Recuperación motora de extremidades con secuelas hemiplejía - hemiparesia: comparación de diferentes modelos experimentales en ratas
Autor: Duque Ropero, David Fernando
Asesor: Galeano Tapias, Adriana Catalina (Thesis advisor)
Fecha: 2011
Programa: Bogotá - Medicina -Fisioterapia
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Se pretende comparar diferentes modelos de hemipljia-hemiparesia en un modelo de experimentación animal en ratas con el fin de establecer cuál es el mejor modelo. Se practicaron cinco modelos diferentes de hemiplejía – hemiparesia, utilizando la microestimulación cerebral, para determinar en algunos modelos, los sitios específicos de lesión. El seguimiento se realizo con pruebas funcionales (prueba del cilindro y prueba de la escalera) tanto en el periodo  prequirúrgico y  hasta 7 meses de seguimiento clínico postoperatorio. / Abstract. Its pretended to compare different models of hemiplegia-hemiparesis in an animal experimentation model (rats) which objective is to establish which is the best model. Five different models of hemiplegia-hemiparesis have been practiced using the brain microstimulation to determine in some models, the specific pats of lesion.  The follow-up has was done functional tests (cilinder  and ladder tests) in both the pre surgical period and up to 7 months later of postoperative clinical follow-up.

1
RECUPERACIÓN MOTORA DE EXTREMIDADES
CON SECUELAS HEMIPLEJÍA - HEMIPARESIA:
COMPARACIÓN DE DIFERENTES MODELOS
EXPERIMENTALES EN RATAS
DAVID FERNANDO DUQUE ROPERO
COD. 597744
Trabajo de grado para optar el titulo de:
Cirujano Plástico
DIRIGIDO POR:
RAÚL ESTEBAN SASTRE CIFUENTES
Profesor Asociado
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE CIRUGÍA
Bogotá D.C.
20112
AGRADECIMIENTOS
Los autores expresan sus agradecimientos a:
Doctor Alejandro Munera, profesor asociado del Departamento de Ciencias
Fisiológicas de la Universidad Nacional de Colombia por su valiosa
colaboración en el planeamiento de los experimentos, el apoyo logístico y
locativo para la realización de las intervenciones quirúrgicas.
La Instrumentadora S.A por su apoyo incondicional con el préstamo de los
quipos de radio frecuencia.
El Instituto Nacional de Cancerología por la donación del microscopio y el
electrocauterio.
Roger Medina y Cristian Navarro, estudiantes de medicina por su apoyo
incondicional en el seguimiento, valoración y cuidado de los animales de
investigación.
Doctor Juan Fernando Ramón, neurocirujano, por su colaboración en el
diseño experimental y la consecución de recursos físicos.3
CONTENIDO
AGRADECIMIENTOS........................................................................................................2
CONTENIDO........................................................................................................................3
TABLA DE FIGURAS.........................................................................................................4
Proyecto:................................................................................................................................5
1. Resumen..................................................................................................................................5
Summary........................................................................................................................................6
2. Objetivo principal..................................................................................................................6
3. Objetivos específicos..............................................................................................................6
4. Resultados esperados.............................................................................................................7
5. Justificación............................................................................................................................7
6. Marco teórico.........................................................................................................................8
7. Consideraciones éticas...........................................................................................................9
8. Metodología..........................................................................................................................12
8.1. Diseño experimental.......................................................................................................12
8.2. Animales.........................................................................................................................12
8.3. Técnica anestésica..........................................................................................................12
8.4. Modelos de hemiplejia – hemiparesia............................................................................13
8.4.1. Electrocoagulación de la corteza motora...............................................................................13
8.4.2. Oclusión de la arteria cerebral media.....................................................................................15
8.4.3. Embolización de la arteria cerebral media con Gel Foam®..................................................18
8.4.4. Hemisección medular.............................................................................................................19
8.4.5. Ablación de la cápsula interna con radiofrecuencia..............................................................23
8.5. Pruebas de valoración funcional.....................................................................................24
8.5.1. Prueba del cilindro.................................................................................................................24
8.5.2. Prueba de la escalera..............................................................................................................25
8.6. Pruebas electrofisiológicas.............................................................................................29
8.6.1. Microestomulación intracortical y profunda (16)..................................................................29
8.6.2. Elaboración del mapa cortical................................................................................................29
9. Resultados.............................................................................................................................30
9.1. Pruebas de valoración funcional.....................................................................................31
9.2. Pruebas electrofisiológicas.............................................................................................32
9.3. Modelos de hemiplejía – hemiparesia............................................................................32
9.3.1. Oclusión de la arteria cerebral media.....................................................................................32
9.3.2. Embolización con Gel Foam® de la arteria cerebral media..................................................32
9.3.3. Electrocoagulación de la corteza motora...............................................................................32
9.3.4. Hemisección medular.............................................................................................................34
9.3.5. Ablación de a capsula interna con radiofrecuencia................................................................34
10. Conclusiones.......................................................................................................................36
BIBLIOGRAFÍA................................................................................................................374
TABLA DE FIGURAS
Figura 1: Esquema de la representación motora de la pata anterior de la rata realizada en el laboratorio de
Comportamiento Animal del departamento de Fisiología de la universidad Nacional de Colombia...............13
Figura 2: representación esquemática toma del libro de Paxinos, don de M1 corteza motora primaria, M2
corteza motora secundaria, Cg1: corteza del cíngulo primaria Cg2: corteza del cíngulo secundaria ..........14
Figura 3: Rata ubicada en el equipo de estereotaxia, la incisión en línea media, la trepanación y la
ablación de la corteza motora,..........................................................................................................................15
Figura 6: Disección inicial del cuello, se observa la vena yugular, que en las ratas es única y esta fuera del
paquete carotida-vago, hacia lateral de observa la glandula salivar submandibular, en azul claro el
músculo esternocleidomastoideo, en amarillo los músculos pretiroideos.........................................................15
Figura 7: se observa el músculo esternocleidomastoideo reparado hacia lateral, al fondo la arteria carótida
como con el nervio vago....................................................................................................................................16
Figura 8: se observa la arteria carótida interna reparada con un hilo morado...............................................17
Figura 9: Arteriotomía de la arteria carotida interna, introducción del monofilamento.................................18
Figura 10: montaje de la llave de tres vías las dos jeringas para realizar la homogenización de la
suspensión, la cual se pasa de jeringa a jeringa varias veces...........................................................................19
Figura 11: Rata en decúbito prono se identifican el músculo dorsal ancho hacia lateral y músculo trapecio
hacia medial.......................................................................................................................................................20
Figura 12: separación de los músculos trapecios, al fondo se identifican los músculo para espinales...........21
Figura 13: Disección de los músculos paraespinales se observa al fondo los músculos de la nuca................21
Figura 14: se observa la disección de los músculos de la nuca con la exposición de la columna vertebral....22
Figura 15: Acercamiento de la figura anterior donde se observa la columna vertebral sin periostio, el
indicador azul indica el área de laminectomía en su interior se observa el cordón espinal............................22
Figura 16: prueba del cilindro se observa un apoyo simétrico de ambas patas delanteras.............................25
Figura 17: esquema para la elaboración de la escalera. Las paredes se fabrican en acrílico, los peldaño
con alambre con un diámetro de 3 mm, y los agujeros para los peldaños cada 10 mm...................................26
Figura 18: montaje de la prueba de la escalera................................................................................................27
Figura 19: Vista ventral donde se registran las 4 extremidades.......................................................................28
Figura 20: El cuadrado negro: brazo enfermo, círculo: mano enferma, cuadrado blanco: pata trasera
enferma, rombo blanco: vibrisas, puntos: área sin respuesta...........................................................................30
Figura 21: Laboratorio de marcha....................................................................................................................31
Figura 22: se muestra el resultado de cada una de las ratas como en la gran mayoría existe un déficit
inicial pero con el paso del tiempo hay una recuperación casi completa.........................................................33
Figura 23: tendencia de las ratas que se les practica electrocoagulación de la corteza motora en la prueba
del cilindro.........................................................................................................................................................33
Figura 24: Valoración a largo plazo de la puntuación general de las ratas sometidas a radiofrecuencia,
valor promedio...................................................................................................................................................34
Figura 25: puntaje especifico para a pata anterior de todas las ratas sometidas a ablación de la capsula
interna con radiofrecuencia...............................................................................................................................35
Figura 26: promedio de os puntajes específicos para la patas anteriores........................................................355
Proyecto:
RECUPERACIÓN MOTORA DE EXTREMIDADES
CON SECUELAS HEMIPLEJÍA - HEMIPARESIA:
COMPARACIÓN DE DIFERENTES MODELOS
EXPERIMENTALES EN RATAS
MOTOR RECOVERY OF EXTREMITIES WITH
LONG TERM EFFECTS OF HEMIPLEGIA -
HEMIPARESIS: COMPARISON OF DIFFERENT
EXPERIMENTAL MODELS ON RATS
1. Resumen
Se pretende comparar diferentes modelos de hemiplejía-hemiparesia en un
modelo de experimentación animal en ratas con el fin de establecer cuál
es el mejor modelo.
Se practicaron cinco modelos diferentes de hemiplejía – hemiparesia,6
utilizando la microestimulación cerebral, para determinar en algunos
modelos, los sitios específicos de lesión. El seguimiento se realizo con
pruebas funcionales ( prueba del cilindro y prueba de la escalera ) tanto en
el periodo prequirúrgico y hasta 7 meses de seguimiento clínico
postoperatorio.
Summary
Its pretended to compare different models of hemiplegia-hemiparesis in an
animal experimentation model (rats) which objective is to establish which is
the best model.
Five different models of hemiplegia-hemiparesis have been practiced using
the brain microstimulation to determine in some models, the specific pats of
lesion. The follow-up has was done functional tests (cilinder and ladder
tests) in both the pre surgical period and up to 7 months later of postoperative
clinical follow-up.
2. Objetivo principal
Determinar la utilidad de las diferentes técnicas para generar hemiplejía –
hemiparesia en ratas como modelo apto para realizar reanimación de los
nervios afectados a través de nervios periféricos funcionales.
3. Objetivos específicos
• Implementar diferentes técnicas para generar hemiplejía – hemiparesia
de origen central.
• Implementar un protocolo para la valoración objetiva de la
funcionalidad motora pre y post operatoria de la ratas.
• Aplicar pruebas electrofisiológicas en el sistema nervioso central para7
señalización de estructuras.
4. Resultados esperados
Determinar cuál es la mejor técnica para generar hemiplejía – hemiparesia
en ratas.
5. Justificación
Los accidentes cerebrovasculares ocupan los primeros lugares de
prevalencia e incidencia de enfermedades en el mundo, y alcanzan cifras
hasta de 400 por 100.000 habitantes/años en mayores de 45 años, y
constituyen una de las patologías más devastadoras, que generan la
primera causa discapacidad, y afectan el autocuidado y las actividades de
la vida cotidiana (1).
El 65% de los pacientes a los 6 meses no incorporan la mano afectada a
las labores de autocuidado y a la vida cotidiana (2), con repercusiones
económicas de alto impacto para los afectados, los sistemas de salud y los
cuidadores.
Las alternativas terapéuticas son poco eficaces, a excepción de la
trombolisis la cual debe ser aplicada tempranamente, dentro de las 3
primeras horas de haber ocurrido el accidente y solo es útil en los eventos
isquémicos. Los tratamientos posteriores que usualmente se aplican están
encaminados a contrarrestar la espasticidad subsecuente y a promover la
plasticidad neuronal que permita la recuperación funcional, lo cual tiene
efectividad durante los primeros 6 meses (2).
Pasado este tiempo se implementan tratamientos paliativos de alto costo y
limitado efecto para el manejo de la espasticidad como son: aplicación de
toxina botulínica, fenolización de los nervios motores, fármacos orales
como el baclofen, y las intervenciones quirúrgicas que son menos
utilizadas como son las neurotomías, transferencias músculo- tendinosas y
alargamientos tendinosos (3).
En el mecanismo fisiopatológico de los accidentes cerebrovasculares
resultan lesionadas las motoneuronas superiores que son las efectoras de8
la intención motora.
6. Marco teórico
Los accidentes cerebrovasculares, independientemente de su origen,
isquémico o hemorrágico, generan la muerte de la moteneurona superior,
produciendo la pérdida de la función motora y de la inhibición espástica
sobre la motoneurona inferior, y en consecuencia se presenta parálisis,
espasticidad muscular, imbalance articular y como resultado final
deformidad y daño funcional de la extremidad contralateral al hemisferio
cerebral afectado (1).
El deterioro motor va tener 3 fases: la primera corresponde al periodo de
lesión aguda en el cual va predominar la flacidez, que se prolonga de 1 a 2
semanas, posteriormente el periodo de recuperación fisiológica, donde la
espasticidad se hace evidente y la plasticidad neuronal juega un rol
fundamental. Pasados 6 meses de la lesión, se hace definitiva y se
establecen las secuelas; durante este periodo la rehabilitación juega su
papel más importante (3).
Cuando se establecen las secuelas los tratamientos que se disponen son de
carácter paliativo, entre los terapéuticos de tipo médico: la toxina
botulínica, método temporal para tratar la espasticidad, costoso y de corta
duración (5); la fenolización de los nervios periféricos ha entrado en
desuso por los amplios efectos adversos, y las bombas intratecales de
baclofen que son prometedoras pero su costo es muy elevado. Los
tratamientos quirúrgicos: alargamientos tendinosos, las transferencias
tendinosas, las artrodesis y las neurotomías selectivas, son técnicas que
buscan que los componentes volitivos recuperados o no afectados por el
accidente cerebrovascular suplan la función de la mano (1).
En los accidentes cerebrovasculares, la muerte de la motoneurona superior
genera la pérdida de la función motora volitiva y del tono motor sobre la
motoneurona inferior. La ausencia del control cortical sobre la
motoneurona inferior, induce un estado de hiperexcitabilidad que se
traduce clínicamente como espasticidad (7). A diferencia de la lesión
traumática de un nervio periférico, la placa neuromuscular se encuentra
estimulada intensamente, y no se degenera.9
Los modelos animales de las condiciones neurológicas humanas no son
tarea fácil, principalmente porque las enfermedades neurológicas tienen
diferentes manifestaciones según la especie. Ningún animal de laboratorio
ha sido estudiado en detalle como la rata, este trabajo ha revelado
numerosos comportamientos motores que se pueden utilizar tanto para el
estudio del daño motor y la recuperación asociada a diferentes
condiciones neurológicas (10).
Adicionalmente los comportamientos específicos de esta especie, en
especial el análisis de los movimientos de las patas anteriores muestra
movimientos muy similares a los componentes de la extremidad superior
en humanos (11). Esta información ha llevado al desarrollo de una batería
de pruebas tanto sensoriales como motoras que miden varios aspectos
tanto del daño motor como su recuperación posterior al insulto isquémico
cerebral. Existe un conocimiento extenso de la organización tanto
anatómica como neurofisiológica del sistema motor del roedor (8; 12), lo
que facilita la identificación de los mecanismos neuronales subyacentes a
la recuperación motora. Esta información puede ser utilizada para el
desarrollo de nuevas terapias adyuvantes novedosas que mejoren la
recuperación motora.
7. Consideraciones éticas
Las primeras descripciones de modelos experimentales para ocluir una
arteria intracraneal se realizaron mediante craneotomías en perros.
Posteriormente se han modificado con el objetivo de minimizar el daño
mecánico directo sobre el parénquima cerebral y evitar así la exposición
del contenido intracraneal a la atmósfera (17).
Así mismo, se desarrollaron modelos para producir una isquemia cerebral
en animales despiertos y modelos en los que la oclusión arterial pudiese
ser transitoria. Los primeros trabajos experimentales se desarrollaron en
mamíferos grandes, sobre todo perros y gatos; posteriormente, se ha ido
tendiendo cada vez más a usar modelos con roedores.
Respecto a los animales empleados, su comportamiento, integración
motora y sensitiva, el tipo de neocórtex y la vascularización cerebral son
factores muy importantes a la hora de elegir un modelo de isquemia. La10
posición erecta y la destreza manual de los primates hacen de ellos los
animales más valiosos para el estudio de la isquemia cerebral humana.
Sin embargo, la investigación con primates es cada vez más difícil, tanto
por razones económicas como éticas, de forma similar a lo que sucede
con el uso de otros mamíferos grandes, como gatos y perros.
Actualmente, los animales con los que generalmente se prefiere trabajar
son los pequeños roedores, especialmente las ratas. Las ratas tienen una
anatomía vascular cerebral y una fisiología aceptablemente similares a
las de los humanos y son animales de bajo costo, fáciles de criar y
manejar, por lo que se han convertido en los animales de
experimentación más ampliamente utilizados (18).
Las primeras descripciones de modelos experimentales para ocluir una
arteria intracraneal se realizaron mediante craneotomías en perros.
Posteriormente se han modificado con el objetivo de minimizar el daño
mecánico directo sobre el parénquima cerebral y evitar así la exposición
del contenido intracraneal a la atmósfera (Hudgins & García, 1970).
Así mismo, se desarrollaron modelos para producir una isquemia
cerebral en animales despiertos y modelos en los que la oclusión arterial
pudiese ser transitoria. Los primeros trabajos experimentales se
desarrollaron en mamíferos grandes, sobre todo perros y gatos;
posteriormente, se ha ido tendiendo cada vez más a usar modelos con
roedores.
Respecto a los animales empleados, su comportamiento, integración
motora y sensitiva, el tipo de neocórtex y la vascularización cerebral son
factores muy importantes a la hora de elegir un modelo de isquemia. La
posición erecta y la destreza manual de los primates hacen de ellos los
animales más valiosos para el estudio de la isquemia cerebral humana.
Sin embargo, la investigación con primates es cada vez más difícil, tanto
por razones económicas como éticas, de forma similar a lo que sucede
con el uso de otros mamíferos grandes, como gatos y perros.
Actualmente, los animales con los que generalmente se prefiere trabajar
son los pequeños roedores, especialmente las ratas.
Las ratas tienen una anatomía vascular cerebral y una fisiología
aceptablemente similares a las de los humanos y son animales de bajo
costo, fáciles de criar y manejar, por lo que se han convertido en los
animales de experimentación más ampliamente utilizados (Kim, 1997).11
las condiciones de alojamiento, la totalidad de los procedimientos
experimentales y la disposición de residuos biológicos y químicos se
realizan observando las normativas nacionales e internacionales
pertinentes: Resolución N° 008430 de 1993 del Ministerio de Salud y la
Ley 84 del 27 de diciembre de 1989; también se observarán los
procedimientos para el manejo y cuidado de animales de laboratorio
recomendados por la normativa de la Unión Europea (861609IEU) y los
Institutos Nacionales de Salud de los Estados Unidos de América
(National Research Council, 1996). con respecto a la aplicación de la
normas anteriormente citadas, cabe hacer las siguientes aclaraciones: (1)
todos los procedimientos experimentales serán sometidos a la
consideración de un Comité de Ética, conformado según lo estipulado en
artículo 26 de la Ley 84 de 1989, el supervisará periódicamente el
desarrollo de los experimentos. (2) todo personal encargado del cuidado
y manejo de los animales de experimentación debe contar con la
formación específica certificada. (3)Los animales que serán sometidos a
experimentos potencialmente dolorosos recibirán anestesia quirúrgica.
(4) al final de los procedimientos de evaluación funcional, los animales
serán sacrificados, previa aplicación de una sobredosis de anestésico. (5)
para garantizar la seguridad de los investigadores, la manipulación de los
residuos contaminados producidos por este estudio se hará de utilizando
botas y gorros desechables, guantes de látex, tapabocas y gafas de
protección. (6) para impedir la contaminación ambiental con elementos
potencialmente tóxicos, los residuos químicos y los materiales
desechables utilizados para la inyección, serán depositados en
contenedores adecuados. (7) los cadáveres de los animales utilizados en
esta investigación serán incinerados en el complejo de Ciencias de
Producción Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia
de la Universidad Nacional de Colombia. (8) La Unidad de Recursos
Físicos de la Universidad Nacional de Colombia, a través del programa
UN Ambiente, se hará cargo de la disposición definitiva de los desechos
orgánicos y químicos producidos por este proyecto.12
8. Metodología
8.1. Diseño experimental
Se trata de un estudio con 32 ratas Wistar machos con un peso de 300gr
+/- 20 gr, que se sometieron a 5 modelos diferentes de hemiplejía –
hemiparesia:
• Oclusión de la arteria cerebral media
• Embolización con Gel Foam® de la arteria cerebral
media
• Electrocoagulación de la corteza motora
• Hemisección medular
• Ablación de la capsula interna con radiofrecuencia
Se medió la regeneración nerviosa con la prueba del cilindro y la prueba
de la escalera.
8.2. Animales
Se utilizaron 32 ratas Wistar de 16 semanas de 300gr +/- 20gr, los
animales serán obtenidos del bioterío de la Facultad de Veterinaria de la
Universidad Nacional de Colombia, se hospedaron en cajas con 2
especimenes e individualmente los 3 primeros días postoperatorios. Se
mantuvieron con 12 horas día/12 horas noche.
8.3. Técnica anestésica
Se realizo con Ketamina 100mg/kg, Xylazina 10mg/kg inyección
intraperitoneal, y dosis de mantenimiento de Ketamina 25mg/kg
intraperitoneal (3).
La temperatura corporal de mantuvo mediante la utilización de una
manta térmica (Conair, HP15RB) durante el procedimiento quirúrgico.13
8.4. Modelos de hemiplejía – hemiparesia
8.4.1. Electrocoagulación de la corteza motora
Según los estudios realizados por Paxinos (8) la corteza motora primaria,
secundaria y la corteza del cíngulo primaria y secundaria son las
encargadas del movimiento voluntario de la ratas, estas áreas tienen una
amplia representación que aproximadamente va desde una ubicación
anteroposterior (AP) al bregma de + 3mm hasta – 4 mm y lateralmente
hasta los 4 mm, estudios recientes sobre (16) la representación de la
corteza motora han mostrado que las patas anteriores se ubican
aproximadamente AP al bregma desde 2 mm hasta -2 mm y lateralmente
hasta 4 mm, tuvimos la oportunidad de realizar en nuestros animales
mapeo cortical (ver más adelante) donde se confirmó la ubicación de la
corteza motora para la ablación (figura 1 y 2)
Figura 1: Esquema de la representación motora de la pata anterior de la rata realizada en el laboratorio de
Comportamiento Animal del departamento de Fisiología de la universidad Nacional de Colombia
La rata se ubica en el equipo de estereotaxia, se practica una incisión
longitudinal en la línea media, se diseca hasta exponer el cráneo, el
periostio se retira con un disector pequeño, con la pieza de mano
realizamos una craneotomía AP + 2mm, - 2mm lateral 4mm (figura 5),
se retira la duramadre, con hisopo de algodón arrancamos la pía madre y
posteriormente con un electrocauterio bipolar (AARON, Inc. USA)
hacemos la ablación de la corteza motora, posterior hacemos el cierre de14
la piel con Catgut® 5/0 (Ethicon).
Figura 2: representación esquemática toma del libro de Paxinos, don de M1 corteza motora primaria, M2
corteza motora secundaria, Cg1: corteza del cíngulo primaria Cg2: corteza del cíngulo secundaria15
Figura 3: Rata ubicada en el equipo de estereotaxia, la incisión en línea media, la trepanación y la ablación
de la corteza motora,
8.4.2. Oclusión de la arteria cerebral media
La oclusión de la arteria cerebral media mediante introducción de un
monofilamento endovascular de monofilamento (13), se busca generar
un infarto de toda el área irrigada por la arteria cerebral media que
incluye toda el área motora, y se estima que en promedio el área del
infarto es alrededor del 40% del volumen del hemisferio cerebral, las
complicaciones mayores como hemorragia subaracnoidea están
alrededor del 30% de los animales operados con esta técnica(13).
Para la realización del procedimiento se coloca el animal en decúbito
dorsal, se fijan sus extremidades, bajo magnificación óptica, se practica
una incisión en la línea media de la cara anterior del cuello (figura 6).
Figura 4: Disección inicial del cuello, se observa la vena yugular, que en las ratas es única y esta fuera del
paquete carotida-vago, hacia lateral de observa la glandula salivar submandibular, en azul claro el
músculo esternocleidomastoideo, en amarillo los músculos pretiroideos.16
Se diseca la glándula submandibular, se localizan los músculo
pretiroideos en la línea media y el esternocleidomastoideo lateral,
posterior a los dos músculos se encuentra la arteria carótida acompañada
del nervio vago.
La arteria carótida común (ACC) se encuentra medial al nervio vago, la
ACC se bifurca dando la arteria carótida externa (ACE) que se dirige
medial y la arteria carótida interna (ACI) que se dirige hacia lateral. La
ACI da una rama extra craneal, la arteria pterigopalatinaque sigue un
trayecto posterolateral y ascendente, la cual se liga. (figura 7)
Figura 5: se observa el músculo esternocleidomastoideo reparado hacia lateral, al fondo la arteria carótida
como con el nervio vago17
Figura 6: se observa la arteria carótida interna reparada con un hilo morado
Se liga la ACC y la ACI para evitar el flujo retrógrado desde ACE. Se
hace una arteriotomía en la ACI y se introduce una monofilamento con
dirección a la base del cráneo (figura 8).
Se emplea un monofilamento Prolene® 4/0 (Ethicon) de 25 mm de
longitud, cuya punta se redondea y se ensancha al fuego. Se debe
introducir sin forzar de 18 a 22 mm (figura 9).18
Figura 7: Arteriotomía de la arteria carotida interna, introducción del monofilamento
8.4.3. Embolización de la arteria cerebral media con Gel Foam®
Se utiliza la misma técnica de disección que para la oclusión
endovascular de la arteria cerebral media, al realizar la arteriotomía se
introduce un catéter venoso calibre 27G y se fija con prolene 6/0
(Ethicon). Se toma el Gel Foam® (Ethicon, USA) y se tritura hasta
llevarlo a fragmentos de 0,1mm aproximadamente, en una jeringa de 1 cc
se prepara 0,1 cc de Gelfoam y 0.9 cc de solución salina al 0,9%, con una
llave de tres vías se coloca la jeringa preparada y otra, se pasa de un lado
a otro hasta homogenizar la suspensión y se aplica a través del catéter de
forma lenta, al terminar se retira el cetéter y se cierra la arteriotomía con
ethilon 9/0 (Ethicon) para restituir el flujo a través de la arteria, se cierra
la piel con prolene 5/0 (Ethicon).19
Figura 8: montaje de la llave de tres vías las dos jeringas para realizar la homogenización de la suspensión,
la cual se pasa de jeringa a jeringa varias veces
8.4.4. Hemisección medular
Basado en los estudios realizados por Berttelli sobre el plexo braquial de
las ratas, en el cual demuestra que la distribución anatómica es muy
parecida a la del Humano, extrapolamos la posibilidad de realizar una
hemiseccion medular a nivel de C6 – C7 para generar una hemiplejia,
reservando intactas los troncos nerviosos de C5-C6 para disminuir la
morbilidad de la pata anterior de la rata intentando preservar el hombro
para permitir el acicalamiento y no deteriorar la alimentación;
adicionalmente al ser solo una hemisección la regulación de la vejiga no
se afecta.20
Se coloca la rata en decúbito prono ubicada en el marco de esterotaxia,
se realiza una incisión desde el occipucio hacia caudal de 2cm, se
identifican el músculo trapecio (figura 11)
Figura 9: Rata en decúbito prono se identifican el músculo dorsal ancho hacia lateral y músculo trapecio
hacia medial
Se separan los músculos trapecios se identifican los músculos para
espinales (figura 12) los cuales se disecan en la línea media y se
observan los músculos de la nuca (figura 13).21
Figura 10: separación de los músculos trapecios, al fondo se identifican los músculo para espinales
Figura 11: Disección de los músculos paraespinales se observa al fondo los músculos de la nuca
Se inciden los músculos de la nuca por la línea media y se identifica la
columna vertebral en su porción cervical (figura 14 y 15). Con un
disector fino se retira el periostio de la lamina de la vértebra C6, con una
pieza de mano y un pinpollo de 1 mm de diámetro se fresa la lamina
hasta retirarla, con la precaución de no dañar la duramadre, con un22
bisturí de 15 grados de oftalmología se incide la duramadre realizando
una ventana, se identifica la línea media del cordón espinal y se realiza la
hemisección, se cierran los planos musculares con Vicryl® 4/0 (Ethicon)
y la piel con Catgut® 5/0 (Ethicon).
Figura 12: se observa la disección de los músculos de la nuca con la exposición de la columna vertebral
Figura 13: Acercamiento de la figura anterior donde se observa la columna vertebral sin periostio, el
indicador azul indica el área de laminectomía en su interior se observa el cordón espinal23
8.4.5. Ablación de la cápsula interna con radiofrecuencia
La introducción de la radiofrecuencia a la neurocirugía a permitido que en
conjunto con la neuronavegación se puedan tratar tumores en lugares
críticos del cerebro – tallo cerebral – sin generar secuelas importantes.
Las técnicas de ablación con radiofrecuencia dan la posibilidad de realizar
lesiones puntuales que se pueden controlar y estandarizar fácilmente, se
puede regular la temperatura y el tiempo de lesión; además los equipos
cuentan con estimuladores motores y sensitivos que disminuyen la
posibilidad de lesionar estructuras sanas.
La capsula interna es una estructura donde confluyen todas las fibras
nerviosas de la corteza cerebral, un estrecho de paso obligatorio, la región
de la rodilla y del brazo anterior son las áreas por donde descienden la
mayoría de las fibras encargadas de efectuar los movimientos de los
miembros anteriores en las ratas.
Basado en las descripciones realizadas por Paxinos (17), ubicamos la rodilla
y el brazo anterior de la capsula interna a 2mm posterior al bregma, 2 mm
lateral con una profundidad de 5mm. Utilizamos un equipo de
radiofrecuencia NEURO® N50 (INNAMED. Inc, Germany) con un
electrodo monopolar de 1 mm de diámetro.
Se coloca la rata en el equipo de esterotaxia y bajo magnificaron óptica con
microscopio, se practica un incisión para craneotomía, se ubica el bregma,
se marcan las coordenadas, con una fresa de 1 mm se realiza la trepanación
hasta evidenciar la duramadre, se procede a introducir el electrodo hasta la
profundidad establecida, se genera un estimulo motor con el equipo para
determinar la ubicación exacta de electrodo, generamos una lesión a 70º C
durante 90 segundos.24
8.5. Pruebas de valoración funcional
Para el seguimiento de las ratas se montaron y estandarizaron dos pruebas
que consideramos son optimas para el seguimiento tanto preoperatorio como
postoperatorio de las ratas, tanto por su aplicación sencilla como su bajo
costo.
Las pruebas se aplicaron en el prequirúrgico y en algunos casos hasta 7
meses posteriores a la aplicación de diferente modelos de hemiplejía –
hemiparesia.
8.5.1. Prueba del cilindro (15)
La pata delantera es utilizada para sostener el peso durante la actividad de
exploración, esta se examina ubicando a la rata en un cilindro transparente
de 20 cm en diámetro y 30 cm de altura durante 3 minutos en cada sesión.
Se ubica un espejo debajo del cilindro, y se ubica una cámara (cámara JVC,
Modelo GR-DVL305U) en la parte superior. La forma cilíndrica estimula a
la rata a la exploración vertical de las paredes. Cuando el animal realiza la
actividad apoya la patas contra el cilindro, el número de veces que las apoya
se contabilizan y se determina si son simétricos los apoyos y se calcula la
siguiente fórmula:
pata afectada / (no afectada + afectada)
se obtiene un índice donde 0,5 es una actitud simétrica, y cuando se acerca a
0 muestra disminución del uso de la pata afectada.25
Figura 14: prueba del cilindro se observa un apoyo simétrico de ambas patas delanteras
8.5.2. Prueba de la escalera (12)
El desarrollo de modelos animales de accidentes cerebrovasculares, lesiones
del cordón espinal y otras enfermedades neurodegenerativas requieren
pruebas de ala sensibilidad para evaluar la función motora y determinar
objetivamente la perdida funcional.
La prueba de la escalera permite una valoración cuantitativa y cualitativa de
la función motora y es sensible a los cambios durante los periodos de
recuperación.
Los animales deben caminar a través de una escalera horizontal con unos
peldaños que son variables en su distancia y que se cambian periódicamente26
para evitar que los animales aprendan la ubicación de los mismos y
disminuir la posibilidad de patrones compensatorios.
La prueba de marcha se realiza en una escalera horizontal, que esta
conformada por paredes de acrílico y peldaños metálicos de 3 mm de
diámetro, los cuales se insertan en el piso de la escalera con una distancia
minima de 1 cm; el largo total de la escalera es de 1 m y su altura desde los
peldaños de 19 cm.
La escalera se ubica a 30 cm del piso soportada en una jaula desconocida
para el animal, la cual es el punto de partida y en el otro extremo la jaula
donde el animal vive habitualmente. La dificultad de la tarea se puede
cambiar variando la distancia entre los peldaños.
Figura 15: esquema para la elaboración de la escalera. Las paredes se fabrican en acrílico, los peldaño con
alambre con un diámetro de 3 mm, y los agujeros para los peldaños cada 10 mm.
Para la grabación se ubica una cámara (cámara JVC, Modelo GR-
DVL305U) en un ángulo ventral en la cual se visualicen las 4 extremidades
y los videos se analizan cuadro por cuadro a una velocidad 30 cuadro por
segundo.27
Los animales pasan de la jaula neutral a la jaula conocida, siempre en la
misma dirección, cada animal debe pasar 5 veces por sesión de evaluación
en el prequirúrgico como en el postoperatorio.
Figura 16: montaje de la prueba de la escalera
La evaluación cuantitativa de la pata anterior y posterior se utiliza una
escala de 0 a 6 basado en el análisis cuadro a cuadro, utilizamos la siguiente
escala:28
Figura 17: Vista ventral donde se registran las 4 extremidades
Cuando múltiples errores ocurren al mismo tiempo, se registra el de menor
puntaje, se analizan 5 recorridos completos y se saca un promedio para el
análisis en cada sesión de evaluación.
Para la pata anterior utilizamos la siguiente escala cuando la rata obtiene un
6 en la escala general:29
se analiza en 5 ensayos y se promedia, dando un puntaje sobre 5 donde 0 es
ausencia de cierre completo de los dígitos con perdía de la fuerza de flexión
de la muñeca y 5 una función normal.
8.6. Pruebas electrofisiológicas
Realizamos el mapa cortical motor aplicando directamente micro
estimulación eléctrica a la corteza cerebral de esta forma se puede establecer
el área de lesión para los casos de electrocoagulación y estimulación más
profunda en los casos de la capsula interna.
8.6.1. Microestomulación intracortical y profunda (16)
Con microelectrodos de tungsteno con impedancia de 0,2-1,0 Mega ohmios
se practicó estimulación intracortical a través de la craneotomía realizadas
sobre el área motora que se encuentra 5 mm anterior y 1mm posterior al
bregma y entre 0,4 a 4 mm lateral a la línea media, Los electrodos se
aplicarán cada 0,5 mm, con una profundidad de 1,8mm.
En los casos de la capsula interna con el mismo electrodo utilizado para
ablación estimulamos para ubicar con exactitud el sitio de lesión.
El umbral de corriente en cada punto de la corteza motora examinada es
definido por la mínima cantidad que genera un movimiento visible de la
pata.
8.6.2. Elaboración del mapa cortical
Los estímulos eléctricos generan movimientos visibles en el cuerpo de la
rata, como resultado de la transferencia nerviosa, la estimulación de la
corteza motora izquierda debe generar movimientos ipsilaterales, en la pata
lesionada. Según los movimientos generado se marca en cada punto, que
movimiento se produce y se grafica.30
Figura 18: El cuadrado negro: brazo enfermo, círculo: mano enferma, cuadrado blanco: pata trasera enferma,
rombo blanco: vibrisas, puntos: área sin respuesta
9. Resultados
El experimento se inicio en enero de 2009 y los últimos análisis se
realizaron en enero de 2011.
Durante este periodo se realizaron 32 procedimientos quirúrgicos de
diferente índole, como se muestra en la siguiente tabla:31
Durante este periodo se constituyó el laboratorio de cirugía experimental, el
cuál cuenta gracias al apoyo de Instituto Nacional de Cancerología con un
microscopio Carl Zeiss en óptimas condiciones y un electrocauterio
quirúrgico, además del equipo de estereotaxia cortesía del Dr Alejandro
Munera del Departamento de Ciencias Fisiológicas. También se dispone de
un equipo completo para realizar microcirugía y con la manta térmica. En
este momento el laboratorio funciona en el 4 piso del Departamento
Ciencias Fisiológicas.
9.1. Pruebas de valoración funcional
Las dos pruebas que se establecieron, la escalera y el cilindro se lograron
estandarizar a cabalidad, y se conformó el laboratorio de marcha; todos los
videos son analizados en Final Cut Pro® para Mac.
Figura 19: Laboratorio de marcha32
9.2. Pruebas electrofisiológicas
La microestimulación cortical y la elaboración de los mapas corticales se
utilizó ampliamente para la ubicación exacta de la corteza motora y de la
capsula interna previa a la ablación logrando homologar la técnica.
9.3. Modelos de hemiplejía – hemiparesia
Las ratas son el mejor modelo de experimentación para accidentes
cerebrovasculares como se explicó previamente, recurrimos a múltiples
modelos.
9.3.1. Oclusión de la arteria cerebral media
Tuvimos la posibilidad de realizar una intervención de este tipo, con un
seguimiento a largo plazo – 6 meses – al cabo la valoración en el cilindro
fue de 0,5 sin evidenciar déficit motor.
9.3.2. Embolización con Gel Foam® de la arteria cerebral media
Se le practicó a 6 animales, tuvimos una mortalidad de 83%, 3 animales
fallecieron intraoperatoriamente y 2 en el postoperatorio inmediato por lo
hallazgos creemos que el fallecimiento fue por edema cerebral masivo. La
rata sobreviviente tuvo un seguimiento de 6 meses una puntuación en el
cilindro de 0,4 que demostraba la presencia de la lesión a largo plazo, el
modelo presento una mortalidad muy alta.
9.3.3. Electrocoagulación de la corteza motora
Este modelo se practicó en 12 animales según técnica descrita, a todos los
animales se determino el área motora con microestimulación intracortical.
La mortalidad fue del 16 %, el seguimiento mínimo fue de 4 semanas y el
máximo de 6 meses, los animales fueron evaluados en la prueba del
cilindro.33
0,6
0,5
Rata I
0,4
Rata II
0,3
Rata III
0,2
rata VI
0,1
0 Rata VII
Rata X
Rata XII
Figura 20: se muestra el resultado de cada una de las ratas como en la gran mayoría existe un déficit inicial
pero con el paso del tiempo hay una recuperación casi completa.
Con el seguimiento a largo plazo evidenciamos una recuperación casi
completa de la función motora como podemos apreciar en la tendencia
general; a largo plazo la recuperación fue evidente
Media
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2 Promedio
0,1
0
pre qx 2 4 16 20
semanas semanass emanas s emanas
Figura 21: tendencia de las ratas que se les practica electrocoagulación de la corteza motora en la prueba del
cilindro.34
9.3.4. Hemisección medular
Se practicaron hemisecciones medulares en 6 animales, con una mortalidad
del 83 %, 4 en el postoperatorio inmediato y una tardío con infección del
sitio operatorio; la rata que sobrevive se evidencia un déficit importante de
la pata anterior afectada con un índice en el cilindro a los 8 días de 0,1 , pero
a los 30 días un índice en el cilindro de 0,4 y a los 2 meses de 0,5 mostrando
una recuperación excepcional.
El modelo mostró una mortalidad alta y una recuperación excepcional de la
rata que se le logro seguir.
9.3.5. Ablación de la cápsula interna con radiofrecuencia
Se le realizó a 4 animales según la técnica quirúrgica descrita, previa
microestimulación para la verificación de la ubicación del electrodo en la
cápsula interna. La mortalidad fue del 0%, y con un seguimiento a 28
semanas de los animales; todos fueron evaluados con la prueba de la
escalera tanto el puntaje general como el especifico para la pata delantera.
Al inicio el la lesión fue muy prometedora, y se mantiene en el puntaje
general a largo plazo como se muestra en el siguiente grafico:
Media
30
25
20
15
10
5
0
Figura 22: Valoración a largo plazo de la puntuación general de las ratas sometidas a radiofrecuencia, valor
promedio35
En el análisis específico de la pata delantera todos los animales muestran un
déficit importante a corto plazo el cual mejora con el paso del tiempo como
se observa en la grafica siguiente:
6
5
4
3
Rata I
2
1
Rata II
0
Rata III
Rata IIII
Figura 23: puntaje especifico para a pata anterior de todas las ratas sometidas a ablación de la capsula interna
con radiofrecuencia.
Cuando miramos el promedio, la recuperación es casi completa a largo
plazo, con un promedio prequirúrgico de 4,625 similar al tardío de 4,375,
aunque durante las primeras 8 semanas se evidencia un déficit mayor al
60% de la función 2,25 y 1,925.
Media
5
4,625
4,375
4 3,85
3,525
3
2,25
2 1,925
1
0
Figura 24: promedio de os puntajes específicos para la patas anteriores36
10. Conclusiones
Las ratas se han considerado como los mejores modelos animales de
experimentación para el estudio de los accidentes cerebrovasculares, tanto
por sus patrones de marcha y agarre similares a los humanos, por su
anatomía vascular cerebral como por su bajo costo y fácil crianza.
Pero tienen una gran capacidad de regeneración y adaptación a situaciones
adversas, como se ha demostrado recientemente (18), tiene rutas neuronales
que les permiten tener representación motora en ambos hemisferios, que
puede llegar a ser útil en casos de lesión cortical o intracerebral que les
permiten rápidamente recuperar la función motora, se han encontrado rutas
intracallosas, intratalamicas, y en la medula espinal.
Estos hallazgos nos pueden explicar el motivo de la recuperación que
presentan los animales con los diferentes modelos de hemiplejia –
hemiparesia; además los estudios publicados (8,9,12) con los diferentes
modelos de lesión cortical tienen un seguimiento máximo a 12 semanas en
las pruebas motoras, que como pudimos comprobar el déficit se marcado en
este periodo pero a largo plazo la recuperación es evidente.
Realizamos seguimientos a largo plazo de lesiones completas del nervio
mediano y del nervio mediano y cubital en ratas donde evidenciamos una
adaptación importante en los patrones de marcha y de agarre que permiten
al animal llevar una rutina normal, siendo similar a las lesiones generadas en
los diferentes modelos de hemiplejía – hemiparesia que realizamos.
La aproximación a los diferentes modelos de hemiplejía – hemiparesias nos
mostró que la ablación con radiofrecuencia es el más preciso, que permite
una estandarización en la técnica y con una lesión que más perdura en el
tiempo.37
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