Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica
Autor: Arenas Mantilla, Mario Andrés
Asesor: Gómez Zuleta, Martín Alonso (Thesis advisor)
Fecha: 2014
Programa: Bogotá - Medicina - Especialidad en Anestesiología y Reanimación
Facultad: Facultad de Medicina

Resumen: Objetivo: Describir las características demográfica y clínicas los pacientes con anemia  aplásica estudiados para HPN y las características de los clones HPN en estos  pacientes.  Metodología: Estudio descriptivo, retrospectivo. Se seleccionaron de la base de datos del  laboratorio DECF pacientes remitidos para estudio de HPN por anemia aplásica. Se  revisaron las historias clínicas para confirmar el diagnóstico de anemia aplásica,  clasificar la severidad y registrar los tratamientos. Se revisaron los reportes de citometría  de flujo para HPN y se relacionaron los resultados con los datos clínicos.  Resultados: Se incluyeron 38 pacientes con anemia aplásica (20 no severa, 10 severa, 8  muy severa), Se encontraron clones HPN en 60,5% (50% de no severa, 70% de severa,  75% de muy severa). En los HPN positivos, 73,9% presentaban HPN subclínica y 26,1%  HPN asociada a anemia aplásica. La mediana del tamaño de los clones HPN fue de 0%  (0–19,1%) en eritrocitos, 4,1% (0,1–98,3%) en monocitos y 3,9% (0,1–99%) en  granulocitos. El tamaño del clon de granulocitos HPN fue similar entre pacientes con  anemia aplásica no severa y severa/muy severa (4,1% (0,6–99%) vs 3,9% (0,1– 81,8%)).  Pacientes con HPN asociada a anemia aplásica presentaron clones HPN mayores que  en HPN subclínica (51,5% (4,2–99%) vs 2,5% (0,1–42,5%)). La respuesta a la  inmunosupresión fue mayor en HPN negativos que en HPN positivos (100% vs 70,6%).  Conclusiones: Los clones HPN son frecuentes en pacientes con anemia aplásica y su  frecuencia aumenta con la severidad de la aplasia. El tamaño de los clones HPN se  relaciona con las manifestaciones clínicas de la HPN, pero no con la severidad de la  aplasia. La relación entre clones HPN y respuesta a inmunosupresión continúa  mostrando resultados conflictivos.

Caracterización de los clones HPN
en pacientes con anemia aplásica
Mario Andrés Arenas Mantilla
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Medicina Interna
Bogotá, Colombia
2014Caracterización de los clones HPN
en pacientes con anemia aplásica
Mario Andrés Arenas Mantilla
Código 05599495
Trabajo de investigación presentado como requisito parcial para optar al título de:
Especialista en Hematología
Director:
Doctor Marco Antonio Grajales Buitrago
Universidad Nacional de Colombia
Facultad de Medicina, Departamento de Medicina Interna
Bogotá, Colombia
2014Resumen y Abstract V
Resumen
Objetivo: Describir las características demográfica y clínicas los pacientes con anemia
aplásica estudiados para HPN y las características de los clones HPN en estos
pacientes.
Metodología: Estudio descriptivo, retrospectivo. Se seleccionaron de la base de datos del
laboratorio DECF pacientes remitidos para estudio de HPN por anemia aplásica. Se
revisaron las historias clínicas para confirmar el diagnóstico de anemia aplásica,
clasificar la severidad y registrar los tratamientos. Se revisaron los reportes de citometría
de flujo para HPN y se relacionaron los resultados con los datos clínicos.
Resultados: Se incluyeron 38 pacientes con anemia aplásica (20 no severa, 10 severa, 8
muy severa), Se encontraron clones HPN en 60,5% (50% de no severa, 70% de severa,
75% de muy severa). En los HPN positivos, 73,9% presentaban HPN subclínica y 26,1%
HPN asociada a anemia aplásica. La mediana del tamaño de los clones HPN fue de 0%
(0–19,1%) en eritrocitos, 4,1% (0,1–98,3%) en monocitos y 3,9% (0,1–99%) en
granulocitos. El tamaño del clon de granulocitos HPN fue similar entre pacientes con
anemia aplásica no severa y severa/muy severa (4,1% (0,6–99%) vs 3,9% (0,1– 81,8%)).
Pacientes con HPN asociada a anemia aplásica presentaron clones HPN mayores que
en HPN subclínica (51,5% (4,2–99%) vs 2,5% (0,1–42,5%)). La respuesta a la
inmunosupresión fue mayor en HPN negativos que en HPN positivos (100% vs 70,6%).
Conclusiones: Los clones HPN son frecuentes en pacientes con anemia aplásica y su
frecuencia aumenta con la severidad de la aplasia. El tamaño de los clones HPN se
relaciona con las manifestaciones clínicas de la HPN, pero no con la severidad de la
aplasia. La relación entre clones HPN y respuesta a inmunosupresión continúa
mostrando resultados conflictivos.
Palabras clave: Anemia aplásica, síndrome de falla medular, hemoglobinuria paroxística
nocturna, citometría de flujo, terapia inmunosupresora.VI Título de la tesis o trabajo de investigación
Abstract
Objective: To describe the demographic and clinical characteristics of patients with
aplastic anemia who had PNH study and the characteristics of PNH clones in these
patients.
Methods: Descriptive, retrospective study. Patients with aplastic anemia and a PNH study
request were selected from the DECF laboratory database. Clinical records were
reviewed to confirm the aplastic anemia diagnosis and to determine the severity and the
treatment of the disease. Results of flow cytometry studies were reviewed and the
association with clinical data was assessed.
Results: Thirty-eight patients with aplastic anemia were included (20 non-severe, 10
severe, 8 very severe). PNH clones were found in 60,5% (50% of non-severe, 70% of
severe, 75% of very sever). Of PNH-positive patients, 73,9% had subclinical PNH and
26,1% had PNH in the setting of aplastic anemia. Median clone size was 0% (0-19,1%) in
erythrocytes, 4,1% (0,1-98,3%) in monocytes and 3,9% (0,1-99%) granulocytes. PNH-
granulocytes clone size was similar among patients with non-severe and sever/vey
severe aplastic anemia (4,1% (0,6–99%) vs 3,9% (0,1– 81,8%)). Patients with PNH in the
setting of aplastic anemia had larger PNH clones than those with subclinical PNH (51,5%
(4,2–99%) vs 2,5% (0,1–42,5%)). Response to immunosuppressive therapy was better in
PNH-negative patients than in PNH-positive (100% vs 70,6%).
Conclusions: PNH clones are often found among patients with aplastic anemia and their
frequency increases with the severity of the aplasia. The size of PNH clones is associated
with the clinical signs of PNH, but no with the severity of the aplasia. The association
between PNH clone and response to immunosuppresive therapy still shows discordant
results.
Keywords: Aplastic anemia, bone marrow failure, paroxysmal nocturnal hemoglobinuria,
flow cytometry, immunosuppressive therapy.Contenido VII
Contenido
Pág.
Resumen ……………………………………………………………………………………… V
Lista de figuras …………………………………………………………………………....... IX
Lista de tablas ………………………………………………………………………………. X
Lista de abreviaturas ……………................................................................................ XI
Introducción …………………………………………………………………………………. 1
1. Objetivos ………………………………………………………………………………… 3
1.1 Objetivo general ………………………………………………………………….. 3
1.2 Objetivos específicos ……………………………………………………………. 3
2. Marco teórico …………………………………………………………………………… 5
2.1 Anemia aplásica ………………………………………………………………….. 5
2.2 Hemoglobinuria paroxística nocturna ………………………………………….. 7
2.3 Asociación entre hemoglobinuria paroxística nocturna y
anemia aplásica …………………………………………………………………... 9
3. Metodología …………………………………………………………………………….. 11
3.1 Diseño del estudio ………………………………………………………………... 11
3.2 Definición de sujetos de estudio ………………………………………………… 11
3.2.1 Criterios de inclusión ………………………………………………………. 11
3.2.2 Criterios de exclusión ……………………………………………………… 12
3.2 Descripción de las intervenciones ………………………………………………. 12
3.4 Procedimientos ……………………………………………………………………. 12
3.5 Definición de variables …………………………………………………………… 13
3.6 Análisis estadístico ……………………………………………………………….. 15
4. Consideraciones éticas ……………………………………………………………….. 17
5. Presupuesto …………………………………………………………………………….. 19
5.1 Presupuesto global de la propuesta por fuentes de financiación …………… 19
5.2 Descripción de inversión en talento humano …………………………………. 19
5.3 Descripción de inversión en equipos y software ……………………………… 19
5.4 Descripción de inversión en impresos y publicaciones ……………………… 20
6. Resultados ……………………………………………………………………………… 21
6.1 Selección de pacientes ………………………………………………………….. 21
6.2 Características demográficas …………………………………………………… 22
6.3 Frecuencia de HPN en pacientes con anemia aplásica ……………………… 22
6.4 Clasificación clínica de la HPN ………………………………………………….. 23VIII Título de la tesis o trabajo de investigación
Pág.
6.5 Tamaño de los clones HPN ……………………………………………………... 24
6.6 Respuesta al tratamiento inmunosupresor ……………………………………. 25
7. Discusión ……………………………………………………………………………….. 27
8. Conclusiones …………………………………………………………………………… 31
A. Anexo: Formato de recolección de datos de historia clínica …………………. 33
B. Anexo: Formato de recolección de datos de citometría de flujo …………….. 35
Bibliografia …………………………………………………………………………………… 37Contenido IX
Lista de figuras
Pág.
Figura 6-1: Proceso de selección de pacientes ………………………………………… 21
Figura 6-2: Granulocitos HPN según la severidad de la anemia aplásica
y la categoría HPN …………………………………………………………… 25
Figura 6-3: Revisión de tratamientos inmunosupresores ……………………………… 25Contenido X
Lista de tablas
Pág.
Tabla 2-1: Clasificación de la anemia aplásica de acuerdo con
su severidad [2,9] …………………………………………………………… 5
Tabla 2-2: Estrategias de identificación y antígenos utilizados [23] ……………….. 8
Tabla 3-1: Criterios de respuesta a terapia inmunosupresora en
anemia aplásica severa / muy severa [35] ……………………………….. 12
Tabla 3-2: Criterios de respuesta a terapia inmunosupresora en
anemia aplásica no severa [35] ……………………………………………. 13
Tabla 6-1: Características demográficas y severidad de la anemia
aplásica ……………………………………………………………………….. 22
Tabla 6-2: Detección de clones HPN según la severidad de la
anemia aplásica ……………………………………………………………… 23
Tabla 6-3: Clasicación de la HPN según la presentación clínica …………………… 23
Tabla 6-4: Relación entre severidad de la anemia aplásica y la
categoría de HPN ……………………………………………………………. 23
Tabla 6-5: Tamaño de los clones HPN según el linaje ……………………………….. 24
Tabla 6-6: Tamaño de los clones de granulocitos HPN según la
severidad de la anemia aplásica y la categoría HPN ……………………. 24
Tabla 6-7: Respuesta a tratamiento inmunosupresor ………………………………… 26Contenido XI
Lista de abreviaturas
Abreviatura Término
ATG Inmunoglobulina antitimocítica (del inglés antithymocyte globulin)
DAF Factor acelerador de decadencia (del inglés decay accelerating factor)
DECF Diagnóstico Especializado por Citometría de Flujo
GPI Glicosil-fosfatidil-inositol (del inglés glycosyl-phosphatidyl-inositol)
HPN Hemoglobinuria paroxística nocturna
ICCS International Clinical Cytometry Society
MIRL Inhibidor de membrana de la lisis reactiva (del inglés membrane inhibitor of
reactive lysis)
UN Universidad Nacional de ColombiaIntroducción
La anemia aplásica es una patología que se caracteriza por la reducción de las células
progenitoras hematopoyéticas y se manifiesta con la disminución de los recuentos de
células hemáticas en sangre periférica y las complicaciones derivadas de estas
citopenias [1]. De los múltiples mecanismos patogénicos propuestos, la etiología inmune
es la que tiene el mayor sustento clínico y experimental. Esto permitió el surgimiento de
la globulina antitimocítica como tratamiento estándar, aunque el trasplante alogénico de
médula ósea sigue siendo el manejo con mayor tasa de curación [2]. Las alteraciones en
la médula ósea de los pacientes con anemia aplásica favorecen el desarrollo de
trastornos clonales, especialmente en quienes ha sido tratados con inmunosupresión [3].
La hemoglobinuria paroxística nocturna (HPN) es una condición que surge a partir de la
mutación somática adquirida en el gen PIGA en células madre hematopoyéticas, que se
manifiesta con la deficiencia de proteínas ancladas a glicosil-fosfatidil-inositol (GPI) en las
membranas de las células hemáticas [4]. Estás células (también denominadas clones
HPN) presentan una expansión clonal, que no está claramente explicada por el defecto
genético que albergan [5]. La principal repercusión clínica de la hemoglobinuria
paroxística nocturna es la hemólisis mediada por la activación del complemento sobre la
superficie de los glóbulos rojos, secundaria a la ausencia de las proteínas reguladoras
CD55 y CD59. La hemólisis se puede asociar a complicaciones trombóticas, que
representan la mayor morbi-mortalidad en estos pacientes [5,6]. El tratamiento actual de
la patología se basa en anticuerpos monoclonales que bloquean la cascada del
complemento [7].
Los clones HPN con frecuencia surgen en pacientes con síndromes de falla medular,
como la anemia aplásica. No obstante, la relación causal entre estas dos entidades aún
es motivo de controversia [6]. Así mismo, la repercusión de los clones HPN sobre el
curso clínico de la anemia aplásica y sobre la respuesta al tratamiento no ha sido
completamente esclarecida [2]. En Colombia no se tienen registros completos de la
incidencia de anemia aplásica ni de las características de los pacientes que la padecen.
Tampoco existe en el país información sobre la frecuencia y las características de los
clones HPN en estos pacientes ni respecto a la influencia de estos clones sobre las
manifestaciones clínicas y la respuesta a los esquemas inmunosupresores. Por estas2 Introducción
razones se justifica la realización de un estudio descriptivo retrospectivo que permita
documentar en nuestro medio las características de los pacientes con anemia aplásica y
el comportamiento de los clones HPN en estos pacientes. Los datos que obtengan de
este estudio facilitaran la planeación y el diseño de estudios prospectivos enfocados en
estas patologías.1. Objetivos
1.1 Objetivo general
Describir las características demográfica y clínicas los pacientes con anemia aplásica
estudiados para HPN y las caracterísitcas de los clones HPN en estos pacientes.
1.2 Objetivos específicos
§ Describir las características demográficas de los pacientes con anemia aplásica
incluidos en el estudio.
§ Determinar la frecuencia de clones HPN en el total de pacientes con anemia aplásica
y acuerdo a la severidad de la anemia aplásica.
§ Clasificar los pacientes con anemia aplásica de acuerdo a la presentación clínica de
la HPN (asociada a anemia aplásica o subclínica).
§ Describir la distribución de los pacientes de acuerdo a la serveridad de la anemia
aplásica y a la categoría de la HPN.
§ Describir el tamaño de los clones HPN en eritrocitos, granulocitos y monocitos.
§ Determinar el tamaño del clon de granulocitos HPN de acuerdo a la severidad de la
anemia aplásica.
§ Determinar el tamaño del clon de granulocitos HPN de acuerdo a la clasificación de
la HPN.
§ Describir la respuesta a los tratamientos para la anemia aplásica severa con
esquemas inmunosupresores (globulina antitimocítica, ciclosporina) y su relación con
la presencia y el tamaño de los clones HPN.2. Marco teórico
2.1 Anemia aplásica
La anemia aplásica es un síndrome clínico que se genera por la reducción en la
hematopoyesis en la médula ósea y se caracteriza por disminución en los recuentos
celulares de los tres linajes. Esta entidad fue descrita por primera vez por el Dr. Paul
Elrlich en 1888 [1]. Su incidencia es de aproximadamente dos casos por cada millón de
personas/año, la mayoría de los cuales se diagnostican entre los 15 y los 25 años, con
un segundo pico de frecuencia entre los 65 y los 69 años. No hay diferencias
significativas en la frecuencia de presentación entre mujeres y hombres [8]. El
diagnóstico requiere la disminución de al menos dos de las tres líneas celulares, sin
presencia de células anormales o malignas y sin fibrosis. La severidad de la enfermedad
se establece en base a los recuentos celulares en sangre periférica y la celularidad de la
médula ósea en la biopsia [2]. En 1975, Camitta y colaboradores establecieron los
criterios anemia aplásica severa [9]. Posteriormente, Bacigalupo y colaboradores
introdujeron la categoría de anemia aplásica muy severa, que discrimina dentro del grupo
de anemia aplásica severa, aquellos con neutropenia más profunda [2]. Los criterios de
severidad de la anemia aplásica se presentan en la tabla 2-1.
Tabla 2-1: Clasificación de la anemia aplásica de acuerdo con su severidad [2,9]
Celularidad en Recuentos en sangre periférica1
Categoría
biopsia Neutrófilos Plaquetas Reticulocitos
No severa Hipocelular <1.500/µl <50.000/µl <40.000/µl
Severa <25% <500/µl <20.000/µl <20.000/µl
Muy severa <25% <200/µl <20.000/µl <20.000/µl
1 Disminución en al menos dos de las tres líneas
La causa de la reducción de los progenitores hematopoyéticos multipotenciales ha sido
motivo de controversia por años. Varios potenciales mecanismos han sido propuestos:
toxicidad directa sobre las células madre hematopoyéticas, defectos en el microambiente
estromal, alteraciones en la producción de factores de crecimiento multilinaje, supresión6 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica
inmune (celular o humoral) de las células hematopoyéticas multipotenciales,
acortamiento progresivo de los telómeros [1]. Los granulocitos y las células
mononucleares de los pacientes con anemia aplásica presentan telómeros más cortos
que las respectivas poblaciones celulares en controles normales [10]. Sin embargo, el
papel de las mutaciones de la telomerasa, presentes hasta en un 40% de los pacientes,
aún no es claro [11].
La evidencia experimental no ha logrado demostrar una asociación clara con defectos
funcionales de las células estromales ni con deficiencias de factores en factores de
crecimiento (los cuales, por el contrario, suelen estar aumentados en el suero de los
pacientes con anemia aplásica). Adicionalmente, la falta de respuesta al tratamiento con
factores de crecimiento administrados exógenamente, sugiere que la generación
insuficiente de citoquinas no hace parte de la etiología de esta patología [1,12].
La instauración del trasplante alogénico de células madre hematopoyéticas como
tratamiento curativo en 1972 [1] ofreció mayor evidencia en contra rol patogénico de las
alteraciones del estroma, puesto que las células estromales en estos pacientes son de
origen autólogo [13]. La sospecha del origen autoinmune de la anemia aplásica también
surgió a partir de la implementación de este tratamiento, al observar que algunos
pacientes se recuperaban después del acondicionamiento, así no fuera trasplantados
[14]. Posteriormente, la asociación con autoinmunidad fue confirmada en un ensayo
clínico, en el cual la mayoría de los pacientes lograron mejoría de la enfermedad con el
tratamiento con globulina antitimocítica (ATG) [15].
Observaciones clínicas y experimentos in vitro demostraron que el ataque a las células
hematopoyéticas multipotenciales está mediado por células T citotóxicas [16].
Ocasionalmente, existe el antecedente de exposición a medicamentos, virus o toxinas,
que afectan directamente a las células madre hematopoyéticas. Se ha propuesto que
estos agentes inducen la expresión de neoantígenos en los progenitores
hematopoyéticos, provocando el ataque secundario mediado por células T citotóxicas [1].
La apoptosis de las células progenitoras mononucleares CD34+ es mediada, al menos
parcialmente, por la vía dependiente de FAS/FASL [17]. Además, la disminución de las
células T reguladoras contribuye a la expansión de la población T CD8+CD28-
autorreactivas, que promueven la apoptosis de las células madre hematopoyéticas [18].
El ambiente de la médula ósea aplásica puede favorecer la evolución de clonas
mutantes. Con el aumento de la supervivencia de los pacientes con anemia aplásica, se
ha observado también una tendencia al desarrollo de trastornos clonales, especialmente
en aquellos tratados con inmunosupresión [3]. Dentro de estos desórdenes clonales seMarco teórico 7
incluyen los síndromes mielodisplásicos, la hemoglobinuria paroxísticas nocturna y las
leucemias agudas.
2.2 Hemoglobinuria paroxística nocturna
La HPN es un trastorno hematológico caracterizado por la expansión clonal, no-maligna,
de células madre hematopoyéticas con una mutación somática adquirida en el gen PIGA
(localizado en el cromosoma X) requerido para la síntesis de la región de anclaje del GPI,
lo cual conlleva a la proliferación de células hemáticas con deficiencia parcial o total de
proteínas ancladas a GPI [4]. La mutación en el gen PIGA no confiere una ventaja
proliferativa y por tanto, no explica la selección ni la expansión clonal [5].
En humanos se han descrito aproximadamente 30 proteínas ancladas a GPI, 23 de ellas
presentes en células hematopoyéticas [5]. Dentro de este grupo de proteínas se
encuentran CD55 (factor acelerador de decadencia, DAF) y CD59 (inhibidor de
membrana de la lisis reactiva, MIRL). El CD55 se encarga de inhibir la formación y
estabilización de las convertasas del C3 y del C5 del complemento, mediante la
interrupción de la interacción entre el factor B activado y el C3 activado (C3b). El CD59
bloquea el ensamblaje del complejo de ataque de membrana (compuesto por C5
activado (C5b), C6, C7, C8 y múltiples moléculas de C9) al impedir la unión de C9 al
complejo. Como consecuencia de lo anterior, los eritrocitos deficientes en proteínas
ancladas a GPI (eritrocitos HPN) son susceptibles a la activación del sistema del
complemento sobre sus membranas, lo cual conlleva a la hemólisis intravascular [5,6].
En su forma clásica, la HPN se caracteriza por hemólisis intravascular y hemoglobinuria
(predominantemente nocturna), que es evidenciada en la primera orina de la mañana.
Sin embargo, esta presentación clínica solo se ve en aproximadamente 25% de los casos
[5]. Aunque infrecuente como manifestación inicial, el tromboembolismo venoso es la
principal causa de morbimortalidad en los pacientes con HPN, afectando típicamente
sitios inusuales, como las venas suprahepáticas, portales, dérmicas y cerebrales [6]. Por
esta razón, están recomendados los estudios para el diagnóstico de HPN en pacientes
con estas manifestaciones [19].
La prueba de hemólisis en suero acidificado (test de Ham), descrita por Ham y Dingle en
1937, y posteriormente la prueba de lisis en sucrosa, descrita por Hartmann y Jenkins en
1966, fueron las técnicas diagnóstica estándar por varias décadas. Sin embargo, éstas
presentaban múltiples limitaciones técnicas que las hacían poco reproducibles [20]. A
finales de los años 80 se introdujo la citometría de flujo como método diagnóstico para la8 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica
HPN, desplazando los test de Ham y de sucrosa [5]. Actualmente, la citometría de flujo
es el método de referencia para el diagnóstico y seguimiento de la HPN [21]. Es un
método rápido, sensible y reproducible; que permite identificar, cuantificar y subtipificar
las poblaciones con deficiencias de antígenos dependientes de GPI. El análisis se puede
realizar estudiando la expresión de antígenos dependientes de GPI en eritrocitos,
granulocitos y monocitos, mediante el uso de anticuerpos monoclonales específicos
contra estos antígenos, o estudiando directamente la presencia del GPI [22]. La selección
de anticuerpos, el procesamiento de la muestra, las estrategias de análisis y la completa
interpretación de los resultados son consideraciones básicas para el análisis de la
expresión de los antígenos dependientes de GPI en las diferentes poblaciones celulares
[23].
En la tabla 2-2 se presentan algunos de los anticuerpos monoclonales y de las
estrategias de identificación recomendados en las guías para el estudio de HPN de la
International Clinical Cytometry Society (ICCS) [23]. Como criterio diagnóstico es
necesario demostrar el defecto en la expresión del GPI (o de proteínas ancladas a GPI)
en al menos dos poblaciones diferentes. La determinación de la deficiencia solo en
glóbulos rojos subestima el tamaño de la clona, más se debe realizar para establecer los
fenotipos presentes y correlacionar con la severidad de las manifestaciones clínicas. La
sensibilidad de los citómetros para identificar clones HPN depende de la cantidad de
eventos de una población celular específica que pueden recolectar. Los equipos
empleados para el análisis de rutina recolectan al menos 5.000 eventos y pueden
identificar clones HPN del ≥1%, mientras que aquellos utilizados en análisis de alta
sensibilidad recolectan al menos 250.000 y pueden detectar clones HPN ≥0.01% [23].
Tabla 2-2. Estrategias de identificación y antígenos utilizados [23]
Estrategias de identificación/
Población Celular Antígenos GPI dependientes
Antígenos de línea
FSC/SSC
Granulocitos CD 16, CD 24
CD 45, CD 15
FSC/SSC
Monocitos CD 14
CD 45, CD 64
Log FSC/SSC
Glóbulos Rojos CD 59
CD 235A
Actualmente, el tratamiento de la HPN depende de las manifestaciones clínicas. En
pacientes con hemólisis severa y alto riesgo de trombosis, el tratamiento de elección es
el eculizumab, un anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra el C5 del
complemento, impidiendo su activación y por ende, la conformación del complejo deMarco teórico 9
ataque de membrana. Este medicamento reduce la anemia y la necesidad transfusional,
mejorando la calidad de vida de los pacientes [7]. Algunos estudios sugieren que también
disminuye la incidencia de eventos tromboembólicos [24]. Otras componentes del manejo
incluyen el soporte transfusional según la severidad de la anemia y la anticoagulación
profiláctica en pacientes con clonas de HPN mayores al 50%. Tratamiento empleados
anteriormente, como corticoides y andrógenos, son motivo de controversia y sus
mecanismos de acción no han sido esclarecidos. La esplenectomía cuenta solo con
reportes anecdóticos y no se recomienda por aumento del riesgo de trombosis [5].
2.3 Asociación entre hemoglobinuria paroxística
nocturna y anemia aplásica
Los clones HPN surgen con frecuencia en asociación a síndromes de falla medular.
Aproximadamente 18% a 20% de los pacientes con síndrome mielodisplásico tipo
anemia refractaria presentan clonas de células deficientes en proteínas ancladas a GPI
[25,26]. En el caso de la anemia aplásica, un 22% a 60% de los pacientes presenta
clones de HPN [27,28]. La gran variabilidad se explica en parte por la sensibilidad de los
citómetros y los puntos de corte empleados. Aunque, como se mencionó anteriormente,
la mutación del gen PIGA no confiere por si misma una ventaja proliferativa, en el
contexto de la anemia aplásica podría favorecer la supervivencia si las proteínas
ancladas a GPI representan epítopes reconocidos por los linfocitos T citotóxicos [29]. El
comportamiento de estos clones es variable. En la mayoría de los casos permanecen
estable en el tiempo, aunque en algunos pacientes pueden aumentar progresivamente de
tamaño, mientras que en otros pueden desaparecer espontáneamente [30]. En 80% de
éstos la población de células tipo HPN es menor al 1%. Más aún, solo 10 a 15% de los
que reciben tratamiento con inmunosupresores desarrolla HPN clínicamente significativa.
La HPN se clasifica de acuerdo a las manifestaciones clínicas de la misma y la presencia
de alteraciones en la médula ósea [19]. Se demonina HPN clásica a la presencia de
clones HPN asociada a hemólisis intravascular, sin evidencia de anormalidades en la
médula ósea. En los pacientes con trastornos específicos de la médula ósea y clones
HPN, la clasificación depende de la presencia o ausencia de hemólisis. En los pacientes
con evidencia clínica y paraclínica de hemólisis, se denomina HPN asociada a trastorno
de la médula ósea. Por el contrario, en pacientes que no presentan hemólisis, la HPN se
clasifica como subclínica. En el caso de los pacientes con anemia aplásica no aplica la
categoría de HPN clásica. Si además de la aplasia existe evidencia de hemólisis, se
denomina HPN asociada a anemia aplásica, de lo contrario se cataloga como HPN
subclínica [19].10 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica
Algunos estudios sugieren que, en los pacientes con anemia aplásica, un aumento en la
proporción de clones HPN se correlaciona con una adecuada respuesta al tratamiento
con ATG y ciclosporina [31,32], mientras que otros no ha logrado demostrar esta
asociación [27,30,33]. En nuestro medio, no existen estudios que describan el
comportamiento de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica.3. Metodología
3.1 Diseño del estudio
Estudio descriptivo, retrospectivo.
3.2 Definición de sujetos de estudio
Pacientes con diagnóstico confirmado de anemia aplásica, quienes fueron atendidos en
Bogotá y les solicitaron citometría de flujo para HPN en el laboratorio Diagnóstico
Especializado por Citometría de Flujo (DECF; centro de referencia certificado), entre el
primero de enero de 2010 y el 31 de marzo de 2013.
3.2.1 Criterios de inclusión
§ Firma de consentimiento informado autorizando el uso de los resultados de
citometría de flujo para fines académicos.
§ Solicitud realizada en Bogotá para diagnóstico de HPN por citometria de flujo.
§ Cumplir los criterios diagnósticos de anemia aplásica [1,34]:
§ Biopsia de médula ósea hipocelular, sin células anormales o malignas, ni
fibrosis.
§ Al menos dos de los siguientes:
§ Hemoglobina menor a 10g/dl
§ Neutrófilos menores de 1,500/µl
§ Plaquetas menores a 50.000/µl
§ Recuento absoluto de reticulocitos menor a 40.000/µl12 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica Título de la tesis o trabajo de investigación
3.2.2 Criterios de exclusión
§ Diagnóstico de neoplasia, excepto cáncer de piel no-melanoma.
§ Citometría de flujo solicitada para seguimiento de HPN previamente diagnosticada.
3.3 Descripción de las intervenciones
El presente estudio no involucra intervenciones sobre los sujetos incluidos.
3.4 Procedimientos
Primero, revisión de la base de datos de DECF y selección de los pacientes con anemia
aplásica como motivo de solicitud de la citometría de flujo para HPN. Segundo, revisión
de las historias clínicas de los pacientes seleccionados para la verificación de los criterios
diagnósticos de anemia aplásica y de los criterios de exclusión. Tercero, clasificación de
la severidad de la anemia según los paraclínicos disponibles, de acuerdo los criterios de
Camitta y Bacigalupo (Tabla 2-1, [2,9]). Cuarto, confirmación de la presentación de
hemolisis y/o trombosis, según la historia clínica. Quinto, revisión de tratamientos con
ATG y/o ciclosporina, y verificación de la respuesta a los mismos. La respuesta a los
tratamientos se clasifica de acuerdo criterios de Camitta (Tablas 3-1 y 3-2) [35].
Tabla 3-1: Criterios de respuesta a terapia inmunosupresora en anemia aplásica
severa / muy severa [35]
Ninguna Continúa siendo severa
Parcial Independencia transfusional
No cumple criterios de enfermedad severa
Completa Hemoglobina normal para la edad
Recuento de neutrófilos > 1.500//µl
Recuento de plaquetas >150.000//µl13
Tabla 3-2: Criterios de respuesta a terapia inmunosupresora en anemia aplásica no
severa [35]
Ninguna Empeoramiento o no cumplir los siguientes criterios
Parcial Independencia transfusional (si era dependiente)
ó
Duplicar o normalizar el recuento en al menos un linaje
ó
Incremento >3g/dl en hemoglobina basal (si inicial <6g/dl)
ó
Incremento >500/µl en recuento basal de neutrófilos (si
inicial <500/µl)
ó
Incremento >20.000/µl en recuento basal de plaquetas (si
inicial <20.000/µl)
Completa Hemoglobina normal para la edad
Recuento de neutrófilos >1.500/µl
Recuento de plaquetas >150.000//µl
Sexto, revisión de los reportes de citometría de flujo para HPN de los pacientes incluidos.
De acuerdo con las recomendaciones de la ICCS [23], por la sensibilidad del citómetro
del laboratorio DECF, se consideran clones HPN positivos aquellos iguales o mayores a
0,1% en al menos dos poblaciones (eritrocitos, granulocitos, monocitos). Septimo,
análisis de datos: descripción de las características demográficas de los pacientes
incluidos, descripción de los resultados de citometría de flujo en la totalidad de los
pacientes incluidos y de acuerdo a la severidad de la anemia aplásica, clasificación de
los pacientes con clones HPN según la presentación clínica (HPN asociada a aplasia
medular o HPN subclínica, [19]) y descripción del tamaño de los clones en cada
categoría.
3.5 Definición de variables
§ Identificacion: Cualitativa nominal. Número de documento de identidad que aparece
registrado en la base de datos de DECF y en la historia clínica.
§ Edad: Cuantitativa discreta. Dato que permite la cuantificación cronológica del tiempo
de vida del individuo, en años cumplidos, al momento del estudio por citometría de
flujo para HPN.14 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica Título de la tesis o trabajo de investigación
§ Sexo: Cualitativa nominal dicotómica. Permite el reconocimiento del género al cual
pertenece un individuo (masculino o femenino). (0) Femenino; (1) Masculino.
§ Fecha de diagnóstico: Ordinal. Documentación cronológica del tiempo (día/mes/año)
que corresponde a la emisión del reporte de Patología de la biopsia de médula ósea.
§ Celularidad: Cuantitativa discreta. Porcentaje de celularidad registrado en el reporte
de Patología de la biopsia de médula ósea. En casos informados como rango, se
tomará el promedio de los valores extremos del rango. En casos informados como
“hipocelular”, se tomará como variable cualitativa.
§ Hemoglobina: Cualitativa ordinal. Nadir del nivel de hemoglobina, registrado en los
hemogramas realizados a partir del mes en que se diagnosticó la anemia aplásica.
(0) Mayor o igual a 10g/dl; (1) Menor de 10g/dl.
§ Recuento de neutrófilos: Cualitativa ordinal. Nadir del recuento de neutrófilos,
registrado en los hemogramas realizados a partir del mes en que se diagnosticó la
anemia aplásica. (0) Mayor o igual a 1.500/µl; (1) 500/µl a 1499/µl; (2) 200/µl a
499/µl; (3) Menor a 200/µl.
§ Recuento de plaquetas: Categórica ordinal. Nadir del recuento de plaquetas,
registrado en los hemogramas realizados a partir del mes en que se diagnosticó la
anemia aplásica. (0) Mayor o igual a 50.000/µl; (1) 20.000/µl a 49.999/µl; (2) Menor a
20.000/µl.
§ Recuento absoluto de reticulocitos: Categórica ordinal. Nadir del recuento de
reticulocitos, registrado en los hemogramas realizados a partir del mes en que se
diagnosticó la anemia aplásica. (0) Mayor o igual a 40.000/µl; (1) 20.000/µl a
39.999/µl; (2) Menor a 20.000/µl.
§ Severidad de anemia aplásica: Cualitativa ordinal. Clasificación de la anemia
aplásica según los criterios de severidad preestablecidos (Tabla 3-1). (1) No severa;
(2) Severa; (3) Muy severa.
§ Hemólisis: Cualitativa nominal dicotómica. Presencia o ausencia de hemólisis de
acuerdo a la información registrada en la historia clínica del individuo. Se considera
marcador de hemólisis un nivel de lactato deshidrogenasa mayor o igual a 1,5 veces
el límite superior normal, sin otras condiciones que lo expliquen. (0) No; (1) Si.
§ Trombosis: Cualitativa nominal dicotómica. Presencia o ausencia de eventos
trombóticos/tromboembólicos de acuerdo a la información registrada en la historia
clínica del individuo. (0) No; (1) Si.
§ Inmunosupresión: Cualitativa nominal dicotómica. Determina si un individuo recibió o
no tratmiento inmunosupresor, de acuerdo a la información registrada en la historia
clínica. (0) No; (1) Si.15
§ Tipo de inmunosupresión: Cualitativa nominal dicotómica. Determina si un individuo
recibió tratmiento con esquemas de ATG (con o sin ciclosporina) o solo ciclosporina
(sin ATG), de acuerdo a la información registrada en la historia clínica. (1) ATG; (2)
Ciclosporina.
§ Respuesta a inmunosupresión: Cualitativa ordinal. Clasificación de la respuesta al
tratamiento inmunosupresor, según los criterios preestablecidos (Tablas 4-1 y 4-2).
(0) Ninguna; (1) Parcial; (2) Completa.
§ Número de muestra: Cualitativa nominal. Número consecutivo asignado en DECF a
las muestras estudiadas mediante citometría de flujo para HPN.
§ Fecha de citometría de flujo: Ordinal. Documentación cronológica del tiempo
(día/mes/año) que aparece en el formato de solicitud de citometría de flujo.
§ Porcentaje eritrocitos HPN: Cuantitativa continua. Porcentaje de eritrocitos con
deficiencia parcial o completa de CD59 registrado en el reporte de DECF.
§ Porcentaje monocitos HPN: Cuantitativa continua. Porcentaje de monocitos con
deficiencia de CD14 registrado en el reporte de DECF.
§ Porcentaje granulocitos HPN: Cuantitativa continua. Porcentaje de granulocitos con
deficiencia de CD16 registrado en el reporte de DECF.
§ Resultado HPN: Cualitativa nominal dicotómica. Permite identificar si un individuo es
positivo o negativo para la presencia de clones HPN, según los criterios
preestablecidos. (0) Negativo; (1) Positivo.
§ Clasificación HPN: Cualitativa nominal dicotómica. Clasificación de los individuos
HPN positivos, de acuerdo a los criterios preestablecidos. (1) Asociada a anemia
aplásica; (2) Subclínica.
3.6 Análisis estadístico
Regstro de los datos obtenidos en formatos de recolección diseñado para tal fin (Anexos
A y B). Digitación por duplicado en bases creadas con el sofware Microsoft Excel 2011
(Microsoft Corp., 2010, Redmond, WA). Comparación de las bases para detección y
corrección de errores de digitación, mediante la revisión de los formatos de recolección.
Descripción de las variables cualitativas como proporciones. Determinación de la
distribución de las variables continuas mediante la prueba de Shapiro-Wilk. Descripción
de las variables de distribución normal empleando el promedio como medida de16 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica Título de la tesis o trabajo de investigación
tendencia central y la desviación estándar como medida de dispersión. Descripción de
las variables de distribución no normal utilizando como medida de tendencia central la
mediana y como medida de dispersión el rango. Análisis estadístico con el software Stata
10.1 (Stata Corp., 2009, College Station, TX).4. Consideraciones éticas
De acuerdo a la resolución del Ministerio de Salud N° 008430 de 1993 para la
investigación con seres humanos, artículo 11, el presente estudio se cataloga como
investigación sin riesgo, por lo tanto no se requiere consentimiento informado escrito. Los
datos recolectados se mantendrán confidenciales y solo estarán disponibles para el
equipo de investigadores del estudio.
No existen conflictos de interés por parte del investigador principal (Mario Andrés Arenas
Mantilla) ni del director (Marco Antonio Grajales Buitrago) del presente estudio.5. Presupuesto
5.1 Presupuesto global de la propuesta por fuentes de
financiación
Conceptos Fuentes financiación
Total
presupuestales UN Personal
Talento Humano 4’000.000 18’000.000 22’000.000
Equipos y software 0 1’200.000 1’200.000
Impresos y publicaciones 0 200.000 200.000
Total 4’000.000 19’400.000 23’400.000
5.2 Descripción de inversión en talento humano
Dedicación N° Valor Fuentes financiación
Cargo Total
(horas/mes) meses costo/hora UN Personal
Hematólogo
8 10 50.000 4’000.000 0 4’000.000
Docente UN
Residente
45 10 40.000 0 18’000.000 18’000.000
Hematología
Total 4’000.000 18’000.000 22’000.000
5.3 Descripción de inversión en equipos y software
Fuentes financiación
Equipos Justificación Total
UN Personal
Creación de base de datos
Computador
Análisis estadístico 0 1’200.000 1’200.000
portatil
Redacción de informe final
Total 0 1’200.000 1’200.00020 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica Título de la tesis o trabajo de investigación
5.4 Descripción de inversión en impresos y
publicaciones
Impresos y Fuentes financiación Total
publicaciones UN Personal
Tinta 0 100.000 100.000
Papel 0 100.000 100.000
Total 0 200.000 200.0006. Resultados
6.1 Selección de pacientes
Al revisar la base de datos de DECF los datos de los pacientes que otorgaron
consentimiento informado, se enecontró que durante el periodo comprendido entre el
primero de enero de 2010 y el 31 de marzo de 2013, en Bogotá fueron solicitados 482
estudios de citometrías de flujo para HPN. De los anteriores, 70 (14,5%) registraban
anemia aplásica como motivo de solicitud. En la Figura 6-1 se resume el proceso de
selección. Se tuvo acceso a la historia clínica (con información completa de hemogramas
y de estudios de médula ósea) de 67 (95,7%) de estos pacientes, de los cuales 38
cumplían con los criterios de inclusión. De los 29 pacientes que no fueron incluidos, 18
tenían menos de dos citopenias, tres presentaba células anormales (displásicas) en la
biospia de médula ósea, uno presentaban mielofibrosis y siete tenían reporte de biospia
de médula ósea normal. Ninguno de los pacientes incluidos presentaba criterios de
exclusión.
Figura 6-1: Proceso de selección de pacientes22 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica Título de la tesis o trabajo de investigación
6.2 Características demográficas
La mediana de edad de los pacientes incluidos fue de 38 años (rango: 17 – 69). Al
agrupar los pacientes por quinquenios, se observó con un pico de frecuencia entre los 15
y los 25 años. En la distribución por géneros se presentó un predominio de las mujeres.
Al clasificar a los pacientes incluidos de acuerdo a la severidad de la aplasia, se encontró
que más de la mitad presentaban anemia aplásica no severa. La mediana de la edad de
los pacientes con anemia aplásica severa/muy severa y fue mayor que en los pacientes
con anemia aplásica no severa (43,5 años vs 36 años), aunque con superposición de los
rangos. La distribución por géneros fue similar entre pacientes con anemia aplásica no
severa y severa/muy severa. En la tabla 6-1 se resumen las características demográficas
y la clasificación de la severidad de la anemia aplásica.
Tabla 6-1: Características demográficas y severidad de la anemia aplásica
Pacientes
(n = 38)
Edad1 38 años (17 – 69 años)
Género
Femenino 23 (60,5%)
Masculino 15 (39,5%)
Severidad de la anemia aplásica
No severa 20 (52,6%)
Severa 10 (26,3%)
Muy severa 8 (21,1%)
1 Datos presentados como mediana (rango)
6.3 Frecuencia de HPN en pacientes con anemia aplásica
Se detectaron clones HPN en 60,5% de los pacientes incluidos. La frecuencia de HPN en
mujeres y en hombres fue similar (60,9% vs 60%, respectivamente). Los pacientes HPN
positivos tendieron a ser menores (mediana: 38 años; rango intercuartil: 25,5 - 55 años)
que los paciente HPN negativos (mediana: 51,5 años; rango intercuartil: 33 – 64,8 años),
aunque con superposición de los rangos totales (17 – 87 años vs 17 – 79 años,
respectivamente). Como se observa en la tabla 6-2, se detectaron clones HPN con mayor
frecuencia en pacientes con anemia aplásica severa y muy severa que en pacientes con
anemia aplásica no severa.23
Tabla 6-2: Detección de clones HPN según la severidad de la anemia aplásica
Clones HPN
Severidad de la
Positivos Negativos
anemia aplásica
No severa 10 (50%) 10 (50%)
Severa 7 (70%) 3 (30%)
Muy severa 6 (75%) 2 (25%)
Total 23 (60,5) 15 (39,5)
6.4 Clasificación clínica de la HPN
Al clasificar a los pacientes con clones HPN de acuerdo a la manifestaciones clínicas
asociadas, solo una cuarta parte presentaban hemólisis, mientras que la mayoría
conrrespondían a HPN subclínica (Tabla 6-3). Ninguno de los pacientes HPN positivos
tenía historia de trombosis. Los pacientes con HPN asociada a anemia aplásica
presentaban menor edad (mediana: 25,5 años; rango: 17 – 49 años) que aquellos con
HPN subclínica (mediana: 38 años; rango: 18 – 69 años). El porcentaje de mujeres fue
mayor en el grupo de HPN asociada a anemia aplásica que en el de HPN subclínica
(83,3% vs 52,9%).
Tabla 6-3: Clasicación de la HPN según la presentación clínica
Categoría HPN Pacientes
Asociada a anemia aplásica 6 (26,1%)
Sublcínica 17 (73,9%)
Evaluando la distribución de los pacientes según la clasificación de la HPN y la severidad
de la anemia aplásica, se observó que en todas las categorías de severidad predominaba
la HPN subclínica (Tabla 6-4). Debido al reducido número de pacientes, a partir de este
punto se toman en conjunto aquellos con anemia aplásica severa y muy severa.
Tabla 6-4: Relación entre severidad de la anemia aplásica y la categoría de HPN
Categoría HPN
Severidad de la anemia Asociada a
Sublcínica
aplásica anemia aplásica
No severa 3 (30%) 7 (70%)
Severa / Muy severa 3 (23,1%) 10 (76,9%)24 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica Título de la tesis o trabajo de investigación
6.5 Tamaño de los clones HPN
Se tomó como medida del tamaño del clon el porcentaje de células HPN en cada linaje.
Como se observa en la tabla 6-5, la mediana del tamaño de los clones HPN fue inferior al
5% en las tres líneas celulares. Adicionalmente, el 52.2% de los pacientes HPN positivos
solo presentaba compromiso de dos líneas (monocítica y granulocítica), sin evidencia de
eritrocitos HPN. El tamaño del clon de monocitos HPN fue similar al de granulocitos HPN,
mientras que el tamaño del clon de eritrocitos HPN fue menor al de los dos anteriores. La
mediana del tamaño de los clones HPN también fue similar entre mujeres y hombres en
los tres linajes.
Tabla 6-5: Tamaño de los clones HPN según el linaje
Clones HPN1
Total
Línaje celular (n = 23)
Eritrocitos 0 %(0 – 19,1%)
Monocitos 4,1% (0,1 – 98,3%)
Granulocitos 3,9% (0,1 - 99%)
1 Datos presentados como mediana (rango)
Tomando como referencia el clon de granulocitos HPN, se evaluó el tamaño de los
clones HPN de acuerdo con la severidad de la anemia aplásica y según la categoría de la
HPN (Tabla 6-6). El tamaño de los clones fue semejante entre los pacientes con anemia
aplásica no severa y aquellos con severa/muy severa (Figura 6-2A). En contraste, los
pacientes con HPN asociada a anemia aplásica mostraron clones de mayor tamaño que
los pacientes con HPN subclínica (Figura 6-2B).
Tabla 6-6: Tamaño de los clones de granulocitos HPN según la severidad de la
anemia aplásica y la categoría HPN
Clasificación Granulocitos HPN1
Severidad de la anemia aplásica
No severa 4,1% (0,6 – 99%)
Severa / Muy severa 3,9% (0,1 – 81,8%)
Categoría HPN
Asociada a anemia aplásica 51,4% (4,2 – 99%)
Sublcínica 2,5% (0,1 – 42,5%)
1 Datos presentados como mediana (rango)25
Figura 6-2: Granulocitos HPN1 según la severidad de la anemia aplásica y la categoría
HPN
1 Las líneas horizontales representan las medianas del tamaño del clon en cada grupo
6.6 Respuesta al tratamiento inmunosupresor
Figura 6-3: Revisión de tratamientos inmunosupresores26 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica Título de la tesis o trabajo de investigación
Se obtuvieron datos completos sobre el empleo de tratamiento para la anemia aplásica
con esquemas inmunosupresores en 30 (78,9%) de los pacientes incluidos. De estos
pacientes, 16 (53,3%) fueron tratados con ATG seguida de ciclosporina, seis (20%)
recibieron solo ciclosporina (con o sin prednisona) y ocho (26,7%) no recibieron
tratamiento inmunosupresor. El proceso de revisión de los tratamientos se resume en la
figura 6-3. El 77,3% de los pacientes tratados lograron algún grado de respuesta. Los
pacientes que no obtuvieron respuesta tendieron a ser de mayor edad, pero con
superposición de los rangos. Un mayor porcentaje de mujeres lograron respuesta parcial
o completa en comparación con los hombres. También se observó un mayor porcentaje
de respuestas parciales o completas en los paciente con anemia aplásica no severa que
en grupo de severa/muy severa. En relación a la presencia de clones HPN, una menor
proporción de pacientes HPN positivos logró algún grado de respuesta en comparación a
los pacientes HPN negativos. El porcentaje de repuesta parcial/completa fue similar entre
paciente con HPN asociada a anemia aplásica y HPN subclínica. Asimismo, el tamaño de
los clones de granulocitos HPN fue semejante entre los pacientes con y sin respuesta al
tratamiento. La evaluación por subgrupos se vio limitada por el escaso número de
pacientes con información completa. La tabla 6-7 resume las respuesta a los esquemas
inmunosupresore de acuerdo a las características de los pacientes.
Tabla 6-7: Respuesta a tratamiento inmunosupresor
Respuesta al tratamiento
Total Ninguna Parcial / Completa
Pacientes tratados 22 5 (22,7%) 17 (77,3%)
35 años 49 años 31 años
Edad1
(17 – 69 años) (18 – 56 años) (17 – 69 años)
Género
Femenino 13 2 (15,4%) 11 (84,6%)
Masculino 9 3 (33,3%) 6 (66,7%)
Severidad de la anemia aplásica
No severa 11 1 (9,1%) 10 (90,9%)
Severa / Muy severa 11 4 (36,4%) 7 (63,6%)
Clones HPN
Positivos 17 5 (29,4%) 12 (70,6%)
Negativos 5 0 5 (100%)
Categoría HPN
Asociada a anemia aplásica 4 1 (25%) 3 (75%)
Sublcínica 13 4 (30,8%) 9 (69,2%)
4,2% 6,5% 4,1%
Granulocitos HPN1
(0,1 – 99%) (0,5 – 38,7%) (0,1 – 99%)
1 Datos presentados como mediana (rango)7. Discusión
La anemia aplásica es una entidad infrecuente, los estudios epidemiológicos previos,
realizados en diferentes poblaciones, reportan incidencias de 2 a 2,4 casos por millón de
habitantes por año [8,34,36]. De acuerdo con lo anterior, la incidencia de anemia aplásica
esperada en Bogotá (con aproximadamente siete millones y medio de habitantes [37])
durante lapso equivalente al periodo de estudio (27 meses) es de 33 a 41 casos. En el
presente estudio, la mediana de edad de los pacientes incluidos (38 años) fue menor a la
reportada en otras series (53 a 56 años) [8,31]. Aunque se encontró un pico de
frecuencia entre los 15 y los 25 años, similar al descrito por otros autores [34,36], no se
observó la distribución bimodal por edad referida en los estudios citados. Asimismo, la
mayor proporción de mujeres con anemia aplásica en este estudio contrasta con los
hallazgos de publicaciones anteriores, las cuales registraron porcentajes similares de
mujer y hombres [8,34] o incluso predominio masculino [36,38,39]. Una pequeña serie del
hospital John Hopkins mostró distribución por género semejante a la del presente estudio
[40]. Los estudios que detallan la distribución de los pacientes de acuerdo a la severidad
de la anemia aplásica muestran preponderancia de la categoría severa/muy severa (61,5
a 83,8%) [8,31,39], contrario a lo hallado en esta serie, donde el 52,6% de los pacientes
correspondían al grupo de anemia aplásica no severa.
El estudio para HPN en pacientes con anemia aplásica está recomendado tanto en las
guías de diagnóstico y manejo de anemia aplásica [2] como en las de HPN [19,23]. En
Colombia, el 16,2% de las citometrías de flujo para estudio de HPN son solicitan por
anemia aplásica, siendo el cuarto motivo más frecuente de solicitud, después de
trombosis, citopenias no especificadas y anemia hemolítica Coombs-negativa [41]. En
Bogotá se mantiene esta proporción, con 14,5% de solicitudes por anemia aplásica. Sin
embargo, como se observó en el presente estudio, más de la tercera parte de los
pacientes remitidos por este motivo no cumplen con los criterios diagnósticos. Esta
situación se explica en parte por las dificultades administrativas y operativas propias del
sistema de salud colombiano, que obligan a los médicos a solicitar los estudios para HPN
antes de contar con la confirmación del diagnóstico de anemia aplásica.
La falta de un punto de corte estandarizado para definir los clones HPN positivos es una
de las principales limitantes en la comparación entre diferentes series. La implementación28 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica Título de la tesis o trabajo de investigación
de distintas definiciones de positividad se deriva las diferencias en el rendimiento de los
citómetros utilizados por cada grupo para el estudio de HPN. En el presente estudio, con
un umbral de 0,1%, el 59% de pacientes fueron HPN positivos. Este valor es similar al
reportado por otros autores (57% a 59,2%), pese a que éstos emplearon citómetros de
alta sensibilidad, con puntos de corte más bajos (0.003% a 0.01%) [30,39]. Estas
publicaciones mostraron además mayor frecuencia de clones HPN en pacientes de
mayor edad que en los más jóvenes. Los resultados del estudio actual mostraron una
tendencia opuesta, siendo mayores los pacientes negativos para HPN. En este estudio,
la distribución por género fue similar entre pacientes HPN positivos y negativos.
Curiosamente, respecto a este aspecto no hay mayor información disponible en la
literatura.
La frecuencia de HPN de acuerdo a la severidad de la anemia aplásica es otro aspecto
del cual hay pocos datos publicados. Recientemente, Kulagin y colaboradores informaron
proporciones similares de pacientes HPN positivos en las diferentes categorías de
severidad (59,5% en anemia aplásica no severa, 59,6% en severa y 58,3% en muy
severa) [39]. En una publicación anterior, se observó una tendencia a encontrar clones
HPN con mayor frecuencia en los pacientes con anemia aplásica severa/muy severa que
en aquellos con anemia aplásica no severa (70,7% vs 63,8%) [31]. En el presente estudio
también se encontraron clones HPN con mayor frecuencia en los pacientes con anemia
aplásica severa y muy severa (70% y 75%, respectivamente) que en pacientes con
anemia aplásica no severa (50%). En cuanto a la clasificación de la HPN según las
manifestaciones clínicas, los resultados de este estudio concuerdan con los reportes
previos, con predominio de la HPN subclínica [6,39]. La relación entre HPN asociada a
anemia aplásica y HPN subclínica fue similar en pacientes con anemia aplásica no
severa (30% vs 70%, respectivamente) y severa/muy severa (23,1% vs 76,9%,
respectivamente). No se encontró información sobre este tipo de distribución en la
literatura.
De acuerdo con la literatura [6,25], en este estudio la mayoría de los pacientes
presentaban clones HPN pequeños (<5%) en las tres líneas celulares analizadas. Los
clones de eritrocitos fueron de menor tamaño que los de monocitos y granulocitos,
probablemente a consecuencia de la destrucción de los eritrocitos HPN, mediada por el
complemento [5,19]. La mediana del tamaño del clon de granulocitos fue menor a la
reportada en otros estudios [30,39]. No obstante, las comparaciones entre diferentes
series están limitadas por el empleo de diferentes puntos de corte para definir los clones
HPN positivos. No se encontraron diferencias en el tamaño del clon de granulocitos HPN
según la severidad de la anemia aplásica, pero si de acuerdo a la categoría de la HPN,
siendo mayores los clones hallados en pacientes con HPN asociada a anemia aplásica
(mediana: 51,5%; rango: 4,2 – 99%) que los identificados en pacientes HPN subclínica
(mediana: 2,5%; rango: 0,1 – 42,5%). Estos datos corresponden con los hallazgos de29
estudios previos, los cuales determinaron que la presentación de hemólisis en pacientes
con anemia aplásica y HPN dependen directamente del tamaño de los clones [6,40].
La relación entre la presencia de clones HPN y la respuesta a los tratamiento
inmunosupresores continúa siendo motivo de controversia [2]. Algunos estudios sugieren
que los pacientes con anemia aplásica y clones HPN pueden responder mejor estos
tratamientos, mientras que otros no ha encontrado una asociación significativa [6]. En
este estudio, se observó una mayor proporción de respuesta parciales o completas en los
pacientes negativos para HPN. Estos resultados son semejantes a los informados por
Timeus y colaboradores en una pequeña serie de pacientes pediátricos. Utilizando un
punto de corte de 0.15% para definir clones HPN positivos (similar al del presente
estudio), estos autores encontraron los pacientes negativos para HPN tenían mayor
respuesta global al tratamiento inmunosupresor [42]. Llamativamente, los estudios que
han encontrado una asociación entre la presencia de clones HPN y mejores respuesta al
tratamiento inmunosupresor, son aquellos que han empleado puntos de corte más bajos
para definir la positividad de los clones [31,39], sugiriendo que son los clones más
pequeños los que repercuten favorablemente en la respuesta a los esquemas
inmunosupresores.
El presente estudio presenta como principal limitación su carácter retrospectivo. Los
datos obtenidos a partir de la historia clínica con frecuencia son insuficientes para realizar
una descripción detallada de un grupo de pacientes en particular. A lo anterior se suma la
atención fraccionada de los pacientes, según la disposición de las entidades
aseguradoras, lo cual impide disponer de la información en un solo centro. La revisión de
la literatura revela limitaciones similares, derivadas generalmente de la baja incidencia de
estas patologías. Quedan importantes vacíos de conocimiento en múltiples aspectos de
la asociación entre HPN y anemia aplásica. En nuestro medio, se requieren estudios
prospectivos que permitan la recolección de información más completa. Dada la baja
frecuencia de la anemia aplásica, tales estudios prospectivos deben ser esfuerzos
multicéntricos, que abarquen varias ciudades del país.8. Conclusiones
§ Aproximadamente dos tercios de los pacientes con anemia aplásica presentan
clones HPN, siendo estos clones más frecuentes en pacientes con mayor severidad
de la aplasia.
§ La mayoría de los pacientes HPN positivos corresponden a la categoría HPN
subclínica.
§ El tamaño de los clones HPN se relaciona con las manifestaciones clínicas de la
HPN, pero no con la severidad de la aplasia.
§ La relación entre clones HPN y respuesta a inmunosupresión continúa mostrando
resultados conflictivos
§ Se requieren estudios prospectivos multicéntricos a gran escala para obtener
información más detallada sobre estas patologías de baja frecuencia, pero de gran
repercusión clínica.A. Anexo: Formato de recolección
de datos de historia clínica
CARACTERIZACIÓN DE LOS CLONES HPN EN PACIENTES CON ANEMIA
APLÁSICA
Formato de recolección de datos de historia clínica
Fecha de diligenciamiento (día/mes/año): ____/____/_________
1. Identificación: _______________________________________________
2. Edad: _____________ años
3. Sexo: Femenino ___ Masculino ___
4. Fecha del diagnóstico (biopsia de médula ósea) de anemia aplásica (día /mes/año):
____/____/_________
5. Celularidad en biopsia de médula ósea al momento del diagnóstico: ________%
6. Hemoglobina al momento del diagnóstico de anemia aplásica:
Menor a 10g/dl ___ Mayor o igual a 10g/dl ___ Sin dato ___
7. Recuento neutrófilos al momento del diagnóstico de anemia aplásica:
Menor a 200/µl ___ 200 a 499/µl ___ 500 a 1,499/µl ___
Mayor o igual a 1,500/µl ___ Sin dato ___34 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica
8. Recuento de plaquetas al momento del diagnóstico de anemia aplásica:
Menor a 20,000/µl ___ 20,000 a 49,999/µl ___
Mayor o igual a 50,000/µl ___ Sin dato ___
9. Recuento de reticulocitos al momento del diagnóstico de anemia aplásica:
Menor a 20,000/µl ___ Mayor o igual a 20,000/µl ___ Sin dato ___
10. Hemólisis (nivel de lactato deshidrogenasa mayor o igual a 1,5 veces el límite
superior normal):
Si ___ No ___ Sin dato ___
11. Trombosis:
Si ___ No ___ Sin dato ___
12. Tratamiento inmunosupresor:
Si ___ No ___ Sin dato ___
Si la respuesta a la pregunta 12 es Si, responder las siguientes preguntas:
13. Tipo de inmunosupresión:
Esquema ATG (con o sin ciclosporina) ___ Ciclosporina (sin ATG) ___
Otro ___ ¿Cuál? __________________________________________________
14. Respuesta a la inmunosupresión:
Ninguna ___ Parcial ___ Completa ___B. Anexo: Formato de recolección
de datos de citometría de flujo
CARACTERIZACIÓN DE LOS CLONES HPN EN PACIENTES CON ANEMIA
APLÁSICA
Formato de recolección de datos de citometría de flujo
Fecha de diligenciamiento (día/mes/año): ____/____/_________
1. Identificación: _______________________________________________
2. Número de muestra: ________________________________________
3. Fecha de citometría de flujo para HPN (día /mes/año): ____/____/_________
4. Porcentaje eritrocitos HPN: ________%
5. Porcentaje monocitos HPN: ________%
6. Porcentaje granulocitos HPN: ________%
7. Resultado HPN: Positivo ___ Negativo ___Bibliografía
1 Segel GB, Lichtman MA. Aplastic Anemia: Acquired and Inherited. In: Kaushansky
K, Beutler E, Seligsohn U, et al., eds. Williams Hematology. China: McGraw-Hill
Professional 2010.
2 Marsh JCW, Ball SE, Cavenagh J, et al. Guidelines for the diagnosis and
management of aplastic anaemia. Br J Haematol 2009;147:43–70.
3 Najean Y, Haguenauer O. Long-term (5 to 20 years) Evolution of nongrafted
aplastic anemias. The Cooperative Group for the Study of Aplastic and Refractory
Anemias. Blood 1990;76:2222–8.
4 Parker CJ. The Pathophysiology of paroxismal nocturnal hemoglobinuria. Exp
Hematol 2007;35:523–33.
5 Parker CJ. Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria. In: Kaushansky K, Beutler E,
Seligsohn U, et al., eds. Williams Hematology. New York City: McGraw-Hill
Professional 2010. 635–47.
6 Parker CJ. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria. Curr Opin Hematol
2012;19:141–8.
7 Hillmen P, Muus P, Röth A, et al. Long-term safety and efficacy of sustained
eculizumab treatment in patients with paroxysmal nocturnal haemoglobinuria. Br J
Haematol 2013;162:62–73.
8 Montané E, Ibáñez L, Vidal X, et al. Epidemiology of aplastic anemia: a prospective
multicenter study. Haematologica 2008;93:518–23.
9 Camitta BM, Rappeport J, Parkman R, et al. Selection of patients for bone marrow
transplantation in severe aplastic anemia. Blood 1975;45:355–63.
10 Ball SE, Gibson FM, Rizzo S, et al. Progressive Telomere Shortening in Aplastic
Anemia. Blood 1998;91:3582–92.
11 Young NS, Scheinberg P, Calado R. Aplastic anemia. Curr Opin Hematol
2008;15:162–8.
12 Holmberg L a, Seidel K, Leisenring W, et al. Aplastic anemia: analysis of stromal
cell function in long-term marrow cultures. Blood 1994;84:3685–90.38 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica
13 Stute N, Fehse B, Schroder J, et al. Human mesenchymal stem cells are not of
donor origin in patients with severe aplastic anemia who underwent sex-
mismatched allogeneic bone marrow transplant. J Hematother Stem Cell Res
2002;11:977–84.
14 Thomas E, Storb R, Giblett E, et al. Recovery from aplastic anemia following
attempted marrow transplantation. Exp Hematol 1976;4:97–102.
15 Speck B, Gluckman E, Haak H, et al. Treatment of aplastic anaemia by
antilymphocyte globulin with and without allogeneic bone-marrow infusions. Lancet
1977;2:1145–8.
16 Young NS, Maciejewski JP. The pathophysiology of acquired aplastic anemia. N
Engl J Med 1997;336:1365–72.
17 Young NS, Calado RT, Scheinberg P. Current concepts in the pathophysiology and
treatment of aplastic anemia. Blood 2006;108:2509–19.
18 Risitano AM, Maciejewski JP, Green S, et al. In-vivo dominant immune responses
in aplastic anaemia : molecular tracking of putatively pathogenetic T-cell clones by
TCR β-CDR3 sequencing. Lancet 2004;364:355–64.
19 Parker C, Omine M, Richards S, et al. Diagnosis and management of paroxysmal
nocturnal hemoglobinuria. Blood 2005;106:3699–709.
20 Parker CJ, Ware RE. Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria. In: Greer JP, Foerster
J, Rodgers GM, et al., eds. Wintrobe’s Clinical Hematology. Philadelphia: Lippincott
Williams & Wilkins 2009. 998–1020.
21 Urbano-Ispizu A, Gaya A, Colado E, et al. Diagnosis and treatment of nocturnal
paroxysmal hemoglobinuria. Med Clin 2011;136:121–7.
22 Madkaikar M, Gupta M, Jijina F, et al. Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria:
diagnostic test, advantages, & limitations. Eur J Haematol 2009;83:503–11.
23 Borowitz M, Craig F, DiGiuseppe J, et al. Guidelines for the diagnosis and
monitoring of paroxismal nocturnal hemoglobinuria and related disorders by flow
cytometry. Cytom Part B (Clinical Cytom 2010;78 B:211–30.
24 Hill A, Kelly RJ, Hillmen P. Thrombosis in paroxysmal nocturnal hemoglobinuria.
Blood 2013;121:4985–96; quiz 5105.
25 Wang H, Chuhjo T, Yasue S, et al. Clinical significance of a minor population of
paroxysmal nocturnal hemoglobinuria-type cells in bone marrow failure syndrome.
Blood 2002;100:3897–902.Bibliografía 39
26 Young NS. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria and myelodysplastic syndromes:
clonal expansion of PIG-A-mutant hematopoietic cells in bone marrow failure.
Haematologica 2009;94:3–7.
27 Scheinberg P, Marte M, Nunez O, et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
clones in severe aplastic anemia patients treated with horse anti-thymocyte
globulin plus cyclosporine. Haematologica 2010;95:1075–80.
28 Dunn DE, Tanawattanacharoen P, Boccuni P, et al. Paroxysmal Nocturnal
Hemoglobinuria Cells in Patients with Bone Marrow Failure Syndromes. Ann Intern
Med 1999;131:467–8.
29 Nakakuma H, Kawaguchi T. Pathogenesis of selective expansion of PNH clones.
Int J Hematol 2003;77:121–4.
30 Sugimori C, Mochizuki K, Qi Z, et al. Origin and fate of blood cells deficient in
glycosylphosphatidylinositol-anchored protein among patients with bone marrow
failure. Br J Haematol 2009;147:102–12.
31 Sugimori C, Chuhjo T, Feng X, et al. Minor population of CD55-CD59- blood cells
predicts response to immunosuppressive therapy and prognosis in patients with
aplastic anemia. Blood 2006;107:1308–14.
32 Ishiyama K, Chuhjo T, Wang H, et al. Polyclonal hematopoiesis maintained in
patients with bone marrow failure harboring a minor population of paroxysmal
nocturnal hemoglobinuria-type cells. Blood 2003;102:1211–6.
33 Scheinberg P, Wu CO, Nunez O, et al. Predicting response to immunosuppressive
therapy and survival in severe aplastic anaemia. Br J Haematol 2009;144:206–16.
34 International Agranulocytosis and Aplastic Anemia Study. Incidence of aplastic
anemia : the relevance of diagnostic criteria . By the. Blood 1987;70:1718–21.
35 Camitta BM. What is the definition of cure for aplastic anemia? Acta Haematol
2000;103:16–8.
36 Maluf EMCP, Pasquini R, Eluf JN, et al. Aplastic anemia in Brazil: incidence and
risk factors. Am J Hematol 2002;71:268–74.
37 Proyecciones de población. http://www.dane.gov.co/index.php/poblacion-y-
demografia/proyecciones-de-poblacion (accessed 29 Jan2014).
38 Issaragrisil S, Sriratanasatavorn C, Piankijagum A, et al. Incidence of aplastic
anemia in Bangkok. The Aplastic Anemia Study Group. Blood 1991;77:2166–8.
39 Kulagin A, Lisukov I, Ivanova M, et al. Prognostic value of paroxysmal nocturnal
haemoglobinuria clone presence in aplastic anaemia patients treated with40 Caracterización de los clones HPN en pacientes con anemia aplásica
combined immunosuppression: results of two-centre prospective study. Br J
Haematol 2013;:Epub ahead of print.
40 Pu JJ, Mukhina G, Wang H, et al. Natural history of paroxysmal nocturnal
hemoglobinuria clones in patients presenting as aplastic anemia. Eur J Haematol
2011;87:37–45.
41 Londoño M, Arenas-Mantilla M, Henao-Uribe AM, et al. Characteristics Of
Paroxysmal Nocturnal Hemoglobinuria Clones In Colombian Patients. Blood
2013;122:4869.
42 Timeus F, Crescenzio N, Lorenzati A, et al. Paroxysmal nocturnal haemoglobinuria
clones in children with acquired aplastic anaemia: a prospective single centre
study. Br J Haematol 2010;150:483–5.