Obtención de ácido cítrico a partir de suero de leche por fermentación en cultivo líquido
Autor: Betancourt Garcés, Adriana Lorenza
Asesor: Sánchez Toro, Oscar Julián (Thesis advisor)
Fecha: 2003
Programa: Bogotá - Medicina -Fisioterapia
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Este trabajo presenta los resultados experimentales hallados en la búsqueda de aceites esenciales de plantas amazónicas, metodología de trabajo y discusiones, partiendo desde la selección de especies, montaje y adecuación del equipo, tratamiento de las muestras y extracciones como tal, con el fin de establecer las condiciones y tomar los datos necesarios para realizar un diseño a nivel de planta piloto para tal operación. Su ejecución requirió el montaje de un equipo apropiado en las instalaciones de la Universidad Nacional Sede Leticia, para facilitar el desarrollo de la metodología. El diseño se realizó con los parámetros y condiciones obtenidas de la especie que presentó mayor rendimiento volumétrico en aceite esencial. Finalmente, para la obtención de los extractos etanólicos se tomaron como muestra para el desarrollo de este tipo de metodología, dos de las especies que presentaron aceite esencial. El control de calidad preliminar tanto para los extractos como para los aceites esenciales seleccionados, se realizó en la Universidad Nacional Sede Bogotá, por la disposición de material y equipos que requiere la realización de las pruebas. / Abstract: This work shows the experimental results found out in the research of essential oils of amazonic plants, developtmen in the Universidad Nacional de Colombia Sede Leticia, methodology of work and discussions, begin from select of species, assembly and adapt of equipment, treatment of samples and extraction, aiming to found conditions and take data for to do a designer of destillator to catch up pilot plant. To obtain the etanolic extracts, it takes 2 species with essential oils. The preliminary quality control for the products, it does in the Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá, for disposition of material and equipment that to require to realize the proofs.

OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE
POR FERMENTACIÓN EN CULTIVO LÍQUIDO
ADRIANA LORENZA BETANCOURT GARCÉS
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA
INGENIERÍA QUÍMICA
MANIZALES
2003OBTENCIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO A PARTIR DE SUERO DE LECHE
POR FERMENTACIÓN EN CULTIVO LÍQUIDO
ADRIANA LORENZA BETANCOURT GARCÉS
Trabajo de grado en la modalidad de proyecto final
Para optar el título de Ingeniera Química
Director
OSCAR JULIÁN SÁNCHEZ TORO
Ingeniero Químico M. Sc. en Biotecnología
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE INGENIERIA Y ARQUITECTURA
INGENIERÍA QUÍMICA
MANIZALES
2003Nota de aceptación
__________________________________
__________________________________
__________________________________
__________________________________
_________________________________
Jurado
_________________________________
Jurado
Manizales, Enero de 2003.
ivA Dios por darme la oportunidad de
llegar hasta esta etapa de mi vida.
A mi familia por su apoyo
incondicional durante mis años
de estudio.
A todas las personas que de
un modo u otro colaboraron
para que este logro se hiciera
realidad.
vAGRADECIMIENTOS
Le agradezco especialmente al Laboratorio de Microbiología General de la
Universidad de Caldas por su disponibilidad absoluta al permitirme hacer uso de
su espacio, material y equipos, como también al Laboratorio de Suelos de la
misma institución.
También hago extensivo este agradecimiento al Ingeniero Químico Oscar Julián
Sánchez coordinador de la Línea de Investigación en biotecnología de la Facultad
de Ingeniería de la Universidad de Caldas y a su grupo de trabajo por confiar en
mi la realización de esta parte del proyecto de investigación al cual pertenece este
trabajo.
Al National Center for Agricultural Utilization Research de Estados Unidos por
facilitarnos las cepas empleadas en estado liofilizado cuando fueron requeridas
durante la investigación.
A los Laboratorios de Química y Procesos Productivos de la Universidad Nacional
de Colombia sede Manizales por permitirme hacer uso de sus instalaciones y
equipos para la realización de la etapa de biosíntesis de ácido cítrico y análisis de
muestras.
A la Industria lechera de Manizales Celema por facilitarnos el suero de leche
necesario para la investigación.
viCONTENIDO
Pág.
INTRODUCCIÓN ................................................................................................................ 17
1. OBJETIVOS ................................................................................................................... 19
1.1. OBJETIVO GENERAL ................................................................................................. 19
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ........................................................................................ 19
2. MARCO TEÓRICO ......................................................................................................... 20
2.1. ANTECEDENTES ........................................................................................................ 20
2.2. CONTAMINACIÓN DE LA INDUSTRIS LÁCTEA ........................................................ 24
2.3. MICROORGANISMOS COMO CATALIZADORES ..................................................... 27
2.3.1. Factores que influyen en el crecimiento microbiano ................................................. 28
2.3.2. Generalidades de los hongos del género Aspergillus ............................................... 30
2.4. SUERO DE LECHE ..................................................................................................... 32
2.4.1. Definición .................................................................................................................. 32
2.4.2. Composición ............................................................................................................. 32
2.4.3. Tratamiento del lactosuero ....................................................................................... 34
2.4.3.1. Extracción de proteínas del suero ......................................................................... 35
2.4.3.2. Determinación del punto isoeléctrico ..................................................................... 35
2.4.3.3. Método térmico para la concentración de proteínas del lactosuero ...................... 35
2.4.4. Usos del lactosuero .................................................................................................. 37
2.4.5. Fermentación del lactosuero ..................................................................................... 38
2.4.5.1. Producción de alcohol ............................................................................................ 39
2.4.5.2. Producción de enzimas .......................................................................................... 40
2.4.5.3. Producción de proteína unicelular ......................................................................... 41
2.4.5.4. Producción de levadura de panadería ................................................................... 42
2.4.5.5. Producción de ácidos orgánicos ............................................................................ 43
2.4.5.6. Otros productos ..................................................................................................... 44
2.5. MATERIAS PRIMAS .................................................................................................... 44
2.5.1. Lactosa ..................................................................................................................... 45
2.5.2. Licor de maceración de maíz .................................................................................... 46
2.6. ÁCIDO CÍTRICO .......................................................................................................... 48
vii2.6.1. Características .......................................................................................................... 48
2.6.2. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos o del ácido cítrico ............................................. 50
2.6.3. Obtención de ácido cítrico ........................................................................................ 50
2.6.3.1. Medio de fermentación .......................................................................................... 51
2.6.3.1.1. Azúcar ................................................................................................................. 52
2.6.3.1.2. Nitrógeno ............................................................................................................ 53
2.6.3.1.3. pH ....................................................................................................................... 53
2.6.3.1.4. Elementos traza .................................................................................................. 53
2.6.3.1.5. Aireación ............................................................................................................. 54
2.6.3.2. Procesos de producción ........................................................................................ 54
2.6.3.2.1. Producción del inóculo ........................................................................................ 54
2.6.3.2.2. Procesos en superficie ........................................................................................ 55
2.6.3.2.3. Procesos sumergidos ......................................................................................... 56
2.6.3.2.4. Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger ............................................... 58
2.6.3.2.5. Producción de ácido cítrico por Candida lipolytica utilizando hidrolizado de
dátiles y suero de leche ...................................................................................... 60
2.6.2.2.6. Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger con suero de leche
permeado ............................................................................................................ 61
2.7. CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN ........................................................................... 61
2.7.1. Modelos de formación de biomasa ........................................................................... 63
2.7.2. Modelos de formación de producto ........................................................................... 66
2.7.3. Modelos de consumo de sustrato ............................................................................. 67
3. METODOLOGÍA ............................................................................................................. 69
3.1. PREPARACIÓN DE LAS CEPAS ................................................................................ 69
3.1.1. Reconstitución de la cepa ......................................................................................... 70
3.1.2. Mantenimiento de la cepa ......................................................................................... 71
3.1.3. Preservación de la cepa ........................................................................................... 73
3.2.DISEÑO DEL MEDIO ÓPTIMO DE FERMENTACIÓN ................................................. 73
3.2.1. Prediseño experimental ............................................................................................ 74
3.2.1.1. Etapa de adaptación .............................................................................................. 74
3.2.1.2. Etapa de producción .............................................................................................. 76
3.2.2. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 368 ............................. 77
3.2.2.1. Preparación de la cepa de Aspergillus carbonarius NRRL 368 ............................. 77
3.2.2.2. Etapa de adaptación .............................................................................................. 77
3.2.2.3. Etapa de producción .............................................................................................. 78
3.2.3. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 67 ............................... 81
3.2.3.1. Preparación de la cepa de Aspergillus carbonarius NRRL 67 ............................... 81
viii3.2.3.2. Etapa de adaptación .............................................................................................. 81
3.2.3.3. Etapa de producción .............................................................................................. 82
3.2.4. Diseño experimental para el Aspergillus niger NRRL 3 ............................................ 82
3.2.4.1. Preparación de la cepa de Aspergillus niger NRRL 3 ........................................... 82
3.2.4.2. Etapa de adaptación .............................................................................................. 83
3.2.4.3. Etapa de producción .............................................................................................. 83
3.3. BIOSÍNTESIS DE ÁCIDO CÍTRICO ............................................................................ 84
3.3.1. Determinación de las curvas biocinéticas ................................................................. 87
3.3.2. Modelamiento de la cinética de fermentación ........................................................... 88
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS ........................................................................................ 89
4.1. PREPARACIÓN DE LA CEPA ..................................................................................... 89
4.1.1. Reconstitución de la cepa ......................................................................................... 89
4.1.2. Mantenimiento de la cepa ......................................................................................... 89
4.2. DETERMINACIÓN DEL MEDIO ÓPTIMO DE FERMENTACIÓN ............................... 92
4.2.1. Prediseño experimental ............................................................................................ 92
4.2.2. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 368 ............................. 93
4.2.2.1. Preparación de la cepa .......................................................................................... 93
4.2.2.2. Etapa de adaptación ............................................................................................. 94
4.2.2.3. Etapa de producción .............................................................................................. 95
4.2.3. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 67 ............................... 97
4.2.3.1. Preparación de la cepa .......................................................................................... 98
4.2.3.2. Etapa de adaptación .............................................................................................. 99
4.2.3.3. Etapa de producción .............................................................................................. 99
4.2.4. Diseño experimental para el Aspergillus niger NRRL 3 ............................................ 101
4.2.4.1. Preparación de la cepa .......................................................................................... 101
4.2.4.2. Etapa de adaptación .............................................................................................. 101
4.2.4.3. Etapa de producción .............................................................................................. 103
4.3. BIOSÍNTESIS DE ÁCIDO CÍTRICO ............................................................................ 105
4.3.1. Modelamiento de la cinética de la fermentación ....................................................... 109
4.3.1.1. Planteamiento del modelo ..................................................................................... 109
4.3.1.2. Determinación de los parámetros cinéticos ........................................................... 111
4.3.1.3. Solución del modelo ............................................................................................... 114
5. CONCLUSIONES ........................................................................................................... 117
6. RECOMENDACIONES ................................................................................................... 120
BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................................. 123
ANEXOS ............................................................................................................................. 127
ixLISTA DE TABLAS
Pág.
Tabla 1. Empresas productora de ácido cítrico .................................................................. 22
Tabla 2. Sectores consumidores de ácido cítrico ............................................................... 23
Tabla 3. Usos del ácido cítrico por sectores ....................................................................... 24
Tabla 4. Contribución de la DBO de efluentes lácteos ...................................................... 25
5
Tabla 5. Carga orgánica por producto fabricado en industrias lácteas ............................... 27
Tabla 6. Composición promedio de la leche, subproductos y desagües expresado en
mg/L ..................................................................................................................... 33
Tabla 7. Composición del lactosuero fresco ....................................................................... 34
Tabla 8. Principales procesos industriales para la obtención de proteína unicelular a
partir de suero ....................................................................................................... 41
Tabla 9. Composición del grano de maíz en base seca ..................................................... 47
Tabla 10. Condiciones que favorecen la producción de ácido cítrico ................................. 51
Tabla 11. Composición de la solución nutritiva para un cultivo en superficie ..................... 56
Tabla 12. Clasificación de la fermentación según Gaden ................................................... 62
Tabla 13. Composición del caldo de cultivo Czapeck ......................................................... 71
Tabla 14. Composición del medio de adaptación sintético 1 .............................................. 75
Tabla 15. Composición del medio de adaptación sintético 2 .............................................. 75
Tabla 16. Descripción de las cepas fúngicas con cada uno de los medios de cultivo
empleados .......................................................................................................... 90
Tabla 17. Condiciones de crecimiento de las cepas fúngicas en medios sólidos .............. 91
Tabla 18. Concentración de ácido cítrico (g/L) arrojada durante el prediseño
experimental ...................................................................................................... 92
Tabla 19. Concentración de azúcares reductores totales (g/L) y concentración de
proteína (g/L) para sueros antes de la fermentación con las diferentes cepas... 95
Tabla 20. Determinación de ácido cítrico (g/L) en suero fermentado por Aspergillus
carbonarius NRRL 368 ....................................................................................... 96
Tabla 21. Determinación de ácido cítrico (g/L) en suero fermentado por Aspergillus
carbonarius NRRL 67 ......................................................................................... 99
Tabla 22. Determinación de ácido cítrico (g/L) en suero fermentado por Aspergillus niger
xNRRL 3 ............................................................................................................... 103
Tabla 23. Resultados de la prueba LSD para las concentraciones de ácido cítrico
obtenidas con el Aspergillus niger NRRL 3 ........................................................ 105
Tabla 24. Datos experimentales promedio de la formación de biomasa, consumo de
sustrato y producción de ácido cítrico en un cultivo sumergido por lotes de 106
Aspergillus niger NRRL 3 ...................................................................................
Tabla 25. Condiciones para realizar la fermentación de ácido cítrico en cultivo
sumergido a partir de suero de leche ................................................................ 116
xiLISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Consumo de ácido cítrico por destino ................................................................. 23
Figura 2. Estructura de la lactosa ....................................................................................... 45
Figura 3. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos y sus productos sintetizados en exceso en
hongos ................................................................................................................ 52
Figura 4. Curva típica de un cultivo por lotes ...................................................................... 63
Figura 5. Montaje utilizado durante el diseño experimental ................................................ 76
Figura 6. Montaje realizado para filtrar las muestras antes de ser analizadas .................. 77
Figura 7. Montaje del biorreactor Applikon para la fermentación del ácido cítrico con A.
niger NRRL 3 ....................................................................................................... 86
Figura 8. Vista superior del Aspergillus carbonarius NRRL 368 cultivado en medio agar
Czapeck Malta modificado .................................................................................. 94
Figura 9. Vista inferior del Aspergillus carbonarius NRRL 368 cultivado en medio agar
Czapeck Malta modificado .................................................................................. 94
Figura 10. Concentración de ácido cítrico en cada uno de los tratamientos de suero con
Aspergillus carbonarius NRRL 368 .................................................................... 97
Figura 11. Vista superior del Aspergillus carbonarius NRRL 67 cultivado en medio agar
Czapeck Malta modificado .................................................................................. 98
Figura 12. Vista superior del Aspergillus carbonarius NRRL 67 cultivado en medio agar
Czapeck Malta modificado .................................................................................. 98
Figura 13. Concentración de ácido cítrico en cada uno de los tratamientos de suero con
Aspergillus carbonarius NRRL 67 ...................................................................... 100
Figura 14. Vista superior del Aspergillus niger NRRL 3 cultivado en medio agar
Sabouraud ......................................................................................................... 102
Figura 15. Vista inferior del Aspergillus niger NRRL 3 cultivado en medio agar
Sabouraud ......................................................................................................... 102
Figura 16. Vista del medio de adaptación ........................................................................... 102
Figura 17. Concentración de ácido cítrico en cada uno de los tratamientos de suero con
Aspergillus niger NRRL 3 .................................................................................. 104
Figura 18. Datos experimentales de la formación de biomasa, consumo de sustrato y
xiiproducción de ácido cítrico en cultivo sumergido por lotes de Aspergillus
niger NRRL 3 .................................................................................................... 107
Figura 19. Datos experimentales del consumo de proteína durante la fermentación en
cultivo sumergido para la producción de ácido cítrico con Aspergillus niger
NRRL 3 .............................................................................................................. 108
Figura 20. Determinación de los parámetros de la ecuación logística que modela la
formación de biomasa ....................................................................................... 111
Figura 21. Determinación del parámetro de la ecuación que modela el consumo de
sustrato............................................................................................................... 112
Figura 22. Determinación del parámetro de la ecuación que modela la producción de
ácido cítrico ........................................................................................................ 113
Figura 23. Simulación de la fermentación para la producción de ácido cítrico con
Aspergillus niger NRRL 3 ................................................................................... 115
Figura 24. Simulación del producto en la fermentación para la producción de ácido
cítrico con Aspergillus niger NRRL 3 ................................................................ 116
xiiiLISTA DE ANEXOS
Pág.
Anexo A. Composición de los medios sólidos .................................................................... 127
Anexo B. Tabla de datos determinación de azúcares reductores totales en sueros
después de la fermentación con Aspergillus carbonarius NRRL 368 .................. 129
Anexo C. Tabla de datos determinación de azúcares reductores totales en sueros
después de la fermentación con Aspergillus carbonarius NRRL 67 ................... 130
Anexo D. Tabla de datos determinación de azúcares reductores totales en sueros
después de la fermentación con Aspergillus niger NRRL 3 ................................. 132
Anexo E. Tabla de datos determinación de proteína en sueros después de la
fermentación con Aspergillus carbonarius NRRL 368 ......................................... 134
Anexo F. Tabla de datos determinación de proteína en sueros después de la
fermentación con Aspergillus carbonarius NRRL 67 .......................................... 135
Anexo G. Tabla de datos determinación de proteína en sueros después de la
fermentación con Aspergillus niger NRRL 3 ....................................................... 137
Anexo H. Manual de manejo del test enzimático para la determinación de ácido cítrico ... 139
Anexo I. Determinación cuantitativa de proteína por el método de Biuret ......................... 152
Anexo J. Determinación cuantitativa de azúcares reductores totales utilizando ácido
dinitrosalicílico ...................................................................................................... 154
Anexo K. Biorreactor Applikon ............................................................................................ 156
Anexo L. Determinación de la concentración de biomasa .................................................. 159
Anexo M. Ficha técnica de la enzima MAXILACT DMS ..................................................... 160
Anexo N. Fotos de los diferentes tipos de suero después de la fermentación con
Aspergillus niger NRRL 3 .................................................................................... 164
Anexo Ñ. Fotos del biorreactor durante la fermentación con Aspergillus niger NRRL 3 .... 166
xivRESUMEN
Uno de los problemas de la producción de derivados en el sector lácteo es el
aumento de la cantidad de suero de leche que se vierte a los cursos de agua.
Como es bien sabido, el suero de leche posee un contenido en proteínas bastante
alto, que para ser degradadas requiere un gran consumo de oxígeno haciendo que
la DBO de las aguas residuales de la industria lechera aumente progresivamente.
5
Este trabajo tiene como propósito presentar un método que permita convertir el
suero de leche en una materia prima que genere, por medio de un proceso
fermentativo, productos de alto valor agregado como lo es el ácido cítrico.
Para llevar a cabo el proceso fermentativo, se empleó el suero que sale de la
planta productora de queso de la Industria Celema (Manizales), que fue tratado de
cuatro maneras diferentes para luego ser fermentado con las cepas Aspergillus
niger NRRL 3, Aspergillus carbonarius NRRL 368 y Aspergillus carbonarius NRRL
67, buscándose con esto encontrar las condiciones que dieran el mejor
rendimiento de producción de ácido cítrico.
Con los resultados obtenidos en esta parte de la investigación, se realizó una
fermentación en un microfermentador de 3 litros para encontrar la cinética que rige
el proceso fermentativo.
xvABSTRACT
One of the problems in the production of milk is the increase of whey. As we all
know, whey has a high percentage of proteins that in order to be break down it
requires a high intake of oxigen makin the DBO of the remaining water of the milk
5
industry to grow progessively.
This job has as a purpose to present a method that facilitates the conversion of
whey in raw material that generates through a fermented process products of high
value such as citric acid.
To put in practice the fermented process, Celema’s serum from the cheese factory
plant of Manizales, was used and treated in four different ways. To be fermented
later with stumps Aspergillus niger NRRL 3, Aspergillus carbonarius NRRL 368,
Aspergillus carbonarius NRRL 67, with the purpose of finding out the best
conditions in the production of citric acid.
With the results obtained in this part of the job a fermentation was realized in a
microfermentator of three liters to find out the kinetics that rules the fermentation
process
xvi17
INTRODUCCIÓN
La biotecnología se ha constituido como uno de los campos de la actividad
científico – técnica de mayor desarrollo y aplicación en la actualidad. La
biotecnología se refiere a la aplicación de bioagentes en la producción de bienes y
servicios. Particularmente, los hongos son capaces de transformar de diferentes
materiales en productos de alto valor agregado como son los ácidos orgánicos en
general, y el ácido cítrico en particular.
El ácido cítrico es el ácido orgánico más usado en el campo de los productos
alimenticios y farmacéuticos. Su buen sabor y la facilidad con que es asimilado
favorecen su utilización como ingrediente ácido para mantener u obtener un pH
conveniente y hacer resaltar el sabor de una extensa variedad de productos.
Además de la industria alimenticia y farmacéutica, se usa en la limpieza y
pulimiento del hierro y el acero, como componente en ciertas soluciones ferrosas
para galvanoplastia, en el acondicionamiento y tratamiento de aguas residuales,
en la preparación de resinas alquídicas, pinturas y lacas, y en el estampado de
telas.
La fermentación de soluciones azucaradas por mohos, la extracción del jugo de
limones y limas y la extracción del jugo de los residuos de piña en las fábricas de
conservas son los tres métodos más importantes para la fabricación del ácido
cítrico.
Con este trabajo se aporta a la Línea de Investigación en Biotecnología industrial
de la Facultad de Ingeniería de la Universidad de Caldas. Se pretende plantear18
otra alternativa de proceso para la obtención del ácido cítrico, que permita obtener
un producto de buena calidad implementado nuevas fuentes de producción
aprovechables, como es el caso del suero de leche. El suero de leche es un
subproducto contaminante de la industria de alimentos, el cual mediante su
fermentación, posibilita la obtención de productos de valor agregado como el ácido
cítrico, reduciendo el impacto ambiental negativo debido a la gran cantidad de
DBO que genera su vertimiento a los cursos de agua al contener niveles
considerables de lactosa, proteínas y minerales.
El ácido cítrico se biosintetiza mediante un proceso de fermentación con diferentes
microorganismos que puedan asimilar la lactosa contenida en el suero, o la
glucosa producida a partir de la lactosa hidrolizada enzimáticamente.
La realización de este trabajo posibilitará el futuro desarrollo de procesos menos
contaminantes, el menor vertido de suero a ríos y lagos, la disminución del índice
de eutrofización de los cursos de agua y un mejoramiento del entorno en el área
de influencia de empresas del sector lácteo, constituyéndose en un estudio
preliminar que conlleve al desarrollo y/o adaptación de tecnologías acordes al
medio para la obtención industrial de diferentes insumos de alto valor agregado.19
1. OBJETIVOS
1.1. OBJETIVO GENERAL
Estudiar la obtención de ácido cítrico a partir de suero de leche por fermentación
con cuatro cepas de Aspergillus.
1.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
(cid:190) Acondicionar las cepas de microorganismos más adecuadas para la
producción de ácido cítrico a partir de suero de leche.
(cid:190) Formular el medio de cultivo más adecuado con base en suero de leche para la
producción de ácido cítrico.
(cid:190) Determinar los parámetros cinéticos y las condiciones de operación del cultivo
sumergido para la obtención de ácido cítrico.20
2. MARCO TEÓRICO
2.1. ANTECEDENTES
La producción de ácido cítrico por fermentación a escala comercial ha constituido
un gran progreso dentro del campo de la microbiología industrial: al mismo tiempo
que independizaba a los países desarrollados en el abastecimiento de este
producto ha modificado notablemente el comercio mundial de ácido cítrico y citrato
cálcico.
El ácido cítrico fue aislado por Scheele en el año 1784 del zumo de limón, en
forma de sólido cristalizado. Luego se sintetizó a partir de glicerol y de otros
compuestos químicos, para finalmente desde 1923 obtenerse por fermentación,
utilizando microorganismos que crecían sobre la superficie de los cultivos.
Wehmer en 1893 fue el primero en describir al ácido cítrico como un producto de
la fermentación por mohos. Dos de estos, que él designó como Citromyces
pfefferianus y Citromyces glaber (clasificados por Thom como penicilios),
producían el ácido a partir de soluciones nutritivas de sacarosa que contenían
carbonato cálcico. Más tarde, Wehmer dio a conocer la formación de ácido cítrico
por Penicillium luteum y Mucor piriformis, aunque creía que los aspergilos negros
solo producían ácido oxálico. Su descubrimiento condujo a extensos estudios de
los factores que influyen sobre la producción micológica del ácido cítrico, las
diversas cepas de mohos capaces de producirlo y el mecanismo por el cual se21
forma una sustancia de cadena ramificada partiendo de compuestos azucarados
de tipo lineal (24).
En 1917, Currie, del Departamento de Agricultura de Estados Unidos, publicó los
resultados de una importante investigación sobre la producción de ácido cítrico por
una variedad de Aspergillus niger. Doelger y Prescott, en 1934, corroboraron los
resultados de Currie, contribuyendo con sus aportes al conocimiento de esta
fermentación (24).
En 1933, la producción mundial superó las 10.000 toneladas, de las cuales, más
del 80% se obtuvieron por fermentación. Inicialmente se utilizaron métodos de
cultivo en superficie con Aspergillus niger. Después de la segunda guerra mundial
se introdujeron procesos de cultivo sumergido también con A. niger y
aproximadamente en 1977 se comercializó un proceso de cultivo sumergido con
levaduras del género Candida. Con la sustitución de los polifosfatos por el citrato
de sodio en los detergentes en 1970, el mercado anual creció rápidamente (28).
La producción de ácido cítrico ha crecido notablemente en el presente siglo.
Actualmente, la capacidad instalada mundial es de 750.000 t/año, con una
producción real de 550.000 t/año. El ácido cítrico se fabrica en más de 20 países.
La Unión Europea, Estados Unidos y China reúnen el 88% del total mundial.
Recientemente, se observó un aumento importante en la capacidad productiva de
Europa Oriental y del Lejano Oriente, particularmente en China, la cual produce
proporcionalmente menor volumen de ácido cítrico de alta calidad, es decir,
purificado y refinado. Sin embargo, la capacidad de elaboración del producto crudo
representa el 24% del total mundial. La Unión Europea incrementó su elaboración
ubicándose primera en el ranking mundial debido, fundamentalmente, a su uso
como materia prima para la fabricación de detergentes biodegradables.
Se estima que la demanda de Estados Unidos, en el último quinquenio, creció
según una tasa cercana al 7% anual. Este crecimiento se relaciona con la22
expansión de la industria de alimentos y bebidas. Las primeras firmas productoras
a nivel mundial son Bayer y ADM, cada una con el 17% del mercado
aproximadamente. Le siguen Jungunzlauter, Cargill y Citrique Belge (que produce
más de 300 toneladas de ácido cítrico diariamente). En Tabla 1, se detallan
algunas importantes firmas elaboradoras de ácido cítrico (29):
Tabla 1. Empresas productoras de ácido cítrico.
Compañía Localización Capacidad total
(tn/año)
Miles Inc. EEUU, Brasil, México, Colombia 120.000
Chas Pfizer EEUU, Irlanda 115.000
A.G. Junbunzlauer Austria, Alemania, Francia, 100.000
Chemische fabrik Indonesia
Citrique Belge Bélgica 60.000
Biacor Italia 28.000
John Sturge Reino Unido 25.000
Cargill EEUU 25.000
AKTIVA República Checa 15.000
Gadot Israel 12.000
Fuente: www.alimentosargentinos.gov.ar/0-3/revistas/r_12/12_06_citrico_htm
Así mismo, países como China (50.000 t), Indonesia (25.000 t), Rusia (22.000 t),
India (10.000 t), Eslovaquia (4.500 t), Turquía (4.500 t) y Tailandia (4.000 tn),
cuentan con plantas pequeñas que permiten elaborar en algunos casos un total
significativo de toneladas de ácido cítrico.
La expansión de la demanda mundial de ácido cítrico se debe, fundamentalmente,
a su utilización como aditivo en la industria de alimentos y bebidas. Por ejemplo,
en Estados Unidos este sector demanda el 72% del total. A principios de la
década del 90´, el producto se destinaba a distintas industrias. El consumo de
ácido cítrico en el mundo crece a razón de 5-8% anual y la tendencia parece
mantenerse estable. A continuación se puede observar tanto en la Tabla 2 como
en la Figura 1, el consumo de ácido cítrico por sectores y su crecimiento anual.23
Tabla 2. Sectores consumidores de ácido cítrico.
SECTOR CONSUMIDOR CRECIMIENTO ANUAL
PORCENTUAL
Alimentos y Bebidas 5-8
Fármacos 2-3
Detergentes 6-7
Limpiadores de Metales s/d
Productos Textiles s/d
Cosméticos 2-3
Otros 9-10
Fuente: www.alimentosargentinos.gov.ar/0-3/revistas/r_12/12_06_citrico_htm
Figura 1. Consumo de ácido cítrico por destino.
Fuente: www.alimentosargentinos.gov.ar/0-3/revistas/r_12/12_06_citrico_htm
El uso que cada uno de los sectores consumidores de ácido cítrico da a éste
producto se describe en la Tabla 3.24
Tabla 3. Usos del ácido cítrico por sectores.
SECTOR USO
Bebidas Saborizante y regulador del pH; incrementa la
efectividad de los conservantes antimicrobianos
Dulces y Conservas Acidulante y regulador del pH para lograr una
óptima gelificación
Caramelos Acidulante y regulador del pH con el objetivo de
alcanzar la máxima dureza de los geles
Verduras Procesadas En combinación con ácido ascórbico, previene la
oxidación
Alimentos Congelados Ayuda a la acción de los antioxidantes; inactiva
enzimas previniendo pardeamientos indeseables;
inhibe el deterioro del flavor y el color
Frutas y Hortalizas Enlatadas Disminuye el pH; al actuar como quelante; previene
la oxidación enzimática y la degradación del color,
resalta el sabor.
Aceites y Grasas Previene la oxidación
Confitería y Repostería Se utiliza como acidulante, resaltador de sabores y
para optimizar las características de los geles
Quesos Pasteurizados y En forma de sal, como emulsificante y texturizante
Procesados
Lácteos Estabilizante en cremas batidas
Productos de la Pesca Para bajar el pH en presencia de otros
conservantes o antioxidantes
Fuente: www.alimentosargentinos.gov.ar/0-3/revistas/r_12/12_06_citrico_htm
2.2. CONTAMINACIÓN DE LA INDUSTRIA LÁCTEA
La industria láctea representa un importante sector dentro de la industria
alimentaria y su contribución material en términos de contaminación de las aguas
receptoras es significativo, lo que hace necesario y obligatorio el tratamiento
previo de sus desechos líquidos antes del vertimiento. El caudal producido por la
industria láctea depende del consumo de agua en la planta procesadora y este
depende de la naturaleza de los productos fabricados y varía de una fábrica a otra.25
Las aguas residuales de estas industrias están constituidas esencialmente por
residuos de leche, productos lácteos diluidos y productos de limpieza como
detergentes, ácidos y álcalis fuertes. Los principales constituyentes orgánicos en
los residuos de la leche son sus sólidos naturales: grasa de la leche emulsionada,
lactosa y proteínas (caseína y lactoalbúmina), sales y oligoelementos. A menudo
también contiene sacarosa.
Las sustancias orgánicas de los efluentes de industrias lácteas provienen de los
productos desechados y en menor grado de los productos de limpieza y desagües
sanitarios. La importancia de cada una de las fuentes contaminantes se observa
en la Tabla 4.
Tabla 4. Contribución de la DBO de efluentes lácteos.
5
DESECHOS Kg DBO/L PORCENTAJE PRESENTE
(equivalente en leche EN LOS EFLUENTES
procesada)
Leche, productos lácteos y
otros materiales orgánicos 3,0 94
Productos de limpieza 0,1 3
Desinfectantes Despreciable -
Lubricantes Despreciable -
Residuos sanitarios 0,1 3
Fuente: BAENA, Sandra et. al. Aguas residuales de la industria láctea: Naturaleza y composición
de las aguas residuales. Revista Ambiente y Desarrollo, 1994, p. 85
El suero como subproducto proviene de la coagulación de la leche durante la
fabricación de quesos. Es un líquido compuesto principalmente de agua, materia
grasa, lactosa, proteínas, vitaminas y minerales. Constituye además el problema
más difícil de resolver con respecto al tratamiento de las aguas residuales de la
industria láctea y se estima que entre el 60 y 70 % de la carga orgánica total de los
efluentes industriales corresponde a suero (7).26
La Demanda Biológica de Oxígeno (DBO), que en los efluentes industriales tiene
una variación media diaria entre 40 y 10.000 mg/L, y la DQO de los desagües de
la industria láctea varían en gran medida en función de los productos fabricados,
porque se requiere de diferentes cantidades de oxígeno para la oxidación de los
diferentes constituyentes de la leche como grasas, carbohidratos y proteínas. La
relación DBO/DQO en efluentes crudos varía de 0,07 a 1,03 con un valor
promedio aproximado de 0,57. De acuerdo con Nemerow (1971), la leche entera
presenta una DBO de 110.000 mg/L y la leche descremada un valor de 80.000
mg/L, donde aproximadamente 45 kilos de leche entera producen 4,5 kilos de
DBO. En la Tabla 5 se especifica la carga orgánica producida por productos
fabricados en la industria láctea (6).
En cuanto al pH, el valor de éste en los desechos in natura varía entre 4,2 y 9,2,
sin embargo según monitoreos realizados en desechos lácteos se han observados
valores entre 2,0 y 12,9 con un valor promedio de 7,5. Estas aguas residuales
tienen la tendencia a volverse ácidas muy rápidamente por la fermentación de la
lactosa que se transforma en ácido láctico, principalmente en ausencia de oxígeno
disuelto y el pH bajo resultante puede causar la precipitación de la caseína. Los
vertidos de las plantas de producción de queso son especialmente ácidos por la
presencia del suero (7).
La concentración de sólidos en suspensión varía en función de las operaciones
industriales y los valores oscilan entre 400 y 2.000 mg/L. En general, las aguas
residuales del procesamiento de la leche contienen poca materia en suspensión a
excepción de los desagües de la fabricación de quesos y sus efectos
contaminantes son casi enteramente debidos a la demanda de oxígeno que se
impone a la corriente receptora.27
Tabla 5. Carga orgánica por producto fabricado en industrias lácteas.
Tipo de proceso kg DBO por 1.000 kg de Kg “ equivalente”
leche (variación) variación promedio
Estación receptora 0,02 – 1,13 0,28
Estación receptora (carga) 0,86
Mantequilla 0,19 – 1,91 0,86
Ricota 1,30 – 42,00 14,64
Queso natural 0,30 – 4,04 2,00
Helados 1,90 – 21,04 5,54
Leche condensada 0,18 – 13,30 3,67
Leche deshidratada 0,40 – 13,50 6,06
Suero condensado 0,27 – 0,31 0,29
Suero seco 3,40 – 57,20 22,33
Fuente: BAENA, Sandra et. al. Aguas residuales de la industria láctea: Naturaleza y composición
de las aguas residuales. Revista Ambiente y Desarrollo, 1994, p. 88
La contaminación producida por estas aguas residuales se caracteriza por la
presencia de lodos negros con fuertes olores a ácido butírico, causado por la
descomposición de la caseína. Sin embargo, el suero constituye el problema más
difícil de resolver con respecto al tratamiento, debido a la dificultad que constituye
su rápida degradación por los métodos biológicos comúnmente usados. En cada
caso el problema debe ser analizado cuidadosamente, ya que según el tipo de
queso producido se obtendrá un suero con características diferentes (7).
2.3. MICROORGANISMOS COMO CATALIZADORES
La actividad catalítica de los microorganismos se manifiesta como su capacidad
para convertir sustratos en productos de alto valor agregado. A este proceso se le
denomina fermentación.
Durante la fermentación, una pequeña cantidad de microorganismos crece y se
multiplica tomando nutrientes del medio en donde se encuentran. Los28
microorganismos al desarrollarse forman una serie de sustancias como resultado
de su metabolismo. La formación de estas sustancias, así como la transformación
de los nutrientes, se lleva a cabo a través de una compleja red de reacciones
bioquímicas, catalizadas todas ellas por enzimas. Por lo anterior, se pueden
considerar las células como biocatalizadores.
2.3.1. Factores que influyen en el crecimiento microbiano. Las funciones de
los microorganismos se ven modificadas por las sustancias químicas y
condiciones físicas de su medio ambiente tales como: temperatura, actividad del
agua, presión hidrostática, pH, entre otras.
a) Temperatura: La temperatura es uno de los factores más importantes a tener
en cuenta, ya que influye en la proliferación y vida de los microorganismos
afectándose en cualquiera de los sentidos. Cuando se aumenta la temperatura,
las reacciones enzimáticas y químicas se aceleran, aumentando su
crecimiento, pero las proteínas, ácidos nucleicos y otros componentes
celulares se inactivan o se destruyen irreversiblemente por su sensibilidad. Es
por esto, que los microorganismos presentan temperaturas mínimas por debajo
de la cual no hay proliferación, y temperaturas óptimas en la que el crecimiento
es más rápido.
b) Necesidades hídricas: Todos los microorganismos requieren agua para vivir.
La cantidad de ella varia según el ambiente, pero su disponibilidad no depende
solo de su contenido, sino que es una función compleja de factores de
adsorción y solución.
c) Actividad del agua: La actividad del agua se relaciona con la presión de vapor
de agua en el aire sobre una solución o sustancia. Cuando un microorganismo
se encuentra en un medio con baja actividad de agua, éste debe realizar un29
trabajo para poder obtener agua de dicho medio; este gasto energético hace
que se reduzca la velocidad de crecimiento del microorganismo.
d) pH: El pH es un factor esencial para el crecimiento de los microorganismos, es
por eso que se determinan el pH mínimo, óptimo y máximo. La mayoría de las
especies crecen a valores casi neutros, pero algunas se ven muy favorecidas
por una reacción ácida, aunque muy pocas especies pueden crecer a valores
de pH menores de dos o mayores de 10.
e) Potencial de óxido reducción: En las diferentes reacciones biológicas de los
microorganismos, hay que tener en cuenta el aprovechamiento del oxígeno del
aire.
f) Presión osmótica: En la membrana celular que es permeable y permite el paso
de agua y algunas moléculas, el microorganismo establece un equilibrio con su
medio, estableciéndose una presión osmótica (variable según el tipo de
microorganismo).
g) Oxígeno: El oxígeno además de ser una sustancia vital para los organismos
respiratorios, es también capaz de formar derivados tóxicos aún para los
organismos que lo respiran y necesitan (el peróxido de hidrógeno es uno de
ellos). Sin embargo, los microorganismos han desarrollado enzimas que los
destruyen, tal es el caso de la catalasa y la peroxidasa.
El conocimiento de lo anterior ayuda a explicar la distribución de los
microorganismos en los alimentos y hace posible diseñar métodos para controlar
las funciones microbianas o destruir organismos que puedan alterar un producto
deseado (21).30
2.3.2. Generalidades de los hongos del género Aspergillus. Los hongos
constituyen un complejo y fascinante grupo de organismos tan grande que se
calculan más de 300.000 especies. Los hongos mejor conocidos por todos son los
macroscópicos, denominados también setas o champiñones, con tamaño, forma y
color de lo más variado (5). Los hongos del género Aspergillus se dan en gran
variedad de hábitats en tierra, en productos almacenados, en productos
alimenticios y en vegetación decaída. Son abundantes en la región tropical y
subtropical ya que son hábiles para florecer en situaciones de baja humedad y
altas temperaturas.
Los hongos tienen como característica común la ausencia de clorofila, por tanto no
pueden realizar fotosíntesis y deben nutrirse de materias orgánicas ya elaboradas.
Pueden descomponer organismos muertos o sus productos y obtener el nutriente
de otros organismos vivos o huésped.
Las características fundamentales de los hongos son:
(cid:131) Todos son heterótrofos por lo que tienen que alimentarse de materia orgánica
preformada que utilizan como fuente de carbono y de energía.
(cid:131) Son eucariotas, es decir, presentan núcleo diferenciado con membrana bien
organizada.
(cid:131) Tienen una pared celular formada por quitina. Esta pared es rígida, por lo que
no pueden fagocitar alimentos sino absorben nutrientes simples y solubles que
obtienen al desintegrar polímeros mediante enzimas extracelulares llamadas
despolimerasas.
(cid:131) La estructura fúngica consta de un complejo llamado talo o micelio, que a su
vez está constituido por múltiples filamentos o hifas (hyphomycetes o mohos)
(5).
Estructuralmente el hongo Aspergillus consta de un conidióforo, una vesícula,
métulas, fiálides y conidias. Las hifas son multinucleadas, el conidióforo se31
desarrolla de una hifa vertical, a partir de una célula horizontal llamada célula pie.
Sobre la vesícula pueden desarrollarse las metulas y las fialides, formando una
segunda capa. Las fiálides pueden crecer directamente sobre la superficie de la
vesícula. Los hongos del género Aspergillus son hongos filamentosos que se ven
influenciados en su crecimiento y biosíntesis por factores extrínsecos como agua,
temperatura, pH y composición gaseosa del medio (5, 33).
Para su identificación cuando crecen en medios como agar de malta o Czapeck,
las colonias se presentan extendidas, con colores que van desde el blanco al
amarillo verdoso o al café maduro o negro, ocasionalmente dominadas por
esclerotias duras, blancas al principio, transformándose a café maduras o negras
con el tiempo y alcanzando un tamaño entre 400 – 700 micras. Las cabezas
conidiales son típicamente radiadas, separadas por varias columnas, a veces poco
definidas.
Los conidióforos son paredes gruesas, incoloras, ordinariamente rugosas con 1
mm de largo y 10 – 20 micras de diámetro por debajo de la vesícula. Las vesículas
jóvenes son alargadas, transformándose de subglobosas a globosas en el tiempo
y presentan fialides de 6,5 x 103 – 5 micras.
Los hongos deben encontrar en los medios de cultivo lo necesario para su
crecimiento y desarrollo: materias nitrogenadas como la peptona, azúcares como
glucosa o maltosa que son indispensables, un soporte sólido como la gelosa que
permite a los hongos filamentosos desarrollar el micelio aéreo con hongos de
fructificación, un pH más ácido (de 5 a 6) es más conveniente (5).
Por si mismos, los hongos sirven como alimento o se utilizan en la elaboración de
otros: pan, vino, cerveza y quesos Roquefort y Cammembert. Se usan para
producir salsa de soya, fermentar la mandioca o yuca y producir tapioca. Se
emplean en procesos industriales como la producción de ácido cítrico. También
sirven para elaborar antibióticos como la penicilina, las cefalosporinas,32
griseofulvina y ácido fusídico, así como hormonas y enzimas. Por sus usos en la
industria se ha desarrollado mucho la ingeniería genética (5).
2.4. SUERO DE LECHE
2.4.1. Definición. El lactosuero suero de leche es el líquido claro de color
amarillo verdoso, color debido al pigmento de la lactoflavina o vitamina B2, que
resulta de la coagulación de la leche durante la elaboración del queso. Tiene una
densidad un poco superior a la densidad del agua. Frecuentemente posee todos
los componentes de la leche con excepción de la caseína y un poco menos de
grasa, posee un sabor ligeramente ácido, bastante agradable. Se obtiene tras la
separación de las caseínas y de la grasa. Representa alrededor del 90% del peso
de la leche utilizada para la elaboración del queso. Contiene entre el 6% y el 6,4%
de extracto seco, es decir, la mitad de la materia seca de la leche (3).
Según el procedimiento utilizado para separar la cuajada del queso (coagulación
ácida o coagulación enzimática), se obtiene lactosuero dulce o lactosuero ácido. El
empleo de uno u otro procedimiento de separación de la cuajada del queso va a
determinar también una diferente composición del lactosuero. El lactosuero
industrial, que es otra variedad, se obtiene coagulando las proteínas por la adición
de otros ácidos como el ácido clorhídrico, sulfúrico o acético (25).
2.4.2. Composición. La composición del suero de leche varía dependiendo de
las características de la leche y de las condiciones de elaboración del queso de
que proceda, pero en términos generales se puede decir que el suero contiene
4,9% de lactosa, 0,9% de proteína cruda, 0,6% de cenizas, 0,3% de grasa, 0,2%
de ácido láctico y 93,1% de agua. Aproximadamente el 70% del nitrógeno total
(proteína cruda), corresponde a proteína verdadera, la cual tiene un valor nutritivo33
superior al de la caseína, y está compuesta por la β-lactoglobulina, la α-
lactoalbúmina, las inmunoglobulinas, la proteosa-peptona y las enzimas nativas; el
resto lo forman aminoácidos, urea, creatina, amoníaco y ácidos nucleicos (15). En
la Tabla 6 se relaciona la composición de la leche y sus productos.
El contenido de grasa depende del que tuviera la leche empleada. Si el contenido
de grasa del lactosuero es superior al 0,1% se debe desnatar. La nata obtenida se
transforma en mantequilla o se utiliza para normalizar el contenido de grasa de los
quesos. En la Tabla 7 se presenta una descripción de la composición del
lactosuero cuando es dulce y ácido.
Tabla 6. Composición promedio de la leche, subproductos y desagües, expresado
en mg/L.
Leche Leche Suero de Suero Suero
entera descremada mantequilla separado
Sólidos totales 125.000 82.300 77.500 72.000 54.772
Sólidos orgánicos 117.000 74.500 68.800 64.400 49.612
Cenizas 8.000 7.800 8.700 8.000 5.160
Sólidos solubles 54.656
Sólidos suspendidos 116
Azúcar de leche 45.000 46.000 43.000 44.000
Caseína 38.000 39.000 36.000 8.000
Nitrógeno orgánico total 1.300
Amoníaco libre 31
Sodio 648
Potasio 1.000
Calcio 350
Magnesio 78
Fósforo 450
D.B.O. 102.500 73.000 64.600 32.000 30.100
Oxígeno consumido 37.750 32.200 28.600 25.900
Grasas 36.000 1.000 5.000 4.000
Fuente: BAENA, Sandra et. al. Aguas residuales de la industria láctea: Naturaleza y composición
de las aguas residuales. Revista Ambiente y Desarrollo, 1994, p. 8834
Tabla 7. Composición del lactosuero fresco
Suero dulce Suero ácido
Agua 93 – 94 % 94 – 95 %
Extracto seco 6 – 7 % 5 – 6 %
Lactosa 4,5 – 5 % 3,8 – 4,2 %
Ácido láctico TRAZAS Hasta 0,8 %
Proteínas 0,8 – 1 % 0,8 – 1 %
Ácido cítrico 0,15 % 0,1 %
Cenizas 0,5 – 0,7 % 0,7 – 0,8 %
Valor de pH 6,45 Alrededor de 5
Fuente: SPREER, E. Lactología industrial. Editorial Acribia. 1991, p. 528
2.4.3. Tratamiento del lactosuero. Para tratar el suero de leche se recomienda
su enfriamiento a 7oC (o un poco menos) si se va a trabajar a dos horas de su
obtención o temperaturas de 4oC para conservaciones de más tiempo (mayores
de 24 horas), y se aconseja un desnatado previo cuando se tiene un contenido
graso mayor a 0,1%, evitando así su descomposición.
Según E. Spreer también se recomienda la adición de peróxido de hidrógeno
(0.2% en peso), como preservativo para tiempos mayores de 10 días. Éste actúa
como un desinfectante evitando la proliferación de microorganismos. El uso de
peróxido de hidrógeno no está permitido en la mayoría de los países, al actuar
éste como oxidante de los componentes de los alimentos. Por esto se plantea la
adición de sulfito de sodio o magnesio a un 0,5% (26).
El proceso de filtración del lactosuero no es necesario, ya que las miscelas de
caseína que permanecen en solución son muy pocas. Sin embargo debido al
contenido de grasa y a los tratamientos en la elaboración de queso y a elementos
no deseables para el tratamiento del lacto suero se hace útil hacerlo y así evitar
una posible contaminación.35
2.4.3.1. Extracción de las proteínas del suero. Durante la elaboración del
queso se hace coagular la leche mediante la adición de cuajo. Con ello la leche se
descompone en dos partes: una masa semisólida compuesta de caseína, y un
líquido que es el suero de leche. Este lactosuero contiene 0,8% de proteínas
(albúminas y globulinas), aproximadamente un 20% de la cantidad total de
proteínas de la leche.
La separación de las proteínas del lactosuero puede realizarse por diferentes
procedimientos (físicos o químicos) de separación:
a) Separación por filtración: En la filtración se establece una diferencia de presión
que hace que el fluido fluya a través de poros pequeños que impiden el paso,
de las partículas sólidas las que a su vez, se acumulan sobre un medio filtrante
como torta porosa.
b) Separación por precipitación (método térmico): Es una separación física
usando un medio térmico, precipitando las proteínas debido a su
desnaturalización.
c) Separación por centrifugación: Es la filtración que se asemeja a la filtración
ordinaria, en la que un lecho se acumula y se utiliza la fuerza centrífuga para
provocar una diferencia de presión (22).
2.4.3.2. Determinación del punto isoeléctrico. Existe un determinado valor de
pH característico para cada uno de los aminoácidos y proteínas (en consecuencia
una propiedad que lo identifica) en el que los aminoácidos y proteínas
permanecen en la forma de ion dipolar o de neutralidad eléctrica.
Las proteínas son compuestos polielectrolíticos cuyas cargas dependen del valor
del pH del medio circundante. Debido al carácter iónico de las proteínas, el ajuste36
del pH hasta el punto correspondiente a una carga neta igual a cero, denominado
punto isoeléctrico de la proteína, determina una solubilidad mínima y la posible
precipitación de la proteína, siendo este punto donde la solución alcanza la
mínima viscosidad.
Para la mayoría de los diversos tipos de lactosuero, existen diferencias marcadas
en el contenido proteico, por lo tanto en el punto isoeléctrico. Esto es debido al
origen, la forma del cuajado y las practicas tradicionales con las que se obtiene
(21).
2.4.3.3. Método térmico para la concentración de proteínas del lactosuero.
Las moléculas de las proteínas sufren fácilmente alteraciones sustanciales al
variar las condiciones físicas y/o químicas del medio que las rodea.
Cuando una proteína soluble se calienta a altas temperaturas (mayores a 60oC) en
una solución neutra o ligeramente ácida, se produce un precipitado (coagulación o
desnaturalización por calor) que no se disuelve cuando se deja enfriar. Como
consecuencia la proteína nativa pierde sus estructuras originales sufriendo una
especie de desdoblamiento o despliegue.
La mayoría de las proteínas son estables en un reducido intervalo de pH, por fuera
del cual la proteína se desnaturaliza al producirse cambios en las cargas de los
grupos R, presentándose una modificación de la estructura física o intramolecular,
más no de la estructura química. Por tal razón, el pH del medio tiene gran
importancia en los fenómenos de desnaturalización de las proteínas.
Muchos investigadores coinciden en que el proceso de calentamiento es el más
simple y el de mayor rendimiento en la precipitación de las proteínas del
lactosuero, proponiendo unos intervalos de pH y temperatura muy parecidos entre37
sí, y las diferencias entre los mismos dependen únicamente de las características
del suero (14).
2.4.4. Usos del lactosuero. El suero de leche forma parte de un gran número de
alimentos. Los reglamentos de Alimentos y Drogas permiten utilizar el lactosuero
en polvo en el pan, helado, queso fundido, charcutería y rellenos de carne, de
pescado y de pollo. También se utiliza en muchos alimentos no normalizados,
como caramelos, dulces, pasteles, etc.
Una forma de usar el lactosuero en polvo es mezclarlo con otros ingredientes para
preparar sustitutos lácteos con fines específicos. Por ejemplo se pueden añadir al
lactosuero proteínas de origen animal, vegetal o incluso lácteas, para conseguir
una mezcla con unas propiedades funcionales determinadas según la aplicación
prevista. Ejemplos de estas mezclas son:
- Lactosuero en polvo y caseinato con un contenido proteico del 20, 25 o 30%
para galletería y charcutería.
- Lactosuero en polvo, caseinato y proteínas de lactosuero, para helado
- Lactosuero en polvo y proteína de soja, para pasteles.
- Lactosuero en polvo y leche desnatada en polvo, para helado.
También se utiliza el lactosuero para producir biomasa como material proteico y en
forma líquida en la alimentación animal de porcinos, bovinos, etc., tal como se
obtiene después de su acidificación natural. Además, constituye la materia prima
para la obtención de otros subproductos importantes como la lactosa y las
proteínas del lactosuero (3).
También se produce alcohol etílico utilizando Saccharomyces fragilis o Torula
cremoris; bebidas de suero alcohólicas y no alcohólicas; mantequilla bien sea
desnatándolo mecánicamente o arrastrando las albúminas mediante un proceso38
térmico. La cantidad de mantequilla obtenida es de mediana calidad y poca
productividad. El lactosuero es también empleado en la elaboración de queso
(requesón).
2.4.5. Fermentación del lactosuero. El suero de leche es un excelente medio
de cultivo ya que se compone aproximadamente en un 70% de lactosa que es la
principal fuente de carbono, por lo que se utiliza como sustrato para la obtención
de un buen número de productos obtenidos a través de fermentación.
Al ser la lactosa un disacárido se puede limitar su uso a ciertos microorganismos,
pero existe la posibilidad de hidrolizarla en sus componentes glucosa y galactosa
para aumentar las probabilidades de implementar microorganismos capaces de
transformar estos monosacáridos en productos fermentados. Sin embargo, el
suero no contiene mucho nitrógeno inorgánico que pueda ser utilizado por los
microorganismos, por lo cual, frecuentemente es necesario añadirle sales de
amonio. Por otra parte, el contenido de proteínas es relativamente alto; debido a
ello es un excelente medio para microorganismos que requieran aminoácidos y
sean capaces de hidrolizar las proteínas.
El lactosuero puede fermentarse directamente o fraccionarse antes de la
fermentación. Los posibles sustratos fermentables son:
a) El lactosuero crudo.
b) El permeato resultante de la ultrafiltración.
c) La melaza resultante de la cristalización de la lactosa.
d) El suero residual resultante del procedimiento Centri-Whey. Este procedimiento
ofrece la posibilidad de reintegrar las proteínas desnaturalizadas por el calor al
proceso de producción de queso.39
La acidez de estos sustratos debe ajustarse antes de la fermentación al valor de
pH que sea favorable para le crecimiento de los microorganismos añadidos. Pocas
levaduras, si se exceptúa a Saccharomyces fragilis, son capaces de fermentar
directamente y de una forma rentable, desde el punto de vista económico, la
lactosa. El empleo de un cultivo mixto de levaduras y bacterias (por ejemplo, de
lactobacilos y de levaduras de pan) ha demostrado ser la mejor solución para
realizar la fermentación del suero. En una primera fase las bacterias fermentan la
lactosa a ácido láctico hasta alcanzar un valor de pH de 4,5-5,0. Por adición de
ácidos inorgánicos como el H SO se puede bajar el pH hasta 2, creando
2 4
condiciones todavía más favorables para el crecimiento de las levaduras. En una
segunda fase las levaduras consumen el ácido haciendo que el pH ascienda
paulatinamente hasta un valor de 6,5. Simultáneamente se autolisan (se
disuelven) las células bacterianas muertas y de esta forma sirven como alimento
adicional para las levaduras. Todo el proceso de fermentación dura de 10 a 60
horas (25).
2.4.5.1. Producción de alcohol. Los primeros estudios realizados en la
producción de etanol a partir de suero de leche se dieron en los años treinta
utilizando levaduras capaces de fermentar la lactosa. Las especies más
empleadas que pueden fermentar este disacárido son Kluyveromyces marxianus
(antes Kluyveromyces fragilis), Kluyveromyces lactis y Candida kefyr (antes
Candida pseudotropicalis). Generalmente se utiliza suero desproteinizado bien sea
por termocoagulación o ultrafiltración.
La limitación principal de este proceso es la baja concentración de etanol que se
obtiene por la intolerancia de algunas cepas (aunque se han encontrado cepas
capaces de fermentar la lactosa con alta tolerancia al alcohol) y la baja
concentración de lactosa que genera como máximo entre 2% y 3% de etanol al
final de la fermentación. Dentro de las plantas industriales que operan en el ámbito
mundial se encuentra la Carbery en Irlanda, que procesa 600.000 litros de suero40
sin concentrar con 4,5% de lactosa, obteniendo un caldo que en promedio
contiene 2,8% de etanol, el cual se destila para obtener 22.000 litros por día de
etanol potable. El etanol obtenido por fermentación de lactosuero se emplea en la
elaboración de bebidas alcohólicas del tipo cerveza y vinos (15).
2.4.5.2. Producción de enzimas. La enzima más importante que se ha
producido utilizando suero como sustrato es la β-galactosidasa o lactasa que
durante la década de los ochenta incrementó sus aplicaciones y volúmenes de
venta.
Los microorganismos productores de la lactasa comercial son las levaduras
Kluyveromyces marxianus, Kluyveromyces lactis y Candida kefyr, y los hongos
Aspergillus niger y A. oryzae. La lactasa es una enzima inducible, por lo tanto se
hace necesario producirla en un medio que contenga lactosa, por lo que el suero
es el mejor sustrato. La fermentación se realiza generalmente en suero
desproteinizado y suplementado con diversos nutrientes como sales inorgánicas
de nitrógeno, extracto de levadura, etc.
También se ha estudiado la posibilidad de producir enzimas pectoníticas de los
hongos Sclerotinia sclerotiorum y Aspergillus awamori utilizando suero como
sustrato, el primero se hizo crecer tanto en cultivo sumergido como en sustrato
sólido. Asimismo se ha reportado la producción de pectinasa de Kluyveromyces
marxianus a partir de suero en forma simultánea a la producción de proteína
unicelular, para lo cual se requiere adicionar pectina al medio como inductor; esta
enzima mostró ser adecuada para la clarificación de jugo de manzana.
Otras posibilidades son la obtención de proteasa alcalina de Bacillus subtilis en
medio de suero ácido, α-amilasa y proteasa de esta misma bacteria en un medio
de soya y suero, y enzimas celulolíticas del hongo Trichoderma lignorum en suero
diluido (15).41
2.4.5.3. Producción de proteína unicelular. El suero ha sido ampliamente
usado como sustrato para la producción de proteína unicelular de diversos
microorganismos entre los cuales los más utilizados han sido las levaduras,
particularmente Kluyveromyces marxianus. Los principales procesos comerciales
se muestran en la Tabla 8.
Tabla 8. Principales procesos industriales para la obtención de proteína unicelular a
partir de suero.
Proceso Microorganismo Condición/ Observación
Waldhof C. utilis Suero entero fermentación por lotes
Viena C. intermedia Suero entero
SAV C. kefir, K. Marxianus Cultivo continuo
Wheast/Knudsen K. marxianus 750 Ton/
año
Amber Lab. K. marxianus Suero concentrado y desproteinizado,
cultivo continuo 5.000 Ton/
año
Fromageries Bel. K. marxianus, K. Lactis Suero desproteinizado
C. pintolopessi Cultivo continuo
Fuente: GARCÍA-GARIBY. Biotecnología alimentaria. Editorial Limusa. 1993, p. 202
Las condiciones generalmente utilizadas para la propagación de la levadura K.
Marxianus en suero son una temperatura entre 30 y 38 ºC, sin que la variación
realmente ejerza una influencia determinante de este rango; un pH entre 4,5 y 5,7,
aunque ocasionalmente se utilizan pH más bajos. El nitrógeno es un nutriente
limitante para la propagación, ya que solamente 25% de la concentración de este
elemento es utilizado por la K. Marxianus, por lo tanto se debe agregar un
suplemento de sales inorgánicas de nitrógeno y de vitaminas (normalmente se
emplean como fuentes adicionales de éstas extracto de levadura o licor de remojo
de maíz). No se requiere la esterilización del medio si se trabaja a un pH bajo, es
suficiente con pasteurizar el suero lo cual es muy conveniente para los procesos
industriales (15).
La principal limitación para la propagación de la levadura es el suministro de
oxígeno. Por lo común se reportan condiciones de aireación del orden de 1,3 a 2,142
vvm y agitaciones de 600 a 800 rpm cuando se trabaja a pequeña escala, porque
en procesos mayores los rendimientos disminuyen como consecuencia de la
imposibilidad de suministrar el oxígeno necesario; esto ocasiona la producción de
etanol, de ahí que muchos autores (Bernstein et al.) propongan su recuperación
como subproducto (15).
2.4.5.4. Producción de levadura de panadería. Aunque la melaza es la materia
prima tradicional para obtener la levadura de panadería, es posible sustituirla por
la lactosa del lactosuero, siempre que la lactosa sea previamente transformada en
una sustancia fermentable por Saccharomyces cerevisiae ya que ésta no es capaz
de utilizar la lactosa como fuente de carbono. Por esta razón se han propuesto
tres alternativas:
1. Hidrolizar la lactosa en sus monosacáridos glucosa y galactosa
2. Realizar una primera fermentación con bacterias lácticas para transformar la
lactosa en ácido láctico, el cual puede ser metabolizado por la levadura
3. Obtener a través de técnicas de ingeniería genética cepas capaces de
metabolizar el disacárido.
La fermentación de suero de leche ultrafiltrado con Streptococcus salivarius
ss.thermophilus permite la conversión de la lactosa en ácido láctico y galactosa, ya
que esta bacteria metaboliza sólo la parte de glucosa del disacárido; ambos
metabolitos pueden ser utilizados por cepas de S. Cerevisiae con adecuadas
características panarias. Esta estrategia es mejor que la transformación de toda la
lactosa en ácido láctico con otras especies de bacterias lácticas, ya que un exceso
de ácido láctico y la ausencia de un azúcar en el medio de cultivo resultan en una
levadura con inadecuadas características fermentativas.
Alternativamente cabe la posibilidad de utilizar como levaduras de panificación a
especies capaces de metabolizar la lactosa, como K. Marxianus. Algunas cepas43
de esta especie han mostrado tener una adecuada capacidad para producir
bióxido de carbono (en particular a bajas actividades de agua), una adecuada
capacidad leudante en masa panaria y adecuadas características organolépticas
del pan resultante (15).
2.4.5.5. Producción de ácidos orgánicos. Un uso industrial importante e
implementado hace años del suero de leche es la obtención de ácido láctico a
partir de una fermentación con bacterias lácticas. Las especies más importantes
para esta fermentación son Lactobacillus delbrueckii ss.bulgaricus y Lactobacillus
delbrueckii ss.delbrueckii y recientemente se ha empezado a utilizar Lactobacillus
helveticus. Esta fermentación se realiza normalmente con suero desproteinizado y
entre un 85 y 90% de la lactosa se convierte a ácido láctico en solo 24 horas (15).
La producción de ácido acético se lleva a cabo realizando primero una
fermentación alcohólica y posteriormente una fermentación acética aeróbica; las
concentraciones obtenidas en estos casos son muy bajas. Se han hecho
publicaciones en las que la producción de ácido acético se realiza mediante
fermentación anaeróbica de suero con un cultivo mixto de Lactobacillus lactis
ss.lactis y Clostridium formicoacticum; la primera bacteria transforma la lactosa en
ácido láctico y la segunda a éste en ácido acético en condiciones anaerobias, con
este sistema se obtuvieron concentraciones hasta de 20 g/ en 20 horas (15).
L
La producción de ácido propiónico a partir de suero de leche se realiza
generalmente utilizando la especie Propionibacterium freudenreichi ss.sheimanii,
otras especies de Propionibacterium, o mezclas de ésta con Lactobacillus sp., ya
que a las primeras les resulta más fácil asimilar el ácido láctico que la lactosa. El
principal problema de esta fermentación es la baja productividad debido al lento
crecimiento de las bacterias propiónicas y a las bajas concentraciones obtenidas.
Se han obtenido resultados más prometedores con sistemas de separación de
células por filtración para su recirculación.44
También se ha propuesto la obtención de ácido glucónico con Gluconobacter
oxydan, pero debido a que este microorganismo es incapaz de metabolizar la
lactosa es necesario primero hidrolizarla mediante un tratamiento con β-
galactosidasa. La producción de ácido cítrico con Aspergillus niger a partir de
suero ultrafiltrado también ha sido probada (15).
2.4.5.6. Otros productos. Otros productos que pueden que pueden obtenerse
de la fermentación del suero incluyen: grasa con hongos de los géneros Penicillum
y Aspergillus y aceite de las levaduras Candida curvata y Trichosporon cutaneum,
siendo más efectiva la primera. Esta última posibilidad ha sido estudiada a nivel de
planta piloto con el fin de producir un sustituto de manteca de cacao.
Se ha propuesto la producción de glicerol con K. Marxianus en condiciones
anaeróbicas y en presencia de sulfito de sodio. También ha sido propuesta la
producción de otros compuestos químicos como: butanol y acetona en permeado
de suero mediante células libres o inmovilizadas de Clostridium acetobutylicum;
producción de metano mediante fermentaciones anaeróbicas con cultivos mixtos.
Se ha reportado la posibilidad de producir polisacáridos extracelulares con
microorganismos capaces de utilizar lactosa como fuente de carbono como
Alcaligenes viscosus y Zooglea ramigera, o bien utilizando suero con lactosa
hidrolizada, como es en el caso de Xanthomonas campestris.
También se pueden producir vitaminas como la riboflavina (vitamina B ) con
2
Eremothecium ashbyii y de vitamina B con Propionibacterium freudnreichi
12
ss.shermanii y otras especies de Propionibacterium (15).
2.5. MATERIAS PRIMAS45
2.5.1. Lactosa. Se encuentra en concentración de 5%, aproximadamente, en la
leche de todos los mamíferos investigados, salvo la foca de California cuya leche
parece que contiene glucosa y no lactosa. Se ha aislado también del fruto maduro
del chicozapote (Achras zapota), árbol del que se obtiene el chicle. Se prepara
comercialmente a partir del suero de la leche (23).
La lactosa además de ser el único glucósido libre que existe en cantidad
importante en la leche es también el más abundante, más simple y más constante
en proporción. En la leche de vaca el contenido de lactosa varia poco (entre 48 y
50 g/L), lo que determina una gran confiabilidad de su presencia en el suero.
Mediante experimentos de metilación y degradación se ha establecido que su
estructura es 4-O-(β-D-galactopiranosil)-D-glucopiranosa (ver Figura 2).
Figura 2. Estructura de la lactosa.
Fuente: www.infocarne.com/comunes/imágenes/Compos1.gif
La lactosa (azúcar de la leche) es un disacárido reductor de D-galactosa y D-
glucosa, unidos mediante un enlace glucosídico β 1-4. La glucosa queda con el
carbono anomérico libre, pudiendo por lo tanto presentar las configuraciones α y β,
siendo la forma α la más abundante. Es un azúcar reductor y sufre mutarrotación,
que es el cambio gradual en la rotación especifica de una solución del
monosacárido hasta alcanzar un valor final estable.
Por hidrólisis ácida o enzimas, la lactosa produce una molécula de galactosa y una
molécula de glucosa. Si primero se oxida a ácido lactónico y luego se hidroliza, los46
productos son galactosa y ácido glucónico. Por consiguiente, la unidad de glucosa
contiene la parte reductora de la molécula (23).
La degradación de la lactosa se logra cuando se alcanza los 110 – 130 ºC, donde
pierde el agua de cristalización. A los 150 ºC se torna de un color amarillento y a
los 175 ºC se oscurece y carameliza (21).
La lactosa es poco soluble en comparación al azúcar ordinario. Presenta un poder
edulcorante seis veces menor que el del azúcar (sacarosa). En la leche, éste
sabor dulce está enmascarado por la caseína. La lactosa se hidroliza por β-
galactósido y, por lo tanto, el enlace entre las porciones galactosa y glucosa se
cree ha de ser β. La hidrólisis se realiza de la siguiente forma:
C H O + H O C H O + C H O
12 22 11 2 6 12 6 6 12 6
Lactosa Agua Glucosa Galactosa
La transformación más importante de la lactosa es la de producir ácido láctico, la
cual la realizan una gran cantidad de bacterias homo y heterofermentativas. La
transformación es en realidad compleja; en general por cada 100 partes de lactosa
transformada por las bacterias, se obtienen 96 partes de ácido láctico y cuatro de
productos diversos (CO , ácidos orgánicos, etc.).
2
Para la determinación de la lactosa, se han utilizado métodos como, los
colorimétricos, la reducción del licor cupro-alcalino de Fehling, la cromatografía
gaseosa, la cromatografía liquida de alta resolución (HPLC), y la
espectrofotometría.
2.5.2. Licor de maceración de maíz. Es usado como fuente de derivados
solubles de proteínas, oligoelementos y otros minerales, así como de sustancias
activadoras del crecimiento que aceleran la fermentación. El contenido óptimo de47
licor de remojo de maíz es de 0,15% en volumen y debe contener un 40% de
sólidos suspendidos (2).
Hay más de 3.500 usos diferentes para los productos que se extraen del maíz. En
muchas ocasiones los productos finales conseguidos son más ecológicos que
otros derivados del petróleo.
Dentro de los productos que llevan derivados del maíz en sus composiciones se
tienen: jabones, geles y cosméticos con derivados de maíz en su formulación; la
mayor parte de las pastas de dientes contienen hasta un 50% de sorbitol (derivado
del maíz) líquido, con el cual se logra un control de la humedad y la absorción de
la humedad en el aire; las pinturas y barnices llevan aceite de maíz; las cabezas
de los cilindros, las bujías, los neumáticos, muchos acabados sintéticos de los
automóviles; papel, cartones, maderas, pegamentos y otros adhesivos, tintas,
tejidos y tintes con los que se tratan muchas telas; cerca de 85 tipos diferentes de
antibióticos llevan maíz en sus fórmulas; la capa fina que recubre las aspirinas y
otros analgésicos está hecha de almidón de maíz (35).
La composición química del grano de maíz es muy compleja. Reducida a un
esquema, contiene alrededor de un 10% de sustancias nitrogenadas, entre el 60 y
el 70% de almidón y azúcares, y del 4 al 8% de materias grasas. El resto, hasta
las 100 partes, es agua, celulosa, sustancias minerales, etc. En la Tabla 9 se
observa la composición del maíz en base seca.
Tabla 9. Composición del grano de maíz en base seca.
Componentes Promedio (%) Rango típico (%)
Fécula 71,3 64 – 78
Proteína 9,91 8 – 14
Grasa 4,45 3,1 – 5,7
Fibra cruda 2,66 1,8 – 3,5
Ceniza 1,42 1,1 – 3,9
Fuente: www.sagpya.mecon.gov.ar/agricu/publicaciones/aceite/composición.htm48
Entre las materias nitrogenadas, se encuentra la zeína, edestina (una globulina), la
maisina (en tres formas: a, b, g), etc. En números, de las 60 partes de fécula, el
maíz dulce sólo contiene 20, otras 20 se hallan convertidas en dextrina, y la
porción restante, en glucosa y sacarosa casi a partes iguales.
2.6. ÁCIDO CÍTRICO
El ácido cítrico es un ácido orgánico que abunda en la naturaleza muy extendido
en el reino vegetal y animal, encontrándose en considerable cantidad en los frutos
cítricos. Como ácido libre o como sal, se encuentra en las semillas y los jugos de
gran variedad de flores y plantas. Es un componente del vino (0,4 g/L), la leche (1
a 4 g/L), los productos lácteos, y los tejidos y líquidos animales.
El ácido cítrico se comercializa como ácido cítrico monohidrato o como ácido
cítrico anhidro. Se emplea en la industria farmacéutica (10% de la utilización total),
cosmética y alimenticia (60% de la producción total). Su buen sabor y la facilidad
con que es asimilado favorecen su utilización como ingrediente ácido para
mantener el pH o para obtener un pH conveniente y hacer resaltar el sabor de una
extensa variedad de productos en esas industrias. Recientemente se ha
convertido en materia prima importante para usos industriales de carácter general
como pulimiento y limpieza del hierro y acero, tratamiento y acondicionamiento de
aguas industriales, y en la preparación de resinas alquídicas, pinturas y lacas, y en
el estampado de telas.
2.6.1. Características. El ácido cítrico es el ácido 2-hidroxi-1,2,3-propanotri-
carboxílico, con fórmula molecular HOOCCH C(OH) (COOH)CH COOH, con un
2 2
peso molecular de 192.12. Tiene dos formas estables: el ácido cítrico monohidrato
con un 91,42% de ácido cítrico anhidro y 8,58% de agua, y el ácido cítrico anhidro.49
Se presenta en forma de cristales incoloros, translúcidos, o polvo fino o granular,
blanco, inodoro y con un sabor ácido agradable.
El ácido cítrico cristaliza de soluciones acuosas en forma del monohidrato. El
monohidrato del ácido cítrico es estable en el aire de humedad normal, pero en
aire seco o en vacío sobre ácido sulfúrico pierde agua. Calentando poco a poco
los cristales monohidratados se ablandan a la temperatura aproximada de 70 – 75
ºC con pérdida de agua y se funden completamente entre 135 y 152 ºC.
Calentando rápidamente los cristales, se funden a 100 ºC, se solidifican al
convertirse en anhidros y se funden a 153 ºC.
El ácido cítrico anhidro cristaliza de soluciones acuosas concentradas y calientes:
la temperatura de transición media de monohidrato a la forma anhidra es 36,3 ±
0,15 ºC. La temperatura de fusión es 153 ºC. Es ópticamente inactivo y no
manifiesta piezoelectricidad.
El ácido cítrico es bastante soluble en agua, medianamente en alcohol y poco en
éter. La forma anhidra es insoluble en cloroformo, benceno, sulfuro de carbono,
tetracloruro de carbono y tolueno.
Cuando se calienta el ácido cítrico a 175 ºC, se convierte parcialmente en ácido
aconítico por eliminación de agua, y en ácido acetondicarboxílico por pérdida de
dióxido de carbono y agua, ácido que a su vez se descompone para formar
acetona y dióxido de carbono. Por encima de 35 ºC, la oxidación con
permanganato potásico produce ácido oxálico. El ácido cítrico se descompone en
ácido oxálico y ácido acético cuando se funde con hidróxido de potasio o se oxida
con ácido nítrico.
El ácido cítrico es tribásico y manifiesta las propiedades usuales de un ácido
polibásico. Forma sales neutras, dos sales diferentes monoalcalinas y dos sales
diferentes dialcalinas. Las diferentes sales de los metales alcalinos son bastante50
solubles, pero las sales neutras de los metales alcalinotérreos son poco solubles.
Forma sales complejas solubles con muchos iones metálicos, por lo cual muchos
hidróxidos metálicos no son precipitados por los álcalis en presencia de ácido
cítrico (20, 34).
2.6.2. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos o del ácido cítrico. Antes de que
los sustratos puedan desembocar en esta ruta metabólica para llegar a la
degradación oxidativa final en la respiración, tienen que ser escindidos en
fragmentos de C en forma de acetil-CoA. Estos de unen entonces al último ácido
2
del ciclo, al oxalacético (C ) por acción de la enzima citrato-sintetasa para formar
4
el ácido cítrico (C ). Durante este ciclo, los dos átomos de C del acetil-CoA se
6
oxidan a CO , se liberan 4 ⋅ 2 átomos de hidrógeno que son transportados a la
2
cadena respiratoria pro coenzimas transportadores de hidrógeno (FAD, flavina
adenina dinucleótido, y NAD, nicotinamida-adenina dinucleótido), para ser
degradados allí a CO y H O (ver Figura 3). Durante la escisión del ácido
2 2
succínico-CoA también se genera energía bioquímica, pero en este caso en forma
de guanosina trifosfato (GTP), rica en energía (18).
2.6.3. Obtención de ácido cítrico. El ácido cítrico es fundamentalmente
producido por 2 especies de aspergillus llamadas Aspergillus niger y Aspergillus
wentii, aunque también se han utilizado levaduras, como Saccharomycopsis
lipolytica, para la producción de ácido cítrico sobre sustratos no azucarados. otras
especies empleadas son A. clavatus, Penicillium citrinum, Paecelomyces
divaricatum, Candida guillermondii, Trichodrema viridae, Arthrobacter paraffineus y
Corynebacterium sp.
Los métodos normales de producción de ácido cítrico emplean bien fermentación
en superficie o tecnología de fermentación sumergida, siendo las fuentes de
carbono preferidas las melazas de remolacha o de caña y los jarabes de glucosa.51
Cuando se utilizan melazas los niveles de contaminación por metales pesados en
el medio tienen que ser controlados estrictamente, bien sea por resinas de
intercambio iónico o eliminándolos mediante un agente quelante como el
ferrocianuro (27).
La materia prima empleada como fuente de carbono es un carbohidrato,
principalmente el azúcar impuro en forma de melazas, utilizándose también la
remolacha, la harina de trigo, el agar, la malta de cebada, la xilosa (azúcar de
madera), etc. Además del carbono, el oxígeno y el hidrógeno suministrados por el
carbohidrato, el organismo necesita como elementos nutritivos nitrógeno, potasio,
fósforo, magnesio y azufre. Otros factores importantes para la conversión de
soluciones azucaradas en ácido cítrico por los hongos son la concentración de la
solución, las técnicas de cultivo e inoculación, la temperatura, el pH y la aireación.
En gran parte la influencia de cada factor está determinada por la cepa de hongo
empleada (20).
2.6.3.1. Medio de fermentación. Los medios utilizados para la producción de
ácido cítrico han sido muy perfeccionados a lo largo de los muchos años que se
lleva a cabo el proceso comercial. Los constituyentes del medio que tienen efecto
sobre la fermentación cítrica se listan en la Tabla 10.
Tabla 10. Condiciones que favorecen la producción de ácido cítrico
Alta concentración de azúcar
Bajas concentraciones de fosfatos
Bajo pH, por debajo de 2,0
Alta tensión de oxígeno
Ausencia de metales taza: Mn+2, Fe+2, Zn+2
Fuente: DELLWEG, H. Biotechnology: A comprehensive treatise in 8 volumes. By H-J Rehm and G.
Reed, p. 42452
Figura 3. El ciclo de los ácidos tricarboxílicos y sus productos sintetizados en
exceso en hongos.
Fuente: JAGNOW, Gerhard. Biotecnología: Introducción con experimentos modelo. Editorial
Acribia. 1991, p. 90
2.6.3.1.1. Azúcar. Como fuente de carbohidrato puede ser utilizada una serie de
materias primas: almidón de papa, hidrolizados de almidón, jarabe de glucosa de
almidón sacarificado, sacarosa de diferentes niveles de pureza, jarabe de caña
con dos tercios de sacarosa convertida en azúcar invertido, melazas de caña de
azúcar, melazas de azúcar de remolacha. Si se utiliza almidón, éste es hidrolizado
a azúcares por las amilasas formadas por el hongo productor o añadidas al caldo
de fermentación. Si se utilizan hidrolizados o jarabes debe ser llevado a cabo un
tratamiento preliminar con precipitantes o cambiadores de iones para separar los53
cationes (10). Para obtener una producción máxima de ácido cítrico, la
concentración de azúcar debe ser de 14 a 22% (w/v) (12).
2.6.3.1.2. Nitrógeno. Convencionalmente, el nitrógeno es suplido en las formas
de nitrato o sulfato de amonio. Los compuestos de amonio son preferidos porque
durante su uso el pH decrese, lo que es un prerrequisito para la fermentación
cítrica. Esto excluye el uso de nitratos de sodio o potasio o a la úrea como fuentes
de nitrógeno. En general la concentración del ion amonio durante la fermentación
del ácido cítrico no debe estar limitada, variando en un amplio rango (0,3 a 1,5 g
NH4+/L) (12, 16).
2.6.3.1.3. pH. Mantener el valor de pH bajo es extremadamente importante para
un progreso exitoso en la fermentación. Durante la idiofase los valores de pH
menores a 3 dan una mayor producción de ácido cítrico al suprimir la formación de
ácidos glucónico y oxálico, ya que éstos se pueden producir a valores de pH altos,
pero durante la trofofase el pH inicial es generalmente 5,0. Durante las primeras
48 horas de la trofofase el pH desciende por debajo de 3 como resultado del
metabolismo de los iones amonio. Para controlar mejor el rendimiento en cultivos
sumergidos, la trofofase y la idiofase pueden ser separadas reduciendo el pH por
debajo de 2, una vez se ha finalizado el crecimiento (8, 10). El pH óptimo de
producción está entre 1,7 y 2,0 (12).
2.6.3.1.4. Elementos traza. El cobre, manganeso, magnesio, hierro, zinc y
molibdeno son necesarios para el crecimiento óptimo en un rango de ppm, sin
embargo, un exceso de las concentraciones óptimas puede tener un efecto tóxico.
Mientras que para un crecimiento óptimo se requiere una concentración alta de
hierro, sólo 0,05 – 0,5 ppm de hierro son necesarias para la producción máxima de
ácido cítrico. La sensibilidad de las cepas a metales pesados como zinc, hierro,54
manganeso y cobre desciende al descender la temperatura. Además, el cobre
revierte el efecto inhibitorio del hierro (10, 16, 30).
2.6.3.1.5. Aireación. En procesos de fermentación sumergida, la aireación es
extremadamente crítica: la producción de ácido cítrico es estimulada por el
incremento del aire. Si el suministro de aire es parado por unos pocos minutos, la
producción de ácido cítrico se detiene irreversiblemente, así se reanude la
aireación. El efecto de parar la aireación depende en parte de la fase en la cual
haya ocurrido la interrupción y el tiempo que ésta haya durado. Así, durante la
fase de producción una interrupción en el flujo de oxígeno por cerca de 2 minutos
decrese al rendimiento del ácido cítrico apreciablemente. Simultáneamente no se
inhibe la producción de biomasa pero se desestimula ligeramente.
2.6.3.2. Procesos de producción. El ácido cítrico se produce tanto en procesos
en superficie como en procesos sumergidos. Los procesos en superficie pueden
ser subdivididos de acuerdo con el estado del medio de cultivo que se utilice:
sólido o líquido. Se utilizan dos tipos de procesos sumergidos: fermentadores
agitados o fermentadores de elevación por aire.
La fermentación continua para la producción de ácido cítrico no ha sido todavía
llevada a cabo. La complejidad de la formación de las bolas de micelio y el control
de los requerimientos de la idiofase pueden ser satisfechos solamente mediante
un sistema en etapas múltiples con fermentadores conectados en serie, sin
embargo, por razones económicas tales sistemas no tendrían sentido, incluso si
pudieran resolverse los problemas microbiológicos y de esterilidad (10).
2.6.3.2.1. Producción del inóculo. El material utilizado como inóculo para la
producción de ácido cítrico es una suspensión de esporas. Las esporas se logran55
después de 10 – 14 días de incubación de las cepas en medio sólido. Cuando se
va a inocular un fermentador sumergido, se induce la germinación de las esporas
en una fermentación previa. En este fermentador de siembra se utiliza una
solución de nutrientes que contenga 15% de azúcar y para producir la formación
de micelio en forma de bolas se añaden iones de cianuro. Si se añade demasiado
poco cianuro el crecimiento continúa bien, pero el rendimiento de ácido cítrico en
la producción posterior a escala de fermentador es baja. Las esporas germinan a
32 ºC y forman bolas de 0,2 – 0,5 mm de diámetro en 24 horas. Durante este
periodo el pH cae a 4,3. Estas bolas se utilizan como inóculo para fermentadores
de producción. La velocidad de conversión y la eficiencia en el fermentador de
producción son extremadamente dependientes de la forma en la que se produzcan
las esporas y las bolas de micelio (10).
2.6.3.2.2. Procesos en superficie. Los procesos en superficie que emplean
sustratos sólidos pueden utilizar miga de pan o pulpa de almidón de papa dulce
como medio de cultivo. En este proceso las cepas de A. niger no son tan sensibles
a los elementos traza como en otros procesos. El pH se reduce hasta 4 – 5 antes
de la esterilización, después de la esterilización el material se inocula con esporas,
se extiende sobre bandejas en capas de 3 – 5 cm de grosor y se incuba a 28 ºC.
El proceso en superficie sólida dura 90 horas, al final de las cuales la solución
entera se extrae con agua caliente para aislar el ácido cítrico. Los procesos en
superficie que utilizan medio líquido son los métodos más antiguos y se emplean
por su baja inversión, bajo coste de energía y tecnología sencilla. El proceso de
fermentación se detiene después de 8 – 14 días. Si hay demasiado hierro se
produce ácido oxálico y se forma un pigmento amarillo que más tarde entorpece el
proceso de recuperación del ácido cítrico.
El rendimiento del proceso en superficie utilizando solución nutritiva líquida
asciende a 1,2 – 1,5 kg de ácido cítrico monohidrato/ m2 de superficie de
fermentación por hora. Durante la recuperación se separan el micelio y la solución56
de nutrientes de la cámara. Debido a su volumen, el micelio debe ser lavado
cuidadosamente en secciones. En algunos casos se utilizan prensas mecánicas
para obtener más ácido cítrico de las células.
En la Tabla 11 se muestra la composición de una solución típica de nutrientes, en
procesos en superficie la sacarosa se suministra como melazas de remolacha más
que como melazas de caña de azúcar (10).
Tabla 11. Composición de la solución nutritiva para un cultivo en superficie.
Sustrato g/L Sustrato
Sacarosa 160 – 200 ca. 320 – 400 g melazas
Nitrato de amonio 1,6 – 3,2. No se necesita con melazas
KH PO 0,3 – 1,0
2 4
MgSO . 7H O 0,2 – 0,5. No se necesita con melazas
4 2
ZnSO 0,01 – 0,10
4
Ferrocianuro de potasio 0,4 – 2,0
Fuente: CRUEGER, Wulf. Biotecnología: Manual de microbiología industrial. Editorial Acribia. 1993,
p. 42.
Cuando se ha transformado un 90% de la sacarosa del medio nutritivo, disminuye
la velocidad de incremento de la acidez total. También disminuye cuando la
concentración de ácido cítrico es mayor, aproximadamente del 7%. En una
fermentación normal la acidez aumenta hasta el noveno o décimo día y entonces
habrá del 7 al 8% de ácido cítrico y menos del 1% de ácido oxálico. Una
concentración de ácido cítrico al 8% es equivalente a una solución 1,2 N. El ácido
cítrico se degrada a menos que sea recuperado con suficiente rapidez tras su
producción (24).
2.6.3.2.3. Procesos sumergidos. Este proceso aunque lleva más tiempo (8
días) tiene varias ventajas: menor inversión en la construcción, 25% menos
inversión total y costes más bajos de mano de obra. Las desventajas son los57
costes más altos de energía y la tecnología de control más sofisticada que
requiere personal más entrenado. Tres factores son especialmente importantes en
procesos sumergidos:
a) La calidad del material utilizado para construir el fermentador: Los
fermentadores deben ser protegidos de los ácidos o construidos en acero
inoxidable. A valores de pH entre 1 – 2 los metales pesados se liberan de las
paredes de los fermentadores normales de acero y pueden inhibir la formación
de ácido cítrico. Con fermentadores de hasta 1.000 L, las cámaras de acero
inoxidable deben llevar un recubrimiento de plástico debido a la gran relación
de superficie a volumen. En fermentadores grandes no es necesario el
recubrimiento si se utiliza acero inoxidable (10).
b) La estructura del micelio: La estructura del micelio que se forma en el cultivo
sumergido durante la trofofase es vital para un proceso de producción con
éxito. Si el micelio es laxo y filamentoso, con ramificaciones limitadas y sin
clamidosporas, se produce poco ácido cítrico en la idiofase. Para conseguir
una velocidad óptima de producción, el micelio debe estar formado por bolas
sólidas muy pequeñas. La relación de hierro a cobre en el medio determina la
estructura del medio (10).
c) El suministro de oxígeno: Aunque el A. niger requiere relativamente poco
oxígeno, es sensible a la deficiencia de éste. A través del periodo entero de
fermentación existe una concentración mínima de oxígeno de 20 – 25% del
valor de saturación. Interrupciones cortas del suministro de oxígeno originan la
detención irreversible de la producción. Las velocidades de aireación en
fermentadores profundos deberían ser de 0,2 – 1,0 volumen/volumen/minuto
(vvm) durante la fase de producción de ácido. Debido a la baja viscosidad no
se requiere agitación, aunque algunas plantas utilizan fermentadores agitados,
también pueden ser utilizados los fermentadores elevados mediante aire.58
La formación de espuma es un problema en los fermentadores sumergidos.
Se necesita una cámara de espuma de 1/3 del tamaño del volumen del
fermentador tanto en los fermentadores elevados por aire como en los
biorreactores agitados. A intervalos frecuentes pueden ser añadidos agentes
antiespumantes, como aceite de tocino y también pueden ser utilizados
dispositivos antiespumantes (10).
2.6.3.2.4. Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger. Las cepas de
Aspergillus niger utilizadas por los fabricantes constituyen un secreto muy
conservado, así como lo son las variaciones menores y las mejoras en la
tecnología del proceso. Esto se debe a que la producción de ácido cítrico es
relativamente sencilla, de forma que solamente se obtiene ventajas competitivas
explotando astucias relacionadas con el tipo de cepa o mejoras en la eficiencia de
los métodos de producción.
La producción bioquímica de citrato por A. niger se caracteriza por:
(cid:131) Una actividad elevada de los enzimas glicolíticos y de la piruvato carboxilasa
inducida por los carbohidratos que conducen a la síntesis de citrato. Esto
debido a la alta concentración azúcar.
(cid:131) La inhibición de un enzima del ciclo del ácido tricarboxílico que podría causar la
descomposición del citrato.
(cid:131) La producción mediada por una deficiencia de manganeso de una
concentración elevada de NH + intracelular que contrarresta la inhibición de la
4
fosfofructoquinasa por el citrato.
(cid:131) Una tensión de oxígeno elevada y suministro continuo de oxígeno para
mantener activa la respiración sensible al SHAM para la reoxidación del NADH.
(cid:131) Un pH bajo para inactivar la glucosa oxidasa.59
Aunque hay muchos hongos o levaduras tipo Candida que sintetizan ácido cítrico
a partir de azúcares o de n-alcanos, se ha impuesto de forma generalizada la
producción con Aspergillus niger, que a pH 2 y en los caldos de cultivo adecuados
a base de glucosa o sacarosa sintetizan un 70 – 95% en peso de ácido cítrico
monohidrato, lo que supone en términos generales un 57 – 77% del rendimiento
teórico. Las soluciones nutritivas contienen 16 – 20% de sacarosa procedente en
su mayor parte de melaza diluida de remolacha azucarera, 2,3 g de NH NO , 0,3 –
4 3
1,0 g de KH PO , 0,2 – 0,5 g de MgSO .7H O, 0,01 – 0,1 g de ZnSO además de
2 4 4 2 4
0,4 – 2,0 de K [Fe(CN) ] (18).
4 6
La producción de ácido cítrico por Aspergillus niger es fuertemente sensible a la
presencia de iones manganeso en el medio, la velocidad de producción se reduce
dramáticamente si hay manganeso presente a una concentración incluso tan baja
como 3µg/mL. Por consiguiente es necesario pretratar el medio conteniendo
melazas con agentes como hexaferrocianuro o con cobre para inhibir la toma de
manganeso, contrarrestando de esta manera sus efectos inhibitorios (27). Cuando
la concentración de manganeso aumenta, la morfología fúngica se vuelve
filamentosa, incrementando drásticamente la viscosidad del cultivo y disminuyendo
rápidamente la tensión del oxígeno disuelto (28).
La temperatura juega también un papel muy importante en la producción de ácido
cítrico. El rango de temperaturas empleado es de 25 a 30 ºC, ya que a 35 ºC se
inhibe la producción de ácido cítrico por la formación de subproductos ácidos, se
inhibe el crecimiento y desarrollo del cultivo (31). Cuando se utilizan melazas
como sustrato, su pH se ajusta primero a 5 ó 7. El pH inicial debe ser superior a 2
para que los conidios puedan germinar. El pH del medio debe ser mantenido por
encima de 3,5 durante la fase de crecimiento para evitar la formación de ácidos
oxálico y glucónico (27).60
2.6.3.2.5. Producción de ácido cítrico por Candida lipolytica utilizando
hidrolizado de semillas de dátiles y suero de leche. Para la formación de ácido
cítrico por Candida lipolytica se utilizaron como ingredientes del medio natural
nitrógeno orgánico, carbohidratos, lípidos y minerales, que se obtuvieron del
hidrolizado de semillas de dátiles y suero de leche, empleándose como biomasa la
levadura que se encuentra estrechamente asociada con formación de ácido
cítrico. El rendimiento de ácido cítrico se incrementó con el aumento del período
de fermentación, alcanzando su valor máximo a las 96 horas.
Se empleó glucosa a una concentración óptima de 25 mg/mL como la mejor
fuente de carbono, lo que impulsó la producción de ácido cítrico a altas
concentraciones. Como fuentes de nitrógeno inorgánico se utilizó (NH ) SO ,
4 2 4
NH CL y NH NO , donde el microorganismo asimiló el nitrógeno en la forma
4 4 3
amoniacal y no nitrada.
La adición de diferentes concentraciones de hidrolizado de semillas de dátiles al
medio incrementó la producción de ácido cítrico, lo cual se vio reflejado por la
presencia de ciertos elementos como magnesio, hierro, calcio, manganeso, zinc y
níquel.
El medio líquido para inocular la levadura contenía 20 g de glucosa, 5 g de
extracto de levadura, 2 g de NH CL, 0,5 g de MgSO . 7H O, 1 g de KH PO , 0,05
4 4 2 2 4
g de MnSO . 4H O, 0,005 g de FeSO . 7H O y 1 L de agua destilada. El medio fue
4 2 4 2
esterilizado con un pH inicial de 5,5, y dispuesto con la levadura en erlenmeyers
de 250 mL en condiciones asépticas que fueron puestos en un agitador rotatorio a
30 ºC por 72 horas.
El medio de fermentación contenía 30 g de hidrolizado de dátiles, 15 g de suero de
leche, 1 g de KH PO , 0,25 g de MgSO . 7H O, 0,05 g de MnSO . 4H O, 0,005 g
2 4 4 2 4 2
de FeSO . 7H O y 1 L de agua destilada. El medio fue esterilizado con un pH
4 2
inicial de 5,5, y dispuesto con el inóculo en erlenmeyers de 250 mL en condiciones61
asépticas que fueron puestos en un agitador rotatorio a 30 ºC por 120 horas. El
porcentaje de inóculo fue de 5%, lográndose hasta 50 mg/mL de ácido cítrico al
final de la fermentación (1).
2.6.3.2.6. Producción de ácido cítrico por Aspergillus niger con suero de
leche permeado. Para esta investigación se uso la caseína láctica del suero
permeado como un sustrato para la producción de ácido cítrico fermentándolo con
un mutante del Aspergillus niger IMI 41874, observándose una concentración de
ácido cítrico de 8,3 g/L que representa un rendimiento de 19% (p/p) basado en
lactosa utilizada. Complementado el suero permeado con lactosa (concentración
final 140 g/L) aumentó la producción a 14,8 g/L (rendimiento de 23%). El pH
natural del permeado (pH 4.5) fue el pH inicial más conveniente para el proceso,
no siendo necesario controlar el pH durante la fermentación. La adición de
metanol (concentración final 3% v/v) a la fermentación aumentó la producción de
ácido cítrico 25 g/L (rendimiento del 33% basado en lactosa utilizada).
El medio líquido se inoculó con una suspensión de esporas en agua destilada
(aprox. 1 X 108 esporas), y se dispuso en erlenmeyers de 250 mL que fueron
esterilizados y puestos en un agitador rotatorio a 180 rpm y 30 ºC. La fermentación
se realizó en un microfermentador de 6 litros donde el volumen de trabajo fue de 5
litros de suero permeado que fueron inoculados al 10 % v/v con el medio líquido.
Durante la fermentación se midió el pH, controlándolo cuando fuera necesario con
NaOH 1M. La velocidad de agitación durante las primeras 48 horas de
fermentación fue de 200 rpm para luego ser incrementada a 300 rpm, con una
velocidad de aireación para las primeras 48 horas fue de 3 L/min y luego
aumentada a 5 L/min (17).
2.7. CINÉTICA DE LA FERMENTACIÓN62
Durante la fermentación, el sustrato se consume, los microorganismos crecen y se
multiplican y se forma el producto. La biocinética de las fermentaciones estudia los
procesos de consumo de sustrato, de formación de biomasa y de biosíntesis de
productos.
Las fermentaciones se pueden clasificar en dependencia de los perfiles de
formación de biomasa y de producto. Para los tipos II y III de fermentaciones se
distinguen la tropofase y la idiofase. La tropofase es el periodo inicial de la
fermentación, durante la cual la biomasa crece con gran velocidad y el producto no
se forma o se forma en bajas concentraciones. La idiofase es el periodo de la
fermentación en el cual la velocidad de formación del producto es alta. En la Tabla
12 se puede observar la forma en que se clasifican las fermentaciones (2).
Tabla 12. Clasificación de la fermentación según Gaden.
Tipo Relación específica de velocidad Ejemplo
I Formación de producto relacionada directamente Etanol
con la utilización del carbohidrato
II Formación de producto indirectamente relacionada Ácido cítrico
con el uso del carbohidrato
III Formación de producto aparentemente no Penicilina
relacionada con el uso del carbohidrato
Fuente: KAFAROV, V. Modelirovaniye Biojimicheskij Reaktorov. 1979, p. 342
Los procesos de fermentación que transcurren dentro de los biorreactores son
bastante complejos, ya que involucran procesos biocinéticos de transferencia de
masa y calor, y en el caso de biorreactores de gran tamaño fenómenos
hidrodinámicos. Para analizar el régimen de trabajo de los biorreactores y su
diseño s necesario utilizar modelos matemáticos. Una de las etapas principales del
modelamiento matemático de un reactor biológico es la etapa de elaboración del
modelo biocinético.63
El modelo biocinético consiste en un conjunto de expresiones matemáticas que
describen la velocidad de crecimiento del cultivo de microorganismos y la
influencia sobre ellos de las condiciones del medio en que éstos se desarrollan.
Durante el proceso de cultivo microbiano cambia la composición cualitativa del
mismo lo que influye a su vez sobre la velocidad de acumulación de biomasa y de
productos del metabolismo (19).
2.7.1. Modelos de formación de biomasa. En un cultivo por lotes se observan
diferentes fases de crecimiento celular. Durante la fase de latencia que se verifica
inmediatamente después de la inoculación, la tasa de crecimiento es
esencialmente nula. Las células aprovechan la fase latente para adaptarse a las
nuevas condiciones ambientales: sintetizar nuevas enzimas o nuevos
componentes estructurales. Le sigue a esta fase, la fase de crecimiento
exponencial. Debido al consumo de nutrientes o a la acumulación de productos
inhibidores, el crecimiento decae y las células entran en la fase estacionaria en la
que no ocurre ningún crecimiento. En la Figura 4 se muestra una curva para un
cultivo por lotes.
Figura 4. Curva típica de un cultivo por lotes.
Fuente: AGUDELO MOTATO, María Alejandra. Obtención de ácido itacónico por fermentación con
Aspergillus terreus. Manizales. 1999, p. 70.64
Durante la fase de crecimiento la velocidad o tasa de crecimiento celular se
describe por el modelo de Malthus:
r =µ⋅X Ec.1
x
donde
r : Tasa o velocidad volumétrica de formación de biomasa, g/(L.h) ó kg/(m3.h)
x
µ: Velocidad específica de crecimiento, h-1
X: Concentración de biomasa, g/L ó kg/m3
En un proceso por lotes, que se considera un sistema cerrado y donde el
crecimiento es el único factor del proceso que afecta la concentración,
reemplazando en la ecuación anterior r =dX dt, derivando la ecuación resultante
x
e integrando se llega a la ecuación 2 que representa el crecimiento exponencial de
la biomasa.
X = X eµ⋅t Ec. 2
0
Durante la fase exponencial de crecimiento celular en un cultivo por lote, la
velocidad específica de crecimiento depende de la concentración de los nutrientes
en el medio. Frecuentemente, un único sustrato ejerce una influencia dominante
sobre la tasa de crecimiento y es denominado sustrato limitante. Para modelar la
dependencia de la velocidad de crecimiento en función de la concentración de
sustrato limitante se utiliza el modelo de Monod:
µ ⋅S
µ= máx Ec. 3
K +S
S
donde:
S: Concentración del sustrato limitante.
µ : Velocidad específica de crecimiento celular máxima, h-1.
máx65
K : Constante de saturación que tiene las mismas unidades de S.
S
Los valores típicos de K son muy pequeños, del orden de mg/L para sustratos
S
con base en carbohidratos y de µg/L para otros compuestos como aminoácidos.
Normalmente el nivel de sustrato limitante en los medios de cultivo es mucho más
grande que K .
S
La ecuación de Monod es la más utilizada para expresar la relación entre
velocidad de crecimiento y la concentración de sustrato, sólo que no es aplicable a
condiciones ambientales que cambien rápidamente, a niveles de sustrato
extremadamente bajos, y cuando se presenta inhibición de por sustrato o producto
se deben agregar términos adicionales para que el modelo tenga en cuenta estos
aspectos (2).
La ecuación 1 proporciona un modelo simple que se utiliza para describir la
velocidad de crecimiento de los microorganismos en función de su concentración
en el medio. Sin embargo, la velocidad de crecimiento específica no es constante
y sobre ella influye la concentración del sustrato limitante. Al realizarse un análisis
más estricto, es necesario considerar la influencia de las condiciones ambientales
de la fermentación sobre el cultivo microbiano y la interacción de las células, que
en últimas, conduce a un déficit de sustrato para las células aisladas. La ecuación
que tiene en cuenta esta situación se relaciona a continuación (19):
dX
=εX −βX2 Ec. 4
dt
Donde ε caracteriza la velocidad máxima de crecimiento de las células en el
cultivo en ausencia de sus interacciones, es decir, limitación por sustrato o
inhibición por productos del metabolismo. El coeficiente β cuantifica el grado de
interacción de las células debido al déficit de sustrato y a la inhibición por66
productos metabólicos y caracteriza el efecto de desaceleración de la tasa de
crecimiento celular.
2.7.2. Modelos de formación de producto. Se han propuesto muchos modelos
para la producción de diferentes metabolitos, tres de ellos han servido para
explicar el comportamiento de sistemas simples:
1. Modelo asociado con el crecimiento: Cuando el sustrato (S) se convierte
estequiométricamente en un producto (P), la tasa de formación está
relacionada con la velocidad de crecimiento por la siguiente expresión:
dP dX
=α Ec. 5
dt dt
Donde α es la constante estequiométrica.
2. Modelo no asociado con el crecimiento: En la ecuación 6 se muestra una
contante β muy similar a la actividad enzimática (la célula tiene un sistema
enzimático constitutivo que controla la tasa de formación del producto) y
representa la unidad de actividad formadora del producto por masa de célula:
dP dX
=β Ec. 6
dt dt
Donde β es la constante de proporcionalidad.
3. Modelo combinado: Este modelo propone expresar la producción como la
suma de ambas ecuaciones:67
dP dX
=α +β⋅X Ec. 7
dt dt
ó
1 dP
v = =α⋅µ+β Ec. 8
X dt
Donde v es la tasa específica de formación de producto (2).
Se considera que los modelos más útiles serán aquellos que envuelvan factores
ambientales como temperatura, pH, oxígeno disuelto, tasa de alimentación del
sustrato, etc., pues además de representar mejor el sistema pueden usarse para
controlar la fermentación por computador. Pirt, empleando un método diferente,
considera que el producto formado durante el crecimiento en un cultivo batch con
un tiempo infinitamente pequeño, dt, esta dado por:
dP
=q X Ec. 9
dt P
Donde q es igual a la tasa específica de formación del producto (2).
P
2.7.3. Modelos para el consumo de sustrato. Se considera que el sustrato
limitante del crecimiento es consumido por los microorganismos para su
crecimiento, para sintetizar los productos que su metabolismo requiera y para
mantener su metabolismo endógeno, es decir, todas las funciones vivas que no
están relacionadas con el crecimiento o reproducción. Esta situación se refleja en
la ecuación 10:68
dS −1 dX 1 dP
= − −k ⋅X Ec. 10
dt Y dt Y dt e
X S PS
donde:
Y : Número de moles (o gramos) de biomasa formada por mol (o gramo) de
X/S
sustrato consumido.
Y : Número de moles (o gramos) de producto sintetizado a partir de una mol (o
P/S
gramo) de sustrato consumido.
K : Coeficiente de metabolismo endógeno.
e
Cada uno de los términos del miembro derecho de la ecuación anterior va a tener
mayor o menor influencia sobre la velocidad de consumo del sustrato, por lo tanto
se pueden sugerir diferentes modelos de consumo de sustrato (2):
dS −1 dX
= Ec. 11
dt Y dt
X S
dS −1 dX
= Ec. 12
dt Y dt
PS
dS
=−k ⋅ X Ec. 13
dt e69
3. METODOLOGÍA
3.1. PREPARACIÓN DE LAS CEPAS
Para la realización de esta parte de la investigación se emplearon como
microorganismos productores de ácido cítrico las cepas fúngicas de Aspergillus
niger NRRL 3, Aspergillus carbonarius NRRL 368, Aspergillus carbonarius NRRL
67, las cuales fueron proporcionadas por el National Center for Agricultural
Utilization Research de Estados Unidos, y una cepa de Aspergillus niger
proveniente de la Universidad de los Andes de Santafé de Bogotá. Estas tres
primeras cepas se encontraban en estado liofilizado, por lo que se hizo necesario
reconstituirlas para sacarlas de su estado latente. La última cepa se encontraba
conservada en nevera en el Laboratorio de Microbiología General de la
Universidad de Caldas en tubos de ensayo con aceite mineral con fecha del 16 de
junio de 1999, razón por la cual esta cepa no fue reconstituida.
La ejecución global de todos los procedimientos para el cultivo de las cepas
incluye cuatro fases, las cuales se llevan a cabo en forma secuencial:
1. Esterilización: Si las normas de preparación no indican otra cosa, la
esterilización se realiza en autoclave a 15 libras de presión y 121 ºC, durante
15 minutos. Esta esterilización es preferible realizarla en los recipientes donde
se va a trabajar, excepto las cajas de petri.70
2. Inoculación: Consiste en la siembra del material vivo en el medio de cultivo
donde se va a desarrollar bajo condiciones de asepsia para evitar su
contaminación. Entre las precauciones más importantes que se toman están:
(cid:15) Desinfectar previamente el mesón de trabajo con medios desinfectantes
(desinfectante comercial y solución de hipoclorito de sodio).
(cid:15) Rodear el sitio con mecheros de gas, preferiblemente encendidos con
anterioridad.
(cid:15) La inoculación se lleva a cabo con aguja curva esterilizada a la flama.
(cid:15) Uso de tapabocas y guantes previamente desinfectados.
El material a inocular lo constituye el tejido micelial o las esporas
resultantes del raspado superficial de las colonias de la cepa fúngica en
cultivo sólido.
3. Incubación: Posterior a la inoculación, el sistema se somete a incubación a la
temperatura de crecimiento del hongo en períodos de tiempo que dependen
del rendimiento en crecimiento micelial y en formación de esporas.
4. Preservación del sistema: Las condiciones de conservación se garantizan
con la exposición del sistema a enfriamiento a 4 ºC inhibiendo de esta manera
el crecimiento micelial y la actividad enzimática del microorganismo.
3.1.1. Reconstitución de la cepa. La reconstitución de las cepas se requiere
para llevar el hongo de su estado latente a un estado en el cual pueda desarrollar
su potencial de reproducción bajo diferentes condiciones.
Para la activación inicial de las 3 cepas que se encontraban en estado liofilizado
se hizo necesario llevarlas a un caldo de cultivo Czapeck (12) cuya composición71
se muestra en la Tabla 13, y mantenerlas por unas horas antes de ser sembradas
en las cajas de petri, con el fin de potenciar su actividad enzimática.
Tabla 13. Composición del caldo de cultivo Czapeck.
Componente Concentración (g/L)
Sacarosa 30
Nitrato de sodio 3
Fosfato dipotásico 1
Sulfato de magnesio 0,5
Cloruro de potasio 0,5
Sulfato ferroso 0,001
Fuente: Manual DIFCO. 1998
Para la activación inicial se empleó una cámara de flujo laminar, que previamente
fue desinfectada y mantenida bajo la acción de la luz ultravioleta. Dentro de la
cámara se rompió la cápsula de vidrio en la que venía el liofilizado de cada una de
las cepas. Paso a seguir se dispuso la cepa dentro de un tubo de ensayo tapa
rosca que contenía el caldo de cultivo Czapeck previamente esterilizado, a una
temperatura ambiente.
3.1.2. Mantenimiento de la cepa. El objetivo de esta etapa es el de disponer de
material de siembra fresco y listo para la etapa de fermentación. El desarrollo de
esta etapa permite que el hongo pueda encontrar el medio sólido capaz de
proporcionarle las condiciones necesarias para reproducirse de manera suficiente,
lo cual se traduce en la disponibilidad permanente de esporas requeridas en la
etapa de fermentación cítrica.
Para poder desarrollar esta parte del trabajo, se sembraron las cuatro cepas en
diferentes medios de cultivo con el fin de determinar cuál era el que otorgaba
mejores condiciones de crecimiento y producción de conidias. Para esto sólo se
emplearon las cepas de Aspergillus niger NRRL 3, Aspergillus carbonarius NRRL72
368 y la cepa de Aspergillus niger proveniente de la Universidad de los Andes.
Debido a que el Aspergillus carbonarius NRRL 67 es una variación del Aspergillus
carbonarius NRRL 368, se utilizó la misma información encontrada para su
homólogo. La cepa de Aspergillus niger NRRL 3 empleada para este estudio se
encontraba bajo refrigeración en el Laboratorio de Microbiología General de la
Universidad de Caldas en tubos de ensayo con aceite mineral con fecha del 25 de
agosto de 2000.
Los medios de cultivo recomendados por la bibliografía para la incubación y
crecimiento de las cepas se nombran a continuación relacionándose su
composición en el Anexo A:
(cid:131) Aspergillus niger: Medio Agar Czapeck y Medio Agar Sabouraud.
(cid:131) Aspergillus carbonarius: Medio Agar Czapeck, Medio Agar Sabouraud, Medio
Agar PDA, Medio Agar Extracto Malta (MEA), Medio Agar Czapeck Yeast
Autolysate (CYA), Medio Agar Czapeck Dox, Medio Agar Czapeck Malta,
Medio Agar Czapeck Malta Modificado.
Para el Aspergillus carbonarius se estudiaron más medios porque la información
disponible de esta cepa era mínima, por lo que se trabajó mas tiempo en ella.
Todos los medios mencionados anteriormente se sembraron con la cepa de
microorganismos que fueron incubados a las temperaturas recomendadas, estas
temperaturas fueron 27 ºC y 37 ºC, de las cuales se seleccionó la temperatura
que mejor crecimiento de conidias presentó en cada cepa en el menor tiempo.
La siembra de la cepa reconstituida se realizó agregando caldo nutritivo en el
centro de las cajas de petri realizando un barrido central en ellas, y la siembra de
las otras cepas se realizó extrayendo una porción de hongo de los tubos de
ensayo para enterrarlas en las cajas de petri. Después de sembrarse las cajas se
sellaron con vinilpel, se rotularon y llevaron a la incubadora a las temperaturas
mencionadas anteriormente.73
Para preparar los medios sólidos, se diluyeron las cantidades en un erlenmeyer
con agua destilada mezclándolas intensamente. Luego se prosiguió a calentar en
estufa cada uno de los erlenmeyer hasta que hirvieran por lo menos 2 veces para
disolver completamente los reactivos, agitando frecuentemente. Paso a seguir, se
taparon los erlenmeyer con unos tapones biológicos (con el fin de evitar la
contaminación después de ser esterilizados) y se llevaron al autoclave hasta que
alcanzaran una presión de 15 libras y 121 ºC, por 15 minutos. Cuando los
erlenmeyer tuvieron una temperatura aproximada de 40 ºC, se dispusieron unos
20 mL de cada medio en las cajas de petri estériles y se dejaron solidificar, luego
se refrigeraron para evitar que se contaminaran y deshidrataran.
3.1.3. Preservación de la cepa. Esta es una etapa muy importante porque se
logra disponer en todo momento de la cepa original en estado latente,
manteniendo las características fisico-químicas de la especie evitando la mutación
del microorganismo debido a los continuos repiques.
Para preservar la cepa, se prepararon junto con las cajas de petri unos tubos con
medio inclinado (los que también fueron esterilizados), que se sembraron con
cepa reconstituida y estuvieron en la incubadora el mismo tiempo que las cajas.
Después de cumplido el tiempo de incubación, los tubos de ensayo se llenaron
con aceite mineral estéril y se llevaron a la nevera a 4 ºC, al igual que las cajas de
petri. Todo esto con el fin de mantener la cepa viva durante todo el trabajo y para
evitar la deshidratación de los medios.
3.2. DETERMINACIÓN DEL MEDIO ÓPTIMO DE FERMENTACIÓN
La determinación del medio óptimo de fermentación en cultivo sumergido se
realizó en erlenmeyers de 250 mL con un volumen de medio líquido de 100 mL por74
cada erlenmeyer obteniéndose una relación de caldo con respecto al espacio
ocupado por el aire de 1:5. A partir de los resultados obtenidos en estos ensayos
se establecen las condiciones de operación para la puesta en marcha de la
fermentación en el biorreactor de 3 L
Cuando la cepa pasa del medio de mantenimiento, en el que se encuentran los
requerimientos nutricionales necesarios para un desarrollo micelial y conidial
óptimo manteniéndose la actividad catalítica de síntesis en estado de latencia, a
un estado de generación del producto deseado en el medio de producción, es
necesario realizar una etapa de adaptación donde el hongo absorba los nutrientes
y desarrolle su crecimiento en las condiciones de producción establecidas.
La determinación del medio óptimo de fermentación se llevó a cabo por bloques
de cepas, es decir, que se trabajaron todos los tipos de sueros por cada cepa,
realizando tres réplicas de cada uno. Cada erlenmeyer con suero se inoculó con 5
mL (5%) de caldo de adaptación.
3.2.1. Prediseño experimental. Después de haber desarrollado el procedimiento
de reconstitución, mantenimiento y preservación de la cepa, eligiendo el mejor
medio de cultivo, se procedió a probar experimentalmente si las cuatro cepas eran
realmente productoras de ácido cítrico. Para esto se emplearon dos medios
sintéticos cuya fuente de carbono era glucosa, ya que este carbohidrato es el más
fácilmente asimilable por los microorganismos. El proceso de fermentación se
dividió en 2 etapas.
3.2.1.1. Etapa de adaptación. En esta etapa se realizó la adecuación de las
conidias y micelio provenientes del medio sólido de mantenimiento a nuevas
condiciones ambientales en un cultivo líquido, permitiéndose el desarrollo de los
pellets que son inoculados en el medio de producción. La composición de los75
medios líquidos empleados en esta etapa se muestra en las Tablas 13 y 14. El
licor de remojo de maíz se preparó dejando en remojo durante 24 horas 20 g de
maíz blanco en 100 mL de agua destilada.
Luego de preparar, ajustar el pH con HCl 1N y NaOH 1 N, y esterilizar, estos
medios fueron sembrados a temperatura ambiente realizando un raspado de las
conidias de Aspergillus carbonarius NRRL 368, Aspergillus niger NRRL 3 y de la
cepa de Aspergillus niger de la Universidad de los Andes, procedentes de los
respectivos medios de mantenimiento. Los erlenmeyer ya inoculados se llevaron a
un baño termostatado con agitación a 30 ºC y 150 rpm por 7 días. El caldo así
obtenido se denominó caldo de adaptación.
Tabla 14. Composición del medio de adaptación 1.
Componente Concentración (g/L)
Glucosa 145
Nitrato de amonio 2,23
Fosfato ácido dipotásico 1,00
Sulfato de magnesio heptahidratado 0,23
Fuente: AGUDELO MOTATO, María Alejandra. Obtención de ácido itacónico por fermentación con
Aspergillus terreus. Universidad Nacional de Colombia. Manizales. 1999.
Tabla 15. Composición del medio de adaptación 2.
Componente Concentración (g/L)
Glucosa 60
Sulfato de amonio 3,0
Sulfato de magnesio heptahidratado 0,8
Licor de remojo de maíz 1,5 mL
Fuente: CAMPO, Carlos; DUQUE VÉLEZ, Hugo Alexander. Determinación de parámetros para la
obtención de ácido itacónico en un biorreactor de tanque con agitación. Universidad Nacional de
Colombia. Manizales. 2000, p. 3776
El montaje utilizado es el que se muestra en la Figura 5, considerando que el
espacio existente entre el medio líquido y el borde del erlenmeyer era suficiente
para permitir la transferencia de oxígeno al medio de cultivo.
Figura 5. Montaje utilizado durante el diseño experimental.
3.2.1.2. Etapa de producción. En esta etapa se determinó la cantidad de ácido
cítrico producida por cada uno de los tratamientos planteados para el suero con
cada una de las cepas. Se emplearon los mismos medios líquidos de la etapa de
adaptación (Tablas 13 y 14), los cuales fueron inoculados con 10 mL
(correspondiente al 10%) del respectivo caldo de adaptación. Los erlenmeyer se
llevaron al baño termostatado con una agitación de 150 rpm y 30 ºC de
temperatura por un período de 10 días.
Terminado este tiempo, se procedió a analizar las muestras usando un Kit
enzimático de bioanálisis, distribuido por Boehringer Manheim / R-biopharm (ver
Anexo H). El procedimiento para preparar las muestras y poder aplicar el Kit fue el
siguiente:
1. Se filtraron las muestras empleando un filtro de gasa para separar la biomasa
del caldo de cultivo (ver Figura 6).77
2. Se calentó en un baño María el filtrado anterior a 80 ºC por 15 minutos con el
fin de detener la actividad enzimática e inactivar los posibles rastros de
biomasa que hayan pasado el filtro.
3. Se alcalinizaron las muestras a un pH de aproximadamente 8,0.
Figura 6. Montaje realizado para filtrar las muestras antes de ser analizadas.
3.2.2. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 368.
3.2.2.1. Preparación de la cepa de Aspergillus carbonarius NRRL 368. La
reconstitución se llevó a cabo tal como se describió en el apartado 3.1.1. Para el
mantenimiento de la cepa se prepararon 150 mL de medio Czapeck Malta
Modificado que fueron esterilizados y repartidos en cajas de petri y tubos
inclinados, puestos en incubadora a 27 ºC por 10 días.
3.2.2.2. Etapa de adaptación. Se prepararon 300 mL de medio líquido 2
ajustando su pH a 5,2 (9, 10). Luego se repartieron en porciones de 100 mL en
tres erlenmeyers de 250 mL (tapándolos con tapones de gasa y algodón para
evitar su contaminación), y se esterilizaron en el autoclave a 121 ºC y 15 psi de
presión por 15 minutos. Cuando los erlenmeyers estuvieron a temperatura
ambiente se procedió a sembrar la cepa que ya tenía 10 días de crecimiento en
medio sólido.78
Teniendo los erlenmeyer sembrados se llevaron al baño termostatado con
agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un período de 8 días.
3.2.2.3. Etapa de producción. Se utilizaron 2 L de suero que se trajeron de la
planta productora de quesos de la Industria Celema cuando se completaban 7
días de la etapa de adaptación. De estos 2 L de suero fresco se separaron 350 mL
como suero entero, 350 mL para desproteinizar, 350 mL para hidrolizar y 750 mL
para evaporar.
El procedimiento de preparación de los cuatro tipos de tratamientos de suero fue
el siguiente:
1. Suero entero: Es el suero traído de la planta procesadora de leche sin ningún
tipo de modificación, el cual tenía un pH de 6,6. Mientras se llegaba el
momento de la esterilización este suero se refrigeró en un erlenmeyer tapado
para que no se contaminara.
2. Suero desproteinizado: Se tomó el suero restante porque los otros 2
tratamientos también tienen suero desproteinizado. Para desproteinizar el
suero se ajustó su pH a 6,0 (pH de su punto isoeléctrico) y se llevó a un baño
María por 1 hora a 90 ºC. Terminado este tiempo se centrifugó todo el suero a
3.500 rpm durante 8 minutos. De todo el suero centrifugado se separaron 350
mL como suero desproteinizado que fueron guardados en nevera en un
erlenmeyer tapado hasta el momento de su esterilización.
3. Suero desproteinizado e hidrolizado: Del suero desproteinizado se sacaron 350
mL para hidrolizar. El procedimiento de la hidrólisis se realizó utilizando la
enzima lactasa (Maxilact de DMS, ver Anexo M), para lo cual se debió ajustar
el pH a 6,7 (el rango de pH requerido según la ficha técnica de la enzima es
6,6 – 6,8). Como se deseaba tener una hidrólisis del 80% en el menor tiempo79
posible, se adicionaron 1,54 mL de la enzima después de haber ajustado el pH,
y se llevó el erlenmeyer a un baño María a 40 ºC por 1 hora. Terminada esta
hora se esperó que se enfriara para llevarlo a la nevera hasta que se
esterilizara.
4. Suero desproteinizado, hidrolizado y evaporado: El suero desproteinizado
restante se repartió en varios beakers de 100 mL que se pusieron sobre la
estufa en un baño María por un periodo de tiempo aproximado de 2 ½ horas
para poder reducirlos a la mitad de su volumen, con el fin de tener una
concentración del 50% del suero. Terminado este proceso se procedió a
centrifugar el suero a 3.500 rpm durante 8 minutos para separar las proteínas
que se desnaturalizaron con el calentamiento. Cuando el suero estuvo a
temperatura ambiente se ajustó su pH a 6,6 para poder adicionar 1,54 mL de la
enzima lactasa (Maxilact de DMS, ver Anexo M) e iniciar el proceso de
hidrólisis, que se realizó a las mismas condiciones que el suero anterior.
Cuando todos los sueros estuvieron preparados, se procedió a ajustar el pH a un
valor aproximado de 3,0 que es el requerido para la etapa de fermentación. Luego
de ajustar el pH, se procedió a esterilizar los sueros que se taparon con tapones
de gasa y algodón para evitar su contaminación. Estos tapones también permiten
el paso de aire que se necesita para la fermentación. En el momento en que los
erlenmeyer estuvieron a la temperatura ambiente se inocularon con 5 mL de
pellets provenientes de la etapa de adaptación, y se llevaron al baño termostatado
con agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un período de 10 días.
Pasado el tiempo de la fermentación, las muestras se filtraron e inactivaron para
ser guardadas en el congelador hasta que se determinaran la cantidad de ácido
cítrico producido, los azúcares reductores como lactosa (ver Anexo B) y proteína
(ver Anexo E). Estos mismos análisis se realizaron a los sueros sin fermentar.80
(cid:131) Diseño experimental: Fue de un factor a cuatro niveles y con tres réplicas por
nivel (tratamiento).
Factor: Tipo de suero.
Tratamientos: Suero entero, Suero desproteinizado, Suero desproteinizado
hidrolizado, Suero desproteinizado, hidrolizado y evaporado.
Variables fijas: pH inicial (3,0), temperatura (30 ºC), agitación (200 rpm), tiempo
de adaptación (8 días) y el tiempo de fermentación (10 días).
Variable de respuesta: Concentración de ácido cítrico en g/L.
Para el análisis de los datos obtenidos se utilizó el paquete estadístico
Statgraphics versión 5 Plus. Se realizó un análisis de varianza donde se tiene 1
factor, 4 tratamientos y 1 respuesta. Las hipótesis empleadas para el análisis de
varianza fueron:
Hipótesis nula (Ho): La media de todos los tratamientos es igual.
Hipótesis alterna (Ha): Alguna de las medias es diferente.
Los principales supuestos evaluados en el análisis de varianza fueron:
(cid:131) Normalidad de los errores por Shapiro – Wilk (11).
(cid:131) Homoscedasticidad de la varianza por Bartlett (11).
(cid:131) Independencia de los errores por un Método gráfico (11).
(cid:131) Mínima diferencia significativa (LSD) por Fisher, que equivale a la prueba de
Tukey (11).
Para la prueba de Normalidad se utilizaron las siguientes hipótesis:81
Ho: Los datos provienen de una distribución normal.
Ha: Los datos no provienen de una distribución normal.
Para la prueba de Homoscedasticidad las hipótesis fueron:
Ho: Las varianzas de todos los tratamientos es igual.
Ha: Alguna de las varianzas es diferente.
3.2.3. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 67.
3.2.3.1. Preparación de la cepa de Aspergillus carbonarius NRRL 67. La
reconstitución se llevó a cabo utilizando las mismas condiciones de medio de
cultivo, esterilización y días de incubación, empleadas para el Aspergillus
carbonarius NRRL 368.
3.2.3.2. Etapa de adaptación. Se prepararon 300 mL de medio líquido 2
ajustando su pH a 5,0. Luego se distribuyó esta cantidad en porciones de 100 mL
en tres erlenmeyers de 250 mL (tapándolos con tapones de gasa y algodón para
evitar su contaminación), y se esterilizaron en el autoclave a 121 ºC y 15 psi de
presión por 15 minutos. Cuando los erlenmeyer estuvieron a temperatura
ambiente se procedió a sembrar la cepa que ya tenía 10 días de crecimiento. El
resto del procedimiento fue igual al descrito en el apartado 3.2.2.
Teniendo los erlenmeyer sembrados se llevaron al baño termostatado con
agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un periodo de 8 días.82
3.2.3.3. Etapa de producción. Al igual que para la etapa de producción del
Aspergillus carbonarius NRRL 368, se utilizaron 2 L de suero que se trajeron de la
planta productora de quesos de la Industria Celema cuando se completaban 7
días de la etapa de adaptación. Además, se realizó el mismo procedimiento para
tratar y preparar los sueros. La preparación de los sueros se trabajó igual a los
procedimientos descritos en el apartado 3.2.2.3.
Cuando todos los sueros estuvieron preparados, se procedió a ajustar el pH a un
valor aproximado de 3,0 que es el requerido para la etapa de fermentación. Luego
de ajustar el pH, se procedió a esterilizar los sueros que se taparon con tapones
de gasa y algodón para evitar su contaminación. Estos tapones también permiten
el paso de aire que se necesita para la fermentación. En el momento en que los
erlenmeyer estuvieron a la temperatura ambiente se inocularon con 5 mL de
pellets provenientes de la etapa de adaptación, y se llevaron al baño termostatado
con agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un periodo de 10 días.
Pasado el tiempo de la fermentación, se llevó a cabo los análisis correspondientes
a la concentración de ácido cítrico, concentración de azúcares reductores como
lactosa y concentración de proteína.
El diseño experimental se planteó de la misma manera descrita en el apartado
3.2.2.3. De igual manera se realizó el análisis de varianza.
3.2.4. Diseño experimental para el Aspergillus niger NRRL 3.
3.2.4.1. Preparación de la cepa de Aspergillus niger NRRL 3. La reconstitución
se llevó a cabo tal como se describió en el apartado 3.1.1, y para el
mantenimiento de la cepa se prepararon 150 mL de medio Czapeck que fueron83
esterilizados y repartidos en cajas de petri y tubos inclinados, puestos en
incubadora a 37 ºC por 10 días.
3.2.4.2. Etapa de adaptación. Se prepararon 300 mL de medio líquido 2
ajustando su pH a 4,5. Luego se repartieron en porciones de 100 mL en tres
erlenmeyer de 250 mL (tapándolos con tapones de gasa y algodón para evitar su
contaminación), y se esterilizaron en el autoclave a 121 ºC y 15 libras de presión
por 15 minutos. Cuando los erlenmeyer estuvieron a temperatura ambiente se
procedió a sembrar la cepa que ya tenía 10 días de crecimiento.
Teniendo los erlenmeyer sembrados se llevaron al baño termostatado con
agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un periodo de 8 días.
3.2.4.3. Etapa de producción. Al igual que para la etapa de producción de las
cepas anteriores, se utilizaron 2 L de suero que se trajeron de la empresa lechera
de Manizales Celema cuando se completaban 7 días de la etapa de adaptación.
Además, se realizó el mismo procedimiento para tratar y preparar los sueros. La
preparación de los sueros se trabajó igual a los procedimientos descritos en el
apartado 3.2.2.3.
Cuando todos los sueros estuvieron preparados, se procedió a ajustar el pH a un
valor aproximado de 3,0 que es el requerido para la etapa de fermentación. Luego
de ajustar el pH, se procedió a esterilizar los sueros que se taparon con tapones
de gasa y algodón para evitar su contaminación. Estos tapones también permiten
el paso de aire que se necesita para la fermentación. En el momento en que los
erlenmeyer estuvieron a la temperatura ambiente se inocularon con 5 mL de
pellets provenientes de la etapa de adaptación, y se llevaron al baño termostatado
con agitación a 30 ºC y 200 rpm, por un periodo de 10 días.84
Pasado el tiempo de la fermentación, se llevó a cabo los análisis correspondientes
a la concentración de ácido cítrico, concentración de azúcares reductores como
lactosa y concentración de proteína.
El diseño experimental se planteó de la misma manera descrita en el apartado
3.2.2.3. De igual manera se realizó el análisis de varianza.
3.3. BIOSÍNTESIS DE ÁCIDO CÍTRICO
El objetivo de esta etapa fue construir las curvas biocinéticas de consumo de
sustrato, crecimiento de biomasa y biosíntesis de ácido cítrico. Esta parte de la
investigación se pudo realizar únicamente después de tener los resultados
obtenidos en la determinación del medio óptimo de fermentación, que arrojaron la
cepa de hongo y el tipo de suero a utilizar.
Lo primero que se realizó fue la preparación de los medios de cultivo para incubar
microorganismo de acuerdo con lo descrito en el numeral 3.1.
Para la etapa de adaptación de la cepa se prepararon 300 mL de medio líquido 2
(Tabla 14) ajustando su pH a 4,98 (9,10). Luego se repartieron en porciones de
100 mL en tres erlenmeyer de 250 mL (tapándolos con tapones de gasa y algodón
para evitar su contaminación), y se esterilizaron en autoclave a 121°C y 15 libras
de presión por 15 minutos. Cuando los erlenmeyers estuvieron a temperatura
ambiente se sembraron con cepa que tenía 10 días en incubadora, y se llevaron al
baño termostatado a 30 °C y 200 rpm por un período de 10 días.
Para la etapa de producción se emplearon 4 litros de suero de la planta productora
de quesos de la empresa lechera de Manizales para preparar 1,5 litros de suero
desproteinizado, hidrolizado y evaporado, que serían dispuestos en el85
microfermentador Applikon (ver Anexo K) para realizar el estudio de la cinética del
proceso de fermentación.
El suero tenía un pH inicial de 6,57, que se ajustó a 6,02 para realizar la
desproteinización por 1 hora a 90 °C en el baño María. Este suero desproteinizado
se pasó por un filtro de gasa y se dispuso en varios beakers para realizar la
evaporación hasta la mitad de su volumen. Cuando se tuvo el suero evaporado se
pasó por la centrífuga a 3.500 rpm por 8 minutos con el fin de separar los residuos
de proteína que alcanzaron a decantar durante este proceso. Teniendo el suero
(1.640 mL) a temperatura ambiente se ajustó su pH a 6,6 para adicionar 7,2 mL de
enzima lactasa (Maxilact DMS) y poder iniciar la hidrólisis en el baño María a
40 °C por 1 hora.
El pH al cual se dejó el suero para iniciar la fermentación fue de 3,05. Terminado
este proceso se esterilizó el suero en autoclave a 121°C y 15 psi de presión por 15
minutos, tapando los erlenmeyers con tapones de algodón y gasa para evitar su
contaminación. De este suero preparado se tomó una muestra para determinar la
cantidad de azúcares reductores y proteína.
Mientras se realizaba esta esterilización, se esterilizó el microfermentador
(incluyendo todos sus accesorios) con el vapor de la caldera del Laboratorio de
Plantas Piloto de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales por 1 ½
hora. A la manguera de suministro de aire al equipo se le adaptó un filtro de lana
de vidrio, buscando la purificación del aire durante todo el proceso de
fermentación.
Luego de tener todo el equipo esterilizado junto con el medio de cultivo, se
procedió a realizar la siembra del suero en el microfermentador, agregando 80 mL
de caldo de adaptación. Este volumen de caldo se consiguió mezclando dos de los
erlenmeyer que mejores pellets produjeron durante la etapa de adaptación,86
dejando decantar para lograr mayor concentración de hongo. Para eliminar la
formación de espuma se adicionaron antiespumantes.
El proceso de fermentación se inició inyectando aire a razón de 0,33 vvm
(volumen de aire por volumen de caldo en un minuto), 200 rpm y 30 °C durante los
dos primeros días de la fermentación. Durante los siguientes 8 días se inyectó aire
a razón de 0,62 vvm y 300 rpm, manteniendo la temperatura entre 28 y 34 ºC, ya
que el baño termostatado no nos permitió tener un control exacto de la misma. En
la Figura 7 se muestra el montaje del equipo para esta etapa.
Figura 7. Montaje del biorreactor Applikon para la fermentación del ácido cítrico con
A. niger NRRL 3.
1. Baño termostatado con mangueras de entra y salida de agua para controlar la temperatura.
2. Microfermentador Applikon.
3. Motor agitador.
4. Motor de aire regulable conectado a una manguera para suministrar el oxígeno al
Microfermentador.
5. Controlador manual para el agitador.
6. Tomamuestras que consta de dos pipetas de 10 mL despuntadas conectadas a los extremos
de una manguera de látex.
7. Pinzas para sellar los extremos de la manguera del tomamuestras.
8. Manguera de látex para la salida de oxígeno.
9. Erlenmeyer de 1 litro para controlar el burbujeo de oxígeno dentro del Microfermentador.
10. Pera para succionar las muestras.87
Las muestras se tomaron empleando una pera como medio de succión que se
ponía en la pipeta de salida cada vez que se realizaba una toma para evitar que
se contaminara. El volumen de muestra por toma fue de 10 mL, los cuales se
dispusieron en un tubo de ensayo tapa rosca que se llevó a un baño María por 15
minutos (para detener la actividad enzimática y crecimiento microbiológico) y luego
se enfrió con agua para poder ser refrigerado. Se recogieron tres muestras por día
con un lapso de 6 horas para determinar la cantidad de biomasa, azúcares
reductores totales y ácido cítrico durante 10 días.
Terminada la toma de muestras se lavaba la pipeta con alcohol para evitar que se
contaminara con otros microorganismos y la proliferación del hongo en la misma.
3.3.1. Determinación de las curvas biocinéticas. Para la construcción de las
curvas biocinéticas experimentales que determinaban la cinética de la
fermentación del ácido cítrico empleando suero de leche, se midió periódicamente
el consumo de sustrato, crecimiento celular y producción de ácido cítrico,
realizando pruebas específicas para la determinación de estas variables durante el
transcurso de la fermentación. Los datos obtenidos con las mediciones sirvieron
para encontrar los parámetros de las ecuaciones que mejor se ajustaban a las
curvas experimentales.
➢ Concentración de sustrato (S): Se refiere al consumo de azúcares reductores
totales presentes en el suero de leche desproteinizado, hidrolizado y
evaporado. Su valor disminuye con el tiempo debido al metabolismo de la cepa
fúngica ya que éste se va transformando en biomasa y ácido cítrico. Esta
variable se mide en g/L. Su determinación se llevó a cabo por el método
mostrado en el Anexo J.
➢ Concentración de biomasa (X): Es la cantidad de masa celular del hongo
filamentoso presente en el medio por unidad de volumen. Esta variable crece a88
medida que el tiempo de fermentación aumenta, y se mide en g/L, su
determinación se realizó por el método de peso seco que se describe en el
Anexo L.
➢ Concentración de producto (P): Con esta variable se obtiene la producción de
ácido cítrico en g/L. Su concentración va aumentando con el tiempo a medida
que el microorganismo en su proceso metabólico transforma el sustrato y
expulsa el ácido. Su determinación se realizó con el Kit enzimático de
bioanálisis de Boehringer que se describe en el Anexo H.
3.3.2. Modelamiento de la cinética de la fermentación. Para desarrollar el
modelo biocinético se llevaron a cabo los siguientes pasos:
1. Planteamiento del modelo: Se escogieron las ecuaciones que de acuerdo a la
literatura y a determinados criterios basados en su mayoría en el tipo de curva
que muestre el crecimiento celular, modele con la mayor precisión las curvas
biocinéticas.
2. Determinación de parámetros: En esta parte se establecieron los parámetros
de las ecuaciones escogidas anteriormente.
3. Solución del modelo: Luego de tener las ecuaciones con los parámetros
definidos se procedió a solucionar el modelo.89
4. ANÁLISIS DE RESULTADOS
4.1. PREPARACIÓN DE LA CEPA
4.1.1. Reconstitución de la cepa. Para reconstituir la cepa se realizaron dos
ensayos:
1. Se diluyó el liofilizado en agua destilada para luego sembrarlo en las cajas de
petri con medio de cultivo.
2. Se diluyó el liofilizado en agua destilada y se pasó a un caldo nutritivo Czapeck
con el fin de “desestresar” la cepa, para luego disponerla en el medio de
cultivo.
Con el primer ensayo el crecimiento del hongo fue muy lento (15 días) y con poca
esporulación. En el segundo, el hongo creció en el tiempo recomendado por la
bibliografía (5), con una muy buena esporulación. Por esta razón se decidió que la
reconstitución de las cepas se iba a realizar utilizando el caldo nutritivo antes de
disponerlas en los medios de cultivo sólido.
4.1.2. Mantenimiento de la cepa. Con base en los datos bibliográficos y en los
medios disponibles se procedió a realizar la siembra de los hongos. Los resultados
obtenidos se muestran en la Tabla 16.90
Tabla 16. Descripción de las cepas fúngicas con cada uno de los medios de cultivo
empleados.
Cepa Medio agar Temperatura Observaciones
A. niger NRRL 3 Czapeck 37 ºC Presentó un crecimiento regular
en un tiempo de incubación de
4 días
A. niger (Bogotá) Czapeck 37 ºC Presentó un crecimiento regular
en un tiempo de incubación de
4 días
A. carbonarius NRRL 368 Czapeck 37 ºC No creció
A. niger NRRL 3 Sabouraud 37 ºC Presentó un mejor crecimiento
en un tiempo de incubación de
4 días
A. niger (Bogotá) Sabouraud 37 ºC Presentó un mejor crecimiento
en un tiempo de incubación de
4 días
A. carbonarius NRRL 368 Sabouraud 37 ºC No creció
A. niger NRRL 3 Czapeck 27 ºC Tuvo un crecimiento muy lento,
el tiempo de incubación fue de
10 días sin mucha proliferación
de conidias
A. niger (Bogotá) Czapeck 27 ºC Tuvo un crecimiento muy lento,
el tiempo de incubación fue de
10 días sin mucha proliferación
de conidias
A. carbonarius NRRL 368 Czapeck 27 ºC No creció
A. niger NRRL 3 Sabouraud 27 ºC El crecimiento fue bueno pero
en un tiempo no inferior a 4
días y no superior a 10
A. niger (Bogotá) Sabouraud 27 ºC El crecimiento fue bueno pero
en un tiempo no inferior a 4
días y no superior a 10
A. carbonarius NRRL 368 Sabouraud 27 ºC No creció
A. carbonarius NRRL 368 PDA 37 ºC No creció
A. carbonarius NRRL 368 MEA 37 ºC No creció
A. carbonarius NRRL 368 CYA 37 ºC No creció
A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Dox 37 ºC No creció
A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Malta 37 ºC Presentó un crecimiento
regular con poca proliferación
de conidias en un tiempo de
incubación de 10 días
A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Malta 37 ºC Presentó un crecimiento un
Modificado poco mejor que en malta en un
tiempo de incubación de 10
días
A. carbonarius NRRL 368 PDA 27 ºC Tuvo un crecimiento regular
con poca proliferación de
conidias en un tiempo de
incubación de 15 días
A. carbonarius NRRL 368 MEA 27 ºC Tuvo un crecimiento regular
con un poco más de conidias
que el PDA en un tiempo de
incubación de 15 días91
Cepa Medio agar Temperatura Observaciones
A. carbonarius NRRL 368 CYA 27 ºC No creció
A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Dox 27 ºC No creció
A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Malta 27 ºC Buen crecimiento con buena
proliferación de conidias en un
tiempo de incubación de 8 días
A. carbonarius NRRL 368 Czapeck Malta 27 ºC Muy buen crecimiento y una
Modificado excelente proliferación de
conidias en un tiempo de 8 días
Los medios de cultivo que mejor crecimiento y esporulación presentaron fueron el
Czapeck y el Sabouraud para el Aspergillus niger, pero por disponibilidad se
escogió el Czapeck. En el caso del Aspergillus carbonarius, los mejores resultados
se dieron con el medio Czapeck Malta Modificado. Para el A. niger las mejores
condiciones de tiempo fueron 4 días, por unificación de datos se escogió el mismo
tiempo de incubación que tuvo el Aspergillus carbonarius, lo cual inclusive
benéfica la conidiogénesis y la formación de micelio. Las condiciones a las cuales
se trabajaron las cepas se muestran en la Tabla 17.
Tabla 17. Condiciones de crecimiento de las cepas fúngicas en medios sólidos.
Cepa Medio agar Temperatura Tiempo incubación
A. niger NRRL 3 Czapeck 37 ºC 10 días
A. niger (Bogotá) Czapeck 37 ºC 10 días
A. carbonarius NRRL Czapeck Malta 27ºC 10 días
368 Modificado
A. carbonarius NRRL Czapeck Malta 27ºC 10 días
368 Modificado
Los datos obtenidos demuestran los requerimientos de fuente de carbono
(sacarosa) y de sales de sodio, potasio, magnesio y hierro que tiene el A. niger
para su desarrollo y mantenimiento en medios sólidos. Igualmente se demuestra
los mayores requerimientos del A. carbonarius para su crecimiento en medios
sólidos en comparación con el A. niger. En particular se obtuvo que es necesario
complementar la fuente de carbono con extracto malta, además de que este92
hongo tiene unos requerimientos mayores en sales (sales de zinc y cobre),
adicionales a las formuladas para el medio sólido del A. niger.
4.2. DETERMINACIÓN DEL MEDIO ÓPTIMO DE FERMENTACIÓN
4.2.1. Prediseño experimental. Antes de iniciar el diseño experimental se
realizaron análisis para conocer si verdaderamente las cuatro cepas producían
ácido cítrico. El pH utilizado inicialmente en las 2 etapas del proceso de
fermentación fue de 2,0 ± 0,1, pero como no dio buenos resultados se decidió que
para la etapa de adaptación se emplearía un pH de 5,0 ± 0,1, pH al que se da un
crecimiento óptimo del hongo, y para la etapa de producción se utilizaría un pH de
3,0 ± 0,1, en el que se da una buena producción de ácido cítrico según la
bibliografía (9, 10).
Con esta modificación en el pH, se procedió a realizar el análisis que determinaría
si las cepas tenían la capacidad de producir ácido cítrico. Los resultados obtenidos
se muestran en la Tabla 18.
Tabla 18. Concentración de ácido cítrico (g/L) arrojada durante el prediseño
experimental.
Medio de adaptación Cepa Concentración de ácido cítrico
Medio 1 A. niger de los Andes 0
Medio 2 A. niger de los Andes 0
Medio 1 A. niger NRRL 3 0,23
Medio 2 A. niger NRRL 3 3,9126
Medio 1 A. carbonarius NRRL 368 0,0303
Medio 2 A. carbonarius NRRL 368 0,8423
Observaciones: Los medios anotados en la primera columna corresponden a los que se describen
en las Tablas 13 y 14.93
Estos resultados nos indican que la cepa de Aspergillus niger proveniente de la
Universidad de los Andes había perdido su capacidad productora, por lo cual no
fue posible utilizarla en las siguientes fases del diseño experimental. El mejor
medio para adaptar la cepa fúngica fue el medio 2 al tenerse una fuente adicional
de nitrógeno orgánico (en forma de aminoácidos libres y proteínas) para el
crecimiento del hongo contenida en el licor de remojo de maíz. Por ello se decidió
seguir utilizando el medio 2 durante todas las posteriores preparaciones del medio
de adaptación.
Antes de iniciar el diseño experimental que definió el mejor medio de producción
de ácido cítrico, se realizó un ensayo utilizando suero en la etapa de producción
con el fin de determinar el volumen del inóculo a utilizar en los experimentos
subsiguientes. Se repartieron 100 mL de cada uno de los sueros en erlenmeyers
de 250 mL, que se inocularon con 10 mL (10% del medio de producción) de caldo
de adaptación, dando como resultado una copiosa formación de biomasa,
consumiéndose todo el sustrato antes de terminar el tiempo de fermentación. Por
esta razón se tomó la decisión de disminuir la cantidad de inóculo a 5 mL (5% del
medio de fermentación).
4.2.2. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 368.
4.2.2.1. Preparación de la cepa. La cepa se sembró tal como se especificó en el
apartado 3.1. Cuando el hongo comenzó a crecer, primero formó una peluza de
color blanco que luego se tornó de color negro carbón (ver Figura 8), lo cual
corresponde a las conidias formadas durante la esporulación del hongo. En el
revés de la caja de petri se observó un crecimiento radial de color blanco, que por
la tonalidad del medio se vio de color ámbar (ver Figura 9). De esta manera se
obtuvo suficiente material para la siembra de los medios de adaptación.94
Figura 8. Vista superior del Aspergillus carbonarius NRRL 368 cultivado en medio
agar Czapeck Malta Modificado.
Figura 9. Vista inferior del Aspergillus carbonarius NRRL 368 cultivado en medio
agar Czapeck Malta Modificado.
4.2.2.2. Etapa de adaptación. En la adaptación de esta cepa al medio sintético,
se pudo observar aglomeraciones de materia oscura amorfa de color verde oscuro
de aspecto no muy compacto, que corresponde a aglomeraciones del hongo
cultivado en medio líquido sometido a agitación constante. El crecimiento se
orientó mayoritariamente a la formación de micelio y no a la formación de conidias.95
4.2.2.3. Etapa de producción. Los resultados de las pruebas de azúcares
reductores totales y de proteína de los diferentes tipos de sueros preparados para
los diseños experimentales se muestran en la Tabla 19.
Tabla 19. Concentración de azúcares reductores totales (g/L) (Anexo J) y
Concentración de Proteína (g/L) (Anexo I), para sueros antes de la fermentación con
las diferentes cepas.
Tipo de suero Azúcares Proteína
reductores
Entero 52,282 38,27
Desproteinizado 50,329 5,57
Desproteinizado, hidrolizado 82,566 6,00
Desproteinizado, hidrolizado, evaporado 165,132 9,29
Con los datos presentados en la Tabla 19 se puede mostrar la efectividad del
procedimiento empleado para la desproteinización del suero. Igualmente se
observa el aumento en la concentración de azúcares reductores con la hidrólisis
de la lactosa y con la evaporación del medio.
Al realizar la siembra de los sueros con el inóculo del caldo de adaptación, se
mezcló el contenido de los tres erlenmeyers y se dejó decantar con el fin de
obtener la mayor cantidad posible de pellets para garantizar que se estaba
inoculando la cantidad suficiente de los mismos.
Los resultados de ácido cítrico obtenidos durante el diseño experimental se
pueden observar en la Tabla 20 y se encuentran representados en la Figura 10.
Como se puede observar en la Tabla 20 y en la Figura 10, la dispersión de los
datos fue muy alta a pesar del método altamente preciso utilizado para la
determinación de la concentración de ácido cítrico. El análisis estadístico realizado
nos indica que se acepta la hipótesis nula, al no encontrarse diferencia96
significativa entre los tratamientos a un nivel de significancia del 5% (P *=
value
0,876).
Tabla 20. Determinación de ácido cítrico (g/L) en suero fermentado por Aspergillus
carbonarius NRRL 368
Muestra Tipo de suero pH inicial pH final Concentración
1 Entero 2,96 2,77 4,6952
2 Entero 2,96 3,59 2,2003
3 Entero 2,96 2,43 13,2571
4 Desproteinizado 3,04 2,20 3,8988
5 Desproteinizado 3,04 2,15 12,6127
6 Desproteinizado 3,04 2,52 9,5746
7 Desproteinizado hidrolizado 2,95 2,52 5,3396
8 Desproteinizado hidrolizado 2,95 2,88 23,9365
9 Desproteinizado hidrolizado 2,95 3,21 2,2463
10 Desproteinizado hidrolizado 3,00 2,77 14,2698
evaporado
11 Desproteinizado hidrolizado 3,00 2,91 13,0730
evaporado
12 Desproteinizado hidrolizado 3,00 3,21 6,1222
evaporado
Lo anterior indica que desde el punto de vista de la biosíntesis de ácido cítrico, el
hongo metaboliza los diferentes tipos de suero independientemente de la forma
como esté presente la fuente de carbono (lactosa o lactosa hidrolizada).
Igualmente la desproteinización del suero no representa una ventaja en la
biosíntesis de ácido cítrico por Aspergillus carbonarius NRRL 368.
Al aplicar la prueba de Shapiro – Wilk para comprobar el supuesto de normalidad
de los errores, se obtuvo como resultado que se acepta la hipótesis nula, al no
haber diferencia significativa en la distribución de los datos a un nivel de
significancia del 5% (P = 0,132161).
value
*
P corresponde al área a la derecha del estadístico calculado.
value97
Figura 10. Concentración de ácido cítrico en cada uno de los tratamientos de suero
con Aspergillus carbonarius NRRL 368.
25
20
15
Concentración
(g/L)
10 Suero evaporado, hidrolizado,
desproteinizado
5
Suero hidrolizado, desproteinizado
0 Suero desproteinizado
1 Suero entero
2
3
Réplicas
Al aplicar la prueba de Bartlett para comprobar la homoscedasticidad nos dio
como resultado que se acepta la hipótesis nula, al no haber diferencia significativa
en las varianzas a un nivel de significancia del 5% (P = 0,487086). Estos
value
resultados nos demuestran la validez del diseño experimental utilizado.
Los resultados obtenidos nos llevan a la necesidad de profundizar el estudio de
este hongo, y la influencia que pueden tener las condiciones de la etapa de
mantenimiento y adaptación sobre la capacidad de biosintetizar ácido cítrico. La
continuación de este estudio puede potencialmente mostrar la influencia del tipo
de suero utilizado durante la etapa de producción, en dependencia de las
condiciones anteriores de mantenimiento y adaptación. Por todo ello el Aspergillus
carbonarius NRRL 368 no puede descartarse como potencial productor de ácido
cítrico a partir de suero de leche.
4.2.3. Diseño experimental para el Aspergillus carbonarius NRRL 6798
4.2.3.1. Preparación de la cepa. La cepa se sembró tal como se especificó en el
apartado 3.1. Al igual que el Aspergillus carbonarius NRRL 368, este hongo
cuando comenzó a crecer formó una peluza de color blanco que luego se tornó de
color negro carbón (ver Figura 11), lo cual corresponde a las conidias formadas
durante la esporulación del hongo. En el revés de la caja de petri se observó un
crecimiento radial de color blanco, que por la tonalidad del medio se vio de color
ámbar (ver Figura 12). De esta manera se obtuvo suficiente material para la
siembra de los medios de adaptación.
Figura 11. Vista superior del Aspergillus carbonarius NRRL 67 cultivado en medio
agar Czapeck Malta Modificado.
Figura 12. Vista inferior del Aspergillus carbonarius NRRL 67 cultivado en medio
agar Czapeck Malta Modificado.99
4.2.3.2. Etapa de adaptación. El comportamiento de esta cepa en la adaptación
al medio líquido fue muy similar al del Aspergillus carbonarius NRRL 368, solo que
en este caso se observó una mejor aglomeración de microorganismos aunque de
manera amorfa. De esta forma, el crecimiento se orientó mayoritariamente a la
formación de micelio y no a la formación de conidias.
4.2.3.3. Etapa de producción. Al realizar la siembra de los sueros con el inóculo
del caldo de adaptación, también se mezcló el contenido de tres erlenmeyer y
dejándolos decantar, para tener la mayor cantidad posible de pellets al momento
de realizar la inoculación.
Los resultados de ácido cítrico obtenidos durante el diseño experimental se
pueden observar en la Tabla 21 y se encuentran representados en la Figura 13.
Los datos de azúcares reductores y proteína se muestran en los Anexos C y F
respectivamente.
Tabla 21. Determinación de ácido cítrico (g/L) en suero fermentado por Aspergillus
carbonarius NRRL 67
Muestra Tipo de suero pH inicial pH final Concentración
1 Entero 3,04 2,19 0,0524
2 Entero 3,04 2,13 12,6587
3 Entero 3,04 2,40 6,8126
4 Desproteinizado 2,96 2,08 3,8344
5 Desproteinizado 2,96 2,09 1,8600
6 Desproteinizado 2,96 2,10 15,6968
7 Desproteinizado hidrolizado 3,03 2,84 0,7411
8 Desproteinizado hidrolizado 3,03 2,71 0,0460
9 Desproteinizado hidrolizado 3,03 2,23 1,9931
10 Desproteinizado hidrolizado 2,98 2,42 10,7714
evaporado
11 Desproteinizado hidrolizado 2,98 2,32 7,9634
evaporado
12 Desproteinizado hidrolizado 2,98 2,80 4,0047
evaporado100
Figura 13. Concentración de ácido cítrico en cada uno de los tratamientos de suero
con Aspergillus carbonarius NRRL 67.
16
14
12
Concentración
10
(g/L)
8
6 Suero evaporado, hidrolizado,
4 desproteinizado
Suero hidrolizado, desproteinizado
2
Suero desproteinizado
0
Suero entero
1
2
3
Réplicas
Como se puede observar en la Tabla 21 y en la Figura 13, la dispersión de los
datos es muy alta a pesar del método altamente preciso utilizado para la
determinación de la concentración de ácido cítrico. El análisis estadístico realizado
nos indica que se acepta la hipótesis nula, al no encontrarse diferencia
significativa entre los tratamientos a un nivel de significancia del 5% (P =
value
0,4156).
Al igual que con el Aspergillus carbonarius NRRL 368, el hongo metaboliza los
diferentes tipos de suero independientemente de la forma como esté presente la
fuente de carbono (lactosa o lactosa hidrolizada). Tampoco se muestra una
ventaja al desproteinizar el suero para la biosíntesis del ácido cítrico.
Al aplicar la prueba de Shapiro – Wilk para comprobar el supuesto de normalidad
de los errores, se obtuvo como resultado que se acepta la hipótesis nula, al no
haber diferencia significativa en la distribución de los datos a un nivel de
significancia del 5% (P = 0,170348).
value101
Al aplicar la prueba de Bartlett para comprobar la homoscedasticidad nos dio
como resultado que se acepta la hipótesis nula, al no haber diferencia significativa
en las varianzas a un nivel de significancia del 5% (P = 0,166383). Estos
value
resultados nos demuestran la validez del diseño experimental utilizado.
Al igual que con el Aspergillus carbonarius NRRL 368, los resultados obtenidos
nos llevan a la necesidad de profundizar el estudio con el A. carbonarius NRRL 67,
mirando la influencia que pueden tener las condiciones de la etapa de
mantenimiento y adaptación sobre la capacidad de biosintetizar ácido cítrico, como
también, la influencia del tipo de suero utilizado durante la etapa de producción, en
dependencia de las condiciones anteriores de mantenimiento y adaptación. Por
todo ello el Aspergillus carbonarius NRRL 67 tampoco puede descartarse como
potencial productor de ácido cítrico a partir de suero de leche.
4.2.4. Diseño experimental para el Aspergillus niger NRRL 3
4.2.4.1. Preparación de la cepa. La cepa se sembró tal como se especificó en el
apartado 3.1. Como las cepas anteriores, el Aspergillus niger NRRL 3 cuando
comenzó a crecer formó una peluza de color blanco pero al final las conidias
fueron de color negro café cuando crecieron en el medio Czapeck, pero con el
medio Sabouraud las esporas fueron de color negro (ver Figura 14),
presentándose en el revés de la caja de petri un crecimiento radial de color blanco
(ver Figura 15).
4.2.4.2. Etapa de adaptación. Al final de la etapa de adaptación el Aspergillus
niger NRRL 3 presentó una formación de los pellets de color negro aunque
amorfos. El líquido en el que se encontraban suspendidos tenía una coloración
negro-café (ver Figura 16). Lo anterior indica un crecimiento de micelio mas no de102
conidias. Es de anotar que la forma de los agregados fue condicionada por la
intensidad de la agitación.
Figura 14. Vista superior del Aspergillus niger NRRL 3 cultivado en medio agar
Sabouraud.
Figura 15. Vista inferior del Aspergillus niger NRRL 3 en medio de cultivo
Sabouraud.
Figura 16. Vista del medio de adaptación antes de ser inoculado el suero con
Aspergillus niger NRRL 3.103
4.2.4.3. Etapa de producción. Como en las etapas anteriores al momento de
realizar la siembra de los sueros con el inóculo del caldo de adaptación se mezcló
el contenido de tres erlenmeyers y se dejó decantar para tener la mayor cantidad
posible de pellets. Una visión clara de la formación de los pellets al final de la
fermentación se puede observar en el Anexo N
Los resultados de ácido cítrico obtenidos durante el diseño experimental se
pueden observar en la Tabla 22 y se encuentran representados en la Figura 17.
Los datos de azúcares reductores y proteína se muestran en los Anexos D y G.
Tabla 22. Determinación de ácido cítrico (g/L) en suero fermentado por Aspergillus
niger NRRL 3
Muestra Tipo de suero pH inicial pH final Concentración
1 Entero 3,02 1,89 0,0151
2 Entero 3,02 2,57 0,7319
3 Entero 3,02 1,95 0,2803
4 Desproteinizado 2,96 2,04 0,1629
5 Desproteinizado 2,96 1,90 0,0052
6 Desproteinizado 2,96 1,76 0,0244
7 Desproteinizado hidrolizado 2,97 2,39 3,1643
8 Desproteinizado hidrolizado 2,97 2,37 3,3419
9 Desproteinizado hidrolizado 2,97 2,29 2,7066
10 Desproteinizado hidrolizado 3,00 2,59 5,6619
evaporado
11 Desproteinizado hidrolizado 3,00 2,46 6,7206
evaporado
12 Desproteinizado hidrolizado 3,00 2,97 4,9253
evaporado
Como se puede observar en la Tabla 22 y en la Figura 17, los mejores resultados
de biosíntesis de ácido cítrico se obtuvieron con el suero desproteinizado,
hidrolizado y evaporado con un promedio de concentración de 5,769 g/L, lo que
indica que conforme se va aumentando la concentración de sustrato (azúcares
reductores totales) aumenta también la concentración de ácido.104
Figura 17. Concentración de ácido cítrico en cada uno de los tratamientos de suero
con Aspergillus niger NRRL 3.
7
6
5
4
Concentración
(g/L)
3 Suero evaporado, hidrolizado,
desproteinizado
2
Suero hidrolizado, desproteinizado
1
Suero desproteinizado
0
Suero entero
1
2
3
Réplicas
El Aspergillus niger no asimila adecuadamente la lactosa, lo que se puede
comprobar al observar las bajas concentraciones obtenidas con los tipos de suero
no hidrolizados. No obstante, cuando se hidroliza este carbohidrato los
rendimientos son mayores. Igualmente, la desproteinización del suero no parece
tener un efecto significativo en las concentraciones de ácido al no notarse
diferencias relevantes en las concentraciones obtenidas con suero entero o con
suero desproteinizado. Se sugiere por lo tanto adelantar ensayos con suero
hidrolizado y evaporado desproteinizándolo o no, lo que permitiría dilucidar el
efecto de las proteínas originales del lactosuero sobre la producción de ácido
cítrico.
El análisis estadístico realizado corrobora las anteriores conclusiones al indicar
que se acepta la hipótesis alterna, al encontrarse diferencia significativa entre los
tratamientos a un nivel de significancia del 5% (P = 0,0000).
value
Al realizar la prueba de LSD (mínima diferencia significativa), equivalente a la
prueba de Tukey para examinar cuáles son los tratamientos que presentan
diferencias significativas, se observa que entre los sueros 1 y 2 no hay una105
diferencia significativa, mientras que los tratamientos 3 y 4 son diferentes entre sí,
y diferentes con los tratamientos 1 y 2. Estos resultados se pueden observar en la
Tabla 23.
Tabla 23. Resultados de la prueba LSD para las concentraciones de ácido cítrico
obtenidas con el Aspergillus niger NRRL 3.
Suero Media Grupos homogéneos
2 0,0643333 X
1 0,342333 X
3 3,07167 X
4 5,769 X
Contraste Diferencia Límite +/-
1 – 2 0,278 0,968603
1 – 3 *-2,72933 0,968603
1 – 4 *-5,42667 0,968603
2 – 3 *-3,00733 0,968603
2 – 4 *-5,70467 0,968603
3 – 4 *-2,69733 0,968603
Al aplicar la prueba de Bartlett para comprobar la homoscedasticidad nos dio
como resultado que se acepta la hipótesis nula, al no haber diferencia significativa
en las varianzas a un nivel de significancia del 5% (P = 0,0805712).
value
Considerando los resultados obtenidos, se decidió utilizar la cepa del hongo A.
niger NRRL3 y el tipo de suero desproteinizado, hidrolizado y evaporado par la
fermentación en el biorreactor.
4.3. BIOSÍNTESIS DE ÁCIDO CÍTRICO
En la Tabla 24 se relacionan los valores obtenidos experimentalmente que se
evalúan como el promedio de los datos tomados por día de fermentación,
correspondientes a una sola corrida. En la Figura 18 se muestran los datos de106
consumo de sustrato que se determinó por la concentración de azúcares
reductores totales, la formación de biomasa y la producción de ácido cítrico,
correspondientes a la fermentación por lotes con Aspergillus niger NRRL 3.
Tabla 24. Datos experimentales de la formación de biomasa, consumo de sustrato y
producción de ácido cítrico en un cultivo sumergido por lotes de Aspergillus niger
NRRL 3.
Tiempo (días) Sustrato (g/L) Biomasa (g/L) Producto (g/L)
0 168,674 3,101 0
1 150,282 7,4500 0,052
2 150,7 10,2566 0,007
3 145,738 12,3966 0,201
4 129,663 24,6800 0,996
5 102,89 24,5533 2,7020
6 90,182 26,1333 2,7089
7 42,759 26,7566 3,1619
8 46,995 29,1000 2,2693
9 46,666 25,3500 2,7573
10 34,49 28,5600 3,3050
11 59,321 22,4600 3,7331
La cantidad de ácido cítrico producida en la biosíntesis fue mucho menor que la
lograda en el diseño experimental, ya que en esta parte se presentó una alta
formación de espuma debido a la inyección de aire. Esta formación de espuma no
permitió tener un flujo de aire mayor, debido a que un aumento progresivo en la
cantidad de espuma implica una disminución del medio de cultivo y una
obstrucción de las vías de salida de gases, con los consecuentes peligros de
contaminación de todo el montaje (ver Anexo Ñ). Lo anterior se constituyó en una
restricción del proceso de fermentación, que no se presenta en gran medida en el
caso de medios sintéticos y semi-sintéticos.
El control de espuma fue difícil a pesar de la adición de antiespumantes como el
glicerol, por ejemplo, en algunos momentos se tuvo que aumentar la agitación
hasta el máximo del agitador para poder romper la capa de espuma y biomasa107
que se formó en la parte superficial del medio, con el fin de permitir un mejor flujo
de aire y disponer de unas muestras más homogéneas.
Figura 18. Datos experimentales de la formación de biomasa, consumo de sustrato
y producción de ácido cítrico en un cultivo sumergido por lotes de Aspergillus niger
NRRL 3.
180
160
140 )L/g(
120
nóicartnecnoC
100
Sustrato
80
Biomasa
60 Producto
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (días)
Otra posible limitante es que el control de temperatura se realizó con un
termostato que presentaba oscilaciones de ± 3 ºC en la temperatura del agua en la
chaqueta del biorreactor, lo que necesariamente influye en el desempeño de la
biosíntesis de ácido cítrico.
Como podemos observar en la Figura 19 el consumo de proteína durante la
fermentación no tuvo cambios significativos durante todo el proceso, indicando
que el mayor consumo de nitrógeno se llevó a cabo durante el primer día de
fermentación, manteniéndose constante este consumo en los días siguientes.
Con base en los datos experimentales se calcularon los rendimientos aparentes
de biomasa y ácido cítrico, expresados como gramos de biomasa o ácido cítrico
producidos por gramo de sustrato consumidos. El rendimiento aparente se obtiene
a partir de los datos experimentales de la cinética de la fermentación y siempre es108
menor al rendimiento estequiométrico, ya que tiene en cuenta el consumo de
sustrato tanto para la formación de nueva masa celular como para el
mantenimiento de la misma, mientras el rendimiento estequiométrico está basado
en la estequiometría de la fermentación.
Figura 19. Datos experimentales del consumo de proteína durante la fermentación
en cultivo sumergido para la producción de ácido cítrico con A. niger NRRL 3.
16
14
)L/g(
12
10 nóicartnecnoC
8
6
4
2
0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (días)
Rendimiento aparente de biomasa
X −X
Y' = 0 Ec. 14
X S
S −S
0
donde
X: Concentración final de biomasa, g/L
X : Concentración inicial de biomasa, g/L
0
S: Concentración final de sustrato, g/L
S : Concentración inicial de sustrato, g/L
0
• Rendimiento aparente de producto
P
Y' = Ec. 15
PS
S −S
0109
donde P es la concentración final de producto en g/L.
Los rendimientos aparentes obtenidos son:
Y’ = 0,1770 g biomasa/
X/S g sustrato
Y’ = 0,0341 g ácido cítrico/
P/S g sustrato
4.3.1. Modelamiento de la cinética de la fermentación. Para modelar la
biocinética se partió de los datos experimentales de la fermentación en cultivo
sumergido, que debido a su dispersión se decidió trabajar con las curvas
suavizadas. Las curvas suavizadas se obtuvieron utilizando el programa de
Microsoft Excel 2000, a través de curvas de ajuste polinómico.
4.3.1.1. Planteamiento del modelo. Para la curva de formación de biomasa se
escogió la ecuación logística (Ecuación 4) que describe mejor el comportamiento
de los datos experimentales. Una de las ventajas del empleo de esta ecuación es
que describe tanto la fase de crecimiento exponencial como la fase estacionaria.
Los valores de consumo de sustrato (azúcares reductores totales) fueron descritos
mejor mediante la ecuación 10, indicando que la velocidad de consumo de
sustrato es directamente proporcional a la velocidad de formación de biomasa.
Para analizar la formación de producto se utilizó la ecuación 9 que describe la
biosíntesis del ácido para el caso cuando la formación de producto está asociada
indirectamente al crecimiento celular, que es el tipo de fermentación característica
para ácidos orgánicos. De esta forma la velocidad de formación de producto es
directamente proporcional a la concentración de biomasa. Esta suposición se110
fundamenta en que cuando el cultivo se encuentra en su fase estacionaria, la
acumulación del producto en el medio de cultivo es mayor.
Por lo tanto, el modelo cinético planteado con tres ecuaciones diferenciales
ordinarias con tres variables, quedó de la siguiente manera:
dX
=εX −βX2
dt
dS 1 dX
=− ⋅ Sistema 1
dt Y dt
X
S
dP
=q ⋅X
dt P
Para un ajuste más adecuado de los datos experimentales, se utilizaron las
siguientes aproximaciones polinómicas, lo cual permitió suavizar las curvas
experimentales. Los coeficientes de determinación fueron adecuados teniendo en
cuenta la naturaleza netamente experimental de los datos.
Para la biomasa:
y =0,0188x4 −0,3922x3 +2,2339x2 +0,6354x+3,101 Ec. 16
Para el sustrato:
y =0,2929x3 −4,3481x2 +0,9348x+168,67 Ec. 17
Para el producto:
y =−0,0063x3 +0,0933x2 +0,036x+0 Ec. 18111
4.3.1.2. Determinación de los parámetros cinéticos. Para resolver el sistema 1
se hace necesario conocer los coeficientes de cada una de las ecuaciones, los
cuales corresponden a los parámetros del modelo cinético. En el caso de modelos
no estructurados y no segregados, el valor de estos parámetros es único para
cada sistema de fermentación, por lo que se deben encontrar a partir de los datos
experimentales de las curvas biocinéticas.
Para encontrar los parámetros de la ecuación logística que simula la formación de
1 dX
biomasa, se linearizó dicha ecuación graficando los valores obtenidos de ⋅
X dt
vs X, tomándose el término independiente y la pendiente de la línea recta
resultante de la linearización. La regresión lineal obtenida se muestra en la Figura
20.
Figura 20. Determinación de los parámetros de la ecuación logística que modela la
formación de biomasa.
0.8
0.7
0.6
0.5 )td/Xd(*)X/1(
0.4
0.3
y = -0.0286x + 0.8069
0.2
R2 = 0.9855
0.1
0
0 5 10 15 20 25 30
X (g/L)
De acuerdo con la Figura 20, el intercepto con el eje y corresponde al parámetro ε
y la pendiente al valor de β. Por lo tanto la ecuación que simula la biomasa es:112
dX
=0,8069X −0,0286X2 Ec. 19
dt
Para determinar el parámetro cinético de la ecuación utilizada para modelar el
dS dX
consumo de sustrato, se graficó vs . La línea obtenida se muestra en la
dt dt
Figura 21.
Figura 21. Determinación del parámetro de la ecuación que modela el consumo de
sustrato.
0
-2 0 1 2 3 4 5 6
-4
-6
-8 td/Sd
y = -4.9061x + 13.183
-10
R2 = 0.9164
-12
-14
-16
-18
dX/dt
1
Donde el valor de la pendiente corresponde al valor del término . Por lo tanto
Y
X
S
la ecuación que simula el consumo de sustrato es:
dS dX
=−4,9061 Ec. 20
dt dt
Según el modelo propuesto, el valor del rendimiento de biomasa teórico es de:113
1
Y = =0,2038
X S 4,9061
que es mayor al rendimiento aparente.
De igual manera, el parámetro de la ecuación que modela la producción de ácido
dP
cítrico se calcula graficando vs X. La línea obtenida se muestra en la Figura
dt
22.
Figura 22. Determinación del parámetro de la ecuación que modela la producción de
ácido cítrico.
0.6
0.5
0.4
y = 0.0163x + 0.1336 td/Pd
0.3
R2 = 0.9399
0.2
0.1
0
0 5 10 15 20 25 30
X (g/L)
Donde la pendiente de esta recta linealizada corresponde al parámetro q . Por lo
P
tanto la ecuación que simula la producción de ácido cítrico es:
dP
=0,0163X Ec. 21
dt114
De acuerdo con lo anterior, las ecuaciones que modelan el sistema de
fermentación son:
dX
=0,8069X −0,0286X2
dt
dS dX
=−1,8954 Sistema 2
dt dt
dP
=0,0163X
dt
4.3.1.3. Solución del modelo. El sistema 2 está conformado por un sistema de
ecuaciones diferenciales ordinarias simultáneas que se resolvió utilizando la rutina
Runge – Kutta de cuarto orden de paso fijo mediante el programa Turbo Basic.
Las condiciones iniciales establecidas para resolver el sistema fueron:
(cid:131) Tiempo cero: t = 0 horas
0
(cid:131) Biomasa en t : X = 3,101 g/L
0 0
(cid:131) Sustrato en t : S = 168,674 g/L
0 0
(cid:131) Producto en t : P = 0 g/L
0 0
Los resultados de la solución del modelo se muestran en las Figuras 23 A y 23 B.
Como podemos observar en la Figura 23, el modelo para la formación biomasa
planteado describe adecuadamente los datos experimentales, mientras que el
modelo encontrado para el consumo de sustrato se aproxima a los datos
experimentales.115
Figura 23. Simulación del sustrato y la biomasa en la fermentación para la
producción de ácido cítrico con Aspergillus niger NRRL 3.
180
160
140
)L/g(
120
nóicartnecnoC
100
80
60
40
20
0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (días)
Modelo para el sustrato Modelo para la biomasa
Sustrato Biomasa
Nota: Las líneas continuas corresponden a los datos calculados por el modelo, las curvas
con puntos discretos corresponden a los datos experimentales.
Se recomienda explorar la posibilidad de utilizar modelos matemáticos más
complejos, lo que implicaría la necesidad de determinar más parámetros cinéticos
y mayor número de datos experimentales para lograr un mejor ajuste en el modelo
del sustrato. Otra opción, es utilizar modelos estructurados, pero sería necesario
un estudio exhaustivo de las vías metabólicas de biosíntesis de ácido cítrico en la
especie de microorganismo que se utilizó.
Como podemos observar en la Figura 24, el modelo para la formación de producto
planteado describe adecuadamente los datos experimentales.
Considerando lo anterior se recomiendan las condiciones de cultivo sumergido
para la obtención de ácido cítrico a partir de suero de leche que aparecen en la
Tabla 25.116
Figura 24. Simulación del producto en la fermentación para la producción de ácido
cítrico con Aspergillus niger NRRL 3.
4.5
4
3.5 )L/g(
3
nóicartnecnoC
2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (días)
Moldeo para el producto Producto
Nota: Las líneas continuas corresponden a los datos calculados por el modelo, las curvas
con puntos discretos corresponden a los datos experimentales.
Tabla 25. Condiciones para realizar la fermentación del ácido cítrico en cultivo
sumergido a partir de suero de leche.
Condición Valor Unidades
Temperatura 30 ºC
Agitación en la adaptación 200 rpm
Agitación fermentación en las primeras 48 horas 200 rpm
Agitación fermentación en las horas siguientes 300 rpm
pH al iniciar la adaptación 5,0 -o-
pH al iniciar la fermentación 3,0 -o-
Duración de la etapa de adaptación 8 Días
Duración de la etapa de producción 11 Días117
5. CONCLUSIONES
(cid:131) En esta etapa inicial del trabajo se pudo comprobar que el suero de leche es
un medio que ofrece los nutrientes necesarios para producir ácido cítrico
utilizando como microorganismos transformadores del proceso Aspergillus
carbonarius y Aspergillus niger.
(cid:131) El suero de leche es un medio rico en nutrientes, necesarios para permitir el
crecimiento de las cepas utilizadas.
(cid:131) El Aspergillus carbonarius es un hongo que requiere una mayor cantidad de
sales y fuentes adicionales de carbono para su mantenimiento en medios
sólidos, como las ofrecidas por el medio sólido Czapeck Malta Modificado.
(cid:131) Las condiciones a las que mejor crecen en medios sólidos las cepas de
Aspergillus carbonarius y Aspergillus niger son 27 ºC y 37 ºC, respectivamente,
en un tiempo de 10 días, permitiendo una mejor conidiogénesis y formación de
micelio.
(cid:131) Para adaptar el hongo a la fermentación se debe utilizar un medio líquido que
tenga fuentes de nitrógeno orgánicas como el licor de maceración de maíz
para permitir un mejor crecimiento de la cepa.
(cid:131) La etapa de adaptación se realiza a 200 rpm durante un tiempo de 10 días, por
ser el tiempo en el que se obtiene la suficiente cantidad de hongo en el medio
líquido para inocular el caldo de fermentación. El pH inicial del medio líquido de118
adaptación debe ser de 5,0 para permitir el adecuado crecimiento del
microorganismo.
(cid:131) Desde el punto de vista de la biosíntesis de ácido cítrico, el Aspergillus
carbonarius es un hongo que metaboliza los tipos de suero
independientemente de la cantidad de proteína que contenga éste y la forma
en que se encuentre la fuente de carbono.
(cid:131) Las cepas de Aspergillus carbonarius NRRL 368 y Aspergillus carbonarius
NRRL 67 tienen un comportamiento similar en cuanto a la producción de ácido
cítrico debido a que uno es homólogo del otro. Por esta razón se hace
independiente el uso de uno de los dos para iniciar un estudio en particular con
respecto a la producción de ácido cítrico.
(cid:131) Se pudo comprobar la poca asimilación que tiene el Aspergillus niger NRRL 3
hacia la lactosa cuando esta se encuentra en su forma no hidrolizada.
(cid:131) Se presentaron diferencias significativas en el diseño experimental del A. niger
NNRL 3 ya que las mejores condiciones de biosíntesis correspondieron al
suero desproteinizado, hidrolizado y evaporado, lo cual indica que este hongo
requiere una alta concentración de sustrato para la biosíntesis de ácido cítrico,
de ahí la necesidad de hidrolizar la lactosa del suero y concentrar el medio.
(cid:131) Cuando se provee de aire el suero de leche produce una gran cantidad de
espuma, que se constituye en una limitante del proceso fermentativo al
provocar una disminución en el volumen del medio de cultivo y no permitir un
adecuado suministro de aire al mismo.
(cid:131) En el empleo del A. niger para producir ácido cítrico a partir de suero de leche
hay un gran campo por investigar ya que los rendimientos son muy inferiores a
los obtenidos en la industria.119
(cid:131) El modelo cinético planteado para la fermentación en cultivo sumergido del
ácido cítrico se ajusta adecuadamente a los datos experimentales, aunque no
se descarta que con un mayor número de datos, el empleo de modelos
cinéticos más complejos y un estudio detallado de las vías metabólicas se
pueda lograr un ajuste mayor.
(cid:131) No se tuvo en cuenta el efecto del contenido de agua en el suero de leche
porque no hacía parte de éste trabajo el analizar la influencia de ciertos
compuestos en la biosíntesis del ácido cítrico.120
6. RECOMENDACIONES
(cid:57) Se recomienda explorar la posibilidad de utilizar cepas industriales o
patentadas de A. niger que garanticen un alto nivel de producción de ácido
cítrico, ya que las cepas disponibles son naturales y no mutadas
genéticamente, lo que influye directamente en los rendimientos obtenidos. Se
requiere una interacción entre la industria y la universidad que garantice el
secreto industrial para llevar a cabo estos estudios con las cepas
mencionadas.
(cid:57) Se sugiere utilizar el mismo suero como medio de adaptación o incluir una
etapa de preadaptación en medio nutritivo líquido con una posterior adaptación
en suero de leche.
(cid:57) Para dilucidar el efecto de las proteínas originales del lactosuero sobre la
producción de ácido cítrico con Aspergillus niger se aconseja adelantar
ensayos con suero hidrolizado y evaporado retirando y manteniendo las
proteínas.
(cid:57) Se invita a continuar los estudios de obtención de ácido cítrico con Aspergillus
niger en erlenmeyer con diferentes grados de hidrólisis de lactosa y de
agitación, para definir otras condiciones de cultivo en el biorreactor, que
posibiliten un aumento del rendimiento del producto.
(cid:57) Los resultados obtenidos con el Aspergillus carbonarius NRRL 368 y NRRL 67
llevan a la necesidad de profundizar el estudio de este hongo, analizando la121
influencia que pueden tener las condiciones de la etapa de mantenimiento y
adaptación sobre la capacidad de biosintetizar ácido cítrico, mostrando
potencialmente la influencia del tipo de suero utilizado durante la etapa de
producción. Por lo tanto, el A. carbonarius NRRL 368 y NRRL 67 no pueden
descartarse como potenciales productores de ácido cítrico a partir de suero de
leche.
(cid:57) Se propone utilizar un mejor control de temperatura en la biosíntesis del ácido
cítrico, como por ejemplo un dispositivo electrónico, ya que este es un factor
que afecta el rendimiento en la producción de ácido cítrico.
(cid:57) Se recomienda evaluar diferentes tipos de antiespumantes naturales y
sintéticos (comerciales) a fin de neutralizar el efecto negativo de la formación
de espuma sobre la producción de ácido cítrico.
(cid:57) Se indica utilizar otro tipo de análisis para determinar ácido cítrico debido a los
altos costos del Kit enzimático. En particular se recomienda implementar el
análisis de ácidos orgánicos por cromatografía de gases.
(cid:57) Se aconseja el empleo de un método analítico que discrimine el nitrógeno
orgánico del inorgánico, para poder evaluar los efectos la desproteinización y
de la formulación del medio de cultivo.
(cid:57) Al aplicar el método de azúcares reductores mostrado en este trabajo, sobre
muestras que contengan buffer citrato, se deben acidificar a un pH aproximado
de3,0, ya que el citrato cuando se tiene a un pH por encima de 8,0 disminuye
el color de la muestra alterando la lectura.
(cid:57) Para evaluar el efecto de la hidrólisis sobre la producción de ácido cítrico se
propone adelantar estudios para implementar en método de análisis que
permita determinar cuantitativamente la concentración de lactosa, glucosa y122
galactosa de forma independiente en un medio de cultivo que contenga una
mezcla de estos tres carbohidratos.
(cid:57) Se recomienda analizar la influencia de compuestos como el agua en estudios
posteriores acerca de la biosíntesis de ácido cítrico.123
BIBLIOGRAFÍA
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3. AMIOT, J. Ciencia y tecnología de la leche. Editorial Acribia, S.A. España
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1993.
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Revista Ambiente y Desarrollo Pontificia Universidad Javeriana. Año 2, No 2 y
3, Mayo – Septiembre. 1994. 83 p.124
7. BAENA, Sandra; CAMPOS, Claudia; LEAL, Luis A. Aguas residuales de la
industria láctea: Contribución al manejo de los residuos de la industria láctea, la
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Pontificia Universidad Javeriana. Año 2, No 2 y 3, Mayo – Septiembre. 1994.
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15. GARCÍA - GARIBAY. LÓPEZ - MUNGUÍA. QUINTERO, R. Biotecnología
Alimentaria. Editorial Limusa. México 1.993.125
16. HOSSAIN, M. AHMED, S.A. The efect of trace elements on citric acid
production from whey permeate by fermentation using Aspergillus niger. En: J.
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17. HOSSAIN, M; BROOKS, J. D.; MADDOX, I. S. Production of citric acid from
whey permeate by fermentation using Aspergillus niger. En: New Zeland
Journal of Dairy Science and Technology. Vol 18, No 2. 1983. 161–168 p.
18. JAGNOW, Gerhard. Biotecnología: Introducción con experimentos modelo.
Editorial Acribia, S.A. España 1.991.
19. KAFAROV, V. Modelirovaniye Biojimicheskij Reaktorov. Lesnaya
promyshlennost`. Moscú. 1979
20. KIRK, Othmer. Encyclopedia of chemical technology, volumen 6. John Wiley
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21. MADRIÑAN, Cecilia. Módulo de química de los alimentos. Universidad del
Valle. 1988. 527 p.
22. MARTH, Elmer. Aprovechamiento del suero por fermentación. En: Industrias
Lácteas. Jul. – Ago. 1973. 17-26 p.
23. NOLLER, Carl R. Química orgánica tercera edición. Editorial Interamericana
S.A. México. 1968.
24. PRESCOTT, Samuel. Microbiología industrial. Editorial Aguilar. Madrid.
25. SPREER, E. Lactología industrial. Editorial Acribia, S.A. Segunda edición.
España 1.991.126
26. SUAREZ M, Francisco Javier. Fermentación láctica en continuo a partir de
suero de leche. Universidad Nacional de Colombia Sede Medellín.
27. WAINWRIGHT, M. Introducción a la biotecnología de los hongos. Editorial
Acribia, S.A. España. 1995.
28. WARD, Owen P. Biotecnología de la fermentación: Principios, procesos y
productos. Editorial Acribia, S.A. España. 1993
PÁGINAS DE INTERNET.
29. www.alimentosargentinos.gov.ar/0-3/revistas/r_12/12_06_citrico_htm
30. www.drwebsa.com.ar/aam/revvol31/v31-2-03.htm
31. www.ejb.org/content/vol5/issue2/full/5/
32. www.infocarne.com/comunes/imágenes/Compos1.gif
33. www.red6.org/~bioland/nutricompoust-mo.htm
34. www.roche.com/vitamins/who/pdf/rvlnk011s.pdf
35. www.sagpya.mecon.gov.ar/agrico/publicaciones/aceite/composición.htm127
ANEXO A
COMPOSICIÓN DE LOS MEDIOS SÓLIDOS
Medio de cultivo Composición (g/L) Condiciones de preparación
Czapeck Sacarosa: 30 Disolver 49 g de medio en 1 L
Nitrato de sodio: 2 de agua destilada.
Hidrógeno Fosfato Dipotásico: 1
Sulfato de magnesio: 0,5 Especial para hongos
Cloruro de potasio: 0,5 filamentosos.
Sulfato ferroso: 0,01
Agar 15 g
Sabouraud Concentrado enzimático de Disolver 65 g de medio en 1 L
caseína: 10 de agua destilada.
Dextrosa: 40
Agar:15 Especial para hongos
filamentosos
Agar Dextrosa –Papa Extracto de papa: 230 mL. Este extracto se prepara
(PDA) Glucosa :20 licuando en 300 mL de agua
Agar – Agar: 20 destilada 100 g de papa,
Agua destilada: 770 mL refrigerando de un día para
otro. En el momento de usar
se debe filtrar, y ese filtrado es
el que se emplea como
extracto.
Especial para Aspergillus
carbonarius
Agar Extracto Malta Extracto malta: 20 Disolver los compuestos en 1
(MEA) Peptona bacteriológica: 1 L de agua destilada.
Glucosa: 20
Agar: 15 Especial para Aspergillus
carbonarius
Agar Czapeck Yeast Fosfato dipotásico: 1 Este concentrado esta
Autolysate (CYA) Extracto levadura: 5 compuesto por: Nitrato de
Sacarosa: 30 sodio 30 g, Cloruro de potasio
Agar: 15 5 g, Sulfato de magnesio
Concentrado Czapeck: 10 mL heptahidratado 5 g, Sulfato de
hierro heptahidratado 0,1 g,
Agua destilada 100 mL
Especial para Aspergillus
carbonarius128
Medio de cultivo Composición (g/L) Condiciones de preparación
Czapeck Dox Solución A: 50 mL Solución A compuesta por:
Solución B: 50 mL Nitrato de sodio 40 g, Cloruro
Sacarosa 30 de potasio 10 g, Sulfato de
Agar: 15 magnesio heptahidratado 0,2
Agua destilada: 900 mL g, Agua destilada 1000 mL.
Solución B compuesta por:
Agua destilada 1000 mL,
Fosfato dipotásico 20 g
Especial para Aspergillus
carbonarius
Czapeck Malta Agar Czapeck: 49 Especial para Aspergillus
Extracto malta: 40 carbonarius
Czapeck Malta Agar Czapeck: 49 Especial para Aspergillus
Modificado Extracto malta: 40 carbonarius
Sulfato de zinc heptahidratado
(1g/100mL): 1 mL
Sulfato de cobre pentahidratado
(0,5g/100mL): 1 mL129
ANEXO B
TABLA DE DATOS
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES EN SUEROS
DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus carbonarius NRRL 368
Fecha de la determinación: Agosto 14 de 2002
Cepa utilizada en la fermentación: Aspergillus carbonarius NRRL 368
Equipo utilizado: Espectrofotómetro UV Perkin-Elmer Lambda 20 Serial Nº:
101N8021921
Método: LACTO_02
Longitud de onda: 540 nm
Observaciones: Estas lecturas se realizaron contra el blanco, por lo que el equipo realizó
los cálculos.
Nomenclatura empleada en las tablas:
Nº: Número de la muestra
F: Factor de dilución
C (g/ ): Concentración de azúcares reductores totales determinados como lactosa, en g/
L L
A: Absorbancia
Nº Tipo de suero F A C (g/ )
L
1 Entero 100 0,0822 10,442
2 Entero 100 0,1751 17,413
3 Entero 100 -0,010 3,520
4 Desproteinizado 100 -0,011 3,445
5 Desproteinizado 100 -0,005 3,895
6 Desproteinizado 100 0,0640 9,0763
7 Desproteinizado hidrolizado 100 -0.013 3294
8 Desproteinizado hidrolizado 100 -0.003 4,045
9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,1787 17,680
10 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,1132 12,768
11 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0763 10,0
12 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0675 9,3391130
ANEXO C
TABLA DE DATOS
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES EN SUEROS
DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus carbonarius NRRL 67
Fecha de la determinación: Octubre 10 y 21, y Noviembre 19 de 2002
Cepa utilizada en la fermentación: Aspergillus carbonarius NRRL 67
Equipo utilizado: Espectrofotómetro UV Perkin-Elmer Lambda 20 Serial Nº:
101N8021921
Método: LACTO_02
Longitud de onda: 540 nm
Observaciones: Para éstas determinaciones, se realizaron las lecturas contra agua
destilada con el fin de poder observar el comportamiento del blanco. Por tal razón los
cálculos se realizaron manualmente. Los cálculos que se realizaron con el Blanco 1
fueron 4, 5, 6, 8, 10 y la 11. Los cálculos realizados con el Blanco 2 fueron los de las
muestras 3, 7, 9 y 12. Con el Blanco 3 se realizaron los cálculos de las muestras 1 y 2.
Nomenclatura empleada en las tablas:
Nº: Número de la muestra
F: Factor de dilución
C (g/ ): Concentración de azúcares reductores totales determinados como lactosa, en mg/
L L
A: Absorbancia
Nº Tipo de suero F A C (g/ )
L
Blanco 1 0 0,0188 0,0567
Blanco 2 0 0,0181 0,0562
Blanco 3 0 0,0172 0,0555
1 Entero 25 0,0213 0,0779
2 Entero 25 0,0223 0,097131
Nº Tipo de suero F A C (g/ )
L
3 Entero 50 0,0191 0,4015
4 Desproteinizado 100 0,0335 1,1073
5 Desproteinizado 100 0,0941 5,6536
6 Desproteinizado 100 0,0775 4,4096
7 Desproteinizado hidrolizado 50 0,0218 13,925
8 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0195 0,06
9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0195 0,11
10 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,1962 13,3216
11 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,1326 8,5466
12 Desproteinizado hidrolizado evaporado 200 0,2962 41,7574132
ANEXO D
TABLA DE DATOS
DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES EN SUEROS
DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus niger NRRL 3
Fecha de la determinación: Noviembre 19 de 2002
Cepa utilizada en la fermentación: Aspergillus niger NRRL 3
Equipo utilizado: Espectrofotómetro UV Perkin-Elmer Lambda 20 Serial Nº:
101N8021921
Método: LACTO_02
Longitud de onda: 540 nm
Observaciones: Estas determinaciones se realizaron haciendo las lecturas contra agua
destilada con el fin de poder observar el comportamiento del blanco. Por tal razón los
cálculos se realizaron manualmente. Las 11 primeras muestras se calcularon con el
Blanco 1, y la última con el Blanco 2 por tener que hacer una dilución mayor.
Nomenclatura empleada en la tabla:
Nº: Número de la muestra
F: Factor de dilución
C (g/ ): Concentración de azúcares reductores totales determinados como lactosa, en mg/
L L
A: Absorbancia
Nº Tipo de suero F A C (g/ )
L
Blanco 1 0 0,0172 0,0555
Blanco 2 0 0,0211 0,0585
1 Entero 100 0,0227 0,4145
2 Entero 100 0,0463 2,1893
3 Entero 100 0,0429 1,9295
4 Desproteinizado 100 0,0578 3,0534
5 Desproteinizado 100 0,1030 6,4453
6 Desproteinizado 100 0,2379 16,5683133
Nº Tipo de suero F A C (g/ )
L
7 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0194 0,1652
8 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0443 2,0376
9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0901 5,4783
10 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,3008 21,2937
11 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,2866 20,2303
12 Desproteinizado hidrolizado evaporado 300 0,2370 53,55134
ANEXO E
TABLA DE DATOS
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN SUEROS
DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus carbonarius NRRL 368
Fecha de la determinación: Agosto 14 de 2002
Cepa utilizada en la fermentación: Aspergillus carbonarius NRRL 368
Equipo utilizado: Espectrofotómetro UV Perkin-Elmer Lambda 20 Serial Nº:
101N8021921
Método: BIURET2
Longitud de onda: 550 nm
Observaciones: Estas lecturas se realizaron contra el blanco, por lo que el equipo realizó
los cálculos.
Nomenclatura empleada en la tabla:
Nº: Número de la muestra
F: Factor de dilución
C (g/ ): Concentración de proteína, en g/
L L
A: Absorbancia
Nº Tipo de suero F A C (g/ )
L
1 Entero 100 0,0129 4,53
2 Entero 100 0,0109 3,80
3 Entero 100 0,0025 0,70
4 Desproteinizado 100 0,0012 0,22
5 Desproteinizado 100 -0,000 0,2
6 Desproteinizado 100 0,0034 1,04
7 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0035 1,08
8 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0057 1,89
9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0085 2,91
10 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0141 4,98
11 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0150 5,30
12 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0104 3,62135
ANEXO F
TABLA DE DATOS
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN SUEROS
DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus carbonarius NRRL 67
Fecha de la determinación: Octubre 10 de 2002
Cepa utilizada en la fermentación: Aspergillus carbonarius NRRL 67
Equipo utilizado: Espectrofotómetro UV Perkin-Elmer Lambda 20 Serial Nº:
101N8021921
Método: BIURET2
Longitud de onda: 550 nm
Observaciones: Para estas determinaciones, se realizaron las lecturas contra agua
destilada con el fin de poder observar el comportamiento del blanco. Por tal razón los
cálculos se realizaron manualmente.
Nomenclatura empleada en la tabla:
Nº: Número de la muestra
F: Factor de dilución
C (g/ ): Concentración de proteína, en g/
L L
A: Absorbancia
Nº Tipo de suero F A C (g/ )
L
Blanco 0 0,0311 0,1122
1 Entero 100 0,0335 0,89
2 Entero 100 0,0315 0,12
3 Entero 100 0,0399 3,22
4 Desproteinizado 100 0,0323 0,44
5 Desproteinizado 100 0,0348 1,36
6 Desproteinizado 100 0,0391 2,94
7 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0360 1,79
8 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0417 3,9136
Nº Tipo de suero F A C (g/ )
L
9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0405 3,43
10 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0503 7,03
11 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0464 5,61
12 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0562 9,2137
ANEXO G
TABLA DE DATOS
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNA EN SUEROS
DESPUÉS DE LA FERMENTACIÓN CON Aspergillus niger NRRL 3
Fecha de la determinación: Noviembre 19 de 2002
Cepa utilizada en la fermentación: Aspergillus niger NRRL 3
Equipo utilizado: Espectrofotómetro UV Perkin-Elmer Lambda 20 Serial Nº:
101N8021921
Método: BIURET2
Longitud de onda: 550 nm
Observaciones: Las lecturas de estas determinaciones se realizaron contra agua
destilada con el fin de poder observar el comportamiento del blanco. Por tal razón los
cálculos se realizaron manualmente.
Nomenclatura empleada en la tabla:
Nº: Número de la muestra
F: Factor de dilución
C (g/ ): Concentración de proteína, en g/
L L
A: Absorbancia
Nº Tipo de suero F A C (g/ )
L
Blanco 0 0,0242 0,0867
1 Entero 100 0,0314 2,64
2 Entero 100 0,0319 2,82
3 Entero 100 0,305 2,3
4 Desproteinizado 100 0,0284 1,55
5 Desproteinizado 100 0,0284 1,55
6 Desproteinizado 100 0,0360 4,35
7 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0275 1,23138
Nº Tipo de suero F A C (g/ )
L
8 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0310 5,52
9 Desproteinizado hidrolizado 100 0,0385 5,27
10 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0490 9,12
11 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0432 6,98
12 Desproteinizado hidrolizado evaporado 100 0,0580 12,44139
ANEXO H
MANUAL DE MANEJO DEL TEST ENZIMÁTICO
PARA LA DETERMINACIÓN DE ÁCIDO CÍTRICO
A. PRINCIPIO
El ácido cítrico (citrato) es convertido a oxaloacetato y acetato en la reacción catalizada
por la enzima citrato liasa (CL) (1).
CitratoCL→oxaloacetato+acetato (1)
En presencia de la enzima L-mamto deshidrogenasa (L-MDH) y L-lactato deshidrogenasa
(L-LDH), el oxalato y el producto de decarboxilación piruvato son reducidos a L-malato y
L-lactato, respectivamente, por reducción de nicotinamida-adenina dinucleotido (NADH)
(2, 3).
Oxaloacetato+NADH +H+ L−LDH→L−malato+NAD+ (2)
Piruvato+NADH +H+ L−LDH→L−lactato+NAD+ (3)
La cantidad de NADH oxidado en las reacciones (2) y (3) es estequiométrica a la cantidad
de citrato. El NADH es determinado por mediciones de luz absorbancia a 334, 340 ó 365
nm.
Nota: El piruvato libre en la muestra no es medido debido al orden de pipeteo de
reactivos.
B. CONTENIDO DE LA PRUEBA
1. Tres frascos marcados con el 1. Cada uno con aproximadamente 1,4 g de liofilizado
con el siguiente contenido: Buffer de glicilglicina de aproximadamente 7,8 de pH; L-
malato deshidrogenasa con aproximadamente 136 U; L-lactato deshidrogenasa con
aproximadamente 280 U; aproximadamente 5 mg de NADH; estabilizantes.
2. Tres frascos marcados con el 2. Cada uno con aproximadamente 50 mg del liofilizado
de citrato liasa, aproximadamente 12 U.
3. Solución estándar de ácido cítrico para control de análisis (la medición de la solución
estándar no es necesaria para el cálculo de los resultados). Use la solución estándar
sin diluir.140
C. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES PARA 10 DETERMINACIONES
1. Disolver el contenido de un frasco marcada con 1 en 12 mL de agua redestilada.
2. Disolver el contenido de un frasco marcada con 2 en 0,3 mL de agua redestilada.
D. ESTABILIDAD DE LOS REACTIVOS
El contenido de los frascos marcados con 1 y 2 es estable a 2 – 8 ºC. La solución 1 es
estable durante 2 semanas a 2 – 8 ºC, o durante 4 semanas entre –20 y –25 ºC. Antes de
usar la solución 1 debe ser llevada a temperatura ambiente (20 – 25 ºC). La solución 2 es
estable durante 1 semana a 2 – 8 ºC, o durante 4 semanas entre –20 y –25 ºC.
E. PROCEDIMIENTO
(cid:131) Longitud de onda: 340 nm, 365 nm Hg ó 334 nm Hg (el máximo de absorción del
NADH se encuentra en 340 nm. En espectrofotómetros, las mediciones se toman en el
máximo de absorción. Si se usa fotómetro de línea espectral equipado con lámpara de
vapor de mercurio, las mediciones se toman a una longitud de onda igual a 365 ó 334
nm.
(cid:131) Cubetas de vidrio de 1 cm de paso de luz (si se desea se pueden usar cubetas
desechables en lugar de las de vidrio).
(cid:131) Temperatura: 20 a 25 ºC.
(cid:131) Volumen final: 3,020 mL
(cid:131) Leer contra aire (sin cubeta en el paso de luz) o agua.
(cid:131) Solución muestra: 1 – 80 µg de ácido cítrico por ensayo (en un volumen de muestra de
0,200 a 2,000 mL)
Pipetear en las cubetas Blanco Muestra
Solución 1 1 mL 1 mL
Solución muestra - 0,2 mL
Agua destilada 2 mL 1,8 mL
Mezcle *, lea las absorbancias de las soluciones (A ) después de aproximadamente 5
1
minutos y empiece la reacción con la adición de:
Solución 2 0,020 mL 0,020 mL
Mezcle **, cuando se complete la reacción (aproximadamente 5 minutos) lea las
absorbancias de las soluciones (A ).
2
*Enjuague la pipeta de la enzima o la punta de la pipeta con la solución muestra antes de
dispensar dicha solución.
**Por ejemplo, con una espátula plástica o con agitación suave después de haber sellado
la cubeta con Parafilm.141
Determine las diferencias de absorbancias (A – A ) para el blanco y para la muestra.
1 2
Reste de la diferencia de absorbancias de la muestra, la diferencia de absorbancias del
blanco.
( ) ( )
∆A= A −A − A −A
1 2 muestra 1 2 blanco
Eventualmente, se puede obtener un valor negativo de (A – A ) . En este caso, este
1 2 blanco
valor se debe adicionar a (A – A ) , de acuerdo a la fórmula de cálculo.
1 2 muestra
Como regla, la diferencia de absorbancias medida debe ser de al menos 0,1000 unidades
de absorbancia, para alcanzar unos resultados suficientemente precisos (vea
Instrucciones para la realización del análisis).
Si la diferencia de absorbancias de la muestra (∆A ) es mayor de 1,000 (medida a
muestra
340 nm, o a 334 nm Hg) o a 0,5000 (medida a 365 nm Hg) respectivamente, la
concentración de ácido cítrico en la solución muestra es demasiado alta. En tal caso, la
solución muestra debe ser diluida de acuerdo a la tabla de diluciones.
F. CÁLCULOS
De acuerdo a la ecuación general para el cálculo de la concentración:
V×PM
[ ]
c = ×∆A g/L
ε×d×v×1000
V: Volumen final, mL
v: Volumen de la muestra, mL
PM: Peso molecular de la sustancia que se analiza, g/mol
d: Paso de luz, cm
ε: Coeficiente de extinción del NADH a:
340 nm = 6,3 (L/mmol cm)
365 nm Hg = 3,4 (L/mmol cm)
334 nm Hg = 6,18 (L/mmol cm)
Entonces, para ácido cítrico calculado como anhidro:
3,020×192,1 2,900
c = ×∆A= ×∆A (g ácido cítrico/L de muestra)
ε×1,00×0,200×1000 ε
Para ácido cítrico calculado como monohidrato:
3,020×210,1 3,173
c = ×∆A= ×∆A (g ácido cítrico monohidrato/L de muestra)
ε×1,00×0,200×1000 ε
Si la muestra fue diluida durante la preparación, el resultado debe ser multiplicado por el
factor de dilución F.142
Cuando se analizan muestras sólidas o semisólidas que han sido pesadas para su
preparación, los resultados deben ser calculados a partir de la cantidad pesada:
( )
c g /L de solución muestra
Contenido = ácido cítrico ×100( g /100g)
ácido cítrico peso ( g /L de solución muestra)
ácido cítrico
1. INSTRUCCIONES PARA LA REALIZACIÓN DEL ANÁLISIS
La cantidad de ácido cítrico presente en la cubeta tiene que estar entre 1 y 80 µg. Para
obtener una diferencia de absorbancias adecuada, la muestra debe ser diluida de tal
manera que la concentración de ácido cítrico esté entre 0,04 y 0,4 g/L.
Tabla de dilución
Cantidad estimada de ácido Dilución con agua Factor de dilución F
cítrico por litro
< 0,4 g - 1
0,4 – 4,0 g 1 + 9 10
4,0 – 40 g 1 + 99 100
> 40 g 1 + 999 1000
Si la diferencia de absorbancias medida (∆A) es muy baja (p ej. < 0,100), la muestra debe
ser preparada nuevamente (pese más muestra o haga una dilución menor) o se puede
incrementar hasta 2 mL el volumen de la muestra que se pipetea en la cubeta. En este
último caso, el volumen de agua se debe reducir de tal manera que se obtenga el mismo
volumen final para el blanco y para la muestra. El nuevo volumen de la muestra v se debe
tener en cuenta para el cálculo.
2. INFORMACIÓN TÉCNICA
2.1. Para llevar a cabo los cálculos, se debe dar una indicación clara de si se expresan
los resultados como ácido cítrico anhidro o monohidrato, o como ión citrato (en las
determinaciones enzimáticas se mide el ión citrato).
2.2. En la evaluación de los resultados analíticos se debe tener en cuenta que en la
determinación acidimétrica de "ácido total calculado como ácido cítrico", se miden
los protones, mientras que en las determinaciones enzimáticas se miden los iones
citrato. Por lo tanto, no es posible comparar estos resultados directamente.
3. ESPECIFICIDAD
El método es específico para ácido cítrico.
4. SENSIBILIDAD Y LÍMITE DE DETECCIÓN143
La diferencia más pequeña de absorbancia para el procedimiento es de 0,005 unidades
de absorbancia. Esto corresponde a un volumen máximo de muestra de v = 2,000 mL y
medida a 340 nm de una concentración de ácido cítrico de la solución de muestra (si el
v = 0,200 mL, esto corresponde a 2,5 mg/ de solución de muestra).
L
El límite de detección de 0,5 mg/ se deriva de la diferencia de absorbancia de 0,010
L
(medida a 340 nm) y un volumen máximo de muestra de v = 2,000 mL.
5. LINEALIDAD
La linealidad de la determinación existe desde 1 µg de ácido cítrico por ensayo (0,5 mg
ácido cítrico / L solución de muestra, volumen de muestra v = 2,000 mL) hasta 80 µg de
ácido cítrico por ensayo (0,4 g ácido cítrico / L solución de muestra, volumen de muestra
v = 2,000 mL).
6. PRECISIÓN
En una determinación doble que usa una solución de muestra, puede ocurrir una
diferencia de 0,005 a 0,010 unidades de absorbancia. Con un volumen de muestra de v =
2,000 mL y medida de 340 nm, esto corresponde a una concentración de ácido cítrico de
aproximadamente 3 – 5 mg/ (si la muestra se diluye durante su preparación, el resultado
L
se multiplica por el factor de dilución F. Si la muestra se pesa para su preparación, por
ejemplo, usando 1 g muestra/ = 10 g/ , se puede esperar una diferencia de 0,03 – 0,05
100 mL L
g/ ).
100 g
Los siguientes datos han sido publicados en literatura (Ref. 1.3):
CV = 4,4 % n =10 Extracto de hígado de conejo
CV = 1,3 % n =10 Vino
Jugo de frutas (Ref. 2.3):
r = 0,095 + 0,025 • ( C en g ) g
ác.cítrico L L
R = 0,13 + 0,054 • ( C en g ) g
ác.cítrico L L
Para datos más amplios ver referencias (Ref. 2.13, 2.14)
Vino:
Ácido cítrico < 400 mg/ : r = 14 mg/ R = 39 mg/
L L L
Ácido cítrico > 400 mg/ : r = 28 mg/ R = 65 mg/
L L L
7. INTERFERENCIAS / FUENTES DE ERROR144
Si la solución de muestra contiene ácido pirúvico libre, el NADH se consume antes de la
medida de A . En este caso se recomienda agregar NADH a la muestra, y adicionalmente
1
(por ejemplo, 0,100 mL solución NADH, 5 mg/ )4 usar menos agua redestilada.
L
8. RECONOCIENDO INTERFERENCIAS DURANTE EL PROCEDIMIENTO DE
ENSAYO
8.1. Si la conversión de ácido cítrico se ha completado según un tiempo menor al dado
para la determinación, se puede concluir que en general no ha ocurrido ninguna
interferencia.
8.2. En la realización de la reacción, la determinación puede reiniciarse agregando
ácido cítrico o citrato de sodio (cualitativo o cuantitativo): si la absorbancia se
altera subsecuente a la adición del material estándar, es también una indicación
de que no ha ocurrido ninguna interferencia.
8.3. Errores del operador o interferencias en la determinación por la presencia de
sustancias contenidas en la muestra pueden ser reconocidas llevando a cabo una
determinación doble usando 2 diferentes volúmenes de muestra (por ejemplo,
0,100 mL y 0,200 mL): Las diferencias en la medida de la absorbancia deben ser
proporcionales a los volúmenes de muestra usados.
Cuando se analizan muestras sólidas, se recomiendan diferentes cantidades (por
ejemplo 1 g y 2 g) pesados en frascos volumétricos de 100 mL. Las diferencias en
las medidas de la absorbancia y los pesos de las muestras usados deben ser
proporcionales para los volúmenes de la muestra idénticos.
8.4. Posibles interferencias causadas por sustancias contenidas en la muestra pueden
ser reconocidas usando un estándar interno como control: en la adición de la
muestra, determinaciones estándar y blanco, se puede llevar a cabo otra
determinación con muestra y solución estándar en el mismo ensayo. La
recuperación puede calcularse entonces de las diferencias de las medidas de
absorbancia.
8.5. Las posibles pérdidas durante la determinación pueden ser reconocidas llevando a
cabo test de recuperación: la muestra debe prepararse y analizarse con y sin el
material estándar. El aditivo debe recuperarse cuantitativamente dentro del rango
de error del método.
9. EL RIESGO DEL REACTIVO
Los reactivos usados en la determinación de ácido cítrico no son materiales peligrosos en
el sentido de la Regulación de Sustancias Peligrosas (Hazardous Substance Regulations),
La Ley Química (The Chemicals Law) o Regulación EC 67/548/EEC (EC Regulation
67/548/EEC) y subsecuente alteración, suplementación y pautas de adaptación. Sin
embargo, las medidas de seguridad generales que se aplican a toda sustancia química
deben tenerse en cuenta.145
Después de usarse, los reactivos pueden ser dispuestos con desechos de laboratorio,
pero las regulaciones locales deben tenerse presente. El material empacado puede ser
dispuesto como desecho para reciclaje.
10. INFORMACIÓN GENERAL SOBRE PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
Llevando a cabo el ensayo:
✓ Use la muestra de líquido clara, descolorida y prácticamente neutra directamente,
o después de la dilución según la tabla de dilución, y de un volumen mayor a 2,000
mL.
✓ Filtrar las soluciones turbias.
✓ Degasificar muestras que contengan dióxido de carbono (por ejemplo, por
filtración).
✓ Ajustar muestra débilmente coloreadas y ácidas a pH 8 adicionando soluciones de
hidróxido de sodio o potasio e incubar aproximadamente 15 minutos.
✓ Ajustar muestras ácidas a aproximadamente pH 8 adicionando soluciones de
hidróxido de sodio o potasio.
✓ Tratar muestra "fuertemente coloreadas" usadas sin diluir o con un volumen de
muestra muy alto con polivinilpolipirrolidona (PVPP) o con poliamida (por ejemplo 1
g/ ).
100 mL
✓ Machacar u homogenizar muestras sólidas o semisólidas, extraer con agua o
disolver en agua y filtrar si es necesario.
✓ Desproteinizar muestras que contengan proteína con ácido perclórico.
✓ Extraer grasas de muestras que contengan grasa con agua caliente (extraer a una
temperatura que esté por encima del punto de fusión de la grasa involucrada). Dejar
enfriar para separar la grasa, realizar una marca, poner el frasco volumétrico en un
baño de hielo por 15 minutos y filtrar.
Nota importante: La Clarificación de Carrez no puede ser utilizada en la preparación de
muestras para determinar ácido cítrico debido a una muy baja velocidad de recuperación
(adsorción de ácido cítrico)
Si se va a determinar la adición de ácido cítrico libre, ácido cítrico esterificado – por
ejemplo ésteres de ácido cítrico de polifenoles o antocianinas – el éster puede ser
convertido a ácido libre por hidrólisis alcalina. Proceda como se muestra abajo en el
“vino”.
11. EJEMPLOS DE APLICACIONES146
✓ Determinación de ácido cítrico en jugos de frutas, bebidas refrescantes, té y
bebidas similares: Remover turbiedades por filtración y diluir la muestra para obtener
una concentración de ácido cítrico entre 0,04 y 0,4 g/ . La solución diluida puede
L
usarse para el ensayo aún cuando está coloreada. Únicamente los jugos
intensamente coloreados pueden ser decolorados cuando se usen sin diluir para los
ensayos por su baja concentración de ácido cítrico. En tales casos, el procedimiento a
seguir es:
Mezclar 10 mL de jugo y 0,1 g de poliamida o polivinilpolipirrolidona (PVPP), agitar
por 1 minuto y filtrar. Usar el clarificador, colorear levemente la solución para el
ensayo, neutralizar, si es necesario.
✓ Determinación de ácido cítrico en vino: Colorear levemente el vino a usar
directamente para el ensayo o después de la dilución de acuerdo con la tabla de
dilución. Los vinos de coloración oscura tienen que ser decolorados cuando se usan
directamente para el ensayo, especialmente con un incremento del volumen de
muestra porque su concentración de ácido cítrico es baja:
Mezclar 10 mil de vino y 0,1 g de poliamida o PVPP, agitar por 1 minuto y filtrar. Usar
el clarificador o colorear la solución levemente para el ensayo.
✓ Determinación de ésteres de ácido cítrico en vino: Calentar 20 mL de muestra y 6
mL de hidróxido de potasio alcohólico (aproximadamente 2 mol/ de metanol o etanol)
L
por 10 minutos a condensador de reflujo mientras se agita, dejar enfriar a temperatura
ambiente y neutralizar con ácido sulfúrico (2 mol/ ). Transferir cuantitativamente 50 mL
L
a un frasco volumétrico y hasta la marca con agua destilada. Usar directamente la
muestra para el ensayo o después de la dilución, si es necesario (= ácido cítrico total,
el cual es la suma del libre y ácido cítrico esterificado).
✓ Determinación de ácido cítrico en cerveza: Para remover el ácido carbónico, agitar
aproximadamente 5 - 10 mL de cerveza por 1 minuto con un agitador de vidrio o filtro.
La muestra de cerveza libre de CO es usada para los ensayos sin diluir.
2
✓ Determinación de ácido cítrico en pan, productos de carne, queso, vegetales y
productos de frutas: Triturar aproximadamente 20 – 50 g del material de muestra
(usando por ejemplo, un mortero, un triturador de carne o un homogenizador). Pesar
exactamente aproximadamente 10 g de la muestra bien mezclada dentro de un beaker
homogenizador y adicionar 50 mL de ácido perclórico (1 mol/ ); homogenizar por 2
L
minutos (por encima de 10 minutos) con el homogenizador. El resultado calentarlo
hasta 35 ºC. Centrifugar para homogenizar. Ajustar 20 mL del sobrenadante a pH 8 –
10 con aproximadamente 4 mL (medido del volumen de HOH que fue necesario) de
solución de hidróxido de potasio (5 mol/ ). Llevar la solución al refrigerador por 15
L
minutos para la precipitación cuantitativa del perclorato de potasio formado, filtrar y
desechar los primeros mL. Usar el filtrado directamente para el ensayo o después de
la dilución de acuerdo con la tabla de diluciones.
Para calcular el contenido (en g/ ) conforme a la fórmula mencionada (ver cálculos)
100 g
se necesita el contenido de la muestra en la solución muestra. Aplicando la
preparación de la muestra mencionada arriba y considerando el contenido de agua de
la muestra, el peso de la muestra se calcula por la siguiente fórmula:147
a×1000 × d ( )
Peso = g/L
muestra (b + a× w)×(b + e) solución de muestra
a: Peso de la muestra, g
b: Volumen de ácido perclórico, mL
d: Volumen de sobrenadante para ajustar el pH, mL
e: Volumen de KOH para ajustar pH a 8 – 10, mL
w: Contenido de agua en la muestra %;w w
100
1000: Factor para expresar g en mg
(La gravedad específica del agua para la muestra a temperatura ambiente es
aproximadamente 1 g/ . Esto puede ser despreciado para los cálculos).
mL
✓ Determinación de ácido cítrico en margarina, aceites comestibles y ungüentos:
Pesar exactamente aproximadamente 5 g de muestra homogénea en un beaker,
adicionar aproximadamente 70 mL de agua destilada y agitar vigorosamente por un
rato en una placa calefactora con agitación magnética, llevar a ebullición. Transferir la
fase acuosa con una pipeta en un frasco volumétrico de 100 mL. Repetir la extracción
con aproximadamente 20 mL de agua destilada.
Dejar enfriar el frasco a temperatura ambiente y completar hasta la marca con agua
destilada. Llevar el frasco por 15 minutos a un baño de hielo o en el refrigerador.
Filtrar a través de un papel filtro. De acuerdo con la concentración de ácido cítrico
esperada. Usar el filtrado diluido o sin diluir para el ensayo.
✓ Determinación de ésteres de ácido cítrico (por ejemplo agentes emulsificantes,
ésteres glicérido ácido cítrico): El ácido cítrico que está ligado con monoglicérido o
diglicérido al éster ácido cítrico, respectivamente, se puede determinar en presencia
de ácido cítrico libre (citratos) si la muestra es extraída con cloroformo y el éster es
subsecuentemente saponificado con hidróxido de potasio. En este caso el
procedimiento es el siguiente:
Ebullir la muestra bien picada y homogenizada que contiene aproximadamente 120
mg de éster ácido monoglicérido (por ejemplo éster monooleilcitril glicérido, MW
aproximado 550) o 170 mg de éster ácido cítrico diglicérido (por ejemplo éster
diooleilcitril glicérido, MW aproximado 810) con aproximadamente 50 mL de
cloroformo bajo condensación a reflujo por aproximadamente 2 horas en un frasco de
fondo redondo. Filtrar y lavar con agua el cloroformo. Evaporar el cloroformo en un
evaporador rotatorio. Ebullir el residuo hasta casi secarlo con 25 mL de hidróxido de
potasio metanólico (1 mol/ ) por 10 minutos en condensador a reflujo. Dejar enfriar a
L
temperatura ambiente y neutralizar o acidificar levemente, respectivamente, con
aproximadamente 5 mL de ácido hidroclórico (5 mol/ ). Transferir cuantitativamente a
L
un frasco volumétrico de 100 mL, hasta la marca con agua destilada, mezclar y filtrar.
Use la solución casi clara para el ensayo.
Para la determinación del volumen debe tenerse en cuenta el peso molecular del
glicérido.
12. APLICACIONES ADICIONALES148
El método puede ser usado también en la inspección de papel, cosméticos, detergentes
(Ref. 3.6), farmacéutica, como también en una investigación cuando se está analizando
plasma (Ref. 4.1) suero y orina (Ref. 4.2, 4.3), plasma seminal o esperma (Ref. 4.4, 4.5),
respectivamente, y otros materiales.
Para especificaciones de muestra, tratamiento y estabilidad de la muestra ver Ref. 1.3 y
1.5.
12.1. Determinación de ácido cítrico en orina (Ref. 4.2, 4.3, 4.8): Filtrar o centrifugar la
muestra para separar ingredientes insolubles de la orina. Usar el filtrado o sobrenadante
respectivamente, diluir de acuerdo con la tabla de dilución, si es necesario, para el ensayo
(factor de dilución = F).
Cálculos:
2,900 × ∆A ×F ( )
c = g /L
e ácido cítrico muestra
15,10 × ∆A ×F ( )
c = mmol /L
e ácido cítrico muestra
Longitud de onda 365 nm Hg 340 nm 334 nm Hg
C (g/L) 0,8529 x ∆A x F 0,4603 x ∆A x F 0,4693 x ∆A x F
C (mmol/L) 4,441x ∆A x F 2,397 x ∆A x F 2,443 x ∆A x F
12.2. Determinación de ácido cítrico en suero:
a) Con desproteinización de la muestra (Ref. 4.2, 4.3, 4.8): Mezclar 1 mL de suero
con 1 mL de ácido perclórico helado (1 mol/ ) y centrifugar. Neutralizar 1 mL de
L
sobrenadante con 0,500 mL de solución de carbonato de potasio (0,3 mol/ ).
L
Incubar por 10 minutos a 0 – 4 ºC y filtrar. Usar el filtrado para el ensayo (volumen
de muestra v = 0,200 mL, si es necesario incrementar el volumen de muestra,
tomar en cuenta el volumen de muestra alterado).
El factor de dilución F (dependiendo de la preparación de la muestra) se obtiene
del volumen de muestra (1 mL), el volumen de ácido perclórico (1 mL), el volumen
de sobrenadante (1 mL), el volumen de la solución de carbonato de potasio (0,5
mL), la gravedad específica del material de muestra (1,03 g/ suero) y la fracción
mL
de líquido (0,92 en el caso del suero):
1×1,03 × 0,92 + 1 1+ 0,5
F = × = 2,92
1,000 1
Cálculos:149
2,900 × ∆A ×F ( )
c = g /L
e ácido cítrico muestra
15,10 × ∆A ×F ( )
c = mmol /L
ε ácido cítrico muestra
Longitud de onda 365 nm Hg 340 nm 334 nm Hg
c (g/L) 2,491 x ∆A 1,344 x ∆A 1,370 x ∆A
c (mmol/L) 12,97x ∆A 6,999 x ∆A 7,135 x ∆A
b) Sin desproteinización de la muestra (Ref. 4.1): Usar suero o plasma para el
ensayo, diluido con solución de cloruro de sodio fisiológico, si es necesario (factor
de dilución = F)
Cálculos:
2,900 × ∆A ×F ( )
c = g /L
ε ácido cítrico muestra
15,10 × ∆A ×F ( )
c = mmol /L
ε ácido cítrico muestra
Longitud de onda 365 nm Hg 340 nm 334 nm Hg
c (g/L) 0,8529 x ∆A x F 0,4603 x ∆A x F 0,4693 x ∆A x F
c (mmol/L) 4,441x ∆A x F 2,397 x ∆A x F 2,443 x ∆A x F
c) Después de filtrar por membrana la muestra (Ref 4.8): Filtrar el suero usando un
filtro de membrana para retener proteínas con una masa molecular por encima de
40000 Daltons. Usar el filtrado para el ensayo después de la dilución acorde con
la tabla de dilución, si es necesario (Factor de dilución = F).
Cálculos:
2,900 × ∆A ×F ( )
c = g /L
ε ácido cítrico muestra
15,10 × ∆A ×F ( )
c = mmol /L
ε ácido cítrico muestra
Longitud de onda 365 nm Hg 340 nm 334 nm Hg
c (g/L) 0,8529 x ∆A x F 0,4603 x ∆A x F 0,4693 x ∆A x F
c (mmol/L) 4,441x ∆A x F 2,397 x ∆A x F 2,443 x ∆A x F
Nota: La fracción de líquido de suero es 0,92, y la fracción sólida es 0,08. De este
modo el resultado obtenido después de la filtración por membrana es superior al
resultado obtenido sin desproteinización de la muestra.150
12.3. Determinación de ácido cítrico en plasma seminal o esperma,
respectivamente:
a) Con desproteinización de la muestra (Ref 4.4, 4.5): Mezclar 0,100 mL de esperma
con 3,900 mL de ácido perclórico (0,3 mol/ ), poner la mezcla en un baño de hielo
L
por 5 – 10 minutos y centrifugar. Mezclar 2 mL de sobrenadante con 1 mL de
solución de carbonato de potasio (0,75 mol/ ), poner la mezcla nuevamente en un
L
baño de hielo por 15 minutos y volver a centrifugar. Usar el sobrenadante para la
determinación de ácido cítrico (y D-fructosa).
El factor de dilución (F = 60) se obtiene de la preparación de la muestra llevada a
cabo arriba. La gravedad específica del material de muestra y la fracción de
líquido son despreciados, también la fracción sólida del precipitado (perclorato de
potasio).
Cálculos:
2,900 × ∆A ×F ( )
c = g /L
ε ácido cítrico muestra
15,10 × ∆A ×F ( )
c = mmol /L
ε ácido cítrico muestra
Longitud de onda 365 nm Hg 340 nm 334 nm Hg
C (g/L) 51,18 x ∆A 27,62 x ∆A 28,16 x ∆A
C (mmol/L) 266,5x ∆A 143,8 x ∆A 146,6 x ∆A
b) Sin desproteinización de la muestra (Ref. 4.7): Centrifugar el esperma y diluir el
sobrenadante con agua destilada en una relación de 1:20 (1+19). La muestra
diluida es usada para la determinación de ácido cítrico (y D-fructosa). Factor de
dilución F = 20.
Cálculos:
2,900 × ∆A ×F ( )
c = g /L
ε ácido cítrico muestra
15,10 × ∆A ×F ( )
c = mmol /L
ε ácido cítrico muestra
Longitud de onda 365 nm Hg 340 nm 334 nm Hg
C (g/L) 17,06 x ∆A 9,206 x ∆A 9,385 x ∆A
C (mmol/L) 88.82x ∆A 47,94 x ∆A 48,87 x ∆A
12.4. Determinación de ácido cítrico en muestras de fermentación y medio de
cultivo celular: Poner la muestra (después de centrifugar, si es necesario) en un
baño de agua a 80 ºC por 15 minutos para detener la reacción enzimática. Centrifugar
y usar el sobrenadante (diluir de acuerdo con la tabla de dilución si es necesario) para151
el ensayo. Alternativamente, la desproteinización puede llevarse a cabo con ácido
perclórico. Ver los ejemplos mencionados arriba.152
ANEXO I
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE PROTEÍNA POR EL
MÉTODO DE BIURET
1. REACTIVOS
(cid:131) 1,5 g de CuSO .5H O
4 2
(cid:131) 6 g de NaKC H O
4 4 6
(cid:131) Solución de NaOH ó KOH al 10%
(cid:131) Agua destilada
(cid:131) Albúmina de suero de bovino o albúmina de huevo estandarizada (disolver 100
mg de proteína en 10 mL de agua destilada) para realizar la curva patrón.
2. PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR LA SOLUCIÓN DE BIURET
1. Disolver los 1,5 g de CuSO .5H O y los 6 g de NaKC H O en 500 mL de agua
4 2 4 4 6
destilada.
2. Adicionar a la solución anterior 300 mL de NaOH ó KOH al 10% agitando
constantemente.
3. Diluir a 1 L con agua destilada y guardar en una botella de polietileno.
3. PROCEDIMIENTO PARA LA CURVA PATRÓN.153
1. Pipetear una cantidad conocida de proteína estandarizada y una de agua
destilada tal como se muestra en la siguiente tabla, y llevar a un tubo de
ensayo.
Tubo Volumen estándar Volumen de agua Concentración O.D.
550
(mL) (mL) estándar (mg/mL)
1ª 0 1,00 0 Poner a 0
2 0,10 0,90 1,0
3 0,25 0,75 2,5
4 0,50 0,50 5,0
5 0,75 0,25 7,5
6 1,00 0 10,0
a Reactivo blanco.
2. Adicionar 4 mL de solución Biuret, mezclar y dejar reposar por 30 minutos a
temperatura ambiente.
3. Leer la densidad óptica a 550 nm en un espectrofotómetro.
4. Graficar la absorbancia a 550 nm contra la concentración de proteína
estandarizada.154
ANEXO J
DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE AZÚCARES REDUCTORES TOTALES
UTILIZANDO ÁCIDO DINITROSALICÍLICO
1. REACTIVOS
(cid:131) 15,7 g de NaOH ó KOH
(cid:131) 8,8 g de DNS (ácido dinitrosalicílico)
(cid:131) 32,5 g de Tartrato de sodio y potasio tetrahidratado
(cid:131) 10 g de Fenol en cristales
(cid:131) 5 g de NaHSO
3
(cid:131) Agua deionizada
2. PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES
(cid:131) Solución A: disolver 13,5 g de NaOH ó KOH en 300 mL de agua deionizada.
(cid:131) Solución B: disolver 8,8 g de DNS con 32,5 g de Tartrato de sodio y potasio en
800 mL de agua deionizada.
(cid:131) Solución C: mezclar las soluciones A y B.
(cid:131) Solución D: disolver 2,2 g de NaOH ó KOH con 10 g de fenol en cristales en
100 mL de agua deionizada.
(cid:131) Solución de bisulfito de sodio: disolver 5 g de NaHSO en 25 mL de agua
3
deionizada.155
(cid:131) Reactivo DNS: adicionar 69 mL de la solución D y 23,2 mL de la solución de
bisulfito a la solución C.
3. PROCEDIMIENTO
1. Tomar 0,5 mL de la solución muestra y ponerlos en un tubo de ensayo tapa
rosca.
2. A este tubo adicionar 0,5 mL de KOH 1m Y 1,5 de reactivo DNS
3. Calentar en agua a ebullición por 5 minutos, inmediatamente poner en un baño
de agua – hielo por 5 minutos.
4. Pasado este tiempo adicionar 9,5 mL de agua destilada, mezclar y dejar
reposar por 30 minutos a temperatura ambiente.
5. Leer la absorbancia en un espectrofotómetro a 540 nm, utilizando siempre el
blanco.
4. PROCEDIMIENTO CURVA DE CALIBRACIÓN BASA EN LACTOSA
1. Preparar soluciones patrones de lactosa de 100, 200, 300, 400, 500 y 600
mg/L.
2. Realizar los pasos anteriormente mostrados, leyendo la absorbancia a 540 nm.156
ANEXO K
BIORREACTOR APPLIKON
Este biorreactor, es un microfermentador esterizable, enchaquetado y con
agitación. El recipiente está construido en vidrio, y la tapa con todos sus
accesorios en acero inoxidable 316.
Descripción:
La tapa tiene orificios especiales para cada uno de los accesorios, y esos son:
➢ Un orificio central para ensamblar el agitador, el cual se acopla directamente al
motor, esta operación es libre de contaminación. Este debe ser
desensamblado, limpiado y lubricado dos veces al año.
➢ Un orificio de 6,75 in para el sensor de oxígeno disuelto.
➢ Trece orificios de diferentes dimensiones para otro tipo de sensores: pH, nivel,
temperatura, etc., y accesorios como pipetas y mangueras.
➢ Un orifico roscado especial para conectar el condensador por el cual son
eliminados los gases producidos, para así evitar la contaminación del medio y
sobrepresionamiento del equipo.
➢ Otro orificio roscado más pequeño para ensamblar el tubo tomamuestras por el
cual se puede extraer la muestra libre de células.157
➢ Seis orificios especiales para los tornillos de ensamble entre la tapa y el
recipiente de vidrio.
➢ Un pozo que tiene contacto directo con el medio al cual se le agrega un líquido
con buena transferencia de calor para introducir el termómetro y hacer las
lecturas a la temperatura interna.
Especificaciones:
➢ Capacidad:
- Volumen total: 3,2 L
- Volumen óptimo de trabajo: 2,7 L
- Volumen mínimo de trabajo: 0,47 mL
- Volumen interno de la chaqueta: 1.3 L
➢ La chaqueta puede ser usada para calentamiento o enfriamiento y gracias a
esta el control de la temperatura puede ser más exacto.
➢ La esterilización debe hacerse en autoclave a 121 °C durante 30 minutos, y
este solo puede abrirse cuando la temperatura sea menor de 90 °C, para evitar
cambios bruscos de presión que puedan dañar el equipo.
➢ La limpieza del equipo debe hacerse con etanol al 70% u otro limpiador
sustituto, no utilizar material abrasivo.
Procedimiento de esterilización:
Llenar el nivel con medio de cultivo, este no debe exceder el volumen total de 3 L
que es especificado, siendo este volumen suficiente para las adiciones posteriores
a la esterilización (inoculación, separación de nutrientes, etc.). Cerrar con la mano
seis de las tuercas en forma cruzada.158
Verifique que se encuentre en su lugar todos los soportes de los niples y demás
auxiliares. Se debe hacer antes de llevar a cabo esta operación, las conexiones
adicionales entre el aire y el líquido y la salida de condensados con manguera de
silicona u otro material esterilizable. Debe de utilizarse en la salida y entrada de la
corriente de aire, filtros apropiados y se debe evitar que durante la esterilización
penetre agua a los filtros. Con tal fin se debe usar una abrazadera entre la
manguera que comunica la entrada y salida de gases del intercambio y los filtros.
Se debe cerrar todas las conexiones, excepto la salida de aire evitando así el
sobrepresionamiento del equipo.
Procedimiento para la toma de muestras:
Se debe adecuar el biorreactor con una línea de toma de muestras, la cual puede
ser una manguera esterilizable de diámetro interno pequeño, creándose vacío con
una jeringa estéril para succionar la muestra. Es recomendable tomar siempre un
volumen constante de muestra para crear homogeneidad en los datos.
Esta operación debe hacerse con guantes, tapa boca y mecheros encendidos
alrededor, para garantizar condiciones asépticas y así evitar contaminaciones en
el caldo de cultivo.159
ANEXO L
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE BIOMASA
Cuando se va a determinar la población celular de un microorganismo filamentoso,
se recomiendan los siguientes pasos:
1. Tomar una muestra de 10 mL del líquido de fermentación y centrifugarla en
unos tubos de ensayo previamente pesados, por 15 minutos para recuperar la
biomasa contenida en ella.
2. Separar el sobrenadante de la biomasa utilizando un gotero.
3. Secar en estufa a 100 ºC por unas 12 horas hasta peso constante.160
ANEXO M
FICHA TÉCNICA DE LA ENZIMA MAXILACT DMS
DESCRIPCIÓN
MAXILACT es una preparación líquida purificada de lactasa aislada a partir de la
levadura láctea Kluyveromyces maxianus var lactis.
CARACTERÍSTICAS Y DATOS TÉCNICOS
MAXILACT hidroliza el azúcar de la leche – lactosa disacárido en 2
monosacáridos: glucosa y galactosa. Las condiciones de la reacción como
temperatura, acidez (pH), tiempo de proceso, concentración de lactosa y
dosificación de MAXILACT determiann la viscosidad de la reacción.
Como MAXILACT se deriva de una levadura láctea, las condiciones óptimas de
reacción son las de una leche natural:
(cid:131) pH = 6,6 –6,8
(cid:131) Temperatura = 35 – 40 ºC
No obstante MAXILACT es también activa a bajas temperaturas de hasta 4 ºC, lo
que permite hidrolizar la leche o suero durante el almacenaje nocturno.
CARACTEÍSTICAS FÍSICAS161
Es un líquido de color ámbar claro, opaco y viscoso, con una densidad de 1,20
g/mL.
De acuerdo al comité de expertos FAO/WHO, sobre aditivos alimenticios, las
especificaciones generales para preparaciones enzimáticas empleadas en la
industria procesadora de alimentos son:
CALIDAD MICROBIOLÓGICA
Recuento total viable ≤ 5*104 UFC en 1 g
Coliformes ≤ 30 en 1 g
Salmonella Neg. en 25 g
E. coli Neg. en 25 g
Actividad antimicrobiana Neg. a la prueba
ESPECIFICACIONES QUÍMICAS
Arsénico No más de 3 ppm
Plomo No más de 10 ppm
Metales pesados No más de 40 ppm
El MAXILACT es un producto bajo la norma ISO9002 de aseguramiento de la
calidad.
INHIBIDORES Zinc, calcio en altas concentraciones,
cobre y sodio.
ACTIVADORES Magnesio, potasio y fosfatos.162
APLICACIONES
(cid:131) Leche y productos lácteos.
(cid:131) Leche hidrolizada.
(cid:131) Uso en panadería y bizcochería.
(cid:131) Dulcería.
ALMACENAMIENTO
(cid:131) Debe almacenarse bajo refrigeración.
(cid:131) Si se almacena a una temperatura ≤ 5 ºC mantiene su actividad declarada por
seis meses.
(cid:131) No se debe congelar.
PRECAUCIONES DE MANEJO
No debe manipularse con las manos ni inhalarse. Puede causar sensibilización, es
decir, debe evitarse el contacto directo con el producto. En caso de derramamiento
o contacto con la piel o los ojos, enjuagarse con abundante agua inmediatamente.
DOSIFICACIÓN
La dosis de la enzima depende del producto a fabricar, del grado de hidrólisis
deseado y de las condiciones del proceso. Las dosis estimadas que se dan a
continuación están calculadas para un contenido del 5% de lactosa en leche o
suero, que es el contenido normal de lactosa en la leche. Para concentraciones
más elevadas de lactosa se debe aumentar la cantidad de MAXILACT
proporcionalmente.163
Dosificación de Tiempo de reacción Temperatura de Grado de hidrólisis
Maxilact L 2000 (Horas) reacción (ºC) (%)
(ml/L)
0,3 - 0,5 10 5 20
0,1 - 0,2 24 5 20
0,5 - 0,9 1 30 20
0,1 - 0,2 4 30 20
0,2 - 0,4 1 40 20
0,05 - 0,1 4 40 20
1,0 - 1,6 10 5 50
0,5 - 0,7 24 5 50
2,1 - 3,1 1 30 50
0,5 - 0,8 4 30 50
0,9 - 1,4 1 40 50
0,2 - 0,4 4 40 50
3,5 - 5,4 10 5 80
1,5 - 2,2 24 5 80
6,9 - 10,4 1 30 80
1,7 - 2,6 4 30 80
2,9 - 4,4 1 40 80
0,7 - 1,1 4 40 80164
ANEXO N
FOTOS DE LOS DIFERNTES TIPOS DE SUERO DESPUÉS DE LA
FERMENTACIÓN CON Aspergillus niger NRRL3
Vista frontal de los sueros entero y desproteinizado
Vista superior del suero entero Vista superior del suero desproteinizado165
Vista frontal de los sueros desproteinizado, hidrolizado, y desproteinizado, hidrolizado y
evaporado
Vista superior del suero desproteinizado, Vista superior del suero desproteinizado,
hidrolizado. hidrolizado, evaporado.166
ANEXO Ñ
FOTOS DEL BIORREACTOR DURANTE LA FERMENTACIÓN
Vista frontal del biorreactor al segundo día de la fermentación, donde se aprecia en la
parte superior del medio de cultivo una gruesa capa de espuma y biomasa.167
En esta fotografía se puede observar la calidad de la biomasa formada al segundo días de
la fermentación.
En la siguiente fotografía se puede observar cómo se ha disminuido el nivel del medio de
cultivo al 6 día de fermentación, como consecuencia de la formación de espuma en la
etapa inicial del proceso fermentativo (el nivel del medio se encontraba en la parte
superior de la marca).168
En la fotografía se puede observar el aumento de la cantidad de biomasa al sexto día de
fermentación.