Presencia de marcadores de transición epitelio-mesénquima por inmunohistoquímica en osteosarcoma pediátrico y asociación con desenlaces clínicos
Autor: Fonseca Sepúlveda, Eileen Viviana
Asesor: Olaya Morales, Natalia
Fecha: 2021-12
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Oncohematología Pediátrica
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Introducción: La transición epitelio-mesénquima (TEM) es la capacidad celular de cambiar su fenotipo original de forma transitoria y ha sido identificado como un mecanismo tumoral asociado con características clínicas agresivas como presencia de enfermedad distante y diseminada. En sarcomas, estos mecanismos no están bien dilucidados. Este trabajo evalúa la expresión de dos factores de transcripción involucrados en la regulación de la TEM mediante inmunohistoquímica: Snail y Twist-1 en osteosarcoma en pacientes pediátricos y su asociación con variables y desenlaces clínicos. Materiales y métodos: estudio de corte retrospectivo en pacientes entre 0-18 años con osteosarcoma. Se realizó estudio de inmunohistoquímica para Twist-1 y Snail y se recolectaron variables clínicas relacionadas con la enfermedad. Fue realizado el análisis de correlación mediante la prueba de chi cuadrado entre las variables clínicas y la positividad de los marcadores y se evaluó la correlación entre la supervivencia global y cada inmunomarcador mediante log rank test. Resultados: 53 pacientes fueron incluidos. En Snail, el patrón de inmunomarcación más frecuente fue a nivel citoplasmático con 26 casos (49,1%) y esto se correlacionó de forma estadísticamente significativa con la presencia de metástasis múltiples (p=0,02) y metástasis de localización ósea distante del primario (p=0,01). Solo 2 casos fueron positivos para Snail a nivel nuclear. Twist fue positivo a nivel nuclear en 45 casos (84,9%) y 13 casos (28,8%) con marcación intensa; 10 casos tenían marcación nuclear y citoplasmática al mismo tiempo. No se encontraron asociaciones con ningún tipo de marcación de Twist y las variables clínicas analizadas. Conclusiones: Snail y Twist-1, se expresan en diferentes localizaciones, de forma frecuente en osteosarcomas pediátricos. Snail citoplasmático se correlacionó de forma estadística enfermedad metastastica y diseminada. La positividad de ambos marcadores sugiere la activación de estas proteínas como reguladores de eventos de TEM/TME en osteosarcomas pediátricos y se plantea un rol esencial en los fenómenos que se relacionan con la agresividad clínica de la enfermedad. Se requieren estudios adicionales que confirmen o descarten nuestros hallazgos. (Texto tomado de la fuente).

Presencia de marcadores de transición epitelio-mesénquima por
inmunohistoquímica en osteosarcoma pediátrico y asociación
con desenlaces clínicos.
Eileen Viviana Fonseca Sepúlveda
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de medicina, Departamento de pediatría
Bogotá, Colombia
2021
1Presencia de marcadores de transición epitelio-mesénquima por
inmunohistoquímica en osteosarcoma pediátrico y asociación
con desenlaces clínicos.
Investigador principal:
Eileen Viviana Fonseca Sepúlveda
Tesis o trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Oncohematóloga pediatra.
Directora:
Natalia Olaya Morales. Doctora en cancerología. Docente asistente. Facultad de
medicina, Departamento de patología.
Universidad Nacional de Colombia.
Codirectora temática:
Adriana Linares Ballesteros. Oncohematóloga pediatra.
Docente titular. Facultad de medicina, Departamento de pediatría.
Fundación Hospital la Misericordia
Asesor temático:
Esteban Felipe Patiño Calderón
Patólogo. Fundación Hospital la Misericordia
Asesor epidemiológico:
Nelson Aponte Barrios
Oncohematólogo pediatra y Epidemiólogo.
Fundación Hospital la Misericordia.
2Declaración de obra original
Yo declaro lo siguiente:
He leído el Acuerdo 035 de 2003 del Consejo Académico de la Universidad Nacional.
«Reglamento sobre propiedad intelectual» y la Normatividad Nacional relacionada al
respeto de los derechos de autor. Esta disertación representa mi trabajo original, excepto
donde he reconocido las ideas, las palabras, o materiales de otros autores.
Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación, he
realizado su respectivo reconocimiento aplicando correctamente los esquemas de citas y
referencias bibliográficas en el estilo requerido.
He obtenido el permiso del autor o editor para incluir cualquier material con derechos de
autor (por ejemplo, tablas, figuras, instrumentos de encuesta o grandes porciones de texto).
Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica, definida
por la universidad.
Eileen Viviana Fonseca Sepúlveda
3A mi familia, en especial a mi mamá, mi hermano y mi nona
quienes siempre me han acompañado y han confiado en cada
aventura que he emprendido, ustedes son mi inspiración, mi
motivo de orgullo y mi fuerza.
Para ti nonito, tu esencia, espíritu y amor me acompañan en
cada paso que doy.
A Luis Carlos Guzmán, compañero de vida, por tu apoyo
incondicional y por tu amor paciente en estos dos años de
camino arduo.
4Agradecimientos
A las doctoras Natalia Olaya y Adriana Linares quienes acompañaron y dirigieron esta tesis
con dedicación y disposición constante, gracias por sus valiosos aportes a todo nivel en la
construcción de este trabajo.
Para Nelson Aponte y Esteban Patiño agradecimientos por su valiosa asesoría en el
desarrollo de este trabajo.
5Resumen.
Título: Presencia de marcadores de transición epitelio-mesénquima por
inmunohistoquímica en osteosarcoma pediátrico y asociación con desenlaces clínicos.
Introducción: La transición epitelio-mesénquima (TEM) es la capacidad celular de cambiar
su fenotipo original de forma transitoria y ha sido identificado como un mecanismo tumoral
asociado con características clínicas agresivas como presencia de enfermedad distante y
diseminada. En sarcomas, estos mecanismos no están bien dilucidados. Este trabajo
evalúa la expresión de dos factores de transcripción involucrados en la regulación de la
TEM mediante inmunohistoquímica: Snail y Twist-1 en osteosarcoma en pacientes
pediátricos y su asociación con variables y desenlaces clínicos.
Materiales y métodos: estudio de corte retrospectivo en pacientes entre 0-18 años con
osteosarcoma. Se realizó estudio de inmunohistoquímica para Twist-1 y Snail y se
recolectaron variables clínicas relacionadas con la enfermedad. Fue realizado el análisis de
correlación mediante la prueba de chi cuadrado entre las variables clínicas y la positividad
de los marcadores y se evaluó la correlación entre la supervivencia global y cada
inmunomarcador mediante log rank test.
Resultados: 53 pacientes fueron incluidos. En Snail, el patrón de inmunomarcación más
frecuente fue a nivel citoplasmático con 26 casos (49,1%) y esto se correlacionó de forma
estadísticamente significativa con la presencia de metástasis múltiples (p=0,02) y
metástasis de localización ósea distante del primario (p=0,01). Solo 2 casos fueron positivos
para Snail a nivel nuclear. Twist fue positivo a nivel nuclear en 45 casos (84,9%) y 13 casos
(28,8%) con marcación intensa; 10 casos tenían marcación nuclear y citoplasmática al
mismo tiempo. No se encontraron asociaciones con ningún tipo de marcación de Twist y
las variables clínicas analizadas.
Conclusiones: Snail y Twist-1, se expresan en diferentes localizaciones, de forma
frecuente en osteosarcomas pediátricos. Snail citoplasmático se correlacionó de forma
estadística enfermedad metastastica y diseminada. La positividad de ambos marcadores
sugiere la activación de estas proteínas como reguladores de eventos de TEM/TME en
osteosarcomas pediátricos y se plantea un rol esencial en los fenómenos que se relacionan
con la agresividad clínica de la enfermedad. Se requieren estudios adicionales que
confirmen o descarten nuestros hallazgos.
Palabras clave: Snail, Twist-1, transición mesénquima-epitelio, osteosarcoma, sarcomas
6Abstract
Title: Presence of epithelial-mesenchymal transition markers by immunohistochemistry in
pediatric osteosarcoma and association with clinical outcomes.
Introduction: The epithelial-mesenchymal transition (EMT) is the cellular capacity to
change its original phenotype in a transitory way, it has been identified as a tumor
mechanism associated with aggressive clinical characteristics such as the presence of
distant and disseminated disease. In sarcomas, these mechanisms are not well elucidated.
This work evaluates the expression of two transcription factors involved in the regulation of
EMT by immunohistochemistry: Snail and Twist-1 in osteosarcoma in pediatric patients and
their association with clinical variables and outcomes.
Materials and methods: a retrospective study in patients between 0-18 years old with
osteosarcoma. An immunohistochemical study was performed for Twist-1 and Snail and
clinical variables related to the disease were collected. Correlation analysis was performed
using the chi-square test between the clinical variables and the positivity of the markers, and
the correlation between overall survival and each immunomarker was evaluated using the
log rank test.
Results: 53 patients were included. In Snail, the most frequent immunostaining pattern was
at the cytoplasmic level with 26 cases (49.1%) and this correlated in a statistically significant
way with the presence of multiple metastases (p=0.02) and distant bone metastases from
the primary (p=0.01). Only 2 cases were positive for Snail at the nuclear level. Twist-1 was
positive at the nuclear level in 45 cases (84.9%) and 13 cases (28.8%) with intense marking;
10 cases had nuclear and cytoplasmic labeling at the same time. No associations were
found with any type of Twist marking and the clinical variables analyzed.
Conclusions: Snail and Twist-1 are expressed in different locations and are frequently
found in pediatric osteosarcomas. Cytoplasmic Snail was statistically correlated with
metastatic and disseminated disease. The positivity of both markers suggests the activation
of these proteins as regulators of EMT events in pediatric osteosarcomas and an essential
role in the phenomena related to the clinical aggressiveness of the disease is considered.
Additional studies are required to confirm or rule out our findings.
Keywords: Snail, Twist-1, mesenchymal-epithelial transition, osteosarcoma, sarcomas
7Contenido
Página
Resumen ………………………………………………………………………………….. 6
Lista de tablas ……………………………………………………………………………. 9
Lista de figuras ……………………………………………………………………………. 10
Introducción ……………………………………………………………………………….. 11
Objetivo general…………………………………………………………………………. 13
Objetivo específico ……………………………………………………………………… 13
Metodología ……………………………………………………………………………... 13
Resultados ………………………………………………………………………………. 16
Discusión ………………………………………………………………………………... 25
Conclusiones ……………………………………………………………………………... 27
Financiación ……………………………………………………………………………..... 28
Aspectos éticos y clasificación de riesgos. …………………………………………..... 28
Bibliografía ……………………………………………………………………………....... 29
8Lista de tablas
Página
Tabla 1: Descripción de marcadores de inmunohistoquímica usados…………………….. 15
Tabla 2: Características de la cohorte de la estadificación inicial en osteosarcoma ……..16
Tabla 3: Toxicidad relacionada con el tratamiento en cohorte de osteosarcoma………… 17
Tabla 4: Correlación de expresión de Snail citoplasmático con características clínicas ....19
Tabla 5: Correlación de expresión de Twist-1 nuclear con características clínicas ………23
9Lista de figuras
Página
Figura 1 Eventos de transición epitelio mesénquima y viceversa ……………………….. 12
Figura 2 Snail citoplasmático por inmunohistoquímica ................................................... 20
Figura 3 Snail citoplasmático y sobrevida global …………………………………………...22
Figura 4 Twist-1 y sobrevida global …………………………………………………………. 24
Figura 5 Twist-1 por inmunohistoquímica ………………………………………………….. 25
101. Introducción.
Existen dos eventos de transformación fenotípica celular: se trata del proceso de transición
epitelio-mesénquima (TEM), un evento biológico en el cual las células de fenotipo epitelial
adoptan características de células mesenquimales y su inverso la transición mesénquima-
epitelio (TME) que implica que células mesenquimales se comportan como células
epiteliales. Estos intercambios fenotípicos entre propiedades epiteliales y mesenquimales
son reversibles y las células tienen la capacidad de volver a adquirir su fenotipo original (1);
ambos son procesos esenciales en fenómenos fisiológicos como la embriogénesis,
organogénesis y cicatrización (2).
Estos prototipos de plasticidad celular también están descritos en diversos tipos de
carcinomas en los cuales se ha encontrado que las células tumorales de origen epitelial
logran cambiar su fenotipo inicial y consiguen así la habilidad de extravasar, migrar e invadir
tejidos distantes al tumor primario, lo cual ha sido asociado con presentaciones clínicas de
mayor agresividad y desenlaces de mal pronóstico (3). Los sarcomas parecen también
presentar este tipo de plasticidad celular exhibiendo un comportamiento inverso en el cual
hay transición desde la célula mesenquimal al fenotipo epitelial, esta capacidad de los
sarcomas parece también asociarse a un peor pronóstico de la enfermedad (4).
En pediatría, el osteosarcoma es un tumor primario de hueso, cuya incidencia oscila de 3 a
5 casos por millón en hombres y de 2 a 4 casos por millón en mujeres. Representa el
sarcoma más frecuente en la edad pediátrica (5). A la fecha los mecanismos biológicos
subyacentes al comportamiento tan agresivo de los osteosarcomas no están
completamente dilucidados, algunos trabajos indican que este tipo de tumores pueden sufrir
cambios fenotípicos involucrados en la TME y TEM y esto tener implicaciones en la
agresividad y desenlaces clínicos (6–8).
Los eventos de TME y TEM se encuentran orquestados por un grupo de factores
transcripcionales activadores cuyo conjunto básico incluye Snail1 (Snail), Snail2 (Slug),
Twist-1, Twist-2, Zeb1 y Zeb2, estos factores de transcripción están involucrados tanto en
la regulación de los eventos en fenómenos fisiológicos como la embriogénesis y en la
regulación de la TME/TEM en las lesiones tumorales (9,10). Ver figura 1.
Figura 1.
11Tomado de Nat Rev Mol Cell Biol 20, 69-84 (11)
Snail, es un factor de transcripción de tipo dedos de zinc, destacado en los procesos de
TME y TEM, además de su expresión durante el periodo embrionario, la sobre-expresión
de Snail se ha documentado en varios tipos de cáncer particularmente carcinomas, su
sobreexpresión en este tipo de lesiones se ha correlacionado con una mayor frecuencia de
metástasis. Existe una relación inversa con la expresión de E-cadherina en este grupo de
tumores y, en consecuencia, Snail también se correlaciona con una diferenciación tumoral
deficiente (12). Otro fenómeno descrito a la sobre-expresión de Snail es su asociación con
quimioresistencia, fundamentalmente a cisplatino, doxorrubicina y 5-fluoracilo en cáncer de
mama y ovario (13).
Twist-1, es otro de los factores de transcripción fundamentales en la TEM/TME y tiene la
capacidad de reprimir o inducir la expresión proteínas relacionadas con la regulación de la
embriogénesis; además se identificado un rol fundamental en la capacidad de inducir varios
cambios celulares, como la formación de invadopodios y la inducción de mimetismo
vasculogénico (10). Diversas investigaciones han demostrado que la expresión de Twist-1
se asocia con resultados clínicos desfavorables y una mayor frecuencia de metástasis en
varios tipos de tumores sólidos, como el de próstata, cuello uterino, mama, estómago y
páncreas (14).
En este trabajo se evalúa la expresión de Snail y Twist-1 mediante inmunohistoquímica
(IHQ) en osteosarcoma en pacientes pediátricos y explora la posibilidad de asociación con
12el comportamiento clínico, la respuesta al tratamiento y la supervivencia de los pacientes
con positividad en alguno de estos dos marcadores.
2. Objetivo general
Evaluar la frecuencia de expresión por IHQ de marcadores relacionados con los eventos de
transición epitelio-mesénquima Snail y Twist-1 en osteosarcoma en población pediátrica.
3. Objetivos específicos.
3.1 Realizar la descripción de los hallazgos de la IHQ para Snail y Twist-1: frecuencia de
positividad, localización de cada uno de los inmunomarcadores e intensidad de marcación.
3.2 Determinar si existe correlación entre los desenlaces clínicos de los pacientes con
osteosarcoma que expresaban por IHQ de Snail y Twist-1.
4. Metodología.
4.1 Tipo de estudio.
Estudio de corte transversal retrospectivo.
4.2 Fases del estudio.
Identificación de los sujetos.
Se realizó un muestreo por conveniencia a partir de la revisión de las historias clínicas
electrónica de la base de datos de una institución de tercer nivel de atención en la ciudad
de Bogotá de pacientes pediátricos (0-18 años) con diagnósticos CIE-10 relacionados con
osteosarcoma. Una vez identificados se procedió a realizar la búsqueda del material
biológico disponible (bloques de parafina) susceptible de realización de estudio de IHQ.
-Criterios de inclusión.
Pacientes pediátricos con diagnóstico de osteosarcoma manejados en la Fundación
Hospital de la Misericordia desde 2010 hasta mayo 2020 que contaban con bloque de
parafina y láminas de hematoxilina-eosina del diagnóstico inicial para estudio de IHQ.
-Criterios de exclusión.
Imposibilidad de contar con registros clínicos del paciente por no tener seguimiento en la
institución o traslados durante el periodo de tratamiento.
Recolección de variables clínicas
13A partir de la historia clínica electrónica, se registraron en la base de datos variables
demográficas, clínicas y de desenlace.
-Variables demográficas: Sexo, edad (años).
-Variables clínicas: localización de la lesión. Estadio según Enneking. Cirugía, tipo de
cirugía: salvamento vs. amputación. Metástasis al diagnóstico: pulmonares, óseas,
pulmonares/óseas, otras. Subtipo histológico; respuesta a quimioterapia: % necrosis.
Variables asociadas a toxicidad de quimioterapia para cada período: neoadyuvancia y
adyuvancia, se incluirán: toxicidad hematológica, cardiotoxicidad, nefrotoxicidad, mucositis
y segundas neoplasias.
-Variables desenlace: recaída, progresión de la enfermedad, supervivencia global,
segundas neoplasias.
Tamaño de la muestra.
Dado que no se puede estimar la proporción de casos que cuenten con el material biológico
necesario para la realización de los estudios de IHQ, para el presente trabajo se decidió
realizar un muestreo no probabilístico por conveniencia ya que no requiere una probabilidad
pre-test y no condiciona el estudio a un número mínimo de individuos a incluir. Fueron
incluidos todos los pacientes que cumplían con los criterios de inclusión.
Estudio de patología
Después de la identificación de los casos con diagnóstico de osteosarcoma se realizó la
revisión del material biológico del diagnóstico (bloque de parafina y estudio de IHQ) y se
seleccionó el material con mayor representatividad del tumor para el procesamiento con los
anticuerpos seleccionados.
Procesamiento y Anticuerpos
Las muestras con diagnóstico de osteosarcoma fijadas en formalina y embebidas en
parafina fueron cortadas a 4 micras en 6 láminas cargadas para cada caso y luego
desparafinadas en xileno y deshidratadas en etanol, seguido por la recuperación antigénica
en buffer citrato por 10 minutos e inactivación de la enzima peroxidasa endógena con H2O2
al 3% por 20 minutos. Posteriormente, las muestras se incubaron con los anticuerpos
primarios contra Snail y Twist-1, durante una hora. Los detalles de las diluciones, clones,
expresión y controles de los anticuerpos se especifican en la tabla No.1. Después se lavó
cada tejido por 1 minuto con solución salina buffer fosfato. Luego las láminas fueron
14incubadas con el anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano a 37°C por 30
minutos y visualizadas por incubación con la solución de 3,3′-diaminobenzidina (Sangon
Biotech, Shanghai, China). Posteriormente, las láminas se colorearon con hematoxilina por
1 minuto y se lavaron por 3 minutos con agua. Finalmente, los cortes se deshidrataron con
etanol seguido por xilol y fueron montados con resina y un portaobjetos.
Tabla 1.
Anticuerpo Compañía Dilución Control Clon
Snail Novusbio 1:500 Tejido renal Policlonal
Twist-1 Novusbio 1:500 Endometrio Policlonal
La inmunohistoquímica fue leída así: se clasificó como no informativa (material escaso,
artefacto, necrosis tumoral), negativa (<5% de las células tumorales), focal, (entre 5–50%
de las células tumorales), difusa (entre 50-100) % de las células tumorales).
En cuanto a la intensidad, se consideró leve si solo se observó a 40X, moderada si era
observable en 10x o intensa si observaba en 4X y según la localización en: citoplasmática,
nuclear o membranosa.
Todos los casos fueron evaluados por dos patólogos con experiencia en patología
pediátrica (Esteban Patiño y Natalia Olaya) y las diferencias serán resueltas por consenso.
Análisis estadístico.
El procesamiento de la base de datos se realizó en IBM Corp. Released 2013. IBM SPSS
Statistics for Windows, Version 22.0. Armonk, NY: IBM Corp. Para el análisis descriptivo de
la cohorte se procesaron las variables cuantitativas en sus medidas de tendencia central y
dispersión y variables nominales en frecuencias absolutas.
El análisis de datos de expresión de cada inmunomarcador (para este análisis se realizará
como positivo o negativo según las localizaciones más frecuentes que se encontraron
positivas) con las características clínicas se llevará a cabo mediante la prueba de chi
cuadrado. El método de Kaplan-Meier con prueba logrank se realizó para examinar la
asociación entre el perfil TME y la supervivencia global. Los resultados fueron interpretados
con base en un nivel de significancia estadística de 0.05.
Este trabajo fue aprobado por el comité de ética de la Fundación Hospital la Misericordia
según acta CEI 75-17 No. 007.
155. Resultados.
5.1 Características generales de la cohorte.
En el periodo evaluado 68 pacientes tuvieron diagnóstico de osteosarcoma, de estos fueron
excluidos 6 casos por no contar con material de parafina disponible para el procesamiento
y los 9 casos restantes se excluyeron por diferentes motivos: traslados de centro de
tratamiento, perdida del seguimiento durante el tratamiento o no aceptación del tratamiento.
En total 53 pacientes fueron incluidos en este trabajo. De estos, 33 casos (62,2%) eran
hombres. La mediana para la edad fue de 13 (RIQ 3-17) años. La localización más frecuente
del tumor primario fue el fémur en 29 pacientes (54,7%), seguido por tibia 14 casos (26,4%),
húmero 8 pacientes (15,1%) y peroné y alerón iliaco cada uno con 1 paciente (1,9%). En
51 pacientes (96,2%) la clasificación histológica del osteosarcoma fue de tipo convencional,
se registró 1 caso con osteosarcoma de célula pequeña (1,9%) y 1 caso (1,9%) de tipo
telangiectásico.
En 18 pacientes (34%) se encontraron metástasis al diagnóstico. La media del % de
necrosis de toda la cohorte fue de 67,8% (DE 34,4); del total de la cohorte 20 pacientes
(37,7%) tenían necrosis superior al 90% posterior a la quimioterapia neo-adyuvante. La
tabla 2 presenta el resumen de las características iniciales los pacientes.
Tabla 2.
Características de la estadificación inicial en
osteosarcoma.
Metástasis al diagnóstico
Si 18 (34%)
No 35 (66%)
Tipo de metástasis
Único sitio 15 (28,3%)
Múltiple sitio 3 (5,7%)
Localización de las metástasis
Saltarinas 6 (11,3%)
Pulmonares 11 (20,8%)
Oseas distantes del primario 4 (7,5%)
Clasificación Enneking
IIA 5 (9,4%)
16IIB 30 (56,6%)
III 18 (34%)
Tipo de control quirúrgico
Tipo de cirugía de control local
Salvamento 41 (77,4%)
Amputación 7 (13,2%)
-Terapéutica 6 ()
-Paliativa 1 ()
Ninguna 5 (9,4%)
Durante el seguimiento se registraron: 10 pacientes (18,9%) con progresión de su
enfermedad y 9 casos (16,9%) de recaída de la enfermedad después de terminar
tratamiento. En total 15 pacientes (28,3%) fallecieron por diferentes causas: 7 (46,6%) por
progresión del osteosarcoma, 4 (26,6%) fallecen en recaída de la enfermedad, 3 (20%)
fallecen por segundas neoplasias y 1 (6,6%) caso por complicaciones derivadas de la
terapia.
5.2 Tratamiento.
En todos los casos revisados los pacientes recibieron quimioterapia neoadyuvante y 45
pacientes (84,9%) continuaron con quimioterapia adyuvante. La tabla 3 presenta la
toxicidad relacionada con ambas fases del tratamiento.
Tabla 3.
Toxicidad relacionada con el tratamiento en cohorte de
osteosarcoma
Neoadyuvancia Adyuvancia (n =45)
Variable (n=53)
n (%) n (%)
Toxicidad
hematológica 42 (79,2) 38 (84,4)
cualquier grado
Si
Neutropenia
Grado 1 2 (3,8) 4 (8,8)
Grado 2 8 (15,1) 8 (17,7)
Grado 3 4 (7,5) 4 (8,8)
17Grado 4 24 (57,1) 21 (46,6)
Anemia
Grado 1 16 (30,2) 15 (33,3)
Grado 2 14 (26,4) 3 (6,6)
Grado 3 - 2 (4,4)
Grado 4 2 (3,8) 9 (20,0)
Trombocitopenia
Grado 1 10 (18,9) 4 (8,8)
Grado 2 11 (20,8) 8 (17,7)
Grado 3 4 (7,5) 8 (17,7)
Grado 4 8 (15,1) 10 (22,2)
Toxicidad hepática
cualquier grado 23 (43,4) 17 (37.7)
Si
Transaminasas
Grado 1 9 (17,0) 9 (20,0)
Grado 2 8 (15,1) 6 (13,3)
Grado 3 6 (11,3) 2 (4,4)
Bilirrubinas
Grado 2 1 (1,9) -
Grado 3 1 (1,9) -
Toxicidad renal 2 (3,8) 3 (6,6)
cualquier grado
Grado toxicidad renal
Grado 1 1 (1,9) 1 (2,2)
Grado 2 1 (1,9) 1 (2,2)
Grado 3 1 (2,2)
Mucositis 5 (9,4) 5 (11,1)
Grado de mucositis
Grado 2 4 (7,5) 2 (4,4)
Grado 3 1 (1,9) 3 (6,6)
5.3 Resultados de inmunohistoquímica
Los 53 casos incluidos contaban con material disponible para selección y procesamiento
de IHQ para Snail y Twist-1. Se presentan a continuación los resultados.
185.3.1 Snail
Para este marcador, se encontró una inmunomarcación más frecuente en la localización
citoplasmática con 26 casos (49,1%) identificados, de estos 14 casos (53,8%) tuvieron
distribución focal y los 12 casos (46,1%) restantes tenían distribución difusa, respecto a la
intensidad de marcación, se distribuyó así: 7 casos (26,9%) con marcación intensa, 7 casos
(26,9%) moderada y 12 casos (46,1%) con marcación débil. En 26 casos (49,0%) no se
documentó positividad de Snail en la muestra en ninguna localización. La tabla 4 presenta
las variables clínicas de los casos Snail citoplasmático positivo y su correlación con las
variables clínicas analizadas. Se encontró una asociación estadística entre la positividad de
Snail citoplasmático positivo e intenso y la presencia de metástasis múltiples al debut de la
enfermedad (p=0,02) y con la localización ósea en la enfermedad metastásica (p=0,01).
Tabla 4.
Correlación de expresión de Snail citoplasmático con características clínicas
Variable Snail n (%) Valor p No. De casos según Valor p
intensidad de marcación
- + + ++ +++
n=26 n=26 (n=12) (n=7) (n=7)
Metástasis al
diagnóstico 11 (42,3) 7 (26,9) 0,38 4 1 2 0,53
Tipo de metástasis
Único sitio 11 (42,3) 4 (15,4) 3 1 -
Múltiple sitio - 3 (11,5) 0,04* 1 - 2 0,02*
Localización de
las metástasis
Saltarinas 3 (11,5) 3 (11,5) 0,62 3 - - 0,43
Pulmonares 8 (30,7) 3 (11,5) 0,33 1 1 - 0,64
Oseas distantes - 4 0,06 2 - 2 0,01*
del primario
Recaída de la 22 (84,4) 4 (15,4) 0,52 3 1 - 0,24
enfermedad
Progresión de la 22 (84,4) 4 (15,4) 0,72 3 - 1 0,65
enfermedad
19Necrosis >90% 10 (38,5) 10 (38,5) 0,76 3 4 3 0,39
posterior a
quimioterapia
Toxicidad 4 (15,4) 22 (84,6) 0,50 12 5 5 0,59
hematológica
Toxicidad 17 (65,4) 9 (34,6) 0,27 5 3 1 0,35
hepática
Toxicidad renal 25 (96,2) 1 (3,8) 0,74 - 1 - 0,74
Toxicidad 24 (92,3) 2 (7,7) 0,68 1 - 1 0,45
cardiaca
Mucositis 24 (92,3) 2 (7,7) 0,51 1 1 - 0,47
Segundas 24 (92,3) 2 (7,7) 0,57 - 1 1 0,31
neoplasias
En la figura 2 se presenta las imágenes de Snail citoplasmático.
Figura 2
a b
a
c
d
20Figura 2. Expresión de Snail en Osteosarcoma. En la imagen se aprecia un osteosarcoma
convencional (a) positivo para marcación citoplasmática de Snail en células tumorales (b).
El osteosarcoma hipercelular con menos formación de osteoide (c) muestra expresión
nuclear en dot para Snail (d).
Solo en dos 2 casos (3,8%) se registró inmuno-marcación en el núcleo, ambos presentaron
distribución difusa en la muestra y la intensidad fue moderada. El primero de estos casos,
se trató de una paciente femenina, de 12 años, que debuta con fractura patológica, la
localización del tumor fue femoral, sin metástasis en el diagnóstico, recibió neoadyuvancia,
cirugía de salvamento y el grado de necrosis pos-quimioterapia fue del 25%, sin embargo,
durante el seguimiento presenta progresión de la enfermedad a nivel pulmonar y fallece
debido a esta causa. El segundo caso, también una paciente femenina, de 13 años, con
localización primaria del tumor a nivel femoral, sin metástasis en el momento del diagnóstico
de la enfermedad, recibió neoadyuvancia, cirugía de salvamento y el grado de necrosis pos-
quimioterapia fue de 89%, la paciente recae en el primer año de seguimiento posterior al
finalizar el tratamiento, se encontraba aún viva en la última visita, pero con la enfermedad
recaída y en progresión.
No se documentó inmunomarcación de membrana en ninguno de los casos para Snail.
Dada la frecuencia alta de positividad en el citoplasma de este marcador, se decidió realizar
análisis de la supervivencia global usando el método de Kaplan-Meier de los casos de
osteosarcoma con Snail positivo a nivel citoplasmático, no se encontraron diferencias
significativas entre quienes tuvieron inmuno-marcación positiva comparado con el grupo
con inmunomarcación negativa y la supervivencia global. Ver figura 3.
Figura 3.
215.3.2 Twist-1
En 12 casos (22,5%) se documentó inmuno-marcación en el citoplasma, de estos 8 casos
(66,6%) la localización del marcador era difusa a lo largo de la muestra y los 4 casos (33,3%)
tenían localización focal; respecto a la intensidad de la positividad se comportaron así: 5
casos (41,6%) con marcación débil, 5 casos (41,6%) moderada y 2 casos (16,6%) fuerte.
No se documentó asociación estadística entre la positividad citoplasmática de Twist y las
variables clínicas estudiadas.
Respecto a la marcación nuclear del Twist, esta se registró en 45 casos (84,9%), de estos
31 casos (68,8%) tenían localización difusa y 14 casos (31,1%) localización focal y de
acuerdo con el grado de intensidad de la marcación se comportaron así: 15 casos (33,3%)
con marcación débil, 17 casos (37,7%) moderada y 13 casos (28,8%) con marcación
intensa; 10 casos tenían marcación nuclear y citoplasmática al mismo tiempo. En el caso
de Twist-1, 6 casos (11,3%) no se documentó ningún tipo de inmuno-marcación. En la tabla
5 se presenta el resumen de las características clínicas y la marcación nuclear de Twist-1.
22Tabla 5.
Correlación de expresión de Twist-1 nuclear con características clínicas
Variable Twist n (%) Valor p No. De casos según Valor p
intensidad de marcación
- + + ++ +++
(n=6) (n=45) (n=15) (n=17) (n=13)
Metástasis al
diagnóstico 1 17 0,16 7 6 4 0,24
Tipo de metástasis
Único sitio 1 14 6 5 3
Múltiple sitio 3 0,83 1 1 1 0,83
Localización de
las metástasis
Saltarinas 1 6 0,66 3 2 1 0,66
Pulmonares 1 10 0,61 5 4 1 0,61
Oseas distantes - 4 0,85 1 1 2 0,85
del primario
Recaída de la 1 8 0,58 3 5 - 0,58
enfermedad
Progresión de la 1 9 0,52 3 4 2 0,52
enfermedad
Necrosis >90% 4 16 0,35 8 3 5 0,35
posterior a
quimioterapia
Toxicidad 3 37 0,34 12 12 13 0,20
hematológica
Toxicidad 1 21 0,44 7 8 6 0,22
hepática
Toxicidad renal - 2 0,71 - - 2 0,71
Toxicidad - 4 1 2 1 0,50
cardiaca 0,50
Mucositis 1 4 0,57 1 3 - 0,57
23Segundas 1 2 0,40
neoplasias
No se encontró correlación entre la positividad de la inmuno-marcación del núcleo y las
variables: presencia o tipo de metástasis, recaída, progresión de la enfermedad, respuesta
a la quimioterapia o algún tipo de toxicidad relacionada con la quimioterapia.
Se realizó el análisis de la supervivencia global y libre de evento usando el método de
Kaplan-Meier de los casos de osteosarcoma con Twist-1 positivo a nivel nuclear, no se
encontraron diferencias significativas entre quienes tuvieron inmuno-marcación positiva.
Ver figura 4.
Figura 4.
No se documentó inmuno-marcación de membrana en ninguno de los casos para Snail. Los
dos casos que mostraron marcación para Snail a nivel nuclear, se encontró también en
Twist-1 positividad nuclear. La figura 5 presenta los hallazgos en imágenes encontrados en
la IHQ.
24Figura 5
a
b
c d
Figura 5. Expresión de Twist-1 en osteosarcoma. Se observa un osteosarcoma
convencional (a), positivo para Twist nuclear por IHQ (b) se resaltan que los núcleos están
embebidos en el estroma osteoide. Otro osteosarcoma semejante (c) en el cual también se
observa Twist-1 fuertemente positivo nuclear (d). En este caso el estroma es menos
abundante.
6. Discusión
La plasticidad celular regulada por factores de transcripción como Twist-1, Snail y otros
como Slug, ZEB1 y ZEB2 juegan un papel fundamental en la regulación de la transición
entre el estado epitelial y mesenquimatoso y así mismo su regulación favorece la invasión
celular y la metástasis en diferentes lesiones tumorales fundamentalmente carcinomas,
25pero también se han descrito en sarcomas (15–17). Este trabajo realizó una evaluación
mediante IHQ de dos factores de transcripción conocidos por ser reguladores
fundamentales de los procesos de TEM/TME: Snail y Twist-1 en osteosarcomas en edad
pediátrica y exploró la posibilidad de una asociación con desenlaces clínicos ante la
positividad en la inmuno-marcación de cada uno de ellos.
Siendo Snail y Twist-1 factores de transcripción, se esperaba que la marcación se
encontrara fundamentalmente en el núcleo para ser considerada como positiva y se
correlacionara con actividad de cada una de estas moléculas, sin embargo, las
localizaciones variaron para ambos marcadores.
Para el caso de Snail, la localización nuclear fue infrecuente y solo dos pacientes registraron
este patrón de inmuno-marcación, sin embargo comparten características clínicas como la
edad, el género y el debut de la enfermedad sin metástasis, ambas pacientes también pese
a recibir tratamiento se documentaron recaídas de la enfermedad; si bien corresponde solo
con dos casos de la cohorte evaluada y no es posible por el tamaño de la muestra
generalizar o hacer conclusiones que puedan extrapolarse a otras poblaciones, si pudiera
sugerir que la expresión nuclear de Snail evaluado mediante IHQ es un factor que puede
predecir la presencia de recaídas.
Adicionalmente, se encontró que hasta el 49% de los casos tiene marcación positiva de
Snail con localización citoplasmática, se decidió explorar la correlación con las variables
clínicas y de desenlace dado la positividad tan importante en la cohorte y de forma llamativa
se encontró correlación estadística con la presencia de múltiples sitios metastásicos al
diagnóstico y con la presencia de metástasis óseas distantes del sitio del tumor primario,
esta asociación se acentúo con la positividad intensa del Snail; otros autores han
documentado expresión citoplasmática por IHQ de Snail en tumores también de origen
mesenquimal, y se presume que esta ubicación podría estar relacionada con un tipo de
nivel regulador pos-transcripcional del crecimiento y diferenciación celular (18).
Snail ya ha sido en otros trabajos asociado como factor que puede lograr predecir la
progresión de la enfermedad cuando se sobre-expresa en osteosarcomas, esto por su
capacidad de regular moléculas como la E-cadherina (19), sin embargo la marcación
citoplasmática previamente no ha sido correlacionada con desenlaces clínicos, por lo que
se plantea como un hallazgo que amerita atención porque pudiera tratarse de una expresión
subrogada de TEM/TEM, y que eventualmente pueda funcionar como un marcador
26temprano de mal pronóstico, sin embargo investigaciones adicionales se requieren al
respecto.
Twist-1, es un factor de transcripción fundamental en la regulación de TEM/TME y la
evidencia actual muestra que su expresión en células tumorales favorece la diseminación
del tumor primario y su posterior establecimiento en órganos distantes (10,14). De forma
llamativa, en este trabajo se encontró una expresión frecuente de Twist-1 a nivel nuclear,
alcanzando casi el 85% de los casos evaluados, sin embargo contrario a lo documentado
por Ying y Cols. (20) no conseguimos encontrar asociación de esta expresión con factores
como la presencia de metástasis o la supervivencia global.
Snail y Twist, como factores de transcripción requieren ingresar al núcleo para cumplir su
función; sin embargo, es posible que los sistemas de transporte hacia el núcleo, importinas
y exportinas, que deben estar intactos para su movilidad, presenten algún tipo de alteración
en este tipo de tumores. Por otra parte, Snail es una proteína inestable que se degrada
rápidamente. Es posible, igualmente, que en estos casos alguna modificación
postranscripcional (fosforilación, ubiquitinación oxidación de lisina) aumente la estabilidad
de la proteína en el citoplasma. Ambos mecanismos biológicos deberían ser explorados en
posteriores estudios (21,22).
Pese a que los factores de transcripción relacionados con la TEM/TME también se han
asociado con quimio resistencia y respuesta a la quimioterapia (12,13,23,24), en esta
investigación no se encontró asociación con (% necrosis posterior a neoadyuvancia), ni con
la toxicidad relacionada con la terapia.
Dentro de las limitaciones de este trabajo, se encuentra que se trata de un estudio de un
único centro con un número limitado de muestras para estudio, fueron explorados solo dos
marcadores relacionados con los eventos de TME/TEM y la herramienta usada fue la IHQ,
Podrían explorarse otros aspectos estructurales de ambas proteínas para confirmar o
descartar nuestros hallazgos como lo muestra la literatura; Aunque nuestros resultados con
el análisis de Twist no fueron concluyentes, ha sido implicado como marcador pronóstico
en osteosarcoma en otras investigaciones (25–27).
7. Conclusión
Snail y Twist-1 pueden expresarse en diferentes localizaciones sub-celulares y con una
frecuencia no despreciable en muestras de pacientes pediátricos con osteosarcoma. El
hallazgo más llamativo de este estudio fue la correlación entre la presencia de Snail
27citoplasmático positivo y la presencia de enfermedad metastásica de múltiple localización.
Es posible que Snail participe en eventos facilitadores de migración y metástasis en
osteosarcoma pediátricos y se plantea un rol esencial en los fenómenos que se relacionan
con la agresividad clínica de la enfermedad. Es probable que la positividad de estas
proteínas a través de la IHQ esté relacionada con su activación y posible inducción de los
eventos de TEM/TME en estas células tumorales, sin embargo, no conseguimos demostrar
un rol claro en correlación con los diferentes eventos clínicos o desenlaces de los pacientes
en esta cohorte. Se requieren estudios adicionales que confirmen o descarten nuestros
hallazgos.
8. Financiación.
Este trabajo fue financiado por el grupo de investigación en Oncohematología Pediátrica a
través del centro de costos Preceptorship 400032.
9. Aspectos éticos y clasificación de riesgos.
Este proyecto se rige bajo las políticas de investigación pública que constituye los
estándares para la investigación y se basa en principios de justicia, respeto, no
maleficencia, beneficencia, autonomía y capacidad. Se ajusta a la normatividad
internacional particularmente la declaración de Helsinki y a las pautas éticas para la
investigación biomédica preparadas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de
las Ciencias Médicas “CIOMS” y la resolución 8430 de 1993 del ministerio de salud.
Se considera que el presente estudio constituye una investigación sin riesgo para el
paciente o sus familias dado que se trata de un estudio retrospectivo y no se realiza ningún
tipo de intervención o modificación de las variables biológicas de sus participantes. Riesgo
identificado según la Res. 8430 de 1993 del Ministerio de Salud.
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