Des bactéries BL21 (LIFE TECH 44-048) ont été transformées par le plasmide pET30a_GPRC5A-C-terminal_poly(R/K)_TEV-cleavage-site_2x-6Histidines, puis cultivées sur boîte de pétri LB-agar supplémenté en kanamycine. Une pré-culture est ensuite réalisée dans laquelle une colonie bactérienne isolée est inoculée dans 100ml de milieu LB BROTH LENNOX (Formedium LBX0102) pendant une nuit à 37°C et 150rpm. A partir de cette pré-culture, les bactéries sont ensemencées à une D.O de 0.15 en milieu HYPER BROTH (ATHENAES AE-0107), puis sont cultivées à 37°C 150rpm. L’évolution de D.O de la culture est suivie toutes les heures afin de tracer une courbe de croissance (ln(DO) au cours du temps). Lors de la phase exponentielle de doublement des bactéries (D.O=0.8-1, environ 2 heures post-ensemencement), 1mM d’IPTG est ajouté au milieu de culture afin de stimuler la production du polypeptide. La culture est ensuite poursuivie jusqu’à la phase stationnaire (environ 6h post-ensemencement), puis les culots bactériens sont récupérés par centrifugation (4000g, 10minutes à 4°C), séparés du surnageant et congelés à -20°C. Lors de l’extraction protéique, les bactéries sont lysées dans un tampon de lyse (PBS1X, 500mM NaCl, 10mM MgCl2, 0.5% Triton X100 – v=1/10 e du volume de culture bactérienne) supplémenté d’inhibiteur de protéases (COMPLETE™ PROTEASE INHIBITOR COKTAIL, ROCHE), DNAse (100µg/ml) et lysozyme (10mg/ml) ; et incubées pendant 30minutes sur roue à 4°C avant de subir une sonication (2x5minutes, pulse 3secondes, amplitude 30). Les débris cellulaires ainsi que la fraction insoluble sont séparés de la fraction soluble par centrifugation (15000g, 15minutes à 4°C). La fraction soluble est ensuite conservée à 4°C, tandis que la fraction insoluble est remise en suspension dans un tampon urée (PBS1X, 8M urée, 500mM NaCl, v=1/4 du volume de tampon de lyse) supplémenté de DNAse (100µg/ml), puis incubée pendant 1heure sur roue à 4°C. Les protéines libérées dans le tampon sont récupérées dans le surnageant par centrifugation (15000g, 15minutes à 4°C) et ajoutées à la fraction soluble préalablement mise de côté. Par la suite, le polypeptide entier est purifié par affinité de son tag 6Histidines avec des billes Ni-NTA (745400 Propino, MACHERY-NAGEL, v=1/1000 e du volume de culture bactérienne). Les billes préalablement lavées au PBS1X sont ajoutées à la suspension protéique et incubées pendant 1heure sur roue à 4°C. Les billes sont ensuite déposées sur colonne (filtre en coton dont la porosité n’excède pas la taille des billes) et la fraction non retenue est éliminée par aspiration grâce à une pompe péristaltique (1ml/minute). Les billes sont ensuite lavées par ajout d’un volume de billes de NaCl à 1M, suivi de 5 volumes de billes de tampon de lavage (PBS1X, 500mM NaCl, 10mM MgCl2, 15mM imidazole). Enfin le polypeptide est élué des billes Ni-NTA par ajout d’un tampon d’élution (PBS1X, EDTA 50mM, v= environ 10 volumes de billes), et dosé (PIERCE™ BCA PROTEIN ASSAY Kit). Sans attendre, le polypeptide en solution est supplémenté de 1mM de DTT puis digéré par ajout de la TEV protéase (SFR BIOSCIENCES – 0,5mg pour 10mg de protéines). Le mélange obtenu est déposé dans un boudin de dialyse rincé au PBS1X (MWCO : 3500Da) et la diffusion contre une solution de PBS1X 500mM NaCl a lieu dans un bécher sous agitation magnétique pendant une nuit à 4°C. Le peptide clivé est finalement purifié en ajoutant comme précédemment des billes Ni-NTA qui fixeront le tag 6Histidines libéré (1ml de billes/50mg de peptide) pendant 1h sur roue à 4°C. Après dépôt de la suspension peptide-billes sur une colonne identique à la précédente, le peptide clivé est récupéré dans la fraction non retenue, dosé puis aliquoté et congelé à -80°C.