INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Selon un premier aspect de ce septième mode de réalisation, pour un acide nucléique donné, l'ensemble de moyens comprend plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant avec la même séquence cible, le nombre de sondes nucléotidiques de séquences identiques pouvant varier de 2 à 10 sondes. Selon cet aspect particulier, l'ensemble de moyens de l'invention permet une mesure quantitative de l'acide nucléique cible contenu dans l'échantillon testé.
Selon un second aspect de ce septième mode de réalisation, pour un acide nucléique donné, l'ensemble de moyens comprend plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant avec des séquences cibles distinctes incluses dans ledit acide nucléique, le nombre de sondes pouvant varier de 2 à 10 sondes. Selon cet aspect particulier, l'ensemble de moyens permet une grande sensibilité de détection, du fait de sa capacité à détecter ledit acide nucléique cible dans l'échantillon testé, même dans le cas où ledit acide nucléique cible a subi des altérations physiques dans l'échantillon, comme par exemple des coupures par des exo- ou des endo- nucléases présentes dans le matériel source de départ, par exemple dans un extrait cellulaire, ou présentes dans l'échantillon à tester.
De même, selon un mode de réalisation avantageux, l'ensemble de moyens de détection selon l'invention comprend, pour un acide nucl éique cible déterminé, plusieurs sondes nucléotidiques s'hybridant spécifiquement avec ce dernier, comme cela est décrit pour les sondes s'hybridant avec les acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou une séquence complémentaire des séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention.
Les acides nucléiques comprenant les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention possèdent des caractéristiques structurales communes, qui sont représentatives d'acides nucléiques dérivés de gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation.
Avantageusement, l'ensemble de moyens de détection de l'invention comprend au moins 10,20, 30,40, 50,50, 100,200, 250,300, 350,400, 450,500, 550,600, 650,700, 750,800, 850,900, 950 ou 1000 sondes nucléotidiques telles que définies ci-dessus.
De manière générale, le nombre total de sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention dépend en premier lieu du nombre d'acides nucléiques cibles distincts, correspondant chacun en un produit de transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, que l'on cherche à détecter dans l'échantillon. Ainsi, le nombre minimum total de sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention est défini par la formule suivante : Nsmin=y, dans laquelle : - Nsmin est le nombre minimal de sondes ; et - y représente le nombre d'acides nucléiques cibles distincts que l'on cherche à détecter.
De plus, le nombre total de sondes nucléotidiques contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention dépend également du nombre de sondes nucléotidiques identiques s'hybridant avec la même séquence cible incluse dans un acide nucléique déterminé que l'on cherche à détecter et dépend aussi du nombre de sondes s'hybridant avec des
séquences cibles distinctes i ncluses dans ledit acide nucléique cible. Ainsi, le nombre de sondes contenues dans l'ensemble de moyens de détection de l'invention peut aussi être exprimé selon la formule suivante : NtotaF [[(aa1.A1ai) + (aa2.A1a2) +...+ (any.A1ay)] + [(ab1.A2a2) + (ab2.A2a2) +...+ (abny.A2ay)] +... + [(ax1.AXaX) + (ax2.A1a2) +...+ (axny.AXay)]], dans laquelle : - Ntotal est le nombre total de sondes ; et - A1, A2,..., AX représentent les acides nucléiques correspondant aux produits de transcription (ARNm ou ADNc) des gènes A1, A2, ... ,AX inductibles par un médiateur de l'inflammation ; - X est un entier dont la valeur maximale est égale au nombre total de séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention ; - A1a1, A1a2, , A1an représentent respectivement les séquences cibles distinctes a1, a2,..., an, contenues dans l'acide nucléique cible A1, pour lesquelles au moins une sonde s'hybride spécifiquement , - n est un entier compris entre 0 et 100, et est préférentiellement égal à 0,1, 3,4, 5,6, 7,8, 9,10, 11,12, 13,14 , 15,16, 17,18, 19 ou 20; - an1, an2, ..., any représentent le nombre de sondes identiques s'hybridant à la même séquence cible A1a1, A1a2, ,A1ay, contenue dans l'acide nucléique cible A1 et représentent, indépendamment l'un de l'autre, un entier compris entre 0 et 100, avantageusement entre 0 et 50, et sont de préférence égaux à 0, 1, 2, 3, 4, 5,6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 ; Une condition obligatoire est que l'ensemble des moyens de détection selon l'invention contienne au moins une sonde s'hybridant spécifiquement avec un acide nucléique comprenant une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou avec une acide nucléique comprenant une séquence complémentaire d'une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention..
Plus le nombre de sondes s'hybridant spécifiquement avec des acides nucléiques cibles distincts est grand, plus la précision concernant la situation
physiologique des cellules du mammifère humain ou non humain dont proviennent les acides nucléiques de l'échantillon est précise.
Selon un premier mode de réalisation préférentiel, l'ensemble de moyens de détection de l'invention comprend au moins une sonde s'hybridant avec chacun des acides nucléiques comprenant une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention, ou comprenant une séquence complémentaire d'une séquence choisie parmi les séquences contenues dans la sixième collection de séquences créée à l'étape a6) du procédé de l'invention.
Selon un second mode de réalisation préférentiel, l'ensemble des moyens de détection selon l'invention peut comprendre certaines seulement des sondes nucléotidiques ci-dessus, en fonction de la situation physiologique suspectée du mammifère humain ou non humain à partir duquel provient l'échantillon à tester.
La mise en #uvre pratique de l'ensemble de moyens de détection selon l'invention pourra montrer que seulement certains sous-ensembles de sondes seront nécessaires pour obtenir un résultat exhaustif de la situation physiologique précise du mammifère humain ou non humain dont provient l'échantillon à tester, selon les symptômes que cet individu exprime, ou selon la nature du pré-diagnostic ou du diagnostic clinique déjà établi, par exemple parce que seulement certains des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation sont activés, ou au contraire inhibés ou bloqués, dans une situation physiopathologique déterminée.
Cette méthode PAP propose de ne pas choisir de loi physique et de rechercher l'indice de réfraction complexe du matériau pour chaque longueur d'onde #i, où ie [l...n], avec À1=Àm et /.n=%1,M .
Pour chaque #i, un algorithme de recherche tente de trouver l'épaisseur, l'indice n(#i) et le coefficient d'extinction k(#i) qui minimisent l'erreur entre la mesure Y (#i) et la réponse théorique V(Âi,n(Âi),k(Â.),e) .
Un tel procédé pose un problème parce que les divers points (,i, E, n (,i) , k (Ài) ) ne sont pas forcément physiquement compatibles entre eux : par exemple, l'épaisseur trouvée peut varier en fonction de la longueur d'onde et la loi suivie par l'indice de réfraction complexe, plus simplement appelée loi d'indice, peut présenter des discontinuités.
Ce procédé est généralement valable seulement lorsque l'épaisseur est très bien connue et que les mesures sont de très bonne qualité.
Le procédé objet de l'invention permet de caractériser un matériau sans utiliser un modèle physique, c'est-à-dire sans utiliser une loi physique suivie par l' indice de réfraction complexe du matériau étudié. Il est donc tout particulièrement utile lorsqu'une telle loi n'est pas connue.
Ce procédé constitue une alternative aux procédés de caractérisation connus, mentionnés plus haut. Il peut être appelé "méthode des n#uds" car il utilise des "n#uds" c'est-à-dire des points de coordonnées (Xi n j ) , où n est la valeur prise par l'indice de réfraction complexe à la longueur d'onde #i et i prend un nombre limité de valeurs (entières).
De façon précise, la présente invention a pour objet un procédé de caractérisation optique d'au moins une couche d'un matériau dans un intervalle A de valeurs prises par une fonction a d'une longueur d'onde optique #, lorsque À varie dans un intervalle de longueurs d'ondes, cette couche étant formée sur un substrat, ce procédé étant caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : 1) on effectue un ensemble de mesures de réflectométrie et/ou d'ellipsométrie sur l'intervalle
A, cet ensemble de mesures conduisant à un spectre mesuré, noté #, et l'on choisit les méthodes de calcul associées à la nature des mesures et au type de couche à caractériser, 2) on choisit m valeurs initiales [alpha]1 ...[alpha]m de la fonction a, appartenant à cet intervalle A, m étant un nombre entier au moins égal à 1, et l'on définit un intervalle B comme étant l'ensemble des points a de l'intervalle allant du plus petit au plus grand des nombres [alpha]1...[alpha]m, lorsque m est supérieur à 1, et comme étant l'intervalle A lorsque m vaut 1, 3) on choisit m valeurs initiales complexes d'un indice de réfraction complexe n*=n+jk aux m points [alpha]i, i allant de 1 à m, 4) lorsque m est différent de 1, on choisit une loi d'interpolation qui permet de calculer l'indice de réfraction n([alpha]) du matériau sur l'intervalle B, à partir des points ([alpha]i, ni), avec ni=n (ai) , i allant de 1 à m, et lorsque m vaut 1, n([alpha]) est pris égal au nombre ni (ai) sur tout l' intervalle B, 5) on choisit M paramètres variables, M étant inférieur ou égal à 2m+l, 6) on choisit une fonction d'erreur Er (T, # ) qui caractérise l'écart entre un spectre mesuré T et un spectre expérimental F, 7) à l'aide d'une fonction de minimisation de Er (Y, F) à M paramètres, on effectue la série d'étapes suivante :
a) à l'aide de la loi d'interpolation des ([alpha]i,ni) sur l' intervalle B, on déduit n(a), a appartenant à B, b) à l' aide de n(a) et de l' épaisseur # de la couche, et de méthodes de calcul de spectres, on calcule un spectre théorique 'Y(n(a),s), c) on compare T et Y à l' aide de Er (T, 'F ) et, si Er(#, #) est suffisamment petite, c'est-à-dire inférieure à une valeur prédéfinie e, ou est minimale, on passe à l'étape e), sinon on passe à l'étape d), d) on fait varier les M paramètres variables de façon à tendre vers le minimum de Er(#, #) et l'on retourne à l'étape a), e) si Er (T, 'I ) est inférieure à e, on obtient donc un ensemble de M paramètres variables, pour lequel Er (, (n (a, M) , E)) est minimum et l'indice de réfraction est alors pris égal à celui qui a été obtenu en dernier, et si Er(#, #) est supérieure ou égale à e on passe à l'étape 8), 8) on augmente le nombre m de valeurs initiales de la fonction a et l'on retourne à l'étape 2) .
Il est donc par exemple possible d'effectuer la caractérisation optique : - sur un intervalle de longueurs d'ondes #, en l' occurrence l' intervalle [#min, Àmax] , - ou sur un intervalle de longueurs d'ondes inverses 1/#, en l'occurrence sur un intervalle
[ (1/.}min, (1/7)max], où (1/7}min est égal à 1/(,max) et (1/7)max à 1/(,min), - ou sur un intervalle d'énergies E (avec E = hv = hc/# où h est la constante de Planck, c la vitesse de la lumière dans le vide et v la fréquence correspondant à #), en l'occurrence sur un intervalle [Emin, Emax], où Emin est égal à hc/ (Àmax) et Emax à hc/ (?min) , - ou, plus généralement, sur un intervalle [amin, amax] de valeurs prises par une fonction a de la variable #.
Il convient en outre de noter que l'invention est utilisable pour caractériser un spectre ou une partie de spectre.
Chaque loi d'interpolation peut être choisie parmi les lois d'interpolation linéaires, les lois d'interpolation cubiques, les lois d'interpolation polynômiales et les lois d'interpolation par exemple de type fonction spline .
Selon un mode de mise en #uvre préféré du procédé objet de l'invention, le spectre est échantillonné uniformément en a (#), c'est-à-dire que les valeurs initiales de la fonction a (voir l'étape 2) mentionnée plus haut) sont réparties de manière uniforme dans l' intervalle A, la répartition des n#uds étant ainsi homogène.
Procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens de détection selon l'invention.
L'invention a pour objet un procédé pour la préparation d'un ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide(s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un
médiateur de l'inflammation, caractérisé en ce que ledit procédé comprend les étapes suivantes : a) préparer une collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, selon les étapes de préparation suivantes : a1) (i) Sélectionner, dans une ou plusieurs collections de séquences nucléotidiques d'origine humaine, dont l'ensemble des séquences recouvrent au moins une fois la totalité du génome humain, les séquences comprenant au moins une copie d'une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à 4, puis (ii) créer une première collection de séquences nucléotidiques à partir de chaque séquence précédemment sélectionnée, chaque séquence nucléotidique contenue dans ladite première collection étant constituée, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', de la séquence SEQ ID N 1, 2,3 ou 4, suivie des 285 nucléotides consécutifs localisés, dans chaque séquence sélectionnée en (i), immédiatement du côté 3' du dernier nucléotide en 3' de ladite séquence SEQ ID N 1, 2, 3 ou 4 ; a2) (i) pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans ladite première collection créée à l'étape a1), éliminer la séquence SEQ ID N 1, 2,3 ou 4 localisée à l'extrémité 5' de ladite séquence nucléotidique et (ii) créer une seconde collection de séquences contenant toutes les séquences modifiées en (i), chacune des séquences contenues dans ladite seconde collection constituant une sonde ; a3) (i) Recherche, pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans la seconde collection de séquences créée à l'étape a2), de la présence d'au moins une copie d'une séquence SEQ ID N 1, 2,3 ou 4, puis (ii) élimination, dans ladite seconde collection, des séquences comprenant au moins une copie de l'une des séquences SEQ ID N 1,2, 3 ou 4, grâce à quoi une troisième collection de séquences, ne comprenant pas les séquences ainsi éliminées, est créée ;
a4) (i) Recherche, pour chacune des séquences nucléotidiques contenues dans la troisième collection de séquences créée à l'étape a3), de chaque enchaînement de nucléotides correspondant à une séquence nucléotidique de type Alu ou de type répété susceptible d'être contenu dans ladite séquence nucléotidique, puis (ii) modification des séquences comprenant un tel enchaînement de nucléotides, par masquage desdits enchaînements de nucléotides correspondant à une séquence nucléotidique de type Alu ou de type répété par remplacement de chaque nucléotide A, T, G ou C contenu dans ladite séquence Alu ou répétée par un nucléotide N signifiant indifféremment A, T, G ou C, puis (iii) créer une quatrième collection de séquences contenant l'ensemble des séquences contenues dans la troisième collection, éventuellement modifiées selon (ii) ; a5) (i) Sélectionner, dans une ou plusieurs collections de séquences contenant des séquences nucléotidiques consistant en des produits de transcription du génome humain, les séquences comprenant au moins l'une des séquences nucléotidiques contenues dans la quatrième collection de séquences créée à l'étape a4), puis (ii) créer une cinquième collection de séquences contenant l'ensemble des séquences sélectionnées en (i) ; a6) (i) Sélectionner, dans la cinquième collection de séquences créée à l'étape a5), les séquences comprenant au moins 60 nucléotides consécutifs définissant un enchaînement ayant au moins 97% d'identité en nucléotides avec un enchaînement nucléotidique inclus dans au moins l'une des sondes contenues dans la seconde collection de séquences créée à l'étape a2), puis (ii) créer une sixième collection de séquences nucléotidiques contenant les séquences ainsi sélectionnées, ladite sixième collection de séquences consistant en la collection d'acides nucléiques contenus dans des gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation ;
b) synthétiser une collection de sondes nucléotidiques hybridant spécifiquement avec le produit de transcription d'au moins un gène inductible par un médiateur de l'inflammation, ledit gène comprenant une séquence nucléotidique contenue dans la sixième collection de séquences préparée à l'étape a6), ladite collection de sondes ainsi synthétisées consistant en l'ensemble de moyens pour détecter la présence, dans un échantillon, d'un ou d'une pluralité d'acide (s) nucléique(s), chaque acide nucléique résultant, directement ou indirectement, de la transcription d'un gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
On a désigné six collections de séquences à l'étape a) du procédé cidessus, essentiellement pour des raisons de clarté dans la compréhension du procédé.
Selon un premier mode de réalisation, les six collections de séquences peuvent consister concrètement en six collections distinctes de séquences.
Selon un second mode de réalisation, une seule collection de séquences est créée, dont le contenu en séquences est modifié au fur et à mesure de la réalisation de chacune des étapes a1) à a6) du procédé.
Selon encore un autre mode de réalisation, moins de six collections de séquences sont créées, certaines seulement d'entre elles étant créées spécifiquement au cours de la réalisation de l'une ou de plusieurs des étapes a1) à a6) du procédé, les autres collections désignées dans le procédé résultant chacune à une étape donnée du procédé, d'une simple modification du contenu en séquences d'une collection créée à l'étape précédente.
Selon un aspect particulier du procédé ci-dessus, la collection de moyens de détection qu'il permet de préparer comprend, pour chaque gène inductible par un médiateur de l'inflammation, plusieurs sondes s'hybridant spécifiquement avec ce dernier.
Avantageusement, selon cet aspect particulier, la collection de moyens de détection comprend, en moyenne, au moins deux, de préférence trois, et de manière tout à fait préférée au moins quatre sondes s'hybridant
spécifiquement avec chaque gène inductible par un médiateur de l'inflammation.
Avantageusement, le procédé décrit ci-dessus est caractérisé en ce qu'il comporte en outre l'étape c) suivante : c) immobiliser chacune des sondes nucléotidiques synthétisées à l'étape b) sur un support.
Préférentiellement, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que les sondes nucléotidiques sont immobilisées de manière ordonnée sur ledit support.
Préférentiellement, le procédé ci-dessus est caractérisé en ce que les sondes nucléotidiques sont immobilisées sur ledit support sous la forme d'une matrice ordonnée de sondes.
Ainsi, en utilisant le procédé décrit ci-dessus, l'homme du métier est en mesure, par de simples opérations de routine, de synthétiser les sondes s'hybridant spécifiquement avec les produits d'expression desdits gènes inductibles par un médiateur de l'inflammation, ces sondes constituant un ensemble de moyens de détection selon l'invention, qui est défini plus loin dans la description.
On préfère en particulier les polyéthers polyuréthanes comportant au moins une chaîne grasse en C,o à C20, et les hydroxypropylguars modifiés par des groupements comportant au moins une chaîne grasse en C8 à C22.
(i) Les esters d'acides carboxyliques insaturés et d'alcools gras sont choisis par exemple parmi les éthacrylates, méthacrylates et/ou acrylates d'alkyles en C10-C30, de préférence en C12-C22. Ils englobent par exemple l'acrylate de lauryle, l' acrylate de stéaryle, l' acrylate de décyle, l'acrylate d'isodécyle, l'acrylate de dodécyle, et les méthacrylates correspondants, à savoir le méthacrylate de lauryle, le méthacrylate de
stéaryle, le méthacrylate de décyle, le méthacrylate d'isodécyle, et le méthacrylate de dodécyle.
(ii) Les éthers allyliques d'alcools gras formant les motifs hydrophobes des polymères amphiphiles anioniques de la présente invention correspondent à la formule (1) suivante : CH2 = C R' CH2 O Bn R (1) dans laquelle R' désigne H ou CH3, B désigne le radical éthylèneoxy, n est nul ou désigne un entier allant de 1 à 100, R désigne un radical hydrocarboné choisi parmi les radicaux alkyle, arylalkyle, aryle, alkylaryle, cycloalkyle, comportant de 8 à 30 atomes de carbone, de préférence 10 à 24, et plus particulièrement encore de 12 à 18 atomes de carbone. Un motif de formule (1) plus particulièrement préféré est un motif dans lequel R' désigne H, n est égal à 10, et R désigne un radical stéaryle (C18).
Ledit monomère réticulant est un composé comportant au moins deux doubles liaisons polymérisables non conjuguées l'une avec l'autre. On peut citer à tire d'exemple le phtalate de diallyle, le (méth)acrylate d'allyle, le divinylbenzène, le diméthacrylate de (poly)éthylèneglycol, le méthylène-bis-acrylamide, le polyallylsucrose ou le polyallylpentaérythritol.
Des polymères amphiphiles anioniques du type décrit ci-dessus sont décrits et préparés, par exemple dans les brevets US-3 915 921 et US-4 509 949 (copolymères d'acide (méth) acrylique et de (méth)acrylates d'alkyles en C20-C30, ou dans le brevet EP-0216479 B2 (copolymères d'acide (méth) acrylique et d'éthers allyliques d'alcools gras).
On peut citer à titre d'exemples de polymères préférés :
-les polymères réticulés d'acide acrylique et de méthacrylate d'alkyle en C10-C30, tels que le CARBOPOL ETD-2020 commercialisé par la société GOODRICH; - les polymères réticulés d'acide acrylique et d'acrylate d'alkyle en C10C30, tels que les polymères commercialisés sous les dénominations CARBOPOL 1382, PEMULEN TRI, PEMULEN TR2 par la société GOODRICH; -le terpolymère acide méthacrylique/acrylate d'éthyle/méthacrylate de stéaryle oxyéthyléné (55/35/10); - le terpolymère acide (méth)acrylique/acrylate d'éthyle/méthacrylate de béhényle oxyéthyléné 25 OE, et - le terpolymère réticulé acide méthacrylique/acrylate d'éthyle/stéareth- 10 allyl éther.
-(II) les polymères amphiphiles comportant comme motifs hydrophiles au moins un monomère à insaturation éthylènique à groupement sulfonique, sous forme libre ou partiellement ou totalement neutralisée et au moins une partie hydrophobe sont par exemple décrits dans les demandes de brevets français de la demanderesse N -0016954 et 0100328 dont le contenu fait partie intégrante de la présente invention.
On peut notamment citer plus particulièrement parmi eux : le copolymère acide acrylamido-2-méthyl-2-propane- sulfonique (AMPS)/n-dodécylacrylamide neutralisé par la soude, le copolymère réticulé par du méthylène-bis-acrylamide constitué de 75% en poids de motifs AMPS neutralisés par NH3 et de 25% en poids de motifs acrylate de GENAPOL T-250, le copolymère réticulé par du méthacrylate d'allyle constitué de 90% en poids de motifs AMPS neutralisés par NH3 et de 10% en poids de motifs méthacrylate de GENAPOL T-250, ou le copolymère réticulé par du méthacrylate
d'allyle constitué de 80% en poids de motifs AMPS neutralisés par NH3 et de 20% en poids de motifs méthacrylate de GENAPOL T-250.
Dans la composition anhydre pâteuse pour la décoloration et la coloration simultanée selon l'invention, le ou les polymères amphiphiles non ioniques et/ou anioniques comportant au moins une chaîne grasse peuvent être présents dans une proportion pondérale allant d'environ 0,01 à 30% et de préférence d'environ 0,01 à 15% par rapport au poids total de la poudre décolorante.