Biología molecular y modo de acción de las endotoxinas de Bacillus thuringiensis
Autor: Gaviria Rivera, Adelaida María
Asesor: Godoy Cordobés, Javier Alfonso (Thesis advisor)
Fecha: 1998
Programa: Bogotá - Medicina -Fisioterapia
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Resumen: el uso intensivo de insecticidas químicos ha originado una gran variedad de problemas tales como, el desarrollo de resistencia en muchas poblaciones de insectos de importancia agrícola y médica, el surgimiento de plagas secundarias o menores al estatus de plagas primarias; la resurgencia de insectos como nuevas plagas y, otros problemas generados por la contaminación de los ecosistemas. Todo lo anterior, ha permitido el desarrollo de alternativas biológicas en programas de control de insectos. Los aislados de diversas subespecies de Bacillus thuringiensis, productores de esporas, son el Entomopatógeno gram positivo más conocido e importante que se utiliza por su eficacia y seguridad como ingrediente activo para la elaboración de insecticidas disponibles comercialmente (Pietrantonio et al. 1993)   Desde mediados de los años 60, el B. thuringiensis se ha estudiado con mayor intensidad como bioinsecticida, ya que se ha comprobado que ataca a más de 180 especies de insectos de importancia económica (Margalit et al. 1985). Desde su descubrimiento en Japón y Alemania a principios de este siglo, se han descrito más de 55 subespecies de B. thuringiensis Berliner (de Bariac. 1985).

BIOLOGIA MOLECULAR Y MODO DE ACCION
DE LAS ENDOTOXINAS DE Bacillus thuringiensis
ADELAIDA MARIA GAVIRIA RIVERA
Trabajo de grado para optar al titulo de
Especialista en Entomologia
Directora Seoa Medelll.
OLGA MONTOYA DEP.... RTAMENTO Of 818110TfCAS
Clenclal ...."r<>oecuariaa v Oendca
Bi61oga, M. SC. Microbiologia
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULT AD DE CIENCIAS Y CIENCIAS AGROPECUARIAS
o .
UNAL-Medellin
II"III~IIIIIIII~II~IIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIIII
SEDE M EDELLI N
1998 6 4000 00108470 9/I
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mis agradecimientos a:
Las profesoras Olga Montoya Campusano y Maria Elena Marquez Fernandez por
su valiosa contribuci6n al presente trabajo.11/
TABLA DE CONTENIDO
INTRODUCCION
1. ANTECEDENTES............................................................................................. 4
1.1 ENDOTOXINAS............................................................................................... 8
1.1.1 Cuerpo parasporal 0 cristal.. ...................................................................... 9
1.1.2 Clasificacion de los genes codificadores de las proteinas del cristal..21
1.2 MECANISMO DE ACCION DE LAS ENDOTOXINAS EN EL INTESTINO
MEDIO DEL INSECTO .........................................•...............................................28
1.2.1 Estructura de las endotoxinas en relacion con la insercion a
la membrana del epitelio del intestino medio del insecto...............................28
1.2.2 Proceso proteolitco y activaci6n de las toxinas.....................................36
1.2.3 Interaccion de las endotoxinas con la membrana ..................................40
1.2.4 Efecto de las delta endotoxinas en el intestino medio del insecto.......49
BIBLIOGRAFIAINTRODUCCION
• EI uso intensivo de insecticidas qUlmicos ha originado una gran variedad de
problemas tales como, el desarrollo de resistencia en muchas poblaciones de
insectos de importancia agricola y medica, el surgimiento de plagas secundarias 0
menores al estatus de plagas primarias; la resurgencia de insectos como nuevas
plagas y, otros problemas generados por la contaminacion de los ecosistemas .
. Todo 10 anterior, ha permitido el desarrollo de alternativas biologicas en programas
de control de insectos. Los aislados de diversas subespecies de Bacillus
thur;ngiens;s, productores de esporas, son el entomopatogeno Gram positivo
mas conocido e importante que se utiliza por su eficacia y seguridad como
ingrediente activo para la elaboraci6n de insecticidas disponibles comercialmente
(Pietrantonio et al. 1993).
, Desde mediados de los arios 60, el B. thur;ng;ensis se ha estudiado con mayor
intensidad como bioinsecticida, ya que se ha comprobado que ataca a mas de 180
especies de insectos de importancia econ6mica (Margalit et al. 1985). Desde su
descubrimiento en Jap6n y Alemania a principios de este siglo, se han descrito
mas de 55 subesoecies de B. thur;na;ens;s Berliner (de Bariac. 1985).2
• B. thuringiensis a pesar de ser muy similar morfologicamente al Bacillus cereus;
se diferencia por la presencia de un cristal parasporal que contiene endotoxinas
tipo delta. Aquellas especies de B. thuringiensis que carecen del cristal
parasporal se distinguen de B. cereus unicamente a nivel bioqufmico e
inmunologico.
B. thuringiensis puede producir exotoxinas y endotoxinas: Las exotoxinas, como
f
las alfa y las beta son producidas durante la fase vegetativa; las delta
endotoxinas, se producen durante la esporulacion y se localizan dentro del cristal
parasporal, y estan estrechamente relacionadas con la patogenicidad especffica al
hospedero, siendo inocuas a aquellos organismos a los cuales no se dirige el
control (Pietrantonio et a/ .1993).
Oesde hace muchas decadas se ha investigado la toxicidad y aplicacion como
bioinsecticida de B. thuringiensis y ha mostrado ser exitoso contra lepidopteros
pero no contra dfpteros. Solo hasta cuando se reporto la cepa de B. thuringiensis
subesp. israelensis serotipo H-14 (de Barjac 1977), se obtuvieron resultados mas
satisfactorios ya que es altamente selectiva a dfpteros, particularmente a
mosquitos de las familias Culicidae y Simuliidae; acontecimiento que marco la
epoca del control biologico en la Entomologfa Medica (Aizawa and Ohba 1985).
B. thuringiensis israelensis se ha evaluado de forma exitosa contra 72 especies
de mosquitos Culicidae de 11 generos diferentes y 14 especies pertenecieentes a
7 generos de la familia Simuliidae (Marglalit, J. 1990)3
EI amplio y rapido reconocimiento de las potencialidades de B. thuringiensis
israelensis para el control de plagas y vectores de enfermedades en el hombre,
ademas de su rapida produccion comercial, abrio el camino para su utilizacion en
metodologias de manejo integrado (Aizawa and Ohba 1985). Ademas, el
desarrollo de resistencia a insecticidas por insectos vectores de enfermedades
humanas y la concientizacion sobre la contaminacion del medio ambiente, ha
permitido que el control de dichas enfermedades por metodos no qufmicos sea un
importante objetivo en salud publica (Margalit et al. 1985).
A pesar del exito de B. thuringiensis en comparacion con otros agentes de
control microbial, su usa en control de insectos es restringido debido a su
selectividad y limitada eficacia contra muchas plagas de importancia economica.
Sin embargo, a causa de que la actividad insecticida de B. thuringiensis es
debida principalmente a proteinas, la tecnologia del ADN recombinante esta
siendo usada para estudiar aun mas bacteria, mejorarla y hacer extensivo su usa
como insecticidas microbiales (Pietrantonio et al. 1993).4
1. ANTECEDENTES
Las bacterias son los microorganismos mas comunmente asociados con insectos
y algunas no son patogemicas pero otras si 10 son (Tanada and Kaya, 1993). Estas
pueden ser divididas en pat6genos potenciales, facultativos u obligados. Los
patogenos potenciales son incapaces de invadir el hospedero a traves de la
pared del cuerpo 0 del tracto digestivo sin la ayuda de factores externos. Estos
factores pueden disminuir la resistencia del insecta 0 aumentar la habilidad del
microorganismo para invadir el insecto.
Los patogenos facultativos no requieren de un insecto debilitado por facto res
externos para causar infecci6n. Ademas, la sobrevivencia de ambos tipos de
pat6genos no depende completamente del insecto, y ellos pueden vivir y
multiplicarse independientemente de este. En cambio, los patogenos obligados
requieren vivir en el insecta hospedero para su sobrevivencia y reproducci6n y
-
pueden estar fuera del insecta en un estado de dormancia, pero son inca paces de
reproducirse independientemente del insecto (Tanada and Kaya, 1993).
• Las bacterias patogimicas facultativas u obligadas son conocidas como agentes
etiol6gicas que causan diversas intoxicaciones 0 enfermedades infecciosas en5
artropodos, los cuales pueden resultar en epizootias (Krieg A. 1987). B.
thur;ng;ens;s es del tipo de microorganismos facultativos resistente a
condiciones adversas del medio ambiente, 10 cual permite aislarla en diferentes
ecosistemas (Buchanan and Gibbons, 1975)
Aunque B. thur;ng;ens;s es muy patogemico para muchos insectos, su papel
como un factor limitante en la dinamica de poblaciones de estos no es muy
importante. Esto puede ser causado principal mente por una insuficiente densidad
y distribucion del patogeno en el habitat de sus hospederos potenciales. Por esto,
B. thur;ng;ens;s debe ser aplicado como se hace con un insecticida qufmico en el
control microbial de plagas (Krieg, A. 1987).
Desde su descubrimiento en Japon y Alemania a principios de este siglo, hasta
ahora se han descrito mas de 55 subespecies de B. thur;ng;ens;s Berliner (de
Barjac 1985), las cuales han sido diferenciadas por metodos bioqufmicos, tales
como, produccion de esterasas produccion de esterasas, de antibioticos, de
enzimas, y grupos de lectinas; 0 por metodos inmunologicos, como el serotipo H
(antfgeno flagelar) y antfgeno del cuerpo parasporal (cristal), 0 por los fagos que la
infectan. Ha existido un considerable acuerdo en la clasificacion del B.
thur;ng;ens;s por la produccion de esterasas, y la produccion del antfgeno
flagelar~ hasta el presente, el usa de serotipos H, complementado en algunos
casos par evaluaciones bioqufmicas especfficas, se acepta universalmente para el
designamiento de subespecies (Tanada and Kaya, 1993).6
Con el fin de obtener bases unifermes para la comparaci6n de patogenicidad de
las diferentes subespecies de B. thur;ng;ens;s y de la susceptibilidad de varias
especies de insectos, se han seleccionado varias subespecies como de referencia
estandard, entre elias estan: B. thur;ng;en;s;s kurstak; para lepid6pteros, B.
thur;ng;ens;s ;srae/ens;s para dipteros acuaticos, y B. thur;ng;ens;s
tenebr;on;s para cole6pteros. Las subespecies que han side utilizadas en
formulaciones comerciales en todo el mundo son B. thur;ng;ens;s thur;ng;ens;s,
B. thur;ng;ens;s kurstak;, B. thur;ng;ens;s dendrolimus, B. thur;ng;ens;s
galler;ae, B. thur;ng;ens;s ;srae/ens;s, y B. thur;ngiens;s a;zawa; (Tanada and
Kaya, 1993).
Hay dos tipos generales de toxinas producidas por los organismos
entomopat6genos, substancias catab6licas y anab6licas. Las toxinas catab61icas
resultan de la descomposici6n producida por la actividad del pat6geno, pueden
aumentarse a partir del sustrato 0 per la descomposici6n del pat6geno por si
mismo. Per ejemplo, la descomposici6n de proteinas, carbohidratos y lipid os per el
pat6geno puede producir alcoholes t6xicos, acidos, mercaptanos, alcaloides, etc.
Las toxinas de tipo anab61ico son sintetizadas directamente por el pat6geno,
pueden ser clasificadas como exotoxinas y ndotoxinas. Las exotoxinas
(ectotoxinas) son solubles y se consideran verdaderas toxinas, son excretadas
fuera de la celula del pat6geno, durante el inicio de la fase estacionaria de su cicio
de vida; se han detectado en entomopat6genos, especial mente bacterias y
hongos. Las endotoxinas no son excretadas al medio si no que se encuentran7
dentro de la celula; solo son liberadas cuando el patogeno muere y degenera, 0
como en el caso de B. thuringiensis, cuando este esporula y la pared del
esporangio se desintegra.
Heimpel (1967) en B. thuringiensis reconocio 4 tipos de toxinas las cuales
. designo con el alfabeto griego como: alfa-exotoxinas, beta-exotoxinas, gama­
exotoxinas y delta-endotoxinas. Esta forma de clasificacion permite incluir nuevas
toxinas. La endotoxina mas ampliamente investigada es la delta-endotoxina 0
endotoxina cristalifera contenida dentro de un cristal proteinaceo formado
durante la esporulacion y se encuentra adyacente a la espora en el esporangio
bacterial. Fue la primera toxina detectada en B. thuringiensis, y es hasta el
presente la mas ampliamente utilizada de todas las toxinas entomopatogenas
(Tanada and Kaya 1993).
La alfa exotoxina es termolabil, producida por algunas variedades de B.
thuringiensis y B. cereus, es alta mente toxica para ciertos insectos cuando se
inocula oral e intrahemocelicamente, causa degeracion del hemocelo y lisis de los
hemocitos. Tambien es toxica a ratones ya otros vertebrados (Krieg 1971).
McConell and Richards (1959) detectaron en cultivos de B. thuringiensis
esterilizados en autoclave, una toxina dializable que mataba a los insectos cuando
se les inoculaba dentro del hemocelo; luego, Bugerjon and de Barjac (1960)
reconfirmaron la existencia de esta toxina en el bacilo. A esta toxina se Ie dio el
nombre de beta-exotoxina (Tanada and Kaya, 1993), aun cuando se Ie han8
asignado varios nombres tales como: thuringiensina, toxina estable al calor, toxina
termoestable, factor fly, toxina fly, entre otros (Bond et a/. 1971).
La thuringiensina, afecta un amplio espectro de hospederos entre insectos, otros
invertebrados y algunos vertebrados. Las especies de insectos susceptibles
pertenecen a los 6rdenes Diptera, Lepidoptera, Hymenoptera, Coleoptera,
Isoptera, Orthoptera, Hemiptera, y Neuroptera (Tanada and Kaya, 1993).
1.2 ENDOTOXINAS
La celula esporangial de B. thuringiensis produce uno 0 mas cuerpos
parasporales 0 cristales proteinaceos que contienen las delta endotoxinas.
Cuando Heirnpel (1967) design6 el cuerpo parasporal como la delta-endotoxina no
se sabia aun que la proteina del cuerpo parasporal era una protoxina y que
algunas cepas producian este cuerpo sin actividad biol6gica conocida; a pesar de
ello, el termino delta-endotoxina es ampliamente usado en la literatura»:; para definir
el cristal, 10 cual es etimol6gicamente incorrecto. por 10 tanto) es necesario definir
la delta-endotoxina como una clase de proteina t6xica proveniente de una
protoxina (proteina del cristal), la cual es lIevada a toxinas mas pequerias,
endotoxinas, por enzimas proteoliticas del intestin~ medio del insecto. In vivo, las
endotoxinas s610 tienen actividad en el intestin~ medio de las larvas susceptibles.
No todos los tipos de cristales producidos por B. thuringiensis poseen protoxinas.
Asi, un aislado de B. thuringiensis darmstadiensis produce grandes cristales de9
forma irregular no t6xicos para larvas de insectos de los 6rdenes Lepidoptera y
Diptera, mientras que otros aislados de esta misma subespecie producen cristales
t6xicos a insectos de estos mismos 6rdenes (Padua ef a/. 1980).
Como las delta-endotoxinas de diferentes subespecies de B. thuringiensis
pueden variar considerable mente por su toxicidad a larvas de insectos, se cree
que estas variaciones son debidas entre otros factores a las diferencias en las
secuencias de aminoacidos de las toxinas, por 10 cual este aspecto es
comunmente el objeto de muchas investigaciones, debido al potencial para
incrementar la toxicidad y el espectro de hospederos a traves de mutagenesis
dirigida a un sitio especffico (Federici ef a/. 1990).
1.1.1 Cuerpo parasporal 0 cristal. Es frecuentemente denominado la inclusi6n
del cristal, endotoxina del cristal, 0 cristaloide. Su formaci6n se inicia durante el
estado temprano de la esporulaci6n bacteriana y coincide con la formaci6n del
septo portador de la espora (Luthy and Studan, 1986) y esta casi completamente
formado en el momento en que el exoesporio ya se ha formado. En general para
todas las especies de B. thuringiensis cuando se ha lisado la pared celular, la
espora madura y el cristal son liberados separadamente
La subespecie B. thuringiensis finitimus es una excepci6n ya que prQduce dos
tipos de cristales: uno formado dentro del exoesporio de modo que la espora y el
cristal permanecen juntos cuando la pared celular se lisa (Huber and Luthy 1981),10
y otro que se forma externamente al exosporio, de la misma manera que se forma
en un B. thuringiensis tipico (Debro et al. 1986).
La creencia general, es que la proteina del crista I no es formada en los estados
vegetativos de la celulas. Sin embargo, Luthy et al.(1970) han detectado en
bioensayos sobre larvas del lepidoptero Bombix mori pequerias cantidades de la
delta-endotoxin a unidas a particulas celulares, probablemente membranas,
durante la fase de crecimiento vegetativo de B. thuringiensis satta.
La formacion de espora no es esencial para la produccion del cristal, ya que los
mutantes no formadores de esporas tambien producen cristales como el caso de
las cepas silvestres normales de B. thuringiensis (Yousten, 1986); sin embargo,
en ciertas cepas de B. thuringiensis yunnanensis, los cristales son formados
unicamente en celulas asporogenas, pero otras cepas forman cristales
conjuntamente con esporas (Ohba and Aizawa 1986). La produccion del cristal se
ha obtenid ·en celulas vegetativas de B. subtilis y B. megaterium insertando los
genes de la proteina del cristal dentro de estas especies (Mettus and Macaluso,
1990).
En el B. thuringiensis israelensis, en la primera. hora de la sintesis del cuerpo
parasporal dentro del esporangio ya se observan dentro del cuerpo inclusiones de
diferentes densidades, perc la sintesis continua hasta el estado 5 de la
esporulacion, de un total de 8 estados (figuras 1a y 1b ). Lo anterior coincide con la
refractibilidad de la espora en ese estado. en el estado 7 de la esporulacion se da11
la lisis de la pared del esporangio , y en el ultimo estado se da la Iiberaci6n del
cuerpo parasporal intacto.
En las tres primeras horas de la esporulaci6n se inicia la sintesis de las proteinas
mayores del cuerpo parasporal y continua por varias horas mas. Bajo condiciones
estandares de crecimiento, en medios como leche de peptona, la formaci6n del
cuerpo paresporal se termina 24 horas despues de iniciaci6n del cultivo, aunque la
aut61isis del esporangio usual mente requiere otras 24-48 horas (Federice et al.
1990).
Usualmente hay un cristal por celula, en cada grupo serol6gico de B.
thuringiensis, cuando estan presentes diferentes cristales en un esporangio,
pueden diferir en tamario, forma y actividad contra insectos, es decir, las proteinas
de cada crista I pueden variar en sus propiedades bioquimicas y t6xicas
(Udayasuriyan et al. 1994) (Figura 1b).
Segun la forma se pueden encontrar bipiramidal (forma de diamante) en
subespecies que son principalmente activas contra lepid6pteros; ovoidal 0
cuboidal en subespecies activas tanto contra lepid6pteros como dipteros y;
triangulares, aplanados, en forma de barra, 0 amorfos en otras subespecies.
Algunas cepas de la subespecie B. thuringiensis kurstaki (serotipo 3a3b3c)
tienen dos tipos de cristales, bipiramidal y ovoidal, los cuales difieren en toxicidad
para insectos y en sus propiedades antigenicas (Sharpe and Baker 1979). La
subesepecie B. thuringiensis tenebrionis (syn . B. thurin iensis san diego), un12
pat6geno de insectos coleopteros, tiene cristales como placas cuadradas a
rectangulares 0 pedazos de bloques (1988; Udayasuriyan et al. 1994).
Tornado de Federici et al. 1990
Figura 1a. Micrografia electr6nica del cuerpo parasporal de B. thuringiensis israe/ensis. (a), desarrollo de la
espora (Sp); del cuerpo parasporal (PB) durante el estado 5 de la esporulaci6; E, exosporiun. Aumento, 250
nm .
EI cuerpo parasporal de B. thuringiensis israelensis es esferico y tiene un
diametro de 0.7 a 1.2 .um, contiene cuatro proteinas mayores con unos pesos
moleculares de 25, 65, 128, Y 135 Kda, separadas en tres diferentes tipos de
inclusiones proteinicas (figuras 2a, b, c) y reunidas conjuntamente por una
envoltura que parece como una red laminar, de composicion no determinada
(figuras 2a, bye) (Federici et al. 1987; Federici et al. 1990).13
Tornado de Federici et al. 1990
Figura 1b . Cuerp6 parasporal completamente formado, justo antes de la lisis del esporangio. Notese las
inclusiones de diferentes densidades y la inclusi6n en forma de barra (.) adyacente al cuerpo principal ; este
ultimo tipo de inclusi6n frecuentemente se encuentra en la periferia del cuerpo parasporal y aparentemente es
el menos fuertemente unido de los tres tipos. Aumento, aproximadamente 250 nm.
Cada inclusi6n esta rodeada individualmente por una 0 mas capas del material
que compone la envoltura que las reune a todas, la cual es estable en presencia
de detergentes y proteasas, de composici6n y origen desconocidos, aunque es
semejante al exoesporio y es permeable a polipeptidos tan grandes como de 135
KDa (Federici et al. 1990).
Por microscopfa electr6nica el cuerpo parasporal de B. thuringiensis israelensis
mostr6 variaciones en el numero y la forma de las inclusiones que parece
contener: una inclusi6n grande de baja densidad electr6nica y una inclusi6n14
pequeria, de alta densidad electronica (figura 2a). Sin embargo, ocasionalmente
se observa un tercer tipo de inclusion, mas pequeria, de forma poliedral, y de
densidad electronica moderada (Ietra c en las figuras 1b, 2b, Y 2c). Todas las
inclusiones no son generalmente observadas en secciones ultradelgadas a traves
del cuerpo parasporal individual debido a que estas tienen usualmente menos de
una decima del ancho de este (Federici ef a/. 1993).
. Los tres diferentes tipos de inclusiones proteinicas, que se presentan dentro del
cuerpo parasporal pueden ser diferenciados uno del otro ultraestructuralmente
usando una combinacion de ca racteres , tamario, forma, densidad electronica, Y
areas donde las inclusiones son cristalinas, denominadas como espacio intercalar.
La inclusion mas grande (figura 2b (c)) ocupa el 40-50% del cuerpo parasporal y
se caracteriza porque esta rodeando al poliedro y es de menor densidad
electronica, tiene un espacio intercalar de 4.3 nm y se cree que contiene la
proteina de 27 Kda.
EI segundo tipo de inclusion tiene frecuentemente forma de varilia, usual mente
rectangular en seccion transversal , de densidad electronica moderada, y
constituye aproximadamente el 15-20% del cuerpo parasporal (figuras 2b (b) y 2c
(b)), tiene un espacio intercalar de 7.8 nm y contiene casi exclusivamente una
proteina de 65 KDa (Federici ef at. 1987).15
EI tercer tipo de inclusion tiene una densidad electr6nica muy alta, forma
hemiesferica a esferica y ocupa el 20 - 25 % de la composici6n protefnica del
cuerpo parasporal (fig. 2b (H) Y 2c (H)). Mikkola ef al. (1982) han reportado dos
inclusiones de este tipo dentro del cuerpo parasporal, por 10 cual se ha
considerado que este tipo de inclusiones contienen cada una las protefnas de 128
y 135 KDa. Una caracterfstica poco comun de este tipo de inclusi6n es que se
encuentre ubicada entre las lamelas translucidas electr6nicamente, las que son
frecuentemente encontradas dentro de la inclusi6n matrix 0 en su periferia (fig .
2b).
Tornado de Federici et al. 1990
Figura 2a. Cuerpo parasporal de B. thur;ng;ens;s ;srae/ens;s recientemente liberado de un esporangio. La
envoltura de varias capas esta aun fuertemente unida alrrededor de las inclusiones. Secciones a traves del
cuerpo parasporal tipicamente revelan unicamente 2 diferentes tipos de inciusiones, tal como se observa en
este cuerpo parasporal.16
Tornado de Federici et al. 1990
Figuras 2b Y 2c: (b), Cuerpo parasporal de B. thuringiensis israe/ensis ilustrando los tres iferentes tipos de
inclusiones; L, inclusi6n grande de baja densidad electronica que se considera que contiene la proteina de 27
KDa; 8, cuerpo en forma de barra que contiene la protefna de 65 KDa; H, inclusion de alta densidad
electronica que puede contener las proteinas de 128 y 135 KDa. (e) , cuerpo parasporal en el cualla envoltura
se ha danado. Notese que el cuerpo en forma de barra es el Gnico que permanece separado del cuerpo
=
parasporal; las f1echas senalan la envoltura. Aumento en (c) 250 nm; (a) y (b) aproximadamente la misma
magnificacion.
Ibarra y Federici selia Ian que los aSignamientos de una protefna especffica a los
diferentes tipos de inclusiones son tentativos y estan basados principalmetne
sobre correlaciones entre la relativa abundancia de las protefnas mayores del
cuerpo parasporal, con el tamalio relativo de los diferentes tipos de inclusiones.
Ademas, si estas correlaciones son ciertas, pueden no ser absolutas. Por ejemplo,
se ha demostrado que la inclusion en forma de varilla contiene una protefna de 65
KDa, pero no se puede conclufr que toda protefna de 65 KDa esta localizada en
este tipo de inclusion, ya que se debe tener en cuenta que el peso molecular
estimado de las subunidades protefnicas del crista I varfa grandemente17
dependiendo del metodo de disoluci6n del cristal, de la remoci6n 0 inactivaci6n de
la proteasa en el cristal, del metodo de analisis, y de las diferentes cepas de
bacilos.
De este modo, Yoshida et al. a, b (1993) seriala que las protefnas del cristal
producidas por B. thuringiensis israelensis tienen un peso molecular de 130,
70, 28 KDa, y asi sucesivamente. Ademas, Federici et al. (1990) serialan que
aunque ha habido algunas discrepancias en el numero y tamario de las proteinas
detectadas en esta subespecie, se han encontrado dos propiedades basicas del
. cuerpo parasporal: en la primera, el cuerpo parasporal intacto contiene cuatro
protefnas mayores, con pesos moleculares de, 27, 65, 128, Y 135 KDa,
respectivamente (figura 3) y, en la segunda se seriala que el numero de proteinas
se incrementa dependiendo de las condiciones en que estas se han solubilizadas.
Los genes que codifican estas protefnas se han clonado y secuenciado, se han
deducido los pesos moleculares de las secuencias nucleoHdicas de cada uno,
como: 27.4, 72.4, 127.8, Y 134.4 KDa, a pesar de haber sido reportadas con pesos
molecualres de 27, 65, 128, Y 135 KOa. (Federici et al. 1990).
Ademas, de las protefnas mayores, se ha observado una sene de protefnas
menores con pesos moleculares de 25, 30 - 40, 53, Y 67 KOa, cuando son teriidas
con plata. Muchas de estas proteinas menores, son productos de cortes
proteoliticos de las protefnas mayores del cuerpo parasporal. Una excepci6n a
esto es posiblemente la protefna 58 KOa, cuyo gen ha sido clonado, secuenciado
y expresado en B. subtilis y Escherichia coli y a pesar de ser t6xica para18
mosquitos no se ha logrado expresar en B. thuringiensis israelensis 0 tal vez su
relativa abundancia en el cuerpo parasporal es muy baja (Thorne et al. 1986).
La toxicidad del cristal es desnaturalizada por el calor (Cooksey 1971). EI cristal
producido es insoluble en agua y solventes organicos, pero es soluble en una
soluci6n altamente alcalina (pH mayor de12), a pHs menores se requiere un
agente reductor para disolver el cristal. Pero, en el intestino medio de un insecto el
cristal se disuelve a un pH menor (10 a 11) Y al mismo tiempo es digerido a traves
de la actividad de enzimas proteoifticas para formar las endotoxinas (Tan ada and
Kaya 1993).
La segunda propiedad basica, seriala que el numero de protefnas detectadas se
incrementa substancialmente si los cuerpos parasporales son solubilizados en
alcalis, a pH 9.5 0 por encima de este, pero resulta una disminuci6n significativa
en las cantidades de las proteinas de 27, 65, 128, Y 135 KOa, tal vez debido a la
degradaci6n proteolitica por proteasas alcalinas bacteriales, asociadas con el
cuerpo parasporal (Chilcott et al. 1983 ; Pffannenstiel et al. 1984).
Probablemente existen proteasas similares en el intestino medio alcalino de las
larvas de dipteros, las cuales pueden incrementar la tasa de activaci6n de la
toxina in vivo. Charles and de 8arjac (1983) demostraron una diluci6n gradual
pero completa del cuerpo parasporal de B. thuringiensis israelensis en el
intestino medio de la larva de Aedes aegypti (Oiptera), esto sugiere una mayor
participaci6n de las enzimas proteoliticas del intestino.19
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45­
-27
Tornado de Federici et a/. 1990
Figura 3. Composicion proteinica del cuerpo parasporal intacto de Bacil/us thuringiensis israe/ensis,
determinada p~r electroforesis en gel de poliacrilamida - sodio dodecil sulfato: (S), tamanos moleculares
estandares: Anidrasa carbonico, 31 KDa ; ovalbumin, 45 KDa; suero albumino de bovino, 66 KDa; fosforilasa
b, 92 KDa; beta - galactosidasa, 116 KDa ; y miosin, 200 KDa . (PB), cuerpo parasporal de B. thuringiensis
israe/ensis.
Se han reportado varias subespecies de Bacillus thuringiensis diferentes de B.
thuringiensis israelensis que producen cuerpos parasporales los cuales
contienen proteinas t6xicas a mosquitos. Estas subespecies incluyen a B.
thuringiensis morrisoni (H8a, 8b), B. thuringiensis darmstadiensis (H10), y B.
thuringiensis kurstaki (H3a, 3b).20
EI B. thuringiensis morrisoni PG-14 es el aislado mas toxico de estas
subespecies reportado por primera vez en Filipinas (Federici et al. 1987), es tan
taxico como B. thuringiensis ;sraelens;s. Estudios han mostrado que el cuerpo
parasporal de ambos entomopatogenos es esferico y contiene las protefnas con
pesos moleculares de 27, 65, 128, Y 135 KDa reunidas dentro de una serie de
inclusiones (Ibarra and Federici, 1986) adem as, las protefnas de 27 y 65 KDa
estan altamente relacionadas inmunologicamente (Gill et al. 1987).
Los genes que codifican las protefnas de 27 KDa difieren en una sola base (Galjart
et al. 1987). Parece ser que la toxicidad de B. thur;ngiensis morrison; PG-14 es
debida probablemente a las protefnas del cuerpo parasporal que este produce y
que tienen propiedades toxicologicas similares a aquellas de B. thuring;ens;s
;sraelens;s; sin embargo, una diferencia interesante es que el cuerpo parasporal
de PG-14 contiene una inclusion adicional de tipo bipiramidal compuesto por una
protefna 0 por varias protefnas con tamario molecular de aproximadamente 144
KDa, aunque el papel mosquiticida de esta proteina no se ha determinado aun.
En Japan, se aislaron cepas mosquitocidas de B. thuring;ens;s darmstadiensis
del gusano de seda (Padua et al. 1980); estudios preliminares del aislado 73-E 10­
2 de esta subespecie, mostraron que tiene un cuerpo parasporal esferico
conteniendo dos tipos de inclusiones con complemento de aproximadamente 5
protefnas mayores con tamarios de 25, 49, 70, 125, Y 144 KDa (Federici et al.
1987).21
Las subespecies que exhiben actividad t6xica contra lepid6pteros contienen
protelnas con pesos moleculares entre 120 a 230 KDa dentro de un cristal
bipiramidal. La subunidad de 230 KDa se ha considerado como un dimero de dos
proteinas de 130 KDa (Nagamatsu et al. 1978). De otro lado B. thur;ng;ens;s
a;zawa; IPL 7 sintetiza principalmente proteinas insecticidas de 130-135 kDa, las
cuales son t6xicas a larvas de este orden de insectos (Wanada et al. 1996).
• 1.1.2 Clasificacion de los genes codificadores las proteinas del cristal. Hasta
ahora, se han reportado 42 secuencias nucleotidicas identicas 0 casi identicas que
codifican para las protelnas del cristal de B. thur;ng;ens;s, las cuales representan
el mismo 0 pequerias variaciones del mismo gen. De acuerdo con 10 anterior,
algunas evidencias sugieren que 13 genes codifican para una familia de proteinas
relacionadas, protein as Cry.
Segun las caracteristicas de similitud estructural y el espectro insecticida de las
prote/nas, estos 13 genes se han clasificado en cuatro clases mayares y, en varias
subclases denominadas par letras. Las cuatro clases de genes mayores son: (I)
especifica a Lepidoptera, (II) especifica a Lepidoptera y Diptera, (III) especifica a
Coleoptera, y (IV) especifica a Diptera. Pueden proponerse y adicionarse nuevas
clases de genes que sean identificadas (ver tabla 1) (Hofte and Whitely, 1989).
EI gen 14 aislado de B. thur;ng;ens;s ;sraelens;s codifica para la protelna de 27
KDa, la cual exhibe actividad citolftica contra una variedad de celulas de
invertebrados y vertebrados. Este gen no esta relacionado estructuralmente con22
los genes cry; par 10 tanto se ha propuesto denominarlo como gen cyt (tabla 1)
(Hofte and Whitely, 1989).
De los 42 genes secuenciados, 20 se han agrupado dentro de la clase cryl (tabla
2) de los cuales se han detectado sels diferentes genes (tabla 1), los 20 genes
codifican protefnas de 130 a 140 KDa, las cuales se acumulan en las inclusiones
cristalinas bipiramidales durante la esporulaci6n de B. thuringiensis y ademas
tfenen actividad insecticida contra lepid6pteros
TABLA 1. Genes de las proteinas del cristal insecticida de B. thuringiensis
Tipo de Rango de N° de amino Masa molecular
genes hospede­ acidos predecicha (KOa)
rosb
crylA(a) L 1,176 133.2
crylA(b) L 1,155 131 .0
crylA(c) L 1,178 133.3
crylB L 1,207 138.0
crylC L 1,189 134.8
crylO L 1,165 132.5
cryilA UD 633 70 .9
cryilB L 633 70.8
cryiliA C 644 73.1
crylVA 0 1,180 134.4
crylVB 0 1,136 127.8
crylVC 0 675 77.8
crylVO 0 643 72.4
cytA D/cito. 248 27.4
b Especificidad de range de hospederos. L, Lepidoptera; 0, Diptera; C, Coleoptera; citol, citolitica y hemolitica.23
TABLA 2. Secuencias reportadas de los genes de las proteinas del cristaI
Gen de la proteina subespecie y/o cepa Diferencias en el N° de
del cristal de B. thuringiensis aminoacidos obtenida de la
secuencia de los holitipos a
Protoxina Toxina D
Cry/A(a) kurstaki HO-1 H H
aizawai 3 2
kurstaki HO-f o
sono 24 3
o
entomocidus 1
Cry/A{b) berliner 1715 H
berliner1 715 2
kurstaki HO-1 2
kurstaki HO-1 5
aizawai IPL-7 4
kurstaki HO-1 6
kurstaki NRO-12 10
aizawai IC-1 4
CryIA(c) kurstaki HO-73 H H
CrylB thuringiensis HO-2 H H
entomocidus HO-110
CrylC entomocidus 601 H H
aizawai HO-137 7 < 7
entomocidus HO-11 0 2 2
CrylD aizawai HO-68 H H
Cry/IA kurstaki HO-263 H
kurstaki HO-1 o o
'CryIlB kurstaki HO-1 H
CrylllA san diego H
o o
tenebrionis
EG2158 o o
CrylVA israelensis H H
israelensis 4 1
CrylVB israelensis H H
israe/ensis 1
israelensis 3 3
israelensis 97 78
Cry/VC israelensis H H
CrylVD israe/ensis H
CytA israe/ensis H
morrisoni PG-14
o o
israelensis
morrisoni PG-14 124
a La primer secuencia reportada de un tipo de gen es considerada la secuencia del holotipo (H). Los reportes
posteriores de secuencias de aminoacidos son definidos por los cam bios en el numero de aminoacidos con
respecto a la secuencia del holotipo.
b Toxina. La mitad N-terminal de la proteina del cristal, delineada por el aminoacido C-terminal de la secuencia
amino acidica del bloque 5 conservado.
La secuencia reportada representa los primeros 823 residuos
C
Todos los genes que pertenecen a la clase cryl contienen como minima un 50%
de aminoacidos idemticos, cuando esta identidad es mayor de un 80% sa agrupan
dentro de la subclase crylA, la cual presenta 3 subdivisiones; a, b, y c (tabla 3).
Las diferencias nucleotfdicas entre a, b, y c estan localizadas principalmente en
una seccion limitada de la region que codifica el fragmento toxico. En cambio, los
genes crylB, crylC, y crylD difieren mucho mas de 10 que difieren los genes crylA
(Hofte and Whitely, 1989).
Un gen de la proteina del cristal de B. thur;ng;ens;s a;zawa; IC-1 aparece en la
tabla 2 como cryIA(b), aunque la proteina codificada por este, tiene doble
especi·flcidad, ya que es toxica a dipteros ya lepidopteros; pero, la toxicidad de la
proteina IC-1 depende de la fuente de la enzima proteolitica. La decision de incluir
el gen IC-1 en la subclase cryIA(b), mas que la creacion de una nueva clase, esta
basada sobre la estructura primaria de la proteina codificada por este, la cual
mostro que la secuencia amino acfdica di·flere del holotipo solo por cuatro amino
acid os (Hofte and Whiteley, 1989)DE f -\ilTAMENTO D" SISLIOTE'CJQ 25
Ci en ciol A~rooea.Jarios " a~nclc:
TABLA 3. Porcentaje de identidad aminoacidica entre las proteinas
codificadas por los genes cry.
Protein % de identidad amino acidica, para:
Cry/ Cry/ Cry/ Cry/ Cry/ Cryl1l Cry/ Cry/ Cry/V
A (b) A (c) B C D A VA VB C
Crv/A 90 82 55 67 71 25 27 27 22
Cry/A 86 56 66 71 28 27 27 23
Cry/A 55 67 70 23 28 24 24
Cry/B 58 56 34 26 28 22
Cry/C 70 31 26 30 21
Cry/D 23 28 28 22
Cryl1lA 23 19 26
Cry/VA 54 29
Cry/VB 29
Los genes cry!! codifican protefnas de 65 KOa las cuales se forman dentro de
inclusiones cristalinas cuboidales producidas por varias cepas de B. thuringiensis
kurstaki, por el aislado HO-1 de esta misma subespecie, B. thuringiensis
thuringiensis Berliner, B. thuringiensis toworthi y por B. thuringienis kenyae,
especificos a lepid6pteros y a dfpteros. Widner and Whiteley (1989) clonaron dos
genes relacionados (cryliA y cryllB) del aislado HO-1 los cuales codifican
protefnas de 633 amino acidos con un peso molecular de 71 KOa. Los genes
cryliA y cryliB fueron expresados en E. coli y sus protefnas recombinantes
purificadas. Aunque las dos proteinas son altamente hom610gas (87% de identidad
aminoacidica) difieren en su espectro insecticida. CryliA es activa contra
lepid6pteros y dfpteros, mientras CryliB solo contra a lepid6pteros. La clasificaci6n26
de la proteina codificada p~r ese ultimo gen como Cryll, mas que como Cryl, se
base en la similaridad estructural entre CryliA y CryliB (Hofte and Whiteley, 1989).
Los genes cry II I codifican para proteinas que tienen actividad especifica contra
insectos del orden Coleoptera y se han aislado de cepas de B. thuringiensis.
tenebrionis, B. thuringiensis san diego y B. thuringiensis EG2158, cada una
de estas cepas produce cristales romboidales que contienen una proteina mayor.
EI gen clonado y expresado en E. coli dirige la sfntesis de una protefna CrylliA de
72 Kda; hom610ga en su regi6n t6xica a las proteinas codificadas por los genes
cryl y crylV (Hofte and Whiteley, 1989).
EI gen cyt codifica proteinas con actividad citolitica para celulas de vertebraddos e
invertebrados, y 10 mismo que los genes de las proteinas crylV, los cuales estan
compuestos de un grupo de genes muy heterogeneos, codifican para proteinas
especificas contra Diptera; ademas, las proteinas cyt poseen actividad citolitica a
celulas de vertebrados e invertebrados. Los genes cry IV; crylVA, crylVB, crylVC,
y crylVD, y el cyt, aislados del plasmido presente en las cepas de B.
thuringiensis israeiensis, codifican proteinas con pesos moleculares de 135,
128, 78, 72 Y 27 KDa, respectivamente; reunidas conjuntamente en un complejo
cristal ovoide, (Hofte and Whiteley, 1989).
La estructura de crylVA y crylVB es similar a la de los genes cryl y estos tambien
codifican proteinas de 130 KDa, las cuales son proteoliticamente convertidos en
pequerios fragmentos t6xicos. La parte media 3' de estos genes son casi identicos27
entre sf y muy similares a la parte media 3' de los genes cryl (Hofte and Whiteley,
1989).
Los genes crylVC codifican para una protefna con peso molecular de 78 KDa.
Pero cuando se clona en B. subtilis 0 dentro de cepas de B. thuringiensis
israelensis se produce la sfntesis de una protefna t6xica de 58 KDa, posiblemente
un fragmento proteolltico del gen, el cual se ha encontrado en cristales de B.
thuringiensis israelensis. De otro lado, la regi6n que especffica la actividad de la
toxina en los genes cry/VA, crylVB, y crylVC es altamente divergente (Hofte and
Whiteley, 1989).
Los genes crylVD codifican para una proteina de 72 KDa, componente principal
del cristal de B. thuringiensis israelensis. Esta protefna difiere de todas las otras
codificadas por los genes cry, y no se conoce la localizaci6n exacta del fragmento
activo en la protefna completa (Hofte and Whiteley, 1989).
La proteina de 27 KDa codificada por cytA no muestra una homolog fa en la
secuencia con los otros genes cry de las proteinas del crista!. Ademas, esta
proteina purificada de cristales de B. thuringiensis israelensis 0 de clones
recombinantes de B. subtilis, presenta caracterfsticas funcionales (micas: es
citolltica in vitro para una variedad de celulas de vertebrados e invertebrados,
incluyendo eritrocitos de mamiferos, sin embargo, su actividad insecticida in vivo
es incierta (Hofte and Whiteley, 1989).28
Knowles et al. (1990) han reportado que la toxina de 28 KDa de B. thuringiensis
darmstadiensis y la de 25 KDa de B. thuringiensis kyushoensis deben
clasificarse en una nueva categoria 0 clase taxonomica, la CytB, por el espectro
de actividad citoiftica de estas toxinas y por su carencia de homolog fa antigemica
con la toxina CytA.
1.2 MECANISMO DE ACCION DE LAS ENDOTOXINAS EN EL INTESTINO
MEDIO DEL INSECTO.
1.2.1 Estructura de las endotoxinas en relaci6n con la inserci6n al intestino
medio del insecto. EI mecanismo de accion de estas toxinas puede ser atribuido
en parte, a su estructura tridimensional. De los tres dominios, el II y III de la region
C-terminal de la toxina activada pueden ser necesarios para la union a las celulas
receptoras del insecto; y una secuencia de aminoc3cidos especffica puede ser
menos importante para el mantenimiento de la correcta conformacion
tridimensional 0Nu and Aronson, 1992). ~a toxina requierH_su.estru.ctWf.a-natural
para actuar tanto in vitro como in vivo ya que CryIA(a) desnaturalizada por calor
no tuvo actividad in vitro sobre los receptores de la membrana de B. mori
(Lepidoptera) (Uemura et al. 1992), 10 cual debe tenerse en cuenta para la
construccion de un insecticida a partir de ella (Pietrantanio et al. 1993).
Debido a la fuerte identidad entre 5 bloques de secuencias conservadas de
aminoacidos en la estructura primaria de muchas protefnas Cry, se cree que los
genes cry han side originados de una proterna ancestral comun (Hofte y Whiteley,29
1989). Ademas, las proteinas Cryll, Crylll, CryIVC, y CrylVD parecen ser
variaciones naturales de la region C-terminal de las proternas mayores, Cryl y
CrylV. Los genes cyt y sus proteinas Cyt, sin embargo, son significativamente
diferentes tanto en su estructura como en su actividad biologica de los genes cry y
sus proteinas Cry, respectivamente (Pietrantonio et a/. 1993).
Recientemente, se ha dilucidado la estructura terciaria de la toxina CrylllA de B.
thuringiensis tenebrionis como representativa para todas las demas proteinas
Cry. Esta toxina esta compuesta por tres dominios (Li et al. 1991). EI dominio I 0
region N-terminal consta de siete helices alfa enrolladas, el dominio II consiste de
tres laminas en conformacion beta, y el dominio III es un beta-sandwich que lIega
hasta la region C-terminal de la molecula.
EI dominio I contiene los residuos amino acidicos 58-290 y forman una superhelice
levogira en la cual sers de las helices anfifaticas, tienen sus superficies
hidrofobicas hacia el centro, y rodean la helice cinco, region helicoidal enrollada
propuesta como el dominio formador del poro u orificio en la membrana de las
celulas epiteliales del intestino medio del insecto.
Despues de que la toxina se une a un receptor de la membrana celular, se
produce un cambio en la conformacion de la toxina en la superficie hidrofobica de
las helices, la cual da la cara al exterior del bundle, para poder penetrar la
membrana celular del intestin~ medio del insecta asr que el par de helices 4-5 0 6­
7 del dominic I. son orobablemente los resoonsables de iniciar la insercion hacia30
dentro de la membrana celular; pero la helice alpha 5, esta protegida por que hace
parte del bloque mas conservado, por otro lado la mitad de la helice 6 y la helice 7
completa se unen dentro del segundo bloque conservado en este dominio
(Pietrantonio et al. 1993).
EI dominio II de esta toxina consta de una region hipervariable en los residuos
aminoacfdicos 294-452 que exhiben topologfa en "clave griega" la cual se
considera que esta involucrada en la union al receptor de la membrana de las
celulas epiteliales. Las cadenas beta de este dominio se han identificado como
responsables de la especificidad hacia lepidopteros y dfpteros (Widner y Whiteley,
1990; Schnepf et al.; 1990; li et al. 1991). Se ha serialado que la secuencia
caracterfstica del dominio de union de la endotoxina afecta la especificidad por el
hospedero de la endotoxina (H6fte and Whiteley, 1989).
EI dominio III posee una topologfa en "rollo de gelatina" que incluye los bloques
conservados III , IV, y V. Una parte de este dominio esta en contacto con el
dominio I, y se cree que es importante para la estabilidad e integridad del cristal
(Pietrantonio et al. 1993).
Por otro lado, se ha serialado que la toxina activada (endotoxina) CrylliA puede
contener tres dominios estructurales: Un dominio N-terminal formador del poro,
comprende los aminoacidos del 1-279 con regiones hidrofobicas conservadas; otro
dominio II region C-terminal que es tambien conservado, que abarca los31
variable entre las dos anteriores que contiene la mayoria de los amino acid os
diferentes (Hofte and Whiteley. 1989; Hodgman and Ellar. 1991; Aronson. 1994; y
Gill. 1994).
Federici (1993) muestra en estudios de algunos genes de B. thur;ng;ens;s que
codifican para las toxinas como minimo dos dominios funcionales: uno se
caracteriza par presentar una serie de cinco bloques de aminoacidos conservados
que comprenden la parte central estructural de la molecula, considerada la parte
toxica y el otro dominic contiene una region hipervariable considerada importante
en la determinacion del espectro de actividad contra insectos.
Las regiones variables y la region C-terminal conservada constan de laminas beta.
parecen ser criticas en la especificidad de la toxina. y determinan la union a un
receptor sobre la membrana del plasma de las celulas epiteliales del intestin~
medio del insecto susceptible (Choma et a/. 1990; Convents et a/. 1990).
Usando la tecnologia del ADN recombinante. se ha construido proteinas mutantes
de CryIA(a) y CryIA(c) con las porciones de diferentes dominios intercambiados,
toxinas que difieren significativamente en su toxicidad a Bomb;x mor;
(Lepidoptera). Se encontro el dominio responsable para la especificidad localizado
entre los residuos 332 y 450 en la toxina CryIA(a) (Ge et al. 1989).32
se confirmo con construcciones quimericas de los residuos 450-612 0 332-428 de
CryIA(a) los cuales mostraron muy poca union, mientras construcciones con la
region hipervariable completa (residuos 332-621) 0 con una deleccion interna
entre los residuos 428 y 450 dentro de la region hipervariable CryIA(a) exhibieron
una fuerte union (Lee et al. 1992) con 10 cual se puede evidenciar de que el
dominic II de las toxinas de B. thuringiensis es un dominio de union que
determina la especificidad (Honee et al . 1991).
Los ensayos de union de protefnas quimericas no muy relacionadas como
CryIA(b) y CrylC al epitelio del intestin~ medio del insecta permitieron identificar la
region C-terminal como el dominic de union y como responsable de la selectividad
en los bioensayos. Dos de once hibridos construfdos fueron toxicos y uno de ellos
que posefa el N-terminal de CryIA(b) y el C-terminal de CrylC mostro competencia
con la toxina CrylC (Honee and Visser, 1993).
Ward et a/. 1988 usaron metodos predictivos por computador para encontrar la
posible estructura secundaria y su configuracion en la membrana de la toxina Cyt
de 27 KDa de B. thuringiensis israelensis. Sin embargo, estos metodos estan
disenados para predecir la conformacion de las protefnas en un medio acuoso, por
10 tanto, el modelo resultante puede no representar exactamente la configuracion
de la toxina en una membrana.
La figura 4 representa un diagrama de la estructura de la toxina en una bicapa
linirlir.~ Fn p.~t~ finllr~ !;P. observan residuos aminocfdicos 50-69 plegados hacia33
dentro y en forma de alfa helice hidrof6bica de suficiente longitud para cruzar la
bicapa. La naturaleza anfifatica del segmento de los residuos 72-86 se muestra
como una posible superficie del dominio de busqueda 0 selecci6n del receptor. EI
segmento beta apolar que va desde los residuos 87-104 puede formar un segundo
elemento alternativo que atraviesa la membrana. Hodgman and Ellar (1991) en un
anal isis de predicci6n, en el cual se incluyeron todas las clases de toxinas de B.
thuringiensis conocidas excepto la toxina de 27 KDa, mostraron una marcada
conservaci6n de seis segmentos helicoidales que atraviesan la membrana en el
residuo N-terminal de todas las toxinas. Esta toxina muestra una fuerte similaridad
al dominio N-terminal alta mente hidrof6bico de las otras toxinas de B.
thuringiensis.
T amado de Chilcott et al. 1900
Figura 4. Diagrama esquematico que muestra como la estructura secundaria de la proteina de 27 KDa puede
unirse a una bicapa lipidica.34
En las helices del dominio I de varias toxinas analizadas se ha encontrado que la
conservaci6n de hidrofobicidad es una caracterfstica mas frecuente que la
conservaci6n de amino acidos, 10 cual puede sujerir el papel significativo de la
hidrofobicidad en la toxicidad; por ejemplo, la modificaci6n, por mutagenesis
dirigida de dos residuos, Ala-92 y Arg-93, dentro de la alfa-helice 3, conlleva a una
perdida de toxicidad de CryIA(c} contra los lepid6pteros Manduca sexta y
Trichop/usia ni y una disminuci6n de la toxicidad para larvas de Heliothis
virescens. Este cambio de Ala -92 por Asp-92, introduce una serie de cargas
negativas 10 que resulta en una perdida de toxicidad y una inhabilidad para
competir con la toxina del tipo silvestre (Wu nad Aronson, 1992). EI mutante de
toxicidad reducida contra H. virescens fue capaz de competir con la toxina del tipo
silvestre en concentraciones mas altas. Estos resultados evidencian que una
carga positiva en el amino acido 92 esta involucrada en la uni6n prerrequisitos
para la inserci6n en la membrana y para la toxicidad (Pietrantonio et al. 1993).
Las mutaciones en los residuos aminoacfdicos 160-177 de la protefna CryIA(c}
dirigidas a mantener la hidrofobicidad en la alfa-helice 5 conllev6 a la toxicidad de
la protefna por la posible inserci6n de la toxina y formaci6n del poro, mientras la
introducci6n en estas mismos sitios de aminoacidos cargados disminuye 0 elimina
la toxicidad (Wu and Aronson, 1992 ). Tambien, mutaciones puntuales que
cambian la carga en la alfa-helice 5 resultan en una perdida de actividad
mosquitocida de CrylV (Chang, 1992). Estudios del segmento conservado alfa-5,
que comprende los amino acid os 193-215 de la delta-endotoxina Cry II lA, revelaron
que este peptido es importante para la formaci6n del poro 0 canal en la membrana