そこへヘンリー八世が現れ、アンとドン・ゴメスが2人きりで会っているのを訝しがり、ドン・ゴメスにアンへの愛を語っているのかと2人の仲を疑う。王はアンのために開かれる夜会にドン・ゴメスを招待する。ドン・ゴメスが退出すると、王はアンへの執拗な求愛を始める。それを固辞するアンに対し、王はアンの美貌と魅力の虜となり、将来の身分を保証し、王妃と離婚さえすると口走ってしまう。これを受けて、アンはついに王の求婚に応じて、王と共に、二重唱「これが運命だ！」を歌う。
部屋に戻り、アンは1人になると「夢が叶ったのだわ、平民の娘が王妃になるのだわ！」とアリアを歌う。すると嫉妬に狂ったキャサリン王妃が現れ「哀れな娘よ、ただではおかぬから用心せよ」と罵倒する。アンは「王は私のもの！」と反駁する。王が戻ると、キャサリン王妃は王を非難するが、王はアンの肩を持つ。ちょうどそこへ、ローマ教皇の使者がやって来るが、王は面会を拒絶する。王とアン・ブーリンを祝し、踊り子によってバレエが披露される。
入廷を前に、王とアン・ブーリンはカンタベリー大司教によって婚礼の式を挙げる。法廷が開き、傍聴席は民衆で埋め尽くされ、関係者が続々と入室してくる。さらに、王、キャサリン王妃、ドン・ゴメスが入廷する。全能の神による国王加護の願いが荘厳に全員で歌われ、宗教裁判が始まる。まず王が、兄の未亡人キャサリンとの婚姻は無効であると裁判官たちに提訴する。苦境に立たされたキャサリン王妃は「王のご慈悲を請います」と身の哀れを歌い、民衆の同情を買いつつ、懇願のアリアを切々と歌う。スペインの同胞としてキャサリン王妃の弁護に立つドン・ゴメスは、「スペインはキャサリン王妃の名誉のためには戦争さえ辞さない」と大見得を切る。しかし王がそれは座視できぬとし「イングランドは復讐も戦争も受けて立つ」と反論する。イングランドの同席者一同が王の言葉を合唱にて繰り返す。そして、カンタベリー大司教から婚姻無効の判決が言い渡され、キャサリン王妃が「裁判官たちは皆、自分の敵である」と言い、裁判の違法性を訴える。