INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Exemple 13 : Caractérisation biochimique de l'hétérocomplexe KLHIFNa 1. Antigénicité Le complexe KLH-IFNa humain présente une antigénicité identique à l'antigénicité de l'IFNa humain.
2. Estimation du porcentage des molécules d'antigène d'intérêt liées à la molécule protéique porteuse par une liaison covalente.
La préparation KLH-IFNa a été passée sur une colonne superdex S200 selon les conditions décrites plus haut. Le pic sorti dans le volume d'exclusion a été collecté, dialysé puis lyophilisé. La concentration en antigène d'intérêt a été déterminée par la technique d'ELISA indirecte. La quantité d'IFNa retrouvée dans le volume exclu est de 30 g alors que 1000 g d'IFN ont été utilisés pour préparer le produit immunogène, sans perte mesurable d'antigène durant le procédé de préparation. Le pourcentage de molécules d'antigène d'intérêt liées à la molécule KLH par une liaison covalente dans le produit immunogène comprenant des hétérocomplexes KLH-IFNa peut donc être estimé à environ 3 % Exemple 14 : Caractérisation biochimique de l'hétérocomplexe gp160IFNa 1. Antigénicité Le complexe gp160-IFNahumain présente une antigénicité identique à l'antigénicité de la protéine gp160 ainsi qu'à celle de l'IFNa humain.
La figure 4 montre que l'hétérocomplexe gp160-IFNahumain migre sous la forme d'une seule bande à un pl qui est très différent du pl de la protéine gp160 recombinante le constituant. Le pl de cet hétérocomplexe est légèrement inférieur à celui de l'IFNa.
Exemple 15 : Caractérisation biochimique de l'hétérocomplexe gel 60Tat toxoide 1. Antigénicité
Le complexe gp160-Tat Toxoid présente une antigénicité identique à l'antigénicité de la protéine gp160 et à celle de la protéine Tat.
Exemple 16 : Caractérisation biochimique de l'hétérocomplexe gp160Tat GM 1-Antiqénicité Le complexe gp160-Tat GM présente une antigénicité identique à l'antigénicité de la protéine gp160 et à celle de la protéine Tat.
Exemples d'activité immunogénique des hétérocomplexes Exempte 17 : Activité immunogénique de l'hétérocomplexe KLH-VEGF murin A, Matériel et méthodes L'activité immunogénique (humorale) de la préparation KLH-VEGF murin par rapport à celle du VEGF murin a été étudiée chez la souris balb c de 18-20 g.
1-immunisation Au jour 0,7, 14,21 un groupe de 8 souris reçoit une injection de 0.1 ml (10 g) d'une émulsion en AIF par voie intramusculaire. Une injection de rappel de 5 g en AIF est donnée à J60.
Un prélèvement sanguin au niveau rétro-orbital est effectué sur chaque souris avant la première injection à j-2 3 souris contrôles reçoivent les mêmes préparations sans immunogène.
2-toxicité La toxicité anormale est recherchée chez 3 souris recevant 1 dose humaine (50 g) selon la pharmacopée.
L'absence d'immunotoxicité de l'hétérocomplexe est évaluée in vitro par un test de prolifération cellulaire réalisé sur des PBMCs cultivées en présence du complexe et stimulées par du PPD ou du Tétanos toxoïde.
B. Résultats : 1. Absence de toxicité de l'hétérocomplexe in vivo et in vitro Les souris immunisées aussi bien par la préparation de KLH-VEGF murin que par le VEGF murin uniquement ne présentent aucun signe clinique et aucune lésion anatomique. Le test d'immunosuppression montre que des doses de 100 ng/ml à 1 g/ml de KLH-VEGF murin ne diminuent pas la prolifération des lymphocytes.
Le milieu de la composition approprié pour la teinture, est de préférence un milieu aqueux constitué par de l'eau et peut avantageusement contenir des solvants organiques acceptables sur le plan cosmétique, dont plus particulièrement, des alcools tels que l'alcool éthylique, l' alcool isopropylique, l'alcool benzylique, et l'alcool phényléthylique, ou des polyols ou éthers de polyols tels que, par exemple, les éthers monométhylique, monoéthylique et monobutylique d' éthylèneglycol, le propylèneglycol ou ses éthers tels que, par exemple, le monométhyléther de propylèneglycol, le butylèneglycol, le dipropylèneglycol ainsi que les alkyléthers de diéthylèneglycol comme par exemple, le monoéthyléther ou le monobutyléther du diéthylèneglycol.
La composition (A) peut encore comprendre une quantité efficace d'autres agents, par ailleurs antérieurement connus en coloration d'oxydation, tels que divers adjuvants usuels comme des séquestrants tel que l'EDTA et l'acide étidronique, des filtres UV, des cires, des silicones volatiles ou non, cycliques ou linéaires ou ramifiées, organomodifiées (notamment par des groupements amines) ou non, des conservateurs, des céramides, des pseudocéramides, des huiles végétales, minérales ou de synthèse, les vitamines ou provitamines comme le panthénol.
Ladite composition peut également comprendre des agents réducteurs ou antioxydants. Ceux-ci peuvent être choisis en particulier parmi le sulfite de sodium, l'acide thioglycolique, l'acide thiolactique, le bisulfite de sodium, l'acide déhydroascorbique, l'hydroquinone, la 2méthyl-hydroquinone, la ter-butyl-hydroquinone et l'acide homogentisique, et ils sont alors généralement présents dans des quantités allant d'environ 0,05 à 1,5% en poids par rapport au poids total de la composition.
Dans la composition prête à l'emploi ou dans la composition (B), l'agent oxydant est choisi de préférence parmi le peroxyde d'urée, les bromates ou ferricyanures de métaux alcalins, les persels tels que les perborates et les persulfates. L'utilisation du peroxyde d'hydrogène est particulièrement préférée. Cet agent oxydant est avantageusement
constitué par une solution d'eau oxygénée dont le titre peut varier, plus particulièrement, d'environ 1 à 40 volumes, et encore plus préférentiellement d'environ 5 à 40.
Le pH de la composition prête à l'emploi et appliquée sur les fibres kératiniques [composition résultant du mélange de la composition tinctoriale (A) et de la composition oxydante (B), est généralement compris entre les valeurs 4 et 11. Il est de préférence compris entre 6 et 10, et peut être ajusté à la valeur désirée au moyen d'agents acidifiants ou alcalinisants bien connus de l'état de la technique en teinture des fibres kératiniques.
accord avec l'existence, chez C. pipiens, de deux AChEs possédant des propriétés catalytiques distinctes.
EXEMPLE 5: Analyse de la liaison entre le gène ace-1 et la résistance aux insecticides Afin d'analyser la liaison entre le gène 6!ce-7 et la résistance aux insecticides, le fragment K amplifié à partir de l'ADN génomique de C. pipiens résistants (souche R), a été séquence. La comparaison des séquences du fragment K entre les souches S et R montre des différences au niveau de 3 nucléotides (substitutions silencieuses, Figure 2B). L'une de ces substitutions affecte un site EcoRI, ce qui permet de différencier facilement le locus ace-1 des souches S et R par PCR-RFLP : les profils de restriction montrent 1 bande (320 pb) chez les individus homozygotes résistants, 2 bandes (106 pb et 214 pb) chez les moustiques homozygotes SS et 3 bandes (103 pb, 214 pb et 320 pb) chez les moustiques hétérozygotes RS (figure 2C).
La liaison entre le gène ace-1 et la résistance au propoxur a été étudiée, en triple, de la façon suivante : des larves de croisement en retour (S x R) x S ont été traitées par une dose létale pour les individus sensibles et le génotype d'ace-1 a été analysé chez les survivants, par PCR-RFLP.
Les résultats montrent que l'exposition au propoxur tue 50 % des larves dans tous les croisements en retour, c'est à dire tous les individus sensibles.
Toutes les larves survivantes (100 pour chaque croisement en retour, 300 au total) montrent un profil hétérozygote en RFLP, indiquant qu'elles possèdent toutes une copie du gène ace-1 de la souche R.
Ces résultats démontrent que le gène ace-1 est lié de façon très étroite avec la résistance aux insecticides (moins de 1 % de recombinaison avec un degré de confiance de 0,05).
EXEMPLE 6 : de la phylogénie des gènes ace-1 et ace-2.
Des arbres phylogénénétiques ont été construits à partir des séquences des régions conservées des AChE d'An gambiae (SEQ ID NO: 1 et fragment 34- 393 de la séquence SEQ ID NO: 53, figure 1), des fragments K de C. pipiens et Aedes aegypti (SEQ ID NO: 8 et 9) et de 33 séquences d'AChE disponibles dans GENBANK, à l'aide de la méthode du plus proche voisin (neighbour-joining method), comme décrit dans le matériels et méthodes.
La figure 3 illustre l'hétérogénéité du nombre de gènes ace au cours de l'évolution du règne animal. Chez les cordés, les céphalocordés possèdent au moins deux gènes ace alors que les urocordés n'en possèdent qu'un seul, comme déduit de l'analyse de leur génome. Chez les arthropodes, les diptères possèdent, soit un seul gène ace (Drosophila du sous-ordre des brachycères) ou deux gènes ace (moustiques du sous-ordre des nématocères). La topologie de l'arbre montre que ces deux gènes ace se sont dupliqués très précocement au cours de l'évolution, probablement avant la séparation entre les protostomes et les deutérostomes. Ces résultats sont supportés par le fait que les AChE de mollusques, de nématodes et d'arthropodes se ramifient à partir des séquences des cordés (craniatia, céphalocordés et urocordés). Les résultats montrent que les arthropodes et les nématodes possèdent une AChE apparentée.
Ces résultats indiquent que les gènes ace-1 et ace-2 identifiés chez les insectes proviennent d'un événement de duplication très ancien et que l'absence du gène ace-1, au moins chez certaines espèces du sous-ordre des brachycères (Drosophila ) résulte de la perte d'un gène ace plutôt que d'une duplication récente du gène ace chez les nématocères. Ces résultats suggèrent également que les extrapolations faites à partir d'études chez D. melanogaster sont à considérer avec réserve dans la mesure où la situation de Drosophila n'est ni représentative des diptères ni de l'ensemble de la classe des insectes.
EXEMPLE 7 : Détermination de la séquence d'ADNc du gène ace-1 L'ADNc d'ace-1 a été cloné à partir de deux souches d'Anopheles gambiae (souche KISUMU sensible et souche YAO résistante) et de deux souches de Culex pipiens (souche S-LAB sensible et souche SR résistante), comme décrit dans le matériels et méthodes.
La séquence complète de l'ADNc de la souche KISUMU correspond à la séquence SEQ ID NO: 125 qui code pour une protéine de 737 acides aminés (SEQ ID NO: 126). La séquence complète de l'ADNc et de la protéine AChEl de la souche YAO correspondent respectivement aux séquences SEQ ID NO: 121 et SEQ ID NO: 122.
Les séquences SEQ ID NO : 4 et SEQ ID NO : 5 correspondent à la séquence quasi-complète (à l'exception du premier exon codant du gène ace-1), respectivement de l'ADNc et de la protéine AChEl de la souche KISUMU.
La séquence complète de l'ADNc des souches S-LAB et SR de C. pipiens correspond respectivement aux séquences SEQ ID NO: 6 et SEQ ID NO: 56 qui codent pour une protéine de 702 acides aminés (SEQ ID NO: 7 et SEQ ID NO: 57, respectivement pour la souche S-LAB et la souche SR).
EXEMPLE 8 : Détermination de la séquence du gène ace-1 La séquence du gène ace-1 a été déterminée à partir de l'ADN génomique de deux souches $ Anophèles gambiae, la souche sensible de référence de l'Afrique de l'Ouest (souche KISUMU) et une souche résistante de Côte d'ivoire (souche YAO), comme décrit dans le matériels et méthodes.
La séquence complète d'An. gambiae correspond à la séquence SEQ ID NO: 127 qui présente une organisation intron-exon comprenant au moins 9 exons et incluant deux exons 5' non-codants (Tableau I) La séquence quasi-complète (à l'exception des deux premiers exons 5' non-codants) du gène ace-1 de la souche KISUMU correspond à la séquence SEQ ID NO: 23.
Nous venons de décrire le profil idéal de la largeur d'électrode selon l'axe Ox dans la direction d'expansion de la décharge, dans la zone Zb d'expansion de la décharge.
En ce qui concerne la définition d'un profil idéal de l'élément d'électrode dans la zone de stabilisation, pour dissiper, comme on l'a vu, le maximum d'énergie dans la décharge lorsque celle ci est à son point optimal d'expansion, c'est à dire au moment où la décharge quitte la zone d'expansion Zb et entre dans la zone de stabilisation Zc, il convient que la capacité longitudinale spécifique de la couche diélectrique dans la zone Zc soit supérieure à la capacité longitudinale spécifique de la couche diélectrique en tout autre point de la zone de décharge. Si Ws est la largeur de l'élément d'électrode dans la zone de stabilisation, de préférence, on choisit Ws aussi élevé que possible, donc relativement proche de Wc (largeur de la cellule) et on choisit We-bc inférieur ou égal à Ws.
Les figures 10A, 10B, 10C, 10D représentent des exemples de formes d'éléments d'électrode conformes à ce deuxième mode général de réalisation de l'invention, selon une vue de dessus (axe Oz de la figure 6) d'une demicellule d'écran de visualisation à plasma: Sur la figure 10A, un élément de forme pleine (zone hachurée) dont les contours, sous la zone d'expansion Zb répondent au conditions spécifiques de
ce deuxième mode de réalisation de l'invention ; de préférence, la zone de l'élément d'électrode qui est hachurée sur la figure est réalisée en matériau conducteur transparent ; au contraire la zone 101 de l'élément d'électrode qui est noircie sur la figure, qui correspond au bus conducteur Yc, Y'c de l'électrode Y, Y', est réalisé en matériau conducteur, généralement opaque et d'épaisseur supérieure à celui de la zone hachurée, de sorte que l'épaisseur de la couche diélectrique 6 est inférieure dans la zone hachurée ; le bus conducteur Yc est positionné de préférence en dehors de la zone de décharge de manière à ne pas obscurcir la lumière visible émise par la couche luminophore recouvrant les parois internes de la cellule de décharge.
On a constaté que les parois des cellules jouaient un rôle important sur le comportement et l'efficacité de production de rayonnements ultraviolets de la décharge, notamment au niveau de zones de l'élément d'électrode qui sont situées au voisinage de ces paroi, dans les zones où cet élément présente une largeur We proche de la largeur Wc de la cellule. Au voisinage des parois, il existe donc dans chaque cellule une zone d'influence dans laquelle on constate une augmentation importante des pertes de particules chargées ou excitées du plasma, qui provoque des pertes énergétiques, une baisse du rendement lumineux, et une dégradation des luminophores généralement déposés sur ces parois. Dans les conditions classiques de fonctionnement des écrans de visualisation à plasma, cette zone d'influence des parois s'étend typiquement jusqu'à une distance des parois comprise entre 30 et 50 m, en fonction, notamment, de la composition et de la pression du gaz de décharge. De préférence, dans la zone de stabilisation de la décharge Zc, on limite les pertes énergétiques résultant de cet effet de parois en choisissant de préférence une largeur Ws d'élément d'électrode inférieure à Wc-(2x30um) = Wc-60um mais proche de cette valeur.
Les éléments d'électrodes sont reliées, en arrière des zones d'allumage et d'expansion, au bus Yb des électrodes coplanaires Y, Y'. Deux options peuvent se présenter :
- soit on intègre le bus à la zone de stabilisation, auquel cas on se heurte aux inconvénients d'effet de paroi précités résultant d'une largeur trop élevée de la zone de stabilisation ; ce cas est illustré à la figure 2C décrite ci-après ; - soit on recule le bus derrière la zone de stabilisation, auquel cas on se heurte au problème de la connexion des éléments d'électrodes au bus ; le bus est alors de préférence positionné au niveau d'un paroi de la cellule et on utilise alors des éléments de raccordement des éléments d'électrodes au bus qui présentent une largeur très inférieure à celle de la zone de stabilisation ; ce cas est illustré aux figures 10B et 10D décrites ci-après.
L'exemple de la figure 10B est similaire à celui de la figure 10A déjà décrite, mais, dans la zone de stabilisation de décharge, l'élément d'électrode présente ici une largeur inférieure à la largeur Wc de la cellule, et est séparée du bus conducteur 101 par une épaisseur isolante 151 de la paroi horizontale 15 de la cellule, sauf en une zone 102 de contact électrique, de manière à ne pas permettre à la décharge de pénétrer dans la zone d'influence de paroi à faible rendement lumineux ; la largeur de la zone de contact électrique 102 est généralement comprise entre 50 m et 150 m de manière à ne pas augmenter la résistance de contact entre le bus conducteur Yc et la zone de stabilisation de déchargeZc. On améliore donc encore le rendement lumineux et la durée de vie des luminophores en utilisant la structure de la figure 10B.
En réduisant ainsi la surface d'électrode dans la zone de stabilisation de décharge, on réduit également en partie la capacité totale de la couche diélectrique dans ladite zone, de sorte que la luminance de la décharge peut être réduite.
L'exemple de la figure 10C reprend la structure générale de la figure 10B, le bus conducteur étant cette fois intégré à la zone de stabilisation de décharge Zc et éloigné de la zone d'influence de paroi, de sorte que la moindre épaisseur de la couche diélectrique recouvrant le bus conducteur augmente la capacité surfacique spécifique le long du bus conducteur et augmente ici la capacité de la zone de stabilisation de décharge. On augmente ainsi le temps et la luminance de la décharge. L'exemple de la figure 10D est une variante de
l'exemple de la figure 10C, permettant de réduire l'opacité du bus conducteur dans la zone d'émission de lumière visible du luminophore.
Les figures 11A à 11D illustrent d'autres exemples du deuxième mode général de réalisation de l'invention.
Le procédé d'alignement pour l'assemblage de la dalle 1 avec la dalle 2 ne permet pas toujours d'aligner des motifs non parallèles ou perpendiculaires entre eux. Il peut donc être préférable de ne pas utiliser une électrode dont les contours seraient courbes comme précédemment décrit. Le but poursuivi par l'invention peut être atteint en générant une augmentation discontinue par sauts de potentiel en surface de la couche diélectrique, en utilisant des portions successives d'élément conducteurs de largeur croissante.
La figure 11A illustre un exemple identique à celui de la figure 10C à la différence près que, sous la zone d'expansion, l'élément d'électrode est formé d'un conducteur central de largeur étroite Wr reliant électriquement une succession de segments conducteurs de largeur constante Wel, We2, We3 s'étendant transversalement au conducteur central dans l'ordre de largeur croissante selon des positions moyennes de ces segments repérées x1, x2, x3 sur l'axe Ox ; selon l'invention, on vérifie que les valeurs de largeur We1, We2, We3 , rapportées aux positions x1, x2, x3 sur l'axe Ox sont bien comprises entre le profil de limite inférieure We-id-inf et le profil de limite supérieure We-id-sup précédemment décrits, qui s'écartent respectivement de-15% et de +15% du profil idéal linéaire We-id-0 précédemment défini pour le deuxième mode général de réalisation de l'invention ; pour évaluer cette conformité à la définition de l'invention, on prend en compte le contour dessiné en traits discontinus reliant les extrémités de chaque segment conducteur. L'espacement (x2-x1), (x3-x2) entre les segments successifs est de préférence décroissant selon la direction Ox ; le nombre de segments conducteurs est généralement compris entre 3 inclus et 5 inclus.
Le procédé de fabrication des éléments conducteurs peuvent ne pas permettre de réaliser des segments suffisamment fins, notamment dans la partie de la zone d'expansion la plus proche de la zone de démarrage de la décharge. Il est alors possible d'utiliser un même et unique segment de faible
largeur We1 sur une première partie de la zone d'expansion Zb située entre xab et une valeur xbl, du moment que la longueur xbl-xab de la partie de zone d'expansion correspondant à ce premier segment est inférieure à la moitié de la longueur de la zone d'expansion xbc-xab' La figure 11 B illustre un exemple identique à celui de la figure 11A à la différence près que les segments s'étendent ici dans la même direction que l'axe Ox ; comme à la figure 11A, leurs extrémités définissent en pointillés un contour conforme à 15% près au contour idéal linéaire d'élément d'électrode We-id-O La figure 11 C illustre un exemple identique à celui de la figure 10C à la différence près que, sous la zone d'expansion, l'élément d'électrode comprend une première zone rectiligne de largeur égale à We-ab ou à la largeur minimale permise par le procédé de fabrication et de préférence inférieure à 50 m, et une seconde zone trapézoïdale dont la plus petite base est égale à la largeur de la zone rectiligne. Les dimensions de la première et de la deuxième zone sont choisies de manière que le contour de l'élément d'électrode s'inscrive globalement entre le profil de limite inférieure We-id-inf et le profil de limite supérieure We-id-sup précédemment décrits, qui s'écartent respectivement de - 15% et de +15% du profil idéal linéaire We-id-O précédemment défini pour le deuxième mode général de réalisation de l'invention. L'élément d'électrode selon cette variante permet d'obtenir un effet sensiblement identique à celui d'un contour idéal en supprimant toutefois avantageusement certaines contraintes de fabrication. De préférence on utilisera une première zone rectiligne de longueur inférieure ou égale à 100pm.
Alternative de gauche : L'endonucléase est exprimée et purifiée. Le substrat ADN est mis en présence avec l'endonucléase.
Alternative de droite : Un substrat ADN portant une cassette d'expression pour une endonucléase est préparé par amplification par PCR. L'endonucléase est exprimée in vitro.
Le substrat ADN résultant de l'incubation en présence de l'endonucléase testée est ensuite soumis à la discrimination entre le substrat ADN coupé et non coupé. Le substrat ADN restant après discrimination est détecté directement ou après amplification par PCR.
FIGURE 6 Schéma représentant une sélection des endonucléases capables de couper un site de coupure déterminé parmi une banque de séquences codantes pour une endonucléase. Des substrats ADN de départ portent deux sites de coupure encadrant une cassette d'expression pour une endonucléase (une représentée par un damier, l'autre par des rayures). Les boites grises et noires représentent les demi-sites de coupure. Les cassettes d'expression contiennent un promoteur, un RBS/Kozak et un terminateur. Ces substrats sont compartimentés. L'endonucléase est exprimée in vitro. Les compartiments sont placés dans des conditions propices à l'activité des endonucléases. Les ronds représentent les endonucléases. La compartimentation est ensuite rompue et les endonucléases sont inactivées. Les substrats ADN résultant de l'incubation en présence d'une endonucléase sont ensuite soumis à la discrimination entre le substrat ADN coupé et non coupé. Les substrats ADN restant après discrimination sont amplifiés par PCR avec des amorces permettant de régénérer les sites de coupure.
FIGURE 7 Schéma représentant une sélection des demi-sites de coupure capables d'être coupés par une endonucléase déterminée parmi une banque de demi-sites de coupure. DS 1 et DS2 désignent respectivement les deux demi-sites de coupure. Les boites noires et grises représentent ces deux demi-sites. Les damiers, hachures et briques représentent des demi-sites variables. Le rond représente l'endonucléase testée. Les flèches épaisses noires représentent les amorces de PCR.
FIGURE 7A : Schéma général représentant une sélection parmi une banque de demi-sites de coupure. Les substrats ADN comprennent un ou deux demi-sites variables. Après incubation de l'endonucléase en présence du pool de substrats ADN contenant les demi-sites variables, les
substrats ADN résultants sont soumis à la discrimination entre les substrats ADN coupés et non coupés. Les substrats ADN restants sont ensuite amplifiés par PCR de façon à restaurer le site de coupure initial. La flèche pointillée indique que l'étape d'amplification par PCR peut être facultative. En effet, lorsque la discrimination est faite par amplification sélective du substrat coupé, l'étape d'amplification par PCR n'est pas nécessaire. Les substrats régénérés peuvent être utilisés pour un tour supplémentaire de sélection.