Treatment of Primary Liver Tumors With Electrochemotherapy (ECT)
Phase: PHASE1
Conditions: Liver Cancer
Sponsor: Masa Bosnjak

 
November 6, 2014 
Clinical Study Protocol 
 
 
Zdravljenje primarnih jetrnih tumorjev z elektrokemoterapijo (ECT) 
 
The Treatment of Primary Liver Tumours with Electrochemotherapy (ECT) 
Acronym: PLECT 
Clinical Trials number: NCT02291133 
 
Principal investigator: 
Mihajlo Đokić, MD 
Assist. Prof. Blaž Trotovšek, MD, PhD 
Coordinators of the clinical part of the study: 
 
Study coordinators: 
Head physician Dragoje Stanisavljević, MD 
Assist. Valentin Sojar, MD 
Prof. Gregor Serša, PhD 
Prof. Borut Štabuc, MD, PhD 
Institution: 
University Medical Centre Ljubljana 
Participating institutions: 
Institute  of  Oncology  Ljubljana,  (Prof.  Gregor 
Serša, PhD) 
University  of  Ljubljana,  Faculty  of  Electrical 
Engineering, Laboratory of Biocybernetics (Prof. 
Damijan Miklavčič, PhD) 
 
Phone number: 
5223168 (Mihajlo Đokić) 
5223756 (head physician Dragoje Stanisavljević) 
5879 434 (Prof. Gregor Serša, PhD) 
E‐mail: 
mihajlo.djokic@kclj.si 
gsersa@onko‐i.si 
 
 

 
November 6, 2014 
Table of Contents 
 
1 PURPOSE OF THE STUDY 
4 
2 STARTING POINTS 
5 
The Principles of Electroporation and Electrochemotherapy (ECT) 
5 
Clinical Applications of ECT 
5 
Treatment of Primary Malignant Liver Tumours 
6 
Planning ECT Treatment 
7 
Electroporation Pulse Synchronization Using Electrocardiogram (ECG) 
8 
3 PATIENT SELECTION 
10 
3.1 Inclusion Criteria 
10 
3.2 Exclusion Criteria 
11 
3.3 Examinations and Tests Before Treatment 
11 
4 TREATMENT PLAN 
12 
5 TREATMENT: ELECTROCHEMOTHERAPY (ECT) 
13 
5.1 Chemotherapeutic Agents 
13 
5.2 Electroporation 
13 
5.2.1 Electric Pulse Generator 
13 
5.2.2 Electrodes 
13 
5.2.3 Electroporation Pulses 
14 
5.3 The Synchronization of Electroporation Pulses with ECG and Holter ECG Recording 
15 
6 FOLLOW‐UP AFTER TREATMENT 
15 
6.1 Effects of Treating Primary Liver Tumours Using ECT 
15 
6.2 The Effects of Electroporation Pulses, BLM or ECT as a Whole on Cardiac Function 
17 
6.3 Recording ECT Adverse Effects will be Performed According to the Criteria of the National 
Cancer Institute (NCI) 
17 
7 DATA PROCESSING 
18 
What do I need to know about the clinical study? 
19 
What is the purpose of the study? 
19 
How long will the cooperation last? 
20 

 
November 6, 2014 
How will the treatment take place? 
20 
What are the potential benefits of the study for me? 
21 
What are the potential risks or adverse effects associated with the study? 
21 
What are my responsibilities if I decide to participate in the study? 
22 
What are my options if I choose not to participate in the study? 
22 
What if new information becomes available during the study? 
22 
How will my privacy be protected? 
22 
Voluntary participation and termination of participation: 
22 
Will I need to pay to participate in the study? 
23 
Who can I contact if I have a question a question about any detrimental effect or reaction 
associated with the study? 
23 
Who can I contact to report a breach of data protection policy: 
23 
Who can I contact if I have a question about my patient rights? 
23 
Patient Consent for Participating in the Study 
24 

 
  
 
1 PURPOSE OF THE STUDY 
 
The  purpose  of  this  clinical  study  is  to  evaluate  the  safety  and  efficacy  of  bleomycin‐based 
electrochemotherapy (ECT) in treating primary liver tumours in a phase I and II clinical study. 
 
This will be achieved by: 
 
applying  treatment  in  a  controlled  manner  based  on  pre‐clinical  and  clinical  experience 
obtained in the ESOPE project; 
 
evaluating the procedures and results achieved; 
 
preparing standardized procedures; 
 
disseminating these new approaches to treatment using written and audio‐visual materials, 
as well as by attending and organizing expert meetings.  
 
The  study  is  designed  as  an  institutional  study  (at  the  University  Medical  Centre  Ljubljana) 
conducted  in  cooperation  with  the  Institute  of  Oncology  Ljubljana  and  the  Faculty  of  Electrical 
Engineering (University of Ljubljana), as well as an industrial partner, IGEA s.r.l., Carpi, Italy, which 
will provide technical support for the study. In phase I, 10 patients will be included in the study, and 
in phase II (i.e. the extension of the study), an additional 15 patients who meet the inclusion criteria 
will be included. 
 
The study will be carried out within the P3‐0003 “Razvoj in ovrednotenje novih terapij za zdravljenje 
malignih tumorjev” (Development and Evaluation of New Therapies for Treating Malignant Tumours) 
research programme headed by Prof. Gregor Serša, PhD. 
 
Principal investigators: 
 
Mihajlo Đokić, MD (surgeon) 
 
Assist. Prof. Blaž Trotovšek, MD, PhD (surgeon) 
Study coordinators:  
Prof. Gregor Serša, PhD (researcher) 
Prof. Borut Štabuc, PhD (gastroenterologist) 
Coordinators of the clinical part of the study: 
Head physician Dragoje Stanisavljević (surgeon) 
Assist. Valentin Sojar, (surgeon) 
Colleagues: 
 
University Medical Centre Ljubljana 
 
 
Rado Janša, PhD (gastroenterologist) 
Peter Popović (radiologist) 
Miha Petrič (surgeon) 
Assist. Robert Juvan (surgeon) 
Assist. Prof. Aleš Tomažič, PhD (surgeon) 
Head physician Vojka Gorjup, PhD (cardiologist) 
 
Institute of Oncology Ljubljana 
Prof. Eldar Gadžijev, PhD (surgeon) 
Assist. Ibrahim Edhemović (surgeon) 
Erik Brecelj, PhD (surgeon) 
 
Tjaša Pečnik (research nurse) 

 
  
 
Prof. Maja Čemažar, PhD (researcher) 
 
 
Faculty of Electrical Engineering, University of Ljubljana 
Prof. Damijan Miklavčič, PhD (researcher) 
Prof. Tomaž Jarm, PhD (researcher) 
Barbara Mali, PhD (researcher) 
Denis Pavliha (researcher) 
Bor Kos (researcher) 
Marija Marčan (researcher) 
 
2 STARTING POINTS 
The Principles of Electroporation and Electrochemotherapy (ECT) 
By exposing a cell to an external electric field, a transmembrane voltage is established on the cell 
membrane. When the threshold value is exceeded, this voltage causes electroporation of the cell 
membrane, i.e. the formation of hydrophilic pores, which allow the increased passage of molecules 
into the cell.1  
The  principle  of  electrochemotherapy  (ECT)  is  based  on  exposing  the  tumour  to  pulses  of 
electroporation  delivered  by  specific  electrodes.  This  allows  the  passage  of  previously  applied 
hydrophilic cytostatics, e.g. bleomycin and cisplatin, into the cells.2 Because the intake of cytostatics 
is only increased in the areas exposed to the electroporation pulses, ECT is a local treatment method. 
In addition to the direct action of cytostatics on tumour cells, ECT has an indirect vascular‐disrupting 
effect,  because  cytostatics  act  on  the  endothelial  cells  in  the  tumour  vasculature.3  The  doses  of 
cytostatics used in ECT are extremely low, resulting in minimal or no systemic toxicity.4 Furthermore, 
the application of electroporation pulses reduces the blood flow in the tumour, which keeps the 
cytostatics in the tumour for a longer period, thus making the treatment more effective.3 
Clinical Applications of ECT 
In the early 1990s, the team at the Institute of Oncology Ljubljana headed by Prof. Serša, PhD, played 
an active part in pioneering clinical studies on treating cutaneous and subcutaneous tumours with 
ECT.5 According to the findings of these first clinical trials, an 80% objective response of the treated 
tumour nodules is achieved using ECT.6 Our team also helped draw up and publish standard surgical 
procedures  for  treating  cutaneous  and  subcutaneous  tumours  using  ECT.  Today,  ECT  is  a  well‐
established method for treating malignant melanoma metastases, especially as part of palliative care, 

 
  
 
in 15 European countries. In 2012, 2500 patients were treated with ECT and, according to several 
databases, ECT is now used in 135 oncology centres.   
The first recorded clinical case of treating a deep‐seated tumour with ECT involved treating melanoma 
metastases in thigh muscles.7 Experience in treating other types of soft tissue tumours with ECT is 
good but limited to a few clinical cases and studies involving a small number of patients.8–11 In addition 
to treating deep‐seated soft tissue tumours, ECT is used to treat deep‐seated tumours in the internal 
organs. Brain and liver metastases have already been shown to be effective targets of ECT.12–14 The 
results of a clinical study on electrochemotherapy used to treat liver metastases of stage I and II 
colorectal cancer prove the safety and efficacy of this approach. Preliminary results have already been 
published  for  the  case  of  one  patient,  where  the  treatment  procedure  is  described  in  detail.14 
Conclusions on safety and efficacy are in the process of publication for the first 17 patients treated 
with electrochemotherapy. No serious side effects attributable to ECT were observed in the study, 
and  the  efficacy  results  suggest  an  80%  response  from  the  treated  metastases  to  ECT,  which  is 
comparable to that of skin metastases. 
Treatment of Primary Malignant Liver Tumours 
 
Primary malignant liver tumours (carcinomas) represent a larger group of tumours that originate from 
various  liver  cells.  Among  such  tumours,  hepatocellular  carcinoma  (90%)  and  intrahepatic 
cholangiocarcinoma  (8.5%)  are  the  most  common,  while  other  primary  liver  carcinomas  are 
significantly rarer. Liver tumours are the sixth most common cancer in the world and represent the 
third  most  common  cause  of  death  from  cancer.  The  incidence  of  liver  tumours  is  increasing 
worldwide, including in Slovenia, where the incidence is 9.3 in men and 4.6 in women per 100,000 
people  per  year.  The  current  treatment  strategy  is  based  on  the  resection  of  the  affected  liver 
parenchyma or radiofrequency ablation – these being the two methods of definitive treatment or 
bridging therapy to possible liver transplantation. Depending on the stage of the disease, transarterial 
chemoembolization  (TACE),  hepatic  intra‐arterial  injection  of  lipiodol  and  systemic  therapy  with 
sorafenib are also considered palliative treatments. Radical liver resection or liver transplantation are 
the only promising treatment methods with a 5‐year survival rate that can be greater than 50%. 
Radiofrequency ablation (RFA) can be used as a definitive treatment method (it can be repeated) or 
as bridging therapy to possible life‐saving liver transplantation. RFA and percutaneous ethanol‐lipiodol 
injection are suitable for smaller tumours and for tumours in specific locations (the proximity of blood 
vessels, subcapsular location). RFA is also offered to patients with individual smaller metastases as a 

 
  
 
local form of treatment. Tumours that grow into the inferior vena cava or into the area of the large 
hepatic  and  portal  veins,  or  on  which  RFA  has  little  or  no  effect  due  to  cooling,  are  particularly 
problematic. Therefore, new and more effective approaches to treating liver metastases are being 
sought for such patients. Distant cancer is usually treated with systemic chemotherapy or biological 
drugs, which are only partially successful while producing high systemic toxicity. 
At the University Medical Centre Ljubljana, in cooperation with the Institute of Oncology Ljubljana, a 
phase I (10 patients) / II clinical study will be designed to assess the safety and efficacy of treatment 
for primary liver tumours using ECT. We aim to include an additional fifteen (15) patients within phase 
II using this protocol. The study aims to prove that treating primary liver tumours using ECT is a safe 
method even in hard‐to‐reach locations. Using imaging, we will also assess the response to therapy 
and the asymptomatic interval. 
Planning ECT Treatment 
The ECT treatment of deep‐seated tumours in internal organs requires planning based on diagnostic 
radiology imaging. The electrode type is selected based on the precise location and measured size of 
the tumour nodules; for tumours located up to 3 cm (the lower edge of the metastasis) below the 
surface of the liver, which are more easily accessible to ECT, short‐needle electrodes with a fixed 
hexagonal  geometric  arrangement  are  appropriate,  while  for  hard‐to‐reach  and  deep‐seated 
metastases, long‐needle electrodes with arbitrary geometric arrangement have recently been made 
available. In line with technological advances and the development of new types of electrodes, experts 
at the Italian company IGEA designed a new electric pulse generator called the Cliniporator VITAE for 
treating  larger  and  deep‐seated  tumours.  The  generator  meets  the  essential  requirements  for 
consumer safety, health and environmental protection as defined by the EU guidelines or regulations, 
as it has the CE mark. 
The distribution of the electrical field within the tissue is an important predictor for the success of ECT 
tumour treatment, as the change in the transmembrane potential of the cell membrane, which is a 
prerequisite  for  successful  electroporation,  is  directly  proportional  to  the  strength  of  the  electric 
field.19 Numerical modelling is currently the only effective method for predicting the electric field 
distribution in tissue, as its structure is, by definition, inhomogeneous, nonlinear and in some cases 
anisotropic.  When  using  long‐needle  electrodes  with  an  arbitrary  geometric  arrangement,  it  is 
necessary  to  determine  the  depth  of  electrode  insertion  into  the  tumour  nodule,  as  well  as  the 

 
  
 
voltage, length and frequency of the supplied electroporation pulses based on numerical modelling in 
order to achieve the optimal coverage of the tumour nodules with the electric field.7 
Electroporation Pulse Synchronization Using Electrocardiogram (ECG) 
In ECT treatment, the electric current reaches the area around the target due to the high electrical 
conductivity  of  the  tissue.  This  increases  the  likelihood  of  possible  interactions  between  the 
electroporation pulses and the heart function when treating deep‐seated tumours in internal organs 
due to the anatomical proximity of the heart. In our clinical study, we will use a synchronization 
procedure  built  into  the  electroporation  pulse  generator  (Cliniporator  VITAE)  to  avoid  cardiac 
dysfunction caused by ECT. So far, this procedure has proven to be effective in preventing cardiac 
pacing during the ‘ventricular sensitivity’ period.14 Nevertheless, further research is urgently needed 
to verify the effectiveness of the existing synchronization procedure and to determine any short‐ or 
long‐term effects of electroporation pulses on the heart function.  
Preliminary  results  suggest  that  ECT  does  not  seriously  affect  cardiac  function  though  there  are 
statistically significant changes in some parameters of heart rate variability during and after therapy 
relative to the pre‐therapy parameter values.  
The analysis of ECG signals recorded during ECT applied to liver tumours shows short‐term effects on 
the cardiac function, even though the delivery of the electroporation pulses was synchronized with 
the ECG. The effects were expressed as a temporary shortening of the corrected QT interval and an 
increase in short‐term heart rate variability. The analysis of the ECG signals recorded before and after 
ECT was applied to liver tumours indicates that ECT has longer‐term effects on cardiac function, which 
are expressed as increased heart rate or a shortened RR interval and as reduced long‐term heart rate 
variability parameters (low‐frequency component). We find that these changes are most likely at least 
partly attributable to the effects of analgesics and other medications received by patients in intensive 
care,  as  well  as  to  postoperative  pain,  and  not  to  the  effects  of  the  electrochemotherapy  itself, 
although these results have yet to be confirmed. These results could be confirmed by capturing ECG 
signals before, during and after abdominal surgery, which would include procedures similar to those 
performed during the ECT of liver tumours. The only difference should be that ECT is not performed 
during these surgical procedures. The ECG signals captured in this way would serve as a control and 
would allow these assumptions to be confirmed. 
 

 
  
 
1. 
Kotnik T, Pucihar G, Miklavcic D. Induced transmembrane voltage and its correlation with 
electroporation‐mediated molecular transport. J Membr Biol 2010; 236(1): 3–13. 
2. 
Sersa G, Stabuc B, Cemazar M, Jancar B, Miklavcic D, Rudolf Z. Electrochemotherapy with cisplatin: potentiation 
of local cisplatin antitumour effectiveness by application of electric pulses in cancer patients. Eur J Cancer 1998; 34(8): 
1213–8. 
3. 
Sersa G, Jarm T, Kotnik T, Coer A, Podkrajsek M, Sentjurc M et al. Vascular disrupting action of electroporation 
and electrochemotherapy with bleomycin in murine sarcoma. Br J Cancer 2008; 98(2): 388–98. 
4. 
Marty M, Sersa G, Garbay J, Gehl J, Collins C, Snoj M et al. Electrochemotherapy – An easy, highly effective and 
safe treatment of cutaneous and subcutaneous metastases: Results of ESOPE (European Standard Operating Procedures of 
Electrochemotherapy) study. Ejc Supplements 2006; 4(11): 3–13. 
5. 
Rudolf Z, Štabuc R, Čemažar M, Miklavčič D, Vodovnik L, Serša G. Electrochemotherapy with bleomycin. The first 
clinical experience in malignant melanoma patients. Radiol Oncol 1995; 29: 229–35. 
6. 
Sersa G, Miklavcic D. Electrochemotherapy of tumours. J Vis Exp 2008; (22). 
7. 
Miklavcic D, Snoj M, Zupanic A, Kos B, Cemazar M, Kropivnik M et al. Towards treatment planning and treatment 
of deep‐seated solid tumours by electrochemotherapy. Biomed Eng Online 2010; 9: 10. 
8. 
Shimizu T, Nikaido T, Gomyo H, Yoshimura Y, Horiuchi A, Isobe K et al. Electrochemotherapy for digital 
chondrosarcoma. J Orthop Sci 2003; 8(2): 248–51. 
9. 
de Bree R, Tijink BM, van Groeningen CJ, Leemans CR. Electroporation therapy in soft tissue sarcoma: a 
potentially effective novel treatment. Sarcoma 2006; 2006: 85234. 
10. 
Curatolo P, Quaglino P, Marenco F, Mancini M, Nardò T, Mortera C et al. Electrochemotherapy in the treatment 
of Kaposi sarcoma cutaneous lesions: a two‐center prospective phase II trial. Ann Surg Oncol 2012; 19(1): 192–8. 
11. 
Campana LG, Mocellin S, Basso M, Puccetti O, De Salvo GL, Chiarion‐Sileni V et al. Bleomycin‐based 
electrochemotherapy: clinical outcome from a single institution's experience with 52 patients. Ann Surg Oncol 2009; 16(1): 
191–9. 
12. 
Soden DM, Larkin JO, Collins CG, Tangney M, Aarons S, Piggott J et al. Successful application of targeted 
electrochemotherapy using novel flexible electrodes and low dose bleomycin to solid tumours. Cancer Lett 2006; 232(2): 
300–10. 
13. 
Agerholm‐Larsen B, Iversen HK, Ibsen P, Moller JM, Mahmood F, Jensen KS et al. Preclinical validation of 
electrochemotherapy as an effective treatment for brain tumours. Cancer Res 2011; 71(11): 3753–62. 
14. 
Edhemovic I, Gadzijev EM, Brecelj E, Miklavcic D, Kos B, Zupanic A et al. Electrochemotherapy: a new 
technological approach in treatment of metastases in the liver. Technol Cancer Res Treat 2011; 10(5): 475–85. 
15. 
Ferlay J, Parkin DM, Steliarova‐Foucher E. Estimates of cancer incidence and mortality in Europe in 2008. Eur J 
Cancer 2010; 46(4): 765–81. 
16. 
Gatta G, Capocaccia R, Sant M, Bell CM, Coebergh JW, Damhuis RA et al. Understanding variations in survival for 
colorectal cancer in Europe: a EUROCARE high resolution study. Gut 2000; 47(4): 533–8. 
17.            Briux J, Sherman M. Management of Hepatocellular Carcinoma: an update. Hepatology 2011; 53(3): 1020–2 
18. 
Miklavcic D, Beravs K, Semrov D, Cemazar M, Demsar F, Sersa G. The importance of electric field distribution for 
effective in vivo electroporation of tissues. Biophys J 1998; 74(5): 2152–8. 
 
 
 
 

 
  
 
3 PATIENT SELECTION 
The suitability of patients for inclusion in the study will be assessed using inclusion and exclusion 
criteria. 
3.1 Inclusion Criteria 
1. Patients 
with 
primary 
liver 
tumours; 
hepatocellular 
carcinoma, 
intrahepatic 
cholangiocarcinoma and other primary tumours, up to 7 cm in size, that are difficult to resect 
due to their position (likelihood of insufficient healthy liver after resection) or inaccessible for 
treatment  with  standard  ablation  techniques  because  they  are  located  on  large  hepatic 
vascular structures (portal veins, hepatic veins or their presence in the inferior vena cava or 
its  immediate  vicinity,  subcapsular  location  of  many  smaller  tumours),  but  are  otherwise 
operable. 
2. Patients in which imaging has conformed disease progression after prior therapy with TACE, 
RFA or percutaneous alcohol injection and who are not candidates for potentially curative 
treatment, but have a satisfactory performance status and a Child‐Pugh score of less than 8. 
Patients in groups 1 and 2 are patients for whom the standard treatment options (systemic 
and/or  surgical)  have  been  exhausted.  ECT  will  be  offered  to  these  patients  as  the  only 
therapeutic option. If a patient has a large number of tumours, the tumours that are both 
unresectable and unsuitable for RFA will be treated with ECT, while any other metastases will 
be resected or treated with RFA. 
3. Patients with smaller tumours that are not suitable for RFA or percutaneous alcohol injection 
due to their location (used as bridging therapy to liver transplantation) 
4. Patients with tumours that are larger than 4 cm in hard‐to‐reach locations (unsuitable for 
surgical resection) and unsuitable for other treatment methods. 
Patients in groups 3 and 4 are potentially curable using standard treatment. The added ECT 
used on these patients will not affect the standard treatment recommended in the current 
guidelines. 
5. The patient is offered ECT treatment even if the patient refuses standard treatment options. 
6. A primary liver tumour confirmed histologically and/or by a multidisciplinary team for liver 
disease based on radiological and laboratory diagnostics. 
7. Age above 18 years. 
8. Life expectancy over 3 months. 
9. Performance  status  (PS)  ≥  70  according  to  Karnofsky  PS  or  <  2  according  to  WHO 
recommendations. 
10. Depending on the type of active substance, 2‐5 weeks have passed since the last treatment, 
if any. 
11. The patient must understand the treatment process and any side effects. 
12. The patient must be able to give consent to participate in a clinical trial (‘informed consent’). 
13. Prior to inclusion in the study, the patient should be treated by a multidisciplinary team for 
gastrointestinal tumours. 
 

 
  
 
3.2 Exclusion Criteria 
1. Any previously confirmed form of cancer other than surgically treated non‐invasive uterine 
cancer or basal cell carcinoma treated with surgery or radiotherapy. 
2. Proven visceral and/or bone metastases or diffuse metastases.  
3. Life‐threatening  infection  and/or  heart  failure  and/or  liver  failure  and/or  other  life‐
threatening systemic conditions. 
4. Clinically significant ascites. 
5. Significantly reduced lung function. 
6. Age under 18 years. 
7. Major coagulation system disorders (coagulation system disorders that do not respond to 
standard therapy, such as vitamin K replacement or fresh frozen plasma). 
8. Received cumulative dose of bleomycin ≥ 250 mg/m2. 
9. Allergic reactions to previous treatment with bleomycin. 
10. Chronic decrease affecting renal function (creatinine > 150 µmol/L). 
11. Epilepsy. 
12. Heart rhythm disorders. 
13. Implanted pacemaker or defibrillator. 
14. Pregnancy. 
15. Patients who are unable to understand the purpose of the study or do not agree to participate 
in the study. 
 
3.3 Examinations and Tests Before Treatment 
Two weeks before inclusion in the study, the following will be performed: 
 
clinical examination, anamnesis 
 
radiological imaging techniques to discover liver metastases: 
‐ 
dynamic contrast‐enhanced ultrasound (DCE‐US) 
‐ 
computed tomography (CT) perfusion 
‐ 
magnetic resonance imaging 
 
Systemic disease evaluation 
o X‐ray or CT of the lungs 
o other examinations depending on the clinical picture (bone scintigraphy, PET/CT) 
 
One week before inclusion in the study, the following will be performed: 
 
laboratory tests: 
‐ 
haematological tests with a complete blood count 
‐ 
coagulation tests 

 
  
 
‐ 
biochemical tests: electrolytes, creatinine, transaminases 
‐ 
immunohistochemical examinations: tumour markers 
 
ECG 
 
4 TREATMENT PLAN 
Where there are liver tumours (up to 3 cm in maximum diameter) with the lower edge located up to 
3  cm  below  the  liver  capsule,  ECT  using  short‐needle  electrodes  with  a  hexagonal  geometric 
arrangement will be performed in line with the standard surgical procedures for treating cutaneous 
and subcutaneous tumours/metastases with ECT. 
Where there are larger liver tumours (up to 5 cm) located near the vena cava or along large hepatic 
or portal veins, ECT using long‐needle electrodes with an arbitrary geometric arrangement will be 
performed. Using numerical modelling, we will prepare a treatment plan to determine the optimal 
position of the electrodes and the required electric current voltage for the optimal electroporation of 
the target tissue. The preparation of a treatment plan using numerical modelling will take place in two 
basic steps (see below) based on radiological images captured up to 2 weeks before the procedure. 
1. Decomposing medical images and constructing a model: 
‐ 
importing medical radiology images into an appropriate program, 
‐ 
determining important areas,  
‐ 
pretreating and decomposing images, 
‐ 
constructing a 3D model. 
2. Planning treatment: 
‐ 
The 3D model will be supplemented with electrodes supplying electroporation pulses, as 
well  as  with  corresponding  tissue  properties  and  boundary  conditions  based  on  the 
calculation using the finite element method and the calculation processed by automatic 
algorithms for determining the criterion function, 
‐ 
the  possibility  of  statistical  and  probability  functions  to  determine  the  probability  of 
electroporation will be examined, the effect probability being a function of the electric 
field strength applied. 
 

 
  
 
 
Figure 1: Schematic representation of electrode placement in the middle and the periphery of a metastasis in healthy 
liver tissue. 
 
5 TREATMENT: ELECTROCHEMOTHERAPY (ECT) 
Patients meeting the inclusion criteria with primary liver tumours for which surgery is not possible due 
to the proximity of the main hepatic veins, for whom the success of other ablation techniques cannot 
be predicted, will undergo ECT. 
 
5.1 Chemotherapeutic Agents 
‐ 
The cytostatic used will be bleomycin (BLM) manufactured by Heinrich MackNachf. GmbH & Co. 
KG, Illertissen, Germany. 
‐ 
The BLM will be dissolved in saline solution and administered intravenously with a bolus injection 
at a dose of 15 mg/m2. 
‐ 
8‐28 min after BLM application, electroporation pulses will be delivered to the metastases.  
 
5.2 Electroporation 
5.2.1 Electric Pulse Generator 
‐ 
We will use the Cliniporator VITAE electric pulse generator manufactured by IGEA, Carpi, Italy, 
designed to treat larger and deep‐seated tumours, such as liver metastases. 
‐ 
It has the CE mark and is authorized for use in a clinical setting. 
5.2.2 Electrodes 
Two types of electrodes will be used: 
a) Short‐needle electrodes with a fixed hexagonal geometric arrangement: 

 
  
 
‐ 
for metastases with their lower edge located up to 3 cm below the liver capsule; 
‐ 
ECT will be performed in line with the standard surgical procedures for cutaneous 
and subcutaneous tumours/metastases; 
 
b) Long‐needle electrodes with an arbitrary geometric arrangement: 
‐ 
for deeper‐seated tumours and tumours located ≥ 3 cm below the liver capsule; 
‐ 
to ensure the safety margin, the required number of electrodes (presumably from 
4 to 6) will be inserted into the tumour and its surrounding area using ultrasound 
guidance in line with the treatment plan prepared based on numerical modelling 
before the procedure. 
 
 
Figure 2: Short‐needle electrodes with a fixed hexagonal geometric arrangement (a), long‐needle electrodes with an 
arbitrary geometric arrangement (b) and Cliniporator VITAE (c). 
5.2.3 Electroporation Pulses 
‐ 
Between each pair of electrodes, 8 rectangular electroporation pulses (length: 100 µs) will 
be supplied to the tumours in two sequences, each containing 4 electroporation pulses of 
reversed polarity and a repeating frequency of 1000 Hz. 
‐ 
The delivery of individual pulse sequences will be synchronized with the occurrence of 
successive heartbeats. 
‐ 
When using long‐needle electrodes with an arbitrary geometric arrangement, the voltage 
of the electroporation pulses for each electrode pair will be determined on the basis of 

 
  
 
numerical  modelling,  and  when  using  short‐needle  electrodes  with  a  fixed  hexagonal 
geometric arrangement, a voltage of 730 V will be supplied. 
‐ 
If  excessive  electric  current  (>  50  A)  makes  it  impossible  to  supply  a  sufficiently  high 
voltage, a larger number of lower‐voltage electroporation pulses will be supplied. 
 
5.3 The Synchronization of Electroporation Pulses with ECG and Holter ECG Recording 
‐ 
To ensure synchronization, the Cliniporator VITAE will be connected to an AccuSync 42 external 
unit, which produces trigger pulses based on the measured ECG signal to deliver electroporation 
pulses on the R wave of each heartbeat. 
‐ 
For interoperative patient monitoring, patients will be connected to AccuSync via three ECG 
electrodes independently of ECG capture. 
‐ 
On the selected ECG lead (standard leads I, II, III; the most suitable lead is chosen depending on 
the intensity of the R wave), AccuSync detects the R wave of individual heartbeats in the early 
phase of the increasing R wave slope and produces a trigger pulse.  
‐ 
The trigger pulse is brought to the Cliniporator VITAE, which uses its built‐in synchronization 
algorithm for the further verification of trigger pulse suitability and, meeting a series of 
conditions, produces electroporation pulses with a 50 ms delay behind the trigger pulse to avoid 
ventricular sensitivity (T wave range). 
‐ 
The ECG signal and trigger pulses will be captured and stored for later analysis of the 
synchronization algorithm function and of any immediate effects of the treatment on heart 
function. 
 
6 FOLLOW‐UP AFTER TREATMENT 
Follow‐up will be carried out at three levels. First, defining the early and late effects of treating primary 
liver tumours using ECT; second, evaluating the short‐ and/or long‐term effects of electroporation 
pulses, BLM or ECT as a whole on the heart function; and third, recording any adverse effects of ECT. 
 
6.1 Effects of Treating Primary Liver Tumours Using ECT 
‐ 
Early treatment effects will be assessed using DCE‐US or CT based on changes in tumour 
blood flow after ECT compared to the pre‐ECT blood flow. 

 
  
 
‐ 
Late effects will be assessed based on modified RECIST criteria, taking into account the 
change in the size and density of the treated tumour nodules before and after ECT. These 
will be assessed based on CT perfusion imaging; the volume of the metastases will be 
calculated using the formula 
, where a is the shorter and b the longer 
metastasis diameter. 
Based on the assessment of the late ECT effects, the response to treatment will be evaluated in 
line with the WHO classification: 
 
Complete response (CR): complete disappearance of the tumour nodule 
 
Partial response (PR): reduction of the tumour nodule size by more than 50% 
 
No change (NC): decrease in tumour nodule size by less than 50% or an increase in the tumour 
nodule size by less than 25% 
 
Progressive disease (PD): growth of the tumour nodule by more than 25% 
‐ 
The direct effect will be assessed by histological analysis of those metastases that are 
surgically removed. 
‐ 
EORTC Quality of Life questionnaire according to the QLQ C30 standards 
 
 
EXAMINATION/TEST 
Screening 
period 
until D −14 
D −1  
 
D7 
 
D30 
 
D60 
 
D90 
 
D120  
 
clinical examination, 
anamnesis 
X 
X 
X 
X 
X 
X 
X 
ECG 
X 
X 
 
 
 
 
 
DCE‐US 
X 
 
 
X 
X 
 
X 
CT perfusion / MRI 
X 
 
 
X 
 
 
X 
Blood count 
X 
X 
X 
 
 
 
 
Coagulation tests 
X 
X 
X 
 
 
 
 
Biochemical blood analysis 
X 
X 
X 
X 
X 
 
X 
EORTC QLQ C30 
questionnaire 
X 
 
X 
X 
 
 
 
*D = day 
 

 
  
 
6.2 The Effects of Electroporation Pulses, BLM or ECT as a Whole on Cardiac Function 
‐ 
To study the short‐term effect, we will use the ECG signal captured during surgery, which 
will cover the period before, during and immediately after ECT, including BLM injection 
and electroporation pulses. 
‐ 
To study possible late and/or long‐term effects, the ECG signal will be recorded using a 
standard Holter system in 24‐hour periods immediately before and after surgery. 5‐10 
patients will be included.  
ECG recordings will also be performed on 10‐15 patients who will undergo abdominal 
surgery without ECT at the Department of Abdominal Surgery, University Medical Centre 
Ljubljana.  
 
6.3 Recording ECT Adverse Effects will be Performed According to the Criteria of the National 
Cancer Institute (NCI) 
An adverse effect is an undesirable and unexpected sign, symptom or disease, regardless of the cause, 
that develops or worsens during the study and that includes pathological clinical observations and 
deviations in the values of laboratory‐measured parameters. The latter are only considered a side 
effect if they require additional treatment or result in the premature withdrawal of the patient from 
the study.  
We  will  record  any  side  effects  that  occur  during  the  study  and  up  to  30  days  after  the  end  of 
treatment. If a serious adverse reaction occurs more than 30 days after the end of treatment, the 
principal investigator will decide whether the complication is study‐related or not. 
We will record the start and end time of any adverse effect and the cause‐and‐effect relationship 
between the adverse effect and the ECT, cancer or other diseases, as well as assessing the severity of 
the adverse effect and describing the actions that will need to be taken. 
The causal relationship between the adverse effect and the ECT will be assessed using the following 
criteria: 
 
Not related to the study. 
 
Probably not related to the study. 
 
Possibly related to the study. 
 
Probably related to the study. 
 
Certainly related to the study. 

 
  
 
The severity of the side effects will be assessed using the following grades: 
 
Grade 1 – mild  
 
Grade 2 – moderate  
 
Grade 3 – a difficult complication requiring medical care 
 
Grade 4 – a life‐threatening condition requiring immediate medical assistance 
 
Grade 5 – death 
If  a  serious  adverse  effect  is  recorded  during  the  study,  the  principal  investigator  will  notify  the 
responsible person at the National Medical Ethics Committee of the Republic of Slovenia in writing 
within 24 hours. A serious adverse effect is a complication that results in the following: 
 
death, 
 
a life‐threatening condition requiring immediate medical assistance, 
 
hospitalization or extended hospitalization, 
 
the prolonged inability of the patient to perform any task that they were able to perform 
before the onset of the complication, 
 
any event or condition that endangers the life or health of the patient and that, according to 
a medical assessment, could lead to any of the serious complications referred to above. 
 
7 DATA PROCESSING 
The results of the proposed clinical trial will be analysed descriptively by describing the antitumour 
effect, any adverse effects and the patients’ quality of life after treatment of the primary liver tumours. 
 
8 STATISTICAL ANALSIS 
All data will be entered into a Microsoft Access 2010 database, which will be used for all calculations 
except for statistical analysis, which will be performed with GraphPad Software (La Jolla, CA, USA). The 
log‐rank (Mantel‐Cox) test will be performed on the Kaplan‐Meier estimates. A chi‐squared test will 
be used for the statistical comparison of response according to tumor location. A two‐tailed P value 
less than 0.05 will be considered to be statistically significant. 
 
 
 

 
  
 
Consent for Participating in a Clinical Study 
 
 
Treatment of Primary Liver Tumours with Electrochemotherapy 
 
What do I need to know about the clinical study? 
You are invited to participate in a clinical study (hereinafter: ‘the study’) in which the research team 
will  evaluate  the  efficacy  and  potential  toxicity  of  treating  primary  liver  tumours  with 
electrochemotherapy. The study is led by Mihajlo Đokić, MD, and coordinated by Prof. Gregor Serša, 
PhD. The head physician Dragoje Stanisavljević, MD, is coordinating the clinical part of the study. Other 
health  professionals  employed  at  the  University  Medical  Centre  Ljubljana  and  the  Institute  of 
Oncology Ljubljana, as well as researchers from the Faculty of Electrical Engineering, University of 
Ljubljana, are also involved in the study. 
It is important that you carefully read and understand this document before signing the consent. The 
document sets out the purpose, procedures, benefits, risks, adverse effects and precautions related 
to  the  study.  If  you  are  not  completely  honest  with  your  doctor  about  your  medical  condition, 
participating  in  the  study  may  be  detrimental  to  you.  If  this  document  contains  any  terms  or 
expressions  that  you  do  not  understand,  please  ask  your  doctor  or  a  healthcare  professional 
participating in the study to explain them to you before signing. 
Participation in the study is voluntary and you can decline to participate. Furthermore, you are free 
to withdraw from the study at any time and without giving a reason – this will not affect your further 
care or your relationship with your doctor at that institution.  
Details of the study are described below. It is important that you understand the information provided, 
as this is the only way you can make an informed decision on whether or not to participate. If you 
decide to participate, you will receive a copy of the signed consent.  
 
What is the purpose of the study? 
The purpose of the study is to determine the efficacy of bleomycin‐based electrochemotherapy and 
potential toxicity during surgery on primary liver tumours. 
 
Why was I asked to participate in the study? 
We suggest the treatment of primary liver tumours using electrochemotherapy because you have 
been identified as having one of the following conditions: 
a) Disease progression following TACE therapy. 
b) Primary liver tumours that are not suitable for other forms of treatment due to their location 
or that are not accessible to other conventional ablation techniques. 
c) Progression of the primary disease for which other treatment is either risky or expected to be 
less effective. 

 
  
 
d) An advanced form of the disease, which the BCLC staging system classifies as symptomatic 
treatment, but the patient’s WHO performance status is good (Child‐Pugh < 8, > 4; minor 
changes in the parenchyma). 
In this case, electrochemotherapy treatment will not affect the course of the disease; your 
treatment  would  be  in  line  with  the  standard  protocol,  completely  uninterrupted  and 
unchanged. By analysing the electrochemotherapy‐treated metastases, we would gain new 
information and knowledge that would help future patients with the same disease. 
 
How long will the cooperation last? 
Your participation in the study, including the screening period, will last approximately 4 months. 
 
How will the treatment take place? 
You will receive treatment while under general anaesthesia. The treatment involves an intravenous 
injection  of  the  chemotherapeutic  agent  bleomycin  and,  after  approximately  8  minutes,  the 
application of electrical pulses via sterile stainless‐steel electrodes inserted into the metastases.  
 
Appointments and procedures during the study 
Prior to inclusion in the study, your case will be reviewed by a by a multidisciplinary team for liver 
disease, who will assess whether it makes sense for you to take part in the study. 
 
During the study, you will have at least 7 appointments over a period of 4 months. 
The treatment consists of the following: 
 1st appointment: screening (up to 2 weeks before treatment) 
If  you  agree  to  participate  in  the  study,  your  doctor  will  examine  you  to  see  if  you  are  a  viable 
candidate. You and your doctor will also discuss any previous illnesses and treatments. 
The examination will consist of the following. 
 General medical examination: measuring the electrical activity of the heart (ECG). 
 Venous blood collection for haematological and biochemical examinations and coagulation tests. 
 Radiological  examinations:  you  will  be  referred  for  computed  tomography  with  perfusion  (CT 
perfusion) or dynamic contrast‐enhanced ultrasonography (DCE‐US). 
 You will complete a quality‐of‐life questionnaire. 
 
 2nd appointment (1 day before treatment) 
 General medical examination: measuring the electrical activity of the heart (ECG). 
 Venous blood collection for haematological and biochemical examinations and coagulation tests. 
 
 3rd appointment (1 week after treatment) 

 
  
 
 General medical examination. 
 Venous blood collection for haematological and biochemical examinations and coagulation tests. 
 You will complete a quality‐of‐life questionnaire. 
 
 4th appointment (1 month after treatment) 
 General medical examination. 
 Venous blood collection for biochemical analysis. 
 Radiological examinations: you will be referred for CT perfusion and/or DCE‐US. 
 You will complete a quality‐of‐life questionnaire. 
 
 5th appointment (2 months after treatment) 
 General medical examination. 
 Venous blood collection for biochemical analysis. 
 Radiological examinations: you will be referred for DCE‐US. 
 
 6th appointment (3 months after treatment) 
 General medical examination. 
 Radiological examinations: you will be referred for CT perfusion. 
 
 7th appointment (4 months after treatment) 
 General medical examination. 
 Venous blood collection for biochemical analysis. 
 Radiological examinations: you will be referred for CT perfusion and DCE‐US. 
 
What are the potential benefits of the study for me? 
Electrochemotherapy  is  used  as  a  standard  method  to  treat  cutaneous  tumours.  Our  experience 
gained  from  having  treated  liver  metastases  using  electrochemotherapy  also  shows  the  possible 
effectiveness of electrochemotherapy in treating primary liver tumours. 
We cannot guarantee that the treatment will be effective in your case, but we hope that we will at 
least manage to reduce the size of the metastases. 
 
What are the potential risks or adverse effects associated with the study? 
As  with  any  medicine  or  treatment,  adverse  effects  may  occur  during  treatment,  so  we  cannot 
guarantee that you will not experience any adverse effects during the study.  
It is important that you inform the doctor monitoring you during the study about any symptoms or a 
new medicine prescribed by another doctor.  

 
  
 
 
What are my responsibilities if I decide to participate in the study? 
You will need to sign a consent form for participating in the study.  
You  will  need  to  visit  your  medical  institution  at  least  7  times  and  undergo  the  treatments  and 
procedures described in this document. 
You will not be allowed to participate in another study while participating in this one. 
Before taking any medicine that you have not taken before, you will need to consult with the doctor 
monitoring you during the study. 
You will need to report any changes in your general well‐being to the doctor monitoring you during 
the study.  
 
What are my options if I choose not to participate in the study? 
If you do not wish to participate in this study, you will continue to be treated by your doctor. Your 
health care and treatment will not be compromised. You are free to withdraw from the study at any 
time. Doing so will not affect your further medical care. 
 
What if new information becomes available during the study? 
Sometimes new information about the treatment in question comes up during the study. In this case, 
your doctor will inform you and you can discuss whether you wish to continue participating in the 
study. If you decide to withdraw from the study, your doctor will offer other treatment options. If you 
decide to continue participating in the study, you will be asked to confirm your continued participation 
in the study by signing an updated consent form. 
 
How will my privacy be protected? 
In  this  study,  your  personal  information  and  information  about  your  medical  condition  will  be 
documented anonymously (without your name, using only the number that you will be assigned upon 
entering the study). 
In  accordance  with  Slovenian  legislation,  all  data  collected  during  the  study  will  be  kept  strictly 
confidential. The results of the study, including photographs of tumour lesions, will be available for 
scientific evaluation purposes and will be published in health publications in an anonymized form. 
 
Voluntary participation and termination of participation: 
Participation in the study is voluntary. You can choose to withdraw from the study at any time. Doing 
so will not affect your current or future medical care. To withdraw from the study, please contact 
Mihajlo Đokić, MD, on +386 1 5223168. 
Please note that if you withdraw from the study, your doctor will still be able to use the information 
gathered while you were part of the study. 

 
  
 
Your participation in the  study  may be terminated without your  consent if  you fail to follow the 
instructions and protocol. Further, we may exclude you from the study without your consent if the 
treatment being studied is detrimental to you and has adverse effects. 
 
Will I need to pay to participate in the study? 
No, the treatment is free of charge. 
 
Who can I contact if I have a question a question about any detrimental effect or reaction associated 
with the study?  
You have the right to ask questions about the study and to have them answered. 
If you have any questions about participating in the study or if you think that you have been harmed 
in the study or that you have a reaction to the treatment being tested, please contact: 
Mihajlo Đokić, MD, by phone: +386 1 5223168 or by email: mihajlo.djokic@kclj.si. 
 
Who can I contact to report a breach of data protection policy:  
If  you  believe  that  there  has  been  a  breach  of  your  personal  data,  please  contact  the  principal 
investigator: 
Mihajlo Đokić, MD, by phone: +386 1 5223168 or by email: mihajlo.djokic@kclj.si. 
 
Who can I contact if I have a question about my patient rights?  
The  study  and  study  protocol  will  be  reviewed  and  approved  by  the  National  Medical  Ethics 
Committee  of  the  Republic  of  Slovenia.  If  you  have  questions  about  your  patient  rights,  you  can 
contact (including anonymously): the office of the Patients’ Rights Representative Duša Hlade Zore, 
who works for the Ministry of Health of the Republic of Slovenia, on the premises of the Ljubljana 
Institute  of  Public  Health  (Zavod  za  zdravstveno  varstvo  Ljubljana),  Zaloška  29,  1000  Ljubljana, 
telephone number: +386 1 5423285, e‐mail: dusa.zore@zzv‐lj. 

 
  
 
Patient Consent for Participating in the Study 
 
I, the undersigned, hereby agree to participate in the study “Treatment of Primary liver 
Tumours with Electrochemotherapy”. I understand that my refusing to participate in the 
study will not affect my health care. 
 
I  have  read  the  description  of  the  study.  The  study  and  the  starting  points  have  been 
explained to me in language that I understand. I am aware that participation is voluntary. I 
am sufficiently familiar with the purpose, methods, risks and benefits of the study. 
 
I understand that the doctor in charge of the study will inform me about any new findings 
that have arisen during the study that may affect my consent. 
 
I allow my study‐related medical information to be used and passed on to health authorities 
and institutions. I consent to the use and disclosure of my personal health information as 
described in this document.  
 
I understand that I may decline to participate in the study. I further understand that I am 
free to withdraw from the study at any time and without giving a reason and that this will 
not affect my further care or the relationship with my doctor. 
 
I declare that I have read this document, have had the opportunity to ask as many questions 
as I wanted, and have received satisfactory answers thereto. I understand that I have not 
waived any legal rights that I have as a participant in the study. 
 
I am aware that I will receive a copy of the signed voluntary consent. 
 
I allow samples of metastases to be stored for histological analyses and photographic records 
to be published for scientific purposes. 
 
 Yes  No 
I have read the whole document. I have asked all the questions I had. I agree to participate in this 
study. 
 
 
 
Name of the patient/subject in block letters
 
 
 
Signature of the patient/subject 
Date (DD/MM/YYYY) 
 
 
 
Name of the person obtaining the consent in block letters
 
 
 
Signature of the person obtaining the consent
Date (DD/MM/YYYY) 
 
 
 
Name of the person responsible for the study in block letters
 
 
 
Signature of the person responsible for the study
Date (DD/MM/YYYY) 
 

 
  
 
INFORMED CONSENT STATEMENT 
for the Study “Treatment of Primary Liver Tumours with Electrochemotherapy” 
 
I, the undersigned ____________________________________________, born on 
____________________, 
have been informed about the method and purpose of the above study. I understand the course of 
my treatment as part of the study.  
I understand that participation in the study is voluntary and that I may decline to participate. I have 
been informed that the results of the study will be used for research purposes and contribute to 
knowledge about the safety and effectiveness of electrochemotherapy in treating primary liver 
tumours. I am aware that the course of the study has been reviewed and approved by the National 
Medical Ethics Committee of the Republic of Slovenia. I allow my tissue sample analysis results to be 
used in the study and for publications in the scientific literature; my personal data is confidential.  
 
By signing, I confirm that I agree with the therapy and give my free consent. 
Date: ______________  
Participant’s signature: ________________________________  
 
I, the undersigned ___________________________________, hereby certify that I have explained 
the course, purpose, risks and potential benefits of the study to the participant in an understandable 
way. 
 
Date: ______________   
Signature of the principal investigator: ________________________