ピーチ姫が建設したベースボールアイランドにマリオ達が招待されたが、そのベースボールアイランドをクッパJr.率いるクッパ軍団によって乗っ取られた。そのクッパ軍団に対抗するため、仲間を集めていくアドベンチャーモード。島中に仕掛けられた数々の複雑な謎を解き、ミッションをこなしていくことでキャラクターを仲間にできる(クッパ軍団のメンバーと対戦するミッションが発動することもある)。最後に待ち受けるクッパ軍団に勝利すればベースボールアイランドを取り戻すことができる。ミニゲーム.ゲーム中の各操作を使用したミニゲームがプレイできる。会場となる球場に(限定)と付いているものは、球場そのものが昼夜どちらかでしか使用できないことを表す。トイフィールド.野球盤のようなフィールドでコインを稼ぎ、最終的に最も稼いだプレイヤーが勝利者となる一風変わった野球ゲーム。トレーニング.操作の基本を練習することができる。登場キャラクター.前作と異なり、キャラクターはタイプ別に分類されておらず、投打の左右変更が不可能。前作登場したキャラはすべて最初から使用できる。登場するスタジアムはチャレンジモードでのもの。キャプテン.()は、そのキャラクターをキャプテンとしたときのチーム名。スペシャル技に説明がないものは、(名前が違っていても)前作と同じ。サブキャラクター.※は隠しキャラで、チャレンジモードで加入させると使用可能。なかよし.前作にもあった「相性」に関するシステムだが、今作では新要素が追加されている。ただしバランス調整のためなのか、前作で「なかよし」だった組み合わせが削除(「ふつう」に格下げ)され、逆に一部の「ふつう」だった組み合わせが新しく「なかよし」になった。おじゃまアイテム.名前の末尾に※が付いたアイテムは、チャレンジモード内で発見した後で使用可能。なかよしそうきゅう.守備の際、打球に向かってタックルすると一番近くの味方にボールをトスする。それをノーバウンドでキャッチし、その2人がなかよし同士だと非常に速い球速で送球することができる。成功した場合、トスを受けた側の味方が送球をするストップモーションの演出が入る。なかよしジャンプ.