Correlación del perfil genético de los genes TPMT y NUDT15 con los efectos secundarios del tratamiento en pacientes pediátricos con Leucemia Linfoide Aguda en tratamiento de mantenimiento en la Fundación HOMI Hospital de la Misericordia durante el 2017
Autor: Correa Jiménez, Oscar Leonardo
Asesor: Linares Ballesteros, Adriana (Thesis advisor)
Fecha: 2019-01
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Objetivo: Correlacionar el perfil genético de los genes TPMT y NUDT15 con los efectos secundarios del tratamiento en pacientes pediátricos con Leucemia Linfoide Aguda que se encuentren en tratamiento de mantenimiento en la Fundación HOMI Hospital de la Misericordia durante el 2017.  Métodos: estudio observacional analítico, de corte longitudinal, en el que se determinaron los genotipos de los genes TPMT y NUDT15 mediante PCR de discriminación alélica con sondas TaqMan® a 70 pacientes que durante el 2017 se encontraban recibiendo quimioterapia en fase de mantenimiento en la Unidad de Oncohematología Pediátrica del Hospital de la Misericordia.    Resultados: un total de 70 pacientes fueron incluidos en el presente estudio, de estos, se logró realizar los análisis genéticos para NUDT15 y TPMT (rs1800462 y rs1800460) a 68 pacientes, en tanto que para el polimorfismo rs1142345 del gen TPMT,  se logró la tipificación en 42 pacientes. 4 pacientes fueron heterocigotos para la variante mutada de NUDT15, igual número de pacientes fueron heterocigotos para rs1800462 y rs1142345 de TPMT, en tanto que para rs1800460 se identificó a 6 pacientes heterocigotos. No se identificó ninguna asociación estadísticamente significativa entre las variantes genéticas y los desenlaces de interés.   Conclusiones: las variantes genéticas de NUDT15 y TPMT no mostraron asociación con los efectos secundarios de mercaptopurina en la muestra de estudio. Se requieren estudios con mayor tamaño poblacional así como la evaluación de otras variantes genéticas que puedan influenciar el desarrollo de efectos secundarios durante la quimioterapia de mantenimiento.

Correlación del perfil genético de los genes
TPMT y NUDT15 con los efectos
secundarios del tratamiento en pacientes
pediátricos con Leucemia Linfoide Aguda en
tratamiento de mantenimiento en la
Fundación HOMI Hospital de la Misericordia
durante el 2017
Óscar Leonardo Correa Jiménez
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Pediatría
Bogotá, D.C., Colombia
2019Correlación del perfil genético de los genes
TPMT y NUDT15 con los efectos
secundarios del tratamiento en pacientes
pediátricos con Leucemia Linfoide Aguda en
tratamiento de mantenimiento en la
Fundación HOMI Hospital de la Misericordia
durante el 2017
Óscar Leonardo Correa Jiménez
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Especialista en Pediatría
Directora:
Doctora Isabel Cristina Sarmiento Urbina
Oncohematóloga Pediatra
Codirectora:
Doctora Adriana Linares Ballesteros
Oncohematóloga Pediatra
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Pediatría
Bogotá, D.C., Colombia
2019"No matter what your age and no matter
where you come from, everyone can change the
world in some way, whether it's being a mentor to
someone younger than you or someone that doesn't
have as much experience as you. If you're
passionate enough, you can do whatever you want
and definitely change the world."
Josh Groban.Agradecimientos
Deseo aprovechar esta sección para expresar mis más sinceros agradecimientos a todos
los que han hecho posible el logro en la ejecución de este trabajo, así como también a
quienes me han acompañado en la meta colateral de ser pediatra.
En primer lugar, agradezco a Dios por todas la bendiciones recibidas, pero sobre todo
por permitirme ser consciente de que nunca me ha abandonado ante adversidades y
pruebas. A mi familia: mi madre y mis hermanos, quienes aun a la distancia me
demuestran a diario su apoyo y amor incondicional.
Mi eterna gratitud a mi tutora: Dra. Isabel Sarmiento, gracias por su comprensión, apoyo
e incondicional orientación y guía durante el desarrollo de este proyecto. A mi cotutora
Dra. Adriana Linares, por su apoyo y acompañamiento en la ejecución de este proyecto.
A ambas gracias por servir de modelos a seguir tanto en lo profesional como en lo
personal, también les agradezco haberme acogido en su grupo de investigación y darme
esta oportunidad de crecimiento científico. Al Dr. Juan Yunis por el acompañamiento en
los ensayos de laboratorio.
Agradezco a los profesores del Departamento de Pediatría de la Universidad Nacional de
Colombia por las enseñanzas. Pero de entre ellos, mis más sinceros sentimientos de
gratitud y admiración para la Dra. Sonia Restrepo, ha sido un gran honor ser su
estudiante y tener la oportunidad de poder realizar trabajos académicos y científicos
adicionales bajo su orientación, pero sobre todo por la palabra precisa en el momento
oportuno y por su apoyo incondicional para la consecución de uno de mis sueños.
Extender mis agradecimientos a la Dra. Milena Villamil por los consejos y la cooperación
académico/científica.
Debo mencionar también a HOMI Fundación Hospital de la Misericordia por prestar sus
instalaciones, para el desarrollo de mis actividades de formación y la atención de los
pacientes incluidos en el estudio. A estos últimos, mi mayor reconocimiento pues sin su
voluntad y la de sus familiares, este proyecto no habría sido posible.Contenido VIII
Finalmente, a mis amigos: a los viejos –Andrea, Carla, Enrique, Kelly y Nel- y a los
nuevos –Dianita, Marce-, por su apoyo y recordarme a diario que vale más tener amigos
de dinero.
Este proyecto ha sido financiado por la Universidad Nacional de Colombia mediante la
Convocatoria Nacional de Proyectos para el Fortalecimiento de la Investigación de la
Universidad Nacional de Colombia 2016-2018, Código 35872.Resumen y Abstract IX
Resumen
Objetivo: Correlacionar el perfil genético de los genes TPMT y NUDT15 con los efectos
secundarios del tratamiento en pacientes pediátricos con Leucemia Linfoide Aguda que
se encuentren en tratamiento de mantenimiento en la Fundación HOMI Hospital de la
Misericordia durante el 2017.
Métodos: estudio observacional analítico, de corte longitudinal, en el que se
determinaron los genotipos de los genes TPMT y NUDT15 mediante PCR de
discriminación alélica con sondas TaqMan® a 70 pacientes que durante el 2017 se
encontraban recibiendo quimioterapia en fase de mantenimiento en la Unidad de
Oncohematología Pediátrica del Hospital de la Misericordia.
Resultados: un total de 70 pacientes fueron incluidos en el presente estudio, de estos, se
logró realizar los análisis genéticos para NUDT15 y TPMT (rs1800462 y rs1800460) a 68
pacientes, en tanto que para el polimorfismo rs1142345 del gen TPMT, se logró la
tipificación en 42 pacientes. 4 pacientes fueron heterocigotos para la variante mutada de
NUDT15, igual número de pacientes fueron heterocigotos para rs1800462 y rs1142345
de TPMT, en tanto que para rs1800460 se identificó a 6 pacientes heterocigotos. No se
identificó ninguna asociación estadísticamente significativa entre las variantes genéticas
y los desenlaces de interés.
Conclusiones: las variantes genéticas de NUDT15 y TPMT no mostraron asociación con
los efectos secundarios de mercaptopurina en la muestra de estudio. Se requieren
estudios con mayor tamaño poblacional así como la evaluación de otras variantes
genéticas que puedan influenciar el desarrollo de efectos secundarios durante la
quimioterapia de mantenimiento.
Palabras clave: (Leucemia linfoblástica aguda, Efectos Colaterales y Reacciones
Adversas Relacionados con Medicamentos, Farmacogenética, niños, tiopurinas ).
Fuente: DeCS server.Contenido X
Abstract
Objective: To correlate the genetic profile of the TPMT and NUDT15 genes with the side
effects of treatment in pediatric patients with Acute Lymphoblastic Leukemia who are
undergoing maintenance therapy at the HOMI Hospital de la Misericordia during 2017.
Methods: this is an analytical, longitudinal observational study in which the genotypes of
the TPMT and NUDT15 genes will be determined by allelic discrimination PCR with
TaqMan® probes to 70 patients who were receiving chemotherapy during the
maintenance phase in the Pediatric Hematology and Oncology Unit at HOMI Hospital de
la Misericordia during 2017. The sociodemographic and clinical characteristics
corresponding to the first 6 months of their maintenance chemotherapy have been
collected. And the correlation between the genotypes obtained and the development of
side effects of maintenance chemotherapy in these patients will be evaluated.
Results: a total of 70 patients were included in the present study, of these, genetic
analyzes were made for NUDT15 and TPMT (rs1800462 and rs1800460) to 68 patients,
while for the rs1142345 polymorphism, typing was achieved in 42 patients. 4/68 patients
were heterozygous for NUDT15, the same number of patients were heterozygous for
rs1800462 and rs1142345, while for rs1800460 6 heterozygous patients were identified.
No statistically significant association was identified between the genetic variants and the
outcomes of interest.
Conclusions: the genetic variants of NUDT15 and TPMT showed no association with the
side effects of mercaptopurine in the study sample. Studies with larger population size
are required as well as the evaluation of other genetic variants that may influence the
development of side effects during maintenance chemotherapy.
Keywords: Acute Lymphoblastic Leukemia, Drug-Related Side Effects and
Adverse Reactions, Pharmacogenetics, Children, Thiopurine. Source: DeCS
Server.Contenido XI
Contenido
Introducción ............................................................................................................................... 1
1. Marco Teórico ..................................................................................................................... 3
2. Pregunta de Investigación .............................................................................................. 7
3. Objetivos ............................................................................................................................... 8
4. Metodología ......................................................................................................................... 9
5. Resultados ......................................................................................................................... 15
6. Discusión ............................................................................................................................ 23
7. Conclusiones y recomendaciones .............................................................................. 26
8. Bibliografía ........................................................................................................................ 27Introducción
La leucemia linfoide aguda (LLA) es el cáncer que más comúnmente afecta a la
población pediátrica(1). En Estados Unidos corresponde al 26% de los casos de cáncer
en niños de 0-14 años(2). Según el informe nacional de la situación del cáncer infantil del
2015; en nuestro país, la primera causa de atención por cáncer en el grupo poblacional
entre 0 y 17 años, corresponde a “tumores malignos del tejido linfático, de los órganos
hematopoyéticos y de tejidos afines”(3).
Aunque en los países desarrollados se han logrado supervivencias hasta de 90%(4), la
realidad nacional es otra. Según los datos del registro poblacional del cáncer en Cali, la
supervivencia global a 5 años para todos los cánceres en niños correspondió a un 48%,
en tanto que para leucemias agudas fue de 41% para el periodo 1994-2003(5). Entre
1985 y 2008 se reportaron 13542 muertes por cáncer en niños, con una distribución de
mortalidad según tipos que cáncer así; las leucemias (48,6%), seguidas de tumores del
sistema nervioso central y linfomas(6).El informe nacional de la situación del cáncer
infantil del 2015, muestra porcentajes de mortalidad por leucemias de 48,3% para niños y
47,3% para niñas en le periodo 2005-2013(3).
Pese a lo mencionado, algunos centros de referencia, como la Fundación HOMI, Hospital
la Misericordia, han publicado resultados de tratamiento en niños con LLA con tasas de
supervivencia libre de eventos de 73,3% y supervivencia global 79,9% en un corte ínterin
del protocolo ALLIC 2009 (7), lo que lo proyecta como escenario propicio para el
desarrollo de investigaciones tendientes a la identificación de factores de riesgo, que
puedan presentar efectos sobre la respuesta a tratamiento y desarrollo de efectos
deletéreos de la terapia.
Aunque diversos estudios de farmacogenética en relación a la quimioterapia para LLA se
han llevado a cabo(8, 9), la representatividad de Latinoamérica en los mismos es pobre.¡Error! No se encuentra el origen de la referencia. 2
A la luz del conocimiento actual, el único hallazgo que puede motivar modificaciones en
el tratamiento es la presencia de polimorfismos del gen TPMT, los cuales se han visto
relacionados con menor requerimiento en la dosis de 6-mercaptopurina que aquellos que
tienen alelo silvestre. A la fecha la FDA (Food Drug Administration) sugiere la realización
de esta prueba antes de iniciar tratamiento, sin llegar al nivel de recomendación. En el
presente trabajo se evalúa si existe correlación entre los polimorfismos de los genes
TPMT y NUDT15 con la aparición de efectos secundarios del tratamiento en pacientes
pediátricos con Leucemia Linfoide Aguda que se encuentren en tratamiento de
mantenimiento en un centro de referencia en Bogotá, Colombia.1. Marco Teórico
La leucemia linfoblástica aguda (LLA) es el cáncer más frecuente en la edad pediátrica,
constituyendo hasta el 25% de casos de cáncer en niños menores de 15 años(1). Se
clasifica en dos grandes grupos según la célula de origen, 85% de los casos corresponde
a LLA de precursores de células B y en el 15% células T(10, 11). Se presenta con mayor
frecuencia en niños con ascendencia hispánica y caucásica que en aquellos de raza
negra(12).
Pocos factores de riesgo ambientales se han asociado con LLA en niños (exposición a
radiación y ciertos químicos); sin embargo, estas asociaciones explican solo una minoría
de los casos(4). De otro lado, se han descrito diversas condiciones genéticas que
aumentan el riesgo de LLA, tales como: Síndrome de Down(13), Neurofibromatosis(14),
Síndrome de Shwachman-Diamond(15), Síndrome de Bloom y la Ataxia
Telangiectasia(16). En este sentido, mediante los estudios de genoma completo (GWAS:
por su sigla en inglés) se han identificado variantes génicas en distintos genes –como:
ARID5B, CEBPE, GATA3 e IKZF1 – que están asociadas con un riesgo aumentado de
padecer LLA(4).
Uno de los grandes hitos en la terapia de niños con LLA fue el desarrollo del régimen
intensivo de 8 drogas, 8 semanas de inducción y consolidación, el mismo que fue la base
del régimen BFM (Berlín-Frankfurt-Münster), el cual es el núcleo de las terapias
contemporáneas para LLA (4). Desde la introducción de este régimen terapéutico, se han
venido desarrollando múltiples ensayos clínicos colaborativos que han logrado
importantes avances en la supervivencia de los pacientes con LLA, alcanzando tasas de
supervivencias total de hasta 90%(4, 17).Capítulo 1 4
Pese a las mejoras alcanzadas en supervivencia para la mayoría de pacientes
pediátricos, la recaídas ocurren entre el 15-20% y son una causa importante de
morbimortalidad en pacientes pediátricos con cáncer(9, 18). De otro lado, con la
quimioterapia intensiva adaptada al riesgo, los niños con LLA tienen una supervivencia
mayor al 80% a 5 años. En la mayoría de los ensayos multicéntricos de primera línea en
LLA en niños, hasta el 5% fallecen debido a los efectos secundarios tóxicos del
tratamiento(19, 20). Las muertes relacionadas al tratamiento ocurren durante episodios
recurrentes y prolongados de neutropenia y linfopenia debidas a drogas citotóxicas e
inmunosupresoras o porque la leucemia, por si misma, inhibe la recuperación de la
médula ósea durante la terapia de inducción, especialmente en pacientes catalogados
como lentos respondedores. (19, 21).
El avance tecnológico ha permitido la identificación de variaciones genómicas que
determinan patrones farmacogenómicos característicos, responsables de las diferencias
individuales observadas en la respuesta al tratamiento en términos de efectividad o de
toxicidad. La evaluación del perfil de expresión genética mediante la utilización de
diferentes técnicas moleculares comparativas, en el contexto de pacientes con LLA, ha
permitido la identificación de genes cuya expresión puede tener implicación en el
pronóstico, lo que permite la posibilidad de seleccionar el tratamiento específico
requerido por cada paciente (22, 23). Estudios iniciales, usando la técnica de los
microarreglos, permitieron establecer la relación entre la expresión de un pequeño
número de genes en las células leucémicas, con sensibilidad a glucocorticoides,
vincristina, asparaginasa y daunorrubicina, al igual que relación con resistencia cruzada a
la quimioterapia y respuesta al tratamiento con altas dosis de metotrexate (24). La mayor
parte de la información derivada del conocimiento más detallado de la genómica de esta
enfermedad, ha esclarecido la participación de genes en particular y/o polimorfismos
específicos, asociados a respuestas desfavorables en términos de toxicidad y asociación
con recaída. Han permitido además la validación del uso de características citogenéticas
puntuales, descritas en el abordaje inicial de estos pacientes, confirmando su uso actual
como marcadores de pronóstico y han permitido también determinar la existencia de
otros subgrupos con implicaciones terapéuticas(22). El porcentaje de anormalidades
detectadas por estudios citogenéticos oscila alrededor del 70%(10, 25).Capítulo 1 5
Diversos estudios de farmacogenética y farmacogenómica han sido desarrollados y se
encuentran en curso, con relación tanto a la respuesta al tratamiento como toxicidad de
los principales agentes quimioterapéuticos empleados en el tratamiento de LLA. De
estos, el que cuenta con mejor evidencia es la mercaptopurina. La mercaptopurina y la
tioguanina son esenciales el tratamiento de la LLA principalmente en la fase de
mantenimiento. Requieren la participación de una vía metabólica compleja para la
formación de los compuestos activos, que ejercen su citotoxicidad mediante su
incorporación al DNA y al RNA. Las moléculas originales o sus metabolitos tóxicos
pueden ser metilados por acción de la enzima tiopurina metiltransferasa (TPMT),
reduciendo sus niveles(25, 26). Algunos metabolitos metilados sin embargo, continúan
inhibiendo la síntesis de novo de purinas, sin perder su acción citotóxica(27). El principal
efecto adverso limitante de la dosis y que refleja los niveles intracelulares del metabolito
activo es la supresión de la médula, mientras que la hepatotoxicidad esta correlacionada
con la metilación de las moléculas primarias(28). Uno de cada 300 individuos tiene
deficiencia de TPMT, manifestando toxicidad severa e inclusive fatal posterior a la
administración de este tipo de medicamento. Se hereda como un rasgo autosómico
codominante (25). Aproximadamente el 10% de la población presenta polimorfismos que
influyen en la eficacia y toxicidad, además del riesgo posterior de neoplasias
secundarias. Los polimorfismos más frecuentemente hallados en el gen TPMT asociados
con baja actividad enzimática son TPMT*2238G>C (rs1800462), TPMT*3460G>A
(rs1800460) y TPMT*3C719A>G (rs1142345), asociándose a alto riesgo de
mielosupresión a dosis estándar(27).
Actualmente el genotipo TPMT es el único patrón farmacogenético con implicaciones en
protocolos de tratamiento, autorizado por la FDA para su realización en pacientes con
LLA, como sugerencia, para el tratamiento a base de estos medicamentos(53). En
pacientes con mutaciones homocigotas se requiere reducción de la dosis entre un 85-
90%(25, 27, 29, 30). Otros genes involucrados en el metabolismo de las tiopurinas han
sido evaluados con respecto a su comportamiento en LLA(27). Dentro de estos,
recientemente ha surgido el gen NUDT15 como un candidato importante en la predicción
de toxicidad(31).
Yang y col. mediante un estudio de GWAS y su respectiva cohorte de replicación,
identificaron dos loci relacionados con la intensidad de dosificación de mercaptopurina:
rs1142345 en el gen TPMT y rs116855232 en NUDT15. Esta ultima variante fue común
entre asiáticos e hispanos pero infrecuente entre europeos y no observada en africanos,Capítulo 1 6
contribuyendo así a las diferencias en la tolerancia a mercaptopurina relacionada con la
ancestría(32). En este mismo estudio, evidenciaron que los pacientes heterocigotos para
las variantes de TPMT o NUDT15, requirieron un una disminución del 50% de la dosis de
mercaptopurina comparados con los de genotipo silvestre(32). El mismo grupo de Yang,
basados en estos resultados replicaron posteriormente en cohortes de Guatemala,
Singapur y Japón estos resultados, adicionando estudios de genómica funcional, con los
que evidenciaron que la presencia de los SNPs resulta en una pérdida de la actividad
nucleótido difosfatasa, por lo que los pacientes con estos alelos defectivos de NUDT15,
presentan niveles elevados de metabolitos activos de tiopurina aumentando así su
toxicidad(33). El interés científico en este gen es creciente en los últimos años y ha
llevado a que se le asocie con reducciones de dosis de mercaptopurina en relación a la
edad(34), asociación con mielosupresión(35), con el desarrollo de toxicidad severa(36) y
la intolerancia a la mercaptopurina en grupos poblacionales específicos(37),
convirtiéndolo en un candidato importante a evaluar en estudios de farmacogenética
relacionados con tolerancia a mercaptopurina; aunque con menor soporte en la evidencia
que el TPMT.
La literatura en el tema abunda, pero poco hay descrito al respecto en poblaciones
latinoamericanas y los esfuerzos encontrados corresponden a estudios de replicación de
los hallazgos en otras latitudes. A la fecha no hay reportes publicados de aproximaciones
farmacogenómicas de la respuesta al tratamiento y toxicidad de quimioterapia para LLA
en población pediátrica de Colombia. Esto cobra aun más importancia, cuando se han
descrito diferencias farmacogenéticas relacionadas con la ancestría(38-41) y se ha
sugerido que estudios de corte farmacogenético deben ser realizados de manera
independiente o colaborativa en distintos países latinoamericanos para un mejor
entendimiento de estas relaciones(42).2. Pregunta de Investigación
¿Existe algún tipo de correlación entre los polimorfismos de los genes TPMT y NUDT15
con la aparición de efectos secundarios relacionados con el tratamiento de
mantenimiento en pacientes pediátricos con leucemia linfoide aguda tratados en la
Fundación HOMI Hospital de la Misericordia?¡Error! No se encuentra el origen de la referencia.apítulo 3 8
3. Objetivos
4.1. General
Correlacionar el perfil genético de los genes TPMT y NUDT15 con los efectos
secundarios del tratamiento en pacientes pediátricos con Leucemia Linfoide Aguda que
se encuentren en tratamiento de mantenimiento en la Fundación HOMI Hospital de la
Misericordia durante el 2017.
4.2 Específicos
4.2.1. Caracterizar clínica y epidemiológicamente a los sujetos de estudios incluidos en el
trabajo.
4.2.2. Determinar frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos de nucleotido
simple (SNPs: de su sigla inglés) rs1800462, rs1800460 y rs1142345 de TPMT y
rs116855232 de NUDT15.
4.2.3. Evaluar relaciones entre los alelos encontrados y la aparición de efectos
secundarios debidos al tratamiento, con enfasis en: neutropenia febril, interrupción o
disminución de mercaptopurina así como en los valores de laboratorio de seguimiento en
los sujetos de estudio.Capítulo 4 9
4. Metodología
5.1. Tipo:
Investigación primaria, cuya fuente de información fueron los pacientes y sus historias
clínicas.
5.2. Diseño:
Observacional analítico, corte longitudinal y seguimiento hasta seis meses posteriores al
inicio de la terapia de mantenimiento.*
5.3. Sitio de realización:
Unidad de Oncohematología Pediátrica, Fundación HOMI Hospital de la Misericordia.
5.4. Muestra y Población de estudio:
5.4.1. Población marco o de referencia:
Pacientes pediátricos con leucemia linfoide aguda que se encuentraban en tratamiento
en fase de mantenimiento durante el 2017.
5.4.2. Población de estudio:
Pacientes pediátricos con leucemia linfoide aguda que se encuentran en tratamiento en
fase de mantenimiento, atendidos en la Fundación HOMI Hospital de la Misericordia.
5.4.3. Población sujeto de estudio:
Pacientes que dentro de la población de estudio cumplieron con los criterios de selección
y quienes aceptaron participar en el estudio, fueron incluidos de manera consecutiva.
*nota aclaratoria: para fines del trabajo de grado el seguimiento para el análisis de datos corresponderá hasta
6 meses posteriores a la inclusión en el estudio, tal como se contempló en el proyecto macro que ha sido
aprobado para financiación por la Universidad Nacional. Sin embargo, el seguimiento a los pacientes
incluidos continuará hasta finalizar protocolo de tratamiento o desenlace fatal.Capítulo 4 10
5.4.3.1. Criterios de inclusión:
a. Edad menor de 18 años.
b. Diagnóstico confirmado de leucemia linfoide aguda B o T.
c. Diagnóstico realizado en la Fundación HOMI Hospital La Misericordia.
d. Pacientes que estén al menos en semana 20 de iniciado el mantenimiento largo.(29)
e. Consentimiento informado aceptando la participación en el presente estudio.
5.4.3.2. Criterios de exclusión:
a. Edad menor a 1 año.
b. Pacientes con síndrome de Down.
5.4.4. Muestra y muestreo:
Para el presente estudio, se realizó un muestreo por conveniencia incluyendo de manera
consecutiva todos los pacientes que cumplieron los criterios de selección y aceptaron
participar del mismo.
5.5. Operacionalización de variables:
Variable Definición Tipo Categorías Rango
Tiempo de vida en
años de cada
paciente teniendo
en cuenta la fecha Cuantitativa
Edad No aplica 1-18
de nacimiento, al continua
momento de inicio
de su fase de
mantenimiento
Cualitativa 0- Masculino
Género Hombre o mujer nominal NA
categórica 1-Femenino
0. Bogotá
Lugar de origen y Cualitatina
1. Remitido.
Procedencia procedencia del nominal NA
(dependiendo de
paciente categórica
orígenes se ampliará la
variable)
Cualitativa
Tipo de vinculación 1. Vinculado
Seguridad nominal NA
al sistema de salud 2. Contributivo
categórica
3. SubsidiadoCapítulo 4 11
Variable Definición Tipo Categorías Rango
Diagnóstico que
Cualitativa
Linaje motivo el manejo NA
nominal B o T
quimioterapeutico.
Dosis en mg/m2/día
recibida de Cuantitativa
Dosis Actual mercaptopurina al A definir
No aplica
momento de ingreso Intervalo
al estudio.
Requirio
modificacion en Cualitativa
Descenso de
descenso de la nominal NA
Dosis Si o No
dosis de categórica
Mercaptopurina
Suspensión de más
Cualitativa
Interrupción de de dos semanas de
nominal NA
Dosis la administración de Si o No
categórica
MP.
Dosis acumulada de
mercaptopurina
Dosis Cuantitativo
recibida por los A definir
Acumulada continua No aplica
pacientes a la
semana 20
Presencia o no de Cualitativa
Toxicidad cualquier tipo de nominal NA
Si o No
toxicidad categórica
Recuentos
leucocitarios
discriminados de
Recuentos cada control Cuantitativa
A definir
leucocitarios mensual durante la continua No Aplica
fase de
mantenimiento. (6
primeros meses)
Valores séricos de
AST y ALT de cada
control mensual Cuantitativa
Transaminasas A definir
durante la fase continua No Aplica
mantenimiento. (6
primeros meses)Capítulo 4 12
Variable Definición Tipo Categorías Rango
Valores séricos de
Bilirrubina Total,
Directa e Indirecta
Cuantitativa
Bilirrubinas de cada control A definir
continua No Aplica
mensual durante la
fase mantenimiento.
(6 primeros meses)
Desarrollo de
neutropenia febril
Cualitativa
durante el periodo
Neutropenia nominal NA
de seguimiento en Si o No
categórica
la fase de
mantenimiento.
Resultado de
genotipificación de
TPMT. Que se *1
Cualitatina
Genotipo obtiene de revisar *2
nominal NA
TPMT los apareamientos *3A
categórica
de los 3 diplotipos *3B
*3C
de cada uno de los
SNPs.
Resultado de Cualitativa
Genotipo CC
genotipificación de nominal NA
NUDT15 CT
NUDT15. categórica
TT
5.6. Recolección y manejo de la información y muestras:
Para el presente estudio, las muestras de sangre periférica empleadas para los ensayos
de genotipificación fueron conseguidas durante la toma programada de los exámenes
establecidos para seguimiento durante el tratamiento con el protocolo ALLIC 2009,
,adoptado en la institución Fundación HOMI Hospital la Misericordia, previo
consentimiento informado,. Los pacientes fueron seguidos hasta por seis meses para
identificar la aparición de efectos deletéreos debidos al tratamiento (mielo-supresión,
toxicidad hepática, muerte tóxica).
Este proyecto cuenta con los avales de los comité de ética de la Universidad Nacional
(Acta Núm. 015-184-16 de 25/08/16) y el Hospital de la Misericordia (CEI-38-16 de
11/08/16).Capítulo 4 13
5.7. Análisis Farmacogenético:
5.7.1. Extracción de ADN:
Para la extracción de ADN de las muestras de interés se empleó el estuche comercial
QIamp DNA Blood Mini Kit™, siguiendo las especificaciones del fabricante. En breve,
200μL de sangre total fueron sometidos a la serie de pasos descritos en la guía del
fabricante, mediante el empleo de la técnica de filtración en columna mediante micro-
centrifugación. La cuantificación del ADN se llevo a cabo mediante espectrofotometría en
un equipo Nanodrop2000™ y en este mismo equipo se realizaron las mediciones de la
razón 260/280nm para determinar la pureza del material genético. El material genético
obtenido se almacenó en tubos eppendorf™ de 1.5 mL a una temperatura de -20°C
hasta su empleo en los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
5.7.2. PCR en tiempo real:
La determinación de los genotipos de los SNP (rs1800462, rs1800460, rs1142345 y
rs116855232) en los genes TPMT y NUDT15 se realizará mediante PCR en tiempo real
de discriminación alélica por 5’ nucleasa basada en sondas TaqMan®, siguiendo las
recomendaciones descritas en “TaqMan® Allelic Discrimination Guide” y protocolos
previos. Para esto, emplearemos una mezcla de PCR que contenga: 15 ng ADN (3µL),
1.25µL de la sonda TaqMan®(20X) correspondiente, 12,5µL TaqMan® Gene Expression
Master Mix y 8.25µL de agua ultrapura libre de nucleasas para un volumen final por
reacción de 25μL, las muestras se corrieron por duplicado. Los ensayos fueron llevados
a cabo empleado el CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad),
siguiendo las condiciones de corrido sugeridas para cada sonda por el fabricante. Estos
ensayos se llevaron a cabo en las instalaciones del Instituto de Genética de la facultad de
Medicina de la Universidad Nacional, bajo la supervisión del Dr. Juan J Yunis.
5.8. Análisis de los datos:
Para el trabajo propuesto se presentarán los datos como medias más desviaciones
estándar para los casos de variables cuantitativas, en tanto que para los datos
cualitativos se presentarán sus respectivas frecuencias. Las frecuencias alélicas,
genotípicas y el equilibrio de Hardy-Weinberg se evaluarán mediante Arlequin v3.5. Para
la determinación de asociación entre las variantes genéticas y el desenlace de interés
(algún tipo de toxicidad) se empleará el estadístico Chi cuadrado o la prueba exacta deCapítulo 4 14
Fisher según la cantidad de datos obtenidos. Para la realización de comparaciones entre
grupos para el caso de variables cuantitativas se empelarán los estadísticos ANOVA de
una vía o Kruskal-Wallis según si los datos obtenidos sean paramétricos o no. Los
análisis estadísticos adicionales fueron realizados mediante SPSS para Mac versión 20,
y se tomó como estadísticamente significante un valor de p <0,05.Capítulo 4 15
5. Resultados
Características generales población de estudio.
Un total de 70 pacientes se incluyeron en el estudio. Hay un equilibrio en la
representación por género (Relación M:F 1:1), con una mediana de edad al momento de
ingresar a la fase de mantenimiento de 6 años (RIC: 7 años). Más del 50% de la
población de estudio es proveniente de Bogotá. En orden de frecuencia, los lugares de
origen de los pacientes que no provenían de Bogotá fueron: otros municipios de
Cundinamarca (n=15, 21.4%), Meta (n=5, 7.1%), Boyacá (n=4, 5.7%), Casanare (n=3,
4.3%) y Guajira, Huila y Tolima con un paciente cada uno. La tabla 1 resume las
características generales de la población de estudio.
Aunque no corresponde a los objetivos del estudio, se recuperó la información
relacionada a la frecuencia de desenlaces desfavorables (muerte, recaídas).
Encontramos una frecuencia de 15.7% de recaídas, de estas, el 63.6% correspondieron
a recaídas medulares y el 27.3% correspondió a recaídas combinadas (medular/testicular
la más frecuente). El 11.4% de los pacientes presentó neutropenia febril en la fase de
mantenimiento durante el periodo de estudio correspondiente a los seis primeros meses
de mantenimiento.
Tomando en consideración que la mayoría de nuestra población de estudio, corresponde
a pacientes cuya leucemia es de linaje B, se recuperó información respecto a
translocaciones frecuentes en esta patología, la finalidad de esto es emplearla como
cofactor y/o variable de asociación con los genotipos de interés y los desenlaces de
efectos secundarios.Capítulo 4 16
Tabla 1. Características generales de la población de estudio.
Medición
Característica
n o mediana % o RIC
Masculino 35 50%
Género
Femenino 35 50%
Edad (años cumplidos) 6 7
Contributivo 51 72.9%
Afiliación
Subsidiado 19 27.1%
Bogotá 40 57.1%
Procedencia Otras 30 42.9%
Otro 5 7.1%
B 65 92.9%
Linaje
T 5 7.1%
Estandar 7 10%
Riesgo Intermedio 34 48.6%
Alto 29 41.4%
Descenso 6MP 23 32.9%
Interrupción 6MP 20 28.6%
Neutropenia 8 11.4%
Recaída 11 15.7%
Muerte 2 2.9%
ALT (IU/L) 48.7 91.25
AST (IU/L) 37 25.3
Leucocitos/mm3 3315 1370
Labs 1 mes Mto
Neutrofilos/mm3 1820 1137.5
Linfocitos/mm3 780 690
Bilirrubina total (mg/dL) 0.5 0.3
ALT (IU/L) 42.5 97.5
AST (IU/L) 33.55 31.125
Leucocitos/mm3 3060 2160
Labs 2 mes Mto
Neutrofilos/mm3 1721 1682.5
Linfocitos/mm3 630 675
Bilirrubina total (mg/dL) 0.5 0.3
ALT (IU/L) 47 98.475
AST (IU/L) 34 37
Leucocitos/mm3 3095 1487.5
Labs 3 mes Mto
Neutrofilos/mm3 1615 1196.5
Linfocitos/mm3 742 546
Bilirrubina total (mg/dL) 0.5 0.4
ALT (IU/L) 50.35 76.425
Labs 4 mes Mto
AST (IU/L) 32.55 23.308Capítulo 4 17
Medición
Característica
n o mediana % o RIC
Leucocitos/mm3 3400 1640
Neutrofilos/mm3 1940 1276.75
Linfocitos/mm3 760 565
Bilirrubina total (mg/dL) 0.6 0.425
ALT (IU/L) 50.8 116.9
AST (IU/L) 37 42.1
Leucocitos/mm3 3360 1700
Labs 5 mes Mto
Neutrofilos/mm3 1850 1707.5
Linfocitos/mm3 840 465
Bilirrubina total (mg/dL) 0.6 0.465
ALT (IU/L) 65.1 101.9
AST (IU/L) 39.8 36.2
Leucocitos/mm3 3370 1920
Labs 6 mes Mto
Neutrofilos/mm3 1830 1674.5
Linfocitos/mm3 910 636
Bilirrubina total (mg/dL) 0.6 0.5
Frecuencias alélicas y genotípicas.
Del total de 70 pacientes incluidos en el estudio, se obtuvo material genético con calidad
y cantidad adecuada en 68 casos (concentraciones desde 10 hasta 129 ng/µL y una
razón 260/280nm promedio de 1.87 -valores óptimos entre 1.8 y 2.0-(43, 44)), para los
otros dos casos aunque se llevo a cabo la extracción de ADN en dos oportunidades no
se obtuvo material genético con las condiciones de calidad para llevar a cabo los
ensayos de Reacción en Cadena de la Polimerasa.
En total, 14 pacientes portaron un alelo mutado de cualquier tipo: 4 para NUDT15, 4 para
el rs1800462 (TPMT), 6 para rs1800460 (TPMT), y de éstos últimos, 4 adicionalmente
portaban un alelo mutado para rs1142345 de TPMT.
Tabla 2. Frecuencias alélicas y genotípicas de los polimorfismos de interés.
TPMT
NUDT15 (n=68)
rs116855232
rs1800462(n=68) rs1800460 (n=68) rs1142345 (n=42)
Alelos C 132 C 132 T 6 C 4
T 4 G 4 C 130 T 80Capítulo 4 18
TPMT
NUDT15 (n=68)
rs116855232
rs1800462(n=68) rs1800460 (n=68) rs1142345 (n=42)
C/C 64 C/C 64 T/T 0 C/C 0
Genotipos
C/T 4 C/G 4 T/C 6 C/T 4
T/T 0 G/G 0 C/C 62 T/T 38
Se describen en la primera fila las frecuencias para cada alelo de los SNPs de interés en cada
sujeto de estudio. En la segunda fila las frecuencias de las respectivas combinaciones alélicas.
Del polimorfismo de NUDT15 (rs116855232) se logró genotipificar a los 68 pacientes de
los que se obtuvo material genético con los criterios de calidad como previamente se
describió. Para este polimorfismo, se considera como alelo mutado -que confiere
susceptibilidad a la toxicidad por mercaptopurina- el T, en tanto que C es considerado el
silvestre. Un total de cuatro pacientes portó un alelo mutado (T) en estado heterocigoto
(Frecuencia Alélica: 0.03) en tanto que, el alelo silvestre (C) tuvo una frecuencia alélica
de 0.97. Cabe resaltar que no identificamos combinaciones del alelo mutado en forma
homocigota (T/T) e identificamos frecuencias genotípicas para C/C y C/T de 0.94 y 0.06
respectivamente.
En relacion al gen TPMT se logró genotipificar al total de 68 muestras para los
polimorfismos rs1800462 y rs1800460, en tanto que, para el caso del tercer polimorfismo
(rs1142345) se logró tipificar a 42 pacientes, de los restantes 26 no se obtuvo
amplificación en dos ensayos independientes de PCR. Al evaluar las posibles dificultades
técnicas relacionadas con esto, se identificó que las sondas TaqMan® especificas para
este polimorfismo presentaron degradación. Para el caso del polimorfismo rs1800462 de
TPMT se identificó a 4 pacientes con genotipo heterocigoto portando un alelo mutado
(G), con las siguientes Frecuencias Alélicas: C 0.97 y G de 0.03; Por su parte , las
frecuencias gemotípicas para este polimorfismo fueron: C/C 0.94, C/G 0.06 y G/G de 0.
Las frecuencias alélicas identificadas para el polimorfismo rs1800460 fueron T (mutado)
de 0.04 y C (silvestre) 0.96, con frecuencias genotípicas para T/T, T/C y C/C de 0, 0.09 y
0.91, respectivamente. Solo dos pacientes presentaron exclusivamente el alelo mutado
para rs1800460, los otros cuatro adicionalmente portaron el alelo mutado para para
rs1142345. Finalmente, para el último polimorfismo de TPMT (rs1142345), se identificó
una frecuencia alélica para el alelo mutado (C) de 0.05 y de 0.95 para el silvestre (T), noCapítulo 4 19
se identificó ningun caso de paciente homocigoto para el alelo mutado y frecuencias
genotípicas para C/T y T/T de 0.095 y 0.905, respectivamente.
La figura 1 muestra algunos ejemplos de las gráficas de discriminación alélica para cada
uno de los polimorfismos. Un hallazgo interesante, fue el que ninguno de los pacientes
que portaba un alelo mutado para el polimorfismo del gen NUDT15 fue portador de
ningun alelo mutante de los polimorfismos del gen TPMT. La tabla 2 muestra el resumen
de las frecuencias alélicas y genotípicas de cada uno de los polimorfismos de interés.
Todos los polimorfismos se encontraron en equilibrio de Hardy-Weinberg. La tabla 3
resume la tipificación de TPMT siguiendo los estandares del “Clinical Pharmacogenetics
Implementation Consortium” en los 42 pacientes en los que se logró la tipificación de los
3 SNPs (53). Esta clasificación se lleva a cabo identificando las posibles combinaciones
de haplotípicas de los polimorfismos rs1800462, rs1800460 y rs1142345 así: *1=CCT,
*2=GCT, *3A=CTC, *3B=CTT Y *3C=CCC (53).
Figura 1. Gráficas de discriminación alélica para cada uno de los polimorfismos.Capítulo 4 20
Tabla 3. Tipificación de TPMT
Frecuencias
*1 78
Haplotipos *2 2
*3A 4
*1/*1 36
Tipos *1/*2 2
*1/*3A 4
Correlación de los genotipos con los efectos secundarios de la quimioterapia.
La tabla 4 resume los resultados de los análisis bivariados en los que se evaluó la
correlación entre las variantes genéticas de los polimorfismos de interés en NUDT15 y
TPMT con los desenlaces de efectos secundarios de interés. No se evidenció ninguna
asociación entre los desenlaces de interés y la variante genética de NUDT15. Similares
análisis fueron llevados a cabo en relación a la tipificación de TPMT, empleando como
variable la homocigosidad para *1 versus portar *2 o *3A como heterocigoto, sin
evidenciarse ninguna asociación estadísticamente significativa (datos no mostrados).
Aunque no se identificaron asociaciones significativamente estadísticas, dos de los
cuatro pacientes heterocigotos para NUDT15 requirieron ajuste en descenso de
mercaptopurina durante el periodo de seguimiento. En relación a las variantes genéticas
de TPMT, para rs1800462 dos de los cuatro pacientes heterocigotos presentaron
neutropenia febril y estos mismos pacientes adicionalmente requirieron interrupción de la
mercaptopurina durante los primeros seis meses de mantenimiento; para el caso de
rs1800460, de los seis pacientes que fueron heterocigotos tres requirieron descenso de
dosis, de estos pacientes que requirieron descenso, dos pacientes también fueron
heterocigotos para rs1142345.
Adicionalmente, se evaluaron las diferencias de medianas en los valores de los
paraclínicos tomados en los primeros 6 meses de tratamiento de mantenimiento:
aminotransferasas, bilirrubina total, leucocitos y diferencial; con base a las variantesCapítulo 4 21
genéticas, sin encontrarse diferencias estadísticamente significativas (datos no
mostrados).
Tabla 4. Análisis de correlación genotipos con desenlaces secundarios.
NUDT15 TPMT
n=68 rs1800462 n=68 rs1800460 n=68 rs1142345 n=42
C/C C/T p C/C C/G p C/C T/C p T/T C/T p
Descenso
Si 21 2 0.559 22 1 1.000 20 3 0.399 8 2 0.236
No 43 2 42 3 42 3 30 2
Interrupción
Si 19 1 1.000 18 2 0.575 19 1 0.662 10 0 0.557
No 45 3 46 2 43 5 28 4
Neutropenia
Si 7 1 0.401 6 2 0.065 8 0 1.000 5 0 1.000
No 57 3 58 2 54 6 33 4
Recaída
Si 8 1 0.441 8 1 0.441 9 0 1.000 5 0 1.000
No 56 3 56 3 53 6 33 4
Muerte
Si 1 1 0.115 2 0 1.000 2 0 1.000 2 0 1.000
No 63 3 62 4 60 6 36 46. Discusión
En nuestro conocimiento, este es el primer estudio en el país, que evalúa los
polimorfismos de los genes NUDT15 y TPMT y describe su correlación con los efectos de
la quimioterapia en paciente pediátricos con Leucemia Linfoide Aguda. Identificamos una
frecuencia de efectos secundarios durante la quimioterapia de mantenimiento: 32.9%
requirió un descenso de la dosis de 6-MP, 28.6% requirió una interrupción del tratamiento
con 6-MP, y 11.4% neutropenia febril.
La frecuencia alélica para la mutación de NUDT15 identificada en nuestro estudio (0.03)
es más baja que las previamente reportadas (32, 45-47). Una posible explicación para
este hallazgo es que la mayoría de estudios sobre este polimorfismo han sido
desarrollados en población de origen asiático, encontrándose en ellos frecuencias
alélicas de hasta 0.27, otra razón puede ser nuestro tamaño de muestra. (37, 48). Para
el caso particular de los polimorfismos de TPMT, solo un estudio ha sido realizado
previamente en población colombiana, en el cual Isaza y col. describen unas frecuencias
para *2 y *3A de 0.004 y 0.035 respectivamente(49), más baja que las encontradas por
nosotros (0.02 y 0.05 respectivamente). Al compararla con otros resultados
latinoamericanos, encontramos que nuestras frecuencias también son ligeramente
diferentes a las descritas por Garrido y col. en pacientes pediátricos con leucemia linfoide
aguda de Guatemala, en quienes identificaron una frecuencia de 0.005 para *2 y 0.0375
para *3A(50). Sin embargo, nuestra frecuencia encontrada de*2 es similar a la
encontrada en Brasil por Boson y col.(51), quienes describen una frecuencia de 0.022
para *2, pero una mucho menor para *3A (0.015). más recientemente, en paciente
pediátricos uruguayos que padecen leucemia linfoide aguda, se ha identificado una
frecuencia similar a la nuestra de *3A (0.05) pero una más baja de *2(52). Una posible
explicación para estas diferencias es que en nuestro caso debido a inconvenientesDiscusión 24
técnicos no hemos logrado terminar la tipificación del polimorfismo rs1142345 en 26
muestras, lo cual podría modificar significativamente las frecuencias de las variaciones
genéticas en TPMT.
Evidencia creciente resalta el papel de las variantes genéticas en NUDT15 con el
desarrollo de efectos secundarios de toxicidad por mercaptopurina(32, 33, 47, 52). Sin
embargo, al evaluar las posibles asociaciones en nuestra población de estudio, no
logramos identificar ninguna estadísticamente significativa, posiblemente por el tamaño
de la muestra. En relación a TPMT hay evidencia que soporta su papel tanto en la
farmacocinética como en los efectos tóxicos de la tioguanina(29, 53). En nuestro estudio
no encontramos ninguna asociación ni entre las frecuencias alélicas de cada
polimorfismo ni en aquellos 42 casos en los que actualmente contamos con la tipificación
completa de TPMT. Por otro lado, no se encontraron diferencias estadísticamente
significativas entre las medianas de los diferentes laboratorios de seguimiento cuando se
compararon con base a los genotipos de interés de cualquiera de los dos genes. Dentro
de las posibles razones que explicarían esto, estarían para el caso de NUDT15 el que los
estudios originales están basados en aproximaciones de secuenciación de genomas
completo(32), en los que la representatividad de población latina sea baja y se pueda
deber a un efecto relacionado con ancestría específica para población colombiana(54).
Por su parte para el caso de TPMT podría explicarse con que los tipos encontrados en
nuestra población (*2 y *3A) corresponden a metabolizadores intermedios que
usualmente no requieren muchos ajustes en terapia(53).
De manera exploratoria, evaluamos si existía asociación entre las variantes genéticas
estudiadas y los desenlaces: recaídas o muerte, revisados estos a octubre de 2018; sin
evidenciarse ninguna correlación. Lo cual concuerda con lo descrito por Lennard y col.
quienes tras realizar genotipificación de TPMT en 2387 pacientes con leucemia linfoide
aguda no encontraron asociación con la supervivencia libre de eventos(55).
Dentro de las limitaciones del presente se estudio, se encuentran: el tamaño de la
muestra, el sesgo de selección al ser una muestra cautiva. Sin embargo, los pacientes
fueron incluidos de manera prospectiva y consecutiva lo que permitió un mejor
seguimiento del desarrollo de eventos adversos de interés. De otro lado, otra gran
fortaleza del presente estudio es el enfoque Translacional, partiendo de observacionesDiscusión 25
clínicas previas y la evaluación de aspectos básicos biomédicos que pudieran darle
respuesta.Discusión 26
7. Conclusiones y recomendaciones
Las frecuencias alélicas de los genes de interés son diferentes a las previamente
descritas, incluso al compararla con estudios latinoamericanos. No encontramos ningún
tipo de asociación con eventos de toxicidad para ningunos de los polimorfismos de
estudio. Esto orienta a la necesidad de estudios futuros en los que se incluyan más
pacientes, se evalúe la posibilidad de que otros genes puedan estar influenciando
relaciones de este tipo, así como el efecto que la ancestría pueda tener.
Este tipo de estudios promueven el objetivo de la medicina translacional, integrar la
investigación básica y aplicarla a la clínica, para solucionar problemas puntuales en
beneficio del paciente.8. Bibliografía
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