Regeneración de nervio periférico en ratas utilizando matriz de fibrina con medios condicionados de células madre mesénquimales
Autor: Erazo Acosta, Lina Marcela
Asesor: Osorio Bernal, Luz Ángela
Fecha: 2017-12
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Las lesiones de nervio periférico son alteraciones causadas en su mayoría por traumas mecánicos que alteran la capacidad axonal del nervio de transmitir impulsos tanto sensitivos como motores, lo que genera severa discapacidad física en los pacientes, alteraciones en su calidad de vida y en su actividad económica. El tratamiento convencional en algunas ocasiones no puede superar las limitaciones fisiológicas de recuperación en cuanto a velocidad de regeneración y restablecimiento de la funcionalidad, debido al mecanismo de trauma o la brecha generada en el nervio, por eso se han explorado diferentes opciones como la terapia celular y el uso biomateriales, con resultados que varían desde un éxito moderado hasta una eficacia nula.     Una alternativa prometedora es el uso de células madre mesénquimales, pues ha demostrado mejorar la velocidad de regeneración axonal y aumentar el grado de mielinización durante el proceso de reparación nerviosa. Sin embargo, recientes estudios científicos parecen indicar que la capacidad neurorregenerativa de las células madre mesénquimales no está basada en una diferenciación a tipos celulares del tejido nervioso, sino más bien en el efecto paracrino que ejercen sobre las células circundantes. Éste efecto paracrino ocurre a través de moléculas biológicamente activas que son liberadas por las células madre al ambiente extracelular y que inician procesos celulares orientados a la reparación del tejido dañado. Las mismas moléculas secretadas por las células madre in vivo se pueden encontrar en los medios de cultivo cuando las células son expandidas en el laboratorio y estos se conocen como medios condicionados de células madre mesénquimales. Los medios condicionados no contienen células madre, reduciendo los riesgos del trasplante celular y otorgando facilidades de manejo, disponibilidad y aplicación.    Éste estudio funcional, comparando la eficacia de los medios condicionados en un modelo de lesión de nervio periférico en ratas, muestra una menor alteración del patrón de marcha y mayores cambios electromiográficos en los subgrupos de autoinjerto, medios condicionados y autoinjerto + medios condicionados, sin diferencias estadísticamente significativas entre ellos y con los otros subgrupos.

Regeneración de nervio periférico en ratas utilizando matriz de
fibrina con medios condicionados de células madre mesénquimales
Lina Marcela Erazo Acosta
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía
Unidad de Ortopedia y Traumatología
Bogotá, Colombia
2017Regeneración de nervio periférico en ratas utilizando matriz de
fibrina con medios condicionados de células madre mesénquimales
Lina Marcela Erazo Acosta
Trabajo presentado como requisito para obtener el título en
Especialista en Ortopedia y Traumatología.
Tutor: Dr. Enrique Vergara Amador
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Cirugía
Unidad de Ortopedia y Traumatología
Bogotá, Colombia
2017
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1TABLA DE CONTENIDO
ESQUEMA DE PRESENTACIÓN ............................................................................................... 4
RESUMEN .................................................................................................................................. 5
JUSTIFICACIÓN ........................................................................................................................ 7
PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN ............................................................................................. 9
OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................... 9
OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................................................... 9
MARCO TEÓRICO ................................................................................................................... 10
LESIÓN DE NERVIO PERIFÉRICO ....................................................................................... 10
BIOLOGÍA DE LA REPARACIÓN DE NERVIO PERIFÉRICO ...................................................... 10
CÉLULAS MADRE ............................................................................................................ 11
LAS CÉLULAS MADRE MESÉNQUIMALES (MSCS) ............................................................... 12
LAS CÉLULAS MADRE MESÉNQUIMALES Y REGENERACIÓN NERVIOSA ................................. 12
EFECTO PARACRINO DE LAS MSCS ................................................................................. 13
MEDIOS CONDICIONADOS (MC) ....................................................................................... 13
USOS Y FORMAS DE EMPLEO DE LOS MC ......................................................................... 13
MODELOS DE LESIÓN DE NERVIO PERIFÉRICO EN ANIMALES .............................................. 13
METODOLOGÍA ....................................................................................................................... 14
TIPO DE ESTUDIO ...................................................................................................... 14
TIPO DE MUESTRA ..................................................................................................... 14
TAMAÑO DE LA MUESTRA ........................................................................................ 14
MATRIZ DE FIBRINA ................................................................................................... 14
CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES HUMANAS ..................................................... 14
MEDIOS CONDICIONADOS ........................................................................................ 14
MATRIZ DE FIBRINA CON CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES ............................. 15
MATRIZ DE FIBRINA CON MEDIOS CONDICIONADOS DE MSCS ............................. 15
PROCEDIMIENTO QUIRURGICO ............................................................................... 15
REGISTRO DE ELECTROMIOGRAFÍA ....................................................................... 15
OBTENCION DE MUESTRAS ...................................................................................... 16
CRITERIOS DE EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO ........................................................ 16
ANÁLISIS ESTADÍSTICO ............................................................................................. 16
RESULTADOS ......................................................................................................................... 15
COMPLICACIONES ................................................................................................................. 17
CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 18
CONSIDERACIONES ÉTICAS ............................................................................................... 189
PROPIEDAD INTELECTUAL ................................................................................................. 189
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................... 20
ANEXOS .................................................................................................................................. 25
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2ESQUEMA DE PRESENTACIÓN
TITULO DEL Regeneración de nervio periférico en ratas utilizando matriz de fibrina con
PROYECTO medios condicionados de células madre mesénquimales
Nombre Lina Marcela Erazo Acosta1
Teléfono fijo
INVESTIGADOR
PRINCIPAL Teléfono celular 3163076264
Correo
gogoliza22@gmail.com
electrónico
Nombre Orlando Chaparro Garzón2
Teléfono fijo 316500. Ext 15057/9
COINVESTIGADOR
Teléfono celular 311 222 1717
Correo
ochaparrog@unal.edu.co
electrónico
Nombre Enrique Vergara Amador3
Teléfono fijo 316 5000 ext. 15107
COINVESTIGADOR Teléfono celular 316 410 6358
Correo
enriquevergaramd@gmail.com
electrónico
Nombre Daniel Enrique Vega Lizarazo4
Teléfono fijo
COINVESTIGADOR Teléfono celular 3006113960
Correo
cowinsaint@gmail.com
electrónico
TIPO DE Convenio Docente- Institución
Contrato directo X X
VINCULACIÓN Servicio educativa
ASESORES Dra. Lucia Botero Espinosa, Dr. Jorge Arturo Díaz5
Requisito para
MOTIVACIÓN DE Requisito para Investigación Otro
título de X
INVESTIGACIÓN título profesional independiente X ¿Cuál?
Postgrado
1 Residente IV año. Ortopedia y Traumatología Universidad Nacional de Colombia.
2 BSc en Biología, MSc en Genética Humana, Universidad Nacional de Colombia - PhD en Ciencias Biomédicas, The Mount
Sinai School Of Medicine, Nueva York, Estados Unidos
3 Especialista en Ortopedia y Traumatología, Universidad Nacional de Colombia - Cirujano de Mano, Miembro Superior y
Microcirugía, Universidad Pierre y Marie Curie, Instituto Francés de la Mano, Paris, Francia - Profesor de ortopedia infantil.
Unidad de Ortopedia y Traumatología - Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Colombia
4 Médico Cirujano. Universidad Nacional de Colombia
5 Médico especialista en Medicina Física y Rehabilitación, Profesor Titular Universidad Nacional de Colombia. Director
Médico CIFEL – Bogotá
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3RESUMEN
Las lesiones de nervio periférico son alteraciones causadas en su mayoría por traumas
mecánicos que alteran la capacidad axonal del nervio de transmitir impulsos tanto
sensitivos como motores, lo que genera severa discapacidad física en los pacientes,
alteraciones en su calidad de vida y en su actividad económica. El tratamiento
convencional en algunas ocasiones no puede superar las limitaciones fisiológicas de
recuperación en cuanto a velocidad de regeneración y restablecimiento de la
funcionalidad, debido al mecanismo de trauma o la brecha generada en el nervio, por eso
se han explorado diferentes opciones como la terapia celular y el uso biomateriales, con
resultados que varían desde un éxito moderado hasta una eficacia nula.
Una alternativa prometedora es el uso de células madre mesénquimales, pues ha
demostrado mejorar la velocidad de regeneración axonal y aumentar el grado de
mielinización durante el proceso de reparación nerviosa. Sin embargo, recientes estudios
científicos parecen indicar que la capacidad neurorregenerativa de las células madre
mesénquimales no está basada en una diferenciación a tipos celulares del tejido nervioso,
sino más bien en el efecto paracrino que ejercen sobre las células circundantes. Éste
efecto paracrino ocurre a través de moléculas biológicamente activas que son liberadas
por las células madre al ambiente extracelular y que inician procesos celulares orientados
a la reparación del tejido dañado. Las mismas moléculas secretadas por las células madre
in vivo se pueden encontrar en los medios de cultivo cuando las células son expandidas
en el laboratorio y estos se conocen como medios condicionados de células madre
mesénquimales. Los medios condicionados no contienen células madre, reduciendo los
riesgos del trasplante celular y otorgando facilidades de manejo, disponibilidad y
aplicación.
Éste estudio funcional, comparando la eficacia de los medios condicionados en un modelo
de lesión de nervio periférico en ratas, muestra una menor alteración del patrón de
marcha y mayores cambios electromiográficos en los subgrupos de autoinjerto, medios
condicionados y autoinjerto + medios condicionados, sin diferencias estadísticamente
significativas entre ellos y con los otros subgrupos.
Palabras clave: Células madre mesenquimales, regeneración nerviosa, medios
condicionados, nervio periférico.
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4ABSTRACT
Peripheral nerve injuries are mostly caused by mechanical trauma, affecting nerve
conduction and resulting in a sensory and motor deficit, leading to functional disabilities
and economic issues for the patients. Conventional treatment could not be enough for
repair sometimes, because of the damaged tissue or nerve gap. As a result, cell
investigation and use of many biomaterials for artificial nerve conduits has been explored
as alternative treatments.
Mesenchymal stem cells have demostrated faster recovery and better quality at the nerve
fiber. However in the last years has been shown its capability to differenciate into multiple
tissue lineages is less important than the paracrine effect on the other cells. This active
molecules in the extracellular enviroment are the beginers of the repair process, and can
be finded at cellular cultures in the laboratory, called condicioned medium, avoiding
inmunologic issues and providing easier access than a cell transplant.
This functional study, comparing efficacy of conditioned medium in a peripheral nerve
injury in rats, shows less impaired walking and more electrophysiologic changes at
autograft, autograft + condicioned medium, and condicioned médium groups, without
significant differences wilth the other groups or between them.
Keywords: Mesenchymal stem cell, nerve repair, condicioned médium, peripheral nerve.
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5JUSTIFICACIÓN
Las lesiones de nervio periférico son una causa de gran morbilidad en los pacientes
afectados [1], ocurriendo desde la infancia, en el mismo momento del nacimiento por un
trabajo de parto complicado, hasta las generadas por accidentes de tránsito, irradiación,
lesiones eléctricas y por temperaturas extremas.
Estadísticas internacionales reportan que en el 2.8% de las heridas traumáticas puede
haber lesión de nervio periférico [2], sin embargo la incidencia varía enormemente en
cada país, según la casuística principal.
Debido a la alta incidencia de accidentes de tránsito y los traumas por lesiones
personales, en nuestro medio es relativamente frecuente encontrar pacientes que han
sufrido lesiones nerviosas con consecuencias tan graves como la perdida de una función
corporal o dolores neuropáticos, disminuyendo notablemente la calidad de vida,
generando problemas psicológicos para él y su familia, y creando condiciones de invalidez
que afectan su desarrollo personal y profesional.
Esta situación genera un gran impacto económico pues los individuos que se encuentran
en edad productiva pierden su capacidad de trabajar, las pensiones por invalidez inician
desde temprana edad y los costos de los tratamientos a los que son sometidos para
recuperar parte de la función comprometida son elevados.
Dependiendo del origen de la lesión, del tamaño de la brecha, y del compromiso de
funciones corporales que conlleve, las alternativas terapéuticas actuales pueden ser
insuficientes para lograr una reparación satisfactoria. Aprobados en Estados Unidos por la
FDA, comercialmente se pueden adquirir conductos a base de colágeno, en especial
colágeno tipo I y III; PGA, que al ser un material poroso presenta procesos de reabsorción
a los 6 meses y coprolactona, un poliéster alifático cuya degradación llega a ser completa
al año del injerto [3]. Además, se cuenta con pegamentos de fibrina humana [4] como
coadyuvantes en la reparación del nervio; sin embargo, su uso está limitado por el costo y
la dificultad de adquisición en nuestro medio.
Se ha investigado el uso de diferentes biomateriales [1, 5] que sirvan como soporte para
el crecimiento axonal [6-9] y también se han realizado estudios empleando células madre
mesénquimales [10, 11], células madre diferenciadas a linajes neurogénicos [8, 12] y
proteínas de la matriz extracelular [13], todo esto en busca de una alternativa al uso de
autoinjertos cuya obtención puede ser difícil teniendo en cuenta la cantidad y longitud
necesaria de la fibra y que dependiendo del sitio donante puede generar un defecto
funcional.
En la última década se ha descrito la capacidad de las células madre como potenciales
regeneradoras de tejido lesionado y su utilidad en diversas patologías donde la
inflamación y la destrucción celular son el problema central [14-16], considerándose que
su principal acción residía en la capacidad de multiplicación y diferenciación. No obstante,
múltiples ensayos in vivo han demostrado que las células madre tienen una baja tasa de
implantación y de diferenciación en tejidos lesionados [17] y no contribuyen de manera
significativa al volumen celular [18, 19]. Por otro lado, evidencia científica reciente sugiere
que las células madre mesénquimales ejercen su función protectora y restaurativa por
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6efecto paracrino —la secreción al medio ambiente celular de moléculas biológicamente
activas— generando cambios fisiológicos sobre las células que la rodean [20-22]. Estas
moléculas secretadas se pueden encontrar en los medios donde son cultivadas las
células madre y estos se conocen como medios condicionados de células madre
mesénquimales.
Esto significa que no es necesario que la célula permanezca en el sitio de la lesión,
usando como alternativa el producto de su metabolismo presente en los medios
condicionados para obtener resultados similares sin los riesgos inherentes al trasplante de
células no diferenciadas y a un menor costo, ya que los medios condicionados no
contienen células de ningún tipo, son de fácil obtención y pueden almacenarse de forma
que estén disponibles en unos cuantos minutos para su uso, siendo una opción de gran
interés para aplicaciones clínicas.
La línea de investigación “Plexo Braquial Y Nervio Periférico, Cirugía De Mano Y
Microcirugía” Unidad de Ortopedia y traumatología, trabajando conjuntamente con el
grupo de investigación “Biología de Células Madre”, de la Facultad de Medicina de la
Universidad Nacional de Colombia, proponen evaluar con el presente estudio la
efectividad de los medios condicionados de células madre mesénquimales para regenerar
tejido nervioso en un modelo de lesión de nervio periférico, en ratas.
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7PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN
¿Pueden los medios condicionados de células madre mesénquimales inducir la
regeneración nerviosa en uno modelo de lesión de nervio periférico en ratas?
OBJETIVO GENERAL
Evaluar la eficacia de los medios condicionados de células madre mesénquimales en la
regeneración de nervio periférico en un modelo de lesión nerviosa en ratas.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Comparar el grado de recuperación funcional durante la marcha, en un modelo de
lesión de nervio periférico en ratas, tratadas con medios condicionados de células
madre mesénquimales vs aquellas tratadas con autoinjerto, células madre o matriz de
fibrina.
 Estudiar la respuesta electrofisiológica de la fibra nerviosa en un modelo de lesión de
nervio periférico en ratas tratadas con medios condicionados de células madre
mesénquimales vs. aquellas tratadas con autoinjerto, células madre o matriz de
fibrina.
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8MARCO TEÓRICO
Lesión de nervio periférico
A diferencia de las alteraciones ocasionadas en el sistema nervioso central, en el nervio
periférico existe la posibilidad de regeneración nerviosa [23], dependiendo de la
naturaleza y extensión del trauma, del tiempo en que posteriormente se lleve a cabo la
reparación [24], y de los requerimientos adicionales que sean empleados para dicho fin.
Sin importar que la lesión sea térmica, química o mecánica, la regeneración dependerá
del compromiso de la fibra, ya sea del axón o de las capas que lo recubren, lo que
interferirá de distinta manera con las señales enviadas desde el cuerpo neuronal.
Sunderland ha descrito 5 grados de lesión [1, 2, 25]:
Grado 1: Neurapraxia, bloqueo de la conducción nerviosa.
Grado 2: Axonotmesis, lesión del axón sin lesión del endoneuro.
Grado 3: Lesión del axón y endoneuro, sin daño del perineuro.
Grado 4: Lesión del funículo, el epineuro mantiene la continuidad.
Grado 5: Lesión del tronco nervioso.
El grado 1 y 2, que corresponden a neurapraxia y axonotmesis, son las de mejor
pronóstico, sin embargo a medida que la lesión progresa y compromete el endoneuro, el
epineuro y el perineuro, peor es el desenlace.
Biología de la reparación de nervio periférico
Los mecanismos de reparación requieren diferentes procesos y mayor tiempo
dependiendo del tipo de lesión que se encuentre, a mayor compromiso de la fibra el
proceso inflamatorio será mayor y tomará más tiempo en su reparación, haciendo
evidente la alteración de la función neuronal y la hipotrofia muscular secundaria, dando
lugar con mayor frecuencia, a conexiones aberrantes y reparación anómala de la fibra.
En la fase inicial del proceso, es posible observar los cambios degenerativos que suceden
proximales y distales al sitio de la lesión e incluso cambios identificables en el cuerpo
neuronal, como la excentricidad del núcleo, los cambios en el citoplasma y alteraciones en
la actividad metabólica de la neurona [2, 26]. La recuperación de estos cambios puede
durar de semanas a meses y depende adicionalmente de la adecuada conexión de las
fibras periféricas. En un primer momento son las señales generadas desde el cuerpo
neuronal en reacción al daño axonal y la degeneración Walleriana [23, 26] las que
conducen una respuesta inflamatoria celular y humoral y procesos mediados por calcio.
Luego la reparación continua por la proliferación y actividad de células de Schwann [24],
generalmente mediada por segundos mensajeros cuya respuesta se evidencia en la
transcripción y traducción de proteínas para la regeneración del axón [2] y la formación de
bandas de Büngner [27]. Cuando la degeneración axonal es demasiado extensa, las
células de Schwann no alcanzan a producir los factores de crecimiento y los componentes
de la matriz celular necesarios, entonces la regeneración no se lleva a cabo. Si la lesión
de la fibra distal no ha sido severa, el crecimiento de la fibra en promedio es de 1 a 3 mm
por día.
Es de anotar que la neurotmesis es la lesión más grave que se puede encontrar y
necesita reparación quirúrgica, sin embargo de debe evaluar muy bien la lesión para
elegir la técnica quirúrgica más adecuada.
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9Muchas estrategias han sido empleadas a través del tiempo para intentar corregir estos
defectos, desde la primera técnica reportada entre 1870 y 1900. Con el desarrollo de la
microcirugía y sus elementos, como la sutura primaria inmediata de extremo a extremo, o
de extremo a la cara lateral de la fibra nerviosa, sutura epineural y sutura de fascículos
individuales [28] se logró un mayor rango de tratamiento para este tipo de lesiones. Sin
embargo, en algunos casos la lesión nerviosa deja un segmento muy amplio entre los
extremos nerviosos que no permite una regeneración satisfactoria, por lo que ha sido
necesario el empleo de injertos nerviosos, sean autoinjertos, aloinjertos o incluso
xenoinjertos. Actualmente los mejores resultados son con la utilización de autoinjertos, los
cuales por su parte presentan el inconveniente de ser limitados en su obtención [24],
dependiendo de la longitud requerida para reparar el daño y de una posible lesión
nerviosa en el sitio donante. Cabe destacar que por más de 100 años desde su incursión
en el campo de la regeneración nerviosa [2], los autoinjertos continúan siendo el “gold
standard” para la reparación de defectos de las fibras nerviosas periféricas [24] y es el
mecanismo con el que se comparan las nuevas tecnologías en cuanto a aloinjertos se
refiere. Los nervios más comúnmente utilizados en el proceso son el nervio sural y nervios
cutáneos, pero también se han empleado ramas sensitivas del nervio radial, del nervio
mediano e injertos del nervio cubital [29]. Actualmente las transferencias nerviosas o
neurotizaciones están siendo ampliamente empleadas para este fin.
Como alternativa, se ha propuesto entonces la utilización de diferentes materiales [2, 6,
30] que pueden servir de conductos [31] para permitir una regeneración nerviosa
adecuada, en pacientes en quienes el autoinjerto no es una opción, por el mecanismo de
trauma, por la longitud de la lesión o por la falta de sitios para conseguir el injerto.
Cuando inicialmente se planteó esta posibilidad, se iniciaron estudios con poliésteres,
pero se observó baja biocompatibilidad, dificultad en el procesamiento y degradación
prematura, por lo que se hicieron modificaciones. También se intentó con otros materiales
como silicona [32], poliuretano, ácido poliglicólico o mezclas de diferentes sustancias [24],
siempre buscando que logren en lo posible los 3 principios básicos: biocompatibilidad,
fuerza mecánica y una adecuada capacidad de conductancia [33].
Además de lograr el material que mejor contribuyera a la regeneración nerviosa, también
se identificó la necesidad de acompañarlo de sustancias que incrementaran el crecimiento
y la diferenciación de la fibra nerviosa [34] para lograr mejores resultados, por lo que se le
ha dado gran importancia a componentes que hacen parte de la matriz extracelular y
factores de crecimiento de diferentes líneas celulares [35-37]. También se ha observado
que existe menor respuesta inflamatoria y menor fibrosis asociada con sellantes de fibrina
[28] en comparación con las suturas usuales.
Células madre
El cuerpo humano contiene varios billones de células de cerca de 225 diferentes tipos
celulares que componen los tejidos de los diferentes órganos. Estos diferentes tipos
celulares se originan a partir de una única célula (el cigoto), a través de un complejo
proceso de diferenciación durante el cual, grupos de genes particulares se activan o
desactivan, dando a cada tipo celular, sus características de individualidad. La mayoría de
las células diferenciadas no pueden replicarse y su reemplazo, cuando así se requiere,
debe hacerse a partir de un grupo de células indiferenciadas que mantienen su capacidad
de autorreplicarse: las células madre [38, 39].
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10Las células madre se pueden definir como un grupo de células indiferenciadas que
poseen dos características principales: capacidad de autorrenovación y capacidad de
diferenciación. La primera es asimétrica ya que una de las células conserva dicha
capacidad y la otra se diferencia en un linaje especializado, incluso luego de un periodo
de inactividad [40-43].
Además de las características anteriores, estas células tienen un enorme potencial de
expansión; pueden diferenciarse a otros tipos celulares distintos a las células de los
órganos en los que residen, capacidad conocida como plasticidad y pueden permanecer
quiescentes en sus microambientes hasta que un estímulo adecuado las hace entrar
nuevamente en sus ciclos celulares, situación que las protege de potenciales daños en su
ADN y amplia el tiempo en que permanecen presentes en el tejido [39, 44-47].
Las células madre mesénquimales (MSCs)
Las MSC son una subpoblación de células indiferenciadas heterogéneas multipotentes,
no hematopoyéticas, de origen mesodérmico, que conservan la capacidad de
diferenciación a linajes mesénquimales [48-50].
Entre sus propiedades únicas, se ha demostrado que las MSCs pueden evadir el sistema
inmune y ser indetectables durante largos periodos de tiempo, también se ha
documentado sus propiedades inmunomoduladoras en enfermedades autoinmunes y han
sido asociadas con una reducción de la incidencia de la enfermedad injerto vs huésped
[51, 52].
Además de estas características, el Comité de Células Madre Mesénquimales y Tisulares
de la Sociedad Internacional para Terapia Celular (ISCT) estableció 3 criterios mínimos
para definir las MSC: 1) ser adherentes al plástico en condiciones estándar de cultivo en
laboratorio, 2) deben ser positivas en la expresión de marcadores de linaje como Stro-1,
CD90, CD73, CD13 y CD105 y negativas para CD11b, CD19, CD45, CD34, CD14, CD79α
y HLA-DR, aunque persiste la dificultad de encontrar los marcadores moleculares que
permitan su identificación apropiada in situ, y 3) capacidad de diferenciarse en
osteoblastos, adipocitos y condroblastos in vitro [53-60].
Las células madre mesénquimales y regeneración nerviosa
La reparación quirúrgica de nervio periférico ha resultado insuficiente en el manejo clínico
de lesiones nerviosas, sin poder solucionar problemas como la muerte neuronal, el lento
crecimiento axonal y la pérdida de sensibilidad [61-63]. Las MSCs son una alternativa
prometedora para terapias celulares en déficits neurológicos por su facilidad de obtención,
rápido crecimiento y propiedades inmunomoduladoras que permiten trasplantes
alogénicos [64-66].
Se han desarrollado diferentes técnicas con biomateriales para facilitar el crecimiento del
nervio, siendo las más eficientes aquellas que incorporan células madre para mejorar la
regeneración nerviosa basadas en la plasticidad celular [12, 67, 68]. Aunque aún se
desconoce el mecanismo neurogénico de las MSCs, se han propuesto varios modelos:
transdiferenciación a células nerviosas, fusión celular espontánea y secreción de factores
de crecimiento y neurotácticos [19].
Varios estudios demuestran el potencial terapéutico de las MSCs en la terapia celular
para la reparación nerviosa, existiendo ya ensayos clínicos en humanos para el
tratamiento de la enfermedad de Parkinson [69].
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11Efecto Paracrino de las MSCs
Nuevas teorías sobre los mecanismos de acción de las MSCs proponen la secreción de
moléculas biológicamente activas que inducen cambios fisiológicos en otras células,
ofreciendo una vía de acción en donde las MSCs no necesitan diferenciarse a la
población tisular específica para poder ser terapéuticas [52]. El reconocimiento de la
importancia del efecto paracrino es demostrado por las nuevas estrategias de ingeniería
genética que buscan incrementar la producción de factores biológicos [70-72].
Existe suficiente evidencia que demuestra la importancia de la actividad secretora de las
células madre in vivo en la regulación de factores de crecimiento, citoquinas y en la
reparación tisular [73, 74]. Cada día aumenta el número de moléculas que tienen efectos
paracrinos y básicamente se pueden dividir según su función en: tróficos,
inmunomoduladores, quimioatrayentes, antifibroticos y antiapoptoticos [52].
Medios condicionados (MC)
Los MC son los medios en el que se han cultivado células por un determinado tiempo, los
cuales contienen factores de crecimiento y citoquinas secretados por las células
cultivadas y liberadas al medio, responsables de la actividad biológica [40].
Usos y formas de empleo de los MC
Los MC de MSCs tienen un efecto similar a las células madre en su capacidad de
disminuir el daño celular, con actividad neurotrópica y neuroprotectora en las neuronas
locales, así como mecanismos de direccionamiento por moléculas de la matriz
extracelular [75-77]. Existen teorías que explican la regeneración neuronal gracias a la
acción de citoquinas y factores solubles liberados por las MSCs en el medio, con
evidencia científica de la modificación del microambiente secundaria a la función exocrina
y paracrina de estas [78, 79].
Modelos de lesión de nervio periférico en animales
Los estudios en animales han sido necesarios para lograr un mejor entendimiento de la
lesión nerviosa y su regeneración, y para investigar nuevas formas para su reparación. El
modelo de lesión en nervio ciático en ratas ha sido ampliamente escogido por que
anatómicamente es un nervio largo que permite un estudio patológico completo y en
cuanto a seguimiento se pueden estudiar patrones definidos en distintos grupos
musculares para valorar su función [25].
El seguimiento funcional de las ratas ha generado diferentes enfoques para su
objetivación, dado la enorme variabilidad en los resultados obtenidos[80], uno de los
métodos empleados se ha hecho mediante observaciones y mediciones de la plantiflexión
de la pata y el ángulo del tobillo durante la marcha[81], además la escala BBB, utilizada
en ocasiones para seguimiento de lesión neurológica central, puede dar un valor
adicional. En cuanto a la observación de la fase de apoyo durante la marcha es necesario
tener en cuenta los 4 periodos de ésta: el contacto inicial, que se hace con los dedos;
despegue opuesto, en el que los dedos terminan de apoyarse en el suelo, al igual que la
planta del pie; elevación de talón en el que la tibia avanza hacia delante del eje del tobillo;
y despegue en el que los dedos dejan el suelo posterior a realizar plantiflexión[82].
Posterior a una lesión neurológica los patrones se alteran y su observación juiciosa puede
ayudar a determinar el estado de la lesión y de posible reinervación.
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12METODOLOGÍA
TIPO DE ESTUDIO
Estudio de tipo experimental in vivo.
TIPO DE MUESTRA
Para el estudio se usó el modelo animal de lesión de nervio periférico en ratas tipo Wistar,
adquiridas en el bioterio de la Universidad Nacional de Colombia y el bioterio de la
Pontificia Universidad Javeriana. Se mantuvieron bajo condiciones estándar, 12 horas de
luz y oscuridad, agua y comida ad líbitum.
TAMAÑO DE LA MUESTRA
Se conformaron siete (7) grupos de experimentación para realizar el procedimiento en la
extremidad izquierda, tomando la derecha como control, distribuidos de la siguiente
manera:
GRUPO NERVIO CIÁTICO IZQUIERDO
1 Cirugía falsa (sin neurectomia) 2
2 MSC 4
3 4
Autoinjerto
4 Matriz de fibrina 4
5 Medios condicionados 4
6 Autoinjerto + medios condicionados 4
7 Segunda intención 2
El periodo de observación total fue de 3 meses.
TUBOS DE SILICONA MÉDICA:
Se utilizaron tubos estériles de silicona médica biológicamente inerte de 14mm de longitud
como conectores de los extremos nerviosos, dentro de los cuales se aplicará la matriz de
fibrina.
MATRIZ DE FIBRINA
La matriz tridimensional de fibrina se elaboró de acuerdo con protocolos estandarizados,
bajo condiciones de esterilidad. Se emplearon los siguientes componentes: Plasma
sanguíneo humano (33.2%), solución salina estéril (53.32%), ácido tranexámico (0.64%),
DMEM 10% de SFB (6.64%) y CaCl2 estéril (6.64%). Una vez mezclados bajo
condiciones completamente estériles, se deja gelificar a 37.5ºC por 8 min.
CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES HUMANAS
Las MSCs humanas fueron tomadas de un stock celular, previamente caracterizadas por
citometría y diferenciación in vitro, que se han obtenido de tejido adiposo humano usando
la técnica de explante bajo condiciones estériles.
MEDIOS CONDICIONADOS
Las MSCs derivadas de tejido adiposo se mantienen hasta el pasaje 8 con medio de
cultivo DMEM bajo en glucosa suplementado al 10% con suero fetal bovino, penicilina
100U/ml, estreptomicina 100µg/ml e incubadas a 37°C en atmósfera húmeda con 5% de
~ ~
13CO2. Cuando las células alcanzan el 80% de confluencia se retira el medio DMEM bajo
en glucosa, se lavan tres veces con PBS y se adicionan 3ml de medio de cultivo libre de
suero fetal bovino. Las células se incuban en este medio por 24 horas en una incubadora
O2/CO2 programada para mantener una tensión de oxigeno del 2%, con las condiciones
habituales de temperatura y humedad para cultivos celulares. Terminadas las 24 horas se
retira el medio condicionado, se pasan por un filtro de 0.22µm y se almacena a -20°C
MATRIZ DE FIBRINA CON CÉLULAS MADRE MESENQUIMALES
Se sigue el mismo procedimiento para la elaboración de la matriz de fibrina descrito
previamente, remplazando la solución salina y el medio de cultivo DMEM por células
madre mesénquimales en suspensión a una concentración de 100.000 células/ml.
MATRIZ DE FIBRINA CON MEDIOS CONDICIONADOS DE MSCs
Se sigue el mismo procedimiento para la elaboración de la matriz de fibrina descrito
previamente, remplazando la solución salina y el medio de cultivo DMEM por los medios
condicionados de células madre mesénquimales en una concentración de 100µg /ml.
PROCEDIMIENTO QUIRURGICO
Luego de 2 semanas de adaptación en el bioterio, las ratas se llevan al sitio de
operaciones donde el primer grupo son anestesiadas con una mezcla de Ketamina
(80mg/kg) + Xilazina (5mg/kg) y el segundo grupo con isofluorane. Luego de 5 minutos de
aplicada la anestesia, con el roedor en decúbito prono, previa asepsia y antisepsia, se
realiza una incisión transversa en el muslo del animal, siguiendo el eje del fémur pero
posterior a este, hasta la rodilla y se disecciona por planos en el rafe entre el músculo
bíceps femoral y el glúteo, hasta lograr la exposición del nervio ciático, observando una
longitud promedio de 24mm. Una vez identificado el nervio, se procederá según el grupo
de experimentación así:
Grupo 1: En el muslo izquierdo se expone el nervio y se procede a cerrar fascia y piel.
Grupo 2: En el muslo izquierdo se resecan 10 mm del nervio y se fijan los extremos al
tubo de silicona que contiene células madre. Cierre de fascia y piel.
Grupo 3: En el muslo izquierdo se reseca 10 mm del nervio y se procede a suturar
nuevamente el segmento resecado a los muñones correspondientes, como un injerto de
nervio, cierre de fascia y piel.
Grupo 4: En el muslo izquierdo se resecan 10 mm del nervio y se fijan los extremos al
tubo de silicona + matriz de fibrina. Sutura de fascia y piel.
Grupo 5: Igual procedimiento que en el grupo previo, pero se utiliza matriz con medios
condicionados en los tubos de silicona. Sutura de fascia y piel.
Grupo 6: Igual procedimiento que en el grupo 3 pero posterior a la neurorrafia se aplican
medios condicionados realizando un bolsillo al suturar parcialmente los músculos
previamente mencionados. Cierre de piel.
Grupo 7: En el muslo izquierdo se reseca 10 mm del nervio, liberando únicamente el
segmento de nervio, sin resecar, y se procede a suturar fascia y piel.
Luego se procede a cubrir la herida y administrar la dosis correspondiente de antibiótico
profiláctico y analgesia. Finalmente se trasladarán los animales a sus jaulas y se
monitorearán cada 10 min hasta su recuperación completa de la anestesia.
REGISTRO DE ELECTROMIOGRAFÍA
Se realiza electromiografía de gastrocnemios con el grupo de seguimiento a los 3 meses
para verificar conducción.
~ ~
141. Se llevaron los animales al sitio de procedimientos, y se aplicó anestesia inhalada con
isofluorane hasta lograr un estado de reposo poco profundo.
2. Se utilizó un equipo de electromiografía Cadwell Sierra Wave y un electrodo de aguja
concéntrica de calibre 27. Se exploró en cada rata el musculo gastrocnemio tanto de
la extremidad intervenida como de la sana, para analizar el comportamiento del
musculo en reposo en busca de signos de denervación, comparar los potenciales de
unidad motora de las dos extremidades, así como evidencia de signos de
reinervación.
OBTENCION DE MUESTRAS
Las ratas fueron sacrificadas con Eutanex y con cámara de CO2. Se tomaron muestras de
tejido muscular y nervioso, que fueron fijadas en paraforlmaldehido al 4%, luego lavadas
con PBS conteniendo 30% de sucrosa y 0,1% de azida de sodio. Las muestras se
mantendrán para estudios histopatológicos posteriores.
CRITERIOS DE EVALUACIÓN Y SEGUIMIENTO
La evaluación de la efectividad del tratamiento estará dada por:
1. La recuperación funcional, por medio de la escala de Basso, Bettie y Bresnahan
(B.B.B.).
2. La recuperación funcional mediante seguimiento en video de la marcha y
observación de las fases de ésta
3. La recuperación electrofisiológica con electromiografía a las 12 semanas.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Se analizó odds ratio entre los diferentes grupos de intervención y se determinó intervalo
de confianza del 95% utilizando el software IBM SPSS23.
RESULTADOS
Inicialmente se tomó un grupo de 24 ratas divididas en los subgrupos según el protocolo,
y los procedimientos se completaron en 6 días; sin embargo durante el seguimiento fue
necesario un sacrificio temprano por complicaciones asociadas con un brote infeccioso
pulmonar que afectó a todo el lote. Con ellas se llegó a un seguimiento de 6 semanas.
Posteriormente fue necesario realizar un proceso con un nuevo grupo para lograr el
seguimiento completo de 3 meses.
Todas las ratas fueron machos, de raza Wistar, el primer grupo con peso entre 200 gr y
400 gr y el segundo grupo con peso entre 350 gr y 560 gr.
Del primer grupo durante los primeros 3 días se tuvo una pérdida de 3 individuos por lo
que se intervinieron 2 individuos adicionales. Entre las semanas 5 y 6, se tuvo una
pérdida de 4 especímenes más. Se logró un seguimiento completo de 20 ratas en 6
semanas. Se realizaron los sacrificios programados durante el siguiente mes.
El peso durante el primer mes, se incrementó en 11 individuos, logrando en promedio en
el grupo un aumento de 8 gr, mientras que en 7 individuos disminuyó, y en 5 siguió igual.
~ ~
15En el segundo grupo se tuvo una pérdida de 1 rata en los 2 primeros meses y 1 más
durante el último mes. En las primeras 6 semanas el 71 % se los individuos tuvo una
disminución de peso entre 3 y 55 gr.
En todas las ratas que fueron sometidas a sección del nervio se observó procesos de
autofagia en la extremidad afectada, principalmente en los últimos 3 dedos, que cesaron
después del primer mes, y se observó aparición de úlceras en el talón o en el pie.
Marcha
Se observó en video la marcha de los individuos en una plataforma de 80 cm, en el plano
sagital. Durante el seguimiento, el principal segmento afectado de la extremidad fue el pie
y los dedos, lo que durante la marcha se ve reflejado en la incapacidad para realizar el
primer apoyo de pie y para completar la fase de despegue (fases 1 y 4 de la marcha).
Todos los especímenes realizan la marcha principalmente con apoyo e impulso en planta
y talón. En el primer grupo, en el primer mes de postoperatorio 3 individuos (sham y
autoinjerto) presentaron algún grado de apoyo de los dedos en la primera fase y 12
individuos presentaban cierto contacto del antepie durante la fase de despegue, entre
éstos se encuentras los 2 del subgrupo de cirugía falsa, 1 individuo de células madre, 3
de autoinjerto, 2 de matriz de fibrina, 2 de medios condicionados, 1 de segunda intención
y 1 de autoinjerto y medios condicionados. Al finalizar el seguimiento, 3 individuos (1
medios condicionados, 1 auntoinjerto y 1 medios condicionados + autoinjerto) lograron
contacto de los dedo durante el apoyo inicial y 11 especímenes lograban una mejor fase
de despegue, de los cuáles 4 individuos no lo hacían inicialmente, este mejor patrón de
marcha se observó en dos especímenes del subgrupo de células madre, uno del
subgrupo de matriz de fibrina y uno de autoinjerto con medios condicionados. Del
segundo grupo 3 individuos presentaron contacto de dedos en el apoyo inicial (sham y
autoinjerto + medios condicionados), 10 individuos presentaron contacto del antepie
durante la fase de despegue al finalizar el seguimiento, de éstos 2 eran de células madre,
2 de medios condicionados, 2 de autoinjerto y medios condicionados y los 2 de cirugía
falsa.
En el primer grupo, exceptuando los individuos con cirugía falsa, los especímenes que
tuvieron mejoría en las 2 fases alteradas de la marcha fueron 2 del grupo de autoinjerto, 1
de medios condicionales y 1 de autoinjerto y medios condicionados. En el segundo grupo
el único espécimen que tuvo mejoría en la 1 y 4 fase de la marcha fue uno perteneciente
al subgrupo de autoinjerto y medios condicionados.
Electromiografía y neuroconducciones
No fue posible realizar el procedimiento en los especímenes 11 y 22 por muerte durante el
periodo de observación.
En el grupo de Sham, no hubo signos de denervación y el examen electromiográfico fue
normal.
En el grupo de autoinjerto el 75 % de los casos tenían signos de denervación leve o
parcial con reinervación en un solo caso (reclutamiento del 100%); mientras que el 25 %
restante no mostró signos de denervación ni reinervación.
En el grupo de segunda intención se observó un examen normal en 50% y denervación y
reinervación parcial en el 50%
En el grupo de células madre el 25 % de los casos presentó denervación y reinervación
parciales, el 50% denervación grave sin signos de reinervación y el 25 % restante no
mostró signos de denervación ni reinervación.
En el grupo de medios condicionados el 25% presentó un examen normal, el 50%
denervación grave sin presencia de reinervación. El caso restante no fue valorable por
espécimen muerto.
~ ~
16En el grupo de matriz de fibrina todos los casos presentaron signos de denervación, el
75% parcial y el 25 % grave, sin reinervación en el 50% (incluyendo el caso de
denervación grave) y con reinervación parcial en el 50%.
En el grupo de autoinjerto con medios condicionados un caso no fue posible examinar por
muerte del espécimen, un caso presentó un examen normal y del 50 % restante hubo
denervación y reinervación parcial en un caso y denervación grave sin reinervación en un
caso.
Los grupos de medios condicionados mostraron un 25 % de especímenes con exámenes
normales al igual que en el grupo de segunda intención. El grupo de células madre
mostro los menores índices de reinervación observados; mientras que el grupo de matriz
de fibrina mostro los mayores índices de denervación. El único caso que mostró
reinervación con reclutamiento de 100% fue un espécimen del grupo de autoinjerto.
COMPLICACIONES
1. Adicionalmente al episodio de infección observado en el primer grupo, a los 4 días del
procedimiento, se identificó dehiscencia de la sutura en el grupo de segunda intención,
los individuos se llevaron a nuevo procedimiento quirúrgico en el que se realizó
desbridamiento de los bordes de la herida y lavado quirúrgico bajo anestesia, posterior
sutura de heridas.
2. Durante el seguimiento del patrón de marcha se identificó autofagia de los artejos en el
pie lesionado, de aparición aleatoria entre los individuos de los diferentes subgrupos a
excepción del grupo se cirugía falsa, se intentaron varios métodos para disminuir las
lesiones y se revisó este tipo de complicación en la literatura, encontrando que puede
ser secundario a parestesias por la lesión.
CONCLUSIONES
1. El patrón de marcha se vió alterado indistintamente en 6 de los 7 grupos; en el
único que no se vio diferencia fue en el grupo de cirugía falsa. El análisis de la
marcha evidenció imposibilidad para la movilidad principalmente del pie y los
dedos, afectando la 1 y 4 fases de la marcha
2. En la escala B.B.B, dado ausencia de plantiflexión por la lesión se asimilaría a una
clasificación 15/20 en 6 de los 7 los grupos, para el grupo 1 de cirugía falsa
continúa siendo 20/20, recordando que la escala inicialmente fue creada para
valorar trauma espinal. Durante el seguimiento la fase de despegue mejoró
discretamente pero nunca llegó a ser consistente como para modificar el puntaje
de la escala.
3. Los principales hallazgos de una patrón de marcha menos alterado se encontraron
en los grupos de autoinjerto, medios condicionados y autoinjerto + medios
condicionados.
4. Los cambios más importantes en el seguimiento electromiográfico fueron
observados predominantemente en los grupos de autoinjerto, medios
~ ~
17condicionados y autoinjerto + medios condicionados. Dado que durante la
regeneración nerviosa es posible pasar de un estado de denervación grave a uno
parcial o a signos ausentes de denervación, es necesario realizar otros estudios
para determinar la posibilidad de tomar estos datos como parte del proceso de
reinervación.
5. No se encontró una diferencia estadísticamente significativa en ninguno de los
grupos estudiados, al comparar los procedimiento con mejores patrones de
marcha o signos de reinervación en el estudio electromiográfico.
CONSIDERACIONES ÉTICAS
La manipulación de los animales se llevó a cabo siguiendo los lineamientos
internacionales [Instituto nacional de Salud de los Estados Unidos de América (National
Association for Biomedical Research, 2007), ARVO] y nacionales [Articulo 11 de la
resolución no008430 de 1993 del Ministerio de Salud y Ley 84 del 27 de diciembre de
1989] con el fin de minimizar el sufrimiento animal.
El estudio fue avalado por el Comité de ética de la Universidad Nacional de Colombia.
Razón por la que se emplean animales experimentales
- El grupo de investigación “Biología de Células Madre” ha estandarizado la
obtención de medios condicionados a partir de MSCs humanas.
- Los medios condicionados de MSCs han demostrado tener la misma capacidad
regenerativa e inmunomoduladora de las MSCs en varios tejidos, pero no existe
evidencia de su eficacia en modelos de lesión de nervio periférico.
- No existe un modelo in vitro de lesión de nervio periférico.
- Como parte de nuestro proceso investigativo se hace necesario evaluar ese
potencial neurogénico en un modelo in vivo para analizar la capacidad de los
medios condicionados en la regeneración nerviosa.
PROPIEDAD INTELECTUAL
La investigación y los aportes que esta pueda generar son avalados y de propiedad
intelectual del grupo de Investigación de la Unidad de Ortopedia y Traumatología de la
Universidad Nacional de Colombia y del grupo de investigación Biología de Células Madre
de la Universidad Nacional de Colombia.
~ ~
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Pinto P, Winter DA: Motion of the foot and ankle during the stance phase in
rats. Muscle & nerve 2002, 26(5):630-635.
~ ~
23ANEXOS
Tabla 1. Resultados electromiográficos
R a t a C ir u g ía D e n e r v a c ió n P o lifá s ic a s R e c lu t a m ie n t o O b s e r v a c io n e s
1 S . In t e n c ió n N o N o 1 0 0 % S in d e n e r v a c ió n , e x a m e n n o r m a l
2 A u t o in je r t o + / + + + + N o 2 5 % D e n e r v a c ió n p a r c ia l, s in e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
3 S . In t e n c ió n + + + / + + + + + / + + + + 2 5 % D e n e r v a c ió n p a r c ia l y r e in e r v a c ió n p a r c ia l
4 A u t o in je r t o + / + + + + + / + + + + 1 0 0 % D e n e r v a c ió n le v e , a d e c u a d a r e in e r v a c ió n
5 M S C + / + + + + + + / + + + + 5 0 % D e n e r v a c ió n p a r c ia l y r e in e r v a c ió n p a r c ia l
6 M S C + + + / + + + + N o 0 % D e n e r v a c ió n g r a v e , s in e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
7 M S C N o N o 7 5 % S in d e n e r v a c ió n n i e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
8 M S C + + + / + + + + N o 0 % D e n e r v a c ió n g r a v e , s in e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
9 M e d io s + + + / + + + + N o 0 % D e n e r v a c ió n g r a v e , s in e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
1 0 M e d io s + + + + / + + + + N o 0 % D e n e r v a c ió n g r a v e , s in e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
1 1 M e d io s n d n d n d N o s e e x a m in ó
1 2 M e d io s N o N o 1 0 0 % S in d e n e r v a c ió n , e x a m e n n o r m a l
1 3 M a t riz s o la + + / + + + + + + / + + + + 7 5 % D e n e r v a c ió n p a r c ia l y r e in e r v a c ió n p a r c ia l
1 4 M a t riz s o la + + + + / + + + + N o 0 % D e n e r v a c ió n g r a v e , s in e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
1 5 M a t riz s o la + / + + + + + / + + + + 2 5 % D e n e r v a c ió n p a r c ia l y r e in e r v a c ió n p a r c ia l
1 6 M a t riz s o la + + + / + + + + N o 2 5 % D e n e r v a c ió n p a r c ia l, s in e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
1 7 A u t o + M C N o + + + / + + + + 7 5 % S in d e n e r v a c ió n , r e in e r v a c ió n p a r c ia l
1 8 A u t o + M C + + + + / + + + + N o 0 % D e n e r v a c ió n g r a v e , s in e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
1 9 A u t o in je r t o N o N o 5 0 % S in d e n e r v a c ió n n i e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
2 0 A u t o in je r t o + + / + + + + N o 5 0 % D e n e r v a c ió n p a r c ia l, s in e v id e n c ia d e r e in e r v a c ió n
2 1 A u t o + M C N o N o 1 0 0 % S in d e n e r v a c ió n , e x a m e n n o r m a l
2 2 A u t o + M C n d n d n d N o s e e x a m in ó
2 3 S h a m N o N o 1 0 0 % S in d e n e r v a c ió n , e x a m e n n o r m a l
2 4 S h a m N o N o 1 0 0 % S in d e n e r v a c ió n , e x a m e n n o r m a l
~ ~
24Tabla 2. Seguimiento de la marcha primer grupo. 09/05/2014
MARCHA RATAS VIDEO 9/5/2014
FASE 1 FASE 2 FASE 3 FASE 4
1 Sham x X X X
2 Sham x x x x
3 MSC x x x
4 MSC x x
5 . . . .
6 MSC x x
7 MF x x
8 MF x x
9 . . . .
10 MF x x *
11 AI * x x *
12 AI x x x
13 AI x x x
14 AI x x
15 MF x x *
16 MC x x x
17 MC x x
18 MC x x *
19 MC x x
20 MSC x x
21 2ª Inten. x x x
22 2ª Inten. x x
23 . . . .
24 AI + MC x x x
25 AI + MC x x
26 AI + MC x x
. Muerte del espécimen.
~ ~
25Tabla 3. Seguimiento de la marcha primer grupo. 23/05/2014
M A R C H A R A T A S V ID E O 2 3 / 5 / 2 0 1 4
F A S E 1 F A S E 2 F A S E 3 F A S E 4
1 S h a m x x x x
2 S h a m x x x x
3 M S C x x x
4 M S C x x
5 . . . .
6 M S C x x *
7 M F . . . .
8 M F x x *
9 . . . .
1 0 M F x x *
1 1 A I x x x
1 2 A I * x x x
1 3 A I x x
1 4 A I x x
1 5 M F x x
1 6 M C x x
1 7 M C x x
1 8 M C * x x x
1 9 M C x x
2 0 M S C x x *
2 1 2 ª I n t e n . . . . .
2 2 2 ª I n t e n . . . . .
2 3 . . . .
2 4 A I + M C . . . .
2 5 A I + M C x x
2 6 A I + M C * x x *
~ ~
26Tabla 4. Seguimiento de la marcha. Segundo grupo. 27/02/2016.
M A R C H A R A T A S V ID E O 2 7 / 0 2 / 2 0 1 6
F A S E 1 F A S E 1 F A S E 2 F A S E 3 F A S E 4
1 S E G U N D A IN T E N C IÓ N x x
2 A U T O IN J E R T O x x
3 S E G U N D A IN T E N C IÓ N x x *
4 A U T O IN J E R T O x x
5 C É L U L A S M A D R E x x x
6 C É L U L A S M A D R E x x
7 C É L U L A S M A D R E C O N M E D IO S x x *
8 C É L U L A S M A D R E C O N M E D IO S x x
9 T U B O + M E D IO S C O N D IC IO N A D O S x x
1 0 T U B O + M E D IO S C O N D IC IO N A D O S x x *
1 1 T U B O + M E D IO S C O N D IC IO N A D O S . . . .
1 2 T U B O + M E D IO S C O N D IC IO N A D O S x x
1 3 T U B O C O N M A T R IZ x x
1 4 T U B O C O N M A T R IZ x x
1 5 T U B O C O N M A T R IZ x
1 6 T U B O C O N M A T R IZ x x
1 7 A U T O IN J E R T O + M E D IO S C O N D IC IO N A D O S * x x x
1 8 A U T O IN J E R T O + M E D IO S C O N D IC IO N A D O S x x x
1 9 A U T O IN J E R T O x x
2 0 A U T O IN J E R T O x x x
2 1 A U T O IN J E R T O x x *
2 2 A U T O IN J E R T O . . . .
2 3 S H A M x x x x
2 4 S H A M x x x x
* NO REALIZA LA FASE COMPLETA
~ ~
27Tabla 5. Análisis estadístico. Reinervación. Segundo grupo.
Odds ratio Intervalo de confianza
MC/MSC 1.33 0.129 - 13.74
AI/MC 0.75 0.073 - 7.73
AI+MC/MC 2 0.334 - 11.96
MF/MC 1.5 0.23 - 9.79
MC/ Segunda intención 0.33 0.67 - 1.65
Tabla 6. Análisis estadístico. Realización Fase 1 de la marcha, Primer grupo.
0 9 / 0 5 / 2 0 1 4 O d d s r a t io In t e r v a lo d e c o n f ia n z a
M C / M S C N S N S
A I/ M C 1 .2 5 0 .4 - 1 .8
A I+ M C / M C N S N S
M C / M F N S N S
S e g u n d a in t e n c ió n / M C N S N S
2 3 / 0 5 / 2 0 1 4 O d d s r a t io In t e r v a lo d e c o n f ia n z a
M C / M S C 1 .2 0 .4 - 1 7
A I/ M C 1 0 .0 9 - 1 1
A I+ M C / M C 4 0 .7 - 2 1
M C / M F N S N S
S e g u n d a in t e n c ió n / M C N S N S
Tabla 7. Análisis estadístico. Realización Fase 4 de la marcha. Primer grupo.
0 9 / 0 5 / 2 0 1 4 O d d s r a t io In t e r v a lo d e c o n f ia n z a
M C / M S C 2 0 .2 - 1 4
A I/ M C 1 .5 0 .4 - 4 .6
A I+ M C / M C 0 .6 0 .1 - 4 .3
M C / M F 1 .5 2 .3 - 9 .7
S e g u n d a in t e n c ió n / M C 1 0 .1 - 5 .4
2 3 / 0 5 / 2 0 1 4 O d d s r a t io In t e r v a lo d e c o n f ia n z a
M C / M S C 0 .3 0 .0 5 - 1 .9
A I/ M C 2 0 .2 - 1 4
A I+ M C / M C 4 0 .7 - 2 1
M C / M F 0 .3 0 .0 5 - 2 .4
M C / S e g u n d a in t e n c ió n N S N S
~ ~
28Tabla 8. Análisis estadístico. Realización Fase 1 de la marcha, Segundo grupo.
O d d s r a t io In t e r v a lo d e c o n f ia n z a
M C / M S C N S N S
A I/ M C N S N S
A I+ M C / M C N S N S
M F / M C N S N S
M C / S e g u n d a in t e n c ió n N S N S
Tabla 9. Análisis estadístico. Realización Fase 4 de la marcha. Segundo grupo.
O d d s r a t io In t e r v a lo d e c o n f ia n z a
M C / M S C 0 .5 0 .0 7 - 3 .5
A I/ M C 1 0 .9 - 1 1
A I+ M C / M C 3 0 .5 - 1 7
M C / M F 1 .3 0 .7 - 2 .3
M C / S e g u n d a in t e n c ió n 0 .5 0 .0 5 - 4 .4
~ ~
29