尾張国愛知郡山崎（現在の名古屋市南区）に生まれ、織田信秀に仕えた。後に幼少の織田信長に重臣としてつけられ、信秀死後の家督相続問題でも一貫して信長に与し、信長の弟・信時を守山城に置くよう進言し、城主だった信長の叔父・織田信次の家臣・角田新五らを寝返らせ、信長の弟・信行の謀反の際も稲生の戦いで信長方の武将として戦った。その功により以後家臣団の筆頭格として扱われ、「退き佐久間」（殿軍の指揮を得意としたことに由来）と謳われた。ただし、信盛の撤退戦での具体的な活躍を記した記録や史料は一切ない。むしろ織田軍の先鋒としての侵攻戦での手柄のほうが多く記録されている。
神田千里によれば、佐久間信盛自身の書状や『多聞院日記』の記述から、信盛が高野山で平穏に余生を送ったことがわかるため、高野山から追い出されたというのは、『信長公記』の誤謬だともされる。
なお高野山在住時、山岡景友が平井阿波入道と共に信盛を訪ねてきたことがあったという。信盛はこれに感激し、涙を流して喜んだと伝わる。
人物.
ルイス・フロイスは織田信孝を評価する際に、「佐久間殿（信盛）の外には、五畿内に於いて此の如く善き教育を受けた人を見たことがない」「思慮あり、諸人に対して礼儀正しく、又大なる勇士である」と記述している。
資料による検証.
佐久間氏の武功を記録した『佐久間軍記』には、追放について「誰かの讒言でもあったのではないか」という意味のことが書かれており、この書が成立した江戸時代初期でもそのような見方が存在していたことが窺える。
また『寛政重修諸家譜』の信栄（正勝）の項には
一、佐久間信盛・信栄親子は天王寺城に五年間在城しながら何の功績もあげていない。世間では不審に思っており、自分にも思い当たることがあり、口惜しい思いをしている。
一、信盛らの気持ちを推し量るに、石山本願寺を大敵と考え、戦もせず調略もせず、ただ城の守りを堅めておれば、相手は坊主であることだし、何年かすればゆくゆくは信長の威光によって出ていくであろうと考え、戦いを挑まなかったのであろうか。武者の道というものはそういうものではない。勝敗の機を見極め一戦を遂げれば、信長にとっても佐久間親子にとっても兵卒の在陣の労苦も解かれてまことに本意なことであったのに、一方的な思慮で持久戦に固執し続けたことは分別もなく浅はかなことである。