INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
On constate donc que le composé testé induit une production massive de vacuoles cytoplasmiques dans la lignée tumorale humaine A549. L'effet constaté est dose-dépendant et il apparaît six heures après le traitement ; il atteint un maximum douze heures après le traitement.
On a constaté que le composé de l'exemple 8 montrait également un effet analogue. En outre, un phénomène analogue a été observé sur les cellules U-937, PC-12, MCF-7, HELA, COS-7, HEK-293, HEK- 293T, NIH-3T3, HT-29 et CHO obtenues et traitées comme indiqué cidessus pour les cellules A 549.
Lorsque le traitement des cellules est stoppé en remplaçant le milieu de croissance par un milieu frais, les vacuoles disparaissent : ceci montre que l'effet du composé selon l'invention est réversible.
Les cellules A549 traitées comme indiqué ci-dessus avec le composé selon l'exemple 9 ont aussi été examinées en microscopie électronique. Pour examiner ces A549 en microscopie électronique, on les fixe à l'aide d'une solution de TPS contenant 3 % de glutaraldéhyde, on les prend dans de la résine (EPON) et enfin on les coupe en fines lamelles à l'ultra-microtome. Ces lamelles sont alors déposées sur des grilles en cuivre de 200 mesh puis examinées en microscopie électronique. Les résultats sont présentés sur la figure 11. Sur la figure 11.1, on voit les cellules "contrôle" (grossissement 6.000) ; la figure 11. 2 on voit les cellules traitées par le composé de l'exemple 9 (grossissement 4.000) ; la figure 11.3, on voit un agrandissement des vésicules détectables sur la figure 11. 2 (grossissement 25.000) ; la
figure 11.4, on voit un détail du contenu d'une vacuole intracytoplasmique (grossissement 72. 000). Sur cette figure 11, les lettres utilisées ont les significations suivantes : N = noyau ; C= cytoplasme ; M = mitochondries ; Vi = vésicules intracytoplasmiques ; Ve = vésicules extracellulaires ; CML = corps multilamellaire.
L'analyse détaillée des photographies de la figure 11permet les observations suivantes : on observe sur la figure 11.1une cellule ayant un noyau volumineux centré, entouré par le cytoplasme ; à la surface de la cellule, on observe de petits prolongements, qui sont des villi. Sur la photographie 11.2, on voit la cellule après qu'elle ait subi un traitement par le composé selon l'invention ; elle a adopté une morphologie fusiforme ; les villi sont concentrés sur une face de la cellule (dans le quart droit en bas sur la figure 11.2) où apparaissent en surface de nombreuses vacuoles ; on observe également de nombreuses vacuoles et mitochondries dans le cytoplasme. Sur la photographie 11.3, on observe de nombreuses mitochondries ainsi que des vacuoles, qui contiennent des corps sombres et qui sont entourées de fibres de cytosquelette ; sur cette vue, deux types de vacuoles sont observables : des vacuoles intracytoplasmiques (Vi) et des vacuoles extracytoplasmiques (Ve). Sur la figure 11.4, on voit un détail d'une structure contenue dans les vacuoles intracytoplasmiques : il s'agit d'un corps multilamellaire caractéristique des cellules pulmonaires produisant des protéines de type surfactant B.
Le brevet US-A-6 187 444 décrit des revêtements polyuréthanes photochromiques obtenus par un procédé de synthèse, exonéré de la contrainte explicitée ci-dessus. La réactivité du mélange de réactifs - isocyanate/polyol - est en effet contrôlée dans la mesure où des isocyanates bloqués interviennent. Leurs fonctions NCO sont, de façon classique, bloquées à l'aide de composés organiques adéquats. Portés à une température suffisante - généralement entre 90 et 200 C -, les isocyanates bloqués larguent le composé bloquant et se retrouvent alors, isocyanates libres, à réagir avec les polyols présents, pour générer le polyuréthane recherché.
Malheureusement, comme mentionné dans ce brevet US, il n'est généralement pas possible de se débarrasser de tous les composés bloquants. Ainsi, doit-on toujours prévoir un excès d'isocyanates bloqués pour assurer la présence d'une quantité donnée d'isocyanates libres (débloqués). Un tel excès d'isocyanate est particulièrement malvenu dans un matériau renfermant des composés photochromiques. On a vu cidessus que les isocyanates sont susceptibles de s'hydrolyser en amines,
amines capables de déstabiliser, de détruire de tels composés photochromiques (tout particulièrement ceux de type chromène).
Par ailleurs, lors de la synthèse de tels revêtements, notamment d'épaisseur conséquente, il n'est pas exclu de piéger des composés bloquants. On peut même, dans certains cas, observer la formation de bulles en surface du revêtement...
La demande WO-A-01 55 269 décrit elle aussi des revêtements polyuréthanes photochromiques.
L'un des inconvénients des polyuréthanes classiques est d'être quasi-biphasiques avec une structure ordonnée. Lesdits polyuréthanes renferment en effet des segments mous, tout à fait mobiles, présents sous la forme de pelotes et des unités oligouréthanes rigides, qualifiées de segments durs. La cohésion de ces polyuréthanes repose principalement sur des liaisons hydrogènes existantes entre les groupes uréthane, à haute polarité, présents dans les segments durs. On peut craindre, en conséquence, que les composés photochromiques, localisés dans lesdits segments durs, souffrent d'un manque de mobilité et donc que les vitesses d'assombrissement et d'éclaircissement du matériau en cause soient ralenties.
A ce jour, on ne dispose pas de polyuréthanes photochromiques très performants et aisés à obtenir...
La demande WO-A-01 02 449 décrit, elle, un revêtement photochromique, de type poly(méth)acrylique, obtenu par copolymérisation d'un mélange de monomères (méth)acryliques qui renferme des molécules photochromiques. Ledit mélange de monomères, peu visqueux, ne permet pas de générer des revêtements d'épaisseur suffisante pour exhiber de bonnes propriétés photochromiques, à un coût raisonnable. En effet, pour compenser la faible épaisseur de revêtement, il est nécessaire que le composé photochromique intervienne à forte concentration, ce qui parfois pose problème, au vu de la solubilité dudit composé dans ledit revêtement.
Dans un tel contexte, on propose, selon l'invention, de nouvelles compositions photochromiques réticulables, précurseurs de revêtements photochromiques polyuréthane ou polyuréthane-urée, particulièrement intéressants, en référence aux problèmes rencontrés selon l'art antérieur, évoqués ci-dessus :
- problème de la présence potentielle d'amines ; - problème de la structure ordonnée ; - problème de l'épaisseur adéquate du revêtement recherché.
Lesdites nouvelles compositions photochromiques réticulables de l'invention renferment : - au moins un polymère linéaire de type polyuréthane ou polyuréthane-urée qui présente au moins une insaturation non terminale, c'est-à-dire dont l'un au moins des motifs constitutifs de la chaîne, motif non terminal, comporte au moins une insaturation ; et - une quantité efficace d'au moins un composé organique photochromique.
De façon caractéristique, elles renferment un certain type de polyuréthane ou polyuréthane-urée, linéaire, avec insaturation(s) dans sa chaîne, préconstitué, qui a été synthétisé en amont, par une réaction classique, en absence de tout composé photochromique. Le(s)dit(s) composé (s) photochromique (s) intervien(nent) en aval de la synthèse dudit polyuréthane ou polyuréthane-urée. Ainsi, on a pu, en amont, faire réagir tous les groupes isocyanates et éviter toute formation ultérieure de groupe amine, susceptible de déstabiliser, de détruire le(s)dit(s) composé (s) photochromique (s).
Le polyuréthane ou polyuréthane-urée linéaire intervenant est toutefois susceptible d'être ultérieurement réticulé - sur lui-même ou avec un partenaire adéquat (voir plus loin) - pour générer une matrice convenable au sein de laquelle le(s) composé (s) photochromique (s) présent(s) sera(seront) piégé(s), dans la mesure où il présente dans sa chaîne au moins une insaturation. Une telle insaturation, au niveau d'au moins un motif constitutif de ladite chaîne, n'exclut nullement la présence d'insaturation(s) au niveau des motifs terminaux.
La réticulation, mettant en jeu les insaturations de la chaîne polyuréthane ou polyuréthane-urée, est mise en oeuvre par voie radicalaire, pour générer des liaisons Carbone-Carbone. Elle ne sera en rien préjudiciable au (x) photochromique(s) présent(s).
Les insaturations en cause sont avantageusement de type (méth)acrylique (c'est-à-dire acrylique ou méthacrylique).
Les insaturations en cause, présentes au niveau des motifs constitutifs de la chaîne polyuréthane ou polyuréthane-urée, sont
Comme monomère porteur de groupement acide, on peut utiliser des acides carboxyliques insaturés [alpha],ss-éthyléniques tels que l'acide acrylique, l'acide méthacrylique, l'acide crotonique, l'acide maléique, l'acide itaconique. On utilise de préférence l'acide (méth)acrylique et l'acide crotonique, et plus préférentiellement l'acide (méth)acrylique.
Les esters de monomères acides sont avantageusement choisis parmi les esters de l'acide (méth)acrylique (encore appelé les (méth)acrylates), notamment des (méth)acrylates d'alkyle, en particulier d'alkyle en C1-C30, de préférence en C1C2o, des (méth)acrylates d'aryle, en particulier d'aryle en C6-C10, des (méth)acrylates d'hydroxyalkyle, en particulier d'hydroxyalkyle en C2-C6 .
Comme amides des monomères acides, on peut par exemple citer les (méth)acrylamides, et notamment les N-alkyl (méth)acrylamides, en particulier d'alkyl en C2-C12. Parmi les N-alkyl (méth)acrylamides, on peut citer le N-éthyl acrylamide, le N-t-butyl acrylamide, le N-t-octyl acrylamide et le Nundécylacrylamide.
Les polymères filmogènes vinyliques peuvent également résulter de l'homopolymérisation ou de la copolymérisation de monomères choisis parmi les esters vinyliques et les monomères styrèniques. En particulier, ces monomères peuvent être polymérisés avec des monomères acides et/ou leurs esters et/ou leurs amides, tels que ceux mentionnés précédemment.
PREPARATION 1 : A-Cyctohexyt-2,3-pyridinediam!ne Stade a : N-Cyclohexyl-3-nitro-2-pyridinamine Un mélange constitué de 0,1 mole (15,85 g) de 2-chloro-3-nitropyridine et de 0,1 mole
(11,50 ml) de cyclohexylamine est chauffé à 120 C pendant 4 heures dans 250 ml DMF en présence de carbonate de potassium (13,81 g). La solution est ensuite extraite par 200 ml d'éther et la phase organique est lavée trois fois à l'eau. Après séchage sur sulfate de magnésium, l'éther est évaporé.
Stade b : N2-Cyclohexyl-2,3-pyridinediamine On introduit dans l'autoclave 800 ml d'éthanol, 0,05 mole (11,06 g) du dérivé nitré préparé au stade précédent et 3,5 g de charbon palladié. Le mélange est chauffé à 60 C pendant 30 mn sous 50 kg d'hydrogène, puis agité horizontalement à température ambiante pendant 3 heures pour homogénéiser la solution. Après ce délai, la solution est filtrée sur büchner, puis sur double filtre pour éliminer les derniers résidus de charbon palladié et l'éthanol est évaporé sous pression réduite.
PREPARATION 2 :N2-Cycloheptyl-2,3-pyridinediamine Le protocole expérimental est identique à celui utilisé dans la préparation 1, en partant au stade a de la cycloheptylamine à la place de la cyclohexylamine.
EXEMPLE 1 : 3-Cyclohexyl-3H imidazo[4,5-b]pyridin-2-ylcarbamate d'éthyle Stade a : {f2-(Cvclohexvlammo)-3-pvridinyl|iminoKdiéthylamino)méthylcarbamate d'éthyle Un mélange de 0,02 mole (3,82 g) de 3-amino-2-cyclohexylaminopyridine de la préparation 1 et de 0,02 mole d'isothiocyanate d'éthoxycarbonyle est agité dans 50 ml de DMF à température ambiante pendant 3 heures. La solution est alors refroidie à 0 C et 0,05 mole de dipropylamine puis 0,02 mole de chlorure mercurique sont ajoutés successivement. Au bout de 15 minutes, le bain de glace est enlevé et la solution est agitée à température ambiante pendant 4 heures. Après avoir dilué la solution par 100 ml d'acétate d'éthyle, on la filtre sur célite et les solvants sont évaporés sous pression réduite. Le produit brut obtenu est ensuite recristallisé dans l'acétonitrile.
Stade b : 3-Cyclohexyl-3H-imidazo[4,5-blp3Édin-2-ylcarbamate d'éthyle On dissout 0,0048 mole du composé préparé au stade précédent dans 100 ml d'une solution de méthanol et de soude à 15 % (50/50). Après avoir chauffé la solution à reflux pendant 3 heures, le méthanol est évaporé. Le précipité ainsi obtenu est essoré, lavé à l'eau et recristallisé dans l'acétonitrile.
Point de fusion : 264 C EXEMPLE 2 : 3-Cycloheptyl-3Jff-imidazo[4,5-*]pyridin-2-ylcarbamate d'éthyle Le protocole expérimental est identique à celui utilisé dans l'exemple 1, en partant au stade a de la 3-amino-2-cyclohephylaminopyridine de la préparation 2, à la place de la 3-amino- 2-cyclohexylaminopyridine.
Point de fusion : 177 C EXEMPLE 3 : 3-Cyclohexyl-3iff-imidazo[4,5-6]pyridin-2-amine On additionne le composé de l'exemple 1 à 100 ml d'une solution de dioxane saturée en acide chlorhydrique gazeux et on chauffe la solution pendant 12 heures à reflux. Après refroidissement de la solution, le précipité est essoré, lavé au bicarbonate de soude puis recristallisé dans l'acétonitrile.
Point de fusion : 210 C EXEMPLE 4 : 3-Cycloheptyl-3H imidazo[4,5-b]pyridin-2-amine Le protocole expérimental est identique à celui utilisé dans l'exemple 3 en utilisant comme produit de départ le composé de l'exemple 2.
Point de fusion : 210 C
ETUDE PHARMACOLOGIQUE EXEMPLE A : Activité de l'AMPK dans un modèle cellulaire: bépatocytes isolés de rat Les hépatocytes sont isolés selon la technique de Berry et Friend [J. Cell Biol, 43,506-520 (1969) ]. L'activité de l'AMPK a été mesurée selon la méthode décrite par Davies et al.
[Eur. J. Biochem., 186,123-128 (1989) ]. Celle-ci implique la phosphorylation à partir de [[gamma]-32P]-ATP d'un substrat peptidique (SAMS), basé sur la séquence entourant le site phosphorylé par l'AMPK de l'ACC. La réaction de mesure de l'activité de l'AMPK se termine par le dépôt d'un aliquot du milieu réactionnel sur un papier de phosphocellulose (Whatman P81), sur lequel le peptide SAMS se fixe et dont la radioactivité est mesurée après lavage.
A titre d'exemple, le composé de l'Exemple 4 active l'AMPK, après 30 minutes à la concentration de 500 M, de 312 % (vs. la valeur basale) alors qu'à la même concentration dans les mêmes conditions l'AICARiboside, pris pour référence, l'active de 178 %.
EXEMPLE B : Activitéhypolipémiante Les produits de l'invention ont été testés in vivo chez la souris obèse ob/ob, utilisé comme modèle d'insulinorésistance associée à l'obésité. A titre d'exemple, le composé de l'Exemple 4 baisse significativement les triglycérides à 125 mg/kg per os, alors qu'avec la metformine, la même diminution est obtenue à 250 mg/kg per os.
Dans ce modèle, les composés de l'invention se sont donc révélés être de puissants hypolipémiants.
EXEMPLE C : Composition pharmaceutique Formule de préparation pour 1000 comprimés dosés à 5 mg : Composé de l'exemple 4.............................................................................. 5 g Hydroxypropylméthylcellulose...................................................................2 g Amidon de blé .............................................................................".'"'''''''' 1 0 g Lactose ....................................................................................................100 g Stéarate de magnésium................................................................................ 3 g
ADN par élongation. Le substrat ADN coupé est spécifiquement amplifié par PCR en utilisant des amorces reconnaissant les adaptateurs. La quantité d'ADN est ensuite détectée.
L'invention concerne donc une méthode de criblage permettant d'identifier parmi une banque de sites de coupure le ou les site (s) coupure coupé (s) une endonucléase déterminée présentant un type de coupure décalée comprenant les étapes suivantes : 1) fournir une banque de substrats ADN double-brins comprenant au moins deux sites de coupure, au moins un des sites de coupure étant variable dans la banque; 2) fournir ladite endonucléase ; 3) distribuer les différents substrats ADN dans des récipients, ajouter ladite endonucléase dans chaque récipient, dans des conditions propices à l'activité de coupure ; 4) discriminer dans chaque récipient les substrats ADN coupés aux deux sites et les substrats ADN non coupés aux deux sites ; 5) détecter le substrat ADN coupé aux deux sites; la présence du substrat ADN coupé révélant la capacité de coupure par l'endonucléase d'un site .
De préférence, lesdits sites de coupure ont une localisation distale sur ledit substrat ADN. Plus particulièrement, ils sont situés aux extrémités du substrat ADN.
Dans un mode de réalisation, la discrimination consiste en la dégradation du substrat ADN non coupé aux deux sites par une exonucléase incapable de dégrader le substrat ADN coupé aux deux sites. Facultativement, ladite exonucléase est inactivée avant l'étape 5) de détection. Lorsque ladite endonucléase possède un type de coupure décalée, plus particulièrement d'au moins 4 nucléotides, générant une extrémité 3' sortante, ladite exonucléase est de préférence l'exonucléase III. Lorsque ladite endonucléase possède un type de coupure décalée, plus particulièrement d'au moins 4 nucléotides, générant une extrémité 5' sortante, ladite exonucléase est de préférence l'exonucléase Lambda.
Dans un autre mode de réalisation, la discrimination consiste en la séparation des substrats ADN coupés aux deux sites et non coupés. De préférence, ledit substrat ADN initial porte à au
moins une de ses extrémités, de préférence aux deux, un ligand et ladite séparation est faite avec la cible du ligand immobilisée sur un support solide. De préférence, le ligand, la cible et le support solide sont respectivement la biotine, la streptavidine et une bille paramagnétique.
Facultativement, l'étape de détection 5) comprend : a) amplifier par PCR le substrat ADN coupé aux deux sites ; b) détecter le produit d'amplification ; ledit produit d'amplification révélant la capacité de clivage du site par ladite endonucléase.
Dans un mode de réalisation additionnel, la discrimination consiste en l'amplification sélective des substrats ADN coupés aux deux sites. Ainsi, des adaptateurs capables de s'hybrider à au moins une des extrémités, de préférence aux deux, sortantes générées par la coupure de ladite endonucléase sur le substrat ADN coupé sont ajoutés et sont soit liés covalemment par l'action d'une ligase soit intégrés au substrat ADN par élongation, lesdits adaptateurs permettant d'introduire une séquence non présente sur le substrat ADN utilisée pour les amorces de PCR.
L'ensemble des résultats sur les différents substrats ADN présentant des sites de coupure variable permet de connaître la spécificité de la première endonucléase.
Facultativement, les substrats ADN peuvent contenir une cassette d'expression pour la première endonucléase et/ou la deuxième endonucléase. Dans ce cas, les étapes 2) et 4) de la méthode sont remplacées par l'expression de la ou des endonucléase(s).
Ces buts et d'autres sont atteints par la présente invention dont un premier objet est constitué par un procédé de préparation de particules polymériques dans lequel : a) on prépare une émulsion multiple eau / huile / eau telle que : # la phase aqueuse interne comprend éventuellement au moins une matière active hydrophile ; # la phase organique comprend : - au moins un monomère principal et/ou au moins un monomère réticulant, éventuellement au moins un co-monomère, - au moins un polymère amphiphile dibloc possédant un bloc hydrophile et un bloc hydrophobe, et/ou un polymère amphiphile tribloc dont les blocs aux
extrémités sont des blocs hydrophobes et/ou au moins un tensioactif non ionique polyalcoxylé ; # la phase aqueuse externe comprend au moins un tensioactif et/ou au moins un polymère amphiphile ; # l'émulsion multiple peut comprendre au moins un initiateur de polymérisation ; b) on se place dans les conditions de polymérisation du ou des monomères principaux et/ou du ou des monomères réticulants, le cas échéant du ou des co- monomères, du ou des agents initiateurs.
Un autre objet de l'invention est constitué par les particules polymériques résultantes dont la surface externe de chaque particule est fermée et dont les pores internes de chaque particule ne sont pas connectés entre eux.
Un troisième objet de l'invention est constitué par l'utilisation de telles particules comme additif pour allègement de charges ; pigment organique ; agent de renfort ; agent d'encapsulation ; agent ignifugeant ; additif anti-UV ; comme additif volumateur.
Les particules susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'invention présentent une structure interne de pores non connectés entre eux, grâce à un contrôle amélioré de la stabilité de l'émulsion multiple lors de la polymérisation, contrôle qui est réalisé par le choix de polymères et de tensioactifs particuliers. Plus précisément, la structure de l'émulsion interne de l'émulsion multiple (c'est-à-dire de l'émulsion eau dans huile) est substantiellement conservée dans les pores internes de chaque particule, notamment la répartition et la taille de ces pores.
Par conséquent, le taux d'encapsulation de la matière active dans les particules selon l'invention est optimisé, de même que les variations de relargage de la matière active à travers lesdites particules deviennent comparables d'une particule à l'autre.
Mais d'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description et de l'exemple qui vont suivre.
Les figures annexées sont des photographies réalisées par microscopie électronique à balayage (Microscope à balayage MEB LE0440) et correspondent : Figure 1 : particule de structure fermée obtenue à partir de styrène et de divinylbenzène dont l'aspect général de la surface est uniforme.
Figure 2 : d'une particule de structure fermée obtenue à partir de styrène et de divinylbenzène.
Dans ce qui va suivre, on appellera phase aqueuse interne, la phase aqueuse de l'émulsion inverse (eau dans huile) de l'émulsion multiple et phase aqueuse externe, la phase aqueuse dans laquelle est dispersée ladite émulsion inverse.
Comme cela a été indiqué auparavant, le procédé consiste dans une première étape, à préparer une émulsion multiple eau/ huile / eau.
La phase aqueuse interne va tout d'abord être décrite.
Ainsi, la phase aqueuse interne peut éventuellement comprendre au moins une matière active hydrophile.
Cette matière active hydrophile peut se présenter sous une forme liquide miscible à l'eau ; ou encore sous une forme solide se présentant soit sous une forme solubilisée dans la phase aqueuse, soit sous une forme dispersée dans ladite phase aqueuse.
La teneur en matière active hydrophile est plus particulièrement comprise entre 0,1 et 50 % en poids de la phase aqueuse interne, et de préférence comprise entre 0,1 et 20 % en poids de la phase aqueuse interne.
Les matières actives sont choisies en fonction des domaines d'applications des particules polymériques A titre d'exemples de matières actives utilisables dans le domaine de la cosmétique, on peut citer les substances qui ont un effet cosmétique, un effet thérapeutique ou toute autre substance utilisable pour le traitement de la peau et/ou du cheveu.
Dans tous les cas, les adénovirus recombinants (réplicatifs ou pseudo-réplicatifs) conformes à l'invention conservent les séquences de l'ITR gauche indispensables à la réplication, à l'activation de la transcription (4 motifs GGTCA répétés situés entre les positions 62 et 99 dans le génome de Cav2) ainsi que les signaux d'encapsidation AI de type 5'TTTGN8CG-3', et Au à AIX de type 5' -TTTA/G-3' (situés
respectivement aux positions 197-200,206-209, 213-216,226- 232, 239-242, 250-253, 258-261, 272-275 et 306-309 dans le génome de Cav2). Ils conservent également la totalité de la séquence codante d'ElA ainsi que des régions du gène El situées en aval de celle-ci (signal de polyadénylation d'ElA et région E1B).
Selon un mode de réalisation préféré d'un adénovirus recombinant conforme à l'invention, il comprend en outre au moins une séquence hétérologue d'intérêt insérée dans son génome.