INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
longueur. Ce mouvement du fluide exerce sur lui une force de cisaillement. Si l'on définit par v (x,t) vitesse d'un point du fluide situé à une distance x de la paroi du canal à un instant t, le cisaillement appliqué en ce point est y =dv (x,t)/dx.
I/ MODELE EXPERIMENTAL 1. 1- Modèle cellulaire : lignée de lymphocytes B, lymphoblastome Bernard immortalisé par EBV1 au laboratoire d'Immuno-modulation par les médiateurs de l'inflammation de l'Université de Bordeaux 2 (UMR-CNRS 5540). Ces cellules seront désignées dans la suite par cellules LB (lignée Bernard).
1.2- Récepteur cellulaire : le récepteur ciblé pour la capture est le CD 19, glycoprotéine de surface de 80kD présente sur tous les lymphocytes B.
Particules : Il s'agit de particules de latex magnétiques d'un diamètre d'environ 3 m produites par la Société Dynal. Ces particules sont couvertes par une protéine de reconnaissance la streptavidine.
1. 3- Lien moléculaire : Le lien moléculaire permettant l'association des particules aux cellules selon un mode spécifique est le lien Streptavidine-biotin. La biotin est un petit ligand d'un poids moléculaire de 244 qui se lie avec une très forte affinité (Ka#1014M-1) à la streptavidine, protéine de 60 kD, qui possède 4 sites équivalents pour la fixation de la biotin. La streptavidine est portée par les particules et la biotin est portée par les cellules via un anticorps anti-CD19 biotinylé dirigé contre une protéine de surface ubiquitaire des lymphocytes B.
III METHODES D'ANALYSE DE L'ASSOCIATION PARTICULES-CELLULES Méthode d'analyse de la capture : 2.1- Cytométrie en flux Les particules utilisées, chargées en oxyde de fer, possèdent une fluorescence à large spectre qui permet de les mettre en évidence à la surface des cellules en utilisant la cytométrie en flux. Les cellules porteuses de particules se distinguent clairement dans un diagramme de cytométrie montrant la fluorescence des cellules sur le canal FL3 mesurant l'intensité émise aux plus grandes longueurs d'onde. Les cellules porteuses de particules apparaissent à une intensité de fluorescence nettement plus élevée que les cellules sans particules comme cela est représenté sur la figure 3.
Sur la figure 3 on observe la fluorescence obtenue sur le canal 3 des plus grandes longueurs d'onde pour (A) des cellules sans particules et (B) des cellules ayant été capturées par des particules.
2. 2- Tri physique en gradient de champ magnétique et comptage La deuxième méthode permettant de suivre l'efficacité de l'association particule-cellule consiste à trier physiquement les cellules ayant capturé des particules magnétiques en plaçant les échantillons dans un gradient de champ après la phase de mise en contact des particules avec les cellules. Cette expérience est réalisée sur une population homogène (lignée). Le gradient de champ permet de concentrer les cellules rendues magnétiques par l'association avec les particules et de les séparer ainsi des cellules sans particules qui sont insensibles au champ comme cela est représenté sur la figure 4.
Sur cette figure, on distingue nettement la formation du culot magnétique sur la paroi du tube à l'endroit ou le champ magnétique est le plus fort. Les objets non magnétiques restés en suspension peuvent être isolés en prélevant le surnageant.
De façon plus précise, l'invention a pour objet une composition cosmétique de soin ou de maquillage des matières kératiniques, contenant au moins un ester à groupement aromatique, liquide à température ambiante, résultant de l'estérification par un acide aromatique d'au moins un groupe hydroxyle pendant ou en bout de chaîne d'un composé aliphatique hydroxylé choisi parmi les acides aliphatiques hydroxylés et leurs esters, ladite composition étant exempte de lanoline ou de dérivés de lanoline.
On entend par dérivés de lanoline, notamment la lanoline oxypropylénée, la lanoline acétylée ou le lanolate d'isopropyle, par exemple la cire de lanoline oxypropylénée (5 OP) commercialisée sous la référence EMERY 1695 par COGNIS.
La composition selon l'invention contient avantageusement au moins un composé pâteux différent de la lanoline ou de ses dérivés.
Ester à groupement aromatique La composition comprend au moins un ester à groupement aromatique, liquide à température ambiante, résultant de l'estérification par un acide aromatique d'au moins un groupe hydroxyle pendant ou en bout de chaîne d'un composé aliphatique hydroxylé choisi parmi les acides aliphatiques hydroxylés et leurs esters.
Par composé aliphatique hydroxyle, on entend un acide hydroxy-carboxylique aliphatique ou un ester d'acide hydroxy-carboxylique aliphatique. L'acide (non estérifié) comporte notamment de 2 à 40 atomes de carbone, de préférence de 10 à 34 atomes de carbone et mieux de 12 à 28 atomes de carbone ; il comporte, en outre, de 1 à 20 groupes hydroxyle, de préférence de 1 à 10 groupes hydroxyle et mieux de 1 à 6 groupes hydroxyle, susceptible(s) d'être estérifié (s) parl'acide aromatique. Le composé hydroxylé sous forme d'ester résulte de l'estérification de la fonction-COOH d'un acide aliphatique hydroxy-carboxylique par un alcool aliphatique qui peut comprendre de 1 à 40 atomes de carbone et mieux de 3 à 30 atomes de carbone. Cet alcool peut être un monoalcool ou un polyol. Les esters issus de la réaction de l'acide hydroxy-carboxylique aliphatique avec un polyol peuvent être des esters partiellement ou totalement estérifiés.
De préférence le composé aliphatique hydroxylé est choisi parmi les esters issus d'acide hydroxy-carboxylique aliphatique. Autrement dit, l'ester aromatique liquide de la composition de l'invention est un ester d'ester. Avantageusement, cet ester aromatique est un ester d'ester d'acide gras dont le reste d'acide gras comporte au moins 12 atomes de carbone. De préférence, le groupe hydroxyle engagé dans l'estérification par l'acide aromatique est porté sur la partie acide du composé hydroxyle.
Selon l'invention, la composition peut contenir un ou plusieurs esters aromatiques, liquides à température ambiante (25 C) et pression atmosphérique (760 mm de Hg).
Lorsque le groupe hydroxyle du composé aliphatique hydroxylé engagé dans l'estérification avec l'acide aromatique est en bout de chaîne, ce groupe est en position a- # par rapport à la fonction-COOH de l'acide hydroxy-carboxylique aliphatique.
De préférence, les esters aromatiques selon l'invention présentent une viscosité supérieure à 500 cP (50 Pa. s) à 20 C mais aussi à 23 C, de préférence allant de 900 à 10 000 cP (90 à 1 000 Pa. s) et mieux de 950 à 5 000 cP (95 à 500 Pa. s), mesurée en particulier avec un viscosimètre type Brookfield RV ou un viscosimètre type Brookfield "DV-II+" de type LV équipé d'une aiguille n 1 tournant entre 0,5 et 10 tr/min, au bout de 10 minutes et/ou un indice de réfraction > 1,48 et notamment allant de 1,48 à 1,55 (l'indice de réfraction étant défini pour la raie D du sodium).
L'acide aromatique peut être choisi parmi les acides carboxyliques suivants : a) les mono acides, tels que l'acide benzoïque, l'acide phényl acétique, l'acide cinnamique, l'acide 3 phényl propanoïque, l'acide salicylique ; b) les diacides tels que l'acide téréphtalique ; c) les triacides tels que l'acide trimellitique ; et d) les tétra-acides tels que l'acide pyromellitique.
De façon avantageuse, l'acide carboxylique aromatique est l'acide benzoïque.
Comme ester utilisable dans l'invention, on peut citer ceux résultant de l'estérification par au moins un acide aromatique de l'un au moins des acides carboxyliques hydroxylés aliphatiques suivants : i) les monoacides mono hydroxylés linéaires saturés de formule : (1) CH3-(CH2)x-CH-(CH2)y-COOH avec 0 ~ OH comme l'acide lactique (x + y = 0) ; l'acide 12-hydroxy octadécanoïque (ou 12-hydroxy stéarique) de formule : [CH3-(CH2)5-CH-(CH2)io-COOH] avec x = 5, y = 10 et x + y =15 OH et l'acide a-hydroxy octadécanoïque CH3-(CH2)15-CH-COOH (avec x = 5 et y = 0) OH ou (2) HO-CH2-(CH2)x-COOH avec 0 # x # 38 comme l'acide glycolique HO-CH2-COOH x = 0 ;ou l'acide junipérique (acide 16- hydroxy hexadécanoïque) de formule HO-CH2-(CH2)i4-COOH avec x = 14 ; ii) les monoacides mono hydroxylés ramifiés saturés de formule : (3) CH3-CH -(CH2)x-CH-(CH2)y-COOH avec 0 # x + y # 35 @ CH3 OH comme l'acide 5-méthyl 2-hydroxy hexanoïque (acide leucinique) de formule : CH3-CH-CH2-CH-COOH CH3 OH avec x = 1 y = 0 et x + y = 1 ou encore l'acide 2-éthyl 3-hydroxy caprylique de formule : CH3-(CH2)4-CH-CH-COOH ;
@ OH CH2CH3 iii) Les monoacides mono hydroxylés insaturés de formule : (4) CH3-(CH2)x-CH-(CH2)y-CH = CH-(CH2)z-COOH avec 0 # x + y + z # 35 OH comme l'acide 12-hydroxy (cis) 9-octadécénoïque (ou l'acide ricinoléïque) de formule : CH3-(CH2)5-CH-CH2-CH = CH-(CH2)7-COOH avec x = 5, y = 1, z = 7 et x + y + z = 13 OH ou (5) CH3-(CH2)x-CH = CH-(CH2)y-CH-(CH2)z-COOH avec 0 # x + y + z # 35 OH comme l'acide 3-hydroxy 4-hexanoïque de formule CH3-CH = CH-CH-CH2-COOH avecx=O,y=O,z=1 etx+y+z=1 OH ou l'acide 2-hydroxy 15-tétracosènoïque (ou acide oxynervonique) de formule : CH3-(CH2)7-CH = CH-(CH2)12-CH-COOH avec x = 7, y = 12, z = 0 et x + y + z = 17 OH ou (6) HOCH2-(CH2)x-CH = CH-(CH2)y-COOH avec 0 # x + y # 36 comme l'acide 16-hydroxy 6-hexadécènoïque avec x = 8, y = 4 et x + y = 12 de formule HO-CH2-(CH2)8-CH = CH-(CH2)4-COOH ; iv) les monoacides poly hydroxylés saturés de formule : (7) CH3-(CH2)x-CH-(CH2)y-CH-(CH2)z-COOH avec 0 # x + y + z # 36 OH OH comme l'acide 9, 10-dihydroxy octadécanoïque de formule CH3-(CH2)7-CH-CH-(CH2)7-COOH avec x = 7, y = 0, z = 7 et x + y + z = 14 OH OH comme l'acide 9,12-dihydroxy octadécanoïque de formule 7 avec x = 5, y = 2, z = 7 et x+y+z=14 ou l'acide 9,10, 16-trihydroxy hexadécanoïque (acide aleuritique), l'acide 9,10, 12 - trihydroxy octadécanoïque de formule CH3-(CH2)5-CH-CH2-CH-CH-(CH2)7-COOH OH OH OH ou encore l'acide hexahydroxy octadécanoïque et l'acide octahydroxy octadécanoïque ; v) les polyacides mono hydroxylés saturés de formule : (8) HOOC-(CH2)x-CH-(CH2)y-COOH avec 0 # x + y # 37 comme l'acide malique, OH ou encore l'acide citrique ; et vi) les polyacides poly hydroxylés saturés comme l'acide tartrique ; et leurs mélanges.
Comme autre composé hydroxylé aliphatique utilisable dans l'invention, on peut citer ceux résultant de l'estérification par au moins un acide aromatique de l'un au moins des esters d'acides hydroxylés aliphatiques suivants : vii) les esters de monoacides aliphatiques mono hydroxylés linéaires saturés tels que : - les esters de l'acide lactique comme le lactate d'isostéaryle, le lactate issu d'alcool en C12-C13, le lactate d'octyl dodécyle, le lactate d'oléyle, le lactate de myristyle ; - les esters de l'acide 12-hydroxy octadécanoïque (ou 12-hydroxy stéarique) comme l'hydroxy stéarate d'éthyl 2-hexyle, l'hydroxy stéarate d'octyl docécyle, l'hydroxy stéarate d'isostéaryle, l'hydroxy stéarate d'isodécyle, le trihydroxy stéarate de glycéryle (ou huile de ricin hydrogénée), l'hexahydroxy stéarate de dipentaérythrityle ; viii) les esters de monoacides aliphatiques mono hydroxylés insaturés tels que les esters de l'acide ricinoléique (ou acide 12-hydroxy (cis) 9-octadécénoïque) comme le ricinoléate de butyle, le ricinoléate d'octyl dodécyle, le ricinoléate de cétyle, le triricinoléate de glycéryle (huile de ricin) ; ix) les esters de polyacides aliphatiques mono hydroxylés saturés tels que le malate de diisostéaryle, le citrate de triisostéaryle, le citrate de trioctyl dodécyle ; x) les esters de polyacides aliphatiques poly hydroxylés saturés comme le tartrate issu de la réaction avec 2 alcools en Cis-Cis ramifiés ; et leurs mélanges.
Comme composé hydroxylé sous forme d'ester, utilisable dans l'invention et résultant de l'estérification d'un polyol, on peut citer de façon générale : xi) les esters partiels ou totaux de polyol en C2 à C16 ayant réagit avec un acide aliphatique hydroxylé comme notamment les triglycérides, les esters du pentaérythritol, du néopentyl glycol, du dipentaérythritol, du polyglycérol, les esters du sorbitol ; et leurs mélanges.
De préférence, les esters aromatiques de l'invention sont choisis parmi les esters d'ester d'acides gras aliphatiques dont le reste d'acide gras comporte au moins 12 atomes de carbone. En particulier, le composé hydroxylé est choisi parmi les esters de l'acide ricinoléïque, les esters de l'acide 12-hydroxy stéarique, les esters de l'acide lactique, les esters de l'acide hydroxy 14-eicosènoïque et leurs mélanges.
95 % d'identité ou au moins 99 % de similarité avec ladite séquence SEQ ID NO: 1, à l'exclusion des séquences présentant les numéros d'accès AAF01322, NP~057299, BAB22222 et AAH12377 dans la base de données du NCBI.
La protéine selon l'invention représente un nouveau facteur soluble, sécrété par les cellules endothéliales des vaisseaux sanguins, lequel facteur dénommé ci-après VE-statine, est capable de bloquer le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse ; le gène codant pour ladite VE-statine est dénommé ci-après VE-statine.
L'invention inclut toute protéine (naturelle, synthétique, semisynthétique ou recombinante) de n'importe quel organisme procaryote ou eucaryote, notamment d'un mammifère humain ou non-humain, comprenant ou consistant en une séquence d'acides aminés d'une protéine VE-statine fonctionnelle. Elle inclut notamment les protéines naturelles isolées chez n'importe quelle organisme procaryote ou eucaryote, ainsi que les protéines recombinantes produites dans un système d'expression approprié.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ladite protéine est une protéine eucaryote, de préférence une protéine de mammifère.
On entend par "fonctionnelle", une protéine possédant une activité biologique normale, en l'occurrence une activité inhibitrice du recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse. Cette protéine peut comprendre des mutations silencieuses n'induisant aucun changement substantiel dans son activité et ne produisant aucune modification phénotypique.
Une protéine VE-statine fonctionnelle présente les propriétés suivantes : - elle est produite sous la forme d'un précurseur intracellulaire d'environ 275 acides aminés possédant (i) un peptide signal clivable d'environ 20 acides aminés, situé à son extrémité NH2, et (ii) 2 domaines du type de ceux du facteur de croissance épidermique (domaines "EGF-like" ou Epidermal growth factor-like) caractérisés par la présence de résidus de cystéine et d'un résidu de glycine conservés tels que prédits par les logiciels SMART (v3. 3 du 13 décembre 2001: http://smart.embl-heidelberg.de) ou PROSITE (http://www.expasy.org/prosite/, version 17. 37 du 1-02-2003), lesdits domaines étant situés respectivement des
positions 107 à 136 et 141 à 178, en référence à la séquence murine SEQ ID NO: 1 (figure 2), - elle est produite dans les cellules de mammifères, sous la forme d'une protéine soluble d'environ 30kDa, sécrétée dans le milieu extracellulaire ; cette forme mature dérive du précurseur par clivage du peptide signal, ainsi que par des modifications post-traductionnelles, - elle est exprimée de façon constitutive, spécifiquement dans les cellules endothéliales de tous les vaisseaux sanguins des précurseurs embryonnaires précoces aux cellules matures chez l'adulte, indépendamment de leur nature (artère ou veine), de leur taille ou de leur origine tissulaire, - elle inhibe le recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse.
La mesure de l'activité inhibitrice du recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse est réalisée par les techniques classiques connues en elles-mêmes notamment par le "test de la blessure" (Gotlieb et al., J. Cell. Physiol., 1979, 100, 563-578) ou par le "test de la chambre de Boyden" (TW Jungi, J. Immunol.
Methods, 1978, 21, 373-382).
L'invention inclut le précurseur de la VE-statine (forme intracellulaire) qui possède un peptide signal à son extrémité NH2, ainsi que la protéine mature (forme sécrétée dans le milieu extracellulaire), dérivée de ce précurseur par clivage du peptide signal, ainsi que par des modifications post-traductionnelles.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, elle présente la séquence de la VE-statine murine ou humaine mature, laquelle séquence est sélectionnée dans le groupe constitué par : - les séquences correspondant respectivement aux positions 17 à 275, 18 à 275,19 à 275, 20 à 275, 21 à 275, 22 à 275, 23 à 275 et 24 à 275 de la séquence SEQ ID NO : 1, et
- les séquences correspondant respectivement aux positions 16 à 273, 17 à 273,18 à 273,19 à 273,20 à 273,21 à 273,22 à 273 et 23 à 273 de la séquence SEQ ID NO : 42.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, elle présente une séquence sélectionnée dans le groupe constitué par la séquence SEQ ID NO: 2 (position 21 à 275 de la séquence SEQ ID NO : 1) et la séquence SEQ ID NO : 3 (positions 20 à 273 de la séquence SEQ ID NO : 42), correspondant respectivement à la VE-statine murine et humaine matures.
Conformément à l'invention, l'homologie d'une séquence par rapport à la séquence SEQ ID NO:1 s'apprécie par rapport à une séquence de longueur équivalente à celle de la séquence SEQ ID NO: 1 (environ 275 acides aminés), c'est à dire que l'homologie est analysée sur la totalité de la séquence SEQ ID NO: 1 et non uniquement sur une portion de celle-ci et par conséquent, le pourcentage de résidus qui sont identiques ou similaires est déterminé sur un nombre d'environ 275 résidus d'acides aminés.
De manière plus précise : L'identité d'une séquence par rapport à une séquence de référence s'apprécie en fonction du pourcentage de résidus d'acides aminés qui sont identiques, lorsque les deux séquences-chacune d'environ 275 acides aminés-sont alignées, de manière à obtenir le maximum de correspondance entre elles.
Une protéine ayant une séquence en acides aminés ayant au moins X % d'identité avec une séquence de référence est définie, dans la présente invention comme une protéine dont la séquence d'environ 275 acides aminés, peut inclure jusqu'à 100-X altérations pour 100 acides aminés de la séquence de référence, tout en conservant les propriétés fonctionnelles de ladite protéine de référence, en l'occurrence son activité inhibitrice du recrutement des cellules périvasculaires du type musculaire lisse. Au sens de la présente invention, le terme altération inclut les délétions, les substitutions ou les insertions consécutives ou dispersées d'acides aminés dans la séquence de référence. Cette définition s'applique, par analogie, aux molécules d'acide nucléique.
Le test est fait dans un volume final de 50 ul ; tous les réactifs sont préparés dans un tampon : # 20 mHepes/NaOH pH 7,5 # 5 mM MgC12 # 100 uM Na2V04 # 1 mM DTT # 100 M EDTA/NaOH # 0,01 % Brij35 5 ul de l'inhibiteur concentré 10 fois sont ajoutés à 25 uL d'enzyme (1000 U/ml final), (Calbiochem ref 102555), après 5 minutes d'incubation à température ambiante 10 uL de PolyGT (400 ng/ml final) et 10 L d'ATP (5 uM final) sont ajoutés. La détection se fait après 15 minutes d'incubation à 30 C.
Résultats obtenus exprimés en pourcentage d' inhibition à 20 M Exemple 24 100 % Exemple 2 100 % Exemple 32 100% 6) Test d'inhibition de l'activité de ZAP kinase L'inhibition de l'activité kinase est déterminée par polarisation de fluorescence, la kinase ZAP phosphoryle un peptide détecté par l'ajout d'un anticorps antiphospho-peptide couplé à un marqueur fluorescent.
Le test est fait dans un volume final de 50 l ; tous les réactifs sont préparés dans un tampon : # 20 m Tris/HCl pH 7,7 # 7 mM MnC12 # 50 uM Na2V04 5 l de l'inhibiteur concentré 10 fois sont ajoutés à 25 uL d'enzyme (0,7 ug/ml final), (Panvera ref P2782), après 5 minutes d'incubation à température ambiante 10 uL de PolyGT (300 ng/ml final) et 10 uL d'ATP (0,25 uM final) sont ajoutés. La détection se fait après 15 minutes d'incubation à température ambiante.
# Résultats obtenus exprimés en pourcentage d'inhibition à 20 M Exemple 8 98 % Exemple 20 95 % Exemple 24 96 % 7) Test d'inhibition de l'activité de Caséine kinase II L'inhibition de l'activité kinase est déterminée par la mesure de la phosphorylation de son peptide substrat.
Le test est fait dans un volume final de 50 ul.
Le tampon d'incubation est le suivant : # 30 mM MES pH 6,9 # 15 mM MgC12 # 195 mM KC1 # 7,25 mM DTT 5 l de l'inhibiteur concentré 10 fois sont ajoutés à 25 ul de tampon d'incubation contenant 1 U/uL final de l'enzyme (Tebu,SE-124) ; puis 10 uL de tampon d'incubation contenant 60 uM final de substrat peptidique sont ajoutés et enfin 10 uL de tampon d'incubation contenant 25 M ATP et de l'ATP radio-marqué [33P]ATP (0,25 uCi) sont ajoutés. La réaction est arrêtée après 30 minutes d'incubation à température ambiante.
Résultats obtenus exprimés en pourcentage d'inhibition à 20 M Exemple 8 93 % Exemple 30 97 % 8) Test d'inhibition de l'activité de CAM kinase II L'inhibition de l'activité kinase est déterminée par la mesure de la phosphorylation de son peptide substrat.
Le tampon d'incubation est le suivant : # 20 mM MOPS pH 7,4 # 5 mM MgC12 # 5 mM CaC12
# 1 mM DTT # 100 M Na2V04 # 25 mM Beta-glycerophosphate 5 l de l'inhibiteur concentré 10 fois sont ajoutés à 25 l de tampon d'incubation contenant 0,2 g/ L final de l'enzyme (Tebu, SE-134) ; puis 10 L de tampon d'incubation contenant 5 uM final de substrat et 1600 U/ml final de calmoduline sont ajoutés et enfin 10 L de tampon d'incubation contenant 20 M ATP et de l'ATP radio-marqué [33P]ATP (0,05 Ci) sont ajoutés. La réaction est arrêtée après 40 minutes d'incubation à température ambiante.
Résultats obtenus exprimés en pourcentage d'inhibition à 20 uM Exemple 30 98 % 9) Test d'inhibition de l'activité de EGF tyr kinase L'inhibition de l'activité kinase est déterminée par la mesure de la phosphorylation de son peptide substrat.
Le test est fait dans un volume final de 100 l.
Le tampon d'incubation est le suivant : # 5 mM Hepes/Tris pH 7,4 # 2 % Glycerol # 0,2 % tritonX100 10 l de l'inhibiteur concentré 10 fois sont ajoutés à 20 l de tampon d'incubation contenant 1 U/ L final de l'enzyme (Tebu, SE-124) ; puis 30 L de tampon d'incubation contenant 0,43 mg/ml final de substrat peptidique sont ajoutés ainsi que 20 l de tampon d'incubation contenant 0,4 M d'enzyme et enfin 20 L de tampon 6 mMtris/HCl pH 7,4, 15 mM MgC12 contenant 10 M ATP et de l'ATP radio-marqué [33P]ATP (0,25 uCi) sont ajoutés. La réaction est arrêtée après 60 minutes d'incubation à 30 C.
# Résultats obtenus exprimés en pourcentage
d'inhibition à 20 M Exemple 20 100 % 10) Test d'inhibition de l'activité de AKT L'inhibition de l'activité kinase est déterminée par polarisation de fluorescence, la kinase AKT phosphoryle un peptide détecté par l'ajout d'un anticorps anti phospho-peptide couplé à un marqueur fluorescent.
Le test est fait dans un volume final de 30 l ; tous les réactifs sont préparés dans un tampon : # 50 m HEPES pH 7,5 # 0,03 % triton X100 # 10 mM MgC12 # 5 % Glycerol ' 1 mM DTT 10 l de l'inhibiteur concentré 10 fois sont ajoutés à 5 L d'enzyme (20 ng final), 5 L de peptide (1 M final) et 10 L d' ATP (80 M final) sont ajoutés. La détection se fait après 20 minutes d'incubation à 25 C.
L'invention a également pour objet un procédé de décontamination in-vitro et in-vivo d'un milieu biologique (cible ou fluide biologique) en au moins un élément métallique, ledit procédé comprenant
une étape consistant à mettre en contact ledit milieu biologique avec un dérivé de per(3,6anhydro)cyclodextrine, tel que défini précédemment, pour fixer lesdits éléments sous forme de complexe avec un dérivé de per(3,6-anhydrocyclodextrine selon l'invention.
Les éléments métalliques susceptibles d'être fixés ou séparés par le procédé de l'invention peuvent être de divers types.
Ainsi, ces éléments métalliques peuvent être choisis parmi Tc, Y, In, Ga, Re, Sc, Co, Cu, Ca, Sr, Ag, Au, Sn, Bi, At, Rh, Er, Pm, Sm, Ho, Lu, Dy, Gd, Eu, Mn, Pb, Tl et éventuellement leurs isotopes radioactifs.
En particulier, des éléments toxiques tels que le plomb polluent l'environnement et peuvent être toxiques aussi bien chez l'animal que chez l'homme. Il est donc nécessaire de séparer et d'éliminer ces éléments de l'environnement. D'autre part, des produits qui permettraient d'assurer la décontamination des êtres vivants sans affecter leur système nerveux et d'autres organes constitueraient un grand intérêt.