[Chem. 42] : On a préparé un polymère en utilisant le microorganisme Pseudomonas putida KT2440 ATCC® 47054™, l’acide nonanoique et l’acide acrylique. Le mode de culture est réalisé en conditions axénique en continu a une dilution de D=0,25h-1 dans un chemostat de 3L contenant 1,1L de milieu de culture. Le système est aéré avec de l’air à un débit de 1 vvm pour une consigne d’oxygène dissous (OD) à 30% de la saturation. Le procédé d’obtention est réalisé à l’aide de trois milieux de culture distincts. Le premier milieu de culture (MC1) est utilisé pour la préparation de l’inoculum. Le second milieu de culture (MC2) est utilisé pour la croissance en batch du microorganisme dans le fermenteur. Le troisième milieu de culture (MC3) est utilisé pour l’alimentation, ou maintenance, de la fermentation en continu contenant la source carbonée d’intérêt et l’inhibiteur de la voie de β-oxydation (acide acrylique).La composition en gramme par litre des trois milieux MC1, MC2 et MC3 est décrite dans le tableau 11 ci-après : MC1 « inoculum » MC2 « batch » MC3 « continu » (NH4)2SO4 4,7 5,02 5,02 Na2HPO4 ; 7H2O 12 2,24 2,24 KH2PO4 2,7 0,5 0,5 Glucose 9 3,9 3,9 MgSO4 ; 7H2O 0,8 1,03 1,03 Acide citrique 1,6 1,03 1,03 Nutrient Broth 1 / / Acide nonanoïque / / 3,8 Solution Microéléments / 1,4 1,4 Acide acrylique / / 0,2 NaOH 2N QSP pH=6,8 Eau milliQ QSP m=1000g La composition du Nutrient Broth en pourcentage massique est de 37,5% d’extrait de bœuf et de 62.5% de peptone. Référence 233000 DIFCO™. La composition de la solution de microéléments en gramme par litre est décrite dans le tableau 12 ci-dessous. FeSO4·7H2O 10.0 g CaCl2·2H2O 3.0 g ZnSO4·7H2O 2.2 g MnSO4·4H2O 0.5 g H3BO3 0.3 g CoCl2·6H2O 0.2 g Na2MoO4·2H2O 0.15 g NiCl2·6H2O 0.02 g CuSO4·5H2O 1.00 g Eau MilliQ QSP 1000 g 100 mL d’inoculum sont préparés en mettant en suspension un cryotube contenant 1mL à DO=10 de la souche avec 100mL de MC1 « inoculum » au pH préalablement ajusté à 7,0 avec NaOH 2N dans un fernbach de 500 mL puis incuber à 30 °C à 150 rpm durant 24h. Le fermenteur de 3L contenant 1 litre de milieu de culture MC2 « batch » à 30°C est inoculé à une densité optique de 0,1 à 600nm (DO600=0,1). Le système est maintenu à 30°C sous agitation de 700rpm +/-200rpm régulé en cascade avec l’oxygénation durant 16h environ et /ou le temps que le microorganisme puisse atteindre son plateau de croissance. L’alimentation du fermenteur avec le milieux MC3 « continu » est débuté une fois que le microorganisme a atteint son plateau de croissance, le soutirage est réalisé afin de garder la masse de milieu de fermentation initiale. Une fois l’état d’équilibre atteint en culture continue, une fraction du soutirage est centrifugée afin de séparer la biomasse du milieu de fermentation. La biomasse est séchée par lyophilisation avant d’être extraite au dichlorométhane durant 24h. La suspension est clarifiée par filtration sur filtre GF/A (Wattman®) le filtrat composé de PHA en solution dans le dichlorométhane est concentré par évaporation puis séché sous vide poussé à 40°C jusqu’à masse constante. Le poids moléculaire du polyhydroxyalcanoate obtenu a été caractérisé par chromatographie d’exclusion stérique, détection Indice de réfraction ■ Eluant : THF ■ Débit analytique : 1 mL/min ■ Injection : 100 μL ■ Colonnes : 1 colonne Agilent PLGel Mixed-D 5μm ; 300 x 7,5 mm ; 1 colonne Agilent PLGel Mixed-C 5μm ; 300 x 7,5 mm ; 1 colonne Agilent Oligopore ; 300 x 7,5 mm ■ à la température ambiante (25 °C) ■ Détection : Waters 2487 Dual l Absorbance Detector , Waters 2414 Refractive ■ Index Detector ■ Intégrateur : indice de réfraction à 45°C et 64mV ■ Empower (Module GPC Masse molaire Relative /conventionnelle) ■ durée injection Empower 40 min ■ Standards: Polystyrène hautes masses / EasiVial PS-H 4 mL de chez Agilent Technologie Part N° PL2010-0200 L’analyse permet de mesurer le poids moléculaire moyen en poids (Mw en g/mole), le poids moléculaire moyen en nombre (Mn en g/mole), l’Indice de polydispersité Ip (Mw/Mn) et de degré de polymérisation DPn. La composition monomérique du polyhydroxyalcanoate obtenu a été définie par chromatographie en phase gazeuse munie d’un détecteur à ionisation de flamme. L’identification est réalisée via l’injection de standards commerciaux et la composition monomérique a été déterminée par un traitement méthanolyse et sylylation Pour déterminer la composition monomérique, 7 mg du polymère polyhydroxyalcanoate a été dissous dans 1,5 mL de chloroforme et a été méthanolysé en présence de 1,5 mL d’une solution de MeOH/HCl (17/2, v/v) à 100°C pendant 4 h. La phase organique a ensuite été lavée par 1 mL d’eau puis séchée sur MgSO4. La sylilation des esters méthyliques formés a été réalisée en ajoutant 100 μL de BSTFA (N,Obis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) et 100 μL de pyridine à l’échantillon méthylé. La solution a été chauffée à 70°C pendant 1h puis évaporée à sec. L’échantillon est alors dissous dans 600 μL de dichlorométhane et analysé par chromatographie dans les conditions suivantes : ■ Appareil Hewlett Packard 6890 Series ■ Colonne à phase stationnaire ZB-5 HT de chez Phenomenex (longueur : 30 m, diamètre : 0,25 mm) ■ Température : isotherme 60°C à 300°C en 6 min (vitesse de chauffage: 10°C/min) ■ Gaz : Helium ; debit : 0.8 ml/min ■ Injecteur : Température : 250°C ; 50 ml/min ■ Détecteur à ionisation de flamme ; Température : 300°C ■ Injection : Volume 1 µl On a ainsi obtenu un copolymère comprenant 86 % en poids de poly(hydroxy-3-nonanoate), 9 % en poids de poly(hydroxy-3-heptanoate et 5 % en poids de poly(hydroxy-3-pentanoate) ■ Mn = 65 900 g/mol ■ Mw = 143 600 g/mol ■ Ip = 2,2 ■ DPn = 531