INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Une partie des rayons lumineux émis par la diode 14, ceux o q u i ont u ne i ncl i naison plus faib le par rapport à l' axe optiq ue A-A,
impactent sur la lentille 54. Cette lentille 54 forme ici une lentille convergente qui permet de dévier
les rayons lumineux entrant sur sa face arrière de manière qu'ils se réfractent à l'intérieur du corps 22 de la pièce optique 12 suivant une direction globalement parallèle à
l'axe optique A-A.
Ces rayons lumineux arrivent donc sur les faces arrière 102 des éléments dioptriques 100 de la surface centrale 80, parallèlement à l'axe optique A-A, et les éléments dioptriques 100 o répartissent spatialement les rayons lumineux de manière à former une image similaire à celle formée par les éléments
dioptriques 100 des faces de sortie 82 à 96.
Sur la figure 6, le trajet des rayons lumineux qui pénètrent dans le corps 22 de la pièce optique 12 par la lentille 54, est
s illustré par le faisceau F3.
Le flux lumineux produit à la sortie de la pièce optique 12 par les faisceau F1 et F2 peut être appelé flux réfléchi, car ses rayons lumineux ont subi une réflexion sur les faces de réflexion
62 à 70 de la pièce optique 12.
o Le flux lumineux produit à la sortie de la pièce optique 12 par le faisceau F3 peut être appelé flux direct, car ses rayons lumineux n'ont pas subi de réflexion à l'intérieur de la pièce
Afin de réduire cette mortalité cellulaire, on a proposé l'utilisation de microbilles non biodégradables sur lesquelles adhèrent les cellules, servant ainsi de transporteurs ou microcarriers . La survie et le fonctionnement d'hépatocytes sont par exemple améliorés quand ces cellules sont greffées, adhérentes à des microbilles de verre ou de dextrane (CytodexR) (Demetriou et al. , 1986 ; Te Velde et al. , 1992) . Cette stratégie a permis d'obtenir des résultats plus intéressants qu'avec des hépatocytes microencapsulés. Plus récemment, ces mêmes microbilles ont été utilisées pour cultiver et greffer des kératinocytes humains afin de reconstituer une couverture cutanée chez la souris nude (Voigt et al., 1999). Cette approche a aussi été utilisée pour greffer des cellules neuro-chromaffines ou des neurones embryonnaires dopaminergiques, dans un modèle murin de la maladie de Parkinson. Dans ce modèle, la survie des cellules transplantées dans le striatum est fortement augmentée quand elles sont préalablement adhérées aux microparticules de verre ou de dextran, et permettent une amélioration comportementale des animaux (Cherskey et al., 1996 ; Saporta et al., 1997 ; et al., 1998). De même, il a été observé (Saporta et al., 1997) que des cellules f#tales humaines adhérées sur des microbilles de dextrane survivent au moins trois mois sans traitement immunodépresseurs, alors que sans microparticules ces cellules sont rejetées rapidement.
Une autre approche, plus récente, permettant d'augmenter la survie de cellules greffées est l'administration, en association avec la greffe, de facteurs de croissance. Ces protéines qui peuvent agir sur
la prolifération, la différenciation, l'activation, et la survie des cellules, constituent un apport majeur en greffe cellulaire. Bien qu'il soit maintenant possible de disposer de facteurs de croissance recombinants humains, leur administration présente une difficulté car ces protéines ont une demi-vie courte et traversent mal certaines barrières biologiques. Elles ont de plus une action pléïotropique, pouvant être la cause d'effets secondaires indésirables. Aucun des modes d'administration actuellement développé n'est totalement satisfaisant et applicable en clinique rapidement.
Un des premiers modes d'administration proposé consistait à greffer les cellules dans une suspension contenant le facteur de croissance. Cette approche, si elle est simple, ne permet pas d'agir à long terme sur les cellules. Un deuxième mode d'administration consiste à cotransplanter un tissu identifié pour produire le facteur de croissance choisi, par exemple les co-greffes nerf périphérique-cellules chromaffines (Date et al., 1996), ou les co-greffes hépatocytes-ilôts de Langherans (Kneser et al., 1999). La survie parfois limitée de ces co-greffes et l'impossibilité de contrôler les doses de facteurs de croissance limitent considérablement cette stratégie. Les progrès de la biologie moléculaire permettent maintenant d'obtenir des cellules génétiquement modifiées produisant un facteur de croissance, et qui peuvent être utilisées en co-greffes ou comme greffe proprement dite (Menei et al 1998 ; Wood et Prior, 2001). Cette approche reste cependant limitée par des problèmes éthiques, des risques biologiques, et le contrôle des doses libérées. Ainsi, il a été rapporté des greffes de cellules nerveuses, comme des cellules neuro-endocriniennes PC12 (Menei et al., 1989 ; Dehaut et al., 1993) ou cellules de Schwann normales ou
génétiquement modifiées pour produire un facteur neurotrophique (Montero-Menei et al., 1992 ; et al., 1998).
Il a également été décrit des microparticules biodégradables libérant des molécules neuroactives, de façon contrôlée et prolongée (Menei et al., 1997 ; Benoit et al., 1999). Ces microsphères sont constituées d'un biopolymère de type poly (acide lactique-co-acide glycolique) (PLGA). Elles sont biocompatibles avec le tissu nerveux et totalement dégradées en quelques mois (Menei et al., 1993 ; 1994b ; Véziers et al., 2000). Leur taille de quelques dizaines de microns permet une implantation stéréotaxique dans le cerveau, au niveau de leur cible pharmacologique, en utilisant les mêmes micro-seringues que pour les implantations de cellules (Menei et al., 1994a).
Elles ont été utilisées avec succès dans une étude clinique de phase I pour la chimiothérapie interstitielle des tumeurs cérébrales (Menei et al., 1999).
Des microsphères libérant des protéines, en particulier les facteurs de croissance et les cytokines ont également été développées. Le nerve growth factor (NGF), est une substance intéressante car parmi les plus anciennement caractérisée. Ainsi, il a été décrit des microsphères pouvant libérer du NGF pendant au moins deux mois (Péan et al., 1998 ; et al., 1999). Leur intérêt thérapeutique a été démontré sur deux modèles animaux de maladies neurodégénératives : modèle murin de la maladie d'Alzheimer, (Péan et al., 2000) et le modèle murin de la Chorée de Huntington (Menei et al., 2000).
Dans le domaine des tumeurs, il a été formulé des microsphères de PLGA capables de libérer des cytokines immunostimulantes après implantation intra-tumorale (Mullerad et al. 2000, Pettit et al., 1997). L'utilisation
de microsphères biodégradables pour la libération des cytokines dans le cadre de vaccin anti-tumoral a ainsi été proposée (Golumbek et al, 1993), mais, dans cette étude, les microsphères sont simplement mélangées aux cellules immédiatement avant injection. De même, la préparation de vaccin constitué de microsphères recouvertes d'antigènes bactériens ou de vésicules membranaires a été déjà proposée, mais sans que la microsphère puisse libérer une molécule immunostimulante (Mescher et Rogers, 1996, Mesher et Savelieva, 1997).
Le but de la présente invention est d'offrir maintenant une combinaison de cellules et de substances actives sur ces cellules, comme des facteurs de croissance ou des cytokines, au niveau des mêmes microparticules pour la greffe de cellules en thérapie cellulaire ou la vaccination.
Les compétences des inventeurs leur ont permis de développer des microcarriers pharmacologiquement actifs, aussi désignés ci-après MPA qui libèrent des facteurs de croissance de façon prolongée et contrôlée. Ces microparticules de quelques dizaines de microns de diamètre sont constituées de polymères biodégradables et biocompatibles permettant l'adhérence des cellules ou de fragments cellulaires grâce aux propriétés propres du polymère ou à un enrobage qui peut être biologiquement actif. Les MPA ne présentent pas de risque biologique et sont remarquables car : - Ils peuvent servir de support pour la culture des cellules. L'adhésion préférentielle des cellules à greffer sur les microparticules permet leur préparation voire leur transformation in vitro sans utiliser pour les recueillir, d'enzymes protéolytiques d'origine animale
déconseillées pour des raisons de sécurité sanitaires évidentes.
Ils peuvent servir de support aux cellules greffées et se dégrader sans toxicité après l'implantation, n'interférant pas avec l'intégration des cellules greffées.
- Ils peuvent libérer un ou plusieurs facteurs de croissance ou cytokines pendant une durée programmée et à une dose déterminée.
Ils peuvent promouvoir la survie et la différenciation des cellules greffées, modifier leur microenvironnement, ainsi que leur intégration dans le tissu hôte.
La polymérisation de l'étape (a) comprend plusieurs cycles de dénaturation, hybridation, extension en présence d'une polymérase, dans des conditions telles que chaque séquence nucléotidique simple brin et acide nucléique simple brin s'il est présent, sert de matrice pour l'élongation
d'une autre séquence nucléotidique simple brin ou acide nucléique simple brin s'il est présent.
L'étape (b) de polymérisation est réalisée avec des amorces comprenant des séquences nucléotidiques complémentaires d'une séquence nucléotidique d'un vecteur de clonage et/ou d'expression.
Le procédé de l'invention est également caractérisé en ce qu'il comprend après l'étape (b), l'insertion de chacun des polynucléotides doubles brins recombinés dans le vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant des extrémités 3' et/ou 5' complémentaires de celles introduites dans lesdits polynucléotides doubles brins recombinés obtenus à l'étape (b), puis le criblage ou la sélection desdits polynucléotides doubles brins recombinés ou des peptides, polypeptides ou protéines codés par ceux-ci pour une ou plusieurs propriétés désirées.
Selon une autre forme de l'invention, le procédé comprend après l'étape (b), la co-transformation d'un organisme hôte avec le vecteur de clonage et/ou d'expression comprenant des extrémités 3' et/ou 5' complémentaires de celles introduites dans lesdits polynucléotides doubles brins recombinés obtenus à l'étape (b) en présence desdits polynucléotides doubles brins recombinés, l'expression dans l'organisme hôte et éventuellement la sécrétion des peptides, polypeptides ou protéines codés par ceux-ci, puis le criblage ou la sélection desdits peptides, polypeptides ou protéines pour une ou plusieurs propriétés désirées.
La ou les propriétés désirées correspondent selon la présente invention à une ou plusieurs propriétés améliorées par rapport à celle(s) des peptides, polypeptides ou protéines de la population de départ.
La ou les propriétés sont choisies parmi le groupe suivant : propriétés anti-bactériennes, propriétés antifongiques, propriétés anti-inflammatoires, propriétés antitumorales, propriétés anti-cancéreuses, cicatrisation des plaies et habilité à lier un récepteur, en particulier un canal ionique.
L'invention concerne également un polynucléotide double brin recombiné, caractérisé en ce qu'il est obtenu par le procédé de l'invention.
L'invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide double brin recombiné obtenu par le procédé de l'invention pour transformer un organisme hôte et exprimer dans ce dernier le peptide, polypeptide ou la protéine codée par le polynucléotide recombiné. Le vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus en particulier un baculovirus. Le vecteur d'expression est avantageusement un vecteur à réplication autonome comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans l'organisme hôte comme une origine de réplication. En outre, le vecteur peut comporter des éléments permettant sa sélection dans l'organisme hôte comme par exemple un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection qui assurent la complémentation avec le gène respectif délèté au niveau du génome de l'organisme hôte. Le vecteur peut également être un vecteur navette comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans chacun des organismes hôte et des éléments permettant sa sélection dans chacun des organismes hôte. De tels vecteurs de clonage et/ou d'expression sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
L'invention concerne également un organisme hôte caractérisé en ce qu'il est transformé par un vecteur de clonage et/ou d'expression de l'invention. Par organisme hôte selon la présente invention, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel un polynucléotide double-brin recombiné obtenu par le procédé de l'invention est introduit pour la production d'un peptide, polypeptide ou d'une protéine obtenus par le procédé de l'invention. L'organisme hôte peut est un microorganisme tel qu'une levure (par exemple une levure de genre Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia ou Schizosaccharomyces), une bactérie (par exemple Escherichia coli) ou un champignon (par exemple Aspergillus nidulans). L'organisme hôte peut également être une cellule animale, en particulier une cellule d'arthropode (par exemple une cellule de Spodoptera frugiperda ou de Trichoplusia ni) ou une cellule de Mammifère. L'organisme hôte peut aussi être une cellule végétale ou une plante.
L'invention concerne donc également un peptide, polypeptide ou une protéine caractérisé(e) en ce qu'il (elle) est obtenu(e) par le procédé de l'invention.
L'invention concerne également une banque, caractérisée en ce qu'elle est constituée de polynucléotides double-brins recombinés ou de vecteurs de clonage et/ou d'expression ou d'organismes hôtes ou de peptides, polypeptides ou protéines.
L'invention concerne également l'utilisation du procédé de l'invention, pour la construction d'un vecteur de clonage et/ou d'expression.
La mise en #uvre du procédé de l'invention permet ainsi de préparer facilement et rapidement des polynucléotides doubles brins recombinés ou des peptides, polypeptides ou protéines pour lesquels ils codent, qui présentent avantageusement une ou plusieurs propriétés améliorées par rapport à celle(s) des peptides, polypeptides ou protéines de la population de départ. L'utilisation de séquences nucléotidiques simples brins telles que précédemment définies, dans l'étape (a) du procédé de l'invention permet de préserver l'intégrité des motifs structuraux élémentaires des peptides, polypeptides ou protéines codés par les polynucléotides doubles brins recombinés obtenus par le procédé de l'invention. Le repliement global des chaînes peptidiques, polypeptidiques ou protéiques et par voie de conséquence la fonctionnalité des peptides, polypeptides ou des protéines ne sont pas altérés.
L'utilisation d'amorces comprenant des séquences nucléotidiques complémentaires d'une séquence nucléotidique d'un vecteur de clonage et/ou d'expression dans l'étape (b) du procédé de l'invention, et éventuellement d'un ou plusieurs acides nucléiques simples brins tels que précédemment définis, dans l'étape (a) du procédé de l'invention permettent quant à eux de construire une banque de polynucléotides doubles brins recombinés capables de s'insérer directement dans un vecteur de clonage et/ou d'expression, par recombinaison homologue à l'intérieur d'un organisme hôte et d'exprimer et éventuellement sécréter directement les peptides, polypeptides ou les protéines pour lesquels les polynucléotides doubles brins recombinés codent.
L'étape d'amplification dans une bactérie, notamment E. coli étant désormais inutile, l'utilisateur gagne non seulement du temps mais évite aussi la perte éventuelle de séquences qui seraient toxiques dans la bactérie.
L'invention a ainsi pour objet des compositions de maquillage des fibres kératiniques, présentant : une teneur en solides définie par un extrait sec en solides supérieure à 45% du poids total de la composition ; et - un profil adhésif < 2,5, ledit profil adhésif représentant le rapport entre le pouvoir adhésif à To (noté PAT0, To correspondant au moment de l'application de la composition) et le pouvoir adhésif au moment où 20% de ladite composition est évaporé (noté PA20%) .
Avantageusement, une telle composition comporte une teneur en solides supérieure à 46%, de préférence supérieure à 47%, encore plus préférentiellement supérieure à 48% ou mieux encore supérieure à 50%. Notamment, cette teneur en solides est avantageusement inférieure ou égale à 85%, de préférence inférieure ou égale à 75%, mieux inférieure à 65%.
Plus l'extrait sec en solides est élevé, plus l'effet épaississant est important.
Avantageusement, une telle composition comporte un profil adhésif de 0,05 à 2,5, de préférence, de 0,1 à 2,2, mieux de 0,2 à 2, encore mieux de 0,3 à 1,8, encore préférentiellement de 0,5 à 1,8 et encore plus préférentiellement de 1 à 1,8.
Une telle composition, présentant les caractéristiques précitées, peut être obtenue avantageusement par une composition comprenant au moins une phase grasse comprenant au moins un agent structurant particulier de ladite phase présentant des propriétés de collant et de dureté définis.
De tels agents structurants présentent l'avantage de pouvoir être incorporés à des teneurs très élevées pouvant aller jusqu'à 50% en poids de la composition sans augmenter de façon importante la consistance.
Il est donc possible d'incorporer ces agents structurants en partie ou totalité de la phase grasse sans augmenter fortement la consistance et donc d'atteindre des teneurs globales en solides beaucoup plus importantes que l'art antérieur avec un pouvoir adhésif optimal.
En effet, grâce à ces agents structurants, il est possible de moduler facilement le pouvoir adhésif puisque celui-ci doit être important au moment de l'application pour une bonne accroche sur les fibres kératiniques mais ne doit pas non plus rendre le dépôt trop collant au cours du séchage afin de conserver une application facile.
L'avantage réside donc sur le fait qu'il est possible d'atteindre une forte teneur globale en solides de la composition finale (> 45%) allié à un pouvoir adhésif contrôlé qui permet un maquillage rapide et volumateur des cils.
Un autre avantage est que l'utilisation de ce type d'agents permet également d'obtenir des compositions de consistance classique d'application facile et formant un dépôt homogène sur les fibres kératiniques.
Un tel agent structurant peut être choisi parmi les cires collantes, les associations d'un composé particulier et d'au moins une huile et les mélanges de ceux-ci.
Lorsque l'un au moins des agents structurants est une cire collante, celle-ci présente avantageusement les caractéristiques suivantes : - un collant 0,7 N. s, notamment allant de 0,7 à 30 N.s ; de préférence > 1 N.s, notamment allant de 1 à 20 N.s ; ou mieux encore 2 N.s, notamment allant de 2 à 10 N.s ; préférentiellement de 2 à 5 N. s.
- une dureté 3,5 MPa, de préférence allant de 0,01 à 3,5 MPa, encore plus préférentiellement de 0,05 à 3 MPa et mieux encore de 0,1 à 2,5 MPa.
Selon l'invention, dans ce qui précède et ce qui suit, on entend par cire un composé gras lipophile, solide à température ambiante (25 C) et pression atmosphérique (760 mm de Hg, soit 105 Pa), à changement d'état solide/liquide réversible, ayant une température de fusion supérieure à 30 C et mieux supérieure à 55 C et pouvant aller jusqu'à 200 C, notamment jusqu'à 120 C.
En portant la cire à sa température de fusion, il est possible de la rendre miscible aux
huiles et de former un mélange homogène microscopiquement, mais en ramenant la température du mélange à la température ambiante, on obtient une recristallisation de la cire dans les huiles du mélange.
EXEMPLE 9 : VÉRIFICATION DE L'ACTIVITÉ DE L'AVIDINE FIXÉE SUR UN FILM DE PMAN ÉLECTRO-GREFFÉ.
On illustre dans cet exemple que l'avidine fixée selon le protocole de l'exemple 8 est active, en l'utilisant comme point de fixation d'un oligonucléotide (ODN) biotinylé. L'ODN utilisé est le 15-mer suivant : Biotine - 5' - GCTTGCTGAAGTTCG - 3' (Biotine - SEQ ID N 1)
Dans un tube, on plonge la lame obtenue selon le procédé de l'exemple 8 dans une solution à 25 M de cet ODN dans un tampon PBS (pH 7,2). La lame est mise à réagir à température ambiante pendant 15 heures, sortie et rincée par jets à plusieurs reprises à l'eau désionisée.
La présence de l'ODN est détectée par spectroscopie de photoélectrons X (XPS). Les courbes correspondant à cette analyse ainsi qu'à celle d'une lame recouverte d'un simple film de PMAN électro-greffé et à celle de la lame obtenu ci-dessus à l'exemple 8 (après fixation de l'avidine) sont représentées sur la figure 11annexée. La région P2p montre la présence des atomes de phosphore des groupements phosphates des bases de l'ODN.
Ces résultats montrent que la lame préparée conformément à l'exemple 8 permet de fixer l'avidine dans une conformation où elle conserve son activité, par réaction avec une molécule porteuse d'un fragment biotine ayant une très grande affinité pour l'avidine.
EXEMPLE 10 : FIXATIOND'ANTI-CORPS SUR UN FILM DE PMAN ÉLECTRO-GREFFÉ ET VÉRIFICATION DE SON ACTIVITÉ.
On illustre ici le fait qu'un film électro-greffé peut être utilisé comme primaire de fixation de molécules de structure tridimensionnelle complexe, et où la structure est déterminante dans les propriétés de la molécule. La grande accessibilité des groupements fonctionnels d'intérêt présents sur la surface permet en effet une distorsion minimale de la protéine sonde, qui peut ainsi conserver une conformation active.
On réalise pour cela la fixation d'un anti-corps, l'immunoglobuline anti-rabbit IgG. L'activité et la spécificité de cet anti-corps sont ensuite vérifiés par réaction d'une part avec un anti-gène spécifique (rabbit IgG), et d'autre part avec un anti-gène non spécifique (sheep IgG).
Il est à noter que la fixation d'anti-corps ouvre notamment la voie vers la fixation de cellule via des polymères électro-greffés.
Pour permettre la fixation d'anticorps sur une surface (par exemple sur le transducteur d'un capteur), il est en général nécessaire, au préalable, de modifier l'électrode. De ce fait, de nombreux groupements superficiels peuvent être créés, mais
qui doivent permettre le couplage des immunoglobulines, aussi trois types de fonctions ont retenu notre attention : amine, alcool, cyano.
Les fonctions amine et alcool sont souvent utilisées pour fixer des anticorps sur une surface. Il existe ainsi de nombreux agents de couplage commerciaux permettant de créer des liaisons covalentes entre les fonctions superficielles et celles des immunoglobulines.
Par contre, la fonction cyano permet la fixation directe de la biomolécule. Cette méthode est originale et n'a jamais été utilisée pour fixer une immunoglobuline à une surface, et notamment à une surface conductrice.
Les anticorps contiennent différentes fonctions : amine (NH2), acide (COOH), hydroxyle (OH) et ponts disulfure (S-S) pouvant conduire à leurs accrochages sur des surfaces. Les fonctions amine et acide proviennent des acides aminés, constituants des anticorps, et sont réparties dans toute la protéine. Il y a donc plusieurs sites de fixation possibles, permettant un couplage aisé mais non localisé, pouvant conduire à une inactivation de l'anticorps (dénaturation) vis-à-vis de l'antigène. Les fonctions amine et acide permettent de greffer l'anticorps entier à une surface. Au contraire, il est nécessaire de couper les ponts disulfure (S-S) et donc de générer des fonctions thiol (SH). Ce sont alors les fragments FAB' qui sont fixés. La couche de biomolécules ainsi obtenue est plus dense en sites réactifs et de plus les anticorps sont orientés car les fonctions thiol sont présentes dans la partie constante restante. Cette dernière caractéristique est importante car l'anticorps ne se fixe pas par l'un de ses sites actifs. Les immunoglobulines ainsi immobilisées ont moins de risque d'être dénaturées et inactivées vis-à-vis des antigènes.
Excepté dans le cas des fonctions cyano, il est indispensable d'utiliser un agent de couplage qui permet de relier de façon covalente les fonctions de la surface et de l'anticorps. On illustre ici le fait que les films électro-greffés permettent à la fois d'assurer une couche primaire et d'offrir des groupements fonctionnels d'intérêt immédiatement disponibles pour l'accrochage de molécules sondes biologiques.