INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Sur un sol plat, chaque traverse 20, 30 et en particulier chaque branche centrale 23, 23 peut être décomposée en une partie supérieure et une partie inférieure vue par un observateur. La partie inférieure et la partie supérieure peuvent par exemple se rejoindre à mi-hauteur de la traverse.
Par ailleurs, chaque traverse 10 est fixée à la cellule 2.
Ainsi, la première traverse 20 est connectée à la cellule 2 du giravion 1 uniquement par deux fixations 41, 42. Chaque fixation 41, 42 entoure sans jeu la première traverse 20 et est solidaire de l’ossature de la cellule 2. Par exemple, les deux fixations 41, 42 sont fixées à deux longerons respectifs de la cellule 2. Selon un exemple, chaque fixation 41, 42 comporte un demi-collier fixé à un portant de l’ossature, et par exemple d’un longeron, le demi-collier enserrant une garniture en deux parties entourant sans jeu la première traverse 20.
En référence à la , la deuxième traverse 30 est uniquement portée en vol, à savoir lorsque les patins 6, 7 ne touchent plus le sol, par un premier support 50 et un deuxième support 60. Le premier support 50 et le deuxième support 60 sont dénommés plus simplement « support ».
Les deux supports 50, 60 sont rendus solidaires de la cellule 2, et en particulier de son ossature. Par exemple, le premier support 50 et le deuxième support 60 sont rendus solidaires respectivement d’un premier longeron 96 de la cellule 2 et d’un deuxième longeron 97 de la cellule 2. Eventuellement, le premier longeron 96 est aussi solidaire d’une fixation 41 alors que le deuxième longeron 97 est solidaire de l’autre fixation 42.
Le premier support 50 et le deuxième support 60 sont traversés de part en part par la deuxième traverse 30 selon une direction transversale DIR allant du premier support 50 au deuxième support 60. En particulier, le premier support 50 et le deuxième support 60 sont traversés par la branche centrale 33 de la deuxième traverse 30.
A cet effet, le premier support 50 et le deuxième support 60 présentent respectivement deux orifices, à savoir respectivement un premier orifice 51 et un deuxième orifice 61. Le premier orifice 51 et le deuxième orifice 61 sont traversés transversalement par la deuxième traverse 30. Les deux orifices 51, 61 peuvent être délimités, radialement autour de la direction transversal DIR, respectivement par deux surfaces d’arrêt 52, 62. Ainsi, le premier orifice 51 peut être délimité radialement par rapport à la direction transversal DIR par une première surface d’arrêt 52 du premier support 50. De même, le deuxième orifice 61 peut être délimité radialement par rapport à la direction transversal DIR par une deuxième surface d’arrêt 62 du deuxième support 60.
Par exemple, le premier support 50 comporte une armature dite « première armature 54 ». La première armature 54 porte une garniture dite « première garniture 53 » qui s’étend le long d’une ligne fermée. Dès lors, la première surface d’arrêt 52 est une face interne de la première garniture 53 qui entoure radialement le premier orifice 51. Selon l’exemple illustré, la première armature 54 comporte un demi-collier 55 en U rendu solidaire de la cellule 2, par exemple directement ou via une pièce de jonction au premier longeron 96.
Par exemple,, le deuxième support 60 comporte une armature dite « deuxième armature 64 ». La deuxième armature 64 porte une garniture dite « deuxième garniture 63 » qui s’étend le long d’une ligne fermée. Dès lors, la deuxième surface d’arrêt 62 est une face interne de la deuxième garniture 63 qui entoure radialement le deuxième orifice 61. Selon l’exemple illustré, la deuxième armature 64 comporte un demi-collier 65 en U rendu solidaire de la cellule 2, par exemple directement ou via une pièce de jonction au deuxième longeron 97.
Pour limiter la liberté de mouvement en translation de la deuxième traverse 30 par rapport à la cellule 2 selon la direction transversale DIR, la branche centrale 33 peut porter une première butée 81 et une deuxième butée 82. La première butée 81 et la deuxième butée 82 sont, par exemple, agencées transversalement entre le premier support 50 et le deuxième support 60. La première butée 81 et la deuxième butée 82 ont pour fonction de limiter, par interférence de forme respectivement avec le premier support 50 et le deuxième support 60, le déplacement transversal de la deuxième traverse 30 par rapport à la cellule 2.
Par exemple, la première butée 81 comporte un système vis-écrou 811 traversant la deuxième traverse 30 pour solidariser un premier plot 812 à cette deuxième traverse 30. De même, la deuxième butée 82 comporte un système vis-écrou 821 traversant la deuxième traverse 30 pour solidariser un deuxième plot 822 à cette deuxième traverse 30. Le premier plot 812 et le deuxième plot 822 sont masqués sur la et visibles sur la .
En référence à la , une première distance D1 représente la plus petite distance entre la première butée 81, voire son premier plot 812, et le premier support 50. De même, une deuxième distance D2 représente la plus petite distance entre la deuxième butée 82, voire son deuxième plot 822, et le deuxième support 60. Dès lors, la première distance D1 peut être différente de la deuxième distance D2 lorsqu’une butée touche le support correspondant. La première distance D1 et la deuxième distance D2 ne sont jamais nulles simultanément.
Indépendamment de cet aspect, et en référence à nouveau à la , la deuxième traverse 30 présente en permanence un jeu 56, 66 avec les deux surfaces d’arrêt 52,62, à savoir un premier jeu 56 avec la première surface d’arrêt 52 et un deuxième jeu 66 avec la deuxième surface d’arrêt 62. Ainsi, un espace vide sépare toujours la deuxième traverse 30 en élévation avec un fond 52INT et/ou un sommet 52SUP de la première surface d’arrêt 52, et un espace vide sépare toujours la deuxième traverse 30 en élévation avec un fond 62INT et/ou un sommet 62SUP de la deuxième surface d’arrêt 62. Le sommet d’une surface d’arrêt 52,62 est de fait situé au dessus du fond de cette surface d’arrêt 52,62 lorsque le giravion 1 repose sur un sol 100 plat et à la vue d’un individu situé sur ce sol 100.
Pour présenter les jeux requis 56, 66, les deux orifices 51, 61 des deux supports 50, 60 peuvent avoir des formes oblongues dans deux plans longitudinaux-verticaux P2, P3 respectifs. A l’inverse, la deuxième traverse 30 peut avoir des sections circulaires dans ces plans longitudinaux-verticaux P2, P3 en l’absence de déformation. Ainsi, la deuxième traverse 30 a une liberté de mouvement en translation par rapport aux deux supports 50,60 selon des axes, éventuellement verticaux lorsque le giravion 1 repose sur un sol 100 horizontal.
Ces perforations permettent de révéler des images personnalisées – en couleurs ou en niveau de gris – lorsque le document est observé suivant un ou des angles d’observation appropriés. Ainsi, en observant le document selon un angle d’incidence du rayonnement layer utilisé pour former des perforations dans la couche métallique, on peut visualiser une image révélée par lesdites perforations dans la couche métallique.
Comme expliqué ci-après, il est ainsi possible de former des images personnalisées, en couleur ou en niveaux de gris, de bonne qualité (en particulier avec un bon contraste), facile à authentifier, robuste vis-à-vis des risques de fraudes, falsification ou contrefaçon, en permettant d’augmenter considérablement le nombre d’images par rapport aux solutions de l’art antérieur. Ceci permet un rendu de meilleure qualité permettant une réelle animation entre les images obtenues ou un rendu en trois dimensions de qualité.
L’invention concerne également un procédé de formation d’une telle image personnalisée.
Dans la suite de cet exposé, des exemples de mises en œuvre de l’invention sont décrits dans le cas d’un document comportant au moins deux images personnalisées selon le principe de l’invention. Ce document peut être un quelconque document, dit document sécurisé, de type livret, carte ou autre. L’invention trouve des applications particulières dans la formation d’images d’identité dans des documents identitaires tels que : cartes d’identité, cartes de crédit, passeports, permis de conduire, badges d’entrée sécurisés etc. L’invention s’applique également aux documents de sécurité (billets de banque, documents notariés, certificats officiels…) comportant au moins une image personnalisée. D’autres implémentations sont toutefois possibles.
De même, les exemples de réalisation décrits ci-après visent à former une image d’identité. On comprend toutefois que l’image personnalisée formée selon le concept de l’invention peut être quelconque (forme, nature, couleurs, etc.). Il peut s’agir par exemple d’une image représentant le portrait du titulaire du document concerné, d’autres implémentations étant toutefois possibles.
Comme déjà indiqué, le document au sens de l’invention peut être quelconque. La représente, selon un mode de réalisation particulier, un document sécurisé 2 comportant un corps de document 4 dans ou sur lequel est formée une pluralité d’images sécurisées IG selon le concept de l’invention. L’image IG est en fait une pluralité d’images selon l’angle d’observation du document sécurisé 2.
On suppose, dans les exemples de réalisation qui suivent, que le document sécurisé 2 est un document identitaire, se présentant par exemple sous la forme d’une carte, telle qu’une carte d’identité, badge d’identification ou autre. Dans ces exemples, les images IG sont des images en niveaux de gris, dont le motif correspond au portait du titulaire du document. Comme déjà indiqué, d’autres exemples sont toutefois possibles. Selon la présente divulgation, plusieurs images IG sont réalisées, celles-ci sont visualisables en faisant varier l’angle d’observation vis-à-vis du document sécurisé 2. Ceci permet un rendu animé ou une visualisation en trois dimensions.
La représente un premier mode de réalisation d’une structure multicouche 10 dans un état initial (vierge), à partir de laquelle peut être formée une pluralité d’images personnalisées telle que représentée en . Comme expliqué par la suite en référence à la , cette structure 10 peut être personnalisée afin de former des images personnalisées. Cette structure 10 constitue par exemple le document 2 représenté en ou peut être comprise dans le document 2 afin de former les images IG.
Comme illustré en , la structure multicouche 10 comprend un réseau lenticulaire 12 positionné en regard (au-dessus) d’une couche métallique 13. La couche métallique 13 est elle-même disposée sur une couche support (ou substrat) 14 de sorte à ce que cette couche métallique 13 soit intercalée entre le réseau lenticulaire 12 et la couche support 14. La couche support 14 est de préférence une couche transparente. Une autre couche transparente 14’ (non représentée) peut être positionnée au-dessus du réseau lenticulaire 12 ou entre le réseau lenticulaire et la couche métallique.
La couche métallique 13 peut comprendre au moins l’un parmi les matériaux suivants : aluminium, argent, cuivre, sulfure de zinc, oxyde de Titane…Cette couche métallique peut également être préférentiellement un oxyde métallique.
Le réseau lenticulaire 12 comprend des lentilles (ou microlentilles) convergentes 11 positionnées en regard (au-dessus) de la couche métallique 13. Divers arrangements et configurations de lentilles 11 peuvent être envisagés comme décrit ci-après. Ces lentilles permettent notamment de focaliser un rayonnement laser sur la couche métallique 13 afin de former des images IG selon le principe de l’invention. Selon ce mode de réalisation, le réseau lenticulaire comprend une pluralité de lentilles 11 convergentes cylindriques s’étendant parallèlement à la couche métallique.
Comme déjà indiqué, la couche métallique 13 représentée en est vierge dans le sens où elle ne comporte pas l’information définissant le motif des images finales IG que l’on souhaite former. Dans son état initial, la structure multicouche 10 ne forme aucune image personnalisée IG. Pour former des images personnalisées IG, des perforations sont formées par rayonnement laser dans la couche métallique 13 comme décrit ci-dessous.
La représente un second mode de réalisation d’une structure multicouche 10 dans un état initial (vierge), à partir de laquelle peut être formée une pluralité d’images personnalisées telle que représentée en . Comme expliqué par la suite en référence à la , cette structure 10 peut être personnalisée afin de former des images personnalisées. Cette structure 10 constitue par exemple le document 2 représenté en ou peut être comprise dans le document 2 afin de former les images IG.
Comme illustré en , la structure multicouche 10 comprend un réseau lenticulaire 12 positionné en regard (au-dessus) d’une couche métallique 13. La couche métallique 13 est elle-même disposée sur une couche opaque noire 15. Cette couche opaque noire 15 ne laisse pas passer de lumière.
Si on n’est pas dans le créneau « après-midi» la recharge ne peut démarrer et une information de connexion correspondante est transmise à l’utilisateur « J2».
illustre le cas où un deuxième utilisateur B stationne sur une place « après-midi» et souhaite recharger son véhicule, mais aucun véhicule n’est présent sur la place « matin » ou bien le premier utilisateur A n’y a pas lancé de charge.
La borne détecte le véhicule de l’utilisateur B « A ».
L’information du véhicule stationné est transmise à l’utilisateur « B ».
L’utilisateur B branche son propre câble de charge dans la prise de charge 11 de la borne: « C».
La borne est informée de la détection de connexion « D».
L’utilisateur peut insérer une clé ou un badge pour lancer la recharge « E ».
L’information de charge est transmise à l’utilisateur « H2 », notamment mais non limitativement après une validation sur l’interface homme-machine du véhicule.
Identification de clones candidats
La variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de la présente invention a été identifiée par sélection à partir d'une bibliothèque de variantes de la protéine Stéfine A avec deux séquences de boucles aléatoires, chaque boucle ayant une longueur d'environ 9 acides aminés affichés dans un squelette de structure constant de la variante de la protéine Stéfine A sur la base de la séquence d'acides aminés de la Stéfine A. De telles procédures de sélection ont été décrites (voir, par ex. Tiede et al. Protein Eng Des Sel. 2014. 27(5): 145–155 et Hughes et al. Sci Signal. 2018. 10(505): eaaj2005). Selon de telles procédures, des suspensions de phages exprimant une variante de la protéine Stéfine A ont été incubées avec du TNFR2 humain (ou de souris dans des expériences ultérieures) selon les besoins, les séquences desquelles étant présentées dans le Tableau 7.
Tableau 7. Séquences de protéines TNFR utilisées lors de la sélection (de Sino Biologicals). Protéine Séquence cible Numéro du plasmide au catalogue SEQ ID NO : TNFR2 humain MAPVAVWAALAVGLELWAAAHALPAQVAFTPYAPEPGSTCRLREYYDQTAQMCCSKCSPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAPLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICNVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDFALPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVIMTQVKKKPLCLQREAKVPHLPADKARGTQGPEQQHLLITAPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGVEASGAGEARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTMGDTDSSPSESPKDEQVPFSKEECAFRSQLETPETLLGSTEEKPLPLGVPDAGMKPS Cat: HG10417-CY 478 TNFR1 humain MGLSTVPDLLLPLVLLELLVGIYPSGVIGLVPHLGDREKRDSVCPQGKYIHPQNNSICCTKCHKGTYLYNDCPGPGQDTDCRECESGSFTASENHLRHCLSCSKCRKEMGQVEISSCTVDRDTVCGCRKNQYRHYWSENLFQCFNCSLCLNGTVHLSCQEKQNTVCTCHAGFFLRENECVSCSNCKKSLECTKLCLPQIENVKGTEDSGTTVLLPLVIFFGLCLLSLLFIGLMYRYQRWKSKLYSIVCGKSTPEKEGELEGTTTKPLAPNPSFSPTPGFTPTLGFSPVPSSTFTSSSTYTPGDCPNFAAPRREVAPPYQGADPILATALASDPIPNPLQKWEDSAHKPQSLDTDDPATLYAVVENVPPLRWKEFVRRLGLSDHEIDRLELQNGRCLREAQYSMLATWRRRTPRREATLELLGRVLRDMDLLGCLEDIEEALCGPAALPPAPSLLR HG10872-CY 479 TNFR2 de cynomolgus MAPAAVWAALAVGLELWAAGHALPAQVAFTPYAPEPGGTCRLREYYDQTAQMCCSKCPPGQHAKVFCTKTSDTVCDSCEDSTYTQLWNWVPECLSCGSRCSSDQVETQACTREQNRICTCRPGWYCALSKQEGCRLCAQLRKCRPGFGVARPGTETSDVVCKPCAPGTFSNTTSSTDICRPHQICHVVAIPGNASMDAVCTSTSPTRSMAPGAVHLPQPVSTRSQHTQPTPAPSTAPGTSFLLPVGPSPPAEGSTGDIVLPVGLIVGVTALGLLIIGVVNCVIMTQVKKKPLCLQRETKVPHLPADKARGAQGPEQQHLLTTVPSSSSSSLESSASALDRRAPTRNQPQAPGAEKASGAGEARASTGSSDSSPGGHGTQVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASSTTGDTDASPSGSPKDEQVPFSKEECAFRSQLETPETLLGSTGEKPLPLGVPDAGMKPS CG90102-ACR 480 TNFR2 de souris MAPAALWVALVFELQLWATGHTVPAQVVLTPYKPEPGYECQISQEYYDRKAQMCCAKCPPGQYVKHFCNKTSDTVCADCEASMYTQVWNQFRTCLSCSSSCTTDQVEIRACTKQQNRVCACEAGRYCALKTHSGSCRQCMRLSKCGPGFGVASSRAPNGNVLCKACAPGTFSDTTSSTDVCRPHRICSILAIPGNASTDAVCAPESPTLSAIPRTLYVSQPEPTRSQPLDQEPGPSQTPSILTSLGSTPIIEQSTKGGISLPIGLIVGVTSLGLLMLGLVNCIILVQRKKKPSCLQRDAKVPHVPDEKSQDAVGLEQQHLLTTAPSSSSSSLESSASAGDRRAPPGGHPQARVMAEAQGFQEARASSRISDSSHGSHGTHVNVTCIVNVCSSSDHSSQCSSQASATVGDPDAKPSASPKDEQVPFSQEECPSQSPCETTETLQSHEKPLPLGVPDMGMKPSQAGWFDQIAVKVA MG50128-CY 481 TNFR1 de souris MGLPTVPGLLLSLVLLALLMGIHPSGVTGLVPSLGDREKRDSLCPQGKYVHSKNNSICCTKCHKGTYLVSDCPSPGRDTVCRECEKGTFTASQNYLRQCLSCKTCRKEMSQVEISPCQADKDTVCGCKENQFQRYLSETHFQCVDCSPCFNGTVTIPCKETQNTVCNCHAGFFLRESECVPCSHCKKNEECMKLCLPPPLANVTNPQDSGTAVLLPLVILLGLCLLSFIFISLMCRYPRWRPEVYSIICRDPVPVKEEKAGKPLTPAPSPAFSPTSGFNPTLGFSTPGFSSPVSSTPISPIFGPSNWHFMPPVSEVVPTQGADPLLYESLCSVPAPTSVQKWEDSAHPQRPDNADLAILYAVVDGVPPARWKEFMRFMGLSEHEIERLEMQNGRCLREAQYSMLEAWRRRTPRHEDTLEVVGLVLSKMNLAGCLENILEALRNPAPSSTTRLPR MG50496-CY 482
Tableau 8. Antigènes commerciaux utilisés lors de la sélection. Les antigènes TNFR2 ayant les séquences présentées dans le Tableau 7 ainsi que d'autres protéines présentées ci-dessous ont été testés dans différents formats pour biotinylation et utilisation dans la sélection TNFR2 AFFIMER® et d'autres essais. Antigène Fournisseur Numéro au catalogue Etiquette Source PM prévu (kDa) hTNFR2-hFc-his-Avi (conjugué à la biotine) BPS 100205 IgG1 humaine, 6x His, Avi, Biotine HEK293 75 hTNFR2-hFc-his-Avi BPS 79363 IgG1 humaine, 6x His, Avi HEK293 75 hTNFR2-his Acro Biosystems AMS.TN2-H5227 Etiquette 6X His HEK293 26 hTNFR2-his-avi (conjugué à la biotine) Acro Biosystems AMS.TN2-H82E3 Etiquette 6X His et Avi, Biotine HEK293 26 hTNFR2-his Sino Biologicals 10417-H08H 6x His HEK293 45 hTNFR2 Peprotech 310-12 N/A E. coli 20 mTNFR2-mFc R&D Biosystems 9707-R2-050 IgG2a de souris NS0 52 mTNFR2-his Sino Biologicals 50128-M08H 6x His HEK293 27 mTNFR2-hFc Sino Biologicals 50128-M02H IgG1 Fc humaine HEK293 52 hTNFa Peprotech 300-01-A N/A E. coli 17,4 mTNFa Peprotech 315-01A N/A E. coli 17,3 hFc (IgG1) AcroBiosystems FCC- H5214 N/A HEK293 26 hFc-Avi (IgG1) (conjugué à la biotine) AcroBiosystems IG1-H8213 Etiquette Avi, biotine HEK293 28,4 mFc (IgG2a) AcroBiosystems IGA-M5207 N/A HEK293 26,4 mFc (IgG2a) biotinylé AcroBiosytems IGA-M8210 N/A HEK293 28,2 hTNFR1-hFc AcroBiosytems TN1-H5251 IgG1 Fc humaine HEK293 47,9 mTNFR1-hFc-His R&D Systems 430-RI/CF IgG1 Fc humaine NS0 48,6
Dans certains cas, le TNFR2 a été biotinylé et capturé sur des billes de streptavidine et de neutravidine en alternance, alternativement le TNFR2 a été passivement absorbé par une surface. Les particules de phage non liées ont ensuite été enlevées par lavage et, en suite du lavage, les phages liés ont été élués. L'élution du phage lié a été accomplie par i exposition à la trypsine. Les particules de phage élués ont ensuite été utilisées pour infecter Escherichia coli (E. coli) et les bactéries infectées ont été incubées dans des conditions adaptées à la réplication du bactériophage. Après libération de particules de bactériophage par ces bactéries infectées, le cycle consistant à permettre aux particules de phage de se lier à l'antigène cible, à éluer les particules de phage liées, à propager les particules de phage éluées dans les bactéries, et à isoler les particules de phage libérées des bactéries infectées a été répété pour enrichir la population de bactériophages pour les particules de phage présentant des protéines qui se lient à l'antigène cible. Des conditions spécifiques ont été modifiées dans ces cycles, telles que l'augmentation du nombre d'étapes de lavage, la réduction de la quantité d'antigène disponible ou l'ajout d'un réactif de blocage, pour sélectionner des particules de phage exhibant des protéines qui se lient plus étroitement ou spécifiquement à l'antigène cible.
Après de multiples tours de sélection et d'amplification de la bibliothèque d'exposition sur phages (de l’anglais « phage display library », les protéines exprimées par les phages ont été exprimées et criblées par dosage immuno-enzymatique (ELISA, de l’anglais « enzyme-linked immunosorbent assay »). En bref, la variante de la protéine Stéfine A ont été surexprimées à partir de vecteurs phagémides, les cellules bactériennes ont été lysées, et les lysats ont été utilisés comme substrats dans les ELISA. Dans ces ELISA, du TNFR2 humain, murin et de cynomolgus a été immobilisé sur une plaque, des lysats ont été ajoutés, et la quantité de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 dans chaque plaque a été mesurée à l'aide d'un anticorps détecteur spécifique de l'étiquette Myc exprimée sur la variante de la protéine Stéfine A candidate. Les vecteurs phagémides codant pour la variante de la protéine Stéfine A avec la meilleure activité de liaison au TNFR2 humain ont été séquencés pour identifier les séquences d'ADN des clones candidats pour un développement ultérieur. Des polypeptides TNFR1 ont également été utilisés pour distinguer la spécificité. Les séquences d'acides aminés de la boucle 2 et de la boucle 4 de chacun de ces clones candidats sont présentées dans le tableau 1.
EXEMPLE 2 : Production d’une variante de la protéine Stéfine A dans des cellules de mammifères sous forme de protéine soluble et criblage
Clonage dans un vecteur d'intérêt
Pour apprécier la capacité de la variante de la protéine Stéfine A sélectionnée à se lier au TNFR2 lorsqu'elle est exprimée à la surface d'une cellule de mammifère, des groupes de cellules transfectées de manière transitoire ont été générés pour 30 clones « accélérés » (en anglais « fast-tracked ») sur la base des séquences les plus répétées lors de la sélection passive. Ces clones ont été utilisés pour la caractérisation initiale et l'optimisation de l’essai. Les séquences de variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 et les cibles TNFR2 ont été clonées à partir du phagémide de l'Exemple 1 dans le vecteur d'expression de mammifère pD609kanR (vecteur personnalisé ATUM) pour expression dans des cellules Expi293F™ (ThermoFisher). La concentration moyenne obtenue à partir de l'expression a été de 2,8 mg/mL, avec 19 clones sélectionnés en fonction de leur pureté et jaugés par ELISA quant à la dégradation.
Ces 19 clones ont été criblés sur des cellules Expi293F™ exprimant hTNFR2 par cytométrie en flux à 1 µM et 0,1 µM tout en étant comparés aux témoins négatifs SQT-GLY et 3T0-GLY qui contiennent des glycines uniquement dans la Boucles 2 et la Boucles 4 et ne sont donc pas des liants spécifiques. Le signal détecté sur les cellules transfectées a été soustrait du signal obtenu sur les cellules Expi293F™ non transfectées. Parmi ceux-ci, 16 clones démontrent une liaison aux cellules hTNFR2-Expi293F™ à 1 µM > 10 % qu’une liaison à la lignée cellulaire parentale ait été soustraite. Les clones 15, 22 et 23 n'ont pas démontré de telle liaison ( ).
Les variantes de la protéine Stéfine A purifiées de mammifère à hTNFR2 ont été criblées dans l’essai rapporteur HEK Blue™ TNFα SEAP (Invivogen) selon les instructions du fabricant pour déterminer si elles pouvaient déclencher la voie NFkB et la production de SEAP via une liaison au TNFR2 lorsqu'elles sont regroupées (de l’anglais « clustered ») par un anticorps anti-his enduit sur la plaque. Dans cette expérience, 5 des clones accélérés (01, 09, 12, 21 et 26) ont démontré une capacité à déclencher la libération de SEAP, le clone 12 montrant l'agonisme le plus constant.