Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Autor: Mojica Figueroa, Iván Leonardo
Asesor: Narváez Rincón, Paulo César
Fecha: 2012
Programa: Bogotá - Medicina -Fisioterapia
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: El reconocimiento de los efectos tóxicos de los reactivos utilizados en el laboratorio de  patología han obligado a los investigadores a buscar nuevas alternativas de  procesamiento histotecnológico; una de esta nuevas técnicas es la denominada “libre de  Xilol”.  El propósito del siguiente trabajo fue el diseño de un estudio experimental para evaluar el  rendimiento de la técnica libre de xilol versus el procesamiento histotecnológico  convencional tendiente a valorar la viabilidad de implementar una técnica de  procesamiento alterna menos lesiva que la actualmente empleada.  Las características principales de los preparados obtenidos fueron la presencia de un  adecuado contraste de la coloración, ausencia de retracciones tisulares, ausencia o  mínimas zonas de desprendimiento, ausencia de zonas de fragmentación tisular,  excelente detalle nuclear y excelente conservación de los tejidos ricos en grasas.  La evaluación de los patólogos mostró que el 95% de los preparados libres de Xilol  coloreados con Hematoxilina  and  Eosina fueron calificados como aceptados para hacer  diagnóstico comparados con el 92% de los preparados convencionales.  La coloración de PAS fue calificada como aceptada en el 92% de los casos procesados  libres de xilol, resultados similares a la coloración PAS convencional. El 82% de las  coloraciones TM libres de xilol fueron calificadas como aceptadas.  Después de estandarizar la técnica y realizar el estudio se demostró que la calidad de los  preparados libres de xilol tienen características similares a las obtenidas con la técnica convencional del Laboratorio de Patología Interfacultades, con un costo 30% menor que el  de la técnica convencional. / Abstract. The identification of the toxic effects of the reagents used in the pathological laboratory  has forced researchers to look for new alternatives in Histotechnologists processing; one  of these new techniques is the called “xylene-free”  The aim of the following project was designing an experimental study to evaluate the  xylene-free technique performance against the conventional processing focused on the  assessment the feasibility of implementing an alternative, less harmful processing  technique than the currently used.  The main features of the preparations obtained were the presence of a suitable color  contrast, no tissue retraction, absent or minimal areas of detachment, absence of tissue  fragmentation zones, excellent nuclear detail and excellent preservation of the tissues rich  in fat.  The pathologists` evaluation showed that 95% of xylene-free preparations stained with  hematoxylin and eosin were rated acceptable for diagnosis compared with 92% of  conventional preparations.  The PAS staining was rated acceptable in 92% of the xylene-free cases processed; these  results are similar to conventional PAS staining. 82% of the xylene-free TM colors were  rated as acceptable.  After standardizing the technique and performing the study it was demonstrated that the  quality of xylene-free preparations have similar characteristics to those obtained with the  conventional technique used in the pathology laboratory, costing 30% less than the  conventional technique.

Evaluación del rendimiento de la técnica de
procesamiento histotecnológico libre de xilol
versus la técnica convencional en el
Laboratorio de Patología Interfacultades de la
Universidad Nacional de Colombia
Iván Leonardo Mojica Figueroa
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Patología
Bogotá D.C.
2012Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de ColombiaEvaluación del rendimiento de la técnica de
procesamiento histotecnológico libre de xilol
versus la técnica convencional en el
Laboratorio de Patología Interfacultades de la
Universidad Nacional de Colombia
Iván Leonardo Mojica Figueroa
Trabajo de Grado presentado como requisito para optar al título de:
Patólogo Anatómico y Clínico
Director (a):
Dr. Angel Yobany Sanchez Merchán
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina
Departamento de Patología
Bogotá D.C.
2012Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de ColombiaDedicado a mi esposa y a mi hija por ser el motivo,
la inspiración, la fuerza, el entusiasmo y la razón de mi vida.
También a ti madre por ser el sustento sobre el cual se cimentó
este sueño de ser Patólogo.
Gracias a ustedes este proyecto fue posible.Agradecimientos
A Dios porque aunque no merecemos nada, su gracia y su amor son tan infinitos que me
permitieron cumplir mi sueño.
A mi esposa y a mi hija por el amor y la paciencia que tuvieron para que pudiera culminar
este proyecto.
A mi madre porque su esfuerzo e incondicionalidad, me han llevado a volar más alto de lo
que nunca pude imaginar.
A mi profesor, el Dr. Angel Yobany Sánchez Merchán, porque su guía, acompañamiento e
iniciativa fueron claves para el desarrollo del presente trabajo
A la Dra. María Teresa Vallejo y a la Estadística Ruth Barrera, por su aporte en el análisis
estadístico de los resultados.
A la Señora Susana Contreras, Maritza Ramírez y Octavio Jiménez, por su colaboración
para la realización del proyecto.
Finalmente, a la Universidad Nacional de Colombia, a mis profesores y a mis compañeros
de residencia porque gracias a ustedes estos cuatro años siempre quedaran en mi
corazón.Resumen y Abstract IX
Resumen
El reconocimiento de los efectos tóxicos de los reactivos utilizados en el laboratorio de
patología han obligado a los investigadores a buscar nuevas alternativas de
procesamiento histotecnológico; una de esta nuevas técnicas es la denominada “libre de
Xilol”.
El propósito del siguiente trabajo fue el diseño de un estudio experimental para evaluar el
rendimiento de la técnica libre de xilol versus el procesamiento histotecnológico
convencional tendiente a valorar la viabilidad de implementar una técnica de
procesamiento alterna menos lesiva que la actualmente empleada.
Las características principales de los preparados obtenidos fueron la presencia de un
adecuado contraste de la coloración, ausencia de retracciones tisulares, ausencia o
mínimas zonas de desprendimiento, ausencia de zonas de fragmentación tisular,
excelente detalle nuclear y excelente conservación de los tejidos ricos en grasas.
La evaluación de los patólogos mostró que el 95% de los preparados libres de Xilol
coloreados con Hematoxilina & Eosina fueron calificados como aceptados para hacer
diagnóstico comparados con el 92% de los preparados convencionales.
La coloración de PAS fue calificada como aceptada en el 92% de los casos procesados
libres de xilol, resultados similares a la coloración PAS convencional. El 82% de las
coloraciones TM libres de xilol fueron calificadas como aceptadas.
Después de estandarizar la técnica y realizar el estudio se demostró que la calidad de los
preparados libres de xilol tienen características similares a las obtenidas con la técnica
9Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
convencional del Laboratorio de Patología Interfacultades, con un costo 30% menor que el
de la técnica convencional.
Palabras Clave: Técnicas de Laboratorio, Técnica Histológica, Procesamiento de tejidos,
Isopropanol, Alcohol isopropílico, Xilenos.
Abstract
The identification of the toxic effects of the reagents used in the pathological laboratory
has forced researchers to look for new alternatives in Histotechnologists processing; one
of these new techniques is the called “xylene-free”
The aim of the following project was designing an experimental study to evaluate the
xylene-free technique performance against the conventional processing focused on the
assessment the feasibility of implementing an alternative, less harmful processing
technique than the currently used.
The main features of the preparations obtained were the presence of a suitable color
contrast, no tissue retraction, absent or minimal areas of detachment, absence of tissue
fragmentation zones, excellent nuclear detail and excellent preservation of the tissues rich
in fat.
The pathologists` evaluation showed that 95% of xylene-free preparations stained with
hematoxylin and eosin were rated acceptable for diagnosis compared with 92% of
conventional preparations.
The PAS staining was rated acceptable in 92% of the xylene-free cases processed; these
results are similar to conventional PAS staining. 82% of the xylene-free TM colors were
rated as acceptable.Resumen y Abstract IX
After standardizing the technique and performing the study it was demonstrated that the
quality of xylene-free preparations have similar characteristics to those obtained with the
conventional technique used in the pathology laboratory, costing 30% less than the
conventional technique.
Key words: Laboratory technics and procedures, histological technique, tissue process,
isopropanol, isopropyl alcohol, xylenes.
11Contenido XIII
Contenido
Pág.
Resumen ............................................................................................................................... 9
Lista de ilustraciones ....................................................................................................... XV
Lista de tablas ................................................................................................................. XVII
Lista de Gráficos ........................................................................................................... XVIIII
Introducción ......................................................................................................................... 1
1. Planteamiento del problema ....................................................................................... 3
2. Justificación .................................................................................................................. 5
3. Objetivos ....................................................................................................................... 7
3.1 Objetivo general................................................................................................... 7
3.2 Objetivos específicos........................................................................................... 7
4. Marco referencial .......................................................................................................... 9
4.1 Definición de técnicas histológicas y reseña histórica........................................ 9
4.2 Procesamiento histotecnológico de tejidos convencionales............................. 10
4.2.1 Fijación.................................................................................................... 12
4.2.2 Deshidratación tisular ............................................................................. 19
4.2.3 Aclaramiento ........................................................................................... 21
4.2.4 Impregnación .......................................................................................... 24
4.2.5 Inclusión .................................................................................................. 25
4.3 Alcohol isopropílico y procesamiento de tejidos libre de xilol........................... 27
4.3.1 Alcohol isopropílico y el laboratorio de patología .................................. 27
4.3.2 Procesamiento histológico libre de xilol ................................................. 28
4.3.3 Efectos tóxicos del alcohol isopropílico.................................................. 30
4.4 Estrategias para disminución de costos en el laboratorio de patología ........... 31
4.5 Control de calidad en el laboratorio de patología ............................................. 34
5. Estandarización de la técnica libre del xilol ............................................................ 39
5.1 Obtención de muestras y procesamiento de tejidos ......................................... 39
5.2 Proceso de coloración ....................................................................................... 40
5.3 Resultados obtenidos ........................................................................................ 41
5.4 Conclusiones y recomendaciones..................................................................... 42XIV Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre Título de la tesis o trabajo de investigación
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
6. Metodología ................................................................................................................. 45
6.1 Diseño metodológico ......................................................................................... 45
6.1.1 Criterios de inclusión .............................................................................. 45
6.1.2 Criterios de exclusión ............................................................................. 45
6.1.3 Realización de la prueba ........................................................................ 45
6.1.4 Planilla para control de la calidad del proceso histotecnológico ........... 46
6.1.5 Consideraciones éticas .......................................................................... 47
6.2 Procesamiento de la información ...................................................................... 48
6.2.1 Descripción del conjunto de datos ......................................................... 48
6.2.2 Análisis de la información ....................................................................... 48
7. Resultados................................................................................................................... 49
7.1 Hematoxilina & eosina ....................................................................................... 49
7.2 Coloración de pas y tricrómico .......................................................................... 51
7.3 Observacione y comentarios ............................................................................. 53
8. Discusión ..................................................................................................................... 55
9. Conclusiones y recomendaciones ........................................................................... 59
A. Anexo A: Planilla de control de calidad del proceso histotecnológico............... 61
B. Anexo B: Guía para el diligenciamiento de la planilla de control de calidad...... 63
Bibliografía ......................................................................................................................... 71Contenido XV
Lista de ilustraciones
Pág.
Ilustración 4-1: Pasos del procesamiento histológico de tejidos. .................................... 10
Ilustración 4-2: Técnica de procesamiento convencional UNAL ..................................... 11
Ilustración 4-3: Procesador automatizado de tejidos Cytadell® 2000 ............................. 26
Ilustración 4-4: Estación de inclusión ............................................................................... 26
Ilustración 4-5: Procesamiento libre de xilol..................................................................... 29
Ilustración 4-6: Comparación métodos de procesamiento de tejidos.............................. 30
Ilustración 4-7: Desparafinización, tinción y montaje ....................................................... 31
Ilustración 4-8: Mama. Comparación de los métodos de procesamiento.. ..................... 32
Ilustración 4-9: Elementos de un proceso ........................................................................ 35
Ilustración 5-1: Proceso de estandarización de la técnica libre de xileno ....................... 41
Ilustración 5-2: Esquema de procesamiento libre de xilol implementado ........................ 40
Ilustración 5-3: Proceso de desparafinización y coloración implementado..................... 41
Ilustración 5-4: Riñón 10X y 20X. Comparación de las técnicas de Procesamiento ...... 43
Ilustración 7-1: Piel. Procesamiento libre de Xilol ............................................................ 53XVI Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre Título de la tesis o trabajo de investigación
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Lista de Tablas
Pág.
Tabla 4-1: Características del fijador ideal ........................................................................ 12
Tabla 4-2: Mecanismos de fijación .................................................................................... 13
Tabla 4-3: Efectos tóxicos del formaldehído ..................................................................... 15
Tabla 4-4: Otros fijadores................................................................................................... 19
Tabla 4-5: Agentes deshidratantes .................................................................................... 20
Tabla 4-6: Agentes aclarantes ........................................................................................... 22
Tabla 4-7: Tipos de parafina .............................................................................................. 25
Tabla 4-8: Soluciones fijadoras que utilizan alcohol isopropílico ...................................... 28
Tabla 4-9: Estrategias para disminución de costos en los laboratorios de patología ...... 33
Tabla 4-10: Criterios para evaluar la calidad de las láminas de histología....................... 37
Tabla 5-1: Componentes del jabón para platos utilizado en el proceso de
desparafinización ................................................................................................................ 42
Tabla 7-1: Comparativo de los criterios de evaluación para la coloración H & E ............. 49
Tabla 7-2: Comparación del puntaje total obtenido por las dos técnicas de Procesamiento
............................................................................................................................................. 51
Tabla 7-3: Comparativo criterios de evaluación coloraciones de PAS y TM .................... 52
Tabla 8-1: Evaluación económica ...................................................................................... 58Contenido XVII
Lista de gráficos
Gráfico 7-1: Puntaje total obtenido por número de casos ................................................ 51
Gráfico 7-2: Puntaje total obtenido por técnica de procesamiento................................... 52Introducción
La histotecnología se encarga de estudiar los fundamentos técnicos y la secuencia
necesaria para llevar a cabo el análisis de los tejidos por medio de preparaciones
histológicas y la demostración microscópica de la morfología celular, la composición
química y la función de los tejidos normales y anormales.
A pesar de la inclusión de algunas coloraciones nuevas, el procesamiento rutinario de
tejidos y la coloración con hematoxilina y eosina continúan siendo la piedra angular en el
diagnóstico patológico sin presentar cambios significativos en sus técnicas durante los
últimos 150 años; mientras en otras áreas del conocimiento se han dado importantes
desarrollos, en la histotecnológia los avances corresponden principalmente a la
implementación de procesos de automatización quedando rezagada la innovación de
nuevas métodos en el laboratorio de patología.
Recientemente el descubrimiento de la toxicidad de muchos de los componentes del
procesamiento y la necesidad de disminuir costos y tiempo de procesamiento han
obligado a buscar alternativas más rápidas, menos costosas y menos tóxicas para
realizar estos procesos, como la incorporación del microondas al procesamiento de
tejidos, la utilización de nuevos fijadores como el UMFIXR y la aplicación de nuevas
estrategias administrativas tendientes a disminuir costos
Siguiendo esta tendencia, hace quince años en Suecia se desarrolló un nuevo método
histotecnológico de procesamiento de tejidos conocido “libre de xilol” obteniendo
resultados que se encuentran a la par del procesamiento de rutina utilizado en los
laboratorios de patología. El principal elemento innovador de esta técnica es la
suspensión de los agentes aromáticos del proceso de aclaramiento, disminuyendo la
exposición laboral a los efectos tóxicos de estas sustancias.2 Introducción
En el trabajo que mostramos a continuación se implementó y estandarizó la técnica de
procesamiento histológico libre de xilol para después evaluar la calidad de los preparados
histológicos procesados con esta técnica y compararla con la técnica convencional
utilizada en Laboratorio de Patología Interfacultades de la Universidad Nacional de
Colombia.Capítulo 1 3
1. Planteamiento del Problema
El laboratorio de patología ha mostrado poco desarrollo en comparación con otras áreas
de apoyo diagnóstico como el laboratorio clínico y las técnicas de imágenes diagnósticas.
El proceso primordial de diagnóstico (la técnica de H&E) se mantiene relativamente igual
a como fue desarrollada hace ya más de 150 años.
El reconocimiento de los efectos tóxicos de los reactivos utilizados durante los procesos
del laboratorio, han obligado al aumento de controles ambientales y laborales, a la
utilización de mecanismos de protección laboral y la identificación de agentes menos
tóxicos que mantengan la misma eficiencia de los utilizados en la rutina.
Por lo tanto el Laboratorio de Patología se enfrenta actualmente a múltiples desafíos que
exigen el desarrollo de estrategias técnicas y administrativas que le permitan mantenerse
dentro de los sistemas de salud y las condiciones ambientales actuales.
El propósito de este trabajo es comparar los preparados obtenidos con la técnica libre de
xileno versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología Interfacultades de la
Universidad Nacional de Colombia.Capítulo 2 5
2. Justificación
Los elevados costos de los servicios de salud han obligado también a que los
departamentos y laboratorios de patología se vean enfrentados a ser dependencias más
productivas y eficientes en el uso de los recursos. En tal sentido se han investigado
estrategias relacionadas con la disminución de costos, disminución del impacto ambiental
producto de los insumos y reactivos usados, y la disminución del tiempo en los procesos
que se cumplen dentro del laboratorio.
Comparado con los grandes laboratorios de referencia los pequeños y medianos
laboratorios son esencialmente manuales, lo que dificulta la implementación de estas
estrategias y aumenta el riesgo laboral, el tiempo de ejecución de los procesos y la
estandarización de los mismos.
Si bien están descritas múltiples estrategias administrativas para la contención de costos
y optimización de los recursos en los laboratorios de patología, es escasa la literatura
sobre técnicas innovadoras y de alto impacto que permitan obtener resultados de calidad
similar o mejor a los obtenidos con las técnicas rutinarias.
El presente trabajo tiene relevancia en el Laboratorio de Patología de la Universidad
Nacional de Colombia, pues permite la estandarización de nuevos métodos que podrían
modificar los costos de procesamiento y el riesgo ambiental, facilitarían la aplicación de
técnicas de biología molecular o inmunopatología y por otra parte, aumentaría el interés
académico por las técnicas del laboratorio.
5Capítulo 3 7
3. Objetivos
3.1 Objetivo general
Establecer el rendimiento de la técnica libre de xilol versus el procesamiento
histotecnológico convencional en muestras de especímenes quirúrgicos recibidas para
estudio histopatológico.
3.2 Objetivos específicos
 Implementar y estandarizar el método de procesamiento histotecnológico conocido
como “libre de xilol” en el Laboratorio de Patología de la Universidad Nacional de
Colombia.
 Describir y evaluar las características técnicas de los preparados histológicos
obtenidos con el uso del procesamiento convencional versus la técnica “libre de xilol”.
 Categorizar el material obtenido mediante el uso del procesamiento convencional
versus la técnica “libre de xilol” de acuerdo con la escala de valoración de calidad
propia del Laboratorio de Patología Interfacultades, modificada de acuerdo a los
criterios de evaluación del Colegio Americano de Patólogos.
 Comparar el resultado de los preparados histológicos procesados con la técnica libre
de xilol y el método convencional de procesamiento utilizado en el Laboratorio de la
Universidad Nacional de Colombia.
74. Marco referencial
4.1 Definición de técnicas histológicas y reseña histórica
Se consideran como técnicas histológicas la serie de procesos a los que se someten la
totalidad o una parte de los tejidos para su estudio microscópico con la finalidad de
investigar su estructura y composición ó para el diagnóstico e identificación etiológica de
la enfermedad.
Históricamente solo dos siglos después a la invención del microscopio y del
descubrimiento de las células por Hooke en 1665, Schleiden y Schwann describen la
teoría celular lo cual induce una explosión en la búsqueda de técnicas histoquímicas1.
Hacia 1825, Raspail y Caventou son los primeros en utilizar el yodo como colorante para
el almidón en el proceso de fertilización de flores. Durante cerca de 40 años el desarrollo
de la histoquímica permaneció estático siendo lentos los avances principalmente en el
área de la botánica, teniendo en cuenta que inicialmente las técnicas producían
importante alteración estructural y estaban encaminados a demostrar componentes
tisulares específicos.
Solo hasta después de 1860 los estudios de Bencke introducen los colorantes de anilina
como actores fundamentales en los procesos histoquímicos, generando un cambio
revolucionario en la práctica histológica diaria. Esto permitió que se emplearan múltiples
colorantes diferentes y mezclas de los mismos para poder correlacionar la tinción con la
estructura tisular. Ehrlich, Witt y Mann inician la búsqueda de las bases químicas de las
tinciones, mientras que se desarrollaban nuevas técnicas histoquímicas como la
hematoxilina y la eosina.
1 Geneser F. “Histología” Ed. Panamericana, 2000, p. 110 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Durante las primeras tres décadas del siglo XX, aparecen múltiples técnicas diferentes
como la reacción Ehrlich para células cebadas o la tinción de Gram entre muchas otras.
Reconocidos autores como Ramón y Cajal desarrollaron otras técnicas durante sus
experimentos.2
A medida que aparecieron las técnicas de inmunopatología se estancó el desarrollo de
nuevas técnicas histoquímicas, sin desconocer que en la práctica diaria se utilizan gran
cantidad de coloraciones como ayuda a la Hematoxilina & eosina. Sin embargo a pesar
de las revisiones que existen sobre la historia de la histoquímica, es poca la literatura que
existe sobre la historia de los métodos del procesamiento histológico.
4.2 Procesamiento histotecnológico de tejidos
convencional
Para poder hacer una observación microscópica se requiere realizar una adecuada
preparación histológica en la que se toman muestras de muy escaso espesor de un
bloque de tejido incluido en parafina. La serie de pasos que permiten la inclusión de los
tejidos en parafina se denomina procesamiento histotecnológico de tejidos y tiene como
objetivo el mantenimiento de la estructura tisular y la dureza del tejido para permitir la
inclusión del tejido en un medio sólido para el corte (Ilustración 4-1).
Ilustración 4-1: Pasos del Procesamiento Histológico de Tejidos.
FFIIJJAACCIIOONN
DDEESSHHIIDDRRAATTAACCIIÓÓNN
AACCLLAARRAAMMIIEENNTTOO
IIMMPPRREEGGNNAACCIIÓÓNN
Son diversos los factores que afectan el procesamiento histológico de tejidos:
2 Pearse A. “Histoquímica Teórica y Aplicada” 1960. p 9.Capítulo 4 11
 El espesor de los cortes entre 2 y 5 mm es fundamental para asegurar la fijación
completa y la adecuada impregnación.
 La temperatura es fundamental para la difusión de los reactivos en los tejidos; una
temperatura de 37º a 45º durante el proceso de deshidratación y aclaramiento
hace más rápido el procesamiento.
 La utilización del vacío y la presión durante el proceso de impregnación agiliza y
optimiza significativamente la difusión de la parafina en el tejido
 La agitación de los casetes permite la circulación de los reactivos y el contacto de
los mismos con la mayor área de superficie tisular.3
La utilización de los nuevos procesadores automatizados de tejidos, permite la
modificación de estas variables para que el proceso se optimice y a su vez pueda ser
agilizado. Además permite que se puedan programar múltiples esquemas de
procesamiento en los que cambian el número de baños consecutivos en los reactivos o el
tiempo de duración de los mismos. En la ilustración 4-2 se muestra el esquema utilizado
actualmente en el procesador automatizado del Laboratorio de Patología de la
Universidad Nacional de Colombia.
Ilustración 4-2: Técnica de Procesamiento Convencional UNAL
FFoorrmmooll AAllccoohhooll 9966%% AAllccoohhooll 9966%% AAllccoohhooll 9966%%
11 hhoorraa 11 hhoorraa 11 hhoorraa 11 hhoorraa
AAllccoohhooll 110000%%
11 hhoorraa
AAllccoohhooll 110000%%
IInncclluussiióónn
11 hhoorraa
PPaarraaffiinnaa
AAllccoohhooll 110000%%
VVaacciióó
11 hhoorraa
11 hhoorraa
PPaarraaffiinnaa XXiillooll XXiillooll AAllccoohhooll 110000%%
11 hhoorraa 11 hhoorraa 11 hhoorraa 11 hhoorraa
3 Crocker J. “The science of the laboratory diagnosis” Jhon Wiley & sons. p.7
1112 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
4.2.1 Fijación
Cuando los tejidos pierden la capacidad de completar el ciclo biológico, aparece la
muerte como la incapacidad celular de recuperar ciertas funciones vitales que le son
inherentes, entrando en un proceso denominado autolisis, que no es otra cosa diferente a
la autodigestión celular.
Para poder preservar los tejidos se debe evitar que el proceso de autolisis se inicie o se
interrumpa lo más pronto posible, utilizando los fijadores tisulares; estas sustancias
buscan conservar la arquitectura y la composición tisular lo más cercano posible a
cuando el tejido se encontraba vivo, es decir una imagen equivalente. De una adecuada
fijación dependerá un satisfactorio diagnóstico; nunca un error de fijación se podrá
corregir.
Los procesos de fijación también permiten preservar la composición molecular y la
bioquímica de los tejidos de manera que puedan ser teñidas por coloraciones especiales
gracias a las reacciones histoquímicas o la identificación de antígenos específicos con
métodos de inmunopatología.
Aunque no existe un fijador ideal, se existen ciertas características que permitirán
comparar una sustancia de la otra y acercarse al fijador óptimo (Tabla 4-1).
Tabla 4-1: Características del fijador ideal
Características del Fijador Ideal
Bloqueo Inmediato de la Autolisis
Efecto microbicida Inmediato
No Inducir retracciones o distorsiones
Inducir cambios de consistencia y textura
para completar el resto del proceso.
La velocidad de penetración del fijador en los tejidos y la velocidad a la cual los tejidos se
fijan, son fundamentales para poder bloquear el proceso de autolisis. El proceso de
penetración depende de cada agente fijador y del tejido; se puede facilitar el acceso de la
sustancia fijadora haciendo cortes en el espécimen, de manera que dicha sustancia
ingrese más rápido hasta las zonas profundas de los tejidos.Capítulo 4 13
Además de las características histoquímicas, debe recordase que existen variables
económicas que hacen parte de la escogencia de los productos que se van a utilizar en
el laboratorio; por tal razón hay que tener en cuenta que los volúmenes a utilizar y el
costo de cada fijador son finalmente parte de las características del fijador ideal.
Los fijadores simples son agrupados en cuatro clases dependiendo del mecanismo por
medio del cual actúan sobre los tejidos (Tabla 4-2). Existen algunas sustancias que son
utilizadas rutinariamente en el Laboratorio de Patología como fijadores. A continuación se
hace una breve descripción de cada uno, enfatizando en el formaldehído que es el fijador
de uso más frecuente.
Tabla 4-2: Mecanismos de Fijación
Mecanismos de Fijación
Eliminación de la mayor cantidad de agua Alcohol etílico
del tejido
Precipitación de las proteínas y perdida de
Deshidratación Tisular su actividad
Conservación de los determinantes Acetona
antigénicos
Producción de alteraciones Morfológicas
Cambio Coloidal por Descenso PH Ácido acético
Cambios Coloides de las Fijadores Ácidos Acido Crómico
proteínas Gran Velocidad de Penetración
Ácido
Capacidad decalcificante
Tricloroacético
Cloruro mercúrico
Formación de sales con Proteínas
Formación de Sales Bloqueo de lísis Dicromato
Potásico
Formol
Reticularización de las Inducción retículo
Proteínas Rompimiento de puentes de Hidrógeno Glutaraldehído
Perdida estructura y función Proteínas
Tetróxido Osmio
 Formaldehído
El formaldehído (C-H2-O) hace parte de la familia de los aldehídos, físicamente a
temperatura y presión normal se encuentra como gas incoloro, con fuerte olor picante. En
las soluciones acuosas el grupo aldehído se hidrata a radical metilenglicol, compuesto
1314 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
altamente reactivo que forma puentes metílicos con los grupos amino, imino, imido y
guanidil entre otros, lo que explica su acción sobre las proteínas tisulares.
El formaldehído tiene la ventaja de ser una molécula pequeña altamente soluble en agua,
que penetra fácilmente a los tejidos y provoca un cambio severo en las moléculas
proteicas y lipídicas lo que a la postre induce perdida funcional de las mismas,
bloqueando el proceso lítico de los tejidos. Estas propiedades del formol permiten la
conservación de los tejidos que van a ser utilizados en las preparaciones histológicas, las
cuales posteriormente son sometidas al resto del proceso histotecnológico.4
Comercialmente se consigue como una solución saturada de gas formaldehído en agua
en una concentración del 37-40% la cual se denomina formalina. Para ser utilizada como
solución fijadora debe ser diluida a una concentración del 4% con agua destilada.
Adicionalmente, para evitar alteraciones en la morfología por cambios severos en la
osmolaridad se puede agregar cloruro de sodio (8,5g/L), sin embargo lo ideal es
tamponar la solución con fosfato monobásico (3.5g/L) más fosfato dibásico (6.5g/L). La
utilización de formol tamponado evita el ingreso de grandes cantidades de agua a los
espacios intercelulares, lo que evita la producción de artificios.
Sin duda es el fijador más utilizado a nivel mundial por ser económico, fácil de preparar,
estable, además de ser desinfectante y no endurecer los tejidos excesivamente; a
diferencia de los alcoholes, produce escasa retracción tisular y penetra los tejidos a una
velocidad de 1 mm/h. En términos generales todos los tejidos se fijan fácilmente en
formol por lo que es el fijador de elección.
La exposición al formaldehído del personal que trabaja en los laboratorios de patología
(patólogos, histotecnólogos, auxiliares) se encuentra en niveles elevados (> a 3 ppm)
suficientes para desarrollar síntomas secundarios.5
4 García R. “Laboratorio de Anatomía Patológica” Interamericana McGraw Hill. 1993, p 42
5 Bingham, E. Patty's Toxicology. John Wiley & Sons,2001, p. 5Capítulo 4 15
En la Universidad Nacional de Colombia se han realizado estudios6,7 para evaluar las
concentraciones de formaldehído en los laboratorios y sus efectos sobre la salud del
personal expuesto. Por tal razón desde el 2004 se ha desarrollado el Sistema de
Vigilancia Epidemiológica Ocupacional para la Prevención y Detección de Efectos en la
Salud, Relacionados con la Exposición al Formaldehído, gracias al cual se han venido
dando la pautas para implantar una metodología que permita identificar a tiempo las
alteraciones de la salud relacionadas con la exposición al formaldehído y así poder
decidir sobre las medidas técnicas y administrativas a que haya lugar.
En el Laboratorio de Patología Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia se
encontró que la concentración del formol, alcanza 2.49 ppm, lo que se considera como
riesgo relativo alto puede desencadenar los efectos mencionados en la Tabla 4-3.
Tabla 4-3: Efectos Tóxicos del Formaldehído
Efectos Tóxicos del Formaldehído
Agudos Crónicos
Escozor nasal Asma de origen laboral
Lagoftalmos Dermatitis alérgica
Irritación y “agrietamiento” dérmico Somnolencia
Ulceración y opacidad cornea Perdida de la Memoria
Broncoespasmo Carcinoma Nasofaríngeo y sinunasal
La irritación ocular es uno de los primeros síntomas en aparecer en las personas que no
están expuestas rutinariamente a concentraciones de 0.5 ppm. Es especialmente grave
la exposición en pacientes con hipersensibilidad bronquial como los asmáticos o
pacientes con EPOC por el alto riesgo de broncoespasmo. La exposición crónica puede
inducir cambios en la espirometría, presentando reducción severa del volumen
espiratorio forzado en el primer segundo VEF-1.
Recientemente la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC), ha
ubicado al Formaldehído en el grupo 1, como agente carcinogénico por la fuerte
evidencia encontrada tanto en humanos como en modelos animales, principalmente en el
6 Rojas G. “Evaluación de concentración del Formaldehido – UNAL”. UNAL – ARS Seguro Social,
2006, p9
7 UNAL – ARS. Seguro Social. “Evaluación de la exposición ocupacional a contaminantes
químicos: Formaldehído y Monoxido de Carbono UNAL” 2007, p16
1516 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
desarrollo de carcinoma nasofaríngeo, carcinoma sinunasal, y el aumento en el riesgo
relativo de desarrollar leucemia de tipo mieloide.8
 Glutaraldehído
Sintetizado en 1908 el glutaraldehído (C5-H8-O2) es un dialdehído líquido de
características oleosas que actúa de manera muy similar al formaldehído, siendo
utilizado mucho tiempo después de su invención en los procesos de fijación para
microscopía electrónica y de luz. Es más estable al encontrarse en soluciones ácidas y a
temperaturas entre 0 y 4 ºC.
Comercialmente el glutaraldehído se consigue como una solución al 25% que debe ser
diluida a una concentración del 1, 2.5 ó 4% utilizando el amortiguador de fosfato de
Sorensen, 0.1 M, de PH 7.4; esta dilución mantiene su potencia aproximadamente
durante tres meses entre 0 y 4ºC o dos semanas a temperatura ambiente.
Las biopsias pueden ser fijadas con solución al 2.5% requiriendo de 2 a 4 horas para la
fijación completa. Los especímenes de mayor tamaño, requieren mínimo de 24 horas
para su completa fijación y un volumen 20 veces mayor al del espécimen, lo que
aumenta sus costos en el laboratorio. Posterior a la fijación, los tejidos deben ser
deshidratados en alcohol etílico y luego ser incluidos de manera habitual.
Son conocidas las características del glutaraldehído como guardián de la morfología
celular ya que forma enlaces más estables con las proteínas, aumentando su estabilidad
y evitando la hidrólisis ácida, razón por la cual es el fijador de elección para la
microscopía electrónica. Tiene una velocidad de fijación muy baja, por lo cual no es muy
utilizado con especímenes de mayor tamaño; de otra parte genera importantes
retracciones y endurecimiento tisular, por lo que requiere que el tiempo de fijación sea
estrictamente vigilado y en la preparación de la técnica de PAS induce un importante
fondo positivo, lo cual tiende a disminuir significativamente su utilidad.
8 IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. “Formaldehyde”. 2006.
p. 2Capítulo 4 17
El glutaraldehído es considerado un irritante de las mucosas y de las vías respiratorias
altas, a bajas concentraciones y por periodos cortos, teniendo presente que por la baja
presión de vapor, la exposición a gases irritantes es relativamente baja. En ojos y piel se
observan reacciones adversas después de 0.3 ppm., pero las reacciones dérmicas no
son frecuentes. No han sido descritos efectos carcinogénicos en animales y humanos.9
 Alcohol etílico
El alcohol etílico (CH -CH -OH) es un líquido transparente, inflamable, muy volátil y de
3 2
olor agradable. En el laboratorio de patología se usa principalmente en el proceso de
deshidratación tisular, pero también puede ser utilizado como fijador.
El etanol se consigue comercialmente como alcohol absoluto siendo muy costoso para
evitar su adquisición clandestina para la elaboración de bebidas alcohólicas de
contrabando. Como fijador se puede utilizar en una concentración entre el 70 y el 90%,
tomando 70 a 90 ml de alcohol absoluto y completando 100 ml con agua destilada.
Tiene las ventajas de preservar el glucógeno, los antígenos y ciertas enzimas por lo que
es el de preferencia como fijador en los métodos inmunohistoquímicos. Por otra parte
penetra rápidamente los tejidos y los deshidrata al mismo tiempo de fijarlos, lo que
disminuye a la postre el tiempo de procesamiento.
Durante el proceso endurece y contrae excesivamente los tejidos, además disminuye
progresivamente su concentración por diluirse con el agua que extrae de los tejidos,
perdiendo de esa forma su actividad. En la práctica se utiliza solo como fijador de
láminas de citología.10
Son conocidos los efectos del etanol sobre el Sistema Nervioso Central cuando es
ingerido como componente de una bebida alcohólica. A nivel laboral, concentraciones
elevadas de vapor del etanol puede producir síntomas irritativos oculares pero no se han
9 American Conference of Governmental Industrial Hygienists. “Threshold Limit Values for
Chemical Substances and Physical Agents and Biological Exposure Indices” 2005, p. 31
10 Op Cit. P. 34
1718 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
documentado lesiones oculares permanentes. El contacto directo del etanol con las
conjuntivas, puede producir quemadura química leve a severa dependiendo de la
concentración y el tiempo de exposición. La manipulación del alcohol etílico debe ser
cuidadosa por su carácter inflamable. La adecuada señalización y precauciones para la
manipulación son fundamentales para evitar accidentes fatales en el laboratorio. No han
sido descritos efectos carcinogénicos en animales ni en humanos.11
 Otros fijadores
Existen otros fijadores que preservan ciertas características tisulares que les permiten ser
escogidos por el patólogo para casos especiales (Tabla 4-4).
Los fosfolípidos por ejemplo, son muy bien preservados con la solución fijadora de Baker
que utilizaba la formalina con cloruro de calcio y de cadmio. Posteriormente, McManus
modifico el cloruro de cadmio por nitrato de cobalto que era más económico y mantenía
la eficiencia.
La solución de Bouin (ácido pícrico más formalina concentrada), es muy utilizada como
alternativa a la formalina en tejidos muy quebradizos como la piel, los órganos
endocrinos, testículo y tejidos embrionarios o cuando el histotecnólogo no es muy
experimentado.
 Nuevos fijadores - UMFIX12
Durante los últimos años se ha utilizado un nuevo fijador molecular desarrollado por
Sakura Finetek USA, Inc. denominado UMFÍX, el cual es una mezcla de polietilenglicol y
metanol que preserva las macromoléculas de los tejidos, moléculas que normalmente se
alteran durante la fijación con formol.
11 American Conference of Governmental Industrial Hygienists. “Threshold Limit Values for
Chemical Substances and Physical Agents and Biological Exposure Indices” 2008, p. 28
12 Vincek V. “A Tissue Fixative that Protects Macromolecules (DNA, RNA, and Protein) and
Histomorphology in Clinical Samples”. Lab Invest 2003; 83: 1427.Capítulo 4 19
Los avances en biología molecular exigen actualmente que las macromoléculas sean
conservadas y hasta ahora solamente los tejidos en fresco son capaces de dar el mejor
rendimiento para técnicas como PCR, CISH, FISH, Western blot o inmunohistoquímica.
En el Hospital Jackson Memorial el Dr. Nadji y colaboradores de la Universidad de
Miami, han probado con éxito el UMFIX como fijador tisular obteniendo resultados
histológicos similares a los que se obtienen con el formol. De otra parte no se han
encontrado diferencias significativas entre los tejidos frescos y fijados con UMFIX al
realizar PCR, microarreglos y otras técnicas moleculares, lo que demuestra que la
preservación y recuperación antigénica es muy similar entre los dos métodos. El UMFIX
también parece tener excelente actividad microbicida gracias al metanol.
Tabla 4-4: Otros Fijadores
Otros Fijadores
Tetróxido Osmio
Cloruro mercúrico
Simples
Dicromato Potásico
Ácido acético
Bouin
B5
Compuestos
Zenker
Bouin Hollander
La cercanía que parece tener el UMFIX con el método de fijación ideal, dista solamente
por el elevado costo que lo hace una alternativa aún lejana para ser utilizado como
método de rutina en el laboratorio.
4.2.2 Deshidratación tisular
Los tejidos contienen gran cantidad de agua intra y extracelular que debe ser extraída y
reemplazada por un medio que llene las cavidades y le confiera consistencia firme para
realizar los cortes. Este proceso recibe el nombre de deshidratación.
Para realizar este proceso se pueden utilizar diferentes sustancias que tengan afinidad
con el agua, que se mezclen con ella y puedan penetrar fácilmente en los tejidos y
cumplir su función sin alterar las estructuras tisulares para posteriormente ser removida
sin inconvenientes por el agente aclarante (Tabla 4-5).
1920 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Tabla 4-5: Agentes Deshidratantes
Agentes Deshidratantes
Alcohol Etílico
Alcohol Metílico
Dioxano
Butanol
Existen otros procesos físico-químicos capaces de cumplir este paso como la
crioprecipitación y la criosustitución, los cuales no son el objeto de la presente revisión.
Dentro de las características que deben tener los agentes deshidratantes está la rapidez
con la que debe concluirse el proceso de deshidratación, disminuir el endurecimiento
tisular, producir escasos niveles de toxicidad por contacto e inhalación de vapores tóxicos
y mínimos riesgos de incendio o explosión. A continuación se describen los más
importantes agentes deshidratantes.
 Alcohol etílico
El agente deshidratante más utilizado en los laboratorios de patología es el alcohol
etílico. Por sus características permite que se termine el proceso de fijación mientras se
realiza la deshidratación tisular.
Para realizar el proceso de deshidratación con etanol se utilizan múltiples baños con
alcoholes de concentraciones ascendentes para evitar retracciones severas de los
tejidos. El volumen del baño de alcohol debe ser 10 veces mayor al volumen de las
muestras que se van a deshidratar para obtener un proceso de deshidratación rápido.
Los baños ascendentes en alcohol permiten que el índice de saturación del agua en el
alcohol sea menor, por lo que los alcoholes pueden ser reutilizados y por lo tanto se
disminuyen costos en el laboratorio de patología.
Recientemente en el Laboratorio de Patología Interfacultades de la Universidad Nacional
de Colombia se están realizando mediciones diarias de las concentraciones de los
alcoholes del procesador automatizado de tejidos, utilizando el alcoholímetro de Gay-
Lussac. Aunque no se han publicado los resultados, la utilización de esta simpleCapítulo 4 21
metodología garantiza que los alcoholes de los baños de deshidratación estén siempre
en concentraciones ascendentes. Por otra parte, permite establecer el comportamiento
de cada uno de los alcoholes a medida que es utilizado, dando criterios objetivos y
cuantitativos para el recambio de los alcoholes.
 Alcohol Metílico
El alcohol metílico o metanol (C-H4-O), es un líquido incoloro de olor picante miscible en
etanol, éter, benceno y en la mayoría de solventes orgánico.13
En el laboratorio de patología su uso es limitado por ser muy inflamable y su alta
toxicidad. Su uso más importante está relacionado con la fijación de las láminas de
citología, pero por su bajo costo, en ocasiones se utiliza como alternativa del alcohol
etílico en el proceso de deshidratación o como componente del alcohol etílico industrial,
el cual es más económico que el alcohol absoluto.
El metanol puede ser fácilmente absorbido vía percutánea, inhalatoria o por vía oral
produciendo acidosis metabólica, toxicidad ocular, alteraciones severas del Sistema
Nervioso Central, ceguera y en casos severos la muerte. La exposición crónica al
metanol se ha relacionado con alteraciones oculares progresivas. En animales se ha
comprobado efecto teratogénico viéndose relacionado con paladar hendido y efectos
embrioletales en ratones. No se han descrito efectos carcinogénicos13.
4.2.3 Aclaramiento
Es el proceso mediante el cual el alcohol depositado en los tejidos durante el proceso de
deshidratación es reemplazado por una sustancia capaz de mezclarse con el medio de
inclusión. El agente ideal debe tener la capacidad de eliminar el alcohol rápidamente sin
inducir lesiones en la morfología tisular como excesivo endurecimiento y retracciones.
Las sustancias más utilizadas en este proceso han sido los hidrocarburos entre los que
13 http://toxnet.nlm.nih.gov/cgibin/sis/search/a?dbs+hsdb:@term+@DOCNO+93
2122 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
se destacan el tolueno, el benceno y el xilol, siendo este último el más utilizado en los
laboratorios de patología por lo cual se revisaran sus características más detenidamente
a continuación (Tabla 4-6).14
Tabla 4-6: Agentes aclarantes15
Agentes Aclarantes
Agente Ventajas Desventajas
Xilol Acción rápida Muy tóxico
Endurece poco el tejido Aclara solo desde alcohol
Se elimina fácil del medio de absoluto
inclusión Vuelve quebradizo el tejido
Tolueno Acción rápida Muy tóxico y Carcinogénico
Endurece poco los tejidos Aclara solo desde alcohol
Conserva en el tiempo la absoluto
muestra sin alteraciones
Benceno Acción rápida Muy tóxico
Eliminación del tejido fácil Altamente inflamable
Produce mínima retracción
tisular
Cloroformo Poca alteración tisular Difícil eliminación de la
Muy útil en tejidos fibrosos parafina
Efectos narcóticos
Tetracloruro de Carbono No es inflamable Muy tóxico y Carcinogénico
Más económico Difícil eliminación de la
parafina.
 Xilol
Es el agente aclarante por excelencia. Es un líquido trasparente de olor dulce que
comercialmente está compuesto por la mezcla de tres isómeros: orto, meta y para-xileno.
Industrialmente es utilizado como componente de la gasolina de los aviones y en la
producción de pinturas como solvente.
En el laboratorio de patología es ampliamente utilizado como aclarante durante el
procesamiento de tejidos gracias a que actúa rápidamente y produce pocos efectos
sobre la consistencia y la morfología tisular; además es miscible en múltiples medios de
14 Crocker J. “The science of the laboratory diagnosis” Jhon Wiley & sons. Pág 9.
15 García R. “Laboratorio de anatomía Patológica” Interamericana McGraw Hill. P. 70.Capítulo 4 23
inclusión como la parafina y la celoidina, siendo eliminado muy fácilmente del tejido
durante el proceso de impregnación.
Idealmente se realizan dos o tres baños sucesivos de una hora cada uno. Cuando este
tiempo se prolonga, se produce un endurecimiento excesivo del tejido y lo hace muy
quebradizo principalmente cuando los tejidos son ganglios linfáticos o el Sistema
Nervioso central.
Los efectos adversos producidos por la exposición al xileno han sido una razón poderosa
para la búsqueda de nuevos métodos que no requieran la utilización de aclarantes
rutinarios durante el procesamiento histológico16.
La inhalación del vapor del xileno produce cefalea, irritabilidad y nauseas; además en
pacientes expuestos crónicamente a concentraciones por encima de 200 ppm, se han
observado redistribución del xilol en el tejido adiposo, alteraciones en el patrón del
sueño, toxidermia, y pancitopenia. A pesar de que los estudios realizados en animales
expuestos crónicamente han mostrado una baja toxicidad, existen evidencias sugestivas
de toxicidad del sistema nervioso central, el hígado y los riñones cuando se incrementa la
concentración ambiental del xileno17. Por otra parte, no se han comprobado efectos
carcinogénicos o teratogénicos por la exposición crónica al xileno.
En Estados Unidos es utilizado como agente aclarante hasta en el 59% de los
laboratorios. Más del 30% de dichos laboratorios tienen el proceso de tinción y de
montaje aún manual, aumentando la exposición del tecnólogo al xilol, especialmente al
realizar las tinciones especiales (87%), reciclaje (57%), montaje (38%) entre otras. En
Colombia no existen estadísticas de cuantos laboratorios tienen completamente
automatizados todos sus procesos, sin embargo es claro que la tinción, montaje y
16 Falkeholm L . “Xylene-Free Method for Histological Preparation: A Multicentre Evaluation”. Lab
Invest. 2001. Vol. 81, No. 9, p. 1213
17 International Programme on Chemical Safety (IPCS). Environmental Health Criteria. “Xylenes”
1997. p. 1
2324 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
realización de coloraciones especiales es manual en más del 95% de los laboratorios,
situación que aumenta la exposición de los técnicos al xilol.18
La Conferencia Americana de Higienistas industriales de Estados Unidos recomienda
434mg/m3 como valor límite para la exposición ocupacional al xilol en el aire del lugar de
trabajo19. Desafortunadamente en el Laboratorio de Patología de la Universidad Nacional
de Colombia, no se han realizado mediciones de la concentración ambiental del xilol.
4.2.4 Impregnación
Es el proceso que tiene por objeto “rellenar” completamente la muestra histológica con el
medio que se va a utilizar para la imbibición del tejido20. La técnica se fundamenta en
reemplazar el agua tisular por un medio que penetre los espacios intersticiales e
intracelulares y le dé al tejido homogeneidad y la dureza suficiente para obtener cortes
finos y de calidad.
Se han utilizado diferentes medios de inclusión pero son la parafinas las que se emplean
actualmente por ser económicas, fáciles de usar y compatibles con los reactivos
utilizados en los procesos previos a la impregnación. Otros medios de inclusión como la
celoidina causan menos distorsión y encogimiento tisular comparado con la parafina,
pero requieren de un procedimiento lento y tedioso por lo cual no es práctico en el
laboratorio de patología. En raras ocasiones se utiliza la inclusión en gelatina, siendo
está reservada para técnicas histoquímicas que requieren mantener ciertas
características químicas tisulares especiales.
La parafina es una sustancia conformada por hidrocarburos saturados de cadenas
largas. El punto de fusión permite la categorización de las mismas estando estas en un
rango entre los 39º y los 68ºC. En los laboratorios de patología se utilizan rutinariamente
18 Buesa R J. "Histology safety: now and then." Ann Diag Pathol, 2007: 334-9.
19 IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Xylene. 1989
20 Op Cit. P. 71Capítulo 4 25
temperaturas de fusión entre 56º a 58ºC, siendo este rango el óptimo para la
impregnación e inclusión posterior de la gran mayoría de los tejidos (Tabla 4-7).
Existe una característica fundamental de la parafina denominada punto de plasticidad
que es “la temperatura más baja a la que puede ocurrir una deformación permanente sin
sufrir fracturas”20. La dureza de la parafina gira alrededor de esta característica siendo
incluso más importante que el mismo punto de fusión.
Tabla 4-7: Tipos de Parafina21
Tipos de Parafina
Temperatura del
Tipo de Parafina Punto de Fusión Grosor del Corte
Bloque
Blanda 50-52ºC Grueso Frío (4ºC)
Blanda 53-55ºC Grueso Frío (4ºC)
Dura* 56-58ºC Fino Frío (4ºC)
Dura 60-68ºC Fino Templada
*Parafina de uso de rutina en Laboratorio de Patología
Para evitar la oxidación (coloración amarillenta y consistencia blanda) de la parafina
clásica se desarrollaron nuevos compuestos como el Paraplast que es una mezcla de
parafina con polímeros plásticos y dimetil sulfóxido dándole mayor dureza y
homogeneidad al bloque, disminuye la fragilidad y lo más importante, permite obtener
cortes más uniformes y de mejor calidad. Para realizar el proceso de infiltración se
realizan dos o tres baños de una a dos horas en parafina en estado líquido.
Actualmente los procesadores automatizados de tejidos (Ilustración 4-3) tienen la ventaja
de tener adosado al último recipiente una cámara al vació permitiendo que este baño en
parafina sea más rápido, elimine eficientemente el aclarante y el aire restante en los
tejidos, lo que mejora ostensiblemente la impregnación tisular.
4.2.5 Inclusión
Es el último proceso antes de realizar el corte. Consiste en colocar el tejido dentro de un
bloque de parafina de dureza y plasticidad homogénea que faciliten el corte del tejido en
21 Op. Cit. P. 72
2526 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
el micrótomo. Aunque se puede realizar el proceso de inclusión en otros medios como
gelatina o celoidina, la parafina es el medio de inclusión utilizado con más frecuencia en
los laboratorios de patología. (Tabla 4-7)
Para realizar el proceso de inclusión, el histotecnólogo debe inicialmente colocar el tejido
en una posición adecuada teniendo en cuenta que la cara inferior es la superficie de
corte y por lo tanto el segmento que será observado en el microscopio; la orientación se
hace sobre un molde metálico donde se depositará la parafina líquida y la base plástica
sobre la cual reposará el bloque. Finalmente se traslada el molde a una placa fría de
manera que la parafina se enfriará lentamente evitando artificios de contracción por el
enfriamiento brusco.
Ilustración 4-3: Procesador Automatizado de Tejidos Cytadell®
2000
Para facilitar la inclusión y la confección de los bloques se han diseñado estaciones que
dispensan la parafina líquida sobre una placa caliente donde se realiza la orientación del
tejido, además tienen incluida la placa fría para el enfriamiento del bloque (Figura 4-4).
Ilustración 4-4: Estación de InclusiónCapítulo 4 27
4.3 Alcohol isopropílico y procesamiento
histotecnológico de tejidos libre de xilol
4.3.1 Alcohol isopropílico y el laboratorio de patología
El alcohol isopropílico (C H O) es un líquido transparente de olor agradable utilizado en
3 8
la industria como disolvente de pinturas, componente de agentes químicos y de la
industria cosmética.22
Desde mediados del siglo XX el alcohol isopropílico fue utilizado en el laboratorio de
patología como sustituto del alcohol etílico en el procesamiento de tejidos gracias a su
bajo costo y a sus escasos efectos tóxicos; posteriormente, por ser miscible en parafina
fundida, se empezó a utilizar como agente aclarante eliminando el uso de reactivos como
el xilol, el benceno y el cloroformo. Este detalle permitió acelerar y simplificar el
procesamiento de tejidos, evitando la condensación tisular que producían los agentes
aclarantes y dándole mayor plasticidad a los bloques embebidos en parafina para el
corte. 23
A pesar de ser un excelente fijador de los ácidos nucleicos y de otras macromoléculas, el
alcohol isopropílico no es recomendado como fijador de rutina por su lenta difusión
tisular, sin embargo el isopropanol ha sido utilizado como componente de múltiples
fijadores compuestos como el fijador de Tellesnitski, fijador de Brasil y el fijador de
Carnoy (Tabla 4-8).
Existe escasa literatura contundente que soporte el uso del alcohol isopropílico como
reactivo de utilización rutinaria en el laboratorio de patología. Viktorov y colaboradores
reportaron que en sus ensayos han encontrado excelentes resultados y disminución de
22 IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Isopropanol. Vol.71
1987. p. 1027
23 I. V. Viktorov. “Use of Isopropyl Alcohol in Histological Assays: Dehydration of Tissue,
Enbessing into paraffin, and Processing of Paraffin Sections” Bullet of Exper Biol and Med. 2003
No. 1, p.105
2728 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
los costos al ser reemplazado el alcohol etílico y el xilol durante el procesamiento por
isopropanol.24
Tabla 4-8: Soluciones Fijadoras que Utilizan Alcohol Isopropílico
Soluciones Fijadoras que utilizan Alcohol Isopropílico
Solución Fijadora Componentes
Tellesnitski 700 ml Isopropanol
200 ml Formol tamponado
100 ml Ácido acético Glacial
Carnoy 600 ml Isopropanol ó Etanol
300 ml Cloroformo
100 ml Ácido Acético Glacial
Brasil 2040 ml Formalina al 30%
6000 ml Alcohol isopropílico
80 g Ácido Pícrico
65g Ácido Tricloracético
4.3.2 Procesamiento histológico libre de xilol
En Suecia en el Hospital Vrinnevi, Fakelholm y colaboradores desarrollaron en 1995 un
nuevo método de procesamiento de tejidos libre de xilol encaminado a afrontar los
problemas actuales de los laboratorios de patología: disminución de costos, disminuir el
tiempo de procesamiento y mejorar el ambiente laboral.25
El método consiste en utilizar tejidos fijados en formol y procesarlos realizando un paso
de 30 minutos en agua y posteriormente seis baños sucesivos en alcohol isopropílico
terminando en cuatro pasos por parafina. (Ilustración 4-5)
Falkelhom comparó el procesamiento de tejidos rutinario con el procesamiento libre de
xilol utilizando cortes de piel, intestino y mama los cuales fueron tratados con cada uno
de los métodos y posteriormente teñidos con las coloraciones de H&E, Van Gieson y
PAS. (Ilustración 4-6)
Para realizar el proceso de desparafinización de las láminas antes de la coloración, utilizó
calor y agua mezclada con detergente para platos, el cual agiliza el proceso comparado
24 Ibid p.106
25 L Falkeholm, “Xylene-Free Method for Histological Preparation: A Multicentre Evaluation”. Lab
Invest. 2001. Vol. 81, No. 9, p. 1213.Capítulo 4 29
con el método convencional que utiliza incubadora y posteriormente xilol y rehidratación
con alcohol etílico. Buesa y colaboradores estandarizan el proceso, optimizando los
resultados de la desparafinización y haciéndolos equivalentes a los resultados obtenidos
con el proceso convencional con xilol (Ilustración 4-7).26
Ilustración 4-5: Procesamiento libre de xilol
FFoorrmmooll FFoorrmmooll AAgguuaa IIssoopprrooppaannooll
3300 mmiinn 3300 mmiinn 3300 mmiinn 4455 mmiinn
IIssoopprrooppaannooll
IInncclluussiióónn
4455 mmiinn
PPaarraaffiinnaa IIssoopprrooppaannooll
112200 mmiinn 6600 mmiinn
PPaarraaffiinnaa
IIssoopprrooppaannooll
6600 mmiinn
9900 mmiinn
PPaarraaffiinnaa PPaarraaffiinnaa IIssoopprrooppaannooll IIssoopprrooppaannooll
6600 mmiinn 6600 mmiinn 6600 mmiinn 6600 mmiinn
En su estudio se encontró que los preparados histológicos tratados sin xilol presentaban
calidad similar a las láminas procesadas con el método de rutina encontrando buena
aceptación de los patólogos participantes en el estudio (Ilustración 4-8).
Los patólogos mostraron como inconveniente la pobre diferenciación entre el citoplasma
y el colágeno con la tinción de Van Gieson; el autor atribuye dicha dificultad a problemas
con reactivos de la tinción y no al método de procesamiento como tal.
Según el autor, el método libre de xilol es equivalente al procesamiento rutinario de
tejidos con la ventaja que permite mejorar las condiciones ambientales del laboratorio;
por otra parte la utilización del alcohol isopropílico disminuye los costos eliminando la
necesidad del xilol para el procesamiento.
Los resultados sugieren que el método de procesamiento libre de xilol puede ser utilizado
como método de rutina en cualquier laboratorio de patología.
26 Ibid. Pág 1213.
2930 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Ilustración 4-6: Comparación Métodos de Procesamiento de Tejidos
Procesamiento de Tejidos
Rutina Libre de
UNAL Xileno
Horas Minutos Minutos Horas
3300 FFoorrmmooll
FFoorrmmooll 6600 3300 FFoorrmmooll
3300 AAgguuaa
EEttaannooll 9966%% 6600
4455 IIssoopprrooppaannooll
EEttaannooll 9966%% 6600
4455 IIssoopprrooppaannooll
EEttaannooll 9966%% 6600
6600 IIssoopprrooppaannooll
EEttaannooll 9999%% 6600
5 6600 IIssoopprrooppaannooll 5
EEttaannooll 9999%% 6600
6600 IIssoopprrooppaannooll
EEttaannooll 9999%% 6600
6600 IIssoopprrooppaannooll
EEttaannooll 9999%% 6600
6600 PPaarraaffiinnaa
XXiilleennoo 6600
6600 PPaarraaffiinnaa
XXiilleennoo 6600
10
9900 PPaarraaffiinnaa 10
PPaarraaffiinnaa 6600
PPaarraaffiinnaa 6600
112200 PPaarraaffiinnaa
720 750
4.3.3 Efectos tóxicos del alcohol isopropílico
Son pocos los efectos tóxicos que se conocen del alcohol isopropílico. Agudamente, se
ha observado irritación ocular y nasal al ser expuesta la persona por varios minutos a
concentraciones mayores a 400 ppm27. La ingesta de pequeñas cantidades de alcohol
isopropílico (2.6–6.4 mg/kg) no se ha relacionado con ningún efecto tóxico. Mayores
cantidades pueden inducir depresión del sistema nervioso central e incluso la muerte;
personas fallecidas por alcohol isopropílico, principalmente alcohólicos, desarrollan
edema pulmonar severo28.
27Clayton, G.D. Toxicology. 4th ed. John Wiley & Sons Inc. 1994, p. 2634
28 IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Isopropanol. Vol.71
1987. p.1031Capítulo 4 31
Según la IARC, no se ha encontrado evidencia de carcinogenicidad inducida por el
alcohol isopropílico (grupo3). Tampoco se ha encontrado efectos teratogénicos en
modelos animales expuestos a alcohol isopropílico29.
Ilustración 4-7: Desparafinización, tinción y Montaje
Desparafinización,
Tinción y Montaje Baño Agua 90º
Rutina Libre de I Agua con jabón 60´´
UNAL Xileno
II Agua con jabón 60´´
Minutos Minutos III Lavar con Agua
0 0
corriente 30´´
Incubadora Incubadora IV Lavar con Agua
60ºC 60ºC Corriente 30´´
Enjuague Agua Tibia
30 20 (45º)
xileno 10 3´45´´ V Lavar con Agua
xileno 10 Corriente por 45´´
Tinción
xileno 10 VI Dejar en agua
60
Etanol 99% 5 0 destilada hasta tinción
Etanol 96% 5
Etanol 96% 5
Agua 1
76 Secado en
Incubadora
Tinción
60ºC
0 10 Agua con Jabón
Etanol 96% 5
Etanol 96% 5 Montaje 1500 ml Agua Destilada
Etanol 99% 5
xileno 5 30 ml Jabón de Platos
25 xileno 5
Montaje
4.4 Estrategias para la disminución de costos en el
laboratorio de patología
Los cambios mundiales en la prestación de servicios de salud han obligado a la
búsqueda de estrategias que permitan la contención de costos en cada una de las
dependencias. Departamentos como el laboratorio clínico han desarrollado extensos
protocolos de control de calidad, estandarización de procesos y proyectos de
automatización de sus instalaciones con el objetivo de volver más eficientes la prestación
de los servicios (Tabla 4-9).
A pesar del boom mundial de los procesos automatizados, muchos de los procesos en
los laboratorios de patología continúan siendo manuales, obligando a los patólogos a
29 Ibid. P. 1032
3132 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
contratar mano de obra que realice cada uno de los procesos, generando costos fijos
elevados que consumen una gran parte de sus recursos.
Ilustración 4-8: Mama. Comparación de los métodos de Procesamiento. A y B. H&E; C y D. Van
Gieson; E y F. PAS. Cortes libres de xilol a la izquierda, Cortes convencionales a la Derecha.25
Laboratorios de patología australianos han enfocado su búsqueda hacia estrategias que
permitan organizar redes de trabajo eficientes, métodos de procesamiento rápidos de
especímenes y la entrega pronta de resultados30. De esta forma han desarrollado
grandes laboratorios centralizados con sistemas de información computarizados que
agilizan la recepción de muestras y el inicio del procesamiento; igualmente han
automatizado los métodos histotecnológicos y de inmunohistoquímica, con grandes
30 Leong A. “Strategies for laboratory cost containment and for pathologist Shortage: centralised
pathology laboratories with microwavestimulated Histoprocessing and telepathology”. Pathology,
2005, p 2.Capítulo 4 33
maquinas que estandarizan y agilizan los procesos, disminuyen la mano de obra y hacen
eficientes el procesamiento de altos volúmenes de trabajo.
Además la utilización de métodos de procesamiento rápido con horno microondas es
fundamental para el concepto de laboratorios centralizados. Se han elaborado hornos
microondas y protocolos de procesamiento que permiten el tratamiento de hasta 120
bloques de especímenes pequeños en una hora aproximadamente con excelentes
rendimientos histomorfológicos, histoquímicas e inmunohistoquímicos.31
Tabla 4-9: Estrategias para disminución de Costos en los laboratorios de patología
Estrategias para Disminución de Costos
Grandes Laboratorios Pequeños Laboratorios32
Centralización de Laboratorios Recuperación de Formaldehído
Procesamiento rápido de Tejidos Procesamiento de tejidos libre de xilol
Automatización de Procesos Modificación de coloraciones Recuperación de
Telepatología Parafina
Monitorización de la concentración de los
Alcoholes del Procesador de Tejidos
Gracias a la innovación de microscopios y cámaras digitales se pueden conseguir
imágenes de calidad que se pueden visualizar en monitores de alta definición.
Aprovechando este recurso, se ha desarrollado la telepatología, la cual aprovecha la
trasmisión de datos por la red a laboratorios retirados del lugar de procesamiento,
facilitando las interconsultas a laboratorios especializados o de mayor complejidad
agilizando los diagnósticos y la entrega de resultados.
Observando la situación desde otro punto de vista, laboratorios de patología cubanos han
desarrollado diferentes métodos encaminados a la solución de problemas específicos
generados por las precarias condiciones económicas del país.
31 Morales A. “Continuous-Specimen-Flow, High-Throughput, 1-Hour Tissue Processing” Arch
Pathol Lab Med. 2002, Vol 126.pág 589.
32 Martínez W. “Manual de Procedimientos Técnicos para Tiempos Difíciles en Anatomía
Patológica”. 2005, p. 39.
3334 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Para dicho fin han desarrollado un “Manual de procedimientos técnicos en tiempo
difíciles” con el que dan soluciones a muchos problemas aplicados al Departamento de
Patología. Entre muchos procedimientos técnicos descritos, aparece la reutilización del
formol tamponado al 10% después de ser decantado, filtrado y pasar por pruebas de
control de calidad32. Otro método hace referencia a la recuperación de parafina cortando
el exceso de los bloques y recogiéndola para ser fundida, filtrada y finalmente
reutilizada33.
Es necesario continuar investigando nuevas metodologías dentro del laboratorio de
patología que permitan a los laboratorios pequeños y medianos, rendimientos superiores
o al menos similares para mantenerse competitivos en el sistema de salud actual y
competir con las fuertes estrategias de los grandes laboratorios de la patología.
4.5 Control de calidad en el laboratorio de patología
El concepto de calidad comprende la totalidad de las características de un producto o
servicio, que le confieren aptitud para satisfacer las necesidades establecidas en un
contrato con un usuario ó cliente34.
Bajo estos lineamientos los laboratorios clínicos y de patología deben prestar un servicio
de calidad que permita ofrecer información sobre el estado de salud al médico solicitante,
utilizando un informe analítico para el diagnóstico, seguimiento y tratamiento del paciente
que se encuentre dentro de los requisitos legales establecidos35.
Para dicho fin se han incorporado en los laboratorios los sistemas de gestión de calidad
que permiten estructurar los procesos y de esta manera ponen de manifiesto la calidad
de un producto o un servicio; un sistema de gestión de calidad es un conjunto de
33 Ibid. 18.
34 Gallego J. “Manual de Calidad, Facultad de Medicina, Universidad Nacional de Colombia,”
2005, p 1.
35 de la Fuente Capdevila B. “El laboratorio clínico y la gestión de la calidad por procesos”. Quím.
Clín 2003; 22 (2) 44-47Capítulo 4 35
elementos relacionados que interactúan estableciendo una política y objetivos para dirigir
y controlar una organización con respecto a la calidad36.
El aseguramiento de la calidad exige que todas las actividades y procedimientos sean
planificados y sistemáticos de manera que se pueda demostrar confianza que el producto
final cumplirá con los requisitos establecidos previamente. Los resultados se ven
reflejados en la mejora continua de la prestación de los servicios.
La gestión de procesos permite estructurar adecuadamente un sistema de gestión de
calidad; “un proceso es una secuencia de actividades que transforman los insumos en un
resultado o servicio que generen una información de salida que generalmente crea un
valor agregado para el usuario”37
En el proceso de estudio histopatológico se distinguen tres etapas claves: Etapa pre
analítica, etapa analítica y la etapa postanalítica. (Ilustración 4-9).
Ilustración 4-9: Elementos de un proceso
En el laboratorio de patología las etapas preanalítica está relacionada con la recepción
de las muestras, confirmación de datos, ingreso de la información al sistema y asignación
de un número de registro; la fase postanalítica está relacionada con la digitación y
36 Op. Cit. p. 1
37 Ramirez E. “Documentación del Sistema de Calidad”. 2005 p 14-15
3536 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
entrega del resultado final al paciente. La calidad de las dos etapas está claramente
percibida por el cliente (médico y paciente) porque su carencia produce insatisfacción
como retraso en la disponibilidad del informe o la necesidad de toma de una nueva
muestra.
La calidad de la fase analítica determina la utilidad clínica del informe producido y el
resultado de los procedimientos ejecutados están implicados directamente con el
patólogo responsable y la calidad de su diagnóstico38. Para tal fin se han desarrollado
documentos que proporcionan instrucciones necesarias para la ejecución correcta de los
procedimientos técnicos39.
En los laboratorios de patología la automatización ha sido un proceso lento que
actualmente compromete a las grandes redes de laboratorios o a los laboratorios de
referencia; los laboratorios medianos y pequeños siguen utilizando procedimientos
manuales que han llevado a un retraso en la implementación de los sistemas de gestión
de calidad comparado con los laboratorios clínicos. El Colegio Americano de Patólogos
(CAP), the Royal College of Pathologists (RCPath) y Real Colegio de Patólogos de
Australasia (RCPA), son algunas de las organizaciones que por más de 30 años se han
encargado de desarrollar los diferentes lineamientos para la acreditación de los
laboratorios de patología, desarrollando múltiples documentos y listas de chequeo para
tener en cuenta dentro del proceso de acreditación y de implementación de los sistemas
de gestión de calidad.40
Sin embargo la determinación de la calidad exige la valoración del rendimiento de los
procedimientos realizados en el laboratorio, convirtiéndose en un mecanismo objetivo de
evaluación41. En nuestro caso se debe medir la calidad del procesamiento
38 Op. Cit. p. 44
39 Op. Cit. p. 16
40 R. L. Robertson. “Pathology laboratory accreditation: the Australian experience” Accred Qual
Assur 1996 (1); p 213
41 Furness P. “Developing and running an EQA scheme in diagnostic histopathology” Cur Diag
Path (2004) 10; p 435-43Capítulo 4 37
histotecnológico de tejidos utilizando la técnica “libre de xilol” y la técnica convencional
para realizar una comparación objetiva de las mismas.
Aunque no se tienen escalas de evaluación estándar validadas, estudios en los que se
realizan comparación de técnicas de procesamiento han utilizado criterios de evaluación
objetivos clasificando los preparados histológicos como satisfactorios, insatisfactorios
pero aceptables para el diagnóstico, e insatisfactorios.42
El CAP dentro de su lista de chequeo para el programa de acreditación de laboratorios
de patología recomienda tener en cuenta algunos items como lo son la adecuada
identificación de la muestra durante el procesamiento de la misma y la correcta
marcación de los bloques; para evaluar el procesamiento de los tejidos y la calidad de los
procesados histológicos, recomienda tener en cuenta los criterios descritos en la Tabla
4-1043.
Tabla 4-10: Criterios para evaluar la calidad de las láminas de histología
Criterios para Evaluar la Calidad de Laminas Histológicas
Fijación Adecuada
Grosor del corte
Ausencia de pliegues y artificios de corte
Calidad de la Coloración
Plano de corte completo
En el Laboratorio de Patología Interfacultades de la Universidad se desarrolló un formato
con los criterios propuestos por el CAP, el cuál se utiliza de rutina para la evaluación de
la calidad de los preparados histológicos, asignándosele un valor óptimo y un punto de
corte para clasificar el preparado como aceptado o insuficiente; aunque no es una escala
validada, ha servido como método de control de calidad interno del procesamiento
histológico de las muestras. Desafortunadamente en Colombia no se tienen
organizaciones que tengan establecidos métodos de control de calidad externo para los
laboratorios de patología.
42 Ralph L. “A Comparison of Routine and Rapid Microwave Tissue Processing in a Surgical
Pathology laboratory Quality of Histologic Sections and Advantages of Microwave Processing” Am
J Clin Pathol 2001;115:705
43 CAP, Commission on Laboratory Accreditation. “Anatomic Pathology Checklist” 2006; p 36
375. Estandarización de la técnica libre de xilol
5.1 Obtención de muestras y procesamiento del tejido
Para realizar el proceso de estandarización se tomaron cortes de tejido (dos por cada
órgano) obtenidos del material sobrante de una autopsia y fijados en formol tamponado
por menos de 15 días después de su recolección. Los tejidos fueron sometidos al
procesamiento de tejidos libre de xilol y al procesamiento de tejidos convencional del
Laboratorio de Patología Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
(Ilustración 5-1).
Ilustración 5-1: Proceso de estandarización de la técnica libre de xileno
El procesamiento de tejidos libre de xilol fue modificado para desarrollarse en el
procesador automatizado de tejidos Cytadell® 2000 del Laboratorio de Patología
Interfacultades. Dichas modificaciones incluyen dos pasos iniciales de los tejidos por
formol tras los cuales se rehidratan por 30 minutos en Agua. Posteriormente los tejidos40 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
pasan por siete baños de alcohol isopropílico para terminar impregnados en dos pasos
finales por parafina (Ilustración 5-2)44
Los tejidos procesados por las dos técnicas fueron incluidos en parafina dura con punto
de fusión entre 56 – 58ºC, tras lo cual se realizaron dos cortes de 5 micrómetros en cada
uno de los bloques para ser “pescadas” en un baño de flotación a 37ºC con gelatina
(0,025% P/V).
Ilustración 5-2: Esquema de procesamiento libre de xilol implementado
5.2 Proceso de coloración
Las láminas obtenidas de cada bloque fueron teñidas utilizando la coloración
convencional del Laboratorio de Patología y la técnica “libre de Xilol” propuesta por
Buesa y colaboradores (Ilustración 5-3)45.
Para realizar este protocolo se preparó el jabón para la desparafinización de las láminas
de acuerdo a las características suministradas por el autor, contando con el apoyo de la
facultad de química de la Universidad Nacional de Colombia. (Tabla 5-1).
44 Falkeholm L. Xylene-Free Method for Histological Preparation: A Multicentre Evaluation. Lab
Invest, 2001: 1213-21.
45 Buesa R J. "Histology without xylene." Ann Diag Patho, 2009: 246-56.Capítulo 5 41
Ilustración 5-3: Proceso de desparafinización y coloración implementado
5.3 Resultados Obtenidos
Los preparados obtenidos con ambas técnicas fueron evaluados cualitativa y
semicuantitativamente usando los criterios del Colegio Americano de Patólogos (CAP)
con los que se obtuvieron los siguientes resultados:
 Los preparados histológicos “libres de xilol” coloreados con la técnica de rutina
mostraron características similares e incluso mejores a las obtenidas con los
preparados convencionales con las siguientes características (Ilustración 5-4):
a. Adecuado contraste de la coloración
b. Ausencia de retracciones tisulares
c. Ausencia de zonas de desprendimiento
d. Ausencia de zonas de fragmentación tisular
e. Excelente detalle nuclear
f. Excelente conservación de los tejidos ricos en grasas (tejido adiposo, cerebro)
 Las láminas histológicas procesadas “libres de xilol” teñidos con la técnica “libre de
xilol” presentaron condiciones histológicas de calidad similares a los resultados
obtenidos con la coloración convencional.
4142 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Tabla 5-11: Componentes del Jabón para platos utilizado en el proceso de desparafinización
Componentes del jabón de platos utilizado en el proceso de
desparafinización
Agua > 30%
Tenso-activos aniónicos 15 – 30%
No iónicos 5-15%
Tenso-activos anfóteros<5%
Monopropilenglicol <5%
Etanol <5%
Conservantes: (metilparabén etilparabeno, propilparabén, 2-fenoxietanol) <5%
Perfume <5%
Apariencia: transparente, morado líquido
Densidad: aprox 1030 kg/m3
ph concentrado: 7,5 + / -0,5
ph de 5%
utilizar la solución aproximadamente 7,0
Punto de inflamación:> 100 ºc
Punto de solidificación aproximado: 0 ºc
Fósforo: 0%
Solubilidad: completamente en el agua
5.4 Conclusiones y recomendaciones
 Los preparados obtenidos con ambas técnicas fueron evaluados cualitativa y
semicuantitativamente usando los criterios del CAP, demostrando que existe
equivalencia en los resultados obtenidos con las dos técnicas de procesamiento.
 La técnica de coloración “Libre de xilol” se estandarizó teniendo en cuenta las
especificaciones técnicas facilitadas por el autor original de la técnica y las
modificaciones propuestas por Buesa y colaboradores. Los resultados obtenidos son
comparables entre la técnica de coloración convencional y la coloración libre de xilol.
 Los resultados fueron puestos a consideración de los organizadores del USCAP
2011. Lastimosamente no fue aceptado para participar en tan prestigioso evento.Capítulo 5 43
Ilustración 5-10: Riñón 10X y 20X. Comparación de las técnicas de Procesamiento
Procesamiento:
Convencional
Coloración
Convencional
Procesamiento:
Libre de Xilol
Coloración:
Convencional
Procesamiento:
Libre de Xilol
Coloración:
Libre de Xilol
436. Metodología
6.1 Diseño metodológico
Para evaluar la hipótesis propuesta se realizó un estudio experimental usando muestras
de especímenes quirúrgicos que fueron procesados por la técnica libre de xilol versus la
técnica o procesamiento convencional.
6.1.1 Criterios de inclusión
 Material sobrante de especímenes quirúrgicos procesados y diagnosticados.
6.1.2 Criterios de exclusión
 Material proveniente de biopsias.
 Material quirúrgico insuficiente para la realización de los dos protocolos de
procesamiento.
6.1.3 Realización de la prueba
Se recolectaron 79 (setenta y nueve) muestras de especímenes quirúrgicos. De cada
espécimen se tomaron dos cortes, uno para el método de procesamiento convencional y
el segundo para el método de procesamiento “Libre de Xilol”. Cada muestra fue
procesada de acuerdo a los protocolos establecidos para cada técnica.
Después de obtener los bloques, se cortaron tres preparados histológicos de 5 µm, cada
uno para realizar la coloración de Hematoxilina & Eosina, la coloración del ácido
peryódico de Schiff (PAS) y para la coloración de tricrómico de Masson (TM).46 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Los preparados obtenidos con la técnica convencional fueron desparafinizados y
montados con la técnica de rutina del laboratorio. Las láminas obtenidas por el
procesamiento “Libre de Xilol” fueron desparafinizadas y montadas con el protocolo
propuesto por Buesa y colaboradores.
Los preparados histológicos fueron rotulados y codificados de forma confidencial por los
autores, se agruparon en cuatro cajas diferentes que fueron entregadas a cuatro
patólogos experimentados del Departamento de Patología de la Facultad de Medicina de
la Universidad Nacional de Colombia junto con la planilla de control de calidad de
preparados histotecnológicos y la guía para el diligenciamiento de la misma. Los
patólogos desconocían la técnica por la cual fueron procesadas las láminas que estaban
valorando.
6.1.4 Planilla para el control de calidad del proceso
histotecnológico
La evaluación de la calidad de los preparados histológicos obtenidos durante el estudio
se realizó utilizando la planilla de Control de Calidad del Procesamiento Histotecnológico
(Anexo A) diseñada por los autores y modificada para el estudio actual.
La planilla fue creada utilizando los criterios para evaluar la calidad de las láminas
histológicas del Colegio Americano de Patólogos para lo que se tiene en cuenta las
características del procesamiento automatizado de tejidos (Deshidratación y
aclaramiento/imbibición), La extensión del corte y la presencia de desprendimientos, y la
coloración (hematoxilina, eosina y desparafinización). La calificación de la fijación no fue
tenida en cuenta ya que es una variable no controlada dentro del estudio actual.
Para una evaluación objetiva y uniforme de los preparados histológicos, se creó una guía
para el diligenciamiento de la planilla de control de calidad del procesamiento
histotecnológico (Anexo B). Para este fin se tuvieron en cuenta los posibles artificios que
se pueden presentar durante el proceso automatizado de tejidos y la coloración de losCapítulo 6 47
preparados histológicos. La guía se explicó y entregó a los patólogos evaluadores junto
con la planilla de Control de Calidad del procesamiento histotecnológico.
Para establecer si un preparado histológico era apto o no para diagnóstico, el patólogo
evaluador examinó el material entregado y determinó la presencia de artificios por el
procesamiento histotecnológico existentes y los calificó como Ausentes (-), Leve (+),
Moderado (++) y Severo (+++).
Cuando la calificación del artificio fue Ausente o leve, el patólogo marcó en la casilla
respectiva con el No.1. Por el contrario, si la calificación era de moderada o severa, la
marcación en la casilla respectiva fue de 0. Al completar las siete casillas, si el puntaje
obtenido por el preparado sumó 6 ó 7, se consideró un preparado aceptado para el
diagnóstico; por el contrario, si el preparado obtenía una calificación igual o menor a 5, se
consideró un preparado no aceptado para el diagnóstico.
6.1.5 Consideraciones éticas
Esta investigación puede considerarse sin riesgo ya que es inexistente la probabilidad de
que el sujeto de investigación sufra algún daño como consecuencia inmediata o tardía
del estudio pues el presente proyecto no incluye el trabajo con pacientes.
Lo anterior se sustenta en la resolución No. 008430 de 1993 de la República de
Colombia, por la cual se establecen las normas científicas, técnicas y administrativas
para la investigación en salud, consignándose lo mencionado en el título II, artículo 11,
literal A: “La investigación planteada en este proyecto se consideraría como una
investigación sin riesgo ya que no se realiza ninguna intervención o modificación
intencionada de las variables biológicas, fisiológicas, psicológicas o sociales de los
individuos que participan en el estudio, ni se tratan aspectos sensitivos de su conducta”.
4748 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
6.2 Procesamiento de la información
6.2.1 Descripción del conjunto de datos
Se obtuvo una base de datos que cuenta con 9 variables, 7 de las cuales son
dicotómicas etiquetadas con 1 y 0 que representan si el material fue aceptado o no
aceptado. La 8ª variable es una variable cualitativa de tipo categórico que puede asumir
un valor entre 0 y 7. La última variable, también dicotómica que nos permite filtrar si la
lámina es aceptada o rechazada para diagnóstico.
6.2.2 Análisis de la información
Para el proceso de la información, se usó el paquete estadístico SPSS 20 (IBM), se
ejecutó el procedimiento de tablas de contingencia, obteniendo la proporción de láminas
cuya calidad es evaluada con la técnica propuesta y la técnica convencional, como s
ilustra en el capítulo de resultados.
Para el estudio se planteó el siguiente sistema de hipótesis:
Esto para corroborar que tenemos evidencia de una similaridad entre las dos técnicas.
Valor del estadístico de prueba:
Sí y entonces igual a 0,05
Adicionalmente, se generó una tabla empleando el procedimiento de pruebas no
paramétricas para las variables, obteniendo los valores correspondientes para el
juzgamiento de la hipótesis nula.7. Resultados
7.1 Hematoxilina & eosina
Se procesaron un total de 79 casos fijados en formol y compuestos por tejidos normales
o con patología de característica tumoral. Para cada caso se obtuvieron láminas de
Hematoxilina & Eosina utilizando el procesamiento convencional y el procesamiento Libre
de Xilol.
La tabla 7-1 muestra los procesos (variables) evaluados en las dos técnicas en estudio.
Merece destacar que no se aprecian diferencias significativas (p<0,05) entre las dos
técnicas de procesamiento tanto en el consolidado como en forma independiente en cada
una de las variables consideradas.
Tabla 7-12: Comparativo de los criterios de evaluación para la coloración H & E
Convencional Libre de Xilol
Variable p
Aceptable % No aceptable % Aceptable % No aceptable %
Deshid/Aclaram 79 100 0 0 78 99 1 1 -
Imbibición 73 92 6 8 76 96 3 4 0,613
Extensión 75 95 4 5 71 90 8 10 0,491
Desprendimiento 76 96 3 4 70 89 9 11 0,527
Desparafinización 70 89 9 11 72 91 7 9 0,320
Hematoxilina 77 97 2 3 78 99 1 1 0,871
Eosina 73 92 6 8 78 99 1 1 0,773
Consolidado 73 92 6 8 75 95 4 5 0,556
En el proceso de deshidratación, el 99%(78) de las láminas procesadas libres de xilol
fueron calificadas como aceptables. Solo uno de los preparados histológicos “libre de
xilol” fue rechazado por los patólogos por este criterio.50 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Para la imbibición de los tejidos, el 96%(76) de los preparados libres de xilol fueron
considerados como aceptados, en contraste con el 92%(73) de los procesados
convencionalmente.
Para evaluar las características del corte y la “pesca”, se evaluaron el desprendimiento y
la extensión del tejido sobre la lámina; estos criterios son también marcadores indirectos
de la calidad del procesamiento del tejido. El 89% y el 90% de las láminas procesadas
sin xilol fueron aceptadas porque no tenían artificios por extensión inadecuada o
desprendimientos respectivamente.
El proceso de desparafinización y coloración fueron evaluados teniendo en cuenta como
criterios, la desparafinización, la hematoxilina y la eosina. Durante el proceso de
estandarización de la prueba, se demostró, que las características de la coloración son
dependientes del proceso de desparafinización de las láminas, razón por la cual estos
criterios fueron tenidos en cuenta durante el proceso de evaluación.
El 91%(72) de los preparados libres de Xilol, no tuvieron problemas de desparafinización
comparado con el 89% los preparados convencionales.
El 98%(78) de las láminas libres de xilol fueron catalogadas como aceptadas para la
hematoxilina, comparado con el 97%(77) de los preparados convencionales. Respecto a
la eosina, el 99% de las láminas libres de xilol fueron aceptables contrastados con el 92%
de las láminas convencionales.
Al evaluar la clasificación global de los preparados histológicos (Tabla 7-2), el 95%(75)
de las láminas libres de xilol obtuvieron un puntaje total de 6 ó 7. Para el método
convencional esta cifra fue del 92%(72) (Gráfico 7-1). Es de resaltar que solo el 5%(4) de
las láminas procesadas por el método libre de xilol fue calificada como no aceptada para
hacer diagnóstico.
Tanto la técnica convencional como la técnica libre de xilol, mostraron un rendimiento
similar al ser comparados durante el experimento; estadísticamente los datosCapítulo 7 51
recolectados no muestran diferencias significativas entre ambas lo que traduce que las
dos técnicas son equivalentes. (Gráfico 7-2)
Tabla 7-13: Comparación del puntaje total obtenido por las dos técnicas de Procesamiento
Convencional
Calificación 7(%) 6(%) ≤5(%) Total
7(%) 33(42) 14(18) 6(8) 53(67)
6(%) 19(24) 3(4) 0(0) 22(28)
Libre de Xileno
≤5(%) 3(4) 0(0) 1(1) 4(5)
Total 55(70) 17(22) 7(9) 79(100)
7.2 Coloraciones de pas y tricrómico
Para la evaluación de las coloraciones de histoquímica se tuvieron en cuenta solamente
la extensión, el desprendimiento y la coloración (Ilustración 7-1). Los demás criterios no
se tuvieron en cuenta ya que estos criterios fueron evaluados previamente en la
coloración de Hematoxilina y Eosina. (Tabla 7-3)
Gráfico 7-1: Puntaje total obtenido por número de casos
Puntaje total obtenido por número de casos
Libre de Xilol Convencional
60 100%
50
80%
s o 40 o d
s a 60% a lu
C
e 30 m
d u
.o 40% c A
20
N %
20%
10
0 0%
7 6 ≤ 5
Puntaje Total
El 89%(74) de los PAS procesados libres de xilol fueron catalogados como aceptados
para la extensión, comparado con el 94%(77) de los preparados convencionales.
5152 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Respecto al desprendimiento, el 90%(71) de los PAS libres de xilol fueron aceptables en
contraste con el 96%(76) de las láminas convencionales.
Gráfico 7-2: Puntaje total obtenido por técnica de procesamiento
Técnica libre de xilol Técnica convencional
5% 9%
28% 22%
67% 70%
7 6 ≤ 5 7 6 ≤5
Para la evaluación de la coloración de PAS, el 82%(65) de los preparados libres de xilol
fueron considerados como aceptados, en contraste con el 95%(75) de los procesados
convencionalmente.
El 92% de los PAS procesados convencionalmente obtuvieron un puntaje total de 2 ó 3
(aceptados) comparado con el 99%(78) de los procesos convencionales.
Tabla 14: Comparativo criterios de evaluación coloraciones de PAS y TM
Convencional Libre de Xileno p
PAS Aceptable % No aceptable % Aceptable % No aceptable %
Extensión 74 94 5 6 70 89 9 11 0,407
Desprendimiento 76 96 3 4 71 90 8 10 0,553
Coloración 75 95 4 5 65 82 14 18 0,696
Consolidado 78 99 1 1 73 92 1 1 0,959
TM
Extensión 76 96 3 4 69 87 10 13 0,501
Desprendimiento 77 97 2 3 65 82 14 18 0,506
Coloración 75 95 4 5 37 47 42 53 0,054
Consolidado 79 100 0 0 65 82 14 18 -
El 87%(69) de los TM procesados libres de xilol fueron catalogados como aceptados para
la extensión, comparado con el 96%(76) de los preparados convencionales. Respecto alCapítulo 7 53
desprendimiento, el 82%(65) de los TM libres de xilol fueron aceptables contrastados con
el 97%(77) de las láminas convencionales.
Ilustración 7-11: Piel. Procesamiento libre de Xilol
H&E 4X H&E 40X
PAS 40X TM 40X
Para la evaluación de la coloración del TM, el 47%(37) de los preparados libres de xilol
fueron considerados como aceptados, en contraste con el 100%(79) de los procesados
convencionalmente.
El 82%(65) de los TM procesados convencionalmente obtuvieron un puntaje total de 2 ó
3 (aceptados) comparado con el 100%(79) de los procesos convencionales.
7.3 Observaciones y comentarios
En la planilla de evaluación los patólogos tenían un espacio para escribir comentarios
adicionales sobre los preparados histológicos que estaban evaluando.
Con respecto a la H&E, en siete preparados histológicos libres de xilol, los patólogos
mencionaron la presencia de burbujas o irregularidades en el montaje del preparados
histológicos. En tres láminas convencionales y en dos libres de xilol, describieron la
5354 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
palidez y la falta de contraste de la misma. En dos láminas preparadas libres de xilol, los
patólogos hicieron referencia a la muy buena calidad del tejido y la coloración.
Con respecto a la coloración de PAS y el TM, en seis láminas libres de xilol se describió
la palidez de la coloración, especialmente en la coloración de TM. En uno de los TM
preparados libres de xilol, se mencionó el desprendimiento de la lesión tumoral de la
lámina. En cuatro de las coloraciones de PAS preparados convencionalmente y uno de
los preparados libres de xilol se exalta la calidad de la técnica.8. Discusión
El reconocimiento de los efectos tóxicos de los reactivos utilizados en el laboratorio de
patología han obligado a los investigadores a buscar nuevas alternativas al proceso
convencional. La decisión de transformar el laboratorio buscando la no utilización de
agentes tóxicos, como el formol o el xilol, es responsabilidad de cada uno de los
responsables de los procesos, siendo la cabeza del laboratorio el patólogo46.
Desde el reconocimiento en los años 70s de la neurotoxicidad del xilol por encima de la
del benzeno y la del tolueno se ha iniciado en países como Estados Unidos. La
monitorízación de los vapores de xilol en los sitios de trabajo encaminados a establecer
un límite de exposición máximo para ocho horas de trabajo de 100 partes por millón
(ppm) y la medición del ácido metilhipúrico en orina, como indicador de exposición de los
trabajadores de los laboratorios de patología.47
Este proceso ha llevado a la descripción de nuevas técnicas de procesamiento
histológico con resultados similares al método convencional en muestras de tejidos que
llegan rutinariamente a un laboratorio de patología, una de esas técnicas es la
denominada “Libre de Xilol”.48
Por tal razón se diseñó un estudio experimental para evaluar el rendimiento de la técnica
libre de xilol versus el procesamiento histotecnológico convencional tendiente a valorar la
viabilidad de implementar una técnica de procesamiento alterna menos lesiva que la
actualmente empleada.
46 Buesa R J. "Histology safety: now and then." Ann Diag Pathol, 2007: 334-9.
47 IARC. Xylene. Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans., World Health
Organization, 1989.
48 Falkeholm L. Xylene-Free Method for Histological Preparation: A Multicentre Evaluation. Lab
Invest, 2001: 1213-21.56 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Los resultados de la estandarización en el Laboratorio de Patología Interfacultades,
evidenciaron que el procesamiento de tejidos libre de xilol permitía obtener preparados
histológicos equivalentes a los procesados con la técnica convencional, desparafinizados
y coloreados tanto con el método de rutina como el método libre de xilol.
Las características principales de los preparados obtenidos fueron la presencia de un
adecuado contraste de la coloración, ausencia de retracciones tisulares, ausencia o
mínimas zonas de desprendimiento, ausencia de zonas de fragmentación tisular,
excelente detalle nuclear y excelente conservación de los tejidos ricos en grasas (tejido
adiposo, cerebro).
Después de estandarizar la técnica se realizó el procesamiento de 79 casos utilizando las
dos técnicas de procesamiento. La evaluación de los casos se realizó por parte de cuatro
patólogos experimentados del Departamento de Patología de la Facultad de Medicina de
la Universidad Nacional de Colombia utilizando la planilla para la evaluación de los
preparados histológicos y una guía para su diligenciamiento. La utilidad de esta guía
radicó en la disminución de la subjetividad de la evaluación de los preparados
histológicos obtenidos.
La evaluación de los patólogos mostró que el 95% de los preparados libres de Xilol
coloreados con Hematoxilina & Eosina fueron calificados como aceptados para hacer
diagnóstico comparados con el 92% de los preparados convencionales. No se encontró
diferencias significativas (p<0,05) entre las dos técnicas.
El proceso de deshidratación y aclaramiento fue el más aceptado por los evaluadores ya
que el 99% de las láminas libres de xilol no tuvieron problemas de este tipo. Estos
resultados confirman que el alcohol isopropílico es capaz de cumplir los dos procesos
(deshidratación y aclaramiento) sin generar alteraciones en el tejido. No se encontró
diferencias significativas (p<0,05) entre las dos técnicas.
El 90% de las láminas libres de xilol tuvieron una extensión aceptable y el 89% ausencia
o mínimas zonas desprendimiento del tejido. Es posible que el desprendimiento estéCapítulo 8 57
relacionado con el requerimiento de temperaturas altas en el proceso de
desparafinización. Se considera que el aumento en la concentración de gelatina en el
baño de flotación o la utilización de láminas cargadas pueda disminuir este artificio. No se
encontró diferencias significativas (p<0,05) entre las dos técnicas.
El proceso de desparafinización de la lámina es uno de los puntos fundamentales en la
técnica libre de xilol; en el estudio se encontró que el 91% de las láminas libres de xilol
tuvieron un proceso de desparafinización adecuado comparado con el 89% de las
láminas procesadas convencionalmente. Este resultado se vio reflejado en las
características de la coloración, en las que más del 90% de los preparados fueron
calificados como aceptados por los patólogos. No se encontró diferencias significativas
(p<0,05) entre las dos técnicas.
Los evaluadores hicieron referencia a algunos problemas del montaje, como la presencia
de burbujas sobre el tejido. Se sugiere que estos artificios pueden estar relacionados con
una inadecuada técnica del operador en el momento del montaje y no por artificios
relacionados con el procesamiento de los tejidos.
La coloración de PAS fue calificada como aceptada en el 92% de los casos procesados
libres de xilol, resultados similares a la coloración PAS convencional. De manera
semejante a los hallazgos que se encontraron en la hematoxilina & eosina, más del 80%
de las láminas no tuvieron inconvenientes con la extensión del tejido sobre la lámina.
Como ya se mencionó, se considera que aumentando la concentración de gelatina en el
baño de flotación se puede optimizar este criterio de evaluación. No se encontró
diferencias significativas (p<0,05) entre las dos técnicas.
El 82% de las coloraciones TM libres de xilol fueron calificadas como aceptadas. Los
patólogos mencionaron en múltiples ocasiones la “palidez” de la coloración. Los cortes de
los tejidos para todas las coloraciones se realizaron a un espesor de 5 micrómetros. La
literatura recomienda que el grosor del corte del tejido para esta coloración sea de 7 a 8
micrómetros para optimizar la calidad de la coloración. No se encontró diferencias
significativas (p<0,05) entre las dos técnicas.
5758 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
Aunque no se tenía como objetivo del presente trabajo, la evaluación económica de las
dos técnicas es favorable hacía el proceso libre de xilol en contraste con la técnica
convencional. Cifras internas del laboratorio del año 2009 muestran que para el
procesamiento de 203 casos semanales, el costo del procesamiento de un bloque y una
lámina de hematoxilina & eosina alcanzaba los $2470. En el presente estudió se
encontró que para este mismo volumen, el costo del procesamiento de un bloque y una
lámina de hematoxilina & eosina procesada con la técnica libre de xilol es de $1808, casi
$650 pesos menos que la técnica convencional. (Tabla 8-1)
Tabla 15: Evaluación económica
Proceso Cantidad Unidad Costo Convencional Costo Libre Xilol
Procesamiento Histotecnológico 1 Cassete $ 1.311 $ 752
Inclusión 1 Lámina $ 302 $ 302
Corte y Montaje 1 Lámina $ 526 $ 526
Batería de Coloración 1 Lámina $ 331 $ 229
Total 1 Lámina $ 2.470 $ 1.808
Después de estandarizar la técnica y realizar el estudio se demostró que la calidad de los
preparados libres de xilol tienen características similares a las obtenidas con la técnica
convencional del Laboratorio de Patología Interfacultades con un costo 30% menor que
el de la técnica convencional.9. Conclusiones y recomendaciones
 Se implementó y se estandarizó la técnica Libre de xilol en el Laboratorio de
Patología Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia.
 Se obtuvieron preparados histológicos procesados libres de xilol de calidad similar a
la de los preparados procesados convencionalmente.
 El 95%y el 92% de las láminas procesadas libres de xilol y coloreadas con
hematoxilina & eosina y PAS respectivamente, fueron categorizadas como
aceptadas para realizar diagnóstico histológico.
 El 82% de las láminas procesadas libres de xilol y coloreadas con TM fueron
calificadas como aceptados para realizar diagnóstico histológico. Se recomienda
aumentar el grosor del corte del tejido para mejorar las características de la
coloración.
 El costo de una lámina procesada por el método libre de Xilol es de $1650, 30%
menos que el procesamiento de una lámina preparada por el método convencional
que cuesta $2470 (Tabla 8-1). Más aún, el costo puede disminuir sí aumenta el
volumen de casetes procesados semanalmente.
 La técnica libre de xilol pueden ser implementada en el Laboratorio de Patología
Interfacultades como método de procesamiento rutinario, con la ventaja de disminuir
el riesgo ocupacional del personal del laboratorio y disminuir el costo de
procesamiento.60 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico libre
de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de Colombia
 Se generó una planilla de evaluación de la calidad de los preparados histológicos y
una guía para su diligenciamiento, la cual puede ser utilizada por cualquier
laboratorio de patología
 Para la implementación de la técnica libre de xilol se recomienda adquirir un baño
termostatado para mantener la temperatura de la solución de jabón y el agua
destilada para el proceso de desparafinización.Anexo A: Planilla de control de
calidad del proceso histotecnológico
Planilla de Control de Calidad del Proceso Histotecnológico
Evaluación Calidad Preparados Histológicos Método “Libre De Xileno” Vs. Técnica Convencional
Laboratorio Interfacultades Patología UNAL
Patólogo:
Item Hematoxilina & Eosina Histoquímica
PAT Corte Coloración Consolidado Corte Coloració Consolidado
No. Caso Imbibición Deshid/Aclaram Ext D Hem Eos Despar P Valor Observaciones Coloración Ext D n P Valor Observaciones
1 TricP rA óS mico
2 TricP rA óS mico
3 TricP rA óS mico
4 TricP rA óS mico
5 TricP rA óS mico
6 TricP rA óS mico
7 TricP rA óS mico
8 TricP rA óS mico
9 TricP rA óS mico
10 TricP rA óS mico
11 TricP rA óS mico
PAS
12 Tricrómico
PAS
13 Tricrómico
PAS
14 Tricrómico
PAS
15 Tricrómico
PAS
16 Tricrómico
PAS
17 Tricrómico
PAS
18 Tricrómico
PAS
19 Tricrómico
PAS
20 Tricrómico
PAT: Procesamiento Automaticado de Tejidos Instrucciones de uso: Realice la valoración de cada uno de los ITEMS, calificandolo así:
D: Desprendimiento Hem: Hematoxilina 0 Inaceptable 0. Inaceptable 1. Aceptable. Un caso es aceptado para rutina cuando el puntaje total obtenido es de 6 a 8
Ext: Extensión del Tejido Eos: Eosina 1 Aceptable En el caso de la histoquímica es aceptado cuando el puntaje obtenido es de 2 a 3
Valor: Valoración P: Puntaje
Deshid/Aclaram: Deshidratación y Aclaramiento Despar: Desparafinización
Elaborado por: A. Y. Sánchez - I. L. MojicaAnexo B: Guía para el diligenciamiento
de la planilla de control de la calidad64 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico
libre de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de ColombiaAnexo B: Guía para la elaboración de la planilla de evaluación de la calidad 65
6566 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico
libre de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de ColombiaAnexo B: Guía para la elaboración de la planilla de evaluación de la calidad 67
6768 Evaluación del rendimiento de la técnica de procesamiento histotecnológico
libre de xilol versus la técnica convencional en el Laboratorio de Patología
Interfacultades de la Universidad Nacional de ColombiaAnexo B: Guía para la elaboración de la planilla de evaluación de la calidad 69
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