Les cancers du côlon et du rectum sont la seconde cause de décès par cancer dans les pays développés, avec 945 000 cas/an et 452 000 décès/an dans le monde (OMS 2003). En France cela représente environ 36 000 cas/an avec un taux de survie sur 5 ans de 40-50%, soit 16 000 décès par an. Le risque de cancer colorectal est comparable chez les hommes et chez les femmes et, à 70 ans, environ 1 personne sur 25 aura été atteinte. Aujourd'hui, la stratégie thérapeutique est basée sur la chirurgie et une chimiothérapie palliative à base de 5-FU modulé par l'acide folinique en association avec l'irinotécan ou le méthotrexate. Récemment, l'association 5-FU/oxaliplatine a reçu l'agrément de la FDA aux Etats-Unis pour le traitement en première ligne du cancer colorectal métastatique, malgré une neurotoxicité avérée. Le mauvais pronostique du cancer colorectal est lié à un diagnostic posé tardivement ce qui est d'autant plus regrettable que le développement de ce cancer s'étend sur plusieurs années, voire dizaines d'années. Ce développement est initié par l'apparition de lésions précancéreuses, qui sont d'abord des foyers de cryptes hyperprolifératives, ou foyers de cryptes anormales (FCA), au niveau de la muqueuse colique. Certains de ces FCA se transforment progressivement en polypes, lesquels peuvent éventuellement dégénérer ensuite en tumeurs. ll est clair qu'un dépistage précoce, au niveau des lésions précancéreuses, et leur traitement, permettrait une intervention bien plus efficace. Cette longue période de transition des lésions précancéreuses vers des tumeurs invasives offre en effet une large fenêtre d'intervention pour toute action pharmacologique visant à prévenir ou à freiner cette progression. De fait, le cancer colorectal paraît particulièrement bien indiqué pour le développement de stratégies de chimioprévention. A l'heure actuelle, les premiers essais (vitamine D + Calcium, aspirine, celecoxib etc...) ont d'ores et déjà été conduits avec des résultats décevants pour certains (vitamine D + Calcium) et plus encourageants pour d'autres (celecoxib, aspirine), mais ces résultats doivent encore être confirmés et affinés. D'autres essais sont en cours et cette voie de recherche dédiée à la chimioprévention du cancer colorectal est aujourd'hui en pleine expansion. Dans la recherche de nouveaux composés utilisables en chimioprévention, certains constituants végétaux offrent des pistes intéressantes. Des études expérimentales montrent en effet que certains microconstituants présents dans l'alimentation, en particulier ceux apportés par les végétaux, pourraient avoir une action 2910325 2 préventive sur le processus de la cancérogenèse (Wattenberg L.W., 1992, Inhibition of carcinogenesis by minor dietary constituents. Cancer Res. 52, 7suppl. 2085-2091). Selon les composés testés, un effet protecteur peut être observé soit durant la phase d'initiation, soit durant la phase de promotion et de progression du développement 5 tumoral. Les mécanismes d'action possibles des phytoconstituants sont multiples. Ils peuvent agir sur des cibles génomiques, en modulant l'expression de gènes spécifiques, par exemple en agissant sur la méthylation de l'ADN, sur l'acétylation des histones. Ils peuvent également interagir directement sur certaines protéines régulatrices, des enzymes ou d'autres substances endo- ou exogènes (Wattenberg L.W., supra ; 10 Wargovich M.J. et al., 2000, Efficacy of potential chemopreventive agents on rat colon aberrant crypt formation and progression. Carcinogenesis 21, 6 : 1149-55). Ces phytoconstituants peuvent avoir des répercussions sur de nombreuses voies métaboliques, sur le statut rédox, sur la transduction de signaux intervenant dans le contrôle de la prolifération et de la mort cellulaire (Wattenberg L.W., supra). 15 Dans ce contexte, les inventeurs ont étudié les propriétés de différents constituants isolés d'extraits issus de la filière brassicole. Des études préliminaires sur des cellules en culture ont permis de mettre en évidence une activité antiproliférative importante de deux constituants des extraits préparés à partir de cônes de houblon (résines a et (3). 20 Les résines 13 ou lupulones correspondent à des acides phénoliques alicycliques, différant des résines a ou humulones par la présence d'une chaîne isoprényle à la place d'un fonction hydroxyle acide. Ces résines, appelées aussi acides a et 13, sont synthétisées exclusivement par les cônes de houblon (Humulus lupulus L., Cannabaceae). Elles existent naturellement sous 5 formes différentes, selon la longueur 25 de la chaîne latérale (co : iso-butyroyle ; n : iso-valéroyle ; ad : méthyl 2-butyroyle ; pré : isopentoyle ; post : propionoyle), les formes co- et n- étant majoritaires. Des extraits de houblon préparés par CO2 supercritique concentrent ces résines a et (3, très lipophiles. Ces extraits concentrés sont utilisés par l'industrie brassicole, qui les ajoute au cours de la cuisson du moût pour apporter arôme et 30 amertume à la bière. Les lupulones, contrairement aux humulones, ne se retrouvent pas dans la bière mais sont piégées lors de la centrifugation du moût dans le "trouble whirlpool", qui est une matière de consistance boueuse contenant des protéines coagulées et des résidus de houblon et constitue actuellement un déchet industriel. Les résultais expérimentaux présentés ci-dessous, obtenus sur un 35 modèle animal de cancer du côlon, montrent le potentiel anticancérogène des lupulones, qui inhibent la phase d'initiation du cancer (formation de foyers de cryptes anormales, 2910325 3 ou FCA), mais également les phases ultérieures (la transformation des FCA en polypes, et la transition des polypes en tumeurs). La présente invention porte donc en premier lieu sur l'utilisation de lupulones, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber la formation de 5 foyers de cryptes anormales au niveau de la muqueuse du côlon d'un mammifère. Selon cet aspect de l'invention, il s'agit donc d'inhiber la phase initiale du processus qui conduit à la formation de tumeurs du côlon. Cette prévention des phases très précoces peut être particulièrement avantageuse chez des sujets qui présentent des facteurs de risque de cancer du côlon, notamment chez des sujets jeunes, en particulier ceux ayant 10 des antécédents familiaux de cancer du côlon ou une prédisposition génétique telle que la polypose adénomateuse familiale ou le syndrome de Lynch. Dans le cadre de la présente invention, on entend par "lupulones" aussi bien les lupulones naturelles extraites du houblon, que des lupulones produites par synthèse chimique ou par hémisynthèse. L'invention peut être mise en oeuvre avec une 15 forme particulière de lupulone purifiée (en particulier l'une des trois formes majoritaires : n-lupulone, colupulone ou adlupulone), ou avec un mélange de plusieurs formes de lupulones. En outre, les lupulones étant très sensibles à l'oxydation et peu solubles dans l'eau, il peut être avantageux, pour mettre en oeuvre la présente invention, d'utiliser un dérivé actif des lupulones. Des tels dérivés peuvent être obtenus, par 20 exemple, en ajoutant des substituants au niveau des fonctions pseudo-phénoliques des différentes formes lupulones., sans toucher à l'intégrité de la structure de la lupulone, afin d'obtenir des composés prodrogues qui pourraient être retransformés en lupulone par des enzymes du type estérases ou hydrolases présentes dans le tube digestif Dans la suite de ce texte, le terme "lupulones" désignera également de tels dérivés actifs des 25 lupulones. A titre d'exemples de tels dérivés, on peut citer le monoacétate et des mono acides obtenus avec l'acide succinique ou glutarique comme représenté sur les schémas présentés à la figure 1. Selon un autre aspect de l'invention, les lupulones sont utilisées pour la préparation d'une composition destinée à inhiber la formation de polypes au niveau 30 de la muqueuse du côlon d'un mammifère. Outre les catégories de sujets mentionnées ci- dessus (ayant des antécédents familiaux et/ou une prédisposition génétique au cancer du côlon), les sujets présentant déjà des foyers de cryptes anormales peuvent très avantageusement bénéficier d'un traitement par une composition selon cet aspect de l'invention, ainsi que les patients présentant un antécédent de polypectomie ou 35 d'exérèse tumorale au niveau colique, ou les personnes âgées, notamment celles de plus de 65 ans ayant un mode de vie sédentaire et/ou une alimentation riche en viandes et pauvre en fruits et légumes. 2910325 4 La présente invention porte également sur l'utilisation de lupulones, pour la préparation d'une composition destinée à inhiber la cancérisation de polypes présents au niveau de la muqueuse du côlon d'un mamrnifère. Bien entendu, cette indication vise en particulier les personnes dont on sait ou on suspecte qu'elles ont des 5 polypes coliques. Ainsi, la présente invention concerne l'utilisation de lupulones pour préparer une composition destinée à prévenir les tumeurs colorectales, en particulier chez des individus présentant un ou plusieurs des facteurs de risque suivants : antécédents familiaux de cancer du côlon ; 10 prédisposition génétique telle que la polypose adénomateuse familiale ou le syndrome de Lynch ; - lésions précancéreuses au niveau du côlon ; antécédent de polypectomie ou d'exérèse tumorale au niveau colique ; - âge supérieur à 65 ans combiné à un mode de vie sédentaire et/ou à une 15 alimentation riche en viandes et pauvre en fruits et légumes. Selon une mise en oeuvre particulière de l'invention, les lupulones sont utilisées sous forme d'extrait du "trouble whirlpool" obtenu dans le procédé de fabrication de la bière. Selon un aspect particulier de l'invention, les lupulones sont utilisées 20 dans une composition nutraceutique telle qu'un aliment fonctionnel ou un complément alimentaire. Par "aliment fonctionnel", on entend une préparation alimentaire à consommer comme un aliment normal bien qu'elle procure des bénéfices supérieurs à la nutrition classique. Un aliment fonctionnel comprenant des lupulones, ou enrichi en lupulones, fait également partie intégrante de la présnete invention. A titre d'exemples 25 non limitatifs d'aliments fonctionnels selon l'invention, on peut citer les jus de fruits, sodas et autres boissons sans alcool, les produits à base de céréales, les yaourts et préparations lactées, les barres chocolatées, la margarine et autres matières grasses à tartiner, les biscuits, etc. Des compléments alimentaires comportant des lupulones font 30 également partie de la présente invention. Ces compléments peuvent se présenter, par exemple, sous forme de gélules, poudres ou comprimés. Bien entendu, ils peuvent contenir d'autres principes actifs, tels que de la vitamine D, du calcium, du magnésium, etc. Alternativement, les lupulones peuvent être utilisées, dans le cadre de 35 la présente invention, pour la préparation d'un médicament. De façon avantageuse, les compositions fabriquées dans le cadre de l'invention sont formulées de façon à permettre l'administration d'environ 30 mg/m2 de 2910325 5 lupulones par jour au mammifère à traiter. En particulier, lorsque ledit mammifère est un humain, la composil:ion peut être formulée pour permettre l'administration de lupulones, en 1 à 3 prises quotidiennes, à raison de 10 à 100 mg/jour, de préférence 30 à 50 mg/jour. 5 Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront des exemples expérimentaux ci-dessous, et des figures annexées. LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : lA : formules développées des humulones et des 10 lupulones. 1B : schéma représentatif des réactions permettant d'obtenir du mono-acétate ou un mono-acide de lupulone. Figure 2 : croissance de cellules SW620 en culture, en présence de différentes concentrations de lupulones issues du trouble Whirlpool. Figure 3 : Phases de la cancérogenèse colique après induction par un 15 cancérogène chimique (A.OM) chez le rat (modèle de cancers sporadiques du colon). Les images ont été obtenues par coloration au bleu de méthylène et observation au microscope optique (X5). Figure 4 : Nombre total de cryptes ou de foyers observés après 6 semaines de traitement. 20 Figure 5 : Nombre de foyers de cryptes hyperprolifératives/cm, après 7 mois de traitement. Figure 6 : 6A : Nombre de tumeurs dans chacun des trois groupes d'animaux après 7 mois de traitement. 6B : Répartition et volume des tumeurs dans les animaux de chaque groupe. 25 EXEMPLES Exemple 1 : Protocole de récupération des résines B (lupulones) à partir du trouble whirlpool issu de la filière brassicole Le "trouble whirlpool" est prélevé des usines de production (Société Brasseries Kronenbourg) et immédiatement congelé (-30 C) pour en faciliter le 30 stockage. Un aliquot est décongelé à température ambiante. 500 grammes sont prélevés et additionnés de 1 litre d'eau déminéralisée dans un récipient protégé de la lumière. Le mélange est agité à l'aide d'un agitateur magnétique à 400t/min durant 15 minutes, à température ambiante. Le mélange homogénéisé est réparti équitablement 35 dans des godets de centrifugation légèrement opaques, de forte contenance (max 750 ml) et à couvercle vissable. Après équilibrage des poids des godets, ils sont centrifugés entre 200 et 300 g, pendant 10 min à 15 C. Les surnageants sont écartés. Cette 2910325 6 opération est effectuée jusqu'à ce que les eaux de lavages soient parfaitement claires et limpides. Un minimum de trois lavages successifs à l'eau distillée est nécessaire. Chaque culot de centrifugation obtenu est additionné de 250 ml d'éthanol pur, qualité CLHP (chromatographie liquide haute performance). A l'aide 5 d'une spatule rigide en inox, le "trouble whirlpool" qui adhère au fond du godet est détaché. Une fois le couvercle du godet revissé, le godet est agité énergiquement pendant 1 à 2 min pour homogénéiser la solution. Les godets sont mis à centrifuger à 200 à 300 g pendant 15 min à 15 C. Cette opération est effectuée jusqu'à ce que les surnageants soient parfaitement incolores. Un minimum de trois extractions successives 10 est nécessaire. Les surnageants réunis constituent le mélange de lupulones, constitué majoritairement de co-lupulone et de n-lupulone. Ce mélange est filtré sous vide, à l'aide d'un verre fritté de porosité 2-3 m, à l'abri de la lumière. Il est ensuite rapidement transvasé dans un. ballon opaque puis concentré à sec, sous pression réduite, 15 en ne dépassant pas 30 C. A la fin de l'évaporation, la solution prend l'aspect d'une suspension blanchâtre dans laquelle précipitent de petites boulettes marron foncé. Cette solution concentrée est reprise dans un faible volume d'eau déminéralisée (40-50 ml) et à l'aide d'une spatule inox, l'extrait lipophile est décroché des parois du ballon. Le mélange est ensuite transvasé dans un tube à centrifuger, puis 20 centrifugé entre 200 et 300 g pendant 10 min, à 15 C. Le surnageant est éliminé. Un aliquot du culot est repris dans du méthanol et immédiatement analysé par CLHP (chromatographie liquide haute performance) pour vérifier l'absence de dégradation des lupulones. Si l'absence d'hulupones (produits d'oxydation des lupulones) est confirmée, le culot est ensuite conservé à -30 C. 25 II sera décongelé à température ambiante et à l'abri de la lumière, puis immédiatement utilisé (préparation de solutions extemporanées). Le rendement massique moyen est de 0,8 % soit 8g de lupulones récupérées à partir d' l kg de "trouble whirlpool". Leur degré de pureté relatif (2,.,27o nm) est d'au minimum 80%. 30 Exemple 2 : Effets des lupulones sur la prolifération de cellules in vitro L'effet des lupulones et d'autres composés issus du houblon a été testé dans un premier temps sur 4 lignées cellulaires humaines de cancer colique ou colorectal : HT29, CaCo-2, SW280 et SW620. Les principaux constituants des extraits préparés à partir de cônes de 35 houblon et recherchés par l'industrie brassicole pour leurs qualités aromatiques et amérisantes (résines a et [3) présentent une activité antiproliférative supérieure aux 2910325 7 autres constituants naturels étudiés. En particulier, les lupulones présentent d'excellents résultats. Le Tableau 1 ci-dessous montre les résultats obtenus sur les cellules CaCo-2. Echantillons Teneurs moyennes dans la bière P.M. % pureté IC50 pM IC50 Ng/ml humulones: a-acides 74 22,5 8 ...%nH+...%coH 0.5mg/L 355 humulones = a-acides 97 12.7 4,5 85% nH + 12% coH Résines a -- ù isohumulones: iso-a-acides 15 mg / L 538 64,5 28 15 isocoH + isoH + isoadH tétrahydro-isohumulones: 3 mg/L 360 97,9 11,1 4 tétrahydro-isocoH + isoadH Résines R lupulones = 13 acides 407 60 11 4,5 35% nL + 25% coL Whirlpool xanthohumol 354 > 95 10 3.5 Polyphénols naringénine 0.04 - 4 mg / L 272 > 95 25 8-prényl-naringénine 340 95 20,6 7 Tableau 1 : effet de différents extraits sur la croissance des cellules CaCo-2 Une inhibition de croissance de 50% a en effet été observée avec les 5 lupulones à la concentration de I l M. Les inventeurs ont en outre démontré que ces effets anti-prolifératifs sont dus à l'activation d'un processus de mort programmée dans ces cellules, induit par les lupulones (altération du cycle cellulaire, activation de caspases, fragmentation de l'ADN). L'effet des hulupones, produit de dégradation des lupulones, est moins 10 important, puisque pour ces composés, testés sur les cellules CaCo-2, IC50 = 20 g/ml. La figure 2 montre l'effet de différentes concentrations de lupulones issues du trouble Whirlpool sur la croissance de cellules SW620 en culture. Pour ces cellules, la concentration entraînant une inhibition de croissance de 50% est de 8,5 g/ml. 15 Exemple 3 : Effets des lupulones sur la formation de lésions précancéreuses Les effets des lupulones ont ensuite été testés dans un modèle animal de cancérogenèse colorectale. Ce modèle reproduit en un an les différentes étapes de la cancérogenèse colorectale observée chez l'homme qui se déroulent sur une période de plusieurs dizaines d'années dans les cas de cancers colorectaux sporadiques qui 20 représentent plus de 80% des cas. Des rats Wistar adultes d'un poids de 230-250g (n=12) ont reçu par voie intrapéritonéale une injection d'azoxyméthane (AOM : 15 mg/kg de poids corporel), une fois par semaine pendant 2 semaines, dans le but d'initier un processus de cancérogenèse colorectale. La figure 3 illustre les différentes phases de la 25 cancérogénèse colique après induction par l'AOM chez le rat, en absence de traitement. 2910325 8 Une semaine après la dernière injection d'AOM, les animaux ont été répartis aléatoirement en 3 groupes de 6 animaux. Les groupes expérimentaux ont reçu comme boisson une solution contenant 0.01% ou 0.005 A (V/V) de l'extrait lupulone dans de l'éthanol à 1% (V/V) et 5 0.001% d'acide ascorbique (V/V). Cette solution a été renouvelée tous les jours pendant la période expérimentale (6 semaines). Le groupe AOM-contrôle a reçu 1% d'éthanol et 0.001% d'acide ascorbique dans les mêmes conditions. L'éthanol favorise la dissolution des lupulones et l'acide ascorbique (Vitamine C) est un antioxydant puissant permettant d'éviter l'oxydation et la dégradation des lupulones. 10 La consommation moyenne quotidienne de lupulones, pour le groupe ayant reçu la solution de l'extrait lupulone la plus diluée, est de 5 mg/kg de poids corporel, soit 30 mg/ln'. Six semaines après le début du traitement avec les lupulones, le côlon a été prélevé sous anesthésie. La mesure de cryptes anormales hyperprolifératives 15 (précancéreuses) a été réalisée dans la moitié distale du côlon (longueur du segment: 5-6 cm). Le segment prélevé a été lavé dans une solution de NaCl 0.9%, ouvert longitudinalement puis épinglé à plat (face muqueuse sur le dessus) au fond d'une boîte de Pétri et immergé dans une solution Krebs Ringer contenant 4% de formaldéhyde. Pour l'analyse, le segment a été placé pendant 5-10 min dans une solution de bleu de 20 méthylène à 0.5% pour coloration, puis rincé dans une solution de Krebs Ringé et placé sur une lame de verre pour observation. Le segment a été observé au microscope optique (grossissement 5X) et le nombre de foyers de cryptes aberrantes a été compté. Les critères retenus pour l'identification des cryptes aberrantes hyperprolifératives sont: (a) un épaississement du contour de la crypte, (b) sa dilatation, (c) la formation de 25 foyers contenant plusieurs cryptes anormales (d) une rétention de la coloration liée à la présence d'amas cellulaires (figure 3A). Les résultats illustrés dans la figure 4 démontrent que l'administration de lupulones induit une diminution de près de 50% du nombre de lésions précancéreuses dans la muqueuse du côlon. 30 Exemple 4 : Effets des lupulones sur la formation de tumeurs colorectales Dans une expérience complémentaire, les effets des lupulones ont été testés dans le même modèle de cancérogenèse colorectale, mais à un stade plus avancé du processus cancéreux. Comme décrit précédemment, une semaine après la dernière injection d'AOM, les animaux ont été répartis aléatoirement en 3 groupes de 6 animaux. 35 Les 3 groupes de rats ont été traités dans les mêmes conditions que précédemment, à ceci près que les teneurs en lupulones administrées aux deux groupes expérimentaux étaient plus faibles : 0.001% et 0.005% au lieu de 0.005% et 0.01% et 2910325 9 que la solution d'éthanol utilisée pour dissoudre les lupulones (groupes expérimentaux) et administrée également au groupe contrôle, est une solution à 0,5% et non 1%. L'administration de lupulones a été réalisée comme précédemment et a été prolongée pendant une durée totale de 7 mois, période à laquelle les animaux traités par l'AOM 5 développent des tumeurs. Le suivi de l'évolution pondérale des animaux n'a montré aucune variation significative de poids entre le groupe contrôle et les groupes expérimentaux, et une absence totale de toxicité des lupulones administrées dans ces conditions. Pour suivre l'évolution des polypes et leur transformation en 10 adénocarcinome sans sacrifier les animaux, les inventeurs ont utilisé une technique originale de colonoscopie virtuelle par un scanner permettant, par un système d'acquisition anatomique, d'obtenir de très bonnes résolutions (jusqu'à 27 m) tout en assurant une synchronisation sur le cycle respiratoire (Micro-CTscanner X, Imtek, San Diego, USA). Tout comme lors d'une colonoscopie chez l'homme, des produits de 15 contraste qui permettent de différencier les tissus sains des tissus pathologiques ont été utilisés. Cette technique permet de détecter la présence (ou l'absence) de polypes et de tumeurs dans le côlon chez un animal vivant et de suivre l'évolution tumorale dans le temps. La figure 5 montre le nombre de foyers cryptiques aberrants présents 20 par centimètre dans le segment terminal du côlon. Une réduction de 50 % du nombre de foyers est observée, ce qui confirme les résultats obtenus précédemment à un stade plus précoce. Il apparaît en outre que la taille des foyers de cryptes hyperprolifératives est en moyenne plus basse chez les animaux traités par les lupulones 25 que chez les animaux témoins, et qu'on observe 2 à 4 fois moins de foyers de grande taille (formés par plus de 10 cryptes) chez les animaux traités que chez les animaux témoins (Tableau 2). 1 crypte 2 cryptes 3 cryptes 4 cryptes 5 cryptes > 6 cryptes > 10 cryptes (%) (%) (%) (%) (%) (%) (nombre total) Témoins 8 2 18+5 16+2 13 1 6+ 1 39 7 12+3 0.001% 11+1 21+2 21+2 13+1 9+1 24+3 6+1 0.005% 12+3 22+2 17+2 15+2 10+2 22+6 3+1 Tableau 2 : Dimension des foyers (nombre de cryptes/foyer) 30 De plus, on observe après 7 mois un effet inhibiteur particulièrement important des lupulones sur la formation des tumeurs. Une analyse du nombre de tumeurs présentes dans la totalité du côlon montre qu'un total de 8 tumeurs est dénombré dans les côlons des rats AOM-contrôles alors qu'une seule tumeur est détectée dans chacun des groupes de rats traités avec les lupulones (figure 6A). Une 2910325 Io analyse du nombre et de la taille des tumeurs dans le côlon de chaque animal est particulièrement révélatrice des propriétés anticancérogènes des lupulones sur la muqueuse colique. Des tumeurs sont ainsi présentes dans 4 rats sur 6 (67%), dont 2 tumeurs supérieurs à120 mm3 dans le groupe AOM-contrôle, alors qu'un seul rat sur 6 5 (20%) présente une tumeur dans chacun des groupes traités par les lupulones, la tumeur en question étant de taille moyenne (85 mm3) ou petite (25 mm3) (figure 6B). Ces résultats montrent clairement que dans le modèle de rat utilisé ici, les lupulones inhibent la formation des polypes à la concentration de 4 mg/kg/j. Pour obtenir un dosage équivalent, chez l'homme, la consommation journalière devrait être 10 de 30 à 50 mg (soit environ 30 mg/m2).