Cuantificación de subpoblaciones de linfocitos Th17 en sangre periférica de pacientes con periodontitis crónica generalizada
Autor: Garzón Vergara, Hernán Santiago
Asesor: Roa, Nelly (Thesis advisor)
Fecha: 2015
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: La Parálisis Cerebral (PC) es la principal causa de discapacidad física motora en pediatría;(1) de acuerdo con la Organización Panamericana de la Salud, en su reporte referente al año 2002, Colombia tiene una prevalencia de discapacidad de 12,1% en la población menor de 14 años.  Son desconocidos en Colombia tanto la prevalencia de la PC, como sus características demográficas, clínicas o etiológicas. Al realizar la búsqueda tanto en bases de datos como literatura gris, un único estudio observacional descriptivo, realizado en 2001 por Ángel y colaboradores, en el municipio de Sabaneta, Antioquia, reporta una prevalencia de pacientes con PC en esta población de 0,11%(2).  Éste estudio descriptivo, busca exponer las características sociodemográficas, clínicas y del tratamiento del paciente con PC, que asiste a consulta en la Fundación Hospital de la Misericordia. Esto con el fin, de conocer las condiciones de los pacientes en nuestro entorno, para a futuro, establecer estrategias para satisfacer las necesidades de estos niños; así como, crear la base para la realización de estudios posteriores en el tema.

Universidad Nacional de Colombia. Facultad de Odontología
C
UANTIFICACIÓN DE SUBPOBLACIONES DE
ESPECIALIDAD
T 17
LINFOCITOS H EN SANGRE PERIFÉRICA DE
EN
PACIENTES CON PERIODONTITIS CRÓNICA
PERIODONCIA
.
GENERALIZADA
Hernán Santiago Garzón V. | Directora: Dra. Lina Suárez.
Co-directora: Dra. Nelly Roa.CUANTIFICACIÓN DE SUBPOBLACIONES DE LINFOCITOS TH17 EN SANGRE PERIFÉRICA DE
PACIENTES CON PERIODONTITIS CRÓNICA GENERALIZADA.
Hernán Santiago Garzón Vergara
Trabajo final para optar al título de:
Especialista en Periodoncia.
Directora:
Dra. Lina Janeth Suárez Londoño
Esp. Periodoncia. Pontificia Universidad Javeriana.
Magíster en Biología. Pontifica Universidad Javeriana.
Co-directora:
Dra. Nelly Roa.
Odontóloga. Pontificia Universidad Javeriana.
PhD Inmunología. Universidad Nacional Autónoma de México.
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Odontología
Especialidad en Periodoncia
Bogotá, Colombia
2015
1AGRADECIMIENTOS
Gracias a mis padres por todo lo que me brindan incondicionalmente y a quienes debo todo.
Gracias a la Dra. Lina por darme la oportunidad de iniciar este viaje que está pronto a terminar,
pero donde aprendí de su mano que fue la mejor decisión que pude tomar. Gracias por su
apoyo, paciencia y empeño por ser excelentes.
Gracias a la Dra. Nelly por ese ejemplo de pasión por lo que se hace, por enseñarme con
paciencia que todo sale bien si se hace con dedicación.
A mis profesores y pacientes por enseñarme día a día lecciones que no se aprenden en ningún
otro lugar.
2TABLA DE CONTENIDO
CONTENIDO PÁGINA
1. Introducción. 5
2. Pregunta de investigación. 6
3. Justificación. 6
4. Objetivo general y objetivos específicos. 7
5. Marco teórico 8
6. Diseño metodológico. 14
7. Resultados. 20
8. Conclusiones y recomendaciones. 32.
9. Bibliografía. 33
LISTA DE TABLAS
Tabla 1: Descripción de sub-poblaciones de linfocitos Th17. 11
Tabla 2: Etapas a desarrollar en la investigación. 15
Tabla 3: Variables a considerar en el estudio. 18
Tabla 4. Porcentaje de linfocitos productores de IFN-γ, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-21
de acuerdo con los diferentes protocolos de estimulación. 24
Tabla 5. Protocolo sugerido para la estimulación de PBMCs con PMA/ionomicina. 25
Tabla 6: Pacientes excluidos posterior a la elaboración de la historia clínica. 28
Tabla 7: Pacientes excluidos posterior a los resultados de los exámenes de laboratorio. 29
Tabla 8: Pacientes con dx gingivitis o periodonto sano. 30
Tabla 9: Pacientes con dx periodontitis crónica severa generalizada. 31
3LISTA DE GRÁFICAS
Figura 1: Adquisición de 100.000 eventos de la región de la población linfoide. 20
Figura 2: Distribución de cultivo celular en pozos utilizado. 21
Figura 3. Porcentaje de Linfocitos productores de citocinas
IFN-γ, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-21. Se presenta las figuras en dot plot de las PBMCs. 23
LISTA DE ANEXOS
ANEXO #1: Escalas para exámenes de laboratorio. 40
ANEXO #2: Historia Clínica. 43
ANEXO #3: Consentimiento informado. 49
ANEXO #4: Protocolo toma individual de muestra de sangre venosa. 51
ANEXO #5. Insertos anticuerpos anti-citocinas intracelulares. 52
41. INTRODUCCIÓN
A
nte la falta de entendimiento de los mecanismos inmunopatogénicos en enfermedad
periodontal y el descubrimiento de poblaciones de linfocitos T cuya naturaleza pro-
inflamatoria respondería a los interrogantes existentes, se plantean hoy en día nuevas
hipótesis acerca del papel de este tipo celular en la patogénesis de la periodontitis. Una de estas
poblaciones, los linfocitos Th17 descritos inicialmente en enfermedades sistémicas inflamatorias y
autoinmunes, como lupus eritematoso sistémico (1) y artritis reumatoide (2), marcan la pauta
para una nueva concepción de la inmunopatogénesis periodontal (3), superando el entendimiento
desde el clásico y a su vez controvertido paradigma Th1/Th2 (4,5).
La IL-17 en humanos se identificó en 1995 (6), pero sólo hasta inicios del siglo XXI recobra
importancia por su relación directa con enfermedades sistémicas inflamatorias. Esta citoquina no
pudo ser relacionada con alguna de las poblaciones de linfocitos CD4+ identificadas hasta ese
momento, describiéndose por tal motivo una nueva población, los Th17 (7,8). Los Th17 se
distinguen por el marcador de superficie CD161+ (9) y están encargados principalmente de la
defensa contra bacterias extracelulares.
Los perfiles de citoquinas presentes en el medio, promueven o regulan la respuesta inmune de
acuerdo con la necesidad. Según las citoquinas presentes, los linfocitos pueden diferenciarse en
sub-poblaciones, capacidad denominada “plasticidad” (10,11). Esto ha llevado a la reciente
descripción de diferentes sub-poblaciones de Th17: Th17 “patológicos” o efectores (Teff17), Th17
reguladores (Treg17) (12) y Th17/Th1 (13). Las diferentes funciones identificadas en cada
subpoblación resultan ser antagónicas entre sí lo que puede llevar a un entendimiento
completamente diferente de su función en las diferentes patologías, pues hasta el momento se
adjudica un papel netamente inflamatorio y mediador de daño tisular (14).
La posible relación entre Th17 y enfermedad periodontal ha sido descrita por diversos autores
(15,16,17). Dado su aumento en número en tejidos periodontales inflamados se intuye un papel
patológico (18); sin embargo, ante la descripción de las diferentes subpoblaciones, estas células
podrían actuar como efectoras o reguladoras de daño tisular.
La clara naturaleza pro-inflamatoria de la enfermedad periodontal se ha relacionado con la
presencia de enfermedades con igual carácter, como artritis reumatoide (19), diabetes (20), y
enfermedades cardiovasculares (21). A pesar de compartir mecanismos fisiopatológicos, aún no
se conoce cómo una infección oral puede contribuir a este tipo de procesos sistémicos (22). En
este contexto, la generación de una inflamación sistémica de baja magnitud (“low grade
inflammation”) (23,24,25) a partir de una infección periodontal, se presenta como una de las
posibles vías de relación. Con la descripción de las diferentes subpoblaciones de Th17 se abre la
posibilidad para esclarecer su papel no solo en la fisiopatogénesis del proceso inflamatorio local si
no a nivel de una posible repercusión sistémica.
No se han descrito las subpoblaciones de linfocitos Th17 relacionados con periodontitis crónica, ni
la repercusión que a nivel sistémico pueden tener las enfermedades crónicas de la cavidad oral
como la periodontitis a nivel de dichas sub-poblaciones. Por tal motivo, la identificación y
5cuantificación de las diferentes subpoblaciones de Th17 en sangre periférica, cuyo presunto
origen sea periodontal, permitirá acercarnos a la función que podría tener la periodontitis en el
proceso fisiopatológico en posible relación con enfermedades inflamatorias sistémicas que se han
descrito como asociadas a infecciones en cavidad oral.
2. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿C
uál es la cantidad de linfocitos Th17 patológicos, reguladores y Th17/Th1 presentes en
sangre periférica de pacientes sistémicamente sanos con periodontitis crónica
generalizada, respecto a pacientes con periodonto sano o con gingivitis asociada a
placa bacteriana?
3. JUSTIFICACIÓN
D
evelar la inmunopatogénesis de la enfermedad periodontal ha sido un proceso
investigativo complejo de casi sesenta años (26), y actualmente sigue siendo controversial
pues aún no existe explicación irrefutable. Durante todos estos años la evidencia ha
mostrado posibles funciones protectoras y/o destructoras de los componentes celulares y
humorales de la inmunidad innata y adquirida en el curso de la periodontitis crónica
(27,28,29,30).
La descripción de la población de linfocitos Th17 en la compresión de la inmunopatogénesis de la
enfermedad periodontal rompe paradigmas anteriores que resultaron ser insuficientes para
entender la complejidad de la misma (31). Si bien se había adjudicado un papel netamente pro-
inflamatorio y “destructor” a los linfocitos Th17 hasta hace unos años, la reciente distinción entre
diferentes sub-poblaciones con funciones antagónicas (Th17 "patológicos" o efectores (Teff17),
Th17 reguladores (Treg17) y Th17/Th1 (Th1 no clásicos), resulta tener un interés especial pues
implicaría un entendimiento diferente de su función.
En un trabajo de investigación previo desarrollado en el posgrado de periodoncia de la
Universidad Nacional de Colombia en el cual se cuantificó la cantidad de linfocitos Th17 total (IL-
23R(+), CD161+) en sangre periférica de pacientes sistémicamente sanos con diagnósticos de:
gingivitis inducida por placa bacteriana y periodontitis crónica, se determinó que la cantidad de
éstos es mayor en pacientes con enfermedad periodontal (0.75%) respecto a pacientes con
inflamación gingival (0.29%), diferencia estadísticamente significativa (32).
Hoy en día es ampliamente aceptado que las infecciones periodontales pueden asociarse a otras
enfermedades inflamatorias sistémicas con características inmunopatológicas similares, sin que
los mecanismos de estas asociaciones sean claros. La infección periodontal puede convertirse en
un reservorio bacteriano cuyo desenlace es una inflamación crónica. Se ha relacionado con un
proceso denominado “low grade inflammation” o una inflamación de baja magnitud sistémica.
6Si bien esta relación no ha sido descrita de forma concluyente, se precisa como una de las vías por
las cuales la enfermedad periodontal puede vincularse a la generación de inflamación sistémica.
Es allí donde la presente investigación cobra importancia, convirtiéndose en un desarrollo
innovador para el acercamiento al papel de los linfocitos Th17 como reguladores o destructores
en esta infección particular; y por otro lado, a esclarecer un poco más cómo la enfermedad
periodontal efectivamente puede ser tenida en cuenta como un foco infeccioso oral capaz de
generar una inflamación sistémica de baja magnitud, recobrando la importancia de la infección
periodontal en el ámbito médico.
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETIVO GENERAL
Comparar el número de linfocitos Th17 patológicos, reguladores y Th17/Th1 en sangre
periférica de pacientes sistémicamente sanos con: periodontitis crónica generalizada,
respecto a pacientes con periodonto sano o gingivitis asociada a placa bacteriana.
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
4.2.1 Estandarización de un protocolo para la cuantificación de sub-poblaciones linfoides
Th17 a través de la marcación intracelular de citocinas específicas para cada sub-
perfil.
4.2.2 Cuantificar linfocitos Th17 (CD4+, CD161+) patológicos mediante marcación
intracelular de IL-17A, IL-17F.
4.2.3 Cuantificar linfocitos Th17 (CD4+, CD161+) reguladores mediante marcación
intracelular de IL-10.
4.2.4 Cuantificar linfocitos Th17 (CD4+, CD161+) Th17/Th1 marcación intracelular de IFN-γ.
75. MARCO TEÓRICO.
A
ctualmente es claro que el entendimiento de diferentes patologías inflamatorias crónicas
resulta en una interpretación de éstas desde una perspectiva diferente: esto implica que
el centro de atención no es el proceso inflamatorio en sí mismo, sino cómo es la presunta
falta de regulación inmunológica el origen del daño tisular. De acuerdo con esto, los procesos
inflamatorios crónicos locales son considerados como contribuyentes en procesos de inflamación
sistémica de baja magnitud. De ahí que, la relación entre enfermedad periodontal y esta
inflamación sistémica esté siendo actualmente estudiada como un tópico de importancia mundial
(33).
La periodontitis crónica inicia con la presencia de agentes infecciosos asociados al biofilm dental
producto del acúmulo de placa bacteriana, cuya patogénesis y progresión es mediada siempre por
el sistema inmune. Es una enfermedad infecciosa inflamatoria crónica, caracterizada por el
infiltrado de linfocitos y monocitos, destrucción del tejido conectivo, y reabsorción ósea.
Molecularmente está mediada por el aumento de mediadores pro-inflamatorios (IL-1β, TNF-α, IL-
6, PGE2) y metaloproteinasas que llevan al daño en la matriz extracelular y pérdida ósea. Esto
llevaría a pensar que la destrucción del tejido no es causada en sí misma por los agentes
infecciosos, sino por aquella respuesta inmunológica sostenida, que en algún punto “pierde” su
propia regulación al no retirarse el factor etiológico (34).
La enfermedad periodontal cuyo origen se ha descrito como multifactorial, involucra uno genético
inmodificable descrito como pacientes con un “fenotipo hiper-inflamatorio”, caracterizado por
una respuesta exacerbada de mediadores inflamatorios en este caso por un origen infeccioso
(35). La ulceración epitelial y conectiva en la bolsa periodontal ha sido descrita como una vía de
entrada para bacterias orales (generalmente gram-negativas y anaerobias) y de sus
lipopolisacáridos o endotoxinas al torrente circulatorio, describiéndose incluso la posibilidad de
colonización en zonas distantes a la infección local (36). Este aumento en los niveles de
endotoxinas en el torrente circulatorio cursando con un cuadro subclínico, conocido como
“endotoxemia metabólica”, se ha referido como el posible factor desencadenante de
enfermedades crónicas como diabetes mellitus tipo II, aterosclerosis, Parkinson e incluso cáncer
(37).
Una infección crónica que lleve a niveles bajos de endotoxinas en el torrente sanguíneo se
enuncia como una de las posibles causas de una inflamación sistémica de baja magnitud o “low
grade inflammation”, acompañada de otras causas como el sobrepeso y el envejecimiento. Esto
hace que persista un estado pro-inflamatorio sin resolución, que conlleve al desarrollo de
enfermedades crónicas en pacientes genéticamente susceptibles (38).
En el contexto de la relación entre enfermedad periodontal y enfermedad sistémica, se ha
entendido a la periodontitis como una infección crónica local que puede llegar a otro sitio del
organismo. Puede denominarse como una “metástasis” de la infección (bacteremia e infecciones
en otros sitios del cuerpo causados por bacterias orales), inflamación y todo lo que conlleva a la
activación de los componentes celulares y humorales del sistema inmune que llevan a tener
consecuencias a nivel sistémico. Sin embargo, esta relación ha sido el resultado de factores de
8riesgo comunes y no una relación causal; de ahí se puede entender que la relación entre
enfermedad periodontal y enfermedad sistémica no es lineal, pero sí muy compleja (39).
Han sido tres las vías por las cuales se ha relacionado la enfermedad periodontal con una afección
sistémica: infección o bacteremia, respuesta inflamatoria y respuesta inmune (36,40). La
infección no se limita a la cavidad oral, la bacteremia resultante se da por manipulación de los
tejidos ulcerados por actos como el cepillado dental, uso de seda dental, masticar goma de
mascar o incluso con la masticación (41) puede llevar a la migración de bacterias y sus productos
al torrente sanguíneo. Las bacterias orales provenientes de la infección periodontal pueden
sobrevivir en la circulación y pueden adherirse a superficies protésicas o tejidos con alteraciones
como microangiopatías o placas ateroescleróticas (42).
La respuesta inflamatoria generada por todo este proceso infeccioso, se ha reportado no se limita
únicamente a nivel local, también a nivel sistémico. Los microorganismos que logran acceso al
torrente sanguíneo a través del tejido conectivo ulcerado son usualmente eliminados por el
sistema retículo endotelial en minutos (bacteremia transitoria), sin manifestación clínica. Sin
embargo, es posible que algunas bacterias persistan en sitios distantes y esto conlleva a la
diseminación de factores de virulencia que actuarían como antígenos solubles (36).
Entonces, los antígenos bacterianos que puedan persistir sistémicamente favorecen esta llamada
inflamación sistémica. Los leucocitos, las células endoteliales y los hepatocitos responden a estas
bacterias/factores de virulencia con la secreción de mediadores inflamatorios (citoquinas,
quimioquinas, proteína C reactiva). Con esta exposición continua los antígenos solubles
reaccionan con anticuerpos específicos circulantes para formar inmuno-complejos que
amplificarían esta inflamación. Es clara la activación presente de los componentes celulares y
humorales del sistema inmune innato de forma constante por ser un reto bacteriano crónico (43).
En principio, debería existir una regulación natural inicial de esta respuesta inmune. Esta
inflamación periodontal inicia como respuesta protectora frente al biofilm. En individuos
susceptibles la inflamación periodontal falla en este papel, y se convierte en una inflamación
crónica por no ser retirado el estímulo bacteriano. Debido a lo anterior resulta en una
destrucción del tejido mediada aparentemente por los propios componentes del sistema inmune.
Las lipoxinas (productos de los eicosanoides) son receptores agonistas que estimulan la
resolución de la inflamación y promueven la restitución de la homeostasis. Son derivados de los
ácidos grasos endógenos. Los ácidos grasos consumidos en la dieta, de la familia de omega-3 son
metabolizados por vías similares y los productos llamados resolvinas tienen una actividad
biológica similar a las lipoxinas (44).
En el sistema inmune adaptativo el componente humoral está dado por la producción de
anticuerpos por parte de los Linfocitos B. La producción de estos anticuerpos tendrá diversas
finalidades: primero, el reconocimiento del antígeno; segundo, su neutralización (mediante unos
mecanismos efectores); y tercero, se encargan de marcar la superficie celular del microrganismo
para que se convierta en célula target o diana, cuyo resultado será una respuesta fagocítica para
la eliminación del mismo. Para lograrlo, dentro de los mecanismos efectores encontraremos la
activación de ciertas células, promover la fagocitosis, y estimular la síntesis de citoquinas pro-
inflamatorias además de algunos mediadores de la inflamación. De esta forma, tras la interacción
de los Linfocitos B con el antígeno se generará una proliferación y diferenciación a células
9plasmáticas que producirán estos anticuerpos específicos, proceso denominado expansión clonal.
Este tipo de inmunidad se ha relacionado para la defensa contra bacterias extracelulares (45).
Teniendo en cuenta la activación celular en el sistema inmune adaptativo cuyo protagonista será
el linfocito T, es necesario tener presente que durante los noventa la aplicación del paradigma
Th1/Th2 para la explicación de diferentes patologías inflamatorias, se adjudicaba un papel
antagónico para cada uno. En enfermedad periodontal inicialmente se adjudicaba un papel
destructor a Th2 por el aumento en el infiltrado de linfocitos B en lesiones avanzadas (46), sin
embargo publicaciones posteriores controvierten estos hallazgos adjudicándole un papel
destructor a Th1 por la activación persistente de macrófagos (47). El panorama era confuso y este
paradigma empieza a reevaluarse a la luz de nuevos descubrimientos, como el de la IL-17 que
ante la dificultad para su clasificación dentro de uno de los perfiles anteriores, se menciona uno
nuevo: el perfil Th17 (48).
Población de linfocitos Th17.
La descripción de la población de linfocitos Th17 se remite a la identificación de IL-17 en 1995,
como una citoquina fundamental en procesos pro-inflamatorios (49). Sin embargo, no sería sino
hasta el 2005 cuando recobra importancia, al relacionarse con enfermedades de tipo inflamatorio
y autoinmune como lupus eritematoso sistémico (50) y artritis reumatoide (51).
Su naturaleza la convertía en una citoquina diferente respecto a su función particular, no
encajaba dentro del paradigma Th1/Th2, y surge entonces la necesidad de clasificar una nueva
población de linfocitos T CD4+: población Th17 productora de IL-17 (52). Años después se
descubre que la producción de IL-17 no es restringida únicamente a esta población de linfocitos T,
sino que también pueden producirla neutrófilos, NK, mastocitos y células epiteliales (53,54).
La familia de citoquinas derivadas de la IL-17 se constituye de seis miembros que varían en su
homología: IL-17 (también llamada IL-17A), IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E (también llamada IL-25) y
la IL-17F. Estos subconjuntos fueron descubiertos en un periodo muy corto, entre el 2000 y 2002
siendo llamados secuencialmente de acuerdo con el orden en que fueron descritos. Estas
moléculas tienen un peso molecular de entre 20 kd a 200 kd y aunque tienen funciones biológicas
similares tienen diferencias sutiles (55).
Para el desarrollo de este perfil, se requiere la presencia en el medio de las siguientes citoquinas:
TGF-β, IL-6, IL-1β y la IL-23. Además este tipo de células necesitan los siguientes factores de
transcripción: RORγ, RORα, IRF-4 y AhR para su desarrollo y posterior producción de citoquinas.
Tanto la IL-17A como la IL-17F activan células de la inmunidad innata como los neutrófilos y
células de los tejidos circundantes no pertenecientes al sistema inmune, como fibroblastos y
células epiteliales mediante la activación del factor de transcripción NF-κB. La IL-17 estimula a las
células epiteliales, endoteliales y fibroblastos para la secreción de citoquinas pro-inflamatorias
como la IL-6, IL-8, GM-CSF, CXCL1, CCL20 y prostaglandina E2. La secreción de CXCL1 y de CCL20
resulta en el reclutamiento de neutrófilos y macrófagos al sitio de inflamación favoreciendo la
migración celular en procesos crónicos, cuya falta de regulación favorece el daño al tejido. La
falta de regulación de una respuesta inmune IL-23/IL-17 es un factor importante para el desarrollo
de enfermedades autoinmunes (56).
10Subpoblaciones de linfocitos Th17.
El tipo de citoquinas con los que cuente el medio es fundamental para la diferenciación de las
subpoblaciones de linfocitos. De ahí que, la existencia de diferentes subpoblaciones permite
entender la multiplicidad inherente a su función. En el siguiente cuadro se resumen sus
características principales (11):
Tabla #1: Descripción de sub-poblaciones de linfocitos Th17.
Th 17 patológico Th17 regulador Th17/Th1
(Teff17) (Treg17)
Activado por: TGF-β3, IL-6, IL-23 TGF-β1 e IL-6 IL-12
Produce: IL-17A, IL-17F, GM –CSF, IL-17A, IL-17F, IL-10. IFN-γ
IL-22
Activa a: Macrófagos, células Inactiva a: Macrófagos, Macrófagos, Linfocitos
endoteliales, células células dendríticas: Th1 (diferenciación)
epiteliales. inhibición de la expresión
de IL-12, co-estimuladores
y clase II de MHC.
Regulado por: IL-2, IL-27. IL-1β, IL-23 IL-4, IL-5, IL-13
Características: Pro-inflamatorio. Regulador. Pro-inflamatorio.
CD4+ CD161+ CD4+ CD161+ CD4+ CD161+
IL-23R high IL-23R low
CD26+
Enfermedades Lupus eritematoso No se ha reportado. Enfermedad de Crohn
relacionadas sistémico (57), (60), síndrome coronario
encefalomielitis agudo (61,62), acné (63).
experimental
autoinmune (58),
artritis reumatoide (59).
Plasticidad del perfil Th17
Dependiendo de del antígeno, el estímulo, las citoquinas, señales co-estimuladoras, y de otros
factores adicionales, las células T CD4+ pueden diferenciarse en diferentes subpoblaciones con
funciones especializadas. De forma clásica, se distinguían los perfiles: Th1 (productor de IFN-γ e
inducido en presencia de IL-12) y el Th2 (inductor de una respuesta humoral y promovido por la
IL-4). Sin embargo, últimamente han sido descritas otras subpoblaciones de estas células T. Si
bien durante muchos años se trataba de explicar la patogénesis de enfermedades infecciosas bajo
11el paradigma Th1/Th2, el surgimiento de otros perfiles surge como una posible explicación ante
un modelo limitado y escaso para encasillar a todas las enfermedades de este tipo. Uno de estos
es el perfil Th17, cuya característica de “plasticidad” le confiere características propias,
permitiéndole bajo ciertas circunstancias el cambio de un fenotipo y de función. Recientemente
se ha descrito que debido a esta función la existencia de sub-poblaciones es posible, y donde es
probable que no todos los Th17 sean patológicos.
Th17 y enfermedad periodontal
Las células del ligamento periodontal actualmente se consideran como facilitadoras del
reclutamiento leucocitario, influenciadas en su función inmuno-reguladora por la liberación de IL-
17. Los fibroblastos de tejidos sanos y con periodontitis muestran un fenotipo totalmente
diferente con alteraciones en la función celular, pues en sitios de inflamación tienen una
interacción importante con las células del sistema inmune mediante la expresión de citoquinas
pro-inflamatorias (64). La IL-17 puede activar tanto los fibroblastos como las células endoteliales
para aumentar la secreción de IL-6 en presencia de TNF-α. La IL-6 y RANTES son factores
reconocidos para la progresión de gingivitis a periodontitis. RANTES es producida por los
fibroblastos gingivales luego de un reto con IL-1β y TNF-α, induciendo el reclutamiento de
monocitos en el tejido; además es un factor de quimio-atracción de células del perfil Th1 (65).
Las citoquinas para la diferenciación celular hacia un perfil Th17 están presentes en el medio
ambiente periodontal, como: TNF-α, IL-1β y la IL-6, producidas por gran cantidad de tipos
celulares (entre estos el macrófago (66)), y su expansión clonal es posible específicamente gracias
a la IL-23. En un estado inicial de inflamación, los fibroblastos gingivales regulan la IL-23; además
la activación de células dendríticas también estimula la producción de prostaglandina E2,
facilitando la liberación de IL-23, promoviendo la expansión de Th17 (67). En muestras de tejido
gingival de pacientes con periodontitis crónica moderada, es elevada la concentración de IL-23, IL-
17 y de IFN-γ (68).
Se encuentra una mayor expresión de IL-17A en tejidos periodontales humanos con enfermedad
periodontal respecto a los tejidos con gingivitis, porque esta citoquina es producida por células T
de memoria CD4+CD45RO+ sólo cuando están activadas; sin embargo, no se ha reportado
diferencia significativa entre la expresión de IL-17F en tejidos con periodontitis crónica o gingivitis
(69). La cantidad de IL-17 es significativamente mayor en fluido crevicular de pacientes con
periodontitis crónica (45.9%) comparados con pacientes sanos (35.6%) (70). Toda esta
estimulación inmunológica es mediada por las bacterias periodontopatógenas, como la
P.gingivalis capaz de iniciar por sí misma la activación de Th17 (71,72).
Se presume que hay una mayor severidad de la enfermedad periodontal en el fondo de la bolsa,
puesto que la concentración de infiltrado inflamatorio y de IL-17 es mayor. Se ha reportado la
presencia de macrófagos (CD68+) y las células B (CD20+) tanto en el fondo de la bolsa como en
una región más coronal del surco gingival; a diferencia de células dendríticas cuya concentración
es significativamente menor. Además la producción de IL-23 es mayor por parte de los
macrófagos que de las células B. De acuerdo con estos datos, se puede decir que son los
12macrófagos como células presentadoras de antígeno se convierten en mediadoras importantes
del infiltrado de Th17 en periodontitis crónica (73).
Zhao y colaboradores (2011) realizaron la medición de la concentración de Th17, Th1/Th2 y sus
factores de transcripción antes y después de una terapia básica periodontal no quirúrgica. Los
resultados demostraron que las citoquinas relacionadas con el perfil Th17 disminuyen después del
tratamiento, las Th1 disminuyeron también pero en una cantidad menor; sin embargo, el nivel de
IL-4 aumentó de manera significativa. Asimismo, la expresión de factores de transcripción: RORC
(Th17), T-bet (Th1) y GATA-3 (Th2) también disminuyeron en células T CD4+ de sangre periférica
(74).
Enfermedad periodontal y relación con enfermedad sistémica.
ALTERACIONES CARDIOVASCULARES
Este quizá ha sido uno de los tópicos con el mayor grado de investigación, pues ha tenido un
desarrollo importante desde hace aproximadamente 20 años atrás. Desde los años 90’s ha
existido un aumento considerable en las publicaciones donde se ha tenido en cuenta esta
relación, sin embargo los resultados son contradictorios. Si bien se han descrito diversos
mecanismos por los cuales esta infección oral puede eventualmente generar efectos adversos
cardiovasculares, la controversia persiste. Sin embargo, este tópico recobra gran importancia por
la alta incidencia de estas dos enfermedades en el mundo, y el impacto que puede tener para re-
interpretar la identificación de factores de riesgo y terapéuticos, que en este caso deben incluir un
periodoncista dentro del grupo interdisciplinar para el manejo de este tipo de pacientes (75)
Las dos enfermedades tienen en común generarse por una compleja interacción entre factores
genéticos, ambientales y personales. Los factores de riesgo asociados incluyen todos aquellos que
no pueden ser cambiados, como la etnia, edad, historia familiar; y por otro lado aquellos
modificables o controlables: hipertensión, dislipidemia, hábito de fumar, exceso de peso y
diabetes mellitus (76).
Se han descrito diversas vías fisiopatológicas para establecer una relación entre las mismas,
enunciándose mecanismos directos e indirectos. Uno de los mecanismos indirectos ha sido la
posible inflamación sistémica causada por la infección periodontal, donde diferentes mediadores
inflamatorios como el TNF-α, IL-1, IL-6, MMPs y fibrinógeno; a su vez la activación de diferentes
células, moléculas de adhesión, TLRs, y la vía de NK-κβ, hacen que esta interacción entre el
endotelio, monocitos y plaquetas sea pro-aterogénico, contribuyendo indirectamente a la
aterogénesis o a diferentes desenlaces adversos cardiovasculares relacionados con la ruptura de
la placa ateromatosa (77).
Dentro de los mecanismos indirectos relacionados encontramos el mimetismo molecular: es un
proceso mediante el cual se da una activación de células auto-reactivas T y B contra péptidos
propios por una reacción cruzada entre los mismos y secuencias similares en organismos
patógenos como bacterias periodontales que han logrado migrar y sobrevivir en el torrente
sanguíneo. Se han detectado este tipo de reacciones en enfermedad periodontal contra
lipopolisacáridos bacterianos y proteínas de choque térmico humanas, específicamente la hsp60
13para el caso de periodontitis. Este mecanismo se ha reportado en enfermedades autoinmunes
con modelos animales como la encefalomielitis alérgica, la miocarditis experimental y la uveitis-
queratinitis experimental autoinmune (78).
Las proteínas de choque térmico (heat shock protein –hsp60) pertenecen a una familia de
proteínas conservadas durante el proceso evolutivo que tienen homología entre las células
procariotas y eucariotas confiriéndoles una fuerte inmunogenicidad. Las proteínas de choque
térmico son moléculas de señalización intercelular ubicadas extracelularmente y pueden mediar e
influenciar un amplio rango de respuestas inflamatorias. La hsp60 humana y bacteriana, activa a
las células endoteliales vasculares humanas para la expresión de E-selectina, molécula de
adhesión intercelular -1 (ICAM-1) y la molécula de adhesión celular vascular -1 (VCAM-1). Éstas
activan a las células vasculares endoteliales, células de músculo liso y monocitos/macrófagos para
la producción de IL-6 y factor de necrosis tumoral-α (TNF-α).
Las bacterias del grupo rojo tienen proteínas de choque térmico homologas a GroEl de Escherichia
coli. La hsp60 humana puede ser un antígeno target para una respuesta autoinmune en
periodontitis, debido al mimetismo molecular con su homólogo GroEl bacteriano en patologías
como aterosclerosis y enfermedad vascular. Ha sido un mecanismo bacteriano referenciado como
forma de evadir la respuesta inmune del hospedero evitando ser eliminada (79).
El mecanismos directo relacionado es la posibilidad de circulación de bacterias
periodontopatógenas y su colonización en sitios distantes a cavidad oral. En este sentido, el
surco gingival o bolsa periodontal se convierte en la vía por la cual las bacterias pueden llegar al
torrente sanguíneo, junto con las células del sistema inmune. Si bien se han reportado la
posibilidad de generar bacteremias transitorias con el cepillado e incluso la masticación; estas
bacterias pueden circular en sangre y depositarse en la placa ateromatosa siendo identificadas
bacterias del grupo rojo (80).
6. DISEÑO METODOLÓGICO
A continuación se menciona el diseño metodológico del proyecto en su totalidad que comprende
diferentes pasos a ser desarrollados de forma paulatina, debido a la extensión y complejidad del
mismo.
Tipo de estudio: Transversal, cuantitativo, analítico.
Población: Pacientes sistémicamente sanos con diagnóstico periodontal de: periodonto sano,
gingivitis asociada a placa bacteriana generalizada, periodontitis crónica severa generalizada, de la
Facultad de Odontología, Universidad Nacional de Colombia.
Muestra:
GRUPO 1: 10 pacientes sistémicamente sanos con diagnóstico de periodontitis crónica moderada
o severa generalizada.
GRUPO 2: 10 pacientes sistémicamente sanos con diagnóstico de periodonto sano o gingivitis
inducida por placa bacteriana generalizada.
14Criterios de inclusión:
Sistémicamente sanos determinados inicialmente de forma presuntiva mediante
diligenciamiento de historia clínica.
Mayores de 18 años.
No ingesta de fármacos de forma crónica.
No hayan recibido terapia antibiótica o anti-inflamatoria en los últimos 6 meses.
No en estado de embarazo o lactancia.
No fumadores
Mínimo 20 dientes presentes en boca.
No requieran profilaxis antibiótica para el examen.
Diagnóstico periodontal que encaje dentro de los ya mencionados para grupo 1 o grupo 2.
Criterios de exclusión:
Factor reumatoideo positivo.
Resultados fuera de los rangos considerados como normales en las pruebas de
laboratorio: cuadro hemático, perfil lipídico y hemoglobina glicosilada. (Ver anexo #1).
Materiales:
Instrumental básico: espejo de boca, pinza algodonera, explorador dental, sonda
periodontal (Hu-Friedy, Carolina del Norte).
Kit de toma de muestra sanguínea por venopunción: aguja, tubo de recolección y
transporte, anticoagulante.
Marca: BD VACUTAINER Blood collection Set: Blood collection needle, Plus plastic K2
EDTA Tubes, EDTA (Ácido erilendiaminotetraacético).
Fabricante: Beckton Dickinson.
Ciudad: Franklin Lakes, NJ, Estados unidos.
Tabla #2: Etapas a desarrollar en la investigación.
ETAPA DEL PROCEDIMIENTO INFORMACIÓN/ MUESTRA PROCESAMIENTO/ANÁLISIS
ESTUDIO RECOLECTADA
1. Estandarización Estandarización de -Análisis de los resultados
de la técnica. la técnica de -Estandarización del obtenidos para la
laboratorio para la protocolo a ser aplicado consecución de una técnica
adecuada para la consecución de los de cuantificación de
cuantificación de las objetivos del proyecto. subpoblaciones linfocitos
células de los sub- Th17: depurada, veraz y
perfiles de Th17 reproducible.
presentes en sangre
periférica.
2. Consecución y Diligenciamiento de -Alerta médica. -Diagnóstico sistémico
examen a Historia clínica (Ver -Datos personales. presuntivo.
pacientes. anexo # 2) por -Motivo de consulta.
2.1.Examen paciente. -Antecedentes médicos
inicial: personales.
Se consignará la
15información de -Examen periodontal: -Diagnóstico periodontal
forma manual en consiste en el sondaje (81)
la historia clínica periodontal en seis
individual superficies por diente, se
desarrollada para registran los datos en
tal fin. periodontograma de la
historia clínica.
3. Selección de De acuerdo con los Pacientes que continúan en No requiere procesamiento.
pacientes. resultados el estudio.
obtenidos en la fase Firma de consentimiento
inicial, se aplicarán informado y se entrega
los criterios de cartilla informativa (Ver
inclusión para anexo #3).
escoger el grupo de Material aprobado por el
pacientes que comité de ética de la
continúan en el Facultad de Odontología de
estudio. la Universidad Nacional de
Colombia, en el acta 20-14.
3.1 Exámenes de Muestra # 1: Enviada a
laboratorio Venopunción Muestra de 4 ml de sangre laboratorio para análisis de:
iniciales. tradicional (ver periférica.
anexo # 4) - Cuadro hemático.
-Perfil lipídico.
-Factor Reumatoideo.
--Hemoglobina glicosilada.
De acuerdo con los resultados de estos exámenes, se aplicarán los criterios de
exclusión y aquellos pacientes que obtengan resultados fuera del parámetro de
normalidad establecido (ver anexo # 1), no continuarán en el estudio. Sólo
aquellos que tengan estos resultados dentro del parámetro de normalidad
continuarán.
4. Obtención de Una vez seleccionados Muestra # 2: Estimulación
muestra # 2 de los pacientes que Muestra de 20 ml de celular e inducción de
sangre periférica. continúan: sangre periférica. citocinas Ex vivo.
Venopunción
tradicional (ver anexo #
4)
165. Obtención Determinación de Resultados obtenidos
de resultados promedios de Grupo 1 y Grupo 2:
Información obtenida Citómetro de
subpoblaciones de
Número total de Flujo FACs CANTO II. Los datos
TH17 en cada uno
linfocitos Th17 (CD4+, obtenidos por el Citómetro, serán
de los grupos.
CD161+). analizados por el programa Flow jo
8,7.
Porcentaje de Th17
patológicos.
Porcentaje de Th17
reguladores.
Porcentaje de Th17/Th1
7. Análisis e Análisis estadístico. Análisis estadístico ANÁLISIS ESTADÍSTICO:
interpretación comparativo de los
Comparación de los Se utilizará un análisis ANOVA de 3
de resultados. resultados.
porcentajes factores:
obtenidos entre
Grupo %Teff1 %Treg %Th17
Grupo 1 y Grupo 2.
7 17 /Th1
Grupo
1
Grupo
2
17Tabla # 3 Variables a considerar en el estudio.
Variable Unidad de Tipo de Identificación Definición para Valores Código. Ejemplo de interpretación.
Medida variable. en la base de el estudio. límites.
datos.
Sexo No aplica. Cualitativa, sexo Sexo biológico No aplica. 0: Femenino. El 45% de los pacientes fueron de
nominal- referido por el sexo masculino.
1: Masculino.
paciente.
Edad Años. Cuantitativa, edadpac Edad en años 18 años – La edad promedio de los
discreta. verificada en 80 años. individuos del estudio fue 40
documento de años.
identidad.
Diagnóstico No aplica. Cualitativa. dxperio Diagnóstico No aplica. 1: Periodonto sano En el grupo 2 el 80% de los
periodontal periodontal de o gingivitis asociada pacientes tenía diagnóstico de
acuerdo con a placa bacteriana periodontitis crónica severa
hallazgos de generalizada. generalizada.
sondaje
2: periodontitis
periodontal.
crónica moderada
o severa
generalizada.
Sistémicamente No aplica. Cualitativa dxsist Sistémicamente No aplica. 0: Sistémicamente En el estudio inicialmente se
sano. sano a sano. incluyeron 20 pacientes en la
descartar con primera fase. En la segunda fase
1: Sistémicamente
historia clínica de acuerdo con los resultados de
comprometido.
y resultados de los exámenes de laboratorio, se
exámenes de excluyeron 2 por tener resultados
laboratorio fuera del rango de normalidad.
18dentro de
rangos de
normalidad.
Número de Cuantitativa. t17total Número de No aplica. En el grupo 1 el total de Th17 fue:
linfocitos Th17 linfocitos Th17 y en el grupo 2 fue:
total (CD4+, totales
CD161+). obtenidos de la
muestra
sanguínea.
Porcentaje de Porcentaje. Cuantitativa. t17patol Porcentaje de No aplica. En el grupo 2 el porcentaje de
Linfocitos Th17 linfocitos Th17 linfocitos Th17 patológicos fue de
patológicos. patológicos. 25%.
Porcentaje de Porcentaje. Cuantitativa. t17regul Porcentaje de No aplica. En el grupo 2 el porcentaje de
Linfocitos Th17 linfocitos Th17 linfocitos Th17 reguladores fue
reguladores. reguladores. de 55%.
Porcentaje de Porcentaje. Cuantitativa. t17th1 Porcentaje de No aplica. En el grupo 2 el porcentaje de
Linfocitos linfocitos Th17 linfocitos Th17 /Th1 fue de 20%.
Th17/Th1 reguladores.
197. Desarrollo de la investigación.
1. Estandarización de la técnica.
Protocolo inicial propuesto para la estimulación y obtención de perfiles Th17 en
enfermedad periodontal
Las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) fueron obtenidas a partir de sangre
anticoagulada con heparina (BD Bioscience) por venopunción. La sangre diluída con PBS 1:1, fue
separada por Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences) (1:2) y se centrifugó a 1750 RPM durante
30 minutos a 22°C. Obtenidas las PBMCs, se resuspendieron en 5ml de RPMI suplementado con
25 mM HEPES, 100 U/ml Penicilina, 100g/ml estreptomicina y 10% de suero fetal bovino (SFB).
Se lavaron las células 2 veces a 2000 RPM por 5 minutos a 4°C. El número de células fue obtenido,
después del conteo en cámara de Neubauer.
Se sembraron 1 x 106 células por pozo, con diferentes concentraciones de PMA/ionomicina
(Estímulo 1 (PMA: 20 μl – Ionomicina: 1 μl), Estímulo 2 (PMA: 500 μl – Ionomicina: 0.5 μl),
Estímulo 3 (PMA: 50 μl – Ionomicina: 0.5 μl)) en presencia de Brefeldina A, por 6 horas a 37°C en
5% de CO . Se retiraron las células en cultivo para realizar la tinción intracelular, y se dispensaron
2
en tubos de citometría para cada citocina de estudio. Se lavaron dos veces con buffer de teñido
(PBS pH 7.6 + 1% SFB + 0.09% de azida de sodio), a 2.000 rpm por 5 minutos a 4°C y se adicionó a
cada uno, 250 l del buffer Cytofix/Cytoperm, por 20 minutos a 4°C en oscuridad.
Posteriormente, se lavaron las células 2 veces con el buffer Perm/Wash 250 l, y se adicionaron
los anticuerpos anti-citoquinas intracelulares, con la cantidad indicada por el fabricante IL-17A (5
μl), IL-17F (5 μl), IL-10 (5 μl), IL-21 (5 μl) e IFN- (10 μl de una dilución 1:40). Se incubaron por 30
minutos a 4°C en la oscuridad.
Finalmente las células fueron lavadas 2 veces con el buffer Perm/Wash y fijadas con
paraformaldehído al 2%. Se adquirieron 100.000 eventos de la región de la población de linfocitos
(Figura 1), en el Citómetro de Flujo FACs CANTO II. Los datos obtenidos, fueron analizados por el
programa Flow jo 8,7.
Figura 1: Adquisición de 100.000 eventos de la región de la población linfoide.
20A. Obtención de células mononucleares de sangre periférica:
Se validó y optimizó el protocolo de obtención de células mononucleares de sangre periférica por
Ficoll Hypaque; por un tubo de 5 ml de sangre heparinizada, se purificaron 3 x 106 cels.
No se ha reportado una técnica unificada que permita, con la obtención de una única muestra de
sangre periférica la identificación de las tres subpablaciones de linfocitos Th17 en un mismo
paciente; la literatura es variable respecto a dichos protocolos de estimulación. Frente a esta
limitante, se hace necesario de forma preliminar desarrollar una técnica estandarizada para la
identificación adecuada de cada subpoblación, que permita veracidad en el proceso de
identificación y con la cual, futuros investigadores puedan reproducirla.
B. Estimulación antigénica in vitro.
Lo primero que se realizó, fue observar el número de células adecuado por pozo. Se escogieron
placas de 24 pozos, en donde se sembraron diferentes número de células: 500.000, 1 x 106 y 2 x
106 de células en 1 ml de RPMI 10% SFB, y después de 24 horas en cultivo, por medio de un
microscopio invertido, se observó viabilidad. Una población celular dispersa, no coagregada o
superpuesta, se obtuvo con 1 x 106 células por pozo.
Para observar citocinas intracelulares en Linfocitos T in vitro, se estandarizó inicialmente, el
control positivo, se probaron 3 concentraciones diferentes de PMA/ionomicina, de acuerdo con
diferentes reportes de la literatura: Estímulo 1: PMA 20 μl, Ionomicina: 1 μl, RPMI: 873 μl.,
Estímulo 2: PMA 500 μl, Ionomicina: 0.5 μl, RPMI: 500 μl, estímulo 3: PMA 50 μl, Ionomicina: 0.5
μl, RPMI: 950 μl.
PBS PBS PBS PBS PBS PBS
Control Control
crecimiento crecimiento SE PMA: 500 μl
Iono: 0.5 μl
500.000 cels 1 x 106cels RPMI: 500 μl
Control
PMA: 20 μl PMA: 50 μl
PBS crecimiento
Iono: 1 μl Iono: 0.5 μl
2 x 106cels RPMI: 873 RPMI: 950.
.
PBS PBS PBS PBS
Figura 2: Distribución de cultivo celular en pozos utilizado.
21La PMA (Phorbol 12 myristate 13-acetate es un activador de la protein kinasa C y por lo tanto de
la vía NF-κβ, se activa en concentraciones nanomolares (82); por otro lado la ionomicina es un
ionóforo producido por la bacteria Strptomyces conglobatus, es usado en investigación para
elevar los niveles de calcio (Ca2+) a nivel intracelular y para entender el transporte de calcio en las
membranas celulares. Por lo tanto, su uso conjunto permitirá, observar poblaciones celulares
activadas con la consecuente producción de citocinas.
Como el objetivo de este trabajo es observar perfiles de LTH17 a partir de la producción de
citocinas, junto al estímulo PMA/ionomicina, se adicionó la Brefeldina A (10 μg/ml), que es un
metabolito fúngico que genera una interferencia en el transporte anterógrado desde el retículo
endoplásmico hasta el aparato de Golgi. Este bloqueo del Golgi permitirá prevenir la secreción de
la citocina en cultivo. Las células en las condiciones descritas, estuvieron durante 6 horas a 37°C
en 5% de CO .
2
Pasado el tiempo de incubación, se procedió a la tinción de citocinas intracelulares, por medio de
anticuerpos monoclonales específicos para cada citocina, con diferentes fluorocromos: α- IFN-γ
PE-Cy7, α-IL-10 BV421, α-IL-17A BV510, α-IL-17F V450, α-IL-21 BV421; siguiendo el protocolo del
kit Golgi Plug (Cytofix/Cytoperm) descrito anteriormente.
A continuación se presenta el porcentaje de linfocitos productores de las citocinas IFN-γ, IL-10, IL-
17A, IL-17F, IL-21 por citometría de flujo (Figura 3):
22Sin Estímulo Estímulo 1 Estimulo 2 Estímulo 3
F
IFN-γ
IL-10
IL-17A
IL-17F
IL-21
Figura 3. Porcentaje de Linfocitos productores de citocinas IFN-γ, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-21. Se
presenta las figuras en dot plot de las PBMCs estimuladas con diferentes concentraciones de
PMA/ionomicina: Estímulo 1 (PMA 20 μl, Ionomicina: 1 μl, RPMI: 873 μl), Estímulo 2 (PMA 500 μl,
Ionomicina: 0.5 μl, RPMI: 500 μl), Estímulo 3 (PMA 50 μl, Ionomicina: 0.5 μl, RPMI: 950 μl.). Los
números representan el porcentaje de linfocitos productores de citocinas.
23Los resultados de la citometría pueden ser analizados de forma individual para la paciente en
cuestión o de forma general para la estandarización de la técnica.
La paciente con quien se realizó la estandarización de la técnica tiene como diagnóstico sistémico
artritis reumatoide seleccionada como control positivo inicial. Estos hallazgos relacionados con su
compromiso sistémico van en concordancia con lo planteado en la literatura, en donde los niveles
de IL-21 a nivel sistémico se encuentran claramente aumentados en un paciente con una
patología de carácter autoinmune respecto a un paciente sano, pues esta citocina aumenta
notablemente la activación de linfocitos B y perpetúa el proceso inflamatorio, aun cuando el
paciente se encuentre con medicación anti-TNF. Sin embargo, se esperaba una mayor producción
de IL-17A e IL-17F (83).
Los resultados muestran una producción positiva evidente de IFN-γ posterior a la estimulación y
una producción basal de IL-21 aumentada posterior a la estimulación. Debido a lo anterior, se
realizó la interpretación de los resultados de la Región 2 del dot plot al evidenciar dos poblaciones
celulares productoras de la IL-21 luego de la estimulación.
De forma general, los hallazgos presentados dan cuenta de la efectividad de este método para la
detección de citocinas intracelulares por el citómetro de flujo previa activación celular y bajo una
reacción antígeno-anticuerpo con la citocina de interés, hallazgo que concuerda con publicaciones
recientes donde el protocolo de detección ha sido mejorado con el paso del tiempo. Sin embargo,
es necesario aclarar que depende del tipo de citocina que se desee visualizar así mismo será la
concentración de los diferentes medios para activación y anticuerpos para su detección (84, 85).
En este caso particular la necesidad de identificación en una misma muestra de cinco citocinas
diferentes termina siendo exigente pues es necesario contar con fluorocromos diferentes para
cada tipo de citocina. De no ser así, se incurre en la necesidad de correr un tubo diferente por el
citómetro para evitar el solapamiento.
En la siguiente tabla se resumen los porcentajes de linfocitos productores de cada una de las
citocinas de interés en cada uno de los diferentes protocolos de estimulación. Los hallazgos
presentados se corroboran con los encontrados en la literatura (columna de la derecha). Bajo esta
condición se hace necesario definir un protocolo de estimulación diferente para cada citocina a
tratar.
Tabla 4. Porcentaje de linfocitos productores de IFN-γ, IL-10, IL-17A, IL-17F, IL-21 de acuerdo con
los diferentes protocolos de estimulación.
Citocina % Sin Estímulo % Estimulo 1 %Estímulo 2 %Estímulo 3 % literatura
IFN-γ 0.19 9.63 11.81 6.26 15% (86)
IL-10 1.22 9.68 1.15 0 < 1 %
IL-17A 0.51 0.54 1.41 0.52 0 – 2.1 % +/-
0.6% (87)
IL-17F 0.066 0,714 0.594 0.654 0.46 +/- 0.41%
(88)
IL-21 R2. 0.35 39.75 26.25 36.85 24% (89)
24Dentro de la tabla se señalan (con color verde) aquellos valores cercanos a los reportados en la
literatura para la visualización de la citocina de interés posterior a los diferentes protocolos de
estimulación con PMA/ionomicina. Resumiendo, se sugiere un protocolo de estimulación de la
siguiente forma:
Citocina Concentración PMA/ionomicina
IFN-γ PMA 500 μl, Ionomicina: 0.5 μl, RPMI: 500 μl. Tiempo: 4 a 6 horas.
IL-10 Requiere re-formularse pues sólo con el estímulo 1 (PMA 20 μl,
Ionomicina: 1 μl, RPMI: 873 μl) logró evidenciarse un 9.68%, sin
embargo la separación celular en el dot plot no es evidente. En la
literatura se sugiere realizar una estimulación con LPS (100 ng/ml)
durante 18 a 24 horas (90).
IL-17A PMA 50 μl, Ionomicina: 1 μl, RPMI: 950 μl. Tiempo: 4 a 6 horas.
IL-17F PMA 50 μl, Ionomicina: 1 μl, RPMI: 950 μl. Tiempo: 4 a 6 horas.
IL-21 R2. PMA 20 μl, Ionomicina: 1 μl, RPMI: 873 μl. Tiempo 4 a 6 horas.
Tabla 5. Protocolo sugerido para la estimulación de PBMCs con PMA/ionomicina.
En la literatura, es posible evidenciar diferentes protocolos de estimulación previa al uso de
PMA/Ionomicina mediante el uso de proteínas recombinantes que favorezcan la inducción hacia
cada uno de los perfiles aprovechando esa capacidad de “plasticidad” de las células Th17. A
continuación se mencionan las concentraciones utilizadas según cada autor:
PERFIL: TH17 efector.
CITOQUINA CONCENTRACIÓN
IL-23 20 ng/ml.
IL-6 50 ng/ml
TGF-β3 3 ng/ml
Tomado de: Longhi MS, Moss A, Bai A, Wu Y, Huang H, et al. Characterization of human
CD39+ Th17 cells with suppressor activity and modulation in inflammatory bowel
disease. Plos One. 2014; 9 (2): e87956.
PERFIL: Th17 regulador.
CITOQUINA CONCENTRACIÓN
IL-6 20 ng/ml
TGF-β1 0.5 ng/ml
Tomado de: Ghoreschi K, Laurence A, Yang X, Tato C, McGeachy M, et al. Generation of
pahtogenic Th17 cells in the abscense of TGF-β signaling. Nature. 2010; 467: 967-972.
25PERFIL: Th17/Th1.
CITOQUINA CONCENTRACIÓN
IL-23 20 ng/ml
IL-12 10 ng/ml
Tomado de: Annunziato F, Cosmi L, Santarlasci V, Maggi L, Liotta F, et al. Phenotypic and
functional features of human Th17 cells. JEM. 2007; 204 (8): 1849-1861.
Sin embargo, se considera que el uso de estas proteínas previo al uso de PMA/ionomicina puede
influir en una inducción de las células presentes en la muestra hacia cada uno de los perfiles,
arrojando resultados de porcentajes de citocinas intracelulares elevados respecto a los
encontrados en la presente estandarización de la técnica. Esto obedece a que los objetivos
iniciales de los autores se ratifican como diferentes al del presente proyecto, pues es evidente
que la estimulación lograda con PMA/ionomicina resultaría suficiente para la detección de
citocinas intracelulares. Si bien el uso de las proteínas recombinantes puede aumentar de forma
significativa la producción de las citocinas de interés, es probable que este estímulo lleve a una
diferenciación celular, lo cual puede en algún momento alterar los resultados.
Bajo esta perspectiva, a continuación se plasma el protocolo definitivo a ser utilizado:
Protocolo de estimulación y obtención de perfiles Th17 en enfermedad periodontal.
1. Obtenga una muestra sanguínea (20 ml) por venopunción convencional en tubos estériles
con heparina (BD Bioscience).
2. Con mucho cuidado, destape el tubo y deposite la sangre en un frasco con tapa rosca
estéril con suave pipeteo. Antes de esto, agite suavemente el tubo de abajo hacia arriba.
3. Diluya la sangre con PBS en proporción 1:1.
4. Separe los componentes sanguíneos utilizando Ficoll-Paque en una proporción 1:2 (3 ml
de sangre por 6 de Ficoll).
5. Centrigue a 1750 RPM durante 30 minutos a 22 °C.
6. Obtenga las células mononucleares y resuspendalas en 5 ml de medio RPMI
suplementado con 25 mM HEPES, 100 U/ml Penicilina, 100g/ml estreptomicina y 10% de
suero fetal bovino (SFB).
7. Lave las células 2 veces y centrifugue a 2000 RPM por 5 minutos a 4°C.
8. Cuente las células en cámara de Neubauer y obtenga un mínimo de 5 x 106 células.
9. Tome una placa de 24 pozos y siembre 1 x 106 células por pozo, siembre 4 pozos por
paciente, uno sin anticuerpo (SE) y 3 con anticuerpos monoclonales: anti-CD3 y CD28 (1
μg/ml) (BD Pharmingen Corp, USA). Recuerde presensibilizar la placa con el anti-CD3. y
aplique la cantidad referida de PMA/Ionomicina de la siguiente forma:
26PBS PBS PBS PBS PBS PBS
PMA: 500 μl
PBS
PBS SE Iono: 0.5 μl
RPMI: 500 μl
PMA: 50 μl PMA: 20 μl PBS
PBS Iono: 1 μl Iono: 1 μl
RPMI: 950. RPMI: 873
.
PBS PBS PBS PBS
10. Pozo C2: estímulo sugerido para: IFN-γ. Pozo B3: estímulo sugerido para IL-17A e IL17F, IL-
10. Pozo C3: estímulo sugerido para IL-21
11. Aplique 10 μl de Brefeldina A en todos los pozos e incube durante 6 horas a 37 °C en 5%
de CO
2.
12. Pasado el tiempo de incubación, obtenga las células del cultivo y proceda a realizar la
tinción extra e intracelular. Dispense en tubos de citometría para cada citocina de
estudio.
13. Resuspenda las células con buffer de teñido (PBS pH 7.6 + 1% SFB + 0.09% de azida de
sodio)
14. Centrifuque a 2000 RPM por 5 minutos a 4°C.
15. Adicione 250 μl del Buffer Cytofix/Cytoperm, por 20 minutos a 4°C en oscuridad.
16. Lave las células 2 veces en buffer Perm /Wash 250 l.
17. Adicione los anticuerpos :
Tubo 1: PerCP-Anti-CD3/FITC-Anti-CD4/APC-Anti-CD161/Alexa Flúor 700-Anti-IL-17A/Alexa
Fluor 647-Anti-IL-17F.
Tubo 2: PerCP-Anti-CD3/FITC-Anti-CD4/APC-Anti-CD161/PE-CF594-Anti-IL-10.
Tubo 3: PerCP-Anti-CD3/FITC-Anti-CD4/APC-Anti-CD161/Alexa Flúor 647-Anti-IFN-
Tubo 4: PerCP-Anti-CD3/FITC-Anti-CD4/APC-Anti-CD161/Alexa Flúor 647-Anti-IL-21.
18. Incube por 30 minutos a 4°C en la oscuridad.
19. Lave 2 veces con el buffer Perm/Wash.
20. Agregue paraformaldehído al 2%.
21. Lleve las muestras a lectura en el citómetro. Ajuste los fluorocromos según fabricante de
los anticuerpos anti-citoquinas.
22. Se sugiere utilice: Citómetro de Flujo FACs CANTO II.
2723. Analice los datos obtenidos en el programa Flow jo 8,7.
2. Consecución y examen inicial a pacientes.
2.1. Examen inicial:
2.1. Elaboración de historia clínica:
Los pacientes asistentes a la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional de Colombia,
quienes recibieron una valoración por odontología general en el área de atención al usuario,
fueron remitidos a las clínicas de posgrado de periodoncia de la Universidad Nacional de
Colombia cuando se evidenciaba compromiso periodontal de cualquier severidad.
Se realizó una valoración de 37 pacientes (21 mujeres y 16 hombres), con un promedio de edad
de 37 años, remitidos de la oficina de atención al usuario de la Facultad de Odontología de la
Universidad Nacional de Colombia.
Se realizó un interrogatorio y examen físico extra e intraoral, diligenciamiento de historia clínica.
Se excluyeron los siguientes pacientes por la condición referida en la tabla:
Tabla 6: Pacientes excluidos posterior a la elaboración de la historia clínica.
Paciente
Sexo Edad Motivo exclusión
Femenino 40 años. Toma de medicamentos: Litio. 400 mg/día. Dx: Trastorno bipolar.
Masculino 32 años. Fumador pesado.
Masculino 50 años. Pre-Obesidad. IMC: 27.6. Se excluye del estudio pues en la literatura
se reporta relación entre obesidad y procesos de inflamación
sistémica de baja magnitud por esta condición (91).
Femenino 45 años. Tensión arterial: 180/110 (Referencia: 120/80)
Masculino 55 años. Tensión arterial: 140/90 Tratado con Enalapril 10 mg/día
Masculino 35 años. Tratamiento antimicótico: Funide 250 mg, 1 diaria por 28 días.
Femenino 39 años. Tratamiento antibiótico. Exodoncia hace 3 días realizada en otra
institución. Amoxicilina 500 mg, 1 cada 8 horas por 7 días.
Masculino 43 años. Dx: Gastritis crónica. Medicado con Omeprazol 20mg.
Masculino 57 años. Durante las primeras dos citas de elaboración de historia clínica el
paciente asistió al médico en la EPS donde fue diagnosticado con
Cáncer de Próstata.
Femenino 30 años Diagnóstico periodontal: Periodontitis crónica moderada localizada.
Femenino 28 años Periodontitis crónica severa localizada.
28Masculino 26 años Agrandamiento gingival generalizado.
Posterior al examen inicial e historia clínica se excluyeron un total de 9 pacientes por compromiso
sistémico o toma de medicamentos y 3 pacientes por tener un diagnóstico periodontal diferente
al requerido.
Sin embargo, todos recibieron el tratamiento periodontal pertinente en las clínicas de periodoncia
de la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional de Colombia.
Un total de 25 pacientes continuaron a la siguiente fase del estudio porque cumplieron con todos
los criterios de inclusión.
2.2 Exámenes de laboratorio iniciales
De acuerdo con el protocolo, se realizó la toma de muestra de sangre periférica por venopunción
convencional (anexo #4) a los pacientes que continuaron en el estudio. Previo a esto, los
pacientes fueron informados verbalmente, se entregó cartilla informativa y firmaron
consentimiento informado (anexo #3). Todos los pacientes estuvieron de acuerdo de forma verbal
y escrita con la participación en el proyecto, se aclaró que si por alguna razón decidían no
continuar en el estudio se podían retirar en el momento deseado sin consecuencias negativas en
su atención.
La muestra de sangre fue tomada en las instalaciones de la clínica de periodoncia de la
Universidad Nacional de Colombia. Los pacientes debían asistir con 12 horas de ayuno previo a la
toma. La auxiliar del laboratorio COLCAN fue quien realizó la toma de la muestra.
Los resultados de cada examen fueron consultados vía web por el investigador, quien posterior a
un análisis de los mismos, aplica los criterios de exclusión:
Tabla 7: Pacientes excluidos posterior a los resultados de los exámenes de laboratorio.
Paciente
Sexo Edad Motivo exclusión
Masculino 27 años Factor reumatoideo positivo.
Femenino 47 años HDL= 108 mg/dl (Referencia: 40 a 70)
Femenino 52 años Colesterol total= 265 (Referencia: < 200)
Masculino 56 años Colesterol total= 228 (Referencia: < 200)
Femenino 28 años Trigliceridos = 286 (Referencia: < 150)
29Los resultados se obtuvieron impresos para entregarlo a cada uno de los pacientes, además se
anexó copia en la historia clínica.
Se excluyeron posterior a conocer los resultados de los exámenes de laboratorio un total de 5
pacientes por resultados fuera de rango de normalidad, los pacientes fueron informados de sus
resultados para tomar una acción pertinente.
A los pacientes excluidos en esta fase se les explicaron los motivos de su no inclusión dentro del
proyecto. De igual forma que los pacientes excluidos en la primera fase, los anteriormente
mencionados recibieron tratamiento periodontal en las clínicas de periodoncia de la Facultad de
Odontología de la Universidad Nacional de Colombia.
Luego de esta selección rigurosa y exhaustiva de los pacientes a ser incluidos dentro del estudio,
la muestra final para el desarrollo del proyecto consistió en un total de 20 pacientes, distribuidos
en dos grupos de 10 personas cada uno:
Grupo 1: Pacientes con diagnóstico: periodonto sano o gingivitis asociada a placa
bacteriana.
Grupo 2: Pacientes con diagnóstico: Periodontitis crónica severa generalizada.
El grupo total se compone de 13 mujeres y 7 hombres, con un promedio de edad de 34 años.
Posterior a todo lo realizado, se consideró no tienen compromiso sistémico actual y pueden
continuar en la siguiente fase del proyecto.
En la siguiente tabla se especifican los pacientes que cumplieron con los criterios:
TABLA 8: Pacientes con dx gingivitis o periodonto sano
Número NOMBRE EDAD TELÉFONO
1 Carolina Rentería 29 3142560375
2 José Antonio Sánchez 21 3214694661
3 Kerly Andrea Pulido 23 3185568861
4 Lina Ardila 26 3146311905
5 Mirabai Bermúdez Nur 28 3102078040
6 Orlando Cruz 31 301522325
7 Patricia Castellanos 25 3017568301
8 Adriana Triana 43 3125399243
9 Asterlis Buitrago 28 3155173602
10 Daniel Mayorga 39 3142932657
30Tabla 9: Pacientes con dx periodontitis crónica severa generalizada
Número NOMBRE EDAD TELÉFONO
11 David Pérez 26 3144049613
12 Mavel Bejarano 33 3125554466
13 Milena Hernández 35 3106130226
14 Tatiana Díaz 27 3202283428
15 Viviana Hincapié 40 3013716975
16 Efraín Hernández 35 3106130226
17 Yolanda Cubides 43 3202137088
18 Lilia González 47 3003943982
19 Miguel Cardona 50 2318628
20 Jaime Moreno 53 3142006340
Posterior a este proceso de les informó a los pacientes que habían sido seleccionados para
continuar en el estudio.
31CONCLUSIONES
- Regidos por el protocolo estandarizado en el presente proyecto es posible la
cuantificación de células linfoides productoras de citocinas a nivel intracelular, mediante
la activación con PMA/ionomicina a diferentes concentraciones de acuerdo con la
proteína particular de interés.
- Las células del sub-perfil Th17 efector productoras de IL-17A e IL-17F son posibles de
cuantificar utilizando el protocolo mencionado pues los porcentajes de detección celular
coincidieron con los reportados en la literatura bajo estas condiciones.
- El protocolo para detección intracelular de IL-10 por parte de las células sub-perfil Th17
regulador requiere continuar en estudio y re-formularse para llegar a una detección
eficaz de la misma.
- Las células del sub-perfil Th17/Th1 productoras de IFN-γ son posibles de cuantificar
utilizando el protocolo mencionado pues los porcentajes de detección celular coincidieron
con los reportados en la literatura bajo estas condiciones.
RECOMENDACIONES
-Previo al desarrollo de cualquier ensayo de laboratorio que implique el uso de diferentes
productos biológicos es necesaria la estandarización de la técnica para certificar la
veracidad y reproducibilidad de los resultados, de lo contrario se puede incurrir en un
gasto de material, económico y de tiempo.
-La elaboración de protocolos estandarizados implica una previa revisión minuciosa de la
literatura enfocado en los objetivos a conseguir. De ahí que, este tipo de protocolos
deben nutrirse de diferentes fuentes bibliográficas para su desarrollo.
-Una vez escrito y validado el protocolo, debe tenerse siempre como documento guía
durante la elaboración de los ensayos preferiblemente impreso en el sitio de trabajo pues
esto disminuye significativamente la probabilidad de error si se encuentra escrito clara y
consecutivamente.
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88 Shan K, lee W, Lee S. Kim S. Dysreguulated balance of Th17 and Th1 cells in systemic lupus
erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 2010; 12: R53.
89 Liu Y, Li L, Huang F. Characterization of memory CD4+ IL-21+ T cells in human PBMC. Journal of cellular
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90 Holan H, Zajicova A, Javorkova E, Trosan P, Chudickova M, et al. Distinct cytokines balance the
development of regulatory T cells and interleukin-10-producing regulatory cells. Immunology. 2014; 141
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91 Apostolopoulos V, de Courten MP, Stojanivska L, Blatch GL, Tangalakis K, et al. The complex
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Sep 1. doi: 10.1002/mnfr.201500272. [Epub ahead of print]
38ANEXO # 1: Escalas para exámenes de laboratorio.
1. HEMOGRAMA
1.1 LEUCOCITOS
Célula Unidad medida Valor referencia
WBC 103/μL 4.4-11.3
Neutrófilos % 40-75
Linfocitos % 20-45
Monocitos % 2-10
Eosinófilos % 2-4
Basófilos. % 0-1
Neutrófilos 10^3/ μL 2-7.5
Linfocitos 10^3/ μL 1.5-4
Monocitos 10^3/ μL 0.2-0.8
Eosinófilos 10^3/ μL 0.04-0.4
Basófilos. 10^3/ μL 0-0.1
1.2 HEMATÍES
Célula Unidad medida Valor referencia
RBC 10^6/ μL 4.1-5.1
HGB g/dL 12.3-15.3
HCT % 35-47
MCV fL 80-96
MCH Pg 28-33
MCHC g/dL 33-36
RDWCV % 11.5-15.5
RDWSD fL 37-51.
391.3 PLAQUETAS
Célula Unidad medida Valor referencia
PLT 10^3/ μL 149-409
MPV fL
2. HEMOGLOBINA GLICOSILADA
Rango normal 4.0%-6.0%
Diabético controlado Hasta 7.0%
Admisible para diabético 7.1%-8.0%
Inadmisible >8.0%
3. PERFIL LIPÍDICO
3.1 COLESTEROL TOTAL
Interpretación de resultados (NCEP ATP III):
Deseable Menor de 200 mg/dL
Limítrofe 200-239 mg/dL
Alto >240 mg/dL
3.2 COLESTEROL HDL
Interpretación de resultados (NCEP ATP III):
Riesgo bajo Mayor de 60 mg/dL
Riesgo alto Menor de 40 mg/dL
3.3 COLESTEROL LDL CALCULADO
Interpretación de resultados (NCEP ATP III):
Óptimo Menor de 100 mg/dL
Ligeramente elevado 100-129 mg/dL
Limítrofe 130-159 mg/dL
40Elevado 160-189 mg/dL
Muy elevado >190 mg/dL
Calculado de acuerdo con la fórmula de Friedewald.
3.4 COLESTEROL LDL DIRECTO
Interpretación de resultados (NCEP ATP III):
Óptimo Menor de 100 mg/dL
Ligeramente elevado 100-129 mg/dL
Limítrofe 130-159 mg/dL
Elevado 160-189 mg/dL
Muy elevado >190 mg/dL
3.5 TRIGLICÉRIDOS
Interpretación de resultados (NCEP ATP III):
Deseable Menor de 150 mg/dL
Limítrofe 150-199 mg/dL
Alto 200-499 mg/dL
41ANEXO # 2 Historia Clínica
N°:________________
HISTORIA CLÍNICA – PROYECTO DE INVESTIGACIÓN
ALERTA MÉDICA: _________________________________________________________________
MOTIVO DE CONSULTA:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
ANAMNESIS PRÓXIMA:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Especifique los antecedentes positivos:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
42Tratamiento farmacológico actual: SI_____________ NO______________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Formulación antibiótica, anti-inflamatoria o corticosteroides en los últimos seis meses:
SI:______________ NO:______________
Embarazo o lactancia:
SI:______________ NO:______________
Fuma:
SI:______________ NO:______________
EXAMEN FÍSICO:
Signos vitales:
TA: ______________ mms / Hg. FC: _____________ x min
Talla: ____________ m Peso:_____________
IMC:__________________
EXAMEN INTRAORAL:
Dental:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Periodontal: Ver periodontograma.
Diagnóstico periodontal principal:
________________________________________________________________________________
Grupo: ___________________
MUESTRA #1: Resultados exámenes de laboratorio
EXAMEN RESULTADO
1. CUADRO HEMÁTICO NORMAL:______ ALTERADO: ________
2. HB GLICOSILADA. NORMAL:______ ALTERADO: ________
3. PERFIL LIPÍDICO NORMAL:______ ALTERADO: ________
4. FACTOR REUMATOIDEO NORMAL:______ ALTERADO: ________
CONTINÚA EN EL ESTUDIO:
SI: ______________ NO:________________
REQUIERE SER NOTIFICADO POR RESULTADO ALTERADO DE LOS EXAMENES DE LABORATORIO:
SI: ______________ NO:________________
43444546MUESTRA #2: Resultados exámenes de laboratorio
1. Th17 total
NÚMERO TOTAL
1. Th17 patológico
MARCADOR RESULTADO
CD4
CD161
IL-17A
IL-17F
VALOR/PORCENTAJE
2. Th2 regulador
MARCADOR RESULTADO
CD4
CD161
IL-10
IL-21
VALOR/PORCENTAJE
3. Th17/Th1
MARCADOR RESULTADO
CD4
CD161
IFN-γ
VALOR/PORCENTAJE
Tratamiento requerido:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Estudiante a cargo:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
Elaborado por:
Estudiante: Hernán Santiago Garzón V.
Directora: Dra. Lina Suárez.
Co-Directora: Dra. Nelly Roa.
47ANEXO #3: CONSENTIMIENTO INFORMADO.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE ODONTOLOGÍA
CONSENTIMIENTO INFORMADO
Investigación: Cuantificación de las sub-poblaciones de linfocitos Th17 en sangre periférica de
pacientes sistémicamente sanos con periodontitis crónica generalizada.
El siguiente consentimiento se realiza para contar con su participación en el desarrollo de la
presente investigación. Es realizada con fines académicos, para esclarecer un vacío en el
conocimiento. Al finalizar, si se encuentra de acuerdo deberá firmar el documento, aceptando su
participación.
El entendimiento de la Enfermedad Periodontal ha implicado muchos años de investigaciones, sin
llegar aún a un consenso. La presencia de estos linfocitos Th17 se ha relacionado con la
enfermedad periodontal, no obstante es necesario determinar cuál es su función dentro de esta
entidad y si su presencia implica otro tipo de alteraciones en todo el cuerpo. Por tal motivo,
resulta de vital importancia realizar esta investigación.
Desarrollaremos las siguientes fases:
1. Historia clínica y examen clínico periodontal: determinación del diagnóstico periodontal.
2. Toma de dos muestras de sangre periférica con una sola venopunción:
 Primera: Sometida a cuatro pruebas de laboratorio: Cuadro hemático,
hemoglobina glicosilada, perfil lipídico y factor reumatoideo. Esto con el fin de
descartar algún tipo de patología en su cuerpo. De encontrarse algo anormal en
sus exámenes, será informado de inmediato para tomar las medidas respectivas.
 Segunda: Permitirá determinar el número y subtipos de linfocitos Th17 en su
sangre a través de diferentes pruebas de laboratorio.
3. Análisis de los resultados.
En cualquiera de las etapas de la investigación usted es libre de denegar el uso de su información
si lo considera pertinente, aclarando que esto no repercutirá negativamente en la atención
odontológica que puede recibir en la Facultad de Odontología de la Universidad Nacional de
Colombia.
Los datos obtenidos serán manejados confidencialmente por los investigadores adscritos al
proyecto. Si bien los resultados generales deben ser publicados, sus datos personales no serán
nunca revelados públicamente. Esta investigación tiene el aval de la Facultad de Odontología de la
Universidad Nacional para su realización.
48Las preguntas que durante el curso de la investigación le puedan surgir, serán aclaradas de forma
oportuna y veraz.
Recuerde que si decide no participar esto no trae ninguna consecuencia negativa.
Recuerde que si ingresa a este estudio es un paciente que requiere tratamiento periodontal, por
tal motivo usted será atendido en las clínicas de pregrado o posgrado de Periodoncia de la
Universidad Nacional, como paciente regular. El costo del tratamiento periodontal será asumido
por usted como paciente regular de la Facultad.
Agradecemos su participación, pues su contribución es valiosa para el desarrollo científico en el
área de Periodoncia.
Declaro que todas las preguntas fueron aclaradas de forma comprensible, previa a la firma de
este documento.
_____________________________
Paciente:
Identificación:
_____________________________ _________________________________
Coordinador: Dra. Lina Suárez. Estudiante: Hernán Santiago Garzón.
_____________________________
Testigo:
Identificación:
49ANEXO #4: PROTOCOLO TOMA INDIVIDUAL DE MUESTRA DE SANGRE VENOSA
1. MATERIALES
1 jeringa de 10 cc desechable
Algodón en rama.
2 tubos de recolección.
1 torniquete o ligadura.
1 almohadilla.
1 par de guantes desechables.
Alcohol al 70%
Gasas estériles.
Implementos de bioseguridad del operador (tapabocas, visor, gorro desechable, bata).
2. MÉTODO:
1. Lavado de manos del operador, previo a cualquier procedimiento.
2. Paciente debe sentarse y colocar el brazo sobre la almohadilla.
3. Revisar la piel y venas del paciente (ubicación).
4. Seleccione el sitio que tenga mayor seguridad de éxito y de menor riesgo para el paciente.
5. Coloque la ligadura aproximadamente cuatro dedos arriba del codo.
6. Desinfecte el área de toma de la muestra con alcohol al 70%.
7. Fije la vena traccionando la piel que la circunda y solicite al paciente que empuñe la mano
suavemente.
8. Inserte la aguja con el bisel hacia arriba, puncione la vena , dirigiendo la aguja en la misma
dirección en que ésta se encuentra (puncionando primero la piel, trate de no puncionar
directamente sobre la vena porque la puede atravesar e impedir la toma de la muestra.
9. Obtener 10 ml.
10. Suelte la ligadura, pídale al paciente que suelte la mano empuñada.
11. Retire la jeringa, deje la torunda de algodón en el sitio puncionado. Pídale al paciente que
sostenga con los dedos de su otra mano el algodón para generar hemostasia.
12. Llene con la cantidad necesaria los frascos de examen, siempre llene primero los frascos
que tienen anticoagulantes, girándolos según corresponda.
13. Coloque tela adhesiva con una gasa seca en el sitio de la punción.
14. Acomode al paciente e infórmele las indicaciones.
15. Deseche el material cortopunzante en el guardián y el resto, en la caneca roja.
16. Retírese los guantes y deséchelos en la caneca roja.
17. Lávese las manos.
18. Llevar la muestra en menos de 30 minutos al sitio de análisis.
50