INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Un exemple de réaction correspondant à l'étape 1 (ici obtention du composé H3) est : est: T) fY p-naphtaldéhyde 4-aminobenzylamine H3 NH (commercial) (commercial) Tableau récapitulatif des produits de départ :
Produit final obtenu Aldéhyde de départ Amine de départ à l'issue de l'étape 2 H3 p-naphtaldéhyde 4-aminobenzylamine A11 p-naphtaldéhyde 4-aminobenzylamine Gll p-naphtaldéhyde 4-éthoxycarbonylbenzylamine H6 p-naphtaldéhyde 4-chlrobenzylamine H4 p-naphtaldéhyde benzylamine H10 p-naphtaldéhyde aniline 801 p-naphtaldéhyde 4-chlorobenzylamine 803 p-naphtaldéhyde 3,4-dichlorobenzylamine 804 a-naphtaldéhyde 4-aminobenzylamine 805 p-naphtaldéhyde benzylamine 806 p-naphtaldéhyde benzylamine 808 p-naphtaldéhyde benzylamine 807 p-naphtaldéhyde benzylamine CVl-80 p-naphtaldéhyde 2-bromobenzylamine CV1-81 p-naphtaldéhyde indol3-méthylamine CV1-84 3-bromobenzaldéhyde benzylamine CV1-85 4-bromobenzaldéhyde benzylamine CV1-93 p-naphtaldéhyde 4-bromobenzylamine CV1-97 3,4-dichlorobenzaldéhyde benzylamine CVl-122 4-chlrobenzaldéhyde benzylamine CV1-123 3-chlrobenzaldéhyde benzylamine
B) Deuxième étape : préparation des amines tertiaires : L'amine secondaire (1,1 éq) obtenue à l'étape précédente est dissoute dans le diméthylformamide, et on ajoute de l'halogénure d'alkyle (chloroacétonitrile, chlorure de propargyle, etc.) (voir loin). La solution est chauffée à reflux pendant 12 heures puis on la laisse revenir à température ambiante. On extrait ensuite avec de l'éther (10 fois plus en volume que le DMF) et on lave avec de l'eau puis avec une solution saturée de NaCl. La phase organique est séchée avec Na2S04 puis elle est évaporée à sec. Le brut est purifié par chromatographie sur gel de silice (AcOEt 1/Hex 9). Les chlorhydrates sont préparés par barbotage de HCl gazeux dans l'AcOEt.
On obtient alors les composés susmentionnés, sous forme de chlorhydrate, de formule telle que définie ci-dessous :
Plus précisément, cette deuxième étape correspond au schéma réactionnel suivant :
Les amines secondaires sont donc mises à réagir avec différents halogénures commerciaux.
On donne maintenant divers exemples d'extracteurs.
Un extracteur comprend un réseau de Bragg (de préférence un réseau apodisé) utilisé en réflexion (caractérisé par un coefficient Rra (#)) et un réseau à saut de phase utilisé en transmission (caractérisé par un coefficient Trsp (iv,) ) . La réponse spectrale ET (À) du dispositif, donnée en transmission, est ainsi : ET (À) =Trsp ( /l. ) xRr a ( / ) L'association entre ces deux réseaux de Bragg se fait de préférence par l'intermédiaire d'un circulateur.
Deux configurations, RT et TR, peuvent alors être considérées suivant que l'onde guidée est tout d'abord réfléchie ou, au contraire, transmise par le premier réseau qu'elle rencontre.
Un extracteur, dans une configuration RT, est schématiquement représenté sur la figure 3 et comprend un réseau apodisé 18 et un réseau à saut de phase 20, qui sont montés sur un support 22, ainsi
qu'un circulateur 24 à trois voies ("ports") vl, v2 et v3 .
L'entrée du signal S à filtrer spectralement se fait par une fibre optique 26 sur la voie vl du circulateur. L'onde guidée est donc dirigée vers la voie v2. Elle y rencontre le réseau apodisé.
Une partie du signal correspondant à la bande de filtrage de ce réseau est réfléchie vers la voie v2 puis dirigée vers la voie v3.
Le signal restant se disperse dans un milieu 28 constitué par un liquide d'adaptation d'indice sans lequel les réflexions de Fresnel en bout de fibre risquent de rediriger une partie non négligeable du signal d'entrée dans le dispositif.
En variante l'extrémité de la fibre, sur laquelle est formé le réseau 18, peut être clivée en biais. On peut aussi utiliser le liquide d'adaptation d'indice et un tel clivage.
La bande spectrale réfléchie dans voie v3 est donnée par le spectre du réseau apodisé qui est caractérisé par une longueur L et une amplitude de modulation d'indice 6.nmod' avec L=10mm et Ànn,od=4xlCT4 dans l'exemple, et rencontre le réseau à saut de phase caractérisé, dans l'exemple, par un saut de phase ## égal à #, une longueur L égale à 3mm et une amplitude de modulation #nmod égale à 15x10-4.
Si les spectres de ces réseaux sont bien accordés, on extrait du signal uniquement le pic central du réseau à saut de phase.
Le signal réfléchi par ce dernier se perd dans l'isolation du circulateur. Aucun effet de
résonance (du type Fabry-Perot) n'est donc observé entre les deux réseaux.
Le signal s ainsi extrait de S est fourni par la fibre optique sur laquelle est formé le réseau à saut de phase.
La configuration TR est similaire à la précédente. Un extracteur, utilisant cette configuration TR, est schématiquement représenté sur la figure 4 et utilise les mêmes composants que l'extracteur de la figure 3, agencés comme on le voit sur la figure 4.
Le signal d'entrée S est guidé dans une fibre 30 jusqu'au réseau à saut de phase 20. Le signal transmis pénètre par la voie vl dans le circulateur qui le dirige vers la voie v2 où il rencontre le réseau apodisé 18. Le signal réfléchi ressort par la voie v3 du circulateur.
La partie de liaison 27 peut être formée de deux voiles parallèles et espacés latéralement.
revendications 1 à 8.
La présente invention a pour objet un dispositif pour solidariser les deux battants d'une ouverture menuisée notamment d'un portail mu par une motorisation dont l'organe de transmission du mouvement immédiatement en contact avec le vantail du
Il existe plusieurs dispositifs qui tentent de résoudre le problème de la fermeture
La deuxième catogorie regroupe des organes de blocage mécaniques comme des
très dépendantes de la structure du portail. En efllet, un portail léger et assez large aura une flexibilité souvent préudiciable à sa bonne fermeture, une pesée sur un vantai} pouvant le désolidariser trés facilement de l'autre vantail, donnant à penser
Le dispositif selon l'invention est un dispositif de rigidification, en position fermeture, des deux battants d'une ouverture menuisée notamment un portail, actionnés chacun par une motorisation, notamment une motorisation dite " à compas ", dont la manivelle forme un angle aigu avec la face interne du portail en
ne présentant pas d'activité en présence du substrat à 4 carbones (crotonoyl-CoA), même à 8 mM (Quémard et al., 1995).
4. 1.3. Détermination des constantes cinétiques pour les substrats à longue chaîne L'utilisation de substrats à longue chaîne (Cgà C20) pose des contraintes liées à leur concentration micellaire critique (CMC). Les acyl-CoAs à longue chaîne sont des composés amphiphiles et ne forment des solutions vraies qu'à faible concentration. Au delà de la CMC, une partie des molécules forme des micelles et la concentration en monomère est fixée à la CMC, donc différente de la concentration totale. Il était donc important d'utiliser des solutions de concentrations inférieures à la CMC. Dans une étude des propriétés physiques des acyl-CoA (Constantinides & Steim, 1985), les CMC de solutions aqueuses de palmitoyl-CoA (C16-CoA) et de stéaroyl-CoA (C18-CoA) déterminées sont respectivement de 70 et 12 M. La présence d'une insaturation (en position 9) dans le cas de l'oléyl-CoA (C18:1-CoA) élève sa CMC à 33 M. La présence d'une fonction cétone sur la chaîne aurait en théorie un effet similaire par rapport à la CMC. Utilisant ces données, nous avons tenté de préparer des solutions de ss-cétothioester dont la concentration soit-en-dessous de la CMC. Les solutions mères utilisées'pour les tests cinétiques sont de 400 M et 100 M pour les .cétothioesters en C8 et C12, respectivement.
4. 1.3.1. Mesure du Km pour les cétoacyl-CoA en C8 et en C12 Nous avons mesuré les paramètres cinétiques de MabA pour le ss-cétooctanoyl-CoA (C8) et le ss-cétododécanoyl-CoA (C12). La protéine présente un Km (60 M) pour le substrat en C8 25 fois inférieur à celui du C4 (1582 M0. Le dérivé en C12 s'avère encore un bien meilleur substrat (Km de 9 M). Là encore, les valeurs obtenues par la méthode de Hanes et celle des moindrescarrés sont proches. Nous avons calculé le rapport Km/Vmax qui reflète l'affinité de l'enzyme pour ses substrats. Km/Vmax est d'autant plus bas que la longueur de chaîne de substrat est longue.
Cette corrélation est due non seulement aux plus faibles Km, mais également à des max plus élevés pour les plus longues chaînes.
Les constantes cinétiques Km et Vmax pour le C16 et C20 n'ont pu être déterminées. Pour ces ss-cétoacyl-CoA de plus de 12 atomes de carbone, des problèmes d'inhibition par le substrat ont été rencontrés, décrits également dans le cas de l'utilisation de substrats de InhA de taille supérieure à C16. Nous avons donc comparé les vitesses initiales de réaction à une même concentration (2 M), en présence des différents -cétoacyl-CoA (C4 à C20). Pour mesurer l'activité, il était nécessaire d'utiliser des solutions d'enzymes à différentes concentrations pour les divers substrats -cétothioesters. La protéine MabA présente une large préférence pour le substrat à 12 carbones par rapport aux substrats courts, et les ss-cétothioesters en C16 et C20 s'avèrent au moins aussi bons substrats que le Cg. La baisse de la vitesse de réaction observée pour les longues chaînes de -cétoesters pourrait être liée à leur faible solubilité (dans le cas où la concentration réelle en molécules libres serait inférieure à 2 M).
4. 1.3.2. Spécificité de substrat et implication dans une voie d'élongation? Bien qu'elle présente une activité en présence du -cétoacyl à 4 carbones, la protéine MabA montre néanmoins une nette préférence pour les substrats en C12-C16. L'affinité de MabA pour les substrats à longue chaîne hydrocarbonée est compatible avec la taille et la nature hydrophobe de la poche de fixation du substrat. La protéine InhA présente quant à elle une affinité légèrement différente, avec une préférence pour des substrats plus longs C16-C24 (Quémard et al., 1995). Les propriétés enzymatiques de MabA et InhA, notamment leur spécificité pour des substrats à chaîne moyenne à longue, va dans le sens de leur appartenance au même système d'élongation d'acides gras, FAS-II, qui est lui-même spécifique de substrats en C -C C12-C1g.
La spécificité de substrat de InhA diffère de celle des énoyl réductases des systèmes de type II de Spinacea oleracea (Shimakata & Stumpf, 1982)) ou de E. coli (Weeks & Wakil, 1968), qui ont une préférence pour des substrats en C6et Cg. De plus, la p-hydroxyacyl deshydratase du système de type II de E. coli (Birge & Vagelos, 1972) est spécifique de substrats à courte chaîne (C4à C12), alors qu'elle est très peu active en présence de substrat en C16. Ces données mettent en avant la spécificité de substrat particulière du système FAS-II mycobactérien.
4. 1.4. MabA et ACP-dépendance? Le complexe enzymatique contenant InhA que nous avons identifié comme le système d'élongation FAS-II, outre sa spécificité pour les substrats C12-C18, a comme propriété d'être ACP-dépendant. L'ACP-dépendance de la protéine InhA est illustrée par son affinité beaucoup plus marquée pour les substrats dérivés d'ACP (le Km pour l'octènoyl-ACP est de 2 ordres de grandeur inférieur à celui pour le dérivé de CoA en C8). Déterminer la préférence de MabA pour des dérivés d'ACP nécessite la synthèse de ces dérivés (non commerciaux) et la comparaison des constantes cinétiques avec celles des dérivés de CoA. Les KAR de plantes sont ACPdépendantes, propriété qui a été corrélée à leur appartenance à un système de type II. Les nombreux arguments en faveur de l'appartenance de MabA à FAS-II suggèrent fortement l'ACPdépendance de la -cétoacyl réductase.
Conclus ion Après mise au point de la surproduction de la protéine MabA dans Escherichia coli et purification, nous avons réalisé une étude enzymatique de cette protéine. Ainsi, nous avons montré que son activité catalytique correspond à la réduction NADPH-dépendante de sscétoesters, ce qui correspond à l'une des étapes de la voie d'élongation d'acides gras.-,La détermination de l'activité de MabA en présence de substrats de plusieurs longueurs de chaîne a permis de montrer la préférence de cette enzyme pour des substrats de taille supérieure ou égale à 12 atomes de carbone, en accord avec son implication potentielle dans un système d'élongation d'acides gras. Nous avons donc recherché la protéine MabA dans le complexe enzymatique FASII contenant InhA, et étudié l'implication de MabA dans l'activité d'élongation de ce système.
5. APPORT DE LA MODÉLISATION MOLÉCULAIRE À L'ÉTUDE DE LA PROTÉINE MABA La modélisation moléculaire permet d'accéder à un ensemble d'informations concernant les caractéristiques structurales de la protéine, l'architecture du site catalytique, mais également d'apprécier les possibilités d'interaction avec des ligands (substrats, inhibiteurs, molécules affines). L' élaboration du modèle tridimensionnel de la protéine MabA est présentée ci-dessous.
5. 1. Recherche de protéines présentant une forte similitude de séquence avec MabA La recherche de séquences peptidiques similaires à celle de MabA (M tuberculosis) dans les banques de données avec le logiciel Psi-blast (Altschul et al., 1997) a montré qu'il existait des ss-cétoacyl-ACP réductases présentant un fort taux d'identité avec MabA (87%, 84%,69%, respectivement) dans d'autres espèces mycobactériennes (avium, smegmatis, leprae). Des protéines homologues à MabA, appelées FabG, sont également présentes dans d'autres organismes, essentiellement des bactéries (exemple dans Streptomyces ceolicolor, 57% d'identité) et des plantes. Cependant, aucune structure de ss-cétoacyl-ACP réductase n'a jamais été résolue. Réaliser un modèle moléculaire de MabA représentait donc un intérêt dans l'étude des FabG.
5. 2. Elaboration du modèle de MabA La modélisation structurale de MabA a été effectuée en utilisant le programme Modeller 4 (Sali & Blundell, 1993). Le modèle est basé sur les structures de protéines cristallisées en complexe avec le NAD(P)(H) et présentant le plus fort taux d'identité et le plus faible score de probabilité (E) avec MabA. Ces protéines "support", sélectionnées grâce au logiciel Psi-blast (Altschul et al., 1997) dans la principale banque de données de structure protéiques, la PDB (Protein Data Bank, (Berman et al., 2000)), sont : PDB2HSD (34%/NAD); PDB1YBV (33%/NADPH); PDB2AE2 (29%/NADP); PDB1FMC (28%/NADH) ; PDB1CYD (28%/NADPH) et PDB1BDB (27%/NAD). Ces protéines, d'origine très diverses, catalysent toutes soit la réduction d'un carbonyle (comme MabA), soit la réaction inverse. L'alignement de séquences utilisé pour la modélisation a été réalisé en considérant les régions bien conservées entre MabA et les supports, d'une part, et entre MabA et les autres ss-cétoacyl-ACP réductases (FabG) connues, d'autre part. Pour vérifier que le modèle est énergétiquement stable, deux programmes ont été utilisés, TITO (Labesse & Momon, 1998) et Verify-3D (Luthy et al., 1992), qui ont donné des scores satisfaisants.
La structure monomérique donnée par le modèle de MabA indique que la protéine appartient à la superfamille structurale [alpha]/ss, avec six hélices a et sept brins ss. Notons que la boucle ss6-[alpha]6" comporte deux hélices appelées [alpha]6 et [alpha]6'. MabA possède un seul domaine, dont la topologie est similaire au repliement (ss/[alpha])6 de Rossmann (Rossmann et al., 1974), typique des protéines fixant un dinucléotide diphosphate (dinucléotide diphosphate-binding protein, DDBP) (Persson et al., 1991). Toutefois, contrairement aux DDBP à deux domaines, la symétrie n'est pas respectée, puisque les hélices de la moitié C-terminale ([alpha]4, [alpha]5) sont plus longues que les structures secondaires de la partie N-terminale. Ces caractéristiques, ainsi que la présence d'un brin supplémentaire (ss7), sont typiques de la superfamille des protéines RED (Reductase/Epimerase/Deshydrogenase) (Labesse et al., 1994). La présence d'une cystéine unique (C60), probablement enfouie, dans MabA exclut la possibilité de formation de pont disulfure intra- ou inter-chaîne au sein de la protéine.
# Le cofacteur NADPH fixé se trouve dans une conformation étendue reposant sur les extrémités C-terminales des brins ss1-ss5 qui forment un feuillet Le brin il des protéines RED qui est impliqué dans la fixation du ribose lié à l'adénine du cofacteur, présente dans la séquence de MabA le motif [***xxr]*, spécifique des enzymes NADP(H)-dépendantes (Labesse et al., 1994). Ceci est en accord avec les données enzymatiques montrant la spécificité stricte de MabA pour le NADPH et indique que le phosphate supplémentaire est probablement important pour la stabilisation du cofacteur dans la bonne orientation pour la catalyse. Le résidu chargé positivement R47, faisant partie du motif [VAVTHR] du brin il, est probablement impliqué dans l'interaction de la protéine avec le phosphate, par des liaisons électrostatiques.
Comme dans les autres protéines RED, le site de liaison du substrat de MabA est probablement délimité par les extrémités C-terminales des brins ss4, ss5, ss6, ss7 et les hélices a4, a5, [alpha]6 ([alpha]6, a6', a6") (Fig. 5.18 ; (Labesseet al., 1994)); la partie nicotinamide du NADPH, impliquée dans les échanges ioniques, est orientée vers le fond de la cavité. Les résidus du site actif très bien conservés, et constituant en partie la signature des protéines RED, sont présents dans le site catalytique de MabA : triade catalytique, S140, Y153, K157 et N112, T188.
* *. résidu hydrophobe, x : quel acide aminé. En lettres majuscules et minuscules les résidus strictement conservés et les plus fréquemment rencontrés, respectivement.
14A2 qui entoure sous forme d'un cylindre l'axe optique Ax.
Dans la lumière émise par la diode photoémissive, la lumière qui est émise avec un petit angle (plus précisément un angle par exemple inférieur ou égal à 40 environ) par rapport à l'axe optique Ax tombe perpendiculairement sur la partie sphérique 14A1 puis avance sous forme rectiligne dans l'organe transparent 14. Au contraire, la lumière émise avec un grand angle (plus précisément un angle supérieur par exemple à 40 environ) par rapport à l'axe optique Ax tombe obliquement sur la partie cylindrique 14A2 puis avance dans
l'organe transparent 14 en étant réfractée vers la périphérie externe de cet organe 14.
Une partie 14B de réflexion interne et une partie 14C de réfraction sont formées à la surface de l'organe transparent 14. La partie de réflexion interne réfléchit intérieurement la lumière incidente de petit angle (lumière tombant sur la partie sphérique 14A1) qui tombe sur l'organe transparent 14 avec un petit angle par rapport à l'axe optique Ax, en direction pratiquement perpendiculaire à l'axe optique Ax. La partie de réfraction réfracte la lumière incidente de grand angle (lumière tombant sur la partie cylindrique 14A2) qui parvient sur l'organe transparent 14 avec un grand angle par rapport à l'axe optique Ax, en direction pratiquement perpendiculaire à l'axe optique Ax. La partie 14B de réflexion interne a une configuration donnée par une surface courbe de révolution autour de l'axe optique Ax ayant une forme générale d'entonnoir, à la face avant de l'organe transparent 14. D'autre part, la partie 14C de réfraction a une configuration donnée par une surface courbe de révolution formée autour de l'axe optique Ax, analogue à un dôme annulaire de façon générale, du côté
arrière de la partie de réflexion interne 14B.
La partie de surface de l'organe transparent 14 qui est du côté de la périphérie externe de la partie de réflexion interne 14B est réalisée sous forme d'une partie périphé25 rique externe cylindrique 14D ayant une configuration donnée
par une surface cylindrique centrée sur l'axe optique Ax.
Dans cette configuration, la lumière émise par la diode photoémissive, réfléchie intérieurement par la partie 14B de réflexion interne pour être dirigée en direction pratique30 ment perpendiculaire à l'axe optique Ax, avance sous forme rectiligne dans la partie périphérique externe cylindrique 14D vers l'extérieur de l'organe 14. Une partie d'extrémité arrière de la partie périphérique externe cylindrique 14D est sous forme d'une partie annulaire plate 14E délimitée par un plan perpendiculaire à l'axe optique Ax afin que la lumière émise par la diode, réfléchie intérieurement par la partie 14B de réflexion interne et réfléchie par la partie 14C de réfraction, ne soit pas arrêtée par la partie
annulaire plate 14E.
Le réflecteur 16 est disposé afin qu'il réfléchisse la
lumière émise par la diode photoémissive et qui est trans5 mise par l'organe transparent 14, vers l'avant de la lampe.
Le réflecteur 16 a une configuration obtenue par application d'un traitement de formation d'une surface réfléchissante à la face avant d'une pièce de résine de synthèse moulée ayant
une forme conique plate, avec une forme circulaire exté10 rieure en élévation frontale.
Une surface réfléchissante 16a du réflecteur 16 est délimitée par plusieurs éléments réfléchissants 16s qui réfléchissent la lumière émise par la diode photoémissive et transmise par l'organe transparent 14, vers l'avant de la lampe. Les éléments réfléchissants 16s sont disposés afin qu'ils divisent la surface réfléchissante 16a radialement et concentriquement. Dans la direction radiale, les éléments réfléchissants 16s sont placés à intervalles réguliers sous forme étagée avec des parties de gradin 16g qui s'allongent dans un plan pratiquement perpendiculaire à l'axe optique Ax. Chacun des éléments réfléchissants 16s est sous forme d'une surface à courbure convexe dans laquelle une surface conique ayant un axe central concidant avec l'axe optique Ax et un angle au sommet de 90 est utilisée comme surface de référence, et qui a une courbure prédéterminée à la fois dans les directions radiales et circonférentielles par rapport à l'axe optique Ax. En conséquence, les éléments réfléchissants réfléchissent de manière diffuse la lumière émise par la diode photoémissive depuis l'organe transparent
14 à la fois dans les directions radiale et circonférentielle par rapport à l'axe optique Ax.
La glace transparente 18 est une glace continue qui est formée d'une pièce de résine transparente de synthèse moulée et dont la forme extérieure est circulaire en élévation frontale de la lampe. Un bord périphérique externe de la
l'hypothèse concernant l'existence du peptide.
EXEMPLE 3 : Immunoempreintes : 3.1) Préparation d'anticorps dirigés contre le peptide : Les peptides ont été synthétisés par la société Eurogentec.
Les anticorps ont été produits sur le peptide synthétique tronqué (sup 16) par la société Eurogentec.
3. 2) Extraction de protéines de siliques : Les protéines ont été extraites par broyage des siliques dans le tampon d'extraction pour immunoempreintes, à l'aide de mini-pilons (Kontes) reliés à un broyeur RZE2021 (Heidolph). Après centrifugation (20 minutes à 10000 g), la concentration protéique du surnageant a été déterminée par la méthode de Bradford à l'aide du réactif vendu par la société Bio-Rad.
3. 3) Analyses électrophorétiques : Les électrophorèses en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE) ont été réalisées selon la méthode décrite par Laemmli (1970). Le gel de concentration est à 3% d'un mélange acrylamide / bis acrylamide (30 % / 0,8 %) et le gel de séparation est à 18% du mélange Prosieve. 15 g de protéines totales auxquelles on ajoute le tampon de charge à la concentration finale de 1 x, sont portés à 100 C pendant 3 minutes puis déposés dans chaque piste.
Les protéines sont séparées par un courant constant de 15 à 20 mA par gel, pendant environ 1 heure. Les gels qui ne sont pas destinés aux immunoempreintes sont colorés au Bleu de Coomassie pendant 30 minutes puis décolorés jusqu'à apparition des bandes correspondant aux protéines.
3. 4) Immunoempreintes : Pour les immunoempreintes, les protéines ont été transférées après migration sur gel, sur des membranes de nitrocellulose (Pure Nitrocellulose membrane, 0,1 m, Protan) dans une cuve d'électrotransfert semi-sec Temblot Ae-6675 (Touzart et Matignon) pendant 40 minutes sous 2,5 mA.cm2.
Les réactions de marquage ont été réalisées à 37 C sous agitation modérée.