L’exemple suivant illustre l’invention sans toutefois la limiter. A. Choix des souches et du matériel : L’essai est réalisé sur des souches de Salmonella typhimurium TA97a, TA98, TA100, TA102 et TA1535 soit en présence, soit en l’absence de S9-Mix dans des plaques 96-puits pour la préincubation puis dans des tubes pour l’incubation. L’incubation est réalisée en milieu liquide sans gélose ni dérivés de gélose. Les plaques 96-puits sont identifiées par le nom de la souche, la date de l’essai, la présence ou l’absence d’activation métabolique et le nom du produit à tester. Tout le matériel utilisé pour l’essai doit être stérile. B. Choix de l’activateur métabolique : L’activateur métabolique utilisé est la solution S9-Mix dont la composition est indiquée dans le tableau 1 suivant : Ingrédients quantités finales par cm 3 (ml) Tampon phosphate 100 µmoles Glucose-6-phosphate (disodium) 5 µmoles NADP (disodium) 4 µmoles Chlorure de magnésium 8 µmoles Chlorure de potassium 33 µmoles S9 (fraction surnageante d’un homogénat de foie de rat commercialisée par Molecular Toxicology Inc. (USA) 100 mm 3 (100µl) Eau Jusqu’à 1 cm 3 C. Préparation des cultures des souches d’essai TA97a, TA98, TA100, TA1535 et TA102 C1. A partir d’un cryotube congelé : Le volume nécessaire de souche est introduit à raison de 2% en volume (2% v/v) de milieu Gencar (milieu de culture liquide), puis supplémenté en ampicilline à raison de 25 µg/cm 3 pour les souches TA97a, TA98, TA100 et TA102 et aussi de 2 µg/cm 3 de tétracycline pour la souche TA102. C2 . A partir d’une culture isolée : Une colonie de chacune des souches isolées est introduite dans 7 cm 3 (7ml) de milieu Gencar puis supplémenté en ampicilline à raison de 25 µg/cm 3 pour les souches TA97a, TA98, TA100 et TA102 et aussi de 2 µg/cm 3 de tétracycline pour la souche TA102. Les quantités utilisées sont recensées dans le tableau 2 suivant : Souche Volumes d’ingrédients mis en œuvre Milieu Gencar Ampicilline (10 mg/cm 3 ) Tétracycline (1 mg/cm 3 ) TA98 140 mm 3 (140 µl) (ou 1 colonie) 7 cm 3 (7 ml) 17,5 mm 3 (17,5 µl) 0 TA100 140 mm 3 (140 µl) (ou 1 colonie) 7 cm 3 (7 ml) 17,5 mm 3 (17,5 µl) 0 TA102 140 mm 3 (140 µl) (ou 1 colonie) 7 cm 3 (7 ml) 17,5 mm 3 (17,5 µl) 14 mm 3 (14 µl) TA1535 140 mm 3 (140 µl) (ou 1 colonie) 7 cm 3 (7 ml) 0 0 TA97a 140 mm 3 (140 µl) (ou 1 colonie) 7 cm 3 (7 ml) 17,5 mm 3 (17,5 µl) 0 C3. Les solutions préparées aux paragraphes C1. et C2. précédents, sont laissées pendant une nuit au bain-marie à une température de 37°C puis conservées à 4°C dès l’arrêt du bain-marie. A l’issue de cette période, les cultures bactériennes obtenues contiennent entre 5.10 8 et 5.10 9 cellules par centimètre cube. D. Préparation des solutions témoins négatifs : Ces solutions sont préparées dans les puits de plaques de quatre-vingt-seize puits selon une distribution détaillée au paragraphe G. suivant. D1. Solution témoin négatif sans activateur métabolique : 1,5 mm 3 (1,5 µl) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm 3 (150 µl) du milieu Gencar, 6 mm 3 (6 µl) de tampon phosphate et 1,2 mm 3 (1,2 µl) du solvant utilisé pour préparer la solution initiale de ladite substance chimique d’essai. D2. Solution témoin négatif avec activateur métabolique : 1,5 mm 3 (1,5 µl) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm 3 (150 µl) du milieu Gencar, 6 mm 3 (6 µl) de l’activateur métabolique S9-Mix tel que défini au paragraphe B. précédent et 1,2 mm 3 (1,2 µl) du solvant utilisé pour préparer la solution de ladite substance chimique d’essai. E. Préparation des solutions témoins positifs : Ces solutions sont préparées dans les puits de plaques de quatre-vingt-seize puits selon une distribution détaillée au paragraphe G. suivant. E1. Solution témoin positif sans activateur métabolique : 1,5 mm 3 (1,5 µl) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm 3 (150 µl) du milieu Gencar, 1,2 mm 3 (1,2 µl) de la solution de la substance chimique de référence et 6 mm 3 (6 µl) de tampon phosphate. E2. Solution témoin négatif avec activateur métabolique : 1,5 mm 3 (1,5 µl) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm 3 (150 µl) du milieu Gencar, 1,2 mm 3 (1,2 µl) de la solution de la substance chimique de référence et 6 mm 3 (6 µl) de l’activateur métabolique S9-mix tel que défini au paragraphe B. précédent. E3. Substances chimiques de référence utilisées : Les solutions initiales des substances chimiques de référence utilisées en l’absence et en présence d’activateur métabolique, sont recensées dans les tableaux 3 et 4 suivants : Substance chimique de référence utilisée en l’absence d’activateur métabolique Souche d’essai Concentration de la solution TA98 2-nitro fluorène 25 µg/cm 3 TA100 4 nitro quinoline-N-oxyde 50 µg/cm 3 TA102 Mitomycine 50 µg/cm 3 TA1535 Azoture de sodium 150 µg/cm 3 TA97a 9-amino acridine 200 µg/cm 3 Substance de référence utilisée en présence d’activateur métabolique Souche d’essai Concentration de la solution TA98 2-amino anthracène 50 µg/cm 3 TA100 2-amino anthracène 50 µg/cm 3 TA102 2-amino anthracène 300 µg/cm 3 TA1535 2-amino anthracène 300 µg/cm 3 TA97a 2-amino anthracène 50 µg/cm 3 F. Préparation des solutions de substances chimiques dont on souhaite détecter le caractère mutagène : Ces solutions sont préparées dans les puits de plaques de quatre-vingt-seize puits selon une distribution détaillée au paragraphe G. suivant. Pour chaque substance chimique d’essai à analyser, il est préparé des solutions de cinq concentrations différentes. F1. Solution sans activateur métabolique : 1,5 mm 3 (1,5 µl) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm 3 (150 µl) du milieu Gencar, 1,2 mm 3 (1,2 µl) de la solution initiale de ladite substance chimique d’essai, et 6 mm 3 (6 µl) de tampon phosphate pour maintenir le pH autour de 7,4. F2. Solution avec activateur métabolique : 1,5 mm 3 (1,5 µl) de chaque culture bactérienne préparée à l’étape C. précédente sont mélangés à 150 mm 3 (150 µl) du milieu Gencar, 1,2 mm 3 (1,2 µl) de la solution initiale de ladite substance chimique d’essai et 6 mm 3 (6 µL) de l’activateur métabolique S9-Mix tel que défini au paragraphe B. précédent. G. Etape de préincubation des souches G1. Préparation des plaques de préincubation . : On prépare, pour chaque souche d’essai, une plaque de 96 puits, comportant 12 colonnes de 8 puits. En ce qui concerne les essais sans activateur métabolique, - 5 puits de ladite plaque de 96 puits contiennent 157,5 mm 3 (157,5 µl) de la solution témoin négatif, comme préparée au paragraphe D1. précédent ; - 5 puits de ladite plaque contiennent 158,7 mm 3 de la solution témoin positif, comme préparée au paragraphes E1. précédent ; - Pour les 5 chaque concentrations choisies, 5 puits de ladite plaque contenant 158,7 mm 3 de la solution de la substance chimique d’essai, comme préparée au paragraphe F1. - Le reste des puits, soit 61 puits contiennent chacun le milieu Gencar. La même distribution est adoptée pour les plaques concernant les essais avec activation métabolique avec les différentes solutions comme préparées aux paragraphes D2., E2. Et F2.. G2. Préincubation : Les plaques comme préparées aux paragraphes G1. et G2. précédents avec chacune des souches d’essais, sont entourées par un film (type Parafilm) et laissées incuber une nuit à 37°C sous agitation. H. Etape d’incubation en milieu liquide H1. Préparation des solutions pour incubation : Les contenus de chacun des puits après préincubation, sont versés dans des tubes contenant 3 cm 3 (3ml) de milieu Gencar puis dans lesquels sont incorporés 720 mm 3 (720 µl) de tampon phosphate. Chaque tube contient environ 3879 mm 3 (3879 µl) de liquide, dont 3225 mm 3 sont finalement répartis dans 5 puits à raison de 645 mm 3 (645 µl) par puits. H2. Incubation : Le produit en quantité de l’ordre du picogramme au microgramme est incubé en présence ou en absence de S9 dans un milieu de culture pendant un temps maximum d’une nuit. I. Analyse des échantillons I1. Conception des amorces nécessaires à la qPCR : La technologie qPCR permet l’amplification spécifique de chaque type d’allèle. La proportion de gènes sauvages et de gènes mutés est déterminée dans le présent essai en comparant les résultats de deux qPCR distinctes effectuées avec différents types d’amorces et de sondes. Un premier mélange spécifique du gène sauvage non muté, appelé mélange Wt, et un deuxième mélange spécifique du gène muté, appelé mélange Mut. Les amorces spécifiques de chaque gène sont conçues en prenant comme référence, la séquence de l’opéron histidine de Salmonella typhimurium (numéro ncbi : JO1804.1) de manière à amplifier la région du gène qui couvre la mutation de chacune des souches TA100, TA98, TA1535, TA102 et TA97a. I2. Extraction de l’ADN de cellules de Salmonella typhimurium des tubes après incubation : Les échantillons de 645 mm 3 (645 µl) résultant de l’ étape H d’incubation précédente, sont si nécessaire centrifugés pour éliminer tout surnageant. On y ajoute ensuite dans chacun 200 mm 3 (200µl) de tampon phosphate sous poste de sécurité microbiologique (sous PSM). Après agitation vigoureuse, la densité optique (DO) à 600 nm de chaque échantillon est mesurée au moyen d’un spectrophotomètre Implen NP80. Si nécessaire les échantillons sont de nouveau centrifugés, puis leur ADN est extrait en utilisant la trousse dénommée « Mag Bind Bacterial DNA 96 kit » commercialisé par la société OMEGA bio teck. L’ADN recueilli de chaque échantillon est ensuite élué dans 50 mm 3 de tampon d’élution puis la quantité et la concentration de l’ADN obtenu est mesurée au moyen du même spectrophotomètre Implen NP80 (DO à 260, 230 et 280 nm). Des dilutions en cascade de plasmides recombinants porteurs des fragments d’intérêt sont préalablement préparés de manière à ce que les nombres de copies (amplifiées pour chacune des souches en version mutée et en version révertante) s’échelonnent de 2,5 copies/mm 3 à 2,5 10 6 copies/mm 3 . 2 mm 3 de chaque échantillon d’ADN sont mélangés à 2 mm 3 d’eau, 5 mm 3 de réactif de la trousse « Genotyping Master Mix » commercialisé par la société ThermoFisher Scientific et à 1 mm 3 des mélanges spécifiques d’amorces et de sondes à chaque souche suivants : - Les mélanges TA100WT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche et TA100 et TA100MUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche, - Les mélanges TA98WT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA98 et TA98MUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche, - Les mélanges TA102WT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA102 et TA102MUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche, - Les mélanges - TA97aWT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA97a et TA97aMUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche, et - Les mélanges TA1535WT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches révertantes de la souche TA1535, et TA1535MUT pour amplifier spécifiquement les ADNs des souches mutées de cette souche. I3. Analyse des échantillons : Deux qPCR sont réalisées pour chaque échantillon de souche, afin de quantifier pour chaque souche, la quantité de gènes sauvages non mutés et celle de gènes mutés. Ces amplifications sont effectuées avec un QuantStudio™ 3.0 (Applied Biosystems), en activant l’attaque à 90°C pendant 10 minutes, en effectuant 45 cycles de PCR (95°C 15 s ; 66°C 60s) avec une rampe de montée en température de 1,6°C/s. La normalisation des résultats de qPCR est permise grâce au réactif ROX contenu dans la trousse « Genotyping Master Mix » I4. Analyse des résultats : Les droites de régression établies à partir des valeurs des cycles de seuil (valeurs de Ct) obtenues pour chacune des gammes de dilutions de plasmide permettent de déterminer la quantité de gènes sauvages (Wt) et mutés (Mut) dans chacune des échantillons traités et leur contrôle respectif (échantillon non traité). Ces quantités sont calculées automatiquement par le logiciel associé au QuantStudio ™ dénommé : « QuantStudio™ Design & Analysis Desktop Software ». Le rapport entre le nombre de gènes révertants (Wt)et le nombre de gènes totaux (Wt + Mut) est ensuite calculé pour chacun des échantillons. La proportion de révertants dans chacun des échantillons exposés à la substance chimique dont on souhaite détecter le caractère mutagène éventuel est alors comparée à la proportion observée dans les échantillons non traités. Un rapport supérieur à 1 suggère un effet mutagène potentiel induit par ladite substance d’essai.