INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les 3 plots MR, conformément à nos attentes, ne présentent pas de fluorescence, ce qui montre l'absence d'adsorption non spécifique à la surface du film de polypyrrole.
Le témoin négatif PCAH-CS greffé au polypyrrole, ne présente qu'une très faible fluorescence, la protéine n'adsorbe pas sur le sucre.
Boîtes gélosées contenant du milieu minimal, enrichi en maltose et X-Gal.
Figure 8 : structure du cristal du répresseur EthR du groupe d'espace P21212 (forme 1).
La partie expérimentale ci-après, appuyée par des exemples et références aux figures, vise à illustrer, sans limiter, la présente invention.
PARTIE EXPERIMENTALE 1- EthR réprime l'expression de ethA en se liant directement sur la région promotrice et opératrice de ethA : A. Matériels et méthodes : A.1. Souches bactériennes et conditions de croissance Toutes les souches ont été cultivées en aérobiose à 37 C. Toutes les étapes de clonage ont été réalisées chez E. coli XL1- Blue (Stratagène).
Les souches de E. coli ont été cultivées en milieu Luria-Bertani (LB) (Life Technologies) en présence ou non de 1,5% d'agar (Difco).
Les souches mycobactériennes ont été cultivées en milieu Sauton (Sauton 1912) enrichi avec 0,001% ZnS04 et 0,25% Triton WR1339 (Sigma) ou sur agar M7H11 enrichi avec 10% de mélange catalase-dextrosealbumine-acide oléique (Becton Dickinson). Mycobacterium smegmatis et M. bovis BCG 1173P2 ont été transformées comme décrit précédemment (Wards et Collins, 1996).
Les cultures à grande échelle de mycobactéries ont été amenées en milieu de phase exponentielle (36 h pour M. smegmatis mc2155 ; 11 à 16 jours pour M. bovis BCG).
Le cas échéant, les antibiotiques (Sigma) ont été ajoutés au milieu aux concentrations suivantes : kanamycine à 20 p.glml, ampicilline à 100 ig/mI, hygromycine à 50 g/m), streptomycine à 20 g/ml et gentamicine à 15 g/ml.
Après croissance, les bactéries ont été récoltées, lavées avec du tampon phosphate PBS et stockées à - 20 C.
A.2. Plasmides et manipulations d'ADN Toutes les manipulations d'ADN ont été réalisées en utilisant des protocoles classiques, tels que décrits par Sambrook et Russell (2001). Le système Fast-linkTM DNA ligation (Epicentre Technologies) a été utilisé pour les ligatures. a) Construction de pBSh -lacZ Le fragment BamHI-Bg/ll de 3,678 kb, contenant le cadre ouvert de lecture (ORF) codant la -galactosidase, a été isolé de pQEGM (Antoine et al., 2000) et inséré dans pBSh-D (Picardeau et al., 2000) avant d'être digéré par BamHI. b) Construction de pBSH-PethA-lacZ La région promotrice PethA a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces 0-161 : 5'-CCAGCGGACGGTCCTCTAGAAGGTTC-3' (SEQ ID N 4), 0-162: 5'-GTGAGATCTCATGGATCCACGCTATCAAGGTAA-3' (SEQ ID N 5). Le produit PCR a été inséré dans pCR2.1Topo (Invitrogen) pour donner pCR2.PethA (2 + 4). Le plasmide a été redigéré par Xbal et Bg/ll et le fragment de 191 pb contenant PethA a été inséré dans pBShlacZ, préalablement digéré par Xbal et BamHl pour donner pBSh-PethAlacZ. c) Plasmides pourle test double hybride bactérien La région codant EthR a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces 0- 243 : 5'-CTGCAGTGACCACCTCCGCGGCCAG-3' (SEQ ID N 6) et 0- 244 : 5'-GGTACCTTATCTGTTCTCGCCGTAA-3' (SEQ ID 7). La séquence amplifiée a été clivée par Pstl et Asp718, et insérée dans pT25 digéré par Pstl-Asp718 (Karimova et al., 1998), pour donner pT25-EthR.
Alternativement, la même région chromosomique a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces 0-240: 5'GGTACCGACTACTTCCGCAGCCAGTCA-3' (SEQ ID N 8) et 0-242 : 5'-
AAGCTTTCGCCGTAAATGCTGGTCA-3' (SEQ ID N 9), clivée par Hindlll et Asp718, et insérée dans pT18 (Karimova et aL, 1998) préalablement digéré par les mêmes enzymes pour donner pT18-EthR. Une souche de E. coli cyclase-déficiente (DHP1) (Karimova et al., 1998) a été cotransformée avec ces deux plasmides. La capacité des clones résultants à fermenter le maltose a été déterminée à 30 C sur des boîtes de milieu minimum M9 solide fraîchement préparé, contenant 1% de maltose comme unique source de carbone et 40 g/ml de 5-bromo-4-chloro-3- indolyl-p-D-galactopyranoside (X-gal, Promega).
A.3. Tests Beta-galactosidase Les activités ss-galactosidase des souches recombinantes de M. smegmatis et M. bovis BCG ont été détectées sur des boîtes d'agar M7H11 enrichi avec 100 ptg/ml de X-gal. Les activités p-galactosidase ont été quantifiées en cultures liquides, en utilisant une méthode adaptée de Miller (1972). Brièvement, les cellules mycobactériennes ont été cultivées en milieu Sauton (50 ml) jusqu'à une densité optique (DO) à 600 nm de 0,6. Les cellules ont ensuite été récoltées par centrifugation (4000 g, 15 min, 4 C), et les culots ont été lavés, puis resuspendus dans 1 ml de PBS.
Après sonication des suspensions bactériennes, des aliquots des lysats ont été incubés avec de l'orthonitrophényl-p-D-galactoside (ONPG, Sigma) à 30 C. La réaction enzymatique a été suivie par spectrophotométrie à une absorbance de 420 nm (A42onm), et la vitesse initiale a été calculée en utilisant la proportion linéaire de la courbe cinétique. L'Activité ssgalactosidase Spécifique (AS) a été déterminée comme suit : AS = (AA420nm min-1) / (DOeoonm x # de culture). Des échantillons en triple exemplaire ont été mesurés pour chaque clone bactérien. Afin d'évaluer l'influence potentielle de l'ETH sur l'activité du répresseur EthR, M. smegmatis co-transformé avec pBSh-PethA-lacZ et pM261-ethR a été cultivé jusqu'à une DO600nm de 0,3.
Des concentrations variables de ETH (0-10-20-40 g/ml) ont ensuite été ajoutées à la culture (en double), et les activités p-galactosidase ont été mesurées toutes les 10 min pendant une heure.
A.4. Production et purification de His6-EthR L'ADN codant EthR a été amplifié par PCR en utilisant l'ADN chromosomique de M. tuberculosis H37Rv comme matrice et les oligonucléotides 0-183 : 5'-CATATGACCACCTCCGCGGCCAGT-3' (SEQ ID N 10) et 0-184 : 5'-GGATCCGAGCACCCCCGACCGAGT-3' (SEQ ID N 11) comme amorces. Le produit PCR a été inséré dans pCR2. 1 Topo de manière à former pCR2.1-ethR. La séquence du fragment codant EthR a été déterminée sur les deux brins et, ensuite, isolée à partir de pCR2.1ethR par digestion avec Ndel et BamHl, puis insérée dans pET-15b (Novagen), pour donner pET-15b-ethR. Ce plasmide code une protéine EthR portant une étiquette amino terminale ayant la séquence suivante : MGSSH6SSGLVPRGSHM (SEQ ID N 12). Ce plasmide a été introduit dans E. coli BL21 (DE3). E. coli BL21(DE3)(pET-15b-ethR) a été cultivé en milieu LB (120 ml) jusqu'à une DO600nm de 0,6-0,7.
Le domaine linéaire viscoélastique est généralement défini par le fait que la réponse du matériau (i.e. la déformation) est à tout moment directement proportionnelle à la valeur de la force appliquée (i.e. la contrainte). Dans ce domaine, les contraintes
appliquées sont faibles et le matériau subit des déformations sans modifier sa structure microscopique. Dans ces conditions, le matériau est étudié au repos et de façon non destructive.
La contrainte #(t) et la déformation y (t) définies respectivement par les relations suivantes : ruz) = ra cos(o - t) 7(t) = 70 0 cos(w . t - 0) #0 étant l'amplitude maximale de la contrainte et yo étant l'amplitude maximale de la déformation. 8 est l'angle de déphasage entre la contrainte et la déformation.
On mesure ainsi l'évolution du module de rigidité G (correspondant au rapport de #0 sur [gamma]o) et de l'élasticité # (correspondant à l'angle de déphasage de la contrainte appliquée par rapport à la déformation mesurée) en fonction de la contrainte #(t) appliquée.
On mesure en particulier la déformation de la composition pour la zone de contrainte dans laquelle la variation du module de rigidité G et de l'élasticité # est inférieure à 7% (zone des microdéformations) et on détermine ainsi les paramètres dits plateaux Gp et #p. La contrainte seuil #c (correspondant à la force minimale qu'il est nécessaire d'appliquer à la composition pour provoquer son écoulement) est déterminée à partir de la courbe 8 = f(#) et correspond à la valeur de # pour laquelle 8 (#c) = 1,05 #p.
Le comportement viscoélastique des compositions selon l'invention peut être notamment caractérisé par un module de rigidité plateau Gp inférieur ou égal à 35 000 Pa, notamment inférieur ou égal à 30 000 Pa, en particulier inférieur ou égal à 28 000 Pa, et plus particulièrement inférieur ou égal à 25 000 Pa, voire à 20 000 Pa.
Les compositions conformes à l'invention peuvent par ailleurs posséder un seuil d'écoulement Te allant de 10 Pa à 200 Pa, et en particulier allant de 20 Pa à 100 Pa.
PROCEDE DE PREPARATION Le procédé de préparation des compositions selon l'invention dépend en particulier de la nature de la ou des cires utilisées. Il dépend en particulier du fait que les cires soient de type traditionnel ou de type micro cire telles que définies précédemment.
Pour les cires de type traditionnel, il dépend de plus du point de fusion commençante de ladite cire.
Dans une première variante, la ou les cire(s) utilisée (s) sont de type traditionnel et présentent un point de fusion commençante inférieur à 45 C.
Dans un tel cas, les compositions de l'invention peuvent être préparées de manière standard par chauffage des cires jusqu'à fusion complète puis introduction dans un solvant non aqueux volatil. Le mélange ainsi obtenu est soumis à une agitation mécanique jusqu'à refroidissement à température ambiante. Le polymère soluble dans le milieu solvant non aqueux et ayant une partie cristallisable conforme à l'invention est généralement introduit avec le solvant non aqueux volatil mais peut aussi l'être postérieurement.
L'eau et/ou le (s) hydrosoluble (s) les éventuels ingrédients supplémentaires peuvent être introduits dans les produits de départ ou éventuellement pendant le refroidissement ou dans la composition terminée.
Dans une deuxième variante, la ou les cire(s) utilisée (s) sont de type traditionnel. Leur point de fusion commençante peut être inférieur, égal ou supérieur à 45 C.
Dans une telle variante, les compositions de maquillage des fibres kératiniques sont généralement obtenues par chauffage de la cire ou d'un mélange de plusieurs cires à une température supérieure à la température de fusion de la cire ayant le point de fusion le plus élevé jusqu'à fusion complète, puis malaxage et refroidissement en continu jusqu'à température ambiante.
e) la comparaison du niveau N1 mesuré à l'étape d) avec le niveau No d'expression du gène rapporteur en l'absence dudit composé candidat ; et f) si N1 est significativement supérieur à No, la sélection du composé.
Pour la mise en oeuvre des étapes citées ci-dessus (clonage, transformation, culture, mesure de l'expression d'un gène rapporteur), l'homme du métier fera appel à des techniques conventionnelles (voir par exemple Sambrook et Russel, 2001).
La région promotrice et opératrice du gène ethA à cloner aux fins de la mise en #uvre d'un procédé selon l'invention comprend au moins la séquence SEQ ID N 1, qui correspond à la région promotrice et opératrice du gène ethA sur laquelle se fixent 4 molécules de répresseur (voir partie expérimentale infra). De préférence, cette région comprend au moins la séquence SEQ ID N 2, sur laquelle se fixent 8 molécules de EthR. De manière encore préférée, cette région comprend au moins la séquence SEQ ID N 3, laquelle correspond à la séquence intergénique ethA-R.
Selon un mode de réalisation particulier, un plasmide d'expression recombinant contenant le gène ethR (codant EthR) est pMV261-ethR (voir partie expérimentale ci-dessous).
Selon un autre mode de réalisation particulier, un plasmide d'expression recombinant contenant au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA en amont d'un gène rapporteur est pBSh-PethA lacZ (voir partie expérimentale ci-dessous).
Dans le plasmide pBSh-PethA - lacZ, le gène rapporteur est lacZ.
Bien évidemment, l'homme du métier peut mettre en oeuvre n'importe quel autre gène rapporteur connu dans le domaine de l'invention pour être utilisable chez les mycobactéries, notamment les gènes xylE, gfp, lux et le gène codant pour la protéine glucuronidase.
Dans les procédés selon l'invention, ladite cellule hôte recombinante est une cellule mycobactérienne. Il s'agit de préférence d'une cellule de Mycobacterium bovis, M. smegmatis, M. tuberculosis ou
M. leprae. En particulier, l'homme du métier peut choisir une cellule de M. bovis BCG 1173P2 (souche vaccinale accessible sur simple demande auprès de l'Organisation Mondiale de la Santé), ou de M. smegmatis mc2155 (Snapper et al., 1988 ; voir partie expérimentale cidessous).
Selon un troisième mode de réalisation, un procédé de sélection conforme à la présente invention comprend au moins : a) la détermination du niveau L1 de liaison du répresseur EthR sur au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA, en présence d'un composé candidat ; b) la comparaison du niveau L1 avec le niveau Lo de liaison du répresseur EthR sur au moins la région promotrice et opératrice du gène ethA, en l'absence dudit composé candidat ; et c) si Li est significativement inférieur à Lo, la sélection du composé.
En particulier, les niveaux de liaison Lo et L1 peuvent être déterminés à l'aide d'une méthode choisie parmi la résonance plasmonique de surface, la détection de la fluorescence naturelle et le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET pour Fluorescence résonance energy transfer ) par lequel l'homme du métier déterminera le transfert d'énergie entre EthR et la région promotrice et opératrice de ethA, en présence et en absence d'un ligand (Jia et al., 1996; Pyles et al., 1998; Hillisch et al., 2001 ; EngohangNdong et al., 2004).
Un deuxième aspect de la présente invention concerne un composé, tel que défini supra, obtenu par la mise en oeuvre d'un procédé de sélection selon l'invention.
En particulier, un tel composé peut être le ligand cocristallisé décrit dans la partie expérimentale ci-dessous, ou un analogue de celui-ci.
Selon un troisième aspect, la présente invention est utile dans le domaine de la prévention et/ou du traitement des maladies, notamment des infections mycobactériennes telles que la tuberculose et la lèpre.
Ainsi, l'invention a trait à un composé tel que visé ci-dessus comme médicament, destiné en particulier à prévenir et/ou traiter les infections mycobactériennes.
En effet, dans la mesure où le mutant knockout ethR décrit dans Baulard et al. (2000) présente un phénotype de ralentissement important de la croissance, EthR constitue à lui seul une cible thérapeutique. Un ligand de EthR est susceptible de donner lieu à un phénotype comparable à celui du mutant sus-cité. En tout état de cause, un ligand de EthR peut présenter des propriétés avantageusement bactériostatiques, voire bactéricides, contre les mycobactéries.
345 0.81 0.63 n.d.
346 2.51 2.45 n.d.
347 0.79 0.69 n.d.
348 0.53 0.38 n.d.
349 n.d. n.d. n.d.
~~~ 350 n.d. n.d. n.d.
351 n.d. n.d. n.d.
352 n.d. n.d. n. d.
353 n.d. n.d. n.d.
354 n.d. n.d. n.d.
355 n. d. n. d. n.d. 356 1. 39 1. 81 19.16 357 0.57 0.59 23. 78 358 34.51 58.95 n.d.
359 25.80 33.60 n.d.
360 12.00 41.30 n.d.
361 13.16 13.46 n.d.
362 17.24 64.59 n. d.
363 8.79 35.99 0.20 364 30. 74 55.06 n.d.
La déphosphatation est réalisée en chromatographiant les extraits protéiques (lysat enzymatique ou caséine de lait de vache (Sigma ref C-5890), solution à 10 mg/ml dans le tampon phosphatase) sur une colonne Sephadex G-25 Superfine (Colonne de dessalage HiTrap de 5 ml ; Amersham Pharmacia). La concentration en protéines des fractions déphosphatées est déterminée par la méthode de Bradford.
2) Détermination de l'activité de PP2A et mesure des constantes d'inhibition.
La mesure de l'activité de PP2A et le mesure des constantes d'inhibition par les composés de l'invention sont réalisées dans des plaques de microtitration de 96 puits selon la méthode publiée par Fahti et al. (Analytical Chemistry Biochem, 310,208-214 (2002) ). Le dosage se fait de façon standard dans un volume d'incubation de 70 fil, avec un temps d'incubation de 1 h, une quantité de lysat de 10 g de protéine/puits, une quantité de substrat de 20 g de caséine/puits et pour activateur, de la protamine à 5mg/ml dans 0,5 mM de MnCl2. La réaction est arrêtée par ajout de 2001 de colorant (25ml de molybdate d'ammonium à 4,2% dans HCl 4M, 75ml de solution de vert de malachite à 45% p/v) et laissée au repos 15 min. L'activité des phosphatases (App) est mesurée à partir de l'absordance (Abs) à 630nm selon : App = AbsEssai - Abs#(biancs) avec 2(blancs) = blanc tampon + blanc substrat + blanc enzyme.
L'inhibition de l'activité phosphatase due à un composé est évaluée selon Ipp = (1 - AppComposé / AppTémoin) * 100 (%) où AppComposé est l'activité phosphatase mesurée en ajoutant une concentration donnée du composé dans le milieu d'incubation.
La mesure de Ipp pour différentes concentrations d'agents inhibiteurs connus a permis d'obtenir une dose-réponse et d'évaluer les IC50 reportées dans le tableau 2.
Des composés de l'invention ont été testés à une concentration de 20 M (voir tableau 2 dans la description).
IV. Exemple 4 : Tests d'activités antimicrobiennes in vitro.
Les activités antibactériennes ont été évaluées in vitro par détermination de l'IC50 (Inhibition de Croissance à 50%).
Les tests ont été réalisés sur les souches bactériennes suivantes : - Bactéries à Gram positif : Staphylococcus aureus (souche 21 ; Don de l'Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire,
Strasbourg), Staphylococcus aureus ATCC 29213, Enterococcus sp. (souche clinique 17 ; du Dr. G. Prevot, Institut de Bactériologie, Strasbourg) ; Enterococcusfaecalis ATCC 29212 - Bactéries à Gram négatif : Pseudomonas aeruginosa ( souche 39 Don de l'Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg) ; Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 et E. Coli ATCC 29181. Toutes ces souches sont sensibles aux antibactériens communément utilisés en milieu hospitalier. a) Préparation des suspensions bactériennes.
Une préculture de 4 ml en milieu LB a été préparée par ensemencement d'une colonie de la souche bactérienne d'intérêt. La préculture a été incubée à 35-37 C sous agitation pendant 6h. La concentration de la préculture a été évaluée par mesure de la densité optique à 600-620 nm suivant la relation densité bactérienne=f(DO). La concentration a été ajustée par dilution de façon à obtenir une suspension de 106/ml en concentration finale. La concentration de la suspension bactérienne a été contrôlée par dénombrement des Unités Formant Colonies (UFC). La suspension bactérienne à 106/ml a été diluée en cascade (10-1, 10-2, 10-3, ... 10-6) puis 100 l des dilutions 10-6, 10-5 et 10-4 ont été étalés sur des boîtes de gélose LB agar. Les boîtes ont été incubées à 35-37 C pendant 16 à 18h puis les UFC ont été dénombrées. b) Détermination des IC50.
Les IC50 ont été déterminées par un test liquide en microplaques de 96 puits. 20 l d'échantillon à tester (composés de l'invention) ont été distribués en duplicats de façon à obtenir une gamme de concentrations finales de 100 M à 1 M dans les puits. 180 l de suspension bactérienne à 106/ml ont été ajoutés dans chaque puits. Les plaques de microtitration ont été incubées à 30-35 C pendant 16 à 18h. La densité optique des puits a été mesurée à 600-620 nm et les résultats ont été interprétés en calculant le pourcentage de pousse dans chaque puits selon la formule : %Pousse= (DO puits - DO du TS)/ (DO TP - DO du TS)*100 où DO du TP= DO du témoin de pousse (suspension bactérienne sans échantillon à tester), DO du TS= DO du témoin de stérilité (milieu de culture sans bactéries) et DO puits= DO du puits dont on souhaite calculer le pourcentage de pousse (suspension
bactérienne + échantillon à tester). L'IC50 correspond au puits où le pourcentage de pousse est inférieur ou égal à 50%.
Les résultats des activités antibactériennes (IC50) sont présentés dans le tableau 3 exposé dans la description.
Le polymère est ensuite filtré et lavé à plusieurs reprises par de l'eau distillée afin d'éliminer les traces de catalyseur.
Caractérisation du polymère Infra-rouge Bande du C=O : 1740 cm-1 ; COO 1580 cm-1 ; OH (bande large 3000-3500 cm-1) Neutralisation du polymère poly(thiophène-3- acide acétique) : Le polymère poly(thiophène-3- acide acétique) (2g) est dissous dans le tétrahydrofuranne (30g) et neutralisé à raison de 1 mol d'hydroxyde de sodium par mole d'acide carboxylique.
L'eau (30 g) est ensuite additionnée.
Le tétrahydrofuranne est évaporé.
Il est ainsi obtenu une solution aqueuse 6% de poly(thiophène-3- acide acétique) sous forme d'un sel de sodium.
Formulation comprenant le polymère et procédé la mettant en #uvre Poly(thiophène-3-acide acétique) * 4g Aminométhyl propanol qs pH 7 Basoplast 265D (de la société BASF) 1g Alcool éthylique 15 g Eau qs 100 g
La formule est déposée sur cheveux foncés. Après 5 minutes d'attente, on procède au séchage (séchage libre).
Nouveau procédé de préparation de microparticules La présente demande concerne un nouveau procédé de préparation, par coacervation, de microparticules à base d'au moins un polymère biodégradable et d'au moins un principe actif, ainsi que les microparticules susceptibles d'être obtenues par un tel procédé.
L'intérêt de la microencapsulation de principes actifs par des polymères biodégradables pour la préparation de formulation à libération prolongée n'est plus à démontrer surtout pour des traitements de quelques semaines ou plus, ou pour des traitements à administration répétée.
Le procédé d'encapsulation par coacervation est une des méthodes dont on dispose aujourd'hui pour la préparation de microparticules. De façon très générale, un procédé par coacervation comprend les étapes suivantes : - l'étape de coacervation : elle consiste en l'ajout d'une solution ou suspension de particules de principe actif dans une solution contenant le polymère d'encapsulation puis l'ajout, dans le mélange ainsi obtenu, d'un agent de coacervation ; du polymère et du principe actif, il entraîne la précipitation du polymère et l'encapsulation de la solution ou de la suspension du principe actif par le polymère sous forme de microgouttelettes : c'est le début de la formation de microparticules.
- l'étape de durcissement : on ajoute ensuite un solvant appelé agent de durcissement ; cet agent de durcissement doit être miscible avec le solvant du polymère mais également avec l'agent de coacervation. Sa miscibilité avec le solvant du polymère va donc entraîner l'extraction du solvant du polymère hors des microparticules et par conséquent le durcissement de ces dernières. Sa miscibilité avec l' agent de coacervation va permettre d'éliminer cet agent.
- l'étape de filtration et de séchage : le mélange final obtenu est filtré afin de récupérer les microparticules ainsi formées qui sont ensuite séchées pour éliminer au maximum le ou les solvants résiduels. Cette dernière étape peut être suivie, si nécessaire, d'une étape de lyophilisation et /ou une étape de radiostérilisation.
Selon les procédés de coacervation standard, le principe actif, sous forme de solution ou de suspension de principe actif généralement broyé, conserve son état initial tout au long de la mise en #uvre du procédé : ainsi, lorsque le principe actif se trouve initialement en solution, le principe actif est alors encapsulé sous forme de gouttelettes dans la matrice polymérique, comme cela est décrit dans le brevet EP 52510.
La présente invention propose un nouveau procédé de préparation de microparticules par coacervation qui présente des avantages industriels tels que un taux d'encapsulation relativement élevé et le fait de pouvoir éviter la radiostérilisation.