[Chem. 20] : Le procédé d’obtention du PHA de l’exemple 1 est adapté de l’article : Fed-batch production of unsaturated medium-chain-length polyhydroxyalkanoates with controlled composition by Pseudomonas putida KT2440 , Z. Sun, J. A. Ramsay, M. Guay, B. A. Ramsay, Applied Microbiololy Biotechnology, 82. 657–662. 2009. Le microorganisme utilisé est Pseudomonas putida KT2440 ATCC® 47054™. Le mode de culture est réalisé en conditions axénique en croissance discontinue alimenté par une solution de maintenance contenant un mélange de source de carbone à un taux de µ=0,15h -1 dans un chemostat de 3L contenant 2,5L de milieu de culture. Le débit de la pompe d’alimentation de la maintenance est proportionnel à la croissance du microorganisme suivant la Equation 1 : Le système est aéré par à un débit d’air de 0.5 vvm pour une consigne d’oxygène dissous (OD) à 30% de la saturation. Le pH est régulé avec une solution d’ammoniaque à 15%. La température du milieu de fermentation est régulée à 30°C Montage du mode de fermentation croissance discontinue alimenté : Le milieu de fermentation est régulé en température-pression d’oxygène dissous et pH (non représenté) Le procédé d’obtention est réalisé à l’aide de quatre milieux de culture distincts. Le premier milieu de culture défini MC1 « inoculum » est utilisé pour la préparation de la préculture. Le second milieu de culture défini MC2 « batch » est utilisé pour la croissance en discontinue non alimentée du microorganisme avec les sources carbonées primaires dans les fioles de Fernbachs. Le troisième milieu de culture défini MC3 « maintenance » est utilisé pour l’alimentation discontinue, ou maintenance, de la fermentation avec les sources carbonées d’intérêt à un débit calibré en fonction de la croissance du microorganisme. On additionne simulanément avec le milieu MC3 un milieu MC4 avec un ratio en volume MC3 : MC4 = 1.25 : 1). La composition en gramme par litre des trois milieux est décrite dans le Tableau 6 MC1 « inoculum » MC2 « batch » MC3 «maintenance » MC4 (NH4) 2 SO4 4,7 4.7 / / Na 2 HPO4 ; 7H2O 12 9 / / KH 2 PO4 2,7 2.03 / / MgSO4 ; 7H2O 0,8 1,03 / / Nutrient Broth 3 / / / Acide nonanoïque / 0.7 700 / Acide undécylènique / 0.3 300 / Solution Microéléments / 10 / / Acide acrylique / / / 12 Glucose / / / 240 NaOH 2N qsp pH 6.8 / / Eau milliQ Qsp m = 1000g / / La composition du Nutrient Broth en pourcentage massique est de 37,5% d’extrait de bœuf et de 62.5% de peptone. Référence 233000 DIFCO™. La composition de la solution de microéléments en gramme par litre est décrite dans le Tableau 7 : FeSO4·7H2O 10.0 g CaCl2·2H2O 3.0 g ZnSO4·7H2O 2.2 g MnSO4·4H2O 0.5 g H3BO3 0.3 g CoCl2·6H2O 0.2 g Na2MoO4·2H2O 0.15 g NiCl2·6H2O 0.02 g CuSO4·5H2O 1.00 g Eau MilliQ (ou HCl 0,5N) QSP 1000 g 100 mL de préculture sont préparés en mettant en suspension un cryotube contenant 1mL de la souche avec 100mL du milieu de culture « inoculum » MC1 au pH ajusté à 6,8 avec NaOH 2N dans une fiole de fernbach de 250mL puis l’inocum est incubé à 30°C à 150rpm durant 24h. 1,9L de milieu de culture MC2 « BATCH » sont placés dans un chemostat de 3L préalablement stérilisé et inoculés à DO=0,1 avec les 100mL d’inocumum. Après 4 heures à 30°C à 850 rpm, l’introduction de la maintenance (MC3 + MC4) est réalisée en appliquant le débit défini par l’équation 1. En fin d’introduction, la biomasse est isolée par centrifugation puis lavée à trois reprises avec de l’eau. La biomasse est séchée par lyophilisation avant d’être extraite à l’acétate d’éthyle durant 24h. La suspension est clarifiée par filtration sur filtre GF/A (Wattman®) le filtrat, composé de PHA en solution dans l’acétate d’éthyle est concentré par évaporation puis séché sous vide poussé à 40°C jusqu’à masse constante. Le PHA ainsi obtenu a été purifié deux fois par solubilisation dans un minimum d’AcOEt et précipitation dans un mélange éthanol/eau 70/30 v/v. Le PHA de l’exemple 1 a entièrement été caractérisé par méthode spectroscopique et spectrométrique et est conforme à la structure chimique attendue. Exemple 2 : Fonctionnalisation du PHA à chaine latérale linéaire R=6 et R=8 insaturée à 30% de l’exemple 1 avec l’acide thiolactique