Novel Mechanisms and Predictors of VEGF Receptor Inhibitor- or Immune Checkpoint Inhibitor-Associated Hypertension and Cardiovascular Disease
Conditions: Renal Cell Carcinoma, Hypertension, Melanoma, Cancer
Sponsor: Vanderbilt University Medical Center

Pr ot o c ol V ersi o n  #:  3  
 
1  
Pr ot o c ol D at e:  D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
 
 
 
 
 
N o v el M e c h a nis ms a n d Pr e di ct ors of V E G F R e c e pt or 
I n hi bit or- or I m m u n e C h e c k p oi n t I n hi bit or-Ass o ci at e d 
H y p ert e nsi o n  a n d C ar di o v as c ul ar Dis e as e  
 
 
N C T 0 3 7 0 9 7 7 1  
 
Pr ot o c ol D at e: D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Pr ot o c ol V ersi o n  #:  3  
 
2  
Pr ot o c ol D at e:  D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
 
 
 
N o v el M e c h a ni s m s a n d Pr e di ct or s of V E G F 
R e c e pt or I n hi bit or - or I m m u n e C h e c k p oi n t 
I n hi bit or -A s s o ci at e d H y p ert e n si o n  a n d 
C ar di o v a s c ul ar Di s e a s e  
 
J o s h u a B e c k m a n, M D  
Di vi si o n of C ar di ol o g y  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Pr ot o c ol V ersi o n  #:  3  
 
3  
Pr ot o c ol D at e:  D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
T a bl e of C o nt e nt s:  
 
St u d y S c h e m a  
1. 0  
B a c k gr o u n d  
2. 0  
R ati o n al e a n d S p e cifi c Ai m  
3. 0  
A ni m al St u di e s a n d Pr e vi o u s H u m a n St u di e s  
4. 0  
I n cl u si o n / E x cl u si o n Crit eri a  
5. 0  
E nr oll m e nt / R a n d o mi z ati o n  
6. 0  
St u d y Pr o c e d ur e s  
7. 0  
Ri s k s of I n v e sti g ati o n a l A g e nt s / D e vi c e s ( si d e eff e ct s)  
8. 0  
R e p orti n g of A d v er s e E v e nt s or U n a nti ci p at e d Pr o bl e m s i n v ol vi n g Ri s k 
t o P arti ci p a nt s or Ot h er s 
9. 0  
St u d y Wit h dr a w al / Di s c o nti n u ati o n  
1 0. 0  St ati sti c al C o n si d er ati o n s  
1 1. 0  Pri v a c y / C o nfi d e nti alit y I s s u e s  
1 2. 0  F oll o w -u p a n d R e c or d R et e nti o n  
 

Pr ot o c ol V ersi o n  #:  3  
 
4  
Pr ot o c ol D at e:  D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
1. 0  
B a c k g ro u n d  
 
T h e st at us q u o f or t h e pr e di cti o n, di a g n osis a n d tr e at m e nt of V E G F R -T KI  a n d i m m u n e 
c h e c k p oi nt -i n hi bit or (I CI) h y p ert e nsi o n  a n d v as c ul ar dis e as e  is a p pli c ati o n of t h e c o ns e ns us 
g ui d eli n es d e v el o p e d f or ess e nti al h y p ert e nsi o n i n t h e g e n er al p o p ul ati o n . I n p arti c ul ar, t h e 
a cti v e s ur v eill a n c e f or h y p ert e nsi o n a n d us e of  c o m m o n a nti -h y p ert e nsi v e m e di c ati o ns i n 
c ar di o -o n c ol o g y p ati e nts is d eri v e d fr o m r a n d o miz e d c o ntr oll e d tri als of h y p ert e nsi o n i n a d ults 
wit h t h e c o m m o n c o m or bi diti es of a gi n g. N ot a bl y, c a n c er p ati e nts h a v e b e e n s yst e m ati c all y 
e x cl u d e d fr o m t h es e tri als. As a r es ult, t h e c urr e nt a p pr o a c h b eli es  t h e disti n ct o n c ol o gi c 
c o nt e xt of V E G F R -T KI or I CI us e a n d t h eir t o xi citi es a n d i n h er e ntl y li mits t h e e vi d e n c e f or 
a p pl yi n g t h es e g ui d eli n es t o t his  u ni q u e p ati e nt gr o u p. O v er all, it r e m ai ns u n cl e ar w h et h er 
pr e v aili n g m e c h a nisti c  c o n c e pts t o e x pl ai n ess e n ti al h y p ert e nsi o n or t h e al g orit h ms f or a nti-
h y p ert e nsi v e m e di c ati o ns s h o ul d b e e xtr a p ol at e d t o p ati e nts wit h m ali g n a n ci es w h o ar e o n 
tr e at m e nt wit h a n ti-a n gi o g e ni c t h er a pi es. F or e x a m pl e, h u m a n st u di es of V E G F R -T KI -m e di at e d 
h y p ert e nsi o n h a v e d es cri b e d c or r el ati o ns b et w e e n s p e cifi c E C m et a b olit es i m pli c at e d i n bl o o d 
pr ess ur e h o m e ost asis s uc h as nitri c o xi d e or E T -1, b ut t h e i m p a ct of t ar g et e d t h er a pi es  to 
i nt er di ct t h es e p at h w a ys r e m ai n u nt est e d. O ur r es e ar c h disr u pts t his p ar a di g m b y c o nstr u cti n g 
a n e w pr e cisi o n m e di ci n e fr a m e w or k f or t h e cli ni c al a p pr o a c h t o t his at -ris k o n c ol o g y p ati e nt 
p o p ul ati o n. T h e c e ntr al i n n o v ati o n i n t his pr o p os al is t h at V E G F R -T KI -m e di at e d h y p ert e nsi o n 
st e ms fr o m c o nt e xt -s p e cifi c bi ol o gi c m e c h a nis ms d et er mi n e d b y m e di c ati o n - a n d p ati e nt -
s p e cifi c v ari a bl es t h at c a n b e l e v er a g e d f or ris k pr e di cti o n a n d i m pl e m e nt ati o n of r ati o n al 
t h er a pi es. A n a d diti o n al a d v a n c e of t his  pr o p os al  is t h e est a blis h m e nt of a n i nt er dis ci pli n ar y 
t e a m f o c us e d o n c ar di o-o n c ol o g y p ati e nts at V U M C t o e n a bl e a n i n n o v ati v e, m ulti-di m e nsi o n al 
r es e ar c h a p pr o a c h s p a n ni n g b asi c, cli ni c al/tr a nsl ati o n al a n d p o p ul ati o n s ci e n c e.  
 
2. 0  
R ati o n al e a n d S p e cifi c Ai m  
 
W e h y p ot h e siz e t h at  V E G F R -T KIs , I CIs, a n d c o m bi n ati o n  tr e at m e nt c a us e h y p ert e nsi o n a n d 
v as c ul ar d ysf u n cti o n t hr o u g h E T -1 i n d u cti o n a n d t his p at h w a y is a t ar g et f or pr e cisi o n 
t h er a p e uti c i nt er v e nti o ns a n d n o v el ris k str atifi c ati o n. 
 
Ai m  
 
V E G F R -T K I s, I C I s, a n d t h e c o m bi n ati o n -m e di at e d i n cr e a s e s i n E T A r e c e pt or 
a cti v ati o n will c a u s e h y p ert e n si o n a n d r e d u c e t h e bi o a v ail a bil it y of e n d ot h eli u m-
d eri v e d nitri c o xi d e. W e h a v e pr e vi o usl y d e m o nstr at e d t h at t w o str u ct ur all y disti n ct V E G F R  
T KIs r e d u c e t h e bi o a v ail a bilit y of e n d ot h eli u m -d eri v e d nitri c o xi d e. W e h y p ot h esiz e t h at V E G F R  
T KIs a nt a g o nis m will r e d u c e di git al mi cr o v ess el h y p er e mi a. As h y p ert e nsi o n is m e di at e d 
pri m aril y i n t h e mi cr o v asc ul at ur e, w e a nti ci p at e a n e n h a n c e d r es p o ns e i n t his v as c ul ar b e d . 
 
3. 0  
A ni m al St u di e s a n d Pr e vi o u s H u m a n St u di e s  
 
V E G F R 2 i n hi bi ti o n d e cr e as es c o nstit uti v e nitri c o xi d e bi o a v ail a bilit y 
W e h a v e st u di e d s e v e nt e e n p ati e nts wit h st a g e I V br e ast c a n c er r e c ei v e d w h o r e c ei v e d t h e 
V E G F R -T K I v a n d et a ni b as p art of  a p h as e 1 pr ot o c ol.  W e d et er mi n e d bl o o d pr ess ur e a n d 
s yst e mi c N O x c o n c e ntr ati o ns. W e f urt h er e x a mi n e d e n d ot h eli al f u n cti o n b y m e as uri n g t h e 
eff e cts o f v a n d et a ni b o n e n d ot h eli al c ell nitri c o xi d e pr o d u cti o n a n d A kt 4 7 3 p h os p h or yl ati o n 
w er e e x a mi n e d i n vitr o.   

Pr ot o c ol V ersi o n  #:  3  
 
5  
Pr ot o c ol D at e:  D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
 
 
 
V a n d et a ni b tr e at m e nt f or 6 w e e ks si g nifi c a ntl y i n cr e as e d bl o o d pr ess ur e  a n d d e cr e as e d pl as m a 
nitrit es a n d nitr ot yr o si n e, b ut n ot a m ar k er of o xi d ati v e str ess ( 8 -O H D G) c o m p ar e d t o b as eli n e 
( T a bl e). 
 
P ar a m et er  
 
B a s eli n e  
6 W e e k s  
C o m p ari s o n  
M e a n Art eri al Pr e s s ur e  
( m m H g) 
9 1 +/ - 8  
1 0 2 +/ - 1 0  
p = 0. 0 0 1  
H e art R at e  
( B P M) 
7 4 +/ - 1 3  
7 1 +/ - 1 0  
p = 0. 2 8  
Nitr at e s / Nitrit e s ( N O x )  
( A U) 
4 8 4 4 6 ± 1 2 6 4  
4 6 7 9 9 ± 1 7 4 0  
p < 0. 0 0 1  
Nitr ot yr o si n e  
( A U) 
2 5 9 8 1 4 ± 2 6 1 3 9  2 4 6 1 5 7 ± 2 0 5 0 1  
p = 0. 0 3  
8 -h y dr o x y -2’ -
d e o x y g u a n o si n e  
( A U) 
1. 9 6 ± 0. 0 9  
2. 0 ± 0. 1 5  
p = 0. 5  
 
4. 0  
I n cl u si o n / E x cl u si o n Crit eri a  
 
I n cl usi o n crit eri a 
•  
M al e or f e m al e, a g e  4 0 - 7 5  y e ars ol d  
•  
Di a g n osis of c a n c er  
•  
R e c ei vi n g V E G F  i n hi bit or, I CI, or c o m bi n ati o n ( V E G F i n hi bit or + I CI  or 
c o m bi n ati o n I CI ) tr e at m e nt, or n ot r e c ei vi n g a n y tr e at m e nt.  
•  
N or m al bl o o d pr ess ur e or bl o o d pr ess ur e tr e at e d t o < 1 4 0/ 9 0 m m H g  wit h ≤2 
a nti h y p ert e nsi v e m e di c ati o ns  
 
E x cl usi o n crit eri a  
•  
Pr es e n c e of  p eri p h er al art er y dis e as e  
•  
Hist or y of a  h e art att a c k  wit hi n 1 y e ar  
•  
Hist or y of  a  str o k e wit hi n 1 y e ar  
•  
D i a b et es 
•  
Lif e e x p e ct a n c y < 3 m o nt hs  
•  
W o m e n w h o ar e pr e g n a nt  
•  
W o m e n w h o ar e n ursi n g  
 
5. 0  
E nr oll m e nt / R a n d o mi z ati o n  
 

Pr ot o c ol V ersi o n  #:  3  
 
6  
Pr ot o c ol D at e:  D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
W e will st u d y 8 0  s u bj e cts wit h c a n c er  w h o will b e tr e at e d wit h V E G F i n hi bit or , I CI, or 
c o m bi n ati o n ( V E G F i n hi bi t or pl us I CI or c o m bi n ati o n I CI tr e at m e nt ), or n ot r e c ei vi n g a n y of t h e 
a b o v e tr e at m e nts a n d will s er v e as c o ntr ols . W e will r estri ct e nr oll m e nt t o a g e 4 0 - 7 5  y e ars.  
S u bj e cts  will b e i d e ntifi e d b y r es e ar c h st aff  fr o m V a n d er bilt I n gr a m C a n c er C e nt er ( VI C C)  
Cli ni cs . If a p pr o pri at e, t h e p h ysi ci a n s e ei n g t h e p ati e nt i n cli ni c will a p pr o a c h t h e p ati e nt a b o ut 
p arti ci p ati n g i n a cl i ni c al tri al a n d al ert t h e a p pr o pri at e r es e ar c h st aff f or f urt h er st u d y 
d is c ussi o n wit h t h e p ati e nt. T h e p ati e nt will b e c o ns e nt e d or b e all o w e d t o  t a k e t h e c o ns e nt 
f or m h o m e t o r e a d if t h e y ar e i nt er est e d.   W e will us e t h e V U M C R es e ar c h D eri v ati v e, a f ull y 
i d e ntifi e d cli ni c al d at a b as e s p e ci aliz e d f or r es e ar c h, t o s c a n t h e p o p u l ati o n of p ati e nts i n t h e 
V U M C el e ctr o ni c h e alt h r e c or d a n d us e t his i nf or m ati o n t o a p pr o a c h p ati e nts  w it h r e n al c ell 
c ar ci n o m a , wit h t h e p arti ci p a nts att e n di n g p h ysi ci a n s’ pri or c o ns e nt. R es e ar c h c o or di n at ors at 
t h e V a n d er bilt Tr a nsl ati o n al a n d Cli ni c al Car di o v as c ul ar R es e ar c h C e nt er ( V T R A C C) h a v e h a d 
s u c c ess i n r e cr uiti n g s e v er al t h o us a n d s u bj e cts i n t h e l ast 5 y e ars f or a v ari et y of pr oj e cts. I n 
a d diti o n  t o t h e V T R A C C r es e ar c h st aff , t h e st u d y will als o utiliz e s er vi c es pr o vi d e d b y t h e  
V a n d er bilt C o or di n at i n g C e nt er .  T h e V C C will pr o vi d e n urs i n g s u p p ort t o assist t h e r es e ar c h 
c o or di n at or s wit h st u d y pr o c e d ur es , c o ns e nti n g  p at ie nts, pl a c i n g t he I V  c at h et er , a n d c oll e cti o n 
of t h e e n d o th eli al  s a m pl es.  
 
6. 0  
St u d y Pr o c e d ur e s  
 
B a s eli n e . W e will r e cr uit s u bj e cts w h o h a v e n ot y et b e g u n t h eir tr e at m e nt . T h e s u bj e cts m ost 
re c e nt l a bs will b e r e vi e w e d b y st u d y st aff as p art of t h e s cr e e ni n g  pr o c ess.  S u bj e cts  will r e p ort 
t o t he Pr est o n R es e ar c h B uil di n g aft er a  ≥ 5 h o ur  f ast. First a n inf or m e d c o ns e nt will  b e  
o bt ai n e d  (if n ot alr e a d y o bt ai n e d d uri n g t h e p ati e nt ’s cli ni c visit) , f oll o w e d b y a m e di c al hist or y , 
a n a b br e vi at e d p h ysi c al e x a m , a n d t a ki n g t h e s u bj e cts w ei g ht. A ft er t h e p ati e nt h as b e e n sittin g 
f or 1 0 min ut es, b l o o d pr ess ur e will b e m e as ur e d i n tri pli c at e usi n g a n a ut o m at e d os cill o m etri c 
d e vi c e , b as eli n e a n d hy p er e mi c v el o cit y ti m e i nt er v al ( V TI),  a n d di git al p uls e a m plit u d e 
t o n o m etr y will b e p erf or m e d t o m e as ur e t h e r e a cti v e h y p er e mi a i n d e x. W e will dr a w  bl o o d f or 
r e n al f u n cti o n, s o di u m a n d p ot assi u m, f asti n g gl uc os e a n d i ns uli n,  m et a b oli cs, m ar k ers of 
i nfla m m ati o n, a n d m ar k ers of o xi d ati v e str ess . W e will m e as ur e uri n ar y  al b u mi n/ cr e ati ni n e  r ati o 
( U A C R). W e will pl a c e a n I V c at h et er f or bl o o d s a m pli n g a n d  e n d ot h eli al c ell h ar v est . 
E n d ot h eli al c ells ( E Cs) will b e h ar v est e d fr o m p ati e nt s f or g e n e e x pr essi o n ( P C R, R N A -
s e q u e n ci n g), st ai ni n g a n d A T A C ass a ys . S u bj e cts will t h e n h a v e a n  a m b ul at or y bl o o d pr ess ur e 
m o nit or ( S p a c el a bs) pl a c e d f or 2 4 h o urs.  
 
F oll o w -u p  Vi sit  A p pr o xi m at el y  1  m o nt h aft er st arti n g tr e at m e nt, s u bj e cts will r et ur n t o t h e 
Pr est o n R es e ar c h B uil di n g.  T h e pr o c e d ur es will b e t h e s a m e as t h e b as eli n e visit pr o c e d ur es.  
W e will st art b y dis c ussi n g  c h a n g es t o m e di c al hist or y  si n c e t h e b e gi n ni n g of t h e st u d y, c o n d u ct 
a n a b br e vi at e d p h ysi c al e x a m , a n d t a k e t h e s u bj e cts w ei g ht. Aft er t h e p ati e nt h as b e e n sitti n g 
f or 1 0 mi n ut es, bl o o d pr ess ur e will b e m e as ur e d i n tri pli c at e usi n g a n a ut o m at e d os cill o m etri c 
d e vi c e , b as eli n e a n d h y p er e mi c v el o cit y ti m e i nt er val ( V TI), a n d di git al p uls e a m plit u d e 
t o n o m etr y will b e p erf or m e d t o m e as ur e t h e r e a cti v e h y p er e mi a i n d e x. W e will dr a w bl o o d  f or 
r e n al f u n cti o n, s o di u m a n d p ot assi u m, f asti n g gl uc os e a n d i ns uli n,  m et a b oli cs,  m ar k ers of 
i nfla m m at i o n, a n d m ar k ers of o xi d ativ e str ess . W e will m e as ur e uri n ar y  al b u mi n/ cr e ati ni n e  r ati o 
( U A C R). W e will pl a c e a n I V c at h et er f or bl o o d s a m pli n g a n d e n d ot h eli al c ell h ar v est . 
E n d ot h eli al c ells ( E Cs) will b e h ar v est e d fr o m p ati e nt s f or g e n e e x pr essi o n ( P C R, R N A -
s e q u e n ci n g), st ai ni n g a n d A T A C ass a ys . S u bj e cts will t h e n h a v e a n  a m b ul at or y bl o o d pr ess ur e 
m o nit or ( S p a c el a bs) pl a c e d f or 2 4 h o urs.  

Pr ot o c ol V ersi o n  #:  3  
 
7  
Pr ot o c ol D at e:  D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
 
St a n d ar d T e c h ni q u e s  
 
P eri p h er al Art er y T o n o m etr y  Di git al p uls e a m plit u d e will b e m e as ur e d i n t h e f asti n g st at e wit h a 
p eri p h er al  art er y t o n o m etr y ( P A T) d e vi c e pl a c e d o n t h e ti p of e a c h i n d e x fi n g er ( E n d o-P A T 2 0 0 0, 
It a m ar M e di c al, C a es ar e a, Isr a el). T h e P A T d e vi c e c o m pris es a p n e u m ati c pl et h ys m o gr a p h t h at 
a p pli es u nif or m pr ess ur e t o  t h e s urf a c e of t h e dist al fi n g er, all o wi n g m e as ur e m e nt of p uls e 
v ol u m e c h a n g es i n t h e fi n g er. T hr o u g h o ut t h e  st u d y, t h e i nfl ati o n pr ess ur e of t h e di git al d e vi c e 
is el e ctr o ni c all y s et t o 1 0 m m H g b el o w di ast oli c bl o o d pr ess ur e or 7 0 m m H g ( w hi c h e v er is 
l o w er). B as eli n e p uls e a m plit u d e is m e as ur e d fr o m e a c h fi n g erti p f or 2  mi n ut es 2 0 s e c o n ds. 
Art eri al fl o w is arr est e d f or 5 mi n ut es b y a c uff pl a c e d o n a pr o xi m al f or e ar m ( H o k a ns o n  A G 1 0 1, 
D. E. H o k a ns o n I n c, B ell e v u e, W A) at w hi c h e v er o c cl usi o n pr ess ur e w o ul d b e hi g h er: 2 0 0 m m 
H g or  6 0 m m H g pl us s yst oli c bl o o d pr ess ur e. P uls e a m plit u d e is r e c or d e d el e ctr o ni c all y i n b ot h 
fi n g ers a n d a n al yz e d b y a c o m p ut eriz e d, a ut o m at e d al g orit h m (It a m ar M e di c al) t h at pr o vi d es 
t h e a v er a g e p uls e a m plit u d e f or e a c h 3 0 -s e c o n d i nt er v al aft er f or e ar m c uff d efl ati o n u p t o 4 
mi n ut es. T o d et er mi n e t h e P A T  r ati o, w e will first c al c ul at e t h e r ati o of t h e p ost-d efl ati o n p uls e 
a m plit u d e t o t h e b as eli n e p uls e a m plit u d e i n  t h e 9 0- t o 1 2 0-s e c o n d p ost d efl ati o n ti m e p eri o d 
(i e, X h 9 0– 1 2 0/ X h 0: wit h h d e n oti n g h y p er e mi c fi n g er a n d 0  d e n oti n g b as eli n e, X b ei n g t h e 
p ul s e a m plit u d e). T h e n, w e di vi d e d t his r es ult b y t h e c orr es p o n di n g r ati o fr o m  t h e c o ntr al at er al, 
c o ntr ol h a n d (i e, X c 9 0 – 1 2 0/ X c 0: wit h c d e n oti n g t h e c o ntr ol fi n g er a n d 0 d e n oti n g b as eli n e) t o  
o bt ai n t h e P A T r ati o. B e c a us e  P A T r ati o h as a h et er os c e d asti c e rror str u ct ur e, w e us e n at ur al 
l o g arit h m tr a nsf or m ati o n i n all a n al ys es s u c h t h at P A T r ati o =l n[( X h 9 0– 1 2 0/ X h 0)/( X c 9 0 – 1 2 0/ 
X c 0)].  
 
E n d ot h eli al c ell h ar v est  T h e Br o w n a n d B e c k m a n  L a b or at ori es h a v e d e v el o p e d  a n o v el  
t e c h ni q u e b as e d o n a pr ot o c ol f or is ol ati o n o f E Cs a n d  l e u k o c yt es dir e ctl y fr o m t h e c u bit al v ei ns 
of h u m a n s u bj e cts 1 . T his pr o c e d ur e i n v ol v es g e ntl e s cr a pi n g of t h e v ei n usi n g a 0. 0 1 4” j -wir e  
f oll o w e d b y s el e cti o n of E Cs (fr o m r e d bl o o d c ells a n d l e u k o c yt es) usi n g  V E -c a d h eri n m a g n eti c 
b e a ds a n d r a p i d s orti n g b y gr a vit y fl o w ( M A C S) . T h e c ell yi el ds usi n g t his t e c h ni q u e r a n g e fr o m 
5 0 0 -1 0 0 0.  I m m u n ofl u or e s c e n c e of fi x e d c ells d e m o nstr at es p ositi v e st ai ni n g f or E C m ar k ers 
i n cl u di n g v o n Will e br a n d f a c t or a n d n o st ai ni n g f or p a n -l e u k o c yt e m ar k er C D 4 5. U n bi as e d R N A -
s e q u e n ci n g c o nfir ms t h e tr a ns cri pt o m es  cl ust er  p erf e ctl y b y c ell t y p e ( Fi g ur e 6). F urt h er, 
f u n cti o n al e nri c h m e nt a n al ysis ( T o p p G e n e) r e v e als diff er e nti al e x pr essi o n of g e n es ass o ci at e d  
wit h c e ll t y p e s p e cifi c f u n cti o ns. I m p ort a ntl y f or t his pr o p osal , t h es e p ati e nt -s p e cifi c E Cs e x pr ess 
g e n es of t h e e n d ot h eli n -1 a n d V E G F  si g n ali n g p at h w a ys i n cl u di n g E D N 1. T his n o v el t e c h ni q u e 
e n a bl es us t o  t est t h e eff e cts of V E G F R-T KI , I CI, a n d t h e c o m b in ati o n  of a g e nts  i n t h e 
v as c ul at ur e dir e ctl y fr o m h u m a ns f or  t he first ti m e. 
 
F or t h es e e x p eri m e nts, w e will is ol at e E Cs fr o m p ati e nts b ef or e a n d aft er st arti n g V E G F R-T KI , 
I CI, a n d c o m bi n ati o n  t h er a p y ( o n tr e at m e nt, a p pr o xi m at el y 3 0 d a ys). E C pr e p ar ati o n s will b e 
di vi d e d f or t h e f oll o wi n g: a) R N A e xtr a cti o n t o m e as ur e  e x pr essi o n  of r el e v a nt g e n es i n v ol v e d i n 
b ot h V E G F a n d E T -1 p at h w a ys i n cl u di n g F L T 1, F L K 1, F L T 4, E D N 1, E T R B a n d  e n d ot h eli n 
c o n v erti n g e nz y m e ( E C E); b) is ol ati o n of n u cl ei t o p erf or m A T A C -s e q wit h t h e g o al of  m a p pi n g 
t h e r e g ul at or y el e m e nts i n p ati e nt-d eri v e d E Cs. A T A C d at a ar e str o n gl y  c orr el at e d wit h 
e n h a n c er m a ps g e n er at e d  wit h C hI P d at as ets 2 . H o w e v er, t h e l o w er c ell yi el d r e n d ers 
c o n v e nti o n al C hI P ass a ys c h all e n gi n g. As s u c h,  A T A C ass a ys w ill b e us e d t o pr o vi d e s p e cifi c 
i nsi g ht i nt o e n h a n c er ar c hit e ct ure.  W e will i nt e gr at e A T A C d at a  wit h g e n e e x pr essi o n d at a fr o m 

Pr ot o c ol V ersi o n  #:  3  
 
8  
Pr ot o c ol D at e:  D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
p ati e nt E Cs t o d et er mi n e t h e eff e cts of V E G F R -T KI , I CI, or t h e c o m bi n ati o n of a g e nts o n t h e E C  
e pi g e n o m e i n vi v o i n h u m a ns.  
 
B P M e as ur e m e nt s At  b as eli n e  a n d t h e f oll o w-u p  visit  o ut p ati e nt B P wil l b e m e as ur e d wit h a n  
a n er oi d s p h y g m o m a n o m et er ( W el c h All y n, S k a n e at el es F alls, N Y), usi n g t h e a p p e ar a n c e a n d 
c o m pl et e  dis a p p e ar a n c e of t h e K or ot k off s o u n ds ( K 1 a n d K 5) as S B P a n d D B P. T h e m e a n  of 
t hr e e s e at e d m e as ur e m e nts , p erf or m e d t w o mi n ut es a p art, wil l b e us e d. D uri n g st u d y d a ys, B P 
will b e m e as ur e d usi n g a n a ut o m at e d os cill o m etri c  r e c or di n g d e vi c e ( Di n a m a p, Criti k o n, 
C arls b a d, C A) a n d will b e c o m pl et e d wit h t h e s u bj e cts  sitti n g. A m b ul at or y B P m o nit ori n g will b e 
p erf or m e d wit h a p ort a bl e  n o ni n v as i v e r ec or d er ( S p a c e L a bs I n c., R e d m o n d, W A) f or 2 4 -
c o ns e c uti v e h o urs  at t h e e n d o f t h e b as eli n e a n d f oll o w u p st u d y visits . 
 
L a b or at or y T esti n g  T h e f oll o wi n g bi o m ar k er m e as ur e m e nts will b e d o n e i n c oll a b or ati o n wit h 
Dr. Y a n R u S u i n t h e V a n d er bilt C ar di o l o g y C or e l a b. H er l a b h as e xt e nsi v e e x p eri e n c e w or ki n g 
w it h E LI S A-b as e d bi o m ar k er d et e cti o n, a n d off ers t h es e t ests as r o uti n e s er vi c e. Pl as m a 
al d ost er o n e l e v el will b e t est e d usi n g Al d ost er o n e E LI S A kit ( E a gl e Bi os ci e n c es, C at # D C M 0 5 3 -
8). B as e d o n t h e m a n uf a ct ur e r’s d at a, t h e i ntr a ass a y v ari ati o n is ≤ 9. 7 % a n d t h e i nt er ass a y 
v ari ati o n is ≤ 1 1 %, r es p e cti v el y.  T h e V as c ul ar  E n d ot h eli al Gr o wt h F a ct or 1 6 5 B ( V E G F -1 6 5 B) will 
b e t est e d usi n g q u a ntit ati v e s a n d wi c h E LI S A kit fr o m  M y Bi os o ur c e ( C at # M B S 1 0 9 0 7 4). T h e 
s e nsiti vi t y of t his kit is 5. 0 p g/ ml a n d b ot h I ntr a-ass a y  C V ( %) a n d  I nt er-ass a y C V ( %) is l ess 
t h a n 1 5 %. H u m a n S er u m A di p o ki n es ( H G F, L e pti n, I L-1 β, I L -6 I L -8/ C X C L 8,  I ns uli n, M C P-
1/ C C L 2, N G F a n d T N F -α) will b e m e as ur e d usi n g E M D Milli p or e/ Si g m a Milli pl e x M a p H u m a n  
A di p o ki n e M a g n eti c B e a d P a n el 1 ( Milli p or e/ Si g m a, C at #  H A D K 1 M A G -6 1 K)  a c c or di n g t o 
m a n uf a ct ur er’s  i nstr u cti o ns. T h e C ar di ol o g y C or e l a b h as L u mi n e x 2 0 0 a n d is w ell s et u p t o r u n 
t h es e t y p es of ass a y s as t h eir  r o uti n e s er vi c e. W e will r u n F 2 -is o pr ost a n es us i n g m ass 
s p e ctr o m etri c m et h o ds d e v el o p e d at V a n d er bilt.  
 
T y p e  a n d A m o u nt Of S a m pl e N e e d e d : A b o ut 4 0  m L  a n d a b o ut 1 0 m L of uri n e at e a c h of t h e 
st u d y visits. 
 
7. 0  
Ri s k s  
 
P hl e b ot o m y:  dr a wi n g bl o o d m a y c a us e p ai n, br uisi n g, li g ht h e a d e d n ess a n d r ar el y, i nf e cti o n.  
 
I ntr a v e n o us c at h et er pl ac e m e nt: c o m m o n  ris ks incl u d e p ai n at t h e sit e of t h e n e e dl e sti c k a n d 
m il d br uisi n g. U n c o m m o n  ris ks ar e he m at o m a , inf e cti o n , a n d phl e bitis . 
 
E n d ot h eli al bi o ps y : t h er e ar e n ot a n y co m m o n  ris ks. A n u n c o mm o n ris k is p hl e biti s. 
 
8. 0  
R e p or ti n g of A d v er s e E v e nt s or U n a nti ci p at e d Pr o bl e m s  i n v ol vi n g Ri s k 
t o P arti ci p a nt s or Ot h er s 
 
A d v ers e e v e nts will b e r e p ort e d t h e I R B p er V a n d er bilt U ni v ersit y I R B P oli c y.   
 
9. 0  
St u d y Wit h dr a w al / Di s c o nti n u ati o n  
 
S u bj e cts m a y wit h dr a w  c o ns e nt f or st u d y p arti ci p at i o n at a n y ti m e b y i nf or mi n g t h e PI. 
 

Pr ot o c ol V ersi o n  #:  3  
 
9  
Pr ot o c ol D at e:  D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
1 0. 0  St ati sti c a l C o n si d er ati o n s 
 
P o w er: H y p ert e nsi o n: I n st u di es of T KI , I CI, a n d t h e c o m bi n ati o nus e, i n cr e as es i n bl o o d 
pr ess ur e b e gi n wit hi n d a ys a n d r e a c h st e a d y st at e o v er w e e ks. P az o p a ni b h as b e e n s h o w n t o 
i n cr e as e m e an art eri al bl o o d pr ess ur e b y 1 5 m m H g i n t his ti m e fr a m e
3, 4 . B as e d o n t h e 
pr e vi o us  st u di es, w e ass u m e t h e m e a n c h a n g es of B P is 1 5 m m H g, wit h a st a n d ar d d e vi ati o n 
of 1 0 m m H g . W e first c o n d u ct e d p o w er a n al ysis wit h A N O V A fr a m e w or k.  Wit h will h a v e 
1 0 0 % p o w er t o d et e ct a diff er e n c e of 8  m m H g. O ur p o w er  a n al ysis is c o ns er v ati v e b e c a us e 
t h e st a n d ar d d e vi ati o n of B P s h o ul d b e m u c h l ess t h a n 1 0 m m H g. 
 
1 1. 0  Pri v a c y / C o nfi d e nti alit y I s s u e s  
 
All eff orts, wit hi n r e a s o n, will b e m a d e t o k e e p pr ot e ct e d h e alt h i nf or m ati o n ( P HI) pri v at e. Usi n g 
or s h ari n g (“ dis cl os ur e”) s u c h d at a will f oll o w f e d er al pri v a c y r ul es.  
 
As p er st a n d ar d pr a cti c e at V U M C, w e m a y s h ar e t h e r es ults of t h e  st u d y a n d/ or n o n -st u d y 
li n k e d l a b t ests, as w ell as p arts of y o ur m e di c al r e c or d, wit h t h e F e d er al G o v er n m e nt Offi c e f or 
H u m a n R es e ar c h Pr ot e cti o ns, t h e V a n d er bilt U ni v ersit y I nstit uti o n al R e vi e w B o ar d, T h e F o o d 
a n d Dr u g A d mi nistr ati o n, ot h er g o v er n m e nt a g e nci es t hr o u g h o ut t h e w orl d a n d i ns ur a n c e 
c o m p a ni es f or bil li n g p ur p os es. 
 
D at a will b e k e pt i n f or at l e ast si x y e ars aft er t h e st u d y is fi nis h e d. T h er e is n o c urr e nt i nt e nt t o 
pl a c e d at a i n t h e m e di c al r e c or d. If s u bj e cts s p e cifi c all y r e q u est, w e will st or e d at a i n d efi nit el y.  
 
1 2. 0  F oll o w -u p a n d R e c or d R et e nti o n  
 
S u b j e ct p arti ci p ati o n i n t h e st u d y will l ast f or a b o ut 3 5  d a ys . R e c or d r et e nti o n will b e i n d efi nit e, 
as d es cri b e d a b o v e.  
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 

Pr ot o c ol V ersi o n  #:  3  
 
1 0  
Pr ot o c ol D at e:  D e c e m b er 1 3, 2 0 1 9  
 
 
 
 
 
 
L I T E R A T U R E C I T E D  
 
1.  T a bit, C. E. , et al. Pr ot ei n ki n a s e C -b et a c o ntri b ut e s t o i m p air e d e n d ot h eli al i n s uli n 
si g n ali n g  i n h u m a n s wit h di a b et e s m ellit u s. Cir c ul ati o n 1 2 7 , 8 6-9 5 ( 2 0 1 3).  
2.  C h e n, X. , et al. A T A C -s e e r e v e al s t h e a c c e s si bl e g e n o m e b y tr a n s p o s a s e -m e di at e d 
i m a gi n g a n d s e q u e n ci n g. N at M et h o d s  1 3 , 1 0 1 3-1 0 2 0 ( 2 0 1 6).  
3.  S uttl e A B, B all H A, M oli m ar d M, et al. R el ati o n s hi p s  b et w e e n p a z o p a ni b e x p o s ur e a n d 
cli ni c al s af et y a n d effi c a c y i n p ati e nt s wit h a d v a n c e d r e n al c ell c ar ci n o m a. Br J C a n c er 
2 0 1 4; 1 1 1: 1 9 0 9 -1 6.  
4.  H e at h EI, I nf a nt e J, L e wi s L D, et al. A r a n d o mi z e d, d o u bl e -bli n d, pl a c e b o -c o ntr oll e d 
st u d y t o e v al u at e t h e eff e ct of r e p e at e d or al d o s e s of p a z o p a ni b o n c ar di a c c o n d u cti o n i n 
p ati e nt s wit h s oli d t u m or s. C a n c er C h e m ot h er P h ar m a c ol 2 0 1 3; 7 1: 5 6 5 -7 3.