Defining Subgroups of Mitochondrial Disease and Dysfunction in Autism Spectrum Disorder
Conditions: Autism Spectrum Disorder, Autism, Mitochondrial Disease, Developmental Delay
Sponsor: University of Arkansas

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 1 of 33 
RESEARCH PROTOCOL: 
Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
 
PRINCIPAL INVESTIGATOR: 
Shannon Rose, PhD 
Assistant Professor of Pediatric Clinical Pharmacology 
13 Children’s Way 
Slot 512‐41B Room R2052D 
Little Rock, AR 72202 
501‐364‐4083 
SRose@uams.edu 
 
Co‐INVESTIGATORS: 
Dr. Stephen Kahler, MD 
Professor of Pediatrics 
University of Arkansas for Medical Sciences 
Division of Genetics and Metabolism 
Arkansas Children’s Hospital 
1 Children’s Way, Slot 512‐22 
Little Rock, AR 72202 
 (501) 364‐2966 
KahlerStephenG@uams.edu 
 
Richard E. Frye, MD/PhD 
Chief, Section on Neurodevelopmental Disorders 
Director Autism Program 
Barrow Neurological Institute at Phoenix Children’s Hospital 
Professor of Child Health 
University of Arizona School of Medicine 
1919 E. Thomas Ave. 
Phoenix, AZ 85016 
281‐546‐8377 
RFrye@phoenixchildrens.com   
 
STUDY LOCATION:  
 
Arkansas Children's Research Institute 
13 Children's Way, Slot 512‐41B 
Little Rock, AR 72202 
Office: 501‐364‐4083 
FAX: 501‐364‐1648 
 
 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 2 of 33 
RESEARCH PLAN 
 
*Background and Significance/Rationale 
 
This research aims to better understand abnormalities in mitochondrial energy metabolism, and 
consequences of such abnormalities, in autism spectrum disorder (ASD). Mitochondrial disease (MD) 
is the most prevalent metabolic disorder affecting children with ASD (1). A recent meta‐analysis by 
Rossignol and Frye found that 5% of children with ASD meet criteria for classic MD and that children 
diagnosed with ASD and MD (ASD/MD) have clinical characteristics distinct from the general ASD 
population, thereby supporting the existence of an ASD/MD subgroup (1). This meta‐analysis also 
found that about 30% of children in the general ASD population exhibit biomarkers consistent with 
mitochondrial dysfunction, although it is not known how many of patients in these studies qualify for 
an MD diagnosis since additional clinical and laboratory findings supporting the diagnosis of MD were 
not reported. A recent study compared electron transport chain (ETC) function in lymphocytes 
between ASD and typically developing (TD) controls to determine if children with ASD manifested 
mitochondrial dysfunction (2). This study reported that 80% of the children with ASD demonstrated 
lower than normal ETC function, consistent with mitochondrial dysfunction. However, this 
lymphocyte study did not use standardized criteria to diagnose MD in the ASD children, leaving open 
the question of whether the children with ASD and mitochondrial dysfunction had classic MD or a 
level of mitochondrial dysfunction that was not severe enough to be considered MD.  
 
This project will examine mitochondrial function in a wide range of ASD children with a minimally‐
invasive assay. The assay will use the Seahorse XF Extracellular Flux Analyzer 96 (Seahorse Bioscience, 
Inc, North Billerica, MA), a new state‐of‐the‐art technology that simultaneously measures oxygen 
consumption (a measure of mitochondrial respiration) and glycolysis (a measure of anaerobic 
metabolism) in real‐time in patient derived leukocytes. Our preliminary evidence below 
demonstrates that some children with ASD/MD demonstrate ETC complex over‐activity, particularly 
complex IV over‐activity, rather than ETC complex under‐activity that is typical for classic MD. 
Additional preliminary evidence demonstrates that lymphoblastoid cell lines (LCLs) derived from ASD 
patients without known MD also demonstrate over‐activity as manifested by high levels of oxygen 
consumption (measured by the Seahorse Analyzer) as compared to unaffected control LCLs. As 
complex IV activity is directly related to oxygen consumption these data suggest a unique profile of 
mitochondrial function in individuals with ASD regardless of whether or not they have MD. Whether 
or not this over‐activity translates to greater ATP production is not known from this preliminary 
evidence but this question will be addressed in this project. Further preliminary evidence 
demonstrates that complex over‐activity, particularly complex IV over‐activity, in our ASD/MD cohort 
may be a compensatory process necessary for maintaining adequate redox metabolism. Parallel to 
this we demonstrate that LCLs have biomarkers consistent will higher levels of reactive oxygen 
species (ROS), suggesting that the over‐activity in the LCLs may also be important for compensating 
for chronically increased ROS. We demonstrate that acutely challenging LCLs with increased ROS 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 3 of 33 
increases mitochondrial oxygen consumption but also produces a detrimental effect on mitochondrial 
function that is greater for ASD LCLs as compared to the control LCLs, suggesting that ASD LCLs are 
more metabolically fragile. 
 
One of our goals is to develop a method using the Seahorse Analyzer to measure individual variations 
in mitochondrial function which can identify ASD children with MD and mitochondrial dysfunction 
without an invasive muscle biopsy. We believe that an assay that measures aerobic and anaerobic 
metabolism at baseline and during challenges of ROS will provide unprecedented new knowledge 
about mitochondrial function and dysfunction in ASD. We believe that this assay will allow us to 
answer important questions, such as whether mitochondrial dysfunction in the general  
ASD population is more prevalent and distinct from MD, and how mitochondrial dysfunction and 
secondary effects of mitochondrial dysfunction, specifically increased ROS, influence core ASD 
symptoms including language and social development. To this end we will develop profiles of 
mitochondrial function for individuals with ASD and known MD (ASD/MD) and individuals with ASD 
known not to have MD (ASD/NoMD), along with children that have a MD without ASD and 
developmentally delayed (DD) children or neurodevelopmentally atypical [NDA] (e.g. ADHD). These 
two groups (i.e., ASD/MD and ASD/NoMD) will serve as the two ends of the spectrum of 
mitochondrial function in children with ASD. We will then examine the profiles of mitochondrial 
function in a general population of individuals with ASD to determine how these individuals fall into 
this spectrum defined by the ASD/MD and ASD/NoMD groups, as well as how these subgroups differ 
from children that have a MD without ASD and children that are DD without either ASD or MD. 
Additionally, we will investigate the relationship between mitochondrial function, glutathione redox 
metabolism, and core ASD symptoms.  
 
A Subset of Children with Autism Spectrum Disorder Demonstrate Electron Transport Chain 
Overactivity. Although the majority of studies that have estimated ASD/MD prevalence in the general 
ASD population have used the modified Walker criterion to define MD (3), there are some serious 
limitations to this criterion. This criterion relies on significant reduction in ETC complex function and 
known mitochondrial DNA mutations (3).  However, only 23% of children with ASD/MD have a known 
mitochondrial DNA mutation (1) and reports have noted that some children with ASD/MD have ETC 
over‐activity rather than deficiencies (4, 5). Thus, Frye and Rossignol (6) suggest that the Morava et 
al. criterion  (7), a standard criterion that considers a wide variety of clinical, metabolic, imaging and 
morphological findings, many be more sensitive for diagnosing MD in children with ASD. ETC complex 
activity measurements were performed by the Baylor Medical Genetic Laboratory in Houston, TX (8) 
on frozen muscle from 20 individuals with ASD diagnosed with MD using the Morava et al. criterion 
(7) and normalized by citrate synthase activity. Examination of ETC function across these 20 
individuals revealed significant variation in ETC function from low (i.e., <50% of normal) to very high 
(i.e., > 250% of normal). One subset of patients had low overall ETC activity, most consistent with a 
classic MD, while a second subset of patients had ETC complex over‐activity (i.e., >= 150%) 
particularly in complex IV. Frye and Naviaux (4) recently published a case‐series of ASD/MD children 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 4 of 33 
with complex IV over‐activity from this cohort. All cases had regressive autistic disorder with many 
having epilepsy, epileptiform EEGs, cerebral folate deficiency and potentially pathological 
mitochondrial DNA mutations. Our preliminary data presented below links this over‐activity with a 
more oxidized microenvironment. This many represent a compensatory process to counteract 
chronic increases in ROS or may reflect a greater level of ETC activity needed to maintain adequate 
ATP levels. Thus, ETC complex over‐activity may not translate into increased energy (i.e., ATP) 
production (this notion will be considered within this project). This project will define 
mitochondrial metabolism profiles in leukocytes from children with ASD/MD using new state‐of‐
the‐art Seahorse Analyzer. This cohort will provide a positive control for which to compare 
leukocytes from a general population of children with ASD. This will allow us to determine whether 
there are specific subgroups of ASD children with MD and/or a milder form of ‘mitochondrial 
dysfunction’.  
 
Measuring Mitochondrial Energetics with the Seahorse Analyzer  
We used the Seahorse Analyzer to evaluate mitochondrial 
function in lymphoblastoid cell lines (LCLs) derived from 
individuals with ASD and unaffected TD controls. This new state‐
of‐the‐art instrument is capable of simultaneously measuring the 
rate of cellular oxygen consumption (OCR) and glycolysis 
(extracellular acidification rate) in real time in intact living cells. 
Several aspects of mitochondrial functional activity are defined in 
the assay by sequential addition of pharmacological inhibitors 
designed to probe individual components of mitochondrial 
function as diagrammed in the left Figure. Initially, Basal OCR is 
measured. Then, oligomycin, an ATP synthase inhibitor, is automatically injected to determine the 
proportion of the Basal OCR linked to ATP production. The Maximal Respiratory Capacity of the 
mitochondria is then determined by injecting the mitochondrial protonophore FCCP to collapse the 
inner membrane proton gradient, thus stimulating the ETC to work at maximum capacity to restore it. 
Reserve Capacity is then calculated by subtracting the Basal OCR from the Maximum Respiratory 
Capacity. Lastly, non‐mitochondrial OCR is measured by automatic injection of antimycin A to inhibit 
electron flux through complex III.  
 
The Figure to the left shows our preliminary data comparing 
Basal and ATP‐linked OCR, Maximum Respiratory Capacity and 
Reserve Capacity in ASD and TD control LCLs (n=5/group). Each 
of these parameters was significantly elevated in the ASD cells, 
as compared to TD cells, under baseline conditions. Although 
the OCR is used to represent mitochondrial (aerobic) activity, 
only complex IV consumes oxygen, so OCR most closely 
represents complex IV activity. Thus, the LCLs from ASD 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 5 of 33 
individuals parallel the complex IV over‐activity identified in some ASD/MD children, suggesting that 
complex IV over‐activity could be a unique characteristic of ASD mitochondria. Indeed, the Seahorse 
Analyzer may be an excellent instrument for measuring mitochondrial function in individual with ASD 
as over‐activity may be particularly important. Since ASD individuals both with and without MD 
appear to have over‐activity these two subgroups may or may not appear similar in Basal OCR. Thus, 
we will investigate a wide range of parameters of mitochondrial function derived from the Seahorse 
Analyzer, including parameters derived from a unique assay we will develop under this project which 
examines mitochondrial function under acute increases in ROS.  
  
Oxidative Stress in Autism Spectrum Disorder              
Glutathione is the major intracellular antioxidant responsible for maintaining redox homeostasis in 
the cytosol and mitochondria. Glutathione (GSH) is particular important in cells that have 
dysfunctional mitochondria, as mitochondrial dysfunction results in increased ROS. Three 
independent case‐control studies conducted by Co‐I James (9‐11) documented that many ASD 
children have a GSH deficit in plasma and in the cytosol and isolated mitochondria from LCLs (Tables 
below). Further, the oxidized form of glutathione (GSSG) was significantly elevated in ASD children, 
resulting in a 2‐fold reduction in the GSH/GSSG ratio (Table below). 
 
Several metabolic precursors for GSH synthesis 
were also lower suggesting that GSH synthesis 
may be insufficient to counteract oxidative 
stress. A deficit in GSH/GSSG antioxidant 
capacity is well known to promote oxidative 
stress and increase vulnerability to pro‐oxidant 
environmental exposures and oxidative 
damage (12, 13). GSH synthesis is integrally 
related to folate‐dependent one‐carbon 
metabolism and methionine‐dependent sulfur 
metabolism that provide the metabolic 
precursors for GSH synthesis. The three 
interconnected pathways leading to GSH synthesis are diagrammed in the Figure above. Pathway 1 is 
the folate cycle, Pathway 2 is the methionine trans‐methylation cycle, and Pathway 3 is the 
Cytosolic and mitochondrial GSH/GSSG Redox  Status in Control and ASD Lymphoblastoid cell lines 
(n=10/group) 
 
fGSH (nmol/mg 
protein) 
GSSG (nmol/mg protein) 
% oxidized GSH 
fGSH/GSSG 
 
Cytosol 
Mito 
Cytosol 
Mito 
Cytosol 
Mito 
Cytosol 
Mito 
Control 
26.48±3.5 
2.64±0.7 
0.287±0.07 
0.258±0.12 
2.2±0.7 
15.8±4.6 
99.14±33.5 
11.63±3.9 
Autistic 
21.72±4.3 
1.75±0.3 
0.356±0.06 
0.366±0.11 
3.2±0.6 
29.1±4.7 
61.81±10.6 
5.06±1.3 
p value 
0.021 
0.001 
< 0.001 
0.059 
0.003 
< 0.001 
< 0.001 
< 0.001 
SAM
SAH
MTase
Homocysteine
B6
Cystathionine
Cysteine
GSH           GSSG
Methionine
Adenosine
5-methylTHF
THF
B12
5,10-CH2THF
Cellular 
Methylation
Reactions
Purines and 
Thymidylate
DNA SYNTHESIS
PROLIFERATION
TRANSMETHYLATION
REDOX 
HOMEOSTASIS
1
2
3
MS
CBS

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 6 of 33 
transsulfuration pathway leading to GSH synthesis. The vital importance of these interconnected 
pathways is underscored by their essentiality for error‐free DNA synthesis (Pathway 1); for cellular 
methylation capacity (Pathway 2); and for the maintenance of cellular redox homeostasis (Pathway 
3).  The ratio of the methyl donor S‐adenosylmethionine (SAM) to the product inhibitor S‐
adenosylhomocysteine (SAH) is a reflection of trans‐methylation efficiency and cellular methylation 
potential. As diagrammed in the above Figure, methionine, SAM, SAH and cysteine are essential 
precursors for GSH synthesis and redox homeostasis. These data provide the basis to interpret the 
Seahorse Analyzer and mitochondrial complex over‐activity data previously described. Based on our 
previous observations of elevated ROS and decreased mitochondrial GSH/GSSG in ASD LCLs relative 
to TD LCLs (14), we interpret our preliminary results to reflect an adaptive up‐regulation of 
mitochondrial function in response to chronic elevations in ROS production in cells from ASD 
individuals.  
 
Mitochondrial Electron Transport Chain Complex Overactivity Supports Redox Metabolism  
The relationship between ETC function and biomarkers of redox metabolism was determined for a 
subset of the cohort of children with ASD/MD presented above. Measures of redox metabolism 
(GSH/GSSG and SAM/SAH ratio) as well as a measure of chronic oxidative stress (3‐nitroTyrosine; 
3NT) were investigated. The activity of each complex individually, the absolute maximum complex 
function, the relative maximum complex function (maximum activity / minimum activity) as well as 
the average complex function were investigated. Higher complex IV activity was associated with a 
higher SAM / SAH ratio (left panel in the figure below; r=0.53, p=0.05) and higher relative maximum 
complex activity was associated with a higher GSH/GSSG ratio (right panel in below figure, r=0.54, 
p<0.05). Overall, these data point to ETC 
complex over‐activity as a compensatory 
mechanism to support redox metabolism and 
are consistent with the preliminary ASD LCLs 
data described above. Indeed, both sets of 
data suggest that mitochondria from children 
with ASD, whether or not they have MD, 
demonstrate over‐activity in attempt to maintain redox homeostasis in order to protect cells from 
oxidative damage. This project will examine these possibilities as understanding the exact 
relationships between cellular metabolic processes will improve treatment recommendations.  
 
The Relationship Between Language Development and Autism Symptoms and Redox Metabolism is 
Moderated by Mitochondrial Dysfunction. The relationship between biomarkers of redox 
metabolism (GSH/GSSG and SAM/SAH ratios, 3NT) and ASD symptoms and language development 
was determined for a subset of the cohort of children with ASD/MD presented above and a 
comparison group of children with ASD without MD (ASD/NoMD) matched for gender and age. The 
difference between these relationships across groups was also considered. ASD symptoms were 
measured by the autism symptoms questionnaire, a checklist of DSM‐IV symptoms developed by the 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 7 of 33 
Center for Autism and Related Disorders, Inc (Tarzana, CA). To evaluate language we used the 
Preschool Language Scales‐3 for children under 6 years of age and the Expressive One‐Word 
Vocabulary Test for children older than 6 years. This combination of tests was used instead of a more 
extensive language assessment due to time constraints of the visit. To derive a measure of language 
delay that was comparable across the two language tests, the age equivalent score derived from 
either test was subtracted from the participant’s age at testing. The studies proposed herein will use 
a comprehensive language assessment tool that spans a wide range of ages.  
 
As seen in Panel A (figure below) the number of ASD symptoms was strongly related to 3‐NT (protein 
oxidative damage marker) for the ASD/MD group [r=‐0.85, r<0.01] but not the ASD/NoMD group [r=‐
0.03, p=ns; group x ASD symptoms interaction, F(1,28)=9.15, p<0.01]. Unexpectedly, higher 3NT 
levels were related to fewer ASD symptoms in the ASD/MD group. Similar findings were found for 
language ability (Panel B). Language ability was related to 3NT for the ASD/MD group (r=0.60,p<0.05), 
but not ASD/NoMD group (r=‐0.12,p=ns; group x language interaction F(1,28)=4.43, p<0.05) such that 
better language development was associated with higher 3NT levels. These data demonstrate that 
the correlation between core ASD symptoms and redox metabolism differs between ASD children 
with and without MD.  
 
In contrast, language ability was strongly associated with the SAM/SAH methylation ratio in both 
ASD/MD and ASD/NoMD groups (Panel C; SAM/SAH covariate F(1,28)=5.40,p<0.05) such that a higher 
SAM/SAH ratio  was associated with better language ability in both groups. To understand whether 
this was due to SAM or SAH, we examined each independently. SAH, but not SAM, was found to be 
related to language ability such that lower levels of the methylation inhibitor SAH was associated 
with better language ability [SAH covariate; F(1,28)=4.02, p=0.05]. Interestingly, none of the 
measures of ETC function in the ASD/MD group were significantly related to ASD symptoms or 
language ability. 
 
Overall, these data demonstrate that chronically higher levels of ROS is related to better language 
development and fewer ASD symptoms in ASD/MD children but not in ASD/NoMD children. This may 
seem unexpected as ROS has been implicated in several neurodegenerative diseases, including 
Alzheimer, Parkinson and Huntington diseases as well as Friedrich’s ataxia and amyotrophic lateral 
sclerosis  (15) and has been implicated in synaptic loss in mitochondrial encephalopathies (16). 
However, it is important to note that elevations ROS also can have positive effects on development. 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 8 of 33 
ROS is important for long term potentiation, a process that is essential for learning and memory, and 
can stimulate pathways responsible for increasing synaptic size and strength as well as synaptic 
vesicle recycling (16). In fact, ROS is necessary to stimulate cellular function, including mitochondrial 
function (17). These data suggest that an adaptive increase in ROS could facilitate development in 
children with ASD/MD, possibly by stimulating cellular pathways for growth, differentiation, synaptic 
development or by up‐regulating protective mechanisms to counteract the destructive effects of ROS. 
It is also possible that this may simply reflect higher ROS levels as a by‐product of abnormal ETC 
activity in ASD/MD children. Additionally, the relationship between language ability and the SAM/SAH 
ratio and SAH indicates that, in general, language development for children with ASD is related to 
adequate methylation capacity and/or the availability of glutathione precursors to provide adequate 
cellular redox buffering. These data have important clinical implication as they point to the 
importance of adequate metabolic precursors for glutathione‐mediated redox buffering but do not 
specifically support the reduction of ROS with extrinsic antioxidant treatment.  In addition, these 
data indicate that mitochondrial dysfunction may have an indirect effect on language development 
and ASD symptom through alterations in redox metabolism. However, only a limited number of 
measures of mitochondrial function were investigated in our preliminary studies. This project will 
examine the relationship between a wide range of indexes of mitochondrial function and core ASD 
symptoms and redox metabolism to more definitively define individual mitochondrial dysfunction 
in relevant subsets of children with ASD. 
 
A Novel Assay Measures of Mitochondrial Response to Acute Increases in ROS 
In order to increase the sensitivity of the Seahorse Analyzer assay for evaluating mitochondrial 
function in children with ASD and to confirm the hypothesis that mitochondria from children with 
ASD increase activity in response to ROS, we developed an assay that examines the effects of 
mitochondrial function in individuals with ASD to acute increases in ROS. ASD LCLs (and TD controls) 
were exposed to the redox cycling agent DNMQ for 1 hr before measurements. DNMQ enters cells 
and generates both superoxide and hydrogen peroxide similar to that generated by NADPH oxidase 
(18). In the Figures below we compared the impact of increasing DNMQ concentrations (5‐15uM) on 
basal and ATP‐linked OCR. In the ASD LCL cells, Basal and ATP‐linked OCR remained significantly 
elevated at all DNMQ concentrations indicating that mitochondria from the ASD cells have a higher 
oxygen requirement for ATP synthesis at baseline and with increasing ROS. These data indicate that, 
as hypothesized, cells compensate for increased ROS by increasing activity and that mitochondrial 
energetics is indeed different in the ASD compared TD control cells, most likely due to increased ROS 
at baseline. These data provide strong support for our hypothesis. 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 9 of 33 
 
Interestingly, baseline Maximum Respiratory Capacity (no DNMQ) was significantly higher in the ASD 
LCLs as compared to the TD LCLs (Figure above). One explanation is that the ASD LCLs have adapted 
to increased ATP synthesis in the context of a more oxidizing intracellular microenvironment. Another 
possibility is there is an adaptive increase in the number of mitochondria per cell (mitochondrial DNA 
copy number). In the experiments proposed within, we will examine both of these possibilities in 
leukocytes from children with ASD to better understand the basis for increased OCR and apparent 
mitochondrial over‐activity.   
 
The significance of increased mitochondrial activity in ASD LCLs is revealed by the fact that the 
apparent adaptive increase in Reserve Capacity is not maintained with increasing oxidative stress 
(Figure above). Indeed, the Reserve Capacity of the ASD LCLs, as compared to the TD LCLs, drops off 
more rapidly and to a greater extent as ROS is increased. This response indicates that ASD cells have 
an impaired ability to adapt to acute increases in ROS reflecting a more fragile redox homeostasis. 
We believe that cells from children with both ASD and MD will be more fragile since dysfunctional 
mitochondria results in a more oxidized microenvironment.  
 
In the present study, we plan to adapt these measurements in LCLs to evaluate leukocytes in real 
time immediately after the blood draw. We do not anticipate difficulty in adapting these 
measurements to leukocytes from individually with ASD as the technique for measuring 
mitochondrial energetics using the Seahorse Analyzer in leukocytes has been developed (19). We will 
also measure intracellular GSH/GSSG, ATP production, mitochondrial DNA copy number, and the 
anaerobic metabolism under baseline conditions and after acute increases in ROS. Our studies will 
provide a better understanding of mitochondrial energetics and how cellular metabolism adapts to 
compensate for increased ROS in children with ASD. This project will establish the specific 
mitochondrial abnormalities and variation in mitochondrial function associated with ASD and lead to 
better care for the subgroup of children with mitochondrial dysfunction. This project will better 
define the proportion of children with ASD who have mitochondrial dysfunction which is currently 
estimated to between 5% and 80% of the general ASD population. This study will identify the impact 
of mitochondrial dysfunction on cognitive and behavioral symptoms in ASD and will shed light on 
potentially core pathophysiological processes that may contribute to ASD, thereby leading to more 
 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 10 of 33 
targeted treatments for ASD. Most importantly, this technology can be easily adapted to screen 
infants to determine vulnerability to developing ASD and thus lead to preventive measures. 
 
 
*Protocol Summary 
 
Objective: The main objective of this proposal is to develop a minimally‐invasive biological assay that 
can be widely used to identify variations in mitochondrial function and dysfunction in children with 
ASD. This assay will allow us to determine the true range of mitochondrial function and dysfunction 
across a population of children with ASD. The relationship between mitochondrial function and 
dysfunction in ASD, redox metabolism and core ASD symptomology will also be investigated. 
 
Specific Aims: 1) To develop a minimally‐invasive assay using immune cells and/or buccal cells that 
can accurately identify children with ASD/MD from the general ASD population. 2) To establish 
whether there is simply an ASD/MD subgroup or whether mitochondrial dysfunction occurs on a 
spectrum from mild to severe in ASD. 3) To determine the relationship between mitochondrial 
function and redox metabolism in children with ASD. 4) To evaluate the effect of mitochondrial 
dysfunction and glutathione redox status on language and social development and ASD symptoms. 5) 
To identify prenatal environmental factors associated with atypical mitochondrial activity in children 
with ASD using blood, buccal cell and tooth‐based assays. 
Study Design: Using the Seahorse Analyzer, we will develop profiles of mitochondrial function for 
individuals with ASD and known MD (ASD/MD) and individuals with ASD known not to have MD 
(ASD/NoMD). These two groups will serve as the two ends of the spectrum of mitochondrial function 
in children with ASD and will be compared to profiles from TD children. We will then examine the 
profiles of mitochondrial function in a general population of individuals with ASD to determine how 
these individuals fall into this spectrum defined by the ASD/MD and ASD/NoMD groups, as well as DD 
and no ASD/MD, and NDA and no ASD/MD. Glutathione redox metabolism will be measured in all 
participants. The relationship between mitochondrial function, redox metabolism and core ASD 
symptoms will be studied in the ASD groups with particular attention to whether ASD symptoms, 
language ability and adaptive behavior are directly related to mitochondrial function or indirectly 
related to mitochondrial function through its effect on redox metabolism. 
 
Study Population: We will recruit several groups of children for this study: 50 children with ASD who 
have MD (ASD/MD); 50 children with ASD who do not have MD (ASD/NoMD); 50 no ASD/MD; 50 no 
ASD/no MD but DD or NDA; 100 TD controls; and a general population of 150 children with ASD. 
 
Statistical Plan: Descriptive statistics, e.g., mean and standard deviation for continuous variables and 
number and percent for categorical variables will be obtained for all demographic variables, 
outcomes and predictors of interest. Data will be checked for errors, inconsistencies and missing 
values. Appropriate statistical methods will be used to test the specific hypotheses of interest. 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 11 of 33 
Analyses will be adjusted for confounding variables such as age, gender, autism severity, etc. 
wherever necessary. Independence of predictor variables and homogeneity of variance assumptions 
will be checked prior to the analysis. P‐values will be adjusted for multiplicity wherever appropriate. 
All tests will be two‐sided and a P‐value less than or equal to 0.05 will be considered to be significant. 
All analyses will be conducted using statistical software SAS v9.2 (SAS Inst, Cary, NC) or STATA 12 
(STATA Corp, College Station, TX), or R (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria; (20)).  
 
*Specific Aims/Objectives 
 
Specific Aim 1: To develop a minimally‐invasive assay using immune cells and/or buccal cells that 
can accurately identify children with ASD/MD from the general ASD population. The diagnosis of 
ASD/MD commonly requires an invasive muscle biopsy. This is particularly true in ASD as the majority 
of ASD/MD cases are not associated with mitochondrial DNA mutations (1) and many cases do not 
manifest lactate elevation (1, 2, 4, 20). Instead of using unreliable biomarkers and invasive muscle 
biopsies to diagnose MD in children with ASD, we will develop a simple method that allows the 
identification of ASD children with MD by examining mitochondrial function using the Goldenthal 
buccal cell assay and the new state‐of‐the‐art Seahorse Analyzer in freshly obtained leukocytes. We 
will also examine ATP production, biomarkers of redox metabolism and/or mitochondria DNA copy 
number in these cells in case the energetic measurements cannot uniquely identify ASD/MD 
individuals. Hypothesis 1: The buccal cells and leukocytes of children with ASD/MD, regardless of the 
specific mitochondrial defect, will demonstrate a unique profile of energy production defects, at 
baseline and/or with exposure to increased ROS, as compared to the buccal cells and leukocytes of 
ASD/NoMD individuals, that will be identifiable using the Goldenthal buccal cell assay and the 
Seahorse Analyzer. 
 
Specific Aim 2: To establish whether there is simply an ASD/MD subgroup or whether 
mitochondrial dysfunction occurs on a spectrum from mild to severe in ASD. We will approach this 
by comparing mitochondrial function in children with a wide range of children with ASD severities to 
children with ASD/MD and ASD/NoMD. Hypothesis 2: Mitochondrial function in leukocytes and buccal 
cells from children recruited from the general ASD population will range from normal to severely 
dysfunctional.  
 
Specific Aim 3: To determine the relationship between mitochondrial function and redox 
metabolism in children with ASD. Both MD and ASD have been associated increased oxidative stress 
in in vivo and in in vitro models (14). Theoretically, glutathione should be depleted in children with 
ASD/MD or functionally significant mitochondrial dysfunction. Empirically demonstrating this in 
primary cells could lead to targeted treatments. Hypothesis 3: In children with ASD/MD and the 
general ASD population, leukocyte GSH/GSSG redox status and glutathione precursor depletion will be 
related to mitochondrial function at baseline and after acute increases in oxidative stress as measured 
by the Seahorse Analyzer.  

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 12 of 33 
 
Specific Aim 4: To evaluate the effect of mitochondrial dysfunction and glutathione metabolism 
status on language and social development and ASD symptoms. This will lead to a better 
understanding of how mitochondrial dysfunction is related to core symptoms of ASD. To facilitate 
this, we will recruit children with ASD with all degrees of severity. We approach this by determining if 
mitochondrial function and/or redox metabolism can predict cognitive development and ASD 
symptoms in ASD children. Hypothesis 4: More severe mitochondrial dysfunction will be related to 
worse cognition and more severe ASD behavior both directly and indirectly through defects in redox 
metabolism. 
 
Specific Aim 5: To identify prenatal environmental factors associated with atypical mitochondrial 
activity in children with ASD using blood, buccal cell and tooth‐based assays. 
Environmental exposures will be compared between the two ASD mitochondrial groups and between 
ASD and controls. Exposures will be measured in two ways: 1) Gestational and early life exposures to 
heavy  metals,  pesticides,  phthalates,  acetaminophen,  and  inorganic  and  organic  toxicants  will  be 
measured in baby teeth using mass‐spectrometry based methods that have been well‐validated; 2) The 
Environmental Exposure Questionnaire (EEQ) will obtain information on environmental, medication, 
infectious  and  inflammatory  exposures  prenatally  and  during  infancy.  Hypothesis  5:  exposure  to 
environmental stressors result in changes in mitochondrial function that persist after the environmental 
stressor has dissipated. 
 
*Study Design and Procedures   
Participants  
Participants will consist of up to 250 children aged 0 years to 17 years 11 months. These 250 children 
will include up to 50 children with ASD diagnosed with a MD (ASD/MD), 50 children with ASD who do 
not have MD (ASD/NoMD), and a general population of 150 children with ASD and unknown MD 
status. Those children with ASD will have documentation of ASD (As defined by either a gold standard 
measure for ASD diagnosis: the Autism Diagnostic Observation Schedule (ADOS), Autism Diagnostic 
Interview‐Revised (ADI‐R), and/or the minimum Arkansas state requirement for autism classification, 
as defined by a consensus diagnosis of ASD by a medical doctor, speech pathologist, and psychologist) 
or in an event where sufficient diagnostic information is lacking, and the PI believes that the clients 
meet all other inclusion criteria and a prospective diagnosis of an ASD is warranted, they may be 
considered potentially eligible. For those the PI believes a prospective diagnosis of ASD is warranted, 
a formal diagnosis will be scheduled to occur within a reasonable time frame from the date of study 
entry and prior to the conclusion of the trial. In addition this study will include 100 TD control 
children and 50 with MD but no ASD and 50 with no ASD or MD, but known DD or NDA.  
 
Subject Recruitment  
Children with ASD/MD, MD but no ASD, DD or NDA, general ASD, and ASD/NoMD will be recruited 
from children diagnosed at the Dennis Developmental Center (DDC) ATN Clinic whose families have 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 13 of 33 
indicated in the ATN consent that they wish to be contacted about future research opportunities, 
from the AAA.org website for parents who have indicated that they are interested in research 
contact, from advertisement through local channels and BOOM text, by using social media through 
Arkansas Children’s Hospital, flyers posted in the community (i.e. primary pediatric clinics), as well as 
referrals from pediatricians. Further description of these recruitment strategies can be found in the 
Recruitment Plan section. Potentially eligible children who wish to participate will be asked 
inclusion/exclusion questions. If the child qualifies, study staff will schedule the study visit and will 
attempt to mail or e‐mail information regarding the scheduled visit to the parent(s). The consent 
form, parent questionnaires, and other helpful information (e.g. a map of the ACH and/or relevant 
published manuscripts to help better understand the trial) may be included with this information for 
review purposes. If the child has a diagnosis of ASD, DD, NDA, or MD, the parent will be asked to 
provide copies of diagnostic testing or to provide the names, address, and contact information of the 
place diagnostic testing was completed so that a release of information can be completed to allow 
study staff to obtain copies of diagnostic testing.   
 
Recruitment may also occur for children (typically developing and non‐typically developing) at 
conferences associated with neurodevelopmental disorders. Participant recruitment at these 
conferences will only be on the study populations listed in this protocol and no data collection will 
occur outside of what is approved and data collection will occur only after consent/assent is 
obtained.  
 
Study Visits 
After completing the screening interview where eligibility is determined, the study visit will be 
scheduled at which the parents will provide consent. The study visit does not require travel to the 
study site.  
 
For study participants who do not visit the study site and who only complete questionnaires, we will 
obtain verbal consent from the parent using a phone script. The parent will be provided with an 
information sheet informing them about the study.  
 
For study participants who complete more than just the questionnaires (e.g., provide baby 
teeth/buccal cells), the parents will sign the consent/HIPAA for the study after all of their questions 
have been addressed and return this signed form to research study staff. For study participants who 
are typically developing and 7 years of age or older (who complete more than just the 
questionnaires), the child will provide assent. The child will sign the assent after all of his/her 
questions have been addressed. If the child has a diagnosis of ASD, DD, NDA, or MD, the parent may 
be asked to provide diagnostic testing and/or to complete a release of information to allow study 
staff to obtain copies of diagnostic testing. For those who have been seen at ACH, diagnostic 
information may be obtained from medical records once the consent/HIPAA has been signed.  
 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 14 of 33 
Following consent, each visit may include various general and/or cognitive‐behavioral measures. The 
first time a measure is collected is to provide information for a cross‐sectional relationship between 
autism symptoms and development to be correlated with mitochondrial function. The second time a 
measure is collected is to look at reliability. This will be enhanced with subsequent visits, up to 5, over 
the course of participation in this trial. Additional visits provide repeated measures to improve the 
fidelity of the analysis and look at reliability, but are not necessary for each participant. Due to the 
fact that many participants will be participating from out of state all visits and measures for each 
visits are optional. This is because we do not want to discourage potential enrollment due to the 
possibility of multiple visits or lengthy visits.  
 
Subsequent visits (visits 2‐5) will be scheduled when it is known if/when participants intend to return 
to ACH Campus and/or if the PI/parent requests an additional visit. If scheduled, visits 2‐5 will occur 
within an approximate 1‐72 months from visit 1. For visit 2‐5, study staff may mail or e‐mail 
information regarding the scheduled visit to the parent(s) prior to the scheduled date. If the consent 
form has been revised since the last informed consent discussion, the consent form and any new 
parent questionnaires may be included with this information for review purposes. In the event that 
the subsequent visit will only involve the completion of questionnaires, the parent will be provided an 
information sheet informing them about the study instead of the consent form. Any questionnaires 
which the parent already consented to may be included with instructions that the parent may 
complete these forms within 1 week of the scheduled re‐consent discussion.  
 
Measures which may be completed at each visit are listed below. All measures are optional and may 
be completed based on PI selection or the child/parent’s willingness or ability to complete the 
measure. Data (questionnaires and/or samples) may be collected offsite at various conferences 
associated with neurodevelopmental disorders or completed at the parent’s convenience and 
returned by mail/fax/e‐mail. 
 
General Measures 
 Demographic Information including age, gender, ethnicity, and race, 
 Information on Medication and Nutritional Supplements. 
 Information on place of residence from prenatal to current  
 
Specimen Collections for Biochemical Measures 
 Baby teeth collection, 
o If the child has lost a tooth/teeth, the parent will be asked to provide baby tooth/teeth 
which may have been collected and stored after child lost by bringing them to the visit 
or mailing them to study staff.  
o If the child is still expected to lose a tooth/teeth, the parent will be asked to collect 
and store the tooth/teeth and provide them to the research site at the next visit or 
mail them to study staff.  

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 15 of 33 
 Buccal cell collection, 
o Buccal cell collection may occur during the visit at ACH or ACHRI in an enclosed room, 
in order to maintain confidentiality during collection.  
o Study staff will use a soft swab to gently swipe the inside of the child’s cheek bilaterally 
for one minute each, twice per cheek. Upon collection, the swabs will be placed into a 
small plastic centrifuge tube labeled with the study ID number of the participant and 
collection date. These tubes will then be placed on ice (or ice bath) until it can be 
delivered to the research site laboratory. 
o Blood, urine, stool, GI biopsies, and muscle biopsies were previously collected as part 
of this study; however, they will no longer be collected from current participants.  
Cognitive‐Behavioral Measures 
 Vineland Adaptive Behavior Scale (VABS) 
o May be completed as interview or questionnaire based on PI discretion, study staff 
availability, or parent willingness/ability to complete.  
 Parent Questionnaires 
o Each questionnaire is optional, based on PI selection and parent willingness/ability to 
complete 
o If a questionnaire was completed for another purpose (e.g. clinical reasons or a 
different research study), study staff will verify that it was completed within the valid 
time frame for the questionnaire per industry standards. Time frames are indicated in 
the brief description of each questionnaire below. If valid, the original questionnaire or 
a photocopy will be obtained for research purposes and the parent will not be asked to 
repeat the questionnaire.  
o If applicable, study staff will provide the selected questionnaires along with a postage‐
paid, addressed envelope to the parent. The parent will be asked to complete the 
questionnaires and return them in the provided envelope.  
o Possible questionnaires to be completed include: 
 Aberrant Behavior Checklist (ABC) 
 Autism Impact Measure (AIM) 
 Child Behavior Checklist (CBCL) 
 Diet Diary 
 Environmental Exposure Questionnaire (EEQ) 
 only completed 1 time, not completed at subsequent visits if previously 
completed 
 Gastrointestinal Severity Index (GSI) 
 Health History and Mitochondrial Symptoms Questionnaire 
 Repetitive Behavior Scale – Revised (RBS‐R) 
 Sensory Questionnaire 
 Social Communication Questionnaire (SCQ) 
 not completed by those with a confirmed ASD diagnosis 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 16 of 33 
 only completed 1 time, not completed at subsequent visits if previously 
completed 
 Social Responsiveness Scale (SRS) 
 Teacher/Provider Questionnaires 
o Each questionnaire is optional, based on PI selection, availability of teacher or 
provider, and parent willingness 
o If applicable, study staff will provide the selected questionnaires along with a postage‐
paid, addressed envelope to the parent. The parent will be asked to give these items to 
the teacher/provider and request they complete the questionnaires and return them 
in the provided envelope.  
o Possible questionnaires to be completed include: 
 Aberrant Behavior Checklist (ABC) 
 Child Behavior Checklist (CBCL) 
 Repetitive Behavior Scale – Revised (RBS‐R) 
 Social Responsiveness Scale (SRS) 
 
Biochemical Measures 
The following measures may be conducted on obtained specimen(s). Previously obtained specimens 
include: blood, urine, stool, GI biopsies, and muscle; however, these will no longer be collected from 
current participants. Specimens which may be obtained from current participants or have been 
previously obtained include: baby teeth and buccal cells. Measures will be selected based on PI 
decision as well as amount collected.  
1. Mitochondrial Energetics: When possible, leukocytes and platelets will be isolated from a 
blood sample. One of several seahorse assays of mitochondrial respiration will be conducted 
these blood cells using the Seahorse Analyzer (Seahorse Bioscience, Inc, North Billerica, MA). 
When possible we will conduct the cell mitochondrial stress test. By using standardized 
compounds to modulate mitochondrial function (as described in the introduction), Basal 
mitochondrial respiration, ATP‐linked mitochondrial respiration, Maximal Respiration Capacity 
and non‐mitochondrial respiration will be measured. Reserve Capacity will be calculated from 
these measures. We will obtain these measures at baseline and during a ROS challenge using 
DNMQ at several concentrations (5 uM, 10 uM, 15 uM, 20uM, 25uM, and/or 30uM). We have 
already optimized parameters of this assay using LCLs derived from ASD and control subjects 
(see Background).  In some cases, additional Seahorse assays may be performed on the 
isolated leukocytes and platelets, including electron transport chain (ETC) function in 
permeabilized cells, the fuel flex test and/or the glycolytic stress test. The ETC function assay 
is conducted by first permeabilizing the cells using a novel permeabilization reagent available 
from Seahorse Bioscience (PMP). Then the cells are fed ADP and substrates for ETC complexes 
(complexes I, II, III/IV, and IV). Using the same pharmacological inhibitors as the cell mito 
stress test, a coupling assay is performed to derive State 3, State 4, State 3 uncoupled and the 
respiratory control ratio (RCR) for each of the complexes. The fuel flex test measures the 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 17 of 33 
dependency, capacity, and flexibility of cells to oxidize any one of three critical mitochondrial 
fuels (glucose, glutamine, or fatty acids) by measuring mitochondrial oxygen consumption of 
cells in the presence or absence of fuel pathway inhibitors, in live cells, in real time. The 
glycolysis stress test measures glycolysis in live cells in real time while inducing acute 
metabolic stress and allows for the measure of basal glycolysis, glycolytic capacity and 
glycolytic reserve. 
2. 
Redox Metabolism:  Active reduced glutathione (GSH); oxidized disulfide inactive form of 
glutathione (GSSG); cysteine (rate‐limiting amino acid for glutathione synthesis); 3‐
nitroTyrosine and 3‐chloroTyrosine (biomarkers of protein damage due to oxidative stress); 8‐
oxo‐deoxyguanine (biomarker of DNA damage due to oxidative stress); methylation 
metabolites and precursors for glutathione synthesis (methionine, SAM, SAH, adenosine); 
These tests are routinely done in plasma and leukocytes in the James Laboratory (9, 10, 14). 
3. 
Blocking Folate Receptor α Autoantibody: The autoantibody titers are measured by the 
laboratory of Dr. Edward Quadros, Ph.D. at the State University of New York, Downstate 
(Brooklyn, NY). Samples that are sent will be coded. 
4. 
ATP Measurement: Quantitative determination of mitochondrial ATP (pmole/106 cells) is 
determined using a bioluminescence assay with a LMAX II luminometer (Molecular Devices) 
using the ATP Bioluminescence Assay kit CLS II (Roche Diagnostics). This assay is based on 
luciferase requirement for ATP in producing light emission and is used in the James Laboratory 
(21). 
5. 
Mitochondrial Copy Number: The Novoquant Human Mitochondrial to Nuclear DNA Ratio Kit 
(Novogen) will be utilized to determine whether there are differences in mitochondrial 
numbers between the ASD groups.  Real‐time PCR with primers specific for mitochondrial DNA 
and nuclear DNA will be used as described by the manufacturer to calculate 
mitochondrial/nuclear copy number ratio for each sample. 
6. 
Clinical Laboratory Testing:  In order to verify that certain blood based immunological factors 
are not skewing the interpretation of the results, we will conduct random clinical laboratory 
testing on a select subset of samples, in order to address this potential confounding variable. 
The laboratory testing may consist of free cortisol, ACTH, Corticotropin Releasing Hormone 
(CRF), CBC w/ differential, CD3 T cell, CD19 B Cell, CD4 T Helper, CD8 T suppressor, IgG, and 
CD56 NK cell testing. 
7. 
Urine Testing:  Testing for the presence of metabolites associated with oxidative stress in 
plasma requires very careful, quick, and precise attention to the blood sample that is 
collected. In order to ensure accuracy and validity associated with these metabolites, very 
close attention to the details associated with collection, preprocessing, handling, storage, and 
processing must be implemented. Due to the very nature of the complexities and potential 
complications associated with the many steps associated with ensuring accuracy of the test 
results, other testing mechanisms are sorely needed. For collection procedures, see above. Up 
to approximately 5mL may be collected. The reason for urine testing is simple. Urinary 
metabolites are much more stable than plasma; however this technique has not been 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 18 of 33 
validated to date. Urine testing will allow an attempt to validate this potential mechanism for 
testing oxidative stress in urine. This methodology could lead to a great technological advance 
in the field of oxidative stress and it would be the first time that urine samples have validated 
the stability of metabolites associated with oxidative stress in the study population. 
8. 
 Stool Testing: Upon receipt to the research site laboratory, the stool will be stored in ‐70 ◦C in 
order to flash freeze the sample. All data sent to other facilities will either be de‐identified or 
coded. 
9. Teeth Collection:  Provided teeth will be sent to the Icahn School of Medicine in Mount Sinai, 
New York along with copies of the EEQ. This group is developing and evaluating procedures to 
analyze the presence of environmental exposures in teeth samples and how these potential 
exposures may contribute to neurodevelopmental outcomes. Copies of the completed EEQs 
and teeth will be stored at ACHRI in dedicated lab space until ready to ship to the Icahn School 
of Medicine for further analysis. Teeth will be individually wrapped and placed in bags and 
coded with patient ID, date of collection, and DOB and stored at room temperature. All data 
sent to other facilities will either be de‐identified or coded. 
10. Buccal Cell Collection: Electron transport chain (ETC) function will be measured in buccal cells 
collected. The de‐identified or coded samples will be sent to Dr. Michael Goldenthal at St. 
Christopher’s Hospital for Children in Philadelphia, PA to assess ETC function. The samples will 
be shipped in closed tubes on frozen cooling packs (such as Nordic Ice, Freez‐Paks, etc.) in a 
sealed Styrofoam container or a closed insulated cooler (such as Arctic Zone) by overnight 
delivery. Samples will be mailed to: 
Dr. Michael Goldenthal 
St. Christopher’s Hospital for Children 
Room 318 
3601 A Street 
Philadelphia, PA 19134 
If possible, samples will be collected on M‐W to give sufficient time for shipment to be 
received and processed. Samples will not be collected on or the day before holidays.  
11. GI Biopsy: GI symptoms are very common in children with autism and GI disorders have been 
documented in many studies. In order to better understand the bioenergetics, redox, and 
metabolic characteristics of GI tissue, GI tissue will be assessed using the same markers that 
are being measured in blood and urine. The purpose of this is to determine if there is tissue 
specific physiological abnormalities or if the abnormalities seen in blood and urine are 
generalizable to other tissue types as well. In Pediatric GI, it is standard practice to take 
endoscopic pinch biopsies in any child who undergoes upper and/or lower 
endoscopy.  Routinely, in the upper GI tract, up to 3 extra duodenal and up to 2 additional 
gastric pinch biopsies may be taken. In the lower GI tract (terminal ileum and colon) up to 6 
additional pinch biopsies may be taken. Furthermore, a rectal sample may be obtained, if the 
physician performing the biopsy agrees for clinical and/or research purposes. If the sample is 
to be obtained for research purposes only, the family can opt in or out to having this occur. 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 19 of 33 
For the purpose of the present study, five additional pinch biopsies during the upper and six 
during the lower endoscopy will be obtained for a total of up to 11 additional pinch biopsy 
specimens. Depending on the pathological findings, several additional upper and lower GI 
biopsies could be obtained. Each pinch biopsy is about 6mg in weight. Therefore, a maximum 
of up to 66 mg of GI tissue solely for research purpose could be taken. There is minimal 
additional inherent risk to obtaining these biopsies and the amounts taken will not be more 
than during standard procedures. Once collected, the samples will be placed into a small 
plastic centrifuge tube labeled with the study ID number of the patient and collection date.  GI 
biopsies will be either flash frozen upon collection or put into a preservation tube for fresh 
tissue analysis and will be de‐identified or coded.   
12. Muscle Biopsy: This tissue will be used to complete ETC measurements through collaboration 
with the ACNC. The tissue will be submerged in an ice‐cold preservation buffer (BIOPS) 
containing 10mM CaK₂‐EGTA; 7.23mM K2‐EGTA; 20mM imidazole; 20mM taurine 50mM K‐
MES; 0.5mM dithithreitol; 6.56 MgCl2; 5.77mM ATP and 15mM creatine phosphate (pH of 
7.1). Samples will be kept in ice‐cold BIOPS buffer and transferred to the laboratory high‐
resolution respirometry (HRR) at the ACNC. Once collected, the samples will be placed into 
tubes labeled with the study ID number of the patient and collection date.   
 
Cognitive‐Behavioral Measures 
Psychological assessment 
Adaptive Behavior: The Vineland Adaptive Behavior Scale (VABS) will measure functional abilities 
with several domains including communication, daily living skills, socialization, and motor skills. 
The VABS has been used widely in ASD assessments and provides a measure of core symptoms 
and adaptive function across a wide age range. All sections of the VABS up through physical 
activity “using small muscles” may be completed. Subsequent sections consisting of problem 
behaviors may not be completed, as these are not needed in order to obtain an adaptive behavior 
composite score. The VABS can be administered as a survey interview or as a questionnaire per 
the Vineland II Manual.  
Medical Questionnaires 
1. Health History and Mitochondrial Symptoms Questionnaire: We have developed a questionnaire 
that reviews the signs, symptoms, laboratory abnormalities and comorbid medical conditions that 
define mitochondrial disease. These questions will be derived from the major criteria used to 
define mitochondria disease including the Modified Walker (3) and Morava (6, 7) criteria. We will 
provide a score based on the number of indicators endorsed. 
 
Parent‐Teacher Questionnaires 
1. Aberrant Behavior Checklist (ABC): The ABC is a behavioral questionnaire developed to rate 
symptoms of hyperactivity, irritability, lethargy, and stereotypic behavior in individuals with 
developmental disabilities. The ABC may be completed by the parent and/or teacher/provider. If 
completed by the consenting parent within 2 weeks of the visit, this form may be considered valid 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 20 of 33 
and the original or a photocopy obtained in place of asking the parent to repeat the 
questionnaire.  
2. Social Responsiveness Scale (SRS): The SRS is a quantitative scale that measures the severity and 
type of social impairments that are characteristic of ASD. The SRS may be completed by the 
parent and/or teacher/provider. If completed by the consenting parent within 6 months of the 
visit, this form may be considered valid and the original or a photocopy obtained in place of 
asking the parent to repeat the questionnaire. 
3. Autism Impact Measure (AIM): The AIM has been recently developed across 8 ATN sites. The AIM 
assesses both frequency and impact of current core ASD symptoms during the past 2‐weeks. 
Initial studies have demonstrated excellent psychometric properties and construct validity. The 
SRS may be completed by the parent. If completed by the consenting parent within 2 weeks of 
the visit, this form may be considered valid and the original or a photocopy obtained in place of 
asking the parent to repeat the questionnaire. 
4. Child Behavior Checklist (CBCL): The CBCL is an easy to complete standardized questionnaire that 
can assess a wide range of behaviors commonly associated with ASD symptoms, including anxiety, 
depression, withdrawal, sleep problems, somatic problems, and aggressive and destructive 
behavior. The CBCL may be completed by the parent and/or teacher/provider. If completed by the 
consenting parent within 2 months of the visit, this form may be considered valid and the original 
or a photocopy obtained in place of asking the parent to repeat the questionnaire. 
5. Social Communication Questionnaire (SCQ): The SCQ is an instrument used to routinely screen for 
Autism Spectrum Disorders.  For children without a confirmed ASD diagnosis this questionnaire 
will be used to rule out ASD by confirming an SCQ score of <12. The Current for will be used for 
children ≤ 5 years of age and the Lifetime form will be used for children > than 5 years of age. The 
SCQ may be completed by the parent. If completed by the consenting parent within 3 months of 
the visit, this form may be considered valid and the original or a photocopy obtained in place of 
asking the parent to repeat the questionnaire. 
6. Environmental Exposure Questionnaire (EEQ): The EEQ is a comprehensive form designed to 
evaluate potential environmental exposures and how they may contribute to neurodevelopmental 
outcome. This data will be attempted to be correlated with teeth that are collected on children 
that are participants in this study. The EEQ may be completed by the parent. 
7. Repetitive Behavior Scale – Revised (RBS‐R): In order to evaluate repetitive behaviors, we will use 
the RBS‐R in order to account for this autism symptoms. The RBS‐R measures a breadth of 
repetitive behaviors in children, adolescents, and adults with Autism Spectrum disorders. The RBS‐
R provides a quantitative, continuous measure of the full spectrum of repetitive behaviors. The 
RBS‐R consists of six subscales including: Stereotyped Behavior, Self‐injurious Behavior, 
Compulsive Behavior, Routine Behavior, Sameness Behavior, and Restricted Behavior, which have 
no overlap of item content. The RBS‐R is a parent or provider report with a standardized Likert 
scale for a variety of stereotyped and repetitive behaviors. To be completed by parents and 
providers. The RBS‐R may be completed by the parent and/or teacher/provider. If completed by 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 21 of 33 
the consenting parent within 1 month of the visit, this form may be considered valid and the 
original or a photocopy obtained in place of asking the parent to repeat the questionnaire.  
8.  Gastrointestinal Severity Index (GSI) Questionnaire:  Researchers at Arizona State University have 
developed an index to assess gastrointestinal disorders. The GSI will be used in order to collect 
supplemental information to assess gastrointestinal disorders on select children. The GSI may be 
completed by the parent. If completed by the consenting parent within 1 week of the visit, this 
form may be considered valid and the original or a photocopy obtained in place of asking the 
parent to repeat the questionnaire. 
9.  Diet Diary: To track dietary habits of select children, we will use the Block diet questionnaire 
developed by the NutritionQuest Group. The Diet Diary may be completed by the parent. If 
completed by the consenting parent within 1 week of the visit, this form may be considered valid 
and the original or a photocopy obtained in place of asking the parent to repeat the 
questionnaire. 
10. Sensory Questionnaire: the sensory questionnaire was developed by Schoen and Miller (2008). 
This questionnaire is a parent‐report measure to assess sensory processing. If completed by the 
consenting parent within 6 months of the visit, this form may be considered valid and the original 
or a photocopy may be obtained in place of asking the parent to repeat the questionnaire. 
 
 
Future Studies: If the family decides to opt in to allowing their samples to be stored for future 
studies, the following will be done. Samples will be stored at Arkansas Children’s Hospital Research 
institute for future autism research projects looking at biomarkers derived from the blood. Samples 
will be given a unique identifier and stored at –80°C in the Arkansas Children’s Hospital Research 
Institute. Samples will be stored until they are used up or destroyed. The Principal Investigator, Dr. 
Shannon Rose, will retain control over the collected samples unless it is requested that the sample be 
destroyed and then it will not be used for any future studies. There is a possibility that the leftover 
de‐identified or coded blood, stool, and/or urine samples may be sent to Dr. Edward Quadros, Ph.D. 
at SUNY‐Downstate in NYC, Dr. Robert Naviaux at UCSD, or to Dr. Daewook Kang at Arizona State 
University for further analysis. If the participant wishes to have the sample removed from storage and 
destroyed at any time, they may contact a study staff at (501) 364‐4519 or 1‐800‐283‐7428 Monday 
through Friday 8:00 a.m. to 4:30 p.m. IRB permission will be obtained prior to sharing samples for 
future studies. These samples and possibly clinical research data will be de‐identified and no PHI will 
be shared with collaborators. If samples or clinical research data are shared, a log of those who 
withdraw samples will be documented thoroughly. 
 
Collaborators and future studies of de‐identified leftover samples and clinical research data are listed 
below. As additional collaborators/studies are identified they will be added to this list. 
1. Dr. Michele Jacob, who will measure changes, related to neurodevelopmental outcomes, in 
levels of cellular proteins and messenger RNA related to the beta‐catenin and WNT cellular 
regulation pathways in her laboratory in immune cells. 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 22 of 33 
Michele Jacob 
Dept. of Neuroscience 
Tufts University, Sch. of Med. 
136 Harrison Ave 
Boston, MA 02111 
Phone: 617‐636‐2429 
2. Dr. Harland Winter, who will examine serum samples using advanced proteomics techniques 
to identify proteins unique to individuals with autism.   
Harland Winter 
Digestive Function Lab 
Massachusetts General Hospital 
50 Blossom Street 
GRJ 1324 
Boston, MA 02114 
3. Dr. Juergen Hahn, who will analyze de‐identified clinical research data to understand the 
effect of comorbidities on biochemical and cognitive‐behavioral measures and understand 
when biochemical measures can be used to distinguish individuals with autism from those 
with typical development and those with developmental delays without autism. 
 
Juergen Hahn 
 
Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Room 4213 
 
110 8th Street 
 
Troy, NY 12180 
4. Dr. Stephen Edelson, who will analyze de‐identified clinical research data to see if certain 
underlying perturbations in mitochondrial function correlate with sensory integration 
problems in children with ASD. Furthermore, he will also assess hypersensitivities to chemical 
exposures and chemical intolerances of mothers to see if this is a possible contributing factor 
as well. 
Stephen Edelson, MD 
Director ‐ Autism Research Institute 
Autism Research Institute 
4182 Adams Ave. 
San Diego, CA 92116 
5. Dr. Janet Cakir, who will analyze de‐identified clinical research data to test for correlations 
between various environmental exposures and the development of autism/occurrence of 
regression. Dr. Cakir is a geographer with vast experience working with environmental 
databases and analyzing environmental data. Dr. Cakir has children enrolled in the study. To 
manage this potential conflict of interest I will have an independent reviewer and myself 
carefully monitor her data analysis. 
Janet Cakir, PhD 
NPS SER Climate Change, Socioeconomics, and Adaptation Coordinator 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 23 of 33 
NCSU Applied Ecology 
South Atlantic Landscape Conservation Cooperative 
1751 Varsity Dr. 
Raleigh, NC 27606 
6. Dr. Manish Arora, who will analyze baby teeth using the technology developed at his 
laboratory. He will be able to provide exposure information on a wide range of chemicals, 
including metals and organic toxicants, over the prenatal and early childhood periods. The 
tooth‐matrix biomarkers can be used to reconstruct past exposure history during key 
developmental periods including prenatal life. The association of metals in teeth and 
mitochondrial function may provide novel insight into the molecular mechanisms linking 
environmental metal exposures and autism severity. 
Manish Arora BDS, MPH, PhD 
Associate Professor 
Division Chief of Environmental Health 
Director of Exposure Biology 
Department of Preventive Medicine 
One Gustave L. Levy Place 
Box 1057 
New York, NY 10029‐6574 
7. Dr. Haiwei Gu, who conducts research in metabolomics in metabolic diseases. He will analyze 
Urine / Plasma pairs from the mitochondrial cohort in order to better characterize metabolic 
aspects of our autism cohort and examine the correlation between urine and plasma 
metabolites. 
Dr. Haiwei Gu 
Center for Metabolic and Vascular Biology  
College of Health Solutions  
Arizona State University‐Mayo Clinic Campus 
13208 E Shea Blvd, CRB 2‐228 
Scottsdale, AZ 85259 
 
*Study Population/Data Source 
 
Inclusion Criteria for ASD children 
1. Autism Spectrum Disorder (As defined by a gold standard measure for ASD diagnosis: the Autism 
Diagnostic Observation Schedule, Autism Diagnostic Interview, and/or the minimum Arkansas 
state requirement for autism classification, as defined by a consensus diagnosis of ASD by a 
medical doctor, speech pathologist, and psychologist.).  
2. 0 years through 17 years 11 months of age 
 
Inclusion Criteria for TD, DD, MD, NDA children 
1. 0 years to 17 years 11 months of age 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 24 of 33 
 
Exclusion Criteria (all children) 
1. Any historical event/information that may, in the opinion of the PI, be a reason to exclude the 
child from participation. 
 
*Ethical Considerations 
 
Subject Screening:  
Children with ASD may be recruited from our Autism Treatment Network (ATN) site whose families 
have signed a HIPAA release to be contacted about research. The UAMS ATN site is the state hub for 
the evaluation of ASD in children. Our ATN site is part of the national ATN organization which is 
sponsored by Autism Speaks. Our site has been approved for funding for the next 3 years before a 
renewal application is necessary. The clinic evaluates 4 new patients per week and follows children 
diagnosed with ASD on a yearly basis. We also have more than 270 participants in the ATN registry 
who have signed consent to be contacted for research studies such as the proposed study.  Children 
may also be recruited from the AAA.org website for parents who have indicated that they are 
interested in research contact, from advertisement through local channels and BOOM text, by using 
social media through Arkansas Children’s Hospital, flyers posted in the community (i.e. primary 
pediatric clinics), as well as referrals from pediatricians. 
 
When a parent inquires about the study or a potentially eligible child is identified, study staff will 
contact the parent(s) and describe the study. Study staff will screen by asking inclusion/exclusion 
criteria questions.  If the child qualifies from the screening interview, study staff will schedule the 
study visit.  
 
Consents:   
 
For those whose participation will only include completion of questionnaires, a phone script will be 
used to obtain verbal consent. For those who previously participated in this study, and their 
subsequent visit will only involve complete of questionnaires, a phone script will be used to obtain 
verbal re‐consent. For these participants, an information sheet informing them about the study will 
be mailed, e‐mailed, or faxed to the parent/LAR(s) at the time of determining eligibility so that they 
can reference it prior to deciding to participate. The conversation and parent/LAR(s) verbal consent 
will be documented.  
For those whose participation will include more than just the completion of the questionnaires (e.g., 
provide baby teeth/buccal cells), the consent form will be mailed, e‐mailed, or faxed to the 
parent/LAR(s) at the time of determining eligibility so that any questions can be addressed before the 
visit. If the parent/LAR is coming to the study site to complete study tasks, the signing of the IRB‐
approved consent will be done in person at the study visit. If the parent/LAR will not travel to the 
study site (e.g. parent/LAR is sending in questionnaires/specimens and/or completing interview by 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 25 of 33 
phone) the consent discussion will occur by phone once the parent has received the consent/HIPAA 
form. For study participants who are typically developing and 7 years of age or older (who complete 
more than just the questionnaires), an assent discussion will also occur by phone. If consent/assent (if 
applicable) is obtained, the parent/LAR will be asked to mail, scan and e‐mail, or fax the signed 
consent/assent/HIPAA form to study staff with the questionnaires. If the parent chooses to mail the 
consent form they can do so in the postage‐paid, addressed envelope provided for the 
questionnaires. In the event questionnaires are returned without a consent form or the consent form 
is not fully completed, study staff will attempt to follow‐up with parent up to 1 year following the 
date of the consent discussion. After 1 year, if a signed consent form is not obtained, the received 
questionnaire data will not be entered and used in data analysis.  
    
Seventeen year old subjects with ASD, DD, or NDA may be recruited into this study. We neither feel it 
is appropriate nor justified to have them re‐consent when they turn 18 years of age, due to the fact 
that we are dealing with a cognitively impaired population and it would be unknown if they truly gave 
an informed consent or not. Thus, we believe that the parent/LAR signature at the time of study entry 
it is the most appropriate. For typically developing controls, assent will be obtained, if 7‐17 years of 
age, inclusive. We anticipate that the study visit can be completed in less than 2 hours. If typically 
developing controls turn 18 while enrolled in the study, they will be asked to consent themselves at 
the time of their next study visit, if they are interested in doing so. 
 
*Risks and Benefits 
The known risks of this study are related to confidentiality research information. 
 
Loss of confidentiality is a slight risk.  This risk is minimized by assigning a unique study number to 
identify the subject instead of using the subject’s name on study documents. The assigned study 
number will be used on the study information collected and when analyzing the data.  Information 
collected about the subject (demographics, study assessments, lab results) will not be kept in health 
records or shared with physicians, employers, and insurers. All subjects’ personal information will be 
kept secure in a locked environment, and/or a computer file that is protected with limited password‐
access for only authorized researchers directly involved in this study. All research records will be kept 
confidential to the extent provided by law. 
 
There are no direct medical benefits to participation. The new knowledge gained from this study may 
help in the development of a minimally‐invasive biological assay that can be used to identify 
variations in mitochondrial function and dysfunction in children with ASD.  
 
*Statistical Plan 
 
Statistical Analysis 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 26 of 33 
Descriptive statistics, e.g., mean and standard deviation for continuous variables and number and 
percent for categorical variables will be obtained for all demographic variables, outcomes and 
predictors of interest. Data will be checked for errors, inconsistencies and missing values. Appropriate 
statistical methods will be used to test the specific hypotheses of interest. Analyses will be adjusted 
for confounding variables such as age, gender, autism severity, etc. wherever necessary. 
Independence of predictor variables and homogeneity of variance assumptions will be checked prior 
to the analysis. P‐values will be adjusted for multiplicity wherever appropriate. All tests will be two‐
sided and a P‐value less than or equal to 0.05 will be considered to be significant. All analyses will be 
conducted using statistical software SAS v9.2 (SAS Inst, Cary, NC) or STATA 12 (STATA Corp, College 
Station, TX), or R (R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria; (22)). 
 
Specific Aim 1: To determine if children with ASD/MD can be differentiated from children with 
ASD/NoMD by their mitochondrial energy profile defined by the Goldenthal buccal cell array and/or 
the Seahorse XF Analyzer. A multivariable logistic regression model will be used to model the 
probability of a child with ASD falling into ASD/MD group. Four oxygen consumption variables, four 
acidification variables, ATP production and DNA copy number among others will be included as 
candidate predictor variables in the model in addition to the covariates age and gender. Additional 
variables characterizing the change in the oxygen consumption and acidification variables (such as 
the slope) with increasing DNMQ dose will also be investigated. We will use data reduction methods 
that guard against overfitting before model development to make it more likely that the statistical 
model will validate on independent data. These methods include principal components analysis, 
variable clustering, and battery reduction (22) and penalized regression (23). In addition to the steps 
above, the modeling strategies of Harrell (22) and Steyerberg  (24) will be followed, including but not 
limited to imputing missing values using the aregImpute function in the RMS library of the R package, 
checking for overly influential observations, checking for linearity assumptions, and checking 
additivity assumptions by testing prespecified interaction terms. Finally, we will develop a reduced 
model (a parsimonious model) that will be manageable for the modeling and the cluster analysis in 
Aim 2. Model discrimination will be assessed using the C‐statistic and by plotting the area under the 
receiver operating characteristic (ROC) curve. The ROC curve will be further examined to determine 
the cutoff value with the highest sensitivity and lowest specificity. 
 
Specific Aim 2: A cluster analysis will be used to determine whether there are several groups of ASD 
patients or whether there are only two groups, one with MD and one with no MD. The cluster 
analysis will be based on the recent work of Hastie et al (25) which has been successful in finding valid 
clusters (subtypes) in breast cancer patients in DNA microarray studies. As recommended by these 
authors, we will use K‐means clustering to find the smallest within‐group sum of squares over the 
variables for k groups and determine the optimal number of groups by using the validation methods 
discussed below. The cluster analysis will be validated according the procedure described in Kapp and 
Tibshirani (26). The R package clusterRepro will be used to implement this procedure. The prediction 
equation from the logistic regression model obtained in Aim 1 will then be used to estimate the 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 27 of 33 
probability of having mitochondrial dysfunction for each patient in the general ASD population. The 
cutoff value determined in Aim 1 will be used to classify each patient as ASD/MD and ASD/NoMD and 
the proportion of patients classified as ASD/MD will be compared across different clusters to finally 
establish the number of levels of MD severity within the general ASD population. If the cluster 
analysis combined with the logistic model does not perform well to establish levels of MD severity, 
linear discriminant analysis will also be explored to distinguish between several groups. 
 
Specific Aim 3: To determine if mitochondrial dysfunction is associated with redox metabolism, a 
linear regression model will be performed using mitochondrial dysfunction as the dependent variable 
and redox metabolism as the primary independent variable along with ASD group classification and 
their interaction. Tests for the interaction effect and contrasts will determine if the association 
between mitochondrial dysfunction and redox metabolism depends on the ASD group classification. 
We will examine these relationships for the various biomarkers of mitochondrial function and redox 
metabolism.   
 
Specific Aim 4: Using ANCOVA, we will evaluate whether mitochondrial function and/or redox 
metabolism predicts cognitive development and/or ASD symptoms, whether the influence of 
mitochondrial function on cognitive development and/or ASD symptoms is indirect through redox 
metabolism and whether these relationships are different for individuals with ASD/NoMD and 
ASD/MD. We will conduct both moderation and mediation analysis. Indirect effects will be assessed 
through mediation analyses which will use the procedures of Baron and Kenny (27) with the 
exception that bootstrapping procedures (28) will be used to test for statistical significance of the 
indirect effects. 
 
Specific Aim 5: Box and Q‐Q plots will be used for data visualization of chemical analytes with and 
without log transformations and used as appropriate. Our experience with the distribution of 
chemicals in teeth is that it is approximately log‐normal. While we do not anticipate problems 
resulting from missing data, multiple imputation will be used when the assumption of missing‐at‐
random can be justified should these procedures be needed. Comparisons of chemical concentration 
between the participant groups (ASD/NoMD, ASD/MD, typically developing) will be made using a 
Kruskal‐Wallis test. The Dunnet test will be used to adjust for multiple comparisons between the 
groups across chemicals with p < 0.05 as the critical cutoff for significance. All analysis will be 
performed with SAS software. Relevant design variables will be included as covariates if justified. 
Lastly, as a secondary analysis, we will determine whether ASD severity (in terms of adaptive 
behavior and ASD symptoms) depends on exposures using a linear regression model including 
aforementioned covariates. Restricted cubic spline may be used if independent variables 
demonstrate non‐linear relationships. 
 
 
Power Analysis  

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 28 of 33 
We intend to sample 50 children in the ASD/MD group, 50 children in the ASD/NoMD group. These 
sample sizes are dictated by the availability of ASD patients with MD. Also 150 children in the general 
ASD group, 50 noASD/noMD (i.e. DD) and 100 for the TD group will be sampled. It is imperative for us 
to establish here that this sample size will produce sound inferences. For Aim 1, an overall sample of 
size 100 assuming equal number of cases and controls will have 83.7% power to detect a change in 
probability from 0.50 to 0.67 (an odds ratio of 2) when the independent variable is increased from its 
mean to one standard deviation above the mean. For the cluster analysis in Aim 2, the number of 
groups will be limited to three, given the sample size of 150. For Aims 3‐5, an ANCOVA model with 
sample sizes 50, 50 and 150 for the three groups has 84% power to detect a significant difference in 
group means assuming a standard deviation of 1 for the group means and a standard deviation of 5 
for observations within each group. All sample size calculations were done using PASS 11 (29) 
assuming a two‐sided significance level of 5% 
 
*Data Handling and Recordkeeping 
 
Methods Used for Data Collection  
All subjects will be given a unique identifier.  All data (cognitive, behavioral, and biochemical) will be 
generated with this number.  All biomaterials will be stored with this unique identifier.  
 
Data generated from sample analysis consists of: 
• 
HPLC and Mass Spectrometer results and source data including source chromatograms 
• 
Excel file recording of plasma and leukocyte metabolite concentrations for intracellular redox 
 
status using oxidized and reduced glutathione and results of nutritional biomarkers. 
• 
Excel file recording of leukocyte mitochondrial respiration, ATP content and mitochondrial 
 
copy number. 
 
Data Quality Assurance 
Steps to ensure the accuracy and reliability of data include selection of qualified research team 
members, review of protocol procedures with the study team, and periodic monitoring of the data 
for accuracy.  Data will be entered into a study specific database and verified for accuracy. 
 
Volunteer Identification 
Unique identifiers for this study will be assigned to each subject enrolled.   
 
Confidentiality / Disposition of Data 
All data additionally coded as described above (volunteer identification).  Access to this link, study 
specimens, and research generated from this study will be password controlled and the identity of 
the samples will be records will be restricted to the research team and institutional (e.g. IRB, 
Research Compliance) and regulatory oversight personnel.   
 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 29 of 33 
Data will be stored in hard copy and/or in password protected database(s).  Research records are 
maintained in a locked and secure environment with restricted access.   
 
Study records will be maintained for the period of time the investigator file is required to be retained 
by local institutional policy or regulatory requirements, whichever is greater.  Biomaterials will be 
stored with the unique identifier until the end of the study and kept for future studies (if consent for 
this is provided) until they are either used or destroyed. 
 
Sharing Research Results 
Any findings from these studies that are unanticipated will result in Dr. Kahler referring the 
participant to the appropriate provider for evaluation. Research results from oxidative stress, 
mitochondrial function, the language assessment, and Vineland will be provided to the families in the 
form of a research results letter. The letter will refer families to their child’s regular doctor if they are 
concerned and that we will assist them in finding a doctor if they do not have one. The results are 
indicated to be from a research study and have not been validated in the clinical population. They are 
based on limited and unpublished data. This information is intended for the sole purpose of providing 
the recipient the information from an on‐going confidential research study. This information is 
confidential in nature and due to the proprietary nature of study it should not be disclosed to persons 
outside of the scope of the research study. 
 
*Study Registration and Publication 
 
The completed study will be published in peer‐reviewed journals and presented at scientific 
conferences. 
 
Additional Safeguards to Protect Vulnerable Populations 
 
IRB approved flyers and advertisements may be utilized for participant recruitment. ACH, UAMS, 
ACNC, and community physicians will be encouraged to refer potential participants and all may be 
utilized for possible participant recruitment and referrals. Previous autism study participants, whose 
parent(s) have given written permission with a HIPAA release to be contacted about future research 
opportunities, will be contacted for interest in participation. 
 
Written or verbal (whichever is appropriate) informed parental/LAR consent will be obtained by 
appropriately trained study personnel. Parent(s)/LAR(s) will be provided a copy of the informed 
consent or study information sheet (whichever is appropriate) to review prior to participation. A 
signed copy of the consent will be provided to parent(s)/LAR(s), as applicable. Data will be entered 
into the database directly from source documents and/or study specific case report forms. For 
typically developing controls, assent will be obtained, if applicable. Participants will be given as much 
time as needed, in order to determine if they want to participate in the study or not.  

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 30 of 33 
 
Recruitment Plan 
 
Children with idiopathic ASD will be recruited from our Autism Treatment Network (ATN) site and the 
registry we have developed over the past 4 years. The University of Arkansas for Medical Sciences 
(UAMS) ATN site is the state hub for the evaluation of ASD in children. Our ATN site is part of the 
national ATN organization which is sponsored by Autism Speaks. Our site has been approved for 
funding for the next 3 years before a renewal application is necessary. The clinic evaluates 4 new 
patients per week and follows children diagnosed with ASD on a yearly basis. We also have more than 
270 participants in the ATN registry who have signed consent to be contacted for research studies 
such as the proposed study. The ATN sites routinely perform the cognitive and behavioral measures 
proposed in this study.  
 
Children with ASD/MD, DD, NDA, noASD/MD and ASD/NoMD may be recruited from outpatient 
clinics at ACH such as the pediatric GI clinic. Groups will try to be balanced across study groups on 
important medical factors, such as seizures, gastrointestinal disorders, and epilepsy, in order to 
provide a robust cohort.  
 
Children (controls and non‐controls) may be recruited by using social media through Arkansas 
Children’s Hospital, advertisement through local channels and BOOM text, word of mouth, ACNC, 
flyers posted in the community (i.e. primary pediatric clinics), as well as referrals from pediatricians. 
Children may also be identified through parent and patient centered online resources, such as 
post0218pediatrictherapies.com, Facebook, http://babyfoodsteps.wordpress.com, Arkansas Autism 
Alliance website, etc. IRB approved flyers and postings will be posted on these outlets for interested 
families.  
 
When a parent inquires about the study or a potentially eligible child is identified, study staff will 
describe the study to the parent to determine interest. If interested, study staff will screen by asking 
inclusion/exclusion criteria questions. If the child qualifies from the telephone interview, study staff 
will schedule the consent discussion phone call and provide the parent with the consent form or 
study information sheet depending on what tasks will be completed.  
 
No compensation will be offered for completing study tasks. 
 
Monitoring Plan 
 
Adherence to the monitoring plan will be documented. The research study staff will be responsible 
for monitoring the following items in the study every 3 months.  Results and deviations will be 
reported to the PI.  All results will be kept as a hard copy and kept secured in a file folder or binder in 
a secure, locked space of the research site.  

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 31 of 33 
Subjects File Documents to be reviewed (located in a locked space of the research site): 
 Initial visit data inquiry  
 Statement of informed consent using the correct, IRB approved version of signed Consent 
Form with all necessary signatures and/or documentation of verbal consent. 
 Exclusion /Inclusion documentation  
o Age 
o If diagnosis of ASD, documentation obtained 
 Cognitive and Behavioral Questionnaires (all present in locked files)  
 
2. The following are password controlled/or identity is coded: 
 Enrollment Log  
 HPLC results and source data including source chromatograms  
 Excel file recording of plasma and leukocyte metabolite concentrations for methionine, S‐
adenosylmethionine, S‐adenosylhomocysteine, adenosine, homocysteine, cystathionine, 
cysteinylglycine, oxidized and reduced glutathione. 
 Excel file recording of leukocyte mitochondrial respiration, ATP content and mitochondrial 
copy number. 
 
 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 32 of 33 
*References 
1.  Rossignol D, Frye RE. Mitochondrial Dysfunction in Autism Spectrum Disorders: A Systematic 
Review and Meta‐Analysis. Mol Psychiatry. 2011. 
2.  Giulivi C, Zhang YF, Omanska‐Klusek A, Ross‐Inta C, Wong S, Hertz‐Picciotto I, et al. 
Mitochondrial dysfunction in autism. JAMA. 2010;304(21):2389‐96. Epub 2010/12/02. 
3.  Bernier FP, Boneh A, Dennett X, Chow CW, Cleary MA, Thorburn DR. Diagnostic criteria for 
respiratory chain disorders in adults and children. Neurology. 2002;59:1406‐11. 
4.  Frye RE, Naviaux RK. Autistic disorder with complex IV overactivity: A new mitochondrial 
syndrome. Journal of Pediatric Neurology. in press. 
5.  Graf WD, Marin‐Garcia J, Gao HG, Pizzo S, Naviaux RK, Markusic D, et al. Autism Associated 
With the Mitochondrial DNA G8363A Transfer RNALys Mutation. J Child Neurol. 2000;15:357‐61. 
6.  Frye RE, Rossignol DA. Mitochondrial dysfunction can connect the diverse medical symptoms 
associated with autism spectrum disorders. Pediatric research. 2011;69(5 Pt 2):41R‐7R. 
7.  Morava E, van den Heuvel L, Hol F, de Vries MC, Hogeveen M, Rodenburg RJ, et al. 
Mitochondrial disease criteria: diagnostic applications in children. Neurology. 2006;67(10):1823‐6. 
8.  Kirby DM, Thorburn DR, Turnbull DM, Taylor RW. Biochemical assays of respiratory chain 
complex activity. Methods in cell biology. 2007;80:93‐119. 
9.  James SJ, Melnyk S, Jernigan S, Cleves MA, Halsted CH, Wong DH, et al. Metabolic 
endophenotype and related genotypes are associated with oxidative stress in children with 
autism. AmJMedGenetB NeuropsychiatrGenet. 2006;141(8):947‐56. 
10. James SJ, Melnyk S, Fuchs G, Reid T, Jernigan S, Pavliv O, et al. Efficacy of methylcobalamin 
and folinic acid treatment on glutathione redox status in children with autism. American Journal 
of Clinical Nutrition. 2009;89(1):425‐30. 
11. Melnyk S, Fuchs GJ, Schulz E, Lopez M, Kahler SG, Fussell JJ, et al. Metabolic Imbalance 
Associated with Methylation Dysregulation and Oxidative Damage in Children with Autism. J 
Autism Dev Disord. 2011. Epub 2011/04/27. 
12. Finkelstein JD. Metabolic regulatory properties of S‐adenosylmethionine and S‐
adenosylhomocysteine. Clin Chem Lab Med. 2007;45(12):1694‐9. Epub 2007/10/30. 
13. Miller AL. The methylation, neurotransmitter, and antioxidant connections between folate 
and depression. Altern Med Rev. 2008;13(3):216‐26. Epub 2008/10/28. 
14. James SJ, Rose S, Melnyk S, Jernigan S, Blossom S, Pavliv O, et al. Cellular and mitochondrial 
glutathione redox imbalance in lymphoblastoid cells derived from children with autism. FASEB J. 
2009;23(8):2374‐83. Epub 2009/03/25. 
15. Emerit J, Edeas M, Bricaire F. Neurodegenerative diseases and oxidative stress. Biomed 
Pharmacother. 2004;58(1):39‐46. Epub 2004/01/24. 
16. Milton VJ, Sweeney ST. Oxidative Stress in Synapse Development and Function. 
Developmental Neurobiology. in press. 
17. Ristow M, Schmeisser S. Extending life span by increasing oxidative stress. Free radical biology 
& medicine. 2011;51(2):327‐36. Epub 2011/05/31. 

TITLE: Defining subgroups of mitochondrial disease and dysfunction in autism spectrum disorder 
Funding Sources: Jane Botsford Johnson Foundation and Dr. Frye startup funds 
IRB #137162 
Sponsor: Frye Recruitment Funds 
PI: Shannon Rose, Ph.D. 
Version 29 
 
 
11/27/2018                                                   
                                                 VERSION 29                                              
 
PAGE 33 of 33 
18. Dranka BP, Hill BG, Darley‐Usmar VM. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The 
impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radic Biol Med. 2010;48(7):905‐14. Epub 
2010/01/23. 
19. Capasso M, Bhamrah MK, Henley T, Boyd RS, Langlais C, Cain K, et al. HVCN1 modulates BCR 
signal strength via regulation of BCR‐dependent generation of reactive oxygen species. Nature 
immunology. 2010;11(3):265‐72. Epub 2010/02/09. 
20. Team RDC. R: A language and environment for statistical computing. Vienna, Austria: R 
Foundation for Statistical Computing; 2010. 
21. Frye RE. Novel cytochrome b gene mutations causing mitochondrial disease in autism. Journal 
of Pediatric Neurology. in press. 
22. Harrell FE. Regression Modeling Strategies: with applications to linear models, logistic 
regression, and survival analysis. . New York: Springer‐Verlag; 2001. 
23. Moons KG, Donder AR, Steyerberg EW, Harrell FE. Penalized maximum likelihood estimation 
to directly adjust diagnostic and prognostic prediction models for overoptimism: A clinical 
example. Journal of Clinical Epidemiology 2004;57:1262‐70. 
24. Steyerberg EW. Clinical Prediction Models: A Practical Approach to Development, Validation, 
and Updating. New York: Springer; 2009. 
25. Hastie T, Tibshirani R, Friedman J. The Elements of Statistical Learning: data mining, inference, 
and prediction. New York: Springer; 2009. 
26. Kapp AV, Tibshirani R. Are clusters found in one dataset present in another dataset? 
Biostatistics. 2007;8:9‐31. 
27. Baron R, Kenny D. The mediator‐moderator variable distinction in social psychological 
research: Conceptual, strategic, and statistical considerations. Journal of Personality and Social 
Psychology. 1986;51:1173‐82. 
28. Preacher K, Hayes A. SPSS & SAS procedures for estimating indirect effects in sim‐ple 
mediation models. Behavior Research Methods, Instruments, & Computers. 2004;36(4):717‐31. 
29. Hintze J. PASS 11. Kaysville, Utah: NCSS, LLC; 2011. 
30. Schaefer GB, Mendelsohn NJ. Clinical genetics evaluation in identifying the etiology of autism 
spectrum disorders. Genetics in medicine : official journal of the American College of Medical 
Genetics. 2008;10(4):301‐5. Epub 2008/04/17. 
31. Frye RE, Melynk, S., and MacFabe, DF. Unique acyl‐carnitine profiles are potential biomarkers    
for acquired mitochondrial disease in autism spectrum disorder. Translational Psychiatry. 2013; 3 
(1): e220‐e230.