The Rufaida Project: Towards a Better Understanding of a Gut-vagina Axis by Investigating the Effects of Ramadan Fasting on Gut and Vaginal Microbial Communities
Conditions: Intermittent Fasting, Gut Microbiome, Vaginal Microbiome
Sponsor: University Hospital, Antwerp

 
 
Protocol van de studie – Versie 3 – 13 februari 2025                                                           Pagina 1 van 7 
 
PROTOCOL VAN DE STUDIE 
Versie 3 – 13 februari 2025 
Het Rufaida project: Onderzoek naar de impact van Ramadan vasten op 
het darm en vaginale microbioom 
Onderzoekstudie aan de Universiteit Antwerpen, Faculteit Wetenschappen, Departement Bio-
ingenieurswetenschappen en de Faculteit Geneeskunde en Gezondheidswetenschappen 
Inclusie/exclusiecriteria 
• Inclusiecriteria: 
o Volwassenen van 18 jaar en ouder op het moment van inschrijving;  
o Geslacht: vrouw;  
o Wonend in België;  
o Voldoende kennis van de Nederlandse taal;  
o Toestemmingsformulier ondertekend;  
• Exclusiecriteria:  
o Menstruatie tijdens het verloop van de studie  
o Het geven van borstvoeding bij aanvang en tijdens de studie; 
o Huidige diagnose van kanker en/of immunosuppressieve therapie in de 6 maanden 
voor de studie; 
o Cardiovasculaire en metabolische aandoeningen (bijvoorbeeld diabetes, prikkelbare 
darmsyndroom, …); 
o Klinisch significante neiging tot bloeden doorheen de geschiedenis; 
o Klinisch significante afwijkingen van de voortplantingsorganen;  
o Elke andere medische aandoening die naar het oordeel van de hoofdonderzoeker 
aanleiding geeft tot uitsluiting van het onderzoek; 
o Gebruik van orale/vaginale antibiotica/antimycotica in de 2 maanden voor de 
studie;  
o Gebruik van orale/vaginale pre-, pro- en postbiotica (i.e., supplementen bovenop de 
voeding) in de 2 weken voor de studie en tijdens de studie;  
o Ketogeen dieet in de 2 weken voor de studie en tijdens de studie;  
o Vaginaal douchen tijdens de studie; 
o Parallelle deelname in een andere klinische studie;  
 
Rekrutering van participanten 
De rekrutering van de vrijwilligers (minimaal n=50 voor staalafnames, n=300 voor vragenlijsten) 
zal verlopen via een vragenlijst die de in- en exclusiecriteria, alsook de algemene 
gezondheidstoestand, medicatiegebruik, etc. bevraagt. In deze vragenlijst wordt geïnformeerd of 
de vrijwilligers graag stalen willen afnemen of niet. Afhankelijk van hun keuze worden de 

 
 
Protocol van de studie – Versie 3 – 13 februari 2025                                                           Pagina 2 van 7 
 
participanten in één van de twee studiepopulaties verdeeld. De vrijwilligers zullen gerekruteerd 
worden via verschillende kanalen, onder meer (maar niet beperkt tot) het communicatieplatform 
van het burgerwetenschapsproject Isala (https://isala.be/; EC nummer: B300201942076; 
ClinicalTrials.gov: NCT04319536) dat tot heden meer dan 6000 mensen bereikt. Indien we 
hiermee niet aan het vooropgestelde aantal vrijwilligers geraken, zullen andere kanalen parallel 
gebruikt worden voor rekrutering. Zo kunnen personeelsleden en studenten van de UAntwerpen en 
het UZA via affiches, ad valvas en mails uitgenodigd worden. Verder  kan er ook gebruik gemaakt 
worden van andere kanalen, onder meer (maar opnieuw niet beperkt tot) het EOS portaal, ‘Citizen 
Science-iedereen wetenschapper’ (www.iedereenwetenschapper.be), website van de ENdEMIC 
onderzoeksgroep 
(https://www.uantwerpen.be/en/research-groups/endemic/) 
of 
andere 
UAntwerpen onderzoeksgroepen, mails naar UAntwerpen geassocieerde hogescholen, andere 
Vlaamse universiteiten en hogescholen, nieuwe outlets, etc. Ook kan een open oproep gelanceerd 
worden bij deelnemers van vorige (klinische) studies uitgevoerd onder toezicht van Prof. Lebeer. 
Daarnaast zal er gebruik gemaakt worden van persberichten via openbare media zoals kranten en 
nieuwssites. Er kan ook rekrutering plaatsvinden via specifieke netwerken en organisaties, onder 
meer (maar niet beperkt tot) KifKif, Mahara, De Reuzen VZW, Medina Expo, etc. Verder kan de 
rekrutering steunen op het gekende netwerk van de betrokken arts(en), verpleegsters en dergelijke, 
en dit via mails, info brochures, enzovoort.   
Er wordt ook een project-specifieke webpagina aangemaakt voor het Rufaida project op de Isala 
website (www.isala.be). De vrijwilligers zullen de informatie over de studie en een 
toestemmingsformulier ontvangen tijdens een infoavond voorafgaand aan de studie, waarbij ook 
de self-sampling kit verdeeld kan worden. De self-sampling kit bevat een gedetailleerde 
handleiding, informatiebrochure en alle materialen die de vrijwilligers nodig hebben voor de 
staalcollectie, -bewaring en -bezorging aan het labo van Prof. Lebeer.  
Studieverloop en staalafnames  
De microbioomonderzoeken worden uitgevoerd aan de UAntwerpen, binnen het departement Bio-
ingenieurswetenschappen in het Laboratorium van Toegepaste Microbiologie en Biotechnologie 
onder leiding van Prof. Dr. Ir. Sarah Lebeer. Het verloop van de studie is schematisch weergegeven 
in Figuur 1.  

 
 
Protocol van de studie – Versie 3 – 13 februari 2025                                                           Pagina 3 van 7 
 
  
 
 
Figuur 1: Verloop van de studie. 
Voorafgaand aan de studie zal een preselectiestap plaatsvinden. Deelnemers worden gevraagd om 
enkele vragen te beantwoorden die nagaat of ze voldoen aan de inclusie- en exclusiecriteria, 
waaronder een evaluatie van hun gezondheidstoestand. Indien ze worden geselecteerd, zal hun 
deelname aan de studie acht weken in beslag nemen. Er wordt gevraagd of ze stalen wensen af te 
nemen. Afhankelijk van hun antwoord worden ze in studiegroep 1 (wel stalen afnemen, n=50) of 
studiegroep 2 (geen stalen afnemen, n=300) geplaatst. De eerste vragenlijst zal ongeveer 35 
minuten duren om in te vullen. De andere vragenlijsten zullen ongeveer 25 minuten in beslag 
nemen.   
Voor studiegroep één (n=50) die vaginale en stoelgangstoelgangstoelgang stalen zullen afnemen. 
De eerste staalname vindt plaats één week voor de aanvang van de Ramadan (tijdspunt 1), waar de 
deelneemster ook informatie ontvangt over het gebruik van de benodigde stalen en vragenlijsten. 
Na het afnemen van deze stalen worden deze ingeleverd. Het tweede tijdspunt is enkele dagen voor 
de Ramadan (tijdspunt 2), gevolgd door een derde staalafname op tijdspunt 3. Na het afnemen van 
stalen van tijdspunt 2 en 3 worden deze ingeleverd. Het vierde en vijfde tijdspunt zijn gedurende 
de Ramadan. Na het afnemen van de stalen van tijdspunt 4 en 5 worden ze ingeleverd. De zesde 
staalname wordt afgenomen op het einde van de Ramadan, gevolgd door de zevende staalafname 
vlak na het einde van de Ramadan en de achtste staalafname een week na de Ramadan. Na het 
afnemen van de stalen van tijdspunt 6, 7 en 8 worden ze ingeleverd. Ieder tijdspunt wordt gepaard 
met een uitgebreide vragenlijst over algemene gezondheid, leefomgeving, mentale gezondheid, 
vaginale gezondheid, seksuele gezondheid en darm gezondheid.  
Bij elk tijdspunt wordt gevraagd om (thuis) één vaginale staal en één stoelgangstoelgangstoelgang 
staal af te nemen, met het doeleind voor het isoleren van het DNA van de bacteriën. Na het afnemen 
van de stalen moeten deze direct bewaard worden in de diepvriezer (ongeveer -20°C). Daarna 

 
 
Protocol van de studie – Versie 3 – 13 februari 2025                                                           Pagina 4 van 7 
 
moeten deze afgegeven worden in het lab van Prof. Sarah Lebeer (Campus Groenenborger, gebouw 
V, verdieping 5, adres: Groenenborgerlaan 171, 2020 Antwerpen).  
Bij tijdspunt 1, 3, 5 en 8 wordt gevraagd om (thuis) één additionele vaginale en één additionele 
stoelgangstoelgangstoelgang staal af te nemen, deze worden gebruikt om te achterhalen welke extra 
producten dat de micro-organismen maken aanwezig zijn in het milieu. Na het afnemen van de 
stalen moeten deze direct bewaard worden in de diepvriezer (+/- -20°C). Daarna moeten deze 
afgegeven worden in het lab van Prof. Sarah Lebeer (Campus Groenenborger, gebouw V, 
verdieping 5, adres: Groenenborgerlaan 171, 2020 Antwerpen). 
Voor studiegroep twee (n=300) die enkel vragenlijsten zullen invullen.  
Op elk tijdspunt zal de deelneemster een mail krijgen met een vragenlijst over algemene 
gezondheid, leefomgeving, mentale gezondheid, vaginale gezondheid, seksuele gezondheid en 
darm gezondheid 
De verwerking en analyse van de stalen zal plaatsvinden onder leiding van de UAntwerpen, binnen 
het departement Bio-ingenieurswetenschappen in het labo van Prof. Sarah Lebeer. We zullen het 
genetisch materiaal van de micro-organismen uit de stoelgangstoelgang en vaginale stalen isoleren 
en kijken naar welke producten geproduceerd worden. Dit helpt ons om de algemene gezondheid 
te begrijpen en hoe de darm- en vaginale microbiomen met elkaar samenwerken. 
stoelgangstoelgangstoelgang 
Door deze gestructureerde aanpak hopen we inzicht te krijgen in de impact van Ramadan vasten 
op de micro-organismen die aanwezig zijn in de darmen en de vagina, en welke gevolgen dit kan 
hebben daarvan voor de gezondheid van vrouwen. Na het aflopen van de studie zal de participant 
van ons een analyse krijgen van hun persoonlijk microbioom met een woordje uitleg over de 
bacteriën die we hebben gevonden. Op een later tijdstip zal er ook een algemene communicatie 
zijn over de resultaten van de studie. 
Steekproefgrootte berekening 
Power-analyses vormen een grote uitdaging voor microbioomstudies. Dit komt doordat de grootte 
en variantie van de effecten onbekend zijn, daarenboven ook sterk afhankelijk van het individu en 
bovendien voor bacterie verschillend. Om de hoeveelheid deelnemers te bepalen baseren we ons 
op gelijkaardige studies die het effect van intermittent fasting zoals de Ramadan op het microbioom 
onderzoeken. Bijvoorbeeld, in de cross-sectional study door Mohammed-zadeh et al. (2021) 
werden stoelgangstalen van 30 participanten verzameld voor en na de Ramadan, om het effect van 
vasten op het darm microbioom te onderzoeken. Dit was voldoende om veranderingen in het 
microbioom waar te nemen tijdens het vasten verlaagt. Studies die het darm microbioom tijdens de 
Ramadan analyseerde hadden van 9 (Ozkul et al. 2020) tot 67 deelnemers (Ali et al. 2021). Naar 
ons beste weten zijn er nog geen studies uitgevoerd die het effect van Ramadan vasten op het 
vaginale en darm microbioom onderzochten. Daarom kiezen wij om 50 vrijwilligers te includeren 
om de vragenlijsten in te vullen en de stalen af te nemen, en 300 vrijwilligers om de vragenlijsten 
Gewijzigde veldcode
Gewijzigde veldcode

 
 
Protocol van de studie – Versie 3 – 13 februari 2025                                                           Pagina 5 van 7 
 
in te vullen zonder stalen af te nemen. In de voorgaande fase van het Rufaida project (enkele 
vragenlijsten) waren 245 participanten geregistreerd.  
Analyse van de stalen 
Labo Toegepaste Microbiologie en Biotechnologie Prof. Sarah Lebeer, Faculteit Wetenschappen, 
Departement Bio-ingenieurswetenschappen, UAntwerpen 
Deel 1: Microbioomanalyse 
Microbieel DNA zal geïsoleerd worden van verschillende lichaamslocaties en -vloeistoffen 
(vaginale wisser, fecaal staal en urine container). De samenstelling van de microbiële gemeenschap 
(bacteriën, virussen, schimmels, etc.) zal worden geanalyseerd op basis van het genetisch materiaal 
van deze microbiële gemeenschap aanwezig in de verzamelde stalen. Hiervoor zal het totale DNA 
van de stalen geïsoleerd worden via commercieel beschikbare DNA-extractie-kits (bv. Qiagen 
PowerFecal PRO of Qiagen PowerSoil PRO DNA kit of gelijkaardig). Het geïsoleerde DNA zal 
vervolgens geanalyseerd worden via amplicon en shotgun sequenering (bv. Illumina en Nanopore 
sequencing platforms) om zo specifiek mogelijk de aanwezige micro-organismen en hun genomen 
in kaart te brengen. Het geïsoleerde DNA zal vervolgens geanalyseerd worden via amplicon 
sequenering (gebaseerd op het 16S rRNA gen) en shotgun sequenering. Het 16S rRNA gen bestaat 
uit 9 verschillende variabele regio’s, die gebruikt kunnen worden voor de microbiële karakterisatie 
en die geflankeerd worden door geconserveerde regio’s. Deze laatste worden als target gebruikt 
voor ‘polymerase chain reaction’ (PCR)-primers met een universele specificiteit voor bijna alle 
bacteriën. Er zal gebruik gemaakt worden van het Illumina sequencing platform bij een externe 
partner (bijvoorbeeld Prebiomics) en in het Centrum voor Medische Genetica. Het protocol voor 
microbioomanalyse van humane stalen werd geoptimaliseerd in de onderzoeksgroep (Ahannach et 
al., 2021) en zal in deze studie geïmplementeerd worden.   
Mijlpaal: Identificatie van verschillen in de microbioomsamenstelling van de verschillende 
lichaamslocaties en -vloeistoffen van de vrijwilligers  
Deel 2: Kwantitatieve analyse van concentratie specifieke micro-organismen 
Via “quantitative real-time polymerase chain reaction” (qPCR) zal m.b.v. stam-, species- of genus-
specifieke primers de concentratie van bepaalde micro-organismen. Bij qPCR wordt de 
hoeveelheid van een specifiek stuk DNA in ‘real time’ gemeten. Hierdoor kan de initiële 
concentratie van dit specifiek DNA bepaald worden. De resultaten geven zo dan een beeld over de 
concentratie van verschillende micro-organismen in een staal. Voor de verwerking van deze data 
zullen de “Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments” 
(MIQE) richtlijnen gebruikt worden, zoals beschreven (Bustin et al., 2009). 
Mijlpaal: Absolute abundantie van micro-organismen in verschillende lichaamslocaties en -
vloeistoffen van de vrijwilligers  
Deel 3: Cultiveren van melkzuurbacteriën en andere beneficiaire micro-organismen uit vaginale 
stalen 

 
 
Protocol van de studie – Versie 3 – 13 februari 2025                                                           Pagina 6 van 7 
 
De huidige probiotische stammen, meestal melkzuurbacteriën, zijn typisch geïsoleerd van de 
gastro-intestinale niche van ons lichaam. Voor toepassingen van probiotica in de vagina zou het 
echter interessant zijn om melkzuurbacteriën te isoleren uit de vagina. Hierbij is het verwacht 
voordeel dat niche-specifieke stammen beter zijn aangepast aan de condities in de vagina en beter 
zijn opgewassen tegen de daar ook aanwezige pathogene bacteriën. Melkzuurbacteriën zijn 
interessant omdat ze een GRAS status hebben (‘Generally Recognized As Safe’) en talrijke 
gezondheidseffecten uitgebreid zijn beschreven, maar ook omdat recente studies hebben 
aangetoond dat lagere hoeveelheden melkzuurbacteriën gepaard gaan met meer vaginale infecties. 
Bijgevolg zullen we vaginale wissers van de vrijwilligers uitplaten op selectieve media voor 
melkzuurbacteriën, zoals MRS (de Man Rogosa and Sharpe), LAMVAB medium en bloedagar. 
Hiervoor zal de wisser opgelost worden in PBS (Phosphate Buffered Saline) en na grondig mengen 
zal een verdunningsreeks uitgeplaat worden. Verschillende kolonies zullen aangestipt worden en 
verdere identificatie op species level zal gebeuren via kolonie-PCR met universele primers voor 
het 16S rRNA gen (bijvoorbeeld 8F-1525R), gevolgd door Sanger sequenering en alignatie t.o.v. 
een referentiegenoom (bijvoorbeeld d.m.v. BLAST, EZBioCloud of een in-house pipeline).  
Mijlpaal: Cultiveren van minimum 50 vaginale melkzuurbacteriën 
Deel 4: Identificatie en kwantificatie van metabolieten uit wissers/lichaamsvloeistoffen  
Naast de identificatie en kwantificatie van specifieke micro-organismen uit wissers en staalnames 
is het ook interessant om te kijken naar welke metabolieten geproduceerd worden door deze micro-
organismen en in welke concentratie. Dit kan achterhaald worden met behulp van metabolomics. 
Concreet zal  (“Ultra-high performance”) vloeistofchromatografie en (hoge-resolutie) 
massaspectrometrie toegepast worden op de afgenomen stalen/supernatans van oplossingen die 
verder zullen bereid worden door extractie met een koud organisch oplosmiddel na toevoeging van 
een 
intern 
standaardmengsel. 
Geschikte 
software 
(bijvoorbeeld 
de 
MassHunter 
Quantitative/Qualitative Analysis Software) zal vervolgens worden gebruikt voor identificatie en 
kwantificatie van metabolieten, gevolgd door piekuitlijning, waardoor metabolietannotatie en 
statistische analyses mogelijk zijn. Vervolgens zal de data aan de hand van bio-informatische 
hulpmiddelen verder geanalyseerd en gevisualiseerd worden. Naast deze microbieel geproduceerde 
metabolieten zullen ook metabolieten afkomstig van de voeding, de omgeving en dergelijke 
bestudeerd worden met bijbehorende identificatie en/of kwantificatie.  
Wat betreft de korte-keten vetzuren zal de modulatie van lokale levels onderzocht worden in 
vaginale wissers en stoelgangstoelgangstoelgang stalen. Dit zal gebeuren aan de hand van 
(un)targeted metabolomics analyse met technieken zoals massaspectrometrie (LC-MS en GC-MS) 
om zo het verdere effect op het microbioom, metaboloom en de algemene gezondheid te bepalen. 
Mijlpaal: Identificatie en kwantificatie van metabolieten in verschillende lichaamslocaties en -
vloeistoffen van de vrijwilligers, met een gerichtere focus op riboflavine en korte-keten vetzuren  
Referenties 

 
 
Protocol van de studie – Versie 3 – 13 februari 2025                                                           Pagina 7 van 7 
 
Ahannach, S., Delanghe, L., Spacova, I., Wittouck, S., Van Beeck, W., De Boeck, I., & Lebeer, S. 
(2021). Microbial enrichment and storage for metagenomics of vaginal, skin, and saliva 
samples. iScience, 24(11), 103306. https://doi.org/10.1016/j.isci.2021.103306 
Bustin, S. A., Benes, V., Garson, J. A., Hellemans, J., Huggett, J., Kubista, M., Mueller, R., Nolan, 
T., Pfaffl, M. W., Shipley, G. L., Vandesompele, J., & Wittwer, C. T. (2009). The MIQE guidelines: 
minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical 
chemistry, 55(4), 611–622. https://doi.org/10.1373/clinchem.2008.112797 
Ozkul, C., Yalinay, M., & Karakan, T. (2020). Structural changes in gut microbiome after Ramadan 
fasting: A pilot study. Beneficial Microbes, 11(3), 227–233. https://doi.org/10.3920/BM2019.0039 
Mohammadzadeh, A., Roshanravan, N., Mesri Alamdari, N., Safaiyan, A., Mosharkesh, E., Hadi, 
A., Asghari Jafarabadi, M., & Meshkani, R. (2021). The interplay between fasting, gut microbiota, 
and 
lipid 
profile. 
International 
Journal 
of 
Clinical 
Practice, 
75(10), 
e14591. 
https://doi.org/10.1111/ijcp.14591 
Ali, I., Madkhali, N., Alreshidi, M., & Siddiqui, M. A. (2021). Ramadan fasting leads to shifts in 
human gut microbiota structured by dietary composition. Frontiers in Microbiology, 12, 642999. 
https://doi.org/10.3389/fmicb.2021.642999