Cuantificación de citoquinas y su relación con la documentación de bacteriemia en pacientes con leucemia aguda y neutropenia febril post quimioterapia en el Instituto Nacional de Cancerología E.S.E.
Autor: Madera Rojas, Ana María
Asesor: Vásquez Hoyos, Pablo (Thesis advisor)
Fecha: 2015-07-29
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Objetivos: En  pacientes con leucemia aguda y neutropenia febril,  conocer el comportamiento de varias citoquinas y su  relación  con la presencia de bacteriemia. Métodos: Se almacenaron muestras de plasma obtenidas al momento del diagnóstico de la neutropenia, al inicio de la fiebre y a las 24 y 48 horas posteriores, las cuales se conservaron a -70 ° C y luego se descongelaron para su procesamiento mediante citometría de flujo.  Resultados: No hubo ningún reporte de muerte al egreso. La  tasa de hemocultivos positivos fue  25%. Las IL 10 y 6 mostraron mayor porcentaje de variación durante el momento de la fiebre comparando el grupo de bacteriémicos con el de no bacteriemicos. IL1, IL12p70 y TNF arrojaron niveles séricos por debajo del límite de detección de la prueba.  Conclusiones: Las citoquinas podrían cumplir un papel promisorio en el seguimiento de los pacientes neutropénicos febriles, dada la potencial asociación con presencia de bacteriemia.

Cuantificación de citoquinas y su
relación con la documentación de
bacteriemia en pacientes con leucemia
aguda y neutropenia febril post
quimioterapia, en el Instituto Nacional de
Cancerología-Empresa Social del Estado
Ana María Madera Rojas
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina. Departamento de Medicina Interna
Bogotá, Colombia
2015Cuantificación de citoquinas y su
relación con la documentación de
bacteriemia en pacientes con leucemia
aguda y neutropenia febril post
quimioterapia, en el Instituto Nacional de
Cancerología-Empresa Social del Estado.
Ana María Madera Rojas
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Especialista en Medicina Interna
Director (a):
Dra. Sonia Isabel Cuervo Maldonado
Grupo de Investigación:
GREICAH: Grupo de Investigación en enfermedades infecciosas en cáncer y alteraciones
hematológicas
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina. Departamento de Medicina Interna
Bogotá, Colombia
2015“Cáncer es una palabra, no una sentencia”
John DiamondAgradecimientos
Especial gratitud con Beckton Dickinson TM por su colaboración al facilitarnos el producto
comercial BD Cytometric Bead Array (CBA) Human Inflammatory Cytokines Kit y por la
asesoría técnico científica para la realización de este trabajo de investigaciónResumen y Abstract XI
Resumen
Objetivos: En pacientes con leucemia aguda y neutropenia febril, conocer el
comportamiento de varias citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia.
Métodos: Se almacenaron muestras de plasma obtenidas al momento del diagnóstico
de la neutropenia, al inicio de la fiebre y a las 24 y 48 horas posteriores, las cuales se
conservaron a -70 ° C y luego se descongelaron para su procesamiento mediante
citometría de flujo. Resultados: No hubo ningún reporte de muerte al egreso. La tasa
de hemocultivos positivos fue 25%. Las IL 10 y 6 mostraron mayor porcentaje de
variación durante el momento de la fiebre comparando el grupo de bacteriémicos con el
de no bacteriemicos. IL1, IL12p70 y TNF arrojaron niveles séricos por debajo del límite
de detección de la prueba. Conclusiones: Las citoquinas podrían cumplir un papel
promisorio en el seguimiento de los pacientes neutropénicos febriles, dada la potencial
asociación con presencia de bacteriemia.
Palabras clave: citoquinas, neutropenia, fiebre, quimioterapia, leucemia aguda,
bacteriemia.XII Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
Abstract
Objectives: In patients with acute leukemia and febrile neutropenia, recognize the
behavior of various cytokines and their relationship to the presence of bacteremia.
Methods: Plasma samples obtained at diagnosis of neutropenia, at the onset of fever
and 24 and 48 hours later were stored. These were preserved at -70°C and then thawed
for processing by flow cytometry. Results: There was no report of death at discharge.
The rate of positive blood cultures was 25% similar to the reviewed literature. The IL 10
and IL 6 showed greater percentage change during the time of fever bacteremic group
comparing with non bacteremic. IL1, IL12p70 and TNF showed serum levels below the
detection limit of the test. Conclusions: Cytokines may play a promising role in the
monitoring of febrile neutropenic patients given the potential association with the
presence of bacteremia.
Keywords: cytokines, neutropenia, fever, chemotheraphy, leukemia acute, bacteremia.Contenido XIII
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... XI
Lista de figuras ............................................................................................................... XI
Lista de tablas .............................................................................................................. XIII
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Planteamiento del problema y justificación .............................................................. 5
2. Objetivos ..................................................................................................................... 9
3. Marco teórico ........................................................................................................... 11
4. Materiales y métodos .............................................................................................. 21
4.1 Diseño del estudio ................................................................................................ 19
4.2 Definición de sujetos a estudio ........................................................................... 20
4.3 Plan de análisis ..................................................................................................... 21
4.4 Descripción de las intervenciones ....................................................................... 22
5. Resultados ............................................................................................................... 29
6. Discusión ................................................................................................................. 30
7. Conclusiones ........................................................................................................... 35
A. Anexo: Manual de procedimientos ..................................................................... 36
Bibliografía .................................................................................................................. 50XIV Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapiaContenido XV
Lista de figuras
Pág
Figura 1: Cinética de procalcitonina en las muestras estudiadas………………...32
Figura 2: Cinética de IL 8 en las muestras estudiadas…………………………… 33
Figura 3: Cinética de IL 8 en las muestras estudiadas…………………………….33
Figura 4: Cinética de IL 10 en las muestras estudiadas………………………..34Contenido XVIContenido XVII
Lista de tablas
Pág
Tabla 1: Características clínicas de los pacientes incluidos en el estudio………29
Tabla 2: Aislamientos microbiológicos en hemocultivos…………………………..32
Tabla 3: Niveles séricos de procalcitonina (ng/mL) distribuidos por medianas
según la presencia o no de bacteriemia ……………………………………………..33
Tabla 4: Niveles séricos de IL6 (pg/mL) distribuidos por medianas según la
presencia o no de bacteriemia……………………………………………………… 33
Tabla 5: Niveles séricos de IL8 (pg/mL) distribuidos por medianas según la
presencia o no de bacteriemia……………………………………………………… 34
Tabla 5: Niveles séricos de IL10 (pg/mL) distribuidos en medianas según la
presencia o no de bacteriemia ………………………………………………………..34Contenido XVIIIContenido XIXIntroducción
Más del 80% de los pacientes con malignidades hematológicas presentan neutropenia
febril durante la quimioterapia de inducción y pueden presentar más de un episodio
durante los siguientes ciclos de quimioterapia1, constituyéndose esta en un factor de
riesgo para el desarrollo de infecciones graves, las cuales generan una alta
morbimortalidad, estancia y costos hospitalarios2.
A pesar de que se conocen los factores que impactan en la susceptibilidad a la infección
y que se han diseñado escalas de predicción de riesgo 3,4, es difícil discriminar entre
infecciones severas y episodios febriles de bajo riesgo. La presencia de bacteriemia por
gérmenes Gram negativos se ha relacionado con desenlaces clínicos adversos, a
diferencia del subgrupo de pacientes en que no se documenta un foco infeccioso claro o
el agente microbiológico causal, población en la cual la resolución de la fiebre suele ser
más rápida y con menor tasa de complicaciones5. Dentro del grupo de pacientes con
neoplasias hematológicas hospitalizados para recibir quimioterapia y que desarrollan
neutropenia febril se han documentado episodios de bacteriemia entre el 20 6 y el 43 7 %
de los casos con predominio de los aislamientos de bacterias Gram negativas con tasas
de hasta el 60.3% 7,8
Dadas las limitaciones en la evaluación clínica de estos pacientes, se ha tratado de
acceder a biomarcadores para el diagnóstico y seguimiento de episodios de neutropenia
febril de alto riesgo. El biomarcador ideal debería ser rápido, específico, costo-efectivo y
que permita predecir de forma temprana la presencia de bacteriemia. Desde hace
algunos años se han evaluado proteínas de fase aguda, citoquinas, moléculas de
adhesión solubles y procalcitonina como marcadores que contribuyan a identificar
infecciones fúngicas o bacterianas, sin embargo el número de estudios que incluyen
pacientes neutropénicos en el contexto post quimioterapia es pequeño con resultados
que difieren ampliamente9.2 Introducción
Los pacientes neutropénicos mantienen la liberación plasmática de citoquinas
independiente del conteo de leucocitos6 y se ha propuesto que gérmenes Gram positivos
y Gram negativos provocan diferentes patrones de concentraciones séricas de
citoquinas. Para investigar en qué medida los perfiles de citoquinas varían en respuesta a
diferentes gérmenes se han diseñado estudios con ELISA y con Citometría de Flujo en
modelos animales y en monocitos humanos10. La inducción más pronunciada en niveles
séricos con Gram negativos se ha observado con IL 6, citoquina que en el contexto de
neoplasias hematológicas y neutropenia febril también ha mostrado la mayor asociación
con bacteriemia (92% de sensibilidad) 7,11. Los resultados con otras citoquinas del perfil
TH1 en relación con la presencia de bacteriemia han mostrado asociación también con
IL8 (87% de sensibilidad)12, IL 10 (71% de sensibilidad) 13 y TNF14 (89% de sensibilidad)
, mientras que para IL 1 e IL 12 no se han documentado reportes de sensibilidad para
detección de bacteriemia en estudios clínicos.
En cuanto al tipo de técnica para su medición, las ventajas que suponen las técnicas de
matrices múltiples como la Citometria de Flujo sobre el ELISA (Enzyme Linked
Immunoabsorbent Assay) incluyen alto rendimiento, necesidad de menor volumen de
muestra, eficiencia en términos de tiempo y costo y principalmente la capacidad de medir
múltiples citoquinas con una alícuota de muestra dada, factor que influyó principalmente
en escoger este método15.
Con el interés de conocer el comportamiento de varias citoquinas en un grupo de
pacientes neutropénicos febriles con leucemias agudas en el Instituto Nacional de
Cancerología, se plantea realizar la medición de las mismas a través de la técnica de
citometría de flujo e identificar su potencial relación con el desarrollo de bacteriemia.
Dado que aún no existe un modelo in vivo que logre describir su cinética en este
escenario clínico, se propone realizar la medición de interleuquinas 1, 6, 8, 10, 12p70 y
factor de necrosis tumoral alfa (TNF) al inicio de la neutropenia, en el momento de
aparición de la fiebre y a las 24 y 48 horas posteriores y compararlas con la cinética de
procalcitonina medida en un estudio previo.Introducción 34 Introducción1. Planteamiento del problema y justificación
En pacientes con neoplasias hematológicas, la infección relacionada al empleo de
quimioterapia genera una alta morbimortalidad, estancia y costos hospitalarios2. La
neutropenia derivada del tratamiento definida como un conteo absoluto de neutrófilos
menor de 500 células/mm3 es un factor de riesgo para el desarrollo de infecciones
graves. La susceptibilidad a la infección está determinada por la enfermedad maligna de
base, la potencia de la quimioterapia, factores ambientales y del hospedero (estado
nutricional, comorbilidades, medidas de protección) y variaciones genéticamente
determinadas del sistema inmune16. Es bien conocido en las últimas cuatro décadas la
relación lineal entre el grado de neutropenia y el mayor riesgo de infección bacteriana y
fúngica4.
Los factores anteriormente mencionados se han empleado en la práctica clínica como
herramientas para definir la vía de terapia antibiótica, el sitio de manejo y el tiempo del
tratamiento mediante escalas de predicción de riesgo17. Sin embargo es difícil discriminar
entre infecciones severas y episodios febriles de bajo riesgo. La presencia de bacteriemia
por gérmenes Gram negativos e infiltrados pulmonares se ha relacionado con desenlaces
clínicos adversos, a diferencia del subgrupo de pacientes en que no se documenta un
foco infeccioso claro o el agente microbiológico causal, población en la cual la resolución
de la fiebre suele ser más rápida y con menor tasa de complicaciones6. Dentro del grupo
de pacientes con neoplasias hematológicas hospitalizados para recibir quimioterapia y
que desarrollan neutropenia febril se han documentado episodios de bacteriemia entre el
20 18 y el 43 19 % de los casos con predominio de los aislamientos de bacterias Gram
negativas con tasas de hasta el 60.3% 19,20
Por estas razones es imperativo acceder a marcadores rápidos, específicos y costo-
efectivos que permitan predecir de forma temprana la presencia de bacteriemia en
pacientes hospitalizados con neutropenia febril post quimioterapia. Es necesario que
estos marcadores sean liberados independientemente del conteo de leucocitos y de la
actividad de la enfermedad de base y reflejen la severidad de la infección subyacente.
Desde hace algunos años se han estado evaluando proteínas de fase aguda, citoquinas
proinflamatorias, moléculas de adhesión solubles y procalcitonina como marcadores que
contribuyan a identificar infecciones fúngicas o bacterianas, sin embargo el número de
estudios que incluyen pacientes neutropénicos en el contexto intrahospitalario post
quimioterapia es pequeño y el valor predictivo es bajo como para influir en decisiones
clínicas. Asimismo, los resultados difieren ampliamente entre los estudios7. Los6 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
marcadores encontrados en la literatura incluyen: procalcitonina, proteína C reactiva,
amiloide sérico A, interleuquinas 6, 8 y 10, TNF dos receptores solubles del TNF
(sTNF-R I y sTNF-R II), la proteína quimiotáctica de monocitos tipo 1, neopterina,
proteína inflamatoria de macrófagos 1 y eotaxina 7. Sin embargo, los marcadores que
han mostrado mayor rendimiento en la identificación temprana de pacientes con alto
riesgo de bacteriemia son procalcitonina e interleuquinas IL 6 y 8 (IL 6 e IL8). Los
resultados con PCR (Proteína C Reactiva) han resultado contradictorios, con tendencia a
mostrar un menor rendimiento 9.
Pocos estudios han comparado procalcitonina con IL 6 y 8, aunque los datos disponibles
a la fecha concluyen en general que ninguno de los marcadores resulta ser superior en
términos de sensibilidad, especificidad, valor predictivo negativo o valor predictivo
positivo, no obstante existen algunos datos acerca de una mayor rapidez en la detección
de bacteriemia por gérmenes diferentes a Estafilococos Coagulasa Negativos 8 y mejor
precisión en detectar bacteriemias por Gram negativos con IL 6 e IL 8 10.
En el contexto de neutropenia febril el inicio de terapia antibiótica está claramente
indicado aun sin evidencia clínica o microbiológica de un proceso infeccioso y si bien la
medición de marcadores indirectos de infección no influirá en la decisión de iniciar terapia
antibiótica si se podrían convertir para el clínico en una herramienta útil para definir
tiempo de la terapia en situaciones clínicas determinadas como es la fiebre de origen
desconocido, con impacto en estancia hospitalaria, resistencia antimicrobiana, calidad de
vida y costos.
Teniendo en cuenta los pocos datos que se encuentran en la literatura internacional y la
ausencia de información en nuestro medio se planteó la siguiente pregunta de
investigación: ¿Cuál es la utilidad de la medición de interleuquinas 1, 6, 8, 10, 12, TNF
 para predecir la presencia de bacteriemia en pacientes con leucemia aguda y
neutropenia febril post quimioterapia, en el Instituto Nacional de Cancerología-Empresa
Social del Estado?Capítulo 1 78 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia2. Objetivos
2.1 Objetivo general
Evaluar la posible asociación entre el cambio en los niveles de citoquinas y la
documentación de bacteriemia en pacientes con neutropenia febril de alto riesgo en el
Instituto Nacional de Cancerología en un año.
2.2 Objetivo específico
 Describir los niveles de interleuquinas 1, 6, 8, 10, 12 y factor de necrosis tumoral
(TNF) en pacientes adultos con leucemia aguda y neutropenia febril post
quimioterapia al momento del diagnóstico de la neutropenia, al momento del inicio
de la fiebre y a las 24 horas y 48 horas posteriores.
.10 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia3. Marco Teórico
Han pasado cuatro décadas desde que Bodey y colaboradores reconocieron por primera
vez la relación entre el grado de neutropenia y el riesgo de infecciones bacterianas y
fúngicas al realizar una descripción detallada de las complicaciones infecciosas en 52
pacientes tratados con citotóxicos para el tratamiento contra la leucemia aguda. Ellos
hicieron la observación que de acuerdo a la disminución de los granulocitos, la
frecuencia, la duración y gravedad de las infecciones aumentaban dramáticamente. Esto
fue especialmente marcado cuando el recuento de neutrófilos cayó por debajo de 500
células / mm3 21. Ahora está claro que los principales factores están determinados por la
enfermedad subyacente y la potencia de la quimioterapia.
Más del 80% de los pacientes con malignidades hematológicas presentan neutropenia
febril durante la quimioterapia de inducción y pueden presentar más de un episodio de
neutropenia febril durante los siguientes ciclos de quimioterapia 22
En pacientes con cáncer la morbilidad y la mortalidad por complicaciones infecciosas
después de quimioterapia agresiva y potencialmente curativa sigue siendo un problema
clínico importante en la actualidad. Discriminar entre las infecciones graves y los
episodios de febriles de bajo riesgo en pacientes febriles con neutropenia es difícil pues
debido a la misma neutropenia los signos clínicos y radiológicos de infecciones
bacterianas pueden no estar presentes 23.
Los pacientes con bacteriemia por gérmenes Gram negativos o con infiltrados
pulmonares, presentan una significativa morbilidad y en estos subgrupos los desenlaces
clínicos suelen ser desalentadores. Por el contrario, los pacientes sin foco clínico
documentado de infección y sin aislamiento microbiológico de germen causal por lo
general tienen una duración más corta de la fiebre y menor riesgo de desarrollar
complicaciones clínicas significativas 2412 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
En la mayoría de los episodios de neutropenia febril los agentes infecciosos causales no
pueden ser identificados. Rintala y colaboradores evaluaron las características de 554
episodios febriles en 126 pacientes con cáncer hematológico durante un período de 6
años (1985-1990) con el fin de estudiar la incidencia y la importancia clínica de la
positividad de los hemocultivos. La infección fue documentada microbiológicamente en
28 % y clínicamente en 30 % de los episodios. Los hemocultivos fueron positivos en el
19% de los episodios febriles. La muerte por sepsis ocurrió en el 23% de los episodios
febriles con hemocultivo positivo, con una mediana de supervivencia de dos días. Por lo
tanto, la pequeña proporción de episodios febriles cuya etiología puede ser establecida
por hemocultivo representa ' la punta del iceberg ", es decir, representan infecciones
rápidamente letales con una alta tasa de mortalidad 24
Un estudio más reciente 19 evidencia aislamientos microbiológicos en hemocultivos en el
43% de los episodios de neutropenia febril en 116 pacientes hospitalizados para
administración de quimioterapia aplasiante en el servicio de hematología en un centro
médico en Malasia estudiados de forma retrospectiva entre enero de 2004 y enero de
2005.
En el mismo contexto de infecciones bacterianas nosocomiales en pacientes
neutropénicos febriles, otro estudio retrospectivo entre septiembre de 2007 y septiembre
de 2009 25 analizó los resultados de cultivos obtenidos en 95 pacientes neutropénicos con
fiebre, la cual se presentó después de 48 horas del ingreso al hospital o a menos de una
semana del egreso hospitalario, encontrando que un 63% de los pacientes tenían
hemocultivos positivos, con 43% de aislamientos de gérmenes Gram negativos, 29,8%
de Gram positivos, 3,2% fueron polimicrobianos y solo un hemocultivo documentó
hongos. El microorganismo más observado fue Escherichia coli (27,7%), seguido de
Pseudomonas aeruginosa (16%), Acinetobacter baumannii (10,5%), Klebsiella
pneumoniae (8%), estafilococo coagulasa positivos (8%) y estafilococos coagulasa
negativos (8%).
Estos datos nos permiten concluir que la tasa de aislamiento microbiológico del germen o
gérmenes causales en neutropenia febril postquimioterapia ha aumentado en los últimos13
años producto del perfeccionamiento de las técnicas de laboratorio microbiológico, sin
embargo algunos factores tales como el momento de la toma de los hemocultivos o el
uso previo de antibióticos podrían afectar este rendimiento.
El valor de las citoquinas proinflamatorias, así como de la procalcitonina y la PCR ha sido
bien establecido en el diagnóstico y evaluación de infección bacteriana en pacientes no
neutropénicos. Recientes estudios con pacientes inmunocomprometidos con neutropenia
febril han demostrado que estos pacientes también son capaces de producir niveles
plasmáticos elevados de citoquinas proinflamatorias, así como de procalcitonina y PCR
26,27,28
Estos estudios también han documentado que el aumento en los niveles de PCR se
correlaciona con las infecciones bacterianas en pacientes leucémicos y que los niveles
de PCR son significativamente mayores si los hemocultivos son positivos. Ha sido difícil
identificar los puntos de corte con un alto poder predictivo que discrimine subgrupos de
pacientes de interés 26,27,28
La procalcitonina, una proteína precursora de la calcitonina humana, ha sido señalada
como un marcador específico y sensible de infección bacteriana severa en pacientes no
inmunocomprometidos 29,30 La cinética de la procalcitonina después de la aparición de
una reacción inflamatoria sistémica es similar a la de la PCR. La vida media es
aproximadamente 20 horas y las concentraciones pico se alcanzan entre las 24 y 48
horas después de un estímulo inflamatorio 30,31
En la literatura hay pocos informes de la fiabilidad de la procalcitonina como marcador
para la discriminación de la gravedad de una infección en los pacientes neutropénicos
febriles. En un estudio la procalcitonina se analizó de forma temprana después de la
aparición de la fiebre y el inicio del tratamiento antimicrobiano. En 28 casos de
neutropenia febril los autores calcularon la sensibilidad para la detección de bacteriemia
o infección clínica a 55 % y la especificidad de 88 % con un nivel del PCT de 0,5 ng / ml
32 Otro estudio incluyó 33 casos de bacteriemia, donde se observaron los niveles más14 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
altos de procalcitonina durante el primer día, en episodios de bacteriemias por gérmenes
Gram negativos en comparación con los otros cuadros clínicos33. Para la predicción de
bacteriemia por gramnegativos los autores calcularon una sensibilidad del 57 %, una
especificidad del 94 % y VPN de 92 % en el caso de la procalcitonina a un nivel de 1,1 ng
/ ml.
Las citoquinas son un grupo de proteínas de bajo peso molecular, secretadas durante las
respuestas inmunes natural y específica. Se unen a receptores específicos de la
membrana de las células donde van a ejercer su función, iniciando una cascada
intracelular de transducción de señales que altera el patrón de expresión génica, de
modo que esas células diana producen una determinada respuesta biológica. Debido a
los correspondientes ARNm que inducen, estas tienen una vida media corta, su
producción suele ser transitoria y limitada al lapso de tiempo que dura el estímulo.
Los niveles reportados de citoquinas circulantes pueden verse afectados por los
protocolos en la recolección de las muestras, tales como la manipulación, el
procesamiento y almacenamiento de las mismas e incluso por comportamientos de los
pacientes antes de la recolección. Variables como la hora del día en que se obtiene la
muestra, el estado de alimentación, el estrés agudo, el método de almacenamiento, su
duración y la elección del anticoagulante pueden influir en los niveles reportados de
citoquinas circulantes 34
Se recomienda la estandarización de los procedimientos de toma de muestras de sangre
y el almacenamiento del plasma para reducir las variaciones inter ensayo. Para obtener
las muestras de plasma, la sangre entera debe recogerse en tubos estériles con
anticoagulantes, colocarse inmediatamente en hielo y ser centrifugada lo antes posible,
preferiblemente dentro de treinta minutos. Muchas citoquinas tienen una vida muy corta y
comienzan a degradarse, por tanto, deben mantenerse pequeñas alícuotas, evitando la
congelación-descongelación repetida 35.36.
La hora del día en que se toman las muestras de sangre debe estar sincronizada,
idealmente en la mañana pues se puede atenuar la influencia de los patrones
circadianos. Ciertas citoquinas, en particular los que están afectados por los
glucocorticoides, pueden exhibir variaciones diurnas que son altamente predecibles. El
interferón gamma (IFN-gamma), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), interleuquina
1 (IL-1) y la IL-12 presentan picos en la mañana y guardan relación inversa con el ritmo
de cortisol plasmático 3715
Algunas mediciones pueden verse afectadas por la alimentación. Por ejemplo, los niveles
circulantes de proteína C-reactiva (PCR), inhibidor del activador del plasminógeno-1
(PAI-1) e IL-6 se elevan después de la ingesta de un alto contenido de grasa, mientras
que los niveles de TNF-alfa disminuyen. Este efecto postprandial se relaciona
probablemente con la respuesta de la insulina a la hiperglucemia aguda 38
El suero y el plasma no son equivalentes. El plasma conservado en tubos con EDTA
(ácido etilendiaminotetraacético) ha demostrado que produce los resultados más
consistentes para muchas citoquinas, mientras que el citrato de sodio puede disminuir
los niveles de algunas citoquinas (IL-6 y TNF-α). Las muestras deben recogerse en
tubos estériles, refrigerados y ser procesados rápidamente para mantener la estabilidad
de citoquinas.
Los niveles de IL-6 disminuyen en muestras de sangre entera a temperatura ambiente
(significativa después de 4 horas). Por el contrario, los niveles de TNF aumentaron en
condiciones similares. Por lo tanto, el plasma o suero deben separarse de las células de
sangre de forma rápida para evitar la degradación o absorción. Las muestras deben
mantenerse refrigeradas hasta su procesamiento, ya que se han encontrado diferencias
en mediciones de citoquinas entre los que se mantienen a temperatura ambiente y -4 °
C. Las muestras se deben congelar a -70° C hasta el ensayo y se deben evitar ciclos
múltiples de congelación-descongelación. La mayoría de las citoquinas son estables
hasta por dos años de almacenamiento a esta temperatura 36.
En cuanto al tipo de técnica, el rendimiento del ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent
Assay) es altamente dependiente de la calidad de los anticuerpos, el fabricante del kit,
así como la habilidad y la experiencia del operador. El ELISA permite la medición de una
sola citoquina a la vez en una alícuota de muestra dada, lo que se convierte en limitante
para medir mayor número de moléculas inflamatorias, sobre todo cuando están
disponibles cantidades limitadas de material biológico, mientras que las técnicas de
matrices múltiples (citometría de flujo, quimioluminiscencia o electroquimioluminiscencia
con citometría de flujo) permiten la medición de hasta de 25 citocinas 39.
Las ventajas de la citometría de flujo sobre la técnica de ELISA incluyen: alto
rendimiento, menos volumen de muestra necesario, eficiencia en términos de tiempo y
costo, capacidad para evaluar los niveles de una molécula inflamatoria en múltiples16 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
contextos y detectar con fiabilidad diferentes proteínas a través de un amplio rango de
concentraciones. Sin embargo, el grado de correlación entre ambos métodos es bueno40.
En cuanto a la cinética de las citoquinas, se ha propuesto que gérmenes Gram positivos
y Gram negativos provocan diferentes patrones de concentraciones plasmáticas. Para
investigar en qué medida los perfiles de citoquinas son similares en diferentes
enfermedades bacterianas se han diseñado estudios con ELISA y con citometría de flujo
para cuantificar los niveles plasmáticos de diversas citoquinas en modelos animales y en
monocitos humanos con respuesta a gérmenes diferentes. En ratones infectados con
Listeria monocytogenes y Campylobacter jejuni la diferencia más pronunciada en la
inducción de citoquinas se observó con la IL 6, citoquina que ha mostrado la mayor
asociación con bacteriemia por Gram negativos41. Los diferentes patrones de citoquinas
se han atribuido a las características en la estructura celular bacteriana, sin embargo aún
no existe un modelo in vivo que logre describir el comportamiento de las citoquinas en
bacteriemias, en parte debido a la gran variabilidad inter e intra individuo y los factores
relacionados a la recolección y procesamiento de las muestras anteriormente
mencionados.
Específicamente en el contexto de neutropenia febril post quimioterapia, un estudio
prospectivo con pacientes hospitalizados, compara diversos métodos (procalcitonina,
PCR y citoquinas: IL 6 e IL 8) 33 mostró una especificidad de 80% con un valor predictivo
negativo de 85% en los pacientes neutropénicos febriles sin bacteriemia. Encontró que
ninguno de los marcadores analizados fue superior en términos de sensibilidad,
especificidad, valor predictivo positivo y valor predictivo negativo para bacteriemia. Sin
embargo, la IL-6 e IL-8 permitieron una detección más precoz de procesos infecciosos
severos (10 horas) comparadas con procalcitonina y PCR.1718 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia194. Materiales y métodos
4.1 Diseño del estudio:
Estudio descriptivo, prospectivo, sujeto a las normas de buenas prácticas en
investigación clínica, en el que se midieron los niveles séricos de interleuquinas 1, 6, 8,
10, 12 y factor de necrosis tumoral (TNF) en pacientes con leucemia aguda y
neutropenia de alto riesgo posquimioterapia hospitalizados en el servicio de hematología
del Instituto Nacional de Cancerología en Bogotá, antes y durante un episodio de
neutropenia febril, con el fin de evaluar la relación entre las concentraciones de
interleuquinas 1, 6, 8, 10, 12 y factor de necrosis tumoral (TNF) y la documentación
de bacteriemia.
4.2. Hipótesis operativas:
4.2.1 Hipótesis alterna: En los pacientes adultos con leucemia aguda y neutropenia
febril post quimioterapia de alto riesgo, los niveles séricos de citoquinas proinflamatorias
se relacionan con la presencia de bacteriemia
4.2.2 Hipótesis nula: En los pacientes adultos con leucemia aguda y neutropenia febril
postquimioterapia de alto riesgo los niveles séricos de citoquinas proinflamatorias no se
relacionan con la presencia de bacteriemia
4.3. Definición de sujetos de estudio: Se analizaron 44 episodios de neutropenia febril
ocurridos en 35 pacientes mayores de 18 años con leucemia aguda, hospitalizados en el
Instituto Nacional de Cancerología entre mayo de 2013 y mayo de 2014 durante la
ejecución del proyecto de investigación INC-C41030610-410 ―Niveles de procalcitonina y
su relación con la documentación de bacteriemia en pacientes adultos con neoplasias
hematológicas y neutropenia febril de alto riesgo inducida por quimioterapia en el Instituto22 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
Nacional de Cancerología” . De estos pacientes, se almacenaron muestras de plasma
obtenidas al momento del diagnóstico de la neutropenia, al inicio de la fiebre y a las 24
horas y 48 horas posteriores. Se obtuvieron entre 2-3 ml de plasma de cada muestra de
sangre y se almacenaron a -70 ° C para su posterior análisis mediante citometría de flujo.
Todas las muestras incluidas contaron con el consentimiento informado de cada uno de
los pacientes que ingresaron al proyecto de investigación en mención1, en relación con
la aceptación voluntaria para donar las muestras de plasma para uso futuro.
4.3.1 Criterios de inclusión
 Este estudio incluye las muestras de suero tomadas en el proyecto de
investigación INC-C41030610-410 ―Niveles de procalcitonina y su relación con la
documentación de bacteriemia en pacientes adultos con neoplasias
hematológicas y neutropenia febril de alto riesgo inducida por quimioterapia en el
Instituto Nacional de Cancerología” y que tengan consentimiento informado
firmado para uso futuro.
 Todos los pacientes hombres y mujeres mayores de 18 años con leucemia aguda
hospitalizados para aplicación de poliquimioterapia aplasiante y neutropenia de
alto riesgo, definida como neutropenia esperada por más de 7 días, conteo
absoluto de neutrófilos inferior a 500/uL, comorbilidades significativas, dolor
abdominal, neumonía, hipotensión o cambios neurológicos, hospitalizados en el
servicio de Hematología del Instituto Nacional de Cancerología E.S.E.
4.3.2 Criterios de exclusión
Se tuvieron en cuenta los criterios de exclusión del proyecto de investigación INC-
C41030610-410 ―Niveles de procalcitonina y su relación con la documentación de
bacteriemia en pacientes adultos con neoplasias hematológicas y neutropenia febril de
alto riesgo inducida por quimioterapia en el Instituto Nacional de Cancerología”:
 Pacientes con neutropenia febril no relacionada a quimioterapia.
 Pacientes que ingresaron remitidos de otra institución.
 Pacientes con infección por VIH/SIDA.
 Pacientes que por sus comorbilidades o refractariedad al tratamiento, o por otras
razones, el servicio tratante contraindique tratamiento activo de su neoplasia.
 Pacientes gestantes.Capítulo 4 23
 Pacientes con enfermedad renal avanzada con depuración calculada de
creatinina inferior a 30 mL/min
 Pacientes con procesos infecciosos diagnosticados por clínica o por el laboratorio
al momento de la toma de la primera muestra de suero
 Pacientes que estén recibiendo antibioticoterapia por más de 24 horas previas al
inicio de la neutropenia febril
Plan de análisis
Se utilizó la base de datos del proyecto de investigación INC-C41030610-410 ―Niveles
de procalcitonina y su relación con la documentación de bacteriemia en pacientes adultos
con neoplasias hematológicas y neutropenia febril de alto riesgo inducida por
quimioterapia en el Instituto Nacional de Cancerología” con las características clínicas y
paraclínicas de los pacientes incluidos y objeto de este estudio. Para el componente
descriptivo se utilizaron medianas junto con sus correspondientes medidas de dispersión
(desviación estándar o rango intercuartílico dependiendo de las características de las
variables continuas). En el caso de variables discretas la descripción se efectuó
utilizando proporciones y porcentajes. Para el caso de los análisis de asociación, y
teniendo en cuenta la eventual no independencia, se utilizaron métodos de regresión
logística condicional. Para las pruebas de hipótesis de los coeficientes de regresión se
utilizarán valores de significación del 5%. Los análisis estadísticos se efectuarán con el
programa STATA 11.
4.4. Descripción de las intervenciones
4.4.1 Descripción de la técnica: La citometría de flujo es un método analítico que
permite la medición rápida de ciertas características físicas y químicas de células o
partículas suspendidas en líquido que producen una señal de forma individual al interferir
con una fuente de luz.
El principio en el que se basa esta tecnología es hacer pasar células u otras partículas en
suspensión alineadas y de una en una, por delante de un haz luminoso. La información
producida puede agruparse en dos tipos fundamentales: la generada por la dispersión de
la luz y la relacionada con la emisión de luz por los fluorocromos presentes en la célula o
partícula al ser excitados por el rayo luminoso. Las señales luminosas detectadas se24 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
transforman en impulsos eléctricos que se amplifican y se convierten en señales digitales
que son procesadas por una computadora 42.
4.4.2 Materiales:
1. Human Inflammatory Cytokines Kit (BD Biosciences™ Cytometric Bead Array:
CBA)
2. Citómetro de flujo BD FACS Canto II.
4.5. Procedimientos
4.5.1 Evaluación de los criterios de inclusión y de exclusión
Los pacientes incluidos en el estudio INC-C41030610-410 ―Niveles de procalcitonina y su
relación con la documentación de bacteriemia en pacientes adultos con neoplasias
hematológicas y neutropenia febril de alto riesgo inducida por quimioterapia en el Instituto
Nacional de Cancerología” fueron evaluados por los investigadores y la coordinadora de
investigación del mencionado estudio, quienes revisaron el cumplimiento de los criterios
de inclusión y de exclusión. Éste estudio adicionalmente contó con monitoría por parte
del Instituto Nacional de Cancerología quienes verificaron que éste se desarrollara de
acuerdo a las normas de buenas prácticas clínicas en investigación.
4.5.2 Explicación sobre el estudio y obtención del consentimiento informado por
escrito
Los consentimientos informados del grupo de pacientes incluidos en INC-C41030610-410
―Niveles de procalcitonina y su relación con la documentación de bacteriemia en
pacientes adultos con neoplasias hematológicas y neutropenia febril de alto riesgo
inducida por quimioterapia en el Instituto Nacional de Cancerología” fueron obtenidos por
la coordinadora de investigación del mencionado estudio, explicando a los pacientes
todos los interrogantes respecto al mismo y la posibilidad de ser incluidos en estudios
posteriores. Sólo se tuvieron en cuenta las muestras de aquellos pacientes que firmaron
consentimiento para uso futuro de las muestras de suero que se encontraban en el
congelador Revco® Ultima Plus del Banco Nacional de Tumores Terry Fox del Instituto
Nacional de Cancerología E.S.E.Capítulo 4 25
4.5.3 Identificación y procesamiento de las muestras
Se obtuvieron las muestras congeladas a -70°C de los pacientes del estudio INC-
C41030610-410 ―Niveles de procalcitonina y su relación con la documentación de
bacteriemia en pacientes adultos con neoplasias hematológicas y neutropenia febril de
alto riesgo inducida por quimioterapia en el Instituto Nacional de Cancerología‖ las cuales
se encuentran en el Revco® del Banco Nacional de Tumores Terry Fox del Instituto
Nacional de Cancerología E.S.E.
Al recibirse las muestras se asignó un número consecutivo a cada tubo para su correcta
identificación con el número del episodio de neutropenia acompañado de las iniciales del
paciente y la fracción correspondiente, según fuera tomada al momento de diagnóstico
de la neutropenia, al momento de la fiebre y a las 24 y 48 horas siguientes.
El procesamiento de muestras mediante citometría de flujo incluyó las siguientes fases:
 Preparación: Visualización del experimento en un análisis previo (pre-citometría)
mediante la adecuación de las condiciones de la muestra y del citómetro.
Selección de parámetros a medir y reactivos necesarios. Diseño de Protocolos de
preparación. Selección de fluorocromos.
 Descongelación de los sueros en baño de María a 37o C por 5 minutos.
 Citometría de Flujo: Procesamiento de las muestras en un citómetro de flujo.
Medición de los parámetros seleccionados en la fase de preparación.
Los niveles de citoquinas se obtuvieron de los resultados arrojados por la matriz Software
Matriz FCAP, propiedad de BD TM.
Los niveles séricos normales descritos para las citoquinas a estudiar corresponden a:
- IL 1: (Indetectable a 5 pg/mL)43
- IL 6: (Indetectable a 4.30 pg/mL)44
- IL 10: ( Indetectable a 13.68 pg/mL)44
- IL 8: 12.35 ± 7.0 pg/mL45
- TNF  6.11 ± 3.3 pg/mL45
- IL 12p70 (Subunidad biológicamente activa): Indetectable en sueros de sujetos
sanos 46
En el anexo A se describe el manual de procedimientos implementado en el desarrollo
del trabajo de investigación.26 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
4.5.4 Recolección de datos:
Los datos de las variables establecidas se obtendrán de la base de datos construida para
el proyecto de investigación ―Niveles de procalcitonina y su relación con la
documentación de bacteriemia en pacientes adultos con neoplasias hematológicas y
neutropenia febril de alto riesgo inducida por quimioterapia en el Instituto Nacional de
Cancerología”, el cual fue aprobado y revisado por el Grupo de Monitoría Clínica y la
copia de esta base de datos se encuentra en el computador de la Oficina de Infectología,
en el INC-E.S.E.
4.5.5 Evaluación del estado funcional según la escala de ECOG
El investigador y el auxiliar de investigación, debidamente cualificado(a), evaluó el estado
funcional del sujeto seleccionado para participar en el estudio INC-C41030610-410
mediante la escala de ECOG que se encuentra anotado en la historia de ingreso del
paciente.
4.5.6. Comprobación de la enfermedad neoplásica de base y de la neutropenia
febril
Los investigadores del estudio INC-C41030610-410 ―Niveles de procalcitonina y su
relación con la documentación de bacteriemia en pacientes adultos con neoplasias
hematológicas y neutropenia febril de alto riesgo inducida por quimioterapia en el Instituto
Nacional de Cancerología” con conocimiento acerca de la enfermedad hematológica de
base y de la condición de la neutropenia febril de los pacientes, construyeron la base de
datos a utilizar en el presente estudio. Esta información obtuvo de la historia clínica del
sujeto seleccionado a través del sistema SAP (Software de Sistema, Aplicaciones y
Productos a nivel empresarial utilizado actualmente en el Instituto Nacional de
Cancerología como apoyo en el manejo de la información).
4.5.7 Repaso de los antecedentes
Se tomaron los datos de historia clínica consignados en el sistema SAP (Software de
Sistema, Aplicaciones y Productos a nivel empresarial utilizado actualmente en el
Instituto Nacional de Cancerología como apoyo en el manejo de la información).Capítulo 4 27
4.5.8 Registro de los medicamentos concomitantes
Se revisó en el sistema SAP la formulación de los medicamentos que adicionalmente se
administraron al paciente.
4.5.9. Registro de talla, peso corporal, conteo absoluto de neutrófilos, creatinina,
ECOG.
Estos datos se tomaron del sistema SAP y se registraron en el formulario.
Definiciones:
Para este estudio se usaron las definiciones propuesta por la Sociedad Americana de
Enfermedades Infecciosas, IDSA por sus siglas en inglés47:
Fiebre: Se definió como una medida única oral de temperatura ≥ 38,3 ° C (101 °F) o una
temperatura de ≥ 38,0 ° C (100,4 °F) sostenida durante un periodo de 1 hora. El uso de la
temperatura oral registrada mediante termómetro de mercurio fue la tomada como
referencia de acuerdo a protocolos Institucionales de enfermería para la toma de signos
vitales y el protocolo institucional de neutropenia febril en el Instituto Nacional de
Cancerología. Mediciones de la temperatura rectal (y exámenes rectales) se evitan
durante la neutropenia para prevenir la colonización de organismos intestinales entren en
la mucosa circundante y los tejidos blandos.
Neutropenia: Se definió como un CAN (conteo absoluto de neutrófilos) de <500
células/mm3 o un CAN que se espera que disminuya a <500 células / mm3 durante las
próximas 48 horas.
Neutropenia febril: se definió como aquel paciente con neutropenia que presentó una
temperatura aislada oral mayor o igual a 38,3ºC, o de 38ºC que se mantuvo por lo menos
durante una (1) hora, asociado a neutropenia tal y como fue definida arriba.
Bacteriemia: Aislamiento de bacterias cultivables en el torrente sanguíneo que nunca
son contaminantes entre los cuales se encuentran las enterobacterias, bacterias Gram
negativas no fermentadoras y cocos Gram positivos como S aureus, S pneumoniae, S
pyogenes, S agalactiae y Streptococcus del grupo B y C.28 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapiaCapítulo 4 29
5. Resultados
Se analizaron 44 episodios de neutropenia febril en 35 pacientes de los cuales 65.8 %
correspondieron a mujeres, con una mediana de edad de 36 años. Las características
clínicas de los pacientes se describen en la Tabla 1.
Tabla 1 Características clínicas de los pacientes incluidos en el estudio
Característica n (44 episodios de neutropenia-
35 pacientes)
Edad
Mediana 36
Rango 18-56
Sexo nº (%)
- Masculino 12 (34,2%)
- Femenino 23 (65,8%)
Diagnóstico oncológico nº (%)
- Leucemia mieloide aguda 22 (62,8)
- Leucemia linfoide aguda 12 (34,2)
- Leucemia promielocítica aguda: 1 (2,8)
+G-CSF (%)
- Si 37 (84%)
- No 7 (6%)
Estado de la leucemia nº (%)
- De novo 8 (18,8)
- Recaída 13 (29,5)
- Remisión 17 (38,6)
- Refractaria
6 (13,6)
Ciclo de quimioterapia nº (%)
- Consolidación 17 (38,6)
- Inducción30 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
- Reinducción 8 (18,8)
- Rescate 6 (13,6)
13 (29,5)
Quimioterapia recibida nº (%)
- Hypercvad: 17 (38.6) 17 (38,6)
- Hidac: 10 (2.72) 10 (2,72)
- IDA-Flag: 5 (1.1) 5 (1,1)
- 7x3: 4 (0.9)
4 (0,9)
- 5x3: 3 (0.68)
3 (0,68)
- POMP: 1 (0.22)
1 (0,22)
- PETHEMA: 1 (0.22)
- AME: 1 (0.22) 1 (0,22)
- CALBG: 1 (0.22) 1 (0,22)
- Larson+Dasatinib: 1 (0.22) 1 (0,22)
1 (0,22)
Días de estancia hospitalaria (mediana) 27
Catéter venoso central nº (%) 12 (27,2%)
Estado funcional: ECOG al ingreso (mediana) 1
Días entre la neutropenia y la fiebre (mediana) 3
Duración de la neutropenia en días (mediana) 15
Diabetes nº (%) 1 (0,22)
HTA nº (%) 3 (0,68)
Cirrosis y falla renal nº (%) 0
Egreso nº (%)
Vivo 35 (100)
Fallecido 0
+G-SCF: Factor estimulante de colonias de granulocitos humanosCapítulo 4 31
Se documentaron 13 casos de bacteriemias, representando 25% de positividad de los
hemocultivos. De estos aislamientos, 9 correspondieron a gérmenes gram negativos.
Los aislamientos microbiológicos de los hemocultivos se reportan en la tabla 2.
Tabla 2 Aislamientos microbiológicos en hemocultivos
Categoría nº Gérmenes
Bacteriemias por gérmenes Gram 4 S. saprophyticus – S. aureus
positivos
S. epidermidis - S. aureus
Streptooccus constelatus
Micrococcus luteus
Bacteriemias por gérmenes Gram 9 E. coli
negativos K. pneumoniae
E. coli
E. coli
K. pneumoniae
Moraxella catarrhalis
E. coli , K pneumoniae
E. coli , K. pneumoniae
E. coli, P. aeruginosa
Los niveles de procalcitonina, así como los de algunas citoquinas, específicamente IL 6,
IL 8 e IL 10, mostraron diferencias en su cinética en relación con la presencia o no de
bacteriemia. Los resultados se establecieron mediante medianas y rangos intercuartílicos
calculados para las cuatro muestras, correspondientes al momento de diagnóstico de la
neutropenia, el momento de aparición de la fiebre y las 24 y 48 horas posteriores. IL 1,
IL12p70 y TNF reflejaron niveles séricos indetectables para los estándares de la
prueba, razón por la cual no se presentan sus resultados. Las figuras 1 a 4 esquematizan
los datos mencionados32 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
Figura 1: Cinética de procalcitonina en las muestras estudiadas
Bacteriemia No bacteriemia
4,0000 0,4000
2,0000 0,2000
0,0000 0,0000
1 2 3 4 1 2 3 4
Procalcitonina Procalcitonina
Tabla 3 Niveles séricos de procalcitonina (ng/mL) distribuidos por medianas según la
presencia o no de bacteriemia
Bacteriémicos n=13 Procal-1 Procal-2 Procal-3 Procal-4
Mediana 0,16 1,04 2,87 1,38
RIQ 0,151 12,315 8,92 4,00
IC 85% 0,08 - 1,07 0,10 - 45,29 0,24 - 20,82 0,15 – 10,88
No bacteriémicos n=31 Procal-1 Procal-2 Procal-3 Procal-4
Mediana 0,13 0,18 0,30 0,29
RIQ 0.129 0.334 0.633 0.810
IC 85% 0,051 - 0,308 0,065 - 2,121 0,066 - 3,199 0,066 - 3,155
Figura 2: Cinética de IL6 en las muestras estudiadas
Bacteriemia No bacteriemia
300,0000 100,0000
200,0000
50,0000
100,0000
0,0000 0,0000
1 2 3 4 1 2 3 4
IL6 IL6Capítulo 4 33
Tabla 4 Niveles séricos de IL6 (pg/mL) distribuidos por medianas según la presencia o no
de bacteriemia
Bacteriémicos n=13 IL6-1 IL6-2 IL6-3 IL6-4
Mediana 9,90 245,30 68,66 65
RIQ 22,11 298,51 54,30 98,80
IC 85% 0,06 – 289,46 37,66 - 1694,42 2,69 -138143,57 0,77 – 783,77
No bacteriémicos n=31 IL6-1 IL6-2 IL6-3 IL6-4
Mediana 16,79 91,72 64,11 44,48
RIQ 32,57 154,35 102,97 117,52
IC 85% 0,000 - 149,6 15,3 -543,8 10,7 - 512,3 6,9 - 610,9
Figura 3: Cinética de IL8 en las muestras estudiadas
No bacteriemia
Bacteriemia
300,0000
150,0000
200,0000
100,0000
100,0000
50,0000
0,0000 0,0000
1 2 3 4 1 2 3 4
IL8 IL8
Tabla 5 Niveles séricos de IL8 (pg/mL) distribuidos por medianas según la presencia o no
de bacteriemia
Bacteriémicos n=13 IL8-1 IL8-2 IL8-3 IL8-4
Mediana 31,61 245,12 164,95 124,22
RIC 31,97 295,57 156,24 138,77
IC 85% 11,68 – 328,01 36,18 – 389781,22 17,01-12068,72 7,42 - 801,90
No bacteriémicos n=31 IL8-1 IL8-2 IL8-3 IL8-4
Mediana 30,97 139,71 106,35 104,97
RIC 47,32 164,15 207,06 190,72
IC 85% 7,01 - 364,98 24,22 - 603,49 17,60 - 546,94 13,79 - 556,6334 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
Figura 4 Cinética de IL 10 en las muestras estudiadas
Bacteriemia No bacteriemia
10,0000 3,0000
2,0000
5,0000
1,0000
0,0000 0,0000
1 2 3 4 1 2 3 4
IL10 IL10
Tabla 6 Niveles séricos de IL10 (pg/mL) distribuidos por medianas según la presencia o
no de bacteriemia
Bacteriémicos n=13 IL10-1 IL10-2 IL10-3 IL10-4
Mediana 0,00 8,67 1,16 0,00
RIC 0,09 65,33 9,2 1,72
IC 85% 0,00 - 4,20 0,54 - 648,32 0,00 – 23,09 0,00 – 2,42
No bacteriémicos n=31 IL10-1 IL10-2 IL10-3 IL10-4
Mediana 0,60 2,04 1,40 1,56
RIC 1,88 7,50 3,94 5,0
IC 85% 0,000 - 7,93 0,000 - 21,17 0,000 - 152,64 0,000 - 25,0Capítulo 4 35
6. Discusión
Está bien descrita la relación entre el grado de neutropenia y el riesgo de infecciones
bacterianas y fúngicas en pacientes con neoplasias hematológicas en quimioterapia.
Hace cuatro décadas, Bodey y cols 2 realizan una descripción detallada de las
complicaciones infecciosas en 52 pacientes tratados con citotóxicos para el tratamiento
contra la leucemia aguda. Ellos hicieron la observación que de acuerdo a la disminución
de los granulocitos, la frecuencia, la duración y gravedad de las infecciones aumentaban
dramáticamente. Esto se presentó especialmente cuando el recuento de neutrófilos cayó
por debajo de 500 células / mm3. En la actualidad, se reconoce no sólo el conteo
absoluto de neutrófilos como factor de riesgo de mortalidad sino que ésta también se
relaciona con la enfermedad subyacente y la potencia de la quimioterapia. A pesar del
mayor conocimiento de la patología y de los avances técnico científicos, la morbilidad y
la mortalidad por complicaciones infecciosas después de quimioterapia agresiva y
potencialmente curativa en pacientes con neoplasias hematológicas sigue siendo un
problema clínico, con tasas de mortalidad reportadas en nuestro medio entre 7,2 48 y
11,6% 49. En nuestro estudio en el que se reportaron 11 bacteriemias no se documentó
ninguna muerte al egreso hospitalario.
Documentación de bacteriemia en neutropenia febril
En la mayoría de los episodios de neutropenia febril los agentes infecciosos causales no
pueden ser identificados. Rintala y cols 4 evaluaron las características de 554 episodios
febriles en 126 pacientes con cáncer hematológico durante un período de 6 años. Los
hemocultivos fueron positivos en el 19% de los episodios febriles. Un estudio más
reciente19 evidencia aislamientos microbiológicos en hemocultivos en el 43% de los
episodios de neutropenia febril en 116 pacientes hospitalizados para administración de
quimioterapia aplasiante. Otro estudio retrospectivo20 analizó los resultados de cultivos
obtenidos en 95 pacientes neutropénicos con fiebre, encontrando que un 63% de los
pacientes tenían hemocultivos positivos, con 43% de aislamientos de gérmenes Gram
negativos, 29,8% de Gram positivos, 3,2% fueron polimicrobianos y solo un hemocultivo
documentó hongos. En nuestro estudio se logró una tasa hemocultivos positivos del 25%
similar a lo revisado en la literatura, con mayor frecuencia de aislamientos de gérmenes36 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
Gram negativos (69%) y con la presencia de bacteriemias polimicrobianas en el 38% de
los casos.
Marcadores inflamatorios y documentación de bacteriemia
Recientes estudios en pacientes inmunocomprometidos con neutropenia febril han
demostrado que estos pacientes también son capaces de producir niveles plasmáticos
elevados de citoquinas, así como de procalcitonina y Proteína C Reactiva 27-29. En un
estudio la procalcitonina se analizó de forma temprana después de la aparición de la
fiebre y el inicio del tratamiento antimicrobiano. En 28 casos de neutropenia febril los
autores calcularon la sensibilidad para la detección de bacteriemia o infección clínica a
55 % y la especificidad de 88 % con un nivel del PCT de 0,5 ng / ml 33. Otro estudio
incluyó 33 casos de bacteriemia, donde se observaron los niveles más altos de
procalcitonina durante el primer día, en episodios de bacteriemias por gérmenes Gram
negativos en comparación con los otros cuadros clínicos41. De forma similar, nuestro
estudio mostró que los mayores niveles de PCT se presentaron hacia las 24 horas del
episodio febril (muestra 3) en los episodios de bacteriemia, sin embargo los intervalos de
confianza resultaron muy amplios para definir la significancia estadística de esta
observación.
En cuanto a las citoquinas, el contexto de neutropenia febril post quimioterapia, un
estudio prospectivo, compara diversos métodos (procalcitonina, PCR y citoquinas: IL 6 e
IL 8) 41 mostrando una especificidad de 80% con un valor predictivo negativo de 85% en
los pacientes neutropénicos febriles sin bacteriemia. Encontró que ninguno de los
marcadores analizados fue superior en términos de sensibilidad, especificidad, valor
predictivo positivo y valor predictivo negativo para bacteriemia. Sin embargo, la IL-6 e IL-
8 permitieron una detección más precoz de procesos infecciosos severos (10 horas)
comparadas con procalcitonina y PCR.
Nuestro estudio infortunadamente y por circunstancias ajenas a los investigadores, no
pudo disponer de todas las muestras del proyecto en prensa INC-C41030610-410
―Niveles de procalcitonina y su relación con la documentación de bacteriemia en
pacientes adultos con neoplasias hematológicas y neutropenia febril de alto riesgo
inducida por quimioterapia en el Instituto Nacional de Cancerología” por lo cual los datos
difieren a los presentados en el mencionado estudio y no se logró establecer valores
predictivos para la documentación de bacteriemia con los marcadores medidos, sin
embargo, se pudo perfilar la cinética de los mismos, encontrándose que IL 10 e IL 6
mostraron mayor porcentaje de variación durante el momento de la fiebre (muestra 2)
comparando el grupo de bacteriémicos con el de no bacteriémicos (42 y 37%,Capítulo 4 37
respectivamente), información que nos permitiría establecer una mayor utilidad de estas
dos pruebas en la detección precoz de los episodios febriles de alto riesgo, hallazgo
similar al encontrado en la referencia anteriormente mencionada. Dada el amplio rango
de concentraciones en estas dos citoquinas en particular, un análisis posterior muy
valioso sería el de establecer puntos de corte relacionados con la presencia de
bacteriemia.
Consideraciones técnicas de la prueba
Llamativamente, IL1, IL12p70 y TNFarrojaron niveles por debajo de los estándares de
la prueba (10 a 2500 pg/mL) situación no esperada según los datos reportados por la
literatura y previamente mencionados. Esta situación podría explicarse por la vida media
tan corta de las citoquinas y por factores relacionados a la toma y procesamiento de las
muestras, aspectos críticos en las variaciones inter ensayo. Se recomienda que al
obtenerse las muestras, la sangre entera debe recogerse en tubos estériles con
anticoagulantes, colocarse inmediatamente en hielo y ser centrifugada lo antes posible,
preferiblemente dentro de treinta minutos 36.
Adicionalmente, la hora del día en que se toman las muestras de sangre debe estar
sincronizada, idealmente en la mañana pues se puede atenuar la influencia de los
patrones circadianos. Ciertas citoquinas, en particular los que están afectados por los
glucocorticoides, pueden exhibir variaciones diurnas que son altamente predecibles. El
interferón gamma (IFN-gamma), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa), interleuquina
1 (IL-1) y la IL-12 presentan picos en la mañana y guardan relación inversa con el ritmo
de cortisol plasmático 37.
Plasma o suero deben separarse de las células de forma rápida para evitar la
degradación de las citoquinas. Las muestras deben mantenerse refrigeradas hasta su
procesamiento pues se han encontrado diferencias en mediciones de citoquinas entre las
que se mantienen a temperatura ambiente y -4 ° C. Las muestras pueden permanecer
congeladas a -70° C hasta por dos años, manteniéndose estables los niveles de
citoquinas. Un aspecto fundamental en el éxito del ensayo es evitar ciclos múltiples de
congelación-descongelación36. Durante la ejecución de nuestra prueba se acataron
estrictamente estas recomendaciones, manteniendo cadena de frío durante todo el
proceso, llevando a cabo una descongelación gradual de las muestras y efectuando la
lectura de citometría en un mismo tiempo para los 180 tubos.38 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapiaCapítulo 4 397. Conclusiones
En el contexto de neutropenia febril, el inicio de terapia antibiótica está claramente
indicado aún sin evidencia clínica o microbiológica de un proceso infeccioso y si bien la
medición de marcadores indirectos de infección no influirá en la decisión de iniciar terapia
antibiótica, sí se podrían convertir para el clínico en una herramienta útil para definir el
tiempo de la terapia en situaciones clínicas complejas como es la fiebre de origen
desconocido, con impacto en estancia hospitalaria, resistencia antimicrobiana, calidad de
vida y costos.
Las citoquinas podrían cumplir un papel promisorio en el seguimiento de los pacientes
neutropénicos febriles dada la potencial asociación con presencia de bacteriemia,
desenlace bien conocido como predictor de morbilidad y mortalidad en esta población.
Sin embargo, se requieren más estudios con mayor población para definir una
recomendación clara en las guías de manejo de neutropenia febril post quimioterapia.
Adicionalmente, con este trabajo se logró iniciar un campo de investigación valioso
basado en la técnica de citometría de flujo, con las ventajas que esta representa:
precisión y velocidad de procesamiento de muestras para estudio inmunológico.42 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia en
leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapiaConclusiones 4346 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia
en leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
A. Anexo: Manual de procedimientos
A continuacion se describen las fases del procesamiento de muestras mediante la técnica
de citometría de flujo39:
1. Preparación: Visualizar el experimento en un análisis previo (pre-citometría),
mediante la adecuación de las condiciones de la muestra y del citómetro. Selección de
los parámetros a medir y reactivos necesarios.
a) Adecuación de las condiciones de la muestra: Descongelación de los sueros a
temperatura de 4o C por 24 horas.
b) Adecuación de las condiciones del citómetro: Seleccionar y ajustar el voltaje
hasta que las poblaciones celulares sean visibles en el centro de los histogramas
tipo dot- plots en un análisis por tamaño de partículas FSC (Forward Scatter).
c) Selección de parámetros a medir: Niveles de IL1, 6, 8, 10, 12 y del factor de
necrosis tumoral alfa (TNF en pg/mL, los cuales se medirán mediante el
producto comercial BD Cytometric Bead Array (CBA) Human Inflammatory
Cytokines Kit.
d) Selección de fluorocromos: Isotiocianato de fluorescencia (FITC), Ficoeritrina
(PE) y Aloficocianina (APC).
2. Citometría de Flujo: Realizar la lectura de la muestra y un pre-análisis de su
comportamiento. Procesamiento de las muestras en un citómetro de flujo. Medición de
los parámetros seleccionados en la fase de preparación.
Preparación de los estándares para el kit
Los estándares del kit son sustancias liofilizadas y debieron ser reconstituidas y diluidas
en serie inmediatamente antes de mezclar las perlas de captura y los reactivos de
detección.
1. Colocar todos las esferas liofilizadas en un tubo de polipropileno de 15 ml. Este se
rotula como tubo estándar.
2. Reconstituir los estándares con 4 ml de diluyente.
3. Dejar que el estándar reconstituido se equilibre durante al menos 15 minutos a
temperatura ambiente.Anexo A. Manual de procedimientos 47
4. Mezclar suavemente el estándar reconstituido sólo con una pipeta.
5. Etiquetar ocho tubos de 12 ×75 mm y organizar en el siguiente orden: 1: 2, 1: 4, 1:
8, 1:16 1:32, 1:64, 1: 128, y 1: 256.
6. Pipetear 500 L de diluyente de ensayo en cada uno de los tubos.
7. Llevar a cabo una serie de dilución.
8. Transferir 500 L del tubo estándar al tubo de dilución 1: 2 tubo de dilución y
mezclar cuidadosamente sólo con una pipeta.
9. Continuar haciendo diluciones seriadas transfiriendo 500 L del tubo 1:2 al tubo
1:4 y así hasta la dilución 1:256
10. Preparar un tubo de 12x75 mm que contenga el diluyente para servir como control
negativo.
Se recomienda que los primeros 10 pozos o tubos en el experimento sean los
estándares. Estos deben ser leídos o corridos en orden de menor concentración (0 pg /
mL) a mayor concentración para facilitar el análisis del Software Matriz FCAP.
Mezclar las perlas de captura
1. Determinar el número de proteínas necesarias para el experimento.48 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia
en leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia
2. Agitar los tubos para resuspender las perlas del fondo.
3. Determinar el volumen total de perlas diluídas necesarios para el experimento.
Cada tubo / pocillo requiere 50 L de las perlas diluídas.
4. Determinar el volumen necesario para cada perla. Las perlas son llenadas de
forma que 1.0 L = 1 test, por lo tanto el volumen requerido por las perlas es igual al
número de test.
5. Determine el volumen de diluyente necesario, restando el volumen de cada perla
medida a partir del volumen total de perlas diluídas necesarias para realizar el ensayo.
6. Pipetear los perlas de captura y las de diluyente en un tubo etiquetado "perlas de
captura mixtas."
Procedimiento para la medición de citoquinas
1. Agitar (vortex) las perlas de captura mixtas y añadir 50 L a todos los tubos de
ensayo.
2. Añadir 50 L de las diluciones estándar de citoquinas inflamatorias humanas (kit)
a los tubos de control como muestra la siguiente figura:Anexo A. Manual de procedimientos 49
3. Añadir 50 L de cada muestra desconocida a los tubos etiquetados.
4. Incubar los tubos de ensayo durante 1,5 horas a la temperatura de la habitación,
protegidos de la luz.
5. En este momento se procederá a la configuración del citómetro.
6. Añadir 1 ml de tampón de lavado a cada tubo de ensayo y centrifugar a 200 g
durante 5 minutos.
7. Con cuidado y consistentemente, aspirar y descartar el sobrenadante, dejando
aproximadamente 100 L de líquido en cada tubo de ensayo.
8. Añadir 50 L del reactivo de citoquinas inflamatorias humanas a todos los tubos
de ensayo y agitar suavemente los tubos para resuspender las partículas.
9. Incubar los tubos de ensayo durante 1,5 horas a la temperatura de la habitación,
protegido de la luz.
10. Añadir 1 ml de tampón de lavado a cada tubo de ensayo y centrifugar a 200 g
durante 5 minutos.
11. Con cuidado aspirar y desechar el sobrenadante de cada tubo de ensayo.50 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia
en leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapiaAnexo A. Manual de procedimientos 5154 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia
en leucemias agudas y neutropenia febril post quimioterapia5556 Cuantificación de citoquinas y su relación con la presencia de bacteriemia
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