Obtención in vitro de micelio de hongos comestibles, shiitake (Lentinula edodes) y orellanas (Pleurotus ostreatus y Pleurotus pulmonarius) a partir de aislamientos de cuerpos fructíferos, para la producción de semilla
Autor: Suárez Arango, Carolina
Asesor: Holguín Hernández, Martha Stella (Thesis advisor)
Fecha: 2010
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Los macromicetos han sido parte de la cultura humana desde hace miles de años y han sido reportados como alimento humano en las más importantes civilizaciones de la historia. Se han descrito muchísimas propiedades nutricéuticas de los macromicetos, como lo son sus propiedades anticancerígenas y antitumorales, hipocolesterolémicas, antivirales, antibacterianas, inmunomoduladoras, entre otras. Igualmente, han sido descritas sus propiedades nutricionales, tienen un elevado contenido de proteína, casi igual o superior al de algunas legumbres; además, poseen todos los aminoácidos esenciales para las funciones humanas, así como un alto contenido de vitaminas y minerales. Géneros de Pleurotus (orellanas) y Lentinula edodes (shiitake) se encuentran entre las setas con un mayor índice de producción a nivel mundial. En Colombia, el cultivo de este tipo de hongos es muy poco generalizado, así como la investigación y las fuentes de información para llevar a cabo este tipo de cultivos. Se desarrollaron varias metodologías para producir micelio a partir de cuerpos fructíferos para la producción de semilla. Al igual, se evaluaron diferentes medios de cultivo sintéticos y diferentes tipos de semillas de cereales para la producción de micelio y semilla (spawn), para la iniciación de los cultivos de setas. El mejor medio de cultivo para la producción de micelio fue PDA (Papa, dextrosa y agar) y el mejor cereal para la producción de semilla fue el trigo. / Abstract. Macrocymectes have been part of the human culture for thousand years and have been reported as food in the most important civilizations in history. Many nutraceutical properties of the macromycetes have been described, for instead, anticancer, antitumor, hypocholesterolemic, antiviral, antibacterial, immunomodulatory, among others. They have also described its nutritional properties, have a high content of protein, nearly equal to or higher than some vegetables, also have all the amino acids essential to human functions and high content of vitamins and minerals. Genera Pleurotus (oyster mushrooms) and Lentinula edodes (shiitake) are among the mushrooms with a higher rate of the production worldwide. In Colombia, the cultivation of these fungi is very widespread, and research and sources of information to carry out this type of crop as well. Various methodologies were developed to produce mycelia from fruiting bodies for the spawn production. Several synthetic media and cereal seeds were evaluated to define the best media to mycelia and spawn production. The best media was PDA (Potato dextrose, agar) and the best grain for spawn production was wheat.

OBTENCIÓN IN VITRO DE MICELIO DE HONGOS COMESTIBLES, SHIITAKE
(Lentinula edodes) Y ORELLANAS (Pleurotus ostreatus y Pleurotus
pulmonarius) A PARTIR DE AISLAMIENTOS DE CUERPOS FRUCTÍFEROS,
PARA LA PRODUCCIÓN DE SEMILLA
CAROLINA SUÁREZ ARANGO
COD. 107407
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIÓN EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
BOGOTÁ D.C.
2010OBTENCIÓN IN VITRO DE MICELIO DE HONGOS COMESTIBLES, SHIITAKE
(Lentinula edodes) Y ORELLANAS (Pleurotus ostreatus y Pleurotus
pulmonarius) A PARTIR DE AISLAMIENTOS DE CUERPOS FRUCTÍFEROS,
PARA LA PRODUCCIÓN DE SEMILLA
CAROLINA SUÁREZ ARANGO
COD. 107407
Trabajo de grado presentado para optar al título de Especialista en Ciencia y
Tecnología de Alimentos
DIRIGIDO POR
MSc. MARTHA STELLA HOLGUÍN H
CODIRECTOR
MSc. NESTOR ARIEL ALGECIRA ENCISO
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE CIENCIAS
ESPECIALIZACIÓN EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
BOGOTÁ D.C.
2010A Dios por darme la oportunidad de seguir
creciendo profesionalmente y por permitirme caer
para volverme a levantar con más fuerza y fe en mí.
A mis padres Hilda y José Vicente, por su amor,
apoyo incondicional y por creer siempre en mi. No
los defraudaré.
A mis hermanos David Ricardo, por ponerle
siempre sal y picante a mi vida y Danna, por ser la
alegría de mi existencia.
A quien no tenía los ojos color del sol, pero si
eran los ojos que adoraba y me llenaban de felicidad,
esperanza, luz y calor. Ahora ya no estás conmigo,
pero siempre estarás en mi corazón como lo que
eres, mi amor.
A mi profe Martha, por demostrarme que hay gente
muy linda en la tierra. Gracias por brindarme su
apoyo, darme ánimo en los momentos difíciles y por
su valiosísima amistad.
A mi amiga del alma, Joha, que aunque estando
lejos, me demuestra que las cosas siempre se pueden
conseguir, eres mi ejemplo a seguir.AGRADECIMIENTOS
• A Julián Guevara, de “Fungita” por facilitar sus instalaciones, recursos y
empleados para la producción de las setas empleadas en el estudio.
• Al Instituto de Ciencia y Tecnología de Alimentos (ICTA) de la Universidad
Nacional de Colombia, sede Bogotá y a su director, Dr. Carlos Novoa por
permitirme realizar mi trabajo experimental y darme la oportunidad de
trabajar en el marco de otras investigaciones realizadas en el Laboratorio
de Control Microbiológico del Instituto.
• Nuevamente, a la profesora Martha Stella Holguín, por brindarme la
confianza de trabajar en el laboratorio y compartir conmigo conocimientos y
experiencias de vida.
• Al profesor Nestor Algecira, por brindarme la oportunidad de ingresar al
programa de especialización y confiar en mí.
• A Gregorio Medina, técnico del Laboratorio de Control Microbiológico del
ICTA, por compartir todo su conocimiento conmigo y brindarme apoyo en mi
trabajo experimental.
• A la Dra Sci. Ivonne Nieto, profesora de la Facultad de Química de la
universidad por darle un nuevo empuje a mi carrera y por darme la
oportunidad de trabajar con ella.
• Al MSc Luis Carlos Veloza, por su inmenso apoyo, confianza y amistad.
• A Kelly y a Susana, por su impagable colaboración en el laboratorio.
• A Álvaro Jiménez y a todos los ingenieros, estudiantes, técnicos y demás
empleados del ICTA, por su colaboración e interés en mí.OBTENCIÓN IN VITRO DE MICELIO DE HONGOS COMESTIBLES, SHIITAKE
(Lentinula edodes) Y ORELLANAS (Pleurotus ostreatus y Pleurotus
pulmonarius) A PARTIR DE AISLAMIENTOS DE CUERPOS FRUCTÍFEROS,
PARA LA PRODUCCIÓN DE SEMILLA
RESUMEN
Los macromicetos han sido parte de la cultura humana desde hace miles de años
y han sido reportados como alimento humano en las más importantes
civilizaciones de la historia. Se han descrito muchísimas propiedades nutricéuticas
de los macromicetos, como lo son sus propiedades anticancerígenas y
antitumorales, hipocolesterolémicas, antivirales, antibacterianas,
inmunomoduladoras, entre otras. Igualmente, han sido descritas sus propiedades
nutricionales, tienen un elevado contenido de proteína, casi igual o superior al de
algunas legumbres; además, poseen todos los aminoácidos esenciales para las
funciones humanas, así como un alto contenido de vitaminas y minerales.
Géneros de Pleurotus (orellanas) y Lentinula edodes (shiitake) se encuentran
entre las setas con un mayor índice de producción a nivel mundial. En Colombia,
el cultivo de este tipo de hongos es muy poco generalizado, así como la
investigación y las fuentes de información para llevar a cabo este tipo de cultivos.
Se desarrollaron varias metodologías para producir micelio a partir de cuerpos
fructíferos para la producción de semilla. Al igual, se evaluaron diferentes medios
de cultivo sintéticos y diferentes tipos de semillas de cereales para la producción
de micelio y semilla (spawn), para la iniciación de los cultivos de setas. El mejor
medio de cultivo para la producción de micelio fue PDA (Papa, dextrosa y agar) y
el mejor cereal para la producción de semilla fue el trigo.
PALABRAS CLAVE
Shiitake, orellanas, producción de micelio, medios sintéticos, producción de
semilla.IN VITRO MICELIA ISOLATION OF EDIBLE MUSHROOMS, SHIITAKE
(Lentinula edodes) AND OYSTER MUSHROOMS (Pleurotus ostreatus and
Pleurotus pulmonarius) FROM FRUITING BOIDIES, FOR SPAWN
PRODUCTION
ABSTRACT
Macrocymectes have been part of the human culture for thousand years and have
been reported as food in the most important civilizations in history. Many
nutraceutical properties of the macromycetes have been described, for instead,
anticancer, antitumor, hypocholesterolemic, antiviral, antibacterial,
immunomodulatory, among others. They have also described its nutritional
properties, have a high content of protein, nearly equal to or higher than some
vegetables, also have all the amino acids essential to human functions and high
content of vitamins and minerals. Genera Pleurotus (oyster mushrooms) and
Lentinula edodes (shiitake) are among the mushrooms with a higher rate of the
production worldwide. In Colombia, the cultivation of these fungi is very
widespread, and research and sources of information to carry out this type of crop
as well. Various methodologies were developed to produce mycelia from fruiting
bodies for the spawn production. Several synthetic media and cereal seeds were
evaluated to define the best media to mycelia and spawn production. The best
media was PDA (Potato dextrose, agar) and the best grain for spawn production
was wheat.
KEY WORDS
Shiitake, oyster mushroom, mycelia production, synthetic media, spawn
production,CONTENIDO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................ 9
LISTA DE TABLAS ................................................................................................ 11
LISTA DE ANEXOS ............................................................................................... 12
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 14
2. MARCO TEÓRICO .......................................................................................... 16
2.1 REINO FUNGI (HONGOS) ........................................................................... 20
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ............................................................. 34
4. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 36
5. OBJETIVOS .................................................................................................... 38
5.1 OBJETIVO GENERAL.................................................................................. 38
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 38
6. METODOLOGÍA Y DISEÑO EXPERIMENTAL ............................................... 39
6.1 DISEÑO EXPERIMENTAL ........................................................................... 40
7. RESULTADOS ................................................................................................... 42
7.1 EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LAS METODOLOGÍAS ............................ 42
7.2 DESCRIPCIÓN DE LAS METODLOGÍAS EMPLEADAS PARA EL
AISLAMIENTO DEL MICELIO ............................................................................ 43
7.3 EVALUACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS SINTÉTICOS PARA EL
AISLAMIENTO Y PRODUCCIÓN DE MICELIO ................................................. 50
7.4 DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE Lentinula
edodes, Pleurotus ostreatus Y Pleurotus pulmonarius EN LOS DIFERENTES
MEDIOS DE CULTIVOS .................................................................................... 527.5 EVALUACIÓN DE LOS GRANOS DE CEREAL PARA LA PRODUCCIÓN
DE SEMILLA ...................................................................................................... 57
8. DISCUSIÓN DE RESULTADOS ........................................................................ 61
9. CONCLUSIONES .............................................................................................. 68
10. RECOMENDACIONES .................................................................................... 69
11. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................ 70
12. CIBERGRAFÍA ................................................................................................. 76
ANEXOS ................................................................................................................ 77LISTA DE FIGURAS
pag.
Figura 1. Carpóforo típico de un macromiceto (Basidiomycete). 21
Amanita muscaria
Figura 2. Ciclo de vida de los Basidiomycete 22
Figura 3. Pleurotus ostreatus en tubulares de aserrín 24
Figura 4. Pleurotus pulmonarius en tubulares de aserrín 25
Figura 5. Estructura química de las estatinas derivadas de productos 26
fúngicos.
Figura 6. Fragmento de la estructura química del manogalactano 27
aislado de P. pulmonarius
Figura 7. Estructura química del β-Glucano con actividad 28
antinociceptica asilado de P. pulmonarius
Figura 8. Estructura química de la pleuromutilina 29
Figura 9. Carpóforos de Lentinula edodes 29
Figura 10. Estructura repetida del lentinan 31
Figura 11. Estructura de la eritadenina 31
Figura 12. Estructura del ergosterol 32
Figura 13. Crecimiento del micelio de los trozos de carpóforos de 44
Pleurotus ostreatus desinfectados
Figura 14. Diagrama general de la metodología de aislamiento de 45
micelio a partir de carpóforo con desinfección
Figura 15. Cámara húmeda para el aislamiento del micelio a partir del 46carpóforo
Figura 16. Presencia de micelio en el carpóforo después de la 46
incubación en cámara húmeda
Figura 17. Germinación de las esporas sembradas en fondo después 47
de 12 días
Figura 18. Diagrama de la metodología de aislamiento de micelio a 49
partir de esporas atrapadas en papel
Figura 19. Crecimiento de Lentinula edodes en los medios PDA, OGY 51
y Sabouraud a los 4 días
Figura 20. Crecimiento de Pleurotus pulmonarius en los medios PDA, 51
OGY y Sabouraud a los 4 días
Figura 21. Crecimiento de Pleurotus ostreatus en los medios PDA, 52
OGY y Sabouraud a los 4 días
Figura 22. Crecimiento Lentinula edodes según los medios de cultivo 53
evaluados
Figura 23. Crecimiento Pleurotus pulmonarius según los medios de 53
cultivo evaluados
Figura 24. Crecimiento de Pleurotus ostreatus según los medios de 54
cultivo evaluados
Figura 25. Frasco de granos de maíz amarillo recién inoculado con el 58
hongo
Figura 26. Crecimiento de Pleurotus pulmonarius en trigo 59
Figura 27. Crecimiento de Pleurotus pulmonarius en millo 59
Figura 28. Crecimiento típico de Lentinula edodes sobre placa de PDA 63
Figura 29. Crecimiento típico de Pleurotus pulmonarius sobre placa de 64
PDA
Figura 30. Crecimiento típico de Pleurotus ostreatus sobre placa de 64
PDALISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1. Contenido de proteína cruda, carbohidratos, grasa y fibra en 17
Pleurotus spp y Lentinula edodes. (Valores en peso seco)
Tabla 2. Contenido de vitaminas y minerales en Pleurotus spp y 18
Lentinula edodes (mg/Kg)
Tabla 3. Propiedades medicinales para Lentinula edodes, Pleurotus 19
ostreatus y Pleurotus pulmonarius
Tabla 4. Principales compuestos medicinales del Shiitake (Lentinula 30
edodes)
Tabla 5. Promedio del crecimiento (mm) de Pleurotus ostreatus, 50
Pleurotus pulmonarius y Lentinula edodes en diferentes
tipos de medio de cultivo
Tabla 6. Ecuaciones de crecimiento obtenidas del tratamiento 56
matemático de los datos arrojados por la experimentación
Tabla 7. Rata de crecimiento específico (μ, día-1) para cada una de 57
los medios de cultivo y cada uno de los hongos evaluados
Tabla 8. Evaluación del crecimiento micelial en granos de cereal 60LISTA DE ANEXOS
pag.
Anexo 1. Crecimiento de Lentinula edodes, Pleurotus pulmonarius y 78
Pleurotus ostreatus (3) en placas de pda, ogy y sabouraud
a 10 días de incubación
Anexo 2. Tabla de ANOVA obtenida con los datos experimentales 80
del crecimiento de los tres hongos en los tres tipo de agar
Anexo 3. Rata de crecimiento máxima específica (μ ) para cada 81
m
hongo, cada medio de cultivo y cada día de
experimentación
Anexo 4. Graficas de crecimiento teóricas ajustadas a las 84
ecuaciones 2 y 3 para los tres hongos y los tres medios de
cultivo1. INTRODUCCIÓN
El reino Fungi comprende un inmenso grupo de organismos muy versátiles, con
diferentes morfologías, fisiologías, ciclos de vida, entre otros. Los macromicetos
han sido parte de la cultura humana desde hace miles de años y han sido
reportados como alimento humano en las más importantes civilizaciones de la
historia. Desde la década de los 70s se han incrementado las investigaciones
científicas en este tipo de organismos debido al legado cultural que se tienen de
ellos, en especial en el lejano oriente, de sus propiedades medicinales. Debido a
esto, se han descrito muchísimas propiedades nutricéuticas de los macrohongos
(macromicetos), como lo son sus propiedades anticancerígenas y antitumorales,
hipocolesterolémicas, antivirales, antibacterianas, inmunomoduladoras, entre
otras. Igualmente, han sido descritas sus propiedades nutricionales, tienen un
elevado contenido de proteína (casi igual o superior al de algunas legumbres) lo
que los hace un gran sustituto de la carne cuando la dieta no incluye mucha
proteína animal, además, poseen todos los aminoácidos esenciales para las
funciones humanas, así como un alto contenido de vitaminas y minerales.
Adicionalmente, este tipo de hongos son apetecidos por su exquisito sabor y son
usados en diferentes platos tipo gourmet. Los géneros Pleurotus y Lentinula se
encuentran entre los primeros en producción mundial, los principales productores
de estos hongos se encuentran en el lejano oriente y Estados Unidos, en
Latinoamérica, Chile es el mayor productor de setas mientras que Colombia ocupa
el tercer lugar, después de la Argentina.
En Colombia, el cultivo de este tipo de hongos está destinado a estratos
socioeconómicos altos, debido a que la oferta en el país es muy baja y sus precios
son muy elevados. Los agricultores colombianos no poseen las herramientas
básicas para producirlos debido a que las fuentes de información acerca de este
tipo de cultivos son en idiomas diferentes al castellano y además, la investigación
en el país sobre este tipo de organismos es prácticamente nula. Uno de los
mayores problemas que tienen los productores de este tipo de hongos es su
procedencia asiática y por consiguiente se debe importar la cepa para producirla;
lo que acarrea costos elevados y por consiguiente, el costo de producción se
aumenta, llevando también ese costo a los consumidores.
14El uso de cepas no foráneas, es decir, cepas aclimatadas a nuestras condiciones,
hace que los productores tengan una ventaja, la producción de las setas se da en
un menor tiempo que si se usa una cepa recién traída del exterior. El tener la
capacidad de reproducir este tipo de organismos por los cultivadores colombianos
y en ambientes autóctonos hace que la rentabilidad del negocio sea mucho mayor
y que muchos más cultivos se instalen a lo largo del país; lo que acarrearía con
muchos más puestos de trabajo y mejorarían las capacidades socioeconómicas de
un tipo de población muy especial en el país, la población desplazada, que es uno
de los tipos de población objetivo para que desarrollen este tipo de cultivos.
El objetivo principal de esta investigación fue el desarrollo in vitro de metodologías
fáciles de desarrollar y reproducir por los cultivadores colombianos para que
puedan producir su propio micelio a partir de su propia producción y así, producir
la semilla para el inicio de este tipo de cultivos. Llevando a un gran impulso en la
producción de este tipo de macromicetos lo que generaría muchas más fuentes de
empleo, mayores ingresos de los productores y por consiguiente una mayor oferta
al consumidor, que se beneficiaría de un menor precio por un producto que
además de nutrirle, le llevaría grandes beneficios en su salud.
152. MARCO TEÓRICO
Las setas han sido parte de la dieta humana desde tiempos inmemoriales, siendo
usados como alimentos, aún antes de que el hombre entendiera el manejo de
otros organismos. Para los antiguos romanos estos eran “la comida de los dioses”,
resultado de los rayos que chocaban contra la tierra empleados por Júpiter
durante las tormentas; los egipcios los consideraban “un regalo del dios Osiris”,
mientras que los chinos los veían como “el elixir de la vida” (Smith et al. 2002).
A través de la historia muchas culturas han construido su conocimiento práctico
sobre cuales hongos eran convenientes para ser consumidos y cuáles eran
venenosos. Muchas culturas, en especial en el oriente, identificaron que ciertas
setas podrían tener profundos beneficios y ser promotores de la salud.
Son considerados tanto una solución para la desnutrición como una cura para el
cáncer y otras enfermedades (MushWorld. 2004). Algunas investigaciones
científicas han concluido que hay aproximadamente 10000 especies que poseen
una estructura y tamaño suficiente para ser consideradas como posible fuente de
alimento. Sin embargo, esto no quiere decir que estas 10000 especies sean
perfectamente digeribles por el cuerpo humano. Se calcula que aproximadamente
1000 de estas especies son venenosas y que el 5% de ellas son consideradas
mortales. Dentro de las 9000 restantes, no todas son consumibles directamente;
algunas sólo son útiles para el ser humano de manera indirecta, requieren de
algún tipo de descomposición química o de tratamiento. Es así como las setas
pueden ser medicinales, alimenticias, alucinógenas y venenosas (Arias et al.
2008).
El cultivo de hongos comestibles se ha convertido en una práctica alrededor del
mundo por la habilidad de crecer en un amplio rango de temperaturas utilizando
varios sustratos. Así mismo, el interés de los consumidores por adquirir productos
libres de fertilizantes, conservantes y otros productos químicos, así como con una
alta proporción de proteínas y otros nutrientes, convierten a estos hongos en un
alimento apetecido y con una creciente demanda.
16Las proteínas constituyen uno de los nutrientes más importantes en la
alimentación y es fundamental para construir los tejidos del cuerpo. Los hongos
con un contenido de proteína que va de 3 – 7% (frescos) a 25 – 40% (secos)
juegan un papel preponderante en el enriquecimiento de la dieta humana cuando
el suministro de proteína cárnica es limitado. El contenido de proteína es casi igual
al del maíz, la leche y las legumbres, aunque es más baja que la de la carne,
pescados y huevos. Como fuente de proteína en la dieta, los hongos son
superiores a la mayoría de las frutas y verduras con la excepción de los fríjoles y
guisantes. Los hongos pueden comerse frescos o cocinados, a diferencia de otras
fuentes de proteína como la soya y la levadura que deben ser procesadas o
enmascaradas de alguna manera para que sean aceptables al paladar.
Tabla 1. Contenido de proteína cruda, carbohidratos, grasa y fibra en Pleurotus spp y
Lentinula edodes. (Valores en peso seco)
Seta Proteína Carbohidratos Grasa Fibra Valor energético
(Kcal/100 g)
% % % %
Lentinula 13,4 – 17,5 66,5 – 78,0 4,9 – 8,0 7,3 – 8,0 387 – 392
edodes
Pleurotus 10,5 – 30,4 57,6 -81,8 1,6 – 2,2 7,5 – 8,7 345 – 367
spp.
Fuente: Arias, et al. 2008.
Las setas también contienen todos los aminoácidos esenciales así como las
amidas y los aminoácidos no esenciales más comunes; la lisina, cuyo contenido
es bajo en la mayoría de los cereales, es el aminoácido más importante en estos
organismos, por lo cual la proteína micótica se convierte en un importante aporte a
la dieta humana.
Los hongos tienen altos contenidos de vitaminas que incluyen cantidades
significativas de vitamina C, aunque desprovistos de vitamina A; los hongos son
ricos en riboflavina, tiamina y cianocobalamina (Vit B ), ésta última sólo se
12
encuentra normalmente en productos animales; su contenido de niacina es casi
equivalente a los niveles encontrados en la carne de cerdo, que se considera la
fuente más rica de esta vitamina. También contienen un alto porcentaje de
17minerales como el calcio, potasio, sodio y fósforo, además del ácido fólico, un
ingrediente que enriquece el torrente sanguíneo y previene deficiencias como la
anemia. El hierro también está presente en los hongos en una cantidad apreciable
y junto con el fósforo, puede proporcionar una buena cantidad de las necesidades
dietéticas diarias recomendadas. Los hongos son bajos en sodio, haciéndolos
ideales para personas con ciertos tipos de dolencias del corazón y del riñón
(MushWorld. 2004).
Tabla 2. Contenido de vitaminas y minerales en Pleurotus spp y Lentinula edodes (mg/Kg)
Seta Tiamina Niacina Riboflavina Ca P K Fe Na
Lentinula 7,8 54,9 4,9 98 476 Nd 8,5 8,5
edodes
Pleurotus spp 4,8 108,7 4,7 33 1348 3793 15,2 8,3
Fuente: Arias, Gutiérrez, Ospina. 2008.
Adicionalmente a su valor nutricional, muchos macromicetos comestibles se han
usado en el oriente para propósitos medicinales. Las costumbres culturales han
suministrado pistas sobre las potenciales fuentes medicinales de los hongos.
Muchas especies no comestibles, también han ganado un importante uso médico.
En el presente, al menos a 270 especies conocidas de setas se les han atribuido
propiedades terapéuticas (Tabla 3).
Los hongos medicinales se han convertido en ingredientes cada vez más comunes
en el tratamiento de varias enfermedades y problemas de salud, debido a la
habilidad de producir metabolitos secundarios con propiedades terapéuticas.
Usando aproximaciones modernas, los científicos han aislado e identificado
componentes específicos, que pueden destruir o por lo menos debilitar tres de las
enfermedades asesinas de la humanidad: el cáncer, las enfermedades del
corazón y el SIDA (Mattila, Suonpää. 2000); además, las setas también ofrecen
otras propiedades terapéuticas potenciales incluyendo las antioxidante, anti
hipertensa, hipocolesterolémica, protección hepática, anti fibrótica, anti
inflamatoria, anti diabética, anti viral y anti microbiana. Como resultado, desde los
años setenta se ha publicado un gran bagaje de literatura científica acerca de los
hongos, principalmente proveniente de hospitales e instituciones de investigación
en Europa, Japón, China y Estados Unidos; influenciando las compañías
18farmacéuticas del lejano oriente que están viendo en los hongos una rica fuente de
moléculas biomédicas innovadoras (hongos medicinales).
Tabla 3. Propiedades medicinales para Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus y Pleurotus
pulmonarius
aimedipilrepiH
aeníugnas
seralucsavoidrac
ocitísarapitnA
nóiserp
,aimeloretselocrepiH
lauxeS
)HIV-itna( rodaludomonumnI senoñir acinórc
oirotamalfniitnA al rotcetorpotapeH osoivreN
y
ocignúfitnA laromutitnA lairetcabitnA ed senedroseD ocitébaiditnA rodaicnetoP
rodalugeR ed sitiuqnorB
larivitnA
ocinóT ocinóT
Lentinula
X X X X X X X X X X X
edodes
Pleurotus
+ + + + +
ostreatus
Pleurotus
+ + +
pulmonarius
X: producto comercialmente desarrollado (medicamento o suplemento dietario=
+: no se ha desarrollado un producto comercial
Fuente: Wasser, 1999
192.1 REINO FUNGI (HONGOS)
Los hongos son descritos como organismos unicelulares o pluricelulares,
eucarióticos, productores de esporas, que carecen de clorofila, heterótrofos, que
se reproducen tanto sexual como asexualmente y que usualmente son
filamentosos, ramificados con estructuras somáticas llamadas hifas y típicamente
rodeados de paredes celulares. En el reino Fungi (hongos) se incluyen los phylum
Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota y Basidiomycota. Otros phylum
adicionales son los Myxomycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota,
Plasmophoromycota, Oomycota, Labyrinthulomycota y Hyphochytromycota.
Incluido en este reino se encuentran los champiñones, u hongos con forma de
concha (setas), mildeos polvosos, mohos del pan, levaduras, morillas y trufas, por
nombrar algunos (Alexopoulos. 1996).
2.1.1 Macromicetos. Son denominados de esta manera los hongos cuyos
carpóforos o cuerpos fructíferos pueden ser vistos a simple vista, comúnmente se
dice que son organismos macroscópicos, sin embargo, esta afirmación es falsa ya
que es solamente el carpóforo el que puede ser visto a simple vista.
Los hongos macromicetos están formados por hifas ramificadas que se reúnen en
cordones y cuerpos de reproducción visibles. Son saprófitos ya que crecen en
materia descompuesta absorbiendo materia orgánica, en simbiosis con plantas,
formando ectomicorrizas o como parásitos sobre los árboles (Pedreros. 2007).
2.1.1.1 Ascomycetes. Pueden ser unicelulares o estar formados por un micelio de
paredes quitinosas, con septos transversales incompletos (presentando un poro
central). Las hifas pueden ser uni o multinucleadas, homocarióticas o dicarióticas
ramificadas. La principal característica de estos hongos es que como producto de
su reproducción sexual se forman unos sacos o bolsas llamados ascos los cuales,
contienen en su interior a las esporas de origen sexual (ascosporas). Los cuerpos
productores de ascos se denominan ascocarpos.
En la gran mayoría de las especies se forman cuerpos fructíferos macroscópicos o
microscópicos que contienen uno o muchos ascocarpos, sin embargo algunas
20especies no forman cuerpos fructíferos ni ascocarpos y los ascos quedan al
descubierto y son diseminados en el micelio (Saldarriaga. 2001).
2.1.1.2 Basidiomycetes. Las esporas que dan nombre al grupo son las
basidiosporas, producidas exógenamente en órganos especiales, los basidios. En
los Basidiomycetes superiores se producen cuatro basidiosporas típicamente y los
basidios se encuentran en laminillas (lamelas) de los basidiocarpos carnosos. Los
Basidiomycetes inferiores tienen un ciclo vital más complicado y su lugar en la
clasificación no es muy seguro. Un buen grupo de especies de Agaricales (hongos
con laminillas) pueden desarrollarse en cultivos artificiales (Stamets. 2000).
Figura 1. Carpóforo típico de un macromiceto (Basidiomycete). Amanita muscaria
Fuente: Universidad de León. España. Consultado Enero 23 de 2010 en
http://www3.unileon.es/personal/wwdbvmgg/practicasconsusfotos/practica5sola/fotospractica5sola/
hongos/amanitamuscariapielaminasbordesombrero.jpg
Una actividad muy importante de los basidiomicetos es la descomposición de la
madera, papel y otros derivados de productos naturales. Estos hongos, por lo
tanto son capaces de producir celulasas y enzimas capaces de catabolizar la
lignina y utilizarla como fuente de carbono y energía. La descomposición de la
lignina en la naturaleza es difícil y es realizada por un reducido grupo de hongos
basidiomicetos, que producen la llamada podredumbre de la madera. Existen dos
21tipos de podredumbre, la marrón, en la que solamente se degrada la celulosa pero
no la lignina y la blanca, en la que ambos polímeros son degradados
eficientemente (Pedreros. 2007).
2.1.1.3 Ciclo de vida. La forma de reproducción de los hongos es a través de las
esporas, los hongos superiores poseen en el himenio unas células madres que
son las encargadas de producir las esporas, en el caso de los Basidiomycetes,
estas son llamadas basidios.
Las esporas son lanzadas por el himenio al exterior, si se depositan en lugares
húmedos y de condiciones favorables, darán origen al micelio, éste crecerá bajo
tierra o leños dando lugar a una seta con basidios en su himenio y se producirán
las esporas para que sean nuevamente liberadas al exterior y se complete el ciclo
de reproducción.
Figura 2. Ciclo de vida de los Basidiomycetes
Fuente: Recuperado, Enero 23 de 2010 en:
http://www.hiperbiologia.net/fungi/fungiclas.htm#ChytridiomycetesGerm%C3%83%C2%A1n
222.1.1.4 Orden agaricales. Los hongos pertenecientes a este orden, son hongos
que se caracterizan por tener esporas de color café chocolate, presentar anillos
diferentes a partir de un velo parcial y laminillas o agallas libres. Lo integran tanto
especies comestibles, como venenosas. Pueden ser saprófitos, parásitos o
ectomicorrizicos.
2.1.2 Orellanas. Los hongos ostra (como son conocidos en Estados Unidos,
Europa y Asia) u orellanas (como son conocidos en Colombia), forman parte del
grupo de hongos comestibles más populares, pertenecen al phylum
Basidiomycetes, familia Pleurotaceae, orden Agaricales y al género Pleurotus. Al
igual que las orellanas, muchos de los Pleurotus son descomponedores primarios
de árboles de madera dura y se encuentran en todo el mundo. Su carpóforo es
redondeado con la superficie lisa, abombada y convexa cuando es joven,
aplanándose en su proceso de maduración, sus colores pueden variar desde azul
oscuro, hasta crema, blanco, café, gris, amarillo y rosado, sin embargo, el color del
carpóforo puede variar de acuerdo a las condiciones ambientales, puede ser
oscuro en condiciones frías y claro en condiciones de luz y calor. Su tamaño
puede variar de 5 a 30 cm de diámetro. El cuerpo fructífero generalmente es
pequeño cuando crece en troncos y es más grande cuando se cultiva en tubulares
sintéticos con otros substratos. El pie es excéntrico o lateral, sin embargo cuando
llega al sombrero, es central (Chang, Miles. 2004). Las esporas son pequeñas,
ovoides, casi cilíndricas, que en gran número forman masas de polvo de color
blanco con cierta tonalidad violácea (Guarín, Ramírez. 2004).
Para su crecimiento micelial, las mejores fuentes de carbono son el almidón,
glucosa, fructosa, maltosa, manosa, sucrosa, pectina y, celulosa. Las fuentes de
nitrógeno utilizadas por el microorganismo son la peptona, licor de maíz, polvo de
torta de soya, polvo de levadura, sulfato de amonio, aspargina, serina, alanina y
glicina. Las temperaturas óptimas de crecimiento del micelio son cercanas a 25°C
a 28°C y el rango de pH es alrededor de 5,5 a 6,5. La tolerancia al CO es baja,
2
concentraciones mayores a 30% hacen que el crecimiento decaiga (Chang, Miles.
2004).
P. ostreatus, es un hongo destructor de la madera, está extendido en las zonas
templadas y forma cuerpos fructíferos a temperaturas relativamente frescas
comparados con otras especies de Pleurotus. Su carpóforo es grisáceo–marrón en
estadios jóvenes, obteniendo un color crema–blanco en su maduración. En los
basidios, se encuentran cuatro esporas para su reproducción.
23Esta es la especie más frecuentemente cultivada dentro del género; una de las
características de esta especie es que requiere un tratamiento de temperatura
llamado “choque frío” para comenzar la formación de primordios (MushWorld.
2004).
Figura 3. Pleurotus ostreatus en tubulares de aserrín.
Fuente: La autora, 2010
Pleurotus pulmonarius crece de forma salvaje en regiones subtropicales y
tropicales en la India. Es compatible con P. sapidus, pero son diferentes en
apariencia. Su sombrero es marrón cuando está maduro. Se ha reportado que sus
basidios albergan cinco esporas en vez de cuatro, como en las demás especies
(Chang, Miles. 2004). Es un hongo apropiado para el cultivo en áreas
subtropicales y tropicales porque su rango de temperatura óptima para el
desarrollo de cuerpos fructíferos es relativamente alto (MushWorld. 2004).
24Figura 4. Pleurotus pulmonarius en tubulares de aserrín.
Fuente: La autora, 2010
2.1.2.1 Propiedades medicinales de las setas del género Pleurotus. Los
efectos benéficos de Pleurotus sp se descubrieron independientemente en
diferentes continentes. La conciencia de sus propiedades medicinales viene no
sólo de Asia sino también de las tradiciones de Europa Central, Sur América y
África. Existen un número de estudios que sugieren un rol importante de éste
hongo en la cura de numerosas enfermedades además actividad anti cáncer,
efectos inmunomoduladores y anti virales. Sin embargo su principal beneficio se
observa en la producción de mevinolina (lovastatina) y sus análogos. Las especies
del género son excelentes productoras de lovastatina, al punto que pueden ser
consideradas como alimentos funcionales.
Estatinas: los inhibidores de la 3-hidroxi-3-metil glutaril conenzima A (HMG-CoA)
redutasa, son comúnmente llamados estatinas (figura 5), son una nueva clase de
droga ampliamente usada para el tratamiento de hipercolesterolemia en pacientes
con enfermedad cardiovascular establecida y también en aquellos pacientes con
un alto riesgo de desarrollar arterioesclerosis (Nirogi et al. 2007). La mevinolina
(lovastatina) es producida por muchas especies del género. P. ostreatus produce
la mayor cantidad de lovastatina en su cuerpo fructífero, especialmente en las
25lamelas. Se ha sugerido que las setas del género puedan ser recomendadas como
disminuidores de colesterol naturales dentro de la dieta humana.
Figura 5. Estructura química de las estatinas derivadas de productos fúngicos.
Fuente: Nirogi et al. 2007
β-D-Glucanos: la producción de glucanos en macromicetos es común, son
hidratos de carbono por lo general, constituyen la pared del hongo, junto con la
quitina y proteínas. Son importantes debido a su potente acción antitumoral,
dentro de los cuales varios glucanos lineales ((1,3)-β-glucanos) y ramificados son
ampliamente conocidos, ya que a nivel genético presentan una poderosa
inhibición de mutaciones, lo que permiten su potencial uso en tratamiento contra
leucocitopenias (Nieto, 2010). Dentro de éstos se encuentra el Pleuran, que posee
una actividad antibacteriana (Karácsonyi et al. 1994) y es producido por P.
ostreatus; un 3-O-mananogalactano (figura 6) con efecto antinociceptivo
(analgésico) producido por P. pulmonarius (Smiderle et al. 2008); otro β-Glucano
(figura 7) aislado de P. pulmonarius con propiedades antiinflamatorias y
analgésicas (Smiderle et al. 2008). Se han reportado otras actividades biológicas
de glucanos aislados del género como lo son la anti bacteriana y antifúngica
(Hearst et al. 2009), inmunoestimulantes (Sun et al. 2009), inhiben la rinitis y las
molestias nasales (Yatsuzuka et al. 2007) y como prebióticos (Synytsya et al.
2009).
26Figura 6. Fragmento de la estructura química del manogalactano aislado de P. pulmonarius
Fuente: Smiderle et al. 2008
Figura 7. Estructura química del β-Glucano con actividad antinociceptica asilado de P.
pulmonarius
Fuente: Smiderle et al. 2008
Pleurostrina: es un péptido de 7kDa, con actividad inhibitoria en el crecimiento
micelial de ciertos micromicetos, entre ellos Fusarium oxysporum, Mycosphaerella
arachidicola y Physalospora piricola.
Pleuromutilina: es un diterpeno (figura 8), tiene actividad antibiótica contra las
infecciones micoplasmáticas y que sirvió para el desarrollo del primer
medicamento de este tipo comercial de origen de un basidiomiceto.
27Figura 8. Estructura química de la pleuromutilina
Fuente: Nieto, 2010
2.1.3 Shiitake. Lentunula edodes, Lentinus edodes, Shiang-gu u hongo fragante
como son conocidos en Asia, su continente de origen, constituyen un alimento
tradicional, exquisito y altamente valorado en las mesas de ese continente. Pero
no solamente son deliciosos, nutritivos, con gran sabor y un aroma seductor, sino
que también contienen un componente conocido por sus beneficios medicinales.
Figura 9. Carpóforos de Lentinula edodes
Fuente: La autora. 2010
Su sombrero cambia de rojizo oscuro a café, su tamaño varía de 5 a 25 cm de
diámetro, semiesférico, convexo y con la edad se vuelve plano. La forma del
28hongo puede ser a veces irregular. Otra característica particular, son las manchas
blancas formadas en la cutícula pero que con el tiempo se pueden oscurecer a
medida que el hongo se va deteriorando; su pie es centrado cuando está unido al
sombrero, corto y con remanentes del velo. Sus esporas blancas en masa,
tetrapolares, formando cuatro esporas en el basidio (Stamets. 1983. Guarín et al.
2004).
Para la producción de micelio se usa aserrín grueso, salvado de arroz y carbonato
de calcio (CaCO ). Hay algunos suplementos que ayudan al crecimiento del
3
micelio, polvo de levadura, harina de soya, leche en polvo y molasas. El
crecimiento más rápido se tiene con una humedad entre 50 – 60%, tiene una baja
resistencia al CO (menor de 1000 mg/Kg) y un pH óptimo entre 5 y 6 (Stamets.
2
1983).
El shiitake crece principalmente, en climas templados como organismos
individuales o en racimos sobre maderas duras en descomposición o muertas. En
la naturaleza, los shiitake son hongos saprofíticos de la pudrición blanca, que
degradan sustratos leñosos que contienen componentes de lignina recalcitrantes,
difíciles de descomponer. Debido a esta capacidad actualmente se utilizan leños y
aserrín como sustratos para cultivarlo (MushWorld. 2005).
2.1.3.1 Propiedades medicinales del shiitake. El shiitake es uno de los hongos
usados en medicina mejor conocidos y caracterizados. Es una fuente de
preparaciones muy estudiadas y documentadas con propiedades farmacéuticas
comprobadas (tabla 3), en la medicina oriental ha sido usado para un amplio
rango de problemas de salud y sus propiedades curativas han sido probadas por
la medicina tradicional. Los estudios se han enfocado especialmente en el
polisacárido llamado lentinan, el micelio del hongo (LEM) y los extractos de
medios de cultivos líquidos (LAP y KS-2) (Wasser, S.P. 2005). En la tabla 4 se
muestran los principales compuestos medicinales de Lentinula edodes.
Se consiguen en el mercado preparaciones en forma de tabletas, cápsulas o
elixires que son ampliamente comercializados en países orientales y cuyo
consumo se ha incrementado en USA y Europa en mercados de alimentos o
medicinas orgánicas (Wasser, S.P. 2005)
29Tabla 4. Principales compuestos medicinales del Shiitake (Lentinula edodes)
Compuesto Activo Tipo de Compuesto Propiedad
Eritadenina Derivado de adenosina Hipolipidémico
C-1-2 Polisacárido Inmunoactivo
Lectina Proteína Inmunoactivo
Lentinan Polisacárido Inmunoactivo, anticancerígeno,
antiviral, antibacterial
Emitanina Polisacárido Inmunoactivo
EP3 Lignina Antiviral, inmunoactivo
KS-2, KS-2-B Péptido Antiviral, inmunoactivo, antibacterial
------ Poliribonucleótidos Inmunoactivos
Ac2p Polisacárido Antiviral
FBP Proteína Antiviral
Tioprolina (TCA) Aminoácidos Eliminador de nitritos
Ergosterol Esterol Anticancerígeno
Fuente: Rendón et al. 2004
Lentinan: es un polisacárido (27,5kDa) β-1,3 glucano con ramificaciones de
glucopiranósidos β-1,6 y β-1,3 y de estructura triple hélice (figura 10). Es soluble
en agua producido en la pared celular del hongo, puede ser extraído del micelio y
el carpóforo. En Japón, es una medicina anti cancerígena aceptada (Chang et al.
2004), que estimula la secresión de citocinas por células T y que incrementa la
generación de linfocitos T citotóxicos y células NK en presencia de interleuquina 2.
Además, se conoce que inhibe el crecimiento de las especies Physalospora
priricola, Botrytis cinérea y Mycosphaerella arachidicola, la actividad de la HIV-1
transcriptasa reversa (enzima que utiliza el virus de la inmunodeficiencia humana)
y la proliferación de células de leucemia. Algunos autores han demostrado que
normaliza parcialmente la caquexia inducida por factor de necrosis tumoral (TNF-
α), que inhibe la infección (in vitro) célula a célula de los virus VIH 1 y VIH 2 y que
aumenta la resistencia del organismo a infecciones bacterianas, fúngicas, virales y
parasitarias (Rendón et al. 2004).
30Figura 10. Estructura repetida del lentinan
Fuente: Zhang et al. 2010
Eritadenina: es un derivado acíclico de adenosina y un hipolipidémico que
disminuye la tasa de colesterol, fosfolípidos y moléculas derivadas del fofatil colina
en el plasma sanguíneo entre un 5% a un 10% (Rendón et al. 2004), una
representación está en la figura 11.
Figura 11. Estructura de la eritadenina
Fuente: Sugiyama et al. 1995
31Inductor de interferón γ: es usado en el tratamiento contra el cáncer, como
antiviral y anti inflamatorio. Se han obtenido buenos resultados en el tratamiento
de la hepatitis B y C y el SIDA (Rendón et al. 2004).
Ergosterol: es un precursor de la vitamina D, necesario para la absorción de
calcio y potasio y eficaz en el tratamiento de cáncer de colon (figura 12).
Figura 12. Estructura del ergosterol
Fuente: Nieto, 2010
Ácido linoléico: es un precursor de la prostanglandina, eficaz en el tratamiento de
problemas de erección masculina.
Quitina: Disminuye las concentraciones de colesterol en el plasma sanguíneo.
Equipo enzimático: se encuentra la súper-óxido dismutasa, que disminuye la
peroxidación de lípidos (tratamiento anticancerígeno); la asparginasa, eficaz en el
tratamiento de la leucemia infantil; la manganeso peroxidasa y la lacasa
peroxidasa. Otras enzimas como las fenol oxidasas, celulasas y xilanasaas.
Otros constituyentes: también se encuentran el LC11, un β-1-6-D-glucano con
ramificaciones en la posición 1-4; peptidomanano KS2, monoglicéridos y ácidos
32libres, fosfolípidos como el fosfatidil etanolamina y la cardiolipina y cerebrósidos,
éstos últimos constituyentes de las neuronas, espermatozoides, leucocitos y
hematíes y de gran ayuda en la lucha contra el mal de Fabry (Rendón et al.
2004).
333. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El cultivo de hongos en América inició en México central en 1933, por medio de
una tecnología simple, seguido por Argentina (1941), Colombia (1950), Brasil
(1951), Chile (1959), Guatemala (1960), Perú (1967), Venezuela (1968), Costa
Rica (1969) y Bolivia (1989) (Torres. 2003).
En nuestro país, el mismo impulsor del cultivo de champiñón en Bogotá, el señor
Alfredo Beck, introdujo el cultivo de Shiitake, principalmente en forma vegetativa,
sobre grano de cereal esterilizado, con el propósito de producir micofarina.
Posteriormente, se introdujeron al país cepas de Pleurotus ostreatus y otras
especies que en la actualidad se están intentando comercializar de manera lenta
(Beltrán et al. 2006); sin embargo, el cultivo de estos hongos podría ser más fácil
que el de otras especies, ya que para el cultivo de éstas no se necesita hacer un
compostaje previo, y se puede utilizar una gran variedad de sustratos que pueden
ser desechos de otras industrias o desechos agrícolas para hacer los bloques
sintéticos.
Al ser cultivos que apenas están incursionando en el país, no existe tecnología, ni
conocimiento disponible para los posibles cultivadores, además, la bibliografía
disponible se encuentra en el idioma inglés, lenguaje que los agricultores y la
mayoría de la población colombiana desconoce. Sólo se conoce de un par de
trabajos realizados por instituciones reconocidas a nivel nacional, el de
Saldarriaga (Universidad de Antioquia, 2001) que trata sobre la producción de
hongos comestibles, en el aspecto de aislamiento de esporas y producción de
Pleurotus ostreatus sobre pulpa de café y el del propio CENICAFÉ (Centro
Nacional de Investigaciones del Café) sobre el aprovechamiento de residuos de la
industria cafetera para la producción de setas del género Pleurotus (MushWorld.
2004). Sin embargo, ninguna de estas instituciones ha estudiado con detenimiento
distintas metodologías claras y sencillas para el aislamiento de micelio a partir de
los carpóforos, ni tampoco han estudiado a Lentinula edodes (shiitake). El resto de
los trabajos realizados en el país, tratan diferentes temas y metodologías
diferentes a la de producción tradicional de setas comestibles, como lo son
34fermentaciones líquidas para el aislamiento o mayor producción de metabolitos
secundarios de hongos, realizadas en la Universidad de Antioquia y en la
Universidad Nacional de Colombia, sede Bogotá; reconocimiento de cepas
autóctonas, por parte de la Universidad Tecnológica del Choco, entre otras.
Otro de los problemas para la producción de este tipo de hongos es que son
cepas foráneas, traídas del Asia, por lo cual la semilla es costosa y de difícil
adquisición. Con esto, los costos de producción se incrementan convirtiéndolos en
productos inviables para la economía de quienes desean incursionar en este
mercado y hace que la creación de este tipo de empresas sea muy reducido, por
no decir nulo; además, este tipo de empresas ayudan a la generación de empleo y
pueden generar proyectos productivos para tipos de población de bajos recursos y
con exclusión social (Arias et al. 2008).
Al aumentar el número de este tipo de empresas, el consumo per capita de este
tipo de alimentos se incrementaría; en la actualidad el consumo de setas alcanza
los 120 gramos por año en nuestro país (La República. 2010), un promedio muy
por debajo de países como Japón (4, 84 Kg por año) y la Unión Europea (3,16 Kg
por año) (Díaz et al. 2001).
La disponibilidad del producto y un precio más accesible, harían que los hongos
comestibles como las orellanas y el shiitake, fueran productos reemplazantes de
alimentos de primera necesidad como algunas legumbres y la carne de res, que
en la actualidad tienen precios bastante elevados; así mismo, son una buena
fuente de proteína a bajo costo, la cual puede mejorar la ingesta en la población
vulnerable de nuestro país con bajos ingresos; además de hacer aportes para la
salud con el suministro de vitaminas, minerales y diferentes compuestos que
inducen una mejora en la respuesta inmune (Mattila, Suonpää. 2000).
354. JUSTIFICACIÓN
El consumo de alimentos bajos en proteínas y otros componentes nutricionales
como vitaminas, minerales, calcio, sodio y demás por parte de la población
colombiana ha venido decreciendo con el tiempo debido a los costos elevados de
los productos con éste tipo de componentes nutricionales. La ingesta de hongos
no es una práctica común y extensiva de nuestro país, se da solamente en tipos
de población de clase alta que tienen un poder adquisitivo mayor; además es muy
poco el conocimiento que tiene la población en general sobre los beneficios del
consumo de hongos, se cree que simplemente sirven como aderezo de comidas
en general, gracias a su delicioso sabor característico.
Con este proyecto, se busca desarrollar tecnología para que la producción de este
tipo de alimentos sea accesible a cualquier público y poder llegar a suministrar una
proteína de bajo costo al tener semillas para la producción de buena calidad y
viabilidad. Al desarrollar este tipo de cultivos, se genera un impacto en la
generación de empleo y la calidad de vida de muchas personas debido a la
generación de industria, un problema que aqueja a la población colombiana.
Por otro lado, se podría incentivar el cultivo de éste tipo de hongos para usos
medicinales, el beneficio de los hongos no se da solamente por la ingesta directa
de éste, sino que porían ser procesados de maneras diferentes para aislar los
componentes, ya conocidos, que tienen actividades benéficas para la salud. Esto
podría inquietar a compañías farmacéuticas para la compra de los carpóforos y de
esta manera hacer más accesible estos componentes benéficos a la población.
El desarrollo de la técnica permitirá obtener y mantener cepas autóctonas,
medicinales y comestibles, cuyo estudio no ha sido desarrollado ampliamente en
el país. Además se permitirá el estudio de sustratos viables y económicos como lo
son los subproductos de la actividad agrícola en el país, que se han convertido en
un problema ambiental ya que son utilizados para otros propósitos y simplemente
son depositados en lotes valdíos o quemados, lo que produce contaminación; y
finalmente, que con el auge de éste tipo de empresas, Colombia se convierta en
un productor líder y competitivo en Latinoamérica de hongos comestibles, además,
36éstos productos alimenticios son muy bien pagos debido a las exenciones
arancelarias que gozan en la Unión Europea y Estados Unidos (Díaz et al. 2001),
lo que permitiría que las ganancias sean mayores en los productores y
exportadores, lo que repercutiría en la economía y la calidad de vida de la
población del país.
375. OBJETIVOS
5.1 OBJETIVO GENERAL
Desarrollar una técnica in vitro reproducible, manejable, fácil y económica para el
aislamiento del micelio de hongos comestibles, Orellanas (Pleurotus ostreatus y
Pleurotus pulmonarius) y Shiitake (Lentinula edodes), a partir de sus cuerpos
fructíferos para la producción de semilla.
5.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Valorar las técnicas de aislamiento de micelio a partir de los cuerpos fructíferos
Aislar micelio procedente de cuerpos fructíferos de los hongos objeto de estudio
en medios de cultivo comerciales específicos
Evaluar el crecimiento micelial de las diferentes especies de hongos en tres tipos
de medio de cultivo sólido
386. METODOLOGÍA Y DISEÑO EXPERIMENTAL
El proyecto de investigación se basó en un modelo experimental comparativo, que
buscó encontrar la mejor técnica para aislar el hongo a partir de sus carpóforos
(cuerpos fructíferos).
Se desarrolló una revisión bibliográfica para adquirir mayor conocimiento sobre el
cultivo de hongos comestibles, en especial de las especies en estudio y
determinar cuáles técnicas se han desarrollado para el aislamiento, conservación,
producción de micelio, producción de semilla y fructificación de los hongos.
Además se buscaron reportes que indiquen el estado del arte de este tipo de
técnicas, especialmente de laboratorio, en el país.
Los cuerpos fructíferos maduros y no esporulados se obtuvieron de un proveedor
local. Se determinó con este proveedor el estado de maduración, tamaño y fechas
destinadas para el análisis y desarrollo del proyecto, para esto, se hizo un
cronograma de siembras que permitieron la obtención de carpóforos de primera o
segunda oleada (cosecha) ya que hay menos peligro de contaminación y las
cepas no han tenido el tiempo de perder sus propiedades características, como
ocurre cuando los cultivos son muy viejos (Stamets, P. 1983).
Se hicieron evaluaciones preliminares de varias metodologías para la obtención de
micelio a partir de los cuerpos fructíferos utilizando trozos, hifas (con cámaras
húmedas, cámaras secas, nevera) y esporas del hongo, aisladas en agar-agar,
agua y tomadas del carpóforo por siembra por contacto (Scrase. 1995) o papel
(Saldarriaga, 2001). El micelio (en cuadrados de agar de aproximadamente
16mm2) se sembró en la superficie del agar (siembra central); las esporas asiladas
por papel y agua se sembraron en superficie y en fondo, tomando 1cm2 del papel
o 1 mL del agua y realizando diluciones seriadas o esparciendo las esporas en la
superficie del medio. A partir de estos resultados, se eligieron las metodologías
con mejor crecimiento y menor contaminación, para posteriormente, con cultivos
puros, valorar el crecimiento en diferentes medios de cultivo.
39Los medios de cultivo específicos para evaluar el crecimiento del micelio fueron:
PDA (Agar Papa Dextrosa) Oxoid®, OGY (Oxytetraciclina, Extracto de Levadura y
Glucosa) Oxoid® y Sabouraud Difco®. Se tomaron trozos de 4x4 mm de los
cultivos puros y se sembraron en la superficie de cada uno de los agares. Los
medios inoculados fueron incubados a 25°C durante el tiempo que empleó el
hongo en colonizar toda la caja de 9 cm (Villegas et al. 2007), se evaluó el
crecimiento del hongo por su avance radial en la caja, con mediciones cada 48
horas con un calibrador (Mitutoyo®).
Como prueba de confirmación de la viabilidad del micelio que se obtuvo, se
hicieron inoculaciones en diferentes tipos de cereales (maíz amarillo, cebada,
trigo, millo y sorgo) para producir semilla, se evaluó cualitativamente el crecimiento
en el sustrato de acuerdo a la rapidez de invasión de la semilla y la densidad de
micelio producido.
6.1 DISEÑO EXPERIMENTAL
Se llevó un arreglo de 3 x 3, con bloques al azar, con tres tipos de aislamiento y en
tres tipos de medios de cultivo; se hicieron 5 repeticiones por tratamiento (135
muestras analizadas), de manera que se pudieron evaluar las diferencias entre
tratamientos y tipos de aislamiento mediante un análisis de varianza (ANOVA) y
realizando la prueba de Fischer con el fin encontrar diferencias significativas (5%).
Las hipótesis planteadas fueron las siguientes:
Para las formas de aislamiento,
H : No hay diferencias significativas entre las técnicas empleadas para el
0
aislamiento del hongo.
Para los medios de cultivo,
40H : No hay diferencias significativas en el crecimiento del hongo, para los medios
0
de cultivo utilizados.
El análisis de los datos se llevó a cabo empleando el software el SPSS 17® para
Windows ®.
417. RESULTADOS
7.1 EVALUACIÓN PRELIMINAR DE LAS METODOLOGÍAS
Como se detalló en el Marco Teórico, los carpóforos son una parte muy importante
para la reproducción de los hongos, para un aislamiento in vitro, se busca aislar el
micelio a partir de las mismas hifas del carpóforo o las esporas producidas
producto de la reproducción sexual del macromiceto; por esto, se evaluaron varias
metodologías para el aislamiento del micelio a partir de los cuerpos fructíferos
para determinar cuál o cuáles de ellas cumplían dos características importantes
para el aislamiento exitoso del micelio; la primera, la mínima contaminación
presente en las cajas sembradas y la segunda, la rapidez de crecimiento del
micelio in vitro en el agar.
Para realizar los aislamientos, se empleó sólo un tipo de agar para que no
hubieran diferencias en los resultados debido a las diferencias del agar, el medio
de cultivo empleado fue PDA (Oxoid ®).
A partir del propio cuerpo fructífero se evaluaron varias metodologías, la primera,
tomar trozos grandes de carpóforo y sembrarlos directamente al agar; la segunda
tomar pequeños trozos del carpórforo que fueron desinfectados y luego
sembrados en cajas de agar; la tercera, llevar el carpóforo a una cámara húmeda,
y después de incubada, se tomaron asadas del micelio que se produjo sobre la
superficie del carpóforo y fueron llevados a cajas de agar (las metodologías se
ampliarán más adelante, en el ítem correspondiente); también se evaluó esta
misma técnica en cámara seca y nevera, sin embargo, en la cámara seca no se
obtuvo micelio y en nevera, aunque se produjo micelio, el índice de contaminación
fue muy alto y no permitió un aislamiento sencillo y con pocos pases, como se
espera en un aislamiento microbiológico.
Para las esporas producidas en el carpóforo se evaluaron varias metodologías, la
primera, descrita por Saldarriaga (2001) en papel; la segunda, el aislamiento de
las esporas en agua estéril, poniendo el carpóforo en una bolsa estéril con agua
42destilada durante 24 horas para que las esporas liberadas sean atrapadas por el
agua y luego con diluciones, se sembraron en fondo y en superficie en el agar; y la
tercera el aislamiento de las esporas en agar-agar, poniendo el carpóforo en una
cámara húmeda la cual en el fondo tiene placas microscópicas cubiertas con agar-
agar que capturen las esporas liberadas y luego de 24 horas de incubación a 22°C
+/- 2°C el agar de las placas microscópicas es cortado en pequeños cuadros de
4x4mm y puestos por siembra central en las placas de agar. La técnica de
aislamiento por agua resultó ser la menos indicada para el aislamiento, ya que el
índice de contaminación es de casi del 100% y obtener un micelio puro en estas
condiciones resulta muy engorrosos y se necesitaría de muchos pases lo que
provoca un cambio genético en la cepa y por consiguiente una posible disminución
en la calidad en la cepa.
7.2 DESCRIPCIÓN DE LAS METODLOGÍAS EMPLEADAS PARA EL
AISLAMIENTO DEL MICELIO
Después de haber realizado la evaluación preliminar de las metodologías a
estandarizar, se tomaron cuatro de ellas para posteriormente estudiarlas en detalle
para que puedan ser reproducidas fácilmente. Se incluyeron dos metodologías de
aislamiento a partir de las hifas que componen el carpóforo y dos metodologías de
aislamiento a partir de las esporas.
7.2.1 Aislamiento del micelio a partir de trozos de carpóforo con
desinfección. Debido a que la evaluación preliminar dio como resultado que el
trozo del cuerpo fructífero es fuente de una amplia contaminación por bacterias,
levaduras y mohos, se planteó una metodología que empleara la desinfección del
carpóforo sin que fuera letal para las hifas, para esto también se pensó que para
una mejor desinfección, los trozos debían tener una menor área para que la
exposición a los desinfectantes fuera mayor. Se tomó el sombrero y se cortaron
con un escalpelo estéril y en un ambiente estéril, pequeños cuadrados de 4mm de
lado. Los trozos se dispusieron en una cada de Petri estéril y se desinfectaron así:
tres lavados con hipoclorito de sodio al 3%, por un minuto con un enjuague entre
cada lavado con agua destilada estéril un minuto, posteriormente, se hizo un
lavado con alcohol al 70% por un minuto con su posterior lavado con agua
destilada estéril por otro minuto.
Luego de tener los trozos desinfectados, se sembraron en superficie en agar PDA,
cinco o seis trozos fueron puestos de forma radial en las placas con una
43separación tal que las hifas tuvieran suficiente espacio para crecer (figura 13). Las
placas fueron incubadas a 22°C +/-2°C, por 5 días o hasta que las placas fueran
cubiertas completamente por el micelio. El agar fue cortado con un escalpelo
estéril en trozos de agar de 4mm de lado y trasferidos a placas de los agares
evaluados (PDA, OGY y Sabouraud), sembrados en forma central. Las cajas
fueron incubadas a 22°C +/-2°C hasta que las cajas fueran cubiertas
completamente por el micelio (aproximadamente una semana para los dos
primeros medios), para posteriormente usar este micelio para la producción de
semilla o “spawn”. La figura 14 muestra el diagrama general de ésta metodología.
Figura 13. Crecimiento del micelio de los trozos de carpóforos de Pleurotus ostreatus
desinfectados
Fuente: La autora. 2010
7.2.2 Aislamiento de micelio a partir de carpóforo con cámara húmeda. Se
tomaron carpóforos maduros sin esporular y se llevaron un vaso de precipitados,
en cuyo interior tenía papel filtro, agua destilada en el fondo y tapa de papel
aluminio (figura 15), estériles y se incubó por 48 a 22°C +/-2°C. Después de la
incubación, se observó la presencia de micelio sobre la superficie del cuerpo
fructífero (figura 16) y se procede a realizar un repique de éste micelio sobre la
superficie de las placas de Petri. Las cajas fueron incubadas nuevamente a 22°C
+/-2°C hasta que el micelio cubrió la superficie del agar (aproximadamente una
semana). El micelio obtenido fue utilizado para la preparación de la semilla.
44Figura 14. Diagrama general de la metodología de aislamiento de micelio a partir de
carpóforo con desinfección
CARPÓFORO
Cortar cuadros de
4mm de lado con
un escalpelo
estéril en un
ambiente estéril.
Desinfectar con tres
lavados con hipoclorito
de sodio al 3% y tres
enjuagues con agua
estéril
Desinfectar con un
lavado con alcohol al 70%
y otro enjuague con agua
estéril
Sembrar en superficie en
placas de agar PDA cinco
trozos de carpóforo. E incubar
a 22°c por 5 días
Cortar el agar en trozos de 4 mm de lado y
transferirlos a placas de PDA. 1 trozo por
cada placa. Incubar a 22°C hasta que la
placa esté cubierta por el agar
Fuente: La autora. 2010
45Figura 15. Cámara húmeda para el aislamiento del micelio a partir del carpóforo
Fuente: La autora. 2010
Figura 16. Presencia de micelio en el carpóforo después de la incubación en cámara húmeda
Fuente: La autora. 2010
467.2.3 Aislamiento de micelio a partir de esporada tomada en papel. La
metodología se llevó a cabo como se describe en Saldarriaga (2001). Se tomaron
carpóforos maduros sin esporular y, tomando una cartulina estéril (220°C por tres
horas) se dispusieron sobre ella sin el estípite. Los hongos se dejaron en un
ambiente estéril a temperatura ambiente (17 – 22°C) de una noche para otra. Al
día siguiente, se observa la esporada (figura 19) y se corta un cuadrado de 1cm2 y
se llevó a 10ml de agua peptonada (1%) estéril, se dejó allí por 3 horas y se
realizaron diluciones seriadas. De cada dilución se sembró 1ml en fondo con agar
OGY para evitar la contaminación con bacterias. Las placas se incubaron a 22°C
+/-2°C hasta que se pudieran distinguir con claridad las colonias del hongo en el
agar, aproximadamente 10 días (figura 17). Luego de esto, el agar es cortado en
cuadros de 4mm de lado para ser sembrados en superficie en el agar y obtener
así, micelio abundante para la producción de semilla. Se realizó un ensayo con
siembra en superficie en agar PDA para disminuir el tiempo de germinación de las
esporas, sin embargo, se obtuvo un menor índice de contaminación en la siembra
en fondo que en la siembra en superficie.
Figura 17. Germinación de las esporas sembradas en fondo después de 12 días
Fuente: La autora. 2010
7.2.4 Aislamiento de micelio a partir de esporas atrapadas en agar. Se toma
un carpóforo maduro y sin esporular y se introduce en una cámara húmeda (como
47la descrita en el parágrafo 7.2.2), sin embargo en el fondo se dispuso un soporte
para un portaobjetos que está cubierto con agar-agar estéril. El carpóforo se pega
con vaselina a la tapa de aluminio y se incuba a 22°C +/-2°C por 24 horas.
Después de ese tiempo se saca el carpóforo de la cámara y el portaobjetos
cubierto por el agar. Se corta el agar en trozos de 4mm de lado y se siembra en
superficie en PDA, se incuba por 8 días a 22°C +/-2°C y luego, este nuevo agar es
cortado nuevamente y transferido a PDA e incubado a 22°C +/-2°C, hasta que el
micelio cubra nuevamente la superficie del agar.
De cada cultivo puro de cada género se realizó un cultivo madre (R1) para
desarrollar posteriores cultivos para la producción de micelio y semilla y
lógicamente, la preservación de la cepa.
48Figura 18. Diagrama de la metodología de aislamiento de micelio a partir de esporas
atrapadas en papel
CARPÓFORO
Disponerlo sobre una
cartulina estéril, sin estípite,
a temperatura ambiente por
una noche
Cortar 1cm2 de la cartulina con las
esporas (mancha blanca) y llevarlo
a un tubo con agua peptonada (1%)
estéril. Dejar por 3 horas.
Realizar diluciones seriadas en agua
peptonada y sembrar en fondo 1 ml de
cada solución, agregar el agar OGY.
Incubar a 22°C hasta que el micelio
cubra la superficie del agar
Cortar el agar en trozos de 4mm de lado
y sembrar en superficie en placas de
agar PDA. Incubar a 22°C hasta que la
placa esté la superficie esté cubierta por
el micelio.
Fuente: La autora. 2010
497.3 EVALUACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS SINTÉTICOS PARA EL
AISLAMIENTO Y PRODUCCIÓN DE MICELIO
Después de tener micelio completamente puro, se procedió a la evaluación de los
diferentes medios de cultivos para determinar cuál de ellos es mejor para el
aislamiento y producción de micelio. Los medios de cultivo fueron reconstituidos
de acuerdo al fabricante y esterilizados a 121°C por 15 minutos; después fueron
servidos en cajas de Petri de vidrio y se dejaron solidificar. Se cortaron trozos de
agar con micelio de 4mm de lado y se sembraron centralmente para poder medir
el radio de crecimiento del micelio en el tiempo. Las cajas se incubaron a 22°C +/-
2°C hasta que el micelio cubriera toda la superficie del agar. El radio de
crecimiento fue medido con un calibrador (Mitutoyo®) cada dos días y reportado
en milímetros. Se realizaron 5 réplicas para cada medio de cultivo y especie de
hongo. Los promedios de los resultados de crecimiento del micelio de acuerdo a la
cepa y al agar se presentan en la tabla 5.
Tabla 5. Promedio del crecimiento (mm) de Pleurotus ostreatus, Pleurotus pulmonarius y
Lentinula edodes en diferentes tipos de medio de cultivo
DIA 2 DIA 4 DIA 6 DIA 8 DIA 10 DIA 12 DIA 14
PDA 3 11,8 31 44,4
L. edodes OGY 0,4 10,8 17,2 25,6 38,8 45
SABOURAUD 0,3 7 13,4 19,2 29,6 39,6
PDA 3 10,4 36,8 45
P.
OGY 3 11,6 20,6 31,6 45
pulmonarius
SABOURAUD 1,2 6,2 11,2 17,8 27,2
PDA 2,6 7,2 23,4 37,4 45
P. ostreatus OGY 2,8 14,2 23,6 34,4 41,6 45
SABOURAUD 1,2 4,6 7,6 11,8 16,6 24,8 33,8
Fuente: La autora. 2010
50Para todas las cepas, se observa que el medio de cultivo que fue más
rápidamente invadido fue PDA, Lentinula edodes y Pleurotus pulmonarius fueron
las cepas que tuvieron un crecimiento más rápido en este medio, invadieron la
caja en 8 días, mientras que Pleurotus ostreatus tuvo un crecimiento más lento en
este tipo de agar. El segundo medio de cultivo más rápido fue OGY, mientras que
Sabouraud tuvo un pobre crecimiento, a tal punto que el crecimiento micelial se
detuvo en un momento determinado. Las figuras 19, 20 y 21 muestran el
crecimiento micelial de las cepas en los tres medios de cultivo a los 4 días.
Figura 19. Crecimiento de Lentinula edodes en los medios PDA, OGY y Sabouraud a los 4
días
Fuente: La autora. 2010
Figura 20. Crecimiento de Pleurotus pulmonarius en los medios PDA, OGY y Sabouraud a
los 4 días
Fuente: La autora. 2010
51Figura 21. Crecimiento de Pleurotus ostreatus en los medios PDA, OGY y Sabouraud a los 4
días
Fuente: La autora. 2010
Al realizar un análisis cualitativo de los resultados se puede observar que hay
diferencias entre los medios y las cepas empleadas, cada cepa tiene un
comportamiento diferente entre los diferentes medios de cultivos y como era de
suponerse, el comportamiento de cada cepa es diferente comparado con otra.
Esto se corrobora con el análisis estadístico de los datos, la prueba de Fischer nos
indica que con un porcentaje de confianza del 95% (p=0,05) se evidencia que hay
diferencias significativas entre los diferentes medios de cultivos y diferencias entre
las cepas empleadas, el Anexo 2 muestra en detalle el análisis de varianza
(ANOVA) que se empleó en el análisis estadístico.
7.4 DETERMINACIÓN DE LA CINÉTICA DE CRECIMIENTO DE Lentinula
edodes, Pleurotus ostreatus Y Pleurotus pulmonarius EN LOS DIFERENTES
MEDIOS DE CULTIVOS
Con los datos obtenidos del crecimiento, se determinó hallar la velocidad de
crecimiento de las diferentes especies de hongos en los diferentes tipos de agar.
Como primera medida se graficaron los datos obtenidos, representados en la tabla
5. Las figuras 22, 23 y 24, representan el crecimiento de los diferentes hongos en
los medios de cultivo sintéticos evaluados.
52Figura 22. Crecimiento Lentinula edodes según los medios de cultivo evaluados
Fuente: La autora. 2010
Figura 23. Crecimiento Pleurotus pulmonarius según los medios de cultivo evaluados
Fuente: La autora. 2010
53Figura 24. Crecimiento de Pleurotus ostreatus según los medios de cultivo evaluados
Fuente: La autora. 2010
Las gráficas nos muestran que el crecimiento en PDA fue más rápido para todas
las cepas el segundo mejor medio fue OGY y por último Sabouraud. El tipo de
crecimiento filamentoso o algodonoso indica cualitativamente la producción de
biomasa de las cepas, sin embargo, para determinar cuantitativamente dicha
producción se procedió a realizar diferentes cálculos matemáticos en base a la
ecuación logística de Velhurst-Pearl (1), originalmente desarrollada para el
crecimiento de una población (Viniegra-González et al. 2003).
dX = μ 1 – X X (1)
M
dt X
M
Donde X es la densidad de biomasa (g por l, por cm2 o por kg), μ la rata máxima
M
de crecimiento específico, (h-1, día-1) y X , el nivel de equilibrio para X donde,
M
dX/dt=0 para X >0. La solución de la ecuación se da en la ecuación 2.
54X(t)= X (2)
M
1 – ((X – X )/ X )e-μMt
M 0 0
Donde X es la condición inicial de X. Esta ecuación asume que los cultivos
0
microbianos están prácticamente saturados por el sustrato y por consiguiente, la
rata de crecimiento específico no es una función de la concentración del sustrato
(Viniegra-González et al. 2003).
Tomando la ecuación 2, se halla μ para cada uno de los medios de cultivos y las
M
cepas para cada uno de los días de experimentación (Anexo 3), luego, estos μ
específicos son graficados nuevamente contra el tiempo y se toma la línea de
tendencia lineal para cada curva para poder obtener una linealización de los datos.
Con esta línea de tendencia se calcularon nuevamente los radios (teóricos) de
crecimiento y se graficaron. Se adicionó una línea de tendencia exponencial para
obtener la ecuación típica de crecimiento microbiano (3) (Anexo 4). La tabla 6
muestra las ecuaciones obtenidas con los datos experimentales y ajustadas a las
ecuaciones 1 y 2.
Y= Aekt (3)
55Tabla 6. Ecuaciones de crecimiento obtenidas del tratamiento matemático de los datos
arrojados por la experimentación
Medio PDA R2 OGY R2 Sabouraud R2
Hongo
Lentinula Y= 0,9796 Y= 0,918 Y= 0,9607
edodes 0,9879e0,8051x 1,3985e0,5456x 1,2616e0,5332x
Pleurotus Y= 0,9678 Y= 0,9557 Y= 0,9738
pulmonarius 0,9659e0,817x 1,4258e0,6145x 1,4339e0,4896x
Pleurotus Y= 1,233e0,648x 0,9621 Y= 0,8829 Y= 0,9856
ostreatus 1,9369e0,5136x 1,5982e0,3982x
Fuente: La autora. 2010
La tabla 7 muestra los μ específicos para cada una de las cepas y para cada uno
de los medios de cultivos evaluados.
56Tabla 7. Rata de crecimiento específico (μ, día-1) para cada una de los medios de cultivo y
cada uno de los hongos evaluados
Medio PDA OGY Sabouraud
Hongo
Lentinula edodes 0,8051 0,5456 0,5332
Pleurotus 0,817 0,6145 0,4896
pulmonarius
Pleurotus ostreatus 0,648 0,5136 0,3982
Fuente: La autora. 2010
7.5 EVALUACIÓN DE LOS GRANOS DE CEREAL PARA LA PRODUCCIÓN DE
SEMILLA
Después de tener el micelio puro en las cajas de Petri, los granos de cereal son
evaluados. El procedimiento para producir la semilla, es descrito por Saldarriaga
(2001). Se toman los granos de cereal y se lavan con abundante agua, eliminando
los granos infectados o rotos, además de los desechos vegetales que quedan
después de la recolección de los cereales (ramas, hojas, tallos, etc). Se dejan en
agua por una noche para que los granos se hidraten y luego, son escurridos. Es
adicionado un 1% (en base húmeda) de carbonato de calcio a los granos de cereal
y posteriormente, son esterilizados a 121°C y 15 lb de presión por una hora, debe
cumplirse el tiempo de esterilización ya que si esto no se da, el porcentaje de
contaminación (por mohos, especialmente Trichoderma spp) se incrementa. Se
midió el porcentaje de humedad y el pH de los granos después de la esterilización.
El promedio de pH fue de 5,96 y el de humedad 46,3%.
Después de que los frascos con los granos están a temperatura ambiente, son
inoculados; se toman cuadrados de agar de 1 cm de lado y se distribuyen en el
frasco que contiene los granos, entre 3 y 4 cuadrados de agar son suficientes para
57que haya una rápida y efectiva infección de los granos (figura 25). Se incubaron en
oscuridad a 22°C +/-2°C por el tiempo que fuera necesario hasta que se observara
una infección completa de los granos, a la semana de incubación, los frascos
fueron agitados para que hubiera una distribución homogénea del micelio y de
humedad.
Figura 25. Frasco de granos de maíz amarillo recién inoculado con el hongo
Fuente: La autora. 2010
El crecimiento del micelio fue medido cualitativamente en el tiempo, se observaba
la distribución y abundancia de micelio en los granos de cereal. Se determinó el
final de la incubación cuando el frasco tenía un color blanco debido al crecimiento
abundante del micelio. Las figuras 26 y 27 muestran las diferencias en el
crecimiento del micelio en dos tipos diferentes de cereal en el mismo tiempo de
incubación (2 semanas).
58Figura 26. Crecimiento de Pleurotus pulmonarius en trigo
Fuente: La autora. 2010
Figura 27. Crecimiento de Pleurotus pulmonarius en millo
Fuente: La autora. 2010
59Según los resultados obtenidos se puede concluir que el trigo es el mejor cereal
para la producción de semilla (spawn) en todos los géneros de hongos. Se dio una
rápida y homogénea infección de los granos. En dos semanas, los frascos fueron
completamente infectados y el micelio era denso. La cebada fue el segundo mejor
cereal, aunque el crecimiento fue mucho más lento que para el trigo (3 semanas),
se dio de manera uniforme en los granos y para las tres cepas de hongos. Hubo
diferencias entre ciertos tipos de cereal, mientras que el trigo fue una excelente
semilla para la producción de spawn para todas las cepas, el sorgo fue mejor para
Lentinula edodes, que para las dos cepas de Pleurotus. El millo y el maíz amarillo
no tuvieron una buena infección por parte del micelio de los hongos, para que se
viera la infección de los granos se debió esperar más de 4 semanas y para ver
una infección total del cereal se debió esperar más de 6 semanas. La tabla 8,
describe el comportamiento de los diferentes granos de cereal, en cuanto a la
infección del micelio de los hongos.
Tabla 8. Evaluación del crecimiento micelial en granos de cereal
Maíz
Trigo Sorgo Cebada Millo amarillo
P. ostreatus +++ + ++ + +
P. pulmonarius +++ + ++ + +
L. edodes +++ ++ ++ + +
Escala:
+++ Alto porcentaje de infección, crecimiento rápido
++ Porcentaje de infección medio, crecimiento lento
+ Poco porcentaje de infección, crecimiento lento
Fuente: La autora. 2010
608. DISCUSIÓN DE RESULTADOS
El objetivo principal de la investigación fue el de proponer metodologías efectivas,
fáciles, económicas y reproducibles para que los productores de setas y población
en general puedan desarrollar para impulsar el cultivo de este tipo de
macromicetos, en este orden, se determinó que las cuatro metodologías descritas
anteriormente son las más adecuadas para el aislamiento de micelio a partir de
cuerpos fructíferos, para su posterior uso en la producción de semilla.
Evaluar la contaminación por parte de otros microorganismos es muy importante al
realizar un protocolo de aislamiento de cualquier tipo de microorganismo, es por
esto que se hizo una evaluación preliminar de métodos para descartar los que
tenían un mayor índice de contaminación por parte de bacterias, levaduras y
mohos. Sin embargo, para esto también se debe tener en cuenta las condiciones
en las que se desarrolla el cultivo de las setas –en este caso- y sus condiciones de
transporte hasta el laboratorio. Si un cultivo presenta un alto índice de
contaminación es casi imposible obtener un micelio puro con un solo aislamiento o
pase, es necesario hacer varios repiques para obtener finalmente la cepa pura. Al
hacer las siembras de los trozos de carpóforo directamente al agar, sin ningún
proceso de desinfección se observó contaminación bacteriana, levaduras, pero
sobre todo, de mohos que se considerarían de tipo ambiental y otros que son
contaminación del cultivo (se sabe que hay presencia de Trichoderma sp en el
cultivo). Es por esto que se tomó la decisión de realizar la desinfección de los
trozos de carpóforo para el aislamiento del micelio. Para esta desinfección es
necesario que los desinfectantes tengan la concentración adecuada y que el
tiempo de contacto de éstos con los trozos de los carpóforos sea el indicado, ya
que un tiempo mayor implicaría la muerte de las hifas del hongo a aislar y no se
lograría el objetivo principal de la técnica.
Los ambientes en los que se realicen los procedimientos son muy importantes
para el éxito del aislamiento, deben ser lo más estériles y aislados posibles ya que
como se sabe, la contaminación ambiental afecta el aislamiento de las cepas, ya
sea porque inhibe el crecimiento de la cepa en cuestión -como sería el caso de la
Trichoderma sp (Romero-Arenas et al. 2009)- y como es obvio, no se obtendría un
cultivo puro para seguir el siguiente paso en la producción de las setas
comestibles, la preparación de la semilla. Estos ambientes deben ser
61desinfectados antes y después de cada procedimiento, además de ser (si es
posible) irradiados con los UV para tratar de eliminar toda la contaminación
existente. En cada procedimiento se debe contar con la presencia de uno o dos
mecheros para crear un ambiente aún más estéril y que el índice de
contaminación sea mínimo.
El carpóforo de los macromicetos está constituido por hifas especializadas que
puedan soportar las condiciones del ambiente externo (recordemos que el micelio
del hongo por lo general se encuentra dentro de la madera como en el caso de los
hongos de pudrición de la madera como Pleurotus spp o Lentinula edodes, bajo el
suelo, la vegetación muerta sobre el suelo, etc.), además de las hifas
especializadas para la producción de las esporas (en el caso de los hongos objeto
de estudio, los basidios) y éstas son liberadas al ambiente. Es por esto que se
puede concluir que el aislamiento del micelio a partir del carpóforo es la
metodología más sencilla. La germinación de las hifas a partir de esta parte del
hongo es mucho más rápida que si se toman las esporas. En dos semanas se
puede obtener micelio puro y abundante para realizar la infección de los granos de
cereal para la producción de semilla, mientras que a partir de las esporas se
puede tomar hasta casi cuatro semanas para obtener el mismo resultado. Esto se
da por la germinación de la espora; esta estructura del hongo es muy fuerte y de
resistencia que se produce cuando el hongo siente “stress” por el ambiente
(mucho frío, mucho calor, poca luz, etc.) o porque los requerimientos nutricionales
para el hongo han disminuido a tal punto que su ciclo de vida vegetativo (micelio)
no se puede dar más. El “stress” es un mecanismo que usan los cultivadores de
setas ya que las esporas de los hongos (macromicetos) sólo se producen en los
carpóforos, si no hay esta tensión, el hongo permanece en su ciclo vegetativo y no
produciría los carpóforos. Las esporas son liberadas y deben soportar un ambiente
hostil hasta que las condiciones ambientales cambien o la espora viaje por medio
del viento, insectos entre otros, y pueda encontrar un ambiente benévolo donde
pueda iniciar su ciclo de germinación (que toma su tiempo) y vuelva su ciclo
vegetativo. En el caso del presente trabajo, el agar es un medio perfecto para la
germinación de la espora por sus condiciones de humedad, temperatura y
nutricionales, sin embargo, a pesar de que los medios de cultivos son ricos en
nutrientes y las condiciones ambientales son favorables, el proceso de
germinación toma su tiempo hasta que la espora termina su estadio de dormancia
y se activa metabólicamente para poder iniciar el ciclo vegetativo.
De las metodologías de aislamiento a partir de las esporas, la descrita por
Saldarriaga (2001) es la más sencilla y económica de seguir, esto porque no es
necesario ensamblar la cámara húmeda que se describe en este trabajo (a pesar
de que es una cámara con muy pocos materiales, económica y fácil de
62ensamblar), sin embargo, si se habla de efectividad y pureza del micelio aislado,
las dos metodologías se encuentran a la par, el tiempo de germinación es el
mismo y en más de tres semanas se puede obtener micelio puro para producir la
semilla.
Otro de los objetivos del presente trabajo fue el de evaluar medios de cultivo
sintéticos, usados comúnmente en un laboratorio de microbiología. Hubo
diferencias significativas (p=0,05) entre los medios de cultivos evaluados y entre
las cepas de hongo, lo que se ve reflejado en las figuras 22, 23 y 24. Ningún
medio de cultivo tuvo un comportamiento diferente para una cepa determinada, los
tres medios de cultivo tuvieron un comportamiento similar para los tres hongos
estudiados, lo que nos puede indicar que esto podría extrapolarse a la totalidad de
hongos de este tipo, es decir, los hongos de la pudrición blanca de la madera, ya
que se estudiaron dos géneros que comparten esta característica (ligninolíticos y
celulolíticos) pero que no tienen la misma clasificación taxonómica. El micelio
obtenido es característico de cada especie, mientras que para Lentinula edodes
(shiitake) el micelio es poco denso, simétrico y podría llamarse “débil” (figura 28),
para las orellanas (Pleurotus pulmonarius y Pleurotus ostreatus) se observa un
micelio denso, de crecimiento irregular, abundante y “fuerte” (figuras 29 y 30); sin
que los adjetivos “débil” y “fuerte” tengan que ver con su índice de infección en los
medios de cultivo o los granos de cereal. Si se observa la tabla 7, a pesar que el
shiitake tenga un crecimiento micelial poco denso, su velocidad de crecimiento es
prácticamente igual que para las otras dos especies.
Figura 28. Crecimiento típico de Lentinula edodes sobre placa de PDA
Fuente: La autora. 2010
63Figura 29. Crecimiento típico de Pleurotus pulmonarius sobre placa de PDA
Fuente: La autora. 2010
Figura 30. Crecimiento típico de Pleurotus ostreatus sobre placa de PDA
Fuente: La autora. 2010
Como se describió anteriormente, el medio de cultivo sintético que mejor resultado
arrojó para el aislamiento y producción de micelio fue PDA (Papa, dextrosa, agar),
no existen estudios científicos que determinen el por qué de este comportamiento
por parte de los hongos, pero como es sabido por microbiólogos, bacteriólogos,
64biólogos y demás personas que estudian hongos (tanto macromicetos, como
micromicetos), éste es uno de los medios de cultivo mayormente utilizados para la
manutención y preservación de los hongos. Este medio de cultivo tiene todos los
componentes nutritivos para que los hongos se desarrollen, el extracto de papa
proporciona almidón, algo de lignina y otros minerales que ayudan a que los
hongos se desarrollen e inhiban el crecimiento de bacterias, la dextrosa (glucosa)
es la fuente de carbono principal para los hongos y el agar es adicionado como
agente gelificante, su pH (5,6 +/-2), es ideal para el crecimiento de hongos y la
inhibición de bacterias debido a su ligera acidez. El OGY (Extracto de levadura,
glucosa y extracto de levadura) tiene en su composición también la glucosa como
su principal fuente de carbono, pero contiene además extracto de levadura y como
agente antibacteriano la oxitetraciclina, aunque el medio contenga la glucosa, es
evidente que el extracto de levadura, que en su mayoría es un componente
protéico no brinda las mejores condiciones nutricionales para el desarrollo de este
tipo de hongos (recordemos que éste es un medio utilizado para el conteo de
mohos y levaduras en el control de calidad microbiológico de alimentos), aunque
se podría contar como una opción al no tener PDA, ya que el crecimiento es más
lento sólo por unos pocos días (2 a 4). El medio Sabouraud fue el que tuvo un
resultado menos favorecedor, en todos los casos, el crecimiento micelial de las
especies de hongos se detuvo, las cajas se tuvieron en incubación días después
que las placas de otros medios fueron retiradas pero en vez de haber crecimiento,
el medio se deshidrató, es por eso que los tiempos se detuvieron hasta cuando se
sacaron las últimas cajas de los otros agares. Por esto se puede concluir que este
medio no es una buena opción para el crecimiento de estos hongos macromicetos,
aunque el medio de cultivo contiene también dextrosa, el complemento, que es un
concentrado enzimático de caseína, no es el adecuado para la producción de
micelio, debido a que es un concentrado proteico y de origen animal, este es un
medio que aunque es utilizado para el conteo de hongos en el laboratorio, no es el
indicado para hongos de la pudrición de la madera.
El realizar un estudio de la cinética de crecimiento de las especies estudiadas, es
importante para el investigador, esto porque se puede entender con mayor
profundidad el comportamiento de los microorganismos estudiados y poder una
mejor explicación a un cambio de las condiciones de crecimiento de las especies.
El punto de partida para estudiar por ejemplo, el crecimiento de un cierto tipo de
microorganismo bajo un nuevo medio de cultivo, debe ser comparado
obligatoriamente con un medio de cultivo ampliamente estudiado y conocido para
determinar si este nuevo medio de cultivo es mejor que el utilizado comúnmente.
No se han realizado muchos estudios de la cinética de crecimiento de este tipo de
hongos en medios sólidos, las investigaciones se han enfocado a la cinética de
crecimiento de hongos en fermentaciones líquidas, ya que son en éste tipo de
fermentaciones en que se puede determinar con mejor precisión, el agotamiento
de un nutriente, o la producción de algún metabolito secundario de interés. Sin
65embargo, es bueno aclarar que la cinética se debe hacer para cada experimento,
ya que las condiciones ambientales, especialmente, cambian de un laboratorio,
pero podrían ser comparables en un momento determinado y los datos serían de
gran utilidad e importancia.
La cinética de crecimiento estudiada en este trabajo nos hace pensar que el
comportamiento de las cepas in vitro es similar en cuanto a los medios de cultivo
utilizados. Se hallaron las ecuaciones de crecimiento que permitieran describir el
crecimiento de las diferentes especies de hongos. El R2 nos indica que los datos
obtenidos no tienen una gran variación entre sí y que se ajustan en buena medida
a la ecuación propuesta. El hongo con una rata de crecimiento específica (μ)
menor fue Pleurotus ostreatus para todos los medios de cultivo, mientras que para
PDA, Pleurotus pulmonarius y Lentinula edodes este índice fue similar, para OGY
y Sabouraud se ven diferencias y Pleurotus pulmonarius tuvo una rata mayor para
estos medios que Lentinula edodes.
Para la preparación de la semilla es primordial los pasos anteriores a la
inoculación de los granos. El grano debe estar sumergido en agua entre 16 a 24
horas para que absorba toda el agua posible y pueda haber una buena infección
del grano (entre más húmedo, más susceptible a la infección) y además, para que
exista las condiciones de humedad propias para el desarrollo del hongo. Debe
existir la proporción perfecta de carbonato de calcio y el peso en base húmeda de
los granos, ya que si se adiciona más carbonato el pH puede bajar más de lo
recomendable (5,5 es lo mínimo (Stamets, P. 2003)) o si no se agrega la cantidad
suficiente el pH permitiría la aparición de bacterias que inhibirían el crecimiento del
hongo si el proceso de esterilización no es el adecuado. Es necesario asegurarse
que la temperatura en el centro térmico de los granos sea superior a los 121°C
(temperatura de esterilización) ya que se puede dar el caso de que los granos
exteriores del frasco queden completamente estériles, pero en el centro, los
granos tengan focos de contaminación, en especial de mohos, que compitan con
el hongo a producir y sea inhibido. Si se presenta un foco de contaminación,
visible ya que por lo general este tipo de mohos poseen un color verde, pardo,
gris, o negro, el frasco debe ser esterilizado nuevamente y el proceso de limpieza
y desinfección debe darse nuevamente, o simplemente los granos son eliminados.
En cuanto a la evaluación de los granos de cereal, aunque no se hizo un análisis
cuantitativo, se puede concluir que el mejor grano es el trigo, seguido por la
cebada, el sorgo, el millo y el maíz amarillo. Esto concuerda con Stamets (2003),
que dice que los mejores cereales son el trigo, la cebada y el sorgo. Esto se da
66por la cantidad de agua que los granos pueden absorber y también al contenido de
almidones de fácil rompimiento, contenido de lignina, celulosa, etc. El millo y el
maíz son granos muy duros que el hongo no puede penetrar. Para que puedan ser
más fáciles de penetrar, los granos deberían tener un menor grado de madurez,
pero esto implica que todos los almidones y azúcares presentes en el grano no
están en un 100% de concentración y entonces el hongo no se desarrollaría por
falta de nutrientes. Si es necesario usar este tipo de cereales se recomendaría que
fueran sumergidos en agua por un periodo de tiempo más largo, para que las
paredes del grano se ablanden más y el hongo pueda penetrar las paredes.
Las metodologías estandarizadas en este trabajo tienen muchas ventajas, entre
ellas un bajo índice de contaminación por otros microorganismos, son fáciles de
aplicar, totalmente reproducibles y con un alto índice de éxito, es decir que el
aislamiento del micelio es satisfactorio, además, el procedimiento para la
producción de semilla cumple con las mismas características aquí citadas,
además que granos de cereales que no serían comercializados por su baja calidad
pueden ser utilizados para la producción de semilla. Lo que cumple el objetivo
primordial de este trabajo, los agricultores tendrán herramientas fáciles de seguir,
en su idioma, económicas y claras para iniciar o complementar sus cultivos de
shiitake y orellanas. Los costos por la compra de semilla importada y costosa
disminuirán considerablemente ya que ellos no deberán comprar esta semilla,
tendrán la capacidad de producir su propia semilla con alta pureza, calidad y
productividad.
679. CONCLUSIONES
Se describieron cuatro metodologías para el aislamiento y producción de micelio a
partir del cuerpo fructífero del hongo, esto con el objetivo de que los productores
de setas en Colombia no tengan la necesidad de comprar semilla costosa e
importada y la puedan producir a partir de su propia producción. Además, se tiene
la ventaja de que los hongos de los que se hacen los aislamientos ya están
adaptados a las condiciones medioambientales del lugar de producción y no se
debe hacer una adaptación, como si se debe hacer con una semilla importada.
Las metodologías descritas en el presente trabajo son económicas, reproducibles,
fáciles de realizar y efectivas para obtener un aislamiento puro y con las
características fisiológicas propias de los hongos en estudio.
La metodología más fácil y con mejores resultados es la de trozo de carpóforo con
desinfección. En dos semanas se puede obtener micelio puro y abundante para la
producción de semilla.
Las metodologías a partir de esporas aunque son efectivas, tienen el
inconveniente de que toman mucho más tiempo (entre una y dos semanas más)
en obtener el mismo resultado que la metodología de trozo de carpóforo con
desinfección.
El medio de cultivo sintético con un mejor crecimiento de todos los hongos
estudiados es PDA, le sigue OGY y Sabouraud.
El mejor grano de cereal para la producción de semilla (spawn) para las tres
especies fue el trigo, seguido de la cebada y el sorgo.
6810. RECOMENDACIONES
Es importante tener en cuenta las condiciones de contaminación de los cultivos, ya
que un alto índice de contaminación hace que el aislamiento sea un procedimiento
más difícil de lograr.
Es importante tener desinfectadas y limpias los sitios de trabajo para evitar
contaminaciones ambientales indeseadas.
Las concentraciones de los desinfectantes deben ser exactas, ya que de lo
contrario se correría el riesgo de matar las hifas vivas de los carpóforos.
El medio de cultivo recomendado para realizar todos los procedimientos es PDA,
sin embargo, se podrían hacer estudios posteriores con un medio “casero”, ya que
no todos los cultivadores tienen las posibilidades de comprar los medios de cultivo
comerciales.
El estudio de la cinética de crecimiento así como de la utilización de sustrato por
parte del hongo en la producción de semilla, sería una importante investigación
que se debería hacer en el futuro.
6911. BIBLIOGRAFÍA
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tospractica5sola/hongos/amanitamuscariapielaminasbordesombrero.jpg]
76ANEXOS
77ANEXO 1. CRECIMIENTO DE Lentinula edodes (1), Pleurotus pulmonarius (2)
Y Pleurotus ostreatus (3) EN PLACAS DE PDA, OGY Y SABOURAUD A 10
DÍAS DE INCUBACIÓN
(1)
Fuente: La autora. 2010
(2)
Fuente: La autora. 2010
78(3)
Fuente: La autora. 2010
79ANEXO 2. TABLA DE ANOVA OBTENIDA CON LOS DATOS
EXPERIMENTALES DEL CRECIMIENTO DE LOS TRES HONGOS EN LOS
TRES TIPO DE AGAR
Origen de las Suma de Grados de Valor crítico para
F
variaciones cuadrados libertad F
Entre grupos 3947,88 6 13,36 3,00
Dentro de las especies 591,11 12
Total 4538,99 18
80ANEXO 3. RATA DE CRECIMIENTO MAXIMA ESPECÍFICA (μ ) PARA CADA
M
HONGO, CADA MEDIO DE CULTIVO Y CADA DÍA DE EXPERIMENTACIÓN
Lentinula edodes
DIA PDA OGY SABOURAUD
1 2,23 2,218 2,345
2 1,15 1,109 1,172
3 0,74 0,739 0,781
4 0,55 0,554 0,586
5 0,44 0,444 0,469
6 0,37 0,37 0,391
7 0,31 0,316 0,335
8 0,27 0,277 0,293
9 0,246 0,26
10 0,222 0,234
11 0,201 0,213
12 0,185 0,195
Fuente: La autora. 2010
81Pleurotus pulmonarius
DIA PDA OGY SABOURAUD
1 2,218 2,218 2,48
2 1,109 1,109 1,24
3 0,734 0,739 0,827
4 0,554 0,554 0,62
5 0,443 0,444 0,496
6 0,37 0,37 0,413
7 0,317 0,317 0,354
8 0,277 0,277 0,31
9 0,246 0,275
10 0,222 0,248
11 0,225
12 0,207
Fuente: La autora. 2010
82Pleurotus ostreatus
DIA PDA OGY SABOURAUD
1 2,218 2,218 2,503
2 1,109 1,109 1,251
3 0,739 0,739 0,834
4 0,554 0,554 0,626
5 0,444 0,444 0,501
6 0,37 0,37 0,417
7 0,317 0,316 0,357
8 0,277 0,277 0,313
9 0,246 0,246 0,278
10 0,222 0,222 0,25
11 0,201 0,227
12 0,185 0,208
13 0,192
14 0,178
Fuente: La autora. 2010
83ANEXO 4. GRAFICAS DE CRECIMIENTO TEÓRICAS AJUSTADAS A LAS
ECUACIONES 2 Y 3 PARA LOS TRES HONGOS Y LOS TRES MEDIOS DE
CULTIVO
Lentinula edodes
Fuente: La autora. 2010
84Pleurotus pulmonarius
Fuente: La autora. 2010
85Pleurotus ostreatus
Fuente: La autora. 2010
86