INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
D'autre part, le segment thérapeutique peut éventuellement être activé à la surface des cellules cibles. En effet, la molécule chimérique peut comprendre des éléments masquant l'activité du segment thérapeutique. Ces éléments peuvent être éliminés par la présence de segments clivables sensibles à l'environnement d'un tissu ou d'une cellule pathologique ciblé entre le segment thérapeutique et lesdits éléments.
Dans un mode de réalisation alternatif, la molécule thérapeutique est une molécule préassemblée en oligomère, de préférence en dimère ou trimère, ciblée et éventuellement libérée et/ou activée dans l'environnement du tissu malade ciblé. De préférence, la molécule thérapeutique assemblée sous forme d'oligomère est inactive avant sa liaison à la cible. De préférence, elle est activée au niveau du site cible. Cette activation est de préférence réalisée par le clivage d'une liaison sensible aux protéases se trouvant dans l'environnement d'un tissu ou d'une cellule en apoptose.
L'invention concerne les acides nucléiques codant pour les molécules chimères selon la présente invention, les vecteurs comprenant ces acides nucléiques, les cellules
recombinantes comprenant ces acides nucléiques, les cellules portant à leur surface une molécule chimère selon la présente invention.
De plus, la présente invention concerne une méthode de production des molécules chimères selon la présente invention. Cette méthode comprend dans un premier mode de réalisation la synthèse peptidique des molécules chimères, par exemple par la chimie Boc ou Fmoc. Dans un second mode de réalisation, cette méthode comprend la production des molécules chimères recombinantes par transformation d'une cellule hôte avec un acide nucléique codant pour une molécule chimère selon la présente invention, la cellule hôte exprimant la molécule chimère.
Un autre objet de l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant une molécule chimère telle que définie ci-avant.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des molécules chimères telles que définies ci-avant pour la préparation de médicaments. Dans un mode préféré de réalisation, ces médicaments sont des médicaments anti-tumoraux ou anti-inflammatoires. L'invention est utilisable notamment pour le traitement de tumeurs solides, liquides ou hématopoiétiques, en particulier de cancers du sein, du poumon, de l'intestin, du colon, du cerveau, tête-et-cou, du foie, de la peau, etc. Lorsque le composé thérapeutique est un antiinflammatoire, les molécules selon l'invention peuvent être utilisées pour la préparation de médicaments destinés au traitement de pathologies aiguës et chroniques comme l'asthme, la rectocolite hémorragique, la maladie de Crohn, le choc septique, les maladies du collagène et la poly-arthrite rhumatoïde.
Un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des molécules chimères telles que définies ci-avant pour la délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets.
La présente invention concerne en outre des méthodes de traitement d'une pathologie chez un sujet comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ci-avant. De préférence, la pathologie concernée est un cancer ou une inflammation. La méthode de traitement peut comprendre en outre une étape préalable consistant en un traitement permettant de générer des cellules engagées dans un processus
d'apoptose dans le tissu pathologique. Elle concerne également des méthodes de délivrance locale de principes actifs dans le voisinage de tissus pathologiques chez des sujets, comprenant l'administration d'une molécule ou d'une composition telles que définies ciavant.
Ces différents aspects de l'invention seront décrits plus en détails dans la suite du texte.
RMN 13C (CDCl3, 50MHz) #(ppm) : 170,169,9, 169,8 (3*C-COCH3) ; 158,9 (C-3') ; 157,3 (C-5') ; 157 (C-l') ; 110 (C-6') ; 99,9 (C-l) ; 98 (C-4') ; 95,3 (C-2') ; 83,8 (C- 7') ; 74,9 (C-13') ; 71,2 (C-4) ; 70,9 (C-3) ; 70,8 (C-2) ; 70,6,70,5, 70,1,69,7 (6*CCH20) ; 69,2 (C-5) ; 67,3,67,1, 66,3 (3*C-CH20) ; 46,5 (C-12') ; 37,3 (C-10') ; 35,8 (C-8') ; 29,5 (C-14') ; 29 (C-16') ; 27,8 (C-19') ; 23,8 (C-15') ; 22,2 (C-11') ; 17,4 (C-6).
SM (FAB+/NOBA) m/z : 819 [M+Na]+ ; 797 [M+H]+.
a-L-rhamnopyranoside de 17-citrylidène phloroglucinyl-3,6,9,12,15- pentaoxaoctadécyle 23 Une solution du surfactant acétylé 22 (115mg, 0,11 mmole) et de méthanolate de sodium (71,3mg, 1,32 mmoles) dans du méthanol (3 ml) est laissée sous agitation à température ambiante pendant 4 heures. Après addition d'acide citrique en poudre jusqu'à neutralité, de la silice est ajoutée au milieu réactionnel qui est ensuite concentré sous pression réduite. Le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice [éluant: gradient de méthanol (0-10%) dans du dichlorométhane] pour conduire à l'a-L-rhamnopyranoside de 17-citrylidène phloroglucinyl-3,6,9,12,15-pentaoxaoctadécyle 23 sous la forme d'une mousse blanche collante (Rdt=75%).
Rf 0,52 (CH2Cl2/MeOH 95/5).
[a]D -28,6(c=l,CHCl3).
RMN'H (CDC13, 250MHz) # (ppm) : 6,1 (2H, s, H-2', H-4') ; 4,85(1H, d, JI-2=1,5Hz, H- 1) ; 4,06 (2H, m, H-OCH2CfuO-Ar) ; 3,96 (1H, m, H-5) ; 3,82 (2H, m, HOCfuCH20-Ar) ; 3,75-3,6 (23H, m, H-CH20, H-2, H-3, H-4) ; 3,22 (2H, m, OH) ; 2,99 (1H, m, OH) ; 2,81 (1H, ddd, J9~8 =3,2Hz, J9-12=2,7Hz, J9~ga=l,7Hz, H-9') ; 2,21 (1H, ddd, J8 ~8a=13,3Hz, Jg.-9=3,2Hz, J8 ~o=l,6Hz, H-8'a) ; 2,01 (1H, ddd, J12~lp=11,4Hz, J12-y5,lHz, J12-9=2,7Hz, H-12') ; 1,83 (1H, dd, J8a.8p=13,2Hz, J813- 9=l,7Hz, H-8'p) ; 1,76 (1H, ddd, J,op-ioa=13,5Hz, Jloa-ly=5,7Hz, Jloa~s 3,lHz, H- 10'p) ; 1,51 (3H, s, H-14') ; 1,45 (1H, dt, JlOa-IOI3=13,5Hz, Jio,-Ilp=13,3Hz, 310 - 11 5,3Hz, H-10'a) ; 1,36 (3H, s, H-16') ; 1,32 (3H, d, J6-5=6,lHz, H-6) ; 1,23 (1H, dt, Jn -1y=13,3Hz, Ju -to 5,3Hz, J,ia-12=5,lHz, H-ll'a) ; 1,01 (3H, s, H-15') ; 0,63 (1H, dddd, Jlp~to 13,5Hz, J a~11 13,3Hz, JItR~2=11,4Hz, J1R-ioa=5,7Hz, H-11 ').
RMN 13C (CDCI3,100MHz) 5 (ppm) : 158,8 (C-3') ; 157,6 (C-5') ; 157,1 (C-l') ; 109,6 (C-6') ; 99,9 (C-1) ; 97,8 (C-4') ; 95,6 (C-2') ; 84,1 (C-7') ; 74,8 (C-13') ; 73,1 (C-4) ; 71,7 (C-3) ; 70,8 (C-2) ; 70,7, 70,5, 70,4, 70,2,69,7 (6*C-CH20) ; 68 (C-5) ; 67,5 (C-
CH20) ; 66,5 (C-CH20) ; 46,7 (C-12') ; 37,3 (C-10') ; 35,3 (C-8') ; 29,7 (C-14') ; 29 (C-16') ; 27,8 (C-9') ; 23,7 (C-15') ; 22 (C-11') ; 17,6 (C-6).
SM (FAB+/NOBA) m/z : 693 [M+Na]+; 260 [M-sucre-TEG]+.
E/ Synthèse des glycosides amphiphiles 28,29 et 30 possédant une partie lipophile de type rétinoïde et acyle 2,3,4-tri-O-acétyl-a-L-rhamnopyranoside de 3,6,8-trioxanonanyle 24 A une solution du compose 6 (538mg, 1,5 mmoles) et de tri (éthylèneglycol) (0,26ml, 1,96 mmoles) dissous dans du dichlorométhane anhydre (12 ml) est additionné goutte à goutte l'éthérate de trifluorure de bore (1,28 ml, 10 mmoles). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 4 heures. Il est ensuite lavé avec une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium. La phase organique est séchée sur du sulfate de sodium anhydre puis concentrée sous vide. Le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice [éluant : dichlorométhane] pour conduire au composé 24 sous forme d'huile incolore (Rdt=81%).
Rf 0,52 (CH2C12/MeOH 95/5).
[a]D -38,2 (c=1,03, CHC13)- RMN'H (CDCl3, 250MHz) 3 (ppm) : 5,29 (1H, dd, J3-4=9,8Hz, J3-2=3,5Hz, H-3) ;5,24 (1H, dd, J2-3=3,5Hz, J2-1=1,7Hz, H-2) ; 5,06 (1H, dd, J4-5=9,8Hz, J4-3=9,8Hz, H-4) ; 4,79 (1H, d, J1-2=1,5Hz, H-l) ; 3,93 (1H, dd, Js-4=9,8Hz, J5.6=6,3Hz, H-5) ; 3,78-3,59 (12H, m, H-CH20) ; 2,44 (1H, t, J=6Hz, OH) ; (9H, s, H-COCH3) ; (3H, d, J6-5=6,l Hz, H-6).
RMN 13C (CDCl3, 50MHz) # (ppm) : 170,2,170,1, 169,9 (3*C-COCH3) ; 97,6 (C-l) ; 72,6 (C-4) ; 71,1 (C-3) ; 70,8 (C-2) ; 70,4,70,1, 69,9 (3*C-CH20) ; 69,1 (C-5) ; 67,1 (C-CH20) ; 66,4 (C-CH20) ; 61,8 (C-CH20H) ; 20,9,20,8, 20,7 (3*C-COCH3) ; 17,4 (C-6).
SM (FAB+/NOBA)
m/z : 445 [M+Na]+ ; 423 [M+H]+ ; 273 [M-TEG]+.
F/ Procédure générale de synthèse des glycosides amphiphiles acétylés 25, 26 et 27 Le 2,3,4-tri-O-acétyl-a-L-rhamnopyranoside de 3,6,8- trioxanonanyle 24 (1 mmole), l'acide rétinoïque ou l'acide 2-trans-(3-ionylidène acétique ou l'acide palmitique (1 mmole) et la 4-diméthylaminopyridine (1,2 mmoles) sont dissous dans une quantité minimum de dichlorométhane anhydre. A cette solution refroidie à 0 C, du chlorhydrate de N-(3-diméthylaminopropyl)-N-éthylcarbodiimide (1,2 mmoles), dissous dans un minimum de dichlorométhane anhydre, est additionné goutte à goutte. Après une nuit à température ambiante, le mélange réactionnel est lavé avec de l'eau, avec une solution aqueuse d'acide citrique à 5% puis avec de l'eau. Les phases organiques sont alors séchées sur du sulfate de sodium anhydre et concentrées sous vide. Le résidu obtenu est à chaque fois purifié par chromatographie sur colonne de gel de silice. Les conditions d'élution et le rendement de chaque composé sont donnés ci-après.
Il est désormais reconnu que les aminoacides excitateurs et tout particulièrement le glutamate, jouent un rôle crucial dans les processus physiologiques de plasticité neuronale et dans les mécanismes sous-tendant l'apprentissage et la mémoire. Des études pathophysiologiques ont indiqué clairement qu'un déficit de la neurotransmission glutamatergique est associé étroitement avec le développement de la maladie d'Alzheimer (Neuroscience and Biobehavioral reviews, 1992,16, 13-24 ; Progress in Neurobiology, 1992, 39, 517-545).
Par ailleurs, d'innombrables travaux ont démontré durant les dernières années l'existence de sous-types réceptoriels aux aminoacides excitateurs et de leurs interactions fonctionnelles (Molecular Neuropharmacology, 1992, 2, 15-31).
Parmi ces récepteurs, le récepteur à l'AMPA ("a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid") apparaît être le plus impliqué dans les phénomènes d'excitabilité neuronale physiologique et notamment dans ceux impliqués dans les processus de mémorisation. Pour exemple, l'apprentissage a été montré comme étant associé à l'augmentation de la liaison de LAMPA à son récepteur dans l'hippocampe, l'une des zones cérébrales essentielles aux processus mnémocognitifs. De même, les agents nootropes tels que l'aniracetam ont été décrits très récemment comme modulant positivement les récepteurs AMPA des cellules neuronales (Journal of Neurochemistry, 1992,58, 1199-1204).
Dans la littérature, des composés de structure benzamide ont été décrits pour posséder ce même mécanisme d'action et pour améliorer les performances mnésiques (Synapse, 1993, 15, 326-329). Le composé BA 74, en particulier, est le plus actif parmi ces nouveaux agents pharmacologiques.
Enfin, le brevet EP 692 484 décrit un dérivé de benzothiadiazine possédant une activité facilitatrice sur le courant AMPA et la demande de brevet WO 99/42456 décrit entre autres
certains dérivés de benzothiadiazine en tant que modulateurs des récepteurs AMPA.
Les dérivés de benzothiazine et de benzothiadiazine, objets de la présente invention, outre le fait qu'ils soient nouveaux, présentent, de manière surprenante, des activités pharmacologiques sur le courant AMPA nettement supérieures à celles des composés de structures proches décrits dans l'Art Antérieur. Ils sont utiles en tant que modulateurs AMPA pour le traitement ou la prévention des désordres mnémocognitifs associés à l'âge, aux syndromes anxieux ou dépressifs, aux maladies neurogénératives progressives, à la maladie d'Alzheimer, à la maladie de Pick, à la chorée d'Huntington, à la schizophrénie, aux séquelles des maladies neurodégénératives aiguës, aux séquelles de l'ischémie et aux séquelles de l'épilepsie.
Plus spécifiquement, la présente invention concerne les composés de formule (I) : dans laquelle : Ri représente un groupement hétéroaryle, R2 représente un atome d'hydrogène, d'halogène ou un groupement hydroxy, A représente un groupement CR4R5 ou un groupement NR4, R3 représente un atome d'hydrogène, un groupement alkyle (C1-C6) linéaire ou ramifié ou un groupement cycloalkyle (C3-C7), R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupement alkyle (Ci -Ce) linéaire ou ramifié, ou bien
A représente un atome d'azote et forme avec le groupement-CHR3- adjacent le cycle dans lequel m représente 1, 2 ou R5 représente un atome d'hydrogène ou d'halogène, leurs isomères ainsi que leurs sels d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable, étant entendu que par groupement hétéroaryle, on comprend groupement aromatique monocyclique ou un groupement bicyclique dans lequel au moins un des cycles est aromatique, contenant un à quatre hétéroatomes, identiques ou différents, choisis parmi azote, oxygène et soufre, éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements, identiques ou différents, halogène, alkyle (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, alkoxy (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, perhalogénoalkyle (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, alkoxy (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, carbonyle, carboxy, acyle (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, perhalogénoalkoxy (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, hydroxy, cyano, nitro, amino (éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements alkyle (Ci-Ce) linéaire ou ramifié), aminosulfonyle (éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements alkyle (Ci-Ce) linéaire ou ramifié), ou alkyl (Ci-Ce) sulfonylamino.
Parmi les acides pharmaceutiquement acceptables, on peut citer à titre non limitatif les acides chlorhydrique, bromhydrique, sulfurique, phosphonique, acétique, trifluoroacétique, lactique, pyruvique, malonique, succinique, glutarique, fumarique, tartrique, maléïque, citrique, ascorbique, méthane sulfonique, camphorique, etc...
Le groupement Rt # n est préférentiellement en position b du phényle qui le porte. 1 V-o- Le groupement Ri préféré est un groupement hétéroaryle monocyclique aromatique contenant 1 à 4 atomes d'azote notamment le groupement tétrazolyle.
Le groupement Ri est préférentiellement en position méta du noyau phénoxy qui le porte.
Le groupement R2 préféré est l'atome d'hydrogène.
Les composés préférés de l'invention sont les composés tels que A représente un atome -N d'azote et forme avec le groupement -CHR3 adjacent le cycle \.( dans lequel m représente 1, 2 ou 3 et préférentiellement 1.
Le composé préféré de l'invention est le 7-[3-(IH-tétrazol-5-yl)phénoxy]-2,3,3a,4- tétrahydro-1H pyrrolo[2,1-c][1,2,4]benzothiadiazine-5,5-dioxide ainsi que ses sels d'addition correspondants.
A titre de solvant organique, on peut par exemple citer, les alcanols, linéaires ou ramifiés, comprenant 1 à 4 atomes de carbone, tels que l'éthanol, l'isopropanol ; les polyols et éthers de polyols comme le glycérol, le 2-butoxyéthanol, le propylèneglycol, le monométhyléther de propylèneglycol, le monoéthyléther, le monométhyléther du diéthylèneglycol, le diméthoxyéthane, les alcools aromatiques comme l'alcool benzylique ou le phénoxyéthanol, les cétones comprenant 3 à 4 atomes de carbone, les acétates d'alkyle en C1-C4, ces composés étant seuls ou en mélanges.
A titre d'illustration, les solvants, s'ils sont présents, représentent 1 à 40 % en poids environ par rapport au poids total de la composition, et de manière plus avantageuse de 5 à 30 % en poids environ par rapport à la même référence.
Le pH de la composition mise en oeuvre dans le procédé selon l'invention est généralement compris entre 3 et 12 environ, et de préférence entre 5 et 11environ.
Il peut être ajusté à la valeur désirée au moyen d'agents acidifiants ou alcalinisants habituellement utilisés.
Parmi les agents acidifiants, on peut citer, à titre d'exemples, les acides minéraux ou organiques comme l'acide chlorhydrique, l'acide orthophosphorique, l'acide sulfurique, les acides carboxyliques comme l'acide acétique, l'acide tartrique, l'acide citrique, l'acide lactique, les acides sulfoniques.
Parmi les agents alcalinisants on peut citer, à titre d'exemples, l'ammoniaque, les carbonates alcalins, les alcanolamines telles que les mono-, di- et triéthanolamines ainsi que leurs dérivés, les hydroxydes de sodium ou de potassium et les composés de formule (A) suivante : dans laquelle W est un reste propylène éventuellement substitué par un groupement hydroxyle ou un radical alkyle en Ci-Ce ; R1, R2, R3 et R4, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un radical alkyle en Ci-Ce éventuellement porteur d'au moins un radical hydroxyle.
La composition peut de plus comprendre au moins un colorant direct additionnel non fluorescent.
Plus particulièrement, ledit colorant additionnel est de nature non ionique, cationique ou anionique.
Généralement, ces colorants directs sont choisis parmi les colorants benzéniques nitrés, les colorants azoïques, azométhiniques, méthiniques, anthraquinoniques, naphtoquinoniques, benzoquinoniques, phénotiaziniques indigoïdes, xanthéniques, phénanthridiniques, phtalocyanines, ceux dérivés du triarylméthane, seuls ou en mélanges.
Il peut par exemple être choisi parmi les colorants benzéniques nitrés rouges ou orangés suivants : - le 1-hydroxy-3-nitro-4-N-(y-hydroxypropyl)amino benzène, - le N-(ss-hydroxyéthyl)amino-3-nitro-4-amino benzène, - le 1-amino-3-méthyl-4-N-((i-hydroxyéthyl)amino-6-nitro benzène, - le 1-hydroxy-3-nitro-4-N-(ss-hydroxyéthyl)amino benzène, - le 1,4-diamino-2-nitrobenzène, - le 1-amino-2-nitro-4-méthylamino benzène, - la N-(-hydroxyéthyl)-2-nitro-paraphénylènediamine, - le 1-amino-2-nitro-4-(p-hydroxyéthyl)amino-5-chloro benzène, - la 2-nitro-4-amino-diphénylamine, - le1-amino-3-nitro-6-hydroxybenzène.
- le 1-(-aminoéthyl)amino-2-nitro-4-(-hydroxyéthyloxy) benzène, - le 1-(, y-dihydroxypropyl)ôxy-3-nitro-4-(3-hydroxyéthyl)amino benzène, - le 1-hydroxy-3-nitro-4-aminobenzène, - le 1-hydroxy-2-amino-4,6-dinitrobenzène, - le 1-méthoxy-3-nitro-4-(ss-hydroxyéthyl)amino benzène, - la 2-nitro-4'-hydroxydiphénylamine, - le 1-amino-2-nitro-4-hydroxy-5-méthylbenzène.
La composition mise en oeuvre dans le cadre de cette première variante peut également comprendre, en addition ou en remplacement de ces colorants benzéniques nitrés, un ou plusieurs colorants directs additionnels choisis parmi les colorants benzéniques nitrés jaunes, jaune-verts, bleus ou violets, les colorants azoïques, les colorants anthraquinoniques, naphtoquinoniques ou benzo-quinoniques, les colorants indigoïdes, ou les colorants dérivés du triarylméthane.
Ces colorants directs additionnels peuvent notamment être des colorants basiques parmi lesquels on peut citer plus particulièrement les colorants connus dans le Color Index, 3ème édition, sous les dénominations "Basic Brown 16", "Basic Brown 17", "Basic Yellow 57", "Basic Red 76", "Basic Violet 10", "Basic Blue 26" et "Basic Blue 99", ou des colorants directs acides parmi lesquels on peut plus particulièrement citer les colorants connus dans le Color Index, 3ème édition, sous les dénominations "Acid Orange 7", "Acide Orange 24", "Acid Yellow 36", Acid Red 33", "Acid Red 184", "Acid Black 2", "Acid Violet 43", et "Acid Blue 62", ou encore des colorants directs cationiques tels que ceux
décrits dans les demandes de brevet WO 95/01772, WO 95/15144 et EP 714954 et dont le contenu fait partie intégrante de la présente invention.
Parmi les colorants directs additionnels benzéniques nitrés jaunes et jaune-verts, on peut par exemple citer les composés choisis parmi : - le 1-p-hydroxyéthyloxy-3-méthylamino-4-nitrobenzène, - le 1-méthylamino-2-nitro-5-([3,y dihydroxypropyl)oxy benzène, - le 1-(ss-hydroxyéthyl)amino-2-méthoxy-4-nitrobenzène, - le 1-(ss-aminoéthyl)amino-2-nitro-5-méthoxy-benzène, - le 1 ,3-di(p-hydroxyéthyl)amino-4-nitro-6-chlorobenzène, - le 1-amino-2-nitro-6-méthyl-benzène, - le 1-(-hydroxyéthyl)amino-2-hydroxy-4-nitrobenzène, - la N-((3-hydroxyéthyl)-2-nitro-4-trifluorométhylaniline, - l'acide 4-(-hydroxyéthyl)amino-3-nitro-benzènesulfonique, - l'acide 4-éthylamino-3-nitro-benzoïque, - le 4-(ss-hydroxyéthyl)amino-3-nitro-chlorobenzène, - le 4-(-hydroxyéthyl)amino-3-nitro-méthylbenzène, - le 4-(P,y-dihydroxypropyl)amino-3-nitro-trifluorométhylbenzène, - le 1-(ss-uréidoéthyl)amino-4-nitrobenzène, - le 1,3-diamino-4-nitrobenzène, - le 1-hydroxy-2-amino-5-nitrobenzène, - le 1-amino-2-[tris(hydroxyméthyl)méthyl]amino-5-nitro-benzène, - le 1-(ss-hydroxyéthyl)amino-2-nitrobenzène, - le 4-(-hydroxyéthyl)amino-3-nitrobenzamide.
Parmi les colorants directs additionnels benzéniques nitrés bleus ou violets, on peut par exemple citer les composés choisis parmi : - le 1-((i-hydroxyéthyl)amino-4-N,N-bis-((3-hydroxyéthyl)amino 2-nitrobenzène, - le 1-(y-hydroxypropyl)amino 4-N,N-bis-(-hydroxyéthyl)amino 2-nitrobenzène, - le 1-(-hydroxyéthyl)amino 4-(N-méthyl, N-ss-hydroxyéthyl)amino 2-nitrobenzène, - le 1-(p-hydroxyéthyl)amino4-(N-éthyl, N-j3-hydroxyéthyt)amino 2-nitrobenzène, - le 1-(,y-dihydroxypropyl)amino 4-(N-éthyl, N-ss-hydroxyéthyl)amino 2-nitrobenzène, - les 2-nitroparaphénylènediamines de formule suivante : dans laquelle :
- un support inerte choisi parmi le groupe consistant d'une membrane synthétique semi-perméable, en particulier une membrane de nitrocellulose semi-perméable, une membrane de nylon semi-perméable, une membrane ou une éponge de téflon, une membrane de polycarbonate ou de polyéthylène, polypropylène, ou de polyéthylène téréphtalate (PET) semi- perméable, une membrane inorganique Anopore semi-perméable, d'acétate ou d'ester de cellulose (HATF), une membrane Biopore-CM semi- perméable, une membrane de polyester semi-perméable, ledit support inerte contenant des cellules stroma les, en particulier des fibroblastes, - un gel à base de collagène et/ou acide hyaluronique et/ou fibronectine, et/ou de fibrine comprenant des cellules stroma les en particulier des fibroblastes, - une matrice poreuse, surfacée ou non surfacée, réalisée à partir de collagène pouvant contenir un ou plusieurs glycosaminoglycannes et/ou éventuellement du chitosane, ces matrices poreuses intégrant des cellules stroma les, en particulier des fibroblastes, - un derme désépidermisé ou derme mort, humain ou animal.
Dans ce groupe, on peut citer particulièrement les modèles Apligraf (Organogenesis), ATS-2000 (CellSystems# Biotechnologie Vertrieb) ainsi que Skin 2TM (ZK1200-1300-2000 - Advanced Tissue Science).
Il existe par ailleurs des modèles dédiés à la thérapie tissulaire qui peuvent également faire l'objet de telles études. On peut citer les modèles Epidex TM (Modex Thérapeutiques), Epibase (Laboratoire Genévrier), Epicell TM (Genzyme), Autoderm TM et Transderm TM (Innogenetics).
Avantageusement, la méthode d'identification met en oeuvre un modèle de peau reconstruite, de préférence au moins un modèle d'épiderme comprenant des kératinocytes.
Avantageusement, la méthode comprend une étape d'analyse de l'expression d'une séquence au moins de la protéine élastine et/ou tropoélastine, ou d'une séquence de nucléotides codant la protéine élastine, notamment pour détecter une éventuelle stimulation de l'expression de la protéine élastine lorsque ladite substance active est en contact avec lesdites cellules vivantes.
Avantageusement, la méthode comprend une étape d'immuno-détection de l'expression de la protéine LOXL, notamment dans le but d'effectuer la traçabilité de la néo-élastogenèse, notamment dans les tissus épithéliaux et/ou dans les tissus conjonctifs, lesdits tissus étant issus d'au moins un modèle de peau reconstruite ou d'un modèle à base de biopsies.
Avantageusement, ladite substance active est choisie parmi le groupe consistant en l'aneth, la groseille, la cardamone, le radis noir, le petit houx, la cannelle, les fermentations à base de bactéries lactiques, l'avoine, la pomme de terre, la soie, la gomme asae foetida, l'hexénoate d'éthyle et ses dérivés, le butyrate de méthyle et ses dérivés, et le décadiènoate d'éthyle et ses dérivés.
Selon un septième aspect, l'invention concerne une méthode de localisation de l'expression de LOXL dans des tissus dans le but d'effectuer la traçabilité de la néo-élastogenèse, notamment dans des tissus conjonctifs, lesdits tissus étant issus d'au moins un modèle de peau reconstruite ou de biopsies, caractérisée en ce que la méthode comprend une étape d'immunodétection de la protéine LOXL ou d'hybridation in situ d'au moins une partie d'une séquence de nucléotides codant LOXL.