INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le retardateur optique 28 dans le trajet commun est choisi pour présenter une retardance optique (par exemple demi-onde ou quart d’onde) relativement stable en longueur d’onde, de la longueur d’onde du laser jusqu’à la longueur d’onde la plus élevée usuellement observée en microscopie Raman ou de PL ou de fluorescence. Par exemple, si le laser utilisé émet à une longueur d’onde de 532nm, et que le spectre Raman utile s’étend jusqu’à 650 nm, on choisit une lame d’onde dont la retardance optique est optimale autour de la longueur d’onde centrale de 585nm.
Dans certaines applications, il peut être utile d’observer la réponse Raman à des excitations en polarisation plus complexes que linéaire ou circulaire. La présente divulgation prévoit de placer un retardateur optique 28 inhomogène spatialement dans le trajet commun. Un tel retardateur optique 28 non uniforme, est par exemple constitué d’un retardateur pixellisé, ou encore un retardateur de type vortex. L’utilisation d’un tel retardateur optique 28 inhomogène spatialement permet de mesurer la réponse Raman selon le mode d’excitation et orthogonale au mode d’excitation, dans une seule opération.
L’appareil 100 permet de contrôler le retardateur optique 28, pour effectuer différentes mesures au choix de l’utilisateur.
Ainsi, l’utilisateur peut effectuer des mesures résolues angulairement en polarisation linéaire, en plaçant une lame demi-onde 28 dans le trajet commun, et en acquérant des mesures de spectres en fonction de l’orientation de la lame demi-onde.
Ces résultats peuvent être représentés sous forme de diagrammes polaires à différentes longueurs d’onde. Ils peuvent aussi être représentés sous la forme du spectre du degré de polarisation, c’est-à-dire l’intensité selon une polarisation divisé par la somme des intensités relatives aux deux polarisations orthogonales détectées. En variante, les résultats peuvent être représentés sous forme de rapport entre les intensités relatives aux deux polarisations orthogonales détectées.
Dans une autre utilisation, l’utilisateur peut effectuer des mesures en polarisation circulaire en plaçant une lame quart d’onde 28 dans le trajet commun, et en mesurant les deux spectres correspondant aux polarisation circulaire droite et gauche. Ces résultats peuvent être représentés sous forme de rapport entre les deux spectres relatifs à la polarisation croisée sur la co-polarisation.
Le LPS utilisé dans notre protocole (E. Coli O111 : B4, Sigma-Aldrich, USA) a été préparé en conditions stériles. Pour chaque souris, 10 mg.kg -1 de LPS ont été dilués dans du PBS pour obtenir un volume final de 50 µL. Pour le protocole d'agression aigue pulmonaire induite par le LPS, les souris ont été placées sous anesthésie générale par injection intrapéritonéale de 75 mg.kg -1 de kétamine et de 0,5 mg.kg -1 demedetomidine, puis, la solution contenant le LPS a été administrée par instillation intratrachéale. L'anesthésie générale a ensuite été antagonisée comme précédemment décrit.
1.7 Évaluation clinique quotidienne et mesure non invasive de l'oxymétrie
Dans chaque protocole, un examen clinique quotidien des souris a été réalisé afin d’évaluer la viabilité de la souris et de mesurer son poids. Un enregistrement continu non invasif de l'oxymétrie transcutanée, du rythme cardiaque ainsi que de la fréquence respiratoire a été réalisé sur souris vigile quotidiennement par le dispositif MouseOx® Plus device (Starr Life Sciences Corp, USA). Toutes les données obtenues ont été moyennées sur une durée d'enregistrement continue durant entre 5 et 10 minutes.
1.8 Prélèvement biologiques et bio-conservation
Immédiatement après le sacrifice de la souris, des prélèvements sanguins et des lavages broncho-alvéolaires (LBA) ont été réalisés et les poumons ont été prélevées. Les prélèvements sanguins ont été réalisés par section des gros vaisseaux thoraciques et stockés dans des aliquotes placés à température ambiante jusqu'à coagulation complète. Au décours, les aliquotes de sang coagulés ont été centrifugés à 1500g pendant 5 minutes à température ambiante. Le sérum et le culot de centrifugation ont alors été séparés et le sérum a été conservé à -20°C. Les LBA ont été réalisés uniquement sur le poumon droit après ligature soigneuse de la bronche souche du poumon gauche, par deux lavages successifs de 500 µL de PBS stérile, puis stockés immédiatement dans des aliquots placés dans de la glace. Les LBA ont alors été centrifugés à 1500g pendant 10 minutes à 4°C. Le surnageant et le culot de centrifugation ont été séparés et le surnageant conservé à -20°C. Le culot de centrifugation a été suspendu à nouveau dans 1 mL de PBS et homogénéisé. Les cellules re-suspendues ont été comptées manuellement sur cellule de Thoma. 100 000 cellules ont alors été étalées sur une lame de verre grâce à un Shandon Cytospin 4 (Thermo electron corporation, USA), puis colorées par une coloration de May-Grünwald Giemsa. Le poumon gauche a été placé dans une solution d'Antigenfix® (réf. 2545826, MM FRANCE, France) pendant 4 heures, rincé par deux bains successifs de PBS, puis progressivement déshydraté par immersion successive dans des bains d’alcool ayant une concentration croissante. Les pièces de poumons ont ensuite été placées dans un bain de Diasolv® (réf. 2545839, MM FRANCE, France) pendant 30 minutes puis inclues en paraffine pendant toute une nuit.
1.9 Comptage des cellules inflammatoire et examen histologique
Pour chaque spot cellulaire de LBA préparé par Cytospin, un minimum de 200 cellules ont été manuellement comptées par un opérateur en aveugle du groupe expérimental de la souris étudiée. Chaque leucocyte visualisé a été catégorisé en tant que polynucléaire neutrophile, macrophage/monocyte, ou lymphocyte. Les proportions respectives et les nombres absolus de chaque type cellulaire ont été calculés. Les poumons inclus en paraffine ont été préparés pour l’analyse histologique à l’aide d’un microtome de façon à obtenir des coupes de 5 µm d’épaisseur. Les lames ont ensuite été colorées et examinées par un anatomopathologiste entrainé et en aveugle du groupe expérimental de la souris, de manière à déterminer le score Lung Injury Scoring System (LISS) comme décrit par [10].
1.10 Détermination de la concentration en protéines totale, en mMPO, en mTNFα et en endocan dans les échantillons
Les échantillons de sérum et de LBA ont été décongelés puis homogénéisés par agitation. La concentration en protéines des LBA a été déterminée par le kit Pierce™ BCA Protein Assay (réf. 23227, Thermo Fisher Scientific, USA). La concentration des LBA en mMPO a été déterminée par le kit mMPO DuoSet ELISA kit (réf. DY3667, R&D Systems, USA). La concentration des LBA en mTNFα a été déterminée par le kit mTNFα DuoSet ELISA (réf. DY410, R&D Systems, USA). Le dosage des taux sériques en endocan a été réalisé par le kit DIYEK M1 ELISA kit (réf. LIK-1101, Biothelis, France).
1.11 Statistiques
Toutes les analyses statistiques ont été réalisé avec le logiciel SPPS® 26 software (IBM, USA) pour Windows et tous les graphiques présentés avec le logiciel GraphPad Prism 6.0 software. La normalité des variables quantitatives n’a pas été retenue du fait des faibles effectifs. Un test de Mann–Whitney a été utilisé pour comparer la distribution des variables quantitatives non appariées. Pour le premier protocole, l’évaluation de l’effet du groupe expérimental de chaque souris sur les paramètres inflammatoires et l’évolution de l’oxymétrie, a été testé à l’aide d’un modèle mixe linéaire sur l’ensemble de la période étudiée de J0 à J10 en utilisant une approximation de Satterwaite. La variable « Groupe » a été considérée comme un effet fixe et la variable « Temps » comme un effet variable. Nous avons évalué l’effet du groupe expérimental de la même manière pour l’évolution de l’oxymétrie dans le second protocole. Les distributions des évaluations répétées dans le temps d’une même variable quantitative ont été testées par un test de Kruskal-Wallis. Tous les tests ont été réalisés en bilatéral avec un risque alpha fixé à 0.05.
2. Résultats
2.1 L’endocan endogène murin diminue la sévérité de l’inflammation aigue pulmonaire et améliore la dysfonction physiologique pulmonaire.
Dans notre premier modèle d’inflammation aigue pulmonaire induite par le LPS, nous avons mis en évidence que le taux sérique d’endocan variait en fonction du temps (p -1 [2.39; 2.78] à J0, 0.42 [0.35; 0.68] à H12 et 2.28 [1.94; 2.57] à J10.
Nous avons observé sur l’ensemble de la période allant de J0 à J10, que les phénomènes de diapédèse leucocytaire étaient moins importants chez les souris WT que chez les souris Esm1 -/- (p -/- (respectivement à J1: 450x10 3 cellules [340; 465] vs 775 x10 3 cellules [700; 1500] p 3 cellules [870; 1140] vs 1440x10 3 cellules [1130; 1850] p = 0.011, à J4: 1365x10 3 cellules [985; 2180] vs 2280x10 3 cellules [1520; 3010] p = 0.03 et à J5: 945x10 3 cellules [690; 1160] vs 2270x10 3 cellules [2090; 3300] p = 0.004) (Figure 2B). Le taux maximal de recrutement de leucocytes se situait à J3 pour les souris WT et J4 pour les souris Esm1 -/- .
Sur la même période, des résultats comparables étaient trouvés pour les polynucléaires neutrophiles avec une diminution du nombre de neutrophiles retrouvés chez les souris WT versus les souris Esm1 -/- (p -/- à J1, J2, J4 et J5 (respectivement à J1: 335x10 3 cellules [278; 406] vs 696 x10 3 cellules [602; 1425] p = 0.003, à J2: 853x10 3 cellules [689; 950] vs 1117x10 3 cellules [1029; 1756] p = 0.007, à J4: 577x10 3 cellules [195; 1765] vs 1932x10 3 cellules [1251; 2153] p = 0.02 et à J5: 365x10 3 cellules [198; 646] vs 1636x10 3 cellules [1407; 1698] p = 0.01) (Figure 2C). Le recrutement maximal des neutrophiles était observé à J3 pour les souris WT contre J4 pour les souris Esm1 -/- .
L'échantillon de sang dans lequel la quantité d’ESM-1 est mesurée peut être le sang total, le sérum ou le plasma.
L’étape a) ne se limite pas à une méthode particulière pour mesurer la quantité d’ESM-1 dans l’échantillon de sang. La quantité d’ESM-1 dans un échantillon de sang peut être mesurée par n’importe quelle méthode permettant de mesurer la quantité d’une protéine dans un échantillon de sang. Il peut par exemple s’agir d’une méthode de détection directe ou indirecte.
Une fois que l'échantillon sanguin du patient est préparé, la concentration d'ESM-1 peut être mesurée par n'importe quel procédé connu dans l'art. Par exemple, la concentration d'ESM-1 peut être mesurée en utilisant des techniques électrophorétiques et immunodiagnostiques standard, y compris des dosages immunologiques tels que des dosages de type compétition, réaction directe ou sandwich. De tels tests comprennent, mais sans s'y limiter, les Western Blot, les tests d'agglutination, les dosages immunoenzymatiques, tel que l’ELISA, les dosages de type biotine/avidine, les radio-immunoessais, l’immunoélectrophorèse, l’immunoprécipitation, la chromatographie liquide haute performance (FIPLC), la chromatographie d'exclusion stérique, l’affinité en phase solide, etc.
Dans un mode de réalisation particulier, de tels procédés comprennent la mise en contact de l'échantillon de sang avec un partenaire de liaison capable d'interagir sélectivement avec l’ESM-1 présent dans l'échantillon de sang. Le partenaire de liaison peut être généralement un anticorps qui peut être polyclonal ou monoclonal, de préférence monoclonal. Des anticorps polyclonaux dirigés contre l’ESM-1 peuvent être produits selon des procédés connus en administrant l'antigène ou l'épitope approprié à un animal hôte choisi, par exemple, parmi les porcs, les vaches, les chevaux, les lapins, les chèvres, les moutons et les souris, entre autres. Divers adjuvants connus dans l'art peuvent être utilisés pour augmenter la production d'anticorps. Bien que les anticorps utiles dans la mise en pratique de l'invention puissent être polyclonaux, les anticorps monoclonaux sont préférés. Les anticorps monoclonaux contre l’ESM-1 peuvent être préparés et isolés en utilisant toute technique qui permet la production d'anticorps par des lignées cellulaires continues en culture. Les techniques de production et d'isolement comprennent, mais sans s'y limiter, la technique d'hybridome. En variante, les techniques décrites pour la production d'anticorps monocaténaires (voir par exemple le brevet US n°4 946 778) peuvent être adaptées pour produire des anticorps monocaténaires anti-ESM-1. Les anticorps utiles dans la mise en pratique de la présente invention comprennent également des fragments anti-ESM-1 comprenant, mais sans s'y limiter, des fragments F(ab') 2, qui peuvent être générés par digestion à la pepsine d'une molécule d'anticorps intacte, et des fragments Fab, qui peuvent être générés par réduction des ponts disulfure des fragments F(ab') 2. En variante, des bibliothèques d'expression Fab et/ou scFv peuvent être construites pour permettre une identification rapide de fragments ayant la spécificité souhaitée pour l’ESM-1. Par exemple, la présentation sur phage d'anticorps peut être utilisée.
Plusieurs techniques permettant de mesurer la quantité d’ESM-1 sont décrites dans la littérature. Par exemple, l'utilisation d'anticorps monoclonaux pour détecter la protéine ESM-1 est décrite dans la demande de brevet français publiée sous le n°2775691 et dans la référence [1]. Ces anticorps monoclonaux ont été préparés par immunisation de souris avec un antigène constitué de la séquence allant de l'acide aminé en position 79 jusqu'à l'acide aminé en position 184 de la protéine ESM-1 qui a été fusionnée à la protéine GST (glutathione-S-transferase). Trois familles d'anticorps monoclonaux avaient été caractérisées, ces familles d'anticorps se fixant respectivement sur les déterminants antigéniques AgD1 79P-99C (anticorps MEP 01, MEP 06 et MEP 21), AgD2 119 S139V (anticorps MEP 08 et MEP13) et AgD3 159G-184R (anticorps MEP 04, MEP 14 et MEP19).
La référence [1] décrit la mise au point d'un test immunoenzymatique du type sandwich mettant en œuvre les anticorps monoclonaux MEP 19 et MEP 21 pour mesurer la quantité d’ESM-1 dans un échantillon. Ce test a permis aux auteurs de montrer une forte production de protéine ESM-1 dans le sérum de patients hospitalisés pour un choc septique. Le test de détection utilisant les anticorps MEP 19 et MEP 21 permet de détecter une concentration de protéine ESM-1 supérieure à 4 nanogrammes (ng) par millilitre de plasma.
Un autre test permettant de mesurer la quantité d’ESM-1 dans un échantillon est décrit dans la demande de brevet internationale publiée sous le numéro WO0239123. Cette demande de brevet décrit notamment une trousse de détection comprenant un premier anticorps se fixant spécifiquement sur la région N-terminale comprise entre l'acide aminé en position 1 et l'acide aminé en position 78 de la séquence en acides aminés de la protéine ESM-1, et un second anticorps se fixant spécifiquement sur la région C terminale comprise entre l'acide aminé en position 79 et l'acide aminé en position 184 de la séquence en acides aminés de la protéine ESM-1.
Un test permettant de mesurer la quantité d’ESM-1 dans un échantillon est également commercialisé par la société Biothélis sous la référence EndoMark® H1A (EMH1A). Ce test est un immunoessai de type sandwich qui permet de mesurer la quantité d’ESM-1 dans le plasma humain.
Dans le cadre de la présente invention, la quantité d’ESM-1 mesurée est généralement exprimée en ng/mL de plasma. Cette valeur peut alors être comparée à une valeur de référence.
La comparaison de la quantité d'ESM-1 avec une valeur de référence indique si ledit patient présente un risque de développer un SDRA. Typiquement, une quantité inférieure à la valeur de référence prédit la survenue d’une SDRA chez le patient. Dans le cadre de la présente invention, de préférence, la valeur de référence va de 2,5 ng/mL de sang à 5 ng/mL de sang, de préférence la valeur de référence est égale à 5 ng/mL de sang.
La mesure de la quantité d’ESM-1 dans un échantillon de sang du patient et la comparaison à la valeur de référence permet également de déterminer la quantité d’ESM-1 administrée au patient, par exemple une quantité suffisante pour restaurer une quantité d’ESM-1 supérieure à la valeur de référence.
Ainsi, les étapes (a) et (b) peuvent être répétées plusieurs fois si nécessaire jusqu’à ce que la quantité d’ESM-1 mesurée à l’étape a) soit supérieure à la valeur de référence. Les étapes (a) et (b) peuvent également être répétées plusieurs fois jusqu’à ce que la quantité d’ESM-1 mesurée à l’étape a) se maintienne à un niveau supérieur à la valeur de référence.
Dans un mode de réalisation particulier, les étapes (a) et (b) sont répétées pendant 5 jours à 10 jours, par exemple tous les jours pendant 5 jours à 10 jours. Cela permet de suivre la quantité d’ESM-1 chez le patient au cours du temps et d’ajuster la quantité d’ESM-1 qui est administrée au patient pendant la période considérée.
illustre les protocoles expérimentaux mis en œuvre dans les exemples. Le premier protocole (A) a été réalisé pour étudier les différences des paramètres inflammatoires entre des souris WT et des souris Esm1 -/- , en réponse à une inflammation aigue pulmonaire induite par LPS. Une instillation intra-trachéale de LPS a été réalisée à J0, des évaluations cliniques avec mesures non-invasives de l’oxymétrie ont été réalisées quotidiennement, et les souris ont été sacrifiées à différents temps pour déterminer l’évolution des paramètres inflammatoires en fonction du temps. Le second protocole (B) a été réalisé pour étudier l’effet d’une administration continue d’endocan murin par des osmopompes chez des souris Esm1 -/- . Les osmopompes ont administré en continu soit de l’endocan soit du PBS et ont été implantées en sous-cutanée un jour avant l’instillation intra trachéale de LPS. Des évaluations cliniques et des mesures non-invasives de l’oxymétrie ont été réalisées quotidiennement, les souris ont été sacrifiées à J5 pour évaluer les paramètres de l’inflammation pulmonaire. LPS : Lipopolysaccharides, i.t. : instillation intra trachéale. .
représente les résultats qui montrent que la présence d’endocan endogène module la réponse inflammatoire et améliore la dysfonction physiologique pulmonaire. Réponse inflammatoire, à différents temps, au décours d’une instillation trachéale de LPS, chez les souris WT (hachuré noir et blanc) et Esm1-/- (blanc). L’évolution des concentrations sériques au cours du temps d’endocan endogène est présentée en (A). Les résultats des analyses des LBA sont présentés en nombres absolus de cellules (cellules.mL -1 ) pour les leucocytes en (B), pour les polynucléaires neutrophiles en (C) et pour les macrophages en (D). Les concentrations de mMPO des LBA sont présentées en (E), les concentrations de m TNFα des LBA en (F), et celle des protéines dans le LBA en (G). L’évolution de l’oxymétrie transcutanée à différents temps est représentée en (H). Les données sont présentées avec leurs médianes, et leurs 25 e et 75 e percentiles. Δ représente le résultat du test de l’effet du groupe par le modèle linéaire mixte. Φ est le résultat du test de Kruskal-Wallis test. * représente un p < 0.05 comme résultat du test de Mann Whitney entre les variables de chaque groupe à un temps spécifique.
représente les résultats qui montrent que l ’ administration continue d’endocan chez les souris Esm1 -/- réduit la réponse inflammatoire et améliore la dysfonction physiologique pulmonaire . Paramètres de la réponse inflammatoire pulmonaire estimés à J5 d’une instillation intra-trachéale de LPS, chez des souris Esm1 -/- traitées par une administration continue sur 3 jours soit d’endocan (hachuré gris) soit de PBS (hachuré noir). Les résultats des examens des LBA sont présentés en nombres absolus avec les leucocytes en (A), les polynucléaires neutrophiles en (B) et les macrophages en (C). Les concentrations de m MPO des LBA sont présentées en (D), les concentrations de m TNFα des LBA en (E) et celle des protéines dans le LBA en (F). L’évolution de l’oxymétrie transcutanée à différents temps est représentée en (G). Les données sont présentées avec leurs médianes, et leurs 25 e et 75 e percentiles. ∆ représente le résultat du test de l’effet du groupe par le modèle linéaire mixte. Φ est le résultat du test de Kruskal-Wallis test. * représente un p < 0.05 comme résultat du test de Mann Whitney entre les variables de chaque groupe à un temps spécifique.
L’ensemble de ces concepts forment l’ontologie de référence du graphe de connaissance d’intérêt. Cette ontologie est dite « hybride » car les concepts sont extraits d’une part des ontologies générales (ou supérieures, « upper ontologies »), applicables à de nombreux domaines, et d’autre part des ontologies des domaines spécifiques pertinent au domaine d’intérêt. Ces concepts extérieurs sont sélectionnés, agrégés et adaptés dans leurs définitions en tant que concepts du modèle sémantique des données, en considérant la portée et l’application du graphe de connaissances d’intérêt. Toute connaissance fournie, par le biais des triplets, s’inscrit dans cette ontologie de référence.
Ces définitions permettant de s’inscrire dans un cadre très générique, qui peut être utilisé dans de nombreux cas d’usages différents. Ils permettent également de simplifier au maximum le graphe de connaissance qui sera ensuite généré, puisque chaque entité du graphe appartient à un concept parmi un faible nombre de concepts.
Cette étape est réalisée manuellement par un expert du domaine d’application, ou semi automatiquement à l’aide de moyens informatiques. L’étape de définition des concepts est réalisée de manière concomitante avec l’étape de définition des types de concepts, mais les concepts peuvent être ensuite complétés au fur et à mesure que l’on découvre des affirmations de connaissance ou que l’on fournit des triplets au graphe topologique.
L’étape d’instanciation des concepts est l’étape permettant la transformation du graphe topologique en graphe de connaissances sémantiques à proprement parler. Ce sont ces instances de concepts qui apparaissent dans le graphe de connaissance final.
Cette étape d’instanciation et d’association pour générer le graphe sémantique de connaissances peut être réalisée manuellement par l’expert via des moyens d’interaction informatique, telle qu’une application logicielle ou web, ou automatiquement par des moyens de Machine Learning ayant été entraînés à produire des instances conformes à une ontologie et à un modèle sémantique de données de référence, à partir d’un graphe topologique.
On peut prévoir que les concepts de cette ontologie incluent eux-mêmes des sous-classes sémantiques. Par exemple, la sous-classe « hôpital » pourrait appartenir au concept « infrastructure », lui-même appartenant au type de concept « Ressource ». On peut alors également réaliser des instanciations de ces sous-classes.
En classifiant de cette manière, comme instances de concepts sémantiques, l’ensemble des triplet fournis dans le graphe topologique en respectant la logique du modelé sémantique des données défini dans l’étape précédente, on produit un graphe de connaissances dans lequel il est aisé de naviguer et de déduire des liens cachés entre les éléments du graphe, de généraliser le contenu du graphe topologique, notamment en évoluant entre différents niveaux de granularités et en réglant la résolution d’informations extraits du graphe.
Le procédé permet le traitement traçable des connaissances qui peuvent être très nombreuses et hétérogènes et fournies par des sources très différentes, non expertes du domaine, sous la forme de simples triplets. Enfin, en se conformant à un modèle sémantique très générique, le procédé peut être utilisé dans tous les domaines pertinents, sans que quiconque ait à apprendre et à appliquer une syntaxe ou des règles compliquées pour apporter les connaissances au graphe.
De préférence, chaque affirmation de connaissance correspond :
- soit à une qualification, auquel cas le prédicat de ce triplet comprend un verbe de liaison pour qualifier l’un des deux noms de ce triplet par l’autre nom de ce triplet ;
- soit à une action, auquel cas le prédicat de ce triplet comprend un verbe d’action pour décrire une interaction entre les deux noms du triplet,