いろは歌の文献上最古の用例は、『金光明最勝王経音義』（大東急記念文庫所蔵）である。著者は不明、「承暦三年己未四月十六日抄了」という奥書を持つ。「音義」とは、経典に記される漢字の字義や発音について説明した書物のことで、これは『金光明最勝王経』にある語句についてのものである。いろは歌は「先可知所付借字」（先づ付する所の借字を知るべし）という但し書きを最初に置き、以下のように仮名ではなく借字で書かれており、音訓の読みとして使われる文字の一覧となっている。七字区切りにして大きく書かれた各字の下に、小さく書かれた同音の借字（〈　〉内の文字）一つ乃至二つが添えられる（ただし「於」〈お〉の借字には小字は無い）。
それぞれの文字には声点が朱で記されており、それぞれの文字のアクセントがわかるようになっている。小松英雄は各文字のアクセントの高低の配置を分析し、このいろは歌が漢語の声調を訓練するための目的に使われたのではないかと考察している（後述）。なお声点の付けられたいろは歌は、真言宗や声明に関わる古文献でも見られるが、この『金光明最勝王經音義』のものとはアクセントの高低がそれぞれ異なる。
出土物.
手習いの手本としてのいろは歌.
明治時代以前の平仮名は、ひとつの仮名に複数の異字体（変体仮名）を有するものであったが、いろは歌が手習いに用いられるときの字体は、そのばらつきがほとんどないことが知られている。その字体はほとんどが現代の平仮名と一致するものであって「え」「お」「そ」のみ異なる。このことから山田孝雄は、現代の平仮名の成立にこのいろは歌の字体が影響したことを指摘している。
作者.
いろは歌の作者について確定した説は無く不明である。
小松英雄もいろは歌が空海の作であるという話は俗信に過ぎず、「大矢透によって否定されて以後、すくなくとも国語史研究の領域では、その俗信が問題にされることはなくなった」と述べているが、なぜ空海が作者とされたかについては、
といった理由をあげ、いろは歌の作者は真言宗系の学僧であると推定している。しかし空海よりさらに古い時代の柿本人麻呂を作者としたり 、讒言で大宰府に左遷された源高明が作ったとする話もある。
内容の解釈.