Evaluación de la actividad resortiva de cmnsp fusionadas con polietilenglicol (peg), tratadas con fuerza centrífuga y con n acetilcisteina (NAC)
Autor: Bedoya Trujillo, Juan Sebastian
Asesor: Forero Niño, Adriana del Pilar (Thesis advisor)
Fecha: 2015
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Con el objeto de evaluar la actividad resortiva de las células mononucleares de sangre periférica (CMNSP), estas fueron aisladas mediante un gradiente de ficol-Hipaque y estimuladas con 10 μg/ml de fitohemaglutinina (PHA) durante 72 h en medio de cultivo RPMI 1640 y suero fetal bovino al 10%. Aproximadamente 20.000 células fueron fusionadas con PEG 3000, otro grupo aproximadamente del mismo tamaño fueron sometidas a fuerza centrífuga a 60 RPM durante120 h, sembradas sobre láminas de hueso cortical bovino estériles de aproximadamente 5 x 5 mm2 x 0.5 de alto y tratadas o no con N-acetilcisteína (NAC). Para esto, se dividieron en 6 grupos de la siguiente manera: 1. Células no fusionadas. 2. Células no fusionadas + NAC. 3. Células no fusionadas + fuerza centrífuga. 4. Células no fusionadas + fuerza centrífuga + NAC. 5. Células fusionadas con PEG. 6. Células fusionadas con PEG + NAC. Transcurrido el tiempo de cultivo las células se fijaron con metanol ácido acético en proporción 1:3; se procedió a identificar proteínas de membrana utilizadas como marcadores característicos de osteoclastos. Entre estas proteínas están: ADAM-12, ATPasa, Integrina β3, DC-stamp, Receptor de calcitonina y Catepsina K. Igualmente se evaluó la actividad de la enzima tartrato resistente (TRAP).  Posteriormente las células se retiraron de la lámina ósea y se evaluó la actividad resortiva sobre el hueso donde se cultivaron las células. Se encontró que al fusionar células con PEG, o aplicar fuerza centrífuga a células no fusionadas, se inducen marcadores característicos de células osteoclasticas y actividad resortiva, probablemente relacionado con un aumento de ROS, dado que al aplicar NAC los marcadores y la actividad resortiva disminuyen.

EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE
CMNSP FUSIONADAS CON POLIETILENGLICOL
(PEG), TRATADAS CON FUERZA CENTRÍFUGA Y
CON N ACETILCISTEINA (NAC)
Presentado por
:
Juan Sebastián Bedoya Trujillo
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Odontología.
Posgrado de Ortodoncia
Bogotá D.C. Colombia
2015EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE
CMNSP FUSIONADAS CON POLIETILENGLICOL
(PEG), TRATADAS CON FUERZA CENTRÍFUGA Y
CON N ACETILCISTEINA (NAC)
Juan Sebastián Bedoya Trujillo
Trabajo de investigación presentado para optar al título de:
Especialista en Ortodoncia y Ortopedia Maxilar
Director
Dr. CARLOS ARTURO GUERRERO
M.D. Msc. PhD
Profesor Titular
Facultad de Medicina
Grupo de Investigación: Metabolismo óseo del laboratorio de biología molecular y celular
de medicina.
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Odontología.
Posgrado de Ortodoncia
Bogotá D.C. Colombia
2015V
AGRADECIMIENTOS Y DEDICATORIA
Doy gracias principalmente a mi papá quien ha sido fuente inagotable de apoyo
durante toda mi vida, en mis proyectos y formación académico, a mis tías: Rosita
Trujillo por su igualmente enorme apoyo y cariño de madre, a Margarita Bedoya y
su familia por su constante interés y soporte, y a mi abuela Ana María quien
siempre me ha dado confianza y su energía espiritual en mi formación.
A toda mi familia y amigos, que saben lo importante que son para mí, y que de
alguna forma hacen parte del desarrollo de mi especialidad.
A los docentes Dr. Salomón Yezioro, el cual me abrió las puertas en el área para
desarrollar este proyecto y la Dra. Natalia Carrillo por su incondicional interés y
apoyo en el desarrollo del mismo.
Al Dr. Carlos Guerrero, director del proyecto, por su disposición y apoyo en la
elaboración de este y al Dr. Pedro Moreno estudiante de maestría quien no solo
me enseño la mayor parte de lo que tenía que saber en el laboratorio, sino que
también me ayudo durante todo el proceso de la fase experimental del proyecto.
Y finalmente dedico este trabajo de grado y todos mis logros a mi mamá Luz
Elena Trujillo Fernández, sin ella no estuviera donde voy…
Al universo gracias.VI EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Resumen
Con el objeto de evaluar la actividad resortiva de las células mononucleares de
sangre periférica (CMNSP), estas fueron aisladas mediante un gradiente de ficol-
Hipaque y estimuladas con 10 μg/ml de fitohemaglutinina (PHA) durante 72 h en
medio de cultivo RPMI 1640 y suero fetal bovino al 10%. Aproximadamente
20.000 células fueron fusionadas con PEG 3000, otro grupo aproximadamente
del mismo tamaño fueron sometidas a fuerza centrífuga a 60 RPM durante120 h,
sembradas sobre láminas de hueso cortical bovino estériles de aproximadamente
5 x 5 mm2 x 0.5 de alto y tratadas o no con N-acetilcisteína (NAC). Para esto, se
dividieron en 6 grupos de la siguiente manera: 1. Células no fusionadas. 2.
Células no fusionadas + NAC. 3. Células no fusionadas + fuerza centrífuga. 4.
Células no fusionadas + fuerza centrífuga + NAC. 5. Células fusionadas con
PEG. 6. Células fusionadas con PEG + NAC. Transcurrido el tiempo de cultivo las
células se fijaron con metanol ácido acético en proporción 1:3; se procedió a
identificar proteínas de membrana utilizadas como marcadores característicos de
osteoclastos. Entre estas proteínas están: ADAM-12, ATPasa, Integrina β3, DC-
stamp, Receptor de calcitonina y Catepsina K. Igualmente se evaluó la actividad
de la enzima tartrato resistente (TRAP). Posteriormente las células se retiraron
de la lámina ósea y se evaluó la actividad resortiva sobre el hueso donde se
cultivaron las células. Se encontró que al fusionar células con PEG, o aplicar
fuerza centrífuga a células no fusionadas, se inducen marcadores característicos
de células osteoclasticas y actividad resortiva, probablemente relacionado con un
aumento de ROS, dado que al aplicar NAC los marcadores y la actividad
resortiva disminuyen.VII
Palabras clave: N-acetilcisteina, polietilenglicol, osteoclasto, marcadores
osteoclasto, metabolismo óseo, resorción y células mononucleares.
Abstract
Whit objective In order to assess the resorptive activity of mononuclear cells from
peripheral blood (PBMC), these were isolated by a gradient of ficoll-Hypaque and
stimulated with 10 ug / ml phytohemagglutinin (PHA) for 72 h in RPMI 1640 fetal
bovine serum and 10%. Approximately 20,000 cells were fused with PEG 3000,
another group of about the same size were subjected to centrifugal force for 60
RPM durante120 h, planted on sheets of cortical bovine bone sterile
approximately 5 x 5 mm x 0.5 tall and treated or not with N -acetilcystein (NAC).
For this, they were divided into 6 groups as follows: 1. Cells unfused. 2. unfused +
NAC. 3. unfused + centrifugal force. 4. unfused + centrifugal force+ NAC. 5. cells
fused with PEG. 6. cells fused with PEG + NAC. After the culture time the cells
were fixed with acetic acid methanol in proportion 1: 3; we proceeded to identify
membrane proteins used as markers characteristic of osteoclasts. Among these
proteins are: ADAM-12, ATPase, β3 integrin, DC-stamp, cathepsin K, calcitonin
recptor and activity enzyme tartrate resistant (TRAP) was evaluated. The cells
were removed from the plate, and resorptive activity was evaluated on bone
where the cells were grown. It was found that by fusing cells with PEG, or
applying centrifugal force to unfused cells, markers characteristic of osteoclastic
cells are induced and resorptive activity, probably related to an increase in ROS,
since applying NAC markers and resorptive activity decrease.
Keywords: N-acetylcysteine, polyethylene glycol, osteoclasts, osteoclast
markers, bone metabolism, bone resorption and mononuclear cells.9
Contenido
Pág.
Resumen ......................................................................................................................... VI
Lista de figuras .............................................................................................................. 11
Lista de símbolos y abreviaturas ................................................................................. 12
1. Introducción ........................................................................................................... 13
2. Justificación ........................................................................................................... 14
3. Marco teórico .......................................................................................................... 16
3.1 Osteoclasto .................................................................................................... 16
3.2 Resorción ósea .............................................................................................. 20
3.3 RANK, RANKL Y OPG ................................................................................... 22
3.4 Resorción ósea y dental en ortodoncia .......................................................... 24
3.5 Células de sangre periférica .......................................................................... 28
3.6 Modelo para generar células con actividad osteoclastica ............................... 29
3.7 N-acetilcisteina .............................................................................................. 31
3.8 Polietilenglicol (PEG) ..................................................................................... 32
3.9 Marcadores propios de osteoclastos .............................................................. 33
3.9.1 ADAM 12 ............................................................................................. 34
3.9.2 ATPasa ............................................................................................... 34
3.9.3 Integrina B3 ......................................................................................... 35
3.9.4 DC-stamp ............................................................................................ 35
3.9.5 Receptor de calcitonina ....................................................................... 36
3.9.6 Catepsina K ........................................................................................ 36
3.9.7 TRAP .................................................................................................. 37
4. Objetivos ................................................................................................................. 38
4.1 Objetivo general............................................................................................. 38
4.2 Objetivos específicos ..................................................................................... 38
5. Materiales y métodos ............................................................................................. 39
5.1 Láminas de hueso .............................................................................................. 39
5.2 Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica y cultivo ............ 40
5.3 División de la muestra.................................................................................... 41
5.4 Fusión celular con PEG y fuerza centrifuga ................................................... 41
5.5 Marcadores de osteoclasto ............................................................................ 43
5.5.1 Inmunofluorescencia ........................................................................... 4310 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
5.5.2 Determinación de la fosfatasa ácida resistente al tartrato TRAP ..........44
5.6 Evaluación de la actividad resortiva ................................................................45
6. Resultados ..............................................................................................................47
6.1 Evaluación mediante de la expresión de marcadores osteoclasticos. .............47
6.1 Evaluación de la expresión de la enzima TRAP .............................................51
6.2 Evaluación de la actividad resortiva ................................................................54
7 Discusión .................................................................................................................58
8 Conclusión ..............................................................................................................62
9. Recomendaciones .....................................................................................................63
Bibliografía .....................................................................................................................64
Anexo 1 ...........................................................................................................................71
Consentimiento informado ............................................................................................71
Anexo 2 ...........................................................................................................................78
Microfotografías .............................................................................................................7811
Lista de figuras
Pag.
Figura 1:
Ultraestructura del osteoclasto y sus tres principales zonas……………….………18
Figura 2:
Principales vías bioquímicas y de transporte en el osteoclasto…………………….22
Figura 3:
Interacción del RNAK, RANKL y OPG en el metabolismo óseo…………..………..24
Tabla 1:
Número de grupos de células para inmunofluorescencia de anticuerpos……...…49
Figura 4:
Inmunofluorescencia ADAM12, ATPasa, INTEGRINA β 3………………………….50
Figura 5:
Tinción TRAP+, fusionadas con PEG, PEG+NAC, fuerza centrífuga, fuerza
centrífuga+NAC, no fusionadas, no tratadas con fuerza (CONTROL) y CONTROL+NAC
………………………………………………………………………………………….…..52
Figura 6:
Número de grupos de células para la tinción de TRAP+..……………………..……….….53
Figura 7:
Microfotografías de tinción Coomassie para evaluar lagunas de resorción, fusionadas con
PEG, PEG+NAC, fuerza centrífuga, fuerza centrífuga+NAC, no fusionadas, no tratadas
con fuerza (CONTROL) y CONTROL+NAC ……………..……………………….…....55
Figura 8:
Número de lagunas de resorción en los 6 grupos experimnetales………………………….5612 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Lista de símbolos y abreviaturas
Símbolos
Símbolo Definición
μ Micra
μl Microlitro
β Beta
Abreviaturas
Abreviatura Término
BMM Bone marrow macrophages=Precursores de osteoclastos
CFU Unidad formadora de colonias
CMNSP Células mononucleares de sangre periférica
MAP Proteína activadora de mitogenesis
MEC Moléculas de adhesión extracelular
mM Pero molecular
NAC N-acetilcisteina
Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa
NFkB
de las células B activadas
No f No tratadas con fuerza
No fu No fusionadas
PEG Polietilenglicol
PHA fitohematoaglutinina
RANK Receptor activador para el factor nuclear κ B
RANKL ligando de receptor activador para el factor nuclear κ B
ROS Especies reactivas de oxigeno
SFB Suero fetal bobino
SOD Superoxido dismutasa
Factor de activación osteoclastogenico secretado por
SOFAT
células t13
1. Introducción
Los osteoclastos son células diferenciadas terminales, provenientes de la línea
hematopoyética que realizaran actividad resortiva sobre hueso o tejidos
mineralizados y presentan marcadores característicos. Se han ensayado
diferentes modelos para tener células con actividad resortiva, algunos utilizan
hormonas recombinantes de alto costo, cultivan las células durante
aproximadamente 15 días o más para lograr la diferenciación y que presenten
marcadores positivos para osteoclastos con actividad resortiva (1) (2) (3).
Las células obtenidas en el laboratorio con actividad resortiva y marcadores
típicos de células osteoclasticas se le denominan “osteoclast-like cell” o células
similares a osteoclastos.
En el laboratorio de biología molecular de la Facultad de Medicina de la
Universidad Nacional se ha generado un modelo con actividad resortiva
consistente en fusionar células de origen monocito-macrófago (U937 humanas o
J774 de ratón), células mononucleares de sangre periférica (CMNSP) humanas,
fibroblastos de origen gingival. La fusión se realiza con polietilenglicol (PEG). El
mismo laboratorio encontró que al someter estas mismas células sin fusionar a
fuerza centrífuga, desarrollaban actividad resortiva y expresaban marcadores
propios de osteoclastos. Esto trajo la posibilidad de evaluar su actividad resortiva
sobre hueso, en un modelo que es de fácil reproducción (4) (5).14 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
2. Justificación
Se ha reportado que durante la actividad del osteoclasto o de células similares a
osteoclastos, se aumentan las ROS (“reactive oxygen species”) probablemente
por un aumento en la generación de hidrogeniones necesarios para generar un
ambiente ácido y poder retirar el calcio del hueso o dentina en el proceso de
resorción. En un estudio (6), cultivaron células de sangre periférica durante 3
semanas estimuladas con FSC-macrofagos y RANKL identifican la expresión
diferencial de TBP-2 (proteína de unión tiorredoxina 2) y Trx-1 (tiorredoxina) la
primera es una proteína antioxidante, que actúa como antagonista de las ROX, es
importante en la regulación de factores de transcripción y en la inactivación del
osteoclasto, la segunda es una agonista importante durante la osteoclastogénesis
incluyendo mecanismos de activación del osteoclastos; cuando al cultivo le
agregaron RANKL, la expresión de TBP-2 se redujo, mientras que se incrementó
Trx-1 sugiriendo que Trx-1 está presente en la diferenciación y activación de los
células similares a osteoclastos y cuando aplicaron el antioxidante N-
acetilcisteína revirtió este patrón aumentando TBP-2 y reduciendo Trx1, con lo
cual se inhibió marcadamente la osteoclastogénesis. La aplicación de N-
acetilcisteína (NAC) como agente reductor inhibió la actividad osteoclastica
bloqueando la acción de NOX (NADPH oxidase) y SOD (superoxido dismutasa),
proteínas que conducen a la formación ROS. Cuando se aplica al cultivo celular
NAC se inhibe la respuesta de las células BMM al RANKL, incluyendo la
producción de ROS, inhibe la diferenciación de osteoclastos o disminuye su
función resortiva15
Por esta razón se quiere explorar si células mononucleares de sangre periférica
(CMNSP) humana fusionadas con PEG o sometidas a fuerza centrífuga,
presentan modificación de la actividad osteoclastica al tratarlas con NAC (7).16 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
3. Marco teórico
3.1 Osteoclasto
Los osteoclastos como los conocemos actualmente fueron descritos en 1873 por
Kolliker, quien propone inicialmente el término de ostoklast para células
multinucleadas, móviles, que presentan en su superficie activa una estructura que
se describe en la literatura como borde en cepillo y que aún es vigente para la
superficie en contacto con el tejido óseo, dentina o cemento, allí genera la
conocida laguna de resorción, cumpliendo así su función al extraer el componente
inorgánico, pasándolo a la circulación sanguínea y descomponiendo la matriz
orgánica del hueso la cual reutiliza y/o exporta a la matriz extracelular, es una
célula de gran tamaño 85 a 100 micras aproximadamente, puede incluir hasta 150
núcleos, cobra una significativa importancia en el metabolismo óseo, su función
es la resorción ósea, desempeñan importantes funciones en el área de
odontología y en procesos patológicos como periodontitis, procesos como
crecimiento y desarrollo, movimiento dental, oseointegración, injertos y reparación
de fracturas, en el remodelado óseo de estructuras de interés como maxilares y
viscerocráneo, entre otros (5) (8) (9).
En cuanto a la estructura general del osteoclasto se reconocen 3 regiones
específicas:
1. Zona clara o zona de sellado es un perímetro de citoplasma, contiguo al
borde en cepillo, contiene abundantes microfilamentos de actina, estos se17
hallan organizados en una estructura circular que está rodeada en ambos
lados por proteínas de unión a la actina (integrina, vinculina y talina), en
esta zona existen moléculas de adhesión célula – MEC que forman el sello
apretado entre la membrana celular y la matriz ósea mineralizada. Varias
clases de receptores están presentes para mantener el sellado: integrinas
como αv β3 para vitronectina, receptor α2 β1 para colágeno o αv β2, al
interior de esta zona se forma el borde festoneado o borde en cepillo (10).
2. Borde festoneado o en cepillo: Es la porción del osteoclasto en contacto
directo con el hueso; contiene muchos repliegues profundos de la
membrana plasmática que forman estructuras de tipo microvellosidades,
es una zona altamente permeable encargada de aumentar el área de
extensión de esta superficie, para la exostosis de las enzimas hidrolíticas,
proteolíticas y secreción de protones por las bombas protónicas
dependientes de ATP, de igual manera estos repliegues también favorecen
la endocitosis de los productos orgánicos e inorgánicos resultado de la
degradación ósea, en el citoplasma cerca del borde festoneado hay una
gran cantidad de mitocondrias y lisosomas, los núcleos se ubican
generalmente en la parte más alejada de la superficie ósea (10).
3. Zona basolateral: interviene en la exocitosis del material digerido, las
vesículas de transporte con material óseo degradado, se fusionan con la
membrana celular para liberar su contenido al medio extracelular (10).18 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Figura 1. Ultraestructura del osteoclasto y sus tres principales zonas (10).
El origen del osteoclasto no es totalmente claro, se han planteado varias teorías,
algunas de ellas son: la primera entre 1949 al 1970 que el osteoclasto y el
osteoblasto tenían el mismo linaje, los osteoblastos se fusionaban para formar el
osteoclasto, y viceversa cuando en ciertas ocasiones el osteoclasto se dividía
para formar osteoblastos y estos formaban el osteocito; posterior a esto 1970 se
propone la teoría bifiletica, en donde se plantea que los osteoblastos y
osteoclastos tenían diferente linaje y finalmente para inicio de los 80 se reconoció
al sistema fagocito-monocítico como precursor del osteoclasto, aceptándose su
origen como hematopoyético, derivando entonces de “Unidades formadoras de
colonias de granulocito-macrófagos” (CFU – colony-forming unity), así mismo
precursoras de monocitos y macrófagos derivados inicialmente de la estirpe
celular hematopoyética comprometida con la línea mieloide, son estimulados por
ligandos como el RANKL marcador de actividad y proliferación de osteoclastos,
también se plantea la inhibición de estos tanto en actividad como en cantidad por19
las OsteoProteGerinas (OPG) producidas por fibroblastos, osteoblastos,
osteocitos y células de tejido conectivo próximos al hueso (5) (11) (12).
Sin embargo gracias a los recientes avances y conocimiento de plasticidad
celular, reconociéndose otros orígenes como es recientemente aceptado, y aún
más popularizado por el premio Nobel de fisiología y medicina en 2012 Sir Johon
B, y otros autores como Gurdon, Shinya Yanamaka, los cuales demostraron que
las células maduras pueden reprogramarse a células pluripotenciales,
generándose el concepto de desdiferenciación, y a partir de esta condición la
célula toma una línea para diferenciarse nuevamente en la célula para la cual se
está generando algún estimulo o mediador, y todo esto dependiendo de la
necesidad del sistema, quedando entonces la posibilidad de grandes adelantos,
al no limitar los linajes celulares a determinados órganos, así, la plasticidad
celular reciente y significativo hallazgo científico evidencia el potencial genético
que mantienen todas las células nucleadas del cuerpo, aun incluso aquellas
totalmente diferenciadas o maduras, gracias a la información presente en el
material genético, del cual toda célula cuenta con un juego en su núcleo, abriendo
grandes posibilidades al campo científico y eliminando limitaciones conceptuales
de gran importancia con las cuales se habían desarrollado los conceptos de
diferenciación hasta ese momento, ahora debemos abrir la mente a una gran
cantidad de posibilidades antes inconcebibles desde la biología y genética para
cualquier célula nucleada (4) (13) (14) (15).20 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
3.2 Resorción ósea
El termino resorción ósea puntualmente hace referencia a la disolución y
desintegración del tejido óseo, retirando parte de este de un tejido que
conformaba una estructura, al tiempo que se hace la reabsorción del mismo para
pasar a circular en sangre en forma de calcio, otros minerales y algunos
productos de la degradación de la materia orgánica en el hueso, solo en este
momento se realiza la reabsorción; se usa frecuentemente de forma
indiscriminada los dos términos resorción y reabsorción, y a nivel óseo se están
dando primero resorción y luego reabsorción ya que este segundo término
(reabsorción) en el cual se hace referencia al verbo reabsorber quien por su parte
refiere absorber nuevamente, puede ser mejor usado en la fisiología renal, en
donde la arteria renal lleva sangre que contiene glucosa previamente resorbida y
los riñones la reabsorben (resorben nuevamente) (16) (17).
El doctor Del Nero Vera, médico y odontólogo propone también el término de
resorción ósea o dental como una inflamación sobre el tejido mineralizado en el
cual hay una desintegración de la matriz orgánica e inorgánica y posterior paso
del resultado a la circulación en sangre (18).
También hay otra diferencia con una connotación un poco semántica, en la cual
se utiliza el término resorción para la adsorción de estructuras propias del cuerpo,
por ejemplo hueso, tejidos o líquidos propios y reabsorción para agentes externos
por ejemplo una sutura reabsorbible (19).
Durante el proceso de resorción ósea la estructura inorgánica debe ser
degradada del hueso, la cual, está constituida por una fase mineral de
hidroxiapatita, seguida por la degradación de la parte orgánica del hueso formada
en su mayoría por colágeno tipo 1 (˃90%) y proteínas no colágenas. En la
desmineralización del hueso se produce una acidificación del microambiente
extracelular, este proceso es mediado por la enzima vacuolar H+-ATPasa (similar21
a una bomba de protones) localizada en el borde de cepillo que se identifican
como entradas y salidas citoplasmáticas especializadas, el cual aumenta su
superficie de contacto y se adhiere con este al área ósea que va a ser resorbida.
Debido a un abundante transporte de protones por un intercambiador
independiente de energía (Cl-/HCO3) sobre la superficie opuesta al borde de
cepillo del osteoclasto mediado por la anhidrasa carbonica II (CAII) a partir de
CO2 y H20.
El resultado de este transporte de iones es la secreción de HCl (ácido clorhídrico)
en el microambiente de resorción llevando a un pH aproximado de 4.5,
sumándose a ello la expresión de enzimas líticas como el TRAP y pro-
CATEPSINA K, en un pozo de resorción denominado lagunas de Howship o
lagunas de resorción. Así mismo ácidos como el cítrico y el láctico, liberados por
las vesículas secretoras y por las mitocondrias son expulsados en la laguna de
resorción atreves del borde de cepillo, en donde disuelve las sales óseas y
produce lisis del hueso en forma de cavidades formando túneles que pueden
llegar a tener entre 100 y 500 μM de largo. Los productos del desarrollo de las
lagunas, entran a la circulación: calcio, fósforo y aminoácidos constituyentes de
las proteínas óseas principalmente del colágeno, especialmente prolina e
hidroxiprolina, que a la vez van a estimular la calcitonina y la PTH de acuerdo con
la concentración del calcio iónico y sérico; estos productos metabólicos son
utilizados como marcadores biológicos que indican resorción ósea (20) (21) (22).22 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Figura 2. Principales vías bioquímicas y de transporte en el osteoclasto (23).
3.3 RANK, RANKL Y OPG
Para que el osteoclasto inicie su función resortiva, debe ser activada por el
RANKL (ligando para el receptor activador del factor nuclear κ β), molécula
principal involucrada en la activación del osteoclasto producida por los
osteoblastos, las células del estroma, los linfocitos T, fibroblastos entre otras. Los
efectos del RANKL están mediados por su unión a un receptor altamente
específico, el RANK (El receptor activador del factor nuclear κ B), una proteína
transmembrana expresada por los osteoclastos, preosteoclastos, monocitos. La
unión del RANK con su ligando RANKL, induce la activación de una cascada de
eventos intracelulares que llevan a la diferenciación y activación de los
osteoclastos (11) (24) (25) (26).23
Las células T son una fuente importante de RANKL, experimentos in vitro e in
vivo demuestran que la activación de células T conlleva al incremento en
osteoclastogénesis y resorción ósea. Sugiriendo que los estados inflamatorios
agudos y crónicos, al igual que ciertas leucemias, contribuyen con perdida
patológica de masa ósea mediada por osteoclastos (5) (27).
El RANKL tiene un inhibidor competitivo que inhibe su unión al ligando RANK,
denominada osteoprotegerina (OPG) miembro de la superfamilia de receptores
del TNF segregado por los osteoblastos no anclados a la membrana. Actúa como
señuelo uniéndose al RANKL y neutralizándolo (receptor trampa), impide su unión
con el RANK, inhibe la diferenciación, supervivencia y fusión de los precursores
de osteoclastos, bloquea la activación de los osteoclastos maduros e induce su
apoptosis. Sin embargo recientemente una nueva citoquina producida por las
células T, denominada SOFAT (por sus siglas en inglés Secreted
osteoclastogenic factor of actívate T Cell), evaluado en monocitos de ratón de la
línea RAW 264.7 demostraron que al ser estimulados con SOFAT, expresan
marcadores osteoclastogénicos como integrina αvβ3, captesina K y anillos de
actina aun cuando dichas células se estimulan simultáneamente con OPG,
demostrando que esta citoquina estimula la formación de células similares a
osteoclastos y no está mediada por RANKL (27).
Dai y colaboradores plantean que la interleukina 18 (IL-18) directa o
indirectamente tiene efectos osteoclastogénicos mediado por células T en Artritis
Reumatoide (AR) sinovial. Compararon sus efectos con la incorporación de IL1β y
TNFα. Esta investigación concluye que en presencia de PHA la cual pre
estimulaba las células T o células T sinoviales de AR, IL18, IL1β, o TNFα
incrementaba el RANKL soluble, la expresión de RANKL membranal en una
relación dosis dependiente. Pero no induce la expresión de M-CSF, GM-CSF,
IFNγ u OPG. Indicando además, que puede estimular la producción de
osteoclastos a través de la sobre regulación de RANKL en las células T AR
sinoviales (28).24 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Figuro 3. Interacción del RNAK, RANKL y OPG en el metabolismo óseo. (29)
3.4 Resorción ósea y dental en ortodoncia
Durante el movimiento dental en los tratamientos ortodónticos es necesaria la
presencia de todos los tipos celulares del metabolismo óseo; así, la resorción por
parte de los osteoclastos en las zonas de presión sobre el ligamento periodontal y
deposito por parte de los osteoblastos en zonas de tensión, son indispensables
para que se produzca el movimiento dental a través del remodelado óseo, pero, al
llegar a la finalización del tratamiento ortodóntico, se pretende mantener esta
posición dental final lograda y evitar a toda costa la recidiva del movimiento; para
ello es indispensable que se suspenda este remodelado óseo, y así evitar el
movimiento dental, ya que la mayoría de los tratamientos ortodonticos tienen25
algún grado de recidiva, sería ideal contar con un reactivo biológico para evitar la
recidiva del movimiento dental ortodóntico. Una posible forma, es evitando la
resorción ya que se suspendería hueso alveolar impidiendo el movimiento por un
nuevo remodelado óseo de su soporte y conservando el diente en la posición
lograda por el tratamiento ortodóntico, sin embargo hasta ahora continua siendo
vigente el uso de un retenedor mecánico (placas Hawley, acetatos, placas Essyx,
retenedores fijos en lingual y en vestibular, entre otros) que no siempre tienen
buena aceptación por parte del paciente y que se muestran en la mayoría de los
casos poco aceptados por parte del paciente como único mecanismo para
mantener los resultados del tratamiento activo de la ortodoncia correctiva (30)
(31) (32) (33).
El movimiento dental inician con una fuerza mecánica normalmente generada
sobre la corona del diente, en la cual hay un aumento en la presión de los fluidos
en el sistema LCS (lacuno-canalicular) y esto se traduce como un estímulo
químico a los receptores de superficie celular de los osteocitos (integrinas) allí se
genera una afluencia celular de Na y Ca al interior del osteocito, activando las
vías de las MAP que a su vez activan los factores de transcripción CREB y NFAT
(34).
El espacio en la matriz que rodea las inmediaciones de la célula y los procesos
citoplasmáticos, forman la laguna y los canalículos osteocitarios, generando una
red tridimensional interconectada a través de la cual transitan líquido intersticial y
sustancias como citoquinas, aportando así la porosidad característica. A esta red
se le conoce como el sistema lacuno-canalicular (LCS) y cobra especial
importancia en el tránsito metabólico e intercambio de sustancias así como
también en la nutrición de las células. Una de las principales funciones que se le
atribuye al osteocito y al LCS es la capacidad de censar y transducir los estímulos
mecánicos que actúan sobre el hueso, a estímulos citoquímicos (34)..26 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
El movimiento ortodóntico entonces se puede interpretar así: con una fuerza
dirigida hacia la derecha, va a existir un lado de presión (derecha) donde hay
actividad osteoclástica; y un lado de tensión (izquierda) donde hay elongación de
las fibras del ligamento que estimula el movimiento de los fluidos en los canales
del hueso y esto se traduce en una señal química para los osteocitos que
responden a estímulos que causan tensión en el hueso y se liberan monofosfato
de adenosina cíclico (cAMP), osteocalcina y factor de crecimiento similar a
insulina. La liberación de estos factores facilita la incorporación de
preosteoblastos que favorecen el remodelado óseo por depósito de matriz y su
posterior mineralización.
Todo lo contrario en los sitios de presión en donde tenemos que la transducción
de esta compresión mecánica a estímulos citoquímicos generara la síntesis de
factores preosteoclasticos, incluyendo, FNT, Interleuquinas, RANL entre otros,
como ya fue descrito en el ítem 3.2 y 3.3 de resorción ósea.
La reabsorción radicular es un aspecto de mucho interés en el área de ortodoncia
ya que muchos pacientes presentas esta condición durante la evolución del
tratamiento, las condiciones a través de las cuales se puede presentar se han
planteado en relación a magnitudes para la fuerza que podría estar generándose
para el movimiento dental, un límite de 250 gr parecería fácil de identificar antes
de estar realizando fuerzas con posibilidad de resultar en una reabsorción
radicular, sin embargo hay muchas otras variables e individualidad de cada
paciente que intervienen en este proceso.
El mecanismo biológico de la reabsorción radicular consiste en una hialinización
inicial o necrosis vascular aséptica por el exceso de presión sobre el ligamento
periodontal, que altera el ambiente bioquímico, comienza con la reabsorción del
cemento al reclutar células para la eliminación de las áreas hialinizadas,
principalmente macrófagos que se acumulan para eliminar el tejido necrótico. La
laguna formada puede continuar si el estímulo desencadenante continúa o
empieza a repararse de 2 a 4 semanas si se elimina dicho estímulo. Los27
odontoclastos son los encargados de la reabsorción radicular desmineralizando el
tejido calcificado y degradan la matriz orgánica, tienen la misma función del
osteoclasto el termino obedece simplemente a su localización al igual que
también se plantea el uso de cementoclastos para aquellos encargados de
resorber el cemento; esta reabsorción radicular es una respuesta que se
caracteriza por la producción de: Prostaglandina E2: regulada por las hormonas
paratiroideas y calcitonina, neurotransmisores como la sustancia P y el
polipéptido intestinal vasoactivo, citoquinas e Interleuquinas (IL1 alfa y beta, IL2),
factor de necrosis tumoral e interferón gama (35) (36) (37).
Se han descrito varias clasificaciones para la resorción dental entre ellas
podemos destacar:
Resorción radicular externa: Es un proceso patológico que se inicia por un
estímulo externo, que avanza desde el cemento hacia la dentina y que afecta la
superficie externa o lateral de uno o varios dientes. En cuanto a su prevalencia,
algunos autores reportan que oscila entre 0.5 – 3 mm de reducción radicular
durante el tratamiento de ortodoncia (38).
Resorción de superficie: Es un proceso autolimitante que compromete áreas
pequeñas de la superficie radicular.
Resorción Inflamatoria: Se relaciona con células multinucleadas que colonizan
las superficies desprovistas de cemento y reabsorben la dentina. A su vez se
subdivide en: transitoria (cuando el daño es de poca magnitud y duración, no se
detecta radiográficamente y es reparado por cemento rápidamente) y progresiva
(por estímulos de largos períodos) mayor magnitud con el tiempo (38).
Resorción radicular por reemplazo: Se produce por una necrosis extensa del
ligamento periodontal con formación de hueso sobre en la raíz. El hueso
reemplaza lentamente el cemento perdido produciendo anquilosis. Para
diagnosticar la anquilosis, un posible método es realizar percusión suave en el28 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
diente y tener presente el sonido que emite (metálico), o ante el intento de
movimiento por 3 meses y no ver respuesta (38).
Se considera como barreras para evitar esta resorción el cemento, más aun el
cemento celular y todos los tejidos blandos ya que estos tienen el potencial de
producir OPG lo que constituye un mecanismo para inhibir la acción de los
osteclastos (37).
3.5 Células de sangre periférica
Las células mononuclear de sangre periférica (PBMC) son
células sanguíneas caracterizadas por poseer un solo núcleo redondo, entre ellas
se diferencian: los linfocitos y monocitos, hacen parte del sistema inmune con
múltiples funciones como son: defensa inmunológica, metabólica e inflamatoria.
Forman poblaciones heterogéneas que se distribuyen en diferentes tejidos y
órganos, adicionalmente están disponibles para llegar a donde hay irrigación
sanguínea y fuera de ella ya que responden a citoquinas quimio atrayentes (12).
Se originan en la medula ósea a partir de células madre pluripotenciales por
efecto de las citoquinas GM-CSF, M-CSF e IL 1 y 3. Tienen una vida promedio de
60 días tiempo tras el cual, si no se encuentran activas mueren por apoptosis.
Aunque también pueden convertirse en células fagociticas fijas o células de
patrullaje que llegan a sitios puntuales tras el estímulo adecuado (12).
Entre las células mononucleares de sangre periférica encontramos los linfocitos T
y B, los cuales tienen relación con el metabolismo óseo. Linfocitos T, expresa
PPR funcional, responde a la PTH y estimula la diferenciación OB (osteoblastos)
también producen RANKL para la estimulación de osteoclastos. El papel del
mecanismo de acción de la PTH en las células T, permaneció sin detectar
durante un periodo de tiempo, pero ya se conoce que al trasplantar tumores para29
la producción de PTH y / o PTHrP en ratones causa una hipercalcemia por
aumentó de la resorción y simultáneamente de linfocito T, algunos autores las
consideran pre-osteoclastogenicas (39).
Las células mononucleares obtenidas de sangre periférica cultivos se obtienen
usando Ficol hypaque, un polisacárido hidrofílico que separa capas de la sangre,
con monocitos y linfocitos formando un buffy coat bajo la capa del plasma.
Este buffy contiene las PBMCs (40) (41) (42) (43).
Para aumentar su cantidad estimulando la actividad mitogenica en cultivo se
plantea el uso de fitohematoaglutinina (FHA), puntualmente en el caso de los
linfocitos T (28).
3.6 Modelo para generar células con actividad
osteoclastica
Se ha definido la actividad y conceptos en relación con los osteoclastos, así como
la plasticidad celular para la desdiferenciación con la connotación de que toda
célula tiene el potencian de ante un estímulo generar otra diferente o expresar
fenotípicamente funciones para las que inicialmente no estaba programada, todo
esto en realidad obedece es aun adecuado estimulo, entonces, podríamos
identificar mecanismos para inhibir funciones, de forma local o para limitarlas,
tendiendo control sobre la actividad de la célula y con ello plantear controles para
patologías, disminuyendo su evolución o eliminándolas (13).
Ya se ha indicado como en el laboratorio de biología molecular de la facultad de
medicina de la Universidad Nacional se ha generado un modelo con actividad
resortiva consistente en fusionar células de origen monocito-macrófago de las
líneas U937/A and J774 de ratón o células mononucleares de sangre periférica30 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
(CMNSP) humanas, e incluso fibroblastos de origen mucosa palatina,
químicamente con polietilenglicol (PEG). El mismo laboratorio determino que al
someter células de estas líneas a fuerza centrífuga desarrollaban actividad
osteoclastica tanto resortiva como la expresión de marcadores propios de
osteoclastos. Esto trae la posibilidad de evaluar su actividad resortiva sobre el
hueso, en un modelo que es de fácil reproducción y de menor costo comparado
con el estímulo hormonal o de paquete comerciales (4) (5) (6) (44) (45).
Adicionalmente ha sido publicado desde 2008 por Wei y colaboradores el efecto
de las fuerzas centrifugas en cultivos de fibroblastos de ligamento periodontal con
potencial de desarrollar expresión de actividad osteoclastica (46).
Desde 1987 un estudio de Lorenzo y colaboradores donde utilizaban la PHA
(fitohematoglutinina) como estimulador de CMSP sumado con IL-1 recombinante,
y TNFα, encontraron que el efecto de PHA favorecía la síntesis local de IL-1 y
ésta media la actividad resortiva, concluyendo que las citoquinas se encuentran
en la circulación de individuos normales y se producen en los sitios localizados de
diversas patologías, ante estímulos como lesiones, o en cualquier proceso
inflamatorio, esto sugiere que puede influenciar el metabolismo esquelético
normal o anormal (45) (47).
Kotaque a partir de células obtenidas de reemplazos articulares en pacientes con
artritis reumatoidea concluye que la PHA activa las células T humanas
expresando RANKL la cual induce osteoclastogénesis de monocitos periféricos
autólogos, los cuales pueden ser bloqueados por inhibición dosis dependiente de
OPG y que en general se observa un aumento en la expresión de RANKL en las
células de pacientes con Artritis reumatoidea (48).31
Weitzmann y colaboradores encontraron que la PHA activa células T CD4+ y
CD8+ humanas y estimula la formación de osteoclastos in vitro por RANKL
(44) (49).
3.7 N-acetilcisteina
La N-acetilcisteína (NAC, N-acetil-L-cisteína) es del grupo (-CO-CH3) unido al
grupo amino (NH2) aminoácido L-cisteína además de un acetilo y un nitrógeno lo
cual le confiere disminuir ligeramente la característica hidrofilica de la L-cisteina,
los aminoácidos que contiene, tienen propiedades antioxidantes, el grupo acetil
cisteína la hace más soluble igualmente en agua, facilitando funciones para la
absorción y velocidad de distribución al ser ingerida por vía oral. Se considera la
NAC segura, incluso en grandes dosis, y es una buena fuente de cisteína
(aminoácido) (50).
El átomo de hidrógeno en el sulfidrilo (-SH), molécula anti-oxidante que contienen
azufre (tioles) puede actuar como un electrón para neutralizar los radicales libres
(50).
El ligando RANKL (factor nuclear kapa β) es esencial para la diferenciación y
activación del linaje monocito-macrófago (BMM) a osteoclastos. Se ha
demostrado que el RANKL estimula las células transitoriamente BMM aumentado
el nivel intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS) a través de una
cascada de señalización que implica TNF (factor de necrosis tumoral) receptor del
factor asociado (TRAF), Rac1, y NADPH (nicotinamida adenina dinucleótido
fosfato) NADPPH oxidasa (Nox). La aplicación de N-acetilcisteína (NAC) bloquea
la actividad de Nox (NADPH oxidasa) y SOD (superoxido dismutasa), proteína
que conduce a la formación ROS, inhibiendo la respuestas de las células a BMM
al RANKL, incluyendo disminución en la producción de ROS, la activación de la32 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
quinasa c-Jun N-terminal (JNK), p38 proteína (MAP) quinasa activada por
nitrógeno, la señal extracelular-quinasa regulada (ERK), y la diferenciación de los
osteoclastos (7) (9) (51).
En un estudio llevado a cabo por Aitken y colaboradores identifican que la
expresión diferencial de TBP-2 (proteína de unión tiorredoxina 2) y Trx-1
(tiorredoxina) se produce durante la osteoclastogénesis, que en presencia de
RANKL, la expresión de TBP-2 se redujo, mientras que se incrementó Trx-1. El
antioxidante N-acetilcisteína revirtió este patrón, aumentando TBP-2 y
reduciendo Trx1, con lo cual se inhibió marcadamente la osteoclastogénesis,
concluye que moduladores del sistema Trx tales como antioxidantes (NAC)
tienen potencial como terapias antirresortiva (6).
Lo descrito anteriormente es la base teórica que permite sustentar el uso de NAC
en nuestro proyecto y su posible aplicación en la clínica para inhibir la resorción
ósea o buscar otros reductores y antioxidantes con similares efectos.
3.8 Polietilenglicol (PEG)
El PEG es un polímero de óxido de etileno con un hidroxilo terminal (C2H6O2.
1,2-dihidroxietano).
Este polímero comenzó a ser usado en la década de los 70 en la producción de
hibridomas (línea celular fija obtenida a través de la fusión de células) (45) (44).
El PEG, es soluble en agua a temperaturas moderadas a diferentes
concentraciones y sobre un amplio rango de pesos moleculares. En la fusión
celular, generalmente se utilizan pesos moleculares entre 100 y 10000 (52) (53).33
Existen dos pasos importante para que el PEG induzca la fusión de membranas
celulares: el primero es la agregación de las células antes de la fusión y segundo,
la desestabilización de las membranas de las células agregadas, permitiendo esto
que se dé la fusión, este proceso fue descrito por Arnold y colaboradores en el
cual, la fusión entre vesículas agregadas o entre células ocurre cuando se utilizan
altas concentraciones de PEG de bajos pesos moleculares (52).
Un requisito para inducir la fusión celular con PEG es que debe existir una gran
cercanía de las membranas a fusionar; El PEG contribuye a cerrar los espacios o
“gaps” de la interbicapa lipídica, entonces, remueve las moléculas de agua entre
las bicapas adyacentes, debido a la alta afinidad que tiene este polímero por el
agua (54).
Además, el solo PEG no puede iniciar la fusión, si los fosfolípidos de membrana
se encuentran dañados o flácidos. Por lo que la fusión ocurre solo cuando la
energía de superficie de las bicapas lipídicas es modificada por la adición de
componentes de bajo estrés (53).
3.9 Marcadores propios de osteoclastos
Actualmente la forma más confiable de identificar y diferenciar una célula de otra
es con marcadores, como receptores de membrana o expresados por la célula en
cuestión, como proteínas o enzimas propias de sus funciones, así entonces se
contara con parámetros de diferenciación constantes y confiables para hablar con
propiedad de un grupo celular sea cultivado o identificándolo de un tejido in vivo
(46) (55) (56).34 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Durante el proceso de resorción ósea la disolución de cristales y en general de la
matriz inorgánica como fue descrito anteriormente se completa en el interior de
vacuolas intracelulares donde fermentos proteolíticos, como la cisteinproteinasa
ácida, la catepsina K, las colagenasas y metaloproteinasas neutras, destruyen la
fracción orgánica. Los osteoclastos multinucleados y algunos mononucleados
(monocitos) con potencial resortivo son positivos a la fosfatasa ácida tartrato
resistente (TRAP), que se usa como su marcador más característico. Otro
marcador de los osteoclastos es el receptor de Calcitonina (RCT), es un
regulador importante de homeostasis de Ca+2 con su acción directa en los
osteoblastos que inhiben la actividad de resorción ósea. (57) (23).
3.9.1 ADAM 12
Es una metaloproteasa y desintegrina, hay más de 30 ADAM identificadas, 4
incluyendo la 12 son proteolíticas importantes, requiere de la presencia de
metales como zinc o cobalto para su activación, a nivel óseo se considera
también una proteína de anclaje a membrana del osteoclasto para iniciar su
actividad resortiva, catalizando la fusión de células mononucleares para formar
macrófagos y también la adhesión de estos al hueso (58) (59).
3.9.2 ATPasa
La capacidad de la excavación o resorción del hueso por los osteoclastos se debe
al microambiente ácido con un pH de aproximadamente 4.5 entre la zona del
borde en cepillo y la zona de sellado, para formar la laguna de resorción ósea,
este microambiente es generado por la ATPasa H+ vacuolar, la cual acidifica con
hidrogeniones la laguna y mantiene el equilibrio de hidrogeniones entre la laguna
y el interior del osteoclastos, es indispensable para la actividad del osteoclasto
(60) (61).35
3.9.3 Integrina B3
La integrina B3 es una glicoproteína transmembrana que hace parte de los
receptores de adhesión, que son los responsables de la interacción del
osteoclasto con la matriz extracelular y en el reconocimiento entre las células,
regula la motilidad celular y la organización del citoesqueleto para permitir su
adhesión o paso a través del endotelio en la diapedesis. Esta localizado en la
zona de sellado de los osteoclastos, se une a Arg-Gly-Asp (RGD) que contienen
proteínas de la matriz extracelular como vitronectina, osteopontina, sialoproteina
ósea. Así un integrina puede unirse a varios receptores y estos a su vez unirse a
varias integrinas, las integrinas son indispensables para formar la zona de sellado
sin la cual no podría ocurrir la resorción ósea (62) (63).
3.9.4 DC-stamp
La DC-stamp o Proteína Dendrítica transmembrana específica, es una proteína
transmembrana originalmente identificada en células dendríticas o macrófagos,
es estimulada por la IL4. Recientemente, se ha informado que puede inducir la
diferenciación de osteoclastos y es inducida por el RANKL, sin embargo, el papel
más conocido de DC-STAMP es en la fusión célula-célula y en vivo sigue siendo
desconocido. En ratones nocaut con deficiencia de DC-STAMP, se demostró el
compromiso de la multinucleación de macrófagos y osteoclastos, con lo que se
puede demostrar la necesidad de su presencia en la fusión celular y con ello
contribuye a posterior producción TRAP (64), (65) .36 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
3.9.5 Receptor de calcitonina
La calcitonina es una hormona hipocalcemica que es secretada por las células C
de la tiroides, sus dos principales objetivos son los riñones y el hueso. La
calcitonina potencialmente inhibe la resorción ósea bloqueando la formación y la
activación de los osteoclastos. El receptor sensible al calcio (RCa) regula la
secreción de PTH y la reabsorción de calcio por los túbulos renales en respuesta
a alteraciones en las concentraciones plasmáticas de calcio. En el RCa normal, la
hipocalcemia induce un aumento de la secreción de PTH y la hipercalcemia
reduce la secreción de PTH.
El receptor de calcitonina es utilizado frecuentemente para identificar células
similares a osteoclastos, este marcador en células de la línea mielomonocitico
solo es expresado por los osteoclastos para generar un mecanismo autoregulador
de la hipercalcemia (5) (66) (67).
3.9.6 Catepsina K
La cisteín catepsina se encuentra principalmente en los compartimentos ácidos
de las células. Su función es de proteasa en la degradación intracelular. De
acuerdo al descubrimiento de nuevas catepsinas como la K, V y F, ha
proporcionado evidencia de que también participan en eventos biológicos
específicos. La catepsina no es estrictamente lisosomica, las proteasas son
transportadas entre fagosomas, endosomas, lisosomas y enzimas. La
acidificación del espacio pericelular de los osteoclastos aumenta la liberación de37
la catepsina K para promover la proteólisis extracelular. Esta enzima es crucial en
la remodelación ósea, en particular en la ruptura de colágeno (68) (69).
3.9.7 TRAP
El TRAP (Fosfatasa ácida tartrato-resistente) Se considera una enzima casi
inexistente en los tejidos humanos, excepto sobre el hueso que expresa gran
cantidad y es por los osteoclastos, por eso se utiliza como marcador de
osteoclastos aunque los macrófagos también pueden expresarlo (5) (70).
La enzima TRAP interviene en la degradación de proteínas no colágenas del
hueso, sin embargo las fosfatasas ácidas son enzimas encontradas en todos los
tejidos del cuerpo, incluyendo leucocitos humanos; estas enzimas hidrolizan
ésteres de mono fosfato en un medio ácido. La TRAP tiene una actividad
catalítica en pirofosfatos orgánicos (ATP, ADP), pirofosfato de sodio inorgánico,
monofosfoésteres de alcoholes aromáticos (1 naftil fosfato y para-nitrofenilfosfato,
considerado como el mejor sustrato para la enzima). La fosfatasa acido resistente
a tartrato es detectable en cerumen fisiológico y circunstancias patológicas
asociadas al incremento de la resorción ósea.
Hay una correlaciona entre la expresión de TRAP y el grado de proceso de
resorción ósea para los osteoclastos, lo que implica un importante papel de esta
enzima en la resorción ósea. Esta afirmación está basada en experimentos en
que utilizaron bloqueadores de la enzima y se demostró que la inhibición de esta
enzima es acompañada por una marcada reducción de la resorción ósea. Se cree
que al ser esta enzima una pirofosfatasa, es probablemente la responsable de la
remoción de pirofosfato, potente inhibidor de la solubilización de la apatita,
considerado el primer paso esencial en la resorción (70).38 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
4. Objetivos
4.1 Objetivo general
Evaluar la actividad resortiva de células mononucleares de sangre periférica
(CMNSP) fusionados con PEG, fusionadas con PEG y tratadas con NAC, no
fusionadas, no fusionadas y tratadas con NAC, tratadas con fuerza centrífuga y
tratadas con fuerza centrífuga y NAC.
4.2 Objetivos específicos
 Evaluar marcadores característicos de osteoclastos, en CMNSP
fusionadas con PEG, sometidas a fuerza centrífuga, no fusionadas no
tratadas con fuerza o tratadas con NAC.
 Evaluar la actividad TRAP, en CMNSP fusionadas con PEG, sometidas a
fuerza centrífuga no fusionadas no tratadas con fuerza o tratadas con
NAC.
 Evaluar actividad resortiva, en CMNSP fusionadas con PEG, sometidas a
fuerza centrífuga no fusionadas no tratadas con fuerza o tratadas con
NAC.39
5. Materiales y métodos
5.1 Láminas de hueso
Se siguió el protocolo utilizado en la tesis: “Análisis de la actividad resortiva de
células fibroblastoides (cultivo primario gingival) luego de someterlas a fuerza
tensil o fusionarlas con PEG” (5); el hueso utilizado para esta investigación fue
cortical de pelvis bovina (bos taurus) láminas de aproximadamente 5 mm de
ancho y largo por 0.5 de grueso, este fue cortado con una pulidora con disco de
carburo de grano grueso y luego pulidas con micromotor eléctrico, piedra rosada
y discos de carbura de grano fino. Estas laminas se sumergieron en una solución
de SDS (dodecil sulfato de sodio) al 10% por 8 horas bajo agitación continua, se
lavaron 10 veces con agua destilada hasta eliminar totalmente el detergente,
posteriormente se esterilizaron con etanol al 70% por 60 minutos y finalmente se
lavaron dos veces con medio DMEM suplementado con 10% SFB. Se utilizaron
cajas estériles de 48 pozos para proceder al cultivo y que al introducir las láminas
óseas fueron llevadas a luz ultravioleta durante un día.40 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
5.2 Aislamiento de células mononucleares de
sangre periférica y cultivo
Para la adquisición de las CMNSP se precedió de la siguiente manera:
Se firmó el consentimiento informado (ver anexo 1). Se tomó muestra de 10 ml
de sangre periférica de un donante voluntario, de 25 años de edad, género
masculino, sin antecedentes de alteraciones en el metabolismo óseo, mediante
punción en el pliegue anterior del brazo, con una jeringa heparinizada (2 μl de
heparina sódica, 5000 UI en 5 ml. Se realizó dilución 1:1 con medio DMEN y 9 ml
se agregaron suavemente sobre un colchón de 3 ml de Ficoll-Hypaque (1:3 v:v)
(SIGMA-ALDRICH) (71). Se centrifugó a 1200 r.p.m durante 30 minutos. Mediante
una pipeta se tomó la interface opaca que contiene las CMSP. Se depositó en un
nuevo tubo. Se realizaron tres lavados con medio DMEN a 1500 r.p.m durante 5
minutos cada uno.
Las células se cultivaron en medio DMEM suplementado en SFB al 10% (v/v), en
presencia de fitohematoglutinina–P (PHA-P) 10 µg/ ml para estimular linfocitos T,
encaja de Petri e incubadora a 37Cº, 95% de humedad y atmosfera de CO al 5%.
2
Al cabo de 72h de cultivo las células en suspensión y adherentes fueron
recolectadas. Estas últimas se desprendieron con una solución de PBS - EDTA
1mM (p/v) por 10 minutos a 37 °C. Posteriormente, las células fueron lavadas con
medio libre de SFB y centrifugadas a 1200 rpm durante 5 minutos antes de la
fusión.41
5.3 División de la muestra
Para proceder a la siembra de las células sobre los huesos se diseñaron 6
grupos, cada uno con 6 láminas de la siguiente manera: 1. Células no fusionadas
(no fu), no tratadas con fuerza (no f) (CONTROL). 2. Células no fusionadas no
tratadas con fuerza (CONTROL) + NAC. 3. Células no fusionadas + fuerza
centrífuga. 4. Células no fusionadas + fuerza centrífuga + NAC. 5. Células
fusionadas con PEG. 6. Células fusionadas con PEG + NAC.
5.4 Fusión celular con PEG y fuerza centrifuga
Las células se centrifugaron y se eliminó el sobrenadante, colocando el tubo
sobre gasa estéril para eliminar todo residuo de DMEM y evitar diluir el
polietilenglicol (PEG). Se tuvo en cuenta que por cada 1X106 células se aplica 50
μl de PEG1450 al 50% (p/v). Las CMSP aisladas y cultivadas como se mencionó
antes, se centrifugaron durante 5 minutos a 700 rpm, se descartó el sobrenadante
y se secó el excedente sobre una gasa estéril. Sobre el botón de células se
depositaron 50 μl de PEG 1450 al 50% (p/v), previamente calentado a 37 °C, se
agito suavemente, mediante golpes con el dedo en la base del tubo, para
homogenizar el botón celular en el PEG y se llevó a 37º C durante 5 minutos.
Transcurrido este tiempo, se adicionó 40 μl de DMEM cada 60 segundos por 5
minutos, posteriormente 80 µl de DMEM durante 5 minutos y 160 µl de DMEM
durante 5 minutos siguiendo el protocolo descrito (Moniere-Faugere et al, 2001).
Una vez se diluyó el PEG las células se centrifugaron 5 minutos a 700 x g y se
lavaron dos veces con DMEM para retirar el PEG y se resuspendió en medio
DMEM con SFB al 10%. Para sembrar en cada lámina de hueso cortical bovino
estéril, colocadas previamente en cajas de cultivo estériles de 48 pozos se42 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
aplicaron 10 μl de la suspensión de células fusionadas con PEG en 30 μl de
medio de cultivo. Para que se adhieran las células se dejaron durante 2 horas en
incubadora a 37ºC, al 95% de humedad y atmosfera de CO2 al 5%.
Posteriormente se adicionó 400 µl de medio con SFB al 10% en cada pozo. Para
las células tratadas con NAC, se agregó una concentración de 30 mM por pozo
de preparado de NAC en PBS, a las 6 horas de realizada la fusión cuando cada
pozo alcanzo 400 μl de medio.
Para las 6 láminas donde se aplicó fuerza centrífuga las células no fusionadas se
sembraron sobre la lámina de hueso, como se describió antes. Luego se pusieron
en un motor rotatorio horizontal (Rototorque – ColeParmer®) a velocidad No. 10
(60 r.m.p) que permaneció constante durante 5 días en incubadora a 37Cº, 95%
de humedad y atmosfera de CO al 5%. Para calcular la fuerza ejercida sobre las
2
células se estableció que fue 9.8 x 10-5 93 gr/cm2 (72), al aplicar la siguiente
fórmula: P=(m x r x r.p.m2 x π2)/(A x 9.8 x 900). Donde P es la presión en Kg por
cm2, m: la masa del medio, r: el radio del motor rotatorio, r.p.m: revoluciones por
minuto y A: el área de contacto entre el medio y las células. Siendo m= 0.015 gr,
r= 0.065m, A=4 cm2 y RPM= 60 (5).
Para las células tratadas con NAC, se agregó una concentración de 30 milimolar
por pozo de preparado de NAC en PBS, a las 6 horas de realizada la fusión
cuando cada pozo alcanzo 400 μl de medio y se continuo la incubación hasta el
día de la cosecha.
Las células se cosecharon fijándolas durante 40 minutos a 4 ºC con metanol
ácido acético en proporción a 1:3, 1 de ácido acético y 3 de metanol, 15 minutos,
pre-enfriado a 0º C y se realizaron tres lavados con 200 µl de PBS. Luego, se
dejaron en 200 µl de PBS y llevaron al refrigerador a 4 °C. Se evaluó la actividad
de la enzima TRAP y la actividad resortiva. Como control se utilizaron el mismo
número de CMSP estimuladas con PHA sin fusionar y otro con NAC.43
5.5 Marcadores de osteoclasto
5.5.1 Inmunofluorescencia
Para determinar si las CMNSP fusionadas con PEG, sometidas a fuerza
centrífuga y tratadas con NAC, expresaban alguno de los marcadores
osteoclastogénicos: se realizó inmunofluorescencia indirecta. Se utilizaron
anticuerpos policlonales a una concentración de 0.8 μg/ml (Santa Cruz
BiotechnologyR): ADAM12, ATPasa, Integrina β 3 y catepsina K generados en
cabra y DCstamp y receptor de calcitonina generados en conejo. Para esto, a las
células fijadas cultivadas sobre la lámina ósea se les retira del PBS, se secan la
lámina ósea por debajo, con una servilleta. Se agregó a cada lámina ósea 30 μl
de la solución con el anticuerpo primario y se incubó durante 1h a 37 °C en
cámara húmeda. Se lavaron 3 veces con 200 μl de PBS dejando 5 minutos entre
cada lavado. Las láminas óseas se secaron por debajo y se cambiaron de caja.
Se agregó a cada lámina ósea 30 μl de la solución con el anticuerpo secundario
FITC anti-cabra (2 μg/ml, Santa Cruz BiotechnologyR) junto con la tinción DAPI, y
se incubó durante 15 min a 15 °C en cámara húmeda, protegido de la luz. La
tinción DAPI se une a la doble hélice en medio del canal menor del DNA, se
excita a 358 nm y emite a 461 nm de color azul cuando se ilumina con luz Uv y
puede usarse tanto en células vivas como fijadas conjugado en el anticuerpo
secundario. Se realizó lavado con 200 μl de PBS cada 5 minutos por 3 veces. La
muestra se analizó en un microscopio de fluorescencia (Vanguard®) con un
objetivo 100X. Se evaluó toda la superficie de la lámina de hueso y tomaron entre44 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
14 y 24 microfotografías representativas por lámina con cámara Panasonic®
DMC-FHS.
5.5.2 Determinación de la fosfatasa ácida resistente al
tartrato TRAP
Este procedimiento fue realizado según la metodología descrita en el trabajo de
Murillo y colaboradores (4). Las láminas de hueso se dejaron secar al medio
ambiente después de retirar el PBS en el que se encontraban. Se inició la
preparación de la tinción mezclando: buffer veronal 30 ml que contenía barbitona
de sodio (ácido barbitúrico al 0.159 g y 0.33 g de NaOH) y 0.582 g de acetato de
sodio. A este buffer veronal se le adicionó 24.36 mg de tartrato de sodio-potasio
Se mezcló por separado la solución formada con 375 µl de pararrosanilina
hexasotizada y 375 µl de nitrito de sodio en hielo. Después, se adicionó
0.00475% de naftol fosfato MX-ASB1 (Sigma-Aldrich), usado como sustrato de la
enzima TRAP. A esta solución se le ajustó el pH a 4.6 usando ácido clorhídrico,
ensayo error. Cada lámina recibió 200 μl de esta solución y fueron llevadas a la
incubadora a 37 °C durante 1 hora y media, se hizo un solo lavado con agua
destilada y se dejaron secar a temperatura ambiente.
La coloración TRAP de acuerdo a las concentraciones de los reactivos y de los
tiempos de incubación varían entre una coloración rojo ladrillo, café y rojo violeta.
Para evaluar la actividad TRAP, se hizo un conteo de las células coloreadas en
las láminas de hueso cortical bovino, de cada uno de los grupos evaluados en
este proyecto. El conteo se realizó en toda la superficie de la lámina ósea, en un
microscopio de luz (Vanguard®), con un objetivo de 40x.45
La evaluación de las células multinucleares TRAP positivas fue realizada
siguiendo un muestreo aleatorio en forma de W, evaluando y registrando siete
campos representativos de toda la lámina. Para esto se utilizó una cámara
Panasonic® DMC-FHS adaptada al microscopio.
5.6 Evaluación de la actividad resortiva
Primero se procedió al retiro de las células para poder observar las lagunas de
resorción, posterior a la tinción y observación de TRAP, las células fueron lisadas
con una solución de NaOCl al 6% y 5.2% de NaCl, (73), bajo agitación continua
por 15 minutos. Las láminas se lavaron cinco veces con agua destilada, bajo
agitación y suave cepillado. Para la valoración de las lagunas de resorción se
realizó la tinción de azul de Coomassie método estándar, para aumentar
contrastes en la superficie de las láminas de hueso una vez removidas las
células.
Las tinción de azul de Coomassie se realizo con 0.25% Coomassie, 50%
metanol, 10% ácido acético 40% H2O, se aplicaron 400 µl a cada pozo y se
dejaron tapados por 10 minutos con agitación leve ocasional. Las láminas de
hueso se decoloraron con una mezcla de metanol, ácido acético y agua
(50:10:30%, V/V) cambiando varias veces la mezcla hasta que no se
desprendiera más colorante y alternando cada lavado de 400 µl con agua
destilada, Finalmente se dejaron con 200 µl de la solución para decolorar la
tinción en cada pozo. Las láminas fueron secadas con servilleta, sin presionar y
al medio ambiente, para realizar el conteo se tomaron quince fotografías
representativas con una cámara Panasonic® DMC-FHS; de cada grupo de 6
huesos, se evaluaron con el objetivo 10 y 20 X en un microscopio de luz46 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Vanguard®, se contó el número de células en cada campo, y se realizó un
clasificación para las lagunas de resorción para hacerlo más descriptivo: lagunas
grandes y profundas, grandes y superficiales, pequeñas y profundas, y pequeñas
y superficiales. Se sumaron los resultados en todas las fotos de cada lamina para
los 6 grupos experimentales (PEG, PEG+NAC, no fusionadas no tratadas con
fuerza (CONTROL) no fusionadas no tratadas con fuerza (CONTROL)+NAC,
fuerza y fuerza+NAC), al final se sumaron los datos y se dividió en el número total
de láminas observadas.47
6. Resultados
6.1 Evaluación mediante de la expresión de marcadores
osteoclasticos.
Para esta evaluación se realizó inmufluorescencia indirecta utilizando anticuerpos
primarios policlonales específicos contra las proteínas celulares. Se encontró que
en todas las láminas, para todos los anticuerpos evaluados: ADAM12, ATPasa,
DCstamp, Integrina β3, receptor de calcitonina y catepsina K, presentaron células
positivas en la tinción DAPI. La distribución fue irregular, algunas presentaron
mayor afinidad por el borde de la lámina ósea (figura 4 C y c), otras muy
dispersas sobre toda la lámina, en grupos de pequeño tamaño (figura 4 C), y
otras con grupos celulares grandes que se ubicaron cerca al centro de la lámina
(Figura 4 A y a ),
Algunas láminas presentaron múltiples grupos de células pequeñas, de una
distribución relativamente constante, acompañado de algunos grupos grandes.
Este patrón se observó principalmente en las láminas sobre las cuales se trataron
las células con NAC, entre ellos ADAM-12 tratado con fuerza centrífuga y NAC,
ATPasa fusionado con PEG y tratados con NAC, ATPasa no fusionadas tratada
con NAC, y Captesina K fusionada con PEG y tratadas con NAC (figura 4 D, E y
G y Anexo 2 figuras 6C, 10C, 11C y 13C). Al evaluar la fluorescencia para los
diferentes anticuerpos, la mayoría de láminas presentaron pocos grupos celulares
positivos para el anticuerpo respectivo (figura 4 d,e y g y Anexo 2 figuras 6D, 10D,
11D y 13D). Sin embargo, fue evidentemente menor la cantidad de grupos
celulares, en los grupos tratados con NAC (figura 4 C y c). Algunos de estos
grupos tratados con NAC, conservaron la misma forma de los grupos no tratados48 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
con NAC, pero otros cambiaron significativamente de forma y tamaño (figura 4 D
y d)
La catepsina K y DC STAMP (figura 4 E y e), fue positivo para las células
fusionadas con PEG, fuerza centrífuga y el grupo no fusionado, en los tratados
con NAC (figura 4 F y f), se observaron pocos grupos celulares positivos para el
marcado (Anexo 2 figuras 11,12 y 13) y (Anexo 2 figura 14, 15 y 16).
Para el marcador de ATPasa (figura 6 C, c ,D y d) casi todos los grupos se
encontraban dispersos, tanto en los grupos tratados NAC como en los no
tratados. Sin embargo, la inmunofluorescencia con mayor cantidad de grupos
celulares positivos fue en los no tratados con NAC.
Al evaluar el marcador DC STAMP, un marcador característico de células
fusionadas, se evidencio en los 3 grupos (fusionados con PEG, no fusionados y
fuerza centrífuga) grupos celulares de tamaño mediano bastante definidos y
positivos para el marcador, a diferencia de los grupos tratados con NAC en los
cuales el marcador se observó prácticamente negativo.
Al evaluar el anticuerpo en ATPasa en el grupo sin NAC, se observaron grupos
celulares fluorescentes de gran tamaño, respecto a los tratados con NAC. (Anexo
2 figura 10 A y B).
A continuación se presenta una tabla con los grupos celulares más significativos
encontrados en la valoración de anticuerpos al microscopio de
inmunofluorescencia 100x, se valuó la fluorescencia de grupos grandes y
pequeños. Se utilzaron 6 anticuerpos: ADAM12, ATPasa, Catepsina K, DC stamp,
integrina β3 y receptor de calcitonina.49
Anticuerpo PEG PEG FUERZA FUERZ CONTROL CONTROL
+NAC +NAC +NAC
DAPI 26 (100%) 29(100%) 65(100%) 231(100%) 62(100%) 45(100%)
ADAM12 14 (54%) 5(17%) 10(15%) 25(11%) 23(37%) 16(36%)
DAPI 65(100%) 88(100%) 164(100%) 156(100%) 234(100%) 262(100%)
ATPasa 27(42%) 21(24%) 34(21%) 11(7%) 36(15%) 25(10%)
DAPI 231(100%) 239(100%) 265(100%) 255(100%) 330(100%) 197(100%)
Catepsina K 84(36%) 28(12%) 70(26%) 62(24%) 48(15%) 52(26%)
DAPI 62(100%) 59(100%) 37(100%) 50(100%) 86(100%) 88(100%)
DC stamp 31(50%) 18(31%) 15(41%) 7(14%) 21(24%) 18(21%)
DAPI 193(100%) 253(100%) 457(100%) 168(100%) 398(100%) 291(100%)
integrina β3 51(26%) 49(19%) 116(25%) 51(30%) 40(10%) 15(5%)
DAPI 142(100%) 234(100%) 246(100%) 360(100%) 183(100%) 112(100%)
receptor de 22(16%) 36(15%) 30(12%) 25(7%) 56(31%) 8 (7%)
calcitonina
Tabla 1. Número de grupos celulares positivos para DAPI (azul) y para anticuerpos
(ADAM12, ATPasa, Catepsina K, DC stamp, integrina β3 y receptor de calcitonina)
(verde), contadas sobre microfotografías de las láminas obtenidas con cámara
Panasonic® DMC-FHS adaptada a Microscopio de fluorescencia (Vanguard®)
observadas a 100x para los 6 grupos experimentales (fusionadas con PEG, fusionadas
con PEG+NAC, tratadas con FUERZA, tratadas con FUERZA+NAC, no fusionadas no
tratadas con fuerza (CONTROL), y no fusionadas no tratadas con fuerza
(CONTROL)+NAC.50 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
A a C c
s
a
B b D d
a
E e G g
s
a
F f H h
Figura 4. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia de anticuerpos policlonales, a
los 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. y anticuerpos, evaluados al Microscopio de
fluorescencia (Vanguard®) observadas con objetivo de 100x, fotografías con cámara Panasonic®.
DMC-FHS A. no fusión no tratadas con fuerza (CONTROL) DAPI, a. no fusión no tratadas con
fuerza (CONTROL) anticuerpo para ADAM12. B. no fusión no tratadas con fuerza
(CONTROL)+NAC DAPI, b. no fusión no tratadas con fuerza (CONTROL)+NAC anticuerpo para
ADAM12. C. fusionadas con PEG DAPI, c. fusionadas con PEG anticuerpo para ATPasa. D.
fusionadas con PEG + NAC DAPI d. fusionadas con PEG +NAC anticuerpo para ATPasa, E.
tratadas con FUERZA DAPI, e. tratadas con FUERZA anticuerpo para CATEPSINA K. .F tratadas
con FUERZA+NAC DAPI f. tratadas con FUERZA +NAC anticuerpo para CATEPSINA K G.
tratadas con FUERZA DAPI, g. tratadas FUERZA anticuerpo para INTEGRINA β 3, H. tratadas
con FUERZA + NAC DAPI, h tratadas con FUERZA+NAC anticuerpo para INTEGRINA β 3.51
6.1 Evaluación de la expresión de la enzima
TRAP
Al evaluar la expresión de la enzima TRAP en las CMNSP, fusionadas con PEG,
sometidas a fuerzas, no fusionadas y tratadas con NAC a los 5 días de
incubación, en las laminas óseas, se identificaron grupos o masas de células con
patrones de forma irregulares (unos redondeados, otros amorfos (figura 5 A y D).
Algunos grupos captaron mejor el color de la tinción que otros (variando entre
color café (figura 5 H) y color rojo ladrillo (figura 5 B y F), en contraste con el color
amarillo del hueso normal (figura 5 C). La distribución de los grupos de células
sobre las láminas también fue muy variable, algunas laminas presentaron una
distribución relativamente uniformemente en toda la lámina; en contraste otras
presentaron la mayor cantidad de agrupaciones justo en la periferia de la lámina.
En las láminas óseas donde se cultivaron las células fusionadas con PEG,
tratadas con fuerza centrífuga o las no fusionadas ni sometidas a fuerza
centrífuga (control) se observaron mayor número de grupos celulares, de mayor
tamaño e intensidad en la tinción, sugiriendo mayor número de células TRAP
positivas (TRAP+) (Figuras 5, A, B, E, F, I y J). En contraste, en las láminas óseas
donde los tres grupos descritos anteriormente fueron tratadas con NAC (Figuras
5, C, D, G, H, K y L) presentaron muy pocos grupos TRAP+, pocos grupos
celulares grandes, y se encontró gran parte de la extensión de la lámina sin
células (Figuras 5 C y K).
Los grupos tratados con PEG, FUERZA y CONTROL presentaron un total de 568
grupos celulares contados en todas las láminas óseas (192 sobre la lámina de
células fusionadas con PEG; 198 donde se aplicó fuerza centrífuga y 178 donde
no se fusionó, ni se aplicó fuerza) y en los mismos tres grupos, las láminas que
fueron tratadas con NAC, presentaron un total de 233 grupos TRAP+ (75, 91 y 5252 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
respectivamente, figura 6). En estas últimas láminas se identificó que los grupos
celulares tendían a ser uniformes en la distribución, es decir, se observaban
grupos pequeños y separados con el mismo patrón en toda la lámina (figura 5 K).
Las no tratadas con NAC presentaron grupos grandes y de fuerte tinción TRAP+ y
las células se observaban en toda la lámina e incluso dos láminas presentaron
una tinción uniforme que daba la apariencia de ser una sola agrupación celular
(Figura 5 B y F).
A C E G
s
a
B D F H
s
a
I K
J L
Figura 5. Láminas óseas representativas de células con tinción TRAP positivas, luego
de 5 días de cultivo, microscopio de luz (Vanguard®), 40X, A, B fusionadas con PEG, y
C, D fusionadas con PEG+NAC, E, F tratadas con fuerza centrífuga, G,H fuerza
centrífuga + NAC, I, J no fusionadas no tratadas con fuerza (control) y K, L no
fusionadas no tratadas con fuerza (control)+ NAC.53
250
200
+
P
A
R150
T
S
O
P
U100
R
G
E
D 50
D
A
D
IT
0
N
A
C
DIVISIÓN DE LOS GRUPOS DEL EXPERIMENTO
Figura 6. Número de agrupaciones celulares TRAP positivos, luego de 5 días de cultivo
sobre láminas óseas. Las láminas fueron observadas y contadas en un microscopio
(Vanguard®), 40X. Células fusionadas con PEG, fusionadas con PEG+NAC, tratadas con
fuerza centrífuga, fuerza centrífuga + NAC, no fusionadas no tratadas con fuerza (control)
y no fusionadas no tratadas con fuerza (control) + NAC.54 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
6.2 Evaluación de la actividad resortiva
Para observar las zonas de resorción sobre las láminas óseas, las células fueron
retiradas como fue descrito en materiales y métodos, y las lagunas de resorción
se observaron mediante contraste con la tinción azul de Coomassie.
Se observaron formas muy variadas al microscopio de luz (10 y 20 X, Vanguard®)
con formas irregulares. Algunas presentaban patrones redondeados que
asemejan la forma de las células (Figura 7 A y E flecha roja). Algunas laminas
captaron mejor el color (figura 7B, 7 I y J) y otras poco (figura G y H).
Para clasificar las lagunas de resorción se dividieron en 4 grupos:
1. Grandes y profundas (figura 7 A flecha azul)
2. Grandes y superficiales (figura 7 B flecha verde)
3. Pequeñas y profundas (figura 7 A flecha roja)
4. Pequeñas y superficiales (figura 7 E flechas rojas)
Las láminas de hueso del grupo celular fusionado con PEG (Figura 7 A y B,
Anexo 2 Figuras 23 A, B y C), presentaron las imágenes con lagunas de resorción
más definida, de mayor tamaño y profundidad. En general todas las superficies de
las láminas con células fusionadas con PEG presentaron lagunas de resorción.
Las láminas de hueso tratadas con fuerza centrífuga, presentaron grandes
cantidades de lagunas de resorción pero muy pequeñas y superficiales, algunas
estaban cercanas entre sí, dando una apariencia de racimo (figura 7, flecha roja).
Los grupos tratados con fuerza más NAC, no presentaron lagunas de resorción,
en toda su extensión (Figura 7 H).55
A C E G
s
a
B C F H
B
I K
J L
Figura 7. Microfotografías representativas de lagunas de resorción tinción Coomasie, a los 5 días
de cultivo. Observadas a microscopio de luz (Vanguard®) objetivo de 10x, fotografías con cámara
Panasonic® DMC-FHS. A, B fusionadas con PEG, y C, D fusionadas con PEG+NAC, E, F
tratadas con FUERZA, G,H tratadass con FUERZA+NAC, I, J no fusionadas, no tratadas con
fuerza (CONTROL) y K, L no fusionadas, no tratadas con fuerza (CONTROL)+NAC.56 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
300
N
Ó
250
IC
R
O 200
S
E
R 150
E
D
100
S
A
N
50
U
G
A 0
L
E
D
D
A
D
IT
N
A
C DIVISIÓN DE LOS GRUPOS DEL EXPERIMENTO
GP GS PP PS
Figura 8. Número de lagunas de resorción contadas en microfotografías obtenidas con
cámara Panasonic® DMC-FHS de láminas óseas con tinción Coomasie, a los 5 días de
cultivo (objetivo 10X, Vanguard®). Fusionadas con PEG, fusionadas con PEG+NAC
tratadas con FUERZA, tratadas con FUERZA+NAC, no fusionadas, no tratadas con
fuerza (CONTROL) no fusionadas, no tratadas con fuerza (CONTROL)+NAC. GP:
grandes y profundas. GS: grandes y superficiales. PP:pequeñas y profundas PS:
pequeñas y superficiales
Al evaluar la tinción para resorción, se evidencio mayor número de lagunas de
resorción grandes y profundas en el grupo celular fusionado con PEG: 50,
pequeñas y profundas 68 y pequeñas y superficiales 124; el grupo de PEG+NAC
presento algunas lagunas grandes y profundas: 4 y un poco más de grandes y
superficiales: 10, pero casi una cuarta parte menos de lagunas profundas y
superficiales: 56 al compararlo con el grupo PEG sin NACC; El grupo de fuerza
centrífuga presento el mayor número de lagunas pequeñas y superficiales: 250 y
solo se identificó un una laguna grande y profunda, aunque presento 25 grandes
y superficiales, en fuerte contraste el grupo tratado con fuerza centrífuga mas
NAC, solo presento lagunas pequeñas y superficiales: 37, El grupo sin PEG y sin
Fuerza (control) presentó principalmente lagunas pequeñas y superficiales: 59 y57
pocas lagunas grandes: 7; en este mismo grupo tratadas con NAC, se
encontraron más lagunas pero todas pequeñas y superficiales: 66.
Se encontró mayor número de lagunas en general en los grupos fusionados con
PEG y tratados con fuerza que en en el grupo control (sin PEG, sin fuerza), y
menor aún para los mismos grupos pero tratados con NAC.58 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
7 Discusión
El objetivo de este estudio era evaluar la actividad resortiva de células
mononucleares de sangre periférica (CMNSP) fusionados con PEG o sometidas a
fuerza centrífuga, luego de tratarlas con un ajente antioxidante, NAC. Como
control se utilizaron células no fusionadas y no fusionadas y tratadas con NAC.
Los resultados obtenidos en relación a los marcadores característicos de células
con actividad de osteoclasto (actividad TRAP y resorción ósea) fueron similares a
lo descrito por Murillo (4), Manrique (44) y Castillo (45). Igualmente, los resultados
relacionados a la aplicación de fuerzas centrífugas a células sembradas sobre
láminas óseas son similares a los obtenidos por Pasos (5). Todos los anteriores
investigadores realizaron su trabajo en células diferentes a las células empleadas
en este trabajo. Igualmente, todos realizaron su trabajo en el laboratorio de
biología celular de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional, donde se
realizó este trabajo. Lo nuevo del presente trabajo radica en aplicar la fuerza
tensíl (fuerza centrífuga) a células mononucleares de sangre periférica y
encontrar que el tratamiento con un agente antioxidante como NAC disminuye los
efectos relacionados con la actividad resortiva cuando se aplica a las células
fusionadas con PEG o sometidas a fuerza centrífuga.
La NAC es un derivado N-Acetil del aminoácido L-cisteína, que actúa como
mucolítico, secretolítico y fluidificante de las secreciones. Es de venta libre y
utilizada desde recién nacidos hasta en ancianos. Los antioxidantes como N-
acetilcisteína (NAC) se han utilizado como herramientas para investigar el papel
de especies radicales de oxígeno, ROS (“reactive oxygen species”), en
numerosos procesos biológicos y patológicos. NAC inhibe la activación de c-Jun,
p38 MAP quinasa, la proteína-1 sensible a actividades redox y al factor de
transcripción nuclear kappa B (NFkB) que regulan la expresión de numerosos
genes. NAC modifica directamente la actividad de varias proteínas por su
actividad reductora. NAC tiene valor terapéutico para la reducción de la disfunción59
endotelial, inflamación, fibrosis, invasión, la erosión del cartílago, la
desintoxicación del fármaco acetaminofén y prolongación de trasplantes.
Se ha reportado que durante la actividad del osteoclasto o de células similares a
osteoclastos, se aumentan las ROS. Esto se logró demostrar en cultivos celulares
de sangre periférica en presencia del factor RANKL. Se encontró que al
aumentarse la actividad de NFkB, por acción de RANKL sobre RANK, se
aumenta la actividad de la enzima NOX (NADPH oxidase) y SOD (superoxido
dismutasa), proteínas que conducen a la formación ROS. Cuando se aplica al
cultivo celular NAC se inhibe la respuesta de las células al RANKL, incluyendo la
producción de ROS, inhibe la diferenciación de osteoclastos o disminuye su
función resortiva. Aunque en este trabajo no se midió la expresión de ROS, un
trabajo paralelo que se desarrolla en el mismo laboratorio, utilizando una línea
celular tumoral, U937, encontró aumento de ROS luego de la fusión celular o de
la aplicación de fuerza tensíl al cultivo. Al aplicar NAC se redujo la expresión de
ROS e igualmente se redujo la actividad resortiva. Esto nos permite confirmar que
también tendría la misma actividad sobre osteoclastos in vivo, como ya fue
reportado en otros estudios sobre ratones (74) (50).
La presencia de células con marcadores positivos en el grupo control se puede
justificar con el hecho que todas las células mononucleares de sangre periférica
posterior a su adquisición pasaron a un cultivo con estimulación mitogénica con
FHA, la cual fue reportado por Böyum desde 1968 que puede ser también una
inductora de osteoclastogenesis a partir de linfocitos T, actuando a través del
RANKL, (47) (71), adicionalmente, otros mecanismos para la estimulación de
diferenciación y actividad de los osteoclastos diferente al realizado por el RANKL,
fue propuesto por Rifas donde se evidencia la producción de SOFAT (Secreted
osteoclastogenic factor of actívate T Cell), la cual fue evaluada sobre monocitos
de ratón de la línea RAW 264.7 y demostraron que al ser estimulados con60 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
SOFAT expresan marcadores osteoclastogénicos como integrina αvβ3, captesina
K y anillos de actina aun cuando dichas células se estimulan simultáneamente
con OPG, demostrando que esta citoquina estimula la formación de células
similares a osteoclastos y no está mediada por RANK (27).
Las lagunas de resorción del grupo tratado con fuerza, fueron muy numerosas
pero muy pequeñas y superficiales, lo que sugiere que las células así estuviesen
juntas y presentaran patrones de resorción en forma de racimo, no estaban
fusionadas o se fusionaron pocas, este mismo hallazgo estuvo presente los
resultados Pazos (5).
Lo encontrado en este estudio se podría considerar un piloto para futuras
investigaciones, y considerar posibles aplicaciones clínicas, para utilizar en
pacientes en la fase de retención postortodontica, evitar o controlar resorción
radicular, realizar anclaje o en otras alteraciones que involucren metabolismo
óseo como procesos infecciosos/inflamatorios entre ellos la periodontitis. NAC no
presenta los efectos adversos de otros medicamentos que se han propuesto o
estudiado con objetivos similares, entre ellos los bifosfonatos, que pueden
presentan osteonecrosis y particularmente en mandíbula. La acción de NAC es
temporal (vida media de 6 horas) y no presenta una acción tan larga como los
bifosfonatos, dado que una vez fijados a la hidroxiapatita en hueso pueden
permanecer y recircular hasta por 10 años (75) (76). El uso de ranelato de
estroncio presenta efectos similares a los encontrados en los bifosfonatos sin
tanta permanencia, pero este medicamento ha sido reevaluado por su gran riesgo
cardiovascular reportado desde 2013 y prohibido en algunos paises (77) (78).
La actividad y expresión de marcadores de un cultivo celular obedecerá al
estímulo que se realiza sobre estas y del sustrato en el cual se cultiva, los
resultados de este estudio en donde se parte de células mononucleares de61
sangre periférica, sometidas a los procedimientos descritos, para finalmente
obtener células con actividad osteoclastica, refuerzan el concepto de plasticidad
celular, y que una célula pude cumplir funciones diferentes dependiendo del
estímulo que reciba y del medio en que se encuentre, como ya fue presentado
por autores como Lensch y colaboradores en 2012 y Leda en 2013 de una forma
más general (13) (15).62 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
8 Conclusión
Fusionar células con PEG, o aplicar fuerza centrifuga a células no fusionadas,
inducen marcadores característicos de células osteoclasticas y actividad
resortiva, probablemente relacionado con un aumento de ROS, dado que al
aplicar NAC los marcadores y la actividad resortiva disminuyen.63
9. Recomendaciones
En futuras investigaciones in vitro con células derivadas de sangre periférica,
realizar valoración de ROS y su relación con mecanismo de acción de la NAC.
Para tener una mejor valoración al microscopio se recomienda ser muy exigente
en la preparación de las láminas de hueso, ya que a menor volumen y más
planas, eran más fácil de enfocar el objetivo en el microscopio y por ello de las
que mejores registros se podían obtener.
Realizar toda la fase experimental descrita en este estudio con otras poblaciones
celulares, como puede ser fibroblastos o células madre de ligamento periodontal,
encía marginal y pulpa dental, estos resultados sumados a los ya evaluados en
esta tesis y en anteriores, puede dar el soporte para iniciar una fase experimental
in vivo y aplicación clínica en pacientes.
Se podría utilizar microscopia electrónica de barrido para observar las lagunas de
resorción, con la posibilidad de realizar medidas y valorar con mayor precisión
cantidad y actividad de las células osteoclastoides sobre las láminas de hueso,
también se podría realizar una comparación de varios tiempos de cultivo.64 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Bibliografía
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.71
Anexo 1
Consentimiento informado
DOCUMENTO DE CONSENTIMIENTO INFORMADO PARA LA DONACIÓN
VOLUNTARIA DE MUESTRAS DE SANGRE PERIFÉRICA
Título del proyecto: Evaluación de la actividad resortiva de CMNSP
fusionadas con polietilenglicol (PEG), tratadas con fuerza centrífuga y con N
acetilcisteina (NAC)
Director del proyecto: Carlos Arturo Guerrero F. MD. MSc. PhD.
Estudiante: Juan Sebastián Bedoya Trujillo.
Organización: Grupo de Investigación: metabolismo óseo del laboratorio de
biología molecular y celular de medicina.
Teléfono de contacto: 3165000 Ext: 15052-15053
e-mail de contacto: caguerrerof@unal.edu.co
jsbedoyat@unal.edu.co
INVITACIÓN
El grupo de metabolismo óseo del laboratorio de Biología molecular y celular de la
facultad de medicina de la Universidad Nacional de Colombia, lo invita a que
contribuya con donación de una muestra de sangre de 20 ml a este estudio.72 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
INFORMACIÓN
El laboratorio de biología molecular de la facultad de medicina tiene evidencia que
un medicamento que normalmente se usa como mucolítico o para eliminar flemas
(n-acetilcisteina o NAC) actúan sobre células que eliminan hueso (osteoclastos),
la NAC inhibe la actividad resortiva (perdida de hueso) de un grupo celular
conocido como: línea tumoral de monocitos U937 (línea de células del laboratorio
de biología molecular de la facultad de Medicina de la Universidad Nacional),
fusionados con PEG (polietilenglicol-medicamento) o sometidos a fuerza
centrífuga. Sin embargo, es necesario determinar si esto mismo sucede con
células mononucleares de sangre periférica (CMNSP) (células que hacen parte
del sistema inmune o de defensa, son células normales no tumorales que circulan
regularmente por el cuerpo). Si los resultados son similares a lo hallado en
células U937 apoyaría el uso de NAC en condiciones en que se desee inhibir la
resorción ósea en odontología, como: retención en ortodoncia, control de
patologías óseas, enfermedad periodontal entre otros. La NAC se puede
consumir sin restricción por ser un producto de venta libre y sin daños colaterales;
podría utilizarse en enjuague bucal o administración sistémica (ingerirlo), para
controlar la actividad resortiva por parte de osteoclastos. Igualmente permitiría
proponer o investigar otros agentes con función similar o mayor potencia para
disminuir la actividad resortiva. De ser aplicable los resultados contribuirían
significativamente al desarrollo del área así como al entendimiento de la biología
molecular de los procedimientos clínicos que realizamos.73
PROPÓSITO
Para desarrollar el proyecto que pretende evaluar la actividad resortiva de células
mononucleares de sangre periférica (CMNSP) (células que se encuentran en las
muestras de sangre sobre la degradación del hueso) fusionados con
polietilenglicol (PEG-medicamento) o tratadas con fuerza centrífuga y tratadas
con N-acetilcisteina (NAC) (medicamento usado como mucolítico para controla la
tos, de venta libre y sin riesgos o eventos adversos por su consumo) se necesita
la colaboración de algunas personas, dado que cada siembra de células se
realiza con una nueva muestra de sangre, la evaluación in vitro debe ser repetible
y se deben confirmar los resultados hallados en todas, deberán realizarse varias
siembras entre 2 y 5 por lo que les proponemos su participación, con el fin de
contribuir a las investigaciones de interés terapéutico en resorción ósea,
inicialmente en relación a odontología.
Es adicionalmente muy importante que tenga en cuenta que esta toma de
muestra de sangre NO REPRESENTA PELIGRO ALGUNO para usted, ni ahora
ni a futuro. La muestra será manipulada bajo la normatividad ética enunciada en
la resolución 008430 capítulos IV de 1993 expedida por el Ministerio de Salud.
SU PAPEL DENTRO DEL PROYECTO
Siendo voluntario para donar una muestra de sangre, usted estará de acuerdo
con lo siguiente:
Usted permitirá que la muestra de sangre sea usada exclusivamente dentro del
proyecto mencionado para investigar el uso de la NAC en la inhibición de la
resorción ósea por células monucleares de sangre periférica obtenidas en esta
muestra.74 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
LOS POSIBLES BENEFICIOS PARA USTED
Su participación en este estudio NO lo beneficiará a usted directamente. Sin
embargo, uno de los propósitos de este proyecto es contribuir al conocimiento en
el área de las ciencias médicas-odontológicas básicas en Colombia y publicar los
resultados para así impulsar a otros grupos a trabajar en las mismas áreas de
investigación, con resultados que mejoraran a futuro la calidad de vida de las
personas que lo necesiten. Es un beneficio para usted contribuir, aumento del
conocimiento en esta área, lo cual podría ayudar al tratamiento de usted o de
futuras generaciones con trastornos en el metabolismo óseo.
ALTERNATIVAS DE PARTICIPACIÓN
Tiene usted la LIBERTAD DE NO ACEPTAR esta invitación.
SEGURIDAD
NO hay riesgos físicos como donante a este proyecto de investigación. Por favor
tenga en cuenta que la participación y los resultados que se obtengan en este
estudio NO modificaran y NO realizaran ninguna intervención sobre usted.
REEMBOLSOS A USTED
NO se le pagará en ningún medio a usted por la donación realizada. La donación
es totalmente VOLUNTARIA y ALTRUISTA.75
GASTOS
Usted NO tendrá que cubrir ningún costo de colección, procesamiento o análisis
de la muestra.
CONFIDENCIALIDAD
Su identidad NO será revelada en ninguna forma como resultado de su
participación en el proyecto. Se conservará la confidencialidad del donante.
PREGUNTAS O DUDAS
Si tiene preguntas o alguna duda sobre esta solicitud o sobre el proyecto en
general, por favor remítalas al LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
CELULAR DE MEDICINA DE LA FACULTAD DE MEDICINA DE LA
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA al Dr. Carlos Arturo Guerrero
Fonseca, Médico MSc. PhD. director del proyecto o al Dr. Juan Sebastian Bedoya
Trujillo residente de Ortodoncia de la Facultad de Odontología de la Universidad
Nacional de Colombia. Teléfono de contacto 3165000 Ext: 15052-15053.
SU FIRMA ABAJO INDICA QUE USTED HA LEÍDO Y ENTENDIDO EL
CONSENTIMIENTO INFORMADO, QUE HA TENIDO LA OPORTUNIDAD DE
HACER PREGUNTAS Y QUE ESTAS HAN SIDO CONTESTADAS DE FORMA
SATISFACTORIA, QUE SE LE HA DADO LA INFORMACIÓN MAS PRECISA
QUE HA SIDO POSIBLE Y QUE ESTA DE ACUERDO EN PARTICIPAR COMO
DONANTE VOLUNTARIO DE UNA MUESTRA DE SANGRE PARA EL
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN MENCIONADO.76 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
APROBACIÓN DE DONACIÓN VOLUNTARIA
Declaro que:
1. Entiendo que la donación de sangre periférica para este estudio es libre y
voluntaria.
2. Entiendo que el procedimiento para la donación de una muestra de 20 ml de
sangre NO implicará un riesgo adicional a mi salud o representado.
3. Entiendo que la muestra de sangre periférica será usada con fines
investigativos
4. Entiendo que mi participación y los resultados que se obtengan en este estudio
no representan modificación, ni necesidad de intervención alguna.
5. Entiendo que mi información será manejada de manera confidencial y que será
protegida mi identidad.
6. Entiendo que NO recibiré ningún estímulo económico por esta donación.
7. He leído y comprendido toda la información entregada, he tenido la oportunidad
de formular preguntas y se me han resuelto mis inquietudes.77
En consecuencia he decidido libremente realizar la donación de una
muestra de sangre periférica.
FECHA: Día: ____ Mes: _____________ Año: __________
 Nombre del donante voluntario: __________________________________
 CC donante voluntario: ________________________
 Teléfono de contacto: ______________________
 Firma: ___________________________
 Nombre de testigo:_______________________________________
 cc testigo:_____________________________________________
 Teléfono de contacto del testigo:__________________________________
 Firma: ___________________________
 Nombre de quien suministró la información: _________________________
 cc: ________________________
 Papel dentro del Proyecto: _____________________________________
 Firma: ___________________________78 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Anexo 2
Microfotografías
Figura 1:
Láminas óseas representativas, tinción TRAP, PEG y PEG+NAC………………………..80
Figura 2:
Láminas óseas representativas, tinción TRAP, FUERZA y FUERZA+NAC ………..…….81
Figura 3:
Láminas óseas representativas, tinción TRAP, no fu no f y no fu no f +NAC.…………….82
Figura 4, tabla 1:
Cantidad de grupos de células para la tinción de TRAP ………………………………….83
Figura 5:
Inmunofluorescencia ADAM12, PEG y PEG+NAC………………………………………..84
Figura 6:
Inmunofluorescencia ADAM12, FUERZA y FUERZA+NAC……………………………....85
Figura 7:
Inmunofluorescencia ADAM12, no fu no f y no fu no f +NAC ……………………….……86
Figura 8:
Inmunofluorescencia ATPasa, PEG y PEG+NAC ……………………………….………..87
Figura 9:
Inmunofluorescencia ATPasa, FUERZA y FUERZA+NAC ……………………………….88
Figura 10:
Inmunofluorescencia ATPasa, no fu no f y no fu no f +NAC ………………………..…….89
Figura 11:
Inmunofluorescencia CATEPSINA K, PEG y PEG+NAC …………………………...…….90
Figura 12:
Inmunofluorescencia CATEPSINA K, FUERZA y FUERZA+NAC …………………..…….9179
Figura 13:
Inmunofluorescencia CATEPSINA K, no fu no f y no fu no f +NAC ……………………..…….92
Figura 14:
Inmunofluorescencia DC STAMP, PEG y PEG+NAC ………………………………………….93
Figura 15:
Inmunofluorescencia DC STAMP, FUERZA y FUERZA+NAC ………………………..……….94
Figura 16:
Inmunofluorescencia DC STAMP, no fu no f y no fu no f +NAC ………………………….……95
Figura 17:
Inmunofluorescencia INTEGRINA B 3, PEG y PEG+NAC ……………………………………..96
Figura 18:
Inmunofluorescencia INTEGRINA B 3, FUERZA y FUERZA+NAC …………………………….97
Figura 19:
Inmunofluorescencia INTEGRINA B 3, no fu no f y no fu no f +NAC …………………........…..98
Figura 20:
Inmunofluorescencia RECEPTOR CALCITONINA, PEG y PEG+NAC ………………………….99
Figura 21:
Inmunofluorescencia RECEPTOR CALCITONINA, FUERZA y FUERZA+NAC ……….....…...100
Figura 22:
Inmunofluorescencia RECEPTOR CALCITONINA, no fu no f y no fu no f +NAC ……….……101
Figura 23:
Láminas óseas representativas, resorción TRAP, PEG y PEG+NAC ………………………….102
Figura 24:
Láminas óseas representativas, resorción, FUERZA y FUERZA+NAC …………………….…103
Figura 25:
Láminas óseas representativas, resorción, no fu no f (CONTROL) y no fu no f (CONTROL)+NAC
………………………………………………………………………………....………………..10480 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Microfotografías de la expresión de la enzima TRAP en CMNSP
fusionadas con PEG, tratadas con fuerza y no fusionadas no tratadas
con fuerza (CONTROL), y los mismos tratadas con NAC a los 5 días
de cultivo sobre las láminas de hueso.
A D
s
a
B E
s
a
F
C
Figura 1. Microfotografías representativas de láminas óseas de células con tinción TRAP
positivas, luego de 5 días de cultivo, observadas microscopio de luz (Vanguard®), 40X. A, B y C
fusionadas con PEG, y D, E y F fusionadas con PEG y tratadas con NAC.81
, A, B fusionadas con PEG, y C, D fusionadas con PEG+NAC, E, F tratadas con fuerza centrífuga,
G,H fuerza centrífuga + NAC, I, J no fusionadas no tratadas con fuerza (control) y K, L no
fusionadas no tratadas con fuerza (control)+ NAC
A D
s
a
B E
s
a
F
C
Figura 2. Microfotografías representativas de láminas óseas de células con tinción TRAP
positivas, luego de 5 días de cultivo, observadas microscopio de luz (Vanguard®) 40X. A, B y C
tratadas con fuerza centrífuga, y D, E y F fuerza centrífuga tratadas con NAC.82 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
A D
s
a
B E
s
a
F
C
Figura 3. Microfotografías representativas de láminas óseas de células con tinción TRAP
positivas, luego de 5 días de cultivo, observadas microscopio de luz (Vanguard®) 40x. A, B y C
células no fusionadas, no tratadas con fuerza (control), y D, E y F células no fusionadas, no
tratadas con fuerza (control), tratadas con NAC.
.83
TRAP
1 2 3 4 5 6
PEG PEG CONTROL CONTROL FUERZA FUERZA
+NAC +NAC +NAC
1 30 10 18 12 15 0
2 28 12 24 11 46 11
3 24 10 22 15 15 9
4 49 15 35 10 48 15
5 26 11 41 20 22 12
6 35 17 38 23 52 5
192 75 178 91 198 52
Figura 4. Tabla 1. Número de grupos celulares TRAP positivos, luego de 5 días de cultivo
contados en observación de láminas oseas al microscopio de luz (Vanguard®) 40x con CMNSP:
fusionadas con PEG, fusionadas con PEG+NAC, tratadas con fuerza centrífuga, fuerza centrífuga
+ NAC, células no fusionadas, no tratadas con fuerza (control), y D, E y F células no fusionadas,
no tratadas con fuerza (control), tratadas con NAC.84 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Microfotografías de inmunofluorescencia de la expresión de
marcadores osteoclasticos:
ADAM-12
A B
s
a
C D
Figura 5. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
ADAM12, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia
(Vanguard®) 100x. A. PEG evaluando DAPI, B. PEG con fluorescencia para evidenciar positivo el
marcador ADAM12. C. PEG tratado con NAC, DAPI, y D. PEG tratado con NAC con fluorescencia
para evidenciar el marcador ADAM12, en este caso prácticamente negativo.85
A
B B
s
s s
a
a a
C D D
Figura 6. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
ADAM12, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia
(Vanguard®) 100x. A. células tratadas con fuerza con DAPI, B. células tratadas con fuerza con
fluorescencia para evidenciar positivo el marcador ADAM12. C. células tratadas con fuerza y con
NAC, DAPI, y D. células tratadas con fuerza y con NAC con fluorescencia para evidenciar el
marcador ADAM12, en este caso prácticamente negativo.86 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
A
B
s
s
a
a
C D
Figura 7. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
ADAM12, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia
(Vanguard®) 100x. A. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con DAPI, B. células
no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con fluorescencia para evidenciar positivo el
marcador ADAM12. C. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con NAC, DAPI, y D.
células tratadas con fuerza y con NAC con fluorescencia para evidenciar el marcador ADAM12,
positivo pero evidentemente de menor tamaño.87
ATPasa
A B
s s
a a
C D
Figura 8. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
ATPasa, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia (Vanguard®)
100x. A. PEG evaluando DAPI, B. PEG con fluorescencia para evidenciar positivo el marcador
ATPasa. C. PEG tratado con NAC, DAPI, y D. PEG tratado con NAC con fluorescencia para
evidenciar el marcador ATPasa, obsérvese el contraste con imagen C, mostrando solo un grupo
lineal positivo, en comparación a la gran cantidad de células presentes.88 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
A B
s s
a a
C D
Figura 9. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
ATPasa, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia (Vanguard®)
100x. A. células tratadas con fuerza con DAPI, B. células tratadas con fuerza con fluorescencia
para evidenciar positivo el marcador ATPasa. C. células tratadas con fuerza y con NAC, DAPI, y
D. células tratadas con fuerza y con NAC con fluorescencia para evidenciar el marcador ATPasa.
.89
A B
s s
a a
C D
Figura 10. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
ATPasa, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia (Vanguard®)
100x. A. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con DAPI, B. células no fusionadas
no tratadas con fuerza (control) con fluorescencia para evidenciar positivo el marcador ATPasa.
C. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con NAC, DAPI, y D. células tratadas con
fuerza y con NAC con fluorescencia para evidenciar el marcador ATPasa.90 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
CATEPSINA K
A B
s s
a a
C D
Figura 11. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
CATEPSINA K, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia
(Vanguard®) 100x. A. PEG evaluando DAPI, B. PEG con fluorescencia para evidenciar positivo el
marcador CATEPSINA K. C. PEG tratado con NAC, DAPI, y D. PEG tratado con NAC con
fluorescencia para evidenciar el marcador CATEPSINA K, obsérvese el contraste con imagen C,
mostrando solo un grupo lineal positivo, obsérvese el contraste con imagen C.91
A B
s s
a a
D
C
Figura 12 Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
CATEPSINA K, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia
(Vanguard®) 100x. A. células tratadas con fuerza con DAPI, B. células tratadas con fuerza con
fluorescencia para evidenciar positivo el marcador CATEPSINA K. C. células tratadas con fuerza
y con NAC, DAPI, y D. células tratadas con fuerza y con NAC con fluorescencia para evidenciar el
marcador CATEPSINA K. obsérvese el contraste con imagen C, mostrando prácticamente
negativo el marcador.
.92 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
A B
s s
a a
C D
Figura 13. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
CATEPSINA K, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia
(Vanguard®) 100x. A. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con DAPI, B. células
no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con fluorescencia para evidenciar positivo el
marcador CATEPSINA K. C. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con NAC,
DAPI, y D. células tratadas con fuerza y con NAC con fluorescencia para evidenciar el marcador
CATEPSINA K.93
DC STAMP
A B
s s
a a
C
D
Figura 14. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal DC
STAMP, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia (Vanguard®)
100x. A. PEG evaluando DAPI, B. PEG con fluorescencia para evidenciar positivo el marcador DC
STAMP. C. PEG tratado con NAC, DAPI, y D. PEG tratado con NAC con fluorescencia para
evidenciar el marcador DC STAMP.94 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
A B
s s
a a
C D
Figura 15. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal DC
STAMP, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia (Vanguard®)
100x. A. células tratadas con fuerza con DAPI, B. células tratadas con fuerza con fluorescencia
para evidenciar positivo el marcador DC STAMP. C. células tratadas con fuerza y con NAC, DAPI,
y D. células tratadas con fuerza y con NAC con fluorescencia para evidenciar el marcador DC
STAMP. obsérvese el contraste con imagen C, mostrando prácticamente negativo el marcador.
.95
A B
s s
a a
C
D
Figura 16. Figura 13. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo
policlonal DC STAMP, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia
(Vanguard®) 100x. A. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con DAPI, B. células
no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con fluorescencia para evidenciar positivo el
marcador DC STAMP. C. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con NAC, DAPI, y
D. células tratadas con fuerza y con NAC con fluorescencia para evidenciar el marcador DC
STAMP.
.96 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
INTEGRINA B 3
A B
s s
a a
C D
Figura 17. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
INTEGRINA β 3, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia
(Vanguard®) 100x. A. PEG evaluando DAPI, B. PEG con fluorescencia para evidenciar positivo el
marcador INTEGRINA β 3. C. PEG tratado con NAC, DAPI, y D. PEG tratado con NAC con
fluorescencia para evidenciar el marcador INTEGRINA β 3, obsérvese el contraste con imagen C,
mostrando solo 2 grupos positivos para el marcador.97
A
B
s
s
a
a
C
D
D
Figura 18. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
INTEGRINA β 3, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia
(Vanguard®) 100x. A. células tratadas con fuerza con DAPI, B. células tratadas con fuerza con
fluorescencia para evidenciar positivo el marcador INTEGRINA β 3. C. células tratadas con
fuerza y con NAC, DAPI, y D. células tratadas con fuerza y con NAC con fluorescencia para
evidenciar el marcador INTEGRINA β 3. Obsérvese el contraste con imagen C, mostrando
prácticamente negativo el marcador.98 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
A B
s s
a a
C D
Figura 19. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
INTEGRINA β 3, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de fluorescencia
(Vanguard®) 100x. A. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con DAPI, B. células
no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con fluorescencia para evidenciar positivo el
marcador INTEGRINA β 3. C. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con NAC,
DAPI, y D. células tratadas con fuerza y con NAC con fluorescencia para evidenciar el marcador
INTEGRINA β 3.99
RECEPTOR DE CALCITONINA
A B
s s
a a
C D
Figura 20. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
receptor de calcitonina, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de
fluorescencia (Vanguard®) 100x. A. PEG evaluando DAPI, B. PEG con fluorescencia para
evidenciar positivo el marcador receptor de calcitonina. C. PEG tratado con NAC, DAPI, y D.
PEG tratado con NAC con fluorescencia para evidenciar el marcador receptor de calcitonina,
obsérvese el contraste con imagen C, mostrando practicamente negativo el marcador.
.100 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
A B
s s
a a
C D
Figura 21. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
receptor de calcitonina, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de
fluorescencia (Vanguard®) 100x. A. células tratadas con fuerza con DAPI, B. células tratadas con
fuerza con fluorescencia para evidenciar positivo el marcador receptor de calcitonina. C. células
tratadas con fuerza y con NAC, DAPI, y D. células tratadas con fuerza y con NAC con
fluorescencia para evidenciar el marcador receptor de calcitonina. Obsérvese el contraste con
imagen C, mostrando prácticamente negativo el marcador.
.101
A B
s s
a a
C D
Figura 22. Microfotografías representativas de inmunofluorescencia del anticuerpo policlonal
receptor de calcitonina, 5 días de cultivo. Tinción con 0.1 μg/ml DAPI. Microscopio de
fluorescencia (Vanguard®) 100x. A. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con
DAPI, B. células no fusionadas no tratadas con fuerza (control) con fluorescencia para evidenciar
positivo el marcador receptor de calcitonina. C. células no fusionadas no tratadas con fuerza
(control) con NAC, DAPI, y D. células tratadas con fuerza y con NAC con fluorescencia para
evidenciar el marcador receptor de calcitonina.102 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
Microfotografías de la valoración de actividad resortiva en CMNSP
fusionadas con PEG, sometidas a fuerza centrífuga y no fusionadas
no sometidas a fuerza (control) y los mismos grupos tratados con
NAC a los 5 días de cultivo sobre las láminas de hueso.
A D
s
a
B E
s
a
C F
Figura 23. Microfotografías representativas de lagunas de resorción tinción Coomasie, a los 5
días de cultivo. Observadas a microscopio de luz (Vanguard®) objetivo de 10x, fotografías con
cámara Panasonic® DMC-FHS, A, B y C fusionadas con PEG, y D, E y F fusionadas con PEG y
tratadas con NAC.103
A D
s
a
B
E
s
a
C F
Figura 24. Microfotografías representativas de lagunas de resorción tinción Coomasie, a los 5
días de cultivo. Observadas a microscopio de luz (Vanguard®) objetivo de 10x, fotografías con
cámara Panasonic® DMC-FHS, A, B y C tratadas con FUERZA, y D, E y F tratadas con FUERZA
y NAC.104 EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD RESORTIVA DE CMNSP
A D
s
a
B E
s
a
C F
Figura 25. Microfotografías representativas de lagunas de resorción tinción Coomasie, a los 5
días de cultivo. Observadas a microscopio de luz (Vanguard®) objetivo de 10x, fotografías con
cámara Panasonic® DMC-FHS, A, B y C no fusionadas no tratadas con fuerza (CONTROL), y D,
E y F no fusionadas no tratadas con fuerza (CONTROL) tratadas con NAC.105