Protocolo para el diagnóstico de Candidiasis Invasiva mediante amplificación de DNA ribosomal por PCR semi-nidada en muestras de plasma
Autor: Ospina Barragán, William Pascual
Asesor: Messa Botero, Oscar (Thesis advisor)
Fecha: 2009
Programa: Bogotá - Medicina -Fisioterapia
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Las infecciones micóticas son propias del paciente inmunocomprometido o severamente invadido. Se ha reconocido el riesgo mayor de invasión por Candida en pacientes neutropénicos, pero actualmente hay otras poblaciones de pacientes críticos no-neutropénicos en alto riesgo de infección.  La candidiasis invasiva es la cuarta causa de infección del torrente circulatorio en el ambiente hospitalario, con una mortalidad atribuible de hasta el 50%. El método estándar de diagnóstico se basa en hemocultivos, los cuales tienen un rendimiento del 50% según se ha documentado por estudios post mortem. Los análisis  preliminares han demostrado alta precisión para pruebas de diagnóstico molecular por PCR en infecciones micóticas amplificando DNA ribosomal; sin embargo, dichos estudios no se han validado con el uso de muestras clínicas. Nuestra  intención es estandarizar el método para la amplificación de DNA ribosomal con Cebadores  pre-elaborados que amplifican la región ITS 2 completa de Candida spp. y mediante protocolo de PCR nidada, amplificar segmentos específicos de 9 especies clínicamente relevantes de Candida, esta vez a partir de muestras clínicas de sangre. Se protocolizará dicha técnica en muestras de sangre para así ponerla en práctica posteriormente en un ensayo comparativo de efectividad diagnóstica de las diversas técnicas de diagnóstico actualmente disponibles para candidiasis invasiva. / Abstract: Fungal infections are characteristic of severely immunocompromised patient or invaded. It has recognized the increased risk of invasion by Candida in neutropenic patients, but today there are other populations of non-neutropenic critically ill patients at high risk of infection.  Invasive candidiasis is the fourth leading cause of bloodstream infection in the hospital environment, with an attributable mortality of up to 50%. The standard method of diagnosis is based on blood cultures, which have an efficiency of 50% as documented by postmortem studies. Preliminary tests have shown high accuracy for molecular diagnostic tests for fungal infections PCR amplified ribosomal DNA, but such studies have not been validated using clinical samples. Our intention is to standardize the method for ribosomal DNA amplification with primers that amplify pre-processed the complete ITS 2 region of Candida spp. and by nest-PCR protocol, amplify specific segments of 9 clinically relevant Candida species, this time from clinical samples of blood. It formalizes the technique on blood samples and subsequently implement it in a comparative test of diagnostic effectiveness of various diagnostic techniques currently available for invasive candidiasis

Protocolo para el diagnóstico de Candidiasis Invasiva
mediante amplificación de DNA ribosomal por PCR semi-
nidada en muestras de plasma.
GLOSARIO
ADN: ácido desoxirribonucleico; el material genético de los seres vivos.
Candidiasis Invasiva: presencia de Candida spp. En sangre o fluidos corporales normalmente
estériles.
DNTP: un nucleosido trifosfato que carece de grupos hidroxilo en los carbono 2 y 3 del
azúcar pentosa.
DNA polimerasa: una enzima que asocia un desoxirubunocleotido complementario a un
desoxiribunocleotido en un templado de cadena de ADN, con una unión fosfodiester al
grupo 3 hidroxilo del último nucleótido incorporado de la cadena creciente durante la
duplicación.
Lisis: la destrucción de las células por virus ó químicos ó tratamiento físico.
PCR: reacción en cadena de polimerasa; una técnica para amplificar un segmento específico
de ADN utilizando una DNA polimerasa termoestable, desoxirribonucleotidos, secuencias
cebadoras en múltiples ciclos de denaturación, renaturación, y síntesis de ADN.
Primer ó cebador: un corto oligonucleótido que hibridiza con una cadena de templado y
provee un terminal 3 hidroxilo para la iniciación de la síntesis de ácidos nucléicos.
Proteólisis: degradación enzimática de una proteína.
RESUMEN
Las infecciones micóticas son propias del paciente inmunocomprometido o severamente
invadido. Se ha reconocido el riesgo mayor de invasión por Candida en pacientes
neutropénicos, pero actualmente hay otras poblaciones de pacientes críticos no-
neutropénicos en alto riesgo de infección.
La candidiasis invasiva es la cuarta causa de infección del torrente circulatorio en el
ambiente hospitalario, con una mortalidad atribuible de hasta el 50%. El método estándar
de diagnóstico se basa en hemocultivos, los cuales tienen un rendimiento del 50% según se
ha documentado por estudios post mortem. Los análisis preliminares han demostrado alta
precisión para pruebas de diagnóstico molecular por PCR en infecciones micóticas
amplificando DNA ribosomal; sin embargo, dichos estudios no se han validado con el uso de
1muestras clínicas. Nuestra intención es estandarizar el método para la amplificación de DNA
ribosomal con Cebadores pre-elaborados que amplifican la región ITS 2 completa de
Candida spp. y mediante protocolo de PCR nidada, amplificar segmentos específicos de 9
especies clínicamente relevantes de Candida, esta vez a partir de muestras clínicas de
sangre. Se protocolizará dicha técnica en muestras de sangre para así ponerla en práctica
posteriormente en un ensayo comparativo de efectividad diagnóstica de las diversas
técnicas de diagnóstico actualmente disponibles para candidiasis invasiva.
PALABRAS CLAVE.
Candidiasis invasiva, diagnóstico molecular, PCR semi-nidada.
INVESTIGADORES.
William Pascual Ospina Barragán, Profesor Asesor Jorge Cortés Luna
2INTRODUCCION
Los adelantos técnico-científicos en medicina han logrado mejorar la supervivencia de
pacientes con enfermedades graves; sin embargo la exposición prolongada de dichos
pacientes al medio hospitalario y una variedad de condiciones subyacentes propias del
paciente predisponen a la colonización y posterior diseminación de infección por agentes
oportunistas incluyendo diferentes especies de hongos. Las infecciones del torrente
sanguíneo de los pacientes críticamente enfermos determinan un factor de mortalidad que
se eleva hasta el 50%. Tradicionalmente con la sospecha de infección bacteriemica se
solicitan hemocultivos seriados y se autoriza al clínico para iniciar antibióticoterapia dirigida
contra los microorganismos más probables según datos epidemiológicos locales y
susceptibilidad a los antibióticos conocida en el mismo lugar. En Estados Unidos Candida
spp. Representa la cuarta causa más frecuente de septicemia con una mortalidad en
promedio del 50%. Según datos locales de reportes de hemocultivos positivos, la infección
por Candida spp. se encuentra ubicada dentro de las primeras diez causas de origen
infeccioso. Estos datos son más dramáticos aún si la población a estudio reúne algunos
factores de riesgo tales como hospitalización prolongada, ingreso a UCI, uso previo de
antibióticos de amplio espectro, ventilación mecánica prolongada, sedación profunda,
presencia de dispositivos de invasión como sondas y catéteres, nutrición parenteral total,
neutropenia, los cuales son aditivos de forma independiente y predisponen
fisiopatológicamente a la infección mediante la colonización superficial micótica previa y la
disrupción de las barreras naturales de defensa y mecanismos de respuesta inmunitaria. De
tal forma se han desarrollado herramientas de predicción de colonización e infección por
hongos, las cuales desde un punto de vista epidemiológico justifican la búsqueda activa de
microorganismos mediante cultivos y el inicio pronto y adecuado de la terapia antifungica
más apropiada en espera de la confirmación microbiológica posterior.
El gold standard de infección micótica diseminada o invasiva lo constituyen los
hemocultivos cuyo rendimiento para mejor los casos es del 50%; esto quiere decir que la
mitad de los pacientes infectados por Candida spp. no se logrará documentar la infección
micótica o solo se identificará en forma tardía. La supervivencia de pacientes con candidiasis
diseminada depende en gran medida del pronto inicio de antimicóticos y de su actividad
frente a la Candida spp. Aislada. Desde un punto de vista fármaco-económico, aquellos
pacientes identificados de alto riesgo para colonización e infección micótica y con signos
clínicos de infección es completamente justificado dar manejo empírico antimicótico con
terapias efectivas pero no costosas y en esta medida es de vital importancia reconocer
también algunos factores de riesgo independientes que determinan resistencia a
antimicóticos habituales y de otro lado no costosos, por nombrar algunos la presencia de
enfermedad hemato-oncológica y el uso previo (tres meses antes) de antimicóticos del tipo
azol.
3Es menester de la biotecnología y biología molecular con aplicación clínica desarrollar una
herramienta de diagnostico para candidiasis invasiva rápida, simple que mejore la
sensibilidad diagnóstica y con suficiente especificidad que permita hacer un diagnostico
temprano y certero para dar tratamiento inequívoco, considerando de antemano mantener
una relación costo: beneficio razonable. Las técnicas de extracción de ADN y amplificación
por PCR se pueden modificar de tal forma que nos permitan esta meta.
4JUSTIFICACIÓN.
La candidiasis invasiva es una infección de pacientes críticos con una mortalidad de hasta el
50%; el diagnóstico clínico es difícil por su heterogeneidad clínica y la herramienta estándar
de diagnóstico actual está basada en los hemocultivos, los cuales, para las muestras de
sangre, alcanzan una sensibilidad del 50% en el mejor de los casos, imponiendo un amplio
sub-diagnóstico y retraso en el inicio de manejo antimicótico adecuado (1).
Es bien conocido que el inicio temprano de antibióticos en los casos de sepsis por
microorganismos bacterianos tiene impacto directo sobre la mortalidad; en el caso de la
candidiasis invasiva se acepta también que hay un impacto real sobre la mortalidad si los
antimicóticos se inician en el lapso de 12 horas después de haber tomado los hemocultivos;
sin embargo, los cultivos tradicionales tardan entre 48 y 72 horas y por tanto, el manejo
antimicótico se inicia de forma empírica si el paciente reúne predictores de alto riesgo para
infección por Candida (2).
Los clínicos tenemos a nuestra disposición tres tipos de medicamentos altamente activos
frente a Candida spp. que incluyen polienos, azoles y equinocandinas, actuando en diversos
procesos relacionados con la síntesis y estabilidad de la pared celular. Los polienos están
dentro del arsenal farmacéutico por más de 50 años y mantiene alta actividad frente a la
inmensa mayoría de especies de Candida clínicamente relevantes; su mayor inconveniente
lo representa el riesgo de nefrotoxicidad que puede afectar hasta el 50% de los pacientes
críticamente enfermos. Los azoles, constituyen la primera línea terapéutica frente a
infecciones por Candida spp. debido a su eficacia, bajo costo y mínima toxicidad; sin
embargo por el uso masivo para el tratamiento de otras micosis han surgido
progresivamente cepas de Candida albicans y no albicans resistentes a los azoles. Las
equinocandinas son medicamentos con un perfil de susceptibilidad adecuado y baja
toxicidad, sin embargo por su reciente introducción siguen teniendo alto costo.
Mencionado dicho contexto, es entonces ideal conocer la especie de Candida infectante y
de tal forma predecir la susceptibilidad al tratamiento con azoles, debido a que la elección
inapropiada del antimicótico tendrá un impacto directo sobre la morbi-mortalidad del
paciente.
Se propone una herramienta de diagnóstico rápido, con nivel óptimo de sensibilidad para
decidir el inicio de manejo y con la especificidad suficiente y capacidad de discriminar al
nivel de especie para de esta forma seleccionar el manejo antimicótico más apropiado
desde un inicio o en fases tempranas del tratamiento y que además no represente costos
inaceptablemente altos (relación costo : beneficio).
5PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA.
La candidiasis nosocomial es una infección micotica grave que ocurre principalmente en
pacientes críticamente enfermos y que han tenido hospitalización prolongada por otas
condiciones subyacentes.
El diagnostico de la candidemia ha sido tradicionalmente difícil por el bajo potencial de
positividad de los hemocultivos. Aunque diversos métodos de laboratorio para la detección
de anticuerpos específicos contra Candida, antígenos de Candida o metabolitos específicos
de Candida se han desarrollado, estos tienen poca especificidad y continúan siendo largos y
tediosos. Aun más, estos métodos son incapaces de diferenciar especies de Candida
diversas, lo cual es fundamental para el inicio de la terapia antimicótica adecuada.
Dadas estas limitaciones diagnosticas, los métodos de detección ADN ofrecen un medio de
diagnostico de candidiasis sistémica por un método más sensible.
Los trabajos hasta el momento realizados que involucran la amplificación de ADN por PCR se
basan en el previo cultivo de sangre y no han probado su eficacia a partir de muestras
clínicas directas. Adicionalmente debido al surgimiento de infecciones por Candida spp.
diversas cuyo perfil de susceptibilidad ha antimicóticos es variable, se quiere disponer de un
método diagnóstico que sea completamente sensible y a la vez suficientemente específico
a nivel de especie.
6OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL.
Protocolizar una prueba de diagnóstico de candidiasis invasiva por amplificación de DNA
ribosomal a partir de muestras de sangre.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.
1. Determinar las condiciones óptimas para toma de muestra de sangre, cantidad
ideal, tipo de anticoagulante y condiciones de transporte y almacenamiento de las
mismas.
2. Definir protocolo de procesamiento para extracción de DNA genómico de Candida a
partir de muestras de sangre.
3. Determinar las condiciones optimas de Reacción en Cadena de Polimerasa para
nuestros primers.
4. Hacer concepto teórico de la sensibilidad y especificidad esperada de dicha prueba
diagnóstica.
7MARCO TEORICO.
La candidemia es la cuarta infección del torrente sanguíneo del paciente hospitalizado,
particularmente prevalente en pacientes críticamente enfermos e inmunocomprometidos
en los cuales se han vulnerado las barreras físicas. Dicha afección alcanza una mortalidad del
50%, con una mortalidad atribuible independiente de hasta el 30 a 40% en pacientes con
malignidades hematológicas, y es mayor para las especies de Candida albicans y tropicalis y
menor para Candida parapsilosis (3).
El diagnóstico tradicional de las infecciones invasivas por hongos levaduriformes, se basa en
la observación directa, el cultivo y las pruebas serológicas, estas últimas dependientes de la
liberación al medio de antígenos de la levadura y la creación de anticuerpos por parte del
huésped.
Los hemocultivos son positivos entre el 40 y 60% de las candidiasis invasivas, según estudios
de autopsias (4).
Las pruebas de detección no basadas en cultivo, como la detección de anticuerpos,
antígenos y metabolitos carecen de sensibilidad y especificidad y además son demoradas en
su realización y no reportan la especie culpable, lo cual es de máxima importancia al
momento de elegir el tratamiento antimicótico, sobre todo en lugares donde la infección
por Candida no-albicans tiene prevalencia de hasta del 50% y cuyo perfil de susceptibilidad
a azoles es inadecuado (1).
La prueba ideal debe ser fácil de realizar, conllevar detección temprana de la infección,
diagnosticar si es posible un amplio rango de hongos y facilitar ultimadamente la detección
a nivel de especie.
La detección de 1,3-β-D-glucano es positiva para micosis invasivas, con un punto de corte de
60 pg/ml y diagnóstico definitivo en 80 pg/ml con sensibilidad de entre 60 y 100%
dependiendo de muestreo secuencial y especificidad entre 83 a 99%, con falsos positivos
entre 4,3 y 10%, incluyendo positividad falsa para pacientes en uso de membranas de
celulosa en hemodiálisis, tratamiento con inmunoglobulinas endovenosas y reactividad
cruzada con amoxicilina-clavulanato (5). Otras pruebas utilizadas en micología, como la
prueba de galactomanano, no son positivas en casos de Candida.
Para Candida se ha aprobado la detección del antígeno manano que se encuentra
mayoritariamente en la pared celular. Al respecto hay que recordar que la mananemia es
transitoria y que el protocolo incluye un paso que libere el manano de los anticuerpos
circulantes, lo cual es un paso crítico que puede disminuir su sensibilidad. Actualmente en
las mejores condiciones la sensibilidad reportada es del 90% y sensibilidad del 95%.
8Adicionalmente en el 55% de los casos la detección del manano precede en promedio 4,7
días al cultivo (5). Se trata de una prueba operador-dependiente.
Las pruebas de detección de anticuerpos por inmunofluorescencia para Ig-G dirigida contra
antígenos de la fase micelial invasiva tienen una sensibilidad del 84,4% y especificidad del
94,7% lo cual se esta optimizando mediante la producción de anticuerpos monoclonales
creados por el reto a modelos animales con antígenos recombinantes puros, evitando falsos
positivos resultado de modificaciones post-traduccionales de antígenos propios (6).
Los métodos de detección basados en ADN ofrecen un medio potencialmente más sensible
para el diagnóstico de infecciones con baja carga de gérmenes. La presencia de ADN de
diversos microorganismos patógenos en la sangre de paciente infectados ha sido
demostrada. La localización del microorganismo en la sangre es de valor crítico y un paso
limitante para definir a partir de qué tipo de muestra se debe trabajar; es decir para
microorganismos de localización intracelular la muestra ideal inicial es sangre total y el
material de trabajo será el concentrado de glóbulos rojos y blancos, luego de centrifugación
y separación del plasma. En el caso de las infecciones por Candida spp. no existía claridad
acerca de la muestra de trabajo inicial para optimizar la localización y posterior purificación
de ADN micótico. Hasta el momento diversos protocolos de PCR realizados en líquidos
corporales para detectar ADN de Candida han producido resultados algunos satisfactorios y
otro no tan alentadores (7). Investigaciones previas han logrado concluir que se puede
optimizar la extracción de ADN si se trabaja a partir de muestras de plasma y suero al
contrario de los se podría pensar pues la Candida al realizar centrifugación estaría a mayor
densidad en la fracción celular de la sangre, pues se han tenido mejores resultados de
muestras centrifugadas y libres de células por fenómenos de liberación de ADN de Candida
en forma fisiológica durante la fungemia.
En otros estudios la PCR carece de sensibilidad cuando se realiza de muestras de sangre o
suero; y en respuesta a esto se han implementado métodos, algunos basados en la
detección radioisotópica, lo cual es por ende de riesgo para el laboratorista e implica alta
complejidad.
Es de anotar que entre los casos de candidemia sospechada con hemocultivos negativos, un
protocolo de PCR nidada basado en la amplificación de ADN ribosomal fue positivo para el
56% de ellos, correlacionado esto con solo el 60% de pacientes con títulos de anticuerpos
positivos, pero correlacionado en 100% con el cultivos en 1 o más sitios anatómicos, con
una sensibilidad teórica de menos de 1 célula por mililitro y la ventaja de detectar células no
viables lo cual la pone a la cabeza como método de detección temprana (8). Nuestra
intención es estandarizar la técnica de extracción y purificación de ADN de Candida spp.
para posterior amplificación por PCR de genes específicos. Según conceptos teóricos
9llevados a la práctica, la sensibilidad puede ser mejorada hasta detectar una célula por 100
microlitros de sangre sin requerir la detección mediante sondas radiomarcadas.
Otra ventaja de los protocolos de PCR es que tienen mejor perfil para detectar infecciones
por 2 o más especies de Candida simultáneas, lo cual se ha encontrado hasta en el 30% de
los casos de infecciones diseminadas cuyo origen fue el tracto gastrointestinal (8-9).
El blanco de la PCR puede ser DNA con una o múltiples copias por genoma, teniendo gran
dificultad para purificar y amplificar genes de una sola copia y por el contario teniendo
mayor rendimiento con genes de múltiples copias; por ejemplo, el DNA ribosomal, tiene
normalmente entre 50 a 100 copias por genoma, lo cual aumenta la sensibilidad de la
prueba.
Se han reportado hasta el momento una sensibilidad de la PCR del 95% o superior, y una
especificidad de 97 a 99%.
Nuestra intención es facilitar el uso de una prueba molecular para el diagnóstico de
infecciones del torrente sanguíneo por Candida spp. y lograr amplificar el material genético
del hongo a partir de muestras de sangre.
Recientemente con el fin de evaluar la mejora potencial al tratamiento antimicrobiano
utilizando ensayos de PCR múltiplex, que identifican microorganismos en sangre
involucrados en sepsis, se comparo el desenlace de los pacientes que guiaron su
tratamiento basado en el resultado de hemocultivos vs el resultado de la PCR realizada de
sangre total. Se logro demostrar que por cada 100 PCR realizadas en UCI se ahorran 36,4
días de antibiótico inadecuado; sin embargo otros resultados como son desenlace de
mortalidad no son claramente diferentes, pues se tiene mortalidad a 30 días de 30% en
pacientes con hemocultivos positivos comparado con 26,7% para aquellos con solo PCR
positiva y 33,8% de mortalidad para aquellos con ambos positivos; de esto finalmente no es
posible determinar diferencias , pues dentro del mismo ensayo se lograron encontrar falsos
negativos importantes para la PCR así como también falsos positivos en relación con la
técnica de laboratorio, haciendo también hincapié en que la positividad de la PCR no se
correlaciona con la presencia de microorganismos activos (vivos). De rescatar de este
trabajo está el hecho que se logró amplificación de 5 especies de Candida spp, a partir de
sangre total pero con resultados bastante disímiles puesto que hay un total de 4
amplificaciones exclusivas para PCR, 3 resultados positivos solo para hemocultivos y 6
resultados positivos en ambos métodos con lo cual se puede tener solo igual sensibilidad de
la PCR comparada a los hemocultivos para candidiasis invasiva.
Conocemos igualmente que la colonización por Candida a menudo precede la infección y
que la colonización de múltiples sitios es un factor de riesgo independiente para infección
invasiva, el inconveniente mayor de esto es de tipo económico pues es costoso hacer
tamización para hongos sistemática en todos los pacientes de UCI luego de una semana de
estancia.
10Quizás lo más importante del índice de colonización sea que la ausencia de al menos 2 sitios
colonizados es un predictor preciso de no infección por Candida con valor predictivo
negativo de 100%.
Nuevamente León, de forma prospectiva esta vez y publicado en el 2009 demuestra que el
mejor predictor para candida invasiva es el score de Candida positivo sumado a un
marcador surrogado como lo es el d-glucano; sin embargo, continua siendo válido dar
tratamiento preventivo a los pacientes con score por encima de 3 como lo hemos planteado
previamente como herramienta de selección para toma de muestra y de esta forma hacer
diagnostico rápido y preciso , lo cual se verá reflejado en tratamiento oportuno y con
espectro adecuado.
Uno de los problemas que limitan la sensibilidad de las pruebas por PCR para hongos
levaduriformes es la presencia de una pared celular gruesa y resistente a los protocolos
habituales de lisis celular, de tal forma que la liberación del ADN genómico se disminuye y
por tanto la extracción efectiva y purificación de ADN son claramente inferiores a los
logrados con microorganismos que no poseen pared celular. Conocido este aspecto
fundamental de barrera mecánica y factor decisivo para la extracción óptima de ADN se
requiere un método efectivo por el cual se logre lisis celular aumentando la disponibilidad
de ADN puro e integro en ausencia de inhibidores de PCR, fácil y rápida de desarrollar.
Los protocolos tradicionales de extracción de ADN de células micóticas son muy extensos en
tiempo y muestran pobre liberación de ADN comparado a los métodos de extracción de
ADN de células humanas, bacterias o virus. Otros protocolos requieren pasos adicionales de
lisis como la disrupción mecánica, zonificación, exposición química, digestión enzimática,
entre otros. Los métodos de exposición a enzimas proteolíticas se utilizan para deteriorar la
integridad de la pared celular, convertir las levaduras a una forma débil llamada
esferoplasto que contiene ADN cubierto por una membrana débil que es francamente
susceptible a las técnicas de destrucción de proteínas para liberación de ácidos nucléicos y
posterior purificación.
Se conocen por los menos tres tipos de enzimas con capacidad de lisis superior al 75-90% de
lisis de la pared celular y que preservan la integridad del ADN liberado, lo cual es requerido
para el posterior análisis y amplificación por técnicas de PCR.
Es probable que dicha dificultad técnica a la hora de trabajar con levaduras, constituye la
principal limitante para mejorar la sensibilidad de una prueba diagnostica basada en ADN.
De las enzimas disponibles podemos mencionar la proteinasa K, la liticasa y la zimoliasa las
cuales se encargan de identificar y destruir glucanos, constituyentes esenciales de la pared
celular; sin embargo, se requiere la exposición previa a agentes osmóticos, detergentes,
entre otros que alteren la estructura tridimensional de las proteínas y de esta manera
facilitar la acción de las enzimas mencionadas.
11Los métodos de amplificación por PCR de ADN desarrollados hasta el momento no son lo
suficientemente sensibles cuando se trabaja a partir de muestras de fluidos y líquidos
corporales potencialmente infectados, y esto ha sido subsanado mediante el precultivo de
muestras clínicas, lo cual desde el punto de vista tiempo no confiere ventajas y a la postre
aumentaría costos.
Existen hoy en día en el mercado múltiples kits desarrollados que facilitan y agilizan la
extracción de ADN de bacteria y hongos, los cuales aumentan de forma ostensible los costos
y cuando se han comparado versus los métodos tradicionales extracción y purificación de
ADN son por lo menos 10 a 100 veces menos sensibles al trabajar con muestras clínicas.
12METODOLOGÍA
Tipo de estudio: Estudio experimental de desarrollo de una prueba molecular para aplicar
en muestras de sangre periférica.
Tipo de pacientes: Pacientes críticamente enfermos en Unidad de Cuidado Intensivo con
alto riesgo para el desarrollo de candidiasis invasiva. Debido a que hasta el momento no hay
ninguna regla de predicción de aplicación clínica ampliamente validada para candidiasis
invasiva y las disponibles no superan una captación de más del 40% de candidemias;
aquellos pacientes que reúnan los criterios clínicos de acuerdo a la escala de León, esto es
puntaje superior a 3 según dicha puntuación. También serán candidatos ideales aquellos
pacientes con al menos 1 hemocultivo positivo para Candida spp. y en quien no se haya
iniciado manejo antifúngico. Para identificar los pacientes en riesgo se utilizará la escala de
puntaje de Candida desarrollada por León y sus colaboradores. Esta escala tiene las
siguientes variables:
Tabla 1
Variable Puntaje
Cirugía al ingreso a UCI 1
Sepsis severa 2
Nutrición parenteral total 1
Colonización por Candida 1
La escala se considera positiva cuando el puntaje es mayor o igual a 3.
Procedimiento:
Con el consentimiento informado y firmado por el paciente o acudiente legal, se procederá
mediante venopunción a la recolección de sangre (usualmente en conjunto con las muestras
de rutina tomadas por el laboratorio).
Las muestras deben ser recolectadas en tubos de vacio con aditivo anticoagulante de EDTA;
dichas muestras serán refrigeradas inmediatamente a 4 grados centígrados ó mantenidas en
ambiente cerrado con hielo seco para asegurar cadena de frio y llevar al laboratorio de
análisis en el transcurso de no más de 24 horas.
Al llegar al laboratorio las muestras serán sometidas a proceso de lisis de glóbulos rojos y
leucocitos así como remoción de enzimas del plasma con potencial de degradación del ADN.
Se debe valorar la técnica de lisis centrifugación que se realiza previo al método de cultivo
13actual, pues este puede ser optimizado para nuestro fin. Este proceso se realizará mediante
protocolo que incluya saponina u otro detergente y proteinasa K o un protocolo similar que
asegure limpieza de la muestra sin degradación del ADN genómico.
La purificación posterior del ADN puede incluir el paso por una columna de nitrocelulosa y
uso secuencial de fenol y cloroformo según se estandarice.
Al tener la muestra purificada de ADN se procederá al protocolo de PCR según se
estandarizo en estudio previo (Estudio sin publicar) que dio rendimiento óptimo con
sensibilidad a partir de cultivo del 100% y especificidad del 100% al corroborar mediante
análisis de secuencia y comparado con la tipificación estándar del protocolo API 20C AUX
cuya especificidad es menor. Esta vez se realizará a partir de muestras de sangre.
Los primers a utilizar son: 2 primers universales CTSF (5’-TCGCATCGATGAAGAACGCAGC-3’) y
CTSR (5’-TCTTTTCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) para amplificar la región ITS 2 entera. Luego
se utilizaran primers específicos para 9 especies de Candida anidados en el extremo 3´.
Las condiciones de PCR serán las determinadas en este mismo estudio.
Los resultados se consideran positivos con la aparición de una ó varias bandas de ADN
marcado con bromuro de etidio, del tamaño esperado y visualizado con luz ultravioleta en
comparación con marcadores de tamaño molecular de 100 pares de bases de ADN.
Según los datos obtenidos y la comparación de su rendimiento versus el rendimiento del
hemocultivo, se realizara el análisis posterior de utilidad, esto incluye revisión sistemática
del tema, determinación de datos estadísticos teóricos de sensibilidad y especificidad al
menos y análisis costo:beneficio para planear un estudio mayor en pacientes críticos de
comparación de técnicas diagnósticas en candidiasis invasiva.
14RESULTADOS ESPERADOS.
1. Definir el protocolo de una prueba de diagnóstico molecular por PCR para
candidiasis invasiva, que sea útil con muestra clínicas de sangre para poder realizar
posteriormente la determinación de su sensibilidad y especificidad en campo.
2. Realizar actividades de investigación básica de aplicación clínica que permitan la
promoción de postgrado como parte integral de la formación de Especialidad en
Medicina Interna.
RESULTADOS
Se ha logrado la aprobación por los comités científico y ético del Hospital de La Samaritana,
E.S.E, además se realizó la gestión administrativa con la entidad coordinadora de una de las
dos unidades de cuidado intensivo de este mismo Hospital.
Se inicio la recolección de muestras clínicas, previa firma de consentimiento informado del
paciente o de su acudiente desde el día 22 de septiembre de 2009, y hasta la fecha.
En breve se han tomado 2 muestras de sangre total por venopunción simple de pacientes
con candidemia diagnosticada por medio de hemocultivos convencionales.
En el laboratorio clínico del Hospital de la Samaritana E.S.E. se nos ha facilitado la
tipificación de las Candidas aisladas a nivel de especie, dato que se ha preferido mantener
cegado para los investigadores.
Cada una de las muestras se ha manipulado en el laboratorio clínico, atendiendo normas de
bioseguridad, asepsia, antisepsia. Como paso inicial se somete a centrifugación las muestras
equilibradas a 1000-2000 revoluciones por minuto rpm, para facilitar la separación del
plasma requerido para posterior análisis.
Luego de la separación por aspiración del plasma, cada una de las muestras se rotula y sella
para su mantenimiento en congelación a -20 grados centigrados.
Al día siguiente de recolección se ha asegurado el trasporte de las muestras hasta el
laboratorio de biología molecular, manteniendo la debida cadena de frío evitando la
degradación térmica del material genético contenido. Se ha dispuesto un sitio de
almacenamiento común con el debido marcado y conocida ubicación de las muestras
propias del proyecto.
Se ha considerado por parte de los investigadores un mínimo de muestras de 10 pacientes
para realizar el análisis molecular previamente especificado por técnica de PCR nidada.
El número de muestras es el que se considera adecuado para lograr la estandarización de la
técnica de biología molecular.
El manteniendo del ciego de los investigadores para el resultado de los estudios de
microbiología se cree conveniente para darle validez interna a la prueba y poderla utilizar
como prueba piloto cuya utilidad clínica se establecerá en análisis posteriores de campo.
A el momento no es posible el análisis inmediato de las muestras clínicas, pues se quiere
hacer el experimento consecutivo de las muestras en su totalidad y no se han adquirido
algunos reactivos específicos susceptibles de degradación; por tal motivo, las muestras
almacenadas corresponden a plasma y no se almacenan muestras de sangre total que
15sufren un rápido proceso de degradación del ADN, el cual se quiere obtener en buenas
condiciones para su análisis.
Bajo las condiciones de almacenamiento y cadena de frío adecuados se asegura la
integridad del ADN por más de un año.
De acuerdo al amplio análisis de los diversos protocolos de extracción de ADN genómico de
levaduras y las diversas formas disponibles de optimizar las técnicas de PCR, hemos
formulados un protocolo unificado que logrará subsanar las debilidades de investigadores
anteriores con respecto a una baja sensibilidad, lograremos un diagnostico rápido y
oportuno que permitirá el pronto inicio de antimicóticos y dispondremos de la suficiente
especificidad y tipificación a nivel de especie de nueve de las más relevantes y de
importancia clínica especies de Candida.
El protocolo involucra utilizar muestras de plasma o suero, hacer predigestión con un buffer
de lisis, digestión enzimática a altas concentraciones de proteinasa K, precipitación de
proteínas por métodos químicos, la no utilización de agentes volátiles en los pasos de
purificación y la posterior amplificación por PCR de genes propios de Candida spp. y un paso
adicional de PCR nidada con cebadores específicos de nueve de las especies clínicamente
relevantes de Candida spp. lo cual esperamos logre la máxima sensibilidad y especificidad
para ser probada y comparada con los métodos actúales de diagnostico manteniendo un
bajo costo.
En breve el protocolo consiste en:
1. Extracción por venopunción simple de 5ml de sangre.
2. Centrifugación de la muestra a 1000 rpm por 1 minuto.
3. Tomar el sobrenadante de plasma, evitando la interfase celular.
4. Trabaje con 1 ml de plasma obtenido por este método.
5. Para un rápido diagnostico procese las muestras de inmediato, de lo contrario
guarde esta muestra a -20 grados centígrados.
6. Centrifugue la muestra de plasma a 3500 rpm durante 5 minutos.
7. Descarte el sobrenadante.
8. Redisuelva el pellet en 750 microlitros de buffer de lisis (50 milimolar tris-HCl pH
7.2, 50m milimolar EDTA, 3% SDS, 1% de beta-mercaptoetanol).
9. Incube a 65 grados centígrados por 1 hora.
10. En este momento adicione proteinasa K 1miligramo por mililitro de solución y deje
en baño maría de 50 grados centígrados por 3 horas si es posible en agitación
permanente.
11. Enfríe al ambiente.
12. Adiciones 0.8 volúmenes de acetato de sodio 3 molar pH 5.2, seguido de igual
volumen de isopropanol absoluto.
13. Mezcle por inversión durante 2 minutos.
14. Centrifugue a 10000 rpm durante 15 minutos.
15. Descarte el sobrenadante.
16. Lave el pellet una vez con etanol al 70% y centrifugue nuevamente en iguales
condiciones.
17. Retire el sobrenadante.
1618. Deje secar a temperatura ambiente o al vacio a 50 grados centígrados por 50
minutos.
19. Resuspenda el pellet en 50 microlitros de buffer TE.
20. Tome para cada reacción de PCR un tubo de PCR de 0.2 mililitros, para una reacción
con volumen total de 10 microlitros, conteniendo buffer de PCR 1X, una unidad de
Taq DNA polimerasa, 10 p mol de cada uno de los primers CTSF y CTSR, 5 microlitro
del DNA extraído en el paso anterior y 0.1 mM de cada uno de los desoxinucleosido
trifosfato.
21. Después del primer paso de amplificación 1 microlitro del producto es amplificado
usando el primer reverso inicial CTS1R y un primer especie específico en 9 tubos
separados para cada especie de Candida spp. a ser detectada.
22. Para cada PCR seminidada la mezcla de reacción consiste de buffer de PCR 1X, una
unidad de Taq DNA polimerasa, 5 pmol de CTSR, junto con 5pmol de cada uno de
los primers especie específicos, 1 microlitro del primer producto de PCR, y 0.1
milimol de cada dNTP.
23. Las condiciones de PCR son las siguientes: denaturación a 94 grados centígrados
por 1 minuto, anillaje a 60 grados centígrados por 30 seg. Y extensión a 72 grados
centrigrados por 1 minuto. Incluya un paso inicial de denaturación a 94 grados
centígrados por 3 minutos y un paso final de extensión a 72 grados centígrados por
10 minutos.
24. Realice 30 ciclos de la primera PCR seguido por 20 ciclos de la PCR seminidada.
25. Para detectar los fragmentos de ADN amplificados realice una electroforesis en gel
de agarosa en comparación con marcadores de peso molecular para cada una de
las muestras y determine la línea amplificada que definirá la especie.
La sensibilidad esperada según los conceptos teóricos debe superar el 80% y la especificidad
será cercana al 100% con la capacidad de identificar 9 especies de candida spp. clínicamente
relevantes.
17CONCLUSIONES
Las limitaciones de los sistemas de hemocultivo para la detección de fungemia han llamado
la necesidad de desarrollar métodos alternativos, rápidos, sencillos y precisos. La PCR
nidada a partir de ADN extraído por métodos de lisis y purificado mediante precipitación
tiene mejor desempeño que los hemocultivos y más aún si se realiza con base en plasma o
suero logrando una detección acelerada y especiación del patógeno causal hasta por cuatro
días.
18BIBLIOGRAFÍA
1. Arjuna N.B. Ellepola1,2 and Christine J. Morrison1, Laboratory Diagnosis of Invasive Candidiasis.
The Journal of Microbiology, February 2005, p.65-84.
2. Garey KW, Rege M, Pai MP et al. Time to initiation of fluconazole therapy impacts mortality in
patients with candidemia: a multi-institutional study. Clin Infect Dis 2006; 43: 25–31.
3. Peter G. Pappas, MD. Invasive Candidiasis. Infect Dis Clin N Am
20 (2006) 485–506.
4. Berenguer J, Buck M, Witebsky F, et al. Lysis-centrifugation blood cultures in the detection
of proven invasive candidiasis: disseminated versus single organ infection. Diagn Microbiol
Infect Dis 1993;17:103–9.
5. Fasahat F Alam, Abu S Mustafa and Zia U Khan*. Comparative evaluation of (1, 3)-β-D-glucan,
mannan and anti-mannan antibodies, and Candida species-specific snPCR in patients with
candidemia. BMC Infectious Diseases 2007, 7:103.
6. Ana La´ın,1 Natalia Elguezabal,1 Elena Amutio,2 I ˜ nigo Fern´andez de Larrinoa,3
Mar´ıa DoloresMoragues,4 and Jos´e Pont´on1. Use of Recombinant Antigens for the Diagnosis of
Invasive Candidiasis. Clinical and Developmental Immunology
Volume 2008, Article ID 721950, 7 pages.
7. P. Lewis White,* Richard Barton,† Malcolm Guiver,‡ Christopher J. Linton,§ Steve Wilson,
Melvyn Smith,_ Beatriz L. Gomez,** Michael J. Carr,†† Patrick T. Kimmitt,‡‡ Shila Seaton,** Kumar
Rajakumar,‡‡ Tessa Holyoake,§§ Chris C. Kibbler,** Elizabeth Johnson,§ Richard P. Hobson,† Brian
Jones, and Rosemary A. Barnes*. A Consensus on Fungal Polymerase
Chain Reaction Diagnosis?. Journal of Molecular Diagnostics, Vol. 8, No. 3, July 2006.
8. Suhail Ahmad, Zaiba Khan, Abu S. Mustafa, and Zia U. Khan*. Seminested PCR for Diagnosis of
Candidemia: Comparison with Culture, Antigen Detection, and Biochemical Methods for Species
Identification. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, July 2002, p. 2483–2489.
9. RETNO WAHYUNINGSIH,1,2* HANS-JOACHIM FREISLEBEN,2 HANS-GU¨NTHER SONNTAG,3
AND PAUL SCHNITZLER4. Simple and Rapid Detection of Candida albicans DNA in
Serum by PCR for Diagnosis of Invasive Candidiasis. JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Aug.
2000, p. 3016–3021.
10. Resolucion 8430 de 1993 del mMinisterio de Salud de Colombia-.
1911. McNeil MM, Nash SL, Hajjeh RA, Phelan MA, Conn LA, Plikaytis BD, Warnock DW: Trends in
mortality due to invasive mycotic diseases in the United States, 1980-1997. Clin Infect Dis 2001,
33(5):641-647.
12. Edmond MB, Wallace SE, McClish DK, Pfaller MA, Jones RN, Wenzel RP: Nosocomial
bloodstream infections in United States hospitals: a three-year analysis. Clin Infect Dis 1999,
29(2):239-244.
13. Wisplinghoff H, Bischoff T, Tallent SM, Seifert H, Wenzel RP, Edmond MB: Nosocomial
bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24,179 cases from a prospective nationwide
surveillance study. Clin Infect Dis 2004, 39(3):309-317.
14. Cheng MF, Yang YL, Yao TJ, Lin CY, Liu JS, Tang RB, Yu KW, Fan YH, Hsieh KS, Ho M et al: Risk
factors for fatal candidemia caused by Candida albicans and non-albicans Candida species. BMC
Infect Dis 2005, 5(1):22.
15. Morgan J, Meltzer MI, Plikaytis BD, Sofair AN, Huie-White S, Wilcox S, Harrison LH, Seaberg
EC, Hajjeh RA, Teutsch SM: Excess mortality, hospital stay, and cost due to candidemia: a case-control
study using data from population-based candidemia surveillance. Infect Control Hosp Epidemiol 2005,
26(6):540-547.
16. Pfaller MA, Diekema DJ: Role of sentinel surveillance of candidemia: trends in species
distribution and antifungal susceptibility. J Clin Microbiol 2002, 40(10):3551-3557.
17. Lopez C, Giro L, Ramos L, Ramadan S, Bulacio L: [Comparison of different methods for species
identification of genus Candida]. Rev Argent Microbiol 2005, 37(1):16-21.
18. Ahmad S, Khan Z, Mustafa AS, Khan ZU: Seminested PCR for diagnosis of candidemia:
comparison with culture, antigen detection, and biochemical methods for species identification.
Journal of clinical microbiology 2002, 40(7):2483-2489.
19. Pfaller MA, Diekema DJ, Messer SA, Boyken L, Hollis RJ, Jones RN: In vitro activities of
voriconazole, posaconazole, and four licensed systemic antifungal agents against Candida species
infrequently isolated from blood. Journal of clinical microbiology 2003, 41(1):78-83.
20. Sullivan D, Coleman D: Candida dubliniensis: characteristics and identification. Journal of
clinical microbiology 1998, 36(2):329-334.
21. Fujita S, Lasker BA, Lott TJ, Reiss E, Morrison CJ: Microtitration plate enzyme immunoassay to
detect PCR-amplified DNA from Candida species in blood. Journal of clinical microbiology 1995,
33(4):962-967.
2022. FastPCR, PCR primer design, DNA and protein tools, repeats and own database searches
program [http://www.biocenter.helsinki.fi/bi/programs/fastpcr.htm]
23. Resende JC, de Resende MA, Saliba JL: Prevalence of Candida spp. in hospitalized patients and
their risk factors. Mycoses 2002, 45(8):306-312.
24. Almirante B, Rodriguez D, Park BJ, Cuenca-Estrella M, Planes AM, Almela M, Mensa J, Sanchez
F, Ayats J, Gimenez M et al: Epidemiology and predictors of mortality in cases of Candida
bloodstream infection: results from population-based surveillance, barcelona, Spain, from 2002 to
2003. Journal of clinical microbiology 2005, 43(4):1829-1835.
25. Pinjon E, Moran GP, Jackson CJ, Kelly SL, Sanglard D, Coleman DC, Sullivan DJ: Molecular
mechanisms of itraconazole resistance in Candida dubliniensis. Antimicrob Agents Chemother 2003,
47(8):2424-2437.
26. St-Germain G, Laverdiere M: Torulopsis candida, a new opportunistic pathogen. Journal of
clinical microbiology 1986, 24(5):884-885.
27. Reiss E, Tanaka K, Bruker G, Chazalet V, Coleman D, Debeaupuis JP, Hanazawa R, Latge JP,
Lortholary J, Makimura K et al: Molecular diagnosis and epidemiology of fungal infections.
Med Mycol 1998, 36 Suppl 1:249-257.
28. Ellepola AN, Hurst SF, Elie CM, Morrison CJ: Rapid and unequivocal differentiation of Candida
dubliniensis from other Candida species using species-specific DNA probes: comparison with
phenotypic identification methods. Oral Microbiol Immunol 2003, 18(6):379-388.
21ANEXOS
CONSIDERACIONES ÉTICAS
A los pacientes seleccionados e involucrados en el estudio se les tomará una muestra de
sangre adicional (es decir, aparte de las muestras requeridas por su condición clínica y
aparte de las necesarias para hemocultivo), de aproximadamente 10 mililitros,
concomitante con las muestras clínicas necesarias. El riesgo de tal intervención es el mínimo
por lo cual se solicitará a las instituciones investigadoras que el consentimiento informado
se obtenga a partir del acudiente por escrito (10). Los resultados del ensayo de laboratorio
no influirán sobre la práctica clínica debido a que este resultado debe ser positivo en el
laboratorio de la Institución para que sea procesado por técnicas moleculares.
IMPACTO
Ambiental: Durante la realización de este estudio no se tienen previstos ninguna
intervención ó impacto ambiental, pues no se incidirá en el tratamiento antifúngico del
paciente y por lo tanto no habrá presión sobre las especies micóticas propias y colonizantes
que podrían modificarse.
Pertinencia social: la meta de este estudio, es demostrar en un estudio piloto la utilidad de
las muestras clínicas de sangre para el diagnóstico rápido por PCR de candidiasis invasiva.
Con los resultados obtenidos se planeará estudio mayor para determinar la sensibilidad y
especificidad de la prueba en comparación con las pruebas de diagnóstico actualmente
disponibles en el mercado. Los pacientes con candidiasis invasiva que no reciben
tratamiento oportuno y acertado resultan en aumento de costos de hospitalización por
complicaciones tardías de la infección y estancia prolongada, además del riesgo de
mortalidad.
Aporte a la educación: en primer plano, este trabajo y su análisis servirán para la promoción
de un estudiante de la Especialidad de Medicina Interna de la Universidad Nacional de
Colombia y se vincularán docentes de la universidad. Además se espera incluir este estudio
dentro de la línea de investigación en micosis del Grupo de Investigación en Enfermedades
Infecciosas de la Facultad de Medicina de la Universidad. Los resultados de este estudio
tendrán inmediata difusión entre los estudiantes de medicina de pregrado y posgrado de
medicina interna e infectología. Este estudio será presentado en eventos de investigación
22locales con el fin de dar a conocer la información a otros grupos médicos y especialistas
interesados en el tema.
Aporte a la ciencia y tecnología: se considera se trata de un estudio innovador en el campo,
en donde no hay estándar de predicción, ni de diagnóstico, en una afección de alto impacto
sobre morbimortalidad para los pacientes. Se espera que los resultados sean positivos y de
utilidad para el diagnóstico rápido de candidiasis invasiva y así depurar la prueba diagnóstica
ofrecida desde el campo de la biología molecular aplicada. Se estima que los resultados y su
análisis puedan ser plasmados en un artículo de investigación como trabajo de grado de la
especialidad de medicina interna y enviado a una revista científica internacional, en
conjunto con los datos del desarrollo de la prueba.
Productividad: A largo plazo se plantea que dar el diagnóstico preciso y rápido de
candidiasis invasiva determine cambios en los protocolos clínicos de diagnóstico de esta
enfermedad, que se traduzcan en menores costos de hospitalización al evitar
complicaciones determinadas por el avance no previsto de dicha infección y eventualmente,
en tratamientos más oportunos con disminución de la morbilidad y mortalidad de la
población afectada.
23