Obtención de Etanol a partir de la Borra de Café
Autor: Agudelo Aguirre, Roberto Arturo
Asesor: Rodríguez Valencia, Luis Angel (Thesis advisor)
Fecha: 2002
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Esta investigación plantea el aprovechamiento biotecnológico de la borra de café, generada masivamente como subproducto de desecho en las industrias de café soluble, en la obtención de  etanol a partir del componente celulósico de la borra deslignificada enzimáticamente y contribuye con metodologías innovativas en la solución de la contaminación ambiental que ocasiona este  residuo y su recuperación actual por el carácter contaminante de los procedimientos disponibles.  Inicialmente se caracterizó químicamente la borra de café, encontrando como principales componentes lignina en 35,17%, celulosa en 33,46% y extractivos en 30,38%. La recuperación y el  aprovechamiento del contenido celulósico se realizó por deslignificación enzimática y por sacarificación - fermentación simultánea del material deslignificado. Las enzimas ligninolíticas se  obtuvieron en extractos de fluidos extracelulares parcialmente purificados, de los organismos con mayor potencial de degradación microbial de contaminantes ambientales recalcitrantes, el hongo P.  chrysosporium BKM-F1767 y la bacteria S. viridosporus T7A en condiciones In vitro de inducción y crecimiento regular. Los extractos del hongo y la bacteria se cuantificaron tanto gravimétrica  como bioquímicamente, obteniendo respectivamente 95 mg y 0,1226 U/mg proteína de actividad enzimática, 750 mg y 232,70 U/mg de proteína, para los respectivos organismos. En la  deslignificación se evaluaron tres relaciones de concentrado bacteriano (1,94 mg/g , 0,90 mg/g y 0,65 mg/g) y las remociones de lignina fueron de 9,78%, 21,87% y 20,34% respectivamente; siendo revalidadas con la cuantificación de lignina hidrosoluble recuperada de los tratamientos. Cantidades iguales de borra sin deslignificar (control de deslignificación) y con el mayor grado de remoción de lignina, se sometieron a sacarificación y fermentación simultánea con el complejo celulolítico Econase y la levadura termotolerante S. cerevisiae D5A, mediante la dosificación del complejo en términos de su actividad celulolítica total (10 IFPU/g y 20 IFPU/g) y en porcentaje (2% y 5%). La obtención de etanol estuvo asociada únicamente con la deslignificación de la borra, produciendose las máximas concentraciones volumétricas el día 4 con 27,84%, 21,89% y 25,81% con las dosificaciones de 10 IFPU/g de celulosa, 2% y 5%, respectivamente; concluyendose que la borra puede ser aprovechada biotecnologicamente, mediante deslignificación enzimática bacteriana y sin la generación de efluentes contaminantes en la obtención de etanol por hidrólisis celulolítica y fermentación etanologénica simultánea

THE NATIONAL UNIVERSITY OF COLOMBIA
FACULTY OF ENGINEERING
ROBERTO AGUDELO. Final Dissertation.
Agudelo, R. 2002. Ethanol Production from Spent Coffee Grounds. The National University of
Colombia at Manizales. The National University of Colombia Dissertations from the Faculty of
Engineering and Architecture. 121 pp. System Number 34779.
Abstract
This study deals with the biotechnological use of spent coffee grounds (SCG), produced at the
industrial coffee brewing stage in the instant coffee making industry, for ethanol production by a
sequential biological delignification pretreatment and further simultaneous saccharification and
fermentation (SSF) process. A primary chemical characterization of SCG was carried out to
establish major lignocellulosic components; the highest compositions were 35.17% wt for total
lignin (quantified as soluble and insoluble lignin) and cellulose 33.46% wt. Other components
found in SCG were extractives (30.38% wt) and ash in minor proportion. The cellulosic content
was targeted specifically at enzyme saccharification by releasing it from lignin by using lignin-
removing enzymes previously obtained from the fungus P. chrysosporium BKM-F1767 and the
bacterium S. viridosporus T7A. Ligninolytic enzymes from the fungus and the bacterium were
produced by induction with veratryl alcohol and by regular growth, respectively. Isoenzymes
from P. chrysosporium showed the highest ligninolytic activity (232.70 U/mg protein) with
respect to S. viridosporus (0.1226 U/mg protein). Delignification was carried out using enzyme
ratios of 1.94 mg/g, 0.90 mg/g and 0.65 mg/g of SCG previously conditioned, obtaining effective
lignin removals of 9.78%, 21.87% and 20.34% of the total lignin content in the treated material,
respectively. In each case, delignification grade was validated by quantification of acid-
precipitable polymeric lignin produced after enzyme treatment. SCG with the lowest residual
lignin content was used as raw material for SSF process, employing simultaneously the
cellulolytic complex Econase at dosages of 10 IFPU/g and 20 IFPU/g cellulose, 2% and 5% wt
in the reaction mixture with a typical size inoculum of the thermotolerant yeast S. cerevisiae
strain D A from National Renewable Energy Laboratory. The SSF treatments were run during
5
120 h at 37C and pH 4.5 which were operation conditions synergistically suitable for both
cellulolytic enzymes and fermentative microorganism. The highest ethanol yield of 27.84% (by
volume) was obtained using 10 IFPU/g at 96 h and the lowest one (21.8%) was reached by a
complex dosage of 2%. However, no ethanol production was found for SCG treated by SSF with
no previous delignification step leading to conclude that enzyme delignification improve
substantially the spent coffee digestibility for further enzyme saccharification, and SCG is a
promising raw material for ethanol production by unified SSF configuration. 
Keywords: Biological delignification; Coffee by-products; Ethanol; Spent-coffee grounds; SSF.OBTENCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE LA BORRA DE CAFÉ
ROBERTO ARTURO AGUDELO AGUIRRE
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MANIZALES
FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
MANIZALES
2002OBTENCIÓN DE ETANOL A PARTIR DE LA BORRA DE CAFÉ
ROBERTO ARTURO AGUDELO AGUIRRE
Trabajo de investigación para optar al título de
Ingeniero Químico
Director
LUÍS ÁNGEL RODRÍGUEZ V.
Ingeniero Químico
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MANIZALES
FACULTAD DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA
CARRERA DE INGENIERÍA QUÍMICA
MANIZALES
2002Nota de aceptación
Presidente del Jurado
Jurado
Jurado
Manizales, 15 de Febrero de 2002A la memoria de mi padre, a mi
madre y mis hermanos por su
constante compañía, M. A y mis
amigos por su apoyo y a Dios por
permitirme disfrutarlos.
IVAGRADECIMIENTOS
El autor expresa sus agradecimientos al Centro Nacional de Investigaciones de Café (Cenicafé) por
el soporte técnico y financiero para la realización de esta investigación, a Arnubio Valencia
(Departamento de química, Universidad de Caldas), Juan C. López y Helena T. Velásquez
(Disciplina de Entomología, Cenicafé) por la orientación durante el transcurso de la
experimentación.
A su vez, hace un reconocimiento especial a Donnald L. Crawford (Department of Microbiology,
Molecular Biology, and Biochemistry; University of Idaho. EE.UU), Hakan Bermek y Karl-Erik L.
Eriksson (Department of Biochemistry and Molecular Biology; University of Georgia. EE.UU),
George P. Philippidis y Tammy K. Hayward (National Renewable Energy Laboratory, Department
of Energy. EE.UU), T. Kent Kirk (Department of Bacteriology, University of Wisconsin. EE.UU) y
Rita M. Rentmeester (Forest Products Laboratory, Department of Agriculture. EE.UU) por la
asistencia metodológica y el suministro de los materiales biológicos y bibliográficos que se
emplearon en esta investigación, a David A. Hopwood (Department of Genetics, John Innes Centre.
Inglaterra), Mercedes Ballesteros P. (Centro de Investigaciones Energéticas Medioambientales y
Tecnológicas. España) y Frederick Archibald (Pulp and Paper Research Institute of Canada.
Canadá) por los invaluables aportes que hicieron posible alcanzar los objetivos propuestos en este
estudio.
VCONTENIDO
pág.
1. INTRODUCCIÓN 1
2. OBJETIVOS DEL ESTUDIO 3
2.1 OBJETIVO GENERAL 3
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 3
3. HIPÓTESIS DE TRABAJO 4
4. MARCO TEÓRICO 5
4.1 BORRA DE CAFÉ 5
4.1.1 Principales componentes de la borra del café 5
4.2 APROVECHMIENTO DEL COMPONENTE CELULÓSICO 8
4.2.1 Métodos de deslignificación de materiales lignocelulósicos. 8
4.2.1.1 Química. 8
4.2.1.2 Física. 9
4.2.1.3 Fisicoquímica. 9
4.2.1.4 Bioquímica. 9
4.2.2 Transformación de celulosa a etanol 17
4.2.2.1 Enzimas celulolíticas. 18
4.2.2.2 Fermentación etanologénica. 19
4.2.2.3 Sacarificación y fermentación simultánea. 19
5. MATERIALES Y MÉTODOS 23
5.1 UBICACIÓN 23
5.2 MATERIALES 23
5.2.1 Materia prima 23
5.2.2 Microorganismos ligninolíticos 23
5.2.3 Complejo celulolítico 23
5.2.4 Microorganismo fermentativo 23
5.3 METODOLOGÍA 23
5.3.1 Etapa 1. Caracterización lignocelulósica de la borra de café 24
5.3.1.1 Contenido de componentes extractivos. 24
5.3.1.2 Contenido de cenizas. 24
VI5.3.1.3 Contenido de lignina. 24
5.3.1.4 Determinación de celulosa. 25
5.3.1.5 Análisis estadístico. 25
5.3.2 Etapa 2. Producción y evaluación de enzimas ligninolíticas de P. chrysosporium BKM-F-
1767 y S. viridosporus T7A 25
5.3.2.1 Enzimas LiP de P. chrysosporium 26
5.3.2.2 Enzimas ALiP de S. viridosporus 30
5.3.2.3 Análisis estadístico. 33
5.3.3 Etapa 3. Deslignificación enzimática de la borra de café 34
5.3.3.1 Acondicionamiento del material. 34
5.3.3.2 Tratamientos enzimáticos de deslignificación. 34
5.3.3.3 Recuperación y cuantificación de la borra residual 35
5.3.3.4 Recuperación y cuantificación de APPL 35
5.3.3.5 Variable de respuesta 35
5.3.3.6 Análisis estadístico 36
5.3.4 Etapa 4. Obtención de etanol a partir del producto deslignificado 37
5.3.4.1 Tratamientos de SSF. 37
5.3.4.2 Tratamientos de control. 38
5.3.4.3 Seguimiento de las variables de proceso. 39
5.3.4.4 Análisis estadístico. 40
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 41
6.1 CARACTERIZACIÓN QUIMICA DE LA BORRA DE CAFÉ 41
6.2 OBTENCIÓN Y EVALUACIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS DE P.
chrysosporium Y S. viridosporus. 42
6.2.1 Enzimas LiP de P. chrysosporium. 42
6.2.1.1 Efecto de la dosis de esporas en la actividad enzimática de LiP. 44
6.2.1.2 Absortividad molar del Azure B. 45
6.2.1.3 Producción y caracterización bioquímica de LiP. 46
6.2.2 Enzimas ALiP de S. viridosporus 48
6.2.2.1 Crecimiento exponencial de S. viridosporus. 48
6.2.2.2 Efecto de la dosis de células en la actividad enzimática de ALiP. 50
6.2.2.3 Producción y caracterización bioquímica de ALiP. 52
6.3 DESLIGNIFICACIÓN ENZIMÁTICA DE LA BORRA DE CAFÉ 54
6.3.1 Cuantificación de la variable lignina total 54
6.3.2 Cuantificación de APPL en el filtrado 56
6.3.3 Caracterización química de la APPL 57
6.4 Etapa 4. Obtención de etanol a partir del producto deslignificado 58
6.4.1 Actividad celulolítica de Econase 58
6.4.2 Seguimiento de las variables de SSF 59
6.4.2.1 Comportamiento de las variables con borra deslignificada. 59
6.4.2.2 Comportamiento de las variables con borra sin deslignificación. 65
6.4.3 ESTUDIO CINÉTICO DEL PROCESO SIMULTÁNEO DE SACARIFICACIÓN Y
FERMENTACIÓN 71
VII7. CONCLUSIONES 80
8. RECOMENDACIONES 82
LITERATURA CITADA 83
VIIITABLAS
Pág.
Tabla 1. Principales propiedades catalíticas de las enzimas LiP de P. chrysosporium 13
Tabla 2. Componentes cuantificados en la borra de café 24
Tabla 3. Dosificación de ALiP en los tratamientos enzimáticos 34
Tabla 4. Composición química de la borra de café 41
Tabla 5. Contenido de lignina ácido insoluble y ácido soluble en la borra residual 55
Tabla 6. Remoción efectiva de lignina en los tratamientos enzimáticos 56
Tabla 7. Cantidades gravimétricas de APPL recuperada y su composición química de lignina
insoluble y carbohidratos 56
Tabla 9. Concentración global de etanol en los tratamientos con borra deslignificada 64
Tabla 10. Designación de los controles de deslignificación 66
Tabla 11. Concentración global de celobiosa y azúcares reductores en los tratamientos de
control de deslignificación 68
Tabla 12. Concentración global de etanol en los tratamientos de control de deslignificación 69
Tabla 13. Concentración de biomasa. 77
Tabla 14. Correlación experimental de conversión de celulosa, producción de etanol y
generación de biomasa. 77
Tabla 15. Valores experimentales de pérdida de peso de borra tratada con TEGA 93
Tabla 16. Valores experimentales de ∇∇∇∇A651 y concentración de proteína para el extracto LiP
parcialmente purificado 100
Tabla 17. Valores experimentales de ∆∆∆∆A510 y concentración de proteína para el extracto ALiP
parcialmente purificado 101
Tabla 18. Estándar molecular de proteína empleado en SDS-PAGE 103
Tabla 19. Análisis descriptivo de concentración global de celobiosa para los tratamientos y
controles de deslignificación 115
Tabla 20. Coeficiente de variación de la concentración global de celobiosa para los
tratamientos y controles de deslignificación 115
IXTabla 21. Prueba de comparación de Tukey de la concentración global de celobiosa para los
tratamientos y controles de deslignificación 116
Tabla 22. Análisis descriptivo de concentración global de azúcares reductores para los
tratamientos y controles de deslignificación 117
Tabla 23. Coeficiente de variación de la concentración global de azúcares reductores para los
tratamientos y controles de deslignificación 117
Tabla 24. Prueba de comparación de Tukey de la concentración global de azúcares reductores
para los tratamientos y controles de deslignificación 118
Tabla 25. Análisis descriptivo de concentración global de etanol para los tratamientos y
controles de deslignificación 119
Tabla 26. Coeficiente de variación de la concentración global de etanol para los tratamientos y
controles de deslignificación 119
Tabla 27. Prueba de comparación de Tukey de la concentración global de etanol para los
tratamientos y controles de deslignificación 120
Tabla 28. Prueba de comparación de Tukey de la concentración de etanol en el día cuatro
para los tratamientos y controles de deslignificación 121
XFIGURAS
pág.
Figura 1. Morfología de un material lignocelulósico. 6
Figura 2. Estructura química típica de una molécula de la lignina. 6
Figura 3. Conformación estructural típica de los polisacáridos. 7
Figura 4. Estructura lineal monomérica de la celulosa. 7
Figura 5. Erosión de la pared celular de una conífera por hongos de la pudrición blanca. 10
Figura 6. Mecanismos catalíticos de la reacción de LiP con la lignina. 13
Figura 7. Estructuras químicas de las moléculas de glucosa y celobiosa. 18
Figura 8. Acción catalítica de la celulasa y ββββ−−−−glucosidasa sobre las moléculas de celulosa y
celobiosa. 18
Figura 9. Diagrama esquemático de la sacarificación y fermentación simultánea. 21
Figura 10. Crecimiento de P. chrysosporium sobre piezas de ciprés y morfología de las
esporas. 43
Figura 12. Valores de ∇∇∇∇A651/mg de proteína de las dosificaciones de esporas evaluadas. 44
Figura 13. Valores de ∇∇∇∇A651/mg de proteína de las dosificaciones de 2,5 ×××× 106 esp/ml , 3,0 ××××
106 esp/ml y 3,5 ×××× 106 esp/ml . 45
Figura 14. Espectro de absorbancia del Azure B 32 µµµµM. 46
Figura 15. Proteínas del extracto enzimático de P. chrysosporium en gel de poliacrilamida en
condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) al 12%. 47
Figura 16. Morfología de S. viridosporus T7A creciendo en agar de tripticasa de soya. 48
Figura 17. Concentración celular de S. viridosporus por lectura en hemocitómetro durante 27
h de crecimiento. 49
Figura 18. Relación de absorbancia y tiempo de crecimiento para células de S. viridosporus. 50
Figura 19. Promedios de ∆∆∆∆A510/mg de proteína de las cuatro dosificaciones de S.
viridosporus. 51
Figura 20. Promedios de ∆∆∆∆A510/mg de proteína de las dosificaciones 1××××103 cel/ml , 1××××104
cel/ml y 1××××105 cel/ml de S. viridosporus. 51
XIFigura 21. Proteínas presentes en el extracto enzimático de S. viridosporus en gel de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes al 15%. 53
Figura 22. Extractos enzimáticos obtenidos de (a) P. chrysosporium y (b) S. viridosporus. 54
Figura 23. Liberación de glucosa por ml de dilución de Econase al 5%, 15%, 30% y 50%
(v/v). 59
Figura 24. Concentración de celobiosa en las dosificaciones evaluadas de Econase con borra
deslignificada. 60
Figura 25. Concentración de azúcares reductores en las dosificaciones de Econase con borra
deslignificada. 63
Figura 26. Concentración de etanol en las dosificaciones evaluadas de Econase con borra
deslignificada. 65
Figura 27. Concentración de celobiosa en los controles de deslignificación. 67
Figura 28. Concentración de azúcares reductores en los controles de deslignificación. 68
Figura 29. Esquema general de los resultados obtenidos en el estudio. 70
Figura 30. Mecanismo hidrolítico y catabólico de la sacarificación y fermentación simultánea.
71
Figura 31. Conversión hidrolítica de celulosa durante el proceso simultáneo. 78
Figura 32. Formación de biomasa durante el proceso simultáneo. 78
Figura 33. Formación de etanol durante el proceso simultáneo. 79
Figura 34. Curva de referencia concentración de albúmina sérica de bovino (BSA)–
absorbancia a 595 nm . 97
Figura 35. Gel electroforético en condiciones desnaturalizantes de la solución estándar de
proteínas entre 34,5 kDa y 116 kDa . 103
Figura 36. Gráfica de referencia concentración de glucosa – absorbancia a 540 nm . 107
Figura 37. Curva lineal de referencia glucosa (1 mg/ml – 4 mg/ml) –absorbancia a 540 nm .109
Figura 38. Gráfica de relación entre concentración volumétrica de etanol y el índice de
refracción. 111
Figura 39. Gráfica de referencia concentración de glucosa – absorbancia a 520 nm . 113
Figura 40. Curva estándar de referencia concentración de glucosa – absorbancia a 540 nm .
114
XIIANEXOS
pág.
ANEXO A. Contenido de componentes extractivos 90
ANEXO B. Contenido de lignina total 91
ANEXO C. Composición de Celulosa. 94
ANEXO D. Medios de propagación Kirk e inducción de LiP 95
ANEXO E. Método colorimétrico de Bradford 97
ANEXO F. Actividad ligninolítica 98
ANEXO G. Fraccionamiento de proteínas 102
ANEXO H. Marcador molecular 103
ANEXO J. Medio de producción de ALiP 104
ANEXO K. Método modificado de lignina Klason 105
ANEXO L. Técnica modificada de Somogyi-Nelson 106
ANEXO M. Actividad celulolítica del complejo Econase 108
ANEXO N. Concentración de etanol en la mezcla 111
ANEXO P. Método Somogyi-Nelson (celobiosa) 112
ANEXO Q. Método del ácido dinitrosalicílico (DNS) 114
ANEXO R. Análisis estadístico en SAS de concentración global de celobiosa 115
ANEXO S. Análisis estadístico en SAS de concentración global de Azúcares reductores 117
ANEXO T. Análisis estadístico en SAS de concentración global de etanol y prueba de
comparación de Tukey para el día cuatro 119
XIIIGLOSARIO
Azure B Colorante textil con enlaces azo de Electroforesis en gel de poliacrylamide
alta estabilidad química y en este caso (PAGE) Método de cuantificación,
empleado como substrato enzimático para comparación y separación de moléculas por
LiP. tamaño y carga (en este caso de proteínas) en
un campo eléctrico. En el análisis de LiP y
Bacteria Organismo unicelular microscópico ALiP se desnaturalizaron las proteínas con la
que se reproduce por división celular y adición de Sodium Dodecyl Sulfate (SDS)
usualmente presenta una pared celular. S. para realizar una separación por carga
viridosporus es un miembro de este tipo de eléctrica únicamente.
microorganismo que tiene la habilidad de
metabolizar lignina. Espora Estructura reproductiva asexual
unicelular o multicelular resistente a
Caldo Mezcla liquida de nutrientes, en el condiciones ambientales desfavorables y la
presente estudio empleado para el cual produce un nuevo individuo vegetativo
crecimiento de S. viridosporus y S. cuando las condiciones son favorables. En
cerevisiae. este estudio, se evaluaron cuatro
concentraciones de estas estructuras de P.
Catabolismo Proceso bioquímico chrysosporium en la producción de LiP.
involucrado en el rompimiento de
compuestos orgánicos. En el caso de
In vitro Proceso biológico que ocurre fuera
fermentación está referido a la acción de la
de un organismo viviente. La producción en
levadura en la producción de energía y etanol
laboratorio de LiP por inducción en cultivos
a partir de glucosa.
de P. chrysosporium y de ALiP por
crecimiento de S. viridosporus corresponden
Coeficiente de extinción Extinción de la
a procesos de este tipo.
solución en una celda de 1 cm de longitud de
paso a la longitud de onda determinada. Las
In vivo Proceso biológico que ocurre dentro
condiciones del estudio para el Azure B
de un organismo viviente. La expresión
correspondieron a 32 µM y 651 nm .
fisiológica de las enzimas ligninolíticas en P.
chrysosporium y S. viridosporus representan
Complejo celulolítico Concentrado
procesos de este orden.
enzimático de celulasa. En la sacarificación-
fermentación simultánea se empleó
Inoculo Material usado para iniciar un
complementado con β-glucosidasa para
cultivo microbial. Los inoculos de esporas de
hidrolizar celobiosa.
P.chrysosporium, células bacterianas de S.
viridosporus y células de levadura de S.
Diálisis Método de concentración de
cerevisiae, se emplearon para iniciar los
proteínas por intercambio de soluto en un
procesos de producción de LiP, ALiP y
ambiente higroscópico. Las soluciones de
etanol, respectivamente.
proteínas LiP y ALiP, contenidas en
membranas de poro selectivo, se
Isoenzimas Grupo de enzimas relacionadas
concentraron contra agua desionizada como
que catalizan la misma reacción pero que
agente receptor de soluto.
poseen diferente estructura química o
XIVinmunológica. Las isoenzimas LiP catalizan de sales (sulfato de amonio) hasta el punto de
las mismas reacciones peroxidativas con la máxima agregación proteínica. La
lignina. precipitación de proteínas LiP y ALiP se
realizó gradualmente hasta un 75% de
Medio de cultivo Solución acuosa de saturación
nutrientes empleados para el crecimiento de
los microorganismos. Proteína Polipéptidos conformados en una
molécula biológicamente activa. Las enzimas
Metabolismo secundario Ruta metabólica son proteínas que operan como catalizadores
especializada productora de compuestos que biológicos. En este caso, se emplearon
no se encuentran en las células. La enzimas LiP, ALiP y un complejo enzimático
producción de ligninaperoxidasa por P. de celulasa y β-glucosidasa.
chrysosporium hace parte de su metabolismo
alterno para transformar lignina como Substrato Molécula específica sobre la que
alimento. actúa una enzima. En el caso de las enzimas
evaluadas, los substratos son: Azure B (LiP),
Micelio Masa de filamentos compuestos por 2,4-dichlorophenol (ALiP), celulasa y β-
cuerpos vegetativos de hongos y algunas glucosidasa (celulosa y celobiosa).
bacterias. Para los objetivos del trabajo,
representaron un material inconveniente Tween 80 Detergente aniónico empleado en
(contaminación) en el estudio de la la solubilización y estabilización de proteínas
producción de LiP de P. chrysosporium. y otras moléculas orgánicas. En el estudio se
empleó para dispersar las esporas de P.
Precipitación con sulfato de amonio chrysosporium y facilitar su cuantificación.
(“Salting Out”) Precipitación de proteínas
mediante el incremento de la concentración
XVRESUMEN
Esta investigación plantea el aprovechamiento biotecnológico de la borra de café, generada
masivamente como subproducto de desecho en las industrias de café soluble, en la obtención de
etanol a partir del componente celulósico de la borra deslignificada enzimáticamente y contribuye
con metodologías innovativas en la solución de la contaminación ambiental que ocasiona este
residuo y su recuperación actual por el carácter contaminante de los procedimientos disponibles.
Inicialmente se caracterizó químicamente la borra de café, encontrando como principales
componentes lignina en 35,17%, celulosa en 33,46% y extractivos en 30,38%. La recuperación y el
aprovechamiento del contenido celulósico se realizó por deslignificación enzimática y por
sacarificación - fermentación simultánea del material deslignificado. Las enzimas ligninolíticas se
obtuvieron en extractos de fluidos extracelulares parcialmente purificados, de los organismos con
mayor potencial de degradación microbial de contaminantes ambientales recalcitrantes, el hongo P.
chrysosporium BKM-F1767 y la bacteria S. viridosporus T7A en condiciones In vitro de inducción
y crecimiento regular. Los extractos del hongo y la bacteria se cuantificaron tanto gravimétrica
como bioquímicamente, obteniendo respectivamente 95 mg y 0,1226 U/mg proteína de actividad
enzimática, 750 mg y 232,70 U/mg de proteína, para los respectivos organismos. En la
deslignificación se evaluaron tres relaciones de concentrado bacteriano (1,94 mg/g , 0,90 mg/g y
0,65 mg/g) y las remociones de lignina fueron de 9,78%, 21,87% y 20,34% respectivamente; siendo
revalidadas con la cuantificación de lignina hidrosoluble recuperada de los tratamientos. Cantidades
iguales de borra sin deslignificar (control de deslignificación) y con el mayor grado de remoción de
lignina, se sometieron a sacarificación y fermentación simultánea con el complejo celulolítico

Econase y la levadura termotolerante S. cerevisiae D A, mediante la dosificación del complejo en
5
términos de su actividad celulolítica total (10 IFPU/g y 20 IFPU/g) y en porcentaje (2% y 5%). La
obtención de etanol estuvo asociada únicamente con la deslignificación de la borra, produciendose
las máximas concentraciones volumétricas el día 4 con 27,84%, 21,89% y 25,81% con las
dosificaciones de 10 IFPU/g de celulosa, 2% y 5%, respectivamente; concluyendose que la borra
puede ser aprovechada biotecnologicamente, mediante deslignificación enzimática bacteriana y sin
la generación de efluentes contaminantes en la obtención de etanol por hidrólisis celulolítica y
fermentación etanologénica simultánea.
XVI1. INTRODUCCIÓN
La borra o café agotado es un subproducto de la industria del café soluble que se genera en el país
en una cantidad cercana a 22300 ton/año y en la actualidad no tiene un uso apropiado; su única
aplicación industrial es su utilización como combustible para calderas, en la generación de vapor de
agua (5938 ton/año) (García, 1999) y su empleo en menor proporción como agregado orgánico en
suelos productivos por su contenido de nitrógeno y potasio (Muzilli, 1982); sin embargo, este
residuo está constituido por compuestos orgánicos de gran utilidad como la celulosa, proteína cruda
y hemicelulosa que pueden ser recuperados y transformados en otros productos.
La recuperación de los principales componentes de la borra de café se encuentra limitado por el
contenido de lignina asociado al material y por lo tanto es fundamental un proceso previo de
remoción de esta. Recientemente, se han encontrado alternativas de aprovechamiento industrial para
este subproducto, como la obtención de pulpas celulósicas y la extracción de compuestos
colorantes; sin embargo, en los métodos propuestos de separación de la lignina se emplean procesos
químicos tradicionales que generan aún más contaminación ambiental que la ocasionada en la actual
disposición final de la borra de café. Lo anterior, plantea la necesidad de recuperación de los
principales componentes de este material de desecho, con el objeto de obtener nuevas materias
primas, mediante procesos alternativos ambientalmente factibles.
En la actualidad se estudia el aprovechamiento del componente celulósico de los materiales
vegetales, principalmente recursos forestales y residuos agrícolas, por medio de metodologías
innovativas de remoción bioquímica de la lignina, involucrando el uso de enzimas ligninolíticas
provenientes de hongos y bacterias con alto potencial degradativo (Martínez et al. (1999);
Johansson et al. (1999), estas enzimas pueden ser absorbidas fácilmente por la naturaleza, en
contraste a lo que sucede con los catalizadores inorgánicos como ácidos y bases, debido a que
provienen de sistemas biológicos. Estos nuevos procedimientos en desarrollo han presentado
selectividad en la remoción de la lignina en materiales forestales como el pino, sin la generación de
compuestos tóxicos para el medio ambiente y presentan un gran potencial para ser empleados en la
1separación selectiva de la lignina, permitiendo un aprovechamiento de la celulosa constitutiva de la
borra de café.
Los componentes constitutivos de agroresiduos y materiales orgánicos de desecho constituyen la
principal alternativa en la búsqueda de nuevas fuentes renovables de biomasa, para la producción de
compuestos de gran demanda actual como combustibles, que emplean materias primas que se
agotan progresivamente como el petróleo. Además, la remoción bioquímica de la lignina
proporciona grandes ventajas ambientales con respecto a los procedimientos tradicionales de
deslignificación, en lo referente a la ausencia de efluentes contaminantes y a la alta selectividad en
la remoción. La celulosa es la fuente más importante de biomasa renovable disponible en la
naturaleza y como compuesto constitutivo de la borra de café puede emplearse en la obtención de
etanol proporcionando otra materia prima sustituta de las tradicionales.
22. OBJETIVOS DEL ESTUDIO
2.1 OBJETIVO GENERAL
Transformar la borra de café en etanol.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Deslignificar enzimáticamente la borra de café.
- Obtener etanol por sacarificación y fermentación simultánea de la borra deslignificada.
33. HIPÓTESIS DE TRABAJO
- La borra de café se deslignifica enzimáticamente.
- Es posible obtener etanol por sacarificación y fermentación simultánea a partir de la borra
deslignificada.
44. MARCO TEÓRICO
4.1 BORRA DE CAFÉ
Se denomina borra de café o café agotado al residuo agroindustrial sólido producido durante el
proceso industrial de extracción de café soluble de los granos de café.
Actualmente en el país, la borra de café se emplea como combustible para calderas en la generación
de vapor de agua; también se han propuesto otros usos como la recuperación de aceites, la
producción de D-manosa y D-manitol por procesos de hidrólisis ácida y más recientemente en
Cenicafé, se han encontrado alternativas de aprovechamiento industrial como la producción de
pulpas celulósicas y la extracción de compuestos colorantes pero mediante procedimientos químicos
que generan licores de digestión altamente contaminantes para el medio ambiente (García, 1999).
4.1.1 Principales componentes de la borra del café
La borra de café puede ser clasificada como un material lignocelulósico constituido principalmente
por celulosa, hemicelulosa y lignina, junto con proteína cruda, nitrógeno orgánico y otros
componentes en menor cantidad. Un material de este tipo está compuesto principalmente por
células en forma de eje y el espesor de la pared celular lo conforman 3 polímeros estructurales:
celulosa, hemicelulosa y la lignina unidos entre sí por este último. La morfología básica de la pared
celular de estos materiales está determinada por las microfibrillas de la celulosa que comprenden
cerca del 45% del peso total del material, como se ilustra en la Figura 1; por su parte, la
hemicelulosa conforma entre el 15% y 30% del peso y la lignina el restante. Sin embargo, el
aprovechamiento de este alto contenido de celulosa está limitado por la remoción de la lignina
(deslignificación) del material vegetal (Chiang et al., 1999).
5Figura 1. Morfología de un material lignocelulósico.
(Fuente: Kirk et al. 1998)
Lignina. La lignina es el biopolímero más complejo y heterogéneo constitutivo de la pared celular
vegetal, compuesto de unidades altamente estables de fenilpropano unidas por enlaces no
hidrolizables C-C y C-O-C y debido a la naturaleza de estos enlaces hace que la lignina sea un
compuesto de gran estabilidad química y de difícil remoción del material vegetal (Evtuguin et al.,
2000). En la Figura 2 se muestra una estructura química de una molécula típica de la lignina en la
que, las líneas punteadas enmarcan dos unidades de fenilpropano con los enlaces terminales β-aril
eter característicos de la lignina.
Figura 2. Estructura química típica de una molécula de la lignina.
(Fuente: Kirk et al. 1998)
6Debido a la compleja naturaleza química de enlaces al azar, no se conoce una estructura química
exacta de la lignina y sus propiedades físicas y químicas dependen del método químico de
extracción empleado. La lignina sulfonada, también llamada lignina sulfito, se obtiene de procesos
de pulpeado con Na SO y presenta un carácter hidrofílico (soluble en agua); por su parte, la lignina
2 3
"kraft" (lignina sulfato) es obtenida del pulpeado con H SO al 72% y es hidrofóbica (Obst et al.,
2 4
1988). Actualmente, la lignina sulfonada tiene más aplicaciones con respecto a la obtenida por
procesos "kraft" y se emplea con cuatro diferentes propósitos: Agregante como adhesivo de
partículas, dispersante en suspensiones, emulsificante de líquidos y por último, como secuestrante
de iones metálicos.
Hemicelulosa. La hemicelulosa, al igual que la celulosa, es un polisacárido compuesto de
moléculas de glucosa unidas entre sí por enlaces β−1,4 y su estructura la conforman entre 100 y 200
unidades especialmente de hexosas y pentosas (Kirk et al., 1998). La estructura básica de un
polisacárido se muestra en la Figura 3.
Enlaces α-1,4 y β-1,4
Figura 3. Conformación estructural típica de los polisacáridos.
Celulosa. La celulosa es un polímero de alto peso molecular que se presenta en forma de fibras en
la pared celular vegetal y está constituido por alrededor de 104 unidades de D-glucosa unidas entre
sí por enlaces glucosídicos β-1,4, como se muestra en la Figura 4; su estructura es cristalina y se
encuentra en una matriz asociada con la lignina y hemicelulosa. (Ballesteros, 1992).
Figura 4. Estructura lineal monomérica de la celulosa.
74.2 APROVECHMIENTO DEL COMPONENTE CELULÓSICO
4.2.1 Métodos de deslignificación de materiales lignocelulósicos.
Existen varios tipos de deslignificación de acuerdo a su naturaleza ya sea química, física,
fisicoquímica y bioquímica.
4.2.1.1 Química.
El material lignocelulósico se pone en contacto con agentes químicos que solubilizan y remueven la
lignina y la hemicelulosa presentes en el material. Los principales compuestos químicos empleados
son NaOH, H SO , HCl, H O , y ozono. En el caso de H O , este se emplea en una solución
2 4 2 2 2 2
generalmente al 0,1% (v/v). Por su parte, en un tratamiento con ozono la deslignificación se realiza
comúnmente a una concentración de ozono alrededor de 10 mg/l. Los tratamientos de
deslignificación mas comúnmente usados son los álcali-ácido con ácidos concentrados como H SO
2 4
y HCl y una base fuerte como NaOH. En el caso de una deslignificación con H SO esta se realiza
2 4
mediante una digestión con una solución del ácido al 72% (v/v) a temperaturas cercanas a 120°C y
al igual que con HCl o NaOH la digestión transforma la celulosa tipo I (celulosa nativa) a la
celulosa tipo II, la cual es altamente susceptible a ataques enzimáticos (Wood et al., 1988).
Existen otros métodos más recientes de deslignificación mediante el empleo de solventes orgánicos
denominados procesos organosolv en los que se emplean soluciones acuosas de solventes
organofílicos al 95% (v/v) que requieren la presencia de un catalizador, generalmente un ácido de
Lewis como Al(SO ) y FeCl . Los solventes empleados son alcoholes, glicerol, dioxano y
4 3 3
etilenglicol ocasionando que se liberen ácidos orgánicos del material que solubilizan conjuntamente
la hemicelulosa y la lignina. y ocasionando pérdidas de celulosa hasta del 10% (Erismann et al.,
1994). Cuando se emplea ácido acético como solvente de deslignificación el proceso se denomina
acetosolv. En este se emplea el solvente en solución al 95%, en presencia de HCl en poca cantidad
(0,2%) como catalizador y una relación aproximada de solvente a sustrato cercana a 10 g/g . En un
proceso acetosolv se obtienen cantidades de pulpa celulósica superiores al 60% con contenidos de
lignina residual aproximados del 7 % (Parajó et al., 1993). También puede emplearse ácido fórmico
como solvente de deslignificación en una concentración entre 79% y 92% (v/v) incluyendo 0,22%
(w/v) de HCl. En la actualidad existen procesos organosolv desarrollados tecnológicamente que
emplean mezclas de alcohol y agua y el proceso de deslignificación organocell que utiliza como
solvente una mezcla de metanol y soda cáustica (Erismann et al., 1994).
84.2.1.2 Física.
En una deslignificación de carácter físico el material lignocelulósico es sometido a fuertes tensiones
producidas por un fluido a altas temperaturas y/o altas presiones o por un agente externo. El método
físico más comúnmente utilizado corresponde a la deslignificación con fluidos en estado
supercrítico. La extracción de lignina por éste método se realiza mediante un sistema binario
metilamina/agua como solvente a temperaturas entre 150 y 180°C . Un segundo método físico de
extracción de lignina corresponde a la deslignificación térmica en el cual el material es expuesto a
temperaturas cercanas a 200°C en presencia de agua por periodos de exposición de 10 h (Wood et
al., 1988).
4.2.1.3 Fisicoquímica.
Los dos principales tratamientos de éste tipo son la oxidación y la explosión con vapor o
autohidrólisis. En el primero, el material lignocelulósico se calienta hasta 120°C a altas presiones en
presencia de agua y oxígeno o aire hidrolizando la hemicelulosa, celulosa y lignina dejando el
material lignocelulósico altamente susceptible a un ataque enzimático. En el segundo tratamiento, el
material se somete por cortos periodos de tiempo a contacto directo (explosión) con vapor de agua a
temperaturas entre 185 y 250°C y presiones cercanas a 4 MPa en presencia de un ácido o álcali,
involucrando cambios estructurales de los componentes constitutivos del material lignocelulósico
(Wood et al., 1988).
4.2.1.4 Bioquímica.
Para la realización de un proceso bioquímico de deslignificación es necesaria la existencia de
organismos, enzimas u otros tipos de moléculas activas biológicamente que puedan operar sobre la
lignina de un material lignocelulósico removiéndola de este. Entre los organismos, los hongos y
algunas bacterias representan los agentes degradativos más importantes de materiales
lignocelulósicos, particularmente forestales y residuos agrícolas.
- Hongos ligninolíticos
Existen principalmente tres tipos diferentes de hongos que tienen la habilidad de degradar algunos o
todos los componentes constitutivos de la pared celular de un material lignocelulósico: hongos de la
pudrición blanca (White rot), hongos de la pudrición blanda "Soft rot" y de la pudrición parda
"Brown rot". Estos microorganismos consumen el material vegetal con el objeto de adquirir sus
fuentes energéticas necesarias para su metabolismo (Eriksson, 1988).
9Los hongos de la pudrición blanca son nativos de materiales vegetales deficientes en nitrógeno
como el caso de las coníferas y otras especies forestales y pueden atacar todos los componentes del
material, tanto la lignina como los polisacáridos presentes. Debido a ésta característica, han sido
mas ampliamente estudiados por su alto potencial en la biodeslignificación de materiales con
respecto a los dos restantes tipos de hongos. Estos microorganismos exhiben los dos patrones de
degradación descritos a continuación, erosionando la pared celular vegetal, cuando se hallan
habitando un material lignocelulósico (Akin et al., 1993).
! Degradación simultánea en la que la celulosa, hemicelulosa y la lignina son removidos casi
simultáneamente.
! Deslignificación en la cual la lignina y la hemicelulosa son removidos primero que la celulosa.
En el primer patrón de degradación, el hongo penetra la pared celular de una manera uniforme y
esta se hace cada vez mas delgada y en el segundo, las paredes celulares retienen su morfología
pero gradualmente se incrementa la coloración de la celulosa como una protección en la ausencia
progresiva de la lignina (Figura 5). Sin embargo, los factores responsables de uno u otro patrón aún
no son muy claros y en muchos de los casos un único microorganismo puede causar una
degradación simultánea en un lugar del material y una deslignificación en otro (Kirk et al. 1998).
Figura 5. Erosión de la pared celular de una conífera por hongos de la pudrición
blanca.
(Fuente: Kirk et al. 1998)
10La erosión del tejido vegetal lignificado y sus componentes constitutivos relacionados (celulosa y
hemicelulosa) está asociada con la enzimología de estos microorganismos, por medio de un proceso
de combustión biológica del material lignocelulósico. En estos hongos, su carácter de aerobios
obligados les permite usar el oxígeno molecular como un aceptor de un electrón terminal para
catabolizar la lignina. Las especies de hongos de este tipo en los que se ha encontrado mayor
actividad ligninodegradativa son Trametes versicolor, Phlebia radiata, y P. chrysosporium; sin
embargo, solo este último ha sido más ampliamente caracterizado bioquímicamente en las enzimas
involucradas en la remoción de lignina (Tien et al., 1993).
En condiciones In vivo P. chrysosporium sólo degrada lignina por medio de un metabolismo
secundario (idiofásico) cuando la celulosa y hemicelulosa se agotan; estos polisacáridos le proveen
al microorganismo las fuentes de carbono y los nutrientes necesarios para su crecimiento. Cuando
esto ocurre, el hongo activa una ruta metabólica alterna mediante la secreción de enzimas
ligninolíticas para metabolizar la lignina y suplir sus requerimientos energéticos. Las enzimas
secretadas por estos hongos son principalmente ligninaperoxidasa (LiP), manganesoperoxidasa
(MnP), arilalcohol deshidrogenasa y xilanasas, entre otras y las cuales utiliza para difundir la
lignina hacia afuera del material y cambiar su morfología (Dosoretz et al., 1999; Vicuña et al.,
2001).
Actualmente no se conocen organismos que puedan vivir y crecer en un medio constituido
únicamente por lignina y es así, como una deslignificación absolutamente específica, por medio de
éstos microorganismos probablemente no puede llevarse a cabo, haciéndose necesaria la obtención
de sus enzimas ligninodegradativas para ser utilizadas independientemente en los procesos de
deslignificación de materiales lignocelulósicos.
El hongo ligninolítico P. chrysosporium es un basidiomycete perteneciente al orden
Aphyllophorales* de la familia Corticiacea que despolimeriza la lignina a CO y H O y además se
2 2
ha encontrado que mineraliza compuestos contaminantes ambientales como el 1,1-bis(4-clorofenil)-
2,2,2,-tricloroetano (DDT), ortoclorofenol, fenantreno e hidrocarburos aromáticos policíclicos,
benceno, tolueno, xileno, trinitrotolueno (TNT), entre otros (Tien et al., 1985; Morgan et al., 1993).
* Orden propuesto por Rea para basidiomycetes que poseen basidiocarpos macroscópicos.
11El conocimiento del comportamiento fisiológico de P. chrysosporium en el proceso biodegradativo
de la lignina y las condiciones apropiadas de producción en la naturaleza de las enzimas
involucradas en este son de gran utilidad para la obtención In vitro de las enzimas ligninolíticas y
emplearse en una deslignificación bioquímica de un material lignocelulósico.
Fisiología de la producción In vivo de enzimas LiP. En la actualidad se han identificado los
principales parámetros fisiológicos de la producción en la naturaleza de las enzimas ligninolíticas de
P. chrysosporium (Kirk et al., 1978):
! El hongo P. chrysosporium requiere de cantidades limitadas o deficientes de nitrógeno y
nutrientes nitrogenados de crecimiento para producir extracelularmente las enzimas
ligninolíticas.
! La expresión de las enzimas ligninolíticas está asociada a la presencia de un metabolito
secundario que activa su producción.
! Debido a que la lignina no es un substrato de crecimiento para P. chrysosporium resulta crucial
una alta tensión superficial de oxígeno molecular del medio circundante del material vegetal
que habita, debido a que el oxígeno determina la velocidad de degradación de la lignina por
parte del microorganismo.
Producción In vitro de enzimas LiP. La producción In vitro de LiP se realiza en cultivos líquidos
con condiciones de crecimiento similares a las que se presentan cuando estas se producen en la
naturaleza. La obtención óptima en el laboratorio de las enzimas ligninolíticas de P. chrysosporium
se logra por la inducción de su metabolismo secundario, debido a la presencia en cantidades
apropiadas del metabolito que estimula su producción en los cultivos . Sin embargo, debido a la
compleja reproducibilidad de estas condiciones existen ciertas características principales de cultivo
que favorecen su producción como la presencia de fuentes de carbono necesarias para obtener la
energía para las síntesis de su metabolismo, la limitación de las fuentes de nitrógeno y nutrientes
nitrogenados, la presencia del metabolito secundario 3,4-dimethoxybencil alcohol (Alcohol veratril)
como inductor del metabolismo secundario, alta tensión superficial de los cultivos mediante el
suministro frecuente de oxígeno y la presencia de minerales como Zn, Fe y Mo en pequeñas
cantidades (Reddy et al., 1992).
12Propiedades catalíticas de LiP. La actividad ligninolítica de P. chrysosporium la conforma un
grupo de 6 isoenzimas extracelulares, genéricamente denominado ligninaperoxidasa (LiP), que han
sido caracterizadas bioquímicamente (Kirk et al., 1989). La Tabla 1 muestra las principales
propiedades catalíticas que identifican al sistema ligninolítico de P. chrysosporium y compuesto por
seis isoenzimas (referenciadas con la letra H).
Tabla 1. Principales propiedades catalíticas de las enzimas LiP de P. chrysosporium
Masa H O Alcohol veratryl
εεεε 2 2
Isoenzima molecular Pi 409 K K TN
(mM) m m
(kDa) (µµµµM) (µµµµM) (s-1)
H1 38 4,7 169 13 86 3,20
H2 38 4,4 165 42 250 8,33
H6 40-42 3,7 162 34 122 6,58
H7 42 - 177 77 483 5,46
H8 42 3,5 168 17 89 1,32
H10 43 3,3 182 24 190 2,78
pI: Punto isoeléctrico; ε : coeficiente de extinción molar a 409 nm; Km: Constante cinética; TN: Número de
409
Turnover. (Fuente: Kirk et al. 1989)
Las enzimas LiP son glicoproteínas de carácter peroxidativo, que operan catalíticamente por medio
del ciclo típico de las peroxidasas. El ciclo catalítico de LiP se inicia cuando esta es oxidada por el
H O , que actúa como cosubstrato, a un intermediario deficiente en 2 electrones, denominado
2 2
compuesto I, regresando a su estado inicial por el desarrollo de dos oxidaciones sucesivas de 1
electrón del substrato donador (Hammel, 1997). La Figura 6 muestra el mecanismo catalítico de la
reacción de LiP con la molécula de la lignina.
Figura 6. Mecanismos catalíticos de la reacción de LiP con la
lignina.
(Fuente: Kirk et al. 1998)
13- Biodegradación de lignina con P. chrysosporium
La recuperación de celulosa de la borra por remoción bioquímica de la lignina no ha sido estudiada
hasta el momento. Los estudios se han centrado principalmente en la acción microbiana de
deslignificación de materiales forestales de tres hongos, Phanerochaete chrysosporium BKM-F
1767 (Tien), Trametes versicolor y Ceriporiopsis subvermispora y la bacteria Streptomyces
viridosporus T7A (Sinden) en los que se ha encontrado mayor actividad de degradación de lignina
por medio de procedimientos de fermentación en estado sólido y contacto micelial directo,
principalmente.
P. chrysosporium es en la actualidad el microorganismo ligninolítico más estudiado; el sistema
enzimático de este hongo fue caracterizado bioquímicamente y las enzimas responsables de la
degradación de lignina encontradas en el fluido extracelular fueron denominadas ligninasas o
ligninaperoxidasas (LiP). Se encontró además que el sistema ligninolítico de este tipo de hongos
está constituido principalmente de dos clases de enzimas peroxidativas, lignina peroxidasa y
manganeso peroxidasa (MnP) y su vez, que LiP requiere la presencia de H O como cosubstrato
2 2
para la actividad ligninolítica (Farrell et al., 1989).
En estudios realizados por Crawford et al. (1992), se encontró que el hongo P. chrysosporium
mineralizó a CO compuestos como cristal violeta, pararosanilina, rojo cresol, azul de bromofenol,
2
verde brillante y verde malaquita, resultando útil en la biodegradación de colorantes azo sulfonados
que son contaminantes ambientales de alta resistencia a la degradación.
La remoción de lignina mediante fermentación en estado sólido de tallos de plantas de algodón,
empleando P. chrysosporium y Pleurotus ostreatus, fue estudiada por Hadar et al. en 1992,
encontrándose una remoción selectiva de lignina por P. ostreatus y una degradación de material
orgánico cerca del 20% durante 30 días; por su parte, P. chrysosporium degradó cerca del 55% de
los componentes orgánicos del material vegetal y no presentó una selectividad en la degradación de
lignina en solo 15 días de tratamiento.
El potencial que presenta el sistema enzimático de P. chrysosporium ha impulsado a su estudio
sobre la degradación de compuestos recalcitrantes del ecosistema y compuestos relacionados con la
lignina, en la naturaleza de sus enlaces químicos, como es el caso del tolueno, etilbenceno y xileno.
En estudios realizados con estos compuestos, este microorganismo mineralizó el 18,1%, 41,4% y
99,5% del benceno, tolueno y etilbenceno adicionado a los cultivos líquidos (Reddy et al., 1992).
14En otro estudio, se evaluó la habilidad de C. subvermispora y tres especies diferentes de P.
chrysosporium en la deslignificación microbial In vitro de hierba (Cynodon dactylon). Los
resultados indicaron que los tratamientos removieron principalmente compuestos aromáticos de la
pared celular y constitutivos de la lignina, como el ácido ferúlico y ácido p-coumárico, presentes en
el material (Akin et al., 1993).
- Bacterias ligninolíticas
En la actualidad se han encontrado pocos organismos procarióticos que degradan lignina, entre ellos
se encuentran Streptomyces badius y Streptomyces viridosporus. La bacteria que presenta mayor
actividad ligninodegradativa es S. viridosporus T7A, la cual es un microorganismo
quimiorganotrófico (metabolismo oxidativo) Gram positivo de la familia Actinomycetacea aislado
originalmente de suelos contaminados con clorofenoles.
Fisiología de la producción In vivo de enzimas ligninolíticas bacterianas. S. viridosporus T7A
produce una variedad de enzimas extracelulares de gran importancia para la degradación de lignina
durante su crecimiento regular a 37°C . Entre estas enzimas se encuentran, endoglucanasas,
esterasas y un sistema ligninolítico denominado genéricamente ALiP, el cual esta formado por
cuatro isoenzimas de ligninaperoxidasa, que representa el principal componente extracelular del
microorganismo(Crawford et al., 1998).
Producción In vitro de ALiP. La producción In vitro de las enzimas ALiP se realiza a 37°C en
cultivos líquidos agitados con una composición apropiada de fuentes de carbono y nitrógeno con el
objeto de asegurar las mejores condiciones de crecimiento del microorganismo. Como fuentes de
carbono se emplean comúnmente extracto de levadura y medios constituidos principalmente por
almidón de maíz; por su parte, los nutrientes y el nitrógeno son suplidos por un medio basal y una
solución de trazas de elementos de composiciones definidas. (Wood et al., 1996).
Propiedades catalíticas de ALiP. Las enzimas ligninolíticas de S. viridosporus, al igual que las
enzimas de P. chrysosporium, requieren peróxido de hidrógeno como donador de un electrón. Sin
embargo, la única isoenzima que parcialmente ha sido estudiada en su carácter bioquímico es la
isoforma ALiP-P3, la cual presenta una masa molecular aparente de 63 kDa y cataliza
específicamente la oxidación del 2,4-dichlorophenol. Esta última característica es la más utilizada
15para determinar la presencia de ALiP-P3 en los cultivos de crecimiento del organismo (Wood et al.,
1997).
La degradación de lignina por las enzimas ALiP es un proceso oxidativo en el cual los enlaces eter
de la molécula se rompen, las cadenas laterales de fenilpropano son modificados químicamente o
removidos y algunos intermediarios aromáticos de bajo peso molecular son liberados de la lignina
como resultado de estas reacciones; El principal efecto del rompimiento de estos enlaces, es la
substancial despolimerización de la lignina en pequeñas unidades de un solo anillo aromático
contenidas en grandes cantidades de un complejo de lignina polimérica hidrosoluble obtenido como
único producto de esta reacción. Este complejo de lignina, llamado técnicamente lignina polimérica
ácido precipitable (APPL, por su abreviación en el idioma inglés), puede recuperarse mediante la
acidificación de la solución acuosa resultante del tratamiento enzimático (Crawford et al., 1988).
- Biodegradación de lignina con S. viridosporus
La degradación de lignina por bacterias se ha centrado sobre actinomycetes y en especial, en S.
setoni y S. viridosporus. En 1983, Antai et al. sometieron spruce y maple a deslignificación con
estos dos microorganismos, causando estos una pérdida cercana al 32% del peso original del
lignina. En recientes estudios de degradación bacteriana de lignina se han encontrado de alrededor
del 8% en peso de lignina y esto ha centrado los esfuerzos en la obtención de enzimas ligninolíticas
de estos microorganismos con el objeto de aumentar la eficiencia en la remoción.
En 1991 Korus et al., estudiaron la producción de enzimas ligninolíticas de S. viridosporus T7A y
S. lividans TK64.1 y se encontró que la producción enzimática de ambos microorganismos estuvo
asociada a la masa celular durante la fase de crecimiento, en contraste con P. chrysosporium, la cual
se presenta sólo en condiciones limitadas de nitrógeno y carbono durante su metabolismo
secundario; sin embargo, la única isoenzima cuantificable en términos de actividad fue la
denominada ALiP-P3.
Últimamente, se han optimizado las formulaciones de los medios de crecimiento de S. viridosporus
T7A con el objeto de incrementar la producción de enzimas ligninolíticas. Wood et al. (1996)
encontró que empleando un medio a base de almidón de maíz se incrementó la densidad de células
bacterianas en un factor de 10 y como consecuencia directa de esto se incrementó seis veces la
actividad enzimática específica de ALiP-P3, obteniendo 10865 nmol/g de células/min y se
16determinó que esta enzima también cataliza la oxidación del 2,4-dichlorofenol con H O como
2 2
intermediario, para formar un dímero clorinado con peso molecular de 322.
4.2.2 Transformación de celulosa a etanol
La celulosa puede ser hidrolizada a sus unidades de glucosa constitutivas (sacarificación)
empleando ya sea un ácido débil o fuerte. La hidrólisis ácida de la celulosa en un sistema de
reacción homogéneo, ocasiona un rompimiento al azar de los enlaces glucosídicos que contienen
grupos terminales hidroxilo y hemiacetal y por consiguiente la D-glucosa puede ser obtenida en
cantidades superiores al 95% de eficiencia bajo condiciones acídicas apropiadas; sin embargo, una
hidrólisis ácida es fuertemente dependiente de un alto pH y cuando esto se presenta, la velocidad de
hidrólisis es apreciable aún por debajo de 100°C si la concentración de ácido es alta (Theander,
1988).
En un proceso con ácido débil la hidrólisis se realiza en dos etapas consecutivas, generalmente con
H SO diluido al 1% y a temperaturas entre 130 y 190°C en la primera etapa, transformando la
2 4
hemicelulosa a azúcares y removiendo la mayoría de pentosanos, por su parte en una segunda
hidrólisis se hidroliza el material residual con ácido al 20% a temperaturas entre 190°C y 265°C
obteniendo principalmente hexosas, celobiosa, 2-furfuraldehido y 5-hidroximetil-furfuraldehido. En
un proceso con ácido concentrado se realiza un único paso de hidrólisis a temperaturas menores de
35°C y se obtiene principalmente hexosas y celobiosa. (Zacchi et al., 1996). En los procesos de
hidrólisis con ácido concentrado se requieren menores cantidades de ácido y no se presenta
degradación de los azúcares a furfural, como ocurre en los procesos de ácido diluido, debido a que
estos se operan a bajas temperaturas; sin embargo, en estos procesos es necesario un sistema de
recuperación del ácido empleado lo que ocasiona que sus costes se incrementen considerablemente.
Por otro lado, resulta económicamente innecesaria la recuperación del ácido en los procesos que lo
emplean diluido debido a las pequeñas cantidades que se recuperan de los efluentes del proceso,
ocasionando un deterioro ambiental progresivo (Ballesteros et al., 1992).
Un proceso alternativo en el rompimiento de la celulosa en unidades de glucosa lo representa la
hidrólisis enzimática. Una hidrólisis de este tipo involucra la ruptura secuencial de la molécula de la
celulosa en un disacárido reductor denominado celobiosa y en unidades de glucosa y una
subsecuente ruptura de la molécula de celobiosa resultante en unidades de glucosa. La primera
ruptura, la realiza una enzima celulolítica, que actúa a temperaturas de hidrólisis entre 45°C y 50°C
17y un pH cercano a 5,0 (Duff et al, 1996). Por su parte, el rompimiento posterior lo efectúa una
enzima adicional denominada β−glucosidasa, la cual hidroliza la celobiosa resultante a su forma
monomérica de glucosa (Philippidis et al., 1997). La Figura 7 muestra las estructuras de los
compuestos resultantes de una hidrólisis enzimática de celulosa.
Figura 7. Estructuras químicas de las moléculas de glucosa y celobiosa.
4.2.2.1 Enzimas celulolíticas.
Las enzimas celulolíticas son sistemas enzimáticos constituidos por endo y exoglucanasas que
actúan sinergísticamente sobre la celulosa para producir celobiosa, glucosa y oligosacáridos. La
acción catalítica de las endoglucanasas se efectúa aleatoriamente sobre la molécula de la celulosa
para producir polisacáridos de cadenas más cortas y las exoglucanasas actúan en las partes
terminales de estas cadenas cortas y remueven la celobiosa (Philippidis., 1994). La acción catalítica
de un complejo enzimático de celulasa y β−glucosidasa se muestra en la Figura 8.
Figura 8. Acción catalítica de la celulasa y β−glucosidasa sobre las moléculas de celulosa y
celobiosa.
(Fuente: Ballesteros, 1992)
184.2.2.2 Fermentación etanologénica.
La glucosa resultante de un proceso de hidrólisis enzimática puede ser empleada para la producción
de etanol en una subsecuente etapa de fermentación por la acción de un microorganismo
fermentativo (etanologénico) como una bacteria o una levadura. Los microorganismos
fermentativos, como Zymomonas mobilis y Saccharomyces cerevisiae, tienen la habilidad de
catabolizar estos azúcares primariamente a etanol y dióxido de carbono para el crecimiento de su
biomasa. Las condiciones apropiadas para el metabolismo de la glucosa a etanol por parte de S.
cerevisiae están alrededor de 30°C y un pH ácido de 5,0 (Ramachandran et al., 1990).
4.2.2.3 Sacarificación y fermentación simultánea.
Recientemente se ha desarrollado un proceso de sacarificación y fermentación simultanea (SSF),
como una alternativa de conversión de celulosa a etanol en una sola etapa, empleando
conjuntamente un complejo celulolítico y un microorganismo fermentativo termotolerante actuando
sinergísticamente a una única temperatura de hidrólisis y fermentación, comprendida entre 38°C y
45°C y empleando un solo reactor. El proceso SSF tiene las ventajas de requerir menores cantidades
de enzima y menores requerimientos energéticos, debido a que la temperatura de hidrólisis es
inferior a los 50°C, con respecto a los procesos tradicionales de dos etapas y a su vez minimizar la
acumulación de azúcares en el reactor, debido a que ellos son metabolizados por el microorganismo
etanologénico inmediatamente después de que son producidos durante la hidrólisis. El proceso SSF
opera generalmente a 38°C , un pH cercano a 5,0 y una dosificación de enzima celulolítica
alrededor de 7 UI/g de celulosa. Sin embargo, los parámetros de sensibilidad como el efecto de las
variables de operación como la temperatura y el pH, características del substrato celulósico,
parámetros del microorganismo fermentativo y características de la enzima celulolítica de un
proceso SSF son más críticos que en aquellos procesos que involucran dos etapas separadamente
(Philippidis et al., 1997).
- Análisis de sensibilidad de un proceso SSF
Efectos de la temperatura y el pH. La temperatura apropiada de actividad enzimática para la
celulasa se encuentra entre 40°C y 50°C y por su parte, el metabolismo de la glucosa a etanol para
la gran mayoría de levaduras etanologénicas ocurre a una temperatura entre 20°C y 30°C . Debido a
lo anterior, se hace necesario el uso de una levadura termotolerante cuando se emplea
conjuntamente con una celulasa. Es así, como la temperatura óptima para un proceso SSF se
19encuentra entre 37°C y 41°C. Por su parte, la actividad de la celulasa se manifiesta en un rango de
pH entre 3 y 6 y tiene un pH óptimo cercano a 4,8; por su parte, las levaduras fermentativas actúan
en un rango de pH entre 3 y 6 y presentan un rango óptimo entre 4 y 5. Por lo tanto, un proceso SSF
debe operar a un pH entre 4,5 y 5 (Philippidis et al., 1997).
Efectos de la dosificación de inóculo. El efecto de la dosificación de inoculo de levadura
influencia significativamente el desarrollo de un proceso batch SSF. A bajos niveles de inoculo, la
conversión de glucosa a etanol es lenta y la glucosa se acumula en el reactor; en el caso de altos
niveles de inoculo la glucosa producida es rápidamente convertida a etanol y esto resulta en un
incremento en la velocidad de producción de etanol. Si embargo, un incremento superior a 2,0 g/l
no representa un incremento significativo en la velocidad de producción de etanol (Ramachandran
et al., 1990).
Efectos de las características del substrato celulósico. Las características de accesibilidad del
substrato se relacionan directamente con la concentración final de etanol. El substrato celulósico
empleado en un proceso de hidrólisis enzimática debe haber sido previamente pretratado con el
objeto de mejorar su accesibilidad a la enzima y lograr una interacción enzima-substrato
apropiadamente ya que en un proceso SSF la hidrólisis enzimática es la etapa limitante (Philippidis
et al., 1997).
Efectos de la dosificación de enzima y suplemento de ββββ−−−−glucosidasa. La cantidad de enzima
agregada por unidad de peso de substrato empleado determina la cantidad de producto, la velocidad
de sacarificación e incrementa los costos de producción en el proceso. Una hidrólisis de un material
celulósico comúnmente se realiza con dosificaciones de celulasa entre 15 IFPU/g y 25 IFPU/g de
celulosa (Zacchi et al., 1996). El complemento de β−glucosidasa es importante debido a que en
reacciones de sacarificación realizadas en forma batch se presenta altos niveles de celobiosa que
tienen un efecto inhibitorio, por ello resulta crítica la adición de suficiente β−glucosidasa que
convierte la celobiosa a glucosa que posee un carácter menos inhibitorio (Duff et al., 1996).
Mecanismo de un proceso SSF. El mecanismo de un proceso simultáneo de sacarificación y
fermentación esta compuesto por un mecanismo catalítico homogéneo, un mecanismo heterogéneo
y un proceso catabólico. El mecanismo heterogéneo se presenta cuando los componentes endo y
exoglucanasas de la celulasa hidrolizan simultáneamente la celulosa a celobiosa y glucosa; a su vez,
20la hidrólisis de la celobiosa a glucosa monomérica por la acción de la β-glucosidasa se realiza por
un mecanismo homogéneo; el proceso catabólico, por su parte, lo realiza la levadura fermentativa al
transformar la glucosa producida a etanol, masa celular y CO . En la Figura 9 se muestra un
2
esquema general del mecanismo hidrolítico y catabólico de un proceso simultaneo de sacarificación
y fermentación.
Celulasa
ββββ-glucosidasa
Levadura termotolerante
Figura 9. Diagrama esquemático de la sacarificación y fermentación
simultánea.
En la última década, la producción de etanol a partir de materiales celulósicos ha sido más
ampliamente estudiada con respecto al proceso convencional de "cracking" del petróleo, debido a
las ventajas ambientales y económicas que presenta, como producto de una materia prima renovable
(Ballesteros et al., 1992).
En estudios de sacarificación y fermentación simultánea (SSF, por su abreviatura en idioma inglés),
realizados con madera de álamo por Philippidis et al. (1995), se obtuvo concentraciones de etanol
cercanas a 10 g/l a las 80 horas y se determinó que la hidrólisis enzimática fue el factor limitante
durante el tiempo de duración de los tratamientos. Más recientemente, Philippidis et al. (1997)
determinaron los efectos de la eficiencia del pretratamiento del substrato, parámetros del
microorganismo fermentativo y las características de la enzima celulolítica sobre la producción de
etanol mediante SSF. Los resultados obtenidos, empleando residuos de lignocelulósicos con 50% de
celulosa y 20% de lignina, indicaron que la producción de etanol está directamente relacionada con
la digestabilidad del substrato, la dosificación y la actividad específica de la enzima celulasa; por su
parte, los parámetros del microorganismo no tuvieron ningún efecto.
Ballesteros et al. (1998) sometieron a SSF biomasa de álamo, suplementada con Tween 80 y
zeolita,. La eficiencia de la hidrólisis se incrementó alrededor del 20% con la concentración del
surfactante (Tween 80) en el medio de fermentación y la zeolita mejoró la conversión y producción
de etanol. El estudio también demostró que estos aditivos disminuyeron el tiempo de fermentación
21requerido, con respecto al tiempo necesario para lograr una completa fermentación sin el empleo de
estos.
Los estudios anteriormente reportados y otras investigaciones como las realizadas por Ballesteros et
al. (1993), Cao et al. (1996) y Alvo et al. (1997) han contribuido al conocimiento y desarrollo de la
tecnología de producción de etanol a partir de biomasa, como nueva alternativa de obtención de
sustitutos del petróleo cuyo agotamiento es progresivo.
225. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 UBICACIÓN
Esta investigación se realizó en el laboratorio de bioquímica de la disciplina de Entomología del
Centro Nacional de Investigaciones de Café (Cenicafé) en Chinchiná (Caldas).
5.2 MATERIALES
5.2.1 Materia prima
La materia prima fue borra de café con un contenido inicial de humedad del 12% y proveniente de
la Fábrica de Café Liofilizado (Chinchiná).
5.2.2 Microorganismos ligninolíticos
El estudio se realizó con el hongo P. chrysosporium BKM-F-1767 (ATCC 24725) y la bacteria S.
viridosporus T7A (ATCC 39115), suplidos por Rita Rentmeester (Forest Products Laboratory, U. S.
Department of Agriculture, Madison, WI. U.S.A) y Donnald L. Crawford (Department of
Microbiology, Molecular Biology, and Biochemistry, University of Idaho, Moscow, ID. U.S.A),
respectivamente.
5.2.3 Complejo celulolítico
Se utilizó Econase constituido por celulasa y β−glucosidasa, proveído por Tammy K. Hayward
(National Renewable Energy Laboratory -NREL-, Department of Energy, Golden, CO, U.S.A).
5.2.4 Microorganismo fermentativo
El microorganismo etanologénico fue S. cerevisiae D A suplido por Tammy K. Hayward (NREL).
5
5.3 METODOLOGÍA
Esta investigación fue realizada en cuatro etapas con el objeto de evaluar las hipótesis de trabajo y
alcanzar los objetivos propuestos:
235.3.1 Etapa 1. Caracterización lignocelulósica de la borra de café
La borra de café fue inicialmente acondicionada, mediante secado a 105°C y reducción de tamaño
hasta 0,42 mm (malla 40 de la serie de tamices Tyler) por molienda en un molino Toastmaster y se
determinó, mediante cinco repeticiones, los componentes especificados en la Tabla 2.
Tabla 2. Componentes cuantificados en la borra de café
Componente Método
Componentes extractivos USDA
Cenizas USDA
ácido insoluble TAPPI T-222 y oxidación con TEGA
Lignina total
ácido soluble TAPPI UM-250
Goering-van Soest
Celulosa
(Diferencia gravimétrica)
5.3.1.1 Contenido de componentes extractivos.
El contenido de componentes extractivos se realizó con borra de café en base húmeda, de acuerdo a
la metodología del USDA y reportada por Han et al. (1997), mediante extracción durante 24 horas
con una mezcla de etanol-tolueno 1:2 (v/v) en un equipo de extracción Soxhlet, como se especifica
en el Anexo A.
5.3.1.2 Contenido de cenizas.
El contenido de cenizas fue determinado acorde al método del USDA y reportado por Han et al.,
sometiendo la muestra a ignición completa en un horno a 575°C ± 25°C durante 4 h y fue calculado
como la cantidad de material residual obtenido después de la ignición de la fibra, libre de humedad,
con respecto al peso inicial y se expresó en porcentaje de peso residual en base seca. El contenido
de humedad inicial del material fue determinado a 105°C en un analizador halógeno HR73
(METTLER TOLEDO).
5.3.1.3 Contenido de lignina.
El contenido de lignina, como estimativo inicial, se determinó mediante el método gravimétrico
indirecto de oxidación selectiva de la lignina con trietilenglicol activado (TEGA), de acuerdo a la
metodología reportada por Edwards (1973). La borra se sometió a solubilización en un autoclave a
24121°C y 15 lb/in2 de presión durante 60 min . El material sólido obtenido fue secado a 105°C
durante 8 h y el contenido de lignina se determinó como la pérdida de peso de la fibra con respecto
al peso inicial de la muestra.
- Contenido de lignina total (ácido insoluble y ácido soluble)
El contenido de lignina total de la borra fue determinado como la adición de los contenidos
individuales de lignina ácido insoluble (lignina insoluble) y lignina ácido soluble (lignina soluble),
mediante la cuantificación del residuo sólido y el análisis espectrofotométrico de los filtrados de la
lignina ácido insoluble, de acuerdo con las normas TAPPI T-222 y TAPPI UM-250,
respectivamente (Anexo B).
5.3.1.4 Determinación de celulosa.
La determinación de celulosa se realizó por el método Goering-van Soest, mediante una extracción
secuencial selectiva de componentes extractivos y lignina y por diferencia gravimétrica después de
ignición completa del residuo agotado de estos dos componentes. El contenido de celulosa se
obtuvo por diferencia entre el peso, en base seca, de la muestra inicialmente sometida a remoción de
lignina por oxidación con KMnO y el peso del material residual correspondiente, luego de la
4
incineración de la muestra libre de lignina, como se especifica en el Anexo C.
5.3.1.5 Análisis estadístico.
Análisis descriptivo. Las variables cuantificadas (por quintuplicado) en las determinaciones de
componentes extractivos, cenizas, lignina ácido insoluble, lignina ácido soluble y celulosa
correspondieron a la pérdida de peso, peso residual después de ignición completa, peso residual
luego de digestión, absorbancia del filtrado y pérdida de peso por oxidación selectiva,
respectivamente. En cada caso se determinó el promedio aritmético y el intervalo de confianza
(límites inferior y superior) para la variable medida, mediante el programa SAS versión 612. Los
valores respectivos se reportan en porcentaje en base seca del material tratado, en la sección de
Resultados y discusión.
5.3.2 Etapa 2. Producción y evaluación de enzimas ligninolíticas de P. chrysosporium BKM-
F-1767 y S. viridosporus T7A
La producción de enzimas LiP y ALiP se realizó en condiciones de inducción y crecimiento regular,
mediante las metodologías reportadas por T. Kent Kirk y Donnald L. Crawford, respectivamente.
255.3.2.1 Enzimas LiP de P. chrysosporium
Inicialmente se propagó P. chrysosporium, a partir del cultivo original, para disponer de una
existencia del microorganismo en cantidad suficiente para el estudio y se evaluaron tres medios de
cultivo con el objeto de seleccionar el mayor inductor de esporas, para conformar con estas el
inoculo de dosificación de los medios de producción de LiP.
Propagación de P. chrysosporium. La cepa original de P. chrysosporium fue propagada en el
medio compuesto por 20 g/l de extracto de malta y 10 g/l de agar con pH 5 suplementado con piezas
de ciprés Cupressus LusitÆnica de dimensiones aproximadas de 0,5 cm × 0,5 cm × 1,5 cm y
esterilizadas previamente en autoclave durante 1 h . Los cultivos fueron incubados
estacionariamente a 30°C hasta que el hongo cubrió totalmente las piezas de ciprés.
Selección del medio de producción de esporas. Se realizaron 10 cultivos superficiales de P.
chrysosporium en cada uno de los medios de cultivo extracto de malta al 2% (MEM), medio de
propagación Kirk y agar de papa-dextrosa (PDA) por barrido con asa microbiológica del cultivo
original. Los cultivos fueron incubados estacionariamente a 39°C y monitoreados diariamente en la
aparición de esporas. La composición del medio Kirk se especifica en el Anexo D. Establecido el
medio de cultivo con el que se obtuvo mayor cantidad de esporas, se obtuvo a partir de este las
esporas necesarias para el inoculo.
Obtención de esporas de P. chrysosporium. Las esporas de P. chrysosporium fueron obtenidas de
40 cultivos superficiales en el medio PDA a partir del cultivo original de reserva. Estos fueron
incubados estacionariamente a 39°C durante 10 días en una incubadora Memmert U10.
Posteriormente se adicionó 10 ml de Tween 80 al 0,1% estéril a cada uno de los cultivos
superficiales y se removió las esporas presentes mediante barrido con pinceles. Las esporas
removidas fueron recolectadas, obteniéndose un volumen total de 350 ml de suspensión de esporas.
Esta se pasó a través de lana de vidrio libre de residuo (Fisher), con el objeto de liberar las esporas
de las impurezas de micelio contaminante. A la suspensión libre de impurezas se le determinó por
triplicado la concentración de esporas por mililitro de suspensión, utilizando un hemocitómetro
Brighline Fisher Scientific. A partir de esta suspensión se realizó una curva espectrofotométrica de
referencia, con el objeto de cuantificar fácilmente la dosis de inóculo de esporas en los medios de
inducción de LiP.
26Curva de referencia para el inoculo de esporas. Se construyó una gráfica de referencia que
relacionó la concentración de esporas y la absorbancia a 650 nm . De la suspensión de esporas
obtenida, se extrajo un volumen homogeneizado de 150 ml y se pasó a través de un filtro de
membrana con tamaño de poro de 0,45 µm (Millipore tipo HVLP), empleando un equipo de
filtración al vacío (Sartorius SM 16309). Las esporas fueron resuspendidas nuevamente en 30 ml de
Tween 80 al 0,1% y a partir de esta, se preparó cinco suspensiones con concentraciones de 1,5 × 106
esp/ml , 2,0 × 106 esp/ml , 2,5 × 106 esp/ml , 3,0 × 106 esp/ml y 3,5 × 106 esp/ml en Tween 80 al
0.1% , que se emplearon para obtener la gráfica. Posteriormente, se determinó mediante cinco
repeticiones, la absorbancia a 650 nm de 1 ml de cada una de estas suspensiones. El blanco para las
lecturas se realizó con Tween 80 al 0,1% , extraído por filtración con membranas de 0,45 µm de la
suspensión de esporas de reserva.
Las esporas fueron preparadas en cuatro concentraciones y se emplearon en la evaluación de su
efecto en la inducción de LiP.
Efecto de la concentración de esporas en la actividad enzimática de LiP. Se estudió el efecto de
cuatro dosis de esporas en la producción y el tiempo de aparición de la máxima actividad
ligninolítica. La inducción de LiP se realizó en cultivos líquidos bajo las mismas condiciones de
cultivo con el metabolito 3,4-dimethoxibencyl alcohol (Alcohol veratryl) en el medio Kirk de
producción de LiP, cuya composición se especifica en el Anexo D.
- Dosificaciones de esporas evaluadas y condiciones de inducción
Las dosificaciones de esporas evaluadas correspondieron a 2,0 ml de suspensión con cada una de las
concentraciones de 2,0 × 106 esp/ml , 2,5 × 106 esp/ml, 3,0 × 106 esp/ml y 3,5 × 106 esp/ml ,
preparadas en Tween 80 al 0.1%. De cada una de las concentraciones evaluadas se realizó tres
cultivos de 20 ml cada uno y se incluyó tres cultivos adicionales sin inóculo de esporas como
control de tratamiento. El inóculo consistió de 2,0 ml de la suspensión de esporas de estudio y los
cultivos de control fueron inoculados con 2,0 ml de Tween 80 al 0.1% estéril en reemplazo del
inóculo de esporas. Las concentraciones finales de los cultivos correspondieron a 2,0 × 105 esp/ml ,
2,5 × 105 esp/ml, 3,0 × 105 esp/ml y 3,5 × 105 esp/ml. Los cultivos fueron realizados en frascos
Erlenmeyer de 250 ml con desprendimiento lateral e incubados estacionariamente a 39°C en
condiciones altamente aeróbicas en una incubadora Lab-Line. A los cultivos se les suministró
oxígeno ultra alta pureza grado 4 (99.99% mínimo) durante 3 min a 100 ml/min , en el momento de
27la inoculación y posteriormente 2 veces por día durante el periodo de incubación. Diariamente, se
extrajo una muestra de 2 ml del fluido extracelular de cada uno de los cultivos y se pasó a través de
filtros de membrana de 0,22 µm (Millipore, Millex-GS) y por último, las muestras fueron
analizadas .
- Variables de seguimiento
A partir del cuarto día de inducción se determinó diariamente la concentración de proteína
extracelular total y actividad ligninolítica LiP.
! Proteína extracelular total
La concentración total de proteína soluble fue determinada mediante el método colorimétrico de
Bradford en un espectrofotómetro UNICAM UV2, empleando el reactivo de proteína Bio-Rad (500-
0006) y albúmina sérica de bovino (SIGMA) como proteína estándar, como se especifica en el
Anexo E.
! Actividad ligninolítica LiP
La actividad ligninolítica diaria de P. chrysosporium fue calculada a 651 nm , a partir de los valores
de decremento por minuto en la absorbancia (∇A ) por mg de proteína. Los decrementos fueron
651
obtenidos de la relación entre los promedios de la concentración diaria de proteína extracelular y el
valor correspondiente de ∇A en cada concentración de esporas evaluada, mediante la oxidación
651
enzima-sustrato de las muestras con la metodología espectrofotométrica reportada por Archibald
(1992). El substrato enzimático empleado fue el colorante Azure B y su coeficiente de extinción
molar fue obtenido en el rango de estabilidad óptica a las condiciones empleadas en la
determinación (Anexo F).
Establecida la dosificación de esporas que presentó la máxima actividad ligninolítica específica y el
tiempo de aparición de esta en el fluido extracelular, se dosificaron 16 cultivos con esta
concentración de esporas, mediante un único tratamiento, con el objeto de producir LiP en una
cantidad suficiente para los tratamientos de deslignificación.
- Obtención de LiP
Se realizaron 16 cultivos de 20 ml cada uno en el medio formulado Kirk en frascos Erlenmeyer de
250 ml con desprendimiento lateral. El inóculo para cada uno de los cultivos consistió de 2,0 ml de
28suspensión de esporas con una concentración de 2,0 × 106 esp/ml determinada mediante la curva
espectrofotométrica de referencia. Los cultivos fueron incubados estacionariamente a 39°C bajo
atmósfera de oxígeno durante 6 días. Finalizado el periodo de incubación de estos, se procedió a
recuperar las proteínas presentes en el fluido extracelular.
- Recuperación de LiP
Los fluidos extracelulares fueron separados por filtración en membranas de 0,45 µm de tamaño de
poro y el filtrado fue sometido a centrifugación a 10000 × g durante 10 min en una centrífuga
Sorval Super T21. Posteriormente, se recuperaron las proteínas presentes en el filtrado por
fraccionamiento gradual hasta saturación.
- Fraccionamiento de proteínas
El fraccionamiento de las proteínas se realizó en forma gradual, mediante la adición de sulfato de
amonio cristalino a 0°C, inicialmente hasta el 35% de saturación y posteriormente hasta el 75% , de
acuerdo al protocolo de “Salting out” reportado por Bollag et al. (1991) (Anexo G).
- Concentración de LiP
Las fracciones proteínicas obtenidas hasta el 75% de saturación fueron unificadas y resuspendidas
en 150 ml de buffer de tartrato de amonio 50 mM pH 4,5. Este volumen se dializó contra 4 l de agua
desionizada durante 3 días, empleando membranas de 3500 dalton (Spectrum), el volumen dializado
se pasó a través de membranas de ultrafiltración de 10 kDa (Amicon) por centrifugación a 5000 × g
durante 24 h . La fracción retenida en la membrana fue finalmente liofilizada y las enzimas
presentes en el concentrado liofilizado se caracterizaron bioquímicamente por espectrofotometría y
electroforesis.
- Caracterización Bioquímica
! Concentración de proteína extracelular soluble. La concentración de proteína extracelular
soluble, del concentrado enzimático parcialmente purificado, se determinó con el reactivo de
Bradford.
! Actividad ligninolítica LiP. La cuantificación de la actividad enzimática del concentrado se
realizó con Azure B, mediante el registro de ∇A .
651
29! Determinación del peso molecular de las enzimas. Las proteínas presentes en el extracto
enzimático LiP fueron separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes (SDS-PAGE), de acuerdo a la metodología reportada por Laemmli (1970). El
peso molecular de las proteínas nativas presentes en el extracto, se determinó mediante una
regresión gráfica entre el logarítmo de las masas moleculares aparentes del patrón y su
movilidad relativa, siendo esta última la relación entre las distancias de migración de la proteína
estándar y del colorante de rastreo (Azul de bromofenol); por último, los pesos aparentes del
patrón fueron luego relacionados con sus pesos moleculares nativos. El marcador molecular
empleado consistió de una solución estándar precoloreada de proteínas con pesos moleculares
entre 25 kDa y 127 kDa (Anexo H).
5.3.2.2 Enzimas ALiP de S. viridosporus
La cepa original de S. viridosporus consistió de 1 g de células liofilizadas y esta fue propagada con
el objeto de disponer de células viables del microorganismo para el estudio.
Propagación de S. viridosporus. La bacteria fue propagada en 160 ml del caldo tripticasa de soya
(CTS) pH 7,2 (BBL), a partir de 0,5 g del cultivo liofilizado original. Para ello, se extrajo una
alícuota de 2,0 ml de caldo y se transfirió a un vial conteniendo 0,5 g de células bacterianas
liofilizadas. La suspensión se agitó en un vortex durante 3 min hasta completa homogeneidad y
volúmenes de 100 µl de esta suspensión de células fueron adicionados a 5 frascos erlenmeyer de
250 ml conteniendo cada uno 30 ml de CTS. Los frascos fueron sellados asépticamente e incubados
a 37°C y 150 r.p.m. en un agitador orbital de plataforma Lab-Line durante 3 días. Finalizado el
periodo de incubación, de cada uno de los cultivos se transfirió células bacterianas por barrido con
asa microbiológica a cajas Petri, conteniendo agar de tripticasa de soya (SIGMA) y se incubaron
estacionariamente a 37°C durante 5 días. Posteriormente, se determinó el tiempo de crecimiento
bacteriano de S. viridosporus, con el objeto de obtener células en fase de crecimiento exponencial
necesarias para el inoculo en el medio de producción de ALiP.
Determinación del periodo de crecimiento exponencial de S. viridosporus. Inicialmente se
obtuvo 10 ml de una suspensión de células en CTS por barrido con asa de un cultivo superficial de
reserva. A esta suspensión se le determinó la densidad de células bacterianas en un hemocitómetro.
De la suspensión se extrajo una alícuota de 2 ml y se resuspendió en 48 ml de CTS en un frasco
30erlenmeyer de 250 ml. El frasco con la suspensión de células se incubó a 37°C y 150 r.p.m. durante
16 h junto con un frasco adicional, como control de tratamiento, conteniendo igual cantidad de CTS
y 2,0 ml de agua estéril en reemplazo de las células.
Transcurrido el periodo de incubación, los volúmenes del cultivo de células y el del tratamiento de
control fueron llevados a 300 ml con CTS, se extrajo una muestra de 2 ml del cultivo con células
bacterianas y nuevamente fueron incubados a las mismas condiciones durante 27 h . A la muestra
extraída se le determinó la concentración de células mediante lecturas en hemocitómetro y de
absorbancia a 600 nm , correspondiendo estos valores a la concentración inicial de células en cada
una de las dos técnicas. Posteriormente, se extrajo muestras de 2,0 ml cada 3 h , durante el tiempo
de incubación y se determinó, por medio de cuatro repeticiones, la concentración celular en
hemocitómetro y en espectrofotómetro. Los blancos en las lecturas espectrofotométricas se
realizaron con muestras de 2,0 ml de CTS, extraidas del tratamiento de control en el mismo tiempo
de incubación respectivo al evaluado.
Establecido el tiempo de crecimiento exponencial de S. viridosporus, a las condiciones
especificadas, se procedió a determinar el efecto en la producción de ALiP de cuatro dosis de
inóculo de células en fase de crecimiento exponencial y el tiempo de aparición de la máxima
actividad ligninolítica específica.
Efecto de la concentración de células en la actividad enzimática de ALiP. Se estudió el efecto
de cuatro dosis de células bacterianas en la producción y el tiempo de aparición de la máxima
actividad ligninolítica, bajo las mismas condiciones de incubación, en el medio maximizado
DeoJim (DJMM) de producción de ALiP, cuya composición se especifica en el Anexo J.
- Dosificaciones evaluadas de células de S. viridosporus
Se evaluaron las concentraciones de células, en crecimiento exponencial, correspondientes a 1,0 ×
103 cel/ml , 1,0 × 104 cel/ml, 1,0 × 105 cel/ml y 1,0 × 106 cel/ml . De cada una de las
concentraciones se realizó tres cultivos líquidos de 90 ml cada uno y se incluyó tres cultivos sin
inoculo de células como control de tratamiento. Los cultivos fueron incubados anaerobicamente en
frascos erlenmeyer de 250 ml a 37°C y 150 r.p.m. en una agitador de plataforma orbital durante 6
días. Diariamente, se extrajo una muestra de 2 ml del fluido extracelular de cada uno de los cultivos
31y se pasó a través de filtros de membrana de 0,22 µm (Millipore, Millex-GS), con el objeto de
evaluar las variables de interés.
- Variables de seguimiento
Se determinó diariamente la concentración de proteína total soluble y la actividad ligninolítica
ALiP.
! Proteína extracelular total
La concentración de proteína total de los fluidos extracelulares fue determinada por el método de
Bradford, de igual manera que la realizada para LiP.
! Actividad ligninolítica ALiP
La actividad ligninolítica, en cada una de las concentraciones de células bacterianas evaluadas, fue
cuantificada a 510 nm a partir del incremento por minuto en la absorbancia (∆A ) por mg de
510
proteína, obtenido de la relación entre los promedios de ∆A y la concentración de proteína
510
correspondiente, mediante la metodología reportada por Wood et al., como se especifica en el
Anexo F.
Establecido el tiempo de aparición de la máxima actividad específica y la dosificación de células
que la presentó, se procedió a obtener enzimas ligninolíticas en las condiciones fijas determinadas
de concentración de inóculo y tiempo de incubación, con el objeto de producir ALiP en una
cantidad suficiente para los tratamientos posteriores de deslignificación enzimática.
- Obtención de ALiP
Se realizaron 8 cultivos de 100 ml cada uno en el medio DJMM empleando frascos Erlenmeyer de
250 ml. Los cultivos fueron incubados a 37°C con agitación a 150 r.p.m. durante un periodo de 6
días, mediante un único tratamiento. La dosificación de S. viridosporus consistió de células en fase
de crecimiento exponencial con un tiempo de incubación de 900 min y en una concentración de 1,0
× 106 cel/ml para cada uno de los cultivos.
- Recuperación de ALiP
Finalizado el periodo de incubación, los fluidos extracelulares fueron separados por filtración con
membranas de 0,22 µm de tamaño de poro, el filtrado fue centrifugado a 104 × g durante 10 min y
32las proteínas presentes en el sobrenadante se sometieron a fraccionamiento en forma gradual hasta
el 75% de saturación, de acuerdo al protocolo de “Salting out”. Las fracciones de proteínas
obtenidas hasta el 75% de saturación fueron unificadas, y resuspendidas en 150 ml de buffer Tris-
HCl 50 mM (pH 8) y este volumen se dializó contra 4 l de agua desionizada durante 3 días
empleando membranas de 3500 dalton (Spectrum) y posteriormente concentradas por ultrafiltración
y liofilización.
- Concentración de ALiP y determinación del peso molecular de las proteínas
El volumen dializado se pasó a través de membranas de ultrafiltración de 30 kDa (Amicon) por
centrifugación a 5000 × g durante 24 h . La fracción retenida en la membrana fue liofilizada y las
enzimas presentes en el concentrado liofilizado se caracterizaron bioquímicamente.
- Caracterización Bioquímica
! Concentración de proteína extracelular. La concentración de proteína extracelular soluble,
del concentrado enzimático ALiP parcialmente purificado, se determinó por el método de
Bradford.
! Actividad ligninolítica ALiP. La cuantificación de la actividad ligninolítica del concentrado
se realizó con 2,4-dichlorophenol como substrato enzimático, mediante el registro de ∆A .
510
! Determinación del peso molecular de las enzimas. Las proteínas en el extracto enzimático
ALiP fueron separadas mediante SDS-PAGE, de acuerdo a la metodología anteriormente
citada.
5.3.2.3 Análisis estadístico.
Análisis descriptivo. La concentración de proteína extracelular soluble, para cada uno de los días
de evaluación, fue considerada como variable de seguimiento y esta fue analizada mediante la
determinación del promedio aritmético y la desviación estándar de las tres lecturas realizadas
diariamente para cada uno de los tratamientos. Por su parte, la variable actividad ligninolítica diaria
(LiP y ALiP) fue analizada mediante un análisis de varianza (ANOVA), seguido por una prueba de
comparación de Tukey con un nivel de significancia al 5% cuando se encontraron diferencias en la
variable cuantificada. Los análisis fueron realizados en el programa SAS versión 612.
335.3.3 Etapa 3. Deslignificación enzimática de la borra de café
La cantidad de extracto enzimático LiP, obtenido en la etapa inmediatamente anterior, no fue
suficiente para su estudio en la deslignificación de la borra de café. Por lo tanto, se evaluó el grado
de remoción de lignina, sobre borra previamente acondicionada, de tres dosificaciones enzimáticas
del concentrado enzimático ALiP del cual se obtuvo la cantidad suficiente para ser empleada en
igual número de tratamientos.
5.3.3.1 Acondicionamiento del material.
El acondicionamiento de la borra de café consistió en la molienda hasta la reducción de tamaño de
partícula de 0,42 mm , el agotamiento de componentes extractivos mediante la extracción con una
solución etanol-tolueno 1:2 (v/v) (en un equipo Soxhlet) durante 24 h y luego de drenado el
solvente se realizó una segunda extracción durante 48 h empleando H O, con el objeto de retirar el
2
solvente de la primera extracción. La borra libre de componentes extractivos se secó a 105°C
durante 12 h .
5.3.3.2 Tratamientos enzimáticos de deslignificación.
Se realizaron cuatro tratamientos de deslignificación en los que se evaluaron las dosificaciones de
concentrado enzimático correspondientes a 18 mg , 9 mg y 6 mg , denotadas como R , R y R ,
2 4 6
respectivamente y un tratamiento de control de deslignificación, en el cual no se dosificó extracto
enzimático, como se especifica en la Tabla 3. Todos los tratamientos fueron realizados en las
mismas condiciones de operación mediante cinco repeticiones.
Tabla 3. Dosificación de ALiP en los tratamientos enzimáticos
Dosificación
Tratamiento Relación
(mg)*
1 R 1,94
2
2 R 0,90
4
3 R 0,65
6
Control - -
* Relación de extracto por gramo de borra en base seca libre de extractivos
- Unidad experimental
La unidad experimental para cada uno de los tratamientos consistió de 10 g de borra acondicionada
y con una humedad promedio de 6,82%. La dosificación del concentrado enzimático fue establecida
en términos de la composición inicial de lignina total (sustrato para la enzima) en la borra, la cual
fue determinada previamente.
34- Procedimiento de deslignificación
La unidad experimental se introdujo en un beaker de 250 ml dispuesto en un baño termostático con
temperatura constante de 30°C y provisto de un agitador externo (LIGHTNIN), se le adicionó 2,5
ml de H O al 30% (v/v) y se ajustó el pH a 7,2 con la adición de 80 ml de buffer Tris 100 mM pH
2 2
8,0. El concentrado enzimático fue dosificado en cada uno de los tratamientos en las cantidades
especificadas anteriormente, a excepción del tratamiento de control, que consistió de igual cantidad
de borra acondicionada, H O al 30% (v/v) y buffer Tris 100 mM pH 8,0 hasta un pH de 7,2, sin la
2 2
adición de concentrado enzimático. Los tratamientos fueron realizados a 30°C y una agitación de
150 r.p.m durante 12 h . Posteriormente, se procedió a recuperar y cuantificar el residuo sólido
(borra residual) y la lignina polimérica ácido precipitable (APPL) de la fase acuosa (filtrados) de
cada uno de los tratamientos.
5.3.3.3 Recuperación y cuantificación de la borra residual
El residuo sólido de cada tratamiento fue recuperado mediante filtración por succión al vacío,
empleando papel filtro Whatman No. 1. El material depositado sobre el papel fue secado a 105°C
hasta obtener peso constante y se determinó gravimetricamente la pérdida de peso (en base seca)
ocasionada por el tratamiento, con respecto al peso inicial del material.
5.3.3.4 Recuperación y cuantificación de APPL
La lignina polimérica fue recuperada por acidificación de los filtrados, adicionando suficiente HCl
concentrado hasta obtener un pH final de 3, estos fueron centrifugados a 16000 × g durante 10 min
y el material precipitado fue separado por filtración. La APPL recolectada se lavó tres veces con
agua acidificada (agua con pH 3 ajustado con HCl) y se secó a 50°C en un horno al vacío hasta
obtener el peso constante.
5.3.3.5 Variable de respuesta
La variable establecida para la deslignificación correspondió al contenido de lignina total en la
borra residual en la borra residual.
- Cuantificación de la variable
35La variable fue cuantificada mediante las metodologías Klason y por espectrofotometría de los
filtrados Klason, anteriormente especificadas. A su vez, con el objeto de revalidar la remoción de
lignina, fue cuantificada gravimetricamente la APPL recuperada por acidificación de la fase acuosa
de los tratamientos evaluados y la composición de lignina ácido insoluble y carbohidratos de la
APPL.
Contenido de lignina ácido insoluble y ácido soluble en la borra residual
! Contenido de lignina total
El residuo sólido recolectado de cada uno de los tratamientos, incluyendo el tratamiento de control,
fue analizado en su contenido de lignina ácido insoluble, mediante el método Klason y a los
filtrados Klason se les cuantificó por espectrofotometría UV la composición de lignina ácido
soluble, de acuerdo a la metodología anteriormente citada.
! Contenido de lignina ácido insoluble y carbohidratos de la APPL
Lignina ácido insoluble. La APPL recuperada se analizó en el contenido de lignina residual,
utilizando el método modificado de lignina ácido insoluble, especificado en el Anexo K y se
cuantificó como una fracción ácido insoluble de las muestras de APPL sometidas a hidrólisis con el
ácido fuerte empleado en la determinación.
Carbohidratos totales en la APPL. El contenido de carbohidratos totales de la APPL fue obtenido
mediante la técnica modificada de Somogyi-Nelson, a partir del análisis espectrofotométrico de los
filtrados de la determinación de lignina ácido insoluble realizada a la APPL, como se describe en el
Anexo L.
5.3.3.6 Análisis estadístico
Se realizó un análisis descriptivo (promedios, intervalo de confianza y coeficiente de variación) de
las variables cuantificadas (por quintuplicado) en las determinaciones después de los tratamientos
enzimáticos: APPL recolectada, peso residual (lignina ácido insoluble residual en la borra),
absorbancia del filtrado (lignina ácido soluble residual en la borra), peso residual de lignina ácido
insoluble (lignina en la APPL) y concentración de azúcares equivalentes (carbohidratos en la
APPL). A su vez, se realizó un estadístico de prueba t al 5% de estas variables, con el objeto de
establecer los tratamientos que presentaron mayor remoción de lignina total en la borra tratada
(lignina ácido insoluble y lignina ácido soluble) y recuperación de APPL, como también el mayor
36contenido de lignina residual y el menor contenido de carbohidratos en la APPL recuperada. Los
anteriores análisis se realizaron en SAS y se reportan en la sección de Resultados y discusión,
correspondiente a esta etapa.
5.3.4 Etapa 4. Obtención de etanol a partir del producto deslignificado
La borra de café tratada enzimáticamente se sometió a sacarificación y fermentación simultánea
con la levadura termotolerante S. cerevisiae D A y el complejo celulolítico Econase, mediante dos
5

tratamientos en los que se evaluó dos tipos de dosificación del complejo Econase , cada uno de los
cuales consistente en igual número de dosificaciones y cada una de estas involucrando tres unidades
experimentales, con el objeto de determinar la dosis de mayor rendimiento en términos de
producción de etanol.
5.3.4.1 Tratamientos de SSF.
Los tratamientos consistieron en la evaluación de dos tipos de dosificación del complejo enzimático

Econase :
! En términos de concentración en porcentaje (p/p) en la mezcla reaccionante: 2% y 5%.
! En términos de actividad celulolítica, expresada en IFPU/g de celulosa: 10 IFPU/g y 20 IFPU/g.
La dosificación de Econase, en términos de IFPU/g de celulosa, se realizó con respecto al contenido
de celulosa en la borra libre de extractivos, a partir de la concentración de proteína y de la actividad
específica de la celulasa en el complejo, lo que requirió la determinación de la actividad celulolítica
total y la cuantificación de proteina presente en el complejo.
La cuantificación de la actividad celulolítica de la celulasa en el complejo se realizó por el método
IUPAC de unidades de actividad con papel filtro, mediante la técnica espectrofotométrica a 540 nm
de liberación de 2,0 mg de glucosa a partir de una cantidad fija de 50 mg de celulosa, como se

especifica en el Anexo M. La concentración de proteína total de Econase fue determinada de una
dilución al 10% (v/v) del complejo en buffer de citrato de sodio 0,005 M pH 4,8, empleando el
método de Bradford y a partir de la gráfica de referencia que relacionó la absorbancia a 595 nm y el
contenido de albúmina sérica de bovino (BSA) como fuente de proteína, en el rango lineal de
concentración de 50 mg/l a 300 mg/l .
375.3.4.2 Tratamientos de control.
Control de deslignificación. Con el objeto de determinar el efecto de la borra sin deslignificación
previa sobre la producción de etanol, se realizaron, por triplicado, un total de cuatro tratamientos de
control, un tratamiento para cada una de las dosificaciones. Estos estuvieron constituidos por

iguales relaciones de complejo Econase , buffer, inóculo de levadura y nutrientes con respecto a
cada uno de las dosificaciones de referencia y la unidad experimental consistió de borra de café
libre de extractivos y sin deslignificación enzimática previa. en el caso del control de enzima, no se
dosificó complejo enzimático y el volumen equivalente a la mayor dosis de este se reemplazó con
buffer de citrato.
Control de sacarificación (control enzima). Se realizó un tratamiento de control de SSF para
determinar si a partir de borra de café deslignificada parcialmente se produce etanol por
fermentación, sin la etapa previa de sacarificación. El control consistió de iguales relaciones de
buffer, inoculo de levadura y nutrientes que se emplearon en la mayor dosificación de complejo y
Econase
en reemplazo de se agregó buffer de citrato. La unidad experimental consistió de borra de
café libre de extractivos y deslignificada enzimática proveniente del tratamiento que removió el
mayor porcentaje de lignina.
- Unidades experimentales
La unidad experimental para cada uno de los tratamientos de la dosificación en términos de IFPU/g
consistió de 6 g de borra tratada enzimáticamente con humedad promedio del 3,43%, proveniente
del tratamiento que presentó el mayor grado de remoción de lignina en la etapa 3; por su parte, para
cada uno de los tratamientos de la dosificación en términos de porcentaje, consistió de 6 g de borra
con humedad promedio de 3,29%, proveniente del tratamiento que presentó el segundo mayor grado
de remoción de lignina en la etapa anterior.
Procedimiento. Los tratamientos de ambos tipos de dosificación se realizaron durante 5 días en
condiciones anaeróbicas a pH 5,0 ajustado con buffer de citrato de sodio 0,05 M y en frascos
Erlenmeyer de 125 ml , a los cuales se les acopló una manguera sumergida en una solución de
H SO al 50% (v/v) como trampa de CO , con el objeto de prevenir la evaporación del etanol
2 4 2
producido. La mezcla de SSF estuvo constituida de borra tratada enzimáticamente, (sustrato
celulósico) en una concentración de 10% (p/p), inoculo de microorganismo fermentativo en 10%
(p/p), solución 10X de medio YP (200 g/l de peptona y 100 g/l de extracto de levadura, pH 5
38ajustado con ácido fosfórico) en 10% (p/p) y la correspondiente dosificación evaluada de Econase.
Las condiciones de operación correspondieron a incubación a 38°C y con agitación a 150 r.p.m. en
un agitador de plataforma orbital Lab-Line.
El inóculo de S. cerevisiae fue obtenido por centrifugación a 6000 × g de los cultivos líquidos con
células en crecimiento durante 24 h en el medio YPD (20 g/l de peptona, 10 g/l de extracto de
levadura y 20 g/l de glucosa) incubados a 34°C y 150 r.p.m.
5.3.4.3 Seguimiento de las variables de proceso.
El seguimiento de las variables de proceso se realizó mediante la extracción diaria de muestras de
2,0 ml de cada una. Las muestras fueron extraidas con jeringas estériles de 2,0 ml, centrifugadas en
una microcentrífuga Eppendorf y filtradas con filtros de membrana de 0,45 µm de tamaño de poro.
El filtrado obtenido se analizó en el contenido de azúcares reductores, celobiosa y etanol.
Concentración de etanol en la mezcla. La concentración se determinó por medio del método
refractométrico de A.O.A.C. (1997), a partir de la muestra previamente destilada en un rotavapor a
150 inHg y 40°C , por medio de una gráfica de referencia que relacionó concentración de etanol en
porcentaje (vol./vol.) e índice de refracción, empleando etanol absoluto (Anexo N).
Concentración de celobiosa. La determinación se realizó por el método de Somogyi-Nelson. La
muestra fue diluída a un volumen apropiado y la concentración de celobiosa se obtuvo a partir de
una curva estándar realizada con glucosa anhidro (Sigma) y la cual relacionó absorbancia a 520 nm
y concentración de glucosa en el rango de 5 µg/ml a 100 µg/ml (Anexo P).
Concentración de azúcares reductores. El contenido reductores se determinó a partir de una
curva estándar previamente obtenida con glucosa anhidro, de acuerdo al método del ácido
dinitrosalicílico (DNS), como se especifica en el Anexo Q.
Recuperación de etanol. La recuperación se realizó por destilación del producto obtenido, una vez
terminado el proceso de sacarificación y fermentación.
395.3.4.4 Análisis estadístico.
Los valores promedios y los intervalos de confianza de las variables de seguimiento de los
tratamientos con borra deslignificada, correspondientes a concentración de celobiosa, azúcares
reductores y etanol, se obtuvieron por un análisis descriptivo. Las diferencias entre los tratamientos
evaluados, en el tiempo de duración de estos, fueron establecidas con análisis diario y global
mediante prueba de comparación de Tukey al 5% de significancia. Análisis similares se realizaron
para los tratamientos que emplearon borra de café sin deslignificación enzimática (tratamientos de
control de deslignificación). Todos los análisis fueron realizados con la ayuda del programa SAS y
se reportan en el Anexo T.
406. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 CARACTERIZACIÓN QUIMICA DE LA BORRA DE CAFÉ
Los resultados de la caracterización química de la borra de café se especifican en la Tabla 4.
Tabla 4. Composición química de la borra de café
Composición I.C
Componente
(%)*
L.I L.S
Extractivos 30,38 30,008 30,756
Cenizas 0,31 0,312 0,315
ácido insoluble 33,76 33,381 34,136
Lignina
ácido soluble 1,40 1,383 1,421
Celulosa 33,62 32,95 34,28
Otros (No cuantificados) 0,34 ----- -----
* Promedio expresado en porcentaje p/p en base seca; I.C: Intervalo de confianza;
L.I: Límite inferior; L.S: Límite superior.
La lignina total fue el componente presente en mayor proporción, siendo 3,9% superior al contenido
de celulosa. Los componentes de interés en este estudio, celulosa y lignina, estuvieron asociados
cuantitativamente, al presentar composiciones cercanas entre si; sin embargo, el contenido
celulósico fue inferior al encontrado en materiales de composición altamente lignocelulósica (entre
40% y 45%). El componente ácido soluble de la lignina presentó una contenido bajo con respecto a
los encontrados comúnmente, alrededor del 5%, en materiales vegetales del mismo tipo
(angiosperma), pero fue significante en relación con el material inorgánico. La caracterización
también evidenció un contenido apreciable de grasas, ácidos grasos, fenoles y terpenos, entre otros,
referidos estos como componentes extractivos. Por su parte, el contenido inorgánico de sales
minerales y analizado como cenizas, fue el más bajo entre los componentes cuantificados. García et
al. (1997) encontró una composición más rica en celulosa (38,83%) de la borra de café proveniente
41de la misma factoría de café soluble, un contenido menor de lignina (27,42%) y un contenido
similar de componentes extractivos (30,59%) al encontrado en este estudio. Las metodologías
empleadas en el presente estudio cuantifican el componente soluble de la lignina en los materiales
vegetales, sin la subestimación de su contenido por otras técnicas y son recomendadas para los
agroresiduos (Han et al., 1997) que no presentan estructuras fibrosas rígidas. Sin embargo, la
extracción de lignina, en el presente estudio, se realizó selectivamente por solubilización y el
contenido encontrado fue estrechamente cercano al presentado por la oxidación con TEGA. El
método gravimétrico con trietilenglicol indicó un contenido del 33,28% de lignina (Anexo B) y el
cual se realizó para establecer la extracción más apropiada.
6.2 OBTENCIÓN Y EVALUACIÓN DE ENZIMAS LIGNINOLÍTICAS DE P.
chrysosporium Y S. viridosporus.
6.2.1 Enzimas LiP de P. chrysosporium.
El hongo presentó un mejor crecimiento superficial en el medio MEM suplementado con piezas de
ciprés, en el cual se logró un cubrimiento de estas al sexto día de incubación (Figura 10), con
respecto al medio de propagación Kirk. Las piezas de ciprés fueron incluidas en el medio evaluado
con el objeto de brindarle a P. chrysosporium las condiciones propias de crecimiento silvestre. En
cuanto a los medios evaluados en la producción de esporas, en el medio de propagación Kirk se
presentó una leve formación de esporas a partir del cuarto día de incubación y con MEM la
producción de esporas fue escasa durante todo el periodo de incubación del microorganismo; por su
parte, la producción de esporas se favoreció considerablemente al emplear el medio de crecimiento
PDA, con respecto a la cantidad producida por cultivo en los otros dos medios evaluados. El
crecimiento de P. chrysosporium sobre ciprés y la morfología de las esporas obtenidas en PDA se
observan en detalle en los insertos a y b de la Figura 10, respectivamente.
42a
b
Figura 10. Crecimiento de P. chrysosporium sobre piezas de ciprés y
morfología de las esporas.
En la cuantificación del inóculo de esporas de P. chrysosporium para la producción de LiP, se
obtuvo la gráfica de referencia que se muestra en la Figura 11 y que relacionó la densidad óptica a
650 nm con la concentración de esporas del microorganismo.
4.0E+06
)lm/saropse(
3.0E+06
nóicartnecnoC
2.0E+06
1.0E+06
0.2 0.25 0.3 0.35 0.4 0.45
Absorbancia a 650 nm
Figura 11. Gráfica de referencia de concentración de esporas de P. chrysosporium - absorbancia.
La concentración de esporas fue correlacionada adecuadamente con la densidad óptica registrada a
650 nm en la gráfica obtenida, mostrando una relación lineal (coeficiente de regresión de 0,9814) y
siendo útil para la dosificación de esporas de P. chrysosporium en la inducción de LiP.
436.2.1.1 Efecto de la dosis de esporas en la actividad enzimática de LiP.
Las dosificaciones de esporas de P. chrysosporium, evaluadas en los cultivos de producción de LiP
durante 6 días de inducción, presentaron los valores de ∇A /mg de proteína que se muestran en la
651
Figura 12.
Los datos experimentales de ∇A , para las concentraciones de esporas estudiadas, presentaron alta
651
variabilidad durante los seis días de evaluación y por consiguiente los valores específicos de
decremento (∇A /mg proteína) mostraron la misma dispersión, como se observa en la Figura 12.
651
La máxima actividad enzimática específica de P. chrysosporium correspondió a 0,01457 U/mg
proteína y se obtuvo con la concentración de 2,0 × 106 esp/ml en el noveno día, presentando el
mayor intervalo de variación.
3
2,0*10E6
2.5 nim
2,5*10E6
2 3,0*10E6 . gm
3,5*10E6 /
1.5 otnemerceD
1
0.5
0
4 5 6 7 8 9
Días de evaluación
Figura 12. Valores de ∇A651/mg de proteína de las dosificaciones de esporas
evaluadas.
El comportamiento diario de las concentraciones de 2,5 × 106 esp/ml , 3,0 × 106 esp/ml y 3,5 × 106
esp/ml se muestra más claramente en la Figura 13, en la que se observa un máximo valor de
∇A /mg = 0,849 unidades de absorbancia (0.007 U/mg proteína), correspondiente a la dosificación
651
de 3,5 × 106 esp/ml en el sexto día de incubación.
441.4
1.2
2,5*10E6
nim
1 3,0*10E6
3,5*10E6 .
gm
0.8
/
otnemerceD
0.6
0.4
0.2
0
4 5 6 7 8 9
Días de evaluación
Figura 13. Valores de ∇A651/mg de proteína de las dosificaciones de 2,5 × 106
esp/ml , 3,0 × 106 esp/ml y 3,5 × 106 esp/ml .
Los resultados observados muestran que la actividad ligninolítica de P. chrysosporium no está
asociada con las concentraciones de esporas evaluadas, en el medio de inducción de LiP empleado y
a partir del comportamiento encontrado, se establecieron las condiciones apropiadas para la
obtención de enzimas ligninolíticas para la deslignificación enzimática de 2,0 × 106 esp/ml como
concentración de inóculo y un periodo de inducción de nueve días.
La actividad ligninaperoxidativa de P. chrysosporium fue obtenida a partir del valor de la
absortividad molar del substrato Azure B, en las condiciones espectrofotométricas de estabilidad
óptica más apropiadas.
6.2.1.2 Absortividad molar del Azure B.
El espectro de absorbancia obtenido para el cálculo de la absortividad molar del Azure B 32 µM a
25°C y pH 4,5, en la cuantificación de la actividad ligninolítica de P. chrysosporium, se muestra en
la Figura 14. El substrato enzimático presentó un máximo valor de absorbancia de 1,974 (unidades
de absorbancia) dentro de un amplio rango de estabilidad óptica comprendido entre 580 nm y 660
nm . De la gráfica obtenida se estableció una longitud de onda de 651 nm (marcada sobre la gráfica)
como la apropiada para la determinación de la actividad ligninolítica y con el máximo valor de la
absorbancia presentado por el compuesto se obtuvo el valor del coeficiente de extinción molar de
61843 M-1 cm-1, como se especifica en el Anexo F.
452.5
7
2
aicnabrosba
1.5
ed
1 sedadinU
0.5
0
500 550 600 650 700 750 800
Longitud de onda (nm)
Figura 14. Espectro de absorbancia del Azure B 32 µM.
La estabilidad óptica presentada por el substrato enzimático Azure B a las condiciones
mencionadas, lo hace apropiado para la cuantificación espectrofotométrica de la actividad
ligninolítica. Archibald (1992) reporta que la estabilidad del Azure B es la principal característica
para ser empleado en la determinación de la actividad enzimática del tipo peroxidativo, por su
relativa resistencia a la degradación microbial.
6.2.1.3 Producción y caracterización bioquímica de LiP.
La cantidad gravimétrica de extracto LiP parcialmente purificado fue de 95 mg y en su
caracterización bioquímica se encontró una concentración proteínica promedio de 134,51 mg/l,
∇A = 0,0051 unidades de absorbancia, una actividad ligninolítica de 0,1226 U/mg proteína
651
(Anexo F). y las fracciones proteínicas presentes en el extracto enzimático presentaron pesos
moleculares aparentes entre 26 kDa y 45 kDa; sin embargo, como se observa en la Figura 15 la
intensidad de la banda superior, en el gel electroforético, indica que esta fracción proteínica se
presentó en mayor proporción con respecto a las restantes y su peso molecular nativo correspondió
a 43 kDa. Por su parte, el peso molecular de la banda inmediatamente inferior a la de mayor
proporción fue de 38 kDa y de 26 kDa el correspondiente a la tercera banda.
461 2 1 2
 116 kDa
 84 kDa
 58 kDa
 45 kDa
HHH111000 4444
 36,5 kDa
4444
4444
Figura 15. Proteínas del extracto enzimático de P. chrysosporium en gel de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE) al 12%.
1. Extracto enzimático LiP; 2, Marcador de peso molecular de rango
amplio con la masa molecular expresada en KDa .
En los resultados de cuantificación espectrofotométrica de actividad enzimática con Azure B a 651
nm, (técnica de alta especificidad enzima – substrato), se comprobó la existencia de enzimas
ligninolítica activas en el concentrado y a su vez, se determinó que los procedimientos de
fraccionamiento de proteínas, diáilis, ultrafiltración y liofilización del fluido extracelular del
microorganismo incrementaron considerablemente la actividad ligninolítica, en un factor de 8,4 con
respecto a la encontrada en el fluido extracelular sin purificación (0,01457 U/mg). En el análisis
electroforético se identificó a la isoenzima H10 como el componente ligninolítico que presentó
actividad enzimática en el análisis espectrofotométrico, de acuerdo con el peso molecular de la
isoenzima reportado por Kirk et al. (1989) y también mostró que la inducción ligninolítica de P.
chrysosporium fue principalmente de la fracción de 43 kDa (isoenzima H10).
El factor crítico en la obtención de LiP lo representó la mínima cantidad de extracto enzimático que
se logró recuperar de los cultivos de P. chrysosporium, debido al carácter inductivo de su
producción por parte del organismo. Los factores que influyen en la inducción de LiP han sido
estudiado, entre otros por Dosoretz et al. (1993), con el objeto de establecer las condiciones
favorables de producción por P. chrysosporium; encontrando que la inducción de la isoenzima H2
se presenta en condiciones de exceso de nutrientes en el medio y la isoforma H10 en medios de
inducción con una concentración de 2,4 mM de NH + como fuente de nutrientes.
4
476.2.2 Enzimas ALiP de S. viridosporus
La propagación en agar de tripticasa de soya, de las células liofilizadas de S. viridosporus que
crecieron en CTS, presentaron la morfología típica de las colonias del género Streptomyces (Figura
16).
Figura 16. Morfología de S. viridosporus T7A creciendo en agar de tripticasa de soya.
En el recuadro se observa una colonia.
6.2.2.1 Crecimiento exponencial de S. viridosporus.
El estudio del periodo de crecimiento bacteriano de S. viridosporus, durante las 27 h de evaluación,
mostró el comportamiento en la densidad celular que se observa en la Figura 17, en la cual I
representa la concentración inicial de células regeneradas del cultivo liofilizado original..
487.0E+08
6.0E+08
)lm/saluléc(
5.0E+08
4.0E+08
ralulec 7
3.0E+08
dadisneD
2.0E+08
1.0E+08
0.0E+00
I 0 180 360 540 720 900 1080 1260 1440 1620
Tiempo (min)
Figura 17. Concentración celular de S. viridosporus por lectura en hemocitómetro durante
27 h de crecimiento.
Los valores experimentales de concentración de células, obtenidos en intervalos periódicos de
tiempo durante 27 h , no mostraron un comportamiento sinusoidal bien definido característico del
crecimiento bacteriano y con el objeto de determinar el tiempo medio de máximo crecimiento, los
valores encontrados fueron clasificados en cinco grupos para su análisis:
Grupo 1. Valores de concentración celular correspondientes a los tiempos entre 0 min y 360 min
Grupo 2. Valores de concentración obtenidos entre 540 min y 720 min
Grupo 3. Concentración correspondiente a 900 min
Grupo 4. Concentración obtenida a los 1080 min
Grupo 5. Concentraciones obtenidas a partir de los 1260 min
A estos cinco grupos se les realizó una prueba de comparación de Duncan, encontrando que los
grupos 2, 3 y 4 presentaron diferencias estadísticas y los grupos 1 y 2 fueron estadísticamente
iguales, al igual que lo fueron los grupos 4 y 5. Del anterior análisis, se concluyó que el tiempo en el
cual se presentó la mayor concentración celular estuvo comprendido entre 720 min y 1080 min y en
promedio correspondió a 900 min .
49La técnica espectrofotométrica a 600 nm , presentó valores inconsistentes de densidad óptica entre
180 min y 720 min y la concentración celular de S. viridosporus no se correlacionó adecuadamente
con la Absorbancia en este intervalo, como se observa en la Figura 18. Sin embargo, la
cuantificación espectrofotométrica mostró que la densidad de células bacterianas presenta
incrementos considerables hasta 900 min y no se incrementa de manera apreciable a partir de 1080
min , como también se observó en la Figura 17.
2
7
1.6
mn
006
1.2
a
aicnabrosbA
0.8
0.4
0
0 180 360 540 720 900 1080 1260 1440 1620
Tiempo de evaluación (min)
Figura 18. Relación de absorbancia y tiempo de crecimiento para células de S.
viridosporus.
El tiempo promedio de máxima concentración celular de S. viridosporus, determinado en este
estudio, se empleó para obtener células en su máximo potencial de crecimiento y con ellas se
conformó el inoculo para obtener enzimas ALiP en el medio formulado.
6.2.2.2 Efecto de la dosis de células en la actividad enzimática de ALiP.
Las concentraciones de células de S. viridosporus, evaluadas en los cultivos de producción de ALiP
durante 9 días, presentaron los valores de ∆A /mg de proteína que se muestran en la Figura 19.
510
50180
1*10E3
150
1*10E4 nim
120 1*10E5 .gm
1*10E6 /
otnemercnI
90
60
30
0
1 2 3 4 5 6
Días de evaluación
Figura 19. Promedios de ∆A510/mg de proteína de las cuatro dosificaciones de S.
viridosporus.
En la Figura 19 se observa que en la concentración de 1×106 cel/ml se obtuvo el máximo valor de
∆A /mg.min y por consiguiente la máxima actividad de 129,65 U/mg el sexto día, con respecto a
510
las restantes concentraciones evaluadas. Por su parte, el comportamiento de las concentraciones de
1×103 cel/ml , 1×104 cel/ml y 1×105 cel/ml se muestran más claramente en la Figura 20.
14
1*10E3
12
1*10E4 nim
10
.gm
1*10E5
8 /
otnemercnI
6
4
2
0
1 2 3 4 5 6
Días de evaluación
Figura 20. Promedios de ∆A510/mg de proteína de las dosificaciones 1×103 cel/ml ,
1×104 cel/ml y 1×105 cel/ml de S. viridosporus.
51El comportamiento enzimático observado por S. viridosporus, mostró que la producción
ligninolítica no está asociada al crecimiento del microorganismo, siendo esto evidente en el
comportamiento presentado por la mayor concentración celular durante el periodo más avanzado de
evaluación. Los resultados obtenidos en el estudio de crecimiento de la bacteria, se encontró que su
fase exponencial de incremento celular finaliza alrededor de 1080 min (18 h) y en el tiempo
posterior el microorganismo alcanza la fase estacionaria. La estrategia de producción enzimática de
ligninaperoxidasa de S. viridosporus, consistió en alcanzar más tempranamente la fase estacionaria
de S. viridosporus, con el objeto de obtener ALiP en un tiempo más corto, para lo cual se
establecieron las condiciones iniciales correspondientes a células en crecimiento exponencial que
alcanzarían más prematuramente la fase estacionaria y además, se empleó como medio de
crecimiento, el caldo DJMM el cual suple eficazmente los requerimientos de nutrientes y estimula
el incremento de su masa celular con respecto a otros medios. Estos resultados son congruentes con
los reportes de Korus et al.(1991), en los que se establece que la producción de ALiP se incrementa
de manera lenta a medida que se incrementa la concentración celular, alcanzando y manteniendo la
máxima actividad durante la fase estacionaria.
Los valores encontrados de ∆A /mg.min para las concentraciones de 1×103 cel/ml , 1×104 cel/ml y
510
1×105 cel/ml, que a su vez corresponden a los valores de actividad específica (U/mg proteína) de S.
viridosporus, no fueron considerables con relación a los encontrados en 1×106 cel/ml y por lo tanto,
se estableció una concentración de 1×106 cel/ml y seis días de crecimiento para la producción de
ALiP en cantidad suficiente para los ensayos de deslignificación.
6.2.2.3 Producción y caracterización bioquímica de ALiP.
La obtención del concentrado enzimático de ALiP, se realizó con la concentración de células de
1×106 cel/ml durante 6 días de crecimiento bacteriano. La cantidad final del extracto enzimático
parcialmente purificado fue de 705,6 mg y la caracterización bioquímica presentó una actividad
ligninolítica específica promedio de 232,70 U/mg (∆A igual a 0,0883 unidades) y una
510
concentración de proteína total de 75,62 mg/l . Los valores experimentales de ∆A y concentración
510
de proteína se reportan en el Anexo F.
Los resultados evidenciaron que la actividad ligninolítica del extracto enzimático parcialmente
purificado se incrementó en un 80% con respecto a la actividad del fluido extracelular sin
tratamientos de purificación (129,65 U/mg), lo que indicó que los procedimientos secuenciales de
52fraccionamiento de proteínas, diálisis, ultrafiltración y liofilización fueron apropiados para la
concentración de las enzimas ligninolíticas presentes en el fluido extracelular bacteriano.
La caracterización electroforética del extracto enzimático ALiP obtenido se observa en la Figura 21.
Las bandas reveladas en el gel de poliacrilamida mostraron únicamente la presencia de dos
fracciones de proteínas en el extracto. Los pesos moleculares de estas fracciones correspondieron a
63 kDa y 53 kDa , la banda superior correspondió a la de mayor densidad y la inferior presentó una
resolución ténue y esto indica que el concentrado enzimático estuvo compuesto principalmente de
la fracción proteínica de mayor peso molecular.
1 2
116 kDa 
88,5 kDa 
3333AAALLLiiiPPP---PPP333
64 kDa 
50 kDa 
Figura 21. Proteínas presentes en el extracto enzimático de S.
viridosporus en gel de poliacrilamida en condiciones
desnaturalizantes al 15%.
1, Marcador de peso molecular con la masa molecular expresada en
kDa; 2, Extracto enzimático ALiP.
En la caracterización espectrofotométrica de actividad ligninolítica del extracto, se registraron
valores periódicos de incremento en la densidad óptica, evidenciando la presencia de ALiP-P3 en el
extracto enzimático. Lo anterior, se derivó de las características específicas de la técnica utilizada
que consistió en la cuantificación a 510 nm del compuesto coloreado antipyrylquinonimine (que
absorbe fuertemente a 510 nm), producto de la oxidación del 2,4-dichlorophenol y 4-
aminoantyprene por la acción de la enzima presente en el extracto obtenido (Anexo F). Wood et
al.(1997), propone esta técnica con el objeto de cuantificar específicamante la isoforma ALiP-P3
por oxidación selectiva del 2,4-dichloropenol.
53En la Figura 22 se observan las cantidades gravimétricas de cada uno de los extractos enzimáticos
LiP y ALiP parcialmente purificados y obtenidos de los microorganismos ligninolíticos de estudio.
a b
Figura 22. Extractos enzimáticos obtenidos de (a) P.
chrysosporium y (b) S. viridosporus.
Los resultados en la obtención de enzimas ligninolíticas de P. chrysosporium y S. viridosporus
presentaron marcadas diferencias en términos gravimétricos y bioquímicos. Estas se presentaron
como consecuencia de las diferencias en la producción de los componentes enzimáticos entre ambos
organismos. El hongo P. chrysosporium expresa este sistema enzimático cuando se le induce su
metabolismo secundario en condiciones ligninolíticas apropiadas (con alcohol veratryl como
inductor) y por su parte, S. viridosporus excreta enzimas ligninolíticas como parte de su actividad
metabólica primaria, como el crecimiento. Lo anteriormente expuesto tienen las implicaciones que
se observaron en este estudio, como la baja producción de LiP por la complejidad en el proceso
fisiológico de inducción por P. chrysosporium y la alta actividad ligninolítica específica de S.
viridosporus por las condiciones apropiadas de crecimiento.
6.3 DESLIGNIFICACIÓN ENZIMÁTICA DE LA BORRA DE CAFÉ
6.3.1 Cuantificación de la variable lignina total
El contenido promedio de lignina insoluble y lignina soluble de la variable cuantificada (lignina
total) en la borra residual de cada uno de los tratamientos enzimáticos, se reportan en la Tabla 5.
54Tabla 5. Contenido de lignina ácido insoluble y ácido soluble en la borra residual
Lignina insoluble Lignina soluble
Tratamiento
(mg/g)*
Designación L.I Promedio** L.S L.I Promedio** L.S
1,94 R 29,83 30,73 b 31,62 0,98 0,99 b 1,01
2
0,90 R 26,33 26,52 c 26,71 0,76 0,95 b 1,14
4
0,65 R 26.34 26,90 c 27,46 0,95 1,11 b 1,26
6
Control - 33,62 34,04 a 34,46 1,42 1,44 a 1,47
D.M.S 0,84 0,18
*Relación de extracto por gramo de borra en base seca libre de extractivos; **expresado en porcentaje p/p en base
seca, promedios seguidos con la misma letra no presentan diferencias significativas, Tukey 5%; L.I: Límite inferior;
L.S: Límite superior; D.M.S: Diferencia mínima significativa.
En la evaluación de lignina insoluble de la borra residual, el análisis de varianza mostró diferencias
significativas en relación con el control (p < 0,0001), donde se observa un aumento gradual de la
remoción de lignina a medida que la dosificación de enzima se disminuye. Para los tratamientos R
4
y R , esta remoción no fue estadísticamente diferente (Tukey al 5%), lo que indica que la acción
6
óptima de la enzima sobre el sustrato está limitada por una relación apropiada de estos dos
elementos. Estos resultados experimentales indican que se presenta un comportamiento enzimático
superior cuando se dosifica el concentrado ALiP en una relación de 0,90 mg de extracto por 0,35 g
de lignina.
El contenido de lignina soluble en la borra residual de los tratamientos R , R y R fue
2 4 6
significativamente diferente al presentado en el control (p < 0,0001), con pérdida del 29% en R , del
2
32% en R y 21% en R , del contenido inicial de este componente en el material tratado (1,40%).
4 6
Sin embargo, las remociones entre los tratamientos fueron estadísticamente iguales (Tukey al 5%),
como consecuencia de la prevalencia catalítica de la enzima sobre el componente ácido insoluble de
la lignina. Estos resultados confirman los estudios sobre el mecanismo enzimático de
despolimerización de la lignina, realizados por Crawford et al.(1988) y en los que se identificó a los
enlaces β-aril eter (principales enlaces de la lignina ácido insoluble) como los sitios de acción de
ALiP.
La remoción de lignina total en la borra tratada enzimáticamente fue del 9,78% con una
dosificación de extracto de 1,94 mg/g , la dosificación de 0,9 mg/g removió el 21,87% y la
dosificación de 0,65 mg/g retiró el 20,34% de la lignina total. Lo anterior indica que la relación
55apropiada de extracto enzimático por gramo de borra libre de extractivos, con base en 9,3 g de borra
tratada, corresponde a 0,97 mg/g .
En la Tabla 6 se muestran las remociones efectivas de lignina total de cada una de las dosificaciones
enzimáticas evaluadas, teniendo en cuenta los componentes ácido insoluble y ácido soluble iniciales
y finales de lignina en el material tratado. Las remociones fueron corregidas por el contenido
residual de carbohidratos en la APPL recuperada, con el objeto de obtener valores reales de lignina.
Tabla 6. Remoción efectiva de lignina en los tratamientos enzimáticos
Lignina
Lignina total removida
Relación
Removida de la borra* Residual en APPL* (g)**
R 9,78 94,12 0,856
2
R 21,87 96,52 1,962
4
R 20,33 93,12 1,76
6
*Expresado en porcentaje en base seca; **con base en 9,3 g de material seco tratado.
6.3.2 Cuantificación de APPL en el filtrado
La cuantificación gravimétrica de la APPL recuperada de cada uno de los tratamientos y la
composición promedio de lignina insoluble y carbohidratos totales de la APPL son presentados en
la Tabla 7.
Tabla 7. Cantidades gravimétricas de APPL recuperada y su composición química
de lignina insoluble y carbohidratos
Relación APPL Lignina insoluble Carbohidratos
L.I Promedio* L.S L.I Promedio** L.S L.I Promedio*** L.S
R 0,47 0,57 c 0,67 2,71 2,94 b 3,17 6,93 6,98 b 7,02
2
R 1,55 1,57 a 1,58 1,42 1,74 c 2,06 6,83 6,88 b 6,92
4
R 0,72 0,76 b 0,79 3,14 3,44 a 3,74 7,22 7,53 a 7,84
6
---
Control 0 0 d 0 ----- ----- ----- ----- -----
--
D.M.S 0,078 0,18 0,25
*peso recuperado en mg; **peso residual en mg; ***expresado en porcentaje p/p en base seca; promedios seguidos con la
misma letra no presentan diferencias significativas, Tukey 5%; L.I: Límite inferior; L.S: Límite superior; D.M.S:
Diferencia mínima significativa.
56El análisis de varianza de la cuantificación gravimétrica de la APPL, indicó diferencias estadísticas
con el tratamiento de control (p < 0,0001), mostrando una correspondencia con el comportamiento
presentado en la cuantificación de lignina insoluble en la borra residual. La APPL obtenida fue
significativamente diferente entre las dosificaciones evaluadas (Tukey al 5%), siendo 1,57 mg la
mayor cantidad promedio recuperada en la dosificación de extracto enzimático de 0,9 mg/g y en el
tratamiento con dosificación de 0,65 mg/g se obtuvo solo el 51,8% de la cantidad recuperada con
0,9 mg/g.
Las diferencias en las cantidades gravimétricas de APPL, obtenidas en la remoción enzimática de la
lignina de la borra, mostró claramente que la cantidad de lignina polimérica en los filtrados estuvo
asociada con la dosificación enzimática y no se debió a otros factores, como por ejemplo las
condiciones de operación de los tratamientos. Estos resultados se revalidan con los reportes de
Crawford et al. (1988), en los que se cuantifica el grado de remoción de lignina por S. viridosporus
mediante la recuperación de la APPL producida por la acción enzimática del microorganismo sobre
el sustrato.
6.3.3 Caracterización química de la APPL
Por su parte, la caracterización química de la APPL, proporcionó la información específica sobre la
naturaleza de la pérdida de peso de la borra tratada enzimáticamente. Las columnas
correspondientes a lignina insoluble y carbohidratos en la Tabla 7, reportan el valor promedio de
peso residual (obtenido de la hidrólisis de 50 mg de APPL) y la composición de carbohidratos
totales presentes en esta. El peso residual representó, con respecto a los 50 mg tratados, la
composición de lignina insoluble fue de 94,12%, 96,52% y 93,12% en la APPL obtenida de las
dosificaciones de extracto de 1,94 mg/g , 0,9 mg/g y 0,65 mg/g, respectivamente. La composición
total de APPL, para cada tratamiento, estuvo conformada de lignina insoluble y carbohidratos y fue
calculada por la adición de estos dos componentes.
El análisis de varianza, realizada para la composición de la APPL, mostró que el contenido de
lignina insoluble fue significativamente diferente en los tres tratamientos (p < 0,0001). La
composición de carbohidratos de la APPL del tratamiento R fue estadísticamente igual a la del
4
tratamiento R (Tukey al 5%).
6
57Los anteriores resultados muestran que la APPL recuperada de todos los tratamientos presentó una
composición de lignina insoluble superior al 93%, lo que correspondió a una deslignificación
altamente selectiva del material; Por su parte, el contenido de carbohidratos totales fue de 7,1%,
indicando que este mismo porcentaje correspondió a la remoción promedio de carbohidratos de los
tratamientos enzimáticos de la borra. Los resultados de la caracterización química de la APPL,
muestran una alta correspondencia con la composición química de la APPL referenciada por
Crawford et al. (1988), en la cual se especifican contenidos promedios de carbohidratos entre 2% y
3% y cenizas entre 4% y 5%.
Como consecuencia de la metodología realizada en la cuantificación independiente de lignina
insoluble y de carbohidratos totales en la APPL, los valores experimentales mostraron una
sobreestimamación promedio de 1,7% en la composición total de esta. Sin embargo, este valor no
resultó considerable debido a la mínima dispersión encontrada en los valores experimentales y a que
la determinación de lignina y carbohidratos se realizó mediante dos técnicas que involucraron
medidas de alta sensibilidad gravimétrica y por consiguiente de alto márgen de error.
Con base en el criterio establecido de deslignificación, como la operación que remueve total o
parcialmente la lignina de un material, los resultados de este estudio indicaron que si se presentó
remoción de lignina en el material tratado enzimáticamente y por lo tanto si es posible una
deslignificación enzimática de la borra.
6.4 Etapa 4. Obtención de etanol a partir del producto deslignificado
6.4.1 Actividad celulolítica de Econase
El complejo enzimático de celulasa y β-glucosidasa presentó una concentración de proteína total de
21,85 mg/ml y una actividad celulolítica de 0,012 FPU. En la determinación de la actividad
enzimática, las diluciones evaluadas del complejo al 5%, 15%, 30% y 50% presentaron el
comportamiento que se muestra en la Figura 23, observandose claramente que la dilución
enzimática al 30% v/v fue la apropiada para el cálculo de la actividad celulolítica y a su vez, que la
determinación experimental se ajustó rigurosamente a los parámetros exigidos por la técnica
IUPAC, con respecto a la liberación de 2 mg de glucosa por la acción enzimática en el caso de la
dilución seleccionada.
582.5
77
2
)gm(
1.5
asoculG
1
0.5
0
0 10 20 30 40 50 60
Dilución de Econase (%) v/v.
Figura 23. Liberación de glucosa por ml de dilución de Econase al 5%, 15%, 30% y
50% (v/v).
6.4.2 Seguimiento de las variables de SSF
Con el objeto de comprobar la segunda hipótesis de trabajo, las variables celobiosa, azúcares
reductores y etanol, de los tratamientos con borra deslignificada, se analizaron entre si en su
comportamiento diario y global, con respecto al control de sacarificación (control de enzima) y un
análisis similar con las mismas variables se realizó entre los tratamientos de control de
deslignificación.
6.4.2.1 Comportamiento de las variables con borra deslignificada.
Celobiosa. El análisis estadístico de la concentración promedio de celobiosa y azúcares reductores,
durante los 5 días de evaluación, se muestra en la Tabla 8 y se reportan en el Anexo R.
59Tabla 8. Concentración de azúcares reductores y celobiosa de los tratamientos con borra
deslignificada
Azúcares reductores Celobiosa
Dosificación Promedio* I.C Promedio* I.C
C.V C.V
(mg/ml) L.I L.S (mg/ml) L.I L.S
10 IFPU/g 2.066 a 1.936 2.197 12.688 0.955 abc 0.789 1.121 34.947
20 IFPU/g 2.130 a 2.024 2.238 10.096 1.202 a 1.013 1.391 31.645
2% 2.076 a 1.908 2.245 16.313 0.757 bc 0.565 0.951 51.249
5% 1.732 a 1.390 2.076 39.795 0.809 abc 0.628 0.988 44.863
Control 1.170 b 0.657 1.685 88.309 0.606 c 0.372 0.841 77.722
*Promedios con la misma letra no son significativamente diferentes (Prueba de comparación de
Tukey. α=0.05); I.C: Intervalo de confianza; L.I: Límite inferior; L.S: Límite superior; C.V:
Coeficiente de variación.
La concentración inicial de celobiosa presentó diferencias estadísticas significativas entre los
tratamientos ( p< 0,0001). El tratamiento con una dosificación de complejo de 20 IFPU/g presentó
el mayor contenido inicial de celobiosa (1,65 mg/ml) y fue estadísticamente significativo al
presentado con las restantes dosificaciones y con el control de enzima (Tukey al 5%). Por su parte,
el control de enzima presentó el menor contenido inicial, correspondiendo a 0,12 mg/ml , siendo
estadísticamente diferente a los presentados en los tratamientos dosificados con el complejo
enzimático, como se observa en la Figura 24, en la cual I corresponde a la concentración inicial..
2
1.6
)lm/gm(
1.2
asoiboleC
0.8
10 IFPU/g
20 IFPU/g
0.4 2%
5%
control enzima
0
I 1 2 3 4 5
Tiempo (días)
Figura 24. Concentración de celobiosa en las dosificaciones evaluadas de Econase con borra
deslignificada.
60El comportamiento global de la celobiosa, mostró una relación directa con las cantidades

dosificadas de complejo Econase , mostrando un incremento de la concentración hasta el cuarto día
con el aumento en el complejo dosificado y un descenso similar el último día de evaluación; Por su
parte, la concentración de celobiosa, en el control de enzima, se incrementó periodicamente durante
los 5 días, siendo de 1,39 mg/ml en el día 5 y estadísticamente igual a la presentada el mismo día
por los tratamientos dosificados (Tukey al 5%).
Los resultados observados, indican que la producción de celobiosa se relaciona directamente con la
dosis de complejo empleado y que la borra de café deslignificada enzimáticamente aporta una
cantidad inicial cercana a 0,8 mg/g de borra. De otro lado, se observa que en el primer día de
tratamiento la concentración de celobiosa disminuye drásticamente, evidenciando la acción del
componente β-glucosidasa en el complejo enzimático, el cual transforma la celobiosa a glucosa
monomérica.
Durante el periodo de evaluación, la concentración promedio de celobiosa en el control de enzima,
fue estadísticamente igual a la presentada por las dosificaciones realizadas en porcentaje ( 2% y 5%)
y a 10 IFPU/g . La dosificación de 20 IFPU/g presentó una concentración de 1,20 mg/ml , superior
y estadísticamente significativa con respecto a las otras dosificaciones y al control. El
comportamiento global de la celobiosa, muestra una acumulación progresiva en las dosificaciones
evaluadas, siendo significativamente mayor la presentada en la dosis de 20 IFPU/g , como
consecuencia de la alta dosis de complejo y por ende del componente celulolítico. Philippidis et al.
(1997), reporta que la acumulación progresiva de celobiosa se presenta como una consecuencia
directa de la fase hidrolítica, etapa limitante en un proceso de sacarificación y fermentación
simultánea y cuando la enzima celulolítica no se dosifica adecuadamente.
Azúcares reductores. La concentración inicial de azúcares fermentables mostró diferencias
estadísticas significativas entre los tratamientos (p < 0,0001), siendo la máxima obtenida de 1,86
mg/ml en la dosificación de 20 IFPU/g y significativamente diferente a la presentada en las
restantes dosis y en el control de enzima. Lo anterior se correlaciona con el contenido inicial de
celobiosa presentado en el mismo tratamiento como consecuencia de la acción de la β-glucosidasa
con el alto contenido disponible de celobiosa en la dosificación de 20 IFPU/g .
61El comportamiento del control de enzima fue particularmente informativo, ya que este presentó la
menor concentración inicial de azúcares reductores (1,49 mg/ml) y fue estadísticamente igual a la
presentada en la dosis de 5% de complejo (Tukey al 5% de significancia), mostrando que la
producción de azúcares está directamente relacionada con la adición de complejo enzimático; la
cantidad inicial encontrada en este, correspondió al aporte fermentable de los componentes iniciales
de sacarificación. La concentración de azúcares de la dosificación al 5% de complejo enzimático
presentó un drástico descenso hasta 0,797 mg/ml el día cuatro, siendo estadísticamente igual a la del
control de enzima para el mismo día y correspondió al mínimo valor obtenido entre los tratamientos
dosificados.
El análisis global de azúcares reductores (Anexo S) mostró diferencias estadísticas significativas
entre todos los tratamientos (p < 0,0001) y la prueba de comparación de Tukey al 5% de
significancia, mostró únicamente diferencias estadísticas entre el control de enzima y los restantes
tratamientos, siendo el control el que presentó la menor concentración global de azúcares reductores
(1,17 mg/ml). El comportamiento presentado en la producción de azúcares reductores, muestra
claramente el efecto de la enzima hidrolítica en la sacarificación del substrato; en ausencia de
enzimas celulolíticas, los azúcares presentes inicialmente en el caldo de fermentación son
consumidos rápidamente por la levadura, hasta el punto de agotarlos, como se observa en la Figura
25.
A su vez, el incremento pronunciado en la producción de azúcares fermentables, observado el
último día de evaluación, es explicado por la acción de la levadura en el material cuya accesibilidad
ha sido incrementada por la deslignificación enzimática previa.
623
2.5
)lm/gm(
2
serotcuder
1.5
seracuzA
1
10 IFPU
20 IFPU
0.5
2%
5%
control enzima
0
I 1 2 3 4 5
Tiempo (dias)
Figura 25. Concentración de azúcares reductores en las dosificaciones de Econase con borra
deslignificada.
Etanol. Los promedios de concentración de etanol por día muestran que no hubo producción en las
condiciones iniciales. Para el primer día, se presentó producción de etanol en los tratamientos
dosificados con 10 IFPU/g, 2% y 5% (a excepción del tratamiento 20 IFPU/g) y el tratamiento que
presentó un mayor promedio de concentración de etanol fue el dosificado al 2% con 0.2121% ±
0.71% (promedio ± I.C). Sin embargo, el análisis de varianza no mostró diferencias significativas
entre los tratamientos evaluados (p= 0,096).
En términos generales, los tratamientos que fueron dosificados presentaron un comportamiento
similar en la producción de etanol, con respecto al tratamiento de control. En estos se presentó la
máxima producción el día cuatro, siendo la del tratamiento con 10 IFPU/g igual a 27,84% y
estadísticamente igual a la concentración de los tratamientos dosificados con 2% y 5% de Econase,
correspondientes a 21,89% y 25,81%, respectivamente.
El análisis de varianza para los promedios globales de la variable concentración de etanol (Anexo
T), mostró diferencias significativas (p< 0,0001) y la prueba de comparación de promedios mostró
las diferencias entre tratamientos que se especifican en la columna de promedio en la Tabla 9, en la
que se observa que el tratamiento dosificado con 10 IFPU/g de celulosa presentó una concentración
63de 10,03% ± 5,27% pero no fue significativamente diferente a la obtenida en los tratamientos
dosificados con el complejo al 2% y 5% .
Tabla 9. Concentración global de etanol en los tratamientos con borra deslignificada
Etanol % (v/v)
Dosificación
L.I Promedio * L.S C.V
10 IFPU/g 4,72 10,03 a 15,34 106,42
20 IFPU/g 0,11 0,30 b 0,49 127,64
2% v/v 4,52 8,98 a 13,44 99,83
5% v/v 2,86 7,80 a 12,74 127,26
Control de enzima 0 0 b 0 0
M.D.S 5,99
L.I: Límite inferior; L.S: Límite superior; *Promedios seguidos con la misma
letra no tienen diferencias significativas, prueba Tukey al 5%; C.V: Coeficiente
de variación; M.D.S: Mínima diferencia significativa.
El tratamiento con 20 IFPU/g presentó la menor producción de etanol y fue comparable con la
obtenida en el control enzima. Lo anterior se muestra como un efecto inhibitorio por exceso de
sustrato para la β-glucosidasa por la alta dosis de complejo; de acuerdo al comportamiento global
observado para la celobiosa en el mismo tratamiento, en el que se evidencia una acumulación
progresiva en el tiempo. Una relación alta de complejo produce celobiosa a altas velocidades de
hidrólisis por el componente celulolítico del complejo y la β-glucosidasa en este no alcanza a
hidrolizar a la misma velocidad. Philippidis et al. (1997) reportan que la velocidad específica de
hidrólisis del componente β-glucosidasa es 10 veces menor a la velocidad de hidrólisis del
componente celulolítico en el complejo Econase y a su vez, que altas relaciones de estos resultan
más ineficaces en la producción de etanol hasta el punto de la saturación del complejo.
La máxima concentración obtenida correspondió a 27,84% (v/v) en el tratamiento dosificado con 10
IFPU/g en el cuarto día (Anexo T), aunque el análisis general muestra concentraciones globales de
etanol alrededor de 10% (v/v). La producción de etanol, en un proceso fermentativo, es una variable
fuertemente dependiente del tiempo, como se observa en la Figura 26 y un análisis diario de su
producción revela mayor información sobre el tiempo de máxima velocidad hidrolítica y catabólica
de los componentes enzimático y fermentativo involucrados en el proceso.
6430
10 IFPU/g
25 20 IFPU/g
2%
20 5% )v/v(
control enzima
%
15
lonatE
10
5
0
I 1 2 3 4 5
Tiempo (dias)
Figura 26. Concentración de etanol en las dosificaciones evaluadas de Econase con borra
deslignificada.
Los resultados experimentales presentaron diferencias numéricas en la producción de etanol a favor
del tratamiento con 10 IFPU/g de celulosa; sin embargo, el análisis estadístico no mostró diferencias
significativas entre este y los tratamientos con 2% y 5% de complejo. El tratamiento 10 IFPU/g
correspondió a la dosificación apropiada para la obtención de etanol, a partir de borra de café
deslignificada enzimáticamente, debido a que una adición del complejo en términos de la actividad
celulasa cuantifica el componente celulolítico en relación más aproximada con el contenido de su
sustrato (celulosa) disponible en el material y además, en experimentaciones de otro orden, como
por ejemplo a nivel de planta piloto, las diferencias en la producción no serán tan estrechas como
las presentadas en este estudio.
6.4.2.2 Comportamiento de las variables con borra sin deslignificación.
En la Tabla 10 se especifican las convenciones asignadas a los tratamientos de control de
deslignificación que se emplearon en la sacarificación-fermentación simultánea con borra sin
tratamiento enzimático de deslignificación.
65Tabla 10. Designación de los controles de deslignificación
Tratamiento Denominación
Control con 10 IFPU/g CD10 IFPU/g
Control con 20 IFPU/g CD 20 IFPU/g
Control con 2 % CD 2 %
Control con 5 % CD 5 %
Las variables cuantificadas en los controles de deslignificación presentaron los siguientes
resultados:
Celobiosa. La concentración inicial de celobiosa para los tratamientos de control de
deslignificación, dosificados de igual manera que los tratamientos que emplearon borra
deslignificada y referenciados en la Tabla 10, no mostró diferencias significativas entre si,
presentando valores promedio de 0,86 mg/ml a 0,98 mg/ml. El cuarto día se presentaron las
máximas concentraciones, siendo CD 20 IFPU/g el tratamiento que presentó el mayor valor con
1,68 mg/ml y solo fue significativamente superior al CD 10 IFPU/g (1,36 mg/ml). En el último día,
la concentración de CD 2% presentó la concentración más baja y fue significativamente diferente a
los restantes tratamientos de control (Tukey al 5%).
El día cuatro se presentó un comportamiento especial en la producción de celobiosa, como se
observa en la Figura 27.
662
CD 10 IFPU/g
CD 20 IFPU/g
1.6
CD 2%
CD 5% )lm/gm(
1.2
asoiboleC
0.8
0.4
0
I 1 2 3 4 5
Tiempo (dias)
Figura 27. Concentración de celobiosa en los controles de deslignificación.
Azúcares reductores. La concentración inicial de azúcares reductores no presentó diferencias
significativas y en promedio fue de 1,59 mg/ml. Para el último día, el tratamiento CD 2% fue
estadísticamente inferior a los restantes, presentando una concentración de 2,22 mg/ml (Tukey al
5% de significancia). El comportamiento global de azúcares en los tratamientos de control de
deslignificación (Figura 28) fue similar, mostrando una gran correspondencia entre los valores
iniciales y finales del componente fermentable, al observado en los tratamientos con borra
deslignificada (Figura 25). Estos resultados evidencian la principal característica en el desempeño
de la sacarificación y fermentación simultánea, en la cual los azúcares producidos en la fase
hidrolítica son rápidamente catabolizados por el microorganismo etanologénico y la cuantificación
de los azúcares es un factor estimativo y no determinante en la variable final (producción de etanol).
672.5
2
lm/gm(
serotcuder
1.5
1 seracuzA
CD 10 IFPU/g
CD 20 IFPU/g
0.5
CD 2%
CD 5%
0
I 1 2 3 4 5
Tiempo (dias)
Figura 28. Concentración de azúcares reductores en los controles de deslignificación.
El análisis de varianza de la concentración global de azúcares reductores indicó que los controles de
tratamiento de deslignificación no presentaron diferencias estadísticas significativas entre si (Tabla
11).
Tabla 11. Concentración global de celobiosa y azúcares reductores en los tratamientos de
control de deslignificación
Azúcares reductores Celobiosa
Dosificación Promedio* I.C Promedio* I.C C.V
C.V
(mg/ml) L.I L.S (mg/ml) L.I L.S
CD 10 IFPU/g 2.075 a 1.926 2.225 14.459 0.945 a b c 0.798 1.092 31.305
CD 20 IFPU/g 2.117 a 1.973 2.262 13.720 1.061 a b 0.869 1.254 36.417
CD 2 % 1.990 a 1.861 2.121 13.142 0.669 b c 0.470 0.869 59.728
CD 5 % 2.103 a 1.936 2.271 15.975 0.907 a b c 0.727 1.088 40.088
*Promedios con la misma letra no son significativamente diferentes (Prueba de comparación de Tukey. α=0.05); I.C:
Intervalo de confianza; L.I: Límite inferior; L.S: Límite superior; C.V: Coeficiente de variación.
Etanol. En los tratamientos de control de deslignificación no se presentó producción de etanol
durante los días de evaluación. Si bien, en el tratamiento CD 20 IFPU/g se encontró una
concentración promedio de 0,02% ± 0,03%, la prueba de comparación de promedios no mostró
diferencias entre tratamientos (Tukey al 5%). La Tabla 12 muestra el análisis de concentración de
etanol obtenido en los tratamientos de control de deslignificación.
68Tabla 12. Concentración global de etanol en los tratamientos de control de deslignificación
Etanol % (v/v)
Dosificación
L.I Promedio * L.S C.V
CD 10 IFPU/g 0 0 b 0 0
CD 20 IFPU/g 0 0,02 b 0,05 247,59
CD 2 % 0 0 b 0 0
CD 5 % 0 0 b 0 0
*Promedios con la misma letra no son significativamente diferentes (Prueba de
comparación de Tukey. α=0.05); L.I: Límite inferior; L.S: Límite superior;
C.V: Coeficiente de variación.
Los resultados obtenidos en los mejores tratamientos, en términos de producción de etanol, con
borra deslignificada y en el control de deslignificación (10 IFPU/g y CD 20 IFPU/g) fueron
comparados estadísticamente por medio de una prueba t (5 %), ya que es posible la producción de
etanol con borra sin deslignificar (en cantidad despreciable), encontrando diferencias significativas
(p = 0,001). Del análisis se concluyó que la hipótesis nula de este estudio es rechazada y se
comprueba que si es posible la obtención de etanol a partir de borra deslignificada enzimáticamente.
En la Figura 29 se muestra un resumen esquemático de los resultados más relevantes obtenidos en
este estudio.
69Características del extracto final :
Actividad: 0,1226 U/mg prot
Condiciones encontradas:
I Tn io emcu plo o: d2 e, 0 i×× n××1 d0 u6 e cs ióp n/m 6l M 0,0á 1x 4im Ua A gc t iv roid ta .d: C Isoan enti zd ia md a: :9 H5 1m 0g
c : días /m p
Concentraciones Evaluadas
2,0×106 esp/ml
P. chrysosporium 2,5×106 esp/ml Inducción de LiP Fluido extracelular Purificación
3,0×106 esp/ml parcial
3,5×106 esp/ml
Lignina total: 35,16%
Borra de café Caracterización Celulosa: 33,62% A condicionamiento Deslignificación ! 1
química Extractivos: 30,38% enzimática
Cenizas: 0,31%
Concentraciones Evaluadas
1,0×103 cel/ml
Producción de Purificación
S. viridosporus 1 1, ,0 0× ×1 10 04 c ce el l/ /m ml ALiP Fluido ext racelular parcial
5 l
1,0×106 cel/ml
Condiciones encontradas:
Inoculo: 1,0××××106 cel/ml Máxima ac tividad: Características del extracto final :
129,6 U/mg prot. Actividad: 232,7 U/mg prot.
Tiempo de incubación: 6 días
Cantidad: 705,6 mg
Isoenzima: ALiP-P3
Dos 1if 0i c Ia Fc Pio Un /ges d ee eE lc uo lon sa ase traC to an mc ie en nt tr oa sción de e t Can oo nl r% e(v s/v)
Dosificación de ALiP RReemmooccióiónn d dee l ilgignnininaa t ototatal:l d c t ol
1 ! R2: 1,94 mg/g de borra R: R2: 9,78% Sacarificación- 20 IFPU/g de celulosa 10 IFPU/g: 27,84% CD 10 IFPU/g: 0%
R4: 0,90 mg/g de borra R4: R4: 21,87% Fermentación Simultánea 2% 20 IFPU/g: 0,96% CD 20 IFPU/g: 0,02%
R6: 0,65 mg/g de borra R6: R6: 20,34% 5% 2%: 21,89% CD 2%: 0%
Control: 0 mg/g de borra Control : 0C%ontrol: 0 % 5%: 25,81% CD 5%: 0%
Figura 29. Esquema general de los resultados obtenidos en el estudio.
706.4.3 Estudio Cinético del Proceso Simultáneo de Sacarificación y Fermentación
El mecanismo de acción enzimática de un proceso SSF de la celulosa se representa en la Figura X.
El sustrato celulósico es hidrolizado aleatoriamente en los enlaces β-1,4-glucósidos a cadenas más
cortas de celulosa por la acción del componente endo-glucanasa de la celulasa, enseguida el
componente exo-glucanasa rompe estas cadenas a unidades de celobiosa (dímero de glucosa) y
glucosa. La celobiosa producida es hidrolizada posteriormente por la β-glucosidasa a glucosa
monomérica.
Celulasa
ββββ-glucosidasa
Levadura termotolerante
Figura 30. Mecanismo hidrolítico y catabólico de la sacarificación y
fermentación simultánea.
De la Figura se establecen las reacciones involucradas en el proceso, que se expresan a continuación
y en las cuales (1), (2) y (3) corresponden a reacciones enzimáticas de hidrólisis y (4) corresponde a
una reacción catabólica.
Celulosar 1→
Celobiosa
r 2→
Celobiosa Glucosa
Celulosar 3→
Glucosa
r G→
Glucosa Etanol
BALANCES DE MATERIA
Los balances de materia de los componentes del proceso se expresan en términos de las velocidades
de reacción, obteniendo las siguientes expresiones:
71Celulosa (C):
d(C)
= −r −r
dt 1 3
Celobiosa (B):
d(B)
= r −r
dt 1 2
Glucosa (G):
d(G)
= r +r −r
dt 2 3 G
Etanol (E):
( ) ( )([( ) ( )] [( ) ( )] [( ) ( )])
∆E = 0,5111−1,559Y G − G +1,053 B − B +1,111 C − C
XG 0 0 0
Biomasa (X):
d(X)
= r
dt X
La cinética enzimática de hidrólisis de la celulosa se representa mediante el modelo cinético de
Michaelis-Menten y el cual está descrito por la expresión:
ν C
r = máx A (6.1)
A K +C
m A
donde r es la velocidad volumétrica de reacción, C corresponde a la concentración del reactante
A A
A, ν es la velocidad máxima de reacción a concentración infinita de reactante y K representa la
máx m
concentración de Michaelis-Menten.
Los factores que afectan la velocidad de hidrólisis de la celulosa corresponden a aquellos que
influencian la actividad de la enzima celulasa, como la inhibición que presenta esta con la presencia
de celobiosa, glucosa, etanol y la pérdida de área superficial activa de la enzima. En el caso del área
superficial de la enzima, la expresión que representa el decremento de la actividad con respecto al
tiempo, está dada por (6.2).
72La velocidad de reacción de la celulosa está afectada por la pérdida de actividad (desactivación) de
la enzima celulasa al ser adsorbida por el sustrato, mediante una función del tiempo de proceso.
Actividad celulasa en el tiempo =e−λt (6.2)
r : la expresión de velocidad para la conversión de celulosa (r ) está dada por la expresión (6.3).
1 1
( )
k ’ C e−λλλλt K
r = 1( ) ( ) 1E ( ) (6.3)
1 B G K + E
1+ +
1E
K K
1B 1G
La máxima velocidad específica de hidrólisis de la celulosa a celobiosa (k '), corresponde a
1
k '= 0,042 h−1
1
Las concentraciones de inhibición de la enzima corresponden a:
K = 50,35 g/l K = 53,16 g/l K = 5,85 g/l
1E 1G 1B
La velocidad de reacción r queda expresada de acuerdo con la expresión (6.4):
1
( )
0,042 C e−0.02t 50,35
r = ( ) ( ) ( ) (6.4)
1 B G 50,35+ E
1+ +
5,85 53,16
r : la velocidad de hidrólisis de celobiosa a glucosa está dada por la ecuación siguiente, teniendo en
2
cuenta las concentraciones de inhibición que presenta la β-glucosidasa:
( )
k ’ B
r = 2 (6.5)
2 ( )
 G  ( )
K 1+ + B
m 
K
 
2G
73La máxima velocidad de conversión de la celobiosa (k ') a glucosa está afectada por la inhibición de
2
la β-glucosidasa a la glucosa (K ) y la saturación de esta por la celobiosa (K ).
2G m
La máxima velocidad específica de hidrólisis de la celobiosa corresponde a k '=3,793 g/UI.h y las
2
concentraciones de inhibición de la β-glucosidasa corresponden a K = 0,62 g/l
2G
yK = 10,56 g/l
m
Con base en los valores de inhibición, la expresión de conversión de celobiosa a glucosa por acción
de la β-glucosidasa, corresponde a:
( )
3,793 B
r = ( ) (6.6)
2  G  ( )
10,561+ + B
 0,62
r : la expresión de velocidad de conversión de celulosa a glucosa corresponde igualmente a la
3
expresión (6.4), para lo cual se asume que la actividad celulolítica de conversión de celulosa a
celobiosa es igual a la correspondiente de conversión de celulosa a glucosa.
( )
0,042 C e−0.02t 50,35
r = ( ) ( ) ( ) (6.7)
1 B G 50,35+ E
1+ +
5,85 53,16
r : la generación de biomasa (velocidad de crecimiento) en el proceso fermentativo está relacionado
X
con la concentración de sustrato, por lo que la expresión que correlaciona el crecimiento de
levadura (µ) con la concentración de sustrato (S) corresponde a la ecuación de Monod:
(cid:181) S
(cid:181) = max (6.8)
Ks+S
Donde Ks corresponde a la concentración de saturación del sustrato.
Para el caso de S. cerevisiae, este presenta inhibición de crecimiento por sustrato (glucosa) y por
etanol (producto). De lo anterior, se obtiene que la velocidad de generación de biomasa está dada
74por la ecuación (6.9), en la cual K y K corresponden a la concentración de glucosa y etanol en las
E G
cuales se inhibe el crecimiento de la levadura y µ es la máxima velocidad de crecimiento de la
m
levadura.
( )
( ) G K
r =(cid:181) X ( ) E ( ) (6.9)
X m K + G K + E
G E
K = 50 g/l K = 0,000037 g/l (cid:181) = 0,19 h-1
E G m
Teniendo en cuenta los anteriores valores, la expresión de generación de biomasa corresponde a:
( )
( ) G 50
r =0,19 X ( ) ( ) (6.10)
X 0,000037+ G 50+ E
r : la velocidad de consumo de glucosa por la levadura es función de las características propias del
G
microorganismo y está correlacionada con la producción de masa celular por g de glucosa
consumida (Y ) y la velocidad de consumo de glucosa para requerimientos de mantenimiento de la
XG
levadura (m), mediante la expresión (6.11).
s
r ( )
r = X +m X (6.11)
G Y s
XG
Y = 0,113 g/g m = 0
XG S
Simplificando,
r
r = X (6.12)
G 0,113
BALANCE DE CELULOSA
La Cantidad de celulosa (teórica) que se convierte a glucosa y celobiosa está dada por la actividad
celulolítica y glucosídica del complejo enzimático.
75Actividad celulasa del complejo Econase:
1 UI libera 1µmol/min de glucosa = 0,18 mg/min glucosa.
Para el caso de una dosificación de 10 IFPU/g de celulosa, la dosificación correspondió a 0,024 g de
proteína.
La actividad del complejo correspondió a 0,012 U/ml, determinada experimentalmente y con base
en estos valores, la glucosa (teórica) producida correspondió a 0,00684 mg/min (4,22 × 10-8
mol/min.
Volumen Cte = 63 ml
Para t = 0
Co = 56,98 g/l
Para t = 24 h
Moles de celulosa = moles iniciales - moles convertidas por actividad celulasa total
moles celulosa = moles residuales de celulosa - (4,22 × 10-8 mol/min × t (min))
celulosa (g/l) = (moles celulosa (en tiempo t) × P.M / 63) × 1000
celulosa
moles celulosa = 0,0219 mol - (4,22 × 10-8 mol/min × 1440 min) = 56,31 g/l
Para t = 48 h
C = 55,80 g/l
Para t = 72 h
C = 55,20 g/l
Para t = 96 h
C = 54,50 g/l
Para t = 120 h
76C = 53,74 g/l
En la etapa fermentativa (componente catabólico) para S. cerevisiae, se obtiene la velocidad
específica de formación de biomasa (r ), a partir de los valores experimentales de concentración de
X
células por unidad de volumen para un periodo de 120 h (Tabla 13).
Tabla 13. Concentración de biomasa.
Tiempo (h) X (g/l)
0 0,1
24 0,6
48 0,95
72 1,10
96 1,06
120 1,01
Inóculo inicial:10 g/100 ml (6,3 g/63 ml = 0,1 g/l)
Las expresiones de velocidad de conversión de cada uno de los componentes del sistema son
equivalentes a las ecuaciones de balance de materia respectivas. Los valores experimentales de
concentración de celobiosa, glucosa, etanol y los valores obtenidos teóricamente de biomasa
celulosa están referenciados en la Tabla 14.
Tabla 14. Correlación experimental de conversión de celulosa, producción de etanol y
generación de biomasa.
t (h) (C) [g/l] (B) [g/l] (G) [g/l] (E) [g/l] (X) [g/l] d(C)/dt d(E)/dt d(X)
0 56,98 0,87 0,12 0,0 0,10 -190,90 0,0 0,019
24 56,31 0,43 0,22 0,028 0,60 -114,95 1,65 0,114
48 55,80 0,37 0,94 1,81 0,95 -45,39 1,847 0,175
72 55,20 0,29 2,12 13,69 1,10 -15,83 1,746 0,172
96 54,50 0,49 2,30 27,85 1,06 -7,99 2,237 0,140
120 53,74 -0,19 -0,28 16,82 1,01 -32,65 4,884 0,151
77Los valores obtenidos de d(C)/dt, d(E)/dt y d(X)/dt se relacionan gráficamente con el tiempo (t) en
las Figuras 31, 32 y 33.
250
200
)l/g(
150
asoluleC
100
50
0
0 24 48 72 96 120 144
Tiempo (h)
Figura 31. Conversión hidrolítica de celulosa durante el proceso
simultáneo.
0.2
0.15 )L/g(
0.1 asamoiB
0.05
0
0 24 48 72 96 120
Tiempo (h)
Figura 32. Formación de biomasa durante el proceso simultáneo.
786.0
4.5
)L/g(
3.0 lonatE
1.5
0.0
0 24 48 72 96 120 144
Tiempo (h)
Figura 33. Formación de etanol durante el proceso simultáneo.
797. CONCLUSIONES
- La borra de café puede ser aprovechada biotecnologicamente, mediante deslignificación
enzimática bacteriana en la obtención de etanol por hidrólisis celulolítica y fermentación
etanologénica simultánea, sin la generación de efluentes contaminantes al medio ambiente.
- Las enzimas ligninolíticas de S. viridosporus deslignifican la borra de café, removiendo hasta
el 22% en peso del contenido de lignina original, cuando se dosifican en una relación de 0,9 mg/g
de borra libre de extractivos.
- La evaluación bioquímica de la obtención de enzimas ligninolítica de P. chrysosporium y S.
viridosporus mostró mayor eficiencia, en términos gravimétricos y catalíticos, en la producción
enzimática bacteriana; manifiesta por las características no inductivas de expresión de
ligninaperoxidasa en S. viridosporus.
- El contenido celulósico de la borra de café puede ser aprovechado en la producción de etanol
por sacarificación y fermentación simultánea, a partir de este subproducto previamente
deslignificado.
- En el procedimiento de inducción metabólica empleado en P. chrysosporium y de crecimiento
regular en S. viridosporus, se obtienen isoenzimas con actividad ligninolítica, predominantemente
las isoformas H10 y ALiP-P3, respectivamente.
- La borra de café presenta una composición apreciable de celulosa del 33,62% asociada a un
contenido aun mayor de lignina del 35,16% y el aprovechamiento del potencial celulósico está
directamente relacionado con un procedimiento de deslignificación.
80- El proceso simultáneo de sacarificación y fermentación con el complejo enzimático Econase y
la levadura termotolerante S. cerevisiae D A puede describirse cinéticamente mediante el modelo de
5
Michaelies-Menten y Monod, como lo muestran los comportamientos de la celulosa, biomasa y
etanol para el periodo de duración del proceso.
818. RECOMENDACIONES
- Evaluar las características inductivas de LiP en P. chrysosporium como la concentración del
metabolito inductor 3,4-dimethoxybencil alcohol, fuentes de carbono, nitrógeno y nutrientes en el
medio de cultivo con el objeto de incrementar la producción enzimática del organismo.
- Estudiar la remoción de lignina de la borra con enzimas ligninolíticas de P. chrysosporium y
establecer el sistema enzimático más eficiente en la deslignificación, entre este y el bacteriano
evaluado en la investigación.
- Realizar procedimientos de deslignificación enzimática con ALiP a nivel de planta piloto, que
permitan establecer criterios de operación catalítica óptimos para su aplicación.
- Continuar experimentaciones exploratorias básicas de deslignificación enzimática de otros
materiales agrícolas de desecho que tienen alto contenido lignínico y compuestos recalcitrantes
ambientales que presentan estructuras similares a la lignina, con el objeto de determinar el
espectro de acción enzimática en estos materiales.
- Estudiar la obtención de etanol, por sacarificación enzimática y fermentación en dos etapas
individuales de la borra de café deslignificada, para identificar los procedimientos que presentan
mayores rendimientos en términos de producción de etanol.
- Optimizar las condiciones de operación como concentración de inoculo, dosificación de
enzima y tiempo de producción en el procedimiento simultáneo empleado en la obtención de

etanol con Econase y S. cerevisiae D A.
5
- Realizar estudios de escalamiento a nivel de planta piloto del proceso simultáneo de
sacarificación y fermentación con el objeto de evaluar las variables más importantes de producción
de etanol a partir de borra de café mediante un proceso economicamente factible a la industria.
82LITERATURA CITADA
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89ANEXO A. Contenido de componentes extractivos
(Han et al. 1997)
El contenido de componentes extractivos se determina como el equivalente de material removido
por la extracción con el solvente etanol-tolueno durante 24 h con respecto al peso inicial de la
muestra. La muestra para la determinación se realiza con una cantidad aproximada de 3 g de
material, previamente acondicionado, la cual se coloca dentro de un dedal de extracción (ASTM
170-220) y este se introduce en la unidad de extracción soxhlet conteniendo 200 ml de una mezcla
de etanol-tolueno 1:2 (v/v). La extracción de la muestra se realiza durante 24 h , manteniendo el
solvente en ebullición a 74ºC (temperatura de ebullición de la mezcla etanol-tolueno) y a 6 ciclos de
extracción por hora. Finalizado el periodo de extracción, se remueve el dedal de la unidad de
extracción, se drena el exceso de solvente de este y la muestra se lava tres veces con etanol grado
analítico. El dedal, conteniendo las muestra del material extractado, se seca en un horno a 45°C y
150 mmHg de vacío durante 24 h , luego se introduce en un desecador con P O por 1 h y se registra
2 5
el peso residual.
90ANEXO B. Contenido de lignina total
(Chen C-L., 1988)
El contenido de lignina total se determina como la suma de los contenidos individuales de lignina
ácido insoluble y ácido soluble mediante la cuantificación del residuo sólido y el análisis
espectrofotométrico de los filtrados obtenidos del método Klason, respectivamente.
Contenido de lignina ácido insoluble
El material para análisis debe estar previamente acondicionado mediante la reducción de tamaño
hasta 0,841 mm (malla 20 de la serie de tamices Tyler), extracción en soxhlet con una solución
etanol-tolueno 1:2 (v/v) durante 24 h y secado a 45°C en un horno al vacío. Se extrae una muestra
de aproximadamente 1 g y se le adiciona 10 ml de H SO al 72% (v/v) con agitación ocasional
2 4
durante 2 h . La mezcla tratada se diluye con agua destilada hasta un volumen de 400 ml y se
transfiere a un matraz al cual se le acondiciona un condensador con un sistema de refrigeración y
enseguida se somete a ebullición bajo reflujo durante 4 h . La muestra tratada se filtra y el residuo
insoluble recolectado se lava varias veces con agua caliente para retirar el ácido y posteriormente se
seca a 105°C hasta obtener el peso constante.
El contenido de lignina ácido insoluble, en base seca, se determina mediante la expresión (1):
100 Ai
Contenido de lignina ácido insoluble (%)= ( )( ) (B.1)
W 1 -M 1+ E
100 100
Donde:
Ai: Peso del material obtenido en base seca (g)
W: Peso de la muestra inicial libre de componentes extractivos (g)
M : Contenido de humedad de la muestra inicial (%)
E: Contenido de componentes extractivos de la muestra (%).
91Contenido de lignina ácido soluble
El contenido de lignina ácido soluble se calcula a partir del filtrado obtenido de la determinación de
lignina ácido insoluble. El filtrado se diluye apropiadamente con agua destilada y se extrae 1,0 ml.
La alícuota se transfiere a una celda espectrofotométrica de cuarzo y se le determina el porcentaje
de transmitancia (%τ) a una longitud de onda de 205 nm en un espectrofotómetro. El blanco de
referencia para la lectura espectrofotométrica consiste de una solución de H SO 0,5 N . Si el
2 4
filtrado presenta un valor de %τ mayor al 70% se diluye con una solución de H SO 0,5 N hasta
2 4
obtener una lectura de %τ entre 20% y 70%. Cuando la lectura del %τ del filtrado se encuentre
dentro de este rango se realiza la lectura de la absorbancia respectiva a la misma longitud de onda.
El contenido de lignina ácido soluble, en base seca, presente en el filtrado Klason se obtiene a partir
de la expresión (2).
100 As V
Contenido de lignina ácido soluble (%)= ( )( ) (B.2)
110 × 1000W 1 -M 1+ E
100 100
Donde:
As: Absorbancia a 205 nm del volumen total del filtrado
V: Volumen total del filtrado con %τ entre 20% y 70% (ml)
W: Peso de la muestra libre de componentes extractivos (g)
M : Contenido de humedad de la muestra inicial (%)
E: Contenido de componentes extractivos de la muestra inicial (%)
Contenido total de lignina
El contenido total de lignina se obtiene de la expresión (B.3).
[( ) ( )]
Contenido total de lignina (%) ≡ Lignina Klason + Lignina ácido soluble (B.3)
92Contenido de lignina por oxidación con TEGA
El contenido de lignina, determinado por el método gravimétrico indirecto, estuvo representado en
la cantidad de material removido por la oxidación selectiva de la lignina presente en las muestras y
fue expresado en porcentaje de pérdida de peso en base seca del material tratado con TEGA (Tabla
15).
Tabla 15. Valores experimentales de pérdida de peso de borra tratada con TEGA
Peso final* Pérdida de peso Lignina Lignina promedio
Repetición (base seca) (base seca) (base seca) (base seca) D.E
(g) (g) (%) (%)
1 1,3185 0,6553 33,20
2 1,3144 0,6598 33,42
3 1,3177 0,6561 33,24 33,28 0,105
4 1,3192 0,6548 33,17
5 1,3153 0,6581 33,35
* con respecto a 2 g de borra inicial con humedad promedio de 1,30%; D.E: Desviación estándar.
93ANEXO C. Composición de Celulosa.
Método Goering-van Soest. (Kirk et al. 1988)
Una muestra de 1 g de material previamente acondicionado hasta un tamaño de partícula promedio
de 0,42 mm se coloca en un matraz dispuesto con un sistema de reflujo (condensador y sistema de
refrigeración) y se le adiciona 100 ml de solución ácido detergente. La solución ácido detergente se
prepara disolviendo 20 g de CTAB (cetyl trimetylamonium bromide) en 1 l de una solución de
H SO 0,5 M ; la muestra con la solución detergente se calienta hasta ebullición durante 10 min y se
2 4
somete a reflujo durante 1 h . La muestra tratada se filtra, el material retenido se lava con agua a
90°C y posteriormente con acetona hasta que el residuo no más color y se introduce en un horno a
100°C durante 8 h para evaporar la acetona y retirar el solvente. El residuo sólido seco se coloca en
un crisol dispuesto en un recipiente conteniendo agua fría y cubriendo a este a 1 cm de la superficie
y se le adiciona 25 ml de una solución 2:1 (v/v) de KMnO saturado y buffer de lignina. La solución
4
de KMnO saturado se prepara adicionando 50 g de KMnO y 0,05 g de AgSO a 1 l de agua
4 4 4
destilada. Por su parte, el buffer de lignina se prepara combinando 6 g de Fe(NO ) #9H O y 0,15 g
3 3 2
de AgNO con 100 ml de agua destilada y adicionando a esta solución 500 ml de ácido acético, 5 g
3
de acetato de potasio y 400 ml de Tert-butanol.
El residuo tratado se mantiene en reposo a 22°C durante 90 min y posteriormente se le adiciona
suficiente KMnO para mantenerlo húmedo y la solución tratante se remueve mediante filtración
4
por succión al vacío. El material residual filtrado se coloca nuevamente en un crisol y se cubre con
suficiente solución desmineralizante para cubrirlo completamente y se permite su estabilización
durante 2 h . La solución desmineralizante se prepara con 5 g de ácido oxálico dihidratado disueltos
en 700 ml de etanol al 95% y adicionando 50 ml de HCl concentrado y 250 ml de agua destilada.
Por último, la solución desmineralizante se remueve por filtración y el residuo se lava con una
solución de etanol al 80% (v/v) y luego con acetona grado analítico, la muestra se seca a 105°C . El
material sólido seco obtenido se transfiere a un crisol y se somete a ignición completa durante 4 h ,
empleando el procedimiento de determinación de cenizas.
94ANEXO D. Medios de propagación Kirk e inducción de LiP
(Kirk et al. 1988)
Medio de propagación Kirk
El medio de propagación está compuesto (por litro) de 10 g de glucosa, 10 g de extracto de malta, 2
g de peptona, 2 g de extracto de levadura, 1 g de asparagina, 2 g de KH PO , 1 mg de tiamina-HCl y
2 4
20 g de gar.
Medio de inducción de LiP de P. chrysosporium
El medio de inducción tiene la siguiente composición por litro:
Medio Basal III. 10% (v/v) Solución de trazas de elementos. 100 ml
Solución de glucosa al 10%. 10% (v/v)
Buffer 2,2-dimetilsuccinato 0,1 M (pH 4,2). Solución de trazas de elementos (por litro):
10% (v/v) MgSO . 3 g
4
Tiamina-HCl (100 mg/l). 0,1% (v/v) MnSO . 0,5 g
4
Tartrato de amonio (8 g/l). 2,5% (v/v) NaCl. 1,0 g
Alcohol veratril 0,4 M . 10% (v/v) FeSO ·7H O. 0,1 g
4 2
Solución de trazas de elementos. 6,0% (v/v) CoCl . 0,1 g
2
ZnSO ·7H O. 0,1 g
4 2
El medio Basal III (por litro): CuSO . 0,1 g
4
KH PO . 20 g AlK(SO ) ·12H O. 10 mg
2 4 4 2 2
MgSO . 5 g H BO . 10 mg
4 3 3
CaCl . 1 g Na MoO ·2H O. 10 mg
2 2 4 2
Nitrilotriacetato. 1,5 g
95La solución de trazas se prepara disolviendo el nitrilotriacetato (trisodium salt) en 800 ml de agua,
se ajusta el pH a 6,5 con KOH 1N y se adiciona posteriormente los restantes componentes,
llevándose el volumen final a 1 litro.
96ANEXO E. Método colorimétrico de Bradford
(Bollag et al., 1991)
La concentración de proteína extracelular total se determina por espectrofotometría empleando el
reactivo de Bradford, preparado en una relación 4:1 con agua desionizada. El contenido de proteína
se determina a partir de una alícuota entre 10 µl y 100 µl de volumen de muestra filtrada, 20 µl de la
solución de NaCl al 0,85% y un volumen de reactivo de Bradford necesario para obtener 1,0 ml de
volumen total. La lectura de absorbancia se realiza a 595 nm y la concentración de proteína se
obtiene a partir de la curva de referencia (Figura 34) que relaciona proteína (mg/l) y A , la cual es
595
generada con cinco concentraciones establecidas de proteína empleando Albúmina sérica de bovino
(BSA); el rango lineal de la curva de referencia para la composición de BSA estuvo comprendido
entre 50 a 300 mg/l. El blanco de la determinación se prepara con 20 µl de una solución de NaCl al
0,85% (p/v) y 800 µl de reactivo de Bradford en un volumen total de 1,0 ml, ajustado con agua
destilada.
0.4
0.35
mn
0.3
595
0.25
a
aicnabrosbA
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 50 100 150 200 250 300 350
BSA (mg/l)
Figura 34. Curva de referencia concentración de albúmina sérica de bovino (BSA)–
absorbancia a 595 nm .
97ANEXO F. Actividad ligninolítica
- P. chrysosporium (Archibald, 1992).
La actividad ligninolítica de P. chrysosporium se determina espectrofotométricamente, mediante la
oxidación del colorante Azure B empleado como substrato. La mezcla de reacción de 0,5 ml de
volumen total consiste de 330 µl de fluido extracelular (en el caso de la actividad de fluido
extracelular sin purificación), 160 µl de buffer de tartrato de sodio pH 4,5 50 mM , 5 µl de una
solución de Azure B al 3,2 mM y 5 µl de H O al 10 mM , estos dos últimos preparados en buffer
2 2
de tartrato de sodio pH 4,5 al 50 mM . La reacción de oxidación se inicia con la adición del H O en
2 2
la mezcla y la actividad enzimática se obtiene del decremento registrado por minuto en la densidad
óptica determinado a una longitud de onda de 651 nm durante los primeros 6 min de la prueba, a
partir de la expresión (4) y el valor del coeficiente de extinción micromolar del substrato
determinado a las condiciones de la prueba espectrofotométrica.
∇Α × V
∇mol = min (F.1)
min K × L
Azure B
En la anterior expresión, ∇mol/min corresponde al promedio de las moles de Azure B reaccionadas
por minuto durante los 6 min , ∇A/min es el decremento en la absorbancia registrado por min , V
representa el volumen total (en litros) empleado en la determinación, K corresponde al
Azure B
coeficiente de extinción molar del Azure B (en M-1 cm-1) y L es la longitud de paso (en cm) de la
celda empleada en la determinación espectrofotométrica.
El blanco de la determinación consiste de iguales volumenes de los componentes de la mezcla de
reacción, excepto el del fluido extracelular el cual es reemplazado por igual cantidad de buffer de
tartrato de sodio.
Una unidad de actividad enzimática, empleando Azure B como substrato, se define como la
cantidad de enzima que cataliza la transformación de 1 µmol de substrato por minuto en las
98condiciones de pH, temperatura y longitud de onda de la determinación espectrofotométrica. Por su
parte, la actividad específica (U/mg) se obtiene con base en el contenido promedio de proteína total
en la muestra analizada.
Coeficiente de extinción molar del Azure B
El coeficiente de extinción molar se determinó a partir del espectro realizado entre 500 nm y 800
nm de una solución de Azure B a 32 µM en buffer tartrato de sodio 50 mM (pH 4,5). El máximo
valor registrado en la densidad óptica en este intervalo de longitud de onda fue utilizado en la
expresión F.2.
Α
K = [ ] (F.2)
Azure B Azure B × L
Donde, K corresponde al coeficiente de extinción molar expresado en µM-1 cm-1, A es la densidad
óptica en unidades de absorbancia, [Azure B] corresponde a la concentración micromolar de Azure
B de la determinación y L representa la longitud de paso de la celda espectrofotométrica empleada
(10 mm).
Actividad ligninolítica y concentración de proteína del extracto LiP.
La actividad ligninolítica del extracto enzimático se obtuvo a partir de los valores de decremento
por minuto en la absorbancia (∇A ) y concentración de proteína total, obtenidos por triplicado de
651
una muestra de 5 µg de extracto liofilizado en 1000 µl de buffer tartrato (Tabla 16). La mezcla de
reacción consistió de 10 µl de H O al 10 mM , 10 µl de una solución de Azure B al 3,2 mM , 970
2 2
µl de buffer de tartrato de sodio 50 mM pH 4,5 y 5 µl de extracto en buffer de tartrato.
99Tabla 16. Valores experimentales de ∇∇∇∇A651 y concentración de proteína para el extracto LiP
parcialmente purificado
Decremento de A Proteína
U/mg de
Repetición A A A ∇∇∇∇A (∇∇∇∇A ) D.E Lectura Promedio D.E proteína*
0 1 2 651 651 (mg/l)
1 0,219 0.206 0,190 0,0048 133,12
2 0,195 0,193 0,160 0,0058 0,0051 0,0006 146,35 134,51 11,20 0,1226
3 0,231 0,227 0,204 0,0045 124,08
A: Absorbancia; A A en t=0 min; A: A en t=3 min; A : A en t=6 min; ∇: Decremento promedio por minuto;
0: 1 2
D.E: Desviación estándar; U: Unidades de actividad enzimática; *con base en 5 µl de extracto enzimático empleados en
la determinación.
- S. viridosporus (Korus et al., 1991)
La actividad ALiP se determina a 510 nm, mediante la prueba espectrofotométrica de formación de
antipirrilquinonimine, producto de la oxidación del 2,4-dichlorophenol y 4-aminoantipyrene por la
acción catalítica de la enzima. El volumen total de la mezcla de reacción consiste de 0,5 ml
conteniendo 5 mM de 2,4-dichlorophenol, 16,4 mM de 4-aminoantipyrene, 4 mM de H O , 100 mM
2 2
de buffer Tris pH 8,0 y un volumen de 100 µl de fluido extracelular o 50 µl de extracto enzimático
preparado en buffer. La reacción de oxidación se inicia con la adición del H O en la mezcla
2 2
reaccionante y la actividad enzimática se obtiene del incremento en la densidad óptica registrada
por minuto a una longitud de onda de 510 nm durante los dos minutos iniciales de la determinación.
El blanco de la determinación consiste de igual concentración de los componentes, excepto del
fluido extracelular el cual es reemplazado por la misma cantidad de buffer Tris 100 mM pH 8.
Una unidad de actividad enzimática (1U) se expresa como la cantidad de enzima requerida para
generar un incremento de 1,0 unidad de absorbancia por minuto, a las condiciones establecidas de la
determinación.
Cálculo de la actividad ligninolítica y concentración de proteína del extracto ALiP.
100La actividad ligninolítica del extracto enzimático se obtuvo a partir de los valores de decremento
por minuto en la absorbancia (∇A ) y concentración de proteína total, obtenidos por triplicado de
651
una muestra de 5 µg de extracto liofilizado en 1000 µl de buffer tartrato (Tabla 17). La mezcla de
reacción consistió de 10 µl de H O al 10 mM , 10 µl de una solución de Azure B al 3,2 mM , 970
2 2
µl de buffer de tartrato de sodio 50 mM pH 4,5 y 5 µl de extracto en buffer de tartrato.
Tabla 17. Valores experimentales de ∆∆∆∆A510 y concentración de proteína para el
extracto ALiP parcialmente purificado
Incremento de A Proteína
Repetición Promedio U/mg proteína*
A A ∆∆∆∆A (∆∆∆∆A ) D.E Lectura D.E
0 1 510 510prom. (mg/l)
1 0,070 0,161 0,091 80,162
2 0,068 0,156 0,088 0,088 0,002 57,116 75,62 16,71 232,70
3 0,060 0,146 0,086 89,610
A: Absorbancia; A A en t=0 min; A: A en t=1 min; ∆: Incremento por minuto; D.E: Desviación estándar;
0: 1
U: Unidades de actividad enzimática; *con base en 5 µl de extracto enzimático (en buffer) empleados.
101ANEXO G. Fraccionamiento de proteínas
(Bollag et al., 1991)
El fraccionamiento de proteínas se realiza en forma secuencial, inicialmente hasta el 35% de
saturación y posteriormente hasta el 75% de acuerdo con el protocolo de “Salting out”, mediante la
adición gradual de sulfato de amonio cristalino a 0°C al fluido extracelular (muestra).
La muestra sometida a fraccionamiento se coloca dentro de un beaker dispuesto con un sistema de
agitación magnética y enseguida se adiciona gradualmente la cantidad de NH SO sólido requerido
4 4
para obtener una saturación del 35%, manteniendo una agitación vigorosa durante la adición.
Después de permitir la equilibración de la muestra durante 30 min , se adiciona lentamente la
cantidad de sulfato de amonio necesaria para obtener una saturación del 75%, manteniendo el pH
constante de la muestra mediante la adición de NH OH 1N y por último, las proteínas precipitadas
4
se separan en un equipo de decantación.
Las cantidades requeridas (por litro de muestra) para la saturación gradual de las proteínas se
obtienen de la expresión (G.1).
( )
( ) 515 X-X
g de NH SO Sólido por litro de solución = O (G.1)
4 4 100 - 0,27X
En la cual:
X: Saturación requerida.
X : Saturación inicial de la solución.
O
102ANEXO H. Marcador molecular
En la Tabla 18 se reportan los pesos moleculares de la solución precoloreada de proteínas, empleada
como estándar molecular en el análisis electroforético de los extractos enzimáticos LiP y ALiP y en
la Figura 35 se observa la resolución de las bandas cuando la solución es analizada en un gel
electroforético 10%-27% en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), de acuerdo al método de
Laemmli.
Tabla 18. Estándar molecular de proteína empleado en SDS-PAGE
Peso molecular Peso molecular aparente
Proteína proteína nativa proteína precoloreada
(kDa) (kDa)
β-Galactosidasa
116,000 116,000
(E. coli)
Fructose-6-Phosphate
84,000 88,500
Kinase (Rabbit muscle)
Pyruvate Kinase 58,000
64,000
(chicken muscle)
Ovalbumin
45,000 50,000
(Chicken egg)
Lactic Dehydrogenase 36,500 38,500
Triosephosphate
26,600 34,500
Isomerase
β-Galactosidasa
Fructose-6-Phosphate Kinase
Pyruvate Kinase
Ovalbumin
Lactic Dehydrogenase
Triosephosphate Isomerase
Figura 35. Gel electroforético en condiciones desnaturalizantes de la
solución estándar de proteínas entre 34,5 kDa y 116 kDa .
103ANEXO J. Medio de producción de ALiP
(Wood et al., 1996)
La composición por litro del medio de cultivo optimizado DJMM a base de almidón de maíz se
especifica a continuación:
Almidón de maíz. 4,0% (p/v) Solución basal (por 800 ml):
Caseína. 2,0% (p/v) Sucrosa. 103 g
CaCO . 0,7% (p/v) MgCl ·6H O. 10,12 g
3 2 2
Extracto de levadura. 0,3% (p/v) D-glucosa. 10 g
NH Cl. 0,1% (p/v) K SO . 0,25 g
4 2 4
Solución de trazas de metales R2YE. Acidos casaminos. 0,1 g
0,1% (v/v)
Solución de CaCl ·2H O. 0,0368 g/ml
2 2
Solución R2YE (por 1062,2 ml): Solución de extracto de levadura. 0,1 g/ml
Thiostrepton. 50 mg Solución de prolina. 0,2 g/ml
Solución basal. 800 ml Solución de KH PO . 0,005 g/ml
2 4
Buffer TES pH 7,2. 100 ml Solución NaOH. 0,4 g/ml
Solución de CaCl ·2H O. 80,2 ml
2 2
Solución de extracto de levadura. 50 ml Solución de trazas de elementos (por litro):
Solución de prolina. 15 ml FeCl ·6H O. 0,2 g
3 2
Solución de KH PO . 10 ml ZnCl . 0,04 g
2 4 2
Solución NaOH. 5,0 ml CuCL ·2H O. 0,01 g
2 2
Solución de trazas de elementos. 2,0 ml MnCl ·4H O. 0,01 g
2 2
Na B O ·10H O. 0,01 g
2 4 7 2
(NH ) Mo O ·4H O. 0,01g
4 6 7 24 2
104ANEXO K. Método modificado de lignina Klason
(Crawford et al., 1988)
La cuantificación se realiza con 50 mg de APPL sometidos a hidrólisis con 1,0 ml de ácido
sulfúrico concentrado. La mezcla se deja en reposo durante 1 h con agitación ocasional y luego se le
adiciona 28 ml de agua destilada. La suspensión resultante se introduce en un autoclave a 121°C
durante 1 h . Posteriormente, el material ácido insoluble se recupera por filtración y el material
recolectado se lava varias veces con pequeñas cantidades de agua destilada. La lignina ácido
insoluble recuperada se seca a 70°C durante 48 h y se pesa en una balanza analítica. El porcentaje
de lignina presente en la APPL se calcula como un porcentaje del peso de la muestra inicial tratada.
105ANEXO L. Técnica modificada de Somogyi-Nelson
(Crawford et al., 1988)
El filtrado obtenido en la determinación de lignina ácido insoluble es neutralizado con la adición de
18 ml de solución de NaOH 2 N y el volumen se lleva a 50 ml con agua destilada. Posteriormente,
se extrae 1 ml del filtrado y se transfiere a un tubo de ensayo conteniendo 3 ml de solución C de
Somogyi. La solución C de Somogyi está compuesta de cuatro partes de solución A de Somogyi y
una parte de solución B de Somogyi. La solución A se prepara combinando 15 g de Rochelle salt,
180 g de Na SO , 30 g de Na CO y 20 g de NaHCO en un volumen total de 1 l de agua
2 4 2 3 3
desionizada. La solución B, se prepara con 180 g de Na SO y 20 g de CuSO ⋅5H O en igual
2 4 4 2
volumen de agua desionizada. El tubo con la muestra se tapa y se coloca dentro de un baño de agua
hirviendo durante 1 h . Posteriormente se enfría a 4°C y se le adiciona 3 ml de reactivo de Nelson y
10 ml de agua destilada. El reactivo de Nelson se prepara combinando 50 g de (NH ) Mo O ·4H O
4 6 7 24 2
en 42 ml de H SO concentrado y 900 ml de agua desionizada. A esta solución, se le adiciona 6 g de
2 4
Na HAsO ·7H O en 50 ml de agua y el volumen total se lleva a 1 litro con agua. Por último, se
2 4 2
extrae una alícuota de 1,0 m con el reactivo de Nelson, se transfiere a una celda y se lee la
absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro.
El blanco de la lectura se prepara a partir de 1,0 ml de agua destilada, en reemplazo del volumen
correspondiente de filtrado, al que se le adiciona 3,0 ml de solución C de Somogyi y posteriormente
se trata de la misma manera que la muestra analizada.
El contenido de carbohidratos, equivalente a azúcares reductores, se obtiene después de trasladar el
valor de absorbancia a concentración de azúcares reductores, a partir de una gráfica de referencia
previamente realizada y que relaciona la absorbancia y el contenido de glucosa en el rango entre
0,10 mg y 0,35 mg (Figura 36). El contenido de carbohidratos totales en la APPL se determina
como un porcentaje del peso inicial de la muestra tratada (50 mg).
1062
1.6
mn
045
1.2
a
aicnabrosbA
0.8
0.4
0
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 0.4
glucosa (mg/ml)
Figura 36. Gráfica de referencia concentración de glucosa – absorbancia a
540 nm .
107ANEXO M. Actividad celulolítica del complejo Econase
(Wood et al., 1988)

La cuantificación de la actividad celulolítica total de la celulasa en el complejo Econase se realiza
por el método IUPAC de unidades de actividad con papel filtro, consistente en la determinación de
la concentración de enzima celulolítica requerida para liberar 2,0 mg de glucosa de una cantidad fija
de 50 mg de celulosa, empleando tiras de papel filtro Whatman No. 1 como el substrato de celulosa

para la enzima. La actividad celulolítica total de Econase se determina de una dilución apropiada
del complejo enzimático preparado en buffer de citrato de sodio y se calcula como las unidades de
glucosa liberadas del papel filtro por la celulasa presente en el complejo, expresándose esta en
unidades de papel filtro (FPU).
Se evalúan varias concentraciones de complejo enzimático diluídas en buffer de citrato de sodio
0,005 M pH 4,8. De cada una de las diluciones enzimáticas se extrae 0,5 ml y se adiciona a tubos de
ensayo de 25 ml de capacidad conteniendo 1,0 ml de buffer de citrato de sodio 0,005 M pH 4,8.
Posteriormente, se introduce en cada un de los tubos una tira de papel filtro enrollado en un agitador
de vidrio y se incuban estos en un baño de agua a 50°C durante 60 min y al cabo de este periodo se
detiene la reacción enzimática por medio de la adición de 3,0 ml de reactivo DNS (Dinitrosalicylic
acid). El reactivo DNS se prepara disolviendo 20 g de DNS, 4 g de fenol, 1 g de sulfito de sodio y
400 g de Rochelle Salt en 1 litro de solución de NaOH al 2% (p/v) y luego se diluye a 4 l con agua
destilada. Las mezclas son enfriadas y luego se les agrega 20 ml de agua destilada, se agitan hasta
homogeneidad en un vortex y se dejan en reposo para permitir la sedimentación de la pulpa. El
color formado en las mezclas es leído a A en un espectrofotómetro.
540
La cantidad de glucosa liberada por las diluciones enzimáticas evaluadas se obtiene de una gráfica
de referencia (Figura 37), que relaciona la absorbancia a 540 nm con la concentración de glucosa
entre 1 mg/ml a 4 mg/ml , luego de la sustracción de los valores de densidad óptica para los dos
blancos de la determinación (blanco de reactivos y blanco de enzima).
108El blanco de reactivos y el blanco de enzima se analizan por el mismo procedimiento que las
muestras enzimáticas evaluadas. El blanco de reactivos consiste de 1,5 ml de buffer de citrato de
sodio 0,005 M pH 4,8 y 3,0 ml de reactivo de DNS. Por su parte, el blanco de enzima, para cada una
de las diluciones enzimáticas evaluadas, se prepara a partir de 0,5 ml de la dilución enzimática
respectiva, 1,0 ml del mismo buffer y 3,0 ml de reactivo DNS.
3
2.5
mn
2 045
a
aicnabrosbA
1.5
1
0.5
0
0 1 2 3 4 5
Glucosa (mg/ml)
Figura 37. Curva lineal de referencia glucosa (1 mg/ml – 4 mg/ml) –absorbancia a
540 nm .
El valor de dilución del complejo enzimático que libera 2,0 mg de glucosa, se emplea en el cálculo
de la actividad celulolítica en unidades de papel filtro (Unidades/ml), a partir de la expresión 1, la
cual se derivada de las equivalencias expresadas por (M.1) y (M.2).
0,37
FPU = (M.1)
Concentración de enzima que libera 2,0 mg de glucosa
1 IU (Unidad Internacional) = 1µmol/min de glucosa equivalente liberada (M.2)
= 0,18 mg/min de glucosa
109El numerador de la expresión (M.1) se deriva de (M.2) por la liberación de 2,0 mg de glucosa
equivalente de un volumen de 0,5 ml de la enzima diluida durante los 60 min de hidrólisis, como
indica la ecuación (M.3).
2
2 mg de glucosa = ×0,5×60 µmol/min/ml
0,18
(M.3)
=0,37 µmol/min/ml
110ANEXO N. Concentración de etanol en la mezcla
(A.O.A.C., 1997)
La Figura 38 corresponde a la gráfica de referencia que relacionó concentración de etanol (v/v) e
índice de refracción (I.R) a la temperatura de determinación, empleando etanol absoluto.
1.365
1.36
1.355
1.35
R.I
1.345
1.34
1.335
1.33
0 10 20 30 40 50 60 70
Etanol % (v/v)
Figura 38. Gráfica de relación entre concentración volumétrica de
etanol y el índice de refracción.
111ANEXO P. Método Somogyi-Nelson (celobiosa)
(Wood et al., 1988)
La solución para análisis (entre 1 y 2 ml) se transfiere a un tubo de ensayo de 30 ml y se le adiciona
2 ml de reactivo Somogyi (4 partes de reactivo Somogyi I y 1 parte de reactivo Somogyi II), luego
se lleva el volumen a 4 ml con agua destilada y luego se calienta en un baño de agua hirviendo
durante 15 min . Inicialmente se realiza una gráfica de referencia que relaciona la absorbancia a 520
nm con la concentración de glucosa. La curva de referencia se obtiene con las lecturas de
absorbancia de cinco concentraciones de glucosa anhidro preparadas con agua destilada como
diluyente. Las concentraciones utilizadas son de 5 µg/ml, 25 µg/ml , 50 µg/ml , 75 µg/ml y 100
µg/ml.
El reactivo Somogyi I se prepara disolviendo 288 g , 24 g de Rochelle salt, 48 g de carbonato de
sodio y 32 g de bicarbonato de sodio en 1 l de agua destilada y luego la solución se diluye a 1600
ml con agua destilada. Por su parte, el reactivo Somogyi II se prepara con 72 g de sulfato de sodio y
8 g de sulfato de cobre disultos en un volumen total de 400 ml con agua destilada. El reactivo
Nelson se prepara con 100 g de molibdato de amonio disultos en 1,8 l de agua destilada y a esta
solución se le agrega 84 ml de H SO concentrado y 100 ml de una solución preparada con 12 g de
2 4
arsenato de sodio en 100 ml agua destilada.
Procedimiento
Para el análisis de la muestra se prepara 2 ml de una solución compuesta por 4 volumenes de
reactivo Somogyi I y 1 volumen del reactivo Somogyi II y se introduce en un tubo de ensayo de 15
ml conteniendo 1,0 ml de la muestra. Posteriormente, el volumen se afora con agua destilada a un
volumen total de 4 ml . La solución resultante se calienta en un baño de agua hirviendo durante 15
min y luego de enfriada se le adiciona 2 ml de reactivo Nelson y 4 ml de agua. De la muestra tratada
se extrae 1,0 ml y se transfiere a una celda espectrofotométrica y se lee la absorbancia a 520 nm y el
valor es trasladado a concentración de celobiosa a partir de la gráfica de referencia (Figura 39) con
112respecto al 90% de la concentración obtenida (de acuerdo a la metodología empleando glucosa
como compuesto de referencia).
El blanco de la determinación se realizó con una solución de 2,0 ml de reactivo Somogyi y 2,0 ml
de agua que fue sometida a calentamiento en un baño de agua hirviendo durante 15 min y
posteriormente se les adicionó 2,0 ml de reactivo Nelson y 4,0 ml de agua. Por último, el blanco se
trata de igual manera que la muestra de análisis.
0.5
0.4
mn
0.3 025
aicnabrosbA
0.2
0.1
0
0 25 50 75 100 125
glucosa (microgramos/ml)
Figura 39. Gráfica de referencia concentración de glucosa – absorbancia a 520 nm .
113ANEXO Q. Método del ácido dinitrosalicílico (DNS)
(Wood et al., 1988)
El reactivo de ácido dinitrosalicílico (DNS) es preparado como se especifica en la determinación de

actividad celulolítica del complejo Econase (Anexo M). La muestra de análisis es diluída
apropiadamente con agua hasta obtener un volumen total de 1 ml , luego se le adiciona 2 ml de
reactivo DNS y se calienta en un baño de agua hirviendo durante 5 min . La muestra es transferida a
una celda espectrofotométrica de 10 mm de longitud de paso de luz y se lee la absorbancia a 540
nm, la concentración de azúcares reductores se obtiene a partir de una curva estándar previamente
obtenida, luego de trasladar el valor de absorbancia obtenido a concentración de glucosa. El blanco
de la determinación se prepara con 1 ml de agua destilada en reemplazo del volumen de muestra
correspondiente y este se trata de la misma manera que la muestra de análisis.
La gráfica estándar se realiza con las lecturas de absorbancia a 520 nm de cinco concentraciones de
glucosa anhidro y las cuales corresponden a 1 mg/ml, 2 mg/ml , 2,5 mg/ml , 3 mg/ml y 4 mg/ml de
glucosa (Figura 40).
3
2.5
mn
2 045
a
1.5 aicnabrosbA
1
0.5
0
0 1 2 3 4 5
Glucosa (mg/ml)
Figura 40. Curva estándar de referencia concentración de glucosa – absorbancia a
540 nm .
114ANEXO R. Análisis estadístico en SAS de concentración global de celobiosa
The MEANS Procedure
13:28 Wednesday, October 17, 2001
Analysis Variable : CELOBIOSA
Tabla 19. Análisis descriptivo de concentración global de celobiosa para los
tratamientos y controles de deslignificación
Trat. N Obs. Minimum Maximum Range Mean Variance Std. Dev. Std Error
1 18 0.4825000 1.5985000 1.1160000 0.9553556 0.1114677 0.3338678 0.0786934
2 18 0.7282000 1.7567000 1.0285000 1.2020778 0.1447066 0.3804032 0.0896619
3 18 0.2815000 1.4263000 1.1448000 0.7576167 0.1507558 0.3882728 0.0915168
4 18 0.3829000 1.6190000 1.2361000 0.8079444 0.1313854 0.3624712 0.0854353
5 18 0.5766000 1.4411000 0.8645000 0.9454056 0.0875936 0.2959621 0.0697589
6 18 0.6442000 1.7338000 1.0896000 1.0613944 0.1494057 0.3865304 0.0911061
7 18 0.3048000 1.5034000 1.1986000 0.6699222 0.1601067 0.4001333 0.0943123
8 18 0.4315000 1.5452000 1.1137000 0.9077000 0.1324075 0.3638784 0.0857670
9 18 0.0183000 1.5255000 1.5072000 0.6066000 0.2222809 0.4714667 0.1111258
Trat: Tratamiento; 1, 2, 3 y 4: Dosificaciones con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 5, 6, 7 y 8: Controles
de deslignificación con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 9: Control de enzima; N obs.: Número de
observaciones; Minimum: Límite inferior; Maximum: Límite superior; Mean: Promedio; Variance: varianza; Std.Dev.:
Desviación estándar; Std. Error: Error estándar.
Tabla 20. Coeficiente de variación de la concentración global de
celobiosa para los tratamientos y controles de deslignificación
Trat. N Obs. Coeff. of Variation
1 18 34.9469633
2 18 31.6454737
3 18 51.2492480
4 18 44.8633805
5 18 31.3053061
6 18 36.4172211
7 18 59.7283268
8 18 40.0879613
9 18 77.7228369
Trat: Tratamiento; 1, 2, 3 y 4: Dosificaciones con 10 IFPU/g, 20
IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 5, 6, 7 y 8: Controles de
deslignificación con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%,
respectivamente; 9: Control de enzima; N obs.: Número de
observaciones; Coeff. of Variation: Coeficiente de variación.
115The GLM Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
TRAT 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Number of observations 162
Dependent Variable: CELOBIOSA
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 8 5.15533705 0.64441713 4.50 <.0001
Error 153 21.93186659 0.14334553
Corrected Total 161 27.08720365
R-Square Coeff. Var. Root MSE CELOBIOSA Mean
0.190324 43.05639 0.378610 0.879335
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
TRAT. 8 5.15533705 0.64441713 4.50 <.0001
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
TRAT. 8 5.15533705 0.64441713 4.50 <.0001
Tukey's Studentized Range (HSD) Test for CELOBIOSA
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 153
Error Mean Square 0.143346
Critical Value of Studentized Range 4.45014
Minimum Significant Difference 0.3971
Means with the same letter are not significantly different.
Tabla 21. Prueba de comparación de Tukey de la concentración global de celobiosa para los
tratamientos y controles de deslignificación
Tukey Grouping Mean N Trat.
A 1.2021 18 2
B A 1.0614 18 6
B A C 0.9554 18 1
B A C 0.9454 18 5
B A C 0.9077 18 8
B A C 0.8079 18 4
B C 0.7576 18 3
B C 0.6699 18 7
C 0.6066 18 9
Tukey Grouping: Agrupamiento de Tukey; Mean: Promedio; N : Número de
observaciones; Trat.: Tratamientos; 1, 2, 3 y 4,: Dosificaciones con 10
IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 5, 6, 7 y 8: Controles de
deslignificación con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 9:
Control de enzima.
116ANEXO S. Análisis estadístico en SAS de concentración global de Azúcares reductores
The MEANS Procedure
09:00 Wednesday, October 17, 2001
Analysis Variable : AZÚCARES
Tabla 22. Análisis descriptivo de concentración global de azúcares reductores
para los tratamientos y controles de deslignificación
N Minimu Maximu Std
Trat. Range Mean Variance Std. Dev.
Obs. m m Error
1 18 1.5775000 2.4367000 0.8592000 2.0666667 0.0687644 0.2622297 0.0618081
2 18 1.8625000 2.4633000 0.6008000 2.1306667 0.0462744 0.2151148 0.0507030
3 18 1.5625000 2.6633000 1.1008000 2.0768000 0.1147757 0.3387856 0.0798525
4 18 0 2.4800000 2.4800000 1.7328222 0.4755173 0.6895776 0.1625350
5 18 1.5300000 2.5500000 1.0200000 2.0754611 0.0900545 0.3000908 0.0707321
6 18 1.5500000 2.4633000 0.9133000 2.1177278 0.0844256 0.2905608 0.0684858
7 18 1.6000000 2.3467000 0.7467000 1.9906167 0.0684395 0.2616094 0.0616619
8 18 1.5275000 2.5800000 1.0525000 2.1035667 0.1129235 0.3360410 0.0792056
9 18 0 2.7233000 2.7233000 1.1709722 1.0693239 1.0340812 0.2437353
Trat: Tratamiento; 1, 2, 3 y 4: Dosificaciones con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 5, 6, 7 y 8:
Controles de deslignificación con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 9: Control de enzima; N obs.:
Número de observaciones; Minimum: Límite inferior; Maximum: Límite superior; Mean: Promedio; Variance: varianza;
Std.Dev.: Desviación estándar; Std. Error: Error estándar.
Tabla 23. Coeficiente de variación de la concentración global de azúcares reductores para los
tratamientos y controles de deslignificación
Trat. N Obs. Coeff. of Variation
1 18 12.6885327
2 18 10.0961247
3 18 16.3128671
4 18 39.7950600
5 18 14.4589933
6 18 13.7204015
7 18 13.1421308
8 18 15.9748186
9 18 88.3096274
Trat: Tratamiento; 1, 2, 3 y 4: Dosificaciones con 10 IFPU/g, 20
IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 5, 6, 7 y 8: Controles de
deslignificación con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%,
respectivamente; 9: Control de enzima; N obs.: Número de
observaciones; Coeff. of Variation: Coeficiente de variación.
117The GLM Procedure
Class Levels Values
TRATAM. 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Number of observations 162
Dependent Variable: AZÚCARES
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 8 14.12439611 1.76554951 7.46 <.0001
Error 153 36.21847941 0.23672209
Corrected Total 161 50.34287552
R-Square Coeff. Var. Root MSE AZÚCARES Mean
0.280564 25.07182 0.486541 1.940589
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
TRATAM. 8 14.12439611 1.76554951 7.46 <.0001
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
TRATAM. 8 14.12439611 1.76554951 7.46 <.0001
The GLM Procedure
Tukey's Studentized Range (HSD) Test for AZÚCARES
NOTE: This test controls the Type I experimentwise error rate, but it generally has a higher Type II
error rate than REGWQ.
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 153
Error Mean Square 0.236722
Critical Value of Studentized Range 4.45014
Minimum Significant Difference 0.5103
Means with the same letter are not significantly different.
Tabla 24. Prueba de comparación de Tukey de la concentración global de azúcares reductores
para los tratamientos y controles de deslignificación
Tukey Grouping Mean N Trat.
A 2.1307 18 2
A 2.1177 18 6
A 2.1036 18 8
A 2.0768 18 3
A 2.0755 18 5
A 2.0667 18 1
A 1.9906 18 7
A 1.7328 18 4
B 1.1710 18 9
Tukey Grouping: Agrupamiento de Tukey; Mean: Promedio; N : Número de
observaciones; Trat.: Tratamientos; 1, 2, 3 y 4: Dosificaciones con 10 IFPU/g,
20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 5, 6, 7 y 8: Controles de
deslignificación con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 9:
Control de enzima.
118ANEXO T. Análisis estadístico en SAS de concentración global de etanol y prueba de
comparación de Tukey para el día cuatro
The MEANS Procedure
13:28 Wednesday, October 17, 2001
Analysis Variable : ETANOL VOLUMEN
Tabla 25. Análisis descriptivo de concentración global de etanol para los
tratamientos y controles de deslignificación
Trat. N Obs. Minimum Maximum Range Mean Variance Std. Dev. Std Error
1 18 0 27.98510 27.98510 10.03429 114.02802 10.67839 2.51692
2 18 0 1.05030 1.05030 0.30075 0.14736 0.38388 0.09048
3 18 0 23.45900 23.45900 8.98408 80.43728 8.96868 2.11393
4 18 0 30.05700 30.05700 7.80281 98.59892 9.92969 2.34045
5 18 0 0 0 0 0 0 0
6 18 0 0.20540 0.20540 0.02305 0.00325 0.05708 0.01345
7 18 0 0 0 0 0 0 0
8 18 0 0 0 0 0 0 0
9 18 0 0 0 0 0 0 0
Trat: Tratamiento; 1, 2, 3 y 4: Dosificaciones con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 5, 6, 7 y 8: Controles de
deslignificación con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 9: Control de enzima; N obs.: Número de observaciones;
Minimum: Límite inferior; Maximum: Límite superior; Mean: Promedio; Variance: varianza; Std.Dev.: Desviación estándar; Std.
Error: Error estándar.
Tabla 26. Coeficiente de variación de la concentración global de etanol para los tratamientos y
controles de deslignificación
Trat. N Obs. Coeff. of Variation
1 18 106.4189467
2 18 127.6417364
3 18 99.8285246
4 18 127.2578780
5 18 0
6 18 247.5916719
7 18 0
8 18 0
9 18 0
Trat: Tratamiento; N obs.: Número de observaciones; Coeff. of
Variation: Coeficiente de variación; 1, 2, 3 y 4: Dosificaciones con 10
IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 5, 6, 7 y 8: Controles
de deslignificación con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%,
respectivamente; 9: Control de enzima.
119The GLM Procedure
Class Level Information
Class Levels Values
TRAT. 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Number of observations 162
Dependent Variable: ETANOL VOLUMEN
Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr > F
Model 8 2889.062615 361.132827 11.08 <.0001
Error 153 4984.652440 32.579428
Corrected Total 161 7873.715055
R-Square Coeff. Var. Root MSE ETANOL VOLUMEN Mean
0.366925 189.2450 5.707839 3.016112
Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr > F
TRAT. 8 2889.062615 361.132827 11.08 <.0001
Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr > F
TRAT. 8 2889.062615 361.132827 11.08 <.0001
Tukey's Studentized Range (HSD) Test for ETANOL VOLUMEN
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 153
Error Mean Square 32.57943
Critical Value of Studentized Range 4.45014
Minimum Significant Difference 5.987
Means with the same letter are not significantly different.
Tabla 27. Prueba de comparación de Tukey de la concentración global de etanol para los
tratamientos y controles de deslignificación
Tukey Grouping Mean N Trat.
A 10.034 18 1
A 8.984 18 3
A 7.803 18 4
B 0.301 18 2
B 0.023 18 6
B 0.000 18 5
B 0.000 18 7
B 0.000 18 8
B 0.000 18 9
Tukey Grouping: Agrupamiento de Tukey; Mean: Promedio; N : Número de
observaciones; Trat.: Tratamientos; 1, 2, 3 y 4,: Dosificaciones con 10
IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 5, 6, 7 y 8: Controles de
deslignificación con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 9:
Control de enzima.
120The GLM Procedure
Tukey's Studentized Range (HSD) Test for ETANOL VOLUMEN
13:28 Wednesday, October 17, 2001
Alpha 0.05
Error Degrees of Freedom 18
Error Mean Square 2.702742
Critical Value of Studentized Range 4.95521
Minimum Significant Difference 4.7033
Means with the same letter are not significantly different.
Tabla 28. Prueba de comparación de Tukey de la concentración de etanol en el día cuatro
para los tratamientos y controles de deslignificación
Tukey Grouping Mean N Trat.
A 27.844 3 1
B A 25.813 3 4
B 21.890 3 3
C 0.963 3 2
C 0.068 3 6
C 0.000 3 5
C 0.000 3 7
C 0.000 3 8
C 0.000 3 9
Tukey Grouping: Agrupamiento de Tukey; Mean: Promedio; N: Número de
observaciones; Trat.: Tratamientos; 1, 2, 3 y 4: Dosificaciones con 10 IFPU/g,
20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 5, 6, 7 y 8: Controles de deslignificación
con 10 IFPU/g, 20 IFPU/g, 2% y 5%, respectivamente; 9: Control de enzima.
121