INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
représente des chromatogrammes correspondants à l’analyse réalisée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) de milieu de culture issue d’une d’expérimentation de bioconversion en présence d’acide cinnamique. L’abscisse correspond au temps d’élution en minute et l’ordonné correspond à des unités arbitraires et permet de voir l’efficacité de la métabolisation. La figure 7A représente un diagramme concernant la métabolisation d’acide cinnamique par bioconversion, sur cette figure la figure 7A représente les chromatogrammes obtenus après culture de la souche E. Coli BL21 (DE3) pLysE transformée avec le plasmide pAIDA1-T7-CYP73A1-ATR1 et la figure 7B représente le diagramme après culture de la souche E. Coli BL21 (DE3) pLysE transformé avec le plasmide pAIDA1-T7 dans la . Dans la figure 7A on constate l’apparition d’acide para-coumarique qui est le produit de métabolisation de l’acide cinnamique. Dans la figure 7B, l’acide cinnamique n’est pas métabolisé.
représente un alignement de séquences peptidiques réalisés avec l’outil de recherche d'alignement local de base (BLAST également désigné en anglais « Basic Local Alignment Search Tool »). Les séquences correspondent aux cytochromes P450 CYP76F112 et P450 CYP73A1
représente la réaction chimique correspondant la transformation de l’acide cinnamique en acide para-coumarique par le cytochrome P450 CYP73A1 (CYP73A1) et la réaction chimique correspondant la transformation de la déméthylsubérosine en Marmesine par le cytochrome P450 CYP76F112 (CYP76F112).
EXEMPLES Exemple 1 : procédé de préparation d’une protéine de fusion et procédé de biotransformation utilisant ladite protéine
1) Construction d’un plasmide d’expression générique pAIDA-T7
La base du plasmide d’expression construit repose sur un plasmide commercial pAIDA1 (https://www.addgene.org/79180/ [11]) qui est un plasmide à faible nombre de copie (« low copy » en anglais).
Remplacement du gène de sélection
Le plasmide pAIDA1 a été d’abord modifié en remplaçant le gène conférant la résistance au chloramphénicol par un gène conférent la résistance à la Tétracycline cloné à partir du plasmide pBR322 commercialisé par la société Fisher Scientific (https://www.fishersci.fr/shop/products/fermentas-pbr322-dna/10191220 [11]). Pour cela, le plasmide pAIDA1 était la matrice qui a été amplifiée par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) en utilisant l’enzyme PrimeSTAR Max polymérase commercialisé par la société Takara Bio Inc, selon le procédé Protocole 1 : PrimeSTAR Max polymérase Protocole tel que décrit dans (https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/R045A_e.v2102Da.pdf [6]). L’amplification a été réalisée en utilisant les amorces LAEWXpr17-lacIQ (tggcgacaccatcgaatggtgc (SEQ ID NO : 21) et LAEWXpr02: Reverse: tttagcttccttagctcctg (SEQ ID NO : 22). Cette amplification a permis de copier le plasmide dans sa globalité à l’exception du gène de résistance au chloramphénicol. Le même procédé a été mis en œuvre et a permis d’amplifier la séquence codant du gène de résistance à la Tétracycline. L’amplification a été faite cette fois à partir du plasmide pBR322 en utilisant les amorces LAEWXpr03 (gctaaggaagctaaaatgaaatctaacaatgcgct (SEQ ID NO 41)) et LAEWXpr04 (tcgatggtgtcgccacgctgcccgagatgc (SEQ ID NO 42)). Les deux produits de PCR obtenus, à savoir le plasmide pAIDA1 sans le gène de résistance au chloramphénicol et la séquence codante du gène de résistance à la tétracycline ont été fusionnés en utilisant le kit In-Fusion commercialisé par la société Takara Bio Inc selon le procédé Protocole 2 : In-Fusion Protocole décrit dans le document https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/In/In-Fusion%20Snap%20Assembly%20User%20Manual_071320.pdf [16]. Le plasmide recombinant obtenu a été introduit dans des bactéries Escherichia coli TOP10 chimiocompétentes commercialisées par la société Life Technologies Corporation selon le protocole de transformation TOP10 décrit dans https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/oneshottop10_man.pdf [17]). Les bactéries transformées ont été étalées sur un milieu de culture LB (bouillon lysogène) (10g peptone, 5g extrait de levure, 5g NaCl) contenant de la tétracycline. L’insertion du gène codant pour la résistance à la tétracycline a été vérifiée par PCR en utilisant les amorces LAEWXpr17 (SEQ ID NO 21) et LAEWXpr02 (SEQ ID NO 22).
Le plasmide pAIDA1-TetR-lacI Q , représenté sur la , recombinant ainsi construit a été utilisé pour la construction des autres plasmides. Pour simplifier la nomenclature, le plasmide est également désigné pAIDA1. Ce plasmide a été amplifié et purifié à partir d’une colonie positive selon le procédé Protocole 3 : le plasmide purification protocole décrit dans le document https://www.mn-net.com/media/pdf/45/51/02/Instruction-NucleoSpin-Plasmid.pdf [18].
a) Promoteur et terminateur
Le promoteur et le terminateur de la cassette AIDA du plasmide pAIDA1 ont été remplacés par deux cassettes de clonage disposant du promoteur et du terminateur de la T7 RNA Polymérase. Pour réaliser cette étape, différents clonages ont été réalisés
(i) pAIDA1 a été amplifié par PCR en utilisant les amorces LAEWXpr30 (tcatcatcatgcctaatgagtgagaattcc (SEQ ID NO 23)) et LAEWXpr31 (ttggtgcgcaaactattaactgg (SEQ ID NO 24)). Cette étape d’amplification s’inclue par le fragment d’ADN contenu entre le promoteur pAIDA1 et le terminateur de pAIDA1. Le produit d’amplification correspondait donc au plasmide sans promoteur et terminateur (ii) En parallèle, le terminateur T7 a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET28b-2 en utilisant les amorces LAEWXpr32-1-fr (ctcattaggcatgatgatgaaaggaagggaagaaagcgaaagg (SEQ ID NO 25)) et LAEWXpr32-2-rv (agtactcctaggactagtggtaccagatccggctgctaacaaagc (SEQ ID NO 26)). Enfin le promoteur T7 a été amplifié par PCR à partir du plasmide pET28b-2 en utilisant les amorces LAEWXpr33-1-rv (gttaatagtttgcgcaccaaatcggtgatgtcggcgatatagg (SEQ ID NO 27)) et LAEWXpr33-2-fr (ggtaccactagtcctaggagtactatggctgctgcccatggtata (SEQ ID NO 28)) selon le Protocole 1 tel que mentionné ci-dessus. (iii) Les trois fragments ont été fusionnés à l’aide du kit In-Fusion selon le Protocole 2 tel que mentionné ci-dessus. Ce produit de ligation a permis de générer le plasmide pAIDA1-T7 représenté sur la .
b) Insertion de la cassette AIDA1
Lorsque le moteur à combustion interne 10 est ensuite arrêté après une utilisation, il existe des risques de présence de résidus de carburant dans la ligne de purge 30, et notamment du côté de la ligne d’admission 40. Si ces résidus restaient dans la ligne de purge 30, ils risqueraient d’être aspirés par la ligne d’amenée 70 puis envoyés vers le catalyseur 51 lors du prochain démarrage du moteur à combustion interne 10. Si la température du catalyseur 51 est en dessous de sa température optimale lors de ce nouveau démarrage comme lors d’un démarrage à froid, cela provoquerait une pollution de l’atmosphère. Pour éviter cette pollution, il est prévu de purger ces résidus de carburant après chaque arrêt du moteur à combustion interne 10, lorsque le catalyseur 51 est dans sa température optimale.
Pour cela, après chaque arrêt du moteur à combustion interne 10, lorsque la température du catalyseur 51 est comprise dans sa plage de températures optimales, le calculateur 90 pilote le moteur à combustion interne 10 dans la configuration telle que schématisée dans la et décrite supra. Alors, les résidus sont aspirés et renvoyés au travers du catalyseur 51 où ils sont traités.
A titre d’exemple, on pourrait prévoir que la vanne secondaire 71 soit remplacée par deux vannes bistables du type de la vanne bistable 32, une première située dans la ligne d’amenée 70 et l’autre située dans la ligne de purge 30, en amont de la jonction entre cette ligne et la ligne d’amenée 70. On pourrait d’ailleurs prévoir que la première de ces vannes soit formée par un simple clapet anti-retour.
Dans un autre mode de réalisation, le calculateur 90 pourrait comporter un régulateur de type proportionnel-intégral afin de commander le moyen de chauffage 52 pour permettre au catalyseur 51 d’atteindre sa température optimale.
Dispositif de régulation d’un flux d’air d’un véhicule automobile et module de régulation thermique La présente invention se rapporte à un dispositif de régulation d’un flux d’air circulant au sein d’un échangeur de chaleur pour véhicule. Elle concerne également un module de régulation thermique comprenant ledit dispositif de régulation. Elle trouve une application particulière mais non limitative dans les véhicules automobiles.
Dans le domaine des véhicules automobiles, un dispositif de régulation d’un flux d’air circulant au sein d’un échangeur de chaleur d’un véhicule automobile, bien connu de l’homme du métier comprend : - au moins un rideau configuré pour se déplacer selon une direction d’ouverture/fermeture, entre une position fermée obturant le passage dudit flux d’air et une position ouverte laissant passer ledit flux d’air, - un cadre configuré pour loger ledit au moins un rideau.
Un tel dispositif de régulation connu de l’homme du métier, est le plus souvent désigné par l’acronyme ACS provenant de l’expression de langue anglaise « Active Curtain Shutter ». L’ACS est installé sur la face avant du véhicule automobile, au niveau d’une calandre du véhicule automobile, en particulier au niveau du compartiment moteur. Ledit au moins un rideau est piloté par un actionneur afin de réduire le coefficient de traînée et aussi d’améliorer les performances de refroidissement et de climatisation du moteur. En position ouverture dudit au moins un rideau, le flux d’air peut circuler à travers la calandre et participer notamment au refroidissement du moteur du véhicule automobile. En position fermée dudit au moins un rideau, le flux d’air ne pénètre pas via la calandre ce qui réduit la traînée et permet ainsi de réduire la consommation de carburant et l'émission de dioxyde de carbone du moteur. L’ACS permet donc de réduire la consommation d'énergie et la pollution lorsque le moteur n'a pas besoin d'être refroidi par l'air extérieur.
Le dispositif de régulation fait partie d’un module de régulation thermique qui comprend en outre un échangeur de chaleur et un groupe moto-ventilateur. Le groupe moto-ventilateur facilite le passage du flux d’air dans le module de régulation thermique, notamment lorsque le véhicule est à l’arrêt. De manière générale, le dispositif de régulation est placé entre l’échangeur de chaleur et le groupe moto-ventilateur.
Un inconvénient de cet état de la technique antérieur est que l’échangeur de chaleur est fixé au groupe moto-ventilateur via des éléments d’encliquetage ce qui entraîne un encombrement important de l’ensemble échangeur de chaleur - dispositif de régulation – groupe moto-ventilateur au niveau du compartiment moteur.
Dans ce contexte, la présente invention vise à proposer un dispositif de régulation d’un flux d’air circulant au sein d’un échangeur de chaleur pour véhicule qui permet de résoudre l’inconvénient mentionné.
A cet effet, l’invention propose un dispositif de régulation d’un flux d’air destiné à circuler à travers un échangeur de chaleur pour véhicule, ledit dispositif de régulation comprenant : - au moins un rideau configuré pour se déplacer selon une direction d’ouverture/fermeture, entre une position fermée obturant le passage dudit flux d’air et une position ouverte laissant passer ledit flux d’air, et - un cadre configuré pour loger ledit au moins un rideau, ledit cadre comprenant : - au moins quatre pans dissociés, et - au moins quatre éléments de jonction configurés pour assembler un pan avec un autre pan, caractérisé en ce que deux pans sont configurés pour être fixés directement avec un échangeur de chaleur.
On comprend donc que le dispositif de régulation d’un flux d’air peut être fixé directement sur un échangeur de chaleur au moyen des pans qui sont configurés pour être fixés directement sur l’échangeur de chaleur. Cet agencement permet de proposer un ensemble comprenant à la fois un échangeur de chaleur et un dispositif de régulation d’un flux d’air, avec un espace réduit entre ces deux composants. L’ensemble est donc plus compact.
Par ailleurs, le fait de relier le dispositif de régulation d’un flux d’air directement à un échangeur de chaleur évite d’utiliser de pièces intermédiaires pour la fixation, ce qui améliore la stabilité du dispositif de régulation d’un flux d’air, notamment en cas de vibration ou de choc du véhicule.
Selon des modes de réalisation non limitatifs, ledit dispositif de régulation peut comporter en outre une ou plusieurs caractéristiques supplémentaires prises seules ou selon toutes les combinaisons techniquement possibles, parmi les suivantes.
Selon un mode de réalisation non limitatif, lesdits éléments de jonction sont composés de deux parties comprenant des éléments d’encliquetage complémentaires. C’est un moyen rapide pour encapsuler des extrémités de pans pour assembler le cadre dans son ensemble.
- le (chaque) cadre avant peut être surmoulé sur la première partie avant (correspondante) du cadre arrière ;
- il peut comprendre deux cadres avant solidarisés fixement et respectivement à deux sous-parties du cadre arrière.
L’invention propose également un véhicule terrestre, éventuellement de type automobile, et comprenant une partie avant comportant, d’une part, une grille d’entrée d’air propre à laisser passer de l’air en direction d’au moins un équipement situé en arrière, et, d’autre part, un dispositif de convoyage d’air du type de celui présenté ci-avant et intercalé entre cette grille d’entrée d’air et cet équipement pour canaliser au moins vers ce dernier l’air ayant traversé la grille d’entrée d’air.
illustre schématiquement, dans une vue en perspective du côté avant, un exemple de réalisation d’un dispositif d’interface auquel est solidarisé un exemple de réalisation d’un dispositif de convoyage d’air selon l’invention,
illustre schématiquement, dans une vue en perspective du côté avant, le cadre arrière rigide du dispositif de convoyage d’air de la , avant sa solidarisation au dispositif d’interface,
illustre schématiquement, dans une vue en perspective du côté avant, un ensemble avant comportant deux cadres avant souples couplés par une sous-partie de liaison, avant qu’il ne fasse partie du dispositif de convoyage d’air de la ,
illustre schématiquement, dans une vue en perspective du côté arrière, une partie des première et seconde parois inférieures du dispositif de convoyage d’air de la , au niveau de leurs nervures complémentaires et nervures de rigidification respectives,
illustre schématiquement, dans une vue en perspective du côté avant, une partie des seconde paroi inférieure et seconde partie avant d’un cadre avant souple du dispositif de convoyage d’air de la , au niveau d’une nervure de rigidification, et
illustre schématiquement, dans une vue en perspective du côté arrière, une partie de la seconde paroi inférieure d’un cadre avant souple du dispositif de convoyage d’air de la , au niveau d’une partie arrière d’une nervure de rigidification, et avant couplage au cadre arrière.
Description détaillée de l’invention L’invention a notamment pour but de proposer un dispositif de convoyage d’air DC destiné à être intercalé entre une grille d’entrée d’air et au moins un équipement d’un véhicule terrestre, et à cadre(s) avant CVj à déformation réduite.
Dans ce qui suit, on considère, à titre d’exemple non limitatif, que le dispositif de convoyage d’air DC est destiné à faire partie d’un véhicule terrestre de type automobile, comme par exemple une voiture. Mais l’invention n’est pas limitée à ce type de véhicule terrestre. En effet, un dispositif de convoyage d’air DC selon l’invention peut faire partie de n’importe quel véhicule terrestre comprenant au moins un équipement devant être alimenté en air ayant traversé une grille d’entrée d’air.
On notera que l’air qui se trouve situé devant l’extrémité avant du véhicule (terrestre) circule de l’avant vers l’arrière de ce véhicule (flèches f1 et f2 de la ).
Sur les figures 1 à 6 la direction X est la direction longitudinale du véhicule, laquelle est parallèle aux côtés latéraux (comportant d’éventuelles portières latérales), la direction Y est la direction transversale du véhicule, laquelle est perpendiculaire à la direction longitudinale X, et la direction Z est la direction verticale du véhicule, laquelle est perpendiculaire aux directions longitudinale X et transversale Y.
On a schématiquement illustré sur la un exemple de réalisation d’un dispositif de convoyage d’air DC selon l’invention destiné à être intercalé entre une grille d’entrée d’air et au moins un équipement d’un véhicule (terrestre). Dans cet exemple, le dispositif de convoyage d’air DC est solidarisé, par exemple par clippage, à un exemple de réalisation d’un dispositif d’interface DI. Ce dispositif d’interface DI comprend notamment un cadre (ou support) auquel est solidarisé le dispositif de convoyage d’air DC et qui est destiné à être solidarisé fixement à la face avant d’au moins un équipement, par exemple par vissage et/ou clippage. Mais le dispositif de convoyage d’air DC pourrait être solidarisé fixement à la face avant d’au moins un équipement.
La séquence AIDA du plasmide pAIDA1 original a été amplifié par PCR en utilisant les amorces LAEWXpr36-AIDA-fr (aactttaagaaggagatataccatgggcaataaggcctacagtatcatttgg (SEQ ID NO 29)) et LAEWXpr37-AIDA-rv (tttgttagcagccggatctgtcattatcagaagctgtattttatc (SEQ ID NO 30)) selon le Protocole 1 tel que mentionné ci-dessus.
En parallèle, le plasmide pAIDA1-T7 a été digéré par les enzymes de restriction Nco I et Kpn I selon le procédé Protocole 4 : protocole de digestion tel que décrit dans http://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/Reference-Materials/fastdigest-restriction-enzymes-labaid.pdf [19]. Le plasmide pAIDA1-T7- Nco I- Kpn I linéarisé et l’amplicon AIDA1 ont été fusionnés par In-Fusion selon le Protocole 2 mentionné ci-dessus. Le plasmide recombinant générique pAIDA1-T7 complet avec AIDA1 a été amplifié par transformation de bactéries. Le plasmide générique pAIDA1-T7 complet avec AIDA1 obtenu est représenté sur la .
3) Protéine de fusion La protéine de fusion obtenue contient de l’extrémité N-terminale à l’extrémité C-terminale : - un tag de 6 Histidines, permettant une immunodétection des protéines avec des anticorps anti His - une séquence de clivage permettant d’enlever le tag, - une séquence c-MYC, permettant une immunodétection des protéines avec des anticorps anti c-MYC - un peptide de liaison AIDA1 - un polypeptide d’adressage et d’ancrage à la membrane externe : la séquence d’ancrage béta Barel de AIDA1, à savoir la séquence SEQ ID NO 1 - une séquence polypeptidique du cytochrome P450 CYP73A1 (cinnamate hydroxylase d’ Helianthus tuberosus , NCBI ID : Sequence ID: Q04468.1) dans laquelle l’ancre membranaire a été retirée de la séquence codante, à savoir la séquence SEQ ID NO 3), - un peptide de liaison de 51 acides aminés PGGSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGSG GSP (SEQ ID NO 6), et - une séquence polypeptidique de la NADPH P450 réductase d’Arabidopsis ( Arabidopsis thaliana P450 reductase 1 (ATR1), mRNA - Sequence ID: NM_118585.4 ) dans laquelle l’ancre membranaire a été retirée, à savoir la séquence SEQ ID NO 7.
Les séquences nucléiques codantes correspondant aux différents éléments de la protéine de fusion décrit ci-dessus ont été utilisées et assemblées successivement de 5’ vers 3’. En particulier, il s’agissait de : - la séquence SEQ ID NO 44 codant pour un lieur AIDA1, - la séquence SEQ ID NO 10 codant pour un polypeptide d’adressage et d’ancrage à la membrane externe : la séquence d’ancrage Tonneau bêta - la séquence SEQ ID NO 11 codant pour le cytochrome P450 CYP73A1 cinnamate hydroxylase d’Helianthus tuberosus, NCBI ID : Sequence ID: Q04468.1) - la séquence SEQ ID NO 15 codant pour un peptide de liaison de 51 acides aminés, et - la séquence SEQ ID NO 17 codant pour la NADPH P450 réductase d’Arabidopsis (Arabidopsis thaliana P450 reductase 1 (ATR1), mRNA - Sequence ID: NM_118585.4)
La est une représentation schématique de la protéine de fusion obtenue.
4) Expression des protéines recombinantes dans les bactéries E. coli
a) Le système d’expression utilisé
Le plasmide pAIDA1 et les plasmides recombinants contenant les gènes codant pour la protéine de fusion ont été introduits dans bactéries E. coli BL21(DE3) plysE » (Novagen's® pET Systems). Les bactéries BL21 (DE3) pLysE sont adaptées pour la production de protéines placées sous le contrôle du promoteur T7. Les bactéries BL21 (DE3) pLysE portent le lysogène lambda DE3 et contiennent le plasmide pLysE, qui exprime de manière constitutive le lysozyme T7. Le lysozyme T7 réduit l'expression basale des gènes cibles en inhibant l'ARN polymérase T7. La souche BL21 (DE3) pLysE permet donc un contrôle plus strict de l'ARN polymérase T7.
b) Préparation d’un exemple de protéine de fusion
La protéine de fusion a été exprimée à partir du plasmide dont la construction a été décrite précédemment. Après la transformation des bactéries par le produit de ligation, il n’y a pas d’étape de sélection sur milieu solide. Les bactéries transformées ont été immédiatement mises en culture dans 50 ml de milieu SOC (Dextrose, 3.603 g/L, KCl, 0.186 g/L, MgSO 4 , 4.8 g/L, Tryptone, 20 g/L, extrait de levure (en anglais « Yeast extract ») 5 g/L) comprenant de la Tétracycline (20 µg/ml) et du Chloramphénicol (20 µg/ml), dans un erlenmeyer stérile de 250 mL. La culture a été réalisée pendant 53 h à 26°C avec une agitation de 180 tours par minute. Les cultures ont été ensuite refroidies sur de la glace pendant 10 minutes. La densité optique de la culture a été ajustée à D0 550nm = 0,3 par dilution dans du milieu SOC (4°C). Le volume du milieu de culture a été mesuré et les antibiotiques ont été re-ajoutés pour être à une concentration finale de 20 µg/ml de Tétracycline et 20 µg/ml de Chloramphénicol. La production de la protéine de fusion a été induite par ajout d’isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) à une concentration de 20µM final pendant 24h à 7°C, sous une agitation de 180 tours par minutes. Au bout de 24h, la densité optique a été ajustée à 0,3 par dilution dans du milieu SOC (4°C). Les bactéries présentent dans 1,5 mL ont été récoltées par deux centrifugations à basse vitesses successives (4°C, 20 min, 1000 xg et 4°C, 10 min, 4000 xg).
Les bactéries ont été ensuite suspendues dans du tampon KPi (88 mM avec des additifs de KCl 1 mM, MgSO 4 4 mM, glycérol 5% v/v, glucose 5% w/v, à 4°C (produits commandés chez Sigma Aldrich)).
La est une représentation schématique de la protéine de fusion obtenue, ladite protéine de fusion étant ancrée dans la membrane bactérienne.
5) Bioconversion Une étude de la bioconversion de l’acide cinnamique a été réalisée. La (CYP73A1) représente la réaction de bioconversion correspondante. Pour cela, de l’acide cinnamique (200 µM) en tant que substrat et du nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) (400 µM) ont été ajoutés dans le milieu comprenant les bactéries E. coli obtenues au point 4 ci-dessus re-suspendues. Le procédé de bioconversion a été réalisé à 20°C pendant 1h et sous agitation à 180 tours par minute. La réaction a été stoppée par une extraction avec 1 volume d’Acétate d’Ethyle. Les milieux ont été mélangés par vortex pendant 1 minutes suivi par une centrifugation à 10 000xg pour séparer les phases organiques et aqueuses. La phase organique supérieures a été récupérée et évaporée par Vivaspin. La poudre obtenue a été suspendue dans 150 µL de méthanol. L’extrait ainsi obtenu a été analysé par Chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à un spectre de masse (UHPLC/MS/MS)