INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Selon l'invention, une molécule d'antigène d'intérêt liée à une molécule protéique porteuse par une liaison covalente signifie que ladite molécule d'antigène d'intérêt est liée de manière covalente, chimiquement, à ladite molécule protéique porteuse, par au moins une liaison covalente, c'est à dire éventuellement par deux liaisons covalentes ou plus.
Le pourcentage de molécules protéiques porteuses et de protéines antigéniques d'intérêt liées entre elles par des liaisons covalentes dans un produit immunogène de l'invention peut être aisément vérifié par l'homme du métier.
Par exemple, la détermination du pourcentage de molécules d'antigène d'intérêt liées aux molécules de protéine porteuse par une liaison covalente dans un produit immunogène de l'invention peut être réalisée selon les étapes suivantes : (i) soumettre ledit produit immunogène en solution à des conditions dénaturantes et réductrices, (ii) réaliser une étape de chromatographie d'exclusion de taille avec le produit obtenu à la fin de l'étape (ii) au cours de laquelle les différents constituants protéiques de masse moléculaires décroissants sont élués successivement du support chromatographique d'exclusion de taille.
(iii) mesurer la quantité d'antigène d'intérêt liée par une liaison covalente à la molécule porteuse dans la fraction d'éluat contenant les constituants protéiques ayant le plus haut masse moléculaire ; (iv) comparer la quantité d'antigène d'intérêt mesurée à l'étape (iii) avec la quantité totale d'antigène d'intérêt inclus initialement dans le produit immunogène de départ.
A l'étape (i) du procédé de détermination du pourcentage de liaisons covalentes décrit ci-dessus, l'incubation d'une quantité donnée (en nombre de moles ou en poids) du produit immunogène de l'invention dans des conditions dénaturantes et réductrices entraîne une dissociation des liaisons faibles entre les différents constituants protéiques non liés entre eux par une liaison covalente.
Des conditions dénaturantes préférées sont la présence d'urée, par exemple à la concentration finale 8M, ou encore la présence de SDS, par exemple à la concentration finale de 1% en poids total de la solution contenant le produit immunogène. Des conditions réductrices préférées sont la présence de ss-mercaptoéthanol, par exemple à la concentration finale de 5% du volume total de la solution contenant le produit immunogène.
A l'étape (ii) du procédé de détermination du pourcentage de molécules d'antigène d'intérêt et de molécules de protéine porteuse liées entre elles par des liaisons covalentes, le support de chromatographie d'exclusion de taille est choisi par l'homme du métier selon ses connaissances générales techniques. Par exemple, l'homme du métier peut avoir recours aux supports chromatographiques commercialisés par la Société Pharmacia sous les noms commerciaux de Superdex 75TM et de Superdex 200TM .
A l'étape (ii), la fraction moléculaire correspondant à la molécule porteuse liée de manière covalente aux molécules d'antigène d'intérêt est éluée en premier lieu, avant la ou les fractions d'éluat contenant l'antigène d'intérêt sous forme libre. L'antigène d'intérêt qui est élué sous forme libre correspond à la fraction d'antigène d'intérêt, qui n'était pas lié par une liaison covalente à la molécule porteuse, au sein du produit immunogène de départ.
C'est sur la fraction protéique de haut masse moléculaire qu'est réalisée la mesure de la quantité d'antigène d'intérêt lié de manière covalente à la molécule protéique porteuse, par exemple dans un test immuno-
enzymatique, dans un test radioimmunologique ou dans un test par immunofluorescence, direct ou indirect ( sandwich ), en utilisant des anticorps spécifiques de l'antigène d'intérêt et qui ne présentent aucune réaction immunologique croisée avec la molécule protéique porteuse.
A l'étape (iii), on compare la quantité d'antigène d'intérêt lié de manière covalente à la molécule protéique porteuse, qui a été mesurée comme décrit ci-dessus, à la quantité initiale d'antigène d'intérêt incluse initialement dans la quantité donnée (en nombre de moles ou en poids) du produit immunogène de départ, et on calcule ainsi le pourcentage d'antigène d'intérêt qui est lié de manière covalente à la molécule protéique porteuse, dans le produit immunogène de l'invention.
A titre illustratif, on a montré selon l'invention que dans le produit immunogène selon l'invention comprenant des hétérocomplexes entre la molécule protéique porteuse KLH (Keyhole limpet hemocyanin) et des molécules d'interféron alpha humain, seulement 3 % des molécules d'interféron alpha sont liées de manière covalente à la molécule protéique porteuse KLH.
L'invention a pour objet un produit immunogène stable pour l'induction d'anticorps à l'encontre d'une ou plusieurs protéines antigéniques chez un sujet, caractérisé en ce qu'il comprend des hétérocomplexes immunogènes protéiques constitués d'associations entre (i) des molécules de protéines antigéniques et (ii) des molécules protéiques porteuses et en ce que moins de 40 pour cent des protéines antigéniques (i) sont liées par une liaison covalente avec les molécules protéiques porteuses (ii).
Comme polymères filmogènes liposolubles utilisables dans l'invention, on peut également citer les polyalkylènes et notamment les copolymères d'alcènes en C2-C20 comme le polybutène, les alkylcelluloses avec un radical alkyle linéaire ou ramifié, saturé ou non en Ci à C8 comme l'éthylcellulose et la propylcellulose, les copolymères de la vinylpyrolidone (VP) et notamment les copolymères de la vinylpyrrolidone et d'alcène en C2 à C40 et mieux en C3 à C2o. A titre d'exemple de copolymère de VP utilisable dans l'invention, on peut citer le copolymère de VP/acétate vinyle, VP/méthacrylate d'éthyle, la polyvinylpyrolidone (PVP) butylée, VP/méthacrylate d'éthyle/acide méthacrylique, VP/eicosène, VP/hexadécène, VP/triacontène, VP/styrène, VP/acide acrylique/méthacrylate de lauryle.
La composition selon l'invention peut comprendre un agent plastifiant favorisant la formation d'un film avec le polymère filmogène. Un tel agent
plastifiant peut être choisi parmi tous les composés connus de l'homme du métier comme étant susceptibles de remplir la fonction recherchée.
Les nacres peuvent être choisies parmi les pigments nacrés blancs tels que le mica recouvert de titane ou d'oxychlorure de bismuth, les pigments nacrés colorés tels que le mica titane avec des oxydes de fer,
le mica titane avec notamment du bleu ferrique ou de l'oxyde de chrome, le mica titane avec un pigment organique du type précité ainsi que les pigments nacrés à base d'oxychlorure de bismuth.
Les colorants liposolubles sont par exemple le rouge Soudan, le D&C Red 17, le D&C Green 6, le p- carotène, l'huile de soja, le brun Soudan, le D&C Yellow 11, le D&C Violet 2, le D&C orange 5, le jaune quinoléine, le rocou. Les colorants hydrosolubles sont par exemple le jus de betterave, le bleu de méthylène, le sel disodique de ponceau, le sel disodique du vert d'alizarine, le jaune de quinoléine, le sel trisodique d'amarante, le sel disodique de tartrazine, le sel monosodique de rhodamine, le sel disodique de fuchsine, la xanthophylle.
Avant d'entrer plus en détail dans l'exposé de ces exemples, nous allons expliciter les protocoles de mesure des différentes grandeurs permettant de définir la présente invention, à savoir la teneur en extrait sec, la valeur de collant, la dureté et la mesure du profil d'écoulement.
Protocole de mesure du collant Le collant de la cire est mesuré à 20 C à l'aide du texturomètre vendu sous la dénomination TAXT2i par la société RHEO, équipé d'un mobile en polymère acrylique en forme de cône formant un angle de 45 , en mesurant l'évolution de la force (force de compression ou force d'étirement) (F) en fonction du temps, pendant l'opération suivante : Le mobile est déplacé à la vitesse de 0,5 mm /s puis pénètre dans la cire jusqu'à une profondeur de pénétration de 2 mm. Lorsque le mobile a pénétré dans la cire à la profondeur de 2 mm, le mobile est maintenu fixe pendant 1 seconde (correspondant au temps de relaxation) puis est retiré à la vitesse de 0,5 mm/s. Pendant le temps de relaxation, la force
Selon les techniques de formation de dispersion envisagées, la dispersion, selon
l'invention, peut être soit une mousse, soit une émulsion.
Généralement, l'étape de formation de la dispersion est effectuée par agitation mécanique du milieu biphasique ou par injection directement dans la première phase liquide surmontée de la couche interfaciale de jets capillaires gazeux ou liquides.
On note qu'une mousse désigne une dispersion comprenant un ensemble de bulles de gaz (typiquement d'air) coexistant avec un milieu liquide interstitiel, sous forme de minces films entre les bulles. Ce type de dispersion ménage ainsi une multitude d'interfaces liquide-gaz. La mousse, selon l'invention, peut être obtenue, par exemple, par agitation mécanique vigoureuse du milieu biphasique ou par injection au sein de ce milieu biphasique de jets capillaires gazeux (typiquement des jets d'air).
On note que, selon l'invention, une émulsion désigne une dispersion, dans laquelle la phase liquide contenant les molécules aptes à fixer la macromolécule ou l'agglomérat de molécules ou particules à concentrer est divisée en globules au sein de l'autre phase liquide du milieu biphasique, ladite autre phase constituant un milieu interstitiel. On forme ainsi une multitude d'interfaces liquide-liquide, et on augmente de ce fait considérablement la surface de contact entre les deux phases du milieu biphasique.
L'émulsion, au même titre que la mousse, peut être obtenue par agitation mécanique du milieu biphasique mais également par injection directe au sein
de la première phase liquide surmontée de la couche interfaciale de jets capillaires liquides ou gazeux.
Ainsi, selon l'invention, le fait de passer par une dispersion du type mousse ou émulsion pour assurer la concentration d'une macromolécule ou d'un agglomérat de molécules ou particules contribue à ménager une multitude de zones interstitielles entre l'échantillon liquide et la couche interfaciale, ce qui augmente considérablement la quantité de surface entre ces deux milieux et facilite, de ce fait, la fixation des macromolécules ou les agglomérats de molécules par la couche interfaciale dispersée. Cette fixation se fait dans des zones quasibidimensionnelles, du fait qu'elle a lieu au niveau des zones interstitielles, ce qui améliore grandement l'efficacité et le temps de capture des macromolécules à concentrer par la couche interfaciale..
Après résorption de la dispersion, on se retrouve, ainsi, en présence d'une couche interfaciale reformée concentrée en macrolécules ou agglomérats de molécules et d'une phase liquide correspondant à l'échantillon liquide dépourvu en-' tout ou partie desdites macromolécules ou desdits agglomérats.
L'avantage de la présente invention est donc de pouvoir concentrer rapidement et sans amplification, les macromolécules ou agglomérats et ceci de manière sélective.
Comme décrit précédemment, après capture des macromolécules ou agglomérat de molécules ou particules à concentrer, la dispersion est amenée à
subir une étape de résorption. Cette étape peut être menée de différentes manières. Par exemple, cette étape de résorption de la dispersion peut être effectuée par drainage des films interstitiels, dans le cas d'une mousse, ou du milieu interstitiel, dans le cas d'une émulsion. La cinétique de la résorption peut être contrôlée soit par un choix judicieux des molécules constitutives de la phase réceptrice des macromolécules ou agglomérats via la longueur, des chaînes moléculaires, par exemple, soit à l'aide d'un cisaillement mécanique de la dispersion.
Selon un mode avantageux, la couche interfaciale comprend au moins une molécule apte à fixer sélectivement les macromolécules ou les agglomérats de molécules ou particules en question.
Selon l'invention, la molécule apte à fixer la macromolécule ou agglomérat de molécules ou particules à concentrer peut être une molécule surfactante comportant des groupements aptes à fixer la macromolécule ou ledit agglomérat par affinité chimique, polarisation électrique ou. magnétique, et/ou ionisation.
Si ladite molécule n'est pas mélangée avec d'autres molécules surfactantes, ladite molécule peut être également, en outre, une molécule stabilisatrice de la dispersion formée au cours d'une des étapes du procédé.
Dans ce cas, la molécule assure une double fonction, qui est de fixer la macromolécule ou l'agglomérat à concentrer et également d'assurer la
En ce qui concerne les complexes protéiniques tels que les prions, ceux-ci doivent
également, pour être détectables, dans des liquides physiologiques, tels que le sang, subir une phase de concentration. Pour ces molécules, la technique PCR précédemment décrite est inutilisable, parce qu'ils ne contiennent pas de nucléotides. De ce fait, des recherches relatives au domaine des prions ont abouti récemment à la mise en place d'une méthode dite 'méthode d'amplification des protéines anormalement repliées' ou PMCA (pour 'Protein Misfolding Cyclic Amplification').
Les prions, responsables notamment des encéphalopathies spongiformes, sont des complexes ou agglomérats constitués d'une protéine naturelle, la glycoprotéine PrPc, normalement présente à la surface de nombreuses cellules dans l'organisme et d'une protéine infectieuse PrPsc, qui ne se différencie de la glycoprotéine normale PrPc que par sa conformation, qui est anormalement repliée. Les protéines PrPsc sont aptes, d'une part, à s'associer aux procéines PrPc et d'autre part, aptes à induire la transformation de protéines normales en protéines infectieuses. La détection des prions est rendue difficile par le fait qu'ils ne sont présents en quantité notable que dans le cerveau, alors qu'ils se retrouvent à l'état de traces dans le sang.
La technique PMCA permet ainsi de concentrer les prions dans le milieu de prélèvement, afin qu'ils puissent être détectés.
Pour ce faire, un procédé de sonication destiné à fragmenter les prions est mis en #uvre. Tous les prions issus de cette fragmentation par ultra-sons,
repoussent in-vitro à l'aide des protéines PrPc de l'échantillon. Ce cycle élémentaire (fragmentationrepousse) est reproduit autant de fois que nécessaire, jusqu'à ce que la quantité de prions devienne détectable.
L'étape de détection, facilitée par l'étape d'amplification, est effectuée par spectroscopie de fluorescence. Les protéines à détecter sont marquées à l'aide d'une sonde fluorescente, dont la présence se manifeste lorsque celle-ci est éclairée par une lumière de longueur d'onde caractéristique. Toutefois, cette technique engendre, le plus souvent, un bruit de fond non négligeable, du fait que les sondes peuvent s'associer à d'autres molécules que les prions à détecter.
Une technique plus élaborée, dite technique de corrélation de fluorescence, met en #uvre deux sondes fluorescentes qui émettent selon deux longueurs d'onde différentes et qui s'accrochent toutes deux symétriquement et spécifiquement sur les protéines PrPc, ces dernières se trouvant en concentration importante au sein des prions. On éclaire ensuite avec des faisceaux à deux longueurs d'onde différentes, un volume très petit du liquide contenant les prions à détecter et on détecte, de manière instationnaire, les deux émissions fluorescentes intenses dues à la présence de prions, qui constituent un agglomérat de protéines PrP normales ou infectieuses sur lesquelles sont accrochées les sondes fluorescentes. Toutefois, un bruit de fond subsiste, dû notamment à la présence de sondes fluorescentes n'ayant pu trouver de sites
d'adsorption spécifiques et à la présence de protéines normales PrPc isolées, auxquelles se sont accrochées des sondes fluorescentes.
Ainsi, les techniques exposées, que ce soient celles inhérentes à la concentration avant détection de macromolécules telles que l'ADN ou d'agglomérats de molécules tels que les prions présentent toutes l'inconvénient maj,eur de ne pas permettre une concentration spécifique des macromolécules ou agglomérats à détecter, du fait que ces techniques peuvent générer des espèces, pouvant entraîner lors de la phase de détection un bruit de fond important.
EXPOSE DE L'INVENTION.
La présente invention a précisément pour objet de proposer un procédé de concentration de macrolécules ou d'agglomérats de molécules ou particules, qui permette notamment une concentration sélective desdites macromolécules ou desdits agglomérats, en vue d'une éventuelle détection en limitant autant que possible les bruits de fond, ou en vue d'une éventuelle purification d'un échantillon contenant lesdites macromolécules ou lesdits agglomérats.
Pour ce faire, la présente invention a pour objet un procédé de concentration sélective d'une macromolécule ou d'un agglomérat de molécules ou
particules présent dans un échantillon liquide, dite première phase liquide, comprenant une étape d'adsorption spécifique de ladite macromolécule ou dudit agglomérat dans une couche interfaciale séparant l'échantillon d'une seconde phase liquide ou gazeuse, ladite couche interfaciale étant apte à fixer sélectivement ladite macromolécule ou ledit agglomérat.
Par couche interfaciale, on entend, selon l'invention, une zone quasi-bidimensionnelle assurant la séparation entre les deux phases précitées. Cette couche est localisée à la surface de l'échantillon liquide comprenant la macromolécule ou l'agglomérat à concentrer. De part ces propriétés spécifiques, cette couche est apte fixer sélectivement ladite macromolécule ou ledit agglomérat et, du fait de son épaisseur infime, à concentrer ladite macromolécule ou ledit agglomérat.
De préférence, l'adsorption sélective est réalisée par la succession d'étapes suivantes : - formation d'une dispersion stabilisée, à partir d'un milieu biphasique, ledit milieu comprenant ladite première phase liquide et ladite seconde phase liquide ou gazeuse, ces phase étant séparées par la couche interfaciale destinée à concentrer ladite macromolécule ou ledit agglomérat ; et - résorption de la dispersion formée lors de l'étape précédente de façon à reformer ladite couche interfaciale.
Sur la figure 3, on peut voir l'orientation du pinceau lumineux 34 par rapport au réflecteur élémentaire 18 qui lui est associé. Le pinceau lumineux 34 émis par la face de sortie 32 est dirigé directement en direction du réflecteur élémentaire 18 qui lui est associé, sans utiliser un quelconque moyen optique intermédiaire, c'est-à-dire que l'axe A général du pinceau 34 est orienté vers la surface concave de réflexion 36 du réflecteur élémentaire 18.
La partie du flux lumineux transportée par chaque fibre optique 14 est émise selon un pinceau lumineux 34 de forme globalement conique, ce qui signifie que tous les rayons lumineux ont une direction comprise dans ce cône, contrairement au système optique 10 décrit dans le document FR-A-2.782. 778, pour lequel les rayons sont émis suivant toutes les directions. Ceci, combiné au fait que le pinceau lumineux 34 est orienté vers le réflecteur élémentaire 18 qui lui est associé, induit que la grande majorité des rayons lumineux est réfléchie par le réflecteur élémentaire, sans que la profondeur du réflecteur élémentaire 18 soit importante. La surface réfléchissante 16 ainsi obtenu a alors un faible encombrement longitudinal.
Selon une caractéristique de l'invention, l'axe A du pinceau lumineux 34 est incliné par rapport à l'horizontale selon un angle aigu a qui est supérieur à la moitié de l'angle au sommet p du pinceau lumineux 34.
Afin d'obtenir un système optique 10 qui offre un aspect avantageux pour lequel les sources de lumière secondaires, c'est- à-dire les fibres optiques 14, ne sont pas apparentes depuis l'extérieur, les tronçons d'extrémité de sortie 22 sont situés en dessous d'un plan P horizontal qui est situé au niveau de la partie inférieure de la surface réfléchissante 16.
La géométrie de la surface de réflexion 36 de chaque réflecteur élémentaire 18 ainsi que la géométrie de la face de sortie 32 de la fibre optique 14 qui lui est associée définissent une partie du faisceau lumineux résultant.
Ainsi, pour définir la portée du système optique, chaque surface de réflexion 36 a une génératrice verticale 38 dont la distance focale est élevée et son foyer est de préférence situé au niveau de la face de sortie 32 qui lui est associée, comme on peut le voir à la figure 3.
Selon une caractéristique de l'invention, la position du foyer de la génératrice verticale 38, dépend du faisceau qui doit être obtenu. Ainsi, par exemple, pour avoir une faisceau du type "croisement", le foyer est situé au niveau de la partie inférieure de la face de sortie 32, et pour avoir un faisceau du type"route", le foyer est situé au niveau du centre de la face de sortie 32.
La répartition latérale du faisceau lumineux est définie par la génératrice horizontale 40 de chaque surface de réflexion 36 comme cela est représenté à la figure 4. Cette génératrice horizontale 40 est conçue de façon convergente, ceci permet de réduire les dimensions latérales du faisceau lumineux. On peut alors avoir une glace de protection 42, appartenant au phare ou au feu, de faible ouverture, ce qui est en général impossible lorsque l'on a recours à des sources de lumière disposées à proximité des réflecteurs, notamment à cause de problèmes thermiques, or, en sortie de fibre optique 14, la lumière est dite "froide", c'est-à-dire que les fibres optiques 14 ne transportent pas la chaleur provenant de la source de lumière 12.
Le fait d'avoir une surface de réflexion 36 dont la génératrice horizontale 40 est convergente, permet de réaliser des réflecteurs élémentaires 18 de formes complexes. Ainsi, selon la variante de l'invention représentée sur la figure 5, la surface de réflexion 36 est divisée en plusieurs surfaces de réflexion, ici une surface de réflexion principale 36a et deux surfaces de réflexion secondaires 36b.
La surface de réflexion principale 36a est conçue en fonction de la portée du système optique 10, notamment en ce qui concerne sa distance focale, et c'est vers elle que l'axe A du pinceau lumineux 34 est dirigé. Les surfaces de réflexion secondaires 36b forment un faisceau lumineux plus large et plus épais. Elles ont ainsi une distance focale inférieure à la distance focale de la surface de réflexion principale 36a.
Les surfaces de réflexion secondaires 36b sont disposées transversalement de part et d'autre de la surface de réflexion principale 36a et symétriquement par rapport à un plan vertical passant par l'axe général du pinceau lumineux 34. Elles sont disposées longitudinalement entre la surface de réflexion principale 36a et la face de sortie 32 de la fibre optique 14 qui leur est associée. Les surfaces de réflexion secondaires 36b sont disposées de manière à"récupérer"une partie secondaire 34b du pinceau lumineux 34, cette partie secondaire 34b étant complémentaire de la partie principale 34a du pinceau lumineux qui est récupérée par la surface de réflexion principale 36a. Cette disposition permet d'utiliser la totalité du pinceau lumineux 34 avec une largeur transversale réduite de la surface de réflexion 36.
Pour ne pas pénaliser l'aspect du système optique les réflecteurs unitaires 18 situés aux extrémités latérales de la surface réfléchissante 16 peuvent ne comporter qu'une seule surface de réflexion secondaire 36b. Cette surface de réflexion secondaire 36b est alors disposée latéralement vers l'extérieur de la surface réfléchissante 16.
Selon une variante de l'invention (non représentée), le pinceau lumineux 34 émis par la face de sortie 32 est dirigé vers l'avant en direction d'un élément de déviation, par exemple un miroir ou prisme, de sorte que son axe A soit dirigé indirectement vers le réflecteur élémentaire associé.
Afin d'améliorer le style particulier du système optique sans source de lumière apparente, le plan P peut consister en un miroir sans tain qui laisse passer le flux lumineux venant des fibres optiques 14 et qui réfléchit les rayons lumineux dirigés vers les fibres optiques.
Les orientations horizontales et verticales sont données à titre d'exemple non limitatif et l'orientation d'un tel système optique 10 peut être différente sans pour autant sortir de l'invention.