INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les membranes sont incubées pendant 1 heure dans 100 ml de TBS-T contenant 5 % de gélatine, puis lavées avec du TBS-T (trois fois 15 minutes). Les membranes sont ensuite incubées séparément en présence de 20 ml de TBS-T additionné de lait écrémé à 1,2 % et de 2 l du 1er anticorps (sérum reconnaissant Sup 16) pendant 2 heures. Puis les membranes sont lavées dans 200 ml de TBS-T (trois fois 15 minutes), puis incubées pendant 1 heure dans 20 ml de TBS-T contenant 1,2 % de lait écrémé et 1 l du second anticorps (anticorps de chèvre anti-IgG de lapin couplé à une peroxydase de radis, Bio-Rad). Les membranes sont ensuite lavées dans 200 ml de TBS-T (trois fois 15 minutes).
La révélation se fait au moyen du kit ECL Western Blotting Detection Reagents (Amersham), suivant les conditions recommandées par le fournisseur.
EXEMPLE 4 : Activité anti-microbienne du peptide : Des expériences de toxicité du peptide de 25 acides aminés (SUP 25) purifié à l'exemple précédent sur différentes bactéries ont été réalisées.
Les différentes bactéries sont cultivées dans 5ml de milieu LB ou de milieu approprié à la souche, puis sédimentées par centrifugation à 3000g, et enfin reprises dans un volume de LB identique au volume de bactéries. 50 l de bactéries sont inoculés dans 9 ml de TOPagar (LB + 7g/l de bactoagar) liquide à 48 C et rapidement coulé sur une boite LB agar carrée de 10 cm de coté. Les gouttes de 10 l de différentes concentrations de peptides sont déposées sur le TOPagar solidifié. La boite est mise en culture pendant 16 heures.
La cécropine A à 20 M, peptide d'insecte reconnu comme ayant une activité antibactérienne, sert de témoin positif.
Bactéries Pathogène Activité Molarité Cécropine A de plante bactériostatique active 20 M Escherichia coli Souche DH5[alpha] Non Négatif- Positif Xanthomonas campestris Oui Positif 200pM Positif pv campestris souche 8004 Pseudomonas syringae Oui Positif 20 M Positif pv tomato souche DC3000 Erwinia amylovora Souche 1430 Oui Positif 25 M Non testé
Le peptide de 25 acides aminés ne présente pas d'activité sur Escherichia coli, mais présente une activité sur Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae et Erwinia amylovora, ce qui permet d'imaginer son utilisation comme agent anti-microbien particulièrement dirigé contre les agents pathogènes de plantes très particulièrement au moins contre Xanthomonas campestris, Pseudomonas syringae et/ou Erwinia amylovora.
dans une synthèse de novo. Ceci conforte l'hypothèse de co-implication de MabA et InhA dans le même complexe d'élongation d'acides gras.
Le modèle de MabA suggère que la protéine en solution est tétramérique, ce qui est en accord avec le résultat des expériences de filtration sur gel, ayant suggéré qu'il y avait, dans les conditions expérimentales testées, un équilibre dimère-tétramère de MabA. Cependant, l' association de MabA avec InhA, chacune sous forme tétramérique dans le complexe FAS-II, est incompatible avec la taille estimée du système. Ainsi, comme InhA et MabA présentent des topologies similaires, on pourrait postuler que ces deux protéines forment un hétérotétramère au sein du complexe FAS-II. Pour tester cette hypothèse, la modélisation moléculaire d'un complexe hétérotétramère MabA-InhA, utilisant les protéines RED tétramériques comme supports, pourra être réalisée. Pour confirmer la possibilité que InhA et MabA puissent s'associer en complexe, un pontage chimique entre les deux protéines, en présence de leurs cofacteurs respectifs, pourra être tenté.
La connaissance de l'organisation tridimensionnelle donnée par le modèle a permis de suggérer une interaction possible entre MabA et l'isoniazide. Nous avons pu montrer, par des études enzymatiques, que l'activité de MabA était effectivement inhibée in vitro par cet antibiotique et que le mécanisme d'inhibition de MabA est probablement comparable à celui décrit pour la protéine InhA.
II) MATÉRIEL ET MÉTHODES M.l. SUREXPRESSION DU GENE mabA DANS E. COLI M.1.1. Construction du plasmide d'expression pET-15::mabA Le gène mabA de M. tuberculosis a été clone entre les sites NdeI et Xho du plasmide pET- 15b, en aval d'une séquence codant pour 6 histidines.
M. 1.2. Transformation de E. coli BL21(#DE3) parle plasmide pET-15b::mabA Après préparation des bactéries compétentes de E. coli BL21(#DE3) (Sambrook et al., 1989), un aliquot (100 ni) est incubé en présence du plasmide pET-15b::mabA (39 ng) pendant 30 min, dans la glace. La transformation est effectuée par choc thermique (90 sec. à 42 C, puis 2 min dans la glace). Du milieu LB est alors ajouté et la suspension est incubée 45 min à 37 C sous
agitation (250 rpm) avant d'être étalée sur boîte LB-agar contenant 50 g/ml de carbenicilline. L'incubation à 37 C pendant 18h environ permet d'obtenir des colonies de taille moyenne à grosse.
M. 1.3. Induction de l'expression du gène cible Quatre colonies de taille moyenne sont utilisées pour ensemencer quatre cultures de 50 ml en milieu LB + carbenicilline. La turbidité du milieu est mesurée par spectrophotométrie à 600 nm toutes les heures jusqu'à ce que la densité optique atteigne 0,8 (milieu de la phase exponentielle de croissance), c'est à dire après 4h d'incubation environ. L'expression du gène mabA est alors induite avec 0,8 mM d'IPTG pendant 2h à 37 C, puis vérifiée par SDS-PAGE. Un aliquot de culture non-induite est conservé et servira de témoin négatif de l'induction.
M. 1.4. Vérification de la surexpression Une fois l'expression de mabA induite, un aliquot de 100 l de culture est analysé pour contrôler l'expression du gène. Après centrifugation (5 min à 12000g), le culot bactérien est repris dans du tampon de charge (Laemmli, 1970) pour être déposé sur gel de polyacrylamide 12% en conditions dénaturantes.
M. 1.5. Test de solubilité de la protéine MabA à petite échelle Les bactéries (10 ml) sont collectées par centrifugation 5 min à 3000g, à 4 C. Le culot est resuspendu dans du tampon phosphate de potassium (100 mM, pH 7,2) dans 1/20 du volume initial de la culture. La suspension est soniquée à l'aide d'une microsonde (Vibracell, Bioblock), en quatre pulses de 10 sec. intercallés de temps de repos de 40 sec. ;(duty cycle : 60%, microtip limit: 5). L'extrait total obtenu est centrifugé 5 min à 12000g, à 4 C. La présence de la protéine MabA dans les fractions correspondant au total, surnageant (soluble) et culot (insoluble) sont analysées par SDS-PAGE (12% de polyacrylamide).
M. 2. PURIFICATION DE MABA Toutes les étapes sont effectuées au froid (0-4 C), pour réduire l'action des protéases.
M. 2.1. Préparation du lysat bactérien
Les cultures rassemblées (4 x 50 ml) sont collectées par centrifugation (15 min à 16000g, à 4 C) puis lavées (tampon phosphate de potassium 50 mM, pH 7,8). Le culot obtenu (0,9 g/ 200 ml de culture) est repris dans 9 ml de tampon de lyse (tampon phosphate de potassium 50 mM, pH 7,8 contenant 500 mM de NaCl et 5 mM d'imidazole). Avant de congeler la suspension à - 70 C (une nuit), un mélange d'inhibiteurs de protéases (0,113 mg/ml, voir ci-dessous) et du lysozyme (0,5 mg/ml) y sont ajoutés. La suspension est décongelée, sous agitation douce, à température ambiante, puis traitée à la DNaseI (5 g/ml) et RNaseA (10 g/ml) en présence de MgCl210 mM pendant 15 min à 4 C, sous agitation douce. Les bactéries entières et les débris sont éliminés par centrifugation (15 min à 3000g, à 4 C). Une dernière ultracentrifugation à 44000g, 45 min à 4 C, permet d'éliminer tout matériel insoluble. 10% (v/v) de glycérol est ajouté au surnageant (lysat clarifié) avant d'être chargé sur la colonne.
Mélange d'inhibiteurs de protéases : leupeptine (inhibiteur de la chymotrypsine): 0,0023 g/1 #soybean (inhibiteur réversible de la trypsine) : 0,02 g/1 #TLCK (inhibiteur irréversible de la trypsine) : 0,0518g/1 #Aprotinine 0,0016 g/1 #Pepstatine (inhibiteur des pepsine-like) 0,0011g/l PMSF (inhibiteur irréversible de la chymotrypsine) 0,0362 g/1 Remarque : Dans ces expériences, l'EDTA (inhibiteur des protéases métal-dépendantes) est omis du mélange d'inhibiteurs de protéases, à cause de sa capacité à chélater les ions nickel lors de la purification sur colonne Ni-NTA.
M. 2.2. Purification de H-MabA en minicolonne Dans une minicolonne vide (volume total 7,5 ml en polypropylène, Polylabo), 500 l de résine Ni-NTA agarose (QIAGEN) (soit 1 ml de suspension à 50%) sont lavés avec 4 fois 2,5 ml de tampon de lyse*. Quatre ml de lysat bactérien clarifié (environ 15 mg de protéines totales) sont incubés avec la résine Ni-NTA sous agitation douce, pendant lh à 4 C. Le matériel non fixé à la résine est récupéré par décantation, puis par "lavages" avec 32 VC (volumes de colonne) de tampon de lyse. Le reste des protéines contaminantes est élué avec 8 VC de tampon à 50 mM imidazole. La protéine MabA est éluée par 8 VC de tampon à 175 mM imidazole. La résine est ensuite nettoyée avec 10 VC de tampon à 250 mM imidazole est récupérée directement dans du
glycérol pur de manière à avoir 50 % (v/v) de glycérol final. Ces précautions sont nécessaires pour éviter la précipitation de MabA en sortie de colonne.
Remarque : tous les tampons utilisés ici contiennent 50 mM de phosphate de potassium pH 7,8 et 500 mM de NaCl.
dont l'extrémité libre est rattachée au pilier solidaire du vantail sur lequel est disposé
ledit organe coulissant OC.
L' invention est enfin caractérisée en ce qu' en fin de course de fermeture du vantail battant, le déplacement horizontal de l'organe coulissant OC par rapport au vantail P1 entrame un déplacement du moto réducteur intégré d'une distance sensiblement égale à celui de l'organe coulissant OC et dans le méme sens que celui-ci
D'autres buts et avantages de l'invention appara^tront mieux dans la description
détaillée qui suit et qui se réfère aux dessins annexés, donnés uniquement à titre d'exemple, et dans lesquels: -La figure 1 est une perspective montrant le bo^tier S en vue arrière avec une
ouverture montrant le téton C2 dans le coulisseau VA.
-La figure 2 est une perspective montrant le dispositif dans son entier installé sur un
portail à 2 vantaux.
-La figure 3 est une vue en perspective de l'extrémité du dispositif montrant l'action de la butée B et son blocage du mécanisme de coulissement par l'intermédiaire du
blocage du coulisseau VA.
-La figure 4 est une perspective montrant plus précisément la transmission du mouvement à un verrou VR par l'intermédiaire du coulisseau VB et de la tringle T. -La figure 5 est une perspective montrant le dispositif autonome, et plus précisément la partie moto réducteur en liaison avec l'organe coulissant (OC) et la liaison avec le pilier. Suivant un exemple de réalisation et se référant à la figure 1, un dispositif conforme à l'invention comprend, disposé et fixé sur un vantail P1 d'un portail motorisé avec une motorisation dite à compas M ou du type vérin, un organe OC, coulissant longitudinalement et horizontalement par rapport au vantail P1 d'un portail. Le coulissement est assuré par au moins une équerre Eq' fixée au vantail Pldu coté gonds, et pourvue d'un galet cylindrique. Le galet pénétre dans l'organe coulissant OC et assure le positionnement dudit organe coulissant OC par rapport au vantail P1,
tout en permettant un coulissement horizontal touj ours par rapport au vantail P1.
L'organe coulissant OC pénètre dans un botier S. fixé sur le vantail V1 à l'opposée des gonds, au travers d'un orifice de forme sensiblement identique à la section de l'organe coulissant OC et de dimensions supérieures à celui-ci de façon à en assurer
d'une part le positionnement et d'autre part le coulissement.
Le bo^tier S est pourvu d'un coulisseau VA à lumière oblique guidé verticalement par les parois S1 et S2 du botier S. ce coulisseau coopére avec l'élément OC par un têton C2 solidaire d'OC qui se déplace horontalement dans la lumière oblique du coulisseau VA, provoquant un mouvement vertical vers le haut ou le bas en fonction du sens du coulissement de l'organe OC. En position organe coulissant tranelaté au maximum en d*ection des gonds, une excroissance V2 du coulisseau VA vient s'enchasser sur la surface B3 d'une butée escamotable B. articulée en B2 sur le botier S. parallèle et immédiatement en contact avec la face extérieure de la paroi S1 dudit bo^tier S. interdisant tout coulissement de l'organe OC par rapport au vantail P1 par emprsonnement du coulisseau VA et par conséquent du têton C2 et de l'organe
La présente invention a également pour objet, selon un de ses aspects, une composition cosmétique de maquillage des fibres kératiniques comprenant au moins une dispersion aqueuse de particules de cire, caractérisée en ce qu'elle possède un module de rigidité plateau Gp supérieur ou égal à 4000 Pa et en ce que lesdites particules de cire possèdent une taille inférieure ou égale à 1 micron.
La présente invention a également pour objet, selon un autre de ses aspects, une composition cosmétique de maquillage des fibres kératiniques comprenant au moins une dispersion aqueuse de particules de cire, caractérisée en ce qu'elle possède une teneur en matière sèche supérieure ou égale à 42 % en poids et en ce que lesdites particules de cire possèdent une taille inférieure ou égale à 1 micron.
Elle se rapporte en outre à l'utilisation d'une composition conforme à l'invention pour obtenir un maquillage séparant, et le cas échéant chargeant, des fibres
kératiniques et notamment des cils et des sourcils.
De manière inattendue, il a ainsi été constaté qu'il était possible de préparer des compositions de maquillage possédant un module de rigidité élevé, c'est-à-dire supérieur ou égal à 4000 Pa, en particulier supérieur ou égal à 5500 Pa et notamment supérieur ou égal à 7000 Pa et/ou une teneur en matière sèche supérieure ou égale à 42 %, notamment supérieure ou égale à 45,5 %, voire supérieure ou égale à 48 % en poids, grâce à la mise en #uvre, dans ces compositions, d'un système d'émulsionnant spécifique et d'une taille de particules de cires déterminée.
CARACTÉRISATION DE LA TENEUR EN MATIÈRE SÈCHE La teneur en matière sèche, c'est à dire la teneur en matière non volatile, peut être mesurée de différentes manières, on peut citer par exemple les méthodes par séchage à l'étuve, les méthodes par séchage par exposition à un rayonnement infrarouge ainsi que les méthodes chimiques par titrage de l'eau selon Karl Fischer.
De préférence, la quantité de matière sèche, communément appelée extrait sec des compositions selon l'invention, est mesurée par échauffement de l'échantillon par des rayons infrarouges de 2 m à 3,5 m de longueur d'onde. Les substances contenues dans lesdites compositions qui possèdent une pression de vapeur élevée, s'évaporent sous l'effet de ce rayonnement. La mesure de la perte de poids de l'échantillon permet de déterminer l'extrait sec de la composition. Ces mesures sont réalisées au moyen d'un dessiccateur à infrarouges commercial LP16 de chez Mettler. Cette technique est parfaitement décrite dans la documentation de l'appareil fournie par Mettler.
Le protocole de mesure est le suivant : On étale environ 1 g de la composition sur une coupelle métallique. Celle-ci, après introduction dans le dessiccateur, est soumise à une consigne de température de 120 C pendant une heure. La masse humide de l'échantillon, correspondant à la masse
initiale et la masse sèche de l'échantillon, correspondant à la masse après exposition au rayonnement, sont mesurées au moyen d'une balance de précision.
La teneur en matière sèche est calculée de la manière suivante : Extrait Sec = 100 x (masse sèche/ masse humide).
Les compositions selon l'invention se caractérisent notamment par une teneur en matière sèche supérieure ou égale à 42 % en poids, notamment supérieure ou égale à 45,5 %, voire supérieure à 48 % en poids par rapport au poids total de la composition.
Les compositions selon l'invention se caractérisent également par une teneur en matière sèche inférieure ou égale à 85 % en poids, notamment inférieure ou égale à 75% en poids et en particulier inférieure ou égale à 65 % en poids.
CARACTÉRISATIONS RHÉOLOGIQUES Les compositions conformes à l'invention sont caractérisées par un comportement viscoélastique.
De façon générale, un matériau est dit viscoélastique quand, sous l'effet du cisaillement, il possède à la fois les caractéristiques d'un matériau purement élastique, c'est à dire capable de stocker de l'énergie et les caractéristiques d'un matériau purement visqueux, c'est à dire capable de dissiper de l'énergie.
une diode électroluminescente.
Ce type de source lumineuse est généralement utilisé en
combinaison avec un conduit, ou guide, de lumière.
Les feux de signalisation obtenus à partir de cette combinaison présentent l'inconvénient de posséder une plage éclairante de longueur importante, mais de faible largeur. De plus, ce type de feux de signalisation nécessite généralement plusieurs sources lumineuses pour réaliser une
seule fonction de signalisation.
L'invention vise à remédier notamment à ces inconvénients 10 en proposant un feu de signalisation qui puisse avoir une profondeur axiale faible, par rapport à la largeur globale de
l'ouverture frontale du feu.
Le feu de signalisation selon l'invention doit permettre l'utilisation d'une source lumineuse sensiblement ponctuelle telle 15 qu'une diode électroluminescente, tout en ayant une luminance acceptable, pour éviter d'éblouir les usagers qui peuvent regarder
en direction du feu de signalisation.
apparaîtront à la lecture de la description détaillée qui suit pour la compréhension de laquelle on se reportera aux dessins annexés
parmi lesquels: - la figure 1 est une vue en perspective éclatée de trois quarts avant qui représente schématiquement un feu de signalisation équipé d'un moteur de lumière selon un premier mode de réalisation de l'invention; - la figure 2 est une vue en coupe axiale qui représente 1o schématiquement le feu de signalisation de la figure 1; - la figure 3 est une vue en perspective de trois quarts arrière qui représente schématiquement la portion tronconique de la face avant de réflexion du moteur de lumière de la figure 1; - la figure 4 est un schéma qui illustre la répartition de la i5 lumière dans le faisceau lumineux produit par le feu de signalisation de la figure 1I - la figure 5 est une vue similaire à celle de la figure 3 qui représente schématiquement une variante de réalisation de la portion tronconique du moteur de lumière de la figure 1; - la figure 6 est un schéma similaire à celui de la figure 4 qui illustre la répartition de la lumière dans le faisceau lumineux produit par un feu de signalisation équipé d'une portion tronconique telle que celle de la figure 5; - la figure 7 est une vue partielle en coupe axiale qui 25 représente une première variante de réalisation du feu de signalisation de la figure 1; - la figure 8 est une vue similaire à celle de la figure 7 qui représente une deuxième variante de réalisation du feu de signalisation de la figure 1; - la figure 9 est une vue en perspective de trois quarts avant avec arrachement qui représente schématiquement un feu de signalisation équipé d'un moteur de lumière selon un deuxième mode de réalisation de l'invention; - la figure 10 est une vue en coupe axiale qui représente schématiquement le feu de signalisation de la figure 9; - la figure 11 est une vue en perspective qui représente schématiquement un motif catadioptrique appartenant au moteur de lumière du feu de signalisation de la figure 9; - la figure 12 est une vue partielle en coupe axiale qui représente schématiquement une première variante de réalisation du feu de signalisation de la figure 9; - la figure 13 est une vue similaire à celle de la figure 12 io qui représente schématiquement une deuxième variante de réalisation du feu de signalisation de la figure 9; - la figure 14 est une vue similaire à celle de la figure 12 qui représente schématiquement un feu de signalisation équipé d'un moteur de lumière selon un troisième mode de réalisation de 15 l'invention; - la figure 15 est une vue similaire à celle de la figure 12 qui représente schématiquement un feu de signalisation équipé d'un moteur de lumière selon un quatrième mode de réalisation de l'invention.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend, à l'étape a), la présence des différents principes actifs potentiels à cribler avec le modèle cellulaire ou tissulaire, pendant un temps compris entre 6 et 48 h, de préférence d'environ 16 h (temps de mise en contact).
Les inventeurs entendent par "principe actif potentiel à cribler", l'ensemble des produits qui sont testés par la méthode de criblage, c'est-àdire tous les produits pouvant être mis sous la forme nécessaire à réaliser cette méthode de criblage.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend à l'étape b) une extraction des ARN totaux et une analyse par RT-PCR de l'expression des ARNm codant pour les bêta-défensines humaines de type 2 et/ou de type 3 précitées.
Avantageusement, ladite méthode de criblage comprend à l'étape b) une RT-PCR sur Tartine (gène rapporteur peu stimulable) de façon à rapporter les augmentations des ARNm codant les hBD2 et hBD3 par rapport à l'ARNm codant pour l'actine.
Avantageusement, ladite méthode de criblage comprend à l'étape b) un dépôt des ARNm amplifiés sur gel d'agarose contenant un intercalant des acides nucléiques visualisable sous UV (comme le bromure d'éthidium par exemple) Avantageusement, ladite méthode de criblage comprend à l'étape b), suite à la migration des produits sur gel d'agarose, une comparaison des rapports d'intensité des bandes hBD2/actine et hBD3/actine sous lumière UV.
Avantageusement, ladite méthode de criblage comprend à l'étape c) un dosage de type ELISA pour doser les molécules pro-inflammatoires ou les molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires.
Avantageusement, ladite méthode de criblage comprend à l'étape d) la sélection d'au moins un principe actif qui est capable de stimuler l'expression des ARNm codant pour lesdites bêta-défensines humaines de type 2 et/ou de type 3 sans ou sensiblement sans stimuler la synthèse, directe ou indirecte, de molécules pro-inflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend la sélection des principes actifs stimulant l'expression des bêta-défensines humaines précitées et ne stimulant pas ou sensiblement pas de façon concomitante au moins une molécule pro-inflammatoire ou au moins une molécule habituellement co-exprimée lors de processus inflammatoires, telles que IL1, ILS, MIP3a.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend les étapes suivantes : - La mise en contact des principes actifs potentiels à cribler avec des kératinocytes humains normaux, en monocouche, en milieu défini sans sérum et enrichi en calcium, par exemple en réalisant parallèlement un