多くの人々が祭りを祝う合唱（「祭りだパンだ」）で幕が開く。宗教裁判所のスパイで、流しの歌手に変装したバルナバが一人柱にもたれたまま、人々の騒ぎを冷ややかに見つめている。人々がゴンドラの競争を見物に行くと、歌手ジョコンダが盲目の母チエカの手を引いて現れる。エンツォに会うために母を待たせて行こうとするジョコンダの前にバルナバが立ちはだかり、執拗に彼女にまとわりつく。しかしジョコンダは相手にせず、そのまま振り切って逃げて行くのだった。逃げられてしまったバルナバは母チエカを見て「彼女は俺のもの」と呟いて利用せんと企む。
エンツォが出帆の準備に中へ降りて行くと、ラウラは聖母の像に自分たちの愛の航海の安全をマリア像に祈る（アリア「水夫の星、清き御母」を歌う）。そこに仮面をつけたジョコンダが忍び入って現れ、ラウラを前に恋敵同士が激しく言い争い、激しい憎悪と嫉妬の念に満ちた言葉を浴びせる。ジョコンダは遂に短刀を抜きラウラを刺そうとするが、追いつめられたラウラは聖母に祈りながらロザリオを高く掲げ、それを見たジョコンダは見覚えのあるロザリオを見て驚き、相手が母の命の恩人であることを悟り、自分の名を名乗って、ラウラを小舟で逃してやる。物陰から様子を見ていたバルナバはラウラの後を追う。
短い前奏曲（アンダンテ）で始まるが後の結末を予期させる。荒れ果てたジュデッカ島の宮殿の一室にジョコンダは一人物思いにふける。そこへ歌手仲間の2人の男が黒いマントに包まれた仮死状態のラウラを運び入れる。ジョコンダは昨晩から姿を消しているチエカを探すよう頼んで男2人はその場を後にする。懐剣を見つめて毒薬の入った瓶を手に取るジョコンダは自分に幸せがもたらされるのではないかと希望を捨て切れず、心が揺れ動く（アリア「自殺!」を歌う）。そこへエンツォが現れ、ラウラのために自分も死ぬつもりであると決意しているエンツォを引き留め、彼女の身体を他の場所に移動したことを言うと、エンツォは怒り、短剣を抜いてジョコンダに差し迫ったところでラウラが目覚め、2人の前に姿を現す。事情を知ったエンツォはジョコンダの計略に感謝し、ラウラとエンツォは小舟に乗って去って行く。