ゲームの中でアシュリーを救出すると、彼女を守りながらゲームを進めていくことになる。アシュリーは敵からの攻撃を数回受けたり、レオンの攻撃が当たってしまうと死亡する。
アイテム管理.
本作では初めて金銭(スペインの旧通貨・ペセタ)の概念が導入されており、アイテムをやり取りする相手として武器商人が登場している。
武器や回復アイテムはアタッシュケースにブロック単位で収納されるようになった。その一方、ゲームの進行に応じて大きなアタッシュケースを購入できるとはいえ、アタッシュケースの容量には限りがあるほか、不要なアイテムを捨てた場合は再入手ができない。
なお、鍵などのイベントアイテムや、武器商人が高額で買い取ってくれる宝物はアタッシュケースとは別に無制限に持てるようになった。
クリア特典.
これまでのシリーズでは本編クリア後にニューゲームで引き継げるのはおまけ武器とコスチュームチェンジの解禁要素のみだったが、本作ではクリア後のデータからニューゲームを始めると、レオンとアシュリーの体力の最大値、所持金・宝、アタッシュケースの中身・アーマー（防弾服）をすべて引き継げるようになった。
本編クリア後に解放される隠しコスチュームおよび隠し武器を装備した場合、キャラクターの挙動などが変化する。
その他、本編クリアによって解放されるモードは下記の通りであり、これらのモードにもそれぞれクリア特典が存在している。
各機種版の特徴.
本作は、ゲームキューブ用ソフトとして発売された後、様々なプラットフォームに展開された。
ゲームキューブ版.
本作を基礎として、他機種との変更点・追加要素を以下に述べていく。
Wii版.
この版では、基本的な操作方法がWiiリモコンとヌンチャクコントローラに準拠したものに変更されている。
リモコンのポインターで銃の照準を定めて攻撃を行うほか、リモコンを軽く振るだけで近接対象物を自動検索してナイフ攻撃を発動するサーチナイフ（通常のナイフ攻撃より威力は若干弱め）機能も搭載され、より直感的な操作が可能となった。
携帯電話版.
登場するクリーチャー.
プラーガの成虫は母体から生み出される仕組みとなっている。
プラーガそのものは短時間で衰弱死してしまう上、肉体も非常に脆弱である。また、光に弱い。