INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
« L’oligomère de sonde de détection », « la sonde de détection » ou « la sonde » désigne un oligomère qui s’hybride spécifiquement à une séquence cible, comprenant une séquence amplifiée, dans des conditions qui favorisent l’hybridation d’acide nucléique, pour la détection de l’acide nucléique cible. La détection peut être directe (par exemple, la sonde hybridée directement à la cible) ou indirecte (par exemple, une sonde est hybridée à une structure intermédiaire qui relie la sonde à la cible). Les sondes de détection peuvent être de l’ADN, de l’ARN, des analogues de ceux-ci ou des combinaisons de ceux-ci ( par exemple des chimères d’ADN/ARN), et elles peuvent être marquées ou non. Les sondes de détection peuvent en outre comprendre d’autres liaisons dorsales telles que, par exemple , des liaisons 2'-O-méthyle. La séquence cible d’une sonde renvoie généralement à la séquence spécifique au sein d’une séquence plus grande que la sonde hybride spécifiquement. Une sonde de détection peut comprendre au moins une séquence spécifique à une cible et au moins une séquence sans cible spécifique. De telles séquences non spécifiques à une cible peuvent comprendre des séquences qui conféreront une structure secondaire ou tertiaire souhaitée, telle qu’une structure en épingle à cheveux, qui peut être utilisée pour faciliter la détection et/ou l’amplification ( voir, par exemple , les brevets américains n° 5 118 801, 5 312 728, 6 835 542 et 6 849 412). Les sondes d’une séquence définie peuvent être produites par des techniques connues du spécialiste du domaine, par exemple par synthèse chimique, et par expression in vitro ou in vivo à partir de molécules d’acides nucléiques recombinantes.
Par « hybridation » ou « hybrider », on entend la capacité de deux brins d’acide nucléique complètement ou partiellement complémentaires à se réunir dans des conditions de test d’hybridation spécifiées dans une orientation parallèle ou antiparallèle pour former une structure stable comportant une région double brin. Les deux brins constitutifs de cette structure double brin, parfois appelée hybride, sont maintenus ensemble par des liaisons hydrogène. Bien que ces liaisons hydrogènes se forment le plus souvent entre des nucléotides contenant les bases adénine et thymine ou de l’uracile (A et T ou U) ou de la cytosine et de la guanine (C et G) sur des brins d’acide nucléique simples, un appariement de bases peut également se former entre des bases qui n’appartiennent pas à ces paires « canoniques ». L’appariement de bases non canoniques est bien connu dans le domaine. Voir , par exemple , RLP Adams et al . The Biochemistry of the Nucleic Acids (11 e édition, 1992).
Par « hybrider préférentiellement », on entend que dans des conditions d’hybridation rigoureuses, un oligomère de sonde d’amplification ou de détection peut s’hybrider à son acide nucléique cible pour former un hybride cible d’oligomères stables, mais pas un nombre suffisant d’hybrides non cibles d’oligomères stables. Les oligomères d’amplification et de détection qui s’hybrident préférentiellement à un acide nucléique cible sont utiles pour amplifier et détecter des acides nucléiques cibles, mais pas des organismes non ciblés, en particulier des organismes étroitement apparentés sur le plan phylogénétique. Ainsi, l’oligomère s’hybride à l’acide nucléique cible dans une mesure suffisamment supérieure à celle de l’acide nucléique non cible pour permettre au spécialiste du domaine d’amplifier et/ou de détecter avec précision la présence (ou l’absence) d’acide nucléique dérivé de la cible spécifiée, le cas échéant. En général, la réduction du degré de complémentarité entre une séquence oligonucléotidique et sa séquence cible diminuera le degré ou le taux d’hybridation de l’oligonucléotide à sa région cible. Cependant, l’inclusion d’au moins un nucléoside ou d’au moins une nucléobase non complémentaire peut faciliter la capacité d’un oligonucléotide à discriminer contre des organismes non cibles.
L’hybridation préférentielle peut être mesurée à l’aide des techniques connues dans le domaine et décrites dans la présente invention, comme dans les exemples fournis ci-dessous. Dans certains modes de réalisation, il existe au moins une différence d’au moins 10 fois entre les signaux d’hybridation cibles et non cibles dans un échantillon de test, d’au moins une différence de 100 fois ou d’au moins 1 000 fois. Dans certains modes de réalisation, les signaux d’hybridation non cibles dans un échantillon de test ne sont pas supérieurs au niveau du signal de fond.
Par « conditions d’hybridation rigoureuses », ou « conditions rigoureuses », on entend des conditions permettant à un oligomère de s’hybrider préférentiellement à un acide nucléique cible et non à un acide nucléique dérivé d’un acide nucléique non cible étroitement lié. Bien que la définition des conditions d’hybridation rigoureuses ne varie pas, l’environnement réactionnel réel qui peut être utilisé pour une hybridation rigoureuse peut varier en fonction de facteurs tels que la teneur en GC et la longueur de l’oligomère, le degré de similarité entre la séquence d’oligomères et les séquences d’acides nucléiques non cibles pouvant être présents dans l’échantillon de test, et la séquence cible. Les conditions d’hybridation comprennent la température et la composition des réactifs ou des solutions d’hybridation. Des conditions de test d’hybridation exemplaires pour amplifier et/ou détecter des acides nucléiques cibles dérivés d’au moins un sérotype à GBS avec les oligomères de la présente invention correspondent à une température d’environ 60 °C lorsque la concentration en sel, telle qu’un sel monovalent, par exemple , KCl, se situe dans la plage d’environ 0,6 à 0,9 M.D’autres conditions de l’hybridation rigoureuses acceptables sont aisément déterminés par le spécialiste du domaine.
Par « conditions de test », on entend des conditions permettant une hybridation stable d’un oligonucléotide à un acide nucléique cible. Les conditions de test ne nécessitent pas une hybridation préférentielle de l’oligonucléotide à l’acide nucléique cible.
Les séquences sont « suffisamment complémentaires » si elles permettent une hybridation stable de deux séquences d’acides nucléiques, par exemple des hybrides stables de séquences de sonde et de séquences cibles, bien que les séquences n’aient pas besoin d’être complètement complémentaires. C’est-à-dire une séquence « suffisamment complémentaire » qui s’hybride à une autre séquence par liaison hydrogène entre une série de nucléotides complémentaires à l’aide d’un appariement de bases standard ( par exemple , G : C, A : T ou A : U), bien que les deux séquences puissent contenir au moins un résidu (comprenant des positions abasiques) qui ne sont pas complémentaires tant que les séquences entières dans des conditions d’hybridation appropriées pour former un complexe d’hybridation stable. Des séquences suffisamment complémentaires peuvent être d’au moins environ 80 %, d’au moins environ 90 % ou complètement complémentaires dans les séquences qui s’hybrident ensemble. Les conditions d’hybridation appropriées sont bien connues des spécialistes du domaine, peuvent être prédites sur la base de la composition de séquence, ou peuvent être déterminées de manière empirique à l’aide de tests de routine (par exemple, Sambrook et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, 2 e édition, §§ 1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51 et 11.47-11.57, en particulier §§ 9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47 et 11.55-11.57).
Un oligomère « non extensible » comprend une fraction de blocage à son extrémité 3' ou à près de celle-ci pour empêcher l’extension. Un groupe de blocage près de l’extrémité 3' est, dans certains modes de réalisation, dans les cinq résidus de l’extrémité 3' et est suffisamment grand pour limiter la liaison d’une polymérase à l’oligomère, et d’autres modes de réalisation contiennent un groupe de blocage lié de manière covalente à l’extrémité 3'. De nombreux groupes chimiques différents peuvent être utilisés pour bloquer l’extrémité 3', par exemple, des groupes alkyle, des groupes de liaison non nucléotidiques, des résidus de didésoxynucléotides d’alcane-diol et de la cordycépine. D’autres exemples de fractions de blocage comprennent un nucléotide 3'-désoxy ( par exemple , un nucléotide 2',3'-didésoxy) ; un nucléotide 3'-phosphorylé ; un fluorophore, un extincteur ou un autre marqueur qui interfère avec l’extension ; un nucléotide inversé ( par exemple, lié au nucléotide précédent par un 3'-à-3' phosphodiester, éventuellement avec un 5'-OH ou un phosphate exposé) ; ou une protéine ou un peptide lié à l’oligonucléotide pour empêcher toute extension supplémentaire d’une chaîne d’acides nucléiques naissante par une polymérase. Un oligonucléotide non-extensible de la présente invention peut avoir une longueur d’au moins 10 bases et une longueur allant jusqu’à 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50 ou plus. Des oligonucléotides non extensibles comprenant un marqueur détectable peuvent être utilisés comme sondes.
Les références, en particulier dans les revendications, à « la séquence de SEQ ID N O : X » renvoient à la séquence de bases de l’entrée de listage de séquences correspondante et ne nécessitent pas l’identité du squelette ( par exemple , ARN, 2'-O-Me ARN, ou ADN) ou des modifications de bases ( par exemple , méthylation de résidus de cytosine) à moins que le contexte n’indique clairement le contraire.
La « préparation d’échantillon » renvoie à toute étape ou procédé qui traite un échantillon pour une amplification et/ou une détection ultérieure des acides nucléiques à GBS présents dans l’échantillon. Les échantillons peuvent être des mélanges complexes de composants dont l’acide nucléique cible est un composant minoritaire. La préparation d’échantillon peut comprendre tout procédé connu de composant de concentration, tels que des microbes ou des acides nucléiques, à partir d’un volume d’échantillon plus important, par exemple par filtration de particules en suspension dans l’air ou présentes dans l’eau d’un échantillon de volume plus important ou par l’isolement des microbes à partir d’un échantillon à l’aide de procédés standard de microbiologie. La préparation d’échantillon peut comprendre une perturbation physique et/ou une lyse chimique de composants cellulaires pour libérer des composants intracellulaires dans une phase sensiblement aqueuse ou organique et l’élimination des débris, par exemple par filtration, centrifugation ou adsorption. La préparation de l’échantillon peut comprendre l’utilisation d’un oligonucléotide d’acide nucléique qui capture de manière sélective ou non spécifique un acide nucléique cible et le sépare des autres composants d’échantillon ( par exemple , comme décrit dans le brevet américain n° 6 110 678 et la publication de demande de brevet internationale WO 2008/016988, chacun étant cité dans la présente invention à titre de référence).
« Séparer » ou « purifier » signifie qu’au moins un composant d’un échantillon est retiré ou séparé des autres composants d’échantillon. Les composants d’échantillon comprennent des acides nucléiques cibles habituellement dans une phase de solution généralement aqueuse, pouvant également comprendre des fragments cellulaires, des protéines, des glucides, des lipides et d’autres acides nucléiques. « Séparer » ou « purifier » n’implique pas de degré de purification. Typiquement, la séparation ou la purification élimine au moins 70 %, ou au moins 80 %, ou au moins 95 % de l’acide nucléique cible des autres composants d’échantillon.
Le terme « tensioactif non linéaire », tel qu’utilisé dans la présente invention, désigne un tensioactif comportant une structure de chaîne ramifiée. Un tensioactif non linéaire peut comprendre au moins une structure cyclique, qui peut se trouver, par exemple, dans une chaîne principale et/ou dans au moins une chaîne ramifiée. Les tensioactifs non linéaires exemplaires comprennent le polysorbate 20, le polysorbate 40, le polysorbate 60 et la digitonine. Dans certaines variantes, un tensioactif non linéaire est non ionique.
Le terme « spécificité », dans le contexte d’un système d’amplification et/ou de détection, est utilisé dans la présente invention pour faire référence à la caractéristique du système qui décrit sa capacité à distinguer les séquences cibles des séquences non cibles en fonction des conditions de séquence et de test. En termes d’amplification d’acide nucléique, la spécificité désigne généralement le rapport entre le nombre d’amplicons spécifiques produits et le nombre de produits secondaires ( par exemple , le rapport signal/bruit). En termes de détection, la spécificité désigne généralement le rapport du signal produit à partir d’acides nucléiques cibles au signal produit à partir d’acides nucléiques non cibles.
Le terme « sensibilité » est utilisé dans la présente invention pour désigner la précision avec laquelle une réaction d’amplification d’acide nucléique peut être détectée ou quantifiée. La sensibilité d’une réaction d’amplification est généralement une mesure du plus petit nombre de copies de l’acide nucléique cible pouvant être détecté de manière fiable dans le système d’amplification, et dépend, par exemple, du test de détection utilisé et de la spécificité de la réaction d’amplification, par exemple , le rapport des amplicons spécifiques aux produits secondaires.
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L’INVENTION La présente invention concerne des compositions, des kits et des procédés permettant d’amplifier et de détecter l’acide nucléique à streptocoque de groupe B (GBS ; Streptococcus agalactiae ) à partir d’un échantillon. De préférence, les échantillons sont des échantillons biologiques. Les compositions, les kits et les procédés fournissent des séquences d’oligonucléotides qui reconnaissent des séquences cibles du génome à GBS, comprenant les séquences cibles de sérotypes à GBS Ia, Ib, Ic, II, III, IV, V, VI, VII, VIII et IX, ou leurs séquences complémentaires. De tels oligonucléotides peuvent être utilisés comme oligonucléotides d’amplification, qui peuvent comprendre des amorces, des promoteurs-amorces, des oligonucléotides bloqués et des oligonucléotides fournisseurs de promoteurs, dont les fonctions ont été décrites précédemment ( voir, par exemple , les brevets américains n° 4 683 195 ; 4 683 202 ; 4 800 159 ; 5 399 491 ; 5 554 516 ; 5 824 518 et 7 374 885, chacun étant cité dans la présente invention à titre de référence). D’autres oligonucléotides peuvent être utilisés comme sondes pour détecter des séquences amplifiées de GBS ou pour capturer un acide nucléique cible à GBS.
L’invention concerne plus particulièrement mais non exclusivement les têtes de distribution destinées à équiper des récipients pressurisés contenant la composition.
De nombreuses têtes de distribution ont été proposées, à un ou à plusieurs orifice(s) de distribution. De nombreux paramètres sont à considérer lors de la conception d’une tête de distribution.
Tout d’abord, le spray généré doit présenter la granulométrie convenant à l’application. A cet égard, la taille des microgouttelettes obtenues ne doit pas être trop petite ni trop grande.
Par ailleurs, le spray généré doit être délivré avec le débit requis et la tête de distribution ne doit pas opposer une trop forte perte de charge à la circulation de la composition.
La forme du spray doit également correspondre à l’application visée et permettre ainsi, selon les cas, de couvrir une surface plus ou moins étendue.
Enfin, la tête de distribution doit être esthétiquement attractive pour le consommateur, et sa fabrication compatible avec les exigences de production à large échelle.
On connait par exemple par les demandes WO 2015/148517, WO 2009/030579 et WO 97/13584 des têtes de distribution comportant une buse tourbillonnaire rapportée sur un diffuseur afin d’obtenir une nappe tourbillonnante.
L’invention vise à proposer un dispositif de pulvérisation et une nouvelle tête de distribution qui convienne tout particulièrement à la pulvérisation d’une composition cosmétique ou non cosmétique, et qui soit simple et peu coûteuse à fabriquer, tout en fournissant un spray satisfaisant.
L’invention a ainsi pour objet, selon un premier de ses aspects, un dispositif de pulvérisation d’une composition à distribuer, comportant : - un récipient contenant la composition, la composition étant une composition non cosmétique, et - une tête de distribution destinée à équiper le récipient, la tête de distribution comportant une chambre de mise en rotation de la composition, alimentée par au moins un canal d’arrivée de la composition et comportant au moins un orifice de sortie de la composition vers l’extérieur, la chambre étant configurée pour qu’un coefficient de décharge Cd de la tête de distribution vérifie la relation 0,3 avec Cd = 0,35 * K 0,5 * ((Ds / Do ) 0,25 ), avec la constante d’atomiseur K définie par K = Ac/(Ds * Do), où Ac est l’aire en section transversale du ou des canaux d’arrivée de la composition, Ds la plus grande dimension de la chambre en section transversale, mesurée perpendiculairement à un axe Y de l’orifice de sortie, et Do le diamètre de l’orifice de sortie.
La section transversale est prise perpendiculairement à un axe longitudinal X de la tête de distribution, qui peut être confondu avec axe longitudinal du récipient. L’axe longitudinal X de la tête de distribution peut être perpendiculaire à l’axe Y de l’orifice de sortie.
Le coefficient de décharge Cd permet de traduire le rapport entre le débit réel de la tête de distribution et son débit théorique calculé pour le diamètre de l’orifice de sortie Do. Ainsi, on peut définir le régime de sortie de la composition lors de la pulvérisation.
Le coefficient de décharge Cd peut notamment vérifier la relation : 0,32 < Cd < 0,47, voire 0,35 < Cd < 0,45.
Le coefficient de décharge Cd peut être tel que défini dans l’article ‘ Air– liquid interactions in a pressure- swirl spray ’ de J. Jedelsky et al., International Journal of Heat and Mass Transfer 121 (2018) 788–804, dans le cadre de l’étude des buses d’injection d’essence dans les moteurs à explosion pour l’automobile. La constante d’atomiseur K peut être telle que définie dans l’article ‘ Effect of geometric parameters on spray characteristics of pressure swirl atomizers ’ de M. Rashad et al., International journal of hydrogen energy 41 (2016) 15790 – 15799.
La composition peut être un produit alimentaire ou domestique, pharmaceutique ou de soins vétérinaires, ou industriel. La composition n’est pas cosmétique. Il peut s’agir d’une peinture ou vernis, ou d’une composition pour l’entretien de la maison, par exemple. La composition peut être autre que de l’essence pour un moteur thermique.
On entend notamment au sens de la présente invention par « composition cosmétique » une composition telle que définie dans le Règlement CE N°1223/2009 du Parlement Européen et du Conseil du 30 novembre 2009 relatif aux produit cosmétiques.
La composition peut être un fluide ou un gaz. Elle peut être sèche, étant par exemple une poudre, un gel ou une mousse. Le récipient peut contenir d’une part la composition et d’autre part un gaz propulseur.
Une étude préliminaire a été réalisée pour déterminer la limite de détection (LoD) des combinaisons d’amorces/de sondes SIP/CFB multiplexées 3 et 17 sur le sérotype III à GBS (à partir d’ATCC) à l’aide d’une analyse probit (logiciciel Minitab® 17).
Le sérotype de souche à GBS III a été diluée en série dans Lim Broth à huit concentrations (sur la base du placage) : 20 000,0, 10 000,0, 5 000,0, 2 500,0, 1 250,0, 625,0, 312,5 et 156,3 UFC/mL, à partir d’une culture précédente de GBS (solution de stock dans le milieu de transport d’échantillons (STM)).
Ces huit dilutions ont été ajoutées dans les tubes à échantillon correspondants comme suit : 250,0 µL d’échantillon dans 750,0 µL de solution de transfert (la solution de transfert étant un mélange de STM + Target Capture Oligo (TCO)(à 1667 pmol/750 µL STM). En raison de la dilution finale 1:4 dans le tube à échantillon, les concentrations finales étaient de 5 000,0, 2 500,0, 1 250,0, 625,0, 312,5, 156,3, 78,1 et 39,1 UFC/mL.
Chaque dilution a été testée dans 20 extractions et un réplicat PCR, sur deux essais sur le système PANTHER FUSION. Un contrôle positif (mélange de plasmides SIP et CFB à GBS à 141 et 781 c/µL dans STM) et un contrôle négatif (Lim Broth) ont également été testés dans un ou deux réplicats d’extraction et un réplicat PCR, respectivement.
L’analyse probit a été réalisée sur la base des concentrations testées, du nombre d’appels positifs et du nombre d’essais obtenus par concentration, à l’aide du logiciel Minitab® 17.
Trois modes de distribution ont été comparés (LogNormal, Weibull et LogLogistic) et celui qui donnait les meilleures valeurs de p, c’est-à-dire , près de 0,000 pour le tableau de régression et le plus près de 1,000 pour les tests de qualité d’ajustement, a été choisi, comme résumé dans Tablea 17 ci-dessous. Sur la base de ce tableau, le mode de distribution Weibull a été utilisé pour la détermination de la limite de détection.
Tableau 17 Paramètres Analyse probit à l’aide du logiciel Minitab® 17 Mode de distribution d’analyse probit LogNormal Weibull LogLogistic Tableau de régression (valeur P)(devrait être ≈ 0,000) 0,000 0,000 0,000 Tests de qualité d’ajustement Pearson (valeur P) (devrait être ≈ 1,000) Déviance (valeur P)(devrait être ≈ 1,000) 0,975 0,966 0,999 0,999 0,927 0,893
Les résultats obtenus sur le système PANTHER FUSION sont résumés dans le tableau 18 ci-dessous. La dernière dilution a été éliminée de l’analyse statistique.
La limite de détection 95 % du sérotype à GBS III a été trouvée à 1 294 UFC/mL dans LB, soit à 324 UFC/mL dans l’échantillon testé.
La sensibilité et inclusivité analytique à l’aide de la combinaison d’amorces/de sondes SIP 3 multiplexée avec la combinaison d’amorces/de sondes CFB 17 a été évaluée par le test des dilutions en série de lysats cellulaires dans la matrice clinique négative de Lim Broth pour les sérotypes à GBS Ia, Ib, Ic, II, III, IV, V, VI, VII, VIII et IX. En outre, une souche non hémolytique (NH) a été évaluée. La limite de détection de 95 % du test de GBS par PANTHER FUSION pour chaque sérotype a été déterminée à l’aide d’une analyse de régression des probits et les limites de détection prévues ont été confirmées dans les 12 sérotypes à GBS. La réactivité croisée et l’interférence des microorganismes ont été évaluées avec 45 espèces bactériennes ou fongiques, avec et sans la présence du sérotype à GBS III à 3 fois la limite de détection. Une étude comparative des procédés a été réalisée par le test des échantillons enrichis Lim Broth (n = 255) prélevés sur des femmes antepartum subissant un dépistage culture de GBS aux normes de soins dans deux hôpitaux différents. La sensibilité et la spécificité par rapport à la culture ont été déterminées pour le test de GBS PAR PANTHER FUSION. Les échantillons présentant des résultats discordants ont été testés avec le test de GBS par BDMax. Tous les tests ont été réalisés sur le système PANTHER FUSION.
Sensibilité et in clusivité analytique . Les panels ont été créés en ajoutant des stocks de lysat de concentrations d’UFC/mL connues dans la matrice d’enrichissement Lim Broth. Chaque panel a été testé dans des réplicats de 30 avec chacun des trois lots de réactifs de test à l’aide de trois systèmes de PANTHER FUSION. Les limites de détection de 50 % et 95 % ont été estimées pour chaque souche et lot de réactifs par l’analyse Probit (voir le tableau 19 ci-dessous). Les limites de détection sont indiquées dans le tableau 19 en UFC/mL dans l’échantillon de Lim Broth (recalculées à partir de UFC/mL dans l’échantillon de test par PANTHER FUSION, soit des dilutions de 1:4 de Lim Broth dans le milieu de transport d’échantillons (STM)). Un test de confirmation des limites de détection prévues a été réalisé et une positivité d’au moins 95 % a été observée pour tous les sérotypes.