国王の座についたものの、バンクォーの存在と、彼の子孫が王になる、という予言を恐れたマクベスは、バンクォーと息子フリーアンスに暗殺者を放つ。バンクォーは殺されるが、フリーアンスは逃げ延びる。その報告を貴族たちとの宴会の席でひそかに受けたマクベスは、バンクォーの亡霊が列席しているのを見て取り乱す。そしてマクベス夫人も、最初のうちは気丈に振る舞うが次第に不安に蝕まれていく。
イングランド王のもとに身を寄せているマルカム王子にマクベス討伐を説得するマクダフ。マルカム王子は自分は王位に相応しくないと答え、それにマクダフは立腹する。しかしそれはマクダフを試すための嘘であった。マクダフがマクベスの回し者でないと知ると、すでにイングランド王麾下のシーワード将軍の助けを得てマクベス討伐の準備をすすめていることを打ち明ける。自分の城が奇襲された知らせを受けたマクダフは、家族を守れなかった自責の念と、マクベスへの怒りに駆られる。
なお、これと並行してイングランド王が不思議な力を神から賜り、不治の病に苦しむ庶民たちを次々に全快させている様子が語られる。暴君と化したマクベスと対比させる効果と共に、王宮での上演にかかる改変であろう。
マクベス夫人は夢遊病に冒されている。侍医と侍女が隠れて見守る中、マクベス夫人は夜中に起き出して、手を洗う仕草を繰り返す。「血が落ちない」とつぶやき、ダンカン王殺害時の言葉を喋り、バンクォーやマクダフ夫人殺害を悔い、嘆き続ける。侍医は治療の手立てはないと判断する。