100 ml d’inoculum ont été préparés en mettant en suspension un cryotube contenant 1 ml de la souche avec 100 ml milieux de culture « inoculum » au pH ajusté à 6,8 avec NaOH 2N dans une fiole de fernbach de 250 mL puis incubé à 30°C à 150 tours/min durant 24 h. 1,9 l de milieu de culture MC2 « BATCH » placé dans une fiole de fernbach de 5 l préalablement stérilisé ont été inoculé à DO=0,1 avec 100 ml d’inoculum. Après 70 heures à 30°C à 110 tours/min, la biomasse a été séchée par lyophilisation avant d’être extraite au dichlorométhane durant 24 h. La suspension a été clarifiée par filtration sur filtre GF/A (Wattman®) le filtrat, contenant le copolymère en solution dans le dichlorométhane a été concentré par évaporation puis séché sous vide poussé à 40°C jusqu’à masse constante. Le polyhydroxyalcanoate brut a été purifié par précipitation d’une solution de ce dernier en solution dans 10 fois son poids de dichlorométhane, dans 10 volumes de la solution de méthanol à froid. Le solide obtenu a été séché sous vide poussé à 40 °C jusqu’à masse constante. Le poids moléculaire du polyhydroxyalcanoate obtenu a été caractérisé par chromatographie d’exclusion stérique, détection Indice de réfraction ■ Eluant : THF ■ Débit analytique : 1 mL/min ■ Injection : 100 μL ■ Colonnes : 1 colonne Agilent PLGel Mixed-D 5μm ; 300 x 7,5 mm ; 1 colonne Agilent PLGel Mixed-C 5μm ; 300 x 7,5 mm ; 1 colonne Agilent Oligopore ; 300 x 7,5 mm ■ à la température ambiante (25 °C) ■ Détection : Waters 2487 Dual l Absorbance Detector , Waters 2414 Refractive ■ Index Detector ■ Intégrateur : indice de réfraction à 45°C et 64mV ■ Empower (Module GPC Masse molaire Relative /conventionnelle) ■ durée injection Empower 40 min ■ Standards: Polystyrène hautes masses / EasiVial PS-H 4 mL de chez Agilent Technologie Part N° PL2010-0200 L’analyse permet de mesurer le poids moléculaire moyen en poids (Mw en g/mole), le poids moléculaire moyen en nombre (Mn en g/mole), l’Indice de polydispersité Ip (Mw/Mn) et de degré de polymérisation DPn. La composition monomérique du polyhydroxyalcanoate obtenu a été définie par chromatographie en phase gazeuse munie d’un détecteur à ionisation de flamme. L’identification est réalisée via l’injection de standards commerciaux et la composition monomérique a été déterminée par un traitement méthanolyse et sylylation Pour déterminer la composition monomérique, 7 mg du polymère polyhydroxyalcanoate a été dissous dans 1,5 mL de chloroforme et a été méthanolysé en présence de 1,5 mL d’une solution de MeOH/HCl (17/2, v/v) à 100°C pendant 4 h. La phase organique a ensuite été lavée par 1 mL d’eau puis séchée sur MgSO4. La sylilation des esters méthyliques formés a été réalisée en ajoutant 100 μL de BSTFA (N,Obis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide) et 100 μL de pyridine à l’échantillon méthylé. La solution a été chauffée à 70°C pendant 1h puis évaporée à sec. L’échantillon est alors dissous dans 600 μL de dichlorométhane et analysé par chromatographie dans les conditions suivantes : ■ Appareil Hewlett Packard 6890 Series ■ Colonne à phase stationnaire ZB-5 HT de chez Phenomenex (longueur : 30 m, diamètre : 0,25 mm) ■ Température : isotherme 60°C à 300°C en 6 min (vitesse de chauffage: 10°C/min) ■ Gaz : Helium ; debit : 0.8 ml/min ■ Injecteur : Température : 250°C ; 50 ml/min ■ Détecteur à ionisation de flamme ; Température : 300°C ■ Injection : Volume 1 µl On a ainsi obtenu un copolymère contenant 91% en poids de poly(hydroxy-3-octanoate), 6 % en poids de poly (hydroxy-3- hexanoate) et 3 % en poids de poly (hydroxy-3-butanoate). ■ Mn = 68 100 g/mol ■ Mw = 149 100 g/mol ■ Ip = 2,2 ■ DPn = 531 Exemple 20 : On a préparé un polymère en utilisant le microorganisme Pseudomonas putida KT2440 ATCC® 47054™, l’acide octanoïque et l’acide acrylique. Le mode de culture a été réalisé en conditions axénique en continu a une dilution de D=0,25h-1 dans un chemostat de 3 L contenant 1,1 L de milieu de culture. Le système a été aéré avec de l’air à un flux de 3 vvm (vvm = volume d’air par volume de milieu de fermentation par minute) pour une consigne d’oxygène dissous (OD) à 30 % de la saturation. Le procédé d’obtention a été réalisé à l’aide de trois milieux de culture distincts. Le premier milieu de culture indéfini (MC1) a été utilisé pour la préparation de l’inoculum. Le second milieu de culture défini (MC2) a été utilisé pour la croissance discontinue non alimentée du microorganisme dans le fermenteur. Le troisième milieu de culture défini (MC3) a été utilisé pour l’alimentation, ou maintenance, de la fermentation en continu contenant l’acide octanoïque et l’acide acrylique (inhibiteur de la voie de β-oxydation). Les milieux MC1 et MC2 sont identiques à ceux décrits dans l’exemple 1. La composition en gramme par litre du milieu MC3 est décrite dans le Tableau 10 ci-après :