Perfil de expresión de pink1 e idh1 en glioblastoma multiforme
Autor: Cano Muñoz, Carlos Arturo
Asesor: Ricaurte Guerrero, Orlando
Fecha: 2021
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Patología Anatómica y Clínica
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: El glioblastoma Multiforme (GBM) es el tumor cerebral primario maligno derivado de los astrocitos más común del sistema nervioso central en adultos. Pertenece a la categoría de los gliomas difusos o infiltrativos. La Organización Mundial de la Salud en 2016 lo clasifica en el grado histológico IV, es decir el más agresivo.
Mutaciones en los genes que codifican la proteína PINK1 están relacionadas con la enfermedad de Parkinson (EP) familiar, autosómica recesiva. De manera sorprendente las personas con EP tienen un pequeño pero significativo incremento en el riesgo para desarrollar cáncer cerebral y pulmonar (Veeriah S, 2010), aunque en este aumento del riesgo no se ha implicado directamente a la proteína PINK1.
A nivel mundial se han desarrollado escasos trabajos de investigación que busquen la relación entre GBM y la proteína PINK1.
El objetivo de este trabajo es describir, por medio de la técnica de inmunohistoquímica en un microarreglo de 23 muestras de GBM, el perfil de expresión y localización subcelular de las proteínas PINK1 e IDH1.

PERFIL DE EXPRESIÓN DE PINK1 E
IDH1 EN GLIOBLASTOMA
MULTIFORME
Dr. Carlos Arturo Cano Muñoz
Residente de cuarto año del programa: Especialidad en Patología Anatómica y Clínica
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Patología
Bogotá D.C, Colombia
2021PERFIL DE EXPRESIÓN DE PINK1 E
IDH1 EN GLIOBLASTOMA
MULTIFORME
Dr. Carlos Arturo Cano Muñoz
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Médico especialista en Patología Anatómica y Clínica
Director:
Dr. Orlando Ricaurte
Codirector:
Dr. Gonzalo Arboleda
Par evaluador:
Dr. Ángel Yobany Sánchez M.
Línea de Investigación:
PINK1 y Cáncer
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Patología
Bogotá D.C, Colombia
2021Dedico este trabajo a Dios, a María Santísima,
a mis padres, a mi hermana Paola y a mi
sobrinita HelenaAgradecimientos
Al Doctor Orlando Ricaurte Guerrero, médico patólogo, dueño de la idea de este trabajo.
Le agradezco por siempre escucharme y ser un gran maestro para mí. Para él toda mi
admiración y respeto.
Al doctor Gonzalo Humberto Arboleda, por la codirección del presente trabajo.
Al doctor Angel Yobany Sánchez por tomarse el trabajo de revisar mi trabajo y ser un par
evaluador
Al doctor Carlos Colegial por darme el aval en la utilización de estas muestras, cuyos
bloques de parafina reposan en el archivo del laboratorio de patología BIOMOLECULAR
DIAGNÓSTICA SAS
A mi estimado amigo Santiago Castro por ayudarme en el análisis estadístico de laos datosResumen y Abstract IX
Resumen
El glioblastoma Multiforme (GBM) es el tumor cerebral primario maligno derivado de los
astrocitos más común del sistema nervioso central en adultos. Pertenece a la categoría de
los gliomas difusos o infiltrativos. La Organización Mundial de la Salud en 2016 lo clasifica
en el grado histológico IV, es decir el más agresivo.
Mutaciones en los genes que codifican la proteína PINK1 están relacionadas con la
enfermedad de Parkinson (EP) familiar, autosómica recesiva. De manera sorprendente las
personas con EP tienen un pequeño pero significativo incremento en el riesgo para
desarrollar cáncer cerebral y pulmonar (Veeriah S, 2010), aunque en este aumento del
riesgo no se ha implicado directamente a la proteína PINK1.
A nivel mundial se han desarrollado escasos trabajos de investigación que busquen la
relación entre GBM y la proteína PINK1.
El objetivo de este trabajo es describir, por medio de la técnica de inmunohistoquímica en
un microarreglo de 23 muestras de GBM, el perfil de expresión y localización subcelular
de las proteínas PINK1 e IDH1.
Palabras clave: PINK1, IDH1, Gliomagénesis, Mitofagia, Glioblastoma multiformeContenido X
Abstract
Glioblastoma multiforme (GBM) is the most common malignant primary brain tumor derived
from astrocytes of the central nervous system in adults. It belongs to the category of diffuse
or infiltrative gliomas. The World Health Organization in 2016 classifies it as histological
grade IV, that is, the most aggressive.
Mutations in the genes encoding the PINK1 protein are related to familial, autosomal
recessive Parkinson's disease (PD). Surprisingly, people with PD have a small but
significant increase in the risk of developing brain and lung cancer (Veeriah S, 2010),
although the PINK1 protein has not been directly implicated in this increased risk.
Worldwide, few research works have been carried out that seek the relationship between
GBM and the PINK1 protein.
The objective of this work is to describe, by means of the immunohistochemical technique
in a microarray of 23 GBM samples, the expression profile and subcellular localization of
the PINK1 and IDH1 proteins.
Key words: PINK1, IDH1, Gliomagenesis, Mitophagy, Glioblastoma multiformeContenido XI
Contenido
Contenido
Agradecimientos ................................................................................................................................. 4
Resumen ............................................................................................................................................. 5
Abst
ract ........................................................................................................................................................ 6
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ....................................................................................... 17
2. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................................... 20
3. OBJETIVOS ................................................................................................................................ 21
3.1
OBJETIVO GENERAL ....................................................................................................................... 21
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................................. 21
4. HIPÓTESIS .................................................................................................................................. 22
4.1
HIPÓTESIS NULA (H0) ...................................................................................................................... 22
4.2
HIPÓTESIS ALTERNATIVA (Ha) ...................................................................................................... 22
5. MARCO TEÓRICO ...................................................................................................................... 23
5.1
Características imagenológicas: .................................................................................................... 30
5. 2
Histopatología:
3
1
5.3
Algoritmo terapéutico:
3
2
5.4
Mitocondria:
3
3
5.5Contenido XII
Autofagia: .......................................................................................................................................... 33
5.6
PINK1 y MITOFAGIA: ........................................................................................................................ 33
5.7
Mitofagia y cáncer: ........................................................................................................................... 35
5.8
Efecto Warburg: ................................................................................................................................ 36
6. METODOLOGÍA ......................................................................................................................... 40
6.1
Operacionalización de las variables
4
0
6.2
T
ipo de estudio
4
1
6.3
Universo de estudio.......................................................................................................................... 41
6.4
Muestra .............................................................................................................................................. 41
6.5
Muestreo ............................................................................................................................................ 42
6.6
Técnicas y procedimientos ............................................................................................................. 42
6.7
Consideraciones éticas .................................................................................................................... 43
7. PLAN DE ANÁLISIS DE DATOS ................................................................................................ 45
8. PRESUPUESTO ......................................................................................................................... 46
9. CRONOGRAMA .......................................................................................................................... 47
10. RESULTADOS ............................................................................................................................ 49
11. DISCUSIÓN ................................................................................................................................. 57
12. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ............................................................................. 61
ANEXO A ............................................................................................................................................ 62
IDH1 POSITIVO .................................................................................................................................. 62
PINK1 POSITIVO (++) ........................................................................................................................ 62
Bibliografía ........................................................................................................................................ 63Contenido X
III
Lista de tablas
Tabla 1 Tasa de incidencia ajustada a la edad por 100.000 personas del GBM ........................ 23
Tabla 2 Subtipos genéticos de GBM según el Atlas del Genoma del Cáncer ............................. 29
Tabla 3 Variables epidemiológicas de los pacientes .................................................................... 49
Tabla 4 Expresión por inmunohistoquímica de IDH1 y Pink1 ...................................................... 52
Tabla 5 Frecuencias absolutas entre Pink1 e IDH1 ..................................................................... 54
Tabla 6 Frecuencias porcentuales entre Pink1 e IDH1 ................................................................ 54
Tabla 7 Expresión de IDH1 y Pink1 en las variantes histológicas de GBM ................................. 56Contenido XIII
Lista de figuras
Figura 1 Distribución de la mortalidad por cáncer en Colombia, 2007-2013 .......................................... 25
Figura 2 Gliomagénesis independiente y dependiente del gen IDH1 y 2 ............................................... 27
Figura 3 Principales vías de señalización alteradas en el glioblastoma ................................................. 28
Figura 4 RMN ponderada en T1 en GBM sin y con contraste ................................................................ 31
Figura 5 Patrón histológico del GBM ....................................................................................................... 32
Figura 6 Representación esquemática del proceso de mitofagia ........................................................... 34
Figura 7 Dominios proteicos de PINK1 y Parkina ................................................................................... 35
Figura 8 Glucólisis aerobia (efecto Warburg) .......................................................................................... 36
Figura 9 Western Blot para HIF1A con regulación a la baja de PINK1 .................................................. 37
Figura 10 Efecto negativo de PINK1 en el ciclo celular .......................................................................... 38
Figura 11 Pérdida de función de PINK1 y su efecto en la radiosensibilidad de las células de
glioblastoma ............................................................................................................................................. 39
Figura 12 Histograma de la edad ............................................................................................................ 51Contenido 15
Lista de Símbolos y abreviaturas
Abreviaturas
Abreviatura Término
T1 Tiempo de relajación corto en MRI
T2 Tiempo de relajación largo en MRI
MRI o RMN Imagen por resonancia magnética
H3 K27M Sustitución de Lisina por Metionina en la
posición 27 de la Histona 3
KI-67 Proteína nuclear necesaria para la proliferación celular
IDH Isocitrato Deshidrogenasa
OR Razón de probabilidad
NOS No especificado de otra manera
EGFR Receptor para el factor de crecimiento epidérmico
TERT Telomerasa transcriptasa inversa
CDKN2A El inhibidor 2A de quinasa dependiente de ciclina, también denominado
CDKN2A o p16 es una proteína supresora de tumores codificada en
humanos por el gen CDKN2A.
MGMT O6 Metilguanina ADN metiltransferasa
ATG Proteínas relacionadas a la autofagia
PINK1 Quinasa 1 inducida por PTEN
PTEN Fosfatidilinositol-3, 4, 5-trisfosfato 3-fosfatasa
INC Instituto Nacional de Cancerología
OMS Organización Mundial de la Salud16
G-CIMP Fenotipo metilador de las islas CpG17
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El glioblastoma multiforme es un tumor raro, con una incidencia global de menos
de 10 casos por 100.000 habitantes y una tasa de supervivencia de 14 a 15 meses
posterior al diagnóstico. Puede ocurrir a cualquier edad, pero su pico de incidencia
es entre los 55 a 60 años. Este tipo de tumor es más frecuente en los grupos étnicos
asiáticos, latinos y blancos comparado con las personas de raza negra (Hanif F,
2017).
Requejo y colaboradores en el 2014 propusieron que la pérdida de la proteína
PINK1 genera una reprogramación del metabolismo de la glucosa (efecto
Warburg), por medio de la estabilización del factor inducible por hipoxia 1 alfa
(HIF1a), generando un incremento en la proliferación celular (Requejo-Aguilar,
2014).
Sameer Agnihotri y colaboradores demostraron en astrocitos humanos, que la
proteína PINK1 (Quinasa 1 inducida por PTEN mitocondrial), es un regulador
negativo del efecto Warburg, las especies reactivas de oxígeno, el factor inducible
por hipoxia 1 alfa y el crecimiento del glioblastoma. La sobreexpresión de PINK1
en Drosophila y modelos de ratón atenuó el crecimiento in vivo de este tumor. Por
el contrario, la pérdida de PINK1 en las células de glioblastoma genera un aumento
en la producción de especies reactivas de oxígeno y una mayor radiosensibilidad.
Por tanto, la sobreexpresión de PINK1 in vivo atenúa el crecimiento de las células
tumorales, pero su expresión a la baja hace que este tumor sea más radiosensible.
Se puede ver a la proteína PINK1 como un objetivo terapéutico, porque por un lado
su sobreexpresión podría disminuir la proliferación de las células cancerígenas en
el glioblastoma y por el lado opuesto su deleción causaría una mayor
radiosensibilidad (Agnihotri S., 2016).
En el año 2018 Zhi-qiang Yao y colaboradores encontraron que el compuesto
F0911-7667 (Comp 5) activa a la proteína deacetilasa dependiente de NAD+:
Sirtuina 1 (SIRT1). Es claro que Comp5 induce la mitofagia por medio de la vía de18
señalización SIRT1–PINK1–Parkina. Comp5 tiene un potencial terapéutico en
glioblastoma al inducir el proceso de mitofagia por medio de la proteína SIRT1 in
vivo (Yao ZQ, 2018).
Por último, la Deglicasa 1 (DJ1), es una proteína que normalmente se une al factor
de transcripción Foxo3a e interactúa con el promotor de PINK1, estimulando su
actividad transcripcional. DJ1 regula el metabolismo y la proliferación celular por
medio de la proteína PINK1 (Requejo-Aguilar, 2015). Además existen diferentes
proteínas que interactúan con PINK1 para conseguir la destrucción de mitocondrias
defectuosas. La primera de ellas la proteína TBK1 (quinasa de unión a TANK1),
usualmente está unida a los centrosomas. Durante la mitofagia PINK1 causa la
translocación y activación de TBK1 a la mitocondria dañada. Su unión a PINK1
genera la detención del ciclo celular en G2/M. Esto indica que PINK1 es una
proteína muy importante en la regulación del metabolismo y la proliferación celular
(Shireen A. Sarraf, 2019).
En concreto el problema de investigación en este estudio es: ¿Existe una expresión
concordante o diferencial entre Pink1 e IDH1 en las 23 muestras de glioblastoma
multiforme?.20
2. JUSTIFICACIÓN
Cardona y colaboradores (Andrés Felipe Cardona, 2016) determinaron en gliomas
de bajo grado de 63 pacientes colombianos la expresión de las proteínas p53,
ATRX y Olig2, el estado de metilación del promotor MGMT, la codeleción 1p19q
por medio de FISH y el estado de mutación de los genes IDH1 y 2 por medio de la
secuenciación de ADN. Ellos encontraron la relevancia en términos de
supervivencia de la codeleción 1p19q y la metilación MGMT, pero no hallaron una
relación entre las mutaciones en los genes IDH1/2 con el pronóstico,
probablemente por un tamaño pequeño de la muestra de estudio
En el año 2018 (Orlando Ricaurte, 2018), se publicó un estudio de mutaciones en
los genes IDH1 e IDH2 en una muestra de gliomas de población colombiana. El
principal objetivo de esta investigación fue determinar la frecuencia de mutaciones
en el exón 4 de los genes IDH1 e IDH2 en 26 muestras de gliomas de pacientes
colombianos. Se encontró que el 34 % y 7,5 % de las muestras presentaban
mutaciones en el gen IDH1 e IDH2 respectivamente.
Hay pocas investigaciones a nivel mundial con respecto a la relación entre la
proteína PINK1 y el glioblastoma multiforme. El estudio más conocido e importante
es el de Sameer Agnihotri y colaboradores, llevado a cabo en Canadá donde por
medio de modelos como Drosophila y ratones determinaron in vivo la importancia
que tiene la deleción de esta proteína en la proliferación de las células del
glioblastoma (Agnihotri S., 2016).
El propósito de este trabajo es determinar la expresión de las proteínas PINK1 e
IDH1. No conocemos estudios en Colombia que busquen la expresión proteica de
PINK1 en muestras de Glioblastoma. Suponemos que va a estar perdida su
expresión, porque cuando esto ocurre se activa metabólicamente la célula
tumoral (efecto Warburg) y aumenta la proliferación celular. Es por esta razón que
se le considera una proteína supresora de tumores.
Los resultados de esta investigación se publicarán en una revista médica indexada
y redundará en el beneficio de los pacientes afectados por este tipo de tumor,
porque no hay duda de que desde la investigación básica se pueden encontrar
mecanismos fisiopatológicos de las enfermedades, para más adelante encontrar
blancos terapéuticos.21
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Estudiar los perfiles de expresión de IDH1 y PINK1 en muestras de GBM
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar el perfil de expresión de IDH1 (mutación R132H) y PINK1 en muestras de GBM
Realizar una asociación por medio de la prueba chi cuadrado entre la expresión de IDH1
(mutación R132H) y PINK1 en muestras de GBM22
4. HIPÓTESIS
4.1 HIPÓTESIS NULA (H0)
No existe relación entre la expresión por medio de inmunohistoquímica de IDH1 (R132H) y
Pink1 en 23 muestras de glioblastoma multiforme analizadas
4.2 HIPÓTESIS ALTERNATIVA (Ha)
Existe relación entre la expresión por medio de inmunohistoquímica de IDH1 y Pink1 en 23
muestras de glioblastoma multiforme analizadas23
5. MARCO TEÓRICO
Los tumores cerebrales se dividen en dos grandes grupos: los no malignos y los
malignos. Los primeros representan el 68,5% del total de tumores cerebrales y los
segundos el 31,5% restante (Ostrom QT, 2017).
Según el observatorio de cáncer global (GLOBOCAN) de 2018, el número de casos
nuevos de cáncer cerebral sin discriminar el tipo histológico, en todas las edades y
ambos sexos fue de 296.851 personas, representando la causa número 17 en
frecuencia de cáncer a nivel mundial. En ese mismo año el número de muertes
atribuibles a esta causa ocupó el puesto número 12, con 241.037 casos. Estos
datos indican un alto índice de letalidad para este grupo de patologías (IARC, 2018).
El glioblastoma multiforme (GBM), el más agresivo de los tumores gliales, es 1.6
veces más frecuente en hombres que en mujeres y su incidencia es 2 veces más
alta en caucásicos comparada con los afroamericanos. La incidencia ajustada a la
edad por 100.000 personas en diferentes países se muestra en la Tabla 1.
Tabla 1 Tasa de incidencia ajustada a la edad por 100.000 personas del GBM
Tasa de incidencia
País Rango de años ajustada a la edad por
100.000 personas
Estados Unidos 2006-2010 3.1924
Australia 2000-2008 3.4
Inglaterra 1999-2003 2.05
Korea 2005 0.59
Grecia 2005-2007 3.69
Jordania 2012-2013 0.89
Fuente: Tomado y modificado de Tamimi AF, Juweid M. Epidemiology and
Outcome of Glioblastoma. In: De Vleeschouwer S, editor. Glioblastoma [Internet].
Brisbane (AU): Codon Publications; 2017 Sep 27. Chapter 8.
El pronóstico de esta neoplasia es ominoso, porque menos del 5% de los pacientes
sobrevive a los 5 años después del diagnóstico (Tamimi AF, 2017)
En Colombia, según datos del Instituto Nacional de Cancerología, los tumores del
sistema nervioso central, en ambos sexos, ocuparon el puesto número 10 en
mortalidad, entre los años 2007 y 2013, como se puede observar en la figura 1.
Con respecto al glioblastoma el doctor Vega encontró que en el INC entre enero de
2007 a diciembre de 2013, de un total de 455 tumores primarios del sistema
nervioso central, 155 casos eran de GMB (Molina, 2016).25
Figura 1 Distribución de la mortalidad por cáncer en Colombia, 2007-2013
Fuente: Tomado de Pardo C, de Vries E, Buitrago L, Gamboa O. Atlas de
mortalidad por cáncer en Colombia. Cuarta edición. Bogotá D. C. Instituto Nacional
de Cancerología, 2017, v.1. p. 124.
Los datos sugieren que la edad es un factor muy importante para el desarrollo de
ciertos tumores cerebrales. Por ejemplo, entre los 15 a 34 años son más frecuentes
las lesiones neoplásicas de la glándula hipófisis comparada con los astrocitomas
malignos. Por el contrario, entre los 55 a 75 años, el GBM ocupa el lugar más
importante dentro de las lesiones tumorales malignas del cerebro (Ostrom QT,
2017).
Los tumores primarios del sistema nervioso central se derivan de células gliales
como los oligodendrocitos (oligodendrogliomas), las células ependimarias
(ependimomas) o los astrocitos (astrocitomas), las neuronas y las células derivadas
de la cresta neural como las células meníngeas (meningiomas). Estas neoplasias
se clasifican en cuatro grados histológicos del I al IV de acuerdo con la
Organización Mundial de la Salud, según el índice de proliferación celular, la26
atipia citológica, la extensión de la necrosis isquémica y la tasa de proliferación
vascular; siendo el grado IV el de peor pronóstico (David N. Louis, 2016)
(Wesseling, 2018).
El GBM es el tumor cerebral primario de origen glial más frecuente del sistema
nervioso central entre los 55 a 75 años. Se deriva de las células astrocitarias y se
clasifica en grado histológico IV de la OMS por su alta tasa de proliferación celular,
necrosis y angiogénesis. Al mismo tiempo se subdivide en cuatro categorías:
• GBM primario: Es aquel tumor que no presenta variantes patogénicas en los
genes IDH1 e IDH2. A esta categoría pertenecen el glioblastoma de células
gigantes, el gliosarcoma y el glioblastoma epitelioide. La edad media del
diagnóstico son los 64 años.
• GBM secundario: Presenta variantes patogénicas en los genes IDH1 e IDH2
y se deriva de astrocitomas de bajo grado o astrocitomas anaplásicos. La
edad media del diagnóstico son los 40 años.
• Glioma difuso de la línea media H3 K27M: Ocurre principalmente en niños,
pero también se reportan casos en los adultos. Se produce por una mutación
que genera una sustitución del aminoácido Lisina por Metionina en la
posición 27 de la Histona 3
• Glioblastoma NOS: Es una categoría diagnóstica transitoria, porque se
aplica cuando no es posible la realización de pruebas moleculares que
permitan una adecuada categorización de este tumor (Wesseling, 2018)
(David N. Louis, 2016).
En la figura 2 se muestran las vías moleculares dependientes e independientes
del gen IDH implicadas en la gliomagénesis27
Figura 2 Gliomagénesis independiente y dependiente del gen IDH1 y 2
Fuente: Tomado de Tamimi AF, Juweid M. Epidemiology and Outcome of
Glioblastoma. In: De Vleeschouwer S, editor. Glioblastoma [Internet]. Brisbane
(AU): Codon Publications; 2017 Sep 27. Chapter 8.
Las 3 vías moleculares claves alteradas en el glioblastoma son: RTK/RAS/PI3K,
RB (Retinoblastoma) y p53. Estas alteraciones en la señalización celular se
producen por la amplificación de PI3K, CDK 4/6 y MDM2; o por la deleción de los
genes PTEN, P53, RB, P16 y CDKN2B. La figura 3 demuestra en verde los genes
amplificados y en rojo los genes delecionados en cada una de las vías de
señalización alteradas.28
Figura 3 Principales vías de señalización alteradas en el glioblastoma
En verde genes amplificados y en rojo genes delecionados
Fuente: Tomado de Tamimi AF, Juweid M. Epidemiology and Outcome of
Glioblastoma. In: De Vleeschouwer S, editor. Glioblastoma [Internet]. Brisbane
(AU): Codon Publications; 2017 Sep 27. Chapter 8.
El Atlas del Genoma del Cáncer clasifica al glioblastoma en 4 subtipos genéticos a
saber: Mesenquimal, clásico o proliferativo, proneural y neural. Recientemente se
han identificado tumores con un fenotipo metilador de las islas CpG (G-CIMP). En
la tabla 2 se observan estos subtipos moleculares.29
Tabla 2 Subtipos genéticos de GBM según el Atlas del Genoma del Cáncer
Características Proneural/Neural Clásico o Mesenquimal G-CIMP
clínicas y proliferativo
Moleculares
Edad Adulto joven Adulto mayor Adulto mayor Adulto joven
Pronóstico Bueno Pobre Pobre Bueno
Proceso activo Neurogénesis Proliferación Angiogénesis Neurogénesis
Genes EGFR normal y EGFR EGFR EGFR normal y
PTEN intacto amplificado y amplificado y PTEN intacto
pérdida de pérdida de
PTEN PTEN
Fuente: Tomado y modificado de Tamimi AF, Juweid M. Epidemiology and
Outcome of Glioblastoma. In: De Vleeschouwer S, editor. Glioblastoma [Internet].
Brisbane (AU): Codon Publications; 2017 Sep 27. Chapter 8.
El estudio de asociación del genoma completo publicado por Melin y colaboradores
en 2017 mostró diferentes loci con mayor OR para el desarrollo de GBM. Entre
ellos se encuentran genes como el receptor para el factor de crecimiento
epidérmico (EGFR), la transcriptasa inversa de la telomerasa, el inhibidor de la
quinasa dependiente de ciclina 2A o el transportador de monocarboxilato 3 (Melin
BS, 2017).
El Consorcio para Informar el Abordaje Práctico y Molecular de la Taxonomía de
los Tumores del Sistema Nervioso Central o cIMPACT-NOW por sus siglas en
inglés, recomienda que un glioma astrocítico difuso con el gen IDH silvestre se30
puede diagnosticar como un Glioblastoma, IDH silvestre, OMS grado 4, si hay
proliferación microvascular o necrosis o uno (o más) de las siguientes tres
alteraciones genéticas: Mutación del promotor del gen TERT, amplificación
del gen EGFR y cambio en el número de copias cromosómicas (ganancia del
7 o +7 y deleción del cromosoma 10 o -10).
El Consorcio cIMPACT-NOW define a los astrocitomas secundarios como
aquellos gliomas astrocitarios difusamente infiltrativos OMS grado 4 (no
toman el nombre de glioblastoma), que presentan mutación en el gen IDH1 o
IDH2 y que además exhibe proliferación vascular o necrosis o deleción
homocigota del gen CDKN2A o B (Louis DN, 2020).
El principal factor de riesgo para el desarrollo de glioblastoma es la exposición
a radiación ionizante. Por el contrario las alergias respiratorias, el asma y el
eczema son factores protectores para el desarrollo de esta neoplasia maligna
(Amirian ES, 2016). Con respecto a los teléfonos celulares que representan
un tipo de radiación no ionizante, el hábito tabáquico, el consumo de alcohol
o la exposición dietaria a compuestos nitrosos existe evidencia contradictoria
(Amirian ES, 2016).
5.1 Características imagenológicas:
El GBM se presenta como una gran masa localizada más comúnmente en la región
supratentorial siendo el lóbulo frontal el lugar más frecuentemente afectado. El GBM
se localiza de manera infrecuente en el cerebelo y cordón medular (Juweid, 2017). Con
el estudio de resonancia magnética cerebral se pueden observar áreas de necrosis
central, paredes periféricas de tejido tumoral viable que captan el material de contraste
(gadolinio), llamado realce en anillo y edema vasogénico perilesional por disrupción de
la barrera hematoencefálica. En la imagen ponderada en T1 el glioblastoma se observa
como una masa mal definida e hipointensa. Con la imagen ponderada en T2 el31
glioblastoma se observa como una masa de bordes mal delimitados, con una región
central hiperintensa por la gran necrosis tumoral (Molina, 2016). En la figura 4 se
observa una imagen de glioblastoma en resonancia magnética ponderada en T1 sin
(A) y con contraste (B)
Figura 4 RMN ponderada en T1 en GBM sin y con contraste
Fuente: Tomado de Wirsching HG, Galanis E, Weller M. Glioblastoma. Handb
Clin Neurol. 2016;134:381‐397.
5. 2 Histopatología
:
El glioblastoma puede presentar necrosis en empalizada, proliferación
vascular glomeruloide y un alto índice de proliferación celular medido con KI-
67. Este tumor puede presentar variantes histológicas como célula pequeña,
células gigantes, células granulares y células epitelioides similares al
melanoma metastásico. Además, el glioblastoma puede mostrar un
componente neuronal primitivo. En la figura 5 se muestra el patrón histológico
más común del GBM.32
Figura 5 Patrón histológico del GBM
A la izquierda proliferación vascular glomeruloide y a la derecha necrosis en
empalizada
Fuente: Tomado de Rosenblum, A. P. (2018). Central Nervous System. In:
Rosai and Ackerman's Surgical Pathology. Philadelphia: Elsevier.
5.3 Algoritmo terapéutico
:
El punto central del manejo de este tumor es la resección quirúrgica en lo
posible total, asociado a radioterapia y quimioterapia. Es muy importante
conocer el estado de metilación del promotor del gen MGMT (metilguanina
DNA metiltransferasa) en los pacientes mayores de 65 años. Si este promotor
no está metilado, el paciente necesita únicamente radioterapia
hipofraccionada para su manejo, sin la adición del medicamento
quimioterapéutico alquilante temozolamida.
Tras una recaída, se considera de nuevo una resección total, temozolamida,
lomustina, bevacizumab y radioterapia adyuvante (Wirsching, 2016).33
5.4 Mitocondria
:
Este organelo es la central energética de la célula. Ella contiene ADN
materno, en su matriz se lleva a cabo el proceso conocido como ciclo de
Krebs o de los ácidos tricarboxílicos y en la membrana mitocondrial interna
se produce el proceso de respiración y de producción de ATP conocido como
fosforilación oxidativa.
5.5 Autofagia
:
Existe un proceso que sirve para el reciclaje, producción de energía y
supervivencia de las células conocido como autofagia. Este mecanismo de
conservación de la vida celular se activa ante condiciones de estrés como la
deprivación de nutrientes u oxígeno, daño del ADN e inflamación. En la
autofagia intervienen una gran cantidad de proteínas como las ATG, beclina-
1 o la subunidad catalítica tipo 3 del fosfatidilinositol 3 quinasa que ayudan
en un primer momento a la formación del fagosoma proveniente de la
membrana celular del retículo endoplasmático rugoso. Posteriormente actúan
otras proteínas de la familia ATG que generan una cascada de ubiquitinación,
con la subsecuente formación del autofagosoma, la fusión de este con el
lisosoma, la creación del autofagolisosoma y la posterior destrucción de la
carga (agregados de proteínas u organelos como la mitocondria) (Dikic, 2018)
5.6 PINK1 y MITOFAGIA:
Un tipo especial de autofagia es la mitofagia, fenómeno que ocurre cuando la
carga del autofagolisosoma es la mitocondria. Ante condiciones de estrés
celular la membrana mitocondrial externa se despolariza y ese cambio de34
potencial de membrana genera la exteriorización de ciertas proteínas como
PINK1 y Parkina. En una mitocondria sana la proteína PINK1 es clivada en la
membrana mitocondrial interna por la proteasa tipo romboide asociada con la
presenilina. Cuando ocurre la despolarización mitocondrial, la proteína PINK1
permanece anclada a la membrana mitocondrial externa y fosforila a la
proteína Parkina, la cual es una E3 ubiquitina ligasa. Posteriormente la
Parkina ubiquitina a la proteína p62. Por último, la p62 atrae a la proteína
cadena liviana 3 asociada a microtúbulos. Esta unión de proteínas formará
los autofagosomas, autofagolisosomas y se llevará a cabo la destrucción
mitocondrial (mitofagia) (Kulikov, 2017) (Bernardini, 2016). En la figura 6 se
ilustra la unión entre la proteína PINK1, parkina y p62.
Figura 6 Representación esquemática del proceso de mitofagia
Fuente: Kulikov, A. V. (2017). Mitophagy: Link to cancer development and
therapy. Biochemical and Biophysical Research Communications.
PINK1 contiene 581 aminoácidos y 3 dominios proteicos: El primero está en
el extremo N terminal llamado secuencia blanco mitocondrial, el segundo es
el segmento alfa hélice transmembrana y el tercero es el dominio serina
treonina quinasa.35
Parkina posee 465 aminoácidos y 5 dominios: El N terminal similar a
ubiquitina, seguido por 3 dominios del nuevo gen realmente interesante
(RING) y un quinto dominio ubicado entre RING1 y RING2, como se puede
observar en la figura 7.
Figura 7 Dominios proteicos de PINK1 y Parkina
Fuente: Tomado de Eiyama, A. &. (2015). PINK1/Parkin-mediated mitophagy
in mammalian cells. Current Opinion in Cell Biology.
5.7 Mitofagia y cáncer
:
Parkina disminuye el metabolismo glucolítico, inhibe la proteína proapoptótica
Bax, degrada las Mitofusinas 1 y 2 alterando la dinámica mitocondrial al inhibir
la fusión de estos organelos y por último degrada a la ciclina D y E para
regular el ciclo celular.
Las alteraciones genéticas de PARK2 (Parkina) y PARK6 (PINK1) se han
descrito en diferentes tumores, como el cáncer de ovario, pulmón, mama,
neuroblastoma, colorrecto y glioblastoma, generalmente por pérdida en el
número de copias (Bernardini, 2016).36
Cuando ocurre la pérdida de función de PINK1 y Parkina, los niveles de
mitofagia disminuyen, esto genera una alteración en el control de calidad
mitocondrial con la subsecuente acumulación de mitocondrias
disfuncionales, aumento en los niveles de especies reactivas de oxígeno,
estabilización del factor de transcripción inducible por hipoxia (HIF1alfa) y el
aumento del metabolismo glucolítico o también conocido en las células
cancerígenas como efecto Warburg (Vara-Perez M, 2019).
5.8 Efecto Warburg:
Es un mecanismo por el cual las células tumorales incrementan la tasa de
consumo de glucosa y la producción preferencial de lactato, en lugar de ATP,
incluso en la presencia de oxígeno. Este efecto le permite a las células
cancerígenas evadir el sistema inmunológico, sintetizar rápidamente ATP y
promover las vías anabólicas o biosintéticas, que permiten un mayor
crecimiento y proliferación celular (Liberti MV, 2016). En la figura 8 se ilustra
el proceso de metabolismo en una célula normal y de una célula tumoral.
Figura 8 Glucólisis aerobia (efecto Warburg)37
Fuente: Tomado de Vander Heiden, Understanding the Warburg Effect: The
Metabolic Requirements of Cell Proliferation, 2009
En la figura 9 se observa en Western Blot el aumento de los niveles proteicos
de HIF1 alfa con la regulación a la baja de Pink1 por medio de ARN de
horquilla corta (Agnihotri S., 2016)
Figura 9 Western Blot para HIF1A con regulación a la baja de PINK1
Fuente: Tomado de Agnihotri S., G. B. (2016). PINK1 Is a Negative Regulator
of Growth and the Warburg Effect in Glioblastoma. Cancer Res.
La recuperación de la función de PINK1 en líneas celulares generadoras de
GBM disminuye la proliferación celular, confirmando el efecto negativo de
Parkina y PINK1 en el efecto Warburg y en el ciclo celular como se observa
en la figura 10.38
Figura 10 Efecto negativo de PINK1 en el ciclo celular
Fuente: Tomado de Agnihotri S., G. B. (2016). PINK1 Is a Negative Regulator of
Growth and the Warburg Effect in Glioblastoma. Cancer Res.
Es claro que tener activa la proteína PINK1 en GBM genera un efecto supresor
tumoral, pero si ocurre la pérdida de función de esta proteína, también se produce
un efecto contra la carcinogénesis, porque la acumulación de especies reactivas
de oxígeno y la disminución de especies reductoras como nicotinamida adenina
dinucleótido (NADH) y el glutatión aumenta el radiosensibiidad de las células
cancerígenas del GBM como se observa en la figura 11.39
Figura 11 Pérdida de función de PINK1 y su efecto en la radiosensibilidad de
las células de glioblastoma
Fuente: Tomado de Agnihotri S., G. B. (2016). PINK1 Is a Negative Regulator of
Growth and the Warburg Effect in Glioblastoma. Cancer Res.40
6. METODOLOGÍA
6.1 Operacionalización de las variables
Variable Definición Indicador Nivel de
medición
Edad Años cumplidos por el paciente Número de años cumplidos Cuantitativa
por el paciente Ordinal
Sexo Condición fenotípica que Hombre o Mujer Cualitativa
diferencia al hombre de la mujer Nominal
Ubicación del Localización de la lesión No especificado Cualitativa
tumor tumoral Frontal Nominal
Parietal
Temporal
Occipital
Fosa posterior
Paraventricular
Derecho o izquierdo y en
combinación, por ejemplo
frontoparietal derecho
Expresión de Expresión por Expresión ausente (0), ligera Semicuantitati
(+), va41
PINK1 inmunohistoquímica de la Moderada (++), intensa (+++)
proteína PINK1
Expresión de Expresión por Positivo o negativo Cualitativa
IDH1 inmunohistoquímica de la nominal
proteína IDH1
6.2 Tipo de estudio
El presente estudio es observacional de tipo descriptivo y de corte transversal
porque las variables de la población se analizan en un tiempo determinado. El
estudio es de carácter retrospectivo con relación al momento de registrar la
información.
6.3 Universo de estudio
La población estudiada son 23 muestras de pacientes con GBM tomadas del
archivo de tumores del laboratorio de biología molecular y patología
BIOMOLECULAR DIAGNÓSTICA SAS (Bogotá D.C, Colombia) desde el año 2014
hasta 2016.
6.4 Muestra
Por ser reducido el número de pacientes, la muestra es igual a la población42
6.5 Muestreo
El tipo de muestra fue seleccionada por un método de muestreo no probabilístico
(muestreo por criterios de inclusión)
Criterios de inclusión: Pacientes de cualquier edad con GBM cuyas muestras se
encuentren en el archivo de tumores del laboratorio de biología molecular y
patología BIOMOLECULAR DIAGNÓSTICA SAS (Bogotá D.C, Colombia) desde el
año 2014 hasta 2016.
6.6 Técnicas y procedimientos
Se utilizó un microarreglo de tejidos previamente diseñado manualmente donde se
ubicaron 23 muestras de GBM. Cada cilindro tenía un diámetro de 3 mm. Este
microarreglo de tejidos estaba organizado por coordenadas (letras A, B, C, D, E y
números 1, 2, 3, 4, 5, 6). Se ubicó un primer control positivo (placenta) en
coordenada A1 y un segundo control positivo (tejido cerebral humano usual) en
coordenada C2. Desafortunadamente no encontramos información sobre la
ubicación exacta de cada caso en el microarreglo (Valencia Artunduaga, 2017).
Según el Atlas de proteínas humanas, la proteína PINK1 es una molécula ubicua
presente en varios tejidos de la economía corporal. Se expresa principalmente en
la glándula paratiroides, glándula adrenal, recto, placenta, glándula mamaria, riñón,
testículo y en menor medida a nivel de la próstata, endometrio y cérvix uterino. En
el tejido cerebral normal y en los gliomas tiene una expresión proteica media (Uhlen
M, 2017).
Inicialmente se estandarizó la dilución del anticuerpo anti-Pink1 (ab23707; Abcam,
Cambridge, MA, USA), incubándolo a 1:10, 1:25 y 1:50 en un corte con tejidos de
riñón, testículo, próstata y placenta. La expresión de PINK1 se detectó por
inmunohistoquímica de la siguiente manera: Las muestras de GBM fijadas en
formalina y embebidas en parafina del microarreglo en bloque, fueron cortadas a 4
micras y luego desparafinadas en xileno y deshidratadas en etanol, seguido por la
recuperación antigénica en buffer citrato por 30 minutos e inactivación de la enzima
peroxidasa endógena con H2O2 al 3% por 20 minutos. Posteriormente las
muestras se incubaron con el anticuerpo primario contra PINK1 (dilución 1:25 con
control positivo de placenta y tejido cerebral humano usual presentes en el
microarreglo y control externo con tejido renal, testículo, placenta y próstata) a 4°C43
en la noche. Posteriormente se lavó el tejido 3 veces con solución salina buffer
fosfato. Luego las láminas fueron incubadas con el anticuerpo secundario marcado
con peroxidasa de rábano a 37°C por 30 minutos y visualizadas por incubación con
la solución de 3,3′ - diaminobenzidina (Sangon Biotech, Shanghai, China).
Posteriormente las láminas se incubaron con hematoxilina por 1 minuto y se
lavaron por 10 minutos con agua. Finalmente los cortes se deshidrataron con etanol
seguido por xilol y montados en Entellan.
La expresión por inmunohistoquímica de la proteína PINK1 se evaluó en los
siguientes términos: Expresión presente o ausente, en caso de estar presente, se
calificó como ligera (+), moderada (++) o intensa (+++).
La inmunotinción para IDH1 se desarrolló de la siguiente manera: Se realizaron
cortes de 4 micras de las muestras fijadas en formalina y embebidas en parafina
del microarreglo en bloque, se secaron a 80°C por 15 minutos y fueron
desparafinadas en xileno, lavadas en etanol y rehidratadas con agua destilada. Los
cortes luego fueron tratados con peróxido de hidrógeno al 3% por 5 minutos a
temperatura ambiente. Para la recuperación antigénica las láminas fueron
pretratadas con el buffer citrato de sodio (10 mM de citrato, pH 6.0) por 15 minutos
a 100°C. Después de lavar con solución salina buffer fosfato por 3 minutos, los
cortes fueron inmunoteñidos con el anticuerpo anti-humano IDH1-R132H (clon
MRQ 67 Cell Marque, dilución de 1:50, con control positivo de placenta y tejido
cerebal humano usual presentes en el microarreglo y control externo con muestra
de astrocitoma anaplásico) e incubados a 4°C toda la noche. Después de lavar 3
veces con la solución salina buffer fosfato, los tejidos fueron cubiertos con el
anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano por 30 minutos a
temperatura ambiente. Luego se adicionó la solución cromógena 3,3′-
diaminobenzidina por 10 minutos. Posteriormente las láminas se incubaron con
hematoxilina por 1 minuto y se lavaron por 10 minutos con agua. Finalmente los
cortes se deshidrataron con etanol seguido por xilol y montados en Entellan. Se
interpretó la tinción de la siguiente manera: (1) Una inmunoreacción fuerte
citoplasmática (positivo); (2) Una tinción débil difusa, nuclear y tinción de los
macrófagos (negativo) (Cai J, 2016) (M. Preusser, 2011)
6.7 Consideraciones éticas
De acuerdo con los principios establecidos en la Declaración de Helsinki, Reporte
Belmont, Pautas CIOMS y en la Resolución 8430 de Octubre 4 de 1993 del
Ministerio de Salud de la República de Colombia, y en cumplimiento con los
aspectos mencionados con el Artículo 6 de dicha Resolución, este estudio se
desarrollará conforme a los siguientes criterios:
• Esta investigación está considerada como “Investigación sin riesgo” de
acuerdo al Artículo 10 de la Resolución 8430/93, al emplear técnicas y
métodos de investigación documental retrospectivos y dado que no se
realiza ninguna intervención o modificación intencionada de las variables
biológicas, fisiológicas, sicológicas o sociales de los individuos que
participan en el estudio.44
• La investigación solamente se llevará a cabo una vez se obtenga la
respectiva autorización y la aprobación del proyecto por parte del Comité de
Ética de la institución.
• El proyecto reconoce que las personas tienen derecho a la privacidad y al
anonimato. Se tomarán toda clase de precauciones para proteger la
confidencialidad de la información y la identidad de los participantes.
• La investigación se realizará de manera que reduzca al mínimo el posible
daño al medio ambiente.
• Respecto a la publicación y difusión de los resultados de la investigación, se
tendrán a la disposición del público, tanto los resultados negativos e
inconclusos como los positivos.45
7. PLAN DE ANÁLISIS DE DATOS
Teniendo en cuenta el tipo de estudio, se realizó el análisis de los datos por medio
de estadística descriptiva. Las variables cualitativas fueron analizadas a través de
la moda (medida de tendencia central) y de distribución de frecuencias a través de
tablas de datos (frecuencia absoluta y relativa); las variables cuantitativas fueron
analizadas igualmente por distribución de frecuencias, media y mediana. Se
empleó el programa estadístico “Excel” versión 2019 y el programa informático
RStudio46
8. PRESUPUESTO
El presente proyecto se desarrollará con financiamiento propio tal cual se
describe en las tablas de presupuesto.
Presupuesto global del proyecto de investigación por fuentes de financiación (en
miles de pesos colombianos)
Rubro Total
s
Personal $500.000
Reactivos, anticuerpos y análisis de laboratorio $0
Secuenciación $0
Equipos (Computador portátil de uso propio) $1.500.00
0
Software $0
Materiales (lapiceros, carpetas e impresiones) $100.000
Salidas de Campo $0
Material bibliográfico (En caso de ser necesario la adquisición de artículos $100.000
de investigación en revistas con costos)
Viajes (Reuniones con asesores del proyecto) $50.000
Administración $0
Total $2.250.00
047
9. CRONOGRAMA
Tiempo Primer Segundo Tercer Cuarto Quinto Sexto Séptimo Octavo
mes mes mes mes mes mes mes mes
Actividades 07/2019 08/2019 09/2019 10/2019 11/2019 02/2020 03/2020 04/2020
Revisión x x x
Bibliográfica
Marco Teórico x x x
Presentación del x
anteproyecto a
los
coinvestigadores
Presetación del X
anteproyecto al
par evaluador
Continuación
Tiempo Noveno Décimo Décimo Décimo Décimo Décimo
mes mes primer segundo tercer cuarto
Actividades 06/2020 07/2020 mes mes mes mes
08/2020 09/2020 10/2020 11/2020
x
Presentación
del proyecto al
comité de
ética
x x x
Ejecución del
proyecto
x
Análisis de
datos48
x
Presentaci
ón del
proyecto49
10. RESULTADOS
En el estudio titulado: “Determinación de la presencia del receptor de orexina 1 en células
de glioblastoma multiforme” de 2016 se seleccionaron inicialmente 25 casos de
glioblastoma multiforme del archivo del laboratorio de patología Biomolecular Diagnóstica
SAS, pero finalmente se analizaron 24 muestras porque se excluyó un caso dado que no
había tejido suficiente. En el presente estudio quisimos estudiar en un principio 24
muestras, pero al final se pudieron analizar 23 casos porque en uno de ellos se observó
necrosis extensa del tumor, lo cual impidió un adecuado análisis de inmunohistoquímica.
En la tabla 3 se detallan las variables epidemiológicas (edad, género, localización y
diagnóstico patológico) de los 23 pacientes analizados.
Tabla 3 Variables epidemiológicas de los pacientes
PACIENTE EDAD GÉNERO LOCALIZACIÓN DIAGNÓSTICO PATOLÓGICO
1 47 Masculino Frontal izquierdo GBM CÉLULAS GIGANTES
2 50 Masculino No especificado GBM COMPONENTE
OLIGODENDROGIAL ASOCIADO
3 72 Femenino Parieto occipital GBM
izquierdo
4 69 Masculino No especificado GBM CÉLULA PEQUEÑA
5 38 Femenino Frontal GBM
6 72 Masculino No especificado GBM
7 53 Masculino Frontoparietal GBM50
8 41 Masculino Prefrontal GBM
derecho
9 64 Masculino Fosa posterior GBM
10 60 Femenino Frontal izquierdo GBM
11 57 Femenino Temporal GBM
izquierdo
12 31 Femenino Temporal GBM VARIANTE GLIOSARCOMA
izquierdo
13 55 Femenino No especificado GBM
14 35 Masculino Frontoparietal GBM CON COMPONENTE
GEMISTOCÍTICO
15 54 Masculino Temporal GBM
derecho
16 51 Masculino No especificado GBM CÉLULA PEQUEÑA
17 9 Masculino Parietal derecho GBM
18 59 Femenino Parietal GBM
izquierdo
19 56 Masculino No especificado GBM CÉLULA PEQUEÑA
20 53 Masculino Occipital GBM
derecho
21 63 Femenino Paraventricular GBM
izquierdo
22 47 Masculino Temporal GBM
izquierdo
23 86 Femenino Parietal GBM
izquierdo
En cuanto a la distribución por género, la mayoría de los casos diagnosticados con
glioblastoma multiforme predominaron en hombres en un 57 %. El género femenino
representó el 43 % de los casos.51
El promedio de edad de los pacientes fue de 53,1 años, con una desviación estándar de
15,9, una mediana de 54 y una moda de 47 años. El paciente con menor edad
diagnosticado con este tipo de tumor glial tenía 9 años y el de mayor edad 89 años. En
el presente estudio encontramos que el rango de edad más frecuente para presentar esta
enfermedad es de los 49 a 69 años. Definitivamente el glioblastoma multiforme se
presenta principalmente en pacientes mayores de 50 años como se observa en la figura
12
Figura 12 Histograma de la edad
En cuanto al diagnóstico patológico, de los 23 casos analizados, se identificaron 2
casos con la variante histológica de células pequeñas, 1 caso con componente
oligodendroglial asociado y 1 caso respectivamente para las siguientes variantes: de
células gigantes, gemistocítica y gliosarcoma.
La literatura nos indica que el glioblastoma multiforme se ubica principalmente en el
lóbulo frontal, pero desafortunadamente no pudimos encontrar información de la
localización tumoral en todos los casos analizados, ya que en 6 de los 23 casos no se
especificó la ubicación del tumor. Con respecto a la lateralidad, en 9 de los 23 casos
analizables para esta variable, se determinó que el lado izquierdo es el lugar más52
frecuente donde se ubica este tumor.
En la tabla 4 se puede observar la expresión de Pink 1 e IDH1 en cada uno de los 23
casos analizados. Cabe resaltar que consideramos la inmunotinción positiva para Pink1
cuando obtuvimos marcación ligera (+), moderada (++) e intensa (+++). La columna
(++) indica doble positividad para Pink1 e IDH1, la columna (+-) señala positividad para
IDH1 y negatividad para Pink1, la columna (-+) nos indica negatividad para IDH1 y
positividad para Pink1; por último la columna (--) señala negatividad para IDH1 y Pink1.
El número uno (1) significa el cumplimiento de una función lógica, es decir, la doble
positividad, doble negatividad o positividad y negatividad alternada. El número cero (0)
por el contrario significa el incumplimiento de la función lógica.
Tabla 4 Expresión por inmunohistoquímica de IDH1 y Pink1
Caso IDH1 Pink1 ++ +- -+ --
1 + ++ 1 0 0 0
2 - ++ 0 0 1 0
3 + + 1 0 0 0
4 + - 0 1 0 0
5 + ++ 1 0 0 0
6 + ++ 1 0 0 0
7 - - 0 0 0 1
8 + ++ 1 0 0 0
9 - ++ 0 0 1 0
10 + - 0 1 0 0
11 - ++ 0 0 1 0
12 - - 0 0 0 1
13 + ++ 1 0 0 0
14 + ++ 1 0 0 0
15 + - 0 1 0 0
16 + ++ 1 0 0 053
17 + + 1 0 0 0
18 + ++ 1 0 0 0
19 - - 0 0 0 1
20 - - 0 0 0 1
21 - - 0 0 0 1
22 - + 0 0 1 0
23 - + 0 0 1 0
Con relación a la inmunotinción para la proteína Pink1 se logró determinar que 15 (65
%) de los casos fueron positivos para esta proteína; distribuidos de la siguiente manera:
marcación de una cruz (+) en 4 casos (17,3 %) y marcación de dos cruces (++) en 11
casos (47,7 %). En ningún caso hubo marcación de tres cruces (+++). 8 (35 %) casos
fueron negativos para Pink1.
Con respecto al IDH1 13 (57 %) tumores expresaron esta proteína y 10 (43 %) fueron
negativos para la misma. Los casos dobles positivos es decir con coexpresión para
estas dos proteínas fueron 10 (43 %) y los casos dobles negativos 5 (22 %). Los casos
que tuvieron expresión positiva para Pink1 pero fueron a la vez negativos para IDH1
representaron el 22 % con solo 5 casos. Por último los casos que tuvieron expresión
positiva para IDH1 pero fueron a la vez negativos para Pink1 representaron el 13 % con
3 casos. Las tabla 5 muestra las frecuencias absolutas entre IDH1 y Pink1. A su vez en
la tabla 6 se observan las frecuencias porcentuales entre estos dos marcadores.
En el anexo A se adjunta una imagen con inmunomarcación positiva para Pink1 (++) y
otra para IDH1.54
Tabla 5 Frecuencias absolutas entre Pink1 e IDH1
Pink1
+ - Total
+ 10 3 13
IDH1
- 5 5 10
Total 15 8 23
Tabla 6 Frecuencias porcentuales entre Pink1 e IDH155
Pink1
+ - Total
+ 0,43 0,13 0,57
IDH1
- 0,22 0,22 0,43
Total 0,65 0,35 1,00
Los 13 (57 %) casos positivos para IDH1 corresponden a glioblastomas multiformes
secundarios con IDH1 mutado. Los 10 casos restantes se consideran glioblastomas
multiformes no especificados (NOS) debido a que con el anticuerpo utilizado solo se
estudió la mutación más frecuente de IDH1, pero no se pudieron identificar otras
mutaciones menos frecuentes ni mutaciones en IDH2.
Se realizó en el programa informático RStudio la función chisq.test (prueba de chi
cuadrado) para observar la asociación entre la expresión de IDH1 y Pink1. El resultado
fue: 0.81421; con un valor de p igual a 0.3669.
En la tabla 7 se observa la expresión de IDH1 y Pink1 en las variantes histológicas del
glioblastoma multiforme. Desafortunadamente contamos con pocos casos de estas
variantes histológicas, lo cual no nos permite realizar conclusiones acerca de la
expresión de Pink1 e IDH1 en estas muestras.56
Tabla 7 Expresión de IDH1 y Pink1 en las variantes histológicas de GBM
VARIANTE
IDH1 Pink1
HISTOLÓGICA
GBM CÉLULAS
+ ++
GIGANTES
GBM CON COMPONENTE
- ++
OLIGODENDROGLIAL
GBM CÉLULA PEQUEÑA + -
GLIOSARCOMA - -
GBM CON COMPONENTE
+ ++
GEMISTOCÍTICO
GBM CÉLULA PEQUEÑA + ++
GBM CÉLULA PEQUEÑA - -57
11. DISCUSIÓN
En el presente estudio se encontró que el promedio de edad de los pacientes fue de 53,1
años, con una desviación estándar de 15,9; una mediana de 54 y una moda de 47 años.
A su vez el rango de edad más común fue entre los 49 a 69 años. Estos hallazgos están
en consonancia con lo reportado en la literatura, donde el glioblastoma multiforme es el
tumor primario glial más agresivo y frecuente en personas mayores de 50 años y
específicamente en el rango de edad de 55 a 75 años (Ostrom QT, 2017) (David N. Louis,
2016). Aunque el GBM es un tumor relativamente raro en pediatría se encontró un caso
de un paciente con tan solo 9 años.
En cuanto a la distribución por género, la mayoría de los casos diagnosticados con
glioblastoma multiforme predominaron en hombres en un 57 %. De acuerdo con Tamimi
AF el GBM es 1,6 veces más frecuente en hombres que en mujeres (Tamimi AF, 2017).
El glioblastoma multiforme se localiza principalmente a nivel supratentorial en el lóbulo
frontal; aunque su crecimiento es rápido y las células tumorales pueden cruzar de un
hemisferio cerebral a otro, usualmente a través del cuerpo calloso (Hanif F, 2017).
Desafortunadamente no pudimos encontrar información de la localización tumoral en
todos los casos analizados, ya que en 6 de los 23 casos no se especificó la ubicación del
tumor.
Inicialmente analizamos la expresión por inmunohistoquímica para las proteínas Pink1 e
IDH1 en los controles positivos. Para Pink1 utilizamos diferentes tejidos como corteza
renal, placenta, músculo estriado esquelético, encéfalo y testículo. De estos tejidos,58
donde obtuvimos mejor marcación, fue en los macrófagos de Hofbauer y en el citoplasma
de las neuronas y células gliales. Para IDH1 empleamos como control positivo externo
placenta y tejido de un astrocitoma anaplásico. El control negativo interno fue el tejido
cerebral normal adyacente a los tumores.
La literatura médica nos indica claramente que existe expresión diferencial de la proteína
IDH1 entre el tejido cerebral normal y los tumores gliales. Por el contrario no existe
expresión diferencial de la proteína Pink1 entre el tejido encefálico usual y los tumores
gliales (Uhlen M, 2017). La hipótesis nula (H0) del presente estudio recita que no existe
relación o asociación entre la expresión por medio de inmunohistoquímica de IDH1 y
Pink1 en 23 muestras de glioblastoma multiforme analizadas. Por el contrario la hipótesis
alternativa (Ha) plantea que existe relación entre la expresión por inmunohistoquímica de
estas dos proteínas en 23 muestras de glioblastoma multiforme. El resultado de la prueba
chi cuadrado fue: 0.81421; con un valor de p igual a 0.3669, el cual no es
estadísticamente significativo porque el valor de p es mayor a 0.05. Por este motivo
aceptamos la hipótesis nula y rechazamos la hipótesis alternativa. Esto significa que no
hay asociación entre la expresión de estas 2 proteínas. Sin embargo, los 10 de 23 casos
dobles positivos nos deja la interrogante si aumentando el número de casos podría
mejorar el valor de p.
Se debe recordar que el GBM es un tumor heterogéneo en relación con su expresión
proteica y que las moléculas Pink1 e IDH1 actúan en compartimientos celulares
diferentes. Por estas razones deben hacerse estudios adicionales como PCR,
secuenciación de primera generación y aumentar el número de muestras para establecer
conclusiones más precisas. En definitiva, obtuvimos resultados negativos en esta
investigación porque no encontramos asociación entre la expresión de Pink1 e IDH1.
La expresión de Pink1 en el control positivo externo e interno, es decir en el tejido cerebral
normal es leve (+) a moderada (++). El comportamiento de la expresión de Pink1 en las
muestras de glioblastoma multiforme fue similar al tejido cerebral normal ya que en 4
(17,3 %) de las 23 muestras analizadas se obtuvo una expresión de esta proteína ligera59
(+) y en 11 (47,7 %) de los 23 casos su expresión fue moderada (++). En ningún caso
hubo sobreexpresión (+++). Esto significa que en 15 (65 %) de 23 casos, esta proteína
está presente en el glioblastoma multiforme. En 8 (35 %) muestras la expresión fue
negativa. Al principio de la investigación creíamos que la expresión de Pink1 en GBM iba
a estar perdida porque se considera a PARK6 como un gen supresor tumoral que inhibe
el efecto Warburg, la angiogénesis y la proliferación celular (Agnihotri S., 2016). Sin
embargo, en 35 % de las muestras la expresión fue nula. En tumores como el
glioblastoma multiforme la pérdida de expresión de Pink1 se produce probablemente por
pérdida en el número de copias donde no se expresa el transcrito y la proteína.
Desconocemos si existen mecanismos de epigenética que generen la hipermetilación del
promotor del gen PARK6 el cual no permita su transcripción. Siendo este un estudio
exploratorio, es necesario determinar qué mecanismos genéticos explican su falta de
expresión (Bernardini, 2016).
No cabe duda de que la expresión de Pink1 es un arma de doble filo para la supervivencia
de la célula tumoral del GBM. Porque por un lado si se sobreexpresa se atenúa el
crecimiento de las células tumorales, pero por el otro si su expresión es regulada hacia
la baja, el tumor se vuelve más radiosensible y por tanto más propenso a morir (Agnihotri
S., 2016).
La expresión de IDH1 en el control positivo externo, es decir en el astrocitoma anaplásico
fue adecuada. En 13 (57 %) de los 23 casos analizados obtuvimos marcación positiva
para esta proteína. Sin embargo no podemos concluir que en los 10 (43 %) casos
restantes en donde obtuvimos marcación negativa, verdaderamente sean negativos para
IDH1, ya que el clon del anticuerpo utilizado solamente detecta la proteína truncada
producto de la mutación R132H. Asociado a esto no podemos detectar otros productos
proteicos resultantes de otras mutaciones en IDH1 o de IDH2. Por tanto en necesario la
realización de estudios de PCR y secuenciación para IDH1 e IDH2 para obtener
conclusiones más precisas.
En el año 2018 se publicó un estudio de mutaciones en los genes IDH1 e IDH2 en una60
muestra de gliomas de población colombiana donde se encontró que el 34 % y 7,5 % de
las muestras presentaban mutaciones en el gen IDH1 e IDH2 respectivamente (Orlando
Ricaurte, 2018). No podemos extrapolar y comparar nuestros datos con este estudio
porque allí se estudió la expresión de IDH1 en gliomas en general y no específicamente
en glioblastoma multiforme. Sin embargo, si podemos concluir que la mayoría de nuestras
muestras de GBM expresan la proteína IDH1 (57%), lo cual no indica que son
glioblastomas secundarios derivados de astrocitomas de bajo grado o anaplásicos con
un relativamente mejor pronóstico que los glioblastomas primarios.
No se encontró la información sobre la ubicación de cada caso en el microarreglo, el Dr.
Mauricio Valencia quien realizó el trabajo sobre expresión de Orexina en gliomas no
incluyó estos datos en su trabajo de grado y tampoco encontró esta información para
proporcionárnosla. Esto impidió la correlación entre distintas variables.61
12. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Existe concordancia entre nuestros hallazgos y los datos reportados en la literatura con
respecto al comportamiento de las variables edad y sexo en el glioblastoma multiforme.
Consideramos que este estudio descriptivo es absolutamente exploratorio, porque los
investigadores creíamos que el gen PARK6 al ser un gen supresor tumoral, la proteína
PINK1 no iba a estar expresada en este tipo de neoplasia, pero encontramos solamente
su ausencia en 8 de los 23 casos analizados.
Este es el primer estudio en Colombia que busca la expresión proteica de PINK1 en
muestras de Glioblastoma multiforme. Nuestra hipótesis nula planteaba que no existía
relación entre la expresión por medio de inmunohistoquímica de IDH1 y Pink1 en 23
muestras de glioblastoma multiforme analizadas, lo cual es cierto, ya que la prueba de
chi cuadrado no mostró una asociación entre estas dos proteínas.
Desafortunadamente no obtuvimos información valiosa acerca de la ubicación exacta de
los casos en el microarreglo de tejidos, lo cual impidió la correlación entre distintas
variables. Sabemos que el poco número de muestras, no nos permitió sacar conclusiones
estadísticamente significativas.
Por último, deben hacerse estudios moleculares para establecer la presencia de otras
mutaciones de IDH1 e IDH2, y así intentar definir la causa de la falta de expresión de
Pink 1 en 8 casos y compararlos con los casos positivos.62
ANEXO A
IDH1 POSITIVO
PINK1 POSITIVO (++)63
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