Dispositif de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques comprenant un thermocycleur (4) agencé pour réaliser une série de cycles thermiques avec un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro contenant au moins deux sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores émettant dans des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant, un capteur de lumière (6) agencé pour mesurer un rayonnement émis par lesdits fluorophores dans lesdites plages de longueurs d’onde de fluorescence, le rayonnement émis par chaque sonde variant selon que celle-ci est dans un état non modifié dans lequel le quencher atténue ou n’atténue pas sensiblement l’émission de fluorescence, ou dans un état modifié dans lequel le quencher a un effet opposé sur l’émission de fluorescence, et un analyseur (8) agencé pour déterminer, pour chaque sonde de fluorescence respective, une valeur représentative d’une concentration dans un état modifié, à partir de signatures temporelles tirées de la fluorescence mesurée en fonction du temps pour un cycle thermique donné d’un mélange réactionnel comprenant une ou plusieurs sondes, lesquelles peuvent être chacune sensiblement entièrement dans un état non modifié ou modifié, et d’au moins deux mesures réalisées au cours de certains au moins des cycles thermiques, lesquelles valeurs représentatives d’une concentration dans un état modifié permettent de qualifier la présence d’une ou plusieurs séquences d’acide nucléique chacune associée à une sonde de fluorescence distincte de manière à provoquer un changement d’état de la sonde de fluorescence de l’état non modifié vers l’état modifié lorsqu’elles interagissent. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel le thermocycleur (4) est un thermocycleur PCR, et les au moins deux sondes de fluorescence sont choisies parmi le groupe comprenant les sondes TaqMan, les balises moléculaires, les sondes duales à transfert de fluorescence, les sondes Scorpion, les sondes Amplifluor, les sondes MGB Eclipse, les sondes LUX, les sondes QUASR et les sondes QZyme. Dispositif selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprend trois sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant. Dispositif selon l’une des revendications précédentes, dans lequel le réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprend au moins deux groupes de sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant au sein de chaque groupe de sondes de fluorescence. Dispositif selon l’une des revendications précédentes, dans lequel l’analyseur (8) est agencé pour déterminer la valeur représentative de la concentration de chaque sonde de fluorescence dans un état modifié en résolvant un système matriciel basé sur les mesures de fluorescence, les signatures temporelles et la constance de la concentration respective de chaque sonde de fluorescence. Dispositif selon les revendications 4 et 5, dans lequel l’analyseur (8) est agencé pour résoudre un système matriciel par groupe de sondes de fluorescence. Dispositif selon la revendication 5 ou 6, dans lequel l’analyseur (8) est agencé pour utiliser un algorithme de minimisation. Dispositif selon l’une des revendications 1 à 4, dans lequel l’analyseur (8) est agencé pour déterminer la valeur représentative de la concentration de chaque sonde de fluorescence dans un état modifié en appliquant une descente du gradient ou en utilisant un réseau de neurones. Procédé de détection multiplexée de séquences d’acides nucléiques comprenant les opérations suivantes : a) réaliser une pluralité de cycles thermiques sur un mélange réactionnel comprenant un échantillon à analyser et un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro contenant au moins deux sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores émettant dans des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant, b) lors de chaque cycle thermique, réaliser au moins deux mesures de fluorescence dans lesdites plages de longueurs d’onde de fluorescence, le rayonnement émis par chaque sonde variant selon que celle-ci est dans un état non modifié dans lequel le quencher atténue ou n’atténue pas sensiblement l’émission de fluorescence, ou dans un état modifié dans lequel le quencher a un effet opposé sur l’émission de fluorescence, c) déterminer une valeur représentative de la concentration de chaque sonde de fluorescence dans un état modifié à partir des mesures de l’opération b) et de signatures temporelles tirées de la fluorescence mesurée en fonction du temps pour un cycle thermique donné d’un mélange réactionnel comprenant une ou plusieurs sondes, lesquelles peuvent être chacune sensiblement entièrement dans un état non modifié ou modifié, lesquelles valeurs représentatives d’une concentration dans un état modifié permettent de qualifier la présence d’une ou plusieurs séquences d’acide nucléique chacune associée à une sonde de fluorescence distincte de manière à provoquer un changement d’état de la sonde de fluorescence de l’état non modifié vers l’état modifié lorsqu’elles interagissent. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l’opération b) comprend la réalisation de cycles PCR, et les au moins deux sondes de fluorescence sont choisies parmi le groupe comprenant les sondes TaqMan, les balises moléculaires, les sondes duales à transfert de fluorescence, les sondes Scorpion, les sondes Amplifluor, les sondes MGB Eclipse, les sondes LUX, les sondes QUASR et les sondes QZyme. Procédé selon la revendication 9 ou 10, dans lequel l’opération b) comprend l’utilisation d’un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprenant trois sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant. Procédé selon l’une des revendications 9 à 11, dans lequel l’opération b) comprend l’utilisation d’un réactif d’amplification d’acides nucléiques in vitro comprenant au moins deux groupes de sondes de fluorescence combinant un quencher et un fluorophore, lesdites sondes de fluorescence étant agencées pour chacune cibler une séquence d’acide nucléique distincte et lesdits fluorophores présentant des plages de longueurs d’onde de fluorescence se chevauchant au sein de chaque groupe de sondes de fluorescence. Procédé selon l’une des revendications 9 à 12, dans lequel l’opération c) comprend la résolution d’un système matriciel basé sur les mesures de fluorescence, les signatures temporelles et la constance de la concentration respective de chaque sonde de fluorescence. Procédé selon les revendications 12 et 13, dans lequel l’opération c) comprend la résolution d’un système matriciel par groupe de sondes de fluorescence. Procédé selon l’une des revendications 9 à 13, dans lequel l’opération c) comprend l’application d’une descente de gradient ou l’utilisation d’un réseau de neurones.