INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
On considère ici qu'un peptide présente une séquence substantiellement homologue lorsque sa séquence en acides aminés présente au moins 60% de similarité avec la séquence en acides aminés d'au moins l'une des séquences SEQ ID NO : 1 à SEQ ID NO : 10 et que le peptide a conservé son activité initiale anti-microbienne, particulièrement son
La conception, à cet effet, des mâchoires 46 relève des aptitudes normales d'un Homme du métier.
On observera qu'ainsi conçus, les moyens de verrouillage 12 assurent un positionnement précis du capuchon 11 par rapport au manchon 9, aussi bien en orientation autour de l'axe 10 qu'en translation relative suivant celui-ci, ce qui permet d'atteindre avec précision une position relative de montage déterminée, c'est-à-dire également une position déterminée de la lampe 8 à l'intérieur du réflecteur 6, ce qui n'est pas le cas lorsque, conformément à l'art antérieur, le capuchon est vissé sur le manchon par rotation relative autour de leur axe commun.
Comme le manchon 9, la jupe 34 du capuchon 11 est imperméable à l'air, à l'eau et a fortiori aux poussières, et il en est de même du chanfrein 35 et de la paroi de fond 33, sauf en ce qui concerne la zone localisée de celle-ci que l'on a repérée en A à la figure 1 et qui est illustrée à la figure 3.
Pour le reste, la paroi de fond 33 présente une conception connue en elle-même et, en particulier, porte solidairement, à l'intérieur du manchon 9, une glissière longitudinale 48 de réception solidaire, mais avec possibilité de réglage longitudinal, d'une équerre 49 portant solidairement la douille 13 suivant l'axe 10. En outre, la paroi de fond 33 est traversée de part en part, longitudinalement, de deux passages tubulaires 50 pour des fils d'amenée de courant à la douille 13 et, par l'intermédiaire de celle-ci, à la lampe 8 ; façon non illustrée mais connue d'un Homme du métier, ces fils,
également non illustrés, sont avantageusement étanchéifiés à l'air et à l'eau à leur traversée de la paroi de fond 33 par les passages 50.
Ce n'est par conséquent que de façon localisée au niveau du détail de la paroi de fond 33 repéré en A à la figure 1 et illustré à la figure 3 que l'ensemble constitué par le capuchon 36 et le manchon 9, ou plus généralement par le bloc optique 3, présente une perméabilité, ceci de façon limitée à l'air et à un sens allant de l'intérieur du réflecteur 6 vers l'extérieur de celui-ci.
A cet effet, dans la zone localisée repérée en A à la figure 1, située sous l'axe 10, entre ce dernier et le chanfrein 35, la paroi de fond 33 du capuchon 36 présente, dans une face transversale, plane 51 qui la délimite longitudinalement à l'opposé des manchons 9, une cavité 52 annulaire de révolution autour d'un axe 53 parallèle à l'axe 10, et cette cavité 52 loge une soupape unidirectionnelle 82 dont un mode de réalisation préféré va être décrit à présent, en référence à la figure 3.
Plus précisément, la cavité 52 est délimitée, respectivement dans le sens d'un éloignement et dans le sens d'un rapprochement par rapport à l'axe 53, par des flancs 54,55 tournés respectivement dans le sens d'un rapprochement et dans le sens d'un éloignement par rapport à cet axe 53, lesquels flancs 54 et 55 raccordent à la face 51 une face de fond plane 56, annulaire de révolution autour de l'axe 53 auquel elle est perpendiculaire, laquelle face 56 est ainsi placée en retrait par rapport à la face 51 et tournée dans le même sens que celle-ci.
La présence de la cavité 52 dans la face 51 se traduit par la présence, sur une face plane, transversale 57 délimitant la paroi de fond 33 dans un sens longitudinal allant de l'extrémité 23 du manchon 9 vers l'extrémité 20 de celui-ci, d'une protubérance localisée 58 délimitée dans le sens d'un éloignement par rapport à l'axe 53 par une face périphérique extérieure 59 cylindrique de révolution autour de cet axe 53 avec un diamètre qui correspond sensiblement au diamètre du flanc 54 de la cavité 52, augmenté d'environ deux fois la dimension longitudinale ou épaisseur courante de la paroi 33. La protubérance 58 est par ailleurs délimitée, dans un sens longitudinal allant de l'extrémité du manchon 9 vers l'extrémité 20 de celui-ci, par une face frontale plane 60, en forme de disque perpendiculaire à l'axe 53, laquelle face 60 est ainsi placée en relief sur la face 57 et raccordée à celle-ci par la face périphérique extérieure 59.
Suivant des axes 61 parallèles à l'axe 53 et régulièrement répartis angulairement autour de celui-ci sont aménagés des trous 62 mutuellement identiques, délimités par une face périphérique intérieure 63 respective cylindrique de révolution autour de l'axe 61 respectif avec un diamètre inférieur à la distance radiale, en référence à l'axe 53, séparant mutuellement les deux flancs 54 et 55 de la cavité 52. Les axes 61 sont disposés de telle sorte que ces trous 62, qui sont des trous traversants, débouchent d'une part dans la face 60 et d'autre part dans le fond 56 de la cavité 52, suivant une couronne marginale de ce fond directement adjacente au flanc 55 le plus proche de l'axe 53.
Le nombre de ces trous 62 est indifférent dès lors que, compte tenu de la section qu'ils présentent perpendiculairement à leur axe 61, ils offrent un passage suffisant à l'air inclus dans le bloc optique 3 lorsque cet air se dilate ; un seul de ces trous 62 pourrait d'ailleurs suffire.
Pour autoriser un tel passage tout en s'opposant à une pénétration d'air, d'eau et a fortiori de poussières à l'intérieur du bloc optique 3 est retenu, à l'intérieur de la cavité 52, un joint à lèvre 64 annulaire de révolution autour de l'axe 53.
Plus précisément, le joint à lèvre 64 est disposé dans la cavité 52 de telle sorte que sa lèvre d'étanchéité 65, annulaire de révolution autour de l'axe 53, soit fixée au flanc 55 de la cavité 52 par une partie annulaire de fixation 66, radialement intérieure en référence à l'axe 53, dans une position décalée longitudinalement vers la face 51 par rapport à la face de fond 56 de la cavité 52 de façon à être espacée longitudinalement de l'embouchure des trous 62 dans cette face de fond 56. La lèvre d'étanchéité 65 présente, dans le sens d'un éloignement par rapport à cette partie de fixation 66, une partie 67 de forme générale tronconique de révolution autour de l'axe 53, s'évasant dans un sens longitudinal allant de l'extrémité 23 du manchon 11 vers l'extrémité 20 de celui-ci, c'est-à-dire également dans le sens d'un rapprochement à la fois par rapport au flanc 54 de la cavité 52 et par rapport à la face de fond 56 de celle-ci, sur laquelle cette partie 67 s'applique à plat, dans un état de précontrainte élastique, par un bord libre 68 annulaire de révolution autour de l'axe 53 et
ainsi situé entre la zone marginale de la face de fond 56 dans laquelle débouchent les trous 62 et le flanc 54, en étant espacée de ce dernier suivant une direction radiale en référence à l'axe 53.
Ainsi, dans un état de la lèvre 65 selon lequel celle-ci s'applique par son bord 68 sur la face de fond 56 de la cavité 52, de façon continue en direction circonférentielle en référence à l'axe 53, la partie 67 de cette lèvre 65 obture l'ensemble des trous 62 de façon étanche à l'encontre de tout passage d'air, d'eau et de poussières dans un sens longitudinal allant de l'extrémité 23 du manchon 9 vers l'extrémité 20de celuici, c'est-à-dire de l'extérieur vers l'intérieur du bloc optique 3. Par contre, si la pression de l'air inclus dans le bloc optique 3 tend à augmenter, par exemple sous l'effet d'une dilatation de cet air elle-même due à la mise en fonctionnement de la lampe 8, cette pression, s'appliquant sur la partie d'obturation 67 de la lèvre 65, provoque un écartement élastique de cette dernière vis-à-vis de la face de fond 56 de la cavité 52, c'est-àdire provoque le dégagement des trous 62 dans le sens d'un passage de cet air de l'intérieur du bloc optique 3 vers l'extérieur de celui-ci, jusqu'à ce que l'intérieur du bloc optique 3 se trouve approximativement en équilibre de pression avec l'extérieur du bloc optique 3, auquel cas la partie d'obturation 67 de la lèvre 65 revient s'appliquer par son bord 68 sur la face de fond 56 pour obturer à nouveau de façon étanche les trous 62.
Plusieurs modes de réalisation du joint à lèvre 64 et plusieurs modes de coopération étanche, à l'air, à l'eau et aux poussières avec le flanc 55 de la cavité 52
4) Purification des peptides. a) Prépurification par extraction en phase solide.
Une quantité d'extrait équivalente à 6 ml d'hémolymphe de C. illioneus a été déposée sur un support de 5 g de phase inverse tel que commercialisé sous la forme de cartouche (Sep-Pak C18, Waters Associates), équilibré avec de l'eau acidifiée (TFA 0,05%). Les molécules hydrophiles ont été éliminées par un simple lavage avec de l'eau acidifiée. L'élution du peptide a été réalisée par une solution à 60% d' acétonitrile dans de l' eau contenant 0,05% de TFA. La fraction éluée avec 60% d' acétonitrile a été séchée sous vide dans le but d'éliminer l'acétonitrile et le TFA puis elle a été reconstituée dans de l'eau acidifiée (TFA 0,05%) stérile avant d'être soumise à la première étape de purification. L'étape 4 a) a été répétée une fois afin d'obtenir la fraction éluée avec 60% d'acétonitrile en quantité plus importante. b) Purification par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) sur colonne de phase inverse.
Première étape : l'élution 60% issue de l'extraction en phase solide décrite ci-dessus contenant le peptide a été fractionnée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase inverse sur une colonne
semi-préparative de marque InterchimTM, de type Modulocart Uptiprep, de taille 250 x 10 mm, de porosité 300 À et de granulométrie 15 m avec un greffage C8. Le fractionnement a été réalisé par un gradient d'acétonitrile/0,05% TFA contre H20/0,05% TFA de 5 à 60% en 50 minutes à un débit constant de 2,5 ml/min. Les fractions ont été collectées automatiquement (collecteur GilsonTM de type FC 204) dans les 80 premiers puits (colonnes A à J) d'une plaque 96puits (Contenance maximale de chaque puits : 2 ml). La collecte se fait par unité de temps et le volume collecté est d'environ 1,6 ml. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide, reconstituées avec de l'eau ultrapure et analysées pour leurs activités antimicrobiennes en utilisant les tests décrits ci-dessous. L'étape a été répétée une fois afin d'obtenir des fractions actives en quantité plus importante.
Seconde étape : les fractions 37 et 45 issues de l'étape précédente présentant une activité contre les bactéries à Gram positif dans les étapes de purification précédemment décrites, éluées à un pourcentage d'acétonitrile égal respectivement à 30 et 35, ont été purifiées de manière plus fine sur une colonne analytique de phase inverse de greffage C18 de type Modulocart Uptisphère (InterchimTm, 250 x 4,6 mm, 300 et 5 m), en utilisant un gradient linéaire diphasique d'acétonitrile/0,05% TFA contre H20/0,05% TFA. Par exemple, pour une fraction éluée à 30% (35%) d'acétonitrile, le gradient utilisé va de 2 à 26% (31%) en 10 min et de 26 (31%) à 34% (39%) en 45 min, avec un débit constant de 0,8 ml/min. Les fractions ont été collectées manuellement en suivant la variation de l'absorbance à 225 nm. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide, reconstituées avec de l'eau ultrapure et analysées pour leurs activités contre les bactéries à Gram positif dans
les conditions décrites ci-dessous. L'activité a été retrouvée dans certaines sous-fractions des fractions décrites ci-dessus.
Troisième étape : les fractions décrites cidessus, contenant les peptides ont été purifiées jusqu'à homogénéité sur une colonne de phase inverse de marque InterchimTM de type Modulocart Uptisphère (greffage C18, granulométrie 3 , de taille 150 x 2 mm) en utilisant un gradient linéaire diphasique d'acétonitrile/0,05% TFA contre H20/0,05% TFA (gradient dépendant du pourcentage d'élution en acétonitrile de la sous-fraction à purifier), avec un débit constant de 0,2 ml/min à une température contrôlée de 30 C. Les fractions ont été collectées manuellement en suivant la variation de l'absorbance à 225 nm. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide, reconstituées avec de l'eau ultrapure filtrée et analysées pour leurs activités contre les bactéries à Gram positif.
II. Exemple 2 : Caractérisation structurale des peptides ETD-P1646, ETD-P1647 et ETD-P1648.
1) Vérification de la pureté par Spectrométrie de masse Maldi-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight).
Le contrôle de pureté a été effectué sur un spectromètre de masse MALDI-TOF Bruker Biflex (Bremen, Allemagne) en mode linéaire positif (voir section 3 cidessous).
2) Réduction et S-pyridyléthylation en vue de la détermination du nombre de cystéines.
Le nombre de résidus cystéine a été déterminé sur les peptides natifs par réduction et Spyridyléthylation. 400 pmoles de peptide natif ont été réduites dans 40 l de tampon Tris/HCl 0,5 M, pH 7,5 contenant 2 mM d'EDTA et 6 M de chlorure de guanidinium en
présence de 2 l de dithiothréitol 2,2 M. Le milieu réactionnel a été placé sous atmosphère d'azote. Après 60 min d'incubation à l'obscurité, 2 l de 4-vinylpyridine fraîchement distillée ont été ajoutés à la réaction qui a été alors incubée durant 10 min à 45 C à l'obscurité et sous atmosphère d'azote. Le peptide S-pyridyléthylé a été ensuite séparé des constituants du milieu réactionnel par chromatographie de phase inverse sur une colonne analytique de phase inverse Aquapore RP-300 C8 BrownleeTM, 220 x 4,6 mm, 300 ), en utilisant un gradient linéaire d'acétonitrile/0,05% TFA contre H20/0,05%TFA de 2 à 52% pendant 70min.
3) Détermination de la masse du peptide natif, du peptide S-pyridyléthylé et des fragments de protéolyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight).
Les mesures de masses ont été effectuées sur un spectromètre de masse MALDI-TOF Bruker Biflex (Bremen, Allemagne) en mode linéaire positif. Les spectres de masse ont été calibrés de façon externe avec un mélange standard de peptides de m/z connues, respectivement 2199,5 Da, 3046,4 Da et 4890,5 Da. Les différents produits à analyser ont été déposés sur une fine couche de cristaux d'acide acyano-4-hydroxycinnamique obtenue par une évaporation rapide d'une solution saturée dans l'acétone. Après séchage sous un léger vide, les échantillons ont été lavés par une goutte d'acide trifluoroacétique à 0,1% avant d'être introduits dans le spectromètre de masse. La différence de masse observée entre le peptide S-pyridyléthylé et le peptide natif permet de déterminer le nombre de résidus cystéine présents dans chacun des peptides.
4) Séquençage par dégradation d'Edman.
sources lumineuses ponctuelles placées aux deux extrémités du bandeau.
Mais dans l'exemple décrit ici, la nervure remplit également une fonction structurelle en procurant un renfort mécanique au bandeau, ce qui permet à ce dernier de constituer
une première barrière contre les chocs à faible énergie que peut subir le pare-chocs.
Toutes formes de nervures peuvent être envisagées selon l'invention.
La figure 3 illustre un autre exemple de nervure 20 formée en saillie de la face
interne 21 d'un dispositif de signalisation 22 conforme à l'invention.
Dans cet exemple, la nervure 20 est conformée en couronne. Elle comporte un certain nombre de facettes 23 disposées en escalier sur une moitié de sa face opposée à la face externe du dispositif de signalisation. Deux échancrures 24 diamétralement opposées sont réservées pour l'installation de sources lumineuses (non représentées) dirigées tangentiellement à la couronne. Dans ce cas, plus encore que dans l'exemple des figures 1 et 2, des rayons lumineux pénétrant dans la nervure 20 sont réfléchis par les faces latérales 25 de la nervure jusqu'à rencontrer une facette 23 qui les renvoie vers la face externe 26 de la
pièce translucide.
Dans une moitié de la nervure 20, on a illustré une variante dans laquelle les facettes 23 sont remplacées par des orifices 25 aptes à recevoir chacun une source lumineuse. Dans ce cas, la nervure guide également les ondes lumineuses qui sont
diffusées par la peau.
On a représenté, sur la figure 4, un exemple d'éclairage de la pièce 22 de la figure
3, vu de sa face externe.
On voit qu'à partir de seulement deux sources lumineuses, on peut générer un
signal optique très visible bien qu'extrêmement bon marché à obtenir.
Les modes de réalisation décrits ci-dessus n'ont été fournis qu'à titre d'exemples non limitatifs et pourront recevoir toute modification désirable sans sortir pour cela du
Les différents tests utilisés pour mesurer les réponses ont été donnés plus haut.
Tous les paramètres d'une réponse peuvent être affectés par un effecteur allostérique positif. Ces paramètres incluent entre autres, la vitesse d'établissement de la
réponse, son amplitude, sa durée, sa fréquence, sa sensibilité à l'agoniste et le niveau de base de la réponse.
Dans sa réalisation préférée, le procédé est destiné à l'étude des récepteurs couplés aux protéines G. Pour ces récepteurs, les réponses pouvant faire l'objet d'une étude sont variées car ils sont couplés à de multiples voies de transduction de signal. On peut citer par exemple la liaison de GTP à la protéine G, la production d'AMPc, d'inositols phosphates, d'acide arachidonique, la phosphorylation de protéines, la libération de calcium intracellulaire, la modification de pH cellulaire, la modification de la vitesse de prolifération cellulaire, l'altération de la morphologie cellulaire, la polymérisation d'actine, ou encore la régulation de canaux ioniques ou celle de l'expression de gènes.
. Chacune de ces réponses peut être enregistrée et les effets de l'effecteur peuvent être déterminés.
Dans les cas les plus répandus, on se focalisera en premier sur les réponses calciques et la production d'AMPc.
Pour les réponses calciques, on pourra employer une sonde optique sensible au calcium ou un enregistrement électrophysiologique de la régulation des courants.
*L'utilisation d'une sonde calcique permet de déterminer le délai d'établissement de la réponse, la durée de la réponse, son intensité ou sa sensibilité à l'agoniste.
L'enregistrement électrophysiologique permet en outre l'analyse de la fréquence d'ouverture de canaux (Mulle et al., 1992). Un effecteur allostérique positif pourra diminuer le délai d'établissement de la réponse et augmenter les autres paramètres (amplitude, durée, sensibilité ...). L'effecteur allostérique négatif aura des effets contraires.
DESCRIPTION DES FIGURES La figure 1 montre le schéma d'un appareil de mélange rapide permettant d'effectuer les mesures de cinétique rapide. L'appareil est constitué de deux seringues, d'une chambre de mélange et d'une chambre d'observation. L'avancée des pistons des seringues permet le mélange du contenu des seringues au niveau de la chambre de mélange. Après un temps mort, le mélange aboutit dans la chambre d'observation munie d'un dispositif d'excitation et de détection de la fluorescence. L'arrêt de la poussée des pistons, ou l'arrivée en butée de la seringue d'arrêt, stoppe l'étape de mélange au terme de laquelle on enregistre l'évolution du mélange.
La figure 2 (empruntée à Monod, Wyman et Changeux, 1965) représente un schéma de protéine régulatrice existant dans deux états conformationnels ou deux états d'oligomérisation. Dans ce modèle, la protéine peut exister dans plusieurs états discrets, en nombre fini, qui correspondent à des états thermodynamiquement stables qui diffèrent entre eux par leur structure tertiaire et quaternaire. L'interconversion entre chaque état peut s'opérer spontanément et est décrite par le paramètre d'isomérisation.
Les conformations diffèrent par leurs propriétés pharmacologiques. Ainsi, les ligands stabilisent les conformations pour lesquelles ils exhibent l'affinité la plus élevée.
Les conformations diffèrent par leurs propriétés fonctionnelles. Ainsi les agonistes stabilisent préférentiellement l'état actif, tandis que les antagonistes stabilisent préférentiellement l'état inactif.
Dans ce schéma, l'état relâché correspond à l'état confonnationnel "actif' de la protéine. Cette conformation peut lier avec une haute affinité les agonistes (A) si c'est un récepteur ou les substrats (S) si c'est une enzyme. Les états contraint et/ou monomère sont moins (ou pas) actifs en comparaison à l'état relâché, qui est le plus actif. L'état contraint lie avec une haute affinité les inhibiteurs ou antagonistes. L'état monomérique lie avec une affinité modérée les agonistes ou les substrats.
Les figures 3A et 3B présentent un schéma quantifié des relations entre les états conformationnels et les interactions avec les ligands.
Dans la figure 3A, la protéine existe dans deux conformations correspondant à un état de repos (non actif au plan biologique) et un état actif. L'isomérisation spontanée entre les états R et A est décrite par la constante d'isomérisation Lo égale au rapport des
Bien plus, il est possible d'utiliser alors, pour constituer la lèvre souple d'étanchéité, un joint
annulaire à lèvre, du commerce, en prévoyant que, dans ladite zone localisée, ledit composant du bloc optique présente, à l'extérieur de celle-ci, une cavité annulaire borgne dont un fond annulaire forme ledit fond, que ledit trou débouche dans une zone annulaire marginale dudit fond, et que ledit composant du bloc optique porte solidairement dans ladite cavité un tel joint annulaire à lèvre, dont la partie de fixation est annulaire, retenue en appui étanche à l'air et à l'eau contre un flanc annulaire de la cavité, adjacent à ladite zone marginale, en respectant un espacement vis-à-vis dudit fond, et dont la lèvre est appliquée en précontrainte élastique contre une zone annulaire dudit fond, située à l'opposé dudit flanc par rapport à ladite zone marginale.
De préférence, ladite zone marginale et ledit flanc constituent une zone marginale et un flanc intérieurs de la cavité et le joint annulaire est monté en précontrainte d'extension circonférentielle de sa partie de fixation sur ledit flanc, ce qui permet de créer sans autre artifice à la fois une étanchéité à l'air, à l'eau et aux poussières entre la zone de fixation du joint et ledit composant du bloc optique et une solidarisation mutuelle par friction, que l'on peut le cas échéant renforcer par aménagement, sur ledit composant, d'une butée mécanique à l'encontre d'une extraction du joint annulaire.
De préférence, le capuchon présente lesdits moyens formant soupape, dans une zone localisée, décalée transversalement vers l'axe par rapport à la portée d'étanchéité correspondante.
Ainsi, les moyens formant soupape peuvent être montés sur le capuchon alors que celui-ci se trouve détaché du reste du bloc optique, et en particulier alors qu'il se trouve au sol, c'est-à-dire dans les meilleures conditions d'intervention, alors que le montage du capuchon sur l'embout et, par conséquent, le montage du joint assurant un passage unidirectionnel dans le cas de l'art antérieur cité en dernier, s'effectuent le plus souvent à plusieurs mètres du sol, dans des conditions peu commodes dans lesquelles il est préférable de ne pas devoir exécuter des opérations d'une certaine précision.
Des essais ont montré une totale fiabilité d'un joint annulaire à lèvre ainsi monté, pour constituer la soupape unidirectionnelle en particulier sur le capuchon.
D'autres caractéristiques et avantages d'un bloc optique selon l'invention ressortiront de la description ci-dessous, relative à un exemple non limitatif de réalisation, ainsi que des dessins annexés qui accompagnent cette description.
La figure 1 montre une vue d'une lanterne de luminaire d'éclairage public ou industriel comportant un bloc optique selon l'invention, en coupe par un plan vertical constituant un plan moyen de symétrie alors que le capuchon occupe sa position déterminée de montage sur l'embout tubulaire du réflecteur.
La figure 2 montre une vue en perspective du capuchon ainsi monté sur l'embout du réflecteur.
La figure 3 montre, en une vue en coupe suivant le même plan qu'à la figure 1, un détail repéré en A sur cette figure 1, à savoir la réalisation de la soupape unidirectionnelle selon cet exemple préféré.