INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
- R et R’’ représente chacun, indépendamment l’un de l’autre, un radical alkyle, un radical cycloalkyle, un radical aryle, un radical hétéroaryle, de préférence un radical alkyle ;
- R’ représente un hydrogène.
Le sel de formule (V-1) est de préférence l’acétate de cuivre.
Le complexe de cuivre de formule (V-2) est de préférence l’acétylacétonate de cuivre.
La teneur totale en complexe(s) métallique(s) de formule (V-2) peut aller de 0 ppm à 3 000 ppm en poids, de préférence de 10 ppm à 2 000 ppm en poids, préférentiellement de 200 ppm à 2 000 ppm en poids, encore plus préférentiellement de 500 ppm à 1 500 ppm en poids par rapport au poids total de la composition bicomposante réticulable.
Composant B Composé dihydropyridine de formules (VI) à (X) Le composant B comprend au moins un composé dihydropyridine ayant l’une des formules (VI) à (X) telles que définies ci-dessus.
Le composé dihydropyridine peut être choisi parmi ceux de formules (VI) à (X) dans lesquelles :
R 11 représente un aryle ou hétéroaryle, lesdits aryle ou hétéroaryle étant éventuellement substitués, et de R 5 à R 10 représente, indépendamment les uns des autres, un hydrogène, un alkyle, un alcényle, un alcynyle, un cycloalkyle, un hétérocycloalkyle, un hétéroaryle, un aryle, un alkylaryle, un arylalkyle,
R 5 à R 10 représentant de préférence indépendamment l’un de l’autre, un hydrogène ou un alkyle.
où R1, R2 et R3 sont choisis indépendamment les uns des autres parmi un hydrogène, un groupe OH ou OCH3 ; et R4 est un groupe CH3 ou aryle.
De préférence, la souche de Pseudomonas putida selon la présente divulgation exprime un gène recombinant codant une benzalacétone réductase capable de produire efficacement un phénylbutanone ou dérivé de phénylbutanone de formule (I), de préférence choisi parmi le groupe consistant en: la 4-(4-hydroxy-3-méthoxyphényl)butan-2-one (zingérone), 4-phénylbutan-2-one (benzylacétone), 4-(4-hydroxyphényl)-2-butanone (frambinone), 1-(3,4-Dihydroxyphényl)butan-2-one, 1-(3,4-Diméthoxyphényl)butan-2-one), 4-(4-méthoxyphényl)-2-butanone (Anisylacétone), 1,3-diphénylpropan-1-one ; dihydrochalcone, 1-(2,4-dihydroxy-6-methoxyphenyl)-3-phenylpropan-1-one ; (uvangoletin) et 4-3,4,5-triméthoxyphényl)butan-2-one, plus particulièrement la frambinone ou la zingérone.
Selon un mode particulier de la demande, la souche de Pseudomonas putida telle que décrite précédemment est capable de surproduire un phénylbutanone ou un dérivé de phénylbutanone de formule (I), de préférence choisi parmi le groupe consistant en: la 4-(4-hydroxy-3-méthoxyphényl)butan-2-one (zingérone), 4-phénylbutan-2-one (benzylacétone), 4-(4-hydroxyphényl)-2-butanone (frambinone), 1-(3,4-Dihydroxyphényl)butan-2-one, 1-(3,4-Diméthoxyphényl)butan-2-one), 4-(4-méthoxyphényl)-2-butanone (Anisylacétone), 1,3-diphénylpropan-1-one ; dihydrochalcone, 1-(2,4-dihydroxy-6-methoxyphenyl)-3-phenylpropan-1-one ; (uvangoletin) et 4-3,4,5-triméthoxyphényl)butan-2-one, plus particulièrement la frambinone ou la zingérone.
De préférence, la souche de Pseudomonas putida selon la présente divulgation est capable de surproduire une frambinone à partir du HBA ou de la zingérone à partir du 4-(4-Hydroxy-3-méthoxyphényl)-3-butèn-2-one.
On entend par « souche surproductrice de phénylbutanone ou un dérivé de phénylbutanone » au sens de la présente divulgation, une souche modifiée de Pseudomonas putida capable de produire un phénylbutanone ou un dérivé de phénylbutanone tel que décrit précédemment, de préférence la frambinone ou la zingérone en quantité supérieure par rapport à une souche Pseudomonas putida sauvage.
De préférence, la souche surproductrice de phénylbutanone ou de dérivé de phénylbutanone selon la présente divulgation est capable de produire 2, 3, 4, 5 ou 6 fois plus d’un phénylbutanone ou un dérivé de phénylbutanone (e.g. la frambinone ou zingérone) par rapport à une souche Pseudomonas putida sauvage comme indiqué dans les exemples.
De préférence, la souche surproductrice de phénylbutanone ou un dérivé de phénylbutanone selon la présente divulgation est capable de convertir la totalité du phénylbutèn-2-one synthétisé in situ ou ajouté au milieu de culture, en phénylbutanone ou un dérivé de phénylbutanone de formule (I), de préférence de convertir la totalité du HBA en frambinone ou de convertir la totalité de 4-(4-Hydroxy-3-méthoxyphényl)-3-butèn-2-one en zingérone.
Selon un mode particulier, la souche selon la présente divulgation est capable de produire un phénylbutanone ou un dérivé de phénylbutanone de formule (I) en ajoutant le substrat correspondant lors de la culture de la souche.
Selon un autre mode de réalisation particulier, la souche selon la présente demande est capable de produire elle-même le substrat du phénylbutanone ou du dérivé de phénylbutanone (synthèse in situ ). La souche peut ainsi comprendre en outre au moins un gène recombinant additionnel permettant la synthèse du substrat du phénylbutanone ou d’un dérivé de phénylbtanone de formule (I), de préférence permettant la synthèse du substrat de la frambinone tel que le HBA ou un des produits intermédiaires.
Par l’expression « gène recombinant additionnel », on entend au sens de la présente invention tout gène recombinant présent dans la souche Pseudomonas putida en plus du gène recombinant codant pour une benzalacétone réductase telle que définie précédemment.
Le gène recombinant additionnel peut résulter de l’insertion d’un promoteur hétérologue, par exemple un promoteur fort pour surexprimer un gène endogène de Pseudomonas putida , ou une séquence codante recombinante codant pour une protéine non naturellement exprimée chez Pseudomonas putida .
Selon un mode de réalisation particulier, la souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène recombinant additionnel codant pour un polypeptide à activité tyrosine ammonia lyase (TAL). Un gène recombinant codant la TAL peut provenir du microorganisme Rhodotorula glutinis et être optimisé selon la référence Zhou et al., Appl Microbiol Biotechnol. 2016 Dec;100(24):10443-10452 (trois mutations ponctuelles de cette enzyme TAL la rende plus efficace : S9N ; A11T ; E518V). Cette enzyme TAL est appelée TAL_rg_opt. En particulier, la souche modifiée peut comprendre un gène recombinant codant pour une tyrosine ammonia lyase (TAL) (EC 4.3.1.23) dont la séquence est définie par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO : 7 (TAL_rg_opt ) ou par une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 7 et codant pour une enzyme à activité TAL.
Selon ce mode de réalisation particulier, la souche génétiquement modifiée selon l’invention est capable de convertir la tyrosine en acide coumarique par l’intermédiaire de l’enzyme TAL.
Selon un autre mode de réalisation particulier pouvant être combiné avec le précédent, la souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène recombinant additionnel codant la 4-coumarate-CoA ligase (4-CL). En particulier, la souche modifiée peut comprendre un gène recombinant codant pour une 4-CL (EC 6.2.1.12) dont la séquence est définie par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO : 8 ou par une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 8 et codant pour une enzyme à activité 4-CL.
Selon ce mode de réalisation particulier, la souche génétiquement modifiée est capable de convertir l’acide coumarique en p-coumaryl-coA par l’intermédiaire de l’enzyme 4-CL.
Selon un autre mode de réalisation particulier pouvant être combiné avec les précédents, la souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida comprend un gène recombinant additionnel codant un polypeptide à activité benzalacétone synthase (BAS). En particulier, la souche modifiée peut comprendre un gène recombinant codant pour une BAS (EC 2.3.1.212) dont la séquence est définie par la séquence d’acide aminés SEQ ID NO : 9 ou par une séquence présentant au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec la séquence SEQ ID NO : 9 et codant pour une enzyme à activité BAS.
- des bisphénol F mono- et di(méth)acrylates; et
- de leurs mélanges.
Le monomère (méth)acrylate M2 peut notamment être choisi parmi le (méth)acrylate de méthyle, le (méth)acrylate d’éthyle, le (métha)crylate de butyle, le (méth)acrylate de 2-éthylhexyle, le (méth)acrylate d’heptyle, le (méth)acrylate de 2-tert-butylheptyle, le (méth)acrylate d’octyle, le (méth)acrylate de 3-isopropylheptyle, le (méth)acrylate de nonyle, le (méth)acrylate de décyle, le (méth)acrylate d’undécyle, le (méth)acrylate de 5-méthylundécyle, le (méth)acrylate de dodécyle, le (méth)acrylate de 2-méthyldodécyle, le (méth)acrylate de tridécyle, le (méth)acrylate de 5-méthyltridécyl, le (méth)acrylate de tétradécyle, le (méth)acrylate de pentadécyle, le (méth)acrylate d’hexadécyle, le (méth)acrylate de 2-méthylhexadécyle, le (méth)acrylate d’heptadécyl, le (méth)acrylate de 5-isopropylheptadécyle, le (méth)acrylate de 4-tert-butyloctadécyle, le (méth)acrylate de 5-éthyloctadécyle, le (méth)acrylate de 3-isopropyloctadécyle, le (méth)acrylate d’octadécyle, le (méth)acrylate de nonadécyle, le (méth)acrylate d’eicosyle, le (méth)acrylate de 3-vinylcyclohexyle, le (métha)crylate de bornyle, le (méth)acrylate de 2,4,5-tri-t-butyl-3-vinylcyclohexyle, le (méth)acrylate de 2,3,4,5-tétra-t-butylcyclohexyle; le (méth)acrylate de benzyle, le (méth)acrylate de phényle, le 2-(2-éthoxyéthoxy)éthyl (méth)acrylate, le (méth)acrylate de 2-phénoxyéthyle, et leurs mélanges.
La teneur en monomère(s) (méth)acrylate M2 dans la composition bicomposante selon l’invention peut aller de 0% à 69% en poids, de préférence 0% de à 49% en poids, et encore plus préférentiellement de 0% à 24% en poids, par rapport au poids total de ladite composition.
La teneur de la somme totale du(des) monomère(s) (méth)acrylate M2 et du(des) monomère(s) M1 dans la composition bicomposante selon l’invention peut aller de 30 % à 99 % en poids, de préférence de 50% à 99 % en poids, et encore plus préférentiellement de 75% à 99 % en poids, par rapport au poids total de ladite composition.
Selon un mode de réalisation, la composition bicomposante susmentionnée ne comprend pas d’hydroxyalkyl(méth)acrylate.
Le composant B tel que défini ci-dessus peut comprendre au moins un monomère méthacrylate M1 tel que défini ci-dessus.
La composition bicomposante réticulable selon l’invention peut comprendre au moins un additif choisi dans le groupe constitué des catalyseurs, des charges, des antioxydants, des stabilisants à la lumière/ absorbeurs d’UV, des désactivateurs de métaux, des antistatiques, des agents antivoile, des agents moussants, des biocides, des plastifiants, des lubrifiants, des émulsifiants, des colorants, des pigments, des agents rhéologiques, des modificateurs d’impact, des promoteurs d’adhésion, des azurants optiques, des ignifugeants, des agents anti-suintement, des agents de nucléation, des solvants, des accélérateurs, et de leurs mélanges.
En particulier, le variant fonctionnel fait référence à un polypeptide qui a une séquence d’acide aminé qui diffère d’une des séquences choisies parmi SEQ ID NO : 1 à 6 par moins de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 substitutions, insertions ou délétions.
Dans un autre mode particulier, le variant fonctionnel fait référence à un polypeptide qui a une séquence d’acide aminé qui diffère d’une des séquences choisies parmi SEQ ID NO : 1 à 6 par moins de 50, 40, 30, 20, 10, 5, 4, 3, 2 ou 1 substitutions, les substitutions étant de préférence des substitutions conservatrices.
Le terme "substitution conservatrice", tel qu'il est utilisé ici, désigne le remplacement d'un résidu d'acide aminé par un autre, sans altérer la conformation ou l’activité enzymatique du polypeptide ainsi modifié, y compris, mais sans s'y limiter, le remplacement d'un acide aminé par un autre ayant des propriétés similaires (telles que, par exemple, la polarité, le potentiel de liaison hydrogène, l'acidité, la basicité, la forme, l'hydrophobie, l'aromaticité et autres).
Des exemples de substitutions conservatrices se trouvent dans les groupes des acides aminés basiques (arginine, lysine et histidine), des acides aminés acides (acide glutamique et acide aspartique), des acides aminés polaires (glutamine et asparagine), des acides aminés hydrophobes (méthionine, leucine, isoleucine et valine), des acides aminés aromatiques (phénylalanine, tryptophane et tyrosine) et des petits acides aminés (glycine, alanine, sérine et thréonine).
Les souches sauvages de P. putida KT2440 sont disponibles par exemple dans la Banque de souches NBRC (National Institute of Technology and Evaluation Biological Resource center https://www.nite.go.jp/en/nbrc/, NBRC100650).
De plus, des souches de Pseudomonas putida ou Pseudomonas taiwanensis optimisées pour la production de tyrosine sont connues de l’homme du métier qui pourra les utiliser comme souche de départ pour obtenir les souches génétiquement modifiées selon l’invention (Calero et al., ACS Synth Biol. 2016 Jul 15;5(7):741-53 ; Wierckx et al., Appl Environ Microbiol. 2005 Dec;71(12):8221-7, Appl Environ Microbiol. 71(12) :8221-7 ; Wynands et al., 2018 ; Otto et al. 2019, Front Bioeng Biotechnol Nov 20 ;7 :312).
Au sens de la présente description, les expressions « souche génétiquement modifiée de Pseudomonas putida » , « souche modifiée de Pseudomonas putida », « souche génétiquement modifiée », ou encore « souche modifiée » sont considérées comme synonymes les unes des autres.
En particulier, on entend par « souche génétiquement modifiée », une souche qui comprend soit (i) au moins un acide nucléique recombinant, ou transgène, intégré de manière stable dans son génome, et/ou présent sur un vecteur, par exemple un vecteur plasmidique, soit (ii) une ou plusieurs mutations non naturelles par insertion, substitution ou délétion de nucléotides, lesdites mutations étant obtenues par des techniques de transformation ou par des techniques d’édition de gènes connues de l’homme du métier. Dans un mode de réalisation particulier, une souche génétiquement modifiée est une souche ayant intégré dans son génome de manière stable au moins un acide nucléique exogène, c’est-à-dire non présent naturellement chez P. putida , par exemple un acide nucléique d’une autre espèce.
Au sens de la présente invention, on entend par « gène recombinant codant pour une benzalacétone réductase », un acide nucléique exogène comprenant au moins une partie codant une benzalacétone réductase selon l’invention telle que décrite précédemment. En plus de la région codant pour la benzalacétone réductase, le gène recombinant peut être sous contrôle d’un promoteur permettant son expression dans la souche, de préférence un promoteur permettant son expression dans la souche P. putida .
Dans un mode particulier de réalisation, l’acide nucléique codant pour une des benzalacétone réductases telles que décrites précédemment est choisie parmi une des séquences SEQ ID NO : 13 to 18, ou une séquence présentant au moins au moins 80%, 85%, 90%, 95% et tout particulièrement, au moins 98% d’identité avec une des séquences choisies parmi les séquences SEQ ID NO : 13 à 18.
Dans un mode de réalisation, qui peut être combiné aux précédents, le gène recombinant codant la benzalacétone réductase telle que décrit précédemment est placée sous le contrôle d’un promoteur hétérologue, en particulier un promoteur constitutif ou inductible, par exemple choisi parmi les promoteurs ptrc, xyls/pm ou araC/pBAD, qui permet de surexprimer le gène recombinant codant la benzalacétone réductase dans la souche génétiquement modifiée selon l’invention.
Les techniques de modifications génétiques par transformation, mutagenèse ou édition de gènes sont bien connues de l’homme du métier et sont décrites par exemple dans « Molecular cloning : a laboratory manual », J. Sambrook, ed. Cold Spring Harbor, « Strategies used for genetically modifying bacterial genome: site-directed mutagenesis, gene inactivation », Journal of Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol) 2016 17(2):83-99., et dans Martinez-Garcia et de Lorenzo, « Pseudomonas putida in the quest of programmable chemistry », Current Opinion in Biotechnology, 59 :111-121, 2019.
Dans un mode de réalisation, une souche génétiquement modifiée peut comprendre un acide nucléique modifiant l’expression, de préférence surexprimant l’expression d’un ou plusieurs gènes naturellement exprimés chez Pseudomonas putida , en particulier surexprimant l’expression de la curcumine/dihydrocurcumine réductase NADPH dépendante (CurA) de Pseudomonas putida (Uniprot Q88K17) définie par la séquence SEQ ID NO : 3.
La surexpression d’un gène s’entend comme une expression supérieure dudit gène dans une souche génétiquement modifiée par rapport à la même souche dans laquelle le gène est exprimée uniquement sous contrôle du promoteur naturel. La surexpression peut être obtenue en insérant une ou plusieurs copies du gène directement dans le génome de la souche, de préférence sous la dépendance d’un promoteur fort, ou également par clonage dans des plasmides, en particulier des plasmides multicopies, de préférence également sous la dépendance d’un promoteur fort.
Dans un autre mode particulier, une souche génétiquement modifiée peut comprendre un acide nucléique codant une ou plusieurs enzymes non naturellement exprimée chez Pseudomonas putida .
De manière tout à fait avantageuse, la Demanderesse a développé une souche de Pseudomonas putida capable d’exprimer une benzalacétone réductase et de produire efficacement un phénylbutanone ou dérivé de phénylbutanone de formule (I):
La tyrosine est le précurseur de l’acide coumarique qui est métabolisé en frambinone en trois étapes.
Selon la première étape, la tyrosine est désaminée par une tyrosine ammonia lyase (TAL, EC 4.3.1.23) pour former de l'acide coumarique. Catalysée par une 4- coumarate:CoA ligase (4CL, EC 6.2.1.12), une molécule de Coenzyme A (CoA) est greffée sur l'acide coumarique. Le coumaroyl-CoA est alors converti par une benzalacétone synthase (BAS, EC 2.3.1.212) en 4-hydroxy benzalacétone. Cette réaction est une condensation décarboxylative et utilise une unité de malonyl-CoA en tant que co-substrat. L'étape finale est la réduction du 4-hydroxy benzalacétone en frambinone par une benzalacétone réductase.
Cette dernière étape implique une réduction de la double liaison d’une cétone a-b insaturée en cétone qui peut être catalysée par une enzyme appartenant à la famille des oxydoréductase, NADPH déshydrogénase (EC 1.6.99.1) spécifiquement appelée benzalacétone réductase ou BAR. La benzalacetone réductase appartient à la famille des enzymes MDR (medium chain dehydrogenase/reductase leukotriene B4 dehydrogenase subfamily).
Il existe dans cette famille plusieurs sous-classes, étudiées pour la production de produits pharmaceutiques, chimiques ou agrochimiques, avec différents degrés de sélectivités. Parmi celles-ci, les enzymes de la famille des Old Yellow Enzymes sont les plus décrites, sans toutefois que leurs fonctions physiologiques n’aient été jusqu’à présent bien étudiées.
La BAR de Rubus idaeus (framboisier) qui porte le nom en anglais de « Raspberry Ketone/Zingerone Synthase » (RKS ou RZS) a été caractérisée par une équipe japonaise en 2011 (Koekuda et al., Biochem Biophys Res Commun. 2011 Aug 19;412(1):104-8). La RZS est une enzyme de 37 kDa et seule l’isoforme 1 a été montrée comme active sur le précurseur naturel de la frambinone, le 4-hydroxybenzalacétone (HBA).
La production de frambinone a été réalisée chez E. coli et S. Cerevisiae (Beekwilder et al., Biotechnol J. 2007 Oct;2(10):1270-9 ; Lee et al., Microb Cell Fact. 2016 Mar 4; 15:49). Dans ces études, la dernière étape de réduction du 4-hydroxy benzalacétone en frambinone est endogène et les enzymes responsables de cette réaction n’ont pas été identifiées. La biosynthèse de la frambinone conduit alors à un mélange de frambinone et de son précurseur avec un rendement de production faible qui n’est particulièrement pas adaptée à une production à grande échelle. Ainsi, le rendement de production de frambinone doit être amélioré.
Moore et al. ont développé une plateforme in vitro acellulaire de production de frambinone utilisant la RKS du framboisier Rubus idaeus (Moore et al., 2017 ; doi: https://doi.org/10.1101/202341). La synthèse de la frambinone a également été étudiée dans E. coli , en exprimant la BAS de R. palmatum et la RKS du framboisier (Wang et al. Appl Microbiol Biotechnol 103, 3715–3725, 2019).
Récemment, l’enzyme CurA (curcumin/dihydrocurcumin réductase, NADPH dépendante) d’ E.coli a été utilisée pour catalyser la dernière étape de synthèse de la frambinone dans Corynebacterium glutamicum (Milke et al. Microb Cell Fact (2020) 19:92) . Cette enzyme a été identifiée comme étant une BAR, par similarité de structure de son substrat avec la frambinone (Hassaninasab A, et al. Proc Natl Acad Sci. 2011;108:6615–20). Bien que la réductase CurA d’ E. coli présente une bonne activité pour la production de FBO dans la bactérie Corynebacterium glutamicum , la réaction reste incomplète après 72h de culture avec 500 mg/L d’HBA .
Problème technique Peu d’enzymes capables de catalyser la dernière étape de réduction du 4-hydroxy benzalacétone en frambinone ont été caractérisées. Ces enzymes ont été essentiellement étudiées dans les souches E. coli et S. Cerevisiae . Cependant, ces souches ne tolèrent pas bien la toxicité des composés phénylpropanoïdes et ne sont donc pas les microorganismes les mieux adaptés pour leur production.
Ainsi, il existe un besoin particulier de caractériser les enzymes capables de catalyser la dernière étape de réduction du phénylbutèn-2-one en phénylbutanone ou un dérivé de phénylbutanone, en particulier 4-(4-hydroxyphényl)-but-3-en-2-one (HBA) en frambinone et de développer de nouvelles souches de microorganismes permettant la production efficace de composés phénylpropanoïdes.
Les bactéries du genre Pseudomonas semblent être plus tolérantes à ces molécules hautement toxiques, notamment la bactérie Pseudomonas putida (Calero et al., Biotechnol Bioeng. 2018 Mar;115(3):762-774). En revanche, les enzymes impliquées dans la production d’acides aminés aromatiques chez P. putida sont peu décrites et aucune enzyme capable de catalyser la réaction de réduction de l’hydroxybenzalacétone en frambinone chez P. putida n’a été caractérisée.
Le développement d’enzymes réductases efficaces pour l’hydroxylation de double liaison en alpha d’une cétone et permettant la production de composés aromatiques comme la frambinone au sein de microorganismes tolérant la synthèse de phénylpropanoïdes est donc crucial.
Résumé Les inventeurs dans la présente divulgation ont identifié et caractérisé des enzymes capables de catalyser cette réaction de manière efficace dans Pseudomonas putida et de permettre la conversion complète de la HBA en frambinone conduisant à une production efficace de la frambinone.