Análisis de la mutación BRAF V600E en una serie de pacientes con Histiocitosis de Células de Langerhans del Hospital de la Misericordia
Autor: Quintero Barbón, Edna Rocío
Asesor: Rey Serrano, Gustavo Enrique (Thesis advisor)
Fecha: 2019-09-02
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: La Histiocitosis de células de Langerhans (HCL) es una enfermedad de comportamiento  clínico variable y etiopatogenia desconocida. Desde 2010 se ha informado que 38-64% de  todos los casos de HCL albergan la mutación activadora BRAFV600E, pero su significado  clínico es incierto; por tanto, se buscó caracterizar las variables demográficas y clínicas de  una serie de niños con diagnóstico de HCL para hacer una correlación con la presencia  de esta mutación. Esto se hizo por medio de Inmunohistoquímica con el Anticuerpo VE1  usando una escala semicuantitativa y Secuenciación de Sanger en pacientes con  diagnostico confirmado de HCL. Se analizaron un total de 50 pacientes (edad promedio:  41 meses), 48% con HCL monosistémica (n:24), 12% con HCL multisistémica sin  compromiso de órgano de riesgo (n:6) y 40% con HCL con compromiso de órgano de  riesgo (n:20). Con el Anticuerpo VE1 se obtuvo positividad para BRAF V600E en 54% de  los casos; 34 de las 50 muestras fueron llevadas a análisis molecular por Secuenciación,  y se encontró concordancia de 90,3% entre los dos métodos utilizados para evaluar la  mutación. Tanto en el estudio de Inmunohistoquímica como en el de secuenciación, se  encontró una diferencia estadísticamente significativa de BRAFV600E con la edad de  presentación (2años vs  2 años) (p= 0,021 y p=0.011 respectivamente); no hubo  correlación estadísticamente significativa con tipo de HCL o con presencia de secuelas,  riesgo de recaída o mortalidad. Las muestras con tinción débil por Inmunohistoquímica  para BRAFV600E (1+) requieren confirmación por medio de un método molecular.

Análisis de la mutación BRAF V600E en una
serie de pacientes con
Histiocitosis de Células de Langerhans del
Hospital de la Misericordia
Edna Rocío Quintero Barbón
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Patología
Bogotá, Colombia
2019Análisis de la mutación BRAF V600E en una
serie de pacientes con
Histiocitosis de Células de Langerhans del
Hospital de la Misericordia
Edna Rocío Quintero Barbón
Trabajo presentado para optar al título de especialista en Patología
Anatómica y Clínica
Director:
Dra. Lina Eugenia Jaramillo Barberi
Codirector:
Dr. Juan José Yunis Londoño
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Patología
Bogotá
2019
2AGRADECIMIENTOS
Al Departamento de Patología de la Fundación HOMI Hospital La Misericordia quienes me
aportaron toda la información y material correspondiente de los casos que fueron
considerados para la ejecución de este estudio.
Al Laboratorio de Patología Interfacultades y sección de Inmunohistoquímica de la
Universidad Nacional de Colombia por todo el apoyo brindado.
Al Laboratorio Servicios Médicos Yunis Turbay y Servicio de Secuenciación y Análisis
Molecular (SSiGMol), por su inmensa colaboración en el análisis molecular.
A mis directores quienes con su constante consejo y enseñanzas que permitieron
culminar este estudio con éxito.
Edna Rocío Quintero B.
3Resumen
La Histiocitosis de células de Langerhans (HCL) es una enfermedad de comportamiento
clínico variable y etiopatogenia desconocida. Desde 2010 se ha informado que 38-64% de
todos los casos de HCL albergan la mutación activadora BRAFV600E, pero su significado
clínico es incierto; por tanto, se buscó caracterizar las variables demográficas y clínicas de
una serie de niños con diagnóstico de HCL para hacer una correlación con la presencia
de esta mutación. Esto se hizo por medio de Inmunohistoquímica con el Anticuerpo VE1
usando una escala semicuantitativa y Secuenciación de Sanger en pacientes con
diagnostico confirmado de HCL. Se analizaron un total de 50 pacientes (edad promedio:
41 meses), 48% con HCL monosistémica (n:24), 12% con HCL multisistémica sin
compromiso de órgano de riesgo (n:6) y 40% con HCL con compromiso de órgano de
riesgo (n:20). Con el Anticuerpo VE1 se obtuvo positividad para BRAF V600E en 54% de
los casos; 34 de las 50 muestras fueron llevadas a análisis molecular por Secuenciación,
y se encontró concordancia de 90,3% entre los dos métodos utilizados para evaluar la
mutación. Tanto en el estudio de Inmunohistoquímica como en el de secuenciación, se
encontró una diferencia estadísticamente significativa de BRAFV600E con la edad de
presentación (<2años vs > 2 años) (p= 0,021 y p=0.011 respectivamente); no hubo
correlación estadísticamente significativa con tipo de HCL o con presencia de secuelas,
riesgo de recaída o mortalidad. Las muestras con tinción débil por Inmunohistoquímica
para BRAFV600E (1+) requieren confirmación por medio de un método molecular.
Palabras Clave: Histiocitosis de Células de Langerhans, Mutación BRAF V600E,
Inmunohistoquímica Ventana VE1, Secuenciación de Sanger
4Abstract
Langerhans cell histiocytosis (LCH) is a disease of variable clinical behavior and unknown
pathogenesis. Since 2010 it has been reported that 38-64% of all cases of HCL harbor the
BRAFV600E activating mutation, but its clinical significance is uncertain; therefore, we
sought to characterize the demographic and clinical variables of a series of children
diagnosed with HCL to make a correlation with the presence of this mutation. This was
done through Immunohistochemistry with the VE1 Antibody using a semiquantitative scale
and Sanger Sequencing in patients with a confirmed diagnosis of HCL. A total of 50
patients were analyzed (average age: 41 months), 48% monosystemic LCH (n: 24), 12%
multisystemic LCH without risk organ involvement (n: 6) and 40% LCH with risk organ
involvement (n: 20). With the VE1 Antibody, positivity was obtained for BRAF V600E in
54% of the cases; 34 of the 50 samples were taken to molecular analysis by sequencing,
and 90.3% concordance was found between the two methods used to evaluate the
mutation. Both in the Immunohistochemical study and in the sequencing study, a
statistically significant difference of BRAFV600E was found with the age of presentation
(<2 years vs> 2 years) (p = 0.021 and p = 0.011 respectively); there was no statistically
significant correlation with type of LCH or with the presence of sequelae, risk of relapse or
mortality. Samples with weak staining by Immunohistochemistry for BRAFV600E (1+)
require confirmation by means of a molecular method.
Keywords: Langerhans Cell Histiocytosis, BRAF V600E Mutation, Venatana VE1
Immunohistochemistry, Sanger Sequencing
5Contenido
1. Introducción ................................................................................................................ 9
2. Justificación .............................................................................................................. 10
3. Objetivos................................................................................................................... 11
4. Marco teórico: Histiocitosis de Células de Langerhans ............................................. 12
4.1 Generalidades ................................................................................................... 12
4.2 Epidemiología .................................................................................................... 13
4.3 Etiopatogenia ..................................................................................................... 13
4.4 Diagnóstico ........................................................................................................ 15
4.5 Clasificación clínica ........................................................................................... 18
4.6 Tratamiento ....................................................................................................... 19
4.7 Complicaciones y secuelas permanentes .......................................................... 21
4.8 Mutaciones puntuales y HCL: BRAF V600E ...................................................... 22
5. Materiales y métodos ................................................................................................ 27
6. Resultados ................................................................................................................ 29
6.1 Fase 1: Caracterización de la población ............................................................ 29
6.2 Fase 2: Análisis de la mutación BRAF V600E por estudio de inmunohistoquímica
con el anticuerpo ventana VE1: .................................................................................... 33
6.3 Fase 3: Estudio molecular de la mutación BRAF V600E por medio de
secuenciación de Sanger: ............................................................................................ 37
7. Discusión .................................................................................................................. 46
8. Conclusiones ............................................................................................................ 48
9. Consideraciones éticas ............................................................................................. 49
10. Referencias bibliográficas ..................................................................................... 50
6Lista de Figuras
Figura 4-1. Lesión de Histiocitosis de Células de Langerhans. ....................................... 16
Figura 4-2. Tratamiento Enfermedad de Bajo Riesgo (1): ................................................ 20
Figura 4-3. Tratamiento Enfermedad de Alto Riesgo (1): ................................................. 20
Figura 6-1: A. Tipo de HCL, B: Órganos comprometidos y C: Evolución clínica ............... 30
Figura 6-2. Kaplan Meier: probabilidad de recaída y supervivencia ................................ 32
Figura 6-3. Inmunohistoquímica para BRAF V600E con Anticuerpo Ventana VE1. Escala
de evaluación................................................................................................................... 34
Figura 6-4. Resultados de evaluación por Inmunohistoquímica para BRAF V600E –
Ventana VE1 ................................................................................................................... 35
Figura 6-5. Inmunohistoquímica para BRAF V600E con Ventana VE1 y su correlación con
tipo de HCL ...................................................................................................................... 36
Figura 6-6. Productos de amplificación: Gel de electroforesis ......................................... 38
Figura 6-7. Resultados de secuenciación para BRAF V600E .......................................... 39
Figura 6-8. Casos dudosos / no interpretables por secuenciación para BRAF V600E ..... 40
Figura 6-9. Correlación de BRAF V600E por inmunohistoquímica con secuenciación de
Sanger ............................................................................................................................. 41
Figura 6-10. Casos discordantes con inmunohistoquímica 2+ con secuenciación para
BRAF V600E negativa ..................................................................................................... 42
Figura 6-11 A. Tipo de HCL y B. Edad (pacientes menores vs mayores de 2 años) con
respecto a la mutación BRAF V600E por secuenciación ................................................. 45
7Lista de Tablas
Tabla 4-1. Clasificación clínica de la HCL de acuerdo a Sociedad del Histiocito LCH-III. . 18
Tabla 4-2. Características clínicas y demográficas de pacientes con HCL ....................... 21
Tabla 6-1. Características clínicas y demográficas de pacientes con Histiocitosis de
Células de Langerhans .................................................................................................... 33
Tabla 6-2. Inmunohistoquímica para BRAF V600E (Ventana VE1) en correlación con
características clínicas y demográficas en HCL ............................................................... 37
Tabla 6-3. Casos dudosos / no interpretables por secuenciación para BRAF V600E....... 40
Tabla 6-4. Casos discordantes con inmunohistoquímica 2+ con secuenciación para BRAF
V600E negativa ............................................................................................................... 41
Tabla 6-5. Casos con tinción equivoca por inmunohistoquímica en correlación con
resultados de secuenciación ............................................................................................ 43
Tabla 6-6. Estado mutacional de BRAF V600E (secuenciación de Sanger) en correlación
con características clínicas y demográficas en HCL ........................................................ 44
81. Introducción
La Histiocitosis de células de Langerhans (HCL) es una patología considerada rara, cuya
etiología aún no es clara y su presentación clínica es variable abarcando desde un
comportamiento benigno hasta casos fatales. La HCL con clasificación de alto riesgo, con
compromiso de órganos como hígado, bazo y medula ósea presenta tasas de mortalidad
del 20% a 5 años.
En el año 2010 Badalian-Very y col reportan la mutación recurrente en BRAF V600E en
57% de muestras estudiadas de pacientes con HCL, una mutación característica de
procesos neoplásicos como son el melanoma, el carcinoma papilar de tiroides y
carcinoma colorrectal, entre otros; desde entonces en diferentes estudios posteriores se
han reportado variables tasas de prevalencia entre el 38-64% de esta mutación activadora
en casos de HCL. En algunos estudios se ha mostrado relación de la presencia de BRAF
V600E con la presentación de la enfermedad a temprana edad y alto riesgo de recaídas,
ambos factores de mal pronóstico en estos pacientes.
En Colombia se desconocen las características de la población con HCL, y por tal motivo
con este proyecto quisimos hacer una caracterización de un grupo de pacientes con
Histiocitosis de células de Langerhans de la Fundación Hospital de La Misericordia, el
hospital pediátrico más grande del país, en un periodo de 12 años, en quienes además
investigamos la presencia de la mutación BRAF V600E por medio de dos técnicas
validadas, como son la Inmunohistoquímica y la Secuenciación de Sanger, para
finalmente establecer una posible correlación clínica.
92. Justificación
Siendo la Histiocitosis de células de Langerhans (HCL) una enfermedad poco entendida,
y al asociarse con la presencia de una mutación somática recurrente asociada a cáncer,
como es BRAF V600E, se empiezan a dilucidar los posibles mecanismos que expliquen la
variabilidad en el comportamiento de esta enfermedad, y asimismo con su amplio
espectro pronóstico. El hallazgo de esta mutación activadora representaría además un
nuevo blanco terapéutico y un potencial marcador en el seguimiento de pacientes tratados
por esta enfermedad.
En nuestro medio, son escasos los reportes de series de casos de pacientes con
Histiocitosis de células de Langerhans, y no existe alguna publicación en la que se haya
hecho la identificación de la mutación BRAF V600E en pacientes con diagnóstico de HCL,
ni correlación con las características clínicas.
En la Fundación Hospital de la Misericordia se ha observado que en los últimos años, la
HCL se viene presentando cada vez más en los pacientes pediátricos de menor edad, con
un mayor número de casos de HCL multisistémica de alto riesgo, que conlleva una mayor
morbimortalidad, a pesar de los esquemas de tratamiento instaurado, y esto podría o no
estar asociado a la presencia de la mutación BRAF V600E. Es por eso que quisimos
estudiar la presencia de esta mutación en casos confirmados de HCL, que incluyan todo
el espectro de la enfermedad: HCL monosistémica con compromiso aislado de piel o
hueso, HCL multisistémica sin compromiso de los órganos de riesgo, y HCL
multisistémica con compromiso de los órganos de riesgo, para poder hacer una
comparación entre estos grupos, y establecer otras asociaciones clínicas con la presencia
de la mutación.
103. Objetivos
3.1 Objetivo general
Caracterizar las variables demográficas y clínicas de una serie de niños con diagnóstico
de Histiocitosis de células de Langerhans del Hospital de la Misericordia, y posteriormente
hacer una correlación con la presencia de la mutación BRAF V600E.
3.2 Objetivos específicos
 Describir las características demográficas y clínicas de niños con diagnóstico
de Histiocitosis de Células de Langerhans
 Identificar la mutación BRAF V600E por medio de inmunohistoquímica y
secuenciación en muestras de pacientes con diagnóstico de HCL
 Comparar la expresión de BRAF V600E con su estado mutacional en pacientes
con HCL
 Investigar la correlación entre esta mutación y las características clinico-
patologicas de la HCL.4. Marco teórico: Histiocitosis de Células de
Langerhans
4.1 Generalidades
La histiocitosis de células de Langerhans (HCL) es una rara enfermedad, de etiopatogenia
desconocida, que puede presentarse a cualquier edad, pero tiene predominancia en la
población pediátrica. Se caracteriza por la formación de lesiones tisulares con
acumulación de células dendríticas inmaduras CD1a+, langerina/CD207+ denominadas
“células de HCL”, mezcladas con eosinófilos, células T policlonales, macrófagos activados
y células gigantes multinucleadas, haciendo que estas lesiones tengan una composición
celular y distribución anatómicas heterogéneas (1).
Cualquier órgano o sistema puede verse afectado por la HCL, y los más frecuentemente
involucrados son: el hueso (80%), la piel (33%) y la glándula pituitaria (25%). En niños el
compromiso de ganglios linfáticos y pulmones es muy raro. Este último se presenta más
en pacientes adultos fumadores (2).
La HCL muestra una distribución especifica según el órgano afectado; por ejemplo, en la
piel el proceso inflamatorio desarrolla en la dermis papilar respetando la epidermis, en los
ganglios linfáticos, el compromiso sinusoidal se observa en las lesiones más tempranas,
en el hígado, hay una predilección por el epitelio de los conductos biliares de gran calibre,
en el pulmón la HCL muestra compromiso peribronquial (3).
Las lesiones frecuentemente regresan espontáneamente o posterior a tratamiento local. A
pesar de heterogeneidad clínica no hay distinción histológica, y existen presentaciones
clínicas pleiotropicas desde lesiones simples tratadas con curetaje hasta una enfermedad
multisistémica fatal(4).4.2 Epidemiología
Las causas y factores de riesgo para el desarrollo de la Histiocitosis de Células de
Langerhans son poco claros; estudios poblacionales han mostrado diferencias en la
incidencia de la enfermedad de alto riesgo entre razas y grupos étnicos; así en las
diferentes series de casos se ha reportado: La incidencia estimada de HCL en una
población de Estocolmo fue de 8.9 casos por millón de habitantes menores de 15 años
por año (5); en Estados Unidos se ha reportado incidencia de 0.05 a 5 casos por millón de
habitantes al año; en la población de Latinoamérica existen pocos casos reportados, se
calcula una incidencia de 4,5 casos por millón de habitantes(6).
La edad pico de presentación esta entre 1-3 años, y la relación hombre: mujer ha sido
variable entre los reportes. Se ha observado asociación familiar con una incidencia
aumentada en gemelos monocigóticos de pacientes afectados, lo que ha sugerido una
predisposición de línea germinal en algunos de los casos(5, 7).
Se han descrito la correlación entre el desarrollo de la enfermedad y varios factores que
incluyen: infecciones maternas y neonatales, esquema de vacunación incompleto, historia
familiar de enfermedad tiroidea, fertilización in vitro, problemas de alimentación,
transfusiones durante la infancia y condiciones socioeconómicas desfavorables (5, 7, 8).
Así, los estudios poblacionales han mostrado variaciones en la incidencia de la HCL por
raza, grupo étnico y factores socioeconómicos, y apuntan a la necesidad de realización de
estudios epidemiológicos analíticos que proporcionen información sobre factores asociado
a la causalidad de esta enfermedad (7).
4.3 Etiopatogenia
Las lesiones de la HCL se caracterizan por contener varios tipos de células inflamatorias
además de las células patológicas características, siendo lesiones heterogéneas y
policlonales; pero hablando específicamente de las células patológicas de la HCL, en
1994 dos estudios independientes liderados por Yu y Willman, utilizaron la lionización, por
13medio del ensayo de inactivación de cromosoma X, en muestras de 3 y 10 pacientes con
HCL, respectivamente, y en ambos se demostró clonalidad de las células de HCL (9, 10).
La acumulación de histiocitos patológicos de carácter clonal, ha generado controversia
respecto al mecanismo subyacente responsable, que sumado a los recientes hallazgos de
mutaciones somáticas activadoras, particularmente BRAF V600E y MAP2K1 en
aproximadamente el 75% de los pacientes, ha sugerido la posible naturaleza neoplásica
de la enfermedad, a diferencia de otras teorías que indican que se trata de una reactividad
a estímulo inmunológico (1). Con respecto a esto último, dada la naturaleza
granulomatosa de las lesiones, que generalmente poseen morfología benigna se ha
sugerido una patogénesis infecciosa, ambiental o autoinmune. Se ha descrito una
respuesta inmune y expresión de citoquina anormales, como deficiencia de linfocitos T
supresores circulantes, y altos niveles de factores estimulantes de colonias de
macrófagos y granulocitos, e interleuquina 17, lo cual se ha denominado “Tormenta de
citoquinas”(11).
La célula de origen de la enfermedad es cuestionada. Dada la presencia de gránulos de
Birbeck, la expresión del marcador CD207 y la similitud fenotípica con las células de
Langerhans de la epidermis inicialmente, Nezelof en 1973 propuso que esta enfermedad
es de origen epidérmico (1, 4). Sin embargo en el año 2010, Allen y col, analizaron 15
muestras de pacientes con diagnóstico de HCL por medio de la tecnología de
microarrays, con el uso del chip Affymetrix, y observaron que las células patológicas de
HCL, mostraron 2113 genes expresados diferencialmente en comparación de las células
epidérmicas de Langerhans CD 207+, y más bien tenían un perfil de expresión genética
más similar al de precursores inmaduros de células dendríticas derivados de la médula
ósea, además de la expresión del gen de la osteopontina, SPP1, importante en la
activación y reclutamiento de linfocitos T a los sitios de inflamación. Estos resultados
sugirieron un modelo de patogénesis de HCL de “precursor de célula dendrítica erróneo”,
en el que las lesiones son debidas a un acumulo de células dendríticas mieloides
inmaduras derivadas de la medula ósea que reclutan células inflamatorias, que se
diferenciaba del modelo inicial de “célula inmadura activada”(12) .
Berres y col, en el año 2014, realizaron genotipificación en 100 muestras de HCL y se
encontró que pacientes con enfermedad activa de alto riesgo, con presencia de la
mutación de BRAF V600E en células circulantes en sangre periférica con marcador
14CD11c+ Y CD14+ y en células progenitoras de células hematopoyéticas de la medula
ósea CD34+, mientras que en pacientes con enfermedad de bajo riesgo la mutación se
limitó a células de origen epidérmico CD207+. De esta forma, se plantea que la HCL de
alto riesgo surge por mutaciones de un progenitor hematopoyético, mientras que la
enfermedad de bajo riesgo se debería a la mutación somática de precursores de células
dendríticas de restricción a tejido (piel) (4).
La ausencia de un modelo animal que reproduzca fielmente la HCL ha impedido el
planteamiento y evaluación de hipótesis acerca de la patogénesis, así como de
potenciales nuevos tratamientos (13).
4.4 Diagnóstico
Entre los síntomas específicos que estos pacientes presentan se encuentran: dolor,
edema, rash cutáneos, otorrea, fiebre, pérdida de apetito, diarrea, pobre ganancia de
peso, falla en el crecimiento, polidipsia, poliuria, síntomas respiratorios, irritabilidad,
cambios neurológicos y del comportamiento (2).
El diagnostico se basa en el examen histopatológico e inmunofenotipico de la lesión
tisular, de acuerdo con la presentación clínica, y hallazgos radiológicos. La HCL tiene una
apariencia histológica característica con la tinción de Hematoxilina-Eosina, pero para un
diagnóstico definitivo debe haber positividad para CD1a y/o CD207 (Langerina)
correlacionado con la presencia ultra estructural de los gránulos de Birbeck (2). La
formación de gránulos de Birbeck en las células dendríticas de la HCL, similares a los
presentes en las células de Langerhans epidérmicas representarían la captura de
antígeno por parte del receptor de lectina II tipo C, llamado langerina o CD207 (4).
15Figura 4-1. Lesión de Histiocitosis de Células de Langerhans.
A. Infiltrado de células grandes con abundante citoplasma eosinofilico y núcleo irregular.
Fondo de Neutrófilos, linfocitos e histiocitos espumosos. B. Prominentes pliegues y
hendiduras nucleares, cromatina fina, nucléolo pequeño/ Indistinto (14)
En los pacientes en quienes la realización de la biopsia puede resultar peligrosa, como en
el compromiso aislado de un cuerpo vertebral, se debe hacer una monitorización con
imágenes diagnosticas por lo menos en los siguientes 6 meses, reevaluando la posibilidad
de realizar la biopsia confirmatoria del diagnóstico (2).
Se requiere una extensa evaluación bioquímica e imagenologica en el momento del
diagnóstico y de presentación de una reactivación de la enfermedad para decidir la más
adecuada aproximación terapéutica; esta evaluación incluye: conteo total sanguíneo
(conteo celular y diferencial de glóbulos blancos, hemoglobina, contero de plaquetas),
química sanguínea (proteínas totales, albumina bilirrubina, ALT, AST, gammaGT,
creatinina, electrolitos), tasa de eritrosedimentación, ultrasonido abdominal (medición de
tamaño estructura de hígado y bazo), estudios de coagulación (INR/PT, APTT/PTT,
Fibrinógeno/factor I), radiografía de tórax, radiografía de huesos largos. (15).
Existen varios criterios para determinar el compromiso de un órgano como son(2):
 Hueso: compromiso general. Compromiso huesos craneofaciales: lesiones en
órbita, huesos temporal, mastoideo, esfenoidal, cigomático o etmoides; lesiones en
hueso maxilar o senos paranasales; lesiones en fosa craneana como extensión
16intracraneana de tejidos blandos. Afectación vertebral con o sin extensión a tejidos
blandos.
 Piel: cualquier rash documentado por examen histológico o cualquier lesión
eritematosa, maculas, pápulas o nódulos costrosos, con o sin ulceración, o
petequias, o un cuadro similar a dermatitis seborreica.
 Ganglios linfáticos
 Mucosas: gomas o lesiones en mucosa oral. Afectación genital o anal.
 Oído: otitis externa, otitis media, otorrea
 Ojo: compromiso de orbita con proptosis o exoftalmos
 Pulmón: nódulos o quistes en TAC, evaluación por lavado bronquialveolar o
biopsia.
 Sistema nervioso central hipotalámico-pituitaria: cualquier deficiencia hormonal de
la pituitaria o aparición de tumor en el eje hipotálamo-hipófisis
 Bazo: mayor de 3 cm por debajo de reborde costal en la línea medio clavicular,
confirmado por ultrasonido
 Hígado: agrandamiento mayor de 3 cm por debajo de reborde costal a nivel de
línea medio clavicular, confirmado por ecografía, o disfunción documentada:
hiperbilirrubinemia mayor de 3 veces el valor normal, hipoalbuminemia menor de
30 g/dL, gamma GT aumentada más de 2 veces del valor normal, aumento en los
valores de ALT-AST por encima de 3 veces del normal, ascitis, edema, o masa
nodular intrahepática.
 Sistema hematopoyético: compromiso moderado: hemoglobina de 7-10 g/dL y
trombocitopenia entre 20000 – 100000 plaquetas/mm3. Compromiso severo:
hemoglobina menor de 7 g/dL y conteo de plaquetas menor de 20000/mm3.
Actualmente no existe un marcador biológico específico de la enfermedad. La afectación
de ciertos órganos es considerada un marcador de alto riesgo de mortalidad o de
desarrollo de complicaciones neurodegenerativas, que son irreversibles y con un curso
clínico debilitante. Los órganos de alto riesgo son: medula ósea, hígado y bazo. Confieren
tasas de mortalidad mayores del 20%. La HCL de bajo riesgo tiene supervivencia cercana
al 100%. El compromiso pulmonar también se ha asociado a alta mortalidad, en medio de
complicaciones mecánicas como neumotórax no controlado o debido a cambios
enfisematosos crónicos, pero es poco frecuente en niños (2, 4).
174.5 Clasificación clínica
Se distinguen dos tipos de HCL: de compromiso de un solo sistema (SS-LCH) y
enfermedad multisistemica (MS-LCH). La HCL de compromiso de un solo sistema se
clasifica en: afectación unifocal o multifocal de órgano o sistema, compromiso unifocal o
multifocal de hueso, compromiso de piel, compromiso de ganglios linfáticos, afectación de
sistema nervioso central/hipotálamo/hipófisis, y compromiso de otros órganos, como por
ejemplo tiroides. En la enfermedad multisistemica se afecta 2 o más órganos o sistemas,
sean órganos de bajo o alto riesgo (1).
Tabla 4-1. Clasificación clínica de la HCL de acuerdo a Sociedad del Histiocito LCH-III.
Clasificación clínica de la HCL de acuerdo a Sociedad del Histiocito LCH-III (5)
GRUPO SISTEMA ORGANOS AFECTADOS PRONÓSTICO
CLINICO AFECTADO
1 Multisistemica – Cualquier órgano de riesgo Tasa de
Alto Riesgo comprometido: Hígado, Bazo, Medula Mortalidad 20%,
Ósea, Disfunción Hematológica Pese a
tratamiento
instaurado
2 Multisistemica – Compromiso >2 órganos, sin órgano Tasas de
Bajo Riesgo de riesgo supervivencia
3 Monosistémica 2 lesiones en un órgano cercanas a 100%
– Multifocal Óseo con extensión a tejidos blandos Secuelas a corto
O Sitio Especial intracraneal o intraespinal y largo plazo
Monosistémica 1 lesión en un órgano
– Unifocal
184.6 Tratamiento
La decisión sobre el tratamiento más adecuado depende de los síntomas clínicos, la
localización de las lesiones y su tamaño. En la enfermedad con afectación de un solo
sistema el paciente es referido al especialista de acuerdo a la localización del órgano
afectado. Para lesiones óseas unifocales, la regresión espontanea puede ocurrir. En el
compromiso multifocal de hueso son frecuentes las reactivaciones, pero muestran tasas
de supervivencia del 100% aproximadamente, con tratamiento que varía desde la
observación clínica hasta quimioterapia, siendo la combinación de esteroides y
Vinblastina (VBL) más frecuentemente usada(2).
Cuando hay compromiso cutáneo aislado es frecuente la regresión espontanea, pero
tiene el potencial de progresar a enfermedad multisistémica, por lo que debe hacerse un
monitorización juiciosa reevaluando la necesidad de tratamiento.
La HCL multisistemica requiere de terapia sistémica haya o no compromiso de los
órganos de riesgo, para el control de la actividad de la enfermedad, disminución de las
reactivaciones, y reducir las consecuencias permanentes. Los diversos protocolos
internacionales concluyen un tratamiento estándar con esteroides y vinblastina, que si es
prolongado por al menos 1 año se reduce el riesgo de reactivaciones, y la evaluación de
una adecuada respuesta al mismo luego de las primeras 6 semanas de tratamiento en un
buen marcador de la evolución de la enfermedad (2).
19Figura 4-2. Tratamiento Enfermedad de Bajo Riesgo (1):
- Observación
Piel - Esteroides tópicos
- Fototerapia
n - Curetaje
Monostótica
ó
- Radioterapia
i
c
a
z
i
l
a Mono/Poliostótica Quimioterapia (Vinblastina) +
c
o SNC esteroides x 6 meses
L
Multisistemica (G linfáticos, Quimioterapia (Vinblastina) +
TGI, Diabetes) esteroides x 6 – 12 meses
Figura 4-3. Tratamiento Enfermedad de Alto Riesgo (1):
M ósea/ Hígado/ Bazo
Quimioterapia (Vinblastina) +
esteroides, 6- mercaptopurina +/-
metotrexate 12 meses
204.7 Complicaciones y secuelas permanentes
Algunas de las secuelas permanentes de la HCL pueden estar presentes al momento del
diagnóstico o pueden manifestarse muchos años después. Más frecuentemente
involucran a los sistemas endocrino y óseo(2).
La Diabetes insípida es la endocrinopatía más frecuentemente asociada con presentación
desde el 15-30% de los pacientes con HCL, pero también puede haber deficiencia de la
hormona de crecimiento hasta en un 10% y otras hormonas que pueden llevar a
panhipopituitaismo y afectación de la pubertad. En cuanto secuelas óseas, se puede
desarrollar escoliosis cuando múltiples vertebras están afectadas; cuando el compromiso
es facial puede llevar a asimetrías que requieran manejo quirúrgico reconstructivo; las
lesiones en hueso temporal pueden conducir a pérdida de audición por compromiso de
oído medio o interno. Las consecuencias neurológicas incluyen ataxia cerebelosa
dificultades para el aprendizaje. Secuelas en otros órganos como pulmones e hígado son
más raras pero pueden causar morbilidad seria(2) .
Tabla 4-2. Características clínicas y demográficas de pacientes con HCL
214.8 Mutaciones puntuales y HCL: BRAF V600E
Gracias a los avances en tecnologías de genómica se puede efectuar la búsqueda de
mutaciones en archivos de muestras de tejidos fijados en formalina-incluidos en parafina,
sin que sea necesario contar con material fresco congelado, como por ejemplo el
genotipado basado en espectrometría de masas, que se separa e identifica moléculas con
diferentes masas moleculares. Basado en este principio, por medio de la herramienta
Oncomap, un ensayo capaz de testear la presencia de cerca de 1000 alelos de 140 genes
relacionados con cáncer, lo que le da una alta sensibilidad para el examen de neoplasias
raras. Baladian- Very y col., en el año 2010, realizaron un estudio que utilizo una versión
de Oncomap que evaluaba 983 mutaciones en 115 genes, examinando 61 casos de
archivo de HCL. Ellos reportaron la primera mutación genética somática recurrente en
HCL, presente en un 57% de las muestras: la mutación de BRAF-V600E. Esta mutación
fue confirmada por la técnica de pirosecuenciación (4, 13).
B-RAF es una proteína quinasa activada por receptores tirosina quinasas acoplados a
Ras (RTK), que pertenece a la familia RAF, y es fundamental en la vía de señalización de
la Quinasa activada por Mitógeno (MAPK). En células normales la actividad de esta vía es
controlada por mitogenos como factores de crecimiento, citoquinas, y hormonas que se
ligan a receptores de superficie celular. Posteriormente, se activa RAS, una proteína G de
la superficie interna de la membrana plasmática, que a su vez se une y activa a RAF, y
ésta fosforila a sus blancos MEK y ERK quinasas que finamente modulan la expresión
genética, coordinando una gran variedad de respuestas celulares involucradas en el
desarrollo, regulación del ciclo celular, proliferación celular y diferenciación, supervivencia
celular y apoptosis, y otros procesos fisiológicos (16, 17).
La mutación puntual de B-RAF V600E, se considera de origen somático y no de línea
germinal, debido a que la hiperactivación de esta proteína en el periodo embrionario
resulta letal en modelos animales. Representa una sustitución de valina por ácido
glutámico en la posición 600, lo cual activa fuertemente a la proteína B-RAF; además se
asocia a altos niveles de ciclina D1, mediando la proliferación celular, y podría así
contribuir a la iniciación tumoral, aunque su presencia no es sinónimo de cáncer (16). En
humanos la mutación somática activadora de B-RAF ha sido encontrada en numerosos
tumores benignos y malignos entre los que se incluyen: nevus benigno, melanoma,
22carcinoma colorrectal y de pulmón, carcinoma papilar de tiroides, carcinoma ovárico de
bajo grado y glioma pediátrico de bajo grado; entre las mutaciones identificadas, V600E
es la más frecuente (17).
El hallazgo de la mutación recurrente de B-RAF V600E en los especímenes de HCL se
explicaría como un oncogen transformante en las células de Langerhans, que le brindaría
una ventaja proliferativa llevando al desarrollo de una lesión clonal. Sin embargo esta
afirmación requiere de la demostración de la mutación específicamente en estas células
en medio de una población celular heterogénea, pero esto se ha inferido por la
abundancia de material celular rico en CD1a, y posterior micro disección por láser (13).
Se ha visto que es necesario que las muestras tengan al menos un 10% de
representación de las células tumorales, para que puedan ser identificadas con problemas
con cualquier de los métodos disponibles en el mercado (18). Dado que la identificación
precisa de las mutaciones somáticas subyacentes es esencial, un estudio evaluó la
sensibilidad, especificidad y viabilidad de seis métodos diferentes para la detección de
mutaciones BRAF, estableciendo que los métodos moleculares como el High Resolution
Melting (HRM) y la secuenciación de Sanger no hubo diferencia en la sensibilidad (98%) y
que todas las mutaciones con hasta el 6,6% de frecuencia de alelos se pudieron detectar
con un 100% de especificidad. Otro método como la pirosecuenciación detectó el 100%
de las mutaciones hasta un 5% de frecuencia de alelos, pero exhibió solo un 90% de
especificidad. La PCR alelo-específica no pudo detectar el 16,3% de las mutaciones
elegibles para la terapia con vemurafenib. La secuenciación de próxima generación (NGS)
pudo analizar el 100% de los casos con un 100% de especificidad pero mostró una
sensibilidad del 97.5%. La Inmunohistoquímica obtuvo un buen rendimiento, dada la
rareza de reactividad cruzada con otras mutaciones BRAF (19). Actualmente los métodos
moleculares que se consideran más sensibles para la detección de esta mutacion son la
PCR digital y la PCR en tiempo real (18).
La identificación de la expresión de la mutación activadora de BRAF V600E por medio de
inmunohistoquímica usando un anticuerpo validado VE1, se correlaciono con el estado
mutacional en la mayoría de los casos en el estudio de Roden y col, tanto en pacientes
con HCL pulmonar y extrapulmonar, obteniendo un índice de correlación del 95.6% entre
las dos técnicas; estudios posteriores como el de Mehes y col mostraron concordancia del
93% entre la inmunohistoquímica con este mismo anticuerpo y la secuenciación,
precedida por PCR. Así, los estudios por inmunohistoquímica pueden ser usados como
23test de tamización para esta mutación en HCL (20, 21). Para su evaluación es necesaria
la tinción fuerte y uniforme del citoplasma, dado que la tinción nuclear se considera
inespecífica. Se han planteado diferentes escalas de evaluación de la inmunotincion,
siendo la más aceptada la propuesta por Ballester y col, que daba una calificación de 0 a
3+, dependiendo de la intensidad observada con diferentes aumentos con la microscópica
óptica de luz (22).
El hallazgo de la mutación BRAF V600E representa una aproximación a la patogénesis de
HCL: la identificación de las mutaciones activadoras del gen BRAF apoyan fuertemente la
hipótesis que HCL es un proceso neoplásico, al menos en un porcentaje de casos (17),
concordante con la presencia de acumulaciones de células clonales, inestabilidad
cromosómica, acortamiento significativo de los telómeros comparados con células e
Langerhans de otros procesos inflamatorios, la presencia de disregulación del ciclo celular
dentro de las lesiones, reportados previamente (3).
En cuanto el significado clínico de portar esta mutación, los reportes en la literatura han
mostrado resultado variables (23): en algunos la mutación BRAF V600E en HCL ha
mostrado correlación con la edad, siendo más frecuente en tumores de pacientes
menores de 10 años comparados con pacientes mayores, 76% versus 44%,
respectivamente (13) y en otro se observó una mayor frecuencia de BRAF V600E en
bebes menores de 2 años de edad (p = 0.013) (18). Respecto al tipo de Histiocitosis de
bajo o alto riesgo, no se ha mostrado una asociación directa, pero se ha demostrado
positividad para BRAF V600E en pacientes con presentación clínica más agresiva, que
incluye el Síndrome hemofagocítico (24). A pesar de no correlacionarse con la
localización anatómica, compromiso de un solo sistema versus compromiso
multisistémico en HCL, la mutación de BRAF V600E se ha encontrado en células
dendríticas patológicas presentes en las lesiones, asociado con enfermedad de alto riesgo
recurrente o refractaria. También ha estado presente en células circulantes, asociado a
severidad de la enfermedad en HCL de alto riesgo, así el estado mutacional estaría
asociado con mayor resistencia a la quimioterapia de primera línea (25). Su expresión se
ha asociado con un riesgo incrementado de recurrencia, y se ha encontrado presente en
las fracciones circulantes de células CD11c+ y CD14+ y células progenitoras
hematopoyéticas CD34+ de pacientes catalogados de alto riesgo; por el contrario, la
mutación se restringe a células dendríticas CD207+ en pacientes de bajo riesgo; a pesar
de tener una etiología desconocida, el modelo de precursores de células dendríticas
24mieloides proporciona un mecanismo subyacente para explicar la localización y
acumulación anormales de células dendríticas, y esto es consistente con el tratamiento de
la HCL como enfermedad hematológica (al menos en casos pediátricos). Esto contrasta
con los tumores sólidos primarios y metastásicos, que tienden a presentar un mayor nivel
de heterogeneidad a nivel genético (26). En modelos animales de ratones, la expresión de
BRAF V600E en precursores de células dendríticas induce el fenotipo de HCL, a
diferencia de lo que ocurre con células diferenciadas (4). Por otra parte, se ha identificado
la relación entre la mutación BRAF V600E y un microambiente inmunitario tumoral
supresivo en la HCL, lo que da como resultado la interrupción de la vigilancia inmunitaria
del huésped-tumor, que abre la puerta al uso inmunoterapia con terapia dirigida a BRAF
en estos pacientes (27) .
La HCL es una neoplasia clonal y el hallazgo de la mutación BRAF V600E y su
consecuente desregulación en la vía RAS-RAF-MAPK representa prometedoras
aproximaciones terapéuticas, como el uso de inhibidores de B-RAF, MEK o ERK, y hace
necesario el evaluar la inhibición selectiva de esta vía, al menos en pacientes con las
formas sistémicas y agresivas de la enfermedad. Adicionalmente su detección en una
muestra de sangre tendría uso en el diagnóstico y monitorización en el seguimiento del
tratamiento, al proporcionar información sobre el estado de enfermedad mínima residual,
y además sus potenciales usos pronósticos (16). También puede conducir a la obtención
de un modelo murino más preciso y de forma más fácil, para poder ampliar los estudios
de esta enfermedad (1, 13).
El uso de Vemurafenib, un inhibidor de BRAF, mostró una buena respuesta clínica en
pacientes con Histiocitosis de células de Langerhans y enfermedad de Erdheim- Chester,
otro desorden relacionado con la mutación BRAF V600E en un 54% de los casos según el
reporte de Haroche y col. La efectividad del tratamiento se vio particularmente en una
paciente con HCL cutánea, donde las lesiones histiociticas de piel resolvieron luego de
pocos días de tratamiento, y se confirmó por biopsia. Las dosis iniciales de Vemurafenib
desarrollaron efectos secundarios como rash, eritema cutáneo y queratosis pilar, que
desaparecieron al reducir la dosis a la mitad. El esquema de dosis y duración de
tratamiento para estas entidades deberá ser determinado por estudios clínicos, así como
la eficacia a largo termino y desarrollo de posibles resistencias secundarias como en
melanoma asociado a mutación BRAF V600E (28).
25Independientemente del estado mutacional de BRAF, la activación de la vía RAF-MEK-
ERK, parece ser una característica general de la HCL. Las proteínas MEK y ERK
fosforiladas son un hallazgo constante y especifico en células patológicas de HCL,
evidenciado por medio de estudios de inmunofluorescencia, en presencia o ausencia de la
mutación de BRAF, un hallazgo inesperado, pues en el 50% de los casos
aproximadamente el origen de esta activación permanece desconocida, y podría estar
asociada a una sobre activación del receptor tirosina quinasa, dependiente o
independientemente del ligando. Esto sugiere que mutaciones en otros genes que regulan
esta vía estarían involucrados en casos con alelos normales de BRAF y deberían ser
investigados (13).
Esta observación se complementa con los hallazgos de Brown y col, quienes por medio
de la tecnología de secuenciación de próxima generación reportaron la mutación somática
de MAP2K1 en aproximadamente el 50% de los pacientes con HCL en quienes se reportó
negatividad en la búsqueda de la mutación BRAF V600E, siendo 2 mutaciones
mutuamente excluyentes y con posibles papeles importantes en la patogénesis de la HCL
(29). Un trabajo similar por parte de Chakrabonty, en el 2014, evaluó un espectro de
mutaciones somáticas en enfermedades histiociticas, incluyendo la Histiocitosis de células
de Langerhans, encontrando la mutación BRAF V600E en el 50% de los pacientes, y en
aquellos con BRAF silvestre, se encontró la mutación de MAP2K1 en el 33%, que incluían
deleciones in-frame y mutaciones miss-sense, comprometiendo el dominio de
autorregulación y núcleo catalítico de la proteína MEK1. Se reportaron además casos
aislados de mutaciones somáticas de otros genes en la vía MAPK: ARAF, y ERBB3. Así
la habilidad de los inhibidores de la vía MAPK, depende de cada mutación específica, al
poner a prueba la respuesta a Vemurafenib (30). Otras mutaciones que se han
encontrado en muestras de pacientes con HCL corresponden a mutación en TP53:
R175H, un alelo transformante en KRAS: G13D, y un alelo transformante candidato en
MET: E168D(13).
La mutación se ha considerado una clave que permitiría elucidar la patogénesis de esta
enfermedad, sin embargo, aún son escasos los reportes que proporcionan información
acerca de la prevalencia de la mutación BRAF V600E en la HCL: esto conduce la
necesidad de llevar a cabo estudios clínicos multicéntricos que evalúen a BRAF como
blanco terapéutico y evaluación adicional de la asociación entre mutaciones del gen BRAF
como sitio de enfermedad, estadio, respuesta clínica y resultados (17, 23).
265. Materiales y métodos
Tipo de estudio: Se trata de un estudio descriptivo que incluye la población de pacientes
con diagnostico histopatológico de Histiocitosis de Células de Langerhans, realizado en la
Fundación Hospital de la Misericordia, durante los años 2005 a 2017.
FASES DEL ESTUDIO
5.1 Serie de casos: Se revisaron el total de historias clínicas de pacientes con
diagnóstico confirmado de Histiocitosis de células de Langerhans, reportados en los
archivos del Departamento de Patología del Hospital de la Misericordia, en el periodo de
2005 al 2017.
Se tabularon las características demográficas y clínicas de niños con diagnóstico de
Histiocitosis de Células de Langerhans atendidos en este lapso de tiempo:
 Variables cuantitativas: edad, tiempo de evolución, seguimiento
 Variables cualitativas: Procedencia, Sexo, Distribución de la afectación por órgano:
evidencia histológica de órganos infiltrados por tumor (HCL) o criterios para compromiso
Hematopoyético, Hígado, Bazo, Pulmón; Clasificación de la Sociedad del Histiocito;
recaídas, secuelas permanentes y muertes.
Se seleccionaron los casos que tenían validez diagnóstica con positividad en el marcador
de inmuhistoquimica CD1a+, considerado la prueba confirmatoria de esta enfermedad.
5.2 Análisis de la mutación BRAF V600E por estudio de Inmunohistoquimica: Se
realizó la búsqueda de los bloques de parafina de los casos analizados, y en el material
disponible se realizaron cortes de cada caso en láminas cargadas para realizar la técnica
de inmunohistoquímica en el Laboratorio de Patología Interfacultades de la Universidad
Nacional de Colombia, para lo cual se adquirió el Kit Optiview DAB IHC, para uso conjunto
con el marcador de inmunohistoquímica Ventana VE1, para la identificación de la
mutación BRAF V600E por medio del por medio del equipo automatizado BENCHMARK
27GX, con los respectivos protocolos estandarizados; el uso de este kit de optimización es
necesario para mejorar la sensibilidad del anticuerpo en la interpretación mediante
microscopía óptica.
5.3 Estudio molecular de la mutación BRAF V600E por medio de secuenciación de
Sanger: Se obtuvieron 4 cortes de 10 micras de cada caso y se prepararon las muestras
para el análisis y confirmación molecular, aislando ADN a partir de los bloques de parafina
por medio del Kit Comercial Zymo, y se determinó la concentración de ADN por medio de
su cuantificación. Luego se llevó a proceso de amplificación por medio Reacción en
Cadena de la Polimerasa (PCR), usando primers específicos del exón 15 del gen BRAF, y
se realizaron corridos en gel de electroforesis para determinar la calidad de las muestras
a las que se les realizo procesos de purificación y secuenciación en en el Servicio de
secuenciación y análisis molecular (SSiGMol), en el Instituto de Genética de la
Universidad Nacional.
5.4 Análisis de resultados: se realizó la evaluación final de los resultados, comparando
los hallazgos obtenidos por inmunohistoquimica y por secuenciación de Sanger,
estableciendo su correlación con las variables clínicas descritas, por medio de análisis
estadístico por medio de la herramienta XLSTAT, calculando las asociaciones
estadísticamente significativas con el test exacto de Fisher y Chi cuadrado, y se
estableció el porcentaje de concordancia entre las dos técnicas usadas para el estudio de
la mutación BRAF V600E.
286. Resultados
6.1 Fase 1: Caracterización de la población
Con los casos recolectados de Histiocitosis de células de Langerhans (HCL)
diagnosticados en la Fundación Hospital de La Misericordia en los últimos 12 años (2005-
2017), positivos para el marcador de inmunohistoquímica CD1a, que es la prueba
confirmatoria de la enfermedad, se obtuvo una muestra significativa de 50 pacientes, cada
uno de ellos con acceso a sus historias clínicas, láminas de histopatología y bloques de
parafina respectivos.
Inicialmente se hizo una revisión detallada de las historias clínicas en formato físico y
electrónico, para describir las características demográficas y clínicas de nuestros
pacientes, y se construyó una base de datos con esta información. Simultáneamente se
realizó la revisión de las láminas histológicas de estos casos para verificar sus
características histopatológicas; fue necesaria la obtención de nuevos cortes a partir de
los bloques de parafina para algunos de los casos, con el fin de optimizar el tejido de las
muestras que tenían áreas sin lesión por hemorragia o necrosis.
Los pacientes de los 50 casos analizados para el estudio se distribuyeron asi: 54% fueron
hombres (n:27) y 46% fueron mujeres (n:23); la edad promedio al momento del
diagnóstico fue de 41 meses, con un rango de edad de 2 a 159 meses; el tiempo
promedio de evolución de los síntomas fue de 16 semanas, con un rango de 1 a 107
semanas, esta variabilidad en correlación con la diferente afectación de órganos
reportada; y el tiempo promedio de seguimiento fue de 35 meses, con un rango de 3 a
120 meses, y 3 pacientes no tuvieron ningún tipo de seguimiento en la institución.
En cuanto a la clasificación de Histiocitosis según los criterios de la Sociedad del
Histiocito, 4% de los casos fueron clasificados como HCL monosistémica con compromiso
de piel (n:2), 32% como HCL monosistémica monostótica (compromiso óseo monofocal)
(n: 16), 12% como HCL monosistémica poliostótica (compromiso óseo multifocal) (n:6),
12% como HCL multisistémica sin compromiso de órgano de riesgo (OR-) (n: 6) y 40%
como HCL multisistémica con compromiso de órgano de riesgo (OR+: Hígado, Bazo y/omedula ósea) (n:20). El órgano más afectado fue el hueso (32% de los órganos
comprometidos) y la piel (13% de los órganos comprometidos), seguidos de los órganos
considerados como órganos de riesgo y el compromiso a ganglio linfático; los huesos más
afectados fueron los huesos craneales
Figura 6-1: A. Tipo de HCL, B: Órganos comprometidos y C: Evolución clínica
30Respecto a la evolución clínica de los 50 casos, el 26% de ellos reporto secuelas (n: 13),
siendo la más frecuente las endocrinopatías, especialmente la diabetes insípida, pero
también se reportaron secuelas de tipo ortopédico por deformidad ósea, neuropatía
crónica, parálisis facial y desnutrición. 20% de los casos (n:10) tuvieron recaída de la
enfermedad, siendo más frecuentes en el tipo de HCL con compromiso de órgano de
riesgo, con una diferencia estadísticamente significativa con respecto a los tipos de HCL
de bajo riesgo (p= 0.005); de igual manera, se registraron 4 fallecimientos como
consecuencia de la enfermedad (8%), todos en pacientes con HCL de alto riesgo (p=
0.009), en quienes la enfermedad evoluciono de forma rápida y llevo a la muerte en los
primeros meses posteriores al diagnóstico.
31Figura 6-2. Kaplan Meier: probabilidad de recaída y supervivencia
Al comparar los tipos de Histiocitosis de células de Langerhans, y simplificando su
clasificación en HCL monosistémica, HCL multisistémica sin compromiso de órganos de
riesgo y HCL multisistémica con compromiso de órganos de riesgo, se observó que esta
última se presentó con mayor frecuencia en pacientes menores de 2 años de edad (85%)
al compararlo con pacientes mayores de 2 años de edad (15%) (p= 0.004). Asimismo se
observó una asociación significativa entre la HCL multisistémica de alto riesgo y la
presencia de recaídas (p= 0.007) y de muerte (p= 0.045). No se encontró asociación
significativa entre el tipo de Histiocitosis y otras variables como el sexo y la presencia de
secuelas.
32Tabla 6-1. Características clínicas y demográficas de pacientes con Histiocitosis de
Células de Langerhans
6.2 Fase 2: Análisis de la mutación BRAF V600E por
estudio de inmunohistoquímica con el anticuerpo
ventana VE1:
Esta fase se realizó con el marcador de inmunohistoquímica Ventana VE1, para la
identificación de la mutación BRAF V600E, en uso conjunto con el Kit Optiview, según los
protocolos del fabricante. Este anticuerpo ha sido validado y usado en diferentes
patologías como Carcinoma papilar de tiroides, carcinoma colorrectal y melanoma; en
Histiocitosis de células de Langerhans se ha demostrado su utilidad y correspondencia
con el estado mutacional, siendo el primer reporte el de Roden en 2014, quien mostro una
correlación del 95.6% entre las dos técnicas en casos de HCL pulmonar y extrapulmonar;
posteriormente otros autores como Mehes observaron correlación del 93%. Para su
evaluación es necesaria la tinción fuerte y uniforme del citoplasma, dado que la tinción
nuclear se considera inespecífica. Se han planteado diferentes escalas de evaluación de
la inmunotinción, siendo la más aceptada la propuesta por Ballester y col. En 2018, una
escala semi-cuantitativa de 0 a 3, donde 0 indica la completa ausencia de tinción, 1+
33indica una tinción débil apreciable solo a 400X aumentos, 2+ indica una tinción moderada,
que es aparente a 100X aumentos y 3+ indica una tinción fuerte e intensa que es
aparente a los 40 X aumentos; se considera entonces 0 como una tinción negativa, 1+
como una tinción equivoca, que requiere estudios adicionales, 2+ como positiva, siempre
y cuando haya tinción en más del 10% de las células tumorales y 3+ como positiva. En
este estudio se realizó una comparación con Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
alelo específica obteniendo la inmunohistoquímica una sensibilidad del 80% y una
especificidad del 100% con el uso de esta escala(22).
Figura 6-3. Inmunohistoquímica para BRAF V600E con Anticuerpo Ventana VE1. Escala
de evaluación.
En nuestro estudio usamos esta misma escala semi-cuantitativa para la evaluación de la
tinción del anticuerpo Ventana VE1, usando como control positivo un caso de Carcinoma
Papilar de Tiroides y obtuvimos los siguientes resultados: la mutación estuvo ausente en
el 28% de los casos (n:14)con tinción negativa 0, la mutación era incierta en 18% de los
casos (n:9) con tinción equivoca 1+ y la mutación se consideró presente en 54% de los
casos con tinciones positiva 2+ (n: 16) y positiva fuerte 3+ (n: 11), dado que todos los
casos de tinción 2+ tenían más de 10% de las células positivas.
34Figura 6-4. Resultados de evaluación por Inmunohistoquímica para BRAF V600E –
Ventana VE1
CONTROL: Carcinoma papilar de Tiroides
NEGATIVO 0 (28%) EQUIVOCO 1+ (18%)
Casos: 6, 7, 10, 25, 26, 27, 28, 36, 37, 39, Casos: 3, 11, 15, 21, 34, 35, 47, 48, 49
44, 45, 46, 50
POSITIVO 2+ (32%) POSITIVO FUERTE 3+ (22%)
Casos: 1, 2, 4, 5, 14, 16, 17, 18, 22, 23, Casos: 8, 9, 12, 13, 19, 20, 24, 29, 31, 42,
30, 32, 33, 38, 40, 41 43
35Cuando se compararon estos resultados según tipo de HCL, se observó que ningún caso
de HCL monosistémica con compromiso exclusivo de piel tuvo la mutación; en el resto de
tipos de HCL se observó una distribución casi equitativa según los grados de tinción, con
mayor presencia de tinción equivoca en los tipos de HCL multisistémica con compromiso
de órganos de riesgo y en HCL monosistémica monostótica.
Figura 6-5. Inmunohistoquímica para BRAF V600E con Ventana VE1 y su correlación con
tipo de HCL
La única asociación significativamente estadística observada fue la presencia de mutación
con el grupo de edad de menores de 2 años (p= 0.021), independiente del sexo femenino
o masculino (p= 0.467), del tipo de Histiocitosis de bajo o alto riesgo (p= 0.431), del
compromiso monosistémico o multisistémico (p= 0.322) y de la evolución clínica con
presentación de secuelas (p= 0.309), recaídas (p= 0.567) o muerte (p= 0.146). Sin
embargo es necesario anotar que en el grupo de tinción equivoca 1+ se encontraba la
mitad del total de pacientes fallecidos (n: 2).
36Tabla 6-2. Inmunohistoquímica para BRAF V600E (Ventana VE1) en correlación con
características clínicas y demográficas en HCL
6.3 Fase 3: Estudio molecular de la mutación BRAF
V600E por medio de secuenciación de Sanger:
A partir de los bloques de parafina de los 50 casos, se obtuvieron 4 cortes de 10 micras y
se prepararon las muestras para el análisis y confirmación molecular, inicialmente con
amplificación por medio Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), usando primers
específicos del exón 15 del gen BRAF, y se realizaron corridos en gel de electroforesis
para determinar la calidad de las muestras. Fue necesaria la repetición de la reacción en
las muestras en la que no se obtuvo visualización del producto por medio de
electroforesis; finalmente se obtuvieron 34 muestras y adicionalmente se evaluó la
muestra usada como control positivo en el estudio de Inmunohistoquímica (Caso de
Carcinoma papilar de tiroides).
37Figura 6-6. Productos de amplificación: Gel de electroforesis
Las 34 muestras más el control positivo fueron llevadas a procesos de purificación para la
Secuenciación de Sanger, que se llevó a cabo en el Servicio de secuenciación y análisis
molecular (SSiGMol), en el Instituto de Genética de la Universidad Nacional. De las 34
muestras analizadas, 10 habían resultado negativas en el estudio de inmunohistoquímica,
9 tuvieron tinción equivoca 1+, 10 fueron positivas 2+ y 5 tuvieron tinción positiva fuerte
3+. Por medio de la Secuenciación de Sanger se observó que la mutaciones estaba
presente en el 44% de las muestras (15 casos), todos ellos heterocigotos; la mutación fue
negativa en el 47% de las muestras (16 casos), y el 9% restante correspondió a 3 casos
dudosos que no fueron interpretables, debido a la presencia de pequeños picos con un
fondo de ruido, a pesar de la repetición de la prueba.
38Figura 6-7. Resultados de secuenciación para BRAF V600E
MUTACIÓN PRESENTE
(44%)
Casos: 2, 5, 9, 11, 12, 15, 18,
21, 23, 24, 30, 32, 34, 35, 40
MUTACION AUSENTE
(47%)
Casos: 3, 6, 7, 10, 16, 17, 25,
27, 28, 33, 37, 39, 47, 48, 49,
50
DUDOSO/ NO
INTERPRETABLE (9%)
Casos: 13, 29, 36
39Estos 3 casos correspondieron a muestras de piel, ganglio linfático y hueso, siendo los
dos primeros casos positivos 3+ para BRAF V600E por inmunohistoquímica, y el último
negativo.
Tabla 6-3. Casos dudosos / no interpretables por secuenciación para BRAF V600E
Figura 6-8. Casos dudosos / no interpretables por secuenciación para BRAF V600E
Al analizar resultados mutados y no mutados y contrastarlos con los resultados de cada
caso por el estudio de inmunohistoquímica se observó un porcentaje de concordancia del
90.3%
40Figura 6-9. Correlación de BRAF V600E por inmunohistoquímica con secuenciación de
Sanger
El 100% de los casos negativos con el marcador Ventana VE1, también fueron negativos
para la secuenciación; esto mismo sucedió con la inmunotinción fuerte 3+, donde todos
los casos fueron positivos por ambas técnicas. En los casos de tinción equivoca 1+, el
44% de los casos (n: 4) resultaron negativos y en el 56% restante (n: 5) se evidencio la
mutación por la técnica de secuenciación. De los 10 casos positivos 2+, 3 de ellos
resultaron negativos en el estudio de secuenciación, que correspondieron a muestras de
bazo, pulmón y hueso, siendo el caso de pulmón el que menor representación de células
de Langerhans tenia, con un 20%, y el caso de hueso presentaba extensas zonas de
necrosis, lo que podría explicar en parte dichos resultados.
Tabla 6-4. Casos discordantes con inmunohistoquímica 2+ con secuenciación para BRAF
V600E negativa
41Figura 6-10. Casos discordantes con inmunohistoquímica 2+ con secuenciación para
BRAF V600E negativa
Los casos con tinción equivoca 1+ por inmunohistoquímica, mostraban características
demográficas y clínicas heterogéneas: 5 de ellos pertenecían a casos de HCL
multisistémica con compromiso de órganos de riesgo y los 4 restantes se distribuyeron en
HCL de tipos monosistémica monostótica y multisistémica sin compromiso de órganos de
riesgo, con un rango de edad de presentación entre 2 y 50 meses, y tampoco mostraron
predilección por tejido de órgano en particular. Como se comentó anteriormente, 2 de los
4 casos que presentaron desenlace fatal estaban en este grupo, y los 2 demostraron tener
la mutación al ser analizados con la secuenciación de Sanger.
42Tabla 6-5. Casos con tinción equivoca por inmunohistoquímica en correlación con
resultados de secuenciación
En cuanto a la correlación del estado mutación de BRAF V600E por medio de
secuenciación con las características clínicas y demográficas de los pacientes, se observó
una asociación estadísticamente significativa con el grupo de edad menor de 2 años (p=
0.011) y la presencia de la mutación, similar a lo anotado para el estudio de
inmunohistoquímica; con otras variables como el sexo, el tipo de histiocitosis (bajo riesgo
y alto riesgo), el compromiso mono o multisistémico y la evolución clínica con eventos de
secuelas, recaídas y muerte no se encontraron una asociación significativa con el
hallazgo de BRAFV600E.
43Tabla 6-6. Estado mutacional de BRAF V600E (secuenciación de Sanger) en correlación
con características clínicas y demográficas en HCL
Al discriminar el tipo de HCL en los 5 grupos se puede observar como hay una
distribución pareja en los casos mutados y en los negativos para la mutación, sin tener
predilección por un tipo de HCL especifica; por otra parte los pacientes menores de 2
años muestran un claro predominio de casos con la mutación, contrario a los pacientes
mayores de 2 años
44Figura 6-11 A. Tipo de HCL y B. Edad (pacientes menores vs mayores de 2 años) con
respecto a la mutación BRAF V600E por secuenciación
457. Discusión
En nuestro estudio el tipo de Histiocitosis de células de Langerhans más frecuente
correspondió a la HCL multisistémica con compromiso de órganos de riesgo (40% de los
casos), esto probablemente debido a que La Fundación HOMI es un centro de referencia
de alta complejidad, y la mayoría de casos de HCL de bajo riesgo pudieron ser tratados y
observados en otros centros. Las secuelas permanentes más frecuentes fueron de tipo
endocrinológico, con Diabetes insípida, y los casos que resultaron fatales tuvieron una
rápida progresión clínica con pobre respuesta al manejo inicial instaurado; estos datos
coinciden con lo reportado en la literatura. En la fase inicial la serie de casos mostró una
asociación estadísticamente significativa entre tipo de Histiocitosis de células de
Langerhans de alto riesgo con: edad de presentación: pacientes menores de 2 años de
edad (p=0.004); con mayor riesgo de recaída (p=0.007) y peor sobrevida (p=0.045), al ser
comparada tanto con Histiocitosis de células de Langerhans de los otros tipos con
compromiso monosistémico, como multisistémico de bajo riesgo.
El estudio de inmunohistoquímica con el marcador Ventana VE1, no mostro dificultades
para su realización y evaluación; esta técnica demostró positividad para la mutación
BRAF V600E en un 54% de los casos, y de las 50 muestras, 34 fueron llevadas a análisis
molecular por Secuenciación, encontrando un porcentaje de concordancia de 90,3% entre
los dos métodos utilizados para evaluar la mutación.
Se observaron discrepancias en 3 de las 34 muestras, que mostraron positividad para
BRAF V600E por inmunohistoquímica y fueron negativas por secuenciación. Haciendo
revisión de la literatura se considera más posible que se traten de falsos negativos de la
secuenciación, que pudieron estar relacionados con la pobre representación de la lesión
en los tejidos, en la fase pre-analítica, como consecuencia del desgaste de los bloques de
parafina que requirieron múltiples cortes como parte de su estudio diagnóstico inicial.
De 9 muestras consideradas equivocas para BRAFV600E por Inmunohistoquímica con
tinción calificada como 1+, el 56% fue positivo por secuenciación, y 44% fue negativo;
esto plantea la necesidad de confirmación con un método molecular, con mayor
sensibilidad, dado que la inmunotinción débil y focal no es suficiente para establecer la
46presencia de la mutación BRAF V600E. La aproximación con Ventana VE1 para BRAF
V600E es útil en los casos con positividad o negatividad evidentes.
Tanto en el estudio de Inmunohistoquímica como en el de secuenciación, se encontró una
diferencia estadísticamente significativa de BRAF V600E con la edad de presentación
(pacientes menores de 2 años vs pacientes mayores de 2 años) (p= 0,021 y p=0.011
respectivamente); esto en correlación con estudios previos reportados en la literatura,
donde esta era la asociación más fuerte relacionada con la mutación; a pesar que la
Histiocitosis de células de Langerhans de alto riesgo es más frecuente en este grupo de
edad, este tipo de histiocitosis no tuvo relación estadísticamente significativa con la
presencia de la mutación.
El hallazgo de la mutación BRAF V600E por las dos técnicas utilizadas no tuvo diferencias
estadísticamente significativas con presencia de secuelas, riesgo de recaída o mortalidad,
a diferencia de otros estudios reportados en la literatura; a pesar de no haber una relación
directa entre la presencia de la mutación y el tipo de Histiocitosis, si se observó que todos
los casos de compromiso exclusivo cutáneo, que tuvieron buen pronóstico fueron
negativos para BRAF V600E por los dos métodos utilizados en este estudio.
Dado el planteamiento de los posibles falsos negativos por la secuenciación de Sanger,
consideramos que sería ideal analizar la totalidad de las muestras con una prueba
molecular de mayor sensibilidad, como PCR en tiempo real y PCR digital, con énfasis en
los resultados equívocos 1+ por inmunohistoquímica, y comprobar la negatividad y/o
positividad para BRAF V600E, lo que abre la puerta a la realización de nuevos proyectos
que despejen estos interrogantes.
478. Conclusiones
La Histiocitosis de células de Langerhans es una enfermedad infrecuente, de naturaleza
heterogénea, que se presenta con mayor frecuencia en la población pediátrica, y en los
pacientes menores de dos años tiende a tener un peor pronóstico asociado a HCL de alto
riesgo, con un mayor riesgo recaída y peor sobrevida. Además, esta edad de
presentación de la enfermedad tiene asociación significativa con la presencia de la
mutación somática BRAF V600E, que en general se reportó en el 54% de los casos.
El estudio de inmunohistoquímica con el marcador Ventana VE1 mostró un buen
rendimiento diagnostico con concordancia de 90.5% con respecto a la secuenciación
directa de Sanger, pero es necesario hacer una graduación de la intensidad de su tinción,
dado que los casos con tinción débil y focal 1+ pueden representar falsos positivos;
entonces la aproximación con Ventana VE1 para BRAF V600E es útil en los casos con
positividad o negatividad evidentes; de otra forma se requiere el uso de métodos
moleculares de mayor sensibilidad para la confirmación.
Es necesario asegurar que la prueba molecular se realice sobre el mismo segmento de
tejido donde se hace la inmunohistoquímica, para evitar confusiones en la interpretación
de los resultados.
489. Consideraciones éticas
 De acuerdo con los principios establecidos en Declaración de Helsinki, Reporte
Belmont, Pautas CIOMS y en la Resolución 008430 de Octubre 4 de 1993 del
Ministerio de Salud de la República de Colombia, y en cumplimiento con los
aspectos mencionados con el Artículo 6 de dicha Resolución, este estudio se
desarrolló conforme a los siguientes criterios:
 Esta investigación está considerada como “Investigación sin riesgo” de acuerdo al
Artículo 10 de la Resolución 008430/93, al emplear técnicas y métodos de
investigación documental retrospectivos y dado que no se realiza ninguna
intervención o modificación intencionada de las variables biológicas, fisiológicas,
sicológicas o sociales de los individuos que participan en el estudio.
 La investigación se llevó a cabo una vez se obtuvieron las respectivas
autorizaciones de la institución investigadora y de la institución donde se realizara
la investigación y la aprobación del proyecto por parte del Comité de Ética en
Investigación de la institución.
 El proyecto reconoce que las personas tienen derecho a la privacidad y al
anonimato. Se tomaron toda clase de precauciones para proteger la
confidencialidad de la información y la identidad de los participantes, realizando la
recolección y el análisis de datos dentro de la institución, sin uso de esta
información por fuera de la misma.
 La investigación se realizó de manera que reduzca al mínimo el posible daño al
medio ambiente.
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