INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les caractéristiques de l’étape de chromatographie d’interaction hydrophobe sont :
Une colonne Phenyl Sepharose HP est initialement aseptisée avec une solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N pendant un temps de contact minimum de 30 minutes (avec au moins environ 3 volumes de colonnes d’une solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N à 200 cm/heure). La colonne est ensuite équilibrée avec au moins environ 5 volumes de colonnes de 50 mM de tampon acétate de sodium, 0,4 M sulfate d’ammonium, pH 4,8. Ensuite la piscine POROS® 20HS (« colonne d’échange de cations ») (de dessus) est combinée 1:1 avec un tampon acétate de sodium 50 mM, sulfate d’ammonium 0,8 M, pH 4,8 et chargée sur la colonne Phenyl Sepharose HP. La colonne est préalablement lavée avec au moins environ 3 volumes de colonnes de tampon ’acétate de sodium 50 mM, sulfate d’ammonium 0,4 M, pH 4,8, puis lavée avec un tampon phosphate de sodium 50 mM, sulfate d’ammonium 0,4 M, pH 6,5. Le complexe de neurotoxine botulinum de type A est élué de la colonne avec un tampon phosphate de sodium 10 mM, sulfate d’ammonium 0,14 M, pH 6,5. L’éluat est dévié dans un sac de collecte de bioprocédé lorsque le A280 augmente jusqu’à ≥ 0,05 AU. L’éluat est collecté jusqu’à ce que le A280 du bord de fuite du pic dʼélution diminue à une valeur ≤ 0,05 AU. La piscine de produit Phenyl Sepharose HP est stockée dans le sac de collecte à température ambiante jusqu’à 6 heures.
Un système de filtration à flux tangentiel est utilisé pour concentrer et diafiltrer la piscine de produit de l’étape de chromatographie de Phenyl Sepharose HP dans le tampon de formulation de substance médicamenteuse. Des cassettes Pall® Filtron Minimate avec une membrane de coupure de poids moléculaire 100 kDa sont utilisées pour les étapes de concentration et de diafiltration. Le matériau formulé est ensuite passé à travers un filtre Pall Mini Kleenpak® 0,2 µm pour réduire la potentielle biocharge. L’étape UF/DF concentre la piscine de produit Phenyl Sepharose HP (éluant de la colonne HIC) à une concentration complexe BoNT/A de 0,7 g/L et diafiltre le matériau concentré avec un tampon de citrate de potassium 10 mM, pH 6,5.
Les caractéristiques du processus d’ultrafiltration/diafiltration utilisé sont les suivantes. L’unité UF/DF et la membrane polyéther sulfone Pall 100 kDa sont initialement rincées avec un minimum de 5 L d’eau pour injection (WFI) pour éliminer la solution de conditionnement et aseptisées avec un minimum de 200 mL d’une solution d’hydroxyde de sodium 1 N dans des conditions de recirculation pendant un minimum de 10 minutes, de préférence au moins 30 minutes, pour assainir l’unité UF/DF. Ensuite, le système de membrane et UF/DF est équilibré avec des volumes suffisants du tampon de formulation de citrate de potassium 10 mM, pH 6,5 jusqu’à ce que le pH de perméat et de rétentat soit de pH 6,5. Après la piscine de produit Phényl Sepharose HP est chargée sur la cassette de filtration à flux tangentiel Minimate® et l’éluat HIC concentré à 0,7 g/L. Après l’étape de concentration, la piscine de rétentat est diafiltrée contre un minimum de 5 volumes de diafiltration du tampon de formulation de substance médicamenteuse (citrate de potassium 10 mM, pH 6,5) à une pression transmembranaire de 7,5 psig (livres par pouce carré). La sortie de perméat est ensuite fermée et le système UF/DF tourne pendant au moins 2 minutes et le système rincé avec 50 mL de tampon de formulation de citrate de potassium 10 mM, pH 6,5. Après le rinçage, la concentration de complexe BoNT/A dans la piscine de rétentat est déterminée en mesurant la A 278 hors ligne et sur la base de la lecture de A 278 , la concentration de la piscine de rétentat est ajustée à 0,5 g/L avec un tampon de citrate de potassium 10 mM, pH 6,5. La piscine de rétentat à concentration ajustée est ensuite filtrée au travers d’un filtre Pall Mini Kleenpak™ 0,2 µm pour réduire la potentielle biocharge. La piscine de rétentat à concentration ajustée filtrée est stockée dans un sac de collecte à 2 °C à 8 °C pendant 2 jours.
Le complexe de neurotoxine botulinum de type A final purifié obtenu est rempli dans des cryoflacons de 1 mL Nunc® à 700 µL par flacon et stockée congelée. L’opération de remplissage est réalisée dans une armoire de biosécurité de classe 100 à température ambiante.
Le procédé en aval (y compris l’utilisation de 1 ou 2 ou 3 colonnes de chromatographie) est complété en seulement 1 à 3 jours et le complexe de neurotoxine botulinum de type A obtenu est conservé congelé dans un tampon citrate de potassium, pH 6,5 à une concentration de 0,5 g/L en tant que solution. En comparaison, le procédé de Schantz aval (purification de toxine) utilise plusieurs étapes de filtration, précipitation, extraction et centrifugation pour purifier le complexe de neurotoxine botulinum de type A et nécessite 1 à 2 semaines pour compléter seulement les étapes en aval, et la substance médicamenteuse résultante (neurotoxine botulinum récupérée) est réfrigérée en suspension de sulfate d’ammonium à une concentration d’environ 2,7 g/L. L’utilisation de chromatographie au lieu de précipitation et le temps de traitement réduit conduisent à un procédé en aval, cohérent, significativement amélioré, comme décrit ici.
1. Matériaux et réactifs
Les matériaux et réactifs sont présentés dans le tableau 8 ci-dessous.
Élément Fabricant Numéro de catalogue Filtre stérilisant de 2 µm, acrodisk Pall 4652 Peroxyde d'hydrogène VWR E882-10ML Méthionine DL Sigma M2768-100G Phosphate de sodium monobasique, monohydrate Produits chimiques Macron Fine 7892-04 Phosphate de sodium dibasique, anhydre Produits chimiques Macron Fine 7917-04
2. Dissolution de substance médicamenteuse BoNT/A (« DS »)
La BoNT/A DS stockée en tant que précipité (concentration de départ 2,5 mg/mL) a été diluée avec 40 mM de phosphate de sodium, pH 6,5 à une concentration de 0,5 mg/mL et incubée pendant au moins 20 heures à 25 °C jusqu'à l'échantillon visiblement limpide. Des échantillons résolus ont été filtrés et aliquotés stériles en fonction des exigences individuelles d'expérimentation.
3. Oxydation de BoNT/A DS
On a traité des échantillons DS dissous avec 0 ppm (témoin), 10 ppm, 50 ppm ou 100 ppm de H 2 O 2 pendant 20 heures à 25 °C. La concentration de BoNT/A DS a été maintenue la même dans tous les échantillons en ajoutant un volume constant de H 2 O 2 (ou eau pour l'échantillon témoin). L'oxydation a été arrêtée avec l'ajout d'un excès molaire de méthionine d’un facteur 10 (par rapport à la concentration de H 2 O 2 ). Comme l'oxydation de la protéine (sur des résidus comme le tryptophane) peut affecter l'absorbance UV, la concentration protéique de l'échantillon témoin a été déterminée par spectrophotométrie UV et apportée sous forme de concentration représentative de tous les échantillons. Les échantillons ont été conservés à ≤ -70 °C.
4. Digestion des échantillons et analyse LC-MS/MS
Des échantillons ont été dénaturés par chauffage à 99 °C en présence de 0,05 % de RapiGestTM, réduits avec du dithiothreitol, alkylés avec de l'iodoacétamide, et digérés à la trypsine au niveau d'un rapport enzyme/protéine de 1:10 (poids de trypsine/poids de BoNT/A DS) pendant 18 heures à 37 °C. Le RapiGestTM a été éliminé par acidification et centrifugation ultérieure à 23 500 rcf. Les peptides obtenus ont été analysés à l'aide d'un poste de travail HPLC capillaire Agilent 1200 couplé à un spectromètre de masse Thermo LTQ-FT Ultra. Vingt picomoles de chaque condensé d’échantillon ont été injectés pour analyse LC-MS/MS. La spectrométrie de masse des peptides en éluant à partir de la colonne de phase inversée a été effectuée en utilisant une ionisation par électronébulisation en mode positif. Les paramètres LC-LC/MS utilisés pour l’analyse des condensés d’échantillons sont fournis dans le tableau 9. Une mesure de masse précise des ions précurseurs a été obtenue en utilisant le détecteur à résonance cyclotron ionique à transformée de Fourier (FT) et les quatre ions précurseurs supérieurs provenant de chaque balayage MS ont été fragmentés et analysés dans le piège à ions linéaire dans des balayages ultérieurs MS/MS. Pour le spectromètre de masse, un étalonnage complet de l'instrument est effectué trimestriellement, tandis que l'étalonnage de la précision de masse FT est effectué hebdomadairement à l'aide du mélange d'étalonnage recommandé par le fabricant. La performance du système a été évaluée avant l'analyse d'échantillon en injectant deux picomoles d'un mélange peptidique standard (Michrom, Auburn, CA).
Tableau 9 Conditions expérimentales LC-MS
Échantillon Condensés de trypsine de BoNT/A DS Charge d’échantillon 20 picomoles Instrument HPLC capillaire Agilent 1200 (pompe de protection S/N DE60555131) couplée à un analyseur de masse Thermo TLQ-FT Ultra (S/N SN6126F) dans le laboratoire TL-M204. Colonne Agilent Zorbax 300 SB-C18, 1,0 x 150 mm, 3,5 µm, 300 Å, à 45 °C Phase Mobile A (MPA) 0,1 % acide formique dans l’eau Phase Mobile B (MPB) 0,1 % acide formique dans 80 % acétonitrile Gradient Temps (min) Débit (µL/min) % MPA % MPB 0 30 100 0 10 30 100 0 100 30 65 35 140 30 40 60 155 30 20 80 160 30 10 90 170 30 10 90 175 30 100 0 200 30 100 0
5. Analyse CBPA
L'analyse CBPA A été réalisée pour les échantillons de BoNT/A oxydés par H 2 O 2 trempés à la méthionine suivant le procédé décrit dans Fernàndez-Salen et al. (2012) PLOS ONE 7(11):e49516. Des cellules de neuroblastome humaine SiMa ont été cultivées dans des flasques de collagène IV en milieu recommandé par DSMZ. Pour une différenciation optimale, les cellules SiMa ont été ensemencées dans des plaques 96 puits à 5 x 104 cellules/puits dans 100 µL de milieu de différenciation (milieu Essentiel minimal avec 2 mM GlutaMAX™ I avec les sels de Earle, 0,1 mM acides aminés Non Essentiels, 10 mM HEPES, le complément 1 x N2, le complément 1x B27) pendant trois jours. Les cellules SiMa ont ensuite été traitées avec des échantillons de BoNT/A, puis en remplaçant le milieu avec des échantillons de BoNT/A par un milieu frais sans toxine.
Les cellules ont été lavées une fois avec du PBS et lysées dans du tampon Triton X-100 de lyse fraîchement préparé (50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl 2 , 1 mM EGTA, 1 % Triton X-100, et un comprimé d'inhibiteurs de protéases sans EDTA) sur glace pendant 20 min. Les cellules lysées ont été centrifugées dans la plaque à 4000 tr/min pendant 20 minutes à 4 °C. Pour l'analyse Western Blot, les lysats ont été transférés dans une plaque de PCR 96 puits, le tampon de chargement 2x SDSPAGE (Invitrogen) a été ajouté, et la plaque a été chauffée à 95 °C pendant 5 minutes. Les gels ont été exécutés dans du tampon d’exécution 1x MOPSSDS (Invitrogen) à 200 V pendant 55 min. Les protéines ont été transférées sur des membranes de nitrocellulose (Bio-Rad) pré-humides en tampon de transfert Western blot (Invitrogen) contenant 20 % de méthanol (Burdick et Jackson). Le Western blot a été transféré à 800 mA pendant 2 heures à l'aide de l'appareil à cellule de transfert TE-62 (GE Healthcare). Les Blots ont été bloqués dans un agent de blocage ECL 2 % (GE Healthcare) dans 1x TBS/0,1 % Tween 20 (Bio-Rad) (TBS-T) pendant 1 heure à température ambiante. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : anticorps anti-SNAP25 197 polyclonal dilué 1:1000, un anticorps SMI-81 (Sternelger Monlonals Inc) dilué 1:5000 pour évaluer les produits SNAP25 intacts et clivés ( c-à-d. SNAP25 206 et SNAP25 197 ont été détectés). Des anticorps ont été dilués dans un tampon agent bloquant 2 %/TBS-T et incubés une nuit à 4 °C sous agitation douce. Des anticorps secondaires sont des conjugués anti-IgG de lapin ou anti-IgG de souris H+L HRP (Invitrogen) dilués 1:5000 ou 1:10000 dans un tampon agent bloquant 2 %/TBS-T pendant 1 heure à température ambiante. Les membranes ont été lavées et exposées pendant 5 min à des réactifs de détection du système de Western Blot Plus (GE Healthcare). La chimioluminescence a été capturée en balayant les blots dans le Typhoon 9410 Imager (GE Healthcare) à λ ex 452/λ em 520. L'intensité des bandes de gel a été calculée à l'aide du logiciel ImageQuant TL (GE Healthcare). Les données ont été analysées à l'aide de SigmaPlot v 10.0 (Systat Software Inc.) ou de PLA2.0 (Stegmann Systems). Des valeurs d'intensité ont été tracées contre la concentration de l'échantillon de BoNT/A en échelle logarithmique et ajustées à une fonction logistique à 4 paramètres (Y=Y 0 +a/[1+(X/X 0 ) b ]) sans contraintes. En fonction des courbes ajustées, les valeurs EC50, correspondant à « X 0 », ont été déterminées.
Pour les plaques ELISA sandwich ECL, MSD High Bind (Meso Scale Discovery) pré-spottées avec anti-SNAP25 197 MAb 2E2A6 ont été bloqués avec 150 µL de tampon de blocage pendant 1 heure à RT. Après blocage, le tampon a été éliminé et 25 mL de lysat cellulaire ont été ajoutés à chaque puits de la plaque suivi d'une incubation comme détaillé dans le texte. Des plaques ont été lavées avec du PBS-T, et un anticorps de détection pAb anti-SNAP25 marqué par un Ester SULFO-TAG NHS (anticorps à terminaison N-terminale de SNAP25, Cat# S9684, Sigma) dans le tampon diluant a été ajouté. Les plaques ont été scellées et secouées à température ambiante pendant 1 h, lavées avec du PBS-T, et 150 mL de tampon de lecture 1x ont été ajoutés par puits. Les plaques ont été lues immédiatement sur le lecteur de plaque d'image SI6000. Pour les ELISA sandwich de chimioluminescence, les plaques blanches (Greiner) ont été revêtues de 100 µL/puits d'anti- SNAP25 197 2E2A6 MAb à 4 °C pendant une nuit. Des plaques ont été bloquées avec un blocage ECL à 2 % avec un sérum de chèvre à 10 % pendant 1 h à RT. Cinquante microlitres de lysat cellulaire ont été ajoutés à chaque puits et les plaques ont été incubées à 4 °C. S9684 anti-SNAP25 pAb conjugué au HRP a été utilisé pour la détection. Les plaques ont été développées avec un mélange SuperSignal ELISA Pico 1:1 (Pierce) et lues à 395 nm sur un Luminomètre (Molecular Devices). Les données ont été ajustées à une fonction logistique à 4 paramètres (Y=Y 0 +a/[1+(X/X 0 ) b ]).
Les effets de matrice potentiels de H 2 O 2 et la méthionine sur le dosage CBPA ont été pris en compte. Comme H 2 O 2 soit réagit à l'achèvement ou soit est trempé par l'excès de-thionine, il n'y a pas de H 2 O 2 restant dans les échantillons au moment de lʼanalyse CBPA. N'importe quels effets de matrice potentiels de la méthionine sont atténués par le fait que les échantillons sont dilués 30 000 fois avec un milieu de dilution avant l'analyse CBPA. La concentration la plus élevée de méthionine dans un échantillon avant dilution pour l'analyse CBPA était de 30 mM (méthionine) ; donc, la concentration la plus élevée de méthionine ajoutée aux cellules traitées après la dilution de 30 000 fois avec le milieu de dilution était d'environ 1 µM (méthionine).
Cet exemple définit le processus de Schantz de l’art antérieur pour obtenir une neurotoxine botulinum . Le procédé est un procédé non-APF utilisant des milieux et réactifs dérivés de l’animal ( i.e. , des plaques d’agar de sang de bœuf pour la culture, la caséine dans le milieu de fermentation et l’utilisation d’enzymes de Rnase et de Dnase pour la purification de neurotoxine botulique). Le processus de Schantz présente environ 16 à 20 étapes majeures, pour un travail à l’échelle de production utilise un fermenteur de 115 L et prend environ 3 semaines. Le processus de Schantz est débuté par décongélation d’un flacon de banque de cellules maîtres (MCB) de Clostridium botulinum non APF à température ambiante suivie de quatre étapes de culture. Premièrement pour sélectionner des colonies avec une morphologie appropriée, des aliquotes provenant du flacon MCB décongelé sont striés sur des plaques d’agar sanguin Columbia pré-réduit (CBA) et incubés de manière anaérobie pendant 30 à 48 heures à 34 °C ± 1 °C. Deuxièmement, des colonies sélectionnées sont inoculées dans des tubes à essai de 9 mL contenant un milieu de croissance de caséine pendant 6 à 12 heures à 34 °C. Le contenu du tube de 9 mL avec la croissance la plus rapide et la densité la plus élevée (étape de sélection de croissance) est ensuite en outre cultivé à travers deux incubations anaérobies d’intensification (les troisième et quatrième étapes de culture), étant une incubation de 12-30 heures à 34 °C dans une bouteille de culture de semences de 600 mL à 1 L, suivie d’une culture dans un fermenteur de semences de 15 L à 25 L contenant un milieu de croissance de caséine pendant 6 à 16 heures à 35 °C. Ces deux cultures d’intensification sont réalisées dans un milieu nutritif contenant 2 % d’hydrolysat de caséine (un condensé de caséine [protéine de lait]), 1 % d’extrait de levure et 1 % de glucose (dextrose) dans l’eau à pH 7,3.
Les cultures d’intensification sont suivies d’une incubation supplémentaire pendant 60 à 96 heures à 35 °C dans un fermenteur de production à l’échelle commerciale ( i.e. de 115 L) dans un milieu contenant de la caséine sous une atmosphère anaérobie contrôlée. La croissance de la bactérie est généralement complète après 24 à 36 heures, et lors de l’étape de fermentation réalisée pendant environ 65 à environ 72 heures où la plupart des cellules subissent une lyse et libèrent la neurotoxine botulique. On pense que la toxine est libérée par lyse cellulaire et activée par des protéases présentes dans le milieu. Un filtrat du milieu de culture peut être préparé en utilisant un filtre à profondeur de couche unique pour éliminer les impuretés brutes ( i.e. des cellules entières et rompues) obtenant ainsi une solution limpide appelée culture clarifiée. La récolte de neurotoxine botulique à partir de culture clarifiée est réalisée en abaissant le pH de la culture clarifiée à pH 3,5 avec de l’acide sulfurique 3M pour précipiter la toxine brute à 20 °C (précipitation d’acidification). La neurotoxine botulique brute est ensuite concentrée (pour atteindre une réduction volumique) par ultramicrofiltration (microfiltration) (dite MF ou UF) suivie d’une diafiltration (DF). Un filtre de 0,1 µm est utilisé pour l’étape de microfiltration.
La toxine brute ou crue récoltée est ensuite transférée dans une cuve de digestion et stabilisée par addition du chlorhydrate de benzamidine inhibiteur de protéase. La Dnase et la Rnase sont ajoutées pour condenser (hydrolyser) les acides nucléiques. La toxine est ensuite extraite avec un tampon de phosphate pH 6,0 et les débris cellulaires éliminés par clarification. Les acides nucléiques hydrolysés et les impuretés de faible masse moléculaire sont ensuite éliminés par des étapes d’UF et de DF supplémentaires. On réalise ensuite trois étapes de précipitation séquentielles (précipitation éthanol froid, acide chlorhydrique et sulfate d’ammoniac). La neurotoxine botulique purifiée (toxine en vrac) est conservée en suspension dans un tampon phosphate de sodium/sulfate d’ammonium de 2 °C à 8 °C.
L’achèvement de ce processus de Schantz (non-APF) de l’exemple 5, y compris les étapes de récolte et de purification, prend environ deux à trois semaines. La neurotoxine botulique en vrac résultante est une suspension de complexe de toxine botulique de haute qualité de 900 kDa de type A, réalisée à partir de la souche de Hall A de Clostridium botulinum avec une puissance spécifique ≥ 2 X 10 7 U/mg, un A 260 /A 278 inférieur à 0,6 et un motif de bandes distinct sur électrophorèse sur gel, et convenant pour le mélange dʼune composition pharmaceutique de toxine botulique.
La neurotoxine botulinum peut également être obtenue à partir d’un procédé APF, non chromatographique, tel que présenté dans l’exemple 7 du brevet US 7 452 697, le procédé APF complet, non chromatographique (du début de culture à la fin de toutes les étapes de purification et de traitement) prenant environ deux à trois semaines. Alternativement, la neurotoxine botulique peut également être obtenue à partir d’un procédé APF, chromatographique, tel que présenté dans l’exemple 16 du brevet US 7 452 697, le procédé APF, chromatographique (du début de culture à la fin de toutes les étapes de purification et de traitement) prenant une semaine ou plus.
6. 6 . Exemple 6 : Systèmes et procédés APF, chromatographiques sur colonne pour obtenir une neurotoxine botulinum
Des systèmes et procédés basés sur une chromatographie anion-cation rapide, APF, sont développés pour obtenir une neurotoxine botulinum à rendement élevé et haute pureté. Le procédé de cet exemple 6 à des fins de production (c-à-d. pour obtenir des quantités de gramme de la neurotoxine botulinum finale) utilise un récipient de fermentation de 20 L et prend uniquement 4 à 7 jours, de préférence environ 4 à environ 6 jours, pour compléter toutes les étapes du processus du début de culture à lʼachèvement du stockage final et de la purification de la toxine. Des appareils utilisés dans les systèmes décrits ici sont abordés ci-dessous. Les processus à milieux chromatographiques sont développés et sont présentés ici. Ces procédés à milieux chromatographiques utilisent un, deux ou trois des suivants : chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC), chromatographie d’échange d’anions, chromatographie d’échange de cations. Spécifiquement, les procédés de milieux chromatographiques développés comportent : (1) un procédé à un milieu qui utilise HIC ; (2) un procédé à deux milieux qui utilise HIC suivie d’une chromatographie d’échange d’anions ; (3) un procédé à deux milieux qui utilise HIC suivie d’une chromatographie d’échange de cations ; (4) un procédé à trois milieux qui utilise HIC suivie d’une chromatographie d’échange d’anions suivie d’une chromatographie d’échange de cations ; (5) un procédé à trois milieux qui utilise HIC suivie d’une chromatographie d’échange de cations suivie d’une chromatographie d’échange d’anions ; (6) un procédé à un milieu qui utilise une chromatographie d’échange d’anions ; (7) un procédé à deux milieux qui utilise une chromatographie d’échange d’anions suivie d’une HIC ; (8) un procédé à deux milieux qui utilise une chromatographie d’échange d’anions suivie d’une chromatographie d’échange de cations ; (9) un procédé à trois milieux qui utilise une chromatographie d’échange d’anions suivie d’une HIC suivie d’une chromatographie d’échange de cations ; (10) un procédé à trois milieux qui utilise une chromatographie d’échange d’anions suivie d’une chromatographie d’échange de cations suivie d’une HIC ; (11) un procédé à un milieu qui utilise une chromatographie d’échange de cations ; (12) un procédé à deux milieux qui utilise une chromatographie d’échange de cations suivie d’une HIC ; (13) un procédé à deux milieux qui utilise une chromatographie d’échange de cations suivie d’une chromatographie d’échange d’anions ; (14) un procédé à trois milieux qui utilise une chromatographie d’échange de cations suivie d’une HIC suivie d’une chromatographie d’échange d’anions ; et (15) un procédé à trois milieux qui utilise une chromatographie dʼéchange de cations suivie dʼune chromatographie dʼéchange dʼanions suivie dʼune HIC. La HIC élimine les impuretés telles qu’une impureté de 49 kDa (qui s’avère être une isomérase glucose phosphate de cellule hôte, comme discuté ci-après).
6.6.1 Préparation de la banque de cellules actives
Une nouvelle banque de cellules de Clostridium botulinum est développée (pour une utilisation pour initier l’étape de culture) sans utilisation de plaques d’agar de sang Columbia, et qui élimine la nécessité de sélection de colonies avant la culture et élimine également la nécessité d’effectuer la culture en tube d’intensification et les multiples étapes de semences (culture) du procédé de Shantz.