INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La localisation sub-cellulaire de la protéine SD' a été évaluée. Premièrement, la fluorescence directe de la protéine SD' fusionnée avec la EGFP dans les cellules NIH3T3 a été observée. Les cellules transfectées de manière transitoire ont été observées directement au microscope. Alors que la EGFP seule est uniformément distribuée d'un bout à l'autre de la cellule, la protéine de fusion SD'/GFP apparaît sous forme de petits points avec une distribution de la fluorescence à la fois dans le cytoplasme et dans le noyau, avec un soulignement des membranes nucléaires et plasmidiques.
De plus, la localisation intracellulaire a été évaluée par fractionnement cellulaire permettant la discrimination entre les fractions cytoplasmique et nucléaire. Le contenu en protéines a été mesuré par analyse Western blot pour chaque compartiment cellulaire.
Ces expériences ont été menées avec des cellules infectées ou non par Friend-MLV, et des cellules transfectées de manière transitoire avec des vecteurs exprimant soit SD', SD'/GFP ou EGFP (Figure 10 A). Comme prévu, la protéine contrôle EGFP s'est accumulée dans le cytoplasme soit des cellules NIH3T3 non-infectées, soit des cellules NIH3T3 infectées (Figure 10 A, B). En revanche, les protéines virales intégrases présentent préférentiellement une localisation nucléaire dans les cellules NIH3T3 infectées (Figure 10B). Ces deux observations soulignent l'efficacité de la procédure de fractionnement. Comme observé précédemment par microscopie, les protéines SD' et SD'/GFP sont également trouvées dans les fractions cytoplasmiques et nucléaires (Figure 10 A, B). Cette localisation n'est pas dépendante des autres composants viraux puisqu'elle a été aussi observée quand SD' ou SD'/GFP ont été surexprimés dans des cellules NIH3T3 non-infectées (Figure 10 B).
II.6 - La protéine SD' est associée aux virions.
La polyprotéine SD' inclut le domaine matrice (MA) qui s'avère contenir les signaux nécessaires pour diriger le transport au site d'assemblage de la capside à la membrane plasmidique. Ainsi, la polyprotéine SD' pourrait être ciblée au site d'assemblage et en conséquence pourrait être incorporée dans les virions. Le surnageant des cellules NIH3T3 infectées avec Friend-MLV surexprimant SD' ou non, a été collecté et filtré à travers un filtre 0,22 pm. Les virions ont été déposés sur gradient de sucrose et leur contenu protéique a été analysé par Western blot en utilisant des anticorps anti IN et anti GFP. Comme montré sur l'exemple de la Figure 10 A, la protéine SD' fusionnée à la GFP, a été retrouvée
dans le culot lors de la centrifugation du surnageant de culture cellulaire de cellules productrices, indiquant son incorporation dans les particules virales. Bien qu'abondamment trouvée dans les cellules NIH3T3, la protéine GFP a été détectée seulement en tant que traces dans le milieu extracellulaire.
Dans ce polymère, les R5 et R6, identiques ou différents, peuvent représenter des hydrogène ou un groupe aliphatique, saturé ou insaturé.
En particulier, les R5 et R6 peuvent représenter un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, comportant de 1 à 10 atomes de carbone, tel qu'un groupe méthyle, éthyle..etc.
Dans ce polymère, les groupes hydrocarbonés aliphatiques ou aromatiques, susceptibles d'être utilisés pour R3 et R4peuvent être de divers types. Ils sont constitués par une chaîne carbonée dans laquelle certains atomes de carbone peuvent être remplacés par un ou plusieurs hétéroatomes tels que 0, S et N, et ils peuvent comporter une ou plusieurs insaturations éthyléniques ou acétyléniques. Par ailleurs, le groupe hydrocarboné peut être substitué par des atomes d'halogène. Les groupes hydrocarbonés aromatiques peuvent être constitués par le groupe phényle et le groupe tosyle, éventuellement substitués, par exemple, par des groupes alkyle de 1 à 20 atomes de carbone.
R3 et R4 peuvent, en particulier, représenter un groupe alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 20atomes de carbone.
Dans ce polymère, lorsque l'un au moins des R1 représente le groupe -OCONHR2, le ou les R2 représente une chaîne aliphatique saturé ou insaturé.
En particulier R2 peut représenter un groupe alkyle linéaire ou ramifié comprenant de 1 à 10 atomes de carbones, tel qu'un groupe méthyle, éthyle, hexyle.
Au même titre que pour les composés de formule (I) et (II), les unités de cyclodextrines enchaînées dans le polymère décrit ci-dessus comprennent au moins, en partie, au niveau des positions 2 des cycles anhydroglucose (si le polymère est obtenu à partir des cyclodextrines de formule (III)) ou anhydromaltose (si le polymère est obtenu à partir des cyclodextrines de formule (IV)) , des liaisons de type carbamate.
De préférence, l'indice n, dans ce polymère est égal à 6 et R5 et R6représentent tous les deux H et m est égal à 6.
De préférence encore, dans ce polymère, tous les-OH réagissent avec le diisocyanate mentionné ci-dessus pour donner une liaison carbamate.
Les dérivés de per(3,6anhydro)cyclodextrine décrits précédemment ainsi que les polymères de per(3,6-anhydro)cyclodextrine peuvent être utilisés en particulier pour la fixation ou la séparation d'ions.
Aussi, l'invention a également pour objet un procédé de fixation ou de séparation d'ions consistant à mettre en contact un milieu contenant lesdits ions avec : 1) un dérivé de per(3,6anhydro)cyclodextrine répondant à l'une des formules (I) ou (II) suivantes :
dans lesquelles l'un au moins des R représente le groupe -OCONHR2 et les autres R1 qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupe répondant à l'une des formules OCONHR2, OH, OR3, SH, SR3, OCOR3, NH2, NHR3, NR3R4, CONH2, CONHR3, CONR3R4, CN, COOR3, OCH2C02H, COOH et R3, dans lesquelles le ou les R2 représentent un groupe aliphatique saturé ou insaturé, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un groupe hydrocarboné, aliphatique ou aromatique, saturé ou insaturé, éventuellement substitué par des atomes d'halogène pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi 0, S et N, et n est égal à 6,7 ou 8 ou l'un au moins des R1 représente un groupe OCONH (CR5R6) mNHCOOR7, les autres R1 répondant à la même définition que celle donnée ci- dessus, R5 et R6, identiques ou différents, représentent H ou un groupe aliphatique, saturé ou insaturé, et R7 représente une unité glucosidique ou maltosidique de la peranhydrocyclodextrine et m est un entier allant de 1 à 20 et/ou :
2) un polymère obtenu par réaction d'au moins deux per(3,6-anhydro)cyclodextrines de formule (III) ou (IV), tel que mentionné ci-dessus et d'un diisocyanate de formule OCN- (CR5R6)m-NCO, pour lequel R5 et R6, identiques ou différents représentent H ou un groupe aliphatique, saturé ou insaturé, les OH n'ayant pas réagi lors de la copolymérisation pouvant être des groupes, identiques ou différents, représentant des groupes choisis parmi les groupes suivants :OCONHR2, OH, OR3, SH, SR3, OCOR3, NH2, NHR3, NR3R4, CONH2, CONHR3, CONR3R4, CN, COOR3, OCHZC02H, COOH et R3, dans lesquelles le ou les R2 représente un groupe aliphatique, saturé ou insaturé, R3 et R4 qui peuvent être identiques ou différents, représentent un groupe hydrocarboné, aliphatique ou aromatique, saturé ou insaturé, pouvant comporter un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi 0, S et N, et n est égal à 6,7 ou 8 et m est un entier allant de 1 à 20, pour fixer lesdits ions sous forme de complexe avec le dérivé de per(3,6-anhydro)cyclodextrine ou le polymère et séparer lesdits ions dudit milieu.
Les ions susceptibles d'être fixés ou séparés par le procédé de l'invention peuvent être de divers types, comme les ions de métaux polluants.
Toutefois, le procédé de l'invention s'applique en particulier à la fixation des anions à base de chrome, en particulier les anions contenant du chrome de valence VI tels que les ions chromate ou bichromate, et les anions à base de manganèse tels que les anions permanganate sous forme de complexe avec le
dérivé ou les polymères de per(3,6anhydro)cyclodextrine mentionnés ci-dessus.
Différentes techniques ont été décrites dans l'art antérieur pour accélérer artificiellement l'évolution fonctionnelle des gènes. Parmi les plus répandues, on peut citer la mutagenèse par remplacement de cassette, l'errorprone PCR et le DNA shuffling.
La mutagenèse par remplacement de cassette est une technique basée sur le remplacement d'un fragment d'ADN plasmidique contenant une portion d'une séquence sauvage d'intérêt, par un fragment d'ADN (cassette) contenant au moins une mutation, désirée ou aléatoire. La cassette mutante est composée de 2 oligonucléotides complémentaires synthétiques de séquence prédéfinie (Cassette mutagenesis :an efficient method for génération of multiple mutations at defined sites, J. A. Wells, M. Vasser and D. B. Powers, Gene 34 :315-323 (1985)) ou de 2 oligonucléotides complémentaires dégénérés ou de 2 oligonucléotides complémentaires dopés (Recombinant DNA, Watson, Gilman, Witkowski and Zoller,
Freeman 204-205 (1992)), de façon à générer une banque de plasmides mutants contenant plusieurs séquences différentes.
L'error-prone PCR est une technique utilisant le faible degré de fidélité des ADN polymérases pour introduire en faible proportion des points de mutations le long des séquences amplifiées (A method for random mutagenesis of a defined DNA fragment using a modified polymerase chaine reaction, D. W. Leung, E. Chen and D. V. Goeddel, Technique 1 :11-15 (1989)).
Le DNA shuffling est une technique basée sur la recombinaison homologue in vitro de séquences polynucléotidiques double-brins par fragmentation aléatoire à l'aide de la DNAse I et réassemblage par PCR (DNA shuffling by random fragmentation and reassembly : In vitro recombinaison for molecular évolution, W. P. C. Stemmer, Proceedings of the national Academy of Scien ces, USA 91 :10747-10751 (1994) ; DNA Shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed évolution, A.
Cremeri, S. Raillard, S. Bermudez and W. P. C. Stemmer, Nature 391 :288-291 (1998) ; Protein évolution by molecular breeding, J. Minshull and W. P. C. Stemmer, Current Opinion in Chemical Biology, 3 : 284-290 (1999) ; WO 95/22625 ; 0 911 396 ; WO 00/09679).
La mutagenèse par remplacement de cassette et l'errorprone PCR sont des techniques qui deviennent rapidement limitantes lorsque l'on cherche à générer rapidement des librairies de peptides ou de protéines recombinées présentant des propriétés améliorées. Ces limitations sont notamment liées aux inconvénients engendrés par la répétition du processus de base qui est requise pour assurer une évolution fonctionnelle (ex. accumulation de mutations neutres).
Le DNA shuffling est une technique d'évolution artificielle qui contraint l'utilisateur à isoler ainsi qu'à
fragmenter préalablement les polynucléotides à assembler. Par ailleurs, la fragmentation des polynucléotides étant aléatoire (DNAse I), une proportion non négligeable de polynucléotides recombinés non fonctionnels est inévitablement générée. En effet, les propriétés fonctionnelles d'un peptide, polypeptide ou d'une protéine présentant une structure tridimentionnelle définie, reposent sur la répartition spatiale des groupements chimiques portant l'activité. Ainsi, la fragmentation de polynucléotides au sein de séquences impliquées dans des motifs structuraux élémentaires est de nature à altérer le repliement global de la chaîne peptidique, polypeptidique ou protéique et par voie de conséquence à altérer sa fonctionnalité. Enfin, la fragmentation aléatoire de gènes de petite taille ne génère que peu de fragments capables de se réapparier au cours du processus d'assemblage. L'ensemble de ces inconvénients concourent ainsi à ralentir et à complexifier l'évolution artificielle de gènes codant pour des peptides, polypeptides ou des protéines fonctionnelles.
La présente invention vise précisément à palier aux inconvénients sus-mentionnés en proposant une méthode simple et rapide pour préparer des polynucléotides recombinés ou des peptides, polypeptides ou protéines pour lesquels ils codent, lesdits peptides, polypeptides ou protéines présentant avantageusement une ou plusieurs propriétés améliorées. On entend respectivement par peptides, polypeptides et protéines selon la présente invention, un enchaînement de 2 à 20 résidus d'acides aminés, enchaînement de 20 à 50 résidus d'acides aminés et enchaînement de plus de 50 résidus d'acides aminés.
La présente invention a donc pour principal objet un procédé de préparation de polynucléotides doubles brins recombinés ou des peptides, polypeptides ou protéines pour lesquels ils codent, caractérisé en ce qu'il comprend : a) l'assemblage de séquences nucléotidiques simples brins chevauchants qui couvrent la séquence de tout ou partie de polynucléotides codant une population de départ de peptides, polypeptides ou protéines, pour obtenir des polynucléotides doubles brins recombinés, lesdits polynucléotides doubles brins recombinés comprenant éventuellement à l'une au moins de leurs extrémités une séquence de régulation de l'expression d'un gène ou une partie 3' ou 5' de cette séquence de régulation, b) l'introduction aux extrémités 3' et/ou 5' de chacun des polynucléotides doubles brins recombinés obtenus à l'étape (a) de séquences nucléotidiques complémentaires d'une séquence nucléotidique d'un vecteur de clonage et/ou d'expression.
L'une au moins des extrémités dudit vecteur de clonage et/ou d'expression linéarisé peut correspondre à la partie 3' ou 5' de séquence(s) de régulation de l'expression d'un gène dont la partie 3' ou 5' complémentaire correspond à l'une des extrémités des polynucléotides doubles brins recombinés obtenus à l'étape (b) du procédé de l'invention. On entend par séquence(s) de régulation de l'expression d'un gène selon la présente invention, des séquences régulatrices de la transcription, de la traduction et/ou de la maturation de peptides, polypeptides ou protéines telles qu'un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal ou de transit (séquences pré, séquence pro), une séquence codant pour une endoprotéase, ou un terminateur. L'ensemble de ces séquences
de régulation est connu de l'homme du métier et ce dernier est capable de les choisir en fonction des organismes hôte dans lesquels les peptides, polypeptides ou protéines codés par les polynucléotides doubles brins recombinés obtenus par le procédé de l'invention sont exprimés.
A l'étape (a) du procédé de l'invention, les polynucléotides doubles brins recombinés comprennent à l'une au moins de leurs extrémités tout ou partie d'une séquence de régulation de l'expression d'un gène, qui est apportée auxdits polynucléotides doubles brins recombinés par des séquences nucléotidiques simples brins supplémentaires présentes : i) soit à l'une des extrémités des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants constituant les extrémités des polynucléotides doubles brins recombinés, avant l'assemblage (a), ii) soit, lors de l'assemblage (a), sous la forme d'un ou plusieurs acides nucléiques simples brins, chacun constitué d'une première et d'une seconde région nucléique, dont : - un premier groupe est constitué de premières régions complémentaires des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants constituant l'une au moins des extrémités des polynucléotides doubles brins recombinés, avant l'assemblage (a), et les secondes régions de ce premier groupe correspondent à tout ou partie d'une séquence de régulation de l'expression d'un gène, - le second groupe, s'il est présent, est constitué de premières régions et secondes régions, pour une part complémentaires des secondes régions du premier groupe et pour une seconde part complémentaires les unes des
autres, de façon à former ladite séquence de régulation de l'expression d'un gène ou une partie de celle-ci, iii) soit par la combinaison de (i) et (ii) .
Chacune des séquences nucléotidiques simples brins utilisées à l'étape (a) du procédé de l'invention est constituée ou comprend : - un segment nucléotidique interne codant une séquence en acides aminés d'une des régions variables d'un des peptides, polypeptides ou protéines de la population de départ, ledit segment nucléotidique variable étant flanqué - en 5' par un segment nucléotidique codant la séquence en acides aminés de tout ou partie de l'une quelconque des régions substantiellement conservées des peptides, polypeptides ou protéines de la population de départ, qui est immédiatement adjacente à l'extrémité N terminale d'une région variable, ledit segment nucléotidique étant lui-même éventuellement flanqué en 5' d'une séquence nucléotidique simple brin supplémentaire correspondant à tout ou partie d'une séquence de régulation de l'expression d'un gène, - en 3' par un segment nucléotidique codant la séquence en acides aminés de tout ou partie de l'une quelconque des régions substantiellement conservées des peptides, polypeptides ou protéines de la population de départ, qui est immédiatement adjacente à l'extrémité C terminale d'une région variable, ledit segment nucléotidique étant lui-même éventuellement flanqué en 3' d'une séquence nucléotidique simple brin supplémentaire correspondant à tout ou partie d'une séquence de régulation de l'expression d'un gène.
La présente invention a pour objet une composition cosmétique de mascara comprenant une cire collante. L'invention concerne aussi un procédé cosmétique de maquillage ou de traitement des cils.
La composition de mascara peut être une composition de maquillage, une composition à appliquer sur un maquillage, dite encore top-coat, ou bien encore une composition de traitement des cils.
Les mascaras sont couramment préparés selon deux types de formulation : les mascaras aqueux, dits mascaras crèmes, sous forme d'émulsion de cires dans l'eau ; les mascaras anhydres ou à faible teneur en eau, dits mascaras waterproofs, sous forme de dispersions de cires dans des solvants organiques.
Il est connu d'employer diverses cires pour la formulation des mascaras comme celles décrites dans le document WO-A-91/12793, par exemple la cire d'abeille, la cire de candellila,la cire de carnauba, ou bien encore la cire de polyéthylène.
Toutefois, lorsque les mascaras contiennent certaines cires comme la cire de carnauba, la cire de son de riz ou la cire de polyéthylène, le maquillage des cils obtenu présente un aspect granuleux conférant ainsi un maquillage non lisse et non homogène, défauts qui rendent le maquillage inesthétique.
Par ailleurs, pour obtenir un mascara présentant de bonnes propriétés chargeantes, c'est-à-dire obtenir un maquillage épais des cils, il est possible d'incorporer dans le mascara une ou plusieurs cires en une teneur totale supérieure à 25 % en poids du poids total du mascara. Or en utilisant les cires classiques comme la cire d'abeille, la cire de candellila, ou la cire de carnauba dans ces teneurs élevées, la composition de mascara devient très consistante, voire trop compacte, et ne peut pas être appliquée facilement sur les cils avec les applicateurs de brosse à mascara couramment utilisés. Le mascara trop épais est déposé sur les cils sous forme de paquets et le maquillage ainsi obtenu ne présente pas l'aspect lisse recherché ; le maquillage n'est pas homogène et a un aspect inesthétique.
En outre, certaines cires comme la cire d'orange, la cire de lanoline, employées à des teneurs supérieures à 25 % en poids conduisent à des compositions qui ne sont pas suffisamment stables, notamment après un stockage de deux semaines à température ambiante (25 C) : la composition prend en masse (augmentation importante de la viscosité) ou présente un déphasage qui s'observe visuellement à l'oeil nu. La composition est alors inappropriée pour être appliquée sur les cils.
Le but de la présente invention est de proposer une composition de mascara permettant d'obtenir un maquillage des cils homogène et lisse.
Un autre but de la présente invention est de disposer d'un mascara qui s'applique facilement sur les cils, pouvant comprendre un taux élevé de cire et présentant de bonnes propriétés chargeantes des cils.
Un autre but de l'invention est d'obtenir un mascara qui soit stable, notamment après un stockage de 24 heures à 25 C.
Les inventeurs ont découverts qu'une telle composition pouvait être obtenue en utilisant une cire particulière présentant des propriétés collantes (collant élevé). Cette cire permet d'obtenir une composition de mascara qui s'applique facilement sur les cils, ayant une bonne accroche sur les cils et qui conduit à la formation d'un maquillage lisse et homogène, ne présentant pas d'aspect granuleux.
De plus, la cire collante peut être incorporée dans la composition en une teneur pouvant aller jusqu'à 50 % en poids, par rapport au poids total de la composition, sans obtenir une prise en masse de la composition : la composition est stable (notamment stabilité après 24 heures à 25 C), reste d'une consistance crémeuse et s'applique facilement sur les cils.
Par ailleurs, le mascara permet d'obtenir une bonne séparation des cils : ces derniers ne sont pas collés entre eux.
De façon plus précise, l'invention a pour objet une composition de mascara comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, une cire ayant un collant supérieur ou égal à 0,7 N. s et une dureté inférieure ou égale à 3,5 MPa.
L'invention a également pour objet un procédé cosmétique de maquillage ou de soin non thérapeutique des cils comprenant l'application sur les cils d'une composition telle que définie précédemment.
L'invention a aussi pour objet l'utilisation d'une composition telle que définie précédemment pour obtenir un maquillage des cils homogène et/ou lisse et/ou épais et/ou une bonne séparation des cils maquillés.
Ces copolymères peuvent être réticulés à l'aide de réticulants qui ont pour but qui peuvent être soit du type vinylique, soit du type allylique ou méthallylique, tels que le tétraallyloxyéthane, le divinylbenzène, l'octanedioate de divinyle, le dodécanedioate de divinyle, et l'octadécanedioate de divinyle.
Comme exemples de ces copolymères, on peut citer les copolymères : acétate de vinyle/stéarate d'allyle, l'acétate de vinyle/laurate de vinyle, acétate de vinyle/stéarate de vinyle, acétate de vinyle/octadécène, acétate de vinyle/octadécylvinyléther, propionate de vinyle/laurate d'allyle, propionate de vinyle/laurate de vinyle, stéarate de vinyle/octadécène-1, acétate de vinyle/dodécène-1, stéarate de vinyle/éthylvinyléther, propionate de vinyle/cétyl vinyle éther, stéarate de vinyle/acétate d'allyle, diméthyl-2,2 octanoate de vinyle/laurate de vinyle, diméthyl-2,2 pentanoate d'allyle/laurate de vinyle, diméthyl propionate de vinyle/stéarate de vinyle, diméthyl propionate d'allyle/stéarate de vinyle, propionate de vinyle/stéarate de vinyle, réticulé avec 0,2 % de divinyl benzène, diméthyl propionate de vinyle/laurate de vinyle, réticulé avec 0,2 % de divinyl benzène, acétate de vinyle/octadécyl vinyl éther, réticulé avec 0,2 % de tétraallyloxyéthane, acétate de vinyle/stéarate d'allyle, réticulé avec 0,2 % de divinyl benzène, acétate de vinyle/octadécène-1 réticulé avec 0,2 % de divinyl benzène et propionate
d'allyle/stéarate d'allyle réticulé avec 0,2 % de divinyl benzène.
Les copolymères et homopolymères liposolubles définis précédemment sont connus et notamment décrits dans la demande FR-A-2232303 ; ils peuvent avoir un poids moléculaire moyen en poids allant de 2. 000 à 500. 000 et de préférence de 4. 000 à 200. 000.
Comme polymères filmogènes liposolubles utilisables dans l'invention, on peut également citer les polyalkylènes et notamment les copolymères d'alcènes en C2-C2o, comme le polybutène, les
alkylcelluloses avec un radical alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou non en Ci à C8 comme l'éthylcellulose et la propylcellulose, les copolymères de la vinylpyrolidone (VP) et notamment les copolymères de la vinylpyrrolidone et d'alcène en C2 à C40 et mieux en C3 à C20. A titre d'exemple de copolymère de VP utilisable dans l'invention, on peut citer le copolymère de VP/acétate vinyle, VP/méthacrylate d'éthyle, la polyvinylpyrolidone (PVP) butylée, VP/méthacrylate d'éthyle/acide méthacrylique, VP/eicosène, VP/hexadécène, VP/triacontène, VP/styrène, VP/acide acrylique/méthacrylate de lauryle.