2) Construction de plasmide recombinant pour l’expression d’une protéine de fusion P450-ATR Le plasmide pAIDA1-T7 a été digéré par les enzymes de restriction Kpn I and Sac I selon le Protocole 4 tel que mentionné ci-dessus. La séquence codant pour la partie extra-membranaire de la NADPH P450 réductase 1 d’ Arabidopsis thaliana (ATR1) telle que décrite dans Urban et al, (1997) J Biol Chem 272(31):19176-86 [20]) a été amplifiée par PCR à partir d’un plasmide (pCR8_ATR1) en utilisant les amorces LAEWXpr05 Forward (agcgctgttccagggtccgggtaccactagagtctctatcttc (SEQ ID NO 31)) et LAEWXpr06 Reverse (ccgccaccagaaccgcccggccagacatctctgaggtatc (SEQ ID NO 32)) selon le Protocole 1 tel que mentionné ci-dessus). Le lieur (en anglais « linker ») (riche en paire GC) a été amplifié à partir d’une séquence synthétique en utilisant l’enzyme PrimeSTAR GXL DNA Polymérase commercialisé par la société Takara Bio Inc en utilisant les amorces LAEWX15-FlexL-fr (ccgggcggttctggtggcgg (SEQ ID NO 33)) et LAEWX16-FlexL-rvs (cggagaaccgccgctaccgc (SEQ ID NO 34)) selon le procédé Protocole 5 décrit dans PrimeSTAR GXL DNA Polymérase Manual, https://www.takara.co.kr/file/manual/pdf/R050A_e.v1906Da.pdf [21]). La séquence d’ADN codant pour la partie extra-membranaire du P450, CYP73A1 (Urban et al, (1997) J Biol Chem 272(31):19176-86 [20]) a été amplifié par PCR à partir d’un plasmide pYeDP60-CYP73A1 en utilisant les amorces LAEWXpr07 Forward (gcggtagcggcggttctccgcctggcccaatcccggttcc (SEQ ID NO 35)) et LAEWXpr08 Reverse (gaagtacaggttttcgagctcaaatgacctaggtttagc (SEQ ID NO 36)) selon le Protocole 1 mentionné ci-dessus. Les 4 fragments d’ADN générés par amplification PCR, à savoir SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 11 et le plasmide pAIDA1-T7 a été digéré par les enzymes de restriction Kpn I and Sac I selon le Protocole 4 tel que mentionné ci-dessus. La séquence du plasmide digérée obtenu correspond à la séquence : aaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgccaatccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctgtcattatcagaagctgtattttatccccagtgctccggagatggcattgctcccgtgacctcctgcctgatatgcgactccgccattcactgacaagttttgagtaatcaccccttcaatacctgtctttatctctccctgatttcggctacctgacaacaactggctgtcatcactcattttaacaccaaattcatgagtgttatggatccagtttgcctctatatacggacggaacctccgcccggtatccttatccagggtgcttttcaccttccaggatgcacgaatacctgcttttgtctgaatattatttttccctgctccctgcaccaccgttccgttatcctcctgatgtgtatccggtgtaacccccatccagacagcctgcaaatgaggctgtaaccagaattcacctgttattccttcaggtgatgtccatgtgtgcacattcaggttatatcccccacctgcagaagcggttaaaccattcagattatatttttcttcttccagtccgtcacctttcactgatgcattaaaccagttatattgcatccaagtttcagcaaagagccctgttgcattttccccattctgataccacgtaccgtataccccgacagaataaccatccagtgtgtttctggcagctttgttgctcgtgtaatttatcgttttaccttttgcattcgcgtatcctcccataatccctaaggtaaaatcacccagttgttcagcatggaatttataaatatcccccccgagctgattgataaactgattggttgttgttttattttgcccgtcattcagcttaccagagcttattcctccagtgatcttcatccacacggatgcagactcaggctgtgtattatcactcatggccctgaattgcttacgctcattcaaatccatgaggaacagtgagttagccagtgccatattggtagcataacttccgttctccggtctgtattgccgggtatcagatgtgggaagatgactggttaaataccatcccttattatctgtcccactctcgtttcctttctgcagtgtgtaatcataagctccggcaactacgcggttcttcagagagaattctgcatcagaatttccctctacagaaataatattaataccatctctcgtctgaccaccactgccatcttcattgacataaacgatgtcactttgaccagaggtattacctttcaccaccagacggtccgtaagtgaattatctccttcaagcacaccaccaagagaaataacacttcccggtgtcccagtataatttgacacggtaagagtattacctatagcggccgcactttcttttgtaggattaagaatgatatttttgttattaacaagactaccattcactgtagcagagagcagctttgctgtaccaaaacttaagtcagcatcattcgtaatattcccgtttataatgctgttattaatgacaatgcttccattgttattcactctagacagatcttcttcgctaatcagtttctgttcaccctggaagtacaggttttcgagctccggaccctggaacagcgcttccagatggtgatggtgatggtggtcgactgcaaatgcatttccgattgtggaaacaaccgccaataccagcagtgtattttttgcaaggacaaaaccatgtcctctggctaactctgaggccacaatccaggcctgtctggagtggctccaaatgatactgtaggccttattgcccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatttggtgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccttaataagatgatcttcttgagatcgttttggtctgcgcgtaatctcttgctctgaaaacgaaaaaaccgccttgcagggcggtttttcgaaggttctctgagctaccaactctttgaaccgaggtaactggcttggaggagcgcagtcaccaaaacttgtcctttcagtttagccttaaccggcgcatgacttcaagactaactcctctaaatcaattaccagtggctgctgccagtggtgcttttgcatgtctttccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcggactgaacggggggttcgtgcatacagtccagcttggagcgaactgcctacccggaactgagtgtcaggcgtggaatgagacaaacgcggccataacagcggaatgacaccggtaaaccgaaaggcaggaacaggagagcgcacgagggagccgccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccaccactgatttgagcgtcagatttcgtgatgcttgtcaggggggcggagcctatggaaaaacggctttgccgcggccctctcacttccctgttaagtatcttcctggcatcttccaggaaatctccgccccgttcgtaagccatttccgctcgccgcagtcgaacgaccgagcgtagcgagtcagtgagcgaggaagcggaatatatcctgtatcacatattctgctgacgcaccggtgcagccttttttctcctgccacatgaagcacttcactgacaccctcatcagtgccaacatagtaagccagtatacactccgctagcgctgaggtctgcctcgtgaagaaggtgttgctgactcataccaggcctgaatcgccccatcatccagccagaaagtgagggagccacggttgatgagagctttgttgtaggtggaccagttggtgattttgaacttttgctttgccacggaacggtctgcgttgtcgggaagatgcgtgatctgatccttcaactcagcaaaagttcgatttattcaacaaagccacgttgtgtctcaaaatctctgatgttacattgcacaagataaaaatatatcatcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctcgagtatccgctcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttgtaagttctcatgtttgacagcttatcatcgataagctttaatgcggtagtttatcacagttaaattgctaacgcagtcaggcaccgtgtatgaaatctaacaatgcgctcatcgtcatcctcggcaccgtcaccctggatgctgtaggcataggcttggttatgccggtactgccgggcctcttgcgggatatcgtccattccgacagcatcgccagtcactatggcgtgctgctagcgctatatgcgttgatgcaatttctatgcgcacccgttctcggagcactgtccgaccgctttggccgccgcccagtcctgctcgcttcgctacttggagccactatcgactacgcgatcatggcgaccacacccgtcctgtggatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtcactggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccgacgcgctgggctacgtcttgctggcgttcgcgacgcgaggctggatggccttccccattatgattcttctcgcttccggcggcatcgggatgcccgcgttgcaggccatgctgtccaggcaggtagatgacgaccatcagggacagcttcaaggatcgctcgcggctcttaccagcctaacttcgatcattggaccgctgatcgtcacggcgatttatgccgcctcggcgagcacatggaacgggttggcatggattgtaggcgccgccctataccttgtctgcctccccgcgttgcgtcgcggtgcatggagccgggccacctcgacctgaatggaagccggcggcacctcgctaacggattcaccactccaagaattggagccaatcaattcttgcggagaactgtgaatgcgcaaaccaacccttggcagaacatatccatcgcgtccgccatctccagcagccgcacgcggcgcatctcgggcagcgtggcgacaccatcgaatggtgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcaagtgagtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgggaattctcactcattaggcatgatgatga (SEQ ID NO 43) . Ensuite, les séquences SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 11 ont été fusionnés par In-Fusion selon le protocole Protocole 2 mentionné ci-dessus. Le produit de ligation a été introduit dans des bactéries E. coli et directement mis en culture sans passer par une phase de sélection sur milieu sélectif. La présence des éléments constitutifs du plasmide a été vérifiée par des PCR en utilisant les amorces LAEWXpr35-amont-T7 (tccatccagtctattaattgttgc (SEQ ID NO 37)), LAEWXpr22- ATR1-rv (ccagacatctctgaggtatcttcc (SEQ ID NO 38)), LAEWXpr24-2kbATR1-fr (ggagcaggaaggtgtgagttcgtc (SEQ ID NO 39)) et LAEWXpr25-P540-rv (accctggaagtacaggttttcg (SEQ ID NO 40)). L’ensemble des étapes a à e a permis la construction d’un plasmide pAIDA1-T7-CYP73A1-ATR1 représenté sur la .