Evaluar el efecto del genipin sobre la cabeza del nervio óptico, en un modelo animal de glaucoma
Autor: Córdoba Ortega, Carlos Miguel
Asesor: Ávila Castañeda, Marcel Yecid
Fecha: 2021-01-13
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Oftalmología
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Purpose: Crosslinking of the collagen of the lamina cribrosa and the peripapillary sclera could be a plausible method to modulate biomechanical stress and strain-based injuries in the laminar region caused by glaucoma.
Method: 32 albino Wistar rats distributed in 4 groups, the right eyes were infiltrated via retrobulbar with genipin (15 mM and 150 mcl), BAPN (beta-aminopropionitrile) (10 mM and 150mcl). The left eyes were used as controls. Immediate and weekly IOP measurements were made for 1 month with the Tonolab rebound tonometer. Immunohistochemistry was performed for the S-100 protein and GFAP, to measure the change in the length of the optic nerve and the degree of transport blockage in ONH. Finally, the molecular changes were analyzed using the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).
Results: Genipin did not affect IOP or optic nerve head morphology, BAPN significantly reduced IOP in all treatment groups. The cup / disc ratio in glaucomatous eyes had increased to approximately 0.6 compared to 0.3 in controls. Axial length was more pronounced in BAPN-treated eyes. Finally, we did not observe any change in gene expression in the treatments.
Conclusion: Crosslinking with genipin in rats avoids biomechanical deformation of the peripapillary sclera, has an anti-inflammatory and neuroprotective effect, we did not observe signs of toxicity when evaluating axons, RGCs and macroscopic anatomy of the eyes after retrobulbar injection of genipin. nor from BAPN.

“EVALUAR EL EFECTO DEL GENIPIN SOBRE LA
CABEZA DEL NERVIO ÓPTICO, EN UN MODELO
ANIMAL DE GLAUCOMA”
Carlos Miguel Córdoba Ortega
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de medicina, Departamento de cirugía, Programa Oftalmología
Bogotá, Colombia
2021“EVALUAR EL EFECTO DEL GENIPIN SOBRE LA
CABEZA DEL NERVIO ÓPTICO, EN UN MODELO
ANIMAL DE GLAUCOMA”
Carlos Miguel Córdoba Ortega
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Oftalmólogo
Director (a):
Dr. Marcel Yecid Ávila Castañeda M.D. Oftalmólogo
Codirector (a):
Dra. Zulma Janeth Dueñas Gómez, Lic. Bio. MSc. PHD
Línea de Investigación: Glaucoma, estudio experimental en un modelo animal
Grupo de Investigación: Grupo de Investigación en Ciencias Básicas y Clínicas en
Oftalmología, Universidad Nacional de Colombia.
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de medicina, Departamento de cirugía, Programa Oftalmología
Bogotá, Colombia
2021Toma una idea. Hazla tu vida: piensa sobre ella, sueña sobre ella,
vívela.
Deja que tus músculos, cerebro, nervios y cada parte de tu cuerpo se
llenen de esa idea.
Luego deja todas las demás ideas solas.
Ese es el camino hacia el éxito
(Swami Vivekananda)
Ora por cada una de tus decisiones de hoy…
Tú sabes lo que quieres, pero solo Dios sabe lo que verdaderamente
te conviene.Declaración de obra original
Yo declaro lo siguiente:
He leído el Acuerdo 035 de 2003 del Consejo Académico de la Universidad Nacional.
«Reglamento sobre propiedad intelectual» y la Normatividad Nacional relacionada al
respeto de los derechos de autor. Esta disertación representa mi trabajo original, excepto
donde he reconocido las ideas, las palabras, o materiales de otros autores.
Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación, he
realizado su respectivo reconocimiento aplicando correctamente los esquemas de citas y
referencias bibliográficas en el estilo requerido.
He obtenido el permiso del autor o editor para incluir cualquier material con derechos de
autor (por ejemplo, tablas, figuras, instrumentos de encuesta o grandes porciones de
texto).
Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica, definida
por la universidad.
Carlos Miguel Córdoba Ortega
Nombre
Fecha 13/01/2021VIII Evaluar el efecto del genipin sobre la cabeza del nervio óptico en un modelo animal
de glaucomaAgradecimientos
A Dios por vigilar mi camino siempre y derramar sus bendiciones sobre mis sueños y
anhelos.
A mi esposa y mi amado hijo por todo el cariño, comprensión y por haberme dado su tiempo
con amor infinito para la consecución de mis sueños.
A mis padres por darme la vida y hacer de mi lo que soy sin pedir nada a cambio, por
inculcar en mi los principios y valores y el don de servicio.
A mis hermanos por extenderme su apoyo y brindarme una mano en los tiempos difíciles.
A Magally por haber aceptado este trabajo a pesar de la magnitud, por brindarme su
amistad y apoyo incondicional y encargarse de darle color a este proyecto.
A Jorge, estudiante de la Universidad Nacional por creer en mí y en la elaboración de este
trabajo.
A mis profes, Dr. Ávila por enseñarme a persistir y elaborar ideas que forjaron mi camino
en la investigación. A la Dra. Zulma Dueñas por enseñarme que las personas buenas
existen y por toda su ayuda en la consecución de este trabajo. A la Dra. Amparo Mora
por su cariño y acompañamiento incondicional.
Especial agradecimiento al equipo de bioterio de la Universidad Nacional de Colombia por
la colaboración prestada para el cuidado de los animales.
Al laboratorio de histotecnopatología de la Universidad Nacional de Colombia,
especialmente a Jeidy Acosta por su colaboración en la obtención y preparación de los
tejidos.
Al Servicio Oftalmológico Veterinario SOV por abrirnos las puertas de la institución y
facilitarnos el uso del tonómetro.Resumen y Abstract XI
Resumen
Propósito: La reticulación del colágeno de la lámina cribosa y la esclera peripapilar, podría
ser un método plausible para modular el estrés biomecánico y las lesiones basados en la
tensión en la región laminar causados por el gluacoma.
Método: 32 ratas wistar albinas distribuidas en 4 grupos, los ojos derechos se infiltraron
vía retrobulbar con genipin (15 mM y 150 mcl), BAPN (beta – aminopropilnitrilo) (10 mM y
150mcl). Los ojos izquierdos se usaron como controles. Se realizarón mediciones de la
PIO inmediatas y semanales durante 1 mes con el tonómetro de rebote Tonolab. Se realizó
inmunohistoquímica para la proteína S-100 y GFAP, para medir el cambio en la longitud
del nervio óptico y el grado de bloqueo del transporte en la cabeza del nervio
óptico. Finalmente, los cambios moleculares se analizaron mediante la reacción en cadena
de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR).
Resultados: Genipin no afectó la PIO ni la morfología de la cabeza del nervio óptico,en
cambio, el BAPN redujo significativamente la PIO en todos los grupos de tratamiento. La
relación copa / disco en ojos glaucomatosos había aumentado aproximadamente 0,6 en
comparación con 0,3 en los controles. La longitud axial fue más pronunciada en los ojos
tratados con BAPN. Por último, no observamos ningún cambio en la expresión de genes
en los tratamientos.
Conclusión: La reticulación con genipin en ratas evita la deformación biomecánica la
esclera peripapilar, tiene un efecto antiinflamatorio y neuroprotector, no observamos signos
de toxicidad al evaluar los axones, las CGR y la anatomía macroscópica de los ojos
después de la inyección retrobulbar de genipin ni de BAPN.
Palabras clave: Glaucoma, Genipin, BAPN, RGC, PIO.XII Evaluar el efecto del genipin sobre la cabeza del nervio óptico en un modelo animal
de glaucoma
Abstract
Purpose: Crosslinking of the collagen of the lamina cribrosa and the peripapillary sclera
could be a plausible method to modulate biomechanical stress and strain-based injuries in
the laminar region caused by glaucoma.
Method: 32 albino Wistar rats distributed in 4 groups, the right eyes were infiltrated via
retrobulbar with genipin (15 mM and 150 mcl), BAPN (beta-aminopropionitrile) (10 mM and
150mcl). The left eyes were used as controls. Immediate and weekly IOP measurements
were made for 1 month with the Tonolab rebound tonometer. Immunohistochemistry was
performed for the S-100 protein and GFAP, to measure the change in the length of the optic
nerve and the degree of transport blockage in ONH. Finally, the molecular changes were
analyzed using the real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).
Results: Genipin did not affect IOP or optic nerve head morphology, BAPN significantly
reduced IOP in all treatment groups. The cup / disc ratio in glaucomatous eyes had
increased to approximately 0.6 compared to 0.3 in controls. Axial length was more
pronounced in BAPN-treated eyes. Finally, we did not observe any change in gene
expression in the treatments.
Conclusion: Crosslinking with genipin in rats avoids biomechanical deformation of the
peripapillary sclera, has an anti-inflammatory and neuroprotective effect, we did not
observe signs of toxicity when evaluating axons, RGCs and macroscopic anatomy of the
eyes after retrobulbar injection of genipin. nor from BAPN.
Keywords: Glaucoma, Genipin, BAPN, RGC, IOP.Contenido XIII
Contenido
Pág.
Resumen ........................................................................................................................ XI
Lista de figuras ........................................................................................................... XVV
Lista de tablas ............................................................................................................. XVI
Lista de Símbolos y abreviaturas .............................................................................. XVII
Introducción ....................................................................... ¡Error! Marcador no definido.9
1. Marco teórico .......................................................................................................... 21
2. Justificación .......................................................................................................... 25
3. Objetivos ................................................................................................................ 26
3.1 Objetivo general .............................................................................................. 26
3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 26
4. Metodología ............................................................................................................... 28
4.1 Tipo y diseño del estudio ................................................................................. 28
4.2 Sujetos experimentales .................................................................................... 28
4.3 Procedimiento ................................................................................................. 29
4.3.1 Inducción de la anestesia ................................................................................. 29
4.3.2 Inducción y medición de la presión intraocular ................................................. 29
4.3.3 Infiltración retrobulbar del genipin y del BAPN .................................................. 30
4.3.4 Inmunohistoquímica ......................................................................................... 30
4.3.5 Medición del grosol esclera .............................................................................. 30
4.3.6 Reacción en cadena de la polimerasa RT-PCR ............................................... 31
4.4 Análisis estadístico ........................................................................................... 31
5. Consideraciones éticas ................................................¡Error! Marcador no definido.
5.1 Normatividad ................................................................................................... 32
5.2 Declaración de conlfictos de interes ................................................................ 32
6. Resultados .....................................................................¡Error! Marcador no definido.
6.1 Cambios en la presión intraocular en un modelo de glaucoma ........................ 33
6.2 Cambios en la PIO ante el tratamiento con genipin y BAPN sin glaucoma ....... 34
6.3 El BPNA disminuye la PIO en modelo animal de glaucoma ............................ 35
6.4 El Genipin no genera cambios en la PIO en animales con glaucoma ............. 35
6.5 Cambios anatómicos e histológicos ................................................................. 36XIV Título de la tesis o trabajo de investigación
6.5.1 Cambios en el grosor escleral ........................................................................ 37
6.5.2 Efecto antiinflamatorio de genipin sobre la cabeza del nervio óptico ................ 38
6.6 Cambios en la expresión genica causada por el glaucoma ............................. 38
7. Discusión ......................................................................¡Error! Marcador no definido.
8. Conclusiones y recomendaciones ..............................¡Error! Marcador no definido.
9. Bibliografía ...................................................................¡Error! Marcador no definido.Contenido XV
Lista de figuras
Pág.
Figura 6-1: Diferencias de la PIO entre los sujetos con glaucoma y sin glaucoma.. . 33
Figura 6-2: El BAPN disminuye la PIO en ojos sanos .............................................. 34
Figura 6-3: El BAPN disminuye la PIO en ojos glaucomatosos. ............................... 35
Figura 6-4: El Genipin no genera cambios en la PIO en glaucoma. ......................... 35
Figura 6-5: Cambios anatómicos en el nervio óptico. . 3¡Error! Marcador no definido.
Figura 6-6: Cambios anatómicos en glaucoma con genipin. ..... 3¡Error! Marcador no
definido.
Figura 6-7: Cambios en el grosor esclerar disminuye con genipin. . ........................ 37
Figura 6-8: Efecto antiinflamatorio del genipin ....................................................... 38Contenido XVI
Lista de tablas
Pág.
Tabla 4-1: Grupos experimentales. ................................... ¡Error! Marcador no definido.Contenido XVII
Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviaturas
Abreviatura Término
PIO Presión intraocular
CGR Células ganglionares de la retina
DM II Diabetes Mellitus Tipo II
BAPN Beta – aminopropilnitrilo
GA Gliceraldehido
LALES Angeles Latino Eye Study
GAA Glaucoma de ángulo abierto
OMS Organización Mundial de la salud
CMT Células de la malla trabecular
LIO Lente intraocular
OCT Tomografía de coherencia ópticaContenido 19
Introducción
El glaucoma está caracterizado por un incremento de la presión intraocular (PIO) causada
por una excesiva tensión biomecánica en la cabeza del nervio óptico donde residen las
células ganglionares de la retina (CGR), las cuales se ven afectadas por esta enfermedad
(1). El nervio óptico puede continuar dañándose a pesar de disminuir la presión intraocular,
es por ello que puede existir daño glaucomatoso con presión normal (2). Existen estudios
recientes sobre el manejo de la hipertensión ocular entre los que se destacan algunos
factores de riesgo como la edad, la PIO, la relación excavación disco y el espesor corneal
adelgazado, siendo este último hallazgo un factor importante que ha permitido el estudio
de otras variables involucradas y ha generado un mayor interés en el estudio de las
propiedades biomecánicas del revestimiento ocular y su papel en la fisiopatología del
glaucoma (3, 4).
En trabajos preliminares como el estudio de tratamiento de hipertensión ocular y el estudio
europeo de prevención del glaucoma, se ha determinado la relación inversa existente entre
la diabetes Mellitus tipo II (DM II) y el riesgo de glaucoma, debido a una forma natural de
reticulación de las fibras de colágeno secundarias a la glucosilación no enzimática de las
proteínas, lo que conduce a la rigidez del tejido y por lo tanto un importante factor de
protección ( 5, 6, 7).
Recientemente se ha propuesto la teoría biomecánica del daño glaucomatoso que según
principios de ingeniería se han utilizado para explicar por qué una carga mecánica, la
presión intraocular, puede llevar al desarrollo de una neuropatía óptica glaucomatosa
específicamente dentro de la esclerótica y la lámina cribosa peripapilar influyendo
directamente en la pérdida de células ganglionares de la retina en el glaucoma (8).
Dentro de las alternativas terapéuticas para mitigar dicho daño, se plantea la hipótesis de
reducir estas tensiones excesivas mediante la reticulación de la esclerótica posterior que20 Título de la tesis o trabajo de investigación
rodea el nervio óptico para proteger a las CGR; es así, que dentro de las alternativas
terapéuticas para obtener dicho efecto sobre la esclerótica se encuentra el genipin, un
agente de entrecruzamiento de colágeno no fotoactivado, de origen natural, extraído de la
fruta Gardenia, previamente investigado como colágeno para el uso ocular (9). El genipin
es una molécula que tiene un efecto entrecruzador logrando la adhesión de las fibras de
colágeno y haciendo los tejidos más fuertes y resistentes a la tracción mecánica y a la
deformidad. Genipin-crosslinking se ha utilizado para mejorar la fuerza del cartílago
articular, los tendones de la rótula humana y el refuerzo de la esclerótica posterior con
excelente biocompatibilidad y menor toxicidad, es un agente de reticulación superior
debido a su estabilidad, biocompatibilidad y seguridad general (9, 10, 11). Estudios previos,
han indetificado que la administración retrobulbar de Genipin contribuye a una rigidez
exitosa de la esclerótica posterior de la rata durante 4 semanas; sin embargo, en
condiciones normales, sin presencia de glaucoma, el genipin no mitiga la perdida axonal,
ni tampoco genera cambios en la expresión génica escleral relacionada con el recambio
de la matriz extracelular o en la expresión génica retiniana de citocinas inflamatorias (12).
Tambien, existen otras teorías que refieren que el endurecimiento del complejo nervio
óptico- esclera peripapilar, podría ser un factor protector. Sin embargo, estudios recientes
usando diversas sustancias como glicerladehido, metilglioxal han demostrado efectos
adversos; la aplicación directa de estos agentes de reticulación a la lámina cribosa y la
esclerótica peripapilar puede aumentar la resistencia a la tracción de estas estructuras en
explantes sometidos a análisis extensométricos (13, 14, 15).
Con base en estos antecedentes y buscando un posible método viable para el tratamiento
del glaucoma, el objetivo de este estudio es utilizar un modelo animal de glaucoma y buscar
revertirlo a través del endurecimiento del colágeno utilizando genipin, molécula de origen
vegetal que tiene un efecto entrecruzador y permite la adhesión de las fibras de colágeno,
haciendo los tejidos más fuertes y resistentes a las tracciones mecánicas y a la deformidad
de la lámina cribosa y la esclerótica peripapilar. Las propiedades del genipin permitirían
modular el estrés biomecánico y los mecanismos de lesión basados en la tensión en la
región laminar, evitando así la aparición o ralentización de la progresión de la neuropatía
óptica glaucomatosa.Bibliografía 21
Marco teórico
El glaucoma representa un grupo de enfermedades definidas por una neuropatía óptica
característica que es consistente con la excavación y el debilitamiento de los elementos
del tejido neural y conectivo del disco óptico que resultan de una lesión en los axones a
nivel de la cabeza del nervio óptico que ocasiona el desarrollo eventual de patrones
distintivos de disfunción visual (14,15, 16).
El glaucoma es el padecimiento que provoca mayor número de pacientes con ceguera
irreversible en el mundo siendo la segunda causa de ceguera a nivel mundial, 4,5 millones
de personas lo padecen en la actualidad con proyección a 11 millones de afectados para
el 2020 según datos de la OMS; presenta una Incidencia 1% - 2% en mayores de 40 años
a nivel mundial siendo afectados 2,4 millones por año, y su prevalencia se encuentra entre
el 0 .8% - 7%, este aumenta con la edad y varía de acuerdo poblaciones. En Estados
Unidos constituye la primera causa de ceguera legal en pacientes de raza negra y la
tercera en pacientes de raza blanca, después de la degeneración macular relacionada con
la edad y la retinopatía diabética (16-19). De acuerdo con las características que originan
el glaucoma, se clasifica así (20):
1. Glaucoma primario de ángulo cerrado
2. Glaucoma primario de ángulo abierto
3. Glaucoma de tensión normal
4. Glaucoma secundario (pseudoexfolitaivo, pigmentario neovascular)
5. Glaucoma congénito
6. Otros tipos de glaucoma (inflamatorio, relacionado al LIO, traumático, por tumores
etc.)22 Título de la tesis o trabajo de investigación
Los factores de riesgo relacionados con el glaucoma varían según su clasificación, por
ejemplo, para glaucoma primario de ángulo cerrado: raza de origen mongoloide, sexo
femenino, mayor edad, antecedentes familiares, hipermetropía; en el caso del glaucoma
primario de ángulo abierto: raza negra, miopía, sexo sin diferencia, corneas delgadas,
antecedentes familiares, edad, migraña. La presión intraocular elevada es el factor de
riesgo más importante que, aunque su presencia no define la entidad si está directamente
relacionada con la misma (21,22, 23) .
El diagnóstico del glaucoma se basa en un estudio clínico y paraclínico detallado y de
seguimiento, es necesario realizar fondo de ojo, toma de presión intraocular, gonioscopia,
campos visuales, paquimetria, OCT de nervio óptico (24).
En cuanto al tratamiento, el objetivo fundamental en el glaucoma es reducir la tasa de daño
glaucomatoso a un punto en el que, con suerte, se mantenga la mayor visión funcional
posible y para ello es necesario un buen control de la PIO que se logra a través de terapia
farmacológica (análogos de las prostaglandinas, b agonistas, inhibidores de la anhidrasa
carbónica agonistas simpaticomiméticos, agentes para simpaticomiméticos), terapia laser
(trabeculoplastia, iridotomía) y si falla lo anterior procedimientos quirúrgicos
(Trabeculectomía, cirugías no penetrantes, dispositivos de drenaje, microimplantes) (21-
25).
Durante la última década, los principios de ingeniería se han utilizado para explicar por qué
una carga mecánica: la presión intraocular, puede llevar al desarrollo de una neuropatía
óptica glaucomatosa, que ha permitido proponer la "teoría biomecánica" del glaucoma
(24,25). Ésta, plantea que el comportamiento de los tejidos conectivos de la cabeza del
nervio óptico (específicamente dentro de la esclerótica y la lámina cribosa peripapilar) en
respuesta a la presión intraocular (independientemente de su magnitud) puede influir
directa e indirectamente en la fisiología y fisiopatología de la cabeza del nervio
óptico. Dado que la biomecánica de la esclerótica y la lámina cribosa probablemente
influyen en la pérdida de células ganglionares de la retina en el glaucoma, permite sugerir
que alterar el comportamiento biomecánico teniendo un efecto protector contra
el glaucoma (26). Los estudios realizados en gatos y monos con hipertensión ocular
inducida experimentalmente han demostrado un bloqueo del transporte axonal ortogrado
y retrógrado a nivel de la lámina cribrosa (27), existe alguna evidencia que sugiere que la
rigidez de la esclerótica peripapilar puede ser protectora contra el desarrolloBibliografía 23
de glaucoma en un modelo animal (28). La idea de que alterar el comportamiento
biomecánico podría proteger contra el glaucoma es una hipotesis prometedora. Es
técnicamente posible como se ha hecho previamente usando crosslinking del
colágeno mediante técnicas ya aplicadas in vivo a la córnea en el tratamiento del
queratocono (27-31).
Como ya se mencionó, el Genipin es un agente entrecruzador de origen natural derivado
de la planta gardenia jasminoides y del Genipa americano y ha demostrado ser el agente
entrecruzador menos citotóxico en comparación de otros agentes como el glutaraldehido
(28) Además de ser biocompatible (29) seguro y efectivo como entrecruzador de injertos
en ingeniería de tejidos, así como en la aplicación en el campo de la producción de
medicamentos de liberación sostenida y la aplicación en el microencapsulamiento de
células madres de origen adiposo (30-31). Además del potencial en el manejo de
enfermedades que tienen inflamación ocular, su efecto antiinflamatorio ha sido evaluado
con resultados exitosos (32-34).
Se ha sugerido la rigidez escleral como una terapia potencial para glaucoma y miopía,
Campbell y colaboradores estudiaron in vivo en modelo animal si la inyección retrobulbar
de genipin causa una inmunidad o respuesta inflamatoria en la retina y concluyeron que
no parece causar una respuesta inmune o inflamatoria en la retina (35).
Kimball y colaboradores en un modelo animal concluyó que la reticulación escleral usando
glicerladehido vía subconjutnival en un modelo de glaucoma indujo mayor daño axonal
(36); recientemente Korneva y colaboradores (37) reforzó esta teoría, el entrecruzamiento
con gliceraldehído de la esclerótica en ratones exacerba los cambios glaucomatosos en
los componentes celulares del nervio óptico y la obstrucción del transporte axonal.
En estudios actuales se ha demostrado el factor antiinflamatorio y neuroprotector que tiene
el genipin sin interferir en la función visual (34), sin embargo, existe también la teoría que
probablemente el reblandecimiento del complejo nervio óptico esclera peripapilar y la
extensión de la lámina cribosa podría tener un efecto relacionado con la disminución de la
sobrecarga mecánica ejercida por la presión ocular, por lo tanto es necesario considerar
comparativamente los efectos de la reticulación escleral y el reblandecimiento en la cabeza24 Título de la tesis o trabajo de investigación
del nervio óptico. Para ello, el BAPN un inhibidor conocido de la reticulación del colágeno,
tiene importantes implicaciones en todas las áreas de la cirugía y lesión ocular para el
control de la maduración del colágeno y sus complicaciones en la cicatrización (38-39).
Se ha demostrado que la reticulación de la matriz tiene efectos profundos sobre la
resistencia al flujo de salida y la composición de las células de la malla trabecular (CMT) y
son consistentes con el paradigma emergente de que cuanto más rígido es el CMT, menor
es la facilidad de flujo de salida acuoso a través de la malla trabecular. No se ha
determinado las implicaciones sobre el efecto del BAPN en el complejo nervio óptico
esclera peripailar (38-40).Bibliografía 25
Justificación
El glaucoma corresponde a una patología ocular neurodegenerativa, que afecta
progresivamente la estructura del nervio óptico, alterando la funcionalidad del campo
visual. Esta afección es considerada la segunda causa más frecuente de ceguera a nivel
mundial, después de la catarata (41). En 2013, se estimó que el número de personas con
glaucoma alrededor del mundo era de 64,3 millones, cifra que se incrementaría a 76
millones en 2020 y a aproximadamente 111,8 millones en 2040, convirtiéndose esta
patología en la segunda causa de ceguera en el mundo después de catarata y causando
ceguera bilateral e irreversible a 8.4 millones de personas, que para el 2020 serían 11,2
millones (42, 43).
En Estados Unidos aproximadamente 4.4 millones de personas tienen glaucoma, de los
cuales más de 120.000 personas resultan ciegas. En la población latina, según Los
Angeles Latino Eye Study (LALES) la prevalencia de Glaucoma de ángulo abierto (GAA)
es en promedio de 4.74%, siendo menor en población menor a 50 años (40-49 años;
1.32%) y hasta 16 veces mayor en población mayor de 80 años (21.76%) (40). Otros
estudios realizados en población de 40-80 años sugiere una prevalencia de GPAA en Asia
de 2.31%, África 4.20%, Europa 2.51%, Norte América 3.29%, Latinoamérica y Caribe de
3.65%, Oceanía 2.63% y mundial de 3.05% (44). En Colombia, en un estudio realizado
por Juan Carlos Rueda en el 2005 se encontró en una población de adultos mayores de
50 años de bajos recursos económicos en el nororiente de Colombia una prevalencia del
5.41% de los cuales 84% desconocían este padecimiento (45). La prevalencia de ceguera
es del 0.7% siendo el glaucoma la segunda causa después de la catarata y la retinopatía
diabética (46).26 Título de la tesis o trabajo de investigación
El glaucoma no tiene cura y no es posible recuperar la visión perdida. En la actualidad,
todas las terapias para el glaucoma, tanto farmacológicas como quirúrgicas, se basan en
la necesidad de reducir la presión intraocular (PIO); cuando estos enfoques fallan, no hay
otra alternativa de tratamiento. Por lo tanto, existe una necesidad clínica significativa de
nuevos tratamientos efectivos para la pérdida de visión debida al glaucoma (47, 48). Dado
lo anterior, el presente estudio busca determinar si el tratamiento con genipin resultar ser
antiinflamatorio y neuroprotector para la enfermedad de glaucoma, dado sus efectos de
entrecruzamiento de colageno sobre las células ganglionares de la retina, ya que, se ha
determinado que el genipin protege el revestimineto esclerar por el efecto crosslinking del
colágeno (49-53).
De acuerdo a lo postulado, el interés central del presente estudio es responder a la
pregunta de investigación: ¿Cuál es el efecto del genipin sobre la cabeza del nervio óptico
en un modelo animal de glaucoma?Bibliografía 27
Objetivos
3.1 Objetivo General
Evaluar el efecto biomecánico del genipin sobre el complejo nervio óptico – lámina cribosa
en un modelo animal de glaucoma.
3.2 Objetivos Específicos
• Identificar los cambios morfológicos del complejo nervio óptico posterior a la
infiltración de genipin y de BAPN en la esclera peripapilar.
• Identificar si la aplicación de genipin induce alteraciones de los tejidos oculares
incluyendo la capa de células ganglionares y fibras nerviosas.
• Determinar si el genipin tiene efecto antiinflamatorio y/o neuroprotector.
• Comparar el efecto del entrecruzamiento con genipin en las fibras del nervio óptico
en un modelo de glaucoma respecto a un grupo control con reblandecimiento de
las mismas usando beta – aminopropionitrilo con/sin glaucoma.28 Título de la tesis o trabajo de investigación
Metodología
4.1 Tipo y diseño del estudio
Estudio experimental en modelo animal con ratas albinas, ver la distribución de los
grupos experimentales en la tabla 4-1.
Tabal 4-1. Grupos de acuerdo a los tratamientos experimentales.
GLAUCOMA SIN GLAUCOMA
GRUPO 1: Glaucoma + BAPN (O.D) / GRUPO 3: BAPN (O.D) / Sano (O.I)
Glaucoma (O.I)
GRUPO 2: Glaucoma + Genipin (O.D) / GRUPO 4: Genipin (O.D) / Sano (O.I)
Glaucoma (O.I)
4.2 Sujetos experimentales
En este estudio se utilizaron 32 ratas albinas Wistar con edades entre 8 a 10 semanas,
con un peso de 250-300 gr. Los sujetos fueron distribuidos en 4 grupos (8 animales en
cada grupo), 26 hembras y 6 machos. Todas las ratas se alojaron en un ciclo de 12 horas
de luz y 12 horas de oscuridad proporcionándoles comida y agua ad libitum. Todos los
procedimientos fueron aprobados por el Comité Institucional de Uso y Cuidado de
Animales de la Universidad Nacional de Colombia.Todos los procedimientos se adhirieron
a la Declaración de ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y visual.Bibliografía 29
4.3 Procedimiento
4.3.1 Inducción de la anestesia
Se realizó de acuerdo con lo reportado por Kimball et al (2014) así: una mezcla de ketamina
/ xilazina (100 mg / kg y 10 mg / kg, respectivamente, intraperitoneal; y se aplicó una gota
de tetracaína tópica (0,5%; Alcon, Ginebra, Suiza), como anestésico local para ambos ojos.
Durante la anestesia, los animales permanecerán en una manta de temperatura
controlada a 37 ° C para mantener la temperatura corporal.
4.3.2 Inducción y medición de la presión intraocular
Se realizó las medición de la PIO basal antes de la de la inducción de la hipertensión
intraocular con sutura circulimbar, se utilizó un tonómetro de rebote (tonolab, I CARE). El
procedimiento de sutura se realiza con una sutura de 8/0 (nylon) alrededor del ecuador del
ojo, mediante cinco o seis puntos de anclaje y nudos dobles en la conjuntiva. La sutura
solo comprometió el espacio subconjuntival y, por lo tanto, no la esclerótica. Se realizo
este procedimiento de acuerdo a lo reportado por Liu y colaboradores (54). Posterior a la
sutura circulimbar se realizaron mediciones de manera inmediata de la PIO; estas
mediciones se realizaron entre las 9:00 a.m. y las 11:00 a.m. El tonómetro se calibró
previamente en un ojo canulado, en el que se configuro externamente la PIO en un rango
de 7 a 50 mm Hg utilizando un depósito externo (datos no mostrados). Las ratas despiertas
se sujetaron suavemente con la mano mientras se registraban diez lecturas de tonómetro
en cada ojo. Eliminamos los valores de PIO más bajos y altos y promediamos las ocho
mediciones restantes para representar la PIO de ese ojo. Las mediciones de la PIO se
registraron en 0 (línea de base, justo antes de la inyección y la inducción de hipertensión
ocular), y una vez por semana durante un mes, en relación con el momento de la inyección
retrobulbar y el procedimiento quirúrgico. En cada uno de estos puntos de tiempo, los ojos
de las ratas también se observaron a simple vista en busca de anomalías derivadas de las
inyecciones retrobulbares y la cirugía.30 Título de la tesis o trabajo de investigación
4.3.3 Infiltración retrobulbar de genipin y BAPN
La administración de genipin se realizó a través de una infiltración por vía retrobulbar; para
ello, se utilizó una aguja de insulina por vía inferotemporal (40, 52). Todas las inyecciones
retrobulbares se realizaron utilizando una aguja de jeringa de insulina 31G estéril (aguja
ultrafina BD 300 µl Insulin Syringe; Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ)
insertada en el cuadrante inferior. Las ratas en los grupos de infiltración de genipin /
HBSS, recibieron una única inyección retrobulbar de genipina (Wako Pure Chemical
Industries, Ltd., Richmond, VA) mezclada en HBSS (15 mM y 150 µl) unilateralmente,
mientras que el ojo contralateral se utilizo como control. El procedimiento para la infiltración
de BAPN se aplicó por vía retrobulbar (10 mM y 150 µl) (Sigma Aldrich, St Louis, MO).
Todos los ojos derechos fueron utilizados para el tratamiento y los ojos izquierdos como
controles. Las ratas recibieron un antibiótico tópico (Certi-sporyn, Kansas City, MO) para
evitar infecciones.
4.3.4 Inmunohistoquímica
Los animales fueron sacrificados con euthanex solución inyectable a una dosis de 150
mg/kg por vía IP para una posterior enucleación de los ojos y el nervio optico, estos se
fijaron en paraformaldehído al 4% que contenía tampón fosfato 0,1 M (pH 7,4) a una
temperatura de 4ºC, luego fueron colocados en sacarosa al 30% durante 3 horas. Los ojos
fueron sumergidos en Tissue Tek y se crioseccionaron a 12 µm de espesor. Las secciones
congeladas se montaron y bloquearon con Blocking One (Nacalai Tesque, Japón) y las
secciones de retina se incubaron con S 100 primario (1: 500), y proteína ácido fibrilar glial
(1: 500) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EE. UU).
Se realizaron tinciones con hematoxilina en cortes de tejido con groso de de 15 µm en el
nervio óptico, para indagar el efecto antinflamatorio del genipin y del BAPN.
4.3.5 Medición del grosor escleral
Para la medición del grosor escleral se realizaron cortes de 5 mm del nervio óptico (NO)
en 6 ubicaciones establecidas según protocolo de evaluación sistemática del ojo del ratón
(47).Bibliografía 31
4.3.6. Reacción en cadena de la polimenresa en RT-PCR
Se enuclearon los globos completos, las escleróticas se limpiaron de grasa, tejido y
músculo, se cortaron a lo largo del limbo y se abrieron para crear cuatro cuadrantes,
inmediatamente después de retirado los tejidos se almacenaron en RNA Later durante dos
dias en congelación -20ºC. El epitelio de pigmento retiniano (RPE) se retiró suavemente
y se raspó de la esclerótica con una cuchilla y la esclerótica lavados en PBS para córtala
en trozos pequeños y luego se colocó en un tubo biomasher con trizol; y se centrifugaron
a 4 ° C durante 15 minutos.
Una vez que se adquirió el ARN, la cadena de ADNc se sintetizó a partir de ARN total
mediante transcripción inversa utilizando oligodT y transcriptasa inversa Superscript I.
4.4 Análisis estadístico
Se realizó un análisis de varianza de las medias de los grupos para determinar si existian
diferencias estadísticamente significativas (p<0.05) entre los grupos evaluados con
diferente tratamiento. Se verificó los supuestos de homocedasticidad (test de levene) del
modelo. Para los grupos donde no hubo diferencias entre las varianzas de las medias
(p>0.05), se utilizó la prueba de t de muestras independientes para determinar la
diferencias entre las medias (p <0.05 en la significancia bilateral) de los grupos evaluados.
En los grupos donde hubo diferencias significativas en las varianzas se realizó una
comparación de medias por medio del estadistico de Mann-Whitney para comparar los
datos de los diferentes grupos. Las comparaciones dentro de las mediciones se realizaron
mediante una prueba de Wilcoxon considerando estadísticamente significativo un valor de
p inferior a 0,05.
Se utilizó SPSS v22 para realizar todos los análisis estadísticos.32 Título de la tesis o trabajo de investigación
Consideraciones éticas
5.1 Normatividad
Todos los procedimientos que se llevarán a cabo durante el desarrollo de esta
investigación se basan estrictamente en lo estipulado por la Ley 84 de 1989, especialmente
lo mencionado en el capítulo VI: Del uso de animales vivos en experimentos e
investigación; así mismo la reglamentación estipulada en la Resolución Nº 008430 de 1993
del Ministerio de Salud y Protección Social de Colombia, en la cual se establecen las
normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en salud, cumpliendo a
cabalidad especialmente lo mencionado en Título V, en donde se mencionan los requisitos
para llevar a cabo investigación biomédica con animales, siendo la presente investigación
justificada en revisiones previas de artículos concernientes a modelos animales para
estudio de glaucoma y a nuestro entender el primer modelo de infiltración directamente en
el nervio óptico. Para el desarrollo de este estudio se seleccionarán y adquirirán
legalmente ratas de la cepa CD1, de las cuales se hará uso del mínimo número requerido
para obtener resultados científicamente válidos y se mantendrán en adecuadas
condiciones sanitarias cumpliendo las reglamentaciones sanitarias en vigencia.
Según la resolución 8430 de 1993, se considera este estudio como una “investigación con
riesgo mínimo” ya que el sujeto de investigación de este estudio, corresponde a
investigación en modelo animal sujeto a todos los parámetros establecidos por la norma.
Los animales serán mantenidos en condiciones controladas de bioterio y serán manejados
bajo los protocolos de la Asociación para investigación en Oftalmología (ARVO)
5.2 Declaración de Conflicto de Intereses
Se declara que no existen conflictos de intereses por parte del investigador con el
desarrollo del presente estudio.Bibliografía 33
Resultados
Se utilizaron 32 sujetos experimentales (8 por cada grupo) 26 hembras y 6 machos. A
todos los sujetos se les realizó medición de la presión intraocular dos veces durante el
primer día (2 minutos y 1 hora) y una vez por semana duarante 30 días.
6.1 Cambios en la presión intraocular a través de una técnica
inductora de glaucoma
La cirugía circulimbar generó un incremento de la PIO durante el procedimiento quirúrgico
a un nivel de 98 mmHg que fue disminuyendo gradualmente durante el mismo día de la
cirugía a un nivel de 21,8 ± 2,42 mmHg. A lo largo de las cuatro semanas la PIO en los
sujetos con cirugía limbar se mantuvo en un promedio de 19,35 mmhg en comparación
con los sujetos sin intervención quirúrgica con una PIO de 8,25 ± 2,35 mmhg (ver figura
6-1), con una diferencia significativa entre las medias de los dos grupos durante las 4
semanas (p= 0,001 para la semana 1 y 2, y una diferencia de p= 0,02 para la semana 3 y
4).
Figura 6-1. Diferencias de la PIO entre los sujetos con glaucoma y sin glaucoma. LB
(Línea Base) fue registrado previamente a la cirugía, 6,45 mmhg fue promedio de todos
los sujetos.
25,0 21,8 22,4
19,5
19,9
20,0
G15,0 Glaucoma
H
M10,0 6,9 Sano
M 5,0 8,5 9,25
7,9 8,5
6
0,0
LB 1 2 3 4
SEMANAS34 Título de la tesis o trabajo de investigación
6.2 Cambios en la PIO ante el tratamiento con genipin y BAPN sin
glaucoma.
Se administró una sola vez el tratamiento con BAPN y Genipin en ojos sanos sin
intervención quirurgica y se comparo con un grupo control. Se encontró una disminución
de la PIO en la segunda y tercera semana en los sujetos con BPNA (P= 0, 010); estos
cambios no se vieron reflejados en la PIO de los sujetos con ojos sanos (P= 0.83), lo que
indica que la PIO se mantvo igual durante las cuatro semanas en los ojos sanos. De
manera contraria, en el trataminto con genipin durante la semana 1 y 2 la PIO estuvo un
poco más elevada (p= 0, 055) en comparación con los ojos de los sujetos sanos (ver figura
6-2).
Figura 6-2. El BAPN disminuye la PIO en ojos sanos, mientras que el Genipin eleva
la PIO durante las dos primeras semanas. Datos de la PIO con infiltración con BAPN en
ojos sanos (color azul) cmparado con la ojos sanos sin ninguna intervención (color rojo).
16
14
12
INFILTRACIÓN
g 10
h BAPN
m 8
m 6 SANO
4
2
0
1 2 3 4
Semanas
6.3 El BPNA disminuye la PIO en ojos glaucomatosos
El BPNA fue administrado una sola vez en el ojo derecho posterior a la cirugía limbar. Se
encontró una disminnucón de la PIO durante la semana 1y 2 en la PIO en los sujetos con
BAPN (p= 0,015) en comparación con los sujetos con glaucoma sin tratamiento (p= 0,859);
sin embargo, en la semana 3 y 4 no se encontraron diferencias en la PIO para ambos
grupos (glaucoma con BAPN P=0,274, y glaucoma p= 0,594) (ver figura 6-3).Bibliografía 35
Figura 6-3. El BAPN disminuye la PIO en modelo de glaucoma durante las dos
primeras semanas.
25 22
20
20 16 16
20 Glaucoma con BPNA
G
15 18
H
M 16 16 Glaucoma
10
M
5
0
1 2 3 4
SEMANAS
6.4 El Genipin no genera cambios en la PIO en animales con
glaucoma
El Genipin fue administrado una única vez en el ojo derecho posterior a la cirugía. No se
encontraron diferencias significativas entre el grupo con glaucoma tratados con genipin (p
= 0,619) y el grupo con solo glaucoma durante las 4 semanas (p=0,341) (Ver figura 6-4).
Figura 6-4. El Genipin no genera cambios en la PIO en glaucoma. Valores de la presión
intraocular en glaucoma con infiltración de genipin. La línea roja refiere los valores de la
PIO con glaucoma durante 4 semanas. La línea azul refiere los valores de la PIO en modelo
animal de glaucoma con infiltración de genipin.
26 25,5
25,5 25
25
24,5 23,9
g H 24 24,1 23,25 Glaucoma y
m 23,5 Genipin
m
23,6 Glaucoma
23
22,5
22,9 22,875
22
21,5
1 2 3 4
Semanas36 Título de la tesis o trabajo de investigación
6.5 Cambios anatómicos e histológicos
Con respecto a los cambios anatómicos en el nervio óptico encontramos una relación copa-
disco en los ojos glaucomatosos sin tratamiento que había aumentado 0,6 mm en
comparación con los 0,2 mm de los controles (Ver figura 6-5).
Figura 6-5. Cambios anatómicos en el nervio óptico. A. Ojo izquierdo sin glaucoma ni
tratamiento. B. Ojo derecho glaucomatoso sin tratamiento.
A. B.
En adición, la longitud y el ancho axiales aumentaron significativamente con la PIO elevada
en los ojos de solo glaucoma frente a los ojos tratados con genipin. La longitud axial fue
mas pronunciada en los ojos tratados con BAPN (Ver figura 6-6).
Figura 6-6. Cambios anatómicos en grupo con glaucoma con genipin. A. Ojo derecho
glaucomatoso. B. Ojo derecho glaucomatoso con infiltración de genipin.
A. B.Bibliografía 37
6.5.1 Cambios en el grosor esclerar
Con respecto al cambio en el grosor esclerar, encontramos en los ojos controles sin
glaucoma una media de 152 ± 2,1 µm en comparación con el gurpo de glaucoma con un
incremento en el grosor esclerar de 157± 6,7 µm con una diferencia significativa de
(p=0.045). Con respecto a los tratamientos, encontramos que el genipin en los ojos con
glaucoma incrementó signitificativamente el grosol esclerar (161 ± 1,6 µm) con respecto al
glaucoma y al control (P=0,036). En contraste, con el grupo de BAPN que no presento
diferencias significativas (P: 0,82) con el grupo control ni con el grupo de genipin con
glaucoma (ver gráfica 6-7).
Figura 6-7. Cambios en el grosor esclerar por el glaucoma con tratamiento con
genipin. A. Ojo derecho glaucomatoso. B. Ojo derecho glaucotmatoso con infiltración de
genipin.
A. B.
6.5.2 Efecto antinflamatorio del genipin sobre la cabeza der nervio
optico
A través de las tinciones con hematoxilina se evidenció una disminución de la deformación
de la esclera peripapilar en el grupo con glaucoma con infilitración de genipin en
comparación con el grupo control (P=0.039), evidenciando que, el genipin mitiga la rapidez
de la deformación biomecánica del nervio óptico causado por el glaucoma, ver figura 6-8 .
No se encontraron diferencias entre los ojos con infiltración de BAPN con glaucoma.38 Título de la tesis o trabajo de investigación
Tampoco se encontraron diferencias entre el grupo control y los de infiltración con genipin
o BAPN. Claramente genipin parecer disminuir la excavación del nervio óptico.
Figura 6-8. El genipin tiene un efecto antinflamatorio sobre la cabeza der nervio optico
afectado por el glaucoma. A. Ojo derecho glaucomatoso con infiltración de genipin.
Relación copa disco 0.4. B. Ojo izquierdo glaucomatoso sin genipin, relación copa disco
0.8
A. B.
6.6 Cambios en la expresión genica causada por el glaucoma
Para identificar los cambios generados sobre el glaucoma en las células ganglionares de
la retina y en la expresión de otras proteinas, se realizó RT-PCR con los siguientes genes:
-GFAP (glial fibrilary acid protein) para mirar la activación de astrocitos como agente activo
inflamatorio, genes pro supervivencia con baja regulación: Ywhaz, Ywhab (Factor de
estimulación de la importación mitocondrial), Cpg 15 (Promotor el crecimiento de neuritas),
C3, B actin, Gadd45. Los resultados mostraron mayor expresión de GFAP y una menor
expresión de los genes C3, y Cpg 15 en el grupo de glaucoma, pero no se encontraron
diferencias entre los grupos con glaucoma con tratamiento de genipin y BAPN.Bibliografía 39
Discusión
El presente estudio evaluó el efecto biomecánico del BAPN y del genipin sobre el nervio
óptico identificando cambios en la presión intraocular, en la reticulación escleral, y en la
histología del nervio óptico en un modelo animal de glaucoma.
Se encontró que a través de la sutura circunlimbar se genera una hipertensión ocular
crónica característico del glaucoma al observar una elevada PIO durante cuatro semanas
en comparación con el grupo control; estos hallazgos son similares a otros estudios donde
el modelo de sutura circunlimbar resulta eficiente para realizar mediciones de la PIO
durante varias semanas permitiendo identificar cambios histopatológicos que inducen
alteraciones en las CGR causados por el glaucoma (54, 56).
Con el fin de determinar el efecto de estos tratamientos en condiciones normales, se evaluó
los cambios de la PIO con BAPN y genipin en ojos sin glaucoma, encontrando que el BAPN
en condiciones normales disminuye levemente la PIO durante la semana dos y tres,
mientras que el genipin eleva la PIO durante las dos primeras semanas. Para indagar su
efecto sobre el glaucoma se utilizó el BAPN como tratamiento inhibidor de la reticulación
del colágeno, encontrando que, la administración de BAPN disminuye la PIO durante las
dos primeras semanas en comparación con el grupo de solo glaucoma; por el contrario, el
tratamiento con genipin como inductor de colagéno no generó ningún cambio en la PIO en
el grupo con glaucoma. Esto resulta similar a los hallazgos de Moorhead y colaboradores,
donde utilizó BAPN como tratamiento posquirúrgico en pacientes con glaucoma severa
durante 3 meses, el cual disminuir la PIO cerca de un 74% (22mmHg) al valor inicial pre
quirúrgico (40 +/- 14.1 mmH) (57); y a los hallazgos de Hannon y colaboradores (50) donde
la rigidez escleral inducida por genipin no afectó la PIO durante 4 semanas.
Con respecto a la morfología, el tratamiento con genipin aumentó la reticulación escleral y
no alteró la morfología de la cabeza del nervio óptico ni la esclera peripapilar después de
4 semanas de tratamiento; en contraste, el tratamiento con BAPN no presentó diferencias
significativas con los ojos tratados con genipin. En estudios previos se observó la rigidez
exitosa de la esclerótica posterior de la rata durante 4 semanas después de una única
inyección retrobulbar de genipin (50,53). La exposición a genipin por sí solo no produjo40 Título de la tesis o trabajo de investigación
pérdida de axones de las células ganglionares a través de un efecto tóxico directo,
evidenciando un proceso inflamatorio reducido para los tejidos tratados con genipin, y
aparentemente no se evidenció daño en otras capas de la retina según lo evaluado por
histología.
Según lo expuesto por Kimball y colaboradores (36), en un estudio en modelo animal con
ratones CD1, sugieren que las alteraciones en la esclerótica inducidas por el tratamiento
con GA condujeron a una mayor pérdida de axones de células ganglionares debido a la
disminución de la tensión escleral (aumento de la rigidez), especialmente en la región
peripapilar; los ojos de ratón tratados con GA tuvieron una mayor pérdida de axones RGC
por la PIO elevada que los ojos inyectados con tampón o los ojos de control, controlando
el nivel de exposición a la PIO. En este estudio, se comprobó que el genipin tiene un efecto
antiinflamatorio importante en comparación con los controles sin tratamiento y con
glaucoma, esto se evidenció a través de una disminución de la infiltración celular
característico de los procesos inflamatorios agudos típicos de la enfermedad
glaucomatosa.
Koo y colaboradores (58), demostraron que el genipin posee un efecto antiinflamatorio y
es un eliminador de radicales hidroxilos específicos. También se presentan sus
propiedades antiangiogénicas e inhibidoras de la producción de oxido nítrico (NO); además
Hannon y colaboradores (50) comprobaron que el endurecimiento escleral posterior con
una única inyección retro bulbar de genipin 15 mM no provoca déficits sostenidos en la
función visual o retiniana ni a nivel molecular en la retina ni en la esclerótica. En nuestros
hallazgos la morfología del axón de las células ganglionares de la retina parecía normal al
identificar que la morfología del nervio óptico se mantiene conservada ante la presencia
del genipin igual que con el BAPN, incluso, se observa un alargamiento del canal escleral
de los ojos tratados con BAPN.
Nuestras comparaciones con BAPN a una concentración de 10mM demostraron un
importante alargamiento del diámetro anteroposterior del globo ocular con respecto a los
tratados con genipin, además moduló la PIO con resultados mas bajos a los observados
en los tratamientos de reticulación escleral, sin embargo, las diferencias histológicas son
similares en los diferentes grupos de tratamiento, es decir, que el genipin no modifica las
morfología de las capas de la retina ni del nervio óptico, ni en condiciones normales ni con
presencia de glaucoma. Con respecto al BAPN, este no genero efectos tóxicos en losBibliografía 41
tejidos tal cual como lo demuestra Yang y colaboradores (38) en todas las secciones los
tratamientos no tóxicos para las células de la malla trabecular, y que los efectos del flujo
de salida no se debían a la pérdida de células.
Con respecto a los cambios en la expresión genética causados por el glaucoma, algunos
estudios han encontrado una mayor expresión de genes prosupervivencia, genes pro
inflamatorios y pro apoptóticos (59), nuestro objetivo fue identificar si esta expresión de
genes podia revertise ante los tratamientos con genipin o glaucoma, sin embargo, no
encontramos diferencias significativas en la expresión de los genes Cpg 15, C3, B actin,
Gadd45, GFAP entre los grupos con tratamiento, posiblemente estos hallazgos sugieren
que existe una gran variedad de cambios en la expresión génicas de las celulas
gaglionares de la retina glaucomatosas que involucran multiples vias moleculares,
incluidos genes pro supervivencia que mitigan las acciones de agentes pro inflamatorios y
pro apoptóticos.
Este estudio es pionero en utilizar el BAPN como inhibidor de la reticulación por vía
retrobulbar en un modelo animal de glaucoma para determinar los efectos del
reblandecimiento a nivel del complejo nervio óptico esclera peripapilar, para establecer un
papel neuroprotector en la neuropatía óptica glaucomatosa.42 Título de la tesis o trabajo de investigación
Conclusiones y recomendaciones
La reticulación de la esclerótica con genipin en ratas evita la deformación biomecánica la
esclera peripapilar con respecto a la evaluación de los controle, tiene un efecto
antiinflamatorio y neruoprotector, no observamos signos de toxicidad al evaluar los axones
RGC y la anatomía macroscópica de los ojos después de la inyección retrobulbar de
genipin ni tampoco de BAPN. La diferencia más representativa en este trabajo con
respecto al tratamiento con genipin y BAPN, es que este último parece modular la PIO en
etapas tempranas de la enfermedad y no deforma el complejo nervio óptico esclera
peripailar en este modelo animal y prolonga el canal escleral. Este trabajo sienta las bases
para futuros estudios in vivo para evaluar el entrecruzamiento escleral inducido por genipin
para el tratamiento del glaucoma y es pionero en el uso de BAPN como probable alternativa
en el tratamiento de la neuropatía óptica glaucomatosa.
Los presentes experimentos tienen ciertas limitaciones. Los ojos de las ratas y las
respuestas oculares y sistémicas en el modelo de glaucoma animal deben interpretarse
con precaución con respecto al glaucoma humano.
Se necesitan más estudios experimentales para ver la compatibilidad de los resultados, los
estudios prospectivos futuros deben evaluar el papel de la rigidez ocular en el desarrollo y
progresión del glaucoma.Bibliografía 43
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