INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le procédé de la présente invention peut comprendre en outre une étape de ligation d'un oligonucléotide adaptateur, appelé aussi, dans la présente, adaptateur. Il peut être utile notamment lorsque le reste de séquence du site de restriction de l'enzyme de restriction utilisée est trop court pour permettre une hybridation stable avec sa séquence complémentaire sur la biopuce. Il peut aussi être utile pour l'étape d'amplification des fragments par la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) car il permet de fabriquer une amorce de taille suffisante et complémentaire à cet adaptateur et au reste de la séquence du site de restriction pour l'action de la polymérase dans le procédé de l'invention. Il peut enfin être utile pour réduire le nombre de fragments hybridables sur la puce comme exposé ci-dessous.
Cet adaptateur peut être préparé par les techniques classiques de synthèse d'oligonucléotides double brins, par exemple par synthèse des deux brins d'ADN complémentaires aux extrémités cohésives d'un fragment obtenu par une enzyme de restriction déterminée, et par hybridation des brins synthétisés dans les conditions d'hybridation adéquates. Les adaptateurs sont préparés par exemple en ajoutant des quantités équimolaires de chaque brin, en chauffant à 65 C, et en laissant refroidir lentement durant environ heure jusqu'à 20 C.
L'essentiel est que cet adaptateur soit de séquence connue afin de pouvoir disposer sur les sondes de la puce sa séquence complémentaire. De préférence, il se fixe de manière spécifique sur les extrémités des
fragments d'ADN issus de l'étape de digestion par l'enzyme de restriction.
Aussi, selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, l'enzyme de restriction est une enzyme de restriction libérant des extrémités cohésives, et l'adaptateur est un oligonucléotide complémentaire audites extrémités cohésives. Ainsi, l'adaptateur se fixe spécifiquement sur les extrémités cohésives.. Ce mode de réalisation permet de sélectionner avec la puce de la présente invention les fragments comportant ces coupures cohésives issues de l'action de l'enzyme de restriction déterminée et l'adaptateur, et donc de réduire le nombre de fragments hybridables sur la puce.
Un second groupe de peptides linéaires selon l'invention sont dérivés de Protégrines et Tachyplésines.
Les Protégrines et Tachyplésines sont des peptides antibiotiques naturels dont la structure est de type épingle à cheveux maintenue par des ponts disulfures. Ces ponts jouent un rôle important dans l'activité cytolytique observée sur cellules humaines.
On désigne sous le nom de protégrines un ensemble de cinq peptides désignés PG-1, PG-2, PG-3, PG-4 et PG-5 dont les séquences sont données ci-dessous, étroitement apparentés et isolés de leucocytes de porc (V. N. Kokryakov & col. FEBS lett. 327,231-236) : SEQ ID NO : 5 : PG-1 : RGGRLCYCRRRFCVCVGR-NH2 SEQ ID NO : 6 : PG-2 : RGGRLCYCRRRFCICV..-NH2 SEQ ID NO : 7 : PG-3 : RGGGLCYCRRRFCVCVGR-NH2 SEQ ID NO : 8 : PG-4 : RGGRLCYCRGWICFCVGR-NH2 SEQ ID NO : 9 : PG-5 : RGGRLCYCRPRFCVCVGR-NH2 Les tachyplésines (Tamura, H. et al., 1993, Chem. Pharm. Bul. Tokyo 41,978-980), désignées Tl, T2 et T3 et les polyphémusines (Muta, T., 1994, CIBA Found. Sym.
186,160-174), désignées Pi et P2, dont les séquences sont données ci-dessous, sont des peptides homologues isolés de l'hémolymphe de deux crabes, Tachyplesus tridentatus pour les tachyplésines Tl, T2 et T3 et Limmulus polyphemus pour les polyphémusines PI et P2 : SEQ ID NO : 10 : PI : RRWCFRVCYRGFCYRKCR-NH2 SEQ ID NO : 11 : P2 : RRWCFRVCYKGFCYRKCR-NH2 Protégrines, tachyplésines et polyphémusines contiennent une forte proportion de résidus basiques (lysines et arginines) et possèdent quatre cystéines qui forment deux ponts disulfures paralléles. Ces trois
familles de peptides présentent également des homologies avec certaines défensines et en particulier avec la défensine humaine NP-1 (Kokryakov, V. N. et al., 1993, Febs Let. 327,231-236).
L'invention a donc pour objet un composé constitué d'au moins un dérivé de Taxoïde lié à au moins un peptide linéaire choisi dans le groupe comprenant : - un peptide linéaire dérivé de protégrines ou de tachyplésines, - un peptide linéaire comprenant un domaine de transduction.
L'invention envisage tout particulièrement comme peptides linéaires comprenant un peptide transduction choisi, de manière non-limitative, parmi : les domaines de transduction dérivés de la protéine Tat de HIV1 les domaines de transduction dérivés de la troisième hélice d'Antennapedia - les domaines de transduction d'une séquence signal L'invention envisage tout particulièrement comme peptides linéaires dérivés de Protégrines, un peptide qui répond à la formule (I) suivante : BX (X ou B) BXXXXBBBXXXXXXB (I) et par peptide linéaire dérivé de Tachyplésines, un peptide qui répond à la formule (II) suivante : BXXXBXXXBXXXXBBXB (II), dans lesquelles : - les groupes B, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé dont la chaîne latérale porte un groupement basique, et - les groupes x, identiques ou différents, représentent un résidu d'acide aminé aliphatique ou aromatique
ou lesdits peptides de formules (I) ou (II), sous forme rétro, constitués d'acides aminés de configuration D et/ou L, ou un fragment de ceux-ci constitué d'une séquence d'au moins 5 et de préférence d'au moins 7 acides aminés successifs des peptides de formules (I) ou (II).
On peut citer comme exemple, les significations de B et X suivantes : B est choisi parmi l'arginine, la lysine, l'acide diaminoacétique, l'acide diaminobutyrique, l'acide diaminopropionique, l'ornithine.
X est choisi parmi glycine, l'alanine, la valine, la norleucine, l'isoleucine, la leucine, la Acm cystéine, la cystéine, la penicillamine, la méthionine, le serine, la thréonine, l'asparagine, la glutamine, la phényalanine, l'histidine, le tryptophane, la tyrosine, la proline, l'Abu, l'acide amino-1-cyclohexane carboxylique, l'Aib, la 2-aminotétraline carboxylique, la 4bromophényalanine, tert-Leucine, la 4-chlorophénylalanine, la bêta-cyclohexyalanine, la 3,4-dichlorophényalanine, la 4-fluorophényalanine, l'homoleucine, la bêta-homoleucine, l'homophényalanine, la 4-méthylphényalanine, la 1naphtyalanine, la 2-naphtyalanine, la 4-nitrophényalanine, la 3-nitrotyrosine, la norvaline, la phénylglycine, la 3pyridyalanine, la [2-thiényl] alanine.
A titre d'exemples, de dérivés de Taxoïde mis en oeuvre dans les composés de l'invention, on peut citer le Taxol, le Taxotère, ou tout autre dérivé du Taxol qui est substitué en une ou plusieurs positions comme les positions C7, C9, C10, C19, R, etc.
La liaison entre le dérivé Taxoïde et le peptide linéaire dans les composés de l'invention est choisie parmi une liaison covalente, une liaison hydrophobe, une liaison ionique, une liaison clivable ou
une liaison non clivable dans les milieux physiologiques ou à l'intérieur des cellules.
Cette liaison peut être directe ou indirecte par l'intermédiaire d'un bras de liaison (linker) et effectuée au moyen d'un groupe fonctionnel naturellement présent ou introduit soit sur le peptide, soit sur le dérivé Taxoïde, soit sur les deux. Ce bras de liaison s'il est présent doit être acceptable compte tenu de la nature chimique et de l'encombrement tant du peptide que du dérivé Taxoïde. On peut citer à titre d'exemple de tels linkers contenant des groupements alkyle, aryle, aralkyle ou peptidique, des esters, aldéhydes ou acides d'alkyle, aryle ou aralkyle, des groupements anhydrides, sulfhydriles, ou carboxyles tels que les dérivés de l'acide maleymil benzoïque, de l'acide maleymil propionique et des dérivés succynimidyle, des groupes dérivés du bromure ou chlorure de cianogène, carbonyldiimidazole, des esters de succinimide ou des halogenures sulphoniques.
Comme groupes fonctionnels, on peut citer : -OH,-SH,-COOH, ou-NH2. Ainsi, le ou les dérivés Taxoïdes peuvent être liés par des liaisons covalentes au niveau des extrémités N-terminale ou C-terminale ou bien au niveau des chaînes latérales du peptide.
Un type de liaison préféré entre le ou les dérivés Taxoïdes et le ou les peptides linéaires implique au moins un pont disulfure. En effet, ce type de liaison se caractérise par sa stabilité dans le plasma après injection du composé, puis une fois que les composés de l'invention ont traversé la barrière hémato-encéphalique, ledit pont disulfure est réduit en libérant le dérivé Taxoïde. La liaison peut être effectuée en n'importe quel site du peptide comme indiqué précédemment.
En outre, le réflecteur qui renvoie les flux lumineux parallèles des lentilles respectives vers l'avant de la lampe est divisé en réflecteurs auxiliaires pour chaque région du réflecteur sur laquelle tombe les flux lumineux parallèles des lentilles respectives, et les réflecteurs auxiliaires respectifs ont une configuration étagée de l'extrémité avant de la lampe vers l'extrémité arrière de la lampe. Avec ces dispositions, on peut obtenir les effets suivants.
Comme le réflecteur est constitué de plusieurs réflecteurs auxiliaires ayant une configuration étagée, même lorsque la glace translucide enveloppe l'arrière de la lampe en direction perpendiculaire à la direction longitudinale de la lampe, il est possible de former le réflecteur afin qu' il s'enroule le long de la glace transparente alors que la lumière réfléchie par les réflecteurs auxiliaires respectifs est émise vers l'avant de la lampe.
En conséquence, dans la lampe de véhicule selon l'invention ayant une structure telle que la lumière est émise par éclairage indirect à partir de plusieurs sources lumineuses à diode photoémissive, il est possible d'obtenir une structure mince de lampe et une quantité suffisante de lumière émise vers l'avant de la lampe, même lorsque celleci est destinée à être montée sur une partie enveloppante de carrosserie de véhicule.
Dans la structure précitée, la longueur, en direction parallèle au flux lumineux de chaque réflecteur auxiliaire, peut être pratiquement constante, ou les longueurs peuvent avoir des valeurs différentes correspondant à la forme de la lampe ou analogue. Lors de l'utilisation de cette dernière structure, lorsque les réflecteurs auxiliaires sont formés afin que l'angle d'inclinaison par rapport à l'avant de la lampe, c'est-à-dire par rapport à la direction verticale de la lampe, augmente lorsque la longueur des réflecteurs auxiliaires dans la direction des flux lumineux parallèles diminue, il est possible de faire tomber tous les flux lumineux parallèles des lentilles respectives sur la surface réfléchissante de chacun des réflecteurs auxiliaires sans perte.
La surface réfléchissante de chacun des réflecteurs auxiliaires peut être constituée d'une surface à une seule courbure, ou la surface peut être constituée de plusieurs éléments réfléchissants. Dans ce cas, lorsque la surface réfléchissante de chacun des réflecteurs auxiliaires est divisée en plusieurs segments, et un élément réfléchissant et une partie de gradin sont formés dans chacun des segments afin que la surface réfléchissante ait une configuration
étagée, il est possible d'émettre efficacement la lumière vers l'avant de la lampe.
En outre, lorsque chaque élément réfléchissant est constitué par une surface courbe qui réfléchit le flux de lumière parallèle de la lentille sous forme diffusée en directions verticale et latérale, il est possible d'obtenir les performances nécessaires de distribution de lumière de la lampe même lorsque la glace translucide a une configuration "continue" (ce terme "continu" indique qu'une glace translucide n'a pas d'élément de lentille diffusant la lumière qui la traverse).
Dans une variante, chacun des éléments réfléchissants peut être constitué par un plan qui renvoie le flux lumineux parallèle de la lentille vers l'avant de la lampe en maintenant le flux lumineux parallèle et, dans ce cas, les éléments de lentille de diffusion sont formés dans la glace translucide ou analogue afin que la lumière soit diffusée à la fois en directions verticale et latérale. Dans une autre configuration, les éléments réfléchissants peuvent être constitués chacun d'une surface courbe n'ayant une courbure que dans une direction afin que les flux lumineux parallèles de la lentille soient réfléchis vers l'avant de la lampe uniquement dans une direction de manière diffusée et, dans ce cas, les éléments de lentille de diffusion sont formés dans la glace transparente ou analogue afin que la lumière soit diffusée en direction perpendiculaire à la direction précitée.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention seront mieux compris à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de réalisation, faite en référence aux dessins annexés sur lesquels : la figure 1 est une vue en élévation frontale d'une lampe de véhicule dans un mode de réalisation préféré de l'invention ; la figure 2 est une coupe suivant la ligne II-II de la figure 1 ; la figure 3 est une coupe suivant la ligne III-III de la figure 1 ;
la figure 4 est une vue en perspective avec des parties arrachées d'une unité à diode photoémissive placée à l'extrémité droite parmi les cinq unités à diode photo- émissive formant l'unité de lampe de la figure 1 ; la figure 5 est une vue détaillée de la partie V de la figure 4 ; la figure 6 est une vue en perspective avec des parties arrachées de l'unité de lampe de la figure 1 ; la figure 7 est analogue à la figure 2 mais représente une lampe connue.
La figure 1 est une vue en élévation frontale d'une lampe de véhicule dans un mode de réalisation, et les figures 2 et 3 sont respectivement des coupes suivant les lignes II-II et III-III de la figure 1.
Comme l' indiquent ces figures, une lampe 10 de véhicule de ce mode de réalisation est un feu de stop et de position arrière destiné à être monté dans la région du coin gauche de l'extrémité arrière d'un véhicule. La lampe 10 est telle qu'une unité 16 de lampe est logée dans une chambre de lampe constituée par un corps 12 de lampe et une glace translucide continue 14.
Comme indiqué par le trait mixte à deux points sur la figure 2, une carrosserie 2 de véhicule est destinée à avoir une forme enveloppante vers l'avant du véhicule dans la région du coin gauche à l'arrière du véhicule, et une glace translucide 14 est aussi formée avec une configuration enveloppante le long du contour de la surface de la carrosserie 2.
Une unité de lampe 16 comprend plusieurs unités 22 à source lumineuse (cinq dans cet exemple), et un réflecteur 18 qui renvoie la lumière des unités respectives 22 à source lumineuse vers l'avant de la lampe (c'est-à-dire l'arrière du véhicule, la même terminologie s'appliquant dans la description qui suit). Le réflecteur 18 est séparé en réflecteurs auxiliaires 24A, 24B, 24C, 24D et 24E, destinés à chacune des unités à source lumineuse 22, et les unités à source lumineuse 22 et les réflecteurs auxiliaires
respectifs 24A à 24E constituent cinq unités à diode photoémissive 20A, 20B, 20C, 20D et 20E.
Les unités à diode photoémissive 20A à 20E sont assemblées à une configuration rectangulaire en élévation et sont destinées à être fixées intimement en direction latérale. Ces unités 20A à 20E ont une configuration étagée vers l'arrière de la partie d'extrémité avant de l'unité 16 vers la partie d'extrémité gauche à l'arrière de la lampe, si bien que l'unité de lampe 16 a une forme enveloppante le long de la glace translucide 14.
Les souris knock-out par exemple sont obtenues par intégration homologue d'une construction dans une cellule souche embryonnaire de souris (cellule ES), construction qui code le gène à inactiver. La séquence de la construction est modifiée et idéalement permet l'intégration conjointe d'un marqueur de sélection positif (un gène de résistance à la néomycine par exemple) au locus du gène à inactiver. Ces changements peuvent alors être introduits dans la lignée germinale de la souris pour générer des individus chimères. (pour détails voir, Doetschman et al., 1985)
L'invention a en outre pour objet une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique selon l'invention ou d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
L'invention est également relative à une composition pharmaceutique comprenant une quantité efficace d'un polypeptide à boîte F, un fragment ou un variant de ce polypeptide, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Utilisation dia-gnostîque des Fbox Les régulateurs du cycle cellulaire sont souvent les produits des oncogènes ou des suppresseurs de tumeur. Les protéines Fbox, en tant que composant des complexes ubiquitine ligases SCF, pourraient en conséquence être les produits des oncogènes ou de gènes suppresseur de tumeurs, en fonction des protéines régulatrices du cycle cellulaire dont elles régulent l'abondance. Les protéines Fbox, ses analogues, dérivés et par voie de conséquence les séquences nucléiques des protéines Fbox, ou les anticorps anti-protéines Fbox peuvent donc avoir leur utilité dans le diagnostique. Les séquences nucléiques des nouvelles protéines Fbox peuvent être utilisées pour détecter, pronostiquer ou diagnostiquer des désordres tels que la tumorigenèse, les carcinomes, les adénomes, etc, par la recherche d'éventuelles mutations par exemple (délétions, changements dans la séquence,...). L'activité des ces ubiquitine ligases peut également être testée dans différentes pathologies afin de détecter un éventuel changement dans leur niveau d'expression et leur possible implication dans la pathologie considérée.
Les molécules de l'invention peuvent ainsi être utilisées dans des tests immunologiques utilisant des techniques tels que les immunoblots, l'immunohistochimie par radioisotope, les test ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), l'immunoprécipitation, les test d'immunodiffusion, les tests d'agglutination pour en nommer certains.
Les gènes des Fbox, leur séquence nucléique directe ou complémentaire peuvent aussi être utilisés dans des tests d'hybridation dans le but de détecter, de diagnostiquer des désordres ou maladies associés avec des changements dans l'expression ou l'activité des protéines Fbox. Ces tests d'hybridation sont effectués en mettent en présence un échantillon contenant des acides nucléiques (comme une coupe de tissu) avec une sonde nucléique capable de
s'hybrider à de l'ARN ou de l'ADN de protéine Fbox dans des conditions favorables à l'hybridation.
Des maladies ou des désordres induisant la surprolifération cellulaire peuvent être diagnostiqués ou détectés (ou leur prédisposition) en recherchant des baisses d'expressions d'une protéine Fbox ou de son ARN, ou de son activité (par exemple, l'activité ubiquitine ligase, la liaison au domaine Fbox, etc.), ou en détectant des mutations dans l'ARN, l'ADN ou la séquence protéique d'une Fbox (par exemple, délétions, translocations) qui causent une diminution de l'expression ou de l'activité. Le niveau de protéine Fbox peut être détecté par immunochimie, le niveau d'ARN par hybridation (northern blot, hybridation in situ). L'activité de la Fbox, peut être détectée en mesurant l'activité ubiquitine ligase E3. L'activité de liaison peut être testée en mesurant la liaison à la protéine Skp1. Les translocations, délétions et mutations ponctuelles dans les séquence nucléiques des Fbox peuvent être détectées par Southern blot, FISH, analyse RFLP, SSCP, PCR, séquençage, etc.
REFERENCES AUSUBEL et T al., 1989. Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y.
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Brown EL, Belagaje R, Ryan MJ, Khorana HG, Methods Enzyme/1979 ; 68 : 109- 151 Flotte et al., 1992, Am. J. Respir. Ce//Moi. Biot., 7 : 349-356.
Fuller S. A. et al., 1996, lmmunology in Current Protocois in Molecular Biology, Ausubel et al.
GAIT (ed.), (1984). Nucleic Acid Hybridization.
GLOVER (ed.), 1985. DNA Cloning : A Practical Approach, Volumes 1 and Il Oligonucleotid Synthesis, MRL Press, Ltd., Oxford, U. K.
HAMES and HIGGINS, 1985. Nucleic Acid Hybridization : a practical approach, Hames & Higgins Ed. IRL Press, Oxford.
Les conditions d'hybridation ci-dessus décrites sont mises en oeuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique de 20 bases de longueur et peuvent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée ou du type de marquage choisi, selon les techniques connues de l'homme du métier.
En particulier, il faut prendre en compte que le niveau et la spécificité d'hybridation dépendent de différents paramètres, tels que : a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; b) la composition en base de la sonde ou de l'amorce, les paires de bases G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologue entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ; f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; g) la présence d'agents dénaturants, tels que des agents favorisant la rupture de liaisons hydrogène, comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'incubation augmentant avec la durée de l'incubation ; i) la présence d'agents d'exclusion de volume, tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils
accroissent les concentrations effectives de la sonde ou de l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 illustre l'alignement des séquences d'acides aminés correspondant au domaine HECT des différentes protéines selon l'invention.
La figure 2 est une représentation schématique des protéines à domaine HECT. Les domaines putatifs d'interaction protéine-protéine sont représentés. La double barre oblique indique que les ADNs complémentaires correspondant sont incomplets en 5'et/ou en 3'. Dans la légende, HECT signifie Homologous to E6-AP Carboxyl-Terminus, WW signifie domaine avec deux résidus Trp conservés, C2 signifie motif de liaison de Ca2+ ou de certains types de lipides, RCC1 signifie Regulator of Chromosome Condensation, IQ signifie petit motif de liaison de la calmoduline avec des résidus lle et Gin et RING signifie un motif de type doigt de zinc.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION Il est fourni selon l'invention de nouveaux polypeptides à domaine HECT impliqués dans l'ubiquitination des protéines cellulaires, étape importante dans la voie de dégradation des protéines.
La caractérisation de ces nouveaux polypeptides à domaine HECT selon l'invention rend possible la mise au point de nouveaux outils diagnostiques pour la détection d'altérations dans l'activité biologique des ubiquitine ligase à domaine HECT et de nouveaux outils thérapeutiques destinés à prévenir ou corriger ces altérations dans l'activité biologique des ubiquitine ligases à domaine HECT.
Les nouveaux polypeptides à domaine HECT selon l'invention sont les polypeptides suivants : - le polypeptide HECT9 de séquence en acides aminés SEQ ID N01 ; - le polypeptide HECT17de séquence en acides aminés SEQ ID D ? 2 ; - le polypeptide HECT18 de séquence en acides aminés SEQ ID ? 3 ; - le polypeptide HECT19 de séquence en acides aminés SEQ ID ? 4 ;
- le polypeptide HECT20 de séquence en acides aminés SEQ ID ? 5 ; - le polypeptide HECT21 de séquence en acides aminés SEQ ID ? 6 ; - le polypeptide HECT22de séquence en acides aminés SEQ ID ? 7 ; - le polypeptide HECT23 de séquence en acides aminés SEQ ID ? 8 ; - le polypeptide HECT24 de séquence en acides aminés SEQ ID N 9 ; - le polypeptide HECT25 de séquence en acides aminés SEQ ID N010 ; - le polypeptide HECT26 de séquence en acides aminés SEQ ID N011 ; Le polypeptide HECT9 possède une homologie de séquence avec la protéine Pub1 de S. pombe.