Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
Autor: Fletscher Covaleda, Gabriel Fernando
Asesor: Chaparro Garzón, Orlando (Thesis advisor)
Fecha: 2014
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: INTRODUCCIÓN: La reconstrucción de defectos óseos segmentarios en huesos largos  continúa siendo un reto para el cirujano ortopedista, y las técnicas quirúrgicas disponibles  tienen múltiples limitaciones. La técnica de reconstrucción en dos tiempos a través de la  inducción de membrana descrita por el Dr. Alain Masquelet aún está en desarrollo y una  de sus limitaciones radica en el volumen del injerto óseo. El objetivo del presente trabajo  es evaluar mediante un modelo animal experimental la utilización de medios  condicionados, productos de la secreción paracrina de células madre mesenquimales  (MSC), como alternativa al uso de injerto óseo en el segundo tiempo quirúrgico de la  técnica y, estudiar los aspectos biológicos de la expansión y diferenciación de las células  madre mesenquimales in vivo en la búsqueda de estrategias terapéuticas para el  tratamiento de defectos óseos estructurales en huesos largos.  MATERIALES Y METODOS: Estudio experimental en modelo animal. 9 Conejos en los  cuales se reprodujo la técnica de membrana inducida posterior a la creación de un defecto  óseo de 1 cm en la diáfisis femoral. Durante la primera intervención se realizó  estabilización de la osteotomía con un fijador externo diseñado para la especie animal y  colocación de polimetilmetacrilato (PMMC) en el área del defecto óseo. Durante el  segundo tiempo quirúrgico se dividieron los animales en cuatro grupos para evaluar el  efecto paracrino de la MSC y su expansión y diferenciación celular. Se realizó evaluación  radiológica 4 semanas posterior a la intervención y se compararon los hallazgos entre los  diferentes grupos en relación al porcentaje de cierre del defecto óseo.  RESULTADOS: En todos los grupos se confirmó la capacidad osteoinductora de la  membrana en ausencia de injerto óseo; esta capacidad se aumenta mediante el uso de  medios condicionados derivados de cultivos der MSC, logrando un 98% de cierre del  defecto óseo.  DISCUSIÓN: Es posible la utilización de medios condicionados producidos por células  madre mesenquimales, basado en su efecto paracrino, como alternativa al injerto óseo  durante el segundo tiempo quirúrgico en la técnica de Masquelet en conejos, para el  tratamiento de defectos óseos en huesos largos. De esta forma, se plantea una alternativa  para el tratamiento de defectos óseos en huesos largos y posible modificación de la  técnica de Masquelet.

Modificación experimental de la técnica de
membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos
por células madre mesenquimales
Gabriel Fernando Fletscher Covaleda
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Cirugía
Unidad de Ortopedia y Traumatología
Bogotá D.C, Colombia
2014Modificación experimental de la técnica de
membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos
por células madre mesenquimales
Gabriel Fernando Fletscher Covaleda
Código: 05598769
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Especialista en Ortopedia y Traumatología
Director:
Dr. Enrique Vergara Amador
Codirectores:
Dr. Orlando Chaparro
Dra. Itali Linero
Línea de Investigación:
Cirugía ortopédica –Ciencias Básicas – Tecnología de Tejidos
Grupos de Investigación:
Grupo de Investigación Unidad de Ortopedia y Traumatología
Grupo de Investigación Biología de Células Madre
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía
Unidad de Ortopedia y Traumatología
Bogotá D.C, Colombia
2014A mi familia, motivadores de mi vida…Resumen y Abstract IV
Resumen
INTRODUCCIÓN: La reconstrucción de defectos óseos segmentarios en huesos largos
continúa siendo un reto para el cirujano ortopedista, y las técnicas quirúrgicas disponibles
tienen múltiples limitaciones. La técnica de reconstrucción en dos tiempos a través de la
inducción de membrana descrita por el Dr. Alain Masquelet aún está en desarrollo y una
de sus limitaciones radica en el volumen del injerto óseo. El objetivo del presente trabajo
es evaluar mediante un modelo animal experimental la utilización de medios
condicionados, productos de la secreción paracrina de células madre mesenquimales
(MSC), como alternativa al uso de injerto óseo en el segundo tiempo quirúrgico de la
técnica y, estudiar los aspectos biológicos de la expansión y diferenciación de las células
madre mesenquimales in vivo en la búsqueda de estrategias terapéuticas para el
tratamiento de defectos óseos estructurales en huesos largos.
MATERIALES Y METODOS: Estudio experimental en modelo animal. 9 Conejos en los
cuales se reprodujo la técnica de membrana inducida posterior a la creación de un defecto
óseo de 1 cm en la diáfisis femoral. Durante la primera intervención se realizó
estabilización de la osteotomía con un fijador externo diseñado para la especie animal y
colocación de polimetilmetacrilato (PMMC) en el área del defecto óseo. Durante el
segundo tiempo quirúrgico se dividieron los animales en cuatro grupos para evaluar el
efecto paracrino de la MSC y su expansión y diferenciación celular. Se realizó evaluación
radiológica 4 semanas posterior a la intervención y se compararon los hallazgos entre los
diferentes grupos en relación al porcentaje de cierre del defecto óseo.
RESULTADOS: En todos los grupos se confirmó la capacidad osteoinductora de la
membrana en ausencia de injerto óseo; esta capacidad se aumenta mediante el uso de
medios condicionados derivados de cultivos der MSC, logrando un 98% de cierre del
defecto óseo.V Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
DISCUSIÓN: Es posible la utilización de medios condicionados producidos por células
madre mesenquimales, basado en su efecto paracrino, como alternativa al injerto óseo
durante el segundo tiempo quirúrgico en la técnica de Masquelet en conejos, para el
tratamiento de defectos óseos en huesos largos. De esta forma, se plantea una alternativa
para el tratamiento de defectos óseos en huesos largos y posible modificación de la
técnica de Masquelet.
Palabras Clave: Técnica de Masquelet, Células Madre Mesenquimales, Huesos
largos.
Abstract
INTRODUCTION: Reconstruction of segmental defects in long bones remains a challenge
for the orthopedic surgeon and surgical techniques available have many limitations. The
two times reconstruction technique through induction of membrane described by Dr. Alain
Masquelet is still in development and one of its limitations lies in the volume of bone graft.
The aim of this study is to evaluate in an experimental animal model the use of conditioned
media, products of paracrine secretion of mesenchymal stem cells (MSC) as an alternative
to bone graft in the second surgical time and study the biological aspects of the expansion
and differentiation of MSC in vivo in the search for therapeutic options for the treatment of
structural bone defects in long bones strategies.
MATERIALS AND METHODS: Experimental study on animal model. 9 rabbits in which the
technique of induced membrane was reproduced later of a creation of a bony defect of 1
cm in the femoral shaft. During the first intervention the stabilization of the osteotomy was
performed with an external fixator designed for this animal specie and placement of
polymethylmethacrylate (PMMC) in the area of the bone defect. During the second
operation the animals were divided into four groups to evaluate the paracrine effect of the
MSC and their expansion and differentiation. Radiological evaluation was performed 4
weeks after the intervention and the findings between different groups were compared on
the percentage bone defect closure.Resumen y Abstract VI
RESULTS : In all groups, the osteoinductive capability of the membrane in the absence of
bone graft is confirmed; this capacity is increased by the use of conditioned media derived
from a MSC cultive , achieving a 98 % closure of the bone defect.
DISCUSSION : It is possible using conditioned media produced by mesenchymal stem
cells based on its paracrine effect, as an alternative to bone graft during the second
procedure in the Masquelet technique in rabbits, for treating bone defects in long bones .
The conditioned media are an alternative for the treatment of long bone defects and
possible modification of the Masquelet technique.
Keywords: Masquelet technique, Mesenchymal stem cells, Long bones.Contenido VII
Contenido
Resumen………………………………………………………………………………………… IV
Lista de figuras………………………………………………………………………………….. IX
Lista de tablas…………………………………………………………………………………… X
Lista de abreviaturas…………………………………………………………………………… XI
Introducción……………………………………………………………………………………… 1
1. Objetivos ....................................................................................................... 2
1.1 Objetivo Geneal ............................................................................................... 2
1.2 Objetivos Específicos ...................................................................................... 2
2. Marco Teórico ............................................................................................... 4
2.1 Técnica membrana inducida (Masquelet) ........................................................ 4
2.2 Células madre mesenquimales (MSC)............................................................. 5
2.3 El futuro de la técnica de membrana inducida ................................................. 8
3. Metodología .................................................................................................. 9
3.1 Estudios previos: ............................................................................................. 9
3.2 Diseño del estudio ........................................................................................... 9
3.2.1 Tipo de Estudio ........... 9
3.2.2 Especie animal ........... 9
3.2.3 Tamaño de la muestra .......... 10
3.3 Fases del proyecto .........................................................................................10
3.3.1 Fase I: Primer tiempo quirúrgico. ..........11
3.3.2 Fase II: Segundo tiempo quirúrgico ..........14
3.3.3 Fase III: Interpretación de resultados. Evaluación radiológica. ..........17
4. Consideraciones éticas ............................................................................... 19
5. Resultados .................................................................................................. 20Contenido VIII
5.1 Fase I ............................................................................................................. 20
5.2 Fase II ............................................................................................................ 21
5.3 Fase III: Evaluación Radiológica ..................................................................... 21
5.3.1 Lectura convencional: .......... 21
5.3.2 Índice Cierre defecto óseo y porcentaje defecto óseo. .......... 23
6. Discusión..................................................................................................... 25
6.1 Técnica De Membrana Inducida (Masquelet) En Conejos ............................. 25
6.2 Comparación Grupos ..................................................................................... 25
6.3 Acciones célula madre mesenquimal (MSC) en relación a membrana
Masquelet .................................................................................................................... 26
6.4 Medios condicionados producidos por MSC y técnica de Masquelet en
humanos .................................................................................................................... 28
7. Conclusiones y recomendaciones ............................................................... 29
7.1 Conclusiones ................................................................................................. 29
7.2 Recomendaciones ......................................................................................... 29
Bibliografía ……………………………………………………………..………………..………. 30Contenido IX
Lista de figuras
Pág.
Figura 1: Acciones célula madre mesenquimal 6
Figura 2: Esquema de obtención de un medio condicionado. 7
Figura 3: Pieza anatómica fémur de conejo. Fijador Externo para investigación
animal en conejos 10
Figura 4: Procedimiento quirúrgico fase I 11
Figura 5: Resultado Radiológico Post operatorio 13
Figura 6: Recuperación y deambulación del animal con el fijador 13
Figura 7: Esquema metodología 15
Figura 8: Procedimiento quirúrgico fase II 17
Figura 9: Medición Porcentaje de cierre del defecto óseo 18
Figura 10: Hallazgos Radiológicos Grupos de Investigación 22
Figura 11: Efectos célula madre mesenquimal en relación
a técnica de Masquelet 27
.Contenido X
Lista de tablas
Pág.
Tabla 1: Complicaciones Fase I 20
Tabla 2: Índice Cierre defecto óseo y porcentaje de cierre defecto
óseo por espécimen 23
Tabla 3: Promedios Índice Cierre defecto óseo y porcentaje de cierre
defecto óseo por grupos de investigación 24Contenido XI
Lista de abreviaturas
Abreviatura Término
MSC Célula madre Mesenquimal
PMMC Polimetilmetacrilato- Cemento óseo
cm Centímetro
VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial
TGF Factor de crecimiento transformante
BMP Proteína morfogénica óseaIntroducción
El manejo de los defectos óseos continua siendo un reto para el cirujano ortopedista quien
a pesar de la introducción de nuevas técnicas quirúrgicas para el manejo de la patología
de origen multifactorial, aun se ve limitado en los resultados postoperatorios y funcionales
del paciente.
Diferentes técnicas se han utilizado y entre las más utilizadas están las de
corticodistracción (Ilizarov) y la transferencia de injertos vascularizados ya que el uso de
injertos no vascularizados no se recomienda para lesiones mayores a 6 cm por la
reabsorción del mismo.1 Con la introducción de técnicas de membrana inducida
(Masquelet) para el tratamiento de los defectos óseos, utilizando volúmenes variables de
injerto óseo autólogo no vascularizado se han descrito reconstrucciones de hasta de 20
cm, por lo que en grandes defectos en los cuales se requieren volúmenes mayores de
injerto, se han venido incorporando técnicas quirúrgicas para la obtención del mismo en
diferentes localizaciones corporales, aumentando la morbilidad del paciente y el riesgo de
complicaciones2,3.
El estudio de las células madre mesenquimales (MSC) ha proporcinado un mejor
entendimiento de sus funciones, efectos capacidad de diferenciación y secreción
paracrina por lo que se plantea la posibilidad de su utilización dentro del arsenal
terapéutico para el manejo de defectos óseos segmentarios. El presente trabajo evalua de
forma experimental la utilización de medios condicionados producto de la secreción
paracrina de células madre mesenquimales como alternativa al uso de injerto óseo en el
segundo tiempo quirúrgico de la técnica de Masquelet.1. Objetivos
1.1 Objetivo General
Evaluar de forma experimental la utilización de medios condicionados producto de la
secreción paracrina de células madre mesenquimales como alternativa al uso de injerto
óseo en el segundo tiempo quirúrgico de la técnica de Masquelet.
1.2 Objetivos Específicos
(cid:1) Estudiar los aspectos biológicos y moleculares de la expansión y diferenciación de las
células madre mesenquimales in vivo (modelo animal) en la búsqueda de estrategias
terapéuticas para tratamiento de defectos óseos estructurales en huesos largos.
(cid:1) Evaluar la utilidad del uso de medios condicionados producto de la actividad paracrina
de la MSC dentro del segundo tiempo quirúrgico técnica de Masquelet para manejo de
defectos óseos críticos en huesos largos.
(cid:1) Evaluar los hallazgos radiológicos del tejido obtenido en área defecto óseo crítico
posterior a la utilización de medios condicionados en el segundo tiempo quirúrgico
técnica de Masquelet.
(cid:1) Evaluar desde el punto de vista experimental posibles estrategias terapéuticas para
patología osteoarticular basadas en la utilización de células madre y modificación de
entornos celulares (citoquinas) y la posible combinación de estas nuevas estrategias3 Objetivos
con las ya utilizadas actualmente en el entorno clínico para manejo de defectos
osteoarticulares (trasplante de tejido osteoarticular, banco de tejido).
(cid:1) Incursionar como unidad de investigación en patología ortopédica en el campo de la
biología molecular y el uso de células madre con el fin de buscar estrategias
terapéuticas en enfermedad degenerativa osteoarticular y en el manejo de defectos
óseos estructurales en huesos largos en los cuales las técnicas disponibles
actualmente a nivel mundial no solucionan de forma satisfactoria la patología del
paciente.2. Marco Teórico
2.1 Técnica membrana inducida (Masquelet)
Diferentes publicaciones desde 1986 han aumentado el conocimiento de la técnica
propuesta por Masquelet para la reconstrucción en dos tiempos quirúrgicos de defectos
óseos mediante la inducción de una membrana biológica 6. Técnica generalmente
utilizada en reconstrucciones traumáticas o post infecciosas.
En el primer tiempo quirúrgico se realiza la remoción del tejido óseo necrótico asociado a
la colocación de un espaciador de cemento (Polimetilmetacrilato - PMMC) y la adecuada
cobertura en tejidos blandos. El segundo tiempo se realiza entre las 6 y 8 semanas
cuando los tejidos blandos tienen una mejoría de signos inflamatorios e infecciosos,
momento en el cual se realiza el retiro del espaciador preservando la membrana que lo
rodea, la cual se rellena con injerto óseo4.
Estudios realizados enfocados al entendimiento del papel de la membrana en la
inhibición de la absorción del injerto óseo, han utilizado ovejas como modelo animal, en
los cuales se crearon defectos óseos de 3cm y se simularon cuatro situaciones
experimentales para el injerto óseo en el segundo tiempo quirúrgico: membrana + injerto,
injerto sin membrana, membrana sin injerto y defecto sin membrana y sin injerto,
evidenciando la importancia de la membrana en la viabilidad del injerto óseo para la
reconstrucción ósea. De forma interesante a pesar de no utilizar sustituto óseo se
documentó la formación de hueso al interior de la membrana5.Marco teórico 5
Estudios posteriores se han enfocado en el análisis histológico y bioquímico de la
membrana encontrando que la membrana está altamente vascularizada en todas sus
capas6. La parte interna (cara al cemento) es un epitelio similar a la sinovial y la parte
exterior está hecha de colágeno, fibroblastos y miofibroblastos. La membrana secreta
factores de crecimiento: alta concentración de factor de crecimiento vascular endotelial
(VEGF) factor de crecimiento transformante 1(TGF B-1); niveles observados desde la
segunda semana. La proteína morfogénica ósea (BMP-2) estaba en su nivel más alto en
la cuarta semana.
Como se ha mencionado, con los resultados clínicos y de los estudios experimentales, se
puede afirmar que la membrana inducida actúa como una cámara biológica. La
membrana evita la reabsorción del hueso esponjoso y promueve la vascularización y la
corticalización del hueso esponjoso. Por último, se considera un sistema de entrega in situ
para factores de crecimiento y factores osteoinductores. Los estudios realizados a la
fecha sugieren que el mejor momento para realizar el injerto es un mes después de la
colocación del espaciador cemento.
2.2 Células madre mesenquimales (MSC)
Las células madre mesenquimales (MSC) fueron inicialmente descritas en medula ósea
hacia 19706 y actualmente se reconoce su existencia en diferentes tejidos: cordón
umbilical, sangre, tejido adiposo, pulmón, cerebro, hígado. Por sus características son
foco de investigación como fuente terapéutica para diferentes enfermedades. Tres
funciones principales de las células mesenquimales han sido asociadas con sus efectos
terapéuticos7: remplazo de tejidos a través de diferenciación, inmunomodulación y efectos
antinflamatorios; y por último la secreción de moléculas que estimulan o asisten en el
proceso de reparación tisular (efecto paracrino) (Figura 1).
La evidencia actual demuestra su capacidad para diferenciarse hacia líneas celulares
provenientes de las tres capas germinativas: hepatocitos (endodermo), osteocitos y
miocitos (mesodermo) y neuronas (ectodermo). Sin embargo, en estudios in vivo, las
MSC son células de vida corta después de su inyección siendo detectables en los tejidos6 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
durante periodos variables entre las 48 horas hasta tres meses8. Hallazgos por los cuales
la diferenciación hacia tejidos células específicos han tomado un segundo plano y se
estudian sus efectos paracrino e inmunomodulares como posibles fuentes dentro de la
tecnología de tejidos.
Figura 1: Acciones MSC
El efecto paracrino descrito para las MSC postula que los factores de crecimiento,
factores neurotrópicos, citoquinas y moléculas de señalización secretadas por las MSC,
son suficientes para ejercer efectos terapéuticos al activar vías que promueven la
angiogenesis y regeneración tisular e inhibir la fibrosis, apoptosis e inflamación9. Gracias
a esta propiedad de las MSC, a nivel experimental se obtiene el Medio Condicionado
enriquecido con factores de crecimiento y moléculas de señalización secretados por estas
células in vitro (Figura 2) 10. Dentro de las proteínas identificadas se resaltan el factor de
crecimiento de hepatocitos (Hepatocyte Growth Factor, HGF), el factor neurotrófico
derivado de cerebro (Brain Derive Neurotrophic Factor, BDNF), el factor de crecimiento
vasculoendotelial (Vascular 2 Endotelial Factor Growth Factor, VEGF) y la interleuquina 6
(Interleukin, IL6). El grupo de investigación Biología de Células Madre de la UniversidadMarco teórico 7
Nacional, ha demostrado la presencia de factores proangiogénicos e inmunomoduladores
como HGF, BDNF, VEGF, SDF-1, TGF-α y βFGF entre otros, que promueven la
migración, proliferación y supervivencia celular11.
Figura 2. Esquema de obtención de un medio condicionado. Las MSC gracias a
su efecto paracrino, secreta factores de crecimiento y moléculas de señalización al
medio que utiliza para su crecimiento. De esta manera tras un cultivo in Vitro se
puede obtener el medio condicionado enriquecido con las proteínas secretadas
por las MSC. Tomado de: Núñez Ríos, Diana Leandra. Evaluación del efecto de
células madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo y de medios
condicionados en la recuperación motora de ratas con lesión medular. Maestría
tesis, Universidad Nacional de Colombia. 2010
Las MSC son candidatas ideales para la medicina regenerativa, ya que pueden ser
obtenidas fácilmente de los tejidos utilizados actualmente en contextos clínicos, tales
como la médula ósea, sangre del cordón umbilical y tejido adiposo. También pueden ser
ampliados en cultivos para proporcionar un número suficiente para el uso clínico. Además,
poseen inmunogenicidad baja, probablemente debido a una falta de HLA-DR y baja
expresión de HLA-1, por lo cual no se requiere la búsqueda de HLA lo que amplía su
utilidad potencial12.8 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
Olli-Matti de la Universidad Oulu en Finlandia, publica su artículo titulado The mechanism
of Action of Induced Membranes in Bone Repair13, en el cual evalúan la influencia de la
membrana inducida en la diferenciación de la célula mesenquimal hacia línea
osteoblastica recreando un ambiente libre de glucocorticoides, b-glicerofosfato y
ascorbato los cuales son conocidos inductores in vitro de las células mesenquimales
hacia osteoblastos. Los autores refieren que al cultivar de forma conjunta la membrana
con la célula mesenquimal, puede observarse hacia las cuatro semanas en las células
cosechadas, actividad de fosfatasa alcalina específica y concentración de calcio en las
células mesenquimales, indicadores de la actividad formadora de hueso. En la misma
publicación se evalúa el tiempo de longevidad de la membrana como osteoinductora
refiriendo mayor capacidad para producir señales químicas citotácticas a las 4 semanas
con respecto a las membranas de 8 semanas, datos en relación a la actividad de la
fosfatasa y niveles de calcio.
2.3 El futuro de la técnica de membrana inducida
La técnica aún se encuentra en desarrollo y es evidente su impacto clínico en los
procesos de reconstrucción 11.Cuando se emplea un aloinjerto u otro sustituto óseo, el
promedio ideal de este en relación al hueso autólogo requerido durante el segundo tiempo
quirúrgico aún no está bien definido; por lo que se debe considerar posibles
modificaciones en el proceso de consolidación y en las propiedades mecánicas dentro de
la membrana. Preguntas que necesitan ser respondidas incluyen cuál es el mejor
elemento osteoconductor y osteoinductor. Adicionalmente, las propiedades
osteoinductoras de la membrana pueden no ser suficientes, por lo que el injerto puede
asociarse con factores osteoinductores o células osteoprogenitoras para mejorar la
formación del hueso14.
Con el progreso en el conocimiento de las MSC asociado a una mayor comprensión de la
función y los efectos de la misma, de sus capacidades de diferenciación y paracrinas, se
plantea la posibilidad de su uso dentro del arsenal terapéutico para el manejo de defectos
óseos segmentarios.3. Metodología
3.1 Estudios previos:
Se adelantó una búsqueda en diferentes bases de datos electrónicas (EMbase, PubMed,
Science Direct, Scielo) utilizando los términos: Masquelet, Induced Membrane,
Mesenchymal Stem Cell y el términos MESH: cell, mesenchymal stem, unidos por
conectores boleanos AND, OR sin encontrar ninguna referencia bibliográfica en el cual se
combinaran las dos técnicas para la reconstrucción ósea en huesos largos tanto en
modelo animal como en experimentación clínica.
3.2 Diseño del estudio
3.2.1 Tipo de Estudio:
Estudio experimental en modelo animal.
3.2.2 Especie animal:
Conejos de raza nueva Zelanda peso entre 2000 y 3000 gramos. La selección de la
especie, raza y peso se fundamentan en trabajos previos, donde se ha demostrado la
posibilidad de inducción de membrana y se ha evaluado las características histológicas de
la misma, resultados que han sido similares a los observados en estudios humanos15,16.
En simulaciones experimentales previas por dos del autor aun sin publicar, donde se
evaluaron los tamaños de fémur y tibia de conejo con el fin de determinar que pieza
anatómica permitiría dos puntos importantes para la realización del modelo experimental:
facilidad técnica para la realización de la osteotomía y facilidad técnica para la colocación
de un fijador externo, se escogió al fémur como pieza anatómica. Asimismo, teniendo en10 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
cuenta como referencia estudios previos sobre fijación externa en modelos animales17,18,19.
y los datos obtenidos del estudio anatómico de las piezas de conejo se realizaron el
diseño y pruebas del fijador externo para investigación animal en conejos (proceso actual
de patente). (Figura 3).
Figura 3: Pieza anatómica fémur de conejo. Fijador Externo para investigación
animal en conejos.
3.2.3 Tamaño de la muestra
Se plantearon cuatro grupos de comparación para lo cual se define una muestra de 10
conejos.
3.3 Fases del proyecto
Se realizó un proceso de investigación de tres fases, las dos iniciales correspondientes a
la intervención experimental en el modelo animal propuesto y una tercera fase de
evaluación, la cual finalizó con la ejecución de los documentos para publicación y
divulgación ante sociedades científicas en el ámbito nacional e internacional.Metodología 11
3.3.1 Fase II:: PPrriimmeerr ttiieemmppoo qquuiirrúúrrggiiccoo..
DDDuuurrraaannnttteee eeessstttaaa fffaaassseee tttooodddooosss lllooosss cccooonnneeejjjooosss fffuuueeerrrooonnn lllllleeevvvaaadddooosss aaa uuunnn ppprrriiimmmeeerrr tttiiieeemmmpppooo qqquuuiiirrrúúúrrrgggiiicccooo cccooonnn lllaaasss
ssiigguuiieenntteess ccaarraacctteerrííssttiiccaass ((FFiigguurraa 4, 5, 6).
FFiigguurraa 4. Procedimiento quirúrgico fase I
1. NNeeuurroolleeppttooaanneesstteessiiaa ((XXiillaacciinnaa, Rompún BAYER ® 66 mmgg//kkgg yy Ketamina
IMALGENE ® 7700 mmgg//kkgg ppoorr ccaaddaa aanniimmaall).
2. PPPrrreeepppaaarrraaaccciiióóónnn dddeee lllaaa eeexxxtttrrreeemmmiiidddaaaddd iiinnnfffeeerrriiiooorrr dddeeerrreeeccchhhaaa pppaaarrraaa rrreeeaaallliiizzzaaaccciiióóónnn dddeee ppprrroooccceeedddiiimmmiiieeennntttooo
qquuiirrúúrrggiiccoo ((RRaassuurraaddoo))..
3. Asepsia y aaannntttiiissseeepppsssiiiaaa dddeee cccaaammmpppooo ooopppeeerrraaatttooorrriiiooo cccooonnn ccclllooorrrhhheeexxxiiidddiiinnnaaa... CCCooolllooocccaaaccciiióóónnn dddeee cccaaammmpppooosss
qquuiirrúúrrggiiccooss eessttéérriilleess12 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
4. Incisión longitudinal sobre cara lateral sobre muslo, disección tejido celular
subcutáneo, apertura de fascias y musculatura hasta exposición del fémur.
5. Colocación de 4 clavos de Steinmann de 1.8 mm roscados bicorticales.
6. Montaje de fijador externo.
7. Realización de defecto óseo de 1 cm (defecto óseo crítico) y resección de periostio
en área ósea expuesta .
8. Colocación de espaciador de cemento PMMC. Preparación intraquirúrgica bajo
técnica estéril sobre área de defecto óseo.
9. Lavado de campo quirúrgico con solución salina.
10. Cierre de fascia y piel. Colocación de gasas alcoholadas sobre heridas quirúrgicas.
11. Toma de radiografía posoperatoria de cada uno de los especímenes operados.
12. Posoperatorio inmediato con esquema de antibiótico durante 5 días con cefalexina
y analgesia con ketoprofeno.
13. Seguimiento de cada uno de los animales hasta completar el día 30, registrando
posibles complicaciones como infección, aflojamiento del fijador externo o muerte
de los especímenes.Metodología 13
Figura 55:: RReessuullttaaddoo RRaaddiioollóóggiiccoo PPoosstt ooppeerraattoorriioo..
Figura 6::: RRReeecccuuupppeeerrraaaccciiióóónnn yyy dddeeeaaammmbbbuuulllaaaccciiióóónnn dddeeelll aaannniiimmmaaalll cccooonnn eeelll fffiiijjjaaadddooorrr...14 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
3.3.2 Fase II: Segundo tiempo quirúrgico
Durante la fase I se presenta la muerte de uno de los especímenes disminuyendo la
muestra a 9 conejos (Ver resultados fase I).
Para la fase II se definen cuatro grupos, (Figura 7): un grupo con aplicación de células
madre en la zona de la membrana, un grupo para colocación de medios condicionados y
dos grupos de control, el primero utilizando únicamente la matriz de fibrina (hidrogel),
medio de suspensión del volumen de células madre y medios condicionados empleado; y
un último grupo de control negativo sin ningún elemento colocado al interior de la
membrana. Para la elaboración del hidrogel se realiza la mezcla de: Plasma 830µL,
Solución salina normal 1330 µL, Acido Tranexámico 16 µL, DMEM 166 µL (o volumen
similar de MSC en caso de utilización de las mismas), CaCl 166 µL. Volumen total de 2,5
2
mL. Esta matriz permanece en estado líquido aproximadamente 10 minutos después de
su preparación su manipulación en el procedimiento quirúrgico.
Para la preparación del hidrogel con medios condicionados se utilizaron células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano con un 80% de confluencia, las
cuales fueron lavadas 3 veces con PBS pH 7.4 (GIBCOTM) para eliminar restos de
DMEM + SFB 10%. Posteriormente se adicionó 3ml de medio libre de suero bovino fetal
(Opti-MEM® marca GIBCOTM) con penicilina 100U/mL, estreptomicina 100µg/mL y se
cultivo por 24h a 37°C, con una atmósfera de dióxido de carbono (CO2) al 5%. Pasadas
las 24h se recuperó el medio de cultivo y se centrifugó a 3000g por 10min en centrifuga
refrigerada para eliminar restos celulares. Finalmente se adicionó un coctel de inhibidores
de proteasas, se realizaron las diluciones necesarias para que todos los medios
condicionados quedaran a la misma concentración de proteína total (134µg/mL,
cuantificada con el método de Bradford) y se almacenó a -20°C hasta el día de su
implementación.Metodología 15
Figura 7: Esquema metodología.
Los 9 conejos fueron sometidos a un segundo procedimiento quirúrgico previa
aleatorización en cada uno de los grupos descritos siguiendo el siguiente protocolo
(Figura 8):
1. Neuroleptoanestesia (Xilacina, Rompún BAYER ® 6 mg/kg y Ketamina
IMALGENE ® 70 mg/kg por cada animal).
2. Preparación de la extremidad a intervenir si guiendo el mismo protocolo de
asepsia y antisepsia utilizado en la fase I.16 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
3. Incisión longitudinal sobre cara lateral sobre muslo a través de incisión quirúrgica
previa, disección tejido celular subcutáneo, apertura de fascias y musculatura
hasta exposición del fémur.
4. Identificación de la membrana y apertura longitudinal de la misma.
5. Retiro de PMMC preservando membrana.
6. Según la aleatorización correspondiente a cada conejo se coloca al interior de la
membrana la intervención a comparar:
a. Hidrogel con medios condicionados (DMEM: medio de cultivo con
citoquinas secretadas por MSC, no contiene células).
b. Hidrogel con Células Madre Mesenquimales.
c. Hidrogel
d. Control Negativo.
7. Cierre de Membrana con sutura absorbible.
8. Lavado de Campo quirúrgico con solución salina.
9. Cierre de fascia y piel. Colocación de gasas alcoholadas sobre heridas quirúrgicas.
10. Seguimiento posoperatorio de cada uno de los animales hasta el día 30,
registrando posibles complicaciones como infección, aflojamiento del fijador
externo o muerte de los especímenes.Metodología 17
Figura 8: Procedimiento quirúrgico fase II.
3.3.3 Fase III: Interpretación de resultados. Evaluación
radiológica.
:
El día 30 postquirúrgico a la Fase II, se realizó evaluación radiológica de cada uno de los
especímenes para comparar los cambios imagenológicos secundarios a cada una de las
intervenciones, para lo cual se tomaron proyecciones anteroposterior (AP) y laterales del
segmento anatómico, correspondiente al muslo de cada conejo previamente intervenido.
Cada imagen fue digitalizada para su posterior análisis. Las radiografías digitalizadas para
cada muestra se analizaron de manera estándar con la finalidad de comparar la calidad
del regenerado óseo y las características del mismo en cada uno de los grupos de
intervención.18 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
En cada zona de defecto, se utilizó la siguiente escala ordinal de 4 puntos para comparar
la cantidad de tejido formado en la zona de Masquelet:
1. = no hay formación de hueso en defecto
2. = densidad es menor que el hueso adyacente
3. =densidad es mayor o igual al hueso adyacente, formación de dos
corticales (sumadas en proyección AP y lateral)
4. =densidad es mayor o igual a la densidad del hueso cortical
adyacente con formación de tres o más corticales sumadas en las
dos proyecciones20.
En la proyección lateral, el segmento correspondiente al defecto óseo y de la diáfisis
proximal y distal al defecto, fue dividido en segmentos de 1x1mm para evaluar en cada
uno de los animales, el porcentaje de cierre del defecto óseo; sustrayendo del área total
del defecto (100%), el porcentaje de área radiolúcida en la zona de osteotomía (Figura 9).
Figura 9: Medición Porcentaje de cierre del defecto óseo4. Consideraciones éticas
Este estudio se realiza dentro de las normas éticas y los principios de bioética sugeridos
por la UNESCO y la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD para la experimentación
en animales. Y la normatividad nacional descrita para tal fin incluída en la Ley No. 84 de
1989. "Por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los Animales", con
especial énfasis al Capítulo Sexto: Del Uso de Animales Vivos en Experimentos e
Investigación. La investigación fue aprobada por el Comité de Ética de la Universidad
Nacional, por lo que se aplicaron todas las normativas de las 3 R de Russell y Burch21.
La investigación y los aportes que esta pueda generar son avalados por el grupo de
investigación y su propiedad intelectual será determinada de acuerdo con la ley y los
reglamentos expedidos por la universidad a este respecto; así mismo la autoría del
presente trabajo será de los investigadores relacionados en la ficha inicial.5. Resultados
5.1 Fase I
Durante la fase I se intervinieron 10 conejos siguiendo el protocolo previamente
establecido sin presentarse complicaciones intraquirúrgicas. Se presentó una
complicación postquirúrgica mayor dada por fractura a través de los clavos del fijador,
ocasionando un aflojamiento del sistema. Ante el deterioro clínico del espécimen animal
se decidió la eutanasia.
No se documentaron infecciones del sitio operatorio en ninguno de los animales
operados. Las complicaciones durante la fase I se resumen en la tabla I. 9 conejos
lograron deambular y desplazarse de forma permanente sin documentarse fallas del
fijador (Figura 5).
Tabla I. Complicaciones Fase IResultados 21
5.2 Fase II
Durante la fase II se intervinieron 9 conejos siguiendo el protocolo previamente
establecido sin presentarse complicaciones intraquirúrgicas ni postquirúrgicas. No se
documentaron infecciones del sitio operatorio en ninguno de los animales operados.
5.3 Fase III: Evaluación Radiológica
5.3.1 Lectura convencional:
Se realizó evaluación de todas las radiografías encontrando en todos los animales de
experimentación formación ósea a nivel del defecto. En todos los animales se observó
formación de cortical posterior. Al evaluar los hallazgos por grupos fue evidente la
formación y cierre del defecto en los animales que se utilizó la técnica de Masquelet
modificada mediante el uso de medios condicionados (Fig. 10A), así como en aquellos
que se utilizaron células madre mesenquimales (Fig.10B). En el grupo de control con
hidrogel se documentó tendencia hacia la pseudoartrosis a nivel del defecto óseo y
perdida de la continuidad de la cortical posterior (Fig. 10C), mientras que en el grupo con
cierre por segunda intención o sin uso de injerto óseo, se evidenció escasa formación de
tejido óseo a nivel del defecto (Fig. 10D).22 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
Figura 10. Hallazgos Radiológicos Grupos de Investigación. A: Hidrogel+ Medios
Condicionados. B. Hidrogel + Células Madre Mesenquimales. C. Hidrogel.
D. Control: Cierre por segunda intención.Resultados 23
5.3.2 Índice Cierre defecto óseo y porcentaje defecto óseo.
Se realizó valoración del índice radiológico y porcentaje de cierre del defecto óseo en
cada uno de los animales de experimentación por parte del grupo investigador. Los
resultados de la valoración se consignan en la Tabla 2. Adicionalmente se realizaron
promedios para cada uno de los grupos los cuales se consignan en la Tabla 3.
INDICE CIERRE DEFECTO ÓSEO
1 2 3 4
Densidad es mayor o
Densidad es mayor o
igual al hueso
No hay Densidad es igual a la densidad del PORCENTAJE DE
adyacente, formación
INTERVENCIÓN formación de menor que el hueso cortical adyacente
de dos corticales CIERRE DEL DEFECTO
POR CONEJO hueso en hueso con formación de tres o
(sumadas en
defecto adyacente más corticales sumadas
proyección AP y
en las dos proyecciones.
lateral)
1: Hidrogel+
Medios X 98%
Condicionados
3: Hidrogel X 60%
4: Hidrogel+
Medios X 100%
Condicionados
5: Hidrogel+
Medios X 92%
Condicionados
6: Hidrogel +
X 80%
Células
7: Hidrogel X 55%
8: Hidrogel +
X 75%
Células
9: Control
Segunda X 35%
Intención
10: Control
Segunda X 45%
Intención
Tabla 2. Índice Cierre defecto óseo y porcentaje de cierre defecto óseo por
espécimen.24 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
PROMEDIOS MEDICIÓN RADIOLÓGICA
Índice De Cierre Del
Porcentaje De Cierre
Defecto
HIDROGEL 2 58%
HIDROGEL+ MEDIOS
33,,66 9977%%
CONDICIONADOS
HIDROGEL +
3 78%
CELULAS
CONTROL
SEGUNDA 1,5 40%
INTENCION
Tabla 3. Promedios Índice Cierre defecto óseo y porcentaje de cierre defecto óseo
por grupos de investigación.6. Discusión
6.1 Técnica De Membrana Inducida (Masquelet) En
Conejos
Con el presente trabajo se reprodujo la técnica de Masquelet en conejos para la formación
adecuada de la membrana, su preservación y como suturarla durante el segundo tiempo
quirúrgico, actuando como contenedor del hidrogel realizado con plasma humano, que
sirvió como vehículo de transporte de células y citoquinas producidas por la célula madre
mesenquimal.
Uno de los principales problemas durante la reproducción de la técnica es la estabilidad y
la alineación de los segmentos óseos posterior a la creación del defecto óseo. Motivo por
el cual se desarrolló un fijador externo para el segmento anatómico escogido, que
presentó baja tasa de complicaciones, soportó las exigencias biomecánicas secundarias a
la movilización y brindo soporte a la descarga de peso temprana sobre la extremidad, en
un animal con actividad física permanente en el postquirúrgico inmediato.
La técnica de Masquelet es reproducible en modelos animales y para su estudio han sido
utilizadas diferentes especies. En conejos se ha empleado para reconstrucción
mandibular posterior a mandibulectomía bilateral16. Para los autores, este es el primer
trabajo del cual tienen conocimiento en el que se utiliza la técnica para reconstrucción de
huesos largos en la especie seleccionada; así mismo, es el primer trabajo en la literatura
mundial en el cual se utilizan medios condicionados producidos por MSC para
regeneración de tejido óseo en huesos largos, como posible estrategia para modificar la
técnica de Masquelet.26 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
6.2 Comparación Grupos
Al revisar la literatura se decidió usar un defecto óseo crítico de 1cm, realizando una
hemidiafisectomía del segmento anatómico con el fin de no conseguir curación
espontanea22. En la especie utilizada un defecto de 1cm, corresponde al 25% del total de
la diáfisis del fémur.
Con el objetivo de no emplear injerto óseo durante el segundo tiempo quirúrgico posterior
a la documentación y preservación de la membrana, se optó por la utilización de medios
condicionados producidos por células madre mesenquimales, lo cual permitió comparar
esta intervención con la utilización de MSC y dos grupos control. No se comparó con la
utilización de injerto autólogo de la especie con el fin de no aumentar la morbilidad en la
especie de experimentación.
Al evaluar los hallazgos obtenidos en los grupos control hidrogel y cierre por segunda
intención (como se denominó al grupo en el cual no se colocó ningún tipo de sustancia
dentro de la membrana, preservando esta última), se confirma la capacidad
osteoinductora de la membrana aún en casos de ausencia de injerto óseo, eventos ya
previamente descritos por otros autores5.
A partir de los resultado de los grupos de intervención con células madre y el grupo en el
cual se colocó dentro de las membranas las citoquinas producidas por la célula
mesenquimal embebidas en plasma, se demuestra que la capacidad osteoinductora de la
membrana se aumenta en relación a grupos de control, logrando un cierre del defecto casi
del 100% sin la utilización de injerto óseo.
6.3 Acciones célula madre mesenquimal (MSC) en
relación a membrana Masquelet
Al confrontar los dos grupos principales del estudio se pretendía evaluar las posibles vías
de acción de la célula mesenquimal dentro de la membrana (Figura 11). En el grupo deDiscusión 27
Medios condicionados (citoquinas y factores de crecimiento depositados por la MSC
dentro de su microambiente), el principal efecto evaluado fue la actividad paracrina,
mientras que al depositar las células a nivel del defecto óseo lo que se pretendió fue
buscar establecer su diferenciación hacia la línea osteoblástica secundaria al estímulo
osteoinductor de la membrana. Los hallazgos encontrados sugieren que el efecto
paracrino de la MSC favorece el crecimiento óseo dentro de la membrana sin la
necesidad de injerto óseo y es superior al efecto producido por la diferenciación celular,
posiblemente secundario a la vida media variable de la MSC que puede ser de días o
semanas7.
Figura 11. Efectos célula madre mesenquimal en relación a técnica de Masquelet.28 Modificación experimental de la técnica de membrana inducida (Masquelet) mediante
uso de medios condicionados producidos por células madre mesenquimales
6.4 Medios condicionados producidos por MSC y técnica
de Masquelet en humanos
Con el auge de la técnica y su aplicabilidad clínica para el manejo de defectos óseos
segmentarios en extremidades se requieren grandes volúmenes de injerto óseo y el
debate con respecto a la relación aloinjerto vs autoinjerto aún no está esclarecida, sin
embargo, aún continua siendo el estándar de oro para la técnica la utilización de injerto
autólogo. Es primordial la búsqueda de estrategias de optimización del volúmen de injerto
en caso de defectos extensos o de nuevos elementos que sustituyan el requerimiento del
mismo con el fin de disminuir las comorbilidades secundarias a procedimientos
quirúrgicos adicionales.
Los medios condicionados embebidos en hidrogel se plantean como una alternativa
económica y de fácil elaboración, ya que pueden ser sintetizados en laboratorio con baja
complejidad tecnológica, en comparación con los altos costos secundarios a la realización
de procedimientos quirúrgicos adicionales o la utilización de otras fuentes de sustitutos o
de proteínas recombinantes.7. Conclusiones y recomendaciones
7.1 Conclusiones
(cid:1) Es posible la utilización de medios condicionados producidos por células madre
mesenquimales, basado en su efecto paracrino, como alternativa al injerto óseo
durante el segundo tiempo quirúrgico en la técnica de Masquelet en conejos para el
tratamiento de defectos óseos en huesos largos.
(cid:1) La principal limitación del estudio radica en el pequeño tamaño de la muestra de
animales de experimentación.
7.2 Recomendaciones
Los hallazgos encontrados plantean una alternativa para el tratamiento de defectos óseos
en huesos largos y posible modificación de la técnica de Masquelet. Estos hallazgos
deben ser evaluados con nuevos estudios en los cuales se aumente la muestra estudiada.
Adicionalmente es importante la realización de estudios de seguridad en humanos para
iniciar estudios clínicos.Bibliografía
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