Réactifs: Les mêmes réactifs indiqués pour l'Exemple 7.1 ont été utilisés. Préparation de culture cellulaire Des plaques de 96 puits ont été préparées avec 2x104 cellules/puits dans 100 pl de DMEM contenant 10% de SFB. Les cellules ont été incubées sur la nuit dans une étuve à CO2. Le milieu de culture a été Io éliminé et les puits lavés avec 2OOpl de PBS. Stimulation des cellules avec des LPS 100 pl de DMEM contenant 1% de SFB et les stimuli appropriés ont été ajoutés. L'incubation a été réalisée dans une étuve à CO2 sur la nuit. Les traitements étaient: 15 - Témoin (uniquement du DMEM contenant 1% de SFB); - LPS 10 ng/ml; - Dexaméthasone 5 uM; - LPS 10 ng/ml + Dexaméthasone 5 uM; - LPS 10 ng/ml + Echantillon A 1 mg/ml; 20 - LPS 10 ng/ml + Echantillon A 0,5 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Echantillon A 0,25 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Echantillon A 0,125 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Echantillon Fr13-23 1 mg/ml; - LPS 10 ng/ml + Echantillon Fr13-23 0, 5 mg/ml; 25 - LPS 10 ng/ml + Echantillon Fr13-23 0,25 mg/ml; -LPS 10 ng/ml + Echantillon Fr13-23 0,125 mg/ml. Stimulation des cellules aux UVB 25 100 pl de DMEM contenant 1% de SFB et les stimuli appropriés ont été ajoutés. L'incubation a été réalisée dans une étuve à CO2 pendant 50 min. Les traitements étaient: - Témoin (uniquement du PBS dans des cellules non irradiées); - UVB 0.23J/cm2 (uniquement du PBS avec irradiation après l'incubation); - UVB 0.23J/cm2 + Hydrocortisone 5 uM; -UVB 0.23J/cm2 + Echantillon A 1 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon A 0,5 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon A 0,25 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon A 0,125 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon Fr13-23 1 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon Fr13-23 0,5 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon Fr13-23 0,25 mg/ml; - UVB 0.23J/cm2 + Echantillon Fr13-23 0,125 mg/ml. Après la période d'irradiation des cellules (sauf pour le témoin), les volumes des puits ont été éliminés et remplacés avec le même traitement préparé dans 1000 de DMEM contenant 1% de SFB et les stimuli appropriés. Ensuite une incubation au CO2 a eu lieu sur la nuit. 2 0 Collecte du surnageant et analyse de la viabilité cellulaire Après la stimulation, les surnageants ont été collectés, stockés à - 20°C et analysés par ELISA (décrit ci-dessous). Afin de maintenir la viabilité cellulaire après stimulation, les cellules ont été incubées avec du Rouge Neutre pendant 3 heures et, après lavage avec 200 pl de PBS, 200 25 pl de solution de révélation ont été ajoutés et la lecture a été réalisée à 540 nm. Pour tous les traitements, la viabilité cellulaire devrait être supérieure ou égale à 80% de la viabilité témoin. Les données de viabilité cellulaire ont 26 aussi été utilisées ensuite pour normaliser les données obtenues par ELISA. ELISA (Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay) Pour le test ELISA, des plaques de 96 puits ont été utilisées. La quantification de marqueurs pro-inflammatoires a été déterminée par comparaison avec les courbes standards fabriquées spécifiquement pour IL-6 ou IL-8. Les surnageants de culture ont été utilisés selon les étapes suivantes: - Ajout de l'anticorps de capture dilué dans du tampon de sensibilisation 10 (1:250, 100 pl/puits); - Incubation sur la nuit à 4°C; - Lavage des plaques 3 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits); - Blocage des sites libres dans la plaque avec du tampon de blocage (200 pl/puits); 15 -Incubation pendant 1 heure à température ambiante; - Lavage des plaques 3 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits) ; - Préparation des dilutions du standard et des échantillons avec du tampon de blocage (1:200); - Ajout des dilutions du standard, des échantillons et du témoin (100 pl 2 0 /puits); - Incubation pendant 2 heures à température ambiante; - Lavage des plaques 5 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits) ; - Ajout de l'anticorps de détection dilué du conjugué streptavidinepéroxidase dilués dans du tampon de blocage (1 :250 chacun, 100 pl/puits); 25 - Incubation pendant 1 heure à température ambiante; - Lavage des plaques 7 fois avec du tampon de lavage (200 pl/puits) ; - Ajout de la solution de substrat (100 pl/puits); 27 - Incubation de la plaque pendant 30 min à température ambiante à l'obscurité ; - Ajout de la solution stop (50 pl/puits); -Lecture de l'absorbance à 450nm.