INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Si l’on considère un cas théorique dans lequel les pertes de conversion d’énergie du circuit de transfert 200 sont nulles, dans lequel le moteur à combustion MC fournit une énergie mécanique constante correspondant à une puissance nominale fixe, et dans lequel le générateur GE et le moteur électrique ME sont identiques et capables de fournir ou recevoir une puissance électrique égale tout au plus à la puissance nominale fixe, alors un rapport cyclique de 50% du signal de commande S permet de transférer 50% de l’énergie mécanique produite par le moteur à combustion MC au moteur électrique ME permettant ainsi d’avoir une force de poussée verticale équivalente à 50% de l’énergie produite par le moteur à combustion MC de chaque côté du corps principal 100. Une réduction du rapport cyclique du signal de commande S a pour effet de réduire l’énergie transmise, ce qui permet de ralentir le moteur électrique ME et de réduire la résistance mécanique appliquée sur le moteur à combustion MC et donc d’augmenter la vitesse du moteur à combustion MC. Ainsi, une réduction du rapport cyclique de signal de commande 200 a pour effet d’augmenter la force de poussée verticale produite par le moteur à combustion MC tout en réduisant la force de poussée du moteur électrique ME, créant ainsi un déséquilibre de poussée qui incline le dispositif volant, sur la , dans le sens horaire. Inversement une augmentation du rapport cyclique du signal de commande S crée un déséquilibre de poussée inverse qui incline le dispositif volant, sur la , dans le sens trigonométrique.
Si l’on prend en compte les pertes liées au transfert d’énergie mécanique, le rapport cyclique du signal de commande S doit être ajusté en conséquence. A titre d’exemple, si les pertes sont de l’ordre de 10%, le rapport cyclique doit correspondre à un appel de 55% de l’énergie du moteur à combustion MC pour ne restituer que 45% de cette énergie au moteur électrique ME afin d’avoir une même force de poussée de chaque côté du dispositif volant. Des différences d’appairage de puissance entre le moteur à combustion MC, le générateur GE et le moteur électrique ME peuvent également être compensées en ajustant le rapport cyclique.
En termes de réactivité, un tel système n’est pas symétrique. En effet, le freinage du moteur à combustion MC est réalisé par le générateur GE qui agit comme un frein électrique et donc plus rapidement que si l’on réduisait une commande de gaz du moteur à combustion. De plus, l’énergie de freinage est directement accessible pour le moteur électrique ME qui peut accélérer très rapidement. Ainsi, le transfert de poussée vers le moteur électrique s’effectue très rapidement. A l’inverse, pour accélérer le moteur à combustion MC, le générateur GE réduit la force de freinage. Cependant, l’accélération du moteur à combustion MC se fait selon une courbe d’accélération dudit moteur MC qui est moins réactif qu’un moteur électrique. Par contre, la réduction de vitesse du moteur électrique ME reste très rapide. Le transfert de poussée vers le moteur à combustion MC est plus lent que le transfert de poussée vers le moteur électrique ME tout en restant plus rapide qu’un transfert de poussée entre deux moteurs à combustion.
Pour améliorer la réactivité, il peut être préférable de contrôler le générateur électrique GE et le moteur électrique ME de manière indépendante. Ainsi, le freinage et l’accélération du moteur à combustion MC peuvent devenir indépendants de l’accélération et du freinage du moteur électrique ME. La illustre un deuxième exemple de circuit électrique implémenté dans le dispositif volant de la qui permet une commande indépendante du générateur électrique GE et du moteur électrique ME.
Dans l’exemple de la , le générateur électrique GE et le moteur électrique ME peuvent être n’importe quel type de moteur électrique, à courant continu, alternatif synchrone ou asynchrone, mono phase ou multi phases, ou encore de type pas à pas. Le générateur électrique GE et le moteur électrique ME peuvent en outre être de deux types différents mais ayant des puissances du même ordre de grandeur que la puissance du moteur à combustion MC. Un circuit de transfert 300 est connecté entre le générateur électrique GE et le moteur électrique ME. Le circuit de transfert 300 comporte principalement un premier convertisseur d’énergie 301, un deuxième convertisseur d’énergie 302 et un élément de stockage d’énergie électrique 303.
Le premier convertisseur d’énergie 301 dispose d’entrées de signaux reliées au générateur électrique GE, d’une sortie de courant et d’une entrée de signal de commande. Le premier convertisseur d’énergie 301 est un convertisseur spécifique adapté au type de moteur utilisé comme générateur électrique GE et dispose d’un nombre d’entrées de signaux adapté au nombre de phases dudit générateur GE pour transformer une énergie mécanique de rotation en courant électrique. Le premier convertisseur d’énergie 301 applique une ou plusieurs impédances de charge sur le ou les enroulements du générateur GE et transforme l’énergie ainsi récupérée en un courant. La sortie de courant du premier convertisseur d’énergie 301 fournit le courant I G proportionnel à l’impédance de charge et à la vitesse de rotation du générateur GE. L’entrée de signal de commande reçoit un signal de commande SG analogique ou numérique qui contrôle l’impédance de charge. Indirectement, le signal de commande SG contrôle la résistance mécanique appliquée sur le moteur à combustion MC par le générateur électrique GE. Le premier convertisseur d’énergie 301 est d’un type connu qui ne sera pas plus amplement détaillé car de très nombreux circuits sont utilisable et correspondent au type de moteur utilisé.
Le deuxième convertisseur d’énergie 302 dispose de sorties de signaux reliées au moteur électrique ME, d’une entrée de courant et d’une entrée de signal de commande. Le deuxième convertisseur d’énergie 302 est un convertisseur spécifique adapté au type de moteur utilisé comme moteur électrique ME et dispose d’un nombre de sorties de signaux adapté au nombre de phases dudit moteur ME pour transformer un courant électrique en énergie mécanique de rotation. Le deuxième convertisseur d’énergie 302 est d’un type connu qui ne sera pas plus amplement détaillé car de très nombreux circuits sont utilisables et correspondent au type de moteur utilisé. L’entrée de signal de commande reçoit un signal de commande SM analogique ou numérique qui correspond à une consigne de puissance à fournir au moteur électrique ME via les sorties de signaux connectées aux phases dudit moteur ME. L’entrée de courant du deuxième convertisseur d’énergie 302 est connectée à la sortie de courant du premier convertisseur d’énergie 301 et appelle un courant I M qui est transformé en signaux de commande du moteur électrique ME.
L’élément de stockage d’énergie électrique 303 est connecté entre la sortie de courant du premier convertisseur d’énergie 301 et la masse. Le circuit de stockage d’énergie reçoit ou fournit un courant correspondant à la différence entre le courant I G et le courant I M afin d’absorber un surplus d’énergie non utilisé par le deuxième convertisseur d’énergie 302 et de restituer cette énergie au deuxième convertisseur d’énergie 302 lorsque l’énergie fournie par le premier convertisseur 301 n’est pas suffisante pour alimenter le deuxième convertisseur 302.
L’élément de stockage 303 sert de tampon d’énergie et sa capacité de stockage reste limitée. En effet, les courant I G et I M peuvent être sensiblement égaux sauf lors de périodes transitoires correspondant aux accélérations et réductions de la vitesse de rotation du moteur à combustion MC et du moteur électrique ME. A titre d’exemple, l’élément de stockage peut être un condensateur de forte capacité également appelé supercondensateur. Le dimensionnement de la capacité d’un tel condensateur peut se calculer en considérant qu’il doit stocker suffisamment d’énergie pour alimenter le moteur électrique pendant quelques secondes.
En termes de fonctionnement, les signaux de commandes SG et SM sont décorrélés, cependant ils doivent être déterminés conjointement. Ainsi, en négligeant les pertes de conversion, pour avoir une répartition des forces de poussée de 50% de part et d’autre du corps principal 100, le signal de commande SG doit correspondre à l’application d’une impédance de charge sur le générateur GE qui permet de prélever 50% de la puissance mécanique produite par le moteur à combustion MC. Le signal de commande SM doit correspondre à une commande de puissance d’alimentation du moteur électrique ME qui correspond également à une puissance égale à 50% de l’énergie mécanique produite par le moteur à combustion MC. Dans une telle configuration, les courants I G et I M sont égaux et correspondent à l’énergie transmise entre le moteur à combustion MC et le moteur électrique ME. Si les pertes de conversion d’énergie sont prises en compte, les signaux de commande SG et SM doivent être adaptés afin de prélever une puissance supérieure sur le moteur à combustion MC par rapport à la puissance restituée au moteur électrique ME.
Pour freiner ou accélérer les moteurs à combustion MC et électrique ME, il convient d’agir sur les signaux de commande SG et SM de manière opposée, à savoir augmenter la puissance prélevée sur le moteur à combustion MC et diminuer la puissance restituée au moteur électrique ME, ou diminuer la puissance prélevée sur le moteur à combustion MC et augmenter la puissance restituée au moteur électrique ME. Comme indiqué précédemment, l’accélération du moteur à combustion MC est plus lente que l’accélération du moteur électrique ME. Pour compenser cette différence, il est possible de relâcher le freinage du moteur à combustion plus que ce qui est nécessaire pour que celui-ci puisse accélérer plus rapidement et ce jusqu’à ce qu’il atteigne la vitesse souhaitée. Un relâchement plus important que nécessaire du freinage va entrainer un transfert d’énergie du moteur à combustion MC moins important que ce qui est nécessaire pour le moteur électrique ME. L’élément de stockage 303 permet de fournir le complément d’énergie au moteur électrique ME. A cet effet, il est nécessaire d’avoir un niveau de charge minimal dans l’élément de stockage 303 pour effectuer une telle compensation.
Le rechargement de l’élément de stockage 303 peut se faire lors d’un basculement inverse où le freinage du moteur à combustion MC peut être légèrement anticipé sur l’accélération du moteur électrique ME créant ainsi une génération d’énergie électrique plus importante que ce que le moteur électrique ME absorbe. Une autre possibilité de rechargement de l’élément de stockage 303 peut se faire lorsque les forces des vecteurs de poussée sont équilibrées entre les moteurs à combustion MC et électrique ME en prélevant légèrement plus de puissance sur le moteur MC tout en fournissant légèrement moins de puissance au moteur électrique ME. Une autre possibilité de recharge peut se faire au niveau d’un contrôle de l’assiette du dispositif volant. Le dispositif volant étant soumis au vent, le contrôle de son assiette peut consister à accélérer ou freiner uniquement l’un des moteurs à combustion MC ou électrique ME pour rétablir l’assiette. Un freinage du moteur à combustion MC ou du moteur électrique ME qui n’est pas compensé par l’autre moteur électrique ME ou à combustion MC permet également de recharger l’élément de stockage 303. Plus généralement, les signaux de commande SG et SM doivent être générés en prenant en compte le niveau de charge de l’élément de stockage 303 afin de le recharger pour qu’il puisse fournir de l’énergie au moteur électrique ME lorsque celui-ci n’est pas en mesure de fournir suffisamment d’énergie au moteur électrique ME.
Le dispositif volant de la ne disposant que de deux moteurs sur deux côtés opposés, celui-ci ne peut contrôler son assiette que selon un seul axe de rotation. Cela peut convenir pour un dispositif volant qui dispose d’autres moteurs ou de moyens d’équilibrage pour assurer un basculement selon un autre axe et assurer un contrôle d’assiette selon plusieurs axes de rotation. A titre d’exemple, un tel dispositif peut être utilisé par exemple sur l’un des dispositifs volants divulgués dans la demande de brevet WO 2017/174942, mais seulement pour le contrôle d’assiette selon une direction en plaçant les moteurs à combustion et électrique soit à gauche et à droite, soit à l’avant et à l’arrière.
La montre une vue de dessus d’une première variante de dispositif volant utilisant deux moteurs à combustion MC1 et MC2 et deux moteurs électriques ME1 et ME2 disposés en étoile autour d’un corps central 100. Chaque moteur à combustion MC1 ou MC2 est placé sur un côté opposé à un moteur électrique ME1 ou ME2 par rapport au corps principal 100, les moteurs électriques ME1 et ME2 étant par exemple placés vers l’avant du dispositif volant et les moteurs à combustion MC1 et MC2 étant par exemple placés vers l’arrière du dispositif volant. En outre, chaque moteur à combustion MC1 ou MC2 est couplé à un générateur électrique qui est relié au moteur électrique ME1 ou ME2 par l’intermédiaire d’un circuit de transfert à l’identique de l’un des circuits décrits à l’aide de la ou de la .
Pour assurer une poussée verticale, les moteurs électriques ME1 et ME2 et les moteurs thermiques MC1 et MC2 fournissent une poussée identique. Pour se déplacer vers l’avant, il convient d’accélérer les moteurs à combustion MC1 et MC2 tout en ralentissant les moteurs électrique ME1 et ME2. Pour un déplacement dans une autre direction, il convient d’incliner le dispositif volant dans la direction souhaitée en transférant plus ou moins d’énergie entre le moteur à combustion MC1 et le moteur électrique ME1 ou entre le moteur à combustion MC2 et le moteur électrique ME2.
Protocole Le nombre de cellules dans chaque puits est déterminé à l'aide du compteur de cellules à fluorescence comme décrit précédemment. La suspension cellulaire est centrifugée à 300 g pendant 10 min. Le surnageant est aspiré complètement et éliminé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 80 μL de tampon A (solution contenant un tampon phosphate salin (PBS) à pH 7,2 ; 0,5 % d'albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d'EDTA) pour 10 7 cellules. 20 μL de suspension de microbilles CD45RO sont ajoutées pour 10 7 cellules. L’ensemble est mélangé et incubé 15 min à 4 °C. Après centrifugation à 300 g pendant 10 min, le culot cellulaire complexé aux microbilles est remis en suspension dans 2 ml de tampon A. La colonne LS est placée dans le champ magnétique du séparateur MidiMACS®. Elle est préparée par rinçage avec 3 mL de tampon A, puis la suspension cellulaire est déposée sur la colonne. Les cellules non marquées qui passent à travers la colonne sont recueillies et les cellules complexées aux microbilles retenues par la colonne sont lavées avec une quantité appropriée de tampon A. La fraction obtenue est nommée (-)CD45RO. Trois étapes de lavage de la colonne sont réalisées successivement chacune par 3 ml de tampon A. Les fractions obtenues successivement sont nommées, respectivement : (-)CD45RO/W1, (-)CD45RO/W2, (-)CD45RO/W3 (ces fractions permettront de récupérer davantage de cellules (-)CD45RO si elles n’ont pas été totalement collectées dans la première fraction nommée (-)CD45RO). La colonne est retirée du séparateur et placée sur un tube de prélèvement approprié. 3 ml d’un tampon approprié (# 130-091-222) livré avec le kit de séparation, sont déposés sur la colonne puis les cellules magnétiquement marquées sont décrochées rapidement en poussant fermement le piston dans la colonne. La fraction obtenue est nommée (+)CD45RO et permet d’évaluer avec la fraction négative le rendement de la purification.
Une nouvelle colonne est préparée. Le nombre de cellules de la fraction cellulaire non marquée (-)CD45RO est déterminé. Cette suspension de cellules (-)CD45RO est centrifugée à 300 g pendant 10 min. Le surnageant est complètement éliminé. Le culot cellulaire est remis en suspension dans 80 μL de tampon A pour 10 7 cellules (comme indiqué ci-dessus). 20 μL de microbilles CD27 sont ajoutées pour 10 7 cellules. L’ensemble est mélangé puis incubé 15 min à 4 °C. Les cellules sont lavées par ajout de 2 ml de tampon A pour 10 7 cellules, puis, après centrifugation à 300 g pendant 10 min, le culot cellulaire est remis en suspension dans 2 ml de tampon A. Il est procédé à la séparation magnétique des cellules (+)CD27 et des cellules de la fraction (-)CD27. A cet effet, la colonne est placée dans le champ magnétique du séparateur MidiMACS®. La colonne est préparée en rinçant avec 3 ml de tampon puis la suspension cellulaire (-)CD45RO est appliquée sur la colonne et la fraction non fixée nommée (-)CD45RO/(-)CD27 est collectée. Elle correspond aux CTEACDs spécifiques de l’antigène grippal. La colonne est lavée avec 3 × 3 mL de tampon et les fractions qui sont obtenues successivement sont nommées, respectivement : (-)CD45RO/(-)CD27/W1, (-)CD45RO/(-)CD27/W2, (-)CD45RO/(-)CD27/W3 (ces fractions permettront de récupérer davantage de cellules (-)CD45RO/(-)CD27 si elles n’ont pas été totalement collectées dans la première fraction nommée (-)CD45RO/(-)CD27)). La colonne est retirée du séparateur et placée sur un tube de prélèvement approprié. 3 ml de tampon sont déposés sur la colonne, puis les cellules magnétiquement marquées sont rincées rapidement en poussant fermement le piston dans la colonne. La fraction obtenue est nommée (-)CD45RO/(+)CD27.
1.3/ Analyse des CTEACDs humaines
Analyse par cytométrie de flux Le protocole de l’expérience est comme suit. La cytométrie en flux polychromatique est réalisée en utilisant un cytomètre BD® LSR-II disposant de 3 rayons lasers et l’analyse des données obtenues après acquisition est réalisée avec le logiciel FlowJo. Les cellules PBMCs et CTEACDs sont mises en culture dans du milieu de culture AIM5 sans sérum dans des plaques 96 puits à puits profonds à une densité de 2x10 6 par mL, puis stimulées avec les antigènes comme indiqué pour l’ELISPOT. Les cellules sont incubées pendant 5 jours à 37 °C, 5% CO 2 et humidité saturante dans un incubateur à culture cellulaire. Les cellules sont restimulées pendant 6 h en présence des anticorps de co-stimulation CD28 (BD, Clone CD28.2) et CD49d (BD, Clone 9F10) (BD Biosciences, France) et la Bréfeldine A (Invitrogen® 00-4506-51). Les cellules sont ensuite rincées avec du 1xPBS+1%BSA et incubées pendant 30 min à température ambiante avec une combinaison d’anticorps de marquage de surface cellulaire (Pacific Blue® anti-CD3 (BD, Clone SP34-2), APC-H7 anti-CD8 (SK1), PE anti-CD4 (BD, Clone L200), APC anti-CD45RA (BD, Clone 5H9), FITC anti-CD197 (BD, Clone 150503). Le monoazide d’éthidium (EMA) à raison de 0,5 mg par puits est aussi ajouté pour permettre la détection et l’exclusion des cellules mortes. Après 15 min d’incubation à température ambiante, les cellules sont rincées avec 1xPBS+1%BSA, puis les cellules sont fixées et perméabilisées par incubation 15 min à température ambiante dans 2 mL de la solution BD Cytofix/Cytoperm® diluée à 1x. Les cellules sont rincées 5 min avec la solution Perm/Wash de BD puis les marquages intracellulaires sont réalisés avec les anticorps monoclonaux PE-Cy®7 anti-IFN-γ (BD, Clone B27) et Alexa Fluor® 700 anti-Granzyme B (BD, Clone GB11). Après 30 min d’incubation à température ambiante, les cellules sont rincées avec 1xPBS+1%BSA, puis les culots cellulaires re-suspendus dans 250 mL de paraformaldéhyde 1% dans 1xPBS puis stockés à l’obscurité à 4 °C jusqu’à l’acquisition par le LSR-II. Les cellules sont acquises au cytomètre de flux et sélectionnées selon leur granulométrie et taille (prodiffusion et diffusion latérale) correspondant aux lymphocytes (FSC/SSC), puis aux populations EMA-, CD3+, CD4+ élevé et CD8+ élevé (>100,000 événements). Le résultat de l’analyse par cytométrie de flux est montré sur la . On y observe que les cellules T CD8+ et CD4+ des CTEACDs humaines (fraction (-)CD45RO/(-)CD27) isolées du sujet ayant été infecté par l’influenza et vacciné contre la grippe à plusieurs reprises, sont composées de plus 98% et 91% de cellules effectrices respectivement. Plus de 96% des cellules CTEACDs T CD8+ sont Granzyme B+ et 40% secrètent aussi l’IFN-gamma. Pour les CTEACDs T CD4+ près de 55% produisent le granzyme B et 45% produisent l’IFN-gamma.
Analyse par Elispot Le protocole de l’expérience est réalisé comme suit. Deux cent cinquante mille PBMCs ou CTEACDs [(-)CD45RO/(-)CD27] des donneurs 1 et 2 sont inoculées en tripliquât dans des puits d’une plaque 96 puits d’un kit ELISA IFN-gamma humain (Mabtech) dans un volume final de 200 mL, puis stimulées avec 15 mL des antigènes contenus dans le vaccin grippal VaxiGripTetra, pendant la nuit dans un incubateur à culture cellulaire. Des contrôles négatifs (cellules non stimulées avec l’antigène) et positifs (cellules stimulées avec la ConA) sont utilisés en parallèle. A la suite d’une nuit d’incubation, les cellules sont éliminées de chaque puits et la détection des spots spécifiques de l’IFN-gamma est réalisée selon le protocole du kit Mabtech. L’anticorps secondaire (human 7-B6-1 biotinylé, anti-INF-γ) est dilué au 1/1000 dans 1xPBS avec Ca 2+ et Mg 2+ et supplémenté avec 0,5% de SVF. En parallèle le substrat Streptavidine-ALP (phosphatase alcaline) est aussi dilué au 1/1000 dans 1xPBS avec Ca 2+ et Mg 2+ et supplémenté avec 0,5% de SVF. Les plaques ne contenant plus de cellules sont rincées 5 fois avec 200 μl PBSx1 par puits, puis égouttées sur un papier absorbant propre. 100 μl d’anticorps dilué sont ajoutés dans chaque puits et la plaque est incubée à température ambiante pendant 2 h. La solution est ensuite éliminée, les puits rincés 5 fois avec le tampon PBSx1 puis 100 μl de Streptavidine-ALP diluée au 1/1000 sont ajoutés et les plaques incubées 1 h à température ambiante. Cette solution est ensuite éliminée, les plaques rincées 5 fois au PBSx1 avant de rajouter 100 μl du substrat BCIP/NBT (0,4 μm). Les plaques sont incubées à température ambiante à l’obscurité jusqu’à l’apparition des spots (environ 12-15 min). Les plaques sont immédiatement rincées à l’eau du robinet, égouttées puis laissées sécher totalement avant de compter les spots. Chaque spot est considéré provenir d’une cellule sécrétrice d’IFN-gamma spécifique des antigènes.
Les résultats obtenus, en termes de nombre de cellules sécrétant l’IFN-gamma, sont montrés sur la , pour chacun des deux individus donneurs, pour les PBMCs et pour les CTEACDs. On observe que la stimulation in vitro des CTEACDs permet une sécrétion massive de l’IFN-gamma. Les cellules mononucléées (PBMCs) du donneur 2 possèdent une proportion plus élevée de cellules T spécifiques de l’antigène grippal qui sont plus réactives et qui se différencient plus fortement en cellules T effectrices terminales (CTEACDs). Ces résultats démontrent clairement que les cellules réactives dans les PBMCs du donneur 2 sont plus prépondérantes que dans les PBMCs du donneur 1.
L’ensemble des résultats ci-dessus démontre que les CTEACDs possèdent toutes les caractéristiques de cellules effectrices cytotoxiques armées pour éradiquer les cellules infectées par la grippe.
Test de cytotoxicité Des CTEACDs (10 6 cellules (-)CD45RO/(-)CD27 /puits) sont mises en culture en suspension dans du milieu RPMI supplémenté de 10% de sérum de veau fœtal dans des puits d’une plaque de 12 puits, puis incubées dans un incubateur à culture cellulaire (37 °C, 5% CO 2 et humidité saturante). A différents temps post-incubation, des fractions (20 ml) sont prélevées pour la mesure de la viabilité cellulaire. La viabilité cellulaire est mesurée au moyen d’un compteur de cellules Luna ® , pendant trois jours après la fin de l’étape de purification. Le jour 0 correspond au jour d’isolement et la mise en culture des CTEACDs.
Les résultats obtenus sont montrés sur la . On observe que la durée de vie des CTEACDs ne dépasse pas 3 jours en culture cellulaire.
Exemple 2 A/ Etude in vitro de la capacité des CTEACDs humaines spécifiques d’un antigène grippal à éliminer les cellules humaines ou canines infectées par la grippe