INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Dans des modes de réalisation spécifiques, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent une chromatographie d’interaction hydrophobe, une chromatographie d’échange d’anions, et une chromatographie d’échange de cations. Dans un mode de réalisation préféré, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, une chromatographie d’interaction hydrophobe, une chromatographie d’échange d’anions, et une chromatographie d’échange de cations. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, une chromatographie d’interaction hydrophobe, une chromatographie d’échange de cations et une chromatographie d’échange d’anions. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, une chromatographie d’échange d’anions, une chromatographie d’échange de cations et une chromatographie d’interaction hydrophobe. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’échange d’anions, la chromatographie d’interaction hydrophobe, et la chromatographie d’échange de cations. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, une chromatographie d’échange de cations, une chromatographie d’échange d’anions et une chromatographie d’interaction hydrophobe. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’échange de cations, la chromatographie d’interaction hydrophobe et la chromatographie d’échange d’anions.
Dans divers aspects et modes de réalisation, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est produit par un procédé ne comprenant pas d’étape de précipitation avec de l’éthanol froid, de l’acide chlorhydrique ou du sulfate d’ammoniac. Dans des modes de réalisation spécifiques, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé ne comprenant pas d’étape de précipitation avec de l’éthanol froid. Dans des modes de réalisation spécifiques, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé ne comprenant pas d’étape de précipitation avec de l’acide chlorhydrique. Dans des modes de réalisation spécifiques, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé ne comprenant pas d’étape de précipitation avec le sulfate d’ammoniac.
Dans divers aspects et modes de réalisation, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé qui comprend les étapes suivantes : soumission de la culture de fermentation à une précipitation acide en utilisant de l’acide sulfurique 3M pour réduire le pH à 3,5 à une température inférieure à 25 °C, soumission du précipité acide à une filtration à flux tangentiel ( par exemple , une filtration à flux tangentiel de 0,1 µm) pour concentrer la masse cellulaire, ajustement du pH à environ 6,0, ajout d’une ou plusieurs nucléases pour réduire la teneur en acide nucléique de cellule hôte, clarification par centrifugation pour éliminer les débris cellulaires, et filtration à 0,2 µm avec du sulfate dʼammonium ajouté.
Dans divers aspects et modes de réalisation, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé qui comprend une ou plusieurs des étapes suivantes : soumission de la culture de fermentation à une précipitation acide en utilisant de l’acide sulfurique 3M pour réduire le pH à 3,5 à une température inférieure à 25 °C, soumission du précipité acide à une filtration à flux tangentiel ( par exemple , une filtration à flux tangentiel de 0,1 µm) pour concentrer la masse cellulaire, ajustement du pH à environ 6,0, ajout d’une ou plusieurs nucléases pour réduire la teneur en acide nucléique de cellule hôte, clarification par centrifugation pour éliminer les débris cellulaires, et filtration à 0,2 µm avec du sulfate dʼammonium ajouté.
Il sera entendu qu’un pic sur un chromatogramme ne se réfère pas seulement à un qui a un et un seul point haut ( à savoir , le sommet), mais fait également référence à celui qui a un sommet (qui est le point le plus haut du pic) et un ou plusieurs points hauts locaux.
La détection et l’intégration de pics chromatographiques peuvent être effectuées par un homme du métier. Dans certains modes de réalisation, la détection de pics est effectuée manuellement. Dans certains modes de réalisation, l’intégration de pics est effectuée manuellement. Dans certains modes de réalisation, la détection de pics est effectuée à l’aide d’un algorithme. Dans certains modes de réalisation, l’intégration de pics est effectuée à l’aide d’un algorithme. Dans des modes de réalisation spécifiques, un algorithme qui peut être utilisé pour la détection et/ou l’intégration de pics prend en considération des facteurs comportant une largeur de crête, un seuil, une hauteur de crête et/ou une courbure du chromatogramme, etc. Dans un mode de réalisation spécifique, un algorithme pouvant être utilisé pour la détection et/ou l’intégration de pics utilise des courbes de Cauchy asymétriques. Dans un mode de réalisation spécifique, un algorithme qui peut être utilisé pour la détection et/ou l’intégration de pics est un qui est construit dans un logiciel de chromatographie ( par exemple , le logiciel Empower ® ). Dans un mode de réalisation spécifique, un algorithme qui peut être utilisé pour la détection et/ou l’intégration de pics est ApexTrac™.
Dans d’autres modes de réalisation, le rapport de l’abondance de BoNT/A de 150 kDa tronquée à l’abondance de BoNT/A de 150 kDa pleine longueur ou le pourcentage de l’abondance de BoNT/A de 150 kDa tronquée dans l’abondance de la pluralité d’espèces de variants de séquence de BoNT/A de 150 kDa, est déterminé à l’aide d’une spectrométrie de masse par chromatographie liquide (LC-MS). Dans certains modes de réalisation spécifiques, le rapport de l’abondance de BoNT/A de 150 kDa tronquée à l’abondance de BoNT/A de 150 kDa pleine longueur ou le pourcentage de l’abondance de BoNT/A de 150 kDa tronquée dans l’abondance de la pluralité d’espèces de variants de séquence de BoNT/A de 150 kDa, est déterminé à l’aide du procédé LC-MS tel que décrit dans l’Exemple 1 ci-dessous. Dans un mode de réalisation spécifique, la LC-MS est effectuée en utilisant les conditions indiquées dans le Tableau 5.
Dans divers aspects et modes de réalisation, la composition décrite ici est exempte de produit d’origine animale. Dans divers aspects et modes de réalisation, la composition décrite ici ne contient pas d’inhibiteur de protéase. Dans certains modes de réalisation, la composition décrite ici ne contient pas de chlorhydrate de benzamidine. Dans divers aspects et modes de réalisation, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est produit par des bactéries de Clostridium botulinum cultivées et développées à partir dʼune banque de cellules actives exemptes de produit d’origine animale. La banque de cellules actives exemptes de produit d’origine animale peut être produite, par exemple et sans limitation, comme décrit dans l’exemple 6.
Dans divers aspects et modes de réalisation, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est produit comme décrit à la Section 5.4.
Dans divers aspects et modes de réalisation, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est produit comme décrit dans l’exemple 1.
Dans un mode de réalisation, la présente description concerne également un procédé de traitement d’un patient (de préférence, un patient humain) en ayant besoin, comprenant l’administration d’une composition décrite ici.
5.4. Production de BoNT /A et Production de compositions de BoNT /A
Une toxine de Botulinum de type A a été approuvée par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour le traitement du blépharospasme essentiel, du strabisme et du spasme hémifacial chez les patients de plus de douze ans, de la dystonie cervicale, des rides de la ligne glabellaire (visage) et pour le traitement de l’hyperhydrose. Une composition pharmaceutique contenant de la toxine de botulinum de type A disponible dans le commerce est commercialisée sous la marque BOTOX ® (onabotulinumtoxinA), disponible commercialement auprès de Allergan, société AbbVie, North Chicago, Illinois, États-Unis. BOTOX ® contient un complexe de toxine de botulinum de 900 kDa de type A purifié, de l’albumine sérique humaine, et du chlorure de sodium conditionné sous forme stérile, séchée sous vide. Le complexe de toxine de botulinum de type A dans BOTOX ® est réalisé à partir d’une culture de la souche Hall de Clostridium botulinum amenée à croître dans un milieu contenant de la caséine amine N-Z et de l’extrait de levure ( à savoir , un procédé non APF) et purifiée à partir de la solution de culture par une série d’étapes de précipitation (y compris la précipitation acide) à un complexe cristallin constitué de la protéine de toxine active de haut poids moléculaire et dʼune protéine dʼhémagglutinine associée. Le complexe cristallin est de nouveau dissous dans une solution contenant une solution saline et de l’albumine et filtré stérile à l’aide d’un filtre irradié gamma (0,2 microns) avant séchage sous vide. BOTOX ® peut être ré-constitué avec une solution saline stérile non conservée avant injection intramusculaire. Chaque flacon de 100 unités de BOTOX ® est constitué d’environ 5 ng de complexe de toxine de botulinum de type A, 0,5 mg d’albumine sérique humaine, et 0,9 mg de chlorure de sodium, sous forme séchée sous vide et destinée à reconstitution avec une solution saline normale stérile sans conservateur (injection de chlorure de sodium 0,9 %).
Plusieurs étapes sont requises pour fabriquer les compositions de BoNT/a décrites ici appropriées pour une administration à un humain ou un animal pour un but thérapeutique, diagnostic, de recherche ou cosmétique. Dans un mode de réalisation, ces étapes peuvent comporter l’obtention d’une neurotoxine de Clostridium botulinum de sérotype A (BoNT/A) puis le mélange de la BoNT/A purifiée. Une première étape peut être de cultiver des bactéries de Clostridial ( par exemple , la souche Hall de Clostridium botulinum ), typiquement sur des plaques d’agar, dans un environnement propice à la croissance bactérienne, comme dans une atmosphère anaérobie chaude. L’étape de culture à l’aide de plaques d’agar permet d’obtenir des colonies de Clostridial à morphologie et autres caractéristiques souhaitables. L’étape de culture peut également être effectuée avec des bactéries provenant d’une cellule active exempte de produit d’origine animale ( voir , par exemple , exemple 6). Dans une deuxième étape, les colonies de Clostridial cultivées sélectionnées peuvent être fermentées dans un milieu approprié. Après une certaine période de fermentation les bactéries de Clostridial réalisent typiquement une lyse et libèrent la toxine Clostridial ( par exemple , BoNT/A) dans le milieu. Troisièmement, la toxine peut être purifiée à partir du milieu de culture pour obtenir une substance médicamenteuse de toxine BoNT/A en vrac ou brute. De préférence, la substance médicamenteuse de toxine BoNT/A n’a pas été soumise à une précipitation ( par exemple , précipitation avec éthanol froid, acide chlorhydrique et/ou sulfate d’ammonium), par exemple , lors de la purification. On préfère également la substance médicamenteuse de toxine BoNT/A qui a été purifiée par chromatographie sur colonne, en particulier la substance médicamenteuse de toxine BoNT/A produite par purification en utilisant une colonne de chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC). Lorsque plusieurs colonnes de chromatographie sont utilisées pour purifier la BoNT/A, il est préférable que la toxine soit purifiée à l’aide d’un procédé dans lequel une colonne HIC est utilisée avant toutes autres colonnes de chromatographie. Il est préférable que la substance médicamenteuse BoNT/A soit produite par un procédé qui se qualifie pour une utilisation sous les bonnes régulations pratiques de fabrication promulguées par la Food and Drug Administration des États-Unis.
Dans certains modes de réalisation, les compositions de BoNT/A décrites ici sont obtenues en utilisant un procédé sensiblement, essentiellement ou totalement, exempt de protéine d’origine animale (APF). Le procédé peut comprendre les étapes séquentielles suivantes : culture de bactéries de Clostridium botulinum ( par exemple , la souche Hall de Clostridium botulinum ) dans un milieu de culture essentiellement APF ; la fermentation des bactéries de Clostridium botulinum du milieu de culture dans un milieu de fermentation sensiblement APF, la récolte du milieu de fermentation en éliminant les débris cellulaires présents dans le milieu de fermentation par filtration ou centrifugation ; la concentration du milieu de fermentation récolté par filtration, telle que par ultrafiltration (UF) ; la dilution du milieu de fermentation concentré en ajoutant un tampon. Après dilution avec le tampon, un procédé chromatographique sensiblement APF peut être effectué pour obtenir un complexe BoNT/A biologiquement actif hautement purifié. Dans certains modes de réalisation, le procédé APF décrit ici n’implique pas l’utilisation d’un inhibiteur de protéase. Dans certains modes de réalisation, le procédé APF décrit ici n’implique pas l’utilisation de chlorhydrate de benzamidine.
Sauf si le contexte s’y oppose, les termes « comprennent », « comprend » et « comprenant » sont utilisés sur la base et la compréhension claire qu’ils doivent être interprétés inclusivement, plutôt qu’exclusivement, de telle sorte qu’ils indiquent l’inclusion de la caractéristique citée mais sans exclure une ou plusieurs autres caractéristiques de ce type. Cependant, il convient de comprendre que partout où les aspects et modes de réalisation sont décrits ici avec le terme « comprennent » (ou « comprend » ou « comprenant »), des aspects autrement analogues décrits en termes de « constitués de » (ou « consiste en » ou « constitué de ») et/ou « constitué sensiblement de » (ou « consiste essentiellement en » ou « constitué sensiblement de ») sont également fournis.
5.2. Neurotoxine de Clostridium Botulinum de sérotype A ( BoNT /A) et compositions de BoNT /A
Une molécule de BoNT/A de 150 kDa est une endopeptidase à zinc qui peut hydrolyser spécifiquement une liaison peptidique de la protéine intracellulaire, associée aux vésicules (VAMP, également appelée synaptobrévine) de 25 kiloDalton (kDa) de protéine associée aux synaptosomes (SNAP-25). Une molécule de BoNT/A de 150 kDa est traduite en un polypeptide à chaîne unique d’environ 150 kDa qui est ensuite clivée par scission protéolytique au sein d’une boucle disulfure par une protéase se produisant naturellement. Ce traitement post-traductionnel donne une molécule di-chaîne comprenant une chaîne légère (LC) d’environ 50 kDa et une chaîne lourde (HC) d’environ 100 kDa maintenues ensemble par une simple liaison disulfure et des interactions non covalentes.
Une bactérie de Clostridial peut produire des complexes de toxine botulinum de type A sous diverses formes, qui comprennent et ne sont pas limités à 900 kDa, 760 kDa, 500 kDa et 300 kDa (poids moléculaires approximatifs). Les complexes ( à savoir , un poids moléculaire supérieur à environ 150 kDa) comprennent une molécule de toxine botulinum de 150 kDa (la composante neurotoxique) et une ou plusieurs protéines hémagglutinine (HA) et/ou protéine non-hémagglutinine non toxique (NTNH).
Dans un mode de réalisation, la molécule de BoNT/A de 150 kDa utilisable dans le cadre de la présente description présente une séquence représentée dans le tableau 1. Dans un mode de réalisation, la molécule de BoNT/A de 150 kDa comprend une chaîne légère (LC : résidus 2-438, environ 50 kDa) et une chaîne lourde (HC : résidus 449-1296, environ 100 kDa). Dans un autre mode de réalisation, la molécule de BoNT/A de 150 kDa comprend une chaîne légère (LC : résidus 2-436, environ 50 kDa) et une chaîne lourde (HC : résidus 449-1296, environ 100 kDa). Des résidus 439-448 sont le site d’accrochage et sont en italique.
[Tableau 1]. Séquences préférées de molécules de BoNT/A SEQ ID NO. 1: Séquence d’acides aminés de la molécule de BoNT/A de 150 kDa MPFVNKQFNY KDPVNGVDIA YIKIPNAGQM QPVKAFKIHN KIWVIPERDT 50 FTNPEEGDLN PPPEAKQVPV SYYDSTYLST DNEKDNYLKG VTKLFERIYS 100 TDLGRMLLTS IVRGIPFWGG STIDTELKVI DTNCINVIQP DGSYRSEELN 150 LVIIGPSADI IQFECKSFGH EVLNLTRNGY GSTQYIRFSP DFTFGFEESL 200 EVDTNPLLGA GKFATDPAVT LAHELIHAGH RLYGIAINPN RVFKVNTNAY 250 YEMSGLEVSF EELRTFGGHD AKFIDSLQEN EFRLYYYNKF KDIASTLNKA 300 KSIVGTTASL QYMKNVFKEK YLLSEDTSGK FSVDKLKFDK LYKMLTEIYT 350 EDNFVKFFKV LNRKTYLNFD KAVFKINIVP KVNYTIYDGF NLRNTNLAAN 400 FNGQNTEINN MNFTKLKNFT GLFEFYKLLC VRGIITSK TK SLDKGYNK AL 450 NDLCIKVNNW DLFFSPSEDN FTNDLNKGEE ITSDTNIEAA EENISLDLIQ 500 QYYLTFNFDN EPENISIENL SSDIIGQLEL MPNIERFPNG KKYELDKYTM 550 FHYLRAQEFE HGKSRIALTN SVNEALLNPS RVYTFFSSDY VKKVNKATEA 600 AMFLGWVEQL VYDFTDETSE VSTTDKIADI TIIIPYIGPA LNIGNMLYKD 650 DFVGALIFSG AVILLEFIPE IAIPVLGTFA LVSYIANKVL TVQTIDNALS 700 KRNEKWDEVY KYIVTNWLAK VNTQIDLIRK KMKEALENQA EATKAIINYQ 750 YNQYTEEEKN NINFNIDDLS SKLNESINKA MININKFLNQ CSVSYLMNSM 800 IPYGVKRLED FDASLKDALL KYIYDNRGTL IGQVDRLKDK VNNTLSTDIP 850 FQLSKYVDNQ RLLSTFTEYI KNIINTSILN LRYESNHLID LSRYASKINI 900 GSKVNFDPID KNQIQLFNLE SSKIEVILKN AIVYNSMYEN FSTSFWIRIP 950 KYFNSISLNN EYTIINCMEN NSGWKVSLNY GEIIWTLQDT QEIKQRVVFK 1000 YSQMINISDY INRWIFVTIT NNRLNNSKIY INGRLIDQKP ISNLGNIHAS 1050 NNIMFKLDGC RDTHRYIWIK YFNLFDKELN EKEIKDLYDN QSNSGILKDF 1100 WGDYLQYDKP YYMLNLYDPN KYVDVNNVGI RGYMYLKGPR GSVMTTNIYL 1150 NSSLYRGTKF IIKKYASGNK DNIVRNNDRV YINVVVKNKE YRLATNASQA 1200 GVEKILSALE IPDVGNLSQV VVMKSKNDQG ITNKCKMNLQ DNNGNDIGFI 1250 GFHQFNNIAK LVASNWYNRQ IERSSRTLGC SWEFIPVDDG WGERPL 1296
SEQ ID NO. 2: Séquence d’acides aminés de la chaîne légère (LC) de BoNT/A de 150 kDa pleine longueur PFVNKQFNY KDPVNGVDIA YIKIPNAGQM QPVKAFKIHN KIWVIPERDT 50 FTNPEEGDLN PPPEAKQVPV SYYDSTYLST DNEKDNYLKG VTKLFERIYS 100 TDLGRMLLTS IVRGIPFWGG STIDTELKVI DTNCINVIQP DGSYRSEELN 150 LVIIGPSADI IQFECKSFGH EVLNLTRNGY GSTQYIRFSP DFTFGFEESL 200 EVDTNPLLGA GKFATDPAVT LAHELIHAGH RLYGIAINPN RVFKVNTNAY 250 YEMSGLEVSF EELRTFGGHD AKFIDSLQEN EFRLYYYNKF KDIASTLNKA 300 KSIVGTTASL QYMKNVFKEK YLLSEDTSGK FSVDKLKFDK LYKMLTEIYT 350 EDNFVKFFKV LNRKTYLNFD KAVFKINIVP KVNYTIYDGF NLRNTNLAAN 400 FNGQNTEINN MNFTKLKNFT GLFEFYKLLC VRGIITSK
SEQ ID NO. 3: Séquence d’acides aminés de la chaîne lourde (HC) de BoNT/A de 150 kDa AL 450 NDLCIKVNNW DLFFSPSEDN FTNDLNKGEE ITSDTNIEAA EENISLDLIQ 500 QYYLTFNFDN EPENISIENL SSDIIGQLEL MPNIERFPNG KKYELDKYTM 550 FHYLRAQEFE HGKSRIALTN SVNEALLNPS RVYTFFSSDY VKKVNKATEA 600 AMFLGWVEQL VYDFTDETSE VSTTDKIADI TIIIPYIGPA LNIGNMLYKD 650 DFVGALIFSG AVILLEFIPE IAIPVLGTFA LVSYIANKVL TVQTIDNALS 700 KRNEKWDEVY KYIVTNWLAK VNTQIDLIRK KMKEALENQA EATKAIINYQ 750 YNQYTEEEKN NINFNIDDLS SKLNESINKA MININKFLNQ CSVSYLMNSM 800 IPYGVKRLED FDASLKDALL KYIYDNRGTL IGQVDRLKDK VNNTLSTDIP 850 FQLSKYVDNQ RLLSTFTEYI KNIINTSILN LRYESNHLID LSRYASKINI 900 GSKVNFDPID KNQIQLFNLE SSKIEVILKN AIVYNSMYEN FSTSFWIRIP 950 KYFNSISLNN EYTIINCMEN NSGWKVSLNY GEIIWTLQDT QEIKQRVVFK 1000 YSQMINISDY INRWIFVTIT NNRLNNSKIY INGRLIDQKP ISNLGNIHAS 1050 NNIMFKLDGC RDTHRYIWIK YFNLFDKELN EKEIKDLYDN QSNSGILKDF 1100 WGDYLQYDKP YYMLNLYDPN KYVDVNNVGI RGYMYLKGPR GSVMTTNIYL 1150 NSSLYRGTKF IIKKYASGNK DNIVRNNDRV YINVVVKNKE YRLATNASQA 1200 GVEKILSALE IPDVGNLSQV VVMKSKNDQG ITNKCKMNLQ DNNGNDIGFI 1250 GFHQFNNIAK LVASNWYNRQ IERSSRTLGC SWEFIPVDDG WGERPL 1296
SEQ ID NO. 4: Séquence d’acides aminés de la chaîne légère (LC) de BoNT/A de 150 kDa tronquée avec une troncature C-terminale (-SK) PFVNKQFNY KDPVNGVDIA YIKIPNAGQM QPVKAFKIHN KIWVIPERDT 50 FTNPEEGDLN PPPEAKQVPV SYYDSTYLST DNEKDNYLKG VTKLFERIYS 100 TDLGRMLLTS IVRGIPFWGG STIDTELKVI DTNCINVIQP DGSYRSEELN 150 LVIIGPSADI IQFECKSFGH EVLNLTRNGY GSTQYIRFSP DFTFGFEESL 200 EVDTNPLLGA GKFATDPAVT LAHELIHAGH RLYGIAINPN RVFKVNTNAY 250 YEMSGLEVSF EELRTFGGHD AKFIDSLQEN EFRLYYYNKF KDIASTLNKA 300 KSIVGTTASL QYMKNVFKEK YLLSEDTSGK FSVDKLKFDK LYKMLTEIYT 350 EDNFVKFFKV LNRKTYLNFD KAVFKINIVP KVNYTIYDGF NLRNTNLAAN 400 FNGQNTEINN MNFTKLKNFT GLFEFYKLLC VRGIIT
Dans un mode de réalisation, la BoNT/A décrite ici est présente comme un complexe de BoNT/A de 900 kDa. Dans un mode de réalisation, la BoNT/A décrite ici est présente comme un complexe de BoNT/A de 900 kDa formé par la molécule de BoNT/A de 150 kDa et les protéines hémagglutinine HA70, hémagglutinine HA34, hémagglutinine HA17, et non toxique non-hémagglutinine (NTNH). Dans un mode de réalisation particulier, la BoNT/A décrite ici ( par exemple le complexe de BoNT/A de 900 kDa) est produite dans une souche de Clostridium botulinum de type A. Dans un mode de réalisation particulier, la BoNT/A décrite ici ( par exemple le complexe de BoNT/A de 900 kDa) est produite dans une souche Hall de Clostridium botulinum de type A. Dans un mode de réalisation préféré, la BoNT/A décrite ici est l’onabotulinumtoxinA.
Dans un mode de réalisation, la molécule de BoNT/A de 150 kDa pleine longueur décrite ici comprend une chaîne légère ayant une séquence d’acides aminés présentée dans SEQ ID NO. 2 et une chaîne lourde ayant une séquence d’acides aminés présentée dans SEQ ID NO. 3, avec des ponts disulfures situés entre les positions 429 et 453 et entre les positions 1234 et 1279.
Dans un autre mode de réalisation, la molécule de BoNT/A de 150 kDa tronquée décrite ici comprend une chaîne légère ayant une séquence d’acides aminés présentée dans SEQ ID NO. 4 et une chaîne lourde ayant une séquence d’acides aminés présentée dans SEQ ID NO. 3, avec des ponts disulfures situés entre les positions 429 et 453 et entre les positions 1234 et 1279.
Le rapport de l’abondance de BoNT/A de 150 kDa tronquée à l’abondance de BoNT/A de 150 kDa pleine longueur ou le pourcentage de l’abondance de BoNT/A de 150 kDa tronquée dans l’abondance de la pluralité d’espèces de variants de séquence de BoNT/A de 150 kDa, peut être déterminé selon toutes technologies connues dans la technique ainsi que celles spécifiquement décrites ici, par exemple, dans la section Exemples ci-dessous.
Dans certains modes de réalisation, le rapport de l’abondance de BoNT/A de 150 kDa tronquée à l’abondance de BoNT/A de 150 kDa pleine longueur ou le pourcentage de l’abondance de BoNT/A de 150 kDa tronquée dans l’abondance de la pluralité d’espèces de variants de séquence de BoNT/A de 150 kDa, est déterminé à l’aide d’une chromatographie d’échange d’anions (AEX) ( par exemple , chromatographie liquide haute performance d’échange d’anions (AEX-HPLC)). Dans un mode de réalisation, la BoNT/A de 150 kDa tronquée correspond au pic qui élue plus tard que ( par exemple , immédiatement après) le pic pour la BoNT/A de 150 kDa pleine longueur dans un chromatographe AEX-HPLC. Dans un mode de réalisation, la BoNT/A de 150 kDa tronquée correspond au second pic de BoNT/A de 150 kDa élué dans un chromatographe AEX-HPLC. Le chromatographe AEX-HPLC décrit ici peut être généré en utilisant une première phase mobile de Tris-HCl 40 mM (pH 8,0) et une deuxième phase mobile de NaCl 1,0 M et de Tris-HCl 40 mM (pH 8,0), et dans lequel le chromatogramme AEX-HPLC est généré en utilisant une détection à 220 nm. Dans un mode de réalisation, le chromatogramme AEX-HPLC est généré en utilisant les conditions indiquées dans le Tableau 4. Dans un mode de réalisation, la BoNT/A de 150 kDa tronquée correspond au pic tronqué 150 kDa comme illustré dans la . Dans certains modes de réalisation spécifiques, le rapport de l’abondance de BoNT/A de 150 kDa tronquée à l’abondance de BoNT/A de 150 kDa pleine longueur ou le pourcentage de l’abondance de BoNT/A de 150 kDa tronquée dans l’abondance de la pluralité d’espèces de variants de séquence de BoNT/A de 150 kDa, est déterminé à l’aide du procédé AEX-HPLC tel qu’illustré dans l’Exemple 1 ci-dessous.
Bien entendu, l’invention n’est pas limitée à l’exemple qui vient d’être décrit. On peut notamment apporter des modifications au mécanisme distributeur, par exemple à la manière dont se déplacent les obturateurs ou à la manière dont ceux-ci sont commandés, ainsi qu’à la forme du contenant.
Dans une variante, le premier obturateur est une lame, notamment formée de métal, de préférence sensiblement élastique.