INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Ce dernier présente à sa périphérie une gorge hélicodale 7 dans laquelle s'enroule l'extrémité d'un câble d'entranement et à partir de laquelle se déroule un autre câble d'entranement, selon le sens de
rotation de la roue d'entranement 14.
La liaison entre la roue d'entranement 14 et le tambour d'enroulement 2 est réalisée par des pattes axiales 18 formées sur une face de l'une de ces pièces, et coopèrant avec des cavités ménagées dans la face en vis-àvis de l'autre pièce avec interposition éventuelle de moyens élastiques anti-vibrations. La référence 19 désigne une plaque solidaire du deuxième bo^'tier 11 qui empêche la roue d'entranement 14 de s'échapper de son logement lorsque le moto-réducteur est désolidarisé d u premier bo^tier, pour des nécessités de réparations par exe m ple. Da ns ces conditions, l'axe 16 étant solidaire du deuxième bo'^tier 11, le tambour d'enroulement 2 n'est plus supporté par l'axe 16 et est susceptible de
Protocole de transformation : Ajouter 1/11 d'ADN ligué (== 0, 1 ng) à 40 ut de bactéries électrocompétentes, laisser en contact pendant 4 min. dans la glace.
Déposer dans la cuve d'électroporation (Biorad gene pulser cuvette ; 0,2 cm) Conditions d'électroporation : 2500 V, 200 ohm, 25 uF.
Mettre 1 ml de SOC immédiatement et laisser reposer de 30 minutes à une heure à 37 C pour permettre l'expression du gène de résistance à l'antibiotique.
Étaler 20 l et 2001. li sur des boîtes de Pétri LB + kanamycine 1 Og/ml final Laisser pousser sur la nuit à 37 C.
Analyse des colonies : Les colonies sont comptées et repiquées dans une plaque 96 puits dans lOOul LB + kanamycine à 1 Og/ml final. Pour vérifier la présence du plasmide dans les colonies, une PCR est effectuée sur ces colonies avec soit le couple midEYFP. a et midECFP. m, soit le couple formé par un des oligos forward suivants : Chaque oligonucléotide est SGp94S1. a CCGGAAGTGGCACGAACATG pour le sIte 1 spécifique d'un fragment SGp94S2. a CCGGAAGTGGCGTGAGAAAT pourlesite2 double-brin cloné. Ils sont centres au niveau du site de SGp94S3. a CCGGAAGTGGCATTGTTCCC pourlesite- restriction BspEI.
... et Foligonucléotide reverse midECFP. m.
Les produits de PCR sont déposés sur gel d'agarose 0, 8% + Bromure d'éthidium 0, 5ug/ml final. Pour vérifier la présence d'un insert dans les plasmides, un certain nombre de produits de PCR de clones positifs sont séquencés avec Foligonucléotide midECFP. m.
2-Culture des cellules eucaryotes : Lignées cellulaires utilisées : C2C12 : Myoblastes murins Milieux utilisés : DMEM : Milieu de Eagle modifié par Dulbecco (Gibco BRL) MEM : Solution d'acides aminés non essentiels (Gibco BRL) SVF : Sérum de veau foetal (Gibco BRL) Milieu utilisé pour la lignée 911 : DMEM + 10% SVF + 1% MEM Milieu utilisé pour les lignées Cos7 et C2C12 : DMEM + 10% SVF Activation des calpaïnes : Du chlorure de calcium à 6mM final et de la ionomycine (Calbiochem) à 0, 5uM final sont ajoutés dans le milieu de culture.
3-Protocole de transfections des vecteurs d'expression dans des cellules eucaryotes : Matériel : L'ADN des différents plasmides est préparé selon le protocole QIAGEN Endofree (ref. 12362) Plasmides utilisés : pECFP-N1 (Clontech) ; pEYFP-Cl (Clontech).
Méthodes : 1er jour : Faire une trypsination des cellules souhaitées puis ensemencer les puits de façon à ce que les cellules soient à 50-80% de confluence le lendemain.
2èmejour : Dans un premier tube stérile en polystyrène (Tl), déposer 94 al de milieu sans sérum de veau foetal.
Ajouter à chaque tube Tl 6 ul de tampon FUGENE 6 (Boeringher Mannheim) Incuber 5 min. à température ambiante.
Dans un second tube stérile en polystyrène (T2), déposer dans le fond du tube 1 à 2 ug de plasmide EndoFree.
Une fois les 5 min d'incubation passées, mettre goutte à goutte le tampon FUGENE 6 (Tl) +milieu dans le tube T2 contenant le vecteur.
Incuber 30 min à température ambiante sans aucune agitation.
Changer le milieu des puits.
Système d'induction Système d'expression Fond génétique de Promoteur Gène Promoteur Gène l'hôte cellulaire ou de la plante I isum2A-/isum2A-a- Constitutif Activateur Sous contrôle Isum2A régulable de l'activateur par inducteur II isum2A-/isum2A- Constitutif ou Répresseur Sous contrôle Isum2A spécifique de régulable du répresseur l'embryon par inducteur III Isum2A+/Isum2A+a Constitutif ou Activateur Sous contrôle Polynucléotide spécifique de régulable de l'activateur antisens de l'embryon par Isum2A inducteur a isum 2A/isum2A : homozygote pour une copie non fonctionnelle du gène isum2A, par exemple une mutation.
'Isum 2A+/lsum2A+ : homozygote portant deux copies fonctionnelles du gène isum2A.
Description du système d'expression inductible 1 du tableau 3 Le système d'expression inductible 1 du tableau 3 constitue une illustration d'une construction d'acides nucléiques dans laquelle le polynucléotide régulateur est un polynucléotide activateur inductible de la transcription et/ou de la traduction, selon le second mode de réalisation défini précédemment.
Le système d'expression 1 comprend :
(i) une première cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un promoteur dont l'activité est induite uniquement en présence d'un composé activateur, lorsque ce composé activateur, en général un facteur de transcription, est lié à un composé inducteur.
(ii) une seconde cassette d'expression comprenant un acide nucléique codant pour le composé activateur, par exemple le facteur de transcription ci-dessus, placé sous le contrôle d'un promoteur permettant l'expression constitutive du composé activateur.
Selon le système l, la transcription ou la traduction de la séquence codant pour un polypeptide ISUM2A est induite uniquement lorsque le composé activateur est complexé au composé inducteur. Le complexe entre le composé activateur et le composé inducteur se fixe sur le promoteur contrôlant l'expression de l'acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, et active l'expression de ce dernier.
Un exemple du système 1 est illustré à l'exemple 3, dans lequel, le système comprend : (i) un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un promoteur contenant la séquence UAS, qui est reconnue par le composé activateur GVG. Le composé activateur GVG est une protéine de fusion entre le domaine de liaison à l'ADN de la protéine GAL4, le domaine activateur du gène VP16 et le récepteur au glucocorticoïde du rat (GR).
(ii) un acide nucléique codant pour la protéine de fusion GVG définie ci-dessus, qui est placé sous le contrôle d'un promoteur constitutif.
Dans l'exemple 3, la protéine de fusion GVG est exprimée constitutivement dans la plante, mais n'active pas le promoteur contrôlant l'expression du polypeptide ISUM2A, en l'absence de glucocorticoïde.
En revanche, lorsque la plante est mise en présence du composé inducteur représenté par un glucocorticoïde, le glucocorticoïde se fixe sur la protéine de fusion GVG, et le complexe ainsi formé entre le composé inducteur activateur (glucocorticoïde) et le composé activateur (la protéine de fusion GVG) va se fixer sur la séquence UAS du promoteur contrôlant l'expression d'un polypeptide ISUM2A, ce qui active le promoteur contenant la séquence UAS et induit la synthèse du polypeptide ISUM2A.
Dans le système d'expression inductible ci-dessus, le glucocorticoïde constitue le composé inducteur.
Le signal inducteur activateur est la fixation du complexe composé activateur/composé inducteur (polypeptide de fusion GVG/glucocorticoïde) sur le polynucléotide régulateur activateur (promoteur contenant la séquence UAS).
On utilisera le système d'expression 1 préférentiellement dans un hôte cellulaire végétal ou dans une plante dont les deux copies du gène isum2A sont non fonctionnelles, par exemple dont les deux copies du gène isum2A sont mutées.
Système d'expression inductible Il du tableau 3.
Le système d'expression inductible Il est une illustration du mode de réalisation d'une construction d'acides nucléiques selon l'invention, selon le premier mode de réalisation exposé précédemment, dans lequel le polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A est placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur répresseur .
L'invention vise également à offrir un kit pour la mise en oeuvre de la méthode ci-dessus permettant de tester les marqueurs génétiques de l'hypercortisolémie à partir d'un échantillon d'ADN. Un tel kit comprend une paire d'amorces nucléotidiques comme définie précédemment qui seront utilisées avec des réactifs d'amplification par PCR disponibles commercialement. Le kit peut aussi inclure des contrôles négatifs et positifs des réactions et des marqueurs.
L'invention se rapporte aussi à une méthode pour identifier des substances capables de moduler l'expression du gène Cbg et/ou sa synthèse dans le but thérapeutique de réduire une hypercortisolémie. En effet, la protéine CBG, de type sauvage ou mutante, peut être utilisée pour un criblage in vitro de composés capables de modifier la liaison de la CBG au cortisol et/ou à la corticostérone. En conséquence, l'invention a pour objet une méthode d'identification de substances capables de
moduler la fonction de la CBG consistant à mesurer par toute technique appropriée la liaison du composé à la CBG (sauvage ou mutante). Il peut s'agir d'une technique utilisant les méthodes de criblage à grande échelle décrites dans la littérature comme par exemple dans l'ouvrage High throughput screening : The discovery of Bioactive Substances , JP Delvin (Ed), Marcel Dekker Inc.
New York (1997).
L'activité de liaison entre la CBG et un composé actif peut par exemple être déterminée par un test de radio-liaison dans lequel la capacité de liaison et l'affinité des composés à tester sont estimés par leur capacité de déplacement de cortisol radioactif. La source de CBG est obtenue par exemple par transfection d'un vecteur contenant l'ADNc du gène Cbg dans des cellules en culture. La protéine étant sécrétée, le test de radioliaison peut-être réalisé sur le milieu de culture. Les composés entrant efficacement en compétition avec le cortisol seront sélectionnés.
L'invention concerne également l'utilisation d'animaux surexprimant le gène Cbg ou exprimant un mutant de ce gène comme modèle d'étude pour comprendre les mécanismes d'action de la CBG sur l'axe corticotrope et/ou pour cribler des composés capables de moduler l'expression de la CBG.
A titre d'exemple, ces animaux transgéniques sont obtenus par micro-injection dans des embryons de l'animal (par exemple souris, rat, porc) d'un acide nucléique contenant la séquence codante du gène Cbg (par exemple SEQ ID n l) ainsi que des séquences régulatrices permettant sa sur-expression dans le tissu cible (dans ce cas le foie) comme il est classiquement d'usage pour cette technologie.
Ces animaux peuvent être utilisés comme modèles de pathologies associées à l'hypercortisolémie dont l'obésité, les réponses inflammatoires et auto-immunes, le vieillissement en particulier cognitif, les toxicomanies.
Le criblage de composés peut être réalisés par l'administration à l'animal du composé à tester suivie de la mesure des altérations dans ledit animal de la fonction corticotrope par les méthodes classiques.
L'identification des marqueurs génétiques selon l'invention permet de disposer de nouveaux outils pour la réalisation de tests génétiques pour la CBG afin d'évaluer l'hypercortisolémie constitutive et par voie de conséquence la vulnérabilité aux pathologies indiquées précédemment et notamment l'obésité. Un tel test est également utile pour la contre-sélection d'animaux d'élevage montrant une hypercortisolémie constitutive.
A titre d'exemple, une telle méthode comprend l'amplification par PCR d'une région de l'ADN de l'échantillon comprenant tout ou partie du gène Cbg puis l'analyse de cette région pour identifier la présence d'au moins une mutation responsable d'une hypercortisolémie et susceptible d'avoir été identifiée par la méthode décrite précédemment.
L'invention se rapporte donc aussi à l'utilisation de la méthode ci-dessus pour le diagnostic d'une hypercortisolémie ou d'une prédisposition à une hypercortisolémie chez un sujet, notamment humain, permettant d'identifier un dysfonctionnement de l'axe corticotrope et donc une maladie ou une prédisposition à une maladie liée à cet axe comme l'obésité, la sensibilité constitutive aux réactions inflammatoires et auto-immunes, ou encore les pathologies du vieillissement (en particulier cognitives) ou la sensibilisation aux drogues d'abus.
L'invention se rapporte enfin à l'identification de composé agoniste ou antagoniste de la CBG et donc capable d'agir directement sur le taux de CBG ou sur son affinité pour le cortisol ce qui indirectement réduira le taux de corticostéroïdes.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant l'identification de mutations dans le gène Cbg chez le porc et l'analyse de liaisons génétiques mettant en une relation de cause à effet entre des variants moléculaires de la CBG et la production de cortisol. 11 sera fait référence aux figures en annexe dans lesquels : - la figure 1 représente la localisation du gène Cbg de porc par cartographie sur hybrides irradiés. En A : Evolution du taux maximal de vraisemblance le long de Sscr 7 (en cM) pour les concentrations de cortisol plasmatique. En B : profil de cartographie par hybrides irradiés du chromosome 7 de porc. Les distances sont en cor7000.
- la figure 2 représente la localisation du gène Cbg de porc à 7q26 par FISH.
- La figure 3 représente l'analyse de liaison génétique des concentrations de CBG plasmatique sur 81 porcs F2.
2) L'acide 4-(R,S)-diazo-(1-hydroxy-4-méthyl-4-phényl-cyclohex-2- ényl)-acétique est préparé de la façon suivante : A une solution, refroidie à-78 C, de 1 g de 4- (R, S) -4-méthyl-4-phényl- cyclohex-2-énone dans 45 cm3 de tétrahydrofurane, on ajoute 0,56 cm3 d'ethyl diazoacétate puis lentement 3,5 cm3 de diisopropylamidure de lithium commercial en solution 2M dans l'hexane. Le mélange réactionnel est alors agité à une température voisine de-78 C pendant 2 heures avant addition de 1 cm3 d'acide acétique glacial, retour au voisinage de 200C et addition de 100 cm3 d'eau distillée. Le mélange obtenu est extrait par 3 fois 50 cm3 d'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont réunies et lavées par 2 fois 60 cm3 d'eau distillée, séchées sur sulfate de magnésium puis concentrées à sec, sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flashchromatographie sur alumine basique, en éluant avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (95/05), on obtient ainsi 622 mg d'ester éthylique de l'acide 4-(R,S)-diazo-(1-hydroxy-4-methyl-4-phenyl-cyclohex-2enyl)-acetique, sous forme d'une huile jaune dont les caractéristiques sont les suivantes : - Rf CCM silice éluant : cyclohexane-acétate d'éthyle (95/05) = 0,45 - spectre de masse (El, DCI, IS) : M/Z = 301 (MH+)
3) L'ester éthylique de l'acide 6- (R, S) -6-méthyl-6-phényl-6, 7-dihydro- 1 H-indazole-3-carboxylique est préparé de la manière suivante : A une solution, refroidie à -10OC, de 350 mg d'ester éthylique de l'acide 4- (R, S)-diazo-(1-hydroxy-4-méthyl-4-phényl-cyclohex-2-ényl)-acétique dans 3,5 cm3 de pyridine, on ajoute goutte à goutte 0,43 cm3 d'oxychlorure de phosphore. Le mélange réactionnel est alors agité à -10OC, pendant 2 heures puis est versé sur environ 50 g de glace pilée. Le mélange résultant est extrait par fois 20 cm3 de dichlorométhane. La phase organique ainsi obtenue est lavée par 2 fois 20 cm3 d'eau distillée, séchée sur sulfate de magnésium puis concentrée à sec sous pression réduite. Le résidu est purifié par flash-chromatographie sur gel de silice (35-70 um), en éluant avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (80/20) pour donner 60 mg d'ester éthylique de l'acide 6- (R, S)-6-méthyl-6-phényl-6, 7-dihydro-1 H-indazole-3- carboxylique sous forme d'une laque incolore dont les caractéristiques sont les suivantes : - Rf CCM silice éluant : cyclohexane-acétate d'éthyle (80/20) = 0, 27 - spectre de RMN : 1H (300 MHz, (CD3) 2SO d6, Ó en ppm) : 1, 32 (t, J = 7 Hz : 3H) ; 1,46 (s : 3H) ; 2,90 (d large, J = 16 Hz : 1H) ; 3,04 (d, J = 16 Hz : 1 H) ; 4,31 (q, J = 7 Hz : 2H) ; 5,98 (mf : 1H) ; 6,78 (d, J = 10 Hz : 1H) ; 7,21 (tt, J = 7,5 et 1,5 Hz : 1 H) ; 7,30 (t large, J = 7, 5 Hz : 2H) ; 7,42 (d mt, J = 7, 5 Hz : 2H) ; 13,35 (mf : 1H).
EXEMPLE 9-2
L'isolement de l'énantiomère dextrogyre de l'ester éthylique de l'acide 6- (R, S) -6-méthyl-6-phényl-6, 7 -dihydro-1 H-indazole-3-carboxylique est réalisé de la façon suivante : 480 mg du mélange racémique de l'ester éthylique de l'acide 6- (R, S)-6- méthyl-6-phényl-6, 7-dihydro-1 H-indazole-3-carboxylique, obtenu à l'exemple 9-1, sont dédoublés sur une colonne chirale CHIRACEL OJ TM, en 1 injection et en éluant par un mélange de n-heptane-éthanol-isopropanol-triéthylamine (90/5/5/0,1 en volumes). En recueillant la deuxième fraction éluée (temps de rétention 45 minutes), on obtient, après concentration du solvant sous pression réduite, 107 mg de l'énantiomère dextrogyre de l'ester éthylique de l'acide 6-méthyl-6-phényl-6, 7-dihydro-1 H-indazole-3-carboxylique, sous forme d'une huile beige dont les caractéristiques sont les suivantes : - CLHP analytique : temps de rétention = 21 mn (phase stationnaire : Chiracel OJ, longueur 25 cm ; phase mobile : mélange de n-heptane-éthanol- isopropano-triéthylaminel 90/5/5/0, 1 en volumes, débit 1 ml/mn).
- spectre de RMN : 1H (300 MHz, (CD3) 2SO d6, en ppm) : 1, 32 (t, J = 7 Hz : 3H) ; 1, 45 (s : 3H) ; 2, 88 (d large, J = 16, 5 Hz : 1 H) ; 3, 13 (d, J = 16,5 Hz : 1H) ; 4,30 (q large, J = 7 Hz : 2H) ; 5,97 (mf : 1H) ; 6,77 (d, J = 10 Hz : 1 H) ; 7, 20 (t large, J = 7, 5 Hz : 1 H) ; 7,31 (t large, J = 7, 5 Hz : 2H) ; 7,41 (d large, J = 7,5 Hz : 2H) ; 13,37 (mf : 1 H).
EXEMPLE 9-3 Préparation de l'ester éthylique de l'acide 6- (R, S) -phényl-6, 7dihydro-2H-indazole-3-carboxylique 1) La 4-phényl-cyclohex-2-énone est préparée de la façon suivante :
On chauffe, pendant 1 heure, à une température voisine du reflux, un mélange de 19, 5 cm3 de phényl-acetaldéhyde, 16,7 cm3 de méthyl vinyl cétone, 0,17 cm3 d'acide sulfurique à 36 % et 85 cm3 de toluène. Après retour à une température voisine de 20 C, on ajoute au mélange réactionnel 50 cm3 d'acétate d'éthyle. Le mélange résultant est lavé par 100 cm3 d'une solution aqueuse saturée en bicarbonate de sodium puis séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré à sec sous pression réduite. Le résidu est purifié par flash chromatographie sur colonne de silice [éluant : cyclohexane/acétate d'éthyle (90/10)] pour donner 4,7 g de 4-phényl- cyclohex-2-énone, sous forme d'une huile jaune dont les caractéristiques sont les suivantes : - Rf CCM silice éluant : cyclohexane-acétate d'éthyle (80/20) = 0,38 - spectre de RMN : 1H (300 MHz, (CD3) 2SO d6, ô en ppm) : 1,97 (mt : 1H) ; de 2, 20 à 2, 65 (mt : 3H) ; 3, 86 (mt : 1H) ; 6, 08 (dd, J = 10 et 3 Hz : 1H) ; 7,07 (ddd, J = 10-3 et 1,5 Hz : 1 H) ; de 7,20 à 7,35 (mt : 3H) ; 7,38 (t large, J = 7, 5 Hz : 2H).
2) L'ester éthylique de l'acide 6- (R, S) -phényl-6, 7-dihydro-2H- indazole-3-carboxylique est obtenu de la façon suivante : A une solution de 2 g de 4-phényl-cyclohex-2-énone dans 2 cm3 de tetrahydrofurane, est ajoutée, goutte à goutte, à-78 C, 1,15 cm3 d'éthyl diazoacétate puis lentement 30 cm3 de solution de diisopropylamidure de lithium préalablement préparée à partir de 8 cm3 de n-butyllithium 1,6M dans l'hexane et de 2 cm3 de diisopropylamine en solution dans 20 cm3 de tetrahydrofurane. Après agitation du mélange réactionnel à une température voisine de-78 C pendant 4 heures, on ajoute 1, 6 cm3 d'acide acétique glacial et on laisse la température du mélange réactionnel remonter au voisinage de 20 C. On ajoute alors 20 cm3 de toluène et le mélange résultant est lavé successivement avec 20 cm3 d'une solution aqueuse saturée de bicarbonate de sodium et 20 cm3 d'eau. La phase organique obtenue est concentrée sous pression réduite pour éliminer le tetrahydrofurane. La
solution toluénique résultante est chauffée au reflux pendant 4 heures dans un ballon équipé d'une trappe de Dean-Stark puis concentré à sec sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash-chromatographie sur gel de silice (35-70 um), en éluant avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (80/20) pour donner 320 mg de l'ester éthylique de l'acide 6- (R, S)-6- phényl-6, 7-dihydro-2H-indazole-3- carboxylique sous forme d'une huile jaune dont les caractéristiques sont les suivantes : - Rf CCM silice éluant : [cyclohexane/acétate d'éthyle (70/30)] = 0,64 - spectre de RMN : 1H (300 MHz, (CD3) 2SO d6 avec ajout de quelques gouttes de CD3COOD d4, 8 en ppm) : 1,33 (t, J = 7 Hz : 3H) ; 2, 82 (dd, J = 16 et 9, 5 Hz : 1H) ; 3, 13 (dd, J = 16 et 8 Hz : 1H) ; 3, 90 (mt : 1H) ; 4,12 (q, J = 7 Hz : 2H) ; 5, 90 (dd, J = 10 et 4 Hz : 1H) ; 6,84 (dd, J = 10 et 1,5 Hz : 1 H) ; de 7,20 à 7,40 (mt : 5H).
3) L'eutomère de l'ester éthylique de l'acide 6- (R, S) -6-phényl-6, 7- dihydro-2H-indazole-3- carboxylique peut être obtenu de la façon suivante : 300 mg du mélange racémique de l'ester éthylique de l'acide 6- (R, S)-6phényl-6, 7-dihydro-2H-indazole-3-carboxylique obtenu à l'exemple 9-3, sont dédoublés sur une colonne chirale CHIRALPAK AD, en 1 injection et en éludant par un mélange de n-heptane-éthanol (60/40 en volumes).
En recueillant la deuxième fraction éluée (temps de rétention 60 minutes), on obtient, après concentration du solvant sous pression réduite, 49,6 mg de l'eutomère de l'ester éthylique de l'acide 6-phényl-6, 7-dihydro-2H-indazole-3- carboxylique, sous forme d'une huile jaune dont les caractéristiques sont les suivantes : - CLHP analytique : temps de rétention = 161 mn (phase stationnaire : Chiralpak, longueur 25 cm ; phase mobile : mélange de n-heptane-éthanol 60/40 en volumes, débit 1 ml/mn).
- spectre de RMN : 1H (300 MHz, (CD3) 2SO d6, 8 en ppm) : 1,34 (t, J = 7 Hz : 3H) ; 2,82 (dd, J = 16 et 9,5 Hz : 1H) ; 3,13 (dd, J = 16 et 8 Hz :
1H) ; 3,90 (mt : 1H) ; 4,32 (q, J = 7 Hz : 2H) ; 5,94 (mf : 1H) ; 6,83 (dd, J = 10 et 1, 5 Hz : 1H) ; de 7, 20 à 7, 40 (mt : 5H) ; 13,40 (mf : 1H).
EXEMPLE 10-1 ester éthylique de l'acide 6, 6-bis- (4-méthoxy-phényl) -6, 7- dihydro-1 H-indazole-3-carboxylique
L'ester éthylique de l'acide 6, 6-bis- (4-méthoxy-phényl) -6, 7-dihydro- 1 H-indazole-3-carboxylique est obtenu de la manière : A une solution, refroidie à-78 C, de 2 g de 4, 4-bis- (4-méthoxy- phényl) -cyclohex-2-énone obtenue selon Chem. Abstr., 64,2004h, 1966 dans 50 cm3 de tétrahydrofurane, est ajoutée, goutte à goutte, 0, 9 cm3 d'éthyl diazoacétate puis lentement 13 cm3 d'une solution de diisopropylamidure de lithium préalablement préparée à partir de 6,5 cm3 de n-butyllithium 1,6M dans l'hexane et de 1,46 cm3 de diisopropylamine en solution dans 15 cm3 de tétrahydrofurane. Après agitation du mélange réactionnel à une température voisine de-70 C pendant 3 heures, on ajoute 1,2 cm3 d'acide acétique glacial et on laisse la température remonter au voisinage de 20 C. On ajoute alors 250 cm3 d'éther éthylique et le mélange résultant est ensuite lavé par 2 fois 200 cm3 d'eau distillée puis séché sur sulfate de sodium et concentré à sec sous pression réduite. Le résidu est mis en solution dans 65 cm3 de toluène puis chauffé à une température voisine de 110 C pendant 1,5 heure avant concentration à sec sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par flash-chromatographie sur gel de silice (35-70 um), en éluant avec un mélange cyclohexane-acétate d'éthyle (70/30) pour donner 0,48 g de l'ester éthylique de l'acide 6, 6-bis- ( 4-methoxy-phenyl) -6, 7 -dihydro-1 H-indazole-3-
carboxylique sous forme d'une meringue jaune dont les caractéristiques sont les suivantes : - Rf CCM silice éluant : cyclohexane-acétate d'éthyle (70/30) = 0, 15 - spectre de RMN : 1H (300 MHz, (CD3) 2SO d6, en ppm) : 1, 31 (t, J = 7 Hz : 3H) ; 3,32 (s large : 2H) ; 3,72 (s : 6H) ; 4,29 (q large, J = 7 Hz : 2H) ; 6,26 et 6,46 (respectivement mf et d large, J = 10 Hz : 1 H en totalité) ; 6,80 (d, J = 10 Hz : 1H) ; 6,84 (d, J=8, 5Hz : 4H) ; 7,11 (d large, J=8, 5 Hz : 4H) ; 13, 37 et 13, 41 (2 mfs : 1 H en totalité).
Ensuite, l'étape 219 de mise àjour du registre 50 PtR est réitérée.