INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Tableau 6 : Caractéristiques GCIMS de la librairie des esters éthyliques 24a-i Temps de 24 Ar rétention(mn) Masse moléculaire Q o et p 23,76 ;24,73 256 24a et 24b OCH3 24e 25,19 24c "j ' 0 24d , N02 28,72 271 24e 9 17,33 244 F 24f 9 25,95 251 CN 24g 19,82 240 24h [!) 17,50 226 24i CO 1 30,12 276 24i
c/ Esters biaryliques propyliques 25a-i Le tableau 7 ci-après correspond au chromatogramme de la figure 4.
Tableau 7 : GC/MS de la librairie des esters propyliques 25a-i Temps de rétention Masse moléculaire 25 Ar en minutes Déterminée par MS 25a 25b o o et 26,42, 27,36 270 25a et 25b OCH3 25e 0-il 28,13 25c ' 0 - 25d N02 32,29 285 25e 9 19,28 25e 19,28 F 25f 9 28,96 25f 28,96 CN 22,82 252 22,82 254 25h f!) 19,53 240 25h 25i co 1 34,52 290 25i * Halogénure d'aryle et acide boronique supportés simultanément : On a greffé un acide arylboronique sur un anion afin de l'engager ensuite dans une réaction de couplage de Suzuki décrochant.
L'acide phénylboronique est greffé sur un support onium via l'anion. En effet, si l'anion X- du sel support est assez nucléophile, il va réagir avec l'acide phénylboronique en quaternarisant l'atome de bore pour donner un borate. Le nucléophile de choix est le fluorure.
Cette réaction de quaternarisation a été réalisée en solubilisant, à température ambiante, le fluorure de tétraméthylammonium dans le THF (anhydre) puis ajout de l'acide phénylboronique. Après 18 heures d'agitation à température ambiante, le précipité qui se forme est filtré puis lavé à l'éther. Le rendement en produit isolé est de l'ordre de 80%. Le suivi de cette réaction a été réalisé à l'aide de la RMN du bore et du fluore.
Le couplage de Suzuki est réalisé dans les mêmes conditions que celles décrites dans la première partie, entre l'acide 4-bromobenzoique supporté et l'acide phénylboronique supporté selon le schéma réactionnel suivant :
La réaction conduit au produit de couplage avec un excellent rendement (98% en produit isolé pur après transestérification) et une réactivité supérieure à celle observée dans le cas de l'acide phénylboronique. Le support ld est récupéré quantitativement et peut être réutilisé.
3) Couplage de Sonogashira : Un autre exemple de couplage où cette famille de supports solubles a été testée est celui de Sonogashira qui consiste en un couplage d'un halogénure d'aryle et d'un alcyne vrai.
Cette étude a été effectuée en supportant l'halogénure d'aryle sur un sel d'onium.
Dans un premier temps et afin de mettre au point les conditions optimales, on a étudié l'influence des différents paramètres sur la réaction de couplage. On a donc examiné l'effet de la température, de la nature du solvant, du catalyseur, de la base et du contreion du support ionique.
Ces différentes études ont été réalisées en utilisant l'acide 4-iodobenzoique selon le schéma réactionnel suivant : N J2 Base -NI---ro 1 01e Base / "2 O Solvant TaC 28 R Cat O "ecyclage ci R'OHI HCI 'ecyOage lAI JR'OH/HC! 1k R Distillation ou extraction 0 R'O R 29(R'=Me), 30(R'=Et) 31 (R'=Pr), 32(R'=Bu) (R = méthyle, éthyle, propyle ou butyle) 1 - Effet de la nature du solvant et de la base : Cette étude a été effectuée en opérant avec 2,5 % de catalyseur, 5 % de Cul et une température de 40 C afin de déterminer l'influence de la nature de la base et du solvant sur la réaction de couplage. On a donc fait varier la nature de la base ou le solvant :
Les différents essais réalisés à 40 C après 1 heure de réaction sont regroupés dans le tableau 8 : Tableau 8 : de Sonogashira à 40 C pendant 1 heure (influence de la base et du solvant) Taux essai base Solvant Conv.(%) 1 K2C03(s) CH3CN 57 2 N(Et)3 CH3CN 100' 3 N(Et)3 DMF 100" 4 N(Et)3 THF 75" 5 N(Et)3 Toluène 6511 6 N(Et)3 CH2Cl2 100" 7 N(Et)3 Acétone 10011 8 N(Et)3 Dioxanne 10011 9 N(Et)3 CH3CN 100" i : X = PF6 ; R = butyle ii: X = NTf2; R = pentyle L'examen du tableau 8 montre que l'emploi de la triéthylamine permet d'observer une meilleure réactivité comparée à l'utilisation du bicarbonate de potassium solide comme base (comparer les essais 1 et 2).
L'activité d'inhibition de l'angiogenèse est également désignée activité antiangiogénique. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vitro en démontrant l'inhibition à la fois de la multiplication, de la migration et de la différenciation, de cellules endothéliales par les séquences peptidiques de l'invention.
La mesure de l'inhibition de la multiplication des cellules endothéliales peut être
réalisée en cultivant des cellules endothéliales en présence de la séquence peptidique dont on souhaite évaluer l'activité. La mesure de l'inhibition de la migration des cellules endothéliales peut être réalisée en effectuant une blessure sur un tapis de cellules endothéliales et en incubant ensuite les cellules en présence de la séquence peptidique à tester. On mesure alors le nombre de cellules ayant migré sur la blessure.
La mesure de l'inhibition de la différenciation (tubulogenèse) des cellules endothéliales peut être réalisée en mesurant la longueur de tubules formés par des cellules endothéliales cultivées sur gel en présence de la séquence peptidique à tester.
Parmi les modèles classiques de mesure d'angiogenèse, on peut citer les modèles par délivrance locale comme : - l'injection sous-cutanée de Matrigel (Becton Dickinson) imprégné du composé de l'invention (Inoki et al., 2002), ou - le dépôt sur la membrane chorio-allantoïdienne de poulet d'un implant contenant un composé de l'invention (Céleri er et al., 2002).
Alternativement, le composé de l'invention peut être injecté par voie systémique (intraveineuse, intrapéritonéale, sous-cutanée) à des animaux chez qui on a créé une maladie angiogénique expérimentale. Le composé de l'invention peut aussi être injecté directement dans une tumeur. Alternativement la protéine NOV ou les fragments ou les anticorps anti-idiotypiques selon l'invention (décrits ci-après) peuvent être délivrés par une méthode de thérapie génique par voie locale ou systémique par toute méthode permettant l'expression de la protéine ou des fragments ou des anticorps antiidiotypiques selon l'invention (virus ou plasmide contenant la séquence de NOV).
Alternativement la séquence de NOV ou des fragments ou des anticorps antiidiotypiques selon l'invention peut être insérée dans un plasmide qui est transfecté dans les cellules cancéreuses (ici la mesure consiste à mesurer l'évolution de tumeurs développées à partir de cellules cancéreuses transfectées par un plasmide contenant ou non la séquence de NOV ou d'un fragment). Tous ces procédés de mesure sont notamment décrits dans l'article de Jain et al. (1997).
On désigne par activité anti-tumorale, une activité permettant d'inhiber la croissance tumorale et/ou d'induire la régression voir la disparition de tumeurs. Cette activité peut être par exemple mise en évidence in vivo en mesurant la masse de tumeurs, dont on a induit le développement chez la souris par injection de cellules tumorales, en présence et en absence d'administration de séquences peptidiques de
l'invention et/ou d'acides nucléiques exprimant les séquences peptidiques de l'invention.
Une composition pharmaceutique avantageuse selon l'invention contient, à titre de substance active, la protéine NOV ou le fragment TSP-1 susmentionné.
Une composition avantageuse selon l'invention est caractérisée en ce que l'activité d'inhibition de l'angiogenèse est mesurée selon le test de prolifération, de migration ou de différenciation, et en ce que cette activité d'inhibition correspond à un pourcentage d'inhibition compris de 20% à 100% de l'angiogenèse obtenue en présence du véhicule seul.
Les tests de prolifération, de migration et de différenciation (angiogenèse in vitro) sont décrits plus loin dans la partie expérimentale.
La présente invention concerne également une composition telle que définie cidessus, caractérisée en ce qu'elle contient à titre de substance active la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2.
Selon un mode de réalisation avantageux de la présente invention, la composition telle que définie ci-dessus est caractérisée en ce qu'elle est susceptible d'être administrée à raison d'environ 0,1à environ 20 mg/kg/jour.
La présente invention concerne également une composition telle que définie cidessus caractérisée en ce qu'elle est administrée sous forme d'un gène, d'une protéine ou d'un peptide contenant la séquence de type TSP-1(SEQ ID NO : 8).
Une composition avantageuse de l'invention est notamment administrée de préférence sous forme injectable.
Les inventeurs ont alors mis au point un modèle permettant de visualiser des expressions accrues de cette isoforme de LO (LOXL), puis ont recherché des actifs, notamment parmi des extraits végétaux ou des molécules chimiques, stimulant en particulier l'expression des ARNm codant LOXL. Les actifs sélectionnés ont été ensuite incorporés dans des formulations cosmétiques, dermo-pharmaceutiques et pharmaceutiques, en particulier, pour des applications dans la lutte contre le relâchement des tissus au cours du vieillissement, ainsi que dans l'amélioration de la qualité du tissu cicatriciel et de l'aspect des cicatrices et des vergetures.
Les inventeurs ont développé des anticorps spécifiques des formes matures de LOXL (voir les exemples 1 et 2), et ont mis en évidence de cette manière que l'absence de cette isoforme lysyl oxydase est corrélée aux troubles de la synthèse de fibres élastiques fonctionnelles notamment lors du vieillissement des tissus cutanés, qu'ils soient naturels ou induits par le rayonnement solaire.
Les isoformes LOXL2, LOXL3 et LOXL4 ne sont pas ou peu exprimées dans le derme et ne sont pas impliquées dans l'élastogenèse (voir exemple 4).
L'isoforme LOX est présente dans le derme et peut être associée aux microfibrilles, mais LOX est impliquée dans la formation des fibres de collagène fonctionnelles et n'est pas manquante dans les peaux adultes. L'absence de LOX n'est donc pas corrélée à la perte d'élasticité des fibres élastiques au cours du vieillissement (voir exemple 3).
Cette mise en évidence du rôle de LOXL dans l'élastogenèse a été cruciale pour la réalisation de la présente invention (voir exemple 5).
L'association entre LOXL et les fibres élastiques ou les microfibrilles a été clairement démontrée par microscopie électronique lors de la réalisation de la présente invention. LOXL associée aux microfibrilles constitue la trame sur laquelle se dépose l'élastine.
LOXL est l'enzyme responsable de la maturation de l'élastine par réticulation et permet donc la formation de fibres élastique fonctionnelles.
Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont mis en #uvre une méthode de localisation de l'expression de LOXL.
Notamment, cette méthode de localisation comprend l'immunodétection de LOXL. Par cette méthode on peut également mettre en évidence l'expression de la protéine élastine. De par les études des inventeurs, il a été mis en évidence que LOXL est détectée en association avec les dépôts denses ou sur les microfibrilles, mais pas avec les fibres de collagène. L'élastine a été détectée dans les mêmes dépôts denses et dans les microfibrilles. Cette détection s'est effectuée sur des modèles de peau reconstruite, et notamment sur des modèles de peau reconstruite 30 jours après l'application des kératinocytes (voir exemple 5).
L'association de LOXL aux microfibrilles et aux fibres élastiques a été également confirmée dans la peau de prépuce, notamment par microscopie électronique à transmission après immunodétection.
LOXL est exprimée dans le derme de peau de prépuce prélevé chez de jeunes patients (quelques mois) présentant encore une synthèse forte d'élastine. Mais LOXL n'est pas exprimée au niveau du derme de la peau du cou, du sein, de l'abdomen ou du visage de personnes adultes. Cette absence de détection de LOXL dans le derme de la peau, du cou, du sein, de l'abdomen, ou du visage, est confirmée chez l'adulte quel que soit l'âge. Il a été également observé une forte expression de LOXL au niveau de l'épiderme de peau humaine, cependant avec une extinction de l'expression de cette
enzyme lorsque les peaux humaines sont issues de sujets âgés d'environ 80 ans et plus (voir exemple 6).
Concernant les cicatrices, LOXL n'a pas été observée dans le derme de ces zones, ni trois mois après la cicatrice, ni cinq ans après la formation de la cicatrice.
Dans ce cadre, il faut noter que l'élastine qui était présente à trois mois, n'est plus présente sur cette zone cicatricielle cinq ans après la formation de la cicatrice.
Les inventeurs ont ainsi mis en évidence le rôle de LOXL dans la formation des fibres élastiques, notamment en utilisant des modèles de peau reconstruite ou des dermes de prépuce de jeunes patients.
Les inventeurs ont mis également en évidence le déficit d'expression de LOXL dans les zones cicatricielles, ainsi que au niveau du derme de la peau humaine à différents âges, donc au cours du vieillissement.
chronologie de déroulement d'un service (début, fin, étape déterminante...) pour prendre ou non la décision de téléchargement, cette chronologie étant généralement synchronisée avec la diffusion générale de programmes associés.
Avantageusement, le module de décision sélective d'obtention est alors prévu pour autoriser le téléchargement si ce téléchargement est destiné à être achevé avant des instants prédéfinis des services, extractibles des informations temporelles, et à interdire ce téléchargement sinon.
Ainsi, selon une première forme de prise en compte de ces informations temporelles, ces instants prédéfinis spécifient des fins de validité d'exécution des services. Dans le cas d'un service de longue durée (tel un service de type portail accessible en continu quotidiennement ou la retransmission d'un événement sportif comme un match de football), il est en effet important de télécharger le(s) plug-in(s) manquant (s) (opération prenant seulement quelques minutes) et ensuite de proposer le service au téléspectateur.
Selon une deuxième forme de prise en compte de ces informations temporelles, ces instants prédéfinis spécifient des débuts de validité d'exécution des services. Les deux formes sont avantageusement combinées, dans la mesure où une information complémentaire reçue permet de discriminer les deux cas (par exemple un indicateur spécifique sur le critère de décision, ou un renseignement sur le type de service tel que portail accessible en continu ).
Dans les cas où l'autorisation de téléchargement est tributaire des instants prédéfinis des services, le module de décision sélective d'obtention est préférentiellement capable d'acquérir des durées de téléchargement des programmes informatiques requis et non disponibles localement, et d'estimer ainsi quand ce téléchargement est destiné à être achevé. Ce mode
d'acquisition est avantageusement obtenu à partir d'informations reçues telles que les tailles des programmes informatiques, et d'informations locales telles que la bande passante disponible.
Préférentiellement, les informations associées aux services comprenant au moins un indicateur de téléchargement forcé ayant une valeur activée et une valeur désactivée, le module de décision sélective d'obtention est prévu pour forcer en autorisation le téléchargement si cet indicateur de téléchargement forcé a la valeur activée.
Plus précisément et à titre d'exemple, même lorsque télécharger le(s) plug-in(s) manquants ne permet pas d'afficher l'occurrence courante d'un service (temps de téléchargement supérieur à la durée de vie du service), il peut être malgré tout intéressant de forcer le terminal à télécharger ce(s) composant(s) manquant (s) pour l'une des raisons suivantes : - ce service interactif (une publicité de courte durée par exemple) doit être émis n fois au cours du mois et à chaque diffusion de la publicité interactive, le terminal n'a pas le temps de télécharger le plug-in ; sans la disposition ci-dessus, il ne proposerait donc jamais ce service au téléspectateur ; le mode de réalisation avec indicateur de téléchargement forcé permet de forcer le téléchargement de ce plug-in pour que le téléspectateur puisse profiter des n-1 diffusions restantes de la publicité ; - ce plug-in est tellement répandu qu'il est incontournable ; ce cas, le mode de réalisation avec indicateur de téléchargement forcé permet de forcer tous les terminaux du parc à l'acquérir, même s'il ne peut pas être utilisé par le service proposé à cet instant.
Dans ces deux cas, on prévoit que les plug-ins téléchargés soient sauvés de manière permanente, c'est à dire qu'ils soient installés en mémoire Flash ou sur disque dur.
Préférentiellement, et de manière générale, le dispositif de décision conditionnelle d'exécution de l'invention comprend aussi un module d'acquisition de tailles des programmes informatiques requis et non disponibles localement et le module de décision sélective d'obtention est capable d'autoriser et d'interdire le téléchargement aussi en fonction de ces tailles.
Une première forme d'exploitation de ces tailles a déjà été mentionnée plus haut : le module de décision sélective d'obtention est prévu pour évaluer des durées de téléchargement des programmes informatiques requis et non disponibles localement en fonction de ces tailles et de capacités de réception locales des programmes informatiques, et pour autoriser le téléchargement lorsque ce dernier permet une exécution ultérieure au moins partielle des services.
Selon une deuxième forme d'exploitation de ces tailles (pouvant être combinée avec la première), le module de décision peut décider de ne pas autoriser le téléchargement bien que les informations arrivent longtemps avant le contenu d'un service associé, du fait de ressources trop limitées du récepteur au regard de la taille d'un des programmes informatiques requis.
Cette limitation des ressources peut être inhérente au récepteur (modem trop lent, espace disque ou plus généralement de stockage trop restreint) ou résulter du mode d'exploitation de récepteur (bande passante devant rester disponible essentiellement pour d'autres types de réceptions, et ne laissant libres par exemple que 10 %).
L'invention concerne aussi un procédé de décision conditionnelle d'exécution de services reçus via un réseau de communications, correspondant au dispositif de décision conditionnelle de l'invention, et préférentiellement destiné à être mis en #uvre au moyen d'un tel dispositif selon l'une quelconque de ses modalités de réalisation.
L'invention porte également sur un dispositif de constitution de messages d'informations associées à des services, ces messages étant destinés à être diffusés à des utilisateurs avant des exécutions des services associés. Ce dispositif comprend des moyens d'incorporation dans les messages, de renseignements relatifs à des programmes informatiques requis pour l'exécution de ces services.
Selon l'invention, les moyens d'incorporation sont prévus pour inclure dans ces renseignements au moins un indicateur de téléchargement forcé ayant une valeur activée et une valeur désactivée, cet indicateur étant destiné à forcer une autorisation de téléchargement des programmes informatiques requis si l'indicateur a la valeur activée.
La présente invention concerne également l'utilisation : - d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : * la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, ou * un fragment de cette protéine, sous réserve que ce fragment présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ledit fragment comprenant notamment d'environ 40 à environ 80 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences suivantes SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 10, ou * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, notamment par substitution, suppression ou addition d'un
ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 80%, et notamment 85%, avec la région comprise entre les acides aminés en position (33) et (338) de la séquence SEQ ID NO :2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'inhibition de l' angiogenèse, - d'une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant : * soit pour la protéine NOV telle que définie ci-dessus, * soit pour un fragment de la protéine NOV tel que défini ci-dessus, * soit pour une séquence dérivée de la protéine NOV telle que définie ci- dessus, * soit pour une séquence homologue de la protéine NOV telle que définie ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour SEQ ID NO : 2, ou à la séquence SEQ ID NO : 3 codant pour SEQ ID NO : 4, ou à la séquence SEQ ID NO : 5 codant pour SEQ ID NO : 6, ou à la séquence SEQ ID NO : 7 codant pour SEQ ID NO : 8, ou à la séquence SEQ ID NO : 9 codant pour SEQ ID NO : 10, - d'un anticorps anti-idiotypique de la protéine NOV, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de la prolifération endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : les cancers, la dégénérescence maculaire liée à l'âge, les rétinopathies diabétiques, la polyarthrite rhumatoïde, les angiomes, les angiosarcomes, en particulier la maladie de Castelman et le sarcome de Kaposi.
L'expression "inhibition de la prolifération endothéliale" désigne toute substance capable de freiner la prolifération de cellules endothéliales selon le test décrit plus loin (partie expérimentale).
La présente invention concerne également l'utilisation - d'une protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par : * la protéine NOV, représentée par la séquence SEQ ID NO : 2, ou * un fragment de cette protéine, sous réserve que ce fragment présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ledit fragment comprenant notamment d'environ 40 à environ 80 acides aminés, et étant notamment représenté par l'une des séquences suivantes SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8 ou SEQ ID NO : 10, ou * toute séquence dérivée de la séquence SEQ ID NO : 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, notamment par substitution, suppression ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que cette séquence dérivée présente une activité d'inhibition de l'angiogenèse, ou * toute séquence homologue de la séquence SEQ ID NO: 2 ou d'un fragment défini ci-dessous, ayant de préférence une homologie d'au moins environ 80%, et notamment 85%, avec la région comprise entre les acides aminés en position (33) et (338) de la séquence SEQ ID NO :2, sous réserve que cette séquence homologue présente une activité d'inhibition de l' angiogenèse, - d'une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par une séquence nucléotidique codant : * soit pour la protéine NOV telle que définie ci-dessus, * soit pour un fragment de la protéine NOV tel que défini ci-dessus, * soit pour une séquence dérivée de la protéine NOV telle que définie ci- dessus, * soit pour une séquence homologue de la protéine NOV telle que définie ci-dessus, ladite séquence nucléotidique correspondant notamment à la séquence nucléotidique SEQ ID NO : 1 codant pour SEQ ID NO : 2, ou à la séquence SEQ ID NO : 3 codant pour SEQ ID NO :4, ou à la séquence SEQ ID NO : 5 codant pour SEQ ID NO : 6, ou à la séquence SEQ ID NO : 7 codant pour SEQ ID NO : 8, ou à la séquence SEQ ID NO : 9 codant pour SEQ ID NO : 10, - d'un anticorps anti-idiotypique de la protéine NOV,
pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de pathologies nécessitant l'inhibition de l'activation endothéliale, notamment dans le cadre des pathologies suivantes : le rejet d'allogreffe et de xénogreffe, les acrocyanoses, les sclérodermies, ou dans le cadre de la préparation de greffons entre le prélèvement et la transplantation.
L'expression "activation endothéliale" correspond à toute pathologie impliquant des cellules endothéliales soumises à une concentration accrue en VEGF par rapport à l'état non pathologique.
DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 correspond à la liaison de la forme iodée du VEGF165 sur la protéine NOV.