Determinación de la presencia y expresión de las enzimas geranylgeranyl difosfato sintasa, farnesyl difosfato sintasa, lanosterol sintasa y escualeno sintasa en cristalinos humanos con catarata senil
Autor: Durán Guzmán, Diego Fernando
Asesor: Ávila Castañeda, Marcel Yecid
Fecha: 2022-02-02
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Oftalmología
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Se desconoce con claridad la fisiopatología exacta por la cual se forman las cataratas relacionadas con la edad. Se han investigado múltiples relaciones entre la biosíntesis del lanosterol y la formación de cataratas. En nuestro estudio se realizó un estudio de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real de las enzimas Farnesyl sintasa, Geranyl sintasa, Lanosterol sintasa y Escualeno sintasa en un cristalino transparente de control y dos cristalinos con catarata senil de diferentes grados de opacidad. En los resultados fue posible evidenciar una diferencia significativa en la expresión relativa de las enzimas Farnesyl sintasa, Geranyl sintasa y Escualeno Sintasa siendo mayor en las muestras 1 y 2 de cristalinos con opacidad nuclear con respecto al cristalino control transparente. Los hallazgos sugieren una modificación patológica en el funcionamiento de la vía metabólica del colesterol bifurcándose hacia un aumento en la expresión de la enzima Geranyl difosfato sintasa. Esta desviación resulta importante al estar este compuesto implicado en el proceso de prenilación de proteínas, lo cual podría explicar la aglomeración de proteínas en cristalinos humanos, conllevando a la opacificación del cristalino con la edad. (Texto tomado de la fuente).

I
Determinación De La Presencia y Expresión De Las Enzimas Geranylgeranyl Difosfato
Sintasa, Farnesyl Difosfato Sintasa, Lanosterol Sintasa y Escualeno Sintasa En
Cristalinos Humanos Con Catarata Senil
Autor
Diego Fernando Durán Guzmán
Universidad Nacional De Colombia
Facultad De Medicina, Departamento De Oftalmología
Bogotá D.C., Colombia
2022II
Determinación De La Presencia y Expresión De Las Enzimas Geranylgeranyl Difosfato
Sintasa, Farnesyl Difosfato Sintasa, Lanosterol Sintasa y Escualeno Sintasa En
Cristalinos Humanos Con Catarata Senil
Diego Fernando Durán Guzmán
Trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título de:
Especialista en Oftalmología
Director:
Marcel Yecid Avila Castañeda, M.D.
Línea de Investigación:
Vía metabólica del Lanosterol en catarata senil de cristalinos humanos
Universidad Nacional De Colombia
Facultad De Medicina, Departamento De Oftalmología
Bogotá D.C., Colombia
2022III
Declaración de obra original
Yo declaro lo siguiente:
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reconocido las ideas, las palabras, o materiales de otros autores.
Cuando se han presentado ideas o palabras de otros autores en esta disertación, he realizado
su respectivo reconocimiento aplicando correctamente los esquemas de citas y referencias
bibliográficas en el estilo requerido.
He obtenido el permiso del autor o editor para incluir cualquier material con derechos de autor
(por ejemplo, tablas, figuras, instrumentos de encuesta o grandes porciones de texto).
Por último, he sometido esta disertación a la herramienta de integridad académica, definida por
la universidad.
Diego Fernando Durán Guzmán
Fecha 02/02/2022IV
Resumen
Determinación De La Presencia y Expresión De Las Enzimas Geranylgeranyl Difosfato
Sintasa, Farnesyl Difosfato Sintasa, Lanosterol Sintasa y Escualeno Sintasa En
Cristalinos Humanos Con Catarata Senil
Se desconoce con claridad la fisiopatología exacta por la cual se forman las cataratas
relacionadas con la edad. Se han investigado múltiples relaciones entre la biosíntesis del
lanosterol y la formación de cataratas. En nuestro estudio se realizó un estudio de reacción en
cadena de polimerasa en tiempo real de las enzimas Farnesyl sintasa, Geranyl sintasa,
Lanosterol sintasa y Escualeno sintasa en un cristalino transparente de control y dos cristalinos
con catarata senil de diferentes grados de opacidad. En los resultados fue posible evidenciar una
diferencia significativa en la expresión relativa de las enzimas Farnesyl sintasa, Geranyl sintasa
y Escualeno Sintasa siendo mayor en las muestras 1 y 2 de cristalinos con opacidad nuclear con
respecto al cristalino control transparente. Los hallazgos sugieren una modificación patológica
en el funcionamiento de la vía metabólica del colesterol bifurcándose hacia un aumento en la
expresión de la enzima Geranyl difosfato sintasa. Esta desviación resulta importante al estar este
compuesto implicado en el proceso de prenilación de proteínas, lo cual podría explicar la
aglomeración de proteínas en cristalinos humanos, conllevando a la opacificación del cristalino
con la edad.
Palabras clave: Catarata Senil, Lanosterol Sintasa, Escualeno Sintasa, Farnesyl Sintasa,
Geranyl Sintasa.V
Abstract
Determination of the presence and expression of the Enzymes Geranylgeranyl
biphosphate Synthase, Farnesyl biphosphate Synthase, Lanosterol Synthase and
Squalene Synthase in Human Lenses with Senile Cataract.
The exact pathophysiology by which age-related cataracts develop is not clearly known. Multiple
relationships between lanosterol biosynthesis and cataract formation have been investigated. In
our study, a real-time polymerase chain reaction assay of the enzymes Farnesyl synthase,
Geranyl synthase, Lanosterol synthase and Squalene synthase was performed on a transparent
control lens and two senile cataractous lenses with different degrees of opacity. In the results it
was possible to evidence a significant difference in the relative expression of the enzymes
Farnesyl synthase, Geranyl synthase and Squalene Synthase, being higher in samples 1 and 2
of lenses with nuclear opacity compared to the control lens. These findings suggest a pathological
modification in the functioning of the cholesterol metabolic pathway, deviating towards an
increase in the expression of the enzyme Geranyl diphosphate synthase. This deviation is
important as this compound is involved in the process of protein prenylation, which could explain
the agglomeration of proteins in human lenses, leading to lens opacification with age.
Palabras clave: Senile Cataract, Lanosterol Synthase, Squalene Synthase, Farnesyl
Synthase, Geranyl Synthase.VI
1. INTRODUCCIÓN
La catarata es la opacificación del lente intraocular natural del globo ocular, el cual tiene
como función enfocar la luz que ingresa a través de la córnea y la pupila hacia la retina
neurosensorial. Esta opacificación del cristalino genera una pérdida progresiva de la
agudeza visual además de provocar síntomas visuales que deterioran progresivamente
la calidad de vida del paciente afectado. A nivel mundial las cataratas son la causa
número uno de ceguera prevenible y tratable. Hasta la fecha no existe ningún tratamiento
no quirúrgico eficaz que permita el retraso, detención o reversión de la progresión de la
enfermedad, por lo cual el único tratamiento usado por los oftalmólogos a nivel mundial
es la cirugía de catarata. 1
En América Latina, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) estimó que la
catarata asociada con la edad es la principal causa de pérdida de visión y ceguera, donde
su proporción de prevalencia varía entre un 39 y 50% dependiendo de la urbanización y
el desarrollo económico. Se estima que en Colombia la prevalencia de ceguera oscila
entre el 0.7%, lo cual implica que, por cada millón de habitantes, 7.000 personas se
encuentran ciegas, entre este porcentaje aún una gran proporción está vinculada con el
desarrollo de catarata relacionada con la edad, especialmente en los sectores del país
con menor desarrollo económico y por ende menor acceso a los servicios de salud. 2
Aproximadamente 3 millones de cirugías de catarata son realizadas anualmente en
Estados Unidos, siendo este el procedimiento quirúrgico más realizado a nivel mundial
de manera ambulatoria. El costo médico directo relacionado con el tratamiento de las
cataratas en Estados Unidos, el cual incluye consultas por especialista, cirugía y
medicamentos prescritos es de aproximadamente 6.8 millones de dólares anualmente.
Existe una diferencia importante en la tasa de cirugías de catarata realizadas por
cantidad de habitantes entre los países desarrollados y los países en desarrollo, siendo
en los primeros un aproximado de 10.000 procedimientos por millón de habitantes por
año, en China es de 300 a 400 por millón y en los países en vía de desarrollo puede ser
tan bajo como 50 cirugías por millón de habitantes anualmente. Para 1999 la OMS lanzó
el programa Visión 2020: El derecho por la visión, enfocado a mejorar las condiciones de
tratamiento de la catarata especialmente a nivel de países en vía de desarrollo. Fue
posible determinar que el número de cirugías realizadas a nivel mundial se debía triplicar
para mantener un equilibrio entre oferta y demanda, con una meta de 3000 cirugías por
millón de habitantes anualmente, una meta que ya pasados 20 años desde su inicio, aún
no ha sido posible cumplirse en muchos países. 1
Se desconoce con claridad la fisiopatología exacta por la cual se forman las cataratas
relacionadas con la edad. A medida que el cristalino envejece aumenta su masa y espesor,
disminuyendo su poder acomodativo. Al parecer ocurren modificaciones químicas y
proteólisis de las proteínas cristalinas, llevando a la formación de agregados proteicos de
alto peso molecular. Estos agregados pueden volverse lo suficientemente grandes como
para causar fluctuaciones importantes en el índice refractivo del cristalino en estos puntos
focales, aumentando la dispersión de la luz y disminuyendo su transparencia. Las
modificaciones químicas en las proteínas nucleares también aumentan la opacidad delVII
cristalino, haciendo que se torne amarillo o marrón progresivamente al avanzar la edad del
paciente 1. Existen múltiples hallazgos que indican que este proceso resulta de un
desequilibrio multifactorial de diferentes vías de metabolismo de las células del cristalino,
siendo de particular importancia la vía metabólica del lanosterol, vinculándose con la
formación de catarata de tipo senil en modelos animales y en cristalinos humanos 3–7.
Además se han encontrado otros cambios en cristalinos sometidos a envejecimiento como
lo son concentraciones disminuidas de glutatión y potasio, además de aumento de
concentraciones de sodio y calcio en el citoplasma celular 1.
El propósito del presente estudio es investigar más a fondo los cambios en la actividad de
enzimas clave en la vía metabólica del lanosterol en cristalinos humanos con catarata
relacionada con la edad en comparación con cristalinos sin desarrollo de opacidades.
Particularmente determinar el nivel de actividad de las enzimas Geranylgeranyl PP sintasa,
Farnesyl sintasa y Escualeno sintasa, este hallazgo es un paso esencial en la comprensión
de la fisiopatología de la formación de opacidades en el cristalino relacionadas con la edad,
permitiendo entender mejor los procesos metabólicos en desequilibrio y dando posibilidades
terapéuticas no quirúrgicas en un futuro8
2. JUSTIFICACIÓN
La opacificación del cristalino relacionada con la edad es a nivel mundial la causa número
uno de ceguera prevenible y tratable. Hasta la fecha no existe ningún tratamiento no
quirúrgico eficaz que permita el retraso, detención o reversión de la progresión de la
enfermedad, por lo cual el único tratamiento usado por los oftalmólogos a nivel mundial
es la cirugía de catarata 1.
En América Latina, la Organización Panamericana de la Salud (OPS) estimó que la
catarata asociada con la edad es la principal causa de pérdida de visión y ceguera, donde
su proporción de prevalencia varía entre un 39 y 50% dependiendo de la urbanización y
el desarrollo económico. Se estima que en Colombia la prevalencia de ceguera oscila
entre el 0.7%, lo cual implica que, por cada millón de habitantes, 7.000 personas se
encuentran ciegas, entre este porcentaje aún una gran proporción está vinculada con el
desarrollo de catarata relacionada con la edad, especialmente en los sectores del país
con menor desarrollo económico y por ende menor acceso a los servicios de salud. 2
A pesar de conocer el mecanismo patológico macroscópico por el cual se forman las
opacidades en el cristalino, se desconocen las vías moleculares específicas alteradas
que conllevan a este desenlace. Una de las vías de especial importancia en la
fisiopatología de la formación de opacidades del cristalino es la vía metabólica del
lanosterol, la cual se ha encontrado directamente responsable tanto de la formación de
cualquiera de los tres tipos principales de catarata senil (cortical, nuclear o subcapsular
posterior) en modelos animales y en cristalinos humanos. Se ha encontrado que al inhibir
enzimas clave en la síntesis del lanosterol se genera como consecuencia la aceleración
de formación de opacidades del cristalino, además se ha encontrado que la estimulación
de la vía metabólica de lanosterol incluyendo el tratamiento de cristalinos con catarata
senil en modelos animales alivia la agregación de proteínas y las opacidades, pudiendo
ser un blanco atractivo en el tratamiento, prevención o retraso de la formación de
opacidades 3–7.
Gracias al estudio realizado por la Dra. Laura Paola Reyes y el Dr. Marcel Yecid Ávila fue
posible llevar estas hipótesis sobre la importancia de la actividad de la enzima lanosterol
sintasa (2,3 oxidoescualeno ciclasa) en la formación de opacidades de cristalino
relacionadas con la edad en cristalinos humanos. La particularidad de este estudio radica en
la excelente cadena de conservación de los especímenes, siendo extraídos en su totalidad
sin fragmentarlos o someterlos a cambios físicoquímicos que pudieran alterar los resultados.
El hallazgo mas importante fue el nivel paradójicamente elevado de enzima lanosterol sintasa
la cual estaba positivamente correlacionada con el grado de las cataratas, pero también se
encontraba elevada en los cristalinos de control 6. Es a partir de estos hallazgos que se
despierta el interés en profundizar el estudio de la vía del lanosterol, particularmente en un
proceso enzimático clave en puntos más tempranos de la vía que determinan la desviación
de la vía metabólica hacia un proceso patológico de prenilación de proteínas, el cual podría
explicar la agregación de complejos proteicos en el citoplasma de las células y dar un paso
más adelante en esclarecer la importancia de esta vía metabólica en la fisiopatología de las
cataratas seniles, siendo incluso un potencial blanco terapéutico en el posible tratamiento no
quirúrgico de esta prevalente causa de ceguera a nivel mundial9
3. MARCO TEÓRICO
Catarata
La catarata es la causa número uno de pérdida visual en el mundo. La OMS estima que
aproximadamente 18 millones de personas se encuentran en estado de ceguera debido
a esta condición, la cual se estima que causa un 48% de los casos de ceguera en el
mundo. Además, se estima que aproximadamente el 33% de la población mundial
experimenta algún grado de deterioro visual debido a este trastorno. Es importante
destacar que la gran mayoría de casos de ceguera debido a esta patología, incluso hasta
un 90%, se encuentran en países en vía de desarrollo 1.
Se entiende que la formación de cataratas puede suceder por múltiples etiologías, tales como
traumas, inflamación, diabetes mellitus, desequilibrios hidroelectrolíticos, post-quirúrgicos y
senescencia, entre otros. Las cataratas relacionadas con la edad usualmente se desarrollan
de manera lenta con un deterioro gradual en la visión que no puede ser corregido
adecuadamente con anteojos. La catarata senil es el tipo mas común de catarata y su
fisiopatología no se encuentra aun totalmente comprendida 1.
En las cataratas seniles se evidencian una serie de factores importantes que involucran la
compactación y endurecimiento del material central del lente, proceso llamado esclerosis
nuclear, a medida que nuevas capas de fibras corticales continúan proliferando con el
tiempo. Además, se evidencian cambios anormales en las proteínas lenticulares llamadas
“cristalinas” lo cual resulta en su alteración química y estructural y una pérdida de la
transparencia de las mismas. Esta alteración progresa con el tiempo adquiriendo una
pigmentación que inicia en el color amarillo y progresa hacia un color marron, brunescente o
negro. Al grado de opacificación y coloración de la opacidad se le atribuye una escala
específica dada por el “sistema de clasificación de opacidades lenticulares III” o LOCS III por
sus siglas en inglés, la cual es una escala subjetiva con imágenes de referencia para cada
grado de opacificación 1.
Las cataratas seniles pueden ser de localización nuclear, de corteza anterior o subcapsulares
posteriores. Se presentan usualmente en personas mayores de 50 años con síntomas como
visión borrosa a la distancia o en cercanía según la localización de la opacidad, “glares” o
halos alrededor de las luces con dificultad para ver con detalle los objetos sometidos a luz
de alta intensidad, dificultad para ver en bajas condiciones de luz, pérdida de sensibilidad al
contraste, pérdida de la habilidad para discernir colores y aumento de dificultad para la
lectura 1.
En la actualidad el manejo de la opacidad de cristalino se reserva únicamente al
procedimiento quirúrgico, el cual consiste en la extracción del núcleo y corteza del cristalino
de manera manual o asistida por ultrasonido (facoemulsificación) a través de un orificio en
la cápsula anterior del cristalino, dejando intacta la cápsula posterior y el resto del saco
capsular con el fin de servir estos últimos de soporte para la colocación de un implante de
lente intraocular fabricado a partir de materiales sintéticos no antigénicos y calculados
previamente con el fin de proveer una aproximación a la refracción que proveía el cristalino
sano. A pesar de haber un interés amplio en la investigación de un posible manejo no10
quirúrgico para tratar esta entidad, debido a los altos costos que genera su tratamiento y la
dificultad para la cobertura del tratamiento quirúrgico en zonas remotas o países en vía de
desarrollo, aún no existe hasta la fecha un tratamiento que permita el retraso en la progresión
o reversión de la opacidad en cristalinos humanos.
Proteínas del cristalino
Aproximadamente el 33 al 35% del peso del cristalino es constituido por proteínas. Se
caracterizan según su hidrosolubilidad. Las proteínas hidrosolubles constituyen el 80% del
total de la masa del tejido en los pacientes jóvenes. A su vez, las proteínas hidrosolubles se
subdividen en proteínas cristalinas alfa, beta y gamma 8.
Las proteínas alfa cristalinas hidrosolubles son las proteínas mas abundantes, clasificadas
dentro de las pequeñas proteínas de choque térmico. Estas son mas largas y usualmente
forman complejos proteicos con otras proteínas cristalinas, uniéndose a proteínas
parcialmente desnaturalizadas, previniendo su completa desnaturalización e insolubilización.
Las proteínas alfa cristalinas se encuentran formadas por subunidades A y B 1,8.
Las beta cristalinas son un conjunto de polipéptidos que se pueden asociar entre sí
formando dímeros y complejos de alto orden. Estos pueden dividirse respecto a su peso
molecular en alto peso y bajo peso.
Las gamma proteínas cristalinas son las más pequeñas del grupo de las hidrosolubles y
constituyen solo un 15% del total. Característicamente no suelen asociarse entre sí o con
otras proteínas, al igual que las beta cristalinas, están altamente conservadas
evolutivamente en su estructura en diferentes vertebrados 8.
Las proteínas cristalinas proveen la transparencia del cristalino y por ende sus
propiedades refractivas únicas. Cualquier tipo de injuria o daño físico o químico sea
genético, congénito, por estrés oxidativo, metabólico o por luz ultravioleta, inducen sobre
ellas la agregación y formación de complejos, lo cual hace perder su propiedad de
transparencia y confiere al cristalino una zona de opacidad, además de la pérdida de su
función refractiva 1.
Las proteínas no hidrosolubles del cristalino incluyen proteínas estructurales y de
citoesqueleto, al igual que en otros tipos celulares estas últimas contienen
microfilamentos y microtúbulos, siendo particular la evidencia de otros dos filamentos
intermedios, algunos compuestos de cimentina y otros de faquinina y filensina, los cuales
son únicos y específicos del cristalino.
Cualquier alteración genética que modifique la estructura de estas proteínas conlleva
también a la formación de agregaciones de proteínas y por ende opacificación del
cristalino. Otra fracción de proteínas encontradas en el cristalino son las insolubles en
urea, donde se encuentran las proteínas de membrana. La mitad de estas es constituida
por la proteína intrínseca mayor (MIP o aquaporina 0), con una función esencial en los
canales de agua y el equilibrio hidroelectrolítico del cristalinos 1,8.11
Lanosterol y la vía metabólica
El lanosterol es una molécula intermedia de la biosíntesis del colesterol a partir del
escualeno. La elaboración del lanosterol por medio de múltiples catálisis enzimáticas
provee la estructura nuclear de los esteroides, siendo la 14-demetilación por CYP51 la
que eventualmente provee la formación de colesterol 9.
El precursor principal e inicial en la vía metabólica del lanosterol es la Acetil-Coenzima
A, la cual es transformada a 3-hidroxi-3-metilglutaryl-Coenzima A y por medio de varios
pasos catalíticos enzimáticos es transformada a Geranyl difosfato y Farnesyl difosfato.
Es en este punto de la vía metabólica que evidenciamos dos potenciales desviaciones,
una patológica donde habría actividad de la Geranylgeranyl difosfato sintasa convirtiendo
el Farnesyl difosfato en Geranylgeranyl difosfato; y la dirección fisiológica de la formación
de escualeno por medio de la escualeno sintasa a partir del Farnesyl difosfato que en
última instancia sintetizará el lanosterol 9.
Se han investigado múltiples relaciones entre la biosíntesis del lanosterol y la formación de
cataratas, desde la inhibición de la lanosterol sintasa (2,3 oxidoescualeno ciclasa) en
modelos animales de perros por medio de lesiones tóxicas y evidenciando el rápido
desarrollo de opacidades de cristalino 4,7. Se han realizado estudios en ratas donde
mutaciones hipo mórficas en la lanosterol sintasa y la farnesil difosfato farnesil transferasa
1, los cuales produjeron disminución de los niveles de colesterol en el cristalino, lo que resultó
en formación de opacidades. Análisis genéticos en familias con historia de susceptibilidad
para la formación de cataratas congénitas evidenciaron la presencia de mutaciones
homocigóticas en el gen de la lanosterol sintasa en el cromosoma 21, las cuales afectaron
residuos de aminoácidos conservados y alteraron la función catalítica de la lanosterol
sintasa. Por otra parte, se han realizado estudios in vitro que demostraron que la utilización
del lanosterol previene la formación de agregados proteicos intracelulares en cristalinos con
mutaciones en las proteínas cristalinas, incluso disminuyendo significativamente los
agregados preformados de proteínas, mientras que estudios in vitreo de cristalinos de conejo
e in vivo en perros con catarata reportaron reducción en la severidad de las opacidades y
aumento de la transparencia de los cristalinos 3,5,10.
La prenilación de proteínas consiste en la adición de moléculas hidrofóbicas a una proteína
o a un compuesto químico. Este proceso es de gran importancia en la interacción proteína-
proteína y proteína-membrana celular, sirviendo como adhesivo molecular. Se conoce poco
de la implicación fisiológica de la prenilación de proteínas en el organismo, proceso que al
parecer ocurre en múltiples sistemas orgánicos con muy pobre conocimiento sobre sus
repercusiones. Es posible deducir que este proceso podría estar mediando una porción
importante de la agregación de proteínas cristalinas en el proceso fisiopatológico del
desarrollo de catarata en cristalinos humanos con disfunción de la vía metabólica del
lanosterol 11.12
4. OBJETIVOS
a. GENERAL
Determinar y analizar la presencia de las enzimas Geranylgeranyl difosfato sintasa,
Farnesyl difosfato sintasa, Lanosterol sintasa y Escualeno sintasa en cristalinos humanos
con catarata comparadas con cristalinos humanos sanos.
b. ESPECÍFICOS
➢ Determinar la presencia de la enzima geranylgeranyl difosfato sintasa en los
cristalinos humanos con catarata
➢ Medir el nivel de expresión de la enzima geranylgeranyl difosfato sintasa en los
cristalinos humanos con catarata
➢ Comparar las mediciones de la enzima geranylgeranyl PP sintasa de los
cristalinos humanos con catarata contra las mediciones de cristalinos sanos
➢ Determinar la presencia de la enzima escualeno sintasa en los cristalinos
humanos con catarata
➢ Medir el nivel de expresión de la enzima escualeno sintasa en los cristalinos
humanos con catarata
➢ Comparar las mediciones de la enzima escualeno sintasa de los cristalinos
humanos con catarata contra las mediciones de cristalinos sanos
➢ Determinar la presencia de la enzima Farnesyl difosfato sintasa en los cristalinos
humanos con catarata
➢ Medir el nivel de expresión de la enzima Farnesyl difosfato sintasa en los
cristalinos humanos con catarata
➢ Comparar las mediciones de la enzima Farnesyl difosfato sintasa de los
cristalinos humanos con catarata contra las mediciones de cristalinos sanos
➢ Determinar la presencia de la enzima Lanosterol sintasa en los cristalinos
humanos con catarata
➢ Medir el nivel de expresión de la enzima Lanosterol difosfato sintasa en los
cristalinos humanos con catarata
➢ Comparar las mediciones de la enzima Lanosterol difosfato sintasa de los
cristalinos humanos con catarata contra las mediciones de cristalinos sanos13
5. METODOLOGÍA
Fuero recolectados dos cristalinos humanos con catarata extraídos por medio de la
técnica de extracción extracapsular manual de cristalino durante la cirugía de catarata.
Fue recolectado para análisis el cristalino transparente de un paciente masculino de 28
años con muerte traumática, con previa autorización de entidad de medicina legal de la
ciudad de Bogotá D.C.
Posteriormente fueron analizados en laboratorio especializado de biología molecular por
medio de técnica de reacción de cadena de polimerasa en tiempo real con expresión
relativa a proteína de control beta actina.
Análisis y procesamiento de datos.14
6. Descripción de la intervención
1. Previo consentimiento informado de uso de material de cristalino para estudio de
histopatología (ya incluido en el consentimiento informado del procedimiento
quirúrgico), se recolectaron dos cristalinos humanos que cumplieron con los
criterios de inclusión.
2. Almacenamiento de los cristalinos en medio de conservación RNAssist a -70
grados.
3. Previa autorización de entidad de medicina legal de la ciudad de Bogotá DC se
recolectó un cristalino transparente de control de un paciente masculino de 28
años de edad.
4. Se almacenó la muestra de cristalino en medio de conservación RNAssist a -70
grados.
5. Procesamiento de muestra en laboratorio molecular especializado para estudio
de reacción en cadena de polimerasa en tiempo real.
6. Análisis estadístico de fluorescencia y resultado de pruebas.
7. Tabulación, gráficas y análisis de resultados.
6.1. TIPO DE ESTUDIO
Estudio observacional descriptivo.
6.2. MUESTRA
Dos cristalinos con catarata extraídos mediante la técnica de cirugía de catarata
extracapsular manual convencional o por pequeña incisión por indicación médica,
independiente de su grado y tipo de opacidad.
Muestra 1: Cristalino de paciente masculino de 73 años con catarata NO4NC4
Muestra 2: Cristalino de paciente femenina de 84 años con catarata NO6NC6
Control: Paciente masculino de 28 años sin antecedentes de importancia,
cristalino sin evidencia de opacidadesXV
6.3. GRUPOS
1. Pacientes con catarata con indicación de tratamiento quirúrgico
6.4. CRITERIOS DE INCLUSIÓN Y EXCLUSIÓN
Podrán ser objeto de esta investigación los pacientes que cumplan todo lo siguiente:
• Pacientes mayores de 18 años
• Pacientes con catarata de tipo relacionada con la edad que se sometan a cirugía
de catarata por la técnica extracapsular manual.
Se excluirán los siguientes pacientes
• Pacientes con patología psiquiátrica que puedan limitar su seguimiento
• Menores de edad
• Pacientes con cataratas de cualquier tipo que no sea senil o en quienes se
encuentren etiologías mixtas con comorbilidades sistémicas u oftalmológicas que
puedan conllevar a una etiología mixta.
• Pacientes con catarata de tipo relacionada con la edad que se sometan a cirugía
de catarata por técnica de facoemulsificación.XVI
7. RESULTADOS
El análisis de la expresión relativa de la enzima Farnesyl difosfato sintasa para la
muestra 1 evidenció un aumento relativo de 8.9 veces con base a la expresión relativa
de la muestra control, mientras que para la muestra 2 evidenció un aumento relativo de
9.61 como se muestra en la gráfica 1 y tabla 1.
1 5
noisserpxe
)nitca-B/PPDlysenraF(
1 0
evitaler
5
ANRm
0
C o n tro l M u e s tra 1 M u e s tra 2
Gráfica 1. Expresión relativa de ARN mensajero de la enzima Farnesyl difosfato
sintasa/Beta actina en cristalinos de control, muestra 1 y muestra 2.
Farnesyl Farnesyl Farnesyl
DPP DPP DPP B-actin B-actin B-actin
PCR efficiency 1,9800 mean 1,9900 mean
Ct values Ct target A Ct target B Ct target C Ct target Ct ref. A Ct ref. B Ct ref. C Ct reference
Control 30,68 32,02 32,16 31,62 22,69 21,49 21,89 22,02
Muestra 1 27,70 28,64 29,24 28,52688612 23,13 20,92 22,07 22,04
Muestra 2 28,56 29,22 28,78 28,85525391 23,05 22,1 22,28 22,48
mean fold change
fold of control A fold of control B fold of control C fold of control
1 1 1 1
10,38580713 6,779496107 8,306865202 8,490722814
5,45537777 10,27599631 13,11226507 9,614546382
Tabla 1. Expresión relativa de ARN mensajero de la enzima Farnesyl difosfato
sintasa/Beta acina en cristalinos de control, muestra 1 y muestra 2.
El análisis de expresión relativa de la enzima Geranylgeranyl difosfato sintasa para la
muestra 1 evidenció un aumento relativo de 3.13 veces con base a la expresión relativa
de la muestra control, mientras que para la muestra 2 evidenció un aumento relativo de
9.43 como se muestra en la gráfica 2 y tabla 2.XVII
1 5
noisserpxe )nitca-B/esahtnys
1 0
evitaler
lynareG( 5
ANRm
0
C o n tro l M u e s tra 1 M u e s tra 2
Gráfica 2. Expresión relativa de ARN mensajero de la enzima Geranylgeranyl difosfato
sintasa/Beta actina en cristalinos de control, muestra 1 y muestra 2.
G. syntase G. syntase G. syntase B-actin B-actin B-actin
PCR
efficiency 1,9870 mean 1,9900 mean
Ct
Ct values Ct target A Ct target B Ct target C Ct target Ct ref. A Ct ref. B Ct ref. C reference
Control 29,88 29,39 28,76 29,34 22,69 21,49 21,89 22,02
Muestra 1 28,17 27,69 27,43 27,76 23,13 20,92 22,07 22,04
Muestra 2 26,72 26,50 26,54 26,59 23,05 22,1 22,28 22,48
mean fold change
fold of control
A fold of control B fold of control C fold of control
1 1 1 1
4,396386046 2,175346393 2,820958629 3,130897023
11,24354173 11,07073958 6,005538629 9,43993998
Tabla 2. Expresión relativa de ARN mensajero de la enzima Geranylgeranyl difosfato
sintasa/Beta actina en cristalinos de control, muestra 1 y muestra 2.
El análisis de expresión relativa de la enzima Lanosterol sintasa para la muestra 1
evidenció una disminución relativa de 0.80 veces con base a la expresión relativa de la
muestra control, mientras que para la muestra 2 evidenció un aumento relativo de 40.00
como se muestra en la gráfica 3 y tabla 3.
50
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Control Muestra 1 Muestra 2XVIII
15
Gráfica 3. Expresión relativa de ARN mensajero de la enzima Lanosterol sintasa/Beta
actina en cristalinos de control, muestra 1 y muestra 2.
L. L. L.
synthase synthase synthase B-actin B-actin B-actin
PCR efficiency 1,9800 mean 1,9900 mean
Ct target Ct target Ct target Ct
Ct values A B C Ct target Ct ref. A Ct ref. B Ct ref. C reference
Control 37,80 37,32 37,42 37,51323244 22,69 21,49 21,89 22,02
Muestra 1 38,19 39,94 37,26 38,46217325 23,13 20,92 22,07 22,04
Muestra 2 32,67 32,37 32,71 32,58313083 23,05 22,1 22,28 22,48
mean fold change
fold of control fold of control fold of control
A B C fold of control
1 1 1 1
1,040799501 0,113097856 1,257674019 0,803857125
42,70381114 44,72345688 32,59918784 40,00881862
Tabla 3. Expresión relativa de ARN mensajero de la enzima Lanosterol sintasa/Beta
actina en cristalinos de control, muestra 1 y muestra 2.
El análisis de expresión relativa de la enzima Escualeno sintasa para la muestra 1
evidenció un aumento relativo de 1.25 veces con base a la expresión relativa de la
muestra control, mientras que para la muestra 2 evidenció un aumento relativo de 3.80
como se muestra en la gráfica 4 y tabla 4.
5
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0
Control Muestra 1 Muestra 2
Gráfica 4. Expresión relativa de ARN mensajero de la enzima Escualeno sintasa/Beta
actina en cristalinos de control, muestra 1 y muestra 2.
S. epox S. epox S. epox B-actin B-actin B-actin
PCR efficiency 1,9800 mean 1,9900 mean
Ct target Ct target Ct target Ct
Ct values A B C Ct target Ct ref. A Ct ref. B Ct ref. C reference
Control 35,55 39,58 35,76 36,96364498 22,69 21,49 21,89 22,02
Muestra 1 36,19 38,12 35,87 36,72765995 23,13 20,92 22,07 22,04XIX
Muestra 2 34,33 38,01 34,12 35,48543132 23,05 22,1 22,28 22,48
16
mean fold change
fold of control fold of control fold of control
A B C fold of control
1 1 1 1
0,874155201 1,829023785 1,049930091 1,251036359
2,949107517 4,459329669 4,009439013 3,805958733
Tabla 4. Expresión relativa de ARN mensajero de la enzima Escualeno sintasa/Beta
actina en cristalinos de control, muestra 1 y muestra 2.XX
8. DISCUSIÓN
Nuestros hallazgos sugieren una modificación patológica en el funcionamiento de la vía
metabólica del colesterol en el punto de bifurcación hacia un aumento en la expresión relativa
de la enzima Geranylgeranyl difosfato sintasa clara en los dos grados de opacidades
evaluados, mientras las enzimas Escualeno sintasa y Lanosterol sintasa, responsables de la
formación de lanosterol y colesterol como productos finales se encontraron ligeramente
elevadas y disminuídas en el grado de opacidad intermedio respectivamente, mientras que
se elevaron significativamente en el grado de opacidad avanzado. Es posible sugerir una
desviación de la vía hacia la formación de Geranylgeranyl difosfato, el cual es sustrato
importante en el proceso de prenilación de proteínas, lo cual podría estar relacionado en la
fisiopatología de la aglomeración de proteínas en cristalinos humanos, explicando la
formación de cataratas seniles.XXI
9. CONSIDERACIONES ÉTICAS
De acuerdo con los principios establecidos en Declaración de Helsinki; Reporte Belmont;
Pautas CIOMS; GPC/ICH) y en la Resolución 008430 de Octubre 4 de 1993: por la cual
se establecen las normas científicas, técnicas y administrativas para la investigación en
salud, Titulo II: de la Investigación en Seres Humanos, Capítulo I: de los Aspectos Éticos
de la Investigación en Seres Humanos: en toda investigación en la que el ser humano
sea sujeto de estudio, deberá prevalecer el criterio del respeto a su dignidad y la
protección de sus derechos y bienestar (Articulo 5) y la Resolución 2378 de (Por la cual
se adoptan las Buenas Prácticas Clínicas para las instituciones que conducen
investigación con medicamentos en seres humanos, y debido a que esta investigación
se consideró como: Articulo 11 (de la Resolución 008430/93): Investigaciones con riesgo
mayor que el mínimo: Son aquellas en que las probabilidades de afectar al sujeto son
significativas, entre las que se consideran: estudios radiológicos y con microondas,
estudios con los medicamentos y modalidades que se definen en los títulos III y IV de
esta resolución, ensayos con nuevos dispositivos, estudios que incluyen procedimientos
quirúrgicos, extracción de sangre mayor al 2% del volumen circulante en neonatos,
amniocentesis y otras técnicas invasoras o procedimientos mayores, los que empleen
métodos aleatorios de asignación a esquemas terapéuticos y los que tengan control con
placebos, entre otros; y en cumplimiento con los aspectos mencionados con el Artículo 6
de la presente Resolución, este estudio se desarrollará conforme a los siguientes
criterios:
a. El presente estudio se ajustará a los principios científicos y éticos que la
justifiquen.
b. Al tratarse de investigación en tejidos humanos se dispondrá de los mismos con
el debido respeto, sin exponer nunca la confidencialidad de los sujetos de origen.
c. El conocimiento que se pretende producir no puede obtenerse por otro medio
idóneo y beneficiara a la población afectada en el entendimiento de los procesos
fisiopatológicos y potencial investigación ulterior en tratamientos no quirúrgicos.
d. La presente investigación se clasifica como “investigación sin riesgo”, puesto que
no se realiza ninguna intervención o modificación intencionada de las variables
biológicas, fisiológicas, psicológicas o sociales de los individuos que participan en el
estudio, entre los que se consideran: revisión de historias clínicas, entrevistas,XXII
cuestionarios y otros en los que no se le identifique ni se traten aspectos sensibles de su
c onducta.
e. Los participantes del estudio no tienen riesgo de lesiones físicas o mentales; el
riesgo potencial es que se pierda la confidencialidad de sus datos personales. Sin
embargo se velará vehemente por mantener su información en forma confidencial. Se
espera que los resultados del presente estudio sirvan como punto de partida para la
creación de recomendaciones y la invitación a crear políticas que permitan el libre
desarrollo del ejercicio médico bajo la tutela de la evidencia científica, situación que
beneficia de forma directa a toda nuestra población gremial.
19
f. El presente estudio se realizó por profesionales idóneos con conocimiento
fundamentado en la academia y bajo el respaldo que nos acredita como miembros de la
Universidad Nacional de Colombia para cuidar la integridad de los pacientes bajo la
responsabilidad de una entidad de salud, supervisada por las las autoridades de salud,
siempre y cuando cuenten con los recursos humanos y materiales necesarios que
garanticen el bienestar del sujeto de investigación.
g. Conforme a lo dispuesto en la ley 1581 de 2012, la información personal
consignada en el instrumento de la investigación fue manejada velando por los principios
de finalidad, libertad, veracidad, calidad, transparencia, acceso y circulación restringida,
por lo tanto, no podrá ser utilizada para fines diferentes a la investigación, y su tratamiento
será restringido al equipo investigador autorizado por el participante previamente. La
información en ningún momento será utilizada con fines comerciales o económicos
h. El presente estudio, se llevó a cabo previa autorización: del representante legal
de la institución investigadora y de la institución donde se realice la investigación; el
Consentimiento Informado de los participantes; y la aprobación del proyecto por parte del
Comité de Ética en Investigación de la institución.
i. El estudio actual no representa ninguna remuneración económica para los
participantes ni el grupo investigador, tampoco se incurrirán en gastos por parte
de las entidades hospitalarias ni sus pacientes.
j. Se declara que no existen conflictos de intereses por parte del investigador
y el desarrollo del presente estudio, ninguno de los integrantes encargados del
análisis de la información está relacionado con empresas afines al sistema de
salud (Farmacéuticas, aseguradoras, empresas promotoras de salud públicas o
privadas)XXIII
Referencias Bibliográficas
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(American Academy of Opthalmology, 2020).
2. López-Jaramillo, P., Camacho López, P. A., Gómez-Arbeláez, D., José, J. &
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pública en Colombia. http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs282/.
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607–611 (2015).
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oxidosqualene cyclase in the dog and mouse. Toxicol. Pathol. 29, 174–179
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Related Cortical Cataract. J. Ophthalmol. 2018, (2018).
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https://iovs.arvojournals.org/article.aspx?articleid=2746343.
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contribute to cataracts caused by U18666A, an oxidosqualene cyclase inhibitor. J.
Lipid Res. 45, 1232–1241 (2004).
8. Andley, U. P. The lens epithelium: Focus on the expression and function of the α-
crystallin chaperones. International Journal of Biochemistry and Cell Biology vol.
40 317–323 (2008).
9. Benson, H. E. Lanosterol biosynthesis pathway (version 2019.4) in the
IUPHAR/BPS Guide to Pharmacology Database. IUPHAR/BPS Guid. to
Pharmacol. CITE 2019, (2019).
10. Huff, M. W. & Telford, D. E. Lord of the rings - The mechanism for
oxidosqualene:lanosterol cyclase becomes crystal clear. Trends in
Pharmacological Sciences vol. 26 335–340 (2005).
11. Casey, P. J. & Seabra, M. C. Protein prenyltransferases. Journal of Biological
Chemistry vol. 271 5289–5292 (1996).