Análisis de la expresión por inmunohistoquímica de MLH1, MSH2, PMS2 y MSH6 en cortes histológicos de casos de Carcinoma Colorrectal sin mutación de KRAS (exón 2 codón 12 y 13)
Autor: Ruiz Amaya, Diego Alberto
Asesor: Espinosa Almanza, Carmelo José (Thesis advisor)
Fecha: 2017
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: El Carcinoma Colorrectal (CCR) es una de las principales neoplasias a nivel mundial, siendo la tercera causa de muerte por cáncer, constituyendo un problema de salud pública en países desarrollados, donde estrategias en tamización y diagnóstico precoz han permitido reducir su mortalidad. El CCR es un tumor heterogéneo, desde el punto de vista molecular, la mayoría siguen la secuencia adenoma-carcinoma, mediada por inestabilidad cromosómica, mientras una fracción menor se asocia a inestabilidad de microsatélites (IMS) por mutación o alteraciones epigenéticas de los genes de reparación del ADN. En Colombia, sin embargo, existen pocos estudios sobre las alteraciones genéticas y epigenéticas en CCR.     El propósito del proyecto fue analizar la expresión de los genes de reparación por inmunohistoquímica en casos de CCR en los cuales se habían excluido mutaciones del gen KRAS por estudios moleculares previos.    Se estudiaron en total 54 casos a los que se les realizó microarreglos de tejidos. A cada microarreglo se les realizó coloración de hematoxilina-Eosina y los 4 marcadores de los genes de reparación (MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6) por inmunohistoquímica.     En los resultados, el fenotipo alterado predominó en hombres (70%), con promedio de edad de 60.9 años y una frecuencia de 18.5%. Los marcadores de inmunohistoquímica con mayor ausencia de expresión fueron MLH1 y PMS2 (total 90%).    Como conclusión podemos decir que la frecuencia de este fenotipo de IMS en nuestra serie es ligeramente superior a lo encontrado en la literatura (18.5% vs 13-15%) en casos no discriminados por genotipo silvestre para la mutación KRAS.

Análisis de la expresión por
inmunohistoquímica de MLH1, MSH2,
PMS2 y MSH6 en cortes histológicos
de casos de Carcinoma Colorrectal
sin mutación de KRAS (exón 2 codón
12 y 13).
Diego Alberto Ruiz Amaya
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Patología
Bogotá, Colombia
2017MLH1, MSH2, PMS2 y MSH6 en cortes
histológicos de casos de Carcinoma
Colorrectal sin mutación de KRAS (exón
2 codón 12 y 13).
Diego Alberto Ruiz Amaya
Trabajo de Grado presentado como requisito para optar al título de:
Patólogo Anatómico y Clínico
Director:
Dra. Jinneth Acosta Forero
Profesora Asociada, Universidad Nacional de Colombia
Codirector:
Dr. Orlando Ricaurte Guerrero
Profesor Titular, Universidad Nacional de Colombia
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Patología
Bogotá, Colombia
2017A Pilar, Sofía y Alejandro, porque son mi inspiración, mi motivo, la fuerza y la
razón de mi vida, por su infinito amor y paciencia, brindándome la fortaleza y
apoyo incondicional.
A mis padres y hermana por su absoluto y sincero apoyo en todos los pasos de mi
vida.
A los demás familiares que siempre me acompañaron y creyeron en mi.
A los Doctores Jinneth Acosta Forero y Orlando Ricaurte Guerrero, por su
iniciativa, acompañamiento y orientación, que fueron fundamentales para el
desarrollo del presente trabajo.
A mis profesores y compañeros de residencia, gracias por enseñarme tanto en
estos 4 años, siempre estarán presentes en corazón.Resumen
El Carcinoma Colorrectal (CCR) es una de las principales neoplasias a nivel
mundial, siendo la tercera causa de muerte por cáncer, constituyendo un
problema de salud pública en países desarrollados, donde estrategias en
tamización y diagnóstico precoz han permitido reducir su mortalidad. El CCR es
un tumor heterogéneo, desde el punto de vista molecular, la mayoría siguen la
secuencia adenoma-carcinoma, mediada por inestabilidad cromosómica, mientras
una fracción menor se asocia a inestabilidad de microsatélites (IMS) por mutación
o alteraciones epigenéticas de los genes de reparación del ADN. En Colombia, sin
embargo, existen pocos estudios sobre las alteraciones genéticas y epigenéticas
en CCR.
El propósito del proyecto fue analizar la expresión de los genes de reparación por
inmunohistoquímica en casos de CCR en los cuales se habían excluido
mutaciones del gen KRAS por estudios moleculares previos.
Se estudiaron en total 54 casos a los que se les realizó microarreglos de tejidos. A
cada microarreglo se les realizó coloración de hematoxilina-Eosina y los 4
marcadores de los genes de reparación (MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6) por
inmunohistoquímica.
En los resultados, el fenotipo alterado predominó en hombres (70%), con
promedio de edad de 60.9 años y una frecuencia de 18.5%. Los marcadores de
inmunohistoquímica con mayor ausencia de expresión fueron MLH1 y PMS2 (total
90%).
Como conclusión podemos decir que la frecuencia de este fenotipo de IMS en
nuestra serie es ligeramente superior a lo encontrado en la literatura (18.5% vs
13-15%) en casos no discriminados por genotipo silvestre para la mutación KRAS.
Palabras clave: Carcinoma Colorrectal, inmunohistoquímica, MLH1, MSH2,
PMS2, MSH6, KRAS.Abstract
Colorectal Carcinoma (CRC) is one of the main neoplasms worldwide, being the
third cause of death by cancer, constituting a public health problem in developed
countries, where strategies in screening and early diagnosis have allowed to
reduce their mortality. The CRC is a heterogeneous tumor, from the molecular
point of view, most follow the adenoma-carcinoma sequence, mediated by
chromosomal instability, while a smaller fraction is associated with microsatellite
instability by mutation or epigenetic alterations of DNA mismatch repair genes. In
Colombia, however, there are few studies on genetic and epigenetic alterations in
CRC.
The purpose of this project was to analyze the expression of mismatch repair
genes by immunohistochemistry in cases of CRC in which mutations of the KRAS
gene were excluded by previous molecular studies.
A total of 54 cases were studied to which tissue microarrays were performed.
Each microarray was stained with hematoxylin-eosin and the 4 markers of the
mismatch repair genes (MLH1, PMS2, MSH2 and MSH6) by
immunohistochemistry.
In the results, the altered phenotype predominated in men (70%), with an average
age of 60.9 years and a frequency of 18.5%. The immunohistochemical markers
with the highest absence of expression were MLH1 and PMS2 (total 90%).
In conclusion we can say that the frequency of this IMS phenotype in our series is
slightly higher than that found in the literature (18.5% vs 13-15%) in cases not
discriminated by wild genotype for the KRAS mutation.
Keywords: Colorectal Carcinoma, immunohistochemistry, MLH1, MSH2, PMS2,
MSH6, KRAS.Contenido
Pág.
Resumen……………………………………………………………………………….. 6
Lista de tablas………………………………………………………………………… 11
Lista de gráficas…………………………………………………………...…………. 12
1. Introducción………………………………………………………………………... 14
2. Justificación………………………………………………………………………... 16
3. Objetivos……………………………………………………………………………. 17
3.1 Objetivo general…………………………………………………………… 17
3.2 Objetivos específicos……………………………………………………... 17
4. Marco conceptual…………………………………………………………………. 18
4.1 Epidemiologia……………………………………………………………… 18
4.2 Clasificación patogénica………………………………………………….. 21
4.3 Características histopatológicas…………………………………………. 31
4.4 Pruebas diagnósticas para Síndrome de Lynch e hipermetilación de
genes de reparación…………………………………………………………... 31
5. Materiales y métodos…………………………………………………………….. 36
5.1 Tipo de estudio…………………………………………………………….. 36
5.2 Población a estudio……………………………………………………….. 36
5.3 Criterios de inclusión……………………………………………………… 36
5.4 Criterios de exclusión……………………………………………………... 36
5.5 Metodología………………………………………………………………... 36
6. Cronograma………………………………………………………………………… 40
7. Consideraciones éticas………………………………………………………….. 41
8. Resultados………………………………………………………………………….. 42
9. Conclusiones………………………………………………………………………. 50
10. Anexos…………………………………………………………………………….. 54
10.1. Cotizaciones de anticuerpos cotizados………………………………. 54
10.2 Cotizaciones de equipos para microarreglos de tejidos: manuales
(sacabocado de piel) y semimanuales………………………………………. 55
10.3 Aval de comité de ética…………………………………………………. 57
Bibliografía…………………………………………………………………………….. 59Lista de tablas
Pág.
Tabla 1: Tasas de incidencia de diferentes tipos de cáncer por localización y 19
género de 1962 a 2007………………………………………………………………..
Tabla 2: Principales indicadores no transmisibles en Colombia, 2011…………. 20
Tabla 3: Criterios revisados de Bethesda………………………………………….. 31
Tabla 4: Patrones de tinción inmunohistoquímica e interpretación para 32
proteínas MMR…………………………………………………………………………
Tabla N°5: Distribución de los casos incluidos en el estudio de acuerdo al 42
procedimiento realizado……………………………………………………………….
Tabla Nº6: Distribución del Diagnóstico Histológico………………………………. 43
Tabla Nº 7: Microarreglos de tejidos………………………………………………… 45
Tabla Nº8: Casos con expresión anormal de las proteínas MMR……………….. 47
Tabla Nº9: Casos con ausencia de expresión de las proteínas MMR de 48
acuerdo con el diagnóstico y grado histológico ……………………………………
Tabla Nº10: Hallazgos generales de los casos con expresión anormal de las 48
proteínas MMR…………………………………………………………………………Lista de gráficas
Pág
Gráfica 1: Clasificación patogénica del carcinoma colorrectal…………………... 22
Gráfica 2: Clasificación molecular del carcinoma colorrectal……………………. 23
Gráfica 3: Inestabilidad cromosómica (secuencia adenoma-carcinoma)………. 24
Gráfica 4: Vía molecular EGFR-KRAS-BRAF para la compresión del 25
desarrollado de la terapia dirigida para esta enfermedad: el anti-EGFR
(Cetuximab)…………………………………………………………….....……………
Gráfica 5: Complejos de inactivación o error en la activación de genes de 27
reparo del ADN…………………………………………………………………………
Gráfica 6: Vías moleculares de desarrollo de CCR con MSI…………………….. 29
Gráfica 7: Ejemplo de tinción inmunohistoquímica que muestra MSI con 33
pérdida en la expresión de proteínas MLH1 y PMS2, con expresión normal de
MSH2 y MSH6………………………………………………………………………….
Gráfica 8: Algoritmo de detección de pacientes con sospecha de Síndrome de 34
Lynch e IMS…………………………………………………………………………….
Gráfica 9: Secuencia de pasos que se utilizan para realizar microarreglos de 37
tejidos…………………………………………………………………………………….
Gráfica N°10: Distribución de los casos de acuerdo al tipo de procedimiento 43
realizado…………………………………………………………………………………
Gráfica Nº 11: Distribución del Diagnóstico Histológico…………………………... 44
Gráfica Nº12 (Caso 13): Adenocarcinoma moderadamente diferenciado, con 46
ausencia de la expresión de PMS, con expresión tenue de MLH1 y fuerte de
MSH2 y MSH6……………………………………………………………………….....
Gráfica Nº13 (Caso 19): Adenocarcinoma mucinoso, con ausencia de la 47
expresión de MSH2 y MSH6, con expresión débil de PMS2 y fuerte de MLH1…
Gráfica Nº14 (Caso 56): Adenocarcinoma bien diferenciado, con ausencia de 47
la expresión de MLH1 y PMS2, con expresión fuerte de MSH2 y MSH6………..1. Introducción
El Carcinoma Colorrectal es una de las principales neoplasias a nivel mundial,
constituyendo un problema de salud pública en países desarrollados, mientras
que en países como Colombia, aunque presenta una menor incidencia su
frecuencia está aumentando progresivamente en los últimos 30 años, pero a
diferencia de los países desarrollados donde por ser un problema de salud pública
las estrategias de tamización y el diagnóstico precoz han permitido reducir
considerablemente la mortalidad, en nuestro medio la letalidad sigue siendo
elevada.
Los estudios iniciales se centraron en el análisis de las alteraciones genéticas y
sus efectos en las vías moleculares implicadas en el desarrollo del cáncer de
colon, que permitieron demostrar alteraciones genéticas relacionadas con la vía
de carcinogénesis predominante: la secuencia adenoma-carcinoma, en la cual las
mutaciones activadoras del gen KRAS están presentes en aproximadamente el
50% de los casos de Carcinoma Colorrectal. Estudios posteriores demostraron
inestabilidad de microsatélites por mutaciones de genes de reparación de
defectos de apareamiento de ADN en el síndrome de carcinoma colorrectal
hereditario no polipoide (síndrome de Lynch) que se presenta en el 3-5% de
casos y más recientemente se han demostrado eventos epigenéticos en estos
mismos genes relacionados con su inactivación por metilación de los promotores.
En Colombia, sin embargo, existen pocos estudios sobre las alteraciones
genéticas en carcinoma colorrectal y aún no hay informes sobre estudios de
alteraciones de los genes de reparación de ADN relacionados con su desarrollo.
Este proyecto pretende analizar la expresión de los genes de reparación de casos
en los cuales se han excluido mutaciones del gen KRAS por estudios moleculares
previos.2. Justificación
El Carcinoma Colorrectal es la tercera causa de mortalidad por cáncer a nivel
mundial, y aunque su incidencia es menor en países en vía de desarrollo, su
frecuencia está aumentando en países como el nuestro, debido posiblemente a
modificaciones de costumbres y hábitos alimentarios, y la mortalidad continúa
siendo alta por su diagnóstico tardío, a diferencia de lo que ocurre en los países
desarrollados.
El Carcinoma Colorrectal es un tumor heterogéneo, desde el punto de vista
molecular, la mayor proporción de tumores siguen la secuencia adenoma-
carcinoma, mediada por inestabilidad cromosómica, que incrimina mutaciones
progresivas en los genes APC, KRAS, P53, DCC, entre otros, mientras una
fracción menor se asocia a inestabilidad de microsatélites por mutación o
alteraciones epigenéticas de los genes de reparación del ADN que determinan la
ausencia de expresión de proteínas de los complejos de reparación.
Este estudio pretende contribuir a determinar la proporción de casos de
carcinoma colorrectal que puedan sugerir alteraciones de los genes de reparación
del ADN mediante el estudio inmunohistoquímico que refleje la expresión de las
proteínas codificadas por ellos, en casos en los cuales se han excluido
previamente mutaciones de KRAS.3. Objetivos
3.1 Objetivo general
Evaluar la expresión de las proteínas codificadas por los genes de reparación
MLH1, MSH2, PMS2 y MSH6 por inmunohistoquímica en cortes histológicos de
casos de carcinoma colorrectal en pacientes sin mutación del gen KRAS (exón 2
codón 12 y 13).
3.2 Objetivos específicos
3.2.1 Determinar la expresión de proteínas codificadas por los genes MLH1,
MSH2, PMS2 y MSH6 por inmunohistoquímica en la población de estudio.
3.2.2 Correlacionar los hallazgos histológicos con las características
histopatológicas de estos tumores (tipo histológico, grado de diferenciación,
infiltrado inflamatorio de linfocitos, componentes mucinoso o medular).4. Marco conceptual
4.1 Epidemiología
El cáncer colorrectal es segundo tipo de cáncer más común en mujeres (614.000
casos, un 9,2% del total) y el tercer más común en hombres (746.000 casos, el
10,0% del total) en todo el mundo. Cerca del 55% de los casos ocurren en las
regiones más desarrolladas. Las tasas de incidencia estimadas más altas están
en Australia - Nueva Zelanda (44,8 y 32,2 por 100.000 en hombres y mujeres
respectivamente), y las más bajas en África occidental (4,5 y 3,8 por 100.000
respectivamente). La mortalidad está más reflejada en las regiones menos
desarrolladas del mundo con un promedio general de 694.000 muertes, 8,5% del
total de muertes por cáncer, con una tasa estimada de mortalidad en ambos
sexos en Europa Central y Oriental de 20,3 por 100.000 para los hombres, y con
una tasa estimada de mortalidad más baja en África occidental (3,5 y 3,0, en
hombres y mujeres respectivamente) [1].
En Estados Unidos es la tercera causa de muerte por cáncer después del cáncer
de próstata y pulmón en hombres, y seno y pulmón en mujeres [2]. De acuerdo
con la base de datos del Programa de Vigilancia, Epidemiología y Resultados
(Surveillance, Epidemiology, and End Results –SEER) del Instituto Nacional de
Cáncer de Estados Unidos, la tasa de incidencia de adenocarcinoma de colon es
33,7 / 100.000 y aumentó un 18% durante el período de 1973 a 1987 (cerca de 80
/ 100.000 habitantes) [3]. La Sociedad Americana de Cáncer reportó para el año
2013, 142.820 casos nuevos de carcinoma colorrectal con 50.830 muertes
durante el mismo año. La tasa de supervivencia a 5 años para un estadío
temprano está entre 60-95% y baja a 35% en casos de compromiso linfático. Se
estima que cerca del 25% de casos de carcinoma colorrectal son por historia
familiar recurrente, y cerca del 75% son esporádicos [2].En Colombia El Registro Poblacional de Cáncer de Cali (RPCC) se ha dedicado a
registrar todos los casos relacionados con cáncer dentro de los limites de Cali y
en el cual se encuentran registros desde hace 50 años, de datos obtenidos
mediante búsqueda activa en hospitales, laboratorios de Patología y Hematología,
centros de radioterapia, oficinas estatales donde se registran y procesan los
certificados de defunción, y en los consultorios médicos privados, entre otros, con
un registro aproximado del 95% de la información. Según los datos que se tienen
desde 1962 se ha presentado un incremento en las tasas de incidencia y
mortalidad en ambos sexos, en todas las edades en los hombres y después de
los 50 años en las mujeres, especialmente desde 1992. Para el año 2007 la
incidencia de carcinoma colorrectal para hombres fue de 15.8 y para mujeres de
14.1 por 100.000 habitantes, generando un incremento gradual de esta patología
desde 1962 (ver tabla 1) [4].
Tabla 1: Tasas de incidencia de diferentes tipos de cáncer por localización y
género de 1962 a 2007. Tomado de: Bravo LE, et al. Trends of cancer incidence
and mortality in Cali, Colombia. 50 years experience. 2012 (Oct-Dec); Colombia
médica, 43(4), 246-255. [4].
Se han realizado otros estudios, entre ellos un estudio del 2010 del Instituto
Nacional de Cancerología, tomando como base el censo nacional poblacional del
2005 y los registros oficiales de los certificados de defunción diligenciados en el
país y que fueron procesados por el Departamento Administrativo Nacional de
Estadística (DANE), se realizó la interpretación de los datos obtenidos, en donde
esta enfermedad ocupó el quinto lugar por mortalidad por cáncer (cuarto lugar en
hombres y quinto lugar en mujeres) con zonas de mayor riesgo ubicadas en
ciudades del centro del país que están en la cordillera central y en Bogotá, yzonas de bajo riesgo en los departamentos de Nariño, Cauca, Guajira y
Magdalena medio. Presentó una tasa de mortalidad estimada para la edad de 5
por 100.000 en hombres, y de 5,3 por 100.000 en mujeres [5]. El Instituto
Nacional de Salud realizó en el 2011 un estudio teniendo el cuenta el Sistema
Integral de Información de la Protección Social (SISPRO) del Ministerio de la
Protección Social, y de este tomó la información de los Registros Individuales de
Prestación de Servicios de Salud (RIPS) de cada enfermedad clasificada según el
CIE-10 (clasificación internacional de enfermedades) y los RUAF (Registro Único
de Afiliados), donde se encontró que la incidencia del carcinoma colorrectal fue en
6.57 por 100.000 habitantes, con una tasa de mortalidad de 6.01 por cada 100.00
habitantes [6] (ver tabla 2).
Tabla 2: Principales indicadores no transmisibles en Colombia, 2011. Tomado de:
Instituto Nacional de Salud. Aspectos relacionados con la frecuencia de uso de los
servicios de salud, mortalidad y discapacidad en Colombia, 2011; 1 ed. Bogotá.
Imprenta Nacional de Colombia, 2011 [6].Además existen otros trabajos en los cuales identifican la incidencia y la
mortalidad de diferentes tipos de cáncer, entre ellos el carcinoma colorrectal, en
diferentes zonas del país así: entre los años 2003 -2007 la incidencia de
carcinoma colorrectal en Manizales fue de 8.4% en hombres y 8.2% en mujeres
con una tasa de mortalidad de 8.6% en hombres y 9.8% en mujeres [7], en
Bucaramanga una incidencia de 13.3% en hombres y 12.2% en mujeres con una
tasa de mortalidad de 5.5% en hombres y 6.9% en mujeres en el mismo periodo
de tiempo [8], en Pasto entre los años 1998-2007 la incidencia de la enfermedad
fue de 4.6% para hombres y 5% para mujeres con una tasa de mortalidad de
5.2% y 5.8% respectivamente [9].
Factores de riesgo
Dentro de los factores de riesgo asociados con la generación de carcinoma
colorrectal diferente a los factores genéticos, se encuentran la dieta (rica en grasa
y carnes rojas, y déficit de fibra), bajo consumo de vitamina D y ácido fólico, estilo
de vida sedentario, índice de masa corporal elevado (IMC) y la obesidad
abdominal [2].
El consumo de alcohol esta débilmente relacionado con el desarrollo de cáncer de
colon, siendo a su vez dosis/dependiente. Además, existe una fuerte asociación
entre la aparición de carcinoma colorrectal y consumo de tabaco y cigarrillo, con
mayor relación en quienes tienen un gran consumo paquete/año y la edad
temprana de inicio del consumo [10].
4.2 Clasificación patogénica
Aspectos generales
Tradicionalmente el Carcinoma Colorrectal (CCR) se ha divido en dos grandes
grupos: el heredado (historia o predisposición familiar a la enfermedad) y el
esporádico (corresponde a los casos donde no hay evidencia genética o familiar
de la enfermedad) [11].
Cerca del 95% de los CCR son esporádicos, dentro de los que se encuentra un
grupo cercano al 25% que presenta historia familiar sin que se trate de casos
hereditarios, posiblemente desarrollados por el ambiente familiar en que se
encuentran este grupo de personas y en los cuales no se presenta una mutaciónen línea germinal, el restante 70% de adenocarcinomas colorrectales son
derivados de condiciones precursoras dentro de las que se encuentran los
adenomas y la displasia, en una secuencia conocido como secuencia adenoma-
carcinoma [12].
El restante 5% de CCR corresponde a condiciones hereditarias dentro de las que
se encuentran un 1% relacionado con poliposis familiar múltiple y un 4% por
síndrome de Lynch [12]. (ver gráfica 1).
Gráfica 1: Clasificación patogénica del carcinoma colorrectal. Modificado de:
Molecular Pathogenesis of Colorectal Cancer. Haigis K. Springer
Science+Business Media, New York: 2013 [12].
Desde el punto de vista molecular el CCR está distribuido en 2 principales
mecanismos que son: la inestabilidad cromosómica (IC) que corresponden al 70%
y el fenotipo mutador con el porcentaje restante [13]. La IC se asocia a una
secuencia de unos pocos genes mutados (decenas de genes mutados), que se
encuentran relacionados con la secuencia adenoma-carcinoma. Dentro de la IC
se encuentra un pequeño grupo que corresponde a cerca del 1% con compromiso
hereditario [14].
El fenotipo mutador corresponde a una serie de eventos moleculares que son
producidos son miles de mutaciones. Dentro de este grupo se encuentran otras
alteraciones moleculares como son: Inestabilidad de microsatélites (IMS) la cual
está relacionada con el Síndrome Lynch y tambien con tumores esporadicos,relacionados con genes de reparacion del ADN. Existen tambien otras
alteraciones moleculares que están relacionadas con otras vías, que son:
deacetilación de histonas y aberraciones de miRNAs. Tipicamente existe una sola
configuración molecular que predomine, y es muy raro que coexistan varias vías
que se solapen a la vez [15] (ver gráfica 2).
Gráfica 2: Clasificación molecular del carcinoma colorrectal. Modificado de:
Zoratto F. et al. Focus on genetic and epigenetic events of colorectal cancer
pathogenesis: implications for molecular diagnosis. Tumor Biol. 2014; 35:6195–
6206 [15].
Vía adenoma-carcinoma – Inestabilidad cromosómica
El proceso de carcinogénesis del CCR es un mecanismo de varios pasos. La IC
comenzó con el estudio de la secuencia adenoma-carcinoma, hipótesis propuesta
a mediados del siglo pasado por el Dr. Basil Morson quien estudió un grupo de
personas que presentan poliposis familiar múltiple y postuló que todos los
carcinomas colorrectales surgían en adenomas precursores [16]. Más adelante en
los años ochentas el Dr. Bert Volgestein describió que los pasos de la secuencia
adenoma-carcinoma estaban determinados por unas vías moleculares definidas,
encontrando que debido al acúmulo de mutaciones de oncogenes y genes
supresores de tumor, se producen varios cambios genéticos que son los que van
a generar el inicio y la progresión de la lesión cancerígena [13]. Gracias a esta
identificación se pueden realizar polipectomías endoscópicas que disminuyen la
incidencia de carcinoma colorrectal previniendo de esta manera la mortalidad por
esta enfermedad.La inestabilidad cromosómica (secuencia adenoma-carcinoma) hace referencia a
un ritmo acelerado en perdidas o ganancias de partes enteras o grandes de
cromosomas que producen variabilidad en el cariotipo de una célula a otra, y
como consecuencia produce un desequilibrio en el número de cromosomas
(aneuploidía), amplificaciones genómicas o una pérdida de heterocigosidad (LOH)
[17]. Esta vía comienza con la mutación de un gen supresor que es el gen de
poliposis adenomatosa coli (APC), primero con la mutación de uno de sus alelos,
y luego se produce la mutación del otro alelo (segundo golpe), ya sea por
mutación o por metilación, presentándose de forma hereditaria y esporádica, y
adquirida a lo largo de la vida por exposición a diferentes condiciones: como
exposición a carcinógenos. Luego de esta mutación aparecen las siguientes
mutaciones, de ellas la mutación en el gen KRAS se produce en el 85-90% de
estos casos, confiriendo proliferación de los adenomas pequeños. Posteriormente
aparecen las otras mutaciones que se relacionan con evasión de la apoptosis o
supervivencia celular y que afectan entre otros a estos genes: SMAD4, p53, DCC
(ver grafica 3) [18].
Gráfica 3: Inestabilidad cromosómica (secuencia adenoma-carcinoma): acúmulo
de mutaciones de genes supresores tumorales (B-catenina, APC, p53, SMAD4,
entre otros) y oncogenes (KRAS). Tomado de: Kumar V, Abbas A, Fausto N,
Robbins S & Cotran R. Robbins and Cotran pathologic basis of disease. 7 ed.
Elsevier Saunders, Philadelphia: 2005. [18].
KRAS tiene una importancia adicional con relación al tratamiento, ya que juega un
papel predictivo negativo como una alternativa terapéutica, que es el
CETUXIMAB, un anticuerpo monoclonal contra el EGFR tipo 1, receptor que se
encuentra amplificado en esta enfermedad. Los pacientes que tienen KRASmutado no van a responder a Cetuximab, ya que la vía molecular por debajo del
EGFR está alterada y por lo tanto las personas que se beneficiarán con este
tratamiento serán muy pocas (aproximadamente 10% de pacientes) mejorando
así el control y la sobrevida por el CCR [19] (ver grafica 4).
Gráfica 4: Vía molecular EGFR-KRAS-BRAF para la compresión del desarrollado
de la terapia dirigida para esta enfermedad: el anti-EGFR (Cetuximab). Tomado
de: Hagland H, et al. Molecular Pathways and Cellular Metabolism in Colorectal
Cancer. Digestive Surgery. 2013;30:12–25. [19].
Vía de Inestabilidad de Microsatélites
La otra vía molecular del desarrollo de CCR se llama fenotipo mutador, donde se
producen cientos y miles de mutaciones, asociado a inestabilidad de
microsatélites y determinado por dos mecanismos principales:
• Mutación en línea germinal de los genes que codifican para las proteínas del
ADN el sistema MMR (síndrome de Lynch), el cual se produce de carácter
hereditario.
• Hipermetilación de islas CPG de promotores de los genes de sistema de
reparo MMR (llamado fenotipo metilador, hipermetilación de islas CPG o
CIMP).También existe una pequeña proporción de casos que se relacionan con otros
mecanismos, relacionados con alteraciones epigenéticas:
• Deacetilación de histonas relacionadas con los genes
• Alteraciones de miARN reguladores de los genes.
La inestabilidad de microsatélites (IMS) juega un papel fundamental en la
carcinogénesis del CCR, debido a que se produce una falla en las vías reparación
del ADN, siendo errores que se producen durante la replicación del ADN. Los
microsatélites son secuencias únicas, repetidas de 1 a 6 nucleótidos, distribuidas
en el genoma cada 25-50 kb, por lo que la inestabilidad de microsatélites es el
resultado en la inactivación o un error en la activación de genes de reparo
mismatch repair (de la sigla en ingles MMR) generando secuencias repetidas de
ADN que son colocadas por error durante la replicación [20-21] que dan lugar a
que una proteína que no se exprese.
Normalmente en la replicación del ADN se pueden producir errores, ya sea por
fallo en las polimerasas o por mutaciones puntuales por diferentes condiciones,
para lo cual existen varios sistemas que hacen la reparación del ADN,
identificando y removiendo lesiones especificas del ADN, de acuerdo con el tipo
de lesión, la fase del ciclo celular y los factores ambientales, dividiéndolos en
directos e indirectos de acuerdo con la molécula y el periodo de tiempo usado
para el reparo. Los mecanismos directos de reparación son mediados por la DNA
polimerasa o por la 6-metilguanin DNA metíltransferasa durante el proceso de
replicación en el momento en que la hebra hija del ADN se esta comenzando a
sintetizar. Los mecanismos de reparo indirectos se producen cuando la lesión a
ocurrido en el periodo de síntesis o replicación del ADN, es decir que toman lugar
después de la síntesis del ADN. Estos se dividen en 3 mecanismos: Reparo por
escisión, reparo por recombinación, y error en la activación o inactivación de la
reparación mismatch repair (MMR) [13].
Complejo de reparación de ADN por defectos de apareamiento “MMR”
Este sistema de inactivación o errores en la activación de genes de reparo del
ADN funciona por medio de complejos de heterodímeros que varían en
composición: El complejo MutL contiene la proteína MLH1 y una de las otras
proteínas compañeras asociadas: PMS2, MLH3, PMS1 o MLH2 (usualmente
PMS2). El complejo MutS contiene la proteína MSH2 y con una de las otras
proteínas compañeras asociadas: usualmente MSH6 o MSH3. Ambos complejos
MutL y MutS interactúan entre sí formando un gran heterocomplejo que contribuye
a la reparación de los diferentes tipos de alteraciones del ADN, entre ellos el delsistema MMR [22]. Para realizar la reparación, estos complejos deben funcionar
como dos sets de heterodímeros, donde MSH2 y MSH6 reconocen el error
(complejo MutS), y MLH1 y PMS2 dirigen la reparación (complejo MutL). Cada
heterodímero está compuesto por una proteína dominante: MLH1 y MSH2 (se
expresa sin importar el estado de su compañero) y una proteína dependiente:
PMS2 y MSH6 (se expresa en ausencia de su compañero, o no se expresa si su
compañero dependiente esta expresado) [21]. El complejo MutS es el que se une
a la cadena lesionada, pero su interacción depende de su acoplamiento con el
heterodímero MutL, en un proceso dependiente de ATP. Para la reparación se
utilizan proteínas intermediarias como son: Exonucleasa tipo 1 (EXO1), el
antígeno nuclear de proliferación celular (PCNA), el factor de replicación C (RF-C)
y la DNA polimerasa, los cuales producen escisión de la cadena lesionada,
acompañados posteriormente por la DNA ligasa I, la cual re-liga la cadena ya
reparada (ver Grafica 5). Los genes que más frecuentemente se encuentran
alterados son MLH1 y PMS2 en cerca del 85% de los casos [22].
Grafica 5: Complejos de inactivación o error en la activación de genes de reparo
del ADN. Tomado de: Poulogiannis G, Frayling I and Arends M. DNA mismatch
repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome.
Histopathology 2010; 56,167–179. [22].Síndrome de Lynch
El estudio de las vías moleculares de la IMS fue precedido a principios del siglo
pasado, por el Dr. Warthin, quien describió una familia que presentaba una serie
de tumores colorrectales que no se encontraban relacionados a pólipos y que
además presentaban otros tumores asociados, entre ellos cáncer de endometrio.
Mas adelante en la década de los ochentas Dr. Lynch retomó este trabajo y
describió otro grupo de familias que presentaban características similares a las
descritas por el Dr Warthin, y que presentaban un patrón de herencia autosómicodominante, describiendo de esta manera otro patrón de herencia del carcinoma
colorrectal.
Posteriormente el Dr. Perucho, determinó que la descripción del Dr. Lynch estaba
relacionada con inestabilidad de microsatélites dado por mutaciones en los 4
genes del sistema reparo MMR (MLH1, PMS2, MLH2 y MLH6), siendo así un
pequeño porcentaje, cercano al 3-4%, de casos hereditarios (conocido primero
como carcinoma colorrectal heredado no polipoide, ahora llamado Síndrome de
Lynch - SL) [12].
El SL es una enfermedad que se caracteriza por un patrón de herencia
autosómico dominante, donde todas las células somáticas poseen un alelo
mutado y el otro no mutado (o llamado wild-type) [22]. En el SL una mutación en
sistema de inactivación o error en la activación de genes de reparo del ADN
MMR, combinado con un segundo hit o segunda mutación y en formas
esporádicas la hipermetilación del promotor MLH1, producen ausencia completa
en la expresión de una o mas proteínas del sistema de inactivación o error en la
activación de genes de reparo del ADN MMR [23].
Las mutaciones se producen de manera aleatoria en estas 2 vías, la mayoría de
los tumores colorrectales con alteraciones de IMS presentan pérdida de la
expresión en MLH1 y PMS2, en cerca del 85% de los casos. El principal gen
relacionado con SL es el MSH2, aunque puede presentarse compromiso de los
genes MLH1 y MSH6, y está frecuentemente relacionado con mutaciones en
KRAS, mientras que en la hipermetilación del promotor la mutación más
frecuentemente encontrada es en BRAF (V600E) [24] (ver Gráfica 6).
Los casos esporádicos de CCR por alteración en la vía de IMS se presentan en
cerca del 12-15%, sin estar relacionados con mutaciones, por lo que se describió
que se producían por alteraciones epigenéticas, la mayoría de casos asociados a
hipermetilación del promotor de MLH1 y en muy pocos casos por deacetilación de
histonas y miRNAs que regulan los genes de reparo del sistema MMR [24].
Gráfica 6: Vías moleculares de desarrollo de CRC con MSI. Tomado de: Boland
C, Goel A. Microsatellite Instability in Colorectal Cancer. Gastroenterology
2010;138:2073–2087. [24].Vía adenoma aserrado - Vía fenotipo metilador de islas CPG (CIMP) - fenotipo
metilador
El primer acercamiento en el desarrollo de esta vía fue descripción hecha por la
Dra. Fenoglio sobre otro tipo de pólipos llamados adenomas/pólipos sésiles
aserrados, de distribución diferente de los adenomas tradicionales (que son colon
izquierdo y predominan en recto), los cuales no tienen displasia, son del colon
derecho y se producen en el 15-20% de las lesiones aserradas [25]. Mas adelante
estudios hechos por el Dr. Perucho sobre la IMS, en los que identificó que una
pequeña proporción de casos son debidos a SL (como se mencionó antes), y que
gracias a la aparición de la epigenética, se reconoció que los adenomas/pólipos
aserrados sésiles se encontraban alterados por los genes de reparación del DNA,
identificando de esta manera que su alteración era debido a una hipermetilación
del promotor, dando respuesta a los casos de CCR con IMS que no tenían
mutaciones (es decir que presentaban IMS pero no tenían SL, resultando ser
casos esporádicos) [12].
La característica molecular de este tipo de tumores, a diferencia de la vía clásica
de inestabilidad cromosómica (genes APC y p53, entre otros), está relacionada
con la activación de MAPK (mutación en BRAF) e hipermetilación del promotor
(MLH1) que producen silenciamiento epigenético de genes supresores de tumor y
de genes involucrados en la reparación del ADN y control del ciclo celular [25-26].
De acuerdo al análisis de investigaciones en IMS y CCR, todavía existían casos
que no mostraban explicación alguna, hasta que junto con el desarrollo de la
epigenética se dieron cuenta algunos de estos casos no explicados estaban
relacionados con la deacetilación de histonas, y más adelante complementando
otras investigaciones en casos todavía sin resolver, encontraron relación conmiRNAs que regulan la expresión genética de los genes del sistema reparo MMR,
y que si están alterados también pueden explicar la génesis de CCR [12].
4.3 Características histopatológicas
De acuerdo con el tipo de origen de lesión tumoral los CCR pueden presentarse
fenotípicamente de forma diferente. Los tumores originados en la vía de IC,
presentan un compromiso más distal del colon (colon izquierdo), son tumores
histológicamente bien diferenciados sin infiltrado linfocítico y un estadiage de TNM
frecuentemente más elevado. Los tumores originados en la vía de IMS
comprometen a personas más jóvenes (usualmente menores de 50 años), se
presentan en el colon proximal (colon derecho), histológicamente son tumores
que se caracterizan por ser pobremente diferenciados con un patrón de
crecimiento medular, infiltrado linfocitario, características mucinosas y
frecuentemente un bajo estadiage de TNM [2-27], además son tumores grandes,
con mayor numero de ganglios linfáticos después de una resección quirúrgica y
presentan menor frecuencia de metástasis a distancia [28].
4.4 Pruebas diagnósticas para Síndrome de Lynch e
hipermetilación de genes de reparación
De acuerdo a la forma en que se desarrolló el estudio de IMS, la primera
aproximación diagnóstica fue hecha para Síndrome de Lynch. Se han utilizando
diferentes criterios para evaluar el SL, los más utilizados son los criterios
revisados (modificados) de Bethesda [29], que son una herramienta de tamizaje
útil para seleccionar pacientes que puedan presentar esta enfermedad, y así
aplicar posteriormente pruebas diagnósticas o consejería genética, según sea el
caso (ver tabla 3).
Tabla 3: Criterios revisados de Bethesda. Tomado de: Payá A. Et al. Carcinoma
colorrectal con alteración de la vía reparadora. Claves para su identificación y
relevancia clínica. Rev Esp Patol. 2006; 39(4): 201-208. [29].
Criterios de Bethesda revisados
CCR en paciente con < 50 años de edad.
Presencia de CCR sincrónico o metacrónico u otra neoplasia relacionada al
CCHNP (estómago, intestino delgado, páncreas, vía biliar, endometrio, ovario,
uréter, pelvis renal, cerebro, adenomas sebáceos, querato-acantomas)
independientemente de la edad.CCR con infiltración linfocitaria, diferenciación mucinosa / células en anillo de
sello o patrón de crecimiento medular en paciente con < 60 años de edad.
Uno o más familiares de 1.er grado con CCR o neoplasia relacionada al
CCRHNP diagnosticada antes de los 50 años de edad.
Dos o más familiares de 1.º ó 2.º grado con CCR o neoplasia relacinoada al
CCHNP con independencia de la edad.
CCHNP: Cáncer Colorectal Heredado No Polipósico (ahora llamado síndrome de Lynch)
La primera prueba utilizada como aproximación diagnóstica fue la evaluación por
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). En esta prueba la evaluación de
IMS se hace por el análisis de dos mononucleótidos (BAT-25 y BAT-26) y tres
dinucleótidos (D2S123, D5S346 y D17S250), prueba conocida como el panel de
Bethesda o el ensayo Pentaplex, el cual compara muestras extraídas de ADN de
tejido normal y tumoral del mismo paciente. Se define que un tumor presenta alta
inestabilidad microsatelital (MSI-H) si 2 o más de los 5 marcadores
microsatelitales muestran inestabilidad (>40%), baja inestabilidad microsatelital
(MSI-L) si presenta 1 de los 5 marcadores para inestabilidad microsatelital, o
estabilidad microsatelital (MSS) cuando ninguno de los marcadores muestra
inestabilidad. La sensibilidad de la prueba es de 55-84% para la detección de
mutaciones [30], su especificidad es del 88-95% de acuerdo al estadiage de la
enfermedad [31].
Posteriormente se desarrolló una prueba que es más sencilla, que se basa en el
uso de anticuerpos monoclonales, la cual es económica y fácil de interpretar: es la
prueba de inmunohistoquímica para la detección de proteínas que codifican genes
del sistema de reparo MMR (MLH1, PMS2, MLH2 y MLH6).
La expresión de las proteínas de estos genes puede ser detectada por 5 patrones
(23) (ver tabla 4):
1. Las 4 proteínas están expresadas.
2. MLH1 y PMS2 no estén expresados; y MSH2 y MSH6 si estén expresados.
3. MSH2 y MSH6 no estén expresados; y MLH1 y PMS2 si estén expresados.
4. MSH6 no este expresado y MLH1, PMS2 y MSH2 si estén expresados.
5. PMS2 no este expresado y MLH1, MSH2 y MSH6 si estén expresados.
Tabla 4: Patrones de tinción inmunohistoquímica e interpretación para proteínas
MMR. Tomado de: Fleming M, Ravula S, et al. Colorrectal carcinoma: Pathologic
aspects. J Gastrointest Oncol, 2012; 3(3): 153-173. [23].MLH1 MSH2 MSH6 PMS2 interpretación
+ + + + MMR intacto
- + + - Mutación línea germinal o hipermetilación en MLH1
+ - - + Mutación línea germinal MSH2
+ + - + Mutación línea germinal MSH6
+ + + - Mutación línea germinal PMS2
+: tinción nuclear positiva (expresión normal); -: tinción nuclear negativa (perdida de
expresión)
Estas pruebas de expresión molecular en la detección por inmunohistoquímica de
las proteínas codificadas por los genes MLH1, MSH2, MSH6 Y PMS2, realizan un
análisis indirecto del estado de la IMS, con una concordancia mayor del 90% [30],
donde la expresión de MLH1 y PMS2 presenta una positividad cercana al 85%,
mientras que con los 4 marcadores inmunohistoquímicos su positividad puede ser
cercana al 100% [12]. (Ver gráfica 7).
Se debe tener cuidado en la interpretación de los resultados de las pruebas de
inmunohistoquímica, tomando a los linfocitos y el estroma como control interno de
la prueba. La prueba es positiva cuando hay expresión de la proteína,
reflejándose como coloración del núcleo celular. Se sabe que la expresión de la
tinción es mas débil después de quimioterapia neoadyuvante, principalmente con
MSH6, la cual puede mostrar una tinción diferente en el núcleo [23].
Gráfica 7: Ejemplo de tinción inmunohistoquímica que muestra IMS con perdida
en la expresión de proteínas MLH1 y PMS2, con expresión normal de MSH2 y
MSH6. Tomado de: Fleming M, Ravula S, et al. Colorectal carcinoma: Pathologic
aspects. J Gastrointest Oncol, 2012; 3(3): 153-173. [23].El algoritmo diagnóstico comienza con la aplicación de los criterios revisados de
Bethesda, que proporcionan la información necesaria para clasificar los pacientes
que pueden presentar IMS. Después de tener alguno de los criterios de Bethesda
se procede a realizar el estudio por inmunohistoquímica de los 4 genes
principales involucrados en el sistema de reparo MMR, y que, de acuerdo con su
resultado, se pueden hacer otras pruebas adicionales, representando una
herramienta diagnóstica de tamización para CCR por IMS.
Si el paciente presenta alteración inmunohistoquímica y existe historia familiar (es
decir que cumple con los criterios de Bethesda) se procede a realizar
secuenciación de los genes para hacer el diagnostico definitivo [27-32] (ver
grafica 8).
Grafica 8: Algoritmo de detección de pacientes con sospecha de Síndrome de
Lynch e IMS. Modificado de: Geiersbach K, and Samowitz W. Microsatellite
Instability and Colorectal Cancer. Arch Pathol Lab Med. 2011; 135: 1269–1277.
[27]. y Whitehall V and Leggett B. Microsatellite instability: Detection andmanagement in sporadic colorectal cancer. J. Gastroenterol. Hepatol. 2011; 26:
1733–1739. [32].
En los casos esporádicos (relacionados con adenomas aserrados) el estudio se
hace de forma similar al Síndrome de Lynch, en los cuales se utiliza la
inmunohistoquímica, la prueba de Bethesda y se usan las pruebas de metilación
(estudio de hipermetilación del promotor por PCR) para determinar la IMS, que si
son normales se profundizará con estudios de deacetilación de histonas o
identificación de miRNAs, evidenciando posiblemente una alteración epigenética
[27-32].5. Materiales y métodos
5.1 Tipo de estudio:
Se realizó un estudio descriptivo de cohorte transversal.
5.2 Población a estudio:
Muestras de tejido tumoral de cáncer de colon de tejidos incluidos en parafina sin
mutación del gen KRAS (exón 2 codón 12 y 13), de pacientes que participaron en
el proyecto “Obesidad, dieta, polimorfismos genéticos y cáncer colorrectal en
diferentes poblaciones colombianas”, del Instituto Nacional de Cancerología.
5.3 Criterios de inclusión:
Bloques de los tejidos incluidos en parafina de especímenes quirúrgicos de
carcinoma colorrectal de la población a estudio sin mutaciones de KRAS (exón 2
codón 12 y 13).
5.4 Criterios de Exclusión:
• Casos de tumores con mutación de KRAS.
• Especímenes de Biopsias.
• Casos con representación inapropiada del tumor o artificios por preservación o
procesamiento deficiente de los bloques de los tejidos incluidos en parafina
que dificulten la realización de microarreglos de tejidos.
5.5 Metodología:
Es de anotar que este proyecto está relacionado con un proyecto colaborativo
entre el Instituto Nacional de Cancerología (INC) y la Universidad Nacional deColombia llamado “Estudio de la regulación de la expresión génica en el gen
KRAS en cáncer de colon en Colombia” el cual se encuentra en desarrollo y con
quien está en estrecha vinculación, considerando que las muestras son de
pacientes del INC.
A todas las muestras del estudio, de acuerdo con los criterios de inclusión y
exclusión se les realizó la respectiva selección. Para esto se analizaron las
laminas de hematoxilina eosina (HE) de cada caso, identificando en ellas el tipo
de espécimen, el diagnóstico histológico, el tamaño tumoral, componente
mucinoso y otros hallazgos histológicos, así como datos tomados de la historia
clínica como son edad, género y tipo de procedimiento realizado. Estos datos
fueron colocados en una base datos y a los cuales se les aplicó el test de chi-
cuadrado (X2). Se utilizó para la base de datos el programa de Microsoft Excel y el
software de GraphPad Prism 7 en el análisis estadístico.
Se procedió a elaborar los microarreglos de tejidos, tomando del bloque de tejido
incluido en parafina de cada caso previamente seleccionado (bloque donante) un
sacabocado de 5 mm del área representativa previamente identificada, el cual se
colocó en un molde para conformar los microarreglos (bloque receptor). Para la
realización de los sacabocados se puede utilizar un equipo automatizado,
semiautomatizado o manual especial, en este caso por ser un trabajo colaborativo
con el Instituto Nacional de Cancerología, se realizaron de forma manual. Se tomó
1 sacabocado por cada caso y se colocó en un orden secuencial de acuerdo a la
identificación asignada. Se completó cada microarreglo con 24 sacabocados, y se
hiso el respectivo procesamiento histotecnológico para la obtención del bloque
receptor, del cual se hicieron cortes a 5 micras y se obtuvieron 5 laminas a las
que se les realizó coloración de H-E y los 4 marcadores de inmunohistoquímica:
MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6 (ver gráfica 9). Es importante mencionar que
después de realizar los microarreglos de tejidos, al momento del corte por el
micrótomo, algunos de los casos se desprendieron del bloque receptor, por lo que
hubo necesidad de repetir un microarreglo.
Gráfica 9: Secuencia de pasos que se utilizan para realizar microarreglos de
tejidos. a. Selección de la muestra e identificación del área de interés. b. Toma de
sacabocado del bloque donante de donde se detectó el área de interés. c.
Conformación de microarreglo de tejidos con muestras de sacabocados de cada
bloque. d y e. Obtención de bloque receptor y cortes a 4 micras para elaborar 5
láminas para coloración de: 1 H-E y 4 con marcadores de inmunohistoquímica
(MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6).Tomado de: Tissue microarray using Quick Ray. User Guide Manual Tissue
Microarrayer.
La coloración de inmunohistoquímica se hizo siguiendo los parámetros
estandarizados de la casa comercial proveedora de los marcadores [ROCHEM
BIOCARE COLOMBIA S.A.S. FLEX Monoclonal Mouse X-H MLH1, Clone ES05,
RTU (Link) referencia: IR07961, FLEX Monoclonal Mo a Hu MSH2, Clone FE11,
RTU (Link) referencia: IR08561, FLEX Monoclonal Rb a Hu PMS2, Clone EP51,
RTU (Link) referencia: IR08761, FLEX Monoclonal Rb a Hu MSH6, Clone EP49,
RTU (Link) referencia: IR08661]. Para la identificación del anticuerpo primario se
utilizó el Kit UltraView universal de detección DAB (Ventana Medical Systems,
Inc.) El proceso se hizo siguiendo la técnica automatizada de ventana: Se pasó
por alcoholes (4 minutos cada uno) y xilol (10 veces) para desparafinizar, luego se
incubó el anticuerpo primario con 20 υl/dl (20 minutos a 37ºC) y se hizo la
incubación del polímero (8 minutos). Para la identificación del anticuerpo primario
se utilizó el Kit UltraView universal de detección DAB (Ventana Medical Systems,
Inc.) (8 minutos). Este Kit de detección emplea un polímero de peroxidasa, libre
de biotina, que identifica los anticuerpos primarios IgG e IgM de ratón y conejo. Se
realizó la detección con diaminobencidina y contratinción con hematoxilina por 4
minutos, todos estos consumibles se incluyeron en el kit de detección. El paso
final fue el montaje de la lámina y la colocación de la laminilla cubre objetos. Estos
pasos se repitieron de la misma manera para cada marcador.Después de obtener la lamina de H-E de cada microarreglo se corroboró la
identificación de cada uno de los casos y se procedió a realizar la lectura de las
láminas de inmunohistoquímica, identificando en cada una la expresión nuclear de
los marcadores, sugiriendo que si no hay expresión nuclear el sistema de reparo
MMR no se encuentra funcionando de forma adecuada. Se debe tener cuidado en
la interpretación de los resultados de las pruebas de inmunohistoquímica,
teniendo en cuenta a los linfocitos y el estroma como control interno de la prueba.
La lectura de las láminas se realizó por el estudiante de posgrado de Patología
Anatómica y Clínica, y por dos Patólogos docentes de la Universidad Nacional de
Colombia. Luego de la lectura se procedió a evaluar y correlacionar los resultados
con los hallazgos histológicos previamente descritos de cada muestra.6. Cronograma
Tiempo estimado para la realización del proyecto: 18 meses.
ACTIVIDADES /MESES 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18
REVISIÓN
BIBLIOGRÁFICA Y X X X X X X X X X X X X X X X X
MARCO TEÓRICO
CONSECUCIÓN DE
SUMINISTROS Y X X X X X
REACTIVOS
SELECCIÓN DE LAS
X X X X X
MUESTRAS
REALIZACIÓN DE
MICROARREGLOS DE
TEJIDOS EN LA X X X
MUESTRAS
RECOLECTADAS.
IMPLEMENTACIÓN DE
MARCADORES MLH1,
MSH2, PMS2 y MSH6
POR
X X X X X X
INMUNOHISTOQUÍMICA
EN LOS
MICROARREGLOS
REALIZADOS.
ANÁLISIS DE
X X X
RESULTADOS
INFORME FINAL DEL
X X X
PROYECTO.7. Consideraciones éticas
Este estudio se realizará sobre muestras de pacientes incluidos previamente en el
proyecto “Obesidad, dieta, polimorfismos genéticos y cáncer colorrectal en
diferentes poblaciones colombianas”, del Instituto Nacional de Cancerología.
Estos pacientes firmaron un consentimiento para el uso futuro de las muestras en
el cual se permite la utilización de las muestras en nuevos proyectos de
investigación. Este es un estudio que se enmarca como SIN RIESGO para el
paciente según el artículo 11 de la Resolución 8430 de 1993 del Ministerio de
Salud, ya que no existe relación directa con el paciente por lo que el riesgo de
daño o perjuicio es inexistente, aunque en el eventual caso que se determine
algún factor de importancia predictiva o de cualquier otro tipo que tenga alguna
influencia sobre la salud del paciente. Se realizó la verificación del proyecto por
parte del comité de ética de la Universidad Nacional de Colombia, otorgando el
aval el día 12 de noviembre de 2015. Ver en anexos carta de aprobación.8. Resultados
Para el estudio se recolectaron y revisaron en total 113 casos, 54 de los cuales
fueron finalmente incluidos en el proyecto; se excluyeron 59 casos (89.8%) por
escasa representación de tumor, 1 caso por predominio de lesión premaligna
sobre maligna, 1 caso con severos artificios por compresión y diatermia, 1 caso
por extensa necrosis, 2 casos con representación de otro tejido diferente al colon
sin identificar tumor, y 1 caso sin disponibilidad de bloques de parafina.
En los 54 casos incluidos se identificó la localización del tumor, edad, género y en
el estudio histológico de las láminas se evaluó el diagnóstico histológico, el
tamaño tumoral, componente mucinoso y otros hallazgos histológicos.
La edad promedio fue de 55 años, con un rango de 18 a 76 años. No se logró
obtener la información de la edad en 2 casos. De los 54 casos seleccionados el
42.5% (n=23) fueron mujeres y el 55.5% (n=30) fueron hombres, no se logró
obtener información de 1 caso (2%).
En relación con el tipo de procedimiento realizado y la localización del tumor, en el
61.1% de los casos el tumor estaba localizado en el colon izquierdo y recto,
distribuidos como se indica en la Tabla N°5 y Gráfica N°10:
Tabla N°5: Distribución de los casos incluidos en el estudio de acuerdo al
procedimiento realizado:
Procedimiento realizado n (%)
1.Apendicectomía, resección implante tumoral peritoneal, 1 (1.8%)
omentectomía y ooferectomía.
2.Colectomía parcial 3 (5.6%)3.Colectomía total 1 (1.8%)
4.Hemicolectomía derecha 8 (14.9%)
5.Hemicolectomía derecha e izquierda 1 (1.8%)
6.Hemicolectomía derecha y colon transverso 1 (1.8%)
7.Hemicolectomía izquierda 4 (7.5%)
8.Hepatectomía izquierda 1 (1.8%)
9.Omentectomía 1 (1.8%)
10.Resección abdóminoperineal 5 (9.3%)
11.Resección anterior de recto 5 (9.3%)
12.Resección lóbulo medio pulmón derecho 1 (1.8%)
13.Polipectomía 1 (1.8%)
14.Sigmoidectomía 17 (31.5%)
15.Sin información 4 (7.5%)
Total 54 (100%)
Gráfica N°10 Distribución de los casos de acuerdo al tipo de procedimiento
realizado:
El diagnóstico histológico más común en este estudio fue Adenocarcinoma NOS,
seguido por Adenocarcinoma mucinoso, como se indica en la Tabla N°6 y la
Gráfica N°11:
Tabla Nº6: Distribución del Diagnóstico Histológico:Diagnóstico Histológico n (%)
1. Adenocarcinoma NOS 49 (90.7%)
• Adenocarcinoma NOS bien diferenciado 29 (59.2%)
• Adenocarcinoma NOS bien diferenciado y componente 2 (4.1%)
mucinoso
• Adenocarcinoma moderadamente diferenciado 14 (28.6%)
• Adenocarcinoma pobremente diferenciado 2 (4.1%)
• Adenocarcinoma pobremente 2 (4.1%)
diferenciado con diferenciación endocrina
2. Adenocarcinoma mucinoso 5 (9.3%)
Gráfica Nº 11: distribución del Diagnóstico Histológico:
Otros hallazgos histológicos evaluados para establecer la calidad del tejido
fueron: necrosis, autólisis, desmoplasia y hemorragia, cuantificando su extensión
en los cortes histológicos y señalando las áreas más representativas para facilitar
el proceso de selección del tumor y evitar estas áreas que limitarían la evaluación
del estudio de inmunohistoquímica.
Se realizaron en total 3 microarreglos de tejido de forma manual, con ayuda de un
sacabocado de piel de 5 mm, conformando una plantilla con las coordenadas de
cada caso para cada microarreglo, como se ve en la tabla Nº 7.Tabla Nº 7: Microarreglos de tejidos:
Microarreglo Nº 1:
Vacío Caso 4 Caso 9 Caso 13 Caso 18 Caso 22
(control)
Caso 1 Caso 5 Caso 10 Caso 15 Caso 19 Caso 23
Caso 2 Caso 6 Caso 11 Caso 16 Caso 20 Caso 24
Caso 3 Caso 8 Caso 12 Caso 17 Caso 21 Caso 25
Microarreglo Nº 2:
Vacío Caso 29 Caso 33 Caso 37 Caso 41 Caso 45
(control)
Caso 26 Caso 30 Caso 34 Caso 38 Caso 42 Caso 46
Caso 27 Caso 31 Caso 35 Caso 39 Caso 43 Caso 47
Caso 28 Caso 32 Caso 36 Caso 40 Caso 44 Caso 48
Microarreglo Nº 3:
Vacío Caso 52 Caso 56
(control)
Caso 49 Caso 53 Caso 57
Caso 50 Caso 54 Caso 58
Caso 51 Caso 55 Caso 59Se realizaron cortes de los microarreglos a 5 micras, como ya se indicó
anteriormente, y se obtuvieron 5 láminas: 1 de H-E y otras 4 con los marcadores
de inmunohistoquímica (MLH1, PMS2, MSH2 y MSH6).
En la lámina de H-E de cada microarreglo se corroboró la identificación de cada
uno de los casos previamente demarcados y se procedió a realizar la lectura de
las láminas de inmunohistoquímica, identificando primero en cada lámina el
control interno positivo y el control negativo (sacabocado de placenta). Se requirió
repetir el estudio de inmunohistoquímica en 5 casos en los cuales se desprendió
el tejido de los microarreglos.
De los 54 casos identificamos alteración de la expresión por IHQ en 10
correspondiendo al 18,5%, 7 de los cuales eran hombres y 3 mujeres. La
alteración más frecuente fue la ausencia de expresión para MLH1, que se
presentó en 6 casos, es decir 60% de los casos con MSI por IHQ (11,1% del total
en individuos), en promedio de 58 años con un rango de 53 a 63 años, uno de los
cuales correspondió a adenocarcinoma mucinoso en una mujer de 53 años.
La siguiente alteración en frecuencia fue pérdida de expresión de PMS2, que se
presentó en tres pacientes (30% de los positivos para IMS por IHQ, 5,5% del total)
con rango de edad entre 59 y 69, y un promedio de 63 años.
En un caso se identificó pérdida de la expresión de MSH2, (10% de los positivos
para IMS por IHQ 1,85% del total) en un hombre de 65 años con un
adenocarcinoma mucinoso.
Ninguno de los tumores con alteraciones de MMR, tenía aspecto de anillo de sello
o importante infiltración linfocitaria.
Las siguientes imágenes (gráficas Nº 12 a 14) ilustran algunos ejemplos de los
hallazgos identificados en el estudio:
Gráfica Nº12 (Caso 13): Adenocarcinoma moderadamente diferenciado, con
ausencia de la expresión de PMS, con expresión tenue de MLH1 y fuerte de
MSH2 y MSH6.
HE-20X MLH1-20X PMS2-20X MSH2-10X MSH6-10XGráfica Nº13 (Caso 19): Adenocarcinoma mucinoso, con ausencia de la expresión
de MSH2 y MSH6, con expresión débil de PMS2 y fuerte de MLH1.
HE-20X MLH1-20X PMS2-20X MSH2-20X MSH6-20X
Gráfica Nº14 (Caso 56): Adenocarcinoma bien diferenciado, con ausencia de la
expresión de MLH1 y PMS2, con expresión fuerte de MSH2 y MSH6.
HE-10X MLH1-20X PMS2-20X MSH2-10X MSH6-10X
La distribución de los casos con expresión anormal de las proteínas MMR, según
el tipo de procedimiento realizado y la localización del tumor en relación con el
tipo de marcador alterado, es la siguiente: Colectomía proximal: 4 casos (40%),
que corresponden a 3 casos de MLH1 y 1 caso de PMS2 y Colectomía distal: 3
casos (30%) que corresponden a casos de 2 PMS2 y 1 caso de MSH2, los cuales
se representan de manera general en la tabla Nº8.
Tabla Nº8: Casos con expresión anormal de las proteínas MMR.
PROCEDIMIENTO MLH1 PMS2 MSH2 MSH6
Colon Derecho 4 1 - -
Colon Izquierdo y Recto - 2 1 -
Sin información 2 - - -
La relación de los casos que presentan ausencia de expresión de las proteínas
MMR de acuerdo con el diagnóstico y grado histológico, fue de 80% (n=8) para
Adenocarcinoma NOS, como se ve en la siguiente tabla Nº9:Tabla Nº9: Casos con ausencia de expresión de las proteínas MMR de acuerdo
con el diagnóstico y grado histológico:
Adenocarcinoma
Adenocarcinoma NOS (n = 8 casos)
mucinoso
Adenocarcinoma (n = 2 casos)
pobremente
Bien Moderadamente Pobremente
diferenciado con
diferenciado diferenciado diferenciado
diferenciación
neuroendocrina
MLH1 2 2 1 - 1
PMS2 1 1 - 1 -
MSH2 - - - - 1
MSH6 - - - - -
En la tabla Nº10 se muestra de manera general los hallazgos encontrados en el
estudio.
Tabla Nº10: hallazgos generales de los casos con expresión anormal de las
proteínas MMR:
CASO PROCEDIMIENTO GENERO EDAD DX HISTOLOGICO MMR
ALTERADO
5 Hemicolectomía M 66 Adenocarcinoma MLH1
derecha moderadamente (MLH1-PMS2)
diferenciado
10 Sigmoidectomía M 61 Adenocarcinoma PMS2
bien diferenciado
13 Hemicolectomía M 69 Adenocarcinoma PMS2
derecha y colon moderadamente
transverso diferenciado
16 Hemicolectomía F 59 Adenocarcinoma PMS2
izquierda pobremente
diferenciado con
diferenciación
neuroendocrina.
18 Hemicolectomía F 53 Adenocarcinoma MLH1
derecha moderadamente
diferenciado
19 Hemicolectomía M 65 Adenocarcinoma MSH2
izquierda Mucinoso (MSH2-MSH6)
20 No información M 65 Adenocarcinoma MLH1
bien diferenciado (MLH1-PMS2)26 No información F 53 Adenocarcinoma MLH1
Mucinoso (MLH1-PMS2)
42 Hemicolectomía M 63 Adenocarcinoma MLH1
derecha pobremente
diferenciado
56 Hemicolectomía M 55 Adenocarcinoma MLH1
derecha e bien diferenciado (MLH1-PMS2)
izquierda9. Conclusiones
El cáncer colorrectal es segundo tipo de cáncer más común en mujeres y el
tercero más común en hombres y explica aproximadamente el 8.5% de las
muertes por cáncer en el mundo de acuerdo a los datos de GLOBOCAN 2012,
teniendo mayor mortalidad en las regiones menos desarrolladas del mundo. En
Colombia el Registro Poblacional de Cáncer de Cali (RPCC) documentó que para
el año 2007 la incidencia de CCR para hombres fue de 15.8 y para mujeres de
14.1 por 100.000 habitantes, generando un incremento gradual de esta patología
desde los años sesentas, en especial desde 1992. Existen otros trabajos que
identifican la incidencia y la mortalidad de diferentes tipos de cáncer en Colombia
en diferentes zonas del país, entre ellos el carcinoma colorrectal.
El carcinoma colorrectal es una enfermedad heterogénea, la comprensión del
proceso carcinogénico ha evolucionado significativamente y el entendimiento de
las vías moleculares ha determinado la posibilidad de definir las vías moleculares
que llevan al fenotipo maligno con la posibilidad de intervenir blancos moleculares
en algunos de los subtipos moleculares. Aproximadamente el 70% de
adenocarcinomas colorrectales son derivados de condiciones precursoras dentro
de las que se encuentran los adenomas y la displasia, propuesta por el Dr. Basil
Morson en una secuencia conocida como secuencia adenoma-carcinoma. El Dr.
Bert Volgestein en los años ochenta determinó las vías moleculares de esta
secuencia, donde describe que debido al acúmulo de mutaciones de oncogenes
(por ejemplo, KRAS) y genes supresores de tumor (por ejemplo, p53), se
producen varios cambios genéticos que son los que van a generar el inicio y la
progresión del cáncer. Con el paso de los años se complementó de manera más
específica esta secuencia de pasos moleculares identificando cada uno de los
genes supresores de tumor y oncogenes comprometidos (ver grafica 1). Debido a
las observaciones realizadas por el Dr. Aldred Warthin, que describió una
predisposición heredada en cáncer de colon, estómago y endometrio, y la cual fue
después desarrollada por el Dr. Henry T. Lynch en los años setentas, se identificó
un patrón de herencia de cáncer colorrectal que se manifiesta con escasos
adenomas colorrectales y está relacionado con otro tipo de tumores, y que añosdespués se llamó Síndrome de Lynch (SL). En 1993, Manuel Perucho y sus
colegas encontraron que el 12% de los tumores CCR tenían bandas más cortas
en longitud. Las secuencias de estas bandas contenían elementos repetitivos
simples (llamados microsatélites), encontrando que estos tipos tumores
presentaron más probabilidad de surgir en el colon proximal, menos probable de
ser invasivo, menos probable de tener mutaciones en KRAS o TP53, más
probable de ser pobremente diferenciado, y además se encontraron en pacientes
jóvenes. Al mismo tiempo, y de manera similar a los hallazgos de Perucho, el
grupo de Thibodeau informó Inestabilidad de Microsatélites (IMS) en el 28% de
los tumores colorrectales y encontró que el 89% de los tumores con IMS fueron
localizados en el colon proximal y se asocia con un mejor pronóstico que los
tumores con Estabilidad Microsatelital (EMS). En los últimos años se han
propuesto dos clasificaciones moleculares la primera de ellas fruto del proyecto
atlas del genoma del cáncer, que definió tres grupos moleculares (hipermutado,
ultramutado y de inestabilidad cromosómica, este último correspondiendo a 84%
de los tumores) y en 2015 la clasificación molecular consenso en la cual se
propuso la existencia de cuatro subtipos moleculares basados en los perfiles de
expresión génica y uno no clasificable (o mixto).
Cuando empezamos el proyecto de investigación habíamos visto que los casos
de carcinoma colorrectal con mutación de KRAS representaban aproximadamente
el 40% de los casos de CCR y aparentemente estaban relacionados con la vía
adenoma carcinoma, pero, durante la ejecución del mismo, se publicaron los
resultados del proyecto genoma del cáncer, que ratificaba esta propuesta, pero
dentro de la definición del fenotipo de inestabilidad cromosómica no se hacía
referencia a la frecuencia de mutación de KRAS, clasificación muy parecida a la
históricamente identificada de inestabilidad cromosómica, inestabilidad de
microsatélites (hipermutados) y un nuevo grupo de carcinomas colorrectales
ultramutados, ninguno de los cuales se caracteriza por mutaciones de KRAS.
Posteriormente se publicó el consenso de la clasificación molecular del cáncer de
colon, producto del análisis por parte de un grupo de científicos de las bases de
datos de expresión génica, por la cual se propuso que la mayoría de tumores
colorrectales pueden clasificarse en cuatro categorías la primera de las cuales
corresponde a la de IMS-inmune (14%) que como desde su descripción se ha
indicado, se caracteriza por presentarse principalmente en mujeres mayores, en
el colon proximal, con intenso infiltrado de linfocitos y en la mayoría de los casos
buen pronóstico con altas tasas de sobrevida a 5 años (recientemente se ha
encontrado que parecen ser susceptibles a inhibición de PD-L1) y aunque el
mecanismo de desarrollo es con mayor frecuencia hipermetilación del promotor
de hMLH1 que puede afectar la expresión de PMS2, un 3 a 4% de los casospuede corresponder a síndrome de Lynch por mutaciones en línea germinal de los
genes de reparación 90% de los cuales suceden en hMLH1 y MSH2 (40 y 50%,
respectivamente) y 10% suceden en MSH6, PMS2 y mutaciones EPCAM, y un
porcentaje podría estar relacionado con deficiencia de reparo constitucional o
deficiencia de reparo somática. Este nuevo esquema ratifica la importancia de
determinar el fenotipo de inestabilidad de microsatélites; sin embargo, en nuestro
estudio encontramos tumores con inestabilidad de microsatélites que se
caracterizan por ser en su mayoría de bajo grado (bien o moderadamente
diferenciados) y sin infiltrado inflamatorio prominente, diferente a lo identificado en
la actual clasificación molecular para el subtipo IMS-inmune. En nuestra serie este
fenotipo alterado predominó en hombres (70%), con promedio de edad de 60.9
años y los marcadores de inmunohistoquímica con mayor ausencia de expresión
fueron hMLH1 y PMS2 (total 90%), que corresponden al mismo complejo
heterodimérico de reparo MutL, a diferencia de lo informado en la literatura (40-
50%).
La frecuencia de este fenotipo de IMS en nuestra serie es ligeramente superior a
lo encontrado en la literatura (18.5% vs 13-15% de reporte en la literatura) en
casos no discriminados por genotipo silvestre para la mutación KRAS; sin
embargo este es un resultado inferior al esperado pues habíamos considerado
que al excluir los tumores con mutación de KRAS, que aparentemente
caracterizan la vía canónica, tendríamos un dramático enriquecimiento del
fenotipo inestable, pero con la nueva evidencia vemos que realmente la mutación
de KRAS puede presentarse en grupos moleculares de carcinoma colorrectal
independientemente de pertenecer a la vía canónica, metabólica, mesenquimal o
incluso IMS- inmune.
Aunque los hallazgos no son definitivos, siguiendo los parámetros de la guía para
el diagnóstico de síndrome de Lynch sobre el análisis de la expresión de
proteínas del sistema MMR, en nuestro estudio vemos que deben estudiarse: 7
casos (70%) para síndrome de Lynch, con mayor probabilidad el caso con pérdida
de MSH2 (10%) y adenocarcinoma mucinoso, y además los casos con pérdida
exclusiva de PMS2 (3 casos, uno bien diferenciado, otro moderadamente
diferenciado y otro pobremente diferenciado). El paso siguiente particularmente
para los tumores con alteración del heterodímero hMLH1/PMS2 (6 casos, 60%)
con alteración exclusiva hMLH1 o hMLH1 y PMS2 es establecer la expresión de
BRAF V600E o la mutación de BRAFV600E o el análisis de hipermetilación del
promotor de hMLH1, para excluir el fenotipo de hipermetilación y de acuerdo a
sus resultados secuenciación génica para confirmar este diagnóstico.Una impresión interesante al realizar este estudio fue aproximarse mediante el
análisis de inmunohistoquímica a la clasificación molecular del cáncer de colon y
parece probable que, al igual que lo que sucede con el cáncer de seno, la
clasificación molecular del cáncer colorrectal se traslade a la patología rutinaria
con la evaluación no solo de estos marcadores de inestabilidad de microsatélites,
sino también de la realización de BRAF V600E, la determinación de la relación de
linfocitos CD4/CD8, la expresión nuclear de Beta Catenina y posiblemente el
desarrollo de otros marcadores de inmunohistoquímica que permitan una
aproximación más económica, simple y difundida, aplicable por cualquier patólogo
en cualquier lugar del mundo de la clasificación molecular.
Queda pendiente como parte del nuevo proyecto de final de residencia,
determinar la mutación BRAF V600E la cual también se realizará por
inmunohistoquímica, en los cortes histológicos de los microarreglos de tejido.
Debemos resaltar también que durante este proyecto se estandarizó la técnica de
realización de microarreglos en el Departamento de Patología de la Facultad de
Medicina de la Universidad Nacional que aunque se habían realizado en
proyectos previos, se estableció un protocolo el cual queda disponible para
futuros proyectos; también se estandarizó el estudio de inmunohistoquímica para
las proteínas del sistema de reparo MMR, el cual se podrá ofrecer para pacientes
con cáncer de colon o para el estudio de pacientes con otros tumores en los
cuales se sugiere que este mecanismo pueda estar involucrado, determinando
por un lado modificación en el protocolo de manejo y en la consejería familiar.
Los autores declaramos que no tenemos conflictos de interés.10. Anexos
10.1. Cotizaciones de anticuerpos cotizados10.2 Cotizaciones de equipos para microarreglos de
tejidos: manuales (punch de piel) y semimanuales:10.3 Aval de comité de ética.Bibliografía
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