INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'invention concerne un projecteur lumineux, pour véhicule automobile, donnant un faisceau à coupure, en particulier du type anti-brouillard, admettant un axe optique et comprenant une source lumineuse comportant un filament dont la forme générale est sensiblement cylindrique, avec l'axe dudit filament de préférence sensiblement horizontal, ledit filament s'étendant obliquement ou perpendiculairement à l'axe optique du projecteur, et au moins un réflecteur donnant un faisceau lumineux réfléchi à coupure. Le projecteur selon l'invention comporte en outre, devant la source lumineuse (2), une lentille (L) déterminée pour donner un faisceau lumineux à coupure.
On comprend au sens de l'invention par source lumineuse le composant global du type lampe, comportant au moins un filament émetteur de lumière, et une enveloppe transparente. Cette enveloppe peut être par exemple de forme de type cylindrique ou sphérique. Quant au filament émetteur, il s'agit généralement d'un fil sous forme d'un enroulement hélicoïdal par exemple, mais dont on approxime la forme générale, l'enveloppe, de façon connue dans ce domaine, par un cylindre.
2877421 3 Ainsi, la lumière émise directement vers l'avant par la source lumineuse est récupérée par la lentille et insérée dans le faisceau, sans provoquer l'éblouissement d'un automobiliste venant en sens inverse. Grâce à cette récupération d'une partie du flux lumineux, la source lumineuse peut être de faible puissance et fournir un flux inférieur à celui que génère une lampe de type code, utilisée usuellement également pour une fonction antibrouillard, en particulier inférieur à 1000 lumens, notamment inférieur ou égale à 900 ou 600 lumens, tout en permettant d'obtenir une photométrie satisfaisante.
De préférence, la lentille est déterminée de telle manière que les rayons incidents extrêmes soient réfractés, en sortie de la lentille, sensiblement parallèlement à l'axe optique, tandis que les autres rayons lumineux émis par le reste de la source sont réfractés avec une inclinaison vers le bas par rapport audit axe optique.
Généralement, la source lumineuse est orientée perpendiculairement à l'axe optique, mais l'angle entre l'axe géométrique de la source lumineuse et l'axe optique pourrait être différent de 90 .
De préférence, la source lumineuse est montée fixe par rapport au boîtier du projecteur; les réflecteurs et la lentille sont solidaires entre eux et sont montés rotatifs autour de l'axe géométrique de la source lumineuse pour le réglage vertical de la coupure.
La première étape d'isolement des chaînes protéiques est notamment effectuée par chromatographie liquide d'exclusion, anionique et phase inverse à partir du mélange susmentionné comprenant les dix chaînes protéiques constituant la molécule d'hémoglobine telles qu'obtenues selon le procédé de dissociation de l'invention.
L'expression "microséquence" désigne des fragments de séquences protéiques.
Les micro séquences susmentionnés peuvent provenir à la fois des extrémités C- et N-terminales mais aussi de séquences internes.
Ces microséquences peuvent être obtenues par chromatographie liquide en phase inverse ou à partir de gel 2D à partir d'hémoglobine purifiée d'Arenicola marina.
Chaque pic ou tache a été découpé et digéré par une protéase. Les peptides ainsi obtenus ont été extraits des gels et séparés par capLC (chromatographie liquide capillaire). Les fragments sont ensuite analysés par spectrométrie de masse.
L'expression "couples d'amorces dégénérées" désigne des séquences nucléotidiques obtenues à partir de fragments de séquences protéiques. On parle d'amorces dégénérées en raison de la dégénérescence du code génétique (plusieurs codons pour 1 acide aminé).
La dernière étape de détermination des couples d'amorces dégénérées correspond à leur synthèse.
Cette étape permet d'obtenir à la fois des amorces sens et des amorces antisens.
La présente invention concerne également des couples d'amorces tels qu'obtenus selon le procédé tel que défini ci-dessus, lesdits couples étant notamment les suivants : a) Amorce sens : GAR TGY GGN CCN TTR CAR CG SEQ ID NO : 9 Amorce antisens : CCA NGC NTC YTT RTC RAA GCA SEQ ID NO: 10 b) Amorce sens : AN TGY GGN CCN CTN CAR CG SEQ ID NO : 11 Amorce antisens : CCA NGC NTC YTT RTC RAA GCA SEQ ID NO : 12 c) Amorce sens : AAR GT AAR CAN AAC TGG SEQ ID NO : 13 Amorce antisens : CCA NGC NCC DAT RTC RAA SEQ ID NO : 14 d) Amorce sens : TGY TGY AGY ATH GAR GAY CG SEQ ID NO: 15 Amorce antisens : CA NGC NYC RCT RTT RAA RCA SEQ ID NO: 16 e) Amorce sens : GAY GAY TGY GTN TGY CC SEQ ID NO : 17 Amorce antisens : ANA CRA ART CRT CNC CRC A SEQ ID NO: 18 où : R représente A ou G, Y représente C ou T, N représente A, G, C ou T, I représente l'inosine, D représente A, G ou T, H représente A, C ou T.
La présente invention concerne également un procédé de préparation de séquences nucléotidiques codant pour les chaînes protéiques constituant la molécule d'hémoglobine d'Arenicola marina, à partir des amorces telles qu'obtenues selon le procédé tel que défini ci-dessus, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il correspond à un procédé d'amplification en chaîne par polymérase (PCR), comprenant une répétition d'au moins 30 fois du cycle constitué par les étapes suivantes : * la dénaturation, par chauffage, de l'ADNc codant pour chacune des dix chaînes protéiques constituant la molécule d'hémoglobine d'Arenicola marina, de façon à séparer l'ADNc en deux brins monocaténaires, ledit ADNc étant obtenu à partir d'ARNm mature,
* l'hybridation des couples d'amorces tels qu'obtenus par le procédé tel que défini ci-dessus aux brins d'ADNc monocaténaires susmentionnés à une température adéquate, pour obtenir des amorces hybridées, et * l'élongation des amorces hybridées par une polymérase à une température adéquate.
L'ADNc codant pour les dix chaînes protéiques susmentionnées est obtenu à partir d'ARNm mature, ledit ARNm mature étant obtenu par purification à partir d'ARN totaux extraits sur des Arénicoles juvéniles en pleine croissance, lesdits Arénicoles juvéniles présentant un taux élevé d'expression des différents ARN messagers. Tout organisme en pleine croissance va synthétiser plus de protéines donc plus d'ARNm.
Si le cycle susmentionné est répété moins de 30 fois, l'amplification de l'ADN est réduite.
L'expression "dénaturation par chauffage" désigne la déstructuration de la double hélice d'ADN en deux brins monocaténaires.
L'expression "hybridation à une température adéquate" désigne la reconnaissance par les amorces de leurs séquences complémentaires sur l'ADN matrice.
L'expression "élongation à une température adéquate" désigne la synthèse de brin d'ADNc par la polymérase.
Sur la figure 1, on a représenté un moteur à combustion interne 10, notamment de véhicule automobile.
La figure 1 représente plus particulièrement un cylindre 12 du moteur 10.
Un piston 14 se déplace suivant l'axe du cylindre Al suivant un mouvement alternatif entre une position axiale de point mort haut et une position axiale de point mort bas.
Le cylindre 12 est aménagé dans un bloc moteur 16 qui est coiffé par une culasse 18, fixée sur sa face supérieure.
La surface inférieure 20 de la culasse 18 délimite la partie supérieure d'une chambre de combustion 22, la partie inférieure de la chambre de combustion 22 étant délimitée notamment par la face supérieure 24 de la tête du piston 14.
io Un conduit d'admission 26 est aménagé dans la culasse 18 de manière à ce qu'il débouche dans la chambre de combustion 22 à travers un orifice de sortie 28.
L'orifice de sortie 28 est obturé par une soupape d'admission 30 qui est montée coulissante suivant un axe de coulissement A2.
L'orifice de sortie 28 est pourvu d'un siège de soupape 32 qui est sensiblement centré sur l'axe de coulissement A2 de la soupape 30.
Sur la figure 1, la soupape d'admission 30 est représentée en position fermée.
Le siège de soupape 32 est pourvu d'une portée sensiblement tronconique 34 qui est prévue pour recevoir en appui axial, suivant l'axe de coulissement A2, une face d'appui tronconique 36 en vis-à-vis de la soupape d'admission 30.
De manière classique, le cylindre 12 comporte une bougie d'allumage 38, un injecteur de carburant 40 qui injecte ici le carburant directement dans la chambre de combustion 22, et une soupape d'échappement 42, qui est prévue pour obturer l'orifice d'échappement 44 d'un conduit d'échappement 46.
De préférence, le moteur 10 comporte plusieurs soupapes d'admission 30 et plusieurs soupapes d'échappement 42 dans chaque cylindre 12.
Sur la figure 2, on a représenté un siège de soupape 32 comportant une restriction de diamètre qui est réalisé conformément aux enseignements du document US-A-6.089.203.
L'orifice de sortie du conduit d'admission 26 comporte un usinage 48 formant épaulement.
Le siège de soupape 32 est monté dans l'épaulement 48.
La paroi interne 50 du siège de soupape 32 comporte ici un tronçon d'extrémité amont globalement cylindrique 52 dont le diamètre d52 est inférieur au diamètre interne D du conduit io d'admission 26 au voisinage de l'extrémité axiale amont 54 du siège de soupape 32.
On a également tenté de polymériser les molécules tétramériques ou de les conjuguer avec un polymère nommé polyéthylène glycol (PEG) (Nho et al., 1992). Ces modifications ont pour conséquence de stabiliser la molécule et d'augmenter sa taille, empêchant son élimination par les reins.
On a beaucoup étudié les Annélides pour leur hémoglobine extracellulaire (Terwilliger, 1992 ; Lamy et al., 1996). Ces molécules d'hémoglobine extracellulaire sont présentes chez les trois classes d'Annélides : Polychètes, Oligochètes et Achètes et même chez les Vestimentifères. Ce sont des biopolymères géants, constitués d'environ 200 chaînes polypeptidiques appartenant à 6 ou 7 types différents que l'on regroupe généralement en deux catégories. La première catégorie, comptant 144 à 192 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites "fonctionnelles" portant un site actif et capables de lier réversiblement l'oxygène ; ce sont des chaînes de type globine dont les masses sont comprises entre 15 et 18 kDa et qui sont très similaires aux chaînes de type a et P de vertébrés. La deuxième catégorie, comptant 36 à 42 éléments, regroupe les chaînes polypeptidiques dites de "structure" possédant peu ou pas de site actif mais permettant l'assemblage des douzièmes.
Les premières images obtenues sur des hémoglobines extracellulaires d'Arénicole (Roche et al., 1960) ont révélé des éléments hexagonaux. Chaque molécule d'hémoglobine est constituée de deux hexagones superposés (Levin, 1963 ;Roche,
1965) que l'on a nommés bicouche hexagonale (hexagonal bilayer) et chaque hexagone est lui-même formé par l'assemblage de six éléments en forme de goutte d'eau (Van Bruggen et Weber, 1974 ; Kapp et Crewe, 1984), nommés structure globulaire creuse (hollow globular structure)(De Haas et al., 1996) ou "douzième". La molécule native est formée de douze de ces sous-unités, d'une masse moléculaire d'environ 250 kDa.
Ainsi, le brevet français n 2 809 624 concerne l'utilisation comme substitut sanguin d'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina, un Annélide Polychète de l'écosystème intertidal, ledit substitut sanguin permettant d'éliminer les problèmes de pénurie de dons.
Bien que l'architecture globale de l'hémoglobine de Arenicola marina soit connue, notamment grâce à son étude quaternaire fine par spectrométrie de masse (Zal et al., 1997), les séquences primaires des différentes chaînes protéiques qui la composent ne le sont pas.
Ainsi, la présente invention a pour but de fournir les séquences protéiques qui composent la molécule d'hémoglobine d'Arenicola marina.
Un autre but de la présente invention consiste à fournir les premières étapes de la synthèse in vitro d'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina afin d'élaborer un substitut sanguin au moyen de procédé de biochimie et de biologie moléculaire.
Un autre but de la présente invention consiste à fournir un procédé de préparation de la molécule d'hémoglobine, éventuellement simplifiée, par génie génétique, et ce afin notamment d'augmenter le stock de cette molécule dans le cadre d'une utilisation comme substitut sanguin.
La présente invention concerne un procédé de dissociation de la molécule d'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, notamment d'Arenicola marina, permettant l'obtention des dix chaînes protéiques constituant ladite molécule, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en présence d'un échantillon d'hémoglobine extracellulaire d'Annélides, notamment d'Arenicola marina avec au moins un agent dissociant, notamment un mélange constitué de dithiothréitol (DTT) ou de chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP) ou de bêta-mercaptoéthanol et d'un tampon de dissociation, pendant un temps suffisant pour séparer les chaînes protéiques les unes des autres.
Par "hémoglobine extracellulaire", on désigne une hémoglobine non contenue dans les cellules et dissoute dans le sang.
L'expression "agent dissociant" désigne un composé chimique capable de rompre les interactions faibles (hydrophobes, électrostatiques, hydrogènes...) ou fortes (ponts disulfures).
Par "tampon de dissociation", on désigne un liquide contenant un tampon permettant d'ajuster le pH et contenant des agents dissociants.
Les dix chaînes protéiques constituant la molécule d'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina comprennent 8 chaînes de type globine et 2 chaînes de type structure.
On rappelle que l'hémoglobine extracellulaire de Arenicola marina d'une masse de 3648 24 kDa est constituée de 198 chaînes polypeptidiques appartenant à 10 types différents regroupés en deux catégories : - la première (156 chaînes) regroupe des chaînes polypeptidiques dites "fonctionnelles" portant un site actif capable de lier réversiblement l'oxygène ; ce sont des chaînes de type globine dont les masses sont comprises entre 15 etl8 kDa; ces chaînes sont très similaires aux chaînes de types a et (3 des vertébrés ; et - la deuxième (42 chaînes) regroupe des chaînes polypeptidiques dites de "structure" (ou "linker") possédant peu ou pas de site actif mais permettant l'assemblage des dodécamères ; chaînes ont des masses moléculaires comprises entre 22 et 27 kDa.
La présente invention concerne un procédé de dissociation de la molécule d'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola marina, permettant l'obtention des dix chaînes protéiques constituant ladite molécule, ledit procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend une étape de mise en présence d'un échantillon d'hémoglobine extracellulaire d'Arenicola ,marina avec un mélange constitué de dithiothréitol (DTT) et d'un tampon de dissociation, pendant environ une heure à trois semaines.
# Formation des dispersions de vésicule tubulaires Les vésicules tubulaires sont préparées dans un premier temps en solubilisant le lipide Al dans le chloroforme. La solution est concentrée lentement sous pression réduite dans un ballon forme c#ur de 20 mL à l'aide d'un évaporateur rotatif. Le film obtenu est ensuite séché sous pression réduite à l'aide d'une pompe à palette. Le film de lipide est réhydraté avec de l'eau distillé à 65 C (10 C au dessus de la température de transition de phase du lipide) à une concentration de 2.5 mg.mL-1. Le mélange est homogénéisé au vortex pendant 5 minutes puis soumis aux ultrasons pendant 30 minutes à 70 C. La solution bleutée translucide obtenue est filtrée à travers un filtre de 0,45 m puis analysée au spectromètre de corrélation photonique et en microscopie électronique par transmission (figures 3,4 et 5).
Avec R=C17H35 (dérivé Al). La température de transition de phase a été mesurée par détection de la polarisation d'une sonde fluorescente, le DPH en spectrofluorimétrie : Tm = 54 C Nous obtenons des vésicules tubulaires dont le diamètre hydrodynamique moyen mesuré par diffraction de la lumière est de 132 nm (IP : 0,35).
Les mesures de forme et de taille établies par observation des clichés de microscopie électronique (figures 4 et 5) ont permis de mettre en évidence la formation de vésicules tubulaires refermées à leurs extrémités dont la section moyenne est de 38 nm et la longueur moyenne de 247 nm. Les analyses en cryofracture ont confirmé la formation de
ces vésicules tubulaires et leurs caractéristiques morphologiques, à savoir la présence d'une cavité aqueuse interne isolée du milieu extérieur.
Ces vésicules tubulaires ont une stabilité élevée puisqu'on n'observe aucune évolution de la taille des particules après un an de stockage tandis que dans les mêmes conditions, des liposomes formés de phosphatidyl choline de jaune d'oeuf évoluent au bout de seulement 5 jours.
La mise en évidence de la cavité interne aqueuse a été prouvée indirectement par des mesures spectrofluorimétriques de l'encapsulation et des cinétiques de libération d'une sonde fluorescente hydrophile, la carboxyfluorescéine (figure 1). Les mesures montrent clairement une cinétique de libération plus lente de la sonde fluorescente comparée à une encapsulation traditionnelle dans un mélange de phosphatidyl choline de jaune d'oeuf.
Exemple 7 : Encapsulation de carboxyfluorescéine dans des vésicules tubulaires fabriquées à partir du dérivé Al Le pouvoir d'encapsulation des différents composés est déterminé par spectrofluorimétrie à l'aide d'une sonde fluorescente : la 5 (6) -carboxyfluorescéine. On mesure la libération de ce marqueur fluorescent à partir des vésicules préparées selon les méthodes standardisées.
Cette étude nécessite la préparation d'un tampon Tris (15 mM et 150 mM NaCI) à pH 7,4, ainsi que d'une solution de carboxyfluorescéine à 120 mM et pH 7,4 également.
Les composés étudiés sont pesés (2,5 mg/mL) et sont dissous dans un minimum de méthanol. Le solvant est évaporé sous pression réduite au rotavapor et le film ainsi obtenu est séché par un flux d'azote.
On ajoute la solution de carboxyfluorescéine 120 mM dans le tampon Tris de manière à obtenir une dispersion de lipides de concentration égale à 2,5 mg/mL. La suspension obtenue est agitée au vortex pendant 1 minute puis soumise aux ultrasons dans un bain de sonication pendant 1 heure à 70 C.
La sonde fluorescente non encapsulée est éliminée par passage sur colonne Séphadex G25 préalablement équilibrée avec le tampon Tris. La fraction de vésicule récoltée est immédiatement étudiée par spectrofluorimétrie.
Les mesures de fluorescence ont été réalisées à l'aide d'un spectrofluorimètre Jobin-Yvon (spectrofluoromax 2), équipé d'une lampe Xénon 150 W.
Toutes les mesures ont été effectuées dans une cuve en quartz, thermostatée à 25 C. Les échantillons ont été analysés à une longueur d'onde d'excitation de 480 nm, et une longueur d'onde d'émission de 530 nm pendant 4 heures.
Les bandes passantes ont été fixées à 0,5 nm aussi bien pour l'excitation que pour l'émission.
Pour chaque mesure, l'intensité de fluorescence initiale (Fo) est déterminée 30 secondes après la filtration sur colonne. La libération est étudié sur une période de 4h et l'intensité de fluorescence (Ft) est mesurée à intervalle régulier. L'intensité maximum de fluorescence (Fmax) qui correspond à 100% de relargage, est obtenue après la lyse des vésicule tubulaires obtenue par ajout de Triton XI 00 (10% v/v).
Le pourcentage de libération est obtenu à l'aide de l'équation suivante (figure 1) : %R = (Ft - F0)/ Fmax Exemple 8: Polymérisation d'un monomère encapsulé dans des vésicules tubulaires obtenues à partir du lipide Al La composition des solutions utilisées est résumée dans le Tableau 1.
Dans la suite de la description, on appellera diamètre interne D du conduit d'admission 26 son diamètre dans le tronçon d'extrémité qui est adjacent à l'extrémité axiale amont 54 du siège de soupape 32.
Dans la suite de la description, on utilisera les adjectifs amont et aval en fonction de la direction globale de circulation du flux F des gaz d'admission.
La portée tronconique 34 du siège de soupape 32 s'étend axialement depuis le tronçon d'extrémité amont 52 jusqu'à l'extrémité axiale aval 56 du siège 32.
La portée tronconique 34 est donc divergente suivant le sens de circulation des gaz d'admission.
Sur la figure 3, on a représenté un premier mode de 25 réalisation du siège de soupape 32 conforme aux enseignements de l'invention.
Selon ce premier mode de réalisation, la paroi interne 50 du siège de soupape 32 comporte un tronçon d'extrémité amont 52 globalement tronconique convergent, délimité ici par une extrémité axiale amont El et une extrémité axiale aval E2.
Selon le mode de réalisation représenté ici, la valeur maximale du diamètre interne d52 du tronçon d'extrémité amont 52, au niveau de son extrémité axiale amont El, est sensiblement égale au diamètre interne D du conduit d'admission 26.
La paroi interne 50 du siège de soupape 32 comporte aussi un tronçon intermédiaire 58, qui s'étend depuis l'extrémité axiale aval E2 du tronçon d'extrémité amont 52 jusqu'à l'extrémité axiale amont E4 de la portée 34.
Le diamètre interne d58 du tronçon intermédiaire 58 est supérieur ou égal à la valeur minimale du diamètre interne d52 du tronçon d'extrémité amont 52.
De préférence, le tronçon intermédiaire 58 est divergent.
Selon le mode de réalisation représenté ici, le tronçon io intermédiaire 58 comporte un premier tronçon 60 dont la génératrice axiale est sensiblement rectiligne et parallèle à l'axe de coulissement A2, et qui s'étend depuis l'extrémité aval E2 du tronçon amont 52 jusqu'à un point intermédiaire E3.
Le tronçon intermédiaire 58 comporte un second tronçon 62 dont la génératrice axiale est sensiblement rectiligne et inclinée par rapport à l'axe de coulissement A2 de manière à former un tronçon divergent qui s'étend depuis le point intermédiaire E3 jusqu'à l'extrémité axiale amont E4 de la portée 34.
Le tronçon intermédiaire 58 constitue donc un tronçon de raccordement entre le tronçon d'extrémité amont 52 et la portée tronconique 34.
Avantageusement, la paroi interne 50 du siège de soupape 32 comporte un tronçon d'extrémité aval divergent 64 qui est adjacent à l'extrémité axiale aval E5 de la portée tronconique 34 et qui s'étend jusqu'à l'extrémité axiale aval 56 du siège 32.
Selon le mode de réalisation représenté ici, la génératrice axiale du tronçon d'extrémité aval 64 est globalement rectiligne et inclinée par rapport à l'axe de coulissement A2 de manière à former un tronçon divergent.
En fonctionnement, lorsque la soupape d'admission 30 est ouverte, le flux des gaz d'admission subi une accélération locale lorsqu'il rencontre le bourrelet annulaire formé par les tronçons amont 52 et intermédiaire 58, ce qui provoque, dans la partie aval i0 du siège de soupape 32 un décollement de l'écoulement des gaz d'admission qui tend à produire un mouvement aérodynamique de tumble dans la chambre de combustion 22 du cylindre 12.
En se reportant aux Figs. 1 à 6 des dessins, on peut voir un dispositif de signalisation S pour véhicule automobile prévu pour assurer une fonction "stop surélevé" également désignée par fonction CHMLS (Central High Mounted Lamp Stop). Bien entendu, le dispositif de signalisation ou d'éclairage selon l'invention n'est pas limité à ce type de fonction.
Le dispositif comporte une source lumineuse L constituée par une diode électroluminescente 1 propre à émettre, vers le haut selon Fig.l, suivant une direction principale X-X et suivant des directions B obliques par rapport à la direction principale X-X.
Un guide de lumière G1 allongé est disposé avec son axe longitudinal Y1 orienté transversalement, au moins au voisinage de la diode 1. De préférence l'axe Y1 est orthogonal à la direction principale d'émission XX. Le guide de lumière Gi peut être constitué par une fibre optique, par exemple cylindrique à section droite circulaire comme illustré sur Fig. 3. La section droite pourrait être différente d'un cercle. La face d'extrémité El du guide G1 voisine de la source L est orthogonale à l'axe Y1.
Une direction B est considérée comme oblique lorsqu'elle est inclinée par rapport à la direction X-X d'un angle suffisant pour entrer dans le guide Gi par la face El. Cet angle peut être de l'ordre de 30 .
La surface extérieure la de la zone émettrice de la diode 1 est sensiblement hémisphérique. La face El est tangente à la surface la, parallèlement à la direction X-X.