INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Parmi les sels d'ammonium quaternaire de formule (XX) on préfère, d'une part, les chlorures de tétraalkylammonium comme par exemple les chlorures de
Les esters d'acides monocarboxyliques sont notamment les monoesters d'acides aliphatiques saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés en C1-C26 et d'alcools aliphatiques saturés ou insaturés, linéaires ou ramifiés en C1-C26 , le nombre total de carbone des esters étant supérieur ou égal à 10.
On peut notamment citer : le sébacate de diéthyle ; le sébacate de diisopropyle ; l'adipate de diisopropyle ;l'adipate de di n-propyle ; l'adipate de dioctyle ; l'adipate de diisostéaryle ; le maléate de dioctyle ; l'undecylénate de glycéryle ; le stéarate d'octyldodécyl stéaroyl ; le monoricinoléate de pentaérythrityle ; le tétraisononanoate de pentaérythrityle ; le tétrapélargonate de pentaérythrityle ; le tétraisostéarate de pentaérythrityle ; le tétraoctanoate de pentaérythrityle ; le dicaprylate le dicaprate de propylène glycol ; l'érucate de tridécyle ; le citrate de triisopropyle ; le citrate de triisotéaryle ; trilactate de glycéryle ; trioctanoate de glycéryle ; le citrate de trioctyldodécyle ; le citrate de trioléyle.
Parmi les silicones organomodifiées, on peut citer les polyorganosiloxanes comportant : - des groupements polyéthylèneoxy et/ou polypropylèneoxy comportant éventuellement des groupements alkyle en C6-C24 tels que les produits dénommés diméthicone copolyol commercialisé par la société DOW CORNING sous la dénomination DC 1248 ou les huiles SILWET L 722, L 7500, L 77, L 711 de la société UNION CARBIDE et l'alkyl (Cl2) méthicone copolyol commercialisée par la société DOW CORNING sous la dénomination Q2 5200 ;
- des groupements aminés substitués ou non comme les produits commercialisés sous la dénomination GP 4 Silicone Fluid et GP 7100 par la société GENESEE ou les produits commercialisés sous les dénominations Q2 8220 et DOW CORNING 929 ou 939 par la société DOW CORNING. Les groupements aminés substitués sont en particulier des groupements aminoalkyle en C1-C4 ; - des groupements thiols comme les produits commercialisés sous les dénominations "GP 72 A" et "GP 71" de GENESEE ; - des groupements alcoxylés comme le produit commercialisé sous la dénomination "SILICONE COPOLYMER F-755" par SWS SILICONES et ABIL WAX 2428, 2434 et 2440 par la société GOLDSCHMIDT ; - des groupements hydroxylés comme les polyorganosiloxanes à fonction hydroxyalkyle décrits dans la demande de brevet français FR-A-85 16334 répondant à la formule (XVI) : dans laquelle les radicaux R3 identiques ou différents sont choisis parmi les radicaux méthyle et phényle ; au moins 60 % en mole des radicaux R3 désignant méthyle ; le radical R'3 est un chaînon alkylène divalent hydrocarboné en C2-C18 ; p est compris entre 1 et 30 inclus ; q est compris entre 1 et 150 inclus ; - des groupements acyloxyalkyle tels que par exemple les polyorganosiloxanes décrits dans le brevet US-A-4957732 et répondant à la formule (XVII) : dans laquelle :
R4 désigne un groupement méthyle, phényle, -OCORs, hydroxyle, un seul des radicaux R4 par atome de silicium pouvant être OH ; R'4 désigne méthyle, phényle ; au moins 60 % en proportion molaire de l'ensemble des radicaux ?4 et R'4 désignant méthyle ; R5 désigne alkyle ou alcényle en C8-C20 ; R" désigne un radical alkylène hydrocarboné divalent, linéaire ou ramifié en C2- C18 ; r est compris entre 1 et 120 inclus ; p est compris entre 1 et 30 ; q est égal à 0 ou est inférieur à 0,5 p, p + q étant compris entre 1 et 30 ; les polyorganosiloxanes de formule (XVII) peuvent contenir des groupements : dans des proportions ne dépassant pas 15 % de la somme p + q + r.
le jugera utile. Dans ce Tableau, les nombres représentent les numéros SEQ ID des séquences en cause.
TABLEAUI
Séquences Séquences Nucléotidiques protéiques Organisme Nom du MLE EGM Gène codant la Extrémités ITR UTR Transposase transposase 5' 3' 5' 3' 5' 3' Bythograea Bytmar 1 1 6 11 12 26 27 28 29 21 thermydron Bytmar 1.11 2 7 13 14 30 31 32 33 22 Alvinella Alvcmar 1,15 3 8 15 16 34 35 36 37 23 caudata Alvcmar 1.16 4 9 17 18 38 39 40 41 24 Ventiella Vensmar 1.3 5 10 19 20 42 43 44 45 25 suif uns
De préférence, l'acide nucléique conforme au premier aspect de l'invention a pour séquence SEQ ID N 4 ou un fragment fonctionnel de celle-ci.
Une séquence nucléotidique ou un acide nucléique selon l'invention sont conformes à l'acception usuelle dans le domaine de la biologie. Ces deux expressions couvrent indifféremment les ADN et les ARN, les premiers pouvant être par exemple génomiques, plasmidiques, recombinants, complémentaires (ADNc), et les seconds, messagers (ARNm), ribosomaux (ARNr), de transfert (ARNt). De manière préférée, les séquences nucléotidiques et acides nucléiques de l'invention sont des ADN.
Dans le contexte de la présente invention, l'on conviendra que les séquences nucléotidiques couvrent non seulement les séquences nucléotidiques visées elles-mêmes et généralement identifiées par leurs numéros de SEQ ID, mais également leurs séquences complémentaires, les séquences similaires à celles-ci ou aux séquences complémentaires de celles-ci à au moins 79%, et les séquences hybridables en conditions strictes à au moins 79% avec celles-ci ou avec les séquences complémentaires de celles-ci. En particulier, un acide nucléotidique conforme à la présente invention est choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 20, les fragments fonctionnels de celles-ci, les séquences complémentaires de celles-ci, les séquences similaires à celles-ci ou aux séquences complémentaires de celles-ci à au moins 90%, de préférence au moins 95%, et de manière encore préférée, au moins 98%, et les séquences hybridables en conditions strictes avec celles-ci ou avec les séquences complémentaires de celles-ci à au moins 90%, de préférence au moins 95%, et de manière encore préférée, au moins 98%.
L'on entend par fragment fonctionnel d'une séquence nucléotidique, ladite séquence nucléotidique codant une protéine présentant une activité biologique donnée, des parties de cette séquence, comprenant au moins toutes les régions essentielles à l'activité biologique de la protéine codée. Les parties de séquence en question peuvent être de taille plus ou moins longue dès lors que l'activité biologique de la protéine qu'elles codent est conservée.
Cette définition peut être étendue aux fragments fonctionnels de la protéine ainsi codée.
S'agissant d'un EGM, qui contient mais ne se limite pas à la séquence nucléotidique codant la transposase, ou d'une extrémité, ou encore d'une ITR, qui sont des régions nucléotidiques non codantes d'un EGM, les fragments fonctionnels sont, dans le contexte de l'invention, définis comme suit. Un fragment fonctionnel d'une ITR d'un MLE est
une partie de cette ITR, nécessaire et suffisante pour être reconnue par la transposase et permettre qu'une transposition ait lieu.
Un fragment fonctionnel d'une extrémité d'un MLE est une partie de cette extrémité, ladite partie étant nécessaire et suffisante pour : # permettre qu'en présence d'une transposase, un mécanisme de transposition ait lieu : il peut par exemple s'agir d'une ITR ou d'un fragment fonctionnel d'une ITR, éventuellement associé (e) à une UTR ou une partie d'UTR ; ou # correspondre à une séquence consensus d'un promoteur transcriptionnel par la présence d'une ITR ou d'une partie d'ITR associée à une UTR ou une partie d'UTR (pour des séquences consensus de promoteurs transcriptionnels, l'homme du métier pourra, par exemple, se référer aux informations données par le site www.infobioqen.fr).
Un fragment fonctionnel d'un MLE peut notamment comprendre : # un fragment fonctionnel du gène codant la transposase de ce MLE ; ou # un fragment fonctionnel d'une extrémité de ce MLE ; encore # un fragment fonctionnel d'une ITR de ce MLE ; enfin # une combinaison de ceux-ci.
Les termes et expressions activité , fonction , activité biologique et fonction biologique sont équivalents et répondent à l'acception usuelle dans le domaine technique de l'invention. Une telle activité est par exemple de nature enzymatique. Dans le contexte de l'invention, l'activité en cause est l'activité transposase. Certes, il est bien connu de l'homme du métier que la transposase d'un MLE présente plusieurs activités enzymatiques, toutes aussi nécessaires les unes que les autres au processus de transposition et chacune d'entre elles pouvant être limitante dans ce processus (Plasterk et al., supra). Cependant,
conformément à l'usage, l'expression activité transposase désigne ici de manière générique l'ensemble des activités enzymatiques de la transposase d'un MLE. En particulier, les activités enzymatiques ainsi couvertes sont : la liaison à l'ADN, spécifique (par reconnaissance des ITR) et non spécifique (grâce au domaine N-terminal des transposases), la dimérisation, le transfert des brins d'ADN (coupure et liaison concomitante des brins d'ADN), les propriétés endonucléasiques (activités de coupure des brins d'ADN) et d'internalisation nucléaire.
Ainsi, s'agissant des transposases, des fragments fonctionnels sont également entendus comme étant des parties desdites transposases, ces parties comprenant au moins toutes les régions essentielles à l'une au moins des activités enzymatiques susmentionnées. Par exemple, il est connu que les transposases de MLE comprennent au moins deux domaines fonctionnels : le domaine N-terminal (acides aminés des positions 1 à 140 de la séquence de la transposase Mos-1 ; plus généralement, acides aminés des positions 1 à 140 +/- 10) responsable de la liaison aux ITR, et le domaine C-terminal (acides aminés des positions 141 à 345 de la séquence de la transposase Mos-1 ; généralement, acides aminés des positions 140 +/- 10 à l'extrémité C- terminale) porteur de l'activité catalytique. Aussi, entre autres exemples, un fragment fonctionnel de telles transposases peut être l'un ou l'autre de ces domaines, ou encore un motif conservé d'un tel domaine. L'on peut ainsi envisager de reconstituer une transposase ou partie de transposase composite, à partir d'au moins deux fragments fonctionnels provenant d'au moins deux transposases distinctes.
Deux séquences nucléotidiques complémentaires sont telles que chaque base de l'une est appariée avec la base complémentaire de l'autre, l'orientation des deux séquences étant inversée. Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U dans le cas des ARN), et C et G.
Les courbes de référence peuvent ainsi être constituées lors d'une étape précédant l'étape de lecture.
Dans ce cas, le lecteur est mis en #uvre pour recueillir la réponse des sondes à des fragments simple brins de type connus (fragments correspondant à un acide nucléique cible sans mutation, et avec mutation), lorsque la température varie continûment sous l'effet de la commande de la centrale 15.
Et ces courbes peuvent être mémorisées, par exemple dans l'ordinateur 17.
Mode dynamique Ce mode est particulièrement bien adapté au cas d'une puce dont les sondes correspondent à des acides nucléiques cibles dont les configurations match ont des températures de fusion très différentes.
Dans ce mode, on commande une évolution de température de la puce (par exemple augmentation constante ou diminution constante), de manière à passer par les températures de fusion des différents acides nucléiques cibles des différentes sondes.
Cette évolution est obtenue par l'envoi d'une consigne adaptée de la centrale 15 au module 111 associé à la table.
Pendant de cette évolution de température : # les moyens de lecture 14 recueillent en temps réel la réponse des duplexes associés aux différents emplacements de la puce à l'excitation des moyens d'excitation 13, et transmettent ladite réponse à l'ordinateur 18, # pour chaque emplacement de la puce, l'évolution de la réponse du duplex en fonction de la température est mémorisée dans une mémoire de l'ordinateur 18.
L'ordinateur construit ainsi pour chaque emplacement de la puce une courbe illustrant l'évolution de réponse de la sonde en fonction de la température, comme représenté sur la figure 4b qui illustre le cas très simple d'une puce à quatre emplacements (courbes 1,2, 3 et 4).
Les sondes sont réparties par couples, une sonde du couple correspondant à un acide nucléique cible sans mutation, l'autre sonde correspondant au même acide nucléique cible avec une mutation.
La réponse des deux sondes de chaque couple va donc correspondre à deux courbes similaires aux deux courbes de référence de la figure 4a.
Et il sera possible, par analyse des courbes de chaque couple de sondes, de déterminer la sonde match et la sonde mismatch .
L'ordinateur comprend à cet effet un programme apte à établir pour chaque emplacement de la puce, à l'issue de la mémorisation de ladite évolution de réponse, un diagnostic d'état de la sonde associée à cet emplacement.
EXEMPLE DE MISE EN OEUVRE DE L'INVENTION Le lecteur de puce selon l'invention permet de lire des puces à ADN.
C'est donc également un objet de la présente invention de fournir une puce à ADN composée de nombreux oligonucléotides (ou sondes) correspondant ou comprenant des fragments de gène sauvage ou muté, notamment du gène CFTR humain (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Une telle puce est particulièrement utile pour la détection de mutations du gène CFTR humain et le diagnostic de la mucoviscidose.
La mucoviscidose est l'une des maladies autosomiques récessives les plus fréquentes dans la population caucasienne puisqu'elle affecte environ une personne sur 2000 naissance en Amérique du Nord (Boat et al., The metabolic basis of inherited disease, 6th Ed. pp2649-1680, McGraw Hill, New York, 1989).
La mucoviscidose a été associée à des mutations dans le gène CFTR qui s'étend sur 250 kb et comprend 27 exons. Depuis la caractérisation du gène en 1989, de nombreuses analyses génétiques ont été menées pour définir le spectre des mutations de ce gène. Celles-ci sont d'une grande variété, et plus de 850 mutations ont ainsi été caractérisées.
L'invention a également pour objet toute composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend un complexe tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Avantageusement les compositions pharmaceutiques selon l'invention se présentent sous une forme administrable par voie intraveineuse.
De préférence, les compositions pharmaceutiques susmentionnées sont caractérisées en ce que la posologie est d'environ 15 à 50 mCi par patient répartis en 3 à 6 fractions sur 2 à 4 jours.
L'invention concerne également l'utilisation de complexes tels que définis cidessus pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers, ou pour la préparation de compositions destinées à l'imagerie médicale.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation de complexes tels que définis ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des cancers à petites cellules tumorales, tels que la leucémie myéloïde aiguë, les lymphomes non hodgkidiens, les dysplasies bronchopulmonaires, les cancers du sein métastatiques, les cancers colorectaux, les lymphomes, et les pathologies dans lesquelles sont impliqués les motifs antigéniques suivants : CD52, CD22, CD20, HLA-DR, CD33, LE-Y, EpCAM, ACE, CAN, EGFR, KSA, VEGF, HER2, GD2, tenascin.
L'invention concerne également un procédé de préparation des composés de formule (I) susmentionnés, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - traitement du composé de formule (II) suivante dans laquelle Xa, Xb, Xc, et Xd, représentent NH2, OH, COOH ou CH2CI, et E, F, G, et H étant définis ci-dessus, ledit composé étant tel que : . Xa, Xb, Xc, et Xd, sont en position a dans le cas de la synthèse de composés de formule (la), . Xa, et Xe, sont en position a, et Xb, et Xd sont en position ss, dans le cas de la synthèse de composés de formule (Ib), . Xa, et Xd, sont en position ss, et Xb, et Xc sont en position a, dans le cas de la synthèse de composés de formule (le), avec un composé de formule Ya-C6H4-CH2Cl dans laquelle Ya représente, COOH, CH2CI, NH2, ou OH, respectivement, - une étape de traitement du composé obtenu lors de l'étape précédente avec un composé de formule Z-CH2-W dans laquelle Z et W sont tels que définis ci-dessus, ce qui conduit à l'obtention d'un composé de formule (I) dont les différentes variantes de
formules (la), (Ib), et (le) sont séparées par purification, notamment par chromatographie basse pression sur gel de silice, ou HPLC préparative.
Les complexes susmentionnés sont obtenus par mise en présence des composés de formule (I) avec un radioélément tel que défini ci-dessus.
La description sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de composés particuliers de l'invention, et de leur procédé d'obtention.
S'agissant du bismuth, compte tenu des propriétés de ce métal, à savoir son caractère azophile et oxophile et son nombre de coordination élevé (jusqu'à neuf atomes), les Inventeurs ont synthétisé des modèles correspondant le mieux possible aux exigences du métal. En effet, les atomes d'azote provenant du cycle porphyrinique interviennent dans la complexation du métal et les anses apportent au métal des groupes possédant des atomes d'oxygène. De plus, il faut noter que le ligand forme une cage capable d'accueillir et de stabiliser le métal. La figure 1 représente le squelette de base de ligands, ainsi que la méthode de synthèse de ces derniers.
L'apport de ce type de porphyrine par rapport aux porphyrines à piquets (Buckingham, D.; Clarck, C.; Webley, W.J. Chem. Soc. Chem. Com. 1981, 192, Michaudet, L.; Richard,?.; Boitrel, B. Chem. Commun. 2000, 1589-1590, Michaudet, L. thèse de doctorat de l'Université de Bourgogne, 7/12/2000, Dijon) réside dans la préorganisation de l'anse (ou des anses). Le fait que les piquets ou les anses soient préorganisés permet de disposer d'un groupe de type carboxylique (acide, ou ester) juste au dessus du métal. De plus, grâce à la modularité de la synthèse, il est envisageable de faire varier le nombre de groupes coordonnants.
Ce schéma, bien que représentant la base de la présente invention, n'est pas applicable et à déjà été publié (Didier, A.; Michaudet, L.; Ricard, D.; Baveux Chambenoit, V.; Richard, P.; Boitrel, B. Eur.J. Org. Chem. 2001, 1917-1926), et ce pour deux raisons différentes. D'une part, après saponification des fonctions ester (et par conséquent décarboxylation), il n'y a aucun contrôle de la position de la fonction acide résiduelle. D'autre part, ces porphyrines ne possèdent pas de point de fonctionnalisation ultérieure, nécessaire pour le greffage sur un anticorps, ou pour rendre le composé hydrosoluble.
Par contre, ce type de ligand possède une structure très rigide, avec une géométrie prédéterminée, qui devrait accroître la stabilité du complexe formé. C'est en effet pour des raisons de stabilisation de l'élément métallique que la synthèse du cyclohexylbenzyl
DTPA avait été mise au point, ce ligand présentant une nature plus rigide que le DTPA (Brechbiel, M.; W.; Gansow, 0. A. J. Chem. Soc., Perkin Transi 1992, 1173).
Afin d'éviter l'obtention de deux produits différents tels que représentés dans la figure 1, la même stratégie de synthèse a été appliquée à l'isomère [alpha][alpha]ssss (figure 2).
L'obtention d'une structure radio-cristallographique montre clairement que le groupement éthoxycarbonyl dirigé vers l'intérieur de la porphyrine est convenablement maintenu au-dessus du métal (figure 3).
Aucune ressemblance entre la VE-statine et des facteurs connus n'a été identifiée.
Exemple 6 : Analyse de l'expression, la localisation et la sécrétion de la VEstatine (figures 6B, 6C, 6D) Les analyses ont été réalisées à partir de cellules transfectées par les vecteurs recombinants pEGFP-VE-statine et pcDNA3-VE-statine-HA, qui surexpriment la VE-statine sous la forme d'une protéine de fusion avec la GFP ou l'épitope HA de l'hémagglutinine du virus influenza (figure 6B).
La localisation cellulaire des protéines de fusion a été analysée par
immunofluorescence dans des cellules endothéliales (1G11) et fibroblastiques (3T3, figure 6C). La VE-statine empêche la migration de la GFP dans le noyau (figure 6C, panneau de gauche) et des expériences de co-immunofluorescence, respectivement avec un anticorps anti-vinculine et anti-cytochrome C, montrent que la VE-statine n'est ni associée avec le cytosquelette, ni avec les mitochondries. En revanche, la VEstatine est présente dans le réticulum endoplasmique, comme le montre sa co-localisation avec l'isomérase à liaisons disulfures qui est un marqueur spécifique de ce compartiment (figure 6C, panneau de droite).
Dans la mesure où la VE-statine (humaine et murine) possède un peptide signal, la présence de cette protéine, à la surface de la membrane plasmique et dans le milieu extracellulaire a été analysée de la façon suivante : - la présence de la VE-statine à la surface cellulaire a été vérifiée à partir de cellules 3T3 transfectées par le plasmide pcDNA3-VE-statine-HA, marquées à la biotine à l'aide d'un agent de couplage incapable de traverser la membrane plasmique (sulfo-NHS-biotine). Après solubilisation, les protéines membranaires (marquées à la biotine) ont été immunoprécipitées à l'aide de billes de streptavidine.
Dans ces conditions, la VE-statine n'est pas détectable dans le matériel immunoprécipité, indiquant qu'elle n'est pas exposée à la surface des cellules.
- la présence de la VE-statine dans le milieu extracellulaire a été analysée à partir de cellules transfectées dans les mêmes conditions, puis le surnageant de culture a été récolté 48 h après la transfection et analysé par immunoprécipitation.
Dans ces conditions, la VE-statine est sécrétée dans le milieu extracellulaire (figure 6D, panneau de gauche), cette sécrétion est partiellement ou fortement inhibée en présence d'inhibiteurs de la sécrétion, respectivement la monensine et la bréfeldine A.
Les résultats illustrés dans la figure 6 (6B, 6C ET 6D) démontrent que la VE-statine est produite dans les cellules, sous la forme d'un facteur soluble sécrété dans le milieu extracellulaire selon la voie classique de sécrétion des protéines.
Le poids moléculaire apparent de la VE-statine sécrétée est supérieur au poids moléculaire apparent prédit à partir de sa composition en acides aminés, ce qui indique que la VE-statine subit des modifications post-traductionnelles au cours de la sécrétion.
Exemple 7 : Analyse de l'effet de la VE-statine sur la migration et la prolifération des cellules musculaires lisses (figure 7) L'effet de la VE-statine sur la prolifération et la migration des cellules musculaires lisses a été testé à l'aide de VE-statine recombinante, produite comme décrit à l'exemple 1.10 et de cultures primaires de cellules musculaires lisses aortiques humaines (AoSMC), dans les conditions telles que décrites à l'exemple 1.13.
De manière plus précise, l'effet de la VE-statine sur la prolifération des cellules musculaires lisses a été analysée sur des cellules AoSMC ensemencées à faible densité et cultivées pendant 8 jours dans du milieu contrôle ou dans du milieu contenant de la VE-statine, en présence ou en l'absence de PDFG-BB ; le PDGF-BB étant ajouté pour maintenir la stimulation de la prolifération. Les résultats montrent que la VE-statine n'a pas d'effet sur la croissance des cellules AoSMC, en présence ou en l'absence de PDGF-BB, comme le démontre la superposition parfaite des courbes de croissance des cellules traitées et non traitées par la VE-statine (figure 7A).
L'effet de la VE-statine sur la migration des cellules musculaires lisses a été analysé à l'aide du test de la blessure , sur des cultures confluentes de cellules AoSMC. Les résultats montrent qu'après deux jours de culture dans du milieu contenant de la VE-statine, la migration est réduite à celle observée avec le milieu de base et le PDGF-BB n'a quasiment pas d'effet sur la migration des cellules AoSMC (figures 7B et 7C). Par comparaison, la migration en présence de milieu contrôle, avec et sans PDGF-BB est respectivement 3,4 fois et 2 fois plus importante qu'en présence de VE-statine (figures 7B et 7C). Des résultats similaires ont été obtenus par le test de la chambre de Boyden.