INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le microcompartiment selon l’invention est ainsi particulièrement adapté aux cultures à grande échelle de lymphocytes pour des thérapie cellulaires de type CAR-T ou CAR-NK.
Le microcompartiment selon l’invention peut être éventuellement congelé pour être stocké. Il devra ensuite être préférentiellement décongelé avant son utilisation.
est une représentation comparative de l’expression de cytokines lors de la culture de Lymphocytes NK après 11 jours de culture avec ou sans encapsulation (pour un donneur B – surnageant dilué au 10ème). Les résultats sont présentés avec des valeurs normalisées par rapport à la sécrétion d’IFN-g.
est une représentation comparative de l’expression de granzyme B lors de la culture de Lymphocytes NK après 11 jours de culture avec ou sans encapsulation (pour un donneur B– surnageant dilué au 100ème). Les résultats sont présentés avec des valeurs normalisées par rapport à la sécrétion d’IFN-g.
Par « alginate » au sens de l’invention, on entend des polysaccharides linéaires formés à partir de β-D-mannuronate et α-L-guluronate, des sels et des dérivés de ceux-ci.
Par « capsule en hydrogel » ou « microcompartiment en hydrogel » au sens de l’invention, on entend une structure tridimensionnelle formée à partir d’une matrice de chaînes polymères, gonflée par un liquide et préférentiellement de l’eau.
Par « cellules humaines » au sens de l’invention on entend des cellules humaines ou des cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées. Même lorsque cela n’est pas précisé, les cellules, les cellules souches, les cellules progénitrices et les tissus selon l’invention sont constitués ou sont obtenus à partir de cellules humaines ou à partir de cellules de mammifères non humains immunologiquement humanisées.
Par « cellule mutante » au sens de l’invention, on entend une cellule porteuse d’au moins une mutation.
Par « diamètre de Feret » d’un microcompartiment (ou d’une partie d’un microcompartiment) selon l’invention, on entend la distance « d » comprise entre deux tangentes audit microcompartiment (ou à ladite partie), ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l’ensemble de la projection dudit microcompartiment (ou de ladite partie) soit compris entre ces deux tangentes parallèles. Un diamètre de Ferret de la partie interne du microcompartiment est mesuré entre deux interfaces de la partie interne et de la couche externe du microcompartiment, c’est-à-dire la distance « d » comprise entre deux tangentes à ladite partie interne, ces deux tangentes étant parallèles, de telle sorte que l’ensemble de la projection de ladite partie interne soit compris entre ces deux tangentes parallèles.
Par « épaisseur variable » d’une couche, on entend au sens de l’invention le fait que la couche pour un même microcompartiment, n’a pas la même épaisseur partout.
Par « microcompartiment » ou « capsule » au sens de l’invention, on entend une structure tridimensionnelle partiellement ou totalement close, contenant plusieurs cellules.
Par « milieu » au sens de l’invention on entend solution aqueuse englobant des cellules, compatible avec la survie, le développement et/ou le métabolisme des cellules. Il peut s’agir d’un milieu de culture.
Par « milieu de culture convectif » au sens de l’invention on entend un milieu de culture animé par des mouvements internes.
Par « mutation » au sens de l’invention, on entend une mutation génétique ou épigénétique, préférentiellement une mutation fonctionnelle. Il peut s’agir en particulier d’une modification ponctuelle de la séquence génétique, d’un variant structurel, d’une modification épigénétique, ou d’une modification de l’ADN mitochondrial.
Par « mutation fonctionnelle » au sens de l’invention, on entend une modification génétique ou épigénétique transmissible qui confère un gain ou perte de fonction ou perte de fonction potentielle à cellule mutante concernée. Il s’agit préférentiellement d’une mutation entrainant une modification du phénotype de la cellule mutante concernée. Très préférentiellement il s’agit d’un changement de la séquence du génome et/ou de l’épigénome qui altère le potentiel thérapeutique d’une population de cellules, soit en augmentant le risque associé à la thérapie produite soit en diminuant le bénéfice apporté par la thérapie produite.
Par « plus petite dimension » d’un microcompartiment ou d’une couche de cellules au sens de l’invention, on entend la valeur du plus petit diamètre de Feret dudit microcompartiment.
Par « lumière » ou « lumen » au sens de l’invention, on entend un volume de solution aqueuse topologiquement entouré de cellules. Préférentiellement son contenu n’est pas en équilibre diffusif avec le volume de liquide convectif présent à l’extérieur du microcompartiment.
L’invention s’applique par exemple à un élément de garnissage formant un panneau de porte, une coiffe de dossier ou d’assise de siège, un revêtement de planche de bord ou de console centrale ou d’autres types d’élément de garnissage.
Dans un tel élément de garnissage, il est souhaitable d’ajouter d’autres fonctionnalités pour les passagers du véhicule sur la surface externe de l’élément de garnissage. L’élément de garnissage peut par exemple comprendre une ou plusieurs surfaces chauffées pour améliorer le confort du véhicule.
L’élément de chauffage agencé pour chauffer une partie de la surface externe, par exemple formé par un circuit résistif, est intégré dans l’élément de garnissage, par exemple sous une couche de décor afin d’être invisible depuis l’habitacle du véhicule. A cet effet, le circuit est par exemple collé à la couche de support avant d’appliquer la couche de décor sur la couche de support. Cependant, un tel procédé est complexe, en particulier lorsque plusieurs éléments de chauffage doivent être placés dans différentes zones de la couche de support. En outre, la production de l’élément de garnissage est coûteuse car l’élément de chauffage doit être mis en forme, par exemple par découpage ou impression, en un circuit résistif.
L’un des buts de l’invention est de surmonter ces inconvénients en proposant un élément de garnissage comprenant au moins une surface chauffée simple à réaliser de façon fiable et économique.
A cet effet, l’invention concerne un élément de garnissage du type précité, dans lequel l’élément de chauffage comprend au moins un élément carbone continu discret, formé d’un matériau carbone s’étendant de façon continue et ininterrompue d’un premier bord à un deuxième bord, et un dispositif de connexion connecté électriquement avec l’élément carbone, ledit dispositif de connexion étant adapté pour être connecté électriquement à une source de courant.
En réalisant l’élément de chauffage en élément continu en matériau carbone discret, l’élément de chauffage peut être produit de façon très simple et ajouté à l’élément de garnissage puisqu’il n’est pas nécessaire de mettre en forme l’élément de chauffage en un circuit résistif ayant un motif particulier. Les coûts de production de l’élément de garnissage sont également réduits car l’élément de chauffage peut être appliqué simplement sur la couche de support sans nécessiter d’étape préalable de mise en forme de l’élément de chauffage.
L’élément de garnissage selon l’invention peut comprendre l’une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises isolément ou selon toute combinaison techniquement envisageable:
- l’élément de garnissage comprend en outre une couche de décor s’étendant sur la face externe de la couche de support, ladite couche de décor recouvrant l’élément de chauffage ;
- l’élément de chauffage comprend en outre au moins une couche de protection s’étendant entre l’élément carbone et la couche de décor, ladite couche de protection étant réalisée en un matériau non-tissé ;
- le dispositif de connexion comprend une première électrode s’étendant au voisinage du premier bord de l’élément carbone et une deuxième électrode s’étendant au voisinage du deuxième bord de l’élément carbone, ladite première électrode et ladite deuxième électrode étant connectées électriquement à l’élément carbone et étant adaptées pour être connectées à une source de courant ;
- la première électrode et la deuxième électrode s’étendent entre l’élément carbone et la couche de support ou sont affleurantes avec la face interne de l’élément carbone ;
- l’élément de support est réalisé en un matériau composite comprenant des fibres naturelles dans une matrice en polypropylène ;
- l’élément de chauffage comprend une face interne s’étendant sur la couche de support et une face externe, opposée à la face interne, la face externe de l’élément de chauffage étant affleurante avec la face de la couche de support sur laquelle l’élément de garnissage s’étend.
Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de réalisation d’un élément de garnissage tel que décrit ci-dessus, comprenant les étapes suivantes :
- prévoir une couche de support,
- placer un élément de chauffage sur une partie d’une face interne ou d’une face externe de la couche de support,
R 1 et R 6 comprenant éventuellement un ou deux substituant(s) choisi(s) parmi -OH, -OR 7 et OCOR 7 , dans lequel R 7 est un groupe alkyle de 1 à 3 atome(s) de carbone,
sous réserve que l’un au moins des groupements R 0, R 1 ou R 6 comprend au moins une fonction alcényle,
une étape d’estérification du composé de formule (20) avec un acide de formule (21) et un acide de formule (22), en particulier les acides gras de formules (21) et (22) sont identiques, pour obtenir le composé de formule (6),
R 1 et R 6 représentent indépendamment, en particulier pouvant être identique :
dans laquelle l’un des groupements R 0 , R 1 ou R 5 comprend au moins une fonction alcényle,
- un groupement alkyle linéaire de 15 atomes de carbone, comprenant éventuellement de 1 à 3 fonctions époxydes ou,
- un groupement alcényle linéaire de 15 atomes de carbone, comprenant x fonctions alcényles, x variant de 1 à 3, comprenant y fonctions époxydes, y variant de 0 à 2, x + y étant inférieur ou égal à 3 ,
- -OC-O-R 6 de formule,
L’invention a également pour objet plusieurs microcompartiments ensemble.
L’invention a également pour objet un ensemble ou série de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu’au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l’invention.
De façon préférée, la série de microcompartiments selon l’invention est dans un milieu de culture, en particulier dans un milieu de culture au moins partiellement convectif. Tout milieu de culture adapté à la culture de lymphocytes peut être utilisé, tel que par exemple le milieu « TexMACS (Miltenyi Biotec) » ou « VIVO 15-20 (Lonza) » ou « CTS™ OpTmizer™ (ThermoFisher) » ou NKMACS (Miltenyi Biotec) ou ExCellerate Human NK Cell Expansion Media (R&D Systems), dès lors que la concentration en sels dissouts est compatible avec le maintien de la réticulation de l’alginate par les cations divalents.
Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, l’invention a pour objet une série de microcompartiments cellulaires dans une enceinte close, telle qu’un bioréacteur, préférentiellement dans un milieu de culture dans une enceinte close, telle qu’un bioréacteur. Ainsi, préférentiellement, les microcompartiments sont disposés dans un milieu de culture dans un bioréacteur clos.
L’ensemble ou série de microcompartiments selon l’invention comprend préférentiellement entre 2 et 10 16 microcompartiments.
Les microcompartiments selon l’invention peuvent être utilisés pour toutes applications, en particulier comme médicament en thérapie cellulaire chez l’homme ou l’animal.
Préférentiellement, les microcompartiments selon l’invention peuvent être utilisés dans la prévention ou le traitement de maladies auto-immunes, de syndromes d’immunodéficience, de cancers, de maladies virales ou de malades inflammatoires.
Ainsi, le microcompartiment selon l’invention est adapté à la culture à grande échelle en fournissant des lymphocytes présentant un phénotype fonctionnel garantissant une efficacité et une persistance optimale in vivo.
Selon un mode de réalisation particulier, l’invention vise un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400µm, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne formant dans un milieu une culture groupée en trois dimensions comprenant : - une teneur en TNF alpha inférieure à 100ng/mL de milieu ; et - une teneur en granzyme B inférieure à 1µg/mL de milieu ; et/ou - une teneur en perforine inférieure à 0,5µg/mL de milieu.
Dans ce mode de réalisation, la proportion de lymphocyte T naif et/ou Tscm reste supérieure à 20%.
Préférentiellement, le microcompartiment est obtenu après encapsulation de lymphocytes dans ajout de matrice extracellulaire ou sans ajout d’élément de matrice extracellulaire.
Procédé de préparation de microcompartiments selon l’invention
L’invention vise également un procédé de préparation de microcompartiments selon l’invention.
Le microcompartiment selon l’invention peut être obtenu à partir de lymphocytes ou de cellules aptes à se différencier en lymphocytes (cellules souches, notamment cellules souches pluripotentes induites, cellules souches hématopoïétiques dont des cellules CD34+, etc…).
Selon un premier mode de réalisation, le microcompartiment selon l’invention est obtenu à partir de lymphocytes.
Le procédé de préparation d’un microcompartiment ou d’un ensemble de microcompartiments selon l’invention, peut comprendre les étapes suivantes : -(a) incuber les lymphocytes dans un milieu de culture comprenant des cytokines -(b) encapsuler les lymphocytes lavés dans un milieu de culture dans une couche d’hydrogel, préférentiellement sans ajouter de matrice extracellulaire ou sans ajouter d’élément de matrice extracellulaire, pour former un microcompartiment en trois dimensions clos de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400µm, de façon à ce que chaque microcompartiment comprennent au moins 5 lymphocytes dans sa partie interne. -(c) cultiver les microcompartiments obtenus à l’étape (b) dans un milieu de culture comprenant des cytokines, pendant 2 à 6 jours.
Le kit de détection utilisé est le MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit (Miltenyi Biotec, 130-125-800)
La préparation des différents réactifs et solutions a été faite selon les recommandations du fournisseur dans la plaque MACSPlex Filter Plate
Les surnageants de culture des cellules encapsulées ou non ont été prélevés à jour 6 après et incubés dans la plaque préparée en étape 2 ;
L’incubation a été réalisée en accord avec les recommandations du fournisseur ;
L’acquisition des données a été réalisée sur un cytomètre MACSQuant 10 (Miltenyi Biotec) en utilisant un Express Mode dédié (Miltenyi Biotec).
Les résultats sont exprimés en moyenne de fluorescence (MFI) dans les tableaux 1,2 et dans la . Un focus est fait sur la comparaison des concentrations extracellulaires de la perforine ( ) et de la granzyme B ( ).
GM-CSF Granzyme B IFNg IL-10 IL-17A IL-21 IL-4 Lymphocytes en suspension 329,52 884,01 19,05 0,255 0,1 0,755 0,295 Lymphocytes encapsulés 293,375 12,175 15,745 0,21 0,21 1,955 0,555
IL-6 MCP-1 Perforine TNF alpha Lymphocytes en suspension 3,025 12,48 43,175 71,605 Lymphocytes encapsulés 7,35 21,6 23,215 2,06
Ces résultats confirment notamment que les lymphocytes encapsulés dans le microcompartiment selon l’invention présentent une concentration en granzyme B, en perforine et en TNF alpha extracellulaires moins importante par rapport aux lymphocytes en suspension.
Comme illustré à la , on observe que le relâchement dans le milieu de cytokines plus particulièrement de granzyme B, de perforine et de TNF-alpha est moins important chez les lymphocytes encapsulés dans le microcompartiment selon l’invention.
Exemple 3 : Polarisation d’un microcompartiment selon l’invention
Les microcompartiment selon l’invention comprenant des lymphocytes T ont été fixés en PFA 4% dilué dans du PBS avec calcium et conservées à 4°C
Protocole de marquage :
Le marquage phalloidin et Lipilight (Membright) ont été fait aux dilutions recommandées par les fournisseurs pendant 72h sous agitation, à température ambiante et protégé de la lumière
L’acquisition des images ( ) a été faite en microscopie confocale.
On peut observer un microcompartiment selon l’invention comprenant des lymphocytes dont le noyau est excentré. Par conséquent, les lymphocytes sont polarisés au sein du microcompartiment et présentent ainsi un phénotype fonctionnel.
- un groupement méthyle CH 3 ;
- un groupement alkyle linéaire de 1 à 30 atome(s) de carbone, comportant éventuellement 1 à 6 fonctions époxydes, ou
- un groupement alcényle linéaire de 2 à 24 atome(s) de carbone, comprenant éventuellement de 1 à 6 fonction(s) époxyde(s), ledit groupement alcényle étant éventuellement substitué par un groupe alkyle de 1 à 5 atome(s) de carbone,
sous réserve que l’un au moins des groupement OR, R 2 ou R 3 est une fonction ester et/ou l’un au moins des R 0 , R 1 , R 5 ou R 6 comporte au moins une fonction époxyde.
Par « fonction époxyde » , on entend un groupement comportant un oxygène ponté sur une liaison carbone-carbone.
Par « fonction alcényle » , on entend un groupement insaturé C=C, à savoir au moins une double liaison(s) carbone-carbone.
On comprend que x et y sont des nombres entiers positifs et que x indique le nombre de fonctions époxydes présent dans le groupement R 0 et que y indique le nombre de fonctions époxydes présent dans le groupement R 0 . Le nombre de fonctions époxydes ou alcényles présent dans le groupement R 0 ne peut être supérieur à 3.
Lorsque y est 0, cela signifie qu’il n’y a pas de groupement époxyde sur le groupement R 0 .
Par « groupement alkyle linéaire de 1 à 30 atome(s) de carbone » on entend une chaine carbonée de 1 à 30 atome(s) de carbone.
Par « comprenant éventuellement de 1 à 6 fonctions époxydes » , on entend que la chaine carbonée comprend de 0 à 6 fonctions époxydes. En d’autres termes, la chaine carbonée soit comprend aucune fonction époxyde soit comporte de 1 à 6 atome(s) d’oxygènes pontés sur les atomes de carbones de la chaine carbonée.
Par « groupement alcényle linéaire de 2 à 24 atomes de carbone » on entend une chaine carbonée linéaire de 2 à 24 atomes de carbone comprenant au moins une fonction alcényle, à savoir au moins une double liaison(s) carbone-carbone.
Par « groupement alkyle de 1 à 5 atome(s) de carbone » on entend un groupement alkyle, linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 5 atome(s) de carbone. Il s’agit des groupements méthyle, éthyle, propyle, butyle, pentyle. La définition de propyle, butyle, pentyle, hexyle, heptyle, octyle, nonyle et décyle inclut tous les isomères possibles. Par exemple, le terme butyle comprend n -butyle, iso -butyle, sec -butyle et te r-butyle.
Par « groupement alkyle de 1 à 3 atome(s) de carbone » on entend un groupement alkyle, linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 3 atome(s) de carbone. Il s’agit des groupements méthyle, éthyle, propyle et isopropyle.
Selon un troisième aspect, l’invention concerne un procédé d’installation d’un dispositif d’automatisation selon le premier aspect de l’invention, le procédé comportant les étapes suivantes : installation du moteur, de l’organe de supervision et de l’interface homme-machine ; définition du type de winch dans une console d’administration ; téléchargement, depuis un serveur, des efforts limites associés au type de winch défini pour différentes manœuvres ; enregistrement des efforts limites dans la mémoire ; et configuration de l’interface homme-machine en fonction des préférences de l’utilisateur.
La est une représentation schématique d’un winch automatisé selon un mode de réalisation de l’invention ;
La est une vue en perspective de l’interface homme-machine d’une implémentation du winch automatisé de la ;
La est une représentation schématique partiellement en coupe d’un mode d’implémentation du moteur du winch automatisé de la ; et
La est représentation d’une partie d’une base de données contenant des caractéristiques de différents winchs.
Description détaillée des modes de réalisation La illustre un winch automatisé selon un mode de réalisation de l'invention. Le winch comporte une base 1 fixée sur une coque 0 d'un bateau et une poupée 2 mobile en rotation autour d'un axe de transmission principale 3.
Plus précisément, la poupée 2 comporte une partie supérieure 2.1 permettant de maintenir un boot 6 pendant l'enroulement de celui-ci autour d'une partie centrale 2. 3 de la poupée 2 . Une liaison pivot 2. 2 est formée entre la poupée 2 et la coque 1 de sorte que la poupée 2 soit mobile en rotation.
Dans un winch manuel, le mouvement de rotation de la poupée 2 est exercé par une manivelle de winch fixée dans un logement 3.1 . Ce logement 3.1 entraîne en rotation deux trains d'engrenages 4 et 5 . Ces deux trains d'engrenages permettent de faire tourner la poupée 2 dans le même sens de rotation mais avec des vitesses distinctes. Ainsi, les pignons 4.1 et 4.2 du train d'engrenages 4 permettent d'inverser le sens de la rotation appliquée sur l'axe de transmission principale 3 . Lorsqu’un mouvement est appliqué dans un premier sens de rotation sur l'axe de transmission principale 3 , seul le train d'engrenages épicycloïdale 4 est mis en œuvre pour entraîner la poupée 2 avec une première vitesse. Inversement, lorsque l'axe de transmission principale 3 est entraîné dans l'autre sens de rotation, seul le train d'engrenages épicycloïdale 5 est mis en œuvre avec les pignons 5.1 et 5.2 qui imposent un rapport de démultiplication permettant de limiter la vitesse de la poupée 2 .
Ainsi, un winch classique présente un axe de transmission 3 permettant de supporter deux sens de rotation de sorte à entraîner une poupée 2 avec deux vitesses distinctes et un même sens de rotation.
Bien entendu, toutes les configurations mécaniques peuvent être envisagées sans changer l’invention.
Quel que soit la configuration mécanique du winch utilisé, l'invention propose d'automatiser le winch en entraînant l'axe de transmission principale 3 par un moteur 12 , de préférence un moteur électrique. Pour ce faire, la partie inférieure 3.2 de l'axe de transmission principale 3 peut être couplée au rotor du moteur 12 .
Plus précisément, tel qu'illustré sur la , le rotor du moteur 12 peut s’étendre perpendiculairement à l'axe de transmission principale 3 de sorte à limiter l'encombrement du dispositif d'automatisation.
Par exemple, le rotor du moteur 12 peut être fixé sur un train d’engrenages épicycloïdal 10 , dont la sortie est connectée à un pignon 9 supporté par un roulement 9 - 1 . Un engrenage 8 permet ensuite de connecter le pignon 9 à l’axe de transmission principal 3 du winch. De préférence, un ventilateur 13 est placé à proximité du moteur 12 pour assurer son refroidissement et le moteur 12 est protégé par un carter 16 .
Outre les éléments mécaniques, le moteur 12 peut être alimenté électriquement par un organe de supervision 15 intégré au carter 16 du moteur 12 . L’organe de supervision 15 correspond par exemple à une carte mère intégrant un processeur et un circuit de contrôle de puissance 19 du moteur 12 .
Tel qu’illustré sur la , cet organe de supervision 15 peut présenter des connecteurs 15-1 accessibles en ouvrant un capot 14.
Selon une autre caractéristique, le cinquième axe E est situé au-dessus de l’extrémité inférieure 5 de la colonne de guidon 4. Le cinquième axe E traverse un bossage 17, décrit plus avant. Le bras supérieur 10 présente une rigidité élevée.
Selon une autre caractéristique, le bras supérieur 10 présente, en vue de côté, une surface inférieure 13 concave et une surface supérieure 16. La surface inférieure 13 s’étend d’une extrémité avant 14, au-delà du troisième axe C, à une extrémité arrière 15, au-delà du premier axe A. La surface supérieure 16 comprend un bossage 17 et une portion plane 18 en arrière du bossage 17. Le bossage 17 forme deux chapes pour le cinquième axe E.