前述のように、本作ではシリーズで初めて任天堂以外のメーカーが製作したキャラクターであるソリッド・スネーク（コナミ、メタルギアソリッド）、ソニック・ザ・ヘッジホッグ（セガ、ソニックシリーズ）がプレイヤーキャラクターとして登場が実現している。
登場キャラクターについて.
スネークが登場するのは、任天堂、ひいては宮本茂のファンだった『メタルギアソリッド』シリーズの監督小島秀夫が桜井に打診したのがきっかけとなった。これは『DX』の発売時期前後より希望があったことが明かされている。
参戦キャラクターのボイスに関しては初代や（最後の切りふだ）、『DX』からのライブラリ出演（マルスなど）なども多数存在している。
ゲームを進めると（特定の条件を満たしたら）隠しキャラクターが出現する（下記記述）。
キャラクター一覧.
プレイヤーキャラクター.
初期キャラクター.
ゲーム開始時から使用可能なキャラクター。
隠しキャラクター.
これらは特定の条件を満たすと使用できるようになるキャラクターである。プリン、トゥーンリンク、ウルフ以外は『「みんなで」を規定回数以上遊ぶ』以外の条件で出現させる場合は必ず亜空の使者クリア後になる。
スネーク、ソニックについては「ゲストキャラクター」を参照。
ゲストキャラクター.
任天堂以外から発売されたゲームシリーズからの参戦キャラ。どちらも特定の条件を満たすと使用できるようになる。
謎のザコ敵軍団.
使用不可能。『初代スマブラ』の謎のザコ敵軍団・謎のザコ敵軍団♂♀とは別物。
ボスキャラクター.
CPU専用のため、プレイヤーとしての使用不可。ここではボスキャラクターとしてだけ登場するキャラクターを挙げる。ここで挙げるボスキャラクターの行動パターンはプレイヤーキャラクターとは異なる。
ステージ.
また、スマブラの世界観の核心を覗かせていたステージの「終点」も、本作では「戦場」と合わせて最初から対戦で使用できるステージとなっている。
対戦・共闘.