Estandarización de un diseño de microarreglos de tejido para la detección inmunohistoquímica de proteínas fusión del gen NTRK en una serie de tumores sólidos
Autor: Londoño Rojas, Erika Alessandra
Asesor: Ricaurte Guerrero, Orlando
Fecha: 2021-10-11
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Patología Anatómica y Clínica
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Los genes NTRK participan en la expresión de receptores tirosina kinasa, los cuales participan en la diferenciación, desarrollo y regulación del sistema nervioso. Las fusiones en estos genes constituyen el principal mecanismo de activación oncogénica y se encuentran en frecuencias variables en diversos tumores tanto en población pediátrica como en adultos. Su detección es relevante ya que actualmente existe terapia dirigida con inhibidores selectivos de receptores TRK con respuesta favorable. Existen múltiples formas de identificar estas fusiones, cada una con ventajas y limitaciones, entre ellas la inmunohistoquímica como herramienta de tamizaje. Este trabajo tiene como propósito la realización y estandarización de una técnica de inmunohistoquímica a través de microarreglos de tejido, con el fin de detectar proteínas que pudieran indicar posibles fusiones de los genes NTRK. Se evaluó el marcador VENTANA pan-TRK (EPR17341) en 93 casos que incluyen gliomas, carcinomas tiroideos, adenocarcinomas de colon y pulmón, carcinoma escamocelular, melanomas y carcinoma secretor de mama, distribuidos en 14 microarreglos. El control positivo sugerido, apéndice cecal, se expresó en todos los microarreglos sumado al control interno del tejido nervioso en los tumores gliales. Su interpretación fue sencilla, exceptuando en los tumores de sistema nervioso, sin presentar discordancias. La expresión fue la esperada según lo reportado en la literatura mundial. La inmunohistoquímica realizada en microarreglos de tejido constituye una técnica útil y costo efectiva que permite evaluar múltiples muestras simultáneamente, racionalizando los recursos y permitiendo la selección de aquellos pacientes que requieren una prueba molecular confirmatoria para que obtengan un tratamiento adecuado. (Texto tomado de la fuente).

ESTANDARIZACIÓN DE UN DISEÑO
DE MICROARREGLOS DE TEJIDO
PARA LA DETECCIÓN
INMUNOHISTOQUÍMICA DE
PROTEÍNAS FUSIÓN DEL GEN NTRK
EN UNA SERIE DE TUMORES
SÓLIDOS
Erika Alessandra Londoño Rojas
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Patología
Bogotá D.C, Colombia
2021ESTANDARIZACIÓN DE UN DISEÑO
DE MICROARREGLOS DE TEJIDO
PARA LA DETECCIÓN
INMUNOHISTOQUÍMICA DE
PROTEÍNAS FUSIÓN DEL GEN NTRK
EN UNA SERIE DE TUMORES
SÓLIDOS
Erika Alessandra Londoño Rojas
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Especialista en Patología Anatómica y Clínica
Director:
Doctor Orlando Ricaurte Guerrero
Codirectora:
Doctora Natalia Olaya Morales
Línea de Investigación:
Tumores Sólidos
Grupo de Investigación:
Anatomopatología
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Patología
Bogotá D.C, Colombia
2021A mi familia, las amoDeclaración de obra original
Yo declaro lo siguiente:
He leído el Acuerdo 035 de 2003 del Consejo Académico de la Universidad Nacional.
«Reglamento sobre propiedad intelectual» y la Normatividad Nacional relacionada al
respeto de los derechos de autor. Esta disertación representa mi trabajo original, excepto
donde he reconocido las ideas, las palabras, o materiales de otros autores.
Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación, he
realizado su respectivo reconocimiento aplicando correctamente los esquemas de citas y
referencias bibliográficas en el estilo requerido.
He obtenido el permiso del autor o editor para incluir cualquier material con derechos de
autor (por ejemplo, tablas, figuras, instrumentos de encuesta o grandes porciones de
texto).
Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica, definida
por la universidad.
________________________________
Nombre: Erika Alessandra Londoño Rojas
Fecha: 04/10/2021Agradecimientos
A los doctores Orlando Ricaurte y Natalia Olaya, mis tutores, por su comprensión,
paciencia y dedicación en la realización y desarrollo de este trabajo.
A la doctora Lina Jaramillo por guiarme, acompañarme y aconsejarme a lo largo de este
camino, mi gratitud por siempre.
A mis profesores y compañeros del programa de patología por su apoyo constante,
brindándome las herramientas necesarias para ser una mejor profesional y persona.
A los doctores Yeimy Viviana Ariza y Fabio Aristizabal del grupo de Farmacogenética del
Cáncer del Departamento de Farmacia, por haberme brindado la oportunidad de participar
en este proyecto.
A los laboratorios de Patología de la Fundación Hospital de la Misericordia (HOMI) y el
Hospital Universitario Nacional de Colombia (HUN) por permitirme el acceso al material de
histopatología.
A mi familia, mi apoyo en todo momento. A mi madre quien a pesar de las adversidades
me motivó para nunca rendirme, siempre juntas.
A Paula y Edna, más que mis compañeras de residencia, mis amigas para siempre.
A Hans quien me acompañó en una parte del camino, apoyándome y animándome en los
momentos mas difíciles, en mi corazón por siempre.Resumen y Abstract IX
Resumen
Estandarización de un diseño de microarreglos de tejido para la detección
inmunohistoquímica de proteínas fusión del gen NTRK en una serie de tumores
sólidos
Los genes NTRK participan en la expresión de receptores tirosina kinasa, los cuales
participan en la diferenciación, desarrollo y regulación del sistema nervioso. Las fusiones
en estos genes constituyen el principal mecanismo de activación oncogénica y se
encuentran en frecuencias variables en diversos tumores tanto en población pediátrica
como en adultos. Su detección es relevante ya que actualmente existe terapia dirigida con
inhibidores selectivos de receptores TRK con respuesta favorable. Existen múltiples
formas de identificar estas fusiones, cada una con ventajas y limitaciones, entre ellas la
inmunohistoquímica como herramienta de tamizaje. Este trabajo tiene como propósito la
realización y estandarización de una técnica de inmunohistoquímica a través de
microarreglos de tejido, con el fin de detectar proteínas que pudieran indicar posibles
fusiones de los genes NTRK. Se evaluó el marcador VENTANA pan-TRK (EPR17341) en
93 casos que incluyen gliomas, carcinomas tiroideos, adenocarcinomas de colon y
pulmón, carcinoma escamocelular, melanomas y carcinoma secretor de mama,
distribuidos en 14 microarreglos. El control positivo sugerido, apéndice cecal, se expresó
en todos los microarreglos sumado al control interno del tejido nervioso en los tumores
gliales. Su interpretación fue sencilla, exceptuando en los tumores de sistema nervioso,
sin presentar discordancias. La expresión fue la esperada según lo reportado en la
literatura mundial.
La inmunohistoquímica realizada en microarreglos de tejido constituye una técnica útil y
costo efectiva que permite evaluar múltiples muestras simultáneamente, racionalizandoContenido X
los recursos y permitiendo la selección de aquellos pacientes que requieren una prueba
molecular confirmatoria para que obtengan un tratamiento adecuado.
Palabras clave: Receptor NTRK1, Receptor NTRK2, Receptor NTRK3, Fusión Génica,
Inmunohistoquímica, Análisis de Matrices Tisulares.Contenido XI
Abstract
Standardization of a tissue microarray design for immunohistochemical detection
of NTRK gene fusion proteins in a solid tumors series
NTRK genes code for three transmembrane tyrosine-kinase receptors, which are involved
in nervous system differentiation, development and regulation. NTRK fusions constitute the
main mechanism of oncogenic activation and are found in variable frequencies in both
pediatric and adult cancer types. Detection of NTRK fusions is relevant given the existence
of targeted therapy with TRK inhibitors with positive outcomes. There are different testing
methods used to identify these molecular alterations, including immunohistochemistry
approach as a screening tool followed by molecular testing to confirm fusion partners.This
project has the intended outcome of standarization of an immunohistochemical assay
through the construction of manual tissue microarrays in order to detect proteins that could
indicate possible NTRK fusions. VENTANA pan-TRK (EPR17341) assay was evaluated in
93 cases including gliomas, thyroid carcinomas, colon and lung adenocarcinomas,
squamous cell carcinoma, melanomas and secretory breast carcinoma. These cases were
distributed in 14 microarrays. The suggested control in appendix, was positive in all tissue
microarrays along with the normal nervous tissue used as internal control in glial tumors.
The interpretation was simple, except in tumors of the nervous system. There were not
significant discrepancies following the established positive criteria. The expression was the
expected as what global sources reported.
Immunohistochemistry performed on tissue microarrays is a useful and cost-effective
technique that allows multiple samples to be evaluated simultaneously, it´s a good way forContenido XII
optimize resources and allowing the selection of those patients who will require a
confirmatory molecular test in order to obtain the most accurate treatment.
Keywords: NTRK 1 Receptor, NTRK 2 Receptor, NTRK 3 Receptor, Gene fusion,
Immunohistochemistry, Tissue Array Analysis.XIII
Contenido
Resumen ........................................................................................................................... IX
Lista de figuras .............................................................................................................. XV
Lista de tablas ............................................................................................................... XVI
Lista de Símbolos y abreviaturas .................................................................................... 1
1. Introducción ............................................................................................................... 3
2. Justificación ............................................................................................................... 5
3. Planteamiento del problema ..................................................................................... 7
4. Objetivo General ........................................................................................................ 8
5. Objetivos específicos ................................................................................................ 8
6. Marco Teórico ............................................................................................................ 9
6.1. Generalidades .......................................................................................................... 9
6.2 Tumores asociados a fusiones ntrk y frecuencia de presentación ............................ 9
6.3 Aspectos moleculares ............................................................................................. 11
6.3.1 Estructura de los receptores Trk y vías de señalización involucradas ................. 11
6.3.2 Alteraciones moleculares del gen NTRK ............................................................. 13
6.4 Métodos de detección de las fusiones ntrk ............................................................. 15
§ Secuenciación de nueva generación (NGS) ................................................... 15
§ Hibridación fluorescente in situ (FISH) ........................................................... 16
§ Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) .. 16
§ Inmunohistoquímica ........................................................................................ 17
6.5 Algoritmos diagnósticos para detectar fusiones ntrk ............................................... 20
6.6 Microarreglos de tejido como herramienta para el estudio inmunohistoquímico .... 21
7. Materiales y métodos .............................................................................................. 24
7.1 Tipo de estudio: ....................................................................................................... 24
7.2 Población: ................................................................................................................ 24
7.3 Selección de tamaño y muestra: ............................................................................. 24
7.4 Criterios de inclusión: .............................................................................................. 25
7.5 Criterios de exclusión: ............................................................................................. 25
7.6 Recolección de la información: ............................................................................... 25
7.7 Evaluación de la fusión NTRK ................................................................................. 26
7.7.1 Elaboración de microarreglos de tejido en bloques de agarosa-parafina ......... 26
7.7.2 Preparación y análisis de los bloques donantes ............................................... 26
7.7.3 Preparación del bloque receptor con matriz de agarosa-parafina .................... 26Contenido XIV
7.7.4 Realización de IHQ para detección de fusión NTRK ........................................ 29
7.7.5 Lectura de la IHQ .............................................................................................. 30
7.8 Análisis de los datos ............................................................................................ 31
8. Resultados ............................................................................................................... 33
9. Discusión .................................................................................................................. 41
10. Conclusiones y recomendaciones ......................................................................... 45
13. Presupuesto ............................................................................................................. 52
14. Anexo 1: Variables clínico demográficas e histopatológicas ............................. 54
Anexo: Variables epidemiológicas de los pacientes ..................................................... 56
Anexo: Organización de los microarreglos de tejidos ................................................... 61
Anexo: Cartas de aceptación comité de ética ............................................................... 66XV
Lista de figuras
Pág.
Ilustración 1. Frecuencia y distribución de fusiones NTRK en tumores pediátricos y del
adulto ................................................................................................................................ 10
Ilustración 2. Estructura proteínas Trk y vías de señalización involucradas en su función
.......................................................................................................................................... 12
Ilustración 3. Ejemplo de control positivo marcador pan-TRK .......................................... 18
Ilustración 4. Ejemplos de patrones de tinción en la Fusión NTRK .................................. 19
Ilustración 5. Ejemplo de algoritmo diagnóstico para la detección de fusiones NTRK
según el tipo tumoral y la frecuencia ................................................................................ 21
Ilustración 6. . Ejemplo de elaboración de un microarreglo de tejido ............................... 22
Ilustración 7. Geles de agarosa y parafina (7a) obtenidos posterior a procesamiento (7b)
e inclusión (7c) .................................................................................................................. 28
Ilustración 8. Preparación del bloque receptor. Se adhiere una cuadrícula para guía de
los sacabocados y con un punch de 5 mm se perfora el bloque (8 a y b). Los cilindros de
tejido de los bloques donantes integrados al bloque receptor para corte (8c). ................ 29
Ilustración 9. Variables clínico epidemiológicas (9A) e histopatológicas (9B) de la
población pediátrica estudiada. ........................................................................................ 34
Ilustración 10. Variables clínico epidemiológicas (7A) e histopatológicas (7B) de la
población adulta estudiada. .............................................................................................. 35
Ilustración 11. Ejemplo de un microarreglo de tejido obtenido (9A) y láminas de H-E e
IHQ pan-NTRK obtenidas del microarreglo (9B) .............................................................. 36
Ilustración 12. Ejemplos de controles positivos en los microarreglos de tejido: Apéndice
cecal, mplexo mientérico (H-E 10A pan-NTRK 10B) y control interno tejido nervioso
normal (H-E 10C pan-NTRK 10D) .................................................................................... 37
Ilustración 13. Ejemplos tinción PanTRK en tumores gliales: Astrocitoma pilocítico niños
(H-E 11 A/C pan-NTRK 11B/D ) ....................................................................................... 39
Ilustración 14. Ejemplo tinción PanTRK en tumores gliales: Patrón Dot-like en
Glioblastoma multiforme en niños (H-E 12A pan-NTRK 12B) .......................................... 40
Ilustración 15. Ejemplos de tinción PanTRK en tumores gliales: Glioblastoma multiforme
niños (H-E 13A pan-NTRK 13B) adultos (H-E 13C pan-NTRK 13D) .............................. 40
Ilustración 16. Carcinoma secretor de mama (14A H-E 10x y 40x) (14B PanTRK 10x y
40x) ................................................................................................................................... 43Contenido XVI
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1. Tabla 1. Vías de señalización activadas según receptor Trk. NGF: Factor de
crecimiento nervioso, BDNF: Factor neurotrófico derivado del cerebro, NT3: Neurotrofina
3, NT4: Neurotrofina 4. ..................................................................................................... 13
Tabla 2. Fusiones NTRK y tipo tumoral asociado ......................................................... 14
Tabla 3. Protocolo del procesador automático de tejidos utilizado para la realización
de bloques de parafina y agarosa ..................................................................................... 27
Tabla 4. Características IHQ panTRK en tumores gliales de población pediátrica ...... 38
Tabla 5. Características IHQ panTRK en tumores gliales de población adulta ............ 39Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviaturas
Abreviatura Término
NTRK 1 Gen receptor de tirosina quinasa neurotrófico tipo 1
NTRK 2 Gen receptor de tirosina quinasa neurotrófico tipo 2
NTRK 3 Gen receptor de tirosina quinasa neurotrófico tipo 3
Trk A Receptor quinasa A de la tropomiosina
Trk B Receptor quinasa B de la tropomiosina
Trk C Receptor quinasa C de la tropomiosina
NGF Factor de crecimiento nervioso
BDNF Factor neurotófico derivado del cerebro
NTF 3 Neurotrofina 3
NTF 4 Neurotrofina 4
PI3K Vía de señalización Fosfatidilinositol 3 kinasa
PLC-γ Vía de señalización Fosfolipasa C Gamma
MAPK Vía de señalización dependiente de la proteincinasa de activación
mitogénica
ETV6 ETS Variant Transcription Factor 6
ADN Ácido desoxirribonucléico
ARN Ácido ribonucléicoIntroducción 2
NGS Secuenciación de nueva generación
FISH Hibridación Fluorescente in situ
RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
IHQ Inmunohistoquímica
H-E Hematoxilina-EosinaIntroducción 3
1. Introducción
Los receptores tirosina quinasa neurotróficos (NTRK) constituyen una familia de
protooncogenes NTRK 1,2 y 3 que codifican tres proteínas transmembrana denominadas
receptor proteína quinasa de tropomiosina (Trk) A, B y C respectivamente. Estos
receptores se expresan de principalmente en el tejido nervioso aunque también en músculo
liso y testículo. Su activación mediada por neurotrofinas hace que desempeñe un papel
preponderante en la diferenciación, desarrollo y regulación del sistema nervioso.
En diversos tipos de tumores sólidos que afectan a la población adulta y pediátrica se han
identificado rearreglos genómicos de NTRK donde el principal mecanismo de activación
oncogénica corresponde a la fusión de su dominio quinasa llevando a la expresión
aberrante de receptores Trk los cuales adquieren potencial oncogénico independiente del
ligando, activando vías de señalización celular involucradas en la proliferación,
supervivencia, invasión y angiogénesis tumoral.
La detección de fusiones oncogénicas de los genes NTRK tiene una importante relevancia
puesto que la existencia de terapia dirigida con inhibidores selectivos TRK en tumores
sólidos con esta alteración ha mostrado una respuesta favorable en una buena proporción
de casos y es independiente de la histología tumoral, el tipo de fusión NTRK o la edad del
paciente (1). Actualmente existen algoritmos diagnósticos que utilizan el tamizaje por IHQ
y pruebas moleculares confirmatorias dependiendo de la probabilidad de presentar esta
alteración (2).2. Justificación
La fusión de NTRK con múltiples genes puede ser conductora oncogénica en una variedad
de tumores sólidos tanto en población adulta como infantil. La frecuencia de presentación
de estos eventos varía según el tipo tumoral, siendo superior al 90% en tumores con baja
incidencia como el fibrosarcoma infantil, Nefroma mesoblástico congénito, carcinoma
secretor mamario y carcinoma análogo secretor de mama de la glándula salival y entre el
5% al 25% en tumores más comunes y con mayor relevancia epidemiológica en nuestro
medio como el carcinoma papilar de tiroides, carcinoma colorrectal, melanoma,
adenocarcinoma pulmonar y los tumores primarios del sistema nervioso central (tumores
gliales) entre otros (1). Varios de estos tumores pueden tener un curso agresivo y ser de
difícil tratamiento dada su localización. En nuestro país se desconoce la frecuencia de
alteraciones de NTRK.
El interés clínico en la detección de esta anomalía radica en que actualmente la terapia
dirigida está plenamente establecida mediante el uso de medicamentos inhibidores del
receptor proteína quinasa de tropomiosina (Trk) tales como el Larotrectinib y Entrectinib,
los cuales han demostrado su eficacia y están aprobados para el tratamiento de tumores
sólidos indistintamente de la edad de presentación, sitio de origen del tumor, la clasificación
histológica o el tipo de fusión NTRK (3).
Por lo anterior, la identificación de fusiones NTRK es importante para un diagnóstico y
tratamiento preciso. Aunque se utilizan diferentes técnicas moleculares avanzadas para su
detección, tales como secuenciación de nueva generación (NGS) y la hibridación
fluorescente in situ (FISH), estas no se encuentran disponibles en todos los laboratorios y
pueden tener un costo elevado, más aún si se considera que la frecuencia de casos con6
fusión NTRK constituye un porcentaje bajo del total de los tumores (2,4), lo que hace
necesario desarrollar algoritmos técnicos específicos que permitan un uso racional de los
recursos, realizando en primer lugar un tamizaje con utilización de técnicas costo-efectivas,
como el estudio de IHQ posterior a la evaluación histopatológica, lo cual permite
seleccionar los casos con mayor posibilidad de ser portadores de las proteínas fusión
NTRK y posteriormente, los casos que se consideren positivos podrán entonces someterse
a estudio confirmatorio por técnicas más sofisticadas tales como la NGS, RT-PCR, entre
otras (2,5).
El presente trabajo hace parte de un proyecto colaborativo entre el Departamento de
Patología de la Facultad de Medicina y el grupo de Farmacogenética del Cáncer del
Departamento de Farmacia de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de
Colombia en el marco del convenio de cooperación celebrado entre el Instituto de
Biotecnología de la Universidad Nacional de Colombia (IBUN) y Bayer S.A y tiene como
propósito la realización y estandarización de una técnica de IHQ a través de microarreglos
de tejido, con el fin de detectar proteínas que pudieran indicar posibles fusiones de los
genes NTRK y evaluarla en una serie de tumores sólidos con el fin de validar su utilidad
como metodología de tamizaje en el estudio molecular de pacientes oncológicos que
podrían beneficiarse de medicamentos sobre este blanco terapéutico.7
3. Planteamiento del problema
Las fusiones del gen NTRK son comunes en algunos tipos raros de tumores pediátricos y
de adultos, pero también se han identificado estas fusiones con menor frecuencia en una
amplia gama de tumores con mayor frecuencia tumores gliales de bajo y alto grado. Estas
situaciones hacen que sea necesario establecer una estrategia diagnóstica costo-efectiva
utilizando técnicas de tamizaje y confirmación para la identificación de estos pacientes y
que puedan beneficiarse de la terapia personalizada existente.8
4. Objetivo General
Evaluar la expresión inmunohistoquímica en microarreglos de tejido de las
proteínas fusión de los genes NTRK en una serie de casos de tumores sólidos de
pacientes adultos y pediátricos atendidos en dos hospitales de referencia entre el
periodo 2019-2020.
5. Objetivos específicos
5.1.1 Describir las características clínicopatológicas de los pacientes con
los tumores estudiados y asociados proteínas fusión NTRK en el Hospital
Universitario Nacional de Colombia (HUN) y la Fundación Hospital de la
Misericordia (HOMI).
5.1.2 Evaluar el patrón de expresión inmunohistoquímico del marcador para
detección de proteínas fusión de los genes NTRK 1,2 y 3).
5.1.3 Contribuir a determinar la frecuencia de alteraciones de los genes
NTRK.9
6. Marco Teórico
6.1. Generalidades
Los receptores quinasa relacionados con la tropomiosina (Trk) comprenden una familia de
tres proteínas transmembrana: Trk A, Trk B y Trk C, las cuales están codificadas por los
protooncogenes NTRK1, NTRK2 y NTRK3. Normalmente, estos receptores se expresan
en el tejido nervioso, músculo liso y testículo. A través de su activación mediada por
neurotrofinas específicas para cada una de ellas: El Factor de crecimiento nervioso (NGF)
para TrkA, Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y neurotrofina 4(NT4) para
TrkB y neurotrofina 3 para TrkC, se relacionan con procesos reguladores de proliferación,
diferenciación, supervivencia y desarrollo del sistema nervioso tales como: Patrones de
crecimiento axonal y dendrítico, expresión y actividad de canales iónicos, receptores de
neurotransmisores y plasticidad neuronal, entre otros (6,7).
6.2 Tumores asociados a fusiones ntrk y frecuencia de
presentación
La incidencia anual de tumores con fusión de NTRK está estimada en 1500-5000 casos
en EEUU (8) y se han informado en diversos tipos de tumor tanto en adultos como en
niños. Igualmente, su presentación es variable y según su frecuencia puede distribuirse
así (1) (Figura 1):
§ Tumores con fusión NTRK > 90%: Son tumores con baja incidencia donde la
fusión es característica. Estos son: Carcinoma secretor de mama, carcinoma10
análogo secretor de mama de la glándula salival (MASC), Nefroma mesoblástico
congénito (subtipos celular y mixto) y fibrosarcoma infantil.
§ Tumores con fusión NTRK entre 5-25% o < 5%: Corresponden a tumores más
comunes donde la fusión es menos frecuente llegando a presentarse en menos del
1%. Dentro del primer grupo (5-25%) se encuentran: Carcinoma papilar de tiroides,
adenocarcinoma colorrectal, adenocarcinoma de pulmón, melanoma, carcinoma
ductal de mama, neoplasias Spitzoides, tumor estromal gastrointestinal (GIST),
tumores gliales de alto y bajo grado y menos del 5% en adenocarcinoma de
páncreas, colangiocarcinoma, carcinoma renal, carcinoma escamocelular de
cabeza y cuello, sarcomas de tejidos blandos no GIST.
Ilustración 1. Frecuencia y distribución de fusiones NTRK en tumores pediátricos y
del adulto
Adaptado de Cocco, E., Scaltriti, M., Drilon, A. (2018). NTRK fusion-positive cancers and
TRK inhibitor therapy. Nature Reviews Clinical Oncology, 155: 731-74711
6.3 Aspectos moleculares
6.3.1 Estructura de los receptores Trk y vías de señalización
involucradas
Similar a otros receptores tirosina quinasa, los Trk están conformados por un dominio
extracelular para la unión del ligando, una región transmembrana y un dominio quinasa
intracelular.
Su dominio extracelular es altamente glicosilado y está constituido por tres regiones ricas
en leucina (LRR 1-3) rodeadas de dos grupos cisteína (C1 y C2) y dos dominios similares
a las inmunoglobulinas tipo C2 (Ig1, Ig2) adyacentes a la región transmembrana, siendo
Ig2 el sitio de mayor afinidad para la unión de neurotrofinas (Figura 2). La unión del ligando
al receptor genera su dimerización y activación a través de la fosforilación de residuos
específicos de tirosina como Y490, Y670, Y674, Y675, Y676, Y680, Y681 y Y785 que
conllevan a la activación de diferentes vías de señalización generando la transcripción de
genes que participan en la diferenciación, proliferación, supervivencia, mantenimiento
neuronal, prevención de la neurodegeneración y apoptosis (7) (Tabla 1).12
Ilustración 2. Estructura proteínas Trk y vías de señalización involucradas en su
función
Tomado de Cocco, E., Scaltriti, M., Drilon, A. (2018). NTRK fusion-positive cancers and
TRK inhibitor therapy. Nature Reviews Clinical Oncology, 155: 731-74713
Tabla 1. Vías de señalización activadas según receptor Trk. NGF: Factor
de crecimiento nervioso, BDNF: Factor neurotrófico derivado del
cerebro, NT3: Neurotrofina 3, NT4: Neurotrofina 4.
RECEPTOR GEN QUE LIGANDO VÍA DE EFECTO
CODIFICA SEÑALIZACIÓN
ACTIVADA
TrkA NTRK 1 NGF Ras/MAPK ­ proliferación y
crecimiento
(1q21-q22) PLCγ
celular.
PI3K
TrkB NTRK 2 BDNF, NTF4 Ras-ERK, PI3K Diferenciación
(9q22.1) and PLCγ neuronal y
supervivencia
TrkC NTRK3 NT3 PI3/AKT ­ supervivencia
celular.
(15q25)
Adaptado de Deinhardt, K., Chao, M. V. (2014). Trk Receptors. Handbook of
Experimental Pharmacology,220: 103–119.
6.3.2 Alteraciones moleculares del gen NTRK
La fusión del gen NTRK a través de rearreglos intra o intercromosómicos constituye
la principal alteración molecular de activación oncogénica. El dominio quinasa que
contiene la región 3´de cualquiera de los genes NTRK va a fusionarse con la región
5´ de alguno de los múltiples genes compañeros descritos en la literatura como por
ejemplo: ETV6, LMNA, TPM3/4, EML4, TPR, TGF (4) (Tabla 2), generando
proteínas quiméricas oncogénicas que van a activar permanentemente vías de14
señalización involucradas en la proliferación, supervivencia, invasión y
angiogénesis tumoral.Se considera que las fusiones NTRK están presentes en los
tumores independientemente del lugar de origen y son mutuamente excluyentes con
otros conductores oncogénicos (9).
Tabla 2. Fusiones NTRK y tipo tumoral asociado
GEN/FUSIÓN TIPO DE TUMOR
NTRK1
LMNA-NTRK1 Ca colorrectal, sarcoma de tejidos
blandos, melanoma Spitzoide,
sarcoma en adolescentes y adultos
jóvenes, fibrosarcoma infantil.
TPM3-NTRK1 Ca colorrectal,carcinoma papilar de
tiroides, glioblastoma.
SQSTM1-NTRK1 Ca pulmón de célula no pequeña
NFASC/BCAN- Glioblastoma multiforme
NTRK1
PPL/TFG-NTRK1 Carcinomas de tiroides
CD74/MPRIP-NTRK1 Adenocarcinoma de pulmón
TP53/NTRK1 Melanoma Spitzoide
NTRK2
AFAP1-NTRK2 Gliomas de bajo grado
AGBL4/VCL-NTRK2 Glioblastoma15
NACC2/QKI-NTRK2 Astrocitoma pilocítico
PAN3-NTRK2 Carcinoma escamocelular de
cabeza y cuello
TRIM24-NTRK2 Adenocarcinoma de pulmón
NTRK3
ETV6-NTRK3 Glioblastoma, carcinoma análogo
secretor de mama de la glándula
salival (MASC), fibrosarcoma,
nefrona mesoblástico congénito,
ca tiroides asociado a radiación,
leucemia mieloide aguda, tumor
gastrointestinal estromal (GIST),
carcinoma papilar de tiroides, ca
colorrectal.
BTBD1-NTRK3 Glioblastoma multiforme
Adaptado de Amatu A, Sartore- Bianchi A, Siena S (2016). NTRK gene fusions as novel
targets of cancer therapy across multiple tumour types. ESMO Open Cancer Horizons,1(2):
E000023
6.4 Métodos de detección de las fusiones NTRK
Las fusiones NTRK pueden detectarse a través de varios métodos (10):
§ Secuenciación de nueva generación (NGS)
Aunque tiene un costo elevado, este método posee una alta sensibilidad y especificidad
(11) y permite la caracterización completa de los genes implicados en la fusión. Se
recomienda especialmente en gliomas de alto grado teniendo en cuenta que el estudio de
inmunohistoquímica puede presentar un factor de confusión debido a la expresión
fisiológica de NTRK en tejido nervioso. Puede realizarse a través de ensayos basados en
ADN o ARN. En la secuenciación basada en ADN tisular pueden evaluarse mutaciones
puntuales, variación en número de copias y carga mutacional tumoral (2). Igualmente es
útil en el seguimiento de pacientes en tratamiento con inhibidores TRK que hayan
generado resistencia. Sin embargo, los paneles de secuenciación con ADN pueden no16
detectar fusiones que involucran NTRK2 y NTRK3 ya que puede haber una secuenciación
inadecuada debido a que estos genes tienen varios puntos de ruptura dentro de regiones
intrónicas largas con muchos elementos repetitivos (12,13).
La secuenciación basada en ARN puede considerarse el gold standard para detectar las
fusiones NTRK con una sensibilidad y especificidad del 93% y 100% respectivamente (12),
ya que al evaluarse ARN mensajero maduro, no se afecta por el tamaño del intron ni por
fusiones que involucran simultáneamente múltiples genes y exones. La limitación más
importante es la calidad del ARN ya que en tejidos embebidos en parafina suele estar
degradado.
§ Hibridación fluorescente in situ (FISH)
Permite la detección de reordenamientos genéticos del ADN utilizando sondas de
separación específicas para los genes NTRK1, NTRK2 o NTRK3. Esta técnica no permite
identificar la pareja de fusión y puede dar falsos positivos ya que los reordenamientos
detectados en el ADN podrían no producir transcripción de fusión. Los casos sugestivos
de fibrosarcoma infantil, nefroma mesoblástico congénito y carcinoma secretor de mama y
glándula salival pueden evaluarse por FISH para la fusión ETV6-NTRK3 para apoyar el
diagnóstico histopatológico (2).
§ Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR)
Permite detectar transcripciones de fusión NTRK, pero requiere el uso de gran cantidad de
primers para poder detectar todas las posibles fusiones. Esta técnica puede dar falsos
negativos por la diversidad de fusiones NTRK. Se ha utilizado en la detección de fusiones17
NTRK en carcinoma de tiroides, fibrosarcoma infantil, glioblastomas, carcinoma secretor
de mama y glándula salival (5).
§ Inmunohistoquímica
Es una técnica de diagnóstico eficaz para los tumores que no se someten de manera
rutinaria a perfiles genómicos moleculares y que se sabe tienen baja incidencia de fusiones
NTRK, esto permite seleccionar los casos que requieren la realización de pruebas
moleculares confirmatorias. Entre sus ventajas se incluye: Se trata de un método
económico, rápido, seguro y es de fácil reproducibilidad y validación para implementar en
el laboratorio.
Como se mencionó anteriormente, las proteínas TrK fisiológicamente sólo se expresan en
tejido nervioso, músculo liso y testículo (6) lo que permite que esta sea una prueba
específica que permita detectar alteraciones al expresarse en otros órganos.
El anticuerpo más estudiado hasta el momento es el VENTANA pan-TRK ERP17341
(Roche) el cual tiene como blanco secuencias comunes de aminoácidos presentes en las
tres proteínas TrK localizadas en la región C-terminal del receptor, la cual se conserva
tanto en las proteínas fusión como en las nativas. La expresión normal de estas proteínas
en tejido nervioso (células ganglionares de la pared intestinal, cerebro, cerebelo) hace que
se utilice como su control positivo (Figura 3). El patrón de tinción de las células neoplásicas
puede sugerir el tipo de fusión que presenta el tumor (14), por ejemplo, se ha encontrado
que tumores con fusiones NTRK1 tienen marcación en el citoplasma y la membrana
celular. Tumores con fusiones NTRK 2 tienen marcación citoplasmática y perinuclear,
mientras que aquellos con fusión de NTRK3 tiene marcación nuclear (15).18
Ilustración 3. Ejemplo de control positivo marcador pan-TRK
3a. Corte histológico del plexo mientérico en apéndice cecal (hematoxilina- eosina
40X). Células ganglionares maduras señaladas con una flecha. 3b. Patrón de tinción
de membrana y citoplasma de controles positivos para el anticuerpo pan-TRK en
apéndice cecal. Marcación en células ganglionares del plexo mientérico de la pared
intestinal (VENTANA pan-Trk IHC clone EPR17341, 40x).
Si bien la intensidad es variable, se considera que una neoplasia con al menos 1% de las
células con cualquier tipo de intensidad en la tinción es positiva (15). (Figura 4)19
Ilustración 4. Ejemplos de patrones de tinción en la Fusión NTRK
4a. Carcinoma secretor de mama ( H-E) 4b.Patrón de inmunotinción pan-
TRK nuclear fuerte y citoplasmática moderada en fusión ETV6-NTRK3
4c.Carcinoma colorrectal moderadamente diferenciado de histología
convencional (H-E) 4d. Patrón de inmunotinción pan-TRK fusión NTRK1-
LMNA con marcación difusa en citoplasma y membrana nuclear. Tomado
de Hechtman, J. F., Benayed, R., Hyman, D. M., Drilon, A., Zehir, A.,
Frosina, D., Jungbluth, A. A. (2017). Pan-Trk Immunohistochemistry Is an
Efficient and Reliable Screen for the Detection of NTRK Fusions. The
American Journal of Surgical Pathology, 41(11):1547–1551.
Múltiples estudios realizados acerca de la sensibilidad y especificidad de este marcador
varían, encontrándose una sensibilidad aproximada del 96% y una especificidad entre 98-
100% en unos (14,21) y otros que indican una sensibilidad mas baja (75%) especialmente
para fusiones de NTRK3 donde aproximadamente el 45% de los tumores con una fusión
ya conocida en este gen eran falsos negativos con la IHQ (15). También se ha mencionado
que la especificidad es dependiente del histotipo tumoral, varía entre 92- 100% en20
adenocarcinoma de colon, carcinoma de pulmón, tiroides, páncreas, tracto biliar y
melanomas (2). En contraste, es importante resaltar que la sensibilidad es mucho menor
en tumores mesenquimales de estirpe muscular (músculo liso) y del sistema nervioso
debido a su expresión fisiológica, lo cual dificulta significativamente su evaluación en estos
tejidos (16).
6.5 Algoritmos diagnósticos para detectar fusiones
NTRK
En general los algoritmos diagnósticos actuales tienen en cuenta varios aspectos para la
identificación de pacientes con tumores con fusión NTRK entre los que se pueden
encontrar (2,5 figura 5):
• Para los casos con una alta probabilidad de fusión NTRK tales como fibrosarcoma
infantil, nefroma mesoblástico congénito, carcinoma de glándulas salivales secretor
análogo mamario y carcinoma secretor mamario, o en casos en los que la tinción
inmunohistoquímica no es apropiada dada su expresión fisiológica, como tumores
del sistema nervioso central, testiculares o de músculo liso) se puede realizar NGS
basado en ARN ( RNASeq).
• Para los tumores en los que el panel NGS se está utilizando como parte de la
práctica clínica (como en adenocarcinoma de pulmón y sarcomas), es ideal que las
fusiones NTRK se incorporen como parte de la prueba del panel de biomarcadores.
• Para el resto de tumores, se debe realizar, en primer lugar, el estudio de
inmunohistoquímica y en los casos positivos continuar con el estudio molecular
confirmatorio (FISH, RT-PCR) y de ser estos negativos realizar NGS basado en
ARN con el fin de detectar falsos negativos potenciales.21
Ilustración 5. Ejemplo de algoritmo diagnóstico para la detección de fusiones
NTRK según el tipo tumoral y la frecuencia
Tomado de Zito Marino, F., Pagliuca, F., Ronchi, A., Cozzolino, I., Montella, M.,
Berretta, Franco, R. (2020). NTRK Fusions, from the Diagnostic Algorithm to
Innovative Treatment in the Era of Precision Medicine. International Journal of
Molecular Sciences, 21(10):3718.
6.6 Microarreglos de tejido como herramienta para el
estudio inmunohistoquímico
Los microarreglos de tejido constituyen un método de alto rendimiento que permite evaluar
múltiples muestras utilizando técnicas homogéneas de proceso (H-E, histoquímica, IHQ o
hibridación in situ). Al mismo tiempo se racionaliza el uso de reactivos dado que en vez de
hacer las técnicas en láminas para cada caso se hacen en una sola placa en simultáneo.22
En general la construcción de los microarreglos de tejido requiere de los siguientes pasos
(Figura 6): En primer lugar, del bloque donante se selecciona la muestra y se delimita el
área de interés (Figura 6 a) de donde se extraerá un sacabocado de tejido para ser
integrado en el bloque de parafina receptor previa identificación por coordenadas de
acuerdo con su ubicación en filas y columnas (figura 6b y c). Una vez conformado el
microarreglo se procede a realizar cortes a 4 micras (figura 6d) para su posterior tinción
con hematoxilina-eosina y con el marcador que se vaya a estudiar (figura 6e).
Ilustración 6. . Ejemplo de elaboración de un microarreglo de tejido
®
Tomado de Quick Ray Manual Tissue Microarrayer user manual
http://unitma.com/pdf/Manual_Quick_Ray.pdf
Inicialmente esta técnica empezó a realizarse manualmente. Posteriormente para
mejorar la eficiencia se diseñaron equipos automatizados o semiautomatizados que
facilitan la elaboración del microarreglo sin embargo, no todos los laboratorios tienen
acceso a este tipo de tecnologías dado su alto costo, por lo tanto la técnica manual aún se
utiliza en los laboratorios que no disponen de estos equipos.
Se han descrito algunas dificultades técnicas al momento de realizar el montaje y corte del
bloque receptor de parafina como por ejemplo la falta de integración del sacabocados al
bloque, la distorsión durante la inclusión y pérdida del tejido por lo que diferentes autores,23
(18,19,20) han generado modificaciones a la técnica para favorecer que cuando se funda
la parafina, los microarreglos no se desplacen. Son técnicas sencillas y de bajo costo para
realizar microarreglos de tejido manuales y “caseros” usando un aditivo como la agarosa
que no se funde en una etapa de calentamiento durante el proceso de inclusión, ya que a
diferencia de la parafina convencional que se funde a los 65° C, esta tiene un punto de
fusión de aproximadamente 90° C lo que genera bloques de agarosa parafinada con una
matriz estable para las muestras permitiendo su adecuada integración.
La técnica descrita para la preparación de bloques receptores de gel de agarosa -
parafinase resume de la siguiente manera (18):
Se prepara agarosa en agua destilada al 2% (peso/volumen) luego se vierte en moldes de
inclusión de parafina y se deja enfriar a temperatura ambiente obteniéndose geles de
agarosa de 4 mm de espesor.
Se retiran los geles de los moldes y se recorta el excedente para que encajen cassettes
de procesamiento histopatológico, se colocan en el procesador automático de tejidos y se
procesan con el programa de rutina preestablecido en el equipo incluyendo la fijación con
formol al 10%, deshidratación con alcoholes, aclaramiento con xilol e impregnación con
parafina dando como resultado geles de agarosa parafinada.
Se incluyen en parafina convencional y estos serán utilizados como bloque receptor. Una
vez introducidos los cilindros de los bloques donantes, se integran por medio de calor al
bloque receptor, posteriormente se enfrían y se realizan cortes con el micrómetro
obteniendo las láminas que se requieran.24
7. Materiales y métodos
7.1 Tipo de estudio:
Experimental, descriptivo retrospectivo.
7.2 Población:
Bloques de tejido embebido en parafina del archivo de dos laboratorios de patología:
Hospital Universitario Nacional (HUN), Fundación Hospital de la Misericordia (HOMI) de
pacientes con diagnóstico histopatológico de los siguientes tipos de cáncer según la
probabilidad reportada en la literatura de portar la fusión NTRK: Tiroides (pacientes con
diagnóstico de carcinoma papilar de tiroides), colon (pacientes con diagnóstico de
adenocarcinoma colorrectal), piel y mucosas de cabeza y cuello ( pacientes con
diagnóstico de carcinoma escamocelular y melanoma), cerebro (pacientes con diagnóstico
de tumores gliales de bajo y alto grado), pulmón ( adenocarcinoma de pulmón de célula no
pequeña) mama ( carcinoma secretor de mama).
7.3 Selección de tamaño y muestra:
Se seleccionó una muestra por conveniencia de mínimo 7 casos de cada tumor propuesto,
exceptuando el carcinoma anaplásico de tiroides, el adenocarcinoma de pulmón y el
secretor de mama los cuales sólo se contó con un caso, previa aprobación del comité de
ética de cada institución.25
7.4 Criterios de inclusión:
§ Material histológico (bloques de parafina) con diagnóstico de alguno de los tumores
sólidos referenciados anteriormente.
§ Material histológico de pacientes con diagnóstico clínico e histopatológico realizado
en Fundación Hospital La Misericordia HOMI y Hospital Universitario Nacional de
Colombia HUN.
§ Pacientes con material histológico (bloques de parafina y láminas de Hematoxilina-
Eosina) disponible y con tejido tumoral suficiente para posibles futuros análisis.
7.5 Criterios de exclusión:
§ Pacientes cuyo diagnóstico inicial no se realizó en la Fundación Hospital La
Misericordia HOMI y Hospital Universitario Nacional de Colombia HUN.
§ Pacientes sin disponibilidad de bloque de tejido.
§ Pacientes cuyo material histológico en bloques de parafina sea insuficiente o no
garantice remanente para futuros estudios que puedan requerirse para el
tratamiento de los pacientes.
§ Casos cuyo material histopatológico presente defectos de preservación.
§
Pacientes sin información clínica completa.
7.6 Recolección de la información:
Se obtuvo la información clínica y sociodemográfica de los datos consignados en la historia
clínica electrónica. La información para el análisis histopatológico se obtuvo a través de los
informes de patología previos y la revisión de las láminas histológicas de H-E y bloques de
parafina para la selección y realización de microarreglos de tejido a partir de los cuales se
realizó el estudio de inmunohistoquímica. Se generó una base de datos en Excel donde
se incluyeron todos los datos de los casos del presente estudio (ver anexo 1).26
7.7 Evaluación de la fusión NTRK
7.7.1 Elaboración de microarreglos de tejido en bloques de
agarosa-parafina
Los microarreglos de tejido se realizaron de forma manual utilizando bloques receptores
preparados con una matriz de agarosa y parafina (18,20).
7.7.2 Preparación y análisis de los bloques donantes
Se realizó la revisión histopatológica de las láminas H-E confirmando su diagnóstico y
seleccionando aquella área que tenga mayor representatividad tumoral e interfase con
tejido normal. Se marcó la zona de interés de la cual se extrajo el tejido. Se registró la
información en la base de datos relacionando para cada caso su ubicación en el
microarreglo (fila y columna) .
7.7.3 Preparación del bloque receptor con matriz de agarosa-
parafina
Se realizó la preparación de geles diluyendo agarosa en agua destilada en una
concentración del 2%, la mezcla se calientó y homogenizó en agitador magnético durante
3 minutos, se virtió en los moldes metálicos de inclusión (3.5 x 2.5 x 0.5 cm) y se dejó
enfriar a temperatura ambiente. Los geles se desmoldaron, se recortó el exceso y se
dejaron con un espesor de 3 mm. Luego se colocaron en la canastilla para cassettes del
procesador automático de tejidos ( Leica asp300, Leica Biosystems) y se procesaron
siguiendo los pasos del programa preestablecido de procesamiento de muestras de rutina
del laboratorio ( fijación en formol al 10%, deshidratación con n-propanol, aclaramiento con
xilol e impregnación con parafina, ver tabla 3), posteriormente se incluyeron de manera
similar a como se hace con los tejidos para estudio histopatológico obteniéndose bloques
con agarosa y parafina (ver figura 7).27
Tabla 3. Protocolo del procesador automático de tejidos utilizado para la
realización de bloques de parafina y agarosa
REACTIVO DURACIÓN TEMPERATURA
(min) (Cº)
FORMOL 120 35
TAMPONADO 10%
ETANOL 90% 30 35
N-PROPANOL 45 35
N-PROPANOL 50 35
N-PROPANOL 50 35
N-PROPANOL 50 35
ISOPROPANOL 60 35
XILOL 45 35
XILOL 60 35
XILOL 60 35
PARAFINA 60 60
PARAFINA 60 60
PARAFINA 60 6028
Ilustración 7. Geles de agarosa y parafina (7a) obtenidos posterior a procesamiento
(7b) e inclusión (7c)
Del área previamente seleccionada en los bloques donantes y utilizando un punch de piel
desechable de 5mm de diámetro, se obtuvo un sacabocado que se integró al bloque
receptor según las coordenadas previamente asignadas.
Para extraer el cilindro de tejido del punch, previo a la toma se inserta un alambre de menor
diámetro con uno de sus extremos doblado en ángulo recto y se realiza una ligera presión
sobre el sacabocado facilitando su salida. Los microarreglos se diseñaron de acuerdo con
el tipo tumoral y cada uno tenía una matriz de ocho cilindros, uno para el control positivo
del marcador de IHQ y siete casos de cada diagnóstico. Para integrar totalmente la parafina
de los cilindros de tejido en el bloque receptor, este se coloca en una placa caliente a 68ºC
por 1-2 minutos y con una lámina portaobjetos se aplana la superficie, posteriormente pasa
a una placa fría por 1 minuto ( Figura 8). Se obtienen cortes tanto para H-E como para
IHQ.29
Ilustración 8. Preparación del bloque receptor. Se adhiere una cuadrícula para guía
de los sacabocados y con un punch de 5 mm se perfora el bloque (8 a y b). Los
cilindros de tejido de los bloques donantes integrados al bloque receptor para
corte (8c).
7.7.4 Realización de IHQ para detección de fusión NTRK
Se tomó como control positivo un cilindro de tejido de apéndice cecal. Del bloque receptor
se obtienen cortes de 4 micras en lámina cargada, posteriormente estas láminas se
incubaron a 60ºC por 12 horas, se retiró la lámina y se etiquetó con código de barras e
ingresó al equipo automatizado VENTANA® BENCHMARK GX SYSTEM para la
realización del marcador de inmunohistoquímica VENTANA® pan-TRK (EPR17341)
Assay, siguiendo las recomendaciones establecidas por el fabricante (22).
El anticuerpo se visualiza utilizando el kit de detección OptiView DAB IHC Detection Kit, el30
cual consiste en un cóctel de anticuerpos secundarios que localizan el anticuerpo primario
unido a ellos. La combinación de anticuerpos secundarios se reconoce mediante una
enzima unida a un anticuerpo terciario que reacciona con sustrato de peróxido de
hidrógeno y el cromógeno de 3, 3'-diaminobenzidina tetraclorhidrato (DAB), lo que produce
un precipitado marrón que se detecta fácilmente mediante microscopía óptica. Cada paso
se incuba durante un tiempo y a una temperatura seleccionable en el instrumento
VENTANA® BENCHMARK GX SYSTEM. Una vez terminado el proceso automatizado, se
retira la lámina del equipo, se realiza lavado, pasa a deshidratación con n-propanol en 3
pasos (70%,80% y 100%), se aclara con xilol y se hace el montaje. Los resultados se
interpretan mediante microscopía óptica. Este proceso se llevó a cabo en el laboratorio de
patología del Hospital Universitario Nacional de Colombia HUN. Los reactivos usados eran
presentaciones comerciales listas para usar en esta plataforma.
7.7.5 Lectura de la IHQ
Para la evaluación del marcador de inmunohistoquímica VENTANA® pan-TRK
(EPR17341), se revisarán en primer lugar las láminas H-E según las coordenadas
asignadas a cada tumor en los distintos microarreglos de tejido para observar la presencia
tanto del tejido histológico normal como del tejido tumoral y la interfase entre ellos para
luego ser correlacionado y evaluado en las láminas de inmunohistoquímica con el
marcador referido. Se tendrán en cuenta las recomendaciones establecidas tanto por el
fabricante como por la ESMO (Sociedad Europea de Oncología médica (4) y otros grupos
de investigación (2,14,16): Se considera postivo cuando la marcación en las células
tumorales es mayor o igual al 1% con cualquier tipo de intensidad por encima del fondo
celular. Tambien se documentará la localización de la marcación en la célula tumoral
( citoplasmática, membrana citoplasmática, nuclear, membrana nuclear, nuclear dot like)
ya que, como se mecionó anteriormente, cada fusión podría sugerir un patrón de
marcación específico (15).
La interpretación de los microarreglos se realizó por los tres investigadores quienes leyeron
cada caso de manera independiente. En primer lugar, por la residente de cuarto año y31
luego por los dos tutores del trabajo quienes cuentan con más de 20 años de experiencia,
posteriormente se realizó lectura de consenso entre los investigadores y se dirimieron
discrepancias. Cada microarreglo tenía un tejido de control positivo recomendado por el
fabricante (apéndice cecal). Para que un caso sea considerado positivo o negativo, debió
coincidir por 2 de los 3 lectores. Los resultados se consignaron en una base de datos de
Excel.
7.8 Análisis de los datos
Se realizó la respectiva estadística descriptiva mediante el cálculo de frecuencias
absolutas y relativas para las variables cualitativas y para las cuantitativas se calcularon
medidas de tendencia central y dispersión de acuerdo con la distribución.3233
8. Resultados
Se evaluaron en total 93 casos. 36 de población pediátrica (37.8%) y 57 de adultos
(61,2%). Para todos los casos se consignaron espécimen, edad, género, diagnóstico
histológico y asignación de coordenadas en el microarreglo del tejido.
En el grupo pediátrico predominó el género femenino con 21 (58.3%) casos y el masculino
con 15 casos (41.6%) (Figura 9A). Los tumores evaluados correspondieron a carcinoma
papilar de tiroides con 12 casos (33.3%), dos de ellos eran vaciamientos ganglionares
cervicales y 24 tumores gliales (66.6%), 12 de alto grado que incluyen glioblastoma
multiforme, ependimoma anaplásico, astrocitoma anaplásico,10 de bajo grado que
corresponden a astrocitoma pilocítico, astrocitoma difuso, ependimoma clásico y
ganglioglioma y dos no graduables, astroblastomas (Figura 9B). La edad promedio fue de
10.4 años (rango 3 a 17 años).(Anexo 2)34
Ilustración 9. Variables clínico epidemiológicas (9A) e histopatológicas (9B) de la
población pediátrica estudiada.
En el grupo adulto igualmente el género femenino fue el predominante con 34 casos
(59.6%) y en hombres se registraron 23 casos (40.3%), se evaluaron los siguientes
tumores: 14 casos de carcinoma papilar de tiroides (24.5%), un carcinoma anaplásico de
tiroides (1.7%),14 casos de adenocarcinoma colorrectal (24.5%), 13 tumores gliales
(22.8%), 11 de alto grado que comprenden glioblastoma multiforme y astrocitoma
anaplásico y 2 de bajo grado que incluyen ganglioglioma y subependimoma, 7 carcinomas
escamocelulares (12.2%), 6 melanomas (10.5%), uno de ellos metastásico a cerebro, un
adenocarcinoma de pulmón (1.7%) y un carcinoma secretor de mama (1.7%). La edad
promedio fue de 52.2 años (rango 19 a 90 años). (Figuras 10A y 10B).35
Ilustración 10. Variables clínico epidemiológicas (7A) e histopatológicas (7B) de la
población adulta estudiada.
Se realizaron 14 microarreglos de tejido con una plantilla de coordenadas para 8 cilindros
por bloque (ver anexo 3), cada uno para un tipo tumoral específico, 6 microarreglos para
los de población pediátrica y 8 para los adultos, el carcinoma anaplásico de tiroides se
encontraba en bloque completo y el primer cilindro correspondía al control. Por cada
microarreglo se obtuvieron 2 láminas, Una de hematoxilina-eosina y otra para el marcador
de inmunohistoquímica pan-NTRK (Figura 11 A y B). Como se mencionó anteriormente,
para cada caso se procuró obtener una muestra que incluyera tanto tejido normal como
tumoral y su interfase.36
Ilustración 11. Ejemplo de un microarreglo de tejido obtenido (9A) y láminas de H-E
e IHQ pan-NTRK obtenidas del microarreglo (9B)
Inicialmente se corroboró la identificación de cada uno de los casos, luego se evaluó la
lámina de H-E de cada microarreglo para confirmar la histopatología y si había
representación tumoral adecuada; posteriormente se realizó lectura de las láminas con el
marcador de IHQ, en primer lugar, identificando el control positivo recomendado en las
células ganglionares del apéndice cecal las cuales fueron visualizadas en todos los
microarreglos, adicionalmente el control interno en tejido nervioso normal en los
microarreglos que incluían los tumores gliales. ( Figura12).37
Ilustración 12. Ejemplos de controles positivos en los microarreglos de tejido:
Apéndice cecal, mplexo mientérico (H-E 10A pan-NTRK 10B) y control interno
tejido nervioso normal (H-E 10C pan-NTRK 10D)
En la evaluación inmunohistoquímica, realizada por cada uno de los investigadores y
posteriormente en consenso, se tuvo en cuenta la información de localización, intensidad
y porcentaje de marcación en rangos. La valoración por parte de los investigadores no
presentó discordancias relevantes en ninguna de las variables. Los tumores tiroideos
(tanto en niños como en adultos), el adenocarcinoma colorrectal, carcinoma
escamocelular, melanoma, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma secretor de mama
fueron negativos para el marcador pan-NTRK.
Al evaluar los tumores del sistema nervioso central se encontró marcación tanto del tejido
nervioso normal y de las células tumorales, sin embargo, es importante anotar que para
todos los casos fue imposible discernir si la marcación en lo que correspondía a tumor en
la H-E era el neuropilo invadido o tumor en la IHQ. El tejido nervioso normal era
intensamente positivo, en cuanto al tejido tumoral en ambas poblaciones de estudio,
predominó la marcación en membrana citoplasmática seguida de marcación citoplasmática
o una combinación de ambas. En dos casos en niños hubo marcación dot-like, ambos38
tumores gliales de alto grado, un caso correspondía a un ependimoma anaplásico y el otro
a un glioblastoma multiforme. No se identificó marcación nuclear en ninguno de los casos.
tres casos, dos en niños y el otro en adultos marcaron negativos, uno con marcación menor
al 1% y los otros dos por representación tumoral inadecuada, estos tumores correspondían
a un ependimoma clásico, un glioblastoma multiforme y un subependimoma
respectivamente. La intensidad y porcentaje de marcación fue variable siendo esta mayor
o igual a 1% considerando el caso como positivo. Las tablas 4 y 5 muestran las
características inmunohistoquímicas evaluadas de los tumores gliales tanto en niños como
en adultos. Las imágenes 13-15 muestran ejemplos de la marcación en estos tumores.
Tabla 4. Características IHQ panTRK en tumores gliales de población
pediátrica39
Tabla 5. Características IHQ panTRK en tumores gliales de población adulta
Ilustración 13. Ejemplos tinción PanTRK en tumores gliales: Astrocitoma pilocítico
niños (H-E 11 A/C pan-NTRK 11B/D )40
Ilustración 14. Ejemplo tinción PanTRK en tumores gliales: Patrón Dot-like en
Glioblastoma multiforme en niños (H-E 12A pan-NTRK 12B)
Ilustración 15. Ejemplos de tinción PanTRK en tumores gliales: Glioblastoma
multiforme niños (H-E 13A pan-NTRK 13B) adultos (H-E 13C pan-NTRK 13D)41
9. Discusión
Las fusiones de NTRK como generadores oncogénicos pueden encontrarse en diferentes
tumores, pero con excepción en un grupo específico de ellos su incidencia es muy baja,
de menos del 0.25%, según lo descrito en la literatura (1, 15). La identificación de estas
fusiones ha adquirido una importancia significativa dada su relevancia terapéutica ya que
la terapia dirigida con inhibidores NTRK ha mostrado una respuesta efectiva en los
pacientes con tumores avanzados (1,3). El tratamiento con inhibidores como entrectinib y
más selectivo, larotrectinib, han demostrado gran actividad antitumoral con respuesta
terapéutica rápida y duradera en la gran mayoría de pacientes (8) es por ello que hay una
necesidad para un conocimiento mas detallado tanto en la fisiopatología como en el
conocimiento detallado de los diferentes métodos para su detección.
Dado lo anterior son varias las técnicas disponibles para la detección de estas fusiones, si
bien se presentan otro tipo de alteraciones genéticas como amplificaciones, deleciones e
inserciones, han sido poco estudiadas y pueden generar resistencia a los anti NTRK (25).
Las fusiones son las más recurrentes, las más estudiadas, las que presentan mayores
propiedades oncogénicas y para las que la terapia dirigida ejerce su función. Es de gran
importancia establecer una secuencia diagnóstica de rutina tanto para los tumores de baja
frecuencia pero que tienen la fusión NTRK > 95% como para los tumores más frecuentes,
pero con una presencia menor de esta fusión. El estudio de IHQ es una técnica rápida,
costo efectiva y de rápida oportunidad como prueba de tamizaje especialmente para
tumores comunes con baja pero aún posible probabilidad de presentar una fusión NTRK.42
En los tumores que comúnmente tienen fusiones NTRK, al realizar la evaluación
histopatológica y teniendo en cuenta aproximadamente los 80 genes que en su extremo
5´pueden fusionarse a la región 3´del NTRK, son ideales las pruebas que permitan detectar
en simultáneo estas fusiones, es por ello que la secuenciación de nueva generación
basada a nivel de RNA es lo preferido puesto que brinda información funcional de la
transcripción y de mejor interpretación dada la remoción de intrones lo que simplifica la
detección (4,10, 24). Sin embargo, los costos de implementación de estas pruebas, la
necesidad de personal experto y el tiempo de respuesta prolongado hacen que este
estudio sea altamente selectivo y para casos específicos. Igualmente debe tenerse en
cuenta la limitación procedente del RNA ya que su labilidad es mucho mayor que el DNA
en tejidos embebidos en parafina los cuales pueden presentar mayor degradación.
La marcación IHQ con pan-NTRK puede utilizarse como una estrategia de tamizaje para
seleccionar aquellos tumores más comunes pero cuya incidencia de fusión NTRK es baja,
por lo que requieren pruebas moleculares confirmatorias como las descritas(14,15,16). La
interpretación de la marcación parece sencilla en tumores que no expresen
fisiológicamente estas proteínas, teniendo en cuenta los criterios de positividad
establecidos: Marcación mayor o igual al 1%, en cualquier localización subcelular y de
cualquier intensidad sin marcación del fondo. Si bien debe tenerse en cuenta que tanto la
localización como la intensidad de marcación puede sugerir el tipo de fusión que tiene el
tumor, debe tenerse en cuenta también su expresión en membrana citoplasmática del TRK
nativo e igualmente su interpretación en tejidos que expresan fisiológicamente esta
proteína (tejido nervioso, músculo liso y testículo), lo que podría llevar a interpretar un falso
positivo.
En el presente trabajo, primero en nuestro medio, fue posible estandarizar esta prueba de
IHQ con el marcador panTRK (EPR17341) a través de microarreglos de tejido, los
controles fueron los recomendados por la casa comercial, teniendo muestras de control
externo en células ganglionares de apéndice cecal en todos los microarreglos y
adicionalmente controles internos en aquellos microarreglos con tumores del sistema
nervioso central cuya tinción en tejido nervioso normal fue muy intensa. Se evaluaron tanto43
en niños como en adultos carcinomas papilares de tiroides y tumores del sistema nervioso
central. En adultos adicionalmente carcinoma anaplásico de tiroides, adenocarcinoma
colorrectal, carcinoma escamocelular, melanomas, adenocarcinoma de pulmón de célula
no pequeña y carcinoma secretor de mama, cuyo resultado fue negativo, lo cual es
esperado según la literatura cuya positividad puede ser menor al %5, con excepción del
carcinoma secretor de mama en el cual se esperaba un resultado positivo dada la
frecuencia de la fusión en estos tumores cuya negatividad puede deberse a situaciones
preanalíticas como errores en la fijación de la muestra o el tiempo transcurrido desde la
toma de la muestra hasta su estudio la cual es superior a diez años, lo que no permitiría
una recuperación antigénica adecuada. (Ver figura 16).
Ilustración 16. Carcinoma secretor de mama (14A H-E 10x y 40x) (14B PanTRK 10x
y 40x)
Los tumores gliales generaron marcada dificultad en su interpretación toda vez que a pesar
de evaluar el tumor tanto en H-E como en IHQ no fue posible excluir con certeza que se
tratara de neuronas atrapadas y marcación de neuropilo invadido por el tumor y que no
fuera el tumor propiamente dicho. Sin embargo, en la parte correspondiente al tumor en H-
E pudo evaluarse en la IHQ que para todos los tumores el sitio de marcación fue
principalmente en la membrana celular seguido del citoplasma, la intensidad fue
ligeramente mayor en los tumores de alto grado y los tres ependimomas anaplásicos
tuvieron una intensidad leve. Hubo dos tumores pediátricos, glioblastoma multiforme y un
ependimoma anaplásico cuya marcación fue dot-like. Un ependimoma clásico y un
subependimoma fueron negativos. En cuanto al porcentaje de marcación sólo hubo un
caso de un glioma de alto grado que marcó 1% y el resto de tumores estaban en rangos44
superiores a este valor por lo que establecer la positividad o negatividad en estos tumores
no presentó mayor dificultad.45
10. Conclusiones y recomendaciones
Las fusiones oncogénicas de NTRK se encuentran en varios tipos de cáncer. Son comunes
en tumores poco frecuentes y raras en tumores más comunes. La identificación de estas
fusiones puede brindar una oportunidad terapéutica importante para pacientes en estados
avanzados de la enfermedad o inoperables. La tamización apropiada con confirmación por
prueba molecular de la fusión NTRK depende del tipo tumoral y el material disponible. En
la actualidad se continúan con estudios para evaluar la validez y utilidad clínica de estos
estudios, pero es posible que estos demoren años deberán tener en cuenta el desenlace
de los pacientes.
Es de anotar que tanto los tumores gliales y el carcinoma secretor de mama aquí evaluados
requerirán una prueba molecular confirmatoria la cual se realizará en una segunda fase
del proyecto existente por investigadores del Instituto de Biotecnología de la Universidad
Nacional de Colombia (IBUN) y Bayer S.A. Igualmente se sugiere ampliar la muestra con
sarcomas pediátricos que no estaban disponibles al momento de la realización de este
trabajo.
Aunque ya se habían realizado en ocasiones anteriores, en este proyecto se estandarizó
la técnica de microarreglos de tejido en bloques de agarosa-parafina, los cuales dan mayor
estabilidad al cilindro y facilitan el corte en el micrótomo. Igualmente, a través de ellos
también pudo estandarizase la IHQ panTRK con los controles adecuados para realizar la
tamización en los pacientes del Hospital Universitario Nacional de Colombia (HUN) y de la46
Fundación Hospital de la Misericordia (HOMI) y su posterior prueba molecular
confirmatoria. Este protocolo queda disponible para futuros proyectos.47
11. Bibliografía
1. Cocco, E., Scaltriti, M., Drilon, A. (2018). NTRK fusion-positive cancers and
TRK inhibitor therapy. Nature Reviews Clinical Oncology, 155: 731-747.
2. Solomon JP, Benayed R, Hechtman JF, Ladanyi M. (2019). Identifying
patients with NTRK fusion cancer. Annals of oncology: official journal of the
European Society for Medical Oncology,30(Suppl_8): viii16-viii22.
3. Drilon A. (2019). TRK inhibitors in TRK-fusion positive cancers. Annals of
oncology: official journal of the European Society for Medical Oncology, 30
(Suppl_8): viii23–viii30.
4. Amatu A, Sartore- Bianchi A, Siena S (2016). NTRK gene fusions as novel
targets of cancer therapy across multiple tumour types. ESMO Open Cancer
Horizons,1(2): E000023.
5. Zito Marino, F., Pagliuca, F., Ronchi, A., Cozzolino, I., Montella, M., Berretta,
Franco, R. (2020). NTRK Fusions, from the Diagnostic Algorithm to
Innovative Treatment in the Era of Precision Medicine. International Journal
of Molecular Sciences, 21(10):3718.
6. Huang, E. J.,Reichardt, L. F. (2003). Trk Receptors: Roles in Neuronal Signal
Transduction. Annual Review of Biochemistry, 72(1): 609-642.48
7. Deinhardt, K., Chao, M. V. (2014). Trk Receptors. Handbook of Experimental
Pharmacology,220: 103–119.
8. Kheder, E. S.,Hong, D. S. (2018). Emerging Targeted Therapy for Tumors
with NTRK Fusion Proteins.Clinical Cancer Research, 24(23):5807-5814.
9. Lange, A., Lo, H-W. (2018). Inhibiting TRK Proteins in Clinical Cancer
Therapy. Cancers, 10(4):105.
10. Marchiò, C., Scaltriti, M., Ladanyi, M., Iafrate, A. J., Bibeau, F., Dietel, M.,
Reis-Filho, J. S. (2019). ESMO recommendations on the standard methods
to detect NTRK fusions in daily practice and clinical research. Annals of
Oncology, 30(9):1417-1427.
11. Beadling, C., Wald, A. I., Warrick, A., Neff, T. L., Zhong, S., Nikiforov, Y. E.,
Nikiforova, M. N. (2016). A Multiplexed Amplicon Approach for Detecting
Gene Fusions by Next-Generation Sequencing. The Journal of Molecular
Diagnostics, 18(2):165–175.
12. Hsiao, S. J., Zehir, A., Sireci, A. N., & Aisner, D. L. (2019). Detection of tumor
NTRK gene fusions to identify patients who may benefit from TRK inhibitor
therapy. The Journal of Molecular Diagnostics, 21(4):553-571
13. Sheikine, Y., Kuo, F. C., & Lindeman, N. I. (2017). Clinical and Technical
Aspects of Genomic Diagnostics for Precision Oncology. Journal of Clinical
Oncology, 35(9): 929–933.
14. Hechtman, J. F., Benayed, R., Hyman, D. M., Drilon, A., Zehir, A., Frosina,
D., Jungbluth, A. A. (2017). Pan-Trk Immunohistochemistry Is an Efficient
and Reliable Screen for the Detection of NTRK Fusions. The American
Journal of Surgical Pathology, 41(11):1547–1551.49
15. Gatalica, Z., Xiu, J., Swensen, J., Vranic, S. (2018). Molecular
characterization of cancers with NTRK gene fusions. Modern Pathology,
32(1):147-153
16. Solomon, J. P., Linkov, I., Rosado, A., Mullaney, K., Rosen, E. Y., Frosina,
D., Hechtman, J. F. (2019). NTRK fusion detection across multiple assays
and 33,997 cases: diagnostic implications and pitfalls.Modern Pathology,
33(1):38-46
®
17. Quick Ray Manual Tissue Microarrayer user manual
http://unitma.com/pdf/Manual_Quick_Ray.pdf
18. Kim, K. H., Choi, S. J., Choi, Y. I., Kim, L., Park, I. S., Han, J. Y., Chu, Y. C.
(2013). In-house Manual Construction of High-Density and High-Quality
Tissue Microarrays by Using Homemade Recipient Agarose-Paraffin Blocks.
Korean Journal of Pathology, 47(3): 238-244.
19. Choi, C. H., Kim, K. H., Song, J. Y., Choi, S. J., Kim, L., Park, I. S., Chu, Y.
C. (2012). Construction of High-Density Tissue Microarrays at Low Cost by
Using Self-Made Manual Microarray Kits and Recipient Paraffin Blocks.
Korean Journal of Pathology, 46(6), 562-568.
20. Yan, P., Seelentag, W., Bachmann, A., & Bosman, F. T. (2006). An Agarose
Matrix Facilitates Sectioning of Tissue Microarray Blocks. Journal of
Histochemistry & Cytochemistry, 55(1): 21–24.
21. Rudzinski E., Lockwood C. M., Stohr B. A., Vargas, S. O., Sheridan, R.,
Black, J. O Davis, J. L. (2018). Pan-Trk Immunohistochemistry Identifies
NTRK Rearrangements in Pediatric Mesenchymal Tumors. The American
Journal of Surgical Pathology, 42(7): 927–935.50
22. R., Lockwood, C. M., Stohr, B. A., Vargas, S. O., Sheridan, R., Black, J. O
Davis, J. L. (2018). Pan-Trk Immunohistochemistry Identifies NTRK
Rearrangements in Pediatric Mesenchymal Tumors. The American Journal of
Surgical Pathology, 42(7): 927–935.
23. Solomon JP, Hechtman JF (2019). Detection of NTRK Fusions: Merits and
Limitations of Current Diagnostic Platforms. Cancer Research, 79(13): 3163-
3168.
24. De Winnie K, Sorber L, Lambin S,Siozopoulou V,Beniuga G et al (2021).
Immunohistochemistry as a screening tool for NTRK gene fusions: results of
a first Belgian ring trial. Virchows Archiv, 478 (2): 283-291.
25. Gambella A, Senetta R, Collemi G, Vallero S.G, Monticelli M et al (2020).
NTRK Fusions in Central Nervous System Tumors: A Rare, but Worthy
Target. International Journal of Molecular Sciences,21(3):753
26. Geiger TR, Song JY, Rosado A, Peeper DS (2011). Functional
characterization of human cancer-derived TRKB mutations. PLoS One, 6(2):
e16871.51
12. Consideraciones Éticas
11.1 DECLARACIÓN DE CONFLICTOS:
La investigación carece de conflictos de intereses desde el punto de vista de
patrocinios o remuneración alguna (Art. 51 Res. 8430/2003).
11.2 CONSIDERACIONES ÉTICAS Y AMBIENTALES:
Este proyecto se regirá de acuerdo a las normas científicas, técnicas y
administrativas para la investigación en salud, del Ministerio de Salud de Colombia
Resolución No. 8430 del 4 de octubre de 1993; se ajusta a la normatividad
internacional: declaración de Helsinki y a las pautas éticas para la investigación
biomédica preparadas por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las
Ciencias Médicas “CIOMS”. Se someterá a la aprobación del comité de ética de la
Fundación Hospital La Misericordia HOMI y del Hospital Universitario Nacional de
Colombia HUN.
El proyecto se clasifica como investigación sin riesgo para el paciente ya que no se
realizará ninguna intervención o modificación intencionada de las variables
biológicas, fisiológicas, psicológicas o sociales de los individuos ni se modificará el
curso clínico de la enfermedad por la realización del estudio. No se realizarán
acciones que generen impacto sobre el ecosistema (estudio sin impacto ambiental).52
13. Presupuesto
• INSUMOS:
TIPO DE INSUMO COSTO
VENTANA® pan-TRK (EPR17341) , $ 9.800.000
reactivo para 50 pruebas.
OptiView DAB IHC Detection Kit, $ 4.100.000
reactivo para 250 pruebas.
10X EZ PREP SOLUTION, 2L $236.453
Reaction Buffer Concentrate (10X) $ 113.600
LCS, 2L $ 79.500
Hematoxilyn II, 250 pruebas $ 120.700
BLUING REAGENT, 250 pruebas $ 85.200
Label,Blank, Flap. Rollo de 540 $ 214.676
etiquetas térmicas
Punch dermatológico desechable 5 $ 103.768
mm. # 8 punch
INSUMOS PARA MICROARREGLOS $ 150.000
Y OBTENCIÓN DE LÁMINAS
(Cassettes para tejido, parafina,
láminas, laminillas, resina, láminas
cargadas, hematoxilina, eosina, xilol).
Rabbit Mono Neg CTl Ig, 250 pruebas $ 600.000
TOTAL $ 15.603.89753
TOTAL
• RECURSO HUMANO:
TIPO COSTO
INVESTIGADORES PATOLOGÍA $ 4.897.760
BACTERIOLOGA $ 3.639.972
HISTOTECNÓLOGO $ 2.800.000
TOTAL $ 11.337.73254
14. Anexo 1: Variables clínico
demográficas e histopatológicas
Variable Definición Tipo Valores de codificación
Variables demográficas
Edad Tiempo de vida en años Cuantitativa Años
cumplidos al momento del continua
diagnóstico
Sexo Masculino o femenino Cualitativa nominal 0 Masculino
1 Femenino
Variables histopatológicas e Inmunohistoquímicas
Tipo de tumor Sistema de clasificación Cualitativa nominal 1 Carcinoma papilar de tiroides
para definir cada tipo
tumoral según su histología. 2 Adenocarcinoma colorrectal
3 Melanoma
4 Carcinoma escamocelular
5 Adenocarcinoma pulmón
6 Gliomas
7 Carcinoma secretor de mama
Marcación proteínas Patrón de marcación Cualitativo nominal 0 No hay marcación
de fusión gen NTRK tumoral en estructuras de
las células tumorales. 1 Membrana celular
2 Citoplasma
3 Membrana nuclear
4 Núcleo55
Porcentaje Porcentaje de marcación en Cuantitativo 0: 0-<1% (negativo)
marcación células tumorales. nominal
1: ≥ 1-25%
2: 26-50%
3: 51 -75%
4: 76-100%56
Anexo 2: Variables epidemiológicas de los
pacientes
CASO SEXO EDAD DIAGNÓSTICO
(años)
1 F 7 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
2 F 16 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
3 F 14 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
4 F 9 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
5 F 17 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
6 F 12 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
7 F 16 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
8 F 11 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
9 F 15 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
10 F 15 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
11 F 17 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
12 M 15 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
13 M 7 ASTROBLASTOMA
14 F 16 ASTROCITOMA DIFUSO
15 F 4 ASTROCITOMA PILOCÍTICO57
16 F 14 EPENDIMOMA ANAPLÁSICO
17 F 12 ASTROCITOMA PILOCÍTICO
18 F 7 ASTROCITOMA PILOCÍTICO
19 M 11 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
20 M 10 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
21 M 17 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
22 M 13 GANGLIOGLIOMA
23 M 7 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
24 M 7 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
25 M 7 ASTROBLASTOMA
26 M 3 EPENDIMOMA CLÁSICO
27 F 12 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
28 M 5 ASTROCITOMA PILOCÍTICO
29 F 6 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
30 M 5 ASTROCITOMA ANAPLÁSICO
31 F 8 EPENDIMOMA ANAPLÁSICO
32 F 8 EPENDIMOMA ANAPLÁSICO
33 M 3 ASTROCITOMA PILOCÍTICO
34 M 17 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
35 F 6 ASTROCITOMA PILOCÍTICO
36 M 7 ASTROCITOMA PILOCÍTICO
37 F 64 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
38 F 25 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
39 M 37 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
40 F 21 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
41 M 39 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
42 F 23 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES58
43 F 24 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
44 F 26 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
45 F 31 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
46 F 29 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
47 F 19 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
48 F 24 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
49 F 23 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
50 F 24 CARCINOMA PAPILAR DE TIROIDES
51 F 78 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
52 F 64 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
53 F 92 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
54 M 63 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
55 F 70 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
56 M 68 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
57 F 79 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
58 F 86 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
59 M 53 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
60 F 85 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
61 M 49 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
62 F 65 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
63 M 78 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
64 M 68 ADENOCARCINOMA COLORRECTAL
65 M 53 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
66 M 43 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
67 M 65 GLIOMA DE ALTO GRADO
68 F 62 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
69 F 50 GLIOBLASTOMA MULTIFORME59
70 M 69 ASTROCITOMA ANAPLÁSICO
71 F 51 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
72 F 52 SUBEPENDIMOMA
73 F 69 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
74 M 63 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
75 M 69 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
76 F 69 GLIOBLASTOMA MULTIFORME
77 F 61 GANGLIOGLIOMA
78 M 79 CARCINOMA ESCAMOCELULAR
79 F 90 CARCINOMA ESCAMOCELULAR
80 F 62 CARCINOMA ESCAMOCELULAR
81 F 85 CARCINOMA ESCAMOCELULAR
82 M 84 CARCINOMA ESCAMOCELULAR
83 M 76 CARCINOMA ESCAMOCELULAR
84 F 86 CARCINOMA ESCAMOCELULAR
85 M 85 MELANOMA
86 F 82 MELANOMA
87 F 74 MELANOMA
88 M 78 MELANOMA
89 M 57 MELANOMA
90 M 42 MELANOMA METASTÁSICO
91 M 70 ADENOCARCINOMA DE PULMÓN
92 F SD CARCINOMA SECRETOR DE MAMA
93 M 66 CARCINOMA ANAPLÁSICO DE TIROIDESAnexo 3: Organización de los microarreglos
de tejidos
Microarreglo 1:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 1 Caso 2 Caso 3
FILA 2 Caso 4 Caso 5 Caso 6 Caso 7
Microarreglo 2:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 8 Caso 9 Caso 10
FILA 2 Caso 11 Caso 12 Caso 13 Caso 14
Microarreglo 3:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 15 Caso 16 Caso 17
FILA 2 Caso 18 Caso 19 Caso 20 Caso 2162
Microarreglo 4:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 22 Caso 23 Caso 24
FILA 2 Caso 25 Caso 26 Caso 27 Caso 28
Microarreglo 5:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 29 Caso 30 Caso 31
FILA 2 Caso 32 Caso 33 Caso 34 Caso 35
Microarreglo 6:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 36 Vacío Vacío
FILA 2 Vacío Vacío Vacío Vacío
Microarreglo 7:63
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 37 Caso 38 Caso 39
FILA 2 Caso 40 Caso 41 Caso 42 Caso 43
Microarreglo 8:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 44 Caso 45 Caso 46
FILA 2 Caso 47 Caso 48 Caso 49 Caso 50
Microarreglo 9:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 51 Caso 52 Caso 53
FILA 2 Caso 54 Caso 55 Caso 56 Caso 57
Microarreglo 10:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 58 Caso 59 Caso 60
FILA 2 Caso 61 Caso 62 Caso 63 Caso 6464
Microarreglo 11:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 65 Caso 66 Caso 67
FILA 2 Caso 68 Caso 69 Caso 70 Caso 71
Microarreglo 12:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 72 Caso 73 Caso 74
FILA 2 Caso 75 Caso 76 Caso 77 Caso 78
Microarreglo 13:
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 79 Caso 80 Caso 81
FILA 2 Caso 82 Caso 83 Caso 84 Caso 85
Microarreglo 14:65
FILA A B C D
FILA 1 Control Caso 86 Caso 87 Caso 88
FILA 2 Caso 89 Caso 90 Caso 91 Caso 9266
Anexo 4: Cartas de aceptación comité de ética67
Bogotá, D.C., 16 de abril del 2021
Doctora
ERIKA ALESSANDRA LONDOÑO
Residente de Patología Anatómica y Clínica Universidad Nacional de Colombia
Doctor
ORLANDO RICAURTE GUERRERO
Profesor Titular
Departamento de Patología
Universidad Nacional de Colombia
Médico Patólogo
Hospital Universitario Nacional de Colombia
Referencia: Resometimiento del proyecto “Estandarización de un diseño de microarreglos de
tejido para la detección inmunohistoquímica de proteínas fusión del gen NTRK en una serie de
tumores sólidos” (ID: CEI-2021-03-03).
EL COMITÉ DE ÉTICA DE LA INVESTIGACIÓN DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO NACIONAL DE
COLOMBIA
CERTIFICA
Que el proyecto de investigación titulado “Estandarización de un diseño de microarreglos de
tejido para la detección inmunohistoquímica de proteínas fusión del gen NTRK en una serie de
tumores sólidos” (ID: CEI-2021-03-03) cuyo(a) investigador(a) principal es la Dra. Érika Alessandra
Londoño, fue valorado por el Comité́ de Ética de la Investigación del Hospital Universitario
Nacional de Colombia (CEI-HUN) previa verificación del quórum, en la tercera sesión ordinaria del
2021 (11 de marzo de 2021). La evaluación tuvo en cuenta la pertinencia del proyecto, su rigor
metodológico, la calidad científica y el cumplimiento de la normatividad ética, técnica y científica
a la que están sujetas investigaciones como la propuesta. Esta decisión será ratificada en la
siguiente sesión ordinaria del CEI-HUN.68
El proyecto implica investigación en seres humanos, y es compatible con las Normas Científicas,
Técnicas y Administrativas para la Investigación en Salud, descritas en la Resolución No. 8430 de
1993 y la Resolución 2378 de 2008. La categoría de riesgo a los seres humanos a la que el
proyecto se ajusta es la de investigación sin riesgo.
Sus miembros revisaron y aprobaron los siguientes documentos del proyecto:
1. Carta de presentación.
2. Protocolo de investigación, versión 2.0 de abril 15 de 2021.
3. Resumen ejecutivo.
4. Hoja de vida resumida y Certificado de Buenas Prácticas Clínicas de los doctores: - Érika
Alessandra Londoño.
- Orlando Ricaurte Guerrero
- Natalia Olaya Morales.
- Viviana Ariza.
Concepto: El CEI-HUN precisa que el estudio cumple los requisitos de calidad y rigor exigidos, por
lo tanto, se permite APROBAR el protocolo y los documentos previamente mencionados.
Declaración de intereses: Los miembros del Comité declaran no tener intereses en la evaluación
de este protocolo con el Investigador.
Nombre
Cargo69
- Presidente del CEI
- Médico, Especialista en Medicina Interna,
José Guillermo Ruíz
Rodríguez
Especialista en Gerencia en Salud, Especialista en Medicina Crítica y Cuidado
Intensivo.
- Médico, Magister en Genética Humana, Magister en Bioética.
Clara Eugenia
Arteaga Díaz
- Miembro de la comunidad.
Jesús Becerra - Químico Farmacéutico, Magister en Administración de Salud, Magister en
Camargo Atención Farmacéutica, Doctor en Farmacia Asistencial.
Giancarlo Buitrago
Carol Cristina Guarnizo Herreño Itali Linero Segrera
- Médico, Magister en Epidemiología Clínica, Magister en Economía, Doctor en Economía.
- Odontóloga, Magister en Salud Pública, Doctora en Epidemiología.
- Odontóloga, Especialista en Cirugía Maxilofacial, Doctora en Biotecnología.
Javier Hernando Eslava - Médico, Especialista en Anestesiología, Magíster en Dirección
Schmalbach Universitaria, Magíster en Epidemiología Clínica, Doctor en Salud Pública.
María Cristina - Matemática, Magister en física Radiológica y Médica, Doctora en Física de la
Plazas Radiobiología Médica.70
- Médico, Especialista en Medicina Interna, Sub- especialista en Reumatología,
Gerardo Quintana
Magister en Epidemiología Clínica.
Mario Orlando - Médico, Especialista en Bioética, Especialista en Ginecología y Obstetricia,
Parra Pineda Magister en Educación, Magister en Bioética, Doctor en Bioética.7172