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Une autre technique, également bien connue, repose sur l'activité fermentaire de microorganismes, génétiquement modifiés ou non, dont le métabolisme cellulaire produit des molécules d’intérêts. La production d’alcool par des levures en est un exemple parmi les plus anciens. La fermentation présente des avantages certains. Elle peut être réalisée toute l’année à un coût modéré, puisque les réactions sont réalisées par les microorganismes. Les rendements théoriques sont en général intéressants, l’apport de la biologie synthétique et de la biologie des systèmes ayant grandement augmenté l’efficacité de ce type de système. Néanmoins, la fermentation présente des inconvénients notables découlant de la nature vivante du biocatalyseur. Ainsi en pratique, les rendements théoriques sont difficiles à obtenir, la cellule tendant toujours à rediriger les flux engagés pour la production de la molécule d’intérêt vers sa biomasse. Par ailleurs, la molécule d’intérêt est sécrétée dans un milieu de fermentation contenant nécessairement un nombre important d'autres molécules, ce qui complique sa séparation et consomme une grande quantité d’eau qu'il faut ensuite retraiter. En outre, toutes les molécules ne peuvent pas être produites par fermentation, soit du fait de leur toxicité pour la cellule, soit du fait que la molécule est peu ou pas excrétée. S'ajoute à ces difficultés le temps de développement d'un organisme fermentaire industriel, d'une dizaine d’années en moyenne.
Plus récemment, des techniques enzymatiques ont permis de synthétiser des molécules à haute-valeur ajoutée sans recourir à des micro-organismes. Ces techniques dans lesquelles des enzymes purifiées catalysent in vitro des réactions avec une grande spécificité, permettent de contrôler facilement les flux en maitrisant le milieu réactionnel. Les rendements obtenus peuvent alors être proches des rendements théoriques, voire les atteindre. L’utilisation directe d’enzymes, immobilisées ou non, surmonte ainsi certains inconvénients de la fermentation. Cependant, ces enzymes doivent être préalablement produites, purifiées et conditionnées, ce qui rend la technique onéreuse. Même si l'émergence des systèmes dits "cell-free" a pu en partie régler le problème de la purification des protéines (enzymes) en les synthétisant concomitamment dans le milieu où se déroule la réaction catalysée, le coût des cofacteurs souvent indispensables à la réaction reste trop important pour une application de ces techniques à grande échelle.
Ainsi, toutes ces approches présentent de sérieux inconvénients. Au demeurant, elles sont limitées à la production de certains composés. Une technique alternative possédant les avantages de la fermentation et ceux de la biocatalyse, mais sans leurs inconvénients respectifs, et pouvant être adaptée à volonté à la synthèse d'une large gamme de molécules d'intérêts, pourrait répondre aux défis économiques et environnementaux actuels.
Dans ce but, la présente invention propose une technologie utilisant la machinerie biologique des cellules microbiennes pour produire différentes enzymes aptes à catalyser les réactions d'un schéma réactionnel conduisant d'un substrat à un composé d'intérêt. Le principe est d'utiliser l'espace périplasmique dont sont pourvues les bactéries (essentiellement les bactéries à Gram négatif) comme espace réactionnel contrôlé, dans lequel une enzyme donnée transforme un substrat et excrète le produit formé dans le milieu de culture. Le produit et les éventuels coproduits excrétés par la première bactérie sont alors disponibles pour servir de substrat à une bactérie exprimant une autre enzyme, formant ainsi un second produit, et ainsi de suite.
En premier lieu, il est apparu de façon surprenante que des bactéries modifiées pour exprimer différentes enzymes de manière périplasmique pouvaient être utilisées dans un même milieu réactionnel, pour réaliser de manière orchestrée, chacune une au moins des différentes réactions d'un schéma réactionnel comportant plusieurs étapes. En effet, selon l'invention, les différentes souches transformées mises en présence dans un même milieu réactionnel, restent opérationnelles et réalisent leur fonction en harmonie.
En second lieu, il a été mis en évidence de manière inattendue, que la paroi périplasmique des bactéries ne faisait pas obstacle à la circulation des produits et réactifs d'une bactérie à l'autre, de sorte que non seulement des schémas comprenant plusieurs réactions sont réalisés en intégralité, et mais aussi que la cinétique réactionnelle est tout à fait satisfaisante pour obtenir le composé désiré en quelques heures seulement.
Des schémas réactionnels séquentiels constituant des voies de biosynthèse complexes, ont pu être élaborés de sorte à être réalisés par plusieurs bactéries exprimant chacune au moins une enzyme dans son périplasme. L'expression périplasmique des enzymes, c'est-à-dire hors de la cellule à proprement parler, offre un milieu réactionnel contrôlé et simplifié, duquel les composés d'intérêt peuvent être extraits sans difficulté. En effet, selon le procédé objet de la présente invention, des enzymes sont produites et transférées dans le périplasme des bactéries, compartiment où elles sont confinées et cependant disponibles et catalytiquement opérationnelles vis-à-vis des composés solubilisés dans le milieu. Dans la mesure où le compartiment périplasmique est aisément accessible aux solutés, les réactions s'y déroulent dans un environnement protégé et beaucoup moins complexe que le cytoplasme cellulaire. Cette externalisation des réactions (hors du cytoplasme cellulaire) évite les problématiques de redirection des flux, de toxicité, de transport propres à la cellule. Le milieu réactionnel est de fait simplifié et peut être contrôlé pour améliorer les réactions enzymatiques, en particulier par l'apport de cofacteurs et d'activateurs contribuant à une activité optimale. La phase d’extraction finale de la molécule d’intérêt est également facilitée. Sachant que l'extraction peut représenter jusqu’à 70 % du coût de production d'un composé par fermentation, cet aspect constitue un atout essentiel.
Un aspect caractéristique de la technique proposée est que le processus de production de la biomasse est découplé de celui de la production de la molécule d’intérêt. La phase de culture cellulaire et la phase de synthèse biochimique se déroulent dans des réacteurs distincts, avec des milieux différents. De ce fait, la biomasse se trouvant dans le réacteur peut être utilisée pour un nouveau processus de synthèse, ou être récupérée à l'issue de la synthèse d'un composé et réutilisée pour un cycle de synthèse ultérieur. Il est alors possible de réaliser de multiples réactions à partir d'une même biomasse. Les coûts de production de la biomasse (multiplication cellulaire des différentes souches) en sont réduits d'autant, notamment du fait des volumes d'eau sensiblement moindres à retraiter. Ce faisant, les coûts de production restent sensiblement ceux des coûts de production microbiens.
Un autre avantage notable de la dissociation des processus de production de biomasse et de synthèse de composés est qu'on évite la compétition dans l'emploi des sources de carbone. Dans un procédé classique de fermentation, on cherche à maximiser l’utilisation du carbone pour la production du composé d'intérêt afin d’atteindre un rendement élevé, mais cette optimisation risque de nuire à la croissance cellulaire (production de biomasse), et d'handicaper aussi par contrecoup la production du composé d'intérêt. La balance entre croissance cellulaire et production du composé d'intérêt est donc critique. Au contraire, dans le procédé inventif, la production de biomasse étant découplée de la production de molécule, les sources de carbone sont distinctes. On peut donc optimiser séparément, à la fois la croissance de la biomasse et le rendement de production du composé d'intérêt.
Le procédé objet de l'invention qui va être décrite en détail ci-après, peut être qualifié de système modulaire, dans la mesure où différentes bactéries, chacune transformée pour exprimer une au moins enzyme dans son périplasme, peuvent être cultivées et conservées, de manière à fournir à volonté les effecteurs d'une large gamme de réactions dans laquelle on peut puiser pour construire un schéma réactionnel complet. Les bactéries choisies pour intervenir dans un schéma défini vont être introduites dans un unique milieu pour agir de concert afin de générer un produit d’intérêt. Cette démarche reposant sur la mise en œuvre combinée de modules cellulaires, s'est avérée adaptée à l'obtention d’une grande variété de composés, conférant au procédé inventif un caractère universel inédit. En particulier, des molécules à haute valeur ajoutée, rares ou difficiles d'accès (peu excrétées, toxiques, racémiques d'isomères difficiles à séparer, …), ont pu être obtenues avec des rendements élevés et un bilan économique et environnemental particulièrement favorable.
Plus précisément, la présente invention a pour objet un procédé de production d'un composé d'intérêt à partir d'un substrat organique, qui comprend les étapes consistant à : a) - préparer un mélange réactionnel comprenant, dans un milieu convenable, - n bactéries, n étant un nombre entier au moins égal à 2, chaque bactérie étant génétiquement modifiée pour exprimer dans son espace périplasmique au moins une enzyme E1, E2, …, En, - une enzyme E1 étant apte à catalyser une première réaction R1 à partir dudit substrat organique pour fournir un premier produit P1, et optionnellement un premier coproduit CoP1, - chacune desdites enzyme E2, …, En, étant apte à catalyser une réaction R2, …, Rn, à partir d'un produit ou d'un coproduit obtenu par une réaction Rn-1, pour fournir respectivement un produit P2, …, Pn, et optionnellement un coproduit CoP2, …, CoPn, - ledit substrat organique, et - optionnellement, un cofacteur dudit substrat organique, un cofacteur desdits produits obtenus par une réaction Rn-1, dits cofacteurs CoF1, CoF2, …, CoFn ; un substrat complémentaire SC d'un coproduit obtenu par une réaction Rn-1, b) - laisser réagir le mélange réactionnel ainsi obtenu, et c) - séparer la biomasse du surnageant et extraire de celui-ci ledit composé d'intérêt constitué par l'un des produits P1, P2, …, Pn.
Il est connu, dans l’art antérieur, de mettre en œuvre des systèmes de localisation d’un ou plusieurs dispositifs émetteurs de signaux radioélectriques, notamment UWB. De tels dispositifs émetteurs peuvent par exemple être matérialisés par des étiquettes radio et émettre des signaux en direction d’un ou plusieurs dispositifs récepteurs, par exemple matérialisés par une ou plusieurs balises. Pour détecter la position de l’émetteur, il est courant d’estimer un temps d’arrivée du signal transmis. Cette estimation du temps d’arrivée est par exemple réalisée par la mise en œuvre d’un corrélateur numérique au niveau du récepteur, qui génère des pics de corrélation en des instants d’échantillonnage du signal reçu. La précision de l’estimation du temps d’arrivée du message est alors corrélée avec la précision de localisation du dispositif émetteur. L’estimation du temps d’arrivée du signal correspond alors à l’instant de détection du premier pic de corrélation dont l’amplitude dépasse un seuil prédéterminé. En raison de sa durée très courte, une impulsion présente des fronts montants et descendants très rapides, ce qui permet de déterminer, au niveau d’un dispositif récepteur du signal UWB, un temps d’arrivée très précis d’une impulsion. Il est en outre possible de distinguer assez nettement le trajet le plus court des autres trajets empruntés par l’onde radio. Tout ceci concourt à optimiser une estimation de la position géographique d’un dispositif émettant un signal UWB à partir de l’instant d’arrivée dudit signal.
Pour estimer le temps d’arrivée d’un message transmis, diverses méthodes sont connues dans l’art antérieur. Par exemple, il est connu de mettre en œuvre une méthode de modulation d’étalement de spectre à séquence directe (mieux connue sous l’acronyme DSSS dans la littérature anglo-saxonne). Dans une telle méthode, un message de données est encodé sous la forme d’une séquence de bits et chaque bit est modulé avec un code pseudo-aléatoire. Le message émis est alors décodé au niveau du récepteur par un échantillonnage du signal reçu et la mise en œuvre de calculs de corrélation à partir du signal reçu et par rapport à un signal de référence. Avec une telle méthode, la précision de l’estimation du temps d’arrivée du message dépend de la fréquence d’échantillonnage du signal reçu : plus cette dernière est élevée, meilleure est l’estimation du temps d’arrivée du message. Toutefois, un inconvénient de cette méthode est que l’augmentation de la fréquence d’échantillonnage pour améliorer l’estimation du temps d’arrivée engendre des coûts importants ; que ce soit d’un point de vue matériel, ou encore d’un point de vue de la consommation énergétique du système. De plus, une telle méthode n’est plus avantageuse lorsque la fréquence de Nyquist est atteinte.
Il est également connu de mettre en œuvre une modulation de type « tout ou rien », également désignée dans la littérature anglo-saxonne par l’appellation « ON OFF Keying ». Dans ce type de modulation, chaque séquence binaire est composée de symboles binaires pouvant prendre deux états : un premier état et un second état. Le second état correspond par exemple à l’état contraire du premier état. A titre d’exemple, le premier état est matérialisé par la valeur « 1 » et le second état est matérialisé par la valeur « -1 », correspondant respectivement à la présence ou l’absence d’une impulsion. Toutefois, un inconvénient d’une telle modulation provient de la difficulté à détecter le signal en raison d’une énergie spectrale faible.
Un objectif de l’invention est de pallier les inconvénients de l’art antérieur en proposant un procédé d’encodage et de décodage d’un message UWB permettant une localisation plus précise, avec une portée améliorée, et nécessitant une faible consommation d’énergie.
Selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé mis en œuvre par ordinateur pour encoder au moins un message de données destiné à être émis par un émetteur UWB à destination d’un récepteur UWB, le procédé comportant :
Génération d’un en-tête encodé par un premier code pseudo-aléatoire, ledit en-tête définissant une référence temporelle après laquelle une séquence de segments de données est destinée à être émise ; Génération de la séquence de segments de données, chaque segment de données encodant au moins une valeur de données utiles au moyen d’un second code pseudo-aléatoire et à partir de : la référence temporelle, une position du segment de données dans la séquence ; un pic d’autocorrélation du second code pseudo-aléatoire.
Un avantage est d’améliorer la précision de calcul du temps d’arrivée du message de données. Un autre avantage est de réduire la consommation énergétique d’un système de localisation UWB. Un autre avantage est d’améliorer la précision de localisation d’un dispositif émetteur.
Selon un mode de réalisation, chaque segment de données comprend un ensemble de bits, le procédé comprenant une opération de glissement temporel d’un sous-ensemble de bits encodant la valeur de données utiles d’au moins un segment de données de la séquence de segments de données pour positionner ledit sous-ensemble de bits en première position dans le segment de données.
Un avantage est de déplacer la position d’un pic d’autocorrélation du message de données pour améliorer le décodage d’une donnée utile dudit message de données.
Selon un mode de réalisation, le procédé comprend la génération du premier code pseudo-aléatoire et/ou du second code pseudo-aléatoire à partir d’un code pseudo-aléatoire initial.
Selon un mode de réalisation, la génération du premier code pseudo-aléatoire ou du second code pseudo-aléatoire en remplaçant au moins un bit du code pseudo-aléatoire initial par un code pseudo-aléatoire de remplacement.
Selon un mode de réalisation, chaque bit du premier code pseudo-aléatoire de remplacement est remplacé par un deuxième code pseudo-aléatoire de remplacement.
Selon un mode de réalisation, le code pseudo-aléatoire initial comprend une première séquence de Barker et le premier code pseudo-aléatoire de remplacement comprend une deuxième séquence de Barker.
Selon un mode de réalisation, le deuxième code pseudo-aléatoire de remplacement comprend une troisième séquence de Barker.
Selon un mode de réalisation, la première séquence de Barker, la deuxième séquence de Barker et la troisième séquence de Barker sont une même séquence de Barker. Selon une variante, il s’agit de séquences de Barker différentes. Par exemple, il s’agit de séquences de Barker de taille différentes.
Un avantage est d’encoder les données avec des séquences plus courtes tout en conservant une valeur minimale d’autocorrélation.
La couche III-V 100 peut être formée d’une couche homogène, typiquement d’un unique matériau. Alternativement, la couche III-V 100 peut être formée d’un empilement de couches en matériau III-N, certaines au moins de ces couches présentant une composition différente. Par exemple, la couche III-V 100 peut être formée d’une ou plusieurs couches de GaN et d’une ou plusieurs couches de GaN dopé P, d’AlGaN, d’AlN et/ou d’InGaN. Typiquement la couche III-V 100 peut être formés d’un ensemble d’une ou plusieurs couches de GaN et d’une couche d’AlGaN surmontant cet ensemble. Tel est par exemple le cas dans certains transistors de type HEMT.
La couche III-V 100 peut reposer sur un substrat, typiquement un substrat de support ou de croissance. Un tel substrat n’est pas représenté sur les figures1A à 1G. Une ou plusieurs couches intermédiaires peuvent être disposées entre le substrat et la face inférieure 102 de la couche III-V 100. Il peut notamment s’agir d’une couche de nucléation.
Une deuxième étape consiste à graver au moins une partie de la couche III-V 100 à partir de sa face supérieure 101 et sur une épaisseur e gravure . Cette étape est représentée par le bloc 31 de la . La gravure est avantageusement effectuée de sorte à graver la couche III-V 100 sur une épaisseur e gravure supérieure à 100 nm (10 -9 mètres), de préférence supérieure à 500 nm, de préférence supérieure à 1 µm (10 -6 mètres), de préférence supérieure à 3 µm. Afin de graver certaines zones seulement de la couche III-V 100, on peut prévoir de former un masque 310 surmontant la couche III-V 100, comme illustré à la . La présence de ce masque 310 n’est cependant pas obligatoire pour mettre en œuvre le procédé de gravure décrit ci-dessous. Selon un exemple, le masque 310 est disposé directement au contact de la face supérieure 101 de la couche III-V 100. Le masque 310 est par exemple formé par lithographie d’une couche de masquage 300 déposée ou reportée sur la couche III-V 100, comme illustré à la . De préférence, le masque 310 est un masque dur. Il est de préférence à base d’un polymère, par exemple d’une résine, ou d’un diélectrique. Il est par exemple formé à base de SiO 2 ou de Si x N y avec x et y entiers non nuls. Le masque dur 310 peut par exemple être formé par l’un des matériaux suivants, ou un mélange de plusieurs des matériaux suivants : SiN, Si 3 N 4 , SiOCN, SiCBN. Le masque 310 présente au moins une ouverture 311, comme illustré en , au travers de laquelle est réalisée la gravure de la couche III-V 100.
La gravure peut être une gravure sèche ou humide. Par exemple, il peut s’agir d’une étape de gravure plasma en chimie chlorée ou fluorocarbonée. Cette étape de gravure peut être réalisée dans un réacteur de gravure ionique réactive RIE (de l’anglais « Reactive Ion Etching »), de préférence un réacteur plasma à couplage inductif ICP (de l’anglais « Inductively Coupled Plasma »). Il est également possible de mettre en œuvre un procédé de gravure cyclique auto-limitante tel que l’ALE (« Atomic Layer Etching », terme anglais pouvant être traduit par « gravure de couche atomique »), seul ou en complément d’une gravure plasma classique. Un tel procédé est généralement constitué d’un ou plusieurs cycles comprenant les étapes suivantes : Une étape de modification d’une partie de la couche à graver se trouvant préférentiellement en surface de cette même couche, par exemple une chlorination auto-limitante par exposition à un plasma de Cl 2 /BCl 3 , Une gravure de la partie de la couche à graver ainsi modifiée sélectivement au reste de la couche à graver, par exemple à l’aide d’un plasma à base d’Ar et sous une tension de polarisation non nulle. Les procédés de gravure cyclique auto-limitante permettent de limiter significativement l’endommagement de la couche gravée. En synergie avec l’étape de traitement plasma qui sera décrite plus loin, une étape de gravure de la couche III-V 100 via un tel procédé permet d’obtenir une qualité d’interface 1000 encore améliorée. Il est cependant tout à fait possible que l’étape de gravure de la couche III-V 100 se limite à une gravure plasma classique.
Les techniques de gravure mentionnées ci-dessus sont données à titre d’exemples mais ne constituent en aucun cas une liste exhaustive des techniques envisageables.
L’étape de gravure venant d’être décrite permet d’exposer une surface dite surface gravée 103 de la couche III-V 100, comme représenté à la . Selon un exemple, cette gravure permet par exemple de former une tranchée dans la couche III-V 100.
Une troisième étape consiste en l’exposition de la surface gravée 103 à un traitement comme représenté à la . Le traitement est figuré sur ce schéma par les flèches verticales orientées vers la surface gravée 103. Ce traitement est par un plasma à base de dioxygène (O 2 ) et/ou de diazote (N 2 ). Cette étape est représentée par le bloc 32 de la . Elle est avantageusement réalisée dans la même chambre que l’étape de gravure de la couche III-V 100. Il s’agit préférentiellement d’un réacteur ICP. Réaliser l’étape de traitement plasma in situ permet de limiter les contaminations dues à la remise à l’air des échantillons et d’améliorer la productivité. Cela présente également un avantage en lien avec les défauts structurels induits par l’étape de gravure. En effet, suite à l’étape de gravure, la surface gravée 103 constitue une surface réactive qui, lors d’une remise à l’air, réagit avec l’air pour former des défauts. Par exemple, des lacunes provoquées par la gravure au niveau de la surface gravée 103 peuvent être comblées par des contaminants présents dans l’air, tels que des contaminants à base de carbone ou d’oxygène. Ces derniers constituent alors des pièges pouvant gêner l’étape de dépôt d’un diélectrique qui sera détaillée plus avant et/ou altérer les performances électroniques d’un dispositif obtenu après des étapes subséquentes supplémentaires. Soumettre la surface gravée 103 au traitement plasma in situ et avant toute remise à l’air de l’échantillon permet de combler ces lacunes par des éléments avantageux fournis par le plasma, et ainsi de limiter le comblement de ces mêmes lacunes par des éléments présents dans l’air. Par exemple, les lacunes d’azote d’une surface gravée 103 à base de GaN peuvent être comblées par des atomes d’azote fournis par un traitement plasma à base de N 2 .
Il est cependant possible de réaliser le traitement plasma dans une chambre distincte de celle utilisée pour la gravure de la couche III-V 100.