heridas, estimulación a la
supervivencia de células neurales y supresión de la neurotoxicidad (61) (60).
2.3.1 Resolvina E1
Las resolvinas, incluyen la resolvina D1 (RvD1 7S,8R,17S-trihidroxi-
4Z,9E,11E,13Z,15E,19Z- ácido decosahexaenóico) y las resolvinas E1 y E2
(5S,12R, 18R-trihidroxi-6Z,8E,10E,14Z,16E-ácido eicosapentaenóico, EPA) (37).
Estas moléculas son miembros de una familia de mediadores lipídicos que
controlan la magnitud y duración de los procesos inflamatorios (63).
La resolvina E1 (RvE1), como ya se mencionó, es derivada de ácidos grasos
dietarios y es biosíntetizada de la siguiente manera; las células productoras
convierten EPA en 18R- ácido hidroxiperoxieicosapentaenoico (18R-HPEPE)
compuesto que posteriormente es transformado en 18R-ácido
hidroxiecicosapentaenoico (18R-HEPE) el cual es rápidamente consolidado como
resolvina, mediante un proceso enzimático mediado por la lipooxigenasa-5; dicho
proceso ha sido identificado principalmente en neutrófilos (30).
21Por otra parte, existe evidencia muy interesante acerca de la función de ciertas
drogas moduladoras de la respuesta del huésped en la producción de resolvinas
y otros proresolutorios, por acción sobre los substratos a partir de los cuales son
producidas. Estudios recientes han mostrado que EPA y DHA (omega 3 PUFAS),
en presencia de aspirina, sufren un proceso metabólico transcelular en células
humanas, produciendo una variedad de potentes antiinflamatorios,
proresolutorios, mediadores lipídicos, llamados 18S- resolvinas. La aspirina es
crítica en el aumento de la actividad de estos esteroisómeros, a través de sus
acciones que modifican la actividad y especificidad de la ciclooxigenasa 2 (10).
La función de la RvE1 está vinculada con la interacción de diferentes receptores
transmembranales ubicados en macrófagos, células dendríticas, células
endoteliales y polimorfonucleares. Esta interacción desencadena una vía de
señalización cascada abajo dentro de la célula (64).
Los principales receptores vinculados con esta molécula incluyen el receptor de
proteína G acoplada (GPCRs) el cual ha sido pobremente descrito para RvE1 y
actualmente está más vinculado con la resolvina D1, el ChemR23, el cual depende
de la fosforilación del Akt activando una vía de señalización cascada abajo que a
su vez activa al complejo enzimático fosfatidilinositol 3 kinasa PI3K/Akt y Raf/ERK,
lo cual inhibe la activación del factor de transcripción NF-kB en células
polimorfonucleares humanas. Por último, está el receptor LTB4 el cual al unirse
con la RvE1 inhibe la activación de adenilato-ciclasa, complejo enzimático
relacionado con la activación del factor de transcripción NF-B en células
polimorfonucleares (64).
La RvE1 posee un gran número de funciones, muchas de las cuales comparte con
otras moléculas homólogas como RvD1; algunas de estas funciones son: reducir
la respuesta pro-inflamatoria de células microgliales estimuladas con LPS
bacteriano bloqueando la producción y liberación de TNF-α, IL-1β e iNOS, así
22como la inhibición del factor de transcripción de NF-B (59) (65). También
contribuye a la regulación del proceso inflamatorio, inhibiendo la transmigración
de polimorfonucleares neutrófilos lo cual ha sido demostrado en modelos in vivo
(61) (30), donde se evidencia que detienen el reclutamiento de neutrófilos,
conduciéndolos a la apoptosis y al mismo tiempo atraen monocitos al sitio de la
lesión para fagocitar a estos neutrófilos sin causar o contribuir al daño a los tejidos,
dado que este tipo de fagocitosis no conduce a la producción de IL-8 o TNF-α (28)
(66) (67).
Las principales células involucradas en la producción de RvE1 son monocitos,
macrófagos, células dendríticas, neutrófilos, linfocitos T y células de la microglia
(17) (33) (34).
2.3.2. Papel de la RvE1 en enfermedad periodontal
Por otro lado, partiendo de la hipótesis de que la suplementación con Omega 3,
tiene el potencial de inducir resultados clínicamente medibles y de interrumpir
farmacológicamente la cascada de la inflamación, ejerciendo un efecto protector a
través de la producción de mediadores endógenos (resolvinas y docosatrienos),
particularmente cuando dichos PUFAS son ingeridos concomitantemente con
aspirina, El-Sharkawy et al. reportan un estudio realizado en pacientes con
periodontitis agresiva sometidos a terapia periodontal, basada en raspaje y alisado
radicular, junto con la aplicación en bajas dosis de aspirina y la prescripción de
suplementos dietéticos ricos en omega 3 (PUFAs). Observaron una mayor
ganancia en cuanto al nivel de inserción clínico y una disminución en la destrucción
de los tejidos periodontales en comparación con los grupos de control (10) (83).
Hasturk, et al, realizaron un estudio en humanos diagnosticados con periodontitis
23agresiva localizada pareados por edad, raza y sexo, en los cuales se midió en
neutrófilos de sangre periférica previamente estimulados con FMLP (péptido
quimiotáctico bacteriano), la producción de anión superóxido en presencia de RvE1;
el estudio demostró que la RvE1 disminuye más del 90% de la generación de anión
superóxido de los neutrófilos. Estos hallazgos son importantes debido a que
actualmente se sabe que la inflamación local juega un rol crítico a nivel sistémico,
ya que existe incremento en la producción de mediadores pro inflamatorios tanto en
periodontitis crónica como agresiva, así como en muchas enfermedades sistémicas
incluyendo, ateroesclerosis, asma, peritonitis, y enfermedad cardiovascular,
(63)(24)(29)(93). Además en este estudio se demostró la capacidad de la RvE1 a
nivel tisular de inhibir la diferenciación y crecimiento de osteoclastos hasta en un
95% usando conejos neozelandeses. A los animales les fue inducida la enfermedad
periodontal mediante el uso de ligaduras y aplicaciones locales de Porphyromonas
gingivalis. Este descubrimiento puede dar un nuevo enfoque para el tratamiento de
la periodontitis agresiva y enfermedades óseas mediadas por la presencia de
osteoclastos (63).
Así también en 2010 Fredman, et al., en un estudio en el cual usaron células
polimorfomucleares obtenidas de sujetos con periodontitis agresiva observaron que
en presencia de resolvina E1 y lipoxina A4 disminuyó la producción de anión
superóxido, el cual posee capacidad destructiva en los tejidos (11).
Un estudio reciente realizado en ratas a las cuales se les indujo periodontitis con
ligaduras, demostró que la RvE1 presenta una potente actividad anti osteoclástica
y media un cambio aparente en la microbiota subgingival, en la cual se observa
mayor presencia de Lactobacillus y Bifidobacterium, los cuales no son
característicos en el desarrollo de la periodontitis; al parecer la RvE1 genera un
medio ambiente menos propicio para las bacterias del biofilm subgingival (94).
2.4 Vitamina D3
24Diversos estudios han mencionado que existe otra molécula fuertemente vinculada
con la inmunomodulación del huésped, la 1,25 dihidroxivitamina D3 (1,25 (OH)
2D3), este es el metabolito activo de la vitamina D. La vitamina D3 es una hormona
pleiotrópica que regula la homeostasis del calcio en el organismo, sin embargo
también le han sido descritas otras funciones a nivel sistémico como la inhibición de
la hormona paratiroidea, promoción de la secreción de insulina, estimulación de la
proliferación y la diferenciación celular y también se ha descrito que posee un rol
importante en la respuesta inmune del huésped (9). Se han asociado niveles
alterados de vitamina D3, con una mayor susceptibilidad a trastornos y
enfermedades inflamatorias (9) (71).
La deficiencia/insuficiencia de calcio y vitamina D son hoy en día condiciones
"cotidianas" en el mundo occidental debido a costumbres y estilos de vida.
Alteraciones del tejido conectivo y de los huesos que culminan en raquitismo,
debilidad muscular, dolores generalizados, alteraciones inmunológicas y fatiga
crónica inexplicable, combinada con trastornos funcionales, se describen como
síndromes dependientes de vitamina D. Siempre que la 25(OH)D3 sea abundante,
la producción local de 1,25(OH)2D3 se dará según necesidades celulares
especiales. Sin embargo, en el caso de reservas bajas de 25(OH)D3, dicha
producción local en los tejidos disminuye y altera la homeostasis tisular, generando
especies reactivas de oxígeno y producción de óxido nítrico, especialmente en
regiones corporales metabólicamente activas (20) (72).
Se supone que la deficiencia de calcio en todo el cuerpo resulta de la deficiencia de
vitamina D; cuando los niveles de 25 (OH) D3 son menores a 40 ng / ml (100 nmol
/ L) se compromete la absorción adecuada del calcio. Debido a esta deficiencia se
activan mecanismos compensatorios como la secreción de PTH, por ejemplo y otros
mecanismos en los huesos que pueden contribuir a la proinflamación incluso
cuando las reservas de vitamina D vuelven a la normalidad (72).
25La mayor fuente de vitamina D3 proviene de la exposición de la piel a la acción
catalítica de los rayos UV, que inducen una reacción fotoquímica convirtiendo el 7
deihidroxi-colesterol en secosteroide vitamina D3 (colecalciferol). Sin embargo para
que se logre la forma activa debe ocurrir primero un proceso de hidroxilación. La
vitamina D3 es hidroxilada en la posición 25 por hidroxilasas hepáticas de vitamina
D3 (CYP2R1) a hidroxivitamina D-25 (hidroxicolecalciferol- 25) la forma principal de
vitamina D en la circulación (73) (74).
La vitamina D3 como molécula bioactiva es capaz de ejercer una acción inhibitoria
sobre el sistema inmune, suprime la proliferación de linfocitos y producción de
inmunoglobulinas, retarda la diferenciación de células B hacia células plasmáticas,
inhibe la proliferación de células T, en particular las células Th1 principales
productoras de IFN- y activadoras de macrófagos. Estas acciones previenen la
futura presentación antigénica, así como el reclutamiento y proliferación de linfocitos
T (papel de IFN-), (función de IL-2). En contraste la producción de IL-4, IL-5 y IL-
10 puede verse incrementada desplazando el equilibrio a un fenotipo de células Th
2 (75).
La 1,25 (OH) 2D3 se une a una proteína receptora, llamada Receptor de vitamina
D (VDR). Este complejo actúa como factor de transcripción y regula la expresión de
una gran variedad de genes.
Otros estudios mostraron que la acción de la vitamina D3 tiene relación con la
supresión de la vía de señalización NF-B en células T, monocitos y macrófagos (9)
(78), mecanismo reportado también para la RvE1 (32). NF-B es conocido como un
factor de transcripción que promueve la expresión de genes que codifican para
citocinas proinflamatorias, como IL-1β, TNF-α (79).
La activación de NF-B es un mecanismo de defensa esencial en el sistema inmune
innato que altera la síntesis de proteínas, expresión genética antes durante y
después de la transcripción, así como crecimiento, diferenciación y apoptosis
26celular. La activación de NF-B induce la producción de altos niveles de especies
reactivas de oxígeno (ROS) como superóxido y óxido nítrico con la generación
resultante de peroxinitrito, lo que conduce a alteración de estructuras y funciones
celulares. 1,25 (OH) 2D3 regula la respuesta al estrés celular de cualquier tipo como
calor, inflamación, estrés oxidativo e IFN y el metabolito activo 1,25 (OH) 2D3 en sí
mismo, es capaz de inducir proteínas de choque térmico 70 (Hsp-70), llamadas
proteínas intracelulares de unión a vitamina D (IDBP). El complejo de Hsp-70 con
25OHD3 o 1,25 (OH) 2D3 interactúa con el receptor TLR2 lo que conduce a la
activación de NF-B como parte de un mecanismo de defensa contra el estrés
celular. Por lo tanto, la vitamina D mejora la respuesta temprana al estrés. Sin
embargo, la activación de NF-B también induce la expresión génica de CYP27B1,
promoviendo así la síntesis aumentada de 1,25 (OH) 2D3 que inhibe la expresión
génica de múltiples productos de la activación de NF-B, como IFN-, IL-2, IL-6,
iNOS y TNF-α y regula negativamente la activación de NF-B directamente por
inhibición de varias proteínas relacionadas con este factor. El resultado neto es una
inhibición potente de respuestas que limitarán la inflamación crónica. Por lo tanto,
1,25 (OH) 2D3 es capaz de suprimir respuestas tardías proinflamatorias al estrés
(72) (84).
1,25 (OH) 2D3 induce la regulación inmune y la tolerancia. 1,25 (OH) 2D3
contrarresta la inflamación a través de muchos mecanismos inmunes indirectos. Por
ejemplo, inhibe la I-12 por parte de los macrófagos y células dendríticas mieloides
(CDm) que dan como resultado una maduración inmune con inhibición posterior de
respuestas autoinmunes. Además, 1,25 (OH) 2D3 mitiga la respuesta inmune en la
presentación del antígeno y las células T al influir diferencialmente en la expresión
génica de ligandos como citocinas, quimiocinas, múltiples receptores inmunes y
proteínas de membrana coestimuladoras, receptores de MHC II y otras proteínas
inmuno-reguladoras. Además, 1,25 (OH) 2D3 inhibe en las células T la expresión
del ligando Fas (CD95L) lo cual es una señal coestimuladora para la maduración
inmune y la polarización en células CD8 +, células Th1 y CDm (72).
271,25 (OH) 2D3 participa en la defensa innata contra microorganismos. 1,25 (OH)
2D3 aumenta la maduración de monocitos en macrófagos, así como la captación de
antígenos por células presentadoras, expresión de citocinas y NADPH-oxidasa,
aumentando así la eliminación de patógenos. Además, 1,25 (OH) 2D3 mejora la
síntesis de catelicidina, un agente con potencia antimicrobiana inherente contra
virus, bacterias y hongos, secretada localmente en células presentadoras de
antígeno y queratinocitos.
En resumen, aumentar los niveles de 1,25 (OH) 2D3 después de una respuesta
inicial al estrés inflamatorio o inespecífico puede reducir las respuestas inmunes
proinflamatorias mediante mecanismos específicos:
(1) Disminución de la actividad del NF-B
(2) Reducción de la inducción de iNOS
(3) Inhibición de IL-6
(4) Inhibición de IL-2
(5) Disminución de IFN-
(6) Disminución de la síntesis de IL-12
2.4.1 VitD3 y enfermedad periodontal
Estudios han demostrado una relación inversa entre indicadores de enfermedad
periodontal y niveles de vitamina D; se ha asociado la ingesta de >800 IU/día de
vitamina D con menores probabilidades de enfermedad periodontal y menor pérdida
de hueso alveolar de moderada a severa en comparación con una ingesta de <400
UI / día. También fue observado que bajos niveles séricos de vitamina D afectan
adversamente el proceso de cicatrización después de procedimientos quirúrgicos.
Concentraciones séricas de vitamina D >20 ng / ml antes de la cirugía periodontal
28en pacientes con periodontitis crónica severa fueron asociadas con mejores
ganancias de nivel de inserción clínico y reducción de profundidad de sondaje a los
12 meses de la cirugía. En otras observaciones se asoció un nivel más alto de
vitamina D sérica en pacientes periodontales con pérdidas menos graves de la
inserción clínica. (76).
Así también se conoce que la vitamina D3 puede modificar el curso de la
periodontitis debido a sus propiedades inmunomoduladoras y antimicrobianas o a
través de sus efectos sobre el metabolismo óseo. La producción local de 1,25 (OH)
2D por varias células inmunes es un factor clave en la regulación de la respuesta
inmune innata y adquirida en los sitios locales de inflamación. Los resultados de
estudios in vitro y experimentos in vivo han mostrado la capacidad de 1,25 (OH)
2D3 para inhibir la producción de citocinas pro inflamatorias como IL – 1 y TNF -
por parte de monocitos, ambas citocinas juegan un papel importante en la
patogénesis de la periodontitis al afectar la cicatrización de heridas e inducir la
reabsorción ósea (76) (84). También se ha mostrado que células dendríticas
generadas en presencia de vitamina D3, son más productoras de citocinas anti
inflamatorias como la IL-10 y el TGF- (77).
Los resultados de modelos experimentales han confirmado el papel de la vitamina
D como modificador de la respuesta inmune en el periodonto. Se ha encontrado que
suplementos de vitamina D reducen la pérdida de hueso alveolar, los niveles séricos
de TNF-α y la expresión de NF-B en el epitelio gingival de ratones diabéticos. Así
también se evidenció que existe un incremento en la expresión de VDR y reducción
en la de TLR-4 en el epitelio gingival (75) (76).
Hoy en día existe muy poca evidencia que relacione la función de Vitamina D3 y
RvE1, en su capacidad de potenciar la respuesta antiinflamatoria a nivel de las
células del sistema inmune.
29En un estudio usando la vitamina D3 y la RvD1 de manera conjunta como
moduladores inmunes en células mononucleares de sangre periférica de pacientes
con Alzheimer, se concluyó que estas dos moléculas inducen el equilibrio de la
inflamación e incrementan la fagocitosis de las placas β-Amieloides por
macrófagos. También se observó un descenso global en la regulación de genes
inflamatorios y autoinmunes. Tanto la RvD1 como la 1,25 OH D3 inhibieron la
secreción de citocinas como IL1-α, IL6, IL10, GMCSF y TNF-α. Se sugirió que una
ingesta baja de vitamina D3 y de ácido docosahexaenoico y / o una producción
anabólica deficiente de 1,25OHD3 / RvD1 podrían contribuir a la aparición y
patología de la Enfermedad de Alzheimer. Este estudio in vitro demostró la
capacidad de 1,25OHD3 y RvD1 para equilibrar la fagocitosis de  amiloide y la
inflamación y se sugirió que la suplementación con vitamina D3 y DHA podría ser
efectiva contra el deterioro cognitivo en sujetos sanos y mejoraría el estado de los
pacientes con dicha patología (37).
3. METODOLOGIA
3.1 Objetivo general
Determinar el efecto de la vitamina D3, en la inflamación mediada por la producción
de anti inflamatorios naturales en células mononucleares de sangre periférica
extraídas de pacientes sistémicamente sanos con y sin enfermedad periodontal.
3.1.1 Objetivos específicos
 Comparar la producción de Resolvina E1 (RvE1) por células
mononucleares de sangre periférica de adultos sistémicamente sanos con y
sin enfermedad periodontal estimuladas con LPS de Porphyromonas
gingivalis.
 Determinar la diferencia en la producción de Resolvina E1 (RvE1) por células
mononucleares de sangre periférica de adultos sistémicamente sanos con y
30sin enfermedad periodontal estimuladas con LPS de Porphyromonas
gingivalis en ausencia y presencia de vitamina D3.
3.2 Población y Muestra
La población para el estudio la constituyeron los pacientes que asistieron a la
clínica del posgrado de periodoncia de la Universidad Nacional de Colombia sede
Bogotá, durante el primer semestre de 2017, con diagnóstico de salud periodontal/
gingivitis y periodontitis crónica severa generalizada. Los pacientes con la
enfermedad debían ser pareados en edad y sexo con sus correspondientes
controles.
3.3 Criterios de inclusión y exclusión
Previa firma del consentimiento informado aprobado por el Comité de Ética de la
Universidad Nacional de Colombia, se incluyeron 8 adultos voluntarios,
sistémicamente sanos al interrogatorio, entre 30 y 50 años de edad, de los cuales
4 pacientes tuvieron diagnóstico de periodontitis crónica y 4 pacientes se
encontraban periodontalmente sanos o con gingivitis. Se excluyeron pacientes que
se encontraban en estado de inmunosupresión, con enfermedad autoinmune,
embarazo, que hubieran recibido tratamiento periodontal o con terapia antibiótica
en los últimos 6 meses.
Para determinar los parámetros de salud o enfermedad, los pacientes fueron
sometidos a un examen clínico periodontal, el cual constó de las siguientes
pruebas: índice de placa bacteriana tomando en cuenta el método O’Leary, índice
31gingival de Lóe y Silness, porcentaje de sitios con sangrado al sondaje,
profundidad al sondaje medida en milímetros, mediciones del nivel de inserción
clínico, los cuales fueron realizados con una sonda periodontal tipo Carolina del
Norte (UNC-15). Los pacientes que presentaron bolsas periodontales mayores a 4
mm y en quienes a la vez fue identificada una pérdida del nivel de inserción clínico
igual o mayor a 1mm fueron sometidos a un examen radiográfico, el cual constó
de un juego periapical, esto con el fin de determinar el porcentaje de pérdida ósea.
Posteriormente los pacientes fueron clasificados de acuerdo al diagnóstico
establecido por el Workshop de Periodoncia realizado por la American Academy
of Periodontology en 1999 (79) (80).
3.4 Obtención de células mononucleares de sangre periférica
Se obtuvo una muestra de sangre total en dos tubos heparinizados cada uno de 4
ml de sangre, posteriormente se separaron las células mononucleares de sangre
periférica (CMSP) mediante gradiente de densidad usando Ficoll®-Hypaque (GE
Healthcare Bio-Sciences corp, Piscataway, NJ, USA). Las células fueron lavadas
y resuspendidas en RPMI suplementado con antibióticos, 20 mM HEPES más 10%
de suero fetal bovino (medio completo).
La muestra se centrifugó a 1400 rpm/10 minutos, posteriormente se retiró el
plasma el cual fue almacenado a -20°c. Las muestras de los dos tubos de sangre
obtenidos de cada paciente se unificaron en 1 tubo Falcon de 15 ml; se realizó la
dilución de la sangre con PBS hasta completar 7ml (3ml de sangre/4ml de PBS).
Posteriormente se adicionaron los 7 ml de sangre diluida a un tubo Falcon que
contenía 3 ml de Ficoll®-Hypaque, el cual fue posteriormente centrifugado
nuevamente a 1400 x g por 30 minutos y se retiró el anillo de células
mononucleares. Se depositaron las células mononucleares en un tubo Falcon y se
32adicionó RPMI hasta completar 10 ml, luego se centrifugó a 1400 rpm/10 minutos
(Centrifuga Beckman Coulter Allegra® X-15R)
Se desechó el sobrenadante y se resuspendieron las células adicionando RPMI
hasta completar 5 ml. Finalmente se tomaron 10 μL de células de cada muestra y
10μL de azul tripán, para realizar el conteo y viabilidad de células mononucleares
en la cámara de Neubauer.
Se centrifugaron los 5 ml de la mezcla de células y RPMI a 1400 rpm/10 minutos,
se desechó el sobrenadante y se resuspendió a 1 millón/ml según el número de
células obtenido.
Se depositó 1 x 106 de células /ml en placas de cultivo de 24 pozos con 4
condiciones por cada muestra de los pacientes.
Para evaluar el papel del LPS en la producción de RvE1, las células fueron
estimuladas con LPS de Porphyromonas gingivalis (1µg/ml) a concentración
óptima previa estandarización (81). Para evaluar el efecto de la vitamina D3 en la
producción de RvE1, esta fue adicionada a concentración de 100nM (1µg/ml) y
como control negativo se usó etanol
Por último a uno de los pozos se le adicionó vitamina D3 y LPS de Porphyromonas
gingivalis (1µg/ml) (81).
Se cultivaron las células a 37°C durante 24 horas y 5% CO . Cumplido el tiempo
2
estipulado, los sobrenadantes fueron recolectados, congelados y conservados a -
20°C hasta su uso.
3.5 Medición de Resolvina E1
La resolvina E1 se midió en los sobrenadantes de cultivo por ELISA tipo sándwich
indirecto siguiendo las instrucciones del fabricante usando un estuche comercial
33My biosource (MBS269927, San Diego, CA 92195-3308 USA). Una vez
determinada la curva de concentración, se añadieron 100µl de las muestra de cada
una de las condiciones. Se sellaron los pozos y se incubaron a 37 grados
centígrados por 90 minutos, posteriormente se siguió con el proceso de lavado con
solución buffer y se adicionaron 100µl de anti-resolvina E1 acoplado a biotina
(anticuerpo de detección) a cada uno de los pozos, estos sellaron y se incubaron
a 37 grados centígrados por 60 minutos, una vez extraídos los pocillos de la
incubadora, se lavaron con una solución buffer y se incubaron con 100µl de
streptavidina peroxidasa por 30 min a 37 ° C. Finalmente se realizó el lavado de
los pozos y se reveló el ELISA, adicionando 100 µl de solución previamente
preparada de TMB + peróxido de hidrógeno. Se adicionaron 100µl de ácido
sulfúrico para parar la reacción. La placa fue leída en espectrofotómetro a una
longitud de onda de 450 nm.
La curva del ELISA se encontró entre 20ng/ml y 0,312ng/ml, está última
concentración, límite de detección del ELISA. A cada muestra se le realizó una
dilución previa según experimentos de estandarización.
3.6 Análisis estadístico
Las diferencias estadísticamente significativas se establecieron mediante pruebas
no paramétricas usando el software Graphpad prism 5.0. Una P≤0.05 se consideró
significativa. Para todas las comparaciones se usó la prueba de Mann Whitney.
4. RESULTADOS
4.1 Evaluación clínica de los pacientes
4.1.1 Análisis de parámetros periodontales
34Se evaluaron cuatro pacientes sanos con edad promedio de 36 años de edad y
cuatro pacientes con periodontitis crónica con edad promedio de 36,4 años de
edad. Todos los pacientes que participaron en este estudio fueron mujeres,
sistémicamente sanas al interrogatorio.
El índice de placa bacteriana (O’Leary) mostró un porcentaje de 33% en los
pacientes sanos/gingivitis comparado con 69,3% de los pacientes con
periodontitis crónica, el índice gingival de Lóe y Silness, mostró para los
pacientes sanos un promedio de 1 y de 3 para los pacientes sanos y con
periodontitis crónica respectivamente. El porcentaje de sangrado para los
pacientes sanos fue de 46% y de 93% para pacientes comprometidos
periodontalmente (88) (89).
En cuanto a la profundidad al sondaje y el nivel de inserción clínica, el promedio
obtenido para los pacientes sanos fue de 2,3 mm y 0,9 mm respectivamente,
comparado con los pacientes con periodontitis crónica en los cuales fue de 5
mm y 4,25 mm respectivamente.
IPB IG ISG PB NIC Ep
Diagnóstico
(O’Leary) (Lóe y % mm mm
% Silness)
Periodontalmente 33% 1 46% 2,3 5 36
sanos
Periodontitis 69,3% 3 93% 3 4,25 36,4
crónica
35Tabla 1. Parámetros clínicos periodontales: Se observan los promedios de las
características clínicas periodontales; IPN: Índice de placa bacteriana, IG: Índice
gingival, ISG: Índice de sangrado gingival, PB: Profundidad al sondaje, NIC: Nivel
de inserción clínica, Ep: Edad de los pacientes.
4.2 Análisis de la producción de resolvina
Con relación al papel del LPS de P. gingivalis sobre células mononucleares de
sangre periférica obtenidas de pacientes sanos y con periodontitis crónica, en la
producción de RvE1 (gráfica 1), los resultados muestran que se detectó un
incremento estadísticamente significativo (P=0.02) en la producción de RvE1 por
CMSP de pacientes sanos/gingivitis en presencia de LPS al ser comparados en
ausencia del estímulo (control). (Mediana de 401,5ng/ml (191,7 - 765 ng/ml) vs
15ng/ml (0,156 – 85ng/ml), respectivamente.
Para los pacientes con Periodontitis crónica los valores de producción de RvE1 en
presencia del activador tuvieron una mediana de 991,45 ng/ml con rangos (703,2
- 2240,9ng/ml) Vs 48,9 ng/ml (26,4 – 80,5 ng/ml) en el experimento de control sin
activar (ETOH) con un incremento igualmente significativo, P= 0,02.
Al comparar la producción de RvE1 por CMSP entre los pacientes
periodontalmente sanos y los pacientes con periodontitis en presencia de LPS, la
diferencia también fue estadísticamente significativa, P= 0,05.
36Gráfica 1: Efecto de la estimulación de células mononucleares de sangre periférica
con LPS en la producción de Resolvina E1. La gráfica representa cuatro
experimentos independientes. Las diferencias se determinaron con la prueba de
Mann-Whitney. El valor de p ≤ 0.05 se consideró significativo.
Respecto al efecto de la VD3 sobre las CMSP obtenidas de pacientes
sanos/gingivitis y con periodontitis crónica, activadas con LPS de P. gingivalis, en la
producción de RvE1 (gráfica 2), los resultados muestran que no existieron
diferencias significativas al comparar el grupo de pacientes sanos/gingivitis y el
grupo de pacientes con periodontitis crónica. Sin embargo, existe una tendencia al
aumento en la producción de resolvina E1 al adicionar VD3 a CMSP estimuladas
con LPS en ambos grupos de pacientes, 1.2 veces para los pacientes sanos y 1.3
veces para los pacientes con periodontitis crónica.
37Gráfica 2: Efecto de la estimulación de células mononucleares de sangre periférica
con LPS y con LPS + VITAMINA D3 en la producción de Resolvina E1. La gráfica
representa cuatro experimentos independientes. Las diferencias se determinaron
con la prueba de Mann-Whitney. El valor de p ≤ 0.05 se consideró significativo.
Con relación al papel de la VD3 sobre células mononucleares de sangre periférica
obtenidas de pacientes sanos y con periodontitis crónica, en la producción de RvE1,
sin ningún otro tipo de activación, en la (gráfica 3), los resultados muestran que no
hubo diferencias significativas entre la mediana de producción de RvE1 en los
pacientes sanos/gingivitis al agregar la VD3 en comparación con su respectivo
control. Sin embargo, se detecta una tendencia a aumentar la producción de
resolvina al adicionar VD3. Mediana de 54,9 ng/ml (18,4 - 110,2 ng/ml), para las
CMSP tratadas con VD3 vs 15ng/ml (0,156 – 85ng/ml) para las CMSP tratadas con
el control (ETOH).
38Para los pacientes con Periodontitis crónica tampoco se detectó un incremento
significativo. Valores de producción de RvE1 en presencia de VD3 de 96,65 ng/ml
(48,1 - 139,7 ng/ml) vs 48,9 ng/ml (26,4 – 80,5 ng/ml) en el experimento de control
(ETOH).
Al comparar los niveles de resolvina E1 de CMSP tratadas con VD3 entre
pacientes sanos/gingivitis y pacientes con periodontitis crónica no se detectaron
diferencias.
Gráfica 3: Efecto de la VD3 en la producción de RvE-1 en pacientes con enfermedad
periodontal. La gráfica representa cuatro experimentos independientes. Mediante la
prueba de Mann-Whitney se determinó que no hubo diferencias estadísticamente
significativas.
39Para corroborar el papel del LPS en el aumento de la producción de RvE1 se
comparó la producción del proresolutorio solamente en presencia de VitD3 vs
VitD3 +LPS. (Gráfica 4) En ambos grupos de pacientes se detectó un aumento
significativo (P= 0,02), al comparar CMSP tratadas solo con VD3 respecto a las
tratadas con LPS + VD3. Mediana de 54,9 ng/ml (18,4 - 110,2 ng/ml) vs 473,35
ng/ml (402,3 – 586,2 ng/ml) para el grupo de pacientes sanos y mediana de 96,65
ng/ml (48,1 -139,7 ng/ml) vs 1264,75 ng/ml (1060,8 – 1971,8 ng/ml) para los
pacientes con periodontitis crónica.
40Gráfica 4: Efecto de la estimulación de células mononucleares de sangre periférica
con VD3 y LPS (P. gingivalis)+ VD3 en la producción de RvE-1 en pacientes con
enfermedad periodontal. La gráfica representa cuatro experimentos
independientes. Las diferencias se determinaron con la prueba de Mann-Whitney.
El valor de p≤0.05 se consideró significativo.
5. DISCUSION
La importancia que tiene hoy en día la ocurrencia de inflamación sistémica en
respuesta a enfermedades inflamatorias locales como la periodontitis, es la base
para explicar las relaciones existentes entre infecciones de la cavidad y
complicaciones en enfermedades inflamatorias de otros sistemas, tales como
enfermedades cardiovasculares, diabetes y artritis reumatoide principalmente. En el
presente trabajo se evaluó la respuesta a nivel sistémico medida por producción de
RvE1 en pacientes sanos periodontalmente y con periodontitis, para a partir de ella
evaluar si la adición de VD3 a cultivos de CMSP potencializaba la producción de
este proresolutorio, en presencia de activación con LPS de P. gingivalis.
Se encontró que la producción basal de resolvina por CMSP, aunque tiende a ser
mayor en el paciente con periodontitis que en el paciente periodontalmente sano
/gingivitis, no es estadísticamente significativa. Esto podría deberse a que la
respuesta sistémica se encuentra regulada, aun en presencia de inflamación de baja
magnitud y solo se necesitaría una “sobre” activación de mecanismos
proresolutorios y antiinflamatorios ante la presencia de un reto (en este caso
bacteriano) adicional.
Correa et al, en 2008, realizaron un estudio para medir los marcadores de
inflamación séricos en pacientes con periodontitis crónica y los compararon con
pacientes periodontalmente sanos. Sus resultados muestran, para los marcadores
antiinflamatorios y reguladores, IL-4, IL-5, IL-10, un aumento en los pacientes con
periodontitis que no es estadísticamente significativo al compararlo con los niveles
41en pacientes periodontalmente sanos (95), lo cual podría corroborar la idea
expresada para explicar los presentes resultados.
Al activar las CMSP con LPS de P. gingivalis, la producción de RvE1 aumenta
significativamente respecto al control en los grupos sanos/gingivitis y periodontitis
crónica. La producción es significativamente mayor en las células obtenidas de
pacientes con periodontitis. Esto podría explicarse desde el origen infeccioso de las
enfermedades periodontales y el efecto que ellas tienen a nivel sistémico. Tanto las
periodontitis crónicas como las agresivas se inician por una infección; la cronicidad
de esta infección, es determinante en las características inmunopatológicas de la
lesión, tanto a nivel local como sistémico. La persistencia de una microflora oral
disbiótica, media una patología inflamatoria tanto a nivel local como en sitios
distantes (96). Las bacterias periodontopáticas especialmente la P. gingivalis
producen LPS, que está directamente relacionado con las manifestaciones
sistémicas de la enfermedad. La ulceración en el epitelio de las bolsas
periodontales, facilita la translocación de bacterias a la circulación sistémica
causando una bacteriemia que está bien documentada en pacientes con
periodontitis y que puede proveer un estímulo inflamatorio (96); por otro lado en
estos pacientes, se producen a nivel local, citocinas proinflamatorias que pueden
entrar a la circulación sistémica e inducir una respuesta de fase aguda en el hígado.
Esto está claramente establecido y se fundamenta en que, en pacientes con
periodontitis crónica y agresiva, se observa incremento de la inflamación sistémica
indicada por niveles elevados de citocinas y marcadores de fase aguda como IL-6
y CRP (96). (97)
En ratas con periodontitis inducida, también se ha observado que los cambios
clínicos e histológicos en el periodonto, se correlacionan con un aumento notable
de la respuesta inflamatoria sistémica (98).
El origen oral de la bacteremia puede ser debido a actividades orales diarias como
cepillado dental, masticación o procedimientos dentales. (99)
42Diferentes estudios han reportado una correlación entre la diseminación sistémica
del LPS bacteriano y la enfermedad periodontal (24); así en el contexto de la
periodontitis, los niveles elevados de bacterias Gramnegativas, pueden conducir a
un incremento en los niveles de LPS en circulación.
En primates, el modelo más similar posible al humano, los hallazgos acerca de
inflamación a nivel sistémico en presencia de periodontitis crónica son comparables
a los ya citados; los niveles de LPS detectados a nivel del suero en este modelo,
varían entre 5 EU (Endotoxin Units) para individuos sanos y 16EU para periodontitis
(100).
Todo lo anterior podría explicar el porqué de la necesidad de aumentar los
mecanismos de control de la inflamación a nivel sistémico en pacientes con
infecciones locales en el periodonto, tanto a nivel de citocinas reguladoras e
inmunomoduladoras (IL-10) (95) como de agentes proresolutorios, respuesta
encontrada en el presente trabajo.
En otras enfermedades inflamatorias, como artritits reumatoide e infecciosas tal
como la infección sistémica por S. Aureus, el organismo intenta regular la respuesta,
aumentando la producción de IL-10, potente antiinflamatorio que juega un papel
crucial, limitando la inmunopatología del huésped durante infecciones bacterianas,
controlando la activación de las células T efectoras (101)(102).
Basados en lo anterior, podríamos deducir que el paciente periodontalmente sano,
necesitaría activar mecanismos proresolutorios al encuentro con un agente
infeccioso, para resolver de manera temprana la inflamación y el periodontalmente
afectado, en el cual las células se encuentran previamente activadas por el paso
constante a la circulación de LPS, necesitaría una respuesta más agresiva de estos
mecanismos, para lograr el mismo efecto. Los presentes resultados, de manera
novedosa demuestran que ante un reto bacteriano agudo (activación con
LPS/Bacteriemia), el paciente con periodontitis crónica activaría la producción de
RvE1 para controlar la inflamación.
43Partiendo, de que en presencia del LPS las CMSP producen significativamente más
resolvina que las células en el experimento control, tanto en sanos como en
enfermos, se quiso determinar si la adición de VITD3 potencializaba dicha
producción. Al respecto se observó que en presencia de LPS +VD3 las células de
los pacientes enfermos producen significativamente más RvE1 que las de los sanos,
sin embargo al mirar si esta producción difiere de la observada ante la activación
solo con LPS en ambos grupos, se halló que no hay diferencias significativas. Por
otra parte, la activación de CMSP con VD3 en ausencia de activación con LPS,
presenta una tendencia al aumento, tanto en los pacientes sanos al comprarlos con
el nivel basal (ETOH) (15ng/ml Vs 54,9ng/ml), como en los pacientes con
periodontitis (48,9 ng/ml Vs 96,65ng/ml), sin embargo el aumento no es
estadísticamente significativo.
No existen reportes en la literatura del posible efecto de la VD3 en la producción de
RvE1 en enfermedades infecciosas. La única referencia encontrada y que fue base
para el desarrollo del presente estudio, fue realizada en pacientes con Alzheimer,
una condición considerada enfermedad inflamatoria y utilizando RvD1 y no RvE1.
Los resultados indican, que la acción conjunta de la Vitamina D3 y la RvD1, induce
al equilibrio del proceso inflamatorio y a un incremento en la fagocitosis del β-
Amiloide por macrófagos en pacientes con la enfermedad de Alzheimer (37); en
dicho estudio se sugiere, que el bajo consumo de VD3 o de ácido
docosahexaenoico, o una pobre producción de 1,25(0H)D3/RvD1, por CMSP,
podrían contribuir en la aparición y patología del Alzheimer.
6. CONCLUSIONES
El LPS de P. gingivalis aumenta significativamente la producción de RvE1 por
CMSP, tanto en pacientes sanos como en pacientes con periodontitis crónica. La
producción es significativamente mayor en el paciente afectado.
44La VD3, no aumenta de manera significativa la producción de RvE1 por CMSP,
previamente activadas con LPS de P. gingivalis, independientemente del
diagnóstico periodontal. A pesar de la ausencia de significancia, se observa una
tendencia al aumento de producción de RvE1 en las células activadas con VD3 tanto
en presencia como en ausencia del activador.
7. RECOMENDACIONES
El presente trabajo soporta la idea de que el mayor aumento en la producción de
RvE1 en CMSP de pacientes sanos/gingivitis y pacientes con periodontitis crónica,
en el modelo utilizado, está mediado por la presencia de LPS y no por la adición de
VD3; a pesar de ello en la búsqueda de coadyuvantes en la producción de agentes
proresolutorios, se recomienda aumentar la muestra, dada la tendencia observada
al aumento de RvE1 con la activación de CMSP en presencia de VD3.
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