箱館・五稜郭を占領後、歳三は額兵隊などを率いて松前へ進軍して松前城を陥落させ、残兵を江差まで追撃した。このとき、榎本武揚は土方軍を海から援護するため、軍艦「開陽丸」で江差沖へ向かったが、暴風雨に遭い座礁。江差に上陸して開陽丸の沈没していく姿を見守っていた榎本と歳三は、そばにあった松の木を叩いて嘆き合ったと言われ、今でもその「嘆きの松」が残っているが、現存するのは近年植樹されたものである。
その後、幹部を決定する選挙が行われ、榎本を総裁とする「蝦夷共和国」（五稜郭が本陣）が成立し、歳三は幹部として陸軍奉行並となり、箱館市中取締や陸海軍裁判局頭取も兼ねた。箱館の地でも歳三は冷静だったという。箱館政府が樹立され、榎本らが祝杯を交わしている時も歳三は1人沈黙を保ち、「今は酒を飲み浮かれるときではない」と言っていたとされる。
最期については諸説あるが、歳三は乱戦の最中に腹部に被弾、落馬したとされる。彼の命令によって台場方面に進軍していた大野率いる兵士らは、一時勢力を盛り返していたが、必死の指揮も空しく総崩れとなった。大野が止むを得ず引き返した所、同じく陸軍奉行添役の安富才助から歳三が撃たれた事を知らされたと云う。大野は急いで駆けつけたが、歳三は既に絶命していたとされる。
墓所・石碑・木碑.
歳三の遺体は小芝長之助らに運ばれ、ほかの戦死者とともに五稜郭内（一本松の土饅頭）に埋葬されたとの説があるが、別の場所の説もあり未だに埋葬場所は確定していない。
東京都北区滝野川の板橋駅東口前（寿徳寺境外墓地）に供養塔があり、土方家の菩提寺である東京都日野市石田の石田寺に墓碑がある。
また、北海道函館市船見町の称名寺境内にも慰霊碑があり、北海道函館市若松町の若松緑地公園内に「土方歳三最期の地碑」がある。公園の本木関門跡の近隣は歳三が銃弾に倒れたと伝わる。
逸話.
剣術の実力.
真紅の面紐に朱塗りの皮胴など洒落た防具を使用していたという。高幡不動の境内をよく稽古場所として使っていたともいわれる。新選組が屯所としていた八木邸の八木為三郎の述懐によれば、新選組の剣術稽古で、近藤勇や芹沢鴨は高いところに座って見ていることが多かったが、歳三はいつも胴を着けて汗を流しながら指導していたという。
大阪上本町駅