INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Parmi les éthers de cellulose non ioniques ne comportant pas de chaîne grasse en C8-C30, on peut citer les alkyl(C1-C4)celluloses, telles que les méthylcelluloses et les éthylcelluloses ; les hydroxyalkyl(C1- C4)celluloses, telles que les hydroxyméthylcelluloses ; les hydroxyéthylcelluloses et les hydroxypropylcelluloses ; les celluloses mixtes hydroxyalkyl(C1-C4)-alkyl(C1-C4)celluloses, telles que les hydroxypropyl-méthylcelluloses, les hydroxyéthyl-méthylcelluloses, les hydroxyéthyl-éthylcelluloses, et les hydroxbutyl-méthylcelluloses.
TEST D'ACTIVITÉ ENDONUCLÉASIQUE La présente invention concerne, de manière générale, une méthode permettant de tester l'activité de clivage d'une endonucléase présentant un type de coupure décalée, comprenant les étapes suivantes :
- mettre en présence, dans des conditions propices à l'activité de coupure, une endonucléase et un substrat, ledit substrat étant un ADN double-brin comprenant deux sites de coupure ; et - détecter la présence de substrat ADN coupé aux deux sites.
Avantageusement, la détection du substrat coupé aux deux sites comprend une étape préalable de discrimination entre les substrats coupés aux deux sites et les substrats non coupés aux deux sites.
Ainsi, selon un mode particulier, la présente invention concerne une méthode permettant de tester l'activité de clivage d'une endonucléase présentant un type de coupure décalée, comprenant les étapes suivantes : 1) fournir un substrat ADN double-brin comprenant deux sites de coupure; 2) fournir ladite endonucléase ; 3) mettre en présence ladite endonucléase et ledit substrat ADN dans des conditions propices à l'activité de coupure ; 4) discriminer les substrats ADN coupés aux deux sites et les substrats ADN non coupés aux deux sites ; 5) détecter le substrat ADN coupé aux deux sites; la détection dudit substrat ADN coupé révélant l'activité de clivage de ladite endonucléase.
Par discriminer est entendu la séparation des deux types de substrat : les substrats coupés aux deux sites et les substrats non-coupés aux deux sites. La séparation peut être faite par séparation physique des deux types de substrats, par dégradation du substrat non coupé, par amplification sélective des substrats coupés aux deux sites, ou une combinaison de ces méthodes.
Cependant les deux sites de coupures peuvent être différents : soit l'un constant et l'autre variable, soit les deux constants ou variables.
Dans un mode de réalisation préféré, la discrimination consiste en la dégradation du substrat ADN non coupé aux deux sites par une exonucléase incapable de dégrader le substrat ADN coupé aux deux sites. Facultativement, ladite exonucléase est inactivée après l'étape de discrimination, plus particulièrement avant l'étape 5) de détection. Lorsque ladite endonucléase possède un type de coupure décalée, plus particulièrement d'au moins 4 nucléotides, générant une extrémité 3' sortante, ladite exonucléase est de préférence l'exonucléase III. Lorsque ladite endonucléase possède un type de coupure décalée, plus particulièrement d'au moins 4 nucléotides, générant une extrémité 5' sortante, ladite exonucléase est de préférence l'exonucléase Lambda.
Dans un autre mode de réalisation, la discrimination consiste en la séparation des substrats ADN coupés aux deux sites et non coupés aux deux sites . De préférence, ledit substrat ADN initial porte à au moins une de ses extrémités, de préférence aux deux, un ligand (par exemple, une biotine), ce ligand n'étant plus présent après la coupure du substrat ADN. Lors de l'étape de discrimination, le substrat ADN non coupé est éliminé par liaison non covalente avec une molécule ou cible présentant une affinité pour le ligand, cette molécule étant de préférence immobilisée sur un support solide. De préférence, le ligand, la cible et le support solide sont respectivement la biotine, la streptavidine et une bille paramagnétique.
Dans un mode de réalisation additionnel, la discrimination consiste en l'amplification sélective des substrats ADN coupés. De préférence, cette amplification sélective est faite par une PCR utilisant des amorces spécifiques d'une séquence présente uniquement sur des adaptateurs capables de s'hybrider à au moins une extrémité du substrat ADN coupé. Ainsi, des adaptateurs capables de s'hybrider à au moins une des extrémités sortantes générées par la coupure de l'endonucléase sur le substrat ADN, de préférence aux deux, sont ajoutés et sont soit liés covalemment par l'action d'une ligase soit intégrés dans le substrat ADN par élongation, lesdits adaptateurs permettant d'introduire une séquence non présente sur le substrat ADN utilisée pour les amorces de PCR.
Dans une alternative également envisagée, le substrat ADN comprend un site de coupure testé avec l'endonucléase étudiée et un autre site de coupure pour une autre endonucléase. Cette autre endonucléase doit présenter un type de coupure décalée. Lorsque l'étape de discrimination implique une digestion par une exonucléase, un même type de coupure que l'endonucléase étudiée est nécessaire. Dans cette alternative, la méthode comprend en outre la fourniture de cette
Un point d'une courbe elliptique peut être représenté par plusieurs types de coordonnées, par exemple par des coordonnées affines ou des coordonnées projectives de Jacobi.
Il existe différents modèles pour définir une courbe elliptique applicable en cryptographie. Un modèle couramment utilisé est le modèle dit de Weierstrass. Le modèle de Weierstrass est très général puisque toute courbe elliptique peut se ramener sous ce modèle.
Chaque modèle peut être utilisé à l'aide des différents types de coordonnées.
Par exemple, en coordonnées affines et dans le cas où la caractéristique p du corps K est différente de 2 et 3, le modèle de Weierstrass est défini de la manière suivante : le point neutre 0 (le point à l'infini dans le modèle de Weierstrass) et l'ensemble des points (X, Y) e K#K vérifiant l'équation : E/9(: y2 = X3 + a*X + b (Fl) avec a, b E X tels que 4a3 + 27b2 * 0, forment le groupe des points rationnels d'une courbe elliptique E(K). Le point P peut aussi être représenté par des coordonnées projectives de Jacobi de la forme générale (U V ,W).
(X, Y) et (U ,V ,W) sont liées par les relations suivantes : X = U/W et Y = V/W2 (F2)
Avec ces coordonnées projectives de Jacobi, l'équation de Weierstrass d'une courbe elliptique devient : E/9( : V2 = U3 + a*UW4 + b*W6 (F3) Les coordonnées projectives sont notamment intéressantes dans les calculs d'exponentiation appliqués à des points d'une courbe elliptique, car ils ne comportent pas de calculs d'inversion dans le corps.
Comme le montrent la formule F2, un même point a plusieurs représentations possibles en coordonnées projectives de Jacobi. Aussi, on définit sur \ {(0, 0, 0)}, la relation d'équivalence suivante : deux éléments, de coordonnées (U ,V , W) et (U', V', W') sont dits équivalents et appartiennent à une même classe d'équivalence si et seulement si il existe un élément non nul de K tel que (U', V, W, %1,U, %12V, W) (F4) Les coordonnées d'un l'élément de cette classe sont notées (U : V : W).
Selon le modèle qui définit la courbe elliptique et selon les coordonnées avec lesquelles on travaille, différentes formules d'addition, de soustraction et de doublement de points sont applicables. Dans le cas du modèle de Weierstrass, de telles formules sont connues et données par la règle bien connue de la sécante et de la tangente.
Dans l'exemple d'une courbe elliptique E donnée par un modèle de Weierstrass en coordonnées affines sur un corps de caractéristique différente de 2 et 3, les formules d'addition, de soustraction et de doublement de points les plus simples sont les suivantes.
L'inverse d'un point P1 = (X1, Yl) de la courbe E est le point - P1 = (Xi, Y1) avec Yl = - Yl (F5)
L'opération d'addition des points P1 de coordonnées (X1, Yl) et P2 de coordonnées (X2, Y2) de cette courbe, avec P1 # - P2, donne le point P3 = P1 + P2 dont les coordonnées (X3, Y3) sont telles que : X3 = X 2 - XI - X2 (F6) Y3 = ')."X(X1-X3) - Yl, (F7) avec # = (Y1-Y2)/(X1-X2), si P1 # P2 (F8) # = (3xX12+a) / (2XY1), si P1 = P2 (F9) La formule F8 est utilisée pour additionner deux points distincts (P3 = P1 + P2) tandis que la formule F9 est utilisée pour une opération de doublement de point (P3 = 2XP1) .
Les formules F6 à F9 ne sont pas valables lorsque P1 et ou P2 est égal au point neutre 0. Le plus souvent, en pratique, on ne réalise pas d'opération de type P3 = P1 + 0. Plus simplement, avant la réalisation d'une opération d'addition de type P3 = P1 + P2, il est testé si l'un au moins des points est égal au neutre 0.
On réalise alors l'opération P3 = P1 si P1 = 0 ou P3 = P2 si P2 = O.
Les opérations d'addition ou soustraction, de doublement d'un point et l'opération d'addition du neutre sont les opérations de base utilisées dans les algorithmes de multiplication scalaire sur les courbes elliptiques : étant donné un point P1 appartenant à une courbe elliptique E et d un nombre prédéterminé (un entier), le résultat de la multiplication scalaire du point P1 par le nombre d est un point P2 de la courbe E tel que P2 = dXP1 = Pi + Pi +... + Pl, d fois. A noter que si P1 est d'ordre n , alors nxP1 = O, (n+l)xPl = P1+ O = P1 etc., O étant le point neutre.
Les algorithmes cryptographiques à clé publique sur courbe elliptique sont basés sur la multiplication scalaire d'un point P1 sélectionné sur la courbe, par un nombre prédéterminé d, une clé secrète. Le résultat de
cette multiplication scalaire dxpl est un point P2 de la courbe elliptique. Dans un exemple d'application au chiffrement selon le procédé de El Gamal, le point P2 obtenu est la clé publique qui sert au chiffrement d'un message.
La composition selon l'invention présente de préférence une viscosité allant de 0,1 Pa. s (soit 1 poise) à 23 Pa. s (230 poises), de préférence de 0,1 Pa. s (1 poise) à 15 Pa. s. (150 poises), cette viscosité étant mesurée à la température ambiante (25 C) avec l'appareil RM180 Rheomat de la société METTLER.
La composition selon l'invention a généralement un pH allant de 4 à 9, mieux de 6 à 8 et encore mieux de 6,5 à 8.
Polymères amphiphiles Les polymères amphiphiles non réticulés utilisés selon l'invention sont des polymères susceptibles d'être obtenus à partir d'au moins un monomère
hydrophile A à insaturation éthylénique et d'au moins un monomère hydrophobe B. Ils sont solubles ou dispersibles dans l'eau, sous forme neutralisée.
Le monomère A comporte au moins un hétéroatome qui peut être un atome d'oxygène, un atome d'azote, un atome de soufre, un atome de phosphore, un atome de chlore, un atome de fluor ou leurs mélanges. De préférence, le monomère A comporte une fonction acide fort, en particulier, une fonction acide sulfonique ou acide phosphonique.
Le monomère hydrophobe B comporte au moins un radical hydrophobe choisi parmi: - les radicaux alkyle en C6-C50, saturés ou insaturés, linéaires (par exemple nhexyle, n-octyle, n-décyle, n-dodécyle, n-hexadécyle, n-octadécyle, n-béhényle, oléyle), ramifiés (par exemple isostéarique) ou cycliques (par exemple cyclododécane ou adamantane) ; - les radicaux fluorés ou alkylfluorés en C6-C30 (par exemple le groupement de formule -(CH2)2-(CF2)9-CF3) ; - le radical cholestéryle ou les radicaux dérivés de cholestérol (par exemple l'hexanoate de cholestéryle) ; - les groupes polycycliques aromatiques comme le naphtalène ou le pyrène ; - les radicaux siliconés ou alkylsiliconés ou encore alkylfluorosiliconés.
Parmi ces radicaux, on préfère plus particulièrement les radicaux alkyle, linéaires et ramifiés. De préférence, le monomère hydrophobe est une chaîne alkyle comportant de 6 à 30 atomes de carbone, plus préférentiellement de 6 à 22 atomes de carbone et encore plus préférentiellement de 6 à 18 atomes et plus particulièrement de 12 à 18 atomes de carbone.
De façon préférentielle, les polymères conformes à l'invention sont neutralisés partiellement ou totalement par une base minérale (soude, potasse, ammoniaque) ou une base organique telle que la mono-, di- ou tri-éthanolamine, un aminométhylpropanediol, la N-méthyl-glucamine, les acides aminés basiques comme l'arginine et la lysine, et les mélanges de ces composés.
En particulier, les polymères utilisés conformément à l'invention sont de préférence des polymères amphiphiles susceptibles d'être obtenus à partir d'au moins un monomère à insaturation éthylénique à groupement sulfonique, sous forme libre ou partiellement ou totalement neutralisée, et d'au moins un monomère hydrophobe.
Les monomères à insaturation éthylènique à groupement sulfonique peuvent être choisis notamment parmi l'acide vinylsulfonique, l'acide styrènesulfonique, les acides (méth)acrylamido(C1-C22)alkylsulfoniques, les acides N-(C,-C22)alkyl-
(méth)acrylamido(C1-C22)alkylsulfoniques comme l'acide undécyl-acrylamidométhane-sulfonique, ainsi que leurs formes partiellement ou totalement neutralisées, et leurs mélanges.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise comme monomères à insaturation éthylénique à groupement sulfonique, les acides (méth)acrylamido(C1-C22)alkylsulfoniques tels que par exemple l'acide acrylamidométhane-sulfonique, l'acide acrylamido-éthane-sulfonique, l'acide acrylamidopropane-sulfonique, l'acide 2-acrylamido-2-méthylpropane-sulfonique, l'acide 2méthacrylamido-2-méthylpropane-sulfonique, l'acide 2-acrylamido-n-butanesulfonique, l'acide 2-acrylamido-2,4,4-triméthylpentane-sulfonique, l'acide 2méthacrylamido-dodécyl-sulfonique, l'acide 2-acrylamido-2,6-diméthyl-3-heptanesulfonique, ainsi que leurs formes partiellement ou totalement neutralisées, et leurs mélanges.
Plus particulièrement, on utilise l'acide 2-acrylamido-2-méthylpropane-sulfonique (AMPS) ainsi que ses formes partiellement ou totalement neutralisées.
Les polymères amphiphiles conformes à l'invention peuvent notamment être choisis parmi les polymères amphiphiles statistiques d'AMPS modifiés par réaction avec une n-monoalkylamine ou une di-n-alkylamine en C6-C22, tels que ceux décrits dans le document WO-A-00/31154 (faisant partie intégrante du contenu de la description). Ils peuvent également être choisis parmi les polymères décrits dans les documents EP-A-1,069,142 et EP-A-1,138,703 (faisant partie intégrante du contenu de la description).
A côté des monomères indiqués ci-dessus, ces polymères peuvent également contenir d'autres monomères hydrophiles éthyléniquement insaturés (ne comportant pas de chaîne grasse hydrophobe) choisis par exemple parmi les acides (méth)acryliques, leurs dérivés alkyl substitués en p ou leurs esters obtenus avec des monoalcools ou des mono- ou poly- alkylèneglycols, les (méth)acrylamides, la vinylpyrrolidone, l'anhydride maléique, l'acide itaconique, l'acide maléique, des monomères cationiques tels que le chlorure de diallyl diméthylammonium, ou les mélanges de ces composés.
On a montré qu'un produit immunogène de l'invention, tel que défini ci-dessus, était stable en solution aqueuse. La stabilité d'un produit immunogène de l'invention est notamment caractérisée en ce que ledit produit immunogène possède un point isoélectrique propre, distinct du point isoélectrique d'au moins l'un de ses constituants protéiques, respectivement la protéine antigénique (i) et la molécule protéique porteuse (ii), et qu'il migre en conséquence selon une bande protéique distincte d'au moins l'une des bandes protéiques correspondant respectivement aux deux éléments protéiques qui le constituent dans des essais d'isoélectrofocalisation.
On a aussi observé , par des essais d'immuno-empreintes ( Western blot ), que le produit immunogène de l'invention migrait en gel d'électrophorèse, en conditions non dénaturantes, selon une seule bande protéique, ce qui illustre le fait que ledit produit immunogène se présente sous la forme d'une population homogène de constructions protéiques solubles.
De plus, on a montré que la protéine antigénique (i) ainsi que la molécule protéique (ii), incluses sous forme d'hétérocomplexes protéiques dans le produit immunogène de l'invention, étaient toutes les deux reconnues par des anticorps reconnaissant spécifiquement chacune de ces protéines.
Ainsi, le produit immunogène selon l'invention comprend la protéine
antigénique (i) et la molécule protéique porteuse (ii) dans leur conformation native. Cette caractéristique technique du produit immunogène selon l'invention est particulièrement avantageuse pour l'induction d'une réponse immunitaire à l'encontre des antigènes natifs, c'est-à-dire d'une réponse immunitaire efficace et réellement protectrice de l'organisme hôte. On a montré en particulier qu'un produit immunogène selon l'invention induisait, dans l'organisme hôte dans lequel il était administré, l'induction d'une forte réponse humorale efficace à l'encontre des antigènes natifs accompagnée de la production d'anticorps neutralisants ou bloquants vis-à-vis de l'activité biologique délétère de ces antigènes natifs.
On a montré selon l'invention, avec divers antigènes d'intérêt, que la réponse immunitaire humorale obtenue avec un produit immunogène te! que défini ci-dessus était supérieure de 10 à 1000 fois à la réponse immunitaire humorale obtenue avec une administration d'un conjugué covalent classique entre l'antigène d'intérêt et la molécule protéique porteuse.
De préférence, dans un hétérocomplexe immunogène inclus dans le produit immunogène de l'invention, la pluralité de protéines antigéniques (i) est constituée d'une pluralité d'exemplaires d'une protéine antigénique unique.
Ainsi, selon un mode de réalisation tout à fait préféré, le produit immunogène de l'invention est mis en #uvre pour l'obtention d'anticorps spécifiques à l'encontre d'un seul antigène d'intérêt.
On a aussi montré selon l'invention qu'un produit immunogène comprenant des hétérocomplexes immunogènes tels que définis ci-dessus était particulièrement bien adapté à l'immunisation d'un individu, par la production d'anticorps, à l'encontre d'un antigène d'intérêt du soi ( self antigen ), c'est à dire à l'encontre d'une protéine produite normalement par ledit individu, pour laquelle il existe une tolérance du système immunitaire, en particulier une délétion au moins partielle des clones de lymphocytes T auxiliaires (cellules T helper) reconnaissant spécifiquement ledit antigène.
En d'autres termes, la présentation d'un antigène du soi aux cellules du système immunitaire dudit individu, sous la forme du produit immunogène comprenant des hétérocomplexes immunogènes de l'invention, permet de casser la tolérance du système immunitaire de l'individu vis-àvis de cet antigène. Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le
demandeur pense que la possibilité d'obtenir un haut niveau de réponse anticorps à l'encontre d'un antigène du soi est due à la présence, au sein de l'hétérocomplexe, de nombreux épitopes de type T auxiliaire (ou T helper) portés par la molécule protéique porteuse, qui activent les lymphocytes T auxiliaires, et que les diverses cytokines produites par les lymphocytes T auxiliaires activés, notamment l'IL-2, permet de promouvoir une activation des cellules B à des antigènes du soi présentes à l'état dormant dans l'organisme, et de rompre ainsi la tolérance immunitaire des cellules B aux antigènes du soi .
Ainsi, selon un mode de réalisation préférentiel, le produit immunogène de l'invention est caractérisé en ce que les protéines antigéniques (i) sont constituées d'une pluralité d'exemplaires d'une protéine normalement reconnue comme une protéine du soi par les cellules du système immunitaire dudit sujet.
Du fait que la plus grande proportion, plus de 60 pour cent, des associations entre l'antigène d'intérêt et la molécule protéique porteuse sont réalisées par des interactions non covalentes, il n'existe aucune limitation théorique dans le nombre de molécules d'antigène d'intérêt associées à une unique molécule protéique porteuse, autre que l'accessibilité stérique des molécules d'antigène d'intérêt à cette molécule porteuse. En particulier, le nombre de molécules d'antigène d'intérêt associées à une même molécule protéique porteuse n'est pas limitée par le nombre de fonctions chimiquement réactives portées par la molécule porteuse permettant la création de liaisons covalentes avec une pluralité de molécules de l'antigène d'intérêt. En conséquence, la seule limite physique semble être le nombre de sites de la molécule protéique porteuse (ii) qui sont accessibles à la protéine antigénique (i).
Pour les mêmes raisons, la taille de l'antigène d'intérêt à associer à la molécule protéique porteuse n'est pas non plus strictement limitée, l'antigène d'intérêt pouvant en conséquence consister en des protéines entières d'au moins 10 kDa, telles les différentes cytokines comme l'IL-4, l'IL-10, le VEGF ou encore l'interféron alpha.
En outre, même pour des antigènes d'intérêt consistant en des protéines entières d'un masse moléculaire supérieur à 10 kDa, un hétérocomplexe immunogène de l'invention peut comprendre une
association de plusieurs antigènes d'intérêt sur une seule molécule porteuse, si la taille de la protéine porteuse le permet.
Afin d'éluer l'ADN fixé sur la silice, 200 l de tampon CE préchauffé à 70 C ont été incubés 5 minutes sur la colonne.
Alternativement, si le lysat n'était pas purifié, 200 l étaient prélevés et stockés dans la glace en vue de l'analyse par PCR.
1-2-2- Extraction d'acides nucléiques à partir d'une matrice alimentaire : 25 g de matrice alimentaire ont été dilués dans 225 ml d'EPT [eau peptonée tamponnée (Biokar, Beauvais, France) ] ou de Fraser (Biokar), respectivement, pour les enrichissements en Salmonella spp. ou Listeria monocytogenes.
Le mélange a été homogénéisé à l'aide d'un stomacher pendant 3 minutes.
Les milieux ainsi obtenus ont été incubés 18 h à 37 C et 24 h à 30 C, respectivement, pour les enrichissements en Salmonella spp. et en L. monocytogenes.
Entre 1 et 10 ml de broyat alimentaire ont été prélevés et centrifugés 5 minutes à 500 x g afin d'éliminer les gros débris, Le., les particules de matrice alimentaire de grande taille.
Le surnageant a été récupéré puis centrifugé 3 minutes à 16 000 x g.
300 l de tampon TENS 2X - Chelex-100 15% ou de solution aqueuse de Chelex-100 à 25% ont été ajoutés au culot bactérien.
Ce mélange a été incubé entre 60 et 100 C aux fins de la lyse chimique (voir paragraphe 1-2-1- supra).
Comme décrit ci-dessus, le mélange pouvait, de manière alternative ou subséquente à la lyse chimique, être traité mécaniquement.
De manière facultative, le lysat a été purifié et concentré à l'aide du système Nucleospin Plant L (voir paragraphe 1-2-1- supra).
1-2-3- Extraction d'acides nucléiques à partir d'eau ; 250 à 1000 ml d'eau sont filtrés sur membrane en polycarbonate 0. 45 m (Sartorius). 1 à 4 ml (préférentiellement 2 ml) de tampon de TENS 2X - Chelex-100 15% ou de solution aqueuse de Chelex-100 à 25% sont ajoutés sur la membrane ayant retenu les bactérie. Ce mélange est incubé entre 60 et 100 C aux fins de la lyse chimique et peut de manière alternative ou subséquente être traité mécaniquement. Le lysat est ensuite purifié et concentré à l'aide du système Nucleospin Plant L .
I-3- Dépôts dans le Genedisc# : Comme indiqué dans la partie descriptive, la présente invention est susceptible d'être mise en #uvre au moyen d'une cartouche à usage unique décrite dans la demande de brevet US n 09/981070 bénéficiant de la priorité de la demande de brevet français publiée le 1er février 2002 sous le numéro 2812306. Le Genedisc commercialisé par GeneSystems (Bruz, France) est un exemple d'une telle cartouche.
Cette cartouche, et en particulier le Genedisc, est utilisable dans un dispositif de type automate pour l'amplification de séquences d'acides nucléiques, également décrit dans les demandes de brevet sus-citées.
Avantageusement, le Genedisc est divisé en secteurs identiques.
BLANOSE 9M31 F, BLANOSE 12M31XP, BLANOSE 12M31 P, BLANOSE 9M31XF , BLANOSE 7H, BLANOSE 7M31, BLANOSE 7H3SXF, par la société AQUALON, ou encore AQUASORB A500 et AMBERGUM 1221, par le société HERCULES, ou encore CELLOGEN HP810A et CELLOGEN HP6HS9, par la société MONTELLO, ou encore PRIMELLOSE par la société AVEBE.