INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les résultats montrent que l'activité de l’endolysine est supérieure à 99,99 % (Log reduction S. a ureus à 1 semaine/25 °C pour le système comprenant le caprylyl/capryl glucoside, l’arachidyl glucoside ou le distearate de polyglycéryle-3 méthylglucose (30 min et 1h de contact). Le caprylyl/capryl glucoside, l’arachidyl glucoside ou le distearate de polyglycéryle-3 méthylglucose sont ainsi capables de maintenir dans le temps la performance antibactérienne contre S. aureus de l’endolysine comme le montrent les résultats de Log de réduction du Tableau 7.
Les préparations comparatives avec les autres tensioactifs hors invention testés présentent une activité significativement beaucoup plus faible à 1 semaine dans les mêmes conditions.
De manière surprenante, les résultats montrent ainsi que la combinaison de l’endolysine avec un tensioactif non ionique comprenant comprenant un ou plusieurs résidu(s) carbohydrate(s) comme le caprylyl/capryl glucoside, l’arachidyl glucoside ou le distearate de polyglycéryle-3 méthylglucose permet un meilleur maintien de l’activité antibactérienne contre S. aureus dans le temps, par rapport à la combinaison de l’endolysine avec d’autres tensioactifs chargés tels que les tensioactifs anioniques, les tensioactifs amphotères et à d’autres tensioactifs non ioniques dépourvus de résidu(s) carbohydrate(s).
Listage de séquences SEQ ID NO: 1 CBD-2638 (protéique)
SEQ ID NO: 2 CBD-2638 (nucléique)
SEQ ID NO: 3 Ply2638 (protéique)
SEQ ID NO: 4 Ply2638 (protéique)
Ces propriétés communes peuvent comporter : une valeur d’un descripteur donné ; des descripteurs dont les valeurs sont proches de l’objet numérique OB i ; des valeurs de probabilités de la classe affectée aux objets proches entre elles ; des valeurs de probabilités de la classe affectée aux objets proches entre elles et une classification fausse ; etc.
(II) dans laquelle n 2 est un entier allant de 1 à 1000, de préférence de 1 à 20, et plus préférentiellement de 1 à 10, P1 , P2 , P3 , X , A et L sont tels que définis ci-dessus, L’ 1 représente le substituant L 1 tel que défini ci-dessus lorsque ledit L 1 se trouve impliqué dans une liaison covalente avec Y 1 , Y 1 représente un produit d’intérêt Y , ledit produit d’intérêt Y étant choisi dans le groupe comprenant des protéines, notamment des anticorps et des enzymes lysosomales, des nanoparticules, des activateurs ou des inhibiteurs de protéines, des composés cytotoxiques et des marqueurs pour l’imagerie médicale, Y 1 formant n 2 liaison(s) covalente(s) avec L’ 1 .
On entend par « conjugué » au sens de l’invention un composé comprenant deux parties liées entre elles par une liaison covalente. La première partie du conjugué représente ainsi le pro-ligand tandis que la deuxième partie du conjugué représente le produit d’intérêt. Le produit d’intérêt Y désigne le produit d’intérêt « libre » lorsqu’il ne forme pas de liaison avec le pro-ligand de formule (I). Le produit d’intérêt Y 1 désigne le produit d’intérêt Y lorsque ce dernier est lié de façon covalente au pro-ligand. Dans la formule (II) du conjugué de l’invention, le composé représenté dans la parenthèse correspond au pro-ligand de formule (I) tel que défini ci-dessus lorsque ce dernier est impliqué dans une liaison covalente avec un produit d’intérêt Y 1 . L’entier n 2 indique le nombre de pro-ligand(s) lié(s) au produit d’intérêt Y 1 . Selon l’invention, n 2 pro-ligand(s) peut (peuvent) être lié(s) de façon covalente à un produit d’intérêt Y 1 . Ces n 2 pro-ligands sont liés au produit d’intérêt par l’intermédiaire du radical L 1 ou LL 1 du pro-ligand de formule (I).
Préparation des conjugués de formule (II) Le conjugué de formule (II) tel que défini ci-dessus est préparé en faisant réagir : - un produit d’intérêt Y tel que défini ci-dessus, avec - n 2 pro-ligand(s) de formule générale (I) telle que définie ci-dessus. Le produit d’intérêt Y libre peut être représenté par Y 1 ’-L’, avec L’ représentant un groupe fonctionnel ou une fonction réactive porté(e) par le produit d’intérêt Y. Autrement dit, Y 1 ’ représente le produit d’intérêt Y sans son groupe fonctionnel L’. C’est le groupe fonctionnel L’ de Y qui va réagir avec un groupe fonctionnel ou une fonction réactive porté(e) par le pro-ligand (I) (en l’occurrence L 1 ou LL 1 ) afin de former une liaison covalente entre le produit d’intérêt Y et le pro-ligand (I) et obtenir ainsi le conjugué de formule (II) de l’invention. Dans la présente demande, on peut employer indifféremment les termes « groupe fonctionnel », « fonction réactive » ou « groupe chimique réactif ». Chacun de ces termes désigne un groupe porté par le produit d’intérêt Y (ou porté par le pro-ligand (I)) capable d’entrer en réaction avec un groupe porté par le pro-ligand (I) (ou porté par le produit d’intérêt Y).
Selon un mode de réalisation de l’invention, dans le conjugué de formule (II) telle que définie ci-dessus, n 2 est un entier égal à 1. La est une illustration de quatre modes de réalisation possibles pour la synthèse de conjugués de formule (II) obtenus par la réaction entre un pro-ligand de formule générale (I) avec un produit d’intérêt Y. Dans les formules générales (I) et (II) représentées aux points 1/ à 4/ : - X, P1, P2 et P3 sont tels que définis ci-dessus, - n 2 est égal à 1, - A représente de l’oxygène, - L représente -(CH 2 ) 2 -(O-CH 2 -CH 2 ) n - avec n étant un entier allant de 0 à 2. La variable réside dans le radical L 1 du pro-ligand (I) et dans le groupe fonctionnel porté par le produit d’intérêt Y. La point 1/ illustre la réaction entre le groupement fonctionnel L 1 du pro-ligand (I) dans lequel L 1 représente -ONH 2 avec une fonction aldéhyde (-CHO) d’un produit d’intérêt Y qui est un anticorps ou une enzyme lysosomale, ladite fonction aldéhyde ayant préalablement été générée lors d’un processus oxydatif sur une chaîne/partie oligosaccharidique de la partie glycosidique de l’anticorps ou de l’enzyme lysosomale. Le produit Y est représenté par Y 1 ’-CHO, Y 1 ’ représentant le produit Y sans son groupe fonctionnel L’ qui est égal à -CHO. La point 2/ illustre la réaction entre le groupement fonctionnel L 1 du pro-ligand (I) dans lequel L 1 représente [Chem3] avec une fonction amine (-NH 2 ) portée par un produit d’intérêt Y tel qu’un anticorps ou une enzyme lysosomale. Le produit d’intérêt Y est représenté par Y 1 ’-NH 2 , Y 1 ’ représentant Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -NH 2 . La fonction amine provient par exemple d’un résidu d’acide aminé lysine. La point 3/ illustre la réaction entre le groupement fonctionnel L 1 du pro-ligand (I) dans lequel L 1 représente [Chem4] avec une fonction thiol (-SH) portée par un produit d’intérêt Y tel qu’un anticorps ou une enzyme lysosomale. Le produit d’intérêt Y est représenté par Y 1 ’-SH, Y 1 ’ représentant Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -SH. La fonction thiol provient par exemple d’un résidu d’acide aminé cystéine. La point 4/ illustre la réaction entre le groupement fonctionnel L 1 du pro-ligand (I) dans lequel L 1 représente [Chem5] avec une fonction thiol (-SH) d’un produit d’intérêt Y (comme un anticorps ou une enzyme lysosomale). Le produit d’intérêt Y est représenté par Y 1 ’-SH, Y 1 ’ représentant Y sans son groupe fonctionnel L’ égal à -SH.
Utilisation des conjugués ( I I) d e l’invention .
Les conjugués (II) de l’invention sont utilisés pour lier, de façon covalente ou non covalente, une cible membranaire ou non membranaire d’un organisme. Ainsi l’invention a encore pour objet l’utilisation des conjugués de formule (II) pour lier, de façon covalente ou non covalente, une cible membranaire ou non membranaire d’un organisme. A titre d’exemples d’une cible membranaire ou non membranaire on pourra citer les protéines, les auto-anticorps, les glycoprotéines, les agrégats de protéines, les antigènes protéiques, les antigènes non protéiques, les activateurs ou inhibiteurs de protéines, les cellules, les virus, les bactéries, le tissu osseux, le collagène et les agrégats de fibres.
Dans la présente invention, le récepteur membranaire extracellulaire de la cellule est : - le récepteur du M6P (à savoir le RM6P-CI), lorsque le pro-ligand (I) de l’invention est un ProAMFA, à savoir un analogue du mannose 6-phosphate (M6P) ou, - un des récepteurs du mannose, lorsque le pro-ligand (I) de l’invention est un ProMan, à savoir un analogue du mannose (Man).
Comme indiqué ci-dessus, la liaison entre le conjugué (II) de l’invention et la cible (non membranaire ou membranaire) peut être de nature covalente ou non covalente. Le composé obtenu après la liaison du conjugué avec la cible sera nommé « complexe » dans la présente demande. La présente invention a encore pour objet un complexe constitué : - d’un conjugué de formule (II) tel que défini ci-dessus, - d’une cible non membranaire ou membranaire, ladite cible étant choisie dans le groupe comprenant des protéines, notamment des récepteurs, des auto-anticorps, des glycoprotéines, des agrégats de protéines, des antigènes protéiques ou non protéiques, des activateurs ou inhibiteurs de protéines, des cellules, des virus, des bactéries, le tissu osseux, le collagène et des agrégats de fibres, le conjugué (II) et la cible étant liés l’un à l’autre par une liaison de type non covalente ou covalente.
Le ligand activé obtenu à l’issue du mécanisme in situ ci-dessus décrit correspond à un composé de formule générale (I) dans laquelle les radicaux P1, P2 et P3 représenteraient chacun un atome d’hydrogène. Le ligand activé AMFA est en mesure d’être reconnu et fixé par le RM6P-CI. Le ligand activé Man est en mesure d’être reconnu et fixé par un des récepteurs du mannose.
Le conjugué activé obtenu à l’issue du mécanisme in situ se produisant dans l’organisme peut être représenté par la formule générale (II bis) suivante
(II bis) dans laquelle : X , A , L , L’ 1 , n 2 et Y 1 sont tels que définis ci-dessus, P’1 , P’2 et P’3 représentent chacun un hydrogène.
L’activation du conjugué (II) au sein du complexe engendre un complexe activé constitué : - d’un conjugué activé de formule (II bis) - une cible telle que ci-dessus définie, le conjugué activé de formule générale (II bis) et la cible étant liés l’un à l’autre par une liaison de type non covalente ou covalente. Le complexe activé ainsi obtenu est utilisé pour lier un récepteur membranaire de type lectine choisi dans le groupe comprenant les récepteurs du mannose et le récepteur du mannose 6-phosphate cation indépendant (RM6P-CI). Selon un mode de réalisation avantageux de l’invention, lorsque le substituant X du conjugué activé de formule (II bis) représente OH, alors le complexe activé se lie aux récepteurs du mannose. Selon un autre mode de réalisation avantageux de l’invention, lorsque le substituant X du conjugué activé de formule (II bis) représente -CH 2 -CO 2 Z ; -CH 2 -P(O)(OZ) 2 ; -CH(CO 2 Z) 2 ; -CH(P(O)(OZ) 2 ) 2 ; =CH-CO 2 Z ; =CH-P(O)(OZ) 2 ; -CHF-CO 2 Z ; -CHF-P(O)(OZ) 2 ; -CF 2 -CO 2 Z ; -CF 2 -P(O)(OZ) 2 ; =CF-CO 2 Z ; =CF-P(O)(OZ) 2 ; -CH(CO 2 Z)(P(O)(OZ) 2 ), avec Z tel que défini ci-dessus, alors le complexe activé se lie au récepteur du mannose 6-phosphate cation indépendant (RM6P-CI).
Selon encore un mode de réalisation de l’invention, lorsque, dans le conjugué activé de formule (II bis), X représente OH, alors le complexe activé présente une affinité, mesurée par la concentration inhibant de 50% (IC 50 ), vis-à-vis des récepteurs du mannose allant de 10 -4 à 10 -7 M.
Selon encore un mode de réalisation de l’invention, lorsque, dans le conjugué activé de formule (II bis), X représente : -CH 2 -CO 2 Z ; -CH 2 -P(O)(OZ) 2 ; -CH(CO 2 Z) 2 ; -CH(P(O)(OZ) 2 ) 2 ; =CH-CO 2 Z ; =CH-P(O)(OZ) 2 ; -CHF-CO 2 Z ; -CHF-P(O)(OZ) 2 ; -CF 2 -CO 2 Z ; -CF 2 -P(O)(OZ) 2 ; =CF-CO 2 Z ; =CF-P(O)(OZ) 2 ; -CH(CO 2 Z)(P(O)(OZ) 2 ; alors le complexe activé présente une affinité, mesurée par la concentration inhibant de 50% (IC 50 ), vis-à-vis du récepteur du mannose 6-phosphate cation indépendant (RM6P-CI) allant de 10 - 5 à 10 - 9 M.
La présente invention a encore pour objet l’utilisation du conjugué de formule (II) tel que défini ci-dessus, pour un ciblage spécifique d’une cellule donnée. En fonction de la cible à laquelle le conjugué de formule (II) se lie, alors le conjugué ou le complexe pourra, après activation, être internalisé dans une cellule spécifique, via la reconnaissance du ligand par le récepteur membranaire de ladite cellule, cette cellule spécifique étant liée à la nature de la cible. Par exemple, si la cible biologique est un récepteur ou un antigène membranaire, alors le complexe activé sera internalisé dans la cellule et la cible biologique sera dégradée ou pas dans les lysosomes. Si la cible est l’hydroxyapatite présente dans le tissu osseux, alors le conjugué ou le complexe activé pourra être internalisé dans une cellule de tissu osseux. Si la cible biologique est constituée d’amas protéique de type plaque amyloïde, alors le conjugué ou le complexe activé pourra être internalisé dans les cellules environnantes.
SEQ ID NO: 5 Ply2638 (nucléique)
SEQ ID NO: 6 M23-LST (protéique)
SEQ ID NO: 7 M23-LST (nucléique)
SEQ ID NO: 8 Ami-2638 (protéique)
SEQ ID NO: 9 Ami-2638 (nucléique)
SEQ ID NO: 10 M23-LST Ami2638 CBD2638 (protéique)
SEQ ID NO: 11 M23-LST Ami2638 CBD2638 (protéique)
SEQ ID NO: 12 M23-LST Ami2638 CBD2638 (nucléique)
GCTGCAACACATGAACATTCAGCACAATGGTTGAATAATTACAAAAAAGGATATGGTTACGGTCCTTATCCATTAGGTATAAATGGCGGTATGCACTACGGAGTTGATTTTTTTATGAATATTGGAACACCAGTAAAAGCTATTTCAAGCGGAAAAATAGTTGAAGCTGGTTGGAGTAATTACGGAGGAGGTAATCAAATAGGTCTTATTGAAAATGATGGAGTGCATAGACAATGGTATATGCATCTAAGTAAATATAATGTTAAAGTAGGAGATTATGTCAAAGCTGGTCAAATAATCGGTTGGTCTGGAAGCACTGGTTATTCTACAGCACCACATTTACACTTCCAAAGAATGGTTAATTCATTTTCAAATTCAACTGCCCAAGATCCAATGCCTTTCTTAAAGAGCGCAGGATATGGAAAAGCAGGTGGTACAGTAACTCCAACGCCGAATACAGGTGAGCTCTTACGCCCTAAAGACGCAAAGAAAGATGAAAAATCACAAGTATGTAGTGGTTTGGCTATGGAAAAATATGACATTACAAATTTAAATGCTAAACAAGATAAATCAAAGAATGGGAGCGTGAAAGAGTTGAAACATATCTATTCAAACCATATTAAAGGTAACAAGATTACAGCACCAAAACCTAGTATTCAAGGTGTGGTCATCCACAATGATTATGGTAGTATGACACCTAGTCAATACTTACCATGGTTATATGCACGTGAGAATAACGGTACACACGTTAACGGTTGGGCTAGTGTTTATGCAAATAGAAACGAAGTGCTTTGGTATCATCCGACAGACTACGTAGAGTGGCATTGTGGTAATCAATGGGCAAATGCTAACTTAATCGGATTTGAAGTGTGTGAGTCGTATCCTGGTAGAATCTCGGACAAATTATTCTTAGAAAATGAAGAAGCGACATTGAAAGTAGCTGCGGATGTGATGAAGTCGTACGGATTACCAGTTAATCGCAACACTGTACGTCTGCATAACGAATTCTTCGGAACTTCTTGTCCACATCGTTCGTGGGACTTGCATGTTGGCAAAGGTGAGCCTTACACAACTACTAATATTAATAAAATGAAAGACTACTTCATCAAACGCATCAAACATTATTATGACGGTGGAAAGCTAGAAGTAAGCAAAGCAGCAACTATCAAACAATCTGACGTTAAGCAAGAAGTTAAAAAGCAAGAAGCAAAACAAATTGTGAAAGCAACAGATTGGAAACAGAATAAAGATGGCATTTGGTATAAAGCTGAACATGCTTCGTTCACAGTGACAGCACCAGAGGGAATTATCACAAGATACAAAGGTCCTTGGACTGGTCACCCACAAGCTGGTGTATTACAAAAAGGTCAAACGATTAAATATGATGAGGTTCAAAAATTTGACGGTCATGTTTGGGTATCGTGGGAAACGTTTGAGGGCGAAACTGTATACATGCCGGTACGCACATGGGACGCTAAAACTGGTAAAGTTGGTAAGTTGTGGGGCGAAATTAAATAA.
Dans ce mode de réalisation préféré, la structure fixe 31 comporte aussi plusieurs membranes déployables de déviation 32, dont l’une est représentée schématiquement dans une configuration non-déployée sur la .
La configuration de poussée directe est également représentée sur la , tandis que la position reculée d’inversion de poussée de la structure mobile 29 est représentée sur la . La représente l’inverseur dans une position intermédiaire entre les positions des figures 2 et 4. L’ensemble des figures 1 à 5A montrent un mode de réalisation préféré de la présente invention.
Une première extrémité 58a de la membrane d’obturation 58 est fixée à un cadre arrière de support 60 appartenant à la structure fixe 31 et cheminant selon la direction circonférentielle, ce cadre se situant dans ou à proximité d’une extrémité axiale arrière de l’ouverture 56 et servant au support des membranes 32. De manière analogue, il est prévu un cadre avant de support 70, appartenant également à la structure fixe 31 et cheminant selon la direction circonférentielle, ce cadre avant 70 se situant dans ou à proximité d’une extrémité axiale avant de l’ouverture 56 et servant au support des membranes 32.
En outre, une seconde extrémité 58b de la membrane d’obturation 58, opposée à la première extrémité de membrane 58a, est fixée sur la paroi 18. Il est noté que la première extrémité 58a peut être fixée à l’arrière du cadre arrière de support 60 comme montré sur les figures, ou bien à l’avant de ce même support.
« 2,3 -O -Isopropylidène-4- O -diméthoxyphosphinyl-6-désoxy-6-diéthoxyphosphinylméthylène-α-D-mannopyranoside de 2-( phtalimidooxy)éthyle » ( 8 ) 0,915 g (1,0 eq ; 1,69 mmol) de composé 7 et 1,296 g (4,0 ; 6,74 mmol) de 5-(Benzylthio)-1 H-tétrazole sont pesés, conditionnés sous atmosphère inerte et dissous dans 35 mL de dichlorométhane. La solution est refroidie avant d’ajouter au goutte-à-goutte 0,724 mL (2,0 eq ; 3,37 mmol) de diméthyl N,N -diisopropylphosphoramidite. En fin de réaction, 0,670 mL (13,0 eq ; 21,8 mmol) de H 2 O 2 (peroxyde d’hydrogène) à 30% sont directement ajoutés à la solution à température ambiante. Après 10 mn, le milieu est dilué dans du dichlorométhane puis 2 lavages avec NaHCO 3 sont effectués. La phase organique est séchée sur MgSO 4 puis concentrée. Une purification sur colonne de gel de silice est effectuée avec de l’AcOEt. Après évaporation des fractions, 0,953 g de composé 8 sont obtenus. Le rendement est de 87%. Rf : (CH 2 Cl 2 /éther éthylique 95/5 (v/v)) SMHR : 652,1922 Da ; Conf (%) : 100,00%
« 4 -O-diméthoxyphosphinyl-6-désoxy-6-diéthoxyphosphinylméthylène-α-D-mannopyranoside de 2-( phtalimidooxy)éthyle » ( 9 ) 0,953 g (1,0 eq ; 1,46 mmol) de composé 8 sont pesés puis 7,3 mL de THF sont ajoutés. 1,625 g de résine Dowex H + sont ensuite introduits dans le milieu réactionnel. Après 18 h, la réaction est totale et la résine est éliminée par filtration. Le filtrat après évaporation permet d’obtenir le composé 9 avec un rendement de 34%. Rf : (CH 2 Cl 2 /éther éthylique 95/5 (v/v)) SMHR : 612,1610 Da ; Conf (%) : 100,00%
« 4-O-dihydroxyphosphinyl-6-désoxy-6-dihydroxyphosphinylméthylène-α-D-mannopyranoside de 2-aminooxyéthyle » ( ProAMFA1 ) 0,300 g (1,0 eq ; 0,49 mmol) de composé 9 sont conditionnés en présence de 0,882 g (12,0 eq ; 5,89 mmol) de iodure de sodium (NaI) et puis 1,1 mL d’acétonitrile anhydre, 0,55 mL (9,0 eq ; 3,93 mmol) de triéthylamine et 0,745 mL (12,0 eq ; 5,89 mmol) de chlorure de triméthylsilyle (TMSCl) sont rajoutés. La solution est agitée à température ambiante sous agitation et sous atmosphère inerte pendant 24h puis les solvants sont évaporés. Le résidu est repris dans du méthanol et les sels en excès sont éliminés par filtration. Le filtrat est traité par une résine échangeuse de cation (DOWEX ® 50WX2, sous la forme H + ) puis la résine est enlevée par filtration et une solution de 0,337 mL (15,0 eq ; 7,37 mmol) d’hydrazine monohydratée diluée dans 2,5 mL de méthanol est ajoutée sur le filtrat. Après réaction et évaporation à sec du milieu réactionnel, ce dernier est purifié sur une colonne de gel de silice 100 C 18 (éluant : H 2 O). 68 mg de ProAMFA1 ont été récoltés. Le rendement sur 2 étapes est de 35%. R f : 0,69 (2-Propanol/NH 4 OH/H 2 O 30/40/30 (v/v)) SMHR : 398,0607 Da ; Conf (%) : 100,00% [α] D 20 : + 32,5° (4 mg pour 1 mL de H 2 O)
Préparation du composé AMFA 1 Le composé AMFA1 est un analogue du mannose 6-phosphate (M6P). Il est synthétisé selon un protocole décrit dans le document EP 2 448 600 B1 et présente la formule développée suivante :
. La différence entre ProAMFA1 et AMFA1 réside dans la définition du radical P1 qui représente le groupe phosphate P(O)(OH) 2 dans ProAMFA1 versus l’atome d’hydrogène dans AMFA1.
Composé mannose 6-phosphate (M6P) Le composé mannose 6-phosphate (M6P) est acheté dans le commerce et présente la formule développée suivante :
Exemple 2 : Préparation des conjugués de l’invention de formule (II)
Deux produits d’intérêt Y, à savoir une enzyme lysosomale et un anticorps, ont respectivement été fonctionnalisés avec les composés Pro-AMFA1 ou AMFA1.
L’enzyme lysosomale testée est achetée dans le commerce sous la dénomination Myozyme ® . Il s’agit de l’enzyme alpha alglucosidase (ou alpha glucosidase acide). Elle peut être représentée dans ce qui suit par « Myo ». Elle contient dans sa structure des résidus M6P permettant le ciblage du RM6P-CI. L’enzyme lysosomale Myo est utilisée pour le traitement de la maladie de Pompe par thérapie enzymatique substitutive. L’anticorps testé est l’infliximab, un anticorps monoclonal chimérique de type IgG1 qui ne possède pas de résidus M6P dans sa structure. Il peut être représenté dans ce qui suit par « Infli ».
Les conjugués ainsi formés peuvent indifféremment être représentés dans la présente demande par « AMFA1 _ Myo » ou « Myo _ AMFA1 », « ProAMFA1 _ Myo » ou « Myo _ ProAMFA1 », « AMFA1 _ Infli » ou « Infli _ AMFA1 », « ProAMFA1 _ Infli » ou « Infli _ ProAMFA1 ». Les conjugués de l’invention sont ceux qui comprennent la partie ProAMFA1. Avantageusement selon l’invention la partie ProAMFA1 permet que le conjugué, une fois introduit dans un organisme, ne soit pas immédiatement reconnu par le récepteur RM6P-CI, ce qui permet ainsi le ciblage spécifique d’une cible biologique prédéterminée (membranaire ou non membranaire).
Couplage et quantification des composés AMFA1 et ProAMFA1 avec un produit d’intérêt Y ( Myo ou Infliximab) Le couplage de AMFA1 ou ProAMFA1 avec un produit d’intérêt Y (Myo ou Infliximab) est réalisé grâce à la fonction éthyloxyamine présente sur le bras espaceur de AMFA1 ou ProAMFA1, qui permet la formation d’une liaison covalente de type oxime avec les fonctions aldéhydes préalablement générées par oxydation ménagée sur les chaînes oligosaccharidiques du produit d’intérêt Y (Myo ou Infliximab). Le couplage d’un produit d’intérêt Y comprenant une fonction aldéhyde (générée préalablement par oxydation) avec ProAMFA1 de formule (I) (ou avec AMFA1) comprenant un bras espaceur avec une fonction éthyloxyamine (L= -(CH 2 ) 2 - et L 1 = -ONH 2 ) est notamment illustré en point 1/ . Couplage des AMFA1 ou ProAMFA1 avec la Myo zyme ® Dans un premier temps, l’enzyme Myozyme ® est oxydée au niveau de ses chaînes oligosaccharidiques. Pour ce faire la Myozyme ® est filtrée sur sépharose G25 avant d’être oxydée par 1 mM de métaperiodate de sodium pendant 30 min à 4°C. L’ajout de glycérol (20 µL par mL) pendant 10 min à 4°C permet d’arrêter l’oxydation. La solution d’enzyme est ensuite filtrée sur sépharose G25 et le composé ProAMFA1 ou AMFA1 est ajouté avec un excès molaire de 100 fois. Après 2 h à 37°C, la Myozyme ® est couplée et l’excès de ProAMFA 1 ou AMFA1 non couplé présent dans la solution est éliminé par une dialyse sur tampon contenant, pour 1 L : 2% mannitol, 3 mM Na 2 HPO 4 , 22,1 mM NaH 2 PO 4 ·et 0,005% polysorbate 80. Les conjugués Myo _ AMFA1 et Myo _ ProAMFA1 ainsi obtenus sont conservés dans ce tampon à 4°C. Quantification Une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF a permis d’estimer à environ 1 le nombre de ProAMFA1 ou d’AMFA1 couplés à l’enzyme Myozyme ® . Couplage des AMFA1 ou ProAMFA1 avec l’infliximab Dans un premier temps, l’anticorps infliximab est oxydé au niveau de ses chaînes oligosaccharidiques. Pour ce faire l’infliximab (5 mg) préalablement filtré sur sépharose G25 est oxydé par 1 mM de métaperiodate de sodium pendant 30 min à 4°C. L’ajout de glycérol (20 µL par mL) pendant 10 min à 4°C permet d’arrêter l’oxydation. La solution d’anticorps est ensuite filtrée sur sépharose G25 et le composé ProAMFA1 ou AMFA1 est ajouté avec un excès molaire de 200 fois. Après 2 h à 37°C, l’infliximab est couplé et l’excès de ProAMFA1 ou AMFA1 non couplé présent dans la solution est éliminé par une dialyse sur tampon contenant, pour 1 L : 2% mannitol, 3 mM Na 2 HPO 4 , 22,1 mM NaH 2 PO 4 ·et 0,005% polysorbate 80. Les conjugués Infli _ AMFA1 et Infli _ ProAMFA1 ainsi obtenus sont conservés dans ce tampon à 4°C. Quantification Une analyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF a permis d’estimer à environ 5 le nombre de ProAMFA1 ou d’AMFA1 couplés à l’anticorps infliximab.