INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Exemple : Le principe de l’invention est démontré sur des échantillons de bactéries "Bacillus subtillis (ci-après Bs)" qui existent sous forme de bactéries végétatives (forme active) ou de spores plus résistantes (forme dormante).
Il est connu que les spores et les bactéries végétatives ne sont pas du tout égales face au traitement thermique. Ce traitement est même utilisé pour éliminer toute trace de bactéries dans les spores.
Pour vérifier les principes de l'invention, deux échantillons ont donc été utilisés :
Un premier échantillon ne comportant que des spores de Bs ; Un deuxième échantillon ne comportant que la forme végétative (active) de Bs ;
Pour chacun des deux échantillons, les étapes sont alors les suivantes :
L'échantillon est divisé en deux parties, première partie A et deuxième partie B, de 0.5mL chacun. La première partie A de l'échantillon ne subit aucun traitement ou au plus un traitement doux sans aucun effet sur les espèces biologiques cibles présentes. La deuxième partie B de l'échantillon subit un traitement actif sous la forme d'un traitement thermique. Un chauffage de l'échantillon est mené à 80°C pendant 10 minutes. Les deux parties de l'échantillon sont injectés dans deux composants micro-fluidiques distincts. Dans chacun des deux composants micro-fluidiques, on effectue une lyse des espèces biologiques présentes dans l'espace inférieur de la chambre. Dans chacun des composants micro-fluidiques, élution à l'aide d'un mix qPCR (25µL) Mise en détection de type PCR des deux éluats pour obtenir les deux quantités d'espèces biologiques cibles, Q1 et Q2 pour chacune des deux parties de l'échantillon. Analyse des résultats selon le principe déjà décrit ci-dessus.
Les résultats obtenus sont résumés dans le tableau ci-dessous : Partie A Partie B Conclusion Sans traitement Traitement actif Echantillon n°1 Ct qPCR* 25,2 Non présente 100% de formes actives Quantité 10080 0 Estimation à 10000 Bs/500µl Echantillon n°2 Ct qPCR* 30,2 32,0 1/3 de formes dormantes et 2/3 de formes actives Quantité 346 102 Estimation à 350 Bs/500µl
*Ct=cycle de seuil qPCR.
Dans l'échantillon n°1, on constate donc que les bactéries ont été cassées par le traitement thermique, les molécules d'ADN n’ont pas été retenues dans le composant micro-fluidique ce qui explique que la détection soit négative. On en conclut que l’échantillon n°1 de 10 000 bactéries Bs/500µL est constitué uniquement de l'espèces biologique Bs sous sa forme végétative (active).
Pour l’échantillon n°2, on obtient au total 350bS/500µL environ et on constate après traitement thermique que la quantité présente a fortement baissé. On en conclut donc que 2/3 des espèces biologiques Bs étaient présentes sous la forme végétative (active) dans cette échantillon n°2.
En résumé, l'invention présente ainsi de nombreux avantages parmi lesquels :
Le principe de détection est simple à mettre en œuvre, ne nécessitant pas de matériel encombrant ; Il utilise des méthodes classiques de détection ; Il est particulièrement fiable et ne nécessite pas l'exécution de modèles mathématiques complexes ; Il est facilement adaptable à différents types d'espèces biologiques ;
Dans son principe, le système de l’invention comporte une régulation thermique du volume interne de l’enceinte climatique par mise en série/cascade de deux moyens de régulation thermique : un premier, dit dispositif de régulation thermique primaire et un second, dit circuit de régulation thermique secondaire.
Grâce au circuit de régulation thermique secondaire, il est possible de chauffer ou refroidir le dispositif de régulation thermique primaire, ce qui permet d’augmenter la plage de température atteignable dans l’enceinte climatique ainsi que la puissance thermique disponible.
Le dispositif de régulation thermique primaire, qui est statique dans son fonctionnement propre, met en œuvre au moins un ensemble thermoélectrique pour pouvoir contrôler la température à l’intérieur de l’enceinte climatique. A cette fin, au moins un capteur de température est disposé dans l’enceinte climatique. La face interne de chaque ensemble est disposée à l’intérieur de l’enceinte climatique et la face externe de chaque ensemble est disposée à l’extérieur de l’enceinte climatique. De préférence, la face interne est la face froide et le sens du courant traversant l’ensemble thermoélectrique est donc imposé par le fait que la face froide, celle qui « aspire » les calories, est du côté interne de/dans l’enceinte climatique. Dans certaines variantes de fonctionnement, la face interne peut devenir une face chaude ou une face froide par inversion de la polarité du courant traversant le/les ensembles thermoélectriques.
Dans la description qui suit, on décrit prioritairement une enceinte climatique mobile car installée dans un simulateur de mouvements et avec un dispositif de régulation thermique primaire dont la face interne du/des ensembles thermoélectriques est une face froide.
L’enceinte climatique est solidaire du simulateur de mouvements et elle est donc mobile selon les mouvements des articulations du simulateur, typiquement selon des axes de rotation et/ou de translation, et en fonction de la manière dont elles sont commandées. Le simulateur de mouvements est typiquement multiaxes.
L’enceinte climatique est remplie d’un gaz. Ce gaz peut être de l’air, air ambient, ou un ou plusieurs gaz spécifiques autres que l’air. L’enceinte climatique qui peut être ouverte, notamment pour la mise en place de l’équipement, et refermée, isole thermiquement l’intérieur de l’enceinte par rapport à l’environnement extérieur. L’intérieur de l’enceinte climatique peut être étanche à l’air et aux gaz et peut pouvoir supporter une dépression ou une surpression par rapport à l’extérieur notamment pour des tests supplémentaires de (dé)pression sur l’équipement. Une enceinte climatique étanche peut aussi permettre l’introduction de gaz spécifique(s), par exemple azote ou argon, pour des tests supplémentaires d’étanchéité de l’équipement en lui-même, notamment à la recherche de fuites ou de risques de contamination dans l’équipement.
Dans d’autres modalités de mise en œuvre, l’enceinte climatique n’est pas prévue pour être étanche à la surpression et à la dépression, les échanges gazeux entre l’intérieur et l’extérieur à l’équilibre des pressions entre l’intérieur et l’extérieur étant toutefois réduits et dans un tel cas, le gaz interne est typiquement de l’air et il est à la pression atmosphérique de l’environnement.
La face froide de chaque ensemble thermoélectrique 10, qui est sur la la face interne 11, comporte une surface d’échange de chaleur qui est de préférence étendue par la présence d’un radiateur 1. Les échanges de chaleur à l’intérieur de l’enceinte climatique 3 sont de préférence favorisés par un dispositif de brassage du gaz 2 interne à l’enceinte climatique 3, typiquement au moins un ventilateur soufflant ou aspirant sur la surface d’échange. Une convexion forcée est donc mise en œuvre dans l’enceinte climatique 3. Le radiateur 1 est un dissipateur thermique du type utilisé pour le refroidissement des composants de puissance en électronique, par exemple un radiateur à ailettes.
La face chaude de l’ensemble thermoélectrique 10, celle qui « rejette » les calories « aspirées » par la face froide, est disposée à l’extérieur de l’enceinte climatique et correspond à la face externe 14 de l’ensemble thermoélectrique 10.
Chaque ensemble thermoélectrique est donc disposé traversants de la paroi de l’enceinte climatique et en évitant de créer un pont thermique entre l’intérieur et l’extérieur de l’enceinte climatique.
L’alimentation électrique du/des ensembles thermoélectriques passe par les articulations du simulateur de mouvements et met en œuvre des liaisons électriques à contacts ou collecteurs, par exemple tournants ou glissants, ou une transmission d’énergie électrique sans contact par induction ou tout autre moyen adéquat.
Il est avantageux de mettre en œuvre plusieurs ensembles thermoélectriques et de câbler les ensembles thermoélectriques en série pour augmenter la tension d’alimentation et ainsi réduire le courant électrique circulant, limitant ainsi l’usure des collecteurs tournants électriques disposés dans les articulations du simulateur de mouvements et le bruit CEM pouvant être généré. On peut aussi par un câblage adapté entre les ensembles thermoélectriques et en utilisant des moyens de pilotage individuels adressables individuellement, un pour chaque ensemble thermoélectrique, réduire le nombre total de liaisons électriques nécessaires, par exemple deux pour un bus d’alimentation de puissance et une pour une liaison de données. Les données peuvent comporter des instructions adressées envoyées aux moyens de pilotage individuels et des mesures de capteurs avec identifiants, les capteurs étant disposés dans le simulateur de mouvement et en particulier dans l’enceinte climatique.
Dans la modalité préférée de mise en œuvre qui est à plusieurs ensembles thermoélectrique, il est mis en œuvre un contrôle individuel et indépendant de la puissance de chaque ensemble thermoélectrique, basé sur la température de chaque face froide individuellement dans l’enceinte climatique. Dans un tel cas, chaque ensemble thermoélectrique comporte son propre capteur de température de face froide et sa propre régulation de courant.
Dans d’autres modalités de mise en œuvre, le contrôle de la puissance des ensembles thermoélectrique se fait globalement pour tous les ensembles thermoélectrique, un seul capteur de température de face interne ou plusieurs capteurs de température avec moyennage des mesures de faces internes étant mis en œuvre et le courant pour tous les ensembles thermoélectrique qui sont donc régulés globalement.
Si un ensemble thermoélectrique est constitué de plusieurs éléments thermoélectriques, il n’y a pas de régulation individuelle de chaque élément (pas de capteur + régulation de courant d’élément), la régulation se faisant sur l‘ensemble thermoélectrique dans sa globalité, et de préférence individuellement (une régulation par ensemble) dans le cas de la mise en œuvre de plusieurs ensembles thermoélectrique dans le système.
Concernant les faces externes des ensembles thermoélectriques dans un système à plusieurs ensembles thermoélectriques, elles sont en parallèle sur le circuit de régulation thermique secondaire.
Le dispositif 1 comporte une chambre 13 ménagée dans le boîtier. Cette chambre représente l’emplacement dans lequel peuvent être effectuées à la fois la purification/concentration et la détection des espèces biologiques cibles. La chambre 13 est fermée vers le bas par la paroi inférieure du boîtier.
Le composant micro-fluidique comporte un premier canal 14 ménagé dans le boîtier et agencé pour injecter des fluides dans la chambre ou pour évacuer des fluides en dehors de la chambre. Le premier canal 14 comporte une première extrémité comportant une ouverture ménagée par exemple à travers la paroi supérieure 12 du boîtier et une deuxième extrémité qui débouche dans ladite chambre 13. La première extrémité du premier canal 14 est par exemple agencée verticalement et sa deuxième extrémité débouche par exemple horizontalement dans la chambre 13. La première extrémité du premier canal est par exemple évasée pour y appliquer le cône d’une pipette ou sera adaptée au type de dispositif employé pour injecter le fluide dans le dispositif. A titre d'exemple, il peut s'agir d'une ouverture présentant un embout de type "luer" pour y connecter une seringue ou adaptée pour y connecter un circuit fluidique.
Le dispositif comporte un deuxième canal 15 ménagé dans le boîtier. Ce deuxième canal 15 comporte également une première extrémité qui communique avec l’extérieur, formant une ouverture réalisée par exemple à travers la paroi supérieure du boîtier et une deuxième extrémité qui communique avec l’espace formé par la chambre 13. Par ce deuxième canal 15, on peut également injecter des fluides dans ladite chambre ou évacuer des fluides en dehors de ladite chambre. Sa première extrémité est par exemple agencée verticalement et sa deuxième extrémité horizontalement. La chambre 13 est placée entre le premier canal 14 et le deuxième canal 15. De manière identique, la première extrémité de ce deuxième canal est par exemple évasée pour y appliquer le cône d’une pipette ou sera adaptée au type de dispositif employé pour injecter le fluide dans le dispositif. A titre d'exemple, il peut s'agir d'une ouverture présentant un embout de type "luer" pour y connecter une seringue ou adaptée pour y connecter un circuit fluidique.
Vers le haut, la chambre 13 peut être fermée par une membrane 18 avantageusement souple et étirable, préférentiellement transparente. La paroi supérieure 12 du boîtier du dispositif comporte ainsi une ouverture qui est recouverte de manière hermétique par ladite membrane 18. Ladite membrane est ainsi ancrée dans le boîtier par toute solution de fixation adaptée, par exemple par collage. Cette membrane 18 sera par exemple composée d’un film, par exemple un film autocollant de type PET, d’épaisseur, de dimensions et de constitution adaptées pour se déformer de manière élastique, par rapport à ses points d’ancrage, notamment jusqu’au fond de la chambre 13.
Par le terme "transparent", on entend que le matériau employé est au moins partiellement transparent à la lumière visible, à la fluorescence ou à la luminescence, de manière à laisser passer au moins 80% de cette lumière. Il faut ainsi comprendre qu'il sera suffisamment transparent pour voir l'intérieur de la chambre 13, au moins le deuxième espace situé au-dessus du filtre 16 évoqué ci-dessous.
Le composant micro-fluidique 1 comporte un filtre 16 agencé dans ladite chambre 13 et séparant ladite chambre 13 en deux espaces. Les deux espaces sont par exemple superposés et désignés ainsi espace inférieur 130 situé sous le filtre et espace supérieur 131 situé au-dessus du filtre et sous la membrane 18. Ce filtre 16 est préférentiellement réalisé en tout ou partie sous la forme d’un film souple et fin, maintenu dans l’espace formé par la chambre de manière à ne permettre le passage d’un espace à l’autre que par les pores du filtre 16. Le film présente avantageusement une déformabilité élastique lui permettant de s’étirer lors de l’exercice d’une force d’appui dans une direction sensiblement verticale, cette déformabilité élastique ayant un niveau suffisant pour atteindre la surface inférieure de la chambre 13. Le filtre 16 présente un diamètre moyen de pores compris entre 0.2 µm et 50 µm, par exemple compris entre 0.2 µm et 1 µm pour la séparation de microorganismes. Le diamètre des pores est bien entendu adapté pour assurer une séparation entre différentes espèces biologiques présentes dans l'échantillon. Le filtre 16 sera par exemple composé d’un film d’épaisseur, de dimensions et de constitution adaptée pour se déformer jusqu’au fond de la chambre 13 par rapport à ses points d’ancrage. Selon un mode de réalisation particulier, le filtre pourra être aussi réalisé dans un matériau transparent, par exemple avec les mêmes caractéristiques de transparence que la membrane. Pour des bactéries, le filtre peut présenter un diamètre de pores allant de 0.2 à 2µm pour retenir les bactéries.
L'un des traitements actifs pouvant être appliqué à une partie de l'échantillon peut consister en une lyse des espèces biologiques présentes dans l'échantillon. En cas de lyse, le composant micro-fluidique peut avantageusement comporter une surface d’appui rugueuse 17 agencée sur le fond de la chambre 13. Cette surface d’appui rugueuse 17 s’étend sur une partie majoritaire du fond de la chambre. Elle comporte un paramètre de rugosité de surface moyen compris entre 0.01µm et 10 µm, préférentiellement compris entre 0.2 µm et 3 µm. Cette surface d’appui rugueuse 17 est destinée à permettre une lyse mécanique des espèces biologiques présentes dans l'échantillon biologique placé dans le dispositif. Préférentiellement, la lyse mécanique est réalisée en broyant lesdites espèces biologiques, par abrasion sur ladite surface d'appui rugueuse. L’opération de broyage est mise en œuvre par un mouvement de friction des espèces biologiques contre la surface d’appui rugueuse, en employant un organe de broyage adapté. Cet organe sera par exemple une spatule ou une tige, par exemple en matériau plastique ou métallique. Cet organe est appliqué depuis l’extérieur de la chambre 13 et son extrémité est appliquée contre la surface externe de la membrane 18 de manière à étirer la membrane 18 et le filtre vers le fond de la chambre et ainsi frictionner les espèces biologiques présentes dans un échantillon contre la surface d’appui rugueuse 17.
En cas de traitement actif de type thermique, le boîtier peut avantageusement intégrer des moyens de chauffage de l’espace interne de la chambre, composés par exemple d’au moins une résistance chauffante. La résistance est par exemple fixée sous la paroi inférieure du boîtier. Une source d’alimentation sera par exemple prévue pour alimenter la résistance. La source d’alimentation comportera par exemple une ou plusieurs piles électriques, fournissant suffisamment d’énergie pour chauffer la chambre à une température comprise dans la fourchette définie ci-dessus, c’est-à-dire de 20°C à 100°C. Bien entendu, d'autres moyens de chauffage pourraient être employés, comprenant par exemple une encre conductrice déposée par imprimerie ou sérigraphie sous la paroi inférieure du boîtier.
Ainsi, pour résumer, le composant micro-fluidique peut avantageusement comporter la structure "multicouches" suivante :
Optionnellement, une surface inférieure d’appui rugueuse 17, Un espace inférieur 130 de la chambre 13, situé au-dessus de la surface d’appui rugueuse 17, Un filtre 16, avantageusement souple et étirable situé au-dessus de l’espace inférieur 130, Un espace supérieur 131 de la chambre 13 situé au-dessus du filtre 16, Une membrane 18, avantageusement souple et étirable située au-dessus de l’espace supérieur 131, fermant hermétiquement la chambre et accessible depuis l’extérieur du dispositif.
La paroi inférieure du composant et la membrane peuvent être réalisés dans des matériaux transparents, notamment pour mettre en œuvre une détection par amplification biomoléculaire.
De manière non limitative, le composant micro-fluidique peut présenter les caractéristiques dimensionnelles suivantes :
Un premier canal 14 composé d'un canal d’entrée de 1mm de diamètre x 3mm de hauteur, puis d'un canal de section rectangulaire de 1mmx150µm de 3mm de long ; Une chambre 13 composée d'un espace inférieur 130 pour concentration/lyse qui présente un diamètre de 8mmx150µm de hauteur et d'un espace supérieur pour élution d'un diamètre 8mmx300µm de hauteur ; Filtre 16 de porosité adaptée à la cible à retenir (virus, levure, moisissure…), par exemple avec une porosité de 0.2 à 2 µm pour retenir les bactéries ou de 10 à 100 nm pour retenir les virus ; Un deuxième canal 15 composé d'un canal de section rectangulaire de 1mm x 150µm et de 3mm de long, puis d'un canal de 1mm de diamètre x3mm de hauteur ;
En utilisant ce composant micro-fluidique, le procédé de l'invention peut être mis en œuvre selon les deux variantes représentées sur les figures 1 et 2.
Il faut noter que le composant micro-fluidique présente notamment l'avantage d'optimiser la quantité d'espèces biologiques cibles obtenues et de les concentrer au maximum dans l'espace inférieur 130 de la chambre 13 du composant 1.
Pour les deux variantes de réalisation, un prélèvement P est d'abord effectué. Ce prélèvement peut consister par exemple en des feuilles du composé végétal ciblé ou dans tout autre prélèvement pour lequel le procédé de l'invention peut s'avérer adapter. Il peut notamment s'agir de cellules d'un être vivant ou de toute autre substance comportant des molécules ADN et susceptible de présenter des espèces biologiques sous une forme active et sous une forme dormante.
Dans le cas d'un traitement thermique, il s'agira de chauffer la deuxième partie B de l'échantillon à une température suffisante et pendant une durée suffisante pour casser les molécules d'ADN de la forme active F2 de l'espèce biologique cible, tout en conservant intactes celles de l'espèce biologique dans sa forme dormante F1.
Dans le cas d'un traitement optique, il s'agit d'éclairer la deuxième partie B de l'échantillon avec un signal lumineux à une longueur d'onde données, à une intensité donnée et pendant une durée suffisante pour casser les molécules d'ADN de la forme active F2 de l'espèce biologique, tout en conservant intactes celles de l'espèce biologique dans sa forme dormante F1.
Dans le cas d'un traitement mécanique, il s'agira d'appliquer une pression mécanique suffisante sur les espèces biologiques de la deuxième partie B de l'échantillon, par exemple en effectuant une lyse, pour casser les molécules d'ADN de la forme active F2 de l'espèce biologique, tout en conservant intactes celles de la forme dormante F1 de l'espèce biologique.
E4 : La première partie A de l'échantillon traité est injecté dans le premier composant micro-fluidique par son premier canal. Les espèces biologiques présentes dans cette première partie d'échantillon restent piégées dans l'espace inférieur 130 de la chambre 13 du composant micro-fluidique, permettant ainsi leur concentration.
Elles sont ensuite avantageusement purifiées par injection d'un liquide tampon par le premier canal du composant, ce liquide traverse la chambre 13 et le filtre 16 et est ensuite évacué via le deuxième canal 15.
E5 : La deuxième partie B de l'échantillon traitée est injectée dans le deuxième composant micro-fluidique par son premier canal14.
Comme indiqué ci-dessus, si l'espèce biologique est initialement présente dans sa forme active, les molécules d'ADN F2' cassées lors de l'étape de traitement actif ne sont pas retenues par le filtre 16 du composant lors de l'étape de purification. Elles sont donc évacuées par élution en passant à travers le filtre 16 puis par le deuxième canal 15 du composant micro-fluidique.
Les autres espèces biologiques présentes dans cette deuxième partie B de l'échantillon restent piégées dans l'espace inférieur 130 de la chambre 13 du composant micro-fluidique, permettant ainsi leur concentration.
Les espèces biologiques restantes sont ensuite avantageusement purifiées par injection d'un liquide tampon par le premier canal du composant, ce liquide traverse la chambre et le filtre 16 et est ensuite évacué via le deuxième canal 15.
E6 : Il s'agit d'une étape de détection par amplification biomoléculaire afin de quantifier les espèces biologiques cibles présentes dans la première partie A de l'échantillon biologique. Cette étape est avantageusement mise en œuvre directement dans le composant micro-fluidique.
E7 : Il s'agit d'une étape de détection par amplification biomoléculaire afin de quantifier les espèces biologiques cibles présentes dans la deuxième partie B de l'échantillon biologique. Cette étape est avantageusement mise en œuvre directement dans le composant micro-fluidique.
E8/E9 : Il s'agit de l'étape de traitement des résultats obtenus. Il s'agit en effet de comparer la quantité Q1 d'espèces biologiques obtenue dans la première partie de l'échantillon et la quantité Q2 d'espèces biologiques obtenue dans la deuxième partie de l'échantillon.
Si Q1 et Q2 sont négatifs : on en déduit que l’espèce biologique recherchée est absente de l'échantillon de départ.
Si Q1=Q2 : On en déduit que l'espèce biologique ciblée est bien présente mais qu'elle n'est présente que sous sa forme dormante F1 dans l'échantillon de départ. Si la forme active F2 avait été présente, le traitement actif T2 réalisé sur la deuxième partie de l'échantillon aurait dû permettre de l'éliminer et les deux quantités Q1, Q2 déterminées seraient alors distinctes.
Si Q1>0 et Q2<Q1 : Cela signifie que l'espèce biologique est présente sous sa forme active F2 dans l'échantillon ECH de départ. En effet, le traitement actif T2 a permis de casser les molécules d'ADN de la forme active de l'espèce biologique, celles-ci (référence F2') ont été évacuées du composant micro-fluidique 1 car non retenues par le filtre 16. La quantité Q2 d'espèces biologiques présentes dans la deuxième partie B de l'échantillon est donc plus faible que la quantité Q1 d'espèces biologiques présentes dans la première partie A de l'échantillon.