De façon générale, afin d'obtenir une dédifférenciation rapide et poussée des tissus sous la forme de cals friables (callogénèse) pour favoriser un passage en milieu liquide, une composition hormonale à base d'auxine (2-4 dichloro- phénoxyacétic acid) et de cytokinine (kinétine) a été testée avec succès. Les explants foliaires stérilisés peuvent être déposés sur la face adaxiale en contact avec le milieu gélosé composé d'un milieu de Murashige et Skoog (Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant 15: 473-496) avec 30g/L de saccharose, 8g/L d'agar, complémenté avec 0,5 mg/L de kinetine et 0.75 mg/L d'acide 2-4 dichloro-phenoxyacetique (24D) et ajusté à pH 6 avant un autoclavage de 20 min à 121°C (1 bar). Les boîtes de pétri contenant les explants sont laissés à incuber à l'obscurité à 28°C. Les premiers cals apparaissent au bout de 2 semaines. Les cals obtenus sont transférés sur un nouveau milieu toutes les 3 - 4 semaines en divisant les cals au scalpel de manière à maintenir une taille de 2 à 3 cm. Ces transferts se succèdent pendant 2 à 6 mois de manière à obtenir des cals friables. c. Etape de mise en suspension cellulaire dans un milieu de culture sans éliciteur La dédifférentiation cellulaire au gré des transferts successifs des cals sur milieu gélosé abouti à la formation de cals friables. Cette baisse de la cohésion entre les cellules est une conséquence de la dédifférentiation qui peut survenir entre deux et six mois selon la plante. Cet état est propice au passage en milieu liquide car il garanti un délitement des cals en suspension cellulaire tout en minimisant les stress mécaniques induits. Ainsi une collection de cals friables est introduit (10-20% du volume) dans le milieu nutritif liquide préparé suivant la même formulation que le milieu gélosé de dédifférentiation mais sans agent gélifiant. Les cals friables sont délités ainsi en milieu liquide par l'action d'une table d'agitation pendant 2 à 3 jours et la suspension cellulaire obtenue est débarrassée des parties de cals non délitées formant ainsi une suspension cellulaire homogène. Cette suspension est maintenue en culture de manière à obtenir une population cellulaire suffisamment dense. A ce stade la suspension est (repiquée ou) diluée dans du milieu nutritif neuf et mise en culture de la même manière. La mise en suspension cellulaire initiale peut être réalisée en déposant environ 20 à 40 g de cals friables dans un erlenmeyer de 500ml contenant 200 ml de milieu. Les cals friables sont délités ainsi en milieu liquide par l'action d'une table d'agitation pendant 2 à 3 jours à 115 RPM à l'obscurité à 29°C. Ensuite le surnageant cellulaire est récolté à la pipette laissant de coté les amas de cals résiduels non délités. Le surnageant cellulaire forme ainsi une suspension cellulaire homogène. Cette suspension est maintenue en culture de manière à obtenir une population cellulaire « suffisamment dense. La suspension cellulaire obtenue est cultivée pendant 15 J puis propagée par dilution au I/5ème dans du nouveau milieu sur la même durée. Des ajustements de la composition du milieu de culture (nutriments, facteurs de croissance etc.) ont été réalisés afin de maximiser la productivité en biomasse. Il en résulte le milieu de propagation de la biomasse ARGMS (Cf tableau 1) optimisé pour la suspension cellulaire liquide. Ce milieu est une version modifiée du milieu de Murashige Skoog pour la callogénèse. Ce milieu est ajusté à pH 6 par l'ajout de KOH suivi d'un autoclavage de 20 min à 121°C (p = 1 bar) ou d'une filtration stérilisante à 0,2pm.