INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Tableau 2 Composé testé Ténnoin EX1M F1046 0,005nnen1 EX2M F1046 0,003nnen1 EX3M F1046 0,005nnen1 EX4M F1046 0,005nnen1 EX13M F1046 0,001nnen1 Taux / ++ ++ ++++ ++ / d'expression de TGK L'extrait EX3MF1046 se révèle le plus actif dans ces conditions. Influence de l'extrait EX3MF1046 à différentes concentrations, sur l'expression de TGK Le tableau 3 illustre le niveau d'expression de la TGK via le marquage fluorescent des NHEK pour différentes concentration de l'extrait EX3MF1046. Tableau 3 Traitement Expression TG1<a) Témoin Composé testé Concentration Moyenne ESM % ESM Témoin - 22042 3399 100 15 CaCl2 1,5nnM 69610 681 316 3 EX3M F1046 0,0016nnünnl 41326 3696 187 17 0,005nnen1 133494 4753 606 22 0,01nnen1 201936 7097 916 32 0,02nnen1 320616 6643 1455 30 a) L'expression de TGK est donnée en Intensité de fluorescence/Nombre de cellules (UA) 15 Ces résultats montrent que l'extrait EX3MF1046 induit de façon dose-dépendante l'expression de TGK dans les cultures de NHEK. L'activité est supérieure à celle de la référence chlorure de calcium, dès la concentration de 5 ug/m1; l'effet maximum qui est 4 fois supérieur à celui du CaCl2 est observé à la concentration non 20 cytotoxique de 20 ug/ml. 10 Influence de l'extrait EX1OMF1046, sur l'expression de la TKG, la filaggrine et la KRT10 La même méthodologie que celle employée pour évaluer l'effet d'un extrait sur l'expression de TGK a été appliquée pour les marqueurs filaggrine et KRT10.
Le tableau 4 présente une évaluation du niveau d'expression des trois marqueurs ci-dessus via le marquage fluorescent des NHEK. Tableau 4 Traitement Expression TKG Expression filaggrine Expression KRT10 Composé testé Concentration Témoin - +1- + CaCl2 1,5nnM +++ +++ +++ EX1OMF1046 20p.g/nnl ++++ ++ ++++ On observe que la filtration de l'extrait EX3MF1046 maintient l'effet pro-différenciant de l'extrait. Dans cette expérience, on retrouve l'effet inducteur de TGK et on observe une très forte surexpression de protéine KRT10. Contrairement au calcium qui focalise l'effet sur quelques cellules en les transformant en très grosses cellules différenciées (cornéocytes), EX1OMF1046 induit une très forte surexpression de KRT10 dans de nombreuses cellules mais n'augmente pas significativement la taille des cellules. Le mécanisme d'action du calcium et de EX1OMF1046 sont donc différents et pourraient être additionnels ou synergiques. Ceci est confirmé par l'analyse de la filaggrine, qui augmente (plus modérément) suite au traitement par EX1OMF1046, mais sans induire la production caractéristique de granules de filaggrine dans les cellules répondant au calcium. Influence de l'extrait EX1OMF1046, sur l'expression d'autres marqueurs 25 de la différenciation épidermique L'analyse a été élargie à d'autres marqueurs protéiques de la différenciation épidermique, à savoir, la loricine, l'involucrine et la kératine 1 (KRT1). L'influence de EX1OMF1046 à 20 ug/m1 est étudiée sur l'expression des transcrits des différents marqueurs ci-dessus par les cultures de kératinocytes à l'état basal. Les traitements sont de 48 h, l'analyse est réalisée par RT-qPCR. Les résultats sont donnés en % des témoins non traités après randomisation des expressions relatives par rapport au gène de ménage GAPDH. Ils sont représentés sur la figure 1. Les analyses en RT-qPCR montrent une surexpression très nette de tous les marqueurs de différenciation en présence de l'extrait ; les stimulations étaient fortes (stimulation d'un facteur 4 à plusieurs dizaines de fois selon les marqueurs) et toutes supérieurs à celles obtenues avec le calcium, à l'exception du marqueur involucrine.
Exemple 3 : Evaluation dans des épidermes reconstruits (RHE) 1) Matériels et méthodes Epidermes reconstruits RHE produits à partir de kératinocytes de prépuce humain et largement décrits dans les publications de BlOalternatives 1-4. Les RHE sont cultivés à 37°C, 5% CO2, à l'interface air-liquide, en milieu Epilife + calcium 1,5 mM et compléments, sans vitamine C. La référence pour les études d'effets pro-différenciants est la vitamine C (50 ug/m1). Extraits testés Extrait EX1OMF1046, testé à 20 ug/ml, dans le milieu de culture des RHE. Immunomarquages in situ Les RHE sont placés à l'interface air-liquide (JO) et cultivés pendant 7 jours en présence ou absence (témoin) de l'extrait EX10MF1046 ou de la vitamine C (référence).
A la fin de l'incubation, les épidermes sont rincés puis fixés dans une solution de formaldéhyde. Les tissus fixés sont déshydratés par des bains d'éthanol successifs et croissants puis inclus en paraffine « Paraplast ». Des coupes transversales sont réalisées au microtome (épaisseur 5 um) puis maintenues à température ambiante jusqu'à la réalisation des marquages.
L'étape (A) : Le broyage réalisé dans l'étape (A) peut être conduit selon toute méthode de cryobroyage ou cryoextraction connue en soi. Par exemple, le broyage réalisé peut être conduit en utilisant des dispositifs de type presse, pilon ou broyeur à marteau.
L'étape (A) est spécifiquement conduite en plaçant le matériau végétal à une température inférieure à sa température de congélation, et de préférence en conservant le matériau végétal à une température inférieure à sa température de congélation pendant toute la durée de l'étape (A). Pour ce faire, et compte tenu de l'échauffement dû au broyage, il est préférable de conduire l'étape (A) à une température maintenue inférieure d'au moins 5°C à la température de congélation du matériau, et plus préférentiellement inférieure d'au moins 10°C, voire d'au moins 15°C à sa température de congélation. Typiquement, l'étape (A) est conduite en portant le matériau végétal à une température inférieure à -10°C, et plus préférentiellement inférieure ou égale à -18°C. Le matériau végétal est plus avantageusement porté à des températures inférieures, par exemple en le plongeant dans un milieu cryogénique de type azote liquide (-196°C). Selon un mode de réalisation qui se révèle généralement intéressant, l'étape (A) est conduite sur des matériaux végétaux qui ont été précongelés ou surgelés aux températures précitées préalablement à l'étape (A). Alternativement l'étape (A) peut être conduite sur des végétaux frais qui ne sont portés à une température inférieure à leur température de congélation qu'au moment de la mise en oeuvre de l'étape (A). Selon ce mode de réalisation, l'étape (A) peut typiquement être mise en oeuvre en plongeant le matériau végétal dans l'azote liquide ou un autre fluide cryogénique, ou en versant un fluide cryogénique de type azote liquide sur le matériau végétal frais (par exemple dans un dispositif de broyage (broyeur, pressoir, mortier) où le matériau végétal frais a été initialement introduit).
A titre de méthodes de cryobroyage ou de cryoextraction utilisables dans le cadre de l'étape (A), on peut par exemple citer celles du type décrit dans la demande FR 2 652 265. L'étape (B) : Dans l'étape (B) du procédé de l'invention, le broyat végétal qui a été obtenu à l'issue de l'étape (A) est traité par au moins une enzyme. L'enzyme employée (ou le mélange (� cocktail �) d'enzymes employé) vise à digérer, en tout ou partie, les éléments solides présents dans le broyat végétal, ce par quoi on libère dans le milieu liquide tout ou partie des composés ou principes actifs présents dans ces éléments solides. Dans cette étape (B), le milieu liquide présent dans le broyat végétal est propre à servir de solvant pour les enzymes employées, ce qui permet d'introduire les enzymes à l'état non solvanté. Les enzymes utilisables dans le cadre de l'étape (B) peuvent notamment être choisies parmi les cellulases, les hemicellulases, les pectinases, les xylanases, et les mélanges de ces enzymes. Des mélanges comprenant une association d'au moins une cellulase ; au moins une pectinase ; et au moins une hémicellulase se révèlent en particulier intéressants. A titre d'exemple d'enzymes bien adaptées à la mise en oeuvre de l'étape (B), on peut notamment citer les enzymes suivantes : l'exopolygalacturonase, l'endopolygalacturonase, la polygalacturonase, la rhamnogalacturonane hydrolase, la rhamnogalacturonane lyase, la rhamnogalacturonane acetylesterase, la rhamnohydrolase, la galacturonohydrolase, la xylogalacturonane hydrolase, la pectine acetylesterase, la pectine methylesterase, l'endo-arabinase, la beta-arabinofuranosidase, la beta-1,4-galactanase, la beta-1,3-galactanase, la beta-galactosidase, l'alpha-galactosidase, la feruloyl acetyl esterase, l'alpha-fucosidase, la beta-apiosidase, l'alpharhamnosidase, la beta-rhamnosidase, l'alpha-arabinopyranosidase, la betaglucuronidase, l'alpha-glucuronidase, la beta-xylosidase, l'alpha-xylosidase ; la pectine methylesterase, la pectine lyase ou la pectate lyase ; l'endoxylanase, l'endo-beta-glucanase.
Des enzyme commerciales intéressantes pour la mise en oeuvre de l'invention sont notamment les cellulases du type de la cellulyve AN3500 �; les pectinases du type de la peclyve V extraction liquide �; les hémicellulases du type de la Feedlyve AXC 1500L� ou la Feedlyve AGL 1500P�. Quelle que soit sa nature exacte, l'enzyme est employée dans l'étape (B) à une température où elle est efficace, et, de préférence aux alentours de (et plus préférentiellement à une température égale à) sa température optimale d'activité.
Cela nécessite généralement de réchauffer le milieu entre l'étape (A) et l'étape (B). A cet effet, on peut par exemple laisser le milieu de l'étape (A) se réchauffer jusqu'à température ambiante, ou bien chauffer plus activement le milieu en évitant dans ce dernier cas toute surchauffe qui pourrait dégrader l'enzyme (typiquement en plaçant le milieu dans un milieu thermostaté (bain marie ou bain d'huile par exemple), ou bien encore en contrôlant la vitesse de montée en température). Le procédé de l'invention s'avère tout particulièrement efficace pour extraire les principes actifs au sein de végétaux riches en eau. En effet, plus le matériau végétal sera riche en eau plus l'extrait obtenu à l'issue de l'étape (A) aura tendance à être riche en milieu liquide et donc propre à dissoudre les enzymes, ce qui permettra d'éviter d'autant plus la mise en oeuvre d'un solvant dans l'étape (B). De préférence, un matériau végétal soumis au procédé d'extraction selon l'invention a une teneur totale en eau d'au moins 80% en masse, plus préférentiellement d'au moins 85% en masse, et plus avantageusement encore au moins 90% en masse, par rapport à la masse totale du matériau végétal. En particulier, des matériaux végétaux présentant une teneur en eau de 85% à 99%, par exemple de 90% à 98%, conviennent particulièrement bien à la mise en oeuvre du procédé de l'invention.
De ce fait, des matériaux végétaux particulièrement adaptés à la mise en oeuvre du procédé d'extraction de l'invention sont typiquement tout ou partie de plantes grasses riches en eau, de plantes aquatiques, de fruits ou bien des parties charnues de plantes (feuilles par exemple). En particulier, le procédé d'extraction de la présente invention se révèle adapté pour des végétaux du type plantes aquatiques ou pour des plantes grasses du type des genres suivants : Agave, Abe, Opuntia, Crassula, Carpobrotus ou Mesambryanthemum. Selon un mode de réalisation particulier, le matériau végétal traité selon le procédé de l'invention est tout ou partie d'une ficoïde glaciale (Mesembryanthemum crystallinum), par exemple des parties aériennes d'une ficoïde glaciale.
La présente invention et ses avantages seront encore davantage illustrés dans l'exemple ci-après.
EXEMPLE Extraction de parties aériennes de ficoïde glaciale Dans cet exemple, on a effectué l'extraction de parties aériennes de ficoïde glaciale selon le procédé de l'invention, dans les conditions décrites ci-après. A des fins de comparaison, on a effectué des extractions en employant d'autres techniques d'extraction. Les résultats obtenus, exposés ci-après, démontrent clairement la supériorité du procédé d'extraction de l'invention aussi bien en termes quantitatif que qualitatif, ce procédé conduisant à des extraits à la fois riches en composés et moins dilués qu'avec les autres techniques. 1. Le matériau végétal employé L'extraction a été réalisée sur des parties aériennes de plants de ficoïde glaciale (Mesembryanthemum crystallinum) cultivés en serre, la récolte des parties aériennes ayant été effectuée au bout de 3 mois environ. Les parties aériennes ainsi récoltées ont été utilisées dans les extractions décrites ci-après, soit à l'état frais, soit après congélation. Le cas échéant, la congélation des parties aériennes a été effectuée à -18°C. 2. Extraction du matériau végétal selon le procédé de l'invention Cryobroyage On a introduit 500 g du matériau végétal, à l'état congelé, dans un mortier. On a versé de l'azote liquide dans ce mortier et le matériau ainsi porté à -196°C a été broyé au pilon jusqu'à l'obtention d'une poudre (cryobroyat).
Enzymolyse Le cryobroyat obtenu à l'issue de l'étape précédente a été transféré dans un bécher placé dans un bain-marie à 50°C (qui correspond à la température optimale de fonctionnement des enzymes employées dans cette étape). Lorsque la température a atteint le point de fusion, et que le cryobroyat est devenu liquide, on y a ajouté 2,5 g d'un cocktail enzymatique comprenant, en masse par rapport à la masse totale du cocktail enzymatique : 33.3% de cellulyve AN3500 � (cellulase) ; 33.3% de peclyve V extraction liquide �(pectinase), 33.3% d'un mélange d'hémicellulases comprenant, en masse par rapport à la masse dudit mélange : 50% de Feedlyve AXC 1500L� et 50% de Feedlyve AG L 1500P�) Il est à noter que la quantité d'enzymes ainsi ajoutée est très faible : elle correspond en effet à 0,5% en masse par rapport à la masse totale du matériau végétal, et environ 10% en masse par rapport à la matière sèche contenue dans le matériau végétal. Si besoin est, le pH du milieu est ajusté à 4,5, la quantité d'acide ou de base à introduire pour réguler le pH étant alors négligeable (quelques microlitres tout au plus). En outre aucun solvant (eau par exemple) n'est ajouté, le cryobroyat décongelé ayant une teneur en eau suffisante pour assurer la dispersion des enzymes. L'ajout d'enzyme n'induit de ce fait aucun effet notable de dilution du milieu d'extraction, contrairement au cas des enzymolyses usuelles. Le mélange obtenu a été agité par une hélice, à 400 tours/minute pendant 1 heure ; puis à 250 tours/minute pendant 7 heures. Le mélange obtenu à l'issue de ces différents traitements a été filtré, sur une toile de nylon de 55 �m. Le filtrat a été centrifugé à 18500 g pendant 15 minutes. Le surnageant est filtré sur plaque de cellulose de seuil de coupure de 3 à 7 �m.
On a ainsi obtenu un extrait végétal E. 3. Préparation de témoins : extraction du matériau végétal selon d'autres procédés Six témoins ont été réalisés en utilisant le même matériau végétal (parties aériennes de plants de ficoïde glaciale), dans les conditions ci-après :
3.1 Témoin 1 "plante fraîche + broyage" 500 g du matériau végétal à l'état frais (parties aériennes de plants de ficoïde glaciale non congelées) ont été introduites dans un mortier puis broyées à température ambiante (20°C environ). Le broyat obtenu a ensuite été soumis aux mêmes étapes de purification que pour l'extrait E préparé précédemment. Ainsi, il a filtré sur toile de nylon de 55 �m. Le filtrat est centrifugé à 18500 g pendant 15 minutes. Le surnageant est filtré sur plaque de cellulose de seuil de coupure de 3 à 7 �m.
3.2 Témoin 2 "plante décongelée+broyage" Le protocole suivi est le même que pour le témoin précédent, à la différence qu'on part du matériau végétal à l'état congelé qu'on décongèle en le portant à température ambiante (20°C) avant le broyage au mortier.
3.3 Témoin 3 "plante + cryobroyage" Le protocole suivi est le même que pour la préparation de l'extrait E, à la différence que le cryobroyat issu de l'étape de cryobroyage est simplement décongelé sans ajout ultérieur d'enzyme. Le cryobroyat décongelé est filtré sur toile de nylon de 55 pm. Le filtrat est centrifugé à 18500 g pendant 15 minutes. Le surnageant est filtré sur plaque de cellulose de seuil de coupure de 3 à 7 �m. 3.4 Témoin 4 'plante décongelée + enzymes" Pour ce témoin, on est parti du matériau végétal à l'état congelé qu'on a placé dans un bécher au bain-marie à 50°C, puis on a ajouté 130 mL d'eau, nécessaires pour obtenir un milieu suffisamment liquide pour assurer la dispersion des enzymes. L'enzymolyse a ensuite été effectuée comme pour la préparation de l'extrait E (ajout de 0,5 g du cocktail d'enzyme mélange à 400 tours/minute pendant 1 heure ; puis à 250 tours/minute pendant 7 heures). Le mélange obtenu à l'issue de ces différents traitements a été filtré, sur une toile de nylon de 55 �m. Le filtrat a été centrifugé à 18500 g pendant 15 minutes. Le surnageant est filtré sur plaque de cellulose de seuil de coupure de 3 à 7 pm.
3.5 Témoin 5'p/ante décongelée + broyage + enzymes" Pour ce témoin, le protocole suivi est le même que pour la préparation de l'extrait E avec comme différence qu'on a effectué le broyage à température ambiante (20°C) après avoir laissé décongelé le matériau à cette température.
3.6 "blanc-enzymes" Afin de corriger les valeurs obtenues lors des analyses chimiques, un blanc-enzymes, sans plante, sans cryobroyage, a été réalisé. Il permet de s'affranchir des artéfacts apportés par les enzymes.
Le dispositif optique de véhicule illustré en figure 1 correspond à d'éclairage et/ou de signalisation. Comme vu précédemment cela n'est pas limitatif, le dispositif optique de véhicule automobile selon l'invention pouvant être également, par exemple, un dispositif de l'intérieur de l'habitacle. Le dispositif d'éclairage et/ou de signalisation comprend principalement : - une enceinte fermée, formée par un boîtier 3 et une glace de fermeture 9, - une source surfacique de lumière 2, et - un système optique 4.
Selon le principe de l'invention, dans le dispositif optique de véhicule automobile, ledit système optique est positionné, au moins localement, à distance de la source surfacique de lumière.
Lorsque la source surfacique de lumière est active, elle émet un faisceau de rayons 7 principalement selon une première direction 5, par exemple perpendiculaire à la surface de la source. Ce faisceau de rayons est dévié et, éventuellement mis en forme par le système optique 4. Les rayons 8 ainsi obtenus sortent du dispositif d'éclairage et/ou de signalisation au travers de la glace de fermeture 9 et assurent ainsi la fonction d'éclairage et/ou de signalisation. De préférence, les rayons sortant du dispositif d'éclairage et/ou de signalisation sont globalement parallèles à une deuxième direction 6 choisie selon la fonction d'éclairage et/ou de signalisation assurée. Selon la fonction d'éclairage et/ou de signalisation assurée, le faisceau formé par les rayons 8 peut présenter un étalement plus ou moins important, c'est-à-dire que ces rayons 8 sont inscrits dans un cône ayant un axe parallèle à la deuxième direction 6 et ayant un angle au sommet plus ou moins important, cet angle correspondant à l'étalement. Par ailleurs, ce cône n'est pas nécessairement de révolution. En effet, pour de nombreuses fonctions d'éclairage et/ou de signalisation, il est intéressant que la section de ce cône perpendiculairement à la direction 6 présente une hauteur inférieure à sa largeur.
De préférence, le système optique s'étend sur toute la surface en regard de la source surfacique de lumière relativement à la direction principale d'émission de lumière de la source surfacique. Ainsi, chaque rayon lumineux ou au moins la plupart des rayons lumineux émis par la source surfacique de lumière selon la direction principale d'émission sont déviés par le système optique de sorte qu'ils sortent du dispositif d'éclairage et/ou de signalisation en étant inscrits dans des cônes identiques à celui mentionné précédemment, les sommets des cônes reposant sur les points de sortie des rayons du dispositif.
Selon une variante de réalisation, la première direction et la deuxième direction peuvent former un angle supérieur à 1°, préférentiellement supérieur à 4°. Préférentiellement, cet angle est compris entre 5 et 50°. Par exemple, cet angle peut être choisi parmi les valeurs suivantes : 5°, 10°, 20°, 30°, 45°.
Dans un premier mode de réalisation 10 du dispositif optique de véhicule automobile représenté partiellement à la figure 2, la glace de fermeture 403 constitue le système optique 40. En effet, celle-ci présente, sur sa face interne, un motif 404 en relief se répétant spatialement. Cette face interne forme un premier dioptre 401. La surface du motif n'étant pas disposée perpendiculairement à la première direction 5 et étant non plane, elle dévie les rayons lumineux 7 en formant un faisceau convergeant. Les rayons ainsi obtenus sortent ensuite de la glace au niveau de sa face externe formant un deuxième dioptre 402 déviant une nouvelle fois les rayons lumineux, en accentuant leur convergence. Les rayons sortants 8, se croisent à faible distance devant la glace 403, et donc divergent après s'être croisés. On va obtenir grâce à la disposition de ces dioptres, des rayons dont la moyenne des directions est environ parallèle à la deuxième direction 6, les directions des rayons étant réparties autour de cette deuxième direction. Ainsi, le faisceau lumineux résultant de ces rayons sortants 8 est globalement parallèle à la deuxième direction 6, et présente un étalement autour de cette deuxième direction 6. Dans ce premier mode de réalisation, des premiers moyens optiques de déviation déviant les rayons lumineux émis selon la première direction 5 comprennent les dioptres 401 et 402. De même, dans ce premier mode de réalisation, des deuxièmes moyens optiques étalant des rayons lumineux comprennent les dioptres 401 et 402. Les termes « premiers » et « deuxièmes » n'ont qu'un sens distinctif. Ils n'ont pas de sens spatial ou temporel.
Dans un deuxième mode de réalisation 11 du dispositif optique de véhicule automobile représenté partiellement à la figure 3, une glace de fermeture 413 ferme l'enceinte en aval d'un système optique 41. Dans ce deuxième mode de réalisation, cette glace de fermeture est dépourvue de motifs en relief permettant de dévier les rayons lumineux. Le système optique 41 comprend un élément 414 en matériau transparent présentant, sur sa face interne, un motif 415 en relief se répétant spatialement. Cette face interne forme un premier dioptre 411. La surface du motif n'étant pas disposée perpendiculairement à la première direction 5 et étant non plane, elle dévie les rayons lumineux 7 en formant un faisceau convergeant. Ainsi, entre l'entrée et la sortie du système optique, les faisceaux lumineux sont déviés, c'est-à-dire que leur direction globale a changé, et leurs formes sont modifiées, c'est-à-dire que l'angle du cône dans lequel leurs rayons lumineux s'inscrivent est modifié. Les rayons ainsi obtenus sortent ensuite de l'élément transparent au niveau de sa face externe formant un deuxième dioptre 412 déviant une nouvelle fois les rayons lumineux en accentuant leur convergence. Les rayons lumineux sortent ensuite du dispositif en traversant la glace de fermeture 413 sans être sensiblement déviés. Les rayons sortants 8, se croisent à faible distance devant la glace 413, et donc divergent après s'être croisés. On va obtenir grâce à la disposition de ces dioptres, 411 et 412, des rayons dont la moyenne des directions est environ parallèle à la deuxième direction 6, les directions des rayons étant réparties autour de cette deuxième direction. Ainsi, le faisceau lumineux résultant de ces rayons sortants 8 est globalement parallèle à la deuxième direction 6, et présente un étalement autour de cette deuxième direction 6. Dans ce deuxième mode de réalisation, des premiers moyens optiques de déviation déviant les rayons lumineux émis selon la première direction 5 comprennent les dioptres 411 et 412. De même, dans ce deuxième mode de réalisation, des deuxièmes moyens optiques d'étalement des rayons lumineux comprennent les dioptres 411 et 412. Ce mode de réalisation permet au système optique d'avoir une forme différente de la glace de fermeture du dispositif. Ainsi, le système optique peut être plus facilement moulé et on peut obtenir un effet de profondeur du fait du retrait du système optique par rapport à la glace de fermeture.