INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Une étude immuno-histologique utilisant le protocole décrit à l'exemple 4 a été réalisée sur des coupes de peau de 5 patients atteints de psoriasis. La Figure 9 est représentative de l'ensemble des coupes observées et montre, au niveau de l'épiderme, une expression très forte de LOX et une présence moyenne de NRAGE, avec un marquage plus ou moins homogène des zones concernées, ne montrant pas de gradient d'expression. A ces caractéristiques d'intensité d'expression variant de la normale, s'ajoutent des anomalies beaucoup plus importantes touchant à la localisation des protéines concernées. Ainsi, dans les peaux psoriatiques, LOX est exprimée essentiellement dans la partie inférieure de l'épiderme et NRAGE uniquement dans sa partie supérieure, l'expression des protéines étant ainsi décalée, sans zone de recouvrement, telle qu'elle est normalement observée dans la peau saine. Au niveau cellulaire, NRAGE est observée au niveau cytoplasmique uniquement et pas en zone périphérique sous-membranaire.
Exemple 11: mise en évidence de la localisation de LOX et de NRAGE dans la peau d'un patient atteint d'eczéma.
Une étude immuno-histologique utilisant le protocole décrit à l'exemple 4 a été réalisée sur des coupes de peau de patients atteints d'eczéma. La Figure 10 met en évidence, au niveau épidermique, une très forte expression péricellulaire de LOX. En revanche, NRAGE est peu exprimée et est observée au niveau cytoplasmique uniquement, ce qui traduit une perte de co-localisation au niveau cellulaire.
Exempte 12: mise en évidence de l'implication de LOX dans l'inhibition de l'apoptose.
L'étude a été réalisée sur des cultures de kératinocytes humains différenciés en monocouche et à confluence. L'effet de LOX sur l'apoptose a été mis en évidence en inhibant son activité, par ajout de R-APN (0,02 p/v û (poids/volume)), en conditions normales ou pro-apoptotiques (choc thermique provoqué par une exposition à une température de 45 C +/-0,5 C pendant 1h30). La détection et la quantification de la mort cellulaire par apoptose utilisent la technique TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP nick end labelling) qui repose sur le marquage des délétions de l'ADN accompagnant l'apoptose. La première étape consiste à marquer les cassures de l'ADN par TdT (Terminal désoxynucléotidyl transférase) qui catalyse la polymérisation des nucléotides marqués fluorescéine à l'extrémité 3'OH libre de l'ADN. La deuxième étape consiste à détecter la fluorescéine incorporée par un anticorps anti-fluorescéine, conjugué avec la phosphatase alcaline, après incubation avec le substrat de cette dernière. L'expérimentation est validée à l'aide d'un témoin positif obtenu par fragmentation de l'ADN par une solution de DNase et d'un témoin négatif obtenu en déposant du tampon phosphate.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau ci-dessous. Tableau 1 Sans choc thermique (% de Avec choc thermique (% cellules marquées) de cellules marquées) Sans R-APN 6 % 39 0/0 Avec ~3-APN 56% 81 h25 Les résultats obtenus démontrent que: le choc thermique (45 C +/-0,5 C pendant 1h30) induit une apoptose cellulaire marquée, - l'inhibition de l'activité enzymatiques de LOX par le R--APN entraîne une augmentation importante de l'apoptose. Ces résultats mettent en évidence un effet anti-apoptotique de l'activité de LOX.
Extraction des ARNtotaux Les ARN totaux sont extraits à l'aide du système SV Total RNA Isolation System (Promega, Meylan, France) pour les conditions de plaques 96 puits selon le protocole du fabriquant. La modification de l'expression des gènes est réalisée par RT-PCR temps réel mesurant l'expression de chaque gène rapportée à l'actine (housekeeping gene) et exprimée en % du témoin négatif non traité.
RT-PCR quantitative en temps réel (Q-RT-PCR) 10pL d'ARNtotaux 5ng/pL sont ajoutés à 40pL de mix PCR (composé de 25pL de SYBR Green Buffer Mix 2X, 0.5pL de mix enzyme, 0.5pM final d'amorce sens et 0.5pM final d'amorce antisens, eau RNase et DNase free qsp 40pL).
La RT-PCR se déroule en différentes étapes dont la retrotranscription à 50 C, 30min, activation de la polymérase 95 C, 15min, réalisation des cycles de PCR (95 C,15s; 60 C, 30s; 72 C,30s) x 50 cycles
Réalisation de la courbe de fusion 90 C, imin 30 C, imin 50 C à 95 C, 10s/ C (courbe de fusion) Le pourcentage de stimulation ou d'inhibition est exprimé par rapport au contrôle non traité (en l'absence de substance à tester).
Gène Actine - Hybridation 60 C Sens GTGGGGCGCCCCAGGCACCA Antisens CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC Gène LOX - Hybridation 60 C Sens ACGTACGTGCAGAAGATGTCC Antisens GGCTGGGTAAGAAATCTGATG Gène NRAGE -Hybridation 60 C Sens TGCACAGACATCAGCAGATGG Antisens TTCACGGATGATATCTCTCAGC
Gène Involucrine - Hybridation 60 C 10 Sens TGTTCCTCCTCCAGTCAATACCC Antisens ATTCCTCATGCTGTTCCCAGTGC
Afin de tenir compte de la population cellulaire présente, tous les résultats ont été rapportés au signal actine , utilisé comme gène 15 rapporteur (Housekeeping gene). Selon l'expérimentation, le seuil de mesure du C(T) (= Cycle Threshold) a été fixé pour T compris entre 0,05 et 0,01 puis une unité arbitraire de mesure est calculée pour chaque gène selon la formule : Sgène x 107 x (1/2) C(T)gène x 20 C(T)gène x signifiant le nombre de cycles nécessaires pour atteindre le seuil de fluorescence de 0,01-0,05 du gène x . Les valeurs des gènes d'intérêt ont été rapportées au signal actine par calcul du rapport: R = Sgène x / Sactine. 25 Ces rapports ont été comparés entre les échantillons traités et non traités, x étant le gène d'actine, de LOX ou de NRAGE.
Criblage de principes actifs: Les quantités d'ADNc de chaque essai sont rapportées à la quantité d'ADNc de l'actine puis aux contrôles négatifs (sans actifs). Les résultats sont considérés comme significatifs lorsque l'effet mesuré atteint un facteur d'environ 2. Sur 120 actifs testés, 3 correspondent à ces critères, aux concentrations testées et dans les conditions définies. Ces actifs sont les suivants et font l'objet du tableau ci-dessous :
3.1.6) Les cancers cutanés épithéliaux On distingue deux grands types de carcinomes cutanés épithéliaux: le carcinome basocellulaire (90 % des cas) est une tumeur d'évolution lente, essentiellement locale, qui ne métastase quasiment jamais. Il résulte d'une prolifération incontrôlée des kératinocytes de la couche basale. le carcinome spinocellulaire (10 % des cas) a une évolution locale beaucoup plus agressive et peut métastaser. Il a pour origine une prolifération incontrôlée des kératinocytes de la couche spineuse. Les inventeurs ont mis en évidence l'absence de LOX et de NRAGE dans les cellules invasives des deux types de cancers étudiés (cancers basocellulaires et spinocellulaires) avec une perte progressive de LOX et de NRAGE dans l'épiderme au voisinage des tumeurs. Les inventeurs ont également observé que LOX est fortement exprimée dans la réaction stromale autour des tumeurs, alors que NRAGE en est absent. On peut noter à ce stade que la perte d'expression de LOX, qui n'avait jamais été mise en évidence précédemment dans les cas de ces deux types de cancers, est inattendue et, peut-être, spécifique aux cancers épithéliaux, puisque LOX est généralement considérée comme étant présente dans les cancers in situ. La perte d'expression de NRAGE est elle aussi complètement nouvelle, et n'a jamais été décrite dans aucun cancer.
Ainsi, la stimulation de l'expression (et/ou l'activité) de NRAGE, et de l'expression (et/ou activité) de LOX, permet de restaurer l'homéostasie. Il est possible de réverser le phénotype tumoral, notamment au niveau des cancers cutanés épithéliaux. 3.2) Conclusion des études sur tissus oathologiques A partir de ces observations, les inventeurs ont pu mettre en évidence que les situations dans lesquelles intervient une dérégulation de l'équilibre entre prolifération, différenciation et apoptose, que ce soit au niveau de l'épiderme de sujets âgés, ou de sujets atteints de différentes pathologies affectant notamment l'épiderme, étaient caractérisées de façon systématique par des défauts d'expression de LOX et/ou de NRAGE, lesquels défauts étant de nature à altérer ou à rendre impossible leur interaction. Ce constat a conduit les inventeurs à rechercher le moyen de restaurer l'équilibre entre prolifération, différenciation et apoptose en utilisant le contrôle exercé par LOX ou NRAGE, de préférence en utilisant le couple LOX-NRAGE. Ainsi, à partir de ces découvertes inattendues, les inventeurs ont réalisé des méthodes d'identification de principes actifs modulant l'expression de LOX et/ou de NRAGE pour restaurer le contrôle exercé par ces protéines via leur interaction, dans le but d'identifier des principes actifs pour réaliser des compositions notamment cosmétiques ou pharmaceutiques.
De cette façon, dans les cas d'hypo-prolifération épidermique (peaux âgées, GVH), caractérisé par un épiderme extrêmement fin et l'absence d'expression de LOX, on stimule l'expression de LOX, avec ou sans inhibition de l'expression de NRAGE, en vue de ré-induire, à travers la modulation de la co-expression de LOX et de NRAGE, une zone de différenciation et d'apoptose régulée, qui conduit à un épaississement de la peau. Dans les cas d'hyper-prolifération épidermique (psoriasis, eczéma), dans lesquels NRAGE est sous-exprimée, on stimule l'expression de NRAGE, avec ou sans inhibition (légère) de celle de LOX, de façon à favoriser l'apoptose en ré-induisant une zone de prolifération régulée (recouvrement LOX/NRAGE) et en permettant de stopper l'hyperprolifération. Dans les cas de forte apoptose au niveau de l'épiderme (peaux âgées, exposition de la peau à un stress, en particulier exposition à la chaleur, ou exposition de la peau à un rayonnement, en particulier un rayonnement solaire, ou exposition de la peau à un agent toxique, par exemple chimique ou microbiologique, ou de la maladie de la réaction du greffon contre l'hôte - GVH), dans lesquels NRAGE est sur-exprimée, on inhibe l'expression de NRAGE avec ou sans stimulation de l'expression de LOX.
4) Mise en évidence de l'implication de LOX dans l'apoptose cellulaire De façon inattendue, les inventeurs ont mis en évidence l'existence d'un lien encore inconnu entre LOX et l'apoptose. Ainsi, les données obtenues reflètent le rôle anti-apoptotique de LOX dans les kératinocytes, lequel rôle fait intervenir la régulation de la protéine pro-apoptotique NRAGE, notamment.
5) Recherche de principes actifs La mise en évidence des principes actifs a été fait notamment par l'analyse de l'expression des ARN messagers de LOX et de NRAGE, en particulier sur des kératinocytes en culture, de préférence des kératinocytes humains. Les principes actifs dont l'activité est à tester sont placés en contact avec les kératinocytes en culture pendant une durée suffisante et dans des conditions adéquates pour que le contact soit efficace. Les principes actifs sont de préférence testés dans différentes concentrations pour éventuellement détecter l'influence de la concentration. Avantageusement, les principes actifs criblés dans la présente invention sont d'origine végétale, notamment pour éviter les problèmes liés à la synthèse chimique. Les avantages des principes actifs d'origine végétale sont bien connus de l'homme de l'art, notamment en pharmacie, en dermo-pharmacie, en neutraceutique, et en cosmétique. La recherche de principes actifs est effectuée notamment en réalisant l'extraction des ARN totaux puis en effectuant une RT-PCR quantitative. En particulier, les séquences d'amorces préférées sont celles utilisées dans l'exemple 13 sans y être limité. La quantité d'ADNc de chaque essai est rapportée à la quantité d'ADNc de l'actine. On compare ensuite l'effet de la présence ou non de principes actifs. Lorsque l'expression et/ou l'activité de NRAGE et/ou LOX sont modulées (stimulées ou inhibées) par rapport aux témoins, on peut alors qualifier la substance de principe actif. Avantageusement, un principe actif permet de moduler d'au moins 50 % l'expression de l'ARN messager de LOX et/ou de NRAGE, ou d'au moins 15 % l'expression et/ou de l'activité de LOX et/ou NRAGE.
Sur les figures : - La figure 1 représente une séquence et un schéma de la protéine NRAGE; - La figure 2 représente la moyenne des résultats obtenus à l'exemple 2 pour l'interaction en double hybride ; - La figure 3 représente la mise en évidence de la présence de LOX et de NRAGE dans la peau reconstruite ; - La figure 4 représente la localisation en microscopie confocale de LOX et NRAGE sur des coupes de peau humaine ; -La figure 5 représente une détection de LOX et NRAGE sur des coupes de peau humaine d'un donneur de 91 ans ; - La figure 6 représente la détection de LOX et de NRAGE dans la peau d'une personne atteinte de la maladie de réponse du greffon contre l'hôte ; - La figure 7 représente la détection de LOX et de NRAGE dans la peau d'un patient présentant un cancer de type basocellulaire ou spinocellulaire. ; - La figure 8 représente la détection de LOX et de NRAGE dans la peau d'un patient atteint de lichen plan ; - La figure 9 représente la mise en évidence de la localisation de LOX et de NRAGE dans la peau d'un patient atteint de psoriasis ; - La figure 10 représente la mise en évidence de la localisation de LOX et de NRAGE dans la peau d'un patient atteint d'eczéma.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront clairement à l'homme de l'art suite à la lecture de la description explicative qui fait référence à des exemples qui sont donnés seulement à titre d'illustration et qui ne sauraient en aucune façon limiter la portée de l'invention.
Ainsi, chaque exemple a une portée générale. D'autre part, dans les exemples, tous les pourcentages sont donnés en poids, sauf indication contraire, et la température est exprimée en degré Celsius sauf indication contraire, et la pression est la pression atmosphérique, sauf indication contraire.
Exemple 1: clonage de NRAGE par technique de double hybride 10 chez la levure. L'invention a initialement consisté à rechercher les partenaires potentiels de LOX dans les kératinocytes. La technique de double hybride chez la levure (2HL) a été employée. Le système 2HL permet l'identification et la caractérisation d'interactions entre une protéine 15 "appât" et des partenaires potentiels "cibles". En l'occurrence, l'appât a été la région mature de LOX fusionnée au domaine de liaison à l'ADN (Binding Domain, BD) du gène Gal4. La cible ou les cibles ont été les gènes codés par une banque d'ADN complémentaire de kératinocytes humains, fusionnés au domaine d'activation (Activation Domain, AD) du gène Gal4. 20 L'interaction des domaines de l'appât (LOX) avec les domaines codés par une séquence de la banque permet la liaison et l'activation du promoteur Gal4, lequel contrôle différents gènes conférant l'auxotrophie aux levures AH109, permettant la croissance sur milieu déficient et l'activation des activités galactosidases. Un gène codant pour une protéine candidate à 25 être partenaire de LOX a ainsi été mis en évidence, grâce à cette technique de sélection possible d'interactants : la protéine intracellulaire Melanoma Associated Antigen Dl (MAGE-Dl) ou NRAGE (Figure 1).
Screening d'une librairie de kératinocytes en double hybride levure par l'appât GAL4 BD-hLOXmat (human LOX mature). La librairie de cDNA de kératinocytes de peau humaine normale dans le vecteur pGAD-10 a été utilisée. L'appât choisi pour ce criblage a été LOXmat, codée par la région de l'ADNc humain de l'enzyme LOX sans le peptide signal ni la pro-région. La séquence nucléotidique a été insérée en phase derrière le domaine de liaison à l'ADN (Binding Domaine : BD) du facteur de transcription GAL4 dans le vecteur pBD-Gal4 Cam. Le fragment LOX +494 à +1254 à insérer a été amplifié par PCR (polymerase chain reaction), en derrière le binding-domain de Gal4 dans un vecteur pGal4-BD à l'aide des amorces suivantes : 1) ggg atc cgc atg gtg ggc gac gac (introduisant Bam HI ) 2) ttg tcg act aat acg gtg aaa ttg tgc (introduisant Sal I au niveau du stop qui est conservé).
Le fragment amplifié a initialement été introduit dans le vecteur TOPO, puis inséré dans pGal4-BD. Pour valider l'expression de la protéine de fusion BD-LOXmat, les levures AH109 ont été transformées par le plasmide appât pBD-LOXmat. On effectue le criblage des levures transformées: 6,88 x 106 cfu (croissance en milieu déficient) dans la levure AH 109, 80 clones sélectionnés poussant en milieu déficient en adénine, histidine, tryptophane et leucine, dont 23 ont été retenus pour leur forte croissance.
Exemple 2: validation de l'interaction entre LOX et NRAGE par technique de double hybride chez le mammifère (2HM). Les cellules Hela sont transfectées d'une part par les plasmides pAct et pAct-NRAGE, et d'autre part par pBind et pBind-LOXmat en présence de lipofectamine. L'activité luciférase est testée après 48h, et les résultats sont exprimés en rapport d'activité luciférase par rapport au contrôle (vecteur vide pBind). Les expériences sont effectuées en triple, la moyenne des résultats obtenus est représentée sur la Figure 2. La séquence hLOX utilisée dans l'exemple 1 pour le double hybride levure a été insérée en phase derrière le binding-domain de GaI4 dans le vecteur pBind (Promega, Madison USA)) pour les interactions double hybride mammifère. La proie N-RAGE a été insérée derrière l'activating domain VP16 Gal4 dans le vecteur pAct (Promega). Elle débute à l'acide aminé 152 (nucléotide 458).
Exemple 3: co-immunoprécipitation de LOX et de NRAGE dans les cellules de mammifères. Les cellules Cos? (cellules épithéliales de rein de mammifère) sont co-transfectées pour les gènes LOX (complet humain, région mature humaine et région mature murine) par les constructions pcLOX32-V5His (LOX), ou, pcLOX36-V5His ou pcLOX-27-V5His et pour le gène NRAGE par pNM3-HA (NRAGE complet) ou pNM7-HA (région IRD). La transfection se fait dans des boites de Pétri de diamètre 100 mm en utilisant la lipofectamine. Après 48h, les cellules transfectées sont lysée dans 500pL de tampon de lyse, Les protéines des lysats cellulaires sont incubées soit avec l'anti-V5 soit avec l'anti-HA ; l'anti-corps monoclonal anti-V5 ou anti-HA est ajouté au 1/250 au lysat cellulaire pendant 1h30 sous agitation à 4 C. Les complexes immuns (CI) ainsi formés sont précipités par la protéine G-sépharose sous agitation à 4 C pendant 1h. Après trois lavages de 10 min en tampon de lyse et une élution en tampon SDS-PAGE, une électrophorèse de la totalité des CI est effectuée sur un gel 10% SDSPAGE suivi d'un Western blot. Après transfert des CI sur membrane PVDF (fluorure de polyvinylidène), la révélation est réalisée: pour NRAGE, avec l'anti-HA dilué au 1/1.000 puis l'anti-souris-HRP (horse radish peroxidase) dilué au 1/20.000 - pour LOX, par l'anti-V5-HRP dilué au 1/5.000, La détection finale est réalisée par chimioluminescence de la HRP.
La figure 5 représente une troisième variante selon l'invention : les pseudo-prismes ont une facette b similaire à celle selon la figure 3, mais la facette a est cette fois également courbe, de façon convexe. Cette variante donne au guide des degrés de liberté supplémentaires (courbure de la face a) pour contrôler l'homogénéité le long du guide, notamment en ajustant la courbure de la face a. La figure 6 représente une quatrième variante selon l'invention : elle est très proche de la troisième variante. La différence réside dans la zone de jonction ou sommet interne B entre deux pseudo-prismes consécutifs : au lieu de présenter un angle, elle est arrondie. Ce sommet interne courbe permet une transition plus douce entre deux pseudo-prismes consécutifs. Il améliore encore l'homogénéité du guide car une quantité plus importante de lumière continue de se propager dans le guide, et parce que la forme courbe de l'arrête autorise l'envoie de rayons au-delà de l'angle de 60 déjà mentionné. Par ailleurs, il est avantageux de faire évoluer les paramètres dimensionnels des pseudo-prismes le long du guide : comme par exemple le pas (entre 0.5 mm et 2 mm), les angles des sommets internes B et externes A (très variables, pouvant varier par exemple entre 45 et 140 ), les courbures des faces a et b (flèches de l'ordre du dixième de millimètre) Tous les exemples selon l'invention décrits plus haut représentent une face de sortie FS du guide optique lisse. Toujours selon l'invention, elle peut, alternativement, avoir un profil strié, comme par exemple écrit dans la demande de brevet français 04 06 375 déposée le 11 juin 2004. Ces stries permettent de modifier l'orientation, de redresser les rayons lumineux en sortie du guide optique, c'est-à-dire de favoriser leur sortie du guide optique avec un angle négatif par rapport à la normale N au guide .
Ces stries peuvent être de différentes formes, par exemple, en forme de prismes ou bien de dômes ou bien une combinaison de prismes et de dômes. Quand on choisit la variante où la face de sortie est munie de stries, chaque strie de la face de sortie FS est de préférence située en regard d'un 25 pseudo-prisme PR de la face de réflexion FR. Dans un mode de réalisation, non représenté sur les figures, par mesure de simplification, le dispositif d'éclairage ou de signalisation de l'invention comporte au moins deux sources lumineuses placées chacune à une extrémité du guide optique. Le guide optique peut ainsi propager des 30 rayons lumineux à partir des deux extrémités du guide optique, ce qui permet d'augmenter la longueur du guide optique. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, le dispositif d'éclairage ou de signalisation comporte plusieurs guides optiques placés de façon à avoir au moins une intersection commune. Une source lumineuse est placée à ce point d'intersection de façon à émettre des faisceaux lumineux dans chacun des guides optiques.
MODULE OPTIQUE AVEC LAMPE VILLE POUR VEHICULE AUTOMOBILE.
L'invention est relative à un module optique pour véhicule automobile, comportant un réflecteur présentant un axe optique, une source lumineuse principale placée au voisinage du foyer du réflecteur, lequel est prévu pour donner un faisceau principal à partir de ladite source lumineuse principale, et une lampe ville, par exemple située au-dessous du plan horizontal passant par l'axe optique. L'invention concerne un module optique à coupure, de type code ou anti-brouillard, ou sans coupure, de type route. Dans les projecteurs du genre en question, le réflecteur est conçu pour optimiser le faisceau principal provenant de la source lumineuse principale. Comme le réflecteur n'est pas spécialement adapté à la lampe ville, le faisceau lumineux ville issu du module optique sera souvent insuffisant pour satisfaire aux normes en vigueur; en particulier, une zone située sous un angle d'environ 10 au-dessous de l'axe optique est généralement insuffisamment éclairée. Une solution consisterait à implanter un réflecteur additionnel dédié à la lampe ville. Cette solution entraînerait une augmentation de l'encombrement du module optique et du coût de production. L'aspect extérieur en serait affecté. L'invention a pour but, surtout, de fournir un module optique du genre défini précédemment qui permet d'obtenir avec la lampe ville un faisceau lumineux satisfaisant aux exigences réglementaires, de manière simple et économique, sans affecter l'aspect extérieur du projecteur.
Selon l'invention, l'invention a pour objet un module optique pour véhicule automobile, comportant un réflecteur présentant un axe optique, une source lumineuse principale placée au voisinage du foyer du réflecteur, lequel réflecteur est prévu pour donner un faisceau principal à partir de la source lumineuse principale et une lampe ville située au-dessous du plan horizontal passant par l'axe optique. Ce module comporte une collerette comprenant des facettes de réflexion, notamment disposées au-dessus de la lampe ville, au moins une des facettes de réflexion, notamment chaque facette de réflexion, étant prévue et orientée pour réfléchir une partie du flux lumineux émis par la lampe ville suivant une direction privilégiée formant un angle a avec l'axe optique du réflecteur. On comprend par module optique un ensemble optique, qui peut générer un ou plusieurs faisceaux lumineux et qui est destiné à être intégré dans un