INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
nanoparticules, 1 g de propidium iodide est ajouté à chaque puits. Il permet de reconnaître les cellules mortes en les colorant en rouge.
Les cellules sont ensuite centrifugées à 1000 tr/min pendant 5 min. Le surnageant est prélevé et les cellules sont lavées une fois encore avec du PBS. 200 l de PBS contenant 4% de formaldéhyde sont alors ajoutés et les cellules sont laissées à température ambiante pendant 30 minutes. Puis les cellules sont lavées deux fois avec du PBS 0.1X. Un autre lavage avec de l'eau stérile est également effectué pour terminer. 20 L de poly-lysine sont ajoutés à la fin. L'observation des cellules se fait au microscope équipé d'un filtre à 480 nm.
Chacune des observations des figures 8,9 et 10 a été effectuée pour les deux types d'oligonucléotides 7 bases et 11 bases.
Les cellules en présence de nanoparticules Chitosan 5 KDa-ODN sont très fluorescentes et aucune toxicité n'est visible. En présence de la formulation nanoparticules Chitosan 5 KDa-Cyd-ODN, elles sont également fluorescentes mais plusieurs cellules mortes sont visibles.
Les nanoparticules Chitosan 10 KDa-Cyd-ODN présentent également une bonne fluorescence mais aussi une toxicité légèrement plus importante que les nanoparticules 5KDa-Cyd-ODN. En présence de nanoparticules 30 KDa-Cyd-ODN, les cellules sont également très fluorescentes, mais le nombre de cellules mortes est encore plus important que dans les deux cas précédents.
Dans le cas des cellules incubées en présence de nanoparticules CTAB-Cyd-ON, la fluorescence est faible et la toxicité très importante. Le complexe CTAB-ODN ne montre aucune fluorescence cellulaire.
Dans le cas des cellules incubées en présence de Cytofectine-ODN aucune fluorescence cellulaire n'est observée.
Exemple VII : Transfection in vitro des cellules NIH-3T3 EWS-Flil par des complexes plasmide-NP-Chitosan.
1) Matériels et Méthodes. a) Plasmide couplé à la rhodamine.
10 g de plasmide p-Galactosidase sont marqués avec un fluorophore rouge Oregon Green 546 (ULYSIS Nucleic Acid Labeling Kits, Molecular Probes). Ce fluorophore donne une fluorescence rouge (Ex/Em est 555/570).
1 g de plasmide marqué et 3 g de plasmide non marqué sont mélangés à des NP-Chitosan dans 200 L de NaCl à 150 mM, et vortexés puis incubés pendant 30 minutes à température ambiante. Les cellules NIH-3T3 EWS-Flil adhérentes sont ensemencées dans des plaques à 6 puits (TPP, Suisse) 24 heures avant la transfection afin d'atteindre 60- 70% de confluence.
30 minutes avant la transfection, les cellules sont lavées avec 2mL de PBS 1X par puits puis 800 L de DMEM contenant 2% de SVF sont ajoutés dans chaque puits. Les complexes (200 L) sont mis au contact de cellules NIH-3T3 EWS-Flil pendant 16 h heures à 37 C. Les images des cellules fluorescentes sont présentées dans la photographie (figure 11B et 11D).
5) Utilisation sous forme sèche/filtration Les nanocapsules conformes à l'invention peuvent avantageusement être lyophilisées puis reconstituées sous forme de suspension colloïdale.
Elles peuvent ainsi être conservées facilement pendant des périodes de temps prolongées. La reconstitution d'une suspension de nanocapsules selon l'invention à partir d'une forme sèche peut en effet s'effectuer extemporanément, juste avant emploi. Une telle lyophilisation peut s'opérer directement après une étape de filtration stérilisante telle que décrite cidessus.
La lyophilisation desdites nanocapsules consiste à éliminer l'eau des préparations par un phénomène de sublimation. On ajoute alors à la suspension de nanocapsules à lyophiliser une quantité adéquate (environ 5% m/m) d'un agent cryoprotecteur ou lyoprotecteur tel que le Mannitol ou le Tréhalose par exemple. Après dissolution totale de ces composés, les suspensions choisies subissent une première étape de congélation rapide aux alentours de-50 C. Puis ces suspensions sont lyophilisées par passage direct de l'eau sous forme vapeur à basse température sous pression
réduite. Les nanocapsules sous forme sèche pourraient alors être stockées sous forme stérile pour de longues périodes de temps avant emploi.
6) Autres administrations On peut prévoir d'utiliser comme vecteur de principes actifs, les nanocapsules conformes à l'invention pour traiter d'autres types d'affections que les tumeurs ou les inflammations. En effet, une des qualités de ce vecteur colloïdal est sa faculté à échapper au système immunitaire de l'hôte et en particulier aux cellules du SPM telles que les macrophages. On peut donc prévoir d'utiliser les nanocapsules furtives de l'invention dans des zones de l'organisme ou l'utilisation de vecteurs conventionnels est particulièrement inadaptée. De telles zones riches en macrophages existent au niveau des alvéoles pulmonaires et des ganglions lymphatiques par exemple. On peut ainsi envisager d'administrer ledit vecteur selon des voies pour lesquelles la phagocytose et/ ou l'opsonisation constituent une limite à l'efficacité de la forme pharmaceutique.
Procédés de préparation des nanocapsules Les nanocapsules constituant le vecteur colloïdal furtif conforme à l'invention peuvent être avantageusement synthétisées par deux procédés.
Le premier procédé est dit classique car couramment utilisé pour la synthèse de nanocapsules lipidiques. Le second procédé à été mis au point par la demanderesse et est adapté aux nanocapsules selon l'invention. Il permet notamment d'obtenir des taux d'incorporation en phospholipides "pégylés" supérieurs à ceux obtenus par le procédé classique et offre également la possibilité d'incorporer des phospholipides couplés à des ligands permettant d'assurer un ciblage actif. Ces deux procédés sont détaillés successivement ci-après.
1) PROCEDE DE SYNTHESE DES NANOCAPSULES CLASSIQUE Le procédé permettant la synthèse du vecteur colloïdal furtif conforme à l'invention est avantageusement exempt de tout solvant organique. Par ailleurs, c'est un procédé simple et relativement rapide qui ne nécessite pas de matériel particulier. En outre, ce procédé ne met en #uvre que des composés biodégradables approuvés pour usage parentéral et naturellement assimilables par l'organisme, par un phénomène de "biorésorption" notamment. Enfin, le procédé conforme à l'invention permet la synthèse de nanocapsules de diamètre défini et choisi par l'utilisateur dans une gamme de diamètres variant de 40 à 200 nm. C'est l'ajustement de la taille des nanocapsules synthétisées qui va permettre d'adapter le vecteur aux différents types de tumeurs à traiter.
On procède tout d'abord à la constitution d'une émulsion huile/eau à partir d'eau, de sel, du tensioactif hydrophile, du tensioactif lipophile, des corps gras nécessaires à la constitution du c#ur desdites nanocapsules, des molécules de lipides couplées aux molécules de PEG et du ou des principes actifs destinés à être transportés par les nanocapsules selon l'invention. Le principe actif sera préalablement dissout dans la phase grasse huileuse devant constituer le c#ur des nanocapsules conformes à l'invention.
La première étape consiste donc à peser l'ensemble des constituants, à les chauffer à une température supérieure à la température de fusion du tensioactif lipophile sous agitation douce, par exemple magnétique, jusqu'à l'obtention d'une émulsion homogène huile/eau. Le mélange est ainsi porté dans un premier temps à 65 C lorsque le tensioactif lipophile est représenté par l'HSPC.
Puis, on provoque l'inversion de phase de cette émulsion huile/eau pour la transformer en une émulsion eau/huile. Pour ce faire, on augmente la température du mélange jusqu'à une température T2 supérieure à la température d'inversion de phase (TIP) du mélange ainsi constitué. On diminue alors la température du mélange jusqu'à une température T1.
L'inversion de phase peut être éventuellement suivie par l'annulation de la conductivité de la formulation lorsque l'émulsion eau/huile se forme,
mais peut être généralement visible à l'oeil nu tel que décrit ci-dessous. T1 est une température à laquelle la conductivité est au moins égale à 90 - 95 % de la conductivité mesurée à 20 C. T2 est la température à laquelle la conductivité s'annule.
On répète cette opération en effectuant au moins un cycle de modification de température autour de la zone d'inversion de phase entre T1 et T2 jusqu'à l'apparition d'une solution translucide. En effet, l'organisation du système sous forme de nanocapsules se traduit visuellement par un changement d'aspect du système initial qui passe de blanc-opaque à blanctranslucide. Ce changement se produit lorsque la température descend en dessous de la température d'inversion de phase (TIP). Cette température est située généralement entre 6 à 15 C en dessous de la TIP.
Le nombre de cycles appliqués à l'émulsion dépend de la quantité d'énergie nécessaire pour former les nanocapsules. L'inversion de phase entre l'émulsion huile/eau et l'émulsion eau/huile se traduit par une diminution de la conductivité quand la température augmente jusqu'à ce qu'elle s'annule. La température moyenne de la zone d'inversion de phase correspond à la température d'inversion de phase (TIP).
On peut alors effectuer la trempe de l'émulsion huile/eau, c'est à dire son refroidissement brutal pour obtenir des nanocapsules stables. Cette opération s'effectue sous agitation magnétique en diluant l'émulsion entre 3 et 10 fois à l'aide d'eau désionisée à 2 C +/- 1 C jetée dans l'émulsion fine.
On entend par "huile hydrocarbonée", une huile contenant principalement des atomes d'hydrogène et de carbone et éventuellement des atomes d'oxygène, d'azote, de soufre, de phosphore. Les huiles hydrocarbonées volatiles peuvent être choisies parmi les huiles hydrocarbonées ayant de 8 à 16 atomes de carbones, et notamment les alcanes ramifiés en C8-C16 comme les isoalcanes en C8-C16 d'origine pétrolière (appelées aussi isoparaffines) comme l'isododécane (encore appelé 2,2,4,4,6-pentaméthylheptane), l'isodécane, l'isohexadécane, et par exemple les huiles vendues sous les noms commerciaux d'Isopars' ou de Permetyls, les esters ramifiés en C8-C16 le néopentanoate d'iso-hexyle, et leurs mélanges. D'autres huiles hydrocarbonées volatiles comme les distillats de pétrole, notamment ceux vendus sous la dénomination Shell Soit par la société SHELL, peuvent aussi être utilisées. De préférence, le solvant volatil est choisi parmi les huiles volatiles
hydrocarbonées ayant de 8 à 16 atomes de carbone et leurs mélanges.
Comme huiles volatiles, on peut aussi utiliser les silicones volatiles, comme par exemple les huiles de silicones linéaires ou cycliques volatiles, notamment celles ayant une viscosité :9 8 centistokes (8 10-6 m2/s), et ayant notamment de 2 à 7 atomes de silicium, ces silicones comportant éventuellement des groupes alkyle ou alkoxy ayant de 1 à 10 atomes de carbone. Comme huile de silicone volatile utilisable dans l'invention, on peut citer notamment l'octaméthyl cyclotétrasiloxane, le décaméthyl cyclopentasiloxane, le dodécaméthyl cyclohexasiloxane, l'heptaméthyl hexyltrisiloxane, l'heptaméthyloctyl trisiloxane, l'hexaméthyl disiloxane, l'octaméthyl trisiloxane, le décaméthyl tétrasiloxane, le dodécaméthyl pentasiloxane et leurs mélanges.
L'huile volatile peut être présente dans la composition selon l'invention en une teneur allant de 0,1 % à 60 % en poids, par rapport au poids total de la composition, de préférence de 0,1% à 30 % en poids.
Comme huile hydrocarbonée non volatile, on peut notamment citer : - les huiles hydrocarbonées d'origine végétale telles que les triglycérides constitués d'esters d'acides gras et de glycérol dont les acides gras peuvent avoir des longueurs de chaînes variées de C4 à C24, ces dernières pouvant être linéaires ou ramifiées, saturées ou insaturées ; ces huiles sont notamment les huiles de germe de blé, de tournesol, de pépins de raisin, de sésame, de maïs, d'abricot, de ricin, de karité, d'avocat, d'olive, de soja, l'huile d'amande douce, de palme, de colza, de coton, de noisette, de macadamia, de jojoba, de luzerne, de pavot, de potimarron, de sésame, de courge, de colza, de cassis, d'onagre, de millet, d'orge, de quinoa, de seigle, de carthame, de bancoulier, de passiflore, de rosier muscat ; ou encore les triglycérides des acides caprylique/caprique comme ceux vendus par la société Stéarineries Dubois ou ceux vendus sous les dénominations Miglyol 810,812 et 818 par la société Dynamit Nobel, - les éthers de synthèse ayant de 10 à 40 atomes de carbone ; - les hydrocarbures linéaires ou ramifiés, d'origine minérale ou synthétique tels
que la vaseline, les polydécènes, le polyisobutène hydrogéné tel que le parléam, le squalane, et leurs mélanges; - les esters de synthèse comme les huiles de formule R1COOR2 dans laquelle RI représente le reste d'un acide gras linéaire ou ramifié comportant de 1 à 40 atomes de carbone et R2 représente une chaîne hydrocarbonée notamment ramifiée contenant de 1 à 40 atomes de carbone à condition que R5 + R6 soit # 10, comme par exemple l'huile de Purcellin (octanoate de cétostéaryle), le myristate d'isopropyle, le palmitate d'isopropyle, le benzoate d'alcool en C12 à C15, le laurate d'hexyle, l'adipate de diisopropyle, l'isononanoate d'isononyle, le palmitate de 2-éthyl-hexyle, l'isostéarate d'isostéarate, des octanoates, décanoates ou ricinoléates d'alcools ou de polyalcools comme le dioctanoate de propylène glycol ; les esters hydroxylés comme le lactate d'isostéaryle, le malate de diisostéaryle ; et les esters du pentaérythritol ; - les alcools gras liquides à température ambiante à chaîne carbonée ramifiée et/ou insaturée ayant de 12 à 26 atomes de carbone comme l'octyl dodécanol, l'alcool isostéarylique, l'alcool oléique, le 2-hexyldécanol, le 2-butyloctanol, le 2undécylpentadécanol ; - les acides gras supérieurs tels que l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide linolénique ; et leurs mélanges.
Les huiles de silicone non volatiles utilisables dans la composition selon l'invention peuvent être les polydiméthylsiloxanes (PDMS) non volatiles, les polydiméthylsiloxanes comportant des groupements alkyle ou alcoxy, pendant et/ou en bout de chaîne siliconée, groupements ayant chacun de 2 à 24 atomes de carbone, les silicones phénylées comme les phényl triméthicones, les phényl diméthicones, les phényl triméthylsiloxy diphénylsiloxanes, les diphényl diméthicones, les diphényl méthyldiphényl trisiloxanes, les 2-phényléthyl triméthylsiloxysilicates ; Les huiles fluorées utilisables dans l'invention sont notamment des huiles fluorosiliconées, des polyéthers fluorés, des silicones fluorées telles que décrit dans le document EP-A-847752.
Les huiles non volatiles peuvent être présentes dans la composition selon l'invention en une teneur allant de 0,1 à 20 % en poids, de préférence de 0,1 % à 12 % en
poids, par rapport au poids total de la composition.
et X désigne le symbole E ou E', E ou E' identiques ou différents désignent un groupe bivalent qui est un groupe alkylène à chaîne droite ou ramifiée, comportant jusqu'à 7 atomes de carbone dans la chaîne principale non substituée ou substituée par des groupements hydroxyle et pouvant comporter en outre des atomes d'oxygène, d'azote, de soufre, 1 à 3 cycles aromatiques et/ou hétérocycliques ; les atomes d'oxygène, d'azote et de soufre étant présents sous forme de groupements éther, thioéther, sulfoxyde, sulfone, sulfonium, alkylamine, alcénylamine, des groupements hydroxyle, benzylamine, oxyde d'amine, ammonium quaternaire, amide, imide, alcool, ester et/ou uréthanne. b) Les polymères de formule : -D-X-D-X- (VI') où D désigne un groupe et X désigne le symbole E ou E' et au moins une fois E' ; E ayant la signification indiquée ci-dessus et E' est un groupe bivalent qui est un groupe alkylène à chaîne droite ou ramifiée, ayant jusqu'à 7 atomes de carbone dans la chaîne principale, substitué ou non par un ou plusieurs groupes hydroxyle et comportant un ou plusieurs atomes d'azote, l'atome d'azote étant substitué par une chaîne alkyle interrompue éventuellement par un atome d'oxygène et comportant obligatoirement une ou plusieurs fonctions carboxyle ou une ou plusieurs fonctions hydroxyle et bétaïnisées par réaction avec l'acide chloracétique ou du chloracétate de soude.
(9) les copolymères alkyl(C1-C5)vinyléther/anhydride maléique modifiés partiellement par semiamidification avec une N,Ndialkylaminoalkylamine telle que la N,N-diméthylaminopropylamine ou par semiestérification avec un N,N-dialkylaminoalcanol. Ces copolymères peuvent également comporter d'autres comonomères vinyliques tels que le vinylcaprolactame.
Parmi les polymères fixants amphotères décrits ci-dessus, les plus particulièrement préférés selon l'invention sont ceux de la famille (3) tels que les copolymères dont là dénomination CTFA est Octylacrylamide/ acrylates/butylamino-ethylmethacrylate copolymer, tels que les produits vendus sous les dénominations AMPHOMER, AMPHOMER LV 71 ou LOVOCRYL 47 par la société NATIONAL STARCH et ceux de la famille (4) tels que les copolymères méthacrylate de méthyle/diméthyl-carboxyméthylammonio-éthylméthacrylate de méthyle vendu par exemple sous la dénomination DIAFORMER Z301 par la société SANDOZ.
Les polymères fixants non ioniques utilisables selon la présente invention sont choisis, par exemple, parmi : - les polyalkyloxazolines ; - les homopolymères d'acétate de vinyle ; - les copolymères d'acétate de vinyle tels que, par exemple, les copolymères d'acétate de vinyle et d'ester acrylique, les copolymères d'acétate de vinyle et d'éthylène, ou les copolymères d'acétate de vinyle et d'ester maléïque, par exemple, de maléate de dibutyle ; - les homopolymères et copolymères d'esters acryliques tels que, par exemple, les copolymères d'acrylates d'alkyle et de méthacrylates d'alkyle tels que les produits proposés par la société ROHM & HAAS sous les dénominations PRIMAL AC-261 K et EUDRAGIT NE 30 D, par la société BASF sous la dénomination 8845, par la société HOECHST sous la dénomination APPRETAN N9212 ; - les copolymères d'acrylonitrile et d'un monomère non ionique choisis, par exemple, parmi le butadiène et les (méth)acrylates d'alkyle ; on peut citer les produits proposés sous la dénomination CJ 0601 B par la société ROHM & HAAS ; - les homopolymères de styrène ; - les copolymères de styrène comme, par exemple, les copolymères de styrène et de (méth)acrylate d'alkyle tels que les produits MOWILITH LDM 6911, MOWILITH DM 611 et MOWILITH LDM 6070 proposés par la société HOECHST, les
produits RHODOPAS# SD 215 et RHODOPAS DS 910 proposés par la société RHONE POULENC ; les copolymères de styrène, de méthacrylate d'alkyle et d'acrylate d'alkyle ; les copolymères de styrène et de butadiène ; ou les copolymères de styrène, de butadiène et de vinylpyridine ; - les polyamides ; - les homopolymères de vinyllactame différents des homopolymères de vinylpyrrolidone, tels que le polyvinylcaprolactame commercialisé sous la dénomination Luviskol PLUS par la société BASF ; et - les copolymères de vinyllactame tels qu'un copolymère poly (vinylpyrrolidone/vinyllactame) vendu sous le nom commercial Luvitec VPC 55K65W par la société BASF, les copolymères poly(vinylpyrrolidone/acétate de vinyle) comme ceux commercialisés sous la dénomination PVPVA S630L par la société ISP, Luviskol VA 73, VA 64, VA 55, VA 37 et VA 28 par la société BASF ; etles terpolymères poly(vinylpyrrolidone/acétate de vinyle/propionate de vinyle) comme, par exemple, celui commercialisé sous la dénomination Luviskol VAP 343 par la société BASF.
Les groupes alkyle des polymères non ioniques mentionnés ci- dessus ont, de préférence, de 1 à 6 atomes de carbone.
Selon l'invention, on peut également utiliser des polymères fixants de type siliconés greffés, comprenant une partie polysiloxane et une partie constituée d'une chaîne organique non siliconée, l'une des deux parties constituant la chaîne principale du polymère et l'autre étant greffée sur ladite chaîne principale.
Ces polymères sont par exemple décrits dans les demandes de brevet EP-A-0 412 704, EP-A-0 412 707, EP-A-0 640 105 et WO 95/00578, EP-A-0 582 152 et WO 93/23009 et les brevets US 4,693,935, US 4,728,571 et US 4,972,037.
Ces polymères peuvent être amphotères, anioniques ou non ioniques, et ils sont de préférence anioniques ou non ioniques.
De tels polymères sont, par exemple, les copolymères susceptibles d'être obtenus par polymérisation radicalaire à partir du mélange de monomères formé : a) de 50 à 90 % en poids d'acrylate de tertiobutyle, b) de 0 à 40 % en poids d'acide acrylique, c) de 5 à 40 % en poids d'un macromère siliconé de formule où v est un nombre allant de 5 à 700, les pourcentages en poids étant calculés par rapport au poids total des monomères.
D'autres exemples de polymères siliconés greffés sont notamment des polydiméthylsiloxanes (PDMS) sur lesquels sont greffés, par l'intermédiaire d'un chaînon de raccordement de type thiopropylène, des motifs polymères mixtes du type poly(acide (méth) acrylique) et du type poly((méth)acrylate d'alkyle), et des polydiméthylsiloxanes (PDMS) sur lesquels sont greffés, par l'intermédiaire d'un chaînon de raccordement de type thiopropylène, des motifs polymères du type poly(méth)acrylate d'isobutyle.
Comme autre type de polymères fixants siliconés, on peut citer le produit Luviflex Silk commercialisé par la société BASF.
On peut également utiliser comme polymères fixants, des polyuréthanes fonctionnalisés ou non, siliconés ou non, cationiques, non-ioniques, anioniques ou amphotères, ou leurs mélanges.
Les polyuréthanes particulièrement visés par la présente invention sont ceux décrits dans les demandes EP 0 751 162, EP 0 637 600, EP 0 648 485 et FR 2 743 297 dont la demanderesse est titulaire, ainsi que dans les demandes EP 0 656 021 et WO 94/03510 de la société BASF, et EP 0 619 111 de la société National Starch.
Comme polyuréthanes convenant particulièrement bien dans la présente invention, on peut citer les produits commercialisés sous les
dénominations LUVISET PUR# et LUVISET Si PUR par la société BASF.
Procédé pour générer des applications interactives, notamment pour des terminaux de télévision numérique La présente invention concerne la réalisation d'applications interactives, notamment pour télévision numérique.
Des applications interactives sont encodées dans un signal distribué sur un canal de transmission numérique (par câble, satellite ou réseau hertzien). Les terminaux qui reçoivent ce signal sont constitués notamment par des récepteurs TV munis d'un module de télécommande, formant des plates-formes d'exécution à disposition d'utilisateurs. Une partie au moins des applications interactives sont ainsi destinées à être installées sur une plate-forme d'exécution pour mettre en #uvre une succession de rubriques thématiques sous forme de menu.
De telles applications interactives sont associées ou non à des programmes de télévision. Elles peuvent concerner aussi bien des applications de type magazine TV que des services tels que des prévisions météorologiques, une gestion de portefeuilles boursiers, ou autres.
A chaque rubrique d'un menu d'application interactive correspond une scène thématique avec un habillage graphique et/ou sonore associé à cette scène. Ainsi, l'édition d'une scène thématique sur un poste TV implique, sur l'écran du poste, un habillage graphique et, par des moyens de restitution sonore associés, un habillage sonore. L'habillage graphique peut consister en l'incorporation dans l'écran TV de séquences animées (issues de fichiers video au format mpeg ou autres), d'images en mode point (issues de fichiers bitmap, gif, ou
autres), ou encore de texte avec des attributs d'édition de texte associés (caractères, fontes, couleur).
L'habillage sonore peut consister en une séquence sonore qui est jouée pendant la scène thématique (lecture d'un fichier au format WAV ou autre).