ピーチ姫が建設したベースボールアイランドにマリオ達が招待されたが、そのベースボールアイランドをクッパJr.率いるクッパ軍団によって乗っ取られた。そのクッパ軍団に対抗するため、仲間を集めていくアドベンチャーモード。島中に仕掛けられた数々の複雑な謎を解き、ミッションをこなしていくことでキャラクターを仲間にできる（クッパ軍団のメンバーと対戦するミッションが発動することもある）。最後に待ち受けるクッパ軍団に勝利すればベースボールアイランドを取り戻すことができる。
ミニゲーム.
ゲーム中の各操作を使用したミニゲームがプレイできる。
会場となる球場に(限定)と付いているものは、球場そのものが昼夜どちらかでしか使用できないことを表す。
トイフィールド.
野球盤のようなフィールドでコインを稼ぎ、最終的に最も稼いだプレイヤーが勝利者となる一風変わった野球ゲーム。
トレーニング.
操作の基本を練習することができる。
登場キャラクター.
前作と異なり、キャラクターはタイプ別に分類されておらず、投打の左右変更が不可能。前作登場したキャラはすべて最初から使用できる。
登場するスタジアムはチャレンジモードでのもの。
キャプテン.
（）は、そのキャラクターをキャプテンとしたときのチーム名。
スペシャル技に説明がないものは、（名前が違っていても）前作と同じ。
サブキャラクター.
※は隠しキャラで、チャレンジモードで加入させると使用可能。
なかよし.
前作にもあった「相性」に関するシステムだが、今作では新要素が追加されている。
ただしバランス調整のためなのか、前作で「なかよし」だった組み合わせが削除（「ふつう」に格下げ）され、逆に一部の「ふつう」だった組み合わせが新しく「なかよし」になった。
おじゃまアイテム.
名前の末尾に※が付いたアイテムは、チャレンジモード内で発見した後で使用可能。
なかよしそうきゅう.
守備の際、打球に向かってタックルすると一番近くの味方にボールをトスする。それをノーバウンドでキャッチし、その2人がなかよし同士だと非常に速い球速で送球することができる。成功した場合、トスを受けた側の味方が送球をするストップモーションの演出が入る。
なかよしジャンプ.