INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Ce procédé peut être conduit en l'absence de solvant dans les étapes (A) et/ou (B), de préférence dans les étapes (A) et (B) (introduction des enzymes sous forme sèche, et en tout état de cause sous la forme la plus concentrée possible), ce qui permet d'obtenir un extrait de ficoïde glaciale particulièrement riche en principes actifs et constitué essentiellement des composés de la ficoïde glaciale elle-même, non dilués dans un milieu dispersant, et donc entièrement naturel. Le broyage réalisé dans l'étape (A) peut être conduit selon toute méthode de cryobroyage ou cryoextraction connue en soi. Par exemple, le broyage réalisé peut être conduit en utilisant des dispositifs de type presse, pilon ou broyeur à marteau. L'étape (A) est spécifiquement conduite en plaçant la ficoïde glaciale à une température inférieure à sa température de congélation, et de préférence en conservant la ficoïde glaciale à une température inférieure à sa température de congélation pendant toute la durée de l'étape (A). Pour ce faire, et compte tenu de l'échauffement dû au broyage, il est préférable de conduire l'étape (A) à une température maintenue inférieure d'au moins 5°C à la température de congélation de la ficoïde glaciale, et plus préférentiellement inférieure d'au moins 10°C, voire d'au moins 15°C à sa température de congélation. Typiquement, l'étape (A) est conduite en portant la ficoïde glaciale à une température inférieure à -10°C, et plus préférentiellement inférieure ou égale à -18°C. La ficoïde glaciale est plus avantageusement portée à des températures inférieures, par exemple en la plongeant dans un milieu cryogénique de type azote liquide (-196°C). L'étape (A) peut être conduite sur une ficoïde glaciale précongelée ou surgelée aux températures précitées préalablement à l'étape (A). Une autre possibilité est de réaliser l'étape (A) sur de la ficoïde glaciale fraîche qui n'est portée à une température inférieure à sa température de congélation qu'au moment de la mise en oeuvre de l'étape (A), typiquement en plongeant la ficoïde glaciale dans l'azote liquide ou un autre fluide cryogénique, ou en versant un fluide cryogénique de type azote liquide sur la ficoïde glaciale fraîche (par exemple dans un dispositif de broyage (broyeur, pressoir, mortier) où la ficoïde glaciale fraîche a été initialement introduite). A titre de méthodes de cryobroyage ou de cryoextraction utilisables dans le cadre de l'étape (A), on peut par exemple citer celles du type décrit dans la demande FR 2 652 265.
EXEMPLES Dans les exemples suivants, l'extrait de ficoïde glaciale a été préparé comme suit.
L'extraction a été réalisée sur des parties aériennes de plants de ficoïde glaciale (Mesembryanthemum crystallinum) cultivés en serre, la récolte des parties aériennes ayant été effectuée au bout de 3 mois environ. Les parties aériennes ainsi récoltées ont été utilisées dans les extractions décrites ci-après, soit à l'état frais, soit après congélation. Le cas échéant, la congélation des parties aériennes a été effectuée à -18°C. Cryobroyage On a introduit 500 g du matériau végétal, à l'état congelé, dans un mortier. On a versé de l'azote liquide dans ce mortier et le matériau ainsi porté à -196°C a été broyé au pilon jusqu'à l'obtention d'une poudre (cryobroyat).
Enzymolyse Le cryobroyat obtenu à l'issue de l'étape précédente a été transféré dans un bécher placé dans un bain-marie à 50°C (qui correspond à la température optimale de fonctionnement des enzymes employées dans cette étape). Lorsque la température a atteint le point de fusion, et que le cryobroyat est devenu liquide, on y a ajouté 2,5 g d'un cocktail enzymatique comprenant, en masse par rapport à la masse totale du cocktail enzymatique : 33.3% de cellulyve AN3500 � (cellulase) ; 33.3% de peclyve V extraction liquide �(pectinase), 33.3% d'un mélange d'hémicellulases comprenant, en masse par rapport à la masse dudit mélange : 50% de Feedlyve AXC 1500L� et 50% de Feedlyve AG L 1500P�) Si besoin est, le pH du milieu est ajusté à 4,5, la quantité d'acide ou de base à introduire pour réguler le pH étant alors négligeable (quelques microlitres tout au plus). En outre aucun solvant (eau par exemple) n'est ajouté, le cryobroyat décongelé ayant une teneur en eau suffisante pour assurer la dispersion des enzymes. 8 Le mélange obtenu a été agité par une hélice, à 400 tours/minute pendant 1 heure ; puis à 250 tours/minute pendant 7 heures. Le mélange obtenu à l'issue de ces différents traitements a été filtré, sur une toile de nylon de 55 �m. Le filtrat a été centrifugé à 18500 g pendant 15 minutes. Le surnageant est filtré sur plaque de cellulose de seuil de coupure de 3 à 7 �m. On a ainsi obtenu un extrait végétal de ficoïde glaciale.
On observe alors de façon avantageuse un effet de synergie. L'association d'un extrait de sureau et d'une souche de lactobacillus rhamnosus selon l'invention a montré de bonnes capacités à induire et/ou stimuler une réponse immunitaire non spécifique démontrant ainsi son intérêt dans les domaines alimentaire et/ou pharmaceutique. La composition selon la présente invention peut avantageusement se présenter sous toutes les formes galéniques normalement utilisées dans les domaines alimentaire et/ou pharmaceutique pour une administration par voie orale ou sublinguale. Dans le cas d'un aliment, il peut s'agir notamment de produits laitiers frais, de produits laitiers fermentés, de yaourts, de lait fermentés, de laits infantiles, de poudres, de pastilles, des jus végétaux, des boissons et de leurs mélanges, avantageusement dans le groupe constitué des produits laitiers frais, des jus de fruits et/ou de légumes ou des compotes de fruits.
De façon avantageuse, le fruit est choisi dans le groupe constitué par pomme, orange, fruits rouges, fraise, pêche, abricot, prune, framboise, mure, groseille, citron, pamplemousse, banane, ananas, kiwi, poire, cerise, noix de coco, fruits de la passion, mangue, figue, rhubarbe, melon, fruits exotiques, litchi, raisins, myrtille ou leurs mélanges. Par « complément alimentaire », on entend au sens de la présente invention une denrée alimentaire dont le but est de compléter le régime alimentaire normal et qui constitue une source concentrée de nutriments ou d'autres substances ayant un effet nutritionnel ou physiologique seuls ou combinés. Avantageusement, le complément alimentaire peut comprendre des vitamines et/ou des minéraux et/ou des oligoéléments. Parmi ces vitamines, on peut en particulier citer, les vitamines A, C, D et E et les vitamines du groupe B, notamment, Bl, B2, B3, B5, B6, B8, B9 et B12.
Les vitamines B fonctionnent souvent ensemble au bénéfice de la santé du corps. Elles augmentent le métabolisme, aident à maintenir une peau saine et des muscles en bonne santé, améliorent le système immunitaire, améliorent le système nerveux 5 et retardent les troubles cognitifs de la maladie d'Alzheimer, promeuvent la croissance des cellules ainsi que leur divisions, elles combattent les symptômes causés par un excès de stress. Avantageusement, les minéraux sont choisis parmi le fer, le zinc, le sélénium, le chrome, le manganèse, le molybdène et 10 leurs mélanges. Les sels minéraux sont des substances provenant de roches qui entrent dans la composition des organismes et qui sont présents dans l'alimentation animale et végétale. Ils se présentent sous forme ionique, on distingue les éléments minéraux majeurs, comme le calcium le fer, le magnésium, le 15 phosphore, le potassium, le sodium, le soufre et les oligoéléments comme l'aluminium, l'arsenic, le bore, le chlore, le chrome, le cobalt, le cuivre, le fluor, l'iode, le manganèse, le molybdène, le nickel, le plomb, le silicium, le sélénium le vanadium, le zinc. 20 Le fer est l'un des sels minéraux essentiels au bon fonctionnement de l'organisme. Il a un rôle fondamental dans la constitution de l'hémoglobine contenue dans les globules rouges, dans la constitution de la myoglobine contenue dans les muscles et dans celle de nombreuses enzymes indispensables au 25 fonctionnement de l'organisme. Sa carence est fréquente dans le monde entier, elle se traduit par une anémie, accompagnée d'une réduction de la capacité physique et intellectuelle, d'une diminution de la résistance aux infections. Le zinc joue un rôle antioxydant en tant que cofacteur des 30 enzymes qui participent directement à la défense contre les oxydants. L'oxyde de zinc, le gluconate de zinc, le citrate de zinc, l'acétate de zinc, le chlorure de zinc, le lactate de zinc ou le sulfate de zinc peuvent être utilisés seuls ou en mélange dans les compositions selon la présente invention. 35 Avantageusement il s'agit du gluconate de zinc.
Un autre objet de la présente invention est une composition pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention des infections respiratoires et/ou intestinales.
L'association des 2 actifs n'a pas d'impact sur la production d'IL-2. Aucun des donneurs testés ne répond au sureau par une production d'IL-5. De la même façon, aucun des donneurs testés ne répond au probiotique par une production d'IL-5.
L'association des 2 actifs n'a pas d'impact sur la production d'IL-5. Tous les donneurs testés produisent de l'IL-6 en réponse au sureau. Cinq des 6 donneurs répondent au probiotique, il est à noter que le non-répondeur possède le plus fort taux basal d'IL- 6. Pour les répondeurs, le probiotique est un plus puissant inducteur d'IL-6 que le sureau. L'association des 2 actifs provoque une production synergique d'IL-6.
Le tableau 2 montre un exemple de résultats de l'activité de l'extrait de sureau associé au probiotique Lactobacillus rhamnosus et la contribution de chacun des actifs sur la production d'IL-6 par des cellules mononucléées du sang périphérique humaine obtenus chez les 6 donneurs. Groupes Donneurl Donneur2 Donneur3 Donneur4 Donneur5 Donneur6 témoin 1,6 1,6 7 1,6 69 4 Prob 148 301 968 362 51 1148 Sureau 17 27 44 12 405 17 Prob + 1258 1426 5398 1721 6081 5369 sureau Prob : probiotique, Lactobacillus rhamnosus Aucun des donneurs testés ne répond au sureau par une 10 production d'IL-9. De même, aucun des donneurs testés ne répond au probiotique par une production d'IL-9. L'association des 2 actifs n'a pas d'impact sur la production d'IL-9. Quatre des 6 donneurs testés produisent de l'IL-10 en réponse au sureau. Tous les donneurs testés produisent de l'IL- 15 10 en réponse au probiotique. La concentration d'IL-10 obtenue avec le sureau + le probiotique pour les 6 donneurs est significativement supérieure à la fois à celle obtenue avec le sureau et celle obtenue avec le probiotique. De plus, la concentration de l'IL-10 obtenue avec l'association sureau 20 probiotique est supérieure à la somme de celle obtenue par le probiotique et celle obtenue par le sureau, il y a donc synergie des 2 actifs pour la production d'IL-10. Aucun des donneurs testés ne répond au sureau par une production d'IL-12p70. En revanche, tous les donneurs produisent 25 de l'IL-12p70 en réponse au probiotique. L'association du sureau et du probiotique ne potentialise pas la production d'IL-12p70. Aucun des donneurs testés ne répond au sureau par une production d'IL-15. De même, aucun des donneurs testés ne répond au probiotique par une production d'IL-15. L'association des 2 30 actifs n'a pas d'impact sur la production d'IL-15.
Aucun des donneurs testés ne répond au sureau par une production d'IL-17A. Il en est de même pour la réponse au probiotique : il n'induit la production d'IL-17A chez aucun des donneurs. L'association des 2 actifs n'a pas d'impact sur la production d'IL-17A. Tous les donneurs testés répondent au sureau par une production de CCL2. Cinq des 6 donneurs répondent au probiotique, il est à noter que le non-répondeur possède le plus fort taux basal de CCL2, le probiotique déclenche une réponse plus forte que le sureau. L'association des 2 actifs stimule une forte sécrétion de CC12 significativement supérieure au sureau mais pas au probiotique. Tous les donneurs testés répondent au sureau par une production de CCL3. Cinq des 6 donneurs répondent au probiotique, il est à noter que le non-répondeur possède le plus fort taux basal de CCL3, le probiotique déclenche une réponse plus forte que le sureau. La concentration de CCL3 obtenue avec le sureau + le probiotique pour les 6 donneurs est significativement supérieure à la fois à celle obtenue avec le sureau et celle obtenue avec le probiotique. De plus, la concentration de CCL3 obtenue avec l'association sureau probiotique est supérieure à la somme de celle obtenue par le probiotique et celle obtenue par le sureau, il y a donc synergie des 2 actifs pour la production de CCL3.
Tous les donneurs testés répondent au sureau par une production de CCL4. Tous les donneurs testés produisent CCL4 en réponse au probiotique, excepté pour un donneur qui présente un fort taux basal de CCL4, le probiotique déclenche une réponse plus forte que le sureau. La concentration de CCL4 obtenue avec le sureau + le probiotique pour les 6 donneurs est significativement supérieure à la fois à celle obtenue avec le sureau et celle obtenue avec le probiotique. De plus, la concentration de CCL4 obtenue avec l'association sureau probiotique est supérieure à la somme de celle obtenue par le probiotique et celle obtenue par le sureau, il y a donc synergie des 2 actifs pour la production de CCL4.
Aucun des donneurs testés ne répond au sureau par une production de CCL5. Un sel des 6 donneurs produit CCL5 en réponse au probiotique. L'association du sureau et du probiotique n'a pas d'action sur CCL5.
Seuls 2 des 6 donneurs testés produisent CCL22 en réponse au sureau. Tous les donneurs testés produisent CCL22 en réponse au probiotique. L'association des 2 actifs n'a pas d'action synergique sur CCL22. Tous les donneurs testés produisent CXCL8 en réponse au sureau. Cinq des 6 donneurs répondent au probiotique, il est à noter que le non-répondeur possède le plus fort taux basal de CXCL8, le probiotique déclenche une réponse plus forte que le sureau. L'association des 2 actifs provoque une production synergique de CXCL8.
Aucun des donneurs testés ne produit de CXCL10 en réponse au sureau, à l'inverse le sureau inhibe significativement la production constitutive de CXCL10. Cinq des 6 donneurs répondent au probiotique. L'association des 2 actifs montre que le sureau inhibe significativement la production induite par le probiotique. Tous les donneurs testés produisent du TNFa en réponse au sureau. Tous les donneurs testés produisent du TNFa en réponse au probiotique. Cette production est plus intense que celle déclenchée par le sureau. L'association du sureau et du 25 probiotique n'a pas d'impact sur la production de TNFa. Aucun des donneurs testés ne produit d'IFNy en réponse au sureau, en revanche, tous les donneurs testés produisent de l'IFNy en réponse au probiotique. L'association du sureau et du probiotique n'a pas d'impact sur la production d'IFNy. 30 Aucun des donneurs testés ne produit de GM-CSF en réponse au sureau. N revanche 5 des 6 donneurs produisent du GM-CSF en réponse au probiotique. La concentration de GM-CSF obtenue avec le sureau + le probiotique pour les 6 donneurs est significativement supérieure à la fois à celle obtenue avec le 35 sureau et celle obtenue avec le probiotique. De plus, la concentration de GM-CSF obtenue avec l'association sureau probiotique est supérieure à la somme de celle obtenue par le probiotique et celle obtenue par le sureau, il y a donc synergie des 2 actifs pour la production de GM-CSF.
Exemple 1 : activité de l'extrait de ficoïde glaciale sur la prolifération des fibroblastes
Différentes études ont été réalisées sur des fibroblastes dermiques humains normaux obtenus par méthode enzymatique de plasties abdominales ou mammaires ensemencés en monocouche dans les conditions de culture adéquates avec du milieu DMEM (milieu de Dulbecco (� Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium � en anglais) - Invitrogen�). Après 24h de culture, les cellules ont été traitées avec 0,5 % en volume/volume d'extrait de ficoïde glaciale. A terme, la viabilité cellulaire a été évaluée par quantification de l'activité métabolique des déshydrogénases mitochondriales, par mesure d'hydrolyse du MTT (MéthylThiazoleTétrazolium - Sigma Aldrich�) après 1, 2, 3 et 6 jours de culture (Chaque condition a été réalisée quatre fois et l'expérience, renouvelée deux fois). Les données du tableau 1 concernent le pourcentage de viabilité des fibroblastes en fonction des traitements. Le témoin positif correspond à l'adjonction de SVNN (5 % en volume/volume, sérum de veau nouveau né, Invitrogen�) et le témoin négatif, au milieu de culture seul (DMEM seul, Invitrogen�) qui sert de base 100.
Tableau 1 : Pourcentage de viabilité des fibroblastes en fonction des traitements. Durée du % de Viabilité des Fibroblastes Humains Normaux traitement Témoin négatif Témoin positif Ficoïde Glaciale (0,5%) J1 100 106 99 J2 100 133 104 J3 100 136 124 J6 100 139 149 Cet exemple montre que l'adjonction de l'extrait de ficoïde glaciale dans le milieu de culture permet aux fibroblastes de mieux proliférer et donc de stimuler leur renouvellement cellulaire à hauteur de 49% après une cinétique de 6 jours. Exemple 2 : activité de l'extrait de ficoïde glaciale sur la protection et la réparation des fibroblastes face à un stress hydrique Des cultures de fibroblastes humains normaux ont été réalisées et soumises à un stress hydrique (cellules sans milieu de culture) pendant 2,5h. 24h après les stress, la viabilité résiduelle des cellules a été évaluée par quantification de l'activité métabolique des déshydrogénases mitochondriales, par mesure d'hydrolyse du MTT (MéthylThiazoleTétrazolium - Sigma Aldrich�). Les traitements avec l'extrait de ficoïde glaciale étaient préventif (avant le stress) et curatif (après le stress) et à 0,5% ou 5.10-2% en volume/volume de ficoïde glaciale. Ces stress occasionnent une mortalité cellulaire : la viabilité résiduelle est en moyenne de 70%.
Les données du tableau 2 ci-après concernent le pourcentage de viabilité résiduelle des fibroblastes en fonction des traitements. Le témoin interne correspond à l'adjonction de SVNN (5% en volume/volume) et le témoin négatif, au milieu de culture seul (DMEM (Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium), Invitrogen� + 1 % en poids/volume SVNN) ayant subi le stress, qui sert de base 100 dans chaque condition pour les calculs. Chaque condition a été réalisée deux fois et l'expérience, renouvelée deux fois.
Tableau 1 : Pourcentage de viabilité des fibroblastes en fonction des traitements. Viabilité des cellules DMEM 1% DMEM 5% Ficoïde Ficoïde soumises à un SVNN (témoin SVNN Glaciale Glaciale stress avec négatif) (témoin positif) (0,5%) (5.10-2%) traitements Traitement curatif 100% 98% 120% 118% Traitement préventif 100% 111°/o 116% 117% Les traitements n'entraînent pas de modifications de la viabilité cellulaire en conditions normales ; en conditions de stress, des effets protecteurs sont observés pour les deux types de traitement. L'extrait de ficoïde glaciale permet donc non seulement de protéger l'activité métabolique des fibroblastes en condition de stress hydrique mais aussi de réparer les dommages liés à ce stress. Exemple 3 : activité de l'extrait de ficoïde glaciale sur la protection des fibroblastes face à un stress solaire
Des cultures de fibroblastes humains normaux obtenus par méthode enzymatique de plasties abdominales ou mammaires, ont été réalisées dans les mêmes conditions que celles de l'exemple 1 et soumises à un stress physique (UV) délivré par une dose énergétique d'irradiation en un temps déterminé par un irradiateur solaire (SUNTEST CPS+, 760W/m2 pendant 16 minutes). Cette dose énergétique d'irradiation a été déterminée afin de provoquer environ 50% de mortalité cellulaire. Elle permet d'observer, par une augmentation du pourcentage de viabilité cellulaire, tout effet bénéfique de l'extrait de ficoïde glaciale sur le métabolisme cellulaire. 24h après ce stress, les analyses suivantes ont été réalisées : dosage fluorimétrique au CellTiter-Blue qui permet de quantifier l'activité métabolique mitochondriale correspondant à la viabilité cellulaire résiduelle avec ou sans irradiation, dosage par colorimétrie à la sulforhodamine B les protéines cellulaires totales. Comme dans l'exemple 2, le traitement (0,5%; 5.10-2% et 5.10-3% en volume/volume) a été réalisé avant et/ou après le stress. Le témoin interne est le DMEM, seul (témoin négatif). Chaque condition a été réalisée trois fois et l'expérience, renouvelée deux fois. Les résultats sont consignés dans les tableaux 3 et 4 suivants : Tableau 3 : Pourcentage de viabilité des fibroblastes en fonction des traitements. 0/0 de viabilité cellulaire (CTB) plaque non irradiée plaque irradiée à 760W/m2-16min Témoin 100 53 préventif 101 40 FG 0,5% curatif 102 36 curatif+préventif 102 31 préventif 101 42 FG 5.10-2% curatif 103 49 curatif+préventif 103 47 préventif 103 55 FG 5.10-3% curatif 104 48 curatif+préventif 104 46 Tableau 4 : Pourcentage de viabilité des fibroblastes en fonction des traitements. 0/0 de protéines totales 0/0 de protéines totales (SRB) rapportées au % de viabilité cellulaire plaque non plaque plaque non plaque irradiée irradiée à irradiée irradiée à 760W/m2- 760W/m2- 16min 16min Témoin 100 61 100 115 préventif 103 58 102 145 FG 0,5% curatif 98 54 96 150 curatif+préventif 103 53 101 171 préventif 109 56 108 133 FG 5.10-2% curatif 107 59 104 120 curatif+préventif 106 57 103 121 préventif 106 60 103 109 FG 5.10-3% curatif 103 59 99 123 curatif+préventif 103 60 99 130 Les résultats montrent que l'extrait de ficoïde glaciale stimule le métabolisme des fibroblastes en condition de stress solaire, sans pour autant augmenter leur viabilité résiduelle. L'extrait de ficoïde glaciale prévient et répare les dommages cellulaires provoqués par les radiations solaires.
Exemple 4 : activité de l'extrait de ficoïde glaciale sur la stimulation du métabolisme des kératinocytes Des cultures de kératinocytes humains normaux (KHN) obtenus par méthode enzymatique de plasties abdominales ou mammaires ont été réalisées en KSFM (keratinocytes serum free medium, invitrogen�) et traitées avec l'extrait de ficoïde glaciale (0,5%; 5.10-2% et 5.10-3% en volume/volume). Des dosages de viabilité et des dosages protéiques ont été réalisés à l'issue de 5 jours de culture.
Le témoin correspond au KFSM seul. Les résultats sont consignés dans le tableau 5 suivant :
Tableau 5 : Pourcentage de viabilité des kératinocytes en fonction des traitements. 0/0 protéines 0/0 totales de protéines totales rapportées au % de viabilité cellulaire Témoin 100 100 FG 0,5% Traitement total 96 98 FG 5.10-2% Traitement total 114 114 FG 5.10-3% Traitement total 124 120 Les résultats montrent que l'extrait de ficoïde glaciale ne stimule pas la viabilité des kératinocytes mais stimule leur métabolisme protéique.
Exemple 5 : activité de l'extrait de ficoïde glaciale sur la protection des kératinocytes face à un stress hydrique
Des cultures de kératinocytes humains normaux ont été réalisées et soumises à un stress hydrique (cellules sans milieu de culture) pendant 2,5h. 24h après les stress, la viabilité résiduelle des cellules a été évaluée par quantification de l'activité métabolique des déshydrogénases mitochondriales, par mesure d'hydrolyse du MTT (MéthylThiazoleTétrazolium). Les traitements avec l'extrait de ficoïde glaciale étaient préventif (avant le stress) et curatif (après le stress) et à 0,5% ou 5.10-2% en volume/volume de ficoïde glaciale. Ces stress occasionnent une mortalité cellulaire : la viabilité résiduelle est en moyenne de 70-80%.
Les données du tableau 6 ci-après concernent le pourcentage de viabilité résiduelle des kératinocytes en fonction des traitements. Chaque condition a été réalisée trois fois et l'expérience, renouvelée deux fois. Le témoin négatif correspond au milieu de culture seul (KSFM) ayant subi le stress, qui sert de base 100 dans chaque condition pour les calculs.