Estudio molecular del síndrome de plaqueta pegajosa mediante análisis del exoma
Autor: Barros García, Gisela
Asesor: Caminos Pinzón, Jorge Eduardo (Thesis advisor)
Fecha: 2016
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: El síndrome de plaqueta pegajosa (SPP) es una condición pro-coagulante  caracterizado por trombosis arterial o venosa debido a hiperagregabilidad  plaquetaria. No se conoce la causa molecular que logre explicar con  claridad el fenómeno de hiperagregabilidad plaquetaria en estos pacientes.  La secuenciación del exoma (WES) está demostrando ser un método eficaz  para la identificación de variantes de novo en trastornos de herencia  mendeliana.  Métodos: Se realizo WES en una paciente con criterios de SPP. El  procesamiento de las secuencias y las anotaciones de las variantes  encontradas fueron realizadas utilizando herramientas bioinformáticas  estándar. Se utilizó un sistema de filtración para dar prioridad a las variantes  de novo de posible importancia funcional y estas fueron comparadas con  genes posiblemente relacionados con SPP e hiperagregabilidad plaquetaria.  Resultados: En una paciente con SPP tipo I, se encontró una mutación  delecional de novo, en el gen Ori1 que codifica una subunidad de canal de  calcio en la membrana plaquetaria.  Conclusión: Estos hallazgos amplían el espectro de condiciones genéticas  relacionadas con el SPP y proporcionan más apoyo para el entendimiento  de su patogénesis, diagnóstico y tratamiento.

ESTUDIO MOLECULAR DEL SINDROME DE PLAQUETA
PEGAJOSA MEDIANTE ANALISIS DEL EXOMA
GISELA BARROS GARCIA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
Bogotá
2016ESTUDIO MOLECULAR DEL SINDROME DE PLAQUETA PEGAJOSA
MEDIANTE ANALISIS DEL EXOMA
GISELA BARROS GARCIA
Residente Oncohematología Pediátrica
Proyecto de investigación realizado como requisito para acceder al título de
Especialista en Oncohematología Pediátrica
Tutores:
EDUARDO BELTRÁN DUSSÁN
Especialista En Oncohematología Pediátrica
Profesor Titular Facultad de Medicina, Departamento de Pediatría, División
de Oncohematología Pediátrica de la Universidad Nacional de Colombia
JORGE EDUARDO CAMINOS PINZÓN
MSc, PhD. Profesor Asociado, Coordinador División de Bioquímica. Facultad
de Medicina Universidad Nacional de Colombia
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
Bogotá
2016Resumen
El síndrome de plaqueta pegajosa (SPP) es una condición pro-coagulante
caracterizado por trombosis arterial o venosa debido a hiperagregabilidad
plaquetaria. No se conoce la causa molecular que logre explicar con
claridad el fenómeno de hiperagregabilidad plaquetaria en estos pacientes.
La secuenciación del exoma (WES) está demostrando ser un método eficaz
para la identificación de variantes de novo en trastornos de herencia
mendeliana.
Métodos: Se realizo WES en una paciente con criterios de SPP. El
procesamiento de las secuencias y las anotaciones de las variantes
encontradas fueron realizadas utilizando herramientas bioinformáticas
estándar. Se utilizó un sistema de filtración para dar prioridad a las variantes
de novo de posible importancia funcional y estas fueron comparadas con
genes posiblemente relacionados con SPP e hiperagregabilidad plaquetaria.
Resultados: En una paciente con SPP tipo I, se encontró una mutación
delecional de novo, en el gen Ori1 que codifica una subunidad de canal de
calcio en la membrana plaquetaria.
Conclusión: Estos hallazgos amplían el espectro de condiciones genéticas
relacionadas con el SPP y proporcionan más apoyo para el entendimiento
de su patogénesis, diagnóstico y tratamiento.Abstract
Sticky platelet syndrome (SPS) is a pro-coagulant condition characterized by
artherial or venous thrombosis due to a platelet hyperaggregability.There is
no known molecular cause that allows to explain with clarity the platelet
hyperaggregability phenomenon in these patients. The whole exome
sequencing (WES) has been an effective method to identify novo variants in
Mendelian hereditary disorders.
Methods: WES was done in a patient with SPP criteria. The processing of
the sequences and the annotated variants found, were done utilizing
bioinformatics standard tools. A filtration system was used to give priority to
the novo variants that could have possible functional relevance. These ones
were compared with genes possibly related with SPP and platelet
hyperaggregability.
Results: In a patient with SPP type I, it was found a deletional novo mutation
in the gene Ori1 that encodes a calcium channel subunit in the platelet
membrane.
Conclusion: These findings expand the spectrum of gene conditions related
to the SPP and provide more support to understand its pathogenesis,
diagnose and treatment.Contenido
Pág.
Contenido
1. Introducción y justificación………………………………1
2. Objetivos……………………………………………………..4
2.1 Objetivo general………………………………………….4
2.2 Objetivos específicos……………………………………4
3. Marco teórico………………………………………………..6
4. Metodología………………………………………………...17
4.1 Tipo de Muestra………………………………………...17
4.2 Criterios de inclusión…………………………………..17
4.3 Criterios de exclusión………………………………….18
4.4 Diagnóstico de SPP……………………………………18
4.5 Preparación de muestras de DNA…………………….18
4.6 Secuenciación Exómica………………………………..19
4.7 Analisis de los datos……………………………………20
4.7.1 Secuenciación Exomica y análisis Bioinformatico ………….20
4.7.2 Alineación de las lecturas con un genoma de referencia…..20
4.7.3 Localización de las variantes…………………………………..21
4.7.4 Filtrado y Anotación de las Variantes…………………………21
4.8 Procedimientos………………………………………….22
5. Conducción del estudio…………………………………..24
5.1 Sitio de investigación……………………………………24
5.2 Manejo de sustancias o especímenes biológicos……24
5.3 Seguridad…………………………………………………24
5.4 Consideraciones éticas………………………………….25Pág.
6. Cronograma general de actividades……………………………27
7. Presupuesto…………………………………………………………28
8. Resultados…………………………………………………………..29
9. Discusión de los resultados……………………………………...31
10. Conclusión y Recomendaciones………………………………..35
11. Agradecimientos……………………………………………………36
12. Anexos………………………………………………………………..37
Anexo 1: Consentimiento informado……………………………….37
Anexo 2: Reglas para la toma de decisiones con respecto a la
participación de niños en la investigación…………………………42
Anexo 3. Listado de posibles genes de interés relacionados
con el SPP……………………………………………………………44
13. Referencias bibliográficas………………………………………..481
1. Introducción y Justificación
La trombosis en la edad pediátrica, es una patología diagnosticada cada vez
con mas frecuencia gracias a los progresos de la medicina actual que
permiten reconocerla y diagnosticarla mas fácilmente. Aun cuando se han
logrado avances en el conocimiento de esta patología en la edad pediátrica
todavía quedan muchas aspectos por dilucidar.
Los eventos trombóticos pueden ser congénitos o adquiridos. Las causas
congénitas son sospechadas ante la presencia de eventos trombóticos
recurrentes, historia familiar y la ausencia de probables causas secundarias.
La mayoría de estos episodios de trombosis son debidos a defectos de las
proteínas anticoagulantes o a fenómenos plaquetarios. Actualmente se
describen como causas genéticas, en primer lugar la Resistencia a la
Proteína C activada seguida por el Síndrome de la Plaqueta Pegajosa y en
tercer lugar la alteración del Gen de la Protrombina. Se cree además que
una alta proporción de los episodios trombóticos en la edad pediátrica
considerados como idiopáticos podrían estar explicados por el Sindrome de
Plaqueta Pegajosa.
El síndrome de la plaqueta pegajosa es un trastorno de la agregabilidad
plaquetaria de relativa reciente identificación caracterizado por un
incremento de la agregación plaquetaria in vitro después de la activación con
bajas concentraciones de adenosin difosfato y/o epinefrina asociado a la
presencia de fenómenos trombóticos arteriales y venosos.
Desde las descripciones iniciales, se ha observado la ocurrencia familiar del
síndrome de plaqueta pegajosa. Por lo tanto ha sido considerado, por lo
menos en una proporción significativa de los individuos afectados, como un
trastorno hereditario. A pesar de la definición clínica clara, la fuerte evidencia
de ocurrencia familiar y los esfuerzos de algunos investigadores, la causa
molecular exacta de este síndrome aun permanece sin identificar.2
La mayoría de las mutaciones relacionadas con las enfermedades conocidas
actualmente se encuentran ubicadas en el exoma o parte codificante del
genoma. La secuenciación del exoma completo es un acercamiento reciente
que ha demostrado su utilidad en encontrar las mutaciones responsables de
distintas enfermedades. En este trabajo se plantea la hipótesis de que esta
técnica podría ser útil para ayudar a aclarar la genética que subyace al
síndrome de plaqueta pegajosa.
Partiendo de esta hipótesis, se pretende secuenciar a un individuo que
cumpla con los criterios de Síndrome de Plaqueta Pegajosa y los miembros
afectados por esta entidad de su familia con el objetivo de encontrar una
variación genética común origen del trastorno en esta familia.34
2. Objetivos
2.1 Objetivo general:
Contribuir al estudio de la etiología del síndrome de plaqueta pegajosa,
realizando una aproximación molecular mediante el estudio del exoma de
una paciente y los miembros de su familia afectada.
2.2 Objetivos específicos:
 Identificar la presencia de alteraciones genéticas mediante el
estudio de secuenciación del exoma en un paciente con síndrome
de plaqueta pegajosa y los miembros afectados de su familia.
 Hacer una descripción de las características clínicas y paraclínicas
de un paciente con diagnostico de síndrome de plaqueta pegajosa
y de su familia.56
3. Marco Teórico
La primera descripción de la función de las plaquetas fue realizada por
William Osler en 1873, quien las describió como estructuras que tendían a
“agruparse unas con otras”. Osler no solo hizo una descripción
macroscópica de las plaquetas sino que también identificó su presencia en
el coagulo sanguíneo. Mas adelante, en 1892 el patólogo italiano Bizzozero
describió como las plaquetas se agrupan en los vasos sanguíneos dañados,
formando el tapón hemostático y proporcionó evidencia de su participación
en los procesos trombóticos identificándolas en los trombos formados en las
placas ateroscleróticas, aneurismas aórticos y en las vegetaciones
valvulares.(1)
Inicialmente, hacia 1880, fueron identificados los primeros trastornos
hemostáticos cuantitativos plaquetarios asociados a una disminución en el
conteo, seguido poco mas tarde de las primeras descripciones de
alteraciones cualitativas hacia 1909 con el síndrome de May Hegglin y el
síndrome de Bernard Soulier en los cuales fueron descritas características
morfológicas únicas asociadas a la presencia de alteraciones en las
pruebas de función plaquetaria presentes en ese momento como por
ejemplo, la retracción del coágulo en la tromboastenia de Glanzmann.(2)
Una descripción mas profunda de la función plaquetaria fue aportada por
Bernard, Caen, Roskam, y Soulier de 1920 a 1960, etapa durante la cual se
desarrollaron métodos de laboratorio especializados como la agregometría
plaquetaria turbidimétrica y métodos analíticos bioquímicos plaquetarios que
fueron fundamentales para el entendimiento de la función plaquetaria en la
hemostasia y sus trastornos. (3)
Las plaquetas son los elementos celulares más pequeñas en la sangre, con
un volumen medio de alrededor de 7 a 9 fL. Se producen por la
fragmentación de megacariocitos en la médula ósea, y son liberados en la7
Marco Teórico
________________
circulación. Su vida en la circulación es de 7 a 10 días. Las plaquetas tienen
una forma discoidal y carecen de núcleo. Su membrana plasmática contiene
glucoproteínas (GP) que se unen a proteínas de adhesión específicas para
promover interacciones entre plaquetas-superficie (adhesión) y entre
plaquetas-plaquetas (agregación). En condiciones normales, las plaquetas
circulan en el torrente sanguíneo sin adherirse al endotelio de la pared del
vaso. Sin embargo, cuando el endotelio se lesiona, las plaquetas se
adhieren al endotelio, se activan, y se someten a un cambio en su forma
discoidea a una forma irregular con m ltiples prolongaciones. Esto se debe
a cambios en el esqueleto contr ctil y cambios en los microtúbulos.(4)
Después de su unión al colágeno subendotelial expuesto por la lesión las
plaquetas se activan adquiriendo seudópodos que les permiten unirse m s
fuertemente entre sí y liberar los agonistas de la agregación plaquetaria
contenidos en los gr nulos. Todo esto lleva a la formación del tapón
plaquetario.
El proceso de adhesión de las plaquetas está mediada por la GPIb del
complejo de GPIb/IX/V, que sirve como un sitio de unión para el factor de
Von Willebrand (vWF) subendotelial. FvW es una proteína de adhesión
secretada por las células endoteliales y las plaquetas, y está presente en el
subendotelio y en el plasma. La unión al colágeno subendotelial está
mediada a través del complejo GPIa/IIa (α2β1 integrina) y la GPVI. La
adhesión al subendotelio estimula la secreción de los gránulos alfa de
almacenamiento y los gránulos densos de las plaquetas, incluyendo
adenosina-difosfato (ADP) y la formación de tromboxano A2 (TXA2); ADP y
TXA2 promueven la agregación. (5)
La liberación de ADP es esencial para la agregación plaquetaria actuando
mediante su interacción con receptores específicos localizados en la
superficie plaquetaria. Se conocen dos receptores para el ADP en la
plaqueta uno acoplado a la prote na Gα (el P2Y1) y otro acoplado a Gi (el
q8
P2Y12). Am os receptores act an de modo sinérgico en la activación de las
plaquetas. P2Y1 acoplado a Gα regula los eventos de señalización calcio
q
dependientes que inician el cambio de forma de las plaquetas y la rápida y
reversible agregación plaquetaria aIIbβ3-dependiente. P2Y12 es Ga
i
relacionado y activa aIIbβ3 por un mecanismo que implica la inhibición de la
producción de cAMP por la adenilatociclasa; P2Y12 es el blanco de
fármacos antitrombóticos que incluyen clopidogrel.(6)
La visión actual de la relación entre estos dos receptores plaquetarios de
ADP es que P2Y1 inicia la agregación, reforzando P2Y12. El ADP es
secretado por los gránulos densos cuando las plaquetas son activadas por
otros agonistas incluyendo colágeno, FvW, o trombina, actuando sobre los
receptores P2Y1/P2Y12 y promoviendo la agregación plaquetaria estable.(7)
La GP Ib/IX/V es un complejo de glucoproteínas compuesto por GPIBα y
GPIBβ unidas por puentes disulfuro, no covalentemente asociados con
GPIX y GPV con una relación 2 2 2 1. El dominio N-terminal de GPIBα
(residuos 1-282) es la región de ligando principal del complejo GPIb-IX-V y
contiene también sitios de unión, para el FvW, la integrina leucocitaria
aMh2 (Mac-1), α trombina, y P-selectina expresada sobre plaquetas
activadas o células endoteliales activadas.(8)
En las plaquetas, la P-selectina y el FvW están presentes en los gránulos α,
mientras que en las células endoteliales contienen gránulos de
almacenamiento, los cuerpos de Weibel-Palade, que liberan también P
selectina y el FvW, en consecuencia, los grandes multímeros de FvW y P-
selectina se expresan rápidamente tras la activación de ambos tipos de
células y pueden mediar la adhesión plaquetaria y leucocitaria por
mecanismos tanto GPIBα-dependientes como GPIBα-independientes.
La GPIbα se expresa en la superficie de la plaqueta e inicia el proceso de
adhesión uniéndose al col geno y al factor von Willebrand. En los vasos
con alto estrés de rozamiento, como ocurre en las arterias el Fv es9
Marco Teórico
________________
esencial para reducir el flujo r pido de las plaquetas mediante la interacción
del dominio A1 del FvW con la GPI α.(6)
El VWF subendotelial asociado con los filamentos de colágeno tipo IV
inducen la activación plaquetaria y su adhesión firme a la pared de tal
manera que el col geno y el Fv forman una especie de unidad funcional
para la formación inicial del trombo. En este proceso participan dos
receptores plaquetarios la GPVI y la integrina α2β1. La GPVI permite una
firme adhesión de las plaquetas y la secreción de las sustancias
procoagulantes contenidas en ellas, consolidando la formación del trombo.
(8)
La GPIIb/IIIa es la mas abundante en la superficie plaquetaria. Esta GP
interviene en la adhesión de la plaqueta a la pared vascular y también en la
interacción plaqueta-plaqueta, lo que se conoce como agregación
plaquetaria, a través principalmente del fi rinógeno que es el principal
ligando, sin embargo otros péptidos que contienen la región RGD (arginina,
glicina, aspártico) como por ejemplo el VWF, o la fibronectina, son capaces
también de interactuar con la GPIIb/IIIa.(9)
La primera descripción de un trastorno cualitativo plaquetario protrombótico
que mas adelante seria conocido como síndrome de plaqueta pegajosa fue
realizada en 1979 por Mefti y colaboradores, quienes describieron 22
pacientes con episodios de accidente isquémico transitorio, que mostraban
en las pruebas aumento de la adhesión y la agregabilidad plaquetaria y en
quienes fueron descartadas otras probables causas de estos episodios,
como presencia de aterosclerosis, émbolos cardiacos, migraña o
enfermedades del colágeno. Metfi llegó a la conclusión de que había un
grupo específico de pacientes con AIT en los que la anormalidad de la
función plaquetaria fue la única causa del evento. Mefti observó una mejoría
de los patrones de agregación con la administración de ASA y su
anormalidad luego de su suspensión.(10)10
Marco Teórico
________________
En 1982 Mammen y colaboradores describieron una mujer de 24 años de
edad, quien sufrio un infarto agudo del miocardio, mientras se encontraba en
el séptimo mes de embarazo. La angiografía coronaria no demostró lesiones
arterioscleróticas. Su madre había tenido un infarto agudo del miocardio
durante uno de sus embarazos, y su hermano de 18 años un episodio de
angina de pecho sin enfermedad coronaria asociada. Todos los estudios de
hipercoagulabilidad fueron normales y en la agregometria plaquetaria en
plasma rico en plaquetas una alta respuesta (100%) fue notada con
adenosin difosfato (ADP) y epinefrina como agonistas, la respuesta a
trombina, colágeno, acido araquidónico y ristocetina fue normal. Idénticos
patrones fueron encontrados en su madre y en su hermano, no siendo así
en su padre y hermana. (11)
Posteriormente estudió el comportamiento plaquetario en función de su
superficie de contacto mediante microscopia electrónica. Las plaquetas de
la paciente, su madre y hermano fueron hiperadhesivas e hiperagregables.
El patrón de agregación plaquetario después del tratamiento con aspirina
regreso a lo normal y luego de descontinuarla regresaban a un patrón
anormal. Mammen, propuso a partir de estos hallazgos que este misma
entidad podía ser encontrada no sólo en pacientes con accidente
cerebrovascular, sino también en otros tipo de eventos trombóticos, de otro
modo inexplicables, especialmente en personas jóvenes sin factores de
riesgo graves, y fue el primero en describir el patrón herencia autosómico
dominante.(12)
En 1983, Mammen y Holiday, en la 9 ª conferencia Internacional de
Trombosis y Circulación Cerebral en Phoenix, Arizona describiendo un grupo
de pacientes con ictus isquémico o AIT y hiperagregabilidad plaquetaria
después de bajas concentraciones de epinefrina y/o ADP. Holiday describió
esta condición como un síndrome clínico distinto y sugirió el término
Síndrome de Plaqueta Pegajosa para enfatizar el defecto de la agregación
plaquetaria.(13)11
La mayoría de los estudios de plaqueta pegajosa publicados entre los años
1980 y 1990 fueron limitados en el número de pacientes, diseño
retrospectivo y, en general agregaban poco al conocimiento del síndrome
mas allá de la descripción de las manifestaciones clínicas. Sin embargo, los
estudios de Mammen y colaboradores añadieron datos importantes para
mejorar la comprensión y la definición del síndrome.
En 1986, Mammen publicó un estudio de un grupo de pacientes con IAM o
angina de pecho, con arterias coronarias angiográficamente normales. Los
datos revelaron diferencia significativa en los patrones de agregación con
ADP y epinefrina y diferencias igualmente significativas en la evaluación
microscópica electrónica.(13)
Mas adelante, Rubenfire y colaboradores estudiaron una serie de pacientes
menores de 45 años de edad que habían sufrido accidentes
cerebrovasculares o AIT trombóticos. No tenían factores de riesgo
identificables, y se descartaron otras causas de hipercoagulabilidad. Los
mismos patrones de agregación y hallazgos en la microscopia electrónica
fueron identificados, y se pudo establecer en ellos un patrón de herencia
autosómico dominante.(14)
Otro estudio realizado por Mammen y colaboradores, en pacientes con
neuropatía óptica isquémica idiopática, que tenían pérdida temporal o
permanente de la visión, demostró, patrones de agregación plaquetaria
alterados y respuestas anormales en la superficie de contacto. (12)
La experiencia de Mammen con decenas de casos se resume en varios
artículos publicados desde mediados de la década de 1990 a 2003. Estos le
permitieron proponer las pruebas de laboratorio claramente definidas y
criterios clínicos para el síndrome de Plaqueta Pegajosa. Tabla 1. De
acuerdo al patrón de agregación plaquetaria, Mammen identificó dos tipos
de síndrome: Tipo I, caracterizado por hiperagregabilidad tanto con ADP
como a con epinefrina y Tipo II, que se caracteriza por hiperagregabilidad12
solo con epinefrina, siendo ésta más frecuente.(5) Esta clasificación, se
basa únicamente en características de laboratorio y Mammen no observó
ninguna relación entre esta clasificación y las manifestaciones clínicas, la
respuesta al tratamiento, o el curso de la enfermedad. (15) En cuanto al
tratamiento, se observo una excelente respuesta al tratamiento con ASA,
en la mayoría de los pacientes, lo que confirma los resultados iniciales de
Mefty.
Tabla 1. Valores de normalidad de las curvas de agregación plaquetaria, y
criterios diagnósticos
Agregación Plaquetaria después de la Activación con
ADP EPI
Concentración
0.58 1.17 2.34 0.55 1.1 11.0
del agente (μM)
Rango normal
0–12 2–36 7.5–55 9–20 15–27 39–80
(% agregación)
Criterios Diagnostico
Diagnostico
• Historia de TE e hiperagrega ilidad a 1 conc. de 1 agente
sugestivo
• Historia de TE e hiperagrega ilidad a 2 conc. de 1 agente
Diagnostico
• Historia de TE e hiperagrega ilidad a 1 conc. de am os agentes
Confirmado
• Historia de TE e hiperagregabilidad con solo 1 conc. de 1 agente, repetidamente
Abreviaturas: ADP, difosfato de adenosina; EPI, epinefrina; TE, tromboembolismo.
Adaptado de MAMMEN E F. Sticky Platelet Syndrome. Seminars in Thrombosis and
homeostasis, 1999
Mas adelante, Bick adopta la clasificación propuesta por Mammen en el
diagnóstico y, en base a su propia observación, agregó el tipo III
caracterizado por hiperagregabilidad solo después de ADP. Al igual que
Mammen, no encontró ninguna relación entre los diferentes tipos ( I, II o III)
y las manifestaciones clínicas o las respuestas terapéuticas. Bick fue de los
primeros en señalar el Síndrome de Plaqueta Pegajosa en pacientes con13
trombosis venosa; y también confirmo la eficacia de las dosis bajas de
aspirina.(16)
Bick y su grupo de investigadores publicaron un estudio con 153 pacientes
que habían presentado eventos tromboembólicos sin explicación, se
identificó la presencia del Síndrome de plaqueta pegajosa en el 17,6% de
los casos. Además demostró que un número significativo de mujeres con
abortos involuntarios recurrentes (18,2%) cumplían con los criterios de SPP.
(17) Sobre la base del análisis en los cohortes de pacientes descritas por
Bick, se llegó a la conclusión de que el síndrome de plaqueta pegajosa es la
trombofilia mas frecuente en los pacientes con eventos trombóticos
inexplicables después de la resistencia a la proteína C activada. Y es la
segunda causa mas frecuente de perdidas fetales recurrentes después del
Sindrome Antifosfolipidos.(17,18)
Chaturvedi y Dzieczkowski en 1999, describieron la ocurrencia de SPP junto
con otros trastorno heredados de trombofilia en los mismos pacientes.
Describieron un caso de una mujer joven con episodios de accidente
cerebrovascular recurrentes y deficiencia de proteína S combinada. (19) Se
informó posteriormente la aparición concomitante de SPP con otras
trombofilias (niveles elevados de factor VIII, síndrome antifosfolipidos,
G20201A protrombina y hiperhomocisteinemia).(20)
El-Amm, Mühlfeld, y Yagmur, describen hiperagregabilidad plaquetaria en
pacientes sometidos a hemodiálisis o receptores de trasplante renal con
complicaciones trombóticas o rechazo del injerto. Ellos evaluaron la curva de
agregación plaquetaria con epinefrina en 30 pacientes sometidos a
hemodiálisis y 34 pacientes con trasplante renal y encontraron una alta
prevalencia de Síndrome de Plaqueta Pegajosa, en el 67 y 82%,
respectivamente, en pacientes con eventos tromboembólicos posteriores.
Los autores sugieren que la prueba de hiperagregabilidad plaquetaria puede
complementar la evaluación de las complicaciones tromboembólicas en
pacientes con enfermedad renal crónica.(21)14
Marco Teórico
En nuestro país, el primer reporte de casos de este síndrome se hizo en
2002 por Beltrán E, Linares A. y Castaño S. en pacientes pediátricos del
Hospital de La Misericordia en donde se advirtió la frecuencia elevada de
esta entidad como causa de eventos trombóticos en la edad pediatrica.(22)
Existe otro reporte de casos en pacientes obstétricas realizado en 2004 por
Velásquez A, Carmona V, y Ramos G. en el Hospital Militar Central quienes
sufrían eventos trombóticos durante el embarazo o tenían antecedente de
abortos recurrentes.(23)
El síndrome de plaqueta pegajosa se ha considerado como un trastorno
hereditario, sin embargo no ha sido posible determinar su causa exacta.
Mammen, sugirió un defecto de glicoproteínas plaquetarias de membrana
(GP) Sin embargo, no logro identificar cambios genéticos específicos.
Kubisz y col, demostraron que la fisiopatología del síndrome esta
relacionada con procesos de activación plaquetaria. Inicialmente, encontró
aumento de la expresión superficial de CD62 y CD51, neoantígenos
expresados sólo después de la activación plaquetaria en pacientes con SPP,
en comparación con la población normal, luego de un episodio trombótico
agudo.(24)
En las ultimas dos décadas, los resultados de varios análisis genéticos
sugieren la relación entre ciertos polimorfismos de nucleótido único (SNPs)
de ciertas glucoproteinas plaquetarias e hiperagregabilidad plaquetaria, en
pacientes portadores del alelo A de GPIIIa PLA. (25) Esta anormalidad se
2
presenta por una sustitución especifica de leucina-prolina que incrementa la
unión del fibrinógeno a IIbIIIa, y expresión en la membrana de P-selectina,
y esta relacionada con riesgo aumentado de eventos trombóticos, como
enfermedad cardiovascular, infarto de miocardio o accidente
cerebrovascular.(26)
GAS6 es una proteína de los gránulos α, vitamina k dependiente, homologa
a la proteína S que interactúa con Axl/Sky/Mer Tirosin-Kinasa, y se ha15
demostrado en modelos animales que potencia la agregación, al afectar la
función de los receptores α-2 adrenergicos y de ADP. (27) El mecanismo por
el cual esta proteína causa hiperagregabilidad plaquetaria aun no esta muy
bien definido. Recientes estudios sugieren que su acción es relativamente
tardía. Un reciente estudio de Chen y colaboradores sugiere que uno de los
receptores tirosin-cinasa de Gas6 esta presente en plaquetas humanas y
que su bloqueo conduce a inhibición de la agregación plaquetaria en
modelos animales, sin embargo en plaquetas humanas esta información no
ha sido demostrada.(28) Kubisz y col, estudiaron el polimorfimo Gas6 c. 834
þ 7G > A en 128 pacientes con síndrome de plaqueta pegajosa no
encontrando diferencias entre los pacientes del grupo control.(29)
La glucoproteina VI es una proteína crucial que participa en la activación,
adhesión y agregación plaquetaria. Recientemente Kubisz y col, han
estudiado la variabilidad del gen de la GPVI, encontrando mayor frecuencia
de cuatro haplotipos en pacientes con síndrome de plaqueta pegajosa, sin
embargo no pudieron demostrar en su estudio, que estos fueran mas
frecuentes que en la población control.(30) Kotuli ov y colaboradores mas
recientemente han encontrado varios SNP de GP6(31) (rs1613662,
rs1654419) en pacientes con síndrome de plaqueta pegajosa.
En los últimos años, Ruiz-Argüelles y su grupo de investigadores han
publicado varios estudios, donde se han encontrado polimorfismos de la
glicoproteína IIIa, sin embargo, los resultados publicados hasta la fecha no
han lograron identificar un solo defecto genético responsable de síndrome
de plaqueta pegajosa, ni mostrar una relación consistente de alteraciones
genéticas en GPIIIa y el desarrollo del síndrome.(32)
Actualmente, tal y como lo planteo Mammen y Bick el ácido acetil salicílico
es el fármaco de elección para el manejo de esta condición. Recientemente,
un estudio de Velázquez-Sánchez-de-Cima publicó un estudio prospectico
sobre su experiencia con AAS, clopidogrel o el uso concomitante de ambos
fármacos en 55 pacientes con SPP. Ellos observaron una excelente eficaciaMarco Teórico 16
________________
de combinación con la terapia de combinación ASA y clopidogrel en la
prevención de retrombosis. (33)
Hasta ahora, la mayor parte de los datos sobre la terapia son recogidos de
pocos estudios en los que se utilizó solo ASA, y el uso de otros agentes
antiplaquetarios es muy escaso y se limita a pocos informes de casos
individuales.
Con el advenimiento de tecnologías de secuenciación de última generación,
la capacidad de secuenciar de forma rápida todo el genoma de un individuo
ha colocado esta estrategia entre las herramientas más eficaces para la
detección de las causas genéticas de enfermedades de herencia
mendeliana. Esto es especialmente cierto para la secuenciación del exoma
(WES), que ha demostrado eficacia notable en la identificación de variantes
genéticas en todo los genes de un individuo (34 35).17
4. METODOLOGIA
4.1 Tipo de muestra:
Muestra por conveniencia.
Fue seleccionada para participar en el estudio una paciente quien
presentó un evento trombótico agudo de la arteria cerebral media a la
edad de 7 anos y en quien se documento como único hallazgo
anormal, hiperagregabilidad plaquetaria con ADP y Epinefrina, sin
antecedente de eventos trombóticos previos, y sin otros antecedentes
patológicos de importancia previo al evento. Como antecedente familiar
madre con migraña y hermana con antecedente de trombosis venosa
en extremidades en la infancia, ambas con agregometrias que
mostraron hiperagragabilidad plaquetaria con ADP y epinefrina.
Esta paciente fue seleccionada tomando como base a los pacientes
diagnosticados con diagnostico de Síndrome de Plaqueta pegajosa en
la Fundación Hospital de la Misericordia y que cumplían con los criterios
de inclusión.
4.2 Criterios de inclusión:
1. Al menos un episodio de trombosis 2. La confirmación de SPP de
acuerdo a los criterios de Mammen y Bick; (Tabla 1) y 3. La firma
voluntaria del consentimiento informado por el paciente y por sus padres o
tutores, 4. Patrón de herencia mendeliano propuesto ( autosómico
dominante).18
Metodología
________________
4.3 Criterios de exclusión:
1. El diagnóstico no claro de evento trombótico 2. Evento trombótico
debido a las otras causas o estados de hipercoagulabilidad; 3. Etiología
indeterminada o secundaria a otras causas de trombofilia primaria.
4.4 Diagnóstico de Síndrome de Plaqueta Pegajosa
Se confirmó en la historia clínica de la paciente que la agregometría fue
realizada teniendo en cuenta los lineamientos propuestos por Mammen.
Cada muestra se realizó con tres bajas concentraciones de ADP (2,34,
1,17, y 0,58 μM) y EPI (11,0, 1,1 y 0,55 μM). Los criterios de Mammen y
Bick se utilizaron para el diagnóstico y clasificación de SPS. Se confirmó
que la prueba fuese llevada a cabo mientras la paciente no recibía
tratamiento antiagregante y esta fue realizada posterior a 3 meses del
evento trombótico agudo.
Se comprobó la normalización de las curvas de agregación plaquetaria
con ADP y epinefrina un mes después del inicio del tratamiento con Acido
Acetilsalicílico. Fueron descartadas otras causas primarias de trombofilia
congénita ( deficiencia de proteína C y S, actividad antitrombina, niveles
de homocisteína, presencia de anticuerpos antifosfolípidos, resistencia a
la proteína C activada (APCR), mutación G20210A de la protrombina,
mutación factor V de Leyden se analizaron mediante métodos estándar en
esta paciente)
4.5 Preparación de muestras de DNA
Este procedimiento se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología
Molecular, de la facultad de Medicina de la Universidad Nacional de
Colombia.
Para la extracción del DNA se realizó aislamiento de leucocitos mediante
metodología de separación por gradientes de sucrosa usando el reactivo19
LSM (lymphocyte Separation Medium), el pellet de células obtenido se
almacenó a -80°C hasta su procesamiento.
La extracción de DNA se realizó a partir de los pellets almacenados a -
80°C, usando el kit PureLink™ Genomic DNA (Invitrogen) siguiendo las
instrucciones del fabricante. La pureza y calidad de cada una de las
extracciones se determinó mediante espectofotometría leyendo a
260nm y determinando la pureza mediante la relación 260/280 nm,
siendo aceptables relaciones por encima de 1,5. Esta medición se
realizó usando el equipo Nanodrop 2000, Thermo
4.6 Secuenciación Exomica
La secuenciación del exoma completo fue realizada por la compañía
FASTERIS Suiza. Para el inicio de la secuenciación se utilizó el Kit
SureSelect Human All Exon V5 (50,4 Mb), según las instrucciones del
fabricante (Agilent Technologies). El DNA genómico (3 μg) se fragmentó
(150-200 pb), se ligó al adaptador, y se amplificó mediante PCR.
Después de la desnaturalización (95 ° C, 5 min), los fragmentos de
biblioteca de DNA amplificados (~ 500 ng) se hibridaron en una
solución a alta rigurosidad (65 ° C, 24 h) con sondas de captura de RNA
con biotina (~ 120 pb). Híbridos de DNA resultantes se recuperaron por
separación con perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal,
Invitrogen, Carlsbad, CA).
El DNA capturado fue eluido (NaOH) y luego sujeto a fase sólida de
secuenciación en un sistema HiSeq2000 (Illumina, San Diego, CA)
usando el Kit Illumina Multiplexing Sample Preparation Oligo-nucleotide
y el Kit HiSeq 2000 Paired-End Cluster Generation de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.20
Metodología
________________
4.7 Análisis de los datos
4.7.1 Secuenciación Exomica y análisis Bioinformatico
La secuenciación del exoma completo fue realizada por la compañía
FASTERIS Suiza. Para el inicio de la secuenciación se utilizó el Kit
SureSelect Human All Exon V5 (50,4 Mb), según las instrucciones del
fabricante (Agilent Technologies). El DNA genómico (3 μg) se fragmentó
(150-200 pb), se ligó al adaptador, y se amplificó mediante PCR.
Después de la desnaturalización (95 ° C, 5 min), los fragmentos de
biblioteca de DNA amplificados (~ 500 ng) se hibridaron en una
solución a alta rigurosidad (65 ° C, 24 h) con sondas de captura de RNA
con biotina (~ 120 pb). Híbridos de DNA resultantes se recuperaron por
separación con perlas magnéticas recubiertas de estreptavidina (Dynal,
Invitrogen, Carlsbad, CA).
El DNA capturado fue eluido (NaOH) y luego sujeto a fase sólida de
secuenciación en un sistema HiSeq2000 (Illumina, San Diego, CA)
usando el Kit Illumina Multiplexing Sample Preparation Oligo-nucleotide
y el Kit HiSeq 2000 Paired-End Cluster Generation de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Parámetros de calidad. Los parámetros de calidad de los datos se
exploraron con el programa FastQC-ReadQC de la plataforma Galaxy
(https://usegalaxy.org). Con base en el informe de calidad de los
archivos FASTQ se mantuvieron las secuencias alta calidad y fueron
eliminadas las secuencias de baja calidad de los nuevos análisis.
4.7.2 Alineación de las lecturas con un genoma de referencia.
El secuenciador Illumina produjo millones de lecturas cortas que
posteriormente fueron alineadas con un genoma de referencia para
obtener la secuencia de DNA original. En este estudio fue utilizado elMetodología 21
________________
algoritmo BWA (Burrows-Wheeler Aligner http://bio-bwa.sourceforge.net/
(36). El genoma de referencia fue descargado del link:
https://icom.illumina.com/Message/iGenome/
4.7.3 Localización de las variantes
El siguiente paso a fue la identificación de todas las variaciones
presentes en el exoma. Para ello se utilizó el programa informático GATK
(desarrollado por el Broad Institute, Cambridge, Massachusetts
http://www.broadinstitute.org/gatk/), disponible de forma libre en la red.
Los SNPs e indeles fueron identificados por el programa
SAMTOOLS v.0.1.19 (http://samtools.sourceforge.net/) . Las variantes
que tuvieron profundidades de menos de 20 x situados fuera de las
regiones del exoma no fueron tenidas en cuenta.
4.7.4 Filtrado y Anotación de las Variantes
Este proceso fue realizado con el apoyo del grupo de Medicina
Genómica del Instituto de Investigación Sanitaria, del laboratorio del
complejo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela. Para la
anotación y el filtrado de las variante fue utilizado el programa
ANNOVAR (www.openbioinformatics.org/annovar/) (37).
Las variantes anotadas fueron filtradas en cuatro bases de datos: NCBI
CCDS (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/CCDS/ccdsBrowse.cgi), RefSeq
(http: //www.ncbi.nlm. nih.gov/ RefSeq /), Ensembl
(http://www.ensembl.org) y Encode (http://genome.ucsc.edu/ENCODE).
En función de la probabilidad de que cada una de las variantes resultado
del proceso de filtración previo fuera o no causal de la patología y que
pudieran alterar la función de alguna proteína se realizó una priorización
de las mismas filtrando de acuerdo a los siguientes puntos:22
- Variantes en regiones no exónicas y de splicing
- Variantes no sinónimas, stop gain, stop loss, frame shift o que
afectan al splicing
- Variantes con una frecuencia inferior a 1/2000 que es la frecuencia
establecida para una enfermedad rara.
- Variantes con una frecuencia del alelo mutado por encima del
20%.
Posterior a este proceso de filtración, los probables daños producidos
por las variantes encontradas en la estructura de las proteínas fueron
predecidos por el programa DANN el cual es un programa de predictor
de patogenicidad.
4.8 Procedimientos
El proyecto se desarrolló en las siguientes fases:
 Consentimiento: Fue solicitado inicialmente a todas las instituciones el
aval para la realización de la investigación, a través del apoyo y soporte
del departamento de pediatría de la Universidad Nacional de Colombia.
 Solitud de Base de datos: Se solicitó al Hospital de la Misericordia la
base de datos de los pacientes que tengan como diagnóstico de la
Clasificación Internacional de Enfermedades en su décima versión
(CIE-10) otros trastornos de la coagulación y que correspondan a
Síndrome de Plaqueta pegajosa.
 Evaluación de las historias. Fueron evaluados los criterios de
inclusión de los pacientes a través de las historias clínicas que
cumplan los correspondientes criterios de inclusión.
 La paciente escogida para participar en el estudio cumplía con todos
los criterios de inclusión se realizará contacto con ellos, por lo que se
solicito el consentimiento informado para la realización de la prueba y
se concertó una cita para firmar el consentimiento informado, y la
toma de la muestra.Metodología 23
________________
 Toma de muestras: Fue tomada mediante punción venosa, según lo
descrito en el punto anterior en el laboratorio de biología molecular
de la Universidad Nacional de Colombia. Estas fueron manejadas
con todos los protocolos de bioseguridad correspondientes.24
5. CONDUCCIÓN DEL ESTUDIO
5.1 Sitio de investigación:
 El estudio fue realizado en la fundación Hospital de la misericordia la
cual es una institución de tercer nivel de atención, de exclusiva
atención en pediatría, ubicada en la Avenida Caracas No 1 – 13
Bogotá D.C.
 El laboratorio en que fueron procesadas las muestras será el
Laboratorio de Biología Molecular de la Universidad Nacional de
Colombia, ubicado en Carrera 45 No 26 – 85, Facultad de Medicina,
piso 3, Bogotá DC
 El laboratorio donde se realizó la secuenciación exómica es
FASTERIS, Suiza
 El laboratorio donde fueron analizados los resultados fue el
laboratorio de Medicina Genómica del Instituto de Investigación
Sanitaria del Complejo Universitario de Santiago de Compostela.
5.2 Manejo de sustancias o especímenes biológicos:
Fue seguido el protocolo de manejo de desperdicios y sustancias
biológicas y no biológicas según el Programa de Gestión Integral de
Residuos Sólidos (PGIRS) de cada institución.
5.3 Seguridad
Fue garantizado , a través de la ejecución de los procedimientos por
personal calificado y entrenado, contando con personal idóneo para la
toma de las muestras y personal de laboratorio entrenado en el
procesamiento de las mismas.Conducción del estudio
25
________________
5.4 Consideraciones éticas
El presente estudio fue basado en la recolección de muestras biológicas y la
revisión de fuentes secundarias.
De acuerdo a la normatividad internacional, particularmente la declaración
de Helsinki y a las pautas éticas para la investigación biomédica preparadas
por el Consejo de Organizaciones Internacionales de las Ciencias Médicas –
CIOMS-, fue establecido un riesgo mínimo y se realizó con adherencia a los
tres principios éticos básicos: respeto por las personas, beneficencia y
justicia.
El riesgo ético de esta propuesta de investigación según la resolución 8430
del 4 de Octubre de 1993 del Ministerio de Salud, artículo 11, literal A, se
corresponde con una investigación con riesgo mínimo. Se estableció que se
mantendrá la confidencialidad de la información relacionada con su
privacidad según el artículo 15, literal H.
Esta propuesta de investigación fue evaluada y aprobada antes de su
ejecución, por el comité de ética médica de la Universidad Nacional de
Colombia y de la Fundación Hospital de la Misericordia.
5.5 Consentimiento Informado ( anexo 1)
Este documento fue elaborado por el investigador principal, revisado por el
comité de ética en investigación de la Fundación Hospital de la Misericordia
y Universidad Nacional de Colombia e indicará los nombres de dos testigos.
Debido a que la paciente tenía una clasificación de Simpson de “no
compresión del lenguaje y no capacidad de decisión” (34), se realizó una
discusión amplia para explicar a los padres los objetivos del estudio y estos
tuvieron la autorizad en la decisión completa para el ejercicio basados en la26
razón riesgo beneficio. Igualmente se brindó esta información a los
miembros de la familia que cumplan con los criterios de inclusión.
El consentimiento informado, fue firmado por los padres o su representante
legal y la paciente que aceptó participar en el estudio previa explicación
detallada de todos los procedimientos a realizar.27
6. Cronograma General de Actividades
SEP- NOV- ENE- ABRIL- JUL/15 AGO- OCT/15 ENE/16
NOV/14 DIC/14 MAR/15 JUN/15 SEP15
Elaboración *
protocolo
Evaluación *
protocolo por
DIB y comité
ética UNAL y
Hx
Misericordia
Solicitud base *
de datos HOMI
Recolección *
de muestras
Análisis de * *
datos
Entrega de *
resultados
Aprobación *
Comité
Postgrado
Sustentación *
Publicación *28
7. Presupuesto
ITEM VALOR
Personal Unidad Tiempo Total
(meses) (pesos)
Investigador principal 250000/mes 12 3000000
10 horas/mes
Hora: 25000
Tutor de investigación 250000/mes 12 3000000
5 horas/mes
Hora: 50000
Asesor epidemiológico 300000/mes 12 3600000
6 horas/mes
Hora: 50000
Subtotal 1 9.600.000
ITEM VALOR
Materiales e insumos Unidad Tiempo Total
(meses) (pesos)
Papelería 400.000
Transporte 100000/mes 4 400.000
Kit PCR – Secuenciacion exoma 15000000 5.000.000
Búsqueda bibliográfica 100.000
Impresión trabajo 100.000
Subtotal 2 6.000.000
SUBTOTAL VALOR (pesos)
Subtotal 1 9.600.000
Subtotal 2 6.000.000
TOTAL 15.600.00029
8. Resultados
Un total de 1'320'253 variantes fueron detectadas inicialmente. Después del
filtro inicial para seleccionar todas las variantes con una cobertura por
encima de 20X fueron identificadas un total de 100'761 variantes. De estas
99.454 fueron anotadas.
Tras el proceso de priorización realizado fueron obtenidas un total de 317
variantes y posterior al filtro por predictores de patogenicidad utilizando el
programa DANN fueron obtenidas 113 variantes.
Dado el número tan elevado de variantes obtenido, se realizó una búsqueda
de posibles genes relacionados con el síndrome de plaqueta pegajosa.
Seleccionamos un total de 176 genes, de los que siete hacen parte de los
genes que han sido relacionados en la literatura con el SPP y los restantes
están relacionados con el proceso de agregación plaquetaria ( anexo 3).
En el listado de variantes filtradas y priorizadas se confirmó una mutación
tipo delecional de Novo de cinco nucleótidos (GCCCC) en el gen ORAI1,
localizado en el cromosoma 12
(ORAI1:NM_032790:exon1:c.124_128del:p.A42fs) (Fig1). que resulto en un
cambio del marco de lectura y provoca un codón de parada prematuro que
afecta la expresión final de la proteína, (Fig 2). la cual es una subunidad del
canal de calcio de membrana activada por el sensor de calcio STIM1
cuando las reservas de calcio son agotadas ubicado en la superficie
plaquetaria.30
Fig 1. Deleción de novo de cinco nucleótidos (GCCCC) en el gen ORAI1 , localizado en
el brazo largo del cromosoma 12 (ORAI1:NM_032790:exon1:c.124_128del:p.A42fs).
Fig 2. Deleción de 5 nucleótidos que produjo cambio del marco de lectura y provocó un
codón de parada prematuro afectando la expresión de la proteína.31
9. Discusión
Con el uso de WES en una paciente con Sindrome de Plaqueta Pegajosa ,
se ha identificado una mutación delecional de 5 nucleótidos del gen ORAI1
localizado en el brazo largo del cromosoma 12 que resulta en un cambio
en el marco de lectura que afecta el producto final de la proteína. La
proteína codificada por este gen es una subunidad del canal de calcio de
membrana activada por el sensor de calcio STIM1 cuando son depletadas
en la célula las reservas de calcio. ORAI1 es expresado en linfocitos T,
mastocitos y mas recientemente se ha demostrado su presencia y vital
importancia en plaquetas humanas (38).
La activación plaquetaria y la formación de trombos es un proceso de
múltiples etapas que involucra diferentes vías de señalización para activar
el cambio de forma de las plaquetas, la activación de integrinas, y
degranulación plaquetaria (39). Las vías de señalización convergen en la
activación de la fosfolipasa C (PLC), que conduce a la formación de inositol
1,4,5-trifosfato (IP ) y diacilglicerol IP3 es entonces capaz de unirse a su
3
receptor en el retículo endoplasmático (ER) y media el flujo de Ca2+ de los
depósitos intracelulares en el citoplasma (40).
El proceso de secreción y agregación plaquetaria, así como la formación de
trombos de plaquetas dependen del aumento de la concentración
citosólico de calcio (Ca2 +), como resultado principalmente de la liberación
intracelular de Ca2+ por los canales de deposito de calcio (SOC) (41). La
molécula estromal 1 (STIM1) ha sido identificada como un sensor de Ca2+
que regula la liberación intrecelular de Ca2+ por los canales de deposito de
calcio (SOC) a través de la activación de la subunidad formadora de poros
Orai1, el principal canal de entrada de Ca2+ que funciona en las plaquetas
(42).32
Discusión
________________
Después de la depleción de calcio de los depósitos intracelulares, Orai1 se
activa por la molécula estromal 1 (STIM1), que se encuentra principalmente
en las depósitos de Ca2 + intracelular. STIM sobresale en el lumen de los
depósitos intracelulares y detecta el contenido de Ca2 por su dominio de
unión al calcio (43).
Han sido descritas tres isoformas Orai expresadas en plaquetas humanas,
pero Orai1 parece ser la principal molécula implicada principalmente con
SOC y la función plaquetaria (44). Orai1 se considera particularmente
importante para la función de las plaquetas ya que el desarrollo de modelos
murinos Orai1 deficientes in vivo ha demostrado que estos ratones Orai1
deficientes, son resistentes a la tromboembolia pulmonar, trombosis
arterial, e infarto cerebral isquémico debido a la producción de canales de
deposito de calcio (SOC) defectuosos, y al deterioro del proceso de
activación y formación de trombos in vitro (41).
Wolfgang et al , desarrollaron un modelo murino in vivo con plaquetas Orai
1R93W mutadas e inactivas que se caracterizaron por una marcada
reducción SOC y aumentos en [Ca2 +] inducido por agonistas. Plaquetas
Orai1R93W mutadas demostraron una reducción de la activación de la
integrina y degranulación deteriorada cuando las plaquetas fueron
estimuladas con concentraciones bajas de agonistas en condiciones
estáticas. Este defecto, sin embargo, no afectó significativamente la
capacidad de las plaquetas Orai1R93W para agregarse o adherirse a
colágeno bajo condiciones de flujo arterial ex vivo. En contraste estas
plaquetas Orai1R93W mutadas fueron defectuosas en la exposición de
fosfatidilserina en su superficie lo que sugiere que Ora1 es crucial para la
respuesta procoagulante plaquetaria mas que otras respuestas Ca(2+)
celular dependientes (45).
Hasta el momento no han sido publicados en la literatura estudios en
humanos que demuestren las implicaciones de mutaciones de Orai1 y su
posible relación con alteraciones en la función plaquetaria que puedan33
aumentar el riesgo de trombosis. Recientemente A. Tolios et al,
demostraron que la estimulación de plaquetas por CRP (péptido
relacionado al colágeno ) no sólo conduce a la activación de Orai1
existente, sino que sobre regula la cantidad de proteína Orai1 en la
membrana plaquetaria aumentando así la capacidad de las plaquetas para
la formación de trombos en pacientes con infarto agudo del miocardio (46).
Como se había demostrado anteriormente (47), un aumento de la
expresión de Orai1 aumenta en paralelo la afluencia de Ca2. En
consecuencia, se observa una correlación positiva entre la expresión de
Orai1 y Ca2 +. La importancia de un rápido aumento de la expresión de
Orai1 en la superficie ya ha sido demostrada para otros tipos de células
(48). Estas observaciones demuestran, que la cantidad de proteínas Orai1
expresada en las plaquetas es mayor en los pacientes con infarto agudo
del miocardio (IAM) que en los pacientes con cardiopatía isquémica
estable, poniendo de relieve la importancia clínica de la expresión en la
superficie plaquetaria de Orai1 para la activación plaquetaria y el desarrollo
de enfermedad vascular oclusiva. Un aumento de la expresión Orai1 ya
había sido demostrado en otras enfermedades con hiperactividad de las
plaquetas, por ejemplo, en pacientes con diabetes mellitus tipo 2 (49).
Si bien el papel decisivo de las plaquetas en la fisiopatología de la
trombosis arterial y venosa en los pacientes con Sindrome de Plaqueta
Pegajosa está bien establecido, una asociación entre la expresión alterada
de Orai1, activación y agregación plaquetaria y el desarrollo de trombosis
a la luz del conocimiento actual no ha sido demostrada. Se considera, con
los hallazgos de esta investigación, que una alteración en la expresión de
Orai1 podría conducir a activación plaquetaria, ganancia de la función de la
proteína, y generar hiperagregabilidad plaquetaria y acontecimientos
tromboembólicos clínicos. Son necesarios ensayos de movilización de
calcio in vitro en plaquetas clonadas con la mutación encontrada en este
estudio para comprobar esta hipótesis.Discusión 34
________________
Por otro lado, considerando el impacto de la activación plaquetaria y la
oclusión trombótica STIM1, Orai1 y sus reguladores pueden ser
considerados moléculas diana para el desarrollo de terapias anti-
trombóticas. Actualmente, varios inhibidores plaquetarios disponibles tienen
como moléculas diana entre otros a la clooxigenasa-1, el receptor
purinérgico P2Y12 y la integrina activada αII β3, pero estas terapias
antiagregantes tienen limitaciones como complicaciones hemorrágicas
graves y la falta de eficacia establecida por la presencia de pacientes no
respondedores. Por lo tanto, estrategias antiplaquetarias nuevas pueden
lograr controlar la activación de plaquetas sin alterar la hemostasia y de
esta manera evitar complicaciones hemorrágicas que amenacen la vida. (50)
Estudios hasta ahora disponibles en modelos animales sugieren que la vía
SOCE/Ori1 en plaquetas es de vital importancia en la formación del trombo
oclusivo arterial, aunque no así en la hemostasia primaria lo que convierte a
esta molécula en un blanco muy interesante de investigación terapéutica
actual (51,52).35
10. Conclusiones y recomendaciones
 En una paciente con SPP tipo I, se encontró una mutación delecional
de novo, en el gen Ori1 que codifica una subunidad de canal de
calcio en la membrana plaquetaria. Estos hallazgos amplían el
espectro de condiciones genéticas relacionadas con el SPP y
proporcionan más apoyo para el entendimiento de su patogénesis,
diagnóstico y tratamiento.
 Son necesarios ensayos de movilización de calcio in vitro en
plaquetas clonadas con la mutación encontrada en este estudio para
comprobar la hipótesis de ganancia de función de Ori1 derivada de
la mutación encontrada
 En una próxima fase de este estudio se realizara la confirmación de la
relación genetipo-fenotipo en los miembros de la familia afectados de
la paciente para de esta manera confirmar el tipo de herencia de la
mutación encontrada.
 Otros datos derivados de esta investigación podrían tener
implicaciones en la fisiopatología del SPP y se encuentran
actualmente en fase de análisis.36
11. Agradecimientos
Agradezco a la paciente y familiares por su participación en esta
investigación. Este estudio fue realizado gracias al apoyo de la Fundación
Hospital de la Misericordia, la Universidad Nacional de Colombia, el
laboratorio Fasteris en Suiza y el equipo de trabajo de la Doctora Maria Brion
y el grupo de Medicina Genómica del Instituto de Investigación Sanitaria del
Complejo Universitario de Santiago de Compostela.37
12. ANEXOS
Anexo 1: Consentimiento informado
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PEDIATRÍA
DIVISIÓN ONCOHEMATOLOGÍA PEDIÁTRICA
ESTUDIO MOLECULAR DEL SINDROME DE PLAQUETA PEGAJOSA
MEDIANTE ANALISIS DEL EXOMA
1. Introducción y propósito del estudio
La Universidad Nacional de Colombia, dentro del programa de Especialidad
de Oncohematología Pediátrica, está haciendo un estudio en el que se
busca encontrar alteraciones moleculares presentes en el Sindrome de
Plaqueta Pegajosa, una de las causas mas frecuentes de trombosis en la
edad pediatrica. Si se encuentran alteraciones moleculares se mejorara la
comprensión y aceptación del síndrome y de su fisiopatología, al igual que
se podrán identificar probables blancos terapéuticos.
2. Porqué ha sido seleccionado
Existen dos razones para ingresar al estudio:
 Una de ellas es que a su hijo(a) se le realizó el diagnóstico de Sindrome
de Plaqueta Pegajosa en la Fundación Hospital de la Misericordia.
 La otra razón es que usted tiene Sindrome de plaqueta Pegajosa y es
familiar de un niño que tienen la enfermedad38
3. Procedimientos del estudio
Si decide participar debe hacer lo siguiente:
- Proporcionar información acerca de su dirección y
teléfono, esto con el fin de contactarlos para el
seguimiento
- Permitir la realización de una punción venosa. En esta
muestra de sangre se realizará el análisis de la
secuenciacion del exoma.
- Asistir a todos los controles planteados y seguir
tratamiento según lo indicado por su médico tratante.
- Informar acerca de sus inquietudes y en caso tal,
expresar el deseo de abandonar el estudio
4. Confidencialidad
La información que suministre, incluyendo los datos sobre su localización y
de su enfermedad es confidencial y solo será conocida por su médico
tratante y los investigadores.
Los resultados del estudio se presentarán en forma general y en ningún
caso ni usted ni su hijo(a) podrán ser identificados.
Los resultados de los an lisis de exoma podr n pu licarse en i liograf a
médica. Estas pu licaciones no incluir n ninguna información que lo
identifique personalmente.
5. Riesgos y beneficios
1. Los riesgos derivados de su participación en este estudio son mínimos y
están asociados a la punción venosa que se realizará para obtener la
muestra. Estos son básicamente sangrado, dolor o infección local.39
2. Es posi le que pueda tener una mutación en un gen incluido en el an lisis
de secuenciación del exoma pero que en este an lisis no se haya podido
detectar la mutación. Por lo tanto es posi le que el an lisis no detecte la
causa de que usted tenga Sindrome de plaqueta pegajosa. Ademas, este
an lisis no se analiza el 100 de los genes del genoma humano. Existen
algunos genes que no se pueden incluir en el an lisis por motivos técnicos.
3. El realizar este estudio traerá beneficio a todos los pacientes que tengan
diagnóstico de Sindrome de Plaqueta Pegajosa, ya que la información
aportada podrá ser tomada como base para el diseño de nuevos estudios
que busquen encontrar las alteraciones encontradas en otras poblaciones.
Adicionalmente, desde su casa tiene acceso telefónico para consultas
respecto a posibles complicaciones o inquietudes.
6. Costos y compensación
Usted no recibirá pago por su participación en el estudio, ni este tampoco
implica costos adicionales para su atención médica.
7. Derecho a rehusar o abandonar el estudio
Usted debe estar saber que su participación en este estudio es
completamente voluntaria. Aun después de dar su aceptación para
participar, tendrá derecho a retirarse del estudio o a negarse a contestar
alguna de las preguntas en el momento en que usted así lo desee. El hecho
de retirarse no implicará cambios en la atención ni en el tratamiento
recibidos.
8. Preguntas40
Por favor siéntase en libertad de hace cualquier pregunta si hay algo que no
haya entendido. También si más adelante le surge alguna duda o inquietud,
usted puede contactar a: Dra. Gisela Barros Garcia en el Departamento de
Pediatría de la Fundación Hospital de la Misericordia (4° piso) o en el
teléfono 3134652727
9. Declaración del participante
Nosotros le entregaremos una copia de este formulario. Al firmar esta forma
usted está aceptando que entiende la información que se le ha dado, que
está de acuerdo en participar como sujeto de investigación en este estudio, y
que está de acuerdo en:
o Proporcionar su dirección y teléfono
o Permitir toma de muestra mediante punción venosa para realizar
secuenciacion del exoma
o Asistir a las consultas de control y seguir el manejo propuesto por su
médico tratante
¿Acepta participar en este estudio voluntariamente? Si_____ NO____
Si usted ha aceptado participar por favor escriba su nombre completo y firme
en el espacio correspondiente:
Nombre del participante_____________________________
Firma del participante: ______________________________Fecha____/___/____
dd mm aa
Nombre del testigo 1_________________________________
Firma del testigo 1
__________________________________Fecha____/___/____
dd mm aa
Nombre del testigo 2_________________________________41
Firma del testigo 2
__________________________________Fecha____/___/____
dd mm aa
10. Asentimiento del paciente (Diligenciar en los casos en que se
requiera, según las reglas para la toma de decisiones con respecto a la
participación de niños en la investigación)
Certifico que he sido informado/a acerca de los objetivos y procedimientos
de esta investigación. Con mi firma, declaro que estoy de acuerdo en
participar en el estudio de analisis molecular del Sindrome de plaqueta
pegajosa mediante analisis del exoma, en una muestra de sangre tomada de
mis venas, aun cuando, en algunas ocasiones, la toma del examen no
coincida con los otros exámenes que me realizarán en el tratamiento de la
enfermedad y que para ello deba ser puncionado nuevamente.
Firma del paciente __________________________________Fecha
____/___/____
dd mm aa
11.Declaración del investigador
Certifico que yo o algún miembro de mi grupo de investigación le ha
explicado a la persona cuyo nombre aparece registrado en este formulario,
sobre esta investigación y que esta persona entiende la naturaleza y el
propósito del estudio así como los posibles riesgos y beneficios asociados
con la participación en el mismo. Todas las preguntas que esta persona ha
hecho, han sido contestadas.
Nombre de quien diligencia el consentimiento (investigador/encuestador):
___________________________________________________________
Firma: __________________________________________ Fecha____/___/____
dd42
8.2 Anexo 2: Reglas para la toma de decisiones con respecto a la
participación de niños en la investigación (34)
Categoría del niño Papel del comité de Papel de los Papel del Papel del niño
ética padres/cuidadores investigador
*No comprensión del (1)Proteger intereses (1)Ejercen autoridad de (1)Asegurar (1)No autoridad de
lenguaje de los niños decisión completa información completa decisión
*no capacidad de aprobando basándose en a los padres (2)Puede protestar
decisión investigación que riesgo/beneficio (2)Retirar al niño si el pero esto no lo
cumpla condiciones (2)Estar riesgo/beneficio no es excluirá del estudio
pre-especificadas presentes/disponibles favorable
(2)Información durante la investigación (3)Anular decisión de
completa a los padres (3)Retirar al niño del los padres (ej: retirar
y su autorización estudio si el riesgo supera al niño del estudio
al beneficio cuando aumenten
riesgos)
*Alguna (1) y (2) (1), (2) y (3) (1), (2) y (3) (1) y (2)
comprensión del (3)La información (4)Compartir información (4)Asegurar (3)Papel limitado en
lenguaje relevante se debe con el niño acerca de la información relevante la toma de decisión
*Capacidad limitada explicar al niño participación y responder al niño acerca de su (4)Puede realizar
para tomar (4)Requiere discusión preguntas participación y preguntas
decisiones y autorización (5)Prestar atención a la resolver preguntas
documentada de protesta del niño (5)Prestar atención a
padres y niño la protesta del niño
*Buena comprensión (1), (2), (3) y (4) (2), (3) y (4) (1), (2), (3) y (4) (5)Tiene mayor papel
del lenguaje (5)Defender que la (6)Se requiere el acuerdo (6)Asegurar que el en la toma de
*Capacidad de protesta del niño de los padres en todos los niño tenga la decisión
decisión en pueda ser autorizada casos. En algunos casos la oportunidad de (6)Se requiere el
desarrollo en algunos casos protesta del niño puede ser expresarse acuerdo para
autorizada (7)Asegurar que los participar, pero no es
(7)Dar al niño la padres tengan en suficiente
oportunidad de expresar cuenta los deseos del (7)La protesta puede
sus deseos y tenerlos en niño excluirlo del estudio,
cuenta en la evaluación del excepto cuando los
riesgo/beneficio padres consideren
(8)Autoridad limitada que los beneficios
superan los riesgos
*Buena comprensión (6)Reconocer la (8) (8)Asegurar (8)suficiente
del lenguaje capacidad del niño (9)El acuerdo parental es información completa autoridad para decidir
*Capacidad de para la toma de necesario en algunas al niño sobre su (9)Se requiere el
decisión sustancial decisiones participaciones participación consentimiento para
*Maduro pero no (7)Aprobar (requerimiento legal, (9)Determinar si el participar y algunas
independiente investigaciones que participación que acarrea consentimiento del veces es suficiente
cumplan condiciones consecuencias a los niño es suficiente o si (el acuerdo de los
pre-especificadas padres, riesgo mayor al se requiere el acuerdo padres se requerirá
(8)Asegurar mínimo) pero no es de los padres en algunos casos)
información completa suficiente (10)Asegurar (10)Se respetará su
al niño y cuando sea información relevante decisión de no
necesario, a sus a los padres cuando participar
padres estén involucrados
(9)Documentar legítimamente en la43
consentimiento del decisión
niño y cuando sea (11)Discutir con el
necesario, acuerdo de niños el retiro del
los padres estudio cuando los
riesgos superen
beneficios
* Buena (10)Similar a (10)No autoridad para la (12)Aplicar (11)Capacidad de
comprensión del investigaciones toma de decisiones obligaciones del decisión completa
lenguaje realizadas en adultos investigador cuando (12)No está obligado
*Capacidad de involucra adultos a compartir
decisión sustancial competentes información con sus
*Maduro e padres
independiente44
Anexo 3. Listado de posibles genes de interés relacionados con el SPP.45464748
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