INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Exemple 6 (comparatif) On part du jus sucré M défini à l’exemple 1. On le traite selon l’invention avec les conditions opératoires suivantes : Le jus est traité dans un réacteur agité en batch, pendant 1 heure à 120°C. On ajoute de l’acide sulfurique à 72% dans de l’eau au jus sucré initial M pour qu’au final la concentration en acide sulfurique pur ajouté dans le mélange total soit de 4% poids.
Le tableau 2 ci-dessous regroupe les concentrations en sucres dans les jus sucrés des exemples une fois hydrolysés selon l’invention. C est la concentration des sucres glucose et xylose analysée par HPLC en g/kg, et R est l’évolution du rendement en sucres monomériques. C Sucre Potentiel théorique Ex.2 0% H 2 SO 4 Ex.3 1% H 2 SO 4 Ex.4 2% H 2 SO 4 Ex.5 3% H 2 SO 4 Ex.6 4% H 2 SO 4 Glucose + xylose t0 g/kg 49,5 49,5 48,8 48,1 47,4 46,7 Glucose + Xylose t0 + 1 h g/kg 57,1 51,3 52,1 50,2 49,4 47,2 R % 15,5 3,7 5,2 1,5 - 0,2 - 4,6
La première ligne t0 correspond aux concentrations du jus M avant démarrage du traitement selon l’invention, à noter que la concentration en sucres diminue quand on ajoute de l’acide, du fait de la dilution provoquée par cet ajout d’acide en solution aqueuse : plus on ajoute d’acide, plus la concentration diminue.
La concentration en sucre potentiel théorique à t0 + 1 heure correspond au glucose et au xylose potentiel total du jus M : c’est la concentration en sucres après hydrolyse acide en présence d’un excès d’acide en conditions diluées. Ainsi l’évolution maximale du rendement en sucres monomériques est de 15,5%.
On voit des données du tableau 2 que, sans ajouter d’acide (exemple 2), puisqu’ici le jus est déjà à pH acide, on convertit par le traitement à chaud une certaine quantité d’oligomères en monomères. En ajoutant 1% (exemple 3) et 2% d’acide (exemple 4), c’est également le cas, avec un rendement qui augmente. En revanche, en ajoutant 3% (exemple 5) ou 4% d’acide (exemple 6), on n’a plus d’évolution favorable du rendement : la conversion des oligomères en monomères est contrecarrée par la dégradation des monomères.
En conclusion, on voit que l’hydrolyse acide selon l’invention des jus est favorable pour obtenir des jus avec de plus fortes teneurs en sucres monomériques et une teneur abaissée en sucres oligomériques. Cependant, le traitement est à ajuster, notamment en termes d’acidité, car une acidité trop forte (et/ou une température de traitement trop élevée) peut conduire à dégrader les sucres monomériques, ce qui peut tendre à faire perdre tout ou partie du bénéfice de l’invention.
Une colonne Phenyl Sepharose HP est initialement aseptisée avec une solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N pendant un temps de contact minimum de 30 minutes (avec au moins environ 3 volumes de colonnes d’une solution d’hydroxyde de sodium 0,1 N à 200 cm/heure). La colonne est ensuite équilibrée avec au moins environ 5 volumes de colonnes de 50 mM de tampon acétate de sodium, 0,4 M sulfate d’ammonium, pH 4,8. Ensuite le regroupement POROS® 20HS (« colonne d’échange de cations ») (de dessus) est combiné 1:1 avec un tampon acétate de sodium 50 mM, sulfate d’ammonium 0,8 M, pH 4,8 et chargé sur la colonne Phenyl Sepharose HP. La colonne est préalablement lavée avec au moins environ 3 volumes de colonnes de tampon ’acétate de sodium 50 mM, sulfate d’ammonium 0,4 M, pH 4,8, puis lavée avec un tampon phosphate de sodium 50 mM, sulfate d’ammonium 0,4 M, pH 6,5. Le complexe de neurotoxine botulinum de type A est élué de la colonne avec un tampon phosphate de sodium 10 mM, sulfate d’ammonium 0,14 M, pH 6,5. L’éluat est dévié dans un sac de collecte de bioprocédé lorsque l’A 280 augmente jusqu’à ≥ 0,05 AU. L’éluat est collecté jusqu’à ce que l’A 280 du bord de fuite du pic dʼélution diminue à une valeur ≤ 0,05 AU. Le regroupement de produit Phenyl Sepharose HP est stocké dans le sac de collecte à température ambiante jusqu’à 6 heures.
Un système de filtration à flux tangentiel est utilisé pour concentrer et diafiltrer le regroupement de produit de l’étape de chromatographie de Phenyl Sepharose HP dans le tampon de formulation de substance médicamenteuse. Des cassettes Pall® Filtron Minimate avec une membrane de coupure de poids moléculaire 100 kDa sont utilisées pour les étapes de concentration et de diafiltration. Le matériau formulé est ensuite passé à travers un filtre Pall Mini Kleenpak® 0,2 µm pour réduire la potentielle biocharge. L’étape UF/DF concentre le regroupement de produit Phenyl Sepharose HP (éluant de la colonne HIC) à une concentration complexe BoNT/A de 0,7 g/L et diafiltre le matériau concentré avec un tampon de citrate de potassium 10 mM, pH 6,5.
Les caractéristiques du processus d’ultrafiltration/diafiltration utilisé sont les suivantes. L’unité UF/DF et la membrane polyéther sulfone Pall 100 kDa sont initialement rincées avec un minimum de 5 L d’eau pour injection (WFI) pour éliminer la solution de conditionnement et aseptisées avec un minimum de 200 mL d’une solution d’hydroxyde de sodium 1 N dans des conditions de recirculation pendant un minimum de 10 minutes, de préférence au moins 30 minutes, pour assainir l’unité UF/DF. Ensuite, le système de membrane et UF/DF est équilibré avec des volumes suffisants du tampon de formulation de citrate de potassium 10 mM, pH 6,5 jusqu’à ce que le pH de perméat et de rétentat soit de pH 6,5. Après cela, le regroupement de produit Phényl Sepharose HP est chargé sur la cassette de filtration à flux tangentiel Minimate® et l’éluat HIC concentré à 0,7 g/L. Après l’étape de concentration, le regroupement de rétentat est diafiltré contre un minimum de 5 volumes de diafiltration du tampon de formulation de substance médicamenteuse (citrate de potassium 10 mM, pH 6,5) à une pression transmembranaire de 7,5 psig (livres par pouce carré). La sortie de perméat est ensuite fermée et le système UF/DF tourne pendant au moins 2 minutes et le système rincé avec 50 mL de tampon de formulation de citrate de potassium 10 mM, pH 6,5. Après le rinçage, la concentration de complexe BoNT/A dans le regroupement de rétentat est déterminée en mesurant la A 278 hors ligne et sur la base de la lecture de A 278 , la concentration du regroupement de rétentat est ajustée à 0,5 g/L avec un tampon de citrate de potassium 10 mM, pH 6,5. Le regroupement de rétentat à concentration ajustée est ensuite filtré au travers d’un filtre Pall Mini KleenpakTM 0,2 µm pour réduire la potentielle biocharge. Le regroupement de rétentat à concentration ajustée filtré est stocké dans un sac de collecte à 2 °C à 8 °C pendant 2 jours.
Selon un aspect, des concentrations de produits à base de légumes, tels que des produits à base de soja, peuvent être de la peptone de soja Type II Hy-soy® ou SE50MK (une peptone de soja casher) en milieux de culture et de fermentation. Hy-Soy® dans le milieu de culture de semences peut être compris entre 10 et 200 g/L. De préférence, la concentration en Hy-Soy® dans le milieu de semences est comprise entre 15 et 150 g/L. Le plus préférablement, la concentration en Hy-Soy® dans le milieu de semences est approximativement comprise entre environ 20 et 30 g/L ou une quantité entre elles. La concentration en glucose dans le milieu de semences peut être comprise entre 0,1 g/L et 20 g/L. De préférence, la concentration en glucose est comprise entre 0,5 et 15 g/L. Le plus préférablement, la concentration en glucose dans le milieu de culture est d’environ 10 g/L. Les quantités d’extrait de levure peuvent être d’environ 5 à 20 g/L, plus préférablement d’environ 10 à 15 g/L ou d’une quantité entre elles. Par exemple, le pH du milieu de culture avant croissance de Clostridium botulinum peut être approximativement pH 7,0-7,5, ou entre eux, de préférence pH 7,3.
Un mode de réalisation d’un procédé en aval à deux colonnes donné à titre d’exemple comprend les étapes suivantes : (a) culture de bactéries, telles que des bactéries Clostridium botulinum provenant dʼun flacon WCB APF, dans une bouteille de semences/culture, (b) puis fermentation des bactéries Clostridium botulinum dans un fermenteur (fermenteur de production de toxine) ayant un milieu de fermentation APF pour étendre la lignée cellulaire, réalisation de la fermentation et la production de toxine botulique jusquʼà ce quʼune phase de lyse cellulaire souhaitée soit atteinte. Ensuite, (c) récolte (par exemple, clarifier par filtration,) du milieu de fermentation APF pour obtenir un milieu de fermentation récolté, (d) réalisation d’une concentration et une dilution conduisant à un milieu de fermentation récolté dilué qui est (e) passé à travers une colonne de capture pour éliminer les impuretés, (f) mise en contact de l’éluant de la colonne de capture avec une colonne de polissage pour éliminer davantage les impuretés, et éventuellement une deuxième concentration en colonne de polissage (g) et un échange de tampon de l’éluant de colonne de polissage, (h) suivi d’une filtration de réduction de biocharge et du (i) remplissage de flacons.
Dans cet exemple ci-dessous, un volume de milieu de fermentation bien réduit est utilisé tout en fournissant toujours un rendement élevé en complexe de neurotoxine botulinum de type A hautement puissante. En utilisant le protocole suivant, seulement 20 L ou moins, par exemple, du milieu de fermentation APF est requis, au lieu des volumes supérieurs typiquement supérieurs, (par exemple 115 L) de milieu de fermentation nécessaires pour produire des quantités utiles dans le commerce pour obtenir une neurotoxine botulinum .
Des sondes (par exemple, sonde redox, sonde à pH, sonde de turbidité, par exemple, par Broadley James et Optek) et la configuration de séquence du fermenteur, tel qu’un fermenteur en acier inoxydable 30 L, sont contrôlées et calibrées, et insérées dans leurs orifices fermenteurs respectifs et serrées en place. Par exemple, un fermenteur peut être un système de fermenteur ABEC 30 L (VT) constitué d’un récipient fermenteur de 30 L en volume, un système d’entraînement d’agitateur, un ensemble de tuyauterie pour raccords d’utilité (CIP, vapeur propre, CDA, azote, oxygène, eau réfrigérée de procédé, bio-déchets, et vapeur d’usine), une instrumentation (pH, température, pression, ReDox, densité optique, et débit massique), et quatre pompes péristaltiques. La vitesse d’agitation montée inférieure est contrôlée à l’aide d’un entraînement à fréquence variable Allen-Bradley (VFD). Le contrôle semi-automatique et automatique du système est géré par un automate Allen-Bradley ControlLogix avec programmation. Le système est conçu pour fournir un contrôle PID en boucle fermée (proportionnel-intégral-dérivé) de température, pression, pH, et redox de la culture lors des opérations de fermentation. Un Allen-Bradley DeviceNet® (un réseau à dispositif ouvert) est utilisé pour commander et communiquer avec des dispositifs et capteurs sur le patin.
L’invention a également pour objet une installation de traitement de biomasse lignocellulosique mettant en œuvre le procédé décrit plus haut.
L’invention a également pour objet une installation de traitement d’une biomasse lignocellulosique, ladite installation comprenant - a) une unité de prétraitement de la biomasse, comprenant un dispositif de cuisson de la biomasse, éventuellement accompagnée d’une explosion à la vapeur, pour obtenir une biomasse prétraitée - b) une première unité de séparation solide/liquide, comprenant notamment un dispositif de filtration, de tout ou partie (3a) de la biomasse prétraitée (3) obtenue dans l’unité a) en une première fraction solide (7) de biomasse prétraitée et une première fraction liquide (6) comprenant un mélange de composés, notamment en phase aqueuse, comprenant des sucres C5 avec 5 carbones et des sucres C6 avec 6 carbones, lesdits sucres C5 et/ou lesdits sucres C6 étant pour partie sous forme monomérique et pour partie sous forme oligomérique - c) une unité d’hydrolyse enzymatique de la première fraction solide de biomasse prétraitée obtenue à l’étape b), pour obtenir un hydrolysat sous forme de sucre(s), dont des sucres C6 avec 6 carbones, - une unité de traitement de ladite première fraction liquide (6) obtenue à l’étape b) par hydrolyse en condition acide et/ou par hydrolyse enzymatique, afin d’obtenir une première fraction liquide traitée qui est enrichie en sucres C5 sous forme monomérique et/ou en sucres C6 sous forme monomérique et appauvrie en sucres C5 forme oligomérique et/ou en sucres C6 sous forme oligomérique.
Au sens de l’invention, les premiers et deuxièmes micro-organismes mentionnés plus haut peuvent être un seul type de microorganisme ou une association de différents micro-organismes. De même, au sens de l’invention, les enzymes peuvent être de même type ou, préférentiellement, être un mélange d’enzymes de type/fonction différente qu’on peut aussi appeler « cocktail » enzymatique.
La biomasse intéressant l’invention et dont est issue la première fraction liquide comprenant des sucres C5 avec 5 carbones et des sucres C6 avec 6 carbones, est de type lignocellulosique, provenant notamment de résidus forestiers et/ou agricoles et/ou papetiers, et/ou de plantes saccharifères et/ou de plantes amylacées et/ou de Fractions Fermentescibles d’Ordures Ménagères (FFOM).
L’invention a également pour objet la première fraction liquide traitée obtenue à l’étape d): elle a ainsi pour objet un liquide comprenant un mélange de composés en solution aqueuse, qui comprend des sucres en C5 et des produits de conversion des sucres en C6 et éventuellement des autres composés minoritaires présents dans le jus à traiter par hydrolyse acide ou enzymatique, avec en outre - une teneur S1 en sucres C5 et/ou sucres C6 comprise entre 10 et 100 g/kg de solution - dont une proportion P1 en sucres C5 et/ou en sucres C6 sous forme oligomérique d’au plus 50% poids, notamment d’au plus 30% poids, notamment d’au plus 20 ou 10% poids par rapport aux sucres monomériques.
Liste des figures La représente sous forme d’un schéma-bloc un procédé de traitement de biomasse lignocellulosique en vue de la convertir en alcool (éthanol), sans mettre en œuvre le traitement par hydrolyse des jus sucrés selon l’invention. La représente sous forme d’un schéma-bloc un procédé de traitement de biomasse lignocellulosique en vue de la convertir en alcool (éthanol), qui modifie le procédé de la pour mettre en œuvre le traitement par hydrolyse des jus sucrés selon l’invention. La représente sous forme d’un schéma-bloc un procédé de traitement de biomasse lignocellulosique en vue de la convertir en sucre(s), sans mettre en œuvre le traitement par hydrolyse des jus sucrés selon l’invention. La représente sous forme d’un schéma-bloc un procédé de traitement de biomasse lignocellulosique en vue de la convertir en sucre(s), qui modifie le procédé de la pour mettre en œuvre le traitement par hydrolyse des jus sucrés selon l’invention. La représente sous forme d’un schéma-bloc un procédé de traitement de biomasse lignocellulosique en vue de la convertir pour partie en sucre(s), pour partie en alcool (éthanol), sans mettre en œuvre le traitement par hydrolyse des jus sucrés selon l’invention. La représente sous forme d’un schéma-bloc un procédé de traitement de biomasse lignocellulosique en vue de la convertir pour partie en sucre(s), pour partie en alcool (éthanol), qui modifie le procédé de la pour mettre en œuvre le traitement par hydrolyse des jus sucrés selon l’invention.
Dans tout le présent texte, et notamment dans la description des figures, le terme de réacteur n’impose pas qu’il y en ait qu’un seul, et peut être compris comme une unité comprenant au moins un réacteur ou plusieurs réacteurs (montés en série ou en parallèle). Il en est de même pour tous les autres dispositifs, notamment les outils de type filtration, séparation solide/liquide etc… (par soucis de concision).
A noter que dans tout le présent texte, « solide » est à comprendre en opposition à « liquide », mais que toute fraction solide peut encore contenir une certaine proportion de liquide (et réciproquement). On peut évaluer cette proportion de solide et composés solubles dans un échantillon par mesure de son taux de Matière Sèche (acronyme "MS"), qui est mesuré selon la norme ASTM E1756 - 08(2015) « Standard Test Method for Determination of Total Solids in Biomass”.
Les figures 1 à 6 représentant des schémas bloc de procédés et sont très simplifiées pour en faciliter la compréhension. Elles ne représentent pas nécessairement toutes les étapes/équipements nécessaires aux procédés décrits, se concentrant sur les étapes/équipements/flux les plus significatifs au vu de l’invention. Les références gardent la même signification d’une figure à l’autre.
Description des modes de réalisation L’invention intègre dans un procédé de conversion de biomasse, de type lignocellulosique, en sucre(s) ou en alcool, un traitement d’hydrolyse acide ou enzymatique de jus sucrés contenant des sucres en C5, et, dans une moindre teneur/proportion, des sucres en C6, de façon à diminuer voire supprimer la teneur en sucres sous forme oligomérique au profit de leur forme monomérique, pour en tirer bénéfice, notamment soit pour augmenter le rendement de conversion de la biomasse (en alcool plus particulièrement), soit pour obtenir des sucres de plus haute qualité/pureté, soit pour diminuer les couts de production. En effet, dans le processus de traitement de biomasse, l’invention s’intéresse aux procédés avec prétraitement de la biomasse avant hydrolyse enzymatique, prétraitement qui entraîne la production de jus sucrés mélangeant des sucres en C5 et des sucres en C6.
On va donc décrire : - dans un premier temps, l’étape de traitement acide ou enzymatique des jus sucrés de l’étape d) de conversion de biomasse lignocellulosique, - puis, dans un second temps, et à l’aide des figures 1 à 6, le procédé de conversion de biomasse lignocellulosique produisant ces jus sucrés et intégrant cette étape de traitement d) pour en tirer bénéfice.
Etape de traitement par hydrolyse de jus sucrés en C5 et C6 Ce traitement chimique ou biochimique de traitement est une mise en contact du jus sucré en sucres C5 et C6, jus obtenu par traitement de matière à base de biomasse lignocellulosique et comprenant majoritairement du sucre en C5, avec un milieu acide à chaud ou avec des enzymes, afin que la proportion de sucre oligomérique diminue au profit de la forme monomérique des sucres.
La composition du jus sucré 6 à traiter peut varier selon la biomasse, le type de prétraitement, les conditions de prétraitement, les conditions de lavage de la biomasse prétraitée.
Dans divers aspects et modes de réalisation, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est produit par une souche de Type A de Clostridium botulinum ( par ex. , la souche Hall de Type A de Clostridium botulinum ). Dans des modes de réalisation spécifiques, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est l’onabotulinumtoxine A.
Dans des modes de réalisation spécifiques, les une ou plusieurs étapes de chromatographie sur colonne réalisées lors de la purification des complexes de BoNTA/ de 900 kDa comprennent la chromatographie d’interaction hydrophobe et la chromatographie d’échange d’anions. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’interaction hydrophobe et la chromatographie d’échange d’anions. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’échange d’anions et la chromatographie d’interaction hydrophobe.
Dans des modes de réalisation particuliers, les une ou plusieurs étapes de chromatographie sur colonne mises en œuvre lors de la purification des complexes de BoNT/A de 900 kDa comprennent une chromatographie d’interaction hydrophobe, une chromatographie d’échange d’anions et une chromatographie d’échange de cations. Dans un mode de réalisation préféré, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, une chromatographie d’interaction hydrophobe, une chromatographie d’échange d’anions, et une chromatographie d’échange de cations. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, une chromatographie d’interaction hydrophobe, une chromatographie d’échange de cations et une chromatographie d’échange d’anions. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, une chromatographie d’échange d’anions, une chromatographie d’échange de cations et une chromatographie d’interaction hydrophobe. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’échange d’anions, la chromatographie d’interaction hydrophobe, et la chromatographie d’échange de cations. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, une chromatographie d’échange de cations, une chromatographie d’échange d’anions et une chromatographie d’interaction hydrophobe. Dans un mode de réalisation spécifique, la ou les étapes de chromatographie sur colonne comprennent, dans l’ordre suivant, la chromatographie d’échange de cations, la chromatographie d’interaction hydrophobe et la chromatographie d’échange d’anions.
Dans divers aspects et modes de réalisation, le complexe de BoNT/A de 900 kDa est produit par un procédé ne comprenant pas d’étape de précipitation avec de l’éthanol froid, de l’acide chlorhydrique ou du sulfate d’ammoniac lors de la purification du complexe de BoNT/A de 900 kDa. Dans des modes de réalisation spécifiques, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé ne comprenant pas d’étape de précipitation avec de l’éthanol froid. Dans des modes de réalisation spécifiques, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé ne comprenant pas d’étape de précipitation avec de l’acide chlorhydrique. Dans des modes de réalisation spécifiques, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé ne comprenant pas d’étape de précipitation avec le sulfate d’ammoniac.
Dans divers aspects et modes de réalisation, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé qui comprend les étapes suivantes : soumission de la culture de fermentation à une précipitation acide en utilisant de l’acide sulfurique 3M pour réduire le pH à 3,5 à une température inférieure à 25 °C, soumission du précipité acide à une filtration à flux tangentiel ( par ex. , une filtration à flux tangentiel de 0,1 µm) pour concentrer la masse cellulaire, ajustement du pH à environ 6,0, ajout d’une ou plusieurs nucléases pour réduire la teneur en acide nucléique de cellule hôte, clarification par centrifugation pour éliminer les débris cellulaires, et filtration à 0,2 µm avec du sulfate dʼammonium ajouté.
Dans divers aspects et modes de réalisation, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé qui comprend une ou plusieurs des étapes suivantes : soumission de la culture de fermentation à une précipitation acide en utilisant de l’acide sulfurique 3M pour réduire le pH à 3,5 à une température inférieure à 25 °C, soumission du précipité acide à une filtration à flux tangentiel ( par ex. , une filtration à flux tangentiel de 0,1 µm) pour concentrer la masse cellulaire, ajustement du pH à environ 6,0, ajout d’une ou plusieurs nucléases pour réduire la teneur en acide nucléique de cellule hôte, clarification par centrifugation pour éliminer les débris cellulaires, et filtration à 0,2 µm avec du sulfate dʼammonium ajouté.
Dans divers aspects et modes de réalisation, les complexes de BoNT/A de 900 kDa sont produits par un procédé qui comprend les étapes suivantes et dans l’ordre suivant : soumission de la culture de fermentation à une précipitation acide en utilisant de l’acide sulfurique 3M pour réduire le pH à 3,5 à une température inférieure à 25 °C, soumission du précipité acide à une filtration à flux tangentiel ( par ex. , une filtration à flux tangentiel de 0,1 µm) pour concentrer la masse cellulaire, ajustement du pH à environ 6,0, ajout d’une ou plusieurs nucléases pour réduire la teneur en acide nucléique de cellule hôte, clarification par centrifugation pour éliminer les débris cellulaires, et filtration à 0,2 µm avec du sulfate dʼammonium ajouté.