INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La montre un système de nettoyage de lidar 10. Le système de nettoyage de lidar 10 a une unité d’essuyage 12 et une unité d’étanchéité 16. L’unité d’essuyage 12 se déplace dans la direction prédéfinie 34 par rapport à l’unité d’étanchéité 16 ; cette unité d’étanchéité 16 s’applique au moins en partie contre l’unité d’essuyage 12. En outre, l’unité d’étanchéité 16 a un élément de déviation 18 pour dévier le jet d’eau 20 par rapport à l’unité d’étanchéité 16. En particulier, l’unité d’étanchéité 16 est placée par rapport à l’unité d’essuyage 12 pour laisser un intervalle 22 entre l’unité d’étanchéité 16 et l’unité d’essuyage 12. L’élément déflecteur 18 est positionné par rapport à l’intervalle 22 pour que l’élément déflecteur 18 pénètre au moins en partie dans l’intervalle 22 ou chevauche celui-ci. Ainsi, l’élément déflecteur 18 peut dévier un jet d’eau 20 dirigé sur l’intervalle 22.
L’élément déflecteur 18 a une première zone partielle 24 et une seconde zone partielle 26. La première zone partielle 24 de l’élément déflecteur 18 est prévue sur la surface extérieure 28 de l’unité d’étanchéité 16. L’élément déflecteur 18 a une seconde zone 26 sur un angle prédéfini 30 par rapport à la première zone partielle 24. L’angle prédéfini est compris entre environ 45° et 135°. La seconde zone partielle 26 de l’élément déflecteur 18 peut avoir une partie bombée 32 réalisée pour modifier l’orientation d’un jet d’eau 20 qui arrive sur l’intervalle 22. L’unité d’étanchéité 16 a une première lèvre 36 et une seconde lèvre 38. La première lèvre 36 s’applique contre un premier côté de l’unité d’essuyage 12. La seconde lèvre 38 s’applique contre le second côté de l’unité d’essuyage 12. Ainsi, la première lèvre 36 et la seconde lèvre 38 de l’unité d’étanchéité 16 réalise une liaison pratiquement par la forme ou la force entre l’unité d’étanchéité 16 et l’unité d’essuyage 12.
Réactivité croisée ELISA (« Enzyme Linked Immunosorbent Assay », soit : « technique d'immunoadsorption par enzyme liée ») de liaison
La spécificité des clones de variantes de la protéine Stéfine A pour TNFR2 a été appréciée par ELISA lorsque les clones se liant au TNFR1 ont été comparés à leur liaison au TNFR1. Aucun des clones n'a montré de liaison au TNFR1 en tant qu'antigène recombinant. L’hTNFR1 a également été exprimé dans des cellules Expi293F™, et aucune liaison n'a été observée à ce hTNFR1 exprimé de manière cellulaire, confirmant l'absence de réactivité croisée entre les variantes de la protéine Stéfine A se liant aux liants hTNFR2 avec l’hTNFR1.
En plus de leur liaison au TNFR2 humain, la liaison des clones au TNFR2 de souris a également été testée pour vérifier si l'un d'entre eux présentait une réaction croisée. Il y avait très peu de chances que cela se produise car l'homologie entre les deux protéines est d'environ 68 % pour le domaine extracellulaire, ce qui a été confirmé car aucun clone n'a démontré de liaison aux cellules Expi293F™ exprimant mTNFR2.
HEK293 – Caractérisation par essai HEK Blue
Les 43 clones principaux ont été transfectés temporairement dans des cellules HEK 293, avec 4 témoins, SQT-Gly (SEQ ID NO : 484), 3t0-Gly (SEQ ID NO: 485), vecteur vide et clone 06 qui s'est révélé être négatif. Environ 29h après la transfection, la viabilité des cellules a été déterminée en utilisant un compteur de cellules, et l'expression de la variante de la protéine Stéfine A a été déterminée par cytométrie en flux en utilisant un anticorps anti-HA. 48 heures après la transfection, les cellules HEK293 exprimant la variante de la protéine Stéfine A ont été cocultivées avec des cellules rapporteuses HEK Blue à 4 densités cellulaires différentes, 40000, 20000, 10000 et 5000 avec un nombre fixe de cellules HEK Blue de 50000 cellules/puits. En parallèle, le contrôle positif MR2-1 a également été incubé avec des cellules HEK Blue pendant 24h sur une plage de concentrations. Après 24h, la libération de SEAP dans le surnageant a été quantifiée en utilisant Quanti-Blue et une mesure d'absorbance 640 nm. La coloration des AFFIMER® avec un anticorps monoclonal anti-HA a montré des niveaux d'expression > 90 % dans chacune des deux expériences. Dans l’essai rapporteur de coculture, l'effet de la variante de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 exhibée sur HEK293 sur les cellules HEK-Blue était visible, ainsi que l'effet du clone MR2-1, permettant la sélection de 16 clones qui ont été classés de manière cohérente parmi les 20 meilleurs clones dans chacune des deux expériences. Ces résultats sont compilés en , avec les clones suivants identifiés : 001, 007, 009, 012, 013, 026, 027, 037, 044, 059, 069, 079, 100, 103, 112 et 115.
Liaison cellulaire au TNFR2 humain et de cynomolgus
Les 16 meilleurs agonistes ont été caractérisés en format soluble pour leur liaison au TNFR2 humain surexprimant Expi293F™ et au TNFR2 de cynomolgus surexprimant Expi293F. L'expérience a été répétée 3 fois et 2 lots différents de cellules transfectées de manière transitoire ont été utilisés. Tous les clones ont montré une liaison spécifique constante aux cellules hTNFR2-Expi293F™. Les clones 26 et 69 ont montré les meilleures CE50 sur à la fois les cellules exprimant TNFR2 humaines et de cynomolgus. 13 des 16 clones testés montrent une réactivité croisée avec le TNFR2 de cynomolgus. Les 3 clones sans réactivité croisée étaient les clones 001, 007 et 009. Sans nécessairement être les meilleurs liants, les clones DAW02-013, DAW02-044 et DAW02-112 sont les clones avec le moins de différence entre la liaison aux cellules surexprimant le TNFR2 humain et le TNFR2 de cynomolgus lorsque les 3 expériences sont compilées ( ).
EXEMPLE 4. Constructions d'homodimères de fusion en ligne
Les clones 001, 009 et 012 ont été choisis pour être formatés en tant qu'homodimères de fusion en ligne (ILF, de l’anglais « in-line fusion »), afin de déterminer si ce format serait un avantage pour déclencher un agonisme par rapport à la forme monomérique des clones, en tant que protéine soluble et lorsqu'il est affiché sur les cellules. Deux constructions ont été utilisées pour la génération des homodimères ILF avec un lieur flexible, un codon optimisé pour une expression de mammifère et un codon non optimisé. Les deux constructions ont été clonées dans un vecteur de sécrétion de mammifère (pD609-KanR) pour purifier la protéine recombinante et apprécier leurs niveaux d'expression, la qualité de la protéine, la cinétique de liaison à hTNFR2-hFc-his-avi par Biacore et l'activité agoniste dans un essai à rapporteur (en anglais, « reporter assay ») avec des cellules rapporteuses HEK. De plus, les deux constructions ont été clonées dans le vecteur pDisplay pour leur expression sur la surface cellulaire Expi293F™ et l'appréciation de leurs niveaux d'expression, de la liaison à hTNFR2-hFc-his-avi et de l'activité agoniste dans un essai à rapporteur de coculture avec des cellules rapporteuses HEK. L'optimisation des codons n'a pas amélioré les rendements ou la pureté des homodimères ILF solubles, ce qui a été confirmé par HPLC.
Lorsqu'ils ont été analysés par Biacore, les clones 001 et 009 ont montré une affinité accrue dans leur format ILF soluble par rapport au format monomère soluble. Le Clone 12 n'a montré aucune réponse. Aucune différence n'a été observée entre les constructions d'optimisation des codons. Dans les essais SEAP, seul le clone 12 a montré un profil amélioré en tant que format ILF soluble, mais lorsqu'il est exhibé sur des cellules, dans les essais SEAP ainsi que dans les essais de présentation par cytométrie en flux, aucune différence n'a pu être déterminée entre les formats ILF et monomère.
Résumé de la sélection de la variante de la protéine Stéfine A se liant au hTNFR2 et caractérisation.
Plus de 2500 phages monoclonaux ont été criblés par ELISA sur phages avec un taux de succès supérieur à 60% avec une bonne diversité (20-40%). Lors du criblage dans l’ELISA sous forme d'extrait brut de cellules, plus de 400 clones ont montré une liaison à l'antigène hTNFR2. A ce stade, il a été décidé d'introduire une autre étape dans la campagne de criblage de sélection pour réduire le nombre de clones à cloner dans le vecteur d'expression de mammifère. En parallèle, il a également été décidé d'accélérer 30 clones de la sélection passive directement à l'expression en tant que protéines AFFIMER® solubles pour faciliter le développement d’essais et la construction de la cascade de criblage pour le reste des clones. 20 de ces clones ont passé les critères de qualité de production de protéines de plus de 80% de pureté par SEC-HPLC (de l’anglais « size exclusion chromatography - high performance liquid chromatography », soit « chromatographie d'exclusion stérique - chromatographie liquide à haute performance ») et ont été utilisés pour mettre en place différents essais ainsi que pour être caractérisés. 5 clones sur 20 ont démontré une activité agoniste dans un essai agoniste préliminaire où la variante de la protéine Stéfine A soluble monomère a été regroupée avec un anticorps anti-his via leur étiquette histidine et incubée avec la lignée cellulaire rapporteuse HEK.
Parallèlement au développement d’essais avec des clones accélérés, la campagne de criblage de phages a été finalisée et un total de 364 variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 humain a été purifié à partir du phagémide et leur liaison à une lignée cellulaire surexprimant le TNFR2 a été testée. A la suite de cet essai, 90 variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 humain ont été reformatées dans le vecteur d'expression mammifère. 55 de ces clones ont passé les critères de qualité de production de protéines de plus de 80% de pureté par SEC-HPLC et ont été repris pour le reste des essais.
Le nombre total de clones (accélérés et non accélérés) a été restreint de 75 à 43 à la suite d'une série d'expériences s’intéressant à la liaison des protéines solubles variantes de la protéine Stéfine A aux cellules surexprimant hTNFR2, l’essai agoniste avec des cellules rapporteuses HEK et les données préliminaires de l’essai agoniste utilisant des cellules rapporteuses HEK en coculture avec des protéines variantes de la protéine Stéfine A exprimées à la surface des cellules Expi293F™. Ces 43 meilleurs clones ont été caractérisés en tant que protéines solubles pour leur liaison au TNFR2 humain par Biacore où 16 sur 43 ont vu leur KD calculé avec succès en utilisant un modèle de liaison à 1:1. Aucun des clones n'a démontré de liaison au TNFR1 humain par ELISA ou au TNFR2 de souris par liaison cellulaire. En tant que variante de la protéine Stéfine A exhibée à la surface de HEK293, la capacité de ces 43 clones à déclencher un agonisme au TNFR2 dans une lignée cellulaire rapporteuse HEK lorsqu'ils sont en coculture a été testée. Une grande majorité des clones testés ont démontré un effet dépendant de la dose sur les cellules rapporteuses HEK (80%). 16 variantes de la protéine Stéfine A ont été sélectionnées comme meilleures agonistes et soumises à une caractérisation supplémentaire pour apprécier la liaison du TNFR2 de cynomolgus et la liaison du TNFR1 humain sur les cellules. Les 16 variantes de la protéine Stéfine A sélectionnées se liant spécifiquement aux polypeptides hTNFR2 sont les clones 001, 007, 009, 012, 013, 026, 027, 037, 044, 059, 069, 079, 100, 103, 112 et 115.
L'utilisation d'homodimères de fusion en ligne en tant que protéines solubles vs. monomères a montré des avantages pour la liaison au TNFR2 recombinant par Biacore et un avantage possible dans l’essai d'agonisme de regroupement anti-his avec des cellules rapporteuses HEK. Cependant, aucun avantage n'a été démontré par rapport aux monomères lorsque les variantes de la protéine Stéfine A de fusion en ligne ont été exhibées sur des cellules pour déclencher la voie d'agonisme de la lignée cellulaire rapporteuse via TNFR2. La raison pour laquelle les homodimères de fusion en ligne n'ont pas obtenu de meilleurs résultats que les monomères dans ce dernier essai pourrait être que le format de fusion en ligne n'était pas bien exhibé sur la surface de la cellule et qu'une seule des deux variantes de la protéine Stéfine A était disponible pour la liaison ou que la limite de l’essai rapporteur avait été atteinte et qu'il n'était pas possible de discriminer entre les deux formats.
EXEMPLE 5. Variantes de la protéine Stéfine A se liant spécifiquement au TNFR2 de souris
La connexion électrique entre le deuxième élément de contact 14 et le bouton de commande 10 est interrompue, et la connexion électrique entre le troisième élément de contact 16 et le bouton de commande 10 est interrompue.
Le module électrique de commande 8 ne détecte pas le contact du deuxième élément de contact 14 sur la surface tactile 6 ni le contact du troisième élément de contact 16 sur la surface tactile 6, et est configuré pour déterminer qu’en conséquence le bouton de commande 10 est en position basse.
Le module électrique de commande 8 associe à la position angulaire du bouton de commande 10 une commande correspondant à la position basse du bouton de commande 10.
Comme illustré sur la , le bouton de commande 10 est élevé en position haute (comme illustré par la flèche U). La connexion électrique entre le deuxième élément de contact 14 et le bouton de commande 10 est effective, et la connexion électrique entre le troisième élément de contact 16 et le bouton de commande 10 est effective.
Le deuxième élément de contact 14 est connecté électriquement au bouton de commande 10, par exemple via la première liaison électrique 44, et le troisième élément de contact 16 est connecté électriquement au bouton de commande 10, par exemple via la troisième liaison électrique 52
Le module électrique de commande 8 détecte le contact du deuxième élément de contact 14 sur la surface tactile 6 et détecte le contact du troisième élément de contact 16 sur la surface tactile 6, et est configuré pour déterminer qu’en conséquence le bouton de commande 10 est en position haute
Le module électrique de commande 8 associe à la position angulaire du bouton de commande 10 une commande correspondant à la position haute du bouton de commande 10.
Il est souhaitable que le module électrique de commande 8 soit en mesure de différencier les signaux de contact générés par le premier élément de contact 12, le deuxième élément de contact 14 et le troisième élément de contact 16, en particulier pour discriminer le contact correspondant au premier élément de contact 12, dont la position sur la surface tactile 6 permet de déterminer la position angulaire du bouton de commande 10, des contacts correspondants au deuxième élément de contact 14 et au troisième élément de contact 16.
Chacun du premier élément de contact 12, du deuxième élément de contact 14 et du troisième élément de contact 16 provoque la génération d’un signal de mesure par le dispositif tactile 4 lorsqu’il est en contact avec la surface tactile 6 et connecté électriquement au bouton de commande 10 touché par un utilisateur, le signal de mesure présentant un ratio signal/bruit.
Dans un exemple de réalisation, le premier élément de contact 12, le deuxième élément de contact 14 et le troisième élément de contact 16 sont configurés pour provoquer la génération de signaux de mesure possédant des ratios signal/ bruit différents.
Ceci peut être obtenu en prévoyant des éléments de contact 12 de formes différentes, en particulier avec des aires de contact différentes.
De manière correspondant, le module électrique de commande 8 est configuré pour discriminer les signaux de mesure du dispositif tactile 4 généré par les éléments de contact en fonction des ratios signal/bruit des signaux de mesure.
Dans un exemple de réalisation, le premier élément de contact 12, le deuxième élément de contact 14 et le troisième élément de contact 16 sont configurés de telle manière que le ratio signal/bruit du signal de mesure généré par le contact du premier élément de contact 12 sur la surface tactile 6 est strictement supérieure à celui des signaux de mesure générés par chacun du deuxième élément de contact 14 et du troisième élément de contact 16.
Un ratio signal/bruit plus élevé pour le premier élément de contact 12 permet de distinguer le premier élément de contact 12 du deuxième élément de contact 14 et du troisième élément de contact 16 tout en disposant d’un bon ratio signal/bruit pour le signal de mesure correspondant au premier élément de contact 12, ce qui permet de détecter plus précisément la position du premier élément de contact 12, et donc la position angulaire du bouton de commande 10.
Un ratio signal/bruit plus faible pour le deuxième élément de contact 14 et le troisième élément de contact 16 est suffisant pour détecter ou non le deuxième élément de contact 14 et le troisième élément de contact 16, sachant qu’il n’est pas nécessaire de déterminer avec précision la position du deuxième élément de contact 14 et du troisième élément de contact 16 sur la surface tactile 6.
La discrimination du deuxième élément de contact 14 et du troisième élément de contact 16 est moins critique dans la mesure où la position axiale du bouton de commande 10 est déterminée en fonction du nombre de contact détecté pour le deuxième élément de contact 14 et le troisième élément de contact 16 : un contact correspond à la position intermédiaire, aucun contact correspond à la position basse et deux contacts correspond à la position haute.
Dans certains exemples la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et 20 % ou plus du mélange (p/p) comprend des hydrocarbures C 20 -C 24 (par ex. 21 % ou plus, 22 % ou plus, 23 % ou plus, 24 % ou plus, 25 % ou plus, 26 % ou plus, 27 % ou plus, ou 28 % ou plus). Dans certains exemples la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et 30 % ou moins du mélange (p/p) comprend des hydrocarbures C 20 -C 24 (par ex. 29 % ou moins, 28 % ou moins, 27 % ou moins, 26 % ou moins, 25 % ou moins, 24 % ou moins, 23 % ou moins, ou 22 % ou moins). La quantité du mélange comprenant des hydrocarbures C 20 -C 24 peut être comprise entre l'une des valeurs minimales décrites ci-dessus et l'une des valeurs maximales décrites ci-dessus. Par exemple, la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et de 20 % à 30 % du mélange (p/p) comprend des hydrocarbures C 20 -C 24 (par ex. de 20 % à 25 %, de 25 % à 30 %, de 20 % à 22 %, de 22 % à 24 %, de 24 % à 26 %, de 26 % à 28 %, de 28 % à 30 %, de 20 % à 28 %, de 20 % à 26 %, de 20 % à 24 %, de 22 % à 30 %, de 24 % à 30 %, de 26 % à 30 %, de 21 % à 29 % ou de 22 % à 28 %).
Dans certains exemples la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et 20 % ou plus du mélange (p/p) comprend des hydrocarbures C 24 -C 28 (par ex. 21 % ou plus, 22 % ou plus, 23 % ou plus, 24 % ou plus, 25 % ou plus, 26 % ou plus, 27 % ou plus, ou 28 % ou plus). Dans certains exemples la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et 30 % ou moins du mélange (p/p) comprend des hydrocarbures C 24 -C 28 (par ex. 29 % ou moins, 28 % ou moins, 27 % ou moins, 26 % ou moins, 25 % ou moins, 24 % ou moins, 23 % ou moins, ou 22 % ou moins). La quantité du mélange comprenant des hydrocarbures C 24 -C 28 peut être comprise entre l'une des valeurs minimales décrites ci-dessus et l'une des valeurs maximales décrites ci-dessus. Par exemple, la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et de 20 % à 30 % du mélange (p/p) comprend des hydrocarbures C 24 -C 28 (par ex. de 20 % à 25 %, de 25 % à 30 %, de 20 % à 22 %, de 22 % à 24 %, de 24 % à 26 %, de 26 % à 28 %, de 28 % à 30 %, de 20 % à 28 %, de 20 % à 26 %, de 20 % à 24 %, de 22 % à 30 %, de 24 % à 30 %, de 26 % à 30 %, de 21 % à 29 % ou de 22 % à 28 %).
Dans certains exemples la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et 10 % ou plus du mélange (p/p) comprend des hydrocarbures C 28 -C 32 (par ex. 11 % ou plus, 12 % ou plus, 13 % ou plus, 14 % ou plus, 15 % ou plus, 16 % ou plus, 17 % ou plus, ou 18 % ou plus). Dans certains exemples la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et 20 % ou moins du mélange (p/p) comprend des hydrocarbures C 28 -C 32 (par ex. 19 % ou moins, 18 % ou moins, 17 % ou moins, 16 % ou moins, 15 % ou moins, 14 % ou moins, 13 % ou moins, ou 12 % ou moins). La quantité du mélange comprenant des hydrocarbures C 28 -C 32 peut être comprise entre l'une des valeurs minimales décrites ci-dessus et l'une des valeurs maximales décrites ci-dessus. Par exemple, la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et de 10 % à 20 % du mélange (p/p) comprend des hydrocarbures C 28 -C 32 (par ex. de 10 % à 15 %, de 15 % à 20 %, de 10 % à 12 %, de 12 % à 14 %, de 14 % à 16 %, de 16 % à 18 %, de 18 % à 20 %, de 10 % à 18 %, de 10 % à 16 %, de 10 % à 14 %, de 12 % à 20 %, de 14 % à 20 %, de 16 % à 20 %, de 11 % à 19 % ou de 12 % à 18 %).
Dans certains exemples la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et le mélange comprend : 20 à 30 % (par ex. 25-30 %) d'hydrocarbures C 9 -C 20 , 20 à 30 % (par ex. 20 à 25 %) d'hydrocarbures C 20 -C 24 , 20 à 30 % (par ex. 20 à 25 %) d'hydrocarbures C 24 -C 28 , et 10 à 20 % (par ex. 10 à 15 %) d'hydrocarbures C 28 -C 32 . Dans certains exemples la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et le mélange comprend : 25-30 % d'hydrocarbures C 9 -C 20 , 20 à 25 % d'hydrocarbures C 20 -C 24 , 20 à 25 % d'hydrocarbures C 24 -C 28 et 10 à 15 % d'hydrocarbures C 28 -C 32 .
Dans certains exemples la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et le mélange est essentiellement exempt d'hydrocarbures C 1 -C 4 . Dans certains exemples la cire comprend un mélange de différents hydrocarbures, dont chacun peut éventuellement être substitué, et le mélange est essentiellement exempt d'hydrocarbures C 1 -C 8 .