INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
a ermB , gène de résistance à l’érythromycine ; catP , gène de résistance au thiamphénicol et au chloramphénicol ; tetA , gène de résistance à la tétracycline ; ColE1 et p15A ori, origines de réplication chez E. coli ; pIP404, pAMB1 et pCB102, origines de réplication chez C. acetobutylicum .
Construction de plasmides Les acides nucléiques ont été purifiés à l’aide des kits QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen), QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) et GenElute Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich). Les amplifications PCR ont été réalisées avec la Q5 High-Fidelity DNA Polymerase (NEB). Les oligonucléotides utilisés pour la construction des plasmides sont présentés dans le Tableau 2 ci-dessous.
Oligonucléotide Séquence (5’-3’) P01 (SEQ ID NO : 1) TCATACTTGGAGCTAATCACCCAA P02 (SEQ ID NO : 2) AAACTTGGGTGATTAGCTCCAAGT P03 (SEQ ID NO : 3) ATGCATGTCGACCAAAATCCTTCTCTGTAAATTCATG P04 (SEQ ID NO : 4) GAAAAAGGTATATTCAAAATAAGTTTACAAGAATCCCC P05 (SEQ ID NO : 5) ATTTTGAATATACCTTTTTCATTAAACAGACCTCC P06 (SEQ ID NO : 6) ATGCATGAATTCTGCAAATGTTTCTGATGATAAAATAG P07 (SEQ ID NO : 7) TAAGGTACACCACACATTAGGTGA P08 (SEQ ID NO : 8) AAACTCACCTAATGTGTGGTGTAC P09 (SEQ ID NO : 9) AAAAAAGTCGACGCGATCATAATCAGATTCTTTAC P10 (SEQ ID NO : 10) TTTAAAGGTTAACGGTCTAACAAATATCTTC P11 (SEQ ID NO : 11) TTAGACCGTTAACCTTTAAAGTACAAAGTGAAAC P12 (SEQ ID NO : 12) AAAAAAGTCGACATCTTCTTCCTTATCCTCAG P13 (SEQ ID NO : 13) TCATAGAATCCCCATTATCAAATG P14 (SEQ ID NO : 14) AAACCATTTGATAATGGGGATTCT P15 (SEQ ID NO : 15) TTGAAGCTTGAGCTCGGTACCCGGGCTTACCCTTGTATTCTAGTTTCTTGCC P16 (SEQ ID NO : 16) GGGGATTATCAAATCCCCATTTTTTATATATAATATAATTTTAGAGGAGGGA P17 (SEQ ID NO : 17) GGGGATTTGATAATCCCCATTCTTGTAAACTTATTTTGAATAATCG P18 (SEQ ID NO : 18) TCGAGATCTCCATGGACGCGTGACGACAGCTGTTTTACTTGGACATAATACT
Le plasmide pGRNA- hbd (SEQ ID NO : 28) a été construit en clonant le produit d’hybridation des oligonucléotides P01 et P02 dans le pGRNA ind (SEQ ID NO : 25) à l’aide de BsaI et de la T4 DNA ligase (NEB). Le fragment obtenu par PCR chevauchante des amplifications obtenues à partir de l’ADNg de DSM 792 à l’aide des couples d’oligonucléotides P03-P04 et P05-P06 a été cloné au niveau des sites BamHI et SalI dans le pGRNA- hbd pour obtenir pGRNA-∆ hbd (SEQ ID NO : 29). Le plasmide pGRNA- pdc (SEQ ID NO : 30) a été construit en clonant le produit d’hybridation des oligonucléotides P07 et P08 dans le pGRNA con (SEQ ID NO : 26) à l’aide de BsaI et de la T4 DNA ligase (NEB). Le fragment obtenu par PCR chevauchante des amplifications obtenues à partir de l’ADNg de DSM 792 à l’aide des couples d’oligonucléotides P09-P10 et P11-P12 a été cloné au niveau des sites BamHI et SalI dans le pGRNA- pdc pour obtenir le pGRNA-∆ pdc (SEQ ID NO : 31). Le plasmide pGRNA-C∆ hbd (SEQ ID NO : 32) a été construit en clonant le produit d’hybridation des oligonucléotides P13 et P14 dans le pGRNA ind à l’aide de BsaI et de la T4 DNA ligase (NEB). Le pGRNA-C hbd (SEQ ID NO : 33) a été obtenu par Assemblage HiFi (NEB) du pGRNA-C∆ hbd digéré par BamHI et SalI et des produits d’amplifications obtenus à partir de l’ADNg de DSM 792 à l’aide des couples d’oligonucléotides P15-P16 et P17-P18.
Le procédé selon l’invention est un procédé simple et efficace qui permet d’obtenir une bonne adhésion entre un substrat en polyamide et une couche d’élastomère thermoplastique. Il est basé sur le dépôt sur le substrat d’un primaire d’adhésion à base de silane par plasma à pression atmosphérique, lequel silane comprend au moins un motif (O) n Si, où n vaut 1, 2, ou 3 et au moins une amine.
Dans l’étape a) du procédé selon l’invention, un primaire d’adhésion est déposé sur une surface du substrat en polyamide par un plasma à pression atmosphérique comprenant un silane, ledit silane comprenant au moins un motif (O) n Si, où n vaut 1, 2, ou 3 et au moins une amine. Ce type de dépôt peut être appelé dépôt chimique en phase vapeur assisté par plasma (ou PE-CVD, acronyme anglais signifiant « Plasma-enhanced chemical vapor deposition »).
Par « silane », on entend un composé organique comprenant un ou plusieurs atomes de silicium. Le silane utilisé dans le procédé de l’invention est tel qu’au moins un atome de silicium forme un motif (O) n Si, où n vaut 1, 2, ou 3. Le(s) oxygène(s) du motif (O) n Si sont typiquement reliés à un groupe hydrocarboné, formant dans ce cas un motif (RO) n Si- où n vaut 1, 2, ou 3 et chaque R, identique ou différent les uns des autres, représente un groupe hydrocarboné. Le silane comprend en outre au moins une amine (par exemple une ou deux amines), ladite au moins une amine étant notamment choisie parmi un groupe -NH 2 et un groupe -NH-. De préférence le silane comprend un groupe -NH 2 , et éventuellement un ou plusieurs (par exemple, un, deux, trois ou quatre, de préférence un seul) groupes -NH-.
De préférence, ledit silane comprend un motif (O) n Si, où n vaut 1, 2, ou 3, un groupe NH 2 et éventuellement un ou plusieurs (par exemple, un, deux, trois ou quatre, de préférence un seul) groupes -NH-. Mieux encore, ledit silane comprend un motif (O) 3 Si et un groupe NH 2 .
Ledit au moins un motif (O) n Si, où n vaut 1, 2, ou 3, et ladite au moins une amine sont typiquement reliés entre eux par un groupe hydrocarboné.
Ledit silane possède généralement entre 3 et 70 atomes de carbone. Ledit silane a généralement une masse molaire comprise entre 100 et 600 g/mol, par exemple entre 150 et 500 g/mol.
De préférence, n vaut 2 ou 3, mieux encore n vaut 3.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit silane est de formule (I) :
- n vaut 1, 2, ou 3 (de préférence 2 ou 3, mieux encore n vaut 3),
- chaque R 1 , identique ou différent, représente un groupe hydrocarboné ayant 1 à 12 atomes de carbone, comprenant éventuellement un ou plusieurs (par exemple, un ou deux) hétéroatomes,
- chaque R 2 , identique ou différent, représente un groupe hydrocarboné ayant 1 à 12 atomes de carbone, et
- R 3 représente un groupe hydrocarboné ayant 1 à 12 atomes de carbone, comprenant un ou plusieurs (par exemple, un, deux ou trois) groupes choisis parmi -NH 2 et -NH-, et éventuellement un ou plusieurs hétéroatomes additionnels.
Lorsque n vaut 1, 2 ou 3, le composé de formule (I) peut être représenté respectivement comme suit :
Un groupe hydrocarboné peut être linéaire ou ramifié, cyclique ou acyclique, saturé ou insaturé, aliphatique ou aromatique.
Dans un mode de réalisation particulier, chaque R 1 , identique ou différent, représente un groupe aliphatique en C1-C12, un groupe alicyclique en C3-C12 ou un aryle en C6-C12. Dans un mode de réalisation plus particulier, chaque R 1 , identique ou différent, représente un alkyle en C1-C12, un alcényle en C2-C12, un cycloalkyle en C3-C12 ou un aryle en C6-C12.
Plus préférentiellement, le terpène ou le dérivé terpénique est choisi parmi le groupe constitué du : myrcène, farnésène, squalène, isosqualène, de l’humulène et du dihydro-farnésène.
De telles matières premières sont présentes naturellement dans les végétaux, dans les espèces marines ou peuvent être produites par fermentation, par des organismes génétiquement modifiés ou non et utilisant éventuellement des sources de carbone renouvelables. Elles sont également disponibles commercialement. Par exemple, la société AMYRIS commercialise le trans-béta-farnésène sous le nom BIOFENE® et la société DRT commercialise le myrcène.
Polythiols Selon l’invention, on appelle « polythiol » le polythiol correspondant au terpène ou au dérivé terpénique de départ tel que défini ci-dessus.
Par « correspondant au terpène ou au dérivé terpénique de départ », on entend que la structure du terpène ou du dérivé terpénique de départ et du polythiol obtenu sont identiques, à l’exception des doubles liaisons C=C qui ont été converties en fonctions -SH (soit -CH-C(SH)-) : pour x doubles liaisons C=C du terpène ou du dérivé terpénique de départ, on obtient x fonctions -SH. Sont également compris par le terme « polythiol », les polythiols isomères de position des doubles liaisons.
On appelle donc ci-après « x », le nombre de doubles liaisons C=C contenues dans ledit terpène ou dérivé terpénique, x étant un nombre entier, de préférence supérieur ou égal à 3. De préférence, x est compris entre 3 et 10, plus préférentiellement entre 3 et 7. On peut également appeler les polythiols selon l’invention des (x)thiols, avec x tel que défini ci-dessus.
Intermédiaires polythioesters Par « intermédiaire polythioester » ou « polythioester », on entend le polythioester correspondant au terpène ou au dérivé terpénique de départ. Par « correspondant au terpène ou au dérivé terpénique de départ », on entend que la structure du terpène ou du dérivé terpénique de départ et du polythioester obtenu sont identiques, à l’exception des doubles liaisons C=C qui ont été converties en fonctions -CH-C(O)-S-R 1 (R 1 dépend de l’acide thiocarboxylique utilisé, de préférence R 1 est un méthyle) : pour x doubles liaisons C=C, on obtient x fonctions thioester, avec x tel que défini ci-dessus. Sont également compris par le terme « polythioesters », les polythioesters isomères de position des doubles liaisons du terpène ou dérivé terpénique de départ.
PROCEDE SELON L’INVENTION Etape a) Lors de l’étape a), on fait réagir un terpène ou un dérivé terpénique tel que défini ci-dessus avec un acide thiocarboxylique en présence d’oxygène (O 2 ) et d’au moins un solvant organique, de façon à obtenir un milieu réactionnel comprenant un polythioester tel que défini ci-dessus et ledit au moins un solvant organique.
La réaction est la suivante : R-CH=CH-R + R 1 -C(O)-SH -> R-CH 2 -CH(S-C(O)-R 1 )-R
L’étape a) est réalisée en présence d’oxygène (O 2 ), agissant ici en tant qu’amorceur de la réaction. On peut ainsi réaliser l’étape a) en présence d’air, d’air appauvri (mélange d’oxygène et d’azote N 2 ) ou d’un mélange d’oxygène et d’un autre gaz inerte. On peut introduire l’oxygène dans le milieu réactionnel par n’importe quelle technique. On peut également ajouter l’oxygène pendant toute la durée de l’étape a) ou non.
En particulier, on fait buller l’oxygène dans le milieu réactionnel, de préférence sous forme d’air appauvri. Par exemple, on fait passer l’air appauvri dans un fritté ou un diffuseur qui plonge dans le milieu réactionnel. De façon alternative, on peut faire buller l’oxygène dans le milieu réactionnel et introduire l’azote dans la phase gazeuse du réacteur (c’est-à-dire le ciel du réacteur).
Le débit d’oxygène peut être compris entre 0,01 et 100 nL/h, de préférence entre 0,05 et 10 nL/h, de préférence encore entre 0,05 et 5 nL/h, en particulier entre 0,05 et 2 nL/h (normo litres/h).
L’étape a) est notamment réalisée en l’absence de tout autre amorceur de la réaction, et plus préférentiellement en l’absence d’AIBN (azobisisobutyronitrile) et/ou en l’absence de radiation UV.
L’étape a) est également effectuée en présence d’un solvant organique ou d’un mélange de solvants organiques. On choisit tout particulièrement un solvant polaire, ou un mélange de solvants polaires. Le(s) solvant(s) peut(peuvent) être polaire(s) protique(s) ou polaire(s) aprotique(s). Parmi les solvants pouvant être utilisés, on peut citer : les alcools, les éthers (de préférence les éthers cycliques et les éthers de glycol comme par exemple les dialkyl éthers de glycol), les solvants organochlorés, les acides carboxyliques ou leurs mélanges.
On préfère les alcools, en particulier de formule générale (IV) suivante :
R 4 -OH (IV)
dans laquelle R 4 représente un alkyle tel que défini ci-dessus. De préférence, l’alcool est choisi parmi le groupe constitué du : méthanol, éthanol, isopropanol, n-propanol, n-butanol, butan-2-ol, isobutanol, tert-butanol, de préférence encore l’éthanol.
1.2 . Synthèse chimique
Après la conception informatique de la séquence nucléotidique électroactive, la séquence obtenue a été produite (Microsynth AG, Suisse) avec une modification par un groupement amine sur une des extrémités de la séquence (5’ou 3’), afin d’en permettre l’immobilisation orientée.
1.3 . Immobilisation de la séquence nucléotidique électroactive sur une électrode de carbone
Avant immobilisation, l’électrode de travail a été prétraitée en voltammétrie linéaire en appliquant cinq cycles entre 1,0 et -1,5 V vs Ag/AgCl dans H 2 SO 4 0,5 M contenant 0,1 M de KCl, ce qui permet d’obtenir des lots d’électrodes présentant des caractéristiques de surface homogènes et régulières. La surface des électrodes de travail a ensuite été activée afin de créer des groupements de surface sur lesquels la séquence nucléotidique électroactive de l’invention peut être immobilisée. Cette activation a été réalisée en utilisant un sel de diazonium obtenu en mélangeant sous agitation pendant 5 minutes du nitrite de sodium (NaN0 2 ) à 2 mM et de l’acide 4-aminophénylacétique à 2 mM dans une solution de HCl à 0,5 M. Un volume de 100 µL du produit obtenu a alors été déposé sur la surface de l’électrode de travail, et la génération électrochimique de groupements phénylacétique de surface a été réalisée in situ par voltammétrie linéaire en balayant le potentiel de 0,4 à -1 V vs Ag/AgCl. Les électrodes ont ensuite été lavées à l’eau distillée et les groupes carboxyliques ainsi obtenus ont ensuite été activés en déposant sur l'électrode de travail 50 µL d’une solution de tampon MES 0,1 M pH 5,5 contenant 100 mM de 1-éthyl-3-[3-(diméthylamino)propyl]carbodiimide (EDC) et 25 mM de N-hydroxysuccinimide (NHS) pour un temps d’incubation de 120 min. Après rinçage à l’eau distillée, 20 µL de solution de la séquence nucléotidique électroactive de l’invention (aminé en 5’ ou en 3’) de concentration 1 µM ont été déposés sur l’électrode de travail et laissés à incuber pendant 4 h afin de permettre l’immobilisation. L’électrode a été ensuite rincée avec le tampon PBS, puis les sites activés résiduels ont été bloqués par incubation pendant 60 min avec 50 µL de solution d’éthanolamine 1 M pH 11. Enfin, l’électrode a été rincée avec le tampon phosphate 0,1M, pH 7,4 et a pu être utilisée.
1.4 . Voltammétrie cyclique
A l’aide d’une station électrochimique de type Autolab PGSTAT100 potentiostat/galvanostat (EcoChimie, Netherlands), ont été réalisés 2 cycles de voltammétrie cyclique entre -0,4 V et +0,6 V vs. Ag/AgCl à une vitesse de 50 mV/sec.
2 . RESULTATS
Après avoir conçu et modélisé la séquence SEQ ID NO : 1, celle-ci a montré qu’elle possède 5 tiges-boucles organisées autour d’un anneau central ( ), lequel, en voltammétrie cyclique, a montré posséder une électroactivité intrinsèque caractéristique. En effet, il a été observé un pic anodique singulier entre 0,1 V et 0,2 V.
A partir de cette séquence nucléotidique électroactive de séquence SEQ ID NO : 1, ont été conçues et modélisées les séquences SEQ ID NOs : 2 à 559 et 636, et l’électroactivité des séquences SEQ ID NOs : 32, 63, 149, 187 et 249 a été mesurée de la même manière. Pour chacune d’entre elles, la même structure secondaire a été modélisée (1 anneau central électroactif + 5 tiges-boucles) ( ) et il a également été mesuré le même pic anodique entre 0,1 V et 0,2 V (Tableau 1). Etonnamment, le signal électrochimique mesuré de la séquence miroir SEQ ID NO : 32 a été davantage significatif que celui de la séquence SEQ ID NO : 1 dont elle est le miroir.
Séquences nucléotidiques électroactives (SEQ ID NO) Signal initial (µA) 1 34 ± 6,3 32 68 ± 8,2 63 23 ± 3,5 149 15 ± 1,4 187 18 ± 1,6 249 24 ± 5,3
Tableau 1 . Mesures de l’activité électrochimique des séquences nucléotidiques électroactives
Avec les séquences SEQ ID NOs : 311, 373, 497 et 559 ayant la même structure secondaire que celle de la séquence SEQ ID NO : 1 ( ), ce pic anodique entre 0,1 V et 0,2 V s’observe également.
Ces données ont finalement permis d’affirmer que le remplacement des bases qui constituent les tiges-boucles et/ou la modification d’autre base n’affecte pas l’activité électrochimique intrinsèque d’oligonucléotide obtenu, à condition que la structure secondaire de ce dernier donne la même forme de cinq tige-boucles et un anneau central à simple brin sur laquelle toutes les tige-boucles s’associent. Des séquences consensus ont donc pu être générées.
EXEMPLE No. 2 : Conception d’un aptamère composite électroactif
1 . MATERIELS & METHODES
1.1 . Conception d’un aptamère composite électroactif
Comme représenté sur les figures 4(A) et 5, à la quatrième vitesse de rotation S4, l'unité de sortie de données de son 5 du troisième mode de réalisation délivre en sortie les données de son de vitesse de rotation DA dans lesquelles la deuxième fréquence F2 est définie comme la fréquence principale F du son. Ensuite, lorsque la vitesse de rotation S du moteur électrique 2 ou de la roue motrice 3 augmente en continu de la quatrième vitesse de rotation S4 à la cinquième vitesse de rotation S5, l'unité de sortie de données de son 5 délivre en sortie les données de son de vitesse de rotation DA de telle sorte que le taux de changement de la fréquence principale F du son dans les données de son de vitesse de rotation DA par rapport à l'augmentation de la vitesse de rotation S du moteur électrique 2 ou de la roue motrice 3 est changé de positif à négatif à un premier point de changement SP1 qui est une vitesse de rotation S supérieure à la quatrième vitesse de rotation S4 et inférieure à la cinquième vitesse de rotation S5. Le premier point de changement SP1 est le point de changement de côté croissant SiP décrit dans le deuxième mode de réalisation. Comme représenté sur les figures 4(A) et 5, en outre, à la cinquième vitesse de rotation S5, l'unité de sortie de données de son 5 du troisième mode de réalisation délivre en sortie les données de son de vitesse de rotation DA dans lesquelles la troisième fréquence F3 est définie comme la fréquence principale F du son. Ensuite, lorsque la vitesse de rotation S du moteur électrique 2 ou de la roue motrice 3 diminue à partir de la cinquième vitesse de rotation S5, l'unité de sortie de données de son 5 délivre en sortie les données de son de vitesse de rotation DA de telle sorte que le taux de changement de la fréquence principale F du son dans les données de son de vitesse de rotation DA par rapport à la diminution de la vitesse de rotation S du moteur électrique 2 ou de la roue motrice 3 est changé de positif à négatif à un second point de changement SP2 qui est inférieur au premier point de changement SP1. Le deuxième point de changement SP2 est une vitesse de rotation S supérieure à la quatrième vitesse de rotation S4, la même vitesse de rotation S que la quatrième vitesse de rotation S4, une vitesse de rotation S inférieure à la quatrième vitesse de rotation S4 et supérieure à la première vitesse de rotation S1, la même vitesse de rotation S que la première vitesse de rotation S1, ou une vitesse de rotation S inférieure à la première vitesse de rotation S1. La (A) montre un exemple où le deuxième point de changement SP2 est une vitesse de rotation S qui est inférieure à la quatrième vitesse de rotation S4 et supérieure à la première vitesse de rotation S1. La montre un exemple où le deuxième point de changement SP2 est une vitesse de rotation S inférieure à la première vitesse de rotation S1.
La (B) est une vue agrandie d'une partie du graphique de la (A) sur la (B), un symbole « o » près d'une flèche indique que la relation entre la vitesse de rotation S et la fréquence principale F peut varier le long de la flèche, tandis qu'un symbole « x » près d'une flèche indique que la relation entre la vitesse de rotation S et la fréquence principale F ne peut pas varier le long de la flèche. Par exemple, dans l'exemple de la (B), il est supposé que l'unité de sortie de données de son 5 délivre en sortie des données de son de vitesse de rotation DA dans lesquelles la troisième fréquence F3 est la fréquence principale F du son à la cinquième vitesse de rotation S5, puis que la vitesse de rotation S du moteur électrique 2 ou de la roue motrice 3 a diminué de la cinquième vitesse de rotation S5 à la quatrième vitesse de rotation S4. Ensuite, lorsque la vitesse de rotation S du moteur électrique 2 ou de la roue motrice 3 augmente à partir de la quatrième vitesse de rotation S4 vers le premier point de changement SP1, l'unité de sortie de données de son 5 délivre en sortie des données de son de vitesse de rotation DA de telle sorte que la relation entre la vitesse de rotation S et la fréquence principale F satisfait la relation représentée par des traits interrompus par deux points tandis que la fréquence principale F augmente.
Dans les exemples des figures 4 et 5, lorsque la vitesse de rotation S du moteur électrique 2 ou de la roue motrice 3 augmente, la fréquence principale F du son dans les données de son de vitesse de rotation DA diminue rapidement au premier point de changement SP1, et lorsque la vitesse de rotation S du moteur électrique 2 ou de la roue motrice 3 diminue, la fréquence principale F du son dans les données de son de vitesse de rotation DA augmente rapidement au second point de changement SP2. Dans les exemples des figures 4 et 5, le premier point de changement SP1 est identique à une vitesse de rotation à laquelle le taux de changement de la fréquence principale F du son dans les données de son de vitesse de rotation DA par rapport à une augmentation de la vitesse de rotation S du moteur électrique 2 ou de la roue motrice 3 change de négatif à positif, et le second point de changement SP2 est identique à une vitesse de rotation à laquelle le taux de changement de la fréquence principale F dans les données de son de vitesse de rotation DA par rapport à une diminution de la vitesse de rotation S du moteur électrique 2 ou de la roue motrice 3 change de négatif à positif. La divulgation n'est cependant pas limitée à cet arrangement.