Les essais ont été réalisés sur des kératinocytes entre le 2ème et le ente passage afin d'assurer une reproductibilité entre les différentes expériences. L'essai a été réalisé en triplicate après 24 heures de contact. Six lots de kératinocytes ont été constitués : Lot 1 : témoin ne recevant aucun produit Lot 2 : application de triacanthine 0,05% Lot 3 : application de triacanthine 0,1 % Lot 4 : application de triacanthine 0,2 % Lot 5 : application de triacanthine 0,5 % Lot 6 : application de triacanthine 1,0 % 13 La viabilité cellulaire a été déterminée par le test de réduction au bleu de Formazan (test MTT). Après 24 heures d'incubation des cellules de kératinocytes de chaque lot où la triacanthine a été appliquée à différentes concentrations en comparaison avec le témoin, les puits contenant les cellules sont vidés par retournement doux et le tapis cellulaire est rincé avec le milieu de culture. On distribue dans tous les puits 200 pl d'une solution diluée de MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényl- tétrazolium), puis les plaques sont incubées à 37°C pendant 3 heures. On observe alors la formation de cristaux bleu de formazan en quantité inversement proportionnelle à l'atteinte des succinates déshydrogénases Les puits sont à nouveau vidés par retournement, les cellules sont ensuite lysées et les cristaux de bleu de Formazan sont dissous par 200 pl de diméthylsulfoxyde. Après homogénéisation de la coloration par agitation, la densité optique (DO) des plaques est lue, au moyen d'un spectrophotomètre à 570 nm, ce qui permet de connaître la quantité relative de cellules vivantes et actives métaboliquement. Les valeurs de la densité optique (DO) après 24 heures de contact sont regroupées dans le tableau ci-dessous. Substance Densité optique DO 570 nm % Témoin 0,513 ± 0,04 - Triacanthine 0,05% 0,520 ± 0,02 ns Triacanthine 0,1% 0,518 ± 0,05 ns Triacanthine 0,2% 0,520 ± 0,03 ns Triacanthine 0,5% 0,481 ± 0,03 n.s. (-6) Triacanthine 1,0% 0,448 ± 0,05 (-12) Ces résultats montrent que la triacanthine ne présente 25 aucune cytotoxicité vis-à-vis des kératinocytes humains en culture aux concentrations inférieures à 0,2%. 14 Adipocytes humains en culture : Les adipocytes sont préparés à partir de prélèvements de tissus adipeux humains provenant d'opérations de chirurgie plastique. Les tissus sont découpés et on les fait incuber à 37°C pendant 40 à 60 minutes sous agitation, dans une solution de collagénase de type II (1 mg/ml dans le tampon HBSS à pH 7,4) à raison de 4 volumes de solution pour 1 volume de tissu. Après incubation, les cellules sont récupérées par filtration (filtre nylon 250 }gym). Les adipocytes ainsi isolés sont séparés par flottation et la suspension adipocytaire est lavée trois fois par un tampon KBR pour éliminer toute trace de collagénase. La composition du tampon KBR est la suivante (pour 1 litre) . - NaCl - KC1 CaC12, 2H2O - MgSO4 20 - NaH2PO4 - NaH2PO3 - Glucose Pour l'essai on ajoute 3,5% de BSA tampon KBR puis on ajoute le tampon KBRA à pH 7,5. 25 Six lots sont constitués comme pour les kératinocytes ci- dessus. La toxicité de la triacanthine vis-à-vis des adipo- cytes est évaluée après 24 heures de contact. Les cellules sont ensuite comptées sous microscope optique à l'aide d'une lame de Neubawer après coloration d'exclusion au bleu Trypan. 30 Les résultats sont regroupés dans le tableau ci-dessous. 10 15 7,183 g/1 0,466 g/1 0,187 g/1 0,144 g/1 0,144 g/1 2,184 g/1 0,826 g/1.