INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
de carbone, le nombre de groupements oxyde d'éthylène ou oxyde de propylène pouvant aller notamment de 2 à 50 et le nombre de groupements glycérol pouvant aller notamment de 2 à 30. On peut également citer les copolymères d'oxyde d'éthylène et de propylène, les condensats d'oxyde d'éthylène et de propylène sur des alcools gras, les amides gras polyéthoxylés ayant de préférence de 2 à 30 moles d'oxyde d'éthylène, les amides gras polyglycérolés comportant en moyenne de 1 à 5 et en particulier de 1,5 à 4 groupements glycérol, les esters d'acides gras du sorbitane éthoxylés ayant de 2 à 30 moles d'oxyde d'éthylène, les esters d'acides gras du saccharose, les esters d'acides gras du polyéthylèneglycol, les alkyl(C6- C24) polyglycosides, les dérivés de N-alkyl(C6-C24)glucamine, les oxydes d'amines tels que les oxydes d'alkyl(C10-C14)amines ou les oxydes de N-acyl(Clo- CI4)aminopropylmorpholine , ainsi que des mélanges de ceux-ci.
Les agents tensioactifs amphotères peuvent être notamment des dérivés d'amines aliphatiques secondaires ou tertiaires dans lesquels le groupe aliphatique est une chaîne linéaire ou ramifiée comportant de 8 à 22 atomes de carbone et contenant au moins un groupe anionique hydrosolubilisant tel que, par exemple, un groupe carboxylate, sulfonate, sulfate, phosphate ou phosphonate ; peut citer encore les alkyl(Cg-C2o)bétaïnes, les sulfobétaïnes, les alkyl(C8-C2o)amidoalkyl(C6- Cg)-bétaïnes ou les alkyl(C8-C2o)amidoalkyl(C6-Cg)sulfobétaïnes, et leurs mélanges.
Parmi les dérivés d'amines, on peut citer les produits commercialisés sous la dénomination MIRANOL, tels que ceux décrits dans les brevets US 2,528,378 et US 2,781,354 et classés dans le dictionnaire CTFA, 3ème édition, 1982, sous les dénominations Amphocarboxyglycinate et Amphocarboxypropionate correspondant respectivement aux formules (a) et (b) : R2-CONHCH2CH2-N+(R3)(R4)(CHZCOO-) (a) dans laquelle : R2 représente un groupe alkyle dérivé d'un acide R2-COOH présent dans l'huile de coprah hydrolysée, un groupe heptyle, nonyle ou undécyle, R3 représente un groupe bêta-hydroxyéthyle, et R4 représente un groupe carboxyméthyle ; et
R2'-CONHCH2CH2-N (B)(C) (b) dans laquelle : B représente -CH2CH20X', C représente -(CH2)z-Y', avec z = 1 ou 2, X' représente le groupe -CH2CH2-COOH ou un atome d'hydrogène, Y' représente-COOH ou le groupe -CH2-CHOH-SO3H, R2' représente un groupe alkyle d'un acide R2'-COOH présent dans l'huile de coprah ou dans l'huile de lin hydrolysée, un groupe alkyle, notamment en CI? et sa forme iso, ou un groupe en Ci? insaturé.
La composition selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs tensioactifs cationiques bien connus en soi, tels que les sels d'amines grasses primaires, secondaires ou tertiaires, éventuellement polyoxyalkylénées, les sels d'ammonium quaternaire, et leurs mélanges.
A titre de sels d'ammonium quaternaires, on peut notamment citer, par exemple : - ceux qui présentent la formule générale (VI) suivante : dans laquelle les radicaux R8 à R11, qui peuvent être identiques ou différents, représentent un radical aliphatique, linéaire ou ramifié, comportant de 1 à 30 atomes de
carbone, ou un radical aromatique tel que aryle ou alkylaryle. Les radicaux aliphatiques peuvent comporter des hétéroatomes tels que notamment l'oxygène, l'azote, le soufre et les halogènes. Les radicaux aliphatiques sont par exemple choisis parmi les radicaux alkyle, alcoxy, polyoxyalkylène (C2-C6), alkylamide, alkyl(Ci2-C22)amidoalkyle(C2-C6), alkyl(C12-C22)acétate, hydroxyalkyle, comportant environ de 1 à 30 atomes de carbone ; X est un anion choisi dans le groupe des halogénures, phosphates, acétates, lactates, alkyl (C2-C6)sulfates, alkyl- ou alkylaryl-sulfonates ; - les sels d'ammonium quaternaire de l'imidazoline, comme par exemple ceux de formule (VII) suivante : dans laquelle R12représente un radical alcényle ou alkyle comportant de 8 à 30 atomes de carbone, par exemple dérivés des acides gras du suif, R13représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle en CI-C4 ou un radical alcényle ou alkyle comportant de 8 à 30 atomes de carbone, R14 représente un radical alkyle en C1-C4, R15 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C4, X' est un anion choisi dans le groupe des halogénures, phosphates, acétates, lactates, alkylsulfates, alkyl- ou alkylaryl-sulfonates.
De préférence, R12 et R13 désignent un mélange de radicaux alcényle ou alkyle comportant de 12 à 21 atomes de carbone, par exemple dérivés des acides gras du suif, R14 désigne un radical méthyle, R15 désigne un atome d'hydrogène. Un tel produit est par exemple commercialisé sous la dénomination REWOQUAT W 75 par la société REWO ; - les sels de diammonium quaternaire de formule (VIII) :
dans laquelle R16 désigne un radical aliphatique comportant environ de 16 à 30 atomes de carbone, R17, R18, R19, R20 et R21 , identiques ou différents sont choisis parmi l'hydrogène ou un radical alkyle comportant de 1 à 4 atomes de carbone, et X est un anion choisi dans le groupe des halogénures, acétates, phosphates, nitrates et méthylsulfates. De tels sels de diammonium quaternaire comprennent notamment le dichlorure de propanesuif diammonium ; - les sels d'ammonium quaternaire contenant au moins une fonction ester, tels que ceux de formule (IX) suivante : dans laquelle : R22 est choisi parmi les radicaux alkyles en Ci-Ce et les radicaux hydroxyalkyles ou dihydroxyalkyles en Ci-Ce ; R23 est choisi parmi : - les radicaux R27 hydrocarbonés en C1-C22, linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés, - l'atome d'hydrogène, R25 est choisi parmi : - les radicaux R29 hydrocarbonés en CI-C6, linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés, - l'atome d'hydrogène, R24, R26 et R28, identiques ou différents, sont choisis parmi les radicaux hydrocarbonés en C7-C21, linéaires ou ramifiés, saturés ou insaturés ;
r, s et t, identiques ou différents, sont des entiers valant de 2 à 6 ; y est un entier valant de 1 à 10 ; x et z, identiques ou différents, sont des entiers valant de 0 à 10 ; X' est un anion simple ou complexe, organique ou inorganique ; sous réserve que la somme x + y + z vaut de 1 à 15, que lorsque x vaut 0 alors R23 désigne R27 et que lorsque z vaut 0 alors R25 désigne R29.
S'il existe des méthodes d'analyse de l'activité de clivage d'une endonucléase, le manque de méthode de sélection in vitro basée sur la capacité de clivage d'un substrat ADN par une endonucléase est considérable.
La sélection s'applique à des systèmes permettant de lier le génotype au phénotype et elle permet de sélectionner parmi un pool le génotype présentant le phénotype désiré. Ces systèmes comprennent, par exemple, le phage display (Smith et Petrenko, 1997, Chem Rev, 97,391-410), le
ribosome display et la fusion ARNm-peptide (Roberts, 1999, Curr Opin Chem Biol, 3, 268-273).
Ces systèmes sont utilisés pour faire des sélections essentiellement basées sur la capacité de fixation.
Des stratégies de sélection sur la base d'une activité catalytique peuvent cependant être utilisées dans un système intramoléculaire à turnover unique (Pedersen et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA, 95, 10523-10528 ; Demartis et al., 1999, J Mol Biol, 286,617-633 ; Neri et al., US 6,184,012). Dans ce système, le substrat doit être lié à la protéine à tester. Ce substrat est techniquement compliqué à préparer.
Une autre stratégie alternative pour une sélection sur la base d'une activité catalytique est de tester la capacité de liaison de la molécule exposée à un intermédiaire de transition de la réaction (McCafferty et al., 1994, Appl Biochem Biotevhnol, 47, 157-173 ; Fujii et al., 1998, Nat Biotechnol, 16, 463-467; Widersten et al, 1995, J Mol Biol, 250,115-222). Cependant, la conception d'un intermédiaire de transition est difficile et incertaine. De plus, cela permet uniquement une appréciation très imprécise et indirecte de l'activité catalytique. Cette technique semble très mal adaptée au cas des endonucléases.
Un autre moyen de sélection consiste en l'utilisation de substrat suicide biotinylé (Soumillon et al, 1994, J Mol Biol, 237,415-422 ; Janda et al, 1994, Proc Natl Acad Sci USA, 91, 2532-2536 ; Janda et al, 1997, Science, 275,945-948 ; Vanwetswinkel et al, 2000, J Mol Biol, 295, 527-540). Les billes portant la streptavidine fixent les phages portant les enzymes liées au substrat suicide. Cependant, le manque de substrats suicides adaptés pour les réactions catalytiques à tester limite l'utilisation de cette stratégie.
Enfin, il existe une possibilité de sélection par phage display basée sur l'activité catalytique par une chromatographie avec élution catalytique (Ponsard et al., 2001, Chembiochem, 2, 253-259).
Le problème commun à toutes ces stratégies de sélection par l'activité est qu'elles sont basées sur la modification d'une unique molécule de substrat. Ainsi, elles ne permettent pas de sélectionner des enzymes selon leur efficacité de catalyse. En effet, ce système peut aboutir à la sélection d'enzymes très peu efficaces. De plus, ces stratégies n'ont jamais été appliquées à la sélection d'endonucléase.
Un système de compartimentation utilise une émulsion eau-huile pour isoler dans une microcapsule un génotype et son phénotype (Tawfik et Griffiths, 1998, Nat Biotechnol, 16,652- 656 ; Griffiths et Tawfik, 2000, Cur Opin Biotechnol, 11,338-353 ; Griffiths et Duncan, 1998, Cur Opin Biotechnol, 9, 102-108 ; WO 00/40712 ; WO 99/02671). Ce système permet de baser la sélection sur une fonction biologique. Cependant, il n'a jamais été adapté à une sélection pour la capacité de clivage d'une séquence d'ADN.
A ce jour, la seule méthode de sélection basée sur l'activité de clivage est utilisée in vivo dans E. coli (Gruen et al., 2002, Nucleic Acids Res, 30, e29). Cette méthode utilise la capacité de couper un plasmide contenant le site à tester et portant un gène codant pour une protéine toxique pour la cellule. La coupure, qui aboutit à la dégradation de ce plasmide, est nécessaire à la survie de la cellule et permet donc d'effectuer la sélection. Elle n'est utilisable que pour des endonucléases présentant des sites de reconnaissance et de coupure rares ou absents dans la cellule. De plus, cette méthode, en raison de l'étape de transfection, est laborieuse et limitante pour la taille des banques de départ.
En conséquence, il existe un besoin pour des tests d'activité d'endonucléase adaptés au criblage à haut rendement et pour des méthodes de sélection in vitro basées sur la capacité de clivage des endonucléases.
RESUME DE L'INVENTION La présente invention fournit des compositions et méthodes permettant de tester de manière efficace l'activité de clivage d'endonucléases présentant un type de coupure décalée. Les méthodes de l'invention peuvent être utilisées pour cribler, sélectionner, améliorer ou identifier des endonucléases spécifiques et/ou actives sur un site de coupure particulier, ou des sites de coupures clivés par une ou des endonucléases déterminées. L'invention est particulièrement adaptée au criblage de banques d'endonucléases ou de banques de sites de coupure.
D'une manière générale, les méthodes de l'invention comprennent la mise en présence, dans des conditions propices à l'activité de coupure, d'une endonucléase et d'un substrat ADN double-brin comprenant deux sites de coupure, et la détection de la présence de substrat coupé aux deux sites. De préférence, le substrat comporte deux sites distaux, plus préférentiellement localisés aux extrémités du substrat, qui peuvent être identiques ou différents, constants ou variables.
L'utilisation de tels substrats permet d'améliorer la sélectivité ou la sensibilité du test, de réduire les faux positifs et/ou d'améliorer l'étape de détection de l'activité de clivage. L'invention est également applicable à des substrats ne portant qu'un seul site de coupure, en utilisant des conditions particulières de détection de l'activité de clivage. L'invention peut être utilisée pour tester, en parallèle ou en mélange, plusieurs types de substrats ou plusieurs types d'endonucléases.
Ces méthodes peuvent être utilisées pour le criblage d'endonucléases ou de sites de coupure mais également pour la sélection d'endonucléases ou de sites de coupure.
Les polymères préférés utilisés de l'invention sont choisis parmi les copolymères amphiphiles d'AMPS et d'au moins un monomère hydrophobe à insaturation éthylénique, comportant au moins une partie hydrophobe ayant de 6 à 30 atomes de carbone, plus préférentiellement de 6 à 22 atomes de carbone, encore plus préférentiellement de 6 à 18 atomes de carbone et plus particulièrement 12 à 18 atomes de carbone.
Comme indiqué ci-dessus, ces copolymères d'AMPS peuvent contenir en outre un ou plusieurs monomères éthyléniquement insaturés ne comportant pas de chaîne grasse, tels que les acides (méth)acryliques, leurs dérivés alkyl substitués en p ou leurs esters obtenus avec des monoalcools ou des mono- ou polyalkylèneglycols, les (méth)acrylamides, la vinylpyrrolidone, l'anhydride maléique,
l'acide itaconique, l'acide maléique, les monomères cationiques ou les mélanges de ces composés.
De tels copolymères d'AMPS sont décrits notamment dans la demande de brevet EP-A-750899, le brevet US-A-5,089,578 et dans les publications de Yotaro Morishima suivantes : - Self-assembling amphiphilic polyelectrolytes and their nanostructures Chinese Journal of Polymer Science Vol. 18, N 40, (2000), 323-336 ; - Miscelle formation of random copolymers of sodium 2-(acrylamido)-2methylpropanesulfonate and a non-ionic surfactant macromonomer in water as studied by fluorescence and dynamic light scattering - Macromolecules 2000, Vol.
33, N 10 - 3694-3704 ; - Solution properties of miscelle networks formed by non-ionic moieties covalently bound to an polyelectrolyte : salt effects on rheological behavior Langmuir, 2000, Vo1.16, N 12, 5324-5332 ; Stimuli responsive amphiphilic copolymers of sodium 2-(acrylamido)-2methylpropanesulfonate and associative macromonomers - Polym. Preprint, Div.
Polym. Chem. 1999, 40(2), 220-221 .
Les monomères hydrophobes à insaturation éthylénique de ces copolymères particuliers sont choisis de préférence parmi les acrylates, alkylacrylates, acrylamides ou alkylacrylamides de formule (I) suivante : dans laquelle R, et R3, identiques ou différents, désignent un atome d'hydrogène ou un radical alkyle linéaire ou ramifié en (C1-C6) (de préférence méthyle) ; Y désigne 0 ou NH ; R2 désigne un radical hydrocarboné hydrophobe comportant au moins de 6 à 30 atomes de carbone, plus préférentiellement de 6 à 22 atomes de carbone, encore plus préférentiellement de 6 à 18 atomes de carbone et plus particulièrement de 12 à 18 atomes de carbone ; x désigne un nombre de moles d'oxyde d'alkylène et varie de 0 à 100.
Le radical R2 est choisi de préférence parmi les radicaux alkyle en C6-C18 linéaires (par exemple n-hexyle, n-octyle, n-décyle, n-hexadécyle, n-dodécyle), ramifiés ou cycliques (par exemple cyclododécane (C12) ou adamantane (C10)) ; les radicaux alkylperfluorés en C6-C18 (par exemple le groupement de formule -(CH2)2-(CF2)g- CF3) ; le radical cholestéryle (C27) ou un reste d'ester de cholestérol comme le groupe oxyhexanoate de cholestéryle ; les groupes polycycliques aromatiques comme le naphtalène ou le pyrène. Parmi ces radicaux, on préfère plus
particulièrement les radicaux alkyle linéaires et plus particulièrement les radicaux n-dodécyle, n-hexadecyle, n-octadécyle ou leur mélanges.
Selon une forme particulièrement préférée de l'invention, le monomère de formule (I) comporte au moins un motif oxyde d'alkylène (x # 1), et de préférence plusieurs motifs oxyde d'alkylène constituant une chaîne polyoxyalkylénée. La chaîne polyoxyalkylénée, de façon préférentielle, est constituée de motifs oxyde d'éthylène et/ou de motifs oxyde de propylène. De manière préférée, le monomère de formule (I) comporte uniquement des motifs de motifs oxyde d'éthylène. Le nombre de motifs oxyalkylénés (ou nombre de moles d'oxyde d'alkylène) varie en général de 3 à 100, plus préférentiellement de 3 à 50 et encore plus préférentiellement de 7 à 25.
Parmi ces polymères, on peut citer : - les copolymères non réticulés, neutralisés ou non, comportant de 15 à 60 % en poids de motifs AMPS et de 40 à 85 % en poids de motifs (C,-Cl6)alkyl(méth)acrylamide ou de motifs (C$ C,6)alkyl(méth)acrylate par rapport au polymère, tels que ceux décrits dans le document EP-A-750 899 ; - les terpolymères comportant de 10 à 90% en mole de motifs acrylamide, de 0,1 à 10% en mole de motifs AMPS et de 5 à 80% en mole de motifs n-(C6-C18)alkylacrylamide, tels que ceux décrits dans le document US-A- 5,089,578.
On peut également citer les copolymères d'AMPS totalement neutralisé et de méthacrylate de dodécyle, de n-hexadécyle et/ou de n-octadécyle, ainsi que les copolymères d'AMPS et de n-dodécylméthacrylamide, non-réticulés, tels que ceux décrits dans les articles de Morishima cités ci-dessus.
On peut citer plus particulièrement les copolymères constitués de motifs acide 2acrylamido-2-méthylpropane-sulfonique (AMPS) de formule (II) suivante : dans laquelle X+ est un proton, un cation de métal alcalin, un cation alcalinoterreux ou l'ion ammonium, et de motifs de formule (III) suivante :
dans laquelle x désigne un nombre entier variant de 3 à 100, de préférence de 5 à 80 et plus préférentiellement de 7 à 25 ; R, a la même signification que celle indiquée ci-dessus dans la formule (1) et R4 désigne un alkyle linéaire ou ramifié en C6-C22 et plus préférentiellement en C10-C22.
Les polymères particulièrement préférés sont obtenus à partir de motifs AMPS de formule (II) et de motifs de formule (III) où x = 8, R, désigne le radical méthyle (CH3) et R4 = C16-18.
Les polymères pour lesquels X+ désigne le sodium ou l'ammonium sont plus particulièrement préférés.
Ainsi, pour chaque secteur du Genedisc, les 120 l de mélange réactionnel ont été déposés dans un compartiment du réservoir central. Le mélange a ensuite été desservi dans les chambres réactionnelles contenant les pré-dépôts de trios , couples d'amorces et sondes associées, et de Tween20 à des concentrations respectives de 200 nM et 0,01 % pour 10 l finals.
1-4- Mise en oeuvre de l'étape d'amplifications multiples retape b) du procédé objet de l'inventionl : Le nombre de cycles d'amplification effectués au cours de cette étape a varié entre 40 et 45.
Comme indiqué dans le paragraphe 1-3 précédent, du Tween20, à une concentration finale de 0,01 %, ainsi que les couples d'amorces et sondes spécifiques de L. monocytogenes et B. cereus, à une concentration finale de 200 nM, avaient préalablement été déposés dans les chambres réactionnelles du secteur correspondant, à raison d'une répartition de 8 chambres par microorganisme à détecter, soit un total de 16 chambres réactionnelles.
La PCR rotative a permis,d'obtenir des courbes d'amplification dans le cadre des deux détections, avec des cycles seuils (cycles à partir desquels la fluorescence est significativement plus élevée que le bruit de fond ; Ct) moyens respectifs de 25,2 0. 84 cycles et 29,5 0,55 cycles pour B. cereus (Figure 11) et L. monocytogenes (Figure 3).
II-2- Comparaison de la mise en #uvre manuelle vs automatisée, à l'aide du Genedisc#: Deux échantillons d'acides nucléiques extraits de steak haché enrichi en L. monocytogenes ont été soumis à une amplification par PCR dans un volume réactionnel final de 10 l, d'une part manuellement, par un expérimentateur, dans le iCycler# (Bio-Rad, Marne la Coquette, France), et d'autre part de manière automatisée, à l'aide du Genedisc, dans le Genedisc Cycler (GeneSystems, Bruz, France).
Les extraits d'ADN ont été dilués au 10eme avant d'être ajoutés au mélange réactionnel.
Les Ct moyens calculés par les deux appareils étaient comparables, avec des valeurs de 26,4 1,7 et 26,2 0,2 cycles pour le iCycler, et 26,3 0,3 et 25,8 0,1 pour le Genedisc Cycler.
II-3- Amplification des acides nucléiques extraits de cultures pures par des couples d'amorces et sondes associées spécifiques d'espèces, genres ou groupes bactériens : 11-3-1- Microorganismes étudiés : Les amplifications ont été effectuées dans un volume réactionnel final de 10 l, sur des gammes de dilution au 10ème d'échantillons d'acides nucléiques extraits de cultures pures de Listeria monocytogenes (11 souches), Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria welshimeri, Salmonella spp. (27 sérovars), Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Campylobacter jejuni, . Çampylobacter coli, Campylobacter lari, Escherichia coli (4 souches), Clostridium perfringens, Proteus vulgaris, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus durans, Pseudômonas stutzeri, Shigella flexneri, Morganella morganii, Hafnia alvei, Providencia rettgeri, Serratia marcescens, Enterobacter aerogenes et Enterobacter cloacae (2 souches), en utilisant les couples d'amorces et sondes associées objets de la présente invention.
11-3-2- Séquences dessinées pour la détection de Listeria monocytogenes : Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour la détection de L. monocytogenes ont permis d'obtenir des courbes d'amplification en temps réel spécifique de cette espèce, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 1). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu avec les autres espèces de Listeria, pas plus qu'avec les bactéries étudiées appartenant à d'autres genres que Listeria. Le produit d'amplification (SEQ. ID n 25 et 26 ci-dessous) a été
purifié et sa séquence déterminée sur les deux brins en utilisant les amorces LmHlyAf (SEQ ID n 1) et LmHlyAr (SEQ ID n 2). La séquence SEQ ID n 25 a été obtenue en utilisant l'amorce LmHlyAr (SEQ ID n 2).
Les nucléotides situés entre les positions 72 et 92, soulignés dans la séquence SEQ ID n 25 ci-dessous, représentent la séquence complémentaire de l'amorce LmHlyAf (SEQ ID n 1). La séquence SEQ ID n 26 a été déterminée à l'aide de l'amorce LmHlyAf (SEQ ID n 1).
Les nucléotides soulignés, situés entre les positions 74 et 94 de la séquence SEQ ID n 26 ci-dessous, représentent la séquence complémentaire de l'amorce LmHlyAr (SEQ ID n 2). La séquence du produit d'amplification ainsi déterminée sur chaque brin et correspondant aux séquences SEQ ID n 25 et SEQ ID n 26, était identique à la séquence cible recherchée.
SEQ ID n 25 5'ATACATTGTTTTTATTGTAATCCAATCCTTGTATATACTTATCGATTT CATGCCGCGTGTTTCTTTTCGATTGGCGTCTTAGGACTTGCAGG 3' SEQ ID n 26 .
5'CGAAAAGAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATT GGATTACAATATAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTG3' 11-3-3- Séquences dessinées pour la détection de Salmonella spp. : Les couple d'amorces et sonde associée dessinés pour l'amplification d'une séquence de Salmonella spp. ont permis d'amplifier un fragment de la taille attendue, et ce, de manière spécifique, avec une sensibilité de 1 à 10 copies d'équivalents d'ADN génomique par réaction PCR (Figure 3). Aucun produit d'amplification n'a été obtenu au cours des réactions réalisées sur les extraits provenant des autres genres bactériens étudiés. La taille du produit d'amplification estimée par électrophorèse sur gel d'agarose était conforme à la taille attendue, à savoir 98 pb (Figure 4).
Il est capable de les ordonner selon une règle, et de les enchaîner lors de la diffusion.
Dans le cas où le système enchaîne plusieurs messages, la bibliothèque de messages types prévoit des locutions différentes, suivant que le message est diffusé en début, ou à la suite d'un autre.
Le système prévoit aussi des messages types de non événement", diffusés toutes les 15 minutes (par exemple : le trafic est fluide"...), et des phrases types de fins de messages ( restez vigilants, 107,7 FM vous tient informés ...).
Enfin, lorsqu'un événement saisi disparaît, un message type pour annoncer la fin de l'événement est également engendré (concernant l'accident signalé sur l'autoroute A XX, au point kilométrique X, il n'y a plus de gêne à la circulation).
En pratique, les messages créés dans la base DB sont lus dès leur première génération, puis toutes les 10 minutes jusqu'à disparition de la fiche, lorsque l'événement perturbateur est considéré comme terminé.
La lecture utilise un logiciel du commerce, ELAN Text to Speech , qui assure uniquement la mise en synthèse vocale des messages créés.