しかし、酵素は生物から抽出するしか方法がなく、微生物と同様に加熱すると失活する性質を持っていたため、その現象は酵素が引き起こしているのか、それとも目に見えない生命（細胞）が混入して引き起こしているのかを区別することは困難であった。
鍵と鍵穴説.
現在でも酵素の反応素過程のモデルとして十分に通用する。ただし、フィッシャーはこのモデルの実体が何であるかについては科学的な実証を行っていない。
酵素の実体の発見.
その後、タンパク質からなる酵素の存在がジョン・ノースロップとウェンデル・スタンレーによって証明され、酵素の実体がタンパク質であるということが広く認められるようになった。
酵素と分子細胞生物学.
今日においては、この酵素の構造論と機能論に基づいて人工的な触媒作用を持つ超分子（人工酵素）を設計し開発する研究も進められている。
特性.
酵素は生体内での代謝経路のそれぞれの生化学反応を担当するために、有機化学で使用されるいわゆる触媒とは異なる基質特異性や反応特異性などの機能上の特性を持つ。
また、酵素はタンパク質をもとに構成されているため、ほかのタンパク質と同様に失活の特性、すなわち熱やpHによって変性し活性を失う特性を持つ。次に酵素に共通の特性である基質特異性、反応特異性、および失活について説明する。
基質特異性.
酵素は作用する物質を選択する能力を持ち、その特性を基質特異性（）と呼ぶ。
一方、タンパク質を（酵素ではなく）酸・塩基触媒で加水分解する場合は、ペプチド結合の任意の箇所に作用する。また、ペプチド分解酵素はペプチド結合だけに反応し、ほかの結合（エステルやグリコシド結合）には作用しないが、酸・塩基触媒ならばペプチド結合もほかの結合も区別することなく分解する。
すなわち、酵素であるタンパク質の立体構造にはさまざまな大きさや形状のくぼみが存在し、それはタンパク質の一次配列（アミノ酸の配列順序）に応じて決定されている。前述の鍵穴はまさにタンパク質立体構造のくぼみ（クラフト）である。酵素は、くぼみに合った基質だけをくぼみの奥に存在する酵素の活性中心へ導くことで、酵素作用を発現する。