Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano y artritis reumatoidea de inicio tardio
Autor: Coy Urrea, Vibian Angélica
Asesor: Caminos Pinzón, Jorge Eduardo (Thesis advisor)
Fecha: 2015
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Introducción: La artritis reumatoidea (AR) es la enfermedad autoinmune con compromiso articular más frecuente en la población (1). Los pacientes con un inicio temprano de la enfermedad (inicio antes de los 65 años) se comportan de una forma diferente a los pacientes con inicio tardío (después de los 65 años) (5). Las citoquinas se han convertido en importantes blancos terapéuticos y son candidatas para biomarcadores de diagnóstico, seguimiento y pronóstico (3). Objetivos: Caracterizar y comparar los perfiles de citoquinas entre los pacientes con ARI temprano y ARI tardío y correlacionar los hallazgos con el DAS28VSG, DAS28PCR, VSG, PCR, Anti CCP y FR. Metodología: Estudio de corte transversal. Población: se evaluaron dos grupos de pacientes con ARI temprano y ARI tardío del servicio de reumatología de la Universidad Nacional de Colombia. Criterios de Inclusión: pacientes mayores de 18 años con diagnóstico de AR evaluados clínica y serológicamente previo al inicio de terapia FARME con cuantificación de DAS28VSG, DAS28PCR, PCR, VSG, FR, Anti CCP, sin otra enfermedad autoinmune ni neoplasias. En quienes se cuantificaron niveles de IL1B, IL2, IL4, IL6, IL5, IL10, IL8, GM-CSF, INFg, TNFa mediante un ensayo de determinacion múltiple de proteínas en fase sólida, (Human Cytokine 10-Plex Panel, Invitrogen Rev. 2.0). La descripción de las variables continuas se realizo según el resultado del test de normalidad de Shapiro Wilk como media y desviación estándar o mediana y rango intercuartil para variables normales y no- normales respectivamente. Las variables categóricas fueron descritas como números absolutos y porcentajes. Se compararon los perfiles de citoquinas entre los grupos de ARI temprano y ARI tardío utilizando U Mann-Withney. Se establecio la correlación entre dos variables numéricas mediante el test de Pearson o Spearman. Resultados: en total ochenta pacientes fueron incluidos en el estudio, cuarenta y nueve pacientes de ARI tardío, y treinta y un pacientes de ARI temprano. Para los valores de DAS28VSG existe una diferencia estadisticamente significativa entre los 2 grupos. Por el contrario no existe diferencia significativa para DAS28PCR, PCR, títulos de Anti CCP ni títulos de FR. En la comparación entre las concentraciones de citoquinas de los 2 grupos, todas las citoquinas muestran una diferencia significativa. Al realizar la correlación entre cada citoquina y las variables de interés se encuentran pocas correlaciones significativas. Para ARI temprano: hay una correlacion alta negativa entre IL2 y PCR, negativa moderada entre IL6 y VSG. Para ARI tardío: correlación negativa moderada entre IL1B y DAS28PCR, positiva moderada entre IL10 y PCR; positiva moderada entre IL8 y títulos de FR y positiva alta entre TNFa y títulos de FR. En el análisis de los pacientes con tres factores de mal pronóstico se encontró: una correlación negativa moderada entre IL2 y DAS28PCR; negativa alta entre IL1B y DAS28VSG e IL1B y DAS28PCR. Positiva moderada entre IL5 y títulos de FR; positiva alta entre TNFa y PCR, positiva alta entre IL10 y TNFa con títulos de FR. Conclusión: La ARI temprano parece comportarse de forma diferente a la ARI tardío desde el punto de vista molecular. Parece importante continuar la caracterización de ciertas citoquinas sobre todo las de mayor positividad y correlación con otras variables tales como: IL1B, IL2, IL5, IL6, IL8, IL10 y TNFa.

Caracterización y comparación de los
perfiles de citoquinas entre pacientes
colombianos con artritis reumatoidea de
inicio temprano y artritis reumatoidea de
inicio tardío
Vibian Angélica Coy Urrea
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Medicina Interna, Servicio de Reumatología
Bogotá, Colombia
2015Caracterización y comparación de los
perfiles de citoquinas entre pacientes
colombianos con artritis reumatoidea de
inicio temprano y artritis reumatoidea de
inicio tardío
Vibian Angélica Coy Urrea
Trabajo de grado presentado como requisito parcial para optar al título de:
Especialista en Reumatología
Director (a):
Doctor Antonio Iglesias Gamarra
Codirector (a):
Doctor Jorge Caminos Pinzón
Doctora Diana Gil Calderón
Línea de Investigación:
Artritis Reumatoidea
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de medicina
Departamento de Medicina, Servicio de Reumatología
Bogotá, Colombia
2015A mis padres y hermanos, por su amor y comprensión
A mis amigos por su apoyo incondicional
“Empieza por hacer lo necesario, luego lo que te es posible y un día acabarás
haciendo... lo imposible “
San Francisco de AsísAgradecimientos
Agradecimientos al Dr. Antonio Iglesias Gamarra y Dr. Federico Rondón Herrera, por sus
observaciones, generosidad y apoyo para la elaboración de este trabajo.
Agradecimientos a mis compañeros de especialización actuales y previos por la
recolección de pacientes, mantenimiento de bases de datos y colaboración.
Agradecimientos al Dr. Jorge Caminos Pinzón y su equipo de trabajo, por su orientación,
toma, procesamiento y almacenamiento de muestras.
Agradecimientos a la Asociación Colombiana de Reumatología por los recursos para la
elaboración del trabajo.
Y especialmente agradecimientos a la Dra. Diana Gil Calderón por su gran apoyo en el
diseño y análisis estadístico.Resumen y Abstract IX
Resumen
Introducción: La artritis reumatoidea (AR) es la enfermedad autoinmune con
compromiso articular más frecuente en la población (1). Los pacientes con un inicio
temprano de la enfermedad (inicio antes de los 65 años) se comportan de una forma
diferente a los pacientes con inicio tardío (después de los 65 años) (5). Las citoquinas se
han convertido en importantes blancos terapéuticos y son candidatas para
biomarcadores de diagnóstico, seguimiento y pronóstico (3). Objetivos: Caracterizar y
comparar los perfiles de citoquinas entre los pacientes con ARI temprano y ARI tardío y
correlacionar los hallazgos con el DAS28VSG, DAS28PCR, VSG, PCR, Anti CCP y FR.
Metodología: Estudio de corte transversal. Población: se evaluaron dos grupos de
pacientes con ARI temprano y ARI tardío del servicio de reumatología de la Universidad
Nacional de Colombia. Criterios de Inclusión: pacientes mayores de 18 años con
diagnóstico de AR evaluados clínica y serológicamente previo al inicio de terapia FARME
con cuantificación de DAS28VSG, DAS28PCR, PCR, VSG, FR, Anti CCP, sin otra
enfermedad autoinmune ni neoplasias. En quienes se cuantificaron niveles de IL1B, IL2,
IL4, IL6, IL5, IL10, IL8, GM-CSF, INFg, TNFa mediante un ensayo de determinacion
múltiple de proteínas en fase sólida, (Human Cytokine 10-Plex Panel, Invitrogen Rev.
2.0). La descripción de las variables continuas se realizo según el resultado del test de
normalidad de Shapiro Wilk como media y desviación estándar o mediana y rango
intercuartil para variables normales y no- normales respectivamente. Las variables
categóricas fueron descritas como números absolutos y porcentajes. Se compararon los
perfiles de citoquinas entre los grupos de ARI temprano y ARI tardío utilizando U Mann-
Withney. Se establecio la correlación entre dos variables numéricas mediante el test de
Pearson o Spearman. Resultados: en total ochenta pacientes fueron incluidos en el
estudio, cuarenta y nueve pacientes de ARI tardío, y treinta y un pacientes de ARI
temprano. Para los valores de DAS28VSG existe una diferencia estadisticamente
significativa entre los 2 grupos. Por el contrario no existe diferencia significativa para
DAS28PCR, PCR, títulos de Anti CCP ni títulos de FR. En la comparación entre las
concentraciones de citoquinas de los 2 grupos, todas las citoquinas muestran unaX Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
diferencia significativa. Al realizar la correlación entre cada citoquina y las variables de
interés se encuentran pocas correlaciones significativas. Para ARI temprano: hay una
correlacion alta negativa entre IL2 y PCR, negativa moderada entre IL6 y VSG. Para ARI
tardío: correlación negativa moderada entre IL1B y DAS28PCR, positiva moderada entre
IL10 y PCR; positiva moderada entre IL8 y títulos de FR y positiva alta entre TNFa y
títulos de FR. En el análisis de los pacientes con tres factores de mal pronóstico se
encontró: una correlación negativa moderada entre IL2 y DAS28PCR; negativa alta entre
IL1B y DAS28VSG e IL1B y DAS28PCR. Positiva moderada entre IL5 y títulos de FR;
positiva alta entre TNFa y PCR, positiva alta entre IL10 y TNFa con títulos de FR.
Conclusión: La ARI temprano parece comportarse de forma diferente a la ARI tardío
desde el punto de vista molecular. Parece importante continuar la caracterización de
ciertas citoquinas sobre todo las de mayor positividad y correlación con otras variables
tales como: IL1B, IL2, IL5, IL6, IL8, IL10 y TNFa.
Palabras Clave: artritis reumatoide de inicio temprano, artritis reumatoide de inicio
tardío, citoquinas, biomarcadores.
Abstract
Backround: Rheumatoid Arthritis (RA) is the most comun autoinmune disease with articular
involvement (1). Patients with younger onset of the disease (onset before 65 years old)
behave differently than patients with elderly onset (older than 65 years old). Cytokines have
become important therapeutic targets, are candidates to become diagnosis, follow up and
prognosis biomarkers. Purpose: To characterize and compare cytokines´s profiles from
patients with younger-onset rheumatoid arthritis (YORA) versus patients with elderly-onset
rheumatoid arthritis (EORA). To correlate those findings with DAS28ESR, DAS28CRP, ESR,
CRP, CCP AB, RF. Methods: This is a cross-sectional study of two groups of patients with
YORA and EORA from the Rheumatology Service of the National University of Colombia.
We included patients older than 18 year old with RA, evaluated previos to the onset of
DMARDS. We collected DAS28ESR, DAS28CRP, ESR, CRP, RF, CCP AB data. Patientes
with other autoimmune diseases or malignansies were excluded. We measured leves of
IL1B, IL2, IL4, IL6, IL5, IL10, IL8, GM-CSF, INFg, TNFa with Human Cytokine 10-Resumen y Abstract XI
Plex Panel, Invitrogen Rev. 2.0. We described continuos variables according to the
normality result from the Shapiro Wilk´s test as mean and standard deviation for normal
variables and median and interquartil ranks for no–normal variables. Categorical
variables were described as absolute numbers or percentages. We compared cytokine´s
profiles between YORA and EORA groups using U Mann-Withney. The correlation
between two numerical variables was established through Pearson or Spearman´s test.
Results: eigthy patients were included; forty-nine in the YORA group and thirty-one in the
EORA group. The values of DAS28ESR showed a statistically significant difference
between the 2 groups. There were not statistically significant difference in the values of
DAS28PCR, ESR, PCR, CCP AB or RF. The comparison between leves of cytokins of
both groups show significant differences for all the cytokines evaluated. by correlating
each cytokine and the clinical variables we did not found much significant differences.
The significant differences for YORA were: a negative high correlation between IL2 and
CRP and a negative moderate correlation between IL6 and ESR. For EORA a negative
moderate correlation between IL1B and DAS28CRP, positive moderate between IL10
and CRP, positive moderate between IL8 and RF, and Positive high between THFa and
RF. In the worst prognosis group analysis we found a negative moderate correlation
between IL2 and DAS28CRP; a negative high correlation between IL1B y DAS28ESR
and IL1B and DAS28DRP; a positive moderate correlation between IL5 and RF, a
positive high correlation between TNFa and CRP and a positive high correlation
between IL10 and TNFa with RF.Conclusion: YORA seems to behave differently than
EORA from a molecular point o view. It seems important to continue characterizing some
cytokines, particularly those that showed more positivity and correllations: IL1B, IL2, IL5,
IL6, IL8, IL10 y TNFa.
Key Words: Younger-onset rheumatoid arthitis, elderly-onset rheumatoid arthritis,
cytokines, biomarkers.Contenido XIII
Contenido
Pág.
Resumen ..............................................................................................................................IX
XV
Lista de tablas ........................................................................................................................
Introducción……………………………………………………………………………………. 1
1. Planteamiento del problema y justificación científica ............................................. 3
2. Objetivos del trabajo e impacto esperado ................................................................ 5
2.1 Objetivo principal ......................................................................................................... 5
2.2 Objetivos secundarios ................................................................................................. 5
2.3 Resultados esperados ................................................................................................ 5
2.4 Impacto esperado ....................................................................................................... 6
3. Marco teórico ................................................................................................................ 7
3.1 Inmunopatogénesis y papel de las citoquinas............................................................ 7
3.2 Biomarcadores ............................................................................................................ 9
3.2.1 Auto anticuerpos ................................................................................................. 10
3.2.2 Reactantes de fase aguda .................................................................................. 10
3.2.3 Biomarcadores clínicos recientes ....................................................................... 11
3.2.4 Biomarcadores en investigación ......................................................................... 11
3.3 Predictores de pronóstico en AR .............................................................................. 12
3.3.1 Factores modificables ......................................................................................... 12
3.3.2. Factores no modificables .................................................................................. 13
4. Metodología ................................................................................................................. 15
4.1 Diseño ....................................................................................................................... 15
4.2 Población ................................................................................................................... 15
4.3 Tamaño de la muestra .............................................................................................. 15
4.4 Criterios de Inclusión................................................................................................. 15
4.5 Criterios de exclusión ................................................................................................ 16
4.6 Variables clínicas de medición ................................................................................. 16
4.7 Variables paraclínicas de medición .......................................................................... 16
4.8 Descripción de los pacientes y análisis .................................................................... 17
4.9 Análisis estadístico .................................................................................................... 18
4.10 Cronograma ............................................................................................................ 19
4.11 Costo y financiación ................................................................................................ 20
5. Resultados .................................................................................................................. 21XIV Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
6. Discusión ..................................................................................................................... 27
7. Limitaciones ................................................................................................................. 342
8. Conclusiones ................................................................................................................. 34
Bibliografía ......................................................................................................................... 35Contenido XV
Lista de tablas
Pág.
Tabla1: Cronograma 19
Tabla 2: Costos 20
Tabla 3: Características demográficas, clínicas y hallazgos de laboratorio de
las poblaciones de AR de inicio temprano versus AR de inicio tardío. 21
Tabla 4. Razón de prevalencias. 22
Tabla 5: Porcentajes de positividad y comparación de niveles de citoquinas
en AR de inicio temprano versus AR de inicio tardío. 23
Tabla 6: Coeficientes de correlación (r) y niveles de significancia (p) de la comparación
de las concetraciones de citoquinas versus las variables de 24
interes en AR de inicio Temprano.
Tabla 7: Coeficientes de correlación (r) y niveles de significancia (p) de la comparación
de las concetraciones de citoquinas versus las variables de interes en AR de inicio 25
Tardío.
Tabla 8: Correlaciones de los pacientes con tres criterios de mal pronóstico. 25Introducción
La artritis reumatoidea (AR) es la enfermedad autoinmune con compromiso articular más
frecuente en la población (1). Con un aumento en la morbilidad y mortalidad de los
pacientes que la padecen y una pérdida en la calidad de vida secundaria al deterioro
funcional (1).
Es la artropatía inflamatoria mejor conocida (2). En los últimos 50 años el diagnóstico y el
tratamiento han tenido grandes avances y se ha modificado el curso clínico de la
enfermedad (2,3).
En la actualidad existen diversos tipos de tratamientos, con diferentes blancos
moleculares y con mecanismos de acción no plenamente dilucidados (3). Pero ¿Cuáles
pacientes se benefician más de qué tipo de tratamiento?, es una pregunta sin clara
respuesta. Mediante la observación de los grupos afectados se han logrado identificar
algunos factores de mal pronóstico que sugieren un tratamiento más agresivo: el género
femenino, el epítope compartido, la presencia de auto anticuerpos, los títulos elevados de
los mismos, la presencia de erosiones, y la alta actividad de la enfermedad (4). La
observación clínica ha mostrado que los pacientes con un inicio temprano de la
enfermedad (inicio antes de los 65 años) se comportan de una forma diferente a los
pacientes con inicio tardío de la enfermedad (inicio después de los 65 años) (5), pero la o
las causas de estas diferencias aún son desconocidas (4, 5).
A pesar de los avances, sigue vigente la necesidad de una mejor caracterización de los
pacientes afectados, no solo desde el punto de vista genético, serológico y clínico, sino
también molecular. El mayor conocimiento de la biología molecular de la enfermedad
permite encontrar puntos clave en la cascada de desarrollo de la misma, susceptibles de
control o bloqueo. Estos puntos suelen ser citoquinas, receptores de citoquinas o
moléculas de superficie de membrana (3). Las citoquinas se han convertido en
importantes blancos terapéuticos, lo cual por diferentes vías permite controlar la2 Introducción
inflamación y el daño articular; al igual que son candidatas para el seguimiento y
clasificación (3). Se elevan en pacientes con presencia de genes asociados a
autoinmunidad de forma previa al inicio de los síntomas, varían con el desarrollo de la
enfermedad, y con los diferentes grados de actividad. Según su patrón pueden
relacionarse con otras variables genéticas, serológicas y clínicas (5,6,7,8,9).
En este sentido, se ha demostrado la elevación de citoquinas en pacientes con AR
comparados contra controles sanos antes, durante y después del inicio de la
enfermedad, y esta elevación parece ser distinta en AR de inicio tardío versus AR de
inicio temprano (5,6,7,8). Los estudios sugieren que existen diferentes patrones de
citoquinas sinoviales y plasmáticas que se relacionan con la actividad de la enfermedad,
la elevación de reactantes de fase aguda, la presencia de auto anticuerpos, la presencia
de erosiones y la posible respuesta a diferentes tratamientos (5,6,7,8).1. Planteamiento del problema y justificación
científica
La heterogeneidad en las manifestaciones de la AR podrían estar asociadas con la
respuesta heterogénea de citoquinas y esto podría explicar por qué todos los pacientes
no responden a los mismos tratamientos (12). Los estudios de evaluación de niveles de
citoquinas en pacientes con artritis indiferenciada, artritis reumatoide temprana, y artritis
establecida, han demostrado la elevación de las citoquinas en los pacientes versus los
controles sanos tanto en plasma como en tejido sinovial (5,6,7,8,9).
Se ha evidenciado la relevancia de la caracterización molecular de los pacientes con AR
al inicio del tratamiento para establecer su severidad, posible pronóstico y propuesta de
tratamiento (3). Los perfiles de citoquinas se podrían comportar como marcadores
biológicos de enfermedad, actividad, severidad, pronóstico y como blancos terapéuticos.
La discusión sobre si la AR de inicio tardío es una entidad diferente a la AR de inicio
temprano aún no tiene conclusión. No está claro cuál es el efecto de la edad, los
cambios hormonales o la inmunosenecencia (5).
Es por esto que es de utilidad conocer los perfiles de citoquinas presentes en los
pacientes colombianos, que permitan evidenciar si los hallazgos son similares con otras
poblaciones, si los niveles de citoquinas se correlacionan con otros marcadores de
severidad, actividad o pronóstico y si los perfiles de citoquinas muestran diferencias entre
los grupos de AR de inicio temprano (ARI temprano) y AR de inicio tardío (ARI tardío).2. Objetivos del trabajo e impacto esperado
2.1 Objetivo principal
Caracterizar y comparar los perfiles de citoquinas entre los pacientes con ARI temprano y
ARI tardío.
2.2 Objetivos secundarios
 Determinar si existe correlación entre los perfiles de citoquinas y la actividad de la
enfermedad medida con puntajes compuestos de actividad: Disease Activity Score 28
(DAS28) por Velocidad de sedimentación globular (VSG) y por proteína C reactiva
(PCR).
 Establecer si existe correlación entre los perfiles de citoquinas y la positividad de auto
anticuerpos: anticuerpos anti citrulinas (Anti CCP) y factor reumatoide cuantitativo
(FR).
 Establecer si existe correlación entre los perfiles de citoquinas y la elevación de
reactantes de fase aguda: VSG y PCR.
 Identificar si los perfiles de citoquinas de los pacientes con tres criterios de mal
pronóstico (títulos altos de auto-anticuerpos, género femenino y alta actividad de la
enfermedad medida por DAS28PCR o VSG) se correlacionan con el DAS28VSG,
DAS28PCR, PCR, VSG, títulos de Anti CCP o títulos de FR.
2.3 Resultados esperados
 Determinar los perfiles de citoquinas de los grupos de ARI temprano y ARI tardío.6 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
 Determinar si existen o no diferencias entre los perfiles de citoquinas de los grupos
de ARI temprano y ARI tardío.
 Determinar si hay correlación entre los perfiles de citoquinas de los pacientes con ARI
temprano, ARI tardío y pacientes de mal pronóstico, con las variables clínicas y
serológicas de interés.
2.4 Impacto esperado
Con el presente estudio se busca aumentar el poder de la evidencia clínica
disponible sobre la utilidad de los perfiles de citoquinas como marcadores
biológicos en la artritis reumatoidea. Conocer la caracterización molecular de los
pacientes colombianos estudiados. Buscar la asociación entre los perfiles de
citoquinas y la actividad de la enfermedad y factores pronósticos.
Profundizar en el conocimiento de los pacientes con artritis reumatoide de los
grupos mencionados, con el fin de mejorar el abordaje de los pacientes desde la
unidad de reumatología de la Universidad Nacional de Colombia. Aumentar la
experiencia investigativa de la unidad y de estudiantes de postgrado y pregrado
asociados a la misma. Fomentar la interacción entra la investigación de las áreas
básicas y clínicas. Realizar publicaciones o exposiciones nacionales e
internacionales que permitan migrar en alguna medida la línea del conocimiento
sobre el tema en mención.
Encontrar información sobre nuevos y mejores marcadores biológicos de:
diagnóstico pre clínico en pacientes en riesgo, diagnóstico clínico, actividad,
severidad y pronóstico.3. Marco teórico
La AR es una enfermedad crónica de etiología autoinmune que afecta aproximadamente
al 1% de la población mundial, produce destrucción articular, deformidad y compromiso
sistémico secundario a la inflamación (1,2,4). Actualmente se utilizan los criterios
clasificatorios de los grupos ACR/EULAR 2010 para definir los pacientes afectados por la
enfermedad (10). Los casos de “AR definida” se basan en la presencia confirmada de
sinovitis en al menos 1 articulación, no explicada por otra enfermedad, asociada a un
valor de 6 o más en un puntaje compuesto. Dicho puntaje está constituido por 4 dominios
que toman en cuenta: el número y ubicación de articulaciones inflamadas, el valor de
reactantes de fase aguda, las anormalidades serológicas (auto anticuerpos) y duración
de los síntomas (10).
Los auto anticuerpos relacionados con la enfermedad son los anticuerpos anti citrulinas
(Anti CCP) y el factor reumatoide (FR), estos auto anticuerpos no solo son determinantes
para el diagnóstico sino que adicionalmente están involucrados en la fisiopatología, al
igual que los reactantes de fase aguda velocidad de sedimentación globular (VSG) y
proteína C reactiva (PCR) (11).
Durante el desarrollo de la enfermedad el diagnóstico debe ser temprano ya que esto
puede determinar una mejor respuesta al tratamiento, incluso antes de completar los
criterios clasificatorios o el inicio de los síntomas (11).
3.1 Inmunopatogénesis y papel de las citoquinas
La AR se caracteriza porque en etapas tempranas de la enfermedad hay niveles
sinoviales altos de citoquinas pro inflamatorias responsables de la proliferación sinovial,
hiperplasia y angiogénesis (6,7). En la inmunopatogenesis inicial hay activación tisular
de macrófagos, linfocitos y neutrófilos, que aumentan su producción de citoquinas, lo8 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
cual perpetúa la inflamación y la formación de pannus, con posterior daño del hueso y
el cartílago articular (3,6,7). Al parecer la causa inicial de la inflamación sinovial se da
por la presentación de antígenos similares a los propios, por mimetismo molecular,
después de una agresión externa que modifica las proteínas normales o asociado a
infecciones (12).
Estos antígenos son presentados por las células presentadoras de antígeno a los
linfocitos T a través del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (CMH II). Las
moléculas del CMH están codificadas en el cromosoma 6. Estos genes presentan un
alto grado de polimorfismos; algunos de estos polimorfismos se han asociado
directamente con el desarrollo de AR como el DR4, que comparte un epítope en la
tercera región hipervariable de la cadena beta (epítope compartido) (9,12).
La presentación de antígenos a través del CMH clase II activa a las células T CD4.
Las células T CD4 activadas producen citoquinas para activar el sistema inmune
adaptativo y limpiar el desencadenante de la activación (12). Los patrones de
citoquinas secretadas dependen de la diferenciación de linfocitos T a patrones T
ayudadores (helper) Th1, Th2, Th9 y Th17 (12). La producción de IFNg por las células
Th1 potencia la respuesta celular y la diferenciación de células T CD4 a Th1. Sin
embargo la red de patrones T ayudadores es cada vez más compleja, y la red de
citoquinas secretadas por estos también. En la actualidad se reportan citoquinas
asociadas al patrón Th17 tales como IL32, IL33 e IL35 (13).
Las citoquinas son las primeras sospechosas del daño articular y la utilidad de los
inhibidores de citoquinas para prevenir la aparición de erosiones lo demuestra (13,3).
Las articulaciones tienen macrófagos residentes que secretan citoquinas del sistema
inmune innato y adaptativo. El reclutamiento de linfocitos T y B dentro de la articulación
requiere la secreción de citoquinas pro inflamatorias por parte de las células
presentadoras de antígeno y las células del endotelio sinovial.
Las articulaciones con compromiso por AR tienden a tener predilección por la
producción de interferón gamma (INFg) (14); el INFg potencia la producción de otrasMarco teórico 9
citoquinas locales como IL1, IL6 y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) (12). La IL6 es
una citoquina pro inflamatoria potente que regula la hematopoyesis y la proliferación de
linfocitos. Se ha sugerido que la AR es una enfermedad dependiente de IL17; la IL23,
una IL miembro de la familia de IL12, puede causar la diferenciación de células
vírgenes a células productoras de IL17. La IL17 también es una citoquina
proinflamatoria que actúa sobre varias células e induce la diferenciación de los
osteoclastos por la vía RANKL (15). La IL5 y la IL10 podrían prevenir la apoptosis de
linfocitos T y B, al igual que su función, perpetuando así la inflamación (14, 16).
Posteriormente por falta de control de la respuesta inicial, se produce daño articular,
deformidad y pérdida funcional.
3.2 Biomarcadores
También son denominados como marcadores biológicos, se refieren a una
característica medible que puede ser usada con un indicador de algún estado o
condición biológica. Este término se refiere también a la presencia de sustancias que
indican la existencia de un organismo vivo (11).
Los biomarcadores cumplen un papel importante en el diagnostico e intervención de
enfermedades en estadios tempranos. También pueden ayudar a reconocer la
respuesta a tratamientos. La exploración de estos indicadores no solo puede mejorar el
diagnóstico sino también pueden comportarse como indicadores de pronóstico y como
marcadores de respuesta a intervenciones. Un buen biomarcador es capaz de medir el
progreso de la enfermedad y la efectividad del tratamiento.
Estos parámetros pueden ser químicos físicos o biológicos.
Los biomarcadores usados actualmente para el diagnóstico de AR son principalmente
clínicos. En el momento hay diferentes biomacadores útiles como los auto
anticuerpos: FR, anti-factor perinuclear, anticuerpos anti keratina, anticuerpos anti
filagrina y anti CCP. La PCR y la VSG también están asociadas a la enfermedad.10 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
3.2.1 Auto anticuerpos
El FR es un anticuerpo contra la fracción FC de la IgG, es una característica clásica de
la enfermedad con una sensibilidad 60-80% (17), pero tienen una baja especificidad y
también puede ser detectado en otras enfermedades autoinmunes como en lupus
eritematoso sistémico y síndrome de Sjögren. Los marcadores patogénicos clave son
los FR Inmunoglobulina (Ig) M, e IgA (18).
Los autoanticuerpos inducidos por citrulinización, que se refiere a la conversión de la
peptidil-arginina a peptidil-citrulina, pueden ser medidos eficientemente usando
péptidos cíclicos citrulinados (CCP) como antígenos (19, 20). La detección de
anticuerpos Anti CCP como de FR, particularmente el anticuerpo IgA, tiene alto valor
predictivo positivo para el diagnóstico de AR (20, 21). Los Anti CCP son importantes
predictores de pérdida mineral ósea temprana (22).
Similar al FR, los anticuerpos contra proteínas citrulinadas (ACPA) tienen correlación
con la destrucción ósea, lo cual se asocia a erosiones de mayor tamaño al inducir
directamente la diferenciación de osteoclastos; esta pérdida ósea inicia antes del inicio
de la enfermedad en los pacientes con títulos positivos de ACPA. Por lo anterior este
biomarcador fue incluido en los criterios diagnósticos ACR/EULAR (10).
3.2.2 Reactantes de fase aguda
En el manejo clínico de la enfermedad, la PCR y la VSG son pruebas comunes para
guiar el diagnóstico independientemente de la medición de auto anticuerpos. La
Proteína C reactiva es una proteína que se eleva en respuesta a la inflamación. Niveles
elevados de PCR son detectados previos al inicio de AR (23) y también indican la
actividad de la enfermedad en el curso de la misma.
La velocidad de sedimentación globular (VSG) es una medida inespecífica de la
inflamación y puede ser útil no solo en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes
sino en la monitorización del proceso. Puede ser un indicador que refleja la actividad y
severidad de la sinovitis en AR. La combinación de VSG y PCR puede mejorar la
sensibilidad y especificidad para el diagnóstico de AR (24,25).Marco teórico 11
3.2.3 Biomarcadores clínicos recientes
Los niveles de calreticulina (CRT) están elevados y se detectan en pacientes con AR
comparados con los controles y tienen una correlación significativa con la actividad de la
enfermedad, por lo cual pueden ser un potencial biomarcador clínico (26).
Existe un sistema de anticuerpos que discrimina entre los antígenos que contienen
citrulina o homocitrulina. Los anticuerpos anti proteína carbamilada (anti-CarP) IgG e IgA
se encontraron en sueros de pacientes con AR (27). Estos anticuerpos también están
presentes en aproximadamente el 20% de los pacientes negativos para ACPA, y se han
asociado con una presentación más agresiva en cuanto al daño articular (27,28).
3.2.4 Biomarcadores en investigación
Adicionalmente a los biomarcadores clínicos usados, se han venido investigando
marcadores biológicos potenciales. Las citoquinas sirven como mensajeros moleculares
entre las células y hay diversos estudios que muestran que múltiples citoquinas se
involucran en la patogénesis de la AR desencadenando y regulando la respuesta
inflamatoria (29,30). La sobre expresión de ciertas citoquinas como IL1, IL6, IL8, IL17,
IL21, TNFa, GM-CSF, se han observado en pacientes con AR. Estas citoquinas pueden
promover la inflamación de la membrana sinovial y la resorción del osteocartílago a
través de la estimulación de mediadores osteoclásticos.(31-36).
La IL1 es producida por una variedad de células que son parte del sistema innato y
median la resorción ósea y la destrucción del cartílago. El eje IL1B- NFKB (factor nuclear
Kappa Beta) es central en la producción de mediadores proinflamatorios en el tejido
sinovial inflamado. La activación de NFKB por la IL1B induce la expresión de genes de
metaloproteinasas de matriz que son componentes que degradan el colágeno del
cartílago y hueso, lo que produce deformidad y dolor (11).
La IL6 tienen un efecto primordial en la diferenciación y activación de células B y T,
macrófagos, osteoclastos, condrocitos y células endoteliales, al igual que efectos en la
hematopoyesis (36). Los niveles de IL6 se han asociado significativamente con síntomas
clínicos y niveles de biomarcadores clínicos (11).12 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
El TNFa ha mostrado su papel en la patogénesis de la enfermedad en etapas tempranas,
es producido localmente por los macrófagos sinoviales y los linfocitos que infiltran el
tejido sinovial; se ha reconocido como la citoquina clave que dirige una de las vías de
daño tisular (11)
3.3 Predictores de pronóstico en AR
Los factores predictores de pronostico pueden ser no relacionados directamente con la
enfermedad y propios de la enfermedad. Los factores externos a la enfermedad que
influencian el pronóstico incluyen la edad, el género, los factores psicosociales, la
genética, los estilos de vida y el tabaquismo. Y los factores específicos de la enfermedad
como la positividad de auto anticuerpos. También se pueden dividir en factores
modificables y no modificables (4).
3.3.1 Factores modificables
Indicadores de actividad de la enfermedad: marcadores séricos de actividad de la
enfermedad como VSG y PCR; los indicadores clínicos como conteos de articulaciones
dolorosas e inflamadas y los índices compuestos de actividad que son predictores de
pobre pronóstico como el DAS28 (37).
La respuesta al tratamiento es un importante predictor de la evolución de la enfermedad,
en los pacientes que fallan al tratamiento con metotrexate en monoterapia o en
combinación, la respuesta a los siguientes tratamientos será un importante predictor de
desenlaces de la enfermedad.
El tabaquismo es un factor de riesgo conocido para AR, particularmente en la AR con
anticuerpos positivos, los fumadores con AR tienen peor pronóstico en términos de títulos
de FR, discapacidad física, daño radiológico, y respuesta al tratamiento. Es conocida la
interacción entre el tabaquismo, el CMH DR1 con epítope compartido y la producción de
ACPA y entre el tabaquismo, los ACPA, el CMH con epítope compartido y la muerte
prematura por enfermedad cardiovascular. (4)Marco teórico 13
3.3.2. Factores no modificables
La edad y el género: la mayor edad al inicio de los síntomas se asocia con peor
pronóstico. El género femenino se ha asociado con una pobre respuesta al tratamiento
mientras que el género masculino se ha asociado a una probabilidad más alta de
remisión (38).
Positividad para autoanticuerpos: los pacientes con anticuerpos negativos parecer
responder adecuadamente a la terapia con fármacos modificadores de la enfermedad
(FARMES) en monoterapia, mientras que los pacientes con ACPA positivos suelen
necesitar terapia combinada (39). Igualmente el FR se ha reportado como predictor de
pobre respuesta (40).
La presencia de erosiones evidentes en la radiografía al momento de la primera
evaluación es un marcador estable de pobre pronóstico (4).4. Metodología
4.1 Diseño
Estudio de corte transversal.
4.2 Población
Se estudiaron dos grupos de pacientes colombianos con ARI temprano (edad de inicio
menor a 65 años) y ARI tardío (edad de inicio mayor a 65 años).
4.3 Tamaño de la muestra
Todos los pacientes de la seroteca del servicio de reumatología de la Universidad
Nacional de Colombia, con muestras almacenadas a - 40° en el laboratorio de Biología
Molecular, que cumplieran los criterios de inclusión y exclusión.
4.4 Criterios de Inclusión
Pacientes mayores de 18 años con diagnóstico de artritis reumatoide según criterios ACR
1987 (41) antes del 2010 y según criterios EULAR- ACR después del 2010 (10),
clasificados como ARI temprano (edad de inicio menor de 65 años) o ARI tardío (edad de
inicio mayor de 65 años). Que hayan sido evaluados clínica y serológicamente previo al
inicio de fármacos modificadores de la enfermedad (FARMEs) sintéticos o biológicos.
Con cuantificación de: puntajes compuestos de actividad de la enfermedad DAS28PCR o
DAS28VSG, PCR, VSG, factor reumatoide cuantitativo y anticuerpos anti citrulinas.
Adicionalmente los pacientes fueron clasificados según la duración de su enfermedad, en
los siguientes sub grupos:
● AR muy temprana (duración de los síntomas menor a seis meses)
 AR temprana (duración de los síntomas menor a dos años)16 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
 AR establecida (duración de los síntomas mayor a dos años)
4.5 Criterios de exclusión
- Presencia de otra enfermedad autoinmune articular
- Presencia de enfermedad auto-inflamatoria o de neoplasia
4.6 Variables clínicas de medición
Género, edad de inicio de la enfermedad, duración de la enfermedad, DAS28 calculado por
PCR y por VSG.
El DAS28 (Disease activity score) es una escala compuesta de actividad que tiene en cuenta
cuatro factores. Es la más usada para evaluar la actividad de la AR en la clínica y en trabajos
de investigación. Es un instrumento práctico, fácil de aplicar y estandarizado, es una medida
de rango continuo, de tipo lineal y no requiere una medida previa. Hasta el momento esta
escala no ha sido validada en Colombia pero se encuentra recomendada para evaluar el
grado de actividad de la enfermedad por la American College of rheumatology (ACR), la
European League Against Rheumatism (EULAR) y la Asociación Colombiana de
Reumatología (42). Se determina a partir de una ecuación que tienen en cuenta 4 factores
de manera asimétrica: 1. El conteo de articulaciones dolorosas de 28 posibles: las diez
interfalángicas proximales de manos, las diez metacarpofalángicas, las dos muñecas, ambos
codos, hombros y rodillas; 2. El conteo de articulaciones inflamadas en las mismas 28
articulaciones señaladas; 3. La calificación por el paciente de la actividad de la enfermedad
en una escala del 0 al 100 y 4. Los valores de reactantes de fase aguda VSG en mm/hr o
PCR en mg/L. A través de una ecuación específica si se usa VSG o PCR, se establece un
puntaje que gradúa la actividad así: muy alta actividad > 5,1; actividad moderada < 5,1 y >
3,2; baja actividad 3,2 o < y remisión 2,6 o < (42).
4.7 Variables paraclínicas de medición
La VSG se determinó por el método de Westergren en mm/hr; los niveles de PCR se
determinaron por métodos de nefelometría o turbidimetría en mg/L. La positividad y
títulos de factor reumatoide cuantitativo (FR) se determinaron por turbidimetría oMetodología 17
nefelometría en UI/mL; los anticuerpos anti citrulinas cuantitativos (Anti CCP) se
determinaron por técnica de ELISA en UI/mL.
Los niveles de citoquinas se midieron de forma simultánea en placas con perlas de 5,6
micras de poliestireno que internamente se encuentran teñidas con fluoróforos rojos e
infrarrojos de diferentes intensidades. A cada perla se le da una ubicación específica en la
placa que permite la diferenciación de cada una de las perlas (2 perlas para cada paciente,
puesto que cada suero se corrió por duplicado). Las perlas con propiedades espectrales
definidas son conjugadas con anticuerpos que capturan proteínas específicas, y se
adicionan junto con las muestras ( que incluyen proteínas con concentraciones conocidas
para la calibración, las muestras control y las muestras a estudio) en pozos donde las
proteínas se unen a los anticuerpos de captura por 2 horas. Posteriormente se lava, y se
adicionan anticuerpos biotinilados específicos para la detección de proteínas y se incuba por
1 hora adicional. Durante esta incubación los anticuerpos se unen a las proteínas
apropiadamente inmovilizadas; después se remueve el exceso de estos últimos anticuerpos
y se adiciona estreptavidina conjugada con una proteína fluorescente llamada R-ficoeritrina
(RPE), se permite su incubación por 30 minutos más. La estreptavidina-RPE se une a los
anticuerpos biotinilados asociados a los complejos inmunes en las perlas, formando un
sándwich en fase sólida de 4 partes. Después de remover por lavado la estreptavidina-RPE
no unida, se analizan las perlas con el sistema de detección Luminex. Monitorizando las
propiedades espectrales de las perlas y la cantidad de fluorescencia asociada a la R-
ficoeritrina, se determina la concentración de: IL- 1 beta, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, CXCL8 (IL-8),
IL-10, factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos (GM-CSF), interferon-g
(IFNg), y factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) en pg/mL (Human Cytokine 10-Plex Panel,
Invitrogen Rev. 2.0, Canada).
4.8 Descripción de los pacientes y análisis
Se tomaron los sueros de pacientes del servicio de reumatología con ARI temprano y ARI
tardío que cumplían los criterios de inclusión y no tenían criterios de exclusión. Estos
sueros venían siendo recolectados para protocolos previos del servicio desde el 2005
hasta el 2013. Los pacientes suministraron su consentimiento en el momento de la toma
de muestras; este consentimiento considero la toma, almacenamiento y estudio de
muestras en proyectos de investigación del servicio de reumatología de la Universidad18 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
Nacional, que tuvieran el propósito de profundizar en el conocimiento de la enfermedad
por la cual estaban afectados. Por lo tanto como tal este estudio no diligencio ningún
consentimiento informado adicional. La categoría de riesgo para el presente estudio se
consideró mínimo: examen físico de diagnóstico, extracción de sangre por punción
venosa única de aproximadamente 20 cc de sangre.
En total treinta y cinco pacientes de ARI temprano y setenta y un pacientes de ARI tardío
cumplían criterios de inclusión según las bases de datos. Solo treinta y un pacientes en el
grupo de ARI temprano (veinticinco mujeres y seis hombres) y cuarenta y nueve
pacientes en el grupo de ARI tardío (veintinueve mujeres y veinte hombres) tenían
suficiente cantidad de suero almacenado (sueros utilizados para estudios previos).
Se extrajo la información de interés de las bases de datos del servicio sin el uso de un
formato de extracción particular. Los datos recopilados de los pacientes incluidos fueron:
edad, género, edad de inicio de síntomas, tiempo de duración de la enfermedad, datos
de DAS28 por VSG y PCR, VSG, PCR, FR y Anti CCP. A partir de esta información se
construyo una nueva base de datos para el análisis estadístico.
La información de las bases de datos iniciales fué recopilada de las historias clínicas por
los reumatologos y residentes del servicio durante las consultas iniciales de pacientes
referidos para evaluación reumatológica.
En los sueros disponibles de los pacientes incluidos se procedió a realizar el ensayo de
detreminación de citoquinas.
4.9 Análisis estadístico
La descripción de las variables continuas se realizo según el resultado del test de
normalidad de Shapiro Wilk como media y desviación estándar o mediana y rango
intercuartil para variables normales y no- normales respectivamente. Las variables
categóricas fueron descritas como números absolutos y porcentajes.Metodología 19
Se compararon los perfiles de citoquinas entre los grupos de ARI temprano y ARI tardío
utilizando el t de student para muestras independientes si tenían distribución normal o U
Mann-Withney si tenían distribución no-normal.
Se estableció la correlación entre dos variables numéricas mediante el test de Pearson o
Spearman.
Con los niveles de citoquinas se estableció el porcentaje de pacientes con niveles
detectables en suero para cada citoquina en cada población, en el grupo con positividad
para cada citoquina se estableció la mediana de las concentraciones. Se compararon las
medianas de las concetraciones entre la población de ARI temprano versus la población
de ARI tardío. En cada grupo se evaluó la correlación de cada citoquina con el
DAS28VSG, DAS28PCR, VSG, PCR, títulos de Anti CCP y títulos de FR.
Se estableció un subgrupo de mal pronóstico conformado por los pacientes de género
femenino, con alta actividad de la enfermedad y títulos altos de auto anticuerpos (mas de
tres veces el valor de referencia). En este grupo se estableció la correlación de las
citoquinas con las variables de interés: DAS28VSG, DAS28PCR, VSG, PCR, títulos de
Anti CCP y títulos de FR.
4.10 Cronograma
Tabla 1. Cronograma de actividades.
ACTIVIDAD MARCO DE TIEMPO
Revisión de la literatura, problema y 4 meses
pregunta de investigación
Diseño y presentación de protocolo de 5 meses
investigación y recolección de fondos
Recolección de pacientes y datos, 4 meses
Análisis de laboratorio
Análisis Estadístico 2 meses
Documento Final 2 meses20 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
4.11 Costo y financiación
Se presentó el protocolo a las convocatorias de la Asociación Colombiana de
Reumatología y convocatoria Hermes de la Universidad Nacional de Colombia para
estudiantes de postgrado, se ganó el apoyo de la Asociación Colombiana de
Reumatología por valor de 12.000.000
Tabla 2. Costos.
ACTIVIDAD CANTIDAD COSTO EN
PESOS
Kit para cuantificación de citoquinas 2 12.000.000
Honorarios bacterióloga y análisis de 48 horas 2.000.000
laboratorio
Honorarios de especialista 10 horas 600.000
epidemiología y estadística médica
Fotocopias de consentimiento 1000 copias 100.000
informado, remisión de muestras y 1000 hojas
papelería
Transporte de muestras al laboratorio Garantía de cadena de frío, 200.000
transporte urbano
Insumos de laboratorio (Tubos, 200 tubos de ensayo, 200 400.000
Agujas, Venojets) venojets
TOTAL $15.300.0005. Resultados
En total ochenta pacientes fueron incluidos en el estudio, cuarenta y nueve pacientes de
ARI tardío, y treinta y un pacientes de ARI temprano; las características demográficas,
clínicas y hallazgos de laboratorio se muestran en la Tabla 3.
Tabla 3. Características demográficas, clínicas y hallazgos de laboratorio de las
poblaciones de AR de inicio temprano versus AR de inicio tardio.
ARI(cid:9)Temprano ARI(cid:9)Tardío p
Edad(cid:9)de(cid:9)Inicio 43,7(cid:9)(14,3) 70,1(cid:9)(4,1)
Género(cid:9)femenino 80,60% 59,10%
DAS28VSG 6,7(cid:9)(4,8-7,2) 5,43(cid:9)(1,66-6,5) 0,07
DAS28PCR 5,8(cid:9)(0,0-6,8) 5,72(cid:9)(4,5-6,4) 0,92
VSG 24(cid:9)(13(cid:9)-(cid:9)18) 20(cid:9)(6(cid:9)-(cid:9)37) 0,32
PCR 0,8(cid:9)(0,4(cid:9)-(cid:9)1,2) 1,2(cid:9)(0,25(cid:9)-(cid:9)4,8) 0,108
Anti(cid:9)CCP(cid:9)valor 69,5(cid:9)(15,1(cid:9)-(cid:9)165,2) 122(cid:9)(8,5(cid:9)-(cid:9)172,7) 0,55
Anti(cid:9)CCP(cid:9)porcentaje 51,60% 61,20%
Anti(cid:9)CCP(cid:9)Titulos(cid:9)Altos(cid:9) 54,80% 59,10%
FR 40(cid:9)(10(cid:9)-(cid:9)75) 23(cid:9)(9(cid:9)-(cid:9)145,5) 0,97
FR(cid:9)porcentaje(cid:9) 51,60% 48,90%
FR(cid:9)Titulos(cid:9)Altos 41,90% 44,80%
Duración(cid:9)de(cid:9)la(cid:9)Enfermedad
<(cid:9)6(cid:9)meses 12,9% 22,4%
<(cid:9)2(cid:9)años(cid:9) 54,8% 40,8%
>(cid:9)2(cid:9)años 32,2% 36,7%
Alta(cid:9)Actividad 64,5% 69,3%
Se observa como las edades de inicio son más homogéneas en el grupo de AR de inicio
tardío; el porcentaje de la población femenina es mayor en el grupo de AR de inicio
temprano. La mediana de la actividad de la enfermedad en ambos grupos se encontraba22 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
clasificada como alta actividad de la enfermedad (alta actividad= valor del DAS28 mayor
a 5,1); pero para los valores de DAS28VSG existe una diferencia estadisticamente
significativa, aunque los dos valores como tál se encuentran en la clasificación de alta
actividad. Sin embargo los rangos entre los dos grupos se sobreponen, siendo más
amplio en el grupo de ARI tardío y va desde remisión hasta alta actividad mientras que
en el grupo de ARI temprano los rangos son más estrechos y se encuentran los valores
entre actividad moderada y alta actividad. Esta diferencia se presenta a pesar de que el
valor como tál de VSG no muestra diferencias signifcativas entre los dos grupos.
No se encontraron diferencias significativas para DAS28PCR, PCR, títulos de Anti CCP
ni títulos de FR. Los porcentajes de titulos altos de FR y AntiCCP y porcentajes de
positividad de FR y AntiCCP fueron similares en los dos grupos. Aproximadamente dos
tercios de los pacientes en ambos grupos tenían una artritis reumatoide no establecida,
es decir, que la mayoria de los pacientes en ambos grupos tenían una evolución menor a
2 años.
Al realizar el análisis de la razón de prevalencias (RP) no encontramos hallazgos
estadísticamente significativos (Tabla 4.). No se hizo corrección para el nivel de
significancia en relación con la múltiples comparaciones dado que ninguna de las RP fue
significativa.
Tabla 4. Razón de prevalencias.
Característica RP IC(cid:9)95%
Género(cid:9)Femenino 0,73 0,54(cid:9)-(cid:9)0,98
Positividad(cid:9)Anti(cid:9)CCP 1,18 0,78(cid:9)-(cid:9)1,78
Titulos(cid:9)altos(cid:9)Anti(cid:9)CCP 1,07 0,72(cid:9)-(cid:9)1.60
Positividad(cid:9)FR 0,94 0,60(cid:9)-(cid:9)1,48
Titulos(cid:9)altos(cid:9)FR 1,06 0,63(cid:9)-(cid:9)1,79
Alta(cid:9)actividad 1,07 0,78(cid:9)-(cid:9)1,48
Duración(cid:9)de(cid:9)6(cid:9)meses 1,73 0,60(cid:9)-(cid:9)4,98Resultados 23
En la comparación entre las concentraciones de citoquinas de los dos grupos, todas las
citoquinas muestran una diferencia significativa (Tabla 5). Adicionalmente se observa que
los porcentajes de positividad para cada citoquina son muy distintos en cada grupo.
Tabla 5. Porcentajes de positividad y comparación de niveles de citoquinas en AR de
inicio temprano versus AR de inicio tardío.
Porcentaje de
Citoquinas positividad Pg/mL P
IL-8 0,018
ARI Tem 29 22,0 (10-32)
ARI Tardío 38.7 41,0 (14,5-66)
IL-6 0,015
ARI Tem 58 25,0 (3-53,2)
ARI Tardío 36.7 32,0 (16- 108,5)
IL-5 0,005
ARI Tem 29 32,0 (11-102,5)
ARI Tardío 36.7 20,5 (15-30)
IL-4 < 0.0001
ARI Tem 32,2 28,6 (11,8-36,2)
ARI Tardío 30.6 12,0 (8,5-23)
IL-2 0,0384
ARI Tem 38,7 32,5 (10,2-65,7)
ARI Tardío 40.8 62,5 (40,9-90)
IL-10 0,0225
ARI Tem 25,8 22,0 (18,5-28,2)
ARI Tardío 36,7 41,5 (21,2 - 69,5)
IL-1B 0,0187
ARI Tem 29 47,0 (26,5-180)
ARI Tardío 48,9 47,5 (22,2-209,2)
INF Gamma 0,0022
ARI Tem 16,1 52,0 (33-102)
ARI Tardío 32,6 42,5 (29,2-56,7)
GM-CSF 0,0054
ARI Tem 22,5 17,0 (13,5 - 35)
ARI Tardío 30,6 30,0 (13,6-66)
TNFa 0,0069
ARI Tem 25,8 26,0 (10,7-32)
ARI Tardío 32,6 42,5 (18,5-109,6)
Al realizar la correlación entre cada citoquina y las variables de interés (Tablas 6 y 7) se
encuentran pocas correlaciones significativas. Para el grupo de AR de inicio temprano se24 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
observa una correlación alta inversamente proporcional entre la IL 2 y los valores de PCR
y una correlación igualmente negativa pero moderada entre la IL6 y los valores de VSG.
Para el grupo de AR de inicio tardío se muestra una correlación inversamente
proporcional moderada entre la IL1B y el DAS28PCR, una correlacion positiva moderada
entre IL10 y PCR e IL8 y títulos de FR; y una correlación positiva alta entre TNFa y
títulos de FR.
Tabla 6. Coeficientes de correlación (r) y niveles de significancia (p) de la comparación
de las concetraciones de citoquinas versus las variables de interes en AR de inicio
Temprano.
IL8 IL6 IL5 IL4 IL2 IL10 IL1B IFN-g GM-CSF TNFa
DAS28VSG r -0,37608 0,019843 0,442589 -0,17793 -0,42329 -0,01198 -0,03405 0,7 0,566139 -0,54325
p 0,3125 0,937708 0,229817 0,632142 0,170347 0,977547 0,93071 0,18812 0,185199 0,164067
DAS28PCR r -0,17095 0,106312 0,442589 0,118808 -0,16552 -0,02395 -0,2308 0,6 0,377426 -0,17095
p 0,64364 0,717557 0,229817 0,733007 0,633662 0,976786 0,551709 0,35 0,395635 0,64364
PCR r 0,237288 -0,51217 0,063292 0,116937 -0,70481 -0,3012 -0,24268 -0,6 0,412861 0,237288
p 0,551709 0,061151 0,880093 0,758931 0,015435 0,46847 0,529241 0,284757 0,35728 0,538712
VSG r 0,153852 -0,59043 0,309626 -0,60791 -0,60281 -0,59036 0,12605 0,1 0,327327 0,153852
p 0,708069 0,026219 0,410081 0,066735 0,051913 0,132292 0,743541 0,95 0,497619 0,708069
TITANTICCP r -0,08404 -0,18302 -0,02521 -0,01824 -0,01367 -0,32336 -0,47699 -0,3 0,145479 -0,08404
p 0,843182 0,531128 0,948391 0,97296 0,967308 0,427877 0,1938 0,683333 0,78254 0,843182
TITFR r 0,215192 -0,5072 0,519191 -0,01841 -0,13532 -0,10779 -0,12605 -0,1 -0,05661 0,215192
p 0,580941 0,064141 0,1618 0,97296 0,693713 0,793006 0,743541 0,95 0,906349 0,580941Resultados 25
Tabla 7. Coeficientes de correlación (r) y niveles de significancia (p) de la comparación de
las concetraciones de citoquinas versus las variables de interes en AR de inicio Tardío.
IL8 IL6 IL5 IL4 IL2 IL10 IL1B IFN-g GM-CSF TNFa
DAS28VSG r -0,02495 0,181914 0,39234 -0,04964 -0,2411 0,097757 -0,36308 0,14927 -0,33666 -0,08272
p 0,919252 0,470019 0,10731 0,860542 0,305835 0,699572 0,081184 0,581117 0,219837 0,760706
DAS28PCR r -0,00877 0,132437 0,411186 -0,08684 -0,13097 0,168215 -0,54284 0,185294 -0,16726 -0,38025
p 0,971569 0,600375 0,090035 0,758286 0,582044 0,504633 0,006126 0,492057 0,551289 0,146261
PCR r 0,199473 -0,04865 -0,03473 0,141704 -0,34915 0,5323 -0,20445 -0,01628 0,222023 -0,21076
p 0,41294 0,847965 0,891172 0,61443 0,131332 0,022964 0,337918 0,952269 0,426442 0,433326
VSG r 0,067319 -0,18257 0,287637 0,141959 -0,38171 0,228616 -0,12212 0,020898 -0,16351 -0,06494
p 0,784217 0,468384 0,247111 0,613786 0,096769 0,361521 0,569736 0,938768 0,560375 0,811139
TITANTICCP r 0,354386 0,185109 -0,04863 0,058192 -0,20316 0,331269 0,103936 -0,25294 -0,084 -0,20619
p 0,136573 0,462119 0,848042 0,836794 0,390302 0,179322 0,628876 0,344563 0,765974 0,443599
TITFR r 0,544337 0,140714 0,474911 -0,32587 0,021829 0,708312 -0,18281 -0,17059 0,200358 -0,48301
p 0,015972 0,57758 0,046417 0,235894 0,927217 0,001003 0,392551 0,52761 0,474008 0,058064
En el análisis de los pacientes con los tres factores de mal pronóstico (Tabla 8.) hay una
correlación estadisticamente significativa entre una cantidad un poco mayor de
citoquinas; inversamente proporcional moderada entre los valores de IL2 y el
DAS28PCR; inversamente proporcional alta entre IL1B y DAS28VSG e IL1B y
DAS28PCR. Una correlación positiva moderada entre IL5 y títulos de FR; positiva alta
entre TNFa y el valor de PCR, positiva alta entre IL10 y TNFa con títulos de FR.
Tabla 8. Correlaciones de los pacientes con 3 Criterios de mal pronóstico.
IL8 IL6 IL5 IL4 IL2 IL10 IL1B IFG GMC-CF TNFA
DAS28VSG r -0,4924 -0,3022 0,433333 -0,57143 -0,46119 0,19247 -0,75 1 -0,51498 -0,35714
p 0,077411 0,157804 0,124959 0,1 0,077288 0,306702 0,033135 0,166667 0,098314 0,222222
DAS28PCR r -0,30395 -0,20879 0,566667 0 -0,52055 0,45 -0,89286 0,5 -0,54762 0,198206
p 0,193453 0,246811 0,060287 0,518254 0,050155 0,114909 0,006151 0,5 0,085491 0,330754
PCR r 0,121581 -0,23416 0,083333 0,234244 -0,21739 0,53557 -0,46429 0,5 0,071429 0,810844
p 0,366504 0,220647 0,421591 0,297421 0,260389 0,073763 0,151191 0,5 0,440997 0,017063
VSG r -0,20122 -0,34986 0,416667 -0,42857 -0,28375 0,235302 -0,32143 1 -0,57836 -0,25226
p 0,291829 0,120629 0,134791 0,176786 0,201175 0,275854 0,24881 0,166667 0,066146 0,297421
TITANTICCP r 0,224242 -0,17033 -0,23333 0,142857 -0,00456 0,416667 0,321429 0,5 -0,54762 0,214286
p 0,26833 0,288988 0,275854 0,39127 0,494733 0,134791 0,24881 0,5 0,085491 0,330754
TITFR r 0,624242 0,225275 0,6 -0,10714 0,132119 0,766667 0 1 -0,02381 0,892857
p 0,030158 0,229653 0,048399 0,419841 0,346856 0,010695 0,518254 0,166667 0,488393 0,0061516. Discusión
En estudios de cohorte basados en poblaciones se ha observado como el porcentaje de
mujeres afectadas por AR es mayor que el porcentaje de hombres, usualmente con una
relación de 3:1 (8). Dicha observación se reproduce en este estudio principalmente en la
población de Artritis reumatoidea de inicio temprano. Sin embargo parece que esa
proporción se disminuye en la ARI tardío; aumentando el porcentaje de hombres
afectados en dicho grupo, con una distribución más equitativa y una relación cercana a
1:1; este hallazgo se ha encontrado previamente en otros estudios (43,44) y aunque no
es clara su causa puede estar asociado a los cambios hormonales y a que es posible que
las anormalidades genéticas que llevan a la presentación de la enfermedad en edades
tardías sean diferentes de la anormalidades conocidas para la ARI temprano (HLA,
epítope compartido o PTPN22).
Aunque se usaron dos criterios diferentes para el diagnóstico de AR, dependiente del año
en el cual fue ingresado el paciente, los criterios ACR/EULAR 2010 han demostrado
clasificar los mísmos pacientes que los criterios ACR 1987, solo que 5 años antes, la
incidencia basal es mayor con los criterios ACR/EULAR 2010, pero 5 años después se
equiparan, es decir, se diagnostican los mísmos pacientes pero de forma temprana (45)
por lo cual no consideramos necesario realizar un analisis estratificado considerando este
factor.
La población de ARI tardío no ha sido hasta el momento ampliamente estudiada; la
mayoría de estudios en AR incluyen pacientes con edades de inicio de la enfermedad
inferiores a 60 años y por lo general no se hace análisis por subgrupos. En dos estudios
cuyo objetivo fue describir la población de ARI tardío, se observó como estos pacientes
mostraban una menor positividad de FR, sin embargo estos estudios fueron realizados
antes del año 2000 y es probable que la sensibilidad y la especificidad de las pruebas se
haya modificado por evolución en las técnicas de detección (43,44). En otro estudio más28 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
reciente se mantiene esta tendencia de menor positividad de FR en la población de ARI
tardío con respecto a los pacientes con ARI temprano, siendo 74,4% versus 88,2 % de
positividad para ARI tardío y ARI temprano respectivamente, en ese estudio la técnica
utilizada fue nefelometria en todos los pacientes (5). Sin embargo estos dos valores se
encuentran dentro de los rangos usuales de positividad para el FR no discriminados por
edad de inicio. En el presente trabajo no encontramos diferencias significativas con
respecto a: títulos de auto anticuerpos (FR y Anti CCP), porcentajes de positividad de los
mísmos o presencia de titulos altos; es importante resaltar que los ensayos de detección
de autoanticuerpos en nuestro trabajo no fueron realizados en los mísmos laboratorios ni
exactamente en el mismo tiempo de evolución de la enfermedad, y se ha observado que
en cuanto se cronifica la enfermedad es más probable positivizar los autoanticuerpos.
Dada la heterogeneidad en estos aspectos no es posible concluir que la detección de
autoanticuerpos en ambas poblaciones sea igual, pero al menos en esta primera
aproximación parecen similares.
Al igual que en otros ensayos, no hubo diferencias significativas en los valores de PCR,
lo cual habla de su estabilidad para la cuantificación de la inflamación,
independientemente de la edad, ya que el elemento de actividad de la enfermedad (que
habla del grado de inflamación) era similar en ambos grupos y la mayoría de los
pacientes en las dos poblaciones presentaban alta actividad de la enfermedad
cuantificada por cualquiera de los métodos de DAS28.
Los resultados fueron más homogéneos para DAS28PCR en el grupo de ARI tardío, con
un rango de clasificación entre moderada y alta, pero cuando la actividad de la
enfermedad es medida con DAS28 con VSG hay diferencias significativas entre los dos
grupos, aunque no hay diferencias en el valor de VSG como tal. Los rangos de
DAS28VSG en ambos grupos se sobreponen, y ambos quedan clasificados en alta
actividad de la enfermedad, lo cual no daría a esta diferencia mayor relevancia clinica,
pero los datos para DAS28VSG en el grupo de ARI tardío son más heterogéneos y van
desde remisión hasta alta actividad; mientras que en ARI temprano se encuentran más
homogéneos y están entre actividad moderada y alta. Esto puede deberse a que en el
cálculo del DAS28 se le da un peso logarítmico al valor de VSG, y este suele ser muyDiscusión 29
variable en pacientes mayores de 65 años; lo cual sugeriría que la evaluación de
actividad de la enfermedad por DAS28PCR es más estable en el grupo de ARI tardío.
Con respecto a los valores y patrones de positividad de las citoquinas, se evidencia
claramente que los dos grupos son diferentes molecularmente a pesar de que su única
diferencia clínica importante sea la edad de presentación. Este hallazgo daría soporte a
la hipótesis de que la edad de presentación podría significar una diferencia en la
inmunopatogenesis de las dos presentaciones, y posible y consecuentemente tambíen
una diferencia en su pronóstico y tratamiento.
Las concetraciones de citoquinas muestran una gran heterogenidad en sus valores, no
todos los pacientes tienen positividad para cada citoquina y los porcentajes de positividad
son muy variables. En ARI temprano van desde 16,1% para INFg hasta 58% para IL6,
siendo esta última la más frecuentemente elevada. En el grupo de ARI tardío las
citoquinas menos frecuentes son GM-CSF e IL4, con un porcentaje de positividad de
30,6 % y la más frecuente es la IL1B con 48,9 %. En otros estudios se ha evidenciado
como las citoquinas más elevadas en la fase preclínica y que diferencian al grupo de
pacientes en fase preclínica de los controles sanos son la IL4, IL12, IFNg e IL10 (8); por
lo cual y dado que los pacientes en nuestro trabajo ya se encontraban en la fase clínica y
activa de la enfermedad, no sorprende que estas citoquinas no sean las más
frecuentemente elevadas.
El hallazgo de la IL6 como la IL más frecuente en la población de ARI temprano, es
similar al de otros estudios. La IL6 fue la segunda citoquina más frecuentemente elevada
en el grupo de ARI tardío y es la justificación que se ha propuesto para los intensos
síntomas costitucionales asociados a la AR en pacientes mayores (5). El bajo porcentaje
de positividad para la mayoría de los pacientes, y en la mayoria de citoquinas, contrasta
con los hallazgos encontrados en otros estudios que reportan que la gran mayoria de
citoquinas son positivas en todos los pacientes. Sin embargo en todos los estudios
realizados hasta el momento existe una gran variabilidad en las concentraciones de cada
citoquina independientemente del ensayo usado para su medición y por lo general son
medidas en fases preclínicas o muy iniciales de la enfermedad, incluso cuando la artritis
aún es indiferenciada (5,6,8,12). Esto habla de una gran variabilidad biológica de las
citoquinas, dependiente al parecer de la fase de la enfermedad, la edad de presentación,
el grado de actividad y probablemente el tratamiento; factores por establecer y que30 Caracterización y comparación de los perfiles de citoquinas
entre pacientes colombianos con artritis reumatoidea de inicio temprano
y artritis reumatoidea de inicio tardío
requerirán en futuros estudios un tamaño de muestra mayor, cálculado con base en los
porcentajes de positividad para cada citoquina de interes. Este estudio muestra los
porcentajes de positividad de cada citoquina en cada uno de los grupos.
Al evaluar las correlaciones entre las citoquinas y las variables de interés encontramos
pocas correlaciones estadísticamente significativas, aunque es importante recalcar que
por las características de diseño del estudio y el tamaño de la muestra es difícil
establecer relaciones de causalidad. Llama la atención la correlación inversamente
proporcional entre la IL2 y PCR e IL6 y VSG en el grupo de ARI temprano, ya que siendo
estas citoquinas de activación, no parece lógico que se relacionen negativamente con los
reactantes de fase aguda, sin embargo este hallazgo se ha encontrado en otros estudios,
donde el perfil de citoquinas no se relaciona directamente con los marcadores clásicos de
inflamación tales como: conteos articulares o reactantes de fase aguda; al parecer las
citoquinas como tal, según la fase de la enfermedad en la que sean medidas muestran
perfiles independientes que se relacionan más con el tiempo de evolución de la
enfermedad, la positividad de autoanticuerpos y la presencia o no de erosiones (6). Por lo
anterior no sorprende encontrar una relación inversamente proporcional entre IL1B y
DAS28PCR para la ARI tardío. Sin embargo el hecho de que la IL1B sea la IL más
frecuente en el grupo de ARI tardío, si puede hablar de peor pronóstico dado que esta IL
se ha encontrado en otros estudios asociada a la presencia de erosiones (8). Además es
una citoquina inducida en las fases activas de la enfermedad, producida por macrófagos
locales y células de órganos linfoides periféricos (8). Igualmente aunque se esperaría una
alta positividad para TNFa, su expresión en sangre periférica no es tan abundante
(porcentajes de positividad de 25,8% en el grupo de ARI temprano y 32,6% en ARI
tardío); en los pacientes con AR clínicamente activa los niveles bajos de TNFa se han
asociado con sinovitis difusa (6).
Con respecto a la correlación positiva encontrada entre IL10 y PCR e IL-8 y TNFa con
títulos de FR, estos hallazgos son similares ha lo reportado en estudios previos y se
podrían relacionar indirectamente con pronóstico.
Al evaluar los pacientes de peor pronóstico se observa una relación negativa entre IL2 Y
DAS28VSG, IL1B y DAS28VSG e IL1B y DAS28PCR, estos datos a simple vista podríanDiscusión 31
parecer difíciles de interpretar pero tienen relación con los hallazgos de un estudio previo
que mostraba tres grupos con fenotipos severos de inflamación, en donde los títulos
bajos de IL2 se encontraban entre las citoquinas con relación inversamente proporcional
a la severidad y donde en la AR activa la IL1B se comporta casi como un marcador
independiente de actividad (6). En el presente trabajo se encontró una correlación
directamente proporcional entre IL5 y FR, IL10 y FR y TNFa con FR y PCR; estos valores
son acordes con los presentados en otras poblaciones y sugieren relaciones positivas
entre estas citoquinas y la positividad de autoanticuerpos que es un factor establecido de
mal pronóstico; sobre todo la presencia de IL4, IL5 e IL10, se ha relacionado
positivamente con la activación y producción de anticuerpos por los linfocitos B (6,8).7. Limitaciones
A final del documento es opcional incluir índices o glosarios. Éstos son listas detalladas y
especializadas de los términos, nombres, autores, temas, etc., que aparecen en el
trabajo. Sirven para facilitar su localización en el texto. Los índices pueden ser
alfabéticos, cronológicos, numéricos, analíticos, entre otros. Luego de cada palabra,
término, etc., se pone coma y el número de la página donde aparece esta información.8. Conclusiones
La ARI temprano parece comportarse de forma diferente a la ARI tardío desde el punto
de vista molecular. La mayor incidencia de la enfermedad en el género femenino se
pierde con la edad. Parece que la PCR es un valor que se afecta en menor proporción
por la edad y puede comportarse como una mejor herramienta para evaluar la actividad
de la enfermedad en su presentación tardía. Se observa una similitud de la positividad de
los autoanticuerpos, tanto Anti CCP como FR, para los dos grupos, lo cual refuerza su
valor como herramienta diagnóstica y pronóstica en la AR en general.
Parece importante continuar la caracterización de ciertas citoquinas sobre todo las de
mayor positividad y correlación con otras variables tales como: IL1B, IL2, IL5, IL6, IL8,
IL10 y TNFa. Las citoquinas a estudio deberán depender de la fase en la cual se quiera
profundizar (pre clínica, clínica o establecida). En futuros estudios es necesario comparar
contra controles sanos y establecer mejor porcentajes de positividad y concentraciones,
homogenizar la muestra en cuanto a tiempo de evolución, edad de presentación,
comorbilidades, severidad, factores pronósticos, tratamiento y posiblemente realizar el
análisis por subgrupos.Bibliografía
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