INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les cellules sont diluées la veille dans 100 l à raison de 20 000 cellules/puits dans du RPMI additionné de 5% de sérum de veau f#tal. Les cellules sont incubées pendant 24 heures à 37 C en présence de concentrations de produits comprises entre 100 g/ml et 0,062 g/ml et la cytotoxicité est mesurée par le test colorimétrique "cell cytotoxicity kit I" (Roche Applied sciences). Les résultats sont donnés dans le tableau ci-après. Un composé présentant une valeur de toxicité égale à 100 g/ml correspond à un composé toxique à partir de la dose de 100 g/ml ; un composé présentant une valeur de toxicité supérieure à 200 g/ml correspond à un composé toxique au-delà de la dose de 200 g/ml.
Identification des molécules déplaçant la liaison entre #70 et l'ARN polymérase Pour identifier les molécules qui déplacent la liaison entre #70 et l'ARN polymérase, on a utilisé le test ELISA tel que décrit dans la demande internationale WO 02/44735.
Mesure des concentrations minimales inhibitrices Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) sont mesurées selon les directives NCCLS. Les souches suivantes ont été utilisées : Staphylococcus aureus (CIP 76. 25), Staphylococcus epidermidis (CIP 68. 21), Streptococcus pneumoniae (CIP 103566), Bacillus cereus (ATCC 14579), Escherichia coli (CIP 76. 24) et Pseudomonas aeruginosa (CIP 76.110). Les CMI sont déterminées en milieu liquide, en boîte de 96 puits, sur deux expériences indépendantes. L'inoculum est préparé à partir de colonies ayant poussées à confluence, puis est dilué dans du MHB (milieu de Mueller et Hinton ; Sigma : M-9677) à 105 bactéries/ml. Les produits sont testés à des concentrations de 100 g/ml à 0,062 ug/ml.
Résultats CMI (Ilglml) Composé Staphylococcus Staphylococcus Bacteroides IC50 Toxicité aureus epidermidis megatrium (Ilglml) (Ilglml) C) /'\/ 0 1,17 0,58 1,17 1,26 >200 p-Rli g S 1,17 . 0,58 1,17 1,26 > 200 S FS F F 5529625 H,C o 9,4 77 4,7 10,1 100 Sus 5681435 OH ô N ' / 0 0 0 s s 4 4 4 1,32 100 5850330 H30N 0 s /p 1 I \ 18,75 4,69 o 1'\ 18,75 4,69 >200 s 18,75 4,69 HO 5888656 /=="N-CH, 0 0 S-\s 8 8 6 0,32 100 HO 6258097
/ rô H,C 0 0-bN s Ns CH, 1,83 / Vy s~4g 18 18 10 1,83 100 H,C 6327700 N={ y-N' 18 . 18 10 3,21 50 7105786 o 0 N j~/#s 1 0,3 0,78 43,5 100 8042021 o 0 .J'\s-s 200 10 5 11,2 100 H2N~s s 0 8042022 1 OH ION )SO 1,04 Cil 0 N 1,04 >200 ci 80811727
2.1.4) Méthode Dl.
Un mélange de 1.28 mmol d'un amino-alcool et de 1. 19 mmol de exo-7-oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dicarboxylic anhydride dans 2 mL d'acide acétique glacial est chauffé à reflux pendant 1h. Après retour à température ambiante, le milieu réactionnel est concentré sous vide, puis co-évaporé 2 fois avec du toluène et une fois avec du dichlorométhane. Le produit brut obtenu est utilisé sans purification.
2.1.5) Méthode El.
Mode opératoire identique à la méthode Bl à la différence que 2 équivalents de triéthylamine sont ajoutés.
2. 1.6) Méthode Fl.
Un mélange de 1. 2 mmol d'un anhydride et de 1. 1 mmol de 3- amino-2,2-dimethyl-propan-1-ol dans 6 mL de toluène est chauffé à reflux pendant 15 heures. Après retour à température ambiante, le milieu réactionnel est lavé par de la saumure puis séché sur sulfate de magnésium anhydre. On concentre sous vide ; le produit obtenu est utilisé sans purification.
2. 1.7) Méthode Gl.
Un mélange de 1. 1 mmol d'un anhydride et de 1. 1 mmol de 3- amino-2,2-dimethyl-propan-1-ol dans 5 mL de N,N- diméthylformamide est chauffé à reflux pendant 5 heures. Après retour à température ambiante, on rajoute de l'acétate d'éthyle, on lave 3 fois avec une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1N. La phase aqueuse est extraite 2 fois avec de l'acétate d'éthyle. Les phases organiques sont réunies, lavées
avec une solution saturée de bicarbonate de sodium dans l'eau, puis par de l'eau, puis par de la saumure. On sèche ensuite sur sulfate de magnésium anhydre et l'on concentre sous vide ; le produit obtenu est utilisé sans purification.
2. 2) Préparation des acides intermédiaires.
2.2.1) Méthode Hl.
Un mélange de 17. 8 mmol de exo-7-oxabicyclo[2.2.1]heptane- 2,3-dicarboxylic anhydride et de 17. 8 mmol d'un amino-acide est chauffé jusqu'à ce que l'on observe une fusion des deux produits. Le chauffage se poursuit jusqu'à prise en masse du milieu réactionnel. Après 10 minutes supplémentaires, le milieu réactionnel est mis à température ambiante, puis dilué avec de l'acétate d'éthyle et filtré. Le produit est utilisé sans purification supplémentaire.
2. 2.2) Méthode Il.
Un mélange de 5. 95 mmol de exo-7-oxabicyclo[2.2.1]heptane- 2,3-dicarboxylic anhydride et de 6. 45 mmol d'un amino-acide dans 9. 5 mL d'acide acétique glacial est chauffé à reflux.
Après disparition des produits de départ et retour à température ambiante, le milieu réactionnel est concentré sous vide et co-évaporé 2 fois au toluène. Le produit est utilisé brut sans purification.
2. 3) Préparation des amines intermédiaires.
L'expression des ARNm de gènes du tableau 2 (Peripheral myelin protein ou PMP22 (SEQ ID N 25) ; Insulin-like growth factor binding protein ou IGFBP7 (SEQ ID N 3 ; SPARC (SEQ ID N 37); EPB41L3 (SEQ ID N 34)) a ensuite été analysé par PCR (polymerase chain réaction) et l'utilisation d'amorces d'amplification spécifiques (amplification du gène PMP22 : brin sens : 5'-AGGGAGGAAG GGAAAACAGA-3' (SEQ ID N 38); brin antisens: 5'-TTAAGGCTCA ACACGAGGCT-3' (SEQ ID N 39) ; gène IGFBP7 : brin sens : 5'-CTTGAGCTGT GAGGTCATCG-3' (SEQ ID N 40); brin antisens :5'-TATAGCTCGG CACCTTCACC-3' (SEQ ID N 41); gène SPARC : brin sens : 5'-CTGCCTGCCA CTGAGGGTTCC-3' (SEQ ID N 42) ; brin antisens: 5'-TCCAGGCAGA ACAACAAACC ATCC-3' (SEQ ID N 43) ; gène EPB41L3: brin sens: 5'ACCACCACCA CTACCCACAT-3' (SEQ ID N 44) ; brin antisens: 5'TGGTTTTCCT AACGGTTTGC-3' (SEQ ID N 45); gène beta actine : brin sens : 5'TGTTGGCGTA CAGGTCTTTG C-3' (SEQ ID N 46); brin antisens: 5'- GCTACGAGCT GCCTGACGG-3' (SEQ ID N 47). L'expression du gène codant la P-actine a été utilisée comme contrôle. Trente cycles de PCR sont ensuite été réalisé en présence des différentes amorces d'amplification (0,2M); de dNTPs (0,15mM, Euromedex) et d'enzyme polymérase (Taq Polymerase ; 0,027U/ l; Perkin Elmer) (dénaturation 30" à 94 C, hybridation l' à 60 C ; polymérisation l' à 72 C).
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 3 ci dessous, qui montre la corrélation existant entre les résultats obtenues par l'utilisation d'une biopuce et ceux obtenues par RT-PCR.
Patients BP Patients MP Résultats Résultats RT Résultats Résultats biopuce PCR biopuce RT PCR SEQ ID N 37 : 0,04 SPARC 3498 2,2 709 0,87 SEQ ID N 3 0,003 IGFBP7 4112 3,7 691 1,87 SEQ ID N 34 0,001 EPB41 L3 6041 4,2 986 1,5 SEQ ID N 25 0,003 PMP22 9051 3,8 2282 2,75
Tableau 3 Les résultats de RT-PCR, obtenus à partir de 15 patients BP et 8 patients MP, sont exprimés par le rapport de quantification relative entre les ARNm du gène cible et les ARNm du gène ss-actine qui servait de contrôle. Les résultats sont exprimés par la moyenne des rapports obtenus pour chacun des groupes de patients. La corrélation des résultats obtenus d'une part avec la biopuce et d'autre part avec la technique en RT-PCR a été établie grâce au test de corrélation du Tau-B de Kendall. Les patients MP présentaient un niveau d'expression diminuée pour les gènes SPARC , IGFBP7 , EPB41L3, et PMP22, confirmant les résultats présentés dans le tableau 2.
Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée des 37 gènes du tableau 2 pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 1.
On observe sur ce dendograme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).
Dans l'objectif de valider le pouvoir de discrimination du profil d'expression de ces 37 gènes, 6 tumeurs supplémentaires de patients test ont été analysées sans connaissance préalable de leur pronostic, et classées comme étant de bon pronostic BP-test ou de mauvais pronostic MP-test en fonction de l'analyse de leur profil d'expression. Leur bon classement a été vérifié ensuite selon leurs propriétés cliniques : tous les échantillons tests analysés en aveugle par l'analyse de
l'expression de 37 gènes avaient été correctement classés dans le groupe de patients de mauvais pronostic test-MP ou dans le groupe de patients de bon pronostic test-BP . Ceci confirme que l'analyse de l'expression de ces 37 gènes est un bon outil pour le pronostic du neuroblastome.
A titre indicatif, l'oncogène N-MYC a également été utilisée comme outil de pronostic. L'utilisation de ce gène mettait en évidence 5 patients de mauvais pronostic (MP). Toutefois, 3 patients étaient également de mauvais pronostic alors qu'aucune augmentation de l'expression de l'oncogène N-MYC n'ait été observée, suggérant que l'analyse unique de ce gène n'est pas suffisant pour le pronostic du neuroblastome.
Les inventeurs ont également défini des panels de gènes plus restreint permettant également de discriminer les patients de bon et de mauvais pronostic.
Un premier panel comportait 19 gènes qui sont présentés dans le tableau 4. Les résultats sont exprimés par le ratio obtenu entre l'expression moyenne du gène chez des patients MP et l'expression du gène chez des patients BP (ratio MP/ BP).
Tableau 4 - liste des 19 gènes exprimés différentiellement dans les neuroblatomes de patients BP et MP
SEQ ID N . Description de la séquence N Genbank Ratio MP/BP 1 Flap structure-specific endonuclease 1 (FEN1) NM 004111 2,7 2 Ubiquitin-conjugating enzyme E2C (UBE2C) NM 007019 2,9 Insulin-like growth factor binding protein 7 3 (IGFBP7) NM 001553 0,2 7 cDNA FLJ30781 fis, clone FEBRA2000874 AK055343 0,3 8 TIF 1 beta zinc finger protein X97548 1,8 Likely ortholog of mouse tumor differentially 9 expressed 1, like (TDEIL) NM 020755 0,5 DKFZp434D1112~sl 434 (synonym: htes3) 10 cDNA clone DKF#p434D1112 3' AL039831 0,4 14 RuvB-like 2 (E. coli)(RUVBL2) NM 006666 2,1 RNA binding protein SI, serine-rich domain 16 (RNPS 1), transcript variant 1 NM 006711 1,6 Structure spécifie recognition protein 1 20 (SSRP1) NM 003146 2,0 Collagen, type VI, alpha 3 (COL6A3), 21 transcript variant 1 NM 004369 0,2 Small nuclear ribonucleoprotein polypeptides 22 B and BI (SNRPB) NM 003091 1,7 Peripheral myelin protein 22 (PMP22), 25 transcript variant 1 NM 000304 0,3 27 KIAA0436 mRNA, partial cds AB007896 0,5 29 Tripartite motif-containing 2 (TRIM2) NM 015271 0,4 Polypyrimidine tract binding protein 1 31 (PTBP1), transcript variant 1 NM 002819 2,1 34 Erythrocyte membrane protein band 4.1-like 3 NM 012307 0,2 36 Fucosidase, alpha-L- 1, tissue (FUCA1) NM 000147 0,2 Secreted protein, acidic, cysteine-rich
37 osteonectin) SPARC NM 003118 0,2 Les inventeurs ont également étudié l'expression simultanée de ces 19 gènes pour obtenir un profil d'expression. Les résultats sont présentés dans la figure 2. On observe sur ce dendogramme deux groupes ayant deux profils d'expression différents : un premier groupe permettant de classer les patients de bon pronostic (BP) et un deuxième groupe permettant de classer les patients de mauvais pronostic (MP).
Dans l'objectif de valider le pouvoir de discrimination de ces 19 gènes, 6 tumeurs de patients test ont été analysées sans connaissance préalable de leur pronostic.
Ainsi, les six tumeurs "MP-test" et BP-test présentées dans la figure 3 sont des tumeurs qui ont été analysés en aveugle . Leur bon classement a été vérifié selon
- un nom de composant, - des informations de présence, et une description de type.
On remarque que valeurs ainsi répertoriées des figures 23a-23c sont organisées selon une topographie à l'image de celle des cellules 16 du plan mémoire 2 qu'elles représentent. Ces valeurs analogiques
constituent ainsi une cartographie bit analogique donnant des informations précieuses sur les valeurs de seuil analogique de chacune des cellules individuellement considérées.
En variante, les mesures et/ou la cartographie peut n'être effectuée que sur/pour certaines cellules du plan, afin d'obtenir un échantillon représentatif ; cette variante permet de diminuer le temps de contrôle et les ressource en stockage analyse des résultats.
Dans les plans, la moitié des cellules sont conçues avec la géométrie cible de la technologie, alors que pour l'autre moitié elles sont dimensionnées de manière aléatoire avec des paramètres géométriques qui présentent une variation comprise entre 5% et 50% de la cible.
Dans le présent exemple, la cartographie bit numérique ne fait apparaître aucun bit défaillant.
Cependant, la cartographie bit analogique révèle l'existence de cellules pour lesquelles l'une au moins de leurs tensions/courants de seuil est hors spécification, et permet en outre de localiser ces cellules. A partir de ces défaillances au niveau des courants/tensions de seuil, il est envisageable de mettre en oeuvre des outils de diagnostic spécifiques pouvant servir à identifier les causes d'origine des paramètres géométriques défectueux. Pour plus d'informations sur cet aspect, on peut se référer à l'article de J.M. Portal et al. "An automated methodology to diagnose geometric defects in EEPROM Cells", Proc. IEEE International Test Conference (ITC), pp.31-36, octobre 2002.
Par ailleurs, à l'instar d'une cartographie bit numérique, les signatures sont cataloguées (écriture cellule, effacement cellule, cellule vierge, écriture
colonne, etc. ), aussi pour aider à déterminer le mécanisme de base en cause.
Pour compléter le diagnostic, on peut générer la distribution des tensions/courants de seuil pour le plan mémoire évalué, de manière a estimer la corrélation de ses valeurs avec le cahier des charges pour les tensions de seuil.
Les figures 24a, 24b et 24c constituent des exemple de distributions appliquées au mémoire précité, pour un plan de 64 éléments respectivement écrits, vierges et effacés.
Ces distributions sont ici représentées sous forme d'histogrammes. Chaque histogramme est composé de colonnes, chacune correspondant à une valeur de courant de seuil (de cellule vierge, effacée ou écrite, selon l'histogramme) ; la hauteur de chaque colonne indique sur une échelle le pourcentage de cellules contrôlées ayant la valeur de courant de seuil correspondante.
Les distributions donnent des informations concernant le contrôle des processus de fabrication et la répartition des défauts sur l'ensemble du plan mémoire.
Les données permettant de constituer les cartographies bit analogique, par exemple telles que présentées aux figures 23a à 23c et/ou des distributions statistiques par exemple telles que présentées aux figures 24a à 24c, peuvent être stockées dans un support électronique adapté, éventuellement avec d'autres données connexes (lots de fabrication, conditions de mesure, d'autres résultats de test, informations de traçabilité, etc. Ce support peut être intégré à l'appareil de contrôle 200 ou en dehors de celui-ci.
De ce qui précède, on comprendra que les mémoires non-volatiles, reposant sur des cellules analogiques,
mène à des problèmes critiques de contrôle de procédé de fabrication et de conception. La structure intégrée au composant, selon le mode de réalisation, permet d'extraire les signatures analogiques de chaque cellule du plan mémoire, c'est-à-dire les différentes tensions de seuil dans le cas considéré. Cette structure permet d'extraire les tensions de seuil durant les tests fonctionnels avec peu de surcharge en termes à la fois d'espace sur puce et de temps de test.
Qui plus est, les tensions seuil sont extraites avantageusement sous forme numérisée, ce qui permet : une compatibilité avec les moyens de test entièrement numériques, - une simplification de l'observation de ces valeurs par le biais du noyau logique dans le cas d'une EEPROM imbriquée.
Intermédiaire 21 : Préparé à partir de trans-4-amino-cyclohexanol selon la méthode Dl.
1H-NMR (DMSO-d6) 8 1. 19 (m, 2H) ; (m, 2H) ; (s, 4H) ; 1. 87 (s, 3H) ; 1. 99-2.09 (m, 2H) ; 2. 95 (s, 2H) ; (m, 1H) ; (m, 1H) ; 4. 66 (s, 2H) Intermédiaire 22 : Préparé à partir de trans-2-amino-cyclohexanol hydrochloride selon la méthode El.
1H-NMR (DMSO-d6) 8 1. 14-1.41 (m, 4H) ; (s, 6H) ; 1. 87- 1. 94 (m, 2H) ; (m, 2H) ; (m, 1H) ; (m, 1H) ; (s, 2H) ; 4. 73 (d, 1H) Intermédiaire 23 : Préparé à partir de l'intermédiaire 28 selon la méthode Ll.
1H-NMR (DMSO-d,) # 1. 64 (s, 4H) ; (m, 4H) ; 3. 41 (m, 2H) ; 3.95(s, 2H) ; 4. 70 (s, 3H) ; (t, 1H) Intermédiaire 24 : Préparé à partir d'anhydride succinique selon la méthode FI.
1H-NMR (DMSO-d6) 8 0.76 (s, 6H) ; (s, 4H) ; (d, 2H) ; 3.25 (s, 2H) ; 4.46 (t, 1H) Intermédiaire 25 : Préparé à partir d'anhydride 3,4,5,6-tetrahydrophthalique selon la méthode FI.
1H-NMR (DMSO-d6) 8 0. 89 (s, 6H) ; (m, 4H) ; 2. 35 (m, 4H) ; (m, 1H) ; (s, 2H) ; (s, 2H) ESI-MS m/z 238 [M+H]+
Intermédiaire 26 : Préparé à partir d'anhydride endo-bicyclo[2.2.2]oct-5-ene- dicarboxylique selon la méthode Gl.
ESI-MS m/z 264 [M+H]+ Intermédiaire 27 : Ce composé est synthétisé selon une méthode usuelle en partant de 3-amino-2,2-dimethyl-propan-1-ol et de di-tert- butyl dicarbonate (Ref 16).
Intermédiaire 28 : Préparé selon une méthode décrite par fusion entre la glycine et le exo-7-oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dicarboxylic anhydride (Ref 9 ) .
Intermédiaire 29 : (Ref 10) Préparé selon une méthode décrite par fusion entre la béta-alanine et le exo-7-oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3- dicarboxylic anhydride (Ref 9).
Intermédiaire 30 : (Ref 11) Préparé selon une méthode décrite par fusion entre le 4- aminobutyric acid et le exo-7-oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3- dicarboxylic anhydride (Ref 9).
Intermédiaire 31 : Préparé à partir de 5-aminovaleric acid et de exo-7- oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dicarboxylic anhydride selon la méthode Hl.
1H-NMR (DMSO-d,) 8 1.43 (s, 4H) ; 1.63 (s, 4H) ; (s, 2H) ; 3. 01 (s, 2H) ; (s, 2H) ; (s, 2H) ; (s, 1H) Intermédiaire 32 :
Préparé à partir de 6-aminocaproic acid et de exo-7- oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dicarboxylic anhydride selon la méthode Hl.
1H-NMR (DMSO-d6) 8 1. 15-1.52 (m, 6H) ; 1. 62 (m, 4H) ; (t, 2H) ; (s, 2H) ; 3. 31 (m, 2H) ; (s, 2H) Intermédiaire 33 : Préparé à partir de glycylglycine et de exo-7- oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dicarboxylic anhydride selon la méthode Hl.
1H-NMR (DMSO-d6) # 1. 65 (s, 4H) ; (s, 2H) ; 3. 76 (d, 2H) ; 4. 00 (s, 2H) ; 4. 70 (s, 2H) ; (t, 1H) Intermédiaire 34 : (Ref 12) Préparé à partir de 4-aminobenzoic acid et de exo-7- oxabicyclo[2.2.1]heptane-2,3-dicarboxylic anhydride selon une méthode décrite (Ref 13).
Dans ce but, l'invention propose un système de spécification et de mise en #uvre d'un protocole de gestion de communication et de transmission entre au moins un émetteur et au moins un récepteur, comprenant: - des moyens de détermination d'un contexte commun comprenant des moyens de description d'un ensemble de données gérées par le ou les émetteurs et/ou leou les récepteurs ; - des moyens d'identification des messages de protocole susceptibles d'être échangés entre le ou les émetteurs et le ou les récepteurs, l'identification étant indépendante de la ou des représentations utilisées pour les messages; - des moyens de définition de représentations de données stockées et/ou transmises par le ou les émetteurs et/ou le ou les récepteurs à partir de
la détermination d'un contexte commun et de l'identification des messages, la définition de représentations permettant de déterminer des instructions d'implémentation du protocole dans au moins un des émetteurs et au moins un des récepteurs ; et - des moyens de mise en #uvre du protocole dans au moins un des émetteurs et au moins un des récepteurs à partir des instructions d'implémentation, de façon à ce que le ou les émetteurs soient aptes à communiquer avec le ou les récepteurs.
Selon une caractéristique particulière, le système est remarquable en ce que tout ou partie des données gérées sont les données que le protocole vise à maintenir cohérent dans au moins un émetteur parmi le ou les émetteurs et au moins un récepteur parmi le ou les récepteurs.
Selon une caractéristique particulière, le système est remarquable en ce que la forme du signal appartient au groupe comprenant : - les suites de données binaires ; - les suites d'éléments pris dans un alphabet prédéterminé ; - les suites de formes d'ondes modulées.
SM (ESI+/ESI-/30eV) m/z : 535 [M+Na]+. m/z:511 [M-H]-. a-L-rhamnopyranoside de 8-palmitoyl-3,6,8-trioxanonanyle 30 L'élution par un gradient de méthanol (0-3%) dans du dichlorométhane conduit à l'obtention de l'a-L-rhamnopyranoside de 8-palmitoyl- 3,6,8-trioxanonanyle 30 sous forme d'une huile incolore (Rdt=90%).
[a]D -29,7(c=l,CHCl3).
RMN 1H (CDCl3, 200MHz) # (ppm): 4,8 (1H, s, H-l) ; 4,24-4,20 (2H, m, H- OCH2CH2OCO) ; 3,94 (1H, m, H-2) ; (13H, m, H-3, H-4, H-5, H-CH20) ; 2,33 (2H, t, J2'-3'=7,6Hz, H-2') ; 2,14-1,98 (9H, s, H-COCH3) ; 1,56 (2H, m, H-3') ; 1,25-1,20 (27H, m, H-6, H-4'-H-15') ; 0,88 (3H, t, J]6'-15,=6,4Hz, H-13'). RMN 13C (CDCI3, 50MHz)
#(ppm) : 174,3 (C-l') ; 170,6,170,5, 170,4 (3*C-COCH3) ; 98 (C-1) ; 71,5 (C-4) ; 71,2 (C-3) ; 71 (C-2) ; 70,5 (C-CH20) ; 69,6 (C-CH20) ; 69,4 (C-5) ; 67,5, 66,7, 63,7 (3*C-CH20) ; 53,8 (C-OCH2ÇH20C0) ; 34,6 (C-2') ; 32,3 (C- 3') ; 30,1 (C-4', C-5') ; 30 (C-6', C-7', C-8', C-9') ; 29,9 (C-10') ; 29,8 (C-1 l') ; 29,7 (C-12') ; 29,6 (C-13') ; 25,3 (C-14') ; 23,1 (C-15') ; 21,3,21,2, 21,1 (3*C-COCH3) ; 17,8 (C-6) ; 14,5 (C-16').
SM (ESI+/30eV) m/z : 557 [M+Na]+.
La présente invention concerne essentiellement un médicament pour Traitement des déficiences membranaires des globules rouges, des déficiences de la circulation, ou de la drépanocytose et la falciformation subséquente des globules rouges drépanocytaires, et son utilisation thérapeutique.
Le gène de la drépanocytose Le gène impliqué dans cette pathologie est celui qui dirige la synthèse de la chaîne 3 de l'hémoglobine. Ce gène est situé sur le chromosome 11. Ce gène est constitué de trois exons et comporte 1638 paires de bases.
La protéine de l'hémoglobine Il est rappelé que l'hémoglobine est une protéine constituée de quatre chaînes peptidiques. Chez l'adulte, ces chaînes sont deux chaînes respectivement oc et deux chaînes respectivement P. Dans le cas de la 35 drépanocytose, ce sont les chaînes P qui sont modifiées. En 1959, il a été démontré que la mutation entraînait une substitution en position 6 de la chaîne peptidique f3 d'un acide glutamique par une valine. Cette substitution entraîne une polymérisation de l'hémoglobine qui forme ainsi un filament déformant, I'hématie.
L'hémoglobine foetale est constituée de deux chaînes cx et de deux chaînes F (pour foetale), ce qui explique que les symptômes de la maladie n'apparaissent pas.
Les fragments d'ADN marqués (10 000 cpm) ont été incubés avec His6EthR purifié. De la DNase 1 diluée (0,025 U, Roche) a été ajoutée à chaque mélange réactionnel pendant 3 min à température ambiante, puis la réaction a été stoppée avec 100 l de solution stop (200 mM NaCl, 20 mM EDTA et 10% de SDS). Les produits de digestion à la DNAse # ont été extraits au phénol, précipités à l'éthanol et séparés sur un gel contenant 8 M d'urée et 6% de polyacrylamide. Un étalon de séquençage généré avec l'amorce universelle et M13mp18 comme matrice a été utilisé pour identifier la position de la région protégée.
B. Résultats : B.1. Répression de EthA par EthR Il a été démontré précédemment que la surexpression de ethR entraînait une résistance accrue à l'ETH chez les mycobactéries, tandis qu'une inactivation par mutation de ethR augmentait la sensibilité à l'ETH (Baulard et al.,2000), ce qui suggère que EthR régule de manière négative la production de EthA, la mono-oxygénase putative requise pour l'activation de l'ETH.
Afin de confirmer cette hypothèse, la région promotrice de ethA a été insérée en amont du gène rapporteur lacZ dans pBSh-D, un plasmide navette E. coli-mycobacterie qui se réplique sous la forme d'une simple copie dans les mycobactéries (Picardeau et al., 2000). Le plasmide résultant, appelé pBSh-PethA-lacZ a été électrotransformé dans M. smegmatis mc2155 et M. bovis BCG 1173P2.