Il existe différentes classes de médicaments disponibles pour le traitement des maladies métaboliques, lesquels ont en commun d'agir sur une des composantes du métabolisme. Des études récentes (Petersen et al, 2004; Petersen et al, 2003) ont montré que la diminution de l'activité métabolique elle-même, et en particulier au niveau de la mitochondrie, était l'une des perturbations majeure et précoce observée dans le développement des maladies métaboliques. 2908309 2 Les patients souffrant de maladies métaboliques voient leur maladie évoluer sur des périodes de 30, voire 40 ans. Pendant ces années, il n'y a pas de réel ressenti d'état malade et la plupart des personnes souffrant de maladies métaboliques ont beaucoup de mal à adhérer à des traitements composés de plusieurs médicaments lesquels sont souvent sources 5 d'effets secondaires. C'est la raison principale pour laquelle les produits d'origine végétale apparaissent particulièrement satisfaisants pour la prise en charge de ces maladies. De plus, les produits utilisés à ce jour pour traiter le diabète n'ont pas de profil véritablement satisfaisant, leurs effets secondaires soutenus et nombreux restreignant leur emploi. La plupart des nouveaux médicaments en développement avancé ou récemment mis sur le 10 marché présentent également des effets secondaires et il devient donc urgent de développer des produits efficaces plus satisfaisants. Au niveau mondial, on a attribué à près de 1200 plantes des effets sur les maladies métaboliques et en particulier le diabète de type 2. Cependant, dans la plupart des cas, la non toxicité des plantes n'a pas été démontrée, les principes actifs qu'elles contiennent 15 n'ont pas été identifiés, leur pharmacologie afin de déterminer à quelle classe thérapeutique la plante appartient et éventuellement identifier une nouvelle classe thérapeutique n'a pas été effectué ou encore aucune méthode d'extraction permettant d'obtenir de manière optimisée techniquement et économiquement leurs principes actifs n'a été décrite. Il s'ensuit que ce manque de connaissances scientifiques précises sur leurs effets 20 empêche leur utilisation thérapeutique. Sans ces informations scientifiques, l'utilisation en nutraceutique est elle aussi difficile, puisque le cadre réglementaire régissant ce domaine s'est récemment renforcé depuis la mise en application du nouveau décret 2006-352 relatif aux compléments alimentaires lequel est la transposition en droit français de la directive européenne 2002/46/CE. 25 Dans un souci d'obtention de données scientifiques précises et de développement d'actifs originaux, les inventeurs ont développé des moyens pour évaluer l'effet d'une composition sur l'activité métabolique au niveau mitochondrial en détournant un test biochimique de son utilisation habituelle. En effet, les inventeurs ont constaté que le test du MTT (bromure 2 3-(4,5diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphényltetrazolium), couramment utilisé pour évaluer la cytotoxicité d'un produit chimique donné, d'origine synthétique ou naturelle (Mosmann, 2908309 3 1983), pouvait constituer un outil de grand intérêt pour sélectionner des compositions actives à partir des plantes. Ce test est basé sur la capacité qu'ont les enzymes déshydrogénase contenues dans les mitochondries à convertir le MTT, molécule de couleur jaune en solution, en cristaux de 5 formazan, de couleur bleue en solution. Il permet d'obtenir une mesure de l'activité déshydrogénase continue dans les mitochondries après traitement avec un produit donné et donc de mesurer la quantité d'ATP produite par la mitochondrie, laquelle est la signature de l'activité métabolique au niveau de la mitochondrie d'une cellule. Les inventeurs ont ainsi développé une méthode de criblage de molécules originales 10 pour leur potentiel à corriger un défaut métabolique, en utilisant le test du MTT, non seulement pour mesurer la cytoxicité d'extraits et composés de plantes sélectionnées mais, de manière originale, pour mesurer la capacité de ces extraits et composés à augmenter l'activité métabolique. L'invention a donc pour but de fournir un procédé de grande fiabilité et facile à 15 mettre en oeuvre pour obtenir de nouvelles compositions utiles pour prévenir, accompagner un régime et traiter des maladies métaboliques. Elle a également pour but de fournir de telles compositions en tant que produits nouveaux et de mettre à profit leurs propriétés pour la fabrication de médicaments ou encore de compléments alimentaires pour le traitement et la prévention des maladies 20 métaboliques. Le procédé d'obtention selon l'invention de compositions biologiquement actives, par extraction à partir d'une ou plusieurs plantes, est caractérisé en ce qu'il comprend les étapes a) de traitement, séparément, des plantes médicinales sélectionnées par rapport à une activité donnée, ou de parties de ces plantes. avec un ou plusieurs solvants pour obtenir des 25 extraits totaux ou des fractions enrichies en principes actifs, plus spécialement des fractions apolaires et des fractions polaires b) de sélection d'extraits ou fractions présentant une activité métabolique dans le test MTT et une activité biologique dans au moins un test spécifique de cette activité métabolique. 2908309 4 Ce procédé comporte avantageusement, outre les étapes a) et b) définies ci-dessus, une étape c), mise en oeuvre après l'étape a), et/ou après l'étape b), cette étape c) comprenant l'analyse desdits extraits ou desdites fractions sélectionnés pour déterminer les composants qu'elles renferment et isoler et purifier, si souhaité, le ou les principes actifs portant 5 l'essentiel de l'activité biologique. Cette analyse est réalisée plus particulièrement par profils HPLC. Cette disposition sur l'identification et l'isolement de composés actifs ouvre la perspective d'obtention de tels composés par voie de synthèse dans l'optique d'un développement pharmaceutique ou en nutraceutique. 10 Dans l'étape a), les plantes ou les parties de plantes sont utilisées, de préférence, sous forme de fine poudre, obtenue après broyage et séchage. Il s'agit plus particulièrement des feuilles, des écorces, des racines, des parties aériennes, des fruits, graines ... L'étape a) comprend généralement une ou plusieurs extractions, ces extractions étant 15 réalisées à l'aide de solvants organiques, notamment un solvant alcoolique (en particulier avec de l'éthanol ou du méthanol) ou du cyclohexane ou tout autre solvant apolaire (éther de pétrole, heptane...), du dichlorométhane ou du chloroforme, et, plusieurs de ces solvants ou tous ces solvants, pouvant être utilisés successivement pour l'isolement de fractions spécifiques 20 On notera que l'utilisation du test du MTT selon l'étape b), appliquée à des plantes auxquelles des effets biologiques étaient reconnus, mais ne pouvaient être utilisés efficacement faute de moyens pour leur caractérisation, permet de révéler des extraits et fractions qui n'avaient jamais été identifiés jusqu'à l'invention. Les compositions susceptibles d'être obtenues par le procédé défini ci-dessus entrent 25 également dans le champ de l'invention en tant que produits nouveaux. L'invention vise ainsi les extraits, fractions et composés susceptibles d'être obtenus en mettant en oeuvre le procédé de l'invention. 2908309 5 L'invention vise également la mise à profit des propriétés biologiques de ces compositions. Selon un premier aspect, l'invention concerne ainsi de nouvelles compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité efficace d'au moins 5 une composition telle que définie ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable. Ces compositions se présentent avantageusement sous des formes galéniques pour une administration par voie orale, topique, ou par injection. Pour une administration par voie orale, les compositions pharmaceutiques se présentent 10 plus particulièrement sous forme de comprimés, tablettes, gélules, granulés, gouttes,... Pour une administration par voie topique, elles se présentent avantageusement sous forme de crèmes, laits, lotions, huiles ou patchs. Des formulations galéniques appropriées comprennent les aérosols. Pour une administration par voie injectable, elles se présentent sous forme de solutions 15 injectables par voie intraveineuse, sous-cutanée ou intramusculaire, élaborées à partir de solutions stériles ou stérilisables, ou encore de suspensions ou d'émulsions. Selon un deuxième aspect, l'invention se rapporte à des compléments alimentaires, caractérisés en ce qu'ils renferment une quantité efficace d'au moins une composition telle que définie ci-dessus pour une application en nutraceutique, en association avec un 20 excipient inerte. Ces compléments se présentent avantageusement sous forme liquide, de gomme, de poudre, de comprimés, de gélules, décoctions, infusions et autres. L'invention est plus particulièrement illustrée ci-après par son application à l'obtention de compositions possédant une activité antidiabétique et utiles en particulier pour la 25 prévention et le traitement du diabète de type 2. Dans ce but, les tests biologiques réalisés selon l'étape b) sont des tests pour déterminer une activité antidiabétique, notamment sur la sécrétion d'insuline. 2908309 6 Des compositions préférées à cet égard sont susceptibles d'être obtenues à partir de plantes choisies parmi les genres et espèces : Strychnos myrtoides, Obetia radula, Trema orientalis, Sclerocarya birrea, Voacanga thouarsii Moringa oleifera (= Moringa moringa, Moringa pterygosperma, Guilandina moringa), Agrimonia eupatoria, Arctium majus= 5 Lappa major, Alchemilla vulgaris, Phaseolus vulgaris , Vaccinium myrtillus, Cichorium intybus, Cynara scolymus, Geranium robertianum, Juglans regia, Kalanchoe crenata, Leptodenia madagascariensis, Morus nigra, Olea europaea, Rubus fructicosus, Spathodea campanulata. Avantageusement, il s'agit de compositions caractérisées en ce qu'elles sont 10 susceptibles d'être obtenues à partir de plantes choisies parmi les genres : Strychnos, Obetia, Trema, Sclerocarya, Voacanga, Moringa, Agrimonia, Arctium, Alchemilla, Phaseolus, Vaccinium, Cichorium, Cynara, Geranium, Juglans, Kalanchoe, Leptodenia, Morus, Olea, Rubus, Spathodea. Des compositions particulièrement préférées sont susceptibles d'être obtenues à partir 15 de plantes choisies parmi les familles : Loganiaceae, Urticaceae, Ulmaceae, Anacardiaceae, Apocynaceae, Moringaceae, Rosaceae, Asteraceae, Fabaceae, Ericaceae, Geraniacaea, Juglandacaea, Crassulaceae, Oleaceae, Bignoniacea. D'autres compositions particulièrement préférées sont des fractions de Trema orientalis Ulmaceae, Strychnos myrtoides Loganiaceae, Obetia radula Urticaceae, Vaccinium 20 myrtillus Ericaceae, Sclerocarya birrea Anacardiaceae, Agrimonia eupatoria Rosaceae, Alchemilla vulgaris Rosaceae et Olea europaea Oleaceae, présentant respectivement, les profils HPLC des figures 1-8, ainsi que les composés biologiquement actifs issus de ces fractions. Comme le montrent les exemples, ces compositions préférées présentent un grand 25 intérêt pour le traitement du diabète. Les compositions préférées ci-dessus présentent également un grand intérêt en nutraceutique et sont avantageusement utilisées pour l'élaboration de compléments alimentaires. Ces compléments permettent notamment d'accompagner un régime alimentaire d'un patient sous traitement ou non. 2908309 7 Selon encore un autre aspect, l'invention vise une méthode de prévention et/ou de traitement de maladies métaboliques, caractérisée en ce qu'elle comprend l'administration d'une quantité efficace en thérapeutique ou en nutraceutique d'au moins une composition telle que définie ci-dessus. 5 De manière générale, l'invention propose donc une alternative pour la prévention et le traitement de ces maladies métaboliques car ces produits d'origine naturelle sont û au moins psychologiquement- associés à une meilleure qualité de vie et d'autre part leur utilisation souvent séculaire dans la pharmacopée traditionnelle assure une connaissance exhaustive des effets secondaires. 10 D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés avec les exemples qui suivent de modes détaillés de réalisation de l'invention. Ces exemples servent à illustrer l'invention sans en limiter la portée. Il est fait référence dans ces exemples aux figures 1 à 9 qui représentent les profils HPLC d'extraits de plantes selon l'invention (figures 1 à 8) et donnent un résultat de test MTT (figure 9). 15 Matériel et méthode Plantes Les parties de plantes séchées (feuilles, racines....) sont broyées afin d'obtenir une poudre fine destinée à l'extraction. Extractionpurification 20 La poudre est épuisée par percolation ou par macération, ou par sonication par des solvants polaires ou apolaires. Ces solvants peuvent être du cyclohexane, de dichorométhane, du chloroforme, de l'acétone, de l'acétate d'éthyle, du butanol, de l'éthanol, du méthanol, de l'eau ou un mélange de ces différents solvants. Les extraits sont obtenus avec des rendements compris entre 2 et 10%. Ils sont évaporés à sec sous pression réduite. Puis 25 fractionnés soit par extraction liquide-liquide, soit par extractions successives par des solvants de polarité croissante. Les composés purs peuvent être obtenus notamment par fractionnement par chromatographie d'adsorption, chromatographie d'exclusion, chromatographie d'affinité, chromatographie d'échanges d'ions, ou par cristallisation fractionnée 2908309 Profils chromatographiques Les extraits, les fractions enrichies, les fractions plus ou moins purifiées ou les composés purs sont analysés par chromatographie à haute pression en utilisant une colonne de phase inverse (RP-CLHP). La phase stationnaire utilisée correspond notamment à une silice 5 greffée C8 ou C18, de 5 à 10 de granulométrie. Les mélanges d'élution correspondent notamment à de l'eau acidifiée (pH 3) additionnée de méthanol ou d'acétonitrile. Le gradient utilisé varie de 98 ,/o à 0% d'eau acidifiée sur au moins 60 min. Test MTT La lignée transformée pancréatique INS1 utilisée pour ce test est un don du Centre 10 Européen du Diabète (Hautepierre, France). Les cellules sont ensemencées à une densité de 3 103/puit dans des plaques 96 puits et cultivées dans du milieu RPMI 1640 enrichi avec du sérum de veau foetal (10%). Les cellules sont traitées avec les différents extraits de plantes (200 g/ml) pendant 24 heures et le test MTT ensuite réalisé: le MTT (bromure 2 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5- diphényltetrazolium) est un sel de tétrazolium donnant une 15 solution de couleur jaune quand il est dilué dans un milieu. Il est converti en formazan violet insoluble dans le milieu de culture après clivage du cycle tétrazolium par les déshydrogénases mitochondriales actives des cellules vivantes seules. Les cellules mortes ne peuvent être le siège de ce changement. La solution de MTT (concentration finale de 0,5 mg/ml) est ajoutée aux cellules pour 4h d'incubation. Le milieu est ensuite aspiré avec 20 précaution afin de ne pas aspirer les cristaux de formazan formés, lesquels seront solubilisés dans 100 l de DMSO. Le matériel dissous est mesuré par spectrophotométrie donnant une absorbance proportionnelle à la concentration de colorant converti. L'absorbance de chaque puits est mesurée à 540-630 après soustraction du bruit de fond sur le spectrophotomètre. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle (DMSO seul). 25 Test de sécrétion d'insuline Les ilôts de Langerhans de pancréas de porc sont obtenus auprès du Centre Européen du Diabète (Hautepierre, France). 100 ilôts/puis sont ensemencés dans des plaques 24 puits et cultivés dans du milieu RPMI 1640 enrichi avec du sérum de veau foetal (10%). Les cellules sont traitées avec les différents extraits de plantes (200 tg/ml) pendant 60 minutes et la 8 2908309 9 sécrétion d'insuline mesurée à l'aide d'un kit Elisa (Mercodia) selon les recommandations du fournisseur. Les résultats sont exprimés en pourcentage du contrôle (DMSO seul). Exemple 1: Etude de l'effet de plantes sélectionnées sur l'activité métabolique de cellules Des cellules INS1 ont été traitées pendant 24 heures avec 200 g/ml d'extrait de plante 5 obtenus par extraction à l'aide d'éthanol, de méthanol ou de dichorométhane. Le taux de conversion du MTT a été calculé et l'effet des extraits exprirné en pourcentage du contrôle. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 1 : extraits éthanolique (total), méthanolique (enrichi en composés polaires) et dichlorométhanique (enrichi en composés apolaires). Dans ce tableau, EtOH = fraction éthanol ; McOH = fraction méthanol ; DCM = 10 fraction dichlorométhane. 2908309 Tableau 1 Genre / Espèce / Partie Pourcentage du contrôle (%) EtOH DCM MeOH Strychnos myrtoides / feuilles 128 107 121 Obetia radula / écorce, tige 112 127 116 Trema orientalis / racines 319 103 355 Voacanga thouarsii / écorce 120 91 111 Arctium majus / feuilles 63 80 ND Arctium majus / racines 156 77 162 Cynara scolymus / feuilles 72 75 123 Geranium robertianum / partie aérienne 172 145 164 Kalanchoe crenata / partie aérienne 107 ND ND Rubus fructicosus / feuilles 130 151 220 Spathodea campanulata / écorce 114 ND ND Sclerocarya birrea / feuilles 284 119 263 Alchemilla vulgaris / partie aérienne 189 117 201 Cichorium intybus / feuilles 122 139 129 Cichorium intybus / racines 105 83 98 Leptodenia madagascariensis / feuilles 109 132 125 Moringa ofeifera / feuilles 104 118 102 Agrimonia eupatoria / partie aérienne 205 121 221 Phaseolus vulgaris / cosses 103 104 86 Vaccinium myrtillus / feuilles 163 172 147 Juglans regia / feuilles 152 110 223 Morus nigra / feuilles 104 117 110 Olea europaea / feuilles [130 135 133 L'examen de ces résultats montre que l'ensemble des plantes sélectionnées a un effet sur l'activité métabolique des cellules. 10 2908309 Exemple 2: Profils HPLC Les fractions actives sont soumises à une RP-HPLC analytique afin d'avoir l'empreinte chromatographique des extraits par rapport à leur activité biologique. Les figures 1-8 donnent, respectivement, les profils RP-HPLC des fractions éthanoliques de Trema 5 orientalis, Strychnos myrtoides, Obetia radula, Vaccinium myrtillus, Sclerocarya birrea, Agrimonia eupatoria, Alchemilla vulgaris et Olea europaea. Les fractions sont ensuite purifiées par RP-HPLC semi-préparative puis soumises au test de MTT afin de confirmer et d'identifier le principe actif. Pour ce test, les cellules 1NS 1 ont été traitées avec 100, 200, 400 ou 800 p.g/ml d['extrait de plante pendant 24h. Un exemple de 10 résultat obtenu avec Trema orientalis est présenté dans la Figure 9. Les abréviations données sur cette figure ont les significations suivantes: TC: témoin cellule seule; DMSO: témoin cellule seule + solvant (DMSO); A-J: fractions obtenues après RP-HPLC semipréparative (détail des fractions présenté figure 1). Le taux de conversion est présenté après mesure de la densité optique à 560 nm. 15 Exemple 3: Effet des extraits de plantes sélectionnées sur la sécrétion d'insuline Il existe quatre classes thérapeutiques d'antidiabétiques distinctes pour traiter le diabète de type 2. Parmi elles, les sulfonylurées, médicament phare aux Etats-Unis pour le traitement du diabète de type 2. Les sulfonylurées favorisent la sécrétion d'insuline par le pancréas et préviennent donc par ce biais l'hyperglycémie. Puisque les plantes sont actives 20 sur le métabolisme cellulaire, afin de déterminer si les actifs appartenaient à une des 4 classes thérapeutiques connues, en particulier les sulfonylurées, l'activité de ces extraits a été vérifiée sur un test de sécrétion d'insuline sur ilôts de Langherans porcins. Les ilôts de Langherans de porc ont été traités pendant 60 minutes avec 200 pg/ml d'extrait de plante. La sécrétion d'insuline est mesurée par test ELISA et l'effet des extraits exprimé 25 en pourcentage du contrôle. Les résultats sont donnés dans le tableau 2 suivant. Dans ce tableau, EtOH, MeOH et DCM correspondent, respectivement, aux extraits éthanolique (total), méthanolique (enrichi en composés polaires) et dichlorométhanique (enrichi en composés apolaires). 11 12 2908309 Tableau 2 Genre / Espèce / Partie Pourcentage du contrôle (%) EtOH MeOH DCM Strychnos myrtoides / feuilles 641 604 364 Obetia radula / écorce, tige 493 392 134 Trema orientalis / racines 235 408 201 Voacanga thouarsii / écorce 352 256 384 Arctium majus / feuilles 118 ND 136 Arctium majus / racines 157 140 119 Cynara scolymus / feuilles 101 105 252 Geranium robertianum / partie aérienne 83 138 226 Kalanchoe crenata / partie aérienne ND ND ND Rubus fructicosus / feuilles 86 98 168 Spathodea campanulata / écorce ND ND ND Sclerocarya birrea / feuilles 81 108 118 Alchemilla vulgaris / partie aérienne 110 162 139 Cichorium intybus / feuilles 100 105 171 Cichorium intybus / racines 100 123 114 Leptodenia madagascariensis / feuilles 197 161 271 Moringa ofeifera / feuilles 216 152 336 Agrimonia eupatoria / partie aérienne 129 137 178 Phaseolus vulgaris / cosses 117 134 115 Vaccinium myrtillus / feuilles 171 134 122 Juglans regia / feuilles 100 180 76 Morus nigra / feuilles 114 189 380 Olea europaea / feuilles 109 139 230 2908309 Références Impaired Mitochondrial Activity in the Insulin-Resistant Offspring of Patients with Type 2 Diabetes. KF Petersen, S Dufour, D Befroy, R Garcia, and GI Shulman. N Engl J Med, 350: 664-671 (2004) 5 Mitochondrial Dysfunction in the Elderly : Possible Role in Insulin Resistance. KF Petersen, D Befroy, S Dufour, J Dziura, C A.riyan, DL Rothman, L DiPietro, GW Cline and GI Shulman. Science, 300: 1140-1142 (2003). Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. T Mosmann, J Immunol Methods, 65(1-2):55-63 (1983). 13 10 14