Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos
Autor: Ramírez Yépez, Camilo Sebastián
Asesor: Ortiz Morales, Jorge Rolando
Fecha: 2022
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Ortopedia y Traumatología
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Introducción: Las lesiones del cartílago hialino, ya sean de tipo traumático o degenerativo dan lugar a defectos condrales u osteocondrales que no cicatrizan con cartílago hialino nuevo. Por esta razón se ha investigado en la terapia regenerativa, con especial atención al secretoma de las células madre mesenquimales (MSC). En el presente estudio se plantea evaluar la condrogénesis del plasma rico en plaquetas (PRP) suplementado con medios condicionados de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AD-MSC-CM) en un modelo de defecto osteocondral (DO) de rodilla en conejos. Materiales y métodos: se plantea un estudio por fases, una fase piloto en la cual se establece el modelo experimental estandarizando primero la técnica quirúrgica con seis piezas cadavéricas, luego se estandariza el método de administración del tratamiento con dos conejos Nueva Zelanda con supervivencia. El primero se trata únicamente PRP administrado de forma infiltrativa en la rodilla, el segundo se trata con PRP + AD-MSC-CM. Se practica eutanasia a los 7 días y se evalúan los desenlaces y las complicaciones perioperatorias. En las fases siguientes del trabajo se plantea un estudio con 20 conejos: un grupo sham (n=2), un grupo control (n=6), un grupo tratado con PRP (n=6) y un grupo tratado con PRP + AD-MSC-CM (n=6), se sacrifican a las 12 semanas y se evalúa la regeneración condral de forma macroscópica e histológica; y la diferenciación del tipo de cartílago mediante inmunohistoquímica. Resultados: El presente documento muestra los resultados de la fase piloto determinando el diseño del modelo esperimental. Se propone un DO en el surco troclear al lado del tendón extensor digitorium longus. A los 7 días, ambos tratamientos seguían intraarticulares, sin embargo, mientras que el conejo tratado únicamente con PRP no mostraba ningún cambio en el DO, el conejo tratado con PRP + AD-MSC-CM exhibía características de cicatrización en el defecto creado rellenando parcialmente el mismo. Durante siete días, ninguno de los conejos mostró ningún tipo de efecto adverso más que una leve cojera. Tampoco mostraron signos importantes de dolor, malestar o angustia por lo que no hubo necesidad de aplicar criterios de punto final. Discusión y conclusiones: A pesar de las diferencias entre especies, el planteamiento de un DO en conejos permite evaluar el principio del tratamiento a aplicar siendo un modelo costo efectivo, que permitirá analizar la capacidad condrogénica del PRP y los AD-MCS-CM. El PRP es una buena estrategia que sirve como andamiaje para la entrega de factores de crecimiento y además actúa de forma sinérgica con los AD-MSC-CM. Debemos aclarar que los resultados respecto a la condrogénesis deben analizarse mediante un estudio histopatológico en las siguientes fases del estudio y tras haber pasado 12 semanas. A pesar de haber realizado un implante xenogénico no observamos ningún tipo de evento adverso en el conejo tratado con AD-MSC-CM, posiblemente indica que estos son seguros en la aplicación en estudios ulteriores. (Texto tomado de la fuente).

Evaluación de la condrogénesis mediada por medios
condicionados de células madre mesenquimales
derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en
plaquetas en defectos osteocondrales de rodilla: un
modelo experimental en conejos
Camilo Sebastián Ramírez Yépez
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía
Unidad de Ortopedia y Traumatología
Bogotá D.C, Colombia
2022Evaluación de la condrogénesis mediada por medios
condicionados de células madre mesenquimales
derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en
plaquetas en defectos osteocondrales de rodilla: un
modelo experimental en conejos
Camilo Sebastián Ramírez Yépez
Trabajo de Investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Especialista en Ortopedia y Traumatología
Director:
Dr. Jorge Rolando Ortiz Morales
Coodirectores:
Dr. Orlando Chaparro Garzón
Dra. Itali Marcelly linero Segrera
Línea de Investigación:
Cirugía de rodilla, Tecnología de tejidos, Ciencias básicas
Grupo de investigación Biología de Células Madre
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía
Unidad de Ortopedia y Traumatología
Bogotá D.C, Colombia
2022A mis padres, profesores y compañeros.Declaración de obra original
Yo declaro lo siguiente:
He leído el Acuerdo 035 de 2003 del Consejo Académico de la Universidad Nacional.
«Reglamento sobre propiedad intelectual» y la Normatividad Nacional relacionada al
respeto de los derechos de autor. Esta disertación representa mi trabajo original, excepto
donde he reconocido las ideas, las palabras, o materiales de otros autores.
Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación, he
realizado el respectivo reconocimiento, aplicando correctamente los esquemas de citas y
referencias bibliográficas en el estilo requerido.
He obtenido el permiso del autor o editor para incluir cualquier material con derechos de
autor (por ejemplo, tablas, figuras, instrumentos de encuesta o grandes porciones de
texto).
Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica, definida
por la universidad.
________________________________
Camilo Sebastián Ramírez Yépez
Fecha: 21 de enero de 2022.Resumen y Abstract V
Resumen
Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células
madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en
plaquetas en defectos osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en
conejos
Introducción: Las lesiones del cartílago hialino, ya sean de tipo traumático o degenerativo
dan lugar a defectos condrales u osteocondrales que no cicatrizan con cartílago hialino
nuevo. Por esta razón se ha investigado en la terapia regenerativa, con especial atención
al secretoma de las células madre mesenquimales (MSC). En el presente estudio se
plantea evaluar la condrogénesis del plasma rico en plaquetas (PRP) suplementado con
medios condicionados de las células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo
(AD-MSC-CM) en un modelo de defecto osteocondral (DO) de rodilla en conejos.
Materiales y métodos: se plantea un estudio por fases, una fase piloto en la cual se
establece el modelo experimental estandarizando primero la técnica quirúrgica con seis
piezas cadavéricas, luego se estandariza el método de administración del tratamiento con
dos conejos Nueva Zelanda con supervivencia. El primero se trata únicamente PRP
administrado de forma infiltrativa en la rodilla, el segundo se trata con PRP + AD-MSC-CM.
Se practica eutanasia a los 7 días y se evalúan los desenlaces y las complicaciones
perioperatorias. En las fases siguientes del trabajo se plantea un estudio con 20 conejos:
un grupo sham (n=2), un grupo control (n=6), un grupo tratado con PRP (n=6) y un grupo
tratado con PRP + AD-MSC-CM (n=6), se sacrifican a las 12 semanas y se evalúa la
regeneración condral de forma macroscópica e histológica; y la diferenciación del tipo de
cartílago mediante inmunohistoquímica.
Resultados: El presente documento muestra los resultados de la fase piloto determinando
el diseño del modelo esperimental. Se propone un DO en el surco troclear al lado del
tendón extensor digitorium longus. A los 7 días, ambos tratamientos seguíanVI Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares).
intraarticulares, sin embargo, mientras que el conejo tratado únicamente con PRP no
mostraba ningún cambio en el DO, el conejo tratado con PRP + AD-MSC-CM exhibía
características de cicatrización en el defecto creado rellenando parcialmente el mismo.
Durante siete días, ninguno de los conejos mostró ningún tipo de efecto adverso más que
una leve cojera. Tampoco mostraron signos importantes de dolor, malestar o angustia por
lo que no hubo necesidad de aplicar criterios de punto final.
Discusión y conclusiones: A pesar de las diferencias entre especies, el planteamiento
de un DO en conejos permite evaluar el principio del tratamiento a aplicar siendo un modelo
costo efectivo, que permitirá analizar la capacidad condrogénica del PRP y los AD-MCS-
CM. El PRP es una buena estrategia que sirve como andamiaje para la entrega de factores
de crecimiento y además actúa de forma sinérgica con los AD-MSC-CM. Debemos aclarar
que los resultados respecto a la condrogénesis deben analizarse mediante un estudio
histopatológico en las siguientes fases del estudio y tras haber pasado 12 semanas. A
pesar de haber realizado un implante xenogénico no observamos ningún tipo de evento
adverso en el conejo tratado con AD-MSC-CM, posiblemente indica que estos son seguros
en la aplicación en estudios ulteriores.
Palabras clave: Cartílago, Células madre mesenquimales, Medios condicionados,
Secretoma.Resumen y Abstract VII
Abstract
Evaluation of adipose-derived mesenchymal stem cell conditioned media mediated
chondrogenesis versus platelet-rich plasma in knee osteochondral defects: an
experimental model in rabbits
Introduction: Hyaline cartilage injuries, whether traumatic or degenerative, give rise to
chondral or osteochondral defects that do not heal with new hyaline cartilage. For this
reason, it has been investigated in regenerative therapy, with special attention to the
mesenchymal stem cell (MSC) secretome. The present study aims to evaluate the
chondrogenesis of platelet-rich plasma (PRP) supplemented with adipose-derived
mesenchymal stem cells conditioned media (AD-MSC-CM) in a model of knee
osteochondral defect (OD) in rabbits.
Materials y methods: A phased study is proposed, a pilot phase in which the experimental
model is established, first standardizing the surgical technique with six cadaveric pieces,
then the treatment administration method is standardized with two New Zealand rabbits
with survival. The first is treated only with PRP administered infiltratively in the knee, the
second is treated with PRP + AD-MSC-CM. Euthanasia is performed at 7 days and
perioperative outcomes and complications are evaluated. In the following phases of the
work, a study with 20 rabbits is proposed: a sham group (n=2), a control group (n=6), a
group treated with PRP (n=6, and a group treated with PRP + AD. -MSC-CM (n=6),
sacrificed at 12 weeks and chondral regeneration is evaluated macroscopically and
histologically; and differentiation of cartilage type by immunohistochemistry.
Results: This document shows the results of the pilot phase determining the design of the
experimental model. A DO is proposed in the trochlear groove next to the extensor
digitorium longus tendon. At 7 days, both treatments were still intra-articular, however, whileVIII Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares).
the rabbit treated with PRP alone did not show any change in DO, the rabbit treated with
PRP + AD-MSC-CM exhibited healing characteristics in the defect created by partially filling
the same. For seven days, none of the rabbits showed any adverse effects other than a
slight lameness. They also did not show significant signs of pain, discomfort or distress, so
there was no need to apply endpoint criteria.
Discussion and conclusions: Despite the differences between species, the approach of
a DO in rabbits allows evaluating the principle of the treatment to be applied, being a cost-
effective model, which will allow analyzing the chondrogenic capacity of PRP and AD-MCS-
CM. PRP is a good strategy that serves as a scaffold for the delivery of growth factors and
also acts synergistically with AD-MSC-CM. We must clarify that the results regarding
chondrogenesis must be analyzed by means of a histopathological study in the following
phases of the study and after 12 weeks have passed. Despite having performed a
xenogenic implant, we did not observe any type of adverse event in the rabbit treated with
AD-MSC-CM, possibly indicating that these are safe in the application in further studies.
Key words: Cartilage, Mesenchimal stem cells, Conditioned media, SecretomeContenido IX
CONTENIDO
Resumen .......................................................................................................................................... V
Lista de imágenes ............................................................................................................................ XI
Lista de tablas ................................................................................................................................ XII
Lista de abreviaturas ..................................................................................................................... XIII
Introducción ..................................................................................................................................... 1
Pregunta de investigación, Hipótesis, Justificación y Objetivos ....................................................... 3
1.1 Pregunta de investigación ................................................................................................ 3
1.2 Hipótesis ........................................................................................................................... 3
1.3 Justificación ...................................................................................................................... 3
1.4 Objetivos .......................................................................................................................... 5
1.4.1 Objetivo general ....................................................................................................... 5
1.4.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 5
Marco teórico................................................................................................................................... 7
1.5 Cartílago hialino y cicatrización ........................................................................................ 7
1.6 Implicaciones clínicas de las lesiones osteocondrales ...................................................... 9
1.7 Modelos animales .......................................................................................................... 10
1.8 Antecedentes y medicina regenerativa .......................................................................... 11
1.9 Plasma rico en plaquetas ................................................................................................ 15
1.10 Células madre mesenquimales ....................................................................................... 17
1.11 Relación del plasma rico en plaquetas con células madre mesenquimales. ................... 20
1.12 Secretoma como alternativa de terapias regenerativas no celulares ............................. 22
Metodología ................................................................................................................................... 27
1.13 Estudios previos ............................................................................................................. 27
1.14 Tipo de estudio ............................................................................................................... 27
1.15 Población ........................................................................................................................ 27
1.16 Tamaño de la muestra y grupos de estudio.................................................................... 27
1.17 Fases del estudio ............................................................................................................ 29
1.17.1 Preparación de plasma rico en plaquetas autólogo y del PRP suplementado con AD-
MSC-CM. 29
1.17.2 Obtención y preparación de medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo. ........................................................................ 30X Contenido
1.17.3 Procedimiento quirúrgico....................................................................................... 31
1.17.4 Estandarización del método de administración del tratamiento ........................... 32
1.17.5 Análisis patológico .................................................................................................. 33
1.17.6 Análisis de resultados ............................................................................................. 36
1.18 Aspectos éticos .............................................................................................................. 38
Resultados ..................................................................................................................................... 39
1.19 Fase Piloto. ..................................................................................................................... 39
1.19.1 Estandarización de la técnica quirúrgica ................................................................ 39
1.19.2 Presencia de signos inflamatorios locales o dehiscencia en la herida. ................... 42
1.19.3 Dolor, malestar y angustia...................................................................................... 43
1.19.4 Criterios de punto final........................................................................................... 43
1.19.5 Evaluación del tratamiento aplicado ...................................................................... 43
Discusión ........................................................................................................................................ 45
1.20 El conejo como modelo de defecto osteocondral en rodilla .......................................... 45
1.21 Determinación del tamaño y ubicación del defecto osteocondral ................................. 46
1.22 Estandarización de la administración del tratamiento ................................................... 47
1.23 PRP como sistema de andamiaje para administración de factores de crecimiento ....... 50
1.24 Nuevos andamiajes biológicos derivados del PRP .......................................................... 52
1.25 Desenlaces adversos ...................................................................................................... 53
Conclusiones .................................................................................................................................. 57
Referencias .................................................................................................................................... 59
Anexos ........................................................................................................................................... 69Contenido XI
Lista de imágenes
Página
Imagen 1 Distribución de subgrupos del grupo piloto. 31
Imagen 2 Distribución de subgrupos del grupo definitivo. 31
Imagen 3 Diagrama de la línea de trabajo. 32
Imagen 4 Preparación del plasma rico en plaquetas (PRP). 32
Imagen 5 Activación del plasma rico en plaquetas (PRP). 33
Imagen 6 Activación del plasma rico en plaquetas (PRP) suplementado 33
con los medios condicionados (AD-MSC-CM).
Imagen 7 Obtención de los medios condicionados (AD-MSC-CM). 34
Imagen 8 Infiltración del Plasma rico en plaquetas (PRP). 35
Imagen 9 Implante de plasma rico en plaquetas (PRP). 36
Imagen 10 Incisión. 42
Imagen 11 Abordaje parapatelar medial. 42
Imagen 12 Luxación lateral de la patela y exposición de los cóndilos 43
femorales.
Imagen 13 Especímenes cadavéricos. 43
Imagen 14 Creación del defecto osteocondral (DO). 44
Imagen 15 Localización del defecto osteocondral (DO). 44
Imagen 16 Evolución de la cicatrización de la herida. (Dia del 45
procedimiento: Día 0).
Imagen 17 Evaluación del tratamiento aplicado (PRP). 46
Imagen 18 Evaluación del tratamiento aplicado (PRP + AD-MSC-CM). 46XII Contenido
Lista de tablas
Página
Tabla 1 International Cartilage Repair Society (ICRS) macroscopic 36
evaluation of cartilage repair.
Tabla 2 International Cartilage Repair Society (ICRS) II Parameters. 38Contenido XIII
Lista de abreviaturas
Abreviatura Término
MSC Células Madre Mesenquimales
PRP Plasma Rico en Plaquetas
AD-MSC Células Madre Mesenquimales Derivadas de Tejido Adiposo
DO Defecto Osteocondral
ICRS Sociedad Internacional de Reparación de Cartílago
OA Osteoartritis
MSC-CM Medios Condicionados de Células Madre
AD-MSC-CM Medios Condicionados de Células Madre Derivadas de Tejido Adiposo
TGF-β Factor de Crecimiento Transformante Beta
BMP Proteína Morfogénica Ósea
IGF Factor de Crecimiento Similar a la Insulina
VEGF Factor de Crecimiento Vascular Endotelial
ACI Implante de Condrocitos Autólogos
MACI Implante de Condrocitos Autólogos asistido por Matriz
BM-MSC Células Madre Mesenquimales Derivadas de Médula Ósea.
PDGF Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas
PLGA Ácido poliláctico/poliglicólico
IL-1RA Antagonista del Receptor de Interleuquina 1
FGF Factor de Crecimiento Fibroblástico
EGF Factor de Crecimiento Epidérmico
IL Interleuquina
sTNF-R Receptores Solubles De Factor De Necrosis Tumoral
INF-γ Interferón gamma
PIGF Factor de Crecimiento Placentario
MCP Proteína Quimioatrayente de Monocitos
CCL Quimiocina de la familia CC
CXCL Quimiocina de la familia CXC
IDO Indoleamina
PGE Prostanglandina E
PRF Fibrina Rica en Plaquetas
SD-MSC Células Madre Mesenquimales Derivadas de Membrana Sinovial
CICUA Comité Institucional de Cuidado y Uso de AnimalesIntroducción 1
Introducción
El cartílago articular es un tejido caracterizado por ser avascular y su aporte nutricional
principalmente se da a través de imbibición. Esta condición hace que sea difícil reparar y
que su capacidad intrínseca de cicatrización sea muy limitada(1) .
El trauma o sobreuso articular puede llegar a ocasionar un deterioro biomecánico
secundario a un impacto sobre la superficie articular, que finalmente resulta en pérdida de
ésta con la subsecuente alteración biomecánica de la articulación en cuestión (2). Situación
compleja teniendo en cuenta que es un hallazgo común encontrar defectos osteocondrales
(DO) ocasionados por procesos degenerativos como la osteoartritis (OA), el trauma agudo
y en condiciones más específicas como la osteocondritis disecante (3).
En el trauma inicial, el hecho de penetrar el hueso subcondral inicia una estimulación de
la médula ósea aumentando principalmente la síntesis de colágeno tipo II dando lugar a
una cicatrización generando fibrocartílago, el cual tiene propiedades biológicas y
mecánicas diferentes del cartílago hialino. Este mismo proceso puede ser iniciado
quirúrgicamente por microfractura asistido por artroscopia, hasta el momento uno de los
métodos de tratamiento más utilizados en la práctica clínica por su baja complejidad y
resultados clínicos aceptables por un tiempo determinado (2).
La medicina regenerativa tiene el objetivo de recuperar el recubrimiento de cartílago hialino
en los DO. Se han estudiado diversas opciones terapéuticas para manejar los DO
incluyendo terapias celulares, métodos de ingeniería tisular y más recientemente la terapia
génica (4).
Los tratamientos con células madre mesenquimales (MSC) es una de las terapias celulares
que más ha demostrado efectos condrogénicos en varios modelos animales de lesión
osteocondral (5), sin embargo, se ha visto que estos efectos están mediados en gran parte
por mecanismos paracrinos que ejercen su acción directa en el tejido lesionado. Los
estudios muestran que la condrogénesis se lleva a cabo mediante diferentes moléculas2 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
secretadas al espacio extracelular (quimiocinas, citoquinas, factores de crecimiento,
hormonas etc.) desde las células, a este conjunto de moléculas se les conoce como el
secretoma celular. Tras algunos días de incubación, se ha demostrado que estas
moléculas del secretoma se encuentran en el medio donde se cultivan las células madre,
a estos medios se les denomina medios condicionados de células madre (MSC-CM). Se
ha demostrado que los mencionados medios tienen un efecto terapéutico comparable al
que exhibe el implante de MSC, no obstante, con ciertas ventajas respecto a los
tratamientos con células, por ejemplo, tienen un menor riesgo de generar rechazo
inmunológico, su almacenamiento es fácil, menor riesgo de tumorigenicidad, entre otras
(6).
El plasma rico en plaquetas (PRP), es un concentrado rico en plaquetas, las cuales una
vez son activadas liberan abundantes factores de crecimiento y citoquinas que afectan
positivamente la proliferación y diferenciación de varios tipos celulares. Adicionalmente, la
fibrina y las partículas responsables de la adhesión plaquetaria presentes proporciona un
excelente andamiaje o matriz que sirve de vehículo para las moléculas presentes en el
PRP (7). Sus aplicaciones en diferentes enfermedades del sistema músculo esquelético
han sido ampliamente estudiadas y se ha visto que el PRP per se no solo estimula la
actividad condrogénica, sino que también potencia el efecto de las MSC y además funciona
como andamiaje de los elementos solubles presentes, lo cual hace fácil su manipulación y
administración (8).
Teniendo en cuenta el efecto regenerador paracrino de cartílago hialino observado en las
células madre mesenquimales (MSC), el objetivo del presente estudio consiste en evaluar
el potencial condrogénico de los medios condicionados de células madre mesenquimales
derivadas de tejido adiposo (AD-MSC-CM) cuando se asocian al PRP y poder compararlo
con los efectos del PRP cuando se administra solo para manejar DO. A la fecha no existe
información sobre estudios similares que evalúen este potencial terapéutico.Pregunta de investigación, Hipótesis, Justificación y Objetivos 3
Pregunta de investigación, Hipótesis,
Justificación y Objetivos
1.1 Pregunta de investigación
¿Existen beneficios al dar un tratamiento combinado de medios condicionados de células
madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo más plasma rico en plaquetas para
defectos osteocondrales en la superficie articular del fémur del conejo?
1.2 Hipótesis
Teniendo en cuenta que el efecto paracrino que tienen las MSC ha demostrado un
potencial condrogénico en estudios preclínicos y clínicos, el uso de medios condicionados
obtenidos a partir de células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo (AD-MSC-
CM), como tratamiento en combinación con plasma rico en plaquetas (PRP) administrado
como una matriz potencian el efecto condrogénico, desde el punto de vista de regeneración
celular y productor de matriz extracelular.
1.3 Justificación
El daño del cartílago articular puede ocurrir como consecuencia de un trauma agudo, el
envejecimiento o ambos. Existen muchos mecanismos por el cual se lleva a cabo este
deterioro de la superficie articular, por ejemplo, el microtrauma repetitivo, la inestabilidad
de la articulación o la trasmisión de la carga con lesiones directas o indirectas (9). Esto
cobra especial importancia cuando observamos en la clínica que la osteoartritis (OA) es la
forma más frecuente de lesión del cartílago hialino, con una significativa carga
epidemiológica global, se estima que afecta a 9.6% de los hombres y 18% de las mujeres
por encima de los 60 años con una proyección hacia el aumento. El curso natural de la4 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
enfermedad da lugar a un importante deterioro de la funcionalidad, calidad de vida y lleva
progresivamente a una discapacidad; En el 2010 de 291 condiciones, la OA fue la causa
número 11 de discapacidad en el contexto mundial, justo por debajo de la diabetes (10).
Dentro de los tratamientos que existen para recuperar el cartílago articular, actualmente el
tratamiento de elección por su accesibilidad, practicidad y bajo costo es la microfractura
del hueso subcondral, con el inconveniente de que el cartílago generado es fibrocartílago
cuya composición y características difieren del nativo, por lo que trae un alivio de los
síntomas, sin embargo, durante un corto plazo.
Con el advenimiento de la terapia regenerativa, se han utilizado desde injertos de cartílago
autólogo y la ingeniería de condrocitos autólogos hasta el trasplante de células madre y
más recientemente la terapia génica, con el objetivo de recuperar el cartílago hialino.
Particularmente las MSC han probado ser eficaces en el manejo del dolor, la mejoría en
las escalas funcionales y han mostrado incluso regeneración de cartílago hialino con
propiedades biológicas y mecánicas similares a las del nativo. No obstante, también se
puede ver ciertas desventajas como, por ejemplo, la necesidad de un donante, el riesgo
latente de generar rechazo inmunológico y su procesamiento y expansión que resultan
dispendiosos (9).
El concepto de secretoma se entiende como un conjunto de factores tróficos liberados al
espacio extracelular desde las células. En este contexto, se ha podido comprobar que los
MSC-CM poseen moléculas secretadas al espacio extracelular con efectos anabólicos,
inmunomoduladores, antiinflamatorios, y antiapoptóticos sobre diferentes tipos celulares
que pueden compararse al efecto observado en las MSC una vez implantadas. Esto ha
podido verificarse en estudios previos realizados por el grupo de investigación Biología en
Células Madre de la Universidad Nacional de Colombia, en donde los MSC-CM han
probado tener el mismo efecto terapéutico que las MSC sin traer consigo las desventajas
inherentes en el uso de estas (11–13).
Teniendo en cuenta la naturaleza del cartílago hialino como tejido, el gran impacto y
trascendencia clínica de su deterioro, la limitada oferta de tratamiento además de su difícil
acceso, proponemos en el presente estudio, el uso de AD-MSC-CM junto con PRP para el
manejo de DO en un modelo preclínico utilizando conejos. Dado que el secretoma de lasPregunta de investigación, Hipótesis, Justificación y Objetivos 5
AD-MSC contiene factores de crecimiento, hormonas y citoquinas, es pertinente
compararlo (mediante los medios condicionados) con los efectos del PRP, del cual, se ha
visto que tiene efectos similares en términos de regeneración de cartílago hialino,
adicionalmente el PRP podría servir de matriz para todos estos elementos biológicos (7).
No se conocen al momento estudios preclínicos o clínicos en los que se realice manejo de
este tipo de lesiones articulares con AD-MSC-CM, de ahí la importancia de comenzar a
evaluar su eficacia en defectos osteocondrales en un modelo preclínico. Esto nos permitirá
evaluar el principio del tratamiento propuesto, evaluar su eficacia, seguridad, y de acuerdo
con los resultados, posiblemente abra paso a fases clínicas.
1.4 Objetivos
1.4.1 Objetivo general
Evaluar el potencial condrogénico del PRP y del PRP suplementado con AD-MSC-CM en
defectos osteocondrales en un modelo preclínico en rodilla de conejo.
1.4.2 Objetivos específicos
1. Desarrollar un modelo in vivo de defecto osteocondral para el implante de PRP y
PRP suplementado con medios condicionados.
2. Evaluar el potencial condrogénico del PRP en lesiones osteocondrales en un
modelo preclínico en rodilla de conejos.
3. Evaluar el potencial condrogénico del PRP suplementado con medios
condicionados en lesiones osteocondrales en un modelo preclínico en rodilla de
conejos.
4. Comparar el potencial regenerativo del PRP y del PRP suplementado con medios
condicionados con base en su capacidad de regenerar el cartílago hialino en
lesiones osteocondrales en un modelo preclínico en rodilla de conejo.Marco teórico 7
Marco teórico
1.5 Cartílago hialino y cicatrización
El cartílago es un tejido conectivo altamente especializado que de acuerdo con su
composición celular y fibrilar ha sido clasificado en distintos subtipos. El cartílago hialino
es uno de los más conocidos debido a su papel en la osificación endocrondral y su
capacidad de amortiguación y distribución de cargas a nivel articular.
La composición del cartílago hialino está dada por células mesenquimales denominadas
condrocitos los cuales se encargan de producir y mantener sustancias fibrilares como
colágeno, glucosaminoglucanos y proteoglicanos, los cuales en conjunto con iones
inorgánicos y agua forman la matriz extracelular del tejido. El colágeno tipo II constituye
cerca del 90 % de estas fibras en la matriz extracelular del cartílago hialino y por tanto
constituye un referente histológico y molecular de este tipo de cartílago. La presencia de
otros tipos de colágeno como el III, IX, XI y VI cumplen funciones estructurales, así como
señales de mecanotransducción para los condrocitos (1). El agrecano, uno de los
proteoglicanos más importantes en el cartílago hialino, tiene la propiedad de crear uniones
no covalentes con el hialuronano y uniones covalentes con glucosaminoglucanos. Éstos,
al tener grupos aniónicos en su estructura molecular, crean cargas negativas que atraen
cationes como el sodio generando un desequilibrio iónico entre el cartílago y el tejido
circundante que resulta en una concentración mayor de agua en el cartílago. De esta
manera el agua se distribuye en el tejido y le da la propiedad de resistir deformaciones y
cargas de alto impacto (14).
La disposición de los condrocitos y los componentes de la matriz extracelular están
distribuidas en 4 zonas histológicamente distinguibles.8 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
La zona superficial compuesta por dos o tres capas de condrocitos aplanados, que en
conjunto con fibroblastos son productores de lubricina, un proteoglicano encargado de la
lubricación de las superficies articulares (15). Algunos autores describen que esta zona
esta subdividida en dos áreas, un área superficial llamada lámina splendens o lubricina
donde predominan finas fibras y polisacáridos, y un área profunda caracterizada por la
presencia de condrocitos (16). La presencia de colágeno es mayor en la zona superficial y
se estima que disminuye cerca del 20% hacia las zonas más profundas (1).
La zona intermedia está compuesta por condrocitos redondos u ovoides asociados a fibras
las cuales se distribuyen oblicuamente con respecto a la superficie. Presenta un alto
contenido en agua que se distribuye hacia la zona superficial y al espacio sinovial como
respuesta a la compresión generada por cargas y que luego retorna a su lugar cuando la
presión disminuye.
La zona profunda presenta condrocitos redondos distribuidos de manera lineal y en
paralelo con respecto a las fibras de colágeno y se encuentra separada de un área
calcificada subyacente por medio de un conjunto de fibras de colágeno tipo I que son
reconocidas histológicamente y que reciben el nombre de marca de marea (15).
La zona calcificada se caracteriza por tener colágeno tipo X en contacto con el hueso
subcondral (17), y presenta condrocitos hipertróficos que tienen la capacidad de calcificar
la matriz extracelular (18).
El cartílago es un tejido avascular, conocido por su limitada capacidad para regenerarse
dada la hipocelularidad condrocitaria y su bajo potencial condrogénico. Usualmente su
capacidad de reparación depende de la profundidad de la lesión. Lesiones que no
alcanzan el hueso subcondral o son defectos parciales presentan proliferación celular con
acumulación de condrocitos los cuales producen una matriz celular subóptima. Lesiones
más profundas que alcanzan hasta el hueso subcondral pueden presentar un potencial
mayor de reparación ya que al comprometer la placa del hueso subcondral se permite la
perfusión sanguínea, la llegada de células inflamatorias y mesenquimales, acumulación de
plaquetas y formación de coágulos de fibrina. Este proceso lleva a la formación de
fibrocartílago, caracterizado por una mayor cantidad de colágeno tipo I con respecto aMarco teórico 9
colágeno tipo II y una densidad menor de proteoglucanos por lo cual presenta
propiedades diferentes al cartílago hialino (1).
1.6 Implicaciones clínicas de las lesiones
osteocondrales
Los DO representan un desafío para la ortopedia moderna dado que el potencial reparador
del cartílago es limitado ya que como se mencionó anteriormente carece de una
vasculatura intrínseca, así como de células con capacidad de diferenciación.
La pérdida de cartílago puede ocurrir como consecuencia de lesiones traumáticas que
conducen a defectos focales, o a través de una degeneración crónica, produciendo
defectos que pueden ser de espesor parcial o completo, este último, siendo el que mayor
probabilidad de reparación espontánea tiene, debido al contacto estrecho que tienen con
las células de la médula ósea, que van a migrar al sitio de la lesión, formando un coágulo
que va empezar a sintetizar matriz extracelular por medio de factores de crecimiento, que
sirven como quimiotácticos para otras células, principalmente factor de crecimiento
transformante beta (TGF-β), proteínas morfogénicas óseas (BMP), factor de crecimiento
similar a la insulina (IGF) y factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) (19,20). Los
DO focales que involucran la articulación patelofemoral, pueden resultar en síntomas
mecánicos que perjudican la función, causan dolor o edema, más aún si se localizan en
áreas de carga de los compartimentos medial o lateral. Lo anterior finalmente resulta en
una OA debido a que se presenta una pérdida progresiva del cartílago articular, formación
de osteofitos, quistes subcondrales, estrechamiento del espacio articular e inflamación
intermitente de los tejidos (21).
Los defectos DO cuando no son tratados, pueden progresar a lesiones más complejas no
susceptibles de manejo con el arsenal terapéutico actual, llevando así a requerir el
reemplazo total de la articulación si las medidas conservadoras fallan, situación que se
viene dando más frecuentemente y cada vez en pacientes más jóvenes (22) .
La OA representa una enfermedad con gran impacto a nivel mundial debido a su gran
prevalencia siendo aproximadamente de 9% para los hombres por encima de los 60 años
y el doble para las mujeres (23), para el año 2010 fue más alta en países de ingresos altos
de la región de Asia y Pacifico, seguida de Oceanía y África del norte con Oriente medio,10 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
en contraste con el sur y sudeste de Asia en donde su prevalencia fue más baja (10). En
Colombia la OA es actualmente la más frecuente de las enfermedades que producen dolor
musculoesquelético y una de las principales causas de dolor e incapacidad, con un
crecimiento exponencial que hace que a la edad de 70 años afecte a 1 de cada 3
individuos, afectando más comúnmente a mujeres que a hombres, se estima que la
prevalencia es de 33.9% después de los 70 años (24) .
Por lo general, las medidas terapéuticas para el manejo de DO, deben cumplir tres
objetivos principales, que son: Restauración del rango de movilidad articular, mejoría del
dolor, así como evitar la aparición o progresión de la OA (7). Es por este motivo, que en
las últimas décadas se ha estudiado el campo de la ingeniería de tejidos, que tiene como
objetivo desarrollar técnicas que restauren o mantengan órganos o tejidos dañados,
usando combinaciones de células, andamios y moléculas activas que generen el mínimo
malestar al paciente (25).
1.7 Modelos animales
Han sido diversos los modelos animales utilizados para el estudio de defectos articulares,
ya sea a partir de un defecto focal o de una simulación de OA, los estudios incluyen
animales pequeños como ratones, ratas y conejos, mientras que los animales grandes en
los diferentes estudios, incluyen caballos, perros, ovejas, corderos y porcinos. El conejo es
el más utilizado dado que tiene un tamaño articular en la rodilla más grande que los
roedores pequeños, las propiedades subcondrales de la tróclea articular son similares al
cóndilo femoral medial del humano, y no tienen la limitante de los altos costos de
mantenimiento y manejo que tienen los animales más grandes. La limitante de estos es su
pequeño tamaño en la articulación, el delgado espesor del cartílago articular, la diferencia
en la biomecánica articular y la mayor capacidad de cicatrización espontánea intrínseca
del animal. Pese a todo esto, los conejos son una herramienta muy útil para la prueba del
principio a evaluar, permite además evaluar la seguridad del tratamiento antes de pasar a
animales más grandes o estudios clínicos (26).Marco teórico 11
1.8 Antecedentes y medicina regenerativa
La evidencia clínica actual en el tratamiento para el manejo de los defectos osteocondrales
(DO), particularmente hablando en la articulación de la rodilla incluye múltiples técnicas de
manejo antes de realizar un reemplazo articular.
Una opción de manejo es mediante técnicas que estimulen la médula ósea subyacente al
cartílago (perforaciones osteocondrales, condroplastia por abrasión y microfractura), éstas
buscan iniciar la liberación de células condroprogenitoras desde la cavidad medular del
hueso a través de la placa subcondral para dar lugar a la formación de fibrocartílago
(compuesto principalmente por colágeno tipo I), este por supuesto con unas propiedades
biomecánicas inferiores a las del cartílago hialino (compuesto principalmente por colágeno
tipo II). Tiene un potencial de reparación impredecible y es considerada por muchos como
un tratamiento paliativo para el manejo del dolor en la OA antes de una artroplastia. Dentro
de las posibles complicaciones de este procedimiento, se ha reportado formación de
quistes subcondrales y osteofitos intralesionales. Para potenciar la estimulación de la
medula ósea, algunos autores han descrito técnicas de aumentación biológica, como la
adición de células, factores de crecimiento o matrices ya sean celulares o acelulares. Estas
tienen como objetivo mejorar las características del tejido de reparación en el defecto de
cartílago (27).
Otra técnica utilizada son los trasplantes condrales u osteocondrales cuyo principio busca
reemplazar el cartílago articular en el sitio del defecto con tapones de cartílago hialino
cosechados de un lugar distante al defecto de la rodilla. La mosaicoplastia trata el mismo
principio al injertar varios tapones de cartílago en un defecto osteocondral más grande. Los
injertos tienen la ventaja de ser autólogos, sin embargo, por este mismo hecho una de sus
desventajas responde a la morbilidad del área donante de cartílago y a su vez constituye
un límite para la cantidad de cartílago donante disponible para la reparación de defectos
grandes. También es posible utilizar aloinjertos para tratar sobre todo defectos más
grandes, tienen la ventaja de que requieren un solo tiempo quirúrgico, con relativa sencillez
de la técnica y han mostrado formar histológicamente cartílago hialino.
Una limitante de los injertos es la no fusión con el tejido nativo, esto debido a que el injerto
puede ser de diferente grosor u orientación rotacional, con la subsecuente alteración de la
biomecánica articular. Otra complicación es el potencial de transmisión de enfermedades
con los injertos alogénicos, y la posibilidad de rechazo inmunológico, además de requerir12 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
estudios a largo plazo para evaluar su efectividad, puesto que la evidencia disponible solo
evalúa resultados a corto y mediano plazo. También existen los tapones sintéticos los
cuales representan un costo importante además de sus complejos y demandantes
procesos de producción (27).
En los últimos años, se han hecho grandes esfuerzos por investigar diferentes alternativas
de manejo, y la medicina regenerativa juega un papel muy importante. Ésta integra la
terapia celular, la terapia con matrices o andamiajes y la integración de estos dos. A la
fecha, se considera un campo muy amplio y aún en desarrollo, cuyas alternativas de
tratamiento exhiben mecanismos de acción que no son completamente entendidos. La
medicina regenerativa tiene como objetivo el poder regenerar tejido favoreciendo ciertas
condiciones como la presencia y producción de factores de crecimiento, hormonas y
distintos nutrientes que benefician las condiciones físicas y mecánicas presentes en los
tejidos que quieren repararse. En este sentido la mayoría de las pruebas se han realizado
en modelos animales, principalmente conejos (7), donde se han utilizado principalmente
por células inflamatorias, células mesenquimales, células hematopoyéticas entre otras.
Dentro de las terapias celulares, el implante de condrocitos autólogos (ACI) es hasta el
momento la única técnica aprobada por la Food and Drug Administration de los estados
unidos (US-FDA). Los condrocitos inicialmente requieren ser extraídos, cultivados y
expandidos, luego al implantarse, se fijan en el defecto con un injerto de periostio o una
membrana de colágeno, lo cual implica un segundo procedimiento artroscópico. En las
técnicas de implantes celulares de segunda generación se encuentra el implante de
condrocitos autólogos asistido por una matriz (MACI). Esta usa materiales bioabsorbibles
como andamiajes que proveen de una estructura tridimensional para la adhesión celular,
proliferación y producción de matriz extracelular, por lo tanto, prescindiendo de un tejido o
material de fijación adicional. Estas técnicas tienen costos importantes, una metodología
dispendiosa, corren riesgo de una mala integración con el tejido circundante, hipertrofia
sintomática y para el ACI, riesgo de falla del implante, principalmente cuando se asocia a
una membrana de periostio (27).
Actualmente una de las fuentes celulares más ampliamente estudiadas son las células
madre, con la capacidad de ser altamente regenerativas, división celular teóricamente
ilimitada, y dar lugar a diferentes linajes celulares de acuerdo con su clasificaciónMarco teórico 13
(totipotenciales, pluripotenciales, multipotenciales y unipotenciales). Desde este punto de
vista las células más utilizadas son las MSC adultas, ya que no están sujetas a los dilemas
éticos y los riesgos tumorigénicos concernientes al uso de células madre embrionarias.
Las fuentes más comunes de MSC que se han estudiado son en médula ósea, tejido
adiposo, piel, folículos de pelo, periostio, músculo esquelético, membrana sinovial y pulpa
dental. Sus limitaciones van a depender del sitio donde son cosechadas, por nombrar
algunos ejemplos, las células madre de médula ósea (BM-MSC) para su obtención
requieren un procedimiento invasivo, y en una baja cantidad en los aspirados medulares,
por lo que tienen que expandirse in vitro. Esto puede solucionarse si las células provienen
de tejido adiposo, ya que es un tejido ampliamente disponible, puede obtenerse cantidades
mucho mayores y los procedimientos se pueden considerar menos invasivos. Como
contraparte, las AD-MSC, exhiben un potencial regenerativo menor que aquellas derivadas
de la medula ósea. En general, en los diferentes estudios, las MSC han demostrado una
habilidad para la formación de cartílago hialino parecido al nativo con resultados variables,
sin embargo, siempre con riesgo de generar un fenotipo fibroblástico durante los cultivos
e hiperproliferación celular intraarticular (7).
Los aspirados concentrados de médula ósea son una gran fuente tanto como de células
madre mesenquimales como de factores de crecimiento como por ejemplo VEGF, TGF-β,
factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), BMP-2 y -7. Éstos últimos contenidos
también dentro de los gránulos de las plaquetas presentes en los concentrados. Se
obtienen mediante centrifugación de aspirados de médula ósea, tienen la ventaja de ser
autólogos, y han probado ser tanto osteogénicos como condrogénicos (4). Se han utilizado
en distintos ensayos clínicos probando mejorar los puntajes de satisfacción del paciente y
los puntajes de evaluación funcional (28).
En cuanto a la construcción de medios, matrices o andamiajes, los biomateriales más
comúnmente utilizados en la regeneración de cartílago hialino están hechos principalmente
de polímeros naturales, artificiales o compuestos. Estos vienen en forma de esponjas,
hidrogeles, enmallados, membranas o nanofibras. Están hechos de proteínas naturales
como colágeno, fibrina, seda, gelatina, o polisacáridos como alginato, agarosa, chitosán y
ácido hialurónico, se consideran biocompatibles y biodegradables. Estas características de
las matrices les dan las propiedades de adherirse al tejido nativo, producir matriz
extracelular como colágeno tipo II y glucosaminoglucanos y una vez implantadas
influencian el efecto condroinductivo. Ejemplos de estas son las matrices de ácido14 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
poliláctico/poliglicólico (PLGA), polietilenglicol, o fumarato de polipropileno. Dentro de sus
desventajas puede decirse que al degradarse pierden sus propiedades biomecánicas,
tienen riesgo de producir una reacción inmunológica y pueden transmitir enfermedades (7).
Los medios sintéticos, son más estables desde el punto de vista biomecánico, son
inmunogénicamente neutros, y no tienen el riesgo de transmitir enfermedades, sin
embargo, desde el punto de vista biológico, pueden tener una menor capacidad
restaurativa del tejido. Dentro de los más utilizados, están aquellos compuestos por
fosfatos de calcio, por ejemplo, biocerámicas de hidroxiapatita (7). Autores como Tang et
al. (29), desarrollaron un constructo hibrido a base de un andamiaje impreso en 3D con
PLGA suplementado con PRP activado como medio para transporte de factores de
crecimiento de MSC así logrando un balance entre las propiedades mecánicas del
andamiaje y una bioactividad para la regeneración de cartílago, el análisis de expresión
génica indico una diferenciación osteogénica y condrogénica mostrando este constructo
como una buena herramienta en la ingeniería de cartílago. Chang et al. (30) comparó el
efecto de preparados en coagulo de PRP, PRP + un andamiaje de PLGA y PRP + PLGA
+ movimiento pasivo continuo en defectos osteocondrales en rodilla de conejos
encontrando que el grupo tratado con PRP + PLGA + CPM a las semanas 4 y 12 tenían
una mejor caracterización de la matriz hacia cartílago hialino que los otros dos grupos que
mostraban una matriz de fibrocartílago.
La terapia génica es otro campo de estudio y opción de tratamiento. Ésta busca utilizar un
segmento del genoma que codifica para un factor bioactivo dado. Esto lo hace mediante
vectores virales (adenovirus, retrovirus, lentivirus o herpes) o no virales, y aplicación puede
realizarse mediante el implante de células transgénicas con el vector ya implantado o se
puede inyectar el vector en el sitio del defecto osteocondral. Uno de los más utilizados es
el antagonista del receptor de interleuquina 1 (IL-1RA) que ha mostrado una disminución
en los síntomas de modelos de enfermedades degenerativas en ratón, rata, conejo, perro
y caballo (31). En otros estudios también se ha buscado codificar para factores de
crecimiento como IGF I, IGF-II, TGF-β, y algunos factores de transcripción como SOX-9,
esenciales para la diferenciación condrogénica (32).
En resumen, podría decirse que el gold estándar al momento para el tratamiento de los
DO es la microfractura por su bajo costo, solo requiere un tiempo quirúrgico, estáMarco teórico 15
fácilmente disponible y no tiene morbilidad en el sitio donante, sin embargo, teniendo en
cuenta que es un procedimiento que genera fibrocartílago y el control del dolor es temporal.
Considerando el alto costo asociado a la ingeniería de condrocitos, los inconvenientes que
tienen las técnicas de injertos osteocondrales, la limitada disponibilidad de biomateriales o
matrices sintéticas y la falta de estudios clínicos y de costo efectividad que justifiquen su
uso, la aplicación de cualquiera de estos tratamientos como técnicas rutinarias de manejo
de DO está lejos de ser un algoritmo de manejo.
1.9 Plasma rico en plaquetas
El PRP se obtiene tras la centrifugación de una muestra de sangre periférica dando lugar
a un producto altamente concentrado en plaquetas. Sus componentes básicos y
principales efectos parten de factores de crecimiento que estimulan el anabolismo celular,
los mediadores y moduladores antiinflamatorios producen un efecto neto antiinflamatorio,
y finalmente el fibrinógeno el cual actúa como un biomaterial de andamiaje.
Una vez son activadas, las plaquetas liberan factores de crecimiento que se encuentran
en concentraciones mayores a las sanguíneas (TGF – β, PDGF, IGF, VEGF, factor de
crecimiento fibroblástico (FGF), factores de crecimiento epidérmicos (EGF), etc.), muchos
de estos protegen y estimulan positivamente los condrocitos de tal manera que sintetizan
agrecanos y colágeno tipo II, estimulan la proliferación de MSC y su diferenciación a
condrocitos, previenen su apoptosis y limitan los efectos de las citoquinas proinflamatorias
como interleuquina 1 beta (IL-1β) y metaloproteinasas.
Por otro lado, las plaquetas pueden liberar numerosas citoquinas antiinflamatorias (IL-1ra,
receptores solubles de factor de necrosis tumoral I y II (sTNF-R I y II), IL-4, IL-10, IL-13,
interferón gamma (INF-γ)) y en menor medida algunas citoquinas proinflamatorias, esto
sugiere que el PRP podría suprimir la inflamación en la OA y por lo tanto el dolor.
Las proteínas contenidas en el PRP (fibrinógeno y otros factores de la coagulación), se
activan y forman un andamiaje provisional para que las células se adhieran, migren y
proliferen, lo que resulta útil en tejidos sin vascularización como por ejemplo el cartílago,
ya que esta matriz se asemeja a la presente en el estadio inicial de la reparación tisular y
la cicatrización de heridas (33).16 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
Se han realizado varios estudios con PRP en los que se utiliza como tratamiento para OA
de rodilla y defectos condrales DO en varios modelos animales, y demuestran resultados
variables en términos de regeneración tisular, sin embargo, con una tendencia hacia la
generación de matriz extracelular, disminución de la actividad inflamatoria, promoviendo
angiogénesis, coagulación y homeostasis (34).
En seres humanos es más complicado establecer el grado de regeneración de cartílago
hialino, por lo que la mayoría de los estudios se enfocan en evaluar la evolución clínica
tras la aplicación del PRP, y muestran tener mejores desenlaces clínicos que en los grupos
control con ácido hialurónico. En una revisión sistemática realizada por Campbell et al. (35)
observó un efecto benéfico significativamente mayor del PRP inyectado comparado a otros
tratamientos como por ejemplo el ácido hialurónico y los corticoesteroides, encajando este
como un tratamiento ideal para los estadios iniciales de la OA. A pesar de lo observado,
se debe tener en cuenta el tiempo transcurrido tras la aplicación, pues tiene un impacto
importante en el efecto observado. En un metaanálisis más reciente realizado por Chen et
al. (36), observaron que no hubo diferencia significativa en términos de dolor a corto plazo,
esto cambia cuando se evalúa los pacientes a un plazo mayor, en donde el tratamiento
con PRP tiene ventajas sobre el control. De igual forma si nos referimos a las escalas
funcionales (IKDC), a corto plazo no hubo diferencias estadísticamente significativas con
el grupo control, situación que se repite en un plazo intermedio, sin embargo, a un largo
plazo si se pudieron observar diferencias estadísticamente significativas favoreciendo el
grupo tratado con PRP. En lo que respecta al hallazgo de eventos adversos, el estudio no
encontró diferencias estadísticamente significativas respecto al grupo control.
Entonces, podemos ver que dentro de las terapias celulares para regeneración
condrogénica, el PRP es uno de los tratamientos hasta ahora más utilizados tanto en
estudios preclínicos como en clínicos, sin embargo, aún queda mucho por entender sobre
sus mecanismos de acción, dosificación, aplicación y métodos de preparación. Por tanto,
a pesar de la evidencia, hasta el momento no es posible emitir un juicio directo sobre la
recomendación de su uso.Marco teórico 17
1.10 Células madre mesenquimales
Las MSC son células multipotenciales capaces de diferenciarse a otros tipos de células
que dan lugar a diferentes tejidos, con funciones distintas como por ejemplo cartílago,
hueso, músculo, tendón, tejido adiposo y estroma hematopoyético. El Comité de Células
Madre Mesenquimales y Tisulares de la sociedad Internacional para Terapia Celular definió
a las células madre mesenquimales como células con una morfología delgada y elongada
que se adhieren al plástico, con características antiinflamatorias, anti apoptóticas, anti
fibróticas con capacidad inmunomoduladora. Una célula madre mesenquimal debe
expresar antígenos de superficie específicos: CD73, CD90, y CD105, que las distinguen
de otro tipo de células madre y deben carecer de CD45, CD34, CD14, o CD11b, CD79 alfa
o CD19 y HLA-DR, además deben demostrar un potencial de diferenciación multipotente
in vitro (37).
En su aplicación clínica, este tipo de células son capaces de liberar diferentes moléculas
biológicamente activas que tienen un efecto benéfico en los tejidos lesionados, inhiben la
fibrosis, apoptosis e inflamación y promueven la angiogénesis y la regeneración del tejido.
Los mecanismos de acción no están entendidos por completo, sin embargo, se ha
observado una relación directa de las MSC con los pericitos vasculares, los cuales
muestran marcadores propios de estas células y, sin importar su tejido de origen, muestran
facultades condrogénicas, osteogénicas y adipogénicas. Lo anterior sugiere que las MSC
podrían corresponder a pericitos que se presentan en cualquier tejido vascularizado que
ante cualquier noxa contribuyen para la reparación del tejido mediante la secreción de
factores tróficos que controlan la reacción inflamatoria endógena (IL-6, IL-8, IL-10, IL-1RA,
PGE-2, IDO, TGF-β), suscitan la angiogénesis (VEGF, IGF-1, factor de crecimiento
placentario (PIGF), Proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1), bFGF, IL-6) y
estimulan la proliferación y diferenciación de células progenitoras (CCL2, CCL3, CCL4,
CCL5, CCL6, CCL20, CX3CL1, CXCL5, CXCL11, CXCL1). A su vez, se reclutan células
madre endógenas que liberan otros factores paracrinos (PDGFs, BMPs, IGFs, TGF-β,
FGF, VEGF, IL-6, angiogenina, MCP-3, MCP-1, EGF).
Cuando se trasplantan MSC en cualquier tipo de tejido con el objetivo de regenerar tejido,
se observa un efecto terapéutico, sin embargo, no se aprecia una diferenciación de estas
a un tipo específico de célula y, por otro lado, no sobreviven por mucho tiempo, lo cual
sugiere que muchos de los efectos terapéuticos si no todos, podrían estar mediados por18 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
factores tróficos con un mecanismo paracrino. Esto da lugar a pensar en la posibilidad de
la administración directa de estos factores para inducir efectos similares mediante
moléculas bioactivas que controlen la inflamación, prevengan las reacciones autoinmunes,
disminuyan la formación de cicatriz, inhiban la apoptosis celular debido a isquemia,
estimulen la formación y estabilización de vasos sanguíneos y secreten factores tróficos
que inducen la replicación de progenitores tisulares endógenos (38) .
Específicamente hablando de la capacidad regenerativa del cartílago articular, las MSC
buscan un complejo de reconstrucción constituido por células, andamiajes y factores de
estimulación. Las fuentes celulares más utilizadas son la médula ósea, el tejido adiposo y
el tejido sinovial, siendo la primera la que mejor capacidad condrogénica tiene en estudios
in vitro e in vivo, aunque las células de tejido sinovial han mostrado un mayor potencial en
cuanto a proliferación y diferenciación se refiere (39). Las AD-MSC, son células que como
su nombre lo indica provienen del tejido adiposo, un tejido que puede ser fácilmente
aislado, en grandes cantidades, con relativa poca morbilidad y dolor del sitio donante. En
el 2001 se hizo el primer reporte de células multipotenciales aisladas de tejido adiposo con
la capacidad de diferenciarse a adipocitos, osteoblastos, condrocitos y miocitos bajo
condiciones específicas in vitro. Desde entonces han surgido numerosos estudios con este
tipo de células.
Para una diferenciación condrogénica, se requiere de un microambiente específico en el
cual confluyan factores de crecimiento para tal fin. El componente más importante podría
ser el TGF-β1, β2 y β3, el cual influye para la expresión de colágeno tipo II y el depósito
de glucosaminoglucanos. Otro factor importante es la BMP-6, que al combinarse con el
TGF-β, incrementa la condrogénesis significativamente con la expresión además de
agrecanos, de igual forma BMP-2, 4 y 7. La expresión de SOX-9 en el medio mantiene el
fenotipo condrogénico, mientras que su supresión causaba desdiferenciación de los
condrocitos (20). Las células una vez trasplantadas además han mostrado disminuir la
producción de metaloproteinasas, también hay liberación de vesículas extracelulares que
tienen influencia en la regeneración de cartílago, promueven la deposición de colágeno
tipo II y glicosaminoglicanos. Sus propiedades inmunomoduladoras derivan de la liberación
y señalización intracelular del secretoma de cada origen celular, este cambia el fenotipo
celular de las células inflamatorias hacia uno antiinflamatorio. Por ejemplo, se ha visto queMarco teórico 19
las células que derivan de médula ósea suprimen la proliferación de linfocitos T e inhiben
la activación de células natural killer mediante la liberación de prostanglandina E2 (PGE2)
e indoleamina 2,3-dioxigenasa (IDO). También hay una inhibición de la proliferación,
activación, maduración y presentación de antígenos de las células dendríticas, la
respuesta producida por los linfocitos B también se modula mediante estas señales
paracrinas (26).
Se han publicado varios ensayos clínicos utilizando trasplantes de MSC con el objetivo de
regenerar cartílago hialino en osteoartritis de rodilla con resultados prometedores. En un
metaanálisis reciente realizado por Lijima et al. (40), se revisa la evidencia de la efectividad
del tratamiento con MSC para OA de rodilla. Los resultados sugerían que el tratamiento
con MSC ya sea intraarticular o implantación mediante artroscopia mejoraba
significativamente el dolor, el desempeño físico y la calidad del cartílago, sin embargo, la
eficacia del tratamiento en cuanto a la mejoría en el volumen del cartílago era limitada. En
el mismo metaanálisis se analizó la frecuencia de efectos adversos, siendo estos
principalmente leves (dolor y edema) con una prevalencia variable (2 – 60%) que se
presentaban dentro de la primera semana del tratamiento, y no se documentaron efectos
adversos severos, probablemente indicando que los beneficios del tratamiento superan los
riesgos. Sin embargo, a pesar de dichos resultados la evidencia se calificó de muy bajo a
bajo de acuerdo con el sistema GRADE (Grading of Recommendations, Assessment,
Development and Evaluation) debido al diseño de los estudios involucrados, alto riesgo de
sesgo, gran heterogeneidad en las poblaciones. En un metaanálisis más reciente realizado
por Maheshwer et al (41). donde se recogieron 25 trabajos con un total de 489 pacientes
con OA, se evaluó la regeneración de cartílago además las escalas de dolor y función
reportados por el paciente. Con respecto al dolor, no hubo una diferencia estadísticamente
significativa entre el grupo tratado con MSC y el control en un término de seguimiento
promedio de 12 meses, no obstante, los grupos entre los estudios eran moderadamente
heterogéneos. En las escalas de evaluación funcional en un promedio de 20 meses, se
encontró una diferencia estadísticamente significativa que favorecia al grupo en
tratamiento. En cuanto a regeneración de cartílago hialino, se reportó una diferencia
estadísticamente significativa que beneficiaba al grupo tratado, sin embargo, no fue
significativa en términos de la calidad del cartílago. Estos hallazgos sugieren que se
requieren de estudios con mayor nivel de evidencia que faciliten un sustento científico para
establecer un algoritmo de manejo eficaz con MSC para el tratamiento de OA.20 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
Las MSC han mostrado ser seguras, en una revisión sistemática realizada por Lalu et al.
(42) con 1012 participantes que recibieron terapia con MSC intravascular tanto autólogas
como alogénicas para diferentes condiciones, no se identificaron eventos adversos
significativos estadísticamente más que fiebre transitoria, y algunos estudios los pacientes
se siguieron hasta 90 meses. De forma intraarticular las células madre autólogas no
mostraron tener algún potencial de infección, malignidad o muerte en un seguimiento de
21 meses en una revisión sistemática realizada por Peeters et al (43).
1.11 Relación del plasma rico en plaquetas con células
madre mesenquimales.
En los coocultivos de MSC con PRP, se ha demostrado que la disponibilidad y el potencial
proliferativo de las células aumenta de forma directamente proporcional a la concentración
de PRP en la mezcla, de igual forma aumentan los niveles de IL-6, IL-8, IL-10, VEGF e
INF-γ, el efecto que se ha comprobado en varios modelos preclínicos. Por otro lado, se
ha demostrado que la red de fibrina intrínseca del PRP da lugar a un andamiaje
tridimensional que sirve como vehículo de entrega de factores de crecimiento, esta
interacción podría aumentar el potencial de diferenciación celular y aumentar el tiempo de
vida de las MSC (8).
En una revisión sistemática realizada por Rubio-Azpeitia et al. (44), incluyen estudios
realizados in vitro que evalúan la interacción del PRP con las MSC humanas y encuentran
que los concentrados PRP poseían propiedades quimiotácticas que potenciaban la
proliferación de las células de una forma no tumorigénica, preservaban el potencial de
diferenciación celular y no interferían con el linaje de diferenciación. Así mismo, también
preservaban el potencial inmunomodulador de las MSC. Atashi et al. (45) realizaron un
estudio de coocultivo de AD-MSC con diferentes concentraciones de PRP (1%, 10%, 20%,
40% y 60%) por 10 días (PRP con una concentración promedio de 1.2 x 106 ± 120.6
plaquetas/µL), en este estudio se evaluó el potencial de proliferación de las células, el
fenotipo celular, la capacidad de multipotencialidad y la estabilidad cromosómica, y
encuentran que el PRP a una concentración de 20% era la más efectiva aumentando 13.9
veces el número de células comparado con otras concentraciones sin cambiar lasMarco teórico 21
características de las células, por tanto concluyen que las acciones del PRP era dosis
dependiente. Loibl et al. (46), adicionalmente estudiaron el efecto del PRP en tres
diferentes escenarios de centrifugación (1500 rpm por 5 minutos con freno, 1500 rpm por
4 minutos sin freno y 3000 rpm por un minuto sin freno) al suplementarse al 10% y 20% en
coocultivo con AD-MSC, y se evaluó la cinética del ciclo celular de las células y encuentran
que un porcentaje mayor de células se hallaban en fase S del ciclo en los cultivos tratados
con PRP al 20% en comparación del 10%, lo cual sugiere una mayor estimulación de la
proliferación celular, esto es concordante con el análisis de Rubio-Azpeitia (44). Jalowiec
et al. (47), evaluaron la influencia de diferentes concentraciones de plaquetas en las
propiedades reológicas, y liberación de factores de crecimiento en geles preparados con
PRP a diferentes concentraciones de plaquetas (1000 x 103, 2000 x 103, 10000 x 103
plaquetas/µL), descubren que estos cambios de su contenido no modifican las propiedades
reológicas del gel preparado y en todos los casos el PRP mostraba una relación positiva
en la liberación de proteínas siendo esta dosis dependiente. Adicionalmente estudiaron la
interacción del PRP con cultivos de BM-MSC, y precisan que la mayor viabilidad de células
cultivadas al día 7 se presentó con geles preparados a concentraciones de 1000 x 103
plaquetas/µL, proveyendo el mejor ambiente para las células madre.
Existen ya modelos preclínicos de implante de células madre con PRP. En el 2012 Lee et
al. (48), condujeron un estudio con conejos con DO en el surco troclear del fémur y se
aplicó tratamiento con células madre derivadas de sinovial (SD-MSC) en conjunto con PRP
y observan una reparación del defecto con cartílago hialino a las 4, 12 y 24 semanas
cuando se comparó con el grupo control y otro grupo tratado únicamente con PRP. Samuel
et al. (49), en un modelo de conejos con lesiones condrales en el cóndilo femoral medial
de forma bilateral estudiaron si el uso concomitante de PRP y BM-MSC podría tener un
efecto reparativo sinérgico al injertarse en el área del defecto. Al término de un mes de la
lesión se trató la rodilla derecha solo con PRP en el primer grupo, BM-MSC solas en un
segundo grupo, y la combinación de ambos en un tercer grupo. Encontraron a los 3 meses
que el tratamiento con PRP y células madre solas fueron igualmente efectivos respecto al
control en términos de regeneración de cartílago hialino, sin embargo, la combinación de
estos mostró mayores puntajes de reparación condrogénica, además de mayor contenido
de glucosaminoglicanos, estos datos se reprodujeron a los 6 meses post tratamiento.
Desde el punto de vista clínico, la evidencia no es muy amplia y los resultados observados
indican que hay efectos positivos respecto a la analgesia y el estado funcional de los22 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
pacientes. En una revisión sistemática realizada por Shi et al. (50), recopiló 33 trabajos en
donde sólo tres de ellos evaluó la combinación del tratamiento conjunto con MSC más
PRP. En uno de estos (51), no se encontró diferencias en los desenlaces del tratamiento
combinado vs el tratamiento únicamente con PRP, sin embargo, si había mejoría con
ambos tratamientos. En otro trabajo (52) si hubo diferencia en los desenlaces funcionales
y escalas de dolor, con ventaja en el tratamiento combinado vs PRP solo. El trabajo
restante (53) mostró resultados superiores con el implante de MSC únicamente y la
combinación de PRP más MSC, sin embargo, sin diferencias estadísticamente
significativas entre estos. En un estudio adicional realizado por Pintat et al. (25), se evaluó
la seguridad de la administración por inyección guiado por fluoroscopia de AD-MSC en
conjunto con plasma rico en plaquetas (PRP), sin evidenciar ningún efecto adverso, por
otro lado, evaluó el desenlace clínico e imagenológico y revela una mejoría sintomática a
los 6 y 12 meses de seguimiento, en la evaluación por resonancia, sin embargo, no hay
diferencias estadísticamente significativas. Se ha probado su seguridad en series de casos
al usarse conjuntamente con efectos secundarios leves (dolor y edema) y ninguno severo
o grave (50).
La evidencia respecto al uso concomitante del PRP con MSC para manejar DO articulares
nos indica que aparentemente esta combinación tiene un efecto sinérgico respecto al
potencial condrogénico, reparador articular e inmunomodulador. Adicionalmente el PRP
como se ha dicho en repetidas ocasiones provee de una matriz donde pueden depositarse
los distintos tratamientos, la evidencia de estudios en humanos es reducida y se requieren
de más estudios para probar su eficacia.
1.12 Secretoma como alternativa de terapias
regenerativas no celulares
En los últimos años ha surgido un nuevo concepto en medicina regenerativa conocido
como el secretoma, el cual se define como una serie de factores o moléculas secretadas
al espacio extracelular (proteínas solubles, ácidos nucleicos libres, lípidos y vesículas
extracelulares) que ejercen un efecto paracrino en las células y tejidos vecinos. CadaMarco teórico 23
secretoma es específico de cada tipo celular y tejido y puede cambiar de acuerdo con el
estado fisiológico o una condición patológica dada (6).
Para el caso de las MSC, se ha documentado ampliamente que una vez implantadas, su
vida media es muy corta para tener algún impacto en el órgano blanco, sugiriendo que los
efectos terapéuticos de las células madre son principalmente paracrinos. Se ha visto que
los factores secretados por estas células tienen diversos efectos benéficos que modulan
el microambiente, lo que subsecuentemente da lugar a unas condiciones favorables para
la regeneración de los tejidos. Dichos factores constituyen el secretoma presente en el
medio de cultivo de las MSC, que se conoce como medios condicionados (38).
Los MSC-CM han demostrado tener una actividad inmunomoduladora y antiinflamatoria
mediada en parte por moléculas entre las que se encuentran citoquinas antiinflamatorias
(TGF-β1, IL 13, proteína de unión a IL18, Factor neurotrófico ciliar (CNTF), neurotrofina 3
(NT-3), IL10, IL12p70, IL17E, IL27 o antagonista del receptor de IL1 (IL1RA)), y citoquinas
proinflamatorias (IL1b , IL6, IL8, and IL9), cuyo balance en el tejido en cuestión determina
el efecto final. Se ha demostrado que las MSC son capaces de afectar la activación y
proliferación de todas las células del sistema inmune, por ejemplo, pueden inhibir la
proliferación de linfocitos CD4 Y CD8, las células presentadoras de antígenos y la
diferenciación de monocito a macrófago (6). Por otro lado, el secretoma de las MSC tiene
actividad anti apoptótica mediante la producción de proteínas inhibitorias de la apoptosis
(BCL-2, VEGF, CXCL12), y la disminución de la expresión de proteínas proapoptóticas
(por ejemplo, Bax, caspasa – 3).
Contienen además diversos factores de crecimiento que pueden variar de acuerdo con el
tipo celular donde se encuentran. Estos se han utilizado como alternativa para la
reparación tisular y regulación de la angiogénesis mediante la inducción de la proliferación
y migración de células endoteliales, promoviendo la formación tubular y previniendo la
apoptosis celular endotelial. Se ha identificado mediante análisis proteómicos algunas
moléculas con un papel clave del efecto angiogénico como por ejemplo el inhibidor tisular
de metaloproteinasa 1 (TIMP-1), TGF-α, VEGF, factor de crecimiento de hepatocitos
(HGF), IL 6, IL 8 (17), y otros con gran actividad osteogénica por ejemplo BMP, PDFG,
TGF-β, IGF, factor de crecimiento endotelial celular (ECGF), FGF, EGF, entre otros (12).
Un estudio realizado en el 2010 (54) evaluó la proteómica de las proteínas presentes en el
secretoma de las MSC y localiza hasta 187 proteínas, y en presencia de TNF-α hasta 118,
como ejemplos las ya mencionadas. Debido a la complejidad y variedad del secretoma de24 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
las células madre mesenquimales (MSC), se requieren aún más estudios de
caracterización cualitativa y cuantitativa que determine cuales son los principales agentes
relacionados con el potencial terapéutico de los medios condicionados.
In vivo, hay varios modelos animales experimentales. Se ha demostrado ampliamente la
cantidad de aplicaciones de los MSC-CM y sobre diversos tejidos, que revelan efectividad
terapéutica similar al trasplante de células madre (6). En una revisión sistemática realizada
por Bousnaki et al. (55), donde se incluyeron 28 trabajos en modelos preclínicos donde se
indujo OA, en general se obtuvieron resultados positivos utilizando medios condicionados,
exosomas y vesículas extracelulares. Estos evidencian reparación del cartílago en el área
de defecto, y regeneración de este, esto soporta la hipótesis de que las células madre
actúan mediante un efecto paracrino en lugar de una regeneración tisular a partir de la
diferenciación de las MSC en un determinado tejido. Además, cuatro de los estudios
incluidos en la revisión prueban que la aplicación de medios condicionados ejercía un
efecto antiinflamatorio, inmunomodulador (mediante la regulación en la producción de
citoquinas proinflamatorias como IL-1β, IL-6, TNF-α), antiapoptótico (disminuyendo la
síntesis de metaloproteinasas), angiogénico y desde luego regenerativo (cartílago hialino).
En términos de practicidad, la aplicación de todo el secretoma es más costo efectivo
comparado con por ejemplo utilizar las vesículas extracelulares, pues su proceso de
obtención es más complejo con el riesgo de disminuir la concentración de factores que
ejercen ese efecto paracrino. Son pocos los estudios clínicos realizados en humanos, en
una revisión de la literatura (56) sobre el uso de medios condicionados para regeneración
en el sistema músculo esquelético, identifican un solo estudio que involucra humanos en
defectos dentales alveolares que mostraban regeneración ósea sin efectos secundarios
importantes (57). También se disponen hasta el momento de algunos modelos de estudio
clínico en reparación de tejidos en heridas de piel (58) y alopecia (59).
Son varias las ventajas del uso de medios condicionados en terapia regenerativa ya que
resuelve varios problemas presentes en la terapia celular como por ejemplo la
compatibilidad inmunológica, tumorigenicidad, formación de émbolos, o transmisión de
infecciones. Su seguridad puede ser evaluada de forma similar a agentes farmacéuticos
convencionales, puede almacenarse sin la necesidad de agentes criopreservativos tóxicos
y durante un largo periodo sin perder su potencia, su producción como mediosMarco teórico 25
condicionados es más económica y práctica a la hora al aplicarse clínicamente, además
de no tener que someter al paciente a procedimientos invasivos de extracción de muestras
en un sitio donante. Puede producirse en masa bajo condiciones de laboratorio
controladas, el efecto terapéutico obtenido puede modificarse de acuerdo con el efecto
celular específico deseado y finalmente no hay conflictos éticos presentes con el uso de
terapias celulares (6).Metodología 27
Metodología
1.13 Estudios previos
Se realizó una búsqueda en la base de datos de PubMed con palabras clave y con los
siguientes términos MeSH: Mesenchymal Stem Cells, Secretome, Culture Media
Conditioned, Paracrine Communication, Knee joint, Cartilage. Además se realizaron
búsquedas en ScienceDirect y SciELO. En todas las ocasiones se utilizaron los conectores
boleanos AND y OR. Sin embargo, hasta ahora no hay ningún estudio planteado en el cual
se evalúe la eficacia clínica de los medios condicionados de células madre mesenquimales
derivadas de tejido adiposo en una matriz de plasma rico en plaquetas para el tratamiento
de defectos osteocondrales de rodilla de conejo.
1.14 Tipo de estudio
Estudio experimental en modelo animal.
1.15 Población
Se selecciona una población para estudio de 3 especímenes cadavéricos y 22 conejos
machos, de la especie Nueva Zelanda (Oryctolagus cunicullus) de entre 2000 a 4000
gramos con una edad aproximada de 4 a 6 semanas.
1.16 Tamaño de la muestra y grupos de estudio
Conejos vivos: 22.
Especímenes cadavéricos: 3
Se planteó un subgrupo de conejos piloto para estandarización del modelo (Imagen 1):28 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
G1: 3 Cadáveres de conejo o piezas anatómicas (6 rodillas).
G2: 1 Conejo vivo para la aplicación de PRP (1 rodilla).
G3: 1 Conejo vivo para la aplicación de PRP suplementado con AD-MSC-CM (1
rodilla).
Imagen 1. Distribución de subgrupos del grupo piloto
Se plantearon 4 subgrupos de conejos sujetos de estudio (n=20) (Imagen 2):
G1: Grupo sham con 2 conejos sanos.
G2: Grupo control con 6 conejos sanos.
G3: Grupo tratado únicamente con PRP con 6 conejos sanos.
G4: Grupo tratado con PRP suplementado con AD-MSC-CM con 6 conejos sanos.
Imagen 2. Distribución de subgrupos del grupo definitivo.Metodología 29
1.17 Fases del estudio
Se planteó una línea de trabajo de 4 fases: una fase piloto para estandarización de la
técnica quirúrgica y el tratamiento, una segunda fase quirúrgica en los sujetos de estudio
de intervención y aplicación del tratamiento, seguido de una fase postoperatoria de análisis
macroscópico e histológico y finalmente una fase de recopilación de datos, análisis y
publicación de resultados (Imagen 3).
Imagen 3. Diagrama de la línea de trabajo.
1.17.1 Preparación de plasma rico en plaquetas autólogo y
del PRP suplementado con AD-MSC-CM.
Se obtienen muestras sanguíneas de los conejos bajo anestesia, se extraen 5 ml de sangre
de la vena central de la oreja y se colectan en un tubo estéril que contiene una solución de
citrato de sodio al 10%. Se centrifuga la muestra inicialmente a 100 g por 10 minutos se
desecha la fracción eritrocitaria y la fracción leucocitaria se pasa a un nuevo tubo estéril.
Este nuevo tubo se centrifuga nuevamente a 400 g por 10 minutos. Se descarta el
sobrenadante y el precipitado final será el producto para utilizar (Imagen 4).
Imagen 4. Preparación del plasma rico en plaquetas (PRP).30 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
Posteriormente se realiza un recuento plaquetario tanto del conejo como del plasma rico
en plaquetas (PRP) de cada espécimen.
Ahora se toma 1cc de PRP preparado, se adiciona 0.1cc de medio de cultivo DMEM y se
activa con 0.1cc de cloruro de calcio al 10% (Imagen 5).
Imagen 5. Activación del plasma rico en plaquetas (PRP).
Para la preparación del PRP suplementado con AD-MSC-CM se repite el proceso, se toma
1cc de PRP preparado, se adiciona 0.1 cc de medio condicionado y se activa con 0.1cc de
cloruro de calcio al 10% (Imagen 6).
Imagen 6. Activación del plasma rico en plaquetas (PRP)
suplementado con los medios condicionados (AD-MSC-CM).
1.17.2 Obtención y preparación de medios condicionados de
células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo.
Para la obtención de los AD-MSC-CM, se hará uso de los medios ya disponibles en el
almacén biológico del laboratorio del departamento de fisiología de la facultad de medicinaMetodología 31
de la Universidad Nacional de Colombia, preparados de acuerdo con los protocolos
adoptados por el grupo de investigación Biología en Células Madre de la Universidad
Nacional de Colombia (11,60) los cuales corresponden a medios preparados a partir de
células de tejido adiposo humanas obtenidas de un donante. Brevemente Las AD-MSC
fueron aisladas de tejido adiposo extraído de 3 madres donantes voluntarias sometidas a
parto por cesárea. Se cultivaron hasta un 70% de confluencia, se lavaron y nuevamente
se cultivaron por 24 horas. Después de 24 horas se recolectaron los medios condicionados
se centrifugaron y se recuperó el sobrenadante, se realizó posteriormente un análisis de
los factores de crecimiento detectados (12) (Imagen 7).
Imagen 7. Obtención de los medios condicionados (AD-MSC-CM).
1.17.3 Procedimiento quirúrgico
Bajo anestesia general se rasura la extremidad inferior derecha, se realiza asepsia y
antisepsia, se efectúa una artrotomía de la rodilla mediante un abordaje parapatelar medial,
se luxa la patela lateralmente exponiendo la superficie articular de los cóndilos femorales.
En el grupo sham se ejecuta únicamente la artrotomía, sin realizarse la lesión osteocondral.
En los grupos subsiguientes se genera un defecto osteocondral cilíndrico de espesor
completo en el surco troclear con una trefina de 5mm de diámetro y a una profundidad de
3 mm, un segundo defecto de similares características se realiza en el cóndilo femoral
medial. Una vez ejecutado esto, se lava la articulación con solución salina estéril.
Tanto el PRP solo, como el PRP suplementado con medios condicionados se preparan
simultáneamente al procedimiento quirúrgico. Se efectúa el cierre de la herida por planos.
Se cubre las heridas con vendaje y gasas estériles.32 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
Los conejos se dejan con antibiótico endovenoso por 3 días consecutivos. No se realiza
ningún tipo de inmovilización rígida y se les permite moverse libremente en sus jaulas. Se
realiza un monitoreo del estado de cicatrización durante la primera semana. Si lo ameritan
curaciones con yodopovidona o clorhexidina.
1.17.4 Estandarización del método de administración del
tratamiento
Al no existir modelos experimentales similares, en la fase piloto se contemplan dos conejos
con supervivencia para estandarizar el método de aplicación del tratamiento. En cada caso,
de 5ml de sangre, se obtienen 1cc de PRP aproximadamente.
En el grupo piloto, el conejo denominado G2 se administra el PRP activado, es decir se
toma 1cc de PRP preparado, se adiciona 0.1cc de medio de cultivo DMEM y se activa con
0.1cc de cloruro de calcio al 1%. Una vez realizado esto, inmediatamente se administra el
tratamiento contenido en una jeringa de 1cc, con un volumen total aproximado de 1.2cc.
Lo anterior con la rodilla cerrada por planos, se administrará el volumen total a manera de
infiltración en la rodilla, de esta forma se espera que se forme un coagulo homogéneo
intraarticular que se distribuye por la rodilla (Imagen 8).
Imagen 8. Infiltración del plasma rico en plaquetas (PRP).
En el grupo piloto, el conejo denominado G3 se administra el tratamiento con el PRP ya
activado de manera que se espera obtener un producto final con una parte en fase liquidaMetodología 33
y otra parte en forma de coagulo. Es decir, se toma 1cc de PRP preparado, se adiciona
0.1cc de AD-MSC-CM y se activa con 0.1cc de cloruro de calcio al 1%. Se permite la
formación del coagulo durante 20 minutos lo que permite manipular el PRP y administrarlo
directamente en el defecto osteocondral creado, se cierra la rodilla por planos tal como se
menciona en el apartado del procedimiento quirúrgico y finalmente se administra a manera
de infiltración el restante liquido del preparado final como para el primer conejo (Imagen
9).
a. b. c.
.
Imagen 9. Implante de plasma rico en plaquetas (PRP). a. 1ml de PRP. b. Coagulo de PRP listo para ser implantado. c.
Coagulo de PRP implantado en el defecto osteocondral (DO).
1.17.5 Análisis patológico
Análisis macroscópico
Una vez estandarizada la técnica quirúrgica y el método de administración del tratamiento,
se repite el proceso en los 20 conejos restantes. Después de 12 semanas del momento
quirúrgico se sacrifican todos los conejos con una sobredosis de sedación, y se extrae
quirúrgicamente el fémur distal tomando los últimos 3 cm por encima de los cóndilos. Dos
evaluadores patólogos de forma cegada determinan el grado de regeneración condral
según el puntaje macroscópico de la sociedad internacional de reparación de cartílago
(ICRS) (61). Para cada categoría de este se puntúa de 0 a 3 con un puntaje total perfecto
de 12 (Tabla 1). Para determinar la confiabilidad de esta evaluación se realiza una
asignación cegada y se procede a un análisis de correlación Inter observador y se deja un
registro fotográfico de las lesiones.34 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
Tabla 1 International Cartilage Repair Society (ICRS) macroscopic evaluation of cartilage repair. Tomado
de van den Borne. 2007.p 1398.
Categories Scores
Degree of defect repair
In level with surrounding cartilage 4
75% repair of defect depth 3
50% repair of defect depth 2
25% repair of defect depth 1
No repair of defect depth 0
Integration to border zone
Complete integration with surrounding cartilage 4
Demarcating border-1 mm 3
Three-quarters of graft integrated, one-quarter with a notable border-1 mm 2
in width
One-half of graft integrated with surrounding cartilage, one-half with a 1
notable border-1 mm
From no contact to one-quarter of graft integrated with surrounding 0
cartilage
Macroscopic appearance
Intact smooth surface 4
Fibrillated surface 3
Small, scattered fissures or cracks 2
Several small or few large fissures 1
Total degeneration of grafted area 0
Overall repair assessment
Grade I: normal 12
Grade II: nearly normal 8-11
Grade III: abnormal 4-7
Grade IV: severely abnormal 1-3
Análisis microscópico
El protocolo de preparación de los especímenes y tinción de estos se efectúa de acuerdo
con las pautas recomendadas por la sociedad internacional para reparación del cartílago
(ICRS) (62), para valoración histológica para estudios de reparación de cartílago en
modelos animales y ensayos clínicos.
Los fémures, sin tejidos blandos asociados, se fijan con solución al 10% de formaldehido
durante 4 días, a continuación, se decalcifican en una solución de ácido clorhídrico 0.5
normal a 4°C durante 10 días. El proceso de decalcificación se verifica perforando el hueso
subcondral usando una aguja calibre 26. Una vez decalcificados, se extraen del defecto
reparado dos muestras de menos de 0,5 cm de grosor, las cuales se toman en distintosMetodología 35
niveles debido a la heterogeneidad del tejido reparado; posteriormente se criopreservan
las muestras. De cada tejido se realiza tinción con hematoxicilina y eosina, azul de toluidina
así como inmunohistoquímica para colágeno tipo I (anticuerpo monoclonal I-8H5) y
colágeno tipo II (anticuerpo monoclonal II-II6B3).
De las muestras teñidas con hematoxicilina y eosina se evalúa la estructura general del
tejido y la celularidad haciendo uso de microscopio de luz. Con microscopio de luz
polarizada se determina la distribución de las fibras de colágeno.
De las muestras teñidas con Azul de toluidina se determina la presencia de
glucosaminoglucanos sulfatados (tinción púrpura) y la presencia de matriz colágena
(tinción azul).
La evaluación de la regeneración se lleva a cabo por dos evaluadores cegados según los
14 criterios histológicos contemplados en el nuevo sistema de puntaje histológico de la
sociedad internacional para reparación de cartílago (ICRS-II por sus siglas en inglés) (63).
Cada criterio histológico es evaluado de acuerdo con la escala visual análoga graduada
de 0 a 100; asignándose 100 para las muestras que cumplan las características
histológicas definidas para regeneración condral y 0 para la ausencia de regeneración
condral (Tabla 2).
Tabla 2 International Cartilage Repair Society (ICRS) II Parameters. Tomado de Mainil.
2010.p 883
Histological Parameter Score
1. Tissue morphology (viewed under 0%: Full-thickness collagen fibers.
polarized light). 100%: Normal cartilage birefringence.
2. Matrix staining (metachromasia). 0%: No staining.
100%: Full metachromasia.
3. Cell morphology. 0%: No round/oval cells.
100%: Mostly round/oval cells.
4. Chondrocyte clustering (4 or more 0%: Present.
grouped cells). 100%: Absent.
5. Surface architecture. 0%: Delamination, or major irregularity.
100%: Smooth surface.
6. Basal integration. 0%: No integration.
100%: Complete integration.
7. Formation of a tidemark. 0%: No calcification front.
100%: Tidemark.36 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
Tabla 2 (Continuación) International Cartilage Repair Society (ICRS) II Parameters.
Tomado de Mainil. 2010.p 883
Histological Parameter Score
8. Subchondral bone abnormalities/marrow 0%: Abnormal.
fibrosis. 100%: Normal marrow.
9. Inflammation. 0%: Present.
100%: Absent.
10. Abnormal calcification/ossification. 0%: Present.
100%: Absent.
11. Vascularization (within the repaired 0%: Present.
tissue). 100%: Absent.
12. Surface/superficial assessment. 0%: Total loss or complete disruption.
100%: Resembles intact articular
cartilage.
13. Mid/deep zone assessment. 0%: Fibrous tissue.
100%: Normal hyaline cartilage.
14. Overall assessment. 0%: Bad (fibrous tissue).
100%: Good (hyaline cartilage).
Para establecer el grado de diferenciación hacia cartílago hialino mediante
inmunohistoquímica se toma como marcador la presencia de colágeno tipo II en la muestra
evaluada. La presencia de colágeno tipo I y II como marcador de fibrocartílago y la
presencia de colágeno tipo I como marcador de tejido fibroso. De forma aleatoria se
seleccionan 5 campos a una magnificación microscópica de 200 x y se determina la
presencia o no de la reacción fluorescente para cada caso.
En todos los casos se realiza un consenso por parte de los evaluadores cuando existen
discrepancias dadas por una diferencia mayor a 30% en los puntajes asignados a cada
muestra, con el fin de aumentar la objetividad del estudio. Para el análisis estadístico, los
datos de los evaluadores son promediados.
1.17.6 Análisis de resultados
Fase pilotoMetodología 37
Con el fin de estandarizar el modelo propuesto se establece un análisis preliminar en este
subgrupo con las siguientes variables:
- Estandarización de la técnica quirúrgica en especímenes cadavéricos.
- Estandarización del método de administración del tratamiento con PRP y PRPR
suplementado con AD-MSC-CM.
- Descripción de complicaciones en herida al día 2 y al día 7 (presente o ausente).
- Dolor, malestar y angustia (Primeras 72 horas postoperatorio). Esta se realizó
mediante escalas estandarizadas y aplicadas por personal veterinario del Bioterio
de la Universidad Javeriana (Anexo 1).
- Criterios de punto final. Se aplica esta escala siguiendo la escala de dolor, malestar
y angustia, si el animal presenta un puntaje mayor a 4 se realiza la eutanasia de
este. Escala estandarizada y aplicada por personal veterinario del CICUA de la
Universidad Javeriana (Anexo 2).
- Evaluación del tratamiento aplicado: a los siete días se hace una descripción
macroscópica de lo observado en el líquido articular y en la superficie articular del
fémur.
Variables de desenlace
Las dos variables de desenlace principal son la formación de una cicatriz de cartílago en
el área de defecto articular y la caracterización a cartílago hialino.
- Regeneración condral según el puntaje macroscópico de la sociedad internacional
de reparación de cartílago (ICRS): Escala de 0 a 12, siendo el 12 puntuación más
alta en términos de reparación del cartílago que evalúa el porcentaje de reparación
del defecto, la integración de este a la zona del borde del defecto y su apariencia
macroscópica.
- Regeneración condral según los 14 criterios histológicos contemplados en el nuevo
sistema de puntaje histológico de la sociedad internacional de reparación de
cartílago (ICRS-II): Escala de 0 a 100, siendo 100 la puntuación más alta en
términos de reparación del cartílago.
- Diferenciación del tipo de cartílago según la relación del número promedio de
células positivas por campo óptico tanto para la tinción de colágeno tipo I, como
para colágeno tipo II: predominio de colágeno tipo II para cartílago hialino, colágeno
tipo I y II para fibrocartílago y colágeno tipo I como marcador de tejido fibroso.38 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
Variables de control
- Recuento plaquetario según el número de plaquetas por microlitro en sangre
venosa periférica del animal y conteo plaquetario en el PRP de cada animal.
Análisis estadístico
Para el análisis estadístico, los datos de los evaluadores son promediados y expresados
como la media y su respectiva desviación estándar. La varianza de los resultados se realiza
según la prueba de ANOVA, se analiza registrando los datos en el software EXCEL®
(Microsoft 365®). Se considera un valor de P estadísticamente significativo < 0.05.
1.18 Aspectos éticos
Este estudio se ciñe a los lineamientos de la normativa nacional dispuestos en la Ley No.
84 de 1989: "Por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los Animales y
se crean unas contravenciones y se regula lo referente a su procedimiento y competencia",
particularmente el Capítulo Sexto: Del Uso de Animales Vivos en Experimentos e
Investigación (64). De igual forma siguiendo la normativa dispuesta en la resolución 8430
de 1993 del Ministerio de Salud donde resuelve en el titulo V la investigación biomédica
con animales (65).
El presente trabajo, fue avalado por el comité de ética de la Facultad de Medicina de la
Universidad Nacional de Colombia, y se lleva a cabo en el bioterio de la Universidad
Javeriana, en donde fue sometido a un segundo Comité Institucional de Cuidado y Uso de
Animales bajo el Formato de Uso de Animales de laboratorio (CICUA) con Formato de Uso
de Animales (FUA) No. 118-21 con el fin de asegurar el mínimo sufrimiento animal. El
bioterio cuenta con los servicios de quirófano, cuidado y evaluación postoperatoria de los
conejos durante la duración del estudio a fin de optimizar al máximo la comodidad y
cuidado de los animales mientras dura el estudio. Así mismo se establecen los criterios de
punto final.
No existen conflictos de interés.Resultados 39
Resultados
1.19 Fase Piloto.
1.19.1 Estandarización de la técnica quirúrgica
Esta se ejecutó en los especímenes cadavéricos. Tal como se estableció en la
metodología, se produjo una incisión sobre la línea media de la rodilla determinando un
tamaño entre 3 y 3.5 cm que permite exponer adecuadamente el mecanismo extensor
(Imagen 10).
a b
. .
Imagen 10. Incisión. a. Diseño de Incisión sobre la línea media de la rodilla. b. Exposición del tendón patelar.
La artrotomía se definió con un abordaje parapatelar medial desde la unión miotendinosa
del vasto medial siguiendo el borde medial del tendón patelar hasta su inserción en la tibia
(Imagen 11).40 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
Imagen 12. Abordaje parapatelar medial.
La luxación lateral de la patela permite exponer adecuadamente los cóndilos femorales y
la escotadura cuando se realiza una flexión completa de la rodilla (Imagen 12).
Imagen 11. Luxación lateral de la patela y exposición
de los cóndilos femorales.
Se determino que 2 lesiones osteocondrales de 5mm de diámetro son muy grandes para
el tamaño promedio de la superficie articular del fémur del conejo en el tipo de población
escogida tal como se muestra en la imagen 13 donde se observa una fractura del cóndilo
femoral lateral.Resultados 41
a. b.
Imagen 13. Especímenes cadavéricos. a. Superficie articular de los cóndilos femorales. b. La imagen muestra un
defecto osteocondral (DO) de 5mm de diámetro, la pinza señala una fractura del cóndilo femoral lateral.
Por lo tanto, se redujo el tamaño de la lesión a 4mm de diámetro con una profundidad de
3mm para asegurar el compromiso del hueso subcondral (imagen 14).
a. b. c.
Imagen 14.Creación del defecto osteocondral (DO). a. Trefina de 3.5 mm de diámetro para realizar los
DO. b. Defecto de 3mm de profundidad. c. Defecto de 4mm de diámetro.
Se evidenció además que al escoger el cóndilo femoral lateral como sitio para la artrotomía
había una inestabilidad biomecánica en valgo, en tal sentido, en los ensayos subsiguientes42 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
se eliminó esta zona para realizar el DO y se escogió únicamente el surco troclear como
sitio para formalizar el DO.
Dado que el defecto creado queda en el trayecto en el que discurre la patela, pudimos
observar un bloqueo en la flexoextensión de la rodilla con un resalto debido a que la patela
se bloqueaba en el defecto osteocondral creado; así que se estandariza la posición de este
justo al lado de la inserción del tendón del extensor digitorium longus, lo que posiciona el
defecto hacia la escotadura intercondílea permitiendo dejar el defecto en una superficie
cartilaginosa (Imagen 15).
a. b.
Imagen 15. Localización del defecto osteocondral (DO). A. La pinza muestra el lugar de
la perforación medial al tendón del extensor digitorium longus. B. DO creado
1.19.2 Presencia de signos inflamatorios locales o
dehiscencia en la herida.
Se revisaron las heridas a los dos días y siete días postoperatorio en los dos conejos con
supervivencia, sin evidencia de signos inflamatorios locales ni dehiscencia (Imagen 16).Resultados 43
Imagen 16. Evolución de la cicatrización de la herida. (Dia del procedimiento: Día 0).
1.19.3 Dolor, malestar y angustia
Estos aspectos se evaluarion los primeros 3 días del postoperatorio y al día 5, y se observó
que como única condición asociada al dolor o malestar era una marcha con cojera y
perdida de la tendencia a correr en los dos conejos (PRP y PRP + AD-MSC-CM). El conejo
tratado con PRP mostraba una disminución en la tendencia a morder (Ver anexo 1).
1.19.4 Criterios de punto final
No se evidenciaron durante el seguimiento signos clínicos que indiquen la necesidad de
realizar eutanasia en ningún conejo (Ver anexo 2).
1.19.5 Evaluación del tratamiento aplicado
Conejo tratado con PRP (G2): al día 7 de administrado el tratamiento se realizó la
eutanasia del animal y se realiza la artrotomía de la rodilla por la misma vía de abordaje
previo observándose completamente la articulación.44 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
Se observa un líquido articular cetrino con un aumento en la viscosidad de
aproximadamente 0.5cc. En la superficie articular del fémur se ve el defecto osteocondral
con un coagulo hemático, sin embargo, no hay cambios estructurales macroscópicos
(Imagen 17).
a. b.
Imagen 17. Evaluación del tratamiento aplicado (PRP). a. Tratamiento contenido intraarticular. b.
Defecto osteocondral (DO) sin cambios al día 7 (Dia del procedimiento: día 0).
Conejo tratado con PRP suplementado con AD-MSC-CM (G3): al día 7 de administrado
el tratamiento se ejecutó la eutanasia del animal y se lleva a cabo la artrotomía de la rodilla
por la misma vía de abordaje previo observándose completamente la articulación.
Se identifica un líquido articular cetrino con aumento en la viscosidad del cual se obtienen
aproximadamente 0.2cc. En la superficie articular del fémur se distingue el defecto
osteocondral creado con la formación de un tejido blanquecino brillante, de consistencia
elástica en continuidad con el borde del defecto en el cartílago articular rellenando
aproximadamente un 60% del total del defecto, al retirarse, este tejido midió 4mm de
diámetro y 1 mm de ancho (Imagen 18).
a. b. c.
Imagen 18. Evaluación del tratamiento aplicado (PRP + AD-MSC-CM). a. Tratamiento contenido intraarticular.
b. defecto osteocondral (DO) con cambios morfológicos al día 7 mostrando cicatrización (Dia del
procedimiento: Dia 0). c. Tejido tomado del DO.Discusión 45
Discusión
La pérdida del cartílago articular en el ser humano por trauma o de tipo degenerativo (OA)
es una condición bastante común, y existen múltiples tratamientos que intentan reducir el
dolor, mejorar la función y hasta recuperar el cartílago articular (7,27), sin embargo, el
hecho que existan múltiples tratamientos indica que posiblemente ninguno de estos ha
logrado ser el ideal para manejar este tipo de lesiones. Por esta razón el desarrollo de
técnicas novedosas y la optimización de las técnicas actuales deben enfocarse en la
investigación desde las ciencias básicas para poderse aplicar posteriormente en ensayos
clínicos.
El presente documento muestra resultados preliminares de la fase piloto, la cual busca
estandarizar el modelo de DO en conejos y el tratamiento propuesto con el fin de evaluar
a posteriori la capacidad condrogénica del PRP y del PRP suplementado AD-MSC-CM.
1.20 El conejo como modelo de defecto osteocondral en
rodilla
Han sido diversos los modelos animales utilizados para el estudio de DO (26). El modelo
propuesto en conejos es uno de los modelos aminales más utilizados, dado que tienen un
tamaño articular en la rodilla más grande que los roedores pequeños, las propiedades
subcondrales de la tróclea articular son similares al cóndilo femoral medial del humano, y
no tienen la limitante de los altos costos de mantenimiento y manejo que tienen los
animales más grandes. La limitante de estos es su pequeño tamaño en la articulación.
Desde el punto de vista morfológico, una desventaja de este modelo es el delgado espesor
del cartílago articular, con un promedio de 0.44 +-0.08 mm para el surco troclear y 0.3 +-
0.07mm para el cóndilo femoral medial. También la diferencia en la biomecánica articular
con el humano, ya que al evaluarse el patrón de marcha se identifica que debido a la gran46 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
variedad de patrones de aterrizaje durante el salto hay un aumento de las fuerzas en la
articulación tibio femoral lateral con un promedio de 303.8% del peso, mientras que en la
medial un 262.3%. Además, las rodillas del conejo están principalmente en flexión, a
diferencia de las del humano que está principalmente bloqueada en extensión (66).
Está documentado que el conejo exhibe una mayor capacidad de cicatrización espontánea
intrínseca en el cartílago, esto probablemente porque los conejos tienen una tasa
metabólica alta, y se ha visto que tienen una densidad mayor de células madre
pluripotenciales cerca al cartílago articular al compararse con otras especies de mayor
tamaño. Se ha estimado que la densidad celular del cóndilo femoral medial humano es de
aproximadamente 1.7%, mientras que en el conejo adulto es de 12.2%, lo que indica una
menor probabilidad de reparación en el cartílago hialino en el humano (67).
Pese a todo, los conejos son una herramienta muy útil para la evaluación del principio a
investigar, permiten evaluar la seguridad del tratamiento y otras variables como
degradación, biocompatibilidad, interacción con los tejidos antes de pasar a animales más
grandes o estudios clínicos. Animales grandes tienen inconvenientes de costos, mayor
duración de los estudios y hasta permisos éticos.
1.21 Determinación del tamaño y ubicación del defecto
osteocondral
El tamaño crítico del defecto osteocondral indica el tamaño más pequeño (en diámetro) en
el que el animal no puede repararlo espontáneamente. Dentro de los protocolos
estudiados, observamos que en aquellos estudios en los que se utiliza como modelo la
rodilla del conejo, se establece como tamaño crítico del defecto 3mm, no obstante, se ha
puesto en duda este tamaño pues se ha reportado cicatrización espontanea, por tanto, se
aconsejan diámetros de 4 a 5 mm (66). Durante los ensayos pudimos ver que defectos de
5mm generaban fracturas de los cóndilos, así pues, para nuestro modelo definimos un
defecto de un tamaño de 4mm de diámetro y 3 mm de profundidad.
El tamaño del defecto tiene implicaciones en la capacidad condrogénica del tratamiento
como lo demuestra Higa et al., en donde utilizaron un gel compuesto por acido poli (2-Discusión 47
acrilamido-2-metilpropano sulfónico) (PAMPS) y poli (N,N’-dimetil acrilamida) (PDMAAm)
en DO de 2.5 mm, 4.3mm y 5.8 mm de diámetro, ellos encontraron en todos los casos
regeneración de cartílago con respecto al control, sin embargo la formación de este era
más rápida en los defectos más pequeños en todos los casos (68).
En nuestro ensayo se pudo ver que dos defectos osteocondrales en la misma rodilla
podrían resultar demasiado mórbidos para la rodilla, de igual manera el tamaño y
profundidad de este, un defecto demasiado grande podría alterar la mecánica normal de
la rodilla, así mismo la ubicación de este, dando lugar a una mayor limitación funcional
pudiendo afectar el desenlace postoperatorio. Por otro lado, teniendo en cuenta el tamaño
de los cóndilos femorales, no escogimos estos como sitio para generar el defecto pues el
tamaño escogido (4mm) daba lugar a una alteración de la mecánica de la rodilla durante
la flexoextensión que podría interferir con la rehabilitación. Esto dejó como opción la
realización del defecto en el surco troclear, inicialmente propuesta en la mitad de este, sin
embargo notamos que la patela se bloqueaba en el defecto ocasionando un resalto durante
la excursión patelar con la flexoextensión de la rodilla, por consiguiente definimos que la
localización del defecto que menos influía en la excursión patelar, era al lado de la inserción
del tendón del extensor digitorium longus, esta ubicación permite dejar el defecto posterior
en el surco y sobre una superficie con un adecuado recubrimiento de cartílago.
1.22 Estandarización de la administración del tratamiento
En medicina regenerativa, sin importar el método que se escoja para la regeneración
condral, uno de los grandes problemas para tener en cuenta es el método de aplicación
del tratamiento, pues debe asegurarse que el tratamiento cumpla su actividad terapéutica,
que este permanezca en el área a tratar durante el tiempo suficiente y que no intervenga
en la funcionalidad de la articulación o que su potencial terapéutico no se afecte por la
funcionalidad de esta. El reto se encuentra en asegurar la máxima eficacia y predictibilidad
al tiempo que se reducen los riesgos de presentar efectos adversos.
Con el objetivo de entregar localmente ya sean células o factores de crecimiento se han
ideado múltiples técnicas como por ejemplo sistemas de andamiaje sintéticos o híbridos
los cuales se basan en carbohidratos como por ejemplo (alginato, quitosano, ácido
polilactico/ poliglicólico, agarosa y ácido hialurónico). Estos andamiajes, aunque no tienen
una actividad biológica importante, tienen como objetivo simular a estructura y función del48 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
tejido nativo, permitir la proliferación celular y mostrar unas propiedades mecánicas
similares al cartílago hialino nativo (69).
Teniendo en cuenta esta ventaja estructural que ofrecen estos andamiajes, se han
realizado ensayos en los que han podido explotarse estas características. Un estudio in
vitro realizado por Yin et al. (70), con geles de agarosa enriquecido con PRP cultivados
con condrocitos porcinos encontró a la microscopia electrónica una estructura uniforme,
porosa con una supervivencia del 100% de los condrocitos a los 28 días del cultivo,
además con una mayor adherencia de los condrocitos en el ensayo con PRP que el control
con el andamiaje en agarosa puro. Zhang et al. (71), desarrollaron un andamiaje en PLGA
a manera de una bicapa para semejar la estructura del cartílago y el hueso subcondral
para ser implantados en DO en conejos y realizaron ensayos con un grupo control, un
grupo únicamente con el PLGA y otro con PLGA + PRP activado y encontraron unos
puntajes mayores en la apariencia microscópica e histológica del grupo tratado con el
andamiaje de PLGA y el PRP demostrando que el PRP mejoraba la reconstrucción de los
DO en conejos. En un ensayo in vitro realizado por Li et al. (72) aprovechan otro
biopolímero susceptible de manejarse con la tecnología de impresión en 3D, ellos
incorporaron PRP en diferentes concentraciones (12.5%, 25%, y 50%) a andamiajes
construidos en fibroína de seda para determinar la tasa de regeneración de cartílago
cultivado de la superficie articular de fémur de conejo, determinaron que los andamiajes
construidos poseían buenas propiedades biomecánicas, una tasa de degradación
aceptable y mostraron una adecuada proliferación de los condrocitos en aquel grupo que
se trató con 50% de PRP que en aquellos con los andamiajes de fibroína solo. Una revisión
sistemática de 14 estudios (73) en animales nivel III y IV acerca de la evaluación del PRP
como coadyuvante en regeneración condral en andamiajes o implantes sintéticos, 10 de
estos reportaron efectos positivos, 2 mostraron efectos negativos y 2 mostraron que no
había cambios o la diferencia no era significativa al compararse con otros tratamientos, sin
embargo, los métodos de preparación de PRP eran diferentes entre los estudios y una
comparación entre estos no era posible.
Estos andamiajes han demostrado ser de utilidad en la entrega de otras fuentes de factores
de crecimiento como es el caso de las MSC (29). Beigi et al. (74), utilizaron un andamiaje
tridimensional en alginato suplementado con PRP y AD-MSC para reparación de cartílagoDiscusión 49
articular. In vitro las AD-MSC pudieron diferenciarse hacia cartílago maduro evaluado por
la expresión de marcadores específicos de cartílago. In vivo en un modelo de DO en ratón
a las 8 semanas, los conejos tratados con el andamiaje en alginato con PRP y AD-MSC
mostraban condrocitos funcionales con una matriz inmadura y, a las 16 semanas
mostraban una matriz de cartílago hialino homogénea e integrada con el tejido nativo, los
andamiajes solos formaron fibrocartílago y el control (sin tratamiento) no genero un
cartílago continuo. Otros autores han ido más allá tratando de adicionar al tratamiento la
rehabilitación mostrando resultados aun mejores (30).
Otro tipo de andamiajes son los que podrían llamarse biológicos, su estructura permite
cierto grado de manipulación, permiten entregar factores de crecimiento directamente, sin
embargo, estructuralmente no exhiben unas características que sean similares al tejido
nativo. Ejemplos de estos son el PRP, la fibrina rica en plaquetas (PRF), los agregados de
gránulos plaquetarios y los coágulos inducidos en el sitio directamente.
En el PRP la polimerización del fibrinógeno en fibrina, le permite adquirir esa estructura
semirrígida. El efecto biológico estará determinado por la identidad del factor de
crecimiento, concentración, duración y la presencia de otras moléculas como por ejemplo
PDGF. Estas características le permiten producir un andamiaje tridimensional autólogo. La
liberación de los factores de crecimiento dependerá de varios factores, por ejemplo, la tasa
de liberación de los gránulos plaquetarios, la mecánica difusora de los factores de
crecimiento a través de la red de fibrina, las propiedades mecánicas de la red en sí misma
y la tasa de degradación de esta para la liberación de los factores. La naturaleza adhesiva
del PRP además facilita la manipulación y la aplicación a biomateriales dentro de los que
se han estudiado materiales, orgánicos, inorgánicos e híbridos (75).
En nuestro ensayo, pudimos darnos cuenta de que aparentemente el PRP aplicado de
forma infiltrativa continuaba intraarticular en la rodilla a los 7 días, no obstante, este tenía
una consistencia liquida viscosa. Mientras tanto el PRP que se administró en el defecto
creado con los medios condicionados en forma de coagulo aparentemente había cambiado
su composición en el defecto, mostrando el inicio de una cicatriz.
Teniendo presente el comportamiento que exhibe el coagulo de fibrina obtenido en nuestro
ensayo, determinamos como mejor vía de administración del tratamiento la manipulación
del coagulo para el implante directo en el DO y, la porción en fase liquida del preparado
administrarla de forma infiltrativa con la rodilla cerrada, ya que observamos una adecuada50 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
contención del coagulo en el defecto. Slimi et al. (76), realizaron un ensayo con 24 rodillas
de conejo, 12 manejadas con PRP en forma de coagulo y 12 sin tratamiento, se comparó
su capacidad condrogénica en defectos osteocondrales a las 3 y 12 semanas
observándose tejido reparado con cartílago hialino en el grupo tratado con PRP, mientras
que se formó fibrocartílago en el grupo sin tratamiento, estos resultados se evaluaron
macroscópicamente y mediante resonancia observándose las superficies reparadas.
La preparación de los coágulos de PRP como andamiajes en defectos osteocondrales se
ha diseñado también para humanos como lo muestra Vinod et al. (77); este estudio es un
ensayo in vitro que determino que el PRP podría ser una estructura de andamiaje con
bioactividad sinérgica en proliferación celular, viabilidad celular y producción de matriz
extracelular. Ellos tomaron muestras de cartílago de rodillas con osteoartrosis de 3
voluntarios humanos que se sometieron a reemplazo de rodilla, se aislaron, cultivaron y
expandieron células condroprogenitoras. Luego de otros tres voluntarios humanos tomaron
PRP y lo activaron formando un gel el cual se coocultivo con las células condroprogenitoras
de cartílago, estos cooultivos lograron ser capaces de mostrar diferenciación adipogénica,
osteogénica y condrogénica bajo cada estimulo de cultivo y aquellas que mostraron
diferenciación condrogénica lograron además producir matriz extracelular y mantuvieron
su viabilidad durante el tiempo que se cultivaron.
1.23 PRP como sistema de andamiaje para
administración de factores de crecimiento
Una de las aplicaciones más frecuentes para los factores de crecimiento que liberan las
MSC. En el presente estudio planteamos una matriz de PRP usada como vehículo
sinérgico que pueda entregar los factores de crecimiento presentes en los AD-MSC-CM.
Se observa que, a los siete días postoperatorio, el DO del conejo que se trató con PRP
infiltrado no presentaba ningún tipo de cambio morfológico grande, sin embargo, el
tratamiento aparentemente parecía seguir contenido intraarticular como se mencionó
anteriormente.Discusión 51
Por otro lado, el DO del conejo tratado con PRP en forma de coagulo suplementado con
los AD-MSC-CM mostraba cambios en su composición, pues a los 7 días de su
administración mostraba características de cicatrización en el defecto creado rellenando
parcialmente el mismo con un tejido blanquecino brillante, de consistencia elástica en
continuidad con el borde del defecto en el cartílago articular. Al tratarse de la fase piloto
del estudio, no realizamos una caracterización histopatológica de este tejido, sin embargo,
en la siguiente fase se plantea una caracterización morfológica macroscópica y
microscópica.
Esto nos induce a pensar que probablemente el PRP sirva no solo como un sistema de
andamiaje biológico y vehículo de entrega de factores de crecimiento, sino que también
podría estar actuando de forma sinérgica con el AD-MSC-CM al mostrar un grado más
avanzado de cicatrización.
En otros ensayos con PRP diseñado como vehículo de entrega de factores de crecimiento,
Berninger et al. (78), desarrollaron un protocolo en conejos para realizar implante de
células BM-MSC en coágulos de fibrina capaces de diseñarse del mismo tamaño que el
DO dejado de tal manera que puede implantarse sin dejar hendiduras entre el implante y
el tejido que lo rodea. A las 12 semanas notaron una cicatrización con un tejido
suficientemente rígido y de una superficie homogénea al tejido alrededor de este. De forma
similar, Lee et al. (48) trataron DO de conejo con SD-MSC en un gel de PRP activado y lo
compararon con el PRP solo y el grupo control, encontraron que a las 24 semanas existía
un tejido fibroso en el grupo control, mientras que en los otros dos grupos se repararon con
cartílago hialino, no obstante, la regeneración del tejido fue incompleta en el grupo tratado
únicamente con PRP. Recientemente otros autores (79) encontraron en el flujo menstrual
una fuente significativa de MSC sanguíneas de tal forma que las asilaron y las aplicaron
en conjunto con un coagulo de PRP activado y lo compararon con PRP solo y con el control
sin tratamiento; a las 12 semanas identificaron que el grupo tratado con PRP + MSC
rellenaban el defecto con cartílago hialino con una adecuada integración cuando se
comparaban con los otros grupos, sin embargo, no hubo diferencias a las 24 semanas.
Una revisión sistemática de 17 artículos realizada por Chona et al. (80), sugiere que el
PRP y los concentrados de medula ósea pueden mejorar los resultados del manejo de los
DO de la rodilla cuando se manejan con un andamiaje, aunque son diversas la formas en
las que se utilizan estas aumentaciones biológicas, por lo tanto, los estudios no son
comparables entre sí y se requiere de más ensayos.52 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
Una de las limitantes para estandarizar el método de preparación del plasma rico en
plaquetas es la variada disponibilidad de literatura en donde plantean diferentes métodos
de preparación de este (81,82).
Nuestros resultados son presentados en esta fase únicamente a los 7 días, tiempo en el
cual llama la atención que ya se observan cambios morfológicos grandes en el defecto
osteocondral creado, sin embargo, no trabajamos conclusiones al respecto sin el debido
estudio histopatológico.
1.24 Nuevos andamiajes biológicos derivados del PRP
Bajo esta premisa de los andamiajes en fibrina, recientemente se han descrito otros
derivados plaquetarios como andamiajes fisiológicos, este es el caso de la fibrina rica en
plaquetas y leucocitos (L-PRF) y la fibrina rica en plaquetas (PRF) los cuales se han
categorizado como protocolos de preparación más fáciles, baratos y rápidos pues una de
las facilidades en su preparación es que no requiere de anticoagulantes y por ese hecho
tampoco activadores plaquetarios, dejando estas matrices más fisiológicas (83), a este tipo
de derivados plaquetarios se les ha llamado de segunda generación.
En una revisión de literatura sobre regeneración de cartílago con derivados de plaquetas,
Barbon et al. (84), realiza una comparación entre estudios que incluyen manejo de defectos
osteocondrales con PRP y PRF, en cada caso se resalta la utilidad de los derivados de
plaquetas como una matriz tridimensional que puede albergar y entregar factores de
crecimiento, la gran mayoría de los estudios utilizan estos asociados a otro tipo de
tratamiento como por ejemplo fragmentos de cartílago, células madre mesenquimales y
otras fuentes de factores de crecimiento. Wong et al. (85), realizo un estudio por
microscopia electrónica de los andamiajes de PRF evidenciando una red porosa de fibrina.
Mas tarde el mismo grupo (85), evidenció en coocultivos con condrocitos que los
condrocitos se adherían a la red y migraban a través de esta indicando una buena afinidad
entre las células y el andamiaje diseñado.
El grupo de Maruyama et al, realizó trasplantes de autoinjertos osteocondrales en un
modelo de conejo y lo compararon al adicionar PRP infiltrado vs PRF interpuesto entre el
defecto y autoinjerto encontrando que a las 3 semanas el grupo tratado con PRF habíaDiscusión 53
cicatrizado parcialmente a diferencia del otro grupo y el control, y a las 12 semanas los tres
grupos habían cicatrizado, sin embargo el grupo tratado con PRF mostraba características
histológicas de cartílago hialino, mientras que los otros dos fibrocartílago (86). Hsu et al.,
comparó el potencial condrogénico de las AD-MSC, el PRF, las AD-MSC + PRF y el PRF
+ condrocitos en defectos osteocondrales en cóndilos femorales mediales de conejos y los
administro de forma infiltrativa, a las 14 semanas evidecia que no hubo complicaciones en
ninguno de los animales, el tamaño del defecto disminuyo y el volumen del cartílago
reparado fue mayor en el grupo tratado con ADMSC + PRF, mostrando una capa más
gruesa de cartílago hialino, exhibían una mejor matriz extracelular y distribución celular
que otros grupos (87). De forma similar Wu et al. (88), evaluó el tratamiento con PRF, MSC
y PRF + MSC y señala que no hubo efectos adversos en los animales a las 12 semanas,
disminuyó el volumen del defecto y además aumento el volumen de cartílago en este, en
el grupo tratado con MSC + PRF al igual que exhibía mejores características histológicas
que en los otros grupos.
Kazemi et al. (89), comparo el PRP y PRF aplicados en forma de coagulo en defectos
osteocondrales en rodilla de perros encontrando a las 4, 16 y 24 semanas que cualquiera
de los dos tratamientos inducen cicatrización.
1.25 Desenlaces adversos
Como se mencionó anteriormente uno de los objetivos principales en terapia regenerativa
es que el tratamiento propuesto tenga la mayor eficacia posible reduciendo al máximo la
probabilidad de presentar efectos adversos.
Es bien conocido que algunas de las características sine qua non de las MSC es que deben
exhibir un comportamiento antiinflamatorio, anti apoptótico, anti fibrótico con capacidad
inmunomoduladora. En la caracterización de las MSC, estas deben expresar antígenos de
superficie específicos: CD73, CD90, y CD105, que las distinguen de otro tipo de células
madre y deben carecer de CD45, CD34, CD14, o CD11b, CD79 alfa o CD19 y HLA-DR,
además deben demostrar un potencial de diferenciación multipotente in vitro (37).
Las propiedades inmunomoduladoras derivan de la liberación y señalización intracelular
del secretoma de cada origen celular, este cambia el fenotipo celular de las células
inflamatorias hacia uno antiinflamatorio. En general, se ha demostrado que las MSC son54 Evaluación de la condrogénesis mediada por medios condicionados de células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo versus plasma rico en plaquetas en defectos
osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
capaces de afectar la activación y proliferación de todas las células del sistema inmune
(6).
Nuestro ensayo es un tratamiento mediante un implante xenogénico de AD-MSC-CM.
Desde lo observado, no detectamos ningún tipo de complicación intra o postoperatoria
hasta el día 7, notamos un adecuado proceso de cicatrización de la herida, aunque fue
evidente una leve disminución en la movilidad del animal en su jaula y un patrón de marcha
con cojera, lo más probable es que esto sea inherente al procedimiento quirúrgico. Estos
resultados probablemente estén soportados por el hecho de que el secretoma de las MSC
contienen moléculas antiinflamatorias, y principalmente anabólicas.
Con respecto a los implantes xenogénicos y su riesgo de generar condiciones adversas,
Lee et al. (90). evaluó la capacidad de regeneración osteocondral con el uso células madre
mesenquimales derivadas de medula ósea humana cultivadas en forma “esférica”, en DO
de rodillas de conejos. No se detectó efectos adversos o rechazo inmunológico evidente,
a las 6-12 semanas de estudio. Sin embargo, hacen la aclaración de que se necesita más
información para determinar la capacidad rechazo inmunogénico del tratamiento. De
manera similar, Zayed et al. (91), evidenció una adecuada regeneración celular con el uso
de SD-MSC de equino en DO realizados en surcos trocleares de fémures de ratas a las 12
semanas de estudio y no hay reporte de rechazo inmunológico, en dicho estudio.
Por otro lado, también existen reportes de rechazo inmunológico con el uso de tratamientos
de distintas especies. Pei et al. (92), realiza un reporte de rechazo inmunológico a los 6
meses de estudio con el uso de SD-MSC porcino para el tratamiento de DO de rodillas de
conejos, esta reacción mediada por la respuesta innata del huésped.
Aunque nuestro ensayo piloto no encontró alguna reacción adversa al tratamiento en los
conejos, se evaluó en un periodo de tiempo muy corto, es difícil predecir la posibilidad de
un rechazo inmunológico en el estudio final, dado que se necesita de un periodo de
observación mayor y los datos ya presentados en la literatura aún son insuficientes para
emitir un juicio. En un ensayo realizado previamente por el grupo de investigación se
evaluó la capacidad osteogénica del implante las AD-MSC derivadas de humano y de los
AD-MSC-CM en un modelo de defecto óseo creado en la mandíbula de conejos evidencióDiscusión 55
que ambos tratamientos inducían la regeneración ósea sin reporte de efectos adversos
durante el seguimiento hasta 45 días (12).
Los ensayos clínicos que mencionan el uso de trasplantes de MSC para regenerar
cartílago hialino en osteoartritis de rodilla muestran que los resultados adversos son
principalmente leves (dolor y edema) (40,41). En cuanto a regeneración de cartílago
hialino, se reportó una diferencia estadísticamente significativa favoreciendo al grupo
tratado, sin embargo, no fue significativa en términos de la calidad del cartílago (41). Estos
hallazgos sugieren que se requieren de estudios con mayor nivel de evidencia que faciliten
un sustento científico para establecer un algoritmo de manejo eficaz con MSC para el
tratamiento de OA.
Las MSC han mostrado ser seguras, en la revisión de Lalu et al. (42) donde 1012
participantes recibieron terapia con MSC intravascular tanto autólogas como alogénicas
para diferentes condiciones, no se identificaron eventos adversos estadísticamente
significativos. De igual modo aplicadas de forma intraarticular, las células madre autólogas
no mostraron tener potencial de infección, malignidad o muerte (43).
Respecto al uso clínico de medios condicionados en humanos la literatura es limitada. Para
regeneración en sistema musculo esquelético un estudio con defectos alveolares mostraba
regeneración ósea, sin efectos secundarios importantes (57). Se ha utilizado en heridas de
piel (58) y alopecia (59).Conclusiones 57
Conclusiones
El presente trabajo muestra los resultados de la fase piloto en donde se estandariza el
modelo animal utilizado y adicionalmente la metodología de implantación del tratamiento
con PRP y PRP suplementado con AD-MSC-CM.
El modelo animal en conejos es una herramienta útil para evaluar el principio del
tratamiento a investigar sin poder extrapolar estos resultados a la especia humana dada
las diferencias biológicas entre las especies, hasta el momento no se ha propuesto en la
literatura un modelo similar de tratamiento de defectos osteocondrales.
Los andamiajes biológicos aun ofrecen una gran versatilidad en el manejo de defectos
osteocondrales en modelos animales, para nuestro caso en particular, el PRP en forma de
coagulo nos permitió utilizarlo como vehículo de factores de crecimiento al estar
suplementado con los AD-MSC-CM sin embargo su efecto terapéutico no es posible
determinar con el presente ensayo. Los cambios morfológicos observados en los defectos
osteocondrales de nuestro proceso preliminar deben ser reproducidos y analizados en las
fases subsiguientes y evaluados mediante un estudio histopatológico.
Aunque se trata de un ensayo piloto, a los 7 días de tratamiento, no observamos ninguna
rección adversa en los conejos más que la discapacidad producida por la cirugía, por lo
que no hubo necesidad de aplicar criterios de punto final. Sin embargo, se requiere una
observación más prolongada para determinar esta variable.Referencias 59
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osteocondrales de rodilla: un modelo experimental en conejos (resultados preliminares)
1 2 /2 1 /3 o N o N iS iS a d ire H a c ig rú riu qD T M o N o N o N o N
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A
Anexo A. Identificación de signos de dolor, malestar y/o angustia. Se
muestran únicamente los datos positivos del original. MTD: Miembro
trasero derecho. Fuente: Bioterio Pontificia Universidad JaverianaAnexos 71
Anexo 2. Criterios de punto final
G2 G3
23/12/2021 23/12/2021
Peso 2800G 2700G
Pérdida de peso 0 0
Apariencia física 0 0
Hidratación 0 0
Comportamiento no 2 2
provocado
Alteraciones clínicas 0 0
Total 2 2
Anexo B. Criterios de punto final. Menor o igual a 4: Adopte medidas de soporte y
manejo veterinario para manejo de la condición. Reevalúe posteriormente. Mayor
a 4: Realice eutanasia. Fuente: Bioterio Pontificia Universidad Javeriana