組換えDNA分子の構築に利用されるDNA配列は、どの生物種に由来するものであってもよい。例えば、植物のDNAを細菌のDNAと連結させたり、ヒトのDNAを菌類のDNAと連結させることも可能である。加えて、自然界には存在しないDNA配列を化学合成（）によって作製し、組換えDNA分子に組み込むこともできる。組換えDNA技術と合成DNAを用いることで、いかなるDNA配列であっても作製可能であり、きわめて多様な生物種へ導入することができる。
組換えDNAと遺伝的組換えには異なる点が存在する。前者は試験管内で行われる人工的手法によって形成されるのに対し、後者は既存のDNA配列が再混合される正常な生物学過程であり、基本的にすべての生物種で行われる過程である。
作製.
組換えDNAの形成には、生細胞内で複製を行うDNA分子であるクローニングベクターを必要とする。ベクターは一般的にプラスミドやウイルスに由来し、複製に必要な遺伝的シグナルを含む比較小さなDNA断片が存在する。その他に、外来DNAの挿入や、細胞が組換えDNAを含んでいるかどうかの同定、外来DNAの発現を行う際に便利なエレメントなどが含まれている場合がある。分子クローニングの際のベクターの選択は、宿主生物の選択、クローニングするDNAのサイズ、外来DNAの発現を行うかどうか、どのように行うかに依存する。DNA断片の結合は、制限酵素とリガーゼによるクローニングやギブソン・アセンブリなど、さまざまな手法で行われる。
発現.
宿主生物への導入の後、組換えDNAコンストラクトに含まれる外来DNAの発現を行う場合と行わない場合がある。すなわち、DNAの発現は行わず複製のみを行う場合と、転写と翻訳を行って組換えタンパク質の生産を行う場合とがある。一般的に外来遺伝子の発現には、宿主生物の転写・翻訳装置を利用するために必要な配列（プロモーター、ターミネーター、翻訳開始シグナルなど）を遺伝子に組み込んでおくことが必要である。このような遺伝子の発現を改善するために、宿主側に特定の変更が施されることもある。さらに、翻訳の最適化、タンパク質の可溶化、組換えタンパク質の細胞内外の適切な部位への輸送、タンパク質の分解を防ぐ安定化などを目的とした変更をコーディング配列に施す必要がある場合もある。
組換えDNAを含む生物の性質.