INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
De plus, le procédé de vaccination par injection d'une solution immunogène, trouve malheureusement ses limites dans de nombreuses applications. En effet, il reste encore difficile d'atténuer certaines souches virulentes ou de mettre au point un vaccin pour certaines applications : lutte contre des maladies tropicales (exemple : le paludisme), éviter l'apparition de cellules cancéreuses, mise au point d'une contraception, stimulation de l'immunité des muqueuses en général conduisant à une sécrétion d'anticorps dans le mucus
Par"fragment"d'un acide nucléique selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique identique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invention possèdent au moins 12, 15, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000 ou 3000 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendu limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence.
Par fragment d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention, on entend un fragment polypeptidique d'une longueur réduite par rapport au polypeptide de référence, le fragment polypeptidique possédant une séquence en acides aminés identique à la séquence en acides aminés du polypeptide de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention possèdent au moins 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide ISUM2A de référence.
ACIDES NUCLEIQUES GENOMIQUES isum2A Comme indiqué ci-dessus, il a été caractérisé selon l'invention deux variants alléliques de l'acide nucléique génomique du gène isum2A, les deux acides nucléiques génomiques variants étant respectivement référencés comme les séquences nucléotidiques SEQ ID N01 et SEQ ID ? 2 du listage de séquences.
En conséquence, la présente invention a pour objet un acide nucléique codant pour un polypeptide ISUM2A, ou pour un fragment de ce polypeptide, ledit acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi SEQ ID N01 et SEQ ID N'2, ou avec un fragment de l'une des séquences SEQ ID N01 et SEQ ID ? 2.
Un autre objet de l'invention est un acide nucléique consistant en un polynucléotide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N01 et SEQ ID N'2, ou avec un fragment de l'une des séquences SEQ ID N01 ou SEQ ID N'2, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 12, de préférence au moins 15 et de manière tout à fait préférée au moins 20 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de séquence SEQ ID N01 ou SEQ ID N'2, étant entendu qu'un tel acide nucléique englobe dans sa définition les fragments d'un acide nucléique selon l'invention tel que défini dans la présente description.
Le gène isum2A, défini par la séquence SEQ ID N01 comprend, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3', respectivement : a) une séquence non codante portant potentiellement des éléments régulateurs de la transcription et/ou de la traduction de ce gène, localisée en amont du premier exon, du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 1812 de la séquence SEQ ID N01 ; b) une région dite codante qui comprend les trois exons et les deux introns du gène isum2A, cette région codante étant localisée du
nucléotide en position 1813 jusqu'au nucléotide en position 4074 de la séquence SEQ ID N01 ; et c) une région non codante localisée en aval de la région codante, du nucléotide en position 4075 jusqu'au nucléotide en position 5620 de la séquence SEQ ID N 1.
La séquence SEQ ID N'2, qui illustre un variant du gène isum2A, ne contient pas la totalité du cadre ouvert de lecture codant pour un polypeptide ISUM2A. La séquence SEQ ID N02 comprend une partie localisée du côté 3'de l'exon n01, ainsi que la totalité des exons n 2 et n 3.
Le nucléotide en position 1 de la séquence SEQ D ? 2 correspond au nucléotide en position 2063 de la séquence SEQ ID N'l. Le nucléotide en position 2004 de la séquence SEQ ID N02 correspond au nucléotide en position 4062 de la séquence SEQ ID N'l.
Toutefois, la connaissance de la séquence SEQ ID N02 par l'homme du métier, et sa comparaison avec la séquence SEQ ID N'l, permet d'accéder directement à la totalité de la séquence codante du gène isum2A défini par la séquence SEQ ID N 2, par exemple en complétant les bases manquantes de l'exon n01 de la séquence SEQ D ? 2 par) es bases correspondantes de l'exon n01 de la séquence SEQ D N 1, en se basant sur les correspondances données ci-dessus et également dans le tableau 1 ci-dessous.
De même, l'homme du métier peut obtenir l'acide nucléique du gène isum2A, par exemple en isolant, à partir des informations de la séquence SEQ ID N 1, les régions nucléotidiques équivalentes ou encore en produisant un acide nucléique hybride, obtenu en fusionnant les acides nucléiques de séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 2, sur la base des correspondances données ci-dessus et également dans le tableau 1 cidessous.
Les caractéristiques structurales des trois introns et des deux exons du gène ISUM2A sont détaillées dans le tableau 1 ci-après.
TABLEAU 1 Séquences des exons du gène Isum2A
Exon n Position du nucléotide en 5'sur Position du nucléotide en 3'sur SEQ ID N01 SEQ ID N02 SEQ ID N01 SEQ ID N02 1 1813 1 2099 37 2 2207 146 2323 262 3 3646 1588 4074 > 2004
Procédés de cribla-ges Identification des partenaires ou des cibles des protéines à domaine HECT L'invention concerne aussi des procédés de criblage de composés candidats interagissant avec un polypeptide à domaine HECT tel que défini dans la présente description.
La première étape vers l'utilisation des protéines à domaine HECT comme cible thérapeutique est l'identification des substrats ciblés pour la dégradation par ces composants. L'identification et la caractérisation de ces cibles peuvent notamment apporter des informations essentielles sur les mécanismes biologiques dans lesquels elles interviennent.
Les méthodes pour identifier les polypeptides qui interagissent avec les protéines à domaine HECT de la présente invention sont variées et comprennent les expériences de double hybride chez la levure ainsi que les méthodes de phage display ; ces méthodes présentent l'avantage que la séquence nucléique codant les peptides interactant est identifiée simultanément, au contraire d'autres méthodes plus biochimiques qui nécessitent un séquençage protéique.
Le double hybride chez la levure peut être utilisé pour cribler une banque d'expression d'ADNc de mammifères (humaines), où un ADNc est fusionné au domaine de liaison à l'ADN ou au domaine activateur de GAL4, et l'acide nucléique codant le peptide d'intérêt, comme la protéine cible, est fusionné également soit au domaine activateur soit au domaine de liaison a l'ADN de GAL4 respectivement (Gyuris et aL, 1993). Le double hybride a été développé afin de détecter des interactions protéine-protéine spécifiques. Un des aspects de la présente invention est d'utiliser une protéine pour détecter des interactants. Cette protéine, qui peut être une protéine à domaine HECT (tronquée ou non), est utilisée comme appât pour identifier un ou des substrats cible potentiels. Alternativement, des substrats cibles d'intérêt peuvent être utilisés pour identifier l'ubiquitine ligase ou le complexe ubiquitine ligase responsable de sa dégradation.
Le ou les polypeptides cibles peuvent également être identifiés par la technologie de"phage display". Une banque de"phage display"est une banque d'expression protéique construite dans un vecteur de type phagique qui exprime une collection de séquences protéiques clonées en fusion avec une protéine de la paroi du phage. Cette construction particulière permet l'expression da la protéine de fusion à l'extérieur de la particule phagique.
Cette disposition favorise donc l'interaction entre la protéine recombinante exposée au niveau de la paroi et une protéine ligand immobilisée. La protéine à domaine HECT est par exemple immobilisée sur une matrice solide et une solution contenant les phages est passée sur ce support. On analyse alors les phages retenus et la nature de la protéine qu'ils expriment.
Les partenaires cible d'une protéine à domaine HECT pourront également être identifiés de la manière suivante. Un peptide correspondant à une protéine à domaine HECT concernée par la présente invention ayant subi ou non des modifications post-traductionnelles est immobilisé sur une
résine, par exemple une résine activée NHS-sepharose@ (pharmacia). Un lysat cellulaire, par exemple de cellules HELA ou d'autres cellules appropriées est fractionné sur la colonne d'affinité préparée selon une méthode standard. Après lavage, les protéines retenues sur la colonne sont éluées en augmentant la force ionique des lavages ou par élution compétitive avec des peptides représentant le domaine HECT en partie ou dans son intégralité. Les protéines cellulaires sont ensuite identifiées par une ou l'autre des combinaisons de techniques mentionnées ci-dessous : fractionnement sur gel SDS PAGE, suivi ou non d'un western-blot, une fois purifiées du gel et éventuellement hydrolysées partiellement les protéines pourront être caractérisées plus avant en utilisant le micro-séquencage peptidique ou l'analyse par MALDI-TOF.
Selon un autre aspect, l'invention concerne aussi un procédé pour cribler des composés candidats se liant à un polypeptide à domaine HECT, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mettre en contact un polypeptide à domaine HECT tel que défini ci- dessus avec au moins un composé candidat à tester ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre ledit polypeptide et le ou les composé (s) candidat (s).
Le procédé de criblage ci-dessus peut en outre être caractérisé en ce qu'il comprend l'étape additionnelle suivante : c) caractériser le ou les composé (s) candidat (s) ayant formé un complexe avec le polypeptide à domaine HECT.
Selon un premier mode de réalisation particulier du procédé ci-dessus, le polypeptide à domaine HECT est préalablement immobilisé sur un support.
Selon un second mode de réalisation particulier, le ou les composé (s) candidat (s) sont initialement contenus dans le lysat cellulaire d'une culture de cellules eucaryotes, de préférence des cellules humaines.
Selon un troisième mode de réalisation, le composé candidat est le produit d'expression d'un phage constitutif d'une collection combinatoire de clones de phages ( phage display ).
L'invention est également relative à un procédé pour cribler des composés candidats se liant à un polypeptide à domaine HECT, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
a) cultiver une cellule hôte recombinante telle que définie ci-dessus dans un milieu de culture approprié, de telle manière à ce que ladite cellule hôte produise un polypeptide à domaine HECT selon l'invention ; b) détecter les complexes éventuellement formés entre le polypeptide à domaine HECT et d'autres composés produits par la cellule hôte.
Selon un mode particulier de réalisation du procédé de criblage cidessus, ledit procédé est caractérisé en ce qu'il s'agit d'un système doublehybride dans lequel la cellule hôte transfectée à l'étape a) est transfectée avec un acide nucléique codant pour un polypeptide à domaine HECT, un fragment ou un variant de ce polypeptide qui est fusionné avec un polypeptide hétérologue, ledit polypeptide hétérologue consistant en un premier partenaire protéique lequel, lorsqu'il interagit spécifiquement avec un second partenaire protéique, a la capacité de se fixer sur un motif d'acide nucléique régulant la transcription d'un gène rapporteur, pour une utilisation dans des systèmes de détection d'interactions du type double-hybride bien connus de l'homme du métier. Un tel polypeptide peut être, par exemple, la protéine GAL4 ou la protéine LexA.
à cristaux liquides comme décrit plus haut, comprenant un film de gouttelettes de cristaux liquides dispersées dans un médium et contenu par deux feuilles protectrices munies chacune d'une électrode. Ces feuilles peuvent être choisies à base de substrats rigides, de préférence essentiellement transparents (verre, polycarbonate PC suffisamment épais), semi-rigides ou flexibles (polymère de faible épaisseur, comme du PC mince). On peut avoir les deux feuilles de natures différentes (un verre et un substrat en polymère par exemple).
La variante préférée consiste à ce que les deux feuilles protectrices soient à base de polymère flexible, notamment transparentes du type PET (polyéthylène-téréphtalate).
Les éléments absorbants (b) peuvent être choisis de différentes natures.
On peut en utiliser un ou plusieurs, de même nature ou de natures différentes. ils vont donc venir ajouter de l'absorption lumineuse au système (a) ou (a'), sur toute sa surface ou la majorité de sa surface.
L'élément absorbant peut tout d'abord consister en un substrat rigide ou semi-rigide (verre, polymère) qui est teinté dans ta masse, par des colorants appropriés. De préférence, on choisit des verres de transmission lumineuse TL de 10 à 60%, pour une épaisseur de l'ordre de 1à 8 mm, notamment de 1,5 à 6 mm.
On peut tout particulièrement utiliser la gamme des verres commercialisés sous la dénomination PARSOL ou VENUS par ta société SAINT-GOBAI GLASS, ou choisir des compositions verrières telles que décrites dans les brevets...
Généralement, on préfère que te verre ou te substrat en plastique ait une couleur en transmission ta plus neutre possible, notamment dans les gris. Dans une application en tant qu'écran de rétro-projection, ce sont ces tonalités qui dénaturent le moins les couleurs originales des images projetées.
L'élément absorbant peut également consister en une feuille de polymère flexible teintée dans la masse, notamment en thermoplastique, c'est-à-dire te type de feuille qu'on utilise comme feuille intercalaire dans les vitrages feuilletés. Il peut s'agir de polyvinylbutyral PVB, de polyuréthane PU, d'éthylène vinyttacétate EVA. Ces feuilles teintées présentent par exemple une transmission lumineuse TL de 25 à 60 %, notamment de 30 à 45% pour une épaisseur généralement comprise entre 0,2 et 0,8 mm (généralement aux environs de 0,38 mm). Pour ta même raison que précédemment, on choisira de préférence une couleur en transmission neutre, dans les gris par exemple. On peut aussi utiliser
une feuille à base de polymère à propriétés absorbantes que l'on vient caladrer à un substrat clair, par exemple un verre clair.
L'élément absorbant peut aussi se présenter sous forme d'une couche mince absorbante disposée sur l'une des faces d'un substrat rigide (verre, polymère), semi-rigide ou flexible (polymère) faisant partie de l'ensemble de l'élément à propriétés optiques variables. On entend par couche mince une couche d'épaisseur interférentielle (inférieure à 1 um, notamment entre 1 et 100 nm ou 2 et 50 nm). Il peut aussi s'agir d'une superposition de couches minces, dont l'une au moins est absorbante dans te visible. Il peut par exemple s'agir de couches à base d'oxyde de nickel et/ou de fer et/ou de chrome, que l'on peut déposer par une technique de décomposition thermique (pyrolyse en phase gazeuse, sous forme de poudre ou en phase liquide), par une technique sous vide (pulvérisation cathodique notamment assistée par champ magnétique) ou par sol-gel. Quand il s'agit d'un procédé par pulvérisation cathodique, elle peut être réactive en présence d'éléments oxydants type O2 à partir de cibles métalliques ou de cibles d'oxyde sous-stoechiométrique, ou non réactive à partir de cibles d'oxyde. La couche absorbante peut aussi être essentiellement métallique, par exemple à base d'un des métaux suivants : nickel Ni, chrome Cr, alliage Ni-Cr, acier, alliage Inconel, Au ou alliage Au, argent Ag ou alliage Ag, cuivre. Elle est alors déposée de préférence par pulvérisation cathodique non réactive. Elle peut être aussi à base de nitrure (s) métallique (s), du type TiN ou ZrN, que l'on peut déposer par CVD ou par pulvérisation cathodique réactive en présence d'éléments nitrurants à partir de cibles métalliques. La couche absorbante peut aussi être à base de matériau électrochrome, comme de l'oxyde de tungstène éventuellement hydraté, de l'oxyde de nickel éventuellement hydraté, de l'oxyde d'iridium ou de tantale éventuellement hydraté.
Dans le cas où le système (a) est un système à cristaux liquides, un autre type d'élément absorbant (b) consiste à utiliser un colorant au sein du film fonctionnel. Il peut tout particulièrement s'agir de colorants dichroïques qui sont dissous au sein des gouttelettes de cristaux liquides et/ou dans le médium dans lequel elles sont dispersées.
Ces colorants dichroïques sont par exemple choisis dans la famille des dérivés de diazoquinone ou dans celle des dérivés d'anthraquinone. Le pourcentage ou poids de colorant par rapport aux cristaux liquides, quand ce
dernier y est dissous, est de préférence compris entre 0,1 et 5%, notamment entre 0,5 et 2%. Dans ta variante où te colorant est dans le médium, son pourcentage en poids par apport au médium peut être compris entre 20 et 30% par exemple.
Dans le cas où l'on utilise un système (a) étectrocommandabte, l'élément absorbant peut être une couche étectroconductrice absorbante faisant partie d'une des électrodes qui alimentent en électricité te film fonctionnel. Il peut s'agir d'une couche à base d'oxyde métallique conducteur (que l'on peut déposer par pyrolyse ou par pulvérisation cathodique comme dans te cas de ta couche absorbante mentionnée plus haut). L'oxyde (ou te mélange d'oxydes) est de préférence dopé. Le fait qu'il soit absorbant vient, dans une première variante, du fait qu'il se trouve à l'état réduit et/ou sous-stoechiométrique en oxygène (tout en restant conducteur électrique). Il peut s'agir par exemple d'oxyde d'indium (dopé à l'étain) et réduit, d'oxyde d'étain (dopé par exemple au fluor) et réduit, d'oxyde de zinc (dopé par exemple Al) et réduit. Il peut aussi s'agir d'oxydes conducteurs qui sont intrinsèquement absorbants, sans être à l'état réduit : c'est te cas de l'oxyde d'étain dopé à l'antimoine, qui à 30 nm, peut avoir une absorption lumineuse A de 10 à environ 62 % selon te pourcentage en dopant (2,5 à 10 % de dopant).
Dans une seconde variante, te fait que ta couche conductrice faisant partie de l'électrode soit absorbante provient de la combinaison de sa nature chimique et du choix de son épaisseur. Ainsi, pour une couche à base d'oxyde métallique (dopé), celle-ci peut devenir suffisamment absorbante pour l'invention si elle est suffisamment épaisse. On peut choisir aussi une couche à base de métal du type Ni, Cr, NiCr, ou de nitrure métallique (TiN, ZrN...) dont on ajuste l'épaisseur de façon appropriée (par exemple, une couche de TiN d'envion 25 nm a une absorption lumineuse d'environ 50%).
L'élément absorbant peit également être un film à base de matériau plastique, qui est absorbant et que l'on peut, par exemple calandrer à un substrat clair, un verre clair notamment.
4, 8-Diamino-quinoléine-2-carboxylate de méthyle 17b En remplaçant dans l'exemple 19, la 8-hydroxy-4- (toluène-4-sulfonylamino) quinoléine-2-carboxylate de méthyle par la 8-amino-4- (toluène-4-sulfonylamino) - quinoléine-2-carboxylate de méthyle 15d, on obtient de la même façon le produit titre. Rdt : 79%.'H-RMN (200 MHz, CDCIs) : 8 7,36 (s, IH arom. ), 7,30 (m, IH arom. ), 7,02 (d, 1H, J= 9Hz, 1H arom. ), 6,89 (d, IH, J = 9Hz, lH arom. ), 5,17 (large s, 2H, NH2), 4,85 (large s, 2H, NH2), 4,00 (s, 3H, CH3).
EXEMPLE 20 Acide 8-acétylamino-4-hydroxy-quinoléine-2-carboxylique 28a Mettre en suspension dans l'acétonitrile (lOml) la 4-hydroxy-8-amino-quinoléine- 2-carboxylate de méthyle 2u (200mg, 0,92mmole). A température ambiante et sous argon rajouter la triéthylamine (0, 13ml, 0, 93mmole), puis le chlorure d'acétyle (0, 065ml, 0, 91mmole). Laisser agiter pendant 3h, puis évaporer le solvant. Reprendre le résidu dans l'eau et laver à l'acétate d'éthyle. Sécher la phase organique sur Na2S04, filtrer et évaporer les solvants. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice, éluant : AcOEt. Le produit O, N-diacétylé (lOOmg, 0,33mmole) ainsi obtenu est solubilisé dans un mélange THF/eau : 1/1 (lOml). Ajouter la solution IN de soude (lml). Agiter à température ambiante pendant une nuit. Refroidir la solution à 0 C, puis acidifier à pH = 3 avec une solution HC1 2N. Filtrer le précipité obtenu. Rdt : 50%. IHRMN (300 MHz, MeOD) : 8 8, 25 (large s, IH arom.), 8, 06 (d, 1H, J= 8Hz, 1H arom. ), 7,50 (m, IH arom. ), 7,30 (s, IH arom. ), 5,36 (large s, IH, NH), 2,31 (s, 3H, CH3)- Acide 8-pivaloylamino-4-hydroxy-quinoléine-2-carboxylique 28b
En remplaçant dans l'exemple 20, le chlorure d'acétyle par le chlorure de pivaloyl, on obtient de la même façon le produit titre. Rdt : 20%.'H-RMN (200 MHz, DMSO-d6) : 8 12,72 et 12,24 (2s large, 2H, COOH et OH), 10,24 (large s, 1H, NH), 8,52 (s, IH arom. ), 7,85 (d, IH, J= 9Hz, IH arom. ), 7,60-7, 47 (m, 2H arom. ), 1, 35 (s, 9H, C (CH3) 3), Acide 8-benzoylamino-4-hydroxy-quinoléine-2-carboxylique 28c En remplaçant dans l'exemple 20, le chlorure d'acétyle par le chlorure de benzoyle, on obtient de la même façon le produit titre. Rdt : 65%.'H-RMN (200 MHz, DMSO-cL) : 8 13,01 et 12,10 (2s large, 2H, COOH et OH), 10,84 (large s, IH, NH), 8,72 (s, IH arom. ), 8,00 (m, 3H arom. ), 7,53 (m, 5H arom.).
EXEMPLE 21 8-Benzylamino-4-hydroxy-quinoléine-Z-carboxylate de méthyle 29a Dissoudre la 4-hydroxy-8-amino-quinoléine-2-carboxylate de méthyle 2u (200mg, 0, 92mmole) dans le méthanol (5ml). Sous argon et à température ambiante ajouter le benzaldéhyde (O, lml, 0,98mmole). Chauffer à reflux une nuit puis refroidir le milieu réactionnel à O'C. Rajouter NaBH4 (87mg, 2,30mmole) et laisser tourner à froid pendant 1 h. Evaporer le méthanol, reprendre le résidu dans l'eau froide et extraire à l'acétate d'éthyle. La phase aqueuse est passée à pH = 5 avec une solution saturée de NH4Cl. Cette phase aqueuse est réextraite à l'acétate d'éthyle.
La phase organique est séchée sur Na2S04, filtrée et évaporée. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice, éluant : Hex/AcOEt : 1/1. Rdt : 85%. IH-RMN (200 MHz, CDCIs) : 8 9,50 (s très large, IH, OH), 7,79 (large s, IH, NH), 7,37 (m, 8H arom. ), 7,00 (s, IH arom. ), 4,47 (s, 2H, CH2), 4,01 (s, 3H, OCH3).
6- (Benzylamino-méthyl)-4-hydroxy-8-méthoxy-quinoléine-2-carboxylate de méthyle 25a
En remplaçant dans l'exemple 21, la 4-hydroxy-8-amino-quinoléine-2-carboxylate de méthyle 2u par la 4-hydroxy-6-formyl-8-méthoxy-quinoléine-2-carboxylate de méthyle 2o et le benzaldéhyde par la benzylamine on obtient de la même façon le produit titre. Rdt : 42%.'H-RMN (200 MHz, CDCIs) : 8 7, 80 (m, 1H arom. ), 7,36-7, 30 (m, 5H arom. ), 7,23 (m, IH arom. ), 6,97 (m, 1H arom. ), 4,05 (s, 3H, OCH3), 4,04 (s, 3H, OCH3), 3,91 (s, 2H, NCH2), 3,83 (s, 2H, NCH2).
EXEMPLE 22-ACTIVITE BIOLOGIQUE DES COMPOSES Protocole de Screening Le screening consiste à tester à une concentration relativement basse (10 JIM) des molécules de synthèses sur le déplacement de 200 nM de [H]-AX (en gardant comme contrôle l'acide xanthurénique non radiomarqué). Ainsi si cette concentration déplace de façon identique ou meilleure cette même concentration en AX non radiomarqué une CI 50 est réalisée.
Le binding est réalisé dans du tampon Pipes 50 mM pH 7,4 à 0 C (dans la glace) en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.1 à 0.3 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié ( [H]-AX) à une concentration de 200 nM finale et - soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale) - soit de l'acide xanthurénique non tritié à 2 mM (pour la détermination de la liaison non spécifique) - soit de l'acide xanthurénique non tritié à 10 u. M (contrôle positif) - soit le produit de synthèse à une concentration de 10 uM finale.