INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le regroupement de produit (éluat (traité en conséquence ou non) de colonne d’échange de cations) est chargé sur la membrane et la recirculation (avec une sortie de perméat fermée) du système (système TFF) est effectuée pendant au moins 2 minutes sans contre-pression, après quoi la vanne de perméat est lentement ouverte en ajustant la vanne de contre-pression de rétentat à une cible d’environ 7 psig-pression transmembranaire. Pour la dilution, le citrate de potassium 10 mM, pH 6,5 est ajouté au volume cible, et déplacé sur diafiltration sans ultrafiltration ; pour la concentration, on commence par l’ultrafiltration. Pour la diafiltration : des déchets de perméat sont recueillis dans un nouveau récipient (volume de diafiltration cible est de 5X volume de diafiltration) et diafiltrés avec au moins 5 volumes de diafiltration de citrate de potassium 10 mM, pH 6,5. Des données de processus de condensation sont collectées à un minimum d’intervalles de 10 minutes (poids de perméat g/volume mL, pression d’entrée (psig), pression de rétentat (psig), pression de perméat (psig) et pression transmembranaire (psig)). Pour la recirculation/ et le rinçage : avec le filtre de sortie du perméat fermé, le système est remis en circulation/exécuté pendant au moins 2 minutes sans contre-pression et le système est rincé avec au moins 20 mL de citrate de potassium 10 mM, pH 6,5. Le regroupement de produit comporte le rétentat et le rinçage. Un échantillon peut être prélevé dans le regroupement de produit et soumis à une analyse de vérification y compris, par exemple, tests UV à 278 nm, SDS-Page, LcHPLC, SE-HPLC, qPCR, RP- HPLC, Native-Page, AUC, lysat d’amébocytes de Limulus, Western Blot et ELISA. Pour le nettoyage post-utilisation, le système est rincé par de l’hydroxyde de sodium 1N, remis en circulation pendant au moins 10 minutes, après quoi le système est rincé et stocké avec de l’hydroxyde de sodium 0,1 N en son sein.
On réalise ensuite une filtration stérile et un remplissage pour stocker et diviser la neurotoxine en vrac. Un ajustement de concentration est effectué pour ajuster la concentration de toxine, en utilisant le citrate de potassium 10 mM, pH 6,5, à environ 0,5 mg/mL avec l’échantillon de post-rinçage. Si la concentration de toxine est inférieure à environ 0,5 mg/mL, alors aucun ajustement de concentration n’est nécessaire.
En utilisant une pipette stérile, des aliquotes de 10 mL/0,75 mL dans chacun de tubes à essai de 15 mL/1,5 mL stériles sont réalisées. Le récipient de produit est agité doucement à la main et transfère la quantité requise de solution (contenant une substance médicamenteuse en vrac, i.e toxine botulinum ) dans chaque flacon. Les échantillons sont conservés au maximum de 5 jours à 2 °C à 8 °C ou 0,75 mL du regroupement de produit de filtrat sont transférés dans des cryoflacons. Les cryoflacons sont conservés à -70 °C +/- 5 °C.
6. 7 . Exemple 7 : Procédé chromatographique sur colonne pour obtenir une neurotoxine botulique
Cet exemple décrit un procédé chromatographique sur en colonne pour obtenir une neurotoxine botulinum . Il est envisagé que certaines étapes décrites dans l’exemple 5, certaines étapes décrites dans l’exemple 6, et certaines étapes décrites dans cet exemple 7 puissent être combinées ou commutées les unes avec les autres pour obtenir la neurotoxine botulinum telle que considérée comme appropriée de l’avis et le jugement de l’homme du métier.
Des bactéries de Clostridium botulinum sont cultivées et autorisées à croître jusquʼà la fermentation. La culture de fermentation est ensuite utilisée dans la procédure de purification suivante :
Le milieu de culture et/ou de fermentation essentiellement APF peut contenir un produit protéique obtenu à partir de levure ( par exemple , un extrait de levure ou un concentré d’extrait de levure), ou d’un légume ( par exemple , blé, soja, malt, lupins, maïs, graine de coton, graine de L. campestri , etc .). Le milieu de culture et/ou de fermentation APF peut comprendre en outre une source de carbone ( par exemple , glucose) et/ou source de sel ( par exemple , du chlorure de sodium). Dans un mode de réalisation, le milieu utilisé pour la fermentation de Clostridium botulinum est exempt de produits dérivés d’origine animale et comprend environ 10 à 100 g/L ( par exemple , de 20 à 60 g/L) de soja hydrolysé (Hy-Soy), environ 7,5 g/L de glucose, et 5,0 g/L de NaCl, comme décrit dans le brevet U.S. No. 7 354 740. Dans un mode de réalisation, le milieu de fermentation peut comprendre 3 % p/v ou 5 % p/v de Hysoy ; 1 % p/v de levure de Hy ; et 1 % p/v de glucose, comme décrit dans le brevet U.S. No. 8 129 139. Dans un mode de réalisation, le milieu de fermentation APF peut comprendre 3,25 % p/v de peptone de soja de type II, 1,2 % p/v d’extrait de levure, 1,5 % p/v de glucose, pH ajusté à 7,3 en utilisant de l’hydroxyde de sodium, comme illustré dans l’exemple 1 ci-dessous.
Dans certains modes de réalisation, les compositions de BoNT/A décrites ici sont obtenues sous une condition de choc à froid, à savoir , à une température inférieure à la température typique de fermentation ( à savoir , à environ 35 ± 1 °C) pendant une courte période de temps au sein du processus de fermentation. Dans certains modes de réalisation, les compositions de BoNT/A sont obtenues dans des conditions de choc à froid d’environ 33 °C, 30 °C, 27 °C, 25 °C, 22 °C, 20 °C, 19 °C, 18 °C, 17 °C, 16 °C ou 15 °C. Les conditions de choc à froid peuvent durer pendant toute période de temps au sein du processus de fermentation entier, par exemple pendant environ 2 heures, 5 heures, 8 heures, ou 10 heures dans un processus de fermentation de 72 heures. Les conditions de choc à froid peuvent se produire une fois ou plusieurs fois lors du processus de fermentation. Dans certains modes de réalisation, les compositions de BoNT/A décrites ici sont obtenues en utilisant un choc à froid d’environ 15 °C à 20 °C ( par exemple , environ 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, ou 20 °C) pendant environ 5 heures ( par exemple , de la 13 e à la 17 e heure dans un processus de fermentation de 72 heures) pendant la fermentation.
Dans certains modes de réalisation, les compositions de BoNT/A décrites ici sont obtenues sous une condition froide continue, à savoir , à une température inférieure en continu ( par exemple , environ 25 °C) que la température typique de fermentation ( à savoir , à environ 35 ± 1 °C) pendant toute la durée de fermentation. Dans certains modes de réalisation, les compositions de BoNT/A sont obtenues sous une condition froide continue à environ 33 °C, 30 °C, 27 °C, 25 °C, 22 °C, 20 °C, 19 °C, 18 °C, 17 °C, 16 °C, ou 15 °C. Dans certains modes de réalisation, les compositions de BoNT/A décrites ici sont obtenues par fermentation d’une culture de Clostridium botulinum à environ 25 °C pendant environ 160 heures.
Selon un aspect, la présente invention a pour objet un procédé de production d’une composition comprenant un complexe de BoNT/A de 900 kDa (tel que l’onabotulinumtoxinA), ledit procédé comprenant l’incubation d’une culture de bactéries de Clostridium botulinum ( par exemple , bactéries de souche Hall de Clostridium botulinum de type A) dans un fermenteur de production à une température qui est inférieure à 35 °C pendant une période de temps.
Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 60 heures à environ 200 heures. Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 60 heures à environ 160 heures. Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 60 heures à environ 120 heures. Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 60 heures à environ 80 heures. Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 68 heures à environ 76 heures. Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 65 heures à environ 72 heures. Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 72 heures. Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 120 heures à environ 200 heures. Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 120 heures à environ 180 heures. Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 140 heures à environ 180 heures. Dans certains modes de réalisation, la totalité de la période de fermentation est d’environ 160 heures.
Dans certains modes de réalisation, la période de temps (pour une incubation basse température) est d’environ 2 heures. Dans certains modes de réalisation, la période de temps est d’environ 5 heures. Dans certains modes de réalisation, la période de temps est d’environ 8 heures. Dans certains modes de réalisation, la période de temps est d’environ 10 heures. Dans certains modes de réalisation, la période de temps est d’environ 2 à 5 heures. Dans certains modes de réalisation, la période de temps est d’environ 5 à 8 heures. Dans certains modes de réalisation, la période de temps est d’environ 8 à 10 heures. Dans certains modes de réalisation, la période de temps est la période de fermentation entière.
Dans certains modes de réalisation, la température est d’environ 33 °C, 32 °C, 31 °C, 30 °C, 29 °C, 28 °C, 27 °C, 26 °C, 25 °C, 24 °C, 23 °C, 22 °C, 21 °C, 20 °C, 19 °C, 18 °C, 17 °C, 16 °C, ou 15 °C. Dans certains modes de réalisation, la température est d’environ 15 °C à 20 °C ( par exemple , environ 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, ou 20 °C). Dans certains modes de réalisation, la température est d’environ 15 °C. Dans certains modes de réalisation, la température est d’environ 20 °C. Dans certains modes de réalisation, la température est d’environ 25 °C.
Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend, dans l’ordre suivant : (a) l’incubation de la culture de bactéries de Clostridium botulinum dans le fermenteur de production à 35 °C pendant environ 12 heures ; (b) le réglage de la température à environ 15 °C -20 °C ( par exemple , environ 15 °C, 16 °C, 17 °C, 18 °C, 19 °C, ou 20 °C) à la fin de l’étape (a) ; (c) la culture à la température réglée jusqu’à environ 5 heures après l’étape (a) ; (d) le réglage de la température à 35 °C à la fin de l’étape (c) ; et (e) la culture à 35 °C jusqu’à environ 55 heures après l’étape (c).
Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend l’incubation de la culture de bactéries de Clostridium botulinum dans le fermenteur de production à 25 °C pendant environ 160 heures.
Dans certains modes de réalisation, les compositions de BoNT/A décrites ici sont obtenues en présence de CO 2 dans le recouvrement de lʼespace de tête pendant le processus de fermentation, par exemple , en présence de CO 2 à une concentration d’environ 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % ou 100 % dans le recouvrement d’espace de tête, ou environ 1 %-10 %, 10 %-20 %, 20 %-30 %, 30 %-40 %, 40 %-50 %, 50 %-60 %, 60 %-70 %, 70 %-80 %, 80 %-90 %, ou 90 %-100 % dans le recouvrement de l’espace de tête. Le recouvrement d’espace de tête peut également comporter N 2 . Par exemple, les compositions de BoNT/A décrites ici peuvent être obtenues en présence, par exemple, sans limitation, d’environ 1 % CO 2 avec 99 % N 2 , 2 % CO 2 avec 98 % N 2 , 5 % CO 2 avec 95 % N 2 , 10 % CO 2 avec 90 % N 2 , 15 % CO 2 avec 85 % N 2 , 20 % CO 2 avec 80 % N 2 , 25 % CO 2 avec 75 % N 2 , 30 % CO 2 avec 70 % N 2 , 35 % CO 2 avec 65 % N 2 , 40 % CO 2 avec 60 % N 2 , 45 % CO 2 avec 55 % N 2 , 55 % CO 2 avec 45 % N 2 , 60 % CO 2 avec 40 % N 2 , 65 % CO 2 avec 45 % N 2 , 70 % CO 2 avec 35 % N 2 , 75 % CO 2 avec 30 % N 2 , 80 % CO 2 avec 20 % N 2 , 85 % CO 2 avec 15 % N 2 , 90 % CO 2 avec 10 % N 2 , 95 % CO 2 avec 5 % N 2 , ou 100 % CO 2 dans le recouvrement d’espace de tête pendant le processus de fermentation, ou environ 1 %-10 %, 10 %-20 %, 20 %-30 %, 30 %-40 %, 40 %-50 %, 50 %-60 %, 60 %-70 %, 70 %-80 %, 80 %-90 %, ou 90 %-99 % CO 2 dans le recouvrement de l’espace de tête lors du processus de fermentation avec le reste du recouvrement de l’espace de tête étant N 2 .
Selon un aspect, la présente invention a pour objet un procédé de production d’une composition comprenant un complexe de BoNT/A de 900 kDa (tel que l’onabotulinumtoxinA), ledit procédé comprenant l’incubation d’une culture de bactéries de Clostridium botulinum ( par exemple , bactéries de souche Hall de Clostridium botulinum de type A) dans un fermenteur de production en présence de CO 2 (et éventuellement N 2 ) dans le recouvrement d’espace de tête de fermenteur au cours du processus de fermentation. Dans certains modes de réalisation, le recouvrement d’espace de tête de fermenteur comprend environ 1 %, 2 %, 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, ou 100 % de CO 2 . Dans certains modes de réalisation, le recouvrement d’espace de tête de fermenteur comprend environ 1 %-10 %, 10 %-20 %, 20 %-30 %, 30 %-40 %, 40 %-50 %, 50 %-60 %, 60 %-70 %, 70 %-80 %, 80 %-90 %, ou 90 %-100 % de CO 2 . Dans certains modes de réalisation, le recouvrement d’espace de tête de fermenteur comprend environ 1 % CO 2 et 99 % N 2 , 2 % CO 2 et 98 % N 2 , 5 % CO 2 et 95 % N 2 , 10 % CO 2 et 90 % N 2 , 15 % CO 2 et 85 % N 2 , 20 % CO 2 et 80 % N 2 , 25 % CO 2 et 75 % N 2 , 30 % CO 2 et 70 % N 2 , 35 % CO 2 et 65 % N 2 , 40 % CO 2 et 60 % N 2 , 45 % CO 2 et 55 % N 2 , 55 % CO 2 et 45 % N 2 , 60 % CO 2 et 40 % N 2 , 65 % CO 2 et 45 % N 2 , 70 % CO 2 et 35 % N 2 , 75 % CO 2 et 30 % N 2 , 80 % CO 2 et 20 % N 2 , 85 % CO 2 et 15 % N 2 , 90 % CO 2 et 10 % N 2 , 95 % CO 2 et 5 % N 2 , ou 100 % CO 2 . Dans certains modes de réalisation, le recouvrement d’espace de tête de fermenteur comprend environ 1 %-10 %, 10 %-20 %, 20 %-30 %, 30 %-40 %, 40 %-50 %, 50 %-60 %, 60 %-70 %, 70 %-80 %, 80 %-90 %, ou 90 %-99 % de CO 2 avec le reste du recouvrement de l’espace de tête étant N 2 .
Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend l’incubation de la culture de bactéries de Clostridium botulinum ( par exemple , bactéries de souche Hall de Clostridium botulinum de type A) dans le fermenteur de production en présence de 25 % de CO 2 (et éventuellement 75 % N 2 ) dans le recouvrement d’espace de tête de fermenteur au cours du processus de fermentation. Dans des modes de réalisation spécifiques, le procédé comprend lʼincubation de la culture de bactéries de Clostridium botulinum ( par exemple , bactéries de souche Hall de Clostridium botulinum de type A) dans le fermenteur de production en présence de 25 % de CO 2 et 75 % N 2 dans le recouvrement d’espace de tête de fermenteur pendant le processus de fermentation.
Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend l’incubation de la culture de bactéries de Clostridium botulinum ( par exemple , bactéries de souche Hall de Clostridium botulinum de type A) dans le fermenteur de production en présence de 50 % de CO 2 (et éventuellement 50 % N 2 ) dans le recouvrement d’espace de tête de fermenteur au cours du processus de fermentation. Dans des modes de réalisation spécifiques, le procédé comprend l’incubation de la culture de bactéries de Clostridium botulinum ( par exemple , bactéries de souche Hall de Clostridium botulinum de type A) dans le fermenteur de production en présence de 50 % de CO 2 et 50 % N 2 dans le recouvrement d’espace de tête de fermenteur au cours du processus de fermentation.
Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend l’incubation de la culture de bactéries de Clostridium botulinum ( par exemple , bactéries de souche Hall de Clostridium botulinum de type A) dans le fermenteur de production en présence de 75 % de CO 2 (et éventuellement 25 % N 2 ) dans le recouvrement d’espace de tête de fermenteur au cours du processus de fermentation. Dans des modes de réalisation spécifiques, le procédé comprend lʼincubation de la culture de bactéries de Clostridium botulinum ( par exemple , bactéries de souche Hall de Clostridium botulinum de type A) dans le fermenteur de production en présence de 75 % de CO 2 et 25 % N 2 dans le recouvrement d’espace de tête de fermenteur pendant le processus de fermentation.
Dans certains modes de réalisation, le procédé comprend l’incubation de la culture de bactéries de Clostridium botulinum ( par exemple , bactéries de souche Hall de Clostridium botulinum de type A) dans le fermenteur de production en présence de 100 % de CO 2 dans le recouvrement d’espace de tête de fermenteur au cours du processus de fermentation.
Pour préparer un milieu de fermentation, le matériau nécessaire comprend D(+) Glucose, anhydride (Mallinckrodt Baker, cat# 7730, 300,0 g), Peptone de soja Type II (SPTII) (Marcor, cat# 1130, 650,0 g), eau pour injection (WFI, 13 L) et extrait de levure (YE) (BD Cat# 212730, 240,0 g), ainsi que des équilibres standards, une bonbonne (20 L par exemple), une bouteille en verre (5 L), des cylindres gradués, des barres d’agitation et des agitateurs. On ajoute environ 10 L de WFI dans la bonbonne avec une barre d’agitation. La bonbonne est placée sur un agitateur et l’agitateur est activé, après quoi on ajoute environ 650,0 g de peptone de soja de type II, ainsi qu’à environ 240,00 g de YE. Le milieu de fermentation est q.s. (quantité suffisante) à 13 L avec WFI, et la bonbonne est coiffée. Une solution de glucose à 10 % (p/v) est ensuite préparée en ajoutant environ 2 L de WFI dans une bouteille de verre 5 L (avec une barre d’agitation en son sein). Placés sur un agitateur et avec la barre en rotation, environ 300,00 g de glucose sont ajoutés dans la bouteille, et mélangés jusqu’à dissolution. La solution de glucose est de q.s. à 3 L avec WFI et le capuchon sur la bouteille, fournissant ainsi une solution de glucose à 10 %.
La fermentation procède ensuite (les cycles de fermentation peuvent aller d’environ 60 heures à environ 80 heures, de préférence d’environ 68 heures à environ 76 heures, le plus préférablement pendant environ 72 heures) alors que des échantillons sont prélevés du fermenteur, à 24 et 48 heures, par exemple, tout en maintenant des conditions aseptiques. Des tests qui sont exécutés sur au moins un échantillon prélevé pendant la fermentation peuvent comporter, mais sans s’y limiter, des mesures de densité optique hors ligne, des mesures de glucose, ELISA, SDS-PAGE, Western blot, par exemple. À la fin de la fermentation (fin du volume de bouillon de fermentation est d’environ 18 à 19 L, par exemple), un échantillon peut être prélevé (pour tester par exemple les mesures de densité optique hors ligne, les mesures de glucose, ELISA, SDS-PAGE, Western blot et la quantification ADN/ARN.
À la fin de la fermentation, la densité optique en ligne, l’EFT (temps de fermentation écoulé), et le temps de fin de fermentation sont enregistrés, ainsi que les tr/min d’agitation, la température en °C, la pression psig et le recouvrement d’azote slpm et la redox mV. Ensuite, le bouillon de fermentation de production est soumis à une récolte, à savoir le bouillon de fermentation de production est clarifié par filtration moyennant quoi on recueille par exemple environ 15 L de filtrat. Les paramètres de fermentation sont fixés pour RÉCOLTE et l’ensemble filtre pour clarification est préparé (CUNO, 3M filtration) qui comporte un pré-filtre, un filtre de profondeur et au moins un manomètre. Le pré-filtre et filtre de profondeur sont rincés par environ 20 L d’eau pour injection. Après rinçage, l’ensemble de filtration est fixé au port de récolte/drain du fermenteur. La température de fermenteur est diminuée à environ 25 °C, après quoi la clarification du bouillon de fermentation commence (enregistrer le temps de début de clarification, la OD initiale, le pH initial, la température initiale et le volume initial de fermenteur). La pression dans le fermenteur est augmentée à un taux d’environ 1 psi (livre par pouce carré) environ toutes les 10 minutes pendant la filtration, jusqu’à atteindre une pression d’environ 6 psi, à laquelle la pression est maintenue jusqu’à la fin de la récolte. Ce filtre élimine environ 80 % de l’ARN/ADN dans le milieu de fermentation APF (le reste essentiellement éliminé lors des étapes de chromatographie ultérieures, comme abordé ci-dessous), ce qui s’affranchit de la prise en charge préalable de la RNase et/ou de la DNase pour éliminer de tels composants du bouillon de fermentation. Des paramètres de processus, tels que la pression d’entrée de pré-filtre, la pression d’entrée de filtre de profondeur, la pression de fermenteur, le volume d’agitation et de filtrat sont surveillés à tous les 2 L de filtrat collectés, à l’issue de quoi le temps de fin de clarification et le volume de filtrat collectés sont enregistrés. Après achèvement de l’étape de récolte, les systèmes sont décontaminés et nettoyés.
La bonbonne de filtrat est amenée dans le BSC pour l’échantillonnage, à partir duquel environ ≤10 mL de filtrat est prélevé pour des mesures de OD hors ligne et d’autres analyses (par exemple ELISA, SDS-PAGE, ADN/ARN et Western blot).
Le filtrat est ensuite soumis à une ultrafiltration/dilution. Un ensemble d’unité de filtre à flux tangentiel (TFF) est assemblé. L’unité TFF est rincée pendant environ 90 minutes avec WFI à un taux préféré d’environ 2 L par minute puis l’unité TFF est aseptisée en faisant circuler de l’hydroxyde de sodium à 0,1 N (re-circulée) à travers elle pendant environ 60 minutes, après quoi 1 L de tampon phosphate de sodium 10 mM, pH 6,5 est amené à circuler à l’intérieur, suivi par un rinçage avec WFI pendant environ 30 minutes. Le filtrat de l’étape de récolte (environ 15 L) est ensuite passé à travers la TFF (cela est effectué dans une armoire de biosécurité), concentrant le filtrat jusqu’à environ 5 L +/- 0,5 L (l’étape de concentration passe à environ 2 L par minute et à une pression trans-membranaire d’environ 5 psig). Un échantillon du perméat peut être prélevé et soumis à des tests ELISA, dsDNA, SDS-PAGE et Western blot par exemple. Une fois concentrée à environ 5 L +/- 0,5 L, le regroupement de rétentat est ensuite dilué jusqu’à environ 20 L avec environ 15 L de tampon phosphate de sodium 10 mM filtré stérile, pH 6,5, à travers la TFF, à environ une vitesse de 2 L par minute. Un échantillon peut ensuite être à nouveau prélevé et soumis à des tests ELISA, ADN/ARN, SDS-PAGE et western blot par exemple. Le matériau d’ultrafiltration/dilution (rétentat) est stocké à 4 °C.
Les matériaux, équipements et procédures suivants sont utilisés pour fabriquer les solutions, tampons, etc., présentés ci-après pour une utilisation dans un exemple de procédé, c’est-à-dire dans la purification du milieu de fermentation obtenu à partir des procédés de l’exemple 6, de manière à obtenir une solution purifiée de complexe de neurotoxine botulinum de type A. Des tampons exemplaires utilisés (filtrés à travers un filtre à vide de 0,2 micron et leur conductivité mesurée en mS/cm, pour un enregistrement) comportent : phosphate de sodium 10 mM, pH 6,5 ; phosphate de sodium 50 mM, pH 6,5 ; acétate de sodium 50 mM, pH 4,8 ; acétate de sodium 50 mM, chlorure de sodium 170 mM, pH 4,8 ; acétate de sodium 50 mM, chlorure de sodium 250 mM, pH 4,8 ; acétate de sodium 50 mM, chlorure de sodium 1 M, pH 4,8 ; acétate de sodium 50 mM, pH 4,0 et citrate 10 mM, pH 6,5.