INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Selon un mode de réalisation visible sur la , chaque meuble système 20 comprend une face avant F20 sensiblement verticale, parallèle à l’axe longitudinal X et orientée vers ledit axe longitudinal X, une face arrière F20’ sensiblement verticale, parallèle à l’axe longitudinal X et opposée à la face avant F20, ainsi que des montants, verticaux, positionnés sur les faces avant et arrière F20, F20’ et répartis sur la longueur du meuble système 20, des montants étant situés à chaque extrémité longitudinale des faces avant et arrière F20, F20’.
Chaque meuble système 20 est relié à la structure primaire du fuselage 10 par des systèmes de liaison inférieurs avant 26.1 et des systèmes de liaison inférieurs arrière 26.2 ainsi qu’aux poutres transversales 18 du plancher 12 par des systèmes de liaison supérieurs 28.
Chaque système de liaison supérieur 28 comprend une bielle 30 qui présente une première extrémité 30.1 reliée par une première articulation rotulée au meuble système 20, plus particulièrement à un montant du meuble système 20, ainsi qu’une deuxième extrémité 30.2 reliée par une deuxième articulation rotulée à l’une des poutres transversales 18 du plancher 12, la bielle 30 et la poutre transversale 18 étant positionnés sensiblement dans un même plan transversal pour optimiser la reprise des efforts.
Chaque système de liaison inférieur avant 26.1 est positionné au niveau de la face avant F20 du meuble système 20 et comprend une bielle 32 qui présente une première extrémité 32.1 reliée par une première articulation rotulée au meuble système 20, plus particulièrement à un montant du meuble système 20, ainsi qu’une deuxième extrémité 32.2 reliée par une deuxième articulation rotulée à la structure du fuselage 10 et plus particulièrement à un cadre 10.1 de la structure primaire du fuselage 10.
Chaque système de liaison inférieur arrière 26.2 est positionné au niveau de la face arrière F20’ du meuble 20 et comprend une chape 30, solidaire du meuble système 20 et plus particulièrement d’un montant du meuble système 20, ladite attache étant reliée par un axe rotulé à une attache solidaire d’un cadre 10.1 de la structure primaire du fuselage 10.
La case de train d’atterrissage est délimitée par des parois et configurée pour loger un train d’atterrissage mobile entre des positions sortie et rentrée. Même si les parois de la case de train d’atterrissage sont renforcées, les mouvements de rentrée et sortie du train d’atterrissage induisent des déformations des parois de la case de train d’atterrissage.
Compte tenu de ces déformations, il est difficile de relier un meuble système 20 à la case de train d’atterrissage.
Ainsi, les meubles systèmes 20 ne peuvent être reliés en partie inférieure qu’aux cadres 10.1 du fuselage. Ne pouvant pas être reliés à la case de train d’atterrissage en raison des déformations de cette dernière, les meubles systèmes 20 en sont écartés, ce qui ne permet pas d’optimiser leur implantation dans la soute avionique.
1 H RMN (CDCl 3 ), δ (ppm) : 11,13 (s, 1H), 7,41 – 7,38 (dd, CH), 7,18-7,16 (dd, J = 8,3, 1,2 Hz, CH), 7,01-6,99 (dd, J = 7,5, 1,2 Hz, CH), 5,96–4,97 (fonction alcényle restante), 3,96 (s, CH 3 ), 3,14 – 3,03 (CH 2 ), 3,02 – 2,6 (m, CH 2 ), 2,93 – 2,85 (m, CH 2 ), 2,85 – 2,74 (m, CH 2 ), 2,29 (s, CH 3 ), 2,12 – 1,95 (m, CH 2 ), 1,72-1,66 (s, CH 2 ), 1,50-1,56 (m, CH 2 ), 1,44 – 1,16 (m, CH 2 ), 0,91-0,88 (m, J = 13.1, 7.2 Hz, 1 CH 3 )
Exemple 13 : Protocole d’extrusion L’acétate de cellulose et le plastifiant sont mélangés dans un extrudeur. Le poids en plastifiant est à un taux de concentration de 25 à 32%. L’extrudeur (twin screw (22)) est lancé à 150-190°C, à une vitesse de rotation de 160 RPM.
Exemple 14 : Préparation de la solution d’acétate de cellulose plastifié et du film plastique
L’acétate de cellulose utilisé a un degré de substitution de 2,5.
Un mélange de plastifiant (30% wt) et d’acétate de cellulose a été dissous à 10% dans de l’acétone. Les solutions ont été mélangées 24h à température de 25°C à pression atmosphérique puis ont été versées sur un plateau en téflon ou en silicone. Les films ont été réalisés par évaporation lente du solvent à 25°C et à pression atmosphérique et ont été stockés dans un dessicateur ou une étuve.
Analyse thermogravimétrique
Les expériences consistent en la mesure de la perte de masse de l’échantillon sous un flux d’air (60mL.min −1 ) en fonction de la température de 25 jusqu’à 500°C avec un taux de chauffage de 10°C.min −1 .
Analyse dynamique mécanique
Les échantillons ont été testés selon une tension uniaxiale pendant chauffage à un taux de 3 °C/min à une fréquence d’1 Hz avec une contrainte fixe de 2,1.10 -6 m pour les échantillons plastifiés avec le diéthylphtalate et 3,6.10 -6 m pour les échantillons plastifiés avec les plastifiants de l’invention.
Les échantillons testés ont une épaisseur de 0,1 mm, 10 mm de largeur et 20 mm de longueur.
Exemple 15 Film plastique avec P1a La préparation du film plastique avec le plastifiant P1a a été effectuée selon l’exemple 14. Les résultats sont les suivants.
La calorimétrie différentielle a montré une température de transition vitreuse de 192°C.
Exemple 16 Film plastique avec P1b La préparation du film plastique avec le plastifiant P1b a été effectuée selon l’exemple 14. Les résultats sont les suivants.
La température de transition vitreuse obtenue par analyse dynamique mécanique est de 128°C. La calorimétrie différentielle a montré une température de transition vitreuse de 171°C. Les analyses thermogravimétriques ont montré qu’il n’y avait pas de perte de stabilité thermique pour le plastique.
Exemple 17 Film plastique avec P5 La préparation du film plastique avec le plastifiant P5 a été effectuée selon l’exemple 14. Les résultats sont les suivants.
La calorimétrie différentielle a montré une température de transition vitreuse de 178°C.
Les cellules ont été rincées en solution 1 une fois.
Une partie du culot cellulaire a été repris en solution 1 a une densité cellulaire de 5 millions de cellules par ml en vue de l’encapsulation.
L’autre partie du culot cellulaire a été repris en solution 1 a une densité cellulaire de 5 millions de cellules par ml (contrôle).
Etape 4 : Encapsulation (J3)
Le dispositif d’encapsulation est préparé comme décrit dans Alessandri et al., 2016 (« A 3D printed microfluidic device for production of functionalized hydrogel microcapsules for culture and differentiation of human Neuronal Stem Cells (hNSC) », Lab on a Chip, 2016, vol. 16, no. 9, p. 1593-1604).
Les trois solutions nécessaires sont chargées sur trois pousse-seringues, i) solution d’alginate (PRONOVA®SLG100 à 2% en masse dans de l’eau distillée), ii) solution intermédiaire (sorbitol à 300mM), iii) solution cellulaire (préparée à l’étape précédente) ; Les trois solutions sont co-injectées de manière concentrique grâce à un injecteur microfluidique qui permet de former un jet qui se fractionne en gouttes dont la couche extérieure est la solution d’alginate et le cœur la solution de cellules ; Ces gouttes sont collectées dans un bain de calcium (à 100mM) qui rigidifie la solution d’alginate pour former la coque.
L’invention favorise surtout l’amplification avec un taux d’expansion élevé, ce qui par conséquent diminue le temps de culture et le nombre de divisions pour obtenir un nombre de lymphocytes fonctionnels très important, et limite donc de nouvelles mutagenèses.
Etape 5 : traitement après encapsulation (J3)
Les capsules sont récupérées avec un tamis cellulaire 40µm puis après rinçage (1x) avec la solution 3 elles sont stockées dans une flasque de 75cm² avec la solution 1 a une densité cellulaire de 100 000 cellules par ml (condition 1) ou 200 000 cellules par ml (condition 2).
La flasque est gardée à l’incubateur à 37°C et 5% de CO2 pendant 3 jours.
Les cellules non encapsulées telles que préparées durant la 3ème étape sont cultivées en parallèle dans les mêmes conditions atmosphériques pendant 3 jours.
Etape 6 : Dissolution des capsules et comptage (J6)
-(a) : Bras 1 : capsule -La suspension de capsules a été prélevée et laissée à sédimenter pendant 5 minutes dans un tube Falcon de 50ml. -Le surnageant a été prélevé avec précaution et éliminé. -Les capsules ont ensuite été traitées avec la solution 4 pendant 5 min à 37°C. -Les cellules libérées des capsules ont été centrifugées à 300g pendant 10minutes pour éliminer la solution 4. -Les cellules ont été finalement comptées au NC2000 (protocole standard 1 cassette)
-(b) : Bras 2 : contrôle en suspension -La suspension cellulaire a été prélevée puis centrifugée à 300g pendant 10min. -Le surnagent a été aspiré. -Les cellules ont ensuite été comptées au NC2000 (protocole standard 1 cassette).
Les résultats d’encapsulation de lymphocytes T selon le protocole décrit montre une meilleure amplification cellulaire en capsules par rapport à une culture classique en suspension. Ainsi nous obtenons un facteur d’amplification de fois 20 en 3 jours de culture en capsule contre un facteur de fois 2 pour une culture classique.
Exemple 2 : Mesure de la sécrétion de cytokines de lymphocytes encapsulés ou non
R 1ep et R 5ep représentent indépendamment :
lesdits groupements R 1ep et R 5ep comprenant éventuellement un ou deux substituant(s) choisi(s) parmi -OH, -OR 7 et OCOR 7 , dans lequel R 7 est un groupe alkyle de 1 à 3 atome(s) de carbone,
sous réserve que l’un au moins des groupements R 0ep , R 1ep ou R 5ep comporte une fonction époxyde.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d’un composé de formule (14) telle que définie ci-dessus, à partir d’un composé de formule (20) avec un acide de formule (21) et un acide de formule (22) pour obtenir un composé de formule (6), suivi d’une époxydation du composé de formule (6) :
formules (21) et (22) dans lesquelles R 1 et R 6 représentent indépendamment, en particulier pouvant être identique :
Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupée en 3D et ayant une faible teneur en granzyme B La présente invention se rapporte au domaine de la culture cellulaire de lymphocytes à grande échelle. L’invention a en particulier pour objet un microcompartiment cellulaire particulier, son procédé de préparation et ses utilisations.
Art antérieur Les progrès réalisés au cours de ces dernières décennies ont permis de mettre en avant l’intérêt de la thérapie cellulaire pour traiter de nombreuses pathologies.
La thérapie cellulaire se définit comme l’administration de cellules vivantes à un patient dans le but de prévenir, traiter ou d’atténuer une pathologie. L’objectif est d’obtenir un effet durable grâce à une injection de cellules thérapeutiques.
De nombreuses approches de thérapie cellulaire peuvent être envisagées telles que : - l’approche dite autologue dans laquelle le patient est son propre donneur. - l’approche dite allogénique dans laquelle le donneur est différent du patient.
La thérapie cellulaire recouvre de larges domaines thérapeutiques et s’applique à de nombreux types cellulaires allant des cellules pluripotentes jusqu’aux cellules adultes spécialisées à fonction métabolique ( e.g hépatocytes) ou à fonction mécanique ( e.g myoblastes, chondrocytes), en passant par les lignées hématopoïétiques telles que les cellules mononucléées du sang ( e.g lymphocytes T ou lymphocytes NK).
Une des thérapies les plus prometteuse à ce jour est la thérapie cellulaire CAR (Récepteur antigénique chimérique). Les cellules CAR-T sont des lymphocytes T exprimant des récepteurs antigéniques chimériques qui sont des récepteurs artificiels conçus pour reconnaitre un antigène présent à la surface des cellules tumorales. Les cellules CAR-T guident le système immunitaire pour cibler et éradiquer les cellules cancéreuses. Cette approche est considérée comme une avancée majeure dans l’immunothérapie et de nombreuses cellules CAR-T sont en cours de développement de façon à étendre leurs utilisations. Les cellules CAR-T sont produites en général selon l’approche autologue. Toutefois, il est également possible de créer des cellules CAR-T allogéniques.
Il existe également une alternative utilisant des lymphocytes NK (natural killer). Les lymphocytes NK sont des cellules effectrices cytotoxiques très puissantes ayant démontré un effet antitumoral.
Afin de pouvoir développer le potentiel des thérapies cellulaires utilisant des lymphocytes, notamment les thérapies CAR-T ou CAR-NK, il est nécessaire de pouvoir s’appuyer sur des techniques de culture cellulaire de lymphocytes à grande échelle.
La production ex vivo de cellules immunitaires tels que les lymphocytes T ou NK est particulièrement complexe, surtout à grande échelle. En effet, les méthodes de cultures in vitro développées à ce jour sont trop stressantes et conduisent rapidement à l’épuisement cellulaire ne permettant pas de produire les lymphocytes à grande échelle. In vivo , la prolifération des cellules immunitaires se produit principalement dans des environnements mécaniquement stables tels que des tissus solides. L’environnement d’un bioréacteur étant rempli de contraintes de cisaillement non physiologiques, les taux d’expansion obtenus sont généralement encore insuffisants par rapport aux capacités d’expansion in vivo .
Actuellement, il n’existe aucune solution satisfaisante pour produire rapidement à grande échelle des lymphocytes fonctionnels, en particulier des cellules CAR-T ou CAR-NK.
Plusieurs méthodes de cultures sont principalement utilisées pour l’expansion des cellules CAR : la culture statique en flasque, la culture en sac statique perméables aux gaz et la culture en bioréacteur à mouvement de bascule (Vormittag P, Gunn R, Ghorashian S, Veraitch FS. Curr Opin Biotechnol. 2018), la plateforme G-rex® (Ludwig et al. “Methods and Process Optimization for Large-Scale CAR T Expansion Using the G-Rex Cell Culture Platform” Methods Mol Biol 2020;2086:165-177).
Toutefois, ces méthodes de culture ne sont pas adaptées à la production de lymphocytes à grande échelle en raison d’exposition des cellules à de nombreuses étapes de manipulation augmentant les risques de contaminations, d’exposition des cellules à des stress trop importants et/ou de contraintes de développement et de capacité des plateformes et méthodes utilisées. Par ailleurs, le travail de maintien en culture et de stockage serait trop exigeant pour une production à grande échelle.
Pour remédier à ce problème, l’art antérieur propose d’activer les lymphocytes avant leur mise en culture afin d’obtenir une prolifération rapide des lymphocytes.
Néanmoins, l’activation précoce des lymphocytes engendre un processus physiologique d’épuisement cellulaire. L’épuisement correspond à une maturation précoce des cellules T naïves vers une sous population de lymphocytes T effecteurs limitant la persistance du greffon in vivo .
Selon l’invention, il est nécessaire de générer des capsules dont la partie interne a un rayon moyen ou plus petit rayon d’au moins 100µm. Pour générer des capsules avec de telles dimensions avec une puce de coextrusion (injecteur microfluidique ou puce microfluidique) l’invention propose notamment de modifier le débit des solutions coextrudées et l’ouverture finale de la puce de co-extrusion. Par débit on entend le débit de de chaque solution qui arrive à l’injecteur. Par ouverture finale de la puce de co-extrusion, on entend l’ouverture interne du canal de sortie de la puce. - pour le débit : on passe préférentiellement d’une valeur comprise entre 20 et 40 ml/h pour chaque solution coextrudée pour les tailles standards de capsules connues de l’art antérieur, à une valeur comprise entre 45 et 150 mL/h, préférentiellement entre 45 et 110 mL par heure pour une variante de l’invention, - pour le diamètre de l’ouverture finale de la puce de coextrusion (injecteur microfluidique) qui passe d’une valeur préférentiellement comprise entre 50 et 120 µm pour les tailles standards de capsules connues de l’art antérieur, à une valeur de diamètre comprise entre 150 et 300 µm, préférentiellement entre 180 et 240 µm.
Ainsi, selon un mode de réalisation particulier l’étape (b) d’encapsulation est réalisée à l’aide d’un injecteur microfluidique dont le diamètre d’ouverture finale est compris entre 150 et 300 µm, préférentiellement entre 180 et 240 µm, et avec le débit de chacune des 3 solutions compris entre 45 et 150 mL/h, préférentiellement entre 45 et 110 mL/h.
Selon un mode de réalisation, les étapes (a) et/ou (c) sont mises en œuvre sous agitation permanente ou séquentielle. Cette agitation est importante car elle maintient l’homogénéité de l’environnement de culture et évite la formation de tout gradient diffusif. Par exemple, elle permet un contrôle homogène de niveau d’oxygénation cellulaire ; évitant ainsi les phénomènes de nécrose lié à l’hypoxie, ou de stress oxydatif lié à l’hyperoxie.
Le procédé selon l’invention est préférentiellement mis en œuvre d’une enceinte close tel qu’un bioréacteur clos.
Dans une variante préférée, le procédé selon l’invention comprend au moins une ré-encapsulation des lymphocytes après l’étape (c), c’est-à-dire au moins deux cycles d’encapsulation. Préférentiellement chaque cycle d’encapsulation correspond à un passage. Dans cette variante du procédé (au moins une ré-encapsulation des cellules après l’étape (c)) le nombre de divisions cellulaires de l’ensemble du procédé (pour l’ensemble des passages) est d’au moins 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 cycles de division cellulaire.
Dans un procédé selon l’invention il peut y avoir plusieurs ré-encapsulations, préférentiellement entre 1 et 100, notamment entre 1 et 10 ré-encapsulation(s).
Selon un mode de réalisation particulier, une étape d’activation des lymphocytes à l’aide d’un système d’activation artificielle (aAPC) peut être réalisée au sein du microcompartiment après au moins une ré-encapsulation.
Chaque ré-encapsulation peut comprendre : - une étape qui consiste à dissocier le microcompartiment ou la série de microcompartiments pour obtenir une suspension de lymphocytes ou une suspension d’amas de lymphocytes ; l’élimination de la couche externe en hydrogel peut être réalisée notamment par hydrolyse, dissolution, perçage et/ou rupture par tout moyen biocompatible, c’est-à-dire non toxique pour les cellules. Par exemple, l’élimination peut être réalisée en utilisant un tampon phosphate salin, un chélateur d’ions divalents, une enzyme comme l’alginate lyase si l’hydrogel comprend de l’alginate et/ou la microdissection laser, et -une étape d’activation des lymphocytes à l’aide d’un système d’activation artificielle (aAPC) préférentiellement à l’aide d’anticorps CD3/CD28 ; -une étape de ré-encapsulation de tout ou partie des lymphocytes ou amas de lymphocytes dans une capsule d’hydrogel. La ré-encapsulation est un moyen adapté pour une augmentation de l’amplification cellulaire obtenue depuis l’étape pluripotente, et diminuer les risques de mutation.
La ré-encapsulation consiste à éliminer la couche externe d’hydrogel, préférentiellement à remettre en suspension de manière partiellement ou totalement dissociées les cellules qui étaient sous forme de cystes dans les microcompartiments et à remettre en œuvre les étapes du procédé.
Selon un mode de réalisation la ré-encapsulation comprend les étapes suivantes : - (i) éliminer la couche externe en hydrogel, - (ii) remettre en suspension les lymphocytes qui étaient contenues dans le microcompartiment de façon à obtenir des cellules uniques et/ou au moins un ensemble ou amas de lymphocytes dans un milieu de culture contenant des cytokines - (iii) encapsuler la solution de lymphocytes dans une couche d’hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , le plus petit rayon ou le rayon moyen de ladite partie interne étant d’au moins 100 µm ; - (iv) cultiver les microcompartiments obtenus dans un milieu de culture contenant des cytokines, - (vi) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer les cytokines ; - (vi) cultiver les microcompartiments dans un milieu de culture dépourvu de cytokines, pendant au moins un cycle de division cellulaire, et - (vii) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus.
La compartimentalisation dans des microcompartiments permet d’éliminer les microcompartiments contenant d’avantage de cellules mutées que les autres capsules. Même si les cellules mutées ont une croissance rapide elles vont atteindre la confluence capsulaire qui va contenir leur multiplication. La compartimentalisation permet aussi de ne pas contaminer l’intégralité de la population cellulaire, et également d’éliminer les capsules contenant des cellules mutantes, à tout moment, en particulier avant une étape de ré-encapsulation. Ce tri peut être fait soit par analyse en ligne, soit par élimination des capsules remplies plus rapidement que les autres par exemple.
Dans un mode de mise en œuvre, au moins une des étapes (préférentiellement toutes les étapes) est réalisée à une température adaptée à la survie des cellules, comprise entre 4 et 42°C. La température lors de la prolifération cellulaire doit être préférentiellement entre 32 et 37°C pour éviter de déclencher des mutations en baissant la performance des enzymes de réparation. De même, de façon préférée, la température doit être basse (idéalement environ 4°C) pour gérer le stress des cellules à l’étape (c).
À tout moment, le procédé selon l’invention peut comprendre une étape consistant à vérifier le phénotype des cellules contenues dans le microcompartiment. Cette vérification peut être réalisée en identifiant l’expression par au moins une partie des cellules contenues dans le microcompartiment, d’au moins 4 gènes spécifiques du phénotype recherché choisis parmi CD45 RA RO, CCR7, CD62L, CD3, CD4,CD8.
Les microcompartiments cellulaires obtenus selon les procédés de l’invention peuvent ensuite être congelés avant toute utilisation. La congélation est préférentiellement réalisée à une température comprise entre -190°C et -80°C. La décongélation peut être réalisée par immersion du véhicule de congélation étanche (ampoule vissable ou poche plastique) dans un bain d'eau tiède (37 degrés préférentiellement) pour que les cellules décongèlent assez rapidement. Les microcompartiments selon l’invention avant leur utilisation peuvent être maintenus à plus de 4°C pendant une durée limitée avant leur utilisation, préférentiellement entre 4°C et 38°C.
La mise en œuvre du procédé selon l’invention, permet d’obtenir des microcompartiments comprenant au moins 80, préférentiellement au moins 500, au moins 800, au moins 1000, notamment au moins 3000 lymphocytes.
dans laquelle l’un au moins des groupements R 0 ou R 1 comprend au moins une fonction alcényle,
une étape d’époxydation du composé de formule (4) pour obtenir le composé de formule (12),
formule (12) dans laquelle R 0ep représente :
- un groupement alkyle linéaire de 1 à 30 atome(s) de carbone, comprenant éventuellement de 1 à 6 fonction(s) époxyde(s), ou
Selon un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé de préparation d’un composé de formule (13) telle que définie ci-dessus, à partir d’un composé de formule (17) avec un alcool de formule (18) et un acide de formule (19) pour obtenir un composé de formule (5) suivi d’une époxydation du composé de formule (5) :
Par exemple, depuis l’interface homme-machine ou depuis la console d’administration, il est possible de modifier la luminosité, la taille d’écriture, la langue de l’interface homme-machine, les paramètres du winch permettant d’obtenir les efforts engagés, les efforts limites associés aux différentes manœuvres enregistrées dans la mémoire, ajouter des nouvelles manœuvres…
Par ailleurs, ce dispositif peut être rapporté sur n’importe quel type de winch en dimensionnant le moteur en fonction des caractéristiques du winch.
Selon un second aspect, l’invention concerne un winch automatisé comprenant : une poupée destinée à recevoir un bout pour réaliser une manœuvre ; et un dispositif d’automatisation du winch selon le premier aspect de l’invention.