Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de  la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Autor: Perdomo Díaz, Alexandra
Asesor: Fontanilla Duque, Martha Raquel (Thesis advisor)
Fecha: 2014
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: La tendencia actual en la ingeniería de tejidos es el empleo de las células madre  mesenquimales (MSCs) aisladas de tejidos adultos, hay un gran interés en el uso de  células madre de la pulpa dental (DPSCs) para la regeneración del tejido dental. Por ello,  el propósito de este estudio fue realizar una revisión narrativa de la literatura científica  disponible para la obtención de muestra, aislamiento y caracterización in vitro de células  madre (SCs) mesenquimales derivadas de la pulpa de dientes permanentes humanos.  Se observa que a partir del tejido pulpar de dientes permanentes humanos es posible  aislar y cultivar MSCs con características clonogénicas. Las DPSCs presentan expresión  de marcadores de superficie de células madre mesenquimales como CD105, CD73 y  CD90, propuestos por la sociedad internacional para la terapia celular (ISCT) como un  estándar para definir MSCs humanas para procesos de investigación científica en  laboratorio y para estudios preclínicos. No obstante, es necesario realizar estudios  encaminados a la identificación de marcadores propios para DPSCs.

Metodología sobre obtención de muestra,
cultivo y caracterización in vitro de células
madre mesenquimales humanas obtenidas
de la pulpa de dientes permanentes.
Revisión narrativa de la literatura
Alexandra Perdomo Díaz
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Odontología, Especialidad en Endodoncia
Bogotá, Colombia
2014Metodología sobre obtención de muestra,
cultivo y caracterización in vitro de células
madre mesenquimales humanas obtenidas de
la pulpa de dientes permanentes. Revisión
narrativa de la literatura
Alexandra Perdomo Díaz
Tesis o trabajo de investigación presentada(o) como requisito parcial para optar al título
de:
Especialista en Endodoncia
Director:
Magíster en Ingeniería Biomédica, Javier Laureano Niño
Codirectora:
PhD Microbiología, Martha Raquel Fontanilla
Asesor metodológico:
PhD Salud pública, John Harold Estrada Montoya
Línea de Investigación:
Endodoncia regenerativa
Grupo de Investigación:
Invendo
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Odontología, Especialidad en Endodoncia
Bogotá, Colombia
2014(Dedicatoria)
A Dios por las oportunidades que me
brinda, por ser mi guía y compañía en
cada camino que recorro.
A mis padres por su apoyo incondicional,
ejemplo de superación, lucha y entrega
en cada acto que realizan. Son mi motor,
fuerza y motivación.Agradecimientos
Expreso un sincero agradecimiento a la Doctora Martha Raquel Fontanilla Duque,
PhD en microbiología, por su colaboración, continua asesoría, por compartir sus
conocimientos en el área de la regeneración y en especial por su interés en la adecuada
elaboración del proyecto y sus aportes durante el desarrollo del documento.
Al Doctor John Harold Estrada Montoya, PhD en salud pública, por su aporte en la
metodología e ideas innovadoras para la generación de este trabajo de grado.
Al director del presente trabajo de grado por la revisión y correcciones que sugirió para el
desarrollo del proyecto.Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales IX
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Resumen
La tendencia actual en la ingeniería de tejidos es el empleo de las células madre
mesenquimales (MSCs) aisladas de tejidos adultos, hay un gran interés en el uso de
células madre de la pulpa dental (DPSCs) para la regeneración del tejido dental. Por ello,
el propósito de este estudio fue realizar una revisión narrativa de la literatura científica
disponible para la obtención de muestra, aislamiento y caracterización in vitro de células
madre (SCs) mesenquimales derivadas de la pulpa de dientes permanentes humanos.
Se observa que a partir del tejido pulpar de dientes permanentes humanos es posible
aislar y cultivar MSCs con características clonogénicas. Las DPSCs presentan expresión
de marcadores de superficie de células madre mesenquimales como CD105, CD73 y
CD90, propuestos por la sociedad internacional para la terapia celular (ISCT) como un
estándar para definir MSCs humanas para procesos de investigación científica en
laboratorio y para estudios preclínicos. No obstante, es necesario realizar estudios
encaminados a la identificación de marcadores propios para DPSCs.
Palabras clave: Células madre, pulpa dental, técnicas de cultivo celular, ingeniería de
tejidos, revisiónX Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Abstract
The actual tendency to tissue engineering is make use of mesenchyme stem cells
(MSCs) derivative from adult tissue and there is an increasing interest in the utility of
dental pulp stem cells (DPSCs) for dental tissue regeneration. For this reason the
purposes of this study were make a review of the scientist literature available about the
obtaining for the sample, isolation and characterization in vitro of (MSCs) originating of
the permanent teeth pulp human. One considers that the pulp tissue is appropriate to the
isolation and culture of (MSCs) with clonogénicas characteristics. The DPSCs express
mesenchyme stem cell surface markers CD105, CD73 and CD90, proposes for the
Mesenchyme and Tissue Stem Cell Committee (ISCT) a set of standards to define
human MSC for both laboratory-based scientific investigations and for pre-clinical studies.
Nevertheless, there is a necessity to recognize own cell surface markers to DPSCs.
Keywords: Stem cells, dental pulp, cell culture techniques, tissue engineering, reviewMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales XI
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Contenido
Pág.
Resumen …………………………………………………………………………………………IX
Abstract …………………………………………………………………………………………..X
Lista de figuras ………………………………………………………………………………..XV
Lista de tablas ………………………………………………………………………………..XVII
Lista de símbolos y abreviaturas ……………………………………………………...…XVIII
Introducción………………………………………………….…………………………………...1
Planteamiento del problema …………………………………………………………………..4
Pregunta de investigación …………………………………………………………………….7
Justificación ……………………………………………………………………………………...8
Objetivos ………………………………………………………………………………………...10
Diseño metodológico …………………………………………………………………………11
Criterios de inclusión y exclusión ………………………………………………………….13
Descripción bibliométrica ……………………………………………………………………14
1. Desarrollo dental ………………………………………………………………………….17
1.1 Evolución dental ……………………………………………………………………17
1.2 Etapas del desarrollo dental ……….…………..…………………………………19
1.2.1 Estadío de iniciación …….…………………………...…………………….20
1.2.2 Estadío de brote …………………………………………………………….21
1.2.3 Estadío de casquete ……….……………………………………….21
1.2.4 Estadío de campana ……….……………………………………….21
2. Características de la pulpa dental ……………………………………………………..23
2.1 Características anatómicas de la pulpa dental……………….………………...23XII Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
2.2 Características histológicas de la pulpa dental ………………………..25
2.3 Funciones de la pulpa dental …………..……….………………………26
2.3.1 Inductora…………………………………………………………….27
2.3.2 Formativa …………………………………………………………...27
2.3.3 Nutritiva ……………………………………………………………..27
2.3.4 Sensitiva …………………………...……………………………….27
2.3.5 Defensiva o reparadora …………………………………………...27
2.4 Matriz extracelular de la pulpa dental ……………………..……………28
2.5 Células de la pulpa dental …………………..……………………………28
2.5.1 Odontoblastos ……………………………………………………...29
2.5.2 Fibroblastos ………………………………………………………...29
2.5.3 Células mesenquimales indiferenciadas ………………………..29
2.5.4 Células inmunes …………………………………………………...30
3. Patologías que afectan la integridad de la pulpa dental …………………………..31
4. Tratamiento de las patologías de la pulpa dental …………………………………..33
4.1 Prevención del daño pulpar ……………………………………………...34
4.2 Tratamientos para patologías reversibles ………………………………34
4.2.1 Recubrimiento pulpar indirecto …………………………………..34
4.2.2 Recubrimiento pulpar directo…………………...………….……..34
4.3 Tratamientos para patologías irreversibles……….…………………….35
4.3.1 Amputación pulpar…….……………...……………………………35
4.3.2 Pulpectomía…………………….…………………………………..35
4.3.3 Tratamiento de conductos radiculares…………………………..35
4.3.4 Cirugía apical……………………….………………………………36
4.3.5 Incisión y drenaje…………...…….………………………………..36
4.3.6 Resección dental……………………….…………………………..36
4.3.7 Extracción con reimplantación……...….…………………………36
4.4 Manejo de dientes con trauma ……………………….…………………..37
5. Limitaciones de los tratamientos empleados para patologías pulpares ……….38Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales XIII
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
6. Regeneración y reparación ……………………………………………………………..40
6.1 Moléculas de señalización ………………………………………………………..42
6.2 Scaffold o andamios ……………………………………………………………….44
6.2.1 Materiales de los andamios ……………………………………………….44
6.3 Células madre ……………………………………………………………………...44
6.3.1 Potencialidad de células madre …………………………………………..44
6.3.2 Clasificación de células madre ……………………………………………45
6.3.3 Inmunofenotipo mesenquimal de células madre………………...………46
6.3.4 MSCs derivadas de los tejidos dentales …………………...…………….46
6.3.5 Caracterización de MSCs derivadas de los tejidos dentales ……...…..54
6.3.6 Aplicación de las células madre en la regeneración ……………..…….58
6.3.7 Aplicación de las células madre en la odontología ……………...……...59
7. Metodologías sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de
MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes ……...……………………….….62
7.1 Obtención de la muestra de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes
permanentes ……………………………………………………………………………………..62
7.1.1 Selección del paciente ……………………………………………………...62
7.1.2 Características de los dientes empleados……………………………......66
7.1.3 Método de extracción pulpar.……………………………………………...77
7.1.4 Aislamiento del tejido pulpar ……………………………………………….80
7.2 Cultivo in vitro de MSCs obtenidas de pulpa de dientes permanentes………...83
7.2.1 Medio de cultivo celular para DPSCs ……………………………………..83
7.2.2 Pasajes o subcultivos ……………………………………………………….86
7.3 Caracterización in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes
……………………………………………………………………………………………………..87
8. Propuesta de metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización
in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes
…………………………………………………………………………………………..…………92
8.1 Propuesta para obtención de la muestra de MSCs obtenidas de la pulpa de
dientes permanentes ……………………………………………………….…………………..92XIV Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
8.1.1 Selección del paciente ……………………………………………………...93
8.1.2 Características de los dientes empleados……………………………......94
8.1.3 Método de extracción pulpar.……………………………………………...96
8.1.4 Aislamiento del tejido pulpar ……………………………………………….96
8.2 Propuesta para cultivo in vitro de MSCs obtenidas de pulpa de dientes
permanentes ……………………………………………………………………………………..96
8.2.1 Medio de cultivo celular para DPSCs ……………………………………..96
8.2.2 Pasajes o subcultivos…………….………………………………………….97
8.3 Propuesta para caracterización in vitro de MSCs obtenidas de pulpa de dientes
permanentes …………………….………………………………………………..……………..98
9. Conclusiones y recomendaciones………………….………………………………..99
9.1 Conclusiones…………………….……………………………………………….....99
9.2 Recomendaciones………………….……………………………………………..101
A. Anexo. Matriz de metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de
muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de
dientes permanentes ………………………………………..............................................103
B. Anexo. Folleto informativo para pacientes que serán incluidos en futuros
estudios experimentales para obtención de muestra, cultivo y caracterización in
vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes
………………………………………………………………………………………….……...…125
Bibliografía………………………………………….………………………………………....127Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales XV
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Lista de figuras
Pág
Figura A Descripción bibliométrica……………………………………………………………14
Figura 1.1 Estadíos del desarrollo dental (22)……………………………………………….22
Figura 2.1 Características anatómicas de la pulpa dental (22) ……………………………24
Figura 2.2 Zonas histológicas de la pulpa dental (25)………………………….…………...26
Figura 5.1 Número de errores de tratamiento endodóntico en fases pre, intra y post-
operatoria (9)………………………………………….………………………………………….39
Figura 6.1 Reparación y regeneración de las heridas (28)……………………….………...41
Figura 6. 2 Los tres elementos clave para la ingeniería de tejidos (16)……………….….42
Figura 6. 3 Reportes de células madre en orden cronológico (33) ……………………….47
Figura 6.4 Cito-arquitectura de DPSCs humanas (17)………………………………….…..48
Figura 6.5 Ubicación de SCs de origen dental (16)……………………….………………...49
Figura 6.6 SCs de origen dental (33)………………………….………………………………50
Figura 6.7 Papila apical (21)…………………………………………………………………...51
Figura 6.8 Ligamento periodontal (21)…………………………….………………………….53
Figura 6.9 Regeneración pulpar por medio de la técnica de homing celular (29)………..59
Figura 6.10 Empleo de SCs dentales en regeneración dental (8) ………………………..61
Figura 7.1 Tercer molar superior e inferior (70) ……………………………………………..66XVI Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Figura 7.2 Estudio radiográfico mínimo para proceso de exodoncia (65)………….……..69
Figura 7.3 Número de DPSCs x 106 después de 14 días (64)………………….………….75
Figura 7.4 Método de extracción pulpar por medio de corte a nivel CEJ (48)…………...77
Figura 7.5 Método de extracción pulpar por medio de corte a nivel CEJ (50)……………78
Figura 7.6 Corte longitudinal de molar (72) ……………………………………………….…78
Figura 7.7 Método de extracción pulpar de diente 21 y 22 (62)…………………….….….79
Figura 7.8 Número de células x 104, con método de digestión enzimática y crecimiento
de explante (50)……………………………………………………………………………....….83
Figura 7.9 Aislamiento de DPSCs empleando suero animal y suero humano (73)……...85
Figura 7.10 Inmunofluorescencia de DPSCs (43)………………….………………………..91Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales XVII
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Lista de tablas
Pág
Tabla A. Tipo de referencias bibliográficas…………………………………………………..15
Tabla B. Empleo de referencias bibliográficas en el texto………………………………….15
Tabla C. Distribución por año para referencias de las metodologías……………………...15
Tabla D. Distribución por tipo de estudio para referencias de las metodologías…………15
Tabla 3.1 Desarrollo de necrosis pulpar en los diferentes tipos de trauma dental (16)….32
Tabla 6.1 Factores de crecimiento y sus aplicaciones (29)……………….………………..43
Tabla 6.2 Perfil de expresión de proteínas o genes de diferentes poblaciones de células
madre mesenquimales in vitro (36)…………………………….………………………………56
Tabla 6.3 Expresión de marcadores de células madre dentales. DPSCs; SHED, PDLSC;
DFPC, SCAP, GSC (33).……………………………………….………………………….……57
Tabla 7.1 Expresión de marcadores de DPSCs……...……………………………………..89Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales XVIII
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Lista de Símbolos y abreviaturas
Símbolos con letras griegas
Símbolo Término
α Alfa
β Beta
Abreviaturas
Abreviatura Término
Ag Antígeno de superficie
ADN Acido desoxirribonucleico
ASCs Células madres adultas
BM Médula ósea
BMP Proteína morfogenética ósea
BMSCs Células madre de médula ósea
BMSSC Células madre estromales de médula ósea
CO Dióxido de carbono
2
CD Clúster de diferenciación
CFU-F Unidadad formadora de colonias fibroblásticas
CFU Unidades formadoras de colonias
DPSCs Células madres de la pulpa dental
DMEM Medio Eagle modificado Dulbecco
DFPCs Células progenitoras del folículo dental
DPBS Solución salina de fosfato tamponada de Dulbecco
ESCs Células madres embrionarias
EDTA Ácido etilendiaminotetraacético
EGF Factor de crecimiento epidermal
FACS Separador celular activado por fluorescencia
FCS Suero de ternera fetal
FBS Suero bovino fetal
FGF Factor de crecimiento fibroblástico
HBSS Solución salina balanceada de hank
HSCs Células madre hematopoyéticas
HTS Hipotermosol
IGF-1 Factor de crecimiento insulínico 1
ISCT Sociedad internacional para la terapia celular
ITS Medio suplementado con insulina, transferrina y selenio
MEM Medio esencial mínimoMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales XIX
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
MSCs Células madres mesenquimales
PDLSCs Células madres del ligamento periodontal
PBS Solución salina de fosfato tamponada
PCR Reacción en cadena de la polimerasa
PDGF Factor de crecimiento derivado de plaquetas
RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa
SCAPs Células madre de la papila apical
SHED Células madre de dientes deciduos exfoliados
TGF Factor de crecimiento transformante
VEGF Factor de crecimiento del endotelio vascularMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas
de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
INTRODUCCIÓN
Durante la etapa del desarrollo embrionario, interacciones epitelio–mesénquima
determinan la formación de todos los componentes dentales incluyendo la pulpa (1- 4).
La compleja estructura dental provee dureza y protección, pero a su vez es vulnerable a
lesiones causadas por agentes microbianos, trauma mecánico y/o químico, defectos
congénitos, entre otros (5). Infortunadamente los componentes dentales no poseen la
capacidad para regenerarse después que una lesión genera daños estructurales, pero se
ha observado que pueden presentar procesos reparativos limitados como la formación de
dentina terciaria, la cual es una matriz mineralizada que sirve como barrera protectora de
la pulpa dental cuando las lesiones no han generado daño irreversible en dicho tejido (2).
Diversos tratamientos se han empleado para el manejo de las patologías pulpares:
recubrimientos directos, amputación parcial de la pulpa, instrumentación y obturación del
conducto radicular, cirugías apicales, entre otros. Estos tratamientos han evolucionado
con el tiempo por la creación de nuevos materiales, instrumentos y advenimiento de
técnicas (6) presentando una tasa de éxito relativamente alta (73–98%
aproximadamente) (7, 8), pero desafortunadamente durante su práctica se pueden
presentar errores y accidentes de procedimiento como fracturas de instrumentos,
perforaciones , fractura radicular por la instrumentación exagerada, susceptibilidad a que
la presencia de caries pase inadvertida y progrese por la imposibilidad de respuesta
celular por parte del complejo pulpo-dentinal, llevando a la necesidad de retratamientos,
procedimientos quirúrgicos e incluso exodoncia del diente que ha sido tratado(8, 9).
Debido a los riesgos que se presentan durante el tratamiento endodóntico y gracias a los
avances científicos se han generado terapias para la regeneración de las estructuras
dentales lesionadas, las cuales hacen parte de la ingeniería de tejidos que ha sido
definida como un campo interdisciplinario que aplica los principios de las ciencias de la
vida y de la ingeniería para desarrollar sustitutos biológicos que restauren, mantengan, o
mejoren la función de tejidos y/u órganos lesionados (10, 11).2 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Uno de los elementos claves para la ingeniería de tejidos son las células madre o stem
cell (SC) en inglés, definidas como células con la capacidad de dividirse continuamente
para auto-replicarse o producir células especializadas que pueden diferenciarse en otros
tipos de células o tejidos (diferenciación multilinaje) (3, 5, 10- 13). Basadas en su origen
pueden categorizarse en dos tipos: células madre embrionarias (ESCs) y células madre
postnatales, adultas o somáticas (ASCs) (3, 5, 11-13). Las ASCs a su vez se clasifican
según su origen en células madre hematopoyéticas (HSCs) obtenidas del cordón
umbilical o de la sangre periférica y en células madre mesenquimales (MSCs) que
residen en una variedad de tejidos como la médula ósea, dermis, hígado, pulpa dental,
mucosa bucal, entre otras (5, 13).
Actualmente se contempla la aplicación de terapias que promuevan la regeneración y
mejoren la reparación de los tejidos dentales, a partir de la identificación y aislamiento de
células progenitoras odontogénicas de la pulpa de dientes permanentes llevada a cabo
en un inicio por Gronthos y colaboradores (3, 5, 10, 11, 13, 14).
Al determinar el tipo de célula madre a usar, las células madre de la pulpa dental tienen
ventajas sobre otro tipo de MSCs o HSCs (derivadas de médula ósea, tejido adiposo,
sangre periférica o sangre de cordón umbilical), ya que su fuente son los dientes
extraídos por indicación terapéutica (generalmente dientes permanentes como terceros
molares incluidos o premolares por indicación ortodóntica), lo cual involucra muy baja
morbilidad y pocas implicaciones éticas (15).
Para la odontología moderna es importante realizar una descripción de la metodología
disponible para obtención de muestra, cultivo y caracterización de MSCs humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes, en el que se establezcan las principales
características de las etapas y métodos empleados ya que los estudios presentan
discrepancias que pueden deberse al año de realización, la disponibilidad de insumos,
reactivos y equipos en los laboratorios donde se generaron, experiencia de las personas
a cargo e incluso el presupuesto con el que se contaba para la realización de cada
estudio.
Por tanto el objetivo de este trabajo de grado fue indagar por las etapas y métodos para
la obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs humanas obtenidasMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 3
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
de la pulpa de dientes permanentes reportado en la literatura científica que se encuentra
disponible desde el año 2000.
Esto se llevó a cabo mediante una revisión bibliográfica detallada en diferentes
buscadores como Cochrane Library, PubMed, Medline, Scielo y EMBASE, se obtuvo
artículos científicos de revistas desde diciembre del año 2000 a mayo del 2014. Para
ampliar conceptos importantes se emplearon artículos científicos disponibles de diversas
fechas de publicación. Todos los idiomas se incluyeron en la búsqueda siempre y cuando
el abstrac se presentará en inglés, utilizando las palabras claves seleccionadas desde
MeSH (stem cells, dental pulp, cell culture techniques, tissue engineering, review) los
cuales soportaron el desarrollo de la investigación. Se seleccionaron los artículos y se
realizó la lectura completa de estos. Una vez obtenidos los artículos electrónicamente se
realizó una búsqueda manual de artículos adicionales en los journals que no se revisaron
y finalmente se ejecutó la descripción y comparación de la información.
Al finalizar la revisión se realizó una propuesta de la metodología sobre la obtención de
muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs humanas obtenidas de la pulpa de
dientes permanentes basado en la literatura científica disponible. El producto final de este
trabajo puede ser empleado en futuros estudios experimentales de la Universidad
Nacional de Colombia y llevar a la generación de un banco de dichas células que permita
a la comunidad universitaria realizar proyectos en el campo de las ciencias biomédicas e
ingeniería de tejidos.4 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Planteamiento del problema
El complejo pulpodentinal tiene dos funciones esenciales para la conservación de los
dientes: 1. la microcirculación que proporciona la nutrición, oxigenación, transporte de
desechos metabólicos y regulación de la inflamación, 2. la inervación que contribuye a la
angiogénesis y extravasación de células inmunes para regular la inflamación. El
componente celular de la pulpa está conformado por células especializadas como los
odontoblastos y células del sistema inmune, perivascularmente la pulpa posee células
madre (DPSCs) y fibroblastos que participan en la respuesta a la agresión física, química
o microbiológica a través de la interacción de mecanismos de defensa celular, molecular
y tisular que conducen a la destrucción del antígeno y a la formación de matrices
biomineralizadas de dentina reparativa o reaccionaria, que aíslan al agente agresor y
contribuyen a mantener la vitalidad del tejido pulpar. Por todo esto se considera que el
complejo dentinopulpar tiene un papel fundamental en la homeostasis de los dientes y es
esencial para su longevidad (15).
La caries dental y las lesiones dentales traumáticas exhiben alta prevalencia en la
población mundial y originan patologías pulpares y periapicales que pueden conducir a la
pérdida temprana de los dientes (5, 15, 16). Aunque la tasa de éxito del tratamiento
endodóntico convencional es relativamente alta (73–98%) (7, 8), durante este se pueden
presentar fractura de instrumentos, perforaciones, fractura radicular por la
instrumentación exagerada. Además, estos dientes son susceptibles a que la presencia
de caries pase inadvertida y progrese por la imposibilidad de respuesta celular por parte
del complejo pulpo-dentinal (8, 9).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 5
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
La odontología moderna ha descrito un enfoque prometedor basado en la aplicación de
células madre para regenerar el complejo pulpo-dentinal y restaurar las funciones
comprometidas por lesiones de la pulpa (15).
La célula madre (SC) es definida como una célula progenitora, autorrenovable que tiene
la capacidad de diferenciación (3, 5, 10, 13). Existen dos categorías básicas de células
madre: las células madre embrionarias (ESCs) y las células madre adultas, también
llamadas células madre postnatales o células madre somáticas (ASCs), estas últimas se
subdividen en HSCs y MSCs. Las células madre pueden ser totipotentes, pluripotentes,
multipotentes o unipotentes; es decir, son capaces de formar un ser completo,
diferenciarse en varios tipos de tejido o un tipo de tejido respectivamente. El proceso por
el cual las células madre se derivan de un tipo de tejido y se diferencian en otros tipos de
tejido se denomina plasticidad o transdiferenciación y eestudios recientes indican que las
MSCs pueden generar tipos de células de un tejido completamente diferente al que
residen (3, 5, 13).
Al determinar el tipo de SC a usar, las células madre de la pulpa dental (DPSCs) tienen
ventajas sobre otro tipo de MSCs o HSCs (derivadas de la médula ósea, tejido adiposo,
sangre periférica o sangre de cordón umbilical), ya que su fuente son los dientes
extraídos por indicación terapéutica, lo cual involucra muy baja morbilidad y pocas
implicaciones éticas (15).
Las DPSCs se encuentran en la '' zona rica en células ''. El origen embrionario de la
pulpa dental es la cresta neural, lo cual explica su multipotencia. Actualmente se
encuentra en estudio el uso de DPSCs para la regeneración del tejido dental, y para
facilitar la reparación de los tejidos dentales y huesos observado en investigaciones in
vitro e in vivo. Además, se ha reportado que estas células pueden ser fácilmente
criopreservadas durante largos periodos de tiempo y conservan su multipotencia y
capacidad de producir hueso (17).
La odontología moderna está contemplando la aplicación de terapias que promuevan la
regeneración y mejoren la reparación de los tejidos dentales, a partir de la identificación y
aislamiento de células progenitoras odontogénicos de la pulpa de dientes permanentes6 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
llevada a cabo por Gronthos y colaboradores (3, 5, 10, 11, 13, 14). En éste trabajo se
identificó como DPSCs de dientes permanentes a aquellas con capacidades
clonogénicas, alta tasa de proliferación y capacidad de formar tejidos biomineralizados
tanto in vitro como in vivo (3, 11, 13, 18- 20).
Los procedimientos de obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células
madre de la pulpa descritos en la literatura proponen diferentes métodos. De ahí, la
importancia de realizar una revisión narrativa de la literatura con el fin de identificar
aproximaciones comunes que permitan proponer un método que se pueda aplicar a los
procesos de laboratorio, con la infraestructura y equipos disponibles en la Universidad
Nacional de Colombia. Éste proyecto, propone realizar una revisión bibliográfica que
permita establecer una metodología local de obtención de muestra, cultivo y
caracterización de éstas células.Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 7
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Pregunta de investigación
¿Cuáles son las etapas y métodos descritos en la literatura científica disponible sobre
obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes?8 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Justificación
Los tratamientos endodónticos actuales presentan una tasa de éxito relativamente alta
(73–98%) (7, 8), pero durante este se pueden presentar fractura de instrumentos,
perforaciones, fractura radicular por la instrumentación exagerada. Además, estos
dientes son susceptibles a que la presencia de caries pase inadvertida y progrese por la
imposibilidad de respuesta celular por parte del complejo dentino-pulpar (8, 9).
Es por eso que en los últimos años se ha desarrollado un nuevo campo del conocimiento
muy promisorio para el tratamiento de las patologías pulpares, conocido como
“Endodoncia Regenerativa” que se ha definido como ''el conjunto de procedimientos
biológicos diseñados para reemplazar las estructuras lesionadas, incluyendo la dentina,
pulpa, cemento, tejido conectivo y óseo perirradicular''. El concepto de regeneración del
tejido pulpar fue promulgado por los estudios clásicos de Nygaard-Ostby desde 1961,
quienes evaluaron los efectos del sangrado generado por la sobreinstrumentación del
sistema de conductos radiculares en perros y humanos. Desafortunadamente, el análisis
histológico reveló la reparación de los tejidos, más no la regeneración (16).
Los procesos regenerativos en odontología buscan aplicar los conceptos de la ingeniería
de tejidos para el manejo de los tejidos orales perdidos utilizando tres componentes:
células madre, moléculas de señalización y matrices tridimensionales o andamios (11,
13).
Con el desarrollo de la línea de investigación “Endodoncia regenerativa” en la Facultad
de Odontología de la Universidad Nacional de Colombia, se realizó una comparación de
la metodología basado en la revisión de la literatura científica disponible para la toma de
muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs humanas obtenidas de la pulpa de
dientes permanentes.Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 9
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Este estudio propone una metodología basada en la literatura científica disponible para la
toma de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs humanas obtenidas de la
pulpa de dientes permanentes, que le servirá a la Universidad Nacional de Colombia, ya
que en un futuro se puede implementar y posteriormente contar con un cultivo y banco de
este tipo de células.10 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Objetivos
Objetivo general
1. Indagar por las etapas y métodos sobre la obtención de muestra, cultivo y
caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de
la pulpa de dientes permanentes reportado en la literatura científica
Objetivos específicos
1. Describir los métodos sobre la obtención de muestra, cultivo y caracterización in
vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes
permanentes basado en la revisión de la literatura científica disponible
2. Establecer las diferencias y similitudes relevantes encontradas en la literatura
científica disponible
3. Describir las ventajas de la utilización de algunos métodos reportados en la
literatura científica disponible
4. Proponer las etapas y métodos basado en la revisión de la literatura científica
para la obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre
mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentesMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 11
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Diseño metodológico
Tipo de estudio
Revisión narrativa de la literatura
Revisión y análisis de la literatura
Se realizó la revisión bibliográfica en diferentes buscadores como Cochrane Library,
Scielo, PubMed, Medline y EMBASE, para obtener artículos científicos de revistas, se
tiene en cuenta publicaciones desde enero de 2000 a agosto de 2014. Para ampliar
conceptos importantes se emplearon artículos científicos disponibles de diversas fechas
de publicación. Todos los idiomas son incluidos siempre y cuando tengan el abstrac en
inglés, utilizando las palabras claves seleccionadas desde MeSH (stem cells, dental pulp,
cell culture techniques, tissue engineering, review) los cuales soportaron el desarrollo de
la investigación
Selección de artículos
Se seleccionaron los artículos y se realizó la lectura completa de estos. Una vez
obtenidos los artículos electrónicamente se implementó una búsqueda manual de
artículos y capítulos de libros adicionales en los journals y páginas que no se revisaron.
Se realizó una comparación de la literatura científica disponible en cada una de las
etapas (obtención de la muestra, cultivo y caracterización) de células madre
mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes por medio de12 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
una matriz con información de los artículos revisados, describiendo las características
que cada uno presenta
Sugerencia de metodología basada en la literatura
científica disponible
Se sugiere una metodología basada en la literatura científica disponible después de
describir los métodos, dicha metodología es viable con relación a resultados, costos,
equipos de laboratorio requeridos y eficiencia para ser utilizado en futuros estudios
experimentales en la Universidad Nacional de ColombiaMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 13
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Criterios de inclusión y exclusión
Criterios de inclusión
§ Población/muestra: Protocolos in vitro con dientes humanos
§ Publicaciones: Artículos de revistas indexadas, libros de texto, año de publicación
de enero 2000 a agosto del 2014 (Para las metodologías). Artículos que reporten
resultados basados en evidencia
§ Pulpa dental: Estudios que involucren pulpa dental de dientes permanentes
Criterios de exclusión
§ Población/muestra: Protocolos realizados con dientes de animales
§ Publicaciones: Publicaciones anteriores al año 2000 (Para las metodologías).
Estudios que no informen conclusiones basadas en los resultados encontrados
§ Pulpa dental: Estudios que involucren únicamente la pulpa dental de dientes
temporales o células madre del ligamento periodontal14 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Descripción bibliométrica
Se realizó una revisión de la literatura científica en los buscadores como Cochrane
Library, Scielo, PubMed, Medline y EMBASE, empleando diversas combinaciones de las
palabras clave seleccionadas desde MeSH (stem cells, dental pulp, cell culture
techniques, tissue engineering, review), de los cuales se obtiene un total de 126 artículos,
se excluyen 45 artículos por su título y abstract, ya que describen ser estudios en
animales y/o no especifican el aislamiento de células madre de la pulpa dental, al realizar
la lectura completa de los 81 artículos, 6 no describen conclusiones basadas en
resultados encontrados. De los 75 artículos obtenidos, 28 son empleados para realizar la
matriz de las metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de muestra,
cultivo y caracterización in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de dientes permanentes y
47 artículos son empleados para la elaboración del marco teórico y perfeccionar la
información de las diversas etapas para obtener células madre mesénquimales humanas
de la pulpa dental de dientes permanentes.
Figura A. Descripción bibliométrica
126 ar’culos
Buscadores y MeSH
45 ar’culos 6 ar’culos
75 ar’culos obtenidos
(Título y abstract) (Lectura completa)
No describen
47 28 No especifican conclusiones basadas
Comple- Metodología Estudios en animales aislamiento DPSCs en resultados
mentos s obtenidosMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 15
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Tabla A. Tipo de referencias bibliográficas
Referencias bibliográficas
Tipo de referencia Cantidad
Journal 70 artículos
Libros de texto 5 capítulos
Total 75 referencias
Tabla B. Empleo de referencias bibliográficas en el texto
Referencias bibliográficas empleadas
Empleo en el texto Cantidad
Metodologías 28 referencias
Complementos 47 referencias
Total 75 referencias
Tabla C. Distribución por año para referencias de las metodologías
Distribución por año para referencias de metodologías
Año Año 2000 Año 2005 Año 2006 Año 2007 Año 2008 Año 2009 Año 2010 Año 2011 Año 2012 Año 2013 Año 2014
Cantidad 1 referencia1 referencia2 referencias 3 referencias 1 referencia3 referencias 5 referencias 2 referencias 3 referencias 4 referencias 3 referencias
Total 28 referencias
Tabla D. Distribución por tipo de estudio para referencias de las metodologías
Distribución por tipo de estudio para las referencias de metodologías
Tipo de estudio Experimental in vitro Experimental in vitro e in vivo
Cantidad 24 referencias 4 referenciass
Total 28 referenciasMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas
de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
1. DESARROLLO DENTAL
Las interacciones entre células y tejidos constituyen un mecanismo central, por lo general
en el desarrollo de organismos multicelulares. A nivel molecular, estas interacciones
involucran una señalización que se compone de señales, receptores y sistemas de
control trascripcional. Dichos elementos son utilizados en la regulación de múltiples
tejidos y órganos de un individuo, incluso a lo largo del desarrollo y evolución del mismo.
Se cree que la evolución de los dientes está asociada con la presencia de la cresta
neural. La mayoría de los cartílagos y huesos cráneo-faciales son formados por células
mesénquimales derivadas de la cresta neural (1). El diente está compuesto de esmalte,
dentina y pulpa, el cual se desarrolla a través de interacciones epitelio-mesénquima, el
periodonto se conforma por el ligamento periodontal, cemento y hueso alveolar que se
encargan del soporte del diente (21).
1.1 Evolución dental
Con el fin de lograr una adecuada taxonomía para la embriología dental es necesario
comparar las características equivalentes a lo largo de las especies existentes y extintas.
Los estudios histológicos de los órganos dentales comenzaron a surgir en el siglo XIX
según Louise J. Baume en su trabajo titulado “la biología de la pulpa y la dentina” en
1980, este expone que las estructuras tubulares en la dentina se encontraron entre los
años 1835 – 1851. Mientras que el reconocimiento de la relación pulpa/dentina se dio
entre 1852 -1863, la dentina peritubular y las estructuras nerviosas se descubrieron entre
1863 – 1868. Los aspectos ontogénicos y filogénicos de la dentina se observaron entre
1867 – 1906.
Los dientes fósiles aportaron pruebas para comparar la relación entre los grupos
existentes y extintos, y se estableció la filogenia de los mamíferos. Como apéndices muy
mineralizados encontramos a la entrada del canal alimenticio a los dientes, con funciones
como el procesamiento de los alimentos, articulación fonética y defensa. El hecho que las18 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
estructuras dérmicas son el origen de los dientes en los vertebrados tiene muchas
implicaciones en la biología dental.
La reducción del número de dientes y generaciones, y el aumento de la complejidad
morfológica de los dientes (de homodonto a heterodonto) representan factores
importantes para la diversificación de los mamíferos (Koussoulakou et al. 2009; Salazar y
Jernvall, 2010). La reaparición de algunos dientes, que fueron perdidos en el tiempo en
las aves es un interesante concepto evolutivo (Chen et al. 2000). Uno de los principios
evolutivos centrales conocidos como ley de Dollo indica que un organismo es incapaz de
volver, aunque sea parcialmente, a una etapa anterior ya realizada en las filas de sus
antepasados (Tomic y Meyer-Rochow, 2011). Obviamente, en condiciones adecuadas, la
capacidad odontogénica perdida del ectomesénquima aviar puede ser recuperada
(Louchart y Viriot, 2011). Las posibles explicaciones para esto son la capacidad
odontogénica conservada en el epitelio oral o un mecanismo de salvaguardia como
redundancia genética. Por otra parte, esas mutaciones no pueden prevenir la formación
de la lámina dental, que puede ser observada en las aves, aunque sus dientes se
perdieron hace más de 60 millones de años (Chen et al. 2000; Koussoulakou et al. 2009).
La comprensión de las normas que rigen la readquisición de las propiedades perdidas
proporcionará una amplia gama de aplicaciones clínicas y biológicas de dientes
lesionados o perdidos (Koussoulakou et al. 2009) (22).
Durante la evolución una variedad de modificaciones en el diente han sido observadas.
El desarrollo básico de la anatomía dental (morfogénesis) se ha conservado en un alto
grado, sin embargo los cambios generados dependen de las diferentes especies y las
funciones que los dientes tienen en un individuo, el número de dientes varía dependiendo
de la función masticatoria, la cual es necesaria para la supervivencia (8).
La dentición de los mamíferos consiste en los dientes que se forman como unidades
separadas, y la disposición lineal de los dientes en los márgenes de los maxilares
muestra repetición espacial. Se planteó una hipótesis de que un campo morfogenético
determina las formas de los dientes (Butler, 1967). Este concepto fue adaptado para la
dentición humana por Dahlberg (1965), quien propuso que había un campo deMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 19
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
funcionamiento en cada una de las clases del diente, es decir, incisivos, caninos,
premolares y molares (22). Las diferencias morfológicas también se pueden deber a
mecanismos regulatorios moleculares y a las concentraciones de químicos morfógenos
como el ácido retinoico que permiten regular la morfogénesis (8).
1.2 Etapas del desarrollo dental
Los dientes son el típico ejemplo de órganos epitelio-mesénquima, se desarrollan a partir
del estomodeo y las células mesénquimales de la cresta neural. La primera señal
morfológica para el desarrollo dental es un engrosamiento del epitelio oral (brote) en una
capa de mesénquima. Las células mesénquimales se condensan alrededor del brote y
durante las siguientes etapas, el epitelio interviene en la morfogénesis (1, 23, 24).
Durante la sexta semana de embriogénesis, después de la migración de las células de la
cresta neural en el mesénquima de la cabeza y cuello, el ectodermo que cubre el
estomodeo comienza a proliferar emergiendo la lámina dental (17, 20), posteriormente se
generan interacciones ecto-mesodermicas, las células de la cresta neural se diferencian
en órgano, papila y folículo dental que favorecen a la formación de estructuras dentales y
periodontales. Por lo tanto la pulpa dental está conformada por un componente
ectodérmico y uno mesenquimal. Dichas células de la cresta neural favorecen su
capacidad multipotencial y de plasticidad (20).
Estas interacciones resultan en la formación de una capa externa de esmalte formada
por la actividad de células derivadas del epitelio oral conocidas como ameloblastos y una
capa interna de matriz orgánica de dentina biomineralizada sintetizada por los
odontoblastos, los cuales son derivados de la papila dental. La cámara central del diente
está compuesta de un tejido pulpar fibroso también derivado de la papila dental. La pulpa
dental posee vasos sanguíneos y fibras nerviosas que emergen del foramen apical. La
compleja estructura dental está rodeada de tejido óseo y un estrato fibro-celular del
ligamento periodontal (LP) derivado del folículo dental, el cual también es de origen
ectomesenquimal (2).20 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
En el desarrollo dental los odontoblastos secretan matriz colágena extracelular que
posteriormente se mineraliza en dentina (con una dureza similar al hueso). Los
ameloblastos depositan la matriz del esmalte la cual se mineraliza directamente
formando el tejido más duro del cuerpo. Después de la morfogénesis coronal, las raíces
de los dientes se desarrollan mientras el diente erupciona en la cavidad oral. Mientras las
raíces de los dientes se desarrollan, el folículo induce a los cementoblastos a depositar
cemento dental y las fibras de la membrana periodontal conectan dichas raíces al hueso
alveolar. La iniciación de una morfogénesis dental temprana ocurre antes que inicie la
formación ósea en los maxilares, el desarrollo del diente y hueso adyacente es
posteriormente coordinado, teniendo en cuenta que los dientes después de su
nacimiento tienen un rol central en regular la extensión y dirección del crecimiento
proceso alveolar del maxilar o la mandíbula (1).
Después de la mineralización de la corona, el germen de la pulpa dental permanece
atrapado al interior de una estructura que lo protege de estímulos de diferenciación en el
medio. Una vez hace erupción la corona, la pulpa dental permanece en el interior de la
cámara pulpar, que actúa como una especie de “nicho sellado” y esto puede explicar
porque es posible encontrar en su interior un gran número de células madre, incluso en
un tejido adulto (20).
Los dientes pasan por cuatro fases morfológicas: iniciación, brote, casquete y campana.
1.2.1 Estadío de iniciación
La iniciación del diente comienza durante la sexta semana de gestación humana. Un
engrosamiento localizado o placodas dentro de las bandas epiteliales primarias, inician el
desarrollo de diente. En una subdivisión de la banda epitelial primaria, la lámina dental,
con actividad proliferativa localizada conduce a crecimientos epiteliales en el
ectomesénquima. Puesto que el ectomesénquima es más activo que las células
epiteliales, estas células ectomesenquimales acumulan los crecimientos epiteliales poco
después. Figura 1. 1Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 21
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
1.2.2 Estadío de brote
Esta etapa se produce entre las 7 y 9 semanas de gestación humana. Está representado
por la invaginación epitelial en el ectomesénquima oral. La parte interna de la raíz del
diente tiene forma de estrella, contiene glucosaminoglicanos que sintetizan las células
del retículo estrellado. El potencial odontogénico cambia del epitelio al ectomesénquima
durante la etapa de brote. Muchos órganos ectodérmicos tales como glándulas
exocrinas, folículos pilosos y dientes comparten similitud morfológica en la fase de brote.
Figura 1. 1
1.2.3 Estadío de casquete
La raíz dental se transforma en un casquete por proliferación diferencial. A medida que
proliferan las células epiteliales del brote, las células del ectomesénquima se condensan
y comienzan las diferencias morfológicas entre los gérmenes del diente durante la etapa
de casquete (morfogénesis). La masa epitelial histológica, llamada nodo del esmalte, es
inducida por proteína morfogénica ósea (BMP4). Las células del nodo del esmalte no
muestran división celular y una vez finalizado su papel organizador transitorio, llegan a
apoptosis al final de la etapa de campana. La histodiferenciación comienza en la etapa
de casquete y en la etapa de campana las células de la corona (ameloblastos y
odontoblastos) se distinguen. La capa de células cilíndricas, que rodean la papila dental y
residen dentro del casquete, se llama epitelio dental interno (EDI). La parte exterior del
casquete está cubierta por el epitelio dental externo (EDE). Mientras que el crecimiento
epitelial en forma de casquete es ampliamente conocido como órgano del esmalte, las
células ectomesenquimales condensadas se denominan papila dentaria. El folículo dental
cubre el exterior de estas dos sustancias. El órgano del esmalte, la papila dentaria y
folículo dental constituyen el germen del diente. La papila dental está separada del
órgano del esmalte por una lámina basal y se encuentra entre EDI y las células
mesenquimales no diferenciadas de la papila. Figura 1. 1
1.2.4 Estadío de campana
Se da la citodiferenciación terminal de ameloblastos del EDI y los odontoblastos de las
células ecto-mesenquimales de la papila dentaria y la formación de dos principales
tejidos duros de los dientes, esmalte y dentina, iniciada durante la etapa de campana. La22 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
diferenciación de los ameloblastos y odontoblastos está regulada por las interacciones
entre el epitelio y ecto-mesénquima (D'Souza 2002; Nanci 2008). La papila dental es el
origen de la futura pulpa dental, el folículo dental da lugar a fibroblastos, osteoblastos y
cementoblastos. En conclusión, las células de la cresta neural dan lugar a la producción
cementoblastos que cubren la dentina radicular, osteoblastos que participan en la
formación de alvéolos dentales y fibroblastos que sintetizan el colágeno del ligamento
periodontal. Figura 1. 1 (22).
Figura 1. 1 Estadíos del desarrollo dental
Se muestra una vista frontal esquemática de la cabeza de embrión con un recuadro
punteado para indicar el sitio donde se formará el molar inferior (mandíbula). A
continuación, las etapas del desarrollo de diente se establecen desde los primeros signos
de engrosamiento hasta la erupción del diente. El germen del diente está formado por el
epitelio oral y mesénquima derivado de la cresta neural. En la etapa de campana se
desarrollan, los ameloblastos y odontoblastos en capas adyacentes en el sitio de
interacción entre el epitelio y mesénquima. Reproducida de Dental Pulp Stem Cells, Sibel
Yildirim (22).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 23
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
2. CARACTERÍSTICAS DE LA PULPA
DENTAL
La pulpa dental es un tejido conectivo laxo, con un volumen de 10-100 µL
aproximadamente, forma parte del complejo dentino-pulpar, que tiene su origen
embriológico en la papila dental (tejido ecto-mesenquimal). Tiene funciones como la
producción de dentina y mantiene la vitalidad dentinal biológica y fisiológica (8). Posee
propiedades únicas que la distinguen de otros tejidos conectivos, como la presencia de
odontoblastos, ausencia de histamina, es un tejido confinado en una cavidad dura con
poca circulación colateral y acceso vascular limitado al ápice de la raíz (22).
2.1 Características anatómicas de la pulpa dental
La pulpa se aloja en la cámara pulpar y los conductos radiculares (figura 2.1), tiene la
particularidad de ser el único tejido blando del diente. La cámara pulpar es una cavidad
central en la dentina, que desde el punto de vista morfológico reproduce la forma del
elemento dental, por lo que cambia según la anatomía de los dientes. El espacio pulpar
en los premolares y molares, bi o multirradiculares) puede dividirse, al igual que su
contenido pulpar, en porción coronaria y porción radicular. En la zona coronaria la
cámara posee un piso y un techo, donde encontramos los cuernos pulpares, que son
prolongaciones camerales que se dirigen hacia las cúspides. La presencia y la dimensión
de los cuernos pulpares, especialmente en dientes jóvenes, son particularidades
anatómicas importantes de recordar a la hora de preservar la vitalidad pulpar durante el
tallado de cavidades especialmente oclusales (operatoria restauradora). Del piso de la
cámara salen dos o más conductos que penetran en las raíces y terminan en uno o
varios orificios en el vértice de la raíz. Dichos conductos se extienden, desde la región
cervical hasta el foramen apical o ápice radicular. Se denomina pulpa radicular a la
porción tisular alojada en estos conductos. En el foramen apical, la pulpa radicular se
conecta directamente con el tejido periapical del ligamento periodontal a nivel del
periápice.24 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
En los elementos unirradiculares la pulpa coronaria se continúa sin límites topográficos
con la pulpa radicular, pues carece de piso, pero sí posee cuernos en número de uno o
tres según el diente. Durante el desarrollo de la raíz, la vaina epitelial de Hertwig es la
que determina la forma y el número de raíces y, por ende, de los conductos.
Generalmente, el resultado es un conducto principal situado en el centro de la raíz, que
se abre en un agujero único central o ligeramente desviado en sentido distal. Sin
embargo, pueden formarse conductos laterales o accesorios, como también terminar a
manera de un delta apical. En el caso de existir conductos laterales el tejido pulpar suele
establecer conexiones con el tejido periodontal, los canales accesorios, si bien pueden
encontrarse a cualquier nivel radicular, son más frecuentes en el tercio apical. Estas
variaciones morfológicas son de gran importancia en la terapéutica endodóntica, por la
dificultad que supone para la eliminación de la pulpa enferma y la posterior
instrumentación y sellado de los conductos (25).
Figura 2.1 Características anatómicas de la pulpa dental
La pulpa se aloja en la cámara pulpar y los conductos radiculares. Reproducida de
Dental Pulp Stem Cells, Sibel Yildirim (22)Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 25
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
2.2 Características histológicas de la pulpa dental
Mientras que la pulpa dental muestra una disposición única en la porción periférica, en el
núcleo central de la pulpa, los componentes básicos se encuentran de una manera
similar a la encontrada en otros tejidos conectivos. Una capa de odontoblastos se localiza
en la periferia del tejido pulpar. Mientras que los cuerpos celulares de los odontoblastos
permanecen en la pulpa, los procesos citoplasmáticos se extienden a los túbulos
dentinales. Esta orientación de los odontoblastos genera que la dentina y la pulpa actúen
en conjunto como un órgano. Lo cual se denomina el "complejo de pulpo-dentinal". Las
relaciones anatómicas, funcionales y de desarrollo del complejo llevan a que la pulpa
responda a las lesiones dentinales, incluso cuando no son estimuladas directamente.
Subyacente a la capa odontoblástica, se presenta una zona libre de células o zona de
Weil. Esta área consta de un entramado de fibras nerviosas, capilares sanguíneos y
algunos fibroblastos (22).
La pulpa es dividida en cuatro zonas histológicas, las cuales son, de la zona externa a la
interna. Figura 2.2
§ Zona periférica, elaborada por odontoblastos que producen dentina.
§ Zona acelular, rica matriz extracelular y pobre en células.
§ Zona rica en células, la cual contiene células progenitoras con capacidad
pluripotencial y plasticidad.
§ Zona central, contiene la microvasculatura y plexo nervioso (20).
Figura 2.2 Zonas histológicas de la pulpa dental26 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Se observan las diferentes zonas histológicas de la pulpa dental y sus componentes
celulares. Reproducida de Histología y embriología bucodental, Gómez M, Campos A
(25).
2.3 Funciones de la pulpa dental
La pulpa dental tiene diversas funciones: inductivas, formativas, protectoras y
sensoriales. Esta provee nutrientes, oxigenación e inervación dental, la formación de
dentina reparativa o reaccionaria y generación de respuesta inmune, por todo esto es
esencial para la longevidad del diente y su calidad de vida (15). La microvasculatura
pulpar tiene un rol importante en la nutrición y oxigenación, transporte de desechos
metabólicos y regulación de la inflamación. Las fibras nerviosas contribuyen a la
angiogénesis, extravasación de células del sistema inmune para regular la inflamación, y
provee mecanismos de defensa pulpar. Hay una íntima asociación entre irrigación eMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 27
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
inervación de la pulpa dental, generando la homeostasis del diente, donde la
angiogénesis, vasculogénesis y neurogénesis son críticas para la regeneración pulpar
(19). La definición de las funciones pulpares se encuentra a continuación:
2.3.1 Inductora
El mecanismo inductor del complejo dentino-pulpar se pone de manifiesto durante la
amelogénesis ya que es necesario el depósito de dentina para que se produzca la
síntesis y el depósito del esmalte.
2.3.2 Formativa
La pulpa tiene como función esencial formar dentina. La capacidad dentinogenética se
mantiene mientras dura su vitalidad. La elaboración de la dentina está a cargo de los
odontoblastos, y según el momento en que ésta se produce, surgen los distintos tipos de
dentina: primaria, secundaria o adventicia y terciaria o reparativa. Esta última variedad se
elabora en respuesta a distintos estímulos como por ejemplo: biológicos (caries), físicos
(calor, presión), o químicos (sustancias nocivas provenientes de algunos materiales
dentales).
2.3.3 Nutritiva
La pulpa nutre la dentina a través de las prolongaciones dontoblásticas de los
metabolitos que provenientes del sistema vascular pulpar se difunden a través del licor
dentinario.
2.3.4 Sensitiva
La pulpa, mediante los nervios sensitivos, responde, ante los diferentes estímulos o
agresiones con dolor dentinal o pulpar. En la sensibilidad de la pulpa y la dentina no
interesa la naturaleza del agente estimulante, ya que la respuesta es siempre de tipo
dolorosa. El dolor dentinal es agudo y de corta duración, mientras que el dolor pulpar es
sordo y pulsátil, persistiendo durante cierto tiempo; estos datos son de importancia para
el diagnóstico clínico diferencial.
2.3.5 Defensiva o reparadora
El tejido pulpar tiene una notable capacidad reparativa, formando dentina ante las28 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
agresiones. Las dos líneas de defensa son: 1) formación de dentina peritubular, con
estrechamiento de los conductos, para impedir la penetración de microorganismos hacia
la pulpa. Esta esclerosis dentinal representa la primera defensa de la pulpa y 2)
formación de dentina terciaria, reparativa o de irritación. Esta dentina es elaborada por
los nuevos odontoblastos que se originan de las células, ectomesenquimáticas o células
madre de la pulpa. Los estudios experimentales con animales de laboratorio han
demostrado que el tiempo que transcurre en una agresión pulpar directa hasta neoformar
odontoblastos, es de aproximadamente cinco días. Estas células recién diferenciadas
comienzan a depositar dentina debajo de los túbulos. En dientes humanos se ha
comprobado que la velocidad de aposición es menor (25).
2.4 Matriz extracelular de la pulpa dental
La matriz extracelular es un componente importante del tejido conectivo e incluye
proteínas fibrilares y sustancia fundamental. El colágeno y la elastina constituyen las
fibras estructurales. La laminina y fibronectina son las glicoproteínas adhesivas
principales, cuya función es mediar las interacciones matriz- células. La sustancia
fundamental de la pulpa se compone principalmente de macromoléculas de
proteoglicanos, que consisten en un núcleo proteico y un número variable de cadenas
laterales de glicosaminoglicanos. El ácido hialurónico, dermatan sulfato y condroitin
sulfato son los más importantes glicosaminoglicanos en la pulpa dental. El colágeno tipo I
es la forma más abundante en la pulpa dental de colágeno fibrilar. Mientras que los otros
tipos de colágeno fibrilar, III, V, VI y XI, se observan en la pulpa en menor concentración.
La composición de los tipos de colágeno en la dentina y predentina difieren
considerablemente de los de la pulpa. Una glicoproteína multifuncional es la fibronectina
que se localiza en la pulpa como redes reticulares y en la capa de odontoblastos. Varios
papeles han sido atribuidos a la fibronectina incluyendo la proliferación, diferenciación y
organización de los odontoblastos. La elastina siempre se encuentra en la pulpa, y se
asocia con los vasos sanguíneos más grandes (22).
2.5 Células de la pulpa dental
La pulpa dental postnatal contiene poblaciones celulares heterogéneas con el fin de
mantener, defender y reparar la estructura del tejido.Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 29
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
2.5.1 Odontoblastos
Los odontoblastos completamente diferenciados son células columnares de 50 – 60 µm.
El cuerpo de la célula posee las organelas, contiene un citoesqueleto bien desarrollado y
vesículas tanto exocitóticas y endocitóticas. Los odontoblastos diferenciados secretan la
primera capa de dentina (dentina del manto). La matriz de dentina alrededor de los
procesos se mineraliza y forma los túbulos dentinarios. La dentina está constituida de
miles de túbulos dentinales que cruzan desde la unión amelodentinal hasta la pulpa.
Aunque los odontoblastos muestran un aspecto epitelial por su alineación en la periferia
de la pulpa, las estrechas uniones entre estas juegan un papel en los procesos de
polarización y diferenciación celular. Aparte de dentina del manto, los odontoblastos
diferenciados depositan diferentes formas de dentina: circumpulpar, intertubular y
dentina peritubular. Todos están formados hasta la zona terminal de la raíz y se definen
como dentina primaria. Sin embargo, los odontoblastos depositan dentina secundaria
durante toda la vida. Mientras que la tasa de secreción de dentina secundaria es más
lenta que la de dentina primaria, sus estructuras son similares. Como se indicó antes, los
odontoblastos son altamente especializados, pos mitótico y producido por células de la
cresta neural.
2.5.2 Fibroblastos
Poca o ninguna atención se ha puesto en la diferenciación de las otras células de la
pulpa dental. Los fibroblastos son el tipo celular predominante en la pulpa dental. En su
mayoría se encuentran en la zona rica en células de la pulpa. Su función particular es el
mantenimiento de la matriz de la pulpa. Sintetizan principalmente colágeno tipo I y tipo III
y una amplia gama de componentes de la matriz extracelular, como proteoglicanos y
fibronectina. En la pulpa adulta, los fibroblastos aparecen como células alargadas y
aplanadas. Los fibroblastos también están incluidos en la degradación de los
componentes de la matriz y por lo tanto son esenciales en la remodelación del tejido
pulpar.
2.5.3 Células mesenquimales indiferenciadas
Se encuentran a lo largo de la zona rica en células y el núcleo de la pulpa, y a menudo se
relacionan con los vasos sanguíneos. Bajo el microscopio óptico, las células30 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
mesenquimales no diferenciadas aparecen como grandes células poliédricas que poseen
un núcleo central. Puesto que no hay ningún marcador conocido para dicha población, no
está todavía claro si las células madre de pulpa dental forman parte de las poblaciones
de células primitivas, que puede ser descritas como células mesenquimales no
diferenciadas.
2.5.4 Células inmunes
Son residentes normales en el tejido conectivo de la pulpa y responden a las situaciones
que amenazan la integridad del diente, como caries, fractura del diente y la preparación
de cavidades. El diente humano es el objetivo de un número considerable de agentes
bacterianos orales que iniciar el desarrollo de lesiones cariosas. En el desarrollo de la
caries, después de la desmineralización del esmalte, la dentina se expone al medio oral.
Esto permite que las bacterias cariogénicas causen inflamación y las respuestas
posteriores del sistema inmune en la pulpa dental subyacente a través de la difusión de
los subproductos en los túbulos dentinarios. La pulpa dental también puede responder
inmunológicamente a la preparación de cavidades y las restauraciones, pero estas
respuestas inmunes son diferentes a aquellas causadas por condiciones como la caries.
La pulpa conserva su capacidad de defensa, incluso en las pulpas envejecidas (22).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 31
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
3. PATOLOGÍAS QUE AFECTAN LA
INTEGRIDAD DE LA PULPA DENTAL
La compleja composición estructural del diente provee dureza, pero estas estructuras
rígidas son vulnerables al daño causado por trauma mecánico, químico, defectos
congénitos, cáncer e infecciones bacterianas (2, 8). Si hay daño en el tejido óseo este
tiene la capacidad para repararse y remodelarse a lo largo de la vida, pero los tejidos
dentales han demostrado limitaciones en procesos reparativos, algunos de estos
procesos son la formación de dentina terciaria (reparativa y reaccionaria), pero esta
posee una pobre organización de la matriz mineralizada con relación a la dentina
primaria y secundaria que sirve como una barrera protectora de la pulpa dental (2, 26).
De manera similar el periodonto (cemento y hueso alveolar) tienen una capacidad de
regeneración limitada. La formación de hueso nuevo puede observarse durante el
movimiento ortodóntico, pero esta es clasificada más como una respuesta fisiológica que
como una verdadera reparación o regeneración. Se ha observado una regeneración
menor del periodonto en fases tempranas de la enfermedad periodontal, la cual puede
causar la perdida de los dientes cuando se encuentra establecida, una regeneración
espontanea no ocurre sin alguna intervención terapéutica (2).
El diente puede verse afectado principalmente por diversas patologías como la caries
dental, enfermedad periodontal y las lesiones dentales traumáticas. La caries dental, es
un problema de salud pública y principal patología que causa la perdida temprana de la
pulpa dental e incluso la perdida de la pieza dental (15).
El trauma dental ocurre frecuentemente en niños y a menudo puede llevar a la necrosis
pulpar. Numerosos estudios indican que la prevalencia de trauma dental va de 4-59 % y
la mayoría de los casos se dan en incisivos. El amplio rango de la tasas de prevalencia32 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
se debe a las diferencias entre las poblaciones estudiadas y métodos de estudios. El
riesgo de desarrollar necrosis pulpar depende del tipo de trauma dental. Tabla 3.1.
Borum M y Andreasen por medio de un análisis de 10.673 dientes permanentes
observados en un centro de atención, estimaron el rango de necrosis pulpar para los
diversos tipos de trauma de la siguiente forma
Tabla 3.1 Desarrollo de necrosis pulpar en los diferentes tipos de trauma dental
DESARROLLO DE NECRÓSIS PULPAR EN DIFERENTES TIPOS DE TRAUMA DENTAL
TIPO%DE%TRAUMA%DENTAL RIESGO%DE%DESARROLLAR%NECRÓSIS%PULPAR
Infracción 0%
Concusión 3%
Extrusión 26%
Luxación6lateral 58%
Avulsión 92%
Intrusión 94%
Datos obtenidos de Hargreaves K, Diogenes A, DDS, Teixeira F. Treatment options:
Biological basis of regenerative Endodontics procedures. Joen. 2013; (39):S30–S43 (16).
El complejo pulpo-dentinal tiene un potencial reparativo natural, pero limitado, en el que
los odontoblastos pueden sobrevivir a daños moderados como atrición, erosión, e incluso
caries temprana, por medio de la secreción de una matriz de dentina reaccionaria. Por
otra parte el trauma de gran intensidad, caries o procedimientos restaurativos pueden
generar muerte en los odontoblastos pre-existentes. La respuesta del complejo pulpo-
dentinal a dicho estimulo es la formación de pseudo-odontoblastos (nuevos
odontoblastos), que son diferenciados en el sitio del daño para que sinteticen una dentina
reparativa atubular, algunos lo llaman osteodentina, la cual es una dentina reparativa que
provee un “puente” de tejido mineralizado adyacente al lugar del daño o la lesión en
búsqueda de la preservación de la vitalidad pulpar (19).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 33
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
4. TRATAMIENTO DE LAS PATOLOGÍAS DE
LA PULPA DENTAL
Desde el reconocimiento en 1963 por la asociación americana dental (ADA) como
especialidad odontológica, la endodoncia ha presentado un sin fin de innovaciones que
se han centrado en aspectos tecnológicos como las modificaciones que se han hecho a
los instrumentos y materiales de obturación que son empleados (8).
La endodoncia se encarga de estudiar la forma, función y salud del diente. Su objetivo es
tratar el daño y enfermedades de la pulpa dental y región perirradicular por lo tanto la
etiología y el diagnostico dental del dolor y la enfermedad son partes integrales de la
practica endodóntica.
El tratamiento endodóntico involucra procedimientos diseñados para mantener la salud
de la pulpa dental o una parte de ella. Cuando la pulpa dental presenta una lesión o
enfermedad irreversible el objetivo del tratamiento es preservar tejido perirradicular
normal; pero cuando el área apical está afectada, el objetivo del tratamiento es restaurar
el tejido periapical o buscar salud. Entre los tratamientos endodónticos podemos
encontrar:
§ Tratamiento del dolor orofacial de origen pulpar y perirradicular.
§ Prevención de la enfermedad pulpar.
§ Terapia de la vitalidad pulpar.
§ Extirpación pulpar.
§ Tratamientos de conductos radiculares.
§ Retratamientos.
§ Cirugía apical.
§ Aclaramiento de dientes tratados endodónticamente.
§ Manejo de trauma dental.34 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Posterior a una valoración y diagnostico se realiza un plan de tratamiento, teniendo en
cuenta si la funcionalidad dental, pronostico y estado periodontal son adecuados.
4.1 Prevención del daño pulpar
Se realiza mediante procesos de promoción y prevención para enfermedades como la
caries, trauma dental o daño químico a los dientes. Un tratamiento temprano para las
lesiones de caries y trauma dental puede contribuir a mantener la salud pulpar. Las
exposiciones dentales deben llevar un recubrimiento que proteja la pupa de daños
adicionales y permita procesos de reparación. Las restauraciones deben tener la
capacidad de adhesión a la estructura dental, para evitar la microfiltración (6).
4.2 Tratamientos para patologías reversibles
Aplicar pruebas de sensibilidad pulpar y seleccionar el tratamiento a realizar.
4.2.1 Recubrimiento pulpar indirecto
Proceso por el cual la pulpa es protegida con una capa de material colocado en el
remanente dentinal. Este procedimiento es realizado cuando microscópicamente la pulpa
dental no presenta exposición, ya que se remueve dentina con caries y se deja una capa
de tejido dentinal que se presume no está infectado. Después de lavar y secar la cavidad
es cubierta con materiales que generen protección pulpar generando procesos de
reparación.
4.2.2 Recubrimiento pulpar directo
Es definido como un procedimiento en el cual la pulpa es recubierta con una base
protectora directamente sobre ella o su sitio de exposición. Se indica su realización
cuando se presenta exposición dental en presencia de dentina no infectada y el diente no
tiene historia reciente de dolor dental espontaneo y la capa de material genera un selle
contra las bacterias. Durante el procedimiento se debe realizar aislamiento para prevenir
la contaminación, la cavidad debe ser lavada con un agente estéril y posteriormente
secar, al igual que el recubrimiento pulpar indirecto debe permitir la reparación del tejido.
Se debe colocar una restauración con un material que provea selle y los controles son
necesarios para evaluar las condiciones de la pulpa por medio de examen clínico,
pruebas de sensibilidad y evaluación radiográfica (6, 27).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 35
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
4.3 Tratamientos para patologías irreversibles
Se realizan procedimientos que buscan preservar los remanentes de pulpa vital, y
finalmente los tratamientos encaminados a la preservación del diente.
4.3.1 Amputación pulpar
Definido como un procedimiento en el cual parte de la pulpa vital expuesta es removida
para preservar la vitalidad y función de los remanentes de la pulpa. Este procedimiento
está indicado en dientes con ápice inmaduro y exposición pulpar. El diente debe ser
aislado para prevenir la contaminación, la posterior remoción del tejido pulpar inflamado
con algún tipo de piezas de alta velocidad bajo irrigación con agua estéril o solución
salina. Cuando es removido parte superficial de la pulpa es llamado “pulpotomía parcial”
si involucra la pulpa coronal por completo se denomina “pulpotomía coronal” en los dos
procedimientos se debe retirar los restos dentinales y controlar la hemorragia. Posterior a
la amputación pulpar se debe colocar un material como protector pulpar que le provea
protección de daños adicionales y permita la reparación.
4.3.2 Pulpectomía
Definido como un procedimiento en el cual toda la pulpa es removida para realizar
posteriormente el tratamiento de los conductos. Se realiza por daños irreversibles a la
pulpa o por necesidades protésicas.
4.3.3 Tratamiento de conductos radiculares
Se realiza cuando no hay vitalidad pulpar o esta ha sido removida para prevenir o tratar
la periodontitis apical su propósito es mantener la asepsia o adecuada desinfección del
sistema de conducto. Este puede ser realizado en una o dos citas, requieren de
medicación intraconducto. Es un procedimiento que involucra varios pasos necesarios
para su realización radiografía preoperatoria, anestesia local, cavidad de acceso,
localización de los conductos, aislamiento del diente, determinación de longitud de
trabajo con ayuda de dispositivos electrónicos y radiografías, preparación de conductos,
irrigación, medicación intraconducto de ser necesaria y obturación de conductos.36 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
4.3.4 Cirugía apical
Se lleva a cabo cuando la realización de un tratamiento intracanal tiene dificultades
técnicas o imprácticas en el cual se deben realizar subprocesos como anestesia,
elevación del colgajo, osteotomía, exploración de los tejidos, curetaje perirradicular y
biopsia de ser necesarios, apicectomía, retro preparación, retro-obturación, reposición del
colgajo, sutura y toma de radiografía final.
4.3.5 Incisión y drenaje
Su objetivo es la eliminación de exudado que se encuentra acumulado y sin vía de
drenaje en los tejidos, dicho exudado no puede ser liberado por medio del conducto
radicular. También es empleado como tratamiento de emergencia previo al inicio del
tratamiento de conducto, se debe anestesiar, realizar incisión en el tejido fluctuante y
realizar el drenaje de ser necesario realizar aspiración previa a la incisión. Usualmente
requiere el tratamiento de conducto de las raíces antes de dicho procedimiento
quirúrgico.
4.3.6 Resección dental
Su objetivo es el corte de dientes multirradiculares en una o varias raíces con la
estructura coronal asociada. Las indicaciones son periodontitis, fractura radicular,
imposibilidad de tratamiento de conducto o cirugía apical y la persistencia de signos y
síntomas. Es necesario realizar tratamientos de conductos de raíces conservadas antes
del procedimiento quirúrgico.
4.3.7 Extracción con reimplantación
Los objetivos es remover el diente intencionalmente realizar el procedimiento
endodóntico que se requiera extraoralmente y reimplantar el diente. Está indicando
cuando no es posible el tratamiento de conductos o este fue realizado sin éxito y cuando
la cirugía endodóntica in situ no se puede realizar.Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 37
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
4.4 Manejo de dientes con trauma dental
El diagnóstico de la vitalidad pulpar en dientes con trauma es complejo estos dientes
generalmente no responden normalmente a pruebas de sensibilidad pulpar durante
varios meses, estas pruebas deben realizarse de manera periódica por un periodo
mínimo de 1 año para que la sensibilidad y vitalidad pueda ser determinado. Se debe
realizar un seguimiento radiográfico para observar signos de periodontitis apical y
reabsorción progresiva externa. De esta manera tomar decisiones endodónticas
terapéuticas (6).38 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
5. LIMITACIONES DE LOS TRATAMIENTOS
EMPLEADOS PARA LAS PATOLOGÍAS
PULPARES
A pesar de que el éxito del tratamiento endodóntico es relativamente alto (78-98%) (7, 8),
hay muchos problemas asociados con los tratamientos: Son técnicas sensibles a errores
y accidentes como:
§ Bloqueo del canal
§ Fracturas de instrumentos
§ Perforaciones
§ Escalones
§ Transportaciones
Dichos errores favorecen a la infección de los tejidos y llevan incluso a la pérdida del
diente, se pueden presentar en cualquier diente y durante las tres fases del tratamiento,
pre, intra y post-operatoria, Figura 5.1(9). En dientes inmaduros con pobre estructura
dentinal, el tratamiento endodóntico no previene la susceptibilidad a la fractura. Después
de un tratamiento endodóntico los dientes pierden abundante estructura dental y la
preparación del espacio para retenedor intrarradicular sacrifica aún más la estructura, lo
cual debilita el diente. Sin la presencia del tejido pulpar del diente no percibe irritantes, ni
puede defenderse de caries progresivas. Desafortunadamente múltiples estudios han
demostrado la perdida de dientes que han sido tratados endodónticamente versus
dientes no tratados con caries secundarias, restauraciones complejas y problemas
asociados (8).
Figura 5.1 Número de errores de tratamiento endodóntico en fases pre, intra y post-
operatoriaMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 39
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Número de errores por grupo de dientes. Se observa la mayor parte de los errores en la
fase intraoperatoria. Reproducida de Givol N, Rosen E, Taicher S, Tsesis I. Risk
Management in Endodontics. Joen (2010).36: 982-984 (9).40 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
6. REGENERACIÓN Y REPARACIÓN
La ingeniería de tejidos tiene como objetivo la construcción de órganos y tejidos por
medio de soportes, células y señales fisicoquímicas del ambiente. El estudio de las
células madre, la ingeniería de tejidos y otras disciplinas, confluyen en el campo de la
medicina regenerativa cuyo objetivo general es estimular la regeneración de órganos y
tejidos con componentes bioactivos que pueden ser, o no, productos de la ingeniería de
tejidos.
Al presentarse una lesión en los tejidos u órganos hay activación de un proceso
inflamatorio que se encarga de iniciar la respuesta fisiológica encargada de reconstruir la
arquitectura y función afectada. El cuerpo responde por medio de dos procesos
dependiendo del tejido u órgano lesionado (regeneración o reparación), los cuales
difieren en el proceso y los resultados. La regeneración genera un remplazo de órganos
o tejidos idénticos (morfológica y funcionalmente) a los originales pues poseen la
capacidad de dediferenciar sus células y hacer morfogénesis durante toda su vida, las
salamandras son anfibios con la capacidad de regeneración de sus extremidades y
muchos de sus órganos con las mismas características de los originales;
desafortunadamente los mamíferos pierden su potencial regenerativo antes de su
nacimiento, sin embargo mantienen el recambio permanente de tejidos epiteliales y
óseos debido a la presencia de poblaciones de células madre con capacidad de auto
renovación y diferenciación.
Por otra parte la reparación responde al daño con la formación de una cicatriz, la cual se
da por la interacción dinámica de todos los elementos que forman el tejido (matriz
extracelular, células sanguíneas, células del lecho de la herida y mediadores solubles
producidos por ellas), conduciendo a la formación de áreas cicatrízales en las que
predominan el tejido fibroso cuyo producto es un tejido disfuncional con diferencias
morfológicas a las del tejido original (Figura 6.1).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 41
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Debido a los efectos negativos de la reparación en la actualidad se procuran procesos
regenerativos, por medio de la modulación de la inflamación se logra una reparación con
poca cicatrización en la que se denota ausencia de células inflamatorias como neutrófilos
y macrófagos. Otra forma de promover la regeneración en el lugar de la reparación es
suministrar células o soportes bioactivos con la capacidad de recrear la complejidad de
las señales biológicas, químicas y/o micro-estructurales (28)
Figura 6.1 Reparación y regeneración de las heridas
Papel de la Ingeniería de Tejidos y de la Medicina Regenerativa en la curación de
lesiones de órganos y tejidos. Cuando son utilizados para el tratamiento de lesiones de
tejidos que cicatrizan con contracción, los productos de ingeniería de tejidos y otras
aproximaciones de la medicina regenerativa favorecen los procesos regenerativos en
lugar de los procesos reparativos. Reproducida de Fontanilla M, Suesca E, Casadiegos
S. Capítulo 6. Ingeniería de tejidos: sustitutos artificiales para uso en piel y mucosa oral
(28).
Como se ha mencionado la ingeniería de tejidos es un campo multidisciplinario que
aplica los principios de la ingeniería y ciencias de la vida para el desarrollo de sustitutos
biológicos que pueden restaurar o mantener la función del tejido. En la Figura 6.2 se42 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
muestra un esquema de los elementos clave para la ingeniería de tejidos los cuales son
las moléculas de señalización, andamios y células madre, que serán descritos a
continuación (10).
Figura 6. 2 Los tres elementos clave para la ingeniería de tejidos
Reproducida de Hargreaves K, Diogenes A, DDS, Teixeira F. Treatment options:
Biological basis of regenerative Endodontics procedures. Joen (2013); 39:S30–S43 (16).
6.1 Moléculas de señalización
Hay factores de crecimiento que juegan un rol en la regeneración del tejido. Los factores
de crecimiento son proteínas que inducen la proliferación celular y/o diferenciación. La
dentina contiene muchas proteínas que son capaces de estimular la respuesta del tejido.
La desmineralización del tejido pulpar generada por la caries puede por sí misma
provocar la liberación de factores de crecimiento, lo cual sugiere que el efecto terapéutico
del hidróxido de calcio se da por la liberación de factores de crecimiento de la matriz
dentinal, por lo cual estos son importantes en procesos de señalización en evento como
la dentinogénesis terciaria, como una repuesta reparativa del complejo pulpodentinal.
Hay dos familias importantes de factores de crecimiento, como la familia del factor de
crecimiento transformante beta (TGF-B) y de la proteína morfogénica ósea (BMPs) (13).
Algunos factores de crecimiento son usados para incrementar el número de célulasMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 43
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
madre, como es el caso del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFs), factor
de crecimiento fibroblástico (FGF), factor de crecimiento insulínico (IGF), factor
estimulante de colonias (CSF) y factor de crecimiento epidermal (EGF). Otros modulan la
respuesta inmune celular y humoral, como la interleuquina 1 (IL- 1), otros son
importantes reguladores de la angiogénesis como el factor de crecimiento endotelial
vascular (VEGF) o importantes para sanar la herida y regenerar el tejido como el factor
de crecimiento transformante alfa y beta. La familia de factores de crecimiento implicadas
en el desarrollo dental y regeneración son las BMPs conocidas por su habilidad para
inducir la formación de hueso y cartílago (10). Se describen los factores de crecimiento
en la Tabla 6.1 (29).
Tabla 6.1 Factores de crecimiento y sus aplicaciones
FACTORES)DE)CRECIMIENTO)Y)SUS)APLICACIONES
FACTORES)DE)CRECIMIENTO FUENTE FUNCIÓN
Diferenciación$odontoblástica,$estimula$la$secreción$
de$matriz,$inducción,$migración$y$proliferación$de$
TGF$B1,$B2,$B3 Matriz$dentinal SCs
Estimula$a$progenitores$celulares$de$la$pulpa$a$
BMP$2,$4,$7 Matriz$dentinal diferenciarse$en$odontoblastos
Inducción,$migración$y$proliferación$de$SCs$y$
FGFG$2 Matriz$extracelular regeneración$dentinal
Induce$la$diferenciación$de$SCs$en$pseudoG$
DMPG$1 Matriz$dentinal odontoblastos
Iniciación,$diferenciación$de$odontoblastos$y$
DSP$DPP Matriz$dentinal regulación$de$la$mineralización$dentinal
BSP Matriz$dentinal Induce$a$la$formación$de$dentina$reparativa
Promueve$la$proliferación$de$células$pulpares$para$
Dentonina$(péptido$de$MEPE) Matriz$dentinal la$reparación$pulpar
TGF, Factor de crecimiento transformante; BMP, Proteína morfogénica ósea; FGF,
Factor de crecimiento fibroblástico; DMP, Proteína de matriz dentinal; DSP, Sialoproteína
dentinal; DPP, Fosfoproteína dentinal; BSP, Sialoproteína ósea; MEPE,
Fosfoglicoproteína de matriz extracelular. Datos obtenidos de Sharma L, Sharma A, Dias44 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
G. Advances in regeneration of dental pulp- a literature review. Journal of Investigative
and Clinical Dentistry (2013), 4, 1–14 (29).
6.2 Scaffold o andamios
Los andamios usados para la regeneración deben ser biodegradables con una taza de
degradación que coincida con la taza se formación del tejido, se requieren que sean
porosos para facilitar la adición celular y difusión de nutrientes. Muchas células fabrican
su propia matriz natural alrededor de sí misma. Los andamios deben proveer integridad
estructural que eventualmente se degrade para permitir la nueva formación de tejido,
durante todo el proceso deben tener las principales características de las células madre y
asegurar una adecuada diferenciación de su progenie.
6.2.1 Materiales de los andamios
Incluyen materiales sintéticos y naturales. Dentro de los materiales naturales se han
probado el colágeno, alginato, agarosa, quitosan y glicosaminoglicanos (GAGs). Los
materiales sintéticos son los más investigados e incluyen hidroxiapatita /fosfato tricalcico
y polímeros como el ácido poliláctico, ácido poliglicólico y policaprolactone. Los polímeros
sintéticos son más conductivos y muestran menos contracción que el colágeno (13, 29).
6.3 Células madre
Son consideradas como las más valiosas células para la medicina regenerativa. Estas
proveen un avance en el conocimiento sobre como un organismo se desarrolla de una
célula, y como células sanas remplazan a células dañadas en organismos adultos. La
células madre tienen la habilidad para seguir dividiéndose (auto replicación) o producir
células especializadas que pueden diferenciarse en varios tipo de células o tejidos
(diferenciación multilinaje) (10).
6.3.1 Potencialidad de células madre
Dependiendo de su potencialidad, las células madre se clasifican en totipotentes,
pluripotentes, multipotentes y unipotentes:Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 45
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
§ Totipotentes: son células capaces de diferenciarse en todos los tipos celulares
de un organismo adulto, formar los tejidos extraembrionarios y por ende crear un
organismo completo. Las células madre totipotentes se encuentran en el zigoto.
§ Pluripotentes: células capaces de formar todos los tipos celulares de un
organismo adulto y en consecuencia, de crear tejidos de las tres capas
embrionarias (endodermo, mesodermo y exodermo). No genera las células de la
membrana embrionaria. Las células madre pluripotentes se encuentran en el
blastocisto, epiblasto, embrión tardío /feto temprano.
§ Multipotentes: células capaces de diferenciarse en todos los tipos celulares
presentes en un tejido. Las células madre multipotentes están presentes en los
tejidos maduros.
§ Unipotentes: células presentes en algunos tejidos que contienen un solo tipo de
células madre, capaces de diferenciarse en un solo tipo celular, con frecuencia
son consideradas como células progenitoras, sin embargo, ha sido sugerido que
esta denominación se aplique a las células que han dejado de ser madre y aún
conservan la capacidad proliferativa. Las células madre unipotentes están
presentes en los tejidos maduros (28).
6.3.2 Clasificación de células madre
De acuerdo a la etapa de desarrollo, las células madre se pueden dividir en células
madres embrionarias (ESCs) y adultas (ASCs). ESCs son derivadas del blastocisto (2 -11
días intrauterinos). Son consideradas inmortales ya que pueden propagarse y
mantenerse en un estado no diferenciado indefinidamente, estas células madre tienen un
alto potencial para regenerar y reparar tejidos y órganos lesionados en el cuerpo. Son
totipotentes y en el proceso de diferenciación celular pueden convertirse en una forma
estable de células madre pluripotentes. La desventaja radica en que su beneficio
terapéutico es controversial pues el proceso de extracción de células madre genera la
destrucción del embrión y por ende de la vida, debido a las implicaciones éticas y
morales no es empleado (11, 13, 18). Las células madre adultas son encontradas en la
mayoría de los tejidos. Estas son multipotentes y dependiendo de su origen pueden ser
clasificadas en células madre hematopoyéticas (HSCs) y células madre mesénquimales
(MSCs). HSCs son obtenidas de la sangre del cordón umbilical o sangre periférica. MSCs46 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
son originadas de una variedad de tejidos como la medula ósea hígado, dermis, pulpa
dental, entre otros. (11, 13, 18, 30).
6.3.3 Inmunofenotipo mesenquimal de células madre
En el 2006 la sociedad internacional para la terapia celular (ISCT) estableció los criterios
mínimos para definir MSC humanas, las cuales incluyen:
• Adhesión al plástico.
• Expresión de antígenos de superficie específicos.
• Capacidad para diferenciación multipotencial in vitro (condrogénica,
adipogénica y osteogénica), la cual es demostrado por tinción de marcadores
específicos para el tipo celular
La definición inmunofenotípica de MSCs requiere que en más del 95% de la población
exprese los antígenos de superficie CD105, CD73 y CD90 por análisis de citometría de
flujo, y expresión menor del 2% de CD45, CD34, CD14, CD11, CD79, CD19, o HLA clase
II (18, 31, 32)
Al determinar el tipo de SC a usar, las células madre de origen dental tienen ventajas
sobre otro tipo de MSCs o HSCs (derivadas de médula ósea, tejido adiposo, sangre
periférica o sangre de cordón umbilical), ya que su fuente son los dientes extraídos por
indicación terapéutica, lo cual involucra muy baja morbilidad y pocas implicaciones éticas
(15).
6.3.4 MSCs derivadas de los tejidos dentales
La terapia celular y la ingeniería de tejidos son importantes para la regeneración dental,
especialmente para la endodoncia regenerativa, donde la regeneración del complejo
pulpo-dentinal con células madre ha sido investigado por diversos autores dicha
regeneración es aun probada en ensayos clínicos para evaluar su eficacia y seguridad.
Los cambios que introducen la endodoncia regenerativa son sustanciales, generando
beneficios a los pacientes y clínicos.
A la fecha múltiples tipos de ASCs han sido aisladas del diente, como se observa en la
figura 6.3, incluyendo DPSCs, su presencia fue divulgada inicialmente en 1985 porMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 47
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Yamamura. Más tarde, Caplan et al. demostraron que estas células presentan un
potencial osteogénico y condrogénico in vitro y capacidad de diferenciarse en dentina in
vivo. En el año 2000, Gronthos et al. aislaron células madre de la pulpa dental humana
de dientes permanentes, que tenía la capacidad de regenerar un complejo dentino-pulpar
similar al original; células madre gingivales (GSCs) (Zhang et al. 2009) (33); células
madre de dientes deciduos exfoliados (SHED) (Miura et al. 2003); células madre del
ligamento periodontal (PDLSCs) (Seo et al. 2004); células madre progenitoras del folículo
dental (DFPCs) (Morsczeck et al. 2005) y células madre de la papila apical (SCAPs)
Sonoyama et al. 2006) (18, 33, 34).
Figura 6. 3 Reportes de células madre en orden cronológico
Cronología sobre los aspectos más destacados en la historia del aislamiento de células
madre dentales. Reproducida de Karamzadeh R, Baghaban M. Dental-related Stem Cells
and their potential in regenerative medicine. http://dx.doi.org/10.5772/55927 (33).
§ DPSCs: Aunque el volumen de los tejidos de la pulpa madura es muy pequeño y
la regeneración de un tejido con un volumen así debería ser relativamente simple
comparada con grandes órganos o tejidos, se considera como una tarea difícil
para la ingeniería la generación del tejido pulpar (8). En la pulpa dental de los48 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
dientes adultos hay una población de células clonogénicas con una alta
capacidad de proliferación, su morfología puede ser detectada mediante
microscopía confocal, figura 6.4 (17), las cuales fueron aisladas exitosamente por
digestión enzimática del tejido pulpar, después de ser separado de la corona y la
raíz (Gronthos et al. 2000) DPSCs son células multipotentes que proliferan
extensivamente, se mantienen por lo menos durante 25 pasajes(Figura 6.5 y 6.6),
pueden ser criopreservadas, poseen propiedades inmunosupresivas y
marcadores de expresión como CD13, CD29, CD24, CD59, CD53, CD90, CD105,
CD146, y STRO-1, pero no expresan CD14, CD24 , CD34, CD45, CD19, y
HLA-DR (descrito por Lindroos et al. 2008; Huang et al. 2009 y Karaöz et al.
2010). La plasticidad de las DPSCs ha sido verificado en estudios in vitro e in
vivo, tienen la habilidad de diferenciarse en pseudo-odontoblastos, osteoblastos,
adipocitos, células neurales, cardiomiocitos, miocitos y condrocitos in vitro
descrito por Zhang et al. 2006; D´Aquino et al. 2007; Carinci et al. 2008; Armiñán
et al. 2009; entre otros. DPSCs pueden formar nódulos mineralizados con una
estructura similar a la dentina bajo condiciones osteoinductivas in vitro y un tejido
similar a la dentina reparativa en la superficie de la dentina in vivo. Carinci et al.
2008 describieron que poseen la capacidad de diferenciarse en osteoblastos in
vivo y producir un tejido similar al hueso.
Figura 6.4 Cito-arquitectura de DPSCs humanasMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 49
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
DPSCs observada con microscopía confocal, magnificación 400x, el verde
fluorescente tiñe el cito-esqueleto celular. Reproducida de D'Aquino R, De Rosa
A, Laino G, Caruso F, Guida L, et al. Human Dental Pulp Stem Cells: From
Biology to Clinical Applications. J Exp Zool B Mol Dev Evol. 2008; 312B(5): 408-
415 (17).
§ SHEDs: Miura et al. 2003 reportaron el potencial para obtener células madres de
los dientes deciduos humanos (Figura 6.5 y 6.6), como las DPSCs, estas células
son multipotentes, se derivan de explantes de la pulpa dental o por digestión del
tejido de la pulpa dental y tienen propiedades inmunosupresivas, SHEDs tiene
una alta taza proliferación comparadas con las células madres mesénquimales de
la medula ósea y DPSCs, expresan Oct4, CD13, CD29, CD44, CD73, CD90,
CD105, CD146 y CD166, pero no expresan CD14, CD34 o CD45 (reportado por
Huang et al. 2009 y Pivoriuunas et al. 2010). Poseen la capacidad de
diferenciarse en una variedad de células, como células neurales, osteoblastos,
condrocitos, adipocitos y miocitos se ha reportado su uso en la reparación de
defectos parietales de ratones inmunocomprometidos (18, 22).
Figura 6.5 Ubicación de SCs de origen dental50 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Ilustración de las posibles fuentes de SCs postnatales en el medio oral. Se
observan SCs del germen progenitor del diente (TGPCs), SCs del folículo dental
(DFSCs), SCs de la glándula salival (SGSCs), SCs de la papila apical (SCAP),
SCs de la pulpa dental (DPSCs), SCs progenitoras de inflamación periapical
(iPAPCs), las SCs de dientes deciduos exfoliados humanos (SHED), SCs del
ligamento periodontal (PDLSCs), las SCs de médula ósea (BMSCs) y, SCs del
epitelio oral (OESCs), SCs derivadas del tejido gingival (GMSCs) y las células
madre periósticas (PSC). Reproducida de Hargreaves K, Diogenes A, DDS,
Teixeira F. Treatment options: Biological basis of regenerative Endodontics
procedures. Joen (2013); 39:S30–S43 (16).
Figura 6.6 SCs de origen dental
SCs obtenidas del folículo dental, dientes temporales y permanentes.
Reproducida de Karamzadeh R, Baghaban M. Dental-related Stem Cells and their
potential in regenerative medicine. http://dx.doi.org/10.5772/55927 (33).
§ SCAPs: Descubiertos en la papila apical de dientes permanentes inmaduros
(Figura 6.7) por Sonoyama et al. 2006 (Figura 6.5 y 6.6). La distinción entre la
pulpa dental y la papila apical es que la papila apical representa un tejido
precursor para la pulpa radicular. SCAPs se obtiene por explantes o digestión
enzimática del tejido de la papila apical, son derivadas de un tejido en desarrollo
que pueden representar una población de células madres progenitoras
tempranas. Expresan marcadores mesénquimales como CD13, CD24, CD29,Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 51
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
CD44, CD73, CD90, CD105, CD106 y CD146, y no expresan CD18, CD34, CD45
O CD150 (descrito por Huang et al. 2009 y Ding et al. 2010), también poseen la
capacidad de diferenciación osteogénica, dentinogénica, neurogénica y
adipogénica, pero la diferenciación miogénica y condrogénica no ha sido
determinada.
Figura 6.7 Papila apical
SCAPs se extraen de papila apical de dientes inmaduros. Reproducida de Young
Y, Lee J, Young G, Kook Y, Choung H, et al. Isolation and Characterization of
Postnatal Stem Cellsfrom Human Dental Tissues. Tissue engineering, 2007(13):
767 – 773 (21).52 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
§ DFPCs: El folículo dental es un tejido mesenquimal que rodea el germen dental
en desarrollo, este juega un rol crucial en el desarrollo dental y contiene
precursores del periodonto (Figura 6.5 y 6.6). Las células precursoras han sido
aisladas del folículo dental humano de terceros molares impactados por medio de
explantes o digestión enzimática del tejido del folículo dental, los cultivos pueden
mantenerse por lo menos durante 15 pasajes, expresan CD10, CD13, CD29,
CD44, CD53, CD59, CD73, CD90, CD105, y no expresan CD34, CD45 o HLA-DR
reportado por Lindroos et al. 2008, Huang et al. 2009 y Yagyuu et al. 2010. Tienen
la habilidad de diferenciarse en osteoblastos/cementoblastos, condrocitos y
adipocitos, cuando crecen en el medio apropiado. Hallazgos in vitro sugieren que
DPSCs poseen un mayor potencial para formar tejido duro que DFPCs. Yokoi et
al. 2007 realizaron una implantación in vivo de estas células las cuales fueron
capaces de recrear un nuevo ligamento periodontal, pero la formación de tejidos
duros como dentina, cemento o hueso no ha sido identificada después de la
trasplantación de estas en ratones inmunocomprometidos, por tanto es necesario
un mayor números de estudios in vivo para evaluar el potencial de regeneración
de tejido duro.
§ PDLSCs: Seo et al. 2004 sugirieron que el ligamento periodontal humano
contiene una población de células madre posnatales multipotentes (Figura 6.5 y
6.6). Las PDLSCs se obtienen de la zona externa de raíces de dientes extraídos
(Figura 6.8) (21), pueden ser aisladas por el método de explantes o digestión
enzimática y expansión in vitro. Las PDLSCs expresan marcadores de MSC como
CD10, CD13, CD29, CD44, CD59, CD73, CD90, CD105, no expresan CD14,
CD34, CD45 y HLA-DR, lo cual fue reportado por Shi et al. 2005, Lindroos et al.
2008, Huang et al. 2009, Wada et al. 2009 y Feng et al. 2010. Las PDLSCs tienen
la capacidad de diferenciarse en células similares a los cementoblastos y células
formadoras de colágeno. La formación de nódulos calcificados es menor que la
observada en DPSCs. PDLSCs tienen la habilidad para diferenciarse in vitro en
células adipogénicas, osteogénicas y condrogénicas. Estudios in vivo demuestran
que las PDLSCs juegan un papel importante en la reparación del tejido
periodontal y tienen un potencial para regenerar el daño del ligamento periodontal
(18, 35).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 53
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Figura 6.8 Ligamento periodontal
Se observa tejido del ligamento periodontal de tercer molar. Reproducida de
Young Y, Lee J, Young G, Kook Y, Choung H, et al. Isolation and Characterization
of Postnatal Stem Cellsfrom Human Dental Tissues. Tissue engineering,
2007(13): 767 – 773 (21).
§ GSCs: El aislamiento de una población de células madre de la encía (Figura 6.5
y 6.6) en primer lugar fue reportado por Zhang et al. 2009. Estos autores obtienen
las células de la capa espinosa de la encía humana y las denominaron células
gingivales (GSCs). En cuanto a los marcadores, se ha demostrado que GSCs son
negativos para CD45 y CD34, pero positivo para CD29, CD44, CD73, CD90,
CD105, CD146, STRO-1 y SSEA4. Además, se ha reportado la expresión de
proteínas de matriz extracelular, como colágeno tipo I, vimentina y fibronectina.
Como MSCs, GSCs poseen una potencial de diferenciación en osteoblastos,
adipocitos y condrocitos in vitro. Estas células son capaces de diferenciar linajes
celulares endoteliales como el neural. El potencial de regeneración ósea in vivo
de GSCs fue demostrado por trasplante de GSCs en ratones. Más importante
aún, en un estudio comparativo, se demostró que GSCs mostraron fenotipos
estables, mantienen la actividad normal del cariotipo y la telomerasa en cultivos a
largo plazo en comparación con las células madre mesenquimales de la médula
ósea (BM-MSC) (33).54 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
6.3.5 Caracterización de MSC derivadas de los tejidos dentales
Shi S. Et al. 2005 reportaron la caracterización de células madre de diversos tejidos.
Teniendo en cuenta los diferentes sitios anatómicos resididos por DPSCs, BMSSC
(Células madre estromales de la médula ósea), PDLSC y SHED es interesante descubrir
que el marcador de células madre, STRO-1, utilizado para aislar y purificar BMSSC
también es expresado por las células madre derivadas de los tejidos dentales, mediante
selección celular inmunomagnética activada. Los análisis posteriores revelaron que
BMSSC, DPSCs, SHED y PDLSC expresaron el marcador de células perivasculares
CD146, donde una proporción de estas células también co-expresó actina del músculo
liso alfa o el antígeno asociado a pericitos, 3G5. Estas observaciones se correlacionaron
con los estudios de localización de estos marcadores en células perivasculares in situ,
mediante inmunotinción de doble color de la médula ósea humana congelada y
secciones del tejido de la pulpa dental. En estudios comparativos inmunofenotípicos, los
cultivos de DPSCs, SHED, PDLSC, y BMSSC no expresaron los marcadores
hematopoyéticos CD14 (monocitos / macrófagos), CD45 (antígeno común del leucocito) y
CD34 (células madre/progenitoras hematopoyéticas / endotelio). Por lo tanto, a pesar de
la ontogenia diversa entre BMSSC, PDLSC y las células madre derivadas de la pulpa,
estas poblaciones de diferentes células mesenquimales parecen residir en un nicho
perivascular común en sus tejidos respectivos. Diversos estudios han llevado a cabo el
análisis fenotípico integral ex vivo de células de la pulpa dental, periodonto, cemento y
las poblaciones de células estromales de la médula ósea, demostrando un perfil común
de expresión para una variedad de antígenos asociados con el endotelio (CD106,
CD146), el tejido perivascular (actinia del músculo liso alfa, CD146, 3G5), el hueso, la
dentina y el cemento (BMPs, fosfatasa alcalina, colágeno tipo I, osteonectina,
osteocalcina, osteopontina, siaoloproteina ósea) y los fibroblastos (colágeno tipo III)
(tabla 6.2).
La expresión de proteínas comunes implica la existencia de un camino molecular común
regular para formación de dentina, cemento y hueso a través de la actividad de factores
de transcripción regulatorios importantes (Runx2, Msx1/2, Dlx1/2 y Pax6/9) y factores de
crecimiento (BMP, FGF, TGF y WNT). Siendo importante la proteína específica del
odontoblasto, sialofosfoproteina dentinal (DSPP) que es un precursor de dos proteínas
de matriz, 1. La sialoproteina dentinal (DSP) y 2. la fosfoproteína dentinal (DPP) que fue
notablemente ausente en los cultivos primarios de DPSCs, SHED, mediante hibridaciónMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 55
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
in situ.
Sin embargo, estudios immunohistológicos identifican la presencia de DSPP durante las
primeras etapas de la mineralización ectópica por DPSCs o SHED en trasplantes
xenogénicos, usando un anticuerpo policlonal específico humano de DSPP. Por el
contrario, ninguna coloración DPSS pudo observarse en los transplantes de hueso
ectópico formado por BMSSC. Estos datos sugieren que las células derivadas de la pulpa
dental representan un fenotipo indiferenciado pre-odontogénico in vitro en condiciones
no-inductivas, de acuerdo con los datos observados en los estudios en animales. El
mayor desafío que enfrenta la caracterización de PDLSC es la falta de marcadores
específicos conocidos asociados con PDL o cemento. Las fibras de colágeno denso del
PDL son algo similares a los encontrados en tendón, donde ambos tejidos están dotados
de la capacidad de absorber las fuerzas mecánicas del estrés y la tensión. Dada esta
similitud, se examinaron los niveles de expresión de Scleraxis, un factor de transcripción
específicos del tendón, en PDLSCs humanas cultivadas. Estos estudios mostraron que
PDLSCs expresan mayores niveles de Scleraxis en comparación con BMSSCs y
DPSCs, mediante el análisis de reacción en cadena polimerasa con transcriptasa inversa
(RT-PCR) semicuantativa. Estos datos implican que PDLSCs representan una población
única de células madre postnatales distintas de la pulpa dental o MSC derivadas de la
médula ósea. Están en marcha estudios para compilar un análisis más exhaustivo de los
patrones de expresión genotípicos y de proteína de BMSSC, DPSCs, SHED y PDLSC
usando microarreglos cDNA y tecnologías proteonómicas. Se espera que este análisis
ayude a facilitar la identificación de moléculas claves que regulen el desarrollo de hueso,
dentina, cemento y PDL (36).
Tabla 6.2 Perfil de expresión de proteínas o genes de diferentes poblaciones de células
madre mesenquimales in vitro56 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
EXPRESIÓN)DE)PROTEÍNAS)O)GENES)DE)MSCs
ANTÍGENO DPSC SHED PDLSC BMSSC
CD14 _ _ _ _
CD34 _ _ _ _
CD44 ** ** ** **
CD45 _ _ _ _
CD106 * */_ */_ **
CD146 **/*/_ **/*/_ **/*/_ **/*/_
3G5 */_ */_ */_ */_
STRO11 **/*/_ **/*/_ **/*/_ **/*/_
Actina8del8músculo8liso8alfa **/_ **/_ **/_ **/*/_
Colágeno8tipo8I ** ** ** **
Colágeno8tipo8III **/* **/*/_ **/*/_ **/*
Fosfatasa8alcalina **/*/_ **/*/_ **/*/_ **/*/_
Osteocalcina **/* **/*/_ **/_ */_
Osteonectina **/* **/* **/* **/*
Osteopontina */_ */_ */_ */_
Sialoproteina8ósea
Scleraxis * * ** *
Sialofosfoproteina8dentinal _ _ _ _
(**) expresión fuerte; (*)expresión débil; negativo ( _ ); subpoblación (/). (Datos obtenidos
de Shi S, Bartold P, Miura M, Seo B, Robey P, Gronthos S. The efficacy of mesenchymal
stem cells to regenerate and repair dental structures. Orthod Craniofac Res. 2005 Aug;
8(3): 191-199) (36).
Un reporte más reciente, descrito por Karamzadeh R. et al. 2013 describe de manera
similar a Shi S. et al, que las DPSCs se caracterizan por su expresión negativa de
antígenos hematopoyéticos (por ejemplo CD45, CD34, CD14) y la expresión positiva de
marcadores estromales asociados (por ejemplo CD90, CD29, CD73, CD105, CD44)
reportados en la Tabla 6.3. También expresan marcadores multipotentes (STRO-1) y
proteínas de matriz extracelular, como colágeno, vimentina, laminina y fibronectina.
curiosamente, algunas de los marcadores celulares pluripotentes, tales como Oct4,
Nanog, Sox2, Klf4, SSEA4 y c-Myc se han expresado en DPSCs. Más recientemente, se
demostró el factor de transcripción de reprogramación del núcleo Oct4, Nanog, Klf4 y c-
Myc disminuyen posterior a la diferenciación de DPSCs. Las DPSCs también expresanMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 57
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
marcadores óseos como sialoproteina ósea, osteocalcina, fosfato alcalino (ALP) y
colágeno tipo I, esto indica su compromiso de diferenciación en tejido óseo. Por otro lado,
la expresión de sialofosfoproteina dentinal (un precursor de la proteína específica del
odontoblasto) no está presente en los cultivos de DPSCs lo cual implica que estas
células representan un fenotipo indiferenciado pre-odontogénico (33).
Tabla 6.3 Expresión de marcadores de células madre dentales. DPSCs; SHED, PDLSC;
DFPC, SCAP, GSC
EXPRESIÓN)DE)MARCADORES)DE)SCs)DENTALES
Reproducida de Karamzadeh R, Baghaban M. Dental-related Stem Cells and their
potential in regenerative medicine. http://dx.doi.org/10.5772/55927 (33).58 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
6.3.6 Aplicación de las células madre en la regeneración
El objetivo de la terapia celular es promover la regeneración del tejido perdido o dañado
por medio de la aplicación de células; dichas células pueden ser indiferenciadas (células
madre de diferentes orígenes) o células diferenciadas (constituyentes del tejido que se
quiere regenerar); el uso de células madre es conocido debido a que al ser cultivadas in
vitro en condiciones apropiadas, pueden ser inducidas a diferenciarse al tipo celular
requerido (28).
Las células madre adultas han sido usadas en estudios pilotos como potenciales terapias
celulares para varia enfermedades. Presentan importantes características que las hacen
candidatas para ser empleadas en terapias celulares, tales como que son fácilmente
obtenidas de los pacientes, presentan una alta capacidad de proliferación celular en los
cultivos, habilidad para integrarse a los tejidos del hospedador e interactuar con los
tejidos que lo rodean, etc.
En el proceso de la terapia celular, las células madre (derivadas de la sangre periférica,
cordón, medula ósea o cualquier tejido adulto) son transportadas en el medio correcto al
laboratorio, centrifugadas o tripsinizadas, propagadas bajo condiciones especiales y
almacenadas en un banco celular. Es ahí donde las colonias de células madre por medio
de señales inductivas y factores de crecimiento apropiados generan una diferenciación
en el tipo celular requerido. Estas son implantadas en pacientes que se someten a
terapia celular (13).
Las células madre se han explorado en una variedad de enfermedades crónicas que no
responden a las terapias tradicionales, con la esperanza que la terapia celular genere
reparación, repoblación y remplazo de los tejidos u órganos que son tratados. Para esto
se han realizado numerosos estudios en animales y actualmente se están llevando a
cabo ensayos clínicos alrededor del mundo. Varios programas terapéuticos en sus
estudios pilotos o de prueba están explorando el rol de la terapia de remplazo celular
bajos condiciones como la enfermedad de Parkinson, falla cardiaca, discrasias
sanguíneas, cáncer, artritis reumatoide, diabetes, lupus eritematoso sistémico (LES),
esclerosis múltiple y enfermedad vascular periférica (13, 37).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 59
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
6.3.7 Aplicación de las células madre en la odontología
Sus aplicaciones potenciales en la odontología se basa en la regeneración de dentina y
pulpa lesionadas, regeneración de reabsorción radicular y reparación de perforaciones,
regeneración periodontal, reparación y remplazo de hueso en defectos cráneo-faciales y
la reparación del diente:
§ Regeneración de dentina y pulpa lesionadas: Para este, materiales no
restaurativos han sido empleados para simular las propiedades mecánicas y
físicas del tejido dental. No se ha tenido éxito en proveer una solución ideal para
determinadas situaciones y la regeneración pulpar que involucra a células madre
autologas/orogénicas en los conductos radiculares o la implantación de pulpa que
ha crecido en un laboratorio usando células madre, requiere de más
investigación. Gronthos y colaboradores demostraron in vitro e in vivo en
animales que las células madre de la pulpa dental fueron capaces de formar un
tejido similar a la dentina (13). La técnica de homing celular se ha popularizado
debido a las dificultades que presenta la terapia celular, como su alto costo,
proceso de aislamiento celular, manejo o manipulación ex vivo, almacenamiento,
y rechazo por parte del sistema inmune del receptor. Esta técnica consiste en
buscar la regeneración del tejido en el mismo lugar donde se presenta la lesión o
patología, por medio del empleo de factores de crecimiento y andamios como se
ilustra en la Figura 6.9, donde se busca la regeneración del tejido pulpar (29).
Figura 6.9 Regeneración pulpar por medio de la técnica de homing celular60 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Se observa, (a) pulpa infectada, (b) limpieza y preparación de los conductos, (c)
trasplantación de un andamio con factores de crecimiento y (d) atracción de SCs
del nicho perivascular. Reproducida de Sharma L, Sharma A, Dias G. Advances in
regeneration of dental pulp- a literatura review. Journal of Investigative and
Clinical Dentistry. 2013; (4), 1–14 (29).
§ Regeneración periodontal: todas las técnicas empleadas como hueso autologo,
materiales aloplasticos tienen limitaciones y no se pueden utilizar en todas las
situaciones clínicas, por lo tanto la técnica de regeneración ósea mediada por
células será una alternativa terapéutica viable. Kawaguchi y colaboradores
demostraron que la trasplantación ex vivo de MSCs autologos, como las PDLSCs,
figura 6.10, pueden regenerar nuevo cemento hueso alveolar y ligamento
periodontal en defectos periodontales clase III en perros, Hasegawua y
colaboradores reportaron que cultivos celulares de ligamento periodontal in vitro
fueron reimplantadas exitosamente en defectos periodontales para promover la
regeneración periodontal en humanos.
§ Reparación y regeneración de hueso en defectos cráneo-faciales: el hueso
autologo es limitado por la morbilidad del sitio donante y hueso orogénico a
menudo se destruye pronto. Las células madre pueden ser sembradas en un
andamio y trasplantadas en el defecto para regenerar el tejido perdido. Abukawa
y colaboradores usaron un andamio diseñado con un nuevo protocolo de
fabricación para generar un tejido autologo el cual fue empleado para reparar un
defecto mandibular segmental, la técnica promueve osteogénesis. El desarrollo
de nuevos andamios ha facilitado el éxito de la reparación tridimensional de los
defectos craneales. La terapia celular para efectos óseos ha sido relativamente
exitosa y numerosos ensayos clínicos en defectos cráneo-faciales de humanos lo
demuestran.
§ Regeneración dental: una opción terapéutica que fue intangible hace muchos
años, es el objetivo actual para el remplazo de dientes perdidos, han sido
empleados los implantes sobre dentaduras y puentes cuyas limitaciones radican
en que su relación es directa con el hueso (ausencia de ligamento periodontal),
están asociados con baja estética y funcionalidad. Ohazama y colaboradoresMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 61
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
reportaron la reconstrucción de un diente de un murino usando células madre las
cuales fueron transferidas a la capsula renal resultando en el desarrollo de las
estructuras dentales y el hueso asociado (13).
Figura 6.10 Empleo de SCs dentales en regeneración dental
Las DPSCs y SCAP presentan potencial para la regeneración dentinal y pulpar.
Reproducida de Huang G. Pulp and dentin tissue engineering and regeneration: Current
progress. Regen Med. 2009; 4(5): 697-707 (8).
Las DPSCs poseen determinadas características, como morfología fibroblástica con
adherencia a las superficies sólidas, potencial proliferativo y capacidad de diferenciación
in vitro y de reparar tejidos in vivo. Las DPSCs se logran diferenciar en linajes de
osteoblastos, condrocitos adipocitos, miocitos, neuronas y hepatocitos in vitro (33).
Para obtener MSCs dentales son necesarios procedimientos clínicos y de laboratorio
descritos en diversas metodologías. Actualmente se contempla la aplicación de terapias
que promuevan la regeneración y mejoren la reparación de los tejidos dentales, a partir
de la identificación y aislamiento de células progenitoras odontogénicas de la pulpa de
dientes permanentes llevada a cabo en un inicio por Gronthos y colaboradores (3, 5, 10,
11, 13, 14, 38).62 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
7. METODOLOGIAS SOBRE OBTENCIÓN DE
MUESTRA, CULTIVO Y CARACTERIZACIÓN
IN VITRO DE MSCs OBTENIDAS DE LA
PULPA DE DIENTES PERMANENTES
Hasta el presente año autores como Hilkens P; Abdullah M; y Horibe H, entre otros
continúan desarrollando estudios para la obtención de muestra, cultivo y caracterización
de células madre mesénquimales derivadas de la pulpa de dientes permanentes con
éxito (39, 40, 41).
7.1 Obtención de la muestra de MSCs obtenidas de la
pulpa de dientes permanentes
7.1.1 Selección del paciente
§ Estado de salud general y bucal del paciente
Con aprobación del comité de ética para el desarrollo del estudio y el
consentimiento del paciente para el mismo, el tejido de la pulpa dental debe ser
extraído de dientes permanentes de adultos sistémicamente sanos. También es
importante que el paciente no refiera consumo de alcohol, drogas y/o cigarrillo
como lo reportó Hosseini et al. 2010 (42) con lo que se asegura una mayor tasa
de éxito al aislar DPSCs, ya que por ejemplo la citotoxicidad de la nicotina inhibe
los procesos de mineralización de las células pulpares (43). Previo a la extracción
dental se debe indagar en búsqueda de enfermedades sistémicas y realizar una
exploración en búsqueda de infecciones orales. Solo los sujetos que no presenten
enfermedades deben ser seleccionados, a su vez los pacientes que participaranMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 63
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
en el estudio deben ser sometidos a tratamientos de higiene oral profesional por
una semana previo a la extracción dental para disminuir su carga microbiana (44).
Trabajos recientes han encontrado la presencia de SCs en el tejido pulpar con
inflamación (vital), estas SCs tienen la capacidad para formar matriz mineralizada
tanto in vitro como in vivo, y dichos resultados hacen de la pulpa dental un tejido
interesante como fuente de SCs, incluso cuando se encuentra enferma, pero al
compararse las DPSCs de dientes sanos y las DPSCs de dientes con inflamación
pulpar se evidencia que presentan variaciones importantes en el potencial de
autorrenovación y expansión in vitro, donde se observan valores inferiores cuando
se emplean DPSCs de tejido pulpar con inflamación (33, 45, 46)
Por lo tanto, lo ideal es seleccionar pacientes sanos (para evitar transmisión de
diversas enfermedades durante la manipulación de los dientes), que no presenten
consumo de sustancias como el cigarrillo, alcohol o drogas, sin la presencia de
infecciones orales. A su vez, el diente del que se extrae el tejido pulpar debe estar
libre de enfermedades ya que son notables las diferencias en las características
de proliferación de las DPSCs de dientes con un tejido pulpar que presenta
inflamación comparado con los dientes sanos (43, 45).
§ Edad del paciente
Se ha reportado que las células de pacientes menores de 22 años exhiben un
tiempo de duplicación significativamente más rápido que la células de pacientes
mayores de 22 años, se concluyó que la edad de los pacientes de los que se
aíslan las DPSCs no es un factor crucial en el máximo potencial de división
celular, pero si en el tiempo de duplicación. En 1961, Hayflick describió que las
células usualmente pierden su habilidad para replicarse después de 50 divisiones
celulares in vitro. Esta capacidad de replicación finita es conocida como el límite
de Hayflick y se ha demostrado en experimentos de trasplantación celular in vivo
su presencia. Los telómeros se acortan tras la división celular, lo cual en casos de
tumores provee una barrera natural para su progresión. La enzima telomerasa es
requerida para mantener la longitud de los telómeros y es altamente activa en64 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
ESCs, haciendo que estas sean casi inmortales. Morkry et al, mostraron que la
expansión de DPSCs ex vivo esta correlacionada con el acortamiento de los
telómeros. Para la actividad de la telomerasa de DPSCs se han encontrado
resultados contradictorios, análisis comparativos de DPSCs y BMSCs revelan
niveles similares para la actividad de la telomerasa, pero reportes de Sonoyama
et al, mostraron mayor actividad de la telomerasa en DPSCs que en BMSCs.
Finalmente la actividad de la telomerasa en las DPSCs no es suficiente para
prevenir el acortamiento de los telómeros, pues finalmente alcanzan el límite de
Hayflick sin existir correlación entre la edad y el máximo potencial de división
celular. Atari et al, direccionaron la expresión de genes de SCs en relación con la
edad, donde tomaron DPSCs de pacientes con un rango de edad de 14 a 60 años
y analizaron la expresión de marcadores embrionarios, mostrando que las DPSCs
de pacientes de 58 años aun los expresaban (43).
En las diferentes metodologías generalmente son empleados dientes de
pacientes con un promedio de edad entre los 19 a 30 años para obtener DPSCs
humanas (hDPSCs), por su capacidad de autorrenovación y diferenciación
multilinaje, pero se ha demostrado que es posible aislar DPSCs de dientes
permanentes de pacientes menores de 19 años, los cuales presentan
características similares y son de fácil obtención, ya que es una edad en la que se
realizan exodoncias de terceros molares por indicación ortodóntica (43, 47).
Autores como Hilkens et al, Abdullah et al, Suchánek et al, Macedo et al, Atari et
al, Navabazan et al y Bonnamain et al, han empleado piezas dentales de
pacientes menores de 19 años en sus estudios, en los que fue posible aislar,
caracterizar y diferenciar DPSCs con éxito (39, 40, 48 - 53).
Aunque es menos común la extracción de dientes sanos en pacientes mayores de
30 años, diversos autores como Young et al, Abdullah et al, Horibe et al, Atari et
al, Navabazan et al, Pierdomenico et al, Papaccio et al, Spath et al y Alleman et
al, han empleado dientes de pacientes mayores de 30 años con resultados
exitosos (21, 40, 41, 51, 52, 54 - 57).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 65
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Lo anterior demuestra que es posible el aislamiento de DPSCs a cualquier edad y
que este es solo un factor que influye en la velocidad de duplicación celular, sin
embargo, ya que los procedimientos para obtención de DPSCs son de alto costo
y requieren de largos tiempos en el laboratorio, es aconsejable buscar la
reducción de estos tiempos, sin afectar los resultados, y el empleo de dientes de
pacientes de edades comprendidas entre los 18 a los 22 años puede favorecer en
este propósito (43).
§ Genero del paciente
Pierdomenico et al, en el año 2005, intentaron establecer si habían diferencias
entre la población celular de dientes obtenidos de mujeres y hombres, aunque
con una muestra pequeña del estudio (5 dientes), evaluaron si era posible el
aislamiento, analizaron la morfología, tasa de proliferación, expresión de
antígenos de superficie y la diferenciación de las células obtenidas, donde se
observó que no se presentaban diferencias en estas características al realizar una
comparación entre el género masculino y femenino (54). Otros autores como
Suchánek et al. 2007 y 2009, realizaron una descripción de la muestra teniendo
en cuenta el género, pero dicho dato no fue empleado en la metodología del
estudio y por lo tanto no se obtienen resultados diferenciales entre los dientes del
estudio obtenidos de mujeres y de hombres (48, 49).
Aunque la mayoría de los artículos, no describen la muestra teniendo en cuenta el
género, se puede inferir que muchos de estos estudios emplean una combinación
de dientes obtenidos de hombres y mujeres, al observar los resultados, en todos
los estudios fue posible el aislamiento, cultivo, caracterización e incluso la
diferenciación de DPSCs, por lo que se puede concluir que el género del paciente
del que se extrae la pieza dental no es un factor que influye en la obtención de
SCs de la pulpa dental, como lo describieron Pierdoménico et al (54). Sin
embargo es importante que se realicen más estudios al respecto, con una
muestra superior a la que fue empleada en dicha metodología.66 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
7.1.2 Características de los dientes empleados
§ Selección del diente
El tejido pulpar se obtiene, generalmente de la pulpa dental de terceros molares
incluidos, figura 7.1, que son de fácil obtención ya que son extraídos por
indicación ortodóntica (47). El germen del tercer molar comienza el desarrollo
alrededor del sexto año de vida, hasta ese momento los tejidos embrionarios de la
lámina dental permanecen estáticos y no diferenciados dentro de los maxilares.
La mineralización de su corona comienza durante el octavo año de vida y a
menudo las raíces de dichos dientes se encuentran incompletas a la edad de 18
años, esto significa que la estructura de los dientes es aún inmadura a esta edad
y las células indiferenciadas que se encuentran presentes en la “zona rica en
células” de la pulpa, son necesarias para el desarrollo (20, 44).
Figura 7.1 Tercer molar superior e inferior
Los terceros molares son los dientes más empleados para el aislamiento de SCs.
Reproducida de Ballini A, De Frenza G, Cantore S, Papa F, Grano M,
Mastrangelo F, et al. In vitro stem cell cultures from human dental pulp and
periodontal ligament: new prospects in dentistry. Int J Immunopathol Pharmacol.
2007; 20 (1): 9-16 (70).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 67
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
También son empleados premolares extraídos por indicación ortodóntica, descrito
por Suchánek et al, Lee et al, Shekar et al, Wang et al y Samiei et al, (48, 58 - 61),
e incluso ha sido reportado un caso de extracción pulpar de dientes anteriores
(central y lateral) indicados para tratamiento endodóntico por trauma dental
descrito por Huang et al, en el año 2009 (62). En el año 2014 Sato et al,
describieron la obtención del tejido pulpar para aislamiento de SCs de dientes
supernumerarios como el mesodens (63).
Se ha logrado obtener DPSCs de la pulpa de dientes permanentes anteriores y
posteriores, sin embargo, como se mencionó anteriormente el requisito es que
estos dientes se encuentren sanos en el momento de su extracción, por lo que se
observa un mayor empleo de terceros molares y premolares, debido a que son los
dientes que generalmente se extraen por indicación ortodóntica cuando se
encuentran sanos. La selección del diente es un proceso que se relaciona
íntimamente con la disponibilidad de las piezas dentales, más no con el volumen
de los diente o su posición en los maxilares.
§ Número de dientes empleados
Muchos de los artículos analizados no reportan el número de dientes empleados
para la obtención de muestra, cultivo y caracterización de DPSCs de dientes
permanentes. Los estudios que exponen el tamaño de muestra varían entre 2 a
94 dientes empleados, y en todos los casos e incluso en los que no se reportan el
número de dientes fue posible el aislamiento de DPSCs. Las muestras de gran
tamaño generalmente son empleadas para observar diferencias entre los
procedimientos de aislamiento, cultivo y caracterización, como el estudio de Perry
et al, donde emplearon una muestra de 94 dientes para observar las diferencias
que se presentaban entre los dientes procesados inmediatamente y los dientes
conservados en 3 soluciones diferentes (64).
Es por esto que el número de dientes empleados para la obtención de DPSCs es
dependiente del uso que se le vaya a dar a dichas células, pues las metodologías
presentan diversos objetivos que van desde la simple obtención de DPSCs, la68 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
comparación de medios de almacenamiento, métodos de aislamiento, medios y
tiempos de cultivo, procedimientos de caracterización y de diferenciación, crio
preservación y trasplantación, entre otros, por tal razón son los objetivos del
proyecto los que determinaran el número de dientes necesarios para llevar a cabo
el estudio, pues de un solo diente es posible aislar DPSCs, si este cultivo no se
contamina, pero no es posible realizar comparaciones en las diversas etapas y
métodos.
§ Proceso de exodoncia
No se encontró en la literatura científica disponible algún artículo que describiera
los procesos de exodoncia realizados para obtener los dientes de los que se
extraerá la pulpa dental. Atari et al, realizaron una descripción que define que “se
empleó un proceso simple en el que se evitó el daño del diente” (51). En el caso
de la metodología empleada por Huang et al, no se realizó una exodoncia ya que
el tejido pulpar fue extraído por pulpotomía del diente 21 y 22 en un paciente de
41 años de edad, que presentó trauma dental a nivel de los dientes mencionados
(62). Es importante realizar una descripción de este procedimiento, pues son
empleados diversos materiales e instrumentos que pueden afectar el estado de la
pulpa dental. El proceso de exodoncia debe ser lo menos traumático posible, para
evitar daño en el tejido dental, generalmente realizado de la siguiente manera:
Antes de proceder a la extracción de un diente deben realizarse: una correcta
historia clínica, una adecuada exploración de la cavidad bucal, especialmente del
diente a extraer y de las estructuras anatómicas vecinas y, dentro de los estudios
complementarios, es imprescindible hacer un detallado estudio radiográfico,
figura 7.2. El paciente y el profesional adoptarán las posiciones adecuadas al
caso, y se iniciará este acto quirúrgico con las maniobras previas a la extracción:
antisepsia del campo operatorio, (65) (bajo condiciones ideales la corona dental
debe ser desinfectada previo a su exodoncia con clorhexidina al 0,3% durante dos
minutos, ya que la cavidad oral presenta una alta proporción de microorganismos
todos los instrumentos deben ser estériles) (22). y la aplicación de la técnica
anestésica pertinente. Recordaremos brevemente las fases propias de la
extracción dentaria, en las que se usan coordinadamente los elevadores y losMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 69
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
fórceps, por lo cual se conjugan los distintos tiempos de la exodoncia de cada uno
de estos instrumentos.
Figura 7.2 Estudio radiográfico mínimo para proceso de exodoncia70 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Estudio radiográfico mínimo para proceso de exodoncia. A. Radiografía
panorámica, B. Radiografía periapical. Reproducida de Tratado de cirugía bucal,
tomo I. Gay C, Berini L. Extracción de dientes en el maxilar superior y en la
mandibula. 227-248 (65).
Exodoncia método convencional
Sindesmotomía: Se desinserta el diente del ligamento periodontal. Puede
realizarse con el sindesmotomo, siempre ejerciendo movimientos muy suaves. El
instrumento se introduce en el surco gingival para cortar las fibras que insertan el
margen gingival al cuello dentario y las fibras transeptales que pasan de un diente
al contiguo. En este momento el diente sólo queda unido al hueso alveolar por el
ligamento periodontal. Es conveniente desprender el tejido gingival marginal para
que no sea lesionado en las maniobras de luxación y tracción. Antes de iniciar
esta acción debemos comprobar una vez más, que estamos actuando sobre el
diente que debe ser extraído.
Luxación: Se ejecuta con el elevador, introduciendo la punta progresivamente en
el alvéolo por las caras vestibular y mesial con ligeros movimientos en dirección
vestíbulo lingual-palatino y con otros muy prudentes en sentido mesiodistal. Debe
evitarse ejercer una fuerza desmesurada y movimientos de palanca o de
supinación, puesto que en esta fase nuestro objetivo no es la avulsión; si no
actuamos así sólo se conseguirá la fractura coronal del diente o la luxación del
diente vecino.
Prensión: Debe realizarse con el fórceps idóneo. Este instrumental tiene unas
reglas que deben respetarse puesto que en caso contrario se convierte en un
rompenueces. El tipo de fórceps a emplear varía para cada diente, aunque hasta
cierto punto la elección depende de las preferencias del odontólogo. La forma de
los fórceps debe permitir una correcta prensión adaptándose al cuello dentario y,
de esta manera, poder asir fuertemente el diente. Si los dientes están en
malposición, suelen existir problemas en la utilización de los fórceps
especializados para cada uno de ellos; en estos casos usamos el fórceps
universal. La estructura de la corona, la integridad de su anatomía, la extensión
de la caries, el estado periodontal, etc., serán puntos a considerar en el acto
operatorio. Tras una correcta valoración se decidirá la extracción convencional
con fórceps tal como describiremos a continuación o nos inclinaremos por otros
métodos.Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 71
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Tracción: Debe realizarse con el fórceps correspondiente, controlando la fuerza
que no debe ser exagerada, sino rítmica y constante. No hay que efectuar
movimientos violentos, repentinos o espasmódicos. En principio no deben
realizarse nunca movimientos de tracción siguiendo el eje mayor del diente, es
decir, ápico-coronal. El movimiento básico de tracción es el vestíbulo-palatino o
vestíbulo-lingual teniendo presente que en este movimiento debe participar todo
nuestro cuerpo, evitando mover demasiado el codo. Realizar hemostasia y un
control.
Exodoncia quirúrgica
Incisión: El diseño debe permitir la preparación de un colgajo bien irrigado, que
represente la mínima injuria posible y que proporcione un campo operatorio
amplio. Cuando se trata de una exodoncia, el colgajo siempre será de espesor
total y se realizará habitualmente por vestibular. La vía palatina o lingual no suele
ser frecuente y además proporciona una visibilidad pequeña con numerosos
impedimentos y molestias de toda índole. El sitio y la ubicación de la incisión
deben ser planteados adecuadamente en función de un estudio clínico y
radiológico correcto. El diente a extraer, la dirección de sus raíces y su
disposición, etc., condicionarán la forma del colgajo. Lo más frecuente suele ser la
realización de una incisión en el surco gingivodentario (marginal) con una sola
descarga vestibular. Raramente se requieren dos descargas que son las
necesarias para preparar un colgajo trapezoidal. Las raíces palatinas de los
molares y premolares superiores se abordan por vía vestibular y a través del
tabique interradicular, previa eliminación del suficiente hueso vestibular.
Disección del colgajo: Con el periostótomo se levanta el colgajo mucoperióstico,
procurando no desgarrar ni traumatizar los tejidos blandos. Se separa el colgajo
en toda su extensión hasta descubrir el hueso a intervenir, sosteniéndolo y
protegiéndolo con el separador de Minnesota. El colgajo debe contener el
periostio, que debe ser tratado de forma delicada, con el fin de no inducir
complicaciones postoperatorias o dificultar o retrasar la curación de la herida
operatoria.
Osteotomía: La realización de la osteotomía o eliminación del hueso alveolar es
el objetivo principal de la extracción quirúrgica. Esta resección de hueso se
efectuará a través del colgajo triangular preparado habitualmente o a través del72 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
pequeño despegamiento gingival que hacemos en ocasiones (casos sencillos). La
eliminación de la cortical ósea externa suele suprimir el principal factor de
retención del diente en su alvéolo. Se trata de quitar el hueso suficiente para
conseguir un buen punto de apoyo para los elevadores, una superficie adecuada
para la prensión con los fórceps. La osteotomía se efectúa habitualmente con
fresas redondas de carburo de tungsteno montadas en pieza de mano y bajo una
irrigación constante con suero fisiológico o agua destilada estéril a fin de evitar el
recalentamiento. Debe existir una buena sincronía entre irrigación y aspiración. La
fresa se aplica contra el hueso y en su giro extirpa la superficie cortical requerida
llegando hasta la zona a la que nos interese acceder. La cantidad y extensión del
hueso a resecar están fijadas por las condiciones del diente a extraer. En general,
es suficiente resecar hasta una altura equivalente a la mitad del diente o su tercio
apical. Cuando hay cementosis, dilaceraciones, eliminamos la cantidad de hueso
necesaria para visualizar toda la amplitud de las malformaciones o entidades
patológicas. Así, por ejemplo, las raíces con cementosis importante exigen una
ostectomía hasta la región apical y en toda la amplitud de la raíz. Debemos
recordar que la eliminación de la cortical externa debe ser lo más económica
posible ya que con posterioridad existirá también una reabsorción ósea
importante. Todo esto producirá una deformidad ósea muy aparente difícil de
disimular debajo de una prótesis fija. En el maxilar superior, la cortical externa
suele ser muy delgada a nivel de caninos, pero en la zona de premolares y
molares, puede ser más gruesa. Debe vigilarse la proximidad de las fosas nasales
y del seno maxilar. En la mandíbula, la extracción quirúrgica suele presentar más
dificultades en razón del mayor espesor y densidad de las corticales óseas. El
acceso suele ser por vestibular, evitando en lo posible la zona lingual, lugar donde
la manipulación acarrea un alto índice de complicaciones. La resección ósea será
más importante cuanto más posterior sea la zona a la que queremos acceder ya
que la cortical externa va aumentando de grosor en sentido distal. En la región
premolar debe vigilarse la presencia del agujero mentoniano y en la zona molar
transcurre el conducto dentario inferior.
Extracción: La eliminación de parte de la cortical externa puede facilitar la
prensión con fórceps, y a continuación efectuamos movimientos de lateralidad o
anteroposteriores. La luxación y tracción vendrán condicionadas por la dirección
de las raíces. Las raíces curvas o dilaceradas deben movilizarse en la direcciónMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 73
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
del arco que describen, buscando una vía de salida que suele ser la ventana
preparada en la cortical externa.
Reparación de la zona operatoria: Una vez eliminado el diente, debe repararse
adecuadamente la cavidad ósea y los tejidos blandos. Para ello se realiza:
- El legrado de toda la zona operatoria, procurando especialmente que no
queden lesiones restos de tejidos patológicos o esquirlas de hueso dentro
del alvéolo.
- Un remodelado de las paredes alveolares con limas de hueso o con fresas
de acero medianas para evitar que bordes agudos y cortantes puedan
lesionar la mucosa que va a cubrirlas.
- La eliminación de los trozos de hueso fracturados y que no están unidos al
periostio, al igual que el hueso adelgazado, para evitar su necrosis y las
complicaciones consiguientes.
- El control de la hemorragia.
- La resección de tejidos blandos traumatizados.
- Una irrigación profusa y lavado de la zona operatoria con agua destilada
estéril.
- La sutura. Se finaliza reponiendo el colgajo en su sitio y manteniéndolo en
tal posición con puntos de sutura.
- Medicar y realizar un control (65).
§ Medio de conservación del diente
Infortunadamente la mayoría de los artículos no describen el proceso de
conservación del diente después de realizada la exodoncia, esto se puede
presentar porque no se requiere un traslado de los dientes a un laboratorio
diferente para extraer la pulpa dental o porque los tiempos entre un proceso y
otro son cortos.
Después de la exodoncia los especímenes se deben desinfectar con isodine, y
etanol al 70% (22). Perry et al. 2008, realizaron un lavado de las superficies del
diente con PBS estéril, inmersión en povidoneiodina al 1% durante 2 minutos,
inmersos en tiosulfato de sodio en PBS durante 1 minuto y un lavado final con74 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
PBS, a pesar de este procedimiento se observó contaminación por hongos de
varios cultivos, lo que indica que el lavado del diente extraído y la
contaminación del cultivo no presentan relación (64).
Los dientes se deben colocar en un medio de transporte de ser requerido su
traslado a otros laboratorios para procedimientos de aislamiento, ya que
requieren un medio húmedo que preserve la vitalidad del tejido pulpar. Dicho
medio de transporte debe incluir por lo menos penicilina y estreptomicina al 3%
y 5 µg/ml de anfotericina B para la eliminación de diversos microorganismos
presentes en la cavidad oral (22).
Para la conservación del diente se han empleado diferentes soluciones, algunos
autores emplean descripciones generales de estas, como Pierdomenico et al,
quienes describen el uso de una solución fisiológica con antibióticos (54). Otros
autores como Zhang et al, son más específicos y reportan el uso de medio
mínimo esencial alfa, con 0,5 mg/ml de gentamicina y 3 g/ml de anfotericina B
(66). Otros medios empleados para la conservación de los dientes son la
solución balanceada de Hank, hypothermosol, mesenCult, solución salina con
fosfato (PBS) y clorhexidina gel 0.3%. Ahmed et al, emplearon una combinación
de DMEM con penicilina, estreptomicina y 10% de suero bovino fetal (FBS)
(67). No todas las soluciones emplean antibióticos, y cuando estos se utilizan en
las soluciones se observa una variedad en sus concentraciones, el número de
antibióticos y la combinación de estos, por ejemplo Shekar et al, emplearon
MEM con 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina (59), Samiei et
al, utilizaron DPBS con 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de estreptomicina y
anfotericina B (61) y Zhang et al, reportan el uso de medio mínimo esencial alfa,
con 0,5 mg/ml de gentamicina y 3 g/ml de anfotericina B (66). Algunos artículos
brindan más datos de los medios de conservación del diente, donde se expone
que se encuentran en condiciones estériles, el tiempo que permanecen en la
solución antes de realizar la extracción pulpar (68), la temperatura en que se
conservan los dientes, que generalmente es a 4·C e incluso si se realiza una
limpieza del medio de conservación presente en la superficie dental, previo a la
extracción del tejido pulpar (69). Finalmente autores como Ballini et al, solo
reportan la limpieza de la superficie dental por medio de 3 lavados en unaMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 75
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
solución con PBS, penicilina, estreptomicina y MEM (70). Pero como se
mencionó en un principio la tendencia de las diversas metodologías fue omitir la
información de este procedimiento como se puede observar en artículos de
autores como Gronthos et al, Young et al, Hilkens et al, Abdullah et al, Horibe et
al, Hosseini et al, Navabazam et al, Bonamain et al, Papaccio et al, Wang et al,
Eslaminejad et al (14, 21, 39 - 42, 52, 53, 55, 60, 71).
Es necesario emplear un medio de conservación del diente para preservar las
propiedades biológicas del tejido pulpar, especialmente cuando deben ser
transportados para su procesamiento, independiente del medio que se emplee,
es conveniente el uso de antibióticos para evitar la contaminación de los
cultivos, en la literatura científica se describió una comparación entre tres
medios de conservación, Solución salina de fosfato (PBS, Sigma Chemical, St.
Louis, MO), hipotermosol (HTS, Solucion de BioLife, Bothell, WA), y medio
basal mesencult® (Tecnologías StemCell, Vancouver, BC, Canadá) donde se
observó que es posible obtener DPSCs de dientes conservados despues de
120 horas de su extracción, y el medio que presentó mejor comportamiento fue
PBS, donde se observó un mayor número de DPSCs después de 120 horas de
conservación, figura 7.3 (64).
Figura 7.3 Número de DPSCs x 106 después de 14 días76 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Se observa que DPSCs pueden ser obtenidas después de preservar dientes en
PBS, HTS, Mesen Cult hasta 120 horas después de la extracción dental.
Reproducida de Perry B, Zhou D, Wu X, Yang F, Byers M, Chu T, Hockema J, et
al. Collection, Cryopreservation, and Characterization of Human Dental Pulp–
Derived Mesenchymal Stem Cells for Banking and Clinical Use. Tissue Eng Part C
Methods. 2008;14(2):149-56 (64).
§ Tiempo de preservación de los dientes antes de extraer el
tejido pulpar
Perry et al. indicaron que el aislamiento de hDPSCs es factible hasta 120 horas
después de la extracción del diente al ser almacenados a 4·C en diferentes
medios. Por lo tanto, el aislamiento inmediato a la extracción del diente no es
absolutamente necesario para tener éxito (64, 72). Infortunadamente, los dientes
extraídos a menudo son descartados como residuos contaminados y el tejido de
la pulpa dental extirpada durante la pulpectomía generalmente se desecha, por
esta razón se ha propuesto la criopreservación de los dientes extraídos,
principalmente de molares y premolares sanos, así como del tejido de la pulpa
dental extirpada por motivos pre protésicos, ya que es beneficioso criopreservar
ambos para el aislamiento de hDPSCs. Sin embargo, se encontró que la tasa de
recuperación de hDPSCs después de almacenar los dientes intactos en nitrógeno
líquido (N2 liq) era sólo del 20% (72). Estos datos son similares a los resultados
de Woods et al, quienes fueron capaces de establecer cultivos de 7 de los 10
dientes criopreservados, pero sólo dos funcionaron de manera similar a las
células recién aisladas, esto puede ser causado por el hecho que hay mayor
protección contra la penetración de agentes criopreservantes en los dientes
intactos (68). Por consiguiente, si una modalidad novedosa de criopreservación
se inventa, según lo demostrado por Lee et al, se pueden lograr avances en la
eficiencia de la criopreservación y las hDPSCs multipotentes se cultivarían
solamente cuando sea necesario su uso clínico, aunque esto aumentaría los
costos del proceso y se debe tener en cuenta que los dientes extraídos por
indicación terapéutica son de fácil acceso (72).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 77
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
7.1.3 Método de extracción pulpar
Se han descrito diversos métodos para la extracción de la pulpa dental, de todos estos el
más empleados es el corte a nivel de la unión amelo-cemental, además de este la
literatura científica describe otros métodos:
§ Como ya se mencionó la realización de un corte a nivel de la unión amelo-
cemental (CEJ), y extracción del tejido dental por medio de diversos instrumentos
como cucharillas endodónticas, curetas, limas endodónticas, pinzas, es el método
más empleado, desde el año 2000 cuando Gronthos et al, lo llevaron a cabo (14),
es un método funcional por lo que autores como Abdullah et al, decidieron
emplearlo en su metodología realizada en el año 2014 (40).
§ La realización de una ranura de 0,5 a 1 mm de profundidad por medio de un disco
de baja velocidad estéril, alrededor de CEJ, figura 7.4, separación de los
fragmentos dentales y extracción de la pulpa dental por medio de instrumentos
endodónticas (61), estas ranuras también se ha realizado con fresas cilíndricas,
que podrían causar sobre calentamiento del tejido pulpar por emplear alta
velocidad (51).
Figura 7.4 Método de extracción pulpar por medio de corte a nivel CEJ
Se observa ranura de 0.5- 1mm de profundidad sin llegar al tejido pulpar.
Reproducida de Suchánek J, Soukup T, Ivancaková R, Karbanová J, Hubková V,
Pytlík R, Kucerová L. Human Dental Pulp Stem Cells – Isolation and Long Term
Cultivation. Acta Medica (Hradec Kralove). 2007;50(3):195-201(48).78 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
§ En el año 2010 Macedo et al, emplearon un método en el que se realizó una
ranura longitudinal con discos estériles de diamante sin alcanzar el tejido pulpar,
se separaron los fragmentos dentales y se extirpó el tejido pulpar con un
cucharillas o limas endodónticas, figura 7.5 y 7.6. Dicho proceso se realizó en
presencia de un mechero para generar un campo de trabajo estéril (50).
Figura 7.5 Método de extracción pulpar por medio de corte a nivel CEJ
Realización de ranura de 0,5-1 mm de profundidad de un tercer molar.
Reproducida de Macedo L, Duarte J, Rodrigues I, Ayrton O, Macedo M, et al.
Comparative isolation protocols and characterization of stem cells from human
primary and permanent teeth pulp. Braz J Oral Sci. 2010. 9(4):427-433 (50).
Figura 7.6 Corte longitudinal de molar
A. Corte longitudinal sin alcanzar el tejido pulpar, B. Se separación de los
fragmentos dentales por medio de un cincel, C. Extracción del tejido pulpar porMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 79
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
medio de instrumentos endodónticos, D. Conservación del tejido pulpar en PBS.
Reproducida de Chen Y, Huang A, Chan A, Shieh T, Lin L. Human dental pulp
stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp
tissues of diseased teeth. J Oral Pathol Med. 2011; 40(10): 793-800 (72).
§ La fractura de la corona y las raíces dentales por medio de fórceps y extracción
del tejido pulpar en condiciones estériles, fue un método empleado en un inicio
por Pierdomenico et al, en el año 2005 (54). Este método aún se utiliza, Hilkens et
al, en el año 2014 optaron por este, donde se previene el sobre calentamiento del
tejido pulpar por el uso de discos o fresas para separar el tejido (39).
§ La extracción de la pulpa a través del foramen apical del conducto por medio de
limas endodónticas, al emplear este método en dientes inmaduros el tejido que se
extrae puede ser diferente al de la pulpa dental, obteniendo cultivos diferentes de
DPSCs tales como SCAPs (48).
§ En el año 2009 Huang et al, realizaron la extracción del tejido pulpar de dos
dientes anteriores indicados para tratamiento de conducto, cuatro días después
de presentar un trauma dental, durante la pulpectomía realizada con limas
endodónticas. Este método es poco convencional en las metodologías
empleadas, pero se logró aislar DPSCs aunque las condiciones de obtención de
la muestra fueron diferentes, figura 7.7 (62).
Figura 7.7 Método de extracción pulpar de diente 21 y 2280 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Diente 21 y 22 con indicación de tratamiento de conducto después de presentar
trauma dental, se observa obtención del tejido pulpar con lima endodóntica.
Reproducida de Huang A, Chen Y, Chan A, Shieh T, Lin L. Isolation and
Characterization of Human Dental Pulp Stem/Stromal Cells From Nonextracted
Crown-fractured Teeth Requiring Root Canal Therapy. J Endod. 2009; 35(5): 673-
81 (62).
Autores como Suchánek et al en el año 2007 realizaron una comparación de los
diferentes métodos de extracción pulpar, como el corte a nivel de la CEJ, uso de fórceps
para fracturar los tejidos duro del diente y el método de obtención pulpar a través del
foramen con instrumentos endodónticos, donde concluyeron que con las técnicas de
fragmentación de los tejidos duros del diente y obtención del tejido pulpar a través del
ápice fue posible aislar DPSCs, contrario del corte a nivel de la CEJ, la cual ha sido
empleada por diversos autores a lo largo del tiempo, en este caso realizada con una
fresa diamantada, fue un método en el que no se logró aislar DPSCs de la muestra del
estudio, lo cual se pudo presentar por sobrecalentamiento del tejido y alto riesgo de
contaminación de la muestra (48). Esta teoría difiere de los reportes científicos de otros
autores, donde emplearon dicho método, tomando la precaución de utilizar baja
velocidad, discos o fresas y condiciones del medio estériles, con resultados
satisfactorios, logrando aislar MSCs de la pulpa dental de dientes permanentes (14, 21,
40, 51, 57, 59 - 61, 64, 66, 68- 71).
7.1.4 Aislamiento del tejido pulpar
Los métodos de aislamiento de DPSCs de dientes permanentes extraídos en la práctica
odontológica de rutina son técnicas rápidas, sencillas y no invasivas. Hay dos métodos
de aislamiento para DPSCs que son los más empleados: Digestión enzimática y método
de crecimiento.
§ Método de digestión Enzimática
Después del lavado con solución amortiguadora estéril de fosfato (PBS), en
cabina de flujo laminar, al obtener la pulpa dental del diente, esta se coloca en
una caja de Petri estéril, el tejido de la pulpa debe cortarse en pedazos tan
pequeños como sea posible (piezas de 1 mm 3). Las muestras del tejido se debenMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 81
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
lavar dos veces con PBS estéril y se colocan en una solución de 2 mg/ml de
colagenasa tipo I y dispasa durante 30 – 45 min a 37 ° C, con agitación suave, en
un agitador orbital (Oktar et al., 2011). Las suspensiones celulares se obtienen
pasando los tejidos a través de una malla de 70 µm. Alternativamente, se debe
centrifugar a 130x g durante 5 min y el sedimento debe ser resuspendido en el
medio de crecimiento. Entonces, las placas de cultivo celular T25 cm 2 pueden
utilizarse para los cultivos y expandir DPSCs en varios pasajes.
Existen diferentes combinaciones enzimáticas con las que se ha logrado aislar
DPSCs:
- 3 mg/ml de colagenasa tipo I y 4 mg/ml de dispasa durante 30 – 60 min a
37 °C (Liu et al. 2006; Huang et al. 2006; Tirino et al. 2011)
- 1 mg/ml de colagenasa tipo I y 2,4 mg/ml de dispasa (Lee et al. 2011)
- 2 mg/ml de colagenasa tipo I y dispasa durante 30 min a 37 ° C (Yildirim et
al 2012).
- 0.2 % tripsina por 5 min a 37 °C (Spath et al. 2010 )
- 3 % de colagenasa tipo I por 1 h a 37 °C (Yan et al. 2011).
Uno de los primeros estudios de Nakashima demostró que las diferentes
separaciones enzimáticas (tripsina, colagenasa con y sin tratamiento de tripsina y
una mezcla de tripsina y colagenasa) no tuvieron efecto en las características
morfológicas de las células cultivadas de la pulpa, pero el método de colagenasa
pre tratado con tripsina generó el mayor número de células aisladas (Nakashima
1991). Sin embargo, el método de digestión enzimática permite el desarrollo de
diferentes tipos de células. Mientras que Nakashima reportó tres morfologías
diferentes (alargadas, estrelladas y epiteliales) (Nakashima 1991), Huang et al
mostró colonias compactas y sueltas después de la digestión enzimática (Huang
et al. 2006). Puesto que la digestión enzimática causa que todos los tipos de
células se liberen de los tejidos, no resulta sorprendente observar diversas
células. Sin embargo, sólo las células que tienen una apariencia fibroblástica son
capaces de sobrevivir después de varios pasajes con el uso de medios de cultivo
que promuevan las células mesenquimales (Huang et al. 2006).82 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
§ Método crecimiento de explantes
En este método, el tejido de la pulpa es cortado en pequeños fragmentos y
colocado directamente en una placa de cultivo celular con el medio de
crecimiento.
Aunque ambos métodos parecen dar lugar a células de la pulpa con propiedades
de SCs (About et al. 2000; Couble et al; 2000; Gronthos et al; 2000; Batouli et al.
2003), los efectos de diversos métodos de aislamiento de poblaciones celulares
de la pulpa también han sido cuestionados. Bakopoulou et al demostró que en las
muestras digeridas enzimáticamente, la tasa de mineralización y la cantidad de
matriz mineralizada producida fueron superiores en comparación con las
muestras obtenidas por el método de crecimiento del explante. Sin embargo, los
medios de cultivo celular fueron diferentes para los cultivos digeridos y los
generados por el método de crecimiento (Bakopoulou et al., 2011). Por el
contrario, Spath et al demostraron que las capacidades de diferenciación con los
cultivos del explante fueron mejores, comparados con las DPSCs por digestión
enzimática (Spath et al., 2010). Sin embargo, los cultivos de explantes fueron pre
tratados con tripsina en una caja de Petri revestida con fibronectina, en medio
completo MegaCell.
Las diferencias para los métodos de digestión enzimática y de crecimiento están
en el número de células y su homogeneidad. Mientras que el primero siempre es
mayor en la digestión enzimática, figura 7.8, los explantes permiten la expansión
de células con morfología fibroblástica en los cultivos de la pulpa dental.
Puesto que no hay marcadores específicos para las células de la pulpa dental, se
presentan continuos esfuerzos para la purificación de células aisladas de la pulpa
dental. Yan et al. 2011, modificaron el método de digestión enzimática utilizando
un protocolo mediante tamizado por tamaño para obtener poblaciones selectivas
de células pequeñas que contienen un alto porcentaje de las células madre. El
método de cultivo de colonias desarrollado como alternativa, no sólo consume
tiempo, sino que también las colonias obtenidas no son uniformes (Gronthos et
al., 2000). (22).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 83
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Figura 7.8 Número de células x 104, con método de digestión enzimática y
crecimiento de explante
Curva de crecimiento de DPSCs obtenidas por los dos métodos de aislamiento
celular, digestión enzimática con colagenasa Tipo I y dispasa, se observa mayor
crecimiento de DPSCs obtenidas por digestión enzimática, excepto en el 8vo día
de cultivo con DMEM, suplementado con 20% de FBS. Reproducida de Macedo
L, Duarte J, Rodrigues I, Ayrton O, Macedo M, et al. Comparative isolation
protocols and characterization of stem cells from human primary and permanent
teeth pulp. Braz J Oral Sci. 2010. 9(4):427-433 (50).
7.2 Cultivo in vitro de MSCs obtenidas de la pulpa de
dientes permanentes
7.2.1 Medio de cultivo celular para DPSCs
El medio de cultivo puede influir en la manipulación y las técnicas de cultivo, así como en
la morfología y la capacidad de diferenciación de las células, especialmente para el
cultivo de poblaciones celulares heterogéneas que contienen células en diversas etapas
de diferenciación como en pulpa dental. Las células de la pulpa dental generalmente son
cultivadas en medio basal de eagle (EBM), medio mínimo esencial de eagle (MEM), MEM
alfa, o medio modificado de eagle Dulbecco (DMEM). El medio nutritivo complejo de Ham84 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
F12 (F12) se ha optimizado para la clonación. Una mezcla 1:1 de DMEM y F12 combina
la riqueza de F12 y la mayor concentración de nutrientes de DMEM. Éstos apoyan la
expansión de las células mesenquimales sin la inducción de senescencia precoz y
diferenciación (Freshney 2005). Se ha demostrado que diversos medios favorecen a
diferentes poblaciones celulares en cultivos de células pulpares. Mientras el medio 199
favorece a las células fibroblásticas, MEM y BME favorecen al tejido conectivo y las
células epiteliales (Miller et al., 1976). Nakashima encontró que el DMEM y la mezcla
DMEM/F-12 conduce a los mejores resultados de adherencia, crecimiento celular y
número de células en confluencia en comparación con el F-12, medio Roswell Park
(RPMI) y medio 199 (Nakashima 1991). Inicialmente Nakashima concluye que DMEM
puede ser preferido para el cultivo de células de la pulpa, debido a que la proporción de
población resultante mostró que era predominante la población de células fibroblástica de
la pulpa. Sin embargo, más tarde su grupo utiliza medios muy complejos para cultivos de
pulpa dental porcina (Iohara et al. 2008). Aunque no se definió claramente su digestión
enzimática, el medio de cultivo fue EBM2, con factores de crecimiento como el factor de
crecimiento fibroblástico básico (bFGF), factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF1),
factor de crecimiento epidermal (EGF), y factor de crecimiento del endotelio vascular A
(VEGF-A). Además, se determinó la concentración óptima de suero porcino para
mantener todas las celdas seleccionadas (Iohara et al. 2008). Aunque usaron DMEM en
sus estudios consecuentes, la proporción de suero fue del 2% (Iohara et al., 2008) o 10%
(Ishizaka et al 2012) y los suplementos no fueron indicados. Lopez-Cazaux et al
demostraron que mientras el medio MEM rico en calcio y pobre en fosfato favoreció el
reclutamiento o proliferación de las células positivas a actina del músculo liso (SMA +), el
medio RPMI 1640 con alto contenido de calcio, disminuye SMA + en las células de los
cultivos de pulpa dental humana y los autores informaron que el MEM fue más potente
para la diferenciación celular en pseudo-odontoblasto, que RPMI 1640 (Lopez-Cazaux et
al. 2006). Govindasamy et al cultivaron las células de la pulpa dental en cuatro diferentes
medios: DMEM-knock-out (DMEM-KO), DMEM bajo en glucosa (DMEM-LG), DMEM/F12
y medio mínimo esencial - alfa (MEM-alfa), todos suplementado con 10% FBS.
Observaron que MEM-alfa y DMEM-KO son las condiciones de cultivo óptimas para
DPSCs en términos de proliferación, morfología, análisis superficial del marcador celular
y tiempo de duplicación de la población. El resultado interesante de este estudio es que
mientras que las células cultivadas en MEM-alfa, DMEM-KO, y DMEM/F12 demostraron
la diferenciación en linajes mesodérmicos en el pasaje temprano (P1) y el último pasajeMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 85
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
(P9), las DPSCs cultivadas en DMEM-LG exhiben defectos de diferenciación cuando las
células fueron reconocidas después del 5 pasaje (Govindasamy et al. 2010) (22).
Suchánek et al. 2009, cultivaron DPSCs en medio de cultivo con 2 o 10% de FBS, o con
2% de FBS con 10 µl/ml de ITS (medio suplementado con insulina, transferrina y selenio),
observaron que al agregar ITS en el medio de cultivo, la proliferación celular aumentaba
claramente. Además observaron que el diámetro de las células no se alteró en función
del medio de cultivo utilizado (49). Eubanks et al. 2014, realizaron el cultivo celular con
MEM- alfa con 15% de FBS (suero que se utiliza generalmente), MEM- alfa con 15% de
suero humano (HS) y MEM- alfa con 15% de HS + fibronectina (FN), demostrando que
no se ve afectada la capacidad de aislar DPSCs. Sin embargo, usando HS en lugar de
FBS en el aislamiento inicial de DPSCs la tasa de éxito de aislamiento fue de 89% (FBS)
y 23% (HS). La incorporación de FN en el aislamiento inicial de DPSCs (usando HS)
aumentó la tasa de éxito de aislamiento al 83%, figura 7.9. Curiosamente, se encontró
que la tasa de proliferación fue mayor para DPSCs en HS que para DPSCs en FBS.
Finalmente, no hubo diferencias en la expresión de CD73, CD90, CD105 o multipotencia
(73). La presencia o ausencia de antifúngicos en el medio de cultivo, no influye en la
contaminación de este, Perry et al. 2008, atribuyen la contaminación a causas
endógenas del huésped que a una contaminación después de la exodoncia (64).
Figura 7.9 Aislamiento de DPSCs empleando suero animal y suero humano
La incorporación de FN en el aislamiento inicial de DPSCs (usando HS) aumentó la tasa
de éxito de aislamiento al 83%. Reproducida de Eubanks E, Tarle S, Kaigler D. Tooth
Storage, Dental Pulp Stem Cell Isolation, and Clinical Scale Expansion without Animal
Serum. JOE. 2014. 40, (5):652-657 (73).86 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Kerkis y Kaplan en el 2012 concluyen que en poblaciones de células aisladas y
cultivadas in vitro, el equilibrio en la cantidad de SCs en las diferentes etapas del cultivo
depende directamente del método de aislamiento y de las condiciones del cultivo celular.
En consecuencia la calidad y cantidad de suero bovino fetal (FBS) agregado en el medio
del cultivo basal, el uso de digestión enzimática, además de otros cambios introducidos
en el protocolo para el aislamiento de células madre y el uso de factores de crecimiento
puede contribuir a la selección o la propagación de las diferentes poblaciones de células
madre o progenitoras. Asimismo, los aminoácidos, proteínas, glucosa y vitaminas en los
medios enriquecidos podría ser responsable de los diferentes resultados. Los datos
preliminares sobre los efectos de la albúmina en proliferación DPSCs mostraron que la
albúmina tiene una fuerte influencia sobre la morfología de las células.
En pocas palabras, las técnicas utilizadas para obtener DPSCs difieren ampliamente,
incluso dentro del mismo grupo. Estas variaciones hacen compleja la comparación de los
cultivos, las técnicas, y los medios de cultivo de células que se utilizan constantemente.
Los datos que están disponibles dentro de la literatura científica con respecto a las
características celulares y moleculares de los cultivos, presentan diferentes técnicas que
causan resultados diferentes y confusos. Por lo tanto, la interpretación de estos informes
necesita una evaluación cuidadosa ya que los datos publicados de los investigadores
podrían centrarse en sus necesidades, y no sólo en los resultados ya interpretados (22).
7.2.2 Pasajes o sub cultivos
Muchos de los artículos no reportan el desarrollo de pasajes o sub cultivos, otros
mencionan que fue realizado, pero omiten el número de pasajes realizados, Zhang et al.
2006 describieron que en su estudio realizaron 26 pasajes o sub cultivos celulares, el
cual fue el mayor número de sub cultivos realizados en las metodologías analizadas (66).
En la literatura científica se encuentra que las DPSCs pueden sobrevivir por largos
periodos y pueden estar en los pasajes por mucho tiempo, es posible que se obtengan
más de 80 pasajes sin signos claros de senescencia determinada por factores intrínsecos
que regulan el ciclo celular, Rb y p53, y se observa el acortamiento de los telómeros en
los cromosomas. Las células iniciales presentes en el cultivo presentan la habilidad de
proliferar, se establece una línea celular por medio de los pasajes o sub cultivos (17).
Estos se realizan tres días después de iniciar el cultivo primario de DPSCs, de laMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 87
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
siguiente manera:
§ Aspirar el medio de cultivo antiguo de las placas de cultivo primarias de DPSCs
(pasaje 0, "P0") y se transfiere a un tubo cónico de 15 ml estéril. Se agrega
inmediatamente la solución de separación celular (0,75 ml de CTC por placa de
cultivo de 35 mm). Se coloca la placa de cultivo en incubadora a 37 ° C durante 2
– 5 minutos hasta que todas las células se han separado. Las células separadas
deben observarse redondos y refractar la luz alrededor de su membrana.
§ Agregar el antiguo medio de cultivo en la placa para inhibir el CTC y entonces
transferir la solución celular a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 1.000 Å ~ g
durante 5 min, aspirar el medio desde el precipitado, las células se encontraran
en la parte inferior del tubo cónico de 15 ml, teniendo cuidado de no perturbar el
sedimento celular.
§ Re suspender el sedimento celular en un medio de cultivo nuevo, precalentado,
mediante pipeteo suave arriba y abajo para obtener la suspensión de células.
Colocar las células derivadas a un volumen de 7 ml de solución de medio de
cultivo y transferir a la placa de cultivo de 100 mm en el pasaje 1 (P1).
§ Una vez que las células alcanzan el 70 – 80% de confluencia (3 días
aproximadamente), se debe repetir el protocolo de pasaje celular descrito y
colocar 2 x 10 3 células / cm2 en platos de 100 mm. Se debe cambiar el medio
cada 3 días (74).
7.3 Caracterización in vitro de MSCs obtenidas de la
pulpa de dientes permanentes
Una vez obtenido un discreto número de células, aproximadamente 60 x 10 6 células
totales en el P5, se deben cosechar o recoger muestras para realizar análisis, tales como
immunofluorescencia, separación celular activada por fluorescencia (FACS), PCR-tiempo
real (74).
Las técnicas de separación celular magnética (MACS) y la separación celular activada
por fluorescencia (FACS) presentan algunas diferencias, la separación celular magnética88 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
parece ser simple y económica, pero FACS ofrece viabilidad y alta pureza, sin embargo,
el alto costo es la desventaja de este método (Tirino et al. 2011). Desde que el anticuerpo
STRO-1 fue identificado como un antígeno de superficie celular expresado por la fracción
osteogénica de precursores estromales en la médula ósea humana, se ha utilizado para
seleccionar el precursor de células estromales de pericitos dentro de la pulpa dental
(Yang et al. 2007). Mientras que la fracción STRO-1 + se puede presentar en células con
potencial odontogénico y multilinaje en la pulpa dental de ratas (Yang et al. 2007), Shi y
Gronthos han demostrado que DPSCs STRO-1 + expresa el antígeno vascular CD146,
actina del musculo liso alfa y un antígeno asociado a pericitos (3G5), por
immunohistoquímica, FACS y/o selección inmunomagnética (Shi y Gronthos 2003) (22).
Laino G et al. 2006 definen que no existe un marcador que caracterice exclusivamente a
las DPSCs. Estas células son positivas para c-kit (receptor de membrana tirosina-
quinasa), se expresa en células derivadas de cresta neural, STRO-1 (marcador que
reconoce el antígeno de células perivasculares, con precursores osteogénicos) y CD34
(marcador de células madre pluripotente tanto del estroma como hematopoyético). Las
DPSCs son negativas para CD44 (detecta células de origen mesenquimal diferenciadas),
CD45 (células hematopoyéticas) y CD14 (marcador monocítico) (55). Atari et al. 2011,
demostraron la pluripotencialidad de las DPSCs reconociendo eran positivas para
marcadores de células madre embrionarias: SSEA-4, Oct4, Nanog, FLK-1, HNF3beta,
Nestin, Sox2, Lin28, c-Myc, CD-13, CD-105 y CD 90, CD-29, CD-73, STRO-1 con baja
expresión; a su vez eran negativas para: CD-3, CD-45 y CD-146 (51).
Se ha observado que después de diferenciarse a osteoblastos, las DPSCs son positivas
para STRO-1, calceína, osteonectina, CD45, CD44 y RUNX-2 negativas para CD34 y c-
kit (55)Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 89
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Tabla 7.1 Marcadores de DPSCs
Marcador Origen de Caracterización Características
las Células
c-­‐kit DPSCs de +(Laino G y Receptor de membrana tirosina-­‐quinasa. Interacciona
humanos cols.2006) con factor de células madre. Se expresa en células de
cresta neural
STRO-­‐1 DPSCs de +(Laino G y Marcador de célula madre de estroma, que reconoce el
humanos cols.2006) antígeno de células perivasculares, y que en la médula
ósea contiene precursores osteogénicos
CD 34 DPSCs de +(Laino G y cols. Marcador de célula madre pluripotente tanto de
humanos 2006) estroma como hematopoyético
CD 44 DPSCs de -­‐ (Papaccio G y Detecta células de origen mesenquimal diferenciadas
humanos cols.2006) adheridas
CD 45 DPSCs de -­‐ (Papaccio G y Marcador de células hematopoyéticas
humanos cols.2006)
CD 14 DPSCs de -­‐ (Papaccio G y Marcador monocíticos
humanos cols.2006)
OCT-­‐04 DPSCs de +(kerkis I y Marcadores de células madre embrionarias
Nanog humanos cols.2006)
NESTIN DPSCs de +(Atari M y Proteína de función desconocida que se expresa en CM
humanos cols.2011) neuroectodérmicas
CD 31 DPSCs de +(waddington RJ ASCs
ratas y cols.2009)
CD 105 DPSCs de +(waddington RJ Marcadores de superficie de células endoteliales que se
Notch 2 ratas y y cols.2009) expresan en MSC
humanos
Expresión de marcadores celulares realizada por diferentes autores
Un estudio realizado en México en el año 2010 por Magallanes et al, describe una
técnica para la caracterización de DPSCs, en la que emplearon marcadores positivos de
MSCs. Para detectar los marcadores específicos STRO-1 y CD-44, las células madre
aisladas de los extractos pulpares, se cultivan en cajas de cultivo durante 3 días. Pasado
el tiempo las células se fijaron con paraformaldehído al 4% por 10 minutos, se lavaron
con buffer de fosfato (PBS) por 2 minutos repitiendo tres veces. Para detectar los
marcadores específicos las células se permeabilizaron con metanol frío durante 10
minutos y se incubaron con los anticuerpos específicos que reconocen a los epítopes
STRO-1 y CD-44, a una concentración de 1:100 incubados a 4°C durante 24 horas.
Pasado el tiempo de reacción se lavaron 3 veces por 10 minutos con PBS-Tritón 100x90 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
para eliminar la señal inespecífica del anticuerpo. La señal se obtendrá por incubar con
un segundo anticuerpo acoplado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) a una
concentración de 1:1000. Esta señal se observó bajo el microscopio de fluorescencia y
se tomaron fotos de 5 campos al azar para foto documentar la señal positiva de los
marcadores (75).
Las DPSCs poseen características fibroblásticas. Conservan la plasticidad durante por lo
menos 25 pasajes, manteniendo el cariotipo normal y la tasa de expansión
característicos de las células madre (Kerkis et al. 2006). Usando la citometría de flujo, el
análisis de marcadores de superficie celular de DPSCs demuestra consistentemente que
son positivas para CD73, CD90, CD105 (endoglina), CD13. CD29 (integrina b1), CD44
figura 7.10, HLA-A, B y C. Son negativos para CD45, CD34, CD14, CD54, CD 133
(Oktar et al 2011; Chen et al. 2012), así que cumplen los criterios de MSC establecidos
por la ISCT (Dominici et al. 2006). Además de cumplir las condiciones descritas
anteriormente, se ha demostrado que DPSCs expresan marcadores de pluripotencia
incluyendo Oct4, Nanog, c-Myc, Sox2, etapa especifica embrionaria (SSEA-3, SSEA-4) y
antígenos de reconocimiento tumoral (TRA-1 – 60 y TRA-1 – 81) (Kerkis et al. 2006;
Nakamura et al., 2009; Govindasamy et al., 2010; Liu et al. 2011). Sin embargo, es
importante señalar que estos niveles de expresión podrían no ser compatibles con los
valores observados en las células madre embrionarias (Lengner et al. 2007). Para más
características fenotípicas in vitro de DPSCs, se ha publicado recientemente el empleo
de micro arreglos cDNA basado en el sistema de comparación entre DPSCs humanas y
MSCs humanas (Yamada et al. 2006). Ampliando el anterior perfil de expresión génica de
4.000 genes humanos en SHED, DPSCs y la médula ósea por Shi et al (2001), Yamada
et al. reveló varios genes que codifican los componentes de la matriz extracelular,
moléculas de adhesión celular, factores de crecimiento y factores de transcripción como
Msx1 y Jun-B. Según sus análisis de clúster Yamada et al, concluyen que existen
diferencias en los niveles de expresión génica para la señalización celular, comunicación
celular y metabolismo de la célula (Yamada et al. 2006). Usando perfiles de expresión
integrados de miRNA y mRNA, Chen et al compararon DPSCs y células madre del
cordón umbilical (UCSC) (Chen et al., 2012). Determinaron mediante el análisis de la red
funcional que dos genes (SATB2 y TNFRSF11B), que están implicados en el desarrollo
óseo, osificación y organización del citoesqueleto de actina, son típicas de DPSCs.Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 91
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
También mostraron regulaciones de NEDD4 y EMP1, que se ha demostrado que están
implicadas en la diferenciación neuroectodermal en DPSCs (Chen et al., 2012). A pesar
del hecho de que la pulpa dental es un tejido heterogéneo, la actual disponibilidad de
datos puede ayudar a desarrollar en el futuro métodos específicos de aislamiento de
DPSCs.
Figura 7.10 Inmunofluorescencia de DPSCs
A. Expresión de CD29, B. Expresión de CD44, C. Expresión de CD166. Reproducida de
Kellner M, Steindorff M, Strempel J, Winkel A, Kuhnel M, et al. Differences of isolated
dental stem cells dependent on donor age and consequences for autologous tooth
replacement. Archives of oral biology. 2014; (59): 559– 567 (43).92 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
8. PROPUESTA DE METODOLOGÍA SOBRE
OBTENCION DE MUESTRA, CULTIVO Y
CARACTERIZACIÓN IN VITRO DE MSCs
HUMANAS OBTENIDAS DE LA PULPA DE
DIENTES PERMANENTES
Las DPSCs tienen una morfología fibroblástica, adherencia al plástico, potencial
proliferativo, capacidad de diferenciación en osteoblastos, condrocitos, adipocitos,
miocitos, neuronas y hepatocitos in vitro y capacidad de reparar tejidos in vivo (33).
Para obtener DPSCs son necesarios procedimientos clínicos y de laboratorio descritos
en diversas metodologías. Actualmente se contempla la aplicación de terapias que
promuevan la regeneración y mejoren la reparación de tejidos dentales, a partir de la
identificación y aislamiento de células progenitoras odontogénicas de la pulpa de dientes
permanentes llevada a cabo en un inicio por Gronthos et al (3, 5, 10, 11, 13, 14, 38).
8.1 Propuesta para obtención de la muestra de MSCs
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes
Para comenzar, es importante la lectura de este documento y adicionalmente de
literatura científica que se publique posterior a la elaboración de esta propuesta, pues
para desarrollar un estudio experimental se requiere estar actualizado en el tema, en
búsqueda de nuevas técnicas, procedimientos o reactivos empleados para la obtención
de muestra, cultivo y caracterización in vitro de MSCs humanas obtenidas de la pulpa de
dientes permanentes, a su vez en los artículos se encuentra la información deMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 93
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
correspondencia de los principales autores, instituciones o laboratorios encargados de
los proyectos que puede ser empleada al momento de alguna inquietud respecto al tema.
Los documentos que involucran estudios en humanos y obtención de células madre a
partir de un tejido humano deben reportar la aprobación del proyecto por parte del comité
de ética institucional. También es importante señalar la forma en que se explica al
paciente las características del estudio y su participación en este, además de la
aprobación por medio del consentimiento informado; con el fin de esclarecer que es un
proyecto que se lleva a cabo bajo todos los requerimientos legales.
8.1.1 Selección del paciente
§ Estado de salud general y bucal de paciente
El tejido de la pulpa dental debe ser extraído de dientes permanentes de adultos
sistémicamente sanos. También es importante que el paciente no presente
consumo de alcohol, drogas y/o cigarrillo como lo reportó Agha - Hosseini et al, en
el año 2010 (42), con lo que se asegura una mayor tasa de éxito al aislar DPSCs.
Previo a su extracción se debe indagar en búsqueda de enfermedades
sistémicas y realizar una exploración en búsqueda de infecciones orales. Solo los
sujetos que no presenten enfermedades deben ser seleccionados. Los pacientes
seleccionados deben ser sometidos a tratamientos de higiene oral profesional por
una semana previo a la extracción dental (44).
A su vez, el diente del que se extrae el tejido pulpar debe estar libre de
enfermedades ya que son notables las diferencias en las características de
proliferación de las DPSCs de dientes con un tejido pulpar que presenta
inflamación comparado con los dientes sanos (33, 45, 46). Se recomienda realizar
pruebas de sensibilidad (prueba al frio, calor, palpación y percusión), inspección
clínica en busca de caries, erosión y atrición dental, entre otras. Solicitar una
radiografía periapical preoperatoria del diente a extraer en busca de signos94 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
imperceptibles en la clínica, como caries interproximales, obliteración parcial o
total del espacio pulpar y patología apical.
§ Edad del paciente
Los procedimientos para obtención de DPSCs son de alto costo y requieren de
largos tiempos en el laboratorio, es aconsejable buscar la reducción de estos
tiempos, sin afectar los resultados, el empleo de dientes de pacientes de edades
comprendidas entre los 18 a los 22 años puede favorecer en este propósito, ya
que se ha reportado que las células de pacientes menores de 22 años exhiben un
tiempo de duplicación significativamente más rápido que la células de pacientes
mayores de 22 años (43).
§ Genero del paciente
El género del paciente del que se extrae la pieza dental no es un factor que
influye en la obtención de SCs de la pulpa dental, como lo describieron
Pierdoménico et al (54).
8.1.2 Características de los dientes empleados
§ Selección del diente
Elección de terceros molares y premolares, debido a que son los dientes que
generalmente se extraen por indicación ortodóntica cuando se encuentran sanos.
§ Número de dientes empleados
Definir los objetivos por los que se realizará el aislamiento, cultivo y
caracterización de hDPSCs y determinar el número de dientes que es
conveniente emplear. Se recomienda utilizar un mínimo de tres dientes de
diferentes pacientes, ya que durante el proceso de aislamiento y cultivo se
pueden presentar fallas de técnica que conducen a la contaminación de las
cultivos y su posterior perdida.Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 95
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
§ Proceso de exodoncia
El proceso de exodoncia debe ser lo menos traumático posible, para evitar daño
en el tejido dental, se debe registrar cada paso y elemento empleado en la
historia clínica del paciente. De manera resumida se describe el proceso:
Antisepsia: Realizar un enjuague con clorhexidina al 0,12% durante un minuto.
Anestesia: Bloqueo de nervio (el nervio a bloquear es dependiente del diente que
se extrae), para el caso de los terceros molares mandibulares se emplea una
técnica troncular y técnica infiltrativa para las extracciones del maxilar. Según el
caso lo dicte se empleara una solución anestésica con o sin vasoconstrictor.
Exodoncia método simple: En un campo operatorio aséptico, posterior a la
anestesia se realiza sindesmotomia, luxación con elevadores según el caso,
extracción, hemostasia y realizar un control.
Exodoncia quirúrgica: Según el caso realizar una incisión, levantar colgajo, de
espesor total, valorar si es necesaria la osteotomía y evitar la odontosección,
curetear el alveolo, suturar , medicar y realizar un control (65).
§ Conservación del diente post- exodoncia
Despues de la exodoncia los dientes se deben desinfectar con isodine, y etanol al
70% (22). No se requiere un lavado adicional del diente. Estos deben ser
transportados y conservados en PBS (Solución que muestra mejor
comportamiento de crecimiento celular, cuando se emplea como medio de
almacenamiento durante 1, 96 o 120 horas), también se recomiendo el uso de la
solución de conservación HTS, con la cual se presenta mayor crecimiento celular
cuando se realiza extracción del tejido pulpar a las 24, 48 y 72 horas tras la
exodoncia (64). Se debe adicionar 100 U/ml de penicilina, 100 ug/ml de
estreptomicina y 3 g/ml de anfotericina B a 4·C, para evitar la contaminación
bacteriana y micótica de los cultivos (61)
§ Tiempo de preservación de los dientes antes de extraer el
tejido pulpar
La tasa de recuperación de hDPSCs después de almacenar los dientes intactos
en nitrógeno líquido (N2 liq) es del 20% (72), por lo que se recomienda realizar su96 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
transporte y extracción del tejido pulpar de forma inmediata (hasta 1 hora), de no
ser posible no se debe exceder los dos días, ya que se ha observado un menor
crecimiento celular tras 72 horas entre exodoncia y cultivo.
8.1.3 Método de extracción pulpar
Realizar una limpieza de los restos del medio de conservación previo a la extracción del
tejido pulpar con etanol al 70% (69). Se plantea una combinación de las metodologías
empleadas para evitar el sobrecalentamiento y la contaminación, al utilizar una ranura de
0,5 a 1 mm de profundidad por medio de un disco de baja velocidad estéril, alrededor de
CEJ sin alcanzar el tejido pulpar, posteriormente separar los fragmentos dentales y
extracción de la pulpa dental por medio de instrumentos endodónticos o pinzas. Dicho
proceso se debe realizar en presencia de un mechero para generar un campo de trabajo
estéril.
8.1.4 Aislamiento del tejido pulpar
Después del lavado con solución amortiguadora estéril con fosfato (PBS), en cabina de
flujo laminar, al obtener la pulpa dental del diente, esta se coloca en una caja de Petri
estéril, el tejido de la pulpa debe cortarse en pedazos tan pequeños como sea posible
(piezas de 1 mm 3). Las piezas del tejido se deben lavar dos veces con PBS estéril y se
colocan en una solución de 3 mg/ml de colagenasa tipo I y 4 mg/ml dispasa durante 30 –
60 min a 37 ° C, con agitación suave, en un agitador orbital (Oktar et al., 2011). Las
suspensiones celulares se obtienen pasando los tejidos a través de una malla de 70 µm.
Alternativamente, se debe centrifugar a 130x g durante 5 min y el sedimento debe ser
resuspendido en el medio de crecimiento (22).
8.2 Propuesta para cultivo in vitro de MSCs obtenidas de
la pulpa de dientes permanentes
8.2.1 Medio de cultivo celular para DPSCs
Se sugiere realizar una mezcla de medio de cultivo, suero animal y suplementos que
conduzca a mejores resultados de adherencia, crecimiento celular y número de célulasMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 97
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
en confluencia, se propone emplear DMEM con 2% de FBS + 10 µl/ml de ITS o 1mg/ml
de glucosa, el agregar medios enriquecidos ha demostrado que aumenta claramente la
proliferación celular.
8.2.2 Pasajes o sub cultivos
Estos se realizan tres días después de iniciar el cultivo primario de DPSCs, de la
siguiente manera:
§ Aspirar el medio de cultivo antiguo de las placas de cultivo primarias de DPSCs
(pasaje 0, "P0") y se transfiere a un tubo cónico de 15 ml estéril. Se agrega
inmediatamente la solución de separación celular (0,75 ml de CTC por placa de
cultivo de 35 mm). Se coloca la placa de cultivo en incubadora a 37 ° C durante 2
– 5 minutos hasta que todas las células se han separado. Las células separadas
deben observarse redondos y refractar la luz alrededor de su membrana.
§ Agregar el antiguo medio de cultivo en la placa para inhibir el CTC y entonces
transferir la solución celular a un tubo cónico de 15 ml. Centrifugar a 1.000x g
durante 5 min, aspirar el medio desde el precipitado, las células se encontraran
en la parte inferior del tubo cónico de 15 ml, teniendo cuidado de no perturbar el
sedimento celular.
§ Re suspender el sedimento celular en un medio de cultivo nuevo, precalentado,
mediante pipeteo suave arriba y abajo para obtener la suspensión de células.
Colocar las células derivadas a un volumen de 7 ml de solución de medio de
cultivo y transferir a la placa de cultivo de 100 mm en el pasaje 1 (P1).
§ Una vez que las células alcanzan el 70 – 80% de confluencia (3 días
aproximadamente), se debe repetir el protocolo de pasaje celular descrito y
colocar 2 x 10 3 células / cm2 en platos de 100 mm. Se debe cambiar el medio
cada 3 días (74).98 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
8.3 Propuesta para caracterización in vitro de MSCs
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes
Debido a que los procedimientos de caracterización son costosos, por los elevados
precios de los equipos e insumos, como los anticuerpos (Ac), se recomienda emplear
dos Ac para detectar la expresión celular positiva y dos Ac para expresión negativa,
incluso hay artículos que reportan el uso de un Ac, donde refieren lograr aislar DPSCs ().
Se recomienda emplear la técnica descrita por Magallanes et al. 2010, ya que es posible
obtener DPSCs, con una metodología de bajo costo, pero con una variación y siguiendo
los lineamientos de la ISCT, al emplear marcadores específicos de células
hematopoyéticas y monocíticos para detectar expresión positiva y negativa. Los
marcadores específicos STRO-1, CD-105, CD45 y CD14 serán empleados. Las células
madre aisladas de los extractos pulpares, se cultivan en cajas de cultivo durante 3 días.
Pasado el tiempo las células se fijan con paraformaldehído al 4% por 10 minutos, se
lavan con solución buffer de fosfato (PBS) por 2 minutos, repitiendo tres veces el
procedimiento. Para detectar los marcadores específicos las células se permeabilizan
con metanol frío durante 10 minutos y se incuban con los anticuerpos específicos que
reconocen a los epítopes STRO-1 y CD-105, CD45 y CD14 a una concentración de 1:100
incubados a 4°C durante 24 horas. Pasado el tiempo de reacción se lavan 3 veces por 10
minutos con PBS-Tritón 100x para eliminar la señal inespecífica del anticuerpo. La señal
se obtendrá por incubar con un segundo anticuerpo acoplado a isotiocianato de
fluoresceína (FITC) a una concentración de 1:1000. Esta señal se observa bajo el
microscopio de fluorescencia y se toman fotos de 5 campos al azar para foto-documentar
la señal positiva y negativa de los marcadores (75).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 99
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
9. Conclusiones y recomendaciones
9.1 Conclusiones
§ Además de la aprobación del comité de ética y el consentimiento informado, es
necesario la elaboración de un folleto que explique al paciente los procedimientos
a realizar y el futuro uso de las DPSCs, por esta razón se elabora este folleto para
su posterior empleo.
§ Se deben seleccionar pacientes sanos (para evitar transmisión de diversas
enfermedades durante la manipulación de los dientes), que no presenten
consumo de sustancias como el cigarrillo, alcohol o drogas, sin la presencia de
infecciones orales.
§ El diente del que se extrae el tejido pulpar debe estar libre de enfermedades ya
que son notables las diferencias en las características de proliferación de las
DPSCs de dientes con un tejido pulpar que presenta inflamación comparado con
los dientes sanos.
§ Es posible el aislamiento de DPSCs a cualquier edad, este es solo un factor que
influye en la velocidad de duplicación celular, sin embargo, ya que los
procedimientos para obtención de DPSCs son de alto costo y requieren de largos
tiempos en el laboratorio, es aconsejable buscar la reducción de estos tiempos,
sin afectar los resultados, y el empleo de dientes de pacientes de edades
comprendidas entre los 18 a los 22 años puede favorecer en este propósito.
§ No hay suficiente literatura científica disponible que establezca diferencias entre
el género del paciente para el aislamiento de DPSCs, es importante que se
realicen más estudios al respecto, con una muestra superior a la que fue
empleada en el estudio de Pierdomenico et al, en el año 2005.100 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
§ La selección del diente es un proceso que se relaciona íntimamente con la
disponibilidad de las piezas dentales, más no con el volumen de los diente o su
posición en los maxilares.
§ Es importante realizar una descripción del proceso de exodoncia, pues son
empleados diversos materiales e instrumentos que pueden afectar el estado de la
pulpa dental. El proceso de exodoncia debe ser lo menos traumático posible, para
evitar daño en el tejido dental.
§ Es necesario emplear un medio de conservación del diente para preservar las
propiedades biológicas del tejido pulpar, especialmente cuando deben ser
transportados para su procesamiento, es conveniente el uso de antibióticos para
evitar la contaminación de los cultivos, Solución salina de fosfato (PBS, Sigma
Chemical, St. Louis, MO) comparada con hipotermosol (HTS, Solucion de BioLife,
Bothell, WA), y medio basal mesencult® (Tecnologías StemCell, Vancouver, BC,
Canadá) es el medio que presentó mejor comportamiento, donde se observó un
mayor número de DPSCs después de 120 horas de conservación.
§ La realización de un corte a nivel de la unión amelo-cemental (CEJ), y extracción
del tejido dental por medio de diversos instrumentos como cucharillas
endodónticas, curetas, limas endodónticas, pinzas, es el método más empleado y
útil, desde el año 2000 cuando Gronthos et al, lo llevaron a cabo.
§ Las diferencias para los métodos de digestión enzimática y de crecimiento están
en el número de células y su homogeneidad. Mientras que el primero siempre es
mayor en la digestión enzimática, los explantes permiten la expansión de células
con morfología fibroblástica en los cultivos de la pulpa dental.
§ El medio de cultivo puede influir en la manipulación y las técnicas de cultivo, así
como en la morfología y la capacidad de diferenciación de las células,
especialmente para el cultivo de poblaciones celulares heterogéneas que
contienen células en diversas etapas de diferenciación como en pulpa dental.
§ No existe un marcador que caracterice exclusivamente a las DPSCs. Estas
células son positivas para múltiples marcadores, por lo que se deben seleccionar
algunos de estos para ser empleados ya que son de alto costo.Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 101
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
9.2 Recomendaciones
§ Se recomienda la continuación de este estudio con una revisión narrativa
exhaustiva de la literatura científica disponible que incluyan procesos de
diferenciación y criopreservación de MSCs humanas obtenidas de la pulpa de
dientes permanentes maduros.
§ El empleo del resultado final de este estudio deberá ser inmediato a su
culminación para que pueda ser aplicable a los procesos de laboratorio con una
validez científica.
§ De igual manera invitamos a la actualización del mismo a la hora de ser
empleado, porque sabemos que con el paso del tiempo pueden surgir cambios
metodológicos para cualquiera de las etapas (obtención de muestra, aislamiento,
cultivo y caracterización).Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas
de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
A. Anexo. Matriz de metodologías
empleadas desde el año 2000 para
obtención de muestra, cultivo y
caracterización in vitro de células madre
mesenquimales humanas obtenidas de la
pulpa de dientes permanentes.104 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
A. Anexo. matriz de metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de muestra, cultivo y
caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes
permanentes (artículos 1, 2, 3, 4)
ARTÍCULO/VARIABLE ARTÍCULO 1 ARTÍCULO 2 ARTÍCULO 3 Artículo 4
REFERENCIA Referencia 14 Referencia 54 Referencia 55 Referencia 66
AUTORES Gronthos S. y colaboradores Pierdomenico L. y colaboradores Papaccio G. y colaboradores Zhang W. y colaboradores
AÑO Año 2000 Año 2005 Año 2006 Año 2006
National institute of Dental and Department os Histology, Embriology, Department of experimental Medicine, Radboud University Nijmegen Medical
LABORATORIO Craniofacial research, Bethesda and Applied Biology, Bologna Naples Centre
Solo reporta para transplantación en
APROBACIÓN COMITÉ ÉTICA SI y para transplantación en animales SI animales SI
CONSENTIMIENTO INFORMADO NR SI NR NR
ANTECEDENTES SISTÉMICOS Sanos NR Sanos NR
TIPO DE DIENTE 3er molar Molares NR Molares
NÚMERO DE DIENTES UTILIZADOSNR 5 dientes NR NR
EDAD PACIENTES 19-­‐29 años Promedio 40 años (3Mujeres Y 2hombres)21-­‐45 años 18-­‐24 años
MOTIVO EXODONCIA Incluidos NR NR Incluidos
Sanos, pretratamiento 1 semana con
ESTADO BUCAL DEL PACIENTE NR NR higienista Sanos
PROCESO EXODONCIA NR NR NR NR
Inmersos en medio mínimo escencial
Inmersión en solución fisiológica con alfa con 0,5mg/ml gentamicina y 3g/ml
CONSERVACIÓN DEL DIENTE NR antibióticos NR de anfotericina B
Antes extraer pulpa se colocó en corona
Uso de forceps para fracturar corona (10 clorhexidina gel al 0,3% por 2 minutos. Con
MÉTODO EXTRACCIÓN PULPAR Corte CEJ minutos) en condiciones estériles cucharilla o cureta gracey Corte CEJMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 105
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
El tejido fue suspendido en medio de
cultivo mínimo escencial (MEM) con 25%
de FBS inactivado, 200 U/ml de Pulpa inmersa en solución digestiva
penicilina, 200µg/ml estreptomicina, colagenasa plus TI 3mg/ml y dispasa
2,5µg/ml anfotericina B a 37·∙C Y 5% CO2 4mg/ml en 4 ml 1 M PBS con 100U/ml de
Tejido pulpar digerido en 3mg/ml hasta que las células se separen de los penicilina, 100µg/ml estreptomicina y Pulpa cameral dividida y digerida en
colagenasa TI y 4mg/ml dispasa a 37·∙C/ 1 explantes, la capa celular fue removida 500µg/ml de claritromicina por 1 hora a 3mg/ml colagenasa TI a 37·∙C/ 1 hora,
hora, después pasa a través de malla 7O por digestión enzimática 0,1% tripsina-­‐ 37·∙C. La solución se filtró en malla de se obtuvo solución celular con filtrado
PROCESAMIENTO PULPAR µm para obtener células EDTA a 37·∙C 70µm por medio de malla de 100µm
Células se sembraron en contenedores
e incubadas a 37·∙C con 5%CO2 EN MEM-­‐
alfa y 20% de serum fetal, las células
Células inmersas en medio de cultivo MEM-­‐fueron conservadas en nitrógeno liquido
alfa suplementado con 20% FCS, 100µM por un mes. Después de la
ácido ascorbico P, 2mM glutamina-­‐L, criopreservación todas las células se
En este experimento las células 100U/ml penicilina, 100µg/ml cultivaron en contenedores de 80cm2
Suspensión celular 0,01 a 1 x 105 en 6 alcanzaron confluencia entre 15-­‐20 dias estreptomicina y puestos en contenedores con MEM-­‐alfa y 10% FCS.
pozos con medio Eagle´s, suplementado de cultivo, después de remover la capa de 75ml con valvulas de filtración Posteriormente los cultivos se
con 20% FCS, 100µM L ácido ascorbico, celular se colocó en una superficie tres incubados a 37·∙C y 5% CO2 y el medio tripsinizaron después de su confluencia
2mM L glutamina, 100 unidades/ml veces mayor, para expansión celular se cambiado dos veces en la semana. Antes y se repitieron los pasajes (solo se
penicilina, 100µg/ml estreptomicina e usó MEM plus 10% FBS y antibióticos, el que alcanzan confluencia celular son seleccionaban cultivos que se
CULTIVO CELULAR incubados a 37·∙C en 5% CO2 medio se cambio cada 48 horas subdivididas en nuevos contenedores mantienen después de 25 pasajes
PASAJES O SUBCULTIVOS NR NR 16-­‐20 pasajes 26 pasajes
Al día 14 fijado con 4% de formalina y
teñido con 0,1% de azúl de toloudina para
evaluar formación de colonias. Agregados Fueron tipificadas como células madre
de más de 50 células reportados como cuando se alcanzó mínimo 1,000,000 por
colonias, células evaluadas si presentan contenedor lograndose aprox al día 22
EVALUACIÓN MORFOLÓGICA morfología fibroblastoide NR cuando aún estan indiferenciadas NR106 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
DPSCs primarias fueron subcultivadas y
fijadas y usaron Ac: anti-­‐CD14, anti-­‐ Celulas se sembraron en pozos de 4x104
CD34, anti-­‐CD45, anti-­‐MyoD, anti-­‐alfa celulas/cm2 y cultivadas toda la noche,
smooth muscle actin, anti-­‐ se lavaron en PBS(pH7,4) y fijadas en
neurofilamento, anti-­‐CD44, 6g10, anti-­‐ Células desprendidas con 0,02% de EDTA 4% de paraformaldehido, preincubadas
MUC-­‐18, anti-­‐COL3, MAB1959, anti-­‐ Se recolectaron las células tratandolas en PBS y procesadas durante 10 min a en suero de cabra por 15 min e
COL1, anti-­‐OC, anti-­‐ON, LF100, anti-­‐OP, con 0,05% tripsina-­‐EDTA e incubado con 1,000 rpm, lavadas en BSA 1% en PBS a 4·∙C incubadas con Ac de ratón anti-­‐humano
MAB1104, E8, anti-­‐FGF2, como control anticuerpos conjugados por 40 minutos a e incubadas en una solución de 1µl Ac/9µl STRO-­‐1 por 1 hora, luego incubadas con
IgG de ratón e Ig de conejo. Se analizó los 4·∙C en la oscuridad. Ac usados: SH2, SH3, al 0,1% BSA en 1M PBS. Lavadas tetramethilrhodamina isithiocianato
niveles de saturación a los Ac usando un SH4, anti-­‐CD29, anti-­‐CD166, anti-­‐CD14, nuevamente y clasificadas con Ac de ratón (TRITC) conjugado con IgM anti-­‐ratón de
kit de espectro de carga de anti-­‐CD34, anti-­‐CD45 y analizadas con anti-­‐humanos: CD117(c-­‐kit), CD34, flk 1, cabra por 45 min y observados usando
CARACTERIZACIÓN inmunoperoxidasa citometría de flujo STRO-­‐1 microscopía fluorescente
Diferenciación celular se logró
permaneciendo por al menos 30 días en el
mismo medio de cultivo con 20% de FBS,
este FBS a alto porcentaje y durante tiempo
prolongado ejerce actividad de Inducción de diferenciación en 4 pasaje
diferenciación osteoblástica. Evaluación a 5 linajes: neurogénico,
Evaluación tasa de proliferación con Inducidas a diferenciarse en tres tipos tasa de proliferación con bromodeoxiuridin osteogénico/odontogénico,
bromodeoxiuridina BrdUrd en primer celulares: adipocitos, osteoblastos y BrdUrd por 12 horas. Criopreservación de adipogénico, miogénico y condrogénico
OTROS PROCESOS pasaje condroblastos en tercer pasaje células diferenciadas y SCs por medio de RT-­‐PCR
Presencia de población celular Obtiene SCs, las cuales pueden ser
clonogénica en tejido de pulpa dental, Se aisló una población de células criopreservadas sin ningún efecto negativo
con morfología fibroblastoide y CFU-­‐F, adherentes, con forma fusiforme, alta al igual que las celulas diferenciadas,
alta tasa de proliferación celular, tasa de proliferación, sin diferencia entre proliferación similar entre células frescas y
expresión a marcadores MUC-­‐18, smooth género y edad. Las células expresaron Ag criopreservadas, evaluación morfológica Después de criopreservación solo dos
muscle actin, fosfatasa alcalina, SH2, SH3, SH4, CD29, CD166. Alta tasa de presenta células redondas u ovaladas con cultivos se mantienen por 25 pasajes.
colágeno TI, osteonectina, osteopontina, diferenciación osteogénica y baja nucleos grandes, citoplasma con vesículas, Mostró un 5-­‐10% de tinción positiva
RESULTADOS osteocalcina, colágeno TIII, FGF2 adipogénica RER, lisosomas y mitocondrias para STRO-­‐1Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 107
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
A. Anexo. matriz de metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de muestra, cultivo y
caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes
permanentes (artículos 5, 6, 7, 8)
ARTÍCULO/VARIABLE Artículo 5 Artículo 6 Artículo 7 Artículo 8
REFERENCIA Referencia 70 Referencia 21 Referencia 48 Referencia 64
AUTORES Ballini A. y colaboradores Young Y. y colaboradores Suchánek J. y colaboradores Perry B. y colaboradores
AÑO Año 2007 Año 2007 Año 2007 Año 2008
Seoul National University Dental Faculty of Medicine and University
LABORATORIO Department of Oral Sciences, Chieti Hospital Hospital Hradec Králové, R Checa General biotehgnology, Indiana
APROBACIÓN COMITÉ ÉTICA NR SI SI NR
CONSENTIMIENTO INFORMADO NR SI SI NR
ANTECEDENTES SISTÉMICOS NR NR Sanos NR
TIPO DE DIENTE 3er molar 3er molar 3er molar y premolares 3er molar
94 dientes (40 procesados
inmediatamente llegan al laboratorio y 54
conservados en tres soluciones en viales
NÚMERO DE DIENTES UTILIZADOS NR NR 20 dientes (16 cordales, 4 primeros PM) diferentes, 18 en cada grupo)
EDAD PACIENTES Menos 29 años 18-­‐35 años, 13 pacientes adultos 12-­‐23 Años (18 Mujeres, 2 Hombres) 18-­‐30 años
MOTIVO EXODONCIA Impactados Impactado o por indicación ortodonciaImpactados o indicación ortodóntica NR
ESTADO BUCAL DEL PACIENTE NR NR NR NR
PROCESO EXODONCIA NR NR NR NR
Transportados en viales estériles
refrigerados que contiene 20ml de una de
Dientes lavados tres veces en una tres soluciones de transporte:
solución que contiene PBS, Inmersos en solución balanceada de HypoThermosol, MesenCult medio basal o
CONSERVACIÓN DEL DIENTE penicilina, estreptomicina y MEM. NR Hank solución salina con fosfato PBS.
Los dientes recibieron varios lavados en
PBS estéril, seguido por inmersión en 1%
Diferentes: Corte CEJ, Uso de de yodopovidona durante 2 minutos,
cucharillas, forceps para fracturar raíces inmersión en tiosulfato de sodio 0.1% en
y obtener pulpa de conductos a traves PBS durante 1 minuto y otro lavado en PBS
MÉTODO EXTRACCIÓN PULPAR Corte CEJ Corte CEJ del forámen instrumentos endodónticos estéril. Corte CEJ108 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
La pulpa se colocó en un baño enzimático
compuesto de colagenasa TI y II con
termolisina como la proteasa neutral. Se
incubaron a 37°C durante 40 minutos para
digerir el tejido y liberar las células. Una
vez completa la digestión, Medio completo
Mesencult se añadió a un volumen final
Tejido pulpar digerido en 3mg/ml Tejido pulpar digerido en 3mg/ml Tratados con colagenasa y dispasa por de 1.5 x el volumen de digestión para
colagenasa TI y 4mg/ml dispasa a colagenasa TI y 4mg/ml dispasa a 70 minutos, se centrifugó y obtuvo neutralizar las enzimas de la digestión.
37·∙C/ 1 hora, después pasa a través 37·∙C/ 1 hora, después pasa a través fracción celular de compartimento Esta mezcla se centrifugó a 500 g por 5
PROCESAMIENTO PULPAR de malla 7O µm para obtener célulasde malla 7O µm para obtener células subodontoblastico y perivascular minutos y el sobrenadante se aspira
Las celulas se resuspendieron en medio
completo Mesencult fresco y 0.25 µg/mL
de anfotericina B, 100 UI/mL penicilina G y
Suspensiones celulares fueron 100 µg/mL estreptomicina. Cultivo fue
cultivadas utilizando medio para las monitoreado diariamente y todo frasco
células progenitoras mesenquimales contaminado se retiró. Cambios del medio
humanas (MPCs) compuesto de alfa-­‐ tres veces por semana. Después de 14
MEM, 2% FCS, EGF , PDGF y días de crecimiento, DPSCs fueron
Células se cultivaron en platos de dexametasona y en algunos casos separadas usando 0.25% tripsina /1mM
100mm con MEM-­‐alfa, suero fetal al suplementados con ITS . DPSCs EDTA, recuento y viabilidad se evaluaron
10%, 100µmol/L ácido ascórbico , Células se cultivaron en platos de cultivados por 3 – 5 días en cultivo mediante tinción azul tripán estándar y
2mM/L glutamina, 100 unidades/ml 10cm2 con MEM-­‐alfa, suero fetal al primario dentro de frascos de cultivo hemacitómetro. Después del primer
penicilina, 100µg/ml estreptomicina 15%, 100umol/L ácido ascórbico , 2 celular, tratados con tripsina-­‐EDTA y pasaje, se dividieron los cultivos de DPSCs
e incubados a 37·∙C en 5% CO2 y mmol/L glutamina, 100 unidades/ml dividido en frascos de cultivos. Cada cuando alcanzaron el 70% de confluencia.
evaluación diaria de formación de penicilina, 100µg/ml estreptomicina e pasaje se realizó después de alcanzar el
CULTIVO CELULAR CFU-­‐F incubados a 37·∙C en 5% CO2 70% de confluencia
PASAJES O SUBCULTIVOS NR NR NR NR
Para evaluar la eficiencia de CFU, es Para evaluar la eficiencia de CFU, es
fijado el cultivo al décimo día con fijado el cultivo al décimo día con
formalina al 4% y teñidos con azúl de etanol al 70% y teñidos con cristal
toloudina 0,1%, agregados de más de violeta 0,1%, agregados de más de 50
EVALUACIÓN MORFOLÓGICA 50 células son denominados coloniascélulas son denominados colonias NR NRMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 109
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Celulas se sembraron en dos pozos de
2x104 celulas/pozo y cultivadas 24 Análisis DNA con tinción ioduro
horas, se lavaron en PBS(pH7,4) y propidium y citometría de flujo, después Cultivos DPSCs de pasajes 3-­‐5 se
fijadas en 2% de paraformaldehido por de 24 horas de cultivo fue sometido a seleccionaron y fueron teñidos con los
15 minutos, incubadas con Ac STRO-­‐1 una incubación de 4 horas seguida por anticuerpos humanos CD73, CD90, CD105,
Uso de STRO-­‐1, CD44, colageno TI, por 3 horas, luego incubadas con desprendimiento con tripsina-­‐EDTA y CD34, CD45, CD11b, CD19 y antígeno
III, MUC-­‐18, osteocalcina, anticuerpos secundarios de cabra IgG-­‐lisis con KCl hipotónica y la fijación en leucocitario humano clase II (HLADR) y
osteopontina,FGF-­‐2, Integrina B1, Cy3 anti-­‐ratón por 1 hora y el núcleo ácido y alcohol para cariotipificar las controles de isotipo apropiado según las
CARACTERIZACIÓN fosfatasa alcalina teñido DAPI 2µg/ml por 30 minutos células (evaluar mitósis) instrucciones del fabricante
Para determinar la tasa de crecimiento de
Se exámino viabilidad celular y número cultivos, DPSCs de pasajes 3-­‐4 fueron
de población usando Vi-­‐cell y Z2 sembradas en triplicado de 2x104 células /
counter. Tinción con ioduro propidium, pozo, en placas seis pocillos. Después de
Evaluación tasa de proliferación con Después de 4, 7 y 10 días del cultivo mediante su análisis de DNA mostró que 72 h, las células se cosechan y cuentan, y
bromodeoxiuridina BrdUrd en primer la tasa de proliferación de celulas el 56% de las células se encuentran se calculó la expansión y el tiempo de
OTROS PROCESOS pasaje madre fue evaluada con prueba MTT entre las fases S-­‐G2 del ciclo celular duplicación
Se obtuvo DPSCs de premolares y
molares, con las tecnicas de forceps y
limas endodónticas. Después de 5 días La esterilización de los dientes para
se encontró grandes colonias en cultivo prevenir la contaminación era el principal
Presencia de población celular primario y las células estaban listas para obstáculo para establecer con éxito los
clonogénica en tejido de pulpa dental, primeros pases, DPSCs de cultivos de DPSCs, estos eran 50%
DPSCs puede usarse para la con morfología fibroblastoide y CFU-­‐F, compartimento perivascular (PVc) eran confluentes para el día 10 y 70%
regeneración ósea, ya que tiene un adecuada tasa de proliferación y células fusiformes con procesos largos confluentes el día 14, se observa mayor
gran potencial de aislamiento de un diferenciación.Determinaron en comparación con las DPSCs del crecimiento celular cuando los dientes son
simple elemento dental y gran condiciones de cultivo óptima al compartimento subodontoblástico (SOc) procesados inmediatamente que si son
diferenciación osteogénica, comparar RPMI, DMEM y alfa MEM, que eran más redondeadas. Se observa almacenados. Al congelar los cultivos de
expresión de todos marcadores observandose este último como el el 56% de DPSCs en fase S-­‐G2 del ciclo DPSCs e incluso los dientes se observó
RESULTADOS fuerte mejor celular viabilidad110 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
A. Anexo. matriz de metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de muestra, cultivo y
caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes
permanentes (artículos 9, 10, 11, 12)
ARTÍCULO/VARIABLE Artículo 9 Artículo 10 Artículo 11 Artículo 12
REFERENCIA Referencia 68 Referencia 62 Referencia 49 Referencia 56
AUTORES Woods E. y colaboradores Huang A. y colaboradores Suchánek J. y colaboradores Spath L. y colaboradores
AÑO Año 2009 Año 2009 Año 2009 Año 2010
Foundation and general BioTechnology, Department of Clinica Genetics, Kralove-­‐ R. Department of Experimental Medicine,
LABORATORIO Indiana Department of Oral Pathology, Kaohsiung Checa Naples
APROBACIÓN COMITÉ ÉTICA SI SI SI SI
CONSENTIMIENTO INFORMADO NR SI SI SI
ANTECEDENTES SISTÉMICOS NR NR Sanos Sanos
TIPO DE DIENTE 3er molar Central y lateral (21 y 22) 3er molar 3er molar
NÚMERO DE DIENTES UTILIZADOSNR 2 permanentes 16 dientes NR
EDAD PACIENTES 18-­‐30 años 41 Años (1 persona) 12-­‐ 23 años (12 mujeres y 4 hombres) 22-­‐35 años (8pacientes)
MOTIVO EXODONCIA NR NA Indicación ortodóntica y otras NR
Sanos, tratamiento de infecciones
ESTADO BUCAL DEL PACIENTE NR NR NR orales
PROCESO EXODONCIA NR NA NR NR
Colocados en solución de 20ml de PBS
estéril y transportada al laboratorio para Inmersos en solución balanceada de Hank a Inmerso en clorhexidina gel 0,3% por 2
CONSERVACIÓN DEL DIENTE procesarse en 24 horas NA 4·∙C minutos
Los dientes recibieron varios lavados en
PBS estéril, seguido por inmersión en 1%
de yodopovidona durante 2 minutos,
inmersión en tiosulfato de sodio 0.1% en
PBS durante 1 minuto y otro lavado en
PBS estéril. Inmersión en listerine por 1 Pulpa obtenida con excavador y cureta
minuto y lavado final con PBS final. Separación de corona y raíces con forceps y de Gracey e inmersa en PBS, se realizo
Corte CEJ y divididas las raíces para Tejido pulpar obtenido 4 días después del posteriormente con cucharillas se extrae el disección de fragmentos o piezas con
MÉTODO EXTRACCIÓN PULPAR exponer la pulpa y extraer con cureta trauma con lima endodóntica tejido pulpar de las raíces escalpeloMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 111
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
La pulpa se colocó en un baño
enzimático compuesto de colagenasa TI
y II con termolisina como la proteasa
neutral. Se incubaron a 37°C durante 15-­‐ Colocado en 0,2% tripsina por 5 min a
30 minutos para digerir el tejido y liberar 37·∙C, el tejido remanente lavado con
las células. Una vez completa la Tejido pulpar digerido en 3mg/ml colagenasa DMEM, suplementado con 10% de FCS,
digestión, Medio completo Mesencult TI y 4mg/ml dispasa a 37·∙C/ 1 hora, después Colocados en colagenasa y dispasa por 70 100 U/ml penicilina, 100µg/ml de
para neutralizar las enzimas de la pasa a través de malla 4O µm para obtener minutos, centrifugados a 600g, 5min para estreptomicina, 2mM glutamina L,
PROCESAMIENTO PULPAR digestión células obtener las células. 0,2mM beta-­‐ mercaptoetanol
Células puestas en recipientes T-­‐25 con
una densidad de un diente digerido por
recipiente y puestas en incubación a
37·∙C, 5% CO2. Cultivo fue monitoreado Transferidos a cajas de petri con
diariamente y todo frasco contaminado fibronectina y cultivadas como
se retiró. Cambios del medio tres veces DPSCs cultivadas a 37·∙C Y 5% CO2 en 3 explantes en medio completo megacell
por semana. Después de 14 días de diferentes medios. El primero con alfa-­‐ a 5% CO2 Y 37·∙C. Despues de dos
crecimiento, DPSCs fueron separadas MEM, 2% FCS, EGF10ng/ml , PDGF 10ng/ml, semanas una capa de células similares
usando 0.25% tripsina /1mM EDTA, ácido ascorbico, 2% glutamina, penicilina, a fibroblastos se generaron del
recuento celular por recipiente se evaluó estreptomicina, gentamicina y explante y encima se observó celulas
mediante hemacitómetro y viabilidad dexametasona. El segundo con los mismos redondas y pequeñas, fueron
con azul de tripan. Células fueron componentes del primero y suplementado separadas lavando dos veces con PBS,
subcultivada por 4 semanas con cambios Células se cultivaron con MEM-­‐alfa, suero con 10µl/ml ITS. El tercero con alfa-­‐MEM, seguido de un lavado con EDTA 0,53
del medio tres veces por semana cuando fetal al 20%, 100µmol/L ácido ascórbico, 100 10% FCS, 1% ácido ascorbico, glutamina, mmol/l por 1-­‐2 minutos, despues con
alcanzaron el 70% de confluencia en el unidades/ml penicilina, 100ug/ml penicilina/ estreptomicina y gentamicina. tripsina 0,5g/l y EDTA 0,53mmol/l por
recipiente T-­‐25. Disociación con tripsina, estreptomicina y cultivados a 37·∙C en 5% DPSCs cultivadas inicialmente por 3-­‐5 días. 2-­‐3 minutos. Las células obtenidas
en el pasaje 3 fueron resuspendidas en CO2, el medio fue cambiado cada 2 días Cada pasaje se realizó despues de alcanzar fueron colocadas en platos recubiertos
CULTIVO CELULAR mesencult hasta que se alcanzó el 80% de confluencia el 70% de confluencia con colágeno con DMEM
PASAJES O SUBCULTIVOS 4 pasajes 7 pasajes 10 pasajes NR
Para evaluar la eficiencia de CFU, las células
del tercer pasaje se colocan (40 células) en
platos de 6 pozos. Después de 2 semanas son
fijadas con formalina al 10% y teñidos con
cristal violeta 3% durante 5 minutos, lavadas
con agua destilada 2 veces. Solo las colonias
de más de 2mm fueron contadas. El
porcentaje de eficiencia para formar colonias
fue expresada como el número total de
colonias dividido por el número inicial de las
células que fueron sembradas y multiplicado
EVALUACIÓN MORFOLÓGICA NR por 100 NR NR112 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Confirmaron los criterios minimos para
definir MSCs según la ISCT con
citometría de flujo. Ac: CD73, CD90,
CD105, CD34, CD45, CD11b, CD19, HLA-­‐
DR. Células positivas con más del 95%
para CD73, CD90, CD105, y menos del Citometria de flujo realizada al día 22
5% para CD34, CD45, CD11b, CD19, HLA-­‐Citometria de flujo con Ac: CD14, CD29, Ac: CD29, CD34, CD44, CD45, CD71, CD90, del cultivo con Ac: c-­‐kit, CD34, CD133,
CARACTERIZACIÓN DR fueron confirmadas como DPSCs CD34, CD45, CD90, CD105 HLA I, HLA II VEGFR, CD31, CD146
Evaluación de tasa de proliferación se
Inducidas a diferenciarse en tres tipos calculó dividiendo el número total de células
celulares: adipocitos, osteoblastos y después de 72 horas de cultivo por el número
condroblastos en tercer o cuarto pasaje inicial de células en el 3 pasaje (25.000).
y se realizó criopreservación en cada Inducidas a diferenciarse en tres tipos La tasa de proliferación se evaluó
proceso que fue realizado en el diente, celulares: adipocitos, osteoblastos y Tasa de población y viabilidad celular realizando un conteo cada 3 días, el
OTROS PROCESOS incluso se realizó en el diente intacto condroblastos evaluadas con Vi-­‐ cell y Z2 potencial de diferenciación
Se aislaron células en los tres medios.
DPSCs cultivados en todos los medios eran
estables y no mostraban signos de DPSCs aislada de explantes de pulpa
Se obtuvo DPSCs. Viabilidad mayor al Alta tasa de proliferación celular en los diferenciación espontánea. Medio que dental muestran una alta tasa de
95% y diferenciación para todos los primeros pasajes, morfologia celular contiene 2% FCS suplementado con ITS proliferación, marcadores
linajes celulares. Después de alargada, el 80% de la población fue capaz de proporciona mejores condiciones de cultivo hematopoyéticos (CD133, CD34,
criopreservar a diferentes temperaturas formar colonias, expresión de marcadores para DPSCs (tiempo de doblaje más corto y CD117) y endoteliales (CD·∙!, VEGFR)
RESULTADOS se observa similar expresión de Ac CD29, CD90, CD105 estable actividad de proliferación) no están presentesMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 113
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
A. Anexo. matriz de metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de muestra, cultivo y
caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes
permanentes (artículos 13, 14, 15, 16)
ARTÍCULO/VARIABLE Artículo 13 Artículo 14 Artículo 15 Artículo 16
REFERENCIA Referencia 71 Referencia 58 Referencia 42 Referencia 50
AUTORES Eslaminejad M. y colaboradores Lee S. y colaboradores Hosseini A. y colaboradores Macedo L. y colaboradores
AÑO Año 2010 Año 2010 Año 2010 Año 2010
Department fo Stem Cell and Institute of Biomedical Materials & Oral Medicine Department, Tehran-­‐ Department of Genetics and
LABORATORIO Developmental Biology, Tehran-­‐Iran Engineering Iran Morphology, Brasilia-­‐Brasil
APROBACIÓN COMITÉ ÉTICA SI SI SI SI
CONSENTIMIENTO INFORMADO NR SI SI SI
ANTECEDENTES SISTÉMICOS NR NR Sanos NR
TIPO DE DIENTE 3er molar Premolares 3er molar 3er molar
NÚMERO DE DIENTES UTILIZADOS NR NR 60 dientes 10 dientes
EDAD PACIENTES 20-­‐25 años 18-­‐30 años 18-­‐28 años 9-­‐15 años
MOTIVO EXODONCIA NR Indicación ortodóntica NR Indicación ortodóntica
Los pacientes recibieron clorhexidina
como enjuague bucal para reducir la
flora microbiana oral antes de la
ESTADO BUCAL DEL PACIENTE NR NR extracción NR
PROCESO EXODONCIA NR NR NR NR
Se limpian con PBS y criopreservados
por 7 días la mitad de la muestra, los
CONSERVACIÓN DEL DIENTE NR otros procesados inmediatamente NR Las superficies fueron limpiadas
Proximo a un mechero, se realizó una
ranura longitudinal con discos estériles
de diamante sin alcanzar el tejido
pulpar, este fue extirpado con
Se extrae la pulpa con forceps y cucharillas y se trasportó en microtubos
cucharillas en condiciones estériles, con DMEM, suplementado con 10% FBS y
inmerso en tubos de medios de cultivo 100U/ml de penicilina y estreptomicina y
y trasladado al laboratorio en menos lavado 3 veces con solución balanceada
MÉTODO EXTRACCIÓN PULPAR Corte CEJ NR de 2 h de Hank114 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Se coloca en 0,1% anfotericina DMEM
+ penicilina/estreptomicina y otros sin
anfotericina. Los especímenes fueron
lavados en (PBS) tres veces, se Dos métodos. tejido pulpar digerido en
centrifugó durante 10 min a 2500 g, y 3mg/ml colagenasa TI y 4mg/ml dispasa
el sobrenadante retirado; los a 37·∙C/ 60 minutos. La suspensión fue
especímenes fueron divididos en lavada 3 veces y centrifugada a 750 x g
pequeños pedazos con bisturí. durante 10 minutos en DMEM y las
Solución de Hank se añade y se incuba células colocadas en platos de 6 pozos.
durante 2 horas a 37·∙C en 5% de CO2. El otro método de aislamiento, los
El medio sobrenadante fue quitado fragmentos del explante fueron
otra vez, y fue agregada 0.1% transferidos a una nueva placa una vez a
Tejido pulpar digerido en 3mg/ml colagenasa T IV. El medio se incuba la semana hasta que ningun crecimiento
colagenasa TI y 4mg/ml dispasa a durante 15 min y se centrifugó (10min se observó (hasta 5 transferencias). El
37·∙C/ 45 minutos. 3ml de DMEM, a 2500 g). El sobrenadante fue cultivo fue mantenido en DMEM
suplementado con 15% FBS fueron quitado, y el medio se colocó en suplementado con 20% FBS y 100
adicionados para digerir el tejido y contenedores 25cm3 con DMEM unidades/mL penicilina y 100 mg/mL
centrifugadas a 1200 rpm durante 5 Tejido pulpar digerido en 3mg/ml penicilina/estreptomicina + 10% FBS + estreptomicina en 80% de humedad, 5%
PROCESAMIENTO PULPAR minutos colagenasa TI y 4mg/ml dispasa a 37·∙C 0.1% L-­‐Glutamina CO2 a 37ºC
El medio fue cambiado una vez cada
cuatro días. Después de 14 días, las
células adherentes alcanzaron
confluencia y estaban listas para el
pasaje. Las células fueron divididas en
dos secciones, y se colocaron en el
medio de cultivo para aumentar el
número de células. El sobrenadante
fue quitado y 1 cc EDTA añadido. Una
Las células se colocaron en platos de vez más, el sobrenadante fue
cultivo de 6 pozos, incubadas a 5% recogido, y 1 cc tripsina 0.25% fue
CO2 y 37·∙C de temperatura, despues agregado para separar las células del
de 3 días, se lavaron los cultivos con piso del recipiente. Las células se Fueron sembradas en placas de 12
PBS y se coloco medio de cultivo colocan en tubos y centrifugadas pocillos con DMEM suplementado con
fresco, el medio de cultivo se cambió Cultivos fueron incubados a 37·∙C, con durante 10 minutos (2500 g). El 20% FBS, 100 unidades/m de penicilina y
dos veces por semana hasta que se 95% de humedificación atmosférica y sobrenadante del tubo fue quitado y estreptomicina 100 mg/mL. Medio de
CULTIVO CELULAR alcanzó confluencia 5% CO2 100 µL de DMEM fue agregado cultivo fue cambiado cada 2 días
PASAJES O SUBCULTIVOS NR 10 pasajes NR NR
Observación microscópica de Observación microscópica de Observación microscópica de Observación microscópica de morfología
EVALUACIÓN MORFOLÓGICA morfología celular morfología celular morfología celular celularMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 115
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Análisis de citometría de flujo con Ac:
CD90, CD49b, CD31, CD45, CD33, Marcadores celulares: STRO-­‐1, CD34, Ocho marcadores: CD31, CD90, CD45,
CARACTERIZACIÓN CD44, CD11b, CD34, CD73 CD44 CD34, CD166, CD44, CD105 y CD13. Ac: CD117, CD34, CD45
Las células fueron contadas con
microscopio invertido sin tinción. Las
células fueron congeladas en
nitrógeno líquido,y se almacenaron
durante al menos 6 meses. Las células
cosechadas fueron descongeladas y
Se realizó conteo celular 30 días cuantificadas mediante microscopía.
Se evaluó diferenciación a diferentes después del cultivo primario, positivas para CD13, CD44, CD90, Crecimiento de la célula se evaluó por el
linages: odontogénica, osteogénico, evaluación de viabilidad con MTT, y CD105, CD166 análisis de exclusión azul tripan después
OTROS PROCESOS adipogénico diferenciación multilinaje de 2, 4, 6, 8, 12 y 14 días del cultivo
Ambos métodos de aislamiento pueden
ser utilizados eficientemente apuntando
el aislamiento de células madre de la
pulpa dental humana. Contaminación de
Se observó CFU-­‐F, los cultivos De 27 muestras evaluadas, 10 fueron las muestras con microorganismos se
alcanzan confluencia a los 10 días, cultivadas en DMEM + P/S medio de observó poco. Los cultivos primarios de
subcultivos de cada célula tienden a cultivo, de las cuales ocho muestras todos los grupos experimentales fueron
exhibir un crecimiento acelerado fueron disminuidas. Con la adición de muy heterogéneos a nivel morfológico.
alcanzando la confluencia en 6 días. Al comparar dientes criopreservados y la anfotericina, intensamente se Para ambos métodos de aislamiento, las
La morfología fibroblástica se observa no criopreservados, la tasa de cultivo redujo la contaminación fúngica y sólo células presentan aspecto de huso y
durante el periodo de cultivo. es de 73% y 100% respectivamente. No dos ejemplares se perdieron de 17. contornos poligonales con extensiones
Expresión del 95% de CD90, CD44 y se presentó diferencia en la morfología Exámenes macroscópicos citoplásmicas, mostrando una
CD73 y negativos para BIII Tubulin y en los dos grupos. Negativo para CD34 demostraron la adherencia de las morfología fibroblastica. Positivo CD117,
RESULTADOS Tau (marcador neural) y positivo para CD44 y STRO-­‐1 células al frasco negativo CD45116 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
A. Anexo. matriz de metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de muestra, cultivo y
caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes
permanentes (artículos 17, 18, 19, 20)
ARTÍCULO/VARIABLE Artículo 17 Artículo 18 Artículo 19 Artículo 20
REFERENCIA Referencia 67 Referencia 51 Referencia 59 Referencia 69
AUTORES Ahmed N. y colaboradores Atari M. y colaboradores Shekar R. y Ranganathan K. Karamzadeh R. y colaboradores
AÑO Año 2011 Año 2011 Año 2012 Año 2012
Nacional Research Center, El Cairo-­‐ Regenerative Medicine Laboratory, Department of Oral and Maxillofacial Department of Stem Cells and
LABORATORIO Egipto Barcelona-­‐ España Pathology, Chennai-­‐ India Developmental Biology, Tehran-­‐Iran
APROBACIÓN COMITÉ ÉTICA NR NR SI SI
CONSENTIMIENTO INFORMADO NR NR NR NR
ANTECEDENTES SISTÉMICOS NR NR NR NR
TIPO DE DIENTE 3er molar 3er molar 3er molar y premolar 3er molar
NÚMERO DE DIENTES UTILIZADOS 20 dientes 25 dientes 15 dientes NR
EDAD PACIENTES 20-­‐29 años 14-­‐60 años (20 pacientes) NR 21-­‐29 años
MOTIVO EXODONCIA Indicación terapeutica Indicación ortodóntica y terapeutica Indicación ortodóntica NR
ESTADO BUCAL DEL PACIENTE NR NR NR NR
PROCESO EXODONCIA NR Proceso simple, evita el daño del diente NR NR
Inmersos en alfa MEM con penicilina 100
Inmediatamente después de la extracción, U/ml, 100ug/ml estreptomicina a 4·∙C y
los terceros molares se limpiaron con una transportados en viales de cultivo estériles, Inmersos en alfa MEM suplementado
Inmersos en DMEM con penicilina y gasa humedecida con etanol al 70%, seguido finalmente se limpiaron las superficies con con 10% FBS a 4·∙C y superficies
CONSERVACIÓN DEL DIENTE estreptomicina y 10% FBS por un lavado con agua destilada estéril. DPBS dentales se limpiaron con etanol al 70%
Sujeta el diente con pinzas, se hace una
ranura entre el esmalte y el cemento usando
una fresa cilíndrica. Se hizo una fractura en
la misma línea y los fragmentos del diente
se colocaron en un frasco de Halcón que Se realizó una ranura a nivel de CEJ con un
contenga PBS estéril 1 X. Las muestras disco de carburo, se divide el diente para
fueron transportadas al laboratorio exponer la cámara pulpar, obteniendo el Bajo condiciones estériles se realiza un
Dientes fueron divididos y extraido el rápidamente y colocadas en cajas Petri en tejido con forceps y cucharillas endodónticas corte CEJ con baja velocidad para evitar
tejido pulpar con instrumento estéril e una cámara de flujo laminar. Extracción de y puestos en 2ml de medio MSC en cajas de sobrecalentamiento y se separa el
MÉTODO EXTRACCIÓN PULPAR inmersos en DMEM tejido con lima endodóntica petri de 60mm de diámetro tejido pulpar de la corona y raízMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 117
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Separación celular fue completado por
digestión del tejido de la pulpa con Tejido pulpar dividido en pequeñas
colagenasa TI que (3 mg/ml) durante 60 fracciones con bisturí e inmersos en
minutos a 37° C. Las células se separaron 3mg colagenasa TI y 4 mg dispasa
utilizando una jeringa de insulina y se disuelta en PBS, 100mg/ml penicilina y
centrifugaron durante 10 minutos a 1.800 100 mg/ml de estreptomicina por 1
rpm. La fracción célular se lavó dos veces hora, agitadas cada 30 minutos,
Todos los procedimientos fueron con PBS estéril 1X y se centrifugó incubadas a 37·∙C, después pasa a
realizados en una cabina con un medio nuevamente durante 10 minutos a 1.800 rpm través de malla 7Oµm para obtener
estéril, tejido pulpar lavado con PBS a temperatura ambiente. Una vez recogidas, Tejido pulpar dividido en pequeñas células, centrifugadas a 1200 rpm
dos veces para asegurar la remoción de las células se contaron y sembraron en fracciones con bisturí e inmersos en 2mg durante 5 minutos. El sobrenadante
debris. El tejido fue dividido en partes medio para DPPSC. Con el fin de establecer colagenasa TI y 1 mg dispasa disuelta en retirado y células resuspendidas en 1ml
con tijeras estériles y colocados en el cultivo primario, las células se cultivaron DPBS por 1 hora, agitadas cada 10 minutos, del medio de proliferación. Tambien
colagenasa TII 0,2%, se colocaron en en frascos 150 ml a 5% CO2 durante 3 incubadas a 37·∙C, centrifugadas a 2400 rpm uso del método directo de crecimiento
PROCESAMIENTO PULPAR un agitador a 37·∙C por 30 min semanas durante 5 minutos. El sobrenadante retirado celular del explante del tejido pulpar
El sobrenadante retirado y células
Fueron suspendidos en medio de Eagle resuspendidas en 1ml del medio de
modificado (DMEM) que contiene 2 ng/ml proliferación. Colocadas en
Células cultivadas en EBM2, factor de crecimiento fibroblástico básico Las células resuspendidas con medio MSC. contenedores de 25cm2. Cultivadas a
suplementado con FBS 10%, factor de (bFGF) y 10% de suero bovino fetal (FBS). Las Cultivadas a 37·∙C en 5% de CO2 en una 37·∙C en 5% de CO2 en una incubadora.
crecimiento recombinante humano células con una densidad de 300.000 incubadora. El medio cambiado cada tercer El medio cambiado cada tercer día
(insulinico-­‐1 y epidermal), e incubados células/cm2. El medio fue cambiado después día y las células fueron subcultivadas cuando las células alcanzan
CULTIVO CELULAR a 37·∙C y 5% CO2 de 72 horas y posteriormente cada 2 días después que alcanzan el 90% de confluencia confluencia
PASAJES O SUBCULTIVOS 3 pasajes NR 4 pasaje 3 pasajes
Observación microscópica de Observación microscópica de morfología Observación microscópica de morfología Observación microscópica de
EVALUACIÓN MORFOLÓGICA morfología celular celular celular morfología celular118 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Amplificaciones (RT-­‐PCR) que se
realizó utilizando transductor de señal y
activador de la transcripción 3 (Stat3),
policomb anillo oncogén (Bmi1) y Beta
– actina (β-­‐actina). El gen Bmi1 se ha
implicado en la renovación de si
Ac: CD13 FITC, SSEA-­‐4 PE, OCT3/4 FITC,
mismo. Del mismo modo, Stat3 se ha
CD45 PE-­‐Cy5, CD105 FITC, CD34 PE-­‐Cy5,
implicado en el mantenimiento de auto
CD73 PE, CD146 FITC, CD29 PE, STRO-­‐1
renovación y pluripotencia. Los
FITC y Nanog FITC
productos de RT-­‐PCR fueron luego
separados por electroforesis en gel de
agarosa al 2% durante 30 minutos y
visualizados por fluorescencia inducida
por etil ultravioleta con transiluminador
Ac: CD44, CD73, CD105, CD90, CD34,
de bromuro de etilo
CARACTERIZACIÓN NR CD45, CD11b, CD105, CD146, STRO-­‐1
Diferenciación celular: condrogénica, Evaluación de la tasa de proliferación
adipogénica, osteogénica y derivado de la fase de crecimiento Diferenciación en celulas mineralizadas
OTROS PROCESOS odontogénica Diferenciación mesodermica y endodermica exponencial de la curva de crecimiento cuantificadas con rojo de alizarina
Las concentraciones enzimáticas, tiempo de Inicio de formación de colonias al 3-­‐5
uso de dichas enzimas, nivel de CO2, y pH y día del aislamiento, en el pasaje 3 en
limpieza de aditamentos usados durante el DPSCs obtenidas por disociación
proceso fueron alterados con cada diente enzimática. DPSCs por disociación
bajo estudio para estandarizar un protocolo enzimática y por crecimiento del
de cultivo celular, encontrandose necesaria explante presentaban el mismo tamaño
Se aislaron DPSCs, FACS demostró que los la esterilización de todos instrumentos y morfología. Presencia de marcadores
Variedad de morfología, desde ovoide marcadores siguientes fueron expresados en empleados, el pH debe estar entre 7,4-­‐ 7,7 celulares CD90, CD44, CD105 y CD73,
hasta fibroblástica es observada, esta DPPSCs en P15: CD105-­‐FITC (87%), CD90-­‐ que se logra mediante la calibración del STRO-­‐1 negativo en ambos grupos. La
forma es conservada despues de varios FITC (28%), CD45-­‐PE-­‐Cy5 (0,2%), CD29-­‐PE dioxido de carbono al 5%, el tiempo de ausencia de STRO-­‐1 en ambos grupos
pasajes, se observa alta tasa de (97%) y CD146-­‐FITC (0,17%). DPPSCs se incubación ideal entre 16-­‐18 horas, la puede indicar que la expresión de este
proliferación. La expresión de Stat3 y caracterizan por pequeñas células con cantidad de tejido encontrada en un diente marcador no podría afectar
Bmi1 fue alta inicando habilidad para grandes núcleos sin el típico aspecto de permanente es suficiente para obtener un directamente potencial de
RESULTADOS renovarse MSC plano y alargado cultivo de DPSCs diferenciación OdontoblasticoMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 119
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
A. Anexo. matriz de metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de muestra, cultivo y
caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes
permanentes (artículos 21, 22, 23, 24)
ARTÍCULO/VARIABLE Artículo 21 Artículo 22 Artículo 23 Artículo 24
REFERENCIA Referencia 60 Referencia 52 Referencia 61 Referencia 57
AUTORES Wang X. y colaboradores Navabazam A. y colaboradores Samiei M. y colaboradores Alleman M. y colaboradores
AÑO Año 2012 Año 2013 Año 2013 Año 2013
Research and Development Center for Research and Clinical Center for Infertility, Department of Molecular Medicine, Department of Biomedical Sciences, Las
LABORATORIO Tissue Engineering, Shaanxi, China Yazd-­‐ Iran Tehran, Iran Vegas-­‐ USA
APROBACIÓN COMITÉ ÉTICA SI SI SI SI
CONSENTIMIENTO INFORMADO SI SI SI SI
ANTECEDENTES SISTÉMICOS NR NR NR Sanos
TIPO DE DIENTE 1er premolar 3er molar 3er molar y premolar 3er molar y otros no específicos
NÚMERO DE DIENTES UTILIZADOSNR 20 dientes 6 (2 cordales, 4 premolares) 31 dientes
EDAD PACIENTES 18-­‐20 años (5 pacientes) 15-­‐ 32 años NR 18-­‐65 años (24 pacientes)
MOTIVO EXODONCIA NR Indicación ortodóntica NR Indicación terapeútica
ESTADO BUCAL DEL PACIENTE NR NR NR NR
PROCESO EXODONCIA NR NR NR NR
Inmersos por 1 minuto en DPBS con
penicilina 100 U/ml, 100µg/ml
estreptomicina y anfotericina B,
finalmente se limpiaron las superficies
CONSERVACIÓN DEL DIENTE NR NR con DPBS Inmersos en PBS estéril
Corte CEJ y pulpa retirada con instrumento
Se realizó una ranura de 0,5-­‐1mm de endodóntico y colocada en tubos estériles
profundidad alrededor del diente con un con PBS y llevados al laboratorio para
disco de baja velocidad estéril, y se cultivo, se retiraron del análisis las que se
expone el tejido dividiendo el diente conservaron más de dos horas en estos
alrededor de la ranura y se extrae el tubos, se rotularon datos demográficos en
MÉTODO EXTRACCIÓN PULPAR Corte CEJ NR tejido pulpar con limas endodónticas cada tubo120 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Se agitó durante 10 – 30 segundos para
desalojar las células y se centrifugó
durante cinco 5 minutos a 2.100 fuerza
centrífuga relativa (RCF), sobrenadante
(PBS) fue aspirado del tubo y las células
Tejido pulpar separado de corona y raíz y Tejido pulpar fue dividido en pequeñas derivadas de la pulpa dental se
digerido en 3mg/ml colagenasa TI y piezas con unas tijeras quirúrgicas. resuspendieron en 1,0 mL de medio
4mg/ml dispasa disuelta en DMEM por 1 Digerido en 3mg/ml colagenasa TI y Hyclone a 1640 RPM con L-­‐glutamina,
Los explantes fueron digeridos en una hora en una incubadora de CO2, después 4mg/ml dispasa a 37·∙C/ 40 minutos, la bicarbonato de sodio 1,5 g/L , glucosa 4,5
solución de colagenasa TI 0,3 mg/ml y pasa a través de malla 7O µm para suspensión resultante se centrifugó a g/L, 10 mM HEPES y 1,0 mM de piruvato
PROCESAMIENTO PULPAR 0.1% dispasa II por 1 h a 37·∙C obtener células 1200 rev/minuto sódico
El medio se complementó con el 1%
Células se cultivaron con MEM-­‐D(1g/1 penicilina (10.000 unidades/mL)-­‐
Tejido pulpar sembrado en placas de 6 La suspensión de células fue cultivada en glucosa, piruvato), suero fetal al 10%, estreptomicina (10.000 ug/ml) y 10% de
pocillos con DMEM que contiene 15% de recipientes plásticos de 25 cm2 con medio 100 unidades/ml penicilina, 100µg/ml FBS. Las células fueron cultivadas en
suero fetal bovino, 100 unidades/mL de Eagle´s, suplementado con 10% FCS, 100 estreptomicina y cultivados a 37·∙C en frascos de 75 cm2 a 37 ° C y 5% de CO2 en
penicilina y 100 mg/mL estreptomicina. unidades/ml penicilina, 100mg/ml 5% CO2, el medio fue cambiado cada 2 cámaras humidificados. Medio fue
Los cultivos se incubaron a 37·∙C en una estreptomicina y anfotericina B e días hasta que se alcanzó el 100% de cambiado cada 48 horas hasta alcanzar el
CULTIVO CELULAR atmósfera de 5% de CO2 humidificada incubados a 37·∙C confluencia 70% de confluencia
PASAJES O SUBCULTIVOS 3 pasajes 3 pasajes 3 pasajes 10 pasajes
Observación microscópica de Observación microscópica de morfología
EVALUACIÓN MORFOLÓGICA NR NR morfología celular celularMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 121
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Aislamiento de RNA de las células, con
ABgene para realizar análisis RT-­‐ PCR para
cuantificar la expresión de mRNA
específicos de DPSC CD44, CD24, NANOG,
Oct-­‐4 y Sox2, GAPDH, CD133, c-­‐myc. Los
productos de RT-­‐PCR fueron luego
separados por electroforesis usando
reliant 4%, gel de agarosa las bandas
Ac: anti CD105, CD90, CD166, CD73, fueron visualizadas por iluminación
Uso de STRO-­‐1, CD146, CD29, CD105 y Ac: STRO-­‐ 1, c-­‐ kit, Nanog, CD44, CD34, CD11b, CD34, CD133, CD64, CD106, ultravioleta de la tinción en gel de
CARACTERIZACIÓN citometría de flujo CD31 CD31 y CD45 y citometro bromuro de etilo
El número de células aisladas y su
Evaluación de proliferación celular con viabilidad fue determinado con tinción azul
tinción de azul de toluidina y conteo de de tripan. Evaluación de tasa de
colonias. Ensayo MTT se realizó en la Evaluación tasa de proliferación con proliferación realizando triptinización y su
primera semana. Diferenciación bromodeoxiuridina BrdUrd en primer confluencia fue medida con miscroscopía
OTROS PROCESOS osteogénica y adipogénica pasaje NR invertida desde pasaje 1-­‐ 10
Rápida proliferación, con morfología
Se obtuvo DPSCs con éxito, citometría de fibroblastoide, más del 80% de la Se logró aislar DPSCs de 30 de los 31
flujo demostró un patrón típico para Células aisladas con morfología población exhiben expresión de dientes, se observa alta tasa de
MSCs: positivo para STRO-­‐1, CD146, CD29 fibroblastica, expresaron moléculas de antígenos de superficie CD105, CD90, proliferación celular con morfología
y CD105. Tasa de proliferación mayor en superficie STRO-­‐1, CD34, CD31, CD44, c-­‐ CD166, CD73. Exhiben alta capacidad alargada, expresión de mRNA para MSC
RESULTADOS SHED que en DPSCs kit y Nanog de proliferación como CD44, CD24, NANOG, Oct-­‐4, Sox2122 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
A. Anexo. matriz de metodologías empleadas desde el año 2000 para obtención de muestra, cultivo y
caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas de la pulpa de dientes
permanentes (artículos 25, 26, 27, 28)
ARTÍCULO/VARIABLE Artículo 25 Artículo 26 Artículo 27 Artículo 28
REFERENCIA Referencia 53 Referencia 39 Referencia 40 Referencia 41
AUTORES Bonnamain V. y colaboradores Hilkens P. y colaboradores Abdullah M. y colaboradores Horibe H. y colaboradores
AÑO Año 2013 Año 2014 Año 2014 Año 2014
Institut de transplantation et de Biomedical Research institute, Department of Dental Regenerative
LABORATORIO Recherche en Transplantation, Nantes-­‐ Agoralaan-­‐ Belgium Human Genome Centre Kelatan-­‐Malasia Medicine, Morioka-­‐ Japón
APROBACIÓN COMITÉ ÉTICA NR SI SI SI
CONSENTIMIENTO INFORMADO SI SI SI SI
ANTECEDENTES SISTÉMICOS Sanos NR NR Sanos
TIPO DE DIENTE 3er molar 3er molar NR 3er molar
12 dientes, 6 de pacientes entre 19-­‐30
NÚMERO DE DIENTES UTILIZADOSNR NR 4 dientes ños y 6 de pacientes entre 44-­‐70 años
EDAD PACIENTES 15-­‐20 años (16 pacientes) 15-­‐20 años 10-­‐40 años 19-­‐70 años
MOTIVO EXODONCIA Indicación terapeútica Indicación ortodóntica o terapeútica NR NR
ESTADO BUCAL DEL PACIENTE NR NR NR NR
PROCESO EXODONCIA NR NR NR NR
CONSERVACIÓN DEL DIENTE NR NR NR NR
Fractura dental con instrumentos y Corte CEJ, posteriormente inmersos en
MÉTODO EXTRACCIÓN PULPAR NR obtención de pulpa dental etanol y bañados en PBS NRMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 123
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
El tejido fue suspendido en medio de
cultivo mínimo escencial (MEM) con 10%
de FBS, 100 U/ml de penicilina,
100µg/ml estreptomicina, 2 mM
glutamina L. El tejido es dividido en
fragmentos de 1-­‐2mm3 y cultivados en 6
pozos para promover el crecimiento
Tejido pulpar removido y dividido en celular. Uso método explante, basado en
fracciones con escalpelo y digerido en adherencia al plastico de las MSCs, Pulpa inmersa en solución digestiva
3mg/ml colagenasa TI y 4mg/ml dispasa seguido de un crecimiento celular fuera colagenasa TI 3mg/ml toda la noche a Tejido pulpar dividido en piezas para
por 1 hora a 37·∙C, después pasa a través de los fragmentos de tejido y obtención 37·∙C. La solución se filtró en malla de colocar liberasa 0,04mg/ml que realiza
PROCESAMIENTO PULPAR de malla 7O µm para obtener células celular 70µm digestión enzimática
Las células fueron cultivadas en medio
MCDB 131 con 10% de FBS, 100 U/ml de
DPSCs cultivadas en medio basal penicilina, 100µg/ml estreptomicina, 10
suplementado con 10% de FCS. Despues mM glutamina L, 110 ng/ml EGF humano
de 12 horas el medio fue cambiado en y µg/ml de hidrocortisona a 37·∙C Y 5%
recipientes de 6 pozos con 2 ml de CO2, el medio se cambio cada 2-­‐3 días y Células inmersas en medio de cultivo
DMEM, Ham´s F12, 33 mM de glucosa, monitoreados con microscopía, cuando MEM-­‐alfa suplementado con 20% FCS,
5mM HEPES, 5µg/ml de estreptomicina, alcanzaron el 80-­‐90% de confluencia las 100µM ácido ascorbico L, 2mM
suplementado con 10% FCS, 5 células fueron recolectadas usando glutamina-­‐L, 100U/ml penicilina, Cultivadas en DMEM suplementado con
unidades/ml penicilina e incubados a 0,05% tripsina/EDTA y subcultivads para 100µg/ml estreptomicina e incubados a suero humano al 10% en platos de 35mm,
CULTIVO CELULAR 37·∙C en 5% CO2 futuros experimentos 37·∙C y 5% CO2 con FGF básico 10 ng/ml
PASAJES O SUBCULTIVOS 2 pasajes 4 pasajes 4 pasajes 6 pasajes
Se detectó la formaciónde colonias con
incubación con TrypLE cuando se alcanzó
una confluencia del 70% y subcultivados
Observación microscópica de morfología con DMEM suplementado con 10% de
EVALUACIÓN MORFOLÓGICA celular NR NR suero humano124 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
Las células se evaluaron con la El linaje de SC fue confirmado con
Ac monoclonales: FITC-­‐CD90, FITC-­‐CD45, expresión de los marcadores: CD31, tinción inmunocitoquímica para detectar
FITC-­‐CD34, FITC-­‐CD71, APC-­‐CD133, PE-­‐ CD34, CD44, CD45, CD90, CD105, STRO-­‐MSCs, uso de Ac de ratón monoclonales Uso Ac contra CD29, CD31, CD44, CD73,
CARACTERIZACIÓN CD56, PE-­‐CXCR-­‐3 y STRO-­‐1 1, HMEC-­‐ 1 antihumanos CD105 y CD166 CD90, CD105, CD146, CXCR4, G-­‐ CSFR
Determinación de proliferación con El número de células aisladas y su
ensayo alarmarBlue 10µl e incubado por viabilidad fue determinado con tinción
Identificación de proteínas involucradas 24 horas, su absorbancia fue azul de tripan, la subpoblación de DPSCs
en angiogénesis por DPSCs por medio de determinada con ELISA, fue evaluada del que se moviliza (MDPSCs) fue aislada
Cultivo de DPSCs adherentes y no un ensayo de Ac y validados con RT-­‐PCR día 1-­‐10 para observar crecimiento de utilizando G-­‐ CSFR que induce
OTROS PROCESOS adherentes al siguiente día del cultivo y ELISA DPSCs mobilización en SC
Frecuencias de la unidad formadora de
colonias (CFU) en MDPSCs jóvenes y
Se logró aislar DPSCsque parecían tener viejas se estimaron en 88% y 87%,
un predominante impacto pro-­‐ respectivamente y los de DPSCs jóvenes y
angiogénicos sobre migración endotelial viejas fueron de 70% y 68%,
Después de 12 horas presencia de y formación de tubulos, in vitro, así respectivamente. Positivos para CD29,
células adherentes y no adherentes, las como en una configuración en vivo. El CD44, CD73 y CD90. Cabe mencionar, sin
adherentes exhiben morfología diversa a campo dental puede significativamente embargo, que las tasas positivas de
los 11 días, más del 90% de la población beneficiarse de las propiedades CD105, CXCR4 y G-­‐CSFR de MDPSCs
con morfología fibroblastoide expresa angiogénicas de DPSCs, en particular en Se obtuvo DPSCs, con expresión de jóvenes y viejas fueron similares y
marcadores específicos como CD90, pero regeneración de pulpa e ingeniería del CD105 y CD166, DPSCs presentan alta significativamente superiores a los de
RESULTADOS negativas para STRO-­‐1 y CD57 diente entero tasa de multiplicación DPSCsMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales 125
humanas obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
B. Anexo: Folleto informativo para
pacientes que serán incluidos en
futuros estudios experimentales para
obtención de muestra, cultivo y
caracterización in vitro de MSCs
humanas obtenidas de la pulpa de
dientes permanentes126 Metodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas
obtenidas de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literaturaMetodología sobre obtención de muestra, cultivo y caracterización in vitro de células madre mesenquimales humanas obtenidas
de la pulpa de dientes permanentes. Revisión narrativa de la literatura
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