INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le protocole opératoire la culture et le traitement des lymphocytes Th17 est décrit en suivant. Des lymphocytes T (LT) naïfs sont isolés à partir de cellules mononucléées du sang périphérique. Ils sont ensemencés dans des plaques pré-coatées avec un anticorps anti-CD3 contenant du milieu spécifique. Un mix permettant la différenciation des LT naïfs en LTh17 est ajouté. Les cellules sont ensuite incubées à 37°C. Après plusieurs jours, le milieu de culture est éliminé et remplacé par un milieu contenant le mix de différenciation en présence ou non du principe actif selon l’invention (0,0015% ou 0,0060%). Le lendemain, les surnageants de culture des cellules sont récupérés et stockés à -80°C.
La sécrétion d’IL-17 a été évaluée par la technique ELISA. Les résultats de l’effet sur les lymphocytes Th17 sont présentés dans le tableau 24 (valeurs moyennes de la sécrétion d’IL-17 par les lymphocytes Th17).
Lymphocytes Th17 Sécrétion d’IL-17 Témoin Invention (ex2) 0,0015% Invention (ex2) 0,0060% Moyenne (pg/mL) 1 538 1 118 949 Ecart-type 389 362 330 Variationde la sécrétion d’IL-17 -27% -38%
On constate que testé à 0,0060% sur des lymphocytes Th17, le principe actif selon l’invention inhibe significativement la sécrétion d’IL-17 de 38%. Le principe actif selon l’invention régule la biologie des LTh17 et limite ainsi l’inflammation induite par ces cellules, actrices importantes de la physiopathologie de l’acné.
IV.C3. Etude de l’efficacité du principe actif selon l’invention sur l’inflammation sébocytaire
C. acnes induit une réponse inflammatoire au niveau des sébocytes. Ces derniers produisent alors de nombreux médiateurs (IL-6, IL-8…) qui contribuent à la réaction inflammatoire observée dans les lésions d’acné. Par ailleurs, le rôle pathogène de la substance P comme neuromédiateur de l’inflammation dans l’acné est à ce jour bien décrit dans la littérature.
L’inflammation sébocytaire a été étudiée en analysant la sécrétion d’IL-6 et d’IL-8 par des sébocytes soumis à une exposition bactérienne ( C. acn es phylotype IA1) et à une influence neuronale (substance P).
Le protocole opératoire la culture et le traitement des sébocytes humains est décrit en suivant. Des sébocytes humains normaux (SHN) sont ensemencés dans un milieu de culture spécifique et incubés à 37°C dans une atmosphère contenant 5% de CO 2 . Les cellules sont traitées avec une suspension de C . acnes et/ou de substance P, et le principe actif selon l’invention est appliqué à 0,0006% ou 0,0015% conjointement au traitement C. acnes +/- Substance P. Les surnageants de culture sont ensuite récupérés et stockés à -80°C.
La sécrétion d’IL-17, d’IL-6, d’IL-8 a été évaluée par la technique ELISA. Les résultats de l’effet sur l’inflammation sébocytaire sont présentés : dans le tableau 25 (synthèse d’IL-6 par les sébocytes traités par C. acnes ), dans le tableau 26 (synthèse d’IL-8 par les sébocytes traités par C. acnes ), dans le tableau 27 (synthèse d’IL-6 par les sébocytes traités par la substance P), dans le tableau 28 (synthèse d’IL-8 par les sébocytes traités par la substance P), dans le tableau 29 (synthèse d’IL-6 par les sébocytes traités par C. acnes + Substance P.) et dans le tableau 30 (synthèse d’IL-8 par les sébocytes traités par C. acnes + Substance P.).
SHN non traités SHN traités C. acnes Synthèse d’IL-6 Témoin Témoin Invention (ex2) 0,0006% Invention (ex2) 0,0015% Moyenne (pg/mL) 109 246 158 97 Ecart-type 71 99 45 36 Variation de la synthèse d’IL-6 -64% -109%
SHN non traités SHN traités C. acnes Synthèse d’IL-8 Témoin Témoin Invention (ex2) 0,0006% Invention (ex2) 0,0015% Moyenne (pg/mL) 145 349 194 91 Ecart-type 72 116 48 49 Variation de synthèse d’IL-8 / Témoin SHN traités C. acnes C. acnes -76% -126%
Le traitement par C. acnes stimule l’inflammation dans les sébocytes humains normaux. Testé à 0,0015%, le principe actif selon l’invention inhibe significativement la sécrétion d’IL-6 et d’IL-8 par les sébocytes humains de respectivement 109% et 126%.
SHN non traités SHN traités Substance P Synthèse d’IL-6 Témoin Témoin Invention (ex2) 0,0006% Invention (ex2) 0,0015% Moyenne (pg/mL) 132 198 112 75 Ecart-type Variation synthèse d’IL-6 / Témoin SHN traités substance P -130% -186%
SHN non traités SHN traités Substance P Synthèse d’IL-8 Témoin Témoin Invention (ex1) 0,0006% Invention (ex1) 0,0015% Moyenne (pg/mL) 166 244 143 91 Ecart-type Variation de synthèse d’IL-8 / Témoin SHN traités Substance P -130% -196%
Le traitement par la substance P, neuromédiateur du stress, stimule l’inflammation dans les sébocytes humains normaux.
L’activité anti-âge sur ce paramètre apparaît différente et nouvelle comparativement aux effets observés avec l’extrait selon le brevet de Pierre Fabre.
Exemple 4 : Effet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention pour inhib er les enzymes Hi stones Desacé tylases (HDACs) et Sirtuine I
L’objectif de cette étude est de démontrer l’activité inhibitrice de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention sur les enzymes HDACs et Sirtuines I. Une solution tamponnée de HDACs & Sirtuine I réagit avec un substrat pendant 20 minutes à 37°C et le transforme pour former un composé qui se colore en présence d’un développeur après incubation à 37°C pendant 10 minutes. L’activité maximum de désacétylation des Sirtuines peut ainsi être évaluée par mesure de l’absorbance à 405 nm L’extrait peregrina selon l’invention ou le produit de référence « Trichostatin A (STA) inhibiteur 1µM » sont mis en contact avec la solution de Sirtuines en même temps que le substrat de l’enzyme pendant 20 minutes à 37°C, le substrat transformé par l’enzyme est coloré par l’ajout d’un développeur. L’activité désacétylante des HDACs et Sirtuine I en présence de l’actif est alors évaluée par mesure de l’absorbance à 405 nm. La modulation de cette activité est exprimée en pourcentage d’inhibition ou d’activation de l’activité maximum des HDACs & Sirtuine I en absence d’actif, c’est-à-dire uniquement en présence du substrat des enzymes HDACs & Sirtuine I.
Protocole : Une solution d’enzymes Sirtuines est incubée dans son substrat pendant 20 mn en absence (contrôle) ou présence du produit de référence, ou de concentrations croissantes des produits à l’essai. L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention est testé aux concentrations suivantes : 2% ; 1% ; 0.1% (V/V). A la fin de la période d’incubation, l’activité des enzymes Sirtuines avec et sans produit à l’essai ou de référence a été révélée par coloration à l’aide d’une solution de développeur (10 mn à 37°C) et évaluée par mesure de l’absorbance des milieux réactionnels à 405 nm. Pour chaque concentration testée, la modulation de l’activité désacétylante des enzymes Histones Désacétysases et Sirtuines I par le produit à l’essai est calculée selon la formule suivante.
[Math. 3] Pourcentage de modulation de l’activité des enzymes Sirtuines = 100 x [(DO 4 0 5 produit à l’essai ou de référence) – (DO 4 0 5 HDACs & Sirtuine I seules)]/DO 4 0 5 Sirtuines seules.
Si le résultat est négatif, le pourcentage est exprimé en inhibition de la réaction enzymatique ; si le résultat est positif, le pourcentage est exprimé en activation de la réaction enzymatique. Les résultats de l’inhibition des enzymes Histones Desacétylases (HDACs) sont donnés ci-dessous.
Hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention pourcentage Inhibition versus Contrôle (%) 2% 15 1% ns 0.10% -18
Conclusion : A 2% L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention montre une inhibition significative des HDACs ; cette inhibition signifie la capacité de promouvoir l’autoprotection des cellules de la peau contre la dérive génétique, notamment liée au processus de vieillissement. Ainsi l’extrait apparaît être utile contre l’une des dérives génétiques les plus courantes à la surface de la peau à savoir la fibrose qui se manifeste par l’apparition de « bouton » de chair (protubérance fibrotique). L’extrait pourra avantageusement interférer avec les phénomènes de fibrose à la surface de la peau et prévenir ainsi le vieillissement de la peau.
Exemple 5 : Effet tenseur de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention .
L’objectif de cette étude est d’évaluer l’effet tenseur de l’actif hydrolysat peptidique peregrina dans un modèle in vi t r o acellulaire de disques de collagène lyophilisé. Des disques de collagène lyophilisé de 8 mm de diamètre ont été utilisés. La contraction de ces disques en réponse aux différents traitements a été mesurée par analyse d’image. Plus la surface des disques de collagène diminue, plus l’effet tenseur des actifs est important. Le produit de référence utilisé dans cette étude est l’albumine sérique bovine à 100 mg/ml.
Protocole : Des disques de collagène de 8 mm de diamètre ont été imbibés avec 40 µl d’eau ultra pure (contrôle), du produit de référence, ou de concentrations croissantes de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention : 0.05 ; 0.1 et 0.5% (v/v). L’hydrolysat peptidique peregrina a été solubilisé directement dans l’eau ultra pure. Des clichés numériques de chacun des disques ont été réalisés à l’aide d’un scanner, avant et 30 minutes après imbibition. La mesure de la surface des disques de collagène a été réalisée sur les clichés à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Les résultats de l’effet tenseur sont donnés ci-dessous.
Reduction Versus Contrôle (%) Hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention 0.5% 51.1 0.1% 38.4 0.05% ns
Conclusion : L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention montre un effet tenseur très significatif à faible concentration (moins de 1%). Ces résultats permettent de démontrer un effet « liftant » et par conséquent un effet antivieillissement à court terme.
Les exemple 2 à 5 permettent de démontrer que l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention a le profil d’un bon actif antivieillissement, à court ou long terme.
Exemple 6 : Effet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention pour inhiber l’action de l‘endothéline 1 Il a été rapporté ces dernières années que l'endothéline favorise une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium dans les mélanocytes épidermiques (cellules de mélanine) pour faciliter la croissance cellulaire à travers le système de transduction du signal intracellulaire. Cette action améliore l'activité de la tyrosinase qui est une enzyme déterminant la vitesse dans la synthèse de mélanine ( Kadono , S. et al. , 2001, The Role of the Epidermal Endothelin Cascade in the Hyperpigmentation Mechanism of Lentigo Senilis, Journal of Investigative Dermatology , 116(4): 571-577). Il a également été rapporté ( Kawahara N. et al. , 2005, About the Component of Snow Tea, Collection of Pharmaceutical, Society of Japan annual convention Subject matter, abstract 30-0823, p. 159) que l'endothéline est un facteur d'activation des mélanocytes produit par les kératinocytes épidermiques, ainsi qu'un facteur important dans la pigmentation induite par la lumière ultraviolette ou la tache sombre sénile ( Aoki , H., 2008, Recent Melanin Pigment Research, Fragrance Journal N° 338, vol. 36(9) : 14). Ces actions biologiques de l'endothéline suggèrent que des matériaux capables de supprimer l'action de l'endothéline peuvent être utiles pour réduire ou empêcher la production de mélanine ou la pigmentation.
L'endothéline est le vaso-constricteur le plus puissant connu dans le corps humain. D'un autre côté, la diminution de l'endothéline est également connue pour créer un effet vasodilatateur ( Hi r ata , Y. et al. , 1988, Cellular mechanism of action by a novel vasoconstrictor endothelin in cultured rat vascular smooth muscle cells, Biochemical and Biophysical Research Communications , 154(3) : 868-875 ; Shalinkumar P. et al. , 2008, H2S Mediates the Vasodilator Effect of Endothelin-1 in the Cerebral Circulation. American Journal of Physiology. Heart Circulatory Physiology , 315, p. 1759-1764).
Protocole : Les kératinocytes humains normaux sont isolés à partir de prépuces et mis en culture dans les plaques 24 et 96 puits selon les procédures internes.
Il s'agit de laisser agir les échantillons à des concentrations définies sur les kératinocytes à 80% de confluence pendant 48 heures, puis de quantifier les ZAG à l’aide du kit ELISA dans les surnageants cellulaires.
Un test préalable de viabilité est réalisé pour définir les doses non-toxiques à utiliser lors de dosage des ZAG.
Le contrôle négatif est réalisé à l'aide des cellules en milieu de culture sans traitement.
Le contrôle positif pour le test de viabilité est le SDS à 0.5%.
Toutes les conditions sont préparées dans des milieux de culture, et les cellules sont ensuite incubées à 36.5°C / 5% CO2 pendant 24 heures pour le test de viabilité et 48 heures pour le dosage des ZAG. Application des solutions à tester sur les kératinocytes : Les produits à tester sont mis en contact avec les kératinocytes en sub-confluence dans les plaques 24 et 96 puits. Pour chaque concentration, le test est réalisé sur 3 puits. Les plaques sont incubées pendant 24 heures et 48 heures à 36.5°C / 5% CO2. Test de viabilité : La viabilité cellulaire est évaluée par la méthode MTT sur les cellules après incubation avec les produits. Après 24 et 48 heures d'incubation, les puits prévus sont rincés 1 fois avec 200µL de PBS. Dans chaque puits 50 µl de solution de MTT à 0,5 mg/ml sont ajoutés : incubation pendant 3 heures à 36.5°C / 5% CO2. Dans chaque puits 100 µl d'isopropanol sont ajoutés. Après homogénéisation, une lecture de l'absorbance est réalisée à 550 nm. Pour chaque condition, le rapport de la moyenne des densités optiques des cellules sur la moyenne des densités optiques des contrôles négatifs déterminera le taux de viabilité. Dosage des protéines ZAG : Après 48 heures d’incubation, tous les surnageants sont récupérés et conservés à -20°C pour les dosages. Le dosage est réalisé à l’aide d’un kit ELISA. Les résultats du dosage de ZAG sont donnés ci-dessous.
Con-centration Croissance cellulaire versus contrôle (%) ZAG versus contrôle (%) ZAG versus contrôle (ng/ml) Hydrolysat peptidique peregrina 2% -17.88 +337.80 0.390 1% -12.54 +195.73 0.157 0.10% -3.88 +151.83 0.085
Conclusion : L’hydolysat peptidique peregrina peut augmenter de manière significative la production de ZAG, avec une bonne dépendance à la dose et une faible toxicité sur les cellules humaines. Il a de ce fait un effet blanchissant, un effet amincissant, un effet anti-fibrotique et un effet apaisant basé sur sa capacité à augmenter significativement la ZAG.
Exemple 9 : Effet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention pour inhiber la production de mélanine
La pigmentation de la peau est un processus complexe qui, dans l'épiderme comme dans les follicules pileux, commence par la synthèse de mélanine dans les mélanosomes à l'intérieur des mélanocytes, suivie du transfert des mélanosomes aux kératinocytes environnants, qui à leur tour transportent le pigment et éventuellement le dégrade. Chez l'homme, toute la population mélanocytaire est localisée dans les follicules pileux et dans la couche basale de l'épiderme. Quelle que soit leur localisation dans la peau, les mélanocytes ont une origine embryologique commune, la crête neurale dont ils dérivent sous forme de mélanoblastes (cellules non pigmentées). Il existe deux types de mélanine dans les cellules épidermiques, l'eumélanine, un pigment brun-noir, et la phéomélanine, un pigment jaune-rouge. Dans les mélanocytes, les eumélanosomes et les phéomélanosomes coexistent. La tyrosinase est l'enzyme clé qui régule les premières étapes de la synthèse de la phéomélanine et de l'eumélanine: la conversion de la L-tyrosine en L-3,4-dihydroxyphénylalanine (L-DOPA) et l'oxydation de ce composé en dopaquinone. À partir de la dopaquinone, les voies de synthèse diffèrent pour l'eumélanine et la phéomélanine. Le rôle principal de la mélanine est de protéger la peau des effets nocifs des rayons UV, empêchant ainsi le développement d'un cancer de la peau ( Brenner M. et al., 2008, The Protective Role of Melanin Against UV damage in human skin, Photochemistry and Photobiology 84(3): 539-549).
L’objectif est de regrouper l'ensemble des données utilisées, ainsi que les résultats obtenus, pour la réalisation du test de modulation de la mélanine sur les mélanocytes humains après exposition pendant 5 jours à l’extrait peregrina selon l’invention. Protocole : Les mélanocytes humains sont mis en culture dans les plaques 96 et 24 puits. Il s'agit de laisser agir l’extrait peregrina selon l’invention à des concentrations de 5%; 2% ; 1% et 0.1% sur les mélanocytes à confluence pendant 5 jours. Un pré-test de viabilité au MTT après 24 heures permet d’évaluer la cytotoxicité et de choisir les concentrations pour le test de modulation de la mélanine. Cette modulation est évaluée par le dosage de la mélanine dans les lysats cellulaires après 5 jours d’exposition aux extraits. Le contrôle négatif est réalisé à l'aide des cellules en milieu de culture sans traitement. Le contrôle positif pour le test de viabilité est le SDS à 0.5%. Pour le test de la modulation de la mélanine des milieux avec et sans α–MSH sont utilisés comme contrôles négatifs. Toutes les conditions sont préparées dans des milieux de culture, et les cellules sont ensuite incubées à 36.5°C / 5% CO2 pendant 24 heures pour le test de cytotoxicité et 5 jours pour le dosage de mélanine. a) Application des solutions à tester sur les mélanocytes : Les concentrations à tester sont mises en contact avec les mélanocytes en confluence dans les plaques 96 (test de cytotoxicité) et 24 (dosage de mélanine) puits. Pour chaque concentration le test est réalisé sur 3 puits. Les plaques sont incubées pendant 24 ± 1 heures et 5 jours à 36.5°C / 5% CO2. b) Test de viabilité : La viabilité cellulaire est évaluée par la méthode MTT sur les cellules après 24 heures d’incubation avec les produits. Après 24 heures d'incubation, les puits prévus sont rincés 1 fois avec 200 μL de PBS. Dans chaque puits 50 μl de solution de MTT à 0.5 mg/ml sont ajoutés et l’incubation est effectuée pendant 3 heures à 36.5°C / 5% CO2. Dans chaque puits 150 μl d'isopropanol sont ajoutés. Après homogénéisation, une lecture de l'absorbance est réalisée à 550 nm. Pour chaque condition, le rapport de la moyenne des densités optiques des cellules sur la moyenne des densités optiques des contrôles négatifs déterminera le taux de viabilité. Une valeur seuil de viabilité à 70 % par rapport à la valeur du contrôle négatif est utilisée pour classifier les substances testées comme cytotoxiques ou non cytotoxiques. Une classification « non cytotoxique » est donnée sur les résultats in vitro pour une viabilité > 70% et une classification « cytotoxique » pour une viabilité ≤ 70%. La concentration à 5% de l’extrait selon l’invention s’est montrée cytotoxique à 5% dans les conditions du test. Les concentrations 2%, 1% et 0.1% sont donc utilisées pour le test de modulation de la mélanine. La quantité de mélanine présente dans les cellules est dosée après la lyse cellulaire. Les résultats de l’inhibition de la production de mélanine sont donnés ci-dessous.
Extrait concentration Croissance cellulaire versus contrôle (%) Inhibition Mélanine versus contrôle (%) Contenu en Mélanine ( µg/ml) Hydrolysat peptidique selon l’invention 2% -24.48 +16.50 152 1,0% -17.15 +55.00 82 0.10% -18.06 +71.40 52
Conclusion : L’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention inhibe la production de mélanine in cellulo ce qui lui confère une propriété blanchissante de la peau.
Exemple 10 : Effet de l’hydrolysat peptidique peregrina selon l’invention sur la modulation du dosage de DKK1 et DKK3
L'implication des interactions entre les mélanocytes et les fibroblastes dans la régulation de la mélanogenèse est bien connue et a été étudiée de manière intensive. Bien que ces interactions ne soient pas encore parfaitement comprises, elles sont à l'origine de la "blancheur" des zones palmo-plantaires et sont désormais utilisées en cosmétique pour le développement de produits dépigmentants Yamaguchi et collègues ( Yamagu c hi Y. e t a l ., 2004, Mesenchymal-Epithelial Interactions in the Skin: Increased Expression of Dickkopf by Palmoplantar Fibroblasts Inhibits Melanocyte Growth and Differentiation, Journal of C e ll B io l ogy 165(2): 275-285) ont démontré qu'un messager soluble produit par les fibroblastes des régions palmo-plantaires, était capable de modifier le programme de différenciation des mélanocytes de ces régions, conduisant à une diminution de la production de mélanine. Ce messager a été identifié par l'équipe comme une protéine nommée Dikkopf-1 (DKK-1).
Les voies de signalisation utilisées par DKK-1 pour produire ces résultats sont bien identifiées aujourd'hui. Grâce à son action antagoniste sur le récepteur Wnt, DKK-1 est en effet capable de "shunter" les voies de signalisation intracellulaires activées par la β-caténine, généralement responsables de la régulation des gènes impliqués dans la mélanogenèse. Yamaguchi et collègues ont également démontré que DKK-3, une molécule comme DKK-1, mais sans effet sur le récepteur Wnt, pourrait jouer un rôle régulateur sur l'effet de DKK-1. En fait, plus la quantité de DKK-3 au voisinage de ce récepteur à Wnt, plus les interactions entre DKK-1 et ce récepteur sont faibles. L'augmentation de DKK3 réduit les effets inhibiteurs de DKK-1 sur la mélanogenèse. Les travaux de Yamaguchi et collègues (cf. supra) suggèrent que l'identification d'agents ayant une influence sur le rapport DKK1 / DKK3 dans des cultures de fibroblastes dermiques humains normaux d'origine non palmo-plantaire permettrait de contrôler la production de mélanine à partir de mélanocytes humains normaux non palmo-plantaires
Le contre-flasque 8 comporte en outre un contre-manchon 83, tubulaire, creux, dont une paroi s’étend à l’intérieur du trou 23 de la vitre 2, ici en direction de l’intérieur, selon une épaisseur de contre-manchon e 83 ; cette épaisseur de contre-manchon e 83 est supérieure à l’épaisseur e 23 de sorte que la paroi du contre-manchon 83 s’étend à la fois plus à l’extérieur que la face 20 et plus à l’intérieur que la face 22 ; la paroi du contre-manchon 83 s’étend en outre dans le manchon 73.
La plaque 70 et la contre-plaque 80 ne sont pas des rondelles ; elles présentent chacune une surface conséquente afin de permettre de s’adapter à la forme des faces de la vitre adjacentes et faciliter ainsi le montage. La surface de la plaque 70 et la contre-plaque 80 est de l’ordre de 3 à 20 fois la surface occupée par le trou 23 ; par exemple 10 fois.
Le manchon 73 est affleurant avec la face intérieure 82 de la contre-plaque 80 et le contre-manchon 83 est affleurant avec la face intérieure 72 de la plaque 70.
Le manchon 73 comporte à une extrémité opposée à la plaque 70 une butée 74 annulaire pour venir au contact et bloquer la face intérieure 82 de la contre-plaque 80 ; ainsi, le contre-flasque 8 ne peut pas aller plus vers l’espace intérieur I que la position autorisée par cette butée 74.
Le manchon 73 comporte en outre à son extrémité opposée à la plaque 70 deux ergots 75, 75’ qui pénètrent chacun dans la contre-plaque 80 pas sa face intérieure 82. Ces deux ergots 75, 75’ traversent chacun la contre-plaque 80 au travers d’une ouverture 85, 85’ ; ainsi le contre-flasque est correctement orienté par rapport au flasque.
En position d’usage, la tige d’attachement 13 est située dans le contre-manchon 83 et est attachée au contre-manchon 83 et ainsi au contre-flasque 8. Ici, la tige d’attachement 13 est filetée et elle est ainsi vissée dans le contre-manchon 83.
Comme visible en figure 4, la plaque 70 et le manchon 73 appartiennent au flasque 7 ; le manchon 73 est un cylindre creux, à parois lisses, qui présente un axe et il s’étend perpendiculairement à partir de la face extérieure 71 de la plaque 70. Son diamètre extérieur est ici de 18 mm et son diamètre intérieur est ici de 14 mm. L’épaisseur de manchon e 73 , considérée à partir de la face extérieure 71 est comprise entre 6 et 10 mm et est ici par exemple de 8 mm. Dans le vitrage 1, l’épaisseur de manchon e 73 , considérée de la face extérieure 71 de la plaque 70 jusqu’à la face intérieure 82 de la contre-plaque 80.