INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
hôte est une levure, ces séquences sont préférentiellement les séquences pré de BGL2 et pro de MF[alpha]1 qui permettent la sécrétion des peptides de l'invention directement dans le milieu de culture. Le gène chimère peut en outre comprendre des séquences codant pour une endoprotéase pour augmenter l'activité protéolytique dans l'organisme hôte durant le processus de sécrétion. Lorsque l'organisme hôte est une levure, ces séquences sont préférentiellement les séquences du gène KEX2 codant pour l'endoprotéase yscf qui permet de cliver la séquence pro du pré-pro-peptide de l'invention durant le processus de sécrétion.
L'invention concerne également un vecteur de clonage et/ou d'expression caractérisé en ce qu'il contient un polynucléotide ou un gène chimère selon l'invention pour transformer un organisme hôte et exprimer dans ce dernier un peptide de l'invention. Le vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus en particulier un baculovirus. Le vecteur est avantageusement un vecteur à réplication autonome comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans l'organisme hôte comme une origine de réplication. En outre, le vecteur peut comporter des éléments permettant sa sélection dans l'organisme hôte comme par exemple un gène de résistance à un antibiotique ou un gène de sélection qui assurent la complémentation avec le gène respectif délèté au niveau du génome de l'organisme hôte. Le vecteur peut également être un vecteur navette comportant des éléments permettant son maintien et sa réplication dans chacun des organismes hôte et des éléments permettant sa sélection dans chacun des organismes hôte. De tels vecteurs de clonage et/ou d'expression sont bien connus de l'homme du métier et largement décrits dans la littérature.
L'invention concerne également un organisme hôte caractérisé en ce qu'il est transformé par un vecteur de l'invention. Par organisme hôte selon la présente invention, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel un polynucléotide ou un gène chimère de l'invention est introduit pour la production d'un peptide de l'invention.
Selon une forme préférée de l'invention, l'organisme hôte est un microorganisme tel qu'une levure, une bactérie ou un champignon. La transformation de tels microorganismes permet de produire les peptides de l'invention à échelle semi-industrielle ou industrielle. A titre de bactérie, l'invention envisage plus particulièrement la bactérie de l'espèce Escherichia coli. A titre de levure, l'invention envisage plus particulièrement une levure de genre Saccharomyces de préférence de l'espèce Saccharomyces cerevisiae, de genre Kluyveromyces de préference de l'espèce Kluyveromyces lactis, de genre Hansenula de préférence de l'espèce Hansenula polymorpha, de genre Pichia de préférence de l'espèce Pichia pastoris ou de genre Schizosaccharomyces de préférence de l'espèce Schizosaccharomyces pombe. A titre de champignon, l'invention envisage plus particulièrement le champignon filamenteux de l'espèce Aspergillus nidulans.
Selon une autre forme de l'invention, l'organisme hôte est une animale, en particulier une cellule d'arthropode (par exemple une cellule de Spodoptera frugiperda ou de Trichoplusia ni) ou une cellule de mammifère.
Selon une autre forme de l'invention, l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante. Par cellule de plante on entend selon la présente invention, toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de
plantes, des plantes ou des semences. Par plante on entend selon 1' invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine.
Les peptides de l'invention sont également utiles pour conférer aux plantes un caractère de résistance aux maladies bactériennes, plus particulièrement dues à des bactéries à Gram positif. L'invention concerne donc également une cellule végétale ou une plante résistante aux maladies bactériennes comprenant un polynucléotide ou un gène chimère de l'invention et exprimant un peptide de l'invention.
La lecture de la plaque est effectuée après une heure d'incubation à température ambiante sur un spectrofluorimètre Rubystar (BMG).
Les résultats obtenus sont exprimés sur la figure 3 qui montre l'évolution du signal pour une concentration croissante d'enzyme.
La diminution du signal est en parfaite corrélation avec l'augmentation de l'activité enzymatique, c'est-à-dire le clivage du substrat DNP-HS-Biotine. Le format utilisé est donc parfaitement adapté à une méthode de dosage d'une enzyme de type héparanase, telle que l'héparitinase, mais également à une méthode de détermination d'un modulateur de cette activité enzymatique.
Exemple 5: Détermination d'un modulateur d'une activité enzymatique de type héparanase.
On procède comme dans l'exemple 4 mais les différents mélanges réactionnels sont incubés avec des activités enzymatiques identiques, en présence ou en absence d'un produit à tester.
On détermine le pourcentage d'inhibition ou d'activation de l'enzyme due au composé à tester par comparaison des résultats obtenus en présence et en l'absence de produit à tester.
B/ Utilisation d'un substrat de type héparane sulfate protéoglycane (HSPG) Dans ce cas, le substrat est fonctionnalisé en utilisant les fonctions OH de l'HS et les fonctions NH2 de la partie protéique (protéoglycane).
Exemple 6 : Synthèse du substrat DNP-Héparane Sulfate Protéoglycane- Biotine (ci-après DNP-HSPG-Biotine).
Réactifs utilisés : HSPG : Sigma, PM 200 kDa Biotine hydrazide : Pierce, PM 258,33 Da Na104 : Sigma NaCNBH4 : Sigma Le HSPG est dialysé contre une solution carbonate 100mM, pH 9.
Marquage au DNP On fait réagir une solution de HSPG et de DNP-NHS pendant 1 h à température ambiante Les quantités utilisées sont telles que le rapport molaire initial est de 15 DNPs par HSPG. Le mélange réactionnel est ensuite purifié sur colonne Sephadex G-25 (NAP-5, Pharmacia) éluée par du tampon P04 100 mM pH7. On obtient une solution de DNP-HSPG.
Marquage à la biotine La solution de DNP-HSPG obtenue précédemment est oxydée par une solution de Na104 10mM pendant 30 min à température ambiante. Après purification sur colonne Sephadex G25 éluée par du tampon P 100 mM pH 7,0, la solution de DNP-HSPG oxydée est mélangée avec une solution de biotinehydrazide. Les quantités utilisées sont telles que le rapport molaire initial est de 10 biotine-hydrazides par DNP-HSPG. Le mélange réactionnel est incubé à 4 C pendant 16 h et est ensuite réduit par une solution de NaCNBH4 15 mM pendant 40 min à 4 C. Après purification sur colonne Sephadex G215 éluée par du tampon P04 100mM pH 7,0, on obtient une solution de DNP-HSPG-Biotine.
Exemple 7 : Dosage du composé DNP-HSPG-Biotine par une méthode homogène de mesure de fluorescence en temps résolu (HTRF).
Le présent exemple permet de valider l'utilisation du produit DNP-HSPGBiotine dans un dosage basé sur la mesure de fluorescence émise par transfert radiatif, en milieu homogène et en temps résolu.
Réactifs utilisés : Conjugué streptavidine-XL (ci-après Sa-XL) solution à 10 g/ml préparée à partir de Sa-XL 625 g/ml (CIS bio international) diluée dans tampon P04(Na/K) à 0,1 M pH7,0 ; 0,2%BSA 0,8M KF.
Conjugué anticorps anti-DNP-Cryptate (ci-après aDNP-K) solution à 0,4 g/ml préparée à partir de aDNP-K 100 g/ml (CIS bio international) diluée dans tampon P04(Na/K) à 0,1 M pH7,0 0,2%BSA 0,8M KF.
Conjugué streptavidine-Cryptate (ci-après Sa-K) solution à 0,8 g/ml préparée à partir de Sa-K 200 g/ml (CIS bio international) diluée dans tampon P04(Na/K) à 0,1M pH7,0 ; 0,2%BSA 0,8M KF Conjugué anticorps anti-DNP-XL (ci-après aDNP-XL) solution à 4 g/ml préparée à partir de aDNP-XL 250 pg/ml (CIS bio international) diluée dans tampon P04(Na/K) à 0,1 M pH7,0 ; 0,2%BSA 0,8M KF.
Cette rainure peut aussi être utilisée comme site de fixation et d'ancrage d'éléments rapportés, notamment lorsque ces derniers sont susceptibles d'être montés à des emplacements variables, non prédéterminés.
Tel est le cas de la rainure, dite"rainure européenne", prévue sur les profilés des cadres ouvrants semi-fixes et des ouvrants des fenêtres et portes en polychlorure de vinyle.
En effet, cette rainure, qui reçoit habituellement des éléments de tringlerie, notamment de tringlerie de manoeuvre et de verrouillage, peut également être utilisée, au moins en partie, dans certaines réalisations de fermetures de baies, comme site d'ancrage pour la fixation d'accessoires tels que, plus particulièrement, des paumelles ou parties de paumelles, et notamment des paumelles à genouillère.
Actuellement, ces parties de paumelles sont généralement solidarisées avec le profilé support comme indiqué sur les figures 1 et 2 des dessins annexés (vues en coupe), c'est-à-dire au moyen de paires de deux vis autoforeuses.
Avant d'utiliser la rainure en tant que site de fixation, il y a lieu de la rendre compatible avec cette fonction et en particulier de prendre des mesures pour augmenter la résistance du montage dans cette rainure.
A cet effet, un profilé ou un segment de profilé A, servant d'élément de calage, d'ancrage de la vis et d'accrochage au niveau de la nervure latérale formée dans ladite rainure, est glissé dans cette dernière.
De plus, pour renforcer davantage encore la résistance de la fixation, un profilé d'ancrage B supplémentaire est introduit dans la
chambre située derrière la paroi de la rainure, au niveau de la face arrière de la paroi de fond de cette rainure (figure 1).
Une autre possibilité consiste à prévoir un profilé de renfort de forme spécifique, c'est-à-dire avec un retour au niveau de la face arrière de la paroi de fond de ladite rainure pour la réception de la vis (figure 2).
Toutefois,. ces solutions sont fastidieuses à mettre en oeuvre, entraînent des coûts de matière et de main d'oeuvre importants, et nécessitent d'avoir à disposition une pluralité d'éléments et de pièces diverses.
A cet effet, l'invention a pour principal objet un dispositif de solidarisation et d'ancrage d'un élément dans une rainure allongée pourvue d'au moins une nervure ou d'une projection saillante latérale analogue située à distance de son fond et s'étendant dans la direction longitudinale de ladite rainure, caractérisé en ce qu'il est principalement constitué, d'une part, par deux ailettes formées d'un seul tenant avec l'élément à solidariser, s'étendant sensiblement parallèlement à partir d'une portion en forme de plaque faisant partie dudit élément et dont l'une au moins est pourvue d'un moyen d'accrochage, et, d'autre part, par au moins un organe mobile allongé monté dans une perforation ménagée dans ladite portion et s'étendant entre lesdites deux ailettes, un déplacement approprié dudit organe provoquant un 1 écartement desdites ailettes, par pliage de l'une au moins d'entre elles, et la venue en prise du moyen d'accrochage de ladite au moins une ailette subissant un pliage avec ladite au moins une nervure saillante.
L'invention sera mieux comprise, grâce à la description ciaprès, qui se rapporte à des modes de réalisation préférés, donnés à titre d'exemples non limitatifs, et expliqués avec référence aux dessins schématiques annexés, dans lesquels : la figure 3 est une vue en coupe d'un profilé de dormant sur lequel une partie de paumelle pourvue du dispositif selon un mode de réalisation de l'invention est montée ; les figures 4 et 5 sont des vues de détail en coupe de deux autres modes de réalisation du dispositif de l'invention ; la figure 6 est une vue en perspective d'une paumelle munie du dispositif de fixation et d'ancrage représenté sur la figure 3, et,
les figures 7 et 8 sont des vues respectivement en coupe transversale et en perspective de portions de profilés d'un dormant et d'un ouvrant relié par une paumelle telle que présentée sur la figure 6.
Comme le montrent les figures 3 à 8 des dessins annexés, l'invention a pour objet un dispositif de solidarisation et d'ancrage d'un élément 1 dans une rainure 2 allongée pourvue d'au moins une nervure 3, 3' ou d'une projection saillante latérale analogue située à distance de son fond 4 et s'étendant dans la direction longitudinale de ladite rainure 2.
Conformément à l'invention, ledit dispositif est caractérisé en ce qu'il est principalement constitué, d'une part, par deux ailettes 5 et 5' formées d'un seul tenant avec l'élément 1 à solidariser, s'étendant sensiblement parallèlement à partir d'une portion en forme de plaque l' faisant partie dudit élément 1 et dont l'une au moins est pourvue d'un moyen d'accrochage 6, et, d'autre part, par au moins un organe mobile allongé 7 monté dans une perforation 8 ménagée dans ladite portion l'et s'étendant entre lesdites deux ailettes 5 et 5', un déplacement approprié dudit organe 7 provoquant un écartement desdites ailettes 5 et 5', par pliage de l'une au moins d'entre elles, et la venue en prise du moyen d'accrochage 6 de ladite au moins une ailette 5 subissant un pliage avec ladite au moins une nervure saillante 3.
Parmi les monomères vinyliques activés de formule (I) ci-dessus, on peut notamment citer le méthacryloyl-succinimide, l'hydroxyéthyl-méthacrylate (HEMA), le méthacrylonitrile, l'acrylonitrile, l'acrylate et le méthacrylate de glycidyle, l'acide acrylique, l'acide méthacrylique, l'aminopropyl méthacrylamide, l'aminohexyl méthacrylamide, le méthacryloyl succinimide, l'acryloyl succinimide, le méthacrylate de méthyle, le méthacrylate d'éthyle, le méthacrylate de propyle, le méthacrylate de butyle, le cyano méthacrylate de méthyle, le cyano acrylate de méthyle, la 2- et la 4-vinyl pyridine et le 4-chloro styrène.
Parmi les molécules clivables par attaque nucléophile de formule (II)
ci-dessus, on peut notamment citer l'oxyde d'éthylène, les oxydes d'éthylène substitués, la butyrolactone, les caprolactones et notamment l'E-caprolactone.
Parmi les molécules, macromolécules et objets fonctionnalisées par des monomères on peut citer les oligonucléotides, les molécules d'acide nucléique telle que l'ADN et l'ARN, les oligo-peptides, les polypeptides tels que la poly-Llysine, les protéines telles que l'avidine, la streptavidine, les anti-corps, les antigènes, les facteurs de croissance, les protéines fluorescentes comme par exemple les "Green Fluorescent Proteins" (GFP), les ferredoxines, etc..., les oligo-saccharides, les polymères tels que par exemple la poly-allyl-amine, les polysaccharides et dérivés comme la cellulose et les celluloses modifiées, l'héparine, les dextranes et les dextranes substitués tels que les dextranes porteurs de groupements méthylcarboxylique (CM), N-benzylméthylènecarboxamide (B) et sulfonate (S) également dénommés CMDBS, les polymères téléchéliques (c'est-à-dire les polymères de structure quelconque substitués à leurs extrémités par des groupements fonctionnels complémentaires adéquats, comme par exemple le polyéthylèneglycol diméthacrylate), etc..., les fullerènes, les nanotubes de carbone fonctionnalisés et les cellules ; lesdites molécules, macromolécules et lesdits objets dérivatisés, totalement ou partiellement, avec des monomères répondant aux formules (I) ou (II) précédemment décrites.
Selon l'Invention la surface conductrice ou semi-conductrice de l'électricité est de préférence une surface d'inox, d'acier, de fer, de cuivre, de nickel, de cobalt, de niobium, d'aluminium (notamment lorsqu'il est fraîchement brossé), d'argent, de titane, de silicium (dopé ou non), de nitrure de titane, de nitrure de tungstène, de nitrure de tantale ou une surface métallique noble choisie par les surfaces d'or, de platine, d'iridium ou de platine iridié ; les surfaces d'or étant particulièrement préférées selon l'Invention.
Sur le support conforme à l'Invention, la densité des groupements fonctionnels d'intérêt accessibles est de préférence comprise entre 104/ m2 et 1010/ m2.
La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un support tel que décrit précédemment, caractérisé par le fait qu'il consiste à réaliser l'électrogreffage, en une seule étape, de précurseurs organiques
électro-actifs sur au moins une zone d'au moins une région conductrice et/ou semiconductrice de l'électricité à oxyde réductible sur sa surface d'un support solide, par électrolyse en milieu organique, d'une composition renfermant, dans ledit milieu organique, au moins un précurseur organique électro-actif comportant au moins un groupement fonctionnel d'intérêt, par mise en contact de ladite composition avec ladite zone, cette dernière étant soumise à un protocole de potentiel au cours duquel elle est portée, pendant tout ou partie du protocole de potentiel (voltammétrique, potentiostatique, multicréneaux, etc...), à un potentiel supérieur ou égal à un potentiel électrique seuil déterminé par rapport à une électrode de référence, ledit potentiel électrique seuil étant le potentiel au-delà duquel se produit le greffage desdits précurseurs et par le fait qu'un taux d'accessibilité en groupements fonctionnels d'intérêt d'au moins 90 % (en nombre) est obtenu : a) en ajustant le protocole de potentiel, et notamment le nombre de balayages et la vitesse de balayage lors d'un protocole répétitif (balayages voltammétriques multicréneaux, etc...) de façon à entraîner un taux de greffage inférieur ou égal à 60 %, et/ou b) par l'utilisation d'une composition dans laquelle les précurseurs organiques électro-actifs fonctionnalisés sont présents en mélange avec des précurseurs organiques électro-actifs ne comportant pas de groupement fonctionnel d'intérêt, ces derniers représentant alors de 0,1% à 95 % du nombre total de précurseurs présents au sein de ladite composition, et/ou c) par l'utilisation de précurseurs organiques électro-actifs choisis parmi ceux dans lesquels le groupement fonctionnel d'intérêt est porté à l'extrémité d'un bras espaceur.
Par ce procédé, on peut fonctionnaliser la surface avec divers groupements organiques, et réaliser un véritable "velcro moléculaire" sur lequel on peut ensuite tirer parti directement de toutes les propriétés du polymère qui a été greffé, qu'il s'agisse de propriétés chimiques ou physiques, pour y fixer divers "objets", comme par exemple des molécules (chimiques ou biochimiques), des polymères, des cellules, ou même obtenir une fonction de collage envers un objet macroscopique, par exemple par adhésion chimique sur le polymère greffé.
Ce résultat est inattendu, étant donné que tout groupement réactif présent sur un monomère vinylique (autre que la liaison vinylique elle-même), est susceptible de faire des réactions parasites voire d'interrompre ou d'interdire la croissance des chaînes lors de l'électro-polymérisation des chaînes greffées (voir par exemple : G. Deniau, et al., J. of Electroanalytical Chem., 1998, 451, 145.
Cependant, l'idée de la présente Invention tient en ce qu'il n'est pas nécessaire d'assurer une croissance de chaînes longues sur la surface pour pouvoir bénéficier de la fixation des groupements fonctionnels d'intérêt initialement portés par les monomères vinyliques fonctionnalisés. Dans cette optique, les réactions parasites, voire les réactions de terminaison, qui peuvent apparaître du fait de la présence - sur le monomère vinylique initial - de groupements fonctionnels protiques ou réactifs par rapport à l'extrémité en croissance, non protégés, sont de peu d'importance, tant qu'elles ne consomment pas la totalité des groupements fonctionnels d'intérêt présents sur les précurseurs.
En particulier, l'électrogreffage de monomères vinyliques ou cycliques porteurs de groupements organiques d'intérêt variés permet donc d'envisager les films organiques électro-greffés comme un moyen d'obtenir en une étape, sur les surfaces conductrices et semi-conductrices, ce que l'on pouvait obtenir en deux étapes au moins en passant par la fabrication préalable d'une couche d'oxyde (par exemple en combinant fabrication d'une couche d'oxyde et fonctionnalisation chimique par un primaire d'adhésion bi-fonctionnel). Le procédé conforme à l'Invention permet la formation de liaisons covalentes entre le métal et le polymère greffé, ce qui permet d'assurer la fabrication d'une couche ayant une contribution importante à la solidité de l'interface.
Selon ce procédé, et dans le cas de la variante a), l'ajustement du protocole de potentiel permet, notamment dans le cas des polymères, d'ajuster le taux de greffage, c'est-à-dire le nombre de chaînes de polymères greffées par unité de surface : un taux de greffage modéré permettra par exemple un espacement des chaînes suffisant pour permettre le mouillage du revêtement dans son épaisseur par un solvant adéquat, ainsi que l'entrée dans le film du revêtement de molécules sondes.
Selon une forme de réalisation préférée de cette variante a), le taux de greffage est ajusté à une valeur comprise entre 10 et 40 %.
Dans le cas de la variante b), les groupements fonctionnels d'intérêt sont espacés les uns des autres en effectuant l'électrogreffage à partir d'un mélange de monomères différents, dont une partie seulement porte les groupements fonctionnels d'intérêt que l'on souhaite voir présents sur le revêtement final. Les proportions relatives des différents monomères permettent alors d'ajuster le nombre de groupements fonctionnels d'intérêt, et donc leur accessibilité. Selon une forme de réalisation préférée de cette variante b), les précurseurs organiques électro-actifs ne comportant pas de groupement fonctionnel d'intérêt représentent de 0,1 à 50 % du nombre total de précurseurs présents au sein de ladite composition.
Les conditions de concentration en précurseur fonctionnalisé (monomère ou autre) sont variables d'un précurseur à l'autre. On pourra cependant considérer comme préférentielles les concentrations comprises entre 0,1et 10 mol/1, et en particulier entre 0,1 et 5 mol/1 en ce qui concerne les précurseurs organiques électro-actifs comportant un groupement fonctionnel d'intérêt. Lorsque des précurseurs organiques électro-actifs ne comportant pas de groupement fonctionnel d'intérêt sont présents au sein de la composition organique (variante b)), ceux-ci sont alors présents à une concentration de préférence comprise entre 10-3 et 18 mol/1 et encore plus préférentiellement entre 10-3 et 9 mol/1.
Exemple 6 : Incorporation à l'émulsion A du silane aminé salifié ou d'APV lors de la confection du bain d'enduction Des essais d'addition de promoteurs d'adhérence ont été réalisés pour rendre les émulsions davantage adhérentes sur la fibre de verre ou des fibres synthétiques. Les silanes hydrosolubles testés sont : 6. 1 Essai comparatif : Le promoteur est le dynasylan HS 2926 commercialisé par la société Degussa-Sivento, silane époxy, pH = 3, à 60% dans l'eau
6. 2 Essai 6.2 Le dynasylan# HS 2929 commercialisé par la société Degussa-Sivento, silane aminé et acrylique condensé et salifié, pH=4, à 60% dans l'eau
6. 3 Essai 6.3 Le promoteur est le Silquest VS142 commercialisé par la société Witco - OSI, silane aminé, pH = 12, à env.25 % dans l'eau, qui est constitué d'un oligomère du silane décrit ci-dessous, partiellement condensé via ses SiOH.
Ce silane a été utilisé après salification préalable obtenue par neutralisation de la solution aqueuse par addition d'une quantité d'acide acétique suffisante pour ramener son pH entre 6 et 7.
Ces promoteurs des essais 6. 1, 6. 2, 6. 3 sont additionnés directement dans la partie A2 de l'émulsion de l'exemple 1,24 H avant la réalisation du bain (mélange A2 + B) à un taux de 2% (en poids de silane sec par rapport à l'huile). Dès confection du bain des tests d'enduction de tissu par sérigraphie et de pelage sont réalisés avec le protocole décrit en annexe. Les résultats d'adhérence sur polyester et sur tissu de verre type toile, exprimés par la force de pelage (mesurée en N/(g/m2), selon un test de pelage à 180 décrit ci-après) sont représentés sur les figures 1 et 2 annexées.
La Figure 1 correspond à un support en tissu polyester.
La Figure 2 correspond à un support en tissu de verre.
Nota : dans les 2 figures, le témoin correspond aux résultats d'adhérence obtenus lorsque le tissu est traité avec l'émulsion 1. 2 de l'exemple 1, sans ajout de promoteur d'adhérence supplémentaire.