INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'élément de support et la plaque d'assise sont de préférence en acier. De préférence, la plaque d'assise est soudée à l'élément de support.
La plaque d'assise présente une dimension telle que la plaque d'assise s'étend latéralement au-delà de l'élément de support. Cela signifie que, vu en direction de l'axe longitudinal de l'élément de support, la plaque d'assise s'étend latéralement au-delà de la section transversale de l'élément de support.
Il est préférable qu'un élément de fixation soit disposé pour chaque élément de mise à niveau. Cela présente l'avantage d'obtenir une bonne fixation, c'est-à-dire un bon serrage par rapport à la structure porteuse.
Dans d'autres variantes, il est également envisageable de disposer plus ou moins d'éléments de mise à niveau.
De préférence, l'au moins un élément de mise à niveau présente un filetage extérieur et l'ouverture présente un filetage intérieur. Le filetage intérieur est en prise avec le filetage extérieur de telle sorte que, par rotation de l'élément de mise à niveau par rapport à la plaque d'assise, l'élément de mise à niveau avec sa surface de soutien est déplaçable ou réglable par rapport à la surface d'appui.
De préférence, le filetage extérieur et le filetage intérieur sont des filetages métriques à pas fin. Le filetage à pas fin présente l'avantage, d'une part, de permettre un réglage fin de la surface de soutien et, d'autre part, d'obtenir un autoblocage entre le filetage intérieur et le filetage extérieur. L'utilisation de filetages normaux est également envisageable.
De préférence, l'élément de mise à niveau présente une ouverture de passage et, en face de la surface de soutien, une surface de butée. L'élément de fixation passe par l'ouverture de passage et vient buter contre la surface de butée avec une surface de sécurité.
En position de montage, la surface de butée se trouve au-dessus de la surface de soutien et au-dessus de la plaque d'assise. En particulier, la surface de butée est située à une certaine distance de la plaque d'assise.
De préférence, il existe un jeu radial entre l'ouverture de passage et l'élément de fixation.
Le diamètre intérieur de l'ouverture de passage est plus grand que le diamètre extérieur de l'élément de fixation dans la zone où l'élément de fixation est situé dans l'ouverture de passage.
Dans une première variante, l'élément de fixation présente une section d'ancrage et une section filetée. Avec la section d'ancrage, l'élément de fixation peut être relié de manière fixe à la structure porteuse. Un écrou peut être relié à la section filetée. L'écrou présente ladite surface de sécurité par laquelle une force est applicable sur l'élément de mise à niveau. En option, une rondelle peut être placée entre l'écrou et l'élément de mise à niveau.
En position de montage, la section filetée dépasse de l'ouverture de passage.
Dans une deuxième variante, l'élément de fixation est une vis avec un filetage extérieur et une tête de vis, la vis avec le filetage extérieur pouvant être vissée dans la structure porteuse et la tête de vis présentant ladite surface de sécurité par laquelle une force est applicable sur l'élément de mise à niveau.
La plaque d'assise est de préférence rectangulaire, en particulier presque carré. L'élément de support est de préférence disposé dans un coin et le ou les éléments de mise à niveau sont disposés dans au moins un autre coin.
Vu de dessus, la plaque d'assise présente de préférence une longueur d'arête comprise entre 40 millimètres et 150 millimètres. Une variante particulièrement préférée de la plaque d'assises présente des dimensions de 100 x 120 millimètres.
De préférence, un élément de mise à niveau est disposé dans chaque coin, sauf dans le coin où se trouve l'élément de support.
En d'autres termes, l'élément de support est placé dans un premier quadrant de la plaque d'assise. De manière particulièrement préférée, un élément de mise à niveau est disposé dans chacun des autres quadrants. Dans ce cas, trois éléments de mise à niveau sont disposés au total. Dans une autre variante avantageuse, un élément de mise à niveau est disposé dans le quadrant qui se trouve en oblique par rapport audit premier quadrant.
De préférence, l'élément de mise à niveau présente une section d'entraînement qui, du côté extérieur, présente de préférence une structure augmentant la friction. La structure augmentant la friction est de préférence un moletage.
La section d'entraînement présente de préférence un diamètre supérieur au diamètre du filetage extérieur. De préférence, la section d'entraînement est située à l'extrémité supérieure de l'élément de mise à niveau. De préférence, la surface de butée fait partie de la section d'entraînement.
La surface d'appui en dessous de la plaque d'assise peut être fournie de différentes manières.
Dans un premier mode de réalisation, la surface d'appui de la plaque d'assise est fournie par la face inférieure de la plaque d'assise.
Dans un deuxième mode de réalisation, la surface d'appui de la plaque d'assise est fournie par une entretoise fixée à la face inférieure de la plaque d'assise, la surface d'appui étant située à distance de la face inférieure de la plaque d'assise.
Dans un troisième mode de réalisation, la surface d'appui de la plaque d'assise est fournie par l'élément de support qui traverse la plaque d'assise et se trouve avec la surface d'appui à distance de la face inférieure de la plaque d'assise.
Il est préférable de prévoir au moins une nervure de renfort entre l'élément de support et la plaque d'assise. La nervure de renfort est reliée de manière fixe à l'élément de support et à la plaque d'assise. L'au moins une nervure de renforcement permet de renforcer la liaison entre la plaque d'assise et l'élément de support.
Un dispositif de montage pour la fixation d'au moins un article sanitaire comprend deux montants espacés l'un de l'autre et réalisés sous forme de profilés creux, qui s'étendent chacun le long d'un axe central, et au moins une traverse qui est reliée de manière fixe aux montants et qui relie les montants entre eux. Une unité de pied selon la description ci-dessus est disposée par montant.
La traverse comprend de préférence des éléments de fixation auxquels un article sanitaire, tel qu'une cuvette de WC, un bidet, un urinoir ou un lavabo, peut être fixé. Typiquement, des tiges filetées correspondantes sont utilisées.
Selon une autre mise en œuvre particulière du procédé, les peptides ciblés sont tout particulièrement ceux indicatifs d’une activité BLSE de l’enzyme, et notamment les peptides présentant les séquences suivantes : - IHYSQNDLVK (SEQ ID NO. 4), - LDHWEPELNEAIPNDER (SEQ ID NO. 5), - LDSWEPELNEAIPNDER (SEQ ID NO. 6), - SGASER (SEQ ID NO. 7), - SGAGK (SEQ ID NO. 8), - SGTGK (SEQ ID NO. 9), - TGASER (SEQ ID NO. 25) et - TGASK (SEQ ID NO. 26).
Enfin, selon une autre mise en œuvre du procédé, les peptides ciblés sont tout particulièrement ceux ayant une courte séquence et étant indicatifs d’une activité BLSE de l’enzyme, et en particulier les peptides présentant les séquences suivantes : - SGASER (SEQ ID NO. 7), - SGAGK (SEQ ID NO. 8), - SGTGK (SEQ ID NO. 9), - TGASER (SEQ ID NO. 25) et - TGASK (SEQ ID NO. 26).
Echantillon biologique testé Selon une mise en œuvre particulière de l’invention, l’entérobactérie présente dans l’échantillon biologique est de l’espèce Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis ou Enterobacter cloacae.
L’échantillon sur lequel le procédé de l’invention est mis en œuvre est tout échantillon susceptible de contenir une souche bactérienne cible. Cet échantillon biologique peut être d’origine humaine ou animale.
Selon une mise en œuvre de l’invention, l’échantillon biologique est choisi parmi : - Un fluide biologique tel que sang, sérum, plasma, urine, liquide céphalo-rachidien ou larmes, - Une culture bactérienne telle qu’une hémoculture, une colonie sur gélose ou un bouillon de culture, - Un échantillon alimentaire, tel que par exemple un échantillon de produit lacté, de viande, de poisson, d’œuf, de fruit, de légume ou d’une boisson, et - tout autre type d’échantillon biologique, comme par exemple un prélèvement d’eau ou un prélèvement effectué sur une surface.
Il s’agira préférentiellement d’un fluide biologique, en particulier d’un échantillon sanguin (sang, sérum, plasma).
Il s’agira plus particulièrement d’une hémoculture positive. Par « hémoculture », on entend un échantillon de sang prélevé chez un patient puis incubé dans des conditions adéquates pour permettre une prolifération des éventuelles bactéries présentes dans ledit échantillon. Cette hémoculture pourra être réalisée dans des flacons d’hémoculture tels que ceux commercialisés dans la gamme Bact/Alert distribuée par BioMérieux, ou ceux de la gamme Bactec distribuée par Becton Dickinson.
Kit La présente invention concerne également un kit pour son utilisation dans la mise en œuvre du procédé tel que décrit ci-dessus, comprenant des réactifs permettant de mettre en œuvre du procédé, notamment : - une enzyme permettant l’hydrolyse des protéines, telle que de la trypsine, et - un agent d’appariement d’ion, tel que de l’acide heptafluorobutyrique (HFBA). Optionnellement, un tel kit comprendra aussi des instructions de préparation et/ou d’utilisation, en particulier une notice précisant les conditions de mise en œuvre du procédé.
EXEMPLES Les exemples présentés ci-après ont pour but d’illustrer le procédé selon l’invention, mais ne limitent en rien l’objet de l’invention.
Exemple 1. Identification des peptides spécifiques des enzymes BLSE de type TEM et SHV
Afin de déterminer les peptides à suivre pour couvrir le maximum de variants possible des enzymes TEM et SHV, une étude préliminaire a été réalisée pour identifier les peptides spécifiques à ces deux enzymes, ainsi que les peptides spécifiques au caractère BLSE. Cette étude a été réalisée à l’aide de la base de données BLDB.
Ainsi, les peptides spécifiques des enzymes de type TEM, retrouvés dans plus de 95% des variants, sont SALPAGWFIADK (SEQ ID NO. 20), VDAGQEQLGR (SEQ ID NO. 22) et VGYIELDLNSGK (SEQ ID NO. 23). Le peptide VAGPLLR (SEQ ID NO. 2) est également retrouvé dans la quasi-totalité des variants de TEM (99%), mais ne peut pas être suivi en spectrométrie de masse comme marqueur spécifique de TEM. En effet, la protéine de SHV possède dans sa séquence le peptide très proche VAGPLIR (SEQ ID NO. 3) qui est de masse identique.
Les peptides spécifiques de SHV, retrouvés dans plus de 92% des variants, sont DTTTPASMAATLR (SEQ ID NO. 27), GIVALLGPNNK (SEQ ID NO. 28), QIGDNVTR (SEQ ID NO. 30) et QLLQWMVDDR (SEQ ID NO. 31). Les peptides VAGPLIR (SEQ ID NO. 3) et FPMMSTFK (SEQ ID NO. 1) sont également retrouvés dans la quasi-totalité des variants (>95%), mais ils ne peuvent pas être suivis pour caractériser spécifiquement SHV car on retrouve VAGPLLR (SEQ ID NO. 2, masse identique au peptide de séquence SEQ ID NO. 3) et FPMMSTFK (SEQ ID NO. 1) dans la séquence peptidique de l’enzyme de type TEM.
L’étude des différentes mutations possibles de TEM montre que les peptides spécifiques indiquant une activité BLSE sont majoritairement : IHYSQNDLVK (SEQ ID NO. 4), LDSWEPELNEAIPNDER (SEQ ID NO. 6), LDHWEPELNEAIPNDER (SEQ ID NO. 5), SGASER (SEQ ID NO. 7), SGTGK (SEQ ID NO. 9), SGAGK (SEQ ID NO. 8).
De la même façon, les peptides spécifiques de l’activité BLSE chez SHV sont TGASER (SEQ ID NO. 25) et TGASK (SEQ ID NO. 26).
En analysant ces peptides par LC-MS/MS, il est possible d’identifier la totalité des variants de TEM et SHV les plus retrouvés en France en milieu hospitalier. Il est également possible d’identifier la majorité des variants à caractère BLSE existants disponibles sur le site BLDB : environ 90% des variants chez TEM et 75% chez SHV, sachant que ces chiffres sont probablement sous-estimés puisque la base de données est incomplète pour les variants les moins fréquents.
En général, les souches productrices de BLSE restent sensibles aux céphamycines et aux carbapénèmes. Par ailleurs, les BLSE du sous-groupe 2be sont inhibées par l'acide clavulanique. Ce composé est donc parfois administré en association avec les antibiotiques β-lactamines, pour limiter l'action des enzymes de résistance.
Conséquences cliniques de l’existence de ces enzymes BLSE induisant une résistance aux antibiotiques β-lactamines
Les enzymes à activité BLSE, désignées ci-après "BLSE", sont de plus en plus retrouvées lors d’infections sanguines chez des patients.
Ces enzymes sont induites par les plasmides des bactéries gram-négatives, résultant pour la plupart de mutations de beta-lactamases naturelles telles que TEM-1, TEM-2 ou SHV-1.
Les BLSE sont une source de préoccupation majeure en termes de santé publique. En effet, elles induisent un degré élevé de résistance aux antibiotiques, y compris aux céphalosporines de troisième génération. La septicémie se caractérise déjà par un taux de mortalité élevé qui augmente rapidement au cours des heures, en absence de traitement adapté. Après 5 heures sans traitement adapté, le taux de survie des patients a déjà diminué de moitié. Il n’est plus que de 10% après 24 heures et descend à moins de 5% après 36 heures.
Lorsqu’il y a une suspicion de sepsis chez un patient, un prélèvement sanguin est réalisé et ce sang est mis en culture (hémoculture). Si des bactéries sont présentes dans l’échantillon recueilli, elles vont se multiplier au cours des heures jusqu’à atteindre une concentration suffisante pour que l’échantillon soit déclaré positif. Il faut au minimum 6 à 8 heures pour qu’une hémoculture soit déclarée positive et 6 heures supplémentaires pour réaliser l’identification de la bactérie. L’évaluation d’une potentielle résistance aux antibiotiques est l’étape la plus longue à réaliser, et nécessite parfois jusqu’à 24h-48h avant d’obtenir les résultats. Cependant, il est fréquent de débuter le traitement antibiotique avant d’obtenir ces résultats, car un tel laps de temps sans traitement induirait un taux de survie des patients très faible.
La solution utilisée en milieu hospitalier pour pallier aux longues méthodes d’identification de la bactérie et de l’évaluation des mécanismes de résistance est de donner au patient des antibiotiques à spectre étendu, puis d’ajuster le traitement au cours du temps. Cependant, ce choix implique différents problèmes subséquents, notamment une augmentation de l’antibiorésistance dans la population.
Techniques actuelles de détection et d’identification des BLSE
L’élaboration de méthodes analytiques rapides, efficaces et robustes est primordiale en diagnostic afin de pouvoir offrir dès que possible le traitement approprié à chaque patient.
Actuellement, les méthodes de détection des BLSE en routine sont limitées et nécessitent plusieurs dizaines d’heures pour obtenir un antibiogramme. Ils reposent majoritairement sur l’utilisation des disques de diffusion, notamment le test de synergie entre le mélange amoxicilline et acide clavulanique (AMC), et une C3G (par exemple la ceftazidime) ou l’aztréonam. Les automates de bactériologie (Vitek 2®, Alfred 60AST®, Mini-Api®, Phoenix®, Microscan®) sont de plus en plus utilisés car plus rapides, par exemple VITEK® 2 peut fournir des résultats d’identification et d'antibiogramme en moins de 5 heures.
Cependant, la sensibilité et la spécificité de ces automates ne sont pas toujours suffisantes et peuvent nécessiter des tests supplémentaires.
De nombreuses études en biologie moléculaire utilisant l’amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) suivies d’un séquençage ont été testées. La PCR en temps réel et le pyroséquençage direct des produits peuvent notamment permettre l’identification des variants de CTX-M à caractère BLSE. Le pyroséquençage est réalisé grâce à des cycles de dénaturation, annihilation et extension de la chaîne, puis d’un séquençage. Toutefois, l’utilisation de la PCR présente des inconvénients tels que le coût élevé des sondes, ainsi que l’absence d'information sur l'expression réelle des protéines impliquées dans les mécanismes de résistances.
En réponse au besoin actuel de détection et évaluation des niveaux d’expression des BLSE, de nouvelles stratégies d’analyse commencent à émerger afin de déterminer rapidement les profils de résistance des bactéries.
Suite aux premières études concernant l’identification de bactéries par MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption lonization - Time Of Flight), la spectrométrie de masse est de plus en plus utilisée.
Le MALDI-TOF est utilisé comme méthode d'analyse bactériologique de routine dans les hôpitaux depuis sa mise en œuvre il y a dix ans. Cette technique a permis de réduire le temps nécessaire à l'identification des bactéries, notamment dans le cas d'infections sanguines. Le MALDI-TOF nécessite moins de temps de retraitement des données que les méthodes d'analyse biochimique conventionnelles en termes d'identification. C'est pourquoi l'utilisation de cette technique analytique s'est rapidement répandue dans les laboratoires des hôpitaux et est devenue une technique de choix pour les tests de routine en microbiologie clinique.
Au cours des dernières années, différentes études ont mis en évidence la possibilité d'utiliser le MALDI-TOF pour identifier le mécanisme d'antibiorésistance et l'activité des β-lactamases (Oviano et al ., 2014). Certaines études utilisent aussi le MALDI-TOF pour réaliser un mini-séquençage notamment dans le domaine de l'antibiorésistance aux β-lactamases à spectre étendu (BLSE).
On prend une 1 ère mesure de chacun des ensembles, laquelle correspond à une mesure de référence.
Puis, de nouvelles mesures sont faites toutes les 15 minutes.
Deux cas peuvent être distingués :
Cas 1 : pas de pollution dans le milieu : la masse de bactéries sur ensemble A augmente, la masse de bactéries sur B reste stable et sur C diminue légèrement (surface bactéricide donc les bactéries vont généralement mourir).
Cas 2 : Pollution : la masse sur A reste stable ou diminue, sur B diminue légèrement ou fortement et sur C diminue fortement jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de bactéries.
Si le cas 2 est observé dès la 2 ème mesure (15 minutes après équilibre), il s’agit généralement d’une pollution aigue.
Si le cas 2 n’est observé qu’après plus de 30 minutes, il s’agit généralement d’une pollution chronique.
Procédé d’identification des enzymes BLSE chez les entérobactéries DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention concerne une méthode d’analyse utilisant la chromatographie liquide en phase inverse couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS/MS) pour détecter les activités de type β-lactamase à spectre étendu (BLSE) liées à la présence de certaines enzymes produites par les entérobactéries.
ETAT DE LA TECHNIQUE La septicémie désigne toute réaction inflammatoire généralisée associée à une infection bactérienne grave. Selon l'Institut Pasteur, une personne meurt de septicémie toutes les 5 secondes dans le monde. En France, cette infection est fatale pour 27% des patients, et ce chiffre peut monter jusqu’à plus de 50% en cas de choc septique. En 2017, l'OMS a classé la septicémie comme priorité de santé publique, et a publié une liste des agents pathogènes devant être étudiés de manière prioritaire pour la détermination de nouvelles approches thérapeutiques ; cette liste contient notamment les bactéries Acinetobacter baumannii , Pseudomonas aeruginosa et les entérobactéries productrices de carbapénémases ou d’enzymes à activité de β-lactamases à spectre étendu (BLSE).
Actuellement, différentes familles d'antibiotiques sont utilisées pour soigner les septicémies en milieu hospitalier. L'une des plus connues et utilisées est la famille des β-lactamines, qui regroupe les pénicillines, les céphalosporines, les monobactames et les carbapénèmes. Les β-lactamines agissent en inhibant la synthèse de la paroi bactérienne en bloquant la production du peptidoglycane. Ces molécules ont une structure commune correspondant à la présence d’un cycle à quatre atomes, le β-lactame, qui est leur site actif.
Les enzymes β-lactamases à spectre étendu (BLSE) Il existe des mécanismes dits « de résistance » qui empêchent l'action de ces antibiotiques : en particulier les systèmes d'efflux, l’imperméabilité de la paroi bactérienne et les β-lactamases. Ces enzymes inactivent les β-lactamines en hydrolysant leur cycle β-lactame. La première β-lactamase TEM, qui hydrolyse l’ampicilline et les céphalosporines de première génération, a été identifiée chez la bactérie Escherichia coli . Pour faire face à ce problème, de nouveaux antibiotiques à spectre étendu ont été mis au point, mais leur utilisation abusive chez l’Homme et dans les élevages d’animaux a conduit à l'apparition des β-lactamases à spectre étendu (BLSE).
La classification d’Ambler et celle de Bush-Jacoby-Medeiros sont les deux classifications existantes pour les β-lactamases.
Le schéma d’Ambler propose une classification moléculaire et répartit ces enzymes en 4 classes : A, B, C et D. Celles de classe A, C et D sont dites à sérine active tandis que celles de classe B sont appelées métallo-β-lactamases (carbapénèmases). A l’exception des BLSE de type OXA (classe D), les BLSE sont des β-lactamases de classe A.
La classification de Bush-Jacoby-Medeiros permet de classer ces enzymes selon leurs groupes fonctionnels. Cette classification a été mise à jour en 2010 et répartit les β-lactamases en 3 groupes : 1, 2 et 3 (Bush & Jacoby, 2010).
Les BLSE de type TEM et SHV font partie des sous-groupes 2be et 2ber, c'est-à-dire qu’elles sont capables d’hydrolyser les pénicillines, les céphalosporines de 1 ère à 4 ème génération et les monobactames.
En effet, la technique d’analyse décrite dans le brevet EP 2 699 692 ne permet pas de caractériser 20% des enzymes à activité BLSE de type TEM, et 90% des enzymes BLSE de type SHV, car des peptides spécifiques de ces enzymes BLSE ne peuvent pas être détectés dans les échantillons par le procédé considéré (calculs réalisés à l’aide du site bldb.eu).
Une solution à ce problème est ici proposée. Elle consiste à augmenter le temps de rétention des peptides non visualisés dans la méthode décrite dans EP 2 699 692, du fait de leur courte séquence, en utilisant lors de l’analyse un agent d’appariement d’ion (IPR).
Ainsi, la présente invention concerne un procédé de détermination des propriétés de résistance aux antibiotiques de type beta-lactamines d’une souche d’entérobactérie présente dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : a) lyse des bactéries et hydrolyse des protéines bactériennes, pour obtenir un mélange de peptides, b) analyse de ce mélange de peptides par spectrométrie de masse ciblée couplée à une chromatographie liquide en phase inverse, la détection d’au moins un peptide spécifique d’une enzyme à activité beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) étant indicative de la résistance aux beta-lactamines de la souche d’entérobactérie présente dans ledit échantillon biologique, ledit procédé étant caractérisé en ce que l’étape (b) d’analyse est effectuée en présence d’un agent d’appariement d’ion (IPR).
Les termes utilisés dans la présente demande sont présentés ci-dessous pour mieux définir l’invention.
Les « antibiotiques de type beta-lactamines » désignent des antibiotiques dont la structure moléculaire contient un noyau beta-lactame. Cette grande famille de composés comprend les dérivés de la pénicilline, les céphalosporines, les monobactames, les carbapénèmes et les inhibiteurs de la β-lactamase.
Au sens de l’invention, une souche d’entérobactérie désigne une souche de la famille des Enterobacteriaceae . Cette grande famille de bactéries gram-négatives inclut notamment les espèces pathogènes suivantes : Salmonella , Escherichia coli , Klebsiella , Shigella , Enterobacter et Citrobacter .
Au sens de l’invention, une «enzyme à activité beta-lactamase à spectre étendu (BLSE) » désigne une enzyme bactérienne capable d’inactiver au moins une β-lactamine en hydrolysant son cycle β-lactame. Ces enzymes à activité BLSE sont également désignés dans la présente demande comme des « variants », car elles dérivent d’enzymes ne possédant pas cette activité BLSE. Deux types sont particulièrement connus, il s’agit des enzymes TEM et SHV.