Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de Glioblastoma Multiforme
Autor: Valencia Artunduaga, Mauricio Hernán
Asesor: Arboleda Granados, Gonzalo (Thesis advisor)
Fecha: 2017-01-18
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: El glioblastoma multiforme es uno de los tumores cerebrales primarios más frecuentes, más agresivos (WHO grado IV) y con mayor tasa de mortalidad, para el cual hasta el momento no existe un tratamiento que modifique significativamente su evolución. Por otro lado, estudios recientes han demostrado la habilidad proapoptótica de dos neuropéptidos, denominados orexinas, los cuales ejercen su acción a través de dos receptores acoplados a proteína G, llamados receptor de orexina 1 (OX1R) y receptor de orexina 2 (OX2R). Se ha evidenciado que la estimulación del OX1R induce apoptosis en algunas líneas celulares tumorales, sin embargo esto no sucede en las respectivas células normales. Por lo anterior, el OX1R  se constituye en un potencial blanco terapéutico para el manejo integral de cualquier tumor donde se exprese este receptor. Hasta la fecha no se había determinado la expresión del OX1R en células de glioblastoma multiforme, aunque se ha reportado su expresión en células de neuroblastoma, carcinoma de colon y en la célula neuroglial normal. El objetivo del presente trabajo fue determinar y analizar la expresión del OX1R en células de glioblastoma multiforme, para lo cual se llevó a cabo un estudio inmunohistoquímico con microarreglo de muestras de glioblastoma multiforme y dos controles positivos. El 87,5% de las muestras fueron imunopositivas para el OX1R, de las cuales el 85,7% presentaron un patrón de marcación focal. Los resultados del presente estudio confirman la presencia del OX1R en células de glioblastoma multiforme y constituyen un primer paso para el estudio del OX1R como potencial blanco terapéutico para este tipo de tumor del sistema nervioso central.

DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DEL RECEPTOR
DE OREXINA 1 EN CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA
MULTIFORME
Mauricio Hernán Valencia Artunduaga
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Salud
Departamento de Medicina Interna
Bogotá D.C, Colombia
2017DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DEL RECEPTOR
DE OREXINA 1 EN CÉLULAS DE GLIOBLASTOMA
MULTIFORME
Mauricio Hernán Valencia Artunduaga
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Médico Especialista en Neurología Clínica
Director:
Dr. Orlando Ricaurte
Codirector:
Dr. Gonzalo Arboleda
Línea de Investigación:
Orexinas y Cáncer
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Salud
Departamento de Medicina Interna
Bogotá D.C, Colombia
2017A Dios, a mis padres, a mi esposa y
a mis hijos: Jesús y Jerónimo.Agradecimientos
Al Dr. Orlando Ricaurte Guerrero, por su enorme y valiosísima ayuda en cada uno de los
pasos llevados a cabo en la elaboración de este trabajo, sin su ayuda e interés todo
hubiera sido más complicado.
Al Dr. Carlos Humberto Colegial Gutiérrez y al personal de BIOMOLECULAR
DIAGNOSTICA LTDA, por su aporte en la consecución de muestras tumorales y gran
parte del material necesario para llevar a cabo este trabajo, sin estos no hubiera sido
posible siquiera iniciarlo.
A la Dra. Jenny Amaya Escobar por su gran apoyo técnico y disposición de trabajo.
A mi compañero y amigo Carlos Arturo Carvajal Arias, Biólogo Molecular, por sus
sugerencias y críticas permanentes, las cuales me hicieron replantear mis ideas todo el
tiempo.
Al Dr. Luis Roberto Amador López, por su disposición de ayuda permanente, por sus
sugerencias y aportes, motor para continuar con este esfuerzo.
Al Dr. Gonzalo Humberto Arboleda, por sus aportes y codirección del presente estudio.Resumen y Abstract V
Resumen
El glioblastoma multiforme es uno de los tumores cerebrales primarios más frecuentes,
más agresivos (WHO grado IV) y con mayor tasa de mortalidad, para el cual hasta el
momento no existe un tratamiento que modifique significativamente su evolución. Por
otro lado, estudios recientes han demostrado la habilidad proapoptótica de dos
neuropéptidos, denominados orexinas, los cuales ejercen su acción a través de dos
receptores acoplados a proteína G, llamados receptor de orexina 1 (OX1R) y receptor de
orexina 2 (OX2R). Se ha evidenciado que la estimulación del OX1R induce apoptosis en
algunas líneas celulares tumorales, sin embargo esto no sucede en las respectivas
células normales. Por lo anterior, el OX1R se constituye en un potencial blanco
terapéutico para el manejo integral de cualquier tumor donde se exprese este receptor.
Hasta la fecha no se había determinado la expresión del OX1R en células de
glioblastoma multiforme, aunque se ha reportado su expresión en células de
neuroblastoma, carcinoma de colon y en la célula neuroglial normal. El objetivo del
presente trabajo fue determinar y analizar la expresión del OX1R en células de
glioblastoma multiforme, para lo cual se llevó a cabo un estudio inmunohistoquímico con
microarreglo de muestras de glioblastoma multiforme y dos controles positivos. El 87,5%
de las muestras fueron imunopositivas para el OX1R, de las cuales el 85,7% presentaron
un patrón de marcación focal. Los resultados del presente estudio confirman la presencia
del OX1R en células de glioblastoma multiforme y constituyen un primer paso para el
estudio del OX1R como potencial blanco terapéutico para este tipo de tumor del sistema
nervioso central.
Palabras clave: Receptor de Orexina 1, Glioblastoma Multiforme, Gliomas de alto
grado.VI Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM
Abstract
Glioblastoma multiforme is one of the most frequent, most aggressive primary brain
tumors (WHO grade IV) and with a higher mortality rate, for which there is currently no
treatment that significantly changes its evolution. On the other hand, recent studies have
demonstrated the proapoptotic ability of two neuropeptides, called orexins, which exert
their action through two G-protein coupled receptors called orexin 1 (OX1R) and orexin 2
receptor (OX2R). It has been shown that stimulation of OX1R induces apoptosis in some
tumor cell lines, however this does not happen in the respective normal cells. Therefore,
the OX1R constitutes a potential therapeutic target for the integral management of any
tumor where this receptor is expressed. To date, OX1R expression in glioblastoma
multiforme cells has not been determined, although its expression has been reported in
neuroblastoma, colon carcinoma and normal neuroglial cells. The objective of the present
study was to determine and analyze the expression of OX1R in glioblastoma multiforme
cells, for which an immunohistochemical study with microarray of glioblastoma multiforme
samples and two positive controls was carried out. 87.5% of the samples were
immunopositive for OX1R, of which 85.7% had a focal pattern. The results of the present
study confirm the presence of OX1R in glioblastoma multiforme cells and constitute a first
step for the study of OX1R as a potential therapeutic target for this central nervous
system tumor.
Keywords: Orexin 1 receptor, Glioblastoma Multiforme, High grade gliomas.Contenido VII
Contenido
Pág.
Resumen............................................................................................................................V
Abstract............................................................................................................................VI
Lista de figuras..……………………………………………………………………………….VIII
Lista de tablas…………………………………………………………………………………...IX
Lista de Símbolos y abreviaturas....................................................................................X
Introducción.......................................................................................................................1
1. Metodología.................................................................................................................5
1.1 Recolección de muestras...................................................................................5
1.2 Selección del área tumoral................................................................................5
1.3 Construcción del microarreglo manual..............................................................5
1.4 Procedimiento de inmunohistoquímica..............................................................5
1.5 Determinación de la presencia del OX1R y estimación de su expresión..........6
2. Resultados..................................................................................................................9
3. Discusión …………………………………………………………………….………….…14
4. Conclusiones y recomendaciones..........................................................................17
4.1 Conclusiones...................................................................................................17
4.2 Recomendaciones...........................................................................................17
A. Anexo: Foto de microarreglo manual.....................................................................19
Bibliografía.......................................................................................................................21Contenido VIII
Lista de figuras
Pág.
Figura 1. Marcación inmunopositiva anti-OX1R GMB 100X...........................................10
Figura 2. Inmunopositividad ox1r tejido cerebral sano ...................................................11
Figura 3. Distribución del tipo de marcaje e intensidad..................................................12Contenido IX
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1: Características epidemiológicas...........................................................................9Contenido X
Lista de abreviaturas
Abreviaturas
Abreviatura Término
GBM Glioblastoma Multiforme
OX1R Receptor de orexina 1
OX2R Receptor de orexina 2
SNC Sistema Nervioso CentralIntroducción
Los glioblastomas multiformes son considerados los tumores cerebrales primarios más
frecuentes (12-15% de todos los tumores intracraneanos y 60-75% de todos los tumores
astrocíticos) y uno de los tipos tumorales más agresivos y con mayor tasa de mortalidad
(96,7 % a 2 años / 98,8% a 3 años)1 , hasta el momento sin un manejo o tratamiento que
modifique de forma significativa su historia natural. Dentro de sus características
histopatológicas encontramos atipia nuclear, pleomorfismo celular, actividad mitótica,
trombosis vascular, proliferación microvascular y necrosis1. En ocasiones ( menos 10%)
estos tumores se desarrollan a partir de lesiones iniciales de menor grado2,3,4
presentandose la gran mayoría en pacientes menores de 55 años y con mutaciones en el
gen de la isocitrato deshidrogenasa 1 o 2 (IDH 1-2)5.
La incidencia en países europeos y de norteamérica está en el rango de 3-4 nuevos
casos por 100.000 hab/año6, 7. En Colombia, según el Instituto Nacional de Cancerología
(INC) de Bogotá D.C,, la incidencia de los tumores del sistema nervioso central (SNC) en
Colombia está entre 2 y 19 casos por 100.000 habitantes/año8,9, sin embargo no hay
datos precisos de la incidencia y/o prevalencia de glioblastomas. En un estudio realizado
en la Clínica El Bosque de la ciudad de Bogotá D.C , los gliomas fueron los tumores más
frecuentes con 71 de los 212 casos estudiados (33,5%)10.
Los glioblastomas se presentan de forma màs frecuente en la sustancia blanca de los
hemisferios cerebrales. Los sitios màs frecuentemente afectados son lóbulo temporal
(31%), parietal (24%), frontal (23%), occipital (16%). La localizaciòn fronto-temporal es
particularmente, una localización tìpica1.
A pesar del mejor resultado en desenlaces con el manejo actual (cirugía y terapia
combinada con temozolomida mas radioterapia con dosis de mantenimiento de
temozolomida) pocos pacientes sobreviven mas allá de cinco años11,12. , menos de la
mitad de los pacientes sobreviven más de un año y a mayor edad del diagnóstico los
pacientes tienen un peor pronóstico1. Sin embargo, estudios genéticos realizados en la
última década han mostrado que aquellos pacientes con glioblastomas que presenten la
mutación en el gen IDH 1 o IDH 2 tienen una mayor sobrevida que aquellos pacientes
con tumores sin esta mutación5. El tumor puede manifestarse a cualquier edad sin2 Introducción
embargo tiene mayor frecuencia en la edad adulta con un pico de incidencia entre los 45
y 75 años de edad, con cierto predominio en el sexo masculino (razón hombre: mujer
1.26 en U.S.A, 1.28 en suiza)1.
Por otra parte, el sistema orexinérgico en el sistema nervioso central (SNC) está
conformado por todas aquellas neuronas que sintetizan orexinas (hipocretinas) dentro de
su ciclo celular normal y todos aquellos receptores (OX1R, OX2R) para estas
sustancias; a través de la activación de estos receptores se genera la acción o influencia
de este sistema sobre otros grupos o sistemas neuronales y no neuronales a todo lo
largo del SNC y por fuera del mismo. Estos grupos neuronales orexinérgicos hasta donde
se conoce, están restringidos a las regiones lateral, posterior y perifornical del
hipotálamo, área diencefálica históricamente reconocida por ser parte fundamental en el
mantenimiento de la homeostasis energética, la regulación del ciclo sueño-vigilia y el
control neuroendocrino13.
Han sido identificados hasta el momento en mamíferos dos subtipos de receptores para
las orexinas/hipocretinas, denominados receptor de orexina 1 (OX1R) y receptor de
orexina 2 (OX2R), los cuales son estructuralmente similares a otros receptores de
neuropéptidos acoplados a proteínas G14. La activación de estos receptores acoplados a
proteínas G movilizaría calcio intracelularmente.
Estudios de hibridización in situ han demostrado que los receptores de Orexinas son
expresados en regiones en las cuales se observa gran densidad de fibras
inmunoreactivas para las Orexinas, los receptores de Orexina A y B muestran una
distribución marcadamente diferente pero complementaria . Por ejemplo, dentro del
hipotálamo, un bajo nivel de expresión del RNAm del OX1R es encontrado en el
hipotálamo dorsomedial, en tanto que, un alto nivel de expresión del RNAm del OX2R es
apreciado en esta región15.
El mecanismo de acción preciso de las orexinas no se conoce con claridad en la mayoría
de órganos, pero en general los datos obtenidos sugieren que las orexinas cumplen un
papel en la función gastrointestinal, en la regulacion de la presion arterial, en la
homeostasis de la glucosa, el metabolismo lipídico y en la reproducción16.
En relación al papel que juega el sistema orexinérgico en cáncer , se ha descrito la
presencia del receptor en células de neuroblastoma, carcinoma de colon y en células deIntroducción 3
cáncer de próstata con diferenciación neuroendocrina17 ; se conoce que su estimulación
induce apoptosis celular en estas células tumorales, sin embargo esto no sucede en las
células normales, por tanto este hecho hace pensar que el OX1 –R podría ser un blanco
terapéutico en el manejo integral de estos tumores y probablemente en los glioblastomas
multiformes que expresen el OX1R.
Patricia Rouet-Benzineb et al. en 2004 identificaron a las orexinas como factores anti-
crecimiento de la línea celular HT29-D4 de cáncer de colon humano, que no alteraban la
proliferación pero si promovían la apoptosis como se evidencia por los cambios
morfológicos en la forma celular, fragmentación del ADN, condensación de la cromatina,
liberación de citocromo C hacia el citosol y activación de las caspasas 3 y 7. De los dos
receptores orexinérgicos solo el OX1R es expresado en las células HT29-D4 así como en
otras líneas celulares de cáncer de colon, pero no en células epiteliales colónicas
normales18. Adicionalmente, células CHO transfectadas con ADNc de OX1R o la línea
celular de neuroblastoma SK-N-MC expresando OX1R endógeno, experimentaron una
supresión del crecimiento e inducción de apoptosis después del tratamiento con orexinas
. Por otro lado, células CHO transfectadas con ADNc de OX2R y una línea de células
acinares de páncreas de rata que expresaban OX2R pero no OX1R, también
experimentaron supresión del crecimiento e inducción de apoptosis después del
tratamiento con orexinas19.
El mecanismo propuesto para la inducción de apoptosis vía OX1R implica la disociación
del dímero βγ de la subunidad α de la proteína G, este dímero estimula la tirosina-cinasa
SRC que fosforila los residuos de Tyr del motivo de inhibición de inmunoreceptor basado
en tirosina (ITIM, secuencia IIYNFL, localizado en extremo carboxilo) y del motivo de
cambio de inmunoreceptor basado en tirosina (ITSM, secuencia TNYFIV, localizado en
ICL1), también presentes en el OX2R y otros GPCRs. Posteriormente es reclutada y
activada la fosfotirosin fosfatasa SHP-2, la cual es necesaria para continuar con la
cascada de apoptosis mitocondrial mediada por citocromo C20,21.
Sin embargo, las características pro-apoptóticas del sistema orexinérgico parecen ser
altamente dependientes del tipo celular. Esto posiblemente debido a que las cascadas de
señalización de la orexina A están relacionadas con efectos diferentes, la activación de
p38 MAPK desencadena la apoptosis mientras que la activación de ERK1/2 parece ser
protectora, incrementando la viabilidad celular y la actividad proliferativa22.4 Introducción
La determinación del receptor de orexina -1 ( OX1–R) en glioblastomas multiformes de
humanos no ha sido reportada, sin embargo se ha informado acerca de la presencia de
este receptor en células de la línea C6 de glioma de rata, un modelo experimental para
estudios en Glioblastoma multiforme, donde se sugiere que la estimulación de los
receptores orexinèrgicos induce muerte celular en esta línea especìfica a través de la
activación de la vìa de las caspasas23
Los anteriores estudios nos motivaron a estudiar la presencia del receptor de orexina 1
en células de glioblastomas multiformes a través de tinción inmunohistoquímica
especifica (anticuerpo primario) para OX1-R y lograr identificar un posible nuevo blanco
terapéutico para el desarrollo de nuevos fármacos con alto potencial de inducir apoptosis
en la célula tumoral respetando o sin inducir daño sobre las células normales.5 Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM
1. Metodología
1.1 Recolección de muestras (Bloques de parafina y
laminas) de cada caso.
Se seleccionaron veinticinco casos (muestras tumorales) de pacientes a partir del archivo
de tumores del laboratorio de biología molecular y patologia BIO-MOLECULAR
DIASNÓSTICA LTDA. (Bogotá D.C, Colombia) desde el año 2014 hasta 2016.
La Identificación de tejidos tumorales (glioblastomas multiformes) fue realizada por
médico Neuropatólogo con amplia experiencia en la identificación de este tipo de
lesiones.
1.2 Selección del área tumoral
Previa revisión de las placas histológicas utilizando microscopio de luz, se seleccionó
delimitando con marcador el área tumoral, evitando áreas de necrosis o hemorragia,
posteriormente se escogió el bloque de parafina correspondiente (bloque donante) que
incluyera esa área tumoral.
1.3 Construcción del microarreglo manual
A partir del bloque seleccionado (bloque donante) se extrajo el área tumoral para ubicar
en el microarreglo manual, se tomó muestra del área tumoral utilizando un punch 3mm
para biopsia (biopsy punch) de piel, cada cilindro de área tumoral se extrajo del bloque
donante y se ubicó en el bloque receptor el cual previamente se había organizado por
coordenadas (letras A,B,C,D,E y números 1,2,3,4,5,6). Se ubicó un primer control
positivo (placenta) en coordenada A1 y un segundo control positivo (tejido cerebral
humano) en coordenada C2.6 Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM
1.4 Procedimiento de inmunohistoquímica
Los receptores de orexina 1 (OX1R) fueron revelados por medio de técnica
inmmunohistoquímica sobre placas histológicas a partir del microarreglo manual. Como
controles positivos se utilizó placenta humana (control externo) y cerebro humano
(control interno).
Se realizó recuperación antigénica con buffer citrato (Dako S2367) ph 9.0 durante 40
minutos steamer. Posteriormente se realizó bloqueo de peroxidasa endógena con
peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos. Luego fueron incubados a 8ºC (nevera)
en una solución de anticuerpos anti- receptor de orexina 1 (C-19) (sc 8072-goat,
Santacruz Biotechnology, USA) dilución 1:25 ON (overnight). Método de detección
streptavidina-biotina (Dako K0690), uso de anticuerpo biotinilado pre diluido durante 30
minutos en cámara húmeda. Complejo streptavidina peroxidasa prediluido durante 30
minutos en cámara húmeda. Revelado con cromógeno Diaminobenzidina (Dako K3468),
uso de contraste con hematoxilina de Harris. Obteniendo marcación en el control positivo
externo :placenta y en el control positivo interno: tejido cerebral.
1.5 Determinación de la presencia del OX1R y estimación
de su expresión
La presencia de inmunoreactividad para el receptor de orexina-1 (OX-1R) fue
determinada a través de microscopio de luz por médico patólogo. Posteriormente se
realizó conteo de las células inmunoreactivas ( usando magnificación del campo
microscópico 4x-10x-40x) y expresándolas como el porcentaje del total del número de
células visualizadas en el campo microscópico o en microfotografìa > 50% marcaje
difuso; < 50% células: marcaje focal.
Interpretación: determinación de la expresión del receptor de orexina 1 en la membrana
de las células tumorales con puntaje: 0: negativo, +: débil (detectable con alto poder 40x)
, ++:moderado (detectable en 10x), +++: Intenso (detectable en 4x).
Control positivo : Se uso placenta y tejido cerebral normal ( Hace referencia a tejido
humano en el cual por estudios previos se conoce ya de la existencia de receptor ).Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM 7
Control negativo: corte del tumor aplicando la técnica exceptuando la incubación con el
anticuerpo primario.
Análisis: Determinamos el número de casos de tumores con expresión del receptor,
analizando su distribución e intensidad, cotejándolo con control positivo.2. Resultados
Se escogieron inicialmente veinticinco (25) casos, los datos relevantes de cada uno de
los pacientes se detallan en la tabla 1.
Tabla 1: Características Epidemiológicas.
Caso Edad Género Localización Dx Patológico
1 47 M Frontal izquierdo GBM Celulas gigantes IDH-
1 mutante
2 50 M No especificado GBM- oligodendroglial
asociado
3 72 F Parietooccipital GBM
izquierdo
4 69 M No especificado GBM
5 38 F Frontal GBM
6 72 M No especificado GBM
7 79 F Occipital GBM
8 59 F Parietal izquierdo GBM
9 53 M Frontoparietal GBM
10 41 M Prefrontal derecho GBM Secundario
11 64 M Fosa posterior GBM
12 60 F Frontal izquierdo GBM
13 57 F Temporal izquierdo GBM
14 31 F Temporal izquierdo GBM IDH- 1 mutante
15 55 F No especificado GBM
16 35 M Frontoparietal GBM Células gigantes
17 54 M Temporal derecho GBM
18 51 M No especificado GBM Células pequeñas
19 9 M Parietal derecho GBM
20 59 F Parietal izquierdo GBM
21 56 M No especificado GBM Células pequeñas
22 53 M Occipital derecho GBM
23 63 F Paraventricular GBM
izquierda
24 47 M Temporal izquierdo GBM
25 86 F Parietal izquierdo GBM
Control Edad Género Localización
Positivo
Interno 47 M Frontal izquierdo
Externo Placenta
Fuente: Autor.Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM 10
De los 25 casos iniciales se excluyó un caso (caso 7) dado que no hubo muestra de
tejido suficiente para lograr determinar marcaje del anticuerpo.
En total se analizaron 24 casos de tumores diagnosticados como glioblastomas
multiformes.
De los 24 casos analizados logramos determinar marcación positiva del anticuerpo en 21
de ellos (87,5%) Figura 1.
Figura 1. Marcación inmunopositiva anti-OX1R GMB 100x
Sólo tres de los 24 casos analizados no presentaron ningún tipo de marcaje (casos 1, 6
y 15)(12,5%).Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM 11
El control positivo interno (tejido cerebral sano) mostró una marcación o
inmunopositividad moderada(++) de forma difusa. Figura 2.
El control negativo se realizó en muestra de tejido tumoral sin la presencia del anticuerpo
primario, el cual no mostró marcación alguna.
Figura 2 Inmunopositividad OX1R tejido cerebral sanoDeterminación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM 12
Figura 3 Distribución del tipo de marcaje e intensidad
De los 21 casos con marcación positiva hubo marcación difusa en 3 casos (14,3%)
(casos 2, 5 y 23) de los cuales el caso 2 correspondió a un glioblastoma multiforme con
tejido oligodendroglial asociado; De estos tres casos, el caso #5 presentó
inmunopositividad marcada o intensa (+++) Figura 1, el caso #2 tuvo marcación de igual
intensidad (++) y el caso #23 marcación de menor intensidad (+) que el control positivo
interno (++).
De los 21 casos inmunopositivos 18 tuvieron marcaje positivo focal (85,7%). Un solo caso
(#21) con inmunopositividad o marcaje intenso +++, siete casos con inmunopositividad
moderada (++) y diez casos con inmunopositividad leve (+). Figura 3.
De los 24 casos analizados 14 casos se presentaron en hombres, 10 casos en mujeres.
(Distribución por género.)Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM 13
En relación a la edad de los pacientes, doce (12) casos de las 24 muestras analizadas
correspondían a individuos menores de 55 años; doce (12) casos tenían 55 años o
mayores.
Sólo dos casos (caso 5 y caso 21) tuvieron marcaje intenso (+++) el primero de forma
difusa y el segundo de forma focal, este segundo caso correspondía a un glioblastoma de
célula pequeña.
De los 21 casos inmunopositivos, hubo marcación difusa en 3 casos (casos 2, 5 y 23,
equivalentes al 14,3% del total de inmunopositivos). El caso 5 presentó
inmunopositividad intensa (+++); el caso 2, correspondiente a un glioblastoma
multiforme con tejido oligodendroglial asociado, exhibió intensidad de marcaje moderado
(++); y el caso 23 presentó intensidad leve (+). En la figura 3 se ilustra el recuento y los
porcentajes correspondientes.
Como ya se mencionó, solo los casos 5 y 21 presentaron marcaje intenso (+++), es decir,
fueron los únicos casos que presentaron una intensidad de marcaje mayor que la del
control. La mayoría de los casos (45,83%) presentaron una intensidad de marcaje leve,
sugiriendo una expresión del OX1R menor a la del control.Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM 14
3. Discusión
Mediante el presente estudio exploratorio y descriptivo se determinó la presencia del
OX1R en el 87,5% de los casos de GBM analizados, constituyendo el primer reporte de
la expresión del OX1R en células humanas de GBM. Este resultado es concordante con
los reportes previos de la expresión de ambos receptores orexinérgicos en líneas
celulares como la línea celular C6 de glioma de rata23,24 y el receptor de orexina 2
(OX2R) en las líneas celulares SN19, U251tg, A172, U373, SF295 de glioblastoma 25.
Este resultado sugiere que la gran mayoría de los glioblastomas expresan el receptor y
que la ruta o la vía de expresión del OX1R se conserva en este tipo de célula tumoral.
El 12,5% de las muestras tumorales restantes no mostró ningún tipo de marcación; vale
la pena corroborar este hallazgo con estudios ulteriores que incorporen un mayor
número de muestras tumorales dado que podría sugerir que algunos de estos tumores
pueden perder la expresión de este receptor.
Encontramos que la gran mayoría de los casos analizados (75,0%) presentaron un
patrón de marcaje de células inmunopositivas de tipo focal, esto representa un 85,7% del
total de casos inmunopositivos (18/21), contrario al marcaje de tipo difuso visto en el
tejido cerebral normal y al 14,3% restante de muestras tumorales inmnopositivas con
patrón de tinción difuso.
Con relación a la estimación de los niveles de expresión, solo los casos 5 y 21
presentaron un marcaje intenso (9,5%), mayor al marcaje moderado que exhibió el
control positivo de tejido cerebral, sugiriendo que estos dos casos presentaron
sobreexpresión del OX1R. Por el contrario, la mayoría de los casos (10 casos/ 47,6%)
presentaron una intensidad de marcaje leve, sugiriendo una expresión del OX1R menor aDeterminación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM 15
la del control. Solo 9 casos (42,9%) presentaron niveles de expresión similares a los del
control. Uno de los estudios consultados sugiere cierta correlación entre la agresividad
del tumor y el nivel de expresión del OX1R, como en el adenocarcinoma avanzado de
próstata con diferenciación neuroendocrina17 sin embargo nuestro estudio no demostró
una clara sobreexpresión de este receptor en este tipo de tumores bastante agresivos.
Este resultado junto con lo observado en cuanto a intensidades de marcaje, sugiere que
al menos en esta serie , los GBM presentan un menor número de células expresando
OX1R comparado con el tejido cerebral normal (glía y neuronas) y hacen pensar en una
expresión dinámica o cambiante a lo largo de la evolución de estos tumores.
Desafortunadamente no contamos con datos de historia clínica en relación a tiempo de
evolución desde el inicio de los síntomas hasta la toma de la muestra de cada uno de los
pacientes.
Nuestros resultados prmiten establecer una correlación entre el subtipo tumoral y el tipo o
nivel de expresión del receptor, así como diferencias por género y por edad. Nuestro
estudio tiene la limitación del número de muestras analizadas y el hecho de que no se
realizó genotipificación o status genético molecular de cada uno de estos tumores lo cual
nos puede brindar una mayor información y establecer una correlación en relación a los
hallazgos de intensidad y tipo de expresión del receptor.
Por otra parte, No es posible hablar de expresión aberrante de este receptor en
glioblastomas como sucede en algunos tumores v.g. cáncer de colon y en las metástasis
hepáticas del mismo27 dado que las células neurogliales expresan el receptor de orexina
normalmente.
Además, tal como se ha señalado en otros estudios18,19 ,20 21,22,23 la función que cumple
este receptor en la biología de la célula tumoral tampoco está claramente entendida. En
algunos tipos tumorales como en cáncer de próstata se ha encontrado que interfiere con
la actividad del receptor de andrógenos lo cual parece regular el inicio y progresión de
estas células tumorales28 .
La activación de los receptores orexinérgicos (OX1R-OX2R) se ha relacionado con una
fuerte inducción de apoptosis en células de ciertos tipos tumorales, especialmente el
receptor de orexina -1 (OX1R) mediando apoptosis en células tumorales como en cáncer
de colon, neuroblastoma y en adenocarcinoma de próstata17,18, lo anterior lo hace unDeterminación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM 16
posible blanco terapéutico interesante en el manejo de estos tumores; sin embargo se
ha encontrado incluso que la orexina-A puede favorecer el crecimiento tumoral a través
del OX1R en algunas células tumorales como el insulinoma de rata25. Hacen falta
estudios que logren aclarar el papel que cumple el OX1R en cada tipo tumoral.
Consideramos nuestro trabajo como un estudio preliminar que abre las puertas a
estudios posteriores que aclaren el papel que desempeña el OX1R en células de
glioblastomas multiformes y la probable implicación que podría tener este receptor en la
terapéutica de este agresivo tumor.Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBM 17
4. Conclusiones y recomendaciones
4.1 Conclusiones
El presente estudio demuestra la presencia del receptor de orexina-1 (OX1R) en células
de glioblastomas multiformes (87,5% de los casos). La gran mayoría de los casos
presentaron inmunopositividad positiva focal (85,7%). Podemos señalar que la ruta o la
vía de expresión del OX1R se conserva en esta célula tumoral; dado su papel
proapoptótico podría representar un blanco terapéutico de interés.
4.2 Recomendaciones
Hacen falta estudios que ayuden a dilucidar el papel que cumple el OX1R en la biología
de esta célula tumoral y que ayuden a determinar si esta función difiere en otros tipos
tumorales, así como la posible respuesta apoptótica que presentaría esta célula tumoral
a la acción de las orexinas o agonistas orexinérgicos.18 Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células de GBMBibliografía 19
A. Anexo: Foto de microarreglo
manualBibliografía 21
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