Inmovilización de lipasa candida rugosa en soporte de quitosano
Autor: Cifuentes Restrepo,  Ali David
Asesor: Orrego Alzate, Carlos Eduardo (Thesis advisor)
Fecha: 2005
Programa: Bogotá - Medicina -Fisioterapia
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Se llevó a cabo la producción de un sistema biocatalítico con características físico químicas adecuadas, para ser aplicado en reacciones de hidrólisis y esterificación. El soporte de inmovilización fue fabricado a partir de un hidrogel macroporoso de quitosano con concentración de 3 % el cual se sometió a un proceso de criogelificación-crioconcentración por un tiempo de 4-5 días, produciéndose en diferentes geometrías. Finalmente se escogió la forma cilíndrica ya que los pellets resultaron de fácil producción, resistentes a la abrasión y a la agitación. La humedad final de los soportes cilíndricos fue de alrededor del 17% . Una solución de glutaraldehido fue utilizada como activador del soporte utiizando el método de brazo espaciador. El valor óptimo de carga enzimática la produjo un tratamiento de activación con glutaraldehido al 0.003 %, La inmovilización de lipasa cándida rugosa (CRL) fue llevada a cabo por inmersión del soporte activado en una solución de la proteína durante 15h. Así se obtuvo una carga de 1.065 mg enzima/ g soporte seco, en promedio. La caracterización del soporte se llevó a cabo por medio de espectroscopia de infrarrojo (FTIR) hallando un grado de D-acetilación de 68.86%. La morfología externa fue estudiada por microscopia de fuerza atómica en modo de contacto encontrándose un tamaño medio de poro de 195 ± 560 nm y rugosidades medias de 229 ± 308 nm para el soporte obtenido a partir de la solución del 3% de quitosano. La resistencia a la agitación y la solubilidad-degradabilidad fue estudiada, encontrándose resistente a agitaciones hasta de 1100 rpm y soluble solo en soluciones de ácido acético. El grado de hinchamiento se evaluó para la hidrólisis encontrándose que el soporte se hincha en un 77.16 % al cabo de 96h. La caracterización del sistema biocatalítico se llevó a cabo por hidrólisis de aceite de oliva y mediante la esterificación de ácido oleico con n-butanol, presentándose una mayor actividad de la enzima inmovilizada con respecto a la enzima libre con valores de 14.79 U/mg y 9.69 U/mg respectivamente. Este trabajo forma parte del proyecto de investigación “Producción de Biodiesel a partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reacción-separación por enzimas Inmovilizadas” adscrito a Colciencias. / Abstract: The aim of this work was the production and characterization of an adequate catalytic system for hydrolisis and esterification reactions. As a support it was used different pellet shapes of a a macroporous dried hydrogel (ca 17% humidity, wet basis) obtained from a chitosan dispersion (3% wt) gelled at 20ºC, crioconcentrated at -20ºC and thawed at 20ºC. Easy way of production, good abrasion and agitation resistance was the principal reasons to choose the cylinders as the final shape of the pellet. Candida Rugosa Lipase – CRL- was immobilized on the chitosan support after immersion contact for 15 h with an enzyme solution .Glutaraldehyde was used as activation agent or spaced arm in the lipase immobilization process. Activating glutaraldehyde solution (0.003% wt) yield higher enzymatic load on chitosan pellets (average value of 1.065 mg enzyme/ g of dried support). Support characterization included infrared spectroscopy – FTIR- for deacetylation degree (68.86%) and atomic force microscopy – contact mode- for roughness (between 229 and 308 nm) and pore size (149 to 226 nm). Agitation resistance and swelling in water and solubility in different media were also studied. Pellets had a good behavior in agitated environment until 1100 rpm; they were dissolved in acetic acid solutions. It was measured 77.6% of swelling after 96 h in contact with aqueous hydrolysis reaction media solutions Hydrolysis and esterification catalytic activity was made in olive oil hydrolysis and n-butanol - oleic acid reaction respectively. Supported lipase system showed higher enzymatic activity than free enzyme catalyzed reactions (14.79 U/mg y 9.69 U/mg forr hydrolysis and esterification respectively). This work is a part of a major research project called “Producción de Biodiesel a partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reacción-separación por enzimas Inmovilizadas” with finantial support of Colciencias and Universidad Nacional Sede Manizales.

INMOVILIZACION DE LIPASA CANDIDA RUGOSA
EN SOPORTE DE QUITOSANO
ALI DAVID CIFUENTES
DIANA MARITZA ROJAS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MANIZALES
FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA
INGENIERIA QUIMICA
Manizales, Enero de 2005INMOVILIZACION DE LIPASA CANDIDA RUGOSA
EN SOPORTE DE QUITOSANO
ALI DAVID CIFUENTES
Código 399514
alidavidc@hotmail.com Cel: 311-3069377
Linea de profundización en alimentos
DIANA MARITZA ROJAS
Código 399052
dianam0729@latinmail.com Cel: 300-7791390
Línea de profundización en alimentos
Trabajo para optar el título de Ingeniero Químico
MODALIDAD
Participación en proyecto de investigación:
Producción De Biodiesel A Partir De Aceite De Palma Y De Higuerilla Por Un
Proceso De Reacción-Separación Por Enzimas Inmovilizadas.
DIR ECTOR
CARLOS EDUARDO ORREGO
Ingeniero Químico, Esp en Tecnología de alimentos
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA SEDE MANIZALES
FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA
INGENIERÍA QUÍMICA
Manizales, Enero de 2005Nota de aceptación
________________________________
________________________________
________________________________
________________________________
Presidente del Jurado
________________________________
Jurado
________________________________
Jurado
Manizales, día____mes___año___Ali David Cifuentes
A mis padres por el esfuerzo hecho, a Dios,
y a los que en una u otra forma me aportaron
algún granito de arena en mi carrera.
Diana Maritza Rojas
A DIOS, a mi madre y a mi hijo
por tantos esfuerzos compartidos.AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a:
• Colciencias y Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales por la
financiación de éste proyecto.
• Carlos Eduardo Orrego, director del trabajo de grado por su valioso apoyo
humano e intelectual.
• Al talento humano pertenecientes a los “laboratorios de Química y Análisis
instrumental de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales.
• Los profesores: Gloria Inés Giraldo, Carlos Ariel Cardona, Héctor Jairo
Osorio por su orientación pedagógica.
• Al personal administrativo de la Dirección de Investigaciones de Manizales,
Universidad Nacional de Colombia Sede Manizales.
• El ingeniero Adamo Alexander Cardona, por su disposición y colaboración
oportuna.
• Jorge Ariel Guapacha por su colaboración incondicional.
• Demás personal asociado al proyecto por aportar conocimientos pertinentes
al desarrollo del mismo.RESUMEN
Se llevó a cabo la producción de un sistema biocatalítico con características físico
químicas adecuadas, para ser aplicado en reacciones de hidrólisis y
esterificación. El soporte de inmovilización fue fabricado a partir de un hidrogel
macroporoso de quitosano con concentración de 3 % el cual se sometió a un
proceso de criogelificación-crioconcentración por un tiempo de 4-5 días,
produciéndose en diferentes geometrías. Finalmente se escogió la forma cilíndrica
ya que los pellets resultaron de fácil producción, resistentes a la abrasión y a la
agitación. La humedad final de los soportes cilíndricos fue de alrededor del 17% .
Una solución de glutaraldehido fue utilizada como activador del soporte utiizando
el método de brazo espaciador. El valor óptimo de carga enzimática la produjo un
tratamiento de activación con glutaraldehido al 0.003 %, La inmovilización de
lipasa cándida rugosa (CRL) fue llevada a cabo por inmersión del soporte
activado en una solución de la proteína durante 15h. Así se obtuvo una carga de
1.065 mg enzima/ g soporte seco, en promedio.
La caracterización del soporte se llevó a cabo por medio de espectroscopia de
infrarrojo (FTIR) hallando un grado de D-acetilación de 68.86%. La morfología
externa fue estudiada por microscopia de fuerza atómica en modo de contacto
encontrándose un tamaño medio de poro de 195 ± 560 nm y rugosidades medias
de 229 ± 308 nm para el soporte obtenido a partir de la solución del 3% de
quitosano. La resistencia a la agitación y la solubilidad-degradabilidad fue
estudiada, encontrándose resistente a agitaciones hasta de 1100 rpm y soluble
solo en soluciones de ácido acético. El grado de hinchamiento se evaluó para la
hidrólisis encontrándose que el soporte se hincha en un 77.16 % al cabo de 96h.
La caracterización del sistema biocatalítico se llevó a cabo por hidrólisis de aceite
de oliva y mediante la esterificación de ácido oleico con n-butanol, presentándose
una mayor actividad de la enzima inmovilizada con respecto a la enzima libre con
valores de 14.79 U/mg y 9.69 U/mg respectivamente.
Este trabajo forma parte del proyecto de investigación “Producción de Biodiesel a
partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reacción-separación por
enzimas Inmovilizadas” adscrito a Colciencias.ABSTRACT
The aim of this work was the production and characterization of an adequate
catalytic system for hydrolisis and esterification reactions. As a support it was used
different pellet shapes of a a macroporous dried hydrogel (ca 17% humidity, wet
basis) obtained from a chitosan dispersion (3% wt) gelled at 20ºC,
crioconcentrated at -20ºC and thawed at 20ºC. Easy way of production, good
abrasion and agitation resistance was the principal reasons to choose the cylinders
as the final shape of the pellet.
Candida Rugosa Lipase – CRL- was immobilized on the chitosan support after
immersion contact for 15 h with an enzyme solution .Glutaraldehyde was used as
activation agent or spaced arm in the lipase immobilization process. Activating
glutaraldehyde solution (0.003% wt) yield higher enzymatic load on chitosan pellets
(average value of 1.065 mg enzyme/ g of dried support).
Support characterization included infrared spectroscopy – FTIR- for deacetylation
degree (68.86%) and atomic force microscopy – contact mode- for roughness
(between 229 and 308 nm) and pore size (149 to 226 nm). Agitation resistance and
swelling in water and solubility in different media were also studied. Pellets had a
good behavior in agitated environment until 1100 rpm; they were dissolved in
acetic acid solutions. It was measured 77.6% of swelling after 96 h in contact with
aqueous hydrolysis reaction media solutions
Hydrolysis and esterification catalytic activity was made in olive oil hydrolysis and
n-butanol - oleic acid reaction respectively. Supported lipase system showed
higher enzymatic activity than free enzyme catalyzed reactions (14.79 U/mg y 9.69
U/mg forr hydrolysis and esterification respectively).
This work is a part of a major research project called “Producción de Biodiesel a
partir de aceite de palma y de higuerilla por un proceso de reacción-separación por
enzimas Inmovilizadas” with finantial support of Colciencias and Universidad
Nacional Sede Manizales.TABLA DE CONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN 13
1. OBJETIVOS 14
1.1 GENERALES 14
1.2 ESPECÍFICOS 14
2. MARCO TEORICO 15
2.1 ANTECEDENTES 15
2.2 INMOVILIZACION 16
2.2.1 Clases De Inmovilización 18
2.2.1.1 Inmovilización por retención física 18
2.2.1.1.1 Atrapamiento 19
2.2.1.1.2 Inclusión en membranas 19
2.2.1.2 Inmovilización por unión química 20
2.2.1.2.1 Unión a soportes 20
2.2.1.2.2 Adsorción iónica 21
2.2.1.2.3 Unión covalente 22
2.2.1.2.4 Inmovilización por reticulación. 23
2.2.2 Efectos de la Inmovilización 25
2.3 LIPASAS EN REACCIONES 27
2.3.1 Clasificación 27
2.3.2 Propiedades 27
2.3.3 Reacción de transesterificación 29
2.3.3.1 Producción de biodiesel 29
2.4 ACTIVIDAD ENZIMÁTICA 30
2.5 SOPORTES DE INMOVIIZACION 31
2.5.1 Características de los soportes para inmovilización 31
2.6 QUITOSANO COMO SOPORTE DE INMOVILIZACIÓN 33
2.7 HIDROGELACION 37
2.8 CRIOGELIFICACION- CRIOCONCENTRACIÓN 38
3. MATERIALES Y METODOS 40
3.1 PRODUCCION DEL SOPORTE 40
3.1.1 Materiales y reactivos 40
3.1.2 Equipos de análisis y proceso 40
3.1.3 Procedimiento de gelificación 40
3.1.4 Procedimiento de secado convectivo 41
3.1.5 Procedimiento de secado por criogelificación 41
3.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACIÓN 41
3.2.1 Materiales y reactivos 42
3.2.2 Enzima Utilizada 42
3.2.3 Equipos de análisis y proceso 42
3.2.4 Procedimiento de activacion 433.2.5 Procedimiento de inmovilización 43
3.2.6 Procedimiento de análisis de proteína 43
3.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL BIOCATALIZADOR 43
3.3.1 Materiales y reactivos 44
3.3.2 Equipos de análisis y proceso 44
3.3.3 Medida de grado de D- acetilación 44
3.3.4 Medida de la resistencia 45
3.3.5 Medida de la solubilidad y la degradabilidad 45
3.3.6 Medida del hinchamiento (swelling) 45
3.3.7 Procedimiento de medición de rango de poro 46
3.3.8 Medida de la actividad enzimática del biocatalizador 46
3.3.8.1 Hidrólisis 46
3.3.8.2 Esterificación 47
4. RESULTADOS Y DISCUSION 48
4.1 PRODUCCION DEL SOPORTE 48
4.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACIÓN 58
4.2.1 Carga enzimática 58
4.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL BIOCATALIZADOR 61
4.3.1 Grado de D- acetilación 61
4.3.2 Resistencia 64
4.3.3 Solubilidad y degradabilidad 65
4.3.4 Swelling 66
4.3.5 Medición de rango de poro 67
4.3.6 Actividad enzimática del biocatalizador 70
4.3.6.1 Hidrólisis 70
4.3.6.2 Esterificación 72
5. CONCLUSIONES 76
6. RECOMENDACIONES 79
BIBLIOGRAFIA 81
ANEXOS 87LISTA DE SIMBOLOS Y ABREVIATURAS
Ac Ácido
AFM Microscopia de fuerza atómica.
°C Grado Centígrado
CRL Lipasa Candida Rugosa
D-Ac Grado de D-acetilación
EtOH Etanol
FTIR Espectrofotometría de infrarrojo por transformada de Fourier.
GA Glutaraldehido
G Grado de hinchamiento
nm Nanómetro
N-Ac Grado de N-acetilación
SPM Microscopia de barrido por sonda
TPP Tripolifosfato
U [µmol/min] ó [µmol/h]
µm Micro metro
UV Ultravioleta
W Peso de muestra seca
d
Ws(t) Peso de la muestra hinchada en función del tiempo
W Peso de soporte hinchado en el equilibrio.
efLISTA DE TABLAS
TABLA DE CONTENIDOS Pág.
Tabla 1. Tipos de Soporte y enzimas utilizadas. 15
Tabla 2. Comparación entre distintas técnicas de inmovilización. 24
Tabla 3. Parámetros característicos para analizar enzimas Inmovilizadas. 32
Tabla 4. Tamaño Inicial y Final de esferas (Diámetro efectivo promedio). 49
Tabla 5. Tamaño inicial de láminas (longitudes en cm). 49
Tabla 6. Tamaño Final de láminas (longitudes en cm). 50
Tabla 7. Tamaño inicial y final de cilindros (Diámetro y longitud media). 50
Tabla 8. Perdida de tamaño para esferas (%). 50
Tabla 9. Perdida de tamaño para laminas (%). 51
Tabla 10. Pérdida de tamaño para cilindros (%) 51
Tabla 11. Porcentaje de pérdida de peso debido al proceso de secado 52
Tabla 12. Humedad final de esferas (%). 53
Tabla 13. Humedad final de Laminas (%) 53
Tabla 14. Humedad final de Cilindros (%) 53
Tabla 15. Humedades finales al cabo de 5-6 días (%) 55
Tabla 16. Análisis de proteína. 58
Tabla 17. Curva patrón 59
Tabla 18 Carga de proteína 59
Tabla 19. Tiempos de carga de enzima 60
Tabla 20. Resultados de N-Ac y D-Ac 63
Tabla 21. Resultados de absorbancia de grupos hidroxilo y amida. 63
Tabla 22. Resistencia del soporte de inmovilización 64
Tabla 23. Solubilidad en diferentes solventes 65
Tabla 24. Rugosidad Media. 68
Tabla 25. Porosidad media. 68
Tabla 26. Gramos de ácido oleico producido con el tiempo. 70
Tabla 27. Actividad del biocatalizador en Hidrólisis. 71
Tabla 28. Gramos de ácido que reaccionan con el tiempo. 72
Tabla 29. Actividad del biocatalizador en Esterificación 73LISTA DE FIGURAS
TABLA DE CONTENIDOS Pág.
Figura 1. Métodos de inmovilización por retención física 18
Figura 2. Métodos de inmovilización por Unión química. 20
Figura 3. Lipasa de naturaleza amfifilica. 28
Figura 4. Migración de la lipasa a la interfase 28
Figura 5. Estructura química del quitosano 34
Figura 6. Estructura química de la quitina 34
Figura 7. Formación de quitosano a partir de quitina 35
Figura 8. Proceso de inmovilización sobre quitosano. 37
Figura 9. Hidrogel de esferas de 1.8% 48
Figura 10. Hidrogel de Láminas de 3% 48
Figura 11. Hidrogel de cilindros de 3% 49
Figura 12. Proceso combinado de secado. 52
Figura 13. Esferas secas 54
Figura 14. Laminas secas 54
Figura 15. Cilindros secos. 54
Figura 16. Comparación del soporte convencional con biológico. 56
Figura 17. Soporte biológico 56
Figura 18. Soportes por hidrogelación en frió 57
Figura 19. Soporte producidos por uso de TPP. 58
Figura 20. Espectros de quitosano puro pastilla de KCl 61
Figura 21. Espectros de quitosano al 1.8% por lámina. 62
Figura 22. Hinchamiento de muestras en hidrólisis a 25ºC 66
Figura 23 Swelling a cada intervalo de tiempo 66
Figura 24. Concentración de quitosano de 1.8 % 67
Figura 25. Concentración de quitosano de 2.4 % 67
Figura 26. Concentración de quitosano de 3 % 68
Figura 27. Micrografía de quitosano con Glutaraldehido de 0.003 % 69
Figura 28. Micrografía de quitosano con Glutaraldehido de 0.01 % 69
Figura 29. Hidrólisis del aceite de oliva (producción del ácido oleico). 70
Figura 30. Actividad de Cándida rugosa en la reacción de hidrólisis. 71
Figura 31. Esterificación del ácido oleico y n-butanol. 72
Figura 32. Actividad de Cándida rugosa en la reacción de Esterificación. 73
Figura 33. Reutilización del sistema biocatalítico (actividad) en hidrólisis 74
Figura 34. Reutilización del sistema biocatalítico en hidrólisis 75
(porcentaje)LISTA DE ANEXOS
Anexo 1. Procedimiento de gelificación
Anexo 2. Procedimiento de secado
Anexo 3. Procedimiento de enlace covalente
Anexo 4. Método de biuret
Anexo 5. Hidrogeles de quitosano
Anexo 6. Métodos de secado
Anexo 7. Espectros de infrarojo
Anexo 8. Espectro de lipasa
Anexo 9. Perfiles Lineales de AFM
Anexo 10. Datos ExperimentalesINTRODUCCIÓN
Hoy por hoy las transformaciones químicas de materias primas en productos
elaborados no son una simple idea de años atrás; la generación de productos con
alto valor agregado a bajos costos, pero al mismo tiempo atractivos
ambientalmente, es la idea de muchas industrias que le apuntan a las reacciones
en síntesis orgánica, siendo esta una de las áreas que aporta elementos para
mejorar la calidad de vida de este último siglo y para la cual se usan
crecientemente los catalizadores enzimáticos como un aporte al mejoramiento de
diferentes procesos industriales de síntesis. Es así como en algunas reacciones
tales como esterificación, transesterificación, interesterificación, alcoholisis,
acidólisis, hidrólisis y glicerolisis aparecen las lipasas como catalizadores “limpios
y biológicos” que aumentan la productividad debido a su alta especificidad por el
sustrato y por su actividad, si se compara con catalizadores orgánicos e
inorgánicos.
Las lipasas se utilizan en diversos campos que van desde la industria de
detergentes, la de alimentos, la farmacéutica, la cosmética, la oleoquímica, la
industria del papel, la síntesis orgánica, pesticidas, fungicidas y aplicaciones
biomédicas, hasta la industria energética; participando en esta ultima en la
producción de biodiesel por transesterificación para contrarrestar el hecho del
agotamiento del petróleo a nivel mundial.
Las lipasas pueden ser obtenidas comercialmente de diferentes microorganismos
tales como levaduras, mohos y de bacterias; se pueden utilizar tanto libres como
inmovilizadas.
Dentro de una gran gama de materiales de soportes de inmovilización una buena
opción es el quitosano (obtenido a partir de la deacetilación de la quitina, el
segundo polímero más abundante en la tierra). Este material es biocompatible,
no-tóxico y de remarcada afinidad con las proteínas.1. OBJETIVOS
1.1 GENERALES
(cid:57) Inmovilizar una lipasa en quitosano
1.2 ESPECÍFICOS
(cid:57) Producir el soporte de quitosano para la inmovilización.
(cid:57) Obtener un protocolo de inmovilización de la lipasa sobre el soporte
(cid:57) Caracterizar el soporte y el sistema biocatalítico.2. MARCO TEORICO
2.1 ANTECEDENTES
Desde una perspectiva biotecnológica existen muchas ventajas del empleo de
enzimas en medios orgánicos: La facilidad de lograr alta solubilidad del sustrato y
de modificar la selectividad propia de la enzima por el simple diseño del medio de
reacción, la mejora sustancial de la termoestabilidad de las enzimas y la
posibilidad de recuperación del producto por evaporación del solvente de reacción.
La baja actividad de las enzimas generalmente observada en los solventes
orgánicos se debe a que las enzimas son insolubles en tales medios y forman
agregados en los cuales aproximadamente el 30%±60% de sus sitios activos son
inaccesibles para los sustratos [31, 65].
La inmovilización de enzimas sobre soportes artificiales se remonta hacia los años
50’s. Se han utilizado técnicas de inclusión de enzimas en matrices poliméricas,
conexión por enlaces sobre materiales de soporte y la adsorción sobre materiales
inertes. Muchos métodos han sido usados para inmovilizar lipasas, incluyendo la
adsorción o la precipitación sobre materiales hidrofóbicos [68], enlace covalente
con grupos funcionales [53], atrapamiento en geles de polímeros [57], adsorción
en resinas de intercambio iónico [52], microencapsulación [4], y atrapamiento en
sol–gel [29, 34]. La lipasa de C. cylindracea fue inmovilizada sobre un copolimero
de divinil metil acrilato y sus derivados [69]. La lipasa inmovilizada tiene una
resistencia mejorada a la desnaturalización térmica que la enzima nativa [50, 69].
Algunos estudios han llegado a la conclusión que el proceso de inmovilización
incrementa la actividad enzimática comparada con la que presentan las enzimas
libres [42]. Con ello se contribuye al desarrollo de procesos continuos y
adaptabilidad a una variedad de configuraciones y procesos específicos llevados
en reactores. Un resumen de los diferentes tipos de soportes y lipasas utilizadas
en algunos estudios anteriores se presenta en la tabla 1.
Tabla 1. Tipos de soporte y enzimas utilizadas reportadas en la literatura
TITULO DEL TRABAJO Ref SOPORTE LIPASA
macro poros de
1. Inmobilized lipase-catalyzed 26
resina acrílica y sílice cándida antártica
production of alkyl esters of
granulado
restaurant grease as biodiesel.
2. Imaging the distribution and
secondary structure of inmobilized 38 Macro poros de
cándida antártica
enzymes using infrared polimetilmetacrilato.
microespectroscopy.TITULO DEL TRABAJO Ref SOPORTE LIPASA
3. Inmobilization of pseudomonas
cepacia lipase in a phyllosilicate 27 Matriz de sol gel de pseudomonas
sol-gel matrix effectiveness as a silicato cepacia
biocatalyst
4. Preparation of porous
Particulas porosas de
polyurethane particles and their 64 cándida rugosa
poliuretano
use in enzyme immobilitation
5. Designer hydrogels for lipase Hidrogeles
immobilitation 25 poliméricos de porcine pancreas
poliacrilamida
6. Catalytic membrane preparation Membrana de
for enzymatic Hydrolysis reactions polipropileno, cándida antarctica y
carried out in the membrane phase 61 nitrocelulosa, pancreatic porcine
contactor celulosa y poliamidas
7. Immobilization, stability and
silica (Merck), pellets
esterification studies of a lipase 13 Bacillus sp.
HP-20 .
from a Bacillus sp
8. Lipase Immobilization into Porous
Chitoxan Beads: Activities in Complejo de
candida rugosa
Aqueous and Organic Media and 15 quitosano.
Lipase Localization
9. Waste edible oils and fats for Silicona,
biodiesel production by lipase- 8 Materiales sol-gel de
catalyzed transesterification silicato.
10. Production of biodiesel fuel from
Pseudomonas
triglycerides and alcohol using 6
Caolita porosa. fluorescens
immobilized lipase
11. Preparation, characterization and
Carboxipeptidasa y
application of immobilized 62 Poliacrilamida.
silica
carboxypeptidase
12. Effect of chemical modification on
the activity of lipases in organic 32 Rhizomucor Miehei,
-
solvent cándida antarctica
14. Immobilization of a-L-
α-L-
arabinofuranosidase on chitin and 55
quitosano arabinofuranoxidase
chitosan
2.2 INMOVILIZACION
A partir de las observaciones de Berzelius en el año de 1835 se detectó la
necesidad de utilizar “sustancias” que modificaran el proceso de elaboración de
vino, queso o pan positivamente, es así como aproximadamente 150 años atrás sellamo a dichas sustancias como “fuerza catalítica”. Los catalizadores son
sustancias que afectan la velocidad de una reacción, sin sufrir cambios,
promoviendo un mecanismo diferente para la reacción sin afectar el equilibrio.
[17].
Los biocatalizadores son un ejemplo simple de lo anterior, también conocidos
como catalizadores biológicos –enzimas, ribositas y anticuerpos catalíticos-, han
invadido el mercado mundial con variadas aplicaciones industriales.
Las enzimas son biocatalizadores con actividad biológica que en su mayoría son
de origen microbiano o pertenecen a enzimas extracelulares con excelentes
propiedades en diferentes aspectos como: a) altamente catalíticas frecuentemente
de 108 -1011 veces mas rápidas que los catalizadores no enzimáticos, manejando
temperaturas suaves y presiones atmosféricas b) poseen un amplio rango de
aplicaciones industriales c) son muchos mas específicos en cuanto al tipo de
reacción que catalizan (incluso estereoselectividad y regioespecificidad); por ello
en aplicaciones industriales de las que hacen parte las enzimas han contribuido
significativas transformaciones industriales [67].
En las reacciones catalizadas por enzimas la separación de los sustratos y
productos es difícil. Las enzimas no se pueden reutilizar y como son estructuras
lábiles e inestables frente a factores físicos como (calor, radiación), químicos
(oxidación, reducción, disolventes orgánicos, iones metálicos, fuerza iónica y pH) o
biológicos (proteólisis, modificación y degradación enzimática) disminuyen su
actividad catalítica y solubilidad a medida que transcurre el tiempo [5].
Para garantizar la estabilidad termodinámica y/o cinética se han elaborado
diversos métodos. Uno de ellos corresponde a la selección de microorganismos
extremófilos, que intervienen en intervalos de temperatura, acidez, basicidad,
presión o salinidad únicos; adicionalmente se ha encontrado que la inmovilización
es de gran utilidad para brindar estabilidad a las enzimas [5]
La inmovilización se define como el proceso por el cual el movimiento de las
enzimas, células, organelas u y otras especies se ve restringido total o
parcialmente, dando lugar a una forma insoluble en el medio de reacción, en
donde se presenta una mayor estabilidad como resultado de este acoplamiento.
La inmovilización de enzimas se refiere a enzimas unidas, insolubilizadas,
soportadas o ligadas a una matriz, que se caracterizan por aspectos positivos
tales como:
(cid:57) Aumento en estabilidad de la enzima.
(cid:57) Posible reutilización del sistema inmovilizado, por lo que disminuyen los
costos del proceso.
(cid:57) Posibilidad de diseñar un reactor enzimático de fácil manejo y control,
adaptado a la aplicación de enzimas inmovilizadas donde se permiten
cargas elevadas de enzima y uso de procesos continuos. Estos sistemaspueden incluir el reciclado, lo que permite la obtención de productos con
mayor pureza.
Pero también implica factores que contrarrestan lo anterior, tales como:
(cid:57) La alteración de la conformación de la enzima respecto de su estado nativo.
(cid:57) La gran heterogeneidad del sistema enzima-soporte donde pueden existir
distintas fracciones de proteínas inmovilizadas con diferente número de
uniones al soporte.
(cid:57) Pérdida de actividad de la enzima durante la inmovilización.
(cid:57) El sistema biocatalitico es más caro que la enzima nativa [2]
2.2.1 Clases De Inmovilización
2.2.1.1 Inmovilización por retención física
Este método representa modificaciones físicas del microentorno de la enzima tal y
como su atrapamiento en la red espacial de una matriz polimérica o su inclusión
en membranas. Un diagrama típico de esta clase de técnicas es mostrado en la
figura 1.
Figura 1. Métodos de inmovilización por retención física.
(Fuente: [2])2.2.1.1.1 Atrapamiento
Consiste en la retención física de la enzima en las cavidades interiores de una
matriz sólida porosa constituida generalmente por prepolímeros entrecruzables o
polímeros de tipo poliacrilamida, colágeno, alginato, carraginato o resinas de
poliuretano. El proceso de inmovilización se lleva a cabo mediante la suspensión
de la enzima en una solución del monómero. Posteriormente se inicia la
polimerización por un cambio de temperatura o mediante la adición de un reactivo
químico. El atrapamiento puede ser en geles (poliacrilamida) o en fibras (acetato
de celulosa), que suelen ser más resistentes que los geles. En el primer caso, la
enzima queda atrapada en el interior de un gel, mientras que en el segundo la
enzima se encuentra ocluida dentro de las microcavidades de una fibra sintética.
El atrapamiento, es simple desde el punto de vista experimental, requiere poca
cantidad de enzima para obtener derivados activos. Como ventaja adicional, la
enzima no sufre ninguna alteración en su estructura ya que la enzima no esta
unida de ninguna forma y además se pueden obtener sistemas multienzimaticos.
De todas formas, el atrapamiento requiere un control riguroso de las condiciones
de polimerización, así como la comprobación de que la naturaleza química del
proceso no altera los grupos reactivos de la proteína [2]
2.2.1.1.2 Inclusión en membranas
Se destacan dos técnicas tales como: el microencapsulado que consiste en
atrapar la enzima en membranas poliméricas semipermeables esféricas y el
reactor de membrana que consiste en confinar la enzima en una membrana que
sirve de pared permeable selectiva al interior de un reactor.
En la microencapsulación las enzimas están rodeadas de membranas
semipermeables que permiten el paso de moléculas de sustrato y producto, pero
no de enzima. Estas membranas semipermeables pueden ser permanentes
(originadas por polimerización interfacial) o no permanentes (generadas por
surfactantes, también llamadas “micelas reversas”). Las microcápsulas obtenidas
son de forma esférica, con tamaños comprendidos entre 1 y 100 mm de diámetro.
Mediante este método se pueden encapsular simultáneamente una gran variedad
de enzimas, células o biomoléculas, permitiendo que se lleven a cabo
determinadas reacciones que suceden en múltiples pasos. Presentan una gran
superficie de contacto entre la enzima y el sustrato para un volumen relativamente
pequeño y la posibilidad de inmovilizar enzimas en una sola etapa [2].2.2.1.2 Inmovilización por unión química
Las técnicas a las que hacen mención la inmovilización por unión química se
basan en las interacciones que puedan generarse entre el soporte y la enzima, ya
sea por interacciones iónicas, por adsorción física, enlace covalente, quelación o
unión metálica o los enlaces que se pueden generar entre enzimas como el
reticulado (entrecruzamiento) [2,67].
Figura 2. Métodos de inmovilización por Unión química.
(Fuente: [2])
2.2.1.2.1 Unión a soportes
Esta técnica implica la unión de una enzima a un soporte insoluble; siendo esta
técnica la más antigua de todas y de la que se dispone de más información. La
elección del soporte y del tipo de enlace resultan determinantes en el
comportamiento posterior del sistema biocatalitico. Se debe procurar que la
inmovilización incremente la afinidad por el sustrato, disminuya la inhibición,
amplíe el intervalo de pH óptimo y reduzca las posibles contaminaciones
microbianas. Además el soporte debe tener resistencia mecánica adecuada a las
condiciones de operación del reactor y ser fácilmente separable del medio líquido
para que pueda ser reutilizado [67].
Se han utilizado una gran variedad de materiales como soportes para la
inmovilización de numerosas enzimas. Estos difieren en tamaño, densidad,
porosidad y forma, aunque generalmente los encontramos en forma de cilindro,hojas, fibras y más corrientemente en forma de esferas, una ampliación del tema
se puede ver en el aparte 2.5.
2.2.1.2.2 Adsorción iónica
Muchos autores encuentran dentro de esta calificación subdivisiones debido a las
variantes que se pueden presentar, otros solo se limitan a unir las interacciones de
tipo iónico entre la enzima y el soporte en una sola clasificación.
En la adsorción, la enzima se une a un soporte mediante interacciones iónicas de
tipo fuerzas de Van de Waals, por puentes de hidrógeno, interacciones
hidrofóbicas y otras. El contacto de la solución acuosa de la enzima se puede
realizar por procedimientos estáticos, electrodeposición, procesos en reactor o
baño con agitación, siendo en esta última en la que se obtiene una deposición
uniforme de la enzima.
Los principales factores que influyen en la adsorción implican el pH del medio ya
que controla el número y la naturaleza de las cargas que presenta la superficie de
la proteína y del sólido, si la fuerza iónica aumenta se produce la desorción de la
enzima, ya que los iones inorgánicos se unen con más fuerza al soporte que la
proteína, el diámetro de poro juega un papel importante ya que debe ser
aproximadamente dos veces el tamaño del eje mayor de la enzima, la presencia
de iones que actúen como cofactores de la enzima incrementa la carga enzimática
del derivado.
Como principales ventajas implican
(cid:57) Preparación sencilla.
(cid:57) su bajo costo.
(cid:57) No hay cambios de especificidad enzimática.
(cid:57) Los derivados son estables en medios de trabajo con bajo contenido en
agua.
Los inconvenientes de la adsorción son principalmente:
(cid:57) La optimización de las variables que controlan la adsorción.
(cid:57) Los derivados obtenidos son poco estables desde el punto de vista
mecánico.
(cid:57) La unión al soporte es débil.
Dentro de las variantes que algunos autores reportan consiste en emplear resinas
de intercambio iónico (método de enlace iónico), las cuales contienen grupos
funcionales y contraiones móviles. Estos contraiones se pueden intercambiar
reversiblemente por otros iones de la misma carga, sin que se produzcan cambios
en la matriz insoluble. La fuerza de unión entre la enzima y el soporte es muchomás alta, los cambios conformacionales solo se producen en pequeña extensión
[67].
2.2.1.2.3 Unión covalente
La unión covalente de una enzima a un soporte es quizá el método de
inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La metodología
de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del soporte
para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas. De entre los 20 aminoácidos
diferentes que se encuentran en la estructura de las enzimas, los más empleados
para la formación de enlaces con el soporte son principalmente la lisina, la
cisteína, la tirosina y la histidina, y en menor medida la metionina, el triptófano, la
arginina y el ácido aspártico y glutámico, el resto de aminoácidos, debido a su
carácter hidrófobo, no se encuentran expuestos hacia el exterior de la superficie
proteica y no pueden intervenir en la unión covalente. Los más involucrados son
los del grupo amino (NH ) de la lisina o arginina, el grupo carboxilo (CO H) del
2 2
ácido aspártico o el ácido glutámico, el grupo hidroxilo (OH) de la serina o
treonina, y el grupo sulfhidrilo (SH) de la cisteína, estos aminoácidos no deben de
ser esenciales en la acción catalítica, con respecto a esto último se han diseñado
varios métodos que previenen la inactivación enzimática por reacción con los
residuos de aminoácidos esenciales en los que se encuentran enlaces covalentes
de enzima en presencia de un substrato o un inhibidor competitivo, por enlace de
un complejo enzima-inhibidor formado mediante un enlace covalente reversible,
uso de enzima soluble modificada químicamente de forma que el enlace covalente
a la matriz se lleve a cabo mediante los residuos nuevos incorporados o el uso del
zimógeno precursor [67].
El enlace normalmente se forma entre el grupo funcional presente sobre la
superficie del soporte y el grupo funcional perteneciente al aminoácido residual
sobre la superficie de la enzima, pero la mayoría de los soportes no poseen
grupos funcionales que reaccionen directamente con las enzimas, sino que tienen
grupos hidroxilo, amino, amido o carboxilo que necesitan ser activados para poder
proceder a el proceso de inmovilización. El bromo cianuro (BrCN) ha sido
ampliamente utilizado como activante del grupo funcional hidroxilo en soportes de
materiales polisacáridos. En este método, la enzima y el soporte están unidos por
medio de un enlace isourea. En el caso de la activación de la carbodiimida, el
material de soporte puede tener un grupo funcional carboxilo (CO H), y la enzima
2
y el soporte están unidos por medio de un enlace peptídico. Si el material de
soporte contiene un grupo funcional amino aromático, puede ser diazotizado
usando ácido nítrico. Seguidamente, la adición de pequeñas cantidades de
enzima conducen a la formación del enlace diazo entre el grupo reactivo diazo
sobre el soporte y el anillo de la estructura de un aminoácido aromático, como la
tirosina [51].Las reacciones de acoplamiento entre los grupos reactivos del soporte y los
grupos reactivos de la enzima han sido ampliamente difundidas, entre ellos se
encuentran la diatozotizacion como los ocurridos entre la celulosa y la tripsina,
papaina o pepsina, la formación de enlaces amida mediante inmovilización de
agarosa con triacilglecerol lipasa, la alquilación o arilación sucedida entre
metacrilato de polihidroxialquilo y la tripsina, la formación de bases de Schiff entre
quitosano y pepsina A, reacciones ugi, reacciones de amidinación, intercambio tiol
disulfuro, interacciones mercurio enzima, acoplamiento inducido por irradiación
gamma, para una amplia consulta de antecedentes se remite al lector a [67].
Este método presenta las siguientes ventajas:
(cid:57) La manipulación de los derivados inmovilizados es sencilla.
(cid:57) La carga de enzima permanece constante después de la inmovilización.
(cid:57) Los derivados pueden utilizarse en reactores en continuo, empaquetados,
de lecho fluidizado o tanque agitado.
(cid:57) Una mayor resistencia a la desactivación por el efecto de la temperatura, de
los disolventes orgánicos o del pH, al tener estabilizada su estructura
terciaria.
En cambio la inmovilización por enlace covalente también presenta una serie de
inconvenientes:
(cid:57) Es necesario conocer la densidad de grupos activos por unidad de
superficie, ya que condiciona el número de uniones enzima-soporte y su
geometría, que puede ser distorsionante y conducir a derivados inactivos.
(cid:57) El proceso de inmovilización puede alterar la estructura del centro activo.
Para evitar esta posible alteración, se realiza la inmovilización en presencia
de un inhibidor que bloquee el centro activo.
(cid:57) La inmovilización covalente no es aconsejable en aquellas enzimas muy
sensibles a cambios de pH, fuerza iónica, etc.
2.2.1.2.4 Inmovilización por reticulación.
También denominado entrecruzamiento o cross-linking, es una técnica que ha sido
ampliamente utilizada en la estabilización de muchas enzimas, el método consiste
en uso de reactivos bifuncionales que originan uniones intermoleculares entre las
moléculas de enzima. Como reactivos bifuncionales (homobifuncionales o
heteromultifuncionales) se pueden emplear dialdehídos, diiminoésteres,
diisocianatos, sales de bisdiazonio e, incluso, diaminas si están activadas con
carbodiimida. El resultado del reticulado son enzimas con enlaces
intermoleculares irreversibles capaces de resistir condiciones extremas de pH y
temperatura.El co-reticulado como una subdivisión alterna permite eliminar las pérdidas de
actividad enzimática debidas a efectos difusionales, mediante el entrecruzamiento
de las enzimas con una proteína sin actividad enzimática y rica en residuos de
lisina (por ejemplo, la albúmina bovina). Un procedimiento mixto de inmovilización
muy común consiste en inmovilizar la enzima por adsorción sobre una resina de
intercambio iónico o un soporte polimérico (con lo que se consigue una elevada
carga enzimática) y posteriormente añadir el reactivo bifuncional.
Actualmente el método más novedoso de cross-linking consiste en la cristalización
de enzimas y su posterior reticulado con glutaraldehido (Cross-Linked Enzyme
Crystals o CLECs). El aumento de estabilidad se basa en la obtención de un
entramado cristalino, donde las moléculas de enzima están rodeadas
exclusivamente por otras moléculas de proteína. De esta manera la propia enzima
actúa como soporte, y su estructura terciaria está estabilizada por las uniones
covalentes intermoleculares. La estructura cristalina posee canales microscópicos
(20-50Å) que permiten el paso de sustratos hasta el centro activo de la enzima
donde se cataliza la reacción. Estos cristales pueden soportar temperaturas
elevadas y pH extremos, así como la acción de las proteasas. Esta tecnología se
ha utilizado en la obtención de compuestos enatioméricamente puros y en la
síntesis de péptidos [3].
Un resumen de algunas propiedades para las diferentes clases de Inmovilización
pueden verse en la tabla 2, en la cual se diferencian varias características entre
distintas técnicas de inmovilización.
Tabla 2. Comparación entre distintas técnicas de inmovilización
Enlace Adsorción Enlace Enlace
Propiedad Quelación Atrapamiento
Cruzado Física Iónico Covalente
Intermedio Simple Simple Simple Difícil Difícil
Preparación
Fuerza del Enlace Fuerte Débil Intermedio Intermedio Fuerte Intermedia
Actividad Bajo Intermedio Alto Alto Alta Bajo
Enzimática
Regeneración del Imposible Posible Posible Intermedio Alta Intermedio
Soporte
Costo de la Intermedio Bajo Bajo Intermedio Alta Intermedia
Inmovilización
Estabilidad Alto Bajo Intermedio Intermedio Alta Alto
Protección de la
enzima contra Algunas No No No No Si
ataque microbiano Veces
Fuente: [67]2.2.2 Efectos de la Inmovilización
La inmovilización altera significativamente el comportamiento de las enzimas, es
así como la actividad de la preparación es siempre diferente a la de la forma
natural, es así como efectos de índole conformacional, de partición o difusionales
son los culpables de estos cambios que pueden afectar la estabilidad y la
actividad enzimática[3].
Generalmente se observa un incremento en la estabilidad de las enzimas después
de su inmovilización ya que la existencia de uniones multipuntuales enzima-
soporte, hacen que la estructura terciaria de la enzima adquiere una mayor rigidez
y se haga más resistente a la desactivación térmica o química; la protección
frente a las proteasas cuando se unen al soporte elimina su capacidad proteolítica,
y evita su autólisis; se evita la agregación intermolecular al mantener las
moléculas de enzima retenidas en una determinada región del espacio y por ultimo
la alteración del microentorno ayuda a diferentes enzimas debida a la interacción
de la enzima con el soporte, es por ello , si una enzima sensible al oxígeno (como
las nitrogenasas, hidrogenasas, etc.) se sitúa en la superficie de un soporte
cargado, la fuerza iónica efectiva en el microentorno de la enzima será muy alta y,
como consecuencia, la concentración de oxígeno disuelto será mucho menor en
esa zona que en el medio de reacción, en otros casos el soporte tiene un efecto
tamponador de tal manera que mantiene el pH óptimo de la enzima en su
microentorno, aunque en la disolución se produzcan cambios importantes de pH.
Por otra parte, en aquellas reacciones catalizadas por enzimas inmovilizadas en
presencia de disolventes orgánicos, el agua ligada al soporte o su capacidad para
retener agua, regula la actividad de la enzima, Cuanto mayor es el
comportamiento hidrófilo del soporte, más agua adsorbe y la enzima poseerá la
cantidad necesaria de agua en su microentorno para mantener su conformación
activa[3].
Tras una inmovilización, la actividad de la enzima puede disminuir e incluso
perderse por diversas razones; la unión al soporte se produce de tal forma que el
paso del sustrato al centro activo está impedido, los grupos reactivos del soporte
reaccionan con algún aminoácido que forme parte del centro activo o que sea
esencial para la actividad catalítica de la enzima, la inmovilización puede originar
un cambio conformacional que da lugar a una forma inactiva o las condiciones
experimentales del proceso causan la desnaturalización o desactivación de la
enzima[3].
Otros cambios que pueden originarse pueden ser debidos a efectos difusionales,
electroestáticos o de microentorno que originarían un aumento o disminución de la
actividad enzimática. Los efectos difusionales se originan debido a la difusión de
los sustratos hacia el centro activo de la enzima, los cuales pueden estar impedida
por resistencias de tipo externo como la película líquida estacionaria (capa de
Nernst o de difusión) que rodea el soporte que origina un gradiente de
concentración a través de la zona de difusión y resistencias de tipo interno ya quelos sustratos tienen que atravesar el interior del gel, microcápsula, fibra o poro del
soporte donde se encuentra la enzima inmovilizada, esto ultimo se contrarresta en
algunos casos disminuyendo el tamaño del sistema biocatalítico, aumentando la
concentración de sustrato, incrementando la agitación o el flujo en el reactor[3].
Los efectos electrostáticos entre el sustrato y el soporte, son importantes a tener
en cuenta, de tal manera que, si tienen la misma carga existe una repulsión
mutua, mientras que si las cargas son opuestas hay atracción. El Impedimento
estérico o de tamaño de sustrato es otra de las variables importantes ya que en un
principio, cualquier enzima puede ser inmovilizada sin que haya una pérdida
apreciable de su actividad, este hecho suele ser válido en el caso de que el
sustrato sea de bajo peso molecular, pero si se trata de sustratos con pesos
moleculares elevados, la actividad de la enzima inmovilizada disminuye
drásticamente. Este “efecto estérico” se puede evitar mediante una inmovilización
covalente a través de un brazo espaciador enzima-soporte más largo[3].
Por ultimo los efectos en el microentorno tienen su efecto sobre la actividad
enzimática ya que la enzima inmovilizada se encuentra en un entorno diferente al
habitual, especialmente cuando el soporte tiene grupos cargados eléctricamente.
El efecto observado suele ser un desplazamiento en el valor del pH óptimo de la
catálisis enzimática y, muchas veces, un ensanchamiento en el intervalo de pH en
el cual la enzima puede actuar, es así como una enzima unida a un soporte
cargado negativamente tendrá en su microentorno una concentración mayor de
hidrogeniones que en el medio de reacción. Como resultado, la enzima
inmovilizada será más activa a un pH más alcalino. La enzima sería más activa a
pH más ácidos si estuviera unida a un soporte cargado positivamente [3].
Como tal las enzimas pertenecen a diferentes clases, pero son las hidrolasas las
que han sido utilizadas en mas de un 80 % de los proceso industriales que a su
vez son el 42 % de los usos que se les dan a las enzimas, se destacan las
proteasas, las isomerasas, carbohidratasas y lipasas que catalizan reacciones de
hidrólisis y que actúan sobre enlaces ester, peptídicos, éter y otros [5].
El estudio de lipasas ha sido de gran estudio y las técnicas de inmovilización
donde se usan polímeros hidrofílicos han causado gran revolución debido a sus
innumerables aplicaciones de las cuales han sido objeto, dentro de ellas se
encuentran: Síntesis orgánicas, aplicaciones farmacéuticas, químicas y
biotecnológicas. La microencapsulación de enzimas es una técnica que ha sido
usada continuamente para la inmovilización, lo cual no solo se puede conjugar con
el atrapamiento al interior del soporte, si no, que da facilidad para crear soportes
en los cuales se puede atrapar exteriormente las enzimas conjugándolas con
enlaces covalentes usando activantes de grupos reactivos determinados o
mediante el uso de brazos espaciadores [58].
Al hablar de lipasas es de primordial importancia reconocer sus propiedades
funcionales tales y como se mencionaron anteriormente, estas clases de enzimasdiferentes autores las han reportado como precursora de muchas síntesis a nivel
orgánico y acuoso [45].
2.3 LIPASAS EN REACCIONES
2.3.1 Clasificación
La clasificación de enzimas según la Enzyme Commission se basa en 4 dígitos
que caracterizan las enzimas, para la triaciglicerol lipasa como comúnmente es
llamada las lipasas se asigno la clasificación con numero 3.1.1.3 que pertenecen a
la clase de hidrolasas y subclase de enlaces ester que catalizan reacciones de
hidrólisis donde los triagliceroles se convierten en glicerol y ácidos grasos libres:
RCOOR ′ + HOH ↔ RCOOH + R′OH
(TRIGLICERIDO) (AGUA) (ACIDO GRASO) (GLICEROL)
Su nombre sistémico corresponde a triaciglicerol acilhidrolasa [5]
2.3.2 Propiedades
Las lipasas son catalizadores versátiles que se aplican dentro de un amplio rango
de bioconversiones tales como hidrólisis, interesterifiación, esterificación,
alcoholisis, acidolisis y aminolisis aplicándose en tecnología de alimentos,
aplicaciones biomédicas e industria química. Son de naturaleza amfifilica, es decir
que se caracterizan por la presencia de una parte tanto hidrofílica como
hidrofóbica en sus moléculas (Figura 3); estas enzimas en una emulsión de aceite
y agua, migran a la interfase en donde la parte de sus moléculas hidrofóbicas
permanecen en contacto con la fase hidrofóbica u oleosa y la parte hidrofílica
permanece en contacto con la fase acuosa (Figura 4).Figura 3. Lipasa de naturaleza amfifílica (Fuente: [54])
(Fuente: [54])
Figura 4. Migración de la lipasa a la interfase (Fuente: [54])
(Fuente: [54]).
Las lipasas han sido estudiadas por muchos años y se han producido de muchos
microorganismos por el crecimiento vía fermentativa. Son mucho mas abundantes
en la flora microbiana comprendida entre bacterias y algunos hongos, además de
encontrarse en el páncreas de mamíferos como cerdos y humanos y además en
plantas muy grandes del tipoRicinus communis. Los principales microorganismos
de los que se han producido son aspergillius, bacilus, cándida y
Chromobacterium.
Las lipasas se han utilizado en diferentes industrias tales como la de detergentes,
por su capacidad para hidrolizar grasas; en la industria de alimentos en la cual las
lipasas permiten alterar las propiedades de lípidos, jugos de frutas, en
fermentación vegetal y para el desarrollo de sabores de quesos; en la industria de
pulpa y papel para remover el residuo hidrofóbico de esta industria. Se utilizan
además en síntesis orgánica tal como en procesos de esterificación y
transesterificación en la industria óleo-química. En aplicaciones biomédicas ya queposeen una excelente capacidad parar reacciones de regioselectividad especifica,
en síntesis de agentes antitumorantes, alcaloides, antibióticos y vitaminas, en
biosensores como diagnostico clínico. También se usan en pesticidas,
insecticidas, herbicidas y fungicidas[45].
Las reacciones típicas en donde intervienen las lipasas corresponden a la
hidrólisis del tipo de reacción de triglicéridos para formar glicerol y ácidos libres, y
la esterificación de ácidos y alcoholes para formar esteres; la reacción de
transesterificación es también catalizada por las lipasas.
2.3.3 Reacción de transesterificación
En la reacción de transesterificación un triglicérido y un alcohol forman un tri-ester
y glicerol mediante uso de un catalizador. Es de importancia que en la reacción
haya cantidades limitadas de agua ya que se pueden presentar reacciones
colaterales de formación de jabón. [9].
2.3.3.1 Producción de biodiesel [9,37].
La nueva tendencia mundial apunta hacia la generación de los denominados
productos “limpios” con lo cual aparecen los biocombustibles basados en la
transformación de la biomasa, que, para el caso de la producción de uno de los
biocombustibles biológicos mas importantes a nivel mundial como es el biodiesel
corresponde a los aceites de origen animal o vegetal.
La producción de biodiesel se basa en la reacción de transesterificación de
triglicéridos. La idea de usar aceites y grasas de origen vegetal y animal no es
algo nuevo. Desde 1900, cuando Rudolf Diesel hizo funcionar el prototipo de su
motor diesel utilizando aceite de maní, el concepto de usar aceites y grasas como
una fuente renovable de combustibles ha sido reintroducido periódicamente.
Pero la idea de usar un combustible biológico se debe a los problemas que han
generado los combustibles derivados del petróleo son muchos entre los que se
encuentran las emisiones contaminantes.
Actualmente la mayoría de los procesos para producir Biodiesel son catalizados
por bases. Se estudian también procesos catalizados por enzimas, siendo estas
últimas del tipo lipasas. Este último proceso, las lipasas se usan como catalizador
en la transesterificación para la preparación de monogliceridos. El proceso tiene
diferentes ventajas, incluyendo la baja formación de coproductos, la fácil
separación de los productos, las condiciones de reacción moderadas y la
formación de esteres de ácidos grasos como el segundo mayor producto.Existen varias ventajas que conlleva el uso de lipasas como catalizador de la
reacción de transesterificación. Entre ellas se encuentran la disminución selectiva
de las energías de activación, la fácil recuperación del glicerol formado, la mejora
considerable de las velocidades de reacción, la posibilidad de recirculación del
catalizador, la transesterificación de triglicéridos con un alto contenido de ácidos
grasos libres (insaturados), las bajas temperaturas de reacción, los altos niveles
de conversión a alquil ésteres, y la posibilidad de uso de alcoholes ramificados
para la síntesis de ésteres con mejores propiedades de ignición, entre otras.
2.4 ACTIVIDAD ENZIMATICA
Se define la unidad de actividad enzimática (U) como la cantidad de enzima que
cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en un minuto. La actividad específica
es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg prot) o por
mililitro de disolución (U/ml), en el caso de enzimas inmovilizadas diferentes
autores reportan como (U/g-soporte). Cuando se usan enzimas en la industria, su
actividad siempre debe ser expresada en una forma dada, y calculada en
condiciones tales que se relacionen lo mas estrechamente posible con su
aplicación, en algunos casos es mas útil expresar la actividad enzimática en
función de la velocidad de cambio de la velocidad u otro, en vez de en términos
mas convencionales como µmol de producto formado por mg de enzima por
segundo.
Recientemente, el Sistema Internacional de unidades (SI) ha definido la unidad de
actividad enzimática como la cantidad de enzima que transforma 1 mol de sustrato
por segundo. Esta unidad se llama katal (kat). Como 1 mol son 106 µmoles y 1
minuto son 60 segundos, resulta que 1 katal equivale a 60 x 106 U. Esta unidad es
muy grande, de forma que se utilizan frecuentemente los submúltiplos como el
microkatal (µkat, 10-6 kat) o el nanokatal (nkat, 10-9 kat) [67].
Cuando se conoce el peso molecular de la enzima pura y el número de centros
activos por molécula de enzima, las medidas de actividad enzimática permiten
calcular el número o frecuencia de recambio de la enzima, o sea, el número de
reacciones elementales que realiza la enzima por cada centro activo y por unidad
de tiempo.[67].
La actividad de las lipasas puede ser medida por diferentes métodos entre los que
se reportan la hidrólisis de aceite de oliva, p-Nitrofenil Palmitato medida por
espectrofotometría o titulación; además puede usarse la esterificación de ácido
butírico con diferentes alcoholes alifáticos (C2 – C10) y n-butanol con diferentes
ácidos carboxílicos (C2-C12) por los mismos métodos [1,12, 15, 23, 24, 42].2.5 SOPORTES DE INMOVIIZACION
Dentro de la tecnología de la inmovilización y según la síntesis biológica que se
desee realizar juegan un papel primordial, el soporte, la enzima y el método de
inmovilización. Al considerar un soporte para un enzima se deberá pensar en
factores tales como el pH, la temperatura, la fuerza iónica, la presión, agitación, la
conjugación de cofactores y el proceso de separación del sustrato del producto
[22].
Como se mencionó anteriormente los soportes pueden variar de forma (láminas,
tubos, cilindros, esferas), tamaño, propiedades físicas o químicas, encontrándose
una gran variedad de compuestos naturales o sintéticos, orgánicos o inorgánicos
clasificándose según [3]:
(cid:57) Soportes inorgánicos:
Naturales: (arcillas como la bentonita, piedra pómez, sílice, etc.).
Manufacturados: (óxidos de metales y vidrio de tamaño de poro controlado,
vidrio no poroso, alúmina, cerámicas, gel de sílice, etc.)
(cid:57) Soportes orgánicos:
Polímeros naturales: Polisacáridos (celulosa, almidón, dextranos, agar-agar,
agarosa, alginatos, quitina, quitosano, etc.); proteínas fibrosas (colágeno,
queratina, etc).
Polímeros sintéticos: Poliolefinas (como el poliestireno); polímeros acrílicos
(poliacrilatos, poliacrilamidas, polimetacrilatos, etc.); Otros tipos (alcohol
polivinílico, poliamidas, etc).
Los polisacáridos que se han utilizados como soportes varían desde micro esferas
a lechos de alginato, dextrano, carrragenatos, agarosa, celulosa, quitosano, entre
otros; todos ellos han sido utilizados con el fin de minimizar los problemas
presentados en otras técnicas de atrapamiento como: a) baja eficiencia b) uso de
solventes orgánicos volátiles que contribuyen a problemas ambientales c) uso de
solventes orgánicos que pueden alterar la estructura y funcionalidad de las
proteínas [67].
2.5.1 Características de los soportes para inmovilización
Aunque no existen soportes universales, hay algunos principios para su selección;
dentro del proceso de aplicación a gran escala se encuentran: (a) El material debe
de estar disponible en abundancia y a un bajo precio, (b) el proceso de
inmovilización tiene que ser simple y efectivo con la consideración de retención dela actividad enzimática, (c) la capacidad y eficiencia de las enzimas inmovilizadas
tiene que ser alta y, (d) el diseño del reactor con respecto al mecanismo manejado
del biocatalizador tiene que ser simple [11]. Además de lo anterior un soporte
ideal para una aplicación dada es aquel que aumente la interacción con el
sustrato, disminuya la inhibición por el producto, cambie el pH aparente óptimo
hasta el valor deseado, frene el crecimiento microbiano y sea fácilmente
recuperable para poder volverlo a utilizar . El soporte debe de ser estable en
solución y no debe de deteriorarse en las condiciones de reacción, debe ser rígido
mecánicamente y tener un grado de compactación bajo en operaciones continuas
a velocidades de flujo altas cuando se adapte a un diseño en reactores; en
conclusión se deben de definir necesidades técnicas y económicas (costo, calidad,
funcionalidad, y seguridad) para definir un buen catalizador en términos de
eficiencia e integración del costo efectivo [10].
Muchos factores tienen influencia en la selección de un soporte particular. Los
grupos hidroxilos del soporte juegan un papel muy importante ya que forman
puentes de hidrógeno con las moléculas de agua, por eso se crea un ambiente
acuoso (hidrofílico) con el soporte. Los soportes de polisacáridos son susceptibles
de desintegración microbiana o fúngica, y solventes orgánicos pueden causar un
encogimiento del gel en los soportes usualmente utilizados para formar estos
lechos [51].
Dentro de la manipulación que se logra observar en el contexto enzima-soporte
deberán de manejarse características como algunos fenómenos de transporte
(efectos de transferencia de masa), estabilidad operacional relacionada con el
numero de ciclos si se hace referencia a un tanque agitado y un método de
inmovilización que se expresará en términos de rendimiento; todo ello apuntando
hacia unos datos de funcionamiento el cual se puede expresar como productividad
(producto producido por unidad de enzima) o consumo de enzima por unidad de
producto producido.
Un resumen de los parámetros de importancia que se deben considerar en la
inmovilización de enzimas se puede observar en la Tabla 3 [60].
Tabla 3. Parámetros característicos para analizar enzimas inmovilizadas
CARACTERISTICAS PARÁMETROS DE IMPORTANCIA
ENZIMA Propiedades bioquímicas: Masa molecular, grupos
funcionales en superficie de proteína, pureza.
Parámetros cinéticos: Actividad específica, perfiles de
pH y temperatura, parámetros cinético de actividad e
inhibición, Perfiles de estabilidad vs. pH y temperatura,
solventes, contaminantes, impurezas.Características químicas: bases químicas y
SOPORTE composición, grupos funcionales, posibles cambios en
su comportamiento, volumen accesibles de matriz,
tamaño de poro, estabilidad química del soporte.
Propiedades mecánicas: diámetro particular,
comportamiento de partículas a la compresión,
resistencia al flujo, (para aplicaciones en lechos fijos),
velocidad de sedimentación (para lechos fluidizados),
abrasión (para tanques agitados).
Método de inmovilización: Rendimiento de la enzima
ENZIMA activa, atrapamiento de proteína, parámetros cinéticos
INMOVILIZADA intrínsicos, (Ej.: propiedades y efectos de transferencia
de masa).
Efectos de transferencia de masa: Diferentes
concentraciones de soluto al interior y afuera de las
partículas catalíticas, difusión interna y externa (poros),
con ello se obtiene la efectividad con relación a la
enzima libre, bajo condiciones de reacción
determinadas.
Estabilidad: Estabilidad operacional (expresada como
actividad que disminuye bajo ciertas Condiciones
durante el proceso), estabilidad de almacenamiento.
‘Rendimiento’: Productividad (cantidad de producto
formado por unidad de actividad o masa de enzima),
consumo de la enzima(Ej.: unidades por Kg. de
producto)
2.6 QUITOSANO COMO SOPORTE DE INMOVILIZACION
El quitosano esta siendo reportado para la inmovilización de enzimas, y en
particular lipasas no solo porque su método de obtención como soporte es simple,
y no toxico, sino porque brinda propiedades físicas y químicas de interacción
enzimas-soporte interesantes para llevar a cabo reacciones biológicas con alto
grado de eficiencia, actividad enzimática y bajo costo [3].El quitosano (Figura 5) es un amino polisacárido (1-4)-2-amino-2-deoxi-β-D-
glucano obtenido por D-acetilación alcalina de la quitina (Figura 6) (1-4)-2-
acetamido-2-deoxy-β-D-glucano, polisacárido duro, inelástico y nitrogenado que se
encuentra en las paredes de algunos hongos y en el exoesqueleto de artrópodos
tales como insectos, escarabajos y crustáceos. La producción mundial de quitina
es calculada en 150.000 toneladas provenientes de la industria de la fermentación
que emplea hongos y el resto de la industria pesquera. El quitosano es producido
por D-acetilación de la quitina al someterla a una solución de NaOH al 40% a 120
°C por 1-3 horas, produciendo quitosano D-acetilado (Figura 7). [24]
Figura 5. Estructura química del quitosano
(Fuente: [35])
Figura 6. Estructura química de la quitina.
(Fuente [35]).Figura 7. Formación de quitosano a partir de quitina
(Quitina)
(Quitosano)
(Fuente: [35])
El quitosano es un biopolímero biodegradable, biocompatible y muco adhesivo, el
cual juega papel importante como material en muchos propósitos en la industria
farmacéutica, medica, alimentaría, de síntesis orgánica y biológica [4,5]. Este
soporte proporciona ventajas como: su versatilidad y disponibilidad en diferentes
formas (hojuelas, lechos porosos, geles, fibras y membranas), posee baja
biodegradabilidad, bajo costo, fácil manejo, alta afinidad con proteínas y no
toxicidad [6], además presenta propiedades físicas, químicas y biológicas muy
particulares debido a sus iones catiónicos. Esta carga positiva atrae todo
elemento cercano que tenga iones de carga negativa. Esta condición singular
permite aplicarla en un extenso abanico de aplicaciones [45].
Dentro de las aplicaciones de la quitina y el quitosano se encuentran la formación
de fibras (sistemas amida-LiCl, oxido de amina-agua), cosméticos (cremas,
lociones), fotografía, piel artificial (neoformación de órganos), comida y nutrición,
oftalmología (lentes de contacto), ingeniería ambiental (captura de metales a partir
de corrientes de agua), industria del papel, baterías, farmacéutica (liberación de
drogas), hidrogeles tales como quitosano–polieter, poli (etilen glicol) macromero-β
quitosano, quitosano-gelatina, tabletas de quitosano (adición de lactosa),
microencapsulados y microesferas de quitosano-oxido de polietileno, quitosano-
alginato de calcio, estimulación celular de plantas y animales, agente antibacterial
y como atrapador de grasa [35].
El quitosano es insoluble en agua y diversos solventes orgánicos, soluble en
diferentes ácidos como ácido acético, fórmico y otros, los cuales protonan los
grupos amino. Produce reacciones típicas de aminas como las N-acetilaciones porreacciones de Schiff, sus derivados son fácilmente obtenidos bajo condiciones
suaves y pueden ser considerados como sustitutos de glucanos. A temperatura
ambiente el quitosano forma aldiminas y cetiminas con aldehídos y cetonas,
respectivamente. El N-carboximetil quitosano es obtenido a partir de ácido
glioxilico [35].
La degradación del quitosano esta inversamente relacionada con el grado de
cristalinidad el cual es controlado principalmente por el grado de D-acetilación , es
de notar que una alta D-acetilación exhibe una velocidad de degradación mas
pequeña [35], además es de notar que el quitosano con D-Ac bajo 40-60 %
permanece en solución arriba de pH cerca de 9.
Entre las propiedades físicas y químicas de este heteropolimero se destacan su
distribución de pesos moleculares entre 50 kDa a 2000 kDa caracterizados por
HPLC y diferentes grados de D-acetilación (DDA) entre 40 y 98 %, el cual se
puede caracterizar por FTIR, RMN o Cromatografía de permeación en gel, entre
otros [17].
Diferentes autores reportan el uso de quitosano para membranas de gel con
propiedades que pueden ser controladas por el grado de entrecruzamiento con el
glutaraldehido [7,40] y para la inmovilización de proteínas [9]. Los hidrogeles de
quitosano han sido reportados como adecuados para la inmovilización de lipasas
por enlaces iónicos intermoleculares estables [7,36, 40,42, 49, 58].
De la información recolectada inicialmente (tabla 1) que reporta una amplia
bibliografía, por las propiedades y condiciones del quitosano según la literatura
antes mencionada y experiencias sobre éste mismo material en la Universidad
Nacional sede Manizales de la carrera de Ingeniería Química [51] indican que el
quitosano es un material adecuado como soporte de inmovilización para enzimas.
La inmovilización de enzimas sobre soporte de quitosano es un proceso en el que
se confina o localiza a la enzima en una región definida del espacio, para dar lugar
a formas insolubles que retienen su actividad catalítica y que pueden ser
reutilizadas repetidamente. Con éste fin existen diversos métodos que a lo largo
de los años se han utilizado y perfeccionado como los son entrecruzamiento
(cross-linking) que se ha utilizado en inmovilizaciones de diversos tipos de lipasas
para aplicaciones en medio no acuoso [39]. La adsorción es comúnmente utilizada
por ser un procedimiento sencillo, teniendo como desventaja una unión débil, por
lo que en algunos casos se utiliza como complemento con otro método [13]; la
unión covalente de una enzima a un soporte como el quitosano es quizá el método
de inmovilización más interesante desde el punto de vista industrial. La
metodología de la unión covalente se basa en la activación de grupos químicos del
soporte para que reaccionen con nucleófilos de las proteínas [12] (Figura 8). Otros
métodos de inmovilización que se reportan mencionan que los hidrogeles de
quitosano son un medio eficiente de encapsulación de proteínas en forma
esféricas y rugosas [1].Figura 8. Proceso de inmovilización sobre quitosano.
(Fuente: [45])
Los diferentes soportes de inmovilización para llevar a cabo distintas reacciones
pueden tener variadas presentaciones, tanto húmedas como secas, donde las
segundas son principalmente utilizadas, donde los contenidos de humedad bajos
son deseables para el almacenaje y la estabilidad reactiva [18]. Los métodos de
secado que se reportan van desde técnicas convectivas en las cuales los soportes
en húmedo se secan a temperatura ambiente durante un largo periodo de tiempo
[32], o se someten a temperaturas superiores a 97 °C mediante flujos de vapor
[18], hasta técnicas de criogelificación y liofilización en las cuales se manejan
temperaturas de congelación; estas últimas son técnicas eficientes que no
destruyen la estructura y evidencian una baja degradación de lipasa [12], Otros
estudios también confirman la utilización de criogeles en esferas de polivinil
alcohol por el método de congelación-descongelación en un sistema de dos fases.
Por la porosidad de los criogeles los biocatalizadores de alto peso molecular
pueden penetrar las esferas, mostrando así un incremento en la estabilidad
térmica de la lipasa al usarse repetidamente en síntesis de ésteres [56].
2.7 HIDROGELACION
Un hidrogel es definido como redes de macromoléculas hinchadas en agua o
fluidos biológicos. Estos se subdividen en tres clases dependiendo de la
naturaleza de la red: a) redes entrecruzadas entre si b) redes entrecruzadas
covalentemente c) redes formadas por interacciones secundarias, para el caso de
quitosano algunos autores dividen la clasificación en hidrogeles químicos
formados por enlaces covalentes irreversibles como las hidrogeles de quitosanoentrecruzados covalentemente e hidrogeles físicos formados por enlaces
reversibles como el tipo de interacciones iónicas [7].
Los hidrogeles de quitosano entrecruzados covalentemente se dividen en tres tipo
s dependiendo de su estructura: a) entrecruzados entre si b) redes poliméricas
híbridas (HPN) c) Redes poliméricas semi – totalmente interpenetradas (IPN).
Dentro de las tres subdivisiones el principio general se basa en interacciones por
enlace covalente, pero además se encuentran otras que no se pueden excluir
como puentes de hidrogeno e interacciones hidrofóbicas, el principio físico de
estos se basa en tener el quitosano y un entrecruzador en un solvente apropiado
que usualmente es agua. Se pueden adicionar otros polímeros para formar HPN o
IPN. Se pueden usar otras moléculas auxiliares para catalizar o iniciar la reacción
durante la preparación de la red. Los entrecruzadores más importantes son
dialdehídos como glyoxal y en particular, el glutaraldehido.[7]
Los hidrogeles de quitosano entrecruzados ionicamente se basan en el hecho de
formar una estructura reversible entre el quitosano, que es un polímero
policationico, y compuestos cargados negativamente formándose una red a través
de enlaces iónicos entre cadenas poliméricas. Las interacciones hidrofóbicas se
favorecen al disminuir el grado de DD del quitosano o los enlaces de hidrogeno
entre las cadenas debido a una repulsión electrostática después de la
neutralización del quitosano con el entrecruzador [7].
En concordancia con lo anterior las dispersiones de quitosano pueden ser
obtenidas en medio acuoso ácido, el cual protona los grupos amino, el polímero se
carga positivamente. En el caso de adición de base fuerte (NaOH) a tal dispersión
se superan las fuerzas asociativas entre cadenas. El quitosano permanece en
solución hasta cuando el pH llega a 6.2 (quitosano con DD bajo permanece en
solución por arriba de pH cerca de 9). Superado ése valor, se empieza la
formación de un tipo de gel hidratado como precipitado, esta precipitación o
formación de hidrogel es debido a la neutralización de los grupos amino del
quitosano y una consecuente remoción de fuerza electrostáticas repulsivas entre
cadenas, lo cual permite agrupar por puentes de hidrogeno e interacciones
hidrofóbicas entre cadenas
2.8 CRIOGELIFICACION (crioconcentración)
Los criogeles son matrices de geles formados como resultado de tratamientos
criogénicos (enfriamiento, almacenamiento en frío por un tiempo definido y
posterior descongelamiento), los cuales son soportes eficientes para la
inmovilización de biomoléculas y células. Su estructura única de criogeles, en
combinación con su estabilidad osmótica, química y mecánica, los hacen matrices
atractivas para cromatografía de nanoparticulas biológicas.El uso de criogeles como matrices para la inmovilización de biopolímeros
(enzimas, polisacáridos y ácidos nucleicos) implica en su producción la producción
de macroporos que permiten una adecuado difusión del sustrato. Los
supermacroporos en camas continuas, tales como las columnas de criogeles
desarrollados para la separación de biopartículas, son perfectamente adecuados
para birreactores de flujo pistón [36].3. MATERIALES Y METODOS
3.1 PRODUCCION DEL SOPORTE
Uno de los objetivos del presente trabajo consiste en producir un soporte con
características adecuadas para los sistemas reaccionantes (hidrólisis y
esterificación).
3.1.1 Materiales y reactivos
Quitosano Sigma grado reactivo
Ácido acético glacial Merck- Grado Reactivo
Etanol Grado técnico 96%
Hidróxido de sodio Carlo Erba Grado reactivo
Tripolifosfato Grado técnico - Disproalquimicos
3.1.2 Equipos de análisis y proceso
(cid:57) PH metro Schoot Handy Lab 1
(cid:57) Balanza analítica Kern (precisión 0.1 mg)
(cid:57) Congelador Icasa
(cid:57) Vidriería en general
(cid:57) Calibrador Digital
3.1.3 Procedimiento de gelificación
Para producir los hidrogeles de quitosano se recurrió a una técnica modificada de
la literatura [42] que utiliza como solución gelificante hidróxido de sodio-etanol a un
pH adecuado que brinde una fuerza iónica para la formación del hidrogel.La dispersión de quitosano se evaluó en tres concentraciones 1.8, 2.4, y 3 %(w/v)
en solución de 1%(v/v) de ácido acético. Las diferentes geometrías evaluadas
fueron esferas, láminas y cilindros, los cuales se prepararan depositando la
mezcla anterior en la solución gelificante, dejándolas en este por un tiempo
prudencial hasta que el gel sea formado por completo, posteriormente se
remueven las geometrías y se acondicionan adecuadamente neutralizando el
hidrogel con agua destilada hasta pH neutro (anexo 1). También se evaluó la
adición de glutaraldehido a concentraciones de 0.003 y 0.1 % (w/w) en soluciones
de quitosano.
Las esferas se produjeron por extrusión del quitosano por una aguja de calibre 21
G (0.8 mm), produciendo una gota que al caer en la solución gelificante formó la
geometría esperada. En el caso de las láminas se produjeron añadiendo el gel en
una rejilla metálica. Después de gelificación se hicieron cortes a tamaños
adecuados. Los cilindros se elaboraron al extruír la solución por una boquilla de
forma circular (4.5 mm) produciendose así unos cilindros continuos (fideos).
Posterior a la gelificación se cortaron a las dimensiones adecuadas (anexo 1)
3.1.4 Procedimiento de secado convectivo
Después de producir el soporte y neutralizarlo, las geometrías de diferentes
concentraciones se sometieron a temperatura ambiente por más de 24 horas y se
evaluó las perdidas de peso, las variaciones de las dimensiones y las humedades
de equilibrio. Las dimensiones se midieron con calibrador digital (anexo 2).
3.1.5 Procedimiento de secado por criogelificación (crioconcentración)
El término se generó por el uso de procedimientos criogénicos en el cual se
expone el hidrogel a un almacenamiento en frío y posterior descongelamiento,
proceso en el cual se elimina el agua y se concentra la estructura del biopolímero.
El soporte se obtuvo por exposiciones sucesivas a -20°C seguidas de
descongelamiento a temperatura ambiente por más de 24 horas (anexo 2).
Evaluándose las perdidas de peso, las variaciones de las dimensiones y las
humedades de equilibrio. Las dimensiones se midieron con calibrador digital.
3.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACION
La producción del sistema biocatalítico correspondió a la inmovilización de la
lipasa por enlace covalente a un soporte de quitosano.3.2.1 Materiales y reactivos
Quitosano Sigma grado reactivo
Ácido acético glacial Merck
Etanol Grado técnico 96%
Aceite de Oliva Tipo comercial – 0.4° acidez
Glutaraldehido BASF grado técnico 50.8 %
Tripolifosfato Grado técnico 95.5 %
Trizma – base Sigma Aldrich- Grado reactivo
Solución Buffer de fosfato
Iso-octano Carlo Erba- Grado Reactivo
Lipasa XX Split- Candida rugosa Proenzimas.
3.2.2 Enzima Utilizada
Se usó la enzima ENZECO® LIPASE XX distribuida por proenzimas® y producida
por Enzyme Development Corporation EDC, a partir del microorganismo de
Candida rugosa, que según especificaciones técnicas puede hidrolizar el 90 % o
mas de triglicéridos en ácidos grasos.
Actividad nominal: 15.000 unidades de lipasa
Forma: Sólido con sal finamente pulverizada como diluyente y un
contenido mínimo de lactosa como vehículo.
Solubilidad: Completamente soluble en agua
3.2.3 Equipos de análisis y proceso
(cid:57) Espectrofotómetro Perkin Elmer Lambda 20 (rango 200-1100nm)
(cid:57) Plancha magnética digital Schoot Gerate GMBH
(cid:57) PH metro Schoot Handy Lab 1
(cid:57) Balanza analítica Kern (precisión 0.1 mg)
(cid:57) Vidriería en general(cid:57) Micropipeta 5-50 microlitros
3.2.4 Procedimiento de activación
Para la inmovilización de la lipasa en el soporte de quitosano se recurrió a un
enlace covalente establecido entre el glutaraldehido y los grupos amino del
quitosano el cual es uno de los grupos funcionales presente sobre la superficie
del soporte y un aminoácido residual en la estructura enzimática.
Inicialmente se preparó la solución acuosa de glutaraldehido (0.003; 0.01; 0.1 %
w/w) en la cual se depositó el soporte por aproximadamente 1.5 horas bajo
agitación suave (400 rpm T = 25°C).
3.2.5 Procedimiento de Inmovilización
El soporte activado se lavó con agua desionizada y se sumergió en la solución
enzimática 0.5% (w/v) (disuelta en fosfato de sodio pH 7.3) a temperatura
ambiente. La enzima inicialmente se diluyó y se centrifugó por 2h, obteniéndose
un sobrenadante rico en proteína tonel cual se hicieron los ensayos.
Posteriormente se realizaron dos lavados con fosfato de sodio a pH 7.3 por dos
minutos cada uno, luego se lavó con 0.1 M tris HCl pH 8 por 2 h para bloquear los
grupos remanentes de CHO. Finalmente el biocatalizador es almacenado en
fosfato de sodio Buffer a 4°C (anexo 3). Las soluciones residua les de fosfato se
reciclaron para análisis de carga de proteína.
3.2.6 Procedimiento de análisis de proteína
Para medir la cantidad de enzima atrapada por el soporte se uso las soluciones
residuales del proceso de inmovilización por enlace covalente a las cuales se les
adicionó el reactivo de Biuret [66] formando una coloración violácea debido a la
reacción entre sales de cobre y el nitrógeno de la enzima, la solución se analizó
por espectrofotometría UV a 540 nm (anexo 4).
3.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL SISTEMA BIOCATALÍTICO
Producir un soporte de inmovilización o un sistema biocatalítico implica el análisis
de las características físicas y/o químicas. A partir de estas propiedades sepuede conocer la interrelación que se genera entre el medio adyacente tal como
las mezclas reaccionantes de hidrólisis y/o esterificación y el soporte catalítico.
3.3.1 Materiales y reactivos
Quitosano Sigma grado reactivo
Ácido acético glacial Merck
Etanol Grado técnico 96%
Hidróxido de sodio Carlo Erba Grado reactivo
Tripolifosfato Grado técnico - 95.5%
Hexano Grado Reactivo
Isooctano Carlo Erba – Grado Reactivo
Glicerina Carlo Erba – Grado Reactivo
3.3.2 Equipos de análisis y proceso
(cid:57) Espectrofotómetro FTIR
(cid:57) Microscopio de barrido por sonda (SPM)
(cid:57) Plancha magnética digital Schoot Gerate GMBH
(cid:57) PH metro Schoot Handy Lab 1
(cid:57) Balanza analítica Kern (precisión 0.1 mg)
(cid:57) Vidriería en general
3.3.3 Medida de grado de D- acetilación
El análisis de espectroscopia de infrarrojo se basó en la relación que existe entre
los grupos hidroxilo y amida del quitosano (derivado N-desacetilado de la quitina)
los cuales absorben energía a determinadas longitudes de onda.
Para el análisis del grado de acetilación del quitosano se usó el método propuesto
por García y Canella [20] en el cual se prepara la muestra a analizar en láminas
transparentes. Estas se realizan con una solución de quitosano de 1.8 % en una
solución al 2% de ácido acético y se filtró. Se evaporó el solvente a 45°C durante
aproximadamente 20h, luego se neutralizó las láminas por inmersión en soluciónacuosa de NaOH al 5% por 16h, y se retiró el exceso de base con agua destilada.
El otro método de análisis manipulado trabajó con quitosano en polvo (3 mg)
mezclándolo con 2 g de KCl, para formar una pastilla. Muestras con adición de
glutaraldehido (0.003, 0.01 y 0.1% w/w) y enzima de 0.5 %w/v también fueron
analizadas.
Los espectros de infrarrojo se realizaron en un espectrofotómetro Perkin Elmer BX
II, analizando en el rango entre 4000-400 cm-1), resolución de 4 cm -1, intervalo de
2 cm-1 en modo de transmitancia /absorbancia.
El grado de D-acetilación se encuentra por
 A 
%DD = 100 -  1650 /1.33*100 Ec. (1)
 
A
 
3450
3.3.4 Medida de resistencia
Se determinó por inmersión del soporte seco a las tres concentraciones del
quitosano en agua destilada, dejándolo en una placa agitadora a altas y bajas
revoluciones (1110 rpm - 500 rpm –250 rpm) por 10 h, se determinó la pérdida de
peso del soporte residual en forma cualitativa comparando el soporte al inicio y al
final del proceso.
3.3.5 Medida de solubilidad y degradabilidad
Se estableció por inmersión del soporte en diferentes solventes orgánicos por 72
horas, al final se cualificó la solubilidad y degradabilidad. Igualmente se evaluó la
solubilidad en las mezclas de reacción de transesterificación, hidrólisis y
esterificación.
Los diferentes medios fueron: n-hexano, Isooctano, etanol, agua, ácido oleico,
ácido acético glacial y acuoso, hidróxido de sodio y glicerina.
3.3.6 Medida del swelling (hinchamiento)
Se determinó por inmersión del soporte de inmovilización en la mezcla de
hidrólisis a 25°C, analizando los pesos del soporte después de tres días, el valor
de swelling fue calculado a partir de[ 70]:W f (t)−W
G = s d
Ec. ( 2).
W
e
Donde W es el peso del soporte seco, W es el peso del soporte hinchado como
d s
función del tiempo y W corresponde al valor del peso del soporte hinchado en el
e
equilibrio, los cambios del grado de swelling contra el tiempo fueron estudiados.
3.3.7 Procedimiento de medición de rango de poro
Se preparan láminas de quitosano que se asemejan a la morfología externa del
soporte bajo las mismas condiciones del aparte 3.1 con el fin de obtener
superficies lo mas planas posibles (diferencias entre pico y valle no mas grande de
3 µm). [16, 46, 47]
El tamaño de poro se cuantificó, en forma aproximada por la técnica de
microscopía de fuerza atómica (AFM) en modo de contacto a condiciones
normales de temperatura (25°C) usando un microscopio de barrido por sonda Park
Scientific Instrument, Moel Autoprobe CP, para analizar la topografía generada en
el proceso de criogelificación (Crioconcentración) con cantilevers (ultralever) y con
punta de nitruro de silicio de constante de resorte 0.25 N/m y con un escáner de
capacidad de traslación x,y,z de 100x100x3 µm,. Se obtuvieron datos cuantitativos
tales como rugosidad media, poro medio, poros detectados y poros por área
cuadrada a partir del uso del software (Imagemetrology SPIP Versión 3.3.3.0, Nov
25 2004).
Se consideran microporos si el tamaño de poro corresponde a <1.4 nm,
mesoporos si 1.4 nm <poro<50 nm y macroporos si se habla de >50 nm.
3.3.8 Medida de la actividad enzimática del biocatalizador
La actividad enzimática del sistema biocatalítico se realizó mediante el
seguimiento de una reacción tipo ya sea hidrólisis de aceite de oliva y/o
esterificación de ácido oleico con n-butanol.
3.3.8.1 Hidrólisis
Para este caso se utilizó la hidrólisis del aceite de oliva con bajo grado de acidez
de marca comercial. Se monitoreó la aparición del ácido oleico bajo agitación a
una temperatura de 40° C y pH 7. El método a seguir tiene una exactitud
aproximada y se encuentra en la referencia [59].Se preparó la mezcla de reacción (Emulsión de aceite de oliva en Isooctano y
mezcla tampón de pH 7); se somete a agitación a 40°C por un tiempo de 30
minutos. Al final de la reacción se tituló con una solución de hidróxido de sodio
0.05 N utilizando como indicador fenolftaleina al 1%. La hidrólisis se repitió sin
lipasa, con lipasa libre y lipasa inmovilizada.
Una unidad (U) de actividad enzimática fue definida como la cantidad de enzima
necesaria para producir 1 µmol de ácidos grasos libres por minuto bajo las
condiciones de prueba (40°C, pH 7.4, 150 rpm).
3.3.8.2 Esterificación
La enzima se acondiciona al igual que en la reacción de hidrólisis por un periodo
de 1 hora. El sistema reaccionante consistió en una mezcla equimolar de ácido
oleico (0.1 M) con n-butanol (0.1M) bajo agitación y a 40°C durante 8 horas,
tiempo durante el cual se tituló para conocer el consumo del ácido oleico (Método
AOCS Cd 3d-63). La esterificación se repitió sin lipasa, con lipasa libre e
inmovilizada. La actividad de la enzima fue calculada a partir de la pendiente de
una grafica de desaparición de ácido oleico contra el tiempo y es definida como
µmol de ácido oleico consumido/ hora. por mg de enzima inmovilizada. El
solvente utilizado en el sistema es el Isooctano, el método se reporta en [23, 27].4. RESULTADOS Y DISCUSIONES
4.1 PRODUCCION DEL SOPORTE
La producción del soporte de inmovilización se llevó a cabo usando tres
concentraciones diferentes de quitosano (1.8, 2.4 y 3%w/v); experimentalmente se
encontró un comportamiento reológico diferente, proporcionando mayor viscosidad
a mayor concentración, a su vez se produjeron tres tipos de geometrías (láminas,
esferas y cilindros).
El método de inyección utilizado para producir esferas requirió soluciones menos
viscosas para mejorar la forma (Figura 9) ya que a medida que se aumentó la
concentración se obstruyó el paso de la solución por la aguja utilizada modificando
la morfología y producción de las mismas.
Las láminas y los cilindros producidos necesitarón una solución mucho más firme
y compacta de quitosano por lo que fueron utilizadas las soluciones de mayor
concentración (Figura 10 y 11) para darle la forma adecuada y estabilidad a estas
geometrías.
Figura 9. Hidrogel de esferas de 1.8%
Figura 10. Hidrogel de Láminas de 3%Figura 11. Hidrogel de cilindros de 3%
Para una mejor ilustración de los resultados anteriores se recomienda al lector
dirigirse a los anexos correspondientes (anexo 5), donde se comparan los
hidrogeles producidos entre concentración de quitosano y su geometría.
Los hidrogeles producidos fueron sometidos a dos métodos de secado en el cual
sus longitudes características variaron con respecto a su longitud inicial; en el
caso de esferas se analizó su diámetro efectivo promedio, para las láminas se
analizó los tres lados y para el caso de los cilindros el diámetro y la longitud. Los
resultados promedio de los diámetros inicial y final se muestran el las tablas 4 a 7.
Tabla 4. Tamaño Inicial y Final de esferas (Diámetro efectivo promedio).
Diámetro Inicial (mm) Diámetro Final (mm)♣
Esferas
% w/v % w/v
Método de
1.8 2.4 3 1.8 2.4 3
secado
Criogelificación 2.91 3.92 4.36 2.49 2.88 3.27
Convección 2.91 3.92 4.36 1.35 1.16 2.03
Tabla 5. Tamaño inicial de laminas (longitudes en cm)
Longitud Inicial
Laminas
% w/v
Método de 1.8 2.4 3
secado L1 L2 H L1 L2 H L1 L2 H
Criogelificación 9,10 9,46 4,70 9,94 10,25 7,84 9,64 10,02 8,26
Convección 9,83 9,68 4,72 10,12 9,97 7,59 9,81 10,06 8,21
♣ Referido a la dimensión circular de la esfera. Las esferas quedaron con dos dimensiones características
después de secar por criogelificación (crioconcentración) , una de ellas (dimensión plana) se generó debido a
que una porción de su superficie reposa durante un tiempo prolongado sobre la superficie (caja de Petri).Tabla 6. Tamaño Final de laminas (longitudes en cm).
Longitud Final
Laminas
% w/v
Método de 1.8 2.4 3
secado L1 L2 H L1 L2 H L1 L2 H
Criogelificación 7,551 8,311 2,357 8,326 8,398 4,877 8,301 8,316 6,053
Convección 3,892 4,377 1,113 3,613 3,800 2,059 3,806 4,075 2,977
Tabla 7. Tamaño inicial y final de cilindros (Diámetro y longitud media)
Tamaño Inicial (mm) Tamaño Final (mm)
Cilindros
% W/V %W/V
Método de 1.8 2.4 3 1.8 2.4 3
secado
Diam. Lon. Diam Lon. Diam Lon. Diam Lon. Diam Lon. Diam Lon.
Criogelificación 3.28 4.93 4.53 5.66 4.58 5.66 1.95 4.51 2.85 4.01 3.11 4.58
Convección 3.28 4.93 4.53 5.66 4.58 5.66 1.12 2.53 1.31 2.32 1.57 2.49
La pérdida de tamaño se atribuyó a la eliminación de agua de los hidrogeles y esta
pérdida se compara entre los métodos de secado con respecto a la disminución
de la longitud característica, como se puede analizar para las tres geometrías el
método de criogelificación conservó mucho más las dimensiones características
que por el método de secado por convección, lo cual no sólo convierte el soporte
en un material de forma regular sino que mejora su estructura interna volviéndola
porosa, siendo conveniente para los propósitos de éste trabajo. El porcentaje de
pérdida se calculó como la razón entre la diferencia de longitud inicial y final, y la
dimensión inicial. Los resultados se muestran en las tablas 8 a 10 para las
diferentes geometrías.
Tabla 8. Perdida de tamaño para esferas (%).
Geometría Esferas*
Método de
1.8% w/v 2.4%w/v 3%w/v
secado
Criogelificación 17.13 23.78 25.21
Convección 53.74 68.9 53.89
*Referido al diámetro efectivo promedioTabla 9. Perdida de tamaño para laminas (%).
Geometría Láminas*
Método de
1.8% w/v 2.4% w/v 3% w/v
secado
Criogelificación 49,85 37,76 26,77
Convección 76,41 72,87 63,73
*Referido a la altura promedio de la lamina.
Tabla 10. Pérdida de tamaño para cilindros (%)
Geometría Cilindros
Método de 1.8% w/v 2.4%w/v 3%w/v
secado Diam. Long. Diam. Long. Diam. Long
Criogelificación 40.55 8.51 37.08 29.15 32.1 19.08
Convección 65.85 48.68 71.08 59.01 65.72 56
Los porcentajes de pérdida de tamaño reflejan que el método de secado
convectivo disminuyó en mayor proporción las longitudes más importantes de
cada geometría que el método de secado por criogelificación (crioconcentración).
Al analizar cada geometría se encuentra que en el caso de las esferas un aumento
de concentración de quitosano aumentó la perdida de tamaño para el caso de la
criogelificación (crioconcentración). Las láminas presentaron una relación
contraria, a mayor porcentaje menor perdida de tamaño para los dos métodos de
secado. El diámetro del los cilindros disminuyó más que su longitud sin tener en
cuenta las concentraciones de quitosano y el método de secado.
La criogelificación (crioconcentración) conservó mejor la forma debido a que
durante el enfriamiento se forman cristales de hielo que nuclean a partir de la
solución y crecen a lo largo de la dirección de los gradientes térmicos conservando
la estructura, la lixiviación del agua y la concentración de la estructura del
biopolímero se genera en el proceso de descongelamiento, el proceso de secado
convectivo es un proceso de transferencia de masa con el medio, en el que el
agua se evapora generando cambios en las estructuras y modificando la
gelificación inicial. El proceso combinado de criogelificación (crioconcentración)
por 48h y posterior secado ambiente fue probado (Figura 12).Figura 12. Proceso combinado de secado.
El proceso de secado además de generar estructuras de tamaños diferentes
produce perdidas de peso durante el proceso de secado y humedades diferentes a
las iniciales. El porcentaje de pérdida de peso se cuantificó al cabo de 48 horas
para el caso de criogelificación (crioconcentración) y de 5 días para el caso de
secado convectivo (Tabla 11).
Tabla 11. Porcentaje de pérdida de peso debido al proceso de secado
Geometría Esferas Láminas Cilindros
% w/v % w/v % w/v
Método de
1.8 2.4 3 1.8 2.4 3 1.8 2.4 3
secado
Criogelificación 92.3 91.9 85.05 83.68 79.50 61.87 94.7 88.4 87.6
Convección 94.1 93.4 92.1 97.31 96.75 94.51 96 95.6 92
La pérdida de peso posee una relación entre las humedades y la concentración
de quitosano, una mayor perdida de peso se generó al disminuir la concentración.
Los métodos de secado generaron una pérdida de peso superior al 50% lo que
sugiere una alta velocidad de eliminación de masa con el medio al que esta
expuesto el soporte (-20°C y 25°C). El proceso de criogelificación
(crioconcentración) es dependiente de la geometría, las láminas que poseen un
mayor volumen en comparación con las otras geometrías presentaron menor
perdida de peso.
Las humedades finales al cabo de 48 h para el método de secado por
criogelificación (crioconcentración) y 5 días para el convectivo se reportan como
pérdida por desecación en estufa corriente [21] a 100°C (tabla 12 a 14). Aunque
no se reporta la temperatura de desnaturalización para este material se hicieron
ensayos de los soportes a diferentes temperaturas (100°C, 120°C y 150). Laresistencia térmica del soporte se estimó en 100ºC debido a que a temperaturas
superiores cambió de color.
Tabla 12. Humedad finales de esferas (%).
% w/v
Método de
1.8 2.4 3
secado
Criogelificación 12.90 15 16
Convección 10.92 14.41 14.51
Tabla 13. Humedad finales de Laminas (%)
% w/v
Método de
1.8 2.4 3
secado
Criogelificación 80.8 82.3 86.125
Convección 12.05 8.67 7.87
Tabla 14. Humedad finales de Cilindros (%)
% w/v
Método de
1.8 2.4 3
secado
Criogelificación 38.76 66.45 79
Convección 17.39 10.9 10.19
Nota: Las humedades de las tablas 12, 13 y 14 corresponden a las humedades
finales de equilibrio correspondientes a cada procedimiento.
Las láminas secas por criogelificación (crioconcentración) presentaron mayor
humedad final con respecto a las demás geometrías, puesto que tenían mucha
mas agua en su estructura en comparación con las esferas y cilindros. A iguales
condiciones se retuvo en las tres geometrías mayor cantidad de agua en el
soporte seco por criogelificación (crioconcentración) al utilizar una mayor
concentración de quitosano.
El método de secado convectivo redujo en mayor proporción el tamaño de los
pellets, generando un soporte compacto y de color amarillo con humedades
inferiores al 15 % y actividades de agua de 0.4-0.45 a 25ºC en contraste con la
criogelificación (crioconcentración) que al cabo de 48 horas genera un soporte con
un tamaño similar al inicial, de textura blanda y de color blanco con humedades
que varían entre 15 % y 80% con actividades de agua entre 0.5-0.95. Se sugiere
que el proceso de secado por criogelificación (crioconcentración) debe ser
prolongado variando de 48 Horas a 5-6 días con periodos iguales decongelamiento-descongelamiento. Los resultados anteriores se muestran en las
figuras 13 a15.
Figura 13. Esferas secas.
Figura 14. Laminas secas.
Criogelificación
Hidrogel (Crioconcentración) Secado Convectivo
Figura 15. Cilindros secos.
Criogelificación
(Crioconcentración)
Hidrogel Secado ConvectivoAl variar el tiempo de exposición de los soportes de 48 horas a 5-6 días por el
método de criogelificación (crioconcentración) se encontró que disminuyeron las
humedades finales entre 10-20 %. Los resultados se muestran en la tabla 15.
Tabla 15. Humedades finales al cabo de 5-6 días (%)
% w/v
Geometría 1.8 2.4 3
Láminas 10-20 10-20 10-20
Cilindros 14.68 20.38 17
Para una mejor ilustración de los resultados anteriores se recomienda al lector
dirigirse a los anexos correspondientes (anexo 6), donde se compara cada
geometría a diferentes niveles de quitosano y métodos de secado.
El método de secado convectivo conservó mucho mejor la forma del soporte con
respecto al inicial, pero el tamaño fué mejor conservado por criogelificación
(crioconcentración). En el caso de las esferas secadas a -20°C se destruyó la
forma debido a que los cristales de hielo generados deformaron las estructuras
esféricas, para el caso de las láminas y cilindros no se deformaron.
Los métodos de secado probados generaron estructuras muy diferentes entre si;
el propósito del secado es obtener un soporte seco con estructuras porosas para
inmovilizar lipasas por enlace covalente. El método de criogelificación proporcionó
este tipo de soporte, por lo cual se eligió para reproducir soportes en la
inmovilización de lipasas. Con el método de secado convectivo se generaron
estructuras fuertes de color amarillo que no demuestran a simple vista una
porosidad adecuada para los propósitos de inmovilización.
Es de gran importancia un soporte poroso con características físicas apropiadas
en reacciones donde la agitación es un parámetro significativo al igual que los
fenómenos de transferencia de masa. Las esferas producidas por criogelificación
sufrieron una deformación resultando inapropiadas para la inmovilización, puesto
que se requerían formas regulares del sistema biocatalítico.
Los catalizadores buscados deben de proveer un tamaño y dimensiones
características para promover una buena actividad catalítica, resistencia a la
abrasión, disminución de la caída de presión (reactores de flujo pistón) y una
distribución de masa en el sistema reaccionante (sistemas agitados). Las láminas
tuvieron una estructura fuerte y un tamaño ideal, pero en la agitación sufrieron
fragilidad tal y como se comprobó en ensayos preliminares desprendiéndose
fragmentos de quitosano y formándose superficies redondas en sus aristas,
algunos autores reportan iguales resultados [18].Los cilindros proporcionaron un soporte ideal, fueron fáciles de reproducir, tuvieron
forma regular de tal manera que para estudios posteriores como procesos de
simulación son de gran utilidad, fueron resistentes a la abrasión y fuertes en
sistemas agitados. Los tamaños generados (diámetro de 2-3 mm y altura de 4-4.5
mm) son similares a los catalizadores convencionales tipo zeolita sintéticas [63]
(diámetro de 3 mm y altura de 5 mm) (figura 16); en el proceso de
descongelamiento se generaron cavidades en su interior en forma de capas que
pueden aportar condiciones favorables para la transferencia de masa de los
sistemas reaccionantes (figura 17).
Figura 16. Comparación del soporte convencional con biológico.
Quitosano Zeolita
Figura 17. Soporte biológico.
Los cilindros de quitosano a las tres concentraciones se les determinaron las
humedades finales por el método de Karl Fischer para verificar la exactitud del
método de secado por estufa (temperatura de 100ºC). La diferencia entre losmétodos es de aproximadamente 5%, lo cual indica que la humedad eliminada por
el secado en estufa se debe fundamentalmente a eliminación de agua y no de
otros compuestos.
Para la elaboración del soporte se ensayaron otras técnicas de elaboración que
consistieron en hidrogelación en frío, entrecruzamiento con glutaraldehido y
gelificación con Tripolifosfato (TPP)
Los soportes por hidrogelación en frío se generaron al congelar la solución
gelificante a -20°C inmediatamente después de introducir la solución de quitosano
en NaOH-etanol, el tratamiento de secado por criogelificación (crioconcentración)
se realizó de igual forma. Los cilindros obtenidos poseen una estructura uniforme,
una geometría de cilindro definida y un color blanco más intenso (Figura 18).
Figura 18. Soportes por hidrogelación en frío
Los soportes por entrecruzamiento se generaron al adicionar 5 ml de
glutaraldehido de concentración (0.003 y 0.1%w/w) a una solución de quitosano al
3%, la solución estuvo en reposo por 30 minutos, según algunos autores [33] al
adicionar glutaraldehido se reduce el contenido de agua y consecuentemente el
tamaño de poro, modificando la superficie porosa. Los resultados cualitativos
demostraron una estructura mucho mas firme al adicionar el glutaraldehido, ya que
al adicionar un entrecruzador aumentó la rigidez y fragilidad del soporte. Los
resultados de porosidad se muestran en el capitulo correspondiente a la
caracterización del soporte (Numeral 4.3.5).
Los soportes gelificados por Tripolifosfato implicaron el uso de una solución iónica
distinta a la que se usó (NaOH-EtOH), la técnica reportada [42] implicó la
preparación de una solución de TPP en tris HCl a un pH de 7.2. Láminas y
cilindros se probaron, generando estructuras que no gelificaron en su interior pero
si en su exterior, además el proceso de secado generó un soporte sólido muy
compacto y duro, pero arenoso, que no ofrece ninguna porosidad visual (Figura
19). Los hidrogeles de esferas generadas no presentaron estos problemas. Eluso de esta técnica sugiere la inmovilización por retención física bajo
atrapamiento.
Figura 19. Soporte producidos por uso de TPP (cilindros)
4.2 PROTOCOLO DE INMOVILIZACION
4.2.1 Carga enzimática
Como se mencionó en el capitulo de producción del soporte la geometría
apropiada para la inmovilización correspondió a los cilindros secados por
criogelificación (crioconcentración) los cuales se escogieron según los argumentos
mencionados anteriormente, el porcentaje de quitosano escogido fue de 3 %
debido a que ofrece una estructura mas fuerte.
Los porcentajes de dilución (sal y lactosa) de la enzima XX Split proveída por
proenzimas no son reportados, para el caso. Se realizó un análisis de proteína
para la enzima adquirida, por el método de Kjeldah (Nitrógeno Total) y el método
del ácido Bisinconílico (método colorimétrico), los resultados se reportan en la
tabla 15.
Tabla 16. Análisis de proteína.
Análisis % proteína
Kjeldah (Nitrógeno Total) 1.2
Método Colorimetrico 2.15
La enzima se centrifugó para eliminar la mayor parte de la sal en la que se
encontraba, eliminar residuos insolubles.Para conocer la carga de proteína en los soportes de quitosano se elaboró una
curva patrón siguiendo el método colorimétrico de Biuret (anexo 4). Los resultados
se muestran en la Tabla 16.
Tabla 17. Curva patrón
Longitud de Onda Concentración Absorbancia
(nm) (mg/L)
0 0
0.1 0.0347
0.25 0.1253
550
0.5 0.2289
0.75 0.3508
1.0 0.4486
La curva de concentración contra absorbancia es C = 5.6360e-2+3.9561e-2*A
con R2= 0.9967.
Tres concentraciones de glutaraldehido como activador del quitosano fueron
probados para determinar la mayor carga de proteína inicial por unidad de soporte
dando los siguientes resultados.
Tabla 18. Carga de proteína
Concentración de Cantidad de proteína* cargada
glutaraldehido inicialmente
%w/w (mg/g quitosano**)
0,003% 6.8935
0,01% 5.4573
0,10% 4.6065
* Valores iniciales de carga sin restar los lavados del soporte.
**Soporte de Quitosano con humedad de equilibrio entre 15-20%
Para el trabajo dentro del laboratorio se escogió la activación con GA de
concentración de 0.003%, ya que generó una mayor cantidad de enzima cargada,
además se sugirió el trabajo con la misma debido a que resultados similares
(óptimo de baja concentración) fueron reportados por otros autores [58].
El tiempo de contacto inicialmente sugerido correspondió a 1 hora entre el soporte
y la enzima, tiempo que no generó carga final de proteína ya que toda la enzima
cargada se perdió en los lavados. Un aumento del tiempo de contacto generó
mejores resultados (Tabla 18) para que la enzima se uniera covalentemente al
soporte. Se usó una solución buffer para conseguir una estabilidad adecuada de
la enzima (estable entre pH de 4.0 a 7.5).Tabla 19. tiempos de carga de enzima
Cantidad de proteina*
cargada finalmente
Tiempo (h) (mg/g quitosano)*
1 0
5 0.951
15 1.057
*g quitosano reportados en base seca
Un aumento del tiempo de contacto aumentó la carga de proteína dentro del
proceso de inmovilización.
El proceso de inmovilización sugerido al utilizar la lipasa XX Split del
microorganismo Candida rugosa y cilindros de quitosano seco por criogelificación
(crioconcentración) es como sigue:
1. Tomar una cantidad de quitosano seco (3g) producido por los métodos
anteriormente mencionados.
2. Sumergir en 50 ml de solución de glutaraldehido (0.003%) hasta que
cubran totalmente los soportes. Agitar a una velocidad de 400 rpm por 1.5
h.
3. Filtrar la solución anterior con un papel de filtro de poro grande y lavar con
abundante agua desionizada. Retirar el exceso de humedad con papel
absorbente.
4. Acondicionar la enzima en solución buffer para obtener una solución
concentrada de enzima. En el caso de la enzima XX Split se diluyó la
enzima en una relación enzima – solvente (Na- Fosfato Buffer) de 3:5 y se
agita por 10 minutos hasta solubilizar la mayor cantidad de sustrato, se
centrifuga por dos horas a altas revoluciones y se retira la solución
sobrenadante, esta solución se centrifuga nuevamente por 30 minutos
hasta obtener una solución transparente.
5. Sumergir los cilindros del paso 3 en 50 ml de la solución enzimática o más
hasta que los cilindros queden completamente cubiertos. Agitar a 400 rpm
por 16 horas.
6. Hacer pasar la solución por un papel de filtro de poro grande y almacenar
la solución residual para análisis de proteína.7. Lavar dos veces los soportes con 50 ml de fosfato de sodio buffer o con
igual volumen de enzima utilizada por 5 minutos y filtre. Almacene la
solución residual para análisis de proteína.
8. Sumerja los soportes en solución de tris Hcl pH 8 y deje en reposo por 2
horas.
9. Lave los soporte con solución de Na-fosfato buffer y déjelos en esta para
almacenarlos. Refrigere a 4°C.
Para una mejor ilustración se muestra en un diagrama el procedimiento de
inmovilización por enlace covalente sugerido (anexo 3).
4.3 CARACTERIZACION DEL SOPORTE Y EL SISTEMA BIOCATALÍTICO
4.3.1 Grado de D- acetilación
El grado de D-acetilación del quitosano con el que se construyen los sistemas
biocatalíticos indica algunas propiedades del soporte tales como:
biodegradabilidad, características de formación del gel y posibles tratamientos
anteriores del quitosano. Un alto grado de D-acetilación es favorable al
entrecruzamiento ya que necesita principalmente unidades reactivas
desacetiladas [33].
Figura 20. Espectros de quitosano puroEl espectro en modo de absorbancia se realizó a una muestra de quitosano puro
(hojuelas en bruto), muestra que fue macerada y pulverizada. La zona de
identificación de grupos funcionales ubicada entre 4000-1600 cm-1 en la cual se
observan los grupos hidroxilo, el enlace característico del quitosano; con un pico
a 3415.65 cm-1, y con una absorbancia de 0.99. La absorbancia de otros grupos
como los alargamientos y tensiones del grupo N-H que aparecen en la zona
característica del hidroxilo no se observan debido a lo ancho del pico del hidroxilo.
El segundo grupo característico del quitosano parcialmente desacetilado es la
amida I que se presenta entre 1620 - 1700 cm-1, este grupo se muestra en el
espectro a un pico en 1651.91 cm-1 con una absorbancia de 0.41.
Figura 21. Espectros de quitosano al 1.8% por lámina.
La interacción entre el ácido y el quitosano en el momento de elaboración de la
lámina para el análisis formó un acetato de quitosano [43, 48], esta reacción
aporta un cambio de los picos de los grupos funcionales tal y como se observó
en el espectro. Los grupos característicos como son el grupo hidroxilo y amida I se
encontraron a 3302.94 cm-1 y 1652.42 cm-1 respectivamente, la presencia de
enlaces N-H propios a 1590cm-1 que en éste caso se observó en un pico de
1588.20, se debió al grupo amina característico del quitosano ya que este es
proveniente de la quitina y se diferencian en éstos grupos.El análisis del espectro de quitosano fue contrapuesto con el espectro de quitina;
la comparación hecha por el equipo es adecuada debido a que el quitosano
proviene de la quitina.
Se evaluó el grado de D-acetilación del quitosano con las dos técnicas
mencionadas, encontrando que por el método de preparación de muestra con
lámina se presenta un % de D-acetilación ( ecuación 1) de 53% y utilizando el
método de pastilla con KCl es 68.86% (N-acetilación de 31.14%) (Tabla 19). El
valor reportado por el proveedor (Sigma Aldrich) correspondió a un grado de D-
acetilación superior al 75%, la diferencia encontrada supone la influencia de la
molécula de agua que afectó en algún nivel los espectros, enmascarando los
grupos hidroxilo y amida; la muestra no tuvo ningún tratamiento de secado
riguroso para el posterior análisis. El grado de D-acetilación del quitosano utilizado
tuvo un valor alto que supone que el soporte producido tendrá velocidades de
degradación bajas y será favorable al entrecruzamiento con glutaraldehido ya que
presenta una buena proporción de unidades reactivas desacetiladas. Se sugiere el
uso de espectroscopia Raman para evitar la interferencia del agua, en caso
contrario el uso de FTIR sugiere que la muestra deberá de ser tratada eliminando
el agua presente.
El método de producción de muestras por pastillas de KCl sugiere un
procedimiento con menor contaminación de la muestra y menor tratamiento físico
que interfieran en el proceso de análisis ya que el producto es tomado en bruto.
Tabla 20. Resultados de N-Ac y D-Ac
A A
Técnica valor valor N-Ac D-Ac
(1650) (3450)
Lamina 1651.63 0.62 3336.54 0.99 0.47 0.53
Pastilla 1680.88 0.41 3414.65 0.99 0.31 0.69
Tabla 21. Resultados de absorbancia de grupos hidroxilo y amida.
A A
Técnica Característica
(~1650) (~3450)
Quitosano Glutaraldehido Enzima
Lamina 1.8 % 0.003 % W/W 0.5 % p/v 0.6 0.99
Lamina 1.8 % 0.003 % W/W - 0.53 0.98
Lamina 1.8 % 0.01 % W/W 0.5 % p/v 0.58 0.98
Lamina 1.8 % 0.01 % W/W - 0.48 1
Pastilla 1.8 % 0.1 % W/W 0.5 % p/v 0.44 1
Pastilla 1.8 % 0.1 % W/W - 0.40 1Un aumento del contenido de glutaraldehido y de enzima afectó la absorbancia de
los grupos amida I (~1650) (tabla 20), una alta concentración de glutaraldehido
(0.1%) mostró un cambio en el pico del grupo amina, de un pico notorio a un
hombro característico debido a la interacción entre el glutaraldehido y los grupos
amino disponibles del quitosano (anexo 7). Los espectros de FTIR (anexos 7) con
diferentes concentraciones de glutaraldehido muestran los grupos propios del
quitosano sin sufrir una deformación pronunciada, tales como:
Grupos hidroxilo -OH (3450-3200)
Grupos amida I (1700-1620) en la región de huellas digitales
Grupos amino -NH (~1590)
2
Enlaces glucosidicos -C-O-C (~1150)
Estiramiento y alargamientos de C-H (2900 -2700)
Estos grupos varíaron en poca proporción al igual que en su absorbancia, los
cambios generados en los espectros hacia la derecha se deben a la interacción
entre el quitosano y parte de los componentes que se añaden, así como la
influencia de la concentración de los mismos.
En el espectro de la lipasa se ven las bandas características del hidroxilo (3450-
3200 cm-1), los grupos carbonilos a 1645.85 cm-1 y enlaces glucosidicos a 1153.32
cm-1 (Anexo 9).
4.3.2 Resistencia
Se determinó una resistencia observada a la inmersión del soporte en agua
destilada (100 ml) con agitación. Adicionalmente las muestras se pesan para
encontrar si existen pérdidas de peso muy considerables. Cinco muestras del
soporte seco fueron sumergidas, encontrándose lo siguientes resultados.
Tabla 22. Resistencia del soporte de inmovilización
Revoluciones
1.8 % 2.4 % 3%
(rpm)
1100 resistente resistente resistente
500 resistente resistente resistente
250 resistente resistente resistente
El soporte fué resistente a altas agitaciones ya que conservó todo su peso original,
inicialmente se sometió a un hinchamiento por un día y posterior agitación,
también a una agitación directa sin hinchamiento previo, en los dos casos seprodujo un aumento del peso debido a la absorción del agua, no se observó
ningún desprendimiento de partículas. La utilización de este soporte en sistemas
altamente agitados es favorable, se piensa que el soporte ayudará a aumentar la
transferencia de masa y por consiguiente mejorar la reacción.
4.3.3 Solubilidad y degradabilidad
La quitina es un polisacárido altamente hidrofóbico, insoluble en agua y en
diferentes solventes orgánicos, el quitosano es el producto D-acetilado de la
quitina es soluble en ácidos diluidos tales como ácido acético y fórmico [35].
Tres cilindros secos de quitosano con glutaraldehido fueron sumergidos sin
agitación en diferentes solventes por un tiempo de 3 días observando
cualitativamente su comportamiento. Los resultados se observan en la tabla 22.
Tabla 23. Solubilidad en diferentes solventes
Pruebas: solubilidad Hinchamiento
Mezcla de reacción de Insoluble No
transesterificación
Mezcla de reacción de hidrólisis Insoluble Si
Mezcla de reacción de esterificación Insoluble No
Hexano Insoluble No
Ácido acético glacial* soluble -
Ácido acético acuoso soluble -
Hidróxido de sodio acuoso Insoluble Si
Glicerina Insoluble No
Isooctano Insoluble No
Agua Insoluble Si
* A un tiempo de 24h se disolvió parcialmente, al cabo de48 h se disolvió
totalmente.
El soporte catalítico es soluble en soluciones de ácido acético e insoluble en los
demás solventes. El soporte presentó un hinchamiento al sumergirlo en soluciones
acuosas, comprobándose el estado hidrofílico del soporte al absorber moléculas
de agua. La utilización del soporte en sistemas reaccionantes es favorable debido
a su insolubilidad en mezclas tipo hidrólisis, esterificación y transesterificación lo
cual es conveniente para esta clase de sistemas biocatalíticos.4.3.4 Swelling
El swelling o hinchamiento es en un aumento del tamaño de la malla de la red
polimérica [70]. Cuatro muestras fueron sumergidas en la mezcla de reaccionante
de hidrólisis a 25 °C, el proceso de swelling se analizó durante 4 días
encontrándose un aumento del peso contra el tiempo (Figura 22).
Figura 22. Hinchamiento de muestras en hidrólisis a 25ºC
0,03
0,025 )rg(
artseum
0,02
0,015 Hidrólisis 1 al
ed
Hidrólisis1
oseP
0,01 Hidrólisis2
Hidrólisis2
0,005
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (h)
Se tomó un promedio de las cuatro muestras de quitosano, encontrándose un
factor de swelling a cada tiempo Figura 23.
Figura 23. Swelling a cada intervalo de tiempo
90
80
70
60
50 )%(
40
G
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo (h)
El grado de hinchamiento para los cilindros a concentración de 3% de quitosano
fue considerable, encontrándose que el soporte se hinchó en un 77,16 % al cabo
de 96 horas en la reacción de hidrólisis bajo agitación a 25 °C.4.3.5 Medición de rango de poro
La morfología observada para las tres concentraciones de quitosano secadas por
criogelificación (crioconcentración) cualitativamente fue distinta (Figura 24 a 26).
Las micrografías tomadas a las películas de quitosano corresponden a un tamaño
de 5µm, y se muestran en escala de grises. Las zonas mas oscuras corresponden
a superficies más profundas, donde se encuentran los poros formados. Algunos
perfiles lineales de las micrografías se observan en el grafico de la derecha.
Figura 24. Concentración de quitosano de 1.8 %
Figura 25. Concentración de quitosano de 2.4 %Las rugosidades reportadas para las anteriores micrografías correspondieron a
valores medios entre 229 y 308 nm (tabla 23). Se puede tener una relación entre
la concentración de quitosano y la rugosidad; la estructura de concentración de
quitosano de 1.8 % corresponde a una estructura mas rugosa y una de 3 % a una
superficie menos rugosa. La rugosidad media muestra que el aumento de la
concentración de quitosano generó superficies más homogéneas en la cual el
tamaño de los poros muestran una tendencia a disminuir cuando se aumenta la
concentración, dicha relación concuerda con la teoría.
Tabla 24. Rugosidad Media.
Rugosidad Media (nm)
1.8 % 2.4 % 3 %
308 245 229
Los poros hallados en promedio correspondieron a valores entre 0.226 y 0.195 µm
(226 y 195 nm) lo cual supone macroporos dentro de las estructuras analizadas
(tabla 24), el tamaño de micro y mesoporos que puedan existir dentro de la
superficie del soporte deberá de ser analizada por estudios de porosimetría.
Tabla 25. Porosidad media.
Concentración Poro medio Desviación Poros
Poros/µm2
(%) (nm) estándar detectados
1.8 195 805 37 1.48
2.4 149 535 95 3.80
3 226 560 81 3.24
Para una mejor visualización de la morfología superficial, algunos perfiles lineales
mostrados por el software del equipo se muestran como anexos (Anexo 9).Entre las modificaciones que se realizaron en la producción del soporte se halla la
adición de un entrecruzador como lo es el glutaraldehido que disminuyó el
contenido de agua en la película y consecuentemente el tamaño de poro y
modificó la superficie porosa, otros autores reportan iguales resultados [33], la
figuras 27 y 28 muestran los resultados de la morfología obtenida al adicionar el
glutaraldehido en las dos concentraciones (0.003% - 0.1%) en una relación (25:5
en volumen) de quitosano – glutaraldehido.
Figura 27. Micrografía de Quitosano con Glutaraldehido de 0.003 %
Figura 28. Micrografía de quitosano con Glutaraldehido de 0.1 %
Al aumentar el contenido de glutaraldehido la rugosidad del soporte se ve
afectada disminuyendo de un valor de 410 nm (Figura 27) a un valor de 180 nm
(Figura 28. ) lo cual supone un cambio en la morfología de las superficies, debido
al efecto del entrecruzador, formando estructuras mucho mas fuertes y uniformes
al aumentar la concentración de glutaraldehido. El tamaño de los poros
reportados fueron del orden de 471 ± 1834 y 367±756 respectivamente. El
aumento de la concentración de GA mostró una relación con la disminución de la
rugosidad y el tamaño de poro, generando estructuras mucho mas uniformes.4.3.6 Actividad enzimática del biocatalizador
4.3.6.1 Hidrólisis
La actividad del biocatalizador se determinó en la reacción de hidrólisis de
aceite de oliva; se realizaron tres ensayos de la reacción: 1) Reacción sin
lipasa (blanco), con el fin de verificar si la reacción es espontánea bajo las
condiciones de ensayo 2) Reacción con lipasa libre y 3) Reacción con lipasa
inmovilizada. El método de seguimiento se llevó a cabo por 30 minutos,
titulando los ácidos grasos libres generados (como ácido oleico) con
fenoftaleína al 1 % (tabla 25).
Tabla 26. Gramos de ácido oleico producido con el tiempo
Acido oleico (gr) Acido oleico(gr) Acido oleico (gr)
Tiempo (lipasa inmovilizada) (lipasa libre) (rxn sóla)
0 0,0113 0,0113 0,0113
10 0,041 0,0141 0,0113
20 0,0424 0,01695 0,0113
30 0,0466 0,028 0,0113
Figura 29. Hidrólisis del aceite de oliva (producción del ácido oleico).
0,05
0,04
)rg(
0,03 ocielo
0,02 Lipasa inmovilizada odicA
lipasa libre
0,01
sin lipasa
0
0 10 20 3040
Tiempo (min)
La reacción de hidrólisis no se llevó a cabo espontáneamente durante un tiempo
de 30 minutos, es decir que cualquier cambio se atribuye a la acción de la enzima
(Figura 29). La producción de ácido oleico (ácido graso monoinsaturado que se
encuentra en mayor proporción en el aceite de oliva [44, 59]) con lipasa
inmovilizada es mayor que la producida por la Candida rugosa en estado nativodespués de los 30 minutos de la reacción, se observó una producción más rápida
del ácido en los primeros minutos de la reacción; El uso de lipasas inmovilizadas
aumentó la velocidad de reacción para la hidrólisis bajo las condiciones de ensayo
(40°C y 400 rpm) resultados similares fueron encontrados por Shao y Weng [12].
El comportamiento de la actividad catalítica muestra la relación entre la cantidad
de sustrato producido (µmol) y la cantidad de enzima presente (tabla 26).
Tabla 27. Actividad del biocatalizador en Hidrólisis
TIEMPO Actividad (L. Inmovilizada) Actividad (L.libre)
(h) U/mg enzima U/mg enzima
0 0 0
10 14,79 12,5
20 7,75 12,5
30 5,87 25
Figura 30. Actividad de Candida rugosa en la reacción de hidrólisis.
30
25
)gm/U(
20
Lipasa inmovilizada 15 DADIVITCA
Lipasa libre
10
5
0
0 10 20 30 40
TIEMPO (min)
El comportamiento para cada enzima fue diferente; la enzima inmovilizada
presentó un máximo de 14.79U/mg de enzima a los 10 minutos de reacción,
siendo 1.2 veces mayor que la libre para este período, al cabo de los 30 minutos
se presentó una pérdida de actividad del sistema biocatalítico.
El comportamiento presentado es posible que se deba al proceso de hinchamiento
que se generó en la reacción de hidrólisis, presentando una subsiguiente
lixiviación enzimática lo cual generó a su vez una disminución de la actividad. Se
sugiere que un hinchamiento previo en el sistema reaccionante debe ser realizado
antes del proceso de inmovilización.La reacción de esterificación se llevó a cabo por titulación de los ácidos grasos
libres que desaparecen y siguiendo el método señalado en [23, 27], dentro de un
lapso de 8 horas, el procedimiento al igual que la hidrólisis se monitoreó por
titulación en las reacciones sin lipasa, con lipasa libre y lipasa inmovilizada. Los
resultados de ácido oleico que reaccionó a través del tiempo se pueden ver en la
tabla 27.
Tabla 28. Gramos de ácido oleico en el tiempo
Tiempo Acido oleico (gr Ácido Oleico Acido oleico (gr)
(h) (rxn espontanea) (lipasa libre)) (lipasa inmovilizada)
0 0,254 0,254 0,254
2 h 0,254 0,254 0,254
4 h 0,251 0,252 0,245
6 h 0,250 0,250 0,236
8h 0,247 0,244 0,229
Figura 31. Esterificación del ácido oleico y n-butanol
Rxn espontanea
Lipasa libre
0,260
Lipasa inmovilizada
0,250
)rg(
ociélo
0,240
odicA
0,230
0,220
0 2 4 6 8 10
Tiempo (h)
Las enzimas inmovilizadas generaron una mayor contribución a la reacción de
esterificación en el que el ácido oleico desaparece. El proceso de esterificación sin
catalizador se llevó a cabo espontáneamente bajo las condiciones de ensayo (40°
y 400 rpm). La lipasa inmovilizada produjo una mayor reacción del ácido oleico
que la reacción sin catalizador al cabo de 8 horas, obteniéndose una mayor
conversión del ester.Tabla 29. Actividad del biocatalizador en Esterificación
TIEMPO Actividad (L. Inmovilizada) Actividad (L.libre)
(h) U/mg enzima U/mg enzima
0 0 0
2 0 0
4 6.89 3.86
6 9.22 5.04
8 9.69 9.6
Figura 32. Actividad de Cándida rugosa en la reacción de Esterificación.
12
10
)gm/U(
8
6 dadivitcA
LIBRE
4
INMOVILIZADA
2
0
0 2 4 6 8 10
Tiempo (h)
La actividad enzimática del biocatalizador es 1.83 veces mayor que la actividad
presentada por la enzima libre al cabo de 6 horas bajo las condiciones de ensayo.
El biocatalizador y la enzima libre se encuentran cercanos al cabo de 8 horas, la
enzima inmovilizada aumentó la velocidad de reacción en la esterificación de ácido
oleico y n-butanol bajo las condiciones de ensayo.
El sistema biocatalítico producido fue eficiente y activo para reacciones de
hidrólisis y esterificación, tal y como fue planteado en la hipótesis de la propuesta.
Se cree que las condiciones favorables obtenidas por parte del sistema
biocatalítico fueron debidos a las siguientes propiedades del soporte:
(i) El tratamiento del soporte con glutaraldehido (activación) generó la introducción
de grupos reactivos CHO entrecruzando la matriz, aportando grupos reactivos
para el enlace y estabilizando la estructura del gel (el soporte no se encogió
significativamente en solventes como isooctano).
(ii) El soporte sirve como una reserva de moléculas de agua, por lo que la adición
de agua no fue requerida para ser introducida dentro del sistema reaccionante.(iii) Los soportes (cilindros) producidos pueden ser usados dentro del sistema
reaccionante hasta con agitación intensa sin daño de su estructura.
El soporte producido muestra una favorable tendencia a ser utilizado en procesos
continuos, como reactores PFR. Ensayos de reutilización del soporte bajo
condiciones continuas fueron probados para contrastar los resultados encontrados
(Figura 33 y 34).
Figura 33. Reutilización del biocatalizador (actividad) en hidrólisis
7
6
5
)gm/U(
4
dadivitcA
3
2
1
0
0 2 4 6 8
Número de reciclos120
100
dadivitca
80
60 ed
ejatnecroP
40
20
0
02468
Número de reciclos
El valor de actividad del biocatalizador se pierde con el tiempo de
almacenamiento y la reutilización. El sistema biocatalítico se reciclo ocho días
después de participar por primera vez en la reacción de hidrólisis las figuras 33 y
34 se encuentran influenciadas por el almacenamiento y al mismo tiempo por el
número de reciclos.
Los primeros reciclos disminuyeron en mayor proporción la actividad (más del
50%), después del cuarto reciclo la enzima no mostró ninguna actividad. La
influencia del tiempo de almacenamiento fue notoria en el primer reciclo. Se cree
que el factor que influenció la perdida de actividad fue debido al hinchamiento del
soporte que pudo generarse en la reacción de hidrólisis y una subsecuente
lixiviación así como también una posible desactivación enzimática. Los resultados
de pérdida de actividad con el número de reciclos y el swelling fueron reportados
por Shao y Wen [12].5. CONCLUSIONES
El método de secado convectivo redujo en mayor proporción el tamaño de los
pellets, generando un soporte compacto y de color amarillo con humedades
inferiores al 15 % y actividades de agua de 0.4-0.45 a 25ºC.
La criogelificación (crioconcentración) generó un soporte de tamaño similar al
inicial, de textura blanda y de color blanco con humedades entre 15 % y 80% y
actividades de agua entre 0.5-0.95.
La resistencia térmica del soporte se estimó en 100ºC debido a que a
temperaturas superiores cambió de color, posiblemente se atribuyó a la
eliminación de otros compuestos distintos del agua.
Los valores de humedad final del método de secado por estufa (a 100°C)
presentan una diferencia del 5% en promedio con respecto al método del Kart
Fischer.
El método de secado convectivo no generó una porosidad adecuada para los
fines que se estaban buscando.
La criogelificación (crioconcentración) no permitió obtener una geometría esférica,
mientras que fue viable para producir láminas y cilindros.
El tiempo adecuado para obtener soportes con actividades de agua de 0.4-0.45 a
25ºC y humedades del 10-20 % fue de 5-6 días.
Los cilindros de quitosano proporcionaron un buen soporte para la inmovilización
de lipasas; por ser fáciles de reproducir, tienen forma regular útil en procesos de
simulación, son resistentes a la abrasión y fuertes en sistemas agitados. Las
láminas bajo agitación fuerte desprendieron fragmentos de quitosano formando
superficies redondas en sus aristas.
La enzima XX Split posee una concentración 1.2 % de proteína (Método de
Kjeldah) y 2.15 % (método del ácido bisinconilico), para la utilización de esta
enzima en la inmovilización enzimática se debe de concentrarla utilizando
centrifugación.
Se encontró que de los tres niveles de glutaraldehido probados, la concentración
de 0.003 % generó los mejores resultados para la inmovilización de lipasa
Cándida Rugosa (CRL) por un tiempo de 15 horas.
La enzima XX Split presentó una posible solución tampón en su estado nativo, ya
que al solubilizarla en buffer de fosfato de sodio a 7.3 el pH bajó hasta pH 5.63.El grado de D-acetilación del quitosano utilizado fue del 68.86% (método de
pastilla) y del 53 % (método lámina) el cual exhibe propiedades características de
este valor, tales como gelificación a pH cercanos a la neutralidad y velocidades de
degradación más pequeñas. Se presume que hubo una interferencia de la
humedad en las muestras.
Un aumento del contenido de glutaraldehido y de enzima afectó la absorbancia de
los grupos amida I (~1650). Una alta concentración de glutaraldehido (0.1%)
mostró un cambio en el pico del grupo amina, de un pico notorio a un hombro
característico debido a la interacción entre el glutaraldehido y los grupos amino
disponibles del quitosano.
El soporte de inmovilización (cilindros) fue resistente a la agitación a revoluciones
de 1100 rpm sin importar la concentración de quitosano utilizada, la agitación
incrementa el hinchamiento del soporte en soluciones acuosas.
El soporte catalítico es soluble en soluciones de ácido acético e insoluble en los
demás solventes probados.
El grado de hinchamiento para los cilindros a concentración de 3% de quitosano
es considerable, encontrando que el soporte se hincha en un 77,16 % al cabo de
96 horas en la reacción de hidrólisis bajo agitación a 25 °C.
Las micrografias de AFM mostraron que la morfología superficial observada para
las tres concentraciones de quitosano secadas por criogelificación
(crioconcentración) cualitativamente es distinta. Puede haber una relación entre la
concentración de quitosano y la rugosidad; la estructura de 1.8 % corresponde a
una estructura mas rugosa y la de 3 % a una superficie menos rugosa.
El tamaño de poro determinado por AFM utilizando software SPIP correspondió a
valores entre 0.226 y 0.195 µm (226 y 195 nm) en promedio, lo cual supone
macroporos en promedio dentro de las estructuras analizadas.
El aumento de la concentración de GA muestra una relación con la disminución de
la rugosidad y el tamaño de poro, generando estructuras más uniformes y fuertes.
La reacción de hidrólisis de aceite de oliva no se llevó a cabo espontáneamente
durante un tiempo de 30 minutos. La enzima inmovilizada presentó un máximo de
14.79U/mg de enzima a los 10 minutos de reacción, siendo 1.2 veces mayor que
la libre para este periodo, al cabo de los 30 minutos se presento una pérdida de
actividad del biocatalizador. El comportamiento presentado es posible que se deba
al proceso de hinchamiento que se generó en la reacción de hidrólisis,
presentando una subsiguiente lixiviación enzimática lo cual generó la disminución
de la actividad.
El proceso de esterificación de ácido oleico y n-butanol sin catalizador se llevó a
cabo espontáneamente bajo las condiciones de ensayo (40° y 400 rpm). LaActividad enzimática del biocatalizador es 1.83 veces mayor que la actividad
presentada por la enzima libre al cabo de 6 horas bajo las condiciones de ensayo.
El sistema biocatalítico producido fue eficiente y activo para reacciones de
hidrólisis y esterificación. Se cree que las condiciones favorables obtenidas por
parte del biocatalizador fueron debidos a las siguientes propiedades del soporte:
(i) El tratamiento del soporte con glutaraldehido (activación) generó la introducción
de grupos reactivos CHO entrecruzando la matriz, aportando grupos reactivos
para el enlace y estabilizando la estructura del gel (el soporte no se encogió
significativamente en solventes como isooctano).
(ii) El soporte sirve como una reserva de moléculas de agua, por lo que la adición
de agua no fue requerida para ser introducida dentro del sistema reaccionante.
(iii) Los soportes (cilindros) producidos pueden ser usados dentro del sistema
reaccionante hasta con agitación intensa sin daño de su estructura.
El soporte producido se adapta a las condiciones necesarias para ser utilizadas
en procesos continuos (reactor PFR) y en medios orgánicos.
Los primeros reciclos en la reacción de hidrólisis disminuyen en mayor proporción
la actividad (más del 50%), después del cuarto reciclo la enzima no mostró
ninguna actividad.
El valor de actividad del biocatalizador se pierde con el tiempo de
almacenamiento y la reutilización. Se cree que el factor que influenció la perdida
de actividad se debió al hinchamiento del soporte que pudo generarse en la
reacción de hidrólisis y una posible desactivación enzimática.
Según los resultados de estabilidad del soporte y la actividad del sistema
biocatalitico en medio orgánico se espera que este sea apropiado para la catálisis
de sistemas orgánicos como la transesterificación, especialmente para la
producción de Biodiesel.6. RECOMENDACIONES
Para la formación de esferas como hidrogeles el uso de soluciones menos
viscosas (concentración de 1.8%) genera menos problemas; en el caso de laminas
y cilindros las soluciones mas concentradas son ideales para ser utilizadas.
Estudiar el efecto del tamaño del pellet sobre la actividad enzimática, ya que un
soporte más pequeño incrementa su área superficial y aumenta la efectividad.
El procedimiento de la gelificación debe ser extendido trabajando a temperaturas
mas bajas con el propósito de incrementar su capacidad de absorción de enzima.
Se recomienda para posteriores estudios utilizar el método de secado por
liofilización para compararlo con los resultados obtenidos por el método de
criogelificación (crioconcentración).
Se propone utilizar un adecuado almacenamiento libre de humedad ya que el
quitosano es biodegradable y puede generarse algún tipo de riesgo a la
contaminación por microorganismos.
Medir la actividad del sistema biocatalítico a diferentes tiempos de
almacenamiento que impliquen varios meses para determinar el grado de
actividad residual.
Para utilizar adecuadamente la enzima XX Split se deberá encontrar un método de
purificación más efectivo para que los componentes de la misma no influyan en
posteriores análisis.
El uso de otras enzimas podrá seguir el mismo protocolo generado siempre y
cuando la enzima tenga alto grado de pureza y los grupos funcionales adecuados
para ser ligada al soporte. En el caso de utilizar enzimas soportadas se
recomienda la disolución seguida de la centrifugación para eliminar cualquier
material insoluble y ser utilizada en la inmovilización por enlace covalente.
Se sugiere que para un posterior trabajo se manejen blancos y se genere un
análisis mas profundo para escoger la concentración de GA, en el cual se
determine la real adición por enlace covalente de la enzima, ya que el soporte
podría llegar a absorber parte de la enzima según los tratamiento generados por
absorción iónica.
Las muestras para FTIR deberán de ser sometidas a un secado riguroso de tal
manera que se pueda eliminar el agua que interfiere en la medida del grado de D-
acetilación. Algunos autores recomiendan secados de 16 h a 80 °C [14].Para encontrar valores mas confiables del grado de D-acetilación se propone
realizar varias muestras (diferentes replicas) y realizar un análisis estadístico,
debido a que los resultados para una misma muestra pueden variar entre si.
Un estudio del grado de hinchamiento en medio orgánico y su comportamiento a
diferentes temperaturas es necesario para definir en concreto el potencial de
reutilización del sistema biocatalítico.
Se aconseja obtener micrografías por SEM y XPS con el objeto de comparar el
cambio de la superficie del soporte cuando se inmoviliza la enzima en el
quitosano.
Se recomienda estudios de porosimetría para analizar el tamaño de micro y
mesoporos que puedan existir dentro de la superficie del soporte.
Se recomienda que en trabajos futuros se analicen variables como: la
temperatura, pH, concentración de solución enzimática a inmovilizar, medio de
activación de la enzima y el tiempo de acondicionamiento que permitan el
adecuado desempeño de la enzima.
Se aconseja realizar el análisis de actividad de agua del soporte para el mejor
desempeño de la enzima, y con ella equilibrar el sistema biocatalítico que hará
parte del sistema reaccionante orgánico.
Se aconseja realizar el estudio cinético del sistema reaccionante con el propósito
de utilizar estos resultados en posteriores simulaciones.
Es necesario encontrar un método de reactivación enzimática, una vez se
presente la desactivación enzimática.
Se sugiere un hinchamiento previo en el sistema reaccionante antes del proceso
de inmovilización.
El uso de éste sistema biocatalítico se recomienda para la producción de
Biodiesel, debido a que presenta buenas características para ser utilizado como
catalizador, mostrando una favorable tendencia en procesos continuos como en
reactores PFR. Se recomienda un análisis más preciso en los reciclos para
sistemas orgánicos ya que se cree que el catalizador conservará más la actividad
puesto que en éstos sistemas no ocurre un hinchamiento considerable.Anexo 1. Procedimiento de gelificación
Solución Inicial Ac. Acético 1 %
Quitosano 3 %
(disolución
Método de Inyección
Solución Iónica NaoH (0.5 N)
EtOh (26 %)
(3 horas)
Lavado Agua destilada
(ph Neutro)
SecadoAnexo 2. Procedimiento de secado
Hidrogel
Secado Convectivo Secado criogelificación
(Crioconcentración)
Temperatura 25 °C
Temperatura -17 °C
Exposición ambiente 5 días
Exposición 24 h
Temperatura 25°C
Exposición 1 h
Temperatura -17°C
Exposición 24 h
Temperatura 25°C
Exposición 1 h
Temperatura -17°C
Exposición 3-5diasAnexo 3. Procedimiento de enlace covalente
Hidrogel seco
Enlace Con Entrecruzador Glutaraldehido
(tiempo 1.5 h) 0.003 % w/w
Filtración
Lipasa 0.5 %p/v
Enlace covalente con lipasa
Na- Fosfato buffer pH 7.3
(Tiempo 15 h)
Na- Fosfato buffer
Lavado 1
pH 7.4
Na- Fosfato buffer
Lavado 2
pH 7.4
Tris Hcl pH 8
Bloqueo de CHO
(Tiempo 2h)
Lavado y almacenamiento Na- Fosfato buffer
(T = 4 °C) pH 7.4Anexo 4. Método de biuret
A continuación se menciona el procedimiento de carga de proteína analizado por
método calorimétrico en espectrofotómetro UV a 550 nm.
Paso 1. Preparación de solución de Biuret.
Se disuelven 1.5 g de CuSO .5H O y 6 gramos de NaKC H O en 500 ml de agua
4 2 4 4 6
destilada. Luego se adiciona 300 ml al 10 % de NaOH con agitación constante.
Diluya 1 a 1 con agua destilada y deje en reposo en lugar oscuro en una botella de
polietileno.
Paso 2. Curva de calibración.
La curva de calibración se realiza con un patrón de proteína (solución de albúmina
conocido x mg /ml) a diferentes concentraciones con agua destilada que totalicen
2 ml, a lo anterior adicionar 4 ml de solución de biuret. Se rotulan y se dejan en
reposo por 30 minutos a temperatura ambiente o por 10 minutos a 30° C para el
desarrollo del color.
Paso 3. Análisis de muestras.
A una muestra de 2 ml adicionar 4 ml de solución de biuret y se lee el porcentaje
de transmitancia a 550 nm. Tener en cuenta que la curva de calibración le permite
construir una gráfica que es una recta con pendiente K con lo que la concentración
de muestras desconocidas es fácilmente identificable a partir de la ecuación 2
C=A/K Ecuación 1
Donde A es la absorbancia de la muestra problema y K la pendiente de la recta
originada a partir de la curva de calibración.Anexo 5. Hidrogeles de quitosano
Hidrogeles de esferas a diferentes concentraciones (2.4 % y 3%)
Hidrogeles de laminas a diferentes concentraciones (1.8 y 2,4 %)
Hidrogeles de cilindros a diferentes concentraciones (1.8 y 2,4 %)ANEXO 6. Métodos de secado
Esferas secas a 2.4%
(Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo)
Esferas secas a 3%
(Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo)Laminas secas a 2.4%
(Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo)
Laminas secas a 1.8 %
(Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo)Cilindros secos a 2.4%
(Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo)
Cilindros secos a 1.8%
(Criogelificación (Crioconcentración) y convectivo).Anexo 7. Espectros de infrarojo
Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.003 % w/w y
0.5 % p/v.
Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.003 % w/wLamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.01 % w/w y
0.5 % p/v.
Pastilla de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.01 % w/w y
0.5 % p/v.Lamina de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.01 % w/w
Pastilla de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.1 % w/wPastilla de quitosano de 1,8 % combinada con glutaraldehido a 0.1 % w/w y 0.5 %p/vAnexo 8. Espectro de lipasa
Espectro de lipasa en transmitancia
Espectro de lipasa en absorbanciaAnexo 9. Perfiles Lineales de AFM
Laminas de concentracion de quitosano de 1.8 %Laminas de concentracion de quitosano 2.4 %Laminas de concentracion de quitosano 3 % lamina de 5 µmLaminas de concentracion de quitosano 3 % lamina de 2 µmAnexo 10. Datos Experimentales
Dimensiones iniciales y finales de las laminas
LC1
Dimensiones Iniciales Dimensiones Finales
L1 L2 H L1 L2 H
8,51 9,25 8,71 9,1 7,7 3,58
11,07 9,66 4,59 7,25 8,86 1,51
9,79 10,33 6,64 7,36 9,66 1,81
8,64 9,27 5,78 8,37 8,03 3,15
10,53 9,26 4,28 9,51 9,81 1,18
9,59 9,86 4,41 9,14 8,13 1,46
7,45 9,04 6,68 8,25 9,19 1,94
10,18 11,2 4,93 8,45 9,24 1,58
10 11,67 3,31 6,63 8,81 2,74
LC2
Dimensiones Iniciales Dimensiones Finales
10,8 11,92 6,93 8,49 8,03 5,38
10,08 10,69 8,14 7,36 7,71 4,37
9,87 10,64 7,61 7,73 9,63 5,02
9,72 11,43 8,12 7,9 7,93 4,67
10,79 10,76 7,81 7,76 8,27 5,45
8,7 9,06 8,66 5,99 9 6,1
10,12 10,56 7,59 7,64 7,32 4,7
10,84 10,7 8,64 7,95 8,3 5,33
10,36 10,01 7,53 9,04 8,23 4,28
10,87 9,36 8,33 6,96 8,58 4,23
8,67 10,34 8,22 8,77 6,78 5,21
8,39 9,55 7,77 8,64 8,17 5,19
10,61 9,7 7,68 8,65 8,19 4,79
10,54 11,23 7,89 7,73 6,95 4,33
10,36 11,3 8 8,69 7,54 5,68
LC3
Dimensiones Iniciales Dimensiones Finales
8,55 9,72 8,17 8,58 7,35 7,14
8,55 11,75 10,51 8,7 9,42 6,81
9,23 10 9,54 10,81 9,69 6,39
8,96 12,17 9,28 9,32 8,59 5,869,9 12,03 9,81 9,16 7,83 5,94
8,49 9,53 9,04 6,49 7,86 9
9,45 9,04 10,45 10,47 8,14 7,54
9,01 8,45 9,11 9,59 7,52 5,96
9,32 8,69 7,85 7,13 7,42 5,78
9,04 7,33 10,01 7,79 8,87 8,22
8,15 10,47 10,98 8,84 7,52 7,46
9,29 7,97 7,78 8,2 9,91 6,84
8,66 9,67 10,15 7,42 7,91 6,38
7,56 8,94 8,52 7,34 8,14 7,11
7,86 8,19 7,14 7,25 7,42 5,79
7,33 9,65 9,44 8,73 8,1 6,06
8,47 8,15 8,01 9,21 8,25 6,72
LA1
Dimensiones Iniciales Dimensiones Finales
9,96 11,52 6,37 3,4 3,98 0,89
12,34 10,07 4,12 3,93 3,6 1,74
9,88 9,15 3,45 3,78 3,9 2,12
9,09 10,59 6,13 3,55 3,64 1,95
9,19 9,9 7,45 3,04 3,55 1,79
9,97 9,17 4,53 2,67 3,75 1,61
9,33 8,11 5,21 11,81 4,96 0,13
9,33 13,26 3,07 3,65 4,37 1,38
9,88 11,12 6,71 3,87 3,96 0,89
LA2
Dimensiones Iniciales Dimensiones Finales
7,67 9,4 7,3 4,1 3,52 2,37
11,23 8,42 7,86 3,43 2,76 2,71
9,96 9,46 7,23 5,01 4,28 2,21
11,7 10,56 7,48 3,64 4,05 2,41
9,82 9,88 8,68 3,42 4,06 1,91
9,34 9,79 7,59 2,78 3,13 2,55
8,97 10,12 7,77 3,58 3,55 2,26
9,46 9,96 7 3,23 3,67 2,45
9,43 10,02 8,92 3,26 2,95 2,59
9,33 9,59 6,56 3,71 2,99 2,18
9,92 8,82 6,97 3,08 3,47 2,07
10,18 9,67 7,57 3,4 3,27 1,91
11,5 9,48 8,15 3,02 3,06 1,8
10,92 9,46 8,28 3,07 3,13 2,51
8,61 10,44 7,94 2,82 4,14 3,07
LA3Dimensiones Iniciales Dimensiones Finales
9,3 8,58 9,44 3,76 3,05 3,55
8,64 10,5 9,77 3,07 3,43 3,18
10 8,39 3,17 4,37 2,87
9,02 11,74 8,93 4,12 4,54 2,55
10,83 10,34 6,74 3,06 2,95 3,69
8,86 8,29 9,49 2,82 3,09 3,56
11,54 8,76 8,51 4,08 3,22 3,15
8,54 10,24 8,54 3,02 2,94 3,86
8,92 10,97 8,28 3,75 3,14 3,04
10,13 8,44 7,52 3,01 3,5 3
10,56 8,91 8,11 3,53 4,17 3,12
10,07 10,2 8,76 3,14 4,32 2,56
8,9 9,56 8,82 3,28 3,56 2,74
8,32 11,95 7,75 4,71 3,84 2,39
8,35 8,5 8,29 3,11 5,01 2,24
8,3 8,6 8,15 3,7 3,68 2,79
8,59 9,71 7,3 4,35 3,78 2,75
LC1 Láminas de concentración de quitosano de 1.8 % secadas por criogelificación
(crioconcentración).
LC2 Láminas de concentración de quitosano de 2.4 % secadas por criogelificación
(crioconcentración).
LC3 Láminas de concentración de quitosano de 3 % secadas por criogelificación
(crioconcentración).
LA1 Láminas de concentración de quitosano de 1.8 % secadas convectivamente.
LA2 Láminas de concentración de quitosano de 2.4 % secadas convectivamente
LA3 Láminas de concentración de quitosano de 3 % secadas convectivamente
Dimensiones iniciales y finales de las esferas
DIMENSIONES INICIALES
1,80% 2,40% 3%
2,96 4 4,41
2,84 3,7 4,52
2,98 3,98 4,44
2,88 3,96 4,5
2,83 4,1 4,1
2,94 3,99 4,3
3,99 4,49
3,7 4,1
3,99 4,48
4,12 4,45
3,71 4,4
3,97 4,49
3,7 4,4
3,99 4,51
4,1
3,97 4,443,98 4,44
3,95 4,2
3,96 4,1
3,88 4,31
3,6 4,5
EC1 EC2 EC3
10%=40 10%=22 10% =10
Dim.delgada Diametro Dim.delgada Diametro Dim.corta Diametro
0,52 3,54 1,63 3,87 2,41 2,87
0,39 2,08 1,3 3,25 2,66 3,09
1,18 2,18 1,48 2,95 2,18 3,61
1,42 2,89 1,42 2,94 1,75 3,12
1,8 2,52 1,86 2,82 2,73 3,28
1,28 2,15 1,67 2,56 2,22 3,1
1,26 2,94 1,9 3,24 2,27 3,6
0,74 2,78 1,43 3,27 1,48 3,3
1,64 2,52 1,47 2,87 1,49 2,78
0,9 2,91 1,47 3,35 2,92 3,9
0,63 2,15 1,79 3,21
0,97 2,56 2,08 3,05
1,31 2,36 1,77 2,42
1,63 2,51 1,41 3,01
1,14 2,73 1,87 2,4
1,65 2,37 1,78 2,91
1,35 2,19 1,65 2,8
1,37 1,92 1,36 3,08
0,63 2,1 2,05 2,44
1,29 2,13 1,4 2,83
1,35 2,55 1,3 2,57
1,6 2,53 1,79 3,8
1,85 2,67
1,36 2,39
1,39 2,36
1,44 2,03
2,25 2,17
1,63 2,71
1,66 2,51
1,3 2,34
0,84 3,46
1,6 3,6
1,36 2,33
1,74 2,33
0,65 3,14
1,55 2,13
1,73 2,24
0,93 2,01
1,39 2,391,49 1,96
EA1 EA2 EA3
Dim. Diámetro Dim. Diámetro Dim. Dim. Diámetro Dim.
pequeña corta larga corta larga
0,54 1,41 1,1 1,11 1,36 1,77 1,81 3,36
0,79 1,34 1,26 1,4 2,9 1,61 1,81 3,87
0,58 1,33 1,24 1,3 2,81 1,44 1,93 3,77
0,68 1,45 1,12 1,26 4,43 1,54 1,94 4,84
0,51 1,48 0,95 1,6 1,6 1,47 2,2 4,75
0,8 1,19 0,71 1 1,8 1,54 2,13 5,62
0,59 1,23 0,88 1,13 1,12 1,48 1,9 4,53
0,41 1,49 0,92 1,12 1,8 1,43 2,03 5,21
0,69 1,47 0,93 1,03 1,73 1,64 2,53 4,59
0,6 1,49 1,2 1,27 2,52 1,36 1,85 4,67
0,58 1,48 1,48 1,63 3,08
0,73 1,4 0,82 0,84 2,29
0,6 1,2 0,89 0,95 2,66
0,8 1,34 0,88 1,02 1,28
0,58 1,9 0,67 0,96 1,86
0,68 1,55 0,89 1,03 2,54
0,51 1,51 0,75 1,02 2,17
0,74 1,41 0,89 1,34 2,16
0,54 1,54 0,95 1,16 1,59
0,47 1,23 1,52 1,65 2,61
0,65 1,29 1,08 1,43 3,95
0,77 1,33 0,69 1,06 2,26
0,87 1,09 0,87 1,4 1,4
0,65 1,19 1,5 1,51 3,21
0,89 1,22
0,73 1,27
0,72 1,26
0,77 1,31
0,37 1,28
0,31 1,52
0,65 1,25
0,74 1,08
0,46 1,44
0,69 1,39
0,8 1,16
0,61 1,56
0,69 1,38
0,64 1,16
0,7 1,14
0,67 1,14
0,74 1,3EC1 Esferas de concentración de quitosano de 1.8 % secadas por criogelificación
(crioconcentración).
EC2 Esferas de concentración de quitosano de 2.4 % secadas por criogelificación
(crioconcentración).
EC3 Esferas de concentración de quitosano de 3 % secadas por criogelificación
(crioconcentración).
EA1 Esferas de concentración de quitosano de 1.8 % secadas convectivamente.
EA2 Esferas de concentración de quitosano de 2.4 % secadas convectivamente
EA3 Esferas de concentración de quitosano de 3 % secadas convectivamente
Dimensiones iniciales y finales de los cilindros
1,80% 2,40% 3%
Diámetro Longitud Diámetro Longitud Diámetro Longitud
3,21 4,88 5,29 5,04 4,54 5,62
3,75 4,48 4,08 4,96 4,64 5,97
3,28 5,07 4,28 6,2 5,16 5,73
3,12 4,84 4,73 5,78 4,6 6,12
3,19 5,37 4,26 6,35 3,97 4,89
3,37 4,99
3,36 5,22
3,04 4,36
3,19 5,14
CA1 CA2 CA3
Diámetro longitud Diámetro longitud Diámetro longitud
1 2,59 1,23 2,62 1,6 1,86
1,28 2,77 1,25 3,16 1,54 1,66
1,2 2,43 1,21 2,45 1,42 2,91
1,119 2,35 1,23 2,44 1,1 3,16
0,95 3,35 1,37 2,6 1,71 2,25
1,18 2,42 1,31 2,45 1,39 2,91
1,24 2,11 1,6 2,56 1,55 2,61
0,97 2,4 1,24 2,34 1,97 2,84
1,06 2,8 1,56 2,28 1,92 2,34
1,22 2,58 1,35 2,13 1,48 2,17
1,2 2,59 1,4 1,88 1,57 2,74
1,37 2,67 1,43 2,44
1,1 3,07 1,19 2,2
1,26 2,24 1,5 1,92
1,1 2,21 1,12 2,42
1,02 2,48 1,27 1,92
1,09 2,51 1,21 2,36
0,95 2,6 1,15 1,96
1,24 2,44 1,17 2,07
0,93 2,06 1,35 2,2
1,15 2,25 1,4 2,31 2,95
1,13 2,34
0,92 2,79
1,27 2,06
1,16 2,62
CC1 CC2 CC3
Diámetro longitud Diámetro longitud Diámetro longitud
2,27 4,55 3,1 3,43 2,72 4,48
2,18 4,08 1,88 4,5 2,7 5,32
1,8 4,77 1,8 3,47 3,35 4,49
1,84 4,79 3,1 3,72 2,75 5,73
2,12 4,73 2,46 3,37 2,85 4,18
1,93 4,82 3,17 3,26 3,74 4,71
2 4,9 2,9 3,85 3,16 3,94
1,81 5,39 3,03 3,33 3,31 4,2
1,82 3,84 3,26 4,13 3,16 5,43
2,3 4,9 2,36 4,52 3,59 4,58
1,6 3,77 2,36 3,96 3,12 4,09
1,63 3,39 3,31 3,33 3,23 4,69
2,4 3,69 2,23 4,83 2,85 5,02
2,26 4,41 3,22 4,58 3,06 4,89
2,02 3,76 2,88 4,7 2,82 5,15
1,75 3,4 3,04 5,16 3,11 3,77
2,2 4,07 3,16 4,83 3,08 3,74
2,1 4,06 2,76 4,39 3,27 4,18
1,72 4,98 2,98 3,79 3,86 4,57
2,3 4,81 2,79 3,28 3,08 4,17
1,38 4,37 2,93 5,37 3,23 4,233
1,37 3,61 2,78 4,44
2,8 5,2 2,21 4,03
1,98 5,37 2,86 5,13
2 4,61 3,25 1,8
1,53 4,46 3,45 3,85
1,94 4,15 3,05 4,79
1,94 3,78 3,72 4,11
2 4,33 3,06 3,52
2,1 4,96 2,74 3,55
2,06 4,56 2,88 3,47
2,02 4,37 2,65 3,2
1,18 5,52 2,79 4,08
2,08 4,73 2,62 4,88
1,83 5,38
1,74 3,96
1,79 5
1,8 5,83CC1 Cilindros de concentración de quitosano de 1.8 % secadas por criogelificación (crioconcentración).
CC2 Cilindros de concentración de quitosano de 2.4 % secadas por criogelificación
(crioconcentración).
CC3 Cilindros de concentración de quitosano de 3 % secadas por criogelificación
(crioconcentración).
CA1 Cilindros de concentración de quitosano de 1.8 % secadas convectivamente.
CA2 Cilindros de concentración de quitosano de 2.4 % secadas convectivamente
CA3 Cilindros de concentración de quitosano de 3 % secadas convectivamenteBIBLIOGRAFIA
1. ALSARRA, Ibrahim. A. Effects of preparative parameters on the properties
of chitosan hydrogel beads containing candida rugosa lipase. Biomaterials.
2003.
2. ARROYO, Miguel. Inmovilización de enzimas. Fundamentos, métodos y
aplicaciones. Departamento de Bioquímica y Biología Molecular. Facultad
de Ciencias Biológicas. Universidad Complutense de Madrid. Madrid.1999.
3. ARROYO, Miguel et al. Thermal stabilization of immobilized lipase B from
Candida antarctica on different supports: effect of water activity on
enzymatic activity in organic media. Enzyme Microb Technol. 2000.24:3–12.
4. BALCAO, VM, Paiva AL, Malcata FX. Bioreactors with immobilized lipases:
state of the art. Enzyme Microb. 1996.
5. BALLESTEROS, Antonio et al. Estabilidad de los biocatalizadores.
Investigación y ciencia. Junio. 1999.
6. BAOXUE, Mamoru Iso et al. Production of biodiesel fuel from triglycerides
and alcohol using immobilized lipase. Journal of molecular catalysis b:
Enzimatic 16. 2001. 53-58.
7. BERGER, j et all. Structure and interactions in covalently and ionically
crosslinked chitosan hidrogels for biomedicals applications. Eurepean
Jounal of Pharmaceutics and biopharmaceutics. 2004. Vol, 57. pg 9-34.
8. BUTHE, A et al. Waste edible oils and fats for biodiesel production by
lipase-catalyzed transesterification. Biotecnology. Aachen University. 2002.
9. CASTAÑO, Leandro y TORRES, J Andrés. Propuesta de trabajo de grado
Obtención De Biodiesel A Partir De Aceite De Palma Utilizando Enzimas
Libres. Agosto de 2003.
10. CHEETAN, Peter S, J. What Makes a good biocatalyst?. Journal of
Biotechnology. 66. 1998. 3-10.
11. CHIBATA, Ichiro, et tal. Applied Biochemestry and Bioengineering.
Academic Press. Volumen 4.
12. CHIOU, Shao – Hua. WU, Wen - Teng. Inmovilization of candida rugosa
lipase on chitosan with activation of hydroxyl groups. Biomaterials. Vol, 25.
2004. pg, 197-204.13. DOSANJH, Nirpjit. Immobilization, stability and esterification studies of a
lipase from a Bacillus sp. Biotechnology aplicattion Chemestry. 2002. 36, 7-
12.
14. DUARTE, M. L et al. An optimised method to determine the degree of
acetylation of chitin and chitosan by FTIR spectroscopy. International
Journal of Biological Macromolecules 31. 2002. 1_/8.
15. DUMITRIU, S. Et al. Lipase immobilization into porous chitoxan vedas:
activities in aqueos and organic media and lipase localization.
Biotecnology progress. Vol,17. 2001. pg, 734-737.
16. FENG, Qian et al. Self assembly and characterization of polyelectrolyte
complex films of hyaluronic acid/chitosan. Colloids and surfaces a:
Physicochem. Eng. Aspects article in press. 2004.
17. FOGLER H. Scott. Elementos de ingeniería de las reacciones
químicas.Tearson educación, Mexico. 2001.
18. FULTON, James W. Making the Catalist. Chemical Engineering. Ce
Refresers. Julio. 1986.
19. GACESA, Peter y HUBBLE, John. Tecnología de las enzimas.Editorial
Acribia, S.A. Zaragoza -España. 1990.
20. GARCIA, Rosangela y Et al. Caracterizacao de Quitosana por
cromatografia de permeacao em gel – influencia do metodo de preparacao
e do solvente. Quim nova, Vol 24, N° 1. 2000. pg, 13-17.
21. GAVIRIA, Luis Enrique et al. Manual de metodos analíticos para el control
de calidad en la industria alimentaria.1996.
22. GHOSE, T, K, et tal. Advances in Biochemical Engineering Inmobilized
Enzymes I. Tomo 10. Springer-Verlay. Cap. Carriers For Inmobilized
Biologically Active Systems. 1978.
23. HAULIN, Maja Et al. Synthesis os oleic acid esters catalyzed by immobilized
lipase. Journal Agriculture food chemical. 44, 1996. 332-338.
24. HERRERA, Jose Luis. Investigación y ciencia. La Quitina. Julio. 1993.
25. HILL, Summer et al. Designer hydrogels for lipase immobilitation. Appl
Microbiol Biotechnol.2004.26. HSU, An-Fei et al. Immobilized lipase – catalysed production of alkil esters
of restaurant grease as biodiesel. Biotechnology applied biochemical. Vol,
36. 2002. pg, 181-186.
27. HSU, An-Fei et al. Inmobilitatión of pseudomonas cepacia lipase in a
phyllosilicate sol-gel matrix effectiveness as a biocatalyst. Biotechnology
applied biocem. 2002. 31, 179-183.
28. INSTITUTO COLOMBIANO DE NORMAS TECNICAS. Documentación.
Presentación de tesis, trabajos de grado y otros trabajos de investigación.
Cuarta actualización.2000.
29. JAEGER, KE, Reetz TM. (1998) Microbial lipases from versatile tools for
biotechnology. Trends Biotechnol 1998;16: 396–403.
30. KANDANI, N Chaput Et al. Rheological Characterisation of thermogelling
chitosan/glicerol-phosphat solutions. Carbohydrate polymers. 2001.
31. KLIBANOV AM. Asymmetric transformations catalyzed by enzymes in
organic solvents. Acc Chem Res. 1990. 23:114–20
32. KOOPS, B.C. Activity and stability of chemically modiÆed Candida
Antarctica lipase B adsorbed on solid supports. Appl Microbiol Biotechnol.
Vol, 52. 1999. pg, 791-796.
33. KRAJEWSKA, Barbara. Diffusional Propierties of chitosan hidrogel
membranes. Journal of Chemical technology and biotechnology. Vol, 76.
2001. pg 636-642.
34. KRISHNAKANT, S, Madamwar D. Ester synthesis by lipase immobilized on
silica and microemulsion based organogels (MBGs). Process Biochem.
2001. 36:607–11.
35. KUMAR, N .V Ravi Majeti. A review of chitin and Chitosan application.
Departament of chemestry, University of Roorkee, India. Reactive y
Functional Polymers 46. 2000. 1-27.
36. LOZINSKY, Bladimir Et al. Polymeric Cryogels as Promising materials of
biotechnological interest. Trends in biotechnology. Vol, 21. 2003. pg 445-
451.
37. MAA, Fangri y HANNAB, A Milford. Biodiesel production: a review.
Department of Food Science and Technology, University of Nebraska,
Lincoln, NE, USA 2 February 1999 Bioresource Technology 70. 1999 1±15.38. MEI, Yin et al. Imaging the distribution and secondary structure of
inmobilized enzymes using infrared microespectroscopy.
Biomacromoleculas. 2003. 4 (70-74)
39. MIROSLAWA, Szczesna-Antczak et al. Stabilization of an intracellular
Mucor circinelloides lipase for application in non-aqueous media. Journal of
Molecular Catalysis B: Enzymatic. 2004.
40. MI. F.L et all. The study of gelation knetics and chain – relation properties of
glutaraldehyde – Crosslinked chitosan gel and their effects on micropheres
preparation and drug release. Carbohydrate polymers. Vol, 41. 2000
41. MONTGOMERY, D. Diseño y análisis de experimentos. Grupo editorial
Iberoamericana. 1991.
42. NEAU, Steven y otro. Innobilization of lipase using hydrophilic polymers in
the form of hydrogel beads. Biomaterials. Marzo. 2002.
43. OSMAN, Z and AROF, A. K. FTIR studies of chitosan acetate based
polymer electrolytes. 2. Electrochimica Acta 48. 2003. 993_/999
44. ONDASALUD. Componentes del aceite de oliva. [On line]. Español. [22 de
junio de 2001]. Disponible en
http://www.ondasalud.com/edicion/noticia/0,2458,28611,00.htm
45. PANDEY, Ashok et al. The realm of microbial lipases in vivo. Laboratorio de
Processos Biotecnologicos, Departamento Engenharia Quimica,
Universidade Federal do Parana. Biotechnol. Appl. Biochem. 1999. 29,
119–131.
46. PAREDES, J. I et al. Microporous and mesoporous materials. Biomaterials.
65. 2003. 93-126.
47. PATEL, Dharmendra et al. An atomic force microscoy investigation of
bioadhesives polymer adsorption onto human bucall cells. International
journal of pharmaceutics. 2000. 271-277.
48. PAWLAK, A and MUCHA, M. Thermogravimetric and FTIR studies of
chitosan blends. Thermochimica Acta 396. 2003. 153–166
49. PEREIRA, E.B et al. Inmobilization y catalitic properties of lipase on
chitosan for hydrolysys and esterification reactions. Brazilian Journal of
Chemical Engineering. Vol 20. 2003. pg 343-355.
50. REETZ, MT, Zonta A, Simpelkamp J. Efficient immobilization of lipases by
entrapment in hydrophobic sol–gel materials. Biotechnol Bioeng. 1996.
49:527–34.51. RIOS, Luis Rolando y . Inmovilización de pectinasas y/o celulasas y
determinación de algunos de sus efectos en el jugo de guayaba.
Universidad Nacional sede Manizales. 2002.
52. RIZZI, M, Stylos P, Rick A, Reuss M. A kinetic study of immobilized lipase
catalyzing the synthesis of isoamyl acetate by transesterification in n-
hexane. Enzyme Microb Technol. 1992. 14:709–13
53. SHAW, JF, Chang RC, Wang HJ. Lipolytic activities of a lipase immobilized
on six selected supporting materials. Biotechnol Bioeng. 1990. 35:132–7.
54. SHIMADA et al. biotransformación de grasas. Journal of molecular
catalysis. 29. 2002.
55. SPAGNA, Giovanni. Immobilization of a-L-arabinofuranosidase on chitin and
chitosan. Appl. Microbial Biotechnology. 1999. 52: 791-796.
56. SZCEZSNA,M.; et al.Catalytic properties of membrane-bound Mucor lipase
immobilized in a hydrophilic carrier. Journal of Molecular Catalysis B:
Enzymatic Vol,2. 2002. pg, 19-20.
57. TELEFONCU, A, Dinekaya E, Vorlop KD. Preparation and characterization
of pancreatic lipase immobilized on Eudragit matrix. Appl Biochem
Biotechnol . 1990. 26:311–7.
58. TIE-CHIEH, Hung, et al. Binary immobilization of Candida rugosa lipase on
chitosan. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. Vol, 26 .2003. pg
69–78
59. TIETZ, N, Fiereck E. A specific method for serum lipase determination. Clin
chim. Acta 13. 1966. pg, 352-357.
60. TISCHER, Wilhelm et al. Inmobilized enzymes: Crystals or carriers. Elsevier
Science. August. 1999.
61. TRUSEK, Anna et al. Catalytic membrane preparation for enzymatic
Hydrolysis reactions carried out in the membrane phase contactor. Enzime
and Microbial technology. 28. 2001. 73-79.
62. VERTESIA, A et al. Preparation, characterization and application of
immobilized carboxypeptidase. Enzime and mcrobial Technology 25. 1999.
73-79.
63. VURUP, Slovnaft. Research Institute of petruleum and hydrocarbon gases,
Inc.64. WANG, X and RUCKENSTEIN, E. Preparation of porous polyurethane
particles and their use in enzyme immobilitation. Biotechnology progress.
1993. 6, 661-666.
65. WANGIKAR, PP, Carmichael D, Clark DS, Dordick JS Active site titration of
serine proteases in organic solvents. Biotechnol Bioeng. 1996. 50: 329-335
66. WEAVER, Connie. The food Chemestry Laboratory. CRC press. 1992 Pág.
58
67. WISEMAN, Alan. Manual de Biotecnologia de las enzimas. Editorial Acribia,
S.A. Zaragoza. 1985.
68. WISSDOM, RA et al. Enzyme esterification of fats: factors influencing the
choice of support for immobilized lipase. Enzyme Microb Technol.1984.
6:443–6
69. XU, H, Li M, He B.. Immobilization of Candida cylindracea lipase on methyl
acylate–divinyl benzene copolymer and its derivatives. Enzyme Microb
Technol. 1995. 17:194–9.
70. XUE, Wei et al. Rapid Swelling and deswelling incriogels of crosslinked
poly (N-isopropylacrylamida-co-acrilic acid). European polymer journal. 40
.2004. 467-476. 0