Le nombre de colonies révertantes spontanées par boîte pour chaque souche a été comparé au taux acceptable décrit dans la littérature par Maron & Ames (1983). Des témoins positifs et négatifs ont été inclus dans tous les tests. Comme témoin négatif, le solvant choisi pour la solubilisation des 3 0 échantillons (100 �i/boîte d'eau dé-ionisée) a été utilisé pour le nombre de colonies révertantes spontanées par boîte, pour une comparaison ultérieure 17 avec le nombre de révertants observés en présence des échantillons. Comme témoins positifs, des substances mutagènes connues ont été utilisées pour s'assurer de la capacité de réponse de chaque souche au mutagène et de l'efficacité du système d'activation métabolique (azide de sodium, 4-nitroquinoline-1-oxyde, 9-amidoacridine, mitomycine C, 2-aminoanthracène, 2-nitrofluorène, hydropéroxyde de cumène). Un test préliminaire a été réalisé avec la souche TA100 afin de déterminer l'intervalle de concentration d'échantillon le plus approprié pour le test définitif en utilisant les concentrations de 8; 40; 200; 1000 et 5000 lug/boîte. Les concentrations utilisées dans ce test n'ont pas présenté de toxicité pour la croissance de Salmonella typhimurion. Ainsi, les concentrations pour le test définitif ont varié de 0,001 à 5 mg/boîte. Toutes les concentrations ont été testées en triple en absence et en presence d'activation métabolique. Les témoins négatifs et positifs ont été réalisés en triple. Les résultats ont été exprimés en nombre de colonies révertantes par boîte et par le rapport de mutagénicité (RM), qui correspond au rapport entre le nombre de colonies révertantes sur les boîtes tests et le nombre de colonies révertantes sur les boîtes de témoin négatif. Le nombre de 2 0 colonies révertantes spontanées a été comparé au taux normalement acceptable décrit dans la littérature (Maron & Ames, 1983). Un résultat est considéré comme positif lorsque le nombre moyen de colonies révertantes sur les boîtes tests est supérieur ou égal à deux fois celui observé sur les boîtes de témoin négatif (RM >2) pour les souches 25 TA97a, TA98, TA 100 et TA 102. Pour les souches TA1535 et TA1537, RM devrait être supérieur ou égal à trois. Les témoins positifs ont présenté un rapport de mutagénicité entre 5 et 152, montrant qu'ils sont appropriés pour valider l'expérience. Aucune augmentation significative dans le nombre de révertants n'a été observée 3 0 chez les souches après le traitement avec les échantillons C et F, à quelque concentration que ce soit en présence et en absence d'activation 18 métabolique. Les échantillons C et F ont montré un rapport de mutagénicité inférieur à 2. Exemple 6 ù Evaluation du potentiel d'irritation et de sensibilisation cutanées in vivo L'extrait de Passiflora alata a été soumis à un test de sécurité in vivo, selon Fisher, 1995: Echantillon C - (contenu en flavonoïdes totaux 16,46% et contenu en vitexine-2-o-r 11,87%) à 25% et 50% d'une solution aqueuse. L'extrait est soumis à une inspection de l'irritation primaire et de l'irritation accumulée et à un test de sensibilisation en pansement. Le test d'irritation primaire est évalué en retirant le pansement de test après 48 heures d'application, avec des mesures réalisées 30 minutes et 24 heures après qu'il soit retiré. Les tests d'irritation accumulée et de sensibilisation, quant à eux, nécessitent l'application du pansement de test de manière quotidienne sur une période de 14 jours, suivie d'une période de rétablissement de 14 jours et ensuite une ré-application du pansement de test pendant 48 heures sur une zone qui n'avait pas été utilisée précédemment pour l'irritation primaire. L'étude était une étude clinique contrôlée, aléatoire et en simple- aveugle. Cinquante-six volontaires ont complété l'étude et aucune réaction indésirable n'a été détectée (érythème, oedème, papules ou vésicules) dans les zones de l'application de l'échantillon. Exemple 7 ù Evaluation du potentiel anti-inflammatoire dans des fibroblastes humains in vitro Le but de ce test est d'évaluer le potentiel anti-inflammatoire d'extraits in vitro, en utilisant des cultures de fibroblastes de derme humain. La significativité statistique (p < 0,05) des données est vérifiée par une analyse de variance (One-Way ANOVA) suivie d'une comparaison multiple de Tukey en utilisant le logiciel SYSTAT 10. 3 0 Exemple 7.1 19 Les échantillons suivants d'extrait de Passiflora alata selon l'invention ont été utilisés: Echantillon A (contenu en flavonoïdes totaux 16,54% et contenu en vitexine-2-o-r 11,02%) Echantillon B (contenu en flavonoïdes totaux 11, 49% et contenu en vitexine-2-o-r 0,39%) Des fibroblastes humains dérivés du derme ont été incubés avec des lipopolysaccharides (LPS) d'Escherichia coli afin d'induire la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires IL-6 and IL-8 (Interleukine 6 and 8). Le potentiel anti-inflammatoire de l'échantillon a été identifié par la réduction de la sécrétion de marqueurs pro-inflammatoires. Matériel utilisé: Fibroblastes humains dérivés du derme, maintenus en culture jusqu'au dixième passage au plus. Plaques de culture stériles de 96 puits, plaques de culture non stériles de 96 puits, tubes coniques de15ml et 50 ml Réactifs: Milieu Eagle modifié de Dulbecco (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM), Serum de Veau Foetal (Fetal Bovine Serum, FBS), Rouge Neutre, Dimethylsulfoxide (DMSO), tampon de révélation (éthanol: acide acétique: eau, 50:1:49), PBS (Phosphate Buffer Saline), Tampon de Lavage (PBS contenant 0,05% de Tween-20), tampon de sensibilisation (0.1M carbonate de sodium), tampon de blocage (PBS contenant 5% d'albumine sérique bovine), lipopolysaccharide bactérien (LPS), dexaméthasone, hydrocortisone, kits pour le dosage de IL-6 et IL-8 par ELISA (R&D Systems�), kit de révélation au substrat TMB (BD Pharmingen�) et solution stop (2N d'acide sulfurique). Préparation de culture cellulaire Des plaques de 96 puits ont été préparées avec 2x104 cellules/puits dans 100 pl de DMEM contenant 10% de SFB. Les cellules ont été incubées sur la nuit dans une étuve à CO2. Le milieu de culture a été éliminé et les puits lavés avec 200p1 de PBS.