INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
illustre schématiquement un détail de la nouvelle stratégie d’activation de la régulation de charge par le papillon. D’une manière analogue, si la mesure de pression répartiteur MPR n’est pas inférieure à la pression de suralimentation naturelle estimée PSNE plus une première valeur de biais papillon «Biais_1_pap», mais inférieure à la pression de suralimentation naturelle estimée PSNE plus une deuxième valeur de biais papillon «Biais_2_pap» (zone hachurée supérieure de ) et que la position turbocompresseur, dite consigne turbocompresseur CT, est inférieure à un seuil turbocompresseur « seuil_turbo » ST (turbo saturé ouvert), alors la régulation de la charge via le papillon est réactivée : ARP activation de la régulation du papillon.
Selon la nouvelle stratégie, la zone mixte de transition TAS définie par les seuils correspondant à la première valeur de biais papillon «Biais_1_pap» et à la première valeur de biais turbocompresseur «Biais_1_turb» pourra être choisie plus étroite que celle de l’art antérieur définie par le biais papillon «Biais_pap» et le biais turbocompresseur «Biais_tur», car le risque de saturation des actionneurs est désormais levé.
La présente invention propose également une utilisation de la cellule génétiquement modifiée et/ou du milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour fabriquer une composition ou un milieu pour une culture de lymphocytes T régulateurs.
La présente invention propose également une composition pour une délivrance de médicament comprenant la cellule génétiquement modifiée de la présente invention ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci.
La présente invention propose également l’utilisation de la cellule génétiquement modifiée de la présente invention ou le milieu de culture cellulaire conditionné de celle-ci pour une délivrance du médicament.
Fig. 1 Schéma de la stratégie de sélection pour la campagne de sélection du TNFR2 humain. Les deux bibliothèques ont subi des sélections par solution et passives. Une stringence a été introduite en diminuant la concentration en hTNFR2 au fur et à mesure que les cycles ont progressé et en augmentant le nombre d'étapes de lavage entre le cycle 1 (5x PBS/0,1 % Tween 20, 2x PBS) et le cycle 2 (15x PBS/0,1 % Tween 20, 2x PBS). (PBS, de l’anglais « Phosphate-buffered saline », soit « solution saline tamponnée ») Pour les sélections passives à l'aide de la bibliothèque de phages AFFIMER® de type 3 propriétaire d'Avacta (Brevet US n° 9.932.575), les approches par désélection et par concurrence ont été simultanément explorées. Pour l'approche de désélection, la concentration en Fc au cycle n+1 était la concentration en hTNFR2 au cycle n. Pour l'approche par concurrence, la concentration en Fc était de 10 fois l'excès molaire de la concentration en hTNFR2 spécifiée dans le cycle donné. Pour les sélections passives à l'aide de la bibliothèque de phages AFFIMER® de type 1 propriétaire d'Avacta (Brevet US n° 8 841 491), l'approche par désélection a été exclusivement réalisée et un cycle 4 a été introduit puisque le dépistage à un stade précoce des résultats du cycle 3 indiquait une diversité et un taux de succès (en anglais « hit rate ») élevés. Pour les sélections par solution, les deux bibliothèques ont subi l'approche par concurrence pour réduire l'enrichissement des polypeptides AFFIMER® présentés sur un phage de liaison au Fc. On a alterné des billes recouvertes de streptavidine et de neutravidine entre les cycles pour réduire l'enrichissement en peptides présentés sur les phages de liaison à la streptavidine et/ou à la neutravidine ;
Fig. 2 Variante de la protéine Stéfine A se liant aux cellules Expi293F™ surexprimant le TNFR2 humain ;
Fig. 3 Compilation des données des expériences de titrage. % d'inhibition à 3 µM et IC50 pour les meilleurs bloqueurs ;
Fig. 4 Résultats SEAP en double, classement de 20 clones ;
Fig. 5 Réactivité croisée de clones de la variante de la protéine Stéfine A se liant au hTNFR2 avec le TNFR2 de cynomolgus, en triple exemplaire ;
Fig. 6 et Fig. 7 et Caractérisation des eMSC (cellules stromales mésenchymateuses d’ingénierie, de l’anglais « engineered Mesenchymal Stromal Cells ») Expression de marqueurs spécifiques des cellules stromales mésenchymateuses par les eMSC CD29, CD44, CD73, CD90 et CD105 ( ), mais pas les marqueurs cellulaires CD45, CD14, CD19, HLA-DR, SSEA-3, TRA-1-60 et TRA-1-81 ( ) (les données représentent une expérience représentative) ;
Fig. 8 Analyse de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 exprimée à la surface cellulaire. L'expression de surface de lysats cellulaires des eMSC transduits avec la variante de la protéine Stéfine A a été testée par transfert Western (de l’anglais « Western blotting ») et comparés à des signaux de chaque clone de la variante de la protéine Stéfine A sur le même gel. Le transfert Western de β-actine (de l’anglais « β-actine Western blot ») sert de témoin de chargement pour les lysats de protéines de diverses eMSC ;
Fig. 9 [Fig. 9] Quantification de la variante de la protéine Stéfine A à la surface des cellules. Le nombre de variantes de la protéine Stéfine A sur la surface cellulaire a été quantifié par le kit de quantification de fluorescence QuantiBRITE PE pour une analyse par cytométrie en flux. Un anticorps pour la variante de la protéine Stéfine A conjuguée à la phycoérythrine (PE) ont été utilisés pour l'analyse par cytométrie en flux ;
Fig. 10 Une libération de SEAP (phosphatase alcaline embryonnaire sécrétée, de l’anglais « Secreted embryonic alkaline phosphatase ») de HEK-Blue TNFα lignée cellulaire rapporteur déclenchée par les 7 meilleures variantes de la protéine Stéfine A à la surface des eMSC. Les cellules HEK-Blue TNFα peuplent à 20.000 cellules/puits. Les populations d’eMSC à 1/2 dilution en série à partir de 40.960 cellules/puits. Les données représentent la moyenne d’un triple exemplaire (Moyenne ± SD).
Description détaillée Sauf indication contraire, tous les termes techniques et scientifiques utilisés ici ont les mêmes significations que celles généralement comprises par les personnes du métier auquel appartient la présente invention. En général, la nomenclature utilisée ici est bien connue dans l'art et est typique.
Le terme, « protéine » ou « polypeptides » sont des polymères d'acides aminés de toute longueur. Le polymère peut être linéaire ou ramifié, il peut comprendre des acides aminés modifiés, et il peut être interrompu par des acides non aminés. Les termes englobent également un polymère d'acides aminés qui a été modifié naturellement ou par intervention ; par exemple, par formation de liaisons disulfure, glycosylation, lipidation, acétylation, phosphorylation, ou toute autre manipulation ou modification, telle qu’une conjugaison avec un composant de marquage. Sont également inclus dans la définition, par exemple, des polypeptides contenant au moins un analogue d'un acide aminé (y compris, par exemple, des acides aminés non naturels), ainsi que d'autres modifications connues dans le métier.
Pour la plupart, les acides aminés et séquences d’acides aminés utilisés dans l’application sont les acides aminés d’occurrence naturelle trouvés dans les protéines, ou les produits anaboliques ou cataboliques d’occurrence naturelle de tels acides aminés qui contiennent des groupes amino et carboxyle, et les isomères de ceux-ci (par ex. les stéréoisomères D- ou L-).
Les résidus d'acides aminés comprennent en outre des analogues, des dérivés et des congénères de tout acide aminé spécifique auquel il est ici fait référence, tel par exemple, le polypeptide AFFIMER® sujet (en particulier s'il est généré par synthèse chimique) peut inclure un analogue d'acide aminé tel que, par exemple, la cyanoalanine, la canavanine, l’acide djenkolique, la norleucine, la 3-phosphosérine, l’homosérine, la dihydroxy-phénylalanine, le 5-hydroxytryptophane, la 1-méthylhistidine, la 3-méthylhistidine, l’acide diaminiopimélique, l’ornithine ou l’acide diaminobutyrique.
A la suite des différentes éditions génétiques qui peuvent être réalisées dans le mégaplasmide pSOL à l’aide de l’outil CRISPR-Cas9, ce dernier peut être utilisé pour réintroduire le gène hbd , et ne conserver ainsi que les modifications autres, situées sur le megaplasmide et/ou sur le chomosome. Cette complémentation au locus peut être réalisée par exemple avec le plasmide pGRNA-C hbd (SEQ ID NO : 33) qui permet de réintroduire un gène fonctionnel n’impactant pas les performances du micro-organisme par rapport à la souche sauvage.
Les performances de mutants DSM 792 hbd C issus du mutant ∆ hbd sont présentées dans le Tableau 6 ci-dessous.
Souches Solvants (g.L -1 ) Ethanol Acétone Propan-2-ol n-Butanol Total DSM 792 1,1 ± 0,2 8,6 ± 0,8 0,1 ± 0,0 12,3 ± 0,7 22,1 ± 0,4 Δ hbd 33,3 ± 1,3 2,9 ± 0,2 0,0 ± 0,0 0,0 ± 0,0 36,3 ± 1,5 hbd C 1,8 ± 0,4 6,7 ± 0,1 0,1 ± 0,0 12,3 ± 0,1 20,9 ± 0,6 Acides (g.L -1 ) Ac. acétique Ac. Butyrique Ac. Lactique Total DSM 792 1,6 ± 0,5 1,6 ± 0,5 0,0 ± 0,0 3,1 ± 1,0 Δ hbd 0,7 ± 0,0 0,0 ± 0,0 0,5 ± 0,0 1,3 ± 0,0 hbd C 0,9 ± 0,0 0,2 ± 0,1 0,1 ± 0,1 1,2 ± 0,0
Les résultats obtenus montrent que la complémentation du gène hbd est fonctionnelle et que le mutant dans lequel le gène a été réintroduit à son locus d’origine se comporte de la même manière que la souche sauvage.
Conclusions Au cours de ce travail, les inventeurs sont parvenus à démontrer la possibilité et l’intérêt d’utiliser un outil CRISPR-Cas9 pour réaliser des modifications génétiques précises au sein du mégaplasmide pSOL de la souche de C. acetobutylicum DSM 792. Cette stratégie peut être envisagée pour la modification de tout élément génétique non essentiel à la survie du micro-organisme dès lors qu’une modification chromosomique préalable permet de le rendre indispensable (/ essentiel) à la survie de la bactérie (dans au moins dans une condition de culture donnée). Une telle modification n’avait jusqu’à présent jamais été identifiée chez C. acetobutylicum , et le fait que le mégaplasmide pSOL soit indispensable dans la souche ∆ hbd est inattendu.
La possibilité de modifier le mégaplasmide pSOL avec CRISPR-Cas9 permet de bénéficier des points forts de l’outil qui sont sa précision, sa facilité d’utilisation, sa rapidité, et le fait qu’il permette de réaliser des modifications au nucléotide près. L’ensemble des éléments génétiques constituant le génome de C. acetobutylicum est désormais modifiable avec un outil de ce type. Une fois les différentes modifications désirées réalisées, le gène hbd peut facilement être réintroduit dans le génome à son locus d’origine, permettant d’obtenir un micro-organisme ne possédant que les modifications d’intérêt.
APTAMÈRE COMPOSITE ET SON UTILISATION POUR DÉTECTER UNE MOLÉCULE D’INTÉRÊT DOMAINE DE L’INVENTION La présente invention concerne la fabrication d’un aptamère composite électroactif à partir d’une séquence nucléotidique électroactive et d’un aptamère donneur. La présente invention concerne également l’utilisation de cet aptamère composite électroactif pour détecter au moins une molécule d’intérêt et/ou pour fabriquer un aptacapteur électroactif, lequel peut également être utilisé pour détecter au moins une molécule d’intérêt.
ART ANTERIEUR Les biocapteurs sont des outils analytiques présentant de multiples possibilités d'utilisation dans de nombreux domaines (médecine, agroalimentaire, environnement...), ils font l'objet d'efforts de recherche intenses depuis une trentaine d'année. Ces outils sont constitués de l'association d'un élément biologique sensible, également appelé biorécepteur, et d'un élément physique, appelé transducteur. Le biorécepteur permet la détection spécifique de l'analyte dans un milieu complexe. Cette étape de reconnaissance spécifique se traduit par un changement physico-chimique du milieu ou de l'interface capteur-solution. Le transducteur va permettre de transformer ce signal issu de la réaction entre l'analyte et le biorécepteur en un signal physique mesurable qui sera ensuite enregistré. Il s'agit généralement d'une électrode ou d'un système optique.
Du point de vue réactionnel, deux types de biocapteurs peuvent être distingués selon la nature de la reconnaissance. Les systèmes catalytiques utilisent généralement une enzyme comme biorécepteur, alors que les dispositifs à affinité sont basés sur l'utilisation d'anticorps. Cependant, une nouvelle génération de capteurs d'affinité est apparue ces dernières années dans laquelle les anticorps sont substitués par des oligonucléotides appelés aptamères. Il s'agit de fragments monocaténaires synthétiques d'ADN ou d'ARN qui ont la propriété de reconnaître spécifiquement la ou les molécules cibles pour lesquelles ils ont été produits. Les aptamères présentent plusieurs avantages par rapport aux anticorps, notamment une plus grande stabilité chimique ainsi qu'une plus grande flexibilité en matière de modification chimique, ce qui les rend particulièrement adaptés à la technologie biocapteurs. De plus des aptamères peuvent être synthétisés pour une très grande variété de cibles, incluant des petits composés organiques ou non organiques, des peptides, des protéines, et même des cellules entières. La sélection des aptamères est réalisé suivant des procédés itératifs in vitro comme le procédé SELEX ( Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment ), remplaçant ainsi avantageusement les méthodes de production in vivo des anticorps. La production d'aptamères est assez rapide, peu coûteuse, et présente une variabilité entre lots quasiment nulle. De plus, le complexe aptamère-cible peut généralement être dissocié, permettant une possible réutilisation de l’aptamère et de la cible.
Bien que de nombreux aptamères aient déjà été décrits dans la littérature, le défi principal de la conception d'aptacapteurs reste le même que pour les autres capteurs d'affinité : il s'agit de pouvoir mesurer de faibles changements physico-chimiques issus de l'interaction entre le biorécepteur et la cible. Pour cela, trois stratégies peuvent être développées :
la première est basée sur l'utilisation de méthodes de mesure directes comme la spectroscopie d'impédance électrochimique, la micro-gravimétrie (microbalances à quartz), ou la résonance de plasmons de surface. Cependant ces méthodes sophistiquées voient leur utilisation limitée à l'analyse de matrices simples et présentent souvent une sensibilité insuffisante.
la deuxième stratégie consiste à réaliser une détection dite « par compétition » mettant en jeu un dérivé de la molécule cible marqué par une sonde facilement détectable (généralement une enzyme ou un marqueur fluorescent). Cette stratégie montre une bonne sensibilité, mais les protocoles de mesure font appel à plusieurs cycles d'incubation/lavage et impliquent des réactifs coûteux.
une troisième stratégie est basée sur le marquage de l'aptamère par une sonde facilement mesurable. Lors de l'interaction de l'aptamère avec la molécule cible, le signal correspondant à cette sonde subit une modification proportionnelle à la concentration de la cible. Cette méthode, très utilisée pour le développement d'aptacapteurs, permet une détection directe de l'analyte. Cependant elle exige le marquage préalable des aptamères et n'est pas applicable à tous les analytes.
BREF APERÇU Pour surmonter l’ensemble de ces problématiques, les inventeurs ont mis au point une stratégie de mesure électrochimique unique basée sur l'intégration d'un fragment d’un aptamère donneur dans une séquence nucléotidique électroactive, permettant la réalisation d’aptacapteurs électrochimiques non seulement sensibles et fiables mais aussi simples d'utilisation. Cet outil étant par ailleurs applicable à de nombreuses cibles, il montre un fort potentiel d'exploitation.
Compte tenu de ce qui précède, un premier but de l’invention est d’utiliser une séquence nucléotidique électroactive pour la fabrication d’un aptamère composite électroactif capable de cibler spécifiquement au moins une molécule d’intérêt. Un deuxième but de l’invention est de proposer cet aptamère composite électroactif soit pour son utilisation pour la détection d’au moins une molécule d’intérêt, soit pour la fabrication d’un aptacapteur électroactif pouvant lui aussi être utilisé pour détecter au moins une molécule d’intérêt. Un troisième but de l’invention est de mettre à disposition des procédés de fabrication de l’aptamère composite électroactif et de l’aptacapteur électroactif. Un autre but de l’invention est de proposer une banque de séquences nucléotidiques électroactives lesquelles servent à la fabrication de l’aptamère composite électroactif.
On peut ainsi obtenir une composition de polythiol issue d’un polyène ayant x doubles liaisons C=C et comprenant :
- le polythiol correspondant audit polyène comprenant x fonctions –SH ; et
- le(s) thiol(s) correspondant(s) audit polyène comprenant (x-1) fonctions –SH.
Une telle composition peut éventuellement comprendre d’autres sous-produits ou impuretés (par exemple des monothiols). Elle peut être caractérisée par le ratio massique . Il s’agit du ratio massique : [polythiol correspondant audit polyène comprenant x fonctions -SH] / [thiol(s) correspondant(s) audit polyène comprenant (x-1) fonctions -SH].
En particulier, on peut obtenir une composition de trithiol à partir d’un triène, ladite composition comprenant : le trithiol correspondant ; et le(s) dithiol(s) correspondant(s).
Par exemple, dans le cas d’un polythiol formé à partir du cis,trans,trans -1,5,9-cyclododécatriene comme polyène de départ, on peut obtenir le dithioester suivant en tant que sous-produit à l’issue de l’étape a) :
Lors de l’étape b), il est également possible que la déprotection ne soit pas totale.
Ainsi, on peut former selon le procédé selon l’invention: des (x-1)thiols à partir des (x-1)thioesters formés à l’étape a) ; et/ou des (x-1)thiols à partir des polythioesters qui ne sont pas totalement déprotégés.
Dans le cas du CDT, on peut donc obtenir les dithiols suivants à l’issue de l’étape b) :
Composition A obtenue à partir d’un polyène cycloaliphatique
La présente invention concerne une composition A de polythiol obtenue à partir d’un polyène cycloaliphatique contenant x doubles liaisons C=C et tel que défini-ci-dessus, ladite composition comprenant : le polythiol correspondant audit polyène cycloaliphatique comprenant x fonctions -SH ; et le(s) thiol(s) correspondant(s) audit polyène cycloaliphatique comprenant (x-1) fonctions -SH (également appelés (x-1)thiols comme expliqué ci-dessus),
avec x tel que défini ci-dessus.
En particulier, ladite composition A comprend au moins 85% en poids, de préférence au moins 90% en poids, de préférence encore au moins 95% en poids dudit polythiol, par rapport au poids total de la composition A.
En particulier, ladite composition A comprend moins de 9% en poids, de préférence moins de 5% en poids, de préférence encore moins de 1% en poids dudit(desdits) (x-1)thiol(s), par rapport au poids total de ladite composition A.
De façon préférée, le ratio massique de la composition A est compris entre 10,1:1 et 20 000:1, de préférence entre 10,5:1 et 20 000:1, de préférence encore entre 15:1 et 20 000:1, par exemple entre 15:1 et 20 000:1.
De façon particulièrement préférée, le ratio massique de la composition A est compris entre 10,1:1 et 10 000:1, de préférence entre 10,5:1 et 10 000 :1, de préférence encore entre 15:1 et 1 000:1, par exemple entre 15 :1 et 500 :1. De façon encore plus préférée, le ratio massique de la composition A est compris entre 10,5:1 et 1000:1.
- les matrices sont désignées par des lettres majuscules en gras, par exemple ,
- les vecteurs sont désignés par des lettres minuscules en gras, par exemple ,
- une transposée matricielle, une transposée conjuguée matricielle, une matrice pseudo-inverse matricielle et la trace d'une matrice sont respectivement désignées par , , et respectivement,
- pour une matrice de dimension , la notation est utilisée, avec pour désigner la n ième colonne, et pour désigner la m ième ligne,
- la matrice identité et la matrice tout-zéros sont respectivement désignées par et ,
- la notation désigne une matrice diagonale avec des éléments
- E [.] représente l'opérateur d'espérance, ! est l'opérateur factoriel et j représente .
La illustre tout d’abord schématiquement un point d’accès 10 d’un réseau MIMO massif distribué et sans cellule selon la présente invention.
Selon la présente invention, un tel point d’accès 10 d’un réseau MIMO massif distribué et sans cellule comprend tout d’abord un module 12 de détermination configuré pour déterminer une information représentative d’une distorsion de signal causée par les propres imperfections matérielles dudit point d’accès 10.
De plus, le point d’accès 10 selon la présente invention comprend un module 14 de transmission configuré pour transmettre, via une liaison fronthaul comprenant une pluralité de points d’accès en série ordonnés selon un sens de parcours prédéterminé de ladite liaison fronthaul jusqu’à l’unité centrale, ladite information représentative de ladite distorsion de signal à un autre point d’accès, ou à l’unité centrale d’une station de base, le suivant directement au sein de ladite liaison fronthaul.
Par ailleurs, le point d’accès 10, selon la présente invention, comprend également un module 16 de réception configuré pour recevoir, via ladite liaison fronthaul, ladite information représentative d’une distorsion de signal causée par les imperfections matérielles d’un point d’accès le précédant directement au sein de ladite liaison fronthaul, et pour la prendre en compte pour déterminer les filtres de précodage locaux dudit point d’accès configurés pour annuler ladite distorsion de signal causée par les imperfections matérielles dudit point d’accès le précédant.
De plus, le point d’accès 10, comprend, de manière classique, un ensemble 18 de modules électroniques dédiés aux traitements classiques mis en œuvre classiquement par un point d’accès d’un réseau MIMO massif distribué et sans cellule, tels que par exemple un module d’estimation de canal configuré pour estimer le canal, un premier module de précodage configuré pour calculer les filtres de précodage locaux (i.e. classiquement sans se préoccuper de la distorsion de signal causée par les imperfections matérielles dudit point d’accès le précédant), un deuxième module de précodage configuré pour précoder chacun des vecteurs de données propres à être transmis à un utilisateur en appliquant lesdits filtres de précodage locaux, des éléments électroniques de l’interface radio configurée pour transmettre, par voie radio, les données précodées, via lesdits filtres de précodages, aux utilisateurs, etc., ces éléments étant par la suite décrits en relation avec la illustre un exemple d’architecture matérielle d’une partie du point d’accès représenté schématiquement sur la .
On décrit ci-après plus en détail un exemple de module de détermination 12 tel que représenté par la .
En effet, selon le mode de réalisation illustré par la , le module de détermination 12 comprend par exemple les éléments 20, 22, 24, 26 et 28.
L’élément 20 est notamment configuré pour obtenir une estimation locale du canal de propagation entre chacun des émetteurs (non représentés sur la ) du point d’accès 10 et chaque terminal utilisateur à sa portée au sein dudit réseau MIMO massif distribué et sans cellule.
Une telle estimation locale de canal est notamment mise en œuvre par un module d’estimation de canal de l’ensemble 18 et l’élément 20 récupère chaque estimation de canal entre chacun des émetteurs (non représentés sur la ) du point d’accès 10 et chaque terminal utilisateur à sa portée au sein dudit réseau MIMO massif distribué et sans cellule.
Pour chaque itération (n), (n+1), n+2),… une copie locale LCP (n), LCP (n+1), LCP (n+2),…. des ID, OD, CSV, USV correspondants est sauvegardée dans la zone sécurisée SMM.
Le second logiciel d’exécution SRS produit sa sortie OD’[i] et USV’[j].
La seconde unité de traitement SCPU informe la première unité de traitement PCPU que des données sont disponibles.
Ensuite, la première unité de traitement PCPU démarre l’exécution du module PSS.
Des contrôles de sécurité sont réalisés par ce module PSS.
Plus particulièrement, un premier contrôle comprend une comparaison entre OD’[i] et OD[i] et entre USV’[j] et USV[j].