INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La diafiltration est en fait une opération « de lavage » dans laquelle un « agent de diafiltration » est apporté, de manière continue ou non, à une solution pour entrainer sélectivement certains composants de la solution ainsi « lavée ». Elle peut être conduite de différentes façons :
• La diafiltration continue, à volume constant : un agent de diafiltration (ici, du perméat métabolisé) est ajouté en continu au même débit que l’écoulement du perméat issu de l’étape (a). L’éthanol est éliminé du rétentat au fur et à mesure que le perméat métabolisé est ajouté.
• La diafiltration séquentielle : l’opération est conduite en mode batch, par une dilution suivie d’une concentration. Le perméat métabolisé est ajouté de manière séquentielle au rétentat avant de re-concentrer ce mélange.
Lorsque cette technique est réalisée de manière séquentielle, on obtient deux nouvelles fractions et en particulier un rétentat dont la valeur de TAV a été abaissée. Cette étape de diafiltration est mise en œuvre autant de fois que nécessaire au regard de l’abaissement recherché de la valeur du TAV.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, l’invention concerne la souche de Christensenella minuta déposée sous le numéro DSM 33715 auprès de l'lnstitut Leibniz DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, en français Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires GmbH). Ladite souche a pour séquence d’ADNr 16S, la séquence SEQ ID NO :1.
Un autre objet de l’invention se rapporte au surnageant de culture obtenu depuis la souche bactérienne DSM 33715 et/ou la souche dérivée. Préférentiellement, le surnageant de culture comprend au moins un des constituants choisi parmi un composé cellulaire bactérien, un débris cellulaire bactérien, un métabolite et/ou une(des) molécule(s) sécrété(s) par la souche et/ou la souche dérivée, ou leurs combinaisons.
Ainsi, les composés cellulaires et/ou débris cellulaires peuvent être des composants de la paroi, des acides nucléiques, des composants membranaires, des protéines, des lipides etc. Les métabolites ou molécules sécrété(s) peuvent être toute molécule produite ou modifiée par la bactérie en raison de son activité métabolique au cours de sa croissance, de son utilisation dans des procédés technologiques (par exemple, mais sans s'y limiter, des procédés de production d'aliments ou de médicaments). A titre d’exemple, les métabolites ou molécules peuvent être des protéines, acides aminées, enzymes, lipides, acides nucléiques etc. Par « métabolite et/ou une(des) molécule(s) sécrété(s) par la souche et/ou la souche dérivée », on entend une molécule produite et exportée ou libérée à l’extérieur de la bactérie par la bactérie.
Ainsi l’invention se rapporte également au surnageant de culture obtenu depuis la souche bactérienne selon l’invention.
La ou les souches selon l’invention ou souche(s) dérivée(s) et/ou le surnageant de culture précédemment décrit et les bactéries issues desdites souches, sont avantageusement administrées dans une composition.
Ainsi, l’invention concerne une composition comprenant : (i) au moins une souche bactérienne selon l’invention et/ou (ii) un surnageant selon l’invention et (iii) au moins un excipient acceptable.
En particulier, la composition comprend au moins une souche bactérienne déposée sous le numéro DSM 33715 et/ou au moins une souche ayant au moins 99,5% d’identité avec la séquence d’ADNr 16S de la souche DSM 33715 et/ou le surnageant de culture obtenu depuis lesdites souches et au moins un excipient acceptable et/ou un milieu physiologiquement acceptable.
Selon un mode de réalisation, la composition peut comprendre la souche bactérienne selon l’invention sous toute forme produisant les effets escomptés et l’efficacité décrite dans la présente demande. En particulier, la souche peut être sous forme vivante (cultivable ou non), morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée. La forme morte, semi-vivante, atténuée ou inactivée peut être obtenue par différentes techniques connues de l’homme du métier. On citera par exemple les techniques suivantes : irradiation, inactivation thermique ou lyophilisation, en particulier par la chaleur, l’exposition à un pH approprié, aux UV, aux rayons gamma, aux rayons X ou à la mise sous haute pression.
Par « semi-vivante » on entend une bactérie à faible activité physiologique dont la capacité à proliférer est réduite, temporairement ou définitivement. Le terme « inactivé » désigne une bactérie qui n'est plus capable, temporairement ou définitivement, de proliférer. Le terme « morte » désigne une bactérie qui n'est plus capable, définitivement, de proliférer. Les bactéries mortes ou inactivées peuvent avoir les membranes cellulaires intactes ou rompues. Ainsi le terme « inactivé » désigne également les extraits et lysats de bactéries obtenues.
La composition selon l’invention peut également comprendre au moins un composé additionnel. Un composé additionnel peut être en particulier un ingrédient, une molécule, un principe actif, un microorganisme, une bactérie ou un mélange de bactéries.
Préférentiellement, le composé additionnel est un microorganisme différent de la souche bactérienne selon l’invention ou de la souche dérivée. Plus préférentiellement, le microorganisme est une bactérie du genre Christensenella . A titre d’exemple on peut citer une bactérie appartenant à l’espèce C. minuta, C. timonensis, C. massiliensis et leurs mélanges.
Selon une variante, le composé additionnel est un probiotique et/ou un prébiotique. Le prébiotique peut-être, par exemple au moins un prébiotique choisi parmi les galactooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les inulines, les arabinoxylanes, les béta-glucanes, les lactoglobulines et/ou les béta-caséines.
Selon une autre variante, le composé additionnel peut être : au moins une bactérie produisant de l’acide lactique qui permet de créer un environnement anaérobique favorable aux Christensenellacées telle qu’au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du genre Lactobacillus spp ., Bifidobacterium spp., Streptococcus spp. et/ou au moins une bactérie produisant de l’acide butyrique qui permet de créer un environnement favorable aux Christensenellacées telle qu’une bactérie des genres Ruminococcaceae et Lachnos piraceae , au moins un autre organisme favorisant les conditions anaérobiques nécessaires à la survie des Christensenellacées telle qu’au moins une levure choisie parmi des Saccharomyces spp. ou des micro-organismes de la famille des Methanobacteriaceae , et/ou au moins une bactérie associée à l’écosystème des Christensenellacées car elles facilitent leur survie dans l’intestin telle qu’au moins une bactérie choisie parmi les bactéries du phylum Firmicutes , Bacteroidetes , Actinobacteria , Tenericutes , et Verrucomicrobia , et/ou au moins un polyphénol tel que par exemple au moins un polyphénol choisi parmi la quercetin, le kaempférol, le resvératrol, les flavones (comme la lutéoline), les flavan-3-ols ou les catéchines, les flavanones (comme la naringinine), les isoflavones, les anthocyanidines, les oligo-proanthocyanidines, et/ou au moins un minéral et/ou au moins une vitamine et/ou au moins un agent nutritionnel, et/ou au moins un principe actif pharmaceutique préférentiellement choisi parmi les anti-inflammatoires non stéroïdien, les anticorps dirigés contre des cibles pro-inflammatoires (tel que anti-TNF-alpha ou anti-IL6), les antirhumatismaux, les analgésiques, les antimicrobiens, les corticostéroïdes, les anaboliques stéroïdiens, les antidiabétiques, les agents thyroïdiens, les antidiarrhéiques, les antitussifs, les antiémétiques, les anti ulcères, les laxatifs, les anticoagulants, l’érythropoïétine, les immunoglobulines, les immunosuppresseurs, les hormones de croissance, les médicaments hormonaux, les modulateurs des récepteurs aux œstrogènes, les agents alkylant, les antimétabolites, les inhibiteurs mitotiques, les radiopharmaceutiques, les anti-dépresseurs, les antipsychotiques, les anxiolytiques, les hypnotiques, les sympathomimétiques, les stimulants, le donepezil, la tacrine, les médicaments pour l'asthme, les bêta-agonistes, les stéroïdes inhalés, les inhibiteurs de leucotriène, les cromoglycates ou acides cromoglycidiques, l’épinéphrine, la dornase alpha, les cytokines, les antagonistes de cytokines, les inhibiteurs de la Janus Kinase, les immunomodulateurs, les hypolipémiants, les hypocholestérolémiant, les anti-hypertenseurs.
Lorsque le composé additionnel est un microorganisme différent de la souche selon l’invention, le microorganisme est préférentiellement choisi parmi Akkermansia muciniphila, Faecalibacterium prausnitzii , Anaerobutiryricum hallii , Hafnia alvei , Roseburia intestinalis , Roseburia hominis, Roseburia faecis , Roseburia inulinivorans , Dysosmobacter welbionis , Oscillospira guillermondii , Lact iplanti bacillus plantarum , Lact icaseibacill u s casei , Latilactobacillus sakei , Ligilactobacillus salivarius , Limosilactobacillus fermentum , Limosilactobacillus reuteri , Levilactobacillus brevis , Bifidobacterium pseudolongum, Bifidobacterium longum , Bifi dobacterium infantis , Bifidobacterium animalis , Bifidobacterium adolescentis , Bifidobacterium bifidum , Bifidobacterium breve , Bifidobacterium lactis , Bifidobacterium stercoris et Bifidobacterium thermophilum .
Lorsque le composé additionnel est un principe actif pharmaceutique, il s’agit préférentiellement d’un principe actif choisi parmi le 5-ASA, la mesalamine, l’olsalazine, le budésonide, le Tofacitinib, le filgotinib, l’upadacitinib, l’infliximab, l’adalimumab, le golimumab, le certolizumab, le vedolizumab et l’ustekinumab.
Selon un dernier objet, l’invention concerne également une utilisation non thérapeutique de la composition selon l’invention pour maintenir et/ou renforcer le microbiote intestinal et/ou soutenir la diversité du microbiote intestinal et/ou promouvoir l’augmentation de bactéries bénéfiques dans le microbiote intestinal et/ou promouvoir la perte de poids chez un sujet sain.
Préférentiellement, lorsque la composition vise à renforcer le microbiote intestinal et/ou soutenir la diversité du microbiote intestinal et/ou promouvoir l’augmentation de bactéries bénéfiques dans le microbiote intestinal et/ou promouvoir la perte de poids chez un sujet sain, alors la composition est sous la forme d’un produit alimentaire, d’une boisson, d’un nutraceutique, d’un additif alimentaire, d’un complément alimentaire ou d’un produit laitier.
L’invention est à présent illustrée par des exemples de bactéries utiles selon l’invention, de procédés de cultures de ces bactéries, des exemples de compositions les contenant et des résultats d’essais démontrant leur efficacité, présentés uniquement à titre d’illustration.
Exemples Exemple 1 : Caractérisation de C. minuta selon l’invention déposée sous le numéro DSM 33 715 .
La souche bactérienne C. minuta DSM 33715 peut être caractérisée selon les méthodes suivantes.
Les bactéries natives de la souche DSM 33715 (10 µL de milieu de culture dosé à 10 9 CFU/mL) ont été déposées sur des grilles en carbone ionisé (Delta Microscopy, Toulouse, France) et une coloration négative a été réalisée avec du Nano-Tungsten (Nano-W, Nanoprobes, LFG Distribution, France).
L’observation des bactéries montées sur grille a été réalisée avec un microscope électronique à transmission (Talos F200S G2 - Thermofisher – Eindhoven) à 200kV, équipé d’une camera 4K*4K One View (Gatan, Paris, France). La préparation des échantillons, ainsi que les acquisitions ont été réalisées au Bordeaux Imaging Center (membre de France-BioImaging, ANR-10-INBS-04).
L’activité oxidase a été déterminée par l’utilisation de bandelettes de test oxidase (Sigma-Aldrich) par évaluation du changement de couleur après ajout d’une goutte de culture bactérienne liquide.
L’activité catalase a été déterminée à deux concentrations d’H 2 O 2 (3 et 15%), ajoutées sur une colonie de DSM 33715, le statut catalase étant évalué visuellement par la formation de bulles.
La coloration de gram a été réalisée suivant la procédure classique.
La tolérance à la bile et au pH ont été évaluées en milieu GAM modifié (HyServe) liquide. Pour la tolérance à la bile, des milieux contenant 0-2-4-6 et 8% d’Oxgall (Difco Laboratories) ont été utilisés, correspondant respectivement à 0-20-40-60 et 80% de bile. Pour la tolérance au pH, des milieux à pH 4-5-6-7 et 8 ont été utilisés. L’ensemble des milieux a été dégazés dans la chambre anaérobiques avant inoculation avec 10 µl d’une suspension bactérienne au 0,5 de McFarland. La densité optique à 600 nm a été prise à 0h, 24h, 48h, 72h et 96h.
Les tests d’antibiorésistance ont été réalisé par l’utilisation de concentration minimale inhibitrice (CMI) selon la méthode de référence de dilution en milieu gélosé du CLSI (Clinical and laboratory Standards Institute). Les solutions stock de chaque antibiotique ont été préparées et stérilisées par filtration à 0,2 µ : ampicilline (Sigma-Aldrich), tétracycline (Sigma-Aldrich, Chloramphénicol (Sigma-Aldrich), clindamycine (Sigma-Aldrich), méropénème (USP), pipéracilline (USP), tazobactam (USP), et ceftriaxone (USP). Le milieu Brucella agar (BD BBL) supplémenté avec 5 µg/ml d’hémine (Sigma-Aldrich), 1 µg/ml de vitamine K1 (Sigma-Aldrich) et 5% (v/v) de sang de mouton hémolysé (laked) (Hemostat) a été utilisé comme milieu de test. Les boîtes agar avec différentes dilutions d’antibiotique ont été préparées et dégazées dans la chambre anaérobique avant inoculation. L’inoculum de DSM 33715 a été resuspendu au standard 0,5 de McFarland en eau peptonée. 2 µl de l’inoculum ont été déposés à la surface de l’agar (chaque spot correspondant approximativement à 10 5 CFU/ml). Un triplicat est réalisé par concentration d’antibiotique. Les boîtes ont ensuite été incubées pendant 6 jours à 37°C en condition anaérobique. Les valeurs de CMI ont été déterminées selon les directives du CLSI et ont été interprétées comme sensible, intermédiaire ou résistante, basées sur les points de rupture des anaérobes du CLSI.
Résultats de caractérisation
La souche DSM 33715 est strictement anaérobique avec une phase exponentielle de croissance entre 20 et 40h et une phase stationnaire commençant à 40h, non motile, non sporulante, négative pour l’activité oxydase et catalase et est gram négative. DSM 33715 est négative pour la majorité des enzymes testées, à l’exception de l’acidification du glucose, du xylose, du rhamnose et de l’arabinose, ce qui est cohérent avec la description des Christensenella minuta faite par Morotomi et al. Elle présente les activités enzymatiques suivantes : β-Glucosidase, α-Arabinosidase, Glutamic Acid Décarboxylase, ainsi qu’Estérase, Acid Phosphatase et Napthol-AS-BI-Phosphatase. Une résistance aux acides biliaires a été observée jusqu’à 80g/l d’Oxgall, correspondant à 80% de bile. DSM 33715 présente également une croissance en milieu avec un pH allant de 6 à 9. Enfin, la souche DSM 33715 montre une résistance à l’ampicilline et la tétracycline.
La représente l’image d’une bactérie Christensenella minuta selon l’invention réalisée en microscopie électronique à transmission en coloration négative (grossissement : 36kX). Les dimensions moyennes d’une bactérie de la souche DSM 33715 sont : longueur= 1,27 +- 0,28 mm ; largeur= 0,507 +- 0,04 mm ; avec une épaisseur de membrane= 29,4 nm (moyenne réalisée à partir de 41 bactéries). La souche a une forme courte avec les extrémités effilées, se présentant en singulet, paires ou rosaces.
La souche selon l’invention peut également être caractérisée par l’analyse d’un spectre MALDI.
Système de revêtement par pulvérisation (sputter coater) EM ACE600, Leica ; Wetzlar, Allemagne
Electrofilage en impression 3D de la couche (ii ), Design ondulé :
Une seringue remplie de pastilles de PCL a été préchauffée pendant au moins 24 heures à 80°C. Pour imprimer des grilles sinusoïdales, une buse 25G a été utilisée et la distance buse-collecteur a été fixée à 3,6 mm, avec une vitesse du collecteur de 180mm/min. Une température de buse légèrement inférieure de 80°C a été utilisée et une différence de tension de 6kV (+4,5kV à la buse et -1,5kV au collecteur) a été appliquée pour initier le jet. La pression utilisée pour extruder le polymère était de 2 bar. Un total de 30 couches (15 couches dans chaque direction ; deux directions) a été déposées, où chaque couche a été déposée à un angle de 90° par rapport à la couche précédente. Un diamètre de fibre de 13 à 15 µm approximativement, de préférence de 14 µm a été obtenu et la hauteur totale des échafaudages était de 400 µm environ.
Exemple 3 : Formation du support bicouche avec un design droit de la couche (ii)
Electrofilage de la couche (i)
Une solution à 15 % de polycaprolactone (PCL) de qualité médicale (Corbion, PC-12) a été préparée dans un solvant mixte de dichlorométhane et de diméthylformamide (rapport DCM:DMF de 3:2). Le flacon en verre a été scellé et la solution a été laissée sous agitation pendant une nuit. Une seringue de 5 ml a été chargée avec la solution préparée et attachée à une buse de 27G. Un débit de 0,5 ml/h a été utilisé pour l'électrofilage de fibres polymères. Une différence de tension de 18 kV a été appliquée entre la buse et le collecteur. Une distance buse-collecteur de 14 cm a été utilisée. Les fibres électrofilées ont été recueillies sur des lames de verre fixées à un collecteur rotatif pendant 30 minutes. La température et l'humidité de la pièce étaient respectivement de 20,8 °C et 43 %.
Electrofilage en impression 3D de la couche (ii)
Design décagonal :
Une seringue a été remplie de pastilles de PCL et préchauffée pendant au moins 24 heures à 77°C. La seringue chargée était équipée d’une buse 22G. Une pression d'air de 1,5 bar a été appliquée à la seringue et une différence de tension de 6 kV (+4,5 kV au niveau de la buse et -1,5 kV au niveau du collecteur) a été appliquée pour initier le jet de liquide. Une impression de stabilisation a été réalisée avant l'impression des structures décagonales. La conception décagonale est composée de 30 couches de fibres imprimées en quadrillage, où chaque couche a été imprimée/électro-écrite à un angle de rotation de 72° (360/5) par rapport à la couche précédente. Un espacement des fibres de 150 µm a été utilisé pour chaque couche. Une distance buse-collecteur de 3,6 mm a été utilisée pour toutes les impressions. Un diamètre de fibre de 8 à 13 µm approximativement, de préférence de 10 µm a été obtenu et la hauteur totale de la couche produite était de 400 µm environ.
Exemple 4 : Obtention d’un équivalent de derme avec support bicouche ayant un design droit de la couche (ii)
Pour stériliser et augmenter l'attachement des cellules, les supports bicouches ont été traités à l'éthanol.
L’idée générale de la présente invention est, lorsque l’une au moins des caméras a été déplacée lors de la conception du véhicule alors que des images avaient été acquises par cette caméra lors d’un roulage d’essai, de modifier les images acquises pour obtenir les images qui auraient été acquises si la caméra avait été dans sa nouvelle position. L’idée est donc de générer une image finale Fin1 de l’environnement à partir d’une image initiale Img0 acquise pour une posture déterminée de la caméra grand angle. Dans cette description, on considère qu’une « posture déterminée » correspond à une orientation prédéterminée et une position prédéterminée du centre de la caméra grand angle dans le repère OXYZ.
Deux modes de réalisation distincts du procédé de génération selon l’invention sont alors introduits dans la suite.
Le premier mode de réalisation (figures 3 à 11) est le plus simple puisqu’il correspond au cas où les images finales et initiales sont proches.
Ce premier mode de réalisation est mis en œuvre lorsqu’une position actualisée du centre de la caméra grand angle est proche d’une position initiale du centre de la caméra grand angle (en d’autres termes, si la position de la caméra a peu changé). Plus précisément, dans ce premier mode de réalisation, la position actualisée du centre de la caméra grand angle est à une distance inférieure à 100 millimètres de la position initiale du centre de la caméra grand angle.
Ce premier mode de réalisation du procédé selon l’invention peut également être mis en œuvre lorsque les objets présents dans le champ de vision de la caméra grand angle sont situés à plusieurs mètres du centre de la caméra grand angle, par exemple à une distance supérieure à 15 mètres du véhicule automobile 10. En effet, dans ce cas, la vue de ces objets sera sensiblement la même, même si la caméra a été beaucoup déplacée.
Le deuxième mode de réalisation ( ), plus complexe, est sinon mis en œuvre. Il correspond donc au cas où la position actualisée du centre de la caméra grand angle est éloignée de la position initiale du centre de la caméra grand angle. Plus précisément, dans ce deuxième mode de réalisation, la position actualisée du centre de la caméra grand angle est à une distance supérieure à 100 millimètres de la position initiale du centre de la caméra grand angle.
Dans ce mode de réalisation, les objets présents dans le champ de vision de la caméra grand angle sont alors situés à proximité du véhicule automobile 10. Plus précisément, les objets présents dans le champ de vision de la caméra grand angle sont situés à une distance inférieure à 15 mètres du véhicule automobile 10.
On peut alors décrire le premier mode de réalisation d’un procédé de génération d’une image finale de l’environnement du véhicule automobile 10. Comme indiqué précédemment, ce procédé est mis en œuvre, par le calculateur 15, lors de la phase de conception du véhicule automobile 10.
Ce premier exemple de procédé est décrit par rapport à une seule caméra grand angle mais s’applique, par exemple, de la même manière à une autre caméra grand angle présente dans le véhicule automobile 10.
Initialement, la caméra grand angle 11a, 11b ; 12a, 12b présente une posture initiale dans un repère OXYZ associé au véhicule automobile 10 (ce repère est visible par exemple sur les figures 1 et 2). La posture initiale correspond donc ici à une orientation initiale et une position initiale du centre de la caméra grand angle 11a, 11b ; 12a, 12b concernée dans le véhicule automobile 10.
Le procédé comporte une première étape au cours de laquelle le véhicule automobile 10 se déplace sur une voie de circulation afin de valider la phase de développement courante.
Plus particulièrement, lors de ce déplacement, la caméra grand angle 11a, 11b ; 12a, 12b acquiert au moins une image initiale Img0 de l’environnement du véhicule automobile 10. Cette image initiale Img0 est donc acquise pour la posture initiale du caméra grand angle 11a, 11b ; 12a, 12b.
Comme cela est connu, un objectif d’une caméra grand angle déforme les images acquises par le capteur d’image. On parle alors de distorsion. La représente ainsi l’image initiale Img0 distordue de l’environnement du véhicule automobile 10, telle qu’elle est acquise par la caméra grand angle 11a, 11b ; 12a, 12b. On y observe alors une vue déformée de la route 30 et d’immeubles 31, 32. Il s’agit d’une vue avec distorsion en forme de globe. Les déformations des lignes sont identiques à celles qu’on pourrait observer sur un miroir convexe.
Le déplacement du véhicule automobile 10 est ensuite interrompu mais le développement du véhicule automobile 10 se poursuit.
Au cours de ce développement, la caméra grand angle 11a, 11b ; 12a, 12b est déplacée. Plus particulièrement, lors de cette étape, la caméra grand angle 11a, 11b ; 12a, 12b présente une posture actualisée différente de la posture initiale. En d’autres termes, à l’étape E10, la caméra grand angle 11a, 11b ; 12a, 12b présente une orientation actualisée et/ou une position actualisée du centre de la caméra grand angle 11a, 11b ; 12a, 12b différentes des paramètres de la posture initiale.
Plus précisément, la modification de posture de la caméra grand angle correspond à une transformation de changement de repère. Cette transformation prend en compte un changement d’axe et/ou un changement de position du centre de la caméra grand angle 11a, 11b ; 12a, 12b.