伊奈線は自動列車運転装置(ATO)を採用しておらず、自動列車制御装置(ATC)による車内信号閉塞方式での運転士による手動運転(ワンマン運転)となっている。将来の自動運転に対応できるように、車両側にはATOの運転装置が搭載されている。駅に停車した際の車両のドアの開閉は、進行方向先頭の運転室(乗務員室)で運転士による車掌スイッチの操作により行なっている。丸山・内宿以外では、運転席側である左側の扉を開けるため、単線区間の各駅(島式ホーム)では、他の多くの日本の鉄道路線の左側通行と違い、右側通行で進入する。各駅にはホームドアは設置されておらず、ホーム上には車両のドアの位置だけ省いた安全柵が設置されており、「線路は高圧電流が流れているので絶対立ち入らない」旨の注意書きが多数掲示されている。自動改札機は駅員(社員)が常駐している大宮駅と鉄道博物館駅のみの設置となっている。その他の駅は早朝深夜を除き、準社員の駅員が交代制で改札業務と駅売店業務を行っている。スタンド式の売店の横に、券売機と改札窓口がある。交通系ICカードは簡易Suica改札機で対応している。駅での放送は接近案内のみであるが、電車到着時には、車内と車外両方のスピーカーで到着駅名の自動放送がされ、駅舎側の到着時放送を兼ねている。案内軌条式鉄道は、通常の鉄道と違いゴムタイヤを装着して走行するため、比較的雨や雪に強いとされているが、当路線は特に雪(結氷)には弱い。これは地上にある丸山車両基地と高架である本線との間がコンクリート製のスロープ軌道で繋がれているがこの傾斜が他の案内軌条式鉄道路線と比べて急であること、および沿線が内陸部のため冬季の最低気温が東京都心よりかなり低く、冬季の降雨や降雪などによる軌道内の結氷で軌道面が滑りやすくなると、安全の観点から運行を見合わせざるを得ないためである。その対策として、勾配軌道面には融雪や融氷のための電熱線を敷いたり、冬季は先頭車両前面に除雪装置が取り付けられる。その他の気象条件や自然災害には比較的強く、並走するJR各線が豪雨や強風で運転を見合わせていても当路線は通常ダイヤで運行されていることが多い。東日本大震災の際もいち早く運転を再開させ、当時沿線住民の貴重な移動手段として活躍した。