INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
On utilise de préférence des tensioactifs permettant l'obtention d'émulsion huiledans-eau ou cire-dans-eau.
Une émulsion peut être préparée à partir d'une combinaison adéquate de liquides non miscibles. De préférence, l'émulsion présente un milieu aqueux dans les gouttes formées et un
liquide non miscible hydrophobe (une huile) comme matrice dans laquelle les gouttes sont suspendues. Ce type d'émulsion présente l'avantage que la phase aqueuse contenant les composants biochimiques est compartimentée dans des gouttes séparées. La phase externe (huile hydrophobe) ne contient aucun composant biochimique et est inerte. Les microcapsules aqueuses sont compatibles avec des procédés biochimiques complexes tels que la transcription et la traduction.
L'émulsion peut être stabilisée par un ou plusieurs surfactants. Ces surfactants sont appelés agents émulsifiants et agissent sur l'interface eau/huile pour éviter la séparation des deux phases en deux phases uniques. Une grande variété d'huiles et d'émulsifiants peuvent être utilisés pour la préparation d'émulsion. L'huile préférée est l'huile minérale (Sigma ; ref M-3516). Les émulsifiants adéquats comprennent le monooléate de sorbitan (Span 80, Fluka ; ref 85548) ou de polyoxyethylenesorbitan (Tween 80, Sigma Ultra ; ref P-8074). Par exemple, le mélange initial comprend l'huile minérale avec 4,5 % de Span 80 (vol/vol) et 0,5 % de Tween 80 (vol/vol).
L'utilisation de surfactants anioniques peut être bénéfique. Les surfactants adéquats incluent le cholate de sodium et le taurocholate de sodium, de préférence le desoxycholate de sodium (Fluka ; ref 30970). L'ajout de ces surfactants peut parfois augmenter l'expression et/ou l'activité des enzymes. L'addition de surfactants anioniques à un mélange non-émulsifié abolit complètement la traduction. Pendant l'émulsification, le surfactant est transféré de la phase aqueuse vers l'interface et l'activité est restaurée. L'addition de surfactant anionique au mélange assure que la réaction ne commence pas avant la compartimentation.
La création d'une émulsion nécessite généralement l'application d'une énergie mécanique pour forcer les phases à se mélanger. De nombreux outils mécaniques peuvent être utilisés, par exemple agitateur, homogénisateur, réducteur colloïdal, sonicateur, outil d'émulsification de membrane. De préférence, l'émulsion est préparée à l'aide d'un agitateur magnétique. Par exemple, on peut utiliser une constante d'agitation de 1150 rpm.
La taille préférée des compartiments varie selon la taille de la banque et la concentration nécessaire des composés dans le compartiment pour effectuer l'expression et la réaction de clivage du substrat ADN. De préférence, le volume moyen des compartiments est inférieur à 5,2 10-16 m3 (diamètre inférieur à 10 m), plus particulièrement inférieur à 6,5 10-17 m3 (diamètre inférieur à 5 m). De préférence, les compartiments présentent un volume d'environ 4 à 9 10-18m3 (diamètre d'environ 2 à 2,6 m).
La taille des compartiments peut être changée simplement par contrôle des conditions d'émulsification utilisées. Plus le compartiment est grand, plus le volume nécessaire pour compartimenter le substrat ADN est grand. Le rapport phase aqueuse/phase huile est, par exemple, 1/19.
Le procédé de compartimentation doit être adapté de telle sorte que chaque compartiment doit contenir une molécule de substrat ADN ou moins. Eventuellement, si la banque de séquences codantes pour une endonucléase est très large ou trop complexe pour avoir une molécule de substrat ADN par compartiment, plusieurs substrats ADN peuvent être contenus dans un même compartiment lors d'un premier tour de sélection.
L'émulsion peut être rompue par divers moyens connus de l'homme du métier. De préférence, elle est rompue par centrifugation (par exemple 3000 G pendant 5 min) suivie d'une extraction. Cette extraction peut être faite par l'éther, par phénol/choloroforme ou par huile minérale pure. Ces méthodes sont bien connues de l'homme du métier.
Plus précisément, après la première centrifugation, la phase huile est enlevée. Un mélange éther/eau, de préférence éther/tampon Tris NaCl (rapport 10/1 par exemple), est ajouté. Le mélange est agité puis centrifugé. La phase éther est enlevée. Une deuxième extraction par l'éther peut éventuellement être faite. Facultativement, le culot est évaporé par speed vac.
Dans une autre alternative, après la première centrifugation, un grand volume d'huile minérale pure est ajouté. Le mélange est agité puis centrifugé. Ce procédé est moins violent. Il permet d'extraire les surfactants/émulsifiant jusqu'à ce que les microcapsules fusionnent en une unique phase aqueuse.
SELECTION D'ENDONUCLEASES L'invention concerne une méthode de sélection des endonucléases capables de couper un site de coupure donné parmi une banque de séquences codantes pour des endonucléases, ladite méthode de sélection étant basée sur la méthode d'observation de l'activité d'une endonucléase selon la présente invention en combinaison de la compartimentation. Une méthode de sélection selon la présente invention est illustrée dans la FIGURE 6.
Dans un premier temps, une banque de substrats ADN présentant au moins deux sites de coupure encadrant une cassette d'expression pour une endonucléase de la banque est préparée. La banque de substrats ADN peut être préparé par amplification par PCR en utilisant deux amorces contenant le site de coupure à tester. La première amorce contient une séquence lui permettant de s'hybrider en amont de la séquence codante pour l'endonucléase. La deuxième amorce s'hybride en aval de la séquence codante. Les méthodes d'obtention de ce substrat ont été décrites plus en détail ci-dessus. De préférence, le substrat ADN comprend deux sites de coupure placés aux extrémités de ce substrat. Ces sites sont de préférence identiques et présentent une orientation inverse. Cette structure de substrat permet de régénérer facilement le substrat ADN par amplification par PCR après un premier tour de sélection.
Une émulsion est ensuite préparée de telle sorte que chaque compartiment comprenne une molécule de substrat et les composants nécessaires pour la transcription/traduction couplée in
vitro. De préférence, la préparation de l'émulsion est faite dans des conditions ne permettant pas la production de l'endonucléase lors de cette phase de préparation. Par exemple, elle est maintenue à basse température. Par exemple, l'émulsion est préparée en ajoutant graduellement 50 l de mélange comprenant lesdits substrats ADN et un extrait de transcription/traduction in vitro à 950 l du mélange huile/émulsifiants froid sous une agitation constante de 1150 rpm.
L'endonucléase à tester est produite au sein du compartiment par transcription/traduction couplée in vitro et peut agir sur le substrat. Les conditions d'expression doivent de préférence permettre l'activité des endonculéases. Les compartiments de l'émulsion sont ensuite rompus et les endonucléases sont inactivées. Les substrats ADN sont ensuite purifiés. L'ensemble des substrats ADN est soumis à l'étape de discrimination. La discrimination peut être faite par séparation physique des deux types de substrats, par dégradation du substrat non coupé, par amplification sélective des substrats coupés aux deux sites, ou une combinaison de ces méthodes. Les substrats ADN présentant deux sites coupés peuvent être détectés directement ou après amplification par PCR. Cependant, dans le cas où plusieurs cycles de sélection doivent se succéder, ces substrats ADN présentant deux sites coupés sont amplifiés par PCR de manière à régénérer les substrats originaux. Pour cela, les amorces contiennent la séquence du demi-site absent ainsi que la séquence du demi-site restant sur le substrat ADN coupé.
Les ordinateurs clients 12 peuvent être des ordinateurs personnels classiques, des postes de travail ou des systèmes d'ordinateurs de toute autre dimension. Chaque client 12 comporte par exemple un ou plusieurs processeurs, des mémoires, des dispositifs d'entrée-sortie et une interface de réseau, par exemple un modem classique ou une carte d'interface avec le réseau. Les serveurs 14 de toile d'annonceur, le serveur 22 de gestion de comptes et le serveur 24 de toile de moteur de recherche peuvent avoir une
configuration semblable. Cependant, les serveurs 14 de toile d'annonceur, le serveur 22 de gestion de comptes et le serveur 24 de toile de moteur de recherche peuvent comprendre chacun de nombreux ordinateurs connectés par un réseau privé séparé. En fait, le réseau 20 peut comprendre des centaines de milliers de réseaux individuels d'ordinateurs.
Des ordinateurs clients 12 peuvent exécuter des programmes 16 de navigation sur la toile, tels que les programmes de navigation "Netscape Navigator", "Microsoft Internet Explorer" ou "Mosaic", pour localiser les enregistrements ou pages 30 de la toile conservés sur le serveur 14 de l'annonceur. Les programmes 16 de navigateur permettent aux utilisateurs de saisir les adresses de pages spécifiques 30 de la toile qui doivent être récupérées. Ces adresses sont appelées adresses de localisation uniformes de ressource URL. En outre, lorsqu'une page a été récupérée, les programmes de navigation 16 peuvent donner accès à d'autres pages ou enregistrements lorsque l'utilisateur clique sur des hyperliens vers d'autres pages de la toile. Ces hyperliens sont placés dans les pages 30 de la toile et constituent un moyen automatique pour l'utilisateur de passer à l'adresse URL d'une autre page et de récupérer cette page. Les pages peuvent être des enregistrements de données qui comprennent des informations sous forme de textes ordinaires ou un contenu multimédia codé numériquement plus complexe, tel que des logiciels, des graphiques, des signaux d'audiofréquences, des séquences vidéo, etc.
Les ordinateurs clients 12 du mode de réalisation représenté comportent un outil 100 de gestion d'enchères. On décrit plus en détail dans la suite la mise en oeuvre de l'outil 100 de gestion d'enchères en référence à la figure 2.
Dans un premier mode de réalisation, les ordinateurs clients 12 exploitent chacun une interface XML 15. L'interface XML 15 comporte un code de programme ayant une configuration permettant la communication avec une interface XML complémentaire 17 du serveur 22 de gestion de comptes
suivant un schéma XML établi, compris par les utilisateurs de logiciels clients et l'opérateur du marché en ligne. Des exemples de tels schémas sont indiqués dans les annexes C et D mais il faut noter que ces schémas ne sont que des exemples et ne limitent aucunement les schémas disponibles pour la mise en oeuvre de l'invention. Comme décrit dans la suite, le serveur 22 de gestion de comptes mémorise les informations relatives au compte de chaque annonceur. Les ordinateurs clients 12 peuvent avoir accès à ces informations et peuvent la remettre à jour avec l'interface XML 15 en communication avec l'interface XML 17 du serveur 22 de gestion de comptes. Un ordinateur client peut être exploité par un annonceur qui gère les listages de recherche d'annonceur. Dans une variante, l'ordinateur client peut être utilisé par un tiers qui gère les listages d'un ou plusieurs annonceurs. Dans ce mode de réalisation, les ordinateurs clients 12 n'interagissent pas avec le serveur 22 de gestion de comptes avec un programme de navigation mais plutôt avec l'interface XML 15. Un individu exploitant un ordinateur client 12 peut activer un programme de navigation, mais la communication réelle des données est commandée par l'interface XML 15.
Dans un mode de réalisation de l'invention illustré sur la figure 1, les ordinateurs clients 12 communiquent par le réseau 20 avec divers fournisseurs d'informations du réseau, y compris le serveur 22 de gestion de comptes, le serveur 24 à moteur de recherche et des serveurs 14 d'annonceur, avec les fonctionnalités données par le protocole de transfert d'hypertexte HTTP, bien que d'autres protocoles de communication, tels que FTP, SNMP, TELNET et un certain nombre d'autres connus puissent être utilisés. De préférence, le serveur 24 de moteur de recherche, le serveur 22 de gestion de compte et les serveurs 14 d'annonceur sont placés dans le réseau Internet ou accessibles par ce réseau.
Comme décrit précédemment, deux types de serveurs au moins sont mis en oeuvre dans un mode d'exécution du système et du procédé selon l'invention. Le premier serveur envisagé est le serveur 22 de gestion de comptes. Ce serveur 22
comporte un support 32 de mémorisation d'ordinateur et un système 34 de traitement. Ce serveur 22 comprend aussi toute une variété de codes de programme, y compris l'interface XML 17. Ces codes de programme sont mémorisés sur un ou plusieurs supports de mémorisation de programme lisibles par ordinateur du serveur 22, par exemple le support de mémorisation 32.
Une base de données 38 est aussi conservée sur le support de mémorisation 32 du serveur 22 de gestion de comptes. La base de données 38 contient des informations de compte d'annonceur. Des informations de compte conservées dans la base de données 38 comprennent des informations relatives aux listages de recherche de chaque annonceur participant au marché en ligne établi par le système distribué 10. Ces informations comprennent des termes de recherche, des enchères, des titres et descriptions de listages de recherche et des adresses URL associées ainsi que d'autres informations comme décrit dans la suite plus en détail. En outre, des informations de compte comprennent des informations produites par le fonctionnement du système de marché, par exemple le rang actuel et l'enchère actuelle de chaque listage de recherche, le nombre de clics enregistrés pour les listages de recherche, une fréquence calculée de clics (CTR) et le solde du compte de l'annonceur.
Il faut noter d'après la description qui suit que le système et le procédé considéré peuvent être exploités avec un ou plusieurs codes de programme qui sont mémorisés sous forme d'instructions exécutables sur un support d'enregistrement d'ordinateur, tel que des mémoires ou des dispositifs de mémorisation de masse, sur le serveur 22 de gestion de comptes. L'interface XML 15 ou un programme classique de navigation 16 exécuté sur les ordinateurs clients 12 peuvent être utilisés pour l'accès aux informations de compte d'annonceur conservées sur le serveur 22. De préférence, l'accès au serveur 22 est réalisé à travers un pare-feu, non représenté, qui protège le programmes de gestion de compte et de mise en place des résultats de la recherche ainsi que les informations de compte contre la
falsification depuis l'extérieur. Une sécurité supplémentaire peut être donnée par renforcement des protocoles classiques de communication, tels que "Secure HTTP" ou "Secure Sockets Layer".
Le second type de serveur envisagé est un serveur 24 de toile de moteur de recherche. Un programme de moteur de recherche permet aux utilisateurs du réseau, par navigation à l'adresse URL d'un serveur de toile à moteur de recherche ou à des sites d'autres serveurs de toile qui peuvent soumettre des requêtes aux serveurs 24 de toile à moteur de recherche par l'intermédiaire de leur navigateur 16, de saisir des requêtes à mots-clés pour identifier des pages intéressantes parmi les milliards de pages disponibles sur Internet. Dans un mode de réalisation préféré de l'inven- tion, le serveur 24 de toile à moteur de recherche crée une liste de résultats de recherche qui contient au moins en partie des inscriptions concernées obtenues et formatées à l'aide des résultats du processus d'enchères exécuté par le serveur 22 de gestion de comptes. Le serveur 24 de toile à moteur de recherche crée une liste de liens hypertextes vers des documents contenant l'information concernant les termes de recherche saisis par l'utilisateur sur l'ordinateur 12 du client. Le serveur 24 de toile à moteur de recherche transmet cette liste sous forme d'une page web à l'utilisateur du réseau et elle est affichée sur le navigateur 16 exécuté sur l'ordinateur client 12. Un exemple de serveur de toile 24 à moteur de recherche peut être trouvé par navigation à la page de toile à l'adresse URL http://www.overture.com/.
Le serveur 24 de toile à moteur de recherche est connecté au réseau Internet 20. Dans un mode de réalisation, ce serveur 24 comporte une base de données 40 de recherche qui comprend des enregistrements de listage de recherche utilisés pour la création des résultats de recherche en fonction des requêtes des utilisateurs. En outre, le serveur 24 peut aussi être connecté au serveur 22 de gestion de comptes. Ce serveur 22 peut aussi être connecté à Internet.
Les serveurs 24 et 22 selon l'invention correspondent à des
besoins différents d'informations des utilisateurs exploitant les ordinateurs clients 12.
Exemple4 : L'extrait de pulpe d'Astrocaryum vulgare préparé dans les conditions de l'exemple 1 a été testé en administration par voie orale pour évaluer son activité anti-inflammatoire. Le test choisi est celui de l'#dème à la carragénine.
La carragénine (0,05 ml à 1% dans NaCl à 0,9%) est injectée dans le coussinet plantaire de la patte postérieure droite du rat, une heure après administration orale des substances à tester.
Cette injection a été effectuée sur sept lots de rats. Chaque lot est composé de six à douze rats de type wistar mâle.
Les cinq premiers lots reçoivent la fraction insaponifiable, de l'huile extraite des pulpes de fruits d'Awara Astrocaryum vulgare , aux doses de 5,10, 50,100 et 200 mg/Kg.
Un lot d'animaux témoins sert de contrôle et reçoit l'excipient (Tween 80 à 2% dans NaCl à 0,9%). Le dernier lot, recevant de l'indometacine à la dose de 25 mg/Kg, qui sert de référence.
Pour chaque dose de substance, les concentrations de suspensions utilisées sont ajustées de manière à administrer exactement lml par 100g de poids corporel. Une précaution supplémentaire s'impose : cette injection est complétée par de l'eau ordinaire jusqu'à un volume total de 5 ml. Ce qui assure une hydratation uniforme chez tous les rats et minimise les variations individuelles de réponse à l'#dème des pattes.
Les mesures pléthysmographiques sont faites à 1h, 2h, 3h, 4h, 5h, 6h et 7h, dans les conditions des exemples précédents, après l'administration de la carragénine. La patte gauche non traitée sert de témoin.
Le volume de l'oedème est calculé à l'aide de pléthysmomètre de LENCE, appareil servant à la lecture de l'#dème.
Pour chaque groupe et pour chaque animal, le volume de l'oedème est calculé. Il est exprimé en pourcentage d'augmentation du volume de la patte par rapport à la mesure faite sur la patte non traitée.
L'oedème moyen de chaque groupe est calculé, ainsi que l'écart type. Il est comparé à celui du groupe témoin statistiquement au seuil de probabilité P = 0. 05 par le test t de Student référencé précédemment.
L'activité anti-inflammatoire est calculée en pourcentage de réduction de l'#dème chez les rats traités par rapport aux témoins.
L'extrait de pulpe d'Astrocaryum vulgare présente une activité anti-inflammatoire marquée lorsqu'il est administré oralement, comme le montre les résultats visualisés dans le tableau suivant :
lh 2h 3h 4h 5h 6h 7h Indométacine 24.57 48.7 78.6 82. 21 60. 63 58. 31 56. 45 25 mg/Kg Extrait 32.41 43.51 56. 61 59.61 58. 42 56. 62 50. 98 5 mg/Kg Extrait 29. 51 46. 61 49. 00 58.32 56. 97 56.32 54. 27 10 mg/Kg Extrait 30.23 42.00 60. 65 63. 45 56. 23 55. 59 55. 28 50 mg/Kg Extrait 32. 14 47. 57 60.38 74. 7 64. 67 60. 16 55. 26 lOOmg/Kg Extrait : 29.6 41. 76 61.25 76.18 70. 51 61.32 55. 45 20mg/Kg Pourcentage de réduction de l'oedème (%) par l'extrait de pulpe d'Astrocaryum vulgare administré par voie orale
Exemple 5 L'extrait de l'amande d'Astrocaryum vulgare a été testé en administration par voie orale pour évaluer son activité antiinflammatoire. Le test choisi est celui de l'oedème à la carragénine.
Le protocole expérimental adopté pour cette étude est identique à celui décrit dans l'exemple 4.
Les polyuréthanes peuvent être choisis parmi les polyuréthanes anioniques, cationiques, non-ioniques ou amphotères, les polyuréthanes-acryliques, les polyuréthanes-polyvinylpirrolidones, les polyester-polyuréthanes, les polyétherpolyuréthanes, les polyurées, les polyurée-polyuréthanes, et leurs mélanges.
L'acide dicarboxylique peut être aliphatique, alicyclique ou aromatique. On peut citer comme exemple de tels acides : l'acide oxalique, l'acide malonique, l'acide diméthylmalonique, l'acide succinique, l'acide glutarique, l'acide adipique, l'acide pimélique, l'acide 2,2-diméthylglutarique, l'acide azélaïque, l'acide subérique, l'acide sébacique, l'acide fumarique, l'acide maléique, l'acide itaconique, l'acide phtalique, l'acide dodécanedioïque, l'acide 1,3-cyclohexanedicarboxylique, l'acide 1,4-cyclohexanedicarboxylique, l'acide isophtalique, l'acide téréphtalique, l'acide 2,5-norbornane dicarboxylique, l'acide diglycolique, l'acide thiodipropionique, l'acide 2,5-naphtalènedicarboxylique, l'acide 2,6-naphtalènedicarboxylique. Ces monomères acide dicarboxylique peuvent être utilisés seuls ou en combinaison d'au moins deux monomères acide dicarboxylique. Parmi ces monomères, on choisit préférentiellement l'acide phtalique, l'acide isophtalique, l'acide téréphtalique.
Le diol peut être choisi parmi les diols aliphatiques, alicycliques, aromatiques. On utilise de préférence un diol choisi parmi : l'éthylène glycol, le diéthylène glycol, le
triéthylène glycol, le 1,3-propanediol, le cyclohexane diméthanol, le 4-butanediol. Comme autres polyols, on peut utiliser le glycérol, le pentaérythritol, le sorbitol, le triméthylol propane.
Le noyau aromatique du monomère aromatique bifonctionnel portant en outre un groupement -S03M tel que décrit ci-dessus peut être choisi par exemple parmi les noyaux benzène, naphtalène, anthracène, diphényl, oxydiphényl, sulfonyldiphényl, méthylènediphényl. On peut citer comme exemple de monomère aromatique bifonctionnel portant en outre un groupement -S03M : l'acide sulfoisophtalique, l'acide sulfotéréphtalique, l'acide sulfophtalique, l'acide 4-sulfonaphtalène-2,7dicarboxylique.
Selon un premier mode de réalisation de la composition selon l'invention, le polymère filmogène peut être un polymère hydrosoluble et peut être présent dans une phase aqueuse de la composition ; le polymère est dons solubilisé dans la phase aqueuse de la composition. Comme exemples de polymères filmogènes hydrosolubles, on peut citer : - les protéines comme les protéines d'origine végétale telles que les protéines de blé, de soja ;les protéines d'origine animale tels que les kératines, par exemples les hydrolysats de kératine et les kératines sulfoniques ; - les polymères de cellulose tels que l'hydroxyéthylcellulose, l'hydroxypropylcellulose, la méthylcellulose, l'éthylhydroxyéthylcellulose, la carboxyméthylcellulose, ainsi que les dérivés quatemisés de la cellulose ;
- les polymères ou copolymères acryliques, tels que les polyacrylates ou les polyméthacrylates ; - les polymères vinyliques, comme les polyvinylpyrrolidones, les copolymères de l'éther méthylvinylique et de l'anhydride malique, le copolymère de l'acétate de vinyle et de l'acide crotonique, les copolymères de vinylpyrrolidone et d'acétate de vinyle ; les copolymères de vinylpyrrolidone et de caprolactame ; l'alcool polyvinylique ; - les polymères d'origine naturelle, éventuellement modifiés, tels que : . les gommes arabiques, la gomme de guar, les dérivés du xanthane, la gomme de karaya ; . les alginates et les carraghénanes ; . les glycoaminoglycanes, l'acide hyaluronique et ses dérivés ; . la résine shellac, la gomme de sandaraque, les dammars, les élémis, les copals ; . l'acide désoxyribonucléïque ; . les muccopolysaccharides tels les chondroïtines sulfate, et leurs mélanges.
Selon une autre variante de réalisation de la composition selon l'invention, le polymère filmogène peut être un polymère solubilisé dans une phase grasse liquide comprenant des huiles ou solvants organiques tels que ceux décrits précédemment (on dit alors que le polymère filmogène est un polymère liposoluble). Par "phase grasse liquide", on entend, au sens de l'invention, une phase grasse liquide à température ambiante (25 C) et pression atmosphérique (760 mm de Hg, soit 105 Pa), composée d'un ou plusieurs corps gras liquides à température ambiante, appelés aussi huiles, généralement compatibles entre eux.