この間、近江市場村の医師である三浦北庵の紹介で、長野義言と師弟関係を結んで国学を学んだ。また、熱心に茶道（石州流）を学んでおり、茶人として大成する。そのほかにも和歌や鼓、禅、兵学、居合術を学ぶなど、聡明さを早くから示していた（後述）。また、このころ村山たかと出会い共に逢瀬を重ねた。
以降、世子として江戸に住まい、直亮の在国時は代わって江戸城溜間に出仕したり、他大名家と交流を持つなどの活動を行っている。後年の将軍継嗣問題における直弼の行動指針となった家格や血筋を重視する姿勢は、この頃に培われたとされる。
彦根藩主.
幕政への関与.
阿部正弘は、幕政を従来の譜代大名中心から雄藩藩主（徳川斉昭、松平慶永ら）との連携方式に移行させ、斉昭を海防掛顧問（外交顧問）として幕政に参与させた。斉昭は攘夷を度々、強く唱えた。しかしこれは溜詰の筆頭であり、また自ら開国派であった直弼としては許しがたいものであった。直弼ら溜詰諸侯と阿部正弘や徳川斉昭の対立は、日米和親条約の締結をめぐる江戸城西湖の間での討議で頂点に達した。
大老職.
就任.
条約調印と将軍継嗣の決定.
安政の大獄.
前代未聞の朝廷の政治関与に、幕府は厳しい態度で取り調べを進める。長野義言からの報告により、直弼は密勅降下の首謀者を梅田雲浜と断じて、所司代・酒井忠義に捕縛させた。
処罰は幕臣にもおよび、旧一橋派の岩瀬忠震や川路聖謨、水野忠徳、永井尚志らが慶喜擁立に奔走していたことを罪に問われ、免職などの処分を受けた。閣内でも直弼の厳罰方針に反対した老中の太田資始、久世広周、寺社奉行・板倉勝静らが免職された。さらに京都から江戸に戻った後、直弼と政治方針をめぐって対立を深めていた間部詮勝も罷免された。
桜田門外の変.
この日、彦根藩側役の宇津木左近は、直弼の駕籠を見送った後、机上に開封された書状を発見した。それには、水戸脱藩の浪士らが襲撃を企てている旨の警告が記されており、宇津木が護衛を増派しようとした時、凶報がもたらされた。
直弼の首級は現場から有村次左衛門によって持ち去られたが、戦闘で重傷を負っていた有村は若年寄・遠藤胤統邸門前で自刃したため、首は遠藤家に引き取られた。事件後、井伊家はこれを供侍の首と称して取り戻し、胴と縫い合わせた。