Système d'élution Lot de Nom de la Observations r fraction 1 fraction et r (numéro de tubes) quantité (mg) Cyclohex 9 /EtOAc 1 (1-35) 1-29 KP-18A 2 taches visibles en UV jaune dans silice (20) 30-35 KP-18B 1 tache visible en UV et 2 taches révélées à l'acide phosphomolybdique (100) 1 jaune dans silice Cyclohex 8 /EtOAc 2 (36-52) 36-56 KP-18C 3 tache visibles en UV rose dans silice (21) r Cyclohex 7 /EtOAc 3 (53-83) 57-69 KP-18D (10) 1 tache visible en UV rose dans silice 70- 86 87-140 Cyclohex 6 /EtOAc 4 E (84-104) KP-18E 1 tache visible en UV rose dans silice (17) Cyclohex 5 /EtOAc 5 (105-122) KP-18F (9) Trace visible en UV rose dans silice Cyclohex 4 /Et0Ac 6 (123-140) Cyclohex 3 /EtOAc 7 (100 ml) KP-18G (8) 1 tache visible en UV rose dans silice Cyclohex 2 /EtOAc 8 (150 ml) KP-18H (5) Trace visible en UV rose dans silice KP-18I Trace visible en UV (8) ose dans silice Cyclohex 1 /EtOAc 9 EtOAc 100 °A) EtOAc 9 /MeOH 1 DCM 8 /Me0H (0,2 % TEA) 2 (100m1 pour chaque) Tableau 5: Regroupement des fractions issues de la colonne chromatographique de la fraction SF5 La pureté en Guieranone B dans les fractions SF5 et KP-18E a été mesurée par HPLC sur colonne Symmetry C18 4.6 x 150 mm, diam : 5mm phase mobile : gradient [H20 + acide trifluoroacétique (0.1%)] et Me0H Tableau 6 : temps (min) H20 + acide trifluoroacétique (0.1%) Me0H 0 95% 5% 1 95% 5% 45 5% 95% 60 95% 5% débit : 1 mL / min détecteur : UV 254 nm volume injecté : 20mL Résultats - SF5: pic caractéristique à 24,062 : aire sous la courbe 4,3681% molaire - KP-18E : pic caractéristique à 24,335 : aire sous la courbe 89,1262% molaire On démontre l'obtention d'un composé de formule (I) substantiellement pur, avec une pureté molaire de plus de 89%. Exemple 4 : Caractérisation complète de KP-SF5-18E (KP-18E1 Guieranone B (C171-11606 - 316 g.mol TOF (pos.) m/z 339 [M+Nar, HRMS-TOF (pos) mlz 317,10181, ([Mi-H]+, calcd. pour C171-11706, 317,10150). (C3); 111,9 (C7); 117,3 (C8a); 130,7 (C2); 134,2 (C2'); 134,9 (C4a); 148,9 158,7 (C8); 159,3 (C4); 179,2 (C1); 182,8 (C5); 193,1 (C1'). 1H RMN (CDC13-d9, 400 MHz) 3 7,56 (s, 1H, H3); 6,59 (m, 1H, H3'); 6,30 (d, J = 15,5, 1H, H2'); 6,08 (s, 1H, H7); 3,95 (s, 3H, 0-CH3-4); 3,90 (s, 3H, 0-CH3-4); 3,82 (s, 3H, O-CH3-6); 1,94 (d, J = 6,60 Hz, 3H, H4') Tableau 7: Position H C HMBC 1 179,2 2 130,7 3 7,56, s, 1H 105,5 1, 2, 4, 4a, 8a, 1', 2' 4 159,3 OCH3-4 3,95, s, 3H 56,0 4 4a 134,9 182,8 6 158,5 OCH3-6 3,82, s, 3H 63,2 7 6,08, s, 1H 111,9 1, 5, 6, 8, 8a 8 158,7 OCH3-8 3,90, s, 3H 56,0 7, 8 8a 117,3 1' 193,1 2' 6,30, d, 1H (1 = 15,5 Hz) 134,2 1', 3', 4' 3' 6,59, m, 1H 148,9 1', 2' 4' 4' 1,94, d, 3H (J = 6,60 Hz) 18,0 1', 2', 3' 13C RMN (CDC13-dl, 100 MHz) 8 18,0 (C4'); 56,0 (OCH3-4, OCH3-8); 63,2 (OCH3-6); 105,5 (C3'); 158,5 (C6); Les spectres RMN 1H, COSY (Correlation Spectroscopy), 13C et HMBC (1H/13C) mettent en évidence la présence de deux groupements aromatiques et d'une cétone éthylénique. Les analyses des spectres de RMN 1H, COSY, 13C, HSQC et HMBC (1H/13C) permettent de confirmer la structure finale de KP18E (naphtylméthoxylate de buténone). Exemple 5 : Protocole détaillé de la mesure de prolifération des cellules cancéreuses mammaires MCF-7 1ère partie Jour 1 : ensemencement des cellules 1. Préparation du milieu : -Préparation du volume pour mettre dans les plaques : Dans un Falcon de 50 mL préparer 30 mL de RPMI complet avec 10% de SVF et 1% de Glutamine : 27 mL de RPMI ; 3 mL de SVF et 300 pL de Glutamine. 2. Préparation de la suspension de cellules : -Aspirer le milieu contenu dans le flasque avec la trompe à vide -Rincer avec 3 mL de PBS et aspirer avec la trompe à vide -Ajouter 1 mL de trypsine et laisser agir 3 min à l'étuve à 37°C en vue de décoller les cellules. -Lorsque les cellules sont décollées, ajouter 2 ml de milieu complet préparé précédemment pour inactiver la trypsine. -Bien mélanger la suspension par aspiration-refoulement et transférer dans un Falcon 15 bien identifié. -Dénombrement des cellules en cellule de Malassez : effectuer une dilution au 20ème pour les compter au bleu Trypan. 3. Ensemencement des plaques: -Ensemencer les plaques avec 200 pL de suspension de cellules selon le schéma déterminé -Mettre 200 pL d'eau dans les puits périphériques -Laisser incuber 24 h. 2ème partie : Jour 2, mise en présence de l'extrait 4. Préparation du milieu: 45 mL au total de milieu à préparer dans un Falcon de 50 stérilisées Soit 40,5 mL de RPMI + 4,5 mL de SVF + 450 pL de glutamine 5. Préparation des extraits : -préparer une solution de 10 mg/mL : Dissoudre 8,1 mg d'extrait brut (noté SF) selon l'exemple 1, de la fraction SF5 selon l'exemple 2 ou de la fraction KP-18E (Guieranone B) dans 810 pL de DMSO -Préparation de la solution mère d'extrait (Ex) à 100 pglmL soit 50pL de (10 mg/m1) dans 4950 pL de RPMI -Réalisation de la gamme d'extrait (pour 1 extrait et 1 seule gamme). -Enlever le milieu dans les plaques et ajouter 200 pL par puits d'une gamme d'extrait (une colonne par concentration). -Mettre à incubation à l'étuve les plaques sous 37°C durant 72H. 6. Préparation de la résazurine (révélateur) et lecture de la plaque To - Pour To 2 colonnes de cellules + une colonne de Résazurine seule= 3 colonnes 200 pL /puits X 3 colonnes X 6 lignes= 3600 pL (volume total à préparer : 5 mL) -Préparer 4,9 mL de milieu + 100 pL Résazurine Enlever le milieu et ajouter 200 pL de (milieu + Résazurine) par puits. -Incuber pendant 2 heures, et lecture au fluoroskan. 3ème partie : Mesure de la prolifération à 24 h (pour to), 72 h (pour extrait) - Pour les extraits à 72h : 200 pL /puits X 18 colonnes X 6 lignes (volume total à préparer : 25 mL) 20 -Préparer 24,5 mL de RPMI + 500 pL de Résazurine -Enlever le milieu et ajouter 200 pL de (milieu + Résazurine) par puits. -Au bout de 2 heures, lecture au fluoroskan. Résultats : 25 1 : Mesure de l'activité antiproliférative de SF en % d'inhibition (Criblage 0 à 100 pg/mL) Tableau 8 SF Pourcentage d'inhibition Concentrations 0 pg/mL 12,5pg/mL 25 pg/mL 50 pg/mL 100 pg/mL Valeurs 0,00 98,10 96,79 100,00 100,00 11,25 98,46 97,74 100,00 100,00 19,60 98,78 97,57 100,00 100,00 0,00 98,20 98,42 100,00 100,00 5,93 97,07 97,82 100,00 100,00 5,72 98,40 96,71 100,00 100,00 Moyennes ESM 7,08 98,17 97,51 100,00 100,00 3,04 0,24 0,27 0,00 0,00 2 : Mesure de l'activité antiproliférative de SF en % d'inhibition (Criblage 0 à 10 pg/mL) Tableau 9 SF Pourcentage d'inhibition Concentrations pg/mL 0,5 pg/mL 1 I2 4 6 8 10 pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL Valeurs 0,00 , 0,95 5,83 28,14 57,42 78,82 96,93 96,63 0,00 10,85 26,32 40,97 73,14 87,61 98,56 97,98 13,68 28,37 30,18 45,99 f 76,24 91,83 98,86 97,89 Moyennes ESM 4,56 13,39 20,78 38,36 68,94 86,09 98,12 97,50 4,56 8,02 7,56 5,31 5,83 3,83 0,60 0,44 3 : Mesure de l'activité antiproliférative de SF en % d'inhibition (Moyennes obtenues pour les 6 essais) Tableau 10 SF 0 0,5 pg/mL 1 2 3 4 6 8 pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL 1 N1 Moyennes 1,87 0,00 0,00 9,54 32,14 58,48 85,92 97,97 N2 Moyennes 1,81 0,00 2,25 9,19 14,19 34,87 67,82 96,44 N3 Moyennes 1,43 0,00 0,00 6,34 17,06 42,39 74,72 97,54 2 N1 Moyennes 0,74 4,73 5,34 16,93 35,35 56,34 81,25 95,94 N2 Moyennes 0,89 3,68 2,74 21,04 43,86 62,87 85,48 96,05 N3 Moyennes 1,50 3,20 1,13 8,84 13,44 36,69 62,80 94,15 Moyenne des 1,37 1,93 1,91 11,98 26,00 48,60 76,33 96,34 manipulations ESM 0,19 0,88 0,82 2,32 5,23 4,93 3,90 0,55 C150 NI 3,64 1 N2 4,81 N3 4,40 pg/mL Ni 3,66 2 N2 3,29 N3 4,91 CI50 moyenne ± ESM 4,12 ± 0,27 pg/mL 4: Pourcentage d'inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses MCF-7 en fonction des concentrations de SF5 du criblage Tableau 11 SF5 Pourcentage d'inhibition Concentrations 0 0,5 pg/ml_ 11 2 3 4 6 8 pglmL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL Valeurs 3,55 0 10,52 32,23 54,69 62,03 72,34 92,45 0 0 3,52 27,79 52,88 58,91 73,28 94,76 2,24 0 5,96 35,51 57,75 63,19 75,16 92,31 o o 2,27 33,29 52,72 59,78 68,72 90,60 1,58 0 0 34,57 56,41 60,19 72,65 89,37 1,30 0 3,46 31,26 55,16 60,06 73,06 87,83 Moyennes ESM 1,44 0 4,29 32,44 54,94 60,69 72,53 91,22 0,55 0 1,47 1,12 0,80 0,65 0,86 1,00 5 : Mesure de l'activité antiproliférative des fractions de SF : SF5 en %d'inhibition (Moyennes obtenues pour les 6 essais) Tableau 12 SF5 0 0,5 pg/mL 1 2 3 4 6 pg/m 8 pglmL pet. pg/mL pg/mL pg/mL L pg/mL N1 1Moyennes 2,47 1,02 26,74 74,39 84,77 86,41 89,95 94,46 N2 Moyennes 1,22 0,71 21,56 72,14 82,94 86,30 90,50 94,89 N3 Moyennes 1,62 6,45 17,76 70,17 82,82 86,00 90,15 94,31 2 N1 Moyennes 3,14 18,51 55,12 84,52 92,33 95,50 99,30 100,00 N2 Moyennes 1,76 19,97 47,68 79,40 89,05 94,02197,60 100,00 N3 Moyennes 2,07 20,15 50,33 82,44 90,30 92,81 95,08 98,87 Moyenne des manips 2,04 11,13 36,53 77,17 87,03 90,17 93,76 97,09 ESM 0,27 3,85 6,66 2,37 1,65 1,79 1,68 1,14 C150 SF5 N1 1,40 pg/mL N2 1,47 N3 1,53 N1 0,90 2 N2 1,05 N3 0,99 C150 moyenne ± ESM 1,22 ± 0,11 pg/mL 6 : Pourcentage d'inhibition de la prolifération des cellules cancéreuses MCF-7 en fonction des concentrations de KP-18E du criblage Tableau 13 KP-18E Pourcentage d'inhibition Concentration s 0 0,25 pg/mL I 0,5 pg/mL 1 1,5 pg/mL 2 , 2,5 13 , 4 5 pglmL ug/mL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL pg/mL Valeurs 30,82 0,00 1,98 15,52 36,10 62,54 57,84 f 77,40 99,38 100,00 0,00 0,00 0,00 0,00 48,15 43,35 59,61 86,16 100,00 100,00 0,00 0,00 7,74 29,28 50,66 59,58 65,92 83,19 100,00 100,00 22,56 0,00 22,99 27,15 53,59 61,13 65,73 84,81 100,00 100,00 0,00 0,00 1,87 39,25 53,16 48,79 68,02 92,10 100,00 100,00 3,37 25,60 31,52 37,44 49,86 68,59 69,73 194,22 100,00 100,00 Moyennes ESM 9,46 4,27 11,02 24,77 48,59 57,33 64,48 86,31 99,90 100,00 5,58 4,27 5,36 6,04 2,63 3,84 1,93 , 2,50 0,10 0,00 7 : Mesure de l'activité antiproliférative de KP-18E en % (Moyennes obtenues pour les 6 essais) Tableau 14 pg/mL 0 0,25 0,5 I1 1,5 2 2,5 3 4 5 N1 Moyennes 3,23 0,89 4,08 16,32 33,96 46,74 74,28 95,88 99,55 99,43 N2 Moyennes 1,95 0,00 0,30 6,50 , 8,86 23,88 40,33 61,22 98,27 99,91 N3 Moyennes 3,22 0,53 2,19 2,87 22,68 41,08 65,99 93,83 99,46 99,29 2 N1 Moyennes 1,79 1,75 3,42 15,89 20,44 38,75 49,01 57,82 91,14 99,02 N2 Moyennes 1,90 4,00 7,57 20,89 32,06 48,73 57,31 70,40 99,55 100,00 N3 Moyennes 3,78 7,53 10,24 28,50 40,50 51,63 61,79 75,79 99,83 100,00 Moyenne des 2,65 2,45 4,63 15,16 26,41 41,80 58,12 75,83 97,96 99,61 manipulations ESM 0,35 1,17 1,49 3,83 4,64 4,08 4,96 6,57 1,38 0,17 C150 Ni 2,0535 per L N2 2,7202 N3 2,1664 2 N1 2,5518 pg/mL N2 2,067 N3 1,9176 C150 moyenne 2,246083333 pg/mL ESM 0,1293 pg/mL Exemple 6 : Comparaison de l'activité antiproliférative de la Guieranone B avec celle du tamoxifène et du 5-FU: Le protocole décrit à l'exemple 5 a été utilisé, en remplaçant la Guieranone B par le tamoxifène ou le 5-FU (5-Fluorouracile). En suivant ce protocole, il a été possible de mesurer les C150 de ces composés et de les comparer à celle de la Guieranone B. Le tableau 15 (identique au tableau 2) décrit l'activité antiproliférative comparée de ces 3 principes actifs (tamoxifène, 5-FU et Guieranone B) sur la lignée cancéreuse mammaire MCF-7 testée dans les mêmes conditions.