INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Aux fins de la présente invention et des exemples présentés ici, nous allons fournir l’explication de certains termes.
Rapports d’équivalence : le rapport d’équivalence global Φ0 pour un processus d’oxydation partiel est le rapport de l’écoulement molaire de comburant dont on a besoin pour la combustion stœchiométrique de tous les combustibles et matières premières entrés, divisé par l’écoulement molaire de comburant réel. Ainsi lorsque Φ0 > 1, le mélange est riche en combustible et lorsqu’il est 1,6.
Le rapport d’équivalence global Φp, pour la chambre de combustion qui produit le gaz brûlé chaud, est défini par la quantité de combustible et de comburant de brûleur délivrée. Φp est d’ordinaire pauvre en combustible, si l’on prend des valeurs de 0,33 à 0,9.
Le rapport d’équivalence Φ1 est le rapport d’équivalence pour la chambre de combustion plus un(e) quelconque combustible ou charge supplémentaire introduit(e) dans la conduite centrale illustrée sur la , mais en laissant de côté la charge introduite au niveau de l’étranglement.
Rendement : le rendement Y est la masse de carbone solide obtenue par masse totale de matière première injectée dans le réacteur de noir de carbone, n’incluant pas le gaz naturel utilisé pour la chambre de combustion sur la , et les unités sont [kg de C/kg de matière première]. Y est égal au débit de masse totale de carbone solide produit dans le réacteur, divisé par le débit de masse totale de la matière première, et celui-ci est mesuré dans les exemples des présentes en mesurant les débit d’entrée de la matière première, du combustible de brûleur et de tous les comburants, ainsi que de la composition du gaz résiduaire produit.
Teneur en carbone : la teneur en carbone [C] est la teneur en carbone moyennée en masse de toutes les matières premières de noir de carbone introduites dans le réacteur, en unités de [kg de C/kg de matière première], et est égale au débit de masse totale d’atomes de carbone entrant dans le réacteur par le biais de matières premières, divisé par le débit de masse totale de la matière première. Cette valeur est calculée selon les débits mesurés de matières premières d’huile de décantation et d’éthylène, et leurs compositions élémentaires mesurées.
Rendement adimensionnel : le rendement adimensionnel Y/[C] est le rendement ci-dessus divisé par la teneur en carbone. Il représente la fraction du rendement possible maximal qui a été obtenu. Si Y/[C] = 0,5, par exemple, cela signifie que ½ de la matière première carbone rentrant dans le réacteur a été convertie en carbone solide. Le reste a été perdu sous forme d’espèces en phase gazeuse.
Substances extractibles par le toluène, I2, STSA, OAN et COAN
L’OAN et le COAN sont analysés sur des granulés secs et respectent les normes ASTM identifiées ci-dessus. L’indice I2 et la STSA sont analysés sur des granulés secs à l’aide des procédés ASTM identifiés ci-dessus.
Configuration et fonctionnement du réacteur.
Dans les exemples, de l’huile de décantation a été utilisée en tant que première matière première de noir de carbone (tableau 5), et du gaz d’éthylène a été utilisé en tant que matière première de noir de carbone à faible rendement ou en tant que matière première de noir de carbone gazeuse.
Pour un processus de noir de carbone au fourneau, du gaz naturel et de l’air chaud sont combinés dans une chambre de combustion pour fournir un courant de gaz brûlé chaud, comme représenté sur la . Ce gaz brûlé était pauvre en combustible (riche en comburant), avec un rapport d’équivalence Φp d’ordinaire entre 0,32 et 0,8. La chambre de combustion était à chemisage réfractaire et son diamètre interne indiqué dans le tableau 3.
Dans certains des exemples, une partie de la matière première a été introduite à l’aide d’une conduite centrale 73, comme le montre la . Cette conduite a été positionnée approximativement sur l’axe longitudinal de l’étranglement, et horizontalement. La conduite présentait un diamètre externe de 5,4 cm. Lorsque la matière première à travers la conduite était de l’huile de décantation liquide, un pulvérisateur à cône plein ou un pulvérisateur à pression avec six orifices espacés de manière régulière perpendiculaires à l’axe long de la conduite centrale a été utilisé.
Lorsque la matière première dans la conduite centrale était la matière première de noir de carbone à faible rendement de type éthylène, un injecteur de gaz 77 tel que représenté sur la a été utilisé, avec les dimensions indiquées dans les tableaux des exemples. Cet injecteur de gaz (figures 6A (présentant un trou 610 de trois trous au total, espacés radialement de manière régulière autour de l’embout) ou 6B (injecteur de gaz coaxial avec un seul trou 611) était monté sur l’extrémité de la conduite centrale. Lorsqu’aucune matière première n’a été injectée de cette manière, la conduite centrale a été retirée.
Ensuite, le gaz brûlé provenant de la chambre, ainsi que la matière première introduite dans la conduite centrale (voir ), le cas échéant, a été poussé dans un rétrécissement de sorte qu’il a pénétré dans un étranglement plus étroit (76 sur la ). Au niveau de l’étranglement, la matière première de noir de carbone à faible rendement de type éthylène a été injectée à l’aide de 3 injecteurs de gaz espacés de manière régulière autour du périmètre interne de l’étranglement. Les injecteurs étaient des tubes droits métalliques, avec un diamètre interne d’environ 2 cm. Ceux-ci étaient positionnés perpendiculairement à la direction d’écoulement, comme illustré sur la .
L’étranglement a été fixé à une chambre de réacteur à chemisage réfractaire. La chambre de réacteur fournissait un temps de séjour pour que la matière première achève sa pyrolyse en particules de noir de carbone. À une distance Lrefroidissement rapide en aval du plan d’injection représenté sur la , une pulvérisation d’eau a été utilisée pour assurer le refroidissement rapide, comme d’ordinaire pour les processus de noir de carbone au fourneau. En aval du refroidissement rapide, un filtre a été utilisé pour séparer les particules de noir de carbone du courant de gaz résiduaire. Le noir de carbone au niveau du filtre a été échantillonné concernant l’absorption d’I2 et les substances extractibles par toluène (S20). Le noir de carbone a ensuite été granulé et séché pour les mesures de STSA, OAN et COAN.
Selon un mode de réalisation, au moins une partie de l’espace entourant la cuve est décloisonné. On entend par l’expression « espace décloisonné » le fait que le volume entre deux cuves contiguës ou entre la cuve et une autre partie du navire (ces espaces étant connus de l’homme du métier sous l’appellation de cofferdam) sont des espaces ouverts, ou non fermés, autorisant la circulation par exemple de l’air ambiant depuis ou vers lesdits volumes et les volumes adjacents.
Selon un mode de réalisation, la cuve contient un produit liquide froid, en particulier du gaz naturel liquéfié (GNL) ou un gaz liquéfié.
La est une vue schématique, en coupe selon l’axe longitudinal du navire, d’un navire de transport comprenant un système de contrôle d’assiette.
La est un diagramme fonctionnel d’un système de contrôle d’assiette intégré dans le navire de transport de la .
La est une vue schématique, depuis le dessus du navire, illustrant un positionnement possible des réservoirs de liquide du système de contrôle d’assiette de la .
La est une vue analogue à la , illustrant un autre positionnement possible des réservoirs de liquide du système de contrôle d’assiette de la .
La est une vue schématique du navire de transport de la selon A-A.
La est une vue en perspective en transparence du réservoir atténuateur de roulis visible en coupe sur la .
La est un schéma de principe illustrant le fonctionnement du réservoir atténuateur de roulis visible sur la et la .
La est une vue analogue à la , montrant le navire dans une configuration où celui-ci est fortement chargé et où le réservoir atténuateur de roulis n’est pas en utilisation.
La est une vue identique à la , à ceci près que le réservoir atténuateur de roulis est en utilisation.
La est une vue analogue à la , montrant le navire dans une configuration où celui-ci est peu chargé et où le réservoir atténuateur de roulis n’est pas en utilisation.
La est une vue analogue à la , montrant le navire dans une configuration où celui-ci est moyennement chargé et où le réservoir atténuateur de roulis n’est pas en utilisation.
2) rincer les mains sous l’eau du robinet pendant 2 secondes et placer les 0,5 ml de produit sur la paume avec la seringue, puis ajouter 1 ml d’eau avec une pipette ;
3) faire des mouvements de va-et-vient pendant 20 tours (2 cercles/seconde) et faire une pause pour rassembler la mousse dans la paume afin d’éviter qu’elle ne coule si nécessaire ;
4) ajouter à nouveau 1 ml d’eau avec une pipette et faire des mouvements de va-et-vient pendant 20 tours (2 cercles/seconde), en faisant une pause pour recueillir la mousse dans la paume de la main afin d’éviter qu’elle ne coule si nécessaire ; et
5) rassembler toute la mousse dans une paume.
La propriété moussante a été évaluée par le volume et la densité de la mousse obtenue à la fin du frottement des mains (40 tours), indépendamment de la taille des bulles. Une note dans une plage de 0 à 15 a été attribuée, où 0 signifiait que la propriété de la mousse était nulle, 1 à 4 signifiait une faible propriété de la mousse, 5 à 7 signifiait une propriété moyenne de la mousse, 8 à 11 signifiait une bonne propriété de la mousse, et 12 à 15 signifiait une excellente propriété de la mousse.
La stabilité de moussage a été évaluée par le volume de mousse obtenu après 30 s. Une note dans une plage de 0 à 15 a été donnée, où 0 signifiait que la propriété de la mousse était nulle, 1 à 4 signifiait une propriété de la mousse faible, 5 à 7 signifiait une propriété de la mousse moyenne, 8 à 11 signifiait une bonne propriété de la mousse, et 12 à 15 signifiait une propriété de la mousse élevée excellente.
Propriétés IE.1’ IE.1 IE.2 CE. 1 CE. 2 CE. 3 CE. 4 CE. 5 Propriétés moussantes 14 14 12 9 4 2 1 2 Stabilité de moussage 12 12 12 6 3 1 1 1
D’après les tableaux 2 et 3 ci-dessus, on peut constater que les compositions, c’est-à-dire IE. 1, IE. 1’ et IE. 2, comprenant le stabilisateur d’interface spécifique selon la présente invention ont effectivement obtenu d’excellentes performances de moussage, incluant à la fois les propriétés moussantes et la stabilité de moussage, puisque toutes ont obtenu des notes de 12 ou plus.
En revanche, les compositions comprenant les épaississants traditionnels, par exemple ceux compris dans les CE. 2 à 5, n’ont pas fourni de performances de moussage améliorées, et ont même détérioré les performances de moussage par rapport à la composition de CE. 1, qui ne comprenait pas les épaississants compris dans les CE. 2 à 5 ou le stabilisateur d’interface selon la présente invention. Cependant, le stabilisateur d’interface de la présente invention a non seulement permis d’améliorer la rhéologie et l’efficacité d’épaississement des compositions, comme le savent les hommes du métier, mais a également renforcé et stabilisé les mousses formées dans ces compositions.
Exemples inventifs 1, 3, 4 et 4’ Les compositions selon les formules inventives IE. 1, 3, 4 et 4’ ont été préparées avec les ingrédients énumérés dans le tableau 4 (les teneurs sont exprimées en pourcentages en poids des ingrédients par rapport au poids total de chaque composition, sauf indication contraire) :
CompoSAnts IE. 1 IE. 3 IE. 4 IE. 4’ EAU QS QS QS QS COCAMIDOPROPYL BÉTAÏNE 2,147 2,147 2,147 2,147 GLYCÉRINE 2 2 2 2 POLYMÈRE RÉTICULÉ DE TRIGLYCÉRIDE CAPRYLIQUE/CAPRIQUE (et) POLY(OLÉFINE C 6-20 ) HYDROGÉNÉE (et) HDI/ TRIMETHYLOL HEXYLLACTONE 0,5 0,5 0,5 POLYURÉTHANE-79 (et) TRIGLYCÉRIDE CAPRYLIQUE/CAPRIQUE 0,5 CAPRYLYL/CAPRYL GLUCOSIDE 2,208 LAURYL SULFOSUCCINATE DISODIQUE 3,5 3,5 3,5 DIÉTHYLHEXYL SULFOSUCCINATE DE SODIUM 3,488 3,488 0 0 HUILE DE GRAINES D’HELIANTHUS ANNUUS (TOURNESOL) 50 50 50 50
1) mélanger de l’eau, de la cocamidopropyl bétaïne, de la glycérine et du caprylyl/capryl glucoside, si présent, à 65 °C dans la cuve principale pour obtenir le pré-mélange 1 ;
Un autre but de la présente invention est de proposer une méthode qui soit applicable à un produit fini, comme du vin, du cidre, de la bière, du vinaigre ou du jus de fruit, éventuellement mis en cuve ou en bouteille et apte à la vente.
Un autre but de l’invention est de proposer une méthode qui permet avec une analyse d’un même échantillon de dénombrer également les bactéries et éventuellement leur état (morte, latente ou vivante)
Brève description de l’invention
La présente invention concerne une méthode de détection, de quantification et de discrimination par cytométrie en flux des cellules des levures Brettanomyces spp contenues dans un substrat liquide organique lequel contient des sucres fermentescibles, selon laquelle on prélève un échantillon dudit substrat, éventuellement on le dilue, on ajoute dans ledit substrat éventuellement dilué au moins un premier fluorochrome apte à se lier à l’ADN des cellules mortes et/ou vivantes, on irradie ledit échantillon de manière à obtenir l’émission de fluorescence dudit premier fluorochrome et on irradie ledit échantillon également de manière à obtenir une émission de fluorescence dudit échantillon à 670 nm, on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la fluorescence due au premier fluorochrome et l’intensité de la fluorescence émise à 670nm, on obtient ainsi au moins un premier nuage de points correspondant à une intensité de fluorescence émise et détectée à 670nm supérieure à celle détectée pour les autres points, on en déduit que les points dudit premier nuage correspondent aux cellules de Brettanomyces spp et on dénombre éventuellement le nombre de cellules de Brettanomyces spp en comptant les points dudit premier nuage.
C’est en effet le mérite de la Demanderesse que d’avoir mis en évidence l’autofluorescence des cellules de Brettanomyces spp à 670nm après excitation avec un laser émettant dans les longueurs d’ondes correspondant au rouge (de 620 nm inclus à 750 nm inclus) et en particulier à 637nm. Le premier fluorochrome se liant à l’ADN, il permet de supprimer le bruit de fond dû aux particules en suspension, par exemple. Seules les cellules des microorganismes présents, c’est-à-dire les levures, les champignons et les bactéries seront marquées. Si le premier fluorochrome ne pénètre que dans les cellules dont la paroi est altérée et donc perméable (cellules mortes), le signal de fluorescence ne permet de détecter que les cellules mortes mais la détermination de la première fenêtre comme expliqué ultérieurement et l’utilisation d’un deuxième fluorochrome se liant à la fois aux cellules mortes et aux cellules vivantes permet de détecter toutes les cellules de Brettanomyces spp .
Par ailleurs, la mise en évidence de l’autofluorescence des cellules de Brettanomyces spp permet de rapidement et précisément définir une fenêtre sur les histogramme bi paramétrique, ce qui confère à la méthode de l’invention une grande précision, une grande fiabilité et une grande rapidité de mise en œuvre.
Avantageusement, le premier fluorochrome se lie à l’ADN des cellules mortes et vivantes.
L’échantillon peut être dilué au 1/10, 1/40,1/100, 1/300 ou 1/1000, en fonction de sa charge en levures et bactéries.
Description détaillée Selon un mode de mise en œuvre particulier, ledit substrat contient en majorité des levures Brettanomyces spp et des levures Sacharomyces spp , on obtient sur ledit histogramme bi paramétrique au moins deux nuages de points, l’un comprenant les points correspondant à une intensité de fluorescence émise à 670nm supérieure à celle des points du deuxième nuage de points, on en déduit que les points dudit premier nuage correspondent aux cellules de Brettanomyces spp et que les points dudit deuxième nuage correspondent aux cellules de Saccharomyces spp et on dénombre éventuellement le nombre de cellules de Brettanomyces spp et/ou de Saccharomyces spp en comptant les points de chacun desdits nuages.
Avantageusement, en fonction de la complexité du substrat, avant de mesurer la fluorescence, on réalise une première discrimination entre les particules et les cellules contenues dans ledit échantillon en mesurant l’intensité de la lumière réfléchie et réfractée et l’intensité de la lumière difractée, on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point correspondant à une particule ou cellule détectée la valeur desdites intensités, on détermine ainsi en fonction des valeurs desdites intensités une première fenêtre qui contient des points affectables à des cellules de levure et éventuellement une deuxième fenêtre qui correspond à des points affectables à des cellules bactériennes, on établit ledit histogramme bi paramétrique donnant l’intensité de la fluorescence due au premier fluorochrome et l’intensité de la fluorescence émise à 670nm pour chaque point situé dans ladite première fenêtre. La détermination de la première fenêtre (stratégie de « gating ») permet de réduire le bruit de fond dû aux particules et bactéries contenues dans le substrat. On isole ainsi les points correspondant aux cellules de levures et on établit pour ces seules cellules l’histogramme bi paramétrique d’émission de fluorescence précité. Ceci permet de détecter les points qui représentent en fait soit une bactérie soit une particule et qui se trouvent encore dans la première fenêtre.
Avantageusement, ledit premier fluorochrome étant apte à se lier à l’ADN des cellules vivantes et à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable, avant toute mesure, on ajoute en outre, audit échantillon éventuellement dilué, un deuxième fluorochrome apte à se lier uniquement à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable, on détermine une troisième fenêtre qui entoure les points dudit premier nuage, on excite l’échantillon de manière à provoquer l’émission de fluorescence du premier et du deuxième fluorochrome et pour les points situés dans ladite troisième fenêtre, on établit également un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la fluorescence du premier et celle du deuxième fluorochrome ou l’intensité de la fluorescence par unité de surface d’un des deux fluorochromes et celle due à l’autre fluorochrome et on détermine, en outre, deux groupes de points, un premier groupe pour lesquels la fluorescence due au fluorochrome qui se fixe uniquement à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable est supérieure à celle du deuxième groupe et éventuellement on compte le nombre de points de chacun des groupes, lequel correspond au nombre de cellules de Brettanomyces sppp vivantes pour le deuxième groupe et le nombre de cellules de Brettanomyces spp mortes pour le premier groupe.
Il est également possible d’utiliser l’intensité de fluorescence par unité de surface pour l’un ou l’autre des fluorochromes.
Le deuxième fluorochrome permet de supprimer encore des points correspondant à des particules ou des bactéries; de tels points peuvent en effet demeurer dans la première fenêtre. Plus la longueur d’onde d’émission en fluorescence du deuxième fluorochrome est proche de 670nm, plus l’intensité de la fluorescence des cellules de Brettanomyces spp marquées à l’aide de ce deuxième fluorochrome est importante. Il est ainsi possible de discriminer les cellules de Brettanomyces spp mortes des cellules de Brettanomyces spp vivantes.
Il est également possible de distinguer les cellules de Brettanomyces spp mortes en utilisant uniquement l’auto fluorescence à 670nm. On établit alors un histogramme bi paramétrique dans la troisième fenêtre donnant la fluorescence pour le premier fluorochrome et la fluorescence détectée à 670nm. La fluorescence des cellules mortes et/ou latentes à 670nm est plus faible que celle émise par les cellules vivantes.
Avantageusement, on détermine ladite deuxième fenêtre et on excite ledit échantillon de manière à provoquer l’émission de fluorescence du premier et du deuxième fluorochrome et pour les points situés dans ladite deuxième fenêtre, on établit un histogramme bi paramétrique donnant pour chaque point l’intensité de la fluorescence du premier et celle du deuxième fluorochrome ou l’intensité de la fluorescence par unité de surface d’un des deux fluorochromes et celle due à l’autre fluorochrome et l’on détermine deux groupes de points, un premier groupe pour lesquels la fluorescence due au fluorochrome qui se fixe uniquement à l’ADN des cellules dont la paroi est perméable est supérieure à celle du deuxième groupe et on compte le nombre de points de chacun des groupes, lequel correspond au nombre de cellules bactériennes vivantes pour le deuxième groupe et le nombre de cellules bactériennes mortes pour le premier groupe.
Avec un seul et même échantillon et avec un seul passage dans le cytomètre, il est possible d’obtenir simultanément une analyse des levures et des bactéries.
Tampon ADN ligase T4 - 2.5ul, Amplicon - 2.3 ul, Fwd_corrector - 0.56ul, Rev_corrector - 0.85ul
BsaI - 0.5ul, T4 DNA ligase - 0.5ul, Eau - 16.8ul
Les réactions sont incubées à 37°C pendant 40 minutes et inactivées à 60°C pendant 10 minutes. Ensuite, les réactions sont nettoyées par PCR clean up kit et éluées dans 10ul de tampon d'élution.
Ici, 6 pb X désigne l’étiquette de l'échantillon ou du patient ; 10 pb N désigne la région UMI dégénérée.
6) Amplification des amplicons liés par le Corrector
Les amplicons liés avec les Correctors ont été amplifiés par une PCR utilisant la polymérase Q5 -
Réaction PCR: Q5 5x Master mix- 5ul ; dNTPs (10mM)- 0.5ul ; Universal_fwd_primer (10mM)- 1.25ul ; Universal_rev_primer (10mM)- 1.25ul ; Template- 5ul ; Eau- 12ul.
Condition de PCR : Dénaturation initiale - 98°C pendant 30 secondes, dénaturation - 98°C pendant 10 secondes, recuit - 65°C pendant 30 secondes, extension - 72°C pendant 30 secondes. Extension finale - 72°C pendant 2 minutes. Pour 30 cycles.
Universal_fwd_primer - 5'- ACACTCTTTCCCTACACGAC -3' (SEQ ID NO.7)
Amorce_rev_universelle - 5'- GACTGGAGTTCAGACGTGTG -3' (SEQ ID NO.8)
7) Expérience "spike-in"
Des produits PCR de 450 pb contenant l'exon 19 et l'exon 21 ont été amplifiés à partir des plasmides pUC57-W ou M. Ils ont ensuite été mélangés à différentes concentrations. Ces amplicons ont ensuite été ajoutés avec du sérum humain (Sigma-Aldrich) pour imiter la condition clinique où l'ADN sans cellules est mélangé avec le sérum humain. Les amplicons ont ensuite été isolés du sérum.
Isolation d'amplicons à partir de sérum humain Le MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit d'Applied Biosystem a été utilisé pour isoler les amplicons de l'échantillon de sérum. Ce kit est conçu pour isoler l'ADN circulant à partir d'échantillons de plasma, de sérum et d'urine humains exempts de cellules, à l'aide de billes magnétiques Dynabeads. Les instructions du fabricant ont été suivies pour isoler les amplicons à partir du sérum. Les amplicons isolés ont été élus dans 20 ul de tampon d'élution.
RÉSULTATS
EXEMPLE 1 - Analyse du gel d'agarose de la PCR d'enrichissement de la mutation
Des PCR d’enrichissement de mutation (MEP) ont été réalisées pour la mutation par délétion de l'Exon19 avec l'amorce Fwd_exon19_enhancer et Reverse_exon21 en utilisant différents modèles plasmidiques - type sauvage pUC57-W, mutant pUC57-M et mélange de ces deux dans des rapports (98- 2) pour voir si l'effet de la PCR d’enrichissement de mutation peut être observé visuellement dans le gel d'agarose. Toutes les matrices ont été utilisées à des concentrations de 10 ng/ul. Après 35 cycles de MEP, les amplicons ont été chargés dans le gel d'agarose à 2%. Le produit PCR attendu est d'environ 430 bp pour la séquence de type sauvage et 415 bp pour la forme mutante. Aucune amplification n'a été observée dans le cas du type sauvage ; en revanche, de fortes bandes d'amplification ont été observées lorsqu'un mutant ou un mélange de type sauvage et de mutants a été utilisé comme matrice ( ).