Comportamiento clínico - microbiológico y dinámicas moleculares en infecciones por clones de Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenémicos portadores del gen blaKPC   en el período post-endémico en pacientes atendidos en una institución de salud de cuarto nivel en Bogotá, período 2014-2016
Autor: Vergara Vela, Erika Paola
Asesor: Cortes Luna, Jorge Alberto
Fecha: 2020-07-01
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Infectología
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Introducción: K. pneumoniae resistente a carbapenémicos está implicada en procesos infecciosos principalmente en pacientes inmunosuprimidos y en eventos por atención en salud. La producción de enzimas que hidrolizan estos antibióticos  es el principal mecanismo de resistencia, siendo KPC la de mayor distribución mundial y el clon CC 258 el más frecuentemente reportado. Recientemente se han informado otros clones; no se conocen comportamientos clínicos diferenciales por tipo de clado y  tampoco el comportamiento en eventos procedentes de un mismo individuo. 
  
Métodos: Estudio tipo serie de casos. En 3 años se tomaron aislamientos con K. pneumoniae resistentes a carbapenémicos con el gen bla KPC (Kp-KPC) en pacientes adultos de una institución de tercer nivel de Bogotá; se incluyeron todos los eventos de un mismo paciente. Se analizaron características clínicas de los individuos y moleculares en los aislamientos con identificación de tipo de  KPC  y otras Betalactamasas  por  reacción en cadena de la polimerasa (PCR ) , relación clonal por  electroforesis de campo pulsado (PFGE ) y tipo de ST . Se realizó secuenciación  genómica en 4 de los clones más frecuentes identificados en el período de estudio.

Resultados: Se analizaron 143 eventos (aislamientos por Kp-KPC) de 69 pacientes quienes tenían alta comorbilidad. KPC 2 se encontró con más frecuencia; se documentó co- expresión con otras betalactamasas como CTX-M (27%) y TEM ( 37%), no se detectó OXA-48, VIM ni NDM. Se identificaron 46 pulsotipos, los más frecuentes  el  4 ( correspondiente con ST 258), 19 (ST 485)  y 37 ( ST111) en el 22%, 6% y 5,5% respectivamente. El pulsotipo 4 se presentó con mayor frecuencia en personas mayores y se asocio a mayor resistencia a ciprofloxacina, amikacina y gentamicina. Se documentó multiclonalidad  y cambios genómicos generados tanto a nivel cromosomal bacteriano como mediados por elementos genéticos móviles en eventos procedentes de un mismo paciente 

Conclusiones: Existe circulación de múltiples clones de Kp-KPC en una misma institución y en eventos procedentes de un paciente;  el ST 258 continua siendo el más reportado y se asocia a resistencia a otros grupos antibióticos. 

Palabras claves: Klebsiella pneumoniae, carbapenemasa, KPC, Resistencia antibiótica

1Comportamiento clínico - microbiológico y dinámicas
moleculares en infecciones por clones de Klebsiella pneumoniae
resistentes a carbapenémicos portadores del gen bla en el
KPC
período post-endémico en pacientes atendidos en una institución
de salud de cuarto nivel en Bogotá, período 2014-2016.
Esta tesis hace parte del proyecto Colciencias con código
130877758007
Erika Paola Vergara Vela
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina - Departamento de Medicina Interna
Bogotá, Colombia
2020
2Comportamiento clínico - microbiológico y dinámicas
moleculares en infecciones por clones de Klebsiella pneumoniae
resistentes a carbapenémicos portadores del gen bla en el
KPC
período post-endémico en pacientes atendidos en una institución
de salud de cuarto nivel en Bogotá, período 2014-2016.
Esta tesis hace parte del proyecto Colciencias con código
130877758007
Erika Paola Vergara Vela
Estudiante postgrado de Infectología
Universidad Nacional de Colombia
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar por el título de:
Especialista en Infectología
Director
Jorge Alberto Cortes Luna MD
Internista-Infectólogo
Director Departamento de Medicina Interna
Universidad Nacional de Colombia
Co-directores
Aura Lucia Leal Castro MD, MSc.
Médica especialista en microbiología
Master en control de infecciones
Líder Grupo de Investigación en Enfermedades Infecciosas-Colciencias
Universidad Nacional de Colombia
Javier Antonio Escobar Pérez MSc, PHD.
Coordinador Laboratorio de Genética Molecular Bacteriana
Universidad El Bosque
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina - Departamento de Medicina Interna
Bogotá, Colombia
2020
IIIAgradecimientos
Primero a Dios y a mis padres Leonardo y Eulalia por su apoyo incondicional; a mi
esposo Christian y a mi Hijo Santiago quienes además de su acompañamiento
paciente, son mi motor de vida y principal motivación para escalar tanto en el
ámbito profesional como en el personal; a mis hermanas Diana y Liliana porque
además de ser mis confidentes, son ejemplo de una vida exitosa y feliz.
Agradezco a todo el grupo de docentes del programa de Infectología, Dra. Sonia
Cuervo, Dr. Carlos Saavedra, Dr. Jorge Cortes y Dr. Carlos Álvarez, porque
además de ser excelentes profesionales a los que admiro profundamente son
unos seres humanos ejemplares y me han ratificado la importancia del equilibrio
entre lo personal y lo profesional. Agradezco a la Dra. Aura Lucía Leal por su
acompañamiento constante en este proceso, sin ella este trabajo no hubiera sido
posible; agradezco a Javier Escobar y su genial grupo de investigación en
genética molecular bacteriana de la Universidad El Bosque, quienes me abrieron
las puertas para trabajar en este proyecto y con quienes he compartido momentos
muy agradables. Finalmente, le agradezco a mi compañero y amigo Juan
Sebastián de quién he aprendido la constancia y disciplina y he recibido apoyo
constante en estos 2 años de aprendizaje.
Erika Paola Vergara Vela
4Agradecimiento a Dra Diana Palacio de Hospital Universitario Fundación Santafé
de Bogotá
5RESUMEN
Introducción: K. pneumoniae resistente a carbapenémicos está implicada en
procesos infecciosos principalmente en pacientes inmunosuprimidos y en eventos
por atención en salud. La producción de enzimas que hidrolizan estos antibióticos
es el principal mecanismo de resistencia, siendo KPC la de mayor distribución
mundial y el clon CC 258 el más frecuentemente reportado. Recientemente se han
informado otros clones; no se conocen comportamientos clínicos diferenciales por
tipo de clado y tampoco el comportamiento en eventos procedentes de un mismo
individuo.
Métodos: Estudio tipo serie de casos. En 3 años se tomaron aislamientos con K.
pneumoniae resistentes a carbapenémicos con el gen bla (Kp-KPC) en
KPC
pacientes adultos de una institución de tercer nivel de Bogotá; se incluyeron todos
los eventos de un mismo paciente. Se analizaron características clínicas de los
individuos y moleculares en los aislamientos con identificación de tipo de KPC y
otras Betalactamasas por reacción en cadena de la polimerasa (PCR ) , relación
clonal por electroforesis de campo pulsado (PFGE ) y tipo de ST . Se realizó
secuenciación genómica en 4 de los clones más frecuentes identificados en el
período de estudio.
Resultados: Se analizaron 143 eventos (aislamientos por Kp-KPC) de 69
pacientes quienes tenían alta comorbilidad. KPC 2 se encontró con más
frecuencia; se documentó co- expresión con otras betalactamasas como CTX-M
(27%) y TEM ( 37%), no se detectó OXA-48, VIM ni NDM. Se identificaron 46
pulsotipos, los más frecuentes el 4 ( correspondiente con ST 258), 19 (ST 485) y
37 ( ST111) en el 22%, 6% y 5,5% respectivamente. El pulsotipo 4 se presentó
con mayor frecuencia en personas mayores y se asocio a mayor resistencia a
ciprofloxacina, amikacina y gentamicina. Se documentó multiclonalidad y cambios
genómicos generados tanto a nivel cromosomal bacteriano como mediados por
elementos genéticos móviles en eventos procedentes de un mismo paciente
Conclusiones: Existe circulación de múltiples clones de Kp-KPC en una misma
institución y en eventos procedentes de un paciente; el ST 258 continua siendo el
más reportado y se asocia a resistencia a otros grupos antibióticos.
Palabras claves: Klebsiella pneumoniae, carbapenemasa, KPC, Resistencia
antibiótica
6ABSTRACT
Introduction: K. pneumoniae resistant to carbapenems, is implicated in infectious
processes primarily in immunosuppressed patients and in events for health care.
The enzyme production that hydrolyzes these antibiotics is the main resistance
mechanism, KPC being the one with the largest world distribution and clone CC
258 the one reported most frequently. Recently, other clones have been reported;
there is no knowledge of differential clinical behaviors by clade type or the behavior
of preceding events of a same individual.
Methodology: Case series study. In 3 years there were preventive isolations with
K. pneumoniae resistant to carbapenems with the bla (Kp-KPC) gen in adult
KPC
patients in a third level institution in Bogota; all events of a same patient were
included. The clinical characteristics of the individuals were analyzed as well as the
molecular characteristics in the isolation with identification of KPC type and other
Betalactamases on chain reaction (PCR), clonal relation for electrophoresis of
pulsed field (PFGE), and ST type. A genome sequence was performed in 4 of the
most frequent cones identified in the research period.
Results: 143 events (isolations for Kp-KPC) out of 69 patients who had high
comorbidity. KPC 2 was encountered with a higher frequency; co-expression was
documented with other betalactamases like CTX-M (27%) and TEM ( 37%), OXA-
48, VIM and NDM were not detected. 46 pulse types were identified, the most
frequent ones were el 4 ( correspondent to ST 258), 19 (ST 485) y 37 ( ST111) in
the 22%, 6% and 5,5% respectively. The 4th pulse type was presented with a
higher frequency in third age people and was associated to higher resistance to
ciprofloxacin, amikacin, and gentamicin. The multiclonality was documented and
genome changes both at a bacterial chromosomal and at the ones mediated by
mobile genetic elements in preceding events in the same patient.
Conclusions: there is circulation of multiple clones of Kp-KPC in a same institution
and in preceding events in patients; the ST 258 continues to be the one reported
the most and it is associated to resistance to other antibiotic groups.
Keywords: Klebsiella pneumonia, KPC, antibiotic resistance
7Contenido
RESUMEN ........................................................................................................................................ 6
ABSTRACT ...................................................................................................................................... 7
LISTA DE TABLAS ......................................................................................................................... 9
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................................... 10
LISTA DE ABREVIATURAS ...................................................................................................... 11
1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ...................................................................................... 12
2. JUSTIFICACIÓN ............................................................................................................................ 14
2.1 Pregunta de investigación .................................................................................................................... 15
3. ESTADO DEL ARTE ..................................................................................................................... 16
3.1 Generalidades Klebsiella pneumoniae ............................................................................................... 16
3.2 Factores de riesgo para infección por K. pneumoniae con resistencia a
carbapenémicos ................................................................................................................................................. 17
3.3 Mecanismos de resistencia en K. pneumoniae y otros Gram negativos . ........................... 17
3.4 Epidemiología de las infecciones por K. pneumoniae con resistencia a
carbapenémicos portadoras del gen bla ........................................................................................... 20
KPC
3.5 Rol del Tansposón 4401 a en la diseminación de Kp-KPC ....................................................... 21
3.6 Determinación fenotípica de carbapenemasas en Klebisella pneumoniae ........................ 22
3.6 Determinación molecular de carbapenemasas en Klebisella pneumoniae ....................... 24
4. OBJETIVOS .................................................................................................................................... 28
4.1 Objetivo General ...................................................................................................................................... 28
4.2 Objetivos Específicos ........................................................................................................................ 28
5. METODOLOGIA ........................................................................................................................... 29
5.3 Proceso de recolección de muestras y datos ................................................................................. 29
5.4 Plan de análisis estadístico .................................................................................................................... 38
5.5 Presupuesto ................................................................................................................................................. 39
5.6 Cronograma de actividades ................................................................................................................... 39
6. CONSIDERACIONES ÉTICAS .................................................................................................... 40
7. RESULTADOS ............................................................................................................................... 41
7.1 Objetivo 1. Descripción de características clínicas de pacientes y sus eventos de
infección o colonización por Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos
portadores del gen bla ............................................................................................................................... 41
KPC
7.2 Objetivo 2. Establecer las características microbiológicas y moleculares de los
aislamientos de Klebsiella pneumoniae portadores del gen bla . ............................................. 46
KPC
7.3 Objetivo 3 . Determinar la relación genética de los aislamientos por medio de PFGE
(Electroforesis campo pulsado) y MLST ................................................................................................. 46
7.4 Objetivo 4 y 5. Establecer la secuencia del genoma de los principales linajes genéticos
identificados en la población de aislamientos de Klebsiella pneumoniae seleccionados y
describir cambios genómicos de algunos aislamientos de K. pneumoniae resistentes a
carbapenémicos procedentes de un mismo paciente tras el uso de diferentes tipos de
antibióticos indicados para este tipo de infecciones. ........................................................................ 53
8. DISCUSIÓN .................................................................................................................................... 65
9. CONCLUSIONES ........................................................................................................................... 70
10. ANEXOS ....................................................................................................................................... 71
ANEXO 1. Algoritmo de trabajo ................................................................................................................... 71
ANEXO 2. Avales comité de ética ................................................................................................................ 72
11. REFERENCIAS ........................................................................................................................... 75
8LISTA DE TABLAS
Tabla3-1 . Clasificación de β-lactamasas y carbapenemasas .................................... 20
Tabla 5-3-1. Operacionalización de variables ................................................................ 31
Tabla 5-2. Presupuesto y financiación .............................................................................. 39
Tabla 5-3- Cronograma ........................................................................................................... 39
Tabla 7-1. Características de la población con eventos por Kp-KPC ....................... 43
Tabla 7-2 . Frecuencia de aislamientos por paciente ................................................... 44
Tabla 7-3. Caracterización de los eventos por Kp-KPC ................................................ 45
Tabla 7-4 . Distribución clonal K. pneumoniae bla 2014-106 ............................... 47
KPC
Tabla 7-5. Características clínicas de pacientes agrupadas por pulsotipo ........... 51
Tabla 7-6. Resistencia antibiótica de los eventos y presencia de otras β -
lactamasas agrupada por pulsotipo ................................................................................... 51
Tabla 7-7. Multiclonalidad en eventos de un mismo paciente .................................. 52
Tabla 7-8. Análisis general de los ensamblajes de los genomas de los tres
aislamientos identificados en el paciente 8 .................................................................... 57
Tabla 7-9. Determinación y localización de los genes de resistencia de 3
aislamientos representativos identificados en el paciente 8. ................................... 58
9LISTA DE FIGURAS
Gráfico 7-1. Algoritmo para inclusión de pacientes y eventos por Kp-KPC. ........ 42
Gráfico 7-2. Distribución por paciente de los clones de Klebsiella pneumoniae
bla 2014-2016 ...................................................................................................................... 48
KPC
Gráfico 7-3. Diversidad clonal en eventos por Kp-KPC 2014-2016 ......................... 50
Gráfico 7- 4. Diversidad clonal en pacientes y comportamiento de clones en los 3
años ............................................................................................................................................... 53
Gráfica 7-5. Análisis genético, perfil de susceptibilidad y resistoma de los
eventos con clones de Kp-KPC comparados con la terapia antibiótica
administrada durante la estancia hospitalaria de la paciente 8 en 2015. ............ 55
Gráfica7-6. Análisis genómico comparativo en eventos Kp-KPC de paciente 8
......................................................................................................................................................... 59
Gráfica 7-7 . Comparación de los plásmidos determinados en los aislamientos
33Kpn9 y 33Kpn12 con los plásmidos IncFII(K) previamente reportados. ......... 61
Gráfica 7-8.Inserción del Tn4401b del plásmido IncI2(Δ) en el cromosoma del
aislamiento de Klebsiella pneumoniae 33Kpn22. .......................................................... 62
Gráfica 7-9. Diversidad clonal en eventos del paciente 10 ......................................... 64
10LISTA DE ABREVIATURAS
EDTA Acido etilendiaminotetraacetico
MIC Concentración mínima inhibitoria
INS Instituto Nacional de Salud
KP-KPC K. pneumoniae resistente a carbapenémicos mediado por gen KPC
LGMB Laboratorio de genética molecular bacteriana
MLST Multilocus sequence typing
PFGE Electroforesis en campo pulsado
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
BLEE Beta-lactamasa de espectro extendido
111. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Klebsiella pneumoniae es responsable de infecciones del tracto urinario, absceso
hepático y neumonía en pacientes inmunocompetentes y principalmente en
inmunocomprometidos, tanto en la comunidad como en escenarios de atención en
salud. La resistencia de K. pneumoniae a los antibióticos ha sido creciente, con
diseminación de clones resistentes a carbapenémicos a nivel mundial, lo que ha
generado incremento en costos por estancia hospitalaria y mortalidad[1, 2] ,
haciendo que este tipo de infecciones sean un importante problema de salud
pública; adicionalmente se cuenta con pocas opciones terapéuticas y con
fármacos de bajo umbral de toxicidad .
La resistencia a carbapenémicos en K. pneumoniae se presenta por varios
mecanismos, el más relevante de tipo enzimático mediado por diferentes enzimas
que hidrolizan esta familia de antibióticos (Serina carbapenemasas del grupo A y
D y metalobetalactamasas del grupo B de Ambler); la que se reporta con más
frecuencia en América es de tipo KPC (carbapenemasa de serina clase A) y
pueden encontrase tanto en elementos genéticos móviles como a nivel
cromosomal [1] [3]. Los primeros informes de estas enzimas datan de 1996 [4],
pero han tenido una amplia diseminación mundial desde la primera década del
siglo XXI. En USA, el sistema de vigilancia nacional SENTRY reportó entre 2007
a 2009 datos de 42 centros médicos informando la presencia de K. pneumoniae
con resistencia a carbapenémicos y gen bla (Kp-KPC) del 5.5% [5]; el año
KPC
siguiente el reporte aumento a 14% identificando variantes del gen KPC tipo 2 y 3
[6]; la incidencia anual en este país para el 2012 - 2013 de enterobacterias
resistentes a carbapenémicos y portadoras del gen bla (principalmente K.
KPC
pneumoniae) fue 2.93 por 100.000 habitantes [7]. Otros países endémicos para
estas enzimas son Grecia e Israel [1]. En Latinoamérica Villegas y colaboradores
informaron frecuencia de carbapenemasas en enterobacterias (en 255 pacientes
con bacteriemias ) de 21% y de ellas un 83% correspondían a KPC (la más
frecuente KPC 3) siendo K. pneumoniae su principal representante [8]. En
Colombia, el primer reporte de KPC se realizó en Medellín en 2005 en 2 pacientes
12sin antecedentes de viaje o exposición a áreas endémicas [9]. Luego en 2008 en
la misma ciudad se presentó un brote por K. pneumoniae resistente a
carbapenémicos, cuyo caso índice fue un paciente proveniente de Israel para el
programa de trasplante hepático; mediante estudios de polimorfismos de longitud
de los fragmentos de restricción y secuenciación, se confirmó la presencia de K.
pneumoniae bla genéticamente similar a la cepa de Israel involucrada en
KPC-3,
múltiples brotes nosocomiales en ese país [10]. El grupo CIDEIM reportó entre los
años 2009 a 2012 (en pacientes de Unidades de Cuidado intensivo) K.
pneumoniae con bla en 68% de los aislamientos [11] considerándose entonces
KPC
Colombia un país endémico para KP-KPC y el complejo clonal 258 (CC258 y sus
variantes ST11 y ST340) los reportados con mayor frecuencia [12]. El último
informe del Instituto Nacional de Salud sobre resistencia antimicrobiana informó
una frecuencia del 15% de K. pneumoniae con resistencia a carbapenémicos [13].
A la fecha se han descrito más de 115 variantes clonales, además hay a cambios
en la epidemiología molecular con reportes de otros ST tanto en Colombia [14]
como en otros países [15] . El reporte del Instituto Nacional de Salud del 2018
informó una frecuencia del 15% de K. pneumoniae con resistencia a
carbapenémicos [13]; esta frecuencia en aumento genera prioridades para la
vigilancia continua de este tipo de microorganismos y se convierte en eje
fundamental para los procesos de control de infecciones.
A pesar que en la literatura se encuentran múltiples publicaciones caracterizando
molecularmente K. pneumoniae con resistencia a carbapenémicos y series de
pacientes con infecciones por estos microorganismos, a la fecha no se conoce
muy bien la dinámica de los clones en individuos infectados, especialmente en
aquellos con colonización crónica, así como los patrones de resistencia y
corresistencia que pueden irse modificando en el tiempo. Tampoco es claro como
cambian los diversos clados en diferentes pacientes atendidos en una institución.
El objetivo de este estudio es describir las características de la población de
pacientes con aislamientos de Kp-KPC, su comportamiento clínico, así como la
variabilidad genética clonal de los aislamientos en una institución de alta
complejidad de Bogotá.
132. JUSTIFICACIÓN
El advenimiento de la resistencia bacteriana y las infecciones derivadas de estas,
constituyen un problema de salud pública en todo el mundo principalmente por las
pocas opciones terapéuticas. La Organización Mundial de la Salud emitió en el
año 2014 el primer reporte global de resistencia antimicrobiana informando altas
tasas en las principales bacterias causantes de infecciones hospitalarias y de
comunidad en el mundo, tales como K. pneumoniae y Acinetobacter baumannii
[16]. Cada año en los Estados Unidos, cerca de dos millones de personas
adquieren infecciones graves por bacterias que son resistentes a uno o más de los
antibióticos que fueron diseñados para su manejo. El CDC (Centers for Disease
Control and Prevention) en su reporte del 2013 clasificó las infecciones causadas
por Enterobacterias con resistencia a carbapenémicos como una amenaza
urgente para el sistema de salud, con aproximadamente 600 muertes atribuibles
a microorganismos resistentes [17]. Desde el punto de vista clínico, se ha
reportado aumento de mortalidad entre 30 – 70% en pacientes con neumonías o
bacteriemias por K. pneumoniae con resistencia a carbapenémicos cuando se
comparan este tipo de infecciones con la contraparte sensible[18] [19]. Así mismo
hay aumento en costos por tratamiento y mayor estancia hospitalaria [1].
Colombia es un país endémico para enterobacterias con resistencia a
carbapenémicos y de ellas la más frecuente K. pneumoniae productora de
enzimas carbapenemasas de tipo serina KPC. La epidemiología molecular ha
permitido conocer los clones de mayor diseminación en el país siendo el CC ST
258 el más frecuentemente reportado y la enzima KPC 3 la de mayor prevalencia.
[20]. Este clon se ha relacionado con mayor probabilidad de resistencia antibiótica
a otros fármacos , aunque sin clara evidencia de mayor virulencia. En los últimos
años se han reportado en diferentes países la aparición de otros complejos
clonales como el ST 307 y el ST 147, y en Colombia un informe del 2016 de 5
hospitales de Medellín muestra como los clones diferentes al ST 258 circulan con
mayor frecuencia . [14]. No hay evidencia directa de que uno u otro clon se asocie
a peores desenlaces, pero es muy llamativo la persistencia en el tiempo de solo
14unos pocos y que a pesar de las políticas de control de infecciones instauradas en
las instituciones la diseminación parece no detenerse e incluso tiende al aumento
lo que sugiere mecanismos diferentes para adaptación y supervivencia de estos
microorganismos .
Por otra parte, los fenómenos de colonización por K. pneumoniae se han
documentado con frecuencia en pacientes que han tenido contacto con el medio
hospitalario y han recibido antibióticos de amplio espectro. las tasas de
colonización nasofarígea por K. pneumoniae se han informado entre 3 a 15% y
son mayores en adultos que en niños ; la colonización en el tracto gastrointestinal
se ha reportado en 35% pero está frecuencia se incrementa hasta el 77% si se ha
recibido antibiótico previo [21]. La persistencia en la colonización por cepas de Kp-
KPC puede prolongarse incluso más de un año[22] y se desconocen cuales son
los mecanismos perpetuadores de este fenómeno y el impacto que tiene el uso de
antibióticos
Es por esto que la integración de estudios clínicos y de biología molecular se
convierte en una necesidad y herramienta para la generación de nuevo
conocimiento en desenlaces clínicos diferenciales, impacto en selección de
terapia antibiótica óptima y creación de estrategias que permiten mayor control
para estas infecciones .
2.1 Pregunta de investigación
¿Cómo es el comportamiento clínico – microbiológico y las dinámicas moleculares
de las infecciones por Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenémicos
portadores del gen bla en el período postendémico en pacientes atendidos
KPC
en una institución de salud de cuarto nivel en Bogotá período 2014-2016
153. ESTADO DEL ARTE
3.1 Generalidades Klebsiella pneumoniae
Klebsiella pneumoniae es un patógeno oportunista, común en infecciones
adquiridas en la comunidad y hospitalarias. Es un bacilo Gram negativo no
esporulado, que pertenece a la familia Enterobacteriaceae. El género Klebsiella
está conformado según la clasificación de Cowan por 5 especies: K. pneumoniae,
K. oxytoca, K. aerogenes, K. edwardsii y K. rhinoscleromatis. Este microorganismo
puede colonizar e invadir diferentes tejidos ya que posee varios factores de
virulencia como el antígeno capsular K que le permite evadir la fagocitosis
bacteriana y la activación del complemento, el lipopolisacárido (LPS) que se
encuentra presente en la membrana externa e impide la activación del completo,
sideroforos que facilitan la captación de hierro del medio ambiente y finalmente, el
pili factor importante para la adherencia celular [23].
Klebsiella pneumoniae es la especie que tiene mayor relevancia clínica; es agente
causal de infección del tracto urinario, absceso hepático y neumonía en pacientes
sin factores de riesgo pero con mayor frecuencia estas infecciones están en
pacientes inmunosuprimidos[23]. La mayoría de infecciones por K. pneumoniae
se adquieren en el hospital, y además de las infecciones ya mencionadas, en este
escenario se presenta también como causal de infección en heridas quirúrgicas,
en dispositivos médicos intravasculares u otros invasivos, en infección biliar, en
peritonitis y en meningitis. Es la segunda aislada, luego de E. coli, en bacteriemias
con foco urinario [24]. Los pacientes con neumonía por K. pneumoniae
generalmente son adultos con antecedente de alcoholismo, y gracias a sus
factores de virulencia tiene la capacidad de generar abscesos pulmonares. Todas
las cepas de son resistentes a la ampicilina gracias a un gen cromosómico que
codifica una B lactamos específicas penicilina [25]. Este microorganismo tiene alta
capacidad de adquirir resistencia a través de plásmidos (Ver mecanismo de
resistencia) .
En Colombia los resultados del programa de vigilancia por laboratorio de
16resistencia antimicrobiana en infecciones asociadas a la atención en salud (IASS)
2016 informan que fue la principal enterobacteria enviada para análisis de los
eventos y que el principal mecanismo de resistencia era de tipo enzimático por la
producción de KPC [26]; en el informe del 2018 K. pneumoniae fue el primer
agente causal de neumonía asociada a la ventilación mecánica, el primero en
infecciones asociadas a dispositivos intravasculares y el segundo ([27]luego de E.
coli) en infecciones urinarias asociadas a sonda vesical. K. pneumoniae también
se encuentra como organismo colonizante a nivel nasofaríngeo y gastrointestinal
[21].
3.2 Factores de riesgo para infección por K. pneumoniae con resistencia a
carbapenémicos
Los factores de riesgo para infección y colonización por CPE (Enterobacterias
productoras de carbapenemasas) se han descrito e incluyen: uso previo de
antibiótico, exposición aguda y crónica a los ambientes hospitalarios,
comorbilidades crónicas y uso de dispositivos médicos invasivos[28]: la alteración
en el microbioma también ha tomado importancia[29]. En el estudio CRAKLE el
promedio de edad de los pacientes con infecciones por K. pneumoniae productora
de KPC fue de 70 años (rango de 58 a 71), predominio en mujeres (60%). Las
comorbilidades más frecuentes fueron Diabetes mellitus 56% , falla cardíaca 57%,
26% insuficiencia renal y el índice de comorbilidad de Charlson fue 4 (rango 2 a 6)
[30]. En los reportes de vigilancia del CDC se informa con frecuencia el uso de
dispositivos médicos : 75% catéter urinario, 43% catéter venoso central y 39%
dispositivos para alimentación enteral . Los estados de inmunodepresión y
principalmente en pacientes con trasplante de órganos sólidos también se
reportan como factores de riesgo [31].
3.3 Mecanismos de resistencia en K. pneumoniae y otros Gram negativos .
El principal mecanismo de resistencia en K. pneumoniae es la producción de
enzimas con capacidad de hidrólisis de B-lactámicos [32]. Las de mayor impacto
clínico y epidemiológico son la B-lactamasas de espectro extendido (BLEE) , las
de tipo AmpC y las carbapenemasas.
17Las β-lactamasas de espectro extendido tienen la capacidad de hidrolizar
penicilinas, cefalosporinas de primera y segunda generación, oximino-
cefalosporinas (cefotaxime, ceftriaxona y ceftazidime) y monobactámicos
(aztreonam); son sensibles a los inhibidos de betalactamasas (ácido clavulánico,
sulbactam tazobactam y avibactam). y en ellas se incluyen las derivadas de TEM,
SHV y las CTX-M (cefotaximasas). La expansión de BLEE, especialmente de tipo
CTX-M se favorece por la transferencia horizontal de plásmidos. En Colombia
además se presenta expresión simultánea de enzimas SHV y TEM y la BLEE
SHV-5 es la más frecuente [33] [34] .
Las cafotaximasas; hidrolizan la cefotaxima y la ceftriaxona con mayor eficiencia
que la ceftazidima; estas enzimas han reemplazado a TEM y SHV en diversas
áreas geográficas, incluido en Latinoamérica, se encuentran en la comunidad y
hospitalariamente. Los primeros reportes para Colombia datan del año 2002 en K.
pneumoniae; posteriormente se describió CTX-M-12 en cepas de K. pneumoniae
hospitalaria, así como en otras enterobacterias como E. coli y K. oxytoca. Se han
reportado otras cefotaximasas como CTX M 12 a, CTX-M-15 , CTX-M-60 [33]
Las enzimas tipo AmpC, presentes cromosomalmente en algunas enterobacterias
y Gram negativos no fermentadores, tienen la capacidad de hidrolizar
cefalosporinas de tercera generación, cefamicinas , diferenciándose de las BLEE
en que no son inhibidas por los inhibidores (Sulbactam y clavulánico) ; en K.
pneumoniae se encuentran más frecuentemente en plásmidos [32].
Las betalactamasas tipo carbapenemasas se han identificado principalmente en
Enterobacteriaceae, Acinetobacter baumannii y Pseudomonas aeruginosa, pueden
estar codificadas en forma cromosómica o por genes asociados con elementos
genéticos móviles como traspones, plásmidos e integrones; estas enzimas tienen
mayor espectro de hidrólisis frente a gran parte de los betalactámicos, incluidos
los carbapenémicos. Se clasifican desde el punto de vista molecular (Clasificación
de Ambler) o desde el punto de vista funcional (Clasificación de Busc-Jacoby –
Medeiros) [35]. Las β lactamasas que confieren resistencia a los carbapenémicos
18en enterobacterias, pertenecen a 3 de estos grupos: clase A, B y D. Las enzimas
clase A incluye la familia de carbapenemasas por K. pneumoniae (KPC) y otras
menos frecuentes como las no metalo carbapenemasas tipo A (NMC-A) y SME
que se encuentran en E. cloacae y S. marcesens respectivamente. Las enzimas
clase B incluyen las metalobetalactamasas como la New Delhi
metalobetalactamasa NDM, la familia IMP y la metalobetalactamasa codificada por
el integrón Verona VIM; requieren Zinc para la hidrólisis, tienen actividad para
todos los B lactámicos, excepto los monobactámicos. En la clase D se incluyen las
carbapenemasas tipo oxacilinasa OXA 48 e inducen hidrólisis leve a penicilinas y
carbapenémicos pero no cefalosporinas y en consecuencia son más difíciles de
detectar y se han llamado de patrón fantasma [36].
La primera descripción de IMP se realizo en Japón en un aislamiento de
Pseudomonas; en latinoamérica se describió en K. pneumoniae multiresistente
[37]
Las enzimas VIM se han reportado en Colombia en Pseudomonas aeruginosa, la
variante VIM 24 en Klebsiella pneumoniae en un gen localizado en un integrón y
transportado en un plásmido; también se tiene reporte de NDM en K. pneumoniae
y tras enterobacterias, así como de enzimas OXA, principalmente OXA 48 [33].
La carbapenemasa más frecuente reportada en K. pneumoniae es de tipo serina
correspondiente a KPC.
19Tabla3-1 . Clasificación de β-lactamasas y carbapenemasas
Clasificación Busch-Jacoby- Encontradas en Econtradas en
Nombre de la familia Atributos
de Ambler Medeiros plásmidos cromosomas
Debilmente inhibidas por
A 2f Serine carbapenemasas KPC;GES SME-1; IMI;NMC-a;SHV
tazobactam y clavulonato.
Inhibidas por ácido
borónico, susceptibles NDM-1;VIM NDM-1
aztreonam
Inhibidas por EDTA . No
inhibidas por clavulonato,
B 3a;3b;3c Metalo B-lactamasas IMP;SIM, SMP NDM-1
tazobactam o ácido
borónico
B-lactamasas d espectro Susceptibles a cloxacilina .
C 1e CMY-10 PDC
extendido AmpC Inhibidas por ácido borónico
No inhibidas por otros
Oxacilinasas que hidrolizan
D 2df componentes que inhiben OXA 48
carbapenémicos
otras carbapenemasas
Adapatado de Revised Ambler Classification [38]
Otros mecanismos para la resistencia a carbapenémicos en enterobacterias es la
pérdida de porinas ( proteínas transmembrana en la capa externa de gram
negativos) y la expresión de bombas de eflujo (proteínas con capacidad de
expuslar sustancias desde el interior hasta el exterior de la célula) [32]. La
hiperexpresión de enzimas tipo AmpC asociado a la presencia de porinas o
bombas de flujo también se manifiestan con la expresión fenotípica de resistencia
a carbapenémicos.
La resistencia a otras familias antibióticas esta mediada por alteración en porinas,
bombas de flujo para antibióticos seleccionados y alteración enzimática (enzimas
modificadoras de la molécula, como en aminoglucósidos). Las cepas de K,
pneumoniae que son resistentes a carbapenémicos tienen mayor probabilidad de
resistencia a otras familias antibióticas.
3.4 Epidemiología de las infecciones por K. pneumoniae con resistencia a
carbapenémicos portadoras del gen bla
KPC
Los primeros informes de las enzimas carbapenemasas datan de 1996 [4], pero
han tenido una amplia diseminación mundial desde la primera década del siglo
XXI. En USA, el sistema de vigilancia nacional SENTRY reportó entre 2007 a
2009 datos de 42 centros médicos informando la presencia de K. pneumoniae
con resistencia a carbapenémicos y gen bla (KP-KPC) del 5.5% [5]; el año
KPC
20siguiente el reporte aumento a 14% identificando variantes del gen KPC tipo 2 y 3
[6]; la incidencia anual en este país para el 2012 -2013 de enterobacterias
resistentes a carbapenémicos y portadoras del gen bla (principalmente K.
KPC
pneumoniae) fue 2.93 por 100.000 habitantes [7]. Otros países endémicos para
estas enzimas son Grecia e Israel [1]. En Latinoamérica Villegas et al informaron
frecuencia de carbapenemasas en enterobacterias (en 255 pacientes con
bacteriemias ) de 21% y de ellas un 83% correspondían a KPC (la más frecuente
KPC 3) siendo K. pneumoniae su principal representante [8] . En Colombia, el
primer reporte de KPC se realizó en Medellín en 2005 en 2 pacientes sin
antecedentes de viaje o exposición a áreas endémicas [9]. Luego en 2008 en la
misma ciudad se presentó un brote por K. pneumoniae resistente a
carbapenémicos, cuyo caso índice fue un paciente proveniente de Israel para el
programa de trasplante hepático; mediante estudios de polimorfismos de longitud
de los fragmentos de restricción y secuenciación, se confirmó la presencia de K.
pneumoniae bla genéticamente similar a la cepa de Israel involucrada en
KPC-3,
múltiples brotes nosocomiales en ese país [10]. El grupo CIDEIM reportó entre los
años 2009 a 2012 (en pacientes de Unidades de Cuidado intensivo) K.
pneumoniae con bla en 68% de los aislamientos [11] considerándose
KPC
entonces Colombia un país endémico para KP-KPC y el complejo clonal 258
(CC258 y sus variantes ST11 y ST340) los reportados con mayor frecuencia [12].
KPC-3 se ha reportado con mayor frecuencia en Colombia .
A la fecha se han descrito más de 115 variantes clonales, además hay a cambios
en la epidemiología molecular con reportes de otros ST tanto en Colombia [14]
como en otros países [15] .
3.5 Rol del Tansposón 4401 a en la diseminación de Kp-KPC
La transmisión de genes KPC (bla ) esta mediado por diferentes mecanismos
KPC
moleculares, el principal es vía Transposón 4401ª el cual tiene la capacidad de
pasar a plásmidos (que sufren procesos frecuentes de conjugación); ellos se han
difundido en diferentes enterobacterias, siendo K. pneumoniae ST 258 la especie
predominante lo que sugiere una ventaja selectiva y mejor fitnes [39].
21El elemento genético móvil que contiene el gen bla KPC es el transposon Tn4401;
este tiene 10 Kb en longitud y contiene además del gen gen bla ,tiene el gen
KPC
transposasa Tn3(tapa), el Tn3 resolvasa gen (tnpR) y 2 secuencias de inserción
ISKpn6 e ISKpn7 [40]. Esta estructura tiene alta capacidad de movilización entre
especies de enterobacterias, y ademas del gen bla alberga otros como los
KPC
genes de enzimas modificadoras de aminoglucósidos aac6 y aadA1 , genes de
otras B-lactamasas , bla y bla .
OXA-9 TEM1
Se han descrito isoformas que se han asociado con varios plásmidos de bla KPC.
Este también se ha descrito en otros elementos genéticos aislados en China ,
Argentina y otras regiones
En relación a los plásmidos, el gen bla KPC se ha descrito en de enterobacterias,
y también en P.aeuriginosa a nivel cromosomal. A la fecha se han secuenciado
más de 40 plásmidos , la mayoría de ; estos contienen varios genes que confieren
resistencia a otros antibióticos como aminoglucosidos , quinolonas , trimetropim y
tetraciclinas , lo que indica co-selección de cepas por presión antimicrobiana para
aparición de multiresistencia.
3.6 Determinación fenotípica de carbapenemasas en Klebisella pneumoniae
El CLSI (Clinical and laboratory Standards Institute) disminuyó los puntos de corte
para carbapenémicos en enterobacterias: Meropenem e Imipenem MICs menor o
igual a 1 y para Ertapenem menor o igual a 0.05. La primera identificación para
resistencia se hace a través de los sistemas automatizados (Vitek, MicroScan,
Phoenix) ; una vez identificadas las muestras se realiza la identificación fenotípica
para lo que se cuenta con 3 técnicas [41]:
1. Ensayos en medio de cultivo con medición de la resistencia en presencia de
antibiótico (Test de Hodge modificado y el método de inactivación de
carbapenémico modificado)
2. Métodos de hidrólisis, se detecta el producto de hidrólisis catalizado por
enzimas carbapenemasas (Ej Carba NP) y
3. Inmunoensayo en flujo lateral , en el que se detectan las enzimas a través con
anticuerpos
El test de Hodge modificado MHT es el mas conocido para la detección de
22carbapenemasas, en este se incluye en el agar un disco impregnado de
meropenem o ertapenem, se inocula una E coli susceptible a carbapenémico, la
cepa problema y un control. El test se fundamenta en la capacidad de disminuir la
concentración local del antibiótico, favoreciendo el crecimiento de la cepa que es
susceptible generando una apariencia de trébol en el agar. El test tiene buena
sensibilidad para la detección de carbapenemasas tipo KPC (entre 93 a 98% para
enterobacterias) pero baja sensibilidad para las Metalo Beta lactamasas MBL. Se
pueden tener falsos positivos con cepas productoras de BLEE o cefalosporinasas
AmpC en conjunto con mutaciones de porinas, por lo tanto su especificidad es
limitada reportada en 91% . Este es un test económico y de fácil realización, sin
embrago consume tiempo ya que requiere de 24 horas adicionales para el
crecimiento de la bacteria luego que se ha tenido la identificación. En el 2018 este
test se retiro del CLSI como prueba Dx.
El CarbaNP detecta carbapenemasas al medir la hidrólisis in vitro del imipenem, al
exponerlo a extractos bacterianos, con cambios en la coloración en 2 horas. La
hidrólisis de imipenem resulta en la producción de un derivado carboxilico , que
disminuye el pH , y este produce cambio de coloración de rojo a amarillo. Su
sensibilidad para la detección de carbapenemsas esta reportada entre73 a 100% ,
sin embargo la sensibilidad para la detección de otro tipo de enzimas como OXA-
48 es menor; en la actualidad existen variantes del mismo. El Carba NP también
se ha utilizado para la evaluación de carbapenemasas en no fermentadores,
incluyendo enzimas de clase A, B y D . La sensibilidad y especificidad para P.
aeuriginosa fue de 98% mientras que la sensibilidad para A. baumannii fue del
19% y especificidad del 100%; el CarbaNP modificado podría incrementar la
sensibilidad en este microrganismo, pero aún es subóptimo.
El método de inactivación del Carbapenémico se fundamenta en el uso de un
disco de 10 ug de meropenem incubado durante 2 horas en agua con 10 ul de una
cepa productora de carbapenemasa , que genera la hidrólisis del medicamento. El
disco se retira y se traslada a un agar Mueller Hinton en el que se encuentra una
cepa de E. coli susceptible. Luego de la incubación, la ausencia de la zona de
23inhibición del microorganismo indica la presencia de carbapenemasa. La
sensibilidad del MIC está entre 91 a 94% y la especificidad entre 99 a 100%; esta
técnica no permite diferenciar entre enzimas serio de metal B lactamasas, por lo
que se han sugerido modificaciones al ensayo, con la adición de EDTA
Los ensayos de flujo lateral son métodos fundamentados en la identificación de
Anticuerpos para la identificación de carbapenemasas; se han introducido
recientemente al mercado y permiten la detección de algunas carbapenemasas de
importancia epidemiológica; también se han desarrollado para detectar NDM, IMP,
OXA 48, KPC e incluso detección simultánea de KPC, NDM y OXA 48; los
resultados se tienen en 15 minutos. En análisis retrospectivos y prospectivos la
sensibilidad de uno de los prototipos de esta técnica llamado NG-Test Carba5 fue
del 100% y la especificidad se informo entre 95 a 100%
El MALDI-TOF MS es una plataforma muy conocida, fundamentada en la
proteómica y usada para la identificación a nivel de género y especie de
microorganismos [42]. En la actualidad se ha propuesto como una técnica para la
identificación rápida de carbapenemasas a través de 2 aproximaciones :1.
Hidrólisis, en la que se detectara los productos de degradación del antibiótico,
posterior a la incubación de extractos de proteínas bacterianas + el sustrato
carbapenémico, y 2, con la identificación del pico de una proteína asociada a
plásmidos de liberación de carbapenemasas. A la fecha no se tienen protocolos
establecidos para los métodos de hidrólisis y se está trabajando la técnica para la
identificación de proteínas asociadas a plásmidos.
3.6 Determinación molecular de carbapenemasas en Klebisella pneumoniae
La caracterización molecular de los mecanismos de resistencia es parte integral
de la investigación clínica; en algunos casos las pruebas fenotípicas son
dispendiosas y consumen tiempo generando demoras en la toma de decisiones
terapéuticas; las pruebas moleculares son utilizadas para la búsqueda de genes o
mutaciones puntuales que permiten identificación temprana de resistencias
antibióticas, esto además de favorecer el inicio de una terapia adecuada, permite
realizar estudios epidemiológicos de brotes y vigilar los perfiles de resistencia
24locales .
Los métodos moleculares de tipificación utilizan como diana DNA cromosómico y
DNA de elementos genéticos móviles de transmisión horizontal (plásmidos,
transpones integrones y secuencias de inserción). Se clasifican en 3 grupos: 1.
basadas en perfiles de restricción del DNA (plasmídico o cromosómica), 2.
amplificación por PCR (reacción en cadena de polimerasa), 3. secuenciación
parcial de genes y 4. secuenciación genómica completa.
En los estudios de perfiles de DNA plasmídico se realiza extracción de plásmidos
que posteriormente son separados por electroforesis en un gel de agarosa y se
analizan con el patrón de número de bandas plasmídicas asi como sus tamaños.
En el estudio de perfiles de restricción de DNA cromosómico se utiliza una enzima
de restricción que genera un número variable de fragmentos de diferente tamaño ,
los cuales se separan por electroforesis , generando 2 patrones: enzimas de corte
frecuente o poco frecuente
La PCR es una técnica que se desarrollo en 1980s por Kari Mullis [43] ; en esta
técnica se logra la amplificación de una secuencia blanco de DNA , utilizando un
primer de PCR reverso , una enzima llamada DNA polimerasa , en presencia de
deoxiribonucleotidos (dntps). La PCR convencional incluye 3 pasos
fundamentales: 1. De-naturalización de la cadena doble de DNA a 95ºC 2. Unión
de los primers a la hebra de DNA a 50 a 60ªC y 3. Extensión del DNA a 72ºC .
Esta técnica permite la detección de genes presentes en la bacteria y depende de
que la secuencia de DNA de interés este disponible o se tenga parte del gen a
partir del cual se puedan diseñar los primers . El producto amplificado del gen se
puede visualizar en un gel de agarosa , en el que se tiñe el DNA con bromuro de
etidio o a través de quelantes fluorescentes. El proceso de una PCR convencional
tarda entre 4 a 5 horas. En la actualidad se cuenta con técnicas avanzadas, en la
que se incluye la PCR en tiempo real (RT-PCR), la amplificación isotérmica y la
amplificación de recombinasa -polimerasa. La diferencia entre una PCR
convencional y una RT-PCR es que en la última el DNA de interés es monitorizado
25en tiempo real y a través de técnica con fluorescencia permite la cuantificación del
mismo; en RT-PCR no se requiere de un gel de agarosa para imprimir el producto.
La diferencia entre una PCR convencional con la PCR con amplificación
isotérmica, como su nombre lo indica, radica en que el proceso se realiza a una
misma temperatura .
En las PCR múltiples diferentes fragmentos de DNA se amplifican
simultáneamente y se pueden realizar con técnica convencional o por RT-PCR;
con esta técnica diferentes genes de resistencia se pueden detectar
simultáneamente utilizando diferentes primers. Actualmente el set de PCR multiplex
permite la detección de diferentes carbapenemasas (IMP, VIM, GIM, SIM NMD, OXA,
KPC) y en el 2011 se amplió la detección de esta PCR a cefalosporinasas tipo AmpC
plasmídicas, (ACC, ACT, DHA, CMY, FOX, LAT, MIR y MOX) metalobetalactamasas (IMI,
SME y NMC-A) y OXA (23, 24, 51, 58 y 143) .
La PCR convencional permite detectar la presencia o ausencia de un gen
particular pero es menos útil para la detección de mutaciones puntuales.
Otra técnica molecular empleada son los microarreglos; estos permiten evaluar la
diversidad genómica al detectar presencia o ausencia de genes del organismo de
interés comparado con un microorganismo referencia.
Los MLST (multilocus sequencing typing): En esta técnica se secuencia
parcialmente 6 o 7 genes metabólicos muy conservados (housekeeping genes)
que tienen baja presión selectiva . Los miembros asignados a un mismo grupo
muestran por lo menos 6 de 7 alelos idénticos. Esta técnica tiene la ventaja de
ofrecer resultados objetivos, reproducibles , permite almacenamiento en formato
electrónico , crear bases de datos , lo que favorece comparar perfiles o secuencias
entre aislamientos de diferentes áreas geográficas Esta técnica permite el estudio
epidemiológico global a largo plazo , en los que se quiere conocer la estructura
poblacional de un microorganismo.
En la secuenciación genómica completa, se pueden detectar determinantes
26genéticas (genes y mutaciones) relacionados con resistencia antibiótica . La gran
ventaja con esta técnica es que tiene la habilidad de cubrir varios blancos
simultáneos y variantes genéticas ; gracias a esta tecnología se obtienen nuevas
secuencias que permiten alimentar bases de datos genómicas ; permite además
reanálisis con cada secuencia identificada. La tecnología Sanger fue la usada
inicialmente ; hoy se cuenta con otras como Illumina y Ion Torrent machines,
denominadas como secuenciación de segunda o próxima generación.
274. OBJETIVOS
4.1 Objetivo General
Describir las característica clínicas y microbiológicas de las infecciones por
Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenémicos portadores del gen
bla y las dinámicas moleculares de las infecciones a partir de muestras
KPC
procedentes de un mismo paciente.
4.2 Objetivos Específicos
• Describir las características clínicas y demográficas de los pacientes con
aislamientos de Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenémicos
portadores del gen bla .
KPC
• Describir las características microbiológicas y moleculares de los
aislamientos de Klebsiella pneumoniae resistentes a carbapenémicos
portadores del gen bla
KPC
• Determinar la relación genética de los aislamientos de K. pneumoniae
resistente a carbapenémicos por medio de PFGE y MLST.
• Establecer la secuencia del genoma de los principales linajes genéticos
identificados en la población de aislamientos de Klebsiella pneumoniae
seleccionados
• Describir cambios genómicos de algunos aislamientos de K. pneumoniae
resistentes a carbapenémicos portadores del gen bla procedentes de un
KPC
mismo paciente tras el uso de diferentes tipos de antibióticos indicados para
este tipo de infecciones
285. METODOLOGIA
5.1. Tipo de estudio
Estudio descriptivo observacional retrospectiva tipo serie de casos en una
institución de cuarto nivel de Bogotá.
5.2 Universo y población
Criterios de inclusión
Se incluyeron aislamientos de K. Pneumoniae resistentes a carbapenémicos
portadores del gen bla (confirmadas por biología molecular) provenientes de
KPC
pacientes adultos y del banco institucional de cepas de la Fundación Santafé en
el período de enero 2014 a diciembre 2016.
Criterios de exclusión
Los aislamientos de K. pneumoniae resistente a carbapenémicos con mecanismos
de resistencia diferente al bla fueron excluidos; de igual forma se excluyeron
KPC
aquellos aislamientos de pacientes en quienes no se tuvieran los registros clínicos
completos
5.3 Proceso de recolección de muestras y datos
El proceso inició con la identificación de muestras clínicas con aislamientos de K.
pneumoniae (confirmadas por equipo MALDI-TOF institucional) que expresaran
resistencia a carbapenémicos (sistema Vitek 2 ®, acorde a puntos de corte CLSI
para los años en vigencia) a las que además se les realizó confirmación fenotípica
(test de Hodge modificado, ácido borónico o prueba Carba NP, este último
disponible desde el 2016). Estos aislamientos se conservaron a -70ºC, y se
enviaron al laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional, en donde se
realizó recuperación, confirmación de viabilidad y pureza de las muestras;
posteriormente se enviaron al laboratorio de genética molecular Bacteriana de la
Universidad El Bosque (LGMB). En LGMB se realizó la confirmación molecular
para género, especie y gen bla
KPC.
29Para el cumplimiento de cada uno de los objetivos se realizaron las siguientes
actividades:
1. Descripción de características clínicas de pacientes y sus eventos de infección
o colonización por Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos
portadores del gen bla
KPC
a. Los registros clínicos de pacientes con aislamientos Kp-KPC fueron
revisados para su caracterización; se incluyeron variables demográficas,
antecedentes médicos, tipo de hospitalización (causa médica o
quirúrgica), grado de comorbilidad (Indice de Charlson), diagnóstico
clínico, uso de antibióticos en el último año, requerimiento de manejo en
Unidad de cuidado intensivo, terapia antibiótica empleada para el
tratamiento y mortalidad, con seguimiento hasta el alta hospitalaria. Se
definió como un evento cada aislamiento clínico (que podría
corresponder a infección o colonización) y en aquellos pacientes que
presentaron más de 1 evento estos se analizaron por separado. Los
eventos se clasificaron acorde a la fuente o procedencia, diagnóstico y
significancia clínica.
30Tabla 5-3-1. Operacionalización de variables
VARIABLE DEFINICIÓN TIPOS DE VARIABLE Nivel operativo
Fecha de ingreso Fecha de ingreso a hospitalización Cuantitativa diá/mes/año
Fecha de egreso Fecha en que finaliza la Cuantitativa día/mes/año
hospitalización
Fecha del evento microbiológico por Fecha de reporte anotada en Vitek Cuantitativa día/mes/año
Kp-KPC
Días de hospitalización Diferencia entre el día de egreso e Cuantitativa días
ingreso
Género Sexo biológico Nominal Femenino/masculino
Edad Edad del paciente en años al momento Cuantitativa de razón Años
del primer evento
Procedencia del paciente en el Lugar donde se ecnontraba el Nominal Urgencias, hospitalización, UCI o
momento del aislamiento (evento) paciente en el momento del consulta externa
aislamiento
Procedencia de la muestra Localización anatómica del Nominal Orina, sangre, muestra
aislamiento microbiológico respiratoria, liquido o tejido
peritoneal, LCR, absceso, otros
Número de aislamientos Número total de aislamientos por Kp- Cuantitativa Razón Número de aislamientos
KPC del paciente en el período de 3
años
Tratamiento antibiótico previo en el El paciente ha recibido cualquier Nominal Sí/No
último año esquema antibiótico en los 12
meses previos alingreso
31Tabla 5-3-1 Continuación
VARIABLE DEFINICIÓN TIPOS DE VARIABLE Nivel operativo
Tipo de antibiótico recibido Se especificará para cada uno de Nominal Recibió: penicilinas/inhibidores,
los eventos tipo de terapia AB cefalosporinas de primera,
recibida ( si la tuvo) segunda o tercera generación,
cefalosporinas cuarta
generación, carbapenémicos,
polimixina, aminoglucósidos,
quinolonas, tigeciclina
Cirugías prevías : instrumentación El paciente tuvo cualquier Nominal Sí/No
procedimiento quirúrgco o
instrumentación como sondajes o
biospias durante el período de
referencia
Indicación de hospitalización por Hospitalización médica indica Nominal Causa médica o causa quirúrgica
causa médica o quirúrgica patología de manejo clínico no
quirúrgico/ patología quirúrgica
implica realización de
procedimientos invasivos o
mínimamente invasivos como causa
primaria de la hospitalización
Otros aislamientos microbiológicos Se enumeraran otros tipos de Nominal Mencionar el tipo de aislamiento
durante el período de observación microorganismos aislados en el
paciente durante el período de
referencia
Indice de comorbilidad Se medirá con la escala de Charlson. Cuantitativa razón 0 a 33
Sistema de evaluación de la
esperanza de vida a los 10 años
dependiente de edad y
comorbilidades . A mayor puntación
menor probabilidad de sobrevida
Cirrosis Resultado final de daño crónico Nominal Sí/No
hepático causada por una
enfermedad prolongada ( crónica)
del hígado. Se presentan cambios
morfológicos ( hígado nodular en
Diabetes Mellitus imágCerinteesri)o, sfi sCiloalsóifgiiccaotso yri ofusn AcDioAn:a les Nominal Sí/No
Glicemia en ayunas mayor a 126
mg/dl, glicemia en cualquier
momento del día mayor a 200mg/dl,
alteraciones en test de tolerancia
oral a carbohidratos o niveles de Hb
glicosilada mayores a 6.5%
32Tabla 5-3-1 Continuación
VARIABLE DEFINICIÓN TIPOS DE VARIABLE Nivel operativo
EPOC Enfermedad respiratoria Nominal Sí/No
caracterizada por una limitación
alflujo aéreo asociada a una
respuesta inflamatoria anormal y
como disnea como manifestación
clínica principal
VIH Infección producida por el virus de la Nominal Sí/No
inmunodeficiencia humana , en
cualquiera de sus estadíos, y
definida por la presencia de 2 ELISAS
reactivos para VIH1 o VIH 2 de
diferente generación
IRC Pérdida progresiva, permanente o Nominal Sí/No
irreversible de la tasa de filtración
glomerular estimado en la
disminución del acaramiento de
creatinina menor a 60 ml / min/1.73
mtdurante al menos 3 meses, y con
cmabios bioquímicos o clínicos como
hipercalcemia, anemia,
hiperfosfatemia entre otros
Inmunosupresión diferente a VIH Alteración primaria o secundaria del Nominal Sí/No
sistema inmunológico que
incrementa susceptibilidad a
procesos infecciosos por defectos
cuantitativos o cualitativos de tipo
celular o humora. En este item se
incluye inmunosupresión
medicamentosa por terapias
biológicas, inmunomiduladores y uso
de corticoides
Trasplante de órgano sólido Se define como una hospitalización Nominal Sí/No
para realización de trasplante de
algún órgano sólido ( hígado,
corazón, riñón, pulmon)
Trasplante de progenitores Se define como una hospitalización Nominal Sí/No
hematopoyéticos para realizar trasnplante de
progenitores por neoplasia u otras
patologias
Cáncer Cualquier patología neoplásica Nominal Sí/No
maligna
Usuario crónico de corticoide u otro uso de más de 10 mg de prednisona Nominal Sí/No
tipo de inmunosupresión o equivalente de forma crónica
farmacológica
33Tabla 5-3-1 Continuación
VARIABLE DEFINICIÓN TIPOS DE VARIABLE Nivel operativo
Tuvo algún ingreso a UCI en la cualquier ingreso a UCI secundario a Nominal Sí/No
hospitalización enfermedad severa
Estado el egreso Se define el último día de Nominal Vivo o fallecido
hospitalización como vivo o fallecido
Evento clínicamente significativo Cualquier aislamiento clínico en el Nominal Sí/No
que el paciente haya presentado
criterios de infección por respuesta
sistémica, disfunción orgánica o
choque atribuído a sépsis, y en el
que el médico tratante así lo haya
considerado y haya inicaido terapia
antibiótica dirigida.Lo que no se
incluye en esta categoría se
interpretará como colonización
Tratamiento antibiótico indicado Si se considero clínicamente Nominal Carbapenémico/polimixina/tige
significativo, indicar dosis, tipo y ciclina/aminoglucósido/quinolo
duración de antibiótico na/aztreonam/otros
Terapia antibiótica combinada En pacientes con aislamiento Nominal Si/no. Especificar
clínicamente significativos, sedio
terapia con 2 o más antibióticos
Ingreso a UCI con el evento Especificar si el paciente ingreso o Nominal Sí/no
no a UCI con el evento
Severidad de le enfermedad al Medido al ingreso con SOFA . Escala Cuantitativa razón 0-16
ingreso a UCI utilizada para medir la severidad del
estado del paciente, incluye
variables respiratorias, (PAFI o
saturación), función hepática (
bilirrubinas) hematológicas (
plaquetas)
Severidad de le enfermedad al Medido al ingreso con APACHE Cuantitativa
ingreso a UCI 0 a 22
Resistencia a otros grupos de Los eventos presentaron resistencia Nominal
antibióticos a aminoglucósdios y/o quinolonas
y/o tigeciclina y/o colistina Sí/no
Pulsotipo identificado por PFGE Clon identificado por PFGE Descriptiva nominal 1-46
Evento con pulsotipo 4 El evento informado presenta Nominal
pulsotipo 4 ( ST 258) Sí/no
b. Se compararon variables clínicas de los pacientes estratificadas por
características moleculares de los aislamientos (Pulsotipo 4 Vs
Pulsotipo no 4); se compararon los perfiles de sensibilidad antibiótica
de los eventos a otros grupos de antimicrobianos usando las mismas
categorías, así como la distribución diferencial de otras enzimas B-
lactamasas (TEM y CTX-M) .
2. Establecer las características microbiológicas y moleculares de los
aislamientos de Klebsiella pneumoniae portadores del gen bla .
KPC
34a. Los aislamientos de Klebsiella pneumoniae se enviaron al Laboratorio
de Genética Molecular Bacteriana de la Universidad El Bosque y al
grupo de investigación en enfermedades infecciosas de la Universidad
Nacional de Colombia en medios de transporte AIMES con carbón
TM ®
activado (BD Culture Swab Plus Aimes, Bencton Dickinson ),
siguiendo las recomendaciones proporcionadas en el decreto 1609 de
2002 del Ministerio de transporte y diligenciando una ficha de envío. Las
muestras se sembraron por agotamiento en medios nutritivos y
selectivos (Mac Conkey para Gram negativos) y se incubaron a las
condiciones adecuadas para cada microorganismo durante 24 horas.
b. Se realizó extracción del DNA de cada aislamiento por el método de
fenol/cloroformo y precipitación con etanol de acuerdo a las condiciones
ya estandarizadas en el laboratorio de Genética Molecular Bacteriana.
Se confirmó género y especie por medio de la amplificación del gen
khe, y se evaluó la posible contaminación con otras especies mediante
la amplificación de los genes pehX (Klebsiella oxytoca), uidA
(Escherichia coli), ehe (Enterobacter cloacae), wosA (Proteus mirabilis)
por PCR múltiple. Para la amplificación se usaron las siguientes
condiciones estandarizadas en el Laboratorio de Genética Molecular
Bacteriana: denaturación a 95°C por 10 minutos, seguido de 30 ciclos a
95°C por 15 segundos, 56°C por 60 segundos, 72°C por 60 segundos
y una extensión final de 7 minutos a 72°C. Los tamaños de amplímero
fueron: pehX (185pb), khe (243pb), ehe (322), uidA (388pb), wosA
(494pb), los cuales fueron visualizados por electroforesis en gel de
agarosa al 1,5%, teñidos con solución de bromuro de etidio 0,5 mg/ml y
revelados con un analizador de geles Gel Doc XR+
System (Bio-Rad.). Las cepas usadas como control positivo fueron:
Klebsiella oxytoca ATCC 43086, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603,
Enterobacter cloacae ATCC 13047 y Proteus mirabilis ATCC 43071.
c. Se evaluaron los genes bla , bla , bla , bla , bla ,
TEM CTX-M GES IMP VIM
bla , bla y bla (relacionados con la resistencia a
KPC NDM OXA-48
35antibióticos B-lactámicos) , siguiendo las condiciones reportadas por
Monteiro y Col [44] .
d. La determinación de las variantes bla y bla se realizó mediante
KPC-2 KPC-3
la restricción enzimática del amplímero de bla con la enzima RsaI por
KPC
dos horas a 37°C, utilizando la mezcla de H O destilada desionizada
2
estéril, 2μl de buffer RE a 10X, 5µg de BSA acetilado, 10μl del producto
de PCR del gen bla y 5u de RsaI. Como control positivo de los genes
KPC
de bla y bla se usaron las cepas de K. pneumonie 24kpn33 y
KPC=2 KPC-3
16kpn4, respectivamente. Los productos esperados de la restricción
para bla fueron 70pb y 740pb y para bla fueron 70pb, 120pb y
KPC=2 KPC-3
680pb; los amplímeros de bla fueron confirmados por
KPC-2
secuenciación.
e. Las pruebas de susceptibilidad antimicrobiana se realizaron con el
sistema VITEK 2®
3. Determinar la relación genética de los aislamientos por medio de PFGE
(Electroforesis campo pulsado) y MLST
La relación genética de los aislamientos se estableció mediante la digestión
del DNA genómico con la enzima XbaI (New England Biolabs). Los
fragmentos de DNA obtenidos fueron separados por PFGE, siguiendo el
protocolo de Schwartz y Col. [45]. Los aislamientos con pulsotipos idénticos
o con menos de dos bandas de diferencia fueron agrupados en clones.
Adicionalmente, el tipo de secuencia (ST) fue determinado en aislamientos
representativos de los clones de mayor circulación (diversidad intra-
institución) y en clones aislados de un mismo paciente (diversidad intra-
paciente) de acuerdo a las condiciones descritas por Diancourt y Col. [46]. .
El resultado fue comparado con los alelos reportados para cada gen, los
cuales se encontraron en la base de datos de MLST del Instituto Pasteur
disponible en https://bigsdb.pasteur.fr/klebsiella/klebsiella.html
4. Establecer la secuencia del genoma de los principales linajes genéticos
identificados en la población de aislamientos de Klebsiella pneumoniae
seleccionados.
36Se seleccionaron 4 eventos con representación de los pulsotipos más
frecuentes para secuenciación para lo cual se realizó un cultivo bacteriano
en caldo LB suplementado con ceftazidima (CAZ) [16 μg/ml], con el fin de
mantener la presión selectiva para bacterias que albergaban el gen de
interés, y se incubó a 37°C durante toda la noche. Posteriormente, se
realizó una dilución 1:100 en caldo LB suplementado con CAZ [16 μg/ml],
que se incubó nuevamente en shaker a 37°C, 200 rpm hasta obtener una
densidad óptica (OD) de 0,6 a 625 nm a partir del cual se extrajo el ADN
total siguiendo el protocolo del kit comercial UltraClean® Microbial ADN
Isolation Kit (QIAGEN N.V.). El ADN extraído fue verificado con un control
de calidad cuantitativo y cualitativo; mediante la cuantificación de la
concentración a 260nm y la revisión de las relaciones 260/280 y 260/230 en
NanoDrop 2000c (BIORAD®) con el fin de descartar la presencia de
proteínas y otros contaminantes; y la visualización de la integridad del ADN
en una electroforesis horizontal en gel de agarosa al 0,6%. Para cada ADN
bacteriano se realizó una librería SMRTbell™ de 20kb, siguiendo el
protocolo de SMRTbell® Express Template Preparation Kit 2.0 (Illumina,
Inc.) y para la obtención de las lecturas se utilizó la plataforma de PacBio
RS II (Illumina, Inc.) con la química P6-C4 y una SMRT cell. Las lecturas
obtenidas fueron ensambladas de novo usando el protocolo SMRT Analysis
v2.3 y el programa HGAP en el SMRT portal. Los contigs obtenidos del
ensamblajese compararon entre ellos mismo para buscar la presencia de
extremos repetidos, sugestivos de estructuras circulares completas, a
través de Artemis Comparison Tool (ACT) [47] y el análisis de dotplot con
el programa GEPARD 1. Las secuencias de los contigs fueron evaluados
haciendo un mapeo de las lecturas obtenidas, usando el programa BWA-
MEM [48] , con el fin de observar el alineamiento de las lecturas a cada uno
de los contigs e identificar si había zonas atípicas en el mapeo que
pudieran corresponder a fallas durante el proceso del ensamblaje. Estos
resultados se observaron sumados al archivo de anotación estructural en
formatoGenBank resultado de la identificación de los marcos de lectura de
los contigs en Prokka v1 [49].1Se observó que, en las zonas de los
37extremos repetidos, algunos genes se encontraban truncados debido a la
baja cobertura de las lecturas, por lo cual se hizo un proceso de
circularización manual con el fin de remover una de las secuencias
repetidas. En el proceso de circularización se conservó las regiones de
cada extremo que presentaban mayor cobertura y marcos abiertos de
lectura completos. Teniendo en cuenta que el punto de inicio de las
secuencias es asignado aleatoriamente durante el ensamblaje, se cambió
empleando el programa Circlator [50] y usando los genes dnaA (definido
como punto de inicio del cromosoma bacteriano) y repA o repB (como punto
de inicio de los plásmidos) en las secuencias que
albergaban estos genes. Posteriormente, se identificó la presencia de los
genes de resistencia a antibióticos mediante la herramienta de BLAST de la
base de datos de ResFinder (https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/) y
CARD (https://card.mcmaster.ca/).
5. Describir cambios genómicos de algunos aislamientos de K. pneumoniae
resistentes a carbapenémicos procedentes de un mismo paciente tras el uso
de diferentes tipos de antibióticos indicados para este tipo de infecciones
a. Se presentan en una línea de tiempo la caracterización fenotípica y
molecular de 14 aislamientos procedentes de un mismo paciente en
relación al tipo de antibiótico utilizado así como sus dosis acumuladas.
Los eventos de este paciente fueron los analizados por secuenciación .
5.4 Plan de análisis estadístico
a. Los datos se analizaron con el programa estadístico Excel (Microsoft,
USA) y con SPSS Statistics versión 21(IBM). Las variables cuantitativas
se presentaron como medianas y rangos , las variables categóricas se
presentaron como frecuencias y porcentajes .Para establecer
diferencias en variables cuantitativas entre los grupos se utilizó la
prueba T de Student o el test Kruskall wallis acorde a su distribución y
correlación. Las variables categóricas se compararon con el test chi2 o
test exacto de Fisher.
385.5 Presupuesto
Tabla 5-2. Presupuesto y financiación
Rubro Financiado Contrapartida en efectivo Contrapartida en Especie Valor Total
Equipos $39.000.000 $3.800.000 $33.014.200 $75.814.200
Eventos académicos $14.100.000 $9.400.000 0 $23.500.000
Gastosde operación $19.013.750 $3.500.000 0 $22.513.750
Materiales e insumos $85.500.000 10.260.000 0 $95.760.000
Personal científico $87.600.000 0 $226.526.023 $314.126.023
Publicaciones $2.320.000 0 0 $2.320.000
Seguimiento y evaluación $8.719.162 0 0 $8.719.162
Servicios técnicos $43.105.000 5.172.600 0 48.277.600
Total $299.357.912 $32.132.600 $259.540.223 $591.030.735
Esta tesis hace parte del proyecto Colciencias con código
130877758007, de quien se recibió financiación.
5.6 Cronograma de actividades
Tabla 5-3- Cronograma
Mes 2 Mes 4 Mes 6 Mes 8 Mes 10 Mes 12 Mes 14 Mes 16 Mes 18
Revisión del proyecto por asesores
temáticos, entrega del proyecto y
aprobación. X
Revisión de registro clínicos X X X
Procesamiento muestras
microbiológicas X X X X X
Análisis estadístico de los datos X X
Preparación del documento final X X
Preparación de artículo X
Sustentación del trabajo X
396. CONSIDERACIONES ÉTICAS
Teniendo en cuenta la resolución No. 008430 de 1993 del Ministerio de Salud, por
la cual se establecen las “normas científicas, técnicas y administrativas para la
investigación en salud”, se consideró que los participantes no estuvieron
expuestos a riesgos por tratarse de un estudio retrospectivo, en el que se
analizaron muestras clínicas con aislamientos de K. Pneumoniae resistentes a
carbapenémicos ; no se realizó ninguna intervención o modificación intencionada
de las variables biológicas, fisiológicas, sicológicas o sociales de los participantes
y sólo se obtuvo información de su historia clínica. Por tratarse de un estudio
retrospectivo no se requirió de consentimiento informado
Se mantuvo la confidencialidad de la información; a los aislamientos se les asignó
un código que no tuvo conexión alguna con el nombre u otro dato que pudiese
identificar al participante
Este estudio no genero ningún tipo de conflicto entre los investigadores y los
médicos tratantes de los participantes. El propósito de la propuesta no fue de
carácter comercial , solo fue investigativo y buscó el beneficio de la comunidad
científica y de la población en general.
Por tratarse de un proyecto en el que se realizó manipulación de muestras con
potencial patógeno se siguieron en todo momento y con rigurosidad las medidas
de prevención de riesgos relacionados con la exposición a agentes biológicos, así
como las recomendaciones de bioseguridad en el laboratorio de la Organización
Mundial de la Salud (OMS). Se contó con recurso humano calificado y entrenado
técnicamente en prácticas de bioseguridad.
Este proyecto fue aprobado por el Comité Corporativo de Ética en Investigación
de la Fundación Santa Fe de Bogotá y por el Comité de la Universidad El Bosque.
Los resultados serán publicados en revistas de índole académica, preservando la
exactitud de los mismos y haciendo referencia a datos globales .
407. RESULTADOS
7.1 Objetivo 1. Descripción de características clínicas de pacientes y sus eventos de
infección o colonización por Klebsiella pneumoniae resistente a carbapenémicos
portadores del gen bla
KPC
Durante el periodo de estudio, se analizaron 182 aislamientos (recuperados de 89
pacientes), previamente identificados como Klebsiella pneumoniae resistente a
carbapenémicos por técnicas microbiológicas; 36 (19.8%) fueron recuperados en
el año 2014, 73 (40.1%) en 2015 y 73 (40.1%) en 2016. Posterior a la confirmación
molecular de género y especie 165 (90.7%) se confirmaron como Klebsiella
pneumoniae, 8 (4.4%) como Klebsiella oxytoca, 7 (3.8%) como Escherichia coli, y
en 2 (1.1%) no se logró establecer la especie. Los 17 (9.3%) aislamientos que no
amplificaron la especie de interés fueron excluidos del estudio. De los 165
aislamientos confirmados molecularmente como Klebsiella pneumoniae se
encontró el gen bla en 152 (92.1%). Estos 152 aislamientos fueron recuperados
KPC
de 77 pacientes, de ellos en 8 (4.8%) no se obtuvieron los registros clínicos para
análisis ; considerándo lo anterior se incluyeron en el estudio 69 pacientes con 143
aislamientos de K. pneumoniae portadores del gen bla . Gráfico 1
KPC
41182 Aislamientos ( de 89
pacientes) de K.pneumoniae
con resistencia a
carbapenémicos entre 2014-
2016
Confirmación molecular para
género y especie Se excluyeron :8
confirmación como
K.oxytoca, 7
confirmación como
E.coli; en 2 no se logró
identificación
165 confirmación como
K.pneumoniae
Confirmación del gen bla KPC
en 152 aislamientos ( de 77
pacientes)
8 pacientes sin
registros clínicos
completos
Se incluyen 143 aislamientos
de Kp-KPC de 69 pacientes
Gráfico 7-1. Algoritmo para inclusión de pacientes y eventos por Kp-KPC.
La proporción de hombres y mujeres fue similar con una mediana de edad de 56
años (rango intercuartílico de 14 a 94 ). En el grupo de edades entre 40 a 59
años se encontraron 24 pacientes (34,8%). La principal causa para hospitalización
fue por indicación quirúrgica en 36 pacientes (52%), los procedimientos más
frecuentes se realizaron en tracto gastrointestinal en 17 (24%) y trasplante
hepático en 9(13%). La mediana del índice de Charlson fue 4 (rango 0-11). En
orden de frecuencia las comorbilidades reportadas fueron : tener algún tipo de
inmunosupresión (diferente a VIH, principalmente medicamentosa por uso de
esteroides u otros fármacos) en 29 (42%), diabetes mellitus en 19 (27%), cirrosis
en19 (27%) y cáncer en 19(27%) pacientes. Ninguno tuvo diagnóstico de VIH .
De los 19 pacientes con cáncer 15 tenían tumores de órganos sólidos y 4 de tipo
hematológico. Tabla 7-1
42Tabla 7-1. Características de la población con eventos por Kp-KPC
N=69
VARIABLE n % Mediana (Rango)
Género
Masculino 35 50.7
Femenino 34 49.2
Edad 56.4 (14-94) años
Menor de 20 años 5 7.2
Entre 20 y 39 años 9 13
Entre 40 y 59 años 24 34.8
Entre 60 y 79 años 20 29
Mayor a 80 años 11 15.9
Causa de Hospitalización
Causa quirúrgica 36 52
Cx Abdominal/ tracto
17 24.6
gastrointestinal
Trasplante hepático 9 13
Neurocirugía 4 5.8
Ortopedia 4 5.8
Cx cabeza y cuello 2 2.9
Causa médica 33 47.8
Comorbilidades
Inmunosupresión (no VIH) 29 42
Cirrosis 19 27
DM 19 27
Cancer 19 27
Organo sólido 15 21.7
Hematológico 4 5.8
Insuficiencia renal crónica 15 21
EPOC 6 8.7
Indice de Charlson 4 ( 0-11)
Antibiótico en el último año 66 95
Ingreso a UCI 45 65
APACHE 18 (5-26)
SOFA 6 (1-18)
Estancia hospitalaria 29 días (0-996)
Muerte 12 17
La mediana de tiempo entre el ingreso a la institución y la aparición de algún
aislamiento por Kp-KPC fue 8 días (rango -4 a 748); el rango negativo
corresponde a 1 paciente en quien el evento se documento 4 días previos al
ingreso en orina y fue hospitalizado con diagnóstico de infección urinaria. En 66
pacientes (95%) se tenía antecedente de haber recibido por lo menos 1 esquema
antibiótico en el último año siendo los más frecuentes penicilinas e inhibidores
43(62%) , carbapenémicos (44%) y cefalosporinas de cuarta generación (18%). En
45 pacientes (65%) que tuvieron algún ingreso a Unidad de cuidado intensivo
durante la hospitalización índice (mediana de ingresos 3), la mediana de APACHE
II (Acute physiology and chronic Health evaluation II) fue 18 (rango 5 a 26) y de
SOFA (Sequential organ failure assessment score) 6 (rango 1-18). Durante el
período de estudio fallecieron 12 pacientes (17%), 3 de estas muertes fueron
atribuibles a sepsis por Kp-KPC.
En el periodo de seguimiento se documentaron 143 eventos. La cantidad de
eventos por paciente en diferentes momentos de la hospitalización fueron: 1 en
42 (60%), 2 en 14( 20%) , 3 en 6(8.7%) y más de 4 en 7 (10%) pacientes. Tabla
7-2; la mediana de estancia hospitalaria para la cohorte general fue 29 días
(rango 0 a 996) y fue mayor para los pacientes que tuvieron más de un evento
(56 días) comparado con pacientes con solo un evento (25 días) (p menor 0.01).
Tabla 7-2 . Frecuencia de aislamientos por paciente
Numero de aislamientos n (pacientes) %
1 42 60.9
2 14 20.3
3 6 8.7
4 1 1.4
5 2 2.9
6 1 1.4
7 1 1.4
13 1 1.4
15 1 1.4
De la totalidad de los eventos 88 (61%) fueron clínicamente significativos , los
restantes correspondieron a algún tipo de colonización. La fuente principal de los
aislamientos fue orina en 66 muestras (46%), seguida de líquido o tejido
peritoneal en 20 (14%) , muestras respiratorias 17 (11.9%) y hemocultivos 15
(10,5%). El principal diagnóstico clínico fue Infección de vías urinarias en 42
casos (29%), seguido de bacteriuria asintomática en 23 (16%), bacteriemia en 17
(11%) y peritonitis en 14 (9.8%). De los eventos en los que se administró
antibiótico en 29 (32%) de los casos se administró terapia combinada de
44carbapenémico + polimixina, 19(21%) monoterapia con carbapenémico, 10(11%)
triple terapia con carbapenémico + aminoglucósido + fosfomicina; los demás
esquemas antibióticos se presentan en la Tabla 7-3 .
Tabla 7-3. Caracterización de los eventos por Kp-KPC
Eventos N= 143 n %
Fuente de la muestra
Orina 66 46.2
Liquido peritoneal u otra fuente abdominal 20 14
Muestra respiratoria 17 11.9
Sangre 15 10.5
Abscesos 5 3.5
LCR 2 1.4
Otros 18 12.6
Diagnóstico clínico de los eventos
Clínicamente significativos 88 60.8
Infección de vías urinarias 42 29,4
Bacteriemias 17 11,9
Foco gastrointestinal/abdominal/biliar 8 5,1
Asociada a cateter 6 4,9
Neutropenia febril 1 0,69
Bacteriemia primaria 1 0,69
Bacteriemia foco urinario 1 0,69
Peritonitis 14 9,8
Infección sitio operatorio órgano espacio 7 4,9
Neumonía 2 1,4
Colangitis 2 1,4
Osteomielitis 2 1,4
Ventriculitis 2 1,4
No significativos 55 38.4
Bacteriuria asintomática 23 16,1
Colonización respiratoria 12 8,4
Otra colonización 20 13,3
Tratamientol eventos significativos
Carbapenemico+polimixina 29 32
Carbapenemico 19 21
Carbapenemico+aminoglucósido+fosfomicina 10 11
Carbapenemico+fosfomicina 6 6,8
Carbapenemico+tigeciclina 4 4,5
Carbapenemico+aminoglucosido 3 3,4
Carbapenemico+tigeciclina+ciprofloxacina 3 3,4
Carbapenemico+tigeciclina+polimixina 3 3,4
Fosfomicina 2 2,2
Polimixina 2 2,2
Aminoglucósido+fosfomicina 2 2,2
Otros 5 5,6
457.2 Objetivo 2. Establecer las características microbiológicas y moleculares de los
aislamientos de Klebsiella pneumoniae portadores del gen bla .
KPC
En los perfiles de sensibilidad antibiótica, además de la resistencia a
carbapenémicos se encontró resistencia a ciprofloxacina en 90 eventos (62%),
amikacina en 53(36%) y gentamicina en 7 (4%); se tuvo información de perfil de
sensibilidad para colistina en 85 eventos y para tigeciclina en 60; en 7 de estos se
detectó resistencia a colistina y en 3 a tigecilcina.
En 92 aislamientos se realizó caracterización molecular para identificación de
tipo de KPC, 65 correspondían a KPC 2 (70%) y 27 a KPC 3 (30%). En los 143
eventos se buscaron genes para otras beta lactamasas ; en 53(37.1%) de ellos
se encontró el gen bla y en 38 (26,6%) bla Se identifico coproducción en
TEM CTX-M.
25 (17.5%) eventos que codificaron para TEM y CTX-M. No hubo amplificación de
genes GES, NDM, OXA-48 y VIM.
7.3 Objetivo 3 . Determinar la relación genética de los aislamientos por medio de PFGE
(Electroforesis campo pulsado) y MLST
Los análisis de PFGE identificaron 46 clones diferentes; los más frecuentes fueron
el 4, 19 y 37 identificados en 32 eventos (de 16 pacientes), 9 eventos (de 6
pacientes) y 8 eventos (de 8 pacientes), respectivamente. Los ST identificados en
los clones de mayor circulación (diversidad intra-institución) y en algunos eventos
procedentes de un mismo paciente (diversidad intra-paciente fueron: ST258 (clon
4), asociado al clon pandémico, ST504 (clon 17), ST485 (clon 19), ST4239 (clon
22 y 49), ST111 (clon 37), ST65 (clon 39), ST1407 (clon 23), ST54 (clon 41),
ST133 (clon 10), ST520 (clon 36), ST846 (clon 21), ST1310 (clon 24) y ST4959
(clon 18) Tabla 7-4 y gráfico 7-2
46Tabla 7-4 . Distribución clonal K. pneumoniae bla 2014-106
KPC
CLON 2014 2015 2016 TOTAL n(%) ST
1 3 0 0 3 (2.1%)
2 2 0 0 2 (1.4%)
3 1 0 0 1 (0.7%)
4 2 19 11 32(22.4%) 258
5 1 0 0 1 (0.7%)
6 1 0 0 1 (0.7%)
7 1 0 0 1 (0.7%)
8 1 0 0 1 (0.7%)
9 1 0 0 1 (0.7%)
10 2 1 0 3 (2.1%) 133
11 3 0 0 3 (2.1%)
12 1 0 0 1 (0.7%)
13 1 0 0 1 (0.7%)
14 1 1 0 2 (1.4%)
15 1 0 0 1 (0.7%)
16 2 0 0 2 (1.4%)
17 2 4 0 6 (4.2%) 2086
18 0 1 0 1 (0.7%) 4959
19 0 6 3 9 (6.3%) 485
20 0 1 0 1 (0.7%)
21 0 1 0 1 (0.7%) 846
22 0 10 0 10(6.9%) 4239
23 0 4 0 4(2.8%) 1407
24 0 1 2 3 (2.1%) 1310
25 0 1 0 1 (0.7%)
26 0 1 0 1 (0.7%)
27 0 1 0 1 (0.7%)
28 0 2 0 2 (1.4%)
29 0 1 0 1 (0.7%)
30 0 1 0 1 (0.7%)
31 0 0 1 1 (0.7%)
32 0 0 4 4(2.8%)
33 0 0 1 1 (0.7%)
34 0 0 1 1 (0.7%)
35 0 0 1 1 (0.7%)
36 0 0 4 4(2.8%) 520
37 0 0 8 8 (5.6%) 111
38 0 0 2 2 (1.4%)
39 0 0 6 6 (4.2%) 65
40 0 0 1 1 (0.7%)
41 0 0 3 3 (2.1%) 54
42 0 0 1 1 (0.7%)
43 0 0 1 1 (0.7%)
44 0 0 4 4(2.8%)
45 0 0 3 3 (2.1%)
46 0 0 1 1 (0.7%)
ND 0 0 5 5 (3.5%)
47Gráfico 7-2. Distribución por paciente de los clones de Klebsiella pneumoniae bla 2014-2016
KPC
(A) 2014, (B) 2015, (C) 2016. Se ilustra el número de paciente en la parte superior, el número del aislamiento, la imagen del
pulsotipo y el número de clon asignado.
4849De los 46 clones identificados, 25 solo se presentaron 1 vez; por su parte el clon
4 circulo durante los 3 años en la institución. De igual forma se identificó la
permanencia de 5 clones durante más de 1 año: los clones 10,14 ,17 en 2014 y
2015 y los clones 19 y 24 en 2015 y 2016. Gráfica 7-2.
Gráfico 7-3. Diversidad clonal en eventos por Kp-KPC 2014-2016
Se muestra la frecuencia de los principales clones circulando cada año en la institución. El clon 4
se identificó los 4 años, los clones 10,14 y 17 se identificaron en 2014 y 2015; los clones 19 y 24 se
identificaron en 2015 y 2016
50Al comparar las características de los pacientes ajustadas por tipo de clon ( 4 versus
no 4) se encontró como única diferencia significativa la edad con una mediana de 71
años en el primer grupo y de 52 años en el segundo ( p 0.03) Tabla7-5. De igual forma
se compararon los perfiles de resistencia de los eventos agrupados en las mismas
categorías y se encontró mayor frecuencia de resistencia a quinolonas (90% vs 54%,
p < 0,005), amikacina (34% vs 7%), p < 0,005 y gentamicina (90% vs 21%, p < 0,005)
en los eventos generados por Kp-KPC clon 4; la frecuencia de bla tuvo el
TEM y CTX-M
mismo comportamiento con diferencias significativas. Tabla 7-6
Tabla 7-5. Características clínicas de pacientes agrupadas por pulsotipo
Variable PULSOTIPO 4 n=16 Pulsotipo No 4 n=53 p
Edad (Mediana) 71 52 0,03
Sexo (Hombre/mujer) 8/8 28/25 0,9
Estancia hospitalaria (Mediana) 33 29 0,6
Ingreso UCI ( si/no) 9/7 35/18 0,47
Causa de Hospitalización (Médica/Quirúrgica) 10/6 23/30 0,18
Clínicamente significativo (Infección/colonización) 23/9 61/47 0,1
Charlson (mediana) 5 4 0,43
Muerte/vivo 2/14 10/43 0,55
Tabla 7-6. Resistencia antibiótica de los eventos y presencia de otras β -
lactamasas agrupada por pulsotipo
Número de eventos
Antibiótico Pulsotipo 4 n=32 Pulsotipo N0 4 n=111 p
con resistencia
Ciprofloxacina 90 29 (90%) 61(54%) Menor 0.05
Amikacina 19 11(34%) 8(7%) Menor 0.05
Gentamicina 53 29(90%) 24(21%) Menor 0.05
Polimixina 7 1(3%) 6(5%) 0.74
Tigeciclina 3 1(3%) 2 (1.8%) 0.16
Número de eventos
Otras beta lactamasas
con la BLEE
TEM 53 26 (81%) 27(25%) Menor 0.05
CTX-M 38 21(65%) 17(15%) Menor 0.05
De los 27 pacientes que presentaron más de un evento, en 14 el clon fue el
mismo , mientras que en 13 se documentó diversidad clonal; el promedio de
pulsotipos en eventos de un mismo sujeto fue 2.9 ( rango de 2 a 6). En uno de los
casos se identificaron 6 clones (17,22,36,37,39 y 19) en 13 eventos, con 8
ingresos hospitalarios en los 3 años y el clon que predomino fue el 22 (en 5 de los
13 aislamientos). Otro de los pacientes presento en 15 eventos 4 clones diferentes
51(4,17,21 y 23) que se registraron en una única hospitalización de 43 días, en este
el clon 4 predomino (10 de 15); fue el primero en registrase el día 9 de
hospitalización (posterior a la realización de trasplante hepático) y también el
último el día 43 cuando fallece. Esta diversidad clonal se resume en el Tabla 7-7.
En la gráfica 7-3 se representa el comportamiento multiclonal por paciente y la
evolución de los clones a lo largo de los 3 años.
Tabla 7-7. Multiclonalidad en eventos de un mismo paciente
Paciente Número de eventos Numero pulsotipos Pulsotipos identificados
7 13 6 17,22,36,37,39,19
8 15 4 4,17,21,23
9 5 3 10,18,19
10 7 3 19,26,41
11 3 2 31,32
16 4 3 4,32,36
19 5 4 4,37,19,36
20 2 2 4, 44
21 3 2 38,37
22 6 3 4,24,39
25 2 2 4,37
2 2 2 4,10
3 2 2 5,7
52Gráfico 7- 4. Diversidad clonal en pacientes y comportamiento de clones en los 3
años
7.4 Objetivo 4 y 5. Establecer la secuencia del genoma de los principales linajes
genéticos identificados en la población de aislamientos de Klebsiella pneumoniae
seleccionados y describir cambios genómicos de algunos aislamientos de K. pneumoniae
resistentes a carbapenémicos procedentes de un mismo paciente tras el uso de
diferentes tipos de antibióticos indicados para este tipo de infecciones.
La gráfica 7-5 muestra la evolución molecular (y genómica) de 15 eventos
proveniente de la paciente No 8 mencionada en el punto anterior quien ingresó
para realización de trasplante hepático por cirrosis biliar primaria. Se trató de una
mujer de 54 años quien tuvo una estancia hospitalaria de 43 días. En la totalidad
de su hospitalización se documentaron 16 eventos de diferentes fuentes por Kp-
KPC. El día 9 de estancia, posterior al trasplante, se informó el primer aislamiento
de Kp-KPC en orina; con diagnóstico de Infección urinaria se inició Meropenem y
53Fosfomicina trometamol. Luego de 10 días presentó 2 nuevos eventos: 1
procedente de una colección intraabdominal y otro nuevamente de orina. El día 30
de hospitalización se diagnosticó absceso hepático y en el cultivo del drenaje se
obtuvo otra Kp-KPC ; reinician Meropenem, asocian amikacina y fosfomicina
disódica (In vitro con sensibilidad a estos 2 antibióticos) . En adelante se
documentaron 12 nuevos eventos por Kp-KPC con este microorganismo ,
manteniéndose el mismo esquema antibiótico hasta el día 43 cuando fallece
(posterior a un retrasplante) . 15 de estas muestras se analizaron molecularmente;
se identificaron 4 clones diferentes: 4 (ST258), 17 (ST504), 21 (ST846) y 23
(ST1407). En 3 aislamientos se realizó secuenciación genómica (denominadas
33Kpn 9, 33Kpn12 y 33 Kpn 22); el primer aislamiento era clon 21 (ST 846), el
segundo clon 17 (ST 504) y el tercero clon 4 (ST 258). Aunque los cambios en los
perfiles de susceptibilidad de los aislamientos no fueron asociados a clones
específicos, en los eventos iniciales, los aislamientos presentaron susceptibilidad
frente a los aminoglucósidos y conforme continuó la presión selectiva a estos
antibióticos se presentó en forma progresiva un incremento en la concentración
mínima inhibitoria (CMI) hasta finalmente evidenciar aislamientos resistentes. Al
igual que el comportamiento global institucional el clon que predomino fue el ST
258 .
54Gráfica 7-5. Análisis genético, perfil de susceptibilidad y resistoma de los eventos
con clones de Kp-KPC comparados con la terapia antibiótica administrada durante
la estancia hospitalaria de la paciente 8 en 2015.
En la gráfica se ilustra a escala la línea de tiempo desde el ingreso de la paciente a la institución (día 0) hasta su deceso
(día 43), con la descripción de los eventos asociados a los aislamientos de Kp-KPC, los cuales se encuentran coloreados de
rojo, con su respectivo MLST. Con respecto al perfil de susceptibilidad, sólo se ilustraron los antibióticos a los que los
aislamientos fueron susceptibles, dentro de los recuadros se describe el valor en blanco, amarillo y rojo oscuro de las
concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) correspondientes al rango de los puntos de corte del CLSI: susceptible,
intermedio y resistente, respectivamente. En recuadros grises se describe el tipo de antibiótico empleado, la dosis
acumulada en gramos y los días de duración del tratamiento. Respecto al resistoma de los aislamientos secuenciados, los
genes presentes fueron organizados teniendo en cuenta el tipo de antibiótico y sombreados en naranja claro si tuvieron
ubicación plasmídica y en oscuro si fue cromosomal. Finalmente se muestra la conexión con otros pacientes que
presentaron el mimo clon y el número de días de diferencia.
55Los análisis detallados de la comparación del resistoma de los tres aislamientos
secuenciados, 33Kpn9 (ST846), 33Kpn12 (ST504) y 33Kpn22 (ST258), con la
terapia antibiótica seleccionada, mostraron que los aislamientos tenían
mecanismos de resistencia a todas las opciones terapéuticas empleadas, lo que
seguramente dificultó el éxito del tratamiento. En el caso de los β-lactámicos,
además del gen constitutivo de la especie bla y del gen bla previamente
SHV KPC
identificado fueron determinados genes de resistencia que codificaban para las
,
βLEE, TEM, CTX-M y OXA. En cuanto a la fosfomicina, antibiótico empleado
durante la mayoría de la estancia hospitalaria, se resalta para todos los
aislamientos la presencia del gen fosA en cromosoma, el cual codifica para una
glutatión S-transferasa dimérica dependiente de Mn2+ y K+ que cataliza la adición
de glutatión al anillo epóxido de la fosfomicina, inactivando al antibiótico[51]. Para
el caso de los aminoglicósidos, se identificaron una gran variedad de genes que
codificaban diferentes Aminoglucósido-acetiltransferasas (AAC), Aminoglucósido-
fosfotransferasas (APH) y Aminoglucósido-adeniltranferasas (AAD), sin embargo,
se observó que, durante la presión selectiva ejercida con la administración de la
amikacina, el número de genes de resistencia a estos antibióticos fue aumentando
en los aislamientos.
En la tabla 7-8 se muestran algunos parámetros obtenidos en el proceso de
secuenciación y el número de contigs obtenidos para cada uno de los
aislamientos, destacando que todos tuvieron extremos repetidos sugiriendo que
son estructuras circulares completas. La secuencia total de los cromosomas tuvo
una longitud promedio de 5 Mb y el número de plásmidos varió entre 2 y 5, con
tamaños variables (tabla 9).
56Tabla 7-8. Análisis general de los ensamblajes de los genomas de los tres
aislamientos identificados en el paciente 8
33Kpn9 33Kpn12 33Kpn22
Fase Variable
(ST846) (ST504) (ST258)
Pre- Número de lecturas 97.161 151.390 83.690
ensamblaje Número de bases 982’927.925 1.564’434.672 892'397.140
Número contigs 3 3 6
Longitud total (pb) 5’721.946 5’418.559 6’102.548
Longitud del contig más largo (pb) 5’464.147 5’285.656 5’501.536
Ensamblaje GC (%) 57.15 57.22 56.58
N50 5’464.147 5’285.656 5’501.536
L50 1 1 1
Número de N's por 100 Kbp 0 0 0
Post- Contigs con extremos repetidos 3 3 6
ensamblaje
Número de plásmidos completos 2 2 5
ST: tipo de secuencia. pb: pares de bases.
La secuenciación de los genomas permitió confirmar que los tres clones fueron
genéticamente diferentes, como había sido sugerido por los análisis de PFGE y
MLST, además albergaron estructuras plasmídicas diversas y diferentes de genes
de resistencia, incluyendo variantes diferentes del gen bla . Interesantemente,
KPC
este gen fue movilizado en diferentes plataformas genéticas, incluso el aislamiento
33Kpn22 (clon 4-ST258) contiene dos copias del gen (una cromosomal y otra
plasmídica), lo cual podría incrementar su MIC a carbapenémicos Tabla 7-9.
El análisis comparativo de las regiones adyacentes a bla en las secuencias de
KPC
estos tres aislamientos, permitió establecer inicialmente la presencia de dos
transposones de la familia Tn3, Tn3-like y Tn4401b, los cuales estuvieron
involucrados en la adquisición de este gen de resistencia (figura 3). El Tn3-like, es
un nuevo transposón putativo identificado en el plásmido p33Kpn12, el cual está
conformado por los genes tnpA y tnpR, los cuales codifican para la transposasa y
resolvasa, necesarios para la movilización del elemento genético con el gen
bla que curiosamente, está flanqueado por los genes truncados: ΔtnpA y
KPC-2
Δbla Por su parte, el Tn4401b se asoció a la variante del gen bla y fue
TEM. KPC-3
identificado tanto en el cromosoma como en el plásmido del aislamiento 33Kpn22,
57lo que sugiere una movilización de este transposón, ampliamente descrito en la
literatura, posiblemente desde el plásmido hacia el cromosoma, evento que
permite la estabilización del mecanismo de resistencia en la progenie de esta
bacteria.
Tabla 7-9. Determinación y localización de los genes de resistencia de 3
aislamientos representativos identificados en el paciente 8.
Aislamiento Clon (ST) Estructuras Características Genes de resistencia
33Kpn9 21 (ST846) Cromosoma 5’464.147 pb bla , fosA y oqxAB
SHV-1
bla , bla , bla , aac(6')-
p33Kpn9-KPC 132.884 pb, IncFII(K) CTX-M OXA-1 KPC-2
Ib-cr, drfA14, tetA y catB3
p33Kpn9-2 124.915 pb, IncFIB(K) -
Cromosoma 5’285.656 pb bla , fosA y oqxAB
SHV-42
33Kpn12 17 (ST504) bla , bla , aadA16,
TEM-1 CTX-M-15
p33Kpn12-1 116.955 pb, IncN aph(6)-Id, aac(6')-Ib-cr, drfA27,
sul1, sul2 y arr3
p33Kpn12-KPC 15,946 pb ColRNAI bla y bla
TEM-1 KPC-2
Cromosoma 5’501.536 pb bla , bla , fosA y oqxAB
SHV-182 KPC-3
p33Kpn22-1 196.777 pb IncF catA1
p33Kpn22-2 174.177 pb -
33Kpn22 (4b-ST258) bla , aac(6')-Ib (dos copias) y
p33Kpn22-3 107.862 pb, IncFII(Yp) SHV-12
dos aac(6')-Ib-cr (dos copias).
p33Kpn22-KPC 74.766 pb, IncI2(Δ) bla y bla
TEM1A KPC-3
aac(3)-IV, aac(6')-Ib, aadA1,
p33Kpn22-5 47.425 pb, IncR aadA2b, aph(4)-Ia, cmlA1, aac(6')-
Ib-cr y sul3
Con el fin de establecer si estos transposones fueron las plataformas que
promovieron el establecimiento de bla tanto en los plásmidos como en el
KPC
cromosoma de los aislamientos, dependiendo de cada caso, se hizo un análisis de
la duplicación del sitio diana [del inglés target site duplication (TSD)] asociado al
evento de transposición, mediante el cual se determinó una “huella” de cinco
nucleótidos generada por la movilización de los transposones en cada una de las
secuencias Gráfica 7-6.
58Gráfica7-6. Análisis genómico comparativo en eventos Kp-KPC de paciente 8
Se muestran las secuencias que albergaron el gen blaKPC en los aislamientos 33Kpn9, 33Kpn12 y 33Kpn22. La zona sombreada
entre las secuencias delimita las regiones de alineamiento con un porcentaje de identidad ≥ 73%. Las flechas azules indican los
marcos abiertos de lectura y, adyacente al gen de interés, se resaltan las regiones codificantes para proteínas hipotéticas (gris),
transposasas (púrpura), resolvasas (lila), genes de resistencia (rojo) y se delimita en un rectángulo morado a los transposones. Los
sitios de duplicación (TSD) generados por la transposición fueron ilustrados y delimitados en líneas punteadas para cada elemento
genético móvil. La gráfica cuenta con una línea de escala de 10.000 pb.
59Aunque las secuencias que albergaron al gen bla fueron diferentes, la
KPC
comparación de los plásmidos de los aislamientos 33Kpn9 y 33Kpn12, reveló dos
resultados muy interesantes. El primero fue asociado a la secuencia del
p33Kpn12-KPC, la cual se encontró 100% en el p33Kpn9-KPC, siendo 99,7%
idéntica, con un cambio asociado al gen tnpA del transposón Tn3-like putativo, el
cual se ubicó al inicio de la región en este último plásmido y fue truncado por una
IS26 (figura 3). Por otra parte, el p33Kpn9-KPC presentó también una cobertura
del 80% e identidad del 99,86% con el plásmido p33Kpn12-1 Gráfica 7-7.
Curiosamente, esta región de cobertura fue conservada con > 99,6% de identidad
con los plásmidos pG4584 y pKDO1 previamente identificados en Klebsiella
pneumoniae y K. quiasipneumoniae, respectivamente. Los cuales fueron
asociados únicamente a los genes de resistencia a β-lactámicos bla y bla
TEM-1 CTX-M-
Estos resultados sugieren que posiblemente el plásmido p33Kpn12-KPC se
15,
insertó en otro plásmido con la estructura conservada de los plásmidos p33Kpn12-
1, pG4584 y pKDO1, en el cual se movilizaron otros genes de resistencia
mediante las IS26, dando origen al plásmido p33Kpn9. Así mismo, el p33Kpn12-
KPC, posiblemente se movilizó del aislamiento 33Kpn9 (ST846) al 33Kpn12
(ST504), preservando la resistencia a carbapenémicos en diferentes clones de la
paciente 8.
60Gráfica 7-7 . Comparación de los plásmidos determinados en los aislamientos
33Kpn9 y 33Kpn12 con los plásmidos IncFII(K) previamente reportados.
La zona sombreada entre las secuencias delimita las regiones de alineamiento con un
porcentaje de identidad ≥ 73%. Las flechas azules indican los marcos abiertos de
lectura y, adyacente al gen de interés, se resaltan las regiones codificantes para
proteínas hipotéticas (gris), transposasas (púrpura), resolvasas (lila), genes de
resistencia (rojo) y se delimita en un rectángulo morado a los transposones. Los sitios
de duplicación (TSD) generados por la transposición fueron ilustrados y delimitados
en líneas punteadas para cada elemento genético móvil. La gráfica cuenta con una
línea de escala de 10.000 pb.
61Por otra parte, en el cromosoma del aislamiento 33Kpn22 (ST258), se determinó
que el Tn4401b fue el responsable de la movilización de bla . Sin embargo,
KPC-3
para establecer si la inserción de este gen de resistencia estuvo asociada
únicamente a este transposón, se realizó una comparación cromosomal de los
aislamientos de K. pneumoniae 33Kpn22 y R1761. Este análisis permitió
determinar que el Tn4401b fue el único elemento genético responsable de la
inserción cromosomal de bla el cualse movilizó dentro de un gen que codifica
KPC-3,
para una alcohol deshidrogenasa, el cual se encuentra flanqueado por los genes
treF y gstA Gráfica 7-8
Gráfica 7-8.Inserción del Tn4401b del plásmido IncI2(Δ) en el cromosoma del
aislamiento de Klebsiella pneumoniae 33Kpn22.
La zona sombreada entre las secuencias delimita las regiones de alineamiento con un
porcentaje de identidad ≥ 67%. Las flechas azules indican los marcos abiertos de
lectura y, adyacente al gen de interés, se resaltan las regiones codificantes para
transposasas (púrpura), resolvasas (lila), genes de resistencia (rojo) se delimita en un
rectángulo morado a los transposones. Los sitios de duplicación (TSD) generados por
la transposición fueron ilustrados y delimitados en líneas punteadas para cada
elemento genético móvil. La gráfica cuenta con una línea de escala de 10.000 pb.
.
La transposición replicativa del Tn4401b en el cromosoma del aislamiento
33Kpn22 se originó probablemente a partir de la copia de este transposón en el
plásmido p33Kpn22-KPC. La secuencia de este plásmido albergando al Tn4401b
ya ha sido descrita previamente en K. pneumonie en plásmidos de los
aislamientos CAV1596, DMC1097, BK15692 y AR00112, los cuales presentaron
una cobertura e identidad ≥ 99% con respecto al p33Kpn22-KPC Gráfica 7-7.
62Estos resultados, sumados a los descritos previamente en este aislamiento ST258
nos sugieren que la co-circulación de diferentes plásmidos en la misma bacteria,
como fue el caso de 33Kpn22, quien albergó a cinco plásmidos con múltiples
genes de resistencia, incluyendo a bla el cual fue movilizado al cromosoma
KPC-3,
mediante elementos genéticos móviles como el Tn4401b, le brindan mayor
capacidad de adaptación y selección frente a los diferentes tratamientos
antibióticos empleados, promoviendo la frecuencia de aparición de este clon en las
infecciones por K. pneumoniae.
En la gráfica 7-9 se presenta el paciente 10 , quien tuvo una estancia hospitalaria
prolongada ( 691 días). Se trata de una de mujer de 63 años atendida durante el
2015 y 2016 con diagnóstico de carcinoma gástrico en quien se realizó
reconstrucción gastroyeyunal y presentó múltiples complicaciones, fístulas
entéricas y peritonitis, con requerimiento de lavados peritoneales a repetición, falla
intestinal secundaria y necesidad de nutrición parenteral exclusiva; presentó
múltiples complicaciones infecciosas con diversos aislamientos microbiológicos ;
falleció por sepsis de origen abdominal con disfunción multiorgánica asociada.
Durante su estancia se documentaron siete eventos con aislamientos de Kp-KPC,
el primero de ellos en el día 93 de hospitalización. Tres aislamientos fueron
asociados al clon 19 (ST485), uno al clon 26 y los dos últimos al clon 41 (ST54).
No se logró obtener la relación genética del quinto aislamiento, por lo cual este fue
marcado como no determinado (ND). Al analizar el tratamiento antibiótico recibido,
no se observó una selección de un clon en particular como en el caso anterior, de
igual manera, la paciente no tuvo clones asociados al ST258. Teniendo en cuenta
los cambios del perfil de susceptibilidad en los aislamientos, no se observaron
diferencias asociadas a clones particulares, sin embargo, en el clon 19 se
encontró un incremento de la CMI a colistina, posterior a altas dosis consecutivas
con polimixina B .
63Gráfica 7-9. Diversidad clonal en eventos del paciente 10
En la gráfica se ilustra a escala la línea de tiempo desde el ingreso de la paciente a la institución (día 0) hasta su deceso (día 691), con la descripción de los eventos asociados a los
aislamientos de Kp-KPC, los cuales se encuentran coloreados de rojo, con su respectivo MLST. Con respecto al perfil de susceptibilidad, sólo se ilustraron los antibióticos a los que fueron
susceptibles, dentro de los recuadros se describe el valor en blanco, amarillo y rojo oscuro de las concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) correspondientes al rango de los puntos de corte
del CLSI: susceptible, intermedio y resistente, respectivamente. En recuadros grises se describe el tipo de antibiótico empleado, la dosis acumulada en gramos y los días de duración del
tratamiento. Finalmente se muestra la conexión con otros pacientes que presentaron el mimo clon y el número de días de diferencia.
648. DISCUSIÓN
Los resultados del estudio muestran el comportamiento policlonal de eventos por
Kp-KPC en el período post endémico en una institución y en diferentes
aislamientos de un mismo paciente, así como cambios en la epidemiología
molecular de este microorganismo. El clon ST258 de K. pneumoniae es el más
frecuente entre los clones resistentes a carbapenémicos y el de mayor
diseminación a nivel mundial [30], fue el primero reportado en Colombia y el más
frecuente; sin embargo en la actualidad se informan otros tipos de clones con
gran variabilidad genética y diferencias en perfiles de resistencia; Ocampo [14] et
al realizaron una descripción clínica y de vigilancia epidemiológica molecular en
hospitales de Medellín en 2 años. Se incluyeron datos para 193 pacientes con
infecciones por K. pneumoniae con resistencia a carbapenémicos, de ellos solo
37,8% correspondieron al CG 258, el 62% restante fueron clones diferentes entre
ellos ST14, ST 17, ST 23, ST 140, ST 307, ST 147. Este fenómeno se presenta en
otros países, como Italia donde Bonura et al lo reportan desde el 2014; en 94
muestras de K. pneumoniae con resistencia a carbapenémicos y gen bla
KPC
identificaron 10 ST diferentes, el ST 258 correspondió al 40%, el ST 307 al 29% el
y ST 273 al 18% [52]. Dortet et al en Francia en 2018 [15] , informaron 15 clones
diferentes de Kp-KPC y solo el 12% correspondían al GC 258 (ST 258 y ST 512) ;
los más frecuentes fueron ST 307, ST 147 y ST 13.
El clon 4-ST258 fue identificado en los 3 años del periodo de estudio, lo que
confirma su amplia capacidad de diseminación y persistencia como ha sido
descrito en estudios globales y asociado a la producción de otras
carbapenemasas como NDM y VIM. Notablemente, los clones 4-ST258, 39-ST65
y el 10-ST133 son los únicos que han sido reportados previamente asociados al
gen bla ; el ST65 en China y Argentina; y el ST133 descrito en Grecia . En
KPC
América se han descrito tres ST, en México se reportó el ST846 portador de
bla el cual ya había sido asociado a esta carbapenemasa previamente en
NDM,
China y en Estados Unidos se han determinado los tipos de secuencia 111 y 485,
;
65los cuales han sido asociados a aislamientos no productores de carbapenemasas
[53] [54]. Por su parte, el ST54 ha sido identificado en España y China, siendo
relacionado con las metalo-β-lactamasas (MβL) NDM, IMP y VIM [54, 55]. Por otro
lado en Colombia no se han reportado aislamientos de los ST520, ST1310,
ST1407, ST4239, ST4959 lo cual brinda evidencia de la circulación de nuevos
clones portadores de bla .
KPC
Esta diversidad clonal podría estar relacionada con fenómenos de presión
selectiva y se deben considerar de importancia epidemiológica para los programas
de control de infecciones. Los cambios en la epidemiología molecular también se
sugieren por la mayor frecuencia de KPC2 respecto a KPC3· en la serie, a
diferencia de datos publicados en años anteriores para Bogotá [20], sin embargo
se deben analizar con cautela por tratarse de una sola institución.
La diversidad clonal en eventos procedentes de un mismo sujeto es un fenómeno
que poco se ha reportado. Un individuo que ha recibido múltiples ciclos
antibióticos y que haya presentado un proceso por Kp-KPC puede permanecer
colonizado hasta por un año [22]; en la serie encontramos pacientes con estas
características y que presentaron múltiples eventos por Kp-KPC en la misma o en
diferentes hospitalizaciones. Desde el punto de vista clínico cada evento es
interpretado como un mismo fenómeno, pero los análisis moleculares
demuestran comportamientos genéticos diferenciales que se traducen en la
expresión variable de resistencia y probablemente en el éxito o fracaso a la terapia
antibiótica. Naas et al describen la evolución genómica de un aislamiento de K.
pneumoniae productora de carbapenemasa ST 258 en un paciente que resultó
infectado posterior a un procedimiento endoscópico. En un período de 4.5 años se
documentaron 17 aislamientos por Kp-KPC. Se realizó secuenciación genómica
de todos los eventos; los análisis filogenéticos demostraron que todas las
muestras correspondieron al Clado I; el sujeto estuvo expuesto a diversos
antibióticos lo que generó acumulación de mutaciones, pero sin adquisición de
nuevos genes y con un plásmido que fue estable en el período de seguimiento; los
cambios genéticos se presentaron a nivel cromosomal. Jousset et al reportan el
66comportamiento molecular de 12 muestras de K. pneumoniae de un mismo
paciente en 2 meses con técnica de secuenciación genómica; detectaron co-
existencia de cepas sensibles y resistentes a carbapenémicos, todas
pertenecientes al clon ST 512 y que solo se diferenciaban por la presencia o no
del transposón 4401a (portador del gen bla ) [56]. Se sugiere que la
KPC
identificación de este fenómeno con métodos moleculares podría ser de
importancia para la formulación de antimicrobianos y para el estudio de botes en
una institución.
Si bien esta serie muestra gran diversidad clonal en Kp-KPC , el ST 258 sigue
siendo el más prevalente y los factores de riesgo para infección y colonización por
estos microorganismos no se han modificado y se conocen ampliamente en la
literatura e incluyen uso previo de antibiótico, exposición a los ambientes
hospitalarios, estancia en unidad de cuidado intensivo, trasplante de órgano,
inmunosupresión por esteroides y uso de dispositivos médicos invasivos [57]. La
mediana de edad reportada en otros estudios como el CRAKLE es mayor en
comparación a nuestra serie (70 Vs 56 años) [30], pero la prevalencia de
inmunosupresión, dada principalmente por trasplante de órgano sólido ( hígado) y
cáncer muestran la importancia de un huésped susceptible [58]. El éxito para la
diseminación y persistencia del ST 258 se ha atribuido al transposón Tn 4401a
[31, 39] el cual tiene la capacidad de pasar a plásmidos (que sufren procesos
frecuentes de conjugación) pero al costo de perder varios factores de virulencia
como los genes de antígenos capsulares K1, K2 y K5, genes de aerobactina y el
gen regulador del genotipo mucoide rmpA. La importancia desde el punto de vista
clínico en la diferenciación del tipo de ST aún no ha podido ser definida, algunos
autores sugieren desenlaces diferentes; Marchaim et al en un reporte breve
publicado en 2016 compararon 67 pacientes con aislamiento de K. pneumoniae
con resistencia a carbapenémicos y ST 258 con 7 pacientes con ST diferentes;
por el bajo número de muestra no se encontraron diferencias significativas, sin
embargo el promedio de edad fue ligeramente mayor en el grupo de pacientes con
ST 258 (65 Vs 63 años) y la resistencia a otros grupos de antibióticos como
aminoglucósidos y quinolonas tuvo mayor frecuencia (100% Vs 50% y 98% Vs
6760% respectivamente) [59]; Ocampo reporto resultados similares [14] En nuestra
serie, al ajustar por tipo de clon los pacientes con por lo menos un evento por
pulsotipo 4 tuvieron una media de edad mayor al comparase con aquellos que
presentaron otros pulsotipos (72 vs 52 años), lo que sugiere comportamiento
clínicos diferenciales y probablemente afectación a un grupo de pacientes con
mayor vulnerabilidad. Se encontraron además diferencias estadísticamente
significativas en la frecuencia de resistencia a Ciprofloxacina, amikacina y
gentamicina en concordancia con los autores citados. Ocampo reporta
coexistencia enzimática con TEM-1 ( 45%), CTX-M 15 (22%) y SHV -12 (17%),
similar a los datos presentados ; en nuestra serie al ajustar por el tipo de clon
resultaron más frecuentes TEM y CTX-M en aquellos eventos con pulsotipo 4.
Estos datos apoyan la teoría de una ventaja selectiva del ST 258 genética
mediada por el transposón y por genotipos particulares de multiresistencia [60].
En la población analizada nuevamente se evidencia la alta frecuencia de
colonización por Kp-KPC y la persistencia de la misma a lo largo del tiempo a
pesar de los múltiples ciclos de antibióticos que reciben los pacientes; las tasas de
colonización nasofarígea por K. pneumoniae se han informado entre 3 a 15% y
son mayores en adultos que en niños; la colonización en el tracto gastrointestinal
se ha reportado en 35% pero está frecuencia se incrementa hasta el 77% en
pacientes hospitalizados y quienes han recibido tratamiento antibiótico previo,
ambas situaciones comunes en la población descrita [21]. La persistencia en la
colonización por cepas de Kp-KPC puede prolongarse incluso más de un año[22].
Considerando que para el tiempo del estudio no se realizaba tamizaje para Kp-
KPC rutinariamente en la institución, no es posible establecer el estado de
colonización de los sujetos, sin embargo la mediana de tiempo para aparición del
primer evento ( 8 días) y los factores de riesgo basales sugieren que muchos de
ellos se encontraban colonizados al momento del ingreso, factores que se deben
considerar en la toma de decisiones para control de infecciones.
Los análisis particulares de los pacientes muestran que son necesarias pruebas
genéticas más específicas para direccionar un mejor tratamiento de los pacientes
68en la práctica, puesto que en algunos casos las infecciones pueden ser causadas
al mismo tiempo por uno o más clones de Klebsiella pneumoniae, los cuales son
muchas veces imperceptibles tanto para el profesional del Laboratorio como por el
médico que observa el análisis del antibiograma sin cambios específicos; lo que
sumado al tratamiento antibiótico administrado puede generar una selección
particular de clones más resistentes.
A nuestro conocimiento el reporte de multiclonalidad de Kp-KPC en muestras
provenientes de un mismo paciente es el primero que se hace en el país; como
debilidades del estudio por su naturaleza retrospectiva, en algunos casos no se
contó con información completa de registros clínicos, la información de
susceptibilidad antibiótica (específicamente para colistina y tigeciclina) no estuvo
disponible en todos los eventos y no se realizaron ST para todos los clones.
699. CONCLUSIONES
1. La población afectada por Kp-KPC en esta serie comparte los factores de
riesgo reportados en la literatura para este tipo de infecciones; es de anotar
que comparada con otros estudios la mediana de edad resulta menor, sin
embargo, tenían altos índices de comorbilidad e inmunosupresión (en su
mayoría farmacológica, por trasplante hepático) y cáncer
2. Existe multiclonalidad intrainstitucional en eventos por Kp-KPC; si bien el
más frecuente continúa siendo el ST 258, se reportan clones adicionales con
potencial de persistencia a lo largo del tiempo. Esta multiclonalidad también se
observa en eventos procedentes de un mismo paciente
3. Los pacientes con eventos por Kp-KPC con clon 4 (ST 258) en esta serie
tuvieron medianas de edad mayores en comparación a aquellos con otro tipo
de clon; adicionalmente estos eventos tuvieron mayor frecuencia de resistencia
a otros grupos de antibióticos; esto sugiere comportamientos clínicos y
microbiológicos diferenciales.
4. La vigilancia molecular en asilamientos por Kp-KPC se convierte en una
herramienta no solo de tipo epidemiológico, sino con potencial en la toma de
decisiones terapéuticas en sospecha de infecciones por clones multirresistente.
7010. ANEXOS
ANEXO 1. Algoritmo de trabajo
71ANEXO 2. Avales comité de ética
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