Análisis mutacional del factor v  de leiden, protrombina g20210a y metilentetrahidrofolato reductasa c677t y a1298c  en una muestra de pacientes con susceptibilidad a trombofilia
Autor: García Acuña, Silvia Margarita
Asesor: Narváez Rincón, Paulo César
Fecha: 2011
Programa: Bogotá - Medicina -Fisioterapia
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: La trombosis es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en el mundo aumentando de 1 por 100000 personas durante la infancia a 1 por 100 personas en los adultos mayores con una evidencia que demuestra la alta prevalencia de genes mutados que aumentan la susceptibilidad. Entre ellos se encuentran el Factor V de Leiden, la mutación de la protrombina G20210A y los polimorfismos C677T y A1298C de la enzima Metilentetrahidrofolato reductasa.   Se tomaron 128 pacientes con historia de un evento tromboembólico o pérdida gestacional recurrente sin otros factores de riesgo y como controles 200 individuos caucasoides.   Se encontró heterocigocidad para el Factor V de Leiden en el 17% de los pacientes y en el 1.5% de los controles con un OR de 15.94 (IC 95%; 4.70-54.04); no se identificaron sujetos homocigotos. La mutación en Protrombina y MTHFR C677T no evidenciaron asociación con la presencia de enfermedad. El análisis estratificado de MTHFR A1298C detectó una asociación con las mujeres que presentaban pérdida gestacional recurrente (OR 4.06 IC95% 1.47-11.23). También se demostró una clara tendencia hacia una interacción entre la mutación del Factor V y este polimorfismo al observarse un aumento del OR a 21.6 (IC95%; 2.8-946.2) en pacientes con las dos alteraciones.  Dadas las asociaciones demostradas, se requieren estudios prospectivos que analicen tratamientos preventivos con anticoagulación en pacientes con las mutaciones y evaluar la aparición de nuevos eventos, y mejor aún evitar el desarrollo de los mismos en pacientes con las alteraciones sin historia clínica de la enfermedad. / Abstract. Thrombosis is a major cause of mortality and morbidity in the world rising from 1 per 100000 people during childhood to 1 per 100 people in older adults with evidence demonstrating the high prevalence of mutated genes that increase susceptibility. These include the Factor V Leiden, prothrombin mutation G20210A and C677T and A1298C polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase enzyme.   We took 128 patients with a history of thromboembolic events or recurrent pregnancy loss without other risk factors and 200 Caucasian individuals as controls.   We found heterozygosity for Factor V Leiden in 17% of patients and in 1.5% of controls with an OR of 15.94 (95% CI 4.70-54.04), no homozygous subjects were identified. The prothrombin mutation and MTHFR C677T showed no association with the presence of disease. Stratified analysis of MTHFR A1298C detected an association with women who had recurrent pregnancy loss (OR 4.06 95% CI 1.47-11.23). Also showed a clear trend towards an interaction between the Factor V mutation and the polymorphism with an increase in OR to 21.6 (95% CI, 2.8-946.2) in patients with both disorders.   Given the demonstrated associations, prospective studies are needed to analyze preventive treatment with anticoagulants in patients with mutations and evaluate the occurrence of new events, and better yet, prevent the development of these abnormalities in patients with no history of disease.

ANÁLISIS MUTACIONAL DEL FACTOR V DE LEIDEN, PROTROMBINA
G20210A Y METILENTETRAHIDROFOLATO REDUCTASA C677T Y A1298C
EN UNA MUESTRA DE PACIENTES CON SUSCEPTIBILIDAD A TROMBOFILIA
SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANATÓMICA Y CLÍNICA
BOGOTÁ
2011ANÁLISIS MUTACIONAL DEL FACTOR V DE LEIDEN, PROTROMBINA
G20210A Y METILENTETRAHIDROFOLATO REDUCTASA C677T Y A1298C
EN UNA MUESTRA DE PACIENTES CON SUSCEPTIBILIDAD A TROMBOFILIA
SILVIA MARGARITA GARCÍA ACUÑA
CÓDIGO 05 - 597837
Trabajo de Grado para optar al título de
Especialista en Patología Anatómica y Clínica
Director
Dr. Juan José Yunis Londoño
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PATOLOGÍA ANATÓMICA Y CLÍNICA
BOGOTÁ
2011DEDICATORIA
Este proyecto de vida, la definición de un futuro, la culminación de un sueño, el
principio y el fin de una etapa maravillosa, está dedicado con todo mi amor a mis
padres y a mis hermanas, porque de ellos he aprendido la responsabilidad, la
entrega y el amor al trabajo, necesarios para ser exitoso no sólo a nivel
profesional sino también personal.AGRADECIMIENTOS
A todas las personas que conocí durante este trayecto, mil y mil gracias por
haberme permitido crecer en todos los sentidos.
Especial reconocimiento a mi director de proyecto, Dr. Juan José Yunis por
haberme mostrado un mundo totalmente desconocido para mi y hacerme ver que
podía ser parte de él.
A la Dra. Helena Hernández Cuervo, investigadora, por su invaluable ayuda en el
campo experimental y analítico.
Al Dr. Andrés Leonardo González, por hacerme entender que los números no son
necesariamente enemigos.
A Paola Andrea García Acuña, por regalarme su talento en las gráficas de este
trabajo.
A mi familia, a mis amigos, a mis compañeros, muchas gracias por la paciencia
durante estos cuatro años.
A Javier por haberme cambiado la vida en menos de cuatro meses.
Finalmente, a los profesores del Departamento de Patología de la Universidad
Nacional de Colombia, el mayor de los agradecimientos por haber creído en mí, y
haberme permitido experimentar la mejor de las residencias, de una manera
íntegra, respetuosa, haciéndome sentir siempre en casa.RESUMEN
ANÁLISIS MUTACIONAL DEL FACTOR V DE LEIDEN, PROTROMBINA
G20210A Y METILENTETRAHIDROFOLATO REDUCTASA C677T Y A1298C
EN UNA MUESTRA DE PACIENTES CON SUSCEPTIBILIDAD A TROMBOFILIA
Autor: Dra. Silvia Margarita García Acuña
Director: Dr. Juan José Yunis Londoño
Trabajo de Grado: Especialidad en Patología Anatómica y Clínica
Facultad de Medicina
Universidad Nacional de Colombia
Enero de 2011
RESUMEN
La trombosis es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en el
mundo aumentando de 1 por 100000 personas durante la infancia a 1 por 100
personas en los adultos mayores con una evidencia que demuestra la alta
prevalencia de genes mutados que aumentan la susceptibilidad. Entre ellos se
encuentran el Factor V de Leiden, la mutación de la protrombina G20210A y los
polimorfismos C677T y A1298C de la enzima Metilentetrahidrofolato reductasa.
Se tomaron 128 pacientes con historia de un evento tromboembólico o pérdida
gestacional recurrente sin otros factores de riesgo y como controles 200 individuos
caucasoides.
Se encontró heterocigocidad para el Factor V de Leiden en el 17% de los
pacientes y en el 1.5% de los controles con un OR de 15.94 (IC 95%; 4.70-54.04);
no se identificaron sujetos homocigotos. La mutación en Protrombina y MTHFR
C677T no evidenciaron asociación con la presencia de enfermedad. El análisis
estratificado de MTHFR A1298C detectó una asociación con las mujeres que
presentaban pérdida gestacional recurrente (OR 4.06 IC95% 1.47-11.23). También
se demostró una clara tendencia hacia una interacción entre la mutación del
Factor V y este polimorfismo al observarse un aumento del OR a 21.6 (IC95%;
2.8-946.2) en pacientes con las dos alteraciones.
Dadas las asociaciones demostradas, se requieren estudios prospectivos que
analicen tratamientos preventivos con anticoagulación en pacientes con las
mutaciones y evaluar la aparición de nuevos eventos, y mejor aún evitar el
desarrollo de los mismos en pacientes con las alteraciones sin historia clínica de la
enfermedad.Palabras claves: trombosis, Factor V de Leiden, protrombina G20210A,
metilentetrahidrofolato reductasa
MUTATIONAL ANALYSIS OF FACTOR V LEIDEN, PROTHROMBIN G20210A
AND METHYLENETETRAHYDROFOLATE REDUCTASE C677T AND A1298C
IN A SAMPLE OF PATIENTS SUSCEPTIBLE TO THROMBOPHILIA
ABSTRACT
Thrombosis is a major cause of mortality and morbidity in the world rising from 1
per 100000 people during childhood to 1 per 100 people in older adults with
evidence demonstrating the high prevalence of mutated genes that increase
susceptibility. These include the Factor V Leiden, prothrombin mutation G20210A
and C677T and A1298C polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase
enzyme.
We took 128 patients with a history of thromboembolic events or recurrent
pregnancy loss without other risk factors and 200 Caucasian individuals as
controls.
We found heterozygosity for Factor V Leiden in 17% of patients and in 1.5% of
controls with an OR of 15.94 (95% CI 4.70-54.04), no homozygous subjects were
identified. The prothrombin mutation and MTHFR C677T showed no association
with the presence of disease. Stratified analysis of MTHFR A1298C detected an
association with women who had recurrent pregnancy loss (OR 4.06 95% CI 1.47-
11.23). Also showed a clear trend towards an interaction between the Factor V
mutation and the polymorphism with an increase in OR to 21.6 (95% CI, 2.8-946.2)
in patients with both disorders.
Given the demonstrated associations, prospective studies are needed to analyze
preventive treatment with anticoagulants in patients with mutations and evaluate
the occurrence of new events, and better yet, prevent the development of these
abnormalities in patients with no history of disease.
Keywords: thrombosis, Factor V Leiden, prothrombin G20210A,
methylenetetrahydrofolate reductaseCONTENIDO
RESUMEN ............................................................................................................... 5
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................ 10
2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................. 11
3. OBJETIVOS .................................................................................................... 12
3.1 OBJETIVO GENERAL ................................................................................. 12
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................ 12
4. MARCO TEÓRICO ......................................................................................... 13
4.1 GENERALIDADES ....................................................................................... 13
4.2 HEMOSTASIS Y REGULACIÓN DE LA COAGULACIÓN ........................... 13
4.3 FACTORES DE RIESGO ............................................................................. 17
4.3.1. Factores de Riesgo adquiridos: ............................................................ 17
4.3.2 Factores de riesgo hereditarios ............................................................. 19
4.4 DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LAS TROMBOFILIAS ........................ 19
4.4.1 Factor V de Leiden................................................................................. 20
4.4.2 Mutaciones en la Protrombina ............................................................... 22
4.4.3 Polimorfismos en la enzima Metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR)
........................................................................................................................ 23
4.5 TROMBOFILIA E IMPACTO EN EL EMBARAZO ........................................ 25
4.6 PRUEBAS GENETICAS PARA DETECCIÓN DE ALTERACIONES EN
FACTORES DE COAGULACIÓN ...................................................................... 26
5. DISEÑO EXPERIMENTAL................................................................................. 30
5.1 DISEÑO ........................................................................................................ 30
5.2 POBLACIÓN A ESTUDIO ............................................................................ 305.3 MÉTODOS ................................................................................................... 30
5.4 ANÁLISIS DE DATOS ................................................................................. 32
6. RESULTADOS ................................................................................................... 36
7. DISCUSIÓN ....................................................................................................... 39
8. CONCLUSIONES .............................................................................................. 43
9. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................... 44LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Esquema de la cascada de coagulación ................................................. 14
Figura 2. Vía de la Proteína C................................................................................ 15
Figura 3. Mecanismos inhibidores de la antitrombina ............................................ 16
Figura 4. Mecanismo de resistencia a la proteína C activada secundario a la
mutación del Factor V (Factor V de Leiden). ......................................................... 21
Figura 5. Metabolismo de la homocisteína ............................................................ 23
Figura 6. Productos de amplificación Factor II y V ................................................. 33
Figura 7. Producto de amplificación para MTHFR C677T ..................................... 33
Figura 8. Producto de amplificación para MTHFR A1298C ................................... 33
Figura 9. Productos de restricción Factor II y V ..................................................... 34
Figura 10. Productos de restricción MTHFR C677T .............................................. 35
Figura 11. Productos de restricción MTHFR A1298C ........................................... 35
LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Métodos disponibles para la detección de Factor V de Leiden y Factor II
G20210A. ............................................................................................................... 28
Tabla 2. Primers usados para la amplificación del DNA y tamaño de los
amplicones en la PCR y en la restricción. .............................................................. 32
Tabla 3. Frecuencias alélicas en Factor V de Leiden, Factor II (protrombina
G20210), MTHFR C677T y A1298 ......................................................................... 371. INTRODUCCIÓN
La trombosis es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en el
mundo aumentando de 1 por 100000 personas durante la infancia a 1 por 100
personas en los adultos mayores con una evidencia que demuestra la alta
prevalencia de genes mutados que aumentan la susceptibilidad (1).
El imbalance entre los sistemas procoagulantes y sus mecanismos regulatorios
causado por la interacción entre factores genéticos y adquiridos, es un paradigma
multifactorial en el cual éstos interactúan de manera cooperativa y llevan a un
riesgo significativo para el desarrollo de trombosis (2).
De ahí que el reconocimiento de factores de riesgo ya establecidos y conocidos
como las trombofilias heredadas, deben determinarse para establecer el potencial
patológico en cada individuo, ya que de esto depende su tratamiento, seguimiento,
prevención y estudios familiares.
102. JUSTIFICACIÓN
El tromboembolismo venoso es el tercer desorden cardiovascular más prevalente
después de la enfermedad isquémica y del choque, pudiendo desencadenar un
embolismo pulmonar, evento que amenaza la vida. Más aún, los eventos
trombóticos agudos generan un aumento en la morbilidad de los pacientes cuando
éstos presentan síndromes postrombóticos ó enfermedad recurrente (3).
En Estados unidos se ha estimado que aproximadamente dos millones de
habitantes presentan algún episodio de tromboembolismo venoso al año, y
600.000 de ellos hacen embolismo pulmonar (4); a pesar de esta enorme cantidad
de población afectada por la entidad, se sabe poco sobre su real patogénesis
dado el carácter multifactorial que la caracteriza. Sin embargo, en los últimos 20
años se ha visto un incremento en el estudio de los factores hereditarios, también
llamados trombofilias, detección que facilitaría a los clínicos decidir sobre la
instauración de terapias de anti coagulación, duración del tratamiento y estudios
de extensión a otros miembros de la familia (1).
Particularmente llaman la atención el estudio del Factor V de Leiden y Protrombina
G20210A por ser las más frecuentes y en quienes se ha detectado mayor riesgo.
En los últimos años, la hiperhomocisteinemia también se ha tenido en cuenta
como factor de riesgo no sólo para trombosis venosa sino para otras alteraciones
como defectos del tubo neural. En particular se estudian los polimorfismos de la
enzima Metilentetrahidrofolato reductasa C677T y A1298C, los cuales han
mostrado un leve incremento del riesgo (1).
En Colombia las patologías tromboembólicas contribuyen de manera importante a
la morbimortalidad, presentándose entre 40.000 y 72.000 casos por año; este es el
primer estudio en el país y en Suramérica que investiga la frecuencia de las
mutaciones y polimorfismos antes descritos en la población general, haciendo
énfasis en su asociación con la presencia de la enfermedad y aumento del riesgo.
113. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar la frecuencia de la mutación G1691A en el gen para el factor V (Factor
V de Leiden), la mutación G20210A del gen del Factor II y los polimorfismos
C677T y A1298C de la enzima metilentetrahidrofolato reductasa y establecer su
relación con la presencia de trombofilias.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Determinar la frecuencia del FV Leiden en pacientes con trombofilia y
compararla con la hallada en la población general
 Determinar la frecuencia de la mutación del FII G20210A en pacientes con
trombofilia y compararla con la hallada en la población general
 Determinar la frecuencia de los polimorfismos de MTHFR A1298C y C677T
en pacientes con trombofilia y compararla con la hallada en la población
general
 Determinar si existe asociación entre las pérdidas gestacionales recurrentes
y la presencia de las mutaciones y polimorfismos.
124. MARCO TEÓRICO
4.1 GENERALIDADES
La definición clínica de trombosis es la presencia patológica de un tapón
hemostático en un vaso sanguíneo o en el corazón que causa obstrucción del flujo
sanguíneo a través del Sistema Circulatorio. Dependiendo de su localización la
enfermedad trombótica puede ser venosa o arterial, siendo sus factores de riesgos
y fisiopatología diferentes para cada una (5).
Además, es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad, generando
una incidencia de 100 a 192 casos por 100000 personas-año; de éstos, un tercio
presentan un émbolo pulmonar sintomático y los demás permanecen con una
trombosis venosa profunda (6,7).
En 1884, Virchow postuló la teoría de una triada de anormalidades (lesión
endotelial, estasis e hipercoagulabilidad) para explicar la etiología de la trombosis.
Este concepto resultó profético, dado que ahora se ha demostrado que los tres
componentes de la triada juegan un rol activo en el desarrollo de los fenómenos
trombóticos. En los últimos años ha sido evidente que el riesgo de desarrollar la
enfermedad es un proceso dinámico que resulta del sinergismo entre factores de
riesgo adquiridos y trombofilias heredadas. Para poder entender cómo estos
factores alteran el mecanismo de la formación del trombo, es necesario entender
la fisiología normal de la hemostasis, los mecanismos que la regulan y los agentes
de diversas índoles que aumentan el riesgo (8).
4.2 HEMOSTASIS Y REGULACIÓN DE LA COAGULACIÓN
La hemostasis es un mecanismo fisiológico que controla la fluidez de la sangre y
tiene el potencial de inducir rápidamente la formación de un tapón en los sitios de
daño con el objetivo de parar o disminuir el sangrado. Este proceso se realiza en
tres diferentes fases. La primera de ellas, inicia con la adhesión de las plaquetas a
las fibras de colágeno subyacentes al endotelio vascular, que han sido expuestas
como consecuencia del daño. Esta adhesión es mediada por las glicoproteínas
Ia/IIa y el factor de Von Willebrand (FvW) y como resultado las plaquetas
empiezan a liberar diferentes factores de coagulación y de activación de
13leucocitos. Posteriormente se adhieren una a otra a través de integrinas lo cual
termina formando el tapón hemostático plaquetario proceso también denominado
hemostasis primaria (4, 5, 9).
El proceso de coagulación como tal, también llamado hemostasis secundaria inicia
con la exposición del factor tisular a la sangre, a partir de las capas
subendoteliales y con gran afinidad y especificidad por las formas cimógena y
activa del factor VII. Una vez unido al factor tisular activa a los factores IX y X. El
IX a su vez interactúa con su cofactor no enzimático, el Factor VIIIa en la
superficie de la plaqueta para formar el complejo “tenase”, el cual activa
eficientemente al factor X. Éste, se ensambla en la membrana plaquetaria con el
Factor Va y forma el complejo de la protrombinasa el cual es el encargado de
transformar la protrombina a trombina y ella a su vez, convierte el fibrinógeno
soluble a fibras de fibrina insolubles que se agregan al coágulo de fibrina suave (4,
5, 9)
La última parte de la hemostasis involucra la fibrinólisis. Su rol, es remover los
depósitos de fibrina después de que el vaso lesionado ha sido restaurado, a través
de la plasmina (forma activa del plasminógeno) de tal manera que la red de fibrina
es disuelta (Figura 1) (4, 5, 9).
Figura 1. Esquema de la cascada de coagulación
14Adaptado de McPherson & Pincus: Henry's Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods, 21st ed.
La formación del coágulo es bastante rápida, sin embargo el peligro radica en que
el exceso del proceso termine produciendo una trombosis. Es así, que la
naturaleza ha creado varios mecanismos anticoagulantes para controlar las vías
en diferentes niveles, dentro de los cuales se destaca el sistema de los inhibidores
de proteasas séricas plasmáticas (antitrombina, alfa 2 macroglobulina y
antitripsina) y la vía de la proteína C. Éste último es considerado el mayor sistema
anticoagulante en vivo. Inicia con la presencia de un exceso de trombina no unida
al coágulo que rápidamente se une a una glicoproteína transmembranal del
epitelio llamada trombomodulina. Una vez unida, su capacidad pro coagulante es
transformada a propiedades anticoagulantes al ser la encargada de activar a la
Proteína C. Es así, que la Proteína C activada (APC) se une a un cofactor, la
Proteína S en la superficie fosfolipídica de las plaquetas y rápidamente inactiva al
factor Va y al VIIa, y de esta manera disminuyen la generación de trombina en la
vía pro coagulante (figura 2) (2,5).
Figura 2. Vía de la Proteína C
15ACP=Proteína C activada; TM=trombomodulina; Thr=trombina; REPC=receptor
endotelial de la proteína C; FVa = factor V activado; FVIIIa = factor VIII activado;
PS=Proteína S. Adaptado de McPherson & Pincus: Henry's Clinical Diagnosis and
Management by Laboratory Methods, 21st ed.
La antitrombina (formalmente llamada antitrombina III) es una proteína inhibidora
circulante del plasma que regula a la trombina y al factor Xa y en menor
proporción a los factores IXa, XIa, XIIa y VIIA. Su función se ve incrementada en
las células endoteliales por glicosaminaglicanos tales como el heparán sulfato,
dermatán sulfato y farmacológicamente por la heparina (Figura 3) (2).
Figura 3. Mecanismos inhibidores de la antitrombina
AT=antitrombina; Heparan= Heparina; AT= antitrombina; Thr= trombina.
Tomado de McPherson & Pincus: Henry's Clinical Diagnosis and Management by
Laboratory Methods, 21st ed.
164.3 FACTORES DE RIESGO
El tromboembolismo venoso a menudo resulta de las interacciones entre varios
factores de riesgo, y el entendimiento de ellos incrementa la posibilidad de
diagnóstico para realizar un tratamiento oportuno. La triada de Virchow
mencionada anteriormente (estasis, hipercoagulabilidad y disfunción endotelial)
promueve la trombogénesis conociéndose ciertos factores de riesgo que alteran
uno ó más elementos de ellos; pueden ser de tipo heredado y adquirido y se
mencionarán a continuación (6).
4.3.1. Factores de Riesgo adquiridos:
- Cirugía Ortopédica mayor (Reemplazo de cadera o rodilla)
Estudios clínicos aleatorizados han demostrado tasas de trombosis 7 a 14 días
después de una cirugía ortopédica mayor en pacientes sin profilaxis hasta de un
60%. También se identificaron signos de embolismo pulmonar hasta en un 28%
cuando se realizó una escanografía de ventilación-perfusión de rutina (6)
- Fractura de pelvis, cadera o huesos largos
Los estudios en pacientes con fractura de cadera fueron de los primeros en
demostrar la magnitud del riesgo de presentar trombosis venosa. En ocho estudios
prospectivos en los cuales se realizó venografía de contraste después de una
cirugía por fractura de cadera, se encontró aproximadamente un 50% de
trombosis venosa profunda en pacientes sin profilaxis (6).
- Cirugía general mayor
Este término se aplica a pacientes que van a cirugía abdominal o torácica y que
requieren anestesia general por lo menos de 30 minutos. Sin trombofilaxis, la
incidencia de trombosis fue de aproximadamente 10%-40% entre los pacientes.
- Trauma múltiple y daño a la médula espinal
Geerts y colaboradores encontraron trombosis venosa profunda en un 47% de
pacientes con trauma.
- Quimioterapia y malignidad
El cáncer activo fue un factor de riesgo para el 22.3% de personas en un estudio
poblacional. La frecuencia de trombosis se incrementó de 2 a 3 veces en
pacientes que iban a cirugía por alguna patología tumoral maligna en comparación
a aquellos que iban por otro tipo de patología. La administración de quimioterapia
17también se ha asociado a un incremento del riesgo. Por ejemplo, mujeres con
carcinoma de mama con quimioterapia y cirugía tienen un riesgo aumentado en 3
veces de presentar un evento trombótico en comparación a mujeres cuyo
tratamiento es solamente quirúrgico (6).
- Cirugía de rodilla artroscópica
Estos pacientes presentan un riesgo bajo a moderado, dependiendo de la
presencia de riesgos adicionales. Cambios adversos en la hemostasis después de
una laparoscopia también han sido reportados (6).
- Anticonceptivos orales y embarazo
Un estudio de casos y controles concluyó que la incidencia de trombosis venosa
profunda en mujeres jóvenes sin enfermedad tomando anticonceptivos
estrogénicos orales es de 1 a 3 por 10000 personas año. El embarazo aumenta
este riesgo 5 veces. El embolismo pulmonar es una de las principales causas de
mortalidad materna postparto, con una incidencia de 1 caso por cada 1000
nacimientos (6).
- Terapia de Remplazo Hormonal
Mujeres recibiendo terapia de remplazo hormonal tienen un aumento del riesgo de
2 a 4 veces de trombosis venosa idiopática en comparación a mujeres sin el
tratamiento. En hombres con terapia hormonal para carcinoma de próstata
también se ha reportado un aumento del riesgo (6).
- Tromboembolismo venoso previo
Pacientes con un episodio previo de trombosis venosa profunda tienen un riesgo
mayor para recurrencia, particularmente cuando están expuestos a condiciones de
alto riesgo (cirugías mayores, inmovilidad prolongada). En un estudio de casos y
controles pacientes con un episodio previo tenían un OR de 15.6 en comparación
a aquellos que no lo tenían (6).
- Inmovilidad prolongada debido a viajes en carro o avión
Reportes de casos sugieren que la mayoría de estos eventos afectan a personas
con otros factores adyuvantes o con un episodio previo de tromboembolismo
venoso (6).
- Venas várices
La importancia de las venas várices como factor de riesgo independiente es
controversial. En general se piensa que es un factor débil para presentar la
patología (6).
18- Edad
Pacientes mayores de 40 años presentan un riesgo significativo aumentado en
comparación a pacientes jóvenes y este riesgo se dobla por cada década
subsecuente (6).
- Obesidad
Un estudio de casos y controles en 1272 pacientes mostró que la obesidad
presentaba un odds ratio de 2.39 y un riesgo relativo de 1.7% a 3.2% (6).
4.3.2 Factores de riesgo hereditarios
La resistencia a la proteína C activada (APC), protrombina G20210A, deficiencia
de antitrombina, proteína C y S, homocistinuria, hiperhomocisteinemia y el
síndrome de anticuerpos antifosfolípidos constituyen la mayoría de las trombofilias
heredadas. Su descubrimiento, clasificación y diagnóstico han sido un reto para la
medicina en los últimos años desde el descubrimiento de la primera mutación
asociada a trombosis en el año de 1965 (6).
4.4 DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN DE LAS TROMBOFILIAS
En los últimos años, se ha vuelto evidente que la generación de la trombosis
implica un proceso dinámico que resulta de la actividad conjunta de los riesgos
antes mencionados con las trombofilias heredadas (1,8).
La deficiencia de antitrombina y la disfibrinogenemia fueron las primeras
trombofilias en ser descritas, encontrándose en familias en donde varios miembros
presentaban trombosis venosa. Posteriormente, deficiencias heterocigotas de la
Proteína C y S fueron identificados también como causa de trombofilia heredada.
Inicialmente la búsqueda de pacientes con trombosis idiopáticas y alteraciones
genéticas fue algo decepcionante porque sólo el 5% de los pacientes las
presentaban. La situación cambió dramáticamente en el año de 1993 tras el
descubrimiento de la resistencia a la Proteína C activada. En 1996 se encontró
que la sustitución de adenina por guanina en el nucleótido 20210 del gen de la
protrombina (G202120A) era otra causa de trombofilia. Recientemente los
estudios se han enfocado en el efecto de la hiperhomocisteinemia como factor de
riesgo tanto heredado como adquirido para el desarrollo de trombosis venosa
profunda (1).
19El término “Trombofilia Hereditaria” fue inicialmente usado para describir la
deficiencia congénita de antitrombina; sin embargo, ahora se usa genéricamente
para todos los desórdenes de hipercoagulabilidad causados por un defecto
hereditario. De esta manera, se ha propuesto clasificarlas en cinco grandes grupos
(8):
Defectos cuantitativos o cualitativos de factores inhibidores de la coagulación:
antitrombina, proteína C, proteína S, heparina, cofactor II, y deficiencias de
trombomodulina.
1. Aumento en los niveles o ganancia de función de los factores de
coagulación: factor V de Leiden, mutación de la protrombina,
hiperfibrinogenemia y elevación en los niveles de los factores VII, VIII, IX y
XI.
2. Hiperhomocisteinemia: polimorfismos de la enzima Metilentetrahidrofolato
reductasa (MTHFR)
3. Defectos en el sistema fibrinolítico: plasminógeno, activador del
plasminógeno tisular, factor XIII y lipoproteína.
4. Alteraciones en la función plaquetaria
Entre todos los factores congénitos, se hace especial énfasis en tres de ellos: la
mutación R506Q del gen del factor V de la coagulación (conocido como factor V
de Leiden) y la mutación G20210A del gen de la protrombina, que se han revelado
de especial importancia porque se encuentran con más frecuencia en los
pacientes con episodios de Trombosis Venosa Profunda (TVP), su prevalencia en
la población general (población occidental) es bastante alta y, además, al ser
factores hereditarios, el estudio familiar de pacientes portadores puede ser útil
como herramienta de prevención. (10)
Por otro lado, estudiar la asociación entre algunas variantes genéticas
(polimorfismos de la enzima Metilentetrahidrofolato reductasa-MTHFR) asociadas
a niveles elevados de homocisteína y trombosis venosa puede ser informativa
para dilucidar si en verdad los niveles altos de ésta juegan un rol crucial en el
desarrollo de la patología. (8)
4.4.1 Factor V de Leiden
20El factor V de la coagulación es una proteína esencial en la hemostasis, jugando
un rol crucial tanto en la vía procoagulante como anticoagulante. En su forma
inactiva, sirve como un cofactor del Factor X activado (FXa) en el complejo de la
protrombinasa el cual cataliza la conversión de protrombina en trombina; sin
embargo también actúa como cofactor de la proteína C activada (APC) en la
regulación de la actividad del Factor VIII activo (8).
El gen que codifica el factor V es de aproximadamente 80 kilobases de tamaño, y
se encuentra localizado en el brazo largo del cromosoma 1 (1q23) y consiste de
25 exones y 24 intrones. Su transcripción da origen a un mRNA maduro de 6.8 kb
el cual codifica una proteína de 330 kDa que circula en la sangre en una
concentración de aproximadamente 21nM (5).
Antes de 1993, la evaluación de las trombofilias heredadas se limitaba a realizar
ensayos funcionales para la proteína C, S o deficiencia de antitrombina; esta
aproximación cambió en 1993, cuando Dahlback y colaboradores describieron una
nueva forma familiar de trombofilia caracterizada por resistencia a la Proteína C
activada. Subsecuentemente varios laboratorios reportaron el defecto genético
responsable de esta resistencia: una mutación sin sentido (Guanina por Adenina)
en el nucleótido 1691 del gen del Factor V. El cambio en el aminoácido resultante,
Arginina por Glutamina en la posición 506, ocurre precisamente en uno de los tres
sitios donde la APC normalmente cliva e inactiva la forma procoagulante del
Factor Va, haciéndose por tanto parcialmente resistente a la acción anticoagulante
de la APC y es inactivado aproximadamente a una velocidad diez veces menor de
lo normal, resultando en un aumento de la trombina circulante y por tanto a un
estado protrombótico (figura 4) (10).
Figura 4. Mecanismo de resistencia a la proteína C activada secundario a la
mutación del Factor V (Factor V de Leiden).
21Esta alteración en su forma heterocigota genera un aumento del riesgo de
presentar un episodio de trombosis venosa de 3 a 7 veces, mientras que para los
homocigotos aumenta de 50 a 100 veces (11-13).
En 1998 se descubrieron otras dos mutaciones en el factor V: el FV Hong Kong y
el FV de Cambridge los cuales fueron reportados en pacientes con trombosis.
Ambas mutaciones son resultado del remplazo de la Arginina 306, en el FV de
Hong Kong por una glicina y en el de Cambridge por treonina. Sin embargo, el
primero no ha sido asociado a resistencia contra APC (14).
4.4.2 Mutaciones en la Protrombina
Unos meses después del descubrimiento del Factor V de Leiden, otro importante
factor de riesgo protrombótico fue identificado. De hecho, hacia finales de 1996, un
estudio mostró que 18% de los pacientes seleccionados con trombosis venosa y
cerca de 1% de controles normales tenían un cambio de nucleótidos en la base
20210 del gen de la protrombina (8,15). Ésta, también denominada Factor II de la
coagulación, es una proteína dependiente de vitamina K, que en el proceso de
coagulación se trasforma en trombina (serina proteasa) y en el mismo proceso se
encarga de producir fibrina. La protrombina se encuentra codificada en el
cromosoma 11 en posición 11p11-q12, el gen de la protrombina posee 14 exones
separados por 13 intrones en sentido 5’ y una región no traducida en sentido 3’
(16).
La mutación 20210 fue descubierta en 1996 por Poort et al. Se debe a un cambio
de G por A en la base 20210 en la región no traducida 3’ del gen. Los análisis de
haplotipos sugieren que la mutación apareció de un único fundador hace 20000 o
30000 años. En Europa, la prevalencia es del 2% con un rango de 0.7-4%. La
prevalencia más alta parece encontrarse en las regiones del sur
(aproximadamente 1.7%). En los Estados Unidos se estima entre 1 y 2%. La
mutación no es común en afroamericanos, asiáticos y nativos americanos (16).
En la primera descripción de la mutación, los portadores heterocigotos
presentaban una media plasmática de niveles de protrombina significativamente
mayor (1.32 U/mL) comparados con individuos con genotipo silvestre (1.05 u/mL).
Por su parte, los homocigotos mutados presentaban niveles de 1.70 u/mL. Un
reporte reciente demuestra que la mutación G por A genera una ganancia de
función debido a un incremento en el reconocimiento de la señal de clivaje en la
región 3’. El resultado final es la acumulación de mRNA y por tanto un aumento en
la síntesis de protrombina. Otros han mostrado que los niveles elevados pueden
22inhibir la proteína C activada mediada por una inactivación del Factor Va, lo cual
llevaría a una intensificación en la generación de trombina después de iniciada la
coagulación (16).
Numerosos estudios de casos y controles han demostrado de manera más o
menos consistente la asociación entre la mutación y la enfermedad
tromboembólica. Poort et al reportó un aumento en el riesgo de casi 3 veces (OR
2.8; 95% IC 1.4-5.6). Desde entonces otros estudios han estimado un riesgo
relativo para trombosis venosa entre 2 y 12, estando la mayoría de los estudios en
un rango de 2 a 3 (13, 16).
4.4.3 Polimorfismos en la enzima Metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR)
La homocisteína es un aminoácido trombogénico, sulfurado, que se forma en el
metabolismo de la metionina. Se cataboliza a cisteína por la vía de la
transulfuración con la intervención de dos enzimas dependientes de la vitamina B6
(cistationina B sintasa y cistationasa) o puede ser remetilada a metionina, proceso
en el que interviene la enzima metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR).
Figura 5. Metabolismo de la homocisteína
23En el punto 1 la enzima involucrada es la cistationina beta sintasa; en el punto 2
es la metilentetrahidrofolato reductasa. Adaptado de Key N, McGlennen Ronald.
Hyperhomocysteinemia and thrombophilia. Arch Pathol Lab Med 2002;126:1373.
Esta enzima cataliza la conversión de 5,10 metilentetrahidrofolato, en una reacción
dependiente de NADPH, a 5-metilentetrahidrofolato; este metabolito que se
produce en una reacción fisiológica irreversible, es uno de los tres dadores del
grupo metilo en la conversión de homocisteína a metionina por la enzima
metionina sintasa (Figura 5) (17-19).
Se han propuesto varias hipótesis acerca de los posibles roles de la
homocisteinemia en la enfermedad vascular. Se estudia el efecto en el endotelio
secundario al daño por auto oxidación de la homocisteína, alteraciones en las
células musculares lisas (respuesta proliferativa y aumento en la producción de
colágeno) y otros efectos que se pueda tener en las vías de coagulación como la
inducción de la síntesis del factor tisular por parte de los monocitos, activación
plaquetaria y biosíntesis de tromboxano. Recientemente se ha reportado que la
homocisteína de una manera dosis dependiente puede llevar a alteraciones del
factor Va, lo cual resulta en una reducción en su tasa de clivaje por la proteína C
activada (19).
El gen de la MTHFR se encuentra localizado en la región cromosómica 1p36.
Frosst et al informaron un polimorfismo en el gen que codifica el dominio catalítico
de la MTHFR mientras que Brattstron y colaboradores encontraron un alza de 20%
en los niveles de homocisteína plasmática en los portadores homocigóticos de
este polimorfismo (19).
Esta variante muestra una actividad reducida de la enzima a 37°C y aumenta su
termolabilidad a 46°C, de aquí que se refieran a ella como la variante termolábil.
Este polimorfismo se debe a una sustitución de C por T en la base 677, el cual
codifica a un cambio de aminoácido de alanina por valina. Aproximadamente el
12% de la población en los Estados Unidos es homocigota para esta mutación y la
hiperhomocisteinemia típicamente se manifiesta cuando los niveles de folato se
encuentran en el extremo inferior de los rangos normales (17-19).
El riesgo que conlleva la presencia de este polimorfismo es de aproximadamente
2.5 veces para presentar un evento de trombosis venosa, sin embargo su
asociación al factor V de Leiden se acompaña de un aumento del riesgo y sirve
como un ejemplo de la interacción gen-gen en las trombofilias (19,20).
24Otras variantes que han sido detectadas incluyen la A1298C que genera un
cambio de glutamina por alanina y ha sido implicada en la patogenia de los
defectos del tubo neural (21, 22); la T1068C y la T1317C no son clínicamente
significativas (19).
4.5 TROMBOFILIA E IMPACTO EN EL EMBARAZO
El aborto es definido como la pérdida del embarazo antes de la semana 20 de
gestación y se encuentra asociado a desórdenes genéticos al azar que no
recurren en un embarazo subsiguiente. (23) Los abortos recurrentes se definen
como la pérdida consecutiva de tres embarazos y la probabilidad clínica de que
esto se presente es de aproximadamente 0.8%. En 1996 se hicieron los primeros
reportes que establecían una asociación entre esta entidad y algunas trombofilias
(25)
La mayoría de estos estudios incluyen el análisis del Factor V de Leiden,
protrombina 20210 y MTHFR C677T. En el más grande de ellos desarrollado por
Rai et al, se investigó la asociación entre el factor V de Leiden y abortos
recurrentes en más de 1000 mujeres caucásicas. En este estudio no se demostró
una asociación directa, pero si un aumento en el número de mujeres con
resistencia a la proteína C activada en comparación con los controles (25). Sin
embargo en el meta análisis de Rey et al, los datos muestran un aumento en los
OR de aproximadamente 2 ó más para el Factor V de Leiden. OR similares se han
demostrado para portadores de la mutación de protrombina G20210A. Por otra
parte los hallazgos relacionados a MTHFR han sido contradictorios (26). Es
importante además tener en cuenta el genotipo paterno e incluso el fetal, puesto
que estudios prospectivos en parejas en donde cualquiera de los dos tiene la
mutación han mostrado un riesgo significativamente alto de aborto comparado con
parejas en las cuales ninguno tiene la mutación (27)
Los reportes histomorfológicos han mostrado compromiso de los vasos
sanguíneos con trombosis, vascularización de las vellosidades, infartos, fibrosis y
vasculopatía decidual. Se ha reportado que estos infartos son más significativos
cuando los fetos tenían el alelo del FV de Leiden en comparación a genotipos
normales (28).
A pesar de la falta de más estudios prospectivos randomizados en mujeres con
abortos recurrentes que tienen un defecto trombofílico, se han hecho tratamientos
con anticoagulantes en otro tipo de estudios, usualmente heparina y
ocasionalmente aspirina. Uno de estos estudios se realizó en mujeres
embarazadas con pérdidas no explicables antes de la semana 10 y con Factor V
25de Leiden o mutación en la protrombina. 80 de ellas recibieron 40 mg de
enoxaparina subcutáneamente y los controles tomaron 100 mg de aspirina al día.
Los resultados mostraron que 86% de las mujeres tratadas con heparina tuvieron
un embarazo a término sin problemas en comparación con el grupo control en
quienes fue exitoso en tan solo el 29%. (26)
Hasta que haya evidencia más fuerte, es difícil decidir qué tratamiento con
heparina debería ser recomendado para mujeres embarazadas con trombofilia y
pérdidas recurrentes. Lo que sí es claro es que su administración disminuye
significativamente el riesgo de eventos tromboembólicos durante el embarazo, lo
cual es particularmente importante para mujeres trombofílicas que no tengan
disponible otras alternativas de tratamiento de eficacia probada. (26)
4.6 PRUEBAS GENETICAS PARA DETECCIÓN DE ALTERACIONES EN
FACTORES DE COAGULACIÓN
Hay varias razones para que los médicos en la práctica diaria soliciten una prueba
de trombofilia genética para sus pacientes:
1. Para proveer una explicación de la causa de Tromboembolismo venoso
dado el carácter multifactorial de la entidad. Los estudios informan que la
sola presencia de una o más factores heredados no es suficiente para
explicar la causa de la entidad pero si influyen elevando el riesgo (29).
2. Para establecer el riesgo de recurrencia y determinar la duración de la
anticoagulación (29).
3. Para predecir el riesgo en familiares asintomáticos (29).
Dado que durante los últimos 25 años se han venido estudiando las mutaciones
en los genes del sistema coagulación/anticoagulación como factores de riesgo
para el tromboembolismo venoso, concomitantemente se han estado
desarrollando métodos diagnósticos moleculares (30).
Los métodos basados en DNA para detectar este tipo de alteraciones se
encuentran ampliamente disponibles en los laboratorios para probar
definitivamente la presencia del polimorfismo o mutación, cada uno con ventajas y
desventajas a la hora de seleccionarlos y utilizarlos (tabla 1). Entre ellos están
aquellos basados en la amplificación genómica por medio de la PCR y los que se
basan en otro método:
Métodos basados en PCR:
26Emplea primers específicos para amplificar la secuencia que contiene la mutación
blanca, por ejemplo parte del exón 10 del FV y la parte 3’ no traducida en
protrombina. Posteriormente los productos de amplificación son corridos en un gel
de electroforesis. Una variedad de métodos basados en PCR se han usado para la
detección de estas mutaciones. Entre ellos están:
- Restricción por enzimas de digestión: Este método se basa en que las
mutaciones o los SNPs pueden abolir o crear sitios de restricción para una
enzima determinada, permitiendo discriminar el genotipo por visualización
de los fragmentos de diferentes tamaños al separarlos por electroforesis en
agarosa o acrilamida. Si más de una mutación va a ser detectada en una
múltiplex, los fragmentos digeridos deben ser de un tamaño suficiente para
permitir una interpretación clara y simple del gel (30).
- Amplification-refractory mutation system (ARMS): es una técnica múltiplex
en donde los alelos silvestres y mutados son amplificados
concomitantemente con primers específicos para cada genotipo con
producción de amplicones específicos de diferente tamaño molecular. Los
productos son detectados por electroforesis en agarosa o acrilamida (30).
Método Prueba Ventajas Desventajas
Basados en PCR RED-PCR múltiplex Ampliamente Multipasos; ensayo
disponible, precisa y manual. Riesgo de
efectiva mala interpretación
con la presencia de
múltiples bandas
ARMS No requiere enzimas Riesgo de toxicidad
de digestión para con bromuro de etidio
restricción (si se usa)
SSCP Puede detectar Falta de especificidad.
mutaciones inusuales Discriminación pobre
de otras mutaciones
ELISA Sencillo Ensayo manual
FRET Resultados Alto costo del equipo.
disponibles en menos Mayor riesgo de
de 2 horas. Muy contaminación
sensible. Puede
27detectar mutaciones
inusuales
Secuenciamiento Sencillo y rápido Alto costo
Microarray Completamente Necesita DNA
automatizado purificado
No basados en PCR Invader Sencillo, de fácil Requiere alta
interpretación con su concentración de DNA
software purificado
Tabla 1. Métodos disponibles para la detección de Factor V de Leiden y Factor II
G20210A.
PCR=reacción en cadena de la polimerasa; FRET= transferencia de energía por
resonancia de fluorescencia; RED= digestión por enzimas de restricción; ARMS=
sistema de amplificación refractaria mutacional; SSCP= polimorfismo
conformacional de cadena única; ELISA= ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas. Tomado de Cooper P..C, Rezende S.M. An overview of methods for
detection of factor V Leiden and the prothrombin G20210A mutation (30).
- Polimorfismo conformacional de cadena única (SSCP): El DNA amplificado
es denaturado a cadenas únicas y luego analizado por electroforesis. La
movilidad de la molécula depende de la longitud del amplicón, del peso
molecular y en general por su conformación, la cual está determinada por la
secuencia de nucleótidos (31)
- Ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas: se hibrida un producto
biotinilado de PCR con un oligonucleótido en una placa con pozos. El
conjugado de estreptavidina-peroxidasa es añadido y finalmente, un buffer
de peróxido de hidrógeno con cromófobos detectan el amplicón unido. Al
comparar la densidad del color generada entre las reacciones de los alelos
silvestres y mutados con las sondas de oligonucleótidos se determina el
genotipo (30).
- Identificación por Fluorescencia de fragmentos de PCR por Real Time PCR:
los genotipos son detectados al comparar las temperaturas melting puesto
que la del alelo mutado ocurre a una temperatura inferior que la del alelo
silvestre (30).
- Secuenciamiento directo de DNA: específicamente la pirosecuenciación es
la que se ha usado para detectar estas mutaciones. La reacción es
28monitoreada con la liberación de pirofosfato con conversión a ATP y
detección por la reacción de luciferin-luciferasa (30).
Métodos no basados en PCR
- Invader Assay: Este método utiliza la enzima clivasa, un tipo de nucleasa que
cliva las regiones no pareadas del DNA de al menos 1 pb. Independientemente del
genotipo, dos sondas de oligonucleótidos llamadas Invasora y Primaria se unen y
se disocian continuamente de una hebra blanco de DNA a 63ºC (30)
295. DISEÑO EXPERIMENTAL
5.1 DISEÑO
Casos y controles de base poblacional
5.2 POBLACIÓN A ESTUDIO
Definición de caso: pacientes remitidos por los servicios de hematología, gineco-
obstetricia y neurología de distintas clínicas de la ciudad de Bogotá, que hubiesen
presentado por lo menos un evento tromboembólico (ETE) ya sea accidente
cerebro vascular (ACV), Trombosis venosa profunda (TVP), o tromboembolismo
pulmonar (TEP) sin otros factores de riesgo o haber presentado pérdida
gestacional recurrente (PGR) sin causa etiológica aparente.
Controles: individuos caucásico-mestizos tomados del proyecto “ANÁLISIS
MUTACIONAL DEL FACTOR V G1691A, PROTROMBINA G20210A, MTHFR
C677T Y A1298C EN UNA MUESTRA DE PACIENTES CON HISTORIA CLÍNICA
DE TROMBOFILIA Y EN UNA MUESTRA DE LOS PRINCIPALES GRUPOS
POBLACIONALES COLOMBIANOS “
5.3 MÉTODOS
Extracción de DNA.
El ADN fue extraído de las muestras de sangre periférica por el método de Salting
Out mediante la utilización del kit Wizard® Genomic “DNA Purification Kit” Cat
A1125. El ADN extraído fue almacenado a -20°C hasta su utilización.
Genotipificación.
30Todas las mutaciones se identificaron mediante amplificación por PCR seguida de
restricción con enzimas de digestión. La Tabla 3 presenta la información de
secuencia de los primers, el tamaño del amplicón, la enzima de restricción
empleada para cada caso, y el tamaño de los productos de digestión.
El Factor V G1691A (Factor V Leiden) y el Factor II (Protrombina) G20210A fueron
amplificados por PCR en una reacción múltiplex mediante el procedimiento
descrito por Koksal (31) con algunas modificaciones. En breve, 5 ul de ADN
genómico se amplificaron en un volumen de 50 ul, 1.4 mM de los primers FV, 0.25
mM de los primers para FII, 0.2 mM de cada dNTP, 2.0 mM de MgCl2, y 1.25
unidades de Go Taq DNA polimerase (Promega Corporation, Madison, WI). Los
parámetros de amplificación consistieron en un ciclo de denaturación inicial a
94°C por 5 min, 35 ciclos de denaturación a 94°C por 30 seg, apareamiento de los
primers a 57°C por 30 seg y extensión a 72°C por 30 seg, seguido de extensión
final de 10 min a 72°C. El tamaño de los productos de PCR fueron verificados en
geles de agarosa Sekeam al 2% (Seakem® LE Agarose, LONZA Cat# 50004) (ver
tabla 2 y figura 6).
La amplificación por PCR para MTHFR C677T y A1298C se realizaron por
separado utilizando 2.5 ul de ADN, primers a 0.50 mM, 0.2 mM de cada dNTP, 1.5
mM de MgCl2, y 1.25 u de Go Taq polimerasa (Promega Corporation, Madison,
WI). Los parámetros de amplificación para C677T fueron los descritos por Frost et
al (32) consistentes en denaturación inicial 94°C por 3 min, 33 ciclos con
denaturación a 94°C 30 seg, apareamiento a 59°C por 30 seg, y extensión a
72°C por 30 seg, seguida de extensión final de 3 min a 72°C. Para la mutación
A1298C las condiciones de amplificación corresponden a las descritas por van
der Put et al. (21) con una denaturación inicial 92°C por 2 minutos, seguidos de 35
ciclos de 92°C por 60 segundos (denaturación), 51° por 60 segundos y 72°Cpor
30 segundos con una extensión final de 72°por 7 minutos. El tamaño de los
productos de PCR fue verificado en geles de agarosa Sekeam al 2% (ver tabla 2 y
figuras 7 y 8).
Un total de 15 ul del producto de amplificación para Factor V Leiden y Protrombina
fueron digeridos con 5 U de Mnl I (New England Biolabs R0163), 1X Buffer de
enzima y 1X BSA en un volumen final de 20 ul. Los fragmentos de restricción
fueron resueltos en geles de agarosa NuSieve al 3% (NuSieve® GTG® Agarose,
Cambrex Cat #50084) en 1X TBE (ver tabla 2 y figura 9). Para la mutación MTHFR
C677T se utilizó la enzima de restricción Hinf I (5 u) (New England Biolabs
R0155) y para la MTHFR A1298C se utilizó la enzima Mbo II (10 U) (New England
Biolabs R0148) en un volumen final de 20 ul, 1X buffer y 1X BSA. Los fragmentos
de restricción fueron resueltos en geles de agarosa 1X TBE, NuSieve al 3% (Ver
31tabla 2 y figura 10). Para A1298C los productos de restricción de fueron resueltos
en geles de agarosa al 6% en 1X TBE Methaphor 40% (Methapor® Agarose FMC
Cat#50180), NuSieve al 30% y Seakem 30% (Ver tabla 2 y figura 11).
5.4 ANÁLISIS DE DATOS
Se calcularon las frecuencias alélicas y genotípicas de cada mutación.
Adicionalmente se evaluó el equilibrio Hardy-Weinberg para cada una.
Las variables categóricas se describieron mediante tablas de frecuencias y se
utilizó la prueba de χ2 o el test exacto de Fisher para las pruebas de hipótesis
según el caso. Las variables continuas se describieron en términos de media y
desviación estándar.
La magnitud de la asociación entre mutación y caso se expresó como Odds Ratio
e intervalos de confianza del 95%. Todos los análisis se realizaron con el software
estadístico Stata versión 10 (Statacorp)
Mutación Secuencia de Primer Producto Enzima de Homocigoto Heterocigoto Homocigoto
PCR Restricción Normal Mutado
FV 5’-CATCGCCTCTGGGCTAATA-3’ 1 6 8pb Mnl I 115/37/17 152/115/37/17 152/17
G1691A 5’-TTGAAGGAAATGCCCCATTA-3’
FII 5’-ATGGGGTGAAGGCTGTGACC-3’ 2 2 1pb Mnl I 192/29 221/192/29 221
G20210A 5’-AGCACTGGGAGCATTGAGCCT-3’
MTHFR 5’-ATCAGAGCCCCCAAAGCAGA-3’ 2 25 pb Hinf I 203 203/180 180
C677T 5’-CAGCCTCAAAGAAAAGCTGC-3’
MTHFR 5’- 163pb Mbo II 56/31-30/28 84/56/31- 84/31-30/28
A1298C CTTTGGGGAGCTGAAGGACTACTAC- 30/28
3’ 5’-
CACTTTGTGACCATTCCGGTTTG-3’
Tabla 2. Primers usados para la amplificación del DNA y tamaño de los
amplicones en la PCR y en la restricción.
32Figura 6. Productos de amplificación Factor II y V
Figura 6. Productos de amplificación FV y FII
Figura 7. Producto de amplificación para MTHFR C677T
33Figura 8. Producto de amplificación para MTHFR
A1298C
Figura 9. Productos de restricción Factor II y V
A. Factor V y Factor II en blanco genotipo para factor II, en negro genotipo para
factor V G: alelo normal, A: alelo mutado; PSR: producto sin restringir; MP:
marcador de peso
34T/T MP PSR C/C C/T
Figura 10. Productos de restricción MTHFR C677T
C: alelo normal, T: alelo mutado PSR: producto sin restringir; MP: marcador de
peso
CC AC AA MP PSR AA
163pb
84pb
56pb
30pb
Figura 11. Productos de restricción MTHFR A1298C
A: alelo normal, C: alelo mutado PSR: producto sin restringir; MP: marcador de
peso
356. RESULTADOS
Se estudiaron un total de 328 muestras, provenientes de 128 casos y 200
controles. Se encontró que del total de los pacientes 111 presentaron enfermedad
tromboembólica y 17 mujeres se estudiaron por tener pérdida gestacional
recurrente.
Del total de pacientes, 31.25% eran de sexo masculino, con una edad promedio
de 26 años (rango 8 meses a 68 años) y 68.75% de sexo femenino, con una
media de edad de 31 años (rango 1 mes a 67 años). Un 63.96% de las mujeres
presentaron evento tromboembólico, mientras que las restantes fueron remitidas
por PGR.
Factor V de Leiden
Se encontró heterocigosidad para la mutación en el 17% de los casos y 1.5% de
los controles. No se registraron casos ni controles homocigotos para la alteración.
La mutación se encontraba en equilibrio de HW para ambos grupos (p= 1.0) y se
asoció fuertemente con la presencia de enfermedad (OR 15.97, IC95% 4.7 a 54).
Al estratificar por patología se identificó una fuerte asociación con las pacientes
que presentaban pérdida gestacional recurrente (OR 8.75, IC95% 1.35-56-50)
Las frecuencias alélicas se muestran en la Tabla 3.
Protrombina G20210A
Se encontró heterocigosidad para la mutación en el 1.6% de los casos y en ningún
control. No se registraron casos ni controles homocigotos para la alteración. La
mutación en los casos se encontró en equilibrio de Hardy Weinberg (p=1.0). La
ausencia de mutaciones en el grupo control impide calcular el Odds Ratio.
MTHFR C677T
Se encontró heterocigosidad para la mutación en el 52% de los casos y en el 50%
de los controles. En este polimorfismo se registró homocigosidad en el 19% de los
casos y en el 24% de los controles. El equilibrio de Hardy-Weinberg en ambos
36grupos se mantuvo (p=1.0) y no hubo asociación con la presencia de enfermedad
(OR 0.92, IC95% 0.55 a 1.52) aún al estratificar el grupo control por patología.
MTHFR A1298C
Para el polimorfismo A1298C la heterocigosidad se encontró en el 28% de los
casos y en el 20% de los controles; la homocigosidad para la mutación se
identificó en el 4% de los casos y el 5% de los controles. El equilibrio de Hardy-
Weinberg se mantuvo en el grupo de casos (p=0.532) pero se observó alterado en
el grupo control (p=0.0026). No hubo asociación con la presencia de enfermedad
cuando se analizó la totalidad de los pacientes (OR 1.40, IC95% 0.85 a 2.33); sin
embargo al estratificarlos por patología se detectó una asociación con las mujeres
que presentaban pérdida gestacional recurrente (OR 4.06 IC95% 1.47-11.23).
Población n Factor V G1691A Factor II G20210A MTHFR C677T N/A MTHFR A1298C†
G A G A C T A C
Controles 200 397 3 400 0 204 196 337 63
(0.9925) (0.0075) (1.0000) (0.0000) (0.5100) (0.4900) (0.8425) (0.1575)
Pacientes 128 234 22 254 2 139 115 182 42
(0.9141) (0.0859) (0.9922) (0.0078) (0.5472) (0.4528) (0.8125) (0.1875)
Tabla 3. Frecuencias alélicas en Factor V de Leiden, Factor II (protrombina
G20210), MTHFR C677T y A1298
Adicionalmente se realizó un análisis estratificado para evaluar si la presencia de
una mutación en MTHFR potenciaba la asociación existente entre la alteración del
factor V y la presencia de enfermedad. Se identificó entonces que el OR de los
pacientes con mutación en el Factor V sin la presencia de MTHFR C677T era de
10.6 (IC95% 1.17 a 494) mientras que en aquellos que si la tenían aumentó a 19
(IC95%; 4.3 a 170.7).
El mismo análisis se realizó para el polimorfismo A1298C. Los individuos con
Factor V de Leiden y sin el polimorfismo presentaban un OR de 15.3 (IC 95%; 3.3-
142) mientras que en aquellos con ambas alteraciones incrementa a 21.6 (IC95%;
2.8-946.2).
37Esto indica una clara tendencia hacia una interacción entre la mutación del Factor
V y los polimorfismos de la enzima.
387. DISCUSIÓN
En el presente estudio se investigó la asociación del FV de Leiden, protrombina
G20210A y MTHFR C677T y A1298C con la presencia de trombosis venosa
profunda, identificándose un aumento del riesgo de casi 16 veces cuando se tiene
la mutación en el Factor V. La frecuencia genotípica en este caso también fue
mayor encontrándose de 19.3% en pacientes contra un 1.5% en los controles.
Esto concuerda con reportes previos en los cuales se ha documentado la
asociación del Factor V y la carencia o menor asociación de los otros
polimorfismos a menos que estén combinados con otro factor de riesgo (11,12)
Esto se evidencia por ejemplo, en el “Physicians Health study” en donde se
encontró un 12% de incidencia de heterocigosidad para la mutación en pacientes
en comparación a un 6% en los controles. La incidencia alcanzó un pico en 31
hombres mayores de 60 años sin factores de riesgo adicionales (12).
Por otra parte, el estudio de trombofilia de Leiden, que consistía en 471 pacientes
menores de 70 años y 474 controles sanos, encontró una incidencia de resistencia
a la APC en el 21% de los pacientes en comparación a un 5% de los controles. La
incidencia de la heterocigosidad (18% vs 3%) fue mayor en los pacientes que en
los controles en concordancia con lo reportado en este trabajo (12). En Colombia,
Varela y colaboradores, reportaron en donantes de sangre una prevalencia de la
mutación del 1.4%, lo cual concuerda con lo encontrado en este proyecto (33).
La asociación con trombosis venosa profunda en el estudio de Trombofilia, fue de
7 veces en los heterocigotos contra un 16 reportado en el presente (12).
La mutación de la protrombina G20210A se describió originalmente en la
población danesa, donde la prevalencia encontrada fue del 2.3% en controles
sanos, 6.2% en pacientes no seleccionados con trombosis venosa profunda y 18%
en pacientes seleccionados con historia familiar. Se ha identificado una mayor
prevalencia de la mutación en Europa del sur (2.6%-6.5%) en comparación a lo
reportado para Europa del Norte. En el estudio actual se observó la mutación en
estado heterocigoto en 2 pacientes y en ningún control. Esto es acorde a lo
reportado por Torres y colaboradores en Colombia, en donde se reportaron 3
pacientes heterocigotos, un homocigoto y ningún control con la mutación (3,16).
Ya que los datos de prevalencia en las poblaciones Amerindia y africana son
extremadamente bajas, la prevalencia en la población Colombiana podría
39explicarse por la mezcla de la población con los Españoles en donde la frecuencia
ha llegado a reportarse de hasta 6.5% (3). Respecto al riesgo de desarrollar TVP
en pacientes con esta mutación, los datos de Poort y Girolami informan un
aumento en el riesgo de hasta 2 y 3 veces; en el estudio actual no es posible
hacer cálculos de riesgo dada la ausencia de mutaciones en el grupo control (15).
Los polimorfismos de MTHFR siempre han estado rodeados de controversias.
Múltiples estudios de casos y controles han mostrado asociaciones entre
trombosis arterial y venosa y los niveles de homocisteína en sangre; sin embargo,
los resultados son contradictorios cuando se comparan con la prevalencia
homocigótica, en especial de MTHFR C677T (20). Un reciente meta análisis
concluyó que a pesar de que la mutación causa leve hiperhomocisteinemia, no
hay un aumento del riesgo cardiovascular. Actualmente es generalmente aceptado
que éste polimorfismo por sí solo no es un factor de riesgo para desarrollar una
trombosis, pero si podría tenerse en cuenta como un factor de sinergismo con
otras condiciones trombofílicas. La frecuencia en este estudio del genotipo
homocigoto fue de 19% en los pacientes y 24% en los controles; los heterocigotos
por su parte, presentaron frecuencias similares en los pacientes y en los controles
de 52% y 50% respectivamente; estos datos coinciden relativamente con el
estudio previo en Colombia de Torres y colaboradores en los cuales reportan una
homocigocidad de 24% en los pacientes y 19.3% en los controles; la
heterocigosidad se detectó en un 52% en los pacientes y en un 50% en los
controles (3, 20). Dado estos resultados el riesgo de presentar un evento
tromboembólico con la presencia de este polimorfismo no puede establecerse
debido a la alta frecuencia de la alteración en la población sana. De la misma
manera, la presencia del polimorfismo A1298C se encuentra distribuida
ampliamente en los individuos sin patología, siendo éste el primer estudio que
reporta la frecuencia genotípica en Colombia y Latinoamérica; sin embargo, al
categorizar las patologías, se evidencia que las pacientes con pérdida gestacional
recurrente presentan un aumento del riesgo de hasta 4 veces cuando tienen el
polimorfismo. Los escasos trabajos sobre éste hacen muy difícil concluir la
significancia del hallazgo; Van der Put y colaboradores reportan un riesgo relativo
aún menor que lo identificado para C677T cuando hicieron el análisis en el
contexto de presencia de defectos del tubo neural (22). No hay estudios similares
en Colombia o Suramérica.
Respecto a la asociación encontrada encontrada en este estudio entre el
polimorfismo MTHFR A1298C y las pacientes con pérdida gestacional recurrente,
diversos estudios han mostrado resultados contradictorios, algunos mostrando un
aumento del riesgo en 2.5 veces y otros incluso han insinuado que este
polimorfismo no contribuye significativamente a la hiperhomocisteinemia ni
40siquiera en combinación con el polimorfismo C677T e incluso se ha cuestionado
su efecto fenotípico desde el punto de vista bioquímico(23-26). Sin embargo, debe
tenerse siempre presente que la ausencia de un fenotipo in vitro no
necesariamente descarta la posibilidad de su importancia in vivo, por ejemplo
durante momentos con altos requerimientos de folato como el embarazo. Un
metanálisis mostró una disminución en los niveles de homocisteína en un 25% al
administrar una dosis diaria de ácido fólico entre 0.5 mg y 5 mg (25). Se requieren
más estudios con un número mayor de pacientes para establecer si existe
realmente una asociación y aún más, si la administración del medicamento
disminuye la tasa de pérdidas gestacionales recurrentes, lo que sería de gran
relevancia clínica e importancia en la salud pública.
Respecto al equilibrio de Hardy Weinberg los resultados fueron los esperados para
el factor V. Varios estudios en diferentes contextos clínicos (carcinoma
endometrial, sepsis, enfermedad tromboembólica, estudios de reproducción
asistida) y en diferentes poblaciones han mostrado equilibrio del polimorfismo (34-
37).
Por otro lado, el desequilibrio que se evidenció en el polimorfismo de MTHFR
A1298C no puede explicarse en esta situación puesto que no se ha presentado en
la población estudiada alteraciones de tipo selección natural o migraciones.
Finalmente, se hace necesario comentar la tendencia hacia una interacción entre
la mutación del Factor V y los polimorfismos de MTHFR. La mutación ocurre
comúnmente y puede ser coheredada con otras trombofilias como deficiencias de
la proteína C, proteína S, antitrombina, protrombina G20210A y MTHFR C677T al
igual que lo encontrado en este trabajo. Además se observa un aumento en sus
OR. Por ejemplo, un análisis de 8 estudios de casos y controles reportó un OR en
pacientes con FV de Leiden y Protrombina G0210A de 20 (IC95%; 11-36)
comparado con el OR de 4.9 (IC95%;4.1-5.9) para aquellos solo con Factor V de
Leiden y el OR de 3.8 (IC95%; 3.0-4.9) en los que tenían solo Protrombina
G20210A (11).
Al parecer las personas que tienen dos defectos presentan un mayor riesgo para
desarrollar un evento trombótico que sus familiares con uno solo. En una revisión
de 4 estudios, aproximadamente el 75% de los miembros de una familia con dos
defectos presentaron el evento en comparación al 10% de aquellos que solo
presentaban una alteración, de lo que se infiere que el aumento del riesgo fue de
aproximadamente 3 veces (11).
El riesgo de trombosis también se ha visto incrementado cuando los pacientes
presentan concomitantemente hiperhomocisteinemia. El estudio de Ridker y
colaboradores en donde se evaluaron pacientes con trombosis venosa idiopática
41reportó un aumento del riesgo de 3.4 veces con hiperhomocisteinemia, 2.3 veces
con el Factor V de Leiden y 21.6 veces con ambos desórdenes (3, 38). Estos
datos se correlacionan con los hallados en este estudio.
En resumen, este trabajo permitió conocer la frecuencia genotípica de las
mutaciones en el Factor V, en el Factor II y en los polimorfismos de MTHFR
C677T y A1298C, compararlas con estudios previos encontrando concordancia,
inferir riesgo de trombosis venosa profunda en pacientes con dichas alteraciones
detectando una mutación con una fuerte asociación (Factor V de Leiden) en
pacientes con eventos trombóticos y otra (MTHFR A1298C) en mujeres con
pérdida gestacional recurrente.
También se reportó una tendencia hacia la interacción entre el Factor V de Leiden
y los polimorfismos de MTHFR C677T en correspondencia con estudios previos.
Se requieren estudios prospectivos en los que se determinen si un tratamiento
preventivo con anticoagulación en pacientes con las mutaciones, realmente pueda
prevenir la aparición de nuevos eventos, y mejor aún evitar el desarrollo de los
mismos en pacientes con las alteraciones sin historia clínica de la enfermedad.
428. CONCLUSIONES
1. Este trabajo permitió conocer la frecuencia genotípica de las mutaciones en
el FV, en el Factor II y los polimorfismos de MTHFR C677T y A1298C
comparando con la literatura mundial y otros reportes colombianos
encontrando concordancia con ellos.
2. Se detectó una fuerte asociación del FV de Leiden en pacientes con
eventos tromboembólicos, mayores a lo reportado mundialmente y a su vez
se encontró una tendencia hacia la interacción con los polimorfismos de
MTHFR.
3. Se evidenció una asociación entre el polimorfismo de MTHFR A1298C y
pérdidas gestacionales recurrentes
4. Es necesario la realización de estudios prospectivos en los que se
determine si un tratamiento preventivo con anticoagulantes en pacientes
con las mutaciones realmente prevengan la aparición de nuevos eventos o
evitar el desarrollo de los mismos en pacientes con las alteraciones pero sin
historia de enfermedad
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