INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Parmi les dérivés d'amines, on peut citer les produits vendus sous la dénomination MIRANOL, tels que décrits dans les brevets US-2 528 378 et US-2 781 354 et classés dans le dictionnaire CTFA, 3ème édition, 1982, sous les dénominations Amphocarboxyglycinates et Amphocarboxypropionates de structures respectives : R2-CONHCH2CH2 -N(R3)(R4)(CH2COO-) dans laquelle : R2 désigne un radical alkyle d'un acide R2-COOH présent dans l'huile de coprah hydrolysée, un radical heptyle, nonyle ou undécyle, R3 désigne un groupement bêta-hydroxyéthyle et R4 un groupement carboxyméthyle ; et R2'-CONHCH2CH2-N(B)(C) dans laquelle : B représente -CH2CH20X', C représente -(CH2)Z -Y', avec z = 1 ou 2, X' désigne le groupement-CH2CH2-COOH ou un atome d'hydrogène Y' désigne-COOH ou le radical-CH2 - CHOH - S03H R2' désigne un radical alkyle d'un acide R9 -COOH présent dans l'huile de coprah ou dans l'huile de lin hydrolysée, un radical alkyle, notamment en C7, C9, C11 ou C13, un radical alkyle en C17 et sa forme iso, un radical Ci? insaturé.
Disodium Lauroamphodiacetate, Disodium Caprylamphodiacetate, Disodium Capryloamphodiacetate, Disodium Cocoamphodipropionate, Disodium Lauroamphodipropionate, Disodium Caprylampho- dipropionate, Disodium Capryloamphodipropionate, Lauroampho- dipropionic acid, Cocoamphodipropionic acid.
(iv) Tensioactifs cationiques : Parmi les tensioactifs cationiques on peut citer en particulier (liste non limitative) : sels d'amines grasses primaires, secondaires ou tertiaires, éventuellement polyoxyalkylénées ; sels d'ammonium quaternaire tels que les chlorures ou les bromures de tétraalkylammonium, d'alkylamidoalkyltrialkylammonium, de trialkylbenzylammonium, de trialkylhydroxyalkyl-ammonium ou d'alkylpyridinium; les dérivés d'imidazoline ; les oxydes d'amines à caractère cationique.
Parmi les paraphénylènediamines, on peut citer à titre d'exemple, la paraphénylènediamine, la paratoluylènediamine, la 2-chloro paraphénylènediamine, la 2,3-diméthyl paraphénylènediamine, la 2,6-diméthyl paraphénylènediamine, la 2,6-
diéthyl paraphénylènediamine, la 2,5-diméthyl paraphénylènediamine, la N,N-diméthyl paraphénylènediamine, la N,N-diéthyl paraphénylènediamine, la N,N-dipropyl paraphénylènediamine, la 4-amino N,N-diéthyl 3-méthyl aniline, la N,N-bis-(P-hydroxyéthyl) paraphénylènediamine, la 4-N,N-bis-((3-hydroxyéthyl)amino 2-méthyl aniline, la 4-N,N-bis-(P-hydroxyéthyl)amino 2-chloro aniline, la 2-ss-hydroxyéthyl paraphénylènediamine, la 2-fluoro paraphénylènediamine, la 2-isopropyl paraphénylènediamine, la N-((3-hydroxypropyl) paraphénylènediamine, la 2-hydroxyméthyl paraphénylènediamine, la N,N-diméthyl 3-méthyl paraphénylènediamine, la N,N-(éthyl, P-hydroxyéthyl) paraphénylènediamine, la N-(ss,[gamma]-dihydroxypropyl) paraphénylènediamine, la N-(4'-aminophényl) paraphénylènediamine, la N-phényl paraphénylènediamine, la 2-ss-hydroxyéthyloxy paraphénylènediamine, la 2-ss-acétylaminoéthyloxy paraphénylènediamine, la N-(P-méthoxyéthyl) paraphénylène-diamine, la 4-aminophénylpyrrolidi-ne, la 2-thiényl paraphénylènediamine, le 2- ss hydroxyéthylamino 5-amino toluène, la 3-hydroxy 1-(4'aminophényl)pyrrolidine et leurs sels d'addition avec un acide.
Parmi les paraphénylènediamines citées ci-dessus, la paraphénylènediamine, la paratoluylènediamine, la 2-isopropyl paraphénylènediamine, la 2-P-hydroxyéthyl paraphénylènediamine, la 2-P-hydroxyéthyloxy paraphénylène-diamine, la 2,6-diméthyl paraphénylènediamine, la 2,6-diéthyl paraphénylènediamine, la 2,3-diméthyl paraphénylènediamine, la N,N-bis-((3-hydroxyéthyl) paraphénylènediamine, la 2-chloro paraphénylènediamine, la 2-ss-acétylaminoéthyloxy paraphénylènediamine, et leurs sels d'addition avec un acide sont particulièrement préférées.
Parmi les bis-phénylalkylènediamines, on peut citer à titre d'exemple, le N,N'-bis-(P-hydroxyéthyl) N,N'-bis- (4'-aminophényl) 1,3-diamino propanol, la N,N'-bis-(P-hydroxyéthyl) N,N'-bis- (4'- aminophényl) éthylènediamine, la N,N'-bis-(4-aminophényl)
tétraméthylènediamine, la N,N'-bis-(ss-hydroxyéthyl) N,N'-bis-(4aminophényl) tétraméthylènediamine, la N,N'-bis-(4-méthylaminophényl) tétraméthylènediamine, la N,N'-bis-(éthyl) N,N'-bis-(4'amino, 3'-méthylphényl) éthylènediamine, le 1,8-bis-(2,5-diamino phénoxy) -3,6-dioxaoctane, et leurs sels d'addition.
* Parmi les para-aminophénols, on peut citer à titre d'exemple, le para-aminophénol, le 4-amino 3-méthyl phénol, le 4-amino 3-fluoro phénol, le 4-amino-3-chlorophénol, le 4-amino 3-hydroxyméthyl phénol, le 4-amino 2-méthyl phénol, le 4-amino 2-hydroxyméthyl phénol, le 4amino 2-méthoxyméthyl phénol, le 4-amino 2-aminométhyl phénol, le 4amino 2-(P-hydroxyéthyl aminométhyl) phénol, le 4-amino 2-fluoro phénol, et leurs sels d'addition avec un acide.
L'épaisseur de cuivre qui se dépose sur le support dépend de la concentration de la composition de précurseur, du débit de cette composition lors du passage dans le dispositif de vaporisation, de la durée de la vaporisation, des températures respectives dans le réacteur et sur le support. De manière générale, on utilise des compositions moins concentrées et/ou des débits plus faibles pour l'obtention de couches fines, et des compositions plus concentrées et/ou des débits plus élevés pour l'obtention de couches épaisses. Par couche fine, on entend généralement une couche ayant une épaisseur inférieure à ou égale à 50 nm, dite couche de nucléation. Par couche épaisse, on entend généralement une couche ayant une épaisseur entre 50 nm et 1 um. Le procédé selon
l'Invention permet de réaliser à partir de précurseurs des métaux sous forme oxydée (+1) les interconnexions et métallisation de circuits intégrés d'une épaisseur allant de 0,2 à 500 nm, préférentiellement de 0,2 à 50 nm.
L'utilisation des compositions selon l'invention pour l'élaboration de couches de cuivre par CVD permet d'obtenir des couches de cuivre de bonne qualité ayant une bonne adhérence au support sur lequel elles sont déposées.
PARTIE EXPERIMENTALE : Abréviations utilisées : acac : anion de l'acétylacétone.
COD : 1,5-cyclooctadiène.
BTMSA : bis-(triméthylsilyl)-acétylène.
EDTA : éthylènediaminetétracétique disodique.
GCMS : Gas Chromatography Mass Spectroscopy 3-NOracac : anion de la 3-nitro-acétylacétone 3-MeO-acac : anion de la 3-MeO-acétylacétone I- Synthèses des 0-dicétones non fluorées 1-1. Svnthèse de la 3-NO2-acac : La synthèse de N02-acac se déroule en deux étapes comme décrit dans la littérature par Z. Yoshida, H. Ogoshi and T. Tokumitsu, Tetrahedron, 1970, 26,5691. La première étape consiste à former le complexe de cuivre (II) : bis-(3nitro-2,4-pentanediono)-cuivre (II) (Cu(N02-acac)2), la deuxième à isoler la ss- dicétone par décomplexation en utilisant de l'EDTA. a- Synthèse du CuflSTO-j-acacV :
Dans un ballon, on introduit 50 ml d'anhydride acétique et 10ml (0. 09 mol) d'acétylacétone. Sous agitation et à 0 C (bain eau/glace), on ajoute alors 7,89g (33
mmol) de nitrate de sodium trihydraté (en plusieurs fractions car la réaction est exothermique). Le milieu réactionnel est laissé sous agitation pendant deux heures à 0 C puis dix-huit heures à température ambiante.
La solution de couleur verte est ensuite traitée avec une solution acétate de sodium/eau glacée (environ 100 ml) qui donne un précipité vert en suspension qui est filtré sur Büchner puis séché sous P20S. Le rendement est de 42%.
Point de fusion : 240 C (déc.). IR (cm-') : 1586 (y C=O), 1525 (Yas N02), 1336 (ysNO2). Sublimation à T = 100 C sous P = 4.10"' mbar. b- Synthèse de la 3-NOz-acac : N02 H3C\J\CH3 (-0 H3c N02 HgC IY 0 J 'CH3 EDTA No H3C\%CH3 NOZ H3C,*CH3 EDTA N ,0 H3C, /CH3 ci, eN.cu ",0 + Ip. 0 o 101 N,-po 1 H3CCH3 NO2 Cu(3-NO2-aCaC)2 CU(EDTA) H(3-N02-aCaC) M = 145g mol-1 Dans un ballon de 500 mL, on introduit 9,3g (22. 8 mmol) de Cu(N02acac)2 en suspension dans 120 ml de dichlorométhane. On ajoute 120 ml d'eau et on obtient deux phases : la phase organique colorée (où se solubilise le complexe de cuivre (II)) et la phase aqueuse (où se forme le complexe cuivre/EDTA). On additionne de l'EDTA jusqu'à l'obtention d'une phase organique décolorée. La phase organique est séparée de la phase aqueuse par décantation et séchée sur MgS04. La dicétone nitrée est obtenue par évaporation du solvant et purifiée par distillation sous pression réduite (P = 10-1mbar, T = 45 C). Le rendement est de 77%.
GCMS : 1 pic à m/z = 145. RMN (CDC13 , T=297 K) : 'H #(ppm) : 15.11(s, 1H, -C-O-H...O=C-), 2. 50 (s, 6H, 2 -CH3). 13C 8(ppm) : 192. 4 (s, -C=O), 134. 7 (s, =(C-NO2), 24.8 (s,-CH3) 1-2. Synthèse de la 4-N02-3.5-heptanedione : a- Synthèse de la 4-Cu(NO-3.5-heptanedionel : Le mode opératoire est identique à celui permettant la préparation de Cu(NO2-acac)2.
4-NO2-3,5-heptanedione Cu(4-NO2-3,5-heptanedione)2 Le mélange réactionnel est constitué de : - 10 g (78 mmol) de 3.5-heptanedione dans 50 ml d'anhydride acétique.
- 6.91g (29 mmol) de nitrate de sodium trihydraté.
Le produit obtenu est un solide vert foncé. Le rendement brut est de 60- 65%. Le composé peut être recristallisé dans un mélange hexane/méthanol (30 ml/10ml).
Comme cela a été décrit dans les Brevets cités ci-dessus, la formation du cuivre métallique est le résultat d'une dismutation de deux molécules de cuivre (1) sur une surface chauffée à une température voisine de 200 C suivant le schéma réactionnel suivant : 2Cu (hfac)L # Cu(II)(hfac)2 + Cu(0) + 2L dans lequel hfac représente l'anion hexafluoro acétylacétonate et L représente la base de Lewis ou Ligand. Le mécanisme est le même pour les autres complexes de cuivre (1) et pour les complexes de l'argent (I).
La nature de la base de Lewis L, aussi désignée ci-après le* ligand, influence très peu la nature des films de cuivre obtenus par CVD. Les films de cuivre sont généralement très purs, et notamment exempts d'atomes de carbone, d'oxygène et de fluor (moins de 1%). Une résistivité de l'ordre de 1.8 uQ.cm est couramment trouvée dans les films de cuivre obtenus par CVD ; cette valeur est très proche de celle trouvée dans le cuivre massif (1.67 #.cm).
En revanche la nature du Ligand L détermine la volatilité du complexe et en conséquence la vitesse du dépôt de cuivre.
Dans les documents de l'art antérieur, notamment dans US-5,098,516 et Uns-5, 144.049, la préférence est généralement donnée à des complexes de cuivre (I) et d'anions porteurs d'atomes de fluor, en particulier en raison de leur volatilité, qui permet d'effectuer le dépôt métallique à des températures plus basses que lorsque l'anion n'est pas une molécule fluorée, et également en raison de la plus grande stabilité de ces complexes.
La technologie prévue pour la métallisation par le cuivre de composants électroniques implique que le cuivre soit déposé sur un film barrière qui empêche le cuivre de diffuser dans le diélectrique et permet l'intégrité du contact électrique.
Cette barrière est choisie parmi des matériaux tels que TiN, TaN ou WN (respectivement nitrure de titane, de tantale ou de tungstène) ou Ta métal. D'autres matériaux peuvent éventuellement être utilisés.
Or, dans certains cas, en particulier lorsque le film de cuivre est déposé su TiN. Ta ou TaN. comme le demande la technologie, même si le film de cuivre ne contient qu'une quantité très faible de fluor, ce fluor diffuse et se trouve concentré à l'interface entre le cuivre et la barrière.
Ce phénomène a été décrit notamment par K. Weiss, S. Riedel, S. E.
Schultz, T. Gessner, AJ1C 1998, MRS Proceedings page 171. Il a pour conséquence :
1 ) une rupture dans la conductivité électrique entre le transistor de base et le film de cuivre qui augmente globalement la résistivité du contact, en raison du caractère isolant du film riche en fluor ; 2) une adhésion insuffisante du film de cuivre sur le film barrière.
Les composés décrits dans le document WO 98/40387 apportaient une première réponse à ce problème.
Toutefois, il subsiste le besoin d'un complexe de cuivre (I) ou d'argent (1) pour la fabrication reproductible de circuits électroniques à base de films minces de cuivre ou d'argent permettant le remplissage de lignes et interconnexions verticales sans défaut et avec une faible résistivité et une bonne stabilité thermique à long terme.
En particulier, il subsiste le besoin d'un précurseur qui soit complètement exempt d'atomes de fluor, tout en étant volatil et suffisamment stable pour être industriellement exploité.
Enfin, ce précurseur doit se décomposer thermiquement suivant la réaction de dismutation donnée précédemment pour assurer une grande pureté au film métallique déposé.
La Demanderesse a mis au point de nouveaux composés, qui sont des complexes de cuivre (I) ou d'argent (I), dépourvus de fluor, précurseurs du cuivre ou de l'argent dans le procédé de dépôt métallique en phase gazeuse, ces composés remédiant aux inconvénients de l'art antérieur.
Les composés selon l'Invention sont caractérisés en ce qu'ils répondent à la formule (I) ci-dessous : dans laquelle - M représente un atome de cuivre ou un atome d'argent ; - R' et R", identiques ou différents représentent un groupement choisi parmi : un alkyle en C1-C8 : un groupement -OR'", dans lequel R'" représente un alkyle en C-C8 ; R représente un groupement choisi parmi : un groupement - OR , dans lequel R représente un alkyle en CI-C8, un groupement nitro : N02 ; une
(14) Les polymères réticulés de sels de méthacryloyloxyalkyl(Cl-C4) trialkyl(Ci-C4)ammonium tels que les polymères obtenus par homopolymérisation du diméthylaminoéthylméthacrylate quaternisé par le chlorure de méthyle, ou par copolymérisation de l'acrylamide avec le diméthylaminoéthyl-
méthacrylate quaternisé par le chlorure de méthyle, l'homo ou la copolymérisation étant suivie d'une réticulation par un composé à insaturation oléfinique, en particulier le méthylène bis acrylamide. On peut plus particulièrement utiliser un copolymère réticulé acrylamide/chlorure de méthacryloyloxyéthyl triméthylammonium (20/80 en poids) sous forme de dispersion contenant 50 % en poids dudit copolymère dans de l'huile minérale. Cette dispersion est commercialisée sous le nom de " SALCARE# SC 92 " par la Société ALLIED COLLOIDS. On peut également utiliser un homopolymère réticulé du chlorure de méthacryloyloxyéthyl triméthylammonium contenant environ 50 % en poids de l'homopolymère dans de l'huile minérale ou dans un ester liquide. Ces dispersions sont commercialisées sous les noms de " SALCARE@ SC 95 " et " SALCARE SC 96 " par la Société ALLIED COLLOIDS.
Les agents d'ajustement de la rhéologie peuvent être choisis parmi les amides d'acides gras (diéthanol- ou monoéthanol-amide de coprah, monoéthanolamide d'acide alkyl éther carboxylique oxyéthyléné), les épaississants cellulosiques (hydroxyéthycellulose, hydroxypropylcellulose, carboxyméthylcellulose.), la gomme de guar et ses dérivés (hydroxypropylguar. ), les gommes d'origine microbienne (gomme de xanthane, gomme de scléroglucane.), les homopolymères réticulés d'acide acrylique ou d'acide acrylamidopropanesulfonique et les polymères associatifs tels que décrits ci-dessous.
Point de fusion : 220 C Exemple 16 : 8-(3,4-Diméthoxyphényl)-2-(dipropylamino)pyrido[3,4-rf]pyrimidin-4(3JÏ)-one En procédant comme dans l'exemple 1 et en remplaçant la 3-amino-2-azocano pyridine par la 3-amino-2-(3,4-diméthoxyphényl)pyridine, on obtient le produit du titre.
Point de fusion : 202 C
ETUDE PHARMACOLOGIQUE Exemple A : Screening sur un panel de Kinases En utilisant des techniques classiques de screening mettant en #uvre les Kinases commercialement disponibles, les produits de l'invention ont montré d'intéressantes propriétés : # activatrices de certaines Kinases pour plusieurs produits de l'invention.
# inhibitrices d'autres Kinases pour plusieurs produits de l'invention.
# potentialisatrices d'activateurs ou d'inhibiteurs de Kinases pour d'autres produits.
Exemple B : Activitéhypolipémiante Les produits de l'invention ont été testés in vivo chez la souris obèse ob/ob, utilisée comme modèle d'insulinorésistance associée à l'obésité. A titre d'exemple, le composé de l'Exemple 6 baisse significativement les triglycérides à 125 mg/kg per os, alors qu'avec la metfonnine, la même diminution est obtenue à 250 mg/kg per os.
Exemple C : Etude de la toxicité aiguë La toxicité aiguë a été appréciée après administration orale à des lots de 8 souris (26 + 6 grammes) de doses croissantes de produit à étudier. Les animaux ont été observés à intervalles réguliers au cours de la première journée et quotidiennement pendant les deux semaines suivant le traitement.
Il apparaît que les composés de l'invention sont totalement atoxiques.
Exemple D : pharmaceutique Formule de préparation pour 1000 comprimés dosés à 5 mg Composé de l'exemple 8 ......................................................5g Hydroxypropylcellulose .......................................................2 g Amidon de blé ......................................................................10 g Lactose.................................................................................. 100 g Stéarate de magnésium.........................................................3 g Talc.......................................................................................3 g
La présente invention est relative à un nouveau gène de l'acétyl- cholinestérase responsable de la résistance aux insecticides, notamment chez les moustiques, aux produits de ce gène (ADNc, protéine) et à leurs applications, notam- ment pour le criblage de nouveaux insecticides et la détection génétique de la résis- tance aux organophosphorés et/ou aux carbamates dans les populations de moustiques.
L'acétylcholinestérase (AChE, E.C. 3. 1.1.7) est une enzyme essen- tielle qui hydrolyse l'acétylcholine dans les synapses, mettant ainsi fin aux transmis- sions cholinergiques au niveau des jonctions neuronales ou neuromusculaires. L'inhi- bition de l'AChE empêche la désactivation du signal synaptique, conduisant ainsi à une perte de contrôle de la transmission cholinergique. La biologie de l'acétyl- cholinestérase a été très étudiée chez les invertébrés, et en particulier les insectes, car cette enzyme est la cible des principales classes de pesticides utilisés, les organo- phosphorés et les carbamates. Cependant, l'utilisation massive de pesticides au cours des dernières décennies a provoqué l'émergence d'espèces résistantes. Parmi les méca- nismes de résistance, la sélection de mutations rendant l'AChE insensible aux insecticides a été observée dans de nombreux cas (Pour une revue, voir Fournier et al., Comp. Biochem. Physiol., 1994,108, 19-31).
Afin de déterminer avec précision, la nature de l'AChE cible des insecticides, ainsi que les mutations responsables de la résistance à ces derniers, les gènes codant pour des AChE (gènes ace) ont été isolés chez différentes espèces d'arthropodes (insectes et arachnides).
Le premier gène ace a été identifié chez la drosophile (Drosophila melanogaster), par génétique inverse (Hall et al., EMBO J., 1986,5, 2949-2954). La preuve que ce gène était impliqué dans la résistance aux insecticides a été fournie par la mise en évidence de substitutions d'acides aminés dans l'AChE de drosophiles résistantes, conférant l'insensibilité aux insecticides cholinergiques (Mutéro et al., P. N.A.S., 1994,91, 5922-5926). Les études chez D. melanogaster semblaient donc indiquer la présence d'un seul gène ace chez les insectes, codant pour l'AChE cible des insecticides cholinergiques.
Toutefois, à l'exception du gène ace de deux autres insectes, Musca domestica (Williamson et al., 1992, In Multidisciplinary approaches to cholinesterase functions, Eds Schafferman A. & Velan B., Plenum Press, New-York, pp 83-86 ;
Walsh et al., Biochem. J., 2001,359, 175-181 ; Kozaki et al., Insect. Biochem. Mol. Biol., 2001, 31,991-997) et Bactrocera oleae (Vontas et al., Insect Molecular Biology, 2002, 11, 329-339), l'étude des gènes ace isolés chez d'autres insectes ou bien chez des arachnides, par homologie avec celui de la drosophile, indiquent qu'ils ne sont pas impliqués dans la résistance aux insecticides.
Le mélange est laissé sous agitation à la température ambiante pendant 24 heures.
Ensuite, P4 et P1 sont séparés du POE-OMe en excès par précipitation sélective dans l'éthanol, filtrés puis séchés sur rampe à vide. Le taux de couplage déterminé par RMN proton est de 38 %.
METHODE DE DETERMINATION DE L'ACTIVITE DE CLIVAGE D'UNE ENDONUCLEASE L'invention porte sur des méthodes et compositions permettant de tester l'activité de coupure d'une endonucléase vis-à-vis d'un substrat. Les méthodes de l'invention sont basées sur la conception de constructions génétiques particulières et/ou sur des conditions et méthodes avantageuses et efficaces de discrimination entre les substrats coupés et les substrats non coupés..
L'invention concerne également des outils et kits utilisables pour la mise en #uvre de ces méthodes, ainsi que leurs utilisations. L'invention peut être appliquée au criblage, à la sélection ou à l'amélioration soit dendonucléases, soit de sites de coupure pour une endonucléase.
Les endonucléases sont des enzymes indispensables en biologie moléculaire et très utiles pour l'ingénierie des génomes. Les endonucléases les plus connues sont les enzymes de restriction.
Les homing endonucleases constituent une autre classe d'endonucléases d'intérêt en raison de leur large site de reconnaissance (Dalgaard et al, 1997, Nucleic Acids Resarch, 25, 4626-463 ; Chevalier et Stoddard, 2001, Nucleic Acids Resarch, 29, 3757-3774).
L'avantage de ces endonucléases est leur spécificité de reconnaissance et de coupure de l'ADN. Il existe une forte demande pour créer des endonucléases présentant de nouvelles spécificités de séquence nucléotidique. Cette demande est particulièrement forte pour les endonucléases présentant un site de coupure rare. Certaines nouvelles endonucléases ont été créées soit par la modification des endonucléases existantes (Wenz et al, 1994, Biochim Biophys Acta, 1219,73-80), soit par la génération d'endonucléases chimériques (par exemple, une tête endonucléasique d'une endonucléase de restriction de type IIS fusionnée à une association de plusieurs doigts de zinc ; et al, 2000, Nucleic Acids Res, 28,3361-3369 ; Kim et al, 1996, Proc Natl Acad Sci USA, 93,1156-1160 ; Kim & Chandrasegaran, 1994, Proc Natl Acad Sci USA, 91,883-887 ; WO 95/09233 ; 94/18313). Ces manipulations nécessitent de disposer de tests de clivage pour estimer l'activité et la spécificité de la nouvelle protéine ou d'un ensemble de protéines. Cependant, à ce jour, il n'existe pas de méthodes de sélection in vitro basée sur l'activité et la spécificité de clivage.
Le grand intérêt des endonucléases justifie la nécessité du développement de méthodes permettant de tester l'activité et la spécificité de clivage avec un haut rendement et/ou adapté pour effectuer une sélection.
Les méthodes existantes de mesure de l'activité de clivage et de sa spécificité ne sont pas adaptées à l'exigence de haut rendement pour les raisons exposées ci-dessous.
Un test est fait en incubant une macromolécule d'ADN avec une endonucléase pendant une période de temps déterminée. La distribution des fragments d'ADN clivés et non-clivés est
analysée par une électrophorèse en gel d'agarose (Yolov et al., 1985, Nucleic Acids Res, 13,8983- 8998). Ce test est l'un des plus anciens encore utilisé. Il est le plus commun pour l'analyse du clivage d'ADN par des endonucléases car il est peu coûteux, ne nécessite aucun matériel de haute technologie et est facile à mettre en oeuvre.
Une mesure de la coupure peut également être effectuée par plusieurs autres méthodes comme la chromatographie en couche fine (Jay et al., 1974, Nucleic Acids Res, 1,331-353), l'élution des produits de la réaction sur filtre de DEAE cellulose (McLaughlin et al., 1987, Biochemistry, 26,7238-7245), ou la chromatographie HPLC en mesurant l'absorbance dans l'UV (Alves et al., 1984, Eur J Biochem, 140, 83-92 ; Newman et al., 1990, Biochemistry, 29,9891- 9901 ; Newman et al., 1990, Biochemistry, 29,9902-9910). Ces méthodes permettent de mesurer la disparition du substrat ou l'apparition des produits.