INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La banque de défensines d'insectes recombinées obtenue selon le protocole précédemment décrit dans la partie A, est étalée sur des boîtes de Pétri (YNBG casamino acides agar) .
Le nombre de clones par boîte est choisi de manière à former des colonies isolées. Ces colonies sont piquées et mises en culture automatiquement en microplaques 384 puits, dans 60 l de milieu (YNBG, casamino acides, 13% glycérol). Les plaques sont incubées à 30 C durant 72h, puis deux copies sont
stockées à -80 C, et une autre copie est conservée à 4 C avant de servir à la suite du processus.
A partir d'une plaque 384 puits, on ensemence 4 plaques 96 puits DeepWell contenant 1ml de milieu de culture Kapeli.
Les plaques Deepwell sont couvertes d'une membrane perméable aux gaz et sont mises à incuber à 30 C sous agitation durant 96h. Au bout de 72h, on fait une adjonction de 100 l de glucose à 500 g/1 par puits.
On ajoute 1ml d'eau ultra pure stérile dans tous les puits des plaques 96 puits. Ces plaques sont ensuite centrifugées pendant 30 min à 4000 rpm et à 20 C. Le surnageant est purifié sur des plaques Oasis HLB (WATERS) : 1.3ml de surnageant sont déposés sur chacune des 96 microcolonnes, soumises à un tirage sous vide pour faire passer le liquide. Un lavage avec 800 l par colonne d'eau supplémentée à 0,05% de Trifluoroacétate (TFA). L'élution est réalisée avec 500 l d'acétonitrile à 60% supplémenté de TFA à 0,05%. L'éluat est récupéré dans une plaque DeepWell 96 puits lml.
Le solvant d'élution est ensuite évaporé sous vide (30 C, 9 mbars, llh) . Les plaques sont alors couvertes d'un film silicone autocollant et stockées à 4 C.
L'équivalent de 40 à 200 l de surnageant purifié selon la précédente étape, est analysé par CLHP (type Alliance, Waters Associates) couplée à la spectrométrie de masse (type ZQ 2000, Waters Associates), pilotée par le logiciel Masslynx (Waters Associâtes). Les échantillons sont injectés de manière automatique et séquentielle (injecteur 2790, Waters Associates) sur une colonne analytique de type Uptisphère de 250 x 4,6 mm, remplie de silice avec un greffage C18 (phase inverse) de granulométrie de 5 et de porosité de 300 A (Interchim). L'élution est réalisée par un gradient d'acétonitrile dans le TFA 0,05% de 15 à 60 % en 30 min. avec un débit constant de 0,8 ml/min.
Le spectre UV (variation d'absorbance à 225 nm ; détecteur à barrette de diodes de type 996, Waters Associates) et le spectre de masse de chaque échantillon sont analysés individuellement. La masse correspondant à chaque pic du spectre UV est calculée par un logiciel de déconvolution (logiciel Transform, Waters Associates). Lorsque la masse mesurée correspond à la masse théorique (gamme de 3500 à 5500 pour les défensines d'insectes), le pic d'intérêt est intégré par le logiciel Masslynx puis quantifié.
La quantification se fait par rapport à une courbe de calibration (aire du pic en fonction de la quantité d'échantillon) établie par injection de quantités connues de la défensine d'Anophèles gambiae dans les mêmes conditions d'analyse. La quantification des défensines recombinées (en g) est calculée par intégration individuelle du pic du chromatogramme correspondant à chaque défensine recombinée.
Tant en santé humaine et animale qu'en santé végétale, le besoin de nouvelles molécules permettant de lutter contre les infections d'origine bactérienne est grandissant. En santé humaine notamment, les infections nosocomiales constituent des infections graves qui affectent les patients hospitalisés. Elles s'avèrent particulièrement redoutables pour les patients dont le système immunitaire est fragilisé suite à des traitements comme la corticothérapie ou la chimiothérapie, des interventions comme des transplantations ou des maladies affectant le système immunitaire telles le Syndrome d'Immunodéficience Acquise. La croissance de la fréquence et de la sévérité des infections nosocomiales coïncide avec l'émergence de bactéries résistantes aux antibiotiques classiques. A titre d'exemples de bactéries à Gram positif présentant un phénomène de pharmacorésistance, on peut notamment citer les bactéries de genre Staphylococcus en particulier Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis, les bactéries de genre
Streptococcus en particulier Streptococcus pneumoniae, les bactéries de genre Enterococcus en particulier Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium et les bactéries de genre Mycobacterium en particulier Mycobacterium tuberculosis. L'exemple le plus préoccupant est celui de Staphylococcus aureus. Plus de 95% des souches bactériennes Staphylococcus aureus sont résistantes à la pénicilline et plus de 60% sont également devenues résistantes à son dérivé, la méthicilline (The new antibiotics, Holger Breithaupt, Nature Biotechnology, Vol 17 December 1999). Des souches présentant une sensibilité réduite à la vancomycine ont également été caractérisées (Infection control programmes to contain antimicrobial résistance, Lindsay E. Nicolle, 14-15, WHO 2001). Ces antibiotiques agissent en inhibant la synthèse de la paroi bactérienne. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé, le taux de souches Staphylococcus aureus méthicilline-résistantes devenues résistantes à la mipirocine, un antibiotique inhibant la synthèse protéique, a progressé de 2,7% à 65% en l'espace de 3 ans (Infection control programmes to contain antimicrobial résistance, Lindsay E. Nicolle, 14-15, WHO 2001). L'action des analogues d'antibiotiques conventionnels est rapidement contrée par des mécanismes de résistances multiples élaborés par les bactéries. On a notamment observé des souches bactériennes ayant une perméabilité membranaire réduite ce qui empêche l'entrée de l'antibiotique. D'autres souches bactériennes au contraire, relarguent rapidement la molécule antibiotique via des pompes d'efflux. D'autres voies de résistance proviennent de la séquestration de la molécule antibiotique, de l'inactivation de la molécule antibiotique par des enzymes bactériennes, de la perte d'efficacité de la molécule antibiotique par production accrue de sa cible ou de la modification de la cible de la
molécule antibiotique. Le phénomène de pharmaco-résistance est d'autant plus inquiétant qu'il n'est plus confiné au secteur hospitalier mais tend à se disséminer au sein de la communauté. Une publication récente fait notamment état de la prévalence des infections causées par Staphylococcus aureus chez les personnes de 65 ans et plus. La proportion d'infections bactériennes, pneumonies, endocardites, infections bactériennes ostéoarticulaires ou urinaires développées par les personnes âgées et liées à Staphylococcus aureus, est préocupante (Staphylococcus aureus infections and antibiotic résistance in older adults, Bradley S.F., Clinical Infectious Diseases, 2002 ; 34 :211-216).
Il existe donc un besoin grandissant de caractériser de nouvelles classes de molécules anti-bactériennes, plus particulièrement actives contre les bactéries à Gram positif touchées par le phénomène de pharmaco-résistance qui progresse dangereusement en milieu hospitalier et se propage au sein de la communauté. Par anti-bactériens , on entend selon la présente invention, toutes molécules présentant des propriétés bactériostatiques ou bactéricides.
Il est connu que les peptides anti-bactériens et plus généralement les peptides anti-microbiens présentent un mécanisme d'action qui diffère radicalement de ceux des antibiotiques classiques. Les peptides anti-microbiens majoritairement cationiques ont pour cible la membrane bactérienne. Un modèle présentant le mécanisme d'action de la plupart des peptides anti-microbiens est le modèle Shai-Matsuzaki-Huang (Cationic peptides with antimicrobial activity - The new generation of antibiotics ?, Rautenbach M. and Hastings J. W., Chimica oggi/ Chemistry today, NovDec 1999, 81-89). Des peptides présentant des propriétés anti-microbiennes sont produits par une grande variété
d'espèces tant animales que végétales, chez lesquels ils participent à des mécanismes non spécifiques de défense contre les infections (Antimicrobial peptides of multicellular organisms, Zasloff M., Nature Vol.415, Jan 2002, 389-395).
Les insectes ont notamment développé un système de défense efficace contre les microorganismes. Cette réponse immunitaire s'appuie pour une large part sur la synthèse rapide et transitoire de peptides antimicrobiens à large spectre d'activité (Antimicrobial peptides in insects ; structure and function, Bulet P. and al., Dev. Comp.
Immunol. 23,1999, 329-344). Les peptides anti-microbiens d'insectes peuvent être classé en quatre familles distinctes: - Des peptides cationiques de 4 kDa, formant des hélices a amphipathiques. Dans cette famille, on répertorie notamment les cécropines (2 hélices a) qui sont actives contre les bactéries à Gram positif et négatif.
- Des peptides cationiques de 2 à 5 kDa comprenant des ponts disulfures intra-moléculaires. Cette famille est elle-même subdivisée en 2 sous-familles. Une première sous-famille est formée par des peptides qui présentent une structure tridimensionnelle du type comportant une hélice a et un feuillet antiparallèle reliés par des ponts disulfure. Ces peptides communément appelés peptides cs[alpha]ss sont notamment représentés par les défensines d'insectes (3 ponts disulfure) qui sont actives contre les bactéries à Gram positif, la drosomycine (4 ponts disulfure) et l'héliomicine (3 ponts disulfure) qui présentent des propriétés antifongiques. Une seconde sous-famille est formée par des peptides qui présentent une structure tridimentionnelle de type comportant un feuillet anti-parallèle et des ponts disulfure. Ces peptides
appelés peptides hairpin-like sont notamment représentés par la thanatine (1 pont disulfure) qui présente un large spectre d'activité puisque dirigée aussi bien contre les champignons qu'envers les bactéries à Gram positif et négatif.
- Des peptides cationiques riches en proline, de 2 kDa à 4 kDa qui peuvent être glycosylés, comme la drosocine, la pyrrhocoricine, et les lébocines, ou non glycosylés comme les apidaecines et les métalnikowines. Ces peptides sont pour la plupart actifs contre les bactéries à Gram négatif.
- Des polypeptides hétérogènes de 8 à 27 kDa, pour la plupart cationiques et fréquemment riches en glycine.
Dans ce groupe, on classe notamment les attacines, les sarcotoxines II, les diptéricines, la coléoptéricine, l'hyménoptéricine, l'hémiptéricine, l'holotricine et les gloverines qui sont essentiellement actifs contre les bactéries à Gram négatif .
Parmi les peptides anti-bactériens d'insectes isolés à ce jour, les cécropines, les défensines et la thanatine se sont révélées actives contre les bactéries à Gram positif (Antibacterial peptides isolated from insects, Otvos L Jr., J. Pept. Sci. 2000 Oct. ; 6(10) :497-511 ; Structure-activity analysis of thanatin, a 21-residue inducible insect défense peptide with séquence homology to frog skin antimicrobial peptides, Fehlbaum P., Bulet P. and al., Proc. Natl. Acad. Sci., Vol.93, 1221-1225, Feb.
1996). Parmi ces derniers peptides les défensines d'insectes présentent une spéficité d'action envers les bactéries à Gram positif pharmaco-résistantes. Le procédé communément utilisé pour obtenir et isoler de nouveaux peptides anti-bactériens et plus généralement antimicrobiens est long et contraignant. Notamment, l'utilisateur doit induire la synthèse biologique des
peptides anti-microbiens dans l'hémolymphe d'insectes vivants qu'il aura préalablement collecté ou cultivé en quantité suffisante. Cette synthèse est induite par une blessure septique ou par injection d'une faible dose de bactéries à chacun des insectes. L'utilisateur doit ensuite procéder à l'extraction des peptides antimicrobiens par mise en contact d'un broyat des insectes ou de l'hémolymphe préalablement recueillie avec un milieu acide à neutre avant de purifier les peptides en vue de leur caractérisation structurale. Un autre procédé communément utilisé pour préparer des nouveaux peptides est la mutagenèse dirigée. Ce procédé présente toutefois des limites. Notamment, la génération de mutations qui affectent la structure tridimentionnelle des peptides conduit à des peptides mutants non fonctionnels. Le temps requis pour la préparation de chaque peptide mutant peut limiter quant à lui le nombre de positions explorées.
Comme actifs, il sera avantageux d'introduire dans la composition utilisée selon l'invention au moins un composé choisi parmi :les agents desquamants ; les agents hydratants ; les agents anti-inflammatoires ou apaisants ; etles agents stimulant la prolifération et/ou la différenciation des kératinocytes.
En effet, la stimulation de la séborrhée par les sapogénines selon l'invention peut, chez certaines personnes, fournir un terrain de prolifération pour la microflore résidente de l'ostium folliculaire (Propionibacterium acnes en particulier), provoquant ainsi une hydrolyse importante des triglycérides du sébum en acides gras libres et la réduction des insaturations des acides gras poly-insaturés (acide linoléique en particulier). Ces deux phénomènes peuvent concourir à une kératinisation de l'infundibulum et à la formation d'un micro-comédon. Celui-ci peut dégénérer en
comédon, bouchant et dilatant le pore de façon inesthétique. A un stade plus avancé, ce bouchon peut diverger vers une lésion acnéique inflammatoire.
L'ajout d'agents desquamants ou régulant la prolifération ou la différenciation des kératinocytes à la composition selon l'invention permettent d'éviter la formation de ces comédons. De même, des agents anti-bactériens ou bactério-statiques permettraient, en modérant la prolifération de la microflore résidente, d'obtenir le même effet.
En outre, les agents hydratants peuvent compléter l'effet obtenu à l'aide des sapogénines selon l'invention, et les agents anti-inflammatoires ou apaisants sont utiles pour améliorer le confort des peaux sèches oligoséborrhéiques.
Des exemples de tels actifs additionnels sont donnés ci-dessous.
Agents desquamants Par "agent desquamant", on entend tout composé capable d'agir : - soit directement sur la desquamation en favorisant l'exfoliation, tel que les sshydroxyacides, en particulier l'acide salicylique et ses dérivés (dont l'acide n-octanoyl 5-salicylique) ; les a-hydroxyacides, tels que les acides glycolique, citrique, lactique, tartrique, malique ou mandélique ; l'urée ; l'acide gentisique ; les oligofucoses ; l'acide cinnamique ; l'extrait de Saphora japonica ; le resvératrol ; - soit sur les enzymes impliquées dans la desquamation ou la dégradation des cornéodesmosomes, les glycosidases, la stratum corneum chymotryptic enzym (SCCE) voire d'autres protéases (trypsine, chymotrypsine-like). On peut citer les agents chélatant des sels minéraux : l'EDTA ; l'acide N-acyl-N,N',N' éthylène diaminetriacétique ; les composés aminosulfoniques et en particulier l'acide (N-2 hydroxyéthylpiperazine-N-2-éthane) sulfonique (HEPES) ; les dérivés de l'acide 2oxothiazolidine-4-carboxylique (procystéine) ; les dérivés d'acides alpha aminés de type glycine (tels que décrits dans EP-0 852 949, ainsi que le méthyl glycine diacétate de sodium commercialisé par BASF sous la dénomination commerciale TRILON M) ;
le miel ; les dérivés de sucre tels que l'O-octanoyl-6-D-maltose et la N-acétyl glucosamine.
Les agents desquamants peuvent représenter de 0,01 à 70%, de préférence de 0,1 à 25% et plus préférentiellement de 0,5 à 10% du poids total de la composition.
Agent hydratant Par "agent hydratant", on entend : - soit un composé agissant sur la fonction barrière, en vue de maintenir l'hydratation du stratum corneum, ou un composé occlusif. On peut citer les céramides, les composés à base sphingoïde, les lécithines, les glycosphingolipides, les phospholipides, le cholestérol et ses dérivés, les phytostérols (stigmastérol, (3sitostérol, campestérol), les acides gras essentiels, le 1-2 diacylglycérol, la 4chromanone, les triterpènes pentacycliques tels que l'acide ursolique, la vaseline et la lanoline ; - soit un composé augmentant directement la teneur en eau du stratum corneum, tel que le thréalose et ses dérivés, l'acide hyaluronique et ses dérivés, le glycérol, le pentanediol, le pidolate de sodium, la sérine, le xylitol, le lactate de sodium, le polyacrylate de glycérol, l'ectoïne et ses dérivés, le chitosane, les oligo- et polysaccharides, les carbonates cycliques, l'acide N-lauroyl pyrrolidone carboxylique, et la N-a-benzoyl-L-arginine ; - soit un composé activant les glandes sébacées tel que la DHEA et ses dérivés, et la vitamine D et ses dérivés.
Agents stimulant la prolifération et/ou la différenciation des kératinocvtes Les agents stimulant la prolifération des kératinocytes, utilisables dans la composition selon l'invention, comprennent notamment les rétinoïdes tels que le rétinol et ses esters, dont le palmitate de rétinyle ; le phloroglucinol ; les extraits de tourteaux de
noix commercialisés par la société GATTEFOSSE ; et les extraits de Solanum tuberosum commercialisés par la société SEDERMA.
Les rétinoïdes sont préférés pour une utilisation dans cette invention, en particulier le rétinol et ses esters, qui peuvent représenter de 0,00001 à 5% et, mieux, de 0,1 à 2% du poids total de la composition.
Les agents stimulant la différenciation des kératinocytes comprennent par exemple les minéraux tels que le calcium ;l'extrait de lupin commercialisé par la société SILAB sous la dénomination commerciale Photopréventine; le beta-sitosteryl sulfate de sodium commercialisé par la société SEPORGA sous la dénomination commerciale Phytocohésine ; et l'extrait de maïs commercialisé par la société SOLABIA sous la dénomination commerciale Phytovityl.
Agents anti-inflammatoires et apaisants Par "agent anti-inflammatoire", on entend tout composé susceptible d'inhiber les principales enzymes impliquées dans le processus inflammatoire (cascade de l'acide arachidonique), à savoir : les phospholipases A2 (PLA2) ; les lipoxygénases (Lox) ; et les prostaglandines humaines synthétases (PGHS). Par "agent apaisant", on entend en particulier les antagonistes de substance P, les antagonistes de CGRP, et les antagonistes de bradykinine.
Parmi les matières premières efficaces comme agents anti-inflammatoires, on peut citer de façon non limitative les actifs suivants : les triterpènes pentacycliques, comme l'acide ss-glycyrrhétinique et ses sels et/ou ses dérivés (acide glyyrrhetique monoglucuronide, stearyl glycyrrhetinate, acide 3- stéaroyloxy glycyrrhetique), l'acide ursolique et ses sels, l'acide oléanolique et ses sels, l'acide bétulinique et ses sels ; les extraits de Paeonia suffruticosa et/ou lactiflora, de Rosmarinus officinalis, d'épilobe, de Pygeum, de Boswellia serrata, de Centipeda cunnighami, d'Helianthus annuus, de Cola nitida, de clou de girofle et de Bacopa moniera ; les sels de l'acide salicylique et en particulier le salicylate de zinc ; les extraits d'algues, en particulier de Laminaria saccharina ; l'huile de Canola, de Tamanu, de calophillum, les huiles insaturées en oméga 3 telles que les huiles de rosier muscat, de cassis, d'ecchium, de poisson ; l'a-
L'outil 100 de gestion d'enchères mémorise localement les informations ou les mémorise sur un support de mémorisation de l'ordinateur client. Les informations mémorisées comprennent l'état du marché, le compte du client et les définitions de groupes. Des actions déclenchées par l'outil 100 de gestion d'enchères qui modifient l'état du marché, telles que les changements d'enchères, sont aussi mémorisées localement et peuvent être vues dans des rapports produits par l'outil 100.
L'outil 100 peut être exécuté de toutes manières convenables par un ordinateur client déterminé. Dans un mode de réalisation, l'outil 100 de gestion d'enchères comporte un ou plusieurs codes de programme lisibles par ordinateur conservés sur un dispositif de mémorisation, tel qu'un disque dur ou une mémoire de l'ordinateur client 12. L'ordinateur client comporte un processeur et une interface de communication. Le processeur travaille avec les codes de programme de l'outil de gestion d'enchères pour remplir les fonctions décrites dans le présent mémoire. Dans un mode de réalisation préféré, l'outil 100 est une application qui peut être installée sur un ordinateur personnel ou un autre dispositif de traitement utilisant une ou plusieurs versions de systèmes d'exploitation "Microsoft Windows". De préférence, l'outil 100 a une fonction de remise à jour automatique qui peut déclencher une session de communication avec un site de la toile pour déterminer si une nouvelle version de l'application est disponible par téléchargement. Si la réponse est positive, l'utilisateur peut recevoir un message lui demandant de déclencher le processus de téléchargement et de remise à jour, qui est alors exécuté automatiquement.
Sur la figure 2, l'outil 100 de gestion d'enchères comporte des menus 102 qui permettent l'interaction de l'utilisateur avec l'outil 100. De préférence, dans un ordinateur client exploitant le système d'exploitation "Windows", les menus 102 correspondent aux fonctionnalités et conventions des menus "Windows" afin que le
fonctionnement soit simplifié pour l'utilisateur. Cependant, les menus 102 peuvent être personnalisés en fonction d'applications particulières de l'outil 100. Dans d'autres systèmes d'exploitation, d'autres systèmes de menus peuvent être utilisés.
Les menus 102 constituent une interface d'utilisateur pour la saisie de données et la sélection d'options. Un premier menu peut être atteint pour la définition des termes de recherche ou des comptes d'annonceur à gérer. Un autre menu peut être atteint pour spécifier le format d'un rapport. Un autre menu peut être atteint pour le déclenchement d'une opération. D'autres types de menus peuvent aussi être incorporés. Les menus interagissent avec d'autres données et applications conservées sur l'ordinateur du client ou accessibles à partir de celui-ci, telles que l'interface XML 15 (figure 1).
Chaque menu respectif comprend des champs ou sous-menus surgissant convenables de type connu pour la réception et l'enregistrement des données saisies par l'utilisateur. Les données peuvent être introduites au clavier ou saisies d'une autre manière dans des champs spécifiés ou sélectionnées parmi les options données par un menu surgissant. En outre, les menus peuvent donner des options permettant à l'utilisateur de spécifier simplement tous les comptes d'un annonceur particulier. Si les informations ne sont pas conservées localement, l'outil 100 de gestion d'enchères peut déclencher une requête demandant au serveur de gestion de comptes d'obtenir des informations d'identification de compte pour l'annonceur spécifié. Par exemple, l'outil 100 peut transmettre des informations d'identification de l'annonceur à l'interface XML de l'ordinateur client. L'interface XML lance une requête au format convenable et communique la requête au serveur de gestion de comptes. La réponse est ensuite reçue et mémorisée par l'interface XML et les données demandées sont transmises à l'outil 100 de gestion d'enchères.
La fonction 104 de mise en place de l'outil 100 a une fonctionnalité d'initialisation et de modification du
fonctionnement de l'outil 100. Elle comprend la définition des annonceurs et des comptes associés à contrôler, par exemple, par réception d'un utilisateur d'un identificateur de texte d'un annonceur et de détermination du numéro de compte d'annonceur ou de réception et de mémorisation de plusieurs termes de recherche à contrôler.