Descripción de tipos de carbapenemasas expresadas en Klebsiella sp. y Pseudomonas aeruginosa en hospitales de tercer nivel de la ciudad de Bogotá, estudio descriptivo.  Parte 3: Comportamiento microbiológico y los mecanismos genéticos en aislamientos de Pseudomonas aeruginosa portadores del gen blaKPC en hospitales de tercer nivel de Bogotá
Autor: Bravo Ojeda, Juan Sebastián
Asesor: Saavedra Trujillo, Carlos Humberto
Fecha: 2020-07-01
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Infectología
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Introduction: Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative rod and an opportunistic pathogen that causes infections in hospitalized patients, some of them with an special issue to treat due to their ability to become resistant to almost all the families of antibiotics available. One of its main mechanisms of resistance to carbapenems is the acquisition and production of carbapenemases, enzymes capable of hydrolyzing most β-lactam antibiotics. KPC enzyme, class A carbapenemase most frequently found in Enterobacteriaceae and widely distributed in Klebsiella pneumoniae. However, in Colombia, P. aeruginosa isolates were detected for the first time with this enzyme and since then, it has spread throughout the country. The objective of this study was to determine the genetic diversity of P. aeruginosa isolates that cause infection in patients treated in tertiary level hospitals in Bogotá, Colombia.

Methodology: A descriptive observational cross-sectional study was carried out in adult patients treated at four third-level institutions in the city of Bogotá. The genetic relationship was determined by PFGE and complete genome sequencing of two isolates was established by PacBio.

Results: During the study period, 23 isolates of P. aeruginosa resistant to carbapenems and carriers of blaKPC gene were identified. Of these, 19 (83%) had blaKPC-2 variant; and 2 blaKPC-3; blaVIM gene was detected in 3 (12%). 100% of isolates were multiresistant. PFGE analysis revealed 12 pulsotypes distributed in 8 different clones. Clone 1 was the most frequent and identified in the 4 institutions, suggesting a wide spread. Two sequenced isolates belonged to ST111 and ST235 (pandemic clones) and showed two new platforms for mobilization of blaKPC gene related to Tn3 transposon and ISPae38 insertion sequence. For the first time, the mobilization and acquisition of blaKPC-3 gene is detected in P. aeruginosa worldwide.

Conclusion: Pseudomonas aeruginosa has acquired, maintained and assimilated carbapenemase KPC. The behavior of the enzyme activity in this pathogen, as its clinical implications and activity to new anti-infective agents are unknown, constituting a new challenge due to the impact on molecular diagnosis of resistance and for the clinician, due to its results in manifestations, prognosis and treatment.

Key words: Pseudomonas aeruginosa, blaKPC-3, Carbapenems, Resistance, genetic variability, Colombia

2
Descripción de tipos de carbapenemasas expresadas en
Klebsiella sp. y Pseudomonas aeruginosa en hospitales de tercer
nivel de la ciudad de Bogotá, estudio descriptivo.
Parte 3:
Comportamiento microbiológico y los mecanismos genéticos en
aislamientos de Pseudomonas aeruginosa portadores del gen
bla en hospitales de tercer nivel de Bogotá.
KPC
Juan Sebastián Bravo Ojeda
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina – Departamento de Medicina Interna
Bogotá, Colombia
2020Descripción de tipos de carbapenemasas expresadas en
Klebsiella sp. y Pseudomonas aeruginosa en hospitales de tercer
nivel de la ciudad de Bogotá, estudio descriptivo.
Parte 3:
Comportamiento microbiológico y los mecanismos genéticos en
aislamientos de Pseudomonas aeruginosa portadores del gen
bla en hospitales de tercer nivel de Bogotá.
KPC
Juan Sebastián Bravo Ojeda
Estudiante de posgrado de Infectología
Universidad Nacional de Colombia
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar por el título de:
Especialista en Infectología
Director:
Carlos Humberto Saavedra Trujillo MD, MSc.
Internista- Infectólogo
Coordinador Programa Infectología
Profesor Titular – Departamento de Medicina Interna
Facultad de Medicina – Universidad Nacional de Colombia
Codirectores:
Javier Antonio Escobar Pérez MSc, PHD.
Coordinador Laboratorio de Genética Molecular Bacteriana
Universidad El Bosque
Aura Lucia Leal Castro MD, MSc.
Médica especialista en microbiología - Master en control de infecciones
Líder Grupo de Investigación en Enfermedades Infecciosas-Colciencias
Profesora Asociada Departamento de Microbiología
Facultad de Medicina - Universidad Nacional de Colombia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina – Departamento de Medicina Interna
Bogotá, Colombia
20204
Agradecimientos
Con profundo agradecimiento a Dios por regalarme la oportunidad de cumplir este sueño.
A mi esposa Andrea, por su amor e incondicional apoyo durante estos años, impulsándome
y regalándome una sonrisa todos los días.
A mis padres Ana Silvia, Juan Evangelista y hermana Sonia Esperanza, quienes dibujaron
con su ejemplo, humildad y entrega, el camino a seguir.
A mis docentes de pregrado y posgrado con quien especial dedicación, constancia y
esfuerzo, forjaron en mí una persona, dejando una huella indeleble.
A mi Profesora Sonia Isabel por su ejemplar entrega al arte de enseñar, contribuyendo en
la formación médica de la Universidad para el país.
A mi Profesor Carlos Humberto, por su confianza y quien, con un método pedagógico
adaptado a las necesidades de aprendizaje, ha trascendido entre sus estudiantes.
A Erika Paola, por su compañía durante este largo camino, por ser esa amiga y compañera
incondicional, a quien respeto con profunda admiración.
A mis profesores Benito, Jorge Alberto, Carlos Arturo y compañeros del Posgrado de
Infectología, por sus enseñanzas, paciencia, tiempo y dedicación.
A mis Profesores Aura Lucia, Javier, Deisy y miembros de Laboratorio de Genética
Molecular Bacteriana por su entrega en el desarrollo de este proyecto.
Y finalmente a mis pacientes, a quienes agradezco su voto de confianza, deseando poder
curarles a veces, aliviarles a menudo y consolarles siempre…
Juan Sebastián Bravo OjedaRESUMEN
Introducción: Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa y un patógeno
oportunista que causa infecciones en pacientes hospitalizados, algunas de ellas de muy
difícil tratamiento por su capacidad de volverse resistente a casi todas las familias de
antibióticos disponibles. Uno de los principales mecanismos de resistencia a
carbapenémicos en Pseudomonas aeruginosa es la adquisición y producción de
carbapenemasas, enzimas capaces de hidrolizar la mayoría de antibióticos β-lactámicos.
La enzima KPC es la carbapenemasa de clase A más frecuentemente hallada en
Enterobacterias y ampliamente distribuida en Klebsiella pneumoniae. Sin embargo, en
Colombia, se detectó por primera vez aislamientos de Pseudomonas aeruginosa con esta
enzima y desde entonces se han diseminado por todo el país. El objetivo de este estudio
fue determinar la diversidad genética de aislamientos de P. aeruginosa causantes de
infección en pacientes atendidos en hospitales de tercer nivel de Bogotá, Colombia.
Metodología: Se realizó un estudio observacional descriptivo de tipo corte transversal en
pacientes adultos atendidos en cuatro instituciones de tercer nivel en la ciudad de Bogotá.
La relación genética fue determinada por PFGE y el genoma completo de dos aislamientos
fue establecido por medio de PacBio.
Resultados: Durante el periodo de estudio, 23 aislamientos de P. aeruginosa resistentes
a carbapenémicos y portadores del gen bla fueron identificados. De estos, 19 (83%)
KPC
tenían la variante bla ; y 2 bla ; en 3 (12%) fue detectado el gen bla . El 100% de
KPC-2 KPC-3 VIM
los aislamientos fueron multirresistentes. El análisis PFGE reveló 12 pulsotipos distribuidos
en 8 clones diferentes. El clon 1 fue el más frecuente e identificado en las 4 instituciones,
sugiriendo una amplia diseminación. Los dos aislamientos secuenciados pertenecieron a
los ST111 y ST235 (clones pandémicos) y mostraron dos nuevas plataformas de
movilización del gen bla relacionadas con el transposón Tn3 y la secuencia de inserción
KPC
ISPae38. Por primera vez se detecta la movilización y adquisición del gen bla en P.
KPC-3
aeruginosa a nivel mundial.
Conclusión: Pseudomonas aeruginosa ha adquirido, mantenido y asimilado la
carbapenemasa KPC. Se desconoce el comportamiento de la actividad de la enzima en
este patógeno, así como sus implicaciones clínicas y actividad a nuevos agentes anti-
infecciosos, constituyendo un nuevo desafío por el impacto en diagnóstico molecular de
resistencia y para clínico por su resultado en manifestaciones, pronóstico y tratamiento.
Palabras clave: Pseudomonas aeruginosa, bla , Carbapenémicos, Resistencia,
KPC-3
variabilidad genética, Colombia.ABSTRACT
Introduction: Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative rod and an opportunistic
pathogen that causes infections in hospitalized patients, some of them with an special issue
to treat due to their ability to become resistant to almost all the families of antibiotics
available. One of its main mechanisms of resistance to carbapenems is the acquisition and
production of carbapenemases, enzymes capable of hydrolyzing most β-lactam antibiotics.
KPC enzyme, class A carbapenemase most frequently found in Enterobacteriaceae and
widely distributed in Klebsiella pneumoniae. However, in Colombia, P. aeruginosa isolates
were detected for the first time with this enzyme and since then, it has spread throughout
the country. The objective of this study was to determine the genetic diversity of P.
aeruginosa isolates that cause infection in patients treated in tertiary level hospitals in
Bogotá, Colombia.
Methodology: A descriptive observational cross-sectional study was carried out in adult
patients treated at four third-level institutions in the city of Bogotá. The genetic relationship
was determined by PFGE and complete genome sequencing of two isolates was
established by PacBioÒ.
Results: During the study period, 23 isolates of P. aeruginosa resistant to carbapenems
and carriers of bla gene were identified. Of these, 19 (83%) had bla variant; and 2
KPC KPC-2
bla ; bla gene was detected in 3 (12%). 100% of isolates were multiresistant. PFGE
KPC-3 VIM
analysis revealed 12 pulsotypes distributed in 8 different clones. Clone 1 was the most
frequent and identified in the 4 institutions, suggesting a wide spread. Two sequenced
isolates belonged to ST111 and ST235 (pandemic clones) and showed two new platforms
for mobilization of bla gene related to Tn3 transposon and ISPae38 insertion sequence.
KPC
For the first time, the mobilization and acquisition of bla gene is detected in P.
KPC-3
aeruginosa worldwide.
Conclusion: Pseudomonas aeruginosa has acquired, maintained and assimilated
carbapenemase KPC. The behavior of the enzyme activity in this pathogen, as its clinical
implications and activity to new anti-infective agents are unknown, constituting a new
challenge due to the impact on molecular diagnosis of resistance and for the clinician, due
to its results in manifestations, prognosis and treatment.
Key words: Pseudomonas aeruginosa, bla , Carbapenems, Resistance, genetic
KPC-3
variability, ColombiaContenido
RESUMEN .................................................................................................................. V
ABSTRACT ................................................................................................................ VI
LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................... 9
LISTA DE TABLAS ..................................................................................................... 10
LISTA DE ABREVIATURAS ......................................................................................... 11
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................... 12
2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................. 13
2.1 Pregunta de Investigación .......................................................................................... 14
3. ESTADO DEL ARTE ............................................................................................ 15
3.1 Introducción .............................................................................................................. 15
3.2 Clasificación de Carbapenemasas .............................................................................. 16
3.3 Reseña histórica ........................................................................................................ 18
3.4 Panorama actual ........................................................................................................ 19
3.5 Pseudomonas aeruginosa en la actualidad ................................................................ 20
3.5.1 Epidemiología clonal ................................................................................................. 21
3.5 Diagnóstico y detección de carbapenemasas ............................................................. 22
3.5.1 Diagnóstico molecular de carbapenemasas ............................................................. 24
3.6 Integración de los diversos métodos diagnósticos ...................................................... 25
3.7 Mecanismos genéticos ............................................................................................... 26
3.7.1 Plataformas genéticas móviles ................................................................................. 26
3.7.2 Secuencias de inserción y transposones ................................................................... 27
3.7.3 Islas genómicas ......................................................................................................... 27
3.7.4 Plásmidos .................................................................................................................. 28
3.7.5 Profagos .................................................................................................................... 29
4. OBJETIVOS ....................................................................................................... 30
4.1 Objetivo General ....................................................................................................... 30
4.2 Objetivos específicos ................................................................................................. 30
5. METODOLOGÍA ................................................................................................ 31
5.1 Tipo de estudio .......................................................................................................... 31
5.2. Universo y Población ................................................................................................ 31
5.3 Muestra ..................................................................................................................... 31
5.4 Criterios de inclusión ................................................................................................. 31
5.5 Criterios de exclusión ................................................................................................ 31
5.7 Instrumentos ............................................................................................................. 33
5.8 Aislamientos microbiológicos y pruebas microbiológicas: intervenciones de laboratorio
microbiológico sobre las muestras aisladas. .................................................................... 33
5.8.1 Aislamientos bacterianos: ........................................................................................ 33
5.8.2 Colección de cepas, perfil de susceptibilidad ........................................................... 34
5.8.3 Detección por PCR de genes de resistencia .............................................................. 34
5.8.4 Relación genética entre aislamientos de P. aeruginosa ........................................... 345.8.5 Secuenciación del genoma completo de aislamientos de P. aeruginosa ................. 35
5.8.6 Identificación del Resistoma ..................................................................................... 35
5.9 Variables para recolección de datos y definición ........................................................ 36
5.10 Plan de análisis estadístico ...................................................................................... 37
5.11 Financiamiento ........................................................................................................ 37
6. CONSIDERACIONES ÉTICAS ............................................................................... 38
7. RESULTADOS ................................................................................................... 39
7.1 Descripción general y resistencia a carbapenémicos .................................................. 39
7.2 Relación genética de los aislamientos ........................................................................ 41
7.3 Secuenciación y análisis de los genomas .................................................................... 42
7.4 Plataformas genéticas que transportan genes de resistencia en aislamientos 34Pae23
ST235 y 34Pae36 ST111 ................................................................................................... 44
8. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 47
9. CONCLUSIONES ................................................................................................ 52
10. ANEXOS ....................................................................................................... 53
Anexo 1. Formato de recolección de muestras ................................................................ 53
Anexo 2. Algoritmo de trabajo ........................................................................................ 55
Anexo 3. Formato recolección de datos ........................................................................... 56
Anexo 4. Aprobación comité de Ética – Universidad Nacional de Colombia ..................... 57
11. REFERENCIAS ............................................................................................... 599
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estructura general de las secuencias de inserción, transposones e
integrones. .............................................................................................................. 26
Figura 2. Diagrama de flujo de metodología ............................................................ 32
Figura 3. Orden cronológico de aparición de los 23 aislamientos de Pseudomonas
aeruginosa incluidos en el estudio, con número de casos en cada una de las
instituciones. ........................................................................................................... 40
Figura 4. Relación genética de los aislamientos de Pseudomonas aeruginosa
potadores del gen bla por medio de macro-restricción del DNA genómico y PFGE.
KPC
................................................................................................................................ 42
Figura 5- Diagrama de secuenciación genómica de aislamientos de P. aeruginosa
seleccionados .......................................................................................................... 43
Figura 6. Estructura general del entorno genético del gen bla en los aislamientos
KPC
de Pseudomonas aeruginosa.. ................................................................................. 45
Figura 7. Inserción cromosomal de bla en el aislamiento de Pseudomonas
KPC
aeruginosa 34Pae36. ............................................................................................... 46LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Clasificación de β-lactamasas de espectro extendido según nomenclatura de
Ambler y Bush (20) .................................................................................................. 17
Tabla 2. Clasificación por patrones fenotípicos de carbapenemasas (19,20). ............ 18
Tabla 3. Frecuencia de resistencia a carbapenémicos por especie de bacterias.
Reporte Grupo GREBO (1). ....................................................................................... 20
Tabla 4. Carbapenemasas encontradas en los Klebsiella pneumoniae y Pseudomona
aeruginosa (19,20). ................................................................................................. 22
Tabla 5. Islas genómicas frecuentemente descritas en P. aeruginosa (56,66). .......... 28
Tabla 6. Descripción de tipo de resistencia a carbapenémicos en aislamientos de P.
aeruginosa .............................................................................................................. 39
Tabla 7. Distribución de los aislamientos de P. aeruginosa de acuerdo a la institución
donde se identificó y los tipos de infección producida. ............................................ 40
Tabla 8. Resistomas de aislamientos de P. aeruginosa 34Pae23 (ST235- bla ) y
KPC-2
34Pae36 (ST111- bla ). ........................................................................................ 44
KPC-3
Tabla 9. Actividad de nuevos agentes antimicrobianos contra bacilos Gram negativos
resistentes a carbapenémicos. ................................................................................. 5111
LISTA DE ABREVIATURAS
AAC Aminoglicósido-acetil-transferasa
AAD Aminoglicósido-adenilil-transferasa
ATCC Del inglés “American Type Culture Collection” ADN Ácido
desoxirribonucleico
APH Aminoglicósido-fosforil-transferasa
ARN Ácido ribonucleico
ARNt Ácido ribonucleico de trasnferencia
bla β-lactamasa
BLEE Beta-lactamasa de espectro extendido
CDC del inglés Centers for Disease Control and Prevention
CLSI del inglés Clinical Laboratory Standard Institute
CTX-M β-lactamasa con capacidad de hidrolizar cefotaxime
EDTA Acido etilendiaminotetraacetico
EUCAST del inglés European Committee on Antimicrobial Suceptibility Testing
G-C Guanina - Citosina
GREBO grupo para control de la resistencia bacteriana en Bogotá
IMP β-lactamasa con capacidad de hidrolizar imipenem
MALDI-TOF desorción/ionización láser asistida por una matriz con detección
de masas por tiempo de vuelo
CIM Concentración mínima inhibitoria
INS Instituto Nacional de Salud
Pae-KPC P. aeruginosa resistente a carbapenémicos mediado por gen KPC
LGMB Laboratorio de genética molecular bacteriana
MLST del inglés Multilocus sequence typing (Tipificación de secuencias de
múltiples loci)
NDM Metalo-ß-lactamasa de Nueva Delhi
OMS Organización Mundial de la Salud ORF Marco abierto de lectura
PAGI Isla genómica de Pseudomonas aeruginosa
pb Pares de bases
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PFGE del inglés Pulse Field Gel Electroforesis (Electroforesis en campo
pulsado)
RPM Revoluciones por minuto
VIM Metalo-ß-lactamasa de Verona codificada por integrón1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El presente estudio pretende establecer la posible relación entre el desconocimiento del
comportamiento local de la resistencia antimicrobiana, y los fenómenos genéticos y
microbiológicos que explican el éxito de la misma. El incremento en la resistencia a los
antibióticos del tipo carbapenémicos en bacilos Gram negativos no fermentadores como
Pseudomonas aeruginosa superan el 25% en diferentes ciudades de Colombia,
especialmente en Bogotá según los últimos reportes disponibles del grupo para control
de la resistencia bacteriana en Bogotá (GREBO) (1). Esta resistencia se ha asociado
a mayores tiempos de estancia hospitalaria, uso prolongado de antibióticos generando
un impacto económico hasta el momento no cuantificado en nuestro medio.
En un estudio precedente, se analizaron 80 aislamientos de P. aeruginosa causantes
de infecciones en 6 instituciones de salud de Bogotá (2), encontrando una mayor
frecuencia de aislamientos portadores de KPC (correspondiente a 48%) en comparación
con VIM (correspondiente a 13%), una situación muy particular a la documentada en la
literatura mundial.
Dado el incremento en la mortalidad, costos para el sistema de salud del país y la
necesidad de fortalecimiento en políticas para el control de la expansión de las cepas
resistentes, plantean el escenario para desarrollo de este estudio.13
2. JUSTIFICACIÓN
Pseudomonas aeruginosa es uno de los patógenos oportunistas más importantes y por
su ubicuidad en el ambiente es un agente frecuente en infecciones (3). La tasa de
susceptibilidad a carbapenémicos varía en un amplio rango en distintos escenarios,
indicando el conocimiento de la epidemiología local para dirigir la terapia antibiótica
inicial razonada en espera del antibiograma rutinario para ajustes posteriores en la
terapia. La resistencia a múltiples antimicrobianos en cepas de P. aeruginosa es un
evento cada vez más frecuente. Su identificación oportuna y comprensión de los
mecanismos de resistencia es elemental en la elección y optimización de la terapia. La
tasa de resistencia a carbapenémicos en P. aeruginosa ha mostrado una tendencia al
aumento en los últimos años debido a la difusión y amplio uso de estos medicamentos
en diversos escenarios hospitalarios, conllevando a la selección de cepas resistentes.
Pseudomonas aeruginosa posee una amplia gama de mecanismos de resistencia que
le confieren multirresistencia, entre ellos las bombas de expulsión, modificación del sitio
blanco, disminución o ausencia de porinas y la presencia de beta-lactamasas. Respecto
a la resistencia a carbapenémicos, en P. aeruginosa está mediada principalmente por
la ausencia de porinas responsables del ingreso del medicamento al interior de la
bacteria (OprD), aumento de bombas de expulsión y la producción de carbapenemasas,
enzimas capaces de degradar los carbapenémicos. La enzima VIM, una metalo-beta-
lactamasas de clase B, es la carbapenemasa más difundida entre aislamientos de P.
aeruginosa, con algunos reportes de las oxacilinasas pertenecientes a la clase D, como
OXA 40 y 198, que han mostrado espectro anti carbapenémico. Sin embargo, en el año
2007 se reportó en Colombia (4), y por primera vez en el mundo, la circulación de
aislamientos de P. aeruginosa portadores del gen bla . Aunque inicialmente la
KPC-2
carbapenemasa VIM era la más frecuente entre los aislamientos colombianos de P.
aeruginosa, en 2014, se reportó una frecuencia similar de aislamientos VIM y KPC en
Medellín. Recientemente Conde y cols (2) analizando 80 aislamientos de P. aeruginosa
causantes de infecciones en 6 instituciones de salud de Bogotá, encontraron una mayor
frecuencia de aislamientos portadores de KPC (correspondiente a 48%) en comparación
con VIM (correspondiente a 13%), una situación muy particular a la documentada en la
literatura mundial (5). Estos aislamientos con KPC serán analizados en el presente
estudio.
Como se ha argumentado previamente, la información sobre el comportamiento
epidemiológico y los posibles cambios en la presentación de las infecciones por
Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos mediante expresión de gen
bla es muy limitada en el país. Comprender la dinámica de la transferencia de
KPCelementos mediante el uso de plataformas genéticas que confieren resistencia es uno
de los factores importantes para diseñar las mejores prácticas para prevenir la
propagación de bacterias resistentes a múltiples fármacos y las infecciones asociadas
con la atención médica. Con el presente trabajo se pretende aportar evidencia científica
para su evaluación y caracterización genética y microbiológica institucional, aportando
en el constructo como recomendación en la toma de decisiones respecto al manejo de
infecciones causadas por bacterias multirresistentes.
2.1 Pregunta de Investigación
¿Qué fenómenos genéticos y microbiológicos podrían estar relacionados con el
aumento de la emergencia y diseminación de Pseudomonas aeruginosa portadores del
gen bla en hospitales de tercer nivel de Bogotá?
KPC15
3. ESTADO DEL ARTE
3.1 Introducción
El advenimiento de la resistencia bacteriana y las infecciones derivadas de estas,
constituyen un problema de salud pública en todo el mundo, agravado por la inexistencia
de tratamientos efectivos. La Organización Mundial de la Salud emitió en el año 2014 el
primer reporte global de resistencia antimicrobiana, en donde reportó altas tasas de
resistencia a antimicrobianos en las principales bacterias causantes de infecciones
hospitalarias y de comunidad en el mundo, tales como Enterobacteriaceae y
Pseudomonas aeruginosa (6). Se ha descrito un aumento en la circulación de
aislamientos de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos, antibióticos
habitualmente utilizados como última línea para el tratamiento de infecciones
intrahospitalarias (7–10). El estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la
diseminación de la resistencia, es fundamental para su entendimiento; esta
diseminación se puede dar verticalmente, a través de la diseminación de clones exitosos
portadores de determinantes de resistencia; u horizontalmente por la transferencia de
DNA foráneo entre dos bacterias de la misma o diferente especie. Cada año en los
Estados Unidos, cerca de dos millones de personas adquieren infecciones graves por
bacterias que son resistentes a uno o más de los antibióticos que fueron diseñados para
su manejo. Los CDC (Centers for Disease Control and Prevention) en su reporte del
2013, clasificaron específicamente a las infecciones causadas por P. aeruginosa con
resistencia a carbapenémicos como una amenaza urgente para el sistema de salud, ya
que cada año aproximadamente 600 muertes son secundarias a infecciones causadas
por este microorganismo (11). Desde el punto de vista clínico, se ha reportado aumento
de mortalidad entre 30 – 70% en pacientes con neumonías o bacteriemias,
comparándose con pacientes con infecciones por aislamientos sensibles (3,12–14). Así
mismo, un aumento de costos para tratamiento y complicaciones derivadas, junto con
estancias hospitalarias prolongadas se atribuyen a estos aislamientos resistentes a
carbapenémicos.
Desde 1996 cuando se documentó el primer caso de infección por Klebsiella
pneumoniae productora de carbapenemasas (KPC) en el mundo (15) en una cepa
aislada en un hospital de Carolina del Norte (EE. UU), se ha documentado una
expansión en el número de casos debido a la facilidad que tienen de transmitirse por
medio de plásmidos entre diferentes Enterobacterias (16). En la actualidad en países
como Argentina, Brasil, Chile, Venezuela y México se ha detectado un aumento en loscasos e incluso ha sido causa de brotes por estos microorganismos productores de
carbapenemasas pues las medidas tomadas contra la expansión han demostrado ser
insuficientes (17).
3.2 Clasificación de Carbapenemasas
Las enzimas betalactamasas tipo carbapenemasas pueden hidrolizar e inactivar los
carbapenémicos, antibióticos bactericidas de mayor espectro antibacteriano y por tanto
de un gran valor para las instituciones de salud pues permiten tratar un amplio número
de infecciones causadas por diversos microorganismos resistentes. Es conocida la
limitación terapéutica cuando se presenta falla al tratamiento con este grupo antibiótico.
Los carbapenemes inhiben la síntesis de la pared bacteriana porque bloquean la
actividad transpeptidasa de las proteínas fijadoras de penicilina (PBP) de peso
molecular alto (18). Atraviesan la membrana externa de las bacterias gramnegativas a
través de unas proteínas específicas de la membrana externa (OMP) para llegar al
espacio periplásmico. La OMP más importante es OprD en Pseudomonas aeruginosa.
La síntesis de peptidoglucano disminuye y la bacteria muere, por efecto osmótico o
digerida por enzimas autolíticas. Aunque existen variaciones según el carbapenem
concreto, se unen principalmente a las PBP 1a, 1b, 2 y 4 y en menor medida a PBP3,
que es la principal diana de las aminopenicilinas y las cefalosporinas. La afinidad de los
carbapenemes por múltiples PBP de diversas bacterias contribuye a su amplio espectro
de actividad. Son bactericidas, con actividad tiempo-dependiente. Activos sólo en fase
de crecimiento bacteriano (19). Efecto bactericida máximo a concentraciones de
antibiótico libre 4-5 veces superiores a la Concentración Inhibitoria mínima (CIM). La
eficacia clínica se correlaciona con la obtención de un tiempo de persistencia de
antibiótico libre, por encima de la CIM, en torno al 50-60 % del intervalo entre dosis
consecutivas (18,19).
Según la clasificación estructural de Ambler, las carbapenemasas se clasifican en 3
clases principales (Clase A, B y D). Las de clase A son enzimas que requieren la
presencia de residuos de serina para que puedan hidrolizar los carbapenémicos razón
por la cual se llaman serinproteasas; mientras que las enzimas tipo B requieren la
presencia de Zinc para que puedan ejercer su efecto y son conocidas como
metalobetalactamasas. Por último, el grupo D, no requiere de ningún cofactor y puede
hidrolizar diferentes grupos de betalactámicos; se conocen como oxacilinasas (tabla 1).
Las carbapenemasas del tipo KPC pertenecen a la clase A y desde su descubrimiento17
han aparecido diferentes tipos de esta enzima debido a mutaciones en los genes
responsables de su expresión, con el pasar de los años se han descubierto nuevas
mutaciones en otros tipos de enzimas, dando una gran diversidad.
Tabla 1. Clasificación de β-lactamasas de espectro extendido según nomenclatura
de Ambler y Bush (20)Tabla 2. Clasificación por patrones fenotípicos de carbapenemasas (19,20).
CLASE CARACTERÍSTICA EJEMPLO
CLASE A Hidroliza un grupo amplio de KPC- ST 258,
antibióticos betalactámicos; GES
incluyendo aztreonam. IMI
Inhibidas por el ácido clavulánico. SME
NMC
CLASE B Metalobetalactamasa. VIM
Resistente a la mayoría de inhibidores IMP
de Betalactamasa, SIN actividad NDM
hidrolítica contra aztreonam. SPM
Inhibidas por agentes quelantes como
EDTA, ácido mercaptoacético, ácido
mercaptopropionico
CLASE D Perfil de hidrólisis variable. OXA-48
No inhibidas por ácido clavulánico y OXA-23
EDTA OXA-24
OXA-51
OXA-58
OXA-143
OXA-235
3.3 Reseña histórica
En el 2005 en Colombia se documentó la presencia de Klebsiella pneumoniae productor
de carbapenemasa bla , y se evidenció que pertenecía a la cepa de mayor extensión
KPC-2
en el mundo ST-258, mismo clon a las presentadas en una epidemia en Israel (21). A
partir de ese momento, se documentó un aumento en la resistencia a carbapenémicos,
con frecuencias que oscilan hasta el 14% en algunos hospitales de Bogotá (extrapolado
de la detección de resistencia a carbapenémicos – meropenem e imipenem en los
reportes del Grupo Para el Control de la Resistencia Bacteriana en Bogotá (GREBO)
(1). Un estudio colombiano en siete ciudades con aislamientos de cepas de Klebsiella
pneumoniae KPC detectó una prevalencia de bla del 59% y bla del 41%. (22)
KPC 2 KPC 3
Se considera a Colombia en la actualidad endémica para KPC, VIM, OXA 23, por lo cual
es prioritario implementar en los hospitales medidas encaminadas a controlar y evitar
infecciones por microorganismos que expresan este mecanismo de resistencia.
En nuestro país se han documentado diferentes tipos de carbapenemasas (KPC, VIM,
NMD, NMC-A, IMP, OXA-23 y OXA-72) (17). Las infecciones por gérmenes productores19
de carbapenemasa tipo kpc-2 traen consigo una mayor mortalidad; esto ha sido
demostrado en un estudio en el cual la mortalidad de microorganismo productor
comparada contra microorganismo no productor de esta enzima fue de 32.3 % vs 9.9%
respectivamente OR 3.6 (IC 95% 1.87 – 6.91) p <0.001 (23). Este aumento de la
mortalidad también se ha documentado en infección por P. aeruginosa productora de
carbapenemasa tipo metalobetalactamasa con tasa de mortalidad general de 17.3 por
1000 pacientes día vs 11.8 por 1000 pacientes día en infección por P. aeruginosa no
productora, con un RR significativo de1.55 (IC95% 1.06 – 2.27) indicando que la
presencia de carbapenemasas aumentó la mortalidad en este estudio (24). En relación
al tipo de carbapenemasa se documentó en el 2004 la presencia de P. aeruginosa
productora de vim-8 en la ciudad de Cali (25), en el 2006 se documentó (26); y en
VIM 2
el 2011 se describió en un paciente pediátrico la infección por K. pneumoniae productor
de (27). Por otra parte, en el 2012 se describió la presencia de 2 diferentes
vim 24
carbapenemasas en la misma bacteria (K. pneumoniae productoras de KPC y VIM) (28).
Otro tipo de metalobetalactamasa documentada en Colombia es la NMD la cual se
describió en el 2013 en 6 pacientes pediátricos infectados por K. pneumoniae; cuyo
estudio molecular documentó una secuencia diferente a las descritas anteriormente
(29).
Las carbapenemasas tipo D también han sido descritas en el país. En Calí se detectó
la presencia de carbapenemasa tipo OXA-23 y OXA-51 en 66 cepas de Acinetobacter
baumannii resistente a carbapenémicos (30), posteriormente en el 2012 se describió
por primera vez en Colombia la presencia de OXA -72 en A. baumannii (31). En el 2015
se describieron en 13 pacientes con infección de tejidos blandos y ostemielitis la
presencia de A. baumannii productor de OXA-51 (32). El hecho de tener diversos
aislamientos en distintas ciudades pone de manifiesto la expansión de estos
mecanismos en todo el territorio nacional.
3.4 Panorama actual
El Instituto Nacional de Salud, en el marco del programa de vigilancia por el laboratorio
de la resistencia bacteriana de infecciones asociadas a la atención en salud (IAAS) entre
el año 2012-2014 (33) indica que en Colombia los microorganismos que más producen
carbapenemasas en orden de frecuencia son Pseudomonas sp., Klebsiella sp.,
Enterobacter sp., Escherichia coli, Acinetobacter sp, Providencia rettgeri y Citrobacter
sp. Los tipos de carbapenemasas más frecuentes en enterobacterias fueron KPC, VIM,
NDM y la combinación KPC + VIM; mientras que, para Pseudomonas sp., el más
frecuente es VIM seguido de KPC y la combinación KPC +VIM.En Acinetobacter sp. la carbapenemasa más frecuente fue OXA-23 presentando
ocasionalmente producción de KPC, NDM y la combinación de OXA-23 +KPC, NDM
+OXA-23 y OXA-24+OXA-143. Para Bogotá puntualmente, se tiene como
microorganismo con mayor tasa de resistencia a carbapenémicos registrada al
Acinetobacter baumanii con resistencias reportada alrededor del 50%, seguidos en
frecuencia por Pseudomonas aeruginosa y en tercer lugar a especies de Klebsiella sp.
(Tabla 2)
Tabla 3. Frecuencia de resistencia a carbapenémicos por especie de bacterias.
Reporte Grupo GREBO (1).
3.5 Pseudomonas aeruginosa en la actualidad
Pseudomonas aeruginosa posee una amplia gama de mecanismos de resistencia que
le confieren multirresistencia, entre ellos las bombas de expulsión, modificación del sitio
blanco, disminución o ausencia de porinas y la presencia de beta-lactamasas. Respecto
a la resistencia a carbapenémicos, en P. aeruginosa está mediada principalmente por
la ausencia de porinas responsables del ingreso del medicamento al interior de la
bacteria (OprD) (34–36), aumento de bombas de expulsión y la producción de
carbapenemasas, enzimas capaces de degradar los carbapenémicos. La enzima VIM,
una metalo-beta-lactamasas de clase B, es la carbapenemasa más difundida entre
aislamientos de P. aeruginosa (37), con algunos reportes de otras metalo-beta-
lactamasas tipo NDM (38) y oxacilinasas pertenecientes a la clase D, como OXA 40 y
198, que han mostrado espectro anti carbapenémico (39). Sin embargo, en el año 2007
se reportó en Colombia, y por primera vez en el mundo, la circulación de aislamientos
de P. aeruginosa portadores del gen bla (4). Aunque inicialmente la carbapenemasa
KPC-221
VIM era la más frecuente entre los aislamientos colombianos de P. aeruginosa, en 2014,
se reportó una frecuencia similar de aislamientos VIM y KPC en Medellín (2).
Recientemente Conde y cols (40) analizando 80 aislamientos de P. aeruginosa
causantes de infecciones en 6 instituciones de salud de Bogotá, encontraron una mayor
frecuencia de aislamientos portadores de KPC (41, correspondiente a 48%) en
comparación con VIM (9, correspondiente a 13%), una situación muy particular a la
documentada en la literatura mundial. Estos aislamientos con KPC serán analizados en
el presente estudio. Las causas del aumento de la frecuencia de los aislamientos de P.
aeruginosa con el gen bla no son claras, no obstante, recientemente se reportó un
KPC
aislamiento de P. aeruginosa con dos copias del gen bla dentro del cromosoma de
KPC-2
la bacteria y una concentración mínima inhibitoria de meropenem de 1024µg/ml,
sugiriendo una posible mayor producción de la carbapenemasa (2,5,40,41).
3.5.1 Epidemiología clonal
P. aeruginosa no presenta comportamiento clonal debido a las altas tasas de
recombinación entre los aislamientos, esto es gracias a que se promueve una estructura
en la población compuesta por un número limitado de clones a partir de recombinación
genética (42,43), Esta variabilidad genética se observa muy bien en los aislamientos
susceptibles, pero en el caso de los aislamientos MDR y XDR no sucede lo mismo. Se
han identificado aislamientos hospitalarios XDR con tipos de secuencia (ST)
específicos, dentro de los cuales se encuentran ST111, ST175 y ST235, considerados
como de alto riesgo siendo este último el más diseminado en todos los continentes (44–
46)
P. aeruginosa ST235 ha sido el clon de alto riesgo más diseminado en diferentes países
asociado además a producción de carbapenemasas. Actualmente sigue existiendo poca
información de los tipos de secuencia que presentan los aislamientos que circulan en
países latinoamericanos. En Brasil desde el año 1997 se ha reportado el clon pandémico
ST277 asociado a SPM-1. En Colombia el ST111 y el ST235 han sido los tipos de
secuencia más asociados a aislamientos resistentes a carbapenémicos, en ellos se han
identificado los genes bla y bla , respectivamente. La asociación de bla al
VIM-2 KPC-2 KPC-2
ST235 es un evento observado en Colombia. Adicionalmente, la movilización de estos
genes ha sido asociada a integrones clase 1 en el caso de bla y el transposón Tn4401
VIM
para bla . A la fecha no se han identificado genes bla en P. aeruginosa
KPC KPC-33.5 Diagnóstico y detección de carbapenemasas
Para detectar la presencia de carbapenemasas es necesario tener en cuenta los
lineamientos establecidos por los comités de CLSI (Clinical and Laboratory Standards
Institute) y EUCAST (European Committee on Antimicrobial Suceptibility Testing) en
relación a las diferentes pruebas que se pueden realizar con el objetivo de detectar la
presencia de carbapenemasas y clasificarlas (47). La presencia de carbapenemasas
puede no resultar en resistencia completa sino en valores de concentración inhibitoria
mínima (CIM) intermedios que a su vez varían cuantitativamente día a día impidiendo
obtener un resultado concreto. La detección mediante métodos automatizados varía
ampliamente en cuanto a sus resultados reflejando los patrones de susceptibilidad a
meropenem e imipenem desde un 7- 87% (48).
Una vez se documente la resistencia por método automatizado, es necesaria la
realización de pruebas que confirmen la presencia de carbapenemasas; se han descrito
diferentes pruebas fenotípicas, siendo el Test de Hodge modificado el más utilizado,
dado su rendimiento y costo. Utilizada recientemente para la detección de KPC, debido
a que estudios posteriores demostraron baja sensibilidad para detectar
metalobetalactamasas (49).
Tipos de Klebsiella sp. Pseudomonas aeruginosa
Carbapenemasa KPC 2 y KPC KPC 2 y 5
Clase A 3 GES-5 Clase A GES 2,5 y 18
NDM-1 IMP- 32 variantes
Clase B IMP Clase B VIM- 23 variantes
VIM SPM-1 (Brasil y
Suiza)
GIM-1
NDM-1
FIM-1
Clase D OXA-48,181, Clase D Oxa 40, 198
204 y 232
Tabla 4. Carbapenemasas encontradas en los Klebsiella pneumoniae y
Pseudomona aeruginosa (19,20).
El test modificado de Hodge consiste en demostrar el crecimiento de un microorganismo
susceptible a carbapenémicos (cepa control) alrededor de una bacteria en estudio23
sospechosa de producir carbapenemasas. Las enzimas carbapenemasas en caso de
estar presentes atraviesan por difusión un medio de cultivo con una concentración
estándar de carbapenémico contenido en disco y favorecen el crecimiento de la cepa
control alrededor del microorganismo en estudio.
Para la detección de metalobetalactamasas (MBL) se utilizan pruebas con discos que
contengan una molécula inhibidora quelante de metales como es el ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) con el objetivo de inactivar la enzima por medio de la
alteración hidroelectrolítica en la presencia de metales como el Zinc (Zn). De esta
manera al comparar el efecto de un disco de antibiótico que tuviera la molécula quelante
en comparación a la que estuviera sin la molécula (prueba de doble disco), se
observarían diferencias significativas en el crecimiento bacteriano (50). Adicionalmente
esta prueba se trasladó al uso de E-test utilizando como marcadores imipenem e
imipenem + EDTA, los cuales posteriormente se modificaron estableciendo el uso de
meropenem debido a una mayor sensibilidad y especificidad en detectar producciones
bajas de carbapenemasas tipo metalobetalactamasas con este último marcador. En
Bogotá el Instituto Nacional de Salud recomienda realizar prueba de sinergismo con
doble agente quelante, usando ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) más Ácido
mercaptoacético de sodio (SMA)
Para la identificación de KPC (clase A), se utilizan pruebas basadas en la utilización del
ácido borónico (51) y sus derivados 3- ácido fenilborónico (ABPA) y ácido fenilborónico
(BPA) como inhibidores de la betalactamasa tipo KPC; de esta misma forma utilizando
el principio para la detección de metalobetalactamasas (prueba de doble disco) usando
como marcador imipenem o meropenem (este último con un mejor rendimiento), se
logra detectar KPC con una buena sensibilidad, pero su especificidad se ve reducida
puesto que esta prueba puede arrojar un falso positivo debido a la hiperproducción de
betalactamasa tipo AmpC (ABPA inhibe AmpC) y disminución de porinas (51,52) razón
por la cual se recomienda el uso adicional de cloxacilina para inactivar a las
cefalosporinasas (53).
Debido a la aparición de microorganismos capaces de expresar más de una
betalactamasa al mismo tiempo (serin proteasa + metalobetalactamasas), los métodos
descritos previamente darían un alto número de resultados falsos negativos pues cada
método estaría enfocado en la detección de una clase determinada de carbapenemasa.
Por esta razón desde el 2010 se describen técnicas con el objetivo de lograr detectarlos;
es así como se combinan las pruebas de identificación con EDTA parametalobetalactamasa y ácido borónico y sus derivados (BPA- ABPA) para KPC en
antibióticos como meropenem (mejor rendimiento) y cloxacilina, el resultado fue una alta
especificidad y baja sensibilidad para detección de KPC/MBL (54,55).
3.5.1 Diagnóstico molecular de carbapenemasas
En la última década han aparecido los métodos moleculares como gold standard en la
detección de genes causante de la producción de carbapenemasas, la mayoría de estas
pruebas están basadas en reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en
ingles), permitiendo identificar diferentes tipos de genes y además establecer según la
técnica (electroforesis) si están localizadas en plásmidos o en cromosomas. Estas
pruebas tienen una gran ventaja, los resultados son rápidos (4 – 6 horas) en
comparación a pruebas fenotípicas (24 – 48 horas), manteniendo una sensibilidad y
especificidad alta y logrando detección de genes que producen carbapenemasa tipo
OXA (56,57). Actualmente el set de PCR multiplex permite la detección de diferentes
carbapenemasas (IMP, VIM, GIM, SIM NMD, OXA, KPC) y en el 2011 se amplió la
detección de esta PCR a cefalosporinasas tipo AmpC plasmídicas, (ACC, ACT, DHA,
CMY, FOX, LAT, MIR y MOX) metalobetalactamasas (IMI, SME y NMC-A) y OXA (23,
24, 51, 58 y 143) (58,59). Las técnicas de PCR han evolucionado y mejorando el tiempo
de detección e identificación de estos genes; es así como PCR en tiempo real mejora la
detección a 2 – 3 horas con una sensibilidad y especificidad del 100% (60); y
posteriormente aparece la detección simultánea de diferentes genes de
carbapenemasas como KPC, Metalobetalactamasas y OXA por medio de micro arreglos
con una alta sensibilidad y especificidad, pero solo validadas en hemocultivos (61).
Actualmente se dispone de pruebas directas novedosas para detectar actividad de
carbapenemasas, razón por la cual se sugiere deberían ser utilizadas en todos los
laboratorios dado su gran utilidad clínica. Dentro de los diferentes métodos, el primero
con el que se cuenta es el colorimétrico, consiste en la detección de hidrólisis de los
betalactámicos por medio de reacciones químicas que ocasionan el cambio de color del
agar donde está creciendo el microorganismo (62). Uno de los más conocidos es el
CarbaNp, en el cual la base es fenol rojo, sulfato de Zinc e imipenem, la presencia de la
carbapenemasa hace que haya un cambio de rojo a amarillo en el cultivo, observando
la positividad de esta prueba frente a carbapenemasas tipo A, B y D (62), con posterior
validación en hemocultivos utilizando además infusión de corazón-cerebro, con un
rendimiento igual y reduciendo el tiempo de detección de 24 horas a 3-5 horas. El
rendimiento de CarbaNP es bueno para detectar betalactamasas tipo A y B, pero
estudios posteriores determinaron que en la detección de carbapenemasas tipo D su25
rendimiento era muy bajo documentándose una mayor tasa de falsos negativos (63).
Desde el 2013 se dispone Blue-carba como una prueba bioquímica fácil de realizar con
un rendimiento similar a CarbaNP (64).
Por último, la espectrometría de masas aparece como un método revolucionario,
permitiendo detectar actividad hidrolítica per se de las carbapenemasas, ha sido
adaptada para la detección de los diferentes tipos, siendo útil para las carbapenemasa
tipo OXA; el MALDI-TOF con un tiempo de aproximadamente 4 horas permite
determinar género y especie del microorganismo involucrado como la actividad
enzimática de la betalactamasa (18).
3.6 Integración de los diversos métodos diagnósticos
Para integrar todos estos métodos diagnósticos se ha sugerido el siguiente esquema a
manera de organigrama para sistematizar la detección de carbapenemasas: (65):
• Detección de MIC elevadas para carbapenémicos en antibiogramas como paso
inicial en las especies bacterianas previamente determinadas.
• Con objetivo clínico se pueden realizar pruebas fenotípicas tipo test de Hodge
modificado y/o prueba de doble disco, así como pruebas colorimétricas como
Carba-Np o Blue carba para detectar actividad de betalactamasas en los
aislamientos derivados del primer paso descrito arriba.
• Con objetivos epidemiológicos adicional, se pueden realizar pruebas
genotípicas y moleculares sobre estos aislamientos (según disponibilidad), para
detección de genes de carbapenemasas, así como para determinar tipo
específico de carbapenemasa.
• Estudios más complejos como análisis de plásmidos o electroforesis en gel.
• Al no detectar actividad de carbapenemasas, se considerará que la resistencia
a carbapenémicos sea secundaria a otros mecanismos.
Estas pruebas dependen de los recursos y la capacidad de los laboratorios de
investigación. Dado la dinámica tan grande en la expansión de este tipo de resistencia
en el mundo es necesario ampliar estudios sobre la epidemiologia de las
carbapenemasas en diferentes regiones geográficas.3.7 Mecanismos genéticos
Los genes bla responsables de la expresión de KPC (clase A de Ambler) han sido
KPC
identificados en un transposón de aproximadamente 10Kb denominado Tn4401, de
transmisión plasmídica facilitando así la transmisión entre cepas de la misma especie e
interespecie (19), diferente de la transmisión clonal cuando el mecanismo es codificado
cromosómicamente. Aparte de la transmisión plasmídicas, los genes KPC han sido
identificados también en cromosomas, la diferencia entre los KPC radica en cambios
puntuales de unos pocos aminoácidos de su secuencia.
3.7.1 Plataformas genéticas móviles
Los elementos genéticos móviles son secuencias de ADN que pueden moverse de
manera autosuficiente a diferentes regiones del genoma bacteriano en una célula o
entre diferentes células por medio de la transferencia horizontal (56). La movilidad de
dichos elementos como plásmidos conjugativos depende de la proximidad entre la
célula donante y receptora, para su transferencia y algunos como transposones y genes
casete se pueden movilizar también dentro de la misma célula (18).
Algunas características de los elementos genéticos móviles como secuencias de
inserción, transposones, islas genómicas, profagos y plásmidos asociados a resistencia
bacteriana se describen a continuación.
Figura 1. Estructura general de las secuencias de inserción, transposones e
integrones. (A) Organización de una secuencia de inserción (SI); las secuencias
invertidas repetidas (IR) se representan en gris con la etiqueta IRL e IRR. Entre las
repeticiones invertidas está un ORF que codifica la transposasa tnp. El promotor de27
transposasa (P) está contenido en IRL. (B) Organización de un transposón compuesto:
uno o más genes están flanqueados por dos SI. (C) Organización del integrón clase 1.
La región 5' conservada consiste en el gen de la integrasa intI1 seguido por el sitio de
recombinación attI, representado por un rectángulo negro, el promotor (Pc) que
promueve la expresión de genes casetes orf1, orf2 y orf3, los cuales están separados
por sus sitios attC (rectángulo naranja). El segmento 3' conservado conformado por un
gen de resistencia a amonio cuaternario truncado (qacEΔ) fusionado con un gen de
resistencia a sulfonamidas (sul1). Modificado de Kung y col. (56,66)
3.7.2 Secuencias de inserción y transposones
Corresponden a secuencias de ADN capaces de movilizarse en el genoma de una
localización a otra por medio de una transposasa. Se clasifican en simples o
compuestos, los transposones simples son secuencias de inserción (SI) flanqueadas
entre secuencias cortas invertidas repetidas (IR), no poseen genes de resistencia a
antibióticos, pero pueden contribuir a la resistencia moderando la expresión,
movilización o inactivación de genes contiguos. Los transposones compuestos pueden
movilizar genes de resistencia a antibióticos y son flanqueados por dos secuencias de
inserción separadas no siempre idénticas. Los transposones de la familia Tn3 como
Tn6061, Tn6001 y Tn4401 frecuentemente se asocian a la movilización de estos
mecanismos de resistencia (18,57).
Los transposones pueden movilizar integrones que son elementos genéticos no móviles
que permiten la captura y expresión de genes exógenos casetes, incluyendo genes de
resistencia que pueden integrarse y eliminarse del integrón fácilmente. De acuerdo a la
secuencia nucleotídica de la integrasa, los integrones han sido clasificados en clases 1,
2 y 3. En P. aeruginosa los integrones de clase 1 son los más frecuentes, usualmente
capturan genes que codifican para enzimas modificadoras de aminoglicósidos y rara
vez integran metalo-β-lactamasas (56).
3.7.3 Islas genómicas
Son segmentos discretos de ADN que son parte del cromosoma de la célula y puede
conducir o impulsar la diferenciación de cepas. Estos segmentos de ADN son
relativamente grandes (>8kb) y a menudo difieren del resto del cromosoma en su
contenido G-C. Normalmente albergan genes que codifican integrasas y tranposasas
favoreciendo la integración de genes que le confieren a la bacteria hospedera diversas
ventajas selectivas. De acuerdo a estas ventajas son denominadas como islas de
patogenicidad, de simbiosis, metabólicas, de aptitud o resistencia (18,58). P. aeruginosa
tiene islas de patogenicidad de tamaño desde 81 a 108 kb y contienen genes que
codifican las funciones necesarias para su movilidad y difusión (56). Existen islasgenómicas móviles y no móviles, algunas capaces de integrarse, extraerse y transferirse
del cromosoma bacteriano hospedero a un nuevo hospedero por transformación,
conjugación o transducción. Para la integración de estas se requiere de la adquisición
de genes por transferencia horizontal, luego la integración en el cromosoma del huésped
mediante recombinación sitio-específica y reordenamientos genéticos como la pérdida
o adquisición de genes, finalmente pueden ser transferido a otro destinatario por medio
de plásmidos o fagos (18). Pocos estudios han investigado la prevalencia de las islas
genómicas de P. aeruginosa en aislamientos clínicos (59,60).
Tabla 5. Islas genómicas frecuentemente descritas en P. aeruginosa (56,66).
3.7.4 Plásmidos
Corresponden a ADN circular extracromosomal de doble cadena, capaces de auto-
replicarse de manera independiente de la célula hospedera y de transferir de una célula
a otra, genes de virulencia o resistencia. Existen plásmidos de resistencia conjugativos
y movilizables, los primeros codifican la maquinaria necesaria para promover su propia
transferencia de célula a célula por medio del sistema de secreción de tipo IV; los
plásmidos movilizables necesitan la colaboración de un plásmido conjugativo para su
transferencia, por lo cual tienden a ser más pequeños. El tamaño de los plásmidos
movilizables a menudo es 10kb, a diferencia de los plásmidos conjugativos cuyo tamaño
es de aproximadamente 30kb o más (61,62). P. aeruginosa posee plásmidos no29
conjugativos que presentan un operón de transferencia truncado (similar al transposón
TnCP23), como el plásmido pNOR-2000 que contiene el gen bla en un integrón In56
VIM-2
(62). Se han reportado plásmidos conjugativos, los cuales movilizan genes de
resistencia a β-lactámicos (especialmente carbapenémicos), como el plásmido p07-406
que contiene un integrón clase 1 truncado con el gen bla y plásmidos pUM505
VIM-9
asociados a una isla de patogenicidad de 78 genes (18,63,64).
3.7.5 Profagos
Los profagos son bacteriófagos integrados por recombinación sitio específica en el
cromosoma bacteriano, pueden desarrollar mutaciones o experimentar recombinación
con otros profagos del cromosoma del huésped y promover así su permanencia en el
genoma. Durante la movilización de los profagos se pueden producir errores en el
empaquetamiento y al momento de infectar otra célula pueden promover la transducción
con la transferencia de ADN bacteriano del huésped previo (18,56).4. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Determinar los fenómenos genéticos y microbiológicos que explican el éxito de la alta
frecuencia en expresión del gen bla en Pseudomonas aeruginosa en hospitales de
KPC
tercer nivel de Bogotá.
4.2 Objetivos específicos
• Establecer perfil de sensibilidad frente a diferentes antibióticos de los
aislamientos de P. aeruginosa
• Determinar la relación genética de los aislamientos por medio de PFGE y MLST
• Establecer la secuencia del genoma en los principales clones genéticos
identificados en la población de aislamientos de P. aeruginosa seleccionados.
• Identificar la presencia y describir las plataformas genéticas previamente
descritas en P. aeruginosa portadora del gen bla
KPC
• Describir los fenómenos genéticos con comportamiento microbiológico en
términos de susceptibilidad antimicrobiana en los aislamientos31
5. METODOLOGÍA
5.1 Tipo de estudio
Estudio observacional descriptivo de tipo corte transversal en 6 hospitales de la ciudad
de Bogotá.
5.2. Universo y Población
El universo es el total de pacientes adultos de 6 hospitales de tercer nivel de
complejidad, en la ciudad de Bogotá, en periodo enero 2017 a agosto 2018 susceptibles
La población del presente estudio corresponde a los aislamientos microbiológicos
obtenidos en las instituciones participantes del presente proyecto.
5.3 Muestra
Cepas aisladas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos obtenidas en tejidos,
orina, sangre y otros líquidos corporales (líquido ascítico o colecciones intrabdominales,
líquido pleural, líquido cefalorraquídeo, secreción oro traqueal) de pacientes
hospitalizados, por métodos automatizados institucionales (VitekÒ - MicroscanÒ), que
cumplan con los criterios de inclusión.
5.4 Criterios de inclusión
• Aislamientos de P. aeruginosa con MICs altas para carbapenémicos que
indiquen resistencia a estos (acorde a los puntos de corte del CLSI 2015);
pertenecientes a pacientes de ambos sexos mayores de 18 años con criterios
de colonización o infección acorde al grupo médico tratante. Se documentará
solamente 1 aislamiento por paciente.
5.5 Criterios de exclusión
• No amplificación de gen bla en los aislamientos de P. aeruginosa
kpcFigura 2. Diagrama de flujo de metodología
5.6 Proceso de recolección de muestras y datos.
Los aislamientos que ingresaron al estudio fueron informados al grupo de investigación
por parte del investigador institucional, designado en cada una de las instituciones
participantes con el fin de que fueran ingresadas a la base de datos. Adicionalmente,
semanalmente los investigadores se comunicaron telefónicamente con las extensiones
correspondientes a laboratorio clínico de cada institución participante, para hacer la
búsqueda activa de las cepas aisladas que cumplan con los criterios de inclusión. Una
vez informadas, se aplicó el protocolo de recolección y transporte de muestras descrito
en el anexo 1
Se elaboró un formato de recolección de la información en físico donde se consignaron
las variables a analizar en el estudio. Por otra parte, los datos de identificación molecular
de las carbapenemasas se obtuvieron en el laboratorio de microbiología de la facultad
de medicina de la Universidad Nacional de Colombia sede – Bogotá.
No se realizó ningún contacto con los pacientes a quienes se aislaron los
microorganismos de este estudio; por lo tanto, ningún paciente fue sometido a nuevos
procedimientos de toma de muestras tales como venopunción, paso de sonda vesical,
entre otros. Cada cepa aislada se replicó y se colocó en los medios de transporte según33
lo descrito en el protocolo de recolección de muestras del anexo 1. Cada muestra fue
llevada al laboratorio de la Universidad Nacional de Colombia. A través de este proceso
de replicación, se garantizó que la cepa original nunca saliera del laboratorio de cada
institución y así no alterar el cepario que cada institución. Adicionalmente los resultados
de análisis de cada cepa aislada no generaró ninguna modificación terapéutica respecto
al tratamiento de cada paciente. Al trabajarse directamente sobre los microrganismos
bacterianos aislados, no se realizó ninguna intervención ni alteración de las variables
biológicas, fisiológicas psicológicas o sociales de los individuos cuyos aislamientos
participaron en el estudio. Ante esta perspectiva, no se requirió consentimiento
informado, acorde a lo establecido en el parágrafo del artículo 11 de la resolución 8430
de 1993.
Para evaluar la viabilidad de las cepas mantenidas en crioconservación, se realizarán
repiques en medio líquido y sólido para asegurar identificación y pruebas de
susceptibilidad.
5.7 Instrumentos
El instrumento para recolección de datos es un formato elaborado con las variables de
estudio, anexado al final de este proyecto (ver anexo 3).
5.8 Aislamientos microbiológicos y pruebas microbiológicas: intervenciones de
laboratorio microbiológico sobre las muestras aisladas.
5.8.1 Aislamientos bacterianos:
Aislamientos de Pseudomonas aeruginosa con identificación a nivel de género, especie
y el perfil de sensibilidad a los antimicrobianos, se realizó en el laboratorio clínico
respectivo de los hospitales participantes en la ciudad de Bogotá, con sistema
automatizado institucional disponible (VitekÒ - MicroscanÒ). Las muestras fueron
criopreservadas en skim milk al 20% a -70°C, en al laboratorio de microbiología de la
Universidad Nacional de Colombia.5.8.2 Colección de cepas, perfil de susceptibilidad
Los 52 aislamientos de P. aeruginosa analizados fueron obtenidos a partir de un estudio
observacional descriptivo de tipo corte transversal en 6 hospitales de tercer nivel de
complejidad, en la ciudad de Bogotá, entre enero 2017 y agosto 2018 (38). Los
aislamientos fueron recuperados desde diferentes fuentes en pacientes hospitalizados.
Los perfiles de susceptibilidad a meropenem, imipenem, doripenem, ceftazidima,
gentamicina, amikacina, ciprofloxacina y Piperacillina/Tazobactam fueron determinados
usando los sistemas automatizados VITEK® 2 o Microscan®. La cepa de P. aeruginosa
ATCC 9721 fue utilizada como control de sensibilidad.
5.8.3 Detección por PCR de genes de resistencia
En cada aislamiento se confirmó su género y especie por medio de la amplificación por
PCR del gen phnX, específico para P. aeruginosa, usando las condiciones previamente
estandarizadas en el laboratorio. Los genes bla , bla , bla , bla , bla y bla
KPC VIM NDM IMP NDM GES
que codifican carbapenemasas fueron evaluados por PCR múltiple usando las
condiciones descritas por Monterio y colaboradores (67). Las variantes bla y bla
KPC-2 KPC-
fueron determinadas por medio de restricción usando la enzima RsaI (Fermentas).
3
5.8.4 Relación genética entre aislamientos de P. aeruginosa
La relación genética de los aislamientos se determinó por medio de macro-restricción
del genoma usando la enzima SpeI (Promega) y posterior separación de los fragmentos
de DNA generados por electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) siguiendo el
protocolo reportado por Herschleb y colaboradores, con algunas modificaciones (65).
Los aislamientos de P. aeruginosa se cultivaron en caldo de infusión cerebro corazón
(BHI), a 37°C, en agitación a 200 rpm durante 12 horas. A partir de este cultivo, se
preparó una suspensión bacteriana con una densidad óptica de 1.5 a 625 nm en buffer
tris-EDTA (100mM Tris + 100mM EDTA, pH: 8,0). Los bloques de agarosa fueron
preparados con 150uL de suspensión bacteriana y 400 µg de proteinasa K. Las
bacterias embebidas en los bloques fueron lisadas usando 1 ml de buffer de lisis (50mM
Tris, 50mM EDTA, pH: 8,0 + Sarcosil al 1%) suplementado con 400µg proteinasa K, e35
incubados por 2 horas a 55°C y agitación a 175 rpm. Posterior a la lisis, se realizaron
varios lavados con agua destilada desionizada estéril a 55 °C y buffer TE (10mM Tris,
1Mm EDTA, pH 8,0). Los bloques se almacenaron a 4 °C hasta su uso.
La restricción se realizó con 12U/µL de la enzima de restricción SpeI (Promega), 1X de
buffer tango por 5 horas a 37°C. Los fragmentos de restricción se separaron por PFGE
usando el equipo CHEFFII (Bio-Rad) y un tiempo inicial de 6,8 segundos y tiempo final
de 35,4 segundos durante 23 horas a un ángulo de 120° y un voltaje de 6,0. Dos
pulsotipos (patrón de bandas) fueron considerados diferentes cuando tenían más de 5
bandas de diferencia. El tipo de secuencia (ST), determinado por medio de la tipificación
de secuencias de múltiples locus (MLST), fue establecido solamente para los
aislamientos secuenciados y usando los genes acsA, aroE, guaA, mutL, nuoD, ppsA y
trpE y la comparación realizada en Pseudomonas aeruginosa MLST Database de
PubMLST disponible en http://pubmlst.org/paeruginosa/ (68).
5.8.5 Secuenciación del genoma completo de aislamientos de P. aeruginosa
Dos aislamientos de P. aeruginosa fueron seleccionados para profundizar en sus
características genéticas por medio de la secuenciación completa de su genoma
utilizando la plataforma PacBio RS II (Pacific Biosciences, EE. UU) como ha sido
ampliamente usado en el Laboratorio de Genética Molecular Bacteriana (68). En
resumen, se extrajo el ADN total y se preparó una biblioteca BluePippin (Sage Science)
de 20 kb de tamaño seleccionado y luego se secuenciaron usando una célula SMRT en
la plataforma PacBio RS II. Las lecturas de secuenciación se ensamblaron de novo
utilizando el protocolo HGAP 3 y HGAP 2 con los parámetros predeterminados. El
ensamblaje se inspeccionó visualmente y se verificó manualmente utilizando el software
BWA-MEM (Burrows-Wheeler Aligner con coincidencias exactas máximas) (69) y Tablet
v1.15.09.01 (70). Las secuencias repetidas terminales se identificaron con Gepard
(Genome Pair Rapid Dotter) (71) y se cortaron manualmente. Todo el genoma fue
anotado usando Prokka v1.11 (72), y las regiones de interés fueron curadas
manualmente usando BLASTn y BLASTp y editadas en Artemis. Las figuras
comparativas fueron realizadas usando los programas ACT (Artemis Comparison Tool)
y EasyFig.
5.8.6 Identificación del Resistoma
Los genes de resistencia a los antibióticos fueron identificados en el genoma de los
aislamientos secuenciados usando las bases de datos ARIBA
(https://github.com/sanger-pathogens/ariba/wiki), ResFinder (73), CARD (TheComprehensive Antibiotic Resistance Database) (74) y ARG-ANNOT (Antibiotic
Resistance Gene-ANNOTation) (75).
5.9 Variables para recolección de datos y definición
Variable Definición Tipo Nivel operativo
Código de Código asignado a cada • Desde 01 hasta
aislamiento muestra a cargo de los Numérico 52
investigadores
Número de Corresponde a la • Número de
Documento identificación del paciente Numérico cédula del
paciente
Confirmación Determinar por medio de Nominal • Si
fenotípica de pruebas fenotípicos (Hodge • No
producción de modificado, prueba de doble
carbapenemasas disco ó CarbaNP) la
por presencia de
CarbaNP, test de carbapenemasas tipo A o B
hodge modificado
o por prueba de
doble disco.
• KPC
Tipo de Por medio de métodos Nominal • GES
Carbapenemasa moleculares determinar • VIM
expresada específicamente el tipo de • IMP
carbapenemasas que
• NDM
expresa el microorganismo
• OXA-48
recolectado.
Microrganismo Por medio métodos cultivo Nominal • Pseudomona
aislado automatizado aeruginosa
Centros hospitalarios
Procedencia de la Institución donde se aisló la Nominal -Hospital Universitario
Muestra bacteria productora de Clínica San Rafael
carbapenemasa -Hospital Militar Central
de Bogotá
- Unidad de Servicios de
Salud Occidente de
Kennedy
-Hospital Santa Clara
E.S.E
-Fundación Santafé de
Bogotá
-Hospital Central de la
Policía
• Sangre
Origen de la Sitio anatómico o fluido Nominal • Orina
muestra corporal de donde se aisló la • Esputo
muestra • Colección
• LCR
• Dispositivo: cual37
5.10 Plan de análisis estadístico
Las variables se presentaron en forma de números absolutos y porcentajes,
demostrados mediante tablas de registro, así como gráficos circulares y pictogramas
para facilitar la interpretación visual de resultados. La prevalencia de carbapenemasas
será medida mediante prueba de prevalencia puntual.
Considerando las características de las variables, aquellas de tipo cualitativo
específicamente las categóricas de denominación binaria, permitirán medir resultados
específicos en términos de frecuencia, presentándose en tablas de contingencia para
poder hacer comparativos de proporción de los resultados a la luz de las variables
estudiadas.
Adicionalmente se realizaron pruebas de concordancia entre resultados de las pruebas
moleculares con al menos 1 prueba fenotípica para evaluar cuan acordes eran los
resultados entre prueba fenotípicas y los resultados de las PCR. Fundamentalmente, no
se están evaluando hipótesis ni grupos comparativos, por lo cual las medidas de
evaluación de hipótesis como t-test no aplicaron en este caso.
5.11 Financiamiento
La contrapartida aportada por el Laboratorio de Genética Molecular Bacteriana de la
Universidad El Bosque corresponden a materiales y gastos de Laboratorio.6. CONSIDERACIONES ÉTICAS
De acuerdo a la resolución 8430 de 1993 del Ministerio de la Protección Social de
Colombia, con base en el artículo 11 de la misma, se dispone a clasificar el tipo de riesgo
de presente estudio. El presente estudio constituye una investigación sin riesgo para el
paciente, toda vez que la información recolectada será a través de muestreo por
conveniencia sin exponer al paciente a procedimientos adicionales para la obtención de
las muestras correspondientes. Se trabajará directamente sobre los microrganismos
aislados, no se realizará ninguna intervención ni modificación de las variables
biológicas, fisiológicas psicológicas o sociales de los individuos que participan en el
estudio. Por lo anteriormente expuesto no se requiere de consentimiento informado
acorde a lo establecido en el parágrafo del artículo 11 de la resolución 8430 de 1993.
Se considera en este caso que existe un consentimiento surrogado una vez aprobado
el proyecto por el comité de ética de cada institución.
En el capítulo 4 de la presente resolución, se tratan los temas respecto a la investigación
con Microorganismo patógenos. Al respecto se contará con el apoyo de personal idóneo
en el área de laboratorio microbiológico con la pericia y preparación académica
adecuada para los procesos relacionados con recolección y procesamiento de los
microrganismos involucrados. Se seleccionarán las prácticas microbiológicas idóneas
para conservación, transporte, almacenamiento y manipulación de las cepas
recolectadas, instruyendo al personal participante sobre estos aspectos y garantizando
siempre las prácticas de bioseguridad, lo mismo que los elementos de protección
pertinentes. Se cuenta con el laboratorio de microbiología de la Facultad de Medicina
de la Universidad Nacional de Colombia y Genetica molecular Bacteriana de la
Universidad el Bosque que cuentan con todas las disposiciones de habilitación
dispuestas por los entes gubernamentales de control.
Conforme a las normas establecidas internacionalmente en la declaración de Helsinki
de la Asociación Médica Mundial actualizada en el 2013, se cuenta con que el presente
estudio se acopla a los lineamientos mencionados. Se tuvo aprobación por parte de
Comité de ética de las instituciones participantes. Se anexa aprobación de Comité de
ética universidad Nacional de Colombia (Anexo 4)39
7. RESULTADOS
7.1 Descripción general y resistencia a carbapenémicos
De las 52 cepas estudiadas, se confirma presencia de resistencia por mecanismo
enzimático en 59.6% (31 cepas) de los aislamientos, con identificación de gen bla en
KPC
74.2% (23 cepas), con mayor proporción de variante bla . Se encontró coproducción
KPC-2
con metalobetalactamasa en 12.9%. No se encontró producción o coproducción con
otras metalobetalactamasas. (Tabla 6)
MECANISMO ENZIMÁTICO n (%)
31 (59.6)
bla 23 (74.2)
KPC
bla 17 (73.9)
KPC-2
bla 4 (17.4)
KPC-3
bla 8 (25.8)
VIM
bla 0 (0)
NDM
bla 0(0)
IMP
Coproducción
bla - bla 4 (12.9)
KPC VIM
MECANISMO NO 21 (40.4)
ENZIMÁTICO
Total 52 (100)
Tabla 6. Descripción de tipo de resistencia a carbapenémicos en aislamientos de
P. aeruginosa
Los 23 aislamientos fueron confirmados como P. aeruginosa y portadores del gen bla
KPC
por medio de PCR. Se encontraron en 4 de las 6 insttituciones. Se identificó sexo
masculino en 83%, con aislamientos correspondientes a infección de vías urinarias en
43% e infección de piel y tejidos blandos en 21.7% (Tabla 7).Tabla 7. Distribución de los aislamientos de P. aeruginosa portadores del gen
bla de acuerdo a la institución donde se identificó y los tipos de infección
KPC
producida. IVU: infección de vías urinarias – IPTB: infección de piel y tejidos
blandos – ITRI: infección de tracto respiratorio inferior – IIA: infección
intraabdominal – ITS: infección de torrente sanguíneo
El orden de identificación de los aislamientos en cada institución se muestra en la figura
3. La mayoría de los aislamientos fueron identificados durante el segundo trimestre del
primer año en las 4 instituciones, con una circulación simultánea.
Figura 3. Orden cronológico de aparición de los 23 aislamientos de P. aeruginosa
incluidos en el estudio, con número de casos en cada una de las instituciones.
Cada color representa una institución; rojo: Institución 1, naranja: Institución 2, azul:
Institución 3 y verde: Institución 441
Respecto a los perfiles de susceptibilidad, 100% de los aislados cumplían criterio de
multirresistencia. Todos los aislamientos eran resistentes a imipenem y meropenem,
este último con MIC mayor a 16 en 30%. Los aislamentos presentaron resistencia a
ceftazidima en el 95.6%. Respecto a aminoglucósido, 91.4% de los aislamientos tenían
resistencia a esta familia de antibióticos. 95.6% presentaban resistencia a
ciprofloxacina. En 21.5% de los casos, no se pudo determinar sensibilidad a polimixina
E.
7.2 Relación genética de los aislamientos
El análisis PFGE de los aislamientos reveló 12 pulsotipos (perfiles de bandas) diferentes
(dos aislamientos fueron no tipificables) (Figura 4), distribuidos en 8 clones, sugiriendo
un comportamiento policlonal de la población de estudio. El clon 1 fue el más frecuente,
encontrado en 13 (56%) aislamientos y con circulación en las 4 instituciones, sugiriendo
una mayor diseminación. Este clon porta el gen bla , el cual ha sido descrito desde
KPC-2
los primeros reportes en P. aeruginosa. De los 7 clones restantes, solo un aislamiento
fue identificado. En la institución 1 se identificó la circulación de 5 clones diferentes, lo
cual indica un desafío mayor para el control de infecciones en esta institución.
Interesantemente, en la institución 4, se identificaron dos clones diferentes portando el
gen bla , lo cual constituye el primer reporte de esta variante en P. aeruginosa a nivel
KPC-3
mundial. Adicionalmente, los cuatro aislados productores de VIM se encontraron en
pulsotipos PFGE no relacionados.Figura 4. Relación genética de los aislamientos de Pseudomonas aeruginosa potadores
del gen bla mediante PFGE. A la izquierda se ilustran los pulsotipos asociados al ST235 y
KPC
ST111 previamente establecidos en el Laboratorio de Genética Molecular Bacteriana (LGMB). A
la derecha se encuentran los pulsotipos de los aislamientos de este estudio sumados al pulsotipo
de la cepa Salmonella enterica subsp.enterica serovar Braenderup (ATCC® BAA664™)
designada como BD, usada como normalizadora de los fragmentos de DNA. En la parte superior
se designan las instituciones de las cuales fueron recuperados los aislamientos con el respectivo
código para cada uno. De igual manera, en la parte inferior se muestra la codificación de los
diferentes pulsotipos y clones. La presencia del gen bla y su variante, fueron ilustrados en la
KPC
parte superior de cada pulsotipo.
7.3 Secuenciación y análisis de los genomas
Teniendo en cuenta, las diferencias de la relación genética de los aislamientos, se
decidió seleccionar para secuenciación genómica a los aislamientos 34Pae23 y
34Pae36, los cuales presentaban mayor variabilidad en la relación genética. Con el fin
de establecer en ellos las plataformas genéticas que movilizaron los genes bla y
KPC-2
bla en la institución uno y cuatro respectivamente. (Figura 5).
KPC-343
Figura 5- Diagrama de secuenciación genómica de aislamientos de P. aeruginosa
seleccionados
El genoma del aislamiento 34Pae23 tuvo un tamaño de 6.870.367 pb, junto con un
plásmido de 42.977 pb con detección de gen bla y resistencia a aminoglucósidos
KPC-2
por el gen aac (6'). El aislamiento perteneció al ST235, un ST de diseminación mundial.
El resistoma de este aislamiento incluía genes de resistencia cromosomal a
aminoglucósidos: aad A6 – aph (3'); betalactámicos (bla , bla ); sulfonamidas
OXA-488 PDC
(sul1); quinolonas: crpP y fosfomicina: (fosA) (Tabla 8). Respecto al aislamiento
34Pae36, el genoma tuvo un tamaño de 7.408.984 pb, junto con un plásmido de 174.560
pb. El aislamiento perteneció al ST111, un ST también de diseminación mundial, ambos
clones son ampliamente conocidos por su extraordinaria capacidad para adquirir genes
de resistencia. El resistoma para este aislamiento incluyó genes de resistencia
cromosomal a aminoglucósidos (aac (6') - aad A6 – aph (3')); betalactámicos (bla –
KPC-3
bla - bla - bla ); sulfonamidas (sul1); quinolonas: crpP y fosfomicina (fosA).
VIM-2 OXA395 PDC
En la figura 3 se muestra un esquema de la conformación de los genomas y la
localización de los genes de interés.
Para la realziación de gráficas e imágenes se utilizaron los programas PHASTER (76)
e IslandViewer (77) y EasyFig (78)Tabla 8. Resistomas de aislamientos de P. aeruginosa 34Pae23 (ST235- bla ) y
KPC-2
34Pae36 (ST111- bla ). ATB: antibiótico – AG: aminoglucósido – BL: betalactámico
KPC-3
– FOS: fosfomicina – FQ: fluoroquinolona – SUF: sulfonamida
7.4 Plataformas genéticas que transportan genes de resistencia en aislamientos
34Pae23 ST235 y 34Pae36 ST111
Se amplió la evaluación genética debido a la importancia clínica del mecanismo de
resistencia del gen bla y la localización plasmídica y cromosomal del mismo en los
KPC
aislamientos 34Pae23 y 34Pae36, respectivamente. En el genoma de los aislamientos
se realizó una búsqueda de los elementos genéticos móviles asociados a bla y una
KPC45
comparación entre las secuencias adyacentes a este gen, con el fin de establecer
similitudes en las plataformas de movilización de estos dos aislamientos. El análisis
genómico comparativo permitió establecer que el transposón Tn4401b, el cual ha sido
ampliamente asociado a la movilización de bla en Pseudomonas aeruginosa (79–
KPC
81), se encontraba presente únicamente en el cromosoma del aislamiento 34Pae36.
Aunque la estructura del transposón se encontró completa, no se observaron las
secuencias flanqueantes sugestivas de un evento de transposición, por lo cual no se
puede afirmar que este fue el único elemento genético móvil involucrado (Figura 6). Por
su parte el entorno genético del plásmido p34Pae23-KPC presenta una estructura
novedosa, con transposasas y resolvasas de la familia Tn3 que no se encuentran
relacionadas con el Tn4401b, por lo cual se desconoce la estructura del elemento
genético móvil que permitió la inserción de bla en este plásmido (Figura 7).
KPC
Figura 6. Estructura general del entorno genético del gen bla en los
KPC
aislamientos de P. aeruginosa. Estructura general del entorno genético del gen bla
KPC
en los aislamientos de Pseudomonas aeruginosa. Se ilustra el alineamiento pareado
entre la secuencia del cromosoma del aislamiento 34Pae36 y el plásmido p34Pae23-
KPC. La región sombreada entre las secuencias delimita las zonas de alineamiento con
un porcentaje de identidad mayor al 83%. Las flechas azules indican los marcos abiertos
de lectura y, adyacente al gen de interés, se resaltan las regiones codificantes para
proteínas hipotéticas (gris), transposasas (púrpura), resolvasas (lila), genes de
resistencia (rojo) y se delimita en un rectángulo morado al transposón Tn4401b. La
gráfica cuenta con una línea de escala de 10.000 pb.
La inserción cromosomal del transposón Tn4401b es un evento importante, debido a
que establece el mecanismo de resistencia en la progenie de la bacteria. Por lo cual,
con el fin de identificar la región completa de la inserción,se realizó un análisis detallado
del entorno genético del mismo y se comparó con otros cromosomas de P. aeruginosa
previamente reportados. El cromosoma del aislamiento AR445 (ST111) de P.
aeruginosa fue el que presentó mayor identidad, con 95% de cobertura y 99,9% de
identidad, con el cromosoma del 34Pae36. La comparación con la región del transposón
permitió identificar a la secuencia de inserción ISPa38, la cual también pertenece a lafamilia Tn3. Aunque en el cromosoma del aislamiento AR445 sólo se evidenció una
copia de ISPa38, en 34Pae36 existen dos copias de esta secuencia de inserción, con
el Tn4401b en el interior, lo que sugiere que la ISPa38 pudo ser la responsable de la
inserción de la región con el Tn4401b y que estas dos secuencias podrían movilizarse
como transposón compuesto.
Figura 7. Inserción cromosomal de bla en el aislamiento de P.
KPC
aeruginosa 34Pae36. Se ilustra el alineamiento pareado entre las secuencias de los
cromosomas de los aislamientos de Pseudomonas aeruginosa AR445 (ST111)
(CP029088) y 34Pae36. La región sombreada entre las secuencias delimita las zonas
de alineamiento con un porcentaje de identidad mayor al 70%. Las flechas azules
indican los marcos abiertos de lectura y, adyacente al gen de interés, se resaltan las
regiones codificantes para proteínas hipotéticas (gris), transposasas (púrpura),
resolvasas (lila), genes de resistencia (rojo) y se delimita en un rectángulo morado a los
elementos genéticos móviles. La gráfica cuenta con una línea de escala de 10.000 pb.47
8. DISCUSIÓN
La resistencia a múltiples antimicrobianos en cepas de P. aeruginosa es un evento cada
vez más frecuente (47). Su identificación oportuna y comprensión de los mecanismos
de resistencia es elemental en la elección y optimización de la terapia. La tasa de
resistencia a carbapenémicos en P. aeruginosa ha mostrado una tendencia al aumento
en los últimos años debido a la difusión y amplio uso de estos medicamentos en diversos
escenarios hospitalarios, conllevando a la selección de cepas resistentes (48).
La susceptibilidad a carbapenémicos varía en amplio rango en distintos escenarios,
indicando el conocimiento de epidemiología local para dirigir terapia antibiótica inicial
empírica en espera del antibiograma rutinario para ajustes posteriores en la terapia. El
estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la diseminación de la
resistencia, es fundamental para su entendimiento; esta diseminación se puede dar
verticalmente, a través de la diseminación de clones exitosos portadores de
determinantes de resistencia; u horizontalmente por la transferencia de DNA foráneo
entre dos bacterias de la misma o diferente especie. Cada año en los Estados Unidos,
cerca de dos millones de personas adquieren infecciones graves por bacterias que son
resistentes a uno o más de los antibióticos que fueron diseñados para su manejo. En
unidades de cuidado intensivo de Colombia, se demostró un incremento en la tendencia
de los perfiles de multirresistencia y una amplia distribución de las carbapenemasas. En
este estudio, de los aislamientos de K. pneumoniae evaluados, 68,4 % fue positivo para
KPC; en P. aeruginosa se observó 46,5 % la presencia de VIM (82).
Aunque inicialmente la carbapenemasa VIM era la más frecuente entre los aislamientos
colombianos de P. aeruginosa, tras reporte en año 2007 de circulación de aislamientos
de P. aeruginosa portadores del gen bla (12), en 2014, se reportó una frecuencia
KPC
similar de aislamientos VIM y KPC en Medellín (15). Según un informe del Instituto
Nacional de Salud en año 2016 (67), en Pseudomonas spp., la carbapenemasa más
prevalente es VIM y en segundo lugar KPC, se observan casos de diferentes co-
producciones siendo la más prevalente el tipo KPC + VIM. Recientemente Conde y cols
(2) analizaron 80 aislamientos de P. aeruginosa causantes de infecciones en 6
instituciones de salud de Bogotá y encontraron una mayor proporción de aislamientos
portadores de KPC (48%) en comparación con VIM (13%).En nuestro estudio, encontramos que en las cepas de P. aeruginosa resistente a
carbapenémicos con presencia de gen bla está presente con mayor proporción la
KPC,
variante bla . Así mismo, coproducción con metalobetalactamasa (bla ) en 12.9%.
KPC-2 VIM
El gen bla en P. aeruginosa se informó por primera vez en Colombia en 2007 (4),
KPC-2
con identificación para este momento en varios países como Estados Unidos y China
(11,22,25). Estudios previos en P. aeruginosa demostraron que el gen bla se
KPC-2
moviliza en una sola copia de Tn4401 dentro de las dos cadenas principales del
plásmido. Abril y cols informaron de una doble inserción cromosómica bla que
KPC-2
alberga Tn4401 en P. aeruginosa en aislamientos de Colombia (4), considerándose esta
duplicación como un evento genético raro. Aunque la duplicación de Tn4401 podría
llevar a una mayor producción de la enzima KPC, se hace necesaria la determinación si
proporciona alguna ventaja en la hidrólisis del carbapenémico y, en consecuencia, un
aumento en los MIC de los mismos. En el estudio relacionado, tras el análisis de
concentración inhibitoria mínima (CIM) para meropenem, mostró un comportamiento
heterogéneo entre los aislados resistentes a carbapenémico. Nueve aislamientos
alcanzaron un valor de CIM de 1024 μg/m, correspondientes a todos los aislados bla
KPC-
-positivos ST235 y dos aislamientos bla -positivos ST111.
2 VIM
Se desconoce el origen de Tn4401b, aunque se sugiere que probablemente adquirió un
plásmido que alberga bla de un aislado de K. pneumoniae que favoreció la
KPC-2
transposición de Tn4401b al cromosoma, dado que el clon de K. pneumoniae productor
de KPC es endémico en Colombia (56,57).
ISPa38, identificado previamente en P. aeruginosa (83), y en otros países como Bélgica
(84) e India (85), donde se conoce el cambio en proporción de NDM a carbapenemasas
similares a OXA-48, OXA-181 y OXA-232. Se conoce que se transportan en
transposones como Tn1999, Tn1999.2, asociado a secuencias de inserción (IS) IS1R.
Sin embargo, tras evaluación de elementos genéticos móviles (EGM), se identificaron
diversas IS (ISX4, IS1, IS3, ISKpn1, ISKpn26, ISKpn25, ISSpu2, ISKox1, IS4321R,
ISEc36), así como ISPa38, encontrado en nuestro estudio, demostrando el papel de
diversos MGE en la transmisión de estas carbapenemasas. A la fecha, no se conoce
reporte de ISPa38, constituyendo un nuevo elemento genético móvil asociado al
Tn4401b.
El gen bla no ha sido reportado en la literatura en P. aeruginosa. Sin embargo, es
KPC-3
conocida su descripción en diferentes publicaciones en aislamientos de Enterobacterias49
y Acinetobacter spp (43,73). Esto denota un cambio en la epidemiología molecular de
este microorganismo, probablemente favoreciendo este clon por las particularidades
desde punto de vista genómico que implica su detección cromosomal.
El análisis genómico comparativo entre los aislamientos ST235 y ST111, muestran una
variabilidad relativamente alta, con una conocida plasticidad genómica en el clon ST235.
Sin embargo, tras la evaluación del ST111, se infiere una gran plasticidad por el hecho
de aceptar, estabilizar y utilizar gen bla de manera exitosa, a tal punto de integración
KPC-3
de mecanismo de resistencia a nivel cromosómico. Este último punto permite realizar
varios comentarios desde punto de vista epidemiológico y clínico.
Primero, pone de hecho que esta flexibilidad genética podría contribuir la mayor
supervivencia del clon ST111 en los entornos hostiles para la bacteria; la posibilidad de
integración en el cromosoma de este mecanismo de resistencia exitoso, permite
disminución de costos energéticos y metabólicos al microorganismo. Este evento no
constituye un evento esporádico; sugiere una amplia interacción permanente para
transmitir bla . Se pone de manifiesto la importancia de la adquisición diferencial de
KPC
diversos elementos genéticos móviles, como pro-fagos, islas genómicas y transposones
(en algunos casos, los genes de resistencia móvil), y para los cambios dentro de ellos
producidos por eventos de recombinación genética, duplicaciones y deleciones. Así
mismo, la adquisición y mantenimiento de un elemento genético móvil (p. ej plásmido)
que alberga un transposón Tn4401b, y posterior transposición del Tn4401 al cromosoma
bacteriano.
Segundo, desde punto de vista epidemiológico, permitirá a este clon trasmitir de manera
exitosa a su descendencia este mecanismo, indicando al clínico sobre adherencia a
medidas de contención y control de infecciones.
Tercero, esta extraordinaria capacidad para incorporar genes de resistencia genera una
producción elevada de enzimas capaces de hidrolizar carbapenémicos (en el caso
puntual de carbapenemasas), planteando un desafío para el especialista en
enfermedades infecciosas. Lo anterior establece la necesidad urgente de encontrar
diferentes estrategias de tratamiento, como el uso de antibióticos combinados y el
desarrollo de nuevas opciones terapéuticas. Aunque es conocida la gran mayoría de
referencias en la literatura para tratamiento en KPC en K. pneumoniae, poca información
se conoce en P. aeruginosa.El tratamiento combinado empírico se recomienda, según los datos locales de
epidemiología. En el tratamiento definitivo, los datos de meta-análisis no encontraron
beneficios para los tratamientos combinados, sin embargo, se prefiere su uso en
pacientes con factores de riesgo para mortalidad, así como en infecciones bacterianas
y choque séptico (58–62). Moléculas como ceftolozano-tazobactam (18,19,63–65) y
ceftazidima/avibactam (68–72) se recomiendan a la fecha proporcionando una columna
vertebral potente para tratamiento; polimixina, fosfomicina, plazomicina, y cefiderocol
podrían actuar como agentes complementarios, con estudios en curso (58–61).
Desconocemos a la luz de este nuevo mecanismo de resistencia en P. aeruginosa, sus
implicaciones clínicas y actividad a nuevos agentes anti-infecciosos, constituyendo un
nuevo desafío para el grupo de microbiología (por el impacto en diagnóstico molecular
de resistencia) y del clínico especialista en enfermedades infecciosas (por su impacto
en manifestaciones clínicas, pronóstico y de tratamiento).51
Actividad antimicrobiana
Enterobacterias
Pseudomona Carbapenemas Carbapenemas Carbapenemas
s aeruginosa a clase A a clase B a clase D
R
carbapenem
FOS
ERA
PLZ
CFD
CAZ/AVI
CEF/TAZ
MER/VA
B
Tabla 9. Actividad de nuevos agentes antimicrobianos contra bacilos Gram
negativos resistentes a carbapenémicos. No se discrimina por mecanismo de
resistencia. Fos: fosfomicina – ERA: eravaciclina – PLZ: plazomicina – CFD:
cefiderocol – CAZ/AVI: ceftazidima/avibactam - CEF/TAZ: ceftolozano/tazobactam –
MER/VAB: meropenem/vaborbactam. Adaptado de Doi Y. Treatment Options for
Carbapenem-resistant Gram- negative Bacterial Infections. Clinical Infectious Diseases.
2019;69(S7): S565–75 (86)9. CONCLUSIONES
La información sobre el comportamiento epidemiológico y los posibles cambios en la
presentación de las infecciones por P. aeruginosa resistente a carbapenémicos
mediante expresión de gen bla es muy limitada en varias ciudades del país.
KPC
Comprender la dinámica de la transferencia de elementos mediante el uso de
plataformas genéticas que confieren resistencia, puede ser una herramienta útil en el
diseño las mejores prácticas para prevenir la propagación de bacterias resistentes a
múltiples fármacos e infecciones asociadas con la atención médica.
Nuestros hallazgos demuestran la extraordinaria plasticidad genómica de P. aeruginosa
ST111, característica que le permite adquirir, conservar y modificar ADN extraño en su
genoma. Esta adquisición de ADN contribuye a un mayor armamento genético para
enfrentar altas concentraciones de antibióticos. Posterior a la evaluación del ST111, se
infiere una gran plasticidad por el hecho de aceptar, estabilizar y utilizar gen bla de
KPC-3
manera exitosa, a tal punto de integrar este mecanismo de resistencia a nivel
cromosómico constituyendo un nuevo mecanismo de resistencia a carbapenémicos en
P. aeruginosa portadora del gen bla . en aislamientos estudiados en algunas
KPC-3
instituciones de Bogotá, Colombia.
Pseudomonas aeruginosa ha adquirido, mantenido y asimilado la carbapenemasa KPC.
Se desconoce el comportamiento de la actividad de la enzima en este patógeno, así
como sus implicaciones clínicas y actividad a nuevos agentes anti-infecciosos,
constituyendo un nuevo desafío por el impacto en diagnóstico molecular de resistencia
y para clínico por su resultado en manifestaciones, pronóstico y tratamiento.53
10. ANEXOS
Anexo 1. Formato de recolección de muestras
Recolección y envío de los aislamientos en medio de transporte
A continuación, se presenta el protocolo de recolección y envío de aislamientos que se
llevará a cabo en cada institución participante durante el desarrollo del proyecto, y que
tiene como objetivo la preservación de las mismas, así como evitar su contaminación.
1. Proceso de Recolección de aislamientos:
Las muestras provenientes de pacientes que cumplan los criterios de inclusión definidos
en el protocolo serán remitidas al laboratorio de referencia de la Universidad Nacional
de Colombia, previo diligenciamiento del formato de captación de datos y anexando el
reporte del equipo automatizado. Cada muestra recolectada tendrá un código de
identificación con fines de organización de datos, y se firmará recibido de la muestra por
parte del personal del proyecto que se encargue de recogerla.
Se espera que en cada institución, se designe por parte del personal del laboratorio y
en logística con los organizadores del proyecto, la (s) personas encargadas de la
recolección de la muestra inicialmente para su preservación mientras es recolectada por
nuestros miembros inscritos al proyecto, para ser enviada al laboratorio de la
Universidad Nacional. Para esto se requiere el apoyo del personal que labora en cada
institución. Los medios físicos e instrumental para los procesos descritos a continuación
serán surtidos por los investigadores del proyecto conforme a la tasa de recolección en
cada institución. Ninguna de las instituciones participantes tendrá que incurrir en gastos
al respecto.
Actividades a desarrollar
Ø Personal de laboratorio designado de cada institución
Colaborarán con la recolección y almacenamiento de las muestras con los insumos
entregados por los investigadores principales del proyecto.
Ø Personal de apoyo adscrito al proyecto de investigación. investigadores
principales o servicio de mensajería certificada
Se encargarán de ir a recoger las muestras, para su transporte hacia la Universidad
Nacional
Procedimiento de recolección
1. A partir de un cultivo puro del microorganismo, resiembre en forma masiva el
aislamiento en un medio primario (BHI, Agar Sangre ó tripticasa de soya)
incúbelo por 24 horas a temperatura de 35◦C.
2. Abra el empaque del medio de transporte Amies en condiciones asépticas y
coloque el nombre del microorganismo y el código del paciente en la etiqueta.
3. En una cámara de flujo laminar o en mechero, recoja la totalidad del aislamiento
de la caja de Petri con el escobillón estéril del medio de Amies.
4. Introduzca el escobillón en el medio de transporte.5. El aislamiento será recogido el día anterior ó el mismo día de realizar el envío.
6. Favor marque el medio de transporte con el mismo código que tiene la hoja de
recolección de datos
2. Proceso de transporte de aislamientos:
Una vez el aislamiento esté listo, la bacterióloga deberá:
1. Introducir el aislamiento en el empaque (Bolsa con sello hermético) con material
absorbente en su interior.
2. Posteriormente proceda a sellarla cubriendo con cinta adhesiva el empaque y
volteando hacia adentro la bolsa de plástico de manera que quede completamente
sellado.
3. Coloque la bolsa dentro de un sobre de manila el día que se recoge para llevarla al
laboratorio de la Universidad Nacional. Anexe el resultado de antibiograma dentro del
sobre de manila.55
Anexo 2. Algoritmo de trabajoAnexo 3. Formato recolección de datos57
Anexo 4. Aprobación comité de Ética – Universidad Nacional de Colombia59
11. REFERENCIAS
1. GREBO. Grupo para el control de la resistencia bacteriana en Bogotá. Boletín
informativo. 2015.
2. Conde C, Saavedra C LA. Descripción de tipos de carbapenemasas expresadas
en Klebsiella sp. y Pseudomonas aeruginosa en hospitales de tercer nivel de la
ciudad de Bogotá, estudio descriptivo. Universidad Nacional de Colombia;
3. Pacheco R, Osorio L, Correa AM, Villegas MV. Prevalencia de bacterias Gram
negativas portadoras del gen blaKPC en hospitales de Colombia. Biomédica
[Internet]. 2014 Apr 1;34(Sup1 SE-Artículos originales):81–90. Available from:
https://revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/view/1642
4. Villegas MV, Lolans K, Correa A, Kattan JN, Lopez JA, Quinn JP, et al. First
identification of Pseudomonas aeruginosa isolates producing a KPC-type
carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase. Antimicrob Agents Chemother
[Internet]. 2007/01/29. 2007 Apr;51(4):1553–5. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17261621
5. Vanegas JM, Cienfuegos A V, Ocampo AM, López L, del Corral H, Roncancio
G, et al. Similar frequencies of Pseudomonas aeruginosa isolates producing
KPC and VIM carbapenemases in diverse genetic clones at tertiary-care
hospitals in Medellín, Colombia. J Clin Microbiol. 2014 Nov;52(11):3978–86.
6. World Health Organization - WHO. Antimicrobial resistance: global report on
surveillance. 2014. 257 p.
7. Prabaker K, Weinstein RA. Trends in antimicrobial resistance in intensive care
units in the United States. Curr Opin Crit Care. 2011 Oct;17(5):472–9.
8. van Duijn PJ, Dautzenberg MJD, Oostdijk EAN. Recent trends in antibiotic
resistance in European ICUs. Curr Opin Crit Care. 2011 Dec;17(6):658–65.
9. Rhomberg PR, Jones RN. Summary trends for the Meropenem Yearly
Susceptibility Test Information Collection Program: a 10-year experience in the
United States (1999-2008). Diagn Microbiol Infect Dis. 2009 Dec;65(4):414–26.
10. Centers for Disease Control and Prevention. Vital signs: carbapenem-resistant
Enterobacteriaceae. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2013 Mar;62(9):165–70.
11. Centers for Disease Control and Prevention. Antibiotic Resistance Threats in the
United States. [Internet]. 2013. Available from:
https://www.cdc.gov/drugresistance/pdf/ar-threats-2013-508.pdf
12. Borer A, Saidel-Odes L, Riesenberg K, Eskira S, Peled N, Nativ R, et al.
Attributable mortality rate for carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae
bacteremia. Infect Control Hosp Epidemiol. 2009 Oct;30(10):972–6.
13. Villalobos AP, Díaz MH, Barrero LI, Rivera SM, Henríquez DE, Villegas MV et
al. Tendencias de los fenotipos de resistencia bacteriana en los hospitales
públicos y privados de alta complejidad de Colombia. Rev Panam Salud
Pública. 2011;30 (6):627–33.
14. Maya JJ, Ruiz SJ, Blanco VM, Gotuzzo E, Guzman-Blanco M, Labarca J, et al.
Current status of carbapenemases in Latin America. Expert Rev Anti Infect Ther.
2013 Jul;11(7):657–67.
15. Yigit H, Queenan AM, Anderson GJ, Domenech-Sanchez A, Biddle JW, Steward
CD, et al. Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase, KPC-1, from a
carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents
Chemother. 2001 Apr;45(4):1151–61.
16. Ruiz-Garbajosa P, Curiao T, Tato M, Gijón D, Pintado V, Valverde A, et al.
Multiclonal dispersal of KPC genes following the emergence of non-ST258
KPC-producing Klebsiella pneumoniae clones in Madrid, Spain. J Antimicrob
Chemother. 2013 Nov;68(11):2487–92.
17. Gales AC, Castanheira M, Jones RN, Sader HS. Antimicrobial resistance among
Gram-negative bacilli isolated from Latin America: results from SENTRYAntimicrobial Surveillance Program (Latin America, 2008-2010). Diagn Microbiol
Infect Dis. 2012 Aug;73(4):354–60.
18. Mensa J, Gatell J G-SJ et al. Guía de terapéutica antimicrobiana [Internet].
Barcelona: Editorial Antares; 2010. Available from:
https://dialnet.unirioja.es/servlet/articulo?codigo=6336737
19. Bennett JE, Dolin R, Blaser MJ. Mandell, Douglas y Bennett. Enfermedades
infecciosas. Síndrome de inmunodeficiencia adquirida [Internet]. Elsevier Health
Sciences Spain; 2015. Available from:
https://books.google.com.co/books?id=txJACwAAQBAJ
20. Bush K, Jacoby GA. Updated functional classification of beta-lactamases.
Antimicrob Agents Chemother. 2010 Mar;54(3):969–76.
21. Villegas MV, Lolans K, Correa A, Suarez CJ, Lopez JA, Vallejo M, et al. First
detection of the plasmid-mediated class A carbapenemase KPC-2 in clinical
isolates of Klebsiella pneumoniae from South America. Antimicrob Agents
Chemother [Internet]. 2006 Aug;50(8):2880–2. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16870793
22. Mojica Medina MF. Widespread Dissemination of KPC-2 and 3-Producing
Enterobacteriaceae (EB) in Colombia. In: 51 st Interscience Conference on
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Chicago-USA; 2011.
23. Gasink LB, Edelstein PH, Lautenbach E, Synnestvedt M, Fishman NO. Risk
factors and clinical impact of Klebsiella pneumoniae carbapenemase-producing
K. pneumoniae. Infect Control Hosp Epidemiol [Internet]. 2009
Dec;30(12):1180–5. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19860564
24. Zavascki AP, Barth AL, Gonçalves ALS, Moro ALD, Fernandes JF, Martins AF,
et al. The influence of metallo-beta-lactamase production on mortality in
nosocomial Pseudomonas aeruginosa infections. J Antimicrob Chemother.
2006 Aug;58(2):387–92.
25. Crespo MP, Woodford N, Sinclair A, Kaufmann ME, Turton J, Glover J, et al.
Outbreak of carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa producing VIM-8,
a novel metallo-beta-lactamase, in a tertiary care center in Cali, Colombia. J
Clin Microbiol. 2004 Nov;42(11):5094–101.
26. Villegas MV, Lolans K, del Rosario Olivera M, Suarez CJ, Correa A, Queenan
AM, et al. First detection of metallo-beta-lactamase VIM-2 in Pseudomonas
aeruginosa isolates from Colombia. Antimicrob Agents Chemother. 2006
Jan;50(1):226–9.
27. Montealegre MC, Correa A, Briceño DF, Rosas NC, De La Cadena E, Ruiz SJ,
et al. Novel VIM metallo-beta-lactamase variant, VIM-24, from a Klebsiella
pneumoniae isolate from Colombia. Antimicrob Agents Chemother [Internet].
2011/01/31. 2011 May;55(5):2428–30. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21282438
28. Rojas LJ, Mojica MF, Blanco VM, Correa A, Montealegre MC, De La Cadena E,
et al. Emergence of Klebsiella pneumoniae Coharboring KPC and VIM
Carbapenemases in Colombia. Antimicrob Agents Chemother [Internet].
2012/12/10. 2013 Feb;57(2):1101–2. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23229478
29. Escobar Pérez JA, Olarte Escobar NM, Castro-Cardozo B, Valderrama Márquez
IA, Garzón Aguilar MI, Martinez de la Barrera L, et al. Outbreak of NDM-1-
producing Klebsiella pneumoniae in a neonatal unit in Colombia. Antimicrob
Agents Chemother. 2013 Apr;57(4):1957–60.
30. Villegas MV, Kattan JN, Correa A, Lolans K, Guzman AM, Woodford N, et al.
Dissemination of Acinetobacter baumannii clones with OXA-23 Carbapenemase
in Colombian hospitals. Antimicrob Agents Chemother [Internet]. 2007/04/02.
2007 Jun;51(6):2001–4. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17403994
31. Montealegre MC, Maya JJ, Correa A, Espinal P, Mojica MF, Ruiz SJ, et al. First61
identification of OXA-72 carbapenemase from Acinetobacter pittii in Colombia.
Antimicrob Agents Chemother [Internet]. 2012/04/16. 2012 Jul;56(7):3996–8.
Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22508295
32. Vanegas JM, Higuita LF, Vargas CA, Cienfuegos AV, Rodríguez EA, Roncancio
GE, et al. Acinetobacter baumannii resistente a carbapenémicos causante de
osteomielitis e infecciones de la piel y los tejidos blandos en hospitales de
Medellín, Colombia. Biomédica [Internet]. 2015 Dec 1;35(4 SE-Artículos
originales):522–30. Available from:
https://revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/view/2572
33. Instituto Nacional de Salud. Resultados del Programa de Informe de Resultados
de la Vigilancia por Laboratorio de Resistencia antimicrobiana en Infecciones
Asociadas a la Atención en Salud (IAAS) 2017. 2017;
34. El Zowalaty ME, Al Thani AA, Webster TJ, El Zowalaty AE, Schweizer HP,
Nasrallah GK, et al. Pseudomonas aeruginosa: arsenal of resistance
mechanisms, decades of changing resistance profiles, and future antimicrobial
therapies. Future Microbiol. 2015;10(10):1683–706.
35. Xiao M, Wang Y, Yang Q-W, Fan X, Brown M, Kong F, et al. Antimicrobial
susceptibility of Pseudomonas aeruginosa in China: a review of two multicentre
surveillance programmes, and application of revised CLSI susceptibility
breakpoints. Int J Antimicrob Agents [Internet]. 2012;40(5):445–9. Available
from: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0924857912002798
36. Potron A, Poirel L, Nordmann P. Emerging broad-spectrum resistance in
Pseudomonas aeruginosa and Acinetobacter baumannii: Mechanisms and
epidemiology. Int J Antimicrob Agents. 2015 Jun;45(6):568–85.
37. Walsh TR, Toleman MA, Poirel L, Nordmann P. Metallo-beta-lactamases: the
quiet before the storm? Clin Microbiol Rev [Internet]. 2005 Apr;18(2):306–25.
Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15831827
38. Marquez-Ortiz RA, Haggerty L, Olarte N, Duarte C, Garza-Ramos U, Silva-
Sanchez J, et al. Genomic Epidemiology of NDM-1-Encoding Plasmids in Latin
American Clinical Isolates Reveals Insights into the Evolution of Multidrug
Resistance. Genome Biol Evol. 2017 Jun;9(6):1725–41.
39. Sevillano E, Gallego L, García-Lobo JM. First detection of the OXA-40
carbapenemase in P. aeruginosa isolates, located on a plasmid also found in A.
baumannii. Pathol Biol (Paris). 2009 Sep;57(6):493–5.
40. Abril D, Marquez-Ortiz RA, Castro-Cardozo B, Moncayo-Ortiz JI, Olarte Escobar
NM, Corredor Rozo ZL, et al. Genome plasticity favours double chromosomal
Tn4401b-blaKPC-2 transposon insertion in the Pseudomonas aeruginosa ST235
clone. BMC Microbiol [Internet]. 2019;19(1):45. Available from:
https://doi.org/10.1186/s12866-019-1418-6
41. Martinez E, Pérez JE, Buelvas F, Tovar C, Vanegas N, Stokes HW.
Establishment and multi drug resistance evolution of ST235 Pseudomonas
aeruginosa strains in the intensive care unit of a Colombian hospital. Res
Microbiol. 2014 Dec;165(10):852–6.
42. Pirnay J-P, De Vos D, Cochez C, Bilocq F, Vanderkelen A, Zizi M, et al.
Pseudomonas aeruginosa displays an epidemic population structure. Environ
Microbiol. 2002 Dec;4(12):898–911.
43. Pirnay J-P, Bilocq F, Pot B, Cornelis P, Zizi M, Van Eldere J, et al.
Pseudomonas aeruginosa population structure revisited. PLoS One. 2009
Nov;4(11):e7740.
44. Mulet X, Cabot G, Ocampo-Sosa AA, Domínguez MA, Zamorano L, Juan C, et
al. Biological markers of Pseudomonas aeruginosa epidemic high-risk clones.
Antimicrob Agents Chemother. 2013 Nov;57(11):5527–35.
45. Cholley P, Thouverez M, Hocquet D, van der Mee-Marquet N, Talon D, Bertrand
X. Most multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates from hospitals in
eastern France belong to a few clonal types. J Clin Microbiol [Internet].2011/05/18. 2011 Jul;49(7):2578–83. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21593258
46. Peña C, Cabot G, Gómez-Zorrilla S, Zamorano L, Ocampo-Sosa A, Murillas J,
et al. Influence of virulence genotype and resistance profile in the mortality of
Pseudomonas aeruginosa bloodstream infections. Clin Infect Dis an Off Publ
Infect Dis Soc Am. 2015 Feb;60(4):539–48.
47. Miriagou V, Cornaglia G, Edelstein M, Galani I, Giske CG, Gniadkowski M, et al.
Acquired carbapenemases in Gram-negative bacterial pathogens: detection and
surveillance issues. Clin Microbiol Infect Off Publ Eur Soc Clin Microbiol Infect
Dis. 2010 Feb;16(2):112–22.
48. Nordmann P, Poirel L, Dortet L. Rapid detection of carbapenemase-producing
Enterobacteriaceae. Emerg Infect Dis [Internet]. 2012 Sep;18(9):1503–7.
Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22932472
49. Cury AP, Andreazzi D, Maffucci M, Caiaffa-Junior HH, Rossi F. The modified
Hodge test is a useful tool for ruling out Klebsiella pneumoniae carbapenemase.
Clinics (Sao Paulo) [Internet]. 2012 Dec;67(12):1427–31. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23295597
50. Giakkoupi P, Vourli S, Polemis M, Kalapothaki V, Tzouvelekis LS, Vatopoulos
AC. Supplementation of growth media with Zn2+ facilitates detection of VIM-2-
producing Pseudomonas aeruginosa. Vol. 46, Journal of clinical microbiology.
2008. p. 1568–9.
51. Tsakris A, Kristo I, Poulou A, Themeli-Digalaki K, Ikonomidis A, Petropoulou D,
et al. Evaluation of boronic acid disk tests for differentiating KPC-possessing
Klebsiella pneumoniae isolates in the clinical laboratory. J Clin Microbiol. 2009
Feb;47(2):362–7.
52. Pasteran F, Mendez T, Guerriero L, Rapoport M, Corso A. Sensitive screening
tests for suspected class A carbapenemase production in species of
Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol [Internet]. 2009/04/22. 2009
Jun;47(6):1631–9. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19386850
53. Giske CG, Gezelius L, Samuelsen Ø, Warner M, Sundsfjord A, Woodford N. A
sensitive and specific phenotypic assay for detection of metallo-β-lactamases
and KPC in Klebsiella pneumoniae with the use of meropenem disks
supplemented with aminophenylboronic acid, dipicolinic acid and cloxacillin. Clin
Microbiol Infect [Internet]. 2011;17(4):552–6. Available from:
http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1198743X14632729
54. Vandenbroucke JP, von Elm E, Altman DG, Gøtzsche PC, Mulrow CD, Pocock
SJ, et al. Strengthening the Reporting of Observational Studies in Epidemiology
(STROBE): Explanation and Elaboration. PLOS Med [Internet]. 2007 Oct
16;4(10):e297. Available from: https://doi.org/10.1371/journal.pmed.0040297
55. World Health Organization - WHO. Global priority list of antibiotic-resistant
bacteria to guide research, discovery, and development of new antibiotics. 2017;
Available from: https://www.who.int/medicines/publications/global-priority-list-
antibiotic-resistant-bacteria/en/
56. Kung VL, Ozer EA, Hauser AR. The accessory genome of Pseudomonas
aeruginosa. Microbiol Mol Biol Rev [Internet]. 2010 Dec;74(4):621–41. Available
from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21119020
57. Tato M, Coque TM, Baquero F, Cantón R. Dispersal of carbapenemase blaVIM-
1 gene associated with different Tn402 variants, mercury transposons, and
conjugative plasmids in Enterobacteriaceae and Pseudomonas aeruginosa.
Antimicrob Agents Chemother. 2010 Jan;54(1):320–7.
58. Juhas M, van der Meer JR, Gaillard M, Harding RM, Hood DW, Crook DW.
Genomic islands: tools of bacterial horizontal gene transfer and evolution. FEMS
Microbiol Rev [Internet]. 2008/10/29. 2009 Mar;33(2):376–93. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19178566
59. Morales-Espinosa R, Soberón-Chávez G, Delgado-Sapién G, Sandner-Miranda63
L, Méndez JL, González-Valencia G, et al. Genetic and phenotypic
characterization of a Pseudomonas aeruginosa population with high frequency
of genomic islands. PLoS One [Internet]. 2012/05/25. 2012;7(5):e37459–
e37459. Available from: https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22662157
60. Battle SE, Rello J, Hauser AR. Genomic islands of Pseudomonas aeruginosa.
FEMS Microbiol Lett [Internet]. 2009 Jan 1;290(1):70–8. Available from:
https://doi.org/10.1111/j.1574-6968.2008.01406.x
61. Bennett PM. Plasmid encoded antibiotic resistance: acquisition and transfer of
antibiotic resistance genes in bacteria. Br J Pharmacol. 2008 Mar;153
Suppl(Suppl 1):S347-57.
62. Bonnin RA, Poirel L, Nordmann P, Eikmeyer FG, Wibberg D, Pühler A, et al.
Complete sequence of broad-host-range plasmid pNOR-2000 harbouring the
metallo-β-lactamase gene bla -2 from Pseudomonas aeruginosa. J Antimicrob
VIM
Chemother. 2013 May;68(5):1060–5.
63. Li H, Toleman MA, Bennett PM, Jones RN, Walsh TR. Complete Sequence of
p07-406, a 24,179-base-pair plasmid harboring the bla metallo-beta-
VIM-7
lactamase gene in a Pseudomonas aeruginosa isolate from the United States.
Antimicrob Agents Chemother. 2008 Sep;52(9):3099–105.
64. Rodríguez-Andrade E, Hernández-Ramírez KC, Díaz-Peréz SP, Díaz-Magaña
A, Chávez-Moctezuma MP, Meza-Carmen V, et al. Genes from pUM505
plasmid contribute to Pseudomonas aeruginosa virulence. Antonie Van
Leeuwenhoek. 2016 Mar;109(3):389–96.
65. Herschleb J, Ananiev G, Schwartz DC. Pulsed-field gel electrophoresis. Nat
Protoc. 2007;2(3):677–84.
66. Abril Riaño DJ. Análisis de las plataformas genéticas de movilización de genes
de resistencia en el clon de Pseudomonas aeruginosa ST235 causante de
infecciones en Colombia [Internet]. Universidad Nacional de Colombia - Sede
Bogotá; 2017 Apr. Available from: http://bdigital.unal.edu.co/57072/
67. Monteiro J, Widen RH, Pignatari ACC, Kubasek C, Silbert S. Rapid detection of
carbapenemase genes by multiplex real-time PCR. J Antimicrob Chemother.
2012 Apr;67(4):906–9.
68. Curran B, Jonas D, Grundmann H, Pitt T, Dowson CG. Development of a
multilocus sequence typing scheme for the opportunistic pathogen
Pseudomonas aeruginosa. J Clin Microbiol. 2004 Dec;42(12):5644–9.
69. Li H, Durbin R. Fast and accurate long-read alignment with Burrows-Wheeler
transform. Bioinformatics. 2010 Mar;26(5):589–95.
70. Milne I, Stephen G, Bayer M, Cock PJA, Pritchard L, Cardle L, et al. Using
Tablet for visual exploration of second-generation sequencing data. Brief
Bioinform. 2013 Mar;14(2):193–202.
71. Krumsiek J, Arnold R, Rattei T. Gepard: a rapid and sensitive tool for creating
dotplots on genome scale. Bioinformatics. 2007 Apr;23(8):1026–8.
72. Seemann T. Prokka: rapid prokaryotic genome annotation. Bioinformatics. 2014
Jul;30(14):2068–9.
73. Zankari E, Hasman H, Cosentino S, Vestergaard M, Rasmussen S, Lund O, et
al. Identification of acquired antimicrobial resistance genes. J Antimicrob
Chemother. 2012 Nov;67(11):2640–4.
74. McArthur AG, Waglechner N, Nizam F, Yan A, Azad MA, Baylay AJ, et al. The
comprehensive antibiotic resistance database. Antimicrob Agents Chemother.
2013 Jul;57(7):3348–57.
75. Gupta SK, Padmanabhan BR, Diene SM, Lopez-Rojas R, Kempf M, Landraud L,
et al. ARG-ANNOT, a new bioinformatic tool to discover antibiotic resistance
genes in bacterial genomes. Antimicrob Agents Chemother [Internet].
2014;58(1):212–20. Available from:
http://europepmc.org/abstract/MED/24145532
76. Arndt D, Grant JR, Marcu A, Sajed T, Pon A, Liang Y, et al. PHASTER: a better,faster version of the PHAST phage search tool. Nucleic Acids Res [Internet].
2016/05/03. 2016 Jul 8;44(W1):W16–21. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27141966
77. Langille MGI, Brinkman FSL. IslandViewer: an integrated interface for
computational identification and visualization of genomic islands. Bioinformatics
[Internet]. 2009/01/16. 2009 Mar 1;25(5):664–5. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19151094
78. Sullivan MJ, Petty NK, Beatson SA. Easyfig: a genome comparison visualizer.
Bioinformatics [Internet]. 2011/01/28. 2011 Apr 1;27(7):1009–10. Available from:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21278367
79. Cuzon G, Naas T, Nordmann P. Functional characterization of Tn4401, a Tn3-
based transposon involved in bla gene mobilization. Antimicrob Agents
KPC
Chemother. 2011 Nov;55(11):5370–3.
80. Naas T, Cuzon G, Truong H-V, Nordmann P. Role of ISKpn7 and deletions in
bla gene expression. Antimicrob Agents Chemother. 2012 Sep;56(9):4753–9.
KPC
81. Cheruvanky A, Stoesser N, Sheppard AE, Crook DW, Hoffman PS, Weddle E, et
al. Enhanced Klebsiella pneumoniae Carbapenemase Expression from a Novel
Tn4401 Deletion. Antimicrob Agents Chemother. 2017 Jun;61(6).
82. Hernández-Gómez C, Blanco VM, Motoa G, Correa A, Maya JJ, de la Cadena
E, et al. Evolución de la resistencia antimicrobiana de bacilos Gram negativos
en unidades de cuidados intensivos en Colombia. Biomédica [Internet]. 2014
Apr 1;34(Sup1 SE-Artículos originales):91–100. Available from:
https://revistabiomedica.org/index.php/biomedica/article/view/1667
83. Pragasam AK, Yesurajan F, Doss C GP, George B, Devanga Ragupathi NK,
Walia K, et al. Draft Genome Sequence of Extremely Drug-Resistant
Pseudomonas aeruginosa (ST357) Strain CMC_VB_PA_B22862 Isolated from
a Community-Acquired Bloodstream Infection. Genome Announc. 2016 Oct;4(5).
84. Bonnin RA, Bogaerts P, Girlich D, Huang T-D, Dortet L, Glupczynski Y, et al.
Molecular Characterization of OXA-198 Carbapenemase-Producing
Pseudomonas aeruginosa Clinical Isolates. Antimicrob Agents Chemother.
2018 Jun;62(6).
85. Shankar C, Mathur P, Venkatesan M, Pragasam AK, Anandan S, Khurana S, et
al. Rapidly disseminating bla carrying Klebsiella pneumoniae belonging to
OXA-232
ST231 in India: multiple and varied mobile genetic elements. BMC Microbiol.
2019 Jun;19(1):137.
86. Doi Y. Treatment Options for Carbapenem-resistant Gram- negative Bacterial
Infections. Clinical Infectious Diseases. 2019;69(S7): S565–75.