INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Peptides Ech 1 Ech 2 Ech 3 Ech 4 Ech 5 Ech 6 Ech 7 Ech 8 Ech 9 Ech 10 FPMMSTFK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui VAGPLLR oui - oui oui oui oui oui oui oui - IHYSQNDLVK oui oui - - - - - - - oui LDHWEPELNEAIPNDER - - - oui - - - - - - LDSWEPELNEAIPNDER - - - - - - - - - oui SGASER oui - - - - - - - oui - SGAGK - - - - - - - - - - SGTGK - - - - - - - - - - DAEDQLGAR - - - oui - - oui oui oui - DTTMPAAMATTLR oui - oui oui oui oui oui - oui - DTTTPAAMATTLR - - - - - - - oui - - EPELNEAIPNDER - - - - - - - - - - FPMLSTFK - - - - - - - - - - FPMVSTFK - - - - - - - - - - GIIAALGPDGKPSR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui GSSGIIAALGPDGKPSR - - - - - - - - - - IHYSQNDLVEYSPVTEK oui - oui oui oui oui oui oui oui - IVVIYMTGSQATMDER - - - - - - - - - - IVVIYTTGSQATMDELNR - - - - - - - - - - IVVIYTTGSQATMDEQNR - - - - - - - - - - IVVIYTTGSQATMDER oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui SALPAGWFIADK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui SGAGER - - oui oui - - - oui - - VDAGQEQLGR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui VGYIELDLNSGK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui WEPELNEAIPNDER oui - oui - oui oui oui oui oui - TGASER - - - - - oui - - - - TGASK - - - - - - - - - - DTTTPASMAATLR oui - - - oui oui - - - - GIVALLGPNNK oui - - - oui oui - - - - LSESQLSGR - - - - - oui - - - - QIGDNVTR - - - - oui oui - - - - QLLQWMVDDR - - - - oui oui - - - - QSESQLSGR - - - - oui oui - - - - TGAGER - - - - - oui oui - - - VGMIEMDLASGR oui - - - oui oui - - - - AVIESENSAER oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui FGFTSR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui FVNILMVDGK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui LQLVGVGYR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui NMAGSLVR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui NYITESGK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui QLGEDPWVAIAK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui VANLGSLGDQVNVK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui
Peptides Ech 11 Ech 12 Ech 13 Ech 14 Ech 15 Ech 16 Ech 17 Ech 18 Ech 19 Ech 20 FPMMSTFK oui - - - - oui oui oui oui oui VAGPLLR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui IHYSQNDLVK - - - - - - - oui oui - LDHWEPELNEAIPNDER - - - - - - - oui - - LDSWEPELNEAIPNDER - - - - - oui oui - - - SGASER - - - - - - - - oui - SGAGK - - - - - - - - - - SGTGK - - - - - - - - - - DAEDQLGAR oui - oui - oui oui oui - oui oui DTTMPAAMATTLR oui - oui - oui oui oui oui - oui DTTTPAAMATTLR - - - - - - - - oui - EPELNEAIPNDER - - - - - - - - - - FPMLSTFK - - oui - oui - - - - - FPMVSTFK - - - - - - - - - - GIIAALGPDGKPSR - - oui - oui oui oui oui oui oui GSSGIIAALGPDGKPSR oui - - - - - - - - - IHYSQNDLVEYSPVTEK oui - oui - oui oui oui oui - oui IVVIYMTGSQATMDER - - - - - - - - - - IVVIYTTGSQATMDELNR - - - - - - - - - - IVVIYTTGSQATMDEQNR - - - - - - - - - - IVVIYTTGSQATMDER oui - oui oui oui oui oui oui oui oui SALPAGWFIADK oui - oui - oui oui oui oui oui oui SGAGER oui - oui - oui oui oui oui - oui VDAGQEQLGR oui - oui - oui oui oui oui oui oui VGYIELDLNSGK oui - oui oui oui oui oui oui oui oui WEPELNEAIPNDER oui - oui - oui - - - oui oui TGASER - - - - - - - - - - TGASK - - - - - - - - - - DTTTPASMAATLR - oui - oui - - - - - - GIVALLGPNNK - oui - oui - - - - - - LSESQLSGR - - - - - - - - - - QIGDNVTR - - - oui - - - - - - QLLQWMVDDR - - - - - - - - - - QSESQLSGR - - - - - - - - - - TGAGER - - - - - - - - - - VGMIEMDLASGR - oui - oui - - - - - - AVIESENSAER oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui FGFTSR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui FVNILMVDGK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui LQLVGVGYR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui NMAGSLVR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui NYITESGK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui QLGEDPWVAIAK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui VANLGSLGDQVNVK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui
Peptides Ech 21 Ech 22 Ech 23 Ech 24 Ech 25 Ech 26 Ech 27 Ech 28 Ech 29 Ech 30 FPMMSTFK oui - - - oui oui oui oui - oui VAGPLLR oui - - - oui oui oui oui oui oui IHYSQNDLVK - - - - - - - oui - oui LDHWEPELNEAIPNDER - - - - oui oui oui oui - oui LDSWEPELNEAIPNDER - - - - - - - - oui - SGASER - - - - - - - - - - SGAGK - - - - - - oui - - - SGTGK - - - - - - - - - - DAEDQLGAR - - - - oui oui oui oui oui oui DTTMPAAMATTLR - - - - oui oui oui oui oui oui DTTTPAAMATTLR - - - - - - - - - - EPELNEAIPNDER - - - - - - - - - - FPMLSTFK - - - - - - - - oui oui FPMVSTFK - - - - - - - - - - GIIAALGPDGKPSR - - oui oui oui oui oui oui oui oui GSSGIIAALGPDGKPSR - - - - - - - - - - IHYSQNDLVEYSPVTEK - - - - oui oui oui - oui oui IVVIYMTGSQATMDER - - - - - - - - - - IVVIYTTGSQATMDELNR - - - - - - - - - - IVVIYTTGSQATMDEQNR - - - - - - - - - - IVVIYTTGSQATMDER oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui SALPAGWFIADK - - oui oui oui oui oui oui oui oui SGAGER - - - - oui - - oui oui oui VDAGQEQLGR - - oui - oui oui oui oui oui oui VGYIELDLNSGK - - oui - oui oui oui oui oui oui WEPELNEAIPNDER - - - - - - - - - - TGASER - - - - - - - - - - TGASK - - - - - - - - - - DTTTPASMAATLR oui - oui - - - - - - - GIVALLGPNNK oui - - - - - - - - - LSESQLSGR oui - - - - - - - - - QIGDNVTR oui - - - - - - - - - QLLQWMVDDR oui - - - - - - - - - QSESQLSGR - - - - - - - - - - TGAGER - - - - - - - - - - VGMIEMDLASGR oui oui - - - - - - - - AVIESENSAER oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui FGFTSR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui FVNILMVDGK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui LQLVGVGYR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui NMAGSLVR oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui NYITESGK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui QLGEDPWVAIAK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui VANLGSLGDQVNVK oui oui oui oui oui oui oui oui oui oui
Tous les échantillons testés présentent au minimum un peptide spécifique d’une enzyme de type TEM ou SHV. Les souches bactériennes testées sont donc résistantes a minima à l’action des pénicillines et des céphalosporines de première génération.
Les échantillons Ech 1, Ech 2, Ech 4, Ech 6, Ech 9, Ech 10, Ech 16, Ech 17, Ech 18, Ech 19, Ech 25, Ech 26, Ech 27, Ech 28, Ech 29, Ech 30 contiennent au moins un peptide spécifique du caractère BLSE de ces enzymes. Ces souches bactériennes sont donc résistantes aux pénicillines, aux céphalosporines de première à quatrième génération, et aux monobactames.
Au moins un peptide parmi SGAGER, SGASER, SGAGK, SGTGK, TGAGER, TGASER et TGASK a été détecté dans les échantillons Ech 1, Ech 3, Ech 4, Ech 6, Ech 7, Ech 9, Ech 11, Ech 13, Ech 15, Ech 16, Ech 17, Ech 18, Ech 19, Ech 20, Ech 25, Ech 27, Ech 28, Ech 29 et Ech 30.
La montre un chromatogramme qui illustre la détection du peptide SGAGK (SEQ ID NO. 8) dans l’échantillon Ech 27.
Parmi les échantillons avec une activité enzymatique de type BLSE cités ci-dessus, les échantillons Ech 6 et Ech 9 ont eu leur profil de résistance correctement caractérisé grâce à l’identification de peptides à 6 acides aminés, respectivement TGASER (SEQ ID NO. 25) et SGASER (SEQ ID NO. 7), qui sont les seuls peptides spécifiques aux BLSE retrouvés dans ces échantillons.
La méthode d’analyse selon l’invention, utilisant l’HFBA pour mieux retenir certains peptides, permet donc d’identifier des souches d’entérobactéries à caractère BLSE qui n’auraient pas pu être détectées en conditions chromatographiques classiques (phase inverse et phase mobile usuelle).
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Selon un mode de réalisation particulier, l’évaluation de la viabilité des bactéries selon l’étape c) se fait à l’aide de capteurs optomécaniques.
Selon un mode de réalisation plus particulier, l’évaluation de la viabilité des bactéries selon l’étape c) se fait à l’aide de capteurs optomécaniques comportant un support, au moins un guide d’onde, au moins un résonateur optique suspendu au support, ledit résonateur optique étant couplé optiquement au guide d’onde, au moins un résonateur mécanique suspendu au support, ledit résonateur mécanique et ledit résonateur optique étant couplés, ledit résonateur mécanique étant configuré pour vibrer en mode de volume et comportant au moins une face s’étendant dans le plan du capteur et configurée pour recevoir des molécules de ladite espèce donnée, au moins ladite face comportant respectivement l’ensemble A, l’ensemble B, et le au moins un ensemble C respectivement, ledit résonateur mécanique présentant une dimension faible dans une direction normale au plan du capteur par rapport aux dimensions de ladite face.
Selon un mode de réalisation particulier, l’évaluation de la viabilité des bactéries selon l’étape c) se fait à l’aide d’une microbalance à quartz.
Par exemple, chaque ensemble A, B et C peut être déposé sur une microbalance à quartz, et la fréquence de résonnance lue à un temps déterminé, par exemple toutes les minutes. Une augmentation de la fréquence de résonnance correspond à une augmentation de la masse, et ainsi à une croissance bactérienne, et donc à un milieu susceptible d’être favorable à la croissance bactérienne car exempt de polluant. Par ailleurs, une fréquence stable correspond à une masse constante, c’est-à-dire que les bactéries étudiées ne sont ni en croissance, ni en décroissance, car les bactéries qui meurent sont par exemple remplacées par les nouvelles. Enfin, si la fréquence de résonnance diminue, cela signifie très généralement que la masse de l’ensemble diminue, et donc que les bactéries meurent dans le milieu. Ceci est susceptible de signifier, en particulier si cela concerne l’ensemble A et éventuellement l’ensemble B, qu’il y a présence de polluant.
Tel qu’on l’utilise dans la présente description, le terme « environ » se réfère à un intervalle de valeurs de ± 10 % d’une valeur spécifique. A titre d’exemple, l’expression « environ 20 » comprend les valeurs de 20 ± 10 %, soit les valeurs de 18 à 22.
Tel qu'il est utilisé ici, le terme "alkyle" désigne un groupe alkyle à chaîne linéaire ou ramifiée ayant le nombre d’atomes de carbone indiqué avant ledit terme, notamment 1 à 8 atomes de carbone, tel que méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, sec-butyle, tert-butyle, pentyle, isoamyle, néopentyle, 1-éthylpropyle, 3-méthylpentyle, 2,2-diméthylbutyle, 2,3-diméthylbutyle, hexyle, octyle, etc. Ainsi, une expression telle que "alkyle en C1-C4" désigne un radical alkyle contenant de 1 à 4 atomes de carbone. Il en est de même pour le terme « alcane ».
Tel qu'il est utilisé ici, le terme "hétéroarène" désigne un système aromatique cyclique contenant 5 à 10 atomes de carbone dans lequel un ou plusieurs atomes de carbone du cycle sont remplacés par au moins un hétéroatome tel que -O-, -N- ou -S-. Les exemples d’hétéroarènes comprennent pyrrole, furane, thiophène, pyrazole, imidazole, thiazole, isothiazole, isoxazole, oxazole, oxathiol, oxadiazole, triazole, oxatriazole, furazane, tétrazole, pyridine, pyrazine, pyrimidine, pyridazine, triazine, indole, isoindole, indazole, benzofurane, isobenzofurane, purine, quinazoline, quinoline, isoquinoline, benzoimidazole, benzothiazole, benzothiophène, thianaphtène, benzoxazole, benzisoxazole, cinnoline, phtalazine, naphtyridine et quinoxaline. Sont inclus dans la définition d'"hétéroarène" les systèmes cycliques condensés, y compris, par exemple, les systèmes cycliques dans lesquels un cycle aromatique est condensé à un cycle hétérocycloalkyle. Les exemples de tels systèmes cycliques fusionnés comprennent, par exemple, le phtalamide, l'anhydride phtalique, l'indoline, l'isoindoline, la tétrahydroisoquinoline, le chromane, l'isochromane, le chromène et l'isochromène.
SEQ ID NO :1 Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg Asp Gly Ile Ile Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala Thr Gln Ile Ala Lys SEQ ID NO :2 Lys Trp Lys Val Phe Lys Lys Ile Glu Lys Met Gly Arg Asn Ile Arg Asn Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Ile Ala Val Leu Gly Glu Ala Lys Ala Leu SEQ ID NO :3 Ser Trp Leu Ser Lys Thr Ala Lys Lys Leu Glu Asn Ser Ala Lys Lys rg Ile Ser Glu Gly Ile Ala Ile Ala Ile Gln Gly Gly Pro Arg SEQ ID NO :4 Met Asn Phe Asn Lys Val Phe Ile Leu Val Ala Ile Val Ile Ala Ile Phe Ala Gly Gln Thr Glu Ala Gly Trp Leu Lys Lys Ile Gly Lys Lys Ile Glu Arg Val Gly Gln His Thr Arg Asp Ala Thr Ile Gln Thr Ile Ala Val Ala Gln Gln Ala Ala Asn Val Ala Ala Thr Ala Arg Gly SEQ ID NO :5 Arg Trp Lys Ile Phe Lys Lys Ile Glu Lys Val Gly Gln Asn Ile Arg Asp Gly Ile Val Lys Ala Gly Pro Ala Val Ala Val Val Gly Gln Ala Ala Thr Ile SEQ ID NO :6 Met Arg Thr Leu Thr Ile Leu Thr Ala Val Leu Leu Val Ala Leu Gln Ala Lys Ala Glu Pro Leu Gln Ala Glu Asp Asp Pro Leu Gln Ala Lys Ala Tyr Glu Ala Asp Ala Gln Glu Gln Arg Gly Ala Asn Asp Gln Asp Phe Ala Val Ser Phe Ala Glu Asp Ala Ser Ser Ser Leu Arg Ala Leu Gly Ser Thr Arg Ala Phe Thr Cys His Cys Arg Arg Ser Cys Tyr Ser Thr Glu Tyr Ser Tyr Gly Thr Cys Thr Val Met Gly Ile Asn His Arg Phe Cys Cys Leu SEQ ID NO :7 Met Arg Thr Ile Ala Ile Leu Ala Ala Ile Leu Leu Val Ala Leu Gln Ala Gln Ala Glu Ser Leu Gln Glu Arg Ala Asp Glu Ala Thr Thr Gln Lys Gln Ser Gly Glu Asp Asn Gln Asp Leu Ala Ile Ser Phe Ala Gly Asn Gly Leu Ser Ala Leu Arg Thr Ser Gly Ser Gln Ala Arg Ala Thr Cys Tyr Cys Arg Thr Gly Arg Cys Ala Thr Arg Glu Ser Leu Ser Gly Val Cys Glu Ile Ser Gly Arg Leu Tyr Arg Leu Cys Cys Arg SEQ ID NO :8 Gly Ile Gly Lys Phe Leu His Ser Ala Gly Lys Phe Gly Lys Ala Phe Leu Gly Glu Val Met Lys Ser SEQ ID NO :9 Gly Ile Lys Glu Phe Ala His Ser Leu Gly Lys Phe Gly Lys Ala Phe Val Gly Gly Ile Leu Asn Gln SEQ ID NO :10 Met Ala Phe Leu Lys Lys Ser Leu Phe Leu Val Leu Phe Leu Gly Met Val Ser Leu Ser Ile Cys Glu Glu Glu Lys Arg Glu Asn Glu Asp Glu Glu Leu Gln Glu Asp Asp Glu Gln Ser Glu Met Lys Arg Gly Leu Trp Ser Thr Ile Lys Asn Val Gly Lys Glu Ala Ala Ile Ala Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Leu SEQ ID NO :11 Met Asp Ile Leu Lys Lys Ser Leu Phe Leu Val Leu Phe Leu Gly Leu Val Ser Leu Ser Ile Cys Glu Glu Glu Lys Arg Glu Asn Glu Asp Glu Glu Lys Gln Glu Asp Asp Glu Gln Ser Glu Met Lys Arg Ala Leu Trp Lys Thr Met Leu Lys Lys Leu Gly Thr Met Ala Leu His Ala Gly Lys Ala Ala Leu Gly Ala Ala Ala Asp Thr Ile Ser Gln Gly Thr Gln
FIGURES La présente un protocole de fabrication des biocapteurs selon l’exemple 1.
Les étapes illustrées sont comme suit :
1. Amincissement de la couche supérieure de Si
2. Oxydation thermique
Les variants de TEM les plus fréquemment retrouvés en France sont reportés dans le TABLEAU 2 . Les parties de la séquence protéique en gras dans le tableau correspondent aux peptides à suivre pour connaître le profil de résistance du variant étudié.
Les variants de SHV les plus fréquemment retrouvés en France sont reportés dans le TABLEAU 3 . Les parties de la séquence protéique en gras dans le tableau correspondent aux peptides à suivre pour connaître le profil de résistance du variant étudié.
Variants de SHV Séquence (source = http://www.bldb.eu/) SEQ ID NO. Activité / résistance SHV-1 MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADK TGAGER GARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 59 pénicillinase plasmidique ou chromosomique (Klebsiella pneumoniae) SHV-2 MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADK TGASER GARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 60 β-lactamases à spectre étendu SHV-5 MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADK TGASK RGARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 61 β-lactamases à spectre étendu SHV-11 MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKQSESQLSGRVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADK TGAGER GARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 62 pénicillinase chromosomique (Klebsiella pneumoniae) SHV-12 MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKQSESQLSGRVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADK TGASK RGARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 63 β-lactamases à spectre étendu SHV-27 MRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIDDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADK TGAGER GARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 64 pénicillinase chromosomique (Klebsiella pneumoniae) SHV-28 MRFIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADK TGAGER GARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 65 pénicillinase chromosomique (Klebsiella pneumoniae) SHV-76 MRYIRLCIISLLAALPLAVHASPQPLEQIKQSESQLSGRVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVEDRVAGPLIRSVLPAGWFIADK TGAGER GARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 66 pénicillinase chromosomique (Klebsiella pneumoniae) SHV-187 MVKRYIRLCIISLLATLPLAVHASPQPLEQIKLSESQLSGRVGMIEMDLASGRTLTAWRADERFPMMSTFKVVLCGAVLARVDAGDEQLERKIHYRQQDLVDYSPVSEKHLADGMTVGELCAAAITMSDNSAANLLLATVGGPAGLTAFLRQIGDNVTRLDRWETELNEALPGDARDTTTPASMAATLRKLLTSQRLSARSQRQLLQWMVDDRVAGPLIRSVLPAGWFIADK TGAGER GARGIVALLGPNNKAERIVVIYLRDTPASMAERNQQIAGIGAALIEHWQR 67 pénicillinase chromosomique (Klebsiella pneumoniae)
Exemple 2. Ajustement des paramètres pour optimiser le temps de rétention des peptides
Plusieurs concentrations en acide heptafluorobutyrique (HFBA) ont été testées dans le cadre de la mise au point du procédé selon l’invention.
En pratique, 5 µL de solution d'HFBA ont été injectés dans la colonne de chromatographie avant l'injection de 5 µL d'échantillon de mélange de peptides ; ce mélange de peptides est compris dans une solution aqueuse acide comprenant 2% d’acide formique (FA), cette acidification du milieu permettant de stopper la digestion enzymatique par la trypsine.
Les pourcentages suivants ont été testés : - 0.05% de HFBA (3.8 mM) - 0.1 % HFBA (7.6 mM) - 0.2 % HFBA (16.2 mM) - 0.3 % HFBA (23.8 mM) - 0.4 % HFBA (31.4 mM) - 0.5 % HFBA (38 mM)
Les résultats obtenus pour 7 peptides : SGASER (SEQ ID NO.7), SGAGER (SEQ ID NO.21), TGASER (SEQ ID NO.25), TGAGER (SEQ ID NO.33), SGAGK (SEQ ID NO.8), TGASK (SEQ ID NO.26), et SGTGK (SEQ ID NO.9), sont présentés en .
Il apparait clairement que la rétention des peptides constitués de 5 ou 6 acides aminés est satisfaisante à partir d’un pourcentage de 0.4 % (31 mM) de HFBA.
Exemple 3. Identification des profils de résistance (BLSE ou pénicillinase) de souches d’entérobactéries exprimant une enzyme de type TEM ou SHV
Les échantillons bactériens qui ont été analysés par LC-MS/MS sont reportés dans le TABLEAU 4 . Ces échantillons sont des géloses (culture bactérienne), mais l’analyse qui est présentée peut également être effectuée avec des hémocultures.
Noms Enzymes Espèces d’entérobactéries Ech 1 TEM-3 K. pneumoniae Ech 2 TEM-24 P. mirabilis Ech 3 TEM-2 E. cloacae Ech 4 TEM-29 E. coli Ech 5 SHV-12 TEM-1 C. freundii Ech 6 SHV-2 TEM-1 K. pneumoniae Ech 7 TEM-1 K. pneumoniae (variicola) Ech 8 TEM-135 R. ornithinolytica Ech 9 TEM-19 E. coli Ech 10 TEM-24 P. mirabilis Ech 11 TEM-30 E. coli Ech 12 SHV-11 K. pneumoniae Ech 13 TEM-33 E. coli Ech 14 SHV-76 K. pneumoniae Ech 15 TEM-40 E. coli Ech 16 TEM-12 E. coli Ech 17 TEM-12 E. coli Ech 18 TEM-1 TEM-16 K. oxytoca Ech 19 TEM-52 E. coli Ech 20 TEM-3 E. coli Ech 21 SHV-5 E. coli Ech 22 SHV-4 E. coli Ech 23 TEM-8 K. pneumoniae Ech 24 TEM-154 E. coli Ech 25 TEM-29 E. coli Ech 26 TEM-28 E. coli Ech 27 TEM-28 E. coli Ech 28 TEM-6 E. coli Ech 29 TEM-158 E. coli Ech 30 TEM-109 E. coli
Tous ces échantillons ont été soumis à une digestion enzymatique. Le protocole qui a été utilisé est le suivant. Les 3 premières étapes sont facultatives et ne sont réalisées que si une pré-concentration de l’échantillon est nécessaire.
Centrifugation de 1 mL de culture bactérienne à 10000 rpm pendant 5 minutes Elimination du surnageant, conservation uniquement du culot bactérien Reprise de l’échantillon dans 200 µL d’eau (MS grade) Ajout de bille de verre (environ 1/3 du volume final) Ajout de 50 µL d’une solution de trypsine (1 mg/mL dans du bicarbonate d’ammonium à 150 mmol) Passage aux ultrasons (Bioruptor® de Diagenode), 10 cycles de 30 secondes ultrasons et 30 secondes de repos à 50°C Arrêt de la digestion avec 5 µL d’acide formique Centrifugation de l’échantillon à 10000rpm pendant 5 minutes Analyse du surnageant (mélange de peptides) par LC-MS/MS.
Les conditions chromatographiques pour les analyses sont les suivantes :
3. Marquages d’alignement pour la lithographie
4. Fabrication du réseau optique (entrée et sortie)
5. Fabrication des guides optiques, des microdisques et des électrodes.
a) Dépôt chimique en phase vapeur à basse pression et création d'un masque dur d'oxyde de silane (SiH 4 ) à haute température
b) Lithogravure de la couche supérieure de Si et élimination des résidus
c) Elimination du SiH 4 et des oxydes natifs
6. Fabrication des électrodes en AlSi
a) Seconde oxydation thermique
b) Dopage localisé de Si
c) Dépôt chimique en phase vapeur d’oxyde de SiH 4 , aplanissement et modelage (oxyde de SiH 4 )
d) Dépôt en phase vapeur de AlSi
e) Aplanissement chimico-mécanique de AlSi
7. Formation du socle du microdisque
a) Gravure à la vapeur d'acide fluorhydrique des couches de SiH 4 et des oxydes natifs
b) Gravure à la vapeur d'acide fluorhydrique de la couche d'oxyde (BOX).
EXEMPLES Exemple 1 : Fabrication de biocapteurs optomécaniques surmontés de graphène fonctionnalisé selon l’invention
La présente invention se base sur une technique d’analyse dite « ascendante » telle que définie ci-dessus.
Selon une mise en œuvre de l’invention, l’analyse par spectrométrie de masse est ciblée pendant l’analyse (mode de type SRM/MRM, MRM3, PRM) ou après l’analyse (mode de type DIA/SWATH).
L'analyseur de masse dans lequel est mis en œuvre l'étape de séparation des marqueurs ionisés en fonction de leur rapport masse/charge (m/z) est tout analyseur de masse connu de l'homme du métier. On peut citer les analyseurs basse résolution, du type quadripôle ou quadrupôle (Q), piège à ions 3D (IT) ou linéaire (LIT), également appelés trappe ionique, et les analyseurs haute résolution, permettant de mesurer la masse exacte des analytes et qui utilisent notamment le secteur magnétique couplé à un secteur électrique, le temps de vol (TOF), et l’orbitrap.