Efecto angiogénico de los medios condicionados por células madre, en el trasplante de aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal)
Autor: Castro Gaona, Ricardo Alfonso
Asesor: Delgado Mejía, Edgar (Thesis advisor)
Fecha: 2016
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: INTRODUCCION:  Actualmente el manejo de los defectos óseos continua siendo un reto para el cirujano ortopedista quien a pesar de la introducción de nuevas técnicas quirúrgicas para el manejo de la patología de origen multifactorial, aun se ve limitado en los resultados postoperatorios y funcionales.  Con el progreso en el conocimiento de las células madre y el mejor entendimiento de la función y los efectos de la célula mesenquimal , sus capacidades de diferenciación y paracrinas, planteamos la posibilidad de la utilización de éstas dentro del arsenal terapéutico para el manejo de defectos óseos segmentarios.  Evaluamos el potencial de los medios condicionados CM por células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo Ad-MCS, como facilitador en el proceso de integración de aloinjertos estructurales diafisarios no vascularizados mediante la promoción de la angiogénesis y consideramos la posibilidad de su utilización dentro del arsenal terapéutico para el manejo de defectos óseos segmentarios.  METODOS:  Ocho conejos blancos de raza Nueva Zelanda fueron intervenidos quirúrgicamente para realizar la reconstrucción de un defecto óseo diafisario intercalar de 1.5 cm. El primer grupo utilizamos aloinjertos congelados (n=4) y en el segundo aloinjertos congelados + medios condicionados (MC) por células madre mesenquimales (MSC) obtenidas de tejido adiposo humano (Ad-MCS) (n=4) ; fueron observados por 12 semanas. Dos conejos fueron sacrificados al inicio del estudio para utilizar los fémures como aloinjertos donantes.  Un segmento cortical diafisario de 1.5 cm fue osteotomizado y luego fijado con ayuda de un tutor externo (diseñado por los autores) compuesto por 4 clavos roscados al hueso. Los aloinjertos fueron despojados del periostio, tejidos blandos adyacentes y del contenido medular, y luego almacenados en bolsas estériles al vacío a -4 °C durante cuatro semanas antes del trasplante. 12 ml de Hidrogel fueron preparados a partir de plasma fresco humano como andamio biodegradable del implante para contener los Medios Condicionados (MC) por Células madre mesenquimales (MCS) de tejido adiposo (Ad-MCS). El Hidrogel con los MC es implantado en el canal medular del aloinjerto y en la superficie cortical en el momento de la reconstrucción femoral del grupo correspondiente.  Los conejos fueron sacrificados a la semana 12 y los especímenes analizados macroscópicamente para valorar la integración entre huésped – injerto y la estabilidad de las uniones, también se analizó la formación de callo mediante radiografías control y finalmente practicó un estudio histológico mediante coloración básica H-E y con inmunohistoquimica CD34 y CD31 para evaluar la vitalidad del tejido óseo del huésped y el aloinjerto , la presencia de resorción ósea, neoformación de hueso y tejido fibrovascular además de la densidad de los vasos en el injerto comparándola con hueso no intervenido.  RESULTADOS.  Se valoraron los 4 especímenes de cada grupo a las 12 semanas. Se encontró formación de callo óseo redundante macroscópica y radiológicamente en la mayoría de especímenes del Grupo B (Aloinjerto + Medios Condicionados) al compararlos con las características de consolidación del Grupo A. Sin embargo, se presentó un caso de aflojamiento del material de fijación asociado a infección en un espécimen de cada grupo.  Todos los índices de vitalidad del injerto (formación de osteoide, encapsulamiento del callo y osteocitos vitales en el aloinjerto) fueron significativamente mayores en el grupo de aloinjerto con MC de Ad-MCS en la valoración histológica con H-E. La densidad de los vasos en el aloinjerto y en las zonas de consolidación no fue cuantificable, sin embargo la densidad de tejido positivo para la inmunohistoquímica con CD31 – CD34, fue significativamente mayor en el Grupo B.  CONCLUSION.  Los aloinjertos con MC de Ad-MCS aumentaron el potencial de integración con el hueso nativo y los índices de vitalidad del aloinjerto. Los marcadores de inmunohistoquimica CD31 y CD34 no permiten cuantificar la densidad vascular por falta de especificidad tisular, sin embargo la mayor captación de contraste en los casos del grupo con MC de Ad-MCS (Grupo B) indica un ambiente enriquecido por una respuesta celular mayor en el sitio de consolidación.

Efecto Angiogénico de los Medios
Condicionados por Células Madre, en el
trasplante de aloinjerto óseo diafisario
(Modelo Animal).
Ricardo Alfonso Castro Gaona.
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Cirugía
Unidad de Ortopedia y Traumatología
Bogotá D.C, Colombia
2016Efecto Angiogénico de los Medios
Condicionados por Células Madre, en el
trasplante de aloinjerto óseo diafisario
(Modelo Animal).
Ricardo Alfonso Castro Gaona.
Código:
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Especialista en Ortopedia y Traumatología
Director:
Dr. José Fernando Galván Villamarin.
Codirectores:
Dr. Orlando Chaparro
Dra. Gabriel Fletscher
Línea de Investigación:
Cirugía Ortopédica –Ciencias Básicas – Tecnología de Tejidos
Grupos de Investigación:
Grupo de Investigación Unidad de Ortopedia y Traumatología
Grupo de Investigación Biología de Células Madre
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía
Unidad de Ortopedia y Traumatología
Bogotá D.C, Colombia
2016A mi hijo Juan Alejandro y a mi esposa Luisa
Fernanda, pilares de mi felicidad…Contenido IV
Resumen
INTRODUCCION:
Actualmente el manejo de los defectos óseos continua siendo un reto para el cirujano
ortopedista quien a pesar de la introducción de nuevas técnicas quirúrgicas para el
manejo de la patología de origen multifactorial, aun se ve limitado en los resultados
postoperatorios y funcionales.
Con el progreso en el conocimiento de las células madre y el mejor entendimiento de la
función y los efectos de la célula mesenquimal , sus capacidades de diferenciación y
paracrinas, planteamos la posibilidad de la utilización de éstas dentro del arsenal
terapéutico para el manejo de defectos óseos segmentarios.
Evaluamos el potencial de los medios condicionados CM por células madre
mesenquimales derivadas del tejido adiposo Ad-MCS, como facilitador en el proceso de
integración de aloinjertos estructurales diafisarios no vascularizados mediante la
promoción de la angiogénesis y consideramos la posibilidad de su utilización dentro del
arsenal terapéutico para el manejo de defectos óseos segmentarios.
METODOS:
Ocho conejos blancos de raza Nueva Zelanda fueron intervenidos quirúrgicamente para
realizar la reconstrucción de un defecto óseo diafisario intercalar de 1.5 cm. El primer
grupo utilizamos aloinjertos congelados (n=4) y en el segundo aloinjertos congelados +
medios condicionados (MC) por células madre mesenquimales (MSC) obtenidas de tejido
adiposo humano (Ad-MCS) (n=4) ; fueron observados por 12 semanas. Dos conejos
fueron sacrificados al inicio del estudio para utilizar los fémures como aloinjertos
donantes.Contenido V
Un segmento cortical diafisario de 1.5 cm fue osteotomizado y luego fijado con ayuda de
un tutor externo (diseñado por los autores) compuesto por 4 clavos roscados al hueso.
Los aloinjertos fueron despojados del periostio, tejidos blandos adyacentes y del
contenido medular, y luego almacenados en bolsas estériles al vacío a -4 °C durante
cuatro semanas antes del trasplante. 12 ml de Hidrogel fueron preparados a partir de
plasma fresco humano como andamio biodegradable del implante para contener los
Medios Condicionados (MC) por Células madre mesenquimales (MCS) de tejido adiposo
(Ad-MCS). El Hidrogel con los MC es implantado en el canal medular del aloinjerto y en la
superficie cortical en el momento de la reconstrucción femoral del grupo correspondiente.
Los conejos fueron sacrificados a la semana 12 y los especímenes analizados
macroscópicamente para valorar la integración entre huésped – injerto y la estabilidad de
las uniones, también se analizó la formación de callo mediante radiografías control y
finalmente practicó un estudio histológico mediante coloración básica H-E y con
inmunohistoquimica CD34 y CD31 para evaluar la vitalidad del tejido óseo del huésped y
el aloinjerto , la presencia de resorción ósea, neoformación de hueso y tejido fibrovascular
además de la densidad de los vasos en el injerto comparándola con hueso no intervenido.
RESULTADOS.
Se valoraron los 4 especímenes de cada grupo a las 12 semanas. Se encontró formación
de callo óseo redundante macroscópica y radiológicamente en la mayoría de
especímenes del Grupo B (Aloinjerto + Medios Condicionados) al compararlos con las
características de consolidación del Grupo A. Sin embargo, se presentó un caso de
aflojamiento del material de fijación asociado a infección en un espécimen de cada grupo.
Todos los índices de vitalidad del injerto (formación de osteoide, encapsulamiento del
callo y osteocitos vitales en el aloinjerto) fueron significativamente mayores en el grupo de
aloinjerto con MC de Ad-MCS en la valoración histológica con H-E. La densidad de los
vasos en el aloinjerto y en las zonas de consolidación no fue cuantificable, sin embargo la
densidad de tejido positivo para la inmunohistoquímica con CD31 – CD34, fue
significativamente mayor en el Grupo B.Contenido VI
CONCLUSION.
Los aloinjertos con MC de Ad-MCS aumentaron el potencial de integración con el hueso
nativo y los índices de vitalidad del aloinjerto. Los marcadores de inmunohistoquimica
CD31 y CD34 no permiten cuantificar la densidad vascular por falta de especificidad
tisular, sin embargo la mayor captación de contraste en los casos del grupo con MC de
Ad-MCS (Grupo B) indica un ambiente enriquecido por una respuesta celular mayor en el
sitio de consolidación.
Key words: biological, healing, deep-frozen, diaphyseal, allografts, experimental,
stem cells.
Abstract
Angiogenic effect of Stem Cell’s Conditioned
Medium in diaphyseal bone allograft’s
transplantation (Animal Model).
INTRODUCTION:
Management of bone defects nowadays is still a challenge for the orthopedic surgeon,
who despite of introduction of novel surgical techniques to handle the multifactorial origin
disease, still have limited postoperative and functional results.
With the improvement of knowledge about stem cell and the better understanding of the
effects and functioning of mesenchymal cells, their differentiation abilities and paracrine
capacity, we pose the possibility of using them on the therapeutic arsenal for managing
segmental bone defects.
We evaluate the potential of mesenchymal stem cells conditioned medium, coming from
fat tissue, as enabling in the process of no vascularized diaphyseal structural allograft
integration by promoting angiogenesis, also we consider the possibility of their use in the
therapeutic arsenal for managing segmental bone defects.Contenido VII
MATERIALS AND METHODS:
Experimental study on animal model. Eight 8 white rabbits of New Zeland breed to make
reconstruction of a diaphyseal bone defect among 1.5 centimeters, in first group we used
frozen allograft (n=4) and in the second group we used frozen allograft plus Mesenchymal
Stem Cell´s Conditioned Medium (CM) obtained from human adipose tissue (Ad-MCS)
(n=4). They were observed along 12 weeks. 2 rabbits were sacrificed at study beginning
to use femurs as allograft donors.
A cortical diaphyseal segment of 1.5 cm went through osteotomy and then fixation with an
external system designed by authors, constituted by four pins screwed to bone.
Periosteum, soft tissue and medulla were removed from allografts, which were stored in
sterile vacuum bags, at -4°C along four weeks before transplantation. 12 ml of hydrogel
were made from human fresh plasma as implant´s biodegradable scaffold to contain fat
tissue stem cell’s conditioned medium. The hydrogel and the conditioned media are placed
in allograft´s medullary cavity and in cortical surface at the moment of reassembling
femurs in the corresponding group.
Rabbits were sacrificed at 12 week and the specimens macroscopically analyzed to
evaluate host – graft integration and stability of bonding, besides, we analyzed callus
formation by control x- rays and finally we made a histological study by basic eosin -
hematoxylin staining and with CD31, CD34 immunohistochemistry to evaluate host bone
tissue vitality, the allograft, presence of bone resorption, formation of new bone and
fibrovascular tissue. We also evaluate the blood vessels density in the graft comparing
with non-operate bone.
RESULTS
We assess the four specimens of each group at twelfth week. We found redundant bone
callus formation macroscopically and with x- rays in most specimens of B group (allograft
plus conditioned media) when comparing with characteristics of group A bone
consolidation. However, we notice a case of fixation pin slackening associated to infection
in one specimen of each group.
At histologic staining with eosin hematoxylin, all vitality index of graft (osteoid formation,
fibrovascular tissue, bone callus encapsulation and allograft´s vital osteocytes) wereContenido VIII
significantly high in the group of fat tissue mesenchymal stem cell´s conditioned medium
allograft. Vascular density in the allograft and in the consolidation zones were not
measurable, however, positive tissue density for immunohistochemistry with CD31 and
CD34 was significantly high in group B.
CONCLUSION.
Fat tissue mesenchymal stem cell´s conditioned medium allografts augmented the
integration potential with native bone and allograft vitality indexes. Immunohistochemistry
markers CD31 and CD34 don´t allow to quantify vascular density due to lack of tissue
specificity, however, the increased capture of contrast in cases with Fat tissue
mesenchymal stem cell´s conditioned medium (group B) indicates an enriched
environment allowing an increased cell response in consolidation site.
Key words: biological, healing, deep-frozen, diaphyseal, allografts, experimental,
stem cells.Contenido IX
Contenido
Resumen………………………………………………………………………………………… IV
Lista de figuras………………………………………………………………………………….. XI
Lista de abreviaturas…………………………………………………………………………… XIII
Introducción…………………………………………………………………………………………1
1. Objetivos ...................................................... ……………………………………2
1.1 Objetivo Geneal ............................................................................................... 2
1.2 Objetivos Específicos ...................................................................................... 2
2. Marco Teórico ............................................................................................... 4
2.1 Aloinjertos estructurales no vascularizados ..................................................... 4
2.2 Medios Condicionados (MC) por Células madre mesenquimales (MSC) ......... 5
3. Metodología .................................................................................................. 7
3.1 Estudios previos: ............................................................................................. 7
3.2 Diseño del estudio ........................................................................................... 7
3.2.1 Tipo de Estudio……………………………………………………………. ........... 7
3.2.2 Especie animal…………………………………………………………….. ........... 8
3.2.3 Tamaño de la muestra……………………………………………………. ........... 8
3.3 Fases del proyecto .......................................................................................... 9
3.3.1 Fase I: Adquisicion del Aloinjerto……………………………………….. ........... 9
3.3.2 Fase II: Segundo tiempo quirúrgico……………………………………… ....... 11
3.3.3 Fase III: Interpretación de resultados. Evaluación radiológica………… ...... 15
3.3.4 Fase III: Interpretación de resultados. Evaluación Macroscopica e
Histologica……………………………………………………………………………. ......... 16
4. Consideraciones éticas ............................................................................... 18
5. Resultados .................................................................................................. 19Contenido X
5.1 Fase I ............................................................................................................ 19
5.2 Fase II ........................................................................................................... 19
5.3 Fase III: ......................................................................................................... 21
5.3.1 Evaluacion Radiologica. Lectura convencional:………………………………..21
5.3.2 Evaluacion Macroscopica:…………………………………………………….. .. 21
5.3.3 Evaluacion Histologica:…………………………………………………….. ....... 22
5.3.4 Evaluación Inmunohistoquimica CD31 y CD34……..……………………….. . 25
6. Discusión..................................................................................................... 27
6.1 Técnica de trasplante aloinjerto óseo diafisario congelado en Conejos ......... 27
6.2 Medios condicionados MC producidos por células madre mesenquimales
derivadas de tejido adiposo por MSC-Ad y angiogénesis en el trasplante de aloinjertos
óseos diafisarios. ......................................................................................................... 27
7. Conclusiones y recomendaciones ................................................................. 29
7.1 Conclusiones ................................................................................................. 29
7.2 Recomendaciones ......................................................................................... 30
8. Bibliografia ..................................................................................................... 31Contenido XI
Lista de figuras
Pág.
Figura 1: Pieza anatómica fémur de conejo. Fijador Externo para investigación
animal en conejos. ………………………………………….……………………………………. 8
Figura 2: Procedimiento quirúrgico fase I……………………………………………….. 9
Figura 3: Esquema de Metodología………..……………………………………………. 11
Figura 4: Procedimiento quirúrgico Fase II. Tutor..……………………………………. 13
Figura 5: Procedimiento quirúrgico Fase II. Hidrogel….….……………..…………….. 14
Figura 6: Procedimiento quirúrgico Fase II. Grupo B………………………………….. 14
Figura 7: Procedimiento quirúrgico fase III. Evaluación Radiológica………………… 15
Figura 8: Procedimiento quirúrgico fase III. Evaluación Macroscópica...……………. 16
Figura 9: Procedimiento quirúrgico Fase III. Valoración Histológica.………..………… 17
Figura 10: Procedimiento quirúrgico Fase II. Radiografía Postoperatoria…….……… 20
Figura 11: Evaluación Histológica. Sitio de interés (SDI)…………………….….……… 23Contenido XII
Figura 12: Evaluación Histológica. Magnificaciones. Sitio de interés (SDI)………… 23
Figura 13: Evaluación Histológica. Grupo A………………………………….………… 24
Figura 14: Evaluación Histológica. Casos de Infección.…………………….………… 25
Figura 15: Evaluación Inmunohistoquimica. Caso Grupo B……….……….………… 25
Figura 16: Evaluación Inmunohistoquimica. Comparación Grupos A y B..………… 26
.Contenido XIII
Lista de abreviaturas
Abreviatura Término
MSC Célula madre Mesenquimal
MSC -Ad Célula madre Mesenquimal derivada del tejido adiposo
MC Medios Condicionados
HBPH Hidrogel del Plasma Sanguíneo Humano
cm Centímetro
VEGF Factor de crecimiento vascular endotelial
TGF Factor de crecimiento transformante
H-E Tinción Básica con Hematoxilina EosinaIntroducción
Actualmente el manejo de los defectos óseos continua siendo un reto para el cirujano
ortopedista quien a pesar de la introducción de nuevas técnicas quirúrgicas para el
manejo de la patología de origen multifactorial, aun se ve limitado en los resultados
postoperatorios y funcionales del paciente. Con el progreso en el conocimiento de las
células madre y el mejor entendimiento de la función y los efectos de la célula
mesenquimal y sus capacidades de diferenciación y paracrinas, se plantea la posibilidad
de la utilización de éstas dentro del arsenal terapéutico para el manejo de defectos óseos
segmentarios.
En este estudio se evalúa el potencial de los medios condicionados CM por células madre
mesenquimales derivadas del tejido adiposo Ad-MCS, como facilitador en el proceso de
integración de aloinjertos estructurales diafisarios no vascularizados mediante la
promoción de la angiogénesis [34 -35]. Se utiliza hidrogel de plasma sanguíneo humano
HBPH como sistema de administración. Los geles obtenidos a partir de plasma humano
se han utilizado en la ingeniería de tejidos para proporcionar un andamio biodegradable,
mínimamente invasivo e histocompatible para la expansión celular in vitro y para la
implantación celular in vivo. [45].1. Objetivos
1.1 Objetivo General
Evaluar de forma experimental la utilización de medios condicionados producto de la
secreción paracrina de células madre mesenquimales como potenciador angiogénico en
el uso de aloinjerto óseo no vascularizado.
1.2 Objetivos Específicos
 Estudiar los aspectos biológicos y moleculares de la expansión y diferenciación de
las células madre mesenquimales in vivo (modelo animal) en la búsqueda de
estrategias terapéuticas para tratamiento de defectos óseos estructurales en
huesos largos.
 Determinar la calidad radiológica e histológica del tejido obtenido en área unión
posterior a la utilización de medios condicionados con el uso de aloinjertos
estructurales no vascularizados.
 Determinar el potencial angiogénico de los medios condicionados en el uso de
aloinjerto estructural no vascularizado, mediante la utilización de
inmunohistoquimica en espécimen animal.
 Continuar como unidad de investigación en patología ortopédica en el campo de la
biología molecular y el uso de células madre con el fin de buscar estrategiasObjetivos 3
terapéuticas en el manejo de defectos óseos estructurales en huesos largos en los
cuales las técnicas disponibles actualmente a nivel mundial no solucionan de
forma satisfactoria la patología del paciente.2. Marco Teórico
2.1 Aloinjertos estructurales no vascularizados.
La osteointegración se consigue cuando no hay movimiento progresivo entre el injerto y el
hueso que está en contacto directo con él. [1], y es el resultado de dos etapas complejas:
osteoinducción, el proceso por el cual se induce la osteogénesis y osteoconducción, que
implica el crecimiento de hueso en una superficie [2].
La Osteoinducción es parte del proceso de curación normal del hueso y es responsable
de la mayoría de la neoformación ósea. La Osteoconducción también ocurre durante la
remodelación ósea normal y depende no únicamente de factores biológicos sino también
de la respuesta a material extraño. [2].
Gran cantidad de sustitutos óseos son utilizados frecuentemente en la práctica clínica [3],
pero ninguno cumple todos los requerimientos de un implante ideal. Teóricamente, para
obtener una adecuada osteointegración, los implantes óseos deben proporcionar cuatro
elementos: integridad estructural; una matriz osteoconductiva como un andamio que
permita el crecimiento interno del hueso; células osteogénicas, que ofrezcan el potencial
de diferenciarse y facilitar varios estadios de la regeneración ósea; y factores
osteoinductivos, como mediadores de los diferentes estadios de la regeneración y
reparación ósea. [3]
Los factores de crecimiento son expresados durante diferentes fases de la cicatrización
del tejido y son por lo tanto pieza clave en promover a regeneración tisular [4]; de hecho,
factores de crecimiento transportados en dispositivos ortopédicos han sido reportados
como potenciadores de la actividad osteoblástica y a favor de la integración del implante.
[5,6].
Las opciones para manejar defectos óseos amplios incluyen autoinjertos vascularizados
[7], autoinjertos no vascularizados [8], aloinjertos [9], prótesis anatómicas [10], yMarco teórico 5
biocerámicas [11]. El uso de aloinjertos tiene las ventajas de menor morbilidad quirúrgica
y reducción en tiempos quirúrgicos y costos hospitalarios, pero involucra el riesgo de
transmisión de enfermedades [12], no unión [13] y falta de incorporación biológica [14].
En un estudio en gatos, la incorporación biológica de autoinjertos corticales no
vascularizados fue buena, con una tasa de resorción ósea del 13 % a las 12 semanas,
una tasa de neoformación ósea cortical de 4.3% a las 16 semanas y una tasa de encierro
del callo de 8 % a las 16 semanas [15,16]. Por el contrario, la actividad reparadora fue
mínima en los aloinjertos corticales, con una tasa de resorción ósea de 1.8 % a 9 meses,
y una tasa de neoformación ósea cortical de 0.74 % a los 9 meses [14]. Además, los
aloinjertos pueden perder gran parte de su fuerza con el tiempo [17]
Para optimizar la remodelación y la incorporación de los aloinjertos, se han utilizado
factores de crecimiento recombinante como la proteína morfogenética formadora de
hueso (BMPs) [18-20], plasma rico en plaquetas (PRP) [21], células madre
mesenquimales derivadas de medula ósea (MCS) [22-25] y una combinación de estas
[26].
2.2 Medios Condicionados (MC) por Células madre
mesenquimales (MSC)
El uso de las células madre y particularmente las células madre mesenquimales (MSC) en
la práctica clínica ha aumentado considerablemente en la última década. Durante este
tiempo, la comunidad científica ha tratado de entender sus mecanismos biológicos en la
reparación y regeneración de tejidos y desvelar su potencial en la terapia celular y la
medicina regenerativa. [27].
Aunque MSC fueron inicialmente aisladas de la médula ósea, la MSC de tejido adiposo
(Ad-MSC) se perfila como la mejor opción para aplicaciones clínicas [28]. Desde su
descripción en 2001 [28], los datos recogidos hasta el momento sugieren que el tejido
adiposo es una fuente abundante de MSC, y debido a su amplia distribución corporal hace
que sea accesible por métodos mínimamente invasivos. Estos MSC son también fáciles
de aislar y expandir in vitro [29,30].
El enfoque inicial de tratamiento de lesiones musculoesqueléticas mediante MSC se basa
en su capacidad de diferenciarse en varios tipos de células [31,32]. En esencia, la
expectativa ha sido que al implantar o inyectar MSC, las células colonizan y se diferencian6 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
en el sitio de la lesión a lo largo de un linaje MSC apropiado. Este mecanismo de acción
de MSC actualmente es controvertido, cambiando el paradigma actual para extenderlo a
un mecanismo alternativo llamado efecto paracrino, donde MSC secretan moléculas
biológicamente activas que ejercen efectos beneficiosos sobre los tejidos lesionados [33]
mediante la promoción de la angiogénesis y la regeneración de tejidos y la inhibición de
fibrosis, apoptosis y la inflamación [34,35].
Dado que la supervivencia y la diferenciación de MSC en el sitio de la lesión es limitada,
se propone que la señalización paracrina es el mecanismo primario de sus efectos
terapéuticos [36]. Esta hipótesis está apoyada por estudios in vitro e in vivo evidenciando
que muchos tipos de células responden a la estimulación paracrina mediada por
señalización de MSC, provocando la modulación de un gran número de respuestas
celulares, tales como la supervivencia, proliferación, migración y expresión de genes [37].
La secreción de factores bioactivos se cree desempeña un papel crítico en la actividad
paracrina mediada por MSC. Estos factores y citoquinas pueden recogerse en lo que se
han denominado medios condicionados (CM), que cuando se trasplantan en modelos
animales con diferentes enfermedades logran tener efectos similares a los ejercidos por
las propias células, aumentando el proceso de reparación tisular en infarto agudo de
miocardio [38,39], la curación de heridas [40,41], como un agente neuroprotector [42] y
su habilidad para reparar defectos óseos gracias a su efecto paracrino en modelos in vivo
[43,44].
En este estudio se evalúa el potencial de los medios condicionados CM por células madre
mesenquimales derivadas del tejido adiposo Ad-MCS, como facilitador en el proceso de
integración de aloinjertos estructurales diafisarios no vascularizados mediante la
promoción de la angiogénesis [34 -35]. Se utiliza hidrogel de plasma sanguíneo humano
HBPH como sistema de administración. Los geles obtenidos a partir de plasma humano
se han utilizado en la ingeniería de tejidos para proporcionar un andamio biodegradable,
mínimamente invasivo e histocompatible para la expansión celular in vitro y para la
implantación celular in vivo. [45].3. Metodología
3.1 Estudios previos:
Se adelantó una búsqueda en diferentes bases de datos electrónicas (EMbase, PubMed,
Science DIrect, Scielo) utilizando los términos: Allograft, fresh-frozen allografts,
Mesenchymal Stem Cell, mesenchymal stem cell-conditioned medium y en términos
MESH: cell, mesenchymal stem unidos por conectores boleanos AND, OR sin encontrar
ningún artículo en el cual se combinaran las dos técnicas para la reconstrucción ósea en
huesos largos.
Se encuentra un gran número de publicaciones que combinan el uso de células madre
derivadas de medula ósea y el uso de aloinjertos para el manejo de defectos óseos en
huesos largos [22-25]. En estos estudios se busca enriquecer con medios celulares
osteoinductores los aloinjertos estructurales.
Consideramos este estudio es el primero en indagar por el potencial osteoinductor y
angiogénico de los Medios condicionados por células madre (acción paracrina con medios
acelulares) derivadas de tejido adiposo humano (células madre alogénicas) sin la
necesidad de terapia inmunosupresora [44], en la integración de aloinjertos estructurales
en el manejo de defectos óseos diafisarios.
3.2 Diseño del estudio
3.2.1 Tipo de Estudio:
Estudio experimental en modelo animal.8 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
3.2.2 Especie animal:
Conejos de raza nueva Zelanda peso entre 2000 y 3000 gramos.
En un estudio experimental previamente realizado por los autores, aun sin publicar, por
facilidad técnica para la realización de la osteotomía y facilidad técnica para la colocación
de un fijador externo, se escogió al fémur como pieza anatómica.
Figura 1: Pieza anatómica fémur de conejo. Fijador Externo para investigación
animal en conejos.
3.2.3 Tamaño de la muestra
Cumpliendo con las recomendaciones de las 3R en investigación animal: remplazar,
reducir y refinar1, se diseñaron dos grupos de comparación para lo cual se define una
muestra de 8 conejos. Se utilizaron 2 Conejos al inicio del estudio como donantes de los
aloinjertos, para un total de 10 diez conejos.Metodología 9
3.3 Fases del proyecto
Se realizó un proceso de investigación de tres fases, las dos iniciales correspondientes a
la intervención experimental en el modelo animal propuesto y una tercera fase de
evaluación, la cual finalizó con la ejecución de los documentos para publicación y
divulgación ante sociedades científicas en el ámbito nacional e internacional.
3.3.1 Fase I: Adquisición de Aloinjerto.
Aloinjerto óseo estructural de la diáfisis del fémur bilateral de # 2 conejos donantes.
Con ayuda de cámara de flujo laminar, los aloinjertos (diáfisis femoral completa) se
despojaron del periostio, tejidos blandos y contenidos medulares, se lavaron con solución
salina, se realizaron osteotomías con sierra oscilante obteniendo dos injertos de 1.5 cm
por cada fémur, los cuales se almacenaron en un congelador a -4ºC. Todos los aloinjertos
fueron congelados durante 4 semanas antes del trasplante para estandarizar la técnica.
Los conejos donantes fueron sacrificados.
Figura 2. Procedimiento quirúrgico fase I10 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
1. El animal se manipula procurando evitar al máximo producirle estrés, se dosifica
15 mg/ Kg de peso de Euthanex (pentobarbital sódico), se suministra por vía
endovenosa por vena periférica de la oreja, efecto instantáneo, se asegura el
deceso del animal con no reversibilidad y asegurándose de la ausencia de reflejo
alguno.
2. Preparación de las extremidades inferiores para realización de procedimiento
quirúrgico (Rasurado).
3. Asepsia y antisepsia de campo operatorio con clorhexidina. Colocación de campos
quirúrgicos estériles.
4. Incisión longitudinal sobre cara lateral del muslo, disección tejido celular
subcutáneo, apertura de fascias y musculatura hasta exposición del fémur.
5. Desarticulación femoral a nivel de la cadera y la rodilla.
6. Exéresis de la pieza quirúrgica. (Fémur total de forma bilateral)
7. Las piezas quirúrgicas son despojadas de contenido endomedular y de tejidos
blandos incluyendo periostio e inserciones musculares.
8. Osteotomía con sierra oscilante para obtener un aloinjerto estructural de 1.5 de
longitud por cada fémur (8 injertos estructurales en total).
9. Se lavan aloinjertos con solución salina y se empacan al vacío en bolsas estériles
después del secado.
10. Congelación a - 4° centígrados durante 4 semanas.Metodología 11
3.3.2 Fase II: Segundo tiempo quirúrgico
Para la fase II se definen dos grupos, (Figura 3):
a. Aloinjerto estructural congelado.
b. Aloinjerto estructural congelado + Medios Condicionados MC (DMEM:
medio de cultivo con citoquinas secretadas por MSC, no contiene células).
Fase I Fase II Fase III
•Adquision de •Intervencion. •Comparacion.
Aloinjertos •Grupo A: 4 conjeos. •Valoracion
•Sacrifico de 2 conejos Aloinjerto estructural radiologica y
donantes. Se Congelado Macroscopica.
Obtienen 8 injertos •Grupo B: 4 conjeos. •Valoracion
Histologica.
estructurales de •Aloinjertos
diafisis femoral de 1.5 estructural •H-E +
cm. congelado + Medios Inmunohistoquimica
•Se almacenan al condiconados. CD34 - CD31
vacio durante 4 • Semana 4 - • Semana 17
semanas. Tecnica
esteril. Semana 16
• Dia 0 -
Semana 4
Figura 3: Esquema metodología.
Ocho 8 conejos fueron sometidos a un segundo procedimiento quirúrgico, Grupo A
(Conejos 1 – 4) fueron intervenidos en el miembro inferior izquierdo y el Grupo B (Conejos
5 – 8 ) en el miembro inferior derecho, siguiendo el siguiente protocolo (Figura 4):12 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
1. El animal se manipula correctamente buscando evitar algún grado de estrés y que
el medicamento surta efecto eficazmente, es puesto en premedicación con
acepromacina2mg/kg de peso, 10 minutos después se le suministra 60 mg/Kg de
peso de ketamina y 2 mg/kg de xilacina por vía intramuscular, para que el animal
quede en estado de anestesia profunda.
2. Preparación de la extremidad a intervenir siguiendo el mismo protocolo de asepsia
y antisepsia utilizado en la fase I.
3. Anestesia local con 5 cc de Lidocaína subcutánea al 1 % sin epinefrina.
4. Incisión longitudinal sobre cara lateral sobre muslo a través de incisión quirúrgica
previa, disección tejido celular subcutáneo, apertura de fascias y musculatura
hasta exposición del fémur.
5. Se realiza montaje de fijador externo con ayuda de 4 clavos Steinman roscados de
2.0 bicorticales con ayuda de perforador manual.
6. Con sierra eléctrica oscilante se crea un defecto óseo de 1.5 cm además de
resección de periostio remante en zona expuesta.
7. Según la aleatorización correspondiente a cada conejo se coloca:
a. Aloinjerto estructural congelado de fémur de 1.5 cm
b. Aloinjerto estructural congelado de femur de 1.5 cm + Hidrogel con medios
condicionados (DMEM: medio de cultivo con citoquinas secretadas por
MSC, no contiene células).
Para la preparación del hidrogel con medios condicionados se utilizaron células madre
mesenquimales derivadas de tejido adiposo humano con un 80% de confluencia, las
cuales fueron lavadas 3 veces con PBS pH 7.4 (GIBCOTM) para eliminar restos de
DMEM + SFB 10%. Posteriormente se adicionó 3ml de medio libre de suero bovino fetal
(Opti-MEM® marca GIBCOTM) con penicilina 100U/mL, estreptomicina 100μg/mL y seMetodología 13
cultivo por 24h a 37°C, con una atmósfera de dióxido de carbono (CO2) al 5%. Pasadas
las 24h se recuperó el medio de cultivo y se centrifugó a 3000g por 10min en centrifuga
refrigerada para eliminar restos celulares. Finalmente se adicionó un coctel de inhibidores
de proteasas, se realizaron las diluciones necesarias para que todos los medios
condicionados quedaran a la misma concentración de proteína total (134μg/mL,
cuantificada con el método de Bradford) y se almacenó a -20°C hasta el día de su
implementación.
8. En el Grupo B el Hidrogel es cargado en el canal medular del aloinjerto y el
sobrenadante se aplica alrededor de los sitios de osteotomía.
9. Lavado de Campo quirúrgico con solución salina.
10. Cierre de fascia y piel. Colocación de gasas alcoholadas sobre heridas quirúrgicas.
11. Seguimiento posoperatorio de cada uno de los animales hasta la semana 16,
registrando posibles complicaciones como infección, aflojamiento del fijador
externo o muerte de los especímenes.
Figura 4: Procedimiento quirúrgico fase II.
Un segmento cortical diafisario de 1.5 cm fue osteotomizado y previamente fijado con ayuda de un
tutor externo (diseñado por los autores) compuesto por 4 clavos roscados al hueso, dos láminas de
acero y tres tornillos con rosca de seguridad para el posterior trasplante del aloinjerto.14 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
Figura 5: Procedimiento quirúrgico fase II.
12 ml de Hidrogel fue preparados a partir de plasma fresco humano como andamio biodegradable
del implante para contener los Medios Condicionados (MC) por Células madre mesenquimales
(MCS) de tejido adiposo (Ad-MCS).
Figura 6: Procedimiento quirúrgico fase II.
En el Grupo B el Hidrogel es cargado en el canal medular del aloinjerto y el sobrenadante
se aplica alrededor de los sitios de osteotomía.Metodología 15
3.3.3 Fase III: Interpretación de resultados. Evaluación
radiológica.
El día 120 postquirúrgico a la Fase II (Semana 17), se realizó el sacrificó de los 8 ocho
especímenes intervenidos, según protocolo descrito en la Fase I. Se realizó
desarticulación de cadera de las extremidades intervenidas para evaluación radiológica.
Se tomaron proyecciones anteroposterior (AP) y laterales del segmento anatómico
correspondiente al muslo de cada conejo previamente intervenido y rotulado. Se valoró la
calidad del callo y el aflojamiento del material.
Figura 7: Procedimiento quirúrgico fase III.
Evaluación Radiológica postoperatoria. (Grupo A Conejos 1-4 y Grupo B Conejos 5 -8)16 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
3.3.4 Fase III: Interpretación de resultados. Evaluación
Macroscópica e Histológica.
Las extremidades desarticuladas son despojadas de las inserciones musculares y demás
tejidos blandos adyacentes conservando el callo óseo conformado. Se valora la
estabilidad en la consolidación, mediante la percepción de movilidad en los sitios de unión
aloinjerto - huésped con la manipulación del fémur total, se describen las características
del callo y posición del aloinjerto. Figura 8.
Figura 8: Procedimiento quirúrgico fase III.
Evaluación Macroscópica postoperatoria. (Grupo A Conejos 1-4 y Grupo B Conejos 5 -8)
El espécimen es fijado en formalina al 10%. Luego decalcificado en ácido fórmico al 30%.
Después de la descalcificación se toma una tira longitudinal de 2 mm de espesor que
contiene el aloinjerto y las interfaces proximal y distal de la porción central del fémur,
denominando las zonas como Sitio de Interés (SDI). Estas tiras se bloquean en parafina y
cortes de 10 micras son utilizados para tinción histológica con tinción básica que evaluaraMetodología 17
el encierro del callo y con inmunohistoquimica marcador CD31 y CD34 que evaluará la
angiogénesis local. Figura 9.
Figura 9: Procedimiento quirúrgico fase III.
Evaluación Histológica. (Grupo A SDI y Grupo B SDI)18 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
4. Consideraciones éticas
Este estudio se realiza dentro de las normas éticas y los principios de bioética sugeridos
por la UNESCO y la ORGANIZACIÓN MUNDIAL DE LA SALUD para la experimentación
en animales. Y la normatividad nacional descrita para tal fin incluida en la Ley No. 84 de
1989. "Por la cual se adopta el Estatuto Nacional de Protección de los Animales", con
especial énfasis al Capítulo Sexto: Del Uso de Animales Vivos en Experimentos e
Investigación.
La investigación y los aportes que esta pueda generar son avalados por el grupo de
investigación y su propiedad intelectual será determinada de acuerdo con la ley y los
reglamentos expedidos por la universidad a este respecto; así mismo la autoría del
presente trabajo será de los investigadores relacionados en la ficha inicial.5. Resultados
5.1 Fase I
Durante la fase I se sacrificaron 2 conejos siguiendo el protocolo previamente establecido.
Se lograron recolectar en total 8 injertos estructurales cilíndricos diafisarios de fémur con
técnica estéril, sin complicaciones. Se almacenaron al vacío en bolsas en un congelador a
-4° durante 4 semanas. Después de este tiempo no se encontraron anormalidades
estructurales ni físicas macroscópicas de los aloinjertos, a la hora del trasplante.
5.2 Fase II
Durante la fase II se intervinieron 8 conejos (4 conejos del Grupo A y 4 conejos del Grupo
B) siguiendo el protocolo previamente establecido sin presentarse complicaciones
intraquirúrgicas ni postquirúrgicas. Las radiografías control mostraron adecuada posición
del material de fijación y del aloinjerto en todos los casos, aunque con el hallazgo
inesperado de presencia de fisis abierta en los especímenes.
No se documentaron manifestaciones sistémicas sugestivas de un proceso infeccioso o
de dolor asociado a complicaciones mecánicas con el dispositivo de fijación.
Todos los conejos mantuvieron nivel de consumo líquido y solido además de la capacidad
de apoyo y deambulación durante las 12 semanas de observación.20 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
Figura 10: Procedimiento quirúrgico fase II.
Radiografía control postoperatoria que muestra adecuada colocación de material de fijación y la
presencia de fisis abierta.5.3 Fase III:
5.3.1 Evaluación Radiológica. Lectura convencional:
Se realizó evaluación de todas las radiografías a las 12 semanas de la fase II y después
del sacrifico de los especímenes. Encontrando que todos los animales alcanzaron la
madurez esquelética durante el estudio, determinada por el cierre de las fisis.
Se encontró una tendencia hacia la formación de callo óseo hipertrófico en los sitios de
unión aloinjerto - huésped predominantemente en el Grupo B (Aloinjerto Congelado +
Medios Condicionados) en comparación al callo visualizado en los sitios de unión del
grupo A. De hecho en el Grupo B se observa callo óseo hipertrófico en sitios distales a la
transición aloinjerto – huésped. El dispositivo de fijación externa se visualizó en adecuada
posición en estos casos.
Se presentó un caso de aflojamiento del material de fijación en un espécimen de cada
grupo asociado a la formación de callo óseo insuficiente, mala orientación del aloinjerto y
deformidad angular. (Casos 2 y 6). Ver Figura 7.
5.3.2 Evaluación Macroscópica.
Se realizó valoración macroscópica de todas las piezas de fémur mediante inspección,
verificación de la estabilidad del fijador externo, la presencia de signos de infección y
movilidad en los sitios de unión aloinjerto – huésped.
A la inspección se encontró callo óseo hipertrófico en la mayoría de los especímenes del
Grupo B en comparación los visualizados del Grupo A, lo que dificulto distinguir con
facilidad los sitios de transición aloinjerto - huésped. Mediante palpación se encontró
estabilidad (ausencia de movilidad) en los sitios de unión y adecuada fijación del tutor
externo en ambos grupos.22 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
En los casos 2 y 6 (Grupo A y Grupo B respectivamente), se encontró la formación de una
colección caseosa en el tejido celular subcutáneo y en comunicación directa con los sitos
de inserción del fijador asociada a movilidad en los sitios de unión, inadecuada orientación
del aloinjerto, apariencia necrótica del aloinjerto, deformidad angular e inestabilidad a la
manipulación en los sitios de consolidación. Estos hallazgos fueron compatibles con un
proceso infeccioso. Ver figura 8.
5.3.3 Evaluación Histológica.
Todos los índices de vitalidad del injerto (formación de osteoide, encapsulamiento del
callo y osteocitos vitales) fueron significativamente mayores en el grupo de aloinjerto con
MC de Ad-MCS (Grupo B) en la valoración histológica con H-E. En el Grupo A no fue
posible identificar con claridad el aloinjerto lo que dificultó su valoración descriptiva
especifica. La densidad de los vasos en el aloinjerto y en las zonas de consolidación no
fue cuantificable, sin embargo la densidad de tejido positivo para la inmunohistoquímica
con CD31 – CD34, fue significativamente mayor en el Grupo B.
Hallazgos Grupo A: Islotes de cartílago con osificación endocondral discreta en la periferia
y en medio de las trabéculas de hueso neoformado hay lagunas de linfáticos. No parece
haber mayor cantidad de vasos. En la periferia de los núcleos de osificación hay tejido
fibroso. Las trabéculas de hueso son muy escasas y dispersas.
Hallazgos Grupo B: En la mayoría de casos se identifica el aloinjerto, parcialmente
reabsorbido y aunque la mayoría de las trabéculas de hueso están desvitalizadas, es
posible aún observar algunos osteocitos en las lagunas y del mismo modo en varias de
ellas hay ribete osteoblástico activo y bien definido con medular vascularizada, fibrosa,
vital. La neoformación de trabéculas de hueso es definitivamente más abundante,
compacta y homogénea que en el Grupo A.Figura 11: Evaluación Histológica.
Sitio de Interés SDI. Grupo B. A: Cortical Aloinjerto, C: Cartílago, *: Osificación endocondral.
Cuadros Verde y Azul: Sitios de Magnificación. Ver Figura 12.
Figura 12: Evaluación Histológica.
Magnificaciones Sitio de Interés (SDI)24 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
Figura 13: Evaluación Histológica.
Grupo A: Aloinjerto no identificable con islotes de cartílago con osificación endocondral discreta en
la periferia. En la periferia los núcleos de osificación hay tejido fibroso. Las trabéculas de hueso
son muy escasas y dispersas.
Casos de Infección Macroscópica (Caso 2 y 6).
Se realizó tinción básica con Hematoxilina y Eosina en los dos casos que se encontró
aflojamiento del material, inadecuada posición del aloinjerto y movilidad en los sitios de
unión para establecer características de la respuesta inflamatoria.
Hallazgos Grupo A (Caso 2): No se define el aloinjerto. Hay múltiples abscesos con
material necro inflamatorio rico en neutrófilos. No es posible evaluar el material ya que el
proceso inflamatorio estimula la producción de hueso. Compatible con proceso infeccioso
bacteriano.
Hallazgos Grupo B (Caso 6): Respuesta inflamatoria granulomatosa con la presencia de
ribete de histiocitos con tejido fibroso. Compatible con respuesta inflamatoria crónica
como reacción a cuerpo extraño.Figura 14: Casos de Infección.
5.3.4 Evaluación Inmunohistoquimica CD31 y CD34.
Los marcadores de inmunohistoquimica CD31 y CD34 no permitieron cuantificar la
densidad vascular por falta de especificidad tisular, sin embargo se encontró mayor
captación de contraste en los casos del grupo con MC de Ad-MCS (Grupo B), lo que
puede indicar un ambiente enriquecido por una respuesta celular mayor, en el sitio de
consolidación.
Figura 15: Evaluación Inmunohistoquimica.
Caso Grupo B con magnificación de las zonas de tinción. Se evidencian algunas arteriolas (a) pero
no es posible identificar vasos menores como capilares.26 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
Figura 16: Evaluación Inmunohistoquimica.
Captación de inmunomarcadores de forma comparativa Grupo A y Grupo B.6. Discusión
6.1 Técnica de trasplante aloinjerto óseo diafisario
congelado en Conejos
Con el presente trabajo se reprodujo la técnica de trasplante de aloinjerto óseo congelado
para manejo de defectos óseos en espécimen animal utilizando como dispositivo de
fijación un tutor externo diseñado por los autores. Sin embargo la cantidad de muestra fue
limitada y los hallazgos macroscópicos, radiológicos e histológicos son de corte trasversal.
Se deben realizar estudios que permitan valorar de manera secuencial en el tiempo los
diversos puntos evaluados y permitan establecer una tendencia de evolución.
6.2 Medios condicionados MC producidos por células
madre mesenquimales derivadas de tejido adiposo
por MSC-Ad y angiogénesis en el trasplante de
aloinjertos óseos diafisarios.
Las Células madre derivadas del tejido adiposo son similares a las derivadas de la Medula
ósea dado que son capaces de madurar a través de múltiples tejidos mesodérmicos,
incluyendo hueso, cartílago y grasa; estas son inmunosupresoras y expresan marcadores
de superficie similares. Las Células madre derivadas de tejido adiposo son únicas porque
se pueden obtener fácilmente en una forma mínimamente invasiva cosechadas a través
de una liposucción o biopsia grasa en una cantidad significativa sin la necesidad de
expansión en cultivos. Por esta razón son atractivas para las terapias celulares basadas
en la regeneración de tejidos.
Las características de las MCS-Ad incluyen la secreción de factores de crecimiento
reparadores, capacidad de diferenciación multilinaje, inmunosupresión de células inmunes
activadas y rastreo de áreas de lesión.
Secreción de factores de crecimiento: el secretoma de las MCS-Ad consiste en factores
de crecimiento, citoquinas, moléculas de matriz extracelular, proteasas, hormonas y28 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
mediadores lipídicos. La expresión de proteínas derivas de MCS-Ad es dirigida por
estímulos locales dentro del ambiente y es influenciada por el estado de diferenciación
celular.
De las proteínas descritas secretadas por las MCS-Ad, varias tienen aplicaciones en la
regeneración tisular y pueden ser benéficas sui se utilizan apropiadamente. Factores
como el Factor de crecimiento endotelial, Factor de crecimiento hepático y factor de
crecimiento Transformante Beta promueven la angiogénesis y la cicatrización de heridas
potenciando el desarrollo y crecimiento de nuevo tejido. Factores como la prostaglandina
E2 y la Interleuquina 10, son inmunosupresores y reducen la maduración de células
dendríticas y la consecuente activación de linfocitos T helper, reduciendo la inflamación y
formación de tejido de granulación.
El CD31 y CD34 son inmunomarcadores para células endoteliales de vasos sanguíneos y
linfáticos por lo que son utilizados para valorar la angiogénesis de algunos tumores en
asociación con el factor de Von Willebrand. Por esta razón se planteó su utilización para
intentar cuantificar la densidad vascular en las porciones centrales del aloinjerto como
prueba del efecto angiogénico de los Medios Condicionados. Sin embargo, el CD31 es
normalmente observado en las células endoteliales, reacciona además con plaquetas,
megacariocitos, macrófagos, granulocitos, linfocitos T y NK, osteoclastos y neutrófilos. Por
su parte el CD34 marca normalmente en el cordón umbilical, células hematopoyéticas,
células madre mesenquimales, células endoteliales progenitoras y maduras pero no es
tan homogéneo como el CD31 en linfáticos. Igualmente en mastocitos, en algunas células
dendríticas, en el intersticio y alrededor de los anexos cutáneo dérmicos [46]. De tal
manera que son marcadores inespecíficos y aún más cuando se interpretan en el
contexto de un proceso de consolidación como la integración de aloinjertos vasculares. La
mayor cantidad de captación de los marcadores en el Grupo B puede estar determinada
por la presencia aumentada de varios de los grupos celulares para los cuales estos
marcadores son positivos.7. Conclusiones y recomendaciones
7.1 Conclusiones
 Es posible la utilización de medios condicionados producidos por células madre
mesenquimales, basado en su efecto paracrino, como potenciador de la integración de
aloinjertos estructurales congelados no vascularizados en conejos para el tratamiento
de defectos óseos en huesos largos.
 La principal limitación del estudio radica en el pequeño tamaño de la muestra de
animales de experimentación y los hallazgos encontrados son puramente descriptivos
y a partir de ellos no se pueden hacer conclusiones generalizadas.
 Se encontró formación de callo óseo redundante macroscópica y radiológicamente en
la mayoría de especímenes del Grupo B (Aloinjerto + Medios Condicionados) al
compararlos con las características de consolidación del Grupo A.
 Todos los índices de vitalidad del injerto (formación de osteoide, encapsulamiento del
callo y osteocitos vitales en el aloinjerto) fueron significativamente mayores en el
grupo de aloinjerto con MC de Ad-MCS en la valoración histológica con H-E.
 La densidad de los vasos en el aloinjerto y en las zonas de consolidación no fue
cuantificable, sin embargo la densidad de tejido positivo para la inmunohistoquímica
con CD31 – CD34, fue significativamente mayor en el Grupo B.30 Efecto Angiogénico de los Medios Condicionados por Células Madre, en el trasplante de
aloinjerto óseo diafisario (Modelo Animal).
7.2 Recomendaciones
Los hallazgos encontrados plantean una alternativa para el tratamiento de defectos óseos
en huesos largos. Estos hallazgos deben ser evaluados con nuevos estudios en los
cuales se aumente la muestra estudiada y con un diseño de corte longitudinal que permita
realizar observaciones en diferentes tiempos de la integración. Adicionalmente es
importante la realización de estudios con marcadores metabólicos que precisen otros
mecanismos de acción de los Medios Condicionados.Bibliografía
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