Evaluación de la capacidad de diferenciación de células de sangre periférica hacia el linaje osteoclástico en diferentes tiempos de aplicación de fuerza tensil
Autor: Montero Córdoba, María Alejandra
Asesor: Guerrero Fonseca, Carlos Arturo (Thesis advisor)
Fecha: 2016-05-10
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Células mononucleares de sangre periférica (CMNSP) fueron aisladas mediante un gradiente de Fycoll-Hypaque y estimuladas con 10 µg/ml de fitohemaglutinina (PHA) durante 72 h en medio de cultivo RPMI 1640 y suero fetal bovino al 10%, con el objetivo de evaluar la capacidad de actividad resortiva. Un grupo de células fue sometido a fuerzas de 5,28g/cm2 y otro grupo de células fueron fusionadas con Polietilenglicol (PEG), ambos evaluados en un periodo de 3, 5 y 7 días. Las células fueron sembradas sobre láminas de hueso cortical bovino estériles de  aproximadamente 6 mm2 x 0.5 de profundidad tratadas o no con N-acetilcisteína (NAC). Para esto, se dividieron en 6 grupos de la siguiente manera: 1. Células no fusionadas, no tratadas con fuerza (-fu, -F) 2. Células no fusionadas, no tratadas con fuerza + NAC (-fu, -F+NAC). 3. Células no fusionadas + fuerza. (F) 4.Células no fusionadas, + fuerza+ NAC (F+NAC) 5. Células fusionadas con PEG (PEG) 6. Células fusionadas con PEG + NAC (PEG + NAC). Las células se fijaron con metanol ácido acético en proporción 1:3; a los 3, 5 y 7 días de cultivo, luego se procedió a evaluar la actividad de la enzima tartrato resistente (TRAP).  Posteriormente se identificó la proteína de membrana utilizada como marcador de osteoclastos: Integrina ß3; por ultimo las células se retiraron de la lámina ósea y se evaluó la actividad resortiva sobre el hueso donde se cultivaron las células. Se  encontró que al fusionar células con PEG, o aplicar una fuerza a células no fusionadas, se inducen marcadores característicos de células osteoclásticas y actividad resortiva, también de determino que NAC es un potente inhibidor de las actividades relacionadas con células resortivas.

1
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS DE
SANGRE PERIFÉRICA HACIA EL LINAJE OSTEOCLÁSTICO EN DIFERENTES
TIEMPOS DE APLICACIÓN DE FUERZA TENSIL.
Presentado por:
María Alejandra Montero Córdoba
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE ODONTOLOGIA
POSGRADO DE ORTODONCIA Y ORTOPEDIA MAXILAR
BOGOTA D.C
20162
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE DIFERENCIACIÓN DE CÉLULAS DE
SANGRE PERIFÉRICA HACIA EL LINAJE OSTEOCLÁSTICO EN DIFERENTES
TIEMPOS DE APLICACIÓN DE FUERZA TENSIL.
María Alejandra Montero Córdoba
Trabajo final presentado para optar por el título de Especialista en
Ortodoncia y Ortopedia Maxilar
Director:
Dra. NATALIA CARRILLO MENDIGAÑO
Msc
Profesor Auxiliar
Facultad de Odontología
Codirector
Dr. CARLOS ARTURO GUERRERO
M.D. Msc. PhD
Profesor Titular
Facultad de Medicina
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE ODONTOLOGIA
POSGRADO DE ORTODONCIA Y ORTOPEDIA MAXILAR
BOGOTA D.C
201634
AGRADECIMIENTOS
Agradezco A Dios, por siempre estar conmigo en cada paso que doy, por
fortalecer mi corazón e iluminar mi mente y por haber puesto en mi camino a
aquellas personas que han sido mi soporte y compañía durante todo el posgrado
A mis padres por ser el pilar fundamental en todo lo que soy, por su incondicional
apoyo perfectamente mantenido a través del tiempo
A mis profesores: Carlos Guerrero por sus enseñanzas y su disposición durante
todo el proceso de la fase experimental y a la Dra. Natalia Carrillo, por su apoyo,
su motivación, por su constante interés y acompañamiento en el desarrollo de
este trabajo.5
CONTENIDO
LISTA DE IMAGENES ................................................................................................................................... 7
LISTA DE TABLAS ........................................................................................................................................ 8
RESUMEN ...................................................................................................................................................... 10
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................... 11
2. JUSTIFICACIÓN ................................................................................................................................... 12
3. MARCO TEÓRICO ................................................................................................................................ 13
3.1 CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS ............................................................................. 13
3.2 HEMATOPOYESIS ...................................................................................................................... 13
3.3 CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA .............................................. 15
3.4 OSTEOCLASTOS ....................................................................................................................... 16
3.5 MARCADORES DE OSTEOCLASTOS ................................................................................... 19
3.5.1 TRAP ......................................................................................................................................... 19
3.5.2 ADAM 12................................................................................................................................... 20
3.5.3 MMP9 ........................................................................................................................................ 21
3.5.4 ATPasa VACUOLAR .............................................................................................................. 22
3.5.5 DC-STAM .................................................................................................................................. 23
3.5.6 INTEGRINA αβ3 ...................................................................................................................... 23
3.6 RESORSIÓN ÓSEA .................................................................................................................... 24
3.7 MODELO PARA GENERAR CÉLULAS CON ACTIVIDAD OSTEOCLÁSTICA .............. 25
3.8 PEG ................................................................................................................................................ 26
3.9 NAC ................................................................................................................................................ 27
4. OBJETIVOS ........................................................................................................................................... 29
4.1 OBJETICO GENERAL ............................................................................................................... 29
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS ...................................................................................................... 29
5. MATERIALES Y METODOS ............................................................................................................... 30
5.1 TIPO DE ESTUDIO: Experimental, in vitro ............................................................................ 30
5.2 MUESTRA: CELULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFERICA (CMSP) ....... 30
5.3 DIVISIÓN DE LA MUESTRA ..................................................................................................... 30
5.4 CULTIVO DE CELULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFERICA ................... 31
5.5 FUSION CELULAR CON PEG .................................................................................................. 31
5.6 LAMINAS DE HUESO ................................................................................................................ 31
5.7 SIEMBRA ...................................................................................................................................... 326
5.8 APLICACIÓN DE FUERZA ........................................................................................................ 33
5.9 FIJACION ...................................................................................................................................... 33
5.10 DETERMINACIÓN DE LA FOSFATASA ÁCIDA RESISTENTE AL TARTRATO (TRAP).. 33
5.11 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA ............................................................................... 34
5.12 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA .................................................................. 35
5.13 ANALISIS ESTADISTICO .......................................................................................................... 35
6. RESULTADOS ...................................................................................................................................... 36
6.11 EXPRESION DE LA ENZIMA TRAP AL 3, 5 Y 7 DIA DE CULTIVO .................................. 36
6.12 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA AL 3, 5 Y 7 DIA DE CULTIVO ............ 42
6.13 EVALUACION DE LA EXPRESIÓN DEL MARCADOR OSTEOCLASTICO INTEGRINA
B3 AL 3, 5 Y 7 DIA DE CULTIVO. ......................................................................................................... 47
7. DISCUSION ............................................................................................................................................ 48
8. CONCLUSIONES .................................................................................................................................. 53
9. RECOMENDACIONES ......................................................................................................................... 54
10. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................................................ 557
LISTA DE IMAGENES
Imagen 1
Láminas óseas representativas de células con tinción TRAP positivas, grupo PEG;
grupo F; grupo PEG+NAC; grupo F+NAC grupo (-fu, -F)
Imagen 2.
Microfotografías de tinción Coomassie para evaluar lagunas de resorción, grupo
PEG; grupo PEG +NAC, grupo F; grupo F+NAC; grupo (–fu,-F)
Imagen 3
Microfotografías representativas de inmunofluorescencia, grupo F; grupo F+NAC;
grupo (–fu,-F)8
LISTA DE TABLAS
Tabla 1
Cantidad de células TRAP positivas observadas en los grupos F y grupos control
negativo evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo
Tabla 2
Cantidad de células TRAP positivas observadas en los grupos PEG y grupos
control negativo evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo
Tabla 3
Cantidad de células TRAP positivas, observadas en los grupos f y grupos PEG
evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo.
Tabla 4.
Cantidad de células TRAP positivas, en los grupos F evaluadas al 3, 5 y 7 día de
cultivo.
Tabla 5
Cantidad de células TRAP positivas, en los grupos PEG evaluadas al 3, 5 y 7 día
de cultivo
Tabla 6
Cantidad de células TRAP positivas en los grupos F y los grupos (F+NAC) al 3, 5
y 7 día de cultivo
Tabla 7
Cantidad de células TRAP positivas en los grupos PEG y los grupos (PEG+NAC)
al 3, 5 y 7 día de cultivo
Tabla 8
Cantidad de células TRAP positivas en los grupos PAG+NAC, y los grupos control
negativo al 3, 5 y 7 día de cultivo
Tabla 9
Cantidad de células TRAP positivas en los grupos F+NAC, y los grupos control
negativo al 3, 5 y 7 día de cultivo
Tabla 10
Número de lagunas de reabsorción evaluadas en los grupos PEG y grupo control
negativo al 3, 5 y 7 día9
Tabla 11
Número de lagunas de reabsorción evaluadas en los grupos F y grupo control
negativo al 3, 5 y 7 día
Tabla 12
Número de lagunas de reabsorción en los grupos F y grupos tratadas con PEG
evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo
Tabla 13
Número de lagunas de reabsorción en los grupos F y los grupos F+NAC al 3, 5 y 7
día de cultivo
Tabla 14
Número de lagunas de reabsorción en los grupos PEG y los grupos PEG+NAC al
3, 5 y 7 día de cultivo
Tabla 15
Número de lagunas de reabsorción, en los grupos F evaluadas al 3, 5 y 7 día de
cultivo.
Tabla 16
Número de lagunas de reabsorción, en los grupos PEG evaluadas al 3, 5 y 7 día
de cultivo.10
RESUMEN
Células mononucleares de sangre periférica (CMNSP) fueron aisladas mediante
un gradiente de Fycoll-Hypaque y estimuladas con 10 µg/ml de fitohemaglutinina
(PHA) durante 72 h en medio de cultivo RPMI 1640 y suero fetal bovino al 10%,
con el objetivo de evaluar la capacidad de actividad resortiva. Un grupo de células
fue sometido a fuerzas de 5,28g/cm2 y otro grupo de células fueron fusionadas con
Polietilenglicol (PEG), ambos evaluados en un periodo de 3, 5 y 7 días. Las
células fueron sembradas sobre láminas de hueso cortical bovino estériles de
aproximadamente 6 mm2 x 0.5 de profundidad tratadas o no con N-acetilcisteína
(NAC). Para esto, se dividieron en 6 grupos de la siguiente manera: 1. Células no
fusionadas, no tratadas con fuerza (-fu, -F) 2. Células no fusionadas, no tratadas
con fuerza + NAC (-fu, -F+NAC). 3. Células no fusionadas + fuerza. (F) 4.Células
no fusionadas, + fuerza+ NAC (F+NAC) 5. Células fusionadas con PEG (PEG) 6.
Células fusionadas con PEG + NAC (PEG + NAC). Las células se fijaron con
metanol ácido acético en proporción 1:3; a los 3, 5 y 7 días de cultivo, luego se
procedió a evaluar la actividad de la enzima tartrato resistente (TRAP).
Posteriormente se identificó la proteína de membrana utilizada como marcador de
osteoclastos: Integrina ß3; por ultimo las células se retiraron de la lámina ósea y
se evaluó la actividad resortiva sobre el hueso donde se cultivaron las células. Se
encontró que al fusionar células con PEG, o aplicar una fuerza a células no
fusionadas, se inducen marcadores característicos de células osteoclásticas y
actividad resortiva, también de determino que NAC es un potente inhibidor de las
actividades relacionadas con células resortivas.11
1. INTRODUCCIÓN
El mantenimiento de la homeostasis ósea es crucial para el adecuado desarrollo
del esqueleto durante toda la vida, éste depende de la interacción continua entre
los osteoclastos, que degradan o reabsorben el hueso, y los osteoblastos, que
forman hueso. Los orígenes de estas células están bien establecidos, los
osteoblastos se derivan de células madre mesenquimales, mientras los
osteoclastos son células altamente especializadas, multinucleadas que se derivan
de las células madre hematopoyéticas, específicamente a partir de células del
linaje monocito-macrófago(1). Estos dos tipos celulares, se encuentran muy
relacionados con el movimiento dental ortodóntico, ya que una vez aplicada una
fuerza ortodóntica sobre el diente se desencadenan una serie de fenómenos que
activan el proceso de remodelado óseo involucrando eventos de resorción y
aposición ósea lo que permite el desplazamiento dental.
Se han desarrollado varios modelos para obtener osteoclastos utilizando una
variedad de células dentro de las que están: células mononucleares de sangre
periférica, (CMNSP) y células madre embrionarias(1)(2)(3)(4), si bien en estos
sistemas de estudio la generación de osteoclastos ha sido exitosa, el uso de
diversos factores de estimulación y diferenciación osteoclástica elevan los costos
para obtener este tipo células lo que limita el estudio básico de la resorción ósea.
Otros sistemas que involucran factores mecánicos también han sido utilizados
para lograr la diferenciación de osteoclastos; se ha reportado en la literatura que
ante un estímulo mecánico las células del ligamento periodontal (LP) apoyan la
osteoclastogénesis(5). Estudios realizados en el laboratorio de Biología Molecular
de Virus de la Facultad de Medicina de la UNAL sugieren que células
fibroblastoides de origen gingival, células mononucleares de sangre periférica y
células de origen monocito-macrófago sometidas a fuerzas y fusionadas con
polietilenglicol (PEG) presentan actividad osteoclástica(6)(7)(8).
Ante la aplicación de un estímulo mecánico sobre el diente se generan factores
que estimulan la diferenciación osteoclástica en el LP permitiendo el movimiento
dental, pero aún no está bien establecido el origen exacto de estas células, se
sugiere que pueden derivar de la activación de osteoclastos ya maduros presentes
en el LP o de la proliferación de células madre de tejidos hematopoyéticos
distantes o de las células madre locales(9), también se ha indicado que la tasa de
reclutamiento o la diferenciación de osteoclastos podría depender del régimen de
la fuerza y del nivel de fuerza aplicada sobre el diente(10)
Por lo tanto es importante evaluar si la diferenciación de las células
mononucleares de sangre periférica (CMNSP) hacia el linaje osteoclástico es
constante o presenta alguna modificación al aplicar una fuerza y al fusionarlas con
PEG en diferentes periodos de tiempo, obteniendo un modelo sencillo y fácil de
reproducir para el estudio de la actividad resortiva semejante al que puede ocurrir
en un tratamiento ortodóntico.12
2. JUSTIFICACIÓN
Las fuerzas ortodónticas aplicadas sobre el diente producen factores locales que
permiten la activación de procesos de remodelado del ligamento periodontal y del
hueso alveolar. Dentro de estos procesos la diferenciación de los osteoclastos es
un paso fundamental e indispensable para que el movimiento dental ortodóntico
tenga lugar ya que estas son las células encargadas de la reabsorción de la matriz
ósea(11). Es por esto que tener un modelo de estudio de los osteoclastos nos
permitirá ampliar el conocimiento de los fenómenos biológicos que se producen
durante el movimiento dental y las variables que lo pueden modificar;
adicionalmente podemos ampliar los conocimientos que involucran el proceso de
reabsorción dental, evento indeseado durante el movimiento ortodóntico y también
nos permitirá reconocer mecanismos de inhibición de la actividad resortiva, con lo
cual se conseguiría dar mayor estabilidad y disminuir la recidiva luego del
tratamiento ortodóntico. Dentro de este modelo de estudio, entender el
comportamiento celular frente a diferentes tiempos de aplicación de la fuerza nos
permitirá tener mayores indicios acerca de los efectos que las fuerzas ortodónticas
ejercen sobre los osteoclastos y de esta forma progresar en el entendimiento de
los eventos celulares producidos por la acción de las fuerzas ortodónticas.13
3. MARCO TEÓRICO
3.1 CÉLULAS MADRE HEMATOPOYÉTICAS
Las células madre hematopoyéticas (CMH) se caracterizan por su gran capacidad
de auto-renovación y su pluripotencialidad, a partir de estas células se origina
todos los tipos de células sanguíneas maduras mediante el proceso de
hematopoyesis. Este proceso hematopoyético, tiene lugar principalmente en la
médula ósea donde las CMH residen en microambientes especializados (nichos)
que proporcionan los factores solubles necesarios para definir su quiescencia,
renovación o diferenciación (15)
Durante la última década, se ha considerado la existencia de al menos dos
subcompartimentos en el nicho de las CMH; el nicho endosteal, que se ha
propuesto como una fuente de factores importantes para la quiescencia de las
CMH, mientras que el nicho sinusoidal vascular ha sido implicado en el
mantenimiento y regeneración de las CMH. Actualmente, los únicos métodos
fiables para detectar estas células siguen dependiendo de la demostración de sus
propiedades regenerativas, en lugar de métodos más directos. Esto es debido, en
parte, a la inestabilidad de cualquier fenotipo hasta ahora identificado así como el
reconocimiento de la heterogeneidad molecular y funcional de las CMH en
ensayos de trasplante(13)
En cuanto a sus aplicaciones, las CMH fueron las primeras en ser trasplantadas
con éxito hace más de medio siglo. Inicialmente sólo podían obtenerse a partir de
la medula ósea, pero actualmente se obtienen mediante un proceso mucho menos
traumático llamado aféresis, tras ser movilizadas a la sangre periférica o, más
recientemente, a partir de la sangre del cordón umbilical(14)
3.2 HEMATOPOYESIS
La producción de células sanguíneas es un proceso complejo a través del cual
una célula madre hematopoyética prolifera y se diferencia dando lugar a los
distintos tipos de células maduras circulantes (eritrocitos, granulocitos, linfocitos,
monocitos y plaquetas). La hematopoyesis tiene lugar en la médula ósea, en
donde una intrincada red de células estromales y sus productos, regulan cada una
de las etapas que conducen a la generación de células primitivas, intermedias y
maduras(15).
Las CMH tienen dos características funcionales que las distinguen: son capaces
de auto-renovarse (al dividirse, por lo menos una de las células hijas conserva las
propiedades de la célula madre) y son multipotenciales (pueden dar origen a los
distintos linajes sanguíneos). Estas células madre dan origen a células14
progenitoras hematopoyéticas (CPH), las cuales han perdido su capacidad de
auto-renovación, pero conservan su potencial proliferativo, estas pueden ser
multipotenciales, o bien, pueden estar restringidas a dos (bipotenciales) o a un
solo linaje (monopotenciales). La CPH se bifurca en un progenitor mieloide común
(PMC) y un progenitor linfoide común (PLC); Estas células responden a un
determinado tipo y número de citocinas, evento que está definido por el número de
receptores que cada progenitor presenta. La maduración posterior en cada uno de
los linajes hematopoyéticos está definida por dos procesos fundamentales: la
pérdida definitiva del potencial de auto-renovación y la adquisición de una
identidad específica(15)(16)
Los progenitores mieloides PMC, dan lugar a unidades formadoras de colonias
granulo-monocíticas (UFC-GM), que a su vez dan origen a unidades formadoras
de colonias granulocíticas (UFC-G) y unidades formadoras de colonias
monocíticas (UFC-M). Una vez encaminadas en la vía de diferenciación, las UFC-
G dan lugar a células maduras (eosinófilos, neutrófilos y basófilos); mientras que
las UFC-M dan lugar a monocitos, y finalmente a macrófagos. A lo largo de toda la
ruta de diferenciación, las células de linaje mieloide son reguladas por un amplio
número de citocinas entre las que se encentran: el factor estimulador de colonias
de granulocitos y monocitos (FSC-GM), el factor estimulador de colonias de
granulocitos (FSC-G), el factor estimulador de colonias de monocitos (FSC-M), la
interleuquina-3 (IL-3), interloquina-6 (IL-6) y el factor de células seminales (FCS),
entre muchas otras(16)(17).
La producción de las células del linaje linfoide (linfocitos B, linfocitos T, células NK
y algunas categorías de células dendríticas) es un proceso dinámico y complejo, el
cual está determinado por combinaciones de factores intrínsecos y
microambientales (18). La linfopoyesis, proceso por el cual se forman los linfocitos,
comienza desde una célula madre hematopoyética, que gracias a la acción de
las interleuquinas, en concreto la Interleuquina-7(IL-7), se especializa en tejido
linfoide, el que a la vez por acción de la IL-3 y la interleuquina-4 (IL-4), se
especializan en linfocitos T y linfocitos B, respectivamente(19)
Estos procesos también son controlados por programas genéticos en donde los
genes que mantienen la capacidad de auto-renovación se apagan, al tiempo que
los genes que regulan la diferenciación se encienden. De esta manera, los
progenitores hematopoyéticos se diferencian a células precursoras, a través de
una serie de eventos en donde grupos alternados de genes en asociación con
diversos factores de crecimiento determinan el destino celular en donde cada
célula madura tiene una identidad y función definitiva(16).
Además de las citocinas estimuladoras existe también un número considerable de
citocinas que inhiben estos procesos, tal y como sucede con el factor de necrosis
tumoral alfa (TNF- α), el factor de crecimiento transformante beta (TGF- β), la
proteína inflamatoria de macrofagos-1α y los interferones (IFN), entre otras. Estas15
moléculas son capaces de disminuir los niveles de células madre y progenitoras
hematopoyéticas mediante la inhibición de su proliferación; dicha inhibición puede
ocurrir de manera directa -por inducir la disminución de la expresión de receptores
de moléculas estimuladoras- o a través del efecto sinérgico entre dos o más
factores, causando un efecto supresor en la proliferación y formación de colonias
hematopoyéticas(15)(17).
Si bien, todo este proceso de proliferación y diferenciación de la célula madre, así
como el crecimiento y desarrollo de células hematopoyéticas maduras es
modulado por citocinas y factores de crecimiento, también están presentes las
interacciones especificas entre las células madre y otras células dentro de un
microambiente en particular llamado ―nicho de células madre‖ que desempeñan un
papel clave en la determinación del destino de la célula, lo que mantiene el
número de éstas mediante el control de auto-renovación y diferenciación, es decir,
que la hematopoyesis no es posible sin la influencia reguladora de microdominios
específicos de la estructura de la médula ósea a pesar de que las células madre
de por sí poseen la capacidad intrínseca de auto-renovación. Los sistemas
endoóseos, mesenquimales y vasculares se han identificado como los principales
componentes de regulación de los nichos de la CMH, sin embargo el concepto del
nicho encarna la entidad física de todos sus componentes individuales(20)(21).
3.3 CÉLULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFÉRICA
Una célula mononuclear de sangre periférica (CMNSP), es
una célula sanguínea caracterizada por poseer un único núcleo redondo, como
los linfocitos o los monocitos, se diferencian de los eritrocitos y las plaquetas que
no tienen núcleo, y de los neutrófilos, basófilos y eosinófilos que tienen núcleos
polilobulados(22). Como se mencionó anteriormente este tipo de células presenta
un origen común en la medula ósea y se diferencian a partir de una célula madre
hematopoyética por efecto de diferentes citoquinas como: FSC-GM, FSC-M e IL-
7, IL-3 y IL-4.
Las CMNSP Tienen una vida promedio de 60 días tiempo tras el cual, si no se
encuentran activas mueren por apoptosis. Aunque también pueden convertirse en
células fagocíticas fijas o células de patrullaje que llegan a sitios puntuales tras el
estímulo adecuado. En los seres humanos, la frecuencia de estas poblaciones
varía en los individuos; los linfocitos están normalmente en un intervalo del 70 -
90% de CMNSP, los monocitos oscilan desde 10 hasta 30% de CMNSP mientras
que las células dendríticas son raras, siendo solamente 1 - 2% de la CMNSP(19)
Estas células se obtienen a menudo de la sangre usando Fycoll,
un polisacárido hidrofílico que separa capas de la sangre; por el gradiente de
centrifugación queda una capa superior de plasma, seguido por una capa de16
CMNSP y una fracción inferior de células polimorfonucleares, eritrocitos y
plaquetas(22)
3.4 OSTEOCLASTOS
Los osteoclastos son células que se diferencian a partir de precursores
hematopoyéticos mononucleares de la línea del monocito/macrófago y tienen la
capacidad de reabsorber la matriz ósea calcificada y disolver la fase inorgánica,
por tanto estas células son encargadas de la resorción y remodelación ósea(23).
Los osteoclastos se originan a partir de la célula madre mieloide y el precursor
más temprano de identificación es la UFC-GM. Los pasos que conducen a la
generación de UFC-GM implican los factores de transcripción PU.1, MITF y c-Fos,
mientras que en esta etapa, la citoquina FSC-M estimula la proliferación y
previene la apoptosis de los primeros progenitores osteoclásticos. Los Pre-
osteoclastos también pueden derivar de la UFC-M, aunque con menor eficiencia.
El factor de transcripción PU.1 es responsable de los primeros eventos de la
osteoclastogénesis, el PU.1 contribuye a la represión de los genes de los
neutrófilos durante la diferenciación de los macrófagos a través de la inducción de
reguladores negativos. El PU.1 es un factor de transcripción para el gen c-fms que
codifica al receptor de la citoquina FSC-M. El FSC-M establece un bucle autocrino
de amplificación y también estimula a PU.1. Esta citoquina es indispensable para
la proliferación y la supervivencia tanto de macrófagos y osteoclastos
progenitores, es producida por un número de células, entre las que se encuentran
las células estromales y osteoblastos. Estas células aumentan la producción de
FSC-M por factores osteotrópicos, incluyendo la PTH (hormona paratiroidea) y las
citocinas inflamatorias tales como TNF- α (factor de necrosis tumoral α ) y la IL-1
(interleuquina 1)(24)
Como PU.1, el factor de transcripción MITF se expresa por el progenitor común de
los macrófagos y osteoclastos y, al menos parcialmente, interactúa con PU.1,
regulando selectivamente la expresión de la catepsina K, la isoforma osteoclasto
específica de TRAcP:5b y el receptor de osteoclastos asociado OSCAR , que
están acoplados con la diferenciación de los osteoclastos . La presencia de ambos
PU.1 y MITF como promotores de genes diana permite que los precursores
comprometidos respondan rápidamente a FSC-M y RANKL y reprogramen la
expresión génica. De hecho, PU.1 también induce la transcripción del receptor
RANK que, al reconocimiento de su ligando, RANKL, determina el compromiso
hacia el linaje de los osteoclastos(24)
Entre los genes diana de MITF, el gen ClC7, que codifica el transporte de cloruro
tipo 7, y el gen OSTM1, que codifica una molécula importante para la
estabilización de proteínas ClC7, han sido reconocidos como fundamentales para17
el fenotipo de los osteoclastos. Por lo tanto, PU.1 y MITF son reconocidos por
desempeñar papeles relevantes también en etapas posteriores de la
diferenciación de los osteoclastos. La proteína c-Fos contribuye a la formación del
factor de transcripción heterodimérico AP-1. Este es inducido en una etapa
posterior en comparación con PU.1 y MITF y es necesario para la diferenciación
de osteoclastos(25)
La diferenciación de los osteoclastos requiere la vía de RANKL / RANK para ser
activado. El RANKL es una glicoproteína que pertenece a la superfamilia de TNF,
expresado por los osteoblastos, las células del estroma y, durante la inflamación,
por ciertas células T y fibroblastos sinoviales. Las células diana-los osteoclastos-
expresan su receptor RANK, la activación del receptor desencadena señales
intracelulares que conducen a la expresión de un panel de genes osteoclasto-
específicos. La actividad del RANKL es contrarrestada por su receptor señuelo, la
OPG (Osteoprotegerina), que secuestra a RANKL impidiendo su unión al RANK.
El equilibrio entre RANKL y OPG determina la resorción ósea en condiciones
fisiológicas. La expresión de RANKL está finamente regulado por hormonas y
factores de activación de la señal de cAMP / PKA, tales como la PTH, la PGE2
(prostaglandina E2), y por el receptor de la vitamina D3: VDR. También está
regulada positivamente por la IL-1 en respuesta a TNFa(26)
La multinucleación de los osteoclastos se produce por fusión de preosteoclastos
mononucleares. Este evento se rige por RANKL, que inicia una cascada de
eventos que conducen a la liberación de señales quimiotácticas. Las quimiocinas
MCP-1 (proteína quimiotáctica de monocitos -1) y RANTES (del acrónimo:
Activation, Normal T Expressed and Secreted: atrayente selectivo para linfocitos T
de memoria y monocitos), desencadenan la fusión de células mononucleares
comprometidas y permiten la transferencia de las señales de RANK a los núcleos
fusionados. MCP-1 es obligatorio para este evento y actúa a través de sus
receptores CCR2 y CCR4, que son inducidos por RANKL, y estimula la señal de
PI3K (fosfoinosil-quinasa-3)activando la expresión génica de los osteoclastos a
través de NFATc1(factor nuclear de células T activadas) Este último también
activa la expresión de la isoforma d2 del dominio V0 de la H+ -ATPasa vacuolar y
a la proteína DC-STAMP (proteína transmembranal especifica de células
dendríticas), ambos implicados en la fusión celular de los osteoclastos y la
multinucleación. Otro factor involucrado en la fusión es MFR (receptor de fusión de
macrófago)(24)
Luego del proceso de multinucleación se requieren los pasos finales de
maduración para inducir la actividad completa. Estos incluyen la polarización de la
célula, la organización de la membrana de sellado y el borde rizado que aíslan la
laguna de resorción, y el transporte específico de membrana para trasladar los
mecanismos moleculares de la resorción ósea a los sitios apropiados. Estos
acontecimientos parecen ser desencadenados por el reconocimiento de la matriz
mineralizada por la integrina avb3. Este receptor reconoce la secuencia RGD (Arg-
Gly-As) de las proteínas óseas, tales como la osteopontina y sialoproteína ósea 2,18
e inicia señales que reclutan las quinasas: c-Src y SYK, esenciales para eventos
de fosforilación intracelulares que conducen a la remodelación del citoesqueleto y
la polarización de las células. El patrón completo de activaciones aún no se ha
reconocido. Sin embargo, los primeros estudios demostraron que el compromiso
de avb3 induce la movilización del calcio en los osteoclastos(27)
Los osteoclastos maduros, son células multinucleadas que pueden ser tan
grandes con un tamaño de 150 micras de diámetro y con un número de núcleos
de hasta 50, dependiendo de la especie. En las secciones histológicas
convencionales los osteoclastos presentan forma y tamaño variables y se adhieren
a la superficie ósea a nivel de pequeñas excavaciones denominadas lagunas de
resorción o laguna de Howship. Cuando la laguna de resorción está bien
delineada, el osteoclasto está en una fase de resorción completa. Presentan un
citoplasma finamente granular. Los núcleos se localizan generalmente en la zona
opuesta a la matriz ósea, cada uno asociado con un complejo de Golgi y un par de
centriolos. El retículo endoplásmico rugoso es escaso, mientras que las
mitocondrias son numerosas, alargadas y localizadas especialmente en la región
de la célula cercana a la superficie del hueso. Esta región también contiene
muchos lisosomas, de aproximadamente 0,5 micras de diámetro, y vacuolas de
aproximadamente 3 micras de diámetro, algunas de las cuales son positivas para
el marcador de osteoclastos típico, la fosfatasa ácida resistente al tartrato
(TRAP)(24)
Los osteoclastos muestran una polaridad marcada. La membrana plasmática
cercana al hueso exhibe profundas e irregulares invaginaciones que representa la
llamada frontera ondulante. El dominio de la membrana periférica se caracteriza
por una extensa área de adhesión, que se encuentra bien conectada con la matriz
ósea, llamada membrana de sellado. Esta área sella dinámicamente la laguna de
resorción. La membrana plasmática restante es lisa, sin rasgos distintivos
morfológicos, que representa el dominio basolateral. La membrana plasmática
muestra una pequeña depresión denominado dominio de secreción funcional que
se cree que está implicado en la transcitosis de los productos degradados de la
matriz de la laguna de resorción al fluido intersticial. Los lisosomas son
prominentes; ellos contienen diversas hidrolasas ácidas, entre las que está TRAP
(isoforma 5b) y la catepsina K que se expresa abundantemente y
específicamente(24)
La catepsina K ha sido reconocido por tener prominente actividad colagenolítica, lo
que conduce a la de destrucción de colágeno tipo I en el microambiente ácido de
la laguna de resorción. En los osteoclastos, los lisosomas tienen la capacidad
única de ser secretados hacia la laguna de resorción, que de hecho tiene un pH
inferior a 4,0 y una concentración de calcio mayor de 25 mM. Las mitocondrias
también están presentes en grandes números en los osteoclastos, conforme con
la energía metabólica elevada requerida para la degradación de la matriz ósea.
Están ubicadas estratégicamente en las proximidades de la frontera ondulante
donde proporcionan el ATP necesario. La esperanza de vida del Osteoclasto varía19
según la especie. In vitro, se reconoce algunos días en ratón, mientras que los
osteoclastos de humanos y conejos pueden persistir en cultivo durante semanas.
Al final de su ciclo de resorción, los osteoclastos se someten a la apoptosis en la
mayoría de las especies(28)
3.5 MARCADORES DE OSTEOCLASTOS
Morfológicamente, los osteoclastos son células multinucleadas, que se distinguen
de los megacariocitos porque están polarizados y se adhieren al hueso. Un criterio
importante para la identidad de los osteoclastos es su capacidad de reabsorción.
In vivo, esto se demuestra por la aparición polarizada y la presencia de la laguna
de reabsorción o de Howship. Además, la concentración de fragmentos de
colágeno liberados por su actividad proteolítica se puede medir en el suero y en la
orina y éstos se utilizan en pacientes como biomarcadores óseos. Hay varios
métodos para medir la resorción ósea in vitro, incluyendo la cuantificación del
número de hoyos, su área y profundidad, así como la evaluación de la cantidad de
fragmentos de colágeno liberados en medios acondicionados(24)
3.5.1 TRAP
La fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP), es una enzima común en el sistema
óseo e inmunológico. Se expresa por las células del linaje monocito incluyendo
macrófagos y células dendríticas (DC). La enzima que también se conoce como
fosfatasa ácida tipo 5, se identificó originalmente por su movilidad catódica única a
pH 4 y se define además por su resistencia a la inhibición del L (+) –tartrato.
TRAP es una proteína que contiene hierro y es capaz de hidrolizar una amplia
gama de fosfato sustratos que incluyen nucleótidos, fosfatos de arilo y
fosfoproteínas incluyendo osteopontina y sialoproteina ósea(29)
Los osteoclastos muestran una tinción intensa para TRAP en hueso normal y
durante muchos años TRAP se ha utilizado como un marcador histoquímico de los
osteoclastos. En la mayoría de otros tejidos normales la enzima presenta niveles
bajos de actividad y es histoquímicamente indetectable excepto en los macrófagos
alveolares pulmonares, donde hay fagocitosis activa de microbios transportados
por el aire y otras partículas inhaladas. La enzima también se ha identificado en
los osteoblastos y los osteocitos(29).
Aunque durante muchos años, TRAP fue considerado en gran medida un
marcador de hueso, se ha demostrado que también se expresa por muchos tejidos
no esqueléticos, es decir que se distribuye ampliamente en tejidos normales de
roedores y humanos. Dentro de estos tejidos se incluye la piel, el timo, el bazo, el20
hígado, el pulmón, el sistema nervioso y revestimientos del tracto gastrointestinal.
TRAP también se ha detectado en las articulaciones y el líquido sinovial de
pacientes con artritis reumatoide (AR), una enfermedad que implica que células
inmunes expresan esta enzima, ocasionando la erosión del hueso subyacente al
cartílago (30)(31)
TRAP es secretada por los osteoclastos durante la resorción ósea y la secreción
se correlaciona con el comportamiento de resorción. Se cree que al ser esta
enzima una pirofosfatasa, es probablemente la responsable de la remoción de
pirofosfato, potente inhibidor de la solubilización de la apatita, considerado el
primer paso esencial en la resorción (15).También se ha demostrado que durante
la resorción realizada por los osteoclastos la TRAP se produce en vesículas
transcitótica que participan en el transporte de productos de degradación de la
matriz a través de la células, las especies reactivas de oxígeno producido por
TRAP ayuda a destruir el colágeno y otras proteínas en estas vesículas.(29)
La expresión de TRAP se asocia fuertemente con la activación y la diferenciación
de osteoclastos, así como de macrófagos y otras células mono histiocíticas; la
actividad de esta enzima se mejora en ciertos macrófagos activados, además se
ha observado que los macrófagos derivados de monocitos humanos expresan
abundante actividad TRAP en cultivo con medio de suero enriquecidas (30)
En experimentos donde se han analizado ratones con deficiencia de esta enzima
se ha demostrado que la TRAP es esencial para la mineralización normal del
cartílago en desarrollo y para el mantenimiento del esqueleto adulto. Estos ratones
también muestran un deterioro de la función de los macrófagos(31)
La actividad de la TRAP se puede detectar en el suero de mamíferos en los que
existe como un complejo con α2 macroglobulina. La actividad enzimática se
aumenta patológicamente en el suero de pacientes que sufren condiciones que
implican aumento de la resorción ósea, tales como la enfermedad de Gaucher,
enfermedad de Paget, hiperparatiroidismo y osteoporosis (32)
3.5.2 ADAM 12
Las proteínas ADAM forman una familia de proteínas de superficie celular
ancladas a la membrana las cuales están implicadas en la adhesión célula-matriz-
célula, presentan una organización estructural común, incluyendo metaloproteasa,
desintegrina, con dominios transmembrana y citoplasmático ricos en cisteina.
Estas proteínas están involucradas en diversas funciones biológicas durante el
crecimiento y diferenciación celular, incluyendo la fertilización, miogénesis,
neurogénesis, el desarrollo de diversos tejidos epiteliales y diferenciación de los
osteoclastos en el hueso. ADAM 12 está implicado en el desarrollo y / o
regeneración del músculo esquelético, esta proteína regula la fusión de
mioblastos para formar miotubos durante la miogénesis(33).21
ADAM12 está involucrada en la diferenciación de osteoclastos multinucleados
resultantes de la fusión de progenitores hematopoyéticos de linaje mieloide,
también se ha informado que participa en la formación de células multinucleadas
en tumores de células gigantes de hueso. Sin embargo en un estudio realizado no
se logró detectar la expresión de ADAM12 en osteoclastos maduros marinos
generados in vitro. Esto podría ser debido al hecho de que un pico de expresión
transitoria de ADAM12 puede ocurrir cuando las células se fusionan, es decir que,
la expresión de ADAM12 se modula durante la formación de osteoclastos, y no se
expresan en las mismas etapas de diferenciación(34)
3.5.3 MMP9
Metaloproteinasa de matriz 9(MMP 9) es una clase de enzimas que pertenecen a
la familia de zinc-metaloproteinasas implicadas en la degradación de la matriz
extracelular de una variedad de órganos incluyendo el hueso. Esta enzima
proteolítica es altamente expresada en los osteoclastos y es importante para la
degradación de la matriz extracelular durante la resorción ósea, así como la
remodelación ósea. Se ha demostrado que RANKL puede aumentar la expresión
de MMP-9 de una manera dependiente de la concentración(35)
En el recambio óseo, las MMP secretadas participan en la descomposición del
colágeno, que a su vez permite la unión de los osteoclastos. Particularmente, la
MMP-9 se asocia con la migración de los osteoclastos a través de la matriz de
colágeno. Las metaloproteinasas de matriz también pueden romper el colágeno
residual dejada por la catepsina K, después de que el pH se eleva en la laguna de
resorción. Esta metaloproteinasa es también activa contra gelatinas (colágenos
desnaturalizados) y los tipos de colágeno I y IV intactos. En el hueso de origen
dérmico, se cree que la degradación de la matriz depende más de las MMP y
menos en la catepsina K(36)
En un estudio(37) se analizó el efecto de la IL-1α sola o RANKL y / o M-CSF en
presencia de IL-1α en la expresión de la enzima anhidrasa carbónica II (CAII), la
catepsina K, y MMP-9 en células cultivadas de RAW264.7 por 14 días. Los
investigadores detectaron que en presencia de IL-1α, la expresión de CAII, la
catepsina K, y MMP-9 se aumentó notablemente en células cultivadas con RANKL
o con FSC-M + RANKL. Por otro lado, los niveles de expresión eran difíciles de
detectar en células cultivadas con IL-1α solo o con FSC-M en presencia de IL-1α.
Estos resultados sugieren que la expresión de CAII, la catepsina K y MMP-9 no es
inducida por la IL-1α y M-CSF, pero si por RANKL, y que sus niveles incrementan
de expresión de acuerdo con la madurez y la diferenciación de las Células
RAW264.7.
Los niveles de una MMP en los osteoclastos están influenciados por una serie de
factores, como el entorno de los osteoclastos el cual es muy importante ya que los
niveles de expresión de los ARNm de las MMP-9, -14, y -10 varían dentro de la22
misma médula. La variación de la expresión de MMP-9 en diferentes áreas óseas
ya ha sido reportada en ratones y conejos. Otro factor es la variabilidad de la
especie animal, ya que hemos encontrado en el ratón in vivo pero no en el conejo,
osteoclastos que exhiben MMP-12. También se informó de diferencias en la
expresión de MMP-1/13 entre los roedores y otras especies. Estas variaciones en
el nivel de expresión de las MMP también se relacionan de acuerdo con la noción
general de que varias MMPs responden a reguladores locales de recambio óseo,
tales como IL-1, IL-6, TNF-α, OPG, PGE2, ácido retinoico, y TGF beta (factor de
crecimiento β) o de los cambios locales relacionadas con fuerzas mecánicas,
consolidación de fracturas, desarrollo o condiciones de la enfermedad. Es decir
que las diferentes conclusiones que se encuentran en la literatura sobre la
presencia de MMP en los osteoclastos es probable que reflejen las condiciones de
observaciones y no son necesariamente contradictorias(38)
En conclusión, se demuestra que la falta de consenso sobre las MMP
osteoclástica en la literatura simplemente refleja la variabilidad de la expresión de
MMP en los osteoclastos. Esta variabilidad tiene que ser considerado en el
contexto de la capacidad de las células óseas para adaptar sus actividades de
acuerdo a las diversas especificidades locales del esqueleto.
3.5.4 ATPasa VACUOLAR
Durante el proceso de resorción ósea, la etapa de acidificación extracelular está
mediada por el complejo vacuolar H + -ATPasa (V-ATPasa), la cual acidifica con
hidrogeniones la laguna y mantiene el equilibrio de hidrogeniones entre la laguna y
el interior del osteoclasto(39)
La V-ATPasas se componen de al menos 13 subunidades distintas y varias de
estas subunidades tienen múltiples isoformas. La expresión de estas isoformas se
regula en un tipo y tejido celular específico. Se han identificado dos isoformas de
la subunidad V0 de V-ATPasa, la, d1 y d2, en ratones y seres humanos. Ambas
isoformas se expresan más abundantemente en los osteoclastos que en otros
tejidos. En particular, la expresión de Atp6v0d2 es más específico que el de
Atp6v0d1 durante la diferenciación de los osteoclastos, con lo cual se pone de
relieve la importancia de Atp6v0d2 para la osteoclastogénesis; aunque la función
exacta de Atp6v0d2 no ha sido dilucidado, se ha demostrado que la inactivación
genética de Atp6v0d2 en ratones resulta en una marcado aumento de masa ósea
debido a la deficiencia de osteoclastos. Curiosamente, la deficiencia de Atp6v0d2
no afecta la diferenciación de los osteoclastos o la actividad de la V-ATPasa en
esta población de células. Más bien, la Atp6v0d2 es necesaria para la maduración
eficiente de los osteoclastos(39)(40)23
3.5.5 DC-STAM
DC-STAMP (proteína dendrítica transmembrana específica) se ha descubierto en
células dendríticas humanas (DC), pero también es expresada por macrófagos y
osteoclastos, esta proteína presentan funciones distintas en cada tipo de
células(41)
C-STAMP juega un papel vital y es importante en la fusión de osteoclastos
mononucleares (MOC) y no tanto en el proceso de osteoclastogénesis. El nivel
transmembranal de DC-STAMP disminuye de manera constante cuando los
monocitos se diferencian en osteoclastos. Los precursores osteoclásticos
responder a RANKL por internalización de DC-STAMP. El desplazamiento de DC-
STAMP desde la superficie hasta el plasma conduce a una clasificación de MOC:
DC-STAMPlo y DC-STAMPhi que representan células con más baja y más alta
expresión de DC-STAMP en la membrana celular, respectivamente. Por tanto las
células DC-STAMPlo manifiestan mayor DC-STAMP intracelular que las células
DC- STAMPhi debido a la internalización de los DC-STAMP(42)
En ratones nocaut con deficiencia de DC-STAMP, se demostró el compromiso de
la multinucleación de macrófagos y osteoclastos, con lo que se puede demostrar
la necesidad de su presencia en la fusión celular y con ello contribuye a posterior
producción TRAP(41).
3.5.6 INTEGRINA αβ3
Las integrinas son receptores heterodiméricos de membrana que median la
interacción entre célula-matriz extracelular (ECM), y célula-célula. Las integrinas
proporcionan un enlace físico entre la ECM y el citoesqueleto celular. Los
osteoclastos exhiben una alta expresión de la integrina αβ3, que se une a una
variedad de proteínas que contienen Arg-Gly-Asp (RGD), incluyendo vitronectina,
osteopontina y sialoproteína ósea, el bloqueo de los anticuerpos de las integrinas
αβ3 inhiben la resorción ósea in vitro, in vivo, lo que sugiere que esta integrina
juega un papel importante en la regulación de la actividad de los osteoclastos.
Esta integrina es clave en la vinculación de la adhesión de los osteoclastos a la
matriz ósea, en la organización del citoesqueleto, la polarización y a la activación
de estas células para la resorción ósea. Las integrinas son indispensables para
formar la zona de sellado sin la cual no podría ocurrir la resorción ósea (43).24
3.6 RESORSIÓN ÓSEA
El osteoclasto es la célula responsable de la resorción de la matriz ósea. La
resorción ósea es un proceso necesario para el desarrollo normal del esqueleto,
por su adaptabilidad, y para su mantenimiento. Este proceso celular es esencial en
el crecimiento, remodelación y reparación de hueso y esta, en condiciones
normales, estrechamente acoplado al proceso de formación de hueso por el
osteoblasto. Es el equilibrio entre estas dos actividades celulares que determinan
la masa esquelética(24)
La resorción ósea consiste en la capacidad de los osteoclastos para disolver la
matriz mineralizada y eliminar hidrolíticamente la matriz orgánica del hueso. Estos
eventos no pueden ocurrir intracelularmente porque el hueso es demasiado amplio
para interiorizarlo y destruirlo por fagocitosis. Sin embargo, los lisosomas son
orgánulos ideales para la degradación tanto de los componentes inorgánicos y
orgánicos de la matriz ósea, ya que son ácidos, una propiedad que permite la
disolución de los cristales de hidroxiapatita, y contienen enzimas que degradan la
matriz y destruyen todos los demás componentes óseos(44)
La resorción se inicia con la hidratación del CO por la anhidrasa carbónica tipo 2,
2
(CAII), en ácido carbónico que luego se disocia en protones y en equivalentes de
bicarbonato. Los protones se liberan en la laguna de resorción por el H+ -ATPasa
vacuolar, Y esta acidificación permite la disolución de cristales de hidroxiapatita y
la solubilización de iones calcio, cuya concentración alcanza valores mucho más
elevadas que en los otros fluidos extracelulares (van de 25 a 40 mM). La liberación
de carga positiva en la laguna de resorción es equilibrada por la liberación de
iones cloruros cargados negativamente. Estos cloruros habían entrado a la célula
a través del intercambiador de cloruro/ bicarbonato localizado en la membrana
basolateral, que también sirve para equilibrar los equivalentes alcalinos producidos
por la disociación del ácido carbónico. Todo esto para liberar calcio y fosfato y
descubrir la matriz orgánica, conformada por de colágeno tipo 1 en un 95%, de
esta manera queda lista para ser degradada por enzimas proteolíticas que
incluyen hidrolasas ácidas, especialmente la catepsina K, liberadas de los
organelos lisosomales, y metaloproteinasas, especialmente la MMP9, liberadas de
la vesícula endosomal. La solubilización de hidroxiapatita precede la degradación
de la matriz orgánica y es obligatorio para este último evento. También es claro
que la resorción ósea requiere grandes cantidades de energía para bombear
protones a la laguna de resorción y contrarrestar el efecto búfer por los fosfatos
liberados por la hidroxiapatita(45)
Al final de la resorción ósea, los productos de degradación de la matriz tienen que
ser liberados a los fluidos extracelulares. En 1997, los grupos de Horton y
Vaananen propusieron que este evento se rige por un proceso de transcitosis que
implica la zona central del borde rizado, implicado en la actividad endocítica; y de
la membrana opuesta, formado por el dominio funcional secretor, que participa en25
la exocitosis. Por lo tanto, el transporte de membrana se considera obligatorio para
la función de los osteoclastos46)
En 1991, se propuso la existencia de una vía alterna para la liberación de los
productos de la resorción ósea, basado en las altas concentraciones de calcio,
que inducen un fenotipo de osteoclasto de alta motilidad. Cuando la concentración
de calcio en la laguna de resorción alcanza niveles umbrales, que se estima en
rangos de mM por encima del nivel fisiológico, la resorción ósea se interrumpe, las
células se vuelve móviles y se mueven lejos de las cavidades de resorción,
perdiendo la adherencia a la matriz ósea. Esto permite que los iones y los
productos orgánicos de la matriz degradada se diluyan rápidamente en el medio
ambiente circundante, volviendo la concentración de calcio extracelular al nivel
fisiológico(24)
3.7 MODELO PARA GENERAR CÉLULAS CON ACTIVIDAD
OSTEOCLÁSTICA
Actualmente se ha logrado inducir osteoclastos maduros a partir de células madre
hematopoyéticas e incluso a partir de células madre embrionarias totipotentes. El
potencial de los precursores de los osteoclastos (ACO) para diferenciarse a
osteoclastos maduros en cultivo se mantiene por una variedad de células, que
incluyen, además de células madre hematopoyéticas, las unidades formadoras de
colonias (UFC). Okuyama y col(47) han demostrado una alta variabilidad en el
potencial de diferenciación de los osteoclastos a partir de precursores cultivados
en presencia de suero y en diferentes tipos de células del estroma.
Se han estudiado diferentes moléculas que son importantes para la
osteoclastogénesis, una de estas moléculas críticas, el factor de diferenciación de
osteoclastos: el ligando de la OPG, se determinó como factor esencial para inducir
el desarrollo de los osteoclastos junto con el factor estimulante de colonias de
macrófagos en cultivos inoculados solamente con una línea celular precursora de
osteoclastos. Las células que se obtuvieron expresaron la fosfatasa ácida
resistente al tartrato, un marcador específico del linaje de los osteoclastos,
posteriormente se localizaron en la periferia de las colonias y finalmente lograron
su maduración a células multinucleadas capaces de reabsorber hueso. Por tanto
el factor estimulante de colonias de macrófagos y el ligando de la OPG, que son
producidos por las células del estroma, promueven la osteoclastogénesis en
colonias enteras, lo que indica que la ubicación y el mantenimiento de los
osteoclastos maduros, así como el crecimiento y diferenciación de precursores de
osteoclastos están reguladas por estos dos factores(47)
Grigoriadis y col(48) han demostrado que, en cultivos de células que expresan
marcadores de macrófagos CD18 y CD11b en presencia de FSC-M y RANKL26
durante 10-14 días se logra la diferenciación y la formación de osteoclastos
multinucleados que expresan TRAP y muestran anillos de actina prominentes. La
inmunotinción y microscopía confocal demuestra que estas células expresan los
marcadores de osteoclastos integrina αβ3 y catepsina K, y el análisis por SEM
(microscopio electrónico de barrido) confirma la presencia de abundantes lagunas
de resorción. Las células cultivadas en ausencia de RANKL no muestran la
formación de osteoclastos ni lagunas de resorción.
En otro estudio realizado por Okuyama y col(49) investigaron los mecanismos de
la osteoclastogénesis desde las primeras etapas, donde examinaron los efectos
de la adición del factor de crecimiento VEGFR-1 (proteína quimérica), en el
desarrollo de los osteoclastos a partir de cultivos de células madre embrionarias.
En este estudio se determinó que la adición de VEGFR-1/Fc afectó el desarrollo
no sólo de las células endoteliales sino también de ACO, UFC-M, y de las células
eritroides, también se analizó el papel del receptor de la tirosin quinasa c-kit,
donde determinaron que el desarrollo de los osteoclastos a partir de células
madre embrionarias es totalmente c- Kit independiente.
Los Osteoclastos se pueden generar a partir de células formadoras de colonias de
granulocitos y macrófagos. Debido a esto se cree que el FSC-GM no es crítico
para el desarrollo de los osteoclastos, o que las señales normalmente
proporcionadas por FSC-GM podrían ser compensadas por otras moléculas. En
contraste, los ratones que presentan una mutación en el gen que codifica el factor
estimulante de colonias de macrófagos (FSC-M), carecen de FSC-M funcional, y
desarrollan osteopetrosis causado por la ausencia de osteoclastos. Por lo tanto, la
señalización a través de c-fms, receptor de FSC-M, parece ser esencial para la
osteoclastogénesis(50)
3.8 PEG
El polietilenglicol (PEG) es un polímero hidrófilo que causa la deshidratación de las
superficies de membrana, promoviendo un estrecho contacto entre ellas. Esta
capacidad deshidratante deriva del hecho de que PEG, como un polímero
dinámico con un gran volumen hidratado, aumenta el potencial químico del agua
en una superficie de la membrana. Debido a su capacidad de agregación, PEG se
utiliza ampliamente para mediar la fusión célula-célula en la producción de
híbridos de células somáticas que incluyen los hibridomas y en la inyección de
fusión de macromoléculas en células cultivadas a partir de eritrocitos o
liposomas(51).
Existen dos pasos importante para que el PEG induzca la fusión de membranas
celulares: el primero es la agregación de las células antes de la fusión y segundo,
la desestabilización de las membranas de las células agregadas, permitiendo el
proceso final de fusión, sin embargo, la fusión entre vesículas agregadas o entre27
células ocurre cuando se utilizan altas concentraciones de PEG de bajos pesos
moleculares (52)
Los primeros estudios propusieron que PEG induce la fusión de membranas por:
(1) modificación de la estructura y propiedades dieléctricas del agua); (2)
alteración del orden molecular de la bicapa en el punto de contacto debido a la
agregación y la deshidratación; (3) la inducción de estructuras no bicapa; (4)
actuando como un detergente para alterar la estructura bicapa; (5) la unión a las
vesículas de reticulación y (6) inducción de la separación de fases que
desestabiliza la bicapa. (51)
Klaus Arnold y col demostraron que la acción de PEG en la promoción de la fusión
célula-célula no era debido a efectos tales como la absorción de la superficie o
solubilización, en su lugar PEG actuaba simplemente por exclusión de volumen, lo
que resulta en una fuerza osmótica que conduce a un estrecho contacto entre
membranas en una región deshidratada (53)
Debido a que la agregación no puede distinguirse de la fusión se han exigido
satisfacer tres criterios para concluir de que se ha producido la fusión: (1) mezcla
de componentes de la membrana, (2) mezcla de compartimentos internos, y (3) un
aumento de diámetro de la vesícula (52)
3.9 NAC
La N-acetilcisteína (NAC) es un tiol antioxidante producido por el cuerpo, que sirve
como un precursor en la síntesis del glutatión, aumentando los niveles de éste. El
glutatión desempeña un papel importante en la protección de las células al daño
de radicales libres derivados del oxígeno y de otros compuestos tóxicos. El
Estímulo de la síntesis de glutatión después de la administración de NAC se
traduce en una mayor disponibilidad de glutatión para la desintoxicación de
radicales libres derivados del oxígeno(54)
Las especies reactivas de oxígeno (ROS) se producen principalmente por las
mitocondrias en las células como un subproducto del metabolismo normal. Estos
incluyen radicales superóxidos (O -), peróxido de hidrógeno (H O ) y radicales
2 2 2
hidroxilo (OH -). Cuando existe un desequilibrio entre oxidantes y antioxidantes se
genera un estrés oxidativo(55); ROS en altas concentraciones causan este estrés
oxidativo que conlleva a fenómenos perjudiciales, incluyendo la respuesta
inflamatoria, la apoptosis, o la isquemia. Además se ha demostrado que los
osteoclastos pueden ser activados por ROS para mejorar la resorción ósea(56)
El RANKL es esencial para la diferenciación de células de médula ósea del linaje
monocito-macrófago (BMM) a osteoclastos. la estimulación del RANKL en células
BMM aumenta el nivel intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS) a
través de una cascada de señalización que implica TNF (factor de necrosis
tumoral) del receptor del factor asociado (TRAF 6), Rac1, y NADPH (nicotinamida28
adenina dinucleótido fosfato ) oxidasa 1 (NOX 1). Luego de la unión de RANKL
con su receptor RANK y del reclutamiento de TRAF 6 se inicia la activación de la
cascada de señalización mediadas por las proteín-quinasas activadas por
mitógenos (MAP), que incluyen la kinasa c -jun N-terminal (JNK), quinasa MAP
p38 (p38), y la quinasa regulada por señal extracelular (ERK). La JNK1-activa la
señalización de c-Jun en cooperación con el factor nuclear de células T activadas
(NFAT) clave para la diferenciación de osteoclastos regulado por RANKL(56)
El mecanismo por el cual ROSs activa las MAP quinasas no se entiende
completamente. Sin embargo la activación de estas quinasas por una serie de
estímulos, incluyendo factores de crecimiento y citoquinas, parece requerir
generalmente a ROS(57).La Aplicación de N-acetilcisteína (NAC) bloquea la
actividad de Nox 1, proteína que conduce a la formación de ROS, lo que inhibe
las respuestas de las células BMM al RANKL, reduciendo la producción de ROS,
igualmente reduce la activación de JNK, p38 y ERK, y por tanto suprime la
diferenciación de los osteoclastos(56)(57).
Zafarullah y col(55) Refieren que NAC puede secuestrar ROS, sirviendo como
agente reductor y que la activación del NF-kB en respuesta a una variedad de
señales (IL-1, TNF, H O ) también puede ser inhibida por NAC. Cao y col(58)
2 2
reportan que las citoquinas pro inflamatorias como TNF-α, IL-1β, y la IL-6 y el
estrés oxidativo son capaces de estimular la diferenciación y la activación de
osteoclastos, además las especies reactivas de oxígeno (ROS) estimulan
directamente la formación y la activación de osteoclastos, lo que conduce a la
resorción ósea. En este estudio se demostró que la suplementación con NAC en la
dieta de ratas aumenta la defensa oxidativa, disminuyendo la diferenciación de
osteoclastos a partir de células de médula ósea y también disminuyo la expresión
de ITGB3, un marcador de osteoclastos. Además, se encontró que NAC disminuye
la formación de osteoclastos en células RAW similares a osteoclastos (en
presencia de RANKL). También se ha demostrado que NAC reduce la expresión
de la ciclooxigenasa-2. (54)(55)(59)
Chen y col(60), demuestran que en precursores osteoclásticos junto con
osteoblastos el etanol estimula la expresión del RANKL resultado de la generación
de ROS asociado con la inducción de la expresión de NOX, y la activación y
acumulación de ERK seguido por la fosforilación del transductor de señal y
activador de la transcripción 3 (STAT3) lo que resulta en un incremento de RANKL
aumentando la osteoclastogénesis. En presencia del antioxidante NAC, la cascada
activada ROS / ERK / STAT3 / RANKL en osteoblastos se atenúa, al parecer
como resultado de la inhibición de la inducción de NOX mediada por etanol.
NAC se ha usado clínicamente en personas mayores de 30 años, principalmente
como un agente mucolítico suprimiendo el estrés oxidativo, la administración oral
de NAC en dosis de hasta 8000 mg / día no causa clínicamente reacciones
adversas en estudios en seres humanos, por lo cual es considerado como un
medicamento seguro con efectos secundarios menores (náuseas, vómitos y ardor
de estómago)(54)29
4. OBJETIVOS
4.1 OBJETICO GENERAL
Evaluar la capacidad de diferenciación de células mononucleares de
sangre periférica (CMNSP) hacia el linaje osteoclástico en diferentes
tiempos de activación con fuerzas.
4.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
 Evaluar la actividad TRAP, en CMNSP sometidas a fuerza durante 3,
5 y 7 días y compararla con células CMNSP fusionadas con PEG y
tratadas con NAC.
 Evaluar marcadores característicos de osteoclastos, en CMNSP
sometidas a fuerza durante 3, 5 y 7 días y compararla con células
CMNSP fusionadas con PEG Y tratadas con NAC.
 Evaluar actividad resortiva, en CMNSP sometidas a fuerza durante
3, 5 y 7 días y compararla con células CMNSP fusionadas con PEG
y tratadas con NAC.30
5. MATERIALES Y METODOS
5.1 TIPO DE ESTUDIO: Experimental, in vitro
5.2 MUESTRA: CELULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFERICA
(CMSP)
Las células mononucleares de sangre periférica se adquirieron tomando una
muestra de 20 mL de sangre periférica de un donante voluntario, de 27 años de
edad, género femenino, sano sistémicamente, mediante punción en el pliegue
anterior del brazo, con un jeringa previamente heparinizada con 2µL de heparina
sódica 5000 UI en 5mL. Posteriormente se diluyo con 30 mL de RPMI 1700 y se
agregó Fycoll-Hypaque en una proporción de 1:3 (v:v) se centrifugo a 1200 r.p.m
durante 30 minutos. Mediante una pipeta se tomó la interface opaca que contiene
las CMNSP depositándolas en un nuevo tubo. Se realizaron tres lavados con
medio RPMI 1700 y se centrifugaron a 1200 rpm durante 6 minutos cada uno.
5.3 DIVISIÓN DE LA MUESTRA
La muestra de dividió en 6 grupos.
1. CMNSP no fusionadas, no tratadas con fuerza (control negativo) (-fu, –F)
2. CMNSP no fusionadas, no tratadas con fuerza, con NAC (-fu, -F, + NAC)
3. CMNSP no fusionadas tratadas con fuerza (F)
4. CMNSP no fusionadas tratadas con fuerza, con NAC (F +NAC)
5. CMNSP fusionadas con PEG (control positivo) (PEG)
6. CMNSP fusionadas con PEG, con NAC (PEG +NAC)
-fu, –F
-fu, -F, + NAC
F
F + NAC
PEG
PEG
+NAC31
Para cada grupo se utilizaron 12 láminas de hueso los cuales fueron evaluadas
en tres tiempos diferentes: al 3, 5 y 7 día
5.4 CULTIVO DE CELULAS MONONUCLEARES DE SANGRE PERIFERICA
Las células se cultivaron en cajas Petri con medio RPMI 1700 suplementado con
SFB (suero fetal bovino) al 10 % (v/v), en presencia de 10 µL de
Fitohemaglutinina (PHA) con el fin de estimular Linfocitos T, se llevaron a
incubadora a 37°C, 95% de humedad y atmosfera de CO al 5%. Luego de 72
2
horas de cultivo se recolectaron las células en suspensión y las adherentes las
cuales fueron desprendidas con una solución de PBS-EDTA 1mM (p/v) por 10
minutos a 37°C. Posteriormente las células fueron lavadas con medio libre de
SFB y centrifugadas a 1200 r.p.m. durante 5 minutos.
5.5 FUSION CELULAR CON PEG
Luego de la centrifugación se eliminó el sobrenadante y se colocó el tubo sobre
gasa estéril para eliminar todo residuo de RPMI y evitar diluir el polietilenglicol
(PEG). Se agregó 50 µL de PEG de peso molecular 3000, previamente calentado
a 37º C, se agito suavemente, mediante golpes con el dedo en la base del tubo,
para homogenizar el botón celular en el PEG y se llevó a 37º C durante 5
minutos. A partir de ese momento se adicionó 40µL de RPMI cada 60
segundos por 5 minutos, posteriormente 80 µL de PRMI durante 5 minutos y
160 µl de RPMI durante 5 minutos, Posteriormente las células se centrifugaron
por 5 minutos a 1200 rpm y se lavaron dos veces con RPMI para retirar el PEG.
Posteriormente se suspendieron en medio de cultivo RPMI suplementado en SFB
al 10% La técnica de fusión, los volúmenes del medio y los tiempos se llevaron a
cabo siguiendo el protocolo de Moniere- Faugere et al. 2001
5.6 LAMINAS DE HUESO
Se utilizó hueso cortical de pelvis bovina, el cual se cortó transversalmente con
sierra, se pulió con esmeril, discos de carburo de grano grueso y fino y piedra
2
rosada hasta obtener laminas con un área de 6mm y grosor de 0.5mm.Estas
laminas se sumergieron en una solución de SDS (Dodecil sulfato de sodio) al 10%
por 8 horas bajo agitación continua, se lavaron doce veces con agua destilada
hasta eliminar totalmente el detergente, posteriormente se esterilizaron con etanol
al 70% por 60 minutos y finalmente se lavaron dos veces con medio RPMI
suplementado con 10% SFB. Las cajas fueron esterilizadas finalmente con luz
ultravioleta durante un día.32
5.7 SIEMBRA
Se utilizaron 12 láminas de hueso para cada grupo evaluado, realizando la
siembra en tres cajas de 24 pozos cada una, se colocaron aproximadamente 450
células en 35µL con un porcentaje de viabilidad del 100%. Los grupos se
distribuyeron de la siguiente manera:
1 2 3 4 5 6
1 2 3 4 5 6
-fu PEG
PEG
– F -fu-F, F+ +
-fu -fu-F, F+ +
+NAC F NAC PEG NAC
A – F +NAC F NAC PEG NAC
B
1 2 3 4 5 6
-fu PEG
– F -fu-F, F+ +
+NAC F NAC PEG NAC
C
Distribución de la muestra: se utilizaron 3 cajas de siembra A (evaluación al 3 día), B (evaluación al 5
día), C (evaluación al 7 día), cada una con los 6 grupos: CMSP no fusionadas, no tratadas con fuerza
BB
(-fu, –F). 2. CMSP no fusionadas, no tratadas con fuerza, con NAC (-fu, -F, + NAC), 3.CMSP no
B
fusionadas tratadas con fuerza (F), 4.CMSP no fusionadas tratadas con fuerza, con NAC (F +NAC),
B
5.CMSP fusionadas con PEG (control positivo) (PEG), 6.CMSP fusionadas con PEG, con NAC (PEG
+NAC)
A cada lamina de hueso estéril del grupo de fusión (24 en total), se les aplico 10
µL de la suspensión de células fusionadas con PEG en 30 µL de medio de cultivo;
para permitir la adhesión de las células se dejaron durante 4 horas en incubadora
a 37°C, 95% de humedad y atmosfera de CO al 5%. Trascurrido este tiempo se
2
agregó 400µL de medio con SFB al 10% en cada pozo, para los grupos de
células tratadas con NAC, se agregó 30Mm a cada pozo de preparado de NAC
con PBS.33
5.8 APLICACIÓN DE FUERZA
Los grupos a los que se les aplico fuerza (+F), (24 en total), se posicionaron en
un motor rotatorio horizontal (Rototorque – ColeParmer®) a velocidad No. 8 (44
r.p.m), trascurrido 3 días se retiraron las 8 láminas y se fijaron las células con
43µL de formaldehido diluido en 400 µL de PBS. Así mismo de procedió con los
diferentes grupos. Para los días 5 y 7, se siguió el mismo protocolo. Para
determinar la fuerza a la cual fueron sometidas las células se utilizó la formula
descrita en el artículo ya publicado(61). Al calcular la fuerza ejercida sobre las
2
células se estableció que fue de 5.28 gr/cm .
2
Donde P es la presión en Kg por cm , m: la masa del medio, r: el radio del
motor rotatorio, r.p.m: revoluciones por minuto y A: el área de contacto entre el
medio y las células.
2
Siendo m= 0.015 gr, r= 0.065m, A=4 cm y r.p.m=44
5.9 FIJACION
Cada grupo de células se fijaron al 3, 5 y 7 día con 43 µL de Formaldehido,
dejándolas con 400 µL de PBS a temperatura ambiente. Posteriormente se evaluó
la actividad de la enzima TRAP, se realizó prueba de inmunofluorescencia para el
anticuerpo: Integrina β y por último se realizó evaluación de la actividad resortiva.
3
5.10 DETERMINACIÓN DE LA FOSFATASA ÁCIDA RESISTENTE AL
TARTRATO (TRAP).
Este procedimiento fue realizado según protocolo del grupo de investigación de
patología de la universidad de Nottingham(62), se retiró el PBS en el que se
encontraban las láminas óseas y se dejó secar al medio ambiente. Para obtener
la tinción, primero se preparó el buffer veronal 10 mL que contenía barbitona de
sodio (ácido barbitúrico 0.006625 g y 0,01375 g de NaOH) y 0,048375 g de
acetato de sodio. A este buffer veronal se le adicionó 0,0291 g de tartrato de
sodio-potasio, luego, se agregó una solución formada por 375 µL de
pararrosanilina hexasotizada y 375 µL de nitrito de sodio en hielo. Después, se34
adicionó 0,00475g de naftol fosfato MX-ASB1 (Sigma-Aldrich), usado como
sustrato de la enzima TRAP. A esta solución se le ajustó el pH a 4.6 +/-
0.2.usando ácido clorhídrico. Cada lámina fue incubada con 300 μL de esta
solución a 37 ° C durante 2 h, se hizo un solo lavado con agua destilada y se
dejaron secar a temperatura ambiente.
La coloración TRAP de acuerdo a las concentraciones de los reactivos y de los
tiempos de incubación varían entre una coloración rojo ladrillo, café y rojo violeta.
Para evaluar la actividad TRAP, se hizo un conteo de las células coloreadas en
las láminas de hueso cortical bovino, de cada uno de los grupos evaluados en
este proyecto. El conteo se realizó en toda la superficie de la lámina ósea, en un
microscopio de luz Vanguard®, con un objetivo de 40x.
5.11 INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
Se realizó la prueba de inmunofluorescencia indirecta sobre los siguientes grupos:
1. CMNSP no fusionadas, no tratadas con fuerza (-fu, -F), 2. CMNSP no
fusionadas, no tratadas con fuerza + NAC (-fu, -F), 3. CMSP no fusionadas
tratadas con fuerza, (F) 4. CMNSP no fusionadas tratadas con fuerza + NAC
(F+NAC). Para determinar la expresión del marcador integrina β3 generado en
cabra. Las láminas de hueso fueron lavadas 3 veces con una solución de PBS,
dejando 2 minutos entre cada lavado, a cada lamina se agregó 30 μL de la
solución con el anticuerpo primario y se incubo durante 1 hora en cámara
húmeda. Las láminas se lavaron nuevamente 3 veces con solución de PBS y se
secaron por debajo con una servilleta y se cambiaron de caja. Se agregó 30 μL de
solución de anticuerpo secundario FITC anti-cabra, (2 μg/mL, Santa Cruz
R
Biotechnology ), junto con la tinción DAPI y se incubo durante 30 minutos en
cámara húmeda y en total oscuridad. Se lavaron 3 veces con PBS cada 2
minutos. La lámina ósea se colocó sobre una laminilla porta objetos, sobre las
láminas de hueso se colocó una laminilla cubre objetos, se colocó aceite de
inmersión y se observó la inmunofluorescencia en un microscopio Vanguard® con
un objetivo 100x. Toda la superficie de cada una de las láminas óseas fue
evaluada y se tomaron varias fotos representativas para cada grupo. Para detectar
la positividad de la prueba, se observaron primero las células con luz blanca y
estas mismas deberían emitir fluorescencia cuando fueran observadas con el lente
indicado para esto. Si no había presencia de ninguna masa fluorescente se
declaró negativa para dicho marcador.35
5.12 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA
Para poder observar las lagunas de reabsorción se procedió primero a retirar las
células de las láminas óseas. Para lisar las células se utilizó el detergente SDS al
10% (dodecil- sulfato sódico), esta solución se dejó por 30 minutos bajo agitación
continua, luego se procedió a desprender mecánicamente las células y residuos
persistentes utilizando un cepillo dental de cerdas suaves, se lavaron con agua
destilada cinco veces, bajo agitación continua.
Posteriormente las láminas fueron teñidas con el colorante azul de Coomassie
(0.25% Coomassie, 50% metanol, 10% ácido acético 40% H2O) por 30 minutos.
El hueso se decoloro con una mezcla de metanol, ácido acético y agua
(50:10:30%, V/V) dejándolo actuar por 15 minutos. Finalmente, las láminas
fueron lavadas con agua destilada bajo agitación continua y se secaron a
temperatura ambiente. Para realizar el conteo se tomaron fotos representativas
de cada grupo, evaluadas con el objetivo 40X en un microscopio de luz
Vanguard®, con una cámara Panasonic® DMC-FHS. Se contó el número de
lagunas de reabsorción en cada campo y se describió su morfología.
5.13 ANALISIS ESTADISTICO
Todos los datos se presentan como el promedio calculado de 4 repeticiones en
cada uno de los grupos evaluados en tres periodos de tiempo: al 3, 5 y 7 día. Las
comparaciones estadísticas entre los grupos de tratamiento se realizaron
mediante análisis de varianza ANOVA de Doble vía complementado con un test de
comparaciones múltiples de Fisher. Los resultados se consideraron
estadísticamente significativos con un valor p < 0.05.36
6. RESULTADOS
6.11 EXPRESION DE LA ENZIMA TRAP AL 3, 5 Y 7 DIA DE CULTIVO
Durante la observación al microscopio de todas las láminas óseas se identificaron
en todos los grupos evaluados masas de células morfológicamente irregulares, de
tamaño variable, con una coloración que vario de una tonalidad café a rojo
ladrillo presentando diferentes intensidades de color.
En las láminas óseas del grupo PEG se observó que las células se encontraban
agrupadas en masas de mayor tamaño, con forma irregular y con alta intensidad
de coloración. El patrón de ubicación fue uniforme en todo el recorrido del hueso
(Imagen 1. A.B) a diferencia del grupo de F (grupo de aplicación de fuerzas), en
las que se observaron pequeños grupos celulares, algunos redondeados y
ubicados predominantemente en la periferia del hueso, en estas láminas se
observaron variaciones en la intensidad de color.(Imagen 1. C.D). Para los grupos
tratado con NAC se observaron en su mayoría grupos celulares pequeños y
dispersos con una intensidad baja del color. (Imagen 1 E.F.G.H)
La cantidad de células TRAP positivas tanto en el grupo F, como en el grupo
PEG fue mayor en comparación al grupo que no se fusiono ni fue sometido a
fuerza(-fu, –F), en los tres periodos de tiempo evaluados (3, 5 y 7 día de cultivo),
presentando una diferencia estadísticamente significativa entre ellos (Tabla 1 y 2).
Tabla 1. Cantidad de células TRAP positivas observadas en el grupo sometido a fuerza
(F) evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo, en comparación con el grupo no sometido a
fuerza ni a fusión (-fu, –F). Diferencia estadísticamente significativa al 3 día de cultivo
con un valor de *P: 0.0154, y con un valor de **P<0.0001 al 5 y 7 día de cultivo.37
A B
C D
E F
G H
I J
Figura 1. Láminas óseas representativas de células con tinción TRAP positivas,
observadas en microscopio de luz (Vanguard®), 40X, A, B Grupo PEG; C, D Grupo F;
E, F: Grupo PEG+NAC; G,H: Grupo F+NAC; I,J: Grupo (-fu, -F)38
Tabla 2. Cantidad de células TRAP positivas observadas en el grupo tratados con fusión
(PEG) evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo, en comparación con el grupo no sometido a
fuerza ni a fusión (-fu, –F). Diferencia estadísticamente significativa al 3 día de cultivo con un
valor de *P: 0.0020, y con un valor de **P<0.0001 al 5 y 7 día de cultivo.
Por otra parte, no se observaron diferencias estadísticamente significativas al
comparar el número de células TRAP positivas encontradas en los grupos F y
PEG a los 3, 5 y 7 días. (tabla 3).
Tabla 3. Cantidad de células TRAP positivas, observadas en el grupo F en comparación con
células TRAP positivas del grupo PEG evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo. Diferencia NO
estadísticamente significativa entre los grupos en los tres periodos de observación, con un valor
de P: 0.04590 al 3 día, un valor de P: 0.7604 al 5 y un valor de P: 0.0601 al 7 día de cultivo.39
Tanto en el grupo F como en el grupo PEG se observó un aumento significativo
de células TRAP positivas al día 3 de cultivo comparándolo con el grupo –fu, -F;
la cantidad de células TRAP positivas incrementó al día 5 y 7 de cultivo para
ambos grupos. Al análisis estadístico se encontró una diferencia estadísticamente
significativa comparando la cantidad de células TRAP positivas en los días 3 y 5 y
entre los días 3 y 7, pero no entre los días 5 y 7, para ambos grupos (tablas 4 y
5).
Tabla 4. Cantidad de células TRAP positivas, en los grupos F evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo.
Diferencia estadísticamente significativa entre los días 3 - 5 y entre los días 3-7 con un valor de
*P<0.0001y una diferencia NO estadísticamente significativa entre los días 5 y 7 con un valor de P:
0.3890
Tabla 5. Cantidad de células TRAP positivas, en los grupos PEG evaluadas al 3, 5 y 7 día
de cultivo. Diferencia estadísticamente significativa entre los días 3 - 5 y entre los días 3-7
con un valor de *P<0.0001 y una diferencia NO estadísticamente significativa entre los
días 5 y 7 con un valor de P: 0.016240
Los grupos que fueron tratados con NAC, (F+NAC) y (PEG+NAC), presentaron
una evidente disminución del número de células TRAP positivas comparados con
los grupos sin aplicación de NAC: F y PEG (tablas 6 y 7). Por otra parte, al
comparar los grupos F+NAC y PEG+NAC con el grupo control negativo (–fu,-F)
no se observaron diferencias estadísticamente significativas en el número de
células TRAP positivas (tablas 8 y 9)
Tabla 6: cantidad de células TRAP positivas en los grupos tratados con fuerza F comparados con
los grupos tratados de igual manera adicionándoles NAC (F+NAC) al 3, 5 y 7 día de cultivo. Se
presenta disminución del número de células TRAP positivas en los grupos tratados con NAC
siendo esta diferencia estadísticamente significativa con los grupos a los que no se trató con NAC
Tabla 7: cantidad de células TRAP positivas en los grupos fusionados con PEG comparados con
los grupos tratados de igual manera adicionándoles NAC (PEG+NAC) al 3, 5 y 7 día de cultivo. Se
presenta disminución del número de células TRAP positivas en los grupos tratados con NAC
siendo esta diferencia estadísticamente significativa con los grupos a los que no se trató con NAC41
Tabla 8 : cantidad de células TRAP positivas en los grupos PEG+NAC, comparados con los grupos
(-fu, -F) al 3, 5 y 7 día de cultivo. No se encuentran diferencias estadísticamente significativas entre
los grupos en ningún periodo evaluado.
Tabla 9: cantidad de células TRAP positivas en los grupos F+NAC, comparados con los grupos (-fu, -
F) al 3, 5 y 7 día de cultivo. No se encuentran diferencias estadísticamente significativas entre los
grupos en ningún periodo evaluado.42
6.12 EVALUACION DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA AL 3, 5 Y 7 DIA DE
CULTIVO
Una vez retiradas las células del hueso y teñidas con azul de Coomassie se
procedió a observar al microscopio las lagunas de reabsorción formadas por estas
en cada uno de los grupos evaluados.
Las láminas de hueso del grupo celular PEG mostraron un número elevado de
lagunas de reabsorción, con un patrón de forma irregular sin bordes definidos;
aunque las lagunas tenían tamaños variables, predominaron las de mayor tamaño
y de gran profundidad fácilmente visibles durante el recorrido del hueso. (Imagen
2. A.B).Mientras que en el grupo de PEG +NAC se observaron pocas cantidades
de lagunas de menor tamaño, igualmente amorfas (Imagen2 C.D)
Al evaluar las láminas de hueso del grupo celular F, se encontraron lagunas de
reabsorción con bordes difusos, de menor tamaño y superficiales, en algunas
láminas las lagunas se observaron agrupadas en forma de racimo y en otras
láminas se encontraron aisladas (Imagen 2. E.F), en el grupo de F+NAC. Se
encontraron lagunas en un número reducido, superficiales y aisladas (Imagen 2
G.H)
Realizando una comparación en el número de lagunas de reabsorción del grupo
PEG y el grupo control negativo (–fu, -F), se encontró que existe una diferencia
estadísticamente significativa entre ellos, siendo PEG el de mayor número, en
cada uno de los días evaluados. (tabla 10), igualmente ocurrió en el grupo F, en
donde el número de lagunas de reabsorción fue mayor comparándolo con el
grupo control negativo (-fu, F), encontrándose una diferencia estadísticamente
significativa en los tres periodos de observación (tabla 11)
Tabla 10. Número de lagunas de reabsorción evaluadas en los grupos PEG al 3, 5 y 7 día
comparándolo con los grupos no tratados con fuerza ni fusión (-fu, F). Diferencias
estadísticamente significativas en los tres periodos de tiempo con valores de *p<0.000143
A
B
A
A
C D
B AA A
AA
A
Imagen 2. Microfotografías
representativas de
lagunas de resorción
F tinción Coomasie.
E
Observadas a microscopio
A
A de luz (Vanguard®) objetivo
A
A de 40x, fotografías con
cámara Panasonic® DMC-
FHS. A, B Grupo PEG; C,
D: Grupo PEG+NAC, E, F:
Grupo F; G,H: Grupo
F+NAC, I, J: Grupo (–fu,-F)
G H
A A
A A
I J
A A
A A44
Tabla 11. Número de lagunas de reabsorción evaluadas en los grupos F al 3, 5 y 7 día en
comparación con los grupos no tratados con fuerza ni fusión (-fu, -F). Diferencias estadísticamente
significativas entre los grupos en los tres periodos de tiempo con valores de *p<0.0001
Las láminas óseas del grupo PEG y del grupo F mostraron cantidades de lagunas
de reabsorción similares, en donde la diferencia entre ambos grupos no fue
estadísticamente significativa en el 3 y 7 día de cultivo.(tabla 12)
Tabla 12. Número de lagunas de reabsorción en los grupos sometidas a Fuerza (F) en comparación
con los grupos tratadas con PEG evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo. Diferencia NO
estadísticamente significativa entre los grupos al 3 y 7 días de cultivo, con un valor de P: 0.2635 y
0.2021 respectivamente. En el día 5 de cultivo se presentó una diferencia significativa con un valor
de P: 0.045045
Los grupo tratados con NAC: ((F+ NAC) y (PEG + NAC)) presentaron una
disminución estadísticamente significativa en el número de lagunas de reabsorción
en comparación con los grupos F y PEG, respectivamente (tabla 13 y 14)
Tabla 13. Número de lagunas de reabsorción en los grupos sometidos a Fuerza F en comparación
con los grupos F+NAC al 3, 5 y 7 día de cultivo. Se presenta disminución del número de lagunas de
reabsorción en todos los grupos tratados con NAC siendo esta diferencia estadísticamente
significativa en los tres periodos de tiempo
Tabla 14. Número de lagunas de reabsorción en los grupos de PEG en comparación con los grupos
de PEG+NAC al 3, 5 y 7 día de cultivo. Se presenta disminución del número de lagunas de
reabsorción en todos los grupos tratados con NAC siendo esta diferencia estadísticamente
significativa en los tres periodos de tiempo46
Las lagunas de reabsorción para el grupo F y PEG se presentaron a partir del 3
día de cultivo, el número se incrementó para los días 5 y 7 en ambos grupos. Se
encontró diferencia estadísticamente significativa al comparar el número de
lagunas del 3 día con el 5 día, del 3 día con el 7 día y del 5 día con el 7 día, tanto
para el grupo F como para el de PEG. (Tabla 15 y 16)
Tabla 15. Número de lagunas de reabsorción, en los grupos de células sometidas a fuerza (F)
evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo. Diferencia estadísticamente significativa entre los días 3 – 5; 3-
7 con un valor de *P<0.0001 y entre el día 5 y 7 con un valor de P: 0.0279
Tabla 16. Número de lagunas de reabsorción, en los grupos de células tratadas con PEG evaluadas
al 3, 5 y 7 día de cultivo. Diferencia estadísticamente significativa entre los días 3 – 5; 3-7 con un
valor de *P<0.0001 y entre los días 5-7 con un valor de P: 0.003947
6.13 EVALUACION DE LA EXPRESIÓN DEL MARCADOR
OSTEOCLASTICO INTEGRINA B3 AL 3, 5 Y 7 DIA DE CULTIVO.
Durante la evaluación de los marcadores por inmunofluerescencia, se observó
que el grupo tratado con fuerza presentó fluorescencia leve para el marcador de
integrina β3. Las zonas fluorescentes se observaron de tamaño pequeño,
asemejando células aisladas con forma irregular sin bordes definidos. Estas
pequeñas masas de observaron en la periferia de la lámina ósea. (Imagen 3 A) El
porcentaje de fluorescencia encontrado en el grupo de fuerza fue de 5%, 15% y
25% al 3, 5 y 7 días respectivamente, es decir que incremento con el tiempo. En los
grupos control negativo (-fu, -F) y los tratados con NAC no se evidenció ningún tipo
de fluorescencia en todo el recorrido de la lámina ósea para los tres periodos de
tiempo evaluados.(Imagen 3. B.C)
A
a B
b
C
c
Imagen 3: Microfotografías representativas de inmunofluorescencia. Tinción con 0.1 µg/ml
DAPI. y anticuerpo para integrina B3, evaluados al Microscopio de fluorescencia (Vanguard®)
observadas con objetivo de 100x, fotografías con cámara Panasonic®. DMC-FHS. A. Grupo
F. a: 7 dia de cultivo. b: 5 dia de cultivo. c: 3 dia de cultivo. B Grupo F+ NAC; C Grupo (–fu,-F)48
7. DISCUSION
La resorción ósea desencadenada por los osteoclastos es crucial para generar un
movimiento dental ortodóntico, Roberts (63) afirma que "la resorción ósea es el
factor que limita la velocidad de movimiento de los dientes", por lo tanto, la
velocidad a la que un diente se puede mover a través del hueso podría estar
restringido principalmente por el número y la actividad de los osteoclastos.
Basados en esto, la aparición de los osteoclastos se considera paso necesario e
importante para que ocurra el movimiento dental; por esto es importante para los
ortodoncistas entender el efecto de la fuerza en la activación de los osteoclastos
Los osteoclastos son grandes células gigantes multinucleadas que expresan
actividad de la fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP) y tienen la capacidad de
formar cavidades de resorción en hueso y dentina. Estos osteoclastos se derivan
a partir de progenitores hematopoyéticos del linaje de monocitos-macrófagos
(64).En este experimento se utilizaron células mononucleares de sangre periférica
CMNSP humanas que comprenden una población mixta de células
mononucleares que contiene monocitos / macrófagos, precursores tempranos de
los osteoclastos del linaje de monocitos, y linfocitos T y B. las CMNPS, no
contienen células estromales o precursores de células del estroma. (65)
Las CMNSP fueron cultivadas con adición al cultivo de fitohemaglutinina, Estudios
realizados in vivo e in vitro han mostrado que los procesos de diferenciación
osteoclastogénica están asociados con un incremento y activación de la población
de linfocitos T. Se ha encontrado que estas células producen citocinas como el
RANKL, la interleucina -17, factor estimulante de colonias de granulocitos y
macrófagos (FSC-GM) y el interferón (IFN) gamma, que tienen efectos
reguladores de gran alcance en la osteoclastogénesis.(66)(64)(67). Con esta
premisa se han desarrollado modelos para la generación de osteoclastos
utilizando CMNSP agregándoles fitohemaglutinina(PHA) lo que estimula la
proliferación de linfocitos T, logrando obtener osteoclastos a partir de
monocitos.(65)(68). Además se ha reportado que la presencia del marcador CD13
y CD14 en las CMNSP estimuladas con PHA, sugiere que existen poblaciones
reportadas como precursores in vitro de células similares a osteoclastos, como
son las células mielomonocito/dendríticas y los monocitos CD14.(69).
Los efectos del estímulo con PHA en la resorción han sido descritos en
osteoclastos extraídos de huesos de ratones adultos, en donde un incremento en
el número de estas células y de su actividad resortiva, ha sido asociado a la
presencia de la PHA(70). Lo anterior podría explicar porque algunas CMNSP no
fusionadas utilizadas como el control negativo presentaron positividad en el
análisis de la enzima TRAP, ya que estas fueron estimuladas con PHA por 72
horas. De igual manera la presencia de la PHA, ayudaría a incrementar y
mantener la función resortiva de las CMNSP en el tiempo.49
Los datos obtenidos durante el experimento muestran que las CMNSP obtenidas a
partir de la fusión con PEG y luego de someterlas a fuerza expresaron la enzima
fosfatasa ácida tartrato resistente (TRAP) y fueron capaces de formar lagunas de
reabsorción en las láminas óseas donde estuvieron cultivadas por 3, 5 y 7 días.
En la evaluación de la expresión de la enzima TRAP y la reabsorción ósea, las
células pertenecientes al grupo PEG, se observaron como grandes agrupaciones
celulares, con una coloración en su mayoría intensa que varió de rojo ladrillo a
café, característica de células TRAP positivas, además las láminas óseas en
donde fueron sembradas presentaron grandes y profundas lagunas de
reabsorción. Estos resultados son similares a los descritos por anteriores estudios
donde se sugiere que el tratamiento de CMNSP con PEG puede inducir la
formación de células multinucleares y la reabsorción ósea (68) (8) (71),
igualmente, el tratamiento de monocitos de la línea tumoral U937/A y J/774 (7)
y de fibroblastos humanos (6) con PEG promueve la formación de células con
actividad TRAP positiva y la reabsorción ósea. Basados en estos resultados, se
sugiere que PEG induce fusión celular eficientemente produciendo una
célula multinucleada, con actividad similar a los osteoclastos debido a sus dos
funciones importantes como son la de agregar las células, cuando extrae el agua
entre las membranas y la de aumentar la fuerza osmótica, generando la fusión de
las membranas celulares. (72). Estos resultados igualmente son concordantes
con otros estudios donde las CMNSP son estimuladas con factores
osteoclastogénicos o calcitrópicos para diferenciarlas en células similares a
osteoclastos(66)(73)(74). Sin embargo en nuestro estudio obtuvimos células
resortivas sin necesidad de estos factores demostrando un modelo fácil de
reproducir y más económico para el estudio del proceso de reabsorción.
En el experimento se determinó que la actividad resortiva del grupo de células
PEG fue mayor al 7 día de observación concordando con los resultados de
Castillo y col. (68) donde se cultivaron las CMNSP por 14 días concluyendo que
al día 7 se presentó un alto porcentaje de áreas resortivas la cual se mantuvo
constante, sin un aumento representativo hasta los 14 días.
En el estudio realizado, Las CMNSP humanas responden ante fuerzas mecánicas
activándose en células similares a osteoclastos, siendo TRAP positivas, con
capacidad de reabsorción. En los resultados de la evaluación de la enzima TRAP
estas células se observaron de menor tamaño que las observadas en el grupo
PEG agrupadas pero no fusionadas y localizadas en su mayoría en la periferia.
Este grupo de células formaron lagunas de reabsorción igualmente pequeñas y
superficiales, estos resultados son similares a los encontrados en anteriores
estudios donde se utilizaron CMNSP(8) y fibroblastos humanos(6), ambos con
métodos similares a los utilizados en el presente estudio.
A este respecto, múltiples autores han reportado que diferentes sistemas que
involucran factores mecánicos han sido utilizados para lograr la diferenciación de
osteoclastos. Sin embargo dependiendo de la naturaleza y magnitud de la fuerza
se activan señales que pueden o no, apoyar el proceso de osteoclastogénesis.50
Kanzaki H. et al(75) refieren que las fuerzas compresivas aplicadas sobre
fibroblastos del ligamento periodontal (LP) promueven la producción de citoquinas
inflamatorias lo que aumenta la expresión de RANKL sobre estas células que
cultivadas con precursores osteoclásticos como CMNPS permiten la diferenciación
osteoclastogénica. Igualmente Nakao y col(76) reportan que una fuerza de
compresión optima e intermitente y no continua aplicada sobre un cultivo de
fibroblastos del LP promueve la expresión de IL-1, esta señal aumenta la
expresión de RANKL, induciendo directamente la osteoclastogénesis en
precursores osteoclásticos. Ichimiy H. et al. (77) reportaron que la compresión
mecánica estática, aplicada sobre células sinoviales promueve la formación de
osteoclastos a través de la expresión de RANKL, luego de que estas células se
cultivaran con células de médula de ratón en presencia del factor estimulante de
colonia (FSC-M). Por otra parte, estos mismos autores reportan que la tensión
mecánica no apoyaba la osteoclastogénesis, esta premisa es afirmada por otras
investigaciones en las que refieren que la aplicación de fuerzas tensiles inhiben
la formación de osteoclastos por la disminución de la expresión de RANKL en
células estromales de la médula(78)(79).
También se ha reportado que fuerzas centrífugas estimulan la producción de
osteoprotegerina (OPG) en fibroblastos gingivales lo cual igualmente inhibe la
formación de células similares a osteoclastos, pero en este mismo estudio se
encontró que fibroblastos del ligamento periodontal, si lograron inducir un gran
número de células multinucleadas TRAP positivas en co-cultivo con células de
médula ósea de ratón, en presencia de Dexametasona y vitamina D, causando
niveles elevados de RANKL por parte de los fibroblastos(80).
Todos los estudios mencionados previamente fueron realizados mediante co-
cultivos de células que expresan RANKL (como fibroblastos de LP y células
estromales) con precursores osteoclásticos acompañados generalmente de algún
estímulo externo como FSC-M, RANKL, Vitamina D3, dexametasona, entre otros
de tal forma que no se establece si es la fuerza la que genera directamente la
sobreexpresión de RANKL o son las citoquinas agregadas en los cultivos. Con este
estudio proponemos un nuevo modelo de generación de células con actividad
osteoclástica debido a que no se utilizó ningún agente externo y tampoco se generó
un cocultivo, es decir que la fuerza que actuó directamente sobre las CMNSP logró
diferenciarlas hacia células con actividad resortiva.
Un hallazgo importante en el experimento es que se determinó que no hubo una
diferencia estadísticamente significativa en el número de células TRAP positivas y
en el número de lagunas de reabsorción entre los grupos tratados con fuerza en
comparación con los grupos tratados con PEG. Esto nos sugiere que la aplicación
de la fuerza puede ser tan eficiente en la diferenciación de células osteoclásticas
como lo es en la fusión con PEG.51
Xu y col(81) Realizaron un estudio donde se aplicaron diferentes magnitudes de
tensión a células RAW264.7 tratadas con FSC-M y RANKL. Los investigadores
encontraron que fuerzas tensionales de baja magnitud suprimen la fusión y
activación de osteoclastos, mientras que fuerzas tensionales de alta magnitud
(2.000 y 2.500 μɛ) aplicadas dentro de la carga fisiológica promueve la fusión y
activación de los osteoclastos, relacionando la expresión de RANK con una
respuesta mecánica dependiente de la magnitud. Hiroyuki y col (75) reportan que
ante el estímulo de una fuerza compresiva aplicada sobre células del LP en
cocultivo con CMNSP, el número de células TRAP positivas se maximiza con
cargas más pesadas y de mayor duración (2 g / cm2 y 24 h), Ichimiya(77) también
concluyo que fuerzas compresivas de 2g/cm2 aplicadas por 12 horas a un co-
cultivo de células sinoviales con células de médula ósea de ratones, promovió la
formación d células osteoclásticas en comparación con una fuerza compresiva de
1g/cm2.
Nakao y col(76) examinan el mecanismo molecular de células del LP humanas
luego de aplicar un fuerza continua e intermitentes de 2g/cm2 y 5 g/cm2
concluyendo que hay un aumento de la expresión del RANKL al aplicar una fuerza
intermitente en comparación con una fuerza continua para ambas magnitudes de
fuerza. Basado en lo anterior, se podría concluir que la magnitud de la fuerza
tiene gran influencia en la activación de los osteoclastos. En este estudio se aplicó
una fuerza de 5g/cm2 la cual fue óptima para obtener células TRAP positivas y con
actividad resortiva. En la mecanoterapia ortodóntica se estima que fuerzas ligeras
que no exceden la presión sanguínea capilar de 20 a 25 g / cm2 son adecuadas
para que el movimiento dental ocurra (82)
Durante la aplicación de una fuerza mecánica ortodóntica sobre el LP, se produce
una liberación de diferentes citoquinas, entre las que se encuentra el RANKL
inductor importante para el proceso de osteoclastogénesis(82). El tiempo óptimo
luego de aplicar una fuerza ha sido evaluado con el fin de conocer el rango de
tiempo donde es posible la activación celular osteoclástica necesaria para que
ocurra el movimiento dental. Roberts y Ferguson(63) encontraron que el número
de osteoclastos por unidad de área de superficie de hueso muestran un nivel de
pico de 50 horas (aproximadamente 2 días después de la aplicación de la fuerza
de ortodóntica). Gaoman y col(83) realizan un estudio en un modelo animal de
ratón donde aplican una fuerza mecánica sobre los molares y refieren que los
osteoclastos demoran en aparecer entre 3 y 5 días luego de la aplicación del
estímulo. Igualmente Rody y col(84) aplicaron una fuerza ortodóntica sobre
molares de ratones y analizaron el sitio de compresión, donde se observó un
número significativo de preosteoclastos en el ligamento periodontal y en la
superficie del hueso en el 3 día.
Estos estudios apoyan los resultados obtenidos en esta investigación donde se
encontró que a partir del tercer día de aplicación de la fuerza se obtuvieron células
TRAP positivas y capaces de formar lagunas de reabsorción sobre el hueso donde
fueron sembradas. Además se encontró que el número de células TRAP positivas52
en el grupo F incremento de manera significativa hasta el día 5(p<0.0001), pero a
partir de este día hasta el día 7 no hubo un aumento estadísticamente significativo
(p: 0.3890)
En los grupos que se añadió NAC (F+NAC; PEG+NAC) se evidencio una
disminución tanto del número de células TRAP positivas como del número de
lagunas de reabsorción para los tres periodos de tiempo evaluados (3, 5 y 7 día).
Por lo que podemos concluir que el agente oxidante NAC, es un potente inhibidor
de las actividades relacionadas con células resortivas.
Se ha reportado que en cultivos celulares de sangre periférica en presencia de
RANKL se obtienen células similares a osteoclastos acompañadas con una
producción de ROS. Cuando se aplica al cultivo celular NAC se inhibe la
respuesta de las células al RANKL, e inhibe la producción de ROS, impidiendo la
diferenciación de osteoclastos.(55)
Toker, H. y col(59) reportan que la administración sistémica de NAC en un modelo
experimental de periodontitis en ratas previene la pérdida de hueso alveolar. Esto
se explica porque durante el proceso inflamatorio, NAC disminuye la expresión de
mediadores inflamatorios inducidos por lipopolisacáridos (IL-1b, IL-6 y IL-8) en
células fagocíticas y fibroblastos gingivales; como resultado directo de estas
acciones
La NAC actúa como mucolítico, secretolítico y fluidificante de las secreciones. Es
de venta libre y es utilizada en personas de todas las edades. NAC tiene valor
terapéutico para la reducción de la disfunción endotelial, inflamación, fibrosis,
invasión, la erosión del cartílago, la desintoxicación del fármaco acetaminofén y
prolongación de trasplantes. (85)
Debido a que NAC suprime la diferenciación de los osteoclastos, este antioxidante
puede conducir a la prevención de la resorción ósea, en ortodoncia podría ser
utilizado como un agente para evitar la recidiva del tratamiento ortodóntico y
apoyando el periodo de retención.53
8. CONCLUSIONES
1. El grupo de células fusionadas con PEG presentaron marcadores de
osteoclastos activos, por lo cual podemos validar este modelo para el
estudio de la reabsorción
2. La acción de la fuerza sobre CMNSP generó una diferenciación positiva de
las células hacia el linaje osteoclástico
3. A partir del tercer día de aplicación de fuerzas sobre el cultivo hubo
diferenciación de células hacia el linaje osteoclástico
4. Existe una mayor diferenciación de células hacia el linaje osteoclástico al 7
día de aplicación de fuerza que al tercer día
5. NAC presenta la capacidad de inhibir la diferenciación de células hacia el
linaje osteoclástico54
9. RECOMENDACIONES
En futuras investigaciones in vitro con células derivadas de sangre periférica,
realizar estudios de aplicación de fuerza con diferentes magnitudes y evaluar su
comportamiento.
Realizar estudios enfocados en el mecanismo de acción del NAC, valorando ROS
y de esta manera contribuir al control de la recidiva en ortodoncia.
Se recomienda ser muy cuidadoso en la preparación de las láminas de hueso, ya
que a menor volumen y más planas, eran más fácil de enfocar el objetivo en el
microscopio, de esta manera se pueden obtener mejores registros..
Se podría emplear la evaluación de la expresión de RANKL en los grupos
sometidos a fuerza para aclarar el modo en que esta actúa sobre las células para
su diferenciación hacia el linaje osteoclástico.55
10. BIBLIOGRAFIA
1. Grigoriadis AE, Kennedy M, Bozec A, Brunton F, Stenbeck G, Park IH,et al.
Directed differentiation of hematopoietic precursors and
functional osteoclasts from human ES and iPS cells Blood. 2010;(115):2769-76
2. Sun HH, Chen B, Zhu QL, Kong H, Li QH, Gao LN, et al. investigation of dental
pulp stem cell isolated fron discarded human teeth extracted due to aggressive
periodontitis.Biomaterials. 2014;(35):9459-72
3. Kim AD, Stachura DL, Traver D. Cell
signaling pathways involved in hematopoietic stem cell specification.
Exp Cell Res. 2014; (329):227-33.
4. Lerner U.H, Osteoblasts, Osteoclasts, and Osteocytes: Unveiling Their
Intimate-Associated Responses to Applied Orthodontic Forces. Seminars in
Orthodontics.2012; (18):237–248.
5. Kanzaki H, Chiba M, Shimizu Y, Mitani H. Dual regulation of osteoclast
differentiation by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and
OPG inhibition. J Dent Res 2001 ;( 80):887–91.
6. Pazos Valencia LB. Análisis de la actividad resortiva de célulasfibroblastoides
(cultivo primario gingival) luego de someterlas a fuerza tensil o fusionarlas con
PEG. Bogotá, 2013. Trabajo de grado para optar por el título de Especialista en
Ortodoncia y Ortopedia Maxilar. Universidad Nacional de Colombia. Facultad
de odontología.
7. Murillo A, Guerrero CA, Acosta O, Cardozo CA.
Bone resorptive activity of osteoclast-like cells generated in vitro by PEG-
induced macrophage fusion. Biol. Res. 2010;(43):205-24
8. Bedoya S. Evaluación de la actividad resortiva de CMNSP fusionadas con
polietilenglicol (PEG), tratadas con fuerza centrífuga y con N acetilcisteina
(NAC). Bogotá, 2015. Trabajo de grado para optar por el título de Especialista
en Ortodoncia y Ortopedia Maxilar. Universidad Nacional de Colombia.
Facultad de odontología56
9. Noxon SJ, King GJ, Gu G, Huang G. Osteoclast clearance from periodontal
tissues during orthodontics tooth movement. Am J Orthod Dentofacial
Orthop. 2001; (120):466-76.
10. Ren Y, Kuijpers-Jagtman AM, Maltha JC.
Immunohistochemical evaluation of osteoclast recruitment during experimental
tooth movement in young and adult rats. Arch Oral Biol. 2005; (50):1032-9.
11. Matsuzaki K, Udagawa N, Tamaguchi K, Yasuda H, Shima N, Morinaga T,
YabeY, Higashiro K, Suda T. Osteoclast differentation factor (ODF) induces
osteoclastlike cell formation in human peripheral blood mononuclear cell
cultures. Bichem Biophys Res Commun. 1998 ;(246):199-204.
12. A. D. Kim; D. L. Stachura; D. Traver. Cell signaling pathways involved in
hematopoietic stem cell specification. Exp Cell Res. 2014; (329):227-33
13. Zimmermann S, Martens UM. Telomeres, senescence, and hematopoietic stem
cells. Cell Tissue Res. 2008; (331):79-90.
14. A. D. Kim; D. L. Stachura; D. Traver. Epigenetic regulation of hematopoietic
stem cell aging. Exp Cell Res. 2014; (329):192–199.
15. Mayani, H., et al. Hematopoyesis. Cancerología, 2007; (2):95-107.
16. Xiao Y, Zijl S, Wang L, de Groot DC, van Tol MJ, Lankester AC, et al.
Identification of the Common Origins of Osteoclasts, Macrophages, and
Dendritic Cells in Human Hematopoiesis. Stem cell reports, 2015; (4):
984-994
17. Ogawa M. Differentiation and proliferation of hematopoietic stem cells. Blood,
1993; (81): 2844-2853
18. Baba Y, Pelayo R, Kincade PW. Relationships between hematopoietic stem
cells and lymphocyte progenitors. Trends Immunol 2004; (25): 645-649
19. Pelayo R, Welner RS, Nagai Y, Kincade PW. Life before the Pre-BCR
checkpoint: specification and commitment of primitive lymphoid progenitors in
adult bone marrow. Semin. Immunol 2006; (18): 2-1157
20. Holzapfel BM, Hutmacher DW, Nowlan B, Barbier V, Thibaudeau
L, Theodoropoulos C. et al. Tissue engineered humanized bone supports
human hematopoiesis in vivo. Biomaterials. 2015 ;( 61): 103-114.
21. Ohishi K, Katayama N, Shiku H, Varnum-Finney B, Bernstein ID. Notch
signalling in hematopoiesis. Semin Cell Dev Biol. 2003; (14):143-150.
22. Perry SS, Welner RS, Kouro T, Kincade PW, Sun XH. Primitive lymphoid
progenitors in bone marrow with T lineage reconstituting potential. J Immunol
2006; (177): 2880-288
23. Sakiyama H, Masuda R, Inoue N, Yamamoto K, Kuriiwa K, Nakagawa K,
Yoshida K. Establishment and characterization of macrophage-like cell lines
expressing osteoclast-specific markers. J Bone Miner Metab. 2001; (19) :220–
7.
24. Peruzzi B; Teti A. The Physiology and Pathophysiology of the Osteoclast. J.
Clinic Rev Bone Miner Metab. 2012; (10): 71-97
25. Soysa NS, Alles N, Aoki K, Ohya K. Osteoclast formation and differentiation: an
overview. J Med Dent Sci. 2012; (59): 65-74
26. Liu W, Zhang X. Receptor activator of nuclear factor-κB ligand
(RANKL)/RANK/osteoprotegerin system in bone and other tissues (Review).
Mol Med Rep (2015), (11) 3212-3218.
27. Zou W1, Reeve JL, Liu Y, Teitelbaum SL, Ross FP. DAP12 couples c-Fms
activation to the osteoclast cytoskeleton by recruitment of Syk. Mol Cell. 2008;
(31): 422-431.
28. Zhuo Y, Gauthier JY, Black WC, Percival MD, Duong LT. Inhibition of bone
resorption by the cathepsin K inhibitor odanacatib is fully reversible. Bone.
2014, (67): 269-280.
29. Hayman AR. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) and the
osteoclast/immune cell dichotomy. Autoimmunity. 2008; (41): 218-223.58
30. Hayman AR, Macary P, Lehner PJ, Cox TM. Tartrate resistant acid
phosphatase (Acp 5): Identification in diverse human tissues and dendritic cells.
J Histochem Cytochem 2001; (49) :675–683
31. Hayman AR, Bune AJ, Cox TM. Widespread expression of tartrate-resistant
acid phosphatase (Acp 5) in the mouse embryo. J Anat 2000; (196) :433–441.
32. Hayman AR. Puriofication and characterization of a Tartrate-Resistant Acid
Phosphatase from human osteoclastomas. Biochem. J. 1989; (261): 601-609.
33. Bartholin L, Destaing O, Forissier S, Martel S, Maguer-Satta V, Jurdic P. et al.
FLRG, a new ADAM12‐associated protein, modulates osteoclast differentiation.
Biol Cell. 2005; (97): 577-588.
34. Yi H, Gruszczynska-Biegala J, Wood D, Zhao Z, Zolkiewska A. Cooperation of
the metalloprotease, disintegrin, and cysteine-rich domains of ADAM12 during
inhibition of myogenic differentiation. J Biol Chem. 2005; (280): 23475-23483.
35. Gu, J. H., Tong, X. S., Chen, G. H., Liu, X. Z., Bian, J. C., Yuan, Y. et al.
Regulation of matrix metalloproteinase-9 protein expression by 1α, 25-(OH)
2D3 during osteoclast differentiation. J Vet Sci. 2014; (15): 133-140.
36. de Vrieze E, Sharif F, Metz JR, Flik G, Richardson MK. Matrix
metalloproteinases in osteoclasts of ontogenetic and regenerating zebrafish
scales. Bone. 2011;(48):704-712.
37. Fujisaki K, Tanabe N, Suzuki N, Kawato T, Takeichi O, Tsuzukibashi O, et al.
Receptor activator of NF-κB ligand induces the expression of carbonic
anhydrase II, cathepsin K, and matrix metalloproteinase-9 in osteoclast
precursor RAW264. 7 cells. Life Sci. 2007;(80):1311-8
38. Andersen TL, del Carmen Ovejero M, Kirkegaard T, Lenhard T, Foged
NT, Delaissé JM. A scrutiny of matrix metalloproteinases in osteoclasts:
evidence for heterogeneity and for the presence of MMPs synthesized by other
cells. Bone. 2004; (35): 1107-1119.
39. Kim T, Ha HI, Kim N, Yi O, Lee SH, Choi Y. Adrm1 interacts with Atp6v0d2 and
regulates osteoclast differentiation. Biochem Biophys Res Commun. 2009;
(390):585-9059
40. Xu J, Cheng T, Feng HT, Pavlos NJ, Zheng MH. Structure and function of V-
ATPases in osteoclasts: potential therapeutic targets for the treatment of
osteolysis. Histol Histopathol. 2007;(4):443-54.
41. Zhang, Chengcheng, et al. "DC‐STAMP, the Key Fusion‐Mediating Molecule in
Osteoclastogenesis." Journal of cellular physiology 229.10 (2014): 1330-1335.
42. Chiu YH, Mensah KA, Schwarz EM, Ju Y, Takahata M, Feng Cet al. Regulation
of human osteoclast development by dendritic cell‐specific transmembrane
protein (DC‐STAMP). J Bone Miner Res. 2012; (1):79-92.
43. Duong, L. T., & Rodan, G. A. Integrin-mediated signaling in the regulation of
osteoclast adhesion and activation. Front Biosci. 1998; (3):d757-68
44. Tian J, Qi W, Zhang Y, Glogauer M, Wang Y, Lai Z. et al. Bioaggregate Inhibits
Osteoclast Differentiation, Fusion, and Bone Resorption in Vitro. J Endod. 2015
(41):1500-6
45. Kleinhans C, Schmid FF, Schmid FV, Kluger PJ. Comparison of
osteoclastogenesis and resorption activity of human osteoclasts on tissue
culture polystyrene and on natural extracellular bone matrix in 2D and 3D. J
Biotechnol. 2015 Jul 10;205:101-10
46. Väänänen K. Mechanism of osteoclast mediated bone resorption—rationale for
the design of new therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 2005; (57):959-71
47. Hemmi H; Okuyama H; Yamane T; S.H. Nishikawa; Nakano T; Yamazaki T;
Kunisada T; S.H Hayashi. Temporal and Spatial Localization of Osteoclasts in
Colonies from Embryonic Stem Cells. Biochem Biophys Res Commun. 2001;
(280):526-34.
48. A.E. Grigoriadis; M. Kennedy; A. Bozec; G. Stenbeck; E.F. Wagner; G. Keller.
Directed differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent
stem cells to functional osteoclasts. J. Bone. 2009 (44):216.
49. Okuyama H; Tsunet M; Yamane T; Yamazaki H; Hayashi S. H. Discrete Types
of Osteoclast Precursors Can Be Generated from Embryonic Stem Cells. J
stem cells. 2003, (21): 670–680.
50. Yamane T, Kunisada T, Yamazaki H, Era T, Nakano T, Hayashi SI..
Development of Osteoclasts From Embryonic Stem Cells Through a Pathway
That Is c-fms but not c-kit Dependent. Blood. 1997; (90):3516-23.60
51. Lentz BR. Polymer-induced membrane fusion: potential mechanism and
relation to cell fusion events. Chem Phys Lipids. 1994 ; (73):91-106.
52. Lentz BR, Lee J. Poly (ethylene glycol) (PEG)-mediated fusion between pure
lipid bilayers: a mechanism in common with viral fusion and secretory vesicle
release? (Review). Mol Membr Biol. 1999 (16):279-96
53. Lentz BR. PEG as a tool to gain insight into membrane fusion. Eur Biophys
J. 2007; (36):315-26.
54. Toker H, Ozdemir H, Balcı H, Ozer H. N-acetylcysteine, a thiol antioxidant,
decreases alveolar bone loss in experimental periodontitis in rats. J Periodontal
Res. 2012 ;(47):793-9
55. Zafarullah M, Li WQ, Sylvester J, Ahmad M. Molecular mechanisms of N-
acetylcysteine actions. Cell Mol Life Sci. 2003; (60):6-20
56. Lee NK, Choi YG, Baik JY, Han SY, Jeong DW, Bae YS. et al. A crucial role for
reactive oxygen species in RANKL-induced osteoclast differentiation.Blood.
2005; (106): 852-859.
57. Chen JR, Lazarenko OP, Shankar K, Blackburn ML, Badger TM, Ronis MJ.. A
role for ethanol‐induced oxidative stress in controlling lineage commitment of
mesenchymal stromal cells through inhibition of Wnt/β‐catenin signaling. J
Bone Miner Res. 2010 ;(25):1117-27
58. Cao JJ, Picklo MJ. N-acetylcysteine supplementation decreases osteoclast
differentiation and increases bone mass in mice fed a high-fat diet. J
Nutr. 2014; (144):289-96
59. Toker H, Ozdemir H, Balcı H, Ozer H. N‐acetylcysteine decreases alveolar
bone loss on experimental periodontitis in streptozotocin‐induced diabetic rats.
J Periodontal Res. 2012; (47):793-9
60. Chen JR, Shankar K, Nagarajan S, Badger TM, Ronis MJ.. Protective effects of
estradiol on ethanol-induced bone loss involve inhibition of reactive oxygen
species generation in osteoblasts and downstream activation of the
extracellular signal-regulated kinase/signal transducer and activator of
transcription 3/receptor activator of nuclear factor-κB ligand signaling
cascade. J Pharmacol Exp Ther. 2008; (324):50-9.61
61. Redlich M1, Roos H, Reichenberg E, Zaks B, Grosskop A, Bar Kana I, et al.
The effect of centrifugal force on mRNA levels of collagenase, collagen type‐I,
tissue inhibitors of metalloproteinases and β‐actin in cultured human
periodontal ligament fibroblasts. J Periodontal Res. 2004; (39):27-32.
62. The university Nottingham. [homepage en Internet]. United Kingdom; university
Nottingham; c2014 [actualizada 19 Noviembre 2014; consultado 21 febrero
2016]. Disponible en: http://www.nottingham.ac.uk/
63. Roberts WE, Jee WS. Cell kinetics of orthodontically-stimulated and non-
stimulated periodontal ligament in the rat. Arch Oral Biol. 1974;(19):17-21.
64. Udagawa, N., Kotake, S., Kamatani, N., Takahashi, N., Suda, T. The molecular
mechanism of osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis Res.
2002; (4): 281-289.
65. Weitzmann, M.N., Cenci, S., Rifas, l., Haug, J., Dipersio, J., and Pacifici, R. T
Cell activation induces human osteoclast formation via receptor activator of
nuclear factor kB ligand–dependent and independent mechanisms. J. Bone
Miner. Res. 2001;(16): 328-337.
66. Yuasa K, Mori K, Ishikawa H, Sudo A, Uchida A, Ito Y. Characterization of two
types of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. Bioch. Bioph.
Res. Commu. 2007; (356): 354–360.
67. Udagawa N. The mechanism of osteoclast differentiation from macrophages:
possible roles of T lymphocytes in osteoclastogenesis. J Bone Miner Metab.
2003;(21):337-43.
68. Castillo lm. Evaluación de la expresión y fosforilación de c src, syk y el re-
arreglo de actina asociados con la actividad resortiva de cmnsp fusionadas con
polietilenglicol. Bogota 2010. Tesis Facultad de Medicina. Universidad
Nacional.
69. Alnaeeli, M. Penninger, J, .M., Yen-Tung, A,.T. Immune interactions with CD4+
T cells promote the development of functional osteoclasts from murine CD11c
dendritic cells. J. Immunology. 2006; (177): 3314–3326.
70. Wang, TM., Jee, WS., Woodbury, LA., and Matthews, JL. Effects of
phytohemagglutinin-P (PHA-P) on bone of the growing rat. Metab. Bone. Dis.
Relat. Res. 1982; (4):193-199
71. Manrique E. G. Evaluación del efecto de fármacos antirresortivos en el fenotipo
y actividad resortiva de células mononucleares de sangre periférica humanas62
fusionadas con polietilenglicol. Bogotá 2007. Tesis para obtener el título de
Maestría. Facultad de Medicina. Universidad Nacional
72. Monck, J.R., and Fernandez, J.M. The fusion pore and mechanisms of
biological membrane fusion. Current. Opin. Cell. Biol. 1996; (8):524-533.
73. Young-Yun, K. et al. Activated T cells regulate bone loss and joint destruction in
adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand. J. Cell Biochem. 1999; (72):
67-80
74. Nicholson GC, Malakellis M, Collier FM, Cameron PU, Holloway WR, Gough
TJ,. Induction of osteoclasts from CD14-positive human peripheral blood
mononuclear cells by receptor activator of nuclear factor B ligand (RANKL).
Clin. Sci. 2000; (99): 133–140.
75. Kanzaki H, Chiba M, Sato A, Miyagawa A, Arai K, Nukatsuka S, et al.
Periodontal Ligament Cells Under Mechanical Stress Induce
Osteoclastogenesis by Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand
Up‐Regulation via Prostaglandin E2 Synthesis. J Dent Res. 2006; (85):457-62.
76. Nakao K, Goto T, Gunjigake KK, Konoo T, Kobayashi S, Yamaguchi K.
Intermittent force induces high RANKL expression in human periodontal
ligament cells. J. Dent Res 2007; (86): 623-628.
77. Ichimiya H1, Takahashi T, Ariyoshi W, Takano H, Matayoshi T, Nishihara T.
Compressive mechanical stress promotes osteoclast formation through RANKL
expression on synovial cells. Oral Surg, Oral Med, Oral Pathol, Oral Radiol
Endod. 2007; (103): 334-341.
78. Rubin J, Murphy T.C, Fan X, Goldschmidt M, Taylor W.R. Activation of
extracellular signal-regulated kinase is involved in mechanical strain inhibition
of RANKL expression in bone stromal cells. J Bone Miner Res. 2002; (17):
1452–1460.
79. Rubin J, Murphy TC, Zhu L, Roy E, Nanes MS, Fan X.. Mechanical strain
differentially regulates endothelial nitric-oxide synthase and receptor activator of
nuclear kappa B ligand expression via ERK1/2 MAPK. J Biol Chem, 2003;
(278):34018–34025.
80. Kook SH, Son YO, Hwang JM, Kim EM, Lee CB, Jeon YM et al. Mechanical
force inhibits osteoclastogenic potential of human periodontal ligament
fibroblasts through OPG production and ERK‐mediated signaling. J. Cellular
Biochem, 2009; (106): 1010-1019.
81. Xu XY, Guo C, Yan YX, Guo Y, Li RX, Song M, et al. Differential effects of
mechanical strain on osteoclastogenesis and osteoclast-related gene
expression in RAW264. 7. Cells. Mol Med Rep, 2012;(6): 409-415.63
82. Krishnan V, Davidovitch Z.. Cellular, molecular, and tissue-level reactions to
orthodontic force. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2006; (129):469.e1-32.
83. Gu G, Lemery SA, King GJ. Effect of appliance reactivation after decay of initial
activation on osteoclasts, tooth movement, and root resorption. Angle
Orthod. 1999 ;(69):515-22.
84. Rody WJ Jr, King GJ, Gu G. Osteoclast recruitment to sites of compression in
orthodontic tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2001; (120):477-
89.
85. N-acetylcysteine Introduction. Alternative Medicine Review. Volume 5, Number
5. 2000. Disponible en: http://www.altmedrev.com/publications/5/5/467.pdf6465
Evaluación de la capacidad de diferenciación de células de
sangre periférica hacia el linaje osteoclástico en diferentes
tiempos de aplicación de fuerza tensil.
Evaluation of differentiation ability of peripheral blood cells towards osteoclast
lineage at different times of application of tensile strength.
María Alejandra Montero Córdoba.1 Natalia Carrillo Mendigaño.2
1. Odontóloga. Residente Ortodoncia. Universidad Nacional de Colombia. mamonteroc@unal.edu.co
2. Ortodoncista. Magister en Ciencias Biológicas. Docente Universidad Nacional de Colombia.
ncarrillom@unal.edu.co
Resumen
Introducción y objetivos: Los Osteoclastos se encuentran muy relacionados con
el movimiento dental ortodóntico, ya que activan el proceso de remodelado óseo
involucrando eventos de resorción. El objetivo de este estudio fue evaluar la
capacidad de diferenciación de células mononucleares de sangre periférica
(CMNSP) hacia el linaje osteoclástico en diferentes tiempos de activación con
fuerzas tensiles
Materiales y métodos: Células mononucleares de sangre periférica (CMNSP)
fueron aisladas mediante un gradiente de Fycoll-Hypaque y estimuladas con 10
µg/ml de fitohemaglutinina (PHA) durante 72 h. Un grupo de células fue sometido
a fuerzas de 5,28g/cm2 y otro grupo de células fueron fusionadas con
Polietilenglicol (PEG), Las células fueron tratadas o no con N-acetilcisteína (NAC)
y evaluadas en un periodo de 3, 5 y 7 días. Se evaluó la actividad de la enzima
tartrato resistente (TRAP), la expresión del marcador Integrina ß3, y la actividad
resortiva
Resultados: Se encontró que al fusionar células con PEG, o aplicar una fuerza a
células no fusionadas por 3, 5 y 7 días se inducen marcadores característicos de
células osteoclásticas y actividad resortiva, siendo el día 7 el de mayor expresión.
También se determinó que NAC es un potente inhibidor de las actividades
relacionadas con células resortivas.
Conclusión: Fusionar células con PEG, o aplicar fuerza a células no fusionadas
por 3,5 y 7 días, se inducen marcadores característicos de células osteoclásticas y
actividad resortiva.
Palabras clave: Osteoclasto. Resorción, Movimiento dental, Células
mononucleares, Polietilenglicol, N-acetilcisteina.66
Abstract
Introduction and objectives: Osteoclasts are related to orthodontic tooth
movement, as they activate the process of bone remodeling events involving
resorption. The aim of this study was to evaluate the ability of differentiation of
peripheral blood mononuclear cells (PBMC) to the osteoclast lineage in different
activation times with tensile forces
Materials and Methods: Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were
isolated by a gradient of Fycoll-Hypaque and stimulated with 10 µg/ml
phytohemagglutinin (PHA) for 72 h. A group of cells was subjected to forces 5,28g
/ cm2 and another group of cells were fused with polyethylene glycol (PEG), cells
were treated or not with N-acetylcysteine (NAC) and evaluated over a period of 3,
5 and 7 days. Activity tartrate-resistant enzyme (TRAP), marker expression Integrin
ß3, and resorptive activity was evaluated.
Results: It was found that by fusing cells with PEG, or apply a force to unfused
cells by 3, 5 and 7 days, The cells showed markers characteristic of osteoclast
cells and resorptive activity, the day 7 showed higher expression. It also found that
NAC is a potent inhibitor related activities resorptive cells.
Conclusion: Fuse cells with PEG, or apply force to unfused cells for 3, 5 and 7
days, markers characteristic osteoclastic cells are induced and resorptive activity.
Keywords: osteoclast. Resorption dental movement, mononuclear cells,
Polyethylene glycol, N-acetylcysteine.67
Introducción mononucleares de sangre periférica y
células de origen monocito-
El mantenimiento de la homeostasis macrófago sometidas a fuerzas y
ósea es crucial para el adecuado fusionadas con polietilenglicol (PEG)
desarrollo del esqueleto durante toda presentan actividad
la vida, éste depende de la osteoclástica(3)(4)(5).
interacción continua entre los
osteoclastos, que degradan o Ante la aplicación de un estímulo
reabsorben el hueso, y los mecánico sobre el diente se generan
osteoblastos, que forman hueso. Los factores que estimulan la
orígenes de estas células están bien diferenciación osteoclástica en el LP
establecidos, los osteoblastos se permitiendo el movimiento dental,
derivan de células madre pero aún no está bien establecido el
mesenquimales, mientras los origen exacto de estas células, se
osteoclastos son células altamente sugiere que pueden derivar de la
especializadas, multinucleadas que activación de osteoclastos ya
se derivan de las células madre maduros presentes en el LP o de la
hematopoyéticas, específicamente a proliferación de células madre de
partir de células del linaje monocito- tejidos hematopoyéticos distantes o
macrófago(1). Estos dos tipos de las células madre locales(6),
celulares, se encuentran muy también se ha indicado que la tasa de
relacionados con el movimiento reclutamiento o la diferenciación de
dental ortodóntico, ya que una vez osteoclastos podría depender del
aplicada una fuerza ortodóntica sobre régimen de la fuerza y del nivel de
el diente se desencadenan una serie fuerza aplicada sobre el diente(7)
de fenómenos que activan el proceso Por lo tanto es importante evaluar si
de remodelado óseo involucrando la diferenciación de las células
eventos de resorción y aposición mononucleares de sangre periférica
ósea lo que permite el (CMNSP) hacia el linaje osteoclástico
desplazamiento dental. es constante o presenta alguna
modificación al aplicar una fuerza y al
Sistemas que involucran factores fusionarlas con PEG en diferentes
mecánicos han sido utilizados para periodos de tiempo, obteniendo un
lograr la diferenciación de modelo sencillo y fácil de reproducir
osteoclastos; se ha reportado en la para el estudio de la actividad
literatura que ante un estímulo resortiva semejante al que puede
mecánico las células del ligamento ocurrir en un tratamiento ortodóntico.
periodontal (LP) apoyan la
osteoclastogénesis(2). Estudios Materiales y métodos
realizados en el laboratorio de
Muestra: células mononucleares
Biología Molecular de Virus de la
de sangre periférica (CMSP)
Facultad de Medicina de la UNAL
Las células mononucleares de
sugieren que células fibroblastoides
sangre periférica se adquirieron
de origen gingival, células
tomando una muestra de 20 mL de68
sangre periférica de un donante
voluntario, de 27 años de edad,
Cultivo de CMSP
género femenino, sano
Las células se cultivaron en cajas
sistémicamente, mediante punción en
Petri con medio RPMI 1700
el pliegue anterior del brazo, con un
suplementado con SFB (suero fetal
jeringa previamente heparinizada con
bovino) al 10 % (v/v), en presencia
2µL de heparina sódica 5000 UI en
de 10 µL de Fitohemaglutinina (PHA)
5mL. Posteriormente se diluyo con 30
con el fin de estimular Linfocitos T, se
mL de RPMI 1700 y se agregó Fycoll-
llevaron a incubadora a 37°C, 95%
Hypaque en una proporción de 1:3
de humedad y atmosfera de CO al
2
(v:v) se centrifugo a 1200 r.p.m
5%. Luego de 72 horas de cultivo se
durante 30 minutos. Mediante una
recolectaron las células en
pipeta se tomó la interface opaca que
suspensión y las adherentes las
contiene las CMNSP depositándolas
cuales fueron desprendidas con una
en un nuevo tubo. Se realizaron tres
solución de PBS-EDTA 1mM (p/v)
lavados con medio RPMI 1700 y se
por 10 minutos a 37°C.
centrifugaron a 1200 rpm durante 6
Posteriormente las células fueron
minutos cada uno.
lavadas con medio libre de SFB y
centrifugadas a 1200 r.p.m. durante 5
minutos.
División de la muestra
La muestra de dividió en 6 grupos.
Fusión celular con PEG
7. CMNSP no fusionadas, no
Luego de la centrifugación se eliminó
tratadas con fuerza (control
el sobrenadante y se colocó el tubo
negativo) (-fu, –F)
sobre gasa estéril para eliminar todo
8. CMNSP no fusionadas, no
residuo de RPMI y evitar diluir el
tratadas con fuerza, con NAC
polietilenglicol (PEG). Se agregó 50
(-fu, -F, + NAC)
µL de PEG de peso molecular 3000,
9. CMNSP no fusionadas
previamente calentado a 37º C, se
tratadas con fuerza (F)
agito suavemente, mediante golpes
10. CMNSP no fusionadas
con el dedo en la base del tubo,
tratadas con fuerza, con NAC
para homogenizar el botón celular en
(F +NAC)
el PEG y se llevó a 37º C durante 5
11. CMNSP fusionadas con PEG
minutos. A partir de ese momento
(control positivo) (PEG)
se adicionó 40µL de RPMI cada
12. CMNSP fusionadas con PEG,
60 segundos por 5 minutos,
con NAC (PEG +NAC)
posteriormente 80 µL de PRMI
durante 5 minutos y 160 µl de RPMI
Para cada grupo se utilizaron 12
durante 5 minutos, Posteriormente
láminas de hueso los cuales fueron
las células se centrifugaron por 5
evaluadas en tres tiempos diferentes:
minutos a 1200 rpm y se lavaron
al 3, 5 y 7 día
dos veces con RPMI para retirar el
PEG. Posteriormente se69
suspendieron en medio de cultivo adhesión de las células se dejaron
RPMI suplementado en SFB al 10% durante 4 horas en incubadora a
La técnica de fusión, los volúmenes 37°C, 95% de humedad y atmosfera
del medio y los tiempos se llevaron a de CO al 5%. Trascurrido este
2
cabo siguiendo el protocolo de tiempo se agregó 400µL de medio
Moniere- Faugere et al. 2001 con SFB al 10% en cada pozo, para
los grupos de células tratadas con
NAC, se agregó 30Mm a cada pozo
Láminas de hueso
de preparado de NAC con PBS.
Se utilizó hueso cortical de pelvis
bovina, el cual se cortó
transversalmente con sierra, se pulió
Aplicación de fuerza
con esmeril, discos de carburo de
Los grupos a los que se les aplico
grano grueso y fino y piedra rosada
fuerza (+F), (24 en total), se
hasta obtener laminas con un área de
posicionaron en un motor rotatorio
2
6mm y grosor de 0.5mm.Estas horizontal (Rototorque –
laminas se sumergieron en una ColeParmer®) a velocidad No. 8 (44
solución de SDS (Dodecil sulfato de r.p.m), trascurrido 3 días se retiraron
sodio) al 10% por 8 horas bajo las 8 láminas y se fijaron las células
agitación continua, se lavaron doce con 43µL de formaldehido diluido en
veces con agua destilada hasta 400 µL de PBS. Así mismo de
eliminar totalmente el detergente, procedió con los diferentes grupos.
posteriormente se esterilizaron con Para los días 5 y 7, se siguió el
etanol al 70% por 60 minutos y mismo protocolo. Para determinar la
finalmente se lavaron dos veces con fuerza a la cual fueron sometidas las
medio RPMI suplementado con 10% células se utilizó la formula descrita
SFB. Las cajas fueron esterilizadas en el artículo ya publicado(61). Al
finalmente con luz ultravioleta durante calcular la fuerza ejercida sobre las
un día. células se estableció que fue de
2
5.28 gr/cm .
Siembra
Se utilizaron 12 láminas de hueso
para cada grupo evaluado,
realizando la siembra en tres cajas Donde P es la presión en Kg por
de 24 pozos cada una, se colocaron 2
cm , m: la masa del medio, r: el
aproximadamente 450 células en
radio del motor rotatorio, r.p.m:
35µL con un porcentaje de viabilidad
revoluciones por minuto y A: el área
del 100%.
de contacto entre el medio y las
A cada lamina de hueso estéril del células.
grupo de fusión (24 en total), se les
Siendo m= 0.015 gr, r= 0.065m,
aplico 10 µL de la suspensión de
2
células fusionadas con PEG en 30 µL A=4 cm y r.p.m=44
de medio de cultivo; para permitir la70
Fijación La coloración TRAP de acuerdo a
las concentraciones de los reactivos
Cada grupo de células se fijaron al 3,
y de los tiempos de incubación
5 y 7 día con 43 µL de Formaldehido,
varían entre una coloración rojo
dejándolas con 400 µL de PBS a
ladrillo, café y rojo violeta. Para
temperatura ambiente.
evaluar la actividad TRAP, se hizo
Posteriormente se evaluó la actividad
un conteo de las células coloreadas
de la enzima TRAP, se realizó
en las láminas de hueso cortical
prueba de inmunofluorescencia para
bovino, de cada uno de los grupos
el anticuerpo: Integrina β y por
3
evaluados en este proyecto. El
último se realizó evaluación de la
conteo se realizó en toda la
actividad resortiva.
superficie de la lámina ósea, en un
microscopio de luz Vanguard®, con
un objetivo de 40x.
Determinación de la fosfatasa
ácida resistente al tartrato (TRAP).
Este procedimiento fue realizado
Inmunofluorescencia indirecta
según protocolo del grupo de
Se realizó la prueba de
investigación de patología de la
inmunofluorescencia indirecta sobre
universidad de Nottingham(8), se
los siguientes grupos: 1. CMNSP no
retiró el PBS en el que se
fusionadas, no tratadas con fuerza (-
encontraban las láminas óseas y se
fu, -F), 2. CMNSP no fusionadas, no
dejó secar al medio ambiente. Para
tratadas con fuerza + NAC (-fu, -F),
obtener la tinción, primero se
3. CMSP no fusionadas tratadas con
preparó el buffer veronal 10 mL que
fuerza, (F) 4. CMNSP no fusionadas
contenía barbitona de sodio (ácido
tratadas con fuerza + NAC (F+NAC).
barbitúrico 0.006625 g y 0,01375 g
Para determinar la expresión del
de NaOH) y 0,048375 g de acetato
marcador integrina β3 generado en
de sodio. A este buffer veronal se
cabra. Las láminas de hueso fueron
le adicionó 0,0291 g de tartrato de
lavadas 3 veces con una solución de
sodio-potasio, luego, se agregó una
PBS, dejando 2 minutos entre cada
solución formada por 375 µL de
lavado, a cada lamina se agregó 30
pararrosanilina hexasotizada y 375
μL de la solución con el anticuerpo
µL de nitrito de sodio en hielo.
primario y se incubo durante 1 hora
Después, se adicionó 0,00475g de
en cámara húmeda. Las láminas se
naftol fosfato MX-ASB1 (Sigma-
lavaron nuevamente 3 veces con
Aldrich), usado como sustrato de la
solución de PBS y se secaron por
enzima TRAP. A esta solución se le
debajo con una servilleta y se
ajustó el pH a 4.6 +/- 0.2.usando
cambiaron de caja. Se agregó 30 μL
ácido clorhídrico. Cada lámina fue
de solución de anticuerpo secundario
incubada con 300 μL de esta
FITC anti-cabra, (2 μg/mL, Santa
solución a 37 ° C durante 2 h, se
R
hizo un solo lavado con agua Cruz Biotechnology ), junto con la
destilada y se dejaron secar a tinción DAPI y se incubo durante 30
temperatura ambiente. minutos en cámara húmeda y en total71
oscuridad. Se lavaron 3 veces con H2O) por 30 minutos. El hueso se
PBS cada 2 minutos. La lámina ósea decoloro con una mezcla de
se colocó sobre una laminilla porta metanol, ácido acético y agua
objetos, sobre las láminas de hueso (50:10:30%, V/V) dejándolo actuar
se colocó una laminilla cubre objetos, por 15 minutos. Finalmente, las
se colocó aceite de inmersión y se láminas fueron lavadas con agua
observó la inmunofluorescencia en un destilada bajo agitación continua y
microscopio Vanguard® con un se secaron a temperatura ambiente.
objetivo 100x. Toda la superficie de Para realizar el conteo se tomaron
cada una de las láminas óseas fue fotos representativas de cada grupo,
evaluada y se tomaron varias fotos evaluadas con el objetivo 40X en un
representativas para cada grupo. microscopio de luz Vanguard®, con
Para detectar la positividad de la una cámara Panasonic® DMC-FHS.
prueba, se observaron primero las Se contó el número de lagunas de
células con luz blanca y estas reabsorción en cada campo y se
mismas deberían emitir fluorescencia describió su morfología.
cuando fueran observadas con el
lente indicado para esto. Si no había
presencia de ninguna masa Análisis estadístico
fluorescente se declaró negativa para Todos los datos se presentan como el
dicho marcador. promedio calculado de 4 repeticiones
en cada uno de los grupos evaluados
en tres periodos de tiempo: al 3, 5 y 7
Evaluación de la actividad día. Las comparaciones estadísticas
resortiva entre los grupos de tratamiento se
realizaron mediante análisis de
Para poder observar las lagunas de
varianza ANOVA de Doble vía
reabsorción se procedió primero a
complementado con un test de
retirar las células de las láminas
comparaciones múltiples de Fisher.
óseas. Para lisar las células se utilizó
Los resultados se consideraron
el detergente SDS al 10% (dodecil-
estadísticamente significativos con un
sulfato sódico), esta solución se dejó
valor p < 0.05.
por 30 minutos bajo agitación
continua, luego se procedió a
Resultados
desprender mecánicamente las
Expresión de la enzima TRAP al 3,
células y residuos persistentes
5 y 7 día de cultivo
utilizando un cepillo dental de cerdas
suaves, se lavaron con agua
destilada cinco veces, bajo agitación Durante la observación al
continua. microscopio de todas las láminas
óseas se identificaron en todos los
Posteriormente las láminas fueron
grupos evaluados masas de células
teñidas con el colorante azul de
morfológicamente irregulares, de
Coomassie (0.25% Coomassie, 50%
tamaño variable, con una coloración
metanol, 10% ácido acético 40%
que vario de una tonalidad café a72
rojo ladrillo presentando diferentes comparándolo con el grupo –fu, -F;
intensidades de color. la cantidad de células TRAP
positivas incrementó al día 5 y 7 de
En las láminas óseas del grupo PEG
cultivo para ambos grupos. Al
se observó que las células se
análisis estadístico se encontró una
encontraban agrupadas en masas de
diferencia estadísticamente
mayor tamaño, con forma irregular y
significativa comparando la cantidad
con alta intensidad de coloración. El
de células TRAP positivas en los
patrón de ubicación fue uniforme en
días 3 y 5 y entre los días 3 y 7, pero
todo el recorrido del hueso (Imagen
no entre los días 5 y 7, para ambos
1. A.B) a diferencia del grupo de F
grupos (tablas 4 y 5).
(grupo de aplicación de fuerzas), en
las que se observaron pequeños Los grupos que fueron tratados con
grupos celulares, algunos NAC, (F+NAC) y (PEG+NAC),
redondeados y ubicados presentaron una evidente
predominantemente en la periferia disminución del número de células
del hueso, en estas láminas se TRAP positivas comparados con los
observaron variaciones en la grupos sin aplicación de NAC: F y
intensidad de color.(Imagen 1. C.D). PEG (tablas 6 y 7). Por otra parte, al
Para los grupos tratado con NAC se comparar los grupos F+NAC y
observaron en su mayoría grupos PEG+NAC con el grupo control
celulares pequeños y dispersos con negativo (–fu,-F) no se observaron
una intensidad baja del color. diferencias estadísticamente
(Imagen 1 E.F.G.H) significativas en el número de
células TRAP positivas (tablas 8 y 9)
La cantidad de células TRAP
positivas tanto en el grupo F, como
en el grupo PEG fue mayor en
Evaluación de la actividad
comparación al grupo que no se
resortiva al 3, 5 y 7 día de cultivo
fusiono ni fue sometido a fuerza(-fu,
–F), en los tres periodos de tiempo Una vez retiradas las células del
evaluados (3, 5 y 7 día de cultivo), hueso y teñidas con azul de
presentando una diferencia Coomassie se procedió a observar al
estadísticamente significativa entre microscopio las lagunas de
ellos (Tabla 1 y 2). reabsorción formadas por estas en
cada uno de los grupos evaluados.
Por otra parte, no se observaron
diferencias estadísticamente Las láminas de hueso del grupo
significativas al comparar el número celular PEG mostraron un número
de células TRAP positivas elevado de lagunas de reabsorción,
encontradas en los grupos F y PEG con un patrón de forma irregular sin
a los 3, 5 y 7 días. (tabla 3). bordes definidos; aunque las lagunas
tenían tamaños variables,
Tanto en el grupo F como en el
predominaron las de mayor tamaño y
grupo PEG se observó un aumento
de gran profundidad fácilmente
significativo de células TRAP
visibles durante el recorrido del
positivas al día 3 de cultivo73
hueso. (Imagen 2. A.B).Mientras que significativa en el número de lagunas
en el grupo de PEG +NAC se de reabsorción en comparación con
observaron pocas cantidades de los grupos F y PEG, respectivamente
lagunas de menor tamaño, (tabla 13 y 14)
igualmente amorfas (Imagen2 C.D)
Las lagunas de reabsorción para el
Al evaluar las láminas de hueso del grupo F y PEG se presentaron a
grupo celular F, se encontraron partir del 3 día de cultivo, el número
lagunas de reabsorción con bordes se incrementó para los días 5 y 7 en
difusos, de menor tamaño y ambos grupos. Se encontró diferencia
superficiales, en algunas láminas las estadísticamente significativa al
lagunas se observaron agrupadas en comparar el número de lagunas del 3
forma de racimo y en otras láminas día con el 5 día, del 3 día con el 7 día
se encontraron aisladas (Imagen 2. y del 5 día con el 7 día, tanto para el
E.F), en el grupo de F+NAC. Se grupo F como para el de PEG. (Tabla
encontraron lagunas en un número 15 y 16)
reducido, superficiales y aisladas
(Imagen 2 G.H)
Evaluación de la expresión del
Realizando una comparación en el
marcador osteoclástico integrina
número de lagunas de reabsorción
β3 al 3, 5 y 7 día de cultivo.
del grupo PEG y el grupo control
negativo (–fu, -F), se encontró que Durante la evaluación de los
existe una diferencia marcadores por
estadísticamente significativa entre inmunofluerescencia, se observó que
ellos, siendo PEG el de mayor el grupo tratado con fuerza presentó
número, en cada uno de los días fluorescencia leve para el marcador
evaluados. (tabla 10), igualmente de integrina β3. Las zonas
ocurrió en el grupo F, en donde el fluorescentes se observaron de
número de lagunas de reabsorción tamaño pequeño, asemejando células
fue mayor comparándolo con el aisladas con forma irregular sin
grupo control negativo (-fu, F), bordes definidos. Estas pequeñas
encontrándose una diferencia masas de observaron en la periferia
estadísticamente significativa en los de la lámina ósea. (Imagen 3 A) El
tres periodos de observación (tabla porcentaje de fluorescencia
11). Las láminas óseas del grupo encontrado en el grupo de fuerza fue
PEG y del grupo F mostraron de 5%, 15% y 25% al 3, 5 y 7 días
cantidades de lagunas de reabsorción respectivamente, es decir que
similares, en donde la diferencia entre incremento con el tiempo. En los
ambos grupos no fue grupos control negativo (-fu, -F) y los
estadísticamente significativa en el 3 tratados con NAC no se evidenció
y 7 día de cultivo.(tabla 12). Los ningún tipo de fluorescencia en todo
grupo tratados con NAC: ((F+ NAC) y el recorrido de la lámina ósea para
(PEG + NAC)) presentaron una los tres periodos de tiempo
disminución estadísticamente evaluados.(Imagen 3. B.C)74
Discusión fitohemaglutinina, Estudios realizados
in vivo e in vitro han mostrado que los
La resorción ósea desencadenada
procesos de diferenciación
por los osteoclastos es crucial para
osteoclastogénica están asociados
generar un movimiento dental
con un incremento y activación de la
ortodóntico, Roberts (9) afirma que
población de linfocitos T. Se ha
"la resorción ósea es el factor que
encontrado que estas células
limita la velocidad de movimiento de
producen citocinas como el RANKL,
los dientes", por lo tanto, la velocidad
la interleucina -17, factor estimulante
a la que un diente se puede mover a
de colonias de granulocitos y
través del hueso podría estar
macrófagos (FSC-GM) y el interferón
restringido principalmente por el
(IFN) gamma, que tienen efectos
número y la actividad de los
reguladores de gran alcance en la
osteoclastos. Basados en esto, la
osteoclastogénesis.(12)(10)(13). Con
aparición de los osteoclastos se
esta premisa se han desarrollado
considera paso necesario e
modelos para la generación de
importante para que ocurra el
osteoclastos utilizando CMNSP
movimiento dental; por esto es
agregándoles fitohemaglutinina(PHA)
importante para los ortodoncistas
lo que estimula la proliferación de
entender el efecto de la fuerza en la
linfocitos T, logrando obtener
activación de los osteoclastos
osteoclastos a partir de
Los osteoclastos son grandes células monocitos.(11)(14). Además se ha
gigantes multinucleadas que reportado que la presencia del
expresan actividad de la fosfatasa marcador CD13 y CD14 en las
ácida tartrato resistente (TRAP) y CMNSP estimuladas con PHA,
tienen la capacidad de formar sugiere que existen poblaciones
cavidades de resorción en hueso y reportadas como precursores in vitro
dentina. Estos osteoclastos se de células similares a osteoclastos,
derivan a partir de progenitores como son las células
hematopoyéticos del linaje de mielomonocito/dendríticas y los
monocitos-macrófagos (10).En este monocitos CD14.(15).
experimento se utilizaron células
Los efectos del estímulo con PHA en
mononucleares de sangre periférica
la resorción han sido descritos en
CMNSP humanas que comprenden
osteoclastos extraídos de huesos de
una población mixta de células
ratones adultos, en donde un
mononucleares que contiene
incremento en el número de estas
monocitos / macrófagos, precursores
células y de su actividad resortiva, ha
tempranos de los osteoclastos del
sido asociado a la presencia de la
linaje de monocitos, y linfocitos T y B.
PHA(16). Lo anterior podría explicar
las CMNPS, no contienen células
porque algunas CMNSP no
estromales o precursores de células
fusionadas utilizadas como el control
del estroma. (11)
negativo presentaron positividad en el
Las CMNSP fueron cultivadas con análisis de la enzima TRAP, ya que
adición al cultivo de estas fueron estimuladas con PHA75
por 72 horas. De igual manera la célula multinucleada, con actividad
presencia de la PHA, ayudaría a similar a los osteoclastos debido a
incrementar y mantener la función sus dos funciones importantes como
resortiva de las CMNSP en el tiempo. son la de agregar las células, cuando
extrae el agua entre las membranas
y la de aumentar la fuerza osmótica,
Los datos obtenidos durante el generando la fusión de las
experimento muestran que las membranas celulares. (18). Estos
CMNSP obtenidas a partir de la resultados igualmente son
fusión con PEG y luego de concordantes con otros estudios
someterlas a fuerza expresaron la donde las CMNSP son estimuladas
enzima fosfatasa ácida tartrato con factores osteoclastogénicos o
resistente (TRAP) y fueron capaces calcitrópicos para diferenciarlas en
de formar lagunas de reabsorción en células similares a
las láminas óseas donde estuvieron osteoclastos(12)(19)(20). Sin
cultivadas por 3, 5 y 7 días. embargo en nuestro estudio
obtuvimos células resortivas sin
En la evaluación de la expresión de
necesidad de estos factores
la enzima TRAP y la reabsorción
demostrando un modelo fácil de
ósea, las células pertenecientes al
reproducir y más económico para el
grupo PEG, se observaron como
estudio del proceso de reabsorción.
grandes agrupaciones celulares, con
una coloración en su mayoría En el experimento se determinó que
intensa que varió de rojo ladrillo a la actividad resortiva del grupo de
café, característica de células TRAP células PEG fue mayor al 7 día de
positivas, además las láminas óseas observación concordando con los
en donde fueron sembradas resultados de Castillo y col. (14)
presentaron grandes y profundas donde se cultivaron las CMNSP por
lagunas de reabsorción. Estos 14 días concluyendo que al día 7 se
resultados son similares a los presentó un alto porcentaje de áreas
descritos por anteriores estudios resortivas la cual se mantuvo
donde se sugiere que el tratamiento constante, sin un aumento
de CMNSP con PEG puede inducir representativo hasta los 14 días.
la formación de células
En el estudio realizado, Las CMNSP
multinucleares y la reabsorción ósea
humanas responden ante fuerzas
(14)(5)(17), igualmente, el
mecánicas activándose en células
tratamiento de monocitos de la línea
similares a osteoclastos, siendo
tumoral U937/A y J/774 (4) y de
TRAP positivas, con capacidad de
fibroblastos humanos (3) con PEG
reabsorción. En los resultados de la
promueve la formación de células
evaluación de la enzima TRAP estas
con actividad TRAP positiva y la
células se observaron de menor
reabsorción ósea. Basados en estos
tamaño que las observadas en el
resultados, se sugiere que PEG
grupo PEG agrupadas pero no
induce fusión celular
fusionadas y localizadas en su
eficientemente produciendo una76
mayoría en la periferia. Este grupo de estas células se cultivaran con
células formaron lagunas de células de médula de ratón en
reabsorción igualmente pequeñas y presencia del factor estimulante de
superficiales, estos resultados son colonia (FSC-M). Por otra parte, estos
similares a los encontrados en mismos autores reportan que la
anteriores estudios donde se tensión mecánica no apoyaba la
utilizaron CMNSP(5) y fibroblastos osteoclastogénesis, esta premisa es
humanos(3), ambos con métodos afirmada por otras investigaciones en
similares a los utilizados en el las que refieren que la aplicación de
presente estudio. fuerzas tensiles inhiben la formación
de osteoclastos por la disminución de
A este respecto, múltiples autores
la expresión de RANKL en células
han reportado que diferentes
estromales de la médula(24)(25).
sistemas que involucran factores
mecánicos han sido utilizados para También se ha reportado que fuerzas
lograr la diferenciación de centrífugas estimulan la producción
osteoclastos. Sin embargo de osteoprotegerina (OPG) en
dependiendo de la naturaleza y fibroblastos gingivales lo cual
magnitud de la fuerza se activan igualmente inhibe la formación de
señales que pueden o no, apoyar el células similares a osteoclastos, pero
proceso de osteoclastogénesis. en este mismo estudio se encontró
Kanzaki H. et al(21) refieren que las que fibroblastos del ligamento
fuerzas compresivas aplicadas sobre periodontal, si lograron inducir un
fibroblastos del ligamento periodontal gran número de células
(LP) promueven la producción de multinucleadas TRAP positivas en co-
citoquinas inflamatorias lo que cultivo con células de médula ósea de
aumenta la expresión de RANKL ratón, en presencia de
sobre estas células que cultivadas Dexametasona y vitamina D,
con precursores osteoclásticos como causando niveles elevados de
CMNPS permiten la diferenciación RANKL por parte de los
osteoclastogénica. Igualmente Nakao fibroblastos(26).
y col(22) reportan que una fuerza de
Todos los estudios mencionados
compresión optima e intermitente y
previamente fueron realizados
no continua aplicada sobre un cultivo
mediante co-cultivos de células que
de fibroblastos del LP promueve la
expresan RANKL (como fibroblastos
expresión de IL-1, esta señal
de LP y células estromales) con
aumenta la expresión de RANKL,
precursores osteoclásticos
induciendo directamente la
acompañados generalmente de algún
osteoclastogénesis en precursores
estímulo externo como FSC-M,
osteoclásticos. Ichimiy H. et al. (77)
RANKL, Vitamina D3, dexametasona,
reportaron que la compresión
entre otros de tal forma que no se
mecánica estática, aplicada sobre
establece si es la fuerza la que genera
células sinoviales promueve la
directamente la sobreexpresión de
formación de osteoclastos a través de
RANKL o son las citoquinas
la expresión de RANKL, luego de que77
agregadas en los cultivos. Con este estímulo de una fuerza compresiva
estudio proponemos un nuevo modelo aplicada sobre células del LP en
de generación de células con actividad cocultivo con CMNSP, el número de
osteoclástica debido a que no se células TRAP positivas se maximiza
utilizó ningún agente externo y con cargas más pesadas y de mayor
tampoco se generó un cocultivo, es duración (2 g / cm2 y 24 h),
decir que la fuerza que actuó Ichimiya(23) también concluyo que
directamente sobre las CMNSP logró fuerzas compresivas de 2g/cm2
diferenciarlas hacia células con aplicadas por 12 horas a un co-cultivo
actividad resortiva. de células sinoviales con células de
médula ósea de ratones, promovió la
formación d células osteoclásticas en
Un hallazgo importante en el
comparación con una fuerza
experimento es que se determinó que
compresiva de 1g/cm2.
no hubo una diferencia
estadísticamente significativa en el Nakao y col(22) examinan el
número de células TRAP positivas y mecanismo molecular de células del
en el número de lagunas de LP humanas luego de aplicar un
reabsorción entre los grupos tratados fuerza continua e intermitentes de
con fuerza en comparación con los 2g/cm2 y 5 g/cm2 concluyendo que
grupos tratados con PEG. Esto nos hay un aumento de la expresión del
sugiere que la aplicación de la fuerza RANKL al aplicar una fuerza
puede ser tan eficiente en la intermitente en comparación con una
diferenciación de células fuerza continua para ambas
osteoclásticas como lo es en la fusión magnitudes de fuerza. Basado en lo
con PEG. anterior, se podría concluir que la
magnitud de la fuerza tiene gran
influencia en la activación de los
Xu y col(27) Realizaron un estudio osteoclastos. En este estudio se
donde se aplicaron diferentes aplicó una fuerza de 5g/cm2 la cual
magnitudes de tensión a células fue óptima para obtener células
RAW264.7 tratadas con FSC-M y TRAP positivas y con actividad
RANKL. Los investigadores resortiva. En la mecanoterapia
encontraron que fuerzas tensionales ortodóntica se estima que fuerzas
de baja magnitud suprimen la fusión y ligeras que no exceden la presión
activación de osteoclastos, mientras sanguínea capilar de 20 a 25 g / cm2
que fuerzas tensionales de alta son adecuadas para que el
magnitud (2.000 y 2.500 μɛ) movimiento dental ocurra (28)
aplicadas dentro de la carga
Durante la aplicación de una fuerza
fisiológica promueve la fusión y
mecánica ortodóntica sobre el LP, se
activación de los osteoclastos,
produce una liberación de diferentes
relacionando la expresión de RANK
citoquinas, entre las que se encuentra
con una respuesta mecánica
el RANKL inductor importante para el
dependiente de la magnitud. Hiroyuki
proceso de osteoclastogénesis(28).
y col (21) reportan que ante el78
El tiempo óptimo luego de aplicar una En los grupos que se añadió NAC
fuerza ha sido evaluado con el fin de (F+NAC; PEG+NAC) se evidencio
conocer el rango de tiempo donde es una disminución tanto del número de
posible la activación celular células TRAP positivas como del
osteoclástica necesaria para que número de lagunas de reabsorción
ocurra el movimiento dental. Roberts para los tres periodos de tiempo
y Ferguson(9) encontraron que el evaluados (3, 5 y 7 día). Por lo que
número de osteoclastos por unidad podemos concluir que el agente
de área de superficie de hueso oxidante NAC, es un potente inhibidor
muestran un nivel de pico de 50 de las actividades relacionadas con
horas (aproximadamente 2 días células resortivas.
después de la aplicación de la fuerza
Se ha reportado que en cultivos
de ortodóntica). Gaoman y col(29)
celulares de sangre periférica en
realizan un estudio en un modelo
presencia de RANKL se obtienen
animal de ratón donde aplican una
células similares a osteoclastos
fuerza mecánica sobre los molares y
acompañadas con una producción de
refieren que los osteoclastos
ROS. Cuando se aplica al cultivo
demoran en aparecer entre 3 y 5 días
celular NAC se inhibe la respuesta de
luego de la aplicación del estímulo.
las células al RANKL, e inhibe la
Igualmente Rody y col(30) aplicaron
producción de ROS, impidiendo la
una fuerza ortodóntica sobre molares
diferenciación de osteoclastos.(31)
de ratones y analizaron el sitio de
compresión, donde se observó un
Toker, H. y col(32) reportan que la
número significativo de
administración sistémica de NAC en
preosteoclastos en el ligamento
un modelo experimental de
periodontal y en la superficie del
periodontitis en ratas previene la
hueso en el 3 día.
pérdida de hueso alveolar. Esto se
Estos estudios apoyan los resultados explica porque durante el proceso
obtenidos en esta investigación inflamatorio, NAC disminuye la
donde se encontró que a partir del expresión de mediadores
tercer día de aplicación de la fuerza inflamatorios inducidos por
se obtuvieron células TRAP positivas lipopolisacáridos (IL-1b, IL-6 y IL-8)
y capaces de formar lagunas de en células fagocíticas y fibroblastos
reabsorción sobre el hueso donde gingivales; como resultado directo de
fueron sembradas. Además se estas acciones
encontró que el número de células
La NAC actúa como mucolítico,
TRAP positivas en el grupo F
secretolítico y fluidificante de las
incremento de manera significativa
secreciones. Es de venta libre y es
hasta el día 5(p<0.0001), pero a partir
utilizada en personas de todas las
de este día hasta el día 7 no hubo un
edades. NAC tiene valor terapéutico
aumento estadísticamente
para la reducción de la disfunción
significativo (p: 0.3890)
endotelial, inflamación, fibrosis,
invasión, la erosión del cartílago, la79
desintoxicación del fármaco 5. NAC presenta la capacidad de
acetaminofén y prolongación de inhibir la diferenciación de
trasplantes. (33) células hacia el linaje
osteoclástico
Debido a que NAC suprime la
diferenciación de los osteoclastos,
este antioxidante puede conducir a la
prevención de la resorción ósea, en
ortodoncia podría ser utilizado como
un agente para evitar la recidiva del
tratamiento ortodóntico y apoyando el
periodo de retención.
Conclusiones
1. El grupo de células fusionadas
con PEG presentaron
marcadores de osteoclastos
activos, por lo cual podemos
validar este modelo para el
estudio de la reabsorción
2. La acción de la fuerza sobre
CMNSP generó una
diferenciación positiva de las
células hacia el linaje
osteoclástico
3. A partir del tercer día de
aplicación de fuerzas sobre el
cultivo hubo diferenciación de
células hacia el linaje
osteoclástico
4. Existe una mayor
diferenciación de células hacia
el linaje osteoclástico al 7 día
de aplicación de fuerza que al
tercer díaFigura 1. Láminas óseas representativas de células con tinción TRAP positivas,
observadas en microscopio de luz (Vanguard®), 40X, A, B Grupo PEG; C, D
Grupo F; E, F: Grupo PEG+NAC; G,H: Grupo F+NAC; I,J: Grupo (-fu, -F)
Tabla 1. Cantidad de células TRAP positivas observadas en el grupo sometido a
fuerza (F) evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo, en comparación con el grupo no
sometido a fuerza ni a fusión (-fu, –F). Diferencia estadísticamente significativa al
3 día de cultivo con un valor de *P: 0.0154, y con un valor de **P<0.0001 al 5 y 7
día de cultivo.2
Tabla 2. Cantidad de células TRAP positivas observadas en el grupo tratados con
fusión (PEG) evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo, en comparación con el grupo no
sometido a fuerza ni a fusión (-fu, –F). Diferencia estadísticamente significativa al
3 día de cultivo con un valor de *P: 0.0020, y con un valor de **P<0.0001 al 5 y 7
día de cultivo.
Tabla 3. Cantidad de células TRAP positivas, observadas en el grupo F en
comparación con células TRAP positivas del grupo PEG evaluadas al 3, 5 y 7 día
de cultivo. Diferencia NO estadísticamente significativa entre los grupos en los tres
periodos de observación, con un valor de P: 0.04590 al 3 día, un valor de P:
0.7604 al 5 y un valor de P: 0.0601 al 7 día de cultivo.3
Tabla 4. Cantidad de células TRAP positivas, en los grupos F evaluadas al 3, 5 y 7
día de cultivo. Diferencia estadísticamente significativa entre los días 3 - 5 y entre
los días 3-7 con un valor de *P<0.0001y una diferencia NO estadísticamente
significativa entre los días 5 y 7 con un valor de P: 0.3890
Tabla 5. Cantidad de células TRAP positivas, en los grupos PEG evaluadas al 3, 5
y 7 día de cultivo. Diferencia estadísticamente significativa entre los días 3 - 5 y
entre los días 3-7 con un valor de *P<0.0001 y una diferencia NO estadísticamente
significativa entre los días 5 y 7 con un valor de P: 0.01624
Tabla 6: cantidad de células TRAP positivas en los grupos tratados con fuerza F
comparados con los grupos tratados de igual manera adicionándoles NAC
(F+NAC) al 3, 5 y 7 día de cultivo. Se presenta disminución del número de células
TRAP positivas en los grupos tratados con NAC siendo esta diferencia
estadísticamente significativa con los grupos a los que no se trató con NAC
Tabla 7: cantidad de células TRAP positivas en los grupos fusionados con PEG
comparados con los grupos tratados de igual manera adicionándoles NAC
(PEG+NAC) al 3, 5 y 7 día de cultivo. Se presenta disminución del número de
células TRAP positivas en los grupos tratados con NAC siendo esta diferencia
estadísticamente significativa con los grupos a los que no se trató con NAC5
Tabla 8: cantidad de células TRAP positivas en los grupos PEG+NAC,
comparados con los grupos (-fu, -F) al 3, 5 y 7 día de cultivo. No se encuentran
diferencias estadísticamente significativas entre los grupos en ningún periodo
evaluado.
Tabla 9: cantidad de células TRAP positivas en los grupos F+NAC, comparados
con los grupos (-fu, -F) al 3, 5 y 7 día de cultivo. No se encuentran diferencias
estadísticamente significativas entre los grupos en ningún periodo evaluado.6
Imagen 2. Microfotografías representativas de lagunas de resorción tinción
Coomasie. Observadas a microscopio de luz (Vanguard®) objetivo de 40x,
fotografías con cámara Panasonic® DMC-FHS. A, B Grupo PEG; C, D: Grupo
PEG+NAC, E, F: Grupo F; G,H: Grupo F+NAC, I, J: Grupo (–fu,-F)7
Tabla 10. Número de lagunas de reabsorción evaluadas en los grupos PEG al 3,
5 y 7 día comparándolo con los grupos no tratados con fuerza ni fusión (-fu, F).
Diferencias estadísticamente significativas en los tres periodos de tiempo con
valores de *p<0.0001
Tabla 11. Número de lagunas de reabsorción evaluadas en los grupos F al 3, 5 y
7 día en comparación con los grupos no tratados con fuerza ni fusión (-fu, -F).
Diferencias estadísticamente significativas entre los grupos en los tres periodos de
tiempo con valores de *p<0.00018
Tabla 12. Número de lagunas de reabsorción en los grupos sometidas a Fuerza
(F) en comparación con los grupos tratadas con PEG evaluadas al 3, 5 y 7 día de
cultivo. Diferencia NO estadísticamente significativa entre los grupos al 3 y 7 días
de cultivo, con un valor de P: 0.2635 y 0.2021 respectivamente. En el día 5 de
cultivo se presentó una diferencia significativa con un valor de P: 0.0450
Tabla 13. Número de lagunas de reabsorción en los grupos sometidos a Fuerza F
en comparación con los grupos F+NAC al 3, 5 y 7 día de cultivo. Se presenta
disminución del número de lagunas de reabsorción en todos los grupos tratados
con NAC siendo esta diferencia estadísticamente significativa en los tres periodos
de tiempo9
Tabla 14. Número de lagunas de reabsorción en los grupos de PEG en
comparación con los grupos de PEG+NAC al 3, 5 y 7 día de cultivo. Se presenta
disminución del número de lagunas de reabsorción en todos los grupos tratados
con NAC siendo esta diferencia estadísticamente significativa en los tres periodos
de tiempo
Tabla 15. Número de lagunas de reabsorción, en los grupos de células sometidas
a fuerza (F) evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo. Diferencia estadísticamente
significativa entre los días 3 – 5; 3-7 con un valor de *P<0.0001 y entre el día 5 y 7
con un valor de P: 0.027910
Tabla 16. Número de lagunas de reabsorción, en los grupos de células tratadas
con PEG evaluadas al 3, 5 y 7 día de cultivo. Diferencia estadísticamente
significativa entre los días 3 – 5; 3-7 con un valor de *P<0.0001 y entre los días 5-
7 con un valor de P: 0.0039
Imagen 3: Microfotografías representativas de inmunofluorescencia. Tinción con
0.1 µg/ml DAPI. y anticuerpo para integrina B3, evaluados al Microscopio de
fluorescencia (Vanguard®) observadas con objetivo de 100x, fotografías con
cámara Panasonic®. DMC-FHS. A. Grupo F. a: 7 dia de cultivo. b: 5 dia de cultivo.
c: 3 dia de cultivo. B Grupo F+ NAC; C Grupo (–fu,-F)11
Referencias
86. Grigoriadis AE, Kennedy M, Bozec A, Brunton F, Stenbeck G, Park IH,et al.
Directed differentiation of hematopoietic precursors and
functional osteoclasts from human ES and iPS cells Blood. 2010;(115):2769-76
87. Kanzaki H, Chiba M, Shimizu Y, Mitani H. Dual regulation of osteoclast
differentiation by periodontal ligament cells through RANKL stimulation and
OPG inhibition. J Dent Res 2001 ;( 80):887–91.
88. Pazos Valencia LB. Análisis de la actividad resortiva de célulasfibroblastoides
(cultivo primario gingival) luego de someterlas a fuerza tensil o fusionarlas con
PEG. Bogotá, 2013. Trabajo de grado para optar por el título de Especialista en
Ortodoncia y Ortopedia Maxilar. Universidad Nacional de Colombia. Facultad
de odontología.
89. Murillo A, Guerrero CA, Acosta O, Cardozo CA.
Bone resorptive activity of osteoclast-like cells generated in vitro by PEG-
induced macrophage fusion. Biol. Res. 2010;(43):205-24
90. Bedoya S. Evaluación de la actividad resortiva de CMNSP fusionadas con
polietilenglicol (PEG), tratadas con fuerza centrífuga y con N acetilcisteina
(NAC). Bogotá, 2015. Trabajo de grado para optar por el título de Especialista
en Ortodoncia y Ortopedia Maxilar. Universidad Nacional de Colombia.
Facultad de odontología
91. Noxon SJ, King GJ, Gu G, Huang G. Osteoclast clearance from periodontal
tissues during orthodontics tooth movement. Am J Orthod Dentofacial
Orthop. 2001; (120):466-76.
92. Ren Y, Kuijpers-Jagtman AM, Maltha JC.
Immunohistochemical evaluation of osteoclast recruitment during experimental
tooth movement in young and adult rats. Arch Oral Biol. 2005; (50):1032-9.
93. The university Nottingham. [homepage en Internet]. United Kingdom; university
Nottingham; c2014 [actualizada 19 Noviembre 2014; consultado 21 febrero
2016]. Disponible en: http://www.nottingham.ac.uk/
94. Roberts WE, Jee WS. Cell kinetics of orthodontically-stimulated and non-
stimulated periodontal ligament in the rat. Arch Oral Biol. 1974;(19):17-21.
95. Udagawa, N., Kotake, S., Kamatani, N., Takahashi, N., Suda, T. The molecular
mechanism of osteoclastogenesis in rheumatoid arthritis. Arthritis Res.
2002; (4): 281-289.12
96. Weitzmann, M.N., Cenci, S., Rifas, l., Haug, J., Dipersio, J., and Pacifici, R. T
Cell activation induces human osteoclast formation via receptor activator of
nuclear factor kB ligand–dependent and independent mechanisms. J. Bone
Miner. Res. 2001;(16): 328-337.
97. Yuasa K, Mori K, Ishikawa H, Sudo A, Uchida A, Ito Y. Characterization of two
types of osteoclasts from human peripheral blood monocytes. Bioch. Bioph.
Res. Commu. 2007; (356): 354–360.
98. Udagawa N. The mechanism of osteoclast differentiation from macrophages:
possible roles of T lymphocytes in osteoclastogenesis. J Bone Miner Metab.
2003;(21):337-43.
99. Castillo lm. Evaluación de la expresión y fosforilación de c src, syk y el re-
arreglo de actina asociados con la actividad resortiva de cmnsp fusionadas con
polietilenglicol. Bogota 2010. Tesis Facultad de Medicina. Universidad
Nacional.
100. Alnaeeli, M. Penninger, J, .M., Yen-Tung, A,.T. Immune interactions with
CD4+ T cells promote the development of functional osteoclasts from murine
CD11c dendritic cells. J. Immunology. 2006; (177): 3314–3326.
101. Wang, TM., Jee, WS., Woodbury, LA., and Matthews, JL. Effects of
phytohemagglutinin-P (PHA-P) on bone of the growing rat. Metab. Bone. Dis.
Relat. Res. 1982; (4):193-199
102. Manrique E. G. Evaluación del efecto de fármacos antirresortivos en el
fenotipo y actividad resortiva de células mononucleares de sangre periférica
humanas fusionadas con polietilenglicol. Bogotá 2007. Tesis para obtener el
título de Maestría. Facultad de Medicina. Universidad Nacional
103. Monck, J.R., and Fernandez, J.M. The fusion pore and mechanisms of
biological membrane fusion. Current. Opin. Cell. Biol. 1996; (8):524-533.
104. Young-Yun, K. et al. Activated T cells regulate bone loss and joint
destruction in adjuvant arthritis through osteoprotegerin ligand. J. Cell Biochem.
1999; (72): 67-80
105. Nicholson GC, Malakellis M, Collier FM, Cameron PU, Holloway WR, Gough
TJ,. Induction of osteoclasts from CD14-positive human peripheral blood
mononuclear cells by receptor activator of nuclear factor B ligand (RANKL).
Clin. Sci. 2000; (99): 133–140.13
106. Kanzaki H, Chiba M, Sato A, Miyagawa A, Arai K, Nukatsuka S, et al.
Periodontal Ligament Cells Under Mechanical Stress Induce
Osteoclastogenesis by Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand
Up‐Regulation via Prostaglandin E2 Synthesis. J Dent Res. 2006; (85):457-62.
107. Nakao K, Goto T, Gunjigake KK, Konoo T, Kobayashi S, Yamaguchi K.
Intermittent force induces high RANKL expression in human periodontal
ligament cells. J. Dent Res 2007; (86): 623-628.
108. Ichimiya H1, Takahashi T, Ariyoshi W, Takano H, Matayoshi T, Nishihara T.
Compressive mechanical stress promotes osteoclast formation through RANKL
expression on synovial cells. Oral Surg, Oral Med, Oral Pathol, Oral Radiol
Endod. 2007; (103): 334-341.
109. Rubin J, Murphy T.C, Fan X, Goldschmidt M, Taylor W.R. Activation of
extracellular signal-regulated kinase is involved in mechanical strain inhibition
of RANKL expression in bone stromal cells. J Bone Miner Res. 2002; (17):
1452–1460.
110. Rubin J, Murphy TC, Zhu L, Roy E, Nanes MS, Fan X.. Mechanical strain
differentially regulates endothelial nitric-oxide synthase and receptor activator of
nuclear kappa B ligand expression via ERK1/2 MAPK. J Biol Chem, 2003;
(278):34018–34025.
111. Kook SH, Son YO, Hwang JM, Kim EM, Lee CB, Jeon YM et al. Mechanical
force inhibits osteoclastogenic potential of human periodontal ligament
fibroblasts through OPG production and ERK‐mediated signaling. J. Cellular
Biochem, 2009; (106): 1010-1019
112. Xu XY, Guo C, Yan YX, Guo Y, Li RX, Song M, et al. Differential effects of
mechanical strain on osteoclastogenesis and osteoclast-related gene
expression in RAW264. 7. Cells. Mol Med Rep, 2012;(6): 409-415.
113. Krishnan V, Davidovitch Z.. Cellular, molecular, and tissue-level reactions to
orthodontic force. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2006; (129):469.e1-32.
114. Gu G, Lemery SA, King GJ. Effect of appliance reactivation after decay of
initial activation on osteoclasts, tooth movement, and root resorption. Angle
Orthod. 1999 ;(69):515-22.
115. Rody WJ Jr, King GJ, Gu G. Osteoclast recruitment to sites of compression
in orthodontic tooth movement. Am J Orthod Dentofacial Orthop. 2001;
(120):477-89.14
116. Zafarullah M, Li WQ, Sylvester J, Ahmad M. Molecular mechanisms of N-
acetylcysteine actions. Cell Mol Life Sci. 2003; (60):6-20
117. Toker H, Ozdemir H, Balcı H, Ozer H. N‐acetylcysteine decreases alveolar
bone loss on experimental periodontitis in streptozotocin‐induced diabetic rats.
J Periodontal Res. 2012; (47):793-9
118. N-acetylcysteine Introduction. Alternative Medicine Review. Volume 5,
Number 5. 2000. Disponible en:
http://www.altmedrev.com/publications/5/5/467.pdf