まず、制限酵素を使って、親遺伝子から目的の遺伝子（インサートと呼ぶ）を切り出す。インサートは、他のDNA分子から単離するために精製される。一般的な精製方法はゲル分離である。その後、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を使用して、遺伝子のコピーを増幅する。
産物プラスミドの増幅.
多くの場合、そのプラスミドを大腸菌のような細菌に形質転換する。細菌が分裂するときにプラスミドも複製されるのが理想的である。最善のシナリオでは、それぞれの細菌細胞がプラスミドの複数コピーを持っているはずである。かなりの数の細菌コロニーが成長した後、それらをしてプラスミドDNAを回収することができる。
セレクション.
形質転換された細菌（回収したい所望のプラスミドを持つ細菌）のみを確実に増殖させるために、マーカー遺伝子をセレクション（選択）のため目的ベクターに導入する。典型的なマーカー遺伝子は、抗生物質耐性または栄養素生合成に関するものである。そのため、たとえば「マーカー遺伝子」は、抗生物質アンピシリンに対する耐性を示すものとすることができる。もし、所望のプラスミドを導入するはずの細菌が所望の遺伝子を導入していれば、それらには「マーカー遺伝子」も含まれているはずである。これで、そのプラスミドを導入した細菌はアンピシリンで増殖できるようになる一方、所望のプラスミドを導入しなかった細菌はアンピシリンで破壊を受けやすくなる。それによって、正常に形質転換された細菌は「セレクト」されることになる。
事例：細菌プラスミドのサブクローニング.
哺乳類DNAはこうした制限部位を持たないので、によって制限部位が組み込まれる。そのプライマーは制限部位を慎重に配置するように設計されており、タンパク質コーディングがインフレームになるように、またタンパク質の両側に最小限の余分なアミノ酸が埋め込まれる。
この新しい制限部位を持った哺乳類遺伝子を含むPCR産物と、目的プラスミドの両方を制限消化にかけ、消化産物をゲル電気泳動で精製する。
このプラスミドを細菌に形質転換し、インサートの同一性をDNAシークエンシングにより確認する。
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