Obtention des inocula : Milieu : - MRS (prêt à l’emploi, Merck) pour les souches Limosilactobacillus fermentum , Limosilactobacillus reuteri , et Lacticaseibacillus rhamnosus . - YE glc (Bacto Yeast Extract, Difco 10g/L + glucose 40g/L) pour les souches Saccharomyces cerevisiae et Gluconobacter Oxydans . Mise en culture : ○ En Erlenmeyer de 500mL non bafflé contenant 100mL de milieu pour les souches Limosilactobacillus fermentum , Limosilactobacillus reuteri , et Lacticaseibacillus rhamnosus , En Erlenmeyer 4 chicanes dans le fond + 1 goutte d’antimousse contenant 100mL de milieu pour les souches Saccharomyces cerevisiae et Gluconobacter Oxydans . ○ Ensemencement : 1% avec un tube de stock congelé (1mL) ○ Incubation : En anaérobie (cloche) pendant 16h à 37°C, 80rpm Limosilactobacillus fermentum , Limosilactobacillus reuteri , et Lacticaseibacillus rhamnosus . En aérobie pendant 16h 150 rpm 30°C pour Gluconobacter Oxydans et 37°C pour Saccharomyces cerevisiae ○ Préparation de la biomasse : Centrifuger la biomasse issue des Erlenmeyers à 3000g pendant 10 minutes pour toutes les souches sauf Gluconobacter Oxydans , qui nécessitera une centrifugation à une accélération de 10000g. Eliminer le surnageant et reprendre les biomasses avec 10mL d’eau physiologique stérile à 4°C. (Le lavage de la biomasse n’est pas nécessaire au vu de l’inoculum nécessaire). Mesure la D.O. à 600nm et réaliser un dénombrement des suspensions cellulaires Fermentation du Nutralys ® S85F 10% à pH natif : - Matériel : Erlenmeyers de 2L non bafflés x11 Flacons d’eau déminéralisée stérile ; env. 6L - Mode opératoire : ○ Mettre à pré incuber les flacons d’eau à 30 et 37°C à 110rpm. ○ Placer 50g de Nutralys® S85F dans chaque Erlenmeyer ○ Ajouter de l’eau stérile qsp 500g ○ Laisser le Nutralys® se réhydrater 30 minutes à la température d’incubation des différents essais. - Paramètres d’incubation des Erlenmeyers ○ Nutralys : Nutralys + Gluconobacter .oxydans : 30°C 110rpm ○ Nutralys + S accharomyces Cerevisiae : 37°C 110rpm ○ Nutralys + Limosilactobacillus fermentum , Limosilactobacillus reuteri , et Lacticaseibacillus rhamnosus : 37°C 60rpm + cloche anaérobie - Calculer le volume d’inoculum pour atteindre une viabilité initiale de 1.10 7 CFU / mL Corrélations entre DO et viabilité (symbolisées par "⇓◊"): ▪ Saccharomyce cerevisiae CBS 6088 : D.O.600nm = 1⇓◊ 1,1.10 7 CFU/mL ▪ Gluconobacter oxydans ATCC 19357 : D.O.600nm = 1⇓◊ 2,5.10 8 CFU/mL ▪ L acticasei bacillus rhamnosus GG LMG18243 (LGG) : D.O.600nm = 1⇓◊ 6,8.10 7 CFU/mL ▪ Limosilactobacillus fermentum CNCM I-5802 : D.O.600nm = 1⇓◊ 3,0.10 8 UFC/mL ▪ Limosilactobacillus reuteri DSM 17509 : D.O.600nm 1 ⇓◊ 5,0.10 7 UFC/mL ○ Doubler les Erlenmeyers Nutralys® pour chaque souche (2 x 5 souches + 1 Témoin) ○ Ensemencer l’ensemble des essais au plus tôt le matin ○ Réaliser un prélèvement de 5mL env. à t0 sur 1 des 2 Erlenmeyers ○ Réaliser les analyses suivantes : pH, Ethanol (Cedex Bio), Lactate (Cedex Bio), Viabilité (inocula + t0), Acide acétique, DH, Teneur en protéines (N6.25), Matière sèche. ○ Arrêter l’Erlenmeyer Témoin et le transférer en Flacon pour congélation. ○ Après 8h de fermentation, arrêter l’un des 2 Erlenmeyer pour chaque souche testée. ○ Réaliser les analyses suivantes : pH, Ethanol (Cedex Bio), Lactate (Cedex Bio), Viabilité (inocula + t0), Acide acétique, DH, Teneur en protéines (N6.25), Matière sèche. ○ Après 24h de fermentation, arrêter le dernier Erlenmeyer pour chaque souche testée. Réaliser les analyses suivantes : pH, Ethanol (Cedex Bio), Lactate (Cedex Bio), Viabilité (inocula + t0), Acide acétique, DH, Teneur en protéines (N6.25), Matière sèche.