INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
De manière non limitative, le composant 1 peut être réalisé sous la forme d'une carte micro-fluidique formé d'un empilement de plusieurs couches. L'empilement peut notamment comporter trois substrats réalisés chacun dans un matériau de type COP/COC (Cyclo Oléfin Polymère/Cyclo Olefin Copolymère), polycarbonate ou de type PMMA (Poly-méthacrylate de Méthyle). Il peut notamment présenter des caractéristiques de transparence, suffisantes pour une lecture optique lorsque l'analyse est mise en œuvre directement dans le composant. Une membrane commune aux différents modules du composant peut être intercalée entre les deux substrats. La membrane est formée d’un matériau très déformable élastiquement, lui permettant de revenir à sa forme initiale après déformation. A titre d'exemple, la membrane peut notamment être réalisée dans des matériaux tels que les élastomères de la famille des silicones tels que les MQ (Methyl-Polysiloxanes), les VMQ (Vinyl-Methyl-Polysiloxanes), les PVMQ (Phenyl-Vynil-Methyl-Polysiloxanes) ou les élastomères de type thermoplastiques (TPE), par exemple les TPE-S, TPS, TPE-E, TPC. Elle joue ainsi le rôle de la membrane déformable poussant le liquide d'élution au niveau du module d'élution et des membranes utilisées dans les deux vannes d'isolation à chaud du dispositif 31 d'isolation.
Les différents circuits fluidiques du composant 1 ainsi que le réservoir 20 d'éluant, le réservoir 32 d'air du premier dispositif 31 de contrôle d'accès et la chambre 30 de réaction, peuvent être réalisés par un usinage ou autre procédé appliqué sur un et/ou les des deux substrats du composant.
Le module M4 de chauffage de l’instrument, en contact avec le composant 1, peut être composé par exemple d'une seule résistance chauffante ou d'un élément chauffant dont la température peut être facilement ajustée comme un module à effet Peltier. Le module M4 de chauffage est avantageusement commun à plusieurs modules du composant, notamment :
Tableau 3 : Quantification des minéraux dans le sérum de pétales de roses de Granville® selon l’invention et dans l’extrait comparatif, cryoextrait de pétales de rose de Granville®.
Minéraux (en mg/Kg) Sérum de pétales de roses de Granville® Invention Cryoextrait de fleurs (pétales) Comparatif Ca 2094 25 Mg 215 17 P 180 19 K 2276 195 Na 509 29 Cu - Fe - Mn 3,5 - Zn 2 - Se - Si - -
On constate donc que, comparativement au cryoextrait, le sérum de pétales de roses de Granville® selon l’invention est plus riche en minéraux. Notamment il est très riche en calcium et potassium.
Dans l’ensemble, ces analyses montrent que le sérum de pétales de roses de Granville® selon l’invention est plus concentré en composés d’intérêt, comparativement à un cryoextrait de pétales de roses.
Exemple 3 : Matériel et méthode 3.1 Cultures cellulaires Cultures cellulaires de kératinocytes Les kératinocytes utilisés pour cette étude proviennent d’un épiderme humain normal de donneurs âgés de 26 à 61 ans. Ils ont été cultivés en milieu sans sérum pour kératinocytes (KSFM, Gibco) avec 5 ng/mL d'EGF (Epidermal Growth Factor) humain recombinant (Gibco), 50 µg/ml d'extrait d'hypophyse bovin (Gibco) et 100 µg/ml de Primocine (agent anti-microbien, InvivoGen). Les cellules ont été cultivées à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2.
Cultures cellulaires de fibroblastes Les fibroblastes utilisés pour cette étude proviennent d’un épiderme humain normal d'une femme donneuse de 48 ans. Ils ont été cultivés dans du DMEM 1 g/L de glucose (Lonza) complété par 10% de FBS (Fœtal Bovine Serum ; Gibco), 2 mM de LGlutamine (Lonza) et 100 pg/ml de Primocine (InvivoGen). Les cellules ont été maintenues à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2.
3.2 Peau humaine normale ou biopsie cutanée La peau humaine normale provient de biopsies cutanées prélevées lors d’interventions de chirurgie plastique sur l'abdomen de donneurs âgés de 26 à 66 ans. Ces biopsies ont été réalisées avec un poinçon de 6 mm de diamètre (pfm médical).
Elles ont été cultivées sur un milieu de culture contenant 50% de DMEM 1 g/L de glucose (Lonza) et 50% de milieu de culture Ham's-F12 (Lonza) complété avec 10% de FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco), 2 mM de L-glutamine (Lonza) et 100 μg/ml de Primocine (InvivoGen). Les biopsies cutanées ont été maintenues en culture à 37°C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de CO2.
3.3 Réactifs Les réactifs utilisés pour cette étude étaient :
Lipopolysaccharide (LPS) (Sigma) dilué à 0,5 mg/mL pendant 6 heures, Ocytocine (Sigma) diluée à 200µM pendant 24 heures, 2-désoxy-D-glucose (2-DG) (Sigma) dilué à 2mM pendant 24 heures, Neutral Red (Sigma) dilué à 0,05 mg/mL pendant 3 heures.
Les amorces et les sondes utilisées pour cette étude étaient de type « TaqMan Gene expression Assays » (Life technologies) :
11-HSD1 (Hs01547870_m1) 18S contrôle endogène (Hs9999999901_s1)
3.4 Anticorps Les anticorps primaires utilisés pour l’étude sont :
- Anti-HMGB1 (Abcam) lapin monoclonal, dilué à 1/500, pendant la nuit,
- Anti-COX-2 (Abcam) lapin monoclonal, dilué à 1/500, pendant 1h30,
- Anti-Filaggrin (Santa Cruz Biotechnology) souris monoclonal, dilué à 1/100, pendant 1h30,
Primaire blanc
Composants Partie Masse Silice colloïdale (30%) A 27,5 Eau distillée A 5 Isopropanol A 3 Pigment blanc TiO2 A 13 Alumine A 14.5 Huile silicone PDMS A 1.1 MTES (methyltriethoxy silane) B 35.5 Acide formique B 0,4 TOTAL 100
Finish hydrophobe
Composants Partie Masse Silice colloïdale (40%) A 29,8 Eau distillée A 8,2 Acide Acétique A 1,3 Isopropanol A 5 Huile silicone PDMS A 1.3 MTES (Methyltriethoxysilane) B 39 Butylglycol B 14 Agent mouillant B 0,9 Paillettes B 0,5 TOTAL 100
Le procédé de formulation du primaire et du finish est le suivant :
Les parties A sont préparées en introduisant successivement la silice colloïdale, l’isopropanol, et le cas échéant le pigment, l’alumine, ou les additifs dans un mélangeur planétaire pour obtenir un liquide homogène. Ce mélange peut également s’effectuer sous pale d’agitation cisaillante.
Les parties B sont préparées séparément en mélangeant les silanes avec l’acide organique, ainsi que l’agent mouillant, le solvant et les paillettes dans le cas du finish.
Ces deux parties peuvent être stockées six mois sous forme séparée.
Les parties A et B sont ensuite mélangées à l’aide d’un agitateur à haute vitesse pendant trois heures afin de permettre l’hydrolyse du silane. Le mélange est ensuite laissé à température ambiante pendant 24 heures avant application. La durée de vie de cette formulation est d’au moins 48h.
Le mélange primaire est ensuite filtré avec un filtre 60 microns avant d’être appliqué par spray sur la sous couche PEEK. L’épaisseur de l’ensemble du composite PEEK/primaire solgel est de 80 microns.
Cette couche primaire est ensuite optionnellement séchée à 50°C pendant une minute avant refroidissement à 30°C.
Le mélange finish sera filtré avec un filtre 110 microns, et appliqué par spray sur la couche de primaire. Son épaisseur sèche sera de 5 microns.
Enfin, le revêtement composite PEEK/sol-gel est cuit à 250°C durant 30 minutes.
Exemple 2 : Sous couche polymérique PEEK poreuse contenant du carbure de silicium, primaire sol-gel blanc et finish hydrophobe, sur aluminium
Procédure :
Matières premières pour fabriquer les revêtements fluorés qui sont appliqués sur la couche dure à base de PEEK/ SiC
Résines polymères hétérocycliques : Résine polyamide-imide (PAI) à 29 % d’extrait sec dans la N-éthylpyrrolidone (NEP), commercialisée par HUNTSMAN sous la marque RHODEFTAL 210 et dont le degré de polymérisation est de l'ordre de 10 à 15 Agent anti-mousse et Tensio-actif non-ionique Tego foamex K7 de chez Evonik Genapol X089 de chez Clariant Silicie colloïdale en dispersion aqueuse à 30% Résines fluorées en dispersion colloïdales
Mise au point des revêtements liquides fluorés Préparation d’une composition aqueuse de semi-fini SF1 à base de polymère hétérocyclique avec une amine et du solvant aprotique polaire non étiqueté.
On réalise une composition aqueuse de semi-fini SF1 comportant les composés suivants, leurs quantités respectives étant indiquées ci-après :
Résine PAI à 29 % d’extrait sec dans NEP 327,9 g N-éthylpyrrolidone 117,7 g Triéthylamine 32,8 g Eau déminéralisée 521,6 g TOTAL 1000,0 g
Les propriétés de la composition aqueuse SF1 ainsi obtenue sont les suivantes :
- extrait sec théorique : 9,5 %
- extrait sec mesuré dans la composition : 9,3 %
Le substrat et la sous couche dure discontinue telle que décrite ci-dessus sont revêtus d’un revêtement anti-adhésif multicouches composé d’un primaire fluoré (4-6 µm), d’un Mid-coat fluoré (6 – 8µm) qui est séché 4 minutes à 100°C et d’un finish (20 – 25 µm). L’ensemble étant finalement chauffé à 430°C pendant 11 minutes. Les compositions sont les suivantes :
Composition du primaire (P) On réalise une composition aqueuse de primaire P d’accrochage comportant les composés suivants, leurs quantités respectives étant indiquées ci-après :
Dispersion PTFE 30,5 g Dispersion de noir de carbone 3,5 g Composition de semi-fini SF1 (9,5 % d'extrait sec) 47,2 g Système tensioactif non-ionique 5,1 g Silice colloïdale 11,0 g NH4OH 1,4 g Eau déminéralisée 1,3 g TOTAL 100,0 g
Les propriétés de la composition de primaire P1 ainsi obtenue sont les suivantes :
- extrait sec théorique dans la composition : 27,6 %
- viscosité (en coupe 2,5 selon la norme DIN EN ISO 2433/ASTM D5125) : 55 s
Composition du Mid-coat (MD) On réalise une composition aqueuse de primaire P d’accrochage comportant les composés suivants, leurs quantités respectives étant indiquées ci-après :
Dispersion PTFE 46,3 g Dispersion PFA 15,8 g Dispersion de noir de carbone 3,5 g Composition de semi-fini SF1 (9,5 % d'extrait sec) 15,7 g Système tensioactif non-ionique 5,1 g Silice colloïdale 11,0 g NH4OH 1,4 g Eau déminéralisée 1,2 g TOTAL 100,0 g
la , une vue illustrant le procédé de l’invention,
la , un schéma illustrant un dispositif de positionnement selon l’invention,
la , un schéma illustrant un exemple de contre-frome d’un dispositif de positionnement selon l’invention,
la , un schéma illustrant un exemple de contre-forme d’un dispositif de positionnement selon l’invention, et
la , un schéma illustrant le fonctionnement du dispositif de positionnement selon l’invention.
La présente un tube cintré 1. Un tel tube cintré 1 comporte au moins un premier tronçon 2, éventuellement rectiligne. Par exemple le premier tronçon 2 comporte un premier cylindre 3, par exemple à base circulaire, s’étendant le long d’un premier axe AX1. Le premier axe AX1 peut être un axe de symétrie du premier tronçon 2.
Le premier tronçon 2 est prolongé par un tronçon cintré 5. Le tronçon cintré 5 peut être cintré de manière usuelle, par exemple pour présenter un ou plusieurs changements de direction et éventuellement un rayon de courbure au regard d’un centre de courbure CTR.
Le tronçon cintré 5 est alors prolongé par un deuxième tronçon 6, éventuellement rectiligne. Par exemple le deuxième tronçon 6 comporte un deuxième cylindre 7, par exemple à base circulaire, s’étendant le long d’un deuxième axe AX2. Le deuxième axe AX2 peut être un axe de symétrie du deuxième tronçon 6.
La présente divulgation concerne notamment un procédé pour identifier au moins une zone particulière 8 sur le tube cintré 1, par exemple pour déterminer la position d’une extrémité de la zone particulière 8.
Ce procédé comprend une étape de détermination STP1 d’un point de référence PTREF, la zone particulière 8 devant être positionnée par rapport à ce point de référence PTREF. De manière innovante et étonnante, ce point de référence PTREF n’appartient pas au tube cintré 1. En particulier, le point de référence PTREF est localisé en dehors du tronçon cintré 5, le cas échéant à l’opposé du centre de courbure CTR par rapport au tronçon cintré 5. Ainsi, le tronçon cintré 5 est situé dans un espace compris entre le point de référence PTREF et le centre de courbure CTR.
A cet effet, le point de référence PTREF est positionné à l’intersection entre une première droite D1 prolongeant le premier tronçon 2 et une deuxième droite D2 prolongeant le deuxième tronçon 6.
Selon l’exemple illustré, la première droite D1 peut passer par une génératrice du premier tronçon 2, présente dans un plan de référence PREF contenant le premier axe AX1 et le deuxième axe AX2. Plus précisément, le premier tronçon 2 comporte, à l’intersection entre le premier tronçon 2 et le plan de référence PREF, un premier segment interne au regard du centre de courbure CTR et un premier segment externe. Dès lors, la première droite D1 passe par le premier segment externe.
De même, la deuxième droite D2 peut passer par une génératrice du deuxième tronçon 6, présente dans le plan de référence PREF. Plus précisément, le deuxième tronçon 6 comporte, à l’intersection entre le deuxième tronçon 6 et le plan de référence PREF, un deuxième segment interne au regard du centre de courbure CTR et un deuxième segment externe. Dès lors, la deuxième droite D2 passe par le deuxième segment externe.
Un avantage très intéressant de ce dispositif est d’interdire une éventuelle dilatation des bulles d’air pouvant se trouver dans la chambre 30 de réaction. En effet, une bulle dans la chambre 30 de réaction verra la même hausse de pression que la membrane 35, car elle verra également la même hausse de température. Avec un tel dispositif, la taille de la bulle dans la chambre ne pourra donc pas varier lors de la chauffe.
Ce dispositif, en fermant les deux circuits fluidiques menant à la chambre 30 de réaction, permet aussi de limiter grandement l’évaporation. Ainsi des analyses de 30 min peuvent être menées sans perte de liquide.
Lorsque la température redescend, les pressions entre le réservoir 32 et les circuits fluidiques s’équilibrent et la membrane 35 retrouve sa position d'ouverture d’origine (P1).
Selon un autre aspect de l'invention, on utilise également un dispositif de scellement à froid de la chambre 30, une fois que la réaction de détection est terminée.
Dans le contexte d’une réaction de détection de type amplification biomoléculaire, il est indispensable de pouvoir isoler le volume réactionnel après analyse, ceci afin d’éviter toute contamination, en scellant la chambre 30 de réaction. En effet, si des molécules d'ARN/ADN sont présentes dans l’échantillon à analyser, leur quantité sera amplifiée de plusieurs ordres de grandeur par la réaction. Le nombre d’amplicons après analyse peut donc être très important. Il faut absolument éviter toute fuite de liquide contenant les amplicons au risque de voir l’instrument et son environnement irrémédiablement pollué.
On présente ci-dessous deux variantes de réalisation de ce dispositif de scellement.
Dans une première variante de réalisation illustrée par la , le dispositif 310 de scellement comporte deux vannes 330a, 330b (référence 330 de manière générale) de scellement à froid intégrées au composant.
Sur le circuit fluidique d'élution C1, la première vanne 330a de scellement à froid est positionnée en amont de la première vanne 33a d'isolation à chaud décrite ci-dessus (voir ).
Sur le circuit fluidique C2 comportant l'évent 39, la deuxième vanne 330b de scellement à froid est positionnée en aval par rapport à la deuxième vanne 33b d'isolation à chaud décrite ci-dessus (voir ).
Il faut noter que la deuxième vanne de scellement 330b, placée sur le circuit fluidique C2 comportant l'évent 39, n'est pas indispensable, l'évent 39 pourrait être muni d'une membrane barrière hydrophobe.
En référence à la , chaque vanne 330 est composée d'au moins deux corps 350 d'un deuxième composé fusible, piégeant initialement un élément capable de se dilater, dans le canal 360 du circuit fluidique considéré, par exemple une bulle d’air 340. Les petits volumes de ce deuxième composé fusible sont déposés par exemple à la pipette dans des emplacements prévus sur le bord du canal considéré. L’emplacement de la bulle d’air 340 entre les deux corps 350 de composés fusibles dans chaque canal est aussi prévu dans le circuit micro-fluidique. Ces emplacements peuvent être obtenus par exemple par usinage au moyen d’une fraise, ou par gravure laser, ou encore par moulage du circuit.
La température de fusion du deuxième composé fusible est choisie pour être supérieure à la valeur de température T1 employée pour activer le module d’élution M2 décrit ci-dessus, et aussi supérieure ou égale à la valeur de température T2 appliquée au dispositif 31 de contrôle d'accès fluidique et à la chambre 30. Le deuxième composé fusible peut être également une paraffine avec une température de fusion de 55°C (la paraffine choisie est par exemple la tetracosane). Le deuxième composé fusible est choisi avec une température de fusion supérieure à celle du premier composé fusible 25 utilisé dans le module d'élution M2, ceci afin de ne pas fondre lors de l'activation du module d'élution M2.
Le principe de fonctionnement de ce dispositif 310 de scellement est le suivant :
Au-dessous de sa température de fusion, donc pendant les étapes d’injection de l’éluant et donc d’élution des particules collectées présentées ci-dessus, les deux corps 350 restent piégés sur le bord du canal : le liquide peut circuler librement ( – P10). Au-dessus de sa température de fusion (à la température T2), le deuxième composé fusible formant les deux corps 350 fond, la bulle d’air 340 sous pression du fait de la chaleur peut se dilater en poussant les deux corps 350 fondus dans le canal. Il n’y a pas de pression dans le canal principal autre que la pression hydrostatique, et les bouchons fondus soumis à la poussée d’Archimède et aux forces capillaires restent liquides durant toute la durée du chauffage nécessaire aux analyses (par exemple 30 minutes). Expérimentalement, on observe ainsi une légère remontée des deux corps fondus dans le canal (la paraffine étant moins dense que l’eau), la géométrie de la vanne favorisant cette remontée ( – P20) dans le canal 360. Lors du refroidissement (à la température T3), cette légère remontée des corps 350 est suffisante pour que lors de la contraction de la bulle d’air 340, du liquide venant de la chambre 30 de réaction vienne remplir l’espace disponible, laissant une bonne partie du deuxième composé fusible se solidifier dans le canal ( – P30).
A haute température, c’est-à-dire au-dessus de la température de fusion T2, en surnageant dans les canaux 360 au-dessus de la chambre 30 de réaction, les corps 350 présents à l'état fondu contribuent pour leur part à limiter l’évaporation du liquide.
A basse température, c’est-à-dire en-dessous de la température de fusion T2, après le chauffage de la chambre 30 ou encore le cycle de chauffe, le deuxième composé fusible revient à l'état solide et les corps 350 scellent complètement les différents canaux, isolant les éventuels amplicons du milieu extérieur. De telles vannes qui isolent la chambre de réaction 30 par un retour à la température ambiante permettent de garantir leur scellement en toute circonstance que ce soit une erreur de manipulation ou encore un dysfonctionnement de l’instrument.
Le conducteur thermique 113a s’étend entre l’émetteur 112 et une extrémité opposée, reliée à un moyen de refroidissement 113b, ce dernier étant configuré pour dissiper la chaleur apportée par le conducteur thermique 113a. Dans l’exemple représenté, le moyen de refroidissement est un radiateur 113b, dissipant la chaleur par convection. Le conducteur thermique 113a s’étend, à partir de chaque émetteur 112, en s’éloignant du fond du puits 111 f .
Le module d’exposition 110 est maintenu en suspension par rapport au puits 111. Le module d’exposition 110 s’étend à travers une lumière 103’ formée dans le couvercle 103. Il est maintenu sur le couvercle 103 par une rondelle d’appui 117, cette dernière étant solidaire du module d’exposition 110. La rondelle d’appui 117 étant plus large que la lumière 103’, elle bloque une translation du module d’exposition à travers la lumière 103’.
Le module d’exposition 110 s’étend, sous le couvercle 103, selon une longueur inférieure L inf et, sur le couvercle 103, selon une longueur supérieure L sup . La longueur inférieure L inf peut être ajustée, de façon à régler la distance entre l’émetteur 112 et l’échantillon S. A cette fin, le module d’exposition 110 peut disposer d’un moyen de réglage 120 de la distance entre l’émetteur et l’échantillon. Le moyen de réglage 120 est par exemple formé par un écrou 121 relié à une tige filetée 122 et solidaire de cette dernière. La tige filetée pénètre dans le la rondelle d’appui 117. La rotation de l’écrou par rapport à la rondelle d’appui permet d’allonger ou de raccourcir la longueur inférieure L in f . La distance δ entre l’émetteur 112 et l’échantillon S est ainsi ajustée. La tige filetée 122 est tubulaire. Elle est traversée par le conducteur thermique 113a.
De façon alternative, le moyen de réglage 120 peut être motorisé. Le moyen de réglage peut être associé à un capteur d’effort, de façon à ajuster la distance entre l’émetteur 112 et l’échantillon S.
Le module d’exposition 110 est relié à une carte de commande 106. Une liaison filaire 106’, ménagée à travers le radiateur 11b et le conducteur thermique 113a permet la transmission de signaux de contrôle et d’alimentation électrique vers chaque émetteur 112.
Quel que soit le mode de réalisation, le dispositif est destiné à être disposé dans une enceinte thermostatée, de type incubateur. De préférence, la teneur en CO 2 et l’humidité sont contrôlés. Par exemple, l’humidité relative est de 95%, la teneur de CO 2 est de 5%, et la température est de 37°C.
Dans les exemples qui précèdent, l’échantillon est disposé dans le puits d’une plaque à puits. D’une façon plus générale, l’échantillon peut être disposé dans un autre type de récipient susceptible de contenir un milieu de culture. Ainsi, les caractéristiques des modes de réalisation précédemment décrits ne se limitent pas aux puits d’une plaque à puits, mais peuvent s’étendre à d’autres types de récipient présentant un fond ainsi qu’une paroi latérale, s’étendant autour du fond, en particulier entre le fond et une ouverture, cette dernière pouvant être bouchée par un bouchon. Il peut par exemple s’agir d’un flasque ou d’un autre type de récipient. Le volume du récipient peut par exemple être compris entre 0.1 mL et 10 L.
L’invention permet d’effectuer une exposition de peau ou de cellules dermiques dans des conditions maîtrisées, qu’il s’agisse de la température, et/ou de la durée, et/ou ou de la périodicité et/ou de la puissance de l’exposition. Il peut s’agir de cellules fibroblastes, mais également d’autres types de cellule, par exemple des kératinocytes, ou des lymphocytes. Des analyses biologiques de l’échantillon exposé, avant et après exposition, permettent d’évaluer l’effet de l’exposition.
Les cellules destinées à être exposées peuvent être cultivées en trois dimensions. Cela peut comprendre des associations de différents types cellulaires dans les gels afin de simuler des tissus (par exemple la peau) ou des organes.
Bien que décrite en lien avec des cellules de la peau, l’invention peut s’appliquer à d’autres types d’échantillons biologiques, par exemple, et de façon non limitative, d’autres types de cellules ou des microorganismes (bactéries, levures, microalgues).
Manchon pour raquette La présente invention concerne le domaine des équipements pour la pratique de sport de raquettes. Il peut s’agir du tennis, du badminton, ou encore du squash, sans que cela ne soit limitatif.
ETAT DE LA TECHNIQUE La manipulation de la raquette est un point essentiel pour la bonne pratique d’un sport de raquette. Le contact entre la main et le manche de la raquette doit être suffisamment performant en termes de confort, de prise et d’absorption de la transpiration.
Il est connu d’équiper le manche d’une raquette d’un revêtement amovible qui présente les qualités requises pour les bonnes performances de la manipulation par le joueur. Cela permet aussi de protéger le revêtement d’origine du manche de la raquette. Le plus souvent, ces revêtements amovibles sont des bandes agrippantes que le joueur enroule progressivement autour du manche de la raquette.