Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y descripción histopatológica en tres grupos etarios
Autor: Acosta Murillo, Nancy Rocío
Asesor: Maya Hijuelos, Luís Carlos (Thesis advisor)
Fecha: 2016
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: La lesión renal aguda (LRA) sigue siendo un serio problema clínico para los niños hospitalizados en las Unidades de Cuidado Intensivo Pediátrico (UCIP) y su ocurrencia va en aumento, con una incidencia variable, que va de 4.5 – 85%, dependiendo de la definición usada y un riesgo 2 – 3 veces mayor de mortalidad que quienes no la desarrollan. La lesión renal isquémica ocurre a menudo en el contexto de un fallo multiorgánico, choque, hipovolemia y sepsis y sus principales componentes fisiopatológicos, descritos tanto en modelos animales como en humanos adultos implican múltiples alteraciones. Sin embargo, a pesar de diversos avances en este sentido, no se conoce si el comportamiento fisiopatológico en la población pediátrica es similar y si en consecuencia la identificación, evolución e intervención de la LRA podrían ser comparables. Una mejor comprensión de los procesos celulares subyacentes a la lesión y reparación renal podrían traducirse en el diseño de terapias más específicas para prevenir la lesión, acelerar la reparación, y minimizar la enfermedad renal crónica progresiva. Se necesitan descripciones histopatológicas en niños para conocer si podrían igualmente beneficiarse de las mismas medidas de prevención y tratamiento dirigidas a ésta grave patología.  Se realizó un experimento no controlado, utilizando modelos murinos del Bioterio de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, se realizó clampeo de la arteria renal, con el fin de evaluar los mecanismos subyacentes de isquemia, posteriormente se permitió la reperfusión, para determinar los efectos de esta. Con el fin de correlacionar con los pacientes pediátricos, que presentan disfunción renal en LRA. Se analizaron un total de 30 ratas, las cuales se distribuyeron según la edad de forma equitativa adicionalmente se tomaron de cada grupo 5 casos y 5 controles. Se realizó análisis patológico a 45 especímenes, con hallazgos variables. Se clasificaron las características histopatológicas utilizando la escala de Goujon.  Los hallazgos encontrados en el modelo murino estudiado acerca de la medición de la creatinina, son concordantes con lo evidenciado en la literatura, acerca de no ser un marcador ideal de la función renal, existiendo así otros marcadores más sensibles a la injuria renal. Llama la atención, en el modelo histopatológico, el hallazgo de necrosis adrenal como posible efecto protector en la lesión por isquemia/ reperfusión planteando futuros estudios e intervenciones en este campo.

Modelo murino comparativo
pediátrico de injuria renal aguda
isquémica y descripción
histopatológica en tres grupos
etarios
Nancy Rocío Acosta Murillo
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Pediatría
Bogotá, Colombia
2016
Parte de este trabajo fue financiado gracias a la CONVOCATORIA DEL PROGRAMA
NACIONAL DE PROYECTOS PARA EL FORTALECIMIENTO DE LA INVESTIGACIÓN, LA
CREACIÓN Y LA INNOVACIÓN EN POSGRADOS DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE
COLOMBIA 2013-2015
Código: 28075Modelo murino comparativo
pediátrico de injuria renal aguda
isquémica y descripción
histopatológica en tres grupos
etarios
Nancy Rocío Acosta Murillo
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Especialista en Cuidado Intensivo Pediátrico
Directores:
Lic. Biol. Zulma Janeth Dueñas Gómez, MSc. PhD.
Dr. Luís Carlos Maya Hijuelos, MD. Intensivista Pediatra.
Línea de Investigación:
Fisiología aplicada al Cuidado Crítico
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Pediatría
Bogotá, Colombia
2016Los sonidos más dulces que
perciben los mortales provienen de un hogar,
el cielo y las palabras de una madre.Agradecimientos
Resulta difícil la tarea de agradecer a tantas personas que gentilmente creyeron en mí y
en éste proyecto que nunca fue imposible.
Ante todo a mi principal maestro en el camino del Cuidado Intensivo Pediátrico, al Dr.
Luís Carlos Maya Hijuelos que siempre me escuchó, apoyó y animó a seguir en los
momentos difíciles. A la Dra. Zulma Janeth Dueñas Gómez, quien desde hace años me
ha enseñado que todo es posible. Sin duda al maestro de vida, Dr. Luís Eduardo Cruz
Martínez, por creer categóricamente en mí y en mis capacidades. Al Dr. Miguel Eduardo
Martínez, a quien le debo su complicidad en todas mis aventuras académicas.
Al Dr. Luís Fernando Ospina QF. MSc. PhD Farmacia, a Mável Ximena Machacado, MSc
(c) en Fisiología, a Ana Judith Otálora, MSc (c) en Farmacología, y a Flor Elena
Chavarro, MSc en Fisiología, quienes con su invaluable ayuda me hicieron ver la luz
cuando más oscuro estaba el camino.
A don Arturo Cortés Tovar, quien con su enorme paciencia y palabras de grandeza, como
un padre me guío sabiamente desde el bioterio en mis inicios en experimentación animal.
A Alba Rocío González Ariza y Diana Arias Rojas, que con su nobleza, determinación y
temple, nunca dudaron en empujarme a continuar.
Y sin duda a mis amigos y familia, a quienes les robé tiempo para compartir, en especial
a Laura Catalina, su compromiso y su incondicionalidad fueron únicos. Y a mi madre, por
todo su inmenso amor, a quien le debo todos mis objetivos de vida y a quien amo y
admiro sin límites….Resumen y Abstract IX
Resumen
La lesión renal aguda (LRA) sigue siendo un serio problema clínico para los niños
hospitalizados en las Unidades de Cuidado Intensivo Pediátrico (UCIP) y su ocurrencia
va en aumento, con una incidencia variable, que va de 4.5 – 85%, dependiendo de la
definición usada y un riesgo 2 – 3 veces mayor de mortalidad que quienes no la
desarrollan. La lesión renal isquémica ocurre a menudo en el contexto de un fallo
multiorgánico, choque, hipovolemia y sepsis y sus principales componentes
fisiopatológicos, descritos tanto en modelos animales como en humanos adultos implican
múltiples alteraciones. Sin embargo, a pesar de diversos avances en este sentido, no se
conoce si el comportamiento fisiopatológico en la población pediátrica es similar y si en
consecuencia la identificación, evolución e intervención de la LRA podrían ser
comparables. Una mejor comprensión de los procesos celulares subyacentes a la lesión
y reparación renal podrían traducirse en el diseño de terapias más específicas para
prevenir la lesión, acelerar la reparación, y minimizar la enfermedad renal crónica
progresiva. Se necesitan descripciones histopatológicas en niños para conocer si podrían
igualmente beneficiarse de las mismas medidas de prevención y tratamiento dirigidas a
ésta grave patología.
Se realizó un experimento no controlado, utilizando modelos murinos del Bioterio de
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, se realizó
clampeo de la arteria renal, con el fin de evaluar los mecanismos subyacentes de
isquemia, posteriormente se permitió la reperfusión, para determinar los efectos de esta.
Con el fin de correlacionar con los pacientes pediátricos, que presentan disfunción renal
en LRA. Se analizaron un total de 30 ratas, las cuales se distribuyeron según la edad de
forma equitativa adicionalmente se tomaron de cada grupo 5 casos y 5 controles. Se
realizó análisis patológico a 45 especímenes, con hallazgos variables. Se clasificaron las
características histopatológicas utilizando la escala de Goujon.X Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Los hallazgos encontrados en el modelo murino estudiado acerca de la medición de la
creatinina, son concordantes con lo evidenciado en la literatura, acerca de no ser un
marcador ideal de la función renal, existiendo así otros marcadores más sensibles a la
injuria renal. Llama la atención, en el modelo histopatológico, el hallazgo de necrosis
adrenal como posible efecto protector en la lesión por isquemia/ reperfusión planteando
futuros estudios e intervenciones en este campo.
Palabras clave: Lesión Renal Aguda, Medicina Translacional, Modelo animal, Cuidado
Intensivo Pediátrico, Fisiología renal comparativa, Creatinina, Necrosis Tubular Aguda
Abstract
Acute kidney injury (AKI) remains a serious clinical problem for children hospitalized in
the Pediatric Intensive Care Units (PICU) and its occurrence is increasing, with a variable
incidence, ranging from 4.5 - 85%, depending on the definition used, and with a mortality
risk 2-3 times higher than those who did not develop. The ischemic kidney injury often
occurs in the context of multiple organ failure, shock, hypovolemia and sepsis and its
main pathophysiological components described both in animal models and in adult
humans involving multiple alterations. However, despite many advances in this sense, it
is not known if the physiopathological behavior in the pediatric population is similar and if
consequently the identification, development and involvement of the AKI could be
comparable. A better understanding of the cellular processes underlying the renal injury
and repair could lead to the design of more specific therapies to prevent injury, speed up
repair and minimize the progressive chronic kidney disease. Histopathological
descriptions are needed to determine whether children could also benefit from those
measures aimed at preventing and treating this serious condition.
An uncontrolled experiment was performed using murine models of the Veterinary
Medicine and Animal Husbandry of the Universidad Nacional de Colombia, clamping of
the renal artery was performed in order to assess the underlying mechanisms of
ischemia-reperfusion, to correlate with pediatric patients with renal dysfunction ARI. AContenido XI
total of 30 rats were tested, equally age distributed in group of 5 cases and 5 controls.
Pathological analysis of 45 specimens, with variable findings was performed. The
histopathologic features were classified using the scale of Goujon.
The findings in creatinine levels are consistent with that observed in the literature, but not
be an ideal marker of renal function and therefore existing other more sensitive renal
injury markers. It draws to our attention, the findings of adrenal necrosis as a possible
protective effect on ischemia-reperfusion considering future studies and interventions in
this field.
Keywords: Acute Kidney Injury, Translational Medicine, Animal model, Pediatric
Intensive Care, Renal Comparative Physiology, Creatinine, Acute Tubular NecrosisContenido XIII
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... IX
Lista de figuras ............................................................................................................. XV
Lista de tablas ............................................................................................................ XVII
Introducción .................................................................................................................... 1
1. Fisiopatología de la lesión renal aguda isquémica ................................................ 3
2. Modelos animales en lesión renal aguda isquémica ........................................... 17
3. Modelo animal en lesión renal aguda isquémica pediátrica ............................... 29
3.1 Objetivo principal .............................................................................................. 29
3.2 Objetivos específicos ....................................................................................... 29
3.3 Materiales y métodos ....................................................................................... 29
3.4 Metodología ..................................................................................................... 33
3.4.1 Mantenimiento de los animales ...................................................................... 33
3.4.2 Preparación para el experimento ................................................................... 34
3.4.3 Procedimiento Quirúrgico para LRA ............................................................... 34
3.4.4 Cirugía ............................................................................................................. 35
3.4.5 Isquemia renal ................................................................................................. 37
3.4.6 Seguimiento isquemia-reperfusión (IR) .......................................................... 38
4. Análisis estadístico ................................................................................................ 41
4.1 Resultados ....................................................................................................... 41
4.1.1 Características ............................................................................................... 41
4.1.2 Evaluación de función renal ........................................................................... 42
4.1.3 Análisis patológico ......................................................................................... 43
5. Discusión ................................................................................................................ 51
6. Conclusiones .......................................................................................................... 59
A. Anexo: Comparación Sistema Urinario Humano vs. Murino ............................... 61
B. Anexo: Comparación Sistema Urinario Humano vs. Murino ............................... 63XIV Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
C. Anexo: Comparación Sistema Urinario Humano vs. Murino ...............................65
D. Anexo: Comparación Sistema Urinario Humano vs. Murino ...............................66
E. Anexo: Descripción inyección intra-peritoneal ....................................................67
F. Anexo: Descripción de anestésicos ......................................................................69
G. Anexo: Descripción de anestésicos ......................................................................75
H. Anexo: Descripción toma de sangre retro-orbital ................................................81
I. Anexo: Método de procesamiento de la sangre ...................................................83
J. Anexo: Método de evaluación histopatológica .....................................................84
K. Anexo: Presupuesto ...............................................................................................86
L. Anexo: Consideraciones Éticas .............................................................................87
M. Anexo: Aval Comité de Ética Universidad Nacional de Colombia .......................91
N. Anexo: Conflictos de interés ..................................................................................93
Bibliografía .....................................................................................................................95Contenido XV
Lista de figuras
Pág.
Figura 1-1: Interacción entre eventos microvasculares y tubulares que contribuyen a la
patología de la LRA isquémica .................................................................. 6
Figura 1-2: Ilustración esquemática de los mediadores inflamatorios producidos por las
células epiteliales tubulares y leucocitos activados en la lesión por
isquemia- reperfusión (LIR). ...................................................................... 7
Figura 1-3: Ilustración esquemática del ciclo de daño celular epitelial tubular y la
reparación renal tras lesión por isquemia/reperfusión ................................ 9
Figura 1-4: Fases fisiológicas de LRA después de la lesión por isquemia -
reperfusión. ............................................................................................. 11
Figura 1-5: Efectos clínicos de la LRA tanto a corto plazo y los efectos clínicos a largo
plazo. ....................................................................................................... 12
Figura 1-6: Potencial curso de un paciente que sobrevive a un episodio de LRA. ERA:
enfermedad renal aguda; ERC: enfermedad renal crónica; ERT:
enfermedad renal terminal. ...................................................................... 13
Figura 1-7: Posibles mecanismos de cambios crónicos inducidos por
isquemia/reperfusión (I/R). ....................................................................... 15
Figura 1-8: Procesos fisiopatológicos potenciales involucrados en LRA/ERA/vía
ERC. ........................................................................................................ 15
Figura 2-1: Una comparación de las fortalezas y debilidades de los modelos
disponibles de insuficiencia renal aguda, utilizando una escala relativa.
NTA, necrosis tubular aguda. .................................................................. 17
Figura 2-2: Tipos de modelo animal de lesión renal por isquemia-reperfusión. .......... 18
Figura 2-3: Efecto de la lesión renal por isquemia-reperfusión en el flujo sanguíneo
renal regional.. ......................................................................................... 21
Figura 3-1: Ratas lactantes en compañía de la madre para asegurar la lactancia. .... 33
Figura 3-2: Equivalencia de edades Ratas : Humanos. ............................................. 34
Figura 3-3: Sitio de inyección intra-peritoneal. ........................................................... 35XVI Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Figura 3-4: Esquema de los sitios de incisión en el flanco del modelo unilateral para
lesión renal aguda isquémica en rata. Los sitios de incisión están
marcados con una línea roja en el lado derecho (B) e izquierdo (A). ........ 36
Figura 3-5: Sitio de incisión en el flanco del modelo unilateral para lesión renal aguda
isquémica en rata. .................................................................................... 36
Figura 3-6: En un primer tiempo quirúrgico se realizó el clampeo unilateral del pedículo
vascular renal. En un segundo tiempo quirúrgico a las 72 horas del
procedimiento inicial se procedió al retiro de ambos riñones en el caso de
los grupos caso y de uno de los dos (2) riñones en el caso de los grupos
control. ..................................................................................................... 37
Figura 3-7: Cambio de color del riñón a púrpura oscuro luego del tiempo total de
isquemia. .................................................................................................. 38
Figura 3-8: Toma de sangre del seno retro-orbital. ..................................................... 39
Figura 5-1: Mecanismos que aumentan la incidencia de LRA con la edad. ................ 56Contenido XVII
Lista de tablas
Pág.
Tablas 2-1: Alteraciones que sugieren que la isquemia renal lleva a lesión y disfunción
de células endoteliales ............................................................................ 22
Tabla 2-2: Retos y soluciones potenciales para la translación de estudios de
condicionamiento isquémicos “del banquillo a la cama” ........................... 23
Tabla 3-1: Tabla de variables. .................................................................................. 30
Tabla 4-1: Distribución de peso pre y posintervención de acuerdo a las edades. ..... 42
Tabla 4-2: Valores de creatinina pre y pos de acuerdo a grupo de casos y controles,
en la población general y de acuerdo a los días de edad. ....................... 43
Tabla 4-3: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón. ....................................................................................................... 44
Tabla 4-4: Distribución de especímenes quirúrgicos de acuerdo a la escala de
Goujon ......................................................................................................45
Tabla 4-5: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón, de acuerdo al grupo de intervención y control. ............................... 45
Tabla 4-6: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón, de acuerdo al grupo de intervención y el total de especímenes no
intervenidos. ............................................................................................ 46
Tabla 4-7: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón, de acuerdo al grupo de intervención y el total de especímenes no
intervenidos en los participantes de 10 días de edad. .............................. 47
Tabla 4-8: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón, de acuerdo al grupo de intervención y el total de especímenes no
intervenidos en los participantes de 20 días de edad. .............................. 48
Tabla 4-9: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón, de acuerdo al grupo de intervención y el total de especímenes no
intervenidos en los participantes de 30 días de edad. .............................. 49Introducción
Si la función depende de la forma, entonces se deduce que los mecanismos que se
invocan para dilucidar la disfunción renal en LRA también deben explicar las alteraciones
morfológicas. En este sentido, la necrosis tubular aguda es un término equivocado,
porque la necrosis franca de las células del túbulo rara vez se encuentran en la LRA
humana. Esta aparente disparidad entre el deterioro severo de la función renal y dichos
cambios histológicos relativamente sutiles tradicionalmente han sido una “molestia”, dado
que ofrecen poca correlación fisiopatológica.
En estudios realizados en ratas adultas de diferentes edades se encontró que después
de la isquemia-reperfusión, la urea sérica y los niveles de creatinina fueron mayores en
ratas de edad avanzada que en ratas jóvenes, lo cual se planteó relacionado con el
potencial antioxidante del plasma ya que fue menor en las ratas mayores que en ratas
jóvenes. Otro aspecto interesante evaluado en recientes estudios es el papel de las
hormonas sexuales y como afectan la estructura y función de los órganos específicos de
género.
A pesar de estos avances y el establecimiento de diferencias entre grupos por edad y
sexo, los mecanismos que subyacen a estos recientes hallazgos morfológicos y sus
implicaciones para la consecuente disfunción renal profunda no se han investigado en
niños. Poco se conoce si el comportamiento clínico a diferentes edades obedece a éstas
diferencias fisiopatológicas. Bajo ésta perspectiva, resulta novedoso describir si estas
diferencias funcionales renales evolutivas en la edad pediátrica, representan
comportamientos disímiles histopatológicos ante una injuria por isquemia-reperfusión. Sin
embargo, los modelos in vivo de animales son indispensables, a causa de la limitación de
los modelos in vitro para imitar la complejidad del cuerpo humano, siendo el modelo
murino el más utilizado e investigado y que permite la correlación entre los diferentes
estudios en este sentido.2 Introducción
En Colombia, no se encuentran datos publicados acerca de modelos murinos que se
acerquen a la fisiopatología de la injuria renal aguda en población pediátrica, de esta
manera este trabajo se plantea como un paso inicial para adquirir conocimiento en esta
área, e incentivar la realización de estudios posteriores.1. Fisiopatología de la lesión renal aguda
isquémica
Un 5 – 20% de los pacientes en Unidades de Cuidado Intensivo, experimentan un
episodio de lesión renal aguda (LRA) durante su estancia. Su ocurrencia va en aumento,
con una incidencia variable, que va de 4.5 – 85%, dependiendo de la definición usada y
un riesgo 2 – 3 veces mayor de mortalidad que quienes no la desarrollan. Constituye un
síndrome que se desarrolla tras una caída transitoria repentina en el flujo sanguíneo
renal total o regional.
A pesar de los avances en las estrategias y medidas de apoyo preventivo, esta
enfermedad continúa estando asociada con una morbimortalidad significativas (1), ya que
a pesar de los avances recientes en las terapias de reemplazo renal, la mortalidad entre
los pacientes que sufren LRA complicada por disfunción de múltiples órganos se estima
aproximadamente en un 50%. Recientes pruebas clínicas sugieren que la LRA no es sólo
un indicador de gravedad de la enfermedad, sino que también conduce a la aparición
más temprana de disfunción multiorgánica con profundos efectos sobre la mortalidad (2).
Sin embargo éstas estadísticas globales no tienen en cuenta los mecanismos
fisiopatológicos que subyacen con los cambios propios de la edad por lo cual es
importante resaltar que varios cambios estructurales se producen en el riñón con el
envejecimiento, a partir de alteraciones histológicas en la vasculatura renal (3).
La evidencia epidemiológica muestra que la LRA es un factor de riesgo independiente de
mortalidad. Esta evidencia no sólo se aplica a las formas más graves de LRA, sino que
es válida también para las pequeñas disminuciones de la función renal, que a su vez se
asocian con una mayor mortalidad a corto plazo, la duración de la estancia hospitalaria,
las tasas de reingreso, y el desarrollo de enfermedad renal terminal. Estos efectos no
pueden ser atribuidos exclusivamente a la pérdida de la función del órgano, ya que
repetidamente se ha demostrado que la mortalidad de pacientes críticamente enfermos4 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
con enfermedad renal terminal es menor que la de los pacientes con LRA, así no
requieran terapia de reemplazo renal (TRR). Por lo tanto, a pesar de numerosos datos
que muestran el impacto clínico, los mecanismos exactos subyacentes de la LRA siguen
siendo en gran parte desconocidos (4).
A pesar de todo lo anterior, la mayoría de los pacientes que sobreviven recuperan
completamente la función renal. La restauración de la función renal después de un
episodio de LRA es atribuible en gran medida a la capacidad del tejido renal para
recuperarse de un daño celular subletal o letal. Sin embargo, la LRA puede resultar en
una recuperación incompleta de la función renal y / o el desarrollo de alteraciones renales
crónicas y progresivas. Los resultados antes mencionados sugieren que la lesión renal
aguda predispone al riñón al desarrollo de complicaciones futuras. Estudios han
demostrado que muchos aspectos de la función renal y la estructura se restauran
después de una lesión isquémica severa, mientras que varios otros aspectos del riñón se
alteran de forma permanente, por lo cual se ha planteado que las anormalidades
subyacentes en la microvasculatura renal dan cuenta de muchos de los efectos a largo
plazo sobre la estructura y función renal después de la lesión (5).
El riñón es exquisitamente sensible a las lesiones hipóxicas debido a la pobre relación
entre el flujo sanguíneo renal (FSR) y la utilización del oxígeno. Las células tubulares del
asa gruesa ascendente medular renal tienen la proporción más alta de extracción de
oxígeno (relación entre consumo [VO2] vs suministro de oxígeno [DO2]) respecto a
cualquier otra célula del cuerpo humano; ellas utilizan aproximadamente el 80% del
oxígeno suministrado. Esto resulta en una médula renal relativamente hipóxica con una
pO2 tisular de alrededor de 10 a 20 mmHg. Éstos altos requerimientos de O2 en la rama
ascendente gruesa medular se deben a la reabsorción de Na+2, que es un proceso
altamente dependiente de ATP. Curiosamente, la reabsorción de Na+2 y el consumo de
O2 se correlacionan estrechamente con la tasa de filtración glomerular (TFG); el mayor
ultrafiltrado se entrega a la nefrona distal, el mayor Na+2 es reabsorbido y, en
consecuencia, más oxígeno es consumido. Esta "dependencia de flujo" está
inherentemente igualada por la perfusión peritubular de manera que la relación VO2 /
DO2 no alcanza un valor crítico bajo condiciones fisiológicas. En otras palabras, aunque
el aumento del flujo sanguíneo al riñón puede aumentar la TFG, y con ello la perfusión
peritubular, el consumo de oxígeno y la entrega de oxígeno deben coincidir (6).Capítulo 1 5
Mientras los riñones humanos adultos representan el 2% del peso corporal total, reciben
aproximadamente 25% del gasto cardíaco. Esto facilita las altas tasas de filtración
glomerular exigidas por la regulación precisa del equilibrio hidroelectrolítico del cuerpo.
Con la autorregulación, la tasa de filtración glomerular (TFG) se mantiene estrechamente
a pesar de los cambios en la presión arteriolar; la TFG permanece constante mientras
que la presión arterial sistémica fluctúa entre 80 y 180 mmHg. Bajo condiciones
fisiológicas, la corteza renal, que contiene la mayoría de los glomérulos (o unidades de
filtración), recibe la mayor parte del flujo sanguíneo renal, mientras que la médula recibe
aproximadamente el 10%. Durante la isquemia, la reducción del flujo sanguíneo es
regional y no uniforme en todo el riñón. La disminución del flujo sanguíneo renal es más
prominente en la médula externa que en la corteza. La fuente del flujo de sangre medular
surge de las arteriolas eferentes de los glomérulos yuxtamedulares dando lugar a los
vasos rectos. Esta organización en serie de la microvasculatura renal permite los
mecanismos de contracorriente vitales para mantener el equilibrio del sodio (7).
En seres humanos y animales experimentales, las reducciones de la TFG se han
atribuido a la vasoconstricción persistente, dada potencialmente por la activación de la
retroalimentación tubuloglomerular como resultado de la entrega mejorada de soluto a la
mácula densa. Se sabe que hay un aumento del tono basal, aumento de la reactividad a
agentes vasoconstrictores, y disminución de las respuestas vasodilatadoras en las
arteriolas tomadas de riñones post-isquémicos en comparación con las tomadas de los
riñones normales. Algunos han argumentado que la persistente vasoconstricción
preglomerular es la explicación del deterioro de la TFG (8) (Figura 1-1).
Una reducción uniformemente distribuida del flujo sanguíneo renal total a los túbulos es
probable que no sea la explicación para el patrón de daño a las células tubulares,
especialmente teniendo en cuenta la baja extracción de oxígeno necesario para apoyar el
metabolismo en los túbulos proximales corticales. Es la reducción en el flujo sanguíneo
regional a la médula externa lo más importante. Se sabe que durante algún tiempo hay
menos flujo a la médula que a los capilares corticales en el riñón post-isquémico.
Adicionalmente, las células endoteliales presentan edema celular y aumento de la
expresión de moléculas de adhesión celular. Esto, junto con la activación de leucocitos,
lleva a aumento de la interacción leucocito-endotelio, lo cual promueve la lesión y el6 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
edema de la célula endotelial, impide físicamente el flujo de sangre, contribuye a la
producción de factores locales que promueven la vasoconstricción, y añade efecto
vasoconstrictor sobre el flujo sanguíneo local y el metabolismo celular tubular.
Figura 1-1: Interacción entre eventos microvasculares y tubulares que contribuyen a la
patología de la LRA isquémica.
Microvascular Tubular
O
2
Glomerular Medular
Vasoconstricción en respuesta a: * Ruptura citoesqueleto
Endotelina, adenosina, angiotensina II, * Pérdida polaridad
tromboxano A2, leucotrienos, actividad * Apoptosis y necrosis
nerviosa simpática * Descamación de
células viables y
Vasodilatación en respuesta a: necróticas
Óxido nítrico, prostaglandina E2, * Obstrucción tubular
acetilcolina, bradiquinina * Fuga
Daño estructural de células musculares
lisas vasculares y endoteliales
Mediadores
inflamatorios
y vasoactivos
Adhesión leucocito-endotelial,
obstrucción vascular, activación
leucocitaria e inflamación
Modificado de: Bonventre, J. V.; Weinberg, J. M. 2003.Capítulo 1 7
La isquemia aguda conduce a la activación del endotelio con un aumento de la
permeabilidad y la expresión de diferentes moléculas de adhesión. Estas moléculas son
cruciales para el reclutamiento y la infiltración de células efectoras en el tejido
postisquémico (9) (Figura 1-2).
Figura 1-2: Ilustración esquemática de los mediadores inflamatorios producidos por las
células epiteliales tubulares y leucocitos activados en la lesión por isquemia- reperfusión
(LIR). El epitelio tubular produce factor de necrosis tumoral-a (TNF-a), interleuquina 1 (IL-
1), interleuquina 6 (IL-6), interleuquina 8 (IL-8), factor de crecimiento transformante-b
(TGF-b), proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1), proteína epitelial activadora
de neutrófilos 78 (ENA-78), células T normales expresadas, secretadas y reguladas tras
la activación (RANTES), y fractalquinas, mientras que los leucocitos producen TNF-a, IL-
1, IL-8, MCP-1, especies reactivas de oxígeno (ROS), y eicosanoides. La liberación de
estas quimoquinas y citoquinas sirven como efectores para una vía de retroalimentación
positiva aumentando la inflamación y lesión de la célula.
Epitelio
Mediador inflamatorio
Membrana basal epitelial
Leucocito
Fibroblasto
Mediador inflamatorio
leucocitario
Molécula de adhesión
celular endotelial
Endotelio
Leucocito
Membrana basal
Modificada de: Gueler, F.; Gwinner, W.; Schwarz, A.; Haller, H. 2004.8 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
La respuesta inflamatoria también conduce a congestión vascular que propaga el
ambiente hipóxico y reduce la capacidad para depurar radicales tóxicos. Así, la región
corticomedular es la más vulnerable del riñón para lesión tubular, inflamación y
alteraciones vasculares que extienden la lesión celular más allá de la lesión inicial y
perpetúan la hipoperfusión. Alteraciones vasculares observadas incluyen la interrupción
de actina endotelial del citoesqueleto, que conduce al desprendimiento de las células de
la monocapa endotelial. Esto lleva a alteración de la función de barrera endotelial,
reactividad vascular y aumento de la permeabilidad (10).
La lesión subletal del epitelio tubular proximal como resultado de la depleción de ATP
lleva a cambios tempranos en el citoesqueleto de actina, la pérdida de complejos de
unión, incluyendo uniones estrechas y uniones adherentes, así como un cambio en la
localización de las moléculas de adhesión celular y en la polaridad de las proteínas de la
membrana. Luego de la lesión por isquemia-reperfusión, el calcio intracelular aumenta y
la calpaína, una proteasa, y la óxido nítrico sintasa (NOS) se activan. Ocurren entonces,
ruptura de los filamentos de actina y digestión de proteínas de unión a actina, que, a su
vez, interrumpen el citoesqueleto de actina cortical (9) (Figura 1-3).
Adicionalmente la interacción leucocito-endotelio, da lugar a una mayor expresión de
moléculas de adhesión intercelular (ICAM), tales como ICAM-1, selectinas P y E y B7-1.
Los experimentos que inhiben la expresión de estas moléculas disminuyen el daño renal
y preservan la función renal en modelos animales de LRA por isquemia y sepsis. La
interacción leucocito-endotelio también conduce a derramamiento de capas ricas en
glicosaminoglicanos sulfatados, o glicocálix, del endotelio. Subsecuentemente se inician
cascadas de señalización y aumenta el acceso de leucocitos que transmigran el
endotelio en los riñones lesionados. Estos factores colectivamente crean un entorno que
conduce a una mayor lesión tubular propagando el insulto inicial, lo que resulta en una
mayor disminución de la TFG y de la función renal. Incluso las lesiones isquémicas
severas producen alteraciones permanentes en la densidad capilar renal, lo que
contribuye a defectos en la concentración urinaria y a la predisposición hacia el desarrollo
de fibrosis renal (5).Capítulo 1 9
Figura 1-3: Ilustración esquemática del ciclo de daño celular epitelial tubular y la
reparación renal tras lesión por isquemia/reperfusión. Las células epiteliales tubulares
son típicamente cúbicas y con polaridad apical-basal; la Na+/K+ -ATPasa se localiza en
la membrana plasmática basolateral, mientras las moléculas de adhesión celular, como
las integrinas se localizan basalmente. En respuesta a la isquemia/reperfusión, la Na+/K+
-ATPasa aparece apicalmente, y las integrinas se detectan en las membranas
plasmáticas laterales y basales. Algunas de las células epiteliales lesionadas sufren
necrosis y/o apoptosis separándose desde la membrana basal subyacente al espacio
tubular donde contribuyen a la oclusión tubular. Las células viables que permanecen
unidos, se dediferencian, difunden, y migran para repoblar la membrana basal desnuda.
Con la proliferación celular, los contactos célula-célula y célula-matriz se restauran y el
epitelio se rediferencia y repolariza, formando un epitelio normal funcional.
Muerte celular
Epitelio normal LIR Necrosis Apoptosis
Moléculas de adhesión
Diferenciación y
restablecimiento Na+/K+ - ATPasa
de la polaridad
Proliferación
Desprendimiento de
células muertas y viables
Migración, dediferenciación de células
con obstrucción tubular
viables
Modificada de: Gueler, F.; Gwinner, W.; Schwarz, A.; Haller, H. 2004.
El transporte tubular en la rama gruesa ascendente medular (AAG) y el segmento S3 del
túbulo proximal exige un alto consumo de O2. Si el suministro de sangre se interrumpe
transitoriamente, el balance de oxígeno se mantiene mediante la reducción de la TFG y
el transporte de solutos hasta el AAG. Éste mecanismo de protección se ve socavado por
la producción de especies reactivas de oxígeno que disminuyen aún más el flujo de
sangre medular y aumentan la actividad del AAG. Clínicamente, esto se traduce en un10 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
aumento de la injuria durante la fase de reperfusión, cuando el balance de oxígeno se
inclina hacia el consumo debido al aumento de la demanda por el transporte tubular. La
lesión inicial además inicia una cascada de acontecimientos que conducen al daño
endotelial (11).
Se conoce que la progresión de la lesión renal típicamente se divide en fases de
iniciación, extensión, mantenimiento y recuperación. La fase de iniciación se refiere a la
lesión isquémica primaria, durante la cual las células del parénquima son pobremente
perfundidas hasta el punto donde tanto los mecanismos celulares para mantener la
integridad celular no responden (necrosis) o se inician las vías de muerte celular
programada (apoptosis). Características morfológicas prominentes de la LRA isquémica
en seres humanos incluyen borramiento y pérdida del borde en cepillo del túbulo
proximal, pérdida en parches de células tubulares, áreas focales de dilatación tubular
proximal y cilindros tubulares distales, y áreas de regeneración celular. La necrosis es
discreta y limitada a regiones susceptibles de la médula externa. Los glomérulos suelen
ser poco llamativos, a menos que una enfermedad glomerular primaria haya causado la
LRA. Estos acontecimientos dan lugar a la obstrucción tubular, aumentan la presión
hidrostática glomerular alterando la formación de filtrado con “reflujo” del mismo.
Múltiples vías diferentes han sido implicadas en este proceso e incluyen el manejo del
calcio intracelular, la señalización intracelular, y la formación de especies reactivas de
oxígeno. Como resultado del daño celular, la inflamación se exacerba por reperfusión.
Esto se conoce como la fase de extensión y se asocia con la infiltración del riñón por
células inflamatorias, neutrófilos en su mayoría y la liberación de citoquinas. Las fases de
mantenimiento y recuperación describen la restauración de la arquitectura renal normal a
través de los mecanismos de reparación y proliferación. (6). La isquemia seguida de
reperfusión induce lesión endotelial microvascular de la célula, dando lugar a la pérdida
de funciones tales como la regulación del tono vascular, la perfusión del tejido,
permeabilidad, y la inflamación en riñón (Figura 1-4).Capítulo 1 11
Figura 1-4: Fases fisiológicas de LRA después de la lesión por isquemia-reperfusión.
Esta figura ilustra la progresión de riesgo para LRA prerrenal y representa los datos
experimentales de isquemia-reperfusión, pero no necesariamente otras formas de lesión
renal aguda tales como nefrotoxicidad directa inducida por fármacos. La capacidad de
medir variables fisiológicas puede conducir a la identificación de pacientes en riesgo de
lesión renal aguda, el diagnóstico precoz de LRA y fundamentar las decisiones
terapéuticas. Estos procesos fisiológicos representan un entorno integrador para la
interacción de mediadores de la inflamación, el desequilibrio en la homeostasis de
oxígeno, óxido nítrico y radicales libres de oxígeno que producen disfunción
microcirculatoria y deterioro de la oxigenación tisular conduciendo a LRA.
Modificada de: Okusa, M. D.; Jaber, B. L.; Doran, P.; Duranteau, J.; Yang, L.; Murray, P.
T.; Mehta, R. L.; Ince, C. 2013 (12).
Mejorar esta disfunción endotelial podría ser un buen enfoque para el tratamiento de la
isquemia-reperfusión inducida por la lesión renal (13).12 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Figura 1-5: Efectos clínicos de la LRA tanto a corto plazo y los efectos clínicos a largo
plazo. La sobrecarga hídrica, así como el desequilibrio ácido-base y electrolítico suelen
estar bien controladas con las terapias de reemplazo renal (TRR). El desarrollo de la
enfermedad renal crónica es un efecto a largo plazo de la LRA. Los efectos de LRA en la
inmunidad innata han surgido recientemente como otro factor importante a corto plazo en
la fisiopatología de la LRA.
Corregidos por
terapias de
reemplazo renal
Alteración en el
aclaramiento de
citoquinas
Alteración en la
función de los
neutrófilos
Complicaciones a
largo plazo
Modificada de: Singbartl, K.; Joannidis, M. 2015.Capítulo 1 13
Figura 1-6: Potencial curso de un paciente que sobrevive a un episodio de LRA. ERA:
enfermedad renal aguda; ERC: enfermedad renal crónica; ERT: enfermedad renal
terminal.
LRA ERA ERC ERT
Recuperación
renal
Modificado de: Doyle, J. F.; Forni, L. G. 2015.
Amplia evidencia desde estudios experimentales, así como algunos pequeños ensayos
clínicos han puesto de manifiesto importantes interacciones entre LRA y la inmunidad
innata. Dos efectos clave de la LRA en la inmunidad innata se han identificado hasta el
momento. La LRA disminuye el aclaramiento de citoquinas y estimula la producción renal
de citoquinas, lo que con frecuencia conduce a aumento prolongado de los niveles de
citoquinas proinflamatorias en el escenario de los procesos inflamatorios agudos. La LRA
también deteriora dos pasos cruciales en la cascada del reclutamiento de leucocitos:
tanto el enlentecimiento en el movimiento como la trasmigración son de suma
importancia para dirigir los leucocitos al sitio de la información. Existe evidencia
experimental ahora que el reclutamiento atenuado de leucocitos en la presencia de LRA
empeora las infecciones bacterianas y la función en última instancia de órganos (4)
(Figura 1-5).
La evolución de lo que sucede más allá de la lesión aguda en caso de no haber
recuperación, no es clara aún, ni como se suceden los cambios hacia la enfermedad
renal crónica. Desde la primera descripción de Riesgo, Lesión, Falla, Pérdida de la
función renal, y Etapa Renal Terminal (Criterios RIFLE), la definición de LRA ha sido
objeto de variaciones. Más recientemente, la clasificación KDIGO define la LRA de
acuerdo a los cambios en la creatinina sérica y la orina y clasifica la LRA en etapas 1, 2 y
3. Del mismo modo, la enfermedad renal crónica (ERC) también se define por KDIGO y
refleja tanto cambios estructurales como funcionales crónicos de los riñones, por14 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
ejemplo, en términos de aclaramiento de creatinina. La definición de ERC requiere al
menos 2 estimaciones de creatinina por lo menos con 90 días de diferencia, lo que ha
dado lugar al concepto de enfermedad renal aguda (ERA), que describe la transición
entre el estado agudo y crónico. Esto en sí mismo, sin embargo, no es sencillo. La Fig. 1-
6 esboza la potencial evolución de los pacientes que se recuperan de un episodio de
LRA (14).
Los mecanismos que se perpetúan en los meses posteriores a una lesión por
isquemia/reperfusión, no están claros. Obviamente, la extensión de la lesión inicial (es
decir, el grado de necrosis y apoptosis) juega un papel importante. Otros mecanismos
celulares son posibles como se muestra en la Figura 1-7 y 1-8. La infiltración por
monocitos parece ser un prerrequisito de la fibrosis y el deterioro posterior. Sin embargo,
qué mecanismos son los responsables de la supervivencia de los monocitos, qué
factores son responsables de la diferenciación en macrófagos y si la proliferación in situ
de los monocitos es importante en la patogénesis de la nefropatía crónica debe que ser
analizado aún más. El sello distintivo de los cambios crónicos después de la lesión por
isquemia y reperfusión es la fibrosis. Parece que el equilibrio entre la actividad de la
proteasa y la expresión de moléculas de la matriz es importante. Más recientemente se
ha empezado a investigar el papel de activadores del plasminógeno en este contexto. En
experimentos con modelos animales, se ha demostrado que el activador del
plasminógeno juega un papel importante en la remodelación vascular y fibrosis después
de trasplante (15).
Sin embargo, con respecto a la expresión monocítica de activador de plasminógeno tipo
uroquinasa (uPA) y su receptor, se ha encontrado una amplia variación de respuestas
individuales en biopsias de protocolo. Esta observación apoya el concepto de que la
respuesta celular y molecular individual a la respectiva lesión juega un papel importante
en ésta patogénesis. Análisis de patrones individuales de la expresión génica utilizando
microarreglos puede ser un método útil para definir estos patrones "de respuesta" (9).
A pesar de todas las investigaciones y avances en la fisiopatología de la LRA isquémica
descritas, hay pocos estudios comparativos entre grupos etarios, sin embargo se sabe
que ratas de edad avanzada son más susceptibles a la insuficiencia renal inducida por la
injuria por isquemia-reperfusión, y se plantea que puede asociarse con el aumento delCapítulo 1 15
estrés oxidativo, peor daño histológico, y el aumento de la inflamación y la fibrosis túbulo-
intersticial. (16).
Figura 1-7: Posibles mecanismos de cambios crónicos inducidos por
isquemia/reperfusión (I/R).
Modificada de: Gueler, F.; Gwinner, W.; Schwarz, A.; Haller, H. 2004.
Figura 1-8: Procesos fisiopatológicos potenciales involucrados en LRA/ERA/vía ERC.
HIF, factor inducible por la hipoxia; TGF, factor de crecimiento transformante.
Infiltración de
Reparo Hiperfiltración células Fibrosis túbulo-
maladaptativo glomerular inflamatorias intersticial
Disfunción Secreción de Estimulación de
mitocondrial mensajeros fibrocitos y
bioactivos miofibroblastos
ERC
ENFERMEDAD RENAL AGUDA
L RA Riesgos tradicionales para enfermedad renal
Citoquinas Galectina - 3 Endotelina 1 HIF
inflamatorias
Modificada de: Doyle, J. F.; Forni, L. G. 2015.2. Modelos animales en lesión renal aguda
isquémica
La utilización de modelos de reconstitución animal, órganos, tejidos, cultivo celular, son
esenciales para la obtención de los datos necesarios para entender completamente los
procesos de patológicos de las enfermedades. Por lo tanto, la búsqueda en las ciencias
básicas, en biología celular y molecular es fundamental para avanzar en el conocimiento
de la fisiopatología de la enfermedad.
Figura 2-1: Una comparación de las fortalezas y debilidades de los modelos
disponibles de insuficiencia renal aguda, utilizando una escala relativa. NTA, necrosis
tubular aguda.
Modificada de: Lieberthal, W.; Nigam, S. K. 2000.18 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
La utilización eficiente y eficaz de la información obtenida de los modelos más simples
requiere la comprensión de las fortalezas y debilidades de cada técnica y el modelo, así
como el uso de un número de diferentes modelos de investigación, pueden
complementarse entre sí en avanzar en nuestra comprensión de las enfermedades
humanas. (Figura 2-1) (17). El presente estudio se basa en las similitudes anatómicas,
tisulares y celulares entre la fisiología renal humana y murina. (Anexos A, B, C y D) (18).
Figura 2-2: Tipos de modelo animal de lesión renal por isquemia-reperfusión.
Adaptado por: La autora. 2015.Capítulo 2 19
Clínicamente, la isquemia es una causa principal de LRA, que puede resultar de una
variedad de condiciones, tales como la disminución del volumen intravascular efectivo o
depleción del volumen intravascular, hipotensión, la oclusión u obstrucción vascular
renal, y trasplante de riñón (19). Modelos in vitro, incluyendo cultivos de células renales,
túbulos renales aislados y riñones perfundidos aislados, han sido valiosos para la
investigación de los mecanismos fisiopatológicos de la LRA isquémica. Sin embargo, los
modelos in vivo con el animal completo son indispensables, a causa de la limitación de
los modelos in vitro para imitar la complejidad del cuerpo humano. Desde la década de
1960, varios modelos animales de LRA isquémica se ha desarrollado y probado, y en la
actualidad, dos tipos de modelos de lesión renal por isquemia-reperfusión (LIR) se
utilizan principalmente (Figura 2-2):
1. LIR bilateral
2. LIR unilateral
Dependiendo de si se retira el riñón contralateral, el modelo unilateral puede dividirse en
dos subtipos:
3. LIR unilateral con nefrectomía contralateral
4. LIR sin nefrectomía contralateral
Los modelos iniciales de LRA isquémica se desarrollaron con animales de
experimentación de tamaño relativamente grande, tales como perros y conejos (20).
Luego el modelo en ratas se convirtió en el más popular modelo animal, ya que de
aproximadamente 1.300 publicaciones de LRA isquémica en estudios animales desde
1960, se han llevado a cabo más de la mitad de ellos en ratas. En 1990, el ratón fue
introducido por primera vez en el campo de investigación de la LRA isquémica. Los
estudios con ratones han sido notablemente promovidos por la disponibilidad de diversos
tipos de ratones transgénicos. En la última década, se han realizado más estudios
utilizando ratones que ratas; el tamaño de un ratón es aproximadamente 1/10 del de una
rata, lo cual sumado a su alta tasa reproductiva, fácil mantenimiento y sencillez en el
manejo, y facilidad para inducirle modificaciones genéticas, hacen que sea considerado
casi el modelo perfecto. La rata ocupa el segundo lugar y es utilizada fundamentalmente
en investigaciones nutricionales, comportamentales y endocrinológicas. A pesar de estas
notables ventajas, se conoce que el modelo en ratón tiene variaciones más grandes,
causando inconsistencia en los resultados (21, 22).20 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
En los años 1980, evaluaciones sobre el efecto del clampeo de la arteria renal por 45
minutos en ratas uninefrectomizadas para reproducir el síndrome humano de
insuficiencia renal aguda mediado hemodinámicamente después de una lesión
isquémica, documentaron que 24 horas después de la isquemia, el aclaramiento de
creatinina se reducía en un 90%, mientras que la excreción fraccionada de sodio se
incrementaba notablemente; durante los días posteriores, ambos valores regresaban a la
normalidad. A pesar de no documentar diferencias en el aclaramiento fraccional de
diferentes tamaños graduados de dextranos neutros (radios de 20-44 A), empleados para
detectar fuga transtubular de inulina, entre animales normales y animales post-isquemia,
la mayoría de los túbulos se veían gravemente lesionados, lo cual sugería que el daño
fundamental de la lesión renal por isquemia-reperfusión ocurría a nivel tubular más que
glomerular (23). El rasgo distintivo de la LRA es una reducción de la tasa de filtración
glomerular, que si no obedece a un daño estructural del glomérulo, implica entonces un
deterioro subyacente en la regulación hemodinámica caracterizado por un aumento
sostenido de la resistencia vascular renal.
Estas descripciones han llevado al estudio de respuestas hemodinámicas renales en
modelos animales con lesión por isquemia- reperfusión. Después de la liberación de la
oclusión de la arteria renal en estudios en ratas, el flujo sanguíneo renal (FSR) se
restaura completamente a los niveles de referencia en cuestión de minutos, seguido de
un posterior descenso, que tiene lugar durante varias horas (Figura 2-3).
Los métodos que discriminan flujo sanguíneo regional en el riñón, sugieren que el FSR
de la médula externa sufre un deterioro temprano y más significativo en relación con el
FSR de todo el riñón. La médula externa es normalmente hipóxica en condiciones
fisiológicas, y una reducción sostenida del flujo medular externo exacerba la hipoxia y
contribuye al más profundo grado de daño morfológico observado en esta región (24).
Los cambios morfológicos de la vasculatura renal descritos hasta la fecha durante LRA
isquémica en modelos animales y en humanos han sido sutiles y limitados a la capa de
músculo liso en arteriolas renales. La falta de detección de un cambio morfológico
consistente en el endotelio vascular renal en LRA isquémica puede ser causada por
sesgo de muestreo en LRA isquémica humana (obtención predominante en las biopsias
de tejido de la cortical externa o medular) y por la dificultad en visualizar el endotelioCapítulo 2 21
microvascular. Sin embargo, la evidencia de disfunción endotelial y lesiones en otros
órganos y sistemas como resultado de una lesión isquémica da credibilidad a la idea de
que la disfunción y daño endotelial pueden desempeñar un papel importante en la LRA
isquémica (25) (Tabla 2-1).
Figura 2-3: Efecto de la lesión renal por isquemia-reperfusión en el flujo sanguíneo
renal regional. Ratas Sprague-Dawley fueron sometidas a 30 min de isquemia renal y
180 min de reperfusión. El flujo sanguíneo cortical (FSC) y el flujo sanguíneo medular
externo (FSM) fueron medidos por flujometría láser Doppler. El FSC y FSM disminuyeron
drásticamente durante el período isquémico y el FSC se recuperó rápidamente a los
niveles basales después de la reperfusión. En contraste, el FSM mejoró transitoriamente
de manera inmediata después de la reperfusión seguido por una disminución gradual a
aproximadamente el 50% de la línea de base que se mantuvo durante el período de 3 h
del experimento.
Modificada de: Regnera, K. R.; Roman, R. J. 2012.22 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Tablas 2-1: Alteraciones que sugieren que la isquemia renal lleva a lesión y disfunción
de células endoteliales.
Alteraciones observadas en LRA Papel potencial del endotelio lesionado
Incremento de la permeabilidad  Desprendimiento celular endotelial de la
capilar peritubular membrana basal
 Uniones intercelulares endoteliales alteradas
Congestión vascular  Edema celular endotelial
corticomedular  Conversión de células endoteliales a fenotipo
procoagulante con depósitos de fibrina
 Sobreregulación de proteínas de adhesión
leucocitaria en células endoteliales (ICAM-1,
selectinas P y E)
Perfusión renal regional alterada  Respuesta endotelial alterada a agonistas
vasodilatadores endógenos
 Producción endotelial alterada de agonistas
vasodilatadores
 Obstrucción microvascular con depósitos de
fibrina
Inflamación  Sobreregulación de proteínas de adhesión
leucocitaria en células endoteliales (ICAM-1,
selectinas P y E)
 Liberación endotelial de citoquinas
Efectos en órganos a distancia  Células endoteliales separadas circulantes
 Liberación endotelial de citoquinas
Modificada de: Molitoris, B. A.; Sandoval, R.; Sutton, T. A. 2002.
La elección del modelo genético debe estar basada en algunas propiedades como
isogenicidad, homocigosis, estabilidad genética a largo plazo, identificabilidad,
uniformidad fenotípica, individualidad, posibilidad de distribución internacional y
reproducibilidad de resultados, y existencia de un banco de datos. Igualmente dependerá
del tipo de trabajo que se desee realizar, de las características de cepas y colonias, de la
información disponible en trabajos publicados y de la disponibilidad local (26).Capítulo 2 23
Es claro que las comorbilidades comunes impactan en la eficacia de las estrategias de
condicionamiento isquémicas y deben ser tenidas en cuenta en el diseño de futuros
estudios de translación. Sin embargo, también puede haber otras explicaciones
fundamentales para la disparidad vista entre los estudios en animales y ensayos clínicos
(Tabla 2-2).
Tabla 2-2: Retos y soluciones potenciales para la translación de estudios de
condicionamiento isquémicos “del banquillo a la cama”. Diagrama de flujo que resume los
principales retos relacionados con las pruebas de condicionamiento isquémico en
estudios (etapa preclínica) y la translación de estos enfoques en ensayos clínicos (fase
de translación temprana, ensayos fase I/II). Posibles soluciones para optimizar tanto la
fase de investigación preclínica como la planificación de ensayos clínicos. Cuando una
estrategia de condicionamiento isquémico pasa con éxito los ensayos clínicos de fase I/II,
los retos a futuro son la difusión más amplia (etapa de translación tardía) incluyendo la
necesidad de desarrollar una guía y la adopción de protocolos estandarizados por
cuerpos nacionales e internacionales.
Estado preclínico
Retos Soluciones
 Los modelos experimentales no  Uso de modelos animales con
representan adecuadamente el múltiples comorbilidades, tratados
fenotipo humano con medicamentos comunes
- Sin comorbilidades  Mejorar la aleatorización/protocolos
- Sin uso de medicamentos ciegos para el trabajo con animales
- Protocolos experimentales  Resultados a más largo plazo en
- Variabilidad interespecies experimentos animales
o Circulación colateral  Uso de tejido humano ex vivo
o Tolerancia a la isquemia  Translación a ensayos clínicos en
 Sesgo de publicación/presentación humanos24 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Tabla 2-2: (Continuación)
Translación temprana: Ensayos fase I/II
Retos Soluciones
 Ensayos a menudo en un solo  Translación a:
centro, a pequeña escala, corta - Ensayos clínicos a gran escala
duración - Ensayos clínicos aleatorizados
 Falta de poder para detectar: multicéntricos
- Impacto de comorbilidades - Mayor poder con objetivos
subyacentes “difíciles” a largo plazo
- Objetivos “difíciles”: por ejemplo,
muerte, admisiones hospitalarias
Translación tardía: Ensayos fase III y adopción más amplia
Retos Soluciones
 Financiamiento  Redes de investigación
- Falta de medicamento o integrados con el apoyo del
dispositivo patentable que Gobierno / Fundaciones para
conduce a falta de patrocinio de proporcionar financiación y
la industria patrocinio de la investigación
 Falta de adopción generalizada  Divulgación y difusión de
de la técnica resultados a través de
publicaciones, desarrollo de
protocolos y adopción por
comités internacionales de
directrices clínicas
Modificada de: McCafferty, K.; Forbes, S.; Thiemermann, C.; Yaqoob. M. M. 2014 (27).Capítulo 2 25
Una diferencia clave es el uso de animales no-comórbidos, genéticamente homogéneos,
juveniles, del mismo sexo, alojados juntos y alimentados con dietas idénticas. En
modelos animales de isquemia-reperfusión, el tiempo de isquemia se conoce con
precisión, a diferencia de gran parte del trabajo en seres humanos, en los que la
aparición de la isquemia tisular es desconocida o conocida de manera imprecisa. Aunque
la duración exacta de la isquemia es de crucial importancia para caracterizar la lesión
tisular, esta duración es muy variable dependiendo del modelo animal utilizado: con los
animales más pequeños, tales como ratas, 30 minutos de isquemia miocárdica es
suficiente para llevar a infartos de tamaño aproximado del 50% de la zona de riesgo,
mientras que, en la animales mayores, como cerdos o primates, hasta 90 minutos de
isquemia son necesarios para llevar a grados similares de lesión tisular. Para el caso de
los estudios de lesiones isquémicas renales en modelos animales, se han utilizado tanto
ratas Wistar como Sprague Dawley, que si bien presentan algunas diferencias fenotípicas
y en otros aspectos funcionales, la literatura no destaca diferencias en la morfofisiología
renal ni en el comportamiento renal a la isquemia.
A continuación, se identifican algunas consideraciones importantes a tener en cuenta en
la rata frente a otras especies cuyo conocimiento facilita la óptima investigación
biomédica (26):
Espacio recomendado para roedores de laboratorio de uso común, alojados en
grupo
Animal Peso corporal en g Área de piso / Animal cm2 Altura a / cm
Rata (Rattus < 100 109,68 17,78
norvergicus) Hasta 200 148,39 17,78
Hasta 300 187,1 17,78
Hasta 400 258,1 17,78
Hasta 500 387,1 17,78
> 500 451,61 17,78
Especie animal Temperatura en ºC
Ratón, rata, hámster 19 - 2326 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Especie Ventaja Fisiología y Reproducción Generalidades
anatomía
Rata (Rattus La más utilizada Tamaño 10 a Hembra con Son menos
norvergicus) en fisiología, 15 veces ciclo estral de 4 agresivos que los
toxicología, mayor al del a 5 días y dura ratones: al igual
farmacología, ratón, no 12 horas. que con éstos se
inmunología. Su posee vesícula debe controlar la
tamaño facilita biliar. Posee temperatura, aire,
técnicas de una glándula humedad y bajos
microcirugía. en la comisura niveles de
del ojo llamada amoníaco; el
Arderían. agua y la comida
se suministran
ad-libitum.
Especie Rata (Rattus norvergicus)
Peso al nacer (g) 5 - 6
Edad de destete (días) 21
Peso al destete (g) 35 – 40
Edad pubertad (días) 45 - 75
Peso adulto (g) 250 – 400
Longevidad promedio (años) 2 - 3
Productividad crías / año 50 - 100
Nº cromosomas (2n) 40
Dosis de anestésicos en Rata (Rattus norvergicus)
Premedicación Atropina 0,05
Anestesia de corta duración
 Propofol IV (5-10 minutos) 10
 Tiopental sódico (20-25 minutos) 30
 Etomidato -Capítulo 2 27
Dosis de anestésicos en Rata (Rattus norvergicus)
Anestesia de media duración
 Fentanilo / Etomidato IP -
 Fentanilo / Metomidato IP -
 Fentanilo + fluanisona (ml/kg) / Diazepam IP -
 Ketamina / Diazepam IP 80 / 10
 Ketamina / Xilacina IP 80 / 10
 Ketamina / Medetomidina IP 75 / 0,5
 Tiletamina + Zolazepam IP -
 Pentobarbital IP 30 - 40
Anestesia de larga duración
 Alfa cloralosa IP 130
 Uretano (g/kg) IP 1 - 2
Anestesia de cualquier duración
 Éter Inducción 15-20%
Mantenimiento 5%
 Halotano Inducción 4-5%
Mantenimiento 1-2%
 Isoflurano Inducción 4%
Mantenimiento 1,5 – 3%
Datos de cría y reproducción Rata (Rattus norvergicus)
Edad reproductiva Rango Hembra-macho 10 – 12 semanas
Ciclo sexual Duración (días) 4 - 5
Receptividad sexual Duración 10 – 20 horas
Gestación Media y Rango (días) 21 20 - 22
Tamaño de la camada 7 - 14
Período reproductivo óptimo 9 – 10 meses28 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Parámetros fisiológicos y nutricionales Rata (Rattus norvergicus)
Temperatura rectal (ºC +/- 0,5) 37,5
Frecuencia respiratoria 92 (80 – 150)
Frecuencia cardíaca 350 ( 260 – 450)
Agua requerida diaria (ml) 20 - 45
Orina excretada diaria (ml) 10 - 15
Comida requerida diaria (g) 10 - 203. Modelo animal en lesión renal aguda
isquémica pediátrica
3.1 Objetivo principal
Analizar en un modelo animal de injuria renal aguda isquémica con varios grupos etarios
pediátricos, las diferencias histopatológicas que expliquen el curso fisiopatológico de la
enfermedad en niños de diferentes edades.
3.2 Objetivos específicos
1. Describir la presencia de alteraciones a nivel glomerular que expliquen las
posibles anormalidades en los niveles séricos de creatinina.
2. Evaluar la presencia de edema intracelular tanto en la zona medular renal interna
como externa.
3. Evaluar la presencia de edema intracelular tanto en túbulos proximales como
distales.
4. Evaluar la presencia de alteraciones en el intersticio y el compartimento vascular
renal.
5. Describir las diferencias existentes en el perfil histológico del riñón y los niveles
séricos de creatinina inducidos por la isquemia renal en diversos grupos etarios.
3.3 Materiales y métodos
Tipo de estudio: Estudio experimental no controlado.
Población: Se utilizaron ratas machos Wistar obtenidos del Bioterio de
Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de
Colombia. Se establecieron 3 grupos etarios casos y controles de
10 individuos cada uno, así: Grupo 1= 10 días de edad, Grupo 2 =30 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
20 días de edad, Grupo 3 = 30 días de edad, correspondientes
aproximadamente al equivalente de edad en humanos para
lactantes, pre-escolares, y pre-púberes respectivamente.
Tabla de variables: (Tabla 3-1).
Tabla 3-1: Tabla de variables.
Variable Definición Tipo de variable Unidad de medida
Clasificación que se le da
Cualitativa 0. Control
Tipo a la rata si es caso o
dicotómica 1. Caso
control
Clasificación que se le da 0. Control
Cualitativa
Tipo Riñón al riñón de la rata de 1. Caso intervenido
ordinal
acuerdo a la intervención 2. Caso no intervenido
Peso en gramos antes de
Cuantitativa
Peso pre realizar la intervención de gr
continuo
clampeo
Peso en gramos a las 72
Cuantitativo
Peso post horas de realizar la gr
continuo
intervención de clampeo
1. Sin anormalidad
2. Lesiones leves que
afectan al 10% o
menos de la muestra
de riñón
3. Lesiones que afectan
Clasificación del daño
Puntaje Goujon Cualitativa el 25% de las
tubular intersticial en
(28) nominal muestras renales
estudio histopatológico
4. Lesiones que afectan
el 50% de las
muestras renales
5. Lesión que afecta el
75% o más de las
muestras renalesCapítulo 3 31
Variable Definición Tipo de variable Unidad de medida
Tabla 3-1: (Continuación)
Adecuada delimitación
Delimitación Cualitativa 0. No
corticomedular al examen
cortico medular dicotómica 1. Si
macroscópico
El sistema colector del
Dilatación Cualitativa 0. No
riñón presenta examen
sistema colector dicotómica 1. Si
macroscópico
Tejido con apariencia
Área Cualitativa 0. No
blanquecina al examen
blanquecina dicotómica 1. Si
macroscópico
Al corte es Consistencia y color al
Cualitativa 0. No
blanquecino corte del tejido renal en
dicotómica 1. Si
reblandecido estudio macroscópico
Característica
Superficie área Cualitativa 0. No
macroscópica de tejido
cruenta dicotómica 1. Si
renal
Arquitectura Característica histológica Cualitativa 0. No
preservada de la estructura renal dicotómica 1. Si
Glomérulos Característica histológica Cualitativa 0. No
normales de la estructura renal dicotómica 1. Si
0. Normal
Característica histológica
TCP 1. Edema
de la estructura renal
2. Necrosis
0. Normal
Característica histológica
TCD 1. Edema
de la estructura renal
2. Necrosis
Intersticio y el
compartimento
vascular Característica histológica Cualitativa 0. No
histología usual de la estructura renal dicotómica 1. Si32 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Variable Definición Tipo de variable Unidad de medida
Tabla 3-1: (Continuación)
Medula Zona
interna y
Característica histológica Cualitativa 0. No
externa con
de la estructura renal dicotómica 1. Si
edema
intracelular
Necrosis de la Característica histológica Cualitativa 0. No
médula de la estructura renal dicotómica 1. Si
Necrosis Característica histológica
Cualitativa 0. No
glándula de la estructura
dicotómica 1. Si
suprarrenal suprarrenal
Compuesto
orgánico generado a
Creatinina pre Cualitativa
partir de la degradación mg/dl
(mg/dl) dicotómica
de la creatina tomado de
plexo venoso retro-orbital
Compuesto
orgánico generado a
Creatinina post Cualitativa
partir de la degradación mg/dl
(mg/dl) dicotómica
de la creatina plexo
venoso retro-orbital
Adaptado por: La autora. 2015.Capítulo 3 33
3.4 Metodología
3.4.1 Mantenimiento de los animales
Figura 3-1: Ratas lactantes en compañía de la madre para asegurar la lactancia.
Adaptado por: La autora. 2015.
Se utilizaron ratas machos Wistar obtenidos del Bioterio de Medicina Veterinaria y
Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia (ver Tabla 3-1 para evaluar el
completo cumplimiento de los requisitos para la decisión de dicha cepa) y se aclimataron
por grupos de 10 sujetos en jaulas específicas, proporcionándoles alimento y agua ad
libitum durante al menos 5 días antes de los procedimientos quirúrgicos. En el caso de
las 10 ratas lactantes (grupos caso y control de 10 días de edad) se garantizó lactancia
materna a libre demanda (Figura 3-1).
Se realizó seguimiento estrecho de su dieta e ingesta de agua junto con el registro de los
pesos corporales. Se establecieron 3 grupos etarios casos y controles de 10 individuos34 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
cada uno, así: Grupo 1= 10 días de edad, Grupo 2 = 20 días de edad, Grupo 3 = 30 días
de edad, correspondientes aproximadamente al equivalente de edad en humanos para
lactantes, pre-escolares, y pre-púberes respectivamente (Figura 3-2).
Figura 3-2: Equivalencia de edades Ratas : Humanos.
Modificada de: Sengupta, P. 2013. (29).
3.4.2 Preparación para el experimento
El equipo, instrumentos quirúrgicos y otros materiales (número necesario en paréntesis)
fueron: sistema de calentamiento (2), podadora de pelo animal (1), cronómetro (1),
pinzas de tejido con puntos romas (2), pinzas con puntas ultra nítidas (2), tijeras de
disección y cirugía con puntas afiladas (1), Vicryl 5-0 aguja curva (1), pinzas mosquito
baby (4), separadores de piel (2), porta-agujas (1), jeringas de 1 ml, jeringas de 5 ml,
hisopos con alcohol, hisopos de algodón, gasas, toallas de papel, bolsas rojas para
desechos anatomo-patológicos, capilares heparinizados para extracción de sangre, tubos
eppendorf, macrocentrífuga de laboratorio, micropipetas, puntas desechables para
micropipetas y guantes quirúrgicos. Las soluciones utilizadas son solución salina (0,9%
de cloruro de sodio), Ketamina 10% y Xilacina 2%, formol tamponado al 10%, alcohol al
70%, frascos recolectores de orina, tubos Falcon de laboratorio cónicos de 15 ml,
lágrimas artificiales veterinarias. Por último, todas las herramientas, materiales y
soluciones estaban estériles.
3.4.3 Procedimiento Quirúrgico para LRA
Todos los procedimientos de los individuos, fueron realizados utilizando técnicas estériles
estrictas bajo anestesia general con ketamina (40 - 90 mg/kg intraperitoneal) y xilacinaCapítulo 3 35
(0,5 – 1,5 mg/kg) (Figura 3-3) (Anexo E, F y G). La solución de ketamina se preparó junto
con la xilacina en jeringa de 1 ml en relación 9:1 respectivamente.
Figura 3-3: Sitio de inyección intra-peritoneal.
Modificada de: Bogdanske JJ, Hubbard-Van Stelle S, Rankin Riley M, Schiffman BM
2011 (30).
Después de las inyecciones de ketamina y xilacina, el pelo a un costado de la rata se
eliminó con la cortadora de pelo. La piel en el área quirúrgica se limpió con un algodón
con alcohol al 70%.
3.4.4 Cirugía
Inmediatamente después de la preparación de la piel, la rata se colocó sobre un sistema
de calentamiento y se cubrió con una gasa estéril. No se inició cirugía hasta que la rata
se encontraba en un plano de anestesia profunda y por lo tanto no respondía a dolor
inducido por un pellizco en la cola. El tiempo aproximado fue de 10 minutos después de
la inyección de ketamina + xilacina para lograr una anestesia profunda. La rata se colocó
en el puesto termostático sobre el lado derecho. La piel y el músculo en el flanco
izquierdo se cortaron a lo largo de la parte de atrás para exponer el riñón izquierdo. La
incisión se realizó en un tercio del cuerpo desde la parte posterior de la rata y el tamaño
de la incisión fue de 1-1,5 cm a lo largo (Figura 3-4 y Figura 3-5). El riñón fue
suavemente empujado hacia fuera del corte con hisopos de algodón estériles para
exponer el pedículo renal. La disección del pedículo se realizó con pinzas de punta36 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
ultra-finas para eliminar el tejido que rodea el pedículo renal y exponer los vasos
sanguíneos para el clampeo del mismo.
Figura 3-4: Esquema de los sitios de incisión en el flanco del modelo unilateral para
lesión renal aguda isquémica en rata. Los sitios de incisión están marcados con una línea
roja en el lado derecho (B) e izquierdo (A).
Tomado de: Wei, Q.; Dong, Z. 2012.
Figura 3-5: Sitio de incisión en el flanco del modelo unilateral para lesión renal aguda
isquémica en rata.
Adaptado por: La autora. 2015.Capítulo 3 37
3.4.5 Isquemia renal
El riñón izquierdo se empujó suavemente de la cavidad del cuerpo con hisopos de
algodón para exponer el pedículo. Una pinza mosquito baby se utilizó para sujetar el
pedículo y bloquear el flujo de sangre al riñón induciendo isquemia renal. La duración de
la isquemia renal comenzó desde el momento del clampeo, la isquemia completa se
evidenció por el cambio de color del riñón de rojo a púrpura oscuro en pocos segundos.
Después de la isquemia, la pinza mosquito baby fue liberada a tiempos deseados de 30
minutos para iniciar la reperfusión, que estuvo indicada por el cambio de color a rojo de
riñón. Una sutura Vicryl 5-0 se utilizó para cerrar la capa muscular de la incisión seguido
por el cierre de la piel. Inmediatamente después del cierre de la herida, se administró 0,5
ml de solución salina estéril tibia por vía intra- peritoneal a cada rata. El animal se
mantuvo después sobre una almohadilla caliente hasta que tuvo plena recuperación de la
conciencia antes de ser devuelto a su jaula de alojamiento para continuar su alimentación
y hábitat general previos. Durante el tiempo de anestesia y hasta la recuperación
completa del parpadeo se colocaron lágrimas artificiales a necesidad.
Figura 3-6: En un primer tiempo quirúrgico se realizó el clampeo unilateral del pedículo
vascular renal. En un segundo tiempo quirúrgico a las 72 horas del procedimiento inicial
se procedió al retiro de ambos riñones en el caso de los grupos caso y de uno de los 2
riñones en el caso de los grupos control.
Tomado de: Wei, Q.; Dong, Z. 2012.38 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
A las 72 horas del procedimiento quirúrgico inicial se procedió a un segundo tiempo de
cirugía igualmente bajo la misma combinación de anestésicos para la extracción del riñón
lesionado y su contralateral no lesionado en los casos a estudio (Figura 3-6). En las ratas
control se realizó la extracción de solo uno de los 2 riñones bajo las mismas condiciones
que las ratas caso. Los riñones retirados se colocaron inmediatamente en frascos
recolectores de orina de 30 ml con 20 ml de formol tamponado al 10% para la fijación del
tejido.
3.4.6 Seguimiento isquemia-reperfusión (IR)
El éxito de la IR renal se monitorizó a varios niveles. En primer lugar, después de la
fijación, el color del riñón cambió de rojo a púrpura oscuro, indicativo de una isquemia
renal exitosa (Figura 3-7).
Figura 3-7: Cambio de color del riñón a púrpura oscuro luego del tiempo total de
isquemia.
Adaptado por: La autora. 2015.Capítulo 3 39
Figura 3-8: Toma de sangre del seno retro-orbital.
Modificado de: Bogdanske, J. J.; Hubbard-Van Stelle, S.; Rankin Riley, M.; Schiffman, B,
M. 2011. (30).
Se solicitó creatinina sérica antes de iniciar el procedimiento y luego a las 72 horas de la
reperfusión. Las muestras fueron obtenidas del plexo venoso retro-orbital (Figura 3-8)
(Anexo H), congeladas y enviadas al Laboratorio Clínico del Departamento para Ciencias
de la Salud Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad
Nacional de Colombia (Anexo I).40 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Finalmente, se realizó examen histopatológico de los tejidos renales con tinción de
hematoxilina y eosina (H & E). Los estudios de histopatología y microscopía de luz fueron
realizados en el Departamento de Patología de la Facultad de Medicina de la Universidad
Nacional de Colombia (Anexo J).4. Análisis estadístico
Se realizó un análisis descriptivo de las variables a estudio, a las variables cualitativas se
obtuvieron frecuencias y porcentajes, a las variables cuantitativas medidas de tendencia
central (mediana y media) y medidas de dispersión (desviación estándar y rango
intercuartílico) de acuerdo a su distribución, la cual se conoció por medio de la prueba
estadística Shapiro Wilk.
Luego se evaluó en cada caso y control la relación con las variables histopatológicas y
función renal. Por último se obtuvo la relación de acuerdo al grupo etario de los
participantes. La relación entre variables se realizó por medio de la prueba f de Fisher
para variables cualitativas, y las diferencias de media por medio de T de student y U
Mann de Whitney. Para análisis entre los valores cuantitativos antes de la intervención y
después de la intervención, se utilizó prueba t de student para muestras pareadas y
Wilcoxon signed-ranks. Para las variables categóricas y relación con variables
cuantitativas se utilizó Kruskall Wallis y ANOVA y para los análisis pre y post se utilizaron
técnicas emparejadas.
Se consideró una p estadísticamente significativa valores <0,05.
4.1 Resultados
4.1.1 Características
Se analizaron un total de 30 ratas, las cuales se distribuyeron según la edad de forma
equitativa en 10 días (n= 10), 20 días (n=10) y 30 días (n=10), se tomaron de cada grupo
5 casos y 5 controles. El análisis patológico estuvo compuesto por 45 especímenes de
riñón, 30 del grupo intervención (15 riñones clampeados, 15 no clampeados) y 15 riñones
en el grupo control. La mediana del peso pre y post-intervención en el grupo de 10 días42 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
de edad días fue igual, en el grupo de 20 días el peso post-intervención fue ligeramente
mayor y en el grupo de 30 días se evidenció un aumento en el peso post-intervención
(Tabla 4-1).
Tabla 4-1: Distribución de peso pre y posintervención de acuerdo a las edades.
Grupo de edad Peso en gr N mín p25 p50 p75 max
Primera intervención 10 22 27 30 31 32
10 días
Reintervención 10 25 28 30 31 35
Primera intervención 10 35 40 40,5 43 50
20 días
Reintervención 10 35 42 42,5 45 60
Primera intervención 10 65 73 81 85 91
30 días
Reintervención 10 80 83 87,5 92 100
Mín: mínimo; max: máximo.
Adaptado por: La autora. 2015.
4.1.2 Evaluación de función renal
La mediana de creatinina sérica antes de la intervención estuvo en 0,46 (±0,04), valor
mínimo de 0,37 y máximo 0,56; luego de la intervención se evidenció un aumento
significativo en los valores con un promedio global de 0,51 (±0,07), mínimo de 0,37 y
máximo 0,71 (p=0,002). Al evaluar si existían diferencias entre los valores de creatinina
inicial encontramos que eran iguales entre los casos y los controles, tanto en la población
global como por grupo etario. Los valores de creatinina post tampoco mostraron
diferencias entre los grupos estudiados (Tabla 4-2). Para los valores entre creatinina pre
y post encontramos en el grupo control una mediana de 0,46 (RIQ = 0.43 – 0.50) en el
valor de creatinina pre y de 0,49 (RIQ = 0.44 – 0.56) en el valor de la creatinina post-
intervención (p=0,09). En el grupo de casos, la mediana pre-intervención de creatinina
estuvo en 0,44 (RIQ = 0.41 – 0.49) y de 0,52 (RIQ = 0.46 – 0.56) para el valor de
creatinina post-intervención (p=0,03).
En el grupo de riñón no intervenido, los participantes con edad de 30 días presentaron
valores de creatinina post-intervención de 0,46 (±0,06), menor que en los participantes de
20 y 10 días de edad, pero no estadísticamente significativo (p=0,39). En los
participantes con riñón intervenido, las ratas de 30 días presentaron valores creatininaCapítulo 4 43
post-intervención de 0,51 (±0,06), resultando mayores que los otros grupos, pero no
estadísticamente significativos (p=0,964). Solamente se evidenció diferencia en los
valores de creatinina pre y post-intervención, en los participantes intervenidos con
edades de 20 días (p=0,00), aunque las diferencias no son clínicamente relevantes.
Tabla 4-2: Valores de creatinina pre y pos de acuerdo a grupo de casos y controles,
en la población general y de acuerdo a los días de edad.
Riñón no Riñón
intervenido intervenido
Creatinina N Promedio DE Promedio DE p
Población Primera 15 0,47 0,04 0,45 0,13 0,51
global intervención
Reintervención 15 0,51 0,08 0,51 0,06 0,77
10 días Primera 5 0,47 0,05 0,45 0,07 0,60
intervención
Reintervención 5 0,51 0,05 0,45 0,05 0,13
20 días Primera 5 0,48 0,03 0,44 0,03 0,13
intervención
Reintervención 5 0,55 0,10 0,55 0,06 0,98
30 días Primera 5 0,45 0,05 0,46 0,05 0,57
intervención
Reintervención 5 0,46 0,06 0,51 0,05 0,16
Adaptado por: La autora. 2015.
4.1.3 Análisis patológico
El análisis patológico estuvo compuesto por 45 especímenes, 30 del grupo intervención
(15 riñones clampeados, 15 no clampeados) y 15 riñones en el grupo control. Las
características macro y microscópicas entre los riñones intervenidos y los no intervenidos
del grupo control se presentan en la Tabla 4-3. Al clasificar las características
histopatológicas utilizando la escala de Goujon, encontramos que 44,4%, presentaron
TCP y TCD con edema intracelular, la médula interna y externa con edema intracelular
(Tabla 4-4).44 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Se observa que el 53% de los intervenidos tiene una adecuada delimitación
corticomedular (p=0,05), 33,3% tiene área blanquecina al corte (p=0,021), 60% tienen
glomérulos normales (p=0,008), 46,6% tienen necrosis de la médula renal y también
necrosis de la glándula suprarrenal (p=0,003) (Tabla 4-5).
Tabla 4-3: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón.
N (45) 100%
Caso
Riñón intervenido 15 33,3
Riñón no intervenido 15 33,3
Control
Riñón no intervenido 15 33,3
Características macroscópicas
Adecuada delimitación corticomedular 36 80
Dilatación sistema colector 1 22,2
Área externa blanquecina 2 4,4
Superficie área cruenta 1 2,2
Al corte es blanquecino 5 11,1
Características microscópicas
Arquitectura preservada 41 91,11
Glomérulos normales 39 86,7
Túbulo contorneado proximal normal 18 40
Túbulo contorneado distal normal 18 40
Intersticio y compartimiento vascular normal 40 88,8
Médula renal con edema 17 37,7
Necrosis de médula renal 7 15,5
Necrosis de la glándula suprarrenal 7 15,5
Adaptado por: La autora. 2015.Capítulo 4 45
Tabla 4-4: Distribución de especímenes quirúrgicos de acuerdo a la escala de
Goujon.
Escala de Goujon N (45) 100%
Normal 18 40
TCP y TCD con edema intracelular, la médula interna y 20 44,4
externa con edema intracelular
Extensa necrosis de coagulación que compromete corteza y 3 6,6
médula
Necrosis de coagulación que compromete corteza y médula 3 6,6
(50% del parénquima renal)
Necrosis y trombosis reciente de una arteria y calcificación 1 2,2
distrófica focal
TCP: Túbulo contorneado proximal; TCD: Túbulo contorneado distal
Adaptado por: La autora. 2015.
Tabla 4-5: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón, de acuerdo al grupo de intervención y control.
Riñón no Riñón intervenido
intervenido
N (15) (100%) N (15) (100%) p
Reporte macroscópico
Adecuada delimitación 13 86,6 8 53,3 0,05
corticomedular
Dilatación sistema colector 0 0 1 6,6 0,500
Área externa blanquecina 1 6,6 1 6,6 0,75
Superficie área cruenta 0 0 1 6,6 0,500
Al corte es blanquecino 0 0 5 33,3 0,021
Reporte microscópico
Arquitectura preservada 15 100 11 73,3 0,05
Glomérulos normales 15 100 9 60 0,008
Túbulo contorneado proximal 5 33,3 5 33,3 0,015
normal
Túbulo contorneado distal normal 5 33,3 5 33,3 0,01546 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Riñón no Riñón intervenido
intervenido
N (15) (100%) N (15) (100%) p
Tabla 4-5: (Continuación)
Intersticio y compartimiento 15 100 10 66,6 0,021
vascular normal
Médula renal con edema 9 60 2 13,3 0,010
Necrosis de médula renal 0 0 7 46,6 0,003
Necrosis de la glándula 0 0 7 46,6 0,003
suprarrenal
Adaptado por: La autora. 2015.
Al comparar los casos intervenidos, con los riñones no intervenidos tanto en el grupo
control como en el grupo de intervención, se mantienen las diferencias
anatomopatológicas entre los grupos. (Tabla 4-6)
Tabla 4-6: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón, de acuerdo al grupo de intervención y el total de especímenes no intervenidos.
Riñón no intervenido Riñón intervenido
N(30) (100%) N (15) (100%) p
Reporte macroscópico
Adecuada delimitación 28 93,3 8 53,3 0,003
corticomedular
Dilatación sistema colector 0 0 1 6,6 0,333
Área externa blanquecina 1 3,3 4 26,6 0,036
Superficie área cruenta 0 0 1 6,6 0,333
Al corte es blanquecino 0 0 5 33,3 0,002
Reporte microscópico
Arquitectura preservada 30 100 11 73,3 0,009
Glomérulos normales 30 100 9 60 0,001
Túbulo contorneado proximal 13 43,3 5 33,3 0,001
normal
Túbulo contorneado distal normal 13 43,3 5 33,3 0,001Capítulo 4 47
Riñón no intervenido Riñón intervenido
N(30) (100%) N (15) (100%) p
Tabla 4-6: (Continuación)
Intersticio y compartimiento 30 100 10 66,6 0,002
vascular normal
Médula renal con edema 15 50 2 13,3 0,017
Necrosis de médula renal 0 0 7 46,6 0,000
Necrosis de la glándula 0 0 7 46,6 0,000
suprarrenal
Adaptado por: La autora. 2015.
Al evaluar los grupos control e intervención de acuerdo a la edad en que se realizó la
misma, encontramos que en el grupo de 10 días, el 20% en los intervenidos presentó
dilatación del sistema colector y en el reporte microscópico no se encentraron diferencias
entre la arquitectura, los glomérulos, y la médula renal (Tabla 4-7). Se evidencia en este
grupo etario la necrosis de la glándula suprarrenal (p=0,000). En el grupo de 20 días, se
encontró diferencias en la delimitación corticomedular entre los grupos intervención y no
intervención (p=0,02), así como en las características microscópicas de los glomérulos,
TCP, TCD y necrosis de la médula renal (Tabla 4-8). En los participantes con edad de 30
días, el grupo intervención al examen macroscópico, presentó en 60% tejido con área
blanquecina al corte; así mismo 40% presentó arquitectura preservada (p=0,022);
glomérulos normales en 40% (p=0,022), y alteraciones en el intersticio. Necrosis de la
médula renal en 60% (p=0,022) (Tabla 4-9).
Tabla 4-7: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón, de acuerdo al grupo de intervención y el total de especímenes no intervenidos en
los participantes de 10 días de edad.
10 días
Riñón no intervenido Riñón intervenido
N (30) 100% N (15) 100%
Reporte macroscópico
Adecuada delimitación córtico-
10 100 4 80
medular48 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
10 días
Riñón no intervenido Riñón intervenido
N (30) 100% N (15) 100%
Tabla 4-7: (Continuación)
Dilatación sistema colector 0 0 1 20
Área externa blanquecina 0 0 0 0
Superficie área cruenta 0 0 0 0
Al corte es blanquecino 0 0 0 0
Reporte microscópico
Arquitectura preservada 10 100 5 100
Glomérulos normales 10 100 5 100
Necrosis túbulo contorneado 0 0 0 0
proximal
Necrosis túbulo contorneado 0 0 0 0
distal
Intersticio y compartimiento 10 100 5 100
vascular normal
Médula renal con edema 7 70 1 20
Necrosis de médula renal 0 0 1 20
Necrosis de la glándula 0 0 5 100
suprarrenal
Adaptado por: La autora. 2015.
Tabla 4-8: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón, de acuerdo al grupo de intervención y el total de especímenes no intervenidos en
los participantes de 20 días de edad.
20 días
Riñón no intervenido Riñón intervenido
N (30) 100% N (15) 100%
Reporte macroscópico
Adecuada delimitación córtico- 10 100 2 40
medular
Dilatación sistema colector 0 0 0 0Capítulo 4 49
20 días
Riñón no intervenido Riñón intervenido
N (30) 100% N (15) 100%
Tabla 4-8: (Continuación)
Área externa blanquecina 0 0 1 20
Superficie área cruenta 0 0 1 20
Al corte es blanquecino 0 0 2 40
Reporte microscópico
Arquitectura preservada 10 100 4 80
Glomérulos normales 10 100 2 40
Necrosis túbulo contorneado 0 0 3 60
proximal
Necrosis túbulo contorneado 0 0 3 60
distal
Intersticio y compartimiento 10 100 3 60
vascular normal
Médula renal con edema 5 50 1 20
Necrosis de médula renal 0 0 3 60
Necrosis de la glándula 0 0 1 20
suprarrenal
Adaptado por: La autora. 2015.
Tabla 4-9: Características macro y microscópicas de los especímenes quirúrgicos de
riñón, de acuerdo al grupo de intervención y el total de especímenes no intervenidos en
los participantes de 30 días de edad.
30 días
Riñón no intervenido Riñón intervenido
N (30) 100% N (15) 100%
Reporte macroscópico
Adecuada delimitación córtico- 8 80 2 40
medular
Dilatación sistema colector 0 0 0 0
Área externa blanquecina 1 10 0 050 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
30 días
Riñón no intervenido Riñón intervenido
N (30) 100% N (15) 100%
Tabla 4-8: (Continuación)
Superficie área cruenta 0 0 0 0
Al corte es blanquecino 0 0 3 60
Reporte microscópico
Arquitectura preservada 10 100 2 40
Glomérulos normales 10 100 2 40
Necrosis túbulo contorneado 0 0 3 60
proximal
Necrosis túbulo contorneado 0 0 3 60
distal
Intersticio y compartimiento 10 100 2 40
vascular normal
Médula renal con edema 3 30 0 0
Necrosis de médula renal 0 0 3 60
Necrosis de la glándula 0 0 1 20
suprarrenal
Adaptado por: La autora. 2015.5. Discusión
El modelo murino pediátrico de injuria renal aguda descrito, evidencia que los cambios
renales tanto morfológicos como funcionales implican un proceso multifactorial complejo,
que predispone a lesión renal aguda en la población indistintamente de la edad. Desde el
punto de vista funcional, los valores de creatinina inicial son iguales entre los casos y los
controles, tanto en la población global como por grupo etario, lo que puede traducirse en
una homogeneidad en los grupos estudiados. Los valores de creatinina post intervención
no mostraron diferencias entre los grupos estudiados, esto soporta que la medición de la
creatinina sérica, es un marcador no ideal de la función renal, ya que debería tenerse en
cuenta un aumento del valor absoluto como mejor indicador que tomar aumentos
porcentuales de la creatinina, como lo plantea Waikar, S. S.; Bonventre, J. V., existiendo
además otros marcadores de mayor utilidad en la práctica clínica, ya que el daño
principal en lesión renal aguda es tubular más que glomerular (31). Por el contrario un
hallazgo clínico relevante es la ganancia de peso en edades mayores, como es sabido a
mayor ganancia de peso, mayor riesgo de morbimortalidad, que puede relacionarse con
mayor edema y deterioro de la función renal (32).
Llama la atención igualmente que en los riñones no intervenidos de las ratas caso y de
las ratas controles de todas las edades, el hallazgo predominante fue la presencia de
edema intracelular del túbulo contorneado proximal (TCP) y túbulo contorneado distal
(TCD), con presencia de edema intracelular también de la médula interna y externa,
estando incluso presente en las ratas caso con riñón intervenido normal. Éste hallazgo es
inespecífico y se infiere que podría atribuirse a causas no relacionadas independientes
de la lesión por isquemia-reperfusión, quizá pueda atribuirse a un proceso de
deshidratación transitorio en el evento quirúrgico sin encontrarse literatura que soporte
dicha explicación.52 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Resulta interesante que dentro de diferentes edades en poblaciones pediátricas se
observe igualmente un mayor daño a mayor edad. Es probable que los mecanismos
implicados en la LRA de los ancianos tengan un comportamiento gradual desde
temprana edad, situación que se pone de relieve por los hallazgos de que el daño se
incrementa, mientras que la mecanismos reparativos disminuyen en los riñones de
animales o humanos de mayor edad, y es posible que dentro de cada una de estas vías
haya muchos mecanismos convergentes en juego. Si bien las investigaciones tanto en
animales como en humanos han mostrado diferencias de la función renal en relación con
el envejecimiento (considerando que los procesos de “envejecimiento” también se dan en
niños con una disminución gradual del potencial biológico a mayor edad), estos estudios
han evaluado diferentes edades únicamente dentro de población adulta; hay varios
cambios histológicos en el riñón con el paso del tiempo que se producen conforme el
paciente crece en edad, incluyendo cambios renovasculares, fibrosis tubulointersticial,
glomeruloesclerosis y pérdida de nefronas (3). Con suerte, el conocimiento más profundo
de todos los mecanismos subyacentes a la LRA por I/R en diferentes edades dará lugar a
la progresión en el desarrollo de intervenciones preventivas y de protección que permitan
disminuir la necesidad de terapias dialíticas y potenciar la resolución de la LRA.
Resulta lógico pensar que los problemas cardiovasculares causados por las condiciones
relacionadas con la edad como la hipertensión y la diabetes contribuyen a la
susceptibilidad para LRA. Se estima que los pacientes mayores de 65 años tienen
aproximadamente un 30% de mayor riesgo de no recuperación de la función renal
completa después de LRA. Sin embargo, las razones para un peor pronóstico entre las
personas de edad avanzada, independiente de las comorbilidades asociadas, no se
entiende bien, ya que el daño renal en LRA resulta de varias causas, entre ellas la
isquemia y reperfusión renal (33). Estudios en ratas ancianas vs ratas adultas jóvenes
han mostrado que las ratas de edad avanzada son más susceptibles a la insuficiencia
renal inducida por LIR, que puede asociarse con el aumento del estrés oxidativo, mayor
compromiso histológico, y el aumento de la inflamación y fibrosis tubulointersticial (34);
en éste sentido se ha planteado como blanco terapéutico la disminución del estrés
oxidativo y de la respuesta inflamatoria para mejorar la recuperación de riñón después de
LIR (16). Incluso el envejecimiento podría desempeñar un papel importante en exagerar
los procesos patológicos de la inflamación y fibrosis en órganos remotos incluyendo elCapítulo 5 53
corazón y el riñón no isquémico después de la estimulación por LIR del riñón unilateral
(35).
Un aspecto que resulta interesante y que podría atenuar el daño por LIR en poblaciones
jóvenes vs envejecidas es el del poscondicionamiento isquémico (IPOC), que se define
como una serie de interrupciones intermitentes del flujo sanguíneo en la fase temprana
de la reperfusión que altera mecánicamente la hidrodinámica de la reperfusión y
disminuye el daño renal después de la lesión isquemia/reperfusión (LIR) in vivo. En un
estudio en el que se utilizaron ratas Wistar de edades de 3 meses (jóvenes) y de 24
meses (viejas), sometidas a 45 minutos de isquemia renal, con y sin tratamiento con
IPOC, se evaluaron niveles de nitrógeno ureico y creatinina sérica, examen histológico y
apoptosis a las 24 horas. El estrés oxidativo fue evaluado y las moléculas relacionadas
con la apoptosis fueron estudiadas por Western Blot. Como resultado, en los riñones de
las ratas jóvenes, el IPOC atenúo significativamente la disfunción y la apoptosis inducida
por isquemia/reperfusión (I/R) de las células renales. En contraste, el IPOC no limitó la
disfunción renal, posiblemente una consecuencia del aumento de la apoptosis en riñones
de ratas de edad avanzada. Se concluye que el IPOC fue ineficaz en los riñones de ratas
viejas. Estos hallazgos pueden tener implicaciones importantes en la severa apoptosis en
riñones envejecidos que podrían ser refractarios al efecto anti-apoptótico por IPOC (36).
Es evidente que en nuestro estudio a mayor edad se presentaron mayores cambios
histológicos, sin embargo se requieren otros estudios que evalúen el grado de apoptosis
dentro de poblaciones pediátricas y si igualmente a menor edad mayor beneficio del
tratamiento con IPOC.
La disminución en la expresión del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) en
los túbulos renales causa pérdida progresiva de la microvasculatura renal con la edad. La
disfunción mitocondrial puede ser un fenómeno que subyace al proceso de
envejecimiento (37). La relación entre la expresión de VEGF y la disfunción mitocondrial
en el envejecimiento no se entiende completamente, y se plantea que la disfunción
mitocondrial bloquea la expresión de VEGF y contribuye a la angiogénesis alterada en el
envejecimiento renal (38), lo cual podría contribuir a la mayor lesión por I/R en ratas
progresivamente mayores y habrá de evaluarse en futuros estudios con microscopía de
luz.54 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Cambios en la actividad o la capacidad de respuesta del sistema renina-angiotensina
(RAS) se producen con el envejecimiento y estudios previos han demostrado que el eje
renina-angiotensina-aldosterona (RAA) se suprime con la edad. En comparación con los
grupos más jóvenes, las poblaciones mayores tienen niveles más bajos de renina
plasmática y aldosterona y muestran un deterioro en la capacidad para desencadenar
respuestas apropiadas a estímulos como la postura, depleción de sodio o infusión de
potasio. Los estudios en animales de mayor edad han mostrado que tanto la formación
como la liberación de renina por el riñón se reducen, lo que resulta en una disminución
en la concentración de renina plasmática. Además, el cambio en la actividad RAA
conduce a una respuesta alterada al bloqueo del SRA. Los efectos de los inhibidores de
la enzima convertidora de angiotensina (iECA) en la presión sanguínea, la función renal y
proteinuria son débiles en animales con mayor edad por lo cual, estas poblaciones
exhiben una respuesta antihipertensiva disminuida con los iECA respecto a los grupos
más jóvenes (39).
Si bien, todos los estudios anteriores evalúan las posibles explicaciones al mayor daño
renal en casos de lesión por isquemia/reperfusión en relación con la edad, también hay
descripciones al respecto en otros tipos de LRA. Resulta interesante observar que en
casos de riñones de mayor edad hay una susceptibilidad aumentada a la nefrotoxicidad
(40); igualmente ocurre en la severidad de la lesión renal aguda inducida por sepsis
(41,42).
Más recientemente se ha reconocido la expresión renal de la proteína Klotho, proteína
transmembrana originalmente identificada en 1997 como una proteína anti-
envejecimiento, descubierta en varias actividades biológicas a partir de entonces. La
proteína Klotho no sólo está presente en la membrana celular, sino que también es
secretada. La membrana Klotho unida a la membrana funciona como un co-receptor
obligado para el factor de crecimiento de fibroblastos 23, y actúa sobre el riñón para
regular el equilibrio negativo de fosfatos. La proteína Klotho secretada funciona como
factor humoral que regula la actividad de múltiples canales iónicos y receptores de
factores de crecimiento. Aunque la proteína Klotho se expresa en múltiples órganos, es
altamente expresada en el riñón, especialmente en el túbulo contorneado distal, y
desempeña diversos papeles fisiológicos en el desarrollo de la lesión renal aguda (LRA)
y en la progresión de la enfermedad renal crónica. Se ha demostrado en ratas que losCapítulo 5 55
niveles de mRNA y proteína Klotho renal se reducen significativamente en la lesión por
isquemia-reperfusión (LIR) en el primer día después de la isquemia, pero se recuperan
poco a poco durante los siguientes 10 días. Igualmente en otros estudios se ha
demostrado que la LRA es un estado de deficiencia aguda y transitoria de Klotho en
sangre, orina y riñones de modelos animales con LIR y que los niveles urinarios en
pacientes con LRA fueron inferiores a los de humanos sanos, lo que sugiere que la
proteína Klotho puede tener potencial diagnóstico y terapéutico en LRA humana. Sin
embargo, todavía hay poca evidencia sobre el papel biológico de Klotho en la LRA
humana, ya que la mayoría de los estudios se han realizado en modelos animales de
LRA por I/R (43, 44, 45). Probablemente siendo reconocida como proteína “anti-
envejecimiento” sus niveles y acción protectora tengan un impacto diferente en la LRA a
diversas edades.56 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Figura 5-1: Mecanismos que aumenta la incidencia de LRA con la edad.1
Modificado de: Wang, X.; Bonventre, J. V.; Parrish, A. R. 2014.
Los cambios renales tanto morfológicos como funcionales con la edad implican un
proceso multifactorial complejo que predispone a LRA en la población progresivamente
de mayor edad (Figura 5-1). Es claro, sin embargo, que el aumento de la susceptibilidad
del riñón “envejecido” a una lesión aguda es compleja y, muy probablemente, no puede
explicarse por un solo mecanismo. Resulta interesante que dentro de diferentes edades
en poblaciones pediátricas se observe igualmente un mayor daño a mayor edad. Es
probable que los mecanismos implicados en la LRA de los ancianos tengan un
1 BMP-7 = proteína morfogenética ósea-7; mTOR = blanco de la rapamicina en mamíferos; Atg7 =
proteína relacionada con la autofagia-7; LC3 = proteína asociada a microtúbulos-3; TNF-a = factor
de necrosis tumoral alfa; MCP-1 = proteína quimioatrayente de monocitos-1; MMP-7 = matrilisina
o metaloproteinasa de la matriz-7; RANTES = células T normales expresadas y secretadas,
reguladas tras la activación; Zag = glicoproteína Zinc-72; P16INK4A = proteína inhibidora de las
quinasas dependientes de ciclinas; p21 = proteína inhibidora de las quinasas dependientes de
ciclinas; Bax = proteína reguladora de la apoptosis; GST = glutatión-S-transferas; 8-OHdG = 8-
hidroxi-2'-deoxiguanosina; p53 = proteína supresora de tumores; Bcl-2 = proteína reguladora de
procesos de permeabilización mitocondrial.Capítulo 5 57
comportamiento gradual desde temprana edad, situación que se pone de relieve por los
hallazgos de que el daño se incrementa, mientras que la mecanismos reparativos
disminuyen en los riñones de animales o humanos de mayor edad, y es posible que
dentro de cada una de estas vías haya muchos mecanismos convergentes en juego. Con
suerte, el conocimiento más profundo de todos los mecanismos subyacentes a la LRA
por I/R en diferentes edades dará lugar a la progresión en el desarrollo de intervenciones
preventivas y de protección que permitan disminuir la necesidad de terapias dialíticas y
potenciar la resolución de la LRA.
Otro aspecto que habrá que evaluarse en poblaciones pediátricas es la diferencia en el
comportamiento de la LRA por I/R entre sexos. Se sabe que las ratas hembras presentan
menos lesión a LRA isquémica, mientras que en la LRA nefrotóxica parecen más
sensibles. En el modelo de isquemia-reperfusión, se han implicado las hormonas
sexuales, sugiriendo que los estrógenos podrían desempeñar un importante papel en la
protección renal a la LIR de las mujeres limitando la activación de la endotelina. En
cambio, la presencia de testosterona parece jugar un papel crítico en las diferencias de
género en la susceptibilidad a LRA isquémica. La investigación de las diferencias de
género a nivel celular y molecular podrían proporcionar modelos interesantes para una
nueva área de investigación en el estudio tanto de la LRA isquémica y nefrotóxica y en
edades pediátricas podrían representar igualmente diferencias según el grupo etario y
posibles estrategias protectoras en pacientes de sexo femenino (46).
Un resultado relevante en el grupo de ratas intervenidas es la presencia de algún tipo de
lesión a nivel suprarrenal desde zonas de necrosis hasta lesiones isquémicas severas,
siendo mayor en especímenes de ratas de 10 días, con lo cual se infiere que el tejido
adrenal es altamente susceptible a la injuria hipóxico-isquémica y por isquemia-
reperfusión. Ramírez y colaboradores plantearon en un modelo animal que la
insuficiencia adrenal es protectora en lesión renal aguda isquémica, lo que lleva a pensar
que una “adrenalectomía fisiológica” al alterar el flujo sanguíneo de la glándula
suprarrenal es una estrategia de protección renal, lo cual podría ampliarse en estudios
posteriores con mayor población (47).
Otro hallazgo importante estuvo en relación con la histología renal normal de 2 ratas
control de 20 días en quienes se documentaron áreas de fibrosis subcapsular en relación58 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
con un proceso reparativo de una lesión antigua. Podría atribuirse a lesiones hipóxicas
perinatales cuyos datos para estos sujetos se desconocen.
El propósito que este trabajo es que sirva como base para que se desarrollen nuevos
acercamientos en el área en nuestra población, buscando ampliar la información sobre
las variables propuestas, evaluando la efectividad de intervenciones específicas y el
costo de las mismas.6. Conclusiones
1. Si bien, estadísticamente las diferencias no fueron significativas
(probablemente en relación con el número de muestra), las lesiones
isquémicas renales con mayor severidad se presentaron en el grupo de
ratas de mayor edad (treinta días).
A pesar que no se conocen estudios previos en población pediátrica, se
sabe que a mayor edad en población adulta, hay múltiples factores dados
por el envejecimiento que podrían explicar este hallazgo.
2. En el estudio se demuestra que definitivamente, los niveles de creatinina
sérica y la subyacente lesión glomerular, no son representativas de la
lesión renal aguda por isquemia-reperfusión en ningún grupo de edad de
ratas, cuestión ya conocida en la literatura previamente.
3. Resulta llamativa la lesión de diferentes grados de severidad a nivel de la
glándula suprarrenal, particularmente en el grupo de ratas de diez días.
Esto podría explicar parcialmente la presencia de la insuficiencia
suprarrenal del paciente crítico en los pacientes lactantes.
Este aspecto requiere de estudios adicionales para poder ampliar las
posibles explicaciones e implicaciones clínicas de este hallazgo.
4. Los modelos animales en diferentes patologías que se presentan en el
paciente critico pediátrico, representan una alternativa interesante de
estudio, que nos permitirá sin duda, desarrollar un mejor perfil
fisiopatológico, farmacológico y de intervención clínica en diferentes60 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
grupos de la población pediátrica que ingresan a una unidad de cuidados
intensivos pediátricos.A. Anexo: Comparación Sistema
Urinario Humano vs. Murino
Característica Murino Humano
Riñón Bilateral, unilobar, liso Bilateral, multilobar, liso pero
puede ser lobulado
Localización Retroperitoneal; el derecho Retroperitoneal; el derecho
es más cranial; próximo al más caudal, las adrenales
hígado, las adrenales sobre los polos superiores
estrechamente opuestas a
los polos craniales
Dimorfismo sexual Más grandes en machos que Iguales
en hembras
Papilas Unipapilares; puede 4 – 18
extenderse al uréter proximal
Tejido adiposo blanco Perirenal En la pelvis, perirenal
Tejido adiposo pardo Pelvis renal y perirenal Usualmente no hay
Uréteres Muy pequeños, Retroperitoneales; entran a la
retroperitoneales; entran a la vejiga en el trígono
vejiga en el trígono
Vejiga En la cavidad abdominal En la cavidad abdominal
inferior, ventral al colon; la inferior, anterior al colon
orientación permite la (hombres) o al útero (mujeres)
acumulación de proteínas y
detritus cristalinos en el ápice62 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Característica Murino Humano
Anexo A: (Continuación)
Uretra Machos: porciones Hombres: prostática,
membranosa y peneana, membranosa y esponjosa
existe en la fosa uretral
Hembras: corre a través del Mujeres: existe abierta frente a
clítoris, existe en la fosa la vagina y aproximadamente
clitoral 2.5 cm más allá del clítoris
Nefronas Predominan las asas largas Predominan las asas cortas
3:1 7:1Anexos 63
B. Anexo: Comparación Sistema
Urinario Humano vs. Murino
Característica Murino Humano
Corteza La zona externa contiene La zona subcapsular contiene
glomérulos y túbulos túbulos contorneados
contorneados proximales; la proximales, la corteza
zona interna tiene apariencia remanente contiene
rayada por la presencia de glomérulos, túbulos
túbulos rectos contorneados proximales y
distales, y porciones gruesas
de las asas de Henle
Glomérulos Diámetro glomerular Diámetro glomerular promedio
promedio 73 micras; la 200 micras; la cápsula de
cápsula de Bowman en Bowman está cubierta por
machos puede estar cubierta epitelio escamoso simple
por epitelio cuboidal, (raramente cuboidal)
dependiente de testosterona
Mesangio Prominente con H-E Menos prominente
El epitelio tubular cortical El citoplasma de las células
contorneado proximal en del epitelio tubular proximal es
machos puede estar granular y eosinofílico debido
vacuolado a la gran cantidad de
mitocondrias64 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Característica Murino Humano
Anexo B: (Continuación)
Túbulos Dimorfismo sexual a nivel de No hay dimorfismo sexual
microscopía electrónica en
segmentos del túbulo
contorneado proximalAnexos 65
C. Anexo: Comparación Sistema
Urinario Humano vs. Murino
Característica Murino Humano
Intersticiales Orientadas horizontalmente Arregladas en filas entre las
en la médula asas de Henle y los vasos
rectos
Ultraestructura El grosor de la membrana El grosor de la membrana
basal promedio es de 80-200 basal promedio es de 320-
nm; muy diferente de las 340 nm; menos diferente de
capas de la membrana basal las capas de la membrana
de los capilares glomerulares basal de los capilares
glomerulares
Inmunofluorescencia Cantidad variada de C3 únicamente en el
depósitos de C3 en la endotelio vascular
membrana basal tubular
Densidad específica Relativamente alta; Relativamente baja; rangos
dependiente de la cepa y el normales dependen del
sexo; rangos normales laboratorio, 1.020-1.028
dependen del laboratorio66 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
D. Anexo: Comparación Sistema
Urinario Humano vs. Murino
Característica Murino Humano
Proteinuria Normalmente presente, Proteinuria fisiológica: < 150
específicamente en machos, mg/24 horas en adultos, <
dependiente de la cepa; 140 mg/m2 en niños; proteína
rangos normales dependen urinaria humana es la
del laboratorio proteína de Tamm-Horsfall
(Uromodulina)
Creatinuria Normal; dependiente de la Rango normal es de 500 –
cepa; rangos normales 2000 mg/dL
dependen del laboratorio
Tapones seminales Ocurrencia agonal frecuente No
en machosAnexos 67
E. Anexo: Descripción inyección
intra-peritoneal
Tomado de: Bogdanske, J. J.; Hubbard-Van Stelle, S.; Rankin Riley, M.; Schiffman, B. M.
2011. (30).
 Propósito: administrar de forma segura una inyección intraperitoneal.
 Uso de ésta técnica: usar grandes volúmenes de líquidos (20 ml/kg), por ejemplo,
si se va a administrar dosis de medicamentos que han sido diluidos. Puede
ampliarse la información de los volúmenes de inyección en
https://www.rarc.wisc.edu/
 Habilidades recomendadas: manejo básico y de manipulación de la rata. Se den
tener precauciones durante la ejecución y el proceso de inyección. Puede ocurrir
algún daño a los órganos internos si no se tiene cuidado de contener el animal y
controlar la inserción de la aguja.
 Suministros recomendados: una aguja de calibre 25, jeringas de 1 ml, guantes
estériles y un contenedor de objetos corto-punzantes.68 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
 Procedimiento:
1. Usted debe contener adecuadamente la rata antes de realizar cualquier
técnica de inyección.
2. Gire la rata en posición ventral de modo que se pueda ver el abdomen.
Asegúrese de que el tórax de la rata se mueve libremente hacia arriba y
hacia abajo y que no se restringe la respiración.
3. El cuadrante 3 es la mejor zona para la Inyección IP. Inyectar en un punto
medio entre la línea media y donde la pata se une al cuerpo.
4. La aguja debe estar en un ángulo de 45º. Se siente el paso de la aguja a
través de la piel y la pared abdominal. Hale hacia atrás ligeramente del
émbolo. Cuando observe una burbuja de vacío, inyecte la solución.
5. Si mientras aspira obtiene un líquido de color, retire la aguja, deseche la
aguja y jeringa, y empiece nuevamente con una nueva solución. Siempre
deseche la aguja y jeringa en un contenedor de objetos corto-punzantes.F. Anexo: Descripción de
anestésicos
Tomado de los insertos de la casa farmacéutica de cada uno de los productos
Ketamina Clorhidrato (Ciruphar)
Medicamento de control especial
Venta exclusiva a médicos veterinarios
USO VETERINARIO
Anestésico general de acción corta cuya designación química es clorhidrato de 2-(o-
clorofenil)-2-(metilamino)-ciclohexanona. Hace parte del grupo de anestésicos
disociativos que se caracterizan por producir catalepsia (estado donde hay una maleable
rigidez de las extremidades y donde el paciente no presenta ninguna respuesta visual al
medio o a estímulos dolorosos moderados, profunda analgesia periférica y alteración de
la conciencia). Debido a estos efectos el Ciruphar (Ketamina HCl) solo ha sido aprobado
por la FDA para su uso en gatos y primates no humanos, aunque según la consideración
de los Médicos Veterinarios es utilizado en otras especies.70 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Mecanismos de acción
Ciruphar (Ketamina HCl), induce anestesia y amnesia mediante disrupción funcional del
Sistema Nervioso Central, produciendo un marcado estado cataléptico. Aunque los
mecanismos de acción aún no han sido comprendidos en su totalidad, se sabe que
disminuye las respuestas sensoriales del SNC, sin bloquear el tallo cerebral y las vías
nerviosas espinales, los efectos depresores de Ciruphar (Ketamina HCl) se observan a
nivel del tálamo, centros del dolor y en las formaciones reticulares, pero no en las áreas
subcorticales y el hipocampo, las cuales sufren activación.
Adicionalmente, se sabe que interfiere e interactúa con algunos neurotransmisores de
acción central tales como la serotonina, la dopamina y GABA. La acción disruptiva en el
sistema nervioso se da a través del sistema GABA, esto debido a que bloquea la
reabsorción de este neurotransmisor en la sinapsis nerviosa, produciendo
hiperpolarización nerviosa y disminución en la capacidad de respuesta neuronal.
Consideraciones farmacéuticas
Ciruphar (Ketamina HCl) produce aumento del gasto cardíaco, presión aórtica central,
presión arterial pulmonar y frecuencia cardíaca, esto al parecer debido a que ejerce un
efecto estimulatorio directo sobre los centros adrenérgicos, acompañado por un efecto
indirecto inhibiendo la reabsorción neural de catecolaminas, especialmente la
norepinefrina.
Tras la aplicación de éste producto, se puede observar una ligera alteración eléctrica en
el EKG correspondiente a una prolongación de los intervalos PR y QT, aunque en
primates estos efectos son poco visibles. Debido a las propiedades estimulatorias
cardíacas, Ciruphar (Ketamina HCl), no produce efecto depresor ventilatorio en respuesta
a la hipoxia, caso contrario a muchos anestésicos. Sin embargo al ser usado como único
anestésico, se preservan los reflejos laríngeo y faríngeo lo que lleva a incrementar el
riesgo de laringoespasmo, broncoespasmo, y tos secundaria a secreciones o
manipulación de la orofaringe, no obstante este mismo este mismo efecto hace que
Ciruphar (Ketamina HCl), sea el anestésico de elección cuando la intubación
endotraqueal es imposible.
Otros efectos observados con Ciruphar (Ketamina HCl), son estimulación de la
salivación, el incremento en el flujo sanguíneo al cerebro debido al aumento en el
metabolismo cerebral y a vasodilatación cerebral, y la presentación marcada de
nistagmus.Anexos 71
Ciruphar (Ketamina HCl), se distribuye rápidamente a nivel de los tejidos corporales
principalmente el tejido adiposo, hígado, pulmón y cerebro; la unión del Ciruphar
(Ketamina HCl) a proteínas plasmáticas es de un 50% incrementando cuando el pH es
mayor de 7.4 y disminuyendo cuando es menor.
La biotransformación ocurre en el hígado y los metabolitos resultantes son eliminados en
la orina.
Gatos
El tiempo de vida media del Ciruphar (Ketamina HCl), es de 66.9 +/- 24.1 minutos
independiente de la ruta de administración. El tiempo de absorción vía IM es rápido,
alcanzando el pico plasmático en 10 minutos. En esta especie a diferencia de otras, el
Ciruphar (Ketamina HCl), no presenta mayor efecto sobre los tremores musculares.
Algunos efectos observados al utilizar el producto como único agente anestésico en sus
dosis clínicas son: Disminución de la temperatura corporal en promedio 1.6º C, dilatación
pupilar, los gatos permanecen con los ojos abiertos, hay movimiento de cabeza y
presencia de los reflejos fóticos, corneal, laríngeo y faríngeo, además de incremento en
el tono muscular. Debido a estos efectos no es recomendable utilizar Ciruphar (Ketamina
HCl) como único agente anestésico. Es recomendable utilizar una correcta
premedicación y dependiendo de la seriedad de las cirugías (abdominales u ortopédicas),
es recomendable acompañarlo de otros agentes anestésicos ya sea inhalados o
inyectables.
La recuperación de los animales a los efectos del Ciruphar (Ketamina HCl) es
prolongada, puede llegar a ser de hasta 10 horas, aunque en términos generales los
gatos se levantan en aproximadamente 2 horas. No obstante estos tiempos pueden
variar dependiendo de la condición del animal, la edad, la dosis utilizada y/o la utilización
de otros agentes anestésicos o preanestésicos.
Usos clínicos
Las dosis recomendadas en gatos para el Ciruphar (Ketamina HCl) son de 11 a 33 mg/kg
vía intramuscular. Estas dosis pueden variar dependiendo del procedimiento y el uso de
agentes preanestésicos en cuyo caso se pueden reducir hasta en un 50%. Una vez
aplicado el producto, el tiempo requerido para alcanzar la anestesia es de 3 a 5 minutos.
La duración de la anestesia es de 20 a 45 minutos llegando a variar de 15 a 60 minutos.72 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Previa utilización del Ciruphar (Ketamina HCl), es recomendable emplear agentes
preanestésicos como el sulfato de atropina vía subcutánea o intramuscular, en dosis de
0.045 mg/kg, con el fin de prevenir la salivación y otros efectos sobre el sistema nervioso
autónomo. También es recomendable utilizar un ungüento oftálmico para prevenir
resequedad e irritación de la córnea.
Después de la administración del sulfato de atropina algunas dosis rutinarias utilizadas
vía intramuscular del Ciruphar (Ketamina HCl) son como se relacionan a continuación:
Dosis Procedimiento
15 mg/kg Cirugías mayores como OVH, cesáreas, laparotomía abdominal
y cirugías ortopédicas en animales sanos. Estos procedimientos
deben acompañarse con anestesia inhalada.
10 mg/kg Cirugías menores como castración y para inmovilización de
gatos agresivos en procedimientos como radiografías y examen
clínico.
5 mg/kg Inmovilizaciones menores. Uso en gatos enfermos para ayudar
a mantener el efecto de la anestesia inhalada.
También se ha empleado la Xilacina a dosis de 0.55 a 1.1 mg/kg vía intramuscular,
previa a la utilización de Ciruphar (Ketamina HCl) a dosis de 11 mg/kg vía intramuscular,
con el fin de prevenir los efectos de hipertonicidad muscular. Este protocolo anestésico
reduce la dosis de Ciruphar (Ketamina HCl) al tiempo que prolonga la duración de la
analgesia y acorta el tiempo de recuperación; sin embargo debido a que la combinación
Xilacina y Ciruphar (Ketamina HCl), pueden producir efectos severos sobre el sistema
cardiorespiratorio, no se recomienda su utilización en animales que se sospeche una
reducida reserva cardiopulmonar.
Otro protocolo empleado con frecuencia para reducir los efectos adversos de Ciruphar
(Ketamina HCl) , es la combinación de este a dosis de 22 mg/kg intramuscular 20
minutos posterior a la aplicación de Acepromacina 0.11 mg/kg y Atropina 0.045 mg/kg vía
intramuscular.
Algunos productos IV recomendados por Muir et al, son los siguientes:
- Acepromacina 0.4 mg/kg y Ciruphar (Ketamina HCl) 2 a 6 mg/kg.
- Xilacina 0.6 mg/kg y Ciruphar (Ketamina HCl) 2 a 6 mg/kg.Anexos 73
Primates no humanos
Ciruphar (Ketamina HCl), es recomendado para la inmovilización y para cirugías
menores. Las dosis terapéuticas recomendadas son de 3 a 15 mg/kg vía IM. Sin
embargo dosis de hasta 20 mg/kg han sido utilizadas logrando sedación de 30 minutos
con mínima depresión respiratoria. La combinación IM de Ciruphar (Ketamina HCl) 11
mg/kg y Acepromacina 0.55 mg/kg provee una excelente relajación muscular, siendo útil
en cirugías mayores y procedimientos ortopédicos.
Contraindicaciones y precauciones
Ciruphar (Ketamina HCl) no se debe utilizar en animales para consumo humano. Está
contraindicado en pacientes con hipertensión arterial, aneurismas arteriales, disfunción
hepática o renal; de igual forma no se recomienda su uso en cirugías cerebrales o en
pacientes con trauma craneal ni tampoco en procedimientos que involucren faringe,
laringe o tráquea.
No es recomendable usar Ciruphar (Ketamina HCl) como único agente anestésico en
cirugías abdominales u ortopédicas, su uso en cirugías mayores debe estar acompañado
de otro tipo de agentes anestésicos.
Se debe tener precaución con posibles hemorragias después de la cirugía, debido al
efecto hipertensor del Ciruphar (Ketamina HCl).
Los efectos farmacológicos del Ciruphar (Ketamina HCl) se antagonizan con la
administración de l-anfetamina y Yohimbia.
Bibliografía
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- Sumano, H.; Ocampo, L. Anestesia en pequeñas especies. 1985. Ed McGraw-Hill.
Pág. 357.74 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etariosG. Anexo: Descripción de
anestésicos
Tomado de los insertos de la casa farmacéutica de cada uno de los productos
Xilacina (Seton 2%)
Solución inyectable
Analgésico, Sedante y Tranquilizante
USO VETERINARIO
Composición
Cada ml contiene 20 mg de Xilacina en solución.
La Xilacina produce una somnolencia que va acompañada de amplia analgesia en
bovinos y en menor grado en equinos.
Su efecto central miorrelajante conduce a una laxitud muscular generalizada que
complementa oportunamente el estado de sueño y de analgesia en los bovinos, o una
reducida sensibilidad al dolor de los equinos. No se han observado estados de excitación
durante las fases de ascendencia y descendencia de la acción del fármaco, tras su
aplicación. Bajo su efecto, aparece bradipnea, como en el sueño natural y al mismo
tiempo una ligera bradicardia. Frecuentemente la temperatura corporal se eleva un poco.
Aplicada vía intravenosa provoca una disminución moderada y pasajera de la presión
sanguínea a la que precede, por corto tiempo, una elevación de la misma.
Ocasionalmente aparecen en los equinos, sudoración en ijares y cuello y aumento de la
micción.76 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
En los bovinos pueden observarse raramente mugidos y defecaciones blandas, que no
duran más de 12 horas. El Seton no influye en el tiempo de coagulación de la sangre.
Indicaciones
En bovinos y equinos, puede utilizarse para tranquilización de los mismos, cuando
ofrecen resistencia a reconocimientos y tratamientos, así como en las intervenciones
quirúrgicas.
En bovinos, el efecto deseado se logra al cabo de 5 a 15 minutos después de la
inyección. En equinos, el efecto se presenta ya a los 5 minutos. Desde el momento de la
aplicación hasta la presentación del efecto deseado, los animales deben permanecer
tranquilos.
El comienzo del efecto se manifiesta por descenso de la cabeza y del párpado superior y
salivación en los bovinos, caída del labio inferior, disminución del movimiento de las
orejas y prolapso parcial del pene en los equinos. A dosis elevadas, el animal se acuesta
y aparece un estado de somnolencia (bovinos).
La intensidad y duración del efecto, dependen de la dosis. Con dosis elevadas, la
tranquilización perdura varias horas en los bovinos y es pronunciada en los equinos (20 -
30 minutos), descendiendo rápidamente en los 30 – 60 minutos siguientes.
En bovinos, el efecto analgésico es suficiente para realizar intervenciones dolorosas
durante 30 o 40 minutos; sin embargo, en los equinos es limitado y se manifiesta de
diferente forma en cada animal.
En operaciones muy dolorosas y profundas (laparotomía, cesárea), se recomienda
aplicar anestesia local o de conducción simultáneamente. Bajo los efectos de la Xilacina,
esta puede realizarse con precisión y sin peligro.
La relajación de la musculatura se establece prontamente y proporciona óptimas
condiciones para reconocimientos manuales de cualquier naturaleza, y facilita un campo
de operación libre de tonicidad.
El tono de la musculatura del intestino grueso disminuye rápidamente, incluso a bajas
dosis, inhibiendo así la defecación, lo que repercute favorablemente en caso de
intervenciones en el tren posterior y en la región vulvoanal, facilitando la exploración
rectal.Anexos 77
Dosis y vía de administración
- BOVINOS: inyección intramuscular
Según el grado de efecto que se desee, la dosis a administrar varía entre 0.25 ml a 1 ml
por cada 100 kg de peso vivo. En animales muy indómitos, puede ser necesaria una
dosis un poco mayor, para lograr una tranquilización del mismo grado que en animales
más mansos.
Dosis ml / 100 kg ml / 500 kg Efecto
peso vivo peso vivo
Clara sedación analgésica para pequeñas
1.2
I intervenciones
0.25
Tranquilización para pesar los animales,
inseminación artificial, radiografías, tratamiento
intraquístico, retirada de las suturas de heridas,
cambios de apósitos, implantación de anestesia
local o de conducción, reposición del prolapso o
torsión uterinas, embriotomías.
Mediana sedación y analgesia
Pequeñas intervenciones quirúrgicas, incisión
II 0.5 2.5 de los pezones, intervenciones en las pezuñas,
incisión de abscesos, obstrucción del esófago,
colocación de narigueras, lavados de prepucio.
Fuerte sedación, analgesia y relajación
muscular
El animal no logra permanecer en pie.
Intervenciones quirúrgicas de importancia,
amputación de cuernos, operaciones de la ubre,
III 1 5.0 suturas de pezones, castraciones,
exploraciones y tratamientos del pene,
tratamientos y amputaciones de pezuñas,
resección del tendón flexor profundo, cesárea
con el animal echado, supresión de las
contracciones musculares en el parto y78 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Dosis ml / 100 kg ml / 500 kg Efecto
peso vivo peso vivo
tratamientos de retenciones placentarias,
extracción de dientes.
En algunas ocasiones, la dosis necesaria varía según las circunstancias individuales. Si
fuera necesario intensificar y prolongar, o solo prolongar el efecto, puede hacerse una
segunda aplicación a los 10 – 30 minutos después de la primera.
En operaciones profundas y muy dolorosas (amputación de la pezuña, laparotomía), se
recomienda la combinación con anestesia local o de conducción.
Precauciones
Deben tomarse las medidas adecuadas para evitar la timpanización de los animales
echados por largo tiempo (posición esterno-abdominal). Evitar la posible aspiración de
saliva o líquido de la panza, colocando cabeza y cuello en posición más baja que el
cuerpo del animal. Cuando se empleen dosis altas, se recomienda hacer ayunar al
animal. Ha de tenerse en cuenta que el reflejo deglutido está disminuido, durante la fase
en que se desarrolla el máximo efecto de la droga.
No se recomienda su uso en el último mes de gestación.
En la dosificación III, se recomienda que el animal permanezca a la sombra, después de
la operación.
- EQUINOS: inyección intravenosa
La dosificación debe ajustarse al grado de sedación que se desee. El efecto analgésico
se manifiesta individualmente distinto y en menor grado que los bovinos.
Animales muy excitados y nerviosos, necesitan generalmente una dosis algo superior.
La dosis oscila entre 3 y 5 ml / 100 kg de peso vivo en casos normales, es suficiente una
dosis de 4 ml / 100 kg de peso vivo.
Efecto
Según la dosis que se emplee, se consigue una sedación ligera o fuerte, con limitada y
variable analgesia según el individuo. A pesar del manifiesto efecto miorrelajante, el
animal no se acuesta.Anexos 79
Usos
Tranquilización en el transporte, herrado, retirada de suturas, exploraciones rectales,
radiografías, curación de heridas, cambios de apósitos, incisión de abscesos, tratamiento
del pene, colocación de catéteres, tratamientos de ojo y oído, realización de anestesia
local o de conducción.
Precauciones
Si bien no se ha observado un efecto negativo en la gestación ni repercusiones sobre el
feto, se recomienda no aplicar Seton en el último mes de gestación.
No deben descuidarse las precauciones requeridas en el manejo de los equinos.
- PERROS: inyección intramuscular
1.5 ml por cada 10 kg de peso vivo.
Efecto
Se logra un efecto que permite intervenciones no muy dolorosas: vendajes, limpieza
dentaria, tratamientos de otitis, heridas superficiales.
Precauciones
No debe emplearse en casos de obstrucción esofágica, torsión de estómago o hernias,
debido a la ocasional presentación de efectos eméticos.
No emplear en afecciones pulmonares.
Contraindicaciones
Evitar la inyección intracarotídea.
No usar conjuntamente con otros productos en la misma jeringa.
Interacciones
No utilizar conjuntamente con tranquilizantes
Efectos secundarios
No se han descrito. A las dosis recomendadas no se presentan.80 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Sobredosificación
A la dosis recomendada es bien tolerado.
En caso de sobredosificación, la actividad sedativa de la Xilacina puede antagonizarse
con la administración de una combinación de 4-aminopiridina y yohimbina.
Si se interrumpe la respiración, se recomiendan duchas de agua fría y respiración
artificial.
Tiempo de retiro
Los animales tratados no deben sacrificarse para consumo humano hasta 3 días
después de finalizado el tratamiento.
La leche producida durante el tratamiento y 3 días después de finalizado el mismo no
debe darse para consumo humano.
Frascos viales de 10 y 25 ml
VENTA BAJO FÓRMULA DEL MÉDICO VETERINARIO
MANTENER EN UN LUGAR FRESCO
MANTENER FUERA DEL ALCANCE DE LOS NIÑOS
CONSULTE SU MÉDICO VETERINARIO
Reg. ICA 3366-DBH. Anexo: Descripción toma de
sangre retro-orbital
Tomado de: Bogdanske, J. J.; Hubbard-Van Stelle, S.; Rankin Riley, M.; Schiffman, B. M.
2011. (30).
 Propósito: obtener de forma segura una muestra de sangre del plexo orbital de la
rata.
 Uso de ésta técnica: se usa para la recolección de grandes volúmenes de sangre.
Para obtener el cálculo de la volemia y el volumen máximo de la muestra de
sangre a obtener en una rata, debe tenerse en cuenta:
Especie Volemia (ml/kg)
Rata (Rattus norvergicus) Promedio Rango
72 63 - 80
Los miembros del Centro de Investigación de Recursos Animales (CARR) recomiendan
el uso de un 10% del volumen total de sangre como la cantidad máxima que se puede
recolectar en una sola toma. Para permitir un periodo de recuperación adecuada, se
recomienda, además, que la cantidad máxima se recolecte una vez cada 2 semanas (con
base al 10%). Muestras diarias se pueden recoger siempre y cuando el volumen de la
sangre acumulada no exceda el máximo calculado durante un período 7 días.
 Habilidades recomendadas: para ésta técnica debe conocer y comprender los
métodos apropiados para contener una rata y cómo realizar una anestesia
correctamente o como manipular adecuadamente una máquina de anestesia.
 Suministros recomendados: un tubo para la recolección de sangre (eppendorf),
tubos capilares heparinizados (diámetro interior 1,1 mm, pared 0,2 mm x 75 mm
L), gasas 2 x 2 cm, guantes de examen, anestesia, y contenedor de objetos corto-
punzantes.82 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
 Procedimiento:
Esta imagen muestra el seno orbital que se encuentra detrás del ojo de la rata.
(Imagen obtenida de Researchgate.net. Retro-orbital injections in mice. Disponible en
internet en: http://www.researchgate.net/figure/51066399_fig1_Figure-10-The-blood-
vessels-contributing-to-the-retro-orbital-sinus-of-the)
1. Puede posicionar la rata en una de dos maneras. Puede apoyarse sobre una mesa
o puede sostenerse en la mano haciendo que la piel alrededor del ojo se estire
hacia los lados y permitiendo que el ojo sobresalga ligeramente. El tubo capilar se
hace avanzar por detrás del ojo, a continuación, trenzado con cuidado para romper
los vasos; el tubo capilar se llena de sangre. Puede transferir la sangre en un tubo
de recolección de sangre o una columna de centrifugación para obtener plasma.
Ser demasiado agresivo puede causar daños permanentes en los ojos, incluso
ceguera.
2. Se permite que la sangre fluya por el tubo capilar y gotee directamente en el tubo
de recolección de sangre. Utilice el tubo capilar para desplazar el ojo mientras se
avanza el tubo hacia los vasos.
3. Cuando haya terminado, utilice la gasa y mantenga el ojo cerrado para detener el
sangrado. Deje que la rata se recupere plenamente y monitoréela de cerca para
asegurar que el sangrado se haya detenido.Anexos 83
I. Anexo: Método de procesamiento de
la sangre
Para el tratamiento de las muestras, se tomó sangre periférica del plexo orbital de las
ratas antes de la intervención quirúrgica; posterior a la intervención se tomó sangre
central de la arteria renal; para las muestras de sangre se llenaron 4 tubos de
hematocrito o capilares de 80uL (320 uL o 0,032 ml), posterior a ello fueron llevados a un
tubo eppendorf de 1,5 ml donde se conservaron en hielo mientras se tomaban el total de
las muestras (éste tiempo no superó las 2 horas), posteriormente fueron centrifugadas a
350 revoluciones durante 7 minutos.
En el caso de obtener muestras hemolizadas se repitió nuevamente el procedimiento de
centrifugado. Posterior a ello se extrajo el suero de la muestra con una micropipeta de
20-200uL de lo cual se estandarizó como mínimo obtener 80uL de suero; para ello se
emplearon puntas de pipetas autoclaveadas, las cuales fueron desechadas con cada
muestra.
La muestra de suero obtenida fue llevada a un nuevo tubo eppendorf de 1,5 ml, donde se
almacenaron las muestras a una temperatura de -20 ºC hasta el procesamiento
bioquímico de las creatininas. Los tubos fueron debidamente rotulados en la tapa de
acuerdo a la nomenclatura utilizada.84 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
J. Anexo: Método de evaluación
histopatológica
El método de evaluación histopatológica involucra una descripción macroscópica donde
se realiza una inspección a simple vista del material recibido, se mide con una regla y se
corta el espécimen por el eje mayor, se describe la superficie de corte y por último se le
asigna un código de identificación único.
En el laboratorio de histopatología se realiza el procesamiento automatizado del tejido
durante 12 horas e involucra las siguientes actividades:
1. Fijación de la muestra en formol tamponado al 10%.
2. Deshidratación del tejido en pasos sucesivos con alcohol etílico en
concentraciones ascendentes hasta culminar en un alcohol al
99.5%, iniciando en alcohol al 80%.
3. Aclaramiento o desalcoholización de la muestra mediante el paso
por xilol.
4. Imbibición en parafina grado histológico (paraplast) con punto de
fusión controlado 56 a 58 grados centígrados.
Al día siguiente se realizó la inclusión del tejido en bloques de parafina en una central de
inclusión Thermo Shandon y luego se realizó el corte de los bloques de parafina en un
micrótomo de rotación marca Leyca, obteniendo cortes de 4 micras de grosor. Los cortes
obtenidos fueron coloreados con hematoxilina eosina (hematoxilina de Harris), se
montaron las láminas histológicas con el uso de resina y se evaluaron en un microscopio
óptico Nikon E100.Anexos 85
La evaluación histopatológica se llevó a cabo por un patólogo con entrenamiento en
patología animal y humana y usando como referencia el manual Comparative Anatomy
and Histology, A Mouse and Human Atlas 2012. Para la evaluación microscópica se
procedió usando el proceso convencional en histopatología procediendo de menor a
mayor aumento. La visión a menor aumento permitió ubicar las áreas de interés sobre las
que posteriormente, con el mayor aumento, se caracterizaron las áreas de interés
previamente definidas.
Los hallazgos se informaron mediante el enfoque semicuantitativo y usando la
terminología normalmente aceptada para caracterizar los hallazgos histopatológicos de
los tejidos. La interpretación por parte del patólogo se realizó en forma ciega y sin
conocer los/las intervenciones ejecutadas sobre los sujetos de investigación.86 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
K. Anexo: Presupuesto
FUENTES DE FINANCIACIÓN
1. Parte de esta investigación fue financiada por la DIB-Facultad de
Medicina, Código: 28075
2. Parte de esta investigación fue financiada por la Coordinación de la
Maestría en Fisiología de la Facultad de Medicina de la Universidad
Nacional de Colombia
3. Parte de esta investigación fue financiada por recursos propios
PRESUPUESTO (GASTOS)
RUBRO DESCRIPCIÓN (pesos FUENTE DE FINANCIACIÓN
colombianos)
Bioterio 1.643.000 DIB - Facultad de Medicina, Código:
28075
Universidad Nacional de Colombia
Instrumental 534.000 DIB - Facultad de Medicina, Código:
quirúrgico 28075
Universidad Nacional de Colombia
Anestésicos 150.000 DIB - Facultad de Medicina, Código:
28075
Universidad Nacional de Colombia
Anestésicos 40.000 Recursos propios
Evaluación 2.916.000 Coordinación Maestría Fisiología
histopatológica Universidad Nacional de Colombia
Procesamiento 919.000 Recursos propios
laboratorio clínico
Valor total de la investigación: 6.282.600 pesos colombianos.Anexos 87
L. Anexo: Consideraciones Éticas
Este estudio se realizó cumpliendo los requerimientos de la Resolución Nº 008430 de
1993 (48) en la cual se establecen las normas científicas, técnicas y administrativas para
la investigación en salud. Los reactivos a utilizar fueron de categoría tóxica moderada y
baja, por lo tanto, el estudio no provocó alteraciones en el medio ambiente. Cabe aclarar
que este estudio es de un riesgo mínimo y que no es duplicativo ya que posee un
carácter científico y que la investigadora titular goza de total experiencia para la ejecución
de los procedimientos descritos en este protocolo y conoce y aplica la normatividad
internacional de la CIOMS (49), IACUC (50) e ICLAS (51).
El hecho de trabajar con material biológico implica consideraciones éticas que deben
estar explícitas para desarrollar procesos investigativos justificables. Los avances
científicos abren más posibilidades cada día y por lo tanto, mayores compromisos de los
cuales el investigador se hace responsable. En este trabajo están definidos los
propósitos de análisis y la utilidad didáctica que el espécimen aporta lo que legitima el
uso de edades pediátricas.
Como ya se mencionó, este estudio se rige éticamente y responde a la nación según la
Resolución 8430 de 1993 “por la cual se establecen las normas científicas, técnicas y
administrativas para la investigación en salud”. El Título V, Artículo 87, expone las
condiciones que el equipo investigador debe seguir al emplear animales como material
de investigación, y el Artículo 88 del mismo Título contempla la necesidad de una
justificación ante el uso de animales como herramienta didáctica en las instituciones
educativas: “El uso de animales en la investigación, enseñanza y ensayos es aceptado
solamente cuando promete contribuir a la comprensión y avance del conocimiento de los
principios fundamentales biológicos o al desarrollo de mejores medios para la protección
de la salud y el bienestar tanto del hombre como del animal” (República de Colombia –
Ministerio de Salud 1993).88 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Institucionalmente existe la normatividad exigida por la Dirección de Investigación de la
Universidad Nacional, que coincide con parte de los decretos y leyes nacionales y que
establece guías, pautas internacionales y principios éticos para la investigación a nivel
mundial (Vicerrectoría de Investigación, Universidad Nacional de Colombia, 2014).
Es necesario ejercer un control sobre los niveles de dolor que se producen, asegurando
condiciones óptimas de cuidado. Toda forma de vida deber ser respetada y protegida; el
respeto hacia los animales, en trabajos como en esta investigación, no es incompatible
desde el punto de vista bioético con el valor del conocimiento, “la crueldad, la brutalidad y
la insensibilidad al dolor ajeno (sea de personas o animales) es una degradación de lo
que debe ser el hombre. Por tanto, el trato cruel con animales, cuando no se hace por
razones serias, o permite su sufrimiento inútil, produce el mayor mal que existe, la
degradación del hombre mismo” (52).
Para lograr la anestesia se utiliza una combinación de sedante, analgésico y relajante
muscular, fármacos aprobados por la Asociación Colombiana de Veterinarios y
Zootecnistas (ACOVEZ) y cuya eficacia ha sido previamente comprobada. En este
trabajo se opta por el uso aprobado de Xilacina y Ketamina, aplicado de manera
intraperitoneal con dosis calculadas según el peso.
La comprobación de la sedación y analgesia se realiza pinzando la punta de la cola del
animal, si no reacciona pero mantiene signos vitales normales, la sedación y analgesia
es óptima.
En cuanto a la eutanasia del animal, una vez anestesiado y sedado el espécimen, se
aborda intraperitonealmente y se coloca una dosis de Ketamina y Xilacina 10 veces
mayor a la terapéutica utilizada para cada animal, lo que inevitablemente causa su
deceso; es por esta razón que previamente se ha sedado, relajado y anestesiado con
una verificación segura del efecto de los fármacos empleados.
Dentro de la Resolución 8430 de 1993 se considera lo establecido en el artículo 87, en su
enunciado g, que explica que todo tipo de dolor debe ser evitado con una analgesia
comprobada, y en su enunciado ante el fallecimiento inminente del animal, el investigador
debe asegurarse de que el mismo sea sin dolor.
De igual manera, la ley 84 de 1989 del Congreso de Colombia, establece en su capítulo
V, artículo 17, los casos en los cuales se permite el sacrificio de un animal no destinado
para el consumo humano, para este caso con fines investigativos o científicos (53).Anexos 89
Es por ello que el animal de laboratorio tiene que ser respetado como ser vivo, entender
que padece necesidades y sufre dolor, por ley es obligación del personal que lo cuida,
mantiene y utiliza (investigador), asegurar su bienestar y confort mientras viva. El
tema ético compete a todos los individuos pero, con mayor razón, a los involucrados en
la investigación biológica, desde el auxiliar a cargo de los animales hasta el directivo de
la institución productora o usuaria
La primera condición del personal que trabaja con animales de laboratorio es el respeto
por la vida, el dolor o el sufrimiento a que éstos pueden ser sometidos en los trabajos de
experimentación bajo su responsabilidad. Siempre que se usen animales en
investigación, se debe considerar que un objetivo tan importante como el de obtener
resultados experimentales, será el de minimizar cualquier dolor o angustia que dichos
animales puedan sufrir. El refinamiento de los procedimientos para conseguir que estos
no causen sufrimiento debe ser parte integrante de toda investigación científica. Esto es
importante tanto desde el punto de vista de la preocupación humanitaria como para
cumplir con los requisitos de la legislación sobre animales de investigación. El personal
que trabaje y experimente con animales está moralmente obligado a mostrar tres tipos de
actitudes: respeto, afecto y gratitud (54).
1. Respeto: por tratarse de seres vivos y sensibles, que están experimentando
sufrimiento y podrían terminar perdiendo la vida, tratárseles con todas las
consideraciones que el caso merece.
2. Afecto: considerándolos partícipes con nosotros, del misterio de la vida.
3. Gratitud: reconocimiento por la importante ayuda al constituirse nuestros más
íntimos colaboradores.
Así mismo, se puede decir que la investigación realizada en animales es éticamente
aceptable, si se sigue el principio de las tres R de la experimentación humanizada para
con los animales, propuesta por William Russell (zoólogo y psicólogo) y Rex Burch
(microbiólogo) en 1959: Reducir, Reemplazar y Refinar.
4. Reducir, al máximo el número de ellos y, por ende, el total de animales utilizados
en investigación.
5. Reemplazar, siempre que sea posible el animal de experimentación por otro
modelo experimental, cuando no resulte imprescindible el uso de animales.
6. Refinar, los métodos y técnicas utilizados de modo que produzcan al animal el
menor sufrimiento posible.90 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etarios
Una vez se ha hecho uso al máximo del material biológico, los desechos deben
disponerse en bolsa roja para su posterior incineración. En cuanto a los reactivos
utilizados, el principal desecho es el sobrante de formol que una vez cuantificado y
envasado en recipientes de plástico es neutralizado con agentes químicos, según lo
establecido por el protocolo de bioseguridad del laboratorio de Histología de la Facultad
de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia.
En vista de que el proyecto no incluye investigación sobre seres humanos, recibe una
calificación tipo A de riesgo inherente a la investigación, según lo establecido en el
artículo 11 de la Resolución 8430 de 1993. Se trata de una investigación sin riesgo para
el ser humano ya que el estudio no incluye la participación de seres humanos como
objeto de estudio.Anexos 91
M. Anexo: Aval Comité de Ética
Universidad Nacional de Colombia92 Modelo murino comparativo pediátrico de injuria renal aguda isquémica y
descripción histopatológica en tres grupos etariosAnexos 93
N. Anexo: Conflictos de interés
Tanto el Investigador titular como el estudiante líder, conocemos y aceptamos el Acuerdo
035 de 2003 y el ACUERDO NÚMERO 007 DE 2008 que reglamentan la propiedad
intelectual en la Universidad Nacional de Colombia y manifestamos no tener ningún
conflicto de interésBibliografía
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