ところがそのあと、持氏に気に入られた源蔵があっというまに大杉源蔵と名乗り家老となる大出世を遂げ、かわりに重臣の紙崎主膳が持氏に疎まれ、大小も取り上げられて館から追放されることになった。館を去ろうとする主膳を尾上が出てきて引き止め、一通の書状を差し出す。それはさきほど岩藤が懐中より落としたものだったが、どうやらこれはお家に仇なそうとする悪事の証拠らしい。主膳は家中の様子に気をつけるよう尾上に言い残し館を去った。
源蔵は道芝を逃がし、持氏を毒殺しようとする将監のたくらみを暴露するので将監はその場を逃げ出した。ところがさらに曲者があらわれ、縫之介と操姫を小脇に抱えさらってゆく。持氏はこの騒ぎに上屋敷へと移ろうとするが、源蔵は将監の手勢が待ち伏せしているかもしれないので、相模川に沿った近道を行くように勧め、持氏一行はそれに従い出立した。紙崎主膳の弟で、いまは浪人している畑介が館の騒動を聞き駆けつけてくる。源蔵は持氏の命を狙ったのは仁木将監であり、相模川へと逃げていったというので、畑介は相模川へと将監のあとを追った。
（相模川の段）時はすでに夜の暗闇、雨も激しく降っている。たいまつに照らされながら、持氏は騎馬で相模川を渡ろうとすると、何者ともしれぬ者たちが持氏めがけて切りかかってきた。供についていた家臣の和田左衛門は応戦するも、持氏は川に落ち、首を討たれる。なんとか持氏の体を川の中から引き上げたものの、それには首が無い。和田左衛門は持氏の死を当分隠すべきであるとし、首のない持氏の死骸を駕籠に乗せ館へと向かった。
そのあと、血刀を下げた者がそっと河原の草むらより現れ、手にした持氏の首を川の中に打ち込んで逃げ去る。
四段目.
（野道の段）道芝の父親である眼兵衛は花売りをして暮らしている。眼兵衛は花を担いで花問屋に向かう道の途中、紙崎主膳とその家来雪平を見かけるが、主膳が縫之介とは縁を切ろうとしない道芝は、お家のためにはならぬゆえ殺さねばならぬというのを聞き、姿を現して親である自分が縫之介とは縁を切るように言い聞かせる、もしいうことを聞かねば自分が手にかけると主膳に願い出た。主膳はそれを聞き入れ、眼兵衛に刀を与えて雪平とともにその場を去った。