信玄の死後、後を継いだ武田勝頼もまた、遠江支配強化のために高天神城を狙い、武田氏と徳川氏は遠江支配の要としての高天神城を奪い合うこととなった。第一次高天神城の戦い.開戦に至るまで.織田氏と同盟関係にある徳川家康も信玄の死を機に反撃に転じ、長篠城の奪回や、武田方の作手亀山城主奥平貞能を寝返らせるなど三河における失地回復を進めていた。経過.この間に高天神城は、武田軍による攻撃で西の丸が落とされ、兵糧が不足して落城の危機に陥っていた。こうして、高天神城は武田軍に占領された、とされる。ただしここまで述べられた、『信長公記』中で小笠原氏助・小笠原長忠とされる人物は小笠原信興という同一人物であり、この間違いにより経過の記述などにも混乱が見られる。武田勝頼はこれら寛大な処置により声望を高めた。逆に織田・徳川陣営は高天神城に援軍を派遣できなかったことにより、名声を失った。浜松城に帰還した大須賀康高は即座に馬伏塚城に配属され、同城が対高天神城の最前線となった。大須賀康高の下には、渥美勝吉・坂部広勝・久世広宣らの同じく帰還組が与力として配属され、彼ら与力はのちに築いた横須賀城に由来する「横須賀衆」「横須賀七人衆」と呼ばれた。武田軍は落城した高天神城を再び修築し、旧今川家臣である岡部元信を武田軍の高天神城の新たな城将(城主)に据えた。武田勝頼は、高天神城(城主は岡部元信)、江尻城(城主は穴山信君)、興国寺城(城主は曽根昌世)で駿河・遠江方面のさらなる支配を目指した。第二次高天神城の戦い.諏訪原城を接収した徳川軍は名目上の城主に駿河国・遠江国の元領主の今川氏真を置いた。そして、城を改修増強し、武田側の大井川沿いの補給路に圧力をかける形勢となった。なお、この時の今川氏真と武田軍の高天神城の守将である岡部元信は、かつての今川時代の旧主君と家臣の間柄である。一方、徳川軍も周辺の城を攻略しようと試み、武田軍と徳川軍の間で「高天神城の補給路」を巡る争いが続いた。徳川軍は城下の田畑に対して複数回にわたって焼き討ちを行った。この頃の高天神城は、この焼き討ちや武田軍による補給の失敗のため、城の食料備蓄は日々乏しくなっていったと推測される。