Les résultats hautement significatif (p< 0,001) montre que ce traitement contenant 0,04% d'adénosine a permis d'augmenter le volume du buste ainsi que sa fermeté Exemple 2 Etude des effets inhibiteurs d'un extrait natif de fruit de Baobab sur la synthèse endogène des sirtuines. Type cellulaire: Normal human epidermal kératinocytes (NHEK) au troisième passage Condition de Culture : 37°C, 5% CO2 Milieu de Culture : Kératinocytes-SFM (Invitrogen 17005-034) supplémentés par Epidermal Growth Factor (EOF) 0.25 ng/ml - Pituitary extract (PE) 25 ug/ml (Invitrogen 3700015) Gentamycine 25 ug/ml (Sigma G1397) Milieu d'étude: Kératinocyte-SFM (Invitrogen 17005-034) supplemented with Gentamycine 25 ug/ml 20 (Sigma G1397) Extrait testé Aspect Solution mère Dilution Concentration testée Extrait Sec Natif Poudre 1% Milieu d'étude 0.004% BAOBAB Fruit Batch n°20707 lb 5B Ref. Culture et traitement: Les cellules sont ensemencées et cultivées dans le milieu de culture décrit ci-dessus jusqu'à confluence et sont ensuite placées dans le milieu d'étude. Les cellules sont ensuite traitées ou non (contrôle) avec l'extrait à tester et cultivées encore 24h. Chaque condition expérimentale est répétée trois fois (triplicate). 25 A la fin du temps d'incubation, les cellules sont lavées avec une solution de PBS (Invitrogen 14190094), 300 ul de TriReagent sont ajoutés et les cellules sont immédiatement congelées à -80°C Quantitative RT-PCR : Reverse Transcription : Les ARN totaux sont extraits de chaque échantillon en utilisant le Tri-reagent suivant les recommandations du fournisseur. 30 Les traces d'ADN potentiellement contaminantes sont éliminées par utilisation du système ADNfree (Ambion ref 1906) La réverse-transciiption de l'ARNm est réalisée en présence d' oligo (dT) et de Supersciipt II reverse transcriptase (Invitrogen). PCR analyse en temps réel La PCR (Polymerase Chain Reactions) est réalisée en triplicate utilisant le « 35 LightCyclert » system (Roche Molecular Systems Inc.) en suivant les recommandations du constructeur et qui fonctionne en 2 étapes faisant intervenir un « thermo-cycler » et un fluorimètre (longueur d'onde détectée: 521 nm). Les primers suivants ont été utilisés pour amplifier les fragments correspondant aux marqueurs sélectionnés. Nom du Gene Abréviation Gène Bank ADNc bp 23-kDa highly basic protein;RPL13A RPL13A NM_002423 483 Sirtuin 1 SIRT1 NM_012238 202 Dans cette expérience le gène RPL13A (Ribosomal Protein L13A) a été utilisé comme marqueur de référence Résultat de la PCR quantitative : L'incorporation de la fluorescence dans l'ADN est mesurée en continu pendant les cycles PCR. La courbe de l'intensité de la fluorescence en fonction du cycle de PCR permet de déterminer une expression relative (RE) pour chaque marqueur. La valeur retenue pour le calcul de la RE est le rendement maximum de la réaction. Ainsi pour un marqueur donné plus le nombre de cycle est grand plus faible est la quantité d'ARNm. Traitementt Concentration RPL13A SIRT1 RPL13A SIRT1 SIRT1 / % Control . Cycles Cycles RE (AU) RE (AU) RPL13A Contrôle - 19.20 25.58 2.235 1.958E-02 9.35E-03 100 18.94 25.65 18.32 2.59 Extrait Sec Natif 0.004% 17.83 25.93 4.446 1.554E-02 3.51E-03 38 17_63 25.91 BAOBAB Fruit 17.89 25.98 Effets de l'Extrait Sec Natif BAOBAB Fruit sur l'expression des SIRT1 après 24h de traitement. Résultats comparés au marqueur RPL13A (gène de référence). Conclusion L'extrait sec natif du fruit de Baobab à une concentration de 0,004% (quelques millièmes de pourcent) réduit l'expression de la sirtuine 1 (SIRT-1) de 62%. Exemple 3 Etude de la concentration efficace d'un extrait natif de calice d'Hibiscus pour inhiber la synthèse endogène des sirtuines. Le protocole est le même que celui décrit dans l'exemple précédent et les résutats sont les suivants.