Determinación de presencia de lanosterol sintasa y proteina alfa cristalina A en cristalinos humanos con catarata.
Autor: Reyes Vivas, Laura Paola
Asesor: Rodriguez Alvarez, Carolina (Thesis advisor)
Fecha: 2019
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: La catarata es la principal causa de ceguera en países industrializados y en vía de desarrollo,  el manejo actual se realiza mediante cirugía de catarata por diferentes técnicas, sin  embargo, el acceso limitado a la valoración y tratamiento oportunos genera un problema  de salud pública en especial en países como el nuestro. Actualmente hay diferentes  estudios en la búsqueda de una mejor comprensión de los procesos que conducen a la  formación de cataratas, dirigidos a encontrar tratamientos alternativos que eviten el  abordaje quirúrgico. En este campo se ha demostrado que el Lanosterol y su síntesis, es  actualmente una estrategia en el manejo de cataratas en perros y en conejos in vivo y ex  vivo. La evaluación de la síntesis de lanosterol sintasa, precursora de la formación de  lanosterol, es crucial en la formación y progresión de las cataratas, por ésta razón, esta  molécula se evaluó en cristalinos humanos con catarata. En el trabajo actual se determinó  la expresión de esta enzima y su relación con la alfa A cristalina. Este es un estudio  descriptivo con el objetivo de determinar la presencia de proteínas de interés, Lanosterol  Sintasa y alfa A cristalinas, en la formación de cataratas en cristalinos humanos.  Se recolectaron 16 cristalinos con diferentes grados de opacidad y 4 cristalinos sin opacidad  para identificación de proteínas mediante inmunofluorescencia y Western Blot. Los análisis  de inmunofluorescencia demostraron una correlación positiva estadísticamente  significativa de las proteínas estudiadas respecto a los grados de opacidad de los  cristalinos, además no se encontraron diferencias significativas respecto a la expresión de  proteínas en diferentes localizaciones de un mismo tejido, sin embargo, si una leve  tendencia a mayor concentración de alfa A cristalina en regiones centrales.

DETERMINACIÓN DE PRESENCIA DE LANOSTEROL SINTASA Y PROTEINA
ALFA CRISTALINA A EN CRISTALINOS HUMANOS CON CATARATA.
Laura Paola Reyes Vivas
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía
Unidad de Oftalmología
2018DETERMINACIÓN DE PRESENCIA DE LANOSTEROL SINTETASA Y PROTEINA
ALFA CRISTALINA A EN CRISTALINOS HUMANOS CON CATARATA.
Autora
Laura Paola Reyes Vivas MD
Residente de tercer año de Oftalmología
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al
título de:
Especialista en Oftalmología
Tutor
Marcel Yecid Ávila Castañeda M.D.
Oftalmólogo
Profesor Asociado
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía
Unidad de OftalmologíaAgradecimientos
A la Doctora Zulma Janeth Dueñas Gómez, profesora de la división de Ciencias
Fisiológicas de la Facultad de Medicina y al profesor Adrían Gabriel Sandoval, del
Departamento de Química de la Universidad Nacional de Colombia, por su participación y
apoyo incondicional en la realización de este trabajo.Resumen
La catarata es la principal causa de ceguera en países industrializados y en vía de desarrollo,
el manejo actual se realiza mediante cirugía de catarata por diferentes técnicas, sin
embargo, el acceso limitado a la valoración y tratamiento oportunos genera un problema
de salud pública en especial en países como el nuestro. Actualmente hay diferentes
estudios en la búsqueda de una mejor comprensión de los procesos que conducen a la
formación de cataratas, dirigidos a encontrar tratamientos alternativos que eviten el
abordaje quirúrgico. En este campo se ha demostrado que el Lanosterol y su síntesis, es
actualmente una estrategia en el manejo de cataratas en perros y en conejos in vivo y ex
vivo. La evaluación de la síntesis de lanosterol sintasa, precursora de la formación de
lanosterol, es crucial en la formación y progresión de las cataratas, por ésta razón, esta
molécula se evaluó en cristalinos humanos con catarata. En el trabajo actual se determinó
la expresión de esta enzima y su relación con la alfa A cristalina. Este es un estudio
descriptivo con el objetivo de determinar la presencia de proteínas de interés, Lanosterol
Sintasa y alfa A cristalinas, en la formación de cataratas en cristalinos humanos.
Se recolectaron 16 cristalinos con diferentes grados de opacidad y 4 cristalinos sin opacidad
para identificación de proteínas mediante inmunofluorescencia y Western Blot. Los análisis
de inmunofluorescencia demostraron una correlación positiva estadísticamente
significativa de las proteínas estudiadas respecto a los grados de opacidad de los
cristalinos, además no se encontraron diferencias significativas respecto a la expresión de
proteínas en diferentes localizaciones de un mismo tejido, sin embargo, si una leve
tendencia a mayor concentración de alfa A cristalina en regiones centrales.
Palabras clave: Lanosterol Sintasa, Alfa A Cristalina, Catarata.Abstract
Cataract is the main cause of blindness in the industrialized and third world countries, the
current management is performed through cataract surgery by different techniques,
however, limited access to assessment and treatment generates a public health issue
especially in countries like ours. There are now different studies in the search for a better
understanding of the processes that lead to the formation of cataracts and in the search of
medical management and alternative treatments in cataract management avoiding
surgery. In this field has been demonstrated that Lanosterol and their synthesis is currently
a strategy in the management of cataracts in dogs and in rabbits in vivo and ex vivo. For
this reason the evaluation of lanosterol synthase , the precursor of lanosterol formation is
crucial in the formation and progression of cataracts , and by this reason this molecule was
evaluated in human cataratous lenses and compared with normal lenses. In the current
work the determination of this enzyme and their relationship with Alpha Crystalline was
evaluated. This is a descriptive study with the objective of determining the presence of
proteins of interest, Lanosterol Synthase and alpha A crystalline, in the formation of
cataracts in human lenses.
Sixteen human lenses with different degrees of opacity and four lenses without opacity
were collected for the identification of proteins by means of immunofluorescence and
Western Blot. The immunofluorescence analyzes showed a statistically significant positive
correlation of the proteins studied with respect to the degrees of opacity of the lenses,
there were not significant differences in the protein expression in different locations of the
same tissue; however, it was a slight higher concentration of crystalline alpha A in central
regions.
Key words: Lanosterol Synthase, Alpha A Crystalline, Cataract.Tabla de contenido
1. Resumen……………………………………………………………………………………………………………………..
2. Lista de Figuras ………………………………………………………………………………………………….………..
3. Lista de Tablas……………………………………………………………………………………………………………..
4. Introducción……………………………………………………………………………………………………..………..
5. Marco teórico………………………………………………………………………………………………………………
6. Justificación…………………………………………………………………………………………………………………
7. Objetivos………………………………………………………………………………………………………….………..
8. Metodología…………………………………………………………………………………………………….…….…
a) Tipo y diseño general del estudio………………………………………………………….………
b) Población blanco……………………………………………………………………………………….….
c) Tamaño de la muestra………………………………………………………………………………….
d) Descripción de la intervención ……………..………………………………………………………
e) Descripción estadística del estudio…………………………………………………………………
9. Consideraciones éticas……………………………………………………………………………………………..
10. Resultados………………………………………………………………………………………………………………..
11. Discusión………………………………………………………………………………………………………………….
12. Conclusiones…………………………………………………………………………………………………………….
13. Anexos……………………………………………………………………………………………………………………..
14. Referencias bibliográficas ………………………………………………………………………………….……..Lista de Figuras
Figura 1. Sistema de Clasificación de Opacidades del Cristalino (LOCS III)
Figura 2. Fotografías cortes hematoxilina eosina floxina.
Figura 3. Fotografías de cristalinos recolectados para Inmunofluorescencia.
Figura 4. Imagen representativa análisis específico centro/periferia en área de
410x410um. Expresión diferencial de Lanosterol Sintasa en centro vs periferia para cada
cristalino.
Figura 5. Análisis específico centro/periferia en área 410x410um.
Expresión diferencial de Lanosterol Sintasa en centro vs periferia para cada cristalino.
Figura 6. Análisis específico centro/periferia en área 410x410um. Expresión diferencial de
Alfa A Cristalina en centro vs periferia para cada cristalino.
Figura 7. Análisis global de fluorescencia de imagen total. Expresión Lanosterol Sintasa en
cada grupo de opacidad.
Figura 8. Análisis global de fluorescencia de imagen centro. Expresión Lanosterol Sintasa
en cada grupo de opacidad.
Figura 9. Análisis global de fluorescencia de imagen periferia. Expresión Lanosterol
Sintasa en cada grupo de opacidad.
Figura 10. Análisis global de imagen. Expresión diferencial de Lanosterol Sintasa en centro
vs periferia para cada grupo de opacidad.
Figura 11. Análisis global de fluorescencia de imagen total. Expresión Alfa A Cristalina en
cada grupo de opacidad.
Figura 12. Análisis global de fluorescencia de imagen centro. Expresión Alfa A Cristalina
en cada grupo de opacidad.
Figura 13. Análisis global de fluorescencia de imagen periferia. Expresión Alfa A Cristalina
en cada grupo de opacidad.
Figura 14. Análisis global de imagen. Expresión diferencial de Alfa A Cristalina en centro vs
periferia para cada grupo de opacidad.
Figura 15. Imágenes representativas de centro y periferia de cada grado de opacidad,
inmunofluorescencia.
Figura 16. Western Blot Lanosterol Sintasa.Lista de Tablas
Tabla 1. Relación de cristalinos y cataratas – Clasificación Opacidad Nuclear LOCS III.
Tabla 2. Valores de p. Análisis global de fluorescencia de imagen total. Expresión Lanosterol
Sintasa en cada grupo de opacidad.
Tabla 3. Valores de p. Análisis global de fluorescencia de imagen centro. Expresión
Lanosterol Sintasa en cada grupo de opacidad.
Tabla 4. Valores de p. Análisis global de fluorescencia de imagen periferia. Expresión
Lanosterol Sintasa en cada grupo de opacidad.
Tabla 5. Valores de p. Análisis global de fluorescencia de imagen total. Expresión Alfa A
Cristalina en cada grupo de opacidad.
Tabla 6. Valores de p. Análisis global de fluorescencia de imagen centro. Expresión Alfa A
Cristalina en cada grupo de opacidad.
Tabla 7. Valores de p. Análisis global de fluorescencia de imagen periferia. Expresión Alfa
A Cristalina en cada grupo de opacidad.Introducción
La catarata es la opacidad del tejido cristaliniano que puede ocurrir secundaria a diferentes
etiologías con múltiples formas de presentación, constituye un problema de salud pública por la
magnitud que representa dentro de la epidemiología de la discapacidad visual, en especial en
países de medios y bajos ingresos. Esta entidad ha acompañado a la humanidad desde siempre,
anecdóticamente, Claude Monet, pintor fundador del impresionismo, refleja en su obra la
progresiva alteración en la sensibilidad al contraste, la visión de detalles y la percepción amarillenta
de los colores, fue intervenido quirúrgicamente de su ojo derecho requiriendo anteojos afáquicos
y desistió de operarse el ojo izquierdo, lo cual también hizo evidente en sus pinturas posibles
aberraciones cromáticas y esféricas (1). Los músicos Johann Sebastian Bach y George Friederic
Handel fueron también víctimas de la evolución de las técnicas quirúrgicas, perdiendo la visión tras
fracasadas intervenciones quirúrgicas en el siglo XVIII (2).
Históricamente, el manejo quirúrgico de la catarata ha tenido una evolución interesante, dando
saltos abismales en los últimos siglos; sin embargo, no existe en la actualidad ningún manejo
diferente al quirúrgico para su corrección, lo que constituye un problema de salud pública no solo
por la dificultad para el acceso a los servicios de salud, sino por los altos costos para el sistema.
El cristalino humano está constituido en una proporción importante por células alargadas
compuestas principalmente por proteínas hidrosolubles y no hidrosolubles que interactúan de
manera muy específica para mantener la transparencia e índice de refracción del tejido. Entre ellas,
las proteínas cristalinas, con capacidad para evitar la completa desnaturalización proteica,
manteniendo amplios complejos proteicos en estados solubles; la Aquaporina 0, involucrada en la
adhesión entre fibras cristalinianas, microcirculación y aparentemente en el proceso de
acomodación; y la enzima lanosterol sintasa, encargada de la formación del lanosterol, proteína
asociada al estado de transparencia cristaliniana. Teniendo en cuenta la importancia de estas
proteínas en la transparencia de los tejidos, encontrar y caracterizar posibles blancos terapéuticos
dentro de la fisiopatología de la catarata abre las posibilidades de un manejo médico a futuro.Marco Teórico
Catarata
El término catarata proviene del latín cataracta y éste del griego αταράκτης kataráktēs y se define
como la opacidad del cristalino de cualquier localización o densidad, sea que afecte o no la agudeza
visual, sin embargo, en muchos casos impide progresivamente el paso de los rayos luminosos
limitando la agudeza y calidad visual.
Las primeras descripciones históricas de la catarata datan de la antigua Grecia, donde se negaba la
existencia del cristalino y se pensaba que la catarata constituía una “acumulación de humor que
caía del cerebro”, presente sólo en cadáveres; los árabes adoptaron este concepto y la llamaron
“nusul-el-ma” que significa “caída de agua”; posteriormente Constantino el Africano, médico
traductor del siglo XI, tradujo la expresión árabe como catarata, persistiendo desde entonces.
Durante el Medioevo e incluso el Renacimiento el conocimiento sobre anatomía ocular era vago;
hasta 1600 Fabricius ab Aquapendente identificó la posición anatómica del cristalino, pero sólo un
siglo más tarde en 1705, Michel Pierre Brisseau asoció la catarata a éste tejido y erradicó la teoría
del humor coagulado dentro del ojo (2).
Las cataratas pueden ser de localización nuclear, cortical o subcapsular y tienen diferentes
etiologías: congénitas, metabólicas, traumáticas, uveíticas, etc., siendo la más común la catarata
senil o relacionada con la edad.
La catarata senil, se presenta generalmente en mayores de 50 años, quienes consultan por
distorsión o disminución de la visión; suele presentarse de manera bilateral y progresar lentamente
en el tiempo, incluso en varios años hasta determinarse el requerimiento de intervención
quirúrgica de ser necesario, sin embargo, la progresión en otros casos puede ser más rápida. (3)
Históricamente, se han realizado diferentes abordajes para el manejo de la catarata, inicialmente,
descrito en manuscritos babilónicos del 1750 a.C. e hindúes del 600 a.C, describen técnicas
utilizando una lanceta afilada a través del limbo esclerocorneal y posteriormente una espátula
roma, para luxar el cristalino cataratoso a cavidad vítrea. Describen el pago a los médicos de la
época por la realización del procedimiento y la multa en el caso de que el paciente perdiera el ojo,
que implicaba perder una mano. En el siglo X describen en Irak la “succión” de la catarata con una
pipeta de cristal a través de una incisión corneal, sin embargo, el método no se expandió y la técnica
de abatimiento de la catarata permaneció en uso hasta 1747 cuando Jacques Daivel realizó la
primera extracción extracapsular de catarata. Posteriormente, los avances más importantes vienen
hasta el siglo XX con el paso a la cirugía intracapsular, extracapsular por diferentes técnicas, el hito
que significó el implante y evolución de los lentes intraoculares y finalmente el advenimiento de la
facoemulsificación (2).
En la actualidad, el manejo de las cataratas es netamente quirúrgico y consiste en la extracción del
núcleo y corteza opacificadas a través de la cápsula anterior del cristalino, dejando intacta la
capsula posterior para la colocación de lentes intraoculares previamente calculadosespecíficamente para las necesidades de cada paciente. A pesar de ser un campo de constante
estudio, no existe en el momento un manejo médico para esta entidad.
Epidemiología
Según datos de la Organización Mundial de la Salud, en el mundo aproximadamente 253 millones
de personas tienen discapacidad visual: 36 millones con ceguera y 217 millones con discapacidad
moderada a grave, de ésta cifra 81% son mayores de 50 años y 80% corresponden a casos evitables
o curables. Los errores refractivos no corregidos y los diferentes tipos de catarata encabezan las
causas principales de discapacidad visual, en especial en los países de ingresos medios y bajos.
Específicamente las cataratas no operadas son la primera causa de ceguera reversible y constituyen
un 25% de los casos de discapacidad moderada a grave y el 35% de los casos de ceguera según
datos de 2017 (4). En Latinoamérica en estimado de pacientes ciegos por catarata oscila entre un
41 y 68% (5) y en Colombia según datos de 2012, las personas ciegas son 1,8% de la población
general, 51% de ellas a causa de catarata (6).
En países desarrollados la cirugía de catarata, único manejo disponible para la patología, significa
un gasto para el sistema de salud cada vez más creciente dado el aumento en la expectativa de vida
de sus poblaciones, mientras que en los países en vía de desarrollo y peor aún en los más pobres,
corresponde a un problema de salud pública de difícil resolución dado el difícil acceso a servicios
de salud y a personal especializado. Un indicador útil para valorar si la cantidad de cirugías es
adecuada o no para una población, es la Tasa de Cirugía de Catarata (TCC), que representa el
número de cirugías por millón de habitantes por año; en Colombia éste dato ha ido en aumento
llegando a ser de 1752 cirugías por millón de habitantes en 2012, sin embargo, la tasa óptima debe
ser mayor a 3000 para controlar la ceguera y el impedimento visual (7,8).
El Cristalino
El cristalino es un tejido derivado embriológicamente del ectodermo superficial, prácticamente
transparente, biconvexo y avascular, ubicado en la cámara posterior del globo ocular, justo
posterior al iris; las fibras zonulares, adheridas también al músculo ciliar, se encargan de
mantenerlo en posición y producir cambios en su morfología secundarios a la relajación o
contracción de este músculo para los procesos de acomodación. Consta de un núcleo y corteza
constituidos por fibras cristalinianas anucleadas que se acumulan y agrupan en laminillas
concéntricas con el transcurso de los años, tiene también una cápsula que rodea por completo
estas láminas y tejido epitelial subcapsular anterior a partir del cual surgen nuevas fibras que
continúan aumentando el volumen del tejido. Forma parte de los medios transparentes del ojo y
es, luego de la córnea, el segundo más importante, aportando alrededor de 20 dioptrías del poder
refractivo del ojo, sin mencionar la función acomodativa que permite enfocar imágenes a
diferentes distancias (3).
Con la edad, el cristalino envejece, aumenta su masa y grosor y pierde su capacidad de
acomodación; cada vez se forman y organizan concéntricamente más capas de fibras corticales que
progresivamente comprimen y endurecen el núcleo del cristalino.La agregación proteica que ocurre progresivamente con la edad es el principal factor etiológico
para la formación de opacidades cristalinianas, sin embargo, no es completamente clara la
fisiología que permite mantener la transparencia de éste tejido. Eventualmente, estos agregados
proteicos son suficientes para causar fluctuaciones en el índice de refracción del cristalino,
dispersando la luz, reduciendo así la transparencia. (9)
Proteínas y opacidad cristaliniana
Aproximadamente el 33 - 35% del peso del cristalino humano lo constituyen las proteínas. Éstas se
dividen según su hidrosolubilidad. Las proteínas hidrosolubles constituyen el 80% del total en
pacientes jóvenes; dentro de este grupo se encuentran las proteínas cristalinas alfa, beta y gamma.
(9,10)
Las alfa cristalinas son las más abundantes, clasificadas dentro de las pequeñas proteínas de
choque térmico, son las más largas y usualmente forman complejos proteicos con otras cristalinas,
los cuales se unen a proteínas parcialmente desnaturalizadas, previniendo su completa
desnaturalización e insolubilización de otras cristalinas. Constituyen un tercio de las proteínas del
cristalino, y están conformados por subunidades A y B.
Las beta cristalinas son un conjunto de polipéptidos que se pueden asociar entre sí formando
dímeros y complejos de alto orden. Pueden dividirse respecto a su alto o bajo peso molecular.
Finalmente, las gamma cristalinas, las más pequeñas, constituyen el 15% de las proteínas
cristalinianas. Característicamente, no suelen asociarse entre sí o con otras proteínas y al igual que
las beta, están altamente conservadas evolutivamente en su estructura en diferentes vertebrados.
(10)
Las cristalinas contribuyen a la transparencia del cristalino y sus propiedades refractivas;
mutaciones, en el caso de las cataratas congénitas o estrés oxidativo sobre éstas, inducen
agregación proteica y opacidad.
Las proteínas no hidrosolubles del cristalino incluyen proteínas estructurales y del citoesqueleto;
similar a otros tipos celulares contiene microfilamentos y microtúbulos, sin embargo, contiene
también 2 tipos de filamentos intermedios, unos compuestos de cimentina y otros de faquinina y
filensina, específicos del cristalino. Alteraciones genéticas que modifiquen la estructura de estos
últimos llevan finalmente también a la formación de cataratas. Otra fracción de proteínas son las
insolubles en úrea, donde están las proteínas de membrana; la mitad de ellas la constituyen la
proteína mayor intrínseca MIP o aquaporina 0, con una función predominante de canales de agua;
empieza a aparecer en las fibras cuando empiezan a elongarse, y conforme el tejido envejece sufre
escisión proteolítica pasando de una masa molecular de 28 a 22. En la edad adulta tanto las de 28
como las de 22 se igualan y posteriormente las de menor peso se acumulan predominantemente
en el núcleo, lo que igualmente genera un impacto en la transparencia del tejido. Adicional a éste
cambio, ocurre un proceso de conversión de proteínas solubles a insolubles como parte de la
maduración de las fibras cristalinianas sin que esto sea patológico, a menos que ocurra en exceso
contribuyendo también a la formación de opacidades. Las fracciones proteicas insolubles contienen
pigmentos amarillos y cafés que se encuentran en mayor proporción en las cataratas nucleares
(9,10).La aquaporina 0 forma parte de la familia de las aquaporinas, conocidas por ser proteínas de canal
que facilitan el transporte de agua a través de la membrana celular. Es la proteína más abundante
en la membrana plasmática de las fibras cristalinianas. A diferencia de otras aquaporinas tiene un
mecanismo de construcción de poro que le permite compartimentalizarse y ser propensa a cierres
dependientes de pH, adicionalmente y también como propiedad única de su familia, contiene
residuos de prolina altamente conservados que le permiten funciones de unión intercelular; de
esta manera actúa no solo como canal de agua, sino que además está involucrada en la adhesión
entre fibras cristalinianas y provee microcirculación entre ellas. Está involucrada en el trasporte
rápido de agua en el cristalino humano mediante la formación de un heterodímero permitiendo un
movimiento rápido de agua, modificando así su forma (11). Estos cambios conformacionales
inducen otros tanto en la forma como en la acomodación que permite el enfoque en los humanos
(12), y se ha propuesto que estos cambios conformacionales, así como la disminución de la
permeabilidad de la aquaporina 0 especialmente en el centro del cristalino estaría involucrada en
la perdida de la acomodación que ocurre con la edad, siendo esencial no solo en la trasparencia
sino también en la acomodación del cristalino humano. Con el envejecimiento sufre modificaciones
postranslacionales y proteólisis en sus dominios C terminales, lo que puede estar asociado con la
formación de cataratas (11,12).
Por otro lado, una importante enzima cada vez más mencionada dentro de la fisiopatología de la
catarata es la lanosterol sintasa. El lanosterol es una molécula intermedia de la biosíntesis del
colesterol a partir del escualeno, La enzima lanosterol sintasa (2,3-oxidoescualeno ciclasa) es
responsable del paso dentro de la biosíntesis del colesterol, en el cual la 2,3 oxidoescualeno se cicla
para formar el catión protosterol, que posteriormente se redistribuye con la migración de grupos
metilos e hidridos y la eliminación de un protón del C9 del esterol, formando finalmente lanosterol
neutro, que será el que posteriormente se transforme a colesterol (13). El impacto de la lanosterol
sintasa en el ser humano radica en su importancia en procesos de síntesis de colesterol, hormonas
esteroideas y vitamina D (14,15) y su expresión ha sido identificada en el cristalino humano y de
otros mamíferos (16).
Estudios previos
- Se han realizado estudios en ratas donde mutaciones hipomórficas en la LSS y la FDFT1
(Farnesil difosfato farnesil transferasa 1), produjeron disminución de los niveles de
colesterol en el cristalino, lo que resultó en formación de cataratas (17).
- Análisis genéticos en familias con historia de catarata congénita evidenciaron la presencia
de mutaciones homocigóticas (variantes W581R y G588S) en el gen de la LSS en el
cromosoma 21, las cuales afectaron residuos aminoacídicos altamente conservados y
alteraron la función catalítica de la lanosterol sintasa (14).
- Igualmente, estudios in vitro demostraron que la LSS previno la formación de agregados
proteicos intracelulares en cristalinos con mutaciones en las proteínas cristalinas,
causantes de catarata. En experimentos tanto in vitro como por transfección celular se
demostró que la aplicación de lanosterol disminuía significativamente los agregadospreformados de proteínas y estudios in vitro de cristalinos de conejo e in vivo en perros
con catarata reportaron conforme a hallazgos previos que el tratamiento con lanosterol
redujo la severidad de las opacidades y aumentó la transparencia de los mismos (14, 16,
17).Justificación
La catarata es la principal causa de ceguera en el mundo tanto en países industrializados como en
países en vías de desarrollo, el manejo actual se realiza mediante la cirugía de catarata por
diferentes técnicas las cuales en resumen consisten en la extracción del cristalino opaco y su
reemplazo con un lente protésico que asume su función, sin embargo, el acceso a los servicios de
salud hace que en los países más pobres la posibilidad de realizar esta cirugía sea mucho menor.
Hasta el momento no existe un tratamiento médico para el manejo de las cataratas y no existe
ningún medicamento capaz de reversar las opacidades del cristalino humano, siendo el manejo
quirúrgico la forma actual de intervención.
El Lanosterol es una molécula que se encuentra de manera abundante en el cristalino, la enzima
lanosterol sintasa es la encargada de su formación; se ha evidenciado que la presencia de
mutaciones con cambio de sentido, de sentido erróneo o contrasentido en este gen y alteraciones
en su expresión inducen su baja producción con consiguiente disminución de la formación de
Lanosterol. También se ha reportado que el lanosterol en dosis dependiente induce cambios in
vitro en las células del cristalino disolviendo las proteínas agregadas que se inducen con la edad,
las cuales son responsables de cambios que llevan a la pérdida de la trasparencia en estas células,
especialmente las proteínas cristalinas, son la que realizan esta formación de agregados fibrinoides.
A pesar del entusiasmo en esta aproximación varias preguntas deben ser resueltas antes de
considerar el uso clínico del Lanosterol en el manejo de cataratas humanas; como si realmente el
cristalino humano es tan dependiente de la enzima Lanosterol sintasa para mantener su
trasparencia, si se encuentra alterada en los cristalinos cataratosos, así como cuál es su interacción
y colocalización respecto a otras proteínas responsables de mantener la trasparencia como son las
alfa cristalinas y la Aquaporina 0 (adicionalmente involucrada en el proceso de acomodación).
Las respuestas a estas preguntas básicas harán relevante la realización de ensayos que impliquen
el uso de Lanosterol para el manejo de la catarata en humanos o el uso de insertos genéticos que
induzcan la expresión de la proteína Lanosterol Sintasa en el cristalino en el futuro.Objetivos
Objetivo General
Determinar la presencia de Lanosterol Sintasa y proteína alfa A cristalina en cristalinos humanos
con catarata.
Objetivos Específicos
• Determinar la expresión de la enzima Lanosterol Sintasa Humana (LSH) en los cristalinos de
humanos con catarata.
• Correlacionar la presencia de Lanosterol Sintasa con el grado de opacidad del cristalino.
• Comparar la concentración de las proteínas estudiadas en áreas opacas respecto a las más
claras de los cristalinos estudiados.
• Colocalizar la Lanosterol Sintasa con otras proteínas responsables de la trasparencia como
la alfa A cristalina.Metodología
Múltiples metodologías se pueden realizar para determinar la presencia de la proteína Lanosterol
Sintasa Humana y alfa A cristalina; en el actual estudio se realizaron ensayos de
Inmunofluorescencia y Western Blot en cortes de cristalinos con catarata para de esta manera
evaluar su presencia y colocalización.
a. Tipo y diseño
Se trata de un estudio observacional descriptivo.
b. Población blanco
Se tomaron los núcleos de cristalinos cataratosos extraídos mediante la técnica de Cirugía de
catarata extracapsular convencional o por pequeña incisión por indicación médica,
independientemente de su grado y tipo de opacidad.
c. Selección de la muestra
Se recolectaron 25 cristalinos para su estudio y descripción.
d. Descripción de la intervención
1. Previo consentimiento informado de uso de material cristaliniano para estudio de
patología (ya incluido dentro del consentimiento informado del procedimiento quirúrgico),
se recolectaron núcleos de cristalino humano que cumplieron con los criterios de inclusión
y exclusión.
2. Almacenamiento inicial de los cristalinos en medio de conservación RNAssist a -70ºC. y
formol al 10%.
3. Realización de prueba piloto para definir medio de conservación más apropiado y continuar
recolección → Se decide RNAssist para almacenamiento a -70ºC como medio de
conservación de proteínas.
4. Procesamiento de muestra en el laboratorio de Fisiología y Equipos Comunes de la
Universidad Nacional de Colombia para protocolos de Inmunofluorescencia y Western Blot
con los siguientes anticuerpos:
• OSC Antibody (D-6): sc-514507 – No conjugado: Anticuerpo monoclonal de ratón
IgG1. Laboratorio Santa Cruz. Apto para Inmunohistoquímica y parafina. (Anexo
ficha técnica).
• Mouse IgG kappa binding protein (m-IgGκ BP) conjugado con CruzFluor™ 488.
• αA-crystallin Anticuerpo (B-2): sc-28306 – Conjugado Alexa Fluor™ 594:
Anticuerpo monoclonal de ratón IgG1. Laboratorio Santa Cruz Biotechnology.
Apto para Inmunohistoquímica y parafina. (Anexo ficha técnica).5. Se utilizaron 13 cristalinos para identificación de proteínas por Inmunofluorescencia y 7
cristalinos para identificación de proteínas por Western Blot.
6. Visualización y fotografía de los extendidos estudiados en microscopia confocal LEICA TCS
SPS X.
7. Extracción de imágenes en software NIS Elements Viewer.
8. Análisis de fluorescencia y edición de imágenes en software ImageJ.
9. Tabulación, graficado y análisis de resultados en software Prism GraphPad.
Descripción estadística del estudio
• Se tomaron los datos de intensidad de fluorescencia (numero arbitrario) de las imágenes
globales obtenidas para total, centro y periferia. Para probar la normalidad de las variables
se utilizó la prueba de Shapiro, posteriormente se utilizó una prueba paramétrica T de
Student para muestras independiente, no pareada tomando en cuenta un valor de P menor
de 0,05 como estadísticamente significativo, adicionalmente se realizó una corrección de
Welch por tratarse de desviaciones estándar no similares.Consideraciones éticas
a. Normatividad:
Fundamentados en las directrices de la Res. N°008430 de 1993, la presente investigación se clasifica
como “Investigación sin riesgo”, puesto que no se realiza ninguna intervención o modificación
intencionada de las variables biológicas, fisiológicas, sicológicas o sociales de los individuos que
participan en el estudio, entre los que se consideran: revisión de historias clínicas, entrevistas,
cuestionarios y otros en los que no se le identifique ni se traten aspectos sensitivos de su conducta.
Adicionalmente conforme al capítulo VI de la Resolución citada, al tratarse de investigación en
tejidos humanos se dispondrá de los mismos con el debido respeto, sin exponer nunca la
confidencialidad de los sujetos de origen.
b. Riesgos y Beneficios
Los participantes del estudio no tienen riesgo de lesiones físicas o mentales; el riesgo potencial es
que se pierda la confidencialidad de sus datos personales. Sin embargo, se velará vehementemente
por mantener su información en forma confidencial. Se espera que los resultados del presente
estudio, sirvan como punto de partida para la creación de recomendaciones y la invitación a crear
políticas que permitan el libre desarrollo del ejercicio médico bajo la tutela de la evidencia
científica, situación que beneficia de forma directa a toda nuestra población gremial.
c. Confidencialidad
Conforme a lo dispuesto en la Ley 1581 de 2012, la información personal consignada en el
instrumento de la investigación, será manejada velando por los principios de finalidad, libertad,
veracidad, calidad, transparencia, acceso y circulación restringida, por lo tanto, no podrá ser
utilizada para fines diferentes a la investigación, y su tratamiento será restringido al equipo
investigador autorizado por el participante previamente. La información en ningún momento será
utilizada con fines comerciales o económicos.
d. Compensación
El estudio actual no representa ninguna remuneración económica para los participantes ni el grupo
investigador, tampoco se incurrirán en gastos por parte de las entidades hospitalarias ni sus
pacientes.
e. Declaración de Conflicto de Intereses:
Se declara que no existen conflictos de intereses por parte del investigador con el desarrollo del
presente estudio, ninguno de los integrantes encargados del análisis de la información está
relacionado con empresas afines al sistema de salud (Farmacéuticas, Aseguradoras, Empresas
Promotoras de Salud Públicas o Privadas).
- Trabajo aprobado por Comité de Ética, Facultad de Medicina, en Acta de Evaluación:
Nº 001-014-18 del 31 de Enero de 2018Resultados
Se recolectaron 25 cristalinos para su estudio, en el período de Febrero hasta Septiembre de 2018,
los cristalinos cumplían con los criterios de inclusión y exclusión, adicionalmente sólo se incluyeron
cristalinos cuya extracción se logrará manteniendo la integridad estructural del núcleo cristaliniano
para poder realizarse cortes regulares en criostato. 5 de los cristalinos recolectados fueron
utilizados para pruebas piloto buscando estandarizar los protocolos, previo al ensayo en una
muestra representativa de 20 núcleos cristalinianos.
La caracterización macroscópica de la opacidad del cristalino se basó en los criterios Lens
Opacification Classification System III (LOCS III) (Figura 1), las opacidades compatibles con
clasificación 5 y 6 se asumieron como cataratas nigras. En la Tabla 1 se relacionan las
características de edad y sexo de los pacientes junto con el grado de opacidad del cristalino
obtenido. Los primeros 5 cristalinos de la tabla fueron utilizados para pruebas piloto, los
cristalinos 6 al 12 fueron utilizados para protocolo Western Blot, los cristalinos 13 a 25 fueron
utilizados para protocolo Inmunofluorescencia.
Figura 1Tabla 1. Relación de cristalinos y cataratas – Clasificación Opacidad Nuclear LOCS III
Paciente Edad Locs sexo
1 70 4 Femenino
2 80 5 Femenino
3 80 5 Femenino
4 72 3 Masculino
5 76 Nigra Femenino
6 (4) 68 5 Masculino
7 (6) 72 3 Masculino
8 (8) 69 Nigra Femenino
9 (9) 79 5 Masculino
10 (10) 76 Nigra Masculino
11 (31) 18 Control Masculino
12 (33) 73 3 Femenino
13 (7) 72 3 Femenino
14 (11) 61 Nigra Masculino
15 (12) 76 Nigra Femenino
16 (17) 60 2 Masculino
17 (18) 60 2 Masculino
18 (19) 74 4 Femenino
19 (23) 72 3 Femenino
20 (25) 68 4 Masculino
21 (26) 76 Nigra Femenino
22 (27) 16 Control Masculino
23 (28) 16 Control Masculino
24 (29) 26 Control Masculino
25 (30) 26 Control MasculinoRESULTADOS HEMATOXILINA – EOSINA - FLOXINA
En la caracterización macroscópica, en general el tejido menos opaco fue más friable al
corte bajo congelación. Se realizaron cortes de 15um y se tiñeron con hematoxilina-eosina-
floxina, al corte y tinción se evidenció mayor fractura en cristalinos más claros, con menor
compactación de las lamelas en esos mismos casos, resultado esperable.
Figura 2
RESULTADOS INMUNOFLUORESCENCIA
Se obtuvieron 13 cristalinos para estudio de inmunofluorescencia directa, la figura 3
muestra el aspecto macroscópico y grado de opacidad de los cristalinos obtenidos. Se
tomaron en total 69 imágenes de las láminas teñidas con anticuerpos marcados con
fluoróforo, por microscopía confocal para posterior análisis. Se realizó un primer análisis
específico centro/periferia en un área de 410x410um y posteriormente un análisis global
de la imagen.Figura 3
o Análisis específico centro/periferia en área de 410x410um.
Se valoró la expresión diferencial de lanosterol sintasa y alfa A cristalina en centro versus
periferia de un área constante en todos los cristalinos, la figura 4 muestra un ejemplo del
área determinada en centro y periferia de un cristalino con opacidad nigra y filtro para
fluorescencia verde.
Se observó que los valores de intensidad de fluorescencia se relacionaron positivamente
respecto al grado de opacidad de los cristalinos, tanto para la expresión de Lanosterol
Sintasa como alfa A cristalina, siendo menor en los cristalinos mas claros y mayor en los
más opacos.Figura 4
En cuanto a la diferencia entre centro y periferia, para el caso de la Lanosterol Sintasa la
expresión fue mayor en el centro que en la periferia salvo porn 3 cristalinos (control, LOCS
2, nigra) (Figura 5). Para el caso de la alfa A cristalina, la expresión proteíca fue mayor en
la periferia en todos los casos (Figura 6).
Figura 5Figura 6
o Análisis global de imagen para expresión de Lanosterol Sintasa.
Para cada grupo de opacidad se tabuló y promedió la intensidad de fluorescencia de cada
grupo de opacidad para luego compararla entre grupos primero de manera total, luego
valorando únicamente la expresión en el centro de los grupos y posteriormente valorando
únicamente la expresión en la periferia entre los grupos. Para el caso del análisis total
(Figura 7, Tabla 2), se obtuvo una expresión proporcional al grado de opacidad de los
tejidos que fue estadísticamente significativo entre los grados de opacidad control y II
(p:0,0019), II y III (p:0,0039), III y IV (p:0,0003), sin ser estadísiticamente significativa entre
el grupo de opacidad IV y cataratas nigras (p:0,1447).
En el análisis tomando en cuenta únicamente la expresión en el centro de los cristalinos
estudiados (Figura 8, Tabla 3), se encontro que al comparar entre grupos, igual que en el
análisis total el aumento en la expresión fue proporcional al aumento en el grado de
opacidad, con diferencia significativa entre los grupos control y II (p:0,0112) y entre II y III
(p:0,0096), sin embargo, no lo fue entre las opacidades III y IV (p:0,167) y las IV y nigra
(p:0,1133).
En el mismo tipo de análisis teniendo en cuenta solo la periferia de los tejidos cortados
(Figura 9, Tabla 4), la relación fue nuevamente positiva, con un salto importante entre los
cristalinos con opacidad grado III y grado IV (p: 0,0001), sin ser significativa entre los otros
grupos.Figura 7 Tabla 2
T o t a l L S S
aicnecseroulF 2 .0 × 1 0 1 1
1 .5 × 1 0 1 1
1 .0 × 1 0 1 1
ed
dadisnetnI
5 .0 × 1 0 1 0
0 .0
RA IV III II OL
G R
NI NT
O
C
O p a c id a d
Figura 8 Tabla 3
Centro LSS
2.0×1011 aicnecseroulF
1.5×1011
1.0×1011
ed
dadisnetnI
5.0×1010
0.0
RA IV III II OL
G R
NI NT
O
C
Opacidad
Figura 9 Tabla 4
Periferia LSS
a ci2.0×1011
n
e
c
s1.5×1011
e
r
o
u
Fl 1.0×1011
e
d
d
a d5.0×1010
si
n
e
nt 0.0
I
RA IV III II OL
G R
NI NT
O
C
Opacidado Análisis global de imagen para expresión de Lanosterol Sintasa en centro vs periferia para
cada grupo de opacidad. (Figura 10)
Comparando el promedio de intensidad de fluorescencia entre los centros y las periferias
de los cristalinos con el mismo grado de opacidad, se identificó una tendencia a menor
expresión en las periferias respecto a los centros, excepto para las opacidades grado IV, si
embargo, el único grupo donde ésta diferencia fue significativa fue en el grupo de opacidad
grado III, donde la expresión en la periferia fue menor que en el centro (p: 0,008).
Figura 10o Análisis global de imagen para expresión de Alfa A Cristalina.
Para cada grupo de opacidad se tabuló y promedió la intensidad de fluorescencia de cada
grupo de opacidad para luego compararla entre grupos primero de manera total, luego
valorando únicamente la expresión en el centro de los grupos y posteriormente valorando
únicamente la expresión en la periferia entre los grupos. Para el caso del análisis total
(Figura 11, Tabla 5), se obtuvo una expresión proporcional al grado de opacidad de los
tejidos, similar a la encontrada para Lanosterol Sintasa. La diferencia en éstos casos fue
significativa sólo entre los grupos deopacidad II y III (p:0,001) y III y IV (p:0,423).
Al valorar solo en el centro del tejido la expresión protéica (Figura 12, Tabla 6), se encontro
una mayor expresión en las opacidades II vs controles, y entre las opacidades II y III, con
una leve disminución entre el grupo IV respecto al III, y nuevamente un aumento en las
cataratas nigras con respecto al grupo de opacidad grado IV. En éste caso solo fue
significativo l cambio entre opacidad II y III (p:0,0004).
En la periferia de los cristalinos comparando por grupo de opacidad para alfa A cristalina
(Figura 13, Tabla 7), la relación fue nuevamente positiva entre todos los grupos, con
significancia sólo entre opacidad III y IV (p:0,0015).
Figura 11 Tabla 5
Total aAC
a 1.5×108
ci
n
e
c
s
e
or 1.0×108
u
Fl
e
d
d 5.0×107
a
d
nsi
e
nt 0.0
I
RA IV III II OL
G R
NI ONT
C
OpacidadFigura 12 Tabla 6
Centro aAC
1.5×108 aicnecseroulF
1.0×108
ed
5.0×107 dadisnetnI
0.0
RA IV III II OL
G R
NI NT
O
C
Opacidad
Figura 13 Tabla 7
Periferia aAC
a 1.5×108
ci
n
e
c
s
e
or 1.0×108
u
Fl
e
d
d 5.0×107
a
d
si
n
e
nt 0.0
I
RA IV III II OL
G R
NI NT
O
C
Opacidado Análisis global de imagen para expresión de Alfa A Cristalina en centro vs periferia para
cada grupo de opacidad. (Figura 14)
Comparando el promedio de intensidad de fluorescencia entre los centros y las periferias
de los cristalinos con el mismo grado de opacidad, la intensidad de fluorescencia fue menor
en la periferia en los grupos de opacidad II, III y nigra, con diferencia significativa sólo en el
grupo de opacidad III (p:0,0022).
Figura 14• A continuación, se presentan imágenes representativas de cortes centro y
periferia con filtro para identificación de Lanosterol Sintasa (verde), Alfa A
Cristalina (rojo) y merge, obtenidas por microscopía confocal. (Figura 15). No se
identificaron diferencias significativas respecto a diferentes localizaciones en un
mismo tejido estudiado, sin embargo si hay una tendencia a mayor concentración
de alfa A cristalina en regiones centrales.
Figura 15
RESULTADOS WESTERN BLOT
Se obtuvieron 7 cristalinos para estudio de Western Blot para identificación de Lanosterol
Sintasa, evidenciando su presencia en los tejidos estudiados, se valoro cuantitativamente
la intensidad de cada banda (números arbitrarios) evidenciandose valores bajos en los
controles con tendencia a aumentar en los cristalinos con opacidad III y IV y nuevamente
disminuyendo en las cataratas más densas (nigras). (Figura 16).Figura 16
120,000,000
Opacidad IV
100,000,000 Opacidad III Control
80,000,000
Opacidad V
60,000,000 Nigra Nigra
40,000,000 Opacidad V
20,000,000
0
1 2 3 4 5 6 7Discusión
La catarata es la principal causa de ceguera reversible en el mundo, donde el mayor porcentaje de
casos corresponden a opacidades seniles; especialmente en los países menos desarrollados, ésta
patología representa un problema de salud pública dado su impacto en las cifras de discapacidad
visual, y la dificultad para realizar manejo quirúrgico en todos los pacientes afectados por las
limitaciones en el acceso a los servicios de salud (4). La posibilidad de manejar la catarata
médicamente ha sido un desafío a través de los años, varios grupos de estudio han propuesto
diferentes mecanismos de desarrollo de los diversos tipos de opacidad, buscando entender mejor
la fisiopatología de las cataratas, pero realmente, aún se desconocen blancos terapéuticos
específicos donde sea posible intervenir, lo que, entre otras dificultades, no ha permitido que en la
actualidad se tenga acceso a algún medicamento que efectivamente resuelva o retrase la aparición
de cataratas en humanos.
Escasos estudios realizados en animales han demostrado que mutaciones en la enzima lanosterol
sintasa resultan en la formación de cataratas por disminución de los niveles de lanosterol, un
producto intermedio en el metabolismo del colesterol; así mismo, estudios in vitro en cristalinos
con opacidades en modelo de conejo, y ensayos in vivo en modelo canino con catarata han
demostrado que la suplencia del lanosterol de forma tópica puede mejorar la transparencia de éste
tejido (14,17). Hasta el momento, no se han reportado ensayos clínicos en humanos para
comprobar ésta hipótesis, sin embargo, la posibilidad futura de lograr retrasar la aparición de
cataratas relacionadas con la edad, incluso 10 años, en población susceptible, podría reducir la
necesidad de cirugía en casi la mitad de los casos (18).
El propósito del estudio actual fue identificar la presencia y expresión diferencial que pudiera
encontrarse en los cristalinos humanos con catarata senil, de 2 proteínas de alto impacto en la
formación de opacidades cristalinianas, como han demostrado ser la lanosterol sintasa y la alfa a
cristalina, en estudios previos. Como era esperable, encontramos una mayor expresión de alfa A
cristalina en cristalinos más opacos, que aumentaba gradualmente con la opacidad, pero
adicionalmente se evidenció una correlación positiva entre la expresión de la enzima lanosterol
sintasa y el grado de opacidad de los cristalinos. Al realizar una normalización de los datos
obtenidos de intensidad de fluorescencia, la expresión de lanosterol sintasa humana en cataratas
nigras fue significativamente mucho mayor a la evidenciada en cristalinos sin opacidad.
Este hallazgo puede sugerir que en los cristalinos con mayor agregación proteica y por ende mayor
grado de opacidad, puede existir un mecanismo de sobreexpresión de la enzima lanosterol sintasa,
de manera compensatoria en respuesta al estrés oxidativo al que está sometida la fibra
cristaliniana. Dicha sobreexpresión con el objetivo de aumentar la producción de lanosterol, que
parece retrasar o evitar la formación de opacidades, gracias a su capacidad de revertir y disolver
en cierto grado los agregados protéicos. Sin embargo, en estos casos, es posible que la
concentración del producto de la enzima, sea insuficiente; y por ello, al suplirse en estudios en
modelo animal, las opacidades mejoren. En dicho contexto, el aumento en la expresión de la
enzima lanosterol sintasa, podría corresponder a isoformas de la enzima no funcionales o menos
funcionales que la original, y al no haber una retroalimentación adecuada, ya que no se está
produciendo exitosamente el paso a conversión a lanosterol, persiste la sobreexpresión de la
enzima.Por otro lado, los hallazgos en Western Blot demostraron que para las opacidades IV y nigra la
banda de proteína en el peso molecular esperado para lanosterol sintasa era menor que para los
otros grupos de opacidad, sin embargo, esto no necesariamente representa una menor expresión
de la proteína, sino puede corresponder a isoformas de la enzima que, por modificaciones,
escisiones postraduccionales u otras variables, cambien su peso molecular ubicándose en otras
localizaciones.
Teniendo en cuenta los hallazgos y posibilidades teóricas, y para un mejor entendimiento del
comportamiento y desarrollo de opacidades que permita comprender partes de la fisiopatología
de la catarata y encontrar otros mecanismos de intervención, es interesante plantear estudios de
lipidómica, identificación de isoformas menos funcionales de la enzima lanosterol sintasa y
determinación adicionalmente de otras enzimas de la vía de biosíntesis de colesterol que puedan
estar alteradas y eventualmente constituir un blanco terapéutico efectivo.Conclusiones
o La enzima lanosterol sintasa se encuentra presente en cristalinos humanos sin y con
opacidad.
o Existe una correlación positiva de la enzima lanosterol sintasa en cristalinos humanos sin y
con catarata. Esta correlación es proporcional a los diferentes grados de opacidad del
cristalino.
o Existe una correlación positiva de la proteína Alfa A Cristalina en cristalinos humanos sin y
con catarata.
o No se identificaron diferencias significativas respecto a diferentes localizaciones en un
mismo tejido estudiado, sin embargo, si hay una tendencia a mayor concentración de alfa
A cristalina en regiones centrales de los cristalinos estudiados.Referencias Bibliográficas
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