1 Extrait de fruit de grenade et utilisation dudit extrait pour la prévention et le traitement de lésions cutanées induites par les rayonnements solaires de type UVA La présente invention concerne un nouvel extrait de fruit de grenade Punica granatum L. et son utilisation pour la réalisation de compositions orales ou de compléments alimentaires, dans le but de prévenir l'apparition et le développement des lésions cutanées induites par l'exposition chronique aux rayonnements solaires de type UVA. L'utilisation d'un tel extrait peut également aider au traitement de telles lésions, en étant associé aux méthodes de traitement connues de l'homme de l'art. Les cancers cutanés constituent un problème de santé publique majeur et en expansion. Le facteur le plus important lors du développement d'un cancer cutané est l'exposition chronique aux rayons UV solaires. Le rôle de plus en plus reconnu des rayons UVA dans le photo-vieillissement, et probablement dans le mélanome, souligne la nécessité de développer une protection anti-UVA plus efficace. Les organismes de réglementation du Japon, de l'Union européenne, du Royaume-Uni, de l'Australie et des Etats-Unis ont adopté de nouvelles politiques visant à assurer l'efficacité de la protection contre les rayons UVA. D'une manière générale, il existe sur le marché de la cosmétique, de la pharmacie et de la nutraceutique, de nombreuses préparations topiques ou orales visant à protéger la peau contre les effets nocifs du rayonnement solaire. Les aliments riches en vitamines C et en antioxydants, tels que la goyave, la grenade, l'orange, sont connus pour aider la peau à se régénérer après une agression due au soleil (coup de soleil par exemple), pour prévenir le vieillissement cutané (apparition des tâches de vieillesse, rides, hyperpigmentation, etc.) et/ou prévenir l'apparition de lésions cancéreuses induites par l'exposition au soleil. La grenade est ainsi particulièrement préférée pour sa haute teneur en antioxydants. L'état des connaissances concernant l'effet photo-protecteur de la grenade porte toutefois principalement sur la protection contre les lésions induites par les 30 rayons solaires de type UVB et l'efficacité de la grenade contre les UVA n'a pas été démontrée. Or, les rayons de type UVA pénètrent plus profondément dans la peau, 3031901 2 et sont ainsi susceptibles de causer des dommages plus sévères. D'autre part, des études ont démontré que l'exposition aux UVA induit des mécanismes de réponse de l'organisme différents de ceux induits par l'exposition aux UVB. En conséquence, les effets observés après radiations aux UVA ou UVB sont bien distincts. Ainsi, il a été 5 relevé que les UVA se trouvent plus particulièrement impliqués dans la genèse de certaines pathologies tumorales ou cancéreuses cutanées, comme le mélanome malin. Il est alors apparu souhaitable de développer un nouvel extrait végétal ayant une capacité hautement protectrice contre les rayons solaires de type UVA. Un tel 10 produit, administré de préférence par voie orale, devrait pouvoir être utilisé avant, pendant ou après l'exposition aux rayons UVA. La déposante a ainsi mis en oeuvre un extrait innovant répondant à ces exigences, à partir du fruit de la grenade, et préférentiellement à partir de la peau du fruit de grenade. Il est également prévu dans la présente invention que ledit extrait 15 soit utilisé dans des compositions orales par exemple sous forme de capsule ou gélule pour une prise isolée, ou sous forme de compléments nutritionnels pour compléter ou enrichir un aliment ou une préparation alimentaire. Une utilisation sous forme topique dudit extrait est également envisagée. Les cancers cutanés sans présence de mélanome, comme le carcinome 20 malpighien (SCC) et le carcinome basocellulaire (BCC), sont les tumeurs malignes les plus fréquentes chez les humains, en particulier chez les humains de type caucasien. Bien que de nombreux facteurs génétiques et environnementaux contribuent au développement des cancers cutanés, le facteur le plus important est l'exposition chronique de la peau aux rayonnements UV solaires 25 (photocarcinogenèse) (Afaq et al., 2005a). Le rayonnement UV est divisé en trois catégories : les ondes courtes UVC (200 nm à 280 nm), les ondes moyennes UVB (280 nm à 320 nm) et les ondes longues UVA (320 nm à 400 nm). Les UVC sont extrêmement dangereux pour la peau, car ces longueurs d'onde 30 de lumière ont une énergie énorme et peuvent pénétrer dans la peau jusqu'à une 3031901 3 profondeur d'environ 60 à 80 micromètres. Cependant, les UVC ne peuvent pas atteindre la terre, car ils sont presque totalement absorbés par la couche d'ozone. Les rayonnements UVB constituent environ 5 % des rayonnements UV. Toutefois, on considère qu'ils sont les constituants les plus actifs du rayonnement 5 solaire et donc responsables de diverses maladies cutanées, notamment les cancers cutanés sans présence de mélanome et avec présence de mélanome. Les UVB pénètrent dans la peau jusqu'à une profondeur d'environ 160 à 180 micromètres et peuvent induire des lésions de l'ADN, un stress oxydatif, l'épuisement du système de défense cutané, une inflammation, une immunosuppression, le vieillissement 10 prématuré de la peau, et il peut jouer le rôle d'initiateur de tumeur, de promoteur de tumeur et de co-carcinogène (Ichihashi et al., 2003). Les rayonnements UVA constituent environ 90 % à 95 % du rayonnement solaire atteignant la surface de la terre et, en raison de leur longueur d'onde plus longue, présentent une forte capacité de pénétration de la peau (1000 micromètres). 15 Une exposition aux UVA conduit à la génération d'espèces réactives de l'oxygène, ce qui peut endommager les protéines cellulaires, les lipides et l'ADN (Afaq et Katiyar, 2011). Photocarcinogenèse L'induction des cancers cutanés par les rayonnements UV solaires, ou 20 photocarcinogenèse, est un processus complexe qui implique plusieurs étapes individuelles. L'initiation d'une tumeur consiste en des effets génotoxiques dans les cellules normales. Ces altérations se produisent dans les gènes et aboutissent finalement à la mutation de l'ADN dans les cellules normales. Ces mutations prennent la forme de transition C à T et CC à TT et ont été détectées dans le gène 25 suppresseur de tumeur p53 dans le cas du carcinome malpighien, du carcinome basocellulaire et des kératoses actiniques d'humains. La formation d'une tumeur consiste en l'expansion clonale de cellules initiées, et ce stade est considéré comme réversible. La progression d'une tumeur implique l'évolution des lésions initiales en tumeur maligne invasive et potentiellement métastatique (Baliga et Katiyar, 2006). 3031901 4 L'antigène nucléaire de prolifération cellulaire (PCNA) est une protéine auxiliaire nécessaire à la synthèse de l'ADN et à la réparation de l'ADN. Le PCNA est utilisé comme marqueur de prolifération cellulaire dans les tissus pour évaluer l'efficacité des médicaments chimiopréventifs dans la recherche contre le cancer. 5 Une abondance anormalement élevée de cellules positives au PCNA a été rapportée dans le cas du carcinome malpighien par rapport aux autres néoplasmes kératinocytaires et par rapport à d'autres maladies cutanées non malignes (Kawahira, 1999). L'incidence croissante des cancers cutanés et des effets nuisibles des UV a 10 encouragé la recherche de plantes ayant un effet protecteur contre les dommages induits par les UV. Au cours des dernières années, plusieurs antioxydants botaniques se sont avérés jouer un rôle dans la prévention de la photocarcinogenèse et du photo-vieillissement. La photoprotection de la peau semble dépendre de leurs propriétés anti-oxydantes, anti-inflammatoires et anti-cancérigènes (Afaq et Mukhtar, 15 2006). Punica granatum L. La grenade (Punica granatum L.), un fruit largement consommé frais et en boisson sous forme de jus ou de vin, a été énormément utilisée en médecine traditionnelle dans diverses parties du monde. Un extrait de grenade est une source 20 riche en composés polyphénoliques et possède de puissantes propriétés antioxydantes et anti-inflammatoires (Afaq et al., 2005c ; Jurenka, 2008). Le jus de grenade contient 85 % d'eau, 10 % de sucres totaux et 1,5 % de pectine, de l'acide ascorbique et des flavonoïdes polyphénoliques. La composition en polyphénols dans le jus comprend principalement des anthocyanines (telles que la 25 cyanidine-3-glucoside, la cyanidine-3,5-diglucoside et la delphindine-3-glucoside), des catéchines, des tanins ellagiques, de l'acide gallique et de l'acide ellagique (Aviram et al., 2000). Les extraits de grenade obtenus à partir de l'écorce (peau) de Punica granatum L. sont riches en polyphénols, en particulier en tannins, en tannins ellagiques, en anthocyanines, en catéchines, en acide gallique et en acide ellagique. Les grenades 3031901 5 ont une longue histoire de consommation humaine en tant que telles, sous forme de jus ou de composants ajoutés à la nourriture ou aux suppléments alimentaires. (Aviram et Dornfeld, 2001 ; Aviram et al., 2004). 5 Le fruit de la grenade est connu pour sa forte activité anti-oxydante, supérieure à celle du vin rouge et du thé vert (Gil et al., 2000), et il a été démontré que la grenade protège l'oxyde nitrique contre la destruction oxydative et réduit le stress oxydatif des macrophages (Aviram et al. 2008 ; Gil et al., 2000 ;. lgnarro et al., 2006 ; Li et al., 2006 ; Rozenberg et al, 2006). En plus de son activité anti-oxydante, il a été 10 rapporté la grenade possède un large éventail d'actions, notamment des effets sur le poids corporel (Lei et al., 2007), sur l'hyperlipidémie et l'hypertension chez les personnes normales et diabétiques (réduction du stress oxydatif, modifications athérogènes du LDL et agrégation plaquettaire) (Aviram et al., 2000 ; Aviram et Dornfeld, 2001 ;. Aviram et al, 2004 ; Cuccioloni et al, 2009 ; Mohan et al, 2010), sur 15 la prolifération des cellules cancéreuses de la prostate (Malik et al., 2005 ; Malik et Mukhtar, 2006 ; Pantuck et al, 2006) par l'inhibition de CYP1B1 (Kasimsetty et al, 2009) ainsi que dans les cellules cancéreuses du côlon (Kasimsetty et al, 2010) et dans le cancer du sein (Adams et al., 2010). Les effets antioxydants/antiathérogènes exercés par le jus de grenade ont été associés à la présence de sucres 20 complexes uniques et/ou de sucres phénoliques (Rozenberg et al., 2006). La capacité anti-oxydante élevée de la grenade, conjointement avec ses puissants effets anti-inflammatoires (Afaq et al, 2005c.), antiprolifératifs (Khan et al, 2007 ; Malik et al, 2005) et anti-tumorigènes (Afaq et al., 2005c) ont contribué à 25 considérer que la grenade pourrait exercer une protection efficace contre les lésions induites par les UV. Effets photo-protecteurs de ta grenade contre les UVB : L'effet photo-protecteur d'extraits de fruit et de peau de grenade contre les 30 lésions cutanées induites par les UVB a été étudié dans plusieurs études notamment in vitro et in vivo, dont : 3031901 6 1. Etudes In vitro sur les effets photo-protecteurs de la grenade contre les UVB : Afaq et al (2005b) ont étudié l'effet in vitro d'un extrait de grenade sur les effets néfastes induits par les UVB chez les kératinocytes épidermiques humains normaux 5 (NHEK). Les résultats montrent que le traitement des NHEK avec 10 à 40 mg/ml d'extrait de grenade pendant 24 h avant exposition aux UVB (40 mJ/cm2) produit une inhibition dépendante de la dose de la phosphorylation médiée par les UV-B d'ERKI/2, de JNK1/2 et de la protéine p38. Dans cette étude, il a été également observé qu'un extrait de grenade (20 mg/m1) inhibe la phosphorylation médiée par 10 les UV-B de la protéine kinase activée par les agents mitogènes (MAPK) d'une manière dépendante du temps. De plus, l'effet d'un extrait de grenade sur l'activation médiée par les UVB de la voie du facteur nucléaire kappa B (NF-kappaB) a été évalué. Le traitement des NHEK avec l'extrait de grenade a entraîné une inhibition dépendante de la dose et du temps de la dégradation et de la phosphorylation 15 médiées par les UV-B de lkappaBalpha et de l'activation de IKKalpha. Un traitement des NHEK avec un extrait de grenade a entraîné une inhibition dépendante de la dose et du temps de la translocation nucléaire et de la phosphorylation médiées par les UV-B de NF-kappaB/p65 au niveau de Ser (536). Les résultats de cette étude montrent qu'un extrait de grenade protège contre les effets nocifs des rayons UV-B 20 par l'inhibition des modulations induites par les UV-B des voies de NF-kappa B et de MAPK et fournissent une base moléculaire pour les effets photochimiopréventifs d'un extrait de grenade. Zaid et al. (2007), dans une étude in vitro, ont rapporté que le prétraitement de cellules HaCaT avec un extrait de grenade (POMx) (10 à 40 microg/ml) avant une 25 exposition aux rayons UVB (15 à 30 mJ/cm2) a donné lieu à une inhibition de la diminution médiée par les UVB de la viabilité cellulaires, à la diminution de la teneur en glutathion intracellulaire et à l'augmentation de la peroxydation des lipides. Il a été découvert que le prétraitement des cellules HaCaT avec POMx inhibe la régulation à la hausse induite par les UVB de la MMP-1, -2, -7 et -9, la diminution induite par UVB 30 de TIMP-1, la phosphorylation induite par UVB des MAPK et la phosphorylation induite par UVB de c-jun, tandis qu'aucun effet n'a été observé sur les taux de protéine c-fos induits par les UVB. 3031901 7 Park et al. (2010) ont étudié l'effet protecteur in vitro d'un extrait de grenade sur le photo-vieillissement cutané induit par les UVB chez des fibroblastes de peau humaine en culture. L'auteur a évalué les effets protecteurs de différents extraits de grenade obtenus à partir de différentes parties du fruit : graines, fruits et écorce. 5 L'effet protecteur a été évalué en déterminant le taux de procollagène de type I et de MMP-1 après irradiation sous UVB. Les résultats montrent que le traitement avec la grenade, en particulier l'extrait obtenu à partir de l'écorce, entraîne une augmentation de la synthèse du collagène et une diminution de l'expression de MMP-1. Afaq et al. (2009), dans une étude in vitro, ont évalué l'effet protecteur de 10 différents produits dérivés de la grenade (jus de grenade (POMx), extrait de grenade (POMx) et huile de grenade (P0Mo)) contre les lésions causées par les UVB sur une peau humaine reconstituée. La peau humaine reconstituée (EpiDerm) a reçu un traitement avec les produits dérivés de la grenade pendant 1 h avant les rayons UVB (60 mni/cm2) à des doses de (1 à 2 p1/0,1 ml par puits), de (5 à 10 pg/0,1 ml par puits) 15 et de (1 à 2 p1/0,1 ml par puits), respectivement. L'oxydation des protéines, les marqueurs d'endommagement de l'ADN et le photo-vieillissement ont été évalués par une analyse de transfert de western et immunohistochimie. Les résultats montrent que le traitement avec la grenade inhibe la formation induite par les UVB des dimères de cyclobutane pyrimidine et de la 8-dihydro-2'-désoxyguanosine, 20 l'oxydation des protéines et l'expression de la protéine PCNA. En outre, il a été observé une inhibition induite par les UVB : de la collagénase (MMP-1), de la gélatinase (MMP-2, MMP-9), de la stromélysine (MMP-3), de la marilysine (MMP-7), de l'élastase (MMP-12) et de la tropoélastine. Une zymographie sur gélatine a révélé que les produits dérivés de la grenade inhibent les activités induites par les UVB de 25 la MMP-2 et de la MMP-9 et diminuent l'expression de la protéine c-Fos et la phosphorylation de c-juin 2. Etudes ln vivo sur les effets photo-protecteurs de la grenade contre les UVB : Des études in vivo récentes ont montré un effet protecteur important de la 30 grenade dans la photoprotection. Dans une étude in vivo réalisée par Yushimura et al. (2005), l'administration orale d'un extrait de grenade obtenu à partir d'écorces a 3031901 8 donné lieu à un blanchiment efficace de la peau pigmentée de cobayes. Pour l'expérience, des cobayes femelles brunâtres ont reçu par administration par voie orale un extrait de grenade contenant 90,16 % d'acide ellagique, ou un acide L-ascorbique pendant 35 jours. Les animaux ont été divisés en 4 groupes, avec six 5 animaux par groupe : groupe 1 (groupe témoin, eau), groupe 2 (100 mg/kg/jour de PE dans l'eau, 10 mg/mi), groupe 3 (1000 mg/kg/jour de PE dans l'eau, 100 mg/ml), groupe 4 (600 mg/kg/jour d'acide L-ascorbique dans l'eau, 60 mg/ml). Les animaux ont été irradiés avec une lampe UVB (64,8 JIcm2) dans une zone rasée de 4 cm2 pendant les jours 7, 9 et 11, et l'effet a été déterminé en mesurant la valeur de L 10 toutes les semaines avec un spectromètre à réflectance. Les résultats montrent que l'administration de l'extrait de grenade inhibe la pigmentation de la peau des cobayes brunâtres. Dans une autre étude in vivo, Afaq et al. (2008) ont rapporté que l'administration par voie orale d'un extrait de grenade a un effet inhibiteur sur la 15 tumorigenèse de la peau médiée par les UVB chez des souris SKH-1 sans poil. Pour l'expérience, les souris ont été divisées en deux groupes, le groupe témoin étant soumis à une exposition aux UVB (180 mJ/cm2) deux fois par semaine pendant 30 semaines. Le groupe recevant la grenade a été soumis à la même exposition aux UVB, mais a également reçu un prétraitement avec un extrait de grenade (0,2 % en 20 poids/volume) à volonté dans l'eau de boisson pendant 14 jours avant l'exposition aux UVB et en continuant jusqu'à la fin de l'expérience. Les résultats montrent un développement réduit du cancer cutané, exprimé en termes du pourcentage de souris présentant des tumeurs et de la multiplicité des tumeurs. L'auteur a étudié le mécanisme associé : dans le groupe recevant la grenade, il a été observé une 25 diminution significative de la phosphorylation de STAT3 et de NF-kB/p65 dans la peau non impliquée provenant de souris porteuses de tumeurs et les tumeurs de la peau. Il a été observé également une diminution de l'expression des protéines iNOS et COX-2. Il a été observé une diminution des taux de la protéine HIF-1 dans les tumeurs des souris. 30 Bae et al. (2010) ont réalisé une étude in vivo pour évaluer l'activité inhibitrice de l'acide ellagique dans la dégradation du collagène et les réponses inflammatoires des cellules de la peau et de souris sans poils induites par une irradiation sous UV-B. 3031901 9 Pour l'expérience, dix-huit souris mâles sans poils SKH-1 ont été divisées en trois groupes (1 : groupe témoin, Il : groupe UVB et Ill : groupe de traitement, acide ellagique UVB). Le premier groupe de six souris n'a pas été irradié par les rayons UVB et a été utilisé comme témoin avec de l'acétone en tant que véhicule de l'acide ellagique. Les 12 autres souris ont été exposées aux UVB trois fois par semaine et l'intensité de l'irradiation a été augmentée chaque semaine de 1 MED (dose minimale d'érythème) à 3 MED, puis cela a été poursuivi jusqu'à 3 MED jusqu'à la semaine 8. L'intensité totale d'irradiation était de 63 MED pendant 8 semaines, et environ 7 minutes étaient nécessaires pour atteindre 1 MED. Le groupe de traitement 10 a reçu 10 pmol/l d'acide ellagique dissous dans 100 pl d'acétone au cours de l'exposition aux rayons UVB et une application topique à long terme d'acide ellagique sur la peau dorsale chaque jour. Les résultats montrent un des effets photoprotecteurs de l'acide ellagique dans l'inflammation cutanée, l'application topique de l'acide ellagique ayant entraîné une diminution des protéines 1L-1p et IL-6, 15 une inhibition de l'expression d'ICAM-1 des kératinocytes et un retard de l'infiltration des macrophages. L'application topique a également réduit la production de MMP et la dégradation du collagène. L'acide ellagique s'avère exercer un effet protecteur contre la rugosification et l'épaississement de la peau induits par les UVB conduisant à la formation de rides. 20 L'effet de la grenade sur les biomarqueurs précoces de photocarcinogenése a été étudié par Afaq et al. (2010) dans une étude in vivo avec des souris sans poils SKH-1. Pour l'expérience, 64 souris femelles sans poil SKH-1 ont été divisés en quatre groupes : groupe 1 (groupe témoin, n = 8), groupe 2 (0,2 % en poids/volume de l'extrait de grenade, n = 8), groupe 3 (irradiation sous UV-B à 180 mJ/cm2, n = 24) 25 et groupe 4 (0,2 % en poids/volume d'extrait de grenade pendant 14 jours avant une irradiation unique sous UVB (180 mJ/cm2), n = 24). Les résultats montrent que l'administration par voie orale de l'extrait de grenade inhibe les oedèmes cutanés induits par les UVB, l'hyperplasie, l'infiltration des leucocytes, la peroxydation des lipides, la génération de peroxyde d'hydrogène, l'activité de l'ornithine décarboxylase 30 (ODC) et l'expression des protéines ODC, COX-2 et PCNA. L'administration par voie orale de l'extrait de grenade a amélioré la réparation de la formation induite par les UVB des dimères de cyclobutane pyrimidine (CPD) et de la 8-oxo-7,8-dihydro-2'- 3031901 10 désoxyguanosine (8-oxodG). Le traitement avec la grenade a amélioré l'augmentation médiée par les UVB du suppresseur de tumeur p53 et de l'inhibiteur p21 de cycline kinase et a inhibé la translocation nucléaire médiée par les UVB de NF-KB, l'activation de IKKa et la phosphorylation et la dégradation de IKBa. s Dans une étude in vivo récente, Khan et al. (2012) ont évalué l'effet photochimiopréventif d'un extrait de grenade contre les rayons UVB sur des souris sans poils SKH-1. L'effet de la grenade contre de multiples dommages induits par les UVB, tels que l'hyperplasie et l'infiltration des leucocytes, le stress oxydatif comme la peroxydation des lipides et l'oxydation des protéines, l'activation de NF-KB et de 10 MAPK, l'inflammation et la prolifération dans la peau de souris, a été déterminé. Pour l'expérience, 48 souris femelles sans poil SKH-1 ont été divisées en quatre groupes contenant chacun douze animaux : le groupe 1 (groupe témoin) a reçu uniquement de l'eau potable, le groupe 2 a reçu un traitement avec 0,2 % en poids/volume de PFE dissous dans l'eau potable, le groupe 3 a été exposé aux rayons UVB 15 (180 mJ/cm2) tous les deux jours pour un total de sept expositions, le groupe 4 a reçu un traitement avec 0,2 % en poids/volume de PFE dissous dans l'eau potable pendant 14 jours avant de multiples irradiations sous UVB (180 mJ/cm2) tous les deux jours pour un total de sept expositions. Les souris ont été sacrifiées 24 h après la dernière exposition aux UVB et des biopsies cutanées ont été collectées pour 20 effectuer une analyse biochimique. Les résultats montrent que l'administration par voie orale de l'extrait de grenade entraîne une réduction de l'hyperplasie épidermique et de l'infiltration des leucocytes, de l'oxydation des protéines et de la peroxydation des lipides. Le traitement avec l'extrait de grenade a inhibé la translocation nucléaire et la phosphorylation induites par les UVB de NF-KB/p65, la phosphorylation et la 25 dégradation de IKBa, l'activation de IKKa/IKKi3, et la phosphorylation des protéines MAPK et de c-jun. En outre, le traitement avec la grenade a inhibé l'expression protéique de COX-2 et d'iNOS, de PCNA et de la cycline D1, et des métalloprotéinases matricielles 2, 3 et 9 dans la peau des souris. 30 Différences entre les lésions cutanées induites par les UVA et celles causées par les UVB : 3031901 11 Les UVA sont subdivisés en UVA2 (315 à 340 nm) et en UVA1 (340 à 400 nm). Les UVA représentent 95 % des rayons UV atteignant la surface de la terre sur un jour d'été. Contrairement aux UVB, l'intensité des rayons UVA est relativement constante tout au long des heures de clarté et elle est très peu affectée par la 5 couverture nuageuse. Les rayons UVA pénètrent plus profondément dans le derme que les rayons UVB en raison de leurs longueurs d'onde plus longues, par conséquent ils jouent un rôle plus important dans le développement du photo-vieillissement et peuvent produire des mutations dans la couche basale de la peau (Jansen et al, 2013b ; Agar et al., 2004). L'exposition à de fortes doses de rayons 10 UVA provoque une réaction d'érythème immédiate qui peut persister pendant 48 à 72 heures après l'exposition, des coups de soleil et un photo-vieillissement, notamment des rides, des lentigos solaires, une poïkilodermie, une perte d'élasticité, des télangiectasies et de grands comédons ouverts (Wickelgren 2007 ; Jansen et al., 2013a) et une carcinogenèse (Sage et al., 2012). L'utilisation de cabines de 15 bronzage, qui émettent principalement des rayons UVA, est associée à un risque accru de mélanome, de BCC et de SCC. (2007 ; Lazovich et al., 2010). La protection contre les rayons UVA lors d'une activité en extérieur est importante, même sans exposition au soleil, car 50 % des UVA se trouvent à l'ombre (Schaefer et al., 1998). Parce qu'ils pénètrent plus ou moins profondément dans la peau du fait de leurs 20 longueurs d'onde différentes, les UVA et les UVB n'induisent pas les mêmes mécanismes de réponse de l'organisme. Des études ont montrées que les UVA sont particulièrement impliqués dans la formation du carcinome malpighien et dans la pathogenèse du mélanome malin, en induisant une réponse photobiologique de la peau différente de celle observée lors 25 de l'exposition de la peau aux rayons de type UVB. Ainsi, une étude clinique a notamment considéré 6 personnes volontaires qui ont été exposées aux radiations de 3 longueurs d'onde différentes : UVC : 254 nm UVB : 300 nm - UVA : 350 nm. Les résultats de cette étude ont démontré que l'exposition de la peau humaine à des doses érythémogènes équivalentes, produit 30 des réponses différentes au niveau de la teneur et de la distribution de la protéine p53 induite. Les radiations induisent une coloration dans la couche supérieure de 3031901 12 l'épiderme dans le cas des UVC, de l'épiderme dans le cas des UVB, et une coloration prédominante dans la couche basale dans le cas des UVA (Campbell et al., 1993). D'autres études et documents viennent affirmer la différence de réponse 5 photobiologique de la peau en fonction du type de rayonnement, et notamment : Wang et al. 1998, Kvam and Tyrell 1997, Drotbetsky et al. 1995, Dittmar et al. 1999, Ley 1997, etc. Enfin, une étude récente a démontré que les mécanismes d'induction du mélanome par UVA requièrent la présence de pigments de mélanine et est associé à in un dommage oxydatif à l'ADN des mélanocytes, tandis que le mélanome induit par les UVB est initié indépendamment des pigments de mélanines par des lésions directes de l'ADN (Noonan et al, 2012). Au contraire des UVB, les UVA sont peu impliqués dans l'excitation directe de la molécule d'ADN. De manière évidente, ces études montrent que l'exposition de la peau aux 15 rayons de type UVB n'induit pas les mêmes mécanismes de réponse que ceux générés par les radiations aux UVA. Ainsi, les résultats des études portant sur les effets photo-protecteurs de la grenade sur les lésions cutanées induites par le rayonnement solaire de type UVB ne peuvent être simplement extrapolés et appliqués aux rayons de type UVA. 20 Description de l'invention La présente invention revendique un nouvel extrait de fruit de grenade, ayant des capacités photo-protectrices remarquables contre les lésions cutanées induites par les rayons solaires UVA, et comprenant : - au moins 0,5 % en poids de punicalagines A et B 25 - et au moins 35% en poids de polyphenols En outre, une réalisation avantageuse dudit extrait comprendra également au moins 1% en poids d'acide ellagique. 3031901 13 Un autre objet de l'invention est l'utilisation de cet extrait pour l'obtention de préparations pharmaceutiques et/ou compositions administrées par voie orale ou sous forme de compléments alimentaires Une utilisation sous forme topique dudit extrait est également envisagée. 5 Procédé d'extraction : L'extrait selon l'invention est préparé selon le procédé suivant : 10 500 kg de fruit de grenade Punica granatum L. sont broyés dans un réacteur. De manière avantageuse, il s'agit de 500 kg de peau ou écorce de fruit de grenade. On soumet ensuite ce broyat à une extraction avec des solvants de type éthanol (EtOH>95%) dans un rapport plante/extrait entre 5/1 et 7/1. 15 De manière préférée, le solvant d'extraction contient 70% d'éthanol et 30% d'eau et est recyclé pendant 3h puis 2 h, dans des conditions normales de température. On obtient alors une solution qui est ensuite lavée puis filtrée sur fond filtrant sur une toile (taille de filtration de type 5pm) en poussant à l'azote. Le filtrat obtenu est ensuite concentré à 40% sous vide. 250 litres d'eau sont ajoutés et 20 distillés. Le mélange est ensuite séché sur une matrice constituée par un composé choisi dans le groupe contenant la maltodextrine jusqu'à obtention d'un extrait sec de 35%. Ce type de séchage permet l'obtention d'une poudre. Selon un mode de réalisation, l'extrait sec ou non aqueux obtenu selon 25 l'invention peut être formulé sous forme de poudre, de granules ou de semi-solides par tout procédé connu de l'homme de l'art, pour permettre par exemple son incorporation à des capsules ou des gélules. Selon un autre mode de réalisation, l'extrait peut être utilisé pour la préparation d'un comprimé, d'une dragée ou d'un comprimé pelliculé. Il peut par ailleurs être encapsulé selon des moyens connus en 30 soi. Son utilisation visera notamment la fabrication d'une composition nutraceutique, d'un complément diététique ou alimentaire, d'un complément 3031901 14 nutritionnel, et/ou d'une composition pharmaceutique pour la prévention et le traitement des lésions cutanées induites par l'exposition aux UVA. La prise régulière à des doses appropriées de l'extrait de grenade selon l'invention par le sujet soumis aux radiations UVA intenses ou chroniques, permettra à l'organisme d'intégrer et de potentialiser les bénéfices de la grenade en vue d'inhiber de manière significative notamment l'incidence tumorale et la surface des lésions. 10 La prise pourra être effectuée avant, pendant ou après l'exposition aux rayons UVA. L'extrait pourra également être utilisé pour la fabrication d'une composition notamment pharmaceutique ou cosmétique destinée à une application topique. Dans 15 ce cas, l'application par étalement sur la peau du sujet à traiter sera effectuée avant, pendant ou après l'exposition aux UVA. Composition nutritionnelle de l'extrait : La composition nutritionnelle de l'extrait de fruit de grenade selon l'invention 20 après analyse est la suivante : énergie 367 kcal/100 g ; glucides 84,2 % (poids/poids); matière grasse 1,4 % (poids/poids) ; protéines 2,4 % (poids/poids) et fibre diététique totale 3,8 % (poids/poids). Teneur en punicalagines et en acide ellagique de l'extrait : 25 La teneur phénolique spécifique totale se trouvant dans l'extrait de fruit de grenade selon l'invention a été déterminée ci-après (poids/poids): Punicalagine A (%) 2,77 Punicalagine B (%) 7,92 Acide ellagique (%) 1,93 Total (%) 12,62 5 3031901 15 De manière préférée, l'extrait de fruit de grenade selon l'invention comprend : a. de 0,5 à 20% en poids de punicalagine A b. de 0,5 à 20% en poids de punicalagine B c. de 35 à 70 % en poids de polyphenols Une autre réalisation de l'invention particulièrement avantageuse comprendra : a. de 0,5 à 20% en poids de punicalagine A b. de 0,5 à 20% en poids de punicalagine B c. de 35 à 70 % en poids de polyphenols d. de 1 à 50 % en poids d'acide ellagique La structure de ces composés est représentée par les formules ci-après : OH O Fie °. 01-1 ' 'OH HO Ho' O !ID \-OH r I Eq ' OH OH HO. ....-)..;.. Pun.calayinb AU! '1 0 -PO )- .-i",- 0 .01-.. ..' OH 0 I \ O ..-.: >,--,..."---r..)H O r:,... .. é/ \.i,,, OH HC-. 0 0 \',, ..- "--i"' ,....0' --\\;..............., HO 0 _ ---"' HO- .0i-, HO ,------". ns té, ; '0 HO HO OH Punicalin Etlagic =id 10 0 . , OHC 0, Il CH 15 La Figure 1 annexée est un chromatogramme d'élution de la punicalagine A, de la punicalagine B et de l'acide ellagique de l'extrait selon l'invention. 3031901 16 Exemples d'application Mise en évidence des effets photo-protecteurs de l'extrait de fruit de grenade selon l'invention sur une photo-carcinogenèse de la peau induite par 5 une exposition chronique aux UVA L'effet photo-protecteur de l'extrait de fruit de grenade selon l'invention utilisé dans l'alimentation a été mesuré par différents tests. Un exemple est donné ci-après. 10 Des souris femelles sans poil SKH-1/CRL (de 4 semaines) ayant un poids corporel moyen de 19,19 ± 0,88 g et obtenues auprès du Laboratory Animais Service of SAI (Servicio de Apoyo a la investigaciOn1Service de soutien à la recherche, licence n° REGAES 300305440012 de l'université de Murcia) ont été utilisées dans 15 l'étude. Les souris ont été logées dans des cages (40 x 30 cm) et ont reçu de la nourriture et de l'eau à volonté. La pièce était soumise à 12 heures de lumière et à 12 heures d'obscurité et était à une température de 22 °C, conformément aux normes de l'Union européenne pour la protection des animaux utilisés en expérimentation (86/609/EEC). L'expérience a été autorisée par le comité de 20 bioéthique de l'université. Pour l'expérience, vingt-deux animaux ont été répartis en deux groupes : Le groupe I (groupe témoin, n = 10) a été exposé à un rayonnement d'UVA et a reçu le régime alimentaire de base, et le groupe II (groupe recevant la grenade, n = 12) a reçu un prétraitement avec l'extrait de fruit de grenade dans son régime alimentaire 25 (0,52 g d'extrait de grenade/kg d'aliment) pendant 15 jours avant l'exposition aux UVA et jusqu'à la fin de l'expérience. Les souris ont été irradiées trois fois par semaine pendant 60 minutes, pour un total de 26 semaines, (80 séances au total). Pour l'irradiation sous UVA, les animaux ont été logés dans des cages en PVC spécialement conçues recouvertes d'une grille 30 métallique, où elles ont été maintenues séparées par des cloisons. La source de rayonnement utilisée était un équipement Philips HB554/01/A, comportant huit 3031901 17 longues lampes à tube (Philips Performance S 100W), les lampes émettant un spectre de 220 à 425 nm et un pic à 364 nm (98,6 % d'UVA et 1,4 % d'UVB). La distance entre la lampe et la peau dorsale était de 20 cm. L'énergie produite par les lampes a été mesurée avec un radiomètre UV. L'énergie absorbée par séance était 5 de 21,1 J/cm2. L'énergie totale absorbée par chaque animal était de 1688 J/cm2. Pour évaluer l'effet protecteur de l'administration par voie orale de l'extrait de fruit de grenade selon l'invention contre les lésions induites par les UVA, les zones de peau exposées au rayonnement ont été soumises à des études macroscopiques et microscopiques et une étude immunohistochimique du PCNA a été réalisée. 10 1. Etude macroscopique : Après la dernière séance d'irradiation sous UV, les animaux ont été placés à côté d'un papier millimétré et des images des animaux ont été prises avec un appareil photo numérique (Canon EOS 500D). Pour mesurer la surface de peau du dos occupée par les lésions macroscopiques (sans distinction de morphologie), une 15 application du logiciel d'analyse d'images Leica Qwin a été utilisée, ce qui a permis d'obtenir le tracé d'un masque binaire des zones lésées et d'effectuer par la suite des mesures individuelles. 2. Etude morphologique et histologique : 20 Après 26 semaines, les souris ont été sacrifiées dans une chambre à CO2, et le tissu de la peau dorsale a été prélevé. Les échantillons de tissu ont été fixés dans une solution neutre tamponnée de formaldéhyde à 10 % pendant au moins 48 h, après quoi ils ont été enrobés dans de la paraffine avant d'effectuer la coloration de sections de 4 pm d'épaisseur avec de l'hématoxyline-éosine. Les préparations ont 25 été examinées au microscope par un observateur n'ayant pas pris part l'expérience afin d'évaluer les effets du traitement. Les paramètres morphologiques suivants ont été évalués : l'hyperplasie, le degré de dysplasie et les néoplasmes (« carcinome in situ », carcinome micro-invasif et carcinome invasif). 3. Etude immunohistochimique (PCNA) : 30 3031901 18 Pour l'étude immunohistochimique, les échantillons ont été déparaffinés et la peroxydase endogène a été bloquée avec 3 % de peroxyde d'hydrogène pendant 30 minutes. Pour la récupération de l'antigène, les échantillons ont été chauffés dans un tampon au citrate (Panreac) à pH 6 dans un micro-onde à puissance 1 pendant 10 5 minutes et laissés à refroidir pendant 20 minutes à température ambiante. Immédiatement après, les échantillons ont été lavés avec du PBS et les tissus ont été soumis à une incubation avec une solution de sérum de chèvre normal (Millipore) à 10 % pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, les sections ont été soumises à une incubation avec un anticorps monoclonal primaire dirigé contre PCNA (Dako) à 10 une dilution de 1/200 pendant une nuit à 4 °C. Après un lavage, les tissus ont été soumis à une incubation avec un anticorps secondaire biotinylé anti-souris de chèvre (Dako) pendant 1 h à température ambiante, et finalement ils ont été soumis à une incubation avec le mélange avidine-biotine-peroxydase (Cultek) à une dilution de 1/100 pendant 1 h supplémentaire à température ambiante. Le développement de 15 l'immuno-coloration a été réalisé avec de la diaminobenzidine (Sigma-Aldrich) pendant 3,5 minutes et les échantillons ont été contrastés avec une solution d'hématoxyline de Mayers. Une étude d'expression quantitative du PCNA (antigène nucléaire de prolifération cellulaire) a été réalisée par une analyse d'images. Dans une première 20 étape, la préparation a été numérisée au moyen d'un microscope à balayage à haute résolution en utilisant un équipement Leica SCN400F. Ensuite, trois zones de 100 pm2 ont été tracées sur chaque image, en utilisant un module d'analyse d'image (Tissue Image Analysis) provenant de l'application Digital Image Hub SlidePath. Des zones ont été sélectionnées à partir du front de dissémination tumorale dans le cas 25 des tumeurs et à partir de la couche basale de l'épiderme il n'y avait pas de carcinome. Le programme a effectué un décompte de noyaux positifs et du nombre total de cellules, à l'aide de l'algorithme Nuclear 3.0, qui détecte le marquage au PCNA des noyaux par l'intermédiaire d'une palette de couleurs préalablement définies. 30 4. Analyse des données : 3031901 19 Les résultats sont exprimés sous la forme de valeurs moyennes ± ETM. Une analyse statistique des données a été réalisée avec le programme de statistique SPSS 12.0 (SPSS® Inc., Chicago, IL). Une étude descriptive a été réalisée pour chaque variable. Les différences entre le groupe témoin et le groupe traité à la fin de 5 l'expérience ont été évaluées par ANOVA à un facteur. Les différences entre les moyennes ont été considérées comme significatives quand p < 0,05. 5. Résultats concernant l'étude de photocarcinogenèse : 5.1 Effets du traitement avec l'extrait de fruit de grenade, étude des 10 tumeurs macroscopiques : A la fin de l'expérience, à la semaine 26, les animaux du groupe I (groupe témoin) présentaient une incidence de tumeurs macroscopiques de 100 °A). Les lésions néoplasiques ont commencé à apparaître à partir de 60 séances. La surface de peau occupée par les lésions dans ce groupe était de 190,43 ± 157,52 mm2. 15 Cependant, dans le groupe Il traité avec l'extrait de fruit de grenade, très peu de lésions macroscopiques ont été observées, les lésions étant de petite taille et d'apparence bénigne. La surface occupée par les lésions dans ce groupe était de 4,49 ± 3,4 mm2 La figure 2 présente les résultats et écart-types des surfaces des lésions dans le groupe recevant la grenade (irradiation UVA + extrait de peau de 20 grenade) et dans le groupe témoin (irradiation UVA). 5.2 Effets du traitement avec la grenade sur l'incidence tumorale et l'histopathologie : 25 L'incidence tumorale est définie comme étant le pourcentage de souris pourtant au moins une tumeur sur la zone traitée. Les effets du traitement avec l'extrait de fruit de grenade selon l'invention sur l'incidence tumorale sont présentés un peu plus loin. Les lésions des animaux du groupe témoin présentaient un carcinome invasif. Lors d'un examen au microscope, les carcinomes malpighiens (SCC) ont révélé des 30 lésions néoplasiques prolifératives de l'épiderme, ces lésions formant des nids et des 3031901 20 nodules pénétrant profondément le derme. Certains nids cellulaires forment des perles de kératine squameuse en leur centre. Une cellule néoplasique typique est une grosse cellule polyédrique ayant un cytoplasme éosinophilique abondant et un gros noyau rond qui est vésicule et qui contient un ou deux nucléoles de grande 5 taille. Des foyers de dyskératose sont observés. Les figures mitotiques sont ordinaires et occasionnellement bizarres. Le derme sous-jacent présente une fibrodysplasie légère et quelques inflammations réactives légères. Les lésions identifiées comme étant des carcinomes in situ étaient très similaires à celles décrites ci-dessus pour le carcinome malpighien, sauf que la lésion est plus petite et 10 confinée à l'épiderme ; sans traverser la couche basocellulaire. Dans le groupe traité avec l'extrait de fruit de grenade selon l'invention, seulement un carcinome invasif et un carcinome in situ ont été détectés. Des différences statistiquement significatives en ce qui concerne l'incidence des tumeurs invasives ont été trouvées entre le groupe témoin et le groupe recevant la grenade. 15 Les résultats histologiques obtenus sont référencés ci-après : Témoin Extrait de grenade innovant Carcinome envahissant Carcinome in situ 100 8,3 0 8,3 Dysplasie III 0 0 Dysplasie Il 0 8,3 Dysplasie I 0 58,3 Hyperplasie 0 58,3 Noyaux positifs au 529,33±102,623 324,67±11,015 PCNA 3031901 21 5.3 Effets du traitement avec l'extrait de fruit de grenade selon l'invention sur les cellules positives au PCNA : L'exposition de la peau à un rayonnement UV renforce le potentiel de prolifération des cellules cutanées, ce qui se traduit par une augmentation des 5 cellules positives au PCNA dans l'épiderme et le derme. Le traitement avec l'extrait de fruit de grenade selon l'invention a entraîné une réduction statistiquement significative (p < 0,001) du nombre de cellules positives au PCNA dans les sections de peau par rapport au groupe témoin (324,67 ± 11,015 par rapport à 529,33 ± 102,623). 10 En conclusion, les résultats de cette étude de photocarcinogenèse démontrent que l'extrait de fruit de grenade selon l'invention possède un effet photoprotecteur élevé à la dose étudiée. L'extrait de fruit de grenade a inhibé de manière significative l'incidence tumorale (inhibition de 91,7 %), la surface des lésions et le nombre de cellules positives au marqueur de prolifération PCNA. 15 3031901 22 Liste des références 1. Adams,L.S., Y.Zhang, N.P.Seeram, D.Heber, and S.Chen. 2010. Pomegranate ellagitannin-derived compounds exhibit antiproliferative and 5 antiaromatase activity in breast cancer cells in vitro. Cancer Prev. Res (Phila) 3:108- 113. 2. Afaq,F., V.M.Adhami, and H.Mukhtar. 2005a. 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