INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Toute méthode de préparation d'organisme transgénique, particulièrement les méthodes appliquées aux végétaux peuvent être utilisées pour la préparation des organismes transgéniques de l'invention.
Les coordonnées atomiques de la structure tridimensionnelle des cristaux de la protéine C (60)V sont représentées sur la figure 2, lesdits cristaux présentant en outre les caractéristiques suivantes : - paramètre de mailles :
. a = 82.230 angstrôms, b = 118.610 angstrôms, c = 53.170 angstrôms, . a = p = 90.00 , y = 122. 74 - groupe d'espace : C2, - diffraction maximale = 2,6 angstrôms.
Les coordonnées atomiques de la structure tridimensionnelle des cristaux de la protéine C (60)V / S (144)L représentées sur la figure 3, lesdits cristaux présentant en outre les caractéristiques suivantes : - paramètre de mailles : . a = 81.072 angstrôms, b = 117.022 angstrôms, c = 53.170 angstrôms, . a = ss = 90.00 = 122.42 - groupe d'espace : C2, - diffraction maximale = 1,75 angstrôms.
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* tampon de lyse : phosphate de potassium 50 mM, pH 7,8 contenant 500 mM NaCl et 5 mM d'imidazole.
M. 2.3. Dialyse de la solution de H-MabApurifiée La solution de protéine MabA après purification, récupérée dans du glycérol 50% (v/v), est dialysée 2 fois 1 h contre 40 volumes de tampon phosphate de potassium 50 mM pH 7,2 contenant 50% (v/v) de glycérol, à 4 C, dans un tube de dialyse (seuil de coupure 8-10 kDa, Spectra/Por, Spectrum) préalablement bouilli dans une solution d'EDTA 1 mM pour éliminer les traces de métaux lourds, puis rincé à l'eau osmosée. Le dialysat est ensuite aliquoté et conservé à -20 C.
M. 2.4. Détermination de la quantité de protéine purifiée par spectroscopie U.V Nous avons estimé la concentration des solutions de protéine purifiée d'après la loi de Beer-Lambert (DO = #lC*) avec son coefficient d'extinction molaire théorique et son absorbance à 280 nm.
* #:coefficient d'extinction molaire, 1: longueur du trajet optique et C : concentration molaire.
Détermination théorique du coefficient d'extinction molaire (déduite de la séquence de la protéine) Les coefficients d'extinction molaire (CEM) de la protéine sont calculés d'après Gill et Von Hippel (Gill & von Hippel, 1989) (en présence de chlorure de guanidine 6M à pH 6,5). La relation est alors la suivante : CEM = (a * ETyr) + (b * ETrp) + (c * ECys) , où a, b et c sont respectivement le nombre de résidus, et Eaa leurs coefficients d'extinction molaire. A 280nm, ils sont respectivement égaux à : ETyr=1280 ETrp=5690 ECys=120 Le CEM (g) de MabA à 280nm est de 9530 M-1cm-1 et ne tient pas compte de l'unique résidu Cys.
M. 3. ETUDE DES PROPRIETES DE MABA M. 3.1. Détermination de la masse de H-MabA par spectrométrie de masse/ionisation électrospray (ESI/MS) Un culot de 2 mg de protéine H-MabA purifiée, précipitée dans du tampon sans glycérol, est lavé 5 fois à l'eau (5 min de centrifugation à 12000g). 200 l de mélange acétonitrile/eau (50/50) + TFA 0,1% (v/v) sont ajoutés, puis le tout est vortexé et centrifugé 2 min à 12000g. Un volume égal d'un mélange méthanol/eau (50/50) + acide acétique 0,5% (v/v) est ajouté à un aliquot du surnageant, l'ensemble est vortexé puis gardé 2h à 4 C avant d'être centrifugé 2 min à 12000g. 60 ni du surnageant sont introduits dans la source du spectromètre par l'intermédiaire d'une pompe seringue (HARVARD), à un débit de 5 l/min, pour être analysé par spectrométrie de masse/ionisation électrospray (ESI/MS) sur un appareil Finnigan MAT (TSQ 700). Les paramètres de la source ESI correspondent à une alimentation de 5kV, une température du capillaire intermédiaire de 250 C et à 40 psi pour le l'azote (gaz de nébulisation).
M. 3.2. Détermination de la taille native par filtration sur gel Les expériences de FPLC ont été réalisées avec le système BioCAD SPRINT (PerSeptive Biosystems, Cambridge, MA). Une colonne Sephacryl S-100 HR (HiPrepTM 16/60 Sephacryl High Resolution, Pharmacia) a été équilibrée avec 1 VC de tampon phosphate de potassium 50 mM, pH 6,8 contenant 100 mM NaCl. Cinq protéines standards de masses moléculaires connues, diluées dans ce même tampon, ont été appliquées sur la colonne (0,5 à 1 mg de chaque protéine): alcool deshydrogénase (150 kDa), albumine de sérum bovin (BSA, 67 kDa), ovalbumine (43 kDa), anhydrase carbonique (29 kDa) et RibonucléaseA (RNaseA, 13,7 kDa). Deux élutions successives ont été effectuées avec une combinaison différente de 3 protéines standards pour obtenir une meilleure résolution des pics, et les profils à 280 nm ont été superposés. La courbe de calibration a été obtenue en reportant le volume d'élution de chaque protéine standard en fonction du logarythme de la masse moléculaire. Une solution de H-MabA à 1,1 mg/ml (0,66 mg de protéine chargé) est déposée sur la colonne et éluée dans les mêmes conditions que les protéines standard. La masse moléculaire de H-MabA est estimée en se reportant à la courbe de calibration.
M.4. ETUDE ENZYMATIQUE DE MABA M. 4.1. Calibration des solutions de réactifs La détermination des paramètres cinétiques pour les différents substrats exige des conditions d'essai enzymatique reproductibles d'une manipulation à l'autre. Les concentrations des solutions de substrat p-cétoester de CoA et de cofacteur (NADPH) sont donc déterminées avant utilisation. Le réactif à calibrer (par exemple p-cétoester de CoA) est ajouté à une concentration largement inférieure à celle du second substrat (NADPH). La réaction est déclenchée avec une concentration en enzyme suffisante pour obtenir l'utilisation rapide du substrat en concentration limitante. La différence de DO340 observée permet de déduire la concentration réelle de ce substrat p-cétoester de CoA dans la réaction.
M.4.1.2. Description du test enzymatique L'activité catalytique de MabA purifiée a été démontrée par spectrophotométrie en présence d'acétoacétyl-CoA et de NADPH.
La cinétique de la réaction de p-cétoacyl réduction est suivie par la mesure de l'absorbance à 340 nm au cours du temps, qui décroît avec l'oxydation du NADPH. La réaction enzymatique est effectuée dans un volume final de 1 ml (en cuve de quartz, trajet optique 1 cm). Le spectrophotomètre (UVIKON 923, Bio-Tek Kontron Instruments) est relié à un bain thermostaté permettant de réguler la température de la cuve à 25 C. Une ligne de base est effectuée en absence d'enzyme. Le mélange réactionnel comprend 80 mM de tampon phosphate de sodium, et des concentrations variables en NADPH et p-cétoacyl-CoA. La réaction est déclenchée par l'addition de l'enzyme (36 nM à 144 nM). Les mesures sont effectuées sur 3 à 5 min.
Le Km pour le NADPH a été déterminé avec des concentrations en coenzyme variant de 5 à 200 M et à concentration fixe (460 M) en acétoacétyl-CoA. Les Km pour les -cétoacyl-CoA ont été déterminés à concentration fixe, 100 M, en NADPH. Une concentration supérieure à 100 M entraînait un bruit de fond trop important au niveau des mesures. Il a été vérifié, en outre, que cette concentration était saturante.
Les Km et Vmax pour les -cétoacyl-CoA ont été mesurés avec les concentrations suivantes: pour l'acétoacétyl-CoA (C4), 100-8570 M; pour le ss-cétooctanoyl-CoA (C8), 4-160 M; pour le ss-cûtododécanoyl-CoA (C12), 2-32 M. Pour le -cétohexadécanoyl-CoA et le -cétoeicosanoyl- CoA (C20), des problèmes d'inhibition par le substrat n'ont pu permettre de déterminer les paramètres cinétiques et la vitesse réactionnelle a été comparée à concentration fixe de 2 M.
Au moins deux séries de points expérimentaux ont été réalisés pour chaque paramètre cinétique. Lajustesse de ces points a été vérifiée graphiquement par la représentation "en doubles inverses", 1/v = f(l/[S]) (équation (1)). Les paramètres cinétiques ont ensuite été déterminés graphiquement d'après la représentation de Hanes [S] /v = f([S]) (équation (2)) ou par calcul d'après la méthode des moindres-carrés, avec le logiciel GraphPad Prism. Version 2.01.
Equation (1) (Lineweaver-Burk) Equation (2) (Hanes)
III) MUTAGENESE DE LA PROTEINE MabA ET METHODES DE PURIFICATION OPTIMALES DE LA PROTEINE MabA, ET DES PROTEINES MabA C (60)V, MabA S (144)L MabA C (60)V S(144)L 1) mutagénèse de la protéine MabA Le mutant MabA C (60)V été obtenu par mutagénèse dirigée après avoir effectuée une PCR inverse. Les amorces nucléotidiques ont été choisises de manière à modifier le codon 60 du gène mabA, à savoir remplacement de TGT (cystéine) en GTT (valine). Le plasmide pET15b::mabA a été utilisé en tant que support pour l'amplification PCR par l'ADN polymérase PfuTurbo (Stratagene, USA).
Les produits PCR ont été digérés avec l'endonucléase Dpnl afin de sélectionner les plasmides comportant le gène muté. Le gène muté a été entièrement séquence afin de vérifier l'absence de mutation secondaire. Le plasmide portant le gène mabA C (60)V (pET15b::mabA C (60)V) a ensuite été utilisé pour transformer la souche surproductrice BL21 (DE3).
Dans un mode de réalisation préféré, ledit substrat ADN contient deux sites de coupure.
De préférence, lesdits sites de coupure ont une localisation distale sur ledit substrat ADN. Plus particulièrement, ils sont situés aux extrémités du substrat ADN. Lesdits sites de coupure sont de préférence identiques. Lorsqu'ils sont identiques, ils ont de préférence une orientation inverse.
Cependant les deux sites de coupures peuvent être différents : soit l'un constant et l'autre variable soit les deux constants ou variables.
De préférence, ledit substrat ADN initial porte à au moins une de ses extrémités un ligand et que ladite séparation est faite avec la cible du ligand immobilisée sur un support solide. De
préférence, le ligand, la cible et le support solide sont respectivement la biotine, la streptavidine et une bille paramagnétique. De préférence, ledit substrat ADN porte un ligand à ses deux extrémités.
La présente invention concerne une méthode permettant de tester l'activité de clivage d'une endonucléase présentant un type de coupure décalée comprenant les étapes suivantes : 1) fournir un substrat ADN double-brin comprenant deux sites de coupure; 2) fournir ladite endonucléase ; 3) mettre en présence ladite endonucléase et ledit substrat ADN dans des conditions propices à l'activité de coupure ; 4) ajouter des adaptateurs capables de s'hybrider à au moins une des extrémités sortantes dudit substrat générées par la coupure de ladite endonucléase, de préférence aux deux extrémités, et soit les lier covalemment soit les intégrer audit substrat par élongation, lesdits adaptateurs permettant d'introduire une séquence non présente sur le substrat ADN; 5) amplifier spécifiquement lesdits substrat ADN coupés aux deux sites avec une amorce s'hybridant sur ladite séquence non présente ; 6) détecter le substrat ADN amplifié; la détection dudit substrat ADN amplifié révélant l'activité de clivage de ladite endonucléase.
Cependant les deux sites de coupures peuvent être différents : l'un constant et l'autre variable soit les deux constants ou variables. Dans un mode de réalisation préféré, ladite
endonucléase possède un type de coupure décalée d'au moins 4 nucléotides, de préférence de 4 nucléotides.
La taille du substrat ADN est de préférence comprise entre 100 et 3000 pb, plus particulièrement entre 300 et 1000 pb.
La composition selon l'invention peut être une composition à usage alimentaire, pharmaceutique, vétérinaire, (composition antimicrobienne ou conservatrice) ou bien entendu encore une composition à usage agricole (biopesticide et/ou désherbant).
L'invention a également pour objet un polynucléotide isolé, naturel ou synthétique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une séquence codant pour l'un au moins des peptides selon l'invention, à l'exception de l'acide désoxyribonucléique (ADN) génomique d'Arabidopsis thaliana.
Selon un mode de réalisation avantageux dudit polynucléotide, il comprend au moins l'une des séquences SEQ ID NO : 11 à SEQ ID NO : 20 suivantes : SEQ ID NO : 11 : ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 SEQ ID NO : 12 : ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA SEQ ID NO : 13 : ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT SEQ ID NO : 14 : ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA SEQ ID NO : 15 : ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG SEQ ID NO : 16 : ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG CGT SEQ ID NO : 17 : ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG CGT CTC SEQ ID NO : 18 : ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG CGT CTC R4 SEQ ID NO : 19 : ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG CGT CTC R4 CAT SEQ ID NO : 20 : ATG TGG TGG CTA GTT GGA CTT ACA CCA GTT GAG TTG ATC CAT CTT R3 GCA TTT CGA GAG CGT CTC R4 CAT CTC
dans laquelle R3 et R4 représentent, indépendamment ou simultanément, un codon cystéine ou un codon sérine.
Selon une disposition avantageuse de ce mode de réalisation, le polynucléotide selon l'invention répond à l'une des séquences SEQ ID NO : 11 à SEQ ID NO : 20, dans laquelle R3 et R4 représentent un codon cystéine ou un codon sérine.
Le polynucléotide selon l'invention peut être sous la forme d'acide désoxyribonucléique (ADN) ou d'acide ribonucléique (ARN), simple brin ou double brin.
Le polynucléotide selon l'invention peut être déduit de la séquence de l'un quelconque des peptides selon l'invention et synthétisé à l'aide d'un synthétiseur à ADN. Le polynucléotide peut également être obtenu à partir de banques d'ADN, particulièrement de banques d'ADN de cellules végétales, très particulièrement à partir d'une banque d'ADN de cellules d'Arabidopsis thaliana.
L'invention a également pour objet une composition comprenant, dans un milieu approprié, au moins un polynucléotide, tel que décrit précédemment, et au moins un véhicule approprié.
Pour l'expression desdits peptides selon l'invention, les polynucléotides peuvent avantageusement être introduits dans un vecteur approprié.
Le vecteur utilisé peut être tout vecteur connu de l'art antérieur. Particulièrement, on peut citer comme vecteurs utilisables selon l'invention les plasmides, les virus ou encore les bactériophages.
Parmi les plasmides utilisables selon l'invention, on peut citer ceux décrits par R. L. Rodriguez et D. T. Denhardt (A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston, 1998) ou encore par J.
Sambrook et al., (Molecular cloning, Cold Spring Arbor, 2001) Particulièrement, les vecteurs pMOSBIue, vendus par la société Amersham, les vecteurs pGEM-T et pGEM-T easy vendus par la société Promega ou encore les plasmides du type Agrobacterium Ti (H. De Greve et al., J. Mol.. Appl. Genet., 1, (1982), 499-511) peuvent avantageusement être utilisés.
Ledit vecteur peut comporter en outre toutes séquences
régulatrices requises pour la réplication du vecteur et/ou l'expression du peptide codé par le polynucléotide (promoteur, sites de terminaison, etc).
Dans une construction particulièrement intéressante, le polynucléotide selon l'invention est placé sous la dépendance d'un promoteur inductible, rendant ainsi la synthèse du peptide dépendante de conditions prédéfinies, par exemple de conditions environnementales, de la présence d'un agent pathogène ou d'un agent chimique.
L'invention a donc aussi pour objet un vecteur comprenant l'un quelconque des polynucléotides tels que décrits précédemment, comprenant ou répondant à l'une au moins des SEQ ID NO : 11à SEQ ID NO : 20 dans lesquelles R3 et R4 représentent, indépendamment ou simultanément, un codon cystéine ou un codon sérine.
Ceci abaisse la charge sur le moteur 2. En conséquence, l'énergie requise pour maintenir la vitesse de ralenti cible est réduite. La quantité d'injection de carburant est diminuée en conséquence. La consommation d'énergie est en conséquence réduite.
Une description complémentaire du processus de commande de température de catalyseur (figure 3) sera maintenant présentée. La description suivante sera donnée en supposant que la faible vitesse de moteur et que la faible charge de moteur continuent lors de la commande neutre, et qu'en raison d'une température d'échappement insuffisante et d'un débit d'échappement insuffisant, la température du catalyseur etempave du catalyseur de NOx 26 soit abaissée au-dessous de A (etempave < A). Dans ce cas, le résultat de l'étape S106 est positif, Fqup est établi actif (étape S110). Par la suite, le processus est temporairement suspendu.
En conséquence, le processus de commande d'injection de carburant (figure 4), le processus de commande de calage d'allumage (figure 5) et le processus de commande de changement de vitesse (figure 6) sont exécutés de la manière suivante.
Dans le processus de commande d'injection de carburant (figure 4) , étant donné que Fqup est actif (le résultat de l'étape S200 est positif), le calage d'injection de carburant est sélectionné d'une manière telle que le carburant est injecté pendant la course de compression (étape S208). Le rapport air-carburant cible AFt est établi au rapport air-carburant st#chiométrique (étape S210). En conséquence, la quantité de carburant Q est établie pour
correspondre au rapport air-carburant cible AFt et pour être injectée pendant la course de compression (étape S212).
Par la suite, le processus est temporairement suspendu. De cette manière, lorsque Fqup est actif, une combustion à charge stratifiée, exceptionnellement avec un rapport aircarburant stoechiométrique, est réalisée.
Dans le processus de commande de calage d'allumage (figure 5), le calage d'allumage demandé #e est établi pour correspondre à l'état de fonctionnement du moteur 2. De même, étant donné que Fqup est actif (le résultat de l'étape S302 est positif), une quantité de correction de retardement d'allumage #e est soustraite du calage d'allumage demandé 9e pour obtenir un calage d'allumage cible #t (étape S308).
#t = #e - #d (1) Les allumeurs sont réglés pour s'allumer au calage d'allumage cible #t (étape S306). Par la suite, le processus est temporairement suspendu. En conséquence, le calage d'allumage est retardé par la quantité de corrections de retardement d'allumage #d.
Dans le processus de commande de changement de vitesse (figure 6), lorsque le résultat des étapes S400 à S410, qui sont des conditions d'exécution de la commande neutre, est positif et que la commande est en cours d'exécution étant donné que Fqup est inactif, Fqup devient actif. Dans ce cas (un résultat négatif à l'étape S414), l'embrayage Cl est mis en prise (étape S418) dans la transmission automatique 6 dans l'état de commande neutre. Ensuite, le processus est temporairement suspendu. C'est-à-dire que la transmission automatique 6 est dans un état en prise équivalent à la mise en prise de la plage D .
En conséquence, la rotation de la turbine 42 est limitée, puis arrêtée par les roues motrices arrêtées. En
conséquence, la charge de rotation appliquée à l'impulseur 40 par le moteur 2 est augmentée. Ainsi, dans la commande de vitesse de ralenti, la quantité d'injection provenant de la soupape d'injection de carburant 10 est augmentée pour maintenir la vitesse du moteur NE à la vitesse de ralenti cible. De plus, comme on l'a décrit ci-dessus, une combustion à charge semi-stratifiée est exécutée au rapport air-carburant st#chiométrique dans le processus de commande d'injection de carburant (figure 4), ce qui augmente la température d'échappement et le débit d'échappement. Etant donné que le calage d'allumage est retardé dans le processus de commande de calage d'allumage (figure 5), la température d'échappement est davantage augmentée.
Une quantité importante de l'échappement chauffé est délivrée au catalyseur de NOx 26, ce qui augmente la température du catalyseur 26. Lorsque le catalyseur de NOx 26 est refroidi, une quantité importante d'échappement est délivrée au catalyseur de NOx 26. Cet état se produit seulement temporairement lorsque le mélange air-carburant n'est pas pauvre. En conséquence, le catalyseur de démarrage 24 et le catalyseur de NOx 26 fonctionnent tous les deux efficacement en tant que catalyseurs à trois voies et empêchent une évacuation excessive de NOx.
En se référant à nouveau au processus de commande de température de catalyseur (figure 3), lorsque le catalyseur de NOx est chauffé par les échappements et que l'inégalité etempave AV est satisfaite (un résultat négatif à l'étape S106), il est déterminé si Fqup est actif (étape S108).
Dans cet exemple, étant donné que l'indicateur d'augmentation de charge Fqup est actif (le résultat de l'étape S108 est positif), il est déterminé si une égalité etempave > B est satisfaite (étape S112). La valeur de
détermination de température B est utilisée pour empêcher le pompage. L'inégalité B > A est satisfaite.
Etant donné que le résultat de l'étape S112 est négatif alors qu'une égalité etempave < B est satisfaite, le processus est temporairement suspendu. En conséquence, Fqup est maintenu actif, et les échappements continuent d'être chauffés dans le processus de commande d'injection de carburant (figure 4), le processus de commande de calage d'allumage (figure 5) et le processus de commande de changement de vitesse (figure 6).
On décrira maintenant un deuxième mode de réalisation de la présente invention. Dans le deuxième mode de réalisation, un processus de commande de température du catalyseur de la figure 9 est exécuté à la place du processus de commande de température de catalyseur de la figure 3, et un processus de commande de changement de vitesse de la figure 10 est exécuté à la place du processus de commande de changement de vitesse de la figure 6. Sur la figure 10, les étapes S400 à S418 sont les mêmes que celles de la figure 6.
De même, un système de freinage automatique est prévu.
Le système de freinage automatique est capable de freiner le véhicule même si le conducteur n'est pas en train d'enfoncer la pédale de frein. Un système de freinage automatique caractéristique comprend une pompe à huile et un accumulateur. La pompe à huile met sous pression l'huile et envoie l'huile vers l'accumulateur, de sorte que de la pression soit accumulée. Au lieu de l'huile provenant d'un maître-cylindre, l'huile sous pression dans l'accumulateur est délivrée au cylindre de roue par un clapet électromagnétique de freinage automatique. Le clapet électromagnétique de freinage automatique est commandé par une ECU de freinage automatique 80 (voir la figure 1). En réponse à une demande de freinage provenant de l'ECU de moteur 4, l'ECU de freinage automatique 80 freine les roues pour maintenir le véhicule dans un état stationnaire même si le conducteur n'est pas en train d'appuyer sur la pédale de frein.