INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
s Exemple 19 : Impact de la protection des facteurs de croissance sur la synthèse des GAGs totaux et des GAGs sulfatés Le but de cette étude était de déterminer si la protection des facteurs de croissance par l'extrait 5c sur des cultures de fibroblastes en io monocouche permettait de stimuler la synthèse de GAG totaux par une méthode radioactive. Les fibroblastes humains normaux issus d'un donneur âgé de 52 ans, étaient cultivés dans des plaques 96 puits avec du milieu (composé par du DMEM, glutamine 2mM, Penicillin 50UI/ml-streptomycin 50pg/ml, 15 sérum de voeu foetal 10%) pendant 24H. Après incubation, les cellules étaient traitées par les produits constitués par la vitamine C à 20pg/ml (témoin positif) et l'extrait 5c à 2% et 1%, pendant 72H. Un contrôle était réalisé en parallèle avec du milieu seulement. Après 48H de contact, la glucosamine radioactive (D-(6-3H)- 20 glucosamine) est rajoutée au milieu. A la fin de l'expérience, les surnageants étaient collectés pour le dosage de l'incorporation de la glucosamine radioactive dans les protéines intracellulaires. Le dosage des protéines est réalisé avec un kit commercial (BioRad 500-0116). 25 Les résultats sont répertoriés dans le tableau 10 suivant :
Tableau 10 : Etude de la stimulation de la synthèse de GAG totaux par J'extrait 5c Produits Activity Proteins Ratio % control p (cpm) (mg/ml) (act./Prot.) contrôle 1059 3.579 296 100 - TGF-f3 10ng/ml 2590 3.650 709 240 P<0.01 Extrait 5c 2% 4173 3.058 1365 461 P<0.01 Extrait 5c 1% 1787 3.396 526 178 P<0.01 Les résultats obtenus montrent que l'extrait 5c appliqué à 2% et 1% sur les fibroblastes humains normaux était capable de stimuler la s synthèse de GAG totaux avec un effet-dose et de façon plus importante que le témoin positif de référence (TGF-33 appliqué à lOng/ml). Les résultats obtenus montrent que la protection des facteurs de croissance du milieu et ceux synthétisés par les fibroblastes, permet in ~o vitro de stimuler la synthèse de GAG totaux. De la même façon une étude d'incorporation du 35S-sulfate est réalisée pour quantifier les GAG sulfatés. Le protocole appliqué est le même que celui des GAG totaux, à l'exception de la nature du précurseur radioactif. Les résultats sont répertoriés dans le tableau 11, ci-dessous: ]s Tableau 11 : Etude de la stimulation de la synthèse des GAG sulfatés par l'extrait 5c Produits Activity Proteins Ratio % control p (cpm) (mg/ml) (act./Prot.) contrôle 3028 3.579 846 100 - TGF-(i 1Ong/ml 5442 3.650 1491 176 P<0.01 Extrait 5c 2% 5586 3.058 1827 216 P<0.01 Extrait 5c 1% 4300 3.396 1266 150 P<0.01 20 Les résultats obtenus montrent que l'extrait 5c permet de stimuler de façon très significative et de façon dose-dépendante la synthèse des GAGs sulfatés. Ce qui signifie qu'outre le rôle de mimique joué par l'extrait 5c vis- à-vis du FGF-2, l'extrait 5c est capable en protégeant les facteurs de croissance de stimuler la synthèse des GAGs sulfatés et permet donc de renforcer la protection du FGF-2 puisque ce sont ces mêmes GAG sulfatés à Héparane sulfate qui protègent le FGF-2.
l0 Exemple 20 : Etude de l'activité protectrice du FGF-2 par l'extrait 5c après perméation transcutanée Le but était de s'assurer que l'extrait 5c conservait ses propriétés de protection du facteur de croissance après avoir pénétré la peau. 15 Une solution de l'extrait 5c pure était déposée à la surface d'expiants de peau, montés en cellules de Franz. Après 24H d'incubation, les milieux contenus dans les compartiments receveurs des cellules étaient récupérés et lyophilisés. Les lyophilisats étaient alors dissous dans l'eau distillée de façon à être testés 20 en final dans le modèle décrit exemple 15 avec un stress thermique à 37°C pendant 24H. La figure 7 représente l'étude de la protection du FGF-2 par l'extrait 5c après passage au travers de la peau. Les résultats obtenus (99.96% de protection) montrent que l'extrait 25 5c a conservé ses propriétés de protection intégralement puisque le résultat obtenu est identique à celui obtenu dans le tableau 4 de l'exemple 15.
Les résultats montrent qu'après avoir pénétré les tissus cutanés l'extrait 5c est capable de protéger les facteurs de croissance et reste donc intègre pour atteindre sa cible.
s Exemple 21 : Etude de la protection du FGF-2 face à la dégradation enzymatique Le but de cette étude était de quantifier la dégradation du FGF-2 par des protéinases présentes au niveau du derme de la peau humaine. io Ces enzymes jouant un rôle important dans la dégradation de la matrice extracellulaire. Notamment, la cathepsine G qui intervient lors de l'inflammation et est sécrétée dans l'environnement extracellulaire. Elle adhère fortement aux surfaces cellulaires de la matrice de part son caractère basique. La is cathepsine G est aussi active contre le collagène mais aussi envers la protéine coeur des protéoglycanes et de glycoprotéines de la matrice. Pour cette raison, une étude de la dégradation du FGF-2 par la cathepsine G a été réalisée. Une cinétique de dégradation a été effectuée dans du tampon Hepes 100mM, pH7 contenant 0.1% de BSA. La 20 cathepsin G à été rajoutée dans les puits de la plaque à une concentration de 0.02U par puits à une solution de FGF-2 à 2ng/puits. La plaque est incubée à 37°C puis à 15, 30, 60, 90 et 120 minutes un prélèvement est réalisé pour doser le FGF-2 restant. Le témoin (100%) est réalisé par un dosage extemporané du FGF- 25 2. En parallèle une solution témoin sans enzyme est placée à 37°C pour étudier la dégradation thermique aux différents temps, de façon à s'affranchir de cette dégradation due à la température et de quantifier la part due à la dégradation enzymatique seule.
Les quantités de FGF-2 (pg/ml) obtenues sont décrites dans le tableau 12, ci-dessous :
Tableau 12 : étude de la dégradation du FGF-2 par la cathepsine G. Temps (minutes) Concentration en FGF-2 Concentration en FGF-2 Témoin température En présence de cathepsine G (Dégradation %) 0 391,8 �3,64 339,05 � 7.43 (13.29%) 15 324,99 �1,7 295,61 � 8,49 (8.95%) 30 291,83 � 2,4 248,04 �1,97 (14,77%) 60 280,64 �3,23 203,67 � 1,13 (27,5%) 90 259,81 �4,9 141,94 �5,14 (45,55%) 120 241,67 �1,97 131,36� 2,49 (45,6%) Les résultats obtenus permettent de montrer qu'avec le temps la dégradation du FGF-2 est augmentée. L'enzyme permet de dégrader le FGF-2 de façon très significative à 90 minutes. io C'est pourquoi ce temps sera sélectionné pour étudier la protection du FGF-2 en présence de cathepsine G par l'extrait 5c. Au milieu réactionnel décrit précédemment (exemple 21) sont ajoutées des concentrations en l'extrait 5c différentes à savoir : 0.01°A), 0.05%, 0.1%, 0.5% et 1%. 15 Après 90 minutes à 37°C, les concentrations en FGF-2 sont évaluées et sont calculés les pourcentages de FGF-2 restant ainsi que les pourcentages de protection du FGF-2. Pour chaque concentration testée le dosage est réalisé en n=9. Les résultats sont décrits dans le tableau 13, ci-dessous : Tableau 13 : Etude de la protection par L'extrait 5c du FGF-2 dégradé par la cathepsine G. Essais Concentration en FGF-2 restant (%) Protection du FGF-2 FGF-2 (%) (pg/ml) Témoin (100%) 455,23 100 - Témoin dégradé 288,11 63,29 0 (enzyme) Extrait 5c 0.01% 336,93 74,01 29,21 Extrait 5c 0.05% 344,65 75,71 33,83 Extrait 5c 0.1% 409,08 89,86 72,38 Extrait 5c 0.5% 414,02 90,95 75,33 Extrait 5c 1% 406,58 89,31 70,89 L'extrait 5c est capable de protéger le FGF-2 face à la dégradation enzymatique de façon dose dépendante. Cette étude in vitro permet de démontrer que l'application de L'extrait 5c peut protéger les facteurs de croissance de la dégradation protéolytique exercée par les enzymes de la matrice extracellulaire. Ceci ne fait que renforcer l'intérêt de l'utilisation de L'extrait 5c en cosmétique.
Exemple 22 : Mise en évidence du taux de FGF-2 avec l'âge Le but de cette étude était d'étudier la concentration en FGF-2 de peaux dites � jeunes � et dites � âgées � pour établir une relation entre l'âge et la perte du contenu en FGF-2 due principalement à la modification du contenu des GAG de la peau.
Des biopsies de peaux issues de donneurs dits jeunes (21, 30, 31 et 38 ans) et issues de donneurs dits âgés (50, 55, 57 et 58 ans) ont été prélevées et extraites après broyage dans un tampon PBS pH 7 contenant du triton X100 à 0.1%, pour réaliser un dosage du FGF-2 par un kit commercial ELISA (R&D system, DFB50). La concentration en FGF-2 est rapportée au taux d'ADN mesuré par un kit commercial Picogreen.
Les résultats obtenus sont représentés dans la figure 8: La figure 8 représente une étude de la concentration en FGF-2 dans ia des hydrolysats de peaux dites � jeunes � et � âgées �. Les résultats montrent une différence du contenu du FGF-2 entre les peaux jeunes et peaux âgées. De plus, cette différence est statistiquement significative (p=0.046). Cet exemple permet de montrer que l'utilisation d'un actif comme 15 protecteur des facteurs de croissance et plus particulièrement du FGF-2 permet de lutter contre les effets liés au vieillissement cutané.
Exemple 23 : Formulation des produits de l'invention 20 On procède selon les méthodes connues de l'homme de l'art pour mélanger ensemble les différentes parties A, B, C, D, E, ou F pour préparer une composition selon la présente invention. Les � produits de l'invention � représentent les principes actifs mentionnés dans la présente invention. 25 Utilisation des produits de l'invention dans des formulations cosmétiques ou pharmaceutiques de type émulsion huile dans eau. 30 44 Formulation 23a :
Une intervention cosmétique et pharmacologique avec cette cascade de production de mélamine est connue dans l'état de la technique, et vise à conférer une dépigmentation locale ou à harmoniser la nuance de la peau. Dans ce contexte, il y a un grand intérêt à utiliser un ou plusieurs composants choisis parmi les composés phénoliques végétaux et les molécules lipidiques à cette fin, par exemple le tanin et des acides gras. Le document US 2005/0163731 fait état d'une composition à usage topique destinée à dépigmenter la peau, comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, au moins un agent actif de dépigmentation en combinaison avec une quantité efficace d'adapalène agissant comme un accélérateur de dépigmentation. Les agents de dépigmentation sont constitués de composés phénoliques, d'extraits végétaux et d'acide linoléique. Le document KR20030007990 fait état d'une composition cosmétique contenant des extraits de Houttuynia cordata, Gossypium indicum, Alpinia speciosa, Schum et Morus alba ; lesquels favorisent les effets anti-âge et blanchissants sur la peau. Ces extraits végétaux sont stabilisés dans un liposome de cristal liquide comprenant, outre d'autres ingrédients, un céramide, de la lécithine hydrogénée, des dérivés de sphingolipides et de l'acide linoléique.
Le document JP2005272471 décrit un conjugué d'ester d'acide linoléique et d'acide gallique, ayant un effet de blanchiment de la peau - inhibition de la tyrosinase - et un effet anti-inflammatoire (inhibition de COX-1 et COX-2).
Le document US 2006/0198800 concerne une composition cosmétique comprenant un agent antirides et un complexe exfoliant naturel, l'agent antirides étant constitué d'acétylhexapeptide. De plus, ce document décrit l'utilisation, dans la préparation de compositions, d'adjuvants cosmétiques tels que des agents actifs éclaircissant la peau et, parmi le choix d'agents éclaircissants, on peut trouver l'acide gallique, les composés phénoliques et plusieurs extraits végétaux. Enfin, le document PI 9916440-0 fait état d'une composition à usage topique comprenant un conjugué d'acide linoléique et/ou des dérivés de celui-ci, 1 % des composants totaux étant représenté par des composants sous leurs formes 10-trans et 12-cis, en plus d'un véhicule acceptable du point de vue dermatologique. Ce document décrit un produit final destiné à éclaircir la peau humaine. Ainsi, d'après la description qui suit de la présente invention, on peut en conclure que l'on ne connaît pas, dans l'état de la technique, de complexe éclaircissant constitué d'acide gallique, obtenu de préférence à partir d'extrait de faux poivrier du Brésil, et d'acide linoléique obtenu de préférence à partir d'huile de passiflore. Par ailleurs, une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant ledit complexe, constituant également un objet de cette invention, présente une meilleure efficacité sur la dépigmentation de la peau. Un objet de la présente invention est un complexe éclaircissant comprenant de l'acide gallique et de l'acide linoléique.
Une telle combinaison présente une synergie conduisant à un pouvoir éclaircissant très élevé, optimisant l'éclaircissement de la peau, réduisant les quantités d'agents actifs par rapport au cas où ils sont utilisés isolément. Un tel complexe peut donc être utilisé pour éclaircir la peau, blanchir la peau, adoucir les taches et les éphélides, et en étant plus efficace que l'utilisation de ses constituants pris isolément. On peut en conclure que ceci constitue une réponse plus simple que celles connues dans la technique connue, un besoin existant pour ne combiner qu'au plus deux composés éclaircissants ou développer un nouveau composé via des réactions chimiques. Complexe éclaircissant Le complexe éclaircissant constituant un objet de la présente invention comprend de l'acide gallique et de l'acide linoléique. Dans des modes de réalisation préférés, le complexe éclaircissant comprend de 0,025 mg/ml à 5 mg/ml, plus préférentiellement de 0,025 mg/ml à 0,075 mg/ml, d'acide linoléique et de 0,025 mg/ml à 5 mg/ml d'acide gallique. De préférence, l'acide gallique est obtenu à partir d'extrait de faux poivrier du Brésil, également appelé "aroeira" (Schinus terebinthifolius). De préférence, l'acide linoléique est obtenu à partir d'huile de passiflore (Passiflora alata). Ainsi, un mode de réalisation préféré peut aussi être un complexe éclaircissant comprenant de 0,025 mg/ml à 5 mg/ml d'acide linoléique et de 0,025 mg/ml à 5 mg/ml d'extrait de faux poivrier du Brésil, sur la base de la masse totale du complexe. Acide gallique L'acide gallique est un composé chimique déjà connu dans l'état de la technique comme étant un éclaircissant pour la peau.
De préférence, il est obtenu à partir de faux poivrier du Brésil, ou "aroeira". Il peut aussi être obtenu à partir d'autres sources. Dans un mode de réalisation préféré, l'extrait de Schinus terenbinthifolius est obtenu via une voie d'extraction aqueuse, sous pression de vapeur.
Comme on peut le voir dans l'organigramme représenté sur la Figure 1, on sélectionne tout d'abord des feuilles fraîches ou sèches de faux poivrier du Brésil ("aroeira") et on les broie avec de l'eau. Puis on met en oeuvre une extraction aqueuse à raison de 1 partie de plante pour 7 parties de solvant d'extraction (eau), sous une pression de vapeur, à une température de 85°C à 110°C et sous 1,60 à 2,4 kgf/cm2. Puis on filtre la solution d'extraction résultante sur un filtre presse en utilisant un élément filtrant en toile brute, par exemple, à une température comprise entre 85°C et 95°C pour obtenir ainsi un filtrat et un surnageant. On concentre sous vide l'extrait aqueux de façon à réduire de 3 volumes la quantité d'eau. Après cette étape de concentration, on effectue un raffinage/une précipitation à l'alcool (éthanol), dans un rapport de 1/3, suivi(e) d'un refroidissement à une température de filtrat située dans la plage de 0°C à 10°C, et d'une évaporation de l'alcool (éthanol).
Finalement, on sèche le filtrat dans un séchoir par pulvérisation, par exemple, et l'on obtient ainsi un extrait raffiné de feuilles de Schinus terenbinthifolius. On caractérise l'extrait raffiné par un dosage quantitatif de l'acide gallique par CLHP, et une analyse centésimale montre la composition indiquée dans le Tableau 1 ci-dessous, par comparaison avec l'extrait brut. Tableau 1 Dosages Unité Extrait Extrait brut raffiné (BA018) (BA021) Teneur en acide gallique % 13,24 16,16 Glucides totaux % 15,76 14,32 Tanins totaux % 50,54 50,41 Extrait dans l'éther % 0,13 0,08 Protéine brute % 3,86 4,18 Substance minérale % - - Comme on peut le voir dans le Tableau 1 ci-dessus, l'extrait raffiné présente des teneurs (%) plus élevées en tanins totaux, le biomarqueur de cet extrait étant l'acide gallique, qui est le principal responsable de l'activité de dépigmentation de l'extrait de faux poivrier du Brésil par comparaison avec l'extrait brut. Par conséquent, le procédé décrit dans la présente invention permet d'obtenir un rendement optimal en ce qui concerne la quantité d'acide gallique présent dans "l'aroeira", responsable de l'effet éclaircissant décrit ci-dessous. Acide linoléique L'acide linoléique est également connu dans le cadre de l'éclaircissement de la peau.
L'acide linoléique présent dans le présent complexe éclaircissant peut être sous sa forme libre ou conjuguée, et on l'utilise de préférence sous sa forme libre. En ce qui concerne l'acide linoléique, celui-ci est obtenu à partir d'huiles végétales, de préférence à partir d'huile de passiflore, mieux encore par une voie comprenant une hydrolyse enzymatique et une distillation moléculaire, comme le montre la Figure 2. D'abord, on soumet l'huile végétale (triglycérides et autres) à une réaction enzymatique à une température de 50°C à 60°C afin de produire des acides gras. Ensuite, on met en oeuvre une première étape de distillation moléculaire à une température d'environ 120°C sous un vide de 0,13 mbar (0,13.1O5Pa). On sépare le résidu et un premier distillat. On soumet ce premier distillat à une deuxième étape de distillation moléculaire à une température d'environ 160°C et sous un vide de 0,002 mbar (0,002.1O5Pa), et l'on obtient ainsi un deuxième résidu et le distillat final avec un rendement global de 61 % et un taux de conversion des acides gras de 100 Les enzymes utilisées dans ce procédé sont choisies parmi . - Lipozyme TL 100L ; - CALB ; et - CALA. Les mélanges d'enzymes utiles présentent un rapport variant entre 1/1 et 9/1 de Lipozyme TL 100L x CALB ou CALA.
Le mélange avec les enzymes Lipozyme TL 100L/CALA (1/1) conduit aux meilleurs résultats, avec une conversion de 95,9 que l'on peut expliquer par une spécificité de 1,3 pour l'enzyme Lipozyme TL 100L conjointement avec la meilleure performance dans l'hydrolyse par l'enzyme CALA, et sa non-spécificité (hydrolyse en position 2 de la chaîne triglycéridique). Ainsi, on peut en conclure que l'objet de l'invention est la combinaison de ces deux agents actifs qui potentialise de façon inattendue l'éclaircissement de la peau, potentialisation inconnue à ce jour. Composant facultatif Par ailleurs, le présent complexe éclaircissant contient éventuellement de l'acide ascorbique et/ou des dérivés de celui-ci, en une proportion de 0,025 mg/ml à 15 mg/ml pour les formulations concentrées de sérum sous forme de gel. Ce mode de réalisation peut présenter une efficacité encore plus grande. De préférence, le procédé pour stabiliser l'acide ascorbique utilisé dans cette invention est tel que décrit dans les documents PI 9704418-0 et PI 9704728-7 au nom de la société demanderesse. Action du mélange selon la présente invention Le mécanisme d'action de ce complexe éclaircissant est basé sur deux principes principaux : 1) l'inhibition de la tyrosinase et 2) la dégradation de la tyrosinase. 1) Inhibition de la tyrosinase Les tanins hydrolysables (acide gallique) présents en fortes quantités dans l'extrait de Schinus terenbinthifolius inhibent l'activité de la tyrosinase par l'intermédiaire de sa propriété de chélation du cuivre, un cofacteur essentiel pour cette activité enzymatique, en l'empêchant ainsi d'agir sur la mélanine. 2) Dégradation de la tyrosinase dans le milieu L'acide linoléique agit sur la tyrosinase présente dans le milieu, en accélérant le processus de sa dégradation. Ainsi, une quantité d'enzyme plus petite est disponible pour la formation de mélanine par les mélanocytes. Les Figures 3 et 4 illustrent les résultats d'un test pour déterminer l'activité du complexe éclaircissant d'acide linoléique et d'extrait de Schinus terenbinthifolius selon cette invention. La méthodologie de dosage pour ce test dure cinq jours pendant lesquels, initialement, on plaque des mélanocytes de lignée B16 sur des récipients conditionnés à 12 puits, à raison de 75 000 cellules/plaque. Les trois jours suivants, on dilue 10 mg (11 pl rapportés à l'acide linoléique) de composant dans le mélange dans 100 pl de DMSO (diméthylsulfoxyde), et ensuite on ajoute 9,9 ml de DMEM (milieu de culture) sans sérum de façon à obtenir finalement une solution mère à 1 mg/ml. On incube ces solutions successivement à 37°C pour faciliter la solubilisation des échantillons. On ajoute à la dilution finale du sérum de veau foetal (SVF) à 1o%. Le Tableau 2 ci-dessous montre des informations sur la composition des mélanges utilisés dans les tests en cause.
Tableau 2 Mélange Acide Acide Total Composition du mélange gallique linoléique des agents actifs 1 0,05 0,05 0,1 200 pl de solution mère mg/ml mg/ml mg/ml d'acide gallique + 200 pl de solution mère d'acide linoléique + 8 pl d'î-MSH à 500 pM + 3,592 ml SVF à 10% 2 0,025 0,075 0,1 100 pl de solution mère mg/ml mg/ml mg/ml d'acide gallique + 300 pl de solution mère d'acide linoléique + 8 pl d'î-MSH à 500 pM + 3,592 ml de milieu SVF à 10% 3 0,075 0,025 0,1 300 pl de solution mère mg/ml mg/ml mg/ml d'acide gallique + 100 pl de solution mère d'acide linoléique + 8 pl d'î-MSH à 500 pM + 3,592 ml de milieu SVF à 10% On soulignera le fait que l'a-MSH est l'hormone mélanostimuline, agissant sur la production et la libération de la mélanine. Le Tableau 3 ci-dessous montre la concentration et la composition des solutions contenant les agents actifs individuels. Les agents actifs sont l'acide gallique et l'acide linoléique. 1110 Tableau 3 Concentration Composition 0,075 mg/ml 300 pl de solution mère + 8 pl d'a-MSH à 500 pM + 3,692 ml de milieu SVF à 10% 0,05 mg/ml 200 pl de solution mère + 8 pl d'a-MSH à 500 pM + 3,792 ml de milieu SVF à 10% 0,025 mg/ml 100 pl de solution mère + 8 pl d'a-MSH à 500 pM + 3,892 ml de milieu SVF à 10% Le cinquième jour du test, on divise les cellules dans deux étapes de caractérisation : - Détermination de la mélanine : on "lave" d'abord les cellules avec du PBS puis on dissout la couche cellulaire dans 500 pl de NaOH 3 N et on homogénéise la suspension par pipetage. On dépose deux portions de la 200 pl de suspension sur une plaque pour une lecture optique à 400 nm. Le Tableau 4 montre les résultats de mesure de la quantité de mélanine détectée après traitement des cellules avec des solutions tant d'acide linoléique que d'acide gallique seul, et le Tableau 5 montre les résultats de mesure de la quantité de mélanine détectée après traitement des cellules avec les mélanges 1, 2 et 3 présentés dans le Tableau 2 ci-dessus.
Tableau 8 - Pourcentage de réduction de mélanine extraite de l'épiderme après 6 jours de traitement Moyenne Moyenne (%) Réduction (%) (11g/ml) Témoin 26,53 100 0 Acide kojique 20,95 78,98 21,02 250pM A - 25 pg/ml 22,29 84,05 15,95 B - 75 pg/ml 21, 40 80, 67 19, 33 A+B, 25+75 pg/ml 20,37 76,80 23,20 15 Les réductions de mélanine sont comparables à celle du témoin (acide kojique 250pM), le mélange A+B montrant une réduction supérieure à celle du témoin. Comme le montre le Tableau 8, la réduction obtenue avec l'acide kojique est d'environ 21,02%, celle obtenue avec l'échantillon A est de 15,95% et celle obtenue avec l'échantillon B est de 19,33%, tandis que celle obtenue avec le complexe mélange A+B est de 23,20%.
Test d'innocuité in vitro Un essai de cytotoxicité permet de déterminer la concentration cytotoxique d'un agent actif, quand on incube avec celui-ci des cellules 3T3 pendant 24 heures.