Les transglutaminases I et III catalysent la formation des enveloppes cornées durant la différenciation des kératinocytes en stabilisant les structures par polymérisation de différentes protéines. La différenciation a été étudiée par la mesure de l'incorporation de l'une d'elles, la cadavérine, couplée à un marqueur fluorescent pour la détection.Le rapport de l'incorporation de la fluorescéine-cadavérine sur la quantité de protéines renseigne sur l'activité de la transglutaminase par unité de cellules en fonction du traitement réalisé. Le rapport de la viabilité cellulaire sur la quantité de protéines 10 confirme que le résultat d'activité métabolique cellulaire est bien indépendant du nombre de cellules. Le rapport de l'incorporation de la fluorescéine sur la viabilité cellulaire : il s'exprime en ng de FC (fluorescéine-cadavérine) incorporé / pg de résorufine produite et il donne le taux de différenciation réel des 15 KHN, permettant de comparer les conditions entre elles. Le calcul du pourcentage de différenciation des cellules pour un actif par rapport à son témoin solvant est ensuite réalisé. Les kératinocytes ont été ensemencés en monocouche selon les 20 conditions définies dans l'exemple précédant. Le traitement est réalisé par l'extrait de Carpobrotus edulis (0,1°A) ou par la référence négative (le rétinol, 10-6M). Après les 10 et 12 jours de traitement, les analyses sont réalisées. 25 Les résultats obtenus sont validés par la présence du témoin de prolifération (T prolif), pour lequel est obtenu le plus faible taux d'incorporation de fluorescéine-cadavérine par rapport à la quantité totale de cellules. En opposition, le témoin de différenciation (T diff) présente un taux en moyenne 3 fois plus important à J12 (soit après 12 jours de 30 traitement). Le rétinol, utilisé comme molécule de référence négative, valide le modèle puisqu'il ralentit l'incorporation de FC ainsi que la mortalité cellulaire par rapport au témoin éthanol (T EtOH). L'extrait de Carpobrotus edulis stimule la différenciation des cellules jusqu'à +152% pour une concentration de 0,1% après 10 jours de traitement, comme le montre le tableau II: Tableau II : Incorporati on de FC (en ng de FC/pg de protéines) Viabilité cellulaire (en pg de resorufin/pg de protéines) Incorpora tion de FC/ Viabilité cellulaire (différenciati on/ témoin corresponda nt) Gain en % Témoin de J10 0,0013 0,0502 0,0262 0,0 prolifération J12 0,0019 0,0501 0,0379 0,0 Témoin de J10 0,0012 0,0135 0,0911 +247,9 Par différenciation rapportAu T prolif J12 0,0076 0,0067 1,1371 +2902,3 Rétinol J10 0,0004 0,0188 0,0207 -86,8 Par rapport au T EtOH 10-6M J12 0,0005 0,0183 0,0270 -98,3 Ethanol J10 0,0019 0,0120 0,1568 +72,2 Par 2.10-2 % rapport au T Diff J12 0,0078 0,0049 1,5722 +38,3 . J10 0,0023 0,0099 0,2297 +152,2 Par Carpobrotus a rapport au T Diff 0,1% J12 0,0089 0,0054 1,6527 +45,3 Exemple 4 : Effet de l'extrait de Carpobrotus edulis sur la synthèse des lipides kératinocytaires Les kératinocytes humains normaux sont ensemencés en plaques 24 puits (Costar-Corning Incorporated, réf 3524) comme précédemment en KSFM complet (Invitrogen), c'est à dire supplémenté des 50 pg/ml de BPE (invitrogen) et des 5 ng/ml d'EGF (invitrogen). Chaque condition est réalisée en quadruplicat, et les traitements sont effectués dans 3 milieux de culture différents : - Milieu de prolifération (KSFM, Keratinocyte Free Medium, Invitrogen) - Milieu de "faible" différenciation = milieu de prolifération + 1mM de Butyrate de sodium + 0,9mM de chlorure de calcium (CaCl2) = diff 1 - Milieu de "forte" différenciation = milieu de prolifération + 1mM de Butyrate de sodium + 1,5mM de chlorure de calcium (CaCl2) = diff 2 Le nombre de plaques est alors doublé afin de pouvoir réaliser 2 temps de lecture. A J6, lorsque les KHN sont à 90-95% de confluence, les actifs sont mis au contact des cellules dans les milieux cités ci-dessus, soit : Une partie des plaques reste en milieu de prolifération avec : - l'actif dilué à deux concentrations et le témoin milieu seul Une partie des plaques est passée en milieu diff 1 : - l'actif dilué à deux concentrations et le témoin milieu seul Une partie des plaques est passée en milieu diff 2 : - l'actif dilué à deux concentrations et le témoin milieu seul L'extrait de Carpobrotus edulis est testé à 5 et 0,5%. A J9 et J10 de prolifération (soit J3 et J4 de différenciation), une mesure de l'activité mitochondriale est effectuée par la méthode colorimétrique au WST-1 (Roche Diagnostics, réf 1644807) afin d'évaluer la viabilité cellulaire. L'utilisation de ce réactif non cytotoxique permet d'effectuer un second dosage sur les cellules. Une coloration au NileRed (nom commercial : AdipoRed®, Lonza, réf PT-7009) est alors réalisée pour quantifier les lipides et plus particulièrement les triglycérides.