INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La détermination des IC90 se fait par un test liquide en microplaques 96 puits. Le test est réalisé sur des souches bactériennes à Gram positif Staphylococcus aureus sensibles (souche clinique 21 ; de l'Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg) et résistantes (souche clinique 4 ; Don du Dr. Gilles Prevost, Institut de Bactériologie, Strasbourg) de façon à obtenir un inoculum selon le protocole décrit dans la partie B) paragraphe 6). 100 l d'échantillons à tester sont distribués en duplicats de façon à obtenir une gamme de concentration de 25 à 0,05 ug/ml dans les puits. Les échantillons sont ajoutés à de 100 l de suspension bactérienne à 2.106/ml dans chaque puits de façon à obtenir une concentration finale de 106/ml. Les plaques de microtitration sont incubées à 30 C pendant 16 à 18 heures. Les colonies sont dénombrées par comptage des UFC (Unités Formant Colonies) et le résultat est rapporté en UFC/ml. La densité optique des puits est mesurée à 600 nm et les résultats sont interprétés en calculant le pourcentage de pousse dans chaque puits selon la formule décrite partie B) paragraphe 7). Les inhibitions de croissance 90 (IC 90) sont les puits où le pourcentage de
des monomères vinyliques ou cycliques qui comportent les groupements fonctionnels que l'on désire fixer sur la surface, ou qui comportent des précurseurs simples originaux (c'est-à-dire des précurseurs qui ne sont pas seulement des groupements protégés) de groupements fonctionnels désirés.
Il a par ailleurs déjà été proposé, notamment dans la demande de brevet EP 0 665 275 de former un film polymère à partir de monomères électrogreffable selon un procédé au cours duquel la croissance des chaînes est interrompue par des groupements fonctionnels. Ainsi, selon ce procédé, les groupements fonctionnels d'intérêt ne sont pas placés directement sur le monomère qui sera utilisé pour l'électro-greffage, mais interrompent essentiellement la croissance avec un inhibiteur porteur du groupement fonctionnel voulu. On note en particulier que ce procédé ne délivre qu'un seul groupement fonctionnel par chaîne, et ne permet pas de disposer d'un grand nombre de groupements accessibles, ce qui est notamment préjudiciable lorsque la molécule sonde est volumineuse. De plus, il a été démontré que la croissance des chaînes polymères sur la surface est nécessairement anionique (C. Bureau et al., Macromolecules, 1997,30, 333), et il est probable que les inhibiteurs radicalaires introduits selon ce procédé se retrouvent dans le film en fin de synthèse parce qu'ils sont adsorbés et/ou réduits sur la surface de l'électrode (ils sont en général électro-actifs), et non parce qu'ils interrompent la croissance des chaînes.
C'est dans la compréhension actuelle des mécanismes de l'électrogreffage, et dans les a priori qui y sont associés, que l'on peut comprendre les raisons pour lesquelles l'Homme de l'Art ne s'est pas orienté vers l'utilisation de monomères présentant des groupements fonctionnels variés.
Il semble aujourd'hui admis que l'obtention de films polymères greffés par électrogreffage de monomères vinyliques activés sur surfaces conductrices procède grâce à une électro-initiation de la réaction de polymérisation à partir de la surface, suivie d'une croissance des chaînes, monomère par monomère (C. Bureau, et al., 1997, pré-cité ; C. Bureau and J. Delhalle, Journal of Surface Analysis, 1999, 6(2), 159 et C. Bureau, et al., Journal ofAdhesion, 1996, 58, 101).
Cette réaction de polymérisation est représentée sur le schéma A ciaprès : SCHÉMA A
Dans ce schéma, la réaction de greffage correspond à l'étape 1, où la croissance a lieu à partir de la surface. L'étape 2 est la réaction parasite principale, qui conduit à l'obtention d'un polymère non greffé.
La croissance des chaînes greffées s'effectue donc par polymérisation purement chimique, c'est-à-dire indépendamment de la polarisation de la surface conductrice qui a donné lieu au greffage. Cette étape est donc sensible à (elle est en particulier interrompue par) la présence d'inhibiteurs chimiques de cette croissance.
Dans l'exemple de la réaction représentée sur le schéma A ci-dessus, où l'on a considéré l'électrogreffage de l'acrylonitrile sous polarisation cathodique, la
croissance des chaînes greffées s'effectue par polymérisation anionique. Cette croissance est interrompue notamment par des protons, et il a été démontré que la teneur en protons constitue même le paramètre majeur qui pilote la formation de polymère en solution, ainsi que les informations récupérées en cours de synthèse, et notamment l'allure des voltammogrammes qui accompagnent la synthèse (C. Bureau, Journal of Electroanalytical Chemistry, 1999, 479, 43).
Les traces d'eau, et plus généralement les protons labiles des solvants protiques, constituent des sources de protons préjudiciables à la croissance des chaînes greffées. Avant même que les mécanismes réactionnels de l'électrogreffage de monomères vinyliques aient été compris, ce point technique bloquant avait été clairement identifié par l'Homme de l'Art.
C'est pourquoi, il apparaît impossible d'envisager une réaction d'électropolymérisation mettant en #uvre des monomères comportant des groupements fonctionnels sources de protons (monomères protiques).
Du fait de ces limitations sévères portant à la fois sur les solvants et les types de monomères de synthèse, l'électrogreffage de monomères vinyliques sur les surfaces conductrices ou semi-conductrices de l'électricité reste un procédé ne permettant que le greffage de polymères relativement peu intéressants du point de vue de la fonctionnalisation chimique des surfaces.
Pour cette raison, les films de polymères électro-greffés ont surtout été utilisés pour réaliser des fonctions passives : anti-corrosion ou lubrification comme cela a par exemple déjà été décrit dans les demandes de brevet EP-A-0 038 244 et FR-A-2 672 661.
Un besoin existe donc de pouvoir réaliser la fonctionnalisation de surfaces conductrices ou semi-conductrices de l'électricité par des couches organiques présentant une grande variété de groupements fonctionnels, ainsi qu'un grand nombre de groupements fonctionnels d'intérêt accessibles par unité de surface, de façon à assurer des réactions de post-fonctionnalisation plus rapides que celles disponibles actuellement.
La Demanderesse s'est en particulier donnée pour but de résoudre le problème d'interface minéral/organique de façon à pourvoir à un support conducteur ou semi-conducteur de l'électricité comportant une zone d'accroche fonctionnalisée ou
"velcro# moléculaire" utile pour la fixation de molécules d'intérêt (molécules sondes) ou d'objets porteurs d'une fonction complémentaire.
Par marquage d'un récepteur ou d'un ligand, on entend : - pour le récepteur, la fusion de son gène ou ADNc, ou partie du gène ou de l'ADNc, avec le gène ou ADNc, ou partie du gène ou ADNc, de la GFP ; - pour le ligand, il peut s'agir d'un couplage chimique entre le ligand et un groupe fluorescent, ou bien de la fusion de son gène ou ADNc, ou partie du gène ou de l'ADNc, avec le gène ou ADNc, ou partie du gène ou ADNc, de la GFP.
L'invention concerne l'utilisation d'une protéine fluorescente selon l'invention dans laquelle le récepteur et le ligand sont marqués par voie génétique, la protéine fluorescente et la substance fluorescente étant respectivement choisies parmi les couples de composés suivants : GFPUV - EYFP EYFP - GFPUV ECFP - EYFP EYFP - ECFP
ECFP - EGFP EGFP - ECFP EGFP - EYFP EYFP - EGFP et notamment dans laquelle le récepteur est marqué par la protéine EYFP ou EGFP et le ligand est marqué par la protéine ECFP, ou le récepteur est marqué par la protéine ECFP et le ligand est marqué par la protéine EYFP ou EGFP.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine fluorescente est EGFP et : - soit la EGFP est donneur d'énergie de fluorescence et le marqueur absorbant la lumière émise par la EGFP est une substance fluorescente ou non, et le marqueur étant choisi parmi des substances, dont le spectre d'excitation chevauche le spectre d'émission de la EGFP, et, dans le cas où le marqueur est une substance fluorescente, il est choisi parmi : le 4,4-difluoro-4-bora-3a,4a-diaza-s-indacene (Bodipy), l'éosine, la lissamine, l'érythrosine, la tétraméthylrhodamine, la sulforhodamine 101 commercialisée par Molecular probe sous la dénomination Texas Red, et leurs dérivés permettant d'une part le greffage et, d'autre part, dont le spectre d'excitation recouvre le spectre d'émission de EGFP, et, dans le cas où le marqueur n'est pas une substance fluorescente, il est choisi parmi le groupe des acides violets [Acid Violet 5, CAS 10130-48-0 ; Acid Violet 7, CAS 4321-69-1 ; Violet 17, CAS 4129-84-4], des acides rouges [Acid Red 1, CAS 3734-67-6 ; Acid Red 8, CAS 4787-93-3 ; Acid Red 37, CAS 6360-07-2 ; Acid Red 40, CAS 12167-45-2 ; Acid Red 106, CAS 6844-74-2 ; Acid Red 114, CAS 6459-94-5], les alizarines, l'aluminon, l'azocarmine B [CAS 25360-72-9], la fuschine basique [Basic Red 9, CAS 569-61-9], le Bordeaux R [Acid Red 17, CAS 5858-33-3], la Carminé [CAS 1390-65-4], - soit la EGFP est accepteur d'énergie de fluorescence et la substance fluorescente est donneur d'énergie de fluorescence et est choisie parmi des substances, dont le spectre d'émission chevauche le spectre d'excitation de la EGFP, et notamment parmi : les coumarines, la fluorescamine, le 6-(N-méthylanilino)naphtalène, (mansyl) et leurs dérivés permettent d'une part le greffage et, d'autre part, dont le spectre d'émission recouvre le spectre d'excitation de EGFP,
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, la protéine fluorescente est ECFP et : - soit la ECFP est donneur d'énergie de fluorescence et la substance fluorescente est accepteur d'énergie et est choisie parmi la fluoresceïne et le 7-nitrobenz-2-oxa-1,3diazole, - soit la ECFP est accepteur d'énergie de fluorescence et la substance fluorescente est donneur d'énergie et est choisie parmi le pyrène ou la coumarine ou leurs dérivés permettant d'une part le greffage, et, d'autre part, dont le spectre d'émission chevauche le spectre d'excitation de la ECFP.
S'agissant du récepteur, il peut être choisi parmi : - les récepteurs membranaires couplés à la protéine G, notamment dans Supplément Trends in Pharmacological Sciences, 1997 (Receptor and ion Channel Nomenclature) et dans les bases de données ensembl.org et GPCRdb, - les récepteurs des facteurs de croissance, notamment ceux qui sont structurellement reliés au récepteur de l'insuline (Yarden, Y. and Ullrich, A., 1988) ou au récepteur de l'interféron y (Brisco et al., 1996 ; Ihle, 1995) et ceux décrits dans les bases de données ensembl.org et GPCRdb, - les récepteurs canaux, notamment dans Supplément Trends in Pharmacological Sciences, 1997 (Receptor and ion Channel Nomenclature) et ceux décrits dans les bases de données ensembl.org et GPCRdb, - les récepteurs nucléaires intracellulaires, notamment ceux qui sont structurellement reliés au récepteur des stéroïdes (Mangelsdorf et al., 1995 ; et al., 1996) et ceux décrits dans les bases de données ensembl.org et GPCRdb.
Selon un mode de réalisation avantageux, le récepteur est choisi parmi les récepteurs membranaires couplés à la protéine G.
Comme défini ci-dessus, on rappelle que par "récepteur" on désigne toute molécule de nature protéique susceptible d'entrer en interaction non covalente avec un agent pharmacologique, et, préférentiellement, un récepteur de neurotransmetteur, d'hormones, de facteur de croissance etc..., capable de produire, après interaction avec un ligand pharmacologique, une réponse de transduction de signal mesurable in vivo et/ou in vitro.
Par réponse de transduction de signal, on désigne toute réponse, ou inhibition de réponse, mesurable in vivo et/ou in vitro, résultant de l'interaction d'un récepteur avec ses agents pharmacologiques spécifiques et conduisant à des activations ou inhibitions
du métabolisme cellulaire par effet sur des messagers secondaires, des enzymes, ou des courants ioniques.
A titre d'exemples de récepteurs membranaires couplés aux protéines G, on peut citer les récepteurs de purines et nucléotides, des amines biogéniques, des peptides et protéines, des eicosanoides, des lipides et dérivés, des acides aminés excitateurs et des ions, des molécules olfactives ainsi que les récepteurs orphelins (ci-après une liste assez exhaustive).
A titre d'exemple de récepteurs de facteurs de croissance, on peut citer les cytokines, le facteur de croissance épidermique, l'insuline, le facteur de croissance dérivé des plaquettes, le facteur de croissance de transformation.
A titre de récepteurs canaux, on peut citer notamment les récepteurs de l'ATP, de la sérotonine, du GABA, de la glycine, de l'acétylcholine, du glutamate.
A titre d'exemple de récepteurs nucléaires, on peut citer notamment les récepteurs des hormones thyroïdiennes, des #strogènes, des glucocorticoïdes, des rétinoïdes.
A titre de ligands des récepteurs couplés à la protéine G on peut citer : # Purines et Nucléotides . Adénosine . cAMP . ATP . UTP . ADP # Amines Biogéniques (et ligands naturels reliés) . 5-hydroxytryptamine . Acétylcholine . Dopamine . Adrénaline . Histamine . Mélatonine . Noradrénaline . Tyramine/Octopamine . autres composés reliés # Peptides . Hormone adrénocorticotrophique (ACTH)
. Hormone stimulatrice de mélanocyte (MSH) . Mélanocortines . Neurotensine (NT) . Bombésine et peptides voisins . Endothélines . Cholecystokinine . Gastrine . Neurokinine B (NKB) . Récepteur des tachykinines . Substance K (NKA) . Substance P (SP) . Neuropeptide Y (NPY) . Facteur de libération de la thyrotropine . Nociceptine . Bradykinine . Angiotensine II . Beta-endorphine . C5a anaphalatoxine . Calcitonine . Chemokines (également appelés intercrines) . Facteur de libération corticotrophique (CRF) . Dynorphine . Endorphine . Peptides formylés . Follitropine (FSH) . Phéromones de maturation fongique . Galanine . Récepteur du polypeptide inhibiteur gastrique (GIP) . Peptides analogues du glucagon (GLPs) . Glucagon . Hormone de libération de gonadotropine (GmRH) . Hormone de libération de l'hormone de croissance (GHRM) . Hormone diurétique d'insecte . Interleukine
Dans une forme de réalisation de l'invention, le dispositif 100 peut être préprogrammé de telle manière qu'il croit que l'adresse F1 est une adresse pour le dispositif 140. Dans ce scénario, le pare-feu 110 peut avoir connaissance lors de la réception de la transmission 210 du dispositif avec lequel il établira ensuite une
association SA secondaire, SA2, sans avoir à vérifier les détails de la transmission SA 210. Cette implémentation peut utiliser des adresses de "boucle" dans le pare-feu 110, une pour chaque homologue possible dans le réseau privé 130. En d'autres termes, il y aura une adresse différente F1 associée à chacun des dispositifs du réseau privé.
Une autre implémentation utilise une adresse IP F1 unique pour tous les flux IPsec du côté réseau WAN. Dans cette solution, le pare-feu 110 doit examiner la transmission 210 pour déterminer le dispositif du réseau privé qui sera le point terminal de tunnel pour des communications avec le dispositif 100. Cette implémentation présente l'avantage qu'un dispositif 100 peut communiquer avec une pluralité de dispositifs dans le réseau privé 130, alors que lui-même n'a besoin d'établir qu'une SA (ou plusieurs) avec le pare-feu 110 (c'est-àdire, une SA par dispositif destinataire).
Dans cette dernière implémentation, il est nécessaire de conserver un nom et une identité au dispositif 100, soit localement au niveau du pare-feu 110, soit au niveau d'un système de nom de domaine/serveur (DNS). Cette information peut être utilisée aussi pour identifier le dispositif 140 comme étant le dispositif recherché.
On remarquera que SA2 peut démarrer en utilisant un message analogue 220 lors de la réception par le pare-feu 110 du premier message SA1. Dans les différents scénarios traités ci-dessus, dans des cas où le pare-feu 110 ne
connaît pas l'identité du dispositif destinataire 140 par un des procédés définis ci-dessus, il attendra un message SA du dispositif 100 contenant une charge utile d'identification. Dans un tel cas, le pare-feu 110 devra procéder avec une négociation de phase 1 avec le dispositif 100 jusqu'à la réception de ce message.
La Fig. 2 décrit seulement soit le cas où l'identité du dispositif 140 est incluse dans le premier message 210, soit le cas où celle-ci est déjà connue par le pare-feu 110. Une limitation lorsque l'identité de destination n'est pas connue est que le pare-feu 110 ne démarrera pas la négociation de paramètres qui peuvent s'avérer être inadaptés pour le dispositif 140; une solution dans ce cas est de définir un ensemble de règles commun qui sera accepté par tous les dispositifs dans le réseau privé 130.
En supposant que le pare-feu 110 a connaissance de l'identité du dispositif 140, le pare-feu 110 peut ensuite démarrer un message SA de phase 1 secondaire 220 pour SA2, en employant une autre adresse IP F2 pour le pare-feu 110 qui appartient au réseau privé 130 et pour laquelle le dispositif 140 sera capable de répondre. Le dispositif 140 est maintenant le répondeur SA et il répondra au pare-feu 110 en utilisant un message de type PH1BA 230. En d'autres termes, le dispositif 140 recevra des paramètres associés au dispositif 100 mais ayant l'adresse F2, et répondra avec ses propres paramètres à cette adresse.
Par la suite, le pare-feu 110 répond au premier message SA 210 et fournit au dispositif 100 un message
PH1FA de réponse 240 analogue. En d'autres termes, les mêmes paramètres sont négociés entre le pare-feu 110 et le dispositif 100, comme entre le pare-feu 110 et le dispositif 140. Les deux associations SA sont donc indépendantes, mais négocieront les mêmes règles et paramètres grâce à l'enchevêtrement des messages SA.
A ce stade, le pare-feu 110 fournit ses propres paramètres d'authentification, tels que sa propre clé publique d'authentification, mais utilise l'identité du dispositif 140. Si cette vérification est faite via des certificats, alors les certificats seront définis conformément à la Fig. 6, comme cela est décrit ci-après.
On notera que les mécanismes SA entre le dispositif 100 et le pare-feu 110, d'une part, et le dispositif 140 et le pare-feu 110, d'autre part, satisfont pleinement aux règles de protocole et traitement IKE, de façon qu'aucune modification n'est requise dans les dispositifs 100 et 140, qui sont donc transparents dans cette implémentation.
Une fois la phase 1 réalisée, un canal authentifié totalement sécurisé, avec possibilité de cryptage, est établi afin de continuer avec la phase 2 SA. La phase 2 autorise la définition de paramètres pour le protocole IPsec lui-même, et utilise de manière générale le mode rapide décrit ci-dessus. Un échange de code de type Diffie-Hellman peut être réalisé afin de garantir le secret de la transmission.
En référence à ce qui précède, la méthodologie Diffie-Hellman classique autorise deux utilisateurs à
mettre en forme une clé secrète symétrique (une même clé est utilisée pour le cryptage et le décryptage) en utilisant leurs clés privées locales, une clé de DiffieHellman (DU) connue et la clé publique de l'autre dispositif (qui peut être transmise via le pare-feu 110, ou être obtenue à partir d'un certificat).
Bien qu'elle soit implémentée de manière classique pour deux utilisateurs, comme cela vient d'être décrit, cette méthodologie peut être étendue à un nombre quelconque d'utilisateurs. Conformément à cette forme de réalisation de la présente invention, une clé partagée secrète peut être développée en utilisant l'algorithme de Diffie-Hellman qui est commun à tous les dispositifs 100, 110 et 140.
Selon la variante c), on peut également améliorer l'accessibilité des groupements fonctionnels d'intérêt en les plaçant à l'extrémité d'un bras espaceur, qui peut être par exemple une chaîne de quelques atomes de carbone. Ce bras espaceur aura pu être présent directement sur les précurseurs du revêtement électro-greffé, ou bien rajouté a posteriori. Ces bras espaceurs trouvent notamment leur utilité lorsque l'objet à fixer sur le revêtement est de taille importante : la fixation d'un bras espaceur sur un revêtement électro-greffé est plus facile que celle d'un objet de taille importante, car la molécule (sonde) qui contient le bras espaceur est en général plus petite que l'objet. Elle peut donc se fixer sur la quasi-totalité des groupements fonctionnels d'intérêt accessibles du revêtement électro-greffé, et les remplacer par des groupements encore plus accessibles.
Selon ce procédé, l'électrolyse est de préférence réalisée par polarisation en conditions voltammétriques.
Le milieu organique mis en #uvre au cours de ce procédé est de
préférence choisi parmi la diméthylformamide, l'acétate d'éthyle, l'acétonitrile et le tétrahydrofurane.
Ce milieu organique peut en outre renfermer au moins un électrolyte support pouvant notamment être choisi parmi les sels d'ammoniums quaternaires tels que les perchlorates, les tosylates, les tetrafluoroborates, les hexafluorophosphates, les halogénures d'ammoniums quaternaires, le nitrate de sodium et le chlorure de sodium.
Parmi ces sels d'ammoniums quaternaires on peut en particulier citer à titre d'exemple le perchlorate de tetraéthylammonium (TEAP), le perchlorate de tetrabutylammonium (TBAP), le perchlorate de tetrapropylammonium (TPAP), le perchlorate de benzyltriméthylammonium (BTMAP).
On obtient par exemple un film de poly-méthacryloyl-succinimide sur or en réalisant 10 balayages voltammétriques de - 0,4 à-2,8 V/(Ag+/Ag) à 50 mV/s sur une surface d'or plongée dans une solution à 0,5 mol/1 de méthacryloylsuccinimide dans la DMF, en présence de 5.10-2 mol/1 de TEAP. Les fonctions succinimide sont détectées en spectroscopie infrarouge en réflexion/absorption (IRRAS) sur le film obtenu, après un rinçage de 5 minutes sous ultra-sons. Comme il est détaillé ensuite dans les exemples de réalisation, ce film greffé permet facilement l'accrochage de poly-allyl-amine, par réaction des groupements amine de la polyallyl-amine avec les groupements succinimide du poly-méthacryloyl-succinimide électro-greffé.
On observe par ailleurs qu'un film de poly-méthacryloylsuccinimide peut également être obtenu à 0,18 mol/1 dans l'acétonitrile, aussi bien sur or que sur platine.
De façon alternative, on observe la formation d'un film électrogreffé de poly-hydroxyéthyl méthacrylate (PHEMA) sur or en réalisant 10 balayages voltammétriques de + 1,0 à - 3,0 V/(Ag+/Ag) à 50 mV/s sur une surface d'or plongée dans une solution à 0,4 mol/1 d'hydroxyéthyl méthacrylate dans la DMF, en présence de 5.10-2 mol/1 de TEAP (Tétra Ethyl Ammonium Perchlorate). On pourra remarquer que ce film est obtenu avec un monomère porteur de groupements hydroxyle non protégés, alors que l'art antérieur mentionnait qu'il fallait protéger ces groupements hydroxyle pour réaliser l'électrogreffage du HEMA (voir notamment la demande de brevet EP-A-0 665.275). Comme il est détaillé dans les exemples de réalisation, ce
film de PHEMA électro-greffé réagit facilement avec des groupements diisocyanate, pour obtenir une post-fonctionnalisation de la surface, ce qui montre que la croissance des chaînes, pourtant gênée par la présence du groupement protique, n'est pas nécessaire pour obtenir des revêtements électro-greffés pouvant servir de "velcro moléculaire".
L'Invention a enfin pour objet l'utilisation du support conforme à l'Invention à titre de primaire d'adhésion ("velcro moléculaire") pour la fixation de molécules d'intérêt (molécules sondes) ou d'objets porteurs d'une fonction complémentaire.
Selon une première forme de réalisation avantageuse de cette utilisation, le support conforme à l'Invention peut être utilisé pour la fixation de protéines (avidine, anti-corps, facteurs de croissance...). Les applications potentielles concernent par exemple la réalisation de surfaces bio-actives (angioplastie, prothèses bio-actives...) favorisant l'adhésion cellulaire et éventuellement la recolonisation ; réalisation de surfaces pouvant servir au tri cellulaire sélectif (par fixation d'anti-corps spécifiques de la paroi d'une cellule donnée) ; réalisation de matrices de puces à protéines basées sur un support à plots conducteurs.