Le « marqueur » ou le « marqueur détectable » se réfère à une fraction ou à un composé relié directement ou indirectement à une sonde détectée ou conduisant à un signal détectable. La jonction directe peut utiliser des liaisons covalentes ou des interactions non covalentes ( par exemple , les liaisons hydrogène, les interactions hydrophobes ou ioniques et la formation de chélates ou de complexes de coordination), tandis que la jonction indirecte peut utiliser une fraction de pontage ou un lieur ( par exemple , par l’intermédiaire d’un anticorps ou au moins un oligonucléotide supplémentaire, qui amplifie un signal détectable). Tout fragment détectable peut être utilisé, par exemple un radionucléide, un ligand tel qu’une biotine ou une avidine, une enzyme, un substrat d’enzyme, un groupe réactif, un chromophore tel qu’un colorant ou une particule ( par exemple , une perle de latex ou de métal) qui confère une couleur détectable, un composé luminescent ( par exemple , un composé bioluminescent, phosphorescent ou chimioluminescent) et un composé fluorescent ( c’est-à-dire un fluorophore). Les modes de réalisation des fluorophores comprennent ceux qui absorbent la lumière dans la plage d’environ 495 à 650 nm et émettent de la lumière dans la plage d’environ 520 à 670 nm, qui comprennent ceux appelés composés FAM™, TET™, CAL FLUOR™ (orange ou rouge), et QUASAR™. Les fluorophores peuvent être utilisés en combinaison avec une molécule d’extincteur qui absorbe la lumière à proximité du fluorophore pour réduire la fluorescence de fond. De tels extincteurs sont bien connus dans le domaine et comprennent, par exemple , les composés BLACK HOLE EXTINCTEUR™ (ou BHQ™) ou TAMRA™. Les modes de réalisation particuliers comprennent un « marqueur détectable homogène » qui est détectable dans un système homogène dans lequel la sonde marquée liée dans un mélange présente un changement détectable par rapport à la sonde marquée non liée, ce qui permet de détecter le marqueur sans éliminer physiquement la sonde hybridée de la sonde marquée non hybridée ( par exemple , brevets américains n° 5 283 174, 5 656 207 et 5 658 737). Les marqueurs détectables homogènes particuliers comprennent des composés chimioluminescents, comprenant des composés d’ester d’acridinium (« AE »), tels que des dérivés AE ou AE classiques qui sont bien connus (brevets américains n° 5 656 207, 5 658 737 et 5 639 604). Les procédés de synthèse de marqueurs, de fixation de marqueurs à l’acide nucléique et de détection de signaux à partir de marqueurs sont bien connus ( par exemple , Sambrook et al. , Molecular Cloning , A Laboratory Manual , 2 e édition) (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), chapitre 10 et brevet américain 5 658 737, 5 656 207, 5 547 842, 5 283 174 et 4 581 333, et brevets EP n o demande 0 747 706). Les procédés particuliers de liaison d’un composé AE à un acide nucléique sont connus ( par exemple , brevets américains n° 5 585 481 et 5 639 604, voir colonne 10, lignes 6 à 11, ligne 3 et exemple 8). Les positions de marquage AE particulières sont la région centrale d’une sonde et près d’une région de paires de bases A/T, à l’extrémité 3' ou 5' d’une sonde, au niveau d’un site de mésappariement avec une séquence connue ou près de celui-ci, laquelle séquence ne doit pas être détectée par la sonde par rapport à la séquence cible souhaitée. Les autres sondes marquées de manière détectable comprennent les sondes TaqMan™, les torches moléculaires et les balises moléculaires. Les sondes TaqMan™ comprennent un marqueur donneur et accepteur, la fluorescence étant détectée lors de la dégradation enzymatique de la sonde pendant l’amplification pour libérer le fluorophore de la présence de l’extincteur. Les torches et les balises moléculaires existent dans des configurations ouvertes et fermées, la configuration fermée éteignant le fluorophore et la position ouverte séparant le fluorophore de l’extincteur pour permettre la fluorescence. L’hybridation à la cible ouvre les sondes autrement fermées.