Analyse et quantification de l’organisation des mélanosomes dans les kératinocytes - Marquage en immunofluorescence : Les mélanosomes dans les kératinocytes sont analysés en immunofluorescence par le marquage de la protéine PMEL17. Les kératinocytes sont fixés en méthanol -20°C sur glace, puis incubés 1h dans la solution de blocage (PBS contenant 5% de Goat Serum, Dako), et marqués pendant 1h à température ambiante avec l’anticorps primaire dirigé contre PMEL17 (Mouse NKI/beteb antibody, Monosan, dilution 1/20). Après rinçage au PBS-Tween 0,05%, les cellules sont incubées avec les anticorps secondaires (Goat anti-Mouse Alexa Fluor 488, dilution 1/150, Life Technologies). Les noyaux sont ensuite marqués pendant 15 minutes avec Hoesch (Life Technologies 1/5000). Après rinçages en PBS, les membranes sont découpées, puis montées entre lames et lamelles (milieu de montage Fluoromount G, Southern Biotech). Les cellules sont observées au 63x à immersion avec un microscope à épifluorescence inversé Leica DMIRB4000B dans les 2 canaux à 488nm pour les vésicules de mélanine marquées PMEL17, et 405nm pour les noyaux en Hoesch. - Analyse des images sous ImageJ : Les images sont analysées automatiquement avec une macro ImageJ pour segmenter les cellules, et les vésicules de mélanine afin de mesurer les localisations des vésicules de mélanine marquées en vert (488nm) avec PMEL17 dans le cytoplasme. Les étapes majeures de l’analyse de chaque image sont : la segmentation des noyaux puis des cellules, la segmentation des vésicules, et enfin la mesure et quantification des caractéristiques suivantes : taille/aire des vésicules, nombre de vésicules par cellules, densité de vésicules/µm², distance relative de chaque vésicule au noyau de la cellule, et pourcentage de vésicules présentes dans une zone périnucléaire. Segmentation des noyaux : les étapes suivantes ont été appliquées pour segmenter les noyaux dans le canal 405nm : filtrage avec un filtre gaussien de sigma=10, soustraction du fond de fluorescence avec un rolling ball=200px, seuillage du masque des noyaux via l’intensité du marquage à 405nm manuellement, analyse des particules (taille minimum 1500px), séparation des objets avec un processus watershed, correction manuelle du masque de noyaux si besoin, enregistrement des ROInoyaux. Segmentation cellulaire : à partir de la segmentation des noyaux, la cellule est individualisée. Une approche de « watershed» est employée. Pour chaque noyau une région cellulaire est initialisée sur le contour extérieur du noyau. Cette région est agrandie en rajoutant itérativement les pixels touchant la région en partant des pixels les plus sombres jusqu’aux pixels les plus intenses. Une analyse de particules sans filtration de taille est réalisée pour sauvegarder les ROIcellule. Segmentation des vésicules de mélanine : les vésicules de mélanine marquées PMEL17 dans le canal 488nm sont segmentées en appliquant un filtre médian de rayon 10, puis une soustraction de ce filtre sur l’image, une segmentation par seuillage avec l’algorithme « triangle dark », une resegmentation par watershed. Une analyse des particules est effectuée avec un seuil de 3px pour les plus petites, et les coordonnées des vésicules sont sauvegardées dans les ROIvesicules. - Quantification de la distance au noyau des vésicules de mélanine dans les kératinocytes Plusieurs paramètres peuvent être mesurés à partir de ces différents objets : noyaux/cellules/vésicules, notamment la taille/aire des vésicules, le nombre de vésicules par cellules, la densité de vésicules/µm², la distance relative de chaque vésicule au noyau de la cellule, et le pourcentage de vésicules présentes dans une zone périnucléaire. Afin de calculer des distances entre les vésicules entre la membrane cytoplasmique et la membrane nucléaire, une carte des distances à la membrane cytoplasmique, ainsi qu’une carte des distances à la membrane nucléaire sont créées avec l’algorithme « Distance map ». Le ratio de ces deux cartes est calculé de la manière suivante (distance au noyau)/(distance au noyau + distance à la membrane cytoplasmique). Il permet d’avoir à la valeur 0 toute la zone nucléaire, à la valeur 1 la membrane cytoplasmique. La zone périnucléaire est définie comme la région comprise entre 0 et 0.35 c’est-à-dire le noyau et une zone de 35% autour du noyau.