INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Dans divers modes de réalisation et aspects, une composition de BoNT/A décrite ici a une puissance plus élevée qu’une composition de BoNT/A disponible dans le commerce qui est connue dans la technique. Dans certains modes de réalisation, une composition de BoNT/A décrite ici a une puissance qui est d’au moins 10 %, au moins 20 %, au moins 30 %, au moins 40 %, au moins 50 %, au moins 60 %, au moins 70 %, au moins 80 %, au moins 90 %, au moins 100 %, au moins 1,5 fois, ou au moins 2 fois supérieure à la puissance d’une composition de BoNT/A disponible dans le commerce qui est connue dans la technique. Dans certains modes de réalisation, une composition de BoNT/A décrite ici a une puissance qui est d’au moins 0,1x10 7 unités/mg, au moins 0,2x10 7 unités/mg, au moins 0,3x10 7 unités/mg, au moins 0,4x10 7 unités/mg, au moins 0,5x10 7 unités/mg, au moins 0,6x10 7 unités/mg, au moins 0,7x10 7 unités/mg, au moins 0,8x10 7 unités/mg, au moins 0,9x10 7 unités/mg, au moins 1x10 7 unités/mg, au moins 1,5x10 7 unités/mg, au moins 2x10 7 unités/mg, au moins 3x10 7 unités/mg, ou au moins 4x10 7 unités/mg supérieure à la puissance d’une composition de BoNT/A disponible dans le commerce qui est connue dans la technique.
La puissance des compositions de BoNT/A décrites ici peut être déterminée avec des procédés connus dans la technique, y compris mais sans s’y limiter, par exemple un test de chromatographie liquide haute performance d’activité de chaîne légère (LCA-HPLC), test de dose létale de 50 % (MLD50) de souris, test d’abduction digitale de souris (DAS), dosage de SNAP-25, test de la puissance à base de cellules (CBPA), etc .
Le test LCA-HPLC mesure la spécificité de clivage SNAP-25. Des échantillons sont mis en réaction avec un substrat fluorescent de BoNT/A disponible dans le commerce dérivé de la séquence SNAP- 25. Les produits de clivage marqués par fluorescence sont séparés et détectés par l’intermédiaire d’un procédé HPLC à phase inverse (RP)-HPLC. Une description supplémentaire de test de LCA-HPLC peut être trouvée dans les publications Hunt et al . (2010) Toxins 2(8):2198-2212 et Rupp et al. (2020) Toxins 12(6):393.
Dans un mode de réalisation, la puissance est déterminée en utilisant un test de dose létale de 50 % (MLD50) de souris. Le dosage de la dose létale de 50 % (MLD50) de souris a été décrit dans, par exemple , Schantz et Kautter (1978) Journal of the AOAC 61(1):96-99, Hunt et Kenneth (2009) Neuropharmacologie clinique 32(1):28-31, brevet U.S. No. 7 160 699, et brevet U.S. No. 9 725 705. Un test de la dose létale de 50 % (MLD50) de souris est un procédé de mesure de la puissance d’une toxine botulique par injection intrapéritonéale de la toxine botulique chez des souris femelles (âgées d’environ quatre semaines) de 17 à 22 grammes chacune au début du test. Chaque souris est maintenue dans une position allongée avec sa tête inclinée vers le bas et reçoit par injection par voie intrapéritonéale dans l’abdomen droit inférieur à un angle d’environ 30 degrés à l’aide d’une aiguille de 25 à 27 jauge 3/8’’ à 5/8" avec une de plusieurs dilutions en série de la toxine botulique en solution saline. Les taux de décès sur les 72 heures qui suivent pour chaque dilution sont enregistrés. Les dilutions sont préparées de sorte que la dilution la plus concentrée produit un taux de décès d’au moins 80 % des souris injectées, et la dilution de moindre concentration produit un taux de décès n’excédant pas 20 % des souris injectées. Il doit y avoir un minimum de quatre dilutions qui tombent dans la plage décroissante monotone des taux de décès. La plage décroissante monotone commence avec un taux de décès de pas moins de 80 %. Au sein des quatre taux décroissants monotones ou plus, les deux plus grands et les deux plus petits taux doivent être décroissants ( à savoir , non équivalents). La dilution à laquelle 50 % des souris meurent dans la période d’observation post-injection de trois jours est définie comme une dilution qui comprend une unité (1 U) de la toxine botulique.
Le test digital d’abduction de souris (DAS) est une évaluation in vivo de la paralyse musculaire induite par toxine à la suite de lʼinjection de toxine BoNT/A dans le muscle du membre arrière dʼun rongeur. Le test DAS peut être utilisé pour évaluer la puissance de compositions de BoNT/A sur la paralyse musculaire, ainsi que la durée d’action. Des protocoles détaillés de test DAS ont été décrits dans Aoki et al . (1999) Eur. J. Neurol. 6:s3-s10, Aoki (2001) Toxicon 39: 1815-1820, Broide et al . (2013) Toxicon 71:18-24, et Rupp et al . (2020) Toxins 12(6):393. Par exemple, le test DAS peut être effectué par injection d’une composition de BoNT/A décrite ici dans le complexe gastrocnémien/soleus de souris, suivi d’une évaluation du Score d’abduction digital en utilisant la méthode de Aoki (2001) Toxicon 39: 1815-1820. Dans le test DAS, les souris sont suspendues brièvement par la queue pour entraîner une réponse de surprise caractéristique dans laquelle la souris étend ses membres postérieurs et abaisses ses doigts postérieurs. Après l’injection de composition de BoNT/A, les degrés d’abduction digitale variables sont notés sur une échelle à cinq points (0=normal à 4=réduction maximale dans l’abduction digitale et extension de jambe). Le rapport de sécurité, le rapport entre la quantité d’une toxine requise pour une chute de 10 % d’un poids corporel (mesuré à effet de pic dans les sept premiers jours après test dans une souris) et la quantité de toxine requise pour un score DAS de 2, peut également être déterminé pour évaluer l’indice thérapeutique de la composition de BoNT/A décrite ici, comme décrit dans le brevet U.S. No. 9 920 310. Les scores élevés de rapport de sécurité sont donc souhaités, et indiquent une toxine qui est apte à paralyser efficacement un muscle cible avec peu d’effets hors cible non souhaités.
Le test SNAP-25 est une méthode basée sur ELISA pour mesurer l’activité protéolytique SNAP-25 de la toxine botulique. Le test utilise une protéine de SNAP-25 tronquée (le peptide de résidu d’acide aminé 206) lié à des plaques de microtitration de 96 puits de polystyrène et un anticorps monoclonal qui reconnaît le produit clivé (un peptide de résidu d’acide aminé 197) qui est fabriqué par hydrolyse enzymatique entre les acides aminés 197 et 198 du SNAP-25 par réduction de la toxine botulique de type A. L’anticorps monoclonal lié au produit clivé est ensuite détecté avec un anticorps secondaire (IgG de chèvre anti-souris conjugué à la peroxydase de raifort HRP), qui produit un changement de couleur en présence d’un substrat chromogène (TMB). Des procédés de SNAP-25 donnés à titre d’exemple sont décrits dans Ekong et al. (1997) Microbiology 143:3337-3347 et brevet U.S. 7 160 699.
Un test de puissance à base de cellules (CBPA) a été décrit dans, par exemple , Fernández-Salas et al. (2012) PLOS ONE 7(11):e499516, Rupp et al. (2020) Toxins 12(6):393, WO 2010/105234 et WO 2009/114748. Dans un mode de réalisation, le CBPA à SNAP-25 197 SiMa H1 électrochimiluminescent (ECL) est utilisé pour déterminer la puissance des compositions de BoNT/A décrites ici. Le CBPA à SNAP-25 197 SiMa H1 électrochimiluminescent (ECL) est un test in vitro à base de cellules qui mesure les étapes clés de l’intoxication à la BoNT/A : liaison cellulaire médiée par récepteur et internalisation, translocation du domaine de protéase (chaîne légère) dans le cytosol, et clivage protéolytique de SNAP-25, permettant une comparaison directe de l’activité biologique du produit de l’activité de BoNT/A in vitro (Fernàndez-Salen et al. (2012) PLOS ONE 7(11):e49516 ; Rupp et al. (2020) Toxins 12(6):393). En bref, les cellules neuroblastome SiMa H1 humaine sont plaquées sur des plaques de 96 puits de type polyD-lysine (PDL) dans des milieux sans sérum (SFM) avec 25 µg/mL de GT 1b pendant trois jours et traités avec des échantillons de toxine pendant 24 heures. Après traitement, les toxines sont éliminées, les cellules sont lysées et les lysats sont transférés vers des plaques de liaison haute MSD revêtues d’un anticorps monoclonal anti-SNAP-25 197 (mAb) 2E2A6. Des plaques sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps polyclonal de type SULFO-TAG NHS-Ester marqué anti-SNAP-25 (pAb) pour la détection. Le SNAP-25 clivé par toxine BoNT/A capturé est ensuite quantifié sur un lecteur de plaque MSD.
6. Exemples Certains modes de réalisation fournis ici sont illustrés par les exemples non limitatifs suivants, qui décrivent différents procédés d’obtention de BoNT/A et démontrent que l’utilisation d’une température inférieure à la température de fermentation standard et l’augmentation de la concentration en CO 2 lors de la fermentation, peuvent toutes deux réduire le rapport de l’abondance d’une espèce de BoNT/A de 150 kDa ayant une chaîne légère à extrémité C-terminale tronquée à l’abondance des espèces de BoNT/A de 150 kDa ayant la chaîne légère pleine longueur
6.1 Exemple 1 : Procédés et matériaux pour les exemples 2 à 3
1. Étapes en amont
A. Fermentation d’une souche Hall de C. botulinum de type A à débit continu (recouvrement) de rapport de pourcentage variable de CO 2 :N 2 dans l’espace de tête.
Des fermentations d’une souche Hall de Clostridium botulinum de type A ont été réalisées en milieu exempt de produit d’origine animale (APF) avec le débit continu (recouvrement) de différents rapports en pourcentage de CO 2 :N 2 (comme décrit dans le tableau 2) pour examiner l’impact sur les attributs du complexe de neurotoxine botulique de type A (BoNT/A) produit dans ces conditions. L’étage amont comportait l’utilisation d’un milieu de culture de semences APF de 40 mL dans une bouteille en verre de 150 mL (avec un barreau magnétique d’agitation) (de 3,25 % p/v de peptone de soja de type II, de 1,2 % p/v d’extrait de levure, de 1,5 % p/v de glucose, pH ajusté à 7,3 à l’aide d’hydroxyde de sodium). Le milieu de culture de semences a été réduit pour éliminer l’oxygène (dans une chambre anaérobie de Bon Whitley Scientific A55) pendant un minimum de 48 heures avant utilisation. Le milieu de culture de semences a été inoculé avec 50 µL d’une banque de cellules actives de souche Hall de C. botulinum de sérotype A décongelée. La culture de semences a été incubée à 35 ± 1 °C avec une agitation de 150 tr/min dans la chambre anaérobie.
L’unité de contrôle 220 est, par ailleurs, arrangée pour commander en ouverture et en fermeture chaque vanne d’arrêt 216a-b en fonction des informations délivrées par les moyens de détection 218s et selon les besoins comme cela est expliqué ci-dessous.
Avec un tel arrangement, même si deux incidents surviennent sur le module 200, la mise en sécurité dudit module 200 et l’évacuation du dihydrogène vers l’extérieur sont assurées comme cela est expliqué ci-dessous.
Les moyens de détection 218 peuvent prendre différentes formes et peuvent être constitués d’un ou plusieurs capteurs de pression disposés dans le caisson intérieur 204. Ainsi, si un capteur de pression détecte une variation de pression dans le caisson intérieur 204 qui est sous vide ou sous une pression connue d’un gaz inerte, cela signifie qu’il y a une fuite. Les moyens de détection 218 peuvent être complétés par des capteurs de détection adaptés à la détection du dihydrogène et du dioxygène et l’analyse des données transmises par ces capteurs de détection permet de savoir si c’est la canalisation 206 qui fuit ou le caisson intérieur 204.
Selon un premier mode de fonctionnement, si la canalisation 206 fuit à l’intérieur du caisson intérieur 204, le dihydrogène se répand dans le caisson intérieur 204 qui monte en pression jusqu’à ce que la pression de décharge (par exemple 3 bars) du deuxième limiteur de pression 210b soit atteinte et le deuxième limiteur de pression 210b s’ouvre sur la canalisation d’échappement 212 pour évacuer le dihydrogène vers l’extérieur. Du fait des variations de pression dans le caisson intérieur 204, les moyens de détection 218 détectent alors la présence de la fuite et informent l’unité de contrôle 220 qui commande la fermeture des deux vannes d’arrêt 216a-b. La fuite n’est plus alimentée et le caisson intérieur 204 reste rempli de dihydrogène à la pression de décharge du deuxième limiteur de pression 210b.
Si, à la suite de la fuite précédente, une deuxième fuite intervient au niveau du caisson intérieur 204, c'est-à-dire que le dihydrogène se répand dans le caisson extérieur 202 qui est ventilé du fait du courant d’air entre l’entrée d’air 202a et la sortie d’air 202b. Le dihydrogène est ainsi évacué vers l’extérieur du caisson extérieur 202, et plus particulièrement l’extérieur de l’aéronef 100.
Selon un deuxième mode de fonctionnement, lorsque le caisson intérieur 204 est inerté par une mise au vide ou lorsque la pression du gaz inerte dans le caisson intérieur 204 est inférieure à la pression du caisson extérieur 202, si une fuite intervient au niveau du caisson intérieur 204, l’air présent dans le caisson extérieur 202 se répand dans le caisson intérieur 204 qui monte en pression. Du fait des variations de pression dans le caisson intérieur 204, les moyens de détection 218 détectent alors la présence de la fuite et informent l’unité de contrôle 220 qui commande la fermeture des deux vannes d’arrêt 216a-b. La canalisation 206 est condamnée et elle reste remplie de dihydrogène à la pression de décharge du premier limiteur de pression 210a. Du fait du remplissage du caisson intérieur 204 par l’air, le caisson intérieur 204 perd ses caractéristiques d’isolant thermique pour la canalisation 206 présente dans ledit caisson intérieur 204. Le dihydrogène présent dans la canalisation 206 se réchauffe alors également, et la pression dans la canalisation 206 augmente jusqu’à ce que la pression de décharge (par exemple 60 bars) du premier limiteur de pression 210a soit atteinte et le premier limiteur de pression 210a s’ouvre sur la canalisation d’échappement 212 pour évacuer le dihydrogène vers l’extérieur du caisson extérieur 202, et plus particulièrement l’extérieur de l’aéronef 100.
Si, à la suite de la fuite précédente, une deuxième fuite apparaît au niveau de la canalisation 206 qui fuit à l’intérieur du caisson intérieur 204, le dihydrogène de la canalisation 206 se répand dans le caisson intérieur 204 puis dans la canalisation d’échappement 212 à travers le premier limiteur de pression 210a ou dans le caisson extérieur 202 à travers la fuite au niveau du caisson intérieur 204. Le caisson extérieur 202 est ventilé du fait du courant d’air entre l’entrée d’air 202a et la sortie d’air 202b et le dihydrogène est ainsi évacué vers l’extérieur du caisson extérieur 202, et plus particulièrement vers l’extérieur de l’aéronef 100.
Ainsi, avec un tel arrangement, même si deux incidents arrivent, la sécurité est assurée car les risques liés à la création d'un mélange explosif sont limités.
Dans le mode de réalisation de l’invention présenté à la , la canalisation d’échappement 212 débouche à l’extérieur par l’intermédiaire d’un clapet anti-retour 214 pour éviter l’entrée de l’air extérieur dans le caisson intérieur 204.
Dans le mode de réalisation de l’invention présenté à la , la partie de la canalisation 206 qui est entre le caisson intérieur 204 et chaque vanne d’arrêt 216a-b, prend la forme d’une canalisation à double peau.
La partie de la canalisation 206 qui est dans le caisson intérieur 204 prend ici la forme d’une canalisation à simple peau.
Dans le mode de réalisation de l’invention présenté à la , le module 200 comporte un troisième limiteur de pression 210c et un quatrième limiteur de pression 210d.
Le troisième limiteur de pression 210c est monté entre la canalisation d’échappement 212 et la canalisation 206 en amont du caisson intérieur 204 afin d’assurer un déchargement de la canalisation 206 vers la canalisation d’échappement 212 puis l’extérieur du caisson extérieur 202, et plus particulièrement l’extérieur de l’aéronef 100 si la pression dans la canalisation 206 dépasse la pression de décharge du troisième limiteur de pression 210c.
De la même manière, le quatrième limiteur de pression 210d est monté entre la canalisation d’échappement 212 et la canalisation 206 en aval du caisson intérieur 204 afin d’assurer un déchargement de la canalisation 206 vers la canalisation d’échappement 212 puis l’extérieur du caisson extérieur 202, et plus particulièrement l’extérieur de l’aéronef 100 si la pression dans la canalisation 206 dépasse la pression de décharge du quatrième limiteur de pression 210d.
Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le module 200 comporte une vanne de décharge 222 qui est commandée par l’unité de contrôle 220. La vanne de décharge 222 est montée sur la canalisation 206 qui est dans le caisson intérieur 204 et est fluidiquement connectée à la canalisation d’échappement 212. La vanne de décharge 222 est préférentiellement une vanne pilotée électriquement, pneumatiquement, ou autre.
Dans certains modes de réalisation, le procédé est mis en œuvre comme décrit dans l’exemple 1.
Dans divers aspects et modes de réalisation, la fermentation est effectuée dans des milieux de culture cellulaire exempts de protéines d’origine animale.
Un système et un procédé chromatographiques exempts de produit d’origine animale ou sensiblement exempts de produit d’origine animale peuvent être utilisés pour purifier une culture clarifiée de Clostridium botulinum obtenue à partir des procédés de fermentation APF décrits ici. Le système et le procédé chromatographiques peuvent comprendre une colonne, deux colonnes ou trois colonnes. Par exemple, le système et le procédé chromatographiques peuvent comprendre une, deux ou trois étapes : une chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC), et/ou une chromatographie d’échange d’anions (AEX), et/ou un chromatographe d’échange de cations. Dans certains modes de réalisation, le procédé chromatographique comprend une première étape consistant à soumettre la culture de BoNT/A obtenue à partir du processus APF à un HIC, suivie d’une soumission d’un éluant contenant une BoNT/A à partir du HIC à un AEX, puis suivie d’une soumission de la solution capturée contenant la BoNT/A de l’AAEX à un CEX. Dans certains modes de réalisation, le procédé de purification par chromatographie comprend en outre le traitement de l’éluant provenant des colonnes par diafiltration (DF) et le filtrage de l’éluant traité. Dans certains modes de réalisation, le processus de purification par chromatographie est tel que décrit dans le brevet U.S. No. 8 129 139.
Le complexe de BoNT/A obtenu à partir des procédés de fermentation et de purification APF décrits ici est biologiquement actif et hautement purifié. Dans un mode de réalisation, les compositions de BoNT/A décrites ici comprennent moins de 3 % ( par exemple moins d’environ 2,5 %, moins d’environ 2,0 %, moins d’environ 1,8 %, moins d’environ 1,5 %, moins d’environ 1,2 %, moins d’environ 1,0 %, moins d’environ 0,8 %, moins d’environ 0,6 %, moins d’environ 0,5 %, moins d’environ 0,4 %, moins d’environ 0,3 %, moins d’environ 0,2 % ou moins d’environ 0,1 %) de la protéine de cellule hôte. Le taux de la protéine de la cellule hôte peut être évalué en utilisant des procédés connus dans la technique, par exemple en utilisant la chromatographie liquide haute Performance dʼexclusion de taille (SEC-HPLC) ou la SEC-HPLC en conjugaison avec la diffusion de lumière laser à angles multiples (MALLS) comme décrit dans Lietzow et al. (2008) Protéine J 27:420-425. Dans un mode de réalisation, le pourcentage de la protéine de cellule hôte dans les compositions de BoNT/A décrites ici est déterminé en utilisant la SEC-HPLC.
Dans divers aspects et modes de réalisation, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est produit par une souche de Type A de Clostridium botulinum ( par exemple , la souche Hall de Type A de Clostridium botulinum ). Dans des modes de réalisation spécifiques, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est l’onabotulinumtoxine A.
Dans divers aspects et modes de réalisation, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est produit comme décrit dans l’exemple 5, l’exemple 6 ou l’exemple 7.
Dans divers aspects et modes de réalisation, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est produit en utilisant une ou plusieurs étapes telles que décrites dans l’exemple 5, l’exemple 6 ou l’exemple 7.
Dans divers aspects et modes de réalisation, le complexe de BNT/A de 900 kDa est produit par un procédé qui comprend une ou plusieurs étapes de chromatographie sur colonne réalisée lors de la purification des complexes de BoNT/A de 900 kDa.
Dans des modes de réalisation préférés, les une ou plusieurs étapes de chromatographie sur colonne réalisées lors de la purification des complexes de BoNT/A de 900 kDa comprennent une chromatographie d’interaction hydrophobe. Dans des modes de réalisation particuliers, les une ou plusieurs étapes de chromatographie sur colonne comprennent une chromatographie dʼéchange dʼanions. Dans des modes de réalisation spécifiques, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent une chromatographie d’échange de cations.
Dans des modes de réalisation spécifiques, les une ou plusieurs étapes de chromatographie sur colonne réalisées lors de la purification des complexes de BoNT/A de 900 kDa comprennent la chromatographie d’interaction hydrophobe et la chromatographie d’échange d’anions. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’interaction hydrophobe et la chromatographie d’échange d’anions. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’échange d’anions et la chromatographie d’interaction hydrophobe.
Dans des modes de réalisation particuliers, les une ou plusieurs étapes de chromatographie sur colonne mises en œuvre lors de la purification des complexes de BoNT/A de 900 kDa comprennent une chromatographie d’interaction hydrophobe et une chromatographie d’échange de cations. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’interaction hydrophobe et la chromatographie d’échange de cations. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’échange de cations et la chromatographie d’interaction hydrophobe.
Dans des modes de réalisation particuliers, les une ou plusieurs étapes de chromatographie sur colonne mises en œuvre lors de la purification des complexes de BoNT/A de 900 kDa comprennent une chromatographie d’échange d’anions et une chromatographie d’échange de cations. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’échange d’anions et la chromatographie d’échange de cations. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’échange de cations et la chromatographie d’échange d’anions.