De la même façon, il a été montré que les GAG stabilisaient la conformation active du FGF-2, le protégeant de la dénaturation acide ou encore thermique et en augmentant l'interaction spécifique avec des récepteurs cellulaires spérifique . En présence d'héparine les FGFs sont 2907014 ont étudié les effets d'un apport supplémentaire de FGF-2 ou encore la protection du FGF-2 par des molécules naturelles ou de synthèse, En effet, Yamanaka, en 2005 (Basic fibroblats growth factor treatment for skin ulcerations in scleroderma, cutis, 2005 ; 76 :373-376), 5 décrit l'utilisation topique de FGF-2 recombinant pour traiter des ulcères de la peau. Le FGF-2 stimule les récepteurs au FGF des fibroblastes et induit une activation des fibroblastes et la prolifération vasculaire. Pendant le processus de réparation, pendant la phase restructurante, le FGF-2 agirait aussi sur la prolifération des kératinocytes, io Des dérivés de dextran ont été synthétisés (Tardieu, 1992, cité précédemment) pour potentialiser l'activité du FGF-2 (activité mitogénique des fibroblastes), en le protégeant contre la chaleur, la dénaturation au pli, la dégradation enzymatique (trypsine et chymotrypsine). Ces dérivés présentent une plus grande protection du FGF-2 que l'héparine, ce qui 15 permet d'avoir des composés présentant une alternative à l'utilisation de l'héparine qui présente une forte activité anti-coagulante. Ils constituent des stabilisateurs, potentialisateur et protectant de la matrice pour des formulations pharmaceutiques agissant sur la réparation tissulaire. De plus, Franck et al, en 2004 (1. Biomater ScL Peiner Edn. Vol. 15 N 11, 20 pp. 1463-1480(2004)), ont montré que d'autres dérivés de dextrans pouvaient en culture de fibroblastes augmenter la prolifération des cellules et promouvoir l'effet du facteur de croissance sur la croissance cellulaire. Enfin, Sylvia Colliec-Jouault et a (Eyopo/ysaccharj-@-pre-luoec/ Lay vith traitent ne .3/ ipj 6 2907014 résultat serait expliqué par l'interaction de l'exopolysaccharide avec les médiateurs solubles dont FGF-2 ; ce qui permettrait d'augmenter l'activité proliférative du FGF-2 et ainsi de favoriser le phénomène de cicatrisation. Cet exopolysaccharide est utilisé pour la cicatrisation dentaire. La peau : FGF-2, protéoglycanes et vieillissement Dans la peau, le FGF-2 se trouve au niveau de l'épiderme, de la jonction dermo-épidermique (ME), du derme, de l'hypoderme et des o capillaires il possède un large spectre d'activité. Il assure la prolifération des fibroblastes au sein du derme leur permettant ainsi de synthétiser les macromolécules de la matrice, essentielles à l'intégrité de la peau, mais il agit également sur d'autres cellules de la peau. La prolifération des mélanocytes est en effet contrôlée par ce FGF-2 qui constitue également 15 un promoteur de la formation des capillaires. Au niveau des fibroblastes, outre leur prolifération, le FGF-2 augmente également le taux d'ARNm des gènes codant pour la hyaluronane synthase et ainsi accroît la production de hyaluronane, principal GAG du derme. Lors de blessures, le FGF-2 est un important acteur du phénomène 20 de cicatrisation. Il agit au niveau des fibroblastes, toujours en augmentant leur prolifération, mais aussi sur les kératinocytes afin d'inhiber l'expression de la collagènase-1 et ainsi permettre à la peau de se reconstruire plus rapidement. Cette action lors de la cicatrisation ne se fait 15 avec l'héparane sulfate comme transporteur/réservoir mais avec le 25 rmatane sulfate. L'exnresçinn rl FC;F-2 es Irç pffp i4p 2907014 138:215-220 (1989)). Ainsi le FGF-2 constitue une importante cytokine de la peau du fait des nombreuses fonctions qu'elle remplit. Les protéoglycanes de la peau et leur répartition ont été étudiés. Les principaux GAG révélés pour leur capacité d'interaction avec le FGF-2 5 se retrouvent dans la peau. La répartition quantitative et qualitative des GAG a été déterminée comme suit : acide hyaluronique (31%), chondroïtine sulfate (25%), kératane sulfate (24%), dermatane sulfate (20%) et enfin héparane sulfate (18%). L'héparane sulfate contenu dans le derme permet un stockage du FGF-2 présent. 10 Au cours du vieillissement, la peau subit de nombreuses modifications physiologiques. Outre les rides qui constituent les marques les plus visibles, ce sont de profonds changements structuraux qui apparaissent. Le derme notamment s'atrophie, conséquence notamment d'une réduction du nombre de fibroblastes et de leur pouvoir de synthèse 15 entraînant des modifications des macromolécules de la matrice extracellulaire. Une diminution de la synthèse des glycosaminoglycanes est constatée impliquant également une réorganisation des protéoglycanes présents. Des études sur des fibroblastes en culture ont permis de montrer que la synthèse d'acide hyaluronique diminuait fortement au 20 cours du vieillissement alors que celle des kératanes et chondroïtines sulfates augmentait. Quant au dermatane et héparane sulfate, leur synthèse ne cesserait de diminuer. Cette diminution ne permettrait plus de stocker et donc de protéger le potentiel endogène de FGF-2. 25 BUT DE L'INVENTION 2907014 Ainsi la présente invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à compléter l'action protectrice des protéoglycanes à héparane sulfate par la mise au point de principes actifs mimant l'action de l'héparane sulfate, pour protéger le stock endogène de s FGF-2, notamment au niveau de la peau et en particulier au niveau du derme, et capables notamment de traverser la barrière cutanée pour atteindre leur cible. Un autre but est la fourniture de principes actifs protégeant la quantité endogène de FGF-2, tout en la rendant disponible pour le renouvellement de la matrice extracellulaire, et en particulier la matrice dermique. L'invention a notamment pour but de résoudre le problème technique consistant en la fourniture de principes actifs protégeant FGF-2 de sa dégradation ou dénaturation, intervenant dans les différents tissus et notamment au niveau de la peau, notamment pour fournir des 15 compositions cosmétiques, dermo-cosmétiques, ou pharmaceutiques destinées à restructurer la matrice extracellulaire, et en particulier le derme par la restructuration de la matrice dermique, à améliorer l'hydratation de la peau, à promouvoir la réparation de la peau, à maintenir l'intégrité du derme, à améliorer la prolifération des mélanocytes, à renforcer la différentiation épidermique, ou à renforcer le renouvellement de l'épiderme, notamment chez l'être humain. La présente invention a notamment pour but de résoudre le nouveau consistant en ia fourniture prïnci actif d'origine végétale Js. Le: [ni es doiver 25 9 2907014 domaine de la cosmétique, de la dermo-cosmétique ou de la pharmacie, en particulier pour une application topique chez l'être humain. La présente invention a également pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant en la fourniture d'une méthode de criblage de principes actifs permettant d'atteindre les buts mentionnés ci-dessus. Ce procédé de criblage doit notamment permettre de cribler un grand nombre de principes actifs à la fois, de manière reproductible, et fiable. RESUME DE L'INVENTION 10 Pour identifier des principes actifs résolvant les problèmes techniques mentionnés ci-dessus, les inventeurs ont développé un modèle in vitro de criblage permettant de mettre en évidence une activité de protection du FGF-2 sur un grand nombre de substances à cribler, en 15 particulier face à la dégradation thermique de FGF-2. Par la protection du FGF-2, ces principes actifs jouent un rôle majeur, assurant l'intégrité de la matrice extracellulaire et notamment de la matrice dermique par le renouvellement de la population cellulaire des fibroblastes. Ils constituent donc des principes actifs de premier choix pour 20 lutter efficacement contre la dégradation du FGF-2, et pour lutter, entre autres, contre le vieillissement cutané. Selon un premier aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une substance qui n'est ni un glycosamiryglycanne até (GAG Ai- FGF-2 25 ru=ti etic Ité 10 2907014 De préférence, la substance protégeant FGF-2 est un extrait végétal et ne comprend pas de GAG sulfaté ni d'analogue structural à un GAG sulfaté. Avantageusement, ladite substance étant choisie parmi le groupe 5 consistant en un extrait d'Hibiscus Abe/moschus ou ambrette, un extrait de Rebokza, un extrait de baies de Gougizi, un extrait de de Banha, un extrait de Lessonia, un extrait de farine de moutarde, un extrait de Wooyin, un extrait d'Orge, un extrait de Sésame ou une des combinaisons résultant de l'association d'au moins deux des extraits énumérés. 10 Avantageusement, FGF-2 est protégé au niveau de la peau humaine et de préférence au niveau de la JDE, et/ou du derme, et/ou de l'hypoderme, et/ou de l'épiderme, et/ou de la paroi des vaisseaux sanguins cutanés. Avantageusement, les altérations cutanées liées à la dégradation du 15 FGF-2 interviennent au niveau de la peau humaine et de préférence au niveau de la JDE, et/ou du derme, et/ou de l'hypoderme, et/ou de l'épiderme, et/ou de la paroi des vaisseaux sanguins cutanés. Avantageusement, ladite substance est un extrait aqueux ou hydroalcoolique en solution obtenu à partir de 1 à 1O% d'une plante ou 20 partie de plante à l'état sec par rapport au poids de la solution totale. De préférence l'extrait aqueux est un extrait hydroglycolique. En particulier, la dégradation du facteur de croissance est résultante d'an moins une dégradation, notamment une dégradation 2907014 synthèse d'au moins un composant matriciel, en particulier d'au moins un type de collagène, et/ou d'au moins une protéine spécifique des microfibrilles, telle que fibrilline 1 ou 2 et/ou fibuline 3 ou 5, et/ou d'au moins un glycosaminoglycanne (GAG), notamment d'un GAG sulfaté. 5 Selon un mode de réalisation particulier, la substance ou composition est utilisée pour effectuer un soin choisi parmi le groupe consistant à restructurer la matrice extracellulaire, et en particulier celle du derme, de la JDE, de la paroi des vaisseaux sanguins cutanés, de l'hypoderme, de l'épiderme, et en particulier le derme par la io restructuration de la matrice dermique, améliorer l'hydratation de la peau, promouvoir la réparation de la peau, maintenir l'intégrité du derme, améliorer la différenciation épidermique, et renforcer le renouvellement de l'épiderme, ainsi que l'une quelconque des combinaisons de ses soins. Ces différentes utilisations visent notamment à prévenir ou lutter 15 contre des altérations cutanées liées à la dégradation de FGF-2. Avantageusement, la substance ou composition est utilisée pour lutter contre le vieillissement de la peau, notamment chez un être humain. Avantageusement, la concentration de ladite substance est une concentration efficace pour la protection du FGF-2, notamment par 20 application topique, et est notamment comprise entre 0,01% et 10% en poids de la composition totale La composition est notamment une composition cosmétique, dermo-cosmétique, ou pharmaceutique, notamment pour l'être humain. (égétal nrotéaean qu( dégradati -éfére! 12 2907014 Selon un second aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'une substance pour la fabrication d'une composition, notamment cosmétique, pharmaceutique, ou dermo-cosmétique, pour protéger FGF-2 de sa dégradation, notamment dans les différentes utilisations listées ci- 5 dessus. La présente invention concerne encore une méthode de soin cosmétique, pharmaceutique, ou dermo-cosmétique utilisant une composition définie ci-dessus selon l'un quelconque des modes de réalisation, notamment pour réaliser un soin lié au moins à l'une des io différentes utilisations listées ci-dessus DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE LA PRÉSENTE INVENTION La présente invention permet d'obtenir une protection du FGF-2 par 15 les protéoglycanes de cette même matrice. On entend par protection du FGF-2 la protection de FGF-2 contre sa dégradation ou sa dénaturation. Cette dégradation ou dénaturation intervient généralement sous la forme d'une lyse due aux conditions environnementales, comme une lyse enzymatique ou thermique. Cette dégradation ou dénaturation peut intervenir du fait de la diminution de la protection assurée par les protéoglycannes. Le procédé de criblage selon la présente invention a permis de cribler différents principes actifs extraits de végétaux. Aucun extrait de sa au a seule ances 'ulrat{ 13 2907014 famille Malvaceae, plus particulièrement au genre Hibiscus et encore plus particulièrement Hibiscus Abelmoschus ou Ambrette. Hibiscus abelmoscus était connu notamment sous forme d'un extrait aqueux obtenu à partir de la plante entière, uniquement pour ses 5 propriétés amincissantes en cosmétique et plus particulièrement pour lutter contre la cellulite (US5705170). D'autres extraits ayant l'activité désirée pour la présente invention ont pu être sélectionnés. Leur activité est particulièrement inattendue, notamment quant à la protection du FGF-2. Les extraits sont notamment un extrait aqueux de Lycium chineuse ou Baies de Gougizi obtenu à partir de baies entières déshydratées, un extrait aqueux de Pinelliae ternata ou Banha obtenu à partir de tubercule, un extrait aqueux de Raphanus sativus ou Rebokza obtenu à partir de la graine, un extrait de Brassica juncea ou moutarde obtenu à partir de la graine, un extrait aqueux de 15 Cotais semer/ ou Wooyin obtenu à partir de la graine, un extrait de Hordeum vu/gare ou d'orge obtenu à partir de la graine, un extrait de Sesamum indicum ou sésame doré obtenu à partir de la graine et un extrait d'algue entière de Lessonia sp ou Lessonia. Ces extraits ne sont cependant pas limités aux seuls extraits 20 aqueux. Ainsi la présente invention couvre également tout solvant polaire permettant d'obtenir essentiellement l'ensemble des composés actifs dans un extrait aqueux pour apporter les propriétés désirées dans le cadre de la présente invention. D'après les essais réalisés par les présents inventeurs, 25 traits hvdroalyco e é 14 2907014 Les proportions du mélange eau/alcool peuvent varier comme le sait l'homme du métier. Les proportions eau/alcool varient généralement de 10/90 à 90/10, et par exemple de 50/50 à 85/15. Il est préférable d'utiliser dans la présente invention comme principe actif un extrait en solution obtenu à partir de 1 à lO% d'une plante ou partie de plante à l'état sec par rapport au poids de la solution totale. La composition selon la présente invention comprend avantageusement de 0, 001% à 20%, de préférence de 0,01 à 10%, de principe actif selon la présente invention en poids de la composition totale. La composition peut être appliquée topiquement ou administrée par voie orale. La méthode de criblage d'une substance potentiellement active pour la protection de FGF-2 quant à sa dégradation chez l'être humain 15 comprend notamment : a) la mise en contact d'une substance potentiellement active et de FGF-2 à une température d'environ 45 C pendant une période d'environ 2h, b) la sélection des substances protégeant FGF-2 d'au moins 50%, de préférence 65 % de sa dégradation. 20 Avantageusement, la méthode de criblage comprend une étape supplémentaire de test de la pénétration transcutanée pour sélectionner une substance active traversant la barrière cutanée. Selon un autre mode de réalisation, présente invention concerne 25 15 2907014 D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention. Les exemples font partie intégrante de la présente invention et toute caractéristique apparaissant nouvelle par rapport à un état de la technique antérieure quelconque à partir de la description prise dans son ensemble, incluant les exemples, fait partie intégrante de l'invention dans io sa fonction et dans sa généralité. Ainsi, chaque exemple a une portée générale. D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression 15 atmosphérique, sauf indication contraire. EXEMPLES Exemple 1 : Etude de la dégradation thermique du FGF-2 Tardieu et al, en 1992 ont étudié la dégradation thermique du FGF- 2 dans un modèle de prolifération fibroblastique par incorporation d'élément radioactif. Les présents inventeurs ont développé une méthode de 25 ific e à Qra éaiisa ige mi Ac r,e' e'lg4 20 e 1.6 2907014 Cette solution est placée à différentes températures : 4 C, 20 C, 37 C, 50 C, et 80 C en présence ou non d'héparine à 500pg/ml. Des dosages du FGF-2 par un kit commercial ELISA (R&D system, France) sont effectués à différents temps (T=O, 3h, 24h et 48h) de façon 5 à établir une cinétique de dégradation pour chaque température d'étude. Les résultats sont exprimés en pourcentage de FGF-2 par rapport au temps T=0. Les expériences sont réalisées en triplicata (n=3). Les résultats obtenus sont représentés dans les figures 1 et 2. Le FGF-2 est sensible aux conditions de température auxquelles il w est soumis. La figure 1 montre l'évolution de la stabilité de FGF-2 en fonction du temps à différentes températures. Le FGF-2 stocké à 4 C est relativement stable sur une période de 48H puisque 20% de FGF-2 est dégradé à cette température. Avec l'augmentation de la température, les 15 pourcentages de dégradations augmentent : après 3H à 37 C, le FGF-2 subit 65% de dégradation et 80% de dégradation à 50 C. Enfin, après 3H à 80 C, une dégradation totale du FGF-2 est observée qui est dû à une dénaturation des protéines à cette température. Enfin, plus le temps est long et plus la dégradation observée est 20 importante, après 24H à 370C, 80% du FGF-2 est dégradé. La figure 2 représente la stabilité du FGF-2 à différentes températures en présence d'héparine. La figure 2, montre que cette dégradation est stoppée par la présence d'héparine à 0.05% qui est le (5--rice et cit. 25 stabilise. polysa 1ari e.nt sulfal sa trè~ 1.7 2907014 De manière surprenante, la dégradation du FGF-2 à environ 50 C intervient sur une période de temps courte. Une température proche de 45 C est sélectionnée pour des raisons pratiques et constitue un paramètre de choix pour réaliser un modèle de stress pour cribler des 5 principes actifs. Le témoin positif d'expérience étant de préférence constitué par l'héparine. Exemple 2 : Modèle in vitro pour la sélection d'un actif protégeant le FGF-2 face à la dégradation thermique. Io La dégradation du FGF-2 observée à environ 50 C est particulièrement intéressante, car une période de temps courte permet une dégradation de FGF-2 de 80% environ, permettant ainsi de réaliser un grand nombre d'essais. Pour cette raison, il a été décidé de réaliser un 15 criblage avec un stress de 2H15 à 45 C et d'étudier la capacité d'un grand nombre d'actifs à protéger le FGF-2 face à cette dégradation thermique. Le modèle de criblage appliqué est le suivant : 180pl d'une solution de FGF-2 à 4.5 ng/ml préparée dans du tampon PBSBSA 0.1% sont répartis dans une microplaque 96 puits. 20p1 d'eau distillée 20 ou d'héparine à 0.05% ou d'une solution contenant différents principes actifs extraits de différents végétaux à tester sont ajoutés. La plaque est agitée à l'aide d'un agitateur de plaque puis recouverte d'une bande adhésive et placée dans une étuve à 45 C pendant 11-11A la fin de la hou-.icut, ,i tie puis un GE-2 est 25 lis^ 8 2907014 Les résultats sont exprimés en pourcentage de protection du FGF-2 par rapport au témoin FGF2 non stressé ou non dégradé. Exemple 3 : Validation du modèle par les GAG et protéoglycanes de la peau. Des essais ont été réalisés avec les GAG et PG disponibles commercialement afin de valider le modèle. Des solutions de GAG à différentes concentrations sont réalisées : 10 L'héparane sulfate, le dermatane sulfate, les chondroïtines sulfate, et l'acide hyaluronique sont solubilisés puis testés à 0.1%-0.01%-0.001%. L'héparine utilisée comme témoin positif est testée à 0.1%, 0.01%, 0.001%, 0.0001% et 0.00001%. Les protéoglycanes testés sont le Glypican-3 et la décorinetestés à 15 0.1%, 0.01%, 0.001%. Le protocole de stress décrit dans l'exemple 2 est appliqué, les 20 pl d'eau étant substitués par 20pl de solution de GAG ou PG correspondante. Les GAG et PG testés subissent ainsi une dilution supplémentaire au 1/10. La figure 3 illustre l'étude de la protection du FGF-2 par des GAG de 20 la peau. Les résultats obtenus figure confirment les données de la littérature, à savoir : L'héparane sulfate protège FGF-2 Pinsi que le dermatane sulfa e d s ^, 25 1.9 2907014 Le test de 2 protéoglycanes, figure 4 (Étude de la protection de FGF-2 par des PG), le glypicane-3 et la décorine a confirmé les données issues de la littérature. A savoir que le glypicane-3 qui possède des chaînes d'héparane sulfate protége le FGF-2 de façon dose dépendante, 5 alors que la décorine (composé de chaînes de chondroïtine sulfate et de dermatane sulfate) se révèle inefficace. Cette étude met en évidence que la protection du FGF-2 dépend de la structure des GAG. L'interaction de l'héparane sulfate au FGF-2 est bien validée. Cette interaction est confirmée lorsque le PG portant les chaînes 10 d'héparane sulfate est testé dans le modèle. Cette étude a permis de valider notre modèle de criblage par la confirmation des résultats issus de la littérature. Exemple 4 : Criblage de principes actifs 1.5 Le criblage a été réalisé selon l'exemple 2, à partir d'une librairie composée de 2000 extraits végétaux et de molécules caractérisées. Ces composés, extraits végétaux, algues marines ou molécules caractérisées, solubilisés sont testés purs, ou à 10% ou 1% dans le milieu réactionnel 20 décrit à l'exemple 2. Les résultats des principes actifs les plus efficaces sont décrits dans le tableau 1, ci-dessous. n s du d 1 1.' 2907014 110% Extrait d'échalote 195.07 1.2 1 Extrait de farine de soja 86.85 ' 67.66 ! Extrait d'urucum 103.5 29.8 !Extrait de moutarde blanche 110.5 17.39 Extrait de Lycopode plante 71 11.27 Extrait de farine de lupin 116.39 65.77 Extrait de pomme de terre 73 16.5 Extrait de Jioh 70.9 23.18 Extrait d'ail 95.99 13.92 Extarit d'angélique souche 72.5 7.31 radicante Extrait d'Haricot mungo 76.78 2.42 Extrait de Ligusticum 70.53 38.15 chuanxiong Extrait de Carotte 83.93 1.65 ' Extrait d'Hibiscus Abelmoschus 135.1 87.53 ou ambrette Extrait de Panais 92.89 2 1 Extrait de Petit pois 74,33 0 1 !Extrait de Pomme de terre 88.96 3.61 Extrait d'Orange ! 70 2.83 .extrait d Piment doux 187.35 28.44 4.5 77.34 nbre de r Exi Extrai 2907014 Extrait de Farine de Moutarde 110,1 56.85 Extrait de Wooyin 106,1 56.18 Extrait d'Orge 79,7 53.81 Extrait de Sésame 124,4 52.73 Extait d'Acore odorant 55,6 49.34 Extrait d'Hongsan 102,3 44.58 Extrait d'Acore odorant , 77,7 43.24 Extrait de Luteolin 67,7 43.17 Extrait de Bryone 81 140.4 Extrait de Mounwhaja 102 39.56 Extrait d'Amande 99,5 38.53 Extrait de Ligusticum 70,5 38.15 chuanxiong Extrait de Chunnansung 108,4 37.7 Extrait de Courge 85,7 37.5 Extrait de Goborn 71,1 37.8 Extrait de Bangpung 117,9 36 Extrait d'Ammonium acrylate 54,9 Extrait de Hesongja 81,9 33.3 Extrait de Lin 93, 3 32.6 Extrait de Persil 97,4 30 Extrait de Graine de pavot bleu 70.33 8.8 Ext 3ft de Bok-in 75.69 27.56 Exi 63.05 Exi Irai 88.56 p pnrr , 2Q 2~ 2907014 Les extraits ci-dessus sont obtenus de préférence par macération d'une partie de la plante dans un mélange eau/alcool, de préférence eau/glycol de 100/0 à 0/100 (v/v). La dilution est alors effectuée dans ce solvant ou mélange de solvants. 5 Certains actifs testés présentent une forte activité de protection qui est de plus dose dépendante. Exemple 5 Extrait d'Hibiscus Abelmoschus (Ambrette) o 5a-Un extrait d'Ambrette hydroalcoolique est réalisé à partir des graines broyées à 5 % (p/p) dans de l'éthanol à reflux. L'extraction est réalisée pendant 1 heure puis la solution est filtrée, l'éthanol éliminé, et le résultat est solubilisé à 5% (p/p) dans un mélange eau/glycol (75/25) puis ultrafiltré sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin 15 filtrée à 0,45pm. 5b-Un extrait d'Ambrette hydroglycolique est réalisé dans un mélange eau (75%)/BG (25%) préférentiellement à partir des graines broyées à 5% (p/p) . La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis 20 la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. BG signifiant butylène glycol. 5c-Un extrait d'Ambrette aqueux est réalisé dans de l'eau partir 3 isée oendani nlH 75 23 25 3o 2907014 Exemple 6 : Extrait de Baies de Gougizi Un extrait de Baies de Gougizi est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de baies entières déshydratées s à 5% (p/p). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. Exemple 7 : Extrait de Banha Un extrait de Banha est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de tubercules à 5% (p/p). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. 15 Exemple 8 : Extrait de Rebokza Un extrait de Rebokza est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de graines à 5% (p/p). La 20 macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. Exemple 9 : Extrait de Lessonia alisé préférera' lent dar de Io 24 2907014 Exemple 10 : Extrait de Moutarde Un extrait de Moutarde est réalisé préférentiellement dans un s mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de la graine à 5% (p/p). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. o Exemple Il : Extrait de Wooyin Un extrait de Wooyin est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de la graine à 5% (p/p). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est 15 ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. Exemple 12 : Extrait d'Orge 20 Un extrait d'Orge est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (750lo)/BG (25%) à partir de la graine à 5% (p/p).La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin filtrée à 0,45pm. 25 emple iit de Sésarr 25 2907014 Un extrait de Sésame est réalisé préférentiellement dans un mélange eau (75%)/BG (25%) à partir de la graine à 5% (pi). La macération est réalisée pendant 1 nuit à 4 C puis la solution est ultrafiltrée sur filtre céramiques a différents seuils de coupure, et enfin 5 filtrée à 0,45pm. Chaque extrait (exemples 5 à a été en partie conservé. L'éventuel conservateur, constitué de préférence par un mélange de Caprylyl Glycol, Phenoxyéthanol, Hexylene Glycol à 1%, est rajouté en final en présence ou non de xanthane. ta Exemple 14 : Sélection des principes actifs ou extraits végétaux Les extraits les plus efficaces sont sélectionnés et testés à différentes concentrations selon le criblage de l'exemple 2. Les principes 15 actifs utilisés sont les extraits des exemples 5 à 13, et sont dilués en utilisant un solvant (ou mélange de solvants) ayant servi pour l'extraction Une gamme de concentration testée entre 0.1 k et 10% dans ce solvant de façon à étudier la spécificité de ces principes actifs vis-à-vis de la dégradation thermique du FGF-2. Les dosages sont effectués en triplicata. Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau 2, ci-dessous : 2907014 lors du criblage Principe actif Protection du FGF-2 (en %) en fonction de la concentration en 1 principe actif 0.1% l 1% 2% 3% 5% 1O% Extrait d'Hibiscus 84.7 6.0 87.5 4.1 99.6 3.1 110.9 4. 123.6 1. 130.8 2. Abe/moschus 3 6 7 9 48 49 (Ambrette) Extrait de rebokza 8.5 1.6 72.3 5.6 99.9 5.4 106.6 3. 123.8 1. 129.4 0. 4 7 21 43 89 Extait de Baies de 7.7 0.5 29.5 3.4 38 4.14 52 2.17 75 3.05 109.4 6. Gougizi 7 34 '44 Tableau 2 : Effet-doses obtenus sur les principes ou actifs sélectionnés Extrait de Banha 8 1.46 52.5 4.1 76.6 2.5 85.5 2.4 91 2.82 98.9 0.7 7 5 5 Extrait de Lessonia sp , 13.2 1.6 36 5.49 50.8 3.1 53.27 3. 53.67 4. 52.15 0. 13 6 04 49 84 Extrait de Moutarde 114.7 2.8 88.7 8.0 104.9 5. 111.3 2. 119 1.2 118 2.8 farine Codex 6 6 01 93 Extrait de Wooyin 9.4 0. 95 I56.4 2.9 69.2 0.8 80.6 2.4 92.9 4.3 102.4 1. 8 j3 9 85 Extrait d'Orge 10.7 0.9 47.4 1.8 60.8 2.3 170.2 0.5 I82.5 0.4 97.8 1.0 5 6 1 9 9 Extrait de Sésame 2.3 1.06 21.5 0.4 48.4 1.7 55.7 19. 74.8Ï0.5 94.8 1.7 3 1 27 2907014 L'extrait d'Hibiscus Abe/moschus (ambrette) présente l'activité la plus forte et constitue donc un principe actif de choix dans la protection du facteur de croissance FGF-2. Dans les exemples 15 à 21 la concentration en principe actif (extrait 5c) est en pourcentage en volume (v/v) dans l'eau. Exemple 15 : Etude de la protection de FGF-2 par l'extrait aqueux d'h'ibiscus Abe/moschus(ambrette) préparé selon l'exemple 5c (extrait 5c) 10 Une étude de la protection du FGF-2 par l'extrait 5c, a été réalisée sur 2 lots industriels. La protection a été étudiée face à un stress selon les conditions de l'exemple 2. Le témoin positif constitué par l'héparine testée à 0.01% dans le 15 milieu réactionnel final après dilution préalable dans l'eau protège à 105.52% 3.04. Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau 3, ci-dessous : Tableau 3 : Protection du FGF-2 à 45 C par 2 lots industriels de l'extrait 5c 20 Protection du FGF- 2 (en %) en fonction de la concentration en principe actif Extrait 5c 0.1% 0.5% 11% 2% Loti 478 146.47 181.01 107.83 112076 1 28 2907014 L'extrait 5c protège le FGF-2 de façon dose dépendante avec une activité forte pour une concentration de 1% en principe actif dans l'eau. Les résultats obtenus sur 2 lots industriels sont sensiblement identiques. Il était indispensable de vérifier que l'extrait 5c pouvait protéger le 5 FGF-2 à température physiologique c'est à dire 37 C. C'est pourquoi une étude a consisté à doser le FGF-2 après 24H à 37 C en absence ou en présence de concentrations croissantes de l'extrait 5c. Le témoin positif constitué par l'héparine à 0.01% protège à 110.53% 3.20. 10 Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau 4, ci-dessous: Tableau 4 : Protection du FGF-2 à 37 C par 2 lots industriels de l'extrait 5c Protection du FGF-2 (en %) en fonction de la concentration en 1 principe actif 1 Extrait 5c 10.01% O. 0.25% 0.5% 0.75% 1% Loti. 18,37 17.81 51.02 82.62 108.39 110.69 4.2 _3.04 4.75 -14.98 4.18 3.28 Lot2 2.12 120.56 55.49 191.06 110.64 122.87 il. .17 2.29 2.61 I 0.87 2.45 5.75 15 Les résultats obtenus montrent que l'c,xtrai:. 5c r otège le FGF-2 à 29 2907014 Exemple 16 : concerne l'étude de cytotoxicité de l'extrait 5c sur des fibroblastes en monocouche par un dosage au PNPP Le but était d'étudier la cytotoxicité de l'extrait 5c sur des s fibroblastes humains normaux. Ce dosage est basé sur la transformation du p-nitrophényl phosphate (PNPP) en p-nitrophénol par les phosphatases acides intracellulaires des cellules viables. L'absorbance du p-nitrophenol à 405 nm est directement proportionnelle au nombre de cellules viables contenues dans les puits de culture. Une fois la confluence des fibroblastes humains normaux atteinte, les milieux de culture étaient remplacés par 200 pl/ puits de milieu additionné ou non (contrôle) de l'extrait 5c en concentrations croissantes : 0,1;0,5; 1 ; 2 ; 3 et 5 %. 15 Les cellules étaient incubées pendant 48 heures en étuve à 37 C. Après incubation et élimination des milieux de culture, les cellules étaient rincées deux fois par du PBS (Phosphate Buffered Solution) puis étaient mises en présence de 200 pl d'un tampon contenant 0,1 M d'acétate de sodium (pH 8), 0,1 % de Triton X-100 et 5 mM de p- 20 nitrophényl phosphate (Sigma, France). Après deux heures d'incubation à 37 C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2, la réaction était stoppée par ajout de 20 pl de NaOH 1N. L'absorbance des milieux réactionnels à 405 nm était alors déterminée à l'aide d'un lecteur de plaques (Victor2 V, Perkin Elmer, Finlande). 25 L'hyel déterminée 3que expéri tes les 3o 2907014 Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau 5, ci-dessous : Tableau 5 : Etude de la cytotoxicité sur fibroblastes humains normaux Concentration en extrait 5c Pourcentage de cellules viables par (%) rapport au témoin négatif 0,1 85,9 0,5 88,7 1 88,8 2 87,5 3 89,8 5 85,5 L'extrait 5c n'est pas cytotoxique dans toute la gamme de concentration testée. Exemple 17 : Etude de la prolifération des fibroblastes par le FGF-2 protégé par l'extrait 5c io Le but de cette étude a été de vérifier que le FGF-2 protégé par l'extrait 5c stimule la prolifération des fibroblastes humains normaux. Une solution de FGF-2 est préparée extemporanément (=FGF-2 non dégradé) ; une solution de FGF-2 est placée 24H à 37 C en absence 15 (=FGF-2 dégradé) et en présence d'héparine (=FGF-2 Héparine à 37 C) 20 31 2907014 milieu en absence (témoin) ou en présence de FGF-2 aux différentes concentrations. Après 48H, l'activité des phosphatases acides intracellulaires (PNPP) est dosée, ce qui permet d'évaluer l'effet des solutions de FGF-2 traitées ou non, sur la prolifération cellulaire. Les résultats sont exprimés en pourcentage de prolifération par rapport au puits témoin c'est à dire au puits non traité. Les résultats obtenus sont représentés dans le tableau 6 ci-dessous et la figure 5: Tableau 6 : Etude de la prolifération (exprimée en % par rapport au puits non traité) obtenue après traitement par différentes concentrations en FGF-2 non dégradé, différentes concentrations en FGF-2 dégradé et différentes concentrations en FGF-2 + héparine à 37 C. 15 Concentration en FGF-2 FGF-2 non FGF-2 dégradé FGF-2 + heparine à (ng/ml) dégradé 37 C 0,1 116,7 96,2 0.014 129,3 0.009 0.012 P=0.006 ** 0,25 138,7 111 0.006 154,8 0.01 0.005 P<0.001 *** 0,5 148,5 123,7 0.005 146,8 0.007 0.007 P<0.001 *** 0,75 163,2 132,5 0.004 149,8 0.016 0.005 P<0.001 *** 1 160 146,4 0.01 148, 0.006 0.003 P=0.003 ** 32 2907014 Les résultats obtenus montrent que le FGF-2 (non dégradé) stimule la prolifération de fibroblastes humains normaux en culture et ce de façon dose dépendante. Le FGF-2 dégradé à 37 C stimule la prolifération mais de façon 5 beaucoup plus faible que le FGF2 non dégradé à 37 C. En effet, pour chaque concentration testée la prolifération en présence de FGF-2 dégradé est statistiquement plus faible que celle obtenue avec le FGF-2 non dégradé. Cet exemple montre la pertinence de développer un actif capable de protéger le FGF-2 de la matrice qui se dégrade à température physiologique ne pouvant plus assurer son rôle de renouvellement des cellules dermiques. En protégeant le FGF-2 de la dégradation thermique, l'héparine utilisée à 0.01% permet aux FGF-2 de conserver ses propriétés 15 biologiques puisque la prolifération est maintenue voire même supérieure à celle obtenue avec la solution de FGF-2 préparée extemporanément jusqu'à la concentration de 0.5 ng/ml. La stimulation très importante en présence d'héparine observée avec des faibles quantités de FGF-2 n'est pas observée avec des quantités 20 plus importantes de FGF-2. La même expérience a été réalisée en remplaçant l'héparine par l'extrait 5c. La solution de FGF-2 mise en présence de 03% de l'extrait 5c est placée 24H à 37 C. La solution est ensuite diluée de façon à appliquer :entratioi 'extra I~iic cellilipç 33 290701 4 observée est bien due à la protection du FGF-2 par l'extrait 5c (voir tableau 8). Les résultats obtenus, exprimés en pourcentage de prolifération par rapport au témoin non traité, sont présentés dans le tableau 7, ci-5 dessous : Tableau 7 : Etude de la prolifération (en pourcentage) des fibroblastes obtenue en présence de FGF-2 non dégradé à 0.5 ng/ml, FGF-2 dégradé à 0.5ng/ml et FGF-2 + l'extrait 5c 0.5% à 37 C. Concentration en FGF-2 FGF-2 non FGF-2 dégradé FGF-2+ l'extrait 5c à dégradé 37 C 0,5 ng/mI 148,5% 123,7 % 143,8% 0.007 0.005 0.007 P<0.001 *** ns par rapport au FGF- 2 non stressé La figure 6 représente l'étude de la prolifération des fibroblastes en présence de FGF-2 non dégradé à 0.5 ng/ml, FGF-2 dégradé à 0.5ng/mI et FGF-2 en présence de l'extrait 5c à 0.5% à 37 C. 15 La co-incubation de FGF-2 et de l'extrait 5c à 37 C permet de protéger le FGF-2 qui garde ses capacités à stimuler la prolifération des fibroblastes humains normaux en culture. Les résultats obtenus permettent d'obtenir une prolifération fibroblastique non statistiquement différente de celle obtenue en présence de FGF-2 préparé 20 extemporaném `intérê ermet 10 Ide de 34- 2907014 Les fibroblastes sont ensemencés en présence de l'extrait 5c à différentes concentrations 0.0025%, 0.01%, 0.25%, 03%, 1% et 2%. Après 48H, un dosage des phosphatases acides est réalisé (dosage au PNPP) à 405 nm puis la prolifération est calculée (en %) par rapport au témoin négatif (=cellules non traitées). Chaque condition est testée en n=6. Les résultats obtenus sont répertoriés dans le tableau 8, ci-dessous : Tableau 8 : Etude de la prolifération des fibroblastes en présence de o l'extrait 5c Concentration en l'extrait Prolifération (en %) vs.témoin négatif 5c (0/0) 0,0025 100 0,01 99 0,25 107 0,5 114 1 111 2 122 * significatif One Way Analysis of Variance/Dunnett Le témoin positif constitué par 10% sérum permet de stimuler la prolifération de façon significative ce qui valide l'expérience (T+ = +126%' rolifération). )ter liféra lasi 2907014 Exemple 18 : Impact de la protection des facteurs de croissance sur la synthèse de collagène Les fibroblastes humains normaux issus d'un donneur âgé de 52 ans, étaient cultivés dans des plaques 96 puits avec du milieu (composé par du DMEM, glutamine 2mM, Penicillin 50UI/ml-streptomycin 50pg/ml, sérum de voeu foetal 10%) pendant 24H. Après incubation, les cellules étaient traitées par les produits constitués par la vitamine C à 20pg/ml (témoin positif) et l'extrait 5c à 2% et 1%, pendant 48H. Un contrôle était io réalisé en parallèle avec du milieu seulement. Après 24H de contact, la praline radioactive (3H-proline) est rajoutée au milieu. A la fin de l'expérience, les surnageants étaient collectés pour le dosage de l'incorporation de la proline radioactive dans les protéines 15 intracellulaires. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 9, ci-dessous : Tableau 9 : Etude de la stimulation de la synthèse de collagène par 20 l'extrait 5c Produits cp m sd n % con ro p !contrôle ! 5981 ! 829 6 100 Vitamine C-20pg/ 110185 287 170 ! p<0.01 Extrait 5c 2% 7342 27 2 p<0.01 Extrait 5c 1% 70 6 783 3 118 p<0.01 Cm :corps Dar minutes n: nombre d'essai Sd dévIRI-inn andard : seuil !JE,-significativité capable de stimi Iipr 1 vnt-hese 25 L'extrai este ollagè anç Dia mains r~orr sic icativ{ 36 2907014 Les résultats obtenus montrent que la protection des facteurs de croissance du milieu et ceux synthétisés par les fibroblastes, permet in vitro de stimuler la synthèse de collagène. 5 Exemple 19 : Impact de la protection des facteurs de croissance sur la synthèse des GAGs totaux et des GAGs sulfatés Le but de cette étude était de déterminer si la protection des facteurs de croissance par l'extrait 5c sur des cultures de fibroblastes en 10 monocouche permettait de stimuler la synthèse de GAG totaux par une méthode radioactive. Les fibroblastes humains normaux issus d'un donneur âgé de 52 ans, étaient cultivés dans des plaques 96 puits avec du milieu (composé par du DMEM, glutamine 2mM, Penicillin 50UI/ml-streptomycin