特定の環境にどのような生物が存在するかを知ることは、生態学、疫学、微生物学、その他の分野の研究に不可欠である。シークエンシングによって、マイクロバイオームにどのような種類の微生物が存在するかを調査できる。
ウイルス学.
ウイルス学で対象とするウイルスは小さすぎて光学顕微鏡で見ることができないため、シークエンシングはウイルスを同定する方法のひとつとなっている。 ウイルスのゲノムはDNAまたはRNAで構成されているが、RNAウイルスは臨床サンプル中での劣化が早いため、シークエンシングは速やかに行う必要がある。
ウイルスシークエンシングは、分子時計の手法を用いてウイルスの発生時期を推定するのにも利用されている。
医学.
患者に遺伝性疾患のリスクがあるかどうかを判断するために、遺伝子（理論的には全ゲノム）を調査する方法がある。これは遺伝学的検査の一種だが、遺伝学的検査の中には詳細なDNA配列までは必要としないものもある。
DNAシークエンシングは、バクテリアを特定してより正確な抗生物質治療を可能にし、バクテリアが抗菌剤耐性を生み出すリスクを軽減できると考えられている。
科学捜査.
法医学的な身元確認や父子鑑定には、DNA型鑑定とともにDNA塩基配列を用いることがある。指紋、唾液、毛根などに含まれるDNAを抽出し、塩基配列の特定の特徴的な領域から人物を特定する技術である。
各決定方法.
DNA断片長による方法.
反応.
酵素法.
元々はデオキシリボヌクレオチドに放射性標識しておき、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により断片長に応じて分離して、オートラジオグラフィーにより検出していたが、その後、蛍光標識やキャピラリー電気泳動といった技術を取り込むことで飛躍的に発展した（後述）。