アボガドロの仮説は認められたものの、そこに現れる分子というものが本当に粒子として実在するのか、それとも単に説明に都合のよい概念に過ぎないのかは不明なままであった。
分子を物理学の法則に従う粒子として扱った研究はアボガドロの仮説が認められるよりも早い時期から存在した。
ルネ・デカルトやアイザック・ニュートンは万物が粒子からなるというの立場をとり、あらゆる物理的な性質を粒子の運動から説明しようと考えていた。
しかしまだ粒子の速度分布などが考慮に入っておらず、この試みは失敗する。
当時の未成熟な物理の理論を化学に適用することは成功せず、そのような試みはその後一世紀近くの間下火となる。
このような成果はあったものの、多くの科学者が原子や分子の実在に懐疑的な立場をとるようになる。
これには熱力学の確立が大きく影響している。
この熱力学第二法則が問題であった。
気体分子運動論はニュートン力学を基礎にしている。
ニュートン力学による運動は可逆であるため、気体分子運動論は熱力学の第二法則を説明できないことになってしまった。
また分子説には気体の性質以外の分野では、ほとんど何も有用な知見を導けていないという限界があった。
一方で熱力学は気体の性質以外に溶液や化学反応にも適用でき、多くの有用な知見を導いていた。
そこで熱の本性がエネルギーであったのと同様に、原子や分子も本性はエネルギーであると考える科学者たちが多くなった。
このエネルギー論の立場をとったのはヴィルヘルム・オストヴァルトやエルンスト・マッハらである。
一方ルートヴィッヒ・ボルツマンは原子、分子の存在を主張し、彼らの間で激しい論争となった。
これに対しボルツマンは再帰に要する時間は非現実的な長さの時間であり考慮する必要はないと主張した。
この式の中にはボルツマン定数が含まれているため、黒体放射から間接的にアボガドロ定数を検証できる。
またさらにブラウン運動をコロイド粒子に分子が多数ランダムに衝突することによるゆらぎの過程として記述する理論を提唱した。
これらの理論により、液体の性質からアボガドロ定数を算出する方法が新たに導かれた。
それらの結果は従来の求められていた値とほぼ同じものであった。