Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858CT del gen PTPN22 en niños con trombocitopenia inmune primaria
Autor: Castillo Plata, María Angélica
Asesor: Caminos Pinzón, Jorge Eduardo (Thesis advisor)
Fecha: 2014
Programa: Bogotá - Medicina -Fisioterapia
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: La trombocitopenia inmune primaria (PTI) es una enfermedad autoinmune, con múltiples mecanismos fisiopatológicos, curso clínico y respuesta al tratamiento variables. Desde 2004 se ha dado importancia al polimorfismo C1858T del gen PTPN22 como marcador de autoinmunidad. Existen hasta el momento 2 estudios que lo relacionan con PTI. Materiales y Métodos: Se realizó un estudio de casos y controles en el que se evaluó la presencia del polimorfismo C1858T PTPN 22 en población pediátrica con PTI y se comparó con la prevalencia encontrada en un grupo control que incluía niños, adolescentes y adultos jóvenes sanos. Resultados: Se incluyeron 21 pacientes con PTI entre los 2 y los 20 años y 118 controles sanos entre los 11 y los 24 años. La prevalencia del polimorfismo en los pacientes fue del 4.7% y en los controles fue del 4.24%, lo cual evidencia que no hay diferencias en las poblaciones estudiadas. Todos los polimorfismos encontrados fueron de expresión heterocigota. Adicionalmente en 2.5% de los controles se encontró un polimorfismo del mismo gen (C1858G), no descrito previamente en la literatura y con implicación clínica hasta el momento desconocida. Conclusiones: Pese a que no se encontraron diferencias en la prevalencia del polimorfismo objeto de estudio en pacientes con PTI cuando se compararon con un grupo de sujetos sanos, es importante realizar nuevos trabajos similares que incluyan muestras de mayor tamaño con el fin de determinar si en realidad nuestra población no tiene una prevalencia importante de esta variante genética o si por el contrario la prevalencia es mayor pero el actual número de muestra no permitió encontrar diferencias significativas. En cuanto al polimorfismo C1858G encontrado en el grupo de sujetos sanos se realizará una nueva secuenciación confirmatoria y seguimiento longitudinal para evaluar el comportamiento clínico y asociación con algún tipo de patología.

Frecuencia del polimorfismo de nucleótido
único 1858C>T del gen PTPN22 en niños con
trombocitopenia inmune primaria
María Angélica Castillo Plata
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Bogotá. D.C.
2014Frecuencia del polimorfismo de nucleótido
único 1858C>T del gen PTPN22 en niños con
trombocitopenia inmune primaria
María Angélica Castillo Plata
Código: 599520
Residente Oncohematología Pediátrica
Proyecto de investigación realizado como requisito para optar al título de Especialista en
Oncohematología Pediátrica
Tutores:
Eduardo Beltrán Dussán
Especialista En Oncohematología Pediátrica
Profesor asociado Facultad de Medicina, Departamento de Pediatría, División de
Oncohematología Pediátrica de la Universidad Nacional de Colombia
Jorge Eduardo Caminos Pinzón
MSc, PhD. Profesor Asociado, Coordinador División de Bioquímica. Facultad de Medicina
Universidad Nacional de Colombia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Bogotá. D.C.
2014Resumen y Abstract V
Resumen
La trombocitopenia inmune primaria (PTI) es una enfermedad autoinmune, con múltiples
mecanismos fisiopatológicos, curso clínico y respuesta al tratamiento variables. Desde
2004 se ha dado importancia al polimorfismo C1858T del gen PTPN22 como marcador
de autoinmunidad. Existen hasta el momento 2 estudios que lo relacionan con PTI.
Materiales y Métodos: Se realizó un estudio de casos y controles en el que se evaluó la
presencia del polimorfismo C1858T PTPN 22 en población pediátrica con PTI y se
comparó con la prevalencia encontrada en un grupo control que incluía niños,
adolescentes y adultos jóvenes sanos.
Resultados: Se incluyeron 21 pacientes con PTI entre los 2 y los 20 años y 118
controles sanos entre los 11 y los 24 años. La prevalencia del polimorfismo en los
pacientes fue del 4.7% y en los controles fue del 4.24%, lo cual evidencia que no hay
diferencias en las poblaciones estudiadas. Todos los polimorfismos encontrados fueron
de expresión heterocigota. Adicionalmente en 2.5% de los controles se encontró un
polimorfismo del mismo gen (C1858G), no descrito previamente en la literatura y con
implicación clínica hasta el momento desconocida.
Conclusiones: Pese a que no se encontraron diferencias en la prevalencia del
polimorfismo objeto de estudio en pacientes con PTI cuando se compararon con un
grupo de sujetos sanos, es importante realizar nuevos trabajos similares que incluyan
muestras de mayor tamaño con el fin de determinar si en realidad nuestra población no
tiene una prevalencia importante de esta variante genética o si por el contrario la
prevalencia es mayor pero el actual número de muestra no permitió encontrar diferencias
significativas. En cuanto al polimorfismo C1858G encontrado en el grupo de sujetos
sanos se realizará una nueva secuenciación confirmatoria y seguimiento longitudinal
para evaluar el comportamiento clínico y asociación con algún tipo de patología.VI Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en niños
con trombocitopenia inmune primaria
Abstract
The primary immune thrombocytopenia (ITP) is an autoimmune disease with multiple
pathophysiological mechanisms, clinical course and treatment response variables . Since
2004 it has given importance to the single nucleotide polymorphism C1858T of PTPN22
gene as a marker of autoimmunity. There are so far two studies that relate it to ITP.
Materials and Methods:It was performed a case-control study in which the presence of
the C1858T polymorphism PTPN 22 in pediatric patients with ITP was evaluated and
compared with the prevalence found in a control group that included children,
adolescents and young healthy adults.
Results: 21 patients with ITP between 2 and 20 years old were included, and 118 healthy
controls between 11 and 24 years old. The prevalence of the polymorphism in patients
was 4.7 % and in the controls was 4.24 %, which shows that there are no differences in
the populations studied . All polymorphisms found were in heterozygous expression.
Additionally, in 2.5 % of controls was found a polymorphism of the same gene (C1858G),
not previously described in the literature and with clinical implications hitherto unknown.
Conclusions: Although no differences were found in the prevalence of the polymorphism
under study in ITP patients when compared with a group of healthy subjects, it is
important to perform similar studies with larger samples in order to determine whether
actually our population does not have a significant prevalence of this genetic variant or if
instead the prevalence is higher but the current sample number not allowed to find
significant differences. As for the C1858G polymorphism found in the group of healthy
subjects and a new confirmatory sequencing and longitudinal follow-up will be performed
to evaluate the clinical behavior and association with any medical condition.VII Contenido
Contenido
Pág.
Contenido
1. Introducción y Justificación .................................................................................... 1
2. Objetivos ................................................................................................................... 3
2.1Objetivo general ....................................................................................................... 3
2.2 Objetivos específicos .............................................................................................. 3
3. Marco teórico ............................................................................................................ 5
4. Metodología .............................................................................................................. 9
4.1 Diseño del estudio .............................................................................................. 9
4.2 Población ........................................................................................................... 9
4.2.1 Población universo .......................................................................................... 9
4.2.2 Población objetivo ............................................................................................ 9
4.2.3 Control ........................................................................................................... 10
4.3 Cálculo de la muestra ....................................................................................... 10
4.4 Criterios de inclusión ........................................................................................ 10
4.5 Criterios de exclusión ....................................................................................... 11
4.6 Descripción de las intervenciones .................................................................... 11
4.7 Procedimientos ................................................................................................ 12
4.8 Instrumento de recolección (Ver anexo 3): ....................................................... 13
4.9 Plan de análisis ................................................................................................ 14
4.9.1 Operacionalización de las variables ............................................................... 14
4.9.2 Mediciones descriptivas ................................................................................. 20
5. Conducción del estudio ......................................................................................... 21
5.1 Sitios de investigación........................................................................................... 21
5.2 Archivo de datos y sistematización ....................................................................... 21
5.3 Manejo de sustancias o especímenes biológicos .................................................. 21
5.4 Seguridad ............................................................................................................. 22
5.5 Consideraciones éticas ......................................................................................... 22
Consentimiento informado .......................................................................................... 22
6. Cronograma general de actividades ..................................................................... 24
7. Presupuesto ........................................................................................................... 25
8. Resultados .............................................................................................................. 26
8.1 Descripción de los pacientes ................................................................................. 26
8.2 Descripción de los controles ................................................................................. 28VIII Contenido
9. Discusión de resultados .........................................................................................32
10. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................37
Anexos: A. Consentimiento informado .......................................................................39
Anexo B: .........................................................................................................................45
Anexo C. Instrumento de recolección ..........................................................................47
Bibliografía .....................................................................................................................491. Introducción y Justificación
La trombocitopenia inmune primaria es una enfermedad de tipo autoinmune, con
múltiples mecanismos fisiopatológicos que llevan a la producción de trombocitopenia, con
un curso clínico y respuesta al tratamiento muy variables.
El conocimiento de la fisiopatogenia de la enfermedad ha llevado al diseño de estrategias
terapéuticas diversas y específicas que aún no logran una resolución de las
manifestaciones en todos los pacientes, llevando a que un porcentaje de estos llegue a la
cronicidad.
Uno de los más recientes mecanismos involucrados es el polimorfismo de nucleótido
único 1858C>T del gen PTPN 22, reconocido como un locus de autoinmunidad en otras
múltiples entidades y que llevaría a una disregulación en la respuesta de los linfocitos T.
Hasta este momento sólo se han publicado dos estudios que buscan la prevalencia de la
mutación en PTI, encontrando datos estadísticamente significativos. En nuestro país no
hay datos publicados al respecto en esta enfermedad, aunque hay dos estudios
publicados en los que se encontró asociación con artritis reumatoidea, lupus eritematoso
sistémico y diabetes mellitus tipo 1.
Este trabajo nos permitirá conocer estadísticas locales y en caso de encontrar
asociación, aportar evidencia que permita utilizar este conocimiento para aplicarlo al
diseño de nuevas estrategias de tratamiento para esta enfermedad.2. Objetivos
2.1Objetivo general
Determinar la frecuenciadel polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22
en niños con trombocitopenia inmune primaria
2.2 Objetivos específicos
Hacer una descripción de las características demográficas de la población en estudio
Realizar determinación de la presencia de mutación 1858 C>T del gen PTPN22
mediante pruebas moleculares (PCR – RFLP) en niños con trombocitopenia inmune
primaria y en un grupo control.
Evaluar si existen diferencias significativas en la prevalencia de la mutación entre los
pacientes con trombocitopenia inmune aguda, crónica y persistente y en el grupo
control.3. Marco teórico
La trombocitopenia inmune primaria o más ampliamente conocida como púrpura
trombocitopénica inmune (PTI), está definida como un desorden inmunológico adquirido,
caracterizado por trombocitopenia aislada (recuento de plaquetas en sangre periférica
menor a 100 * 109/L) y ausencia de un disparador evidente o causa subyacente que la
explique.1 Existen adicionalmente causas secundarias de trombocitopenia inmune, dentro
de las más frecuentes encontramos enfermedades autoinmunes como el síndrome de
anticuerpos antifosfolípidos y lupus eritematoso sistémico, inmunodeficiencia variable
común, infecciones (citomegalovirus, virus de la inmunodeficiencia humana y hepatitis C,
entre otros), efecto adverso de medicamentos y vacunas, enfermedades
linfoproliferativas y efecto secundario a trasplante de médula ósea.2
Fue descrita por primera vez en el año de 1735 por el médico alemán Paul
GottliebWerlhof, en dos niñas que se presentaron con epistaxis y púrpura. La descripción
de estos casos fue publicada en ―Disquisitio medica et philologica de variolis
etanthracibus‖, recibiendo la denominación de ―Morbushaemorrhagicus maculosus‖.3Fue
hasta el año de 1883 en que se reportó por primera vez que este síndrome clínico estaba
relacionado con trombocitopenia. Después de este hallazgo han surgido múltiples teorías
que intentan explicar el evento fisiopatológico que lleva al descenso en el recuento
plaquetario.
Los datos epidemiológicos de esta entidad han sido obtenidos principalmente de estudios
realizados en Europa. La incidencia reportada es de 4.8 a 5.3 casos por cada 100000
niños menores de 15 años,4 con edad media de presentación de 5.7 años con desviación
estándar de 4.1 años y una mayor frecuencia en el género masculino.4
A diferencia de los adultos en quienes la trombocitopenia inmune primaria tiene un curso
insidioso con tendencia a la cronificación, el curso en niños tiende a ser más benigno con6 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
altos porcentajes de recuperación espontánea. Según la duración de la trombocitopenia,
la enfermedad ha sido dividida de forma arbitraria en: aguda (< 6 meses de duración) y
crónica (> 6 meses de duración), sin embargo, uno de los últimos reportes del
Intercontinental Cooperative ITP StudyGroup5 ha planteado que se debería considerar la
cronicidad con un curso superior a 12 meses, debido a que se encontró que hasta un
25.7% de los niños que aun persistían con trombocitopenia al sexto mes, recuperaban
entre los 6 y 12 meses. De esta manera el Consenso Internacional publicado en el año
de 2010, teniendo en cuenta esta consideración, la clasifica en diagnóstico reciente (< 3
meses), persistente (3-12 meses) y crónica (> 12 meses). 1
Clásicamente se ha considerado que la trombocitopenia en esta entidad es secundaria a
destrucción plaquetaria mediada por anticuerpos, sin embargo, la variabilidad en el curso
clínico y en la respuesta al tratamiento sugieren que existen mecanismos fisiopatológicos
adicionales.
En el año de 1950, dos residentes de hematología del Barnes Hospital en St. Louis,
William J. Harrington y James W. Hollingsworth evidenciaron un neonato hijo de madre
con púrpura trombocitopénica crónica, el cual desarrolló púrpura con resolución
espontánea al cabo de tres semanas.6 Esto los llevó a plantear la existencia de un factor
humoral antiplaquetario cuyo paso transplacentario habría generado la destrucción
plaquetaria transitoria. Para probar esta hipótesis se realizó un experimento en el cual
Harrington recibió 500 cc de sangre de un paciente con púrpura trombocitopénica. Al
cabo de 3 horas presentó trombocitopenia severa y sangrados y adicionalmente fiebre,
escalofríos, confusión y un episodio convulsivo. El conteo plaquetario retornó a valores
normales al quinto día.6, 7, 8 El aspirado de médula ósea obtenido por punción esternal no
mostró cambios visibles en los megacariocitos. Este experimento fue posteriormente
reproducido con todos los miembros de la división de hematología del Barnes Hospital
con resultados similares. 8Estos hallazgos llevaron a encontrar el componente
inmunológico en una entidad que hasta ese momento era catalogada como
idiopática.8Estudios posteriores permitieron determinar que este factor antiplaquetario se
trataba de inmunoglobulina G (IgG)9, 10 dirigida principalmente contra la glicoproteína
IIB/IIIa11, 12 y Ib/IX13, 14y en algunos casos contra múltiples antígenos plaquetarios. La
región Fc de la IgG unida a las plaquetas es reconocida por los receptores Fcγ de los
macrófagos, permitiendo así la fagocitosis de plaquetas y acortamiento de su vida mediaMarco teórico 7
de 10 días a sólo pocas horas. Este proceso ocurre principalmente en el bazo y en el
hígado. La trombocitopenia se produce de forma secundaria al sobrepasarse la
capacidad regenerativa de la médula ósea,8pero también se han descrito experimentos in
vitro que muestran supresión directa de los megacariocitos por estos anticuerpos. 15, 16
Cabe anotar que a pesar de la importancia de este mecanismo en la fisiopatología de la
enfermedad, los anticuerpos antiplaquetarios se detectan el alrededor de 50% de los
pacientes y puede ocurrir remisión de la enfermedad a pesar de que los títulos de
anticuerpos estén aun presentes.6Esasí que se plantean otros posibilidades en la
patogenia. Dentro de estas tenemos el papel de la trombopoyetina (TPO) y de los
linfocitos T.
La TPOes el regulador primario de la producción plaquetaria normal. Cuando se une a
sus receptores en megacariocitos y en precursores de megacariocitos se incrementa el
crecimiento celular, la endomitosis y maduración así como también se disminuye la tasa
de apoptosis. De esta manera se aumenta el número de megacariocitos y la producción
plaquetaria.17Fisiológicamente ocurre, que cuando el conteo plaquetario es bajo, los
niveles de TPO se elevan con el fin de incrementar la producción. 18 Es de esperarse
entonces que en la trombocitopenia inmune primaria se encuentren niveles elevados de
TPO, sin embargo, esto no ocurre así, hay estudios que han demostrado que los valores
de esta proteína permanecen sin cambio, a diferencia, por ejemplo de la anemia
aplásica en la que se ha documentado elevación hasta de 10 veces el valor normal. 18,19,
20El encontrar niveles reducidos de TPO en presencia de conteos plaquetarios bajos
sugiere falla en la trombopoyesis como un mecanismo adicional en la trombocitopenia
inmune primaria.20Estudios de cinética plaquetaria apoyan esta hipótesis, mostrando que
el recambio de plaquetas en la mayoría de pacientes con PTI se encuentra bajo o normal
pero no aumentado.21, 24
En cuanto a los linfocitos T, se han encontrado dos principales acciones en esta entidad,
la primera es la actividad citotóxica directa contra las plaquetas y los megacariocitos 22 y
la segunda, la regulación de la producción deautoanticuerpos producidos por las células
B23.
Estudios recientes han demostrado que la tirosín fosfatasa linfoide (LYP), una enzima
intracelular de 807 aminoácidos, codificada por el gen PTPN22 localizado en el8 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
cromosoma 1p13.3–13.1y que pertenece a la familia de tirosín fosfatasas, tendría un
papel importante en las enfermedades autoinmunes al estar involucrada en la supresión
de la activación espontánea de las células T y en el mantenimiento del fenotipo de
reposo de los linfocitos.25
La activación de los linfocitos T requiere estimulación del complejo receptor de célula T
(TCR/CD3) mediante presentación antigénica, en combinación con coestimulación de
CD28 por ligandos que son también expresados en las células presentadoras de
antígeno. 26La regulación de este proceso de activación involucra una serie de
interacciones entre tirosín kinasas y tirosín fosfatasas las cuales generan cascadas de
señalización citoplasmática que permiten la modificación de diversas funciones celulares.
26 básicamente las tirosín kinasas se encargan de la amplificación de señales, mientras
que las tirosín fosfatasas gobiernan el modo y tiempo de duración. 27 Estos procesos
deben ser controlados de forma muy estrecha, principalmente en el contexto de la
respuesta inmune, en el que las células son activadas bajo circunstancias apropiadas
para contrarrestar el efecto de un proceso infeccioso o tumoral evitando respuestas
autodirigidas que culminen en una enfermedad autoinmune.28 De los 107 genes que
codifican para tirosín fosfatasas los linfocitos T expresan al menos 45, algunas de las
cuales producen efectos activadores y otras efectos inhibitorios. Dentro de este último
grupo encontramos la LYP. Lo que se conoce acerca de esta última enzima es
extrapolado de experimentos en ratones con su enzima homóloga PEP, la cual es una
potente inhibidora de la señalización de los TCR y de la actividad de las tirosín kinasas
LCK, FYN, ZAP70 y CSK. 28El polimorfismo1858 C>T en LYP, que modifica el sitio de
unión a CSK, ha sido reportado como un locus de susceptibilidad que se asocia con
múltiples enfermedades autoinmunes, como diabetes tipo 1,29, 30artritis reumatoidea, 31, 32,
33lupus eritematoso sistémico34 y enfermedad de Graves 35 entre otras.
Considerando a la trombocitopenia inmune primaria como una enfermedad de tipo
autoinmune, se han publicado recientemente dos trabajos en los que se busca la
frecuencia del polimorfismo mencionado en pacientes con esta enfermedad,
comparándolos con grupos controles sin trombocitopenia, encontrando diferencias
estadísticamente significativas entre ambos grupos. 25, 36 Este hallazgo es de marcada
importancia para el manejo de la PTI ya que encontrar otro de los mecanismos
fisiopatológicos involucrados lleva a proponer nuevas terapéuticas para esta enfermedad.4. Metodología
4.1 Diseño del estudio
Estudio de casos y controles, en el que se evaluó la frecuencia del polimorfismo de
nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en niños con trombocitopenia inmune
primaria, tomando como base a los pacientes diagnosticados como PTI aguda,
persistente y crónica en la Fundación Hospital de la Misericordia desde el año 2005 y que
estén en seguimiento por la consulta externa de Oncohematología pediátrica o que
asistan al servicio de urgencias de esta institución y se comparó con la frecuencia de
dicha mutación en una población de sujetos sanos (niños, adolescentes y adultos
jóvenes)
Se planteó una duración promedio de 8 meses desde la aprobación del estudio hasta el
análisis de los resultados.
4.2 Población
4.2.1 Población universo
Menores de 18 años con diagnóstico de trombocitopenia inmune primaria aguda,
persistente y crónica.
4.2.2 Población objetivo
Niños del universo, diagnosticados con trombocitopenia inmune primaria aguda en la
Fundación Hospital de la Misericordia desde el 01/01/05 hasta el 30/11/2013 y aquellos
con diagnóstico de PTI crónica que se encontraban en seguimiento por la consulta
externa durante este mismo período de tiempo.10 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
4.2.3 Control
Niños, adolescentes o adultos jóvenes sin antecedentes personales o familiares de
enfermedades hematológicas y sin trombocitopenia documentada por hemograma. Se
seleccionaron por conveniencia, los estudiantes de primer y segundo semestre de
medicina de la Universidad Nacional de Colombia.
4.3 Cálculo de la muestra
El cálculo de la muestra se realizó basado en estudio descriptivo realizado de forma
exclusiva para pacientes de pediatría en el Cairo (The role of PTPN22 gene
polymorphism in childhoodimmunethrombocytopenic purpura Shahira K. Anisa, Eman A.
AbdelGhanyb, Naglaa O. Mostafac and Aliaa A. Alib). En el cual se encontró una
prevalencia del 26% del polimorfismo 1858C>T para el gen PTPN 22 en los pacientes
con PTI frente a una prevalencia del 6% para los pacientes sin PTI. Este Cálculo se
realizó con una potencia estadística del 80% y un nivel de confianza del 95% para
disminuir los errores tipo 1 y 2 y los resultados fueron:
• 52 Pacientes con PTI aguda
• 52 Pacientes con PTI crónica
Posterior a esto se aplicó la corrección de Yates debido a que se trata de una variable
continua y el resultado fue:
• 62 Pacientes con PTI aguda
• 62 Pacientes con PTI crónica.
Por conveniencia se definió tomar igual número de controles sanos.
4.4 Criterios de inclusión
Historia clínica y examen físico sugestivos de trombocitopenia inmune primaria según
lo descrito en el Consenso Internacional1, ya sea como antecedente o que cursen con
la enfermedad en el momento de la toma de la muestra.
No compromiso de otra línea celularMetodología 11
Morfología de médula ósea compatible con el diagnóstico de trombocitopenia inmune
primaria
4.5 Criterios de exclusión
Uso de medicamentos relacionados con trombocitopenia y/o alteración de la función
plaquetaria
Infección concurrente
Diagnóstico de otra enfermedad autoinmune
Neoplasia concomitante
4.6 Descripción de las intervenciones
Se solicitó autorización a la gerencia científica de la Fundación Hospital de la
Misericordia para acceder a la información de las historias clínicas de la institución. Se
incluyeron pacientes con diagnóstico de PTI en los períodos planteados, que ingresaron
a la institución por el servicio de urgencias o que estaban en seguimiento en la consulta
externa y que cumplieron con los criterios de inclusión. Se solicitó el consentimiento
informado (Ver anexo 1) a los padres o cuidadores y el asentimiento a los niños, según
su capacidad de decisión, basado en la clasificación de Simpson. 37, 38 (Ver anexo 2).
La muestra se tomó de la siguiente manera:
*Niños con PTI: se realizó toma de muestra, en tubo tapa lila con EDTA, de forma
simultánea con la punción venosa para los exámenes de rutina solicitados en el servicio
de urgencias o cuando asistieron a seguimiento en la consulta externa de
Oncohematología pediátrica
*Sujetos sanos, grupo control: Se hizo una charla explicando los objetivos y metodología
del estudio a los estudiantes de primer y segundo semestre de medicina de la
Universidad Nacional de Colombia. Aquellos que aceptaron participar, se citaron a
diferentes jornadas de toma de muestras dentro de las instalaciones de la facultad de
medicina de la universidad. A aquellos menores de edad se les solicitó consentimiento
informado de sus padres o cuidadores.12 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
Todas las muestras fueron recogidas inmediatamente y trasladadas hacia el laboratorio
de biología molecular de la Universidad Nacional de Colombia.A los controles se les
realizó adicionalmente un hemograma el cual fue procesado en el laboratorio Anamed,
sede La Castellana ubicado en la Cra. 48 No. 95-67.
Se obtuvo el DNA genómico de la sangre anticoagulada mediante la técnica de salting-
out estándar. Posteriormente se realizóla técnica de PCR-restriction fragment length
polymorphism (RFLP). Las condiciones para la realización de la PCR incluyeron 50 ng de
DNA genómico, 20 pmol/ml of cada primer y Taq PCR Master Mix (Fermentas Life
Sciences, número de catálogo K0171; Glen Burnie, Maryland, USA), en un volumen total
de 25μl. Las muestras fueron inicialmente desnaturalizadas a 94°C por 2 minutos,
posteriormente sometidas a 35 ciclos de 30 segundos a 94°C, 30 segundos a 60°C, 30
segundos a 72°C y finalmente 2 minutos a 72°C. Los productos amplificados se digirieron
usando RsaI (Fermentas Life Sciences, número de catálogo ER1121) por reacción,
durante toda la noche a 37°C. Los fragmentos digeridos fueron separados en gel de
agarosa al 2% y las bandas se visualizaron en tinción de bromuro de etidio bajo luz UV.
Dichas muestras se enviaron vía correo a la ciudad de Seoul, Korea, en donde la
compañía Macrogen realizó la secuenciación del fragmento de DNA en donde se
encontraba el polimorfismo. Los resultados fueron recibidos a través de correo
electrónico.
4.7 Procedimientos
El proyecto se desarrolló en las siguientes fases:
Consentimiento: Se solicitó inicialmente a todas las instituciones el aval para la
realización de la investigación, a través del apoyo y soporte del departamento de
pediatría de la Universidad Nacional de Colombia.
Solitud de Base de datos: Se solicitóen el servicio de patología de la Fundación
Hospital de la Misericordia la base de datos de los pacientes a quienes se les hubiera
realizado biopsia de médula ósea por diagnóstico de PTI desde el año de 2005.
Evaluación de las historias. Se realizó un estudio de los criterios de inclusión de cada
uno de los pacientes a través de la revisión de los datos contenidos en las historias
clínicas.Metodología 13
Contacto: se contactaron de forma telefónica a los padres de los pacientes incluidos
en la base de datos y que cumplían con los criterios de inclusión. A aquellos que
aceptaron participar se les brindaron dos opciones para la toma de la muestra, asistir
al servicio de consulta externa de Oncohematología pediátrica del Hospital de la
Misericordia, en donde la jefe de enfermería de quimioterapia realizaba la
venopunción o se concertó una fecha en la que acudió una auxiliar de enfermería
hasta su hogar para tomar la muestra. Durante estos momentos se obtuvo el
consentimiento informado y se diligenció el instrumento de recolección de datos.
También se incluyeron pacientes internados por este diagnóstico, previa explicación del
estudio a sus padres o acudientes y firma del consentimiento informado. En estos casos
la muestra se tomó junto con los hemogramas de rutina ordenados por el servicio tratante
para evitar venopunciones adicionales.
De forma simultánea se realizaron visitas a la Universidad Nacional para recolectar los
controles. Se programaron jornadas de recolección para toma de muestras.
Toma de muestras: Se tomaron mediante punción venosa y se trasladaron
inmediatamente por servicio de mensajería especializada hacia el laboratorio de
biología molecular de la Universidad Nacional de Colombia. Adicionalmente la muestra
obtenida de los controles se envió al laboratorio Anamed para procesamiento de
hemograma. Estas muestras fueron manejadas con todos los protocolos de
bioseguridad correspondientes.
Elaboración de base de datos
Análisis y discusión de los resultados
4.8 Instrumento de recolección (Ver anexo 3):
Este instrumento contiene los siguientes aspectos:
1. Características Demográficas
2. Características Clínicas14 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
4.9 Plan de análisis
4.9.1 Operacionalización de las variables
N Objetivo Nombre de la Descripción de la Nivel de Medición
Especifico Variable Variable
1 Realizar una Historia clínica Número de Cuantitativa
descripción de identificación del discreta
las paciente, asignado
características por la institución
demográficas tratante
y clínicas de
la población en
estudio
2 Realizar una Fecha de Fecha en que nació el Cuantitativa
descripción de nacimiento paciente
las (dd/mm/aaa), tomada
características del registro civil o de
demográficas su documento de
y clínicas de identidad
la población en
estudio
3 Realizar una Género Genero fenotípico de Cualitativa,
descripción de nacimiento dicotómica,
las nominal
características
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio
4 Realizar una Residencia Municipio en donde Cualitativa,
descripción de vive el paciente nominal
las
características
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio
5 Realizar una Procedencia Municipio de remisión Cualitativa,
descripción de nominal
las
características
demográficas
y clínicas de
la población en
estudioMetodología 15
6 Realizar una Teléfono Número de teléfono Cuantitativa,
descripción de fijo o celular en donde discreta
las ubique al paciente o
características sus acudientes
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio
7 Realizar una Dirección Dirección del sitio de Cuantitativa,
descripción de resi-dencia discreta
las
características
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio
8 Realizar una Estrato Clasificación de los Cualitativa, ordinal
descripción de socioeconómico inmuebles realizada
las por el DANE
características 0=Estrato 0 (Inferior),
demográficas 1= Estrato 1 (Muy
y clínicas de Bajo)
la población en 2=Estrato 2 (Bajo)
estudio 3=Estrato 3 (Medio-
Bajo)
4=Estrato 4 (Medio)
5=Estrato 5 (Medio-
alto)
6=Estrato 6 (Alto)
9 Realizar una Régimen Régimen de Cualitativa,
descripción de seguridad social seguridad social al nominal
las que pertenece el
características paciente
demográficas 0= Contributivo
y clínicas de 1= Subsidiado
la población en 2=Especial
estudio 3=Excepción
4=No afiliado
10 Realizar una Nombre de la Nombre de la EPS-C, Cualitativa,
descripción de aseguradora EPS-S, régimen nominal
las especial o excepción
características al que pertenece.
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio16 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
11 Realizar una Escolaridad Nombre del último Cualitativa, ordinal
descripción de ciclo escolar
las aprobado
características 0= Ninguno
demográficas 1= Primaria
y clínicas de 2=Secundaria
la población en 3=Universitario
estudio
12 Realizar una Manifestaciones Síntomas y signos Cualitativa,
descripción de clínicas que llevaron a nominal
las consultar.
características Se evaluarán signos
demográficas específicos de PTI y
y clínicas de algunos que permitan
la población en descartar otras
estudio enfermedades.
Petequias, equimosis,
epistaxis,
gingivorragia,
sangrado SNC,
Sangrado
gastrointestinal,
artritis/artralgias,
fiebre, caída de
cabello, úlceras
orales, rash con
exposición al sol,
otros
13 Realizar una Fecha de Día en que se realizó Cuantitativa,
descripción de diagnóstico el diagnóstico de discreta
las trombocitopenia
características inmune primaria
demográficas (dd/mm/aaaa)
y clínicas de
la población en
estudio
14 Realizar una Clasificación PTI Clasificación según la Cualitativa,
descripción de duración de la nominal
las trombocitopenia en
características Diagnóstico reciente:
demográficas menor de 3 meses
y clínicas de Persistente: >3-<12
la población en meses
estudio Crónica > 12 mesesMetodología 17
15 Realizar una Hemograma al Resultado del primer Cuantitativas
descripción de diagnóstico cuadro hemático (continuas y
las realizado al paciente discretas)
características en la Fundación
demográficas Hospital de la
y clínicas de Misericordia
la población en Se registrarán los
estudio valores de leucocitos,
diferencial en
porcentaje, Hb (g/dl),
Hto (%) y recuento
plaquetario
16 Realizar una Mielograma Lectura de Cualitativa,
descripción de mielograma realizada nominal
las por laboratorio de
características hematología especial
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio
17 Realizar una Uso de Medicamentos Cualitativa,
descripción de medicamentos utilizados en los 3 nominal
las previos meses previos al
características diagnóstico, de forma
demográficas permanente u
y clínicas de ocasional
la población en
estudio
18 Realizar una Antecedentes Enfermedades de los Cualitativa,
descripción de patológicos pacientes que hayan nominal
las requerido intervención
características o valoración médica
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio
19 Realizar una Antecedentes Datos conocidos de Cualitativa,
descripción de familiares de enfermedades nominal
las enfermedades hemorrágicas, tanto
características hemorrágicas de la hemostasia
demográficas congénitas primaria o secundaria,
y clínicas de congénitas, en
la población en familiares de primer y
estudio segundo grado18 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
20 Realizar una Hemoclasificació Tipificación de grupo Cualitativa,
descripción de n ABO y sistema Rh nominal
las
características
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio
21 Realizar una Coombs directo Resultado de la Cualitativa,
descripción de prueba de coombs dicotómica,
las directo nominal
características
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio
22 Realizar una Necesidad de Describir si el Cualitativa,
descripción de tratamiento paciente requirió o no dicotómica,
las farmacológico de alguna nominal
características intervención
demográficas farmacológica
y clínicas de
la población en
estudio
23 Realizar una Qué tipo de Medicamento Cualitativa,
descripción de tratamiento recibido, dosis, nominal
las farmacológico frecuencia y duración
características recibió
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio
24 Evaluar si Presencia del Definir si el paciente Cualitativa,
existen Polimorfismo presentó o no el nominal
diferencias 1858C>T del gen polimorfismo
significativas PTPN22 1858C>T en el
en la estudio de Biologia
prevalencia de Molecular
la mutación
entre los
pacientes con
trombocitopeni
a inmune
aguda y
crónicaMetodología 19
25 Evaluar si Cigocidad Determinar la Cualitativa,
existen cigocidad del alelo. nominal
diferencias Homocigoto o
significativas en heterocigoto
la prevalencia
de la mutación
entre los
pacientes con
trombocitopenia
inmune aguda y
crónica
26 Realizar una Días de estancia Total de días que Cuantitativa,
descripción de hospitalaria duró la primera discreta
las hospitalización del
características paciente, en la que se
demográficas hizo el dx de PTI
y clínicas de
la población en
estudio
27 Realizar una Total de Total de ingresos Cuantitativa,
descripción de hospitalizaciones hospitalarios por PTI discreta
las por PTI
características
demográficas
y clínicas de
la población en
estudio
28 Realizar una Hemograma al Último hemograma Cuantitativas
descripción de egreso realizado durante la (continuas y
las primera discretas)
características hospitalización y con
demográficas el que se consideró
y clínicas de dar de alta al paciente
la población en Se registrarán los
estudio valores de leucocitos,
diferencial en
porcentaje, Hb (g/dl),
Hto (%) y recuento
plaquetario
29 Realizar una Último Hemograma más Cuantitativas
descripción de hemograma reciente dentro del (continuas y
las realizado seguimiento del discretas)
características paciente
demográficas Se registrarán los
y clínicas de valores de leucocitos,
la población en diferencial en
estudio porcentaje, Hb (g/dl),
Hto (%) y recuento
plaquetario20 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
4.9.2 Mediciones descriptivas
Se realizó un análisis descriptivo de los pacientes con PTI aguda, persistente y
crónica y de los controles que fueron o no positivos para el polimorfismo. Para las
variables cualitativas dicotómicas o politómicas, se prefirió la presentación de los
datos en forma de tablas, en las que se especificó la frecuencia absoluta y relativa;
con los datos considerados como más relevantes, se realizaron gráficas en barras
para su mejor visualización.
Las variables cuantitativas, de razón e intervalo, se analizaron mediante la medición
de la frecuencia absoluta, relativa y frecuencias acumuladas. Se calcularon las
medidas de tendencia central y medidas de dispersión, y los valores respectivos de
cada variable se expresaron mediante tablas.5. Conducción del estudio
5.1 Sitios de investigación
Fundación Hospital de la Misericordia, ubicada en la Avenida Caracas No 1 – 13
Bogotá D.C.
Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Nacional de Colombia,
ubicado en Carrera 45 No 26 – 85, Facultad de Medicina, piso 3, Bogotá DC.
Laboratorio Anamed, Sede La Castellana, ubicado en la Cra. 48 No. 95-67,
Bogotá DC.
Compañía MacrogenKorea, # 60-24, Gasan-dong Geumchen-gu, Seoul, Korea.
5.2 Archivo de datos y sistematización
Todos los datos fueron recolectados a través del instrumento diseñado para tal fin
(Ver anexo 3), y fueron digitados por duplicado en el programa Excel 2007. Se
codificaron todos los datos en la hoja maestra según lo establecido en la tabla de
operacionalización de las variables, y se eliminaron los datos de nombre e
identificación de los pacientes. Los datos fueron procesados mediante los programas
estadísticos Epidat 4.0 y STATA 12.0
5.3 Manejo de sustancias o especímenes biológicos
Se siguió el protocolo de manejo de desperdicios y sustancias biológicas y no
biológicas según el Programa de Gestión Integral de Residuos Sólidos (PGIRS) de
cada institución.22 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
5.4 Seguridad
Se garantizó, a través de la ejecución de los procedimientos por personal calificado y
entrenado, contando con personal idóneo para la toma de las muestras y personal de
laboratorio entrenado en el procesamiento de las mismas.
5.5 Consideraciones éticas
El presente estudio se basó en la recolección de muestras biológicas y la revisión de
fuentes secundarias.
De acuerdo a la normatividad internacional, particularmente la declaración de Helsinki
y a las pautas éticas para la investigación biomédica preparadas por el Consejo de
Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas –CIOMS-, se estableció un
riesgo mínimo y se declara que se realizó con adherencia a los tres principios éticos
básicos: respeto por las personas, beneficencia y justicia.
El riesgo ético de esta propuesta de investigación según la resolución 8430 del 4 de
Octubre de 1993 del Ministerio de Salud, artículo 11, literal A, se correspondió con
una investigación con riesgo mínimo,
Se estableció también la seguridad que de que no se identificará al sujeto y que se
mantuvo la confidencialidad de la información relacionada con su privacidad según el
artículo 15, literal H.
Esta propuesta de investigación fue evaluada, antes de su ejecución, por el comité de
ética médica de la Fundación Hospital de la Misericordia.
Consentimiento informado
(Ver anexo 1)
Este documento fue elaborado por el investigador principal y revisado por el comité
de ética en investigación de la Fundación Hospital de la Misericordia.
Debido que los pacientes tenían una clasificación de Simpson de ―no compresión del
lenguaje y no capacidad de decisión‖, se realizó una discusión amplia con los padresConducción del estudio 23
para su autorización y estos tuvieron la autoridad en la decisión completa para el
ejercicio basados en la razón riesgo beneficio, y adicionalmente tuvieron la potestad,
junto con el equipo de investigación, de retirar al niño si esta razón es desfavorable.
El consentimiento informado fue firmado por los padres o representantes legales de
los sujetos que aceptaron participar en el estudio, previa explicación detallada de
todos los procedimientos a realizar.6. Cronograma general de actividades
OCT- MAY- JUN/13 AGO- OCT- DIC/13
NOV/1 OCT/13 OCT/13 NOV/1
2 3
Elaboración *
protocolo
Evaluación *
protocolo por
DIB y comité
ética UNAL y
Hx Misericordia
Solicitud base *
de datos
Visita Colegio y *
Facultad
Medicina
Recolección *
pacientes y
muestras
Análisis de *
datos
Entrega de *
resultados7. Presupuesto
ITEM VALOR
Personal Unidad Tiempo Total
(meses) (pesos)
Auxiliar enfermería toma de 200000/mes 1 200000
muestras
Bacterióloga 2000000/mes 2 4000000
Asesor epidemiológico 1300000/mes 1 1300000
Hora: 100000
Transporte muestras 100000
Subtotal 1 5600000
ITEM VALOR
Materiales e insumos Unidad Tiempo Total
(meses) (pesos)
Papelería 400000
Primers 38000
Kit PCR – procesamiento muestras 4378000 4378000
Hemogramas 8000 c/u 1128000
Secuenciación Macrogen 1800000
Refrigerios controles 400000
Insumos toma muestras 300000
Subtotal 2 8444000
SUBTOTAL VALOR (pesos)
Subtotal 1 5.600.000
Subtotal 2 8.444.000
TOTAL 14.044.0008. Resultados
En total se incluyeron 21 pacientes con PTI y 118 controles sanos.
8.1 Descripción de los pacientes
El 57.14% de los pacientes reclutados fue de género masculino (Tabla 1). La media de
edad fue de 9,8 años y la mediana de 8 años.Teniendo en cuenta el tamaño de muestra
se observó un valor de varianza elevado, lo cual probablemente se explica porque el
rango de edad, al momento de la toma de la muestra estuvo entre los 2 y los 20 años
(Tabla 2).
Tabla 1: Distribución por géneros en los pacientes con PTI
Gènero Frecuencia Porcentaje Porcentaje
Acumulado
Masculino 12 57,14 57,14
Femenino 9 42,86 100,00
TOTAL 21 100,00
Tabla 2: Descripción variable edad en pacientes con PTI
Descripción Variable Edad
N 21
Media 9,81
Mediana 8
Desviación 5,887
típica
Varianza 34,662
Mínimo 2
Máximo 20Resultados
Conducción del estudio 27
La mayoría de mujeres estaba concentrada en el estrato 3 (58%), los hombres estaban
distribuidos en su mayoría en estrato 2 (41%) y 3 (41%) (Figura 1).La mayor proporción
de los casos evaluados procedían de Bogotá, sin embargo, como era esperable por
tratarse de un centro de referencia, también se encontraron casos provenientes de otros
municipios como Yopal, Espinal o Villavicencio (Tabla 3).
Figura 1: Estrato socieconómico y género en pacientes con PTI
Tabla 3: Procedencia pacientes con PTI
Procedencia Frecuen Porcentaj Porcentaje
cia e Acumulado
Bogotá 16 76,19 76,19
Espinal, Tolima 1 4,76 80,95
Villavicencio, Meta 1 4,76 85,71
Purificación, Tolima 1 4,76 90,48
Soacha 1 4,76 95,24
Yopal, Casanare 1 4,76 100,00
Total 21 100,0028 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
El 38% de los pacientes tenía grado de escolaridad de jardín, de ahí en adelante, la
distribución fue similar, con el 19.05% para pacientes que cursaban primaria, secundaria
o estudio superiores (Tabla 4).
Según la clasificación actual de duración de la enfermedad, se encontró que 13 niños
(62%) cursaron con PTI aguda, 4 niños (19%) con PTI persistente y 4 niños (19%) con
PTI crónica. De los 4 pacientes identificados con PTI crónica, 3 (75%) eran de género
masculino.
En cuanto a la presencia del polimorfismo C1858T en el gen PTPN22, ésta se encontró
sólo en uno de los pacientes incluidos, el cual cursó con PTI aguda, ya resuelta al
momento de la evaluación. Esto correspondió a una prevalencia del 7.69% en el grupo
de PTI aguda y a 4.7% en el grupo de pacientes con PTI.
Dicho polimorfismo fue de expresión heterocigota (genotipo CCG/CCA).
Tabla 4: Escolaridad en pacientes con PTI
Género/ Ningun Jardín Primaria Secundaria Técnico o Total
Escolaridad a profesiona
l
Masculino 1 5 2 2 2 12
8,33 41,67 16,67 16,67 16,67 100,00
100,00 62,50 50,00 50,00 50,00 57,14
Femenino 0 3 2 2 2 9
0,00 33,33 22,22 22,22 22,22 100,00
0,00 37,50 50,00 50,00 50,00 42,86
Total 1 8 4 4 4 21
4,76 38,10 19,05 19,05 19,05 100,00
100,00 100,00 100,00 100,00 100,00 100,00
8.2 Descripción de los controles
La media de edad fue de 17 años, el 50% de los pacientes evaluados era menor de 17
años y el 50% restante era mayor de 17 años. Teniendo en cuenta que el tamaño de
muestra fue superior al de los pacientes se observó un valor de varianza menor, con
menor dispersión desde el punto de vista de la edad. Esta población seleccionada estaba
concentrada en las edades de 11 a 24 años (Tabla 5).RCeosnudltuacdcoiósn del estudio 29
Tabla 5: Distribución edad en grupo control
Descripción Población según Edad
n 118
Media 17,203
Mediana 17
Desviación típica 1,771
Varianza 3,138
Mínimo 11
Máximo 24
El 60,17% de los sujetos sanos era de género masculino, concentrados en igualdad y
mayoría en estratos 2 y 3, mientras que las mujeres (39.83%) se encontraron en mayor
proporción en el estrato 4 (Figura 2).
Figura 2: Estrato socieconómico y género en controles30 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
En cuanto a la escolaridad, el 96.6% de los pacientes se encontraba matriculado en una
carrera técnica o universitaria (Tabla 6)
Tabla 6: Escolaridad en el grupo control
Escolaridad Frecuencia Porcentaje Porcentaje
Acumulado
Jardín 1 0,85 0,85
Primaria 2 1,69 2,54
Secundaria 1 0,85 3,39
Técnico o 114 96,61 100,00
Universitario
TOTAL 118 100,00
Respecto al polimorfismo objeto del estudio, se encontró que 5 personas de esta
población (4,24%) tenían positividad para la misma, todas con expresión heterocigota,
con un genotipo CCG/CCA. Dentro de este subgrupo de pacientes, 4 (80%) eran de
género masculino y 1 (20%) de género femenino (Tabla 7), todos tenían hemograma
normal y todos tenían edad superior a 15 años.
Adicionalmente se encontró que 3 de los sujetos del grupo control tenían un polimorfismo
de expresión también heterocigota, diferente al del estudio, el cual consistía en el
reemplazo en uno de los alelos de una citocina por una guanina lo que generaba que en
la secuencia de aminoácidos ocurriera cambio del aminoácido arginina por prolina. El
100% de los pacientes con este polimorfismo pertenecían al género femenino, sin
hallazgos en su historia clínica de antecedentes patológicos ni familiares de importancia y
con hemograma completamente normal.Resultados
Conducción del estudio 31
Tabla 7: Polimorfismos en grupo control. CCG=secuencia normal,
CCG/CCA=polimorfismo heterocigoto PTPN22 (cambio citocina por timina),
CCG/CCC=polimorfismo heterocigoto PTPN22 (cambio citocina por guanina)
Género/Polimorfi CCG CCG/CCA CCG/CCC Total
smo
Masculino 67 4 0 71
94,37 5,63 0,00 100,00
Femenino 43 1 3 47
91,49 2,13 6,38 100,00
TOTAL 110 5 3 118
93,22 4,24 2,54 100,00
Teniendo en cuenta lo que evidenciaron los grupos, se calculó el ODDS Ratio tomando
como evento la PTI y como exposición de riesgo la presencia del polimorfismo objeto del
estudio:
OR= 1.13
95% IC= 0.1253-10.1890
Z= 0.109
p= 0,9133
Esto significa que las personas que presentan la mutación tienen 1.13 más posibilidades
de desarrollar PTI; sin embargo al observar el valor de p y el IC, estos indican que este
resultado no es estadísticamente significativo.9. Discusión de resultados
Debido a múltiples limitaciones en los aspectos logístico, económico y de tiempo, no fue
posible recolectar el número de pacientes calculado inicialmente, razón por la cual se
considera éste como un informe preliminar y se deberá continuar con el estudio para
lograr dar respuesta a los objetivos planteados y obtener resultados con suficiente poder
desde el punto de vista epidemiológico.
Con respecto a las características de la población estudiada, hay similitud con las
reportadas en estudios poblacionales europeos4, con ligero predominio del género
masculino y porcentaje de cronicidad del 20%. En cuanto a la edad de diagnóstico se
encuentran diferencias ya que la media y mediana reportadas son superiores a las de la
población europea. No hay datos epidemiológicos en población colombiana con los
cuales se pueda realizar comparación.
Desde el año 2004 han venido en desarrollo múltiples estudios que han intentado
demostrar asociación entre el polimorfismo C1858T del gen de la tirosín fosfatasa no-
receptor tipo 22 (PTPN22). Existe evidencia fuerte a favor de su relación en
enfermedades como artritis reumatoidea, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de
Graves, enfermedad de Addison, vasculitis ANCA (+), artritis idiopática juvenil y
miastenia gravis39.
La creciente importancia de este polimorfismo se ha centrado en la posibilidad de
convertirse en blanco terapéutico para el manejo de estas enfermedades40.
En relación con trombocitopenia inmune primaria hasta el momento han sido publicados
3 estudios al respecto y sólo uno de ellos exclusivamente en población infantil.DCisocnudsuiócnc idóen rdeesl ueltsatuddoiso 33
El primero de estos, publicado en el año 2010, se desarrolló en Michigan e incluyó 45
pacientes adultos con PTI y como control histórico una población de 926 sujetos sanos
de New York. Se encontró el polimorfismo en 12 de los 45 pacientes, 10 de ellos
heterocigotos y 2 homocigotos para un porcentaje total de 27%, mientras que la
positividad en población sana fue de 16.7% con p= 0.08 36.
El segundo fue realizado exclusivamente en población pediátrica de El Cairo. Se
compararon 24 pacientes con PTI aguda y 26 con PTI crónica con un grupo de 50 niños
control, pareados por género y edad. Se encontró positividad en 26% de los pacientes y
en 6% de los controles con una p=0.006. Adicionalmente describen que no se
encontraron diferencias en la prevalencia del polimorfismo en PTI aguda y crónica
(p>0,05)25.
El tercer estudio fue desarrollado en población china y publicado en el año 2013. Incluyó
191 casos de PTI entre los 0,2 y 77.9 años y 216 controles sanos pareados por grupo
étnico41. En este estudio pese a que se evaluó también un polimorfismo del PTPN22, no
fue el C1858T, sino el G1123C que se había encontrado positivo en pacientes con
diabetes mellitus tipo 1 y artritis reumatoidea. El motivo de esta selección es porque
previamente se había demostrado que el alelo 1858T está virtualmente ausente en
asiáticos y africanos42. Los resultados de este trabajo muestran una prevalencia del
polimorfismo en 36.4% de los pacientes y en 29.4% de los controles con una p=0.034.
Cuando se realiza el análisis estratificado por grupos etáreos se encuentra que en los
adultos con PTI se mantienen estos hallazgos mientras que no es así en la población
infantil estudiada.
Los resultados reportados en el presente estudio mostraron la presencia del polimorfismo
C1858T del gen PTPN22 en sólo uno de los 21 pacientes lo que equivale a una
prevalencia del 4.7% y que es inferior a lo que se ha reportado previamente en la
literatura en los dos trabajos relacionados que han sido publicados.
En cuanto a los hallazgos en el grupo control, se encontró una prevalencia del 4.2%,
similar a la que se informa en el estudio de Anisa SK25, realizado exclusivamente en
población pediátrica egipcia, pero inferior al que se reporta en el estudio estadounidense
en el cual es del 16% y que se realizó solamente con adultos.34 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
Los resultados de este estudio mostraron que no existe asociación entre la presencia del
polimorfismo C1858T del gen PTPN22 con el desarrollo de trombocitopenia inmune
primaria, ya que la proporción encontrada fue similar tanto en el grupo de pacientes como
en el grupo control. Estos hallazgos llevan a reflexionar sobre dos aspectos importantes,
el primero es considerar que la población estudiada tiene una prevalencia mayor de la
mutación, similar a la reportada en otros estudios descritos, pero que el tamaño de
muestra pequeño y con poco poder no permite encontrar estas diferencias sutiles.
El segundo es que, teniendo en cuenta que ya ha sido reportado que existen
discrepancias y heterogeneidad en la expresión de algunos alelos relacionados con
autoinmunidad en diferentes etnias, debido a la segregación y al gradiente geográfico42,
43, se podría concluir que la población que se estudió podría tener también ausencia o
muy baja prevalencia de algunos de estos alelos.
Debido a que esta proteína mutada se ha considerado como un posible blanco
farmacológico, es muy importante determinar en realidad cual es el comportamiento del
polimorfismo en estudio en cada etnia y/o población, ya que por las diferencias
anteriormente mencionadas no se deberían extrapolar los resultados en estudios que se
hayan realizado con etnias diferentes; para esto se deberá plantear la realización de
otros trabajos del mismo diseño con muestras de mayor tamaño lo cual permitirá
encontrar asociación entre estos cambios genéticos y la presencia de autoinmunidad,
pero además se considera importante plantear a futuro el seguimiento longitudinal de los
controles sanos con polimorfismos, para evaluar si desarrollan o no enfermedades
autoinmunes y establecer de esta forma relación causal con evidencia de mayor peso
epidemiológico.
Como hallazgo incidental se encontró también la presencia del polimorfismo C1858G del
gen PTPN22 en tres de los 118 sujetos sanos incluidos. Se realizó una búsqueda en
diferentes bases de datos para verificar la significancia clínica de este hallazgo sin que se
encontrara literatura publicada al respecto. Teniendo en cuenta que el cambio que
generaría este polimorfismo en la secuencia de aminoácidos es el de una arginina por
una prolina, aminoácidos con características bioquímicas diferentes, se pude pensar que
esta alteración derivaría probablemente en alteración en el marco de lectura que podría
reflejarse en disminución o ausencia de la actividad enzimática. Es de resaltar que losDiscusión de resultados
Conducción del estudio 35
individuos en los que se encontró este polimorfismo son hasta el momento sanos, sin
historia personal o familiar de importancia. Adicionalmente, la presencia de alteraciones
genéticas no es suficiente en muchos casos para desarrollar enfermedad, ya que se
requiere también de la interacción de un sinnúmero de factores dentro de los que
destacan los ambientales y epigenéticos.
Se plantea realizar una segunda secuenciación del material genético de estos sujetos
con el fin de verificar que se trate realmente de una variante y acto seguido hacer
seguimiento clínico en el tiempo.10. Conclusiones y recomendaciones
Las características demográficas de los pacientes con PTI incluidos en este estudio
son similares a las reportadas en estudios poblacionales europeos, excepto por la
edad, la cual es ligeramente mayor respecto a la previamente reportada.
No se encontró asociación entre la presencia del polimorfismo C1858T del gen
PTPN22 y la trombocitopenia inmune primaria
Existe la posibilidad que nuestra población, tenga ausencia o bajas prevalencias de
algunos polimorfismos relacionado principalmente con heterogeneidad y segregación
étnica.
Es importante caracterizar los polimorfismos presentes en cada población con el fin
de definir si existe o no susceptibilidad a recibir manejo farmacológico cuyo blanco
son las enzimas o proteínas producto de estas variantes genéticas.
Se debe completar lo planteado en la metodología para logar responder a los
objetivos propuestos.
Se considera que se debería realizar seguimiento longitudinal a largo plazo de los
controles en los que se encontró el polimorfismo de significado indeterminado.
Se deben plantear nuevos estudios con número mayor de muestra con el fin de
verificar si existe o no asociación entre el polimorfismo C1858T del gen PTPN22 y la
trombocitopenia inmune primaria en población infantil colombiana.Anexos: A. Consentimiento informado
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PEDIATRÍA
DIVISIÓN ONCOHEMATOLOGÍA PEDIÁTRICA
Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
1. Introducción y propósito del estudio
La Universidad Nacional de Colombia, dentro del programa de Especialidad de
Oncohematología Pediátrica, está haciendo un estudio en el que se busca la frecuencia
del polimorfismo 1858C>T del gen PTPN22 en niños que tengan el diagnóstico de
púrpura trombocitopénica inmunológica primaria (PTI).
Este hallazgo ha sido encontrado en algunos estudios realizados en otros países, pero
hasta ahora no hay ningún estudio realizado en Colombia. Si se logra comprobar que
esta mutación está involucrada en el desarrollo de la enfermedad, se podrán diseñar
nuevos tratamientos que sean efectivos para el manejo de los pacientes afectados.
2. Porqué ha sido seleccionado
Existen dos razones para ingresar al estudio:
Una de ellas es que a su hijo(a) se le realizó el diagnóstico de púrpura
trombocitopénica inmunológica en la Fundación Hospital de la Misericordia.
La otra razón es que su hijo(a) es un niño sano (sin PTI) y vamos a tomar una
muestra para hacer comparación con los niños que tienen la enfermedad.40 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
3. Procedimientos del estudio
Si decide participar debe hacer lo siguiente:
- Proporcionar información acerca de su dirección y teléfono, esto con el fin de
contactarlos para el seguimiento
- Permitir la realización de una punción venosa. En esta muestra de sangre se realizará
el análisis de la mutación previamente mencionada. En lo posible se tratará de que
esta muestra se tome junto con los exámenes de rutina que se realizan a su hijo (a),
con el fin de evitarle riesgos adicionales por el procedimiento.
- Asistir a todos los controles planteados y seguir tratamiento según lo indicado por su
médico tratante.
- Informar acerca de sus inquietudes y en caso tal, expresar el deseo de abandonar el
estudio
4. Confidencialidad
La información que suministre, incluyendo los datos sobre su localización y de su
enfermedad es confidencial y solo será conocida por su médico tratante y los
investigadores.
Los resultados del estudio se presentarán en forma general y en ningún caso ni usted ni
su hijo(a) podrán ser identificados.
5. Riesgos y beneficios
Los riesgos derivados de su participación en este estudio son mínimos y están asociados
a la punción venosa que se realizará para obtener la muestra. Estos son básicamente
sangrado, dolor o infección local.
El realizar este estudio traerá beneficio a todos los pacientes que tengan diagnóstico de
púrpura trombocitopénica inmune, ya que la información aportada podrá ser tomada
como base para el diseño de nuevos tratamientos que puedan curar a estos pacientes.
Adicionalmente, desde su casa tiene acceso telefónico para consultas respecto a
posibles complicaciones o inquietudes.
6. Costos y compensación
Usted no recibirá pago por su participación en el estudio, ni este tampoco implica costos
adicionales para su atención médica.Anexos 41
7. Derecho a rehusar o abandonar el estudio
Usted debe estar saber que su participación en este estudio es completamente
voluntaria. Aun después de dar su aceptación para participar, tendrá derecho a retirarse
del estudio o a negarse a contestar alguna de las preguntas en el momento en que usted
así lo desee. El hecho de retirarse no implicará cambios en la atención ni en el
tratamiento recibidos.
8. Preguntas
Por favor siéntase en libertad de hace cualquier pregunta si hay algo que no haya
entendido. También si más adelante le surge alguna duda o inquietud, usted puede
contactar a: Dra. María Angélica Castillo Plata en el Departamento de Pediatría de la
Fundación Hospital de la Misericordia (4° piso) o en el teléfono 3005296852
9. Resultados:
Se aclara que al finalizar el estudio le haremos entrega y le explicaremos los resultados
del análisis genético.
Con los resultados obtenidos de todos los niños que participen en este estudio se
redactará un artículo el cual será publicado en una revista científica.
10. Declaración del participante
Nosotros le entregaremos una copia de este formulario. Al firmar esta forma usted está
aceptando que entiende la información que se le ha dado, que está de acuerdo en
participar como sujeto de investigación en este estudio, y que está de acuerdo en:
o Proporcionar su dirección y teléfono
o Permitir toma de muestra mediante punción venosa para verificar la presencia de la
mutación en el gen PTPN22
o Asistir a las consultas de control y seguir el manejo propuesto por su médico tratante
¿Acepta participar en este estudio voluntariamente? Si_____ NO____42 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
Si usted ha aceptado participar por favor escriba su nombre completo y firme en el
espacio correspondiente:
Nombre del participante_____________________________
Firma del participante: ______________________________Fecha____/___/____
Dd mm aa
Nombre del testigo 1_________________________________
Firma del testigo 1 __________________________________Fecha____/___/____
dd mm aa
Nombre del testigo 2_________________________________
Firma del testigo 2 __________________________________Fecha____/___/____
dd mm aa
11. Asentimiento del paciente (Diligenciar en los casos en que se requiera, según las reglas
para la toma de decisiones con respecto a la participación de niños en la investigación)
Certifico que he sido informado/a acerca de los objetivos y procedimientos de esta
investigación. Con mi firma, declaro que estoy de acuerdo en participar en el estudio para
la mutación 1858C>T del gen PTPN22 en una muestra de sangre tomada de mis venas,
aun cuando, en algunas ocasiones, la toma del examen no coincida con los otros
exámenes que me realizarán en el tratamiento de la enfermedad y que para ello deba ser
puncionado nuevamente.
Firma del paciente __________________________________Fecha____/___/____
dd mm aa
12. Declaración del investigador
Certifico que yo o algún miembro de mi grupo de investigación le ha explicado a la
persona cuyo nombre aparece registrado en este formulario, sobre esta investigación y
que esta persona entiende la naturaleza y el propósito del estudio así como los posibles
riesgos y beneficios asociados con la participación en el mismo. Todas las preguntas que
esta persona ha hecho, han sido contestadas.Anexos 43
Nombre de quien diligencia el consentimiento (investigador/encuestador):
___________________________________________________________
Firma: __________________________________________ Fecha____/___/____
dd mm aa
___________________________________________________________
Firma: __________________________________________ Fecha____/___/____
dd mm aaAnexo B:
Reglas para la toma de decisiones con respecto a la participación de niños en la
investigación 37,38
Categoría del Papel del Papel de los Papel del Papel del niño
niño comité de ética padres/cuidadores investigador
*No (1)Proteger (1)Ejercen autoridad (1)Asegurar (1)No
comprensión intereses de los de decisión completa información autoridad de
del lenguaje niños basándose en completa a los decisión
*no capacidad aprobando riesgo/beneficio padres (2)Puede
de decisión investigación (2)Estar (2)Retirar al protestar pero
que cumpla presentes/disponibles niño si el esto no lo
condiciones durante la riesgo/beneficio excluirá del
pre- investigación no es favorable estudio
especificadas (3)Retirar al niño del (3)Anular
(2)Información estudio si el riesgo decisión de los
completa a los supera al beneficio padres (ej:
padres y su retirar al niño
autorización del estudio
cuando
aumenten
riesgos)
*Alguna (1) y (2) (1), (2) y (3) (1), (2) y (3) (1) y (2)
comprensión (3)La (4)Compartir (4)Asegurar (3)Papel
del lenguaje información información con el información limitado en la
*Capacidad relevante se niño acerca de la relevante al toma de
limitada para debe explicar al participación y niño acerca de decisión
tomar niño responder preguntas su participación (4)Puede
decisiones (4)Requiere (5)Prestar atención a y resolver realizar
discusión y la protesta del niño preguntas preguntas
autorización (5)Prestar
documentada atención a la
de padres y protesta del
niño niño
*Buena (1), (2), (3) y (2), (3) y (4) (1), (2), (3) y (4) (5)Tiene mayor
comprensión (4) (6)Se requiere el (6)Asegurar papel en la
del lenguaje (5)Defender acuerdo de los que el niño toma de
*Capacidad de que la protesta padres en todos los tenga la decisión
decisión en del niño pueda casos. En algunos oportunidad de (6)Se requiere
desarrollo ser autorizada casos la protesta del expresarse el acuerdo
en algunos niño puede ser (7)Asegurar para participar,46 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
casos autorizada que los padres pero no es
(7)Dar al niño la tengan en suficiente
oportunidad de cuenta los (7)La protesta
expresar sus deseos deseos del niño puede excluirlo
y tenerlos en cuenta del estudio,
en la evaluación del excepto
riesgo/beneficio cuando los
(8)Autoridad limitada padres
consideren
que los
beneficios
superan los
riesgos
*Buena (6)Reconocer (8) (8)Asegurar (8)suficiente
comprensión la capacidad (9)El acuerdo información autoridad para
del lenguaje del niño para la parental es necesario completa al decidir
*Capacidad de toma de en algunas niño sobre su (9)Se requiere
decisión decisiones participaciones participación el
sustancial (7)Aprobar (requerimiento legal, (9)Determinar consentimiento
*Maduro pero investigaciones participación que si el para participar
no que cumplan acarrea consentimiento y algunas
independiente condiciones consecuencias a los del niño es veces es
pre- padres, riesgo mayor suficiente o si suficiente (el
especificadas al mínimo) pero no es se requiere el acuerdo de los
(8)Asegurar suficiente acuerdo de los padres se
información padres requerirá en
completa al (10)Asegurar algunos casos)
niño y cuando información (10)Se
sea necesario, relevante a los respetará su
a sus padres padres cuando decisión de no
(9)Documentar estén participar
consentimiento involucrados
del niño y legítimamente
cuando sea en la decisión
necesario, (11)Discutir con
acuerdo de los el niños el retiro
padres del estudio
cuando los
riesgos
superen
beneficios
* Buena (10)Similar a (10)No autoridad (12)Aplicar (11)Capacidad
comprensión investigaciones para la toma de obligaciones de decisión
del lenguaje realizadas en decisiones del investigador completa
*Capacidad de adultos cuando (12)No está
decisión involucra obligado a
sustancial adultos compartir
*Maduro e competentes información
independiente con sus padresAnexo C. Instrumento de recolección
FRECUENCIA DEL POLIMORFISMO DE NUCLEÓTIDO ÚNICO 1858C>T DEL GEN
PTPN22 EN NIÑOS CON TROMBOCITOPENIA INMUNE PRIMARIA
Instrumento de recolección de datos
DATOS DEMOGRÁFICOS
1HISTORIA CLINICA____________
2FECHA NACIMIENTO __/__/_____ (dd/mm/aaaa)
3GÉNERO: masculino ( ) femenino ( )
4RESIDENCIA _________________
5 PROCEDENCIA _______________
6TELEFONO __________________
7DIRECCION __________________
8ESTRATO SOCIOECONÓMICO: 0 ____ 1____ 2____ 3____ 4____ 5____ 6____
9RÉGIMEN DE SEGURIDAD SOCIAL:
Contributivo____ subsidiado____ especial ____ excepción ____ no afiliado____
10NOMBRE DE LA ASEGURADORA: _____________________
11ESCOLARIDAD: ninguno ____ preescolar ____ primaria ____ secundaria ____48 Frecuencia del polimorfismo de nucleótido único 1858C>T del gen PTPN22 en
niños con trombocitopenia inmune primaria
DATOS CLÍNICOS
12 MANIFESTACIONES CLÍNICAS
Petequias____ equimosis____ epistaxis____ gingivorragia____ sangrado SNC____
Sangrado gastrointestinal ____ artritis/artralgias____ fiebre____ caída de cabello ____
úlceras orales ____ rash con exposición al sol ____ otros____
especifique_________________________
13 FECHA DIAGNÓSTICO __/__/____ (dd/mm/aaaa)
14 CLASIFICACIÓN PTI: Dx reciente ____ persistente ____ crónica ____ sano____
15 HEMOGRAMA DEL DX: LEU ________ S% ____ L%____ M%____
HB____ HTO%____ PLAQUETAS____
16 MIELOGRAMA _________________
17 USO MEDICAMENTOS PREVIOS: Si ____ No___ cúales?___________________
18 ANTECEDENTES PATOLÓGICOS
_____________________________________________________________________
19 ANTECEDENTES FAMILIARES DE ENFERMEDADES HEMORRÁGICAS? Si ___
No____ Cuáles?________________________________________________________
20 HEMOCLASIFICACIÓN_______
21 COOMBS DIRECTO _________
22 REQUIRIÓ TRATAMIENTO FARMACOLÓGICO? Si____ No____
23 SI REQUIRIÓ TRATAMIENTO ESPECIFIQUE CUAL
Esteroide ____ Dosis___________________________________________________
IVIG ________ Dosis___________________________________________________
Ig anti D _____ Dosis___________________________________________________
Otros ________ Especifique nombre y dosis_________________________________
24 PRESENCIA DEL SNP 1858 C>T DEL GEN PTPN 22? Si _____ No_____
25 CIGOCIDAD: Homocigoto _____ heterocigoto _____
26 DÍAS ESTANCIA HOSPITALARIA ______
27 TOTAL HOSPITALIZACIONES POR PTI ______
28 HEMOGRAMA AL EGRESO: LEU ________ S% ____ L%____ M%____
HB____ HTO%____ PLAQUETAS____
29 ULTIMO HEMOGRAMA: LEU ________ S% ____ L%____ M%____
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