INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Éliminer les surnageants avec précaution et reprendre chaque culot dans 5 ml de glycérol 10% (autoclave et conservé à-20 C) et regrouper les 4 volumes dans un seul tube ; centrifuger comme précédemment.
Éliminer les surnageants, reprendre le culot dans 400 u. 1 de glycérol 10%, Aliquoter par 40 III en eppendorf, congeler à-80 C.
Contrôle des bactéries compétentes : Les transformer avec un plasmide témoin selon le protocole décrit ci-après. Le titre doit être supérieur à 108 colonies par microgramme de vecteur transformé.
Elle s'applique notamment à la surveillance de la pression dans un puits de pétrole.
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE On sait que de nombreux capteurs résonants ont été fabriqués par micro-usinage du silicium. Ces capteurs permettent, en particulier, de mesurer des pressions absolues, des pressions différentielles, des viscosités, des densités, des contraintes, des forces et des déplacements.
Divers principes sont utilisables pour l'excitation et la lecture d'un capteur résonant et dépendent essentiellement de la fréquence de vibration de l'élément résonant de ce capteur et des performances que l'on vise.
En général, l'excitation consiste à donner une certaine quantité d'énergie à l'élément résonant. Cette énergie peut être fournie de façon temporaire ou permanente et peut être, par exemple, de nature acoustique, électrostatique ou optique.
La lecture, ou détection, est fondée sur la détermination de la fréquence de vibration de l'élément
résonant et peut être, par exemple, de nature capacitive, piézorésistive, optique ou acoustique.
L'utilisation de moyens optiques pour l'excitation et la détection est très séduisante car elle permet d'associer des fibres optiques à de tels moyens.
On connaît déjà divers capteurs résonants en silicium qui sont couplés à des moyens optiques d'excitation et de détection par l'intermédiaire de fibres optiques.
Pour exciter l'élément résonant en silicium de tels capteurs, il est nécessaire d'utiliser un rayonnement que le silicium est capable d'absorber, rayonnement dont la longueur d'onde est donc inférieure à celle à laquelle le silicium est transparent.
En fait, on utilise un effet photoélastique pour exciter cet élément résonant. L'énergie lumineuse est d'abord convertie en énergie thermique. A cause de l'absorption optique différentielle engendrée dans le silicium massif, un gradient thermique est créé. Ce dernier est alors converti en un gradient mécanique (une interaction thermo-mécanique étant mise en oeuvre).
On peut calculer la quantité d'énergie qui est nécessaire pour exciter convenablement l'élément résonant et créer une variation suffisante de l'amplitude de vibration de cet élément afin de détecter la fréquence de vibration. Cette quantité d'énergie dépend principalement du nombre de photons qui sont absorbés par l'élément.
Tous les capteurs résonants à excitation optique que l'on connaît utilisent, pour l'excitation
de leur élément résonant, des longueurs d'onde inférieures à la longueur d'onde de la bande interdite du silicium, c'est-à-dire 1100 nm. Au-delà de cette valeur, le silicium non dopé est transparent et son absorption est donc négligeable.
Malheureusement, des signaux optiques ayant de telles longueurs d'onde sont rapidement atténués par les fibres optiques en silice qui sont utilisées pour les télécommunications optiques et l'on ne peut donc transporter ces signaux sur de grandes distances avec de telles fibres.
EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention a pour but de remédier à cet inconvénient.
L'invention permet l'excitation optique de l'élément résonant des capteurs considérés plus haut à l'aide de rayonnements ayant des longueurs d'onde supérieures à 1100 nm, en particulier celles qui sont utilisées pour les télécommunications optiques.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique selon l'invention dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant : a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques telles que décrites cidessus ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation. Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit cidessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes des acides nucléiques selon l'invention, plus particulièrement des acides nucléiques de séquences SEQ ID N 12 à SEQ ID ? 22 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Ainsi, les sondes selon l'invention immobilisées sur un support peuvent être ordonnées en matrices telles que les"puces à ADN". De telles matrices ordonnées ont été en particulier décrites dans le brevet US No 5,143, 854, dans les demandes PCT NO WO 90/150 70 et 92/10092.
Des matrices supports sur lesquelles des sondes oligonucléotidiques ont été immobilisées à une haute densité sont par exemple décrites dans les brevets US N05, 412,087 et dans la demande PCT N WO 95/11995.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID ? 12 à SEQ ID N"22, ou encore un variant de celui-ci.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement un acide nucléique de séquences SEQ ID N012 à SEQ ID N022 ou un fragment ou un variant de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de :
a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection des acides nucléiques amplifiés.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID ? 12 à SEQ ID N022, ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3'de l'acide nucléique cible dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
2) Consommation réduite : Compte tenu du fait que les champs à générer pour l'écriture sont beaucoup plus faibles que dans l'art antérieur (typiquement 10 Oe dans la présente invention contre 50 Oe dans l'art antérieur), l'intensité des impulsions de champ à envoyer dans les lignes conductrices est grandement réduite.
De plus, une seule impulsion dans la ligne conductrice inférieure est nécessaire dans le cas de la figure 3, contre une impulsion dans la ligne conductrice inférieure et une impulsion dans la ligne conductrice supérieure dans l'art antérieur.
La puissance nécessaire pour provoquer l'échauffement du point mémoire étant beaucoup plus faible que pour générer les impulsions de champ de 50 Oe (typiquement lpJ pour chauffer de 2000C une jonction tunnel magnétique de 150 nm x 150 nm contre plusieurs dizaines de pJ pour générer une impulsion de champ de 50 Oe le long d'une ligne de 500 points mémoires), il s'ensuit que la consommation électrique peut être divisée par 10 avec le principe de fonctionnement de la présente invention.
3) Stabilité de l'information pour de petites dimensions : La présente invention permet d'utiliser, pour la couche de stockage, des matériaux à forte énergie de piégeage à température ambiante. Dans l'art antérieur,
cela n'est pas possible car plus le piégeage de la couche de stockage est important, plus il faut fournir d'énergie pour faire commuter l'aimantation de la couche de stockage.
Dans la présente invention, on abaisse l'énergie de piégeage lors de l'écriture en échauffant le matériau. On peut donc se permettre d'avoir une énergie de piégeage forte à température ambiante. Cela présente un avantage considérable pour de petites dimensions. En effet, dans l'art antérieur, l'information stockée dans la couche de stockage devient instable par rapport aux fluctuations thermiques à température ambiante.
En effet, si K et V désignent respectivement l'anisotropie magnétique par unité de volume (ou, plus généralement, l'énergie de piégeage par unité de volume) et le volume de la couche de stockage, l'information devient instable si KV < 25kT (où k est la constante de Boltzmann et T la température).
Pour un matériau donné, cette limite est toujours atteinte à un moment ou à un autre lorsqu'on diminue la taille du point mémoire alors que, dans la présente invention, on peut très bien compenser la diminution du volume par une augmentation de l'énergie de piégeage à température ambiante et donc réduire la taille du point mémoire autant que le permet le procédé de fabrication (par exemple lithographie/gravure) utilisé.
4) Simplicité de la réalisation si l'on utilise comme principe de commutation un échauffement plus une injection d'un courant d'électrons à spin
polarisé : En effet, il n'y a pas besoin, dans ce cas, de rajouter un niveau de lignes pour la génération des champs magnétiques locaux. La réalisation de l'ensemble des. points mémoires s'en trouve simplifiée, ce qui peut permettre d'atteindre des densités d'intégration supérieures.
On reviendra plus loin sur l'utilisation, dans la présente invention, d'un courant d'électrons à spin polarisé.
On considère, dans ce qui suit, divers exemples de l'invention.
Comme on l'a vu plus haut, la structure de base, dans la présente invention, comporte deux couches magnétiques Fl et F2 séparées par une barrière tunnel 0 de sorte que l'on peut noter cette structure Fl/O/F2.
Les deux couches magnétiques sont telles que le champ de retournement de l'aimantation de l'une de ces deux couches magnétiques (la couche de stockage) décroît beaucoup plus vite, lorsque la température augmente, que celui de l'autre couche magnétique (la couche de référence).
Dans un premier mode de réalisation de l'invention, les aimantations des deux couches Fl et F2 sont perpendiculaires au plan des couches ou, plus précisément, aux interfaces de ces couches.
Des couches Fl et F2 peuvent être constituées d'un matériau pur, d'un alliage ou d'un ensemble de couches alternées dont certaines sont magnétiques.
Méthodes : Les animaux sont sacrifiés par irradiation aux micro-ondes, les cerveaux sont rapidement disséqués sur une plaque de verre. De nombreuses structures cérébrales et divers noyaux sont isolés et conservés dans l'azote liquide jusqu'à l'analyse. Après pesée de chaque structure, les tissus sont homogénéisés dans 10 volumes d'acide perchlorique (w/v) et centrifugés. Les surnageants sont
analysés par HPLC avec détection électrochimique. La limite de détection est de 0.05 nmoles/g de poids frais.
Résultats : Les résultats sont présentés sur la Figure 7. Ils montrent une concentration hétérogène, particulièrement élevée dans le cervelet et le bulbe olfactif.
4. IDENTIFICATION ET CARACTERISATION DES SITES DE FIXATION POUR L'ACIDE XANTHURENIQUE DANS LE CERVEAU DE RAT.
Protocole de préparation des membranes synaptiques : Les membranes synaptiques ont été préparées selon le protocole décrit ci-après.
10) Prélèvement rapide de deux cerveaux entiers de rats mâles Wistar (décapitation) et pesée des cerveaux.
2 ) Homogénéisation des cerveaux dans 10 x le poids en volume de solution S : S = sucrose 0.32 M KH2P04 10 mM pH 6. 0 EDTA 1 mM 30) Centrifugation à 915 g à 4 C pendant 10 minutes (Du Pont Instruments, Sorvall RC-5B) et récupération du surnageant.
4 ) Centrifugation à 18200 g à 40C pendant 20 minutes (Du Pont Instruments, Sorvall RC-5B).
5 ) Prélèvement du culot et éclatement des synaptosomes dans 70 x le poids en volume d'eau distillée à 0 C. Polytroner 30 secondes à vitesse maximale.
6 ) Partage dans des tubes de centrifugation Beckman selon le volume et centrifugation à 51000 g à 40C (Beckman, ultracentrifugeuse L8-70M) pendant 20 minutes.
7 ) Lavage des culots dans le tampon KH2PO4 50 mM pH 6.0 à 0 C
8 ) Partage dans des tubes de centrifugation Beckman selon le volume et centrifugation à 51000 g à 4 C (Beckman, ultracentrifugeuse L8-70M) pendant 20 minutes.
9 ) Récupération et congélation des culots à -800C.
Partie 1 : ETUDE DES CARACTERISTIQUES PHARMACOLOGIQUES DU SITE DE LIAISON DE L'ACIDE XANTHURENIQUE SANS IONS Protocole de liaison Protocole classique : Le binding est réalisé dans du tampon Pipes 50 mM pH 7,4 à OOC (sur glace) en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.1 à 0.3 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié ([3H]-AX en concentration variable selon le type d'expérience) et soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale : LT) soit de l'acide xanthurénique"froid"non tritié (Sigma) à 2 mM (pour la détermination de la liaison non spécifique : LNS). La soustraction entre liaison totale et liaison non spécifique donne la liaison spécifique : LS. Le temps d'incubation est de 25 min. La filtration qui permet la séparation du [3H]-AX libre du [3H]-AX fixé à son (ses) site (s) de binding s'effectue par aspiration rapide du milieu d'incubation à travers des filtres en fibres de verre (GF/B) whatman qui sont ensuite lavés de façon successive 2 fois par du tampon Pipes 50 mM pH 7,4 froid (en tout 3x3 ml). Les filtres sont placés dans des fioles de comptage et on y ajoute 5 ml de Rotiszint@ (Roth). Le comptage s'effectue dans un compteur à scintillation liquide (Beckman LS6000sc).
Protocole pour la détermination de l'effet pH : Le binding est réalisé selon le modèle classique : Le milieu d'incubation est préparé à partir de tampon Pipes 50 mM à différents pH (pH étudiés : 5,5 ; 6,0 ; 6, 5 ; 7,0 ; 7,5 ; 8,0). La concentration en acide xanthurénique tritié ([3H]-AX) est de 200 nM et pour l'étude de la liaison non spécifique on utilise une concentration de 2 mM
d'acide xanthurénique non tritié (AX). La soustraction entre liaison totale et liaison non spécifique donne la liaison spécifique qui varie en fonction du pH. Les résultats présentés dans la Figure 8 montrent que le pH optimum de binding de l'acide xanthurénique est de 7,4-7, 5.
Laisser agir pendant 10 minutes dans la glace.
Centrifuger à 10000g pendant 10 minutes à 4 C.
Récupérer le surnageant et conserver à-20 C B/Test de la spécificité du clivage des peptides "sites d'autolyse" par la calpaïne 3 Avant de vérifier si la calpaïne 3 peut cliver les peptides correspondant à ses sites d'autolyse, un premier test a consisté à vérifier que ces peptides (site 1, site 2, site 3) ne pouvaient pas être clivés par d'autres protéases, en particulier par les calpaïnes
ubiquitaires (voir figure 2). Les calpaïnes 1 et 2 n'ont pas d'activité de clivage sur chacun des sites d'autolyse puisque les courbes contrôles"peptide sans enzyme"se superposent aux courbes"peptide + enzyme"Des résultats analogues ont été obtenus avec une autre protéase, la caspase 3.
On sait que la calpaïne 3 a une stabilité plus importante dans les cellules musculaires en raison de la présence de la titine. Dans le but de prouver que la calpaïne 3 pouvait cliver ses propres sites d'autolyse, on la surexprime donc dans des cellules C2C12 en transfectant ces cellules avec un plasmide codant pour la calpaïne 3. Une transfection témoin avec pECFP a été réalisée en même temps que la transfection avec le plasmide codant pour la calpaïne 3. L'efficacité de transfection sur les C2C12 est inférieure à 10%. Les protéines sont ensuite extraites et leur activité est testée sur les sites d'autolyse (Figure 3).
Les courbes représentant l'activité d'extraits de C2C12 transfectées ou non transfectées sur les sites 1 et 2 montrent une légère augmentation de fluorescence, ce qui pourrait vouloir dire que la calpaïne 3 peut cliver ces sites. La calpaïne 3 est une protéine exprimée dans le muscle donc l'activité basale observée pour les extraits de cellules non transfectées est normale. Cependant, aucune différence ne peut être détectée entre cellules transfectées ou non transfectées pour les sites 1 et 2. En revanche, sur le site 3, l'activité de clivage est plus importante chez les cellules transfectées. La différence est minime mais elle est cohérente avec le faible pourcentage de cellules transfectées.
On teste ensuite le système sur des extraits de cultures cellulaires déficientes ou non en calpaïne 3. Pour ce faire, on part de souris déficientes pour le gène de la calpaïne 3 pour lesquelles des cultures de cellules myogéniques ont été dérivées [Richard, 2000].
Des extraits de cultures de cellules musculaires déficientes en calpaine 3 (cellules-/-) peuvent donc être comparées à des extraits de cultures de cellules musculaires normales (cellules +/+). Dans un premier temps, le test a été effectué sur des cellules non différenciées (myoblastes) (Figure 4).
Ces expériences ont permis de montrer qu'une faible activité de clivage pouvait être détectée sur le site 1. La différence d'activité entre les cellules +/+ et-/-est cependant très faible. Aucune activité de clivage n'a pu être détectée sur le site 2. Une activité de clivage est détectée sur le site 3 mais aucune différence d'activité n'est visible entre cellules +/+ et cellules-/-.
Pour essayer de mettre en évidence une différence d'activité plus importante entre des extraits +/+ et des extraits-/-, les mêmes tests ont été réalisés sur des extraits de cellules musculaires différenciées en myotubes (Figure 5). La calpaïne 3 est en effet théoriquement plus exprimée dans les myotubes que dans les myoblastes.
Cette expérience permet de montrer que l'activité de clivage du site 3 dans les extraits de cellules-/-est plus important que dans les extraits de cellules +/+, ce qui est étonnant puisque la déficience en calpaïne 3 est la seule différence entre les cellules +/+ et les cellules-/-. Une diminution d'activité dans les cellules déficientes en calpaïne 3 serait donc plus vraisemblable.
Pour essayer de mettre en évidence une plus forte différence d'activité entre extraits de cellules +/+ et de cellules-/-, la même réaction a été réalisée sur 6h au lieu de Ih (Figure 6) L'activité de clivage sur les sites 1 et 2 est plus importante dans des extraits de cellules +/+ que dans des extraits de cellules-/-. L'augmentation d'activité sur le site 3 est ici confirmée lorsque la réaction se fait sur 6h. L'activité est plus importante dans des extraits de cellules-/-que dans des extraits de cellules +/+. Ces expériences permettent de montrer que, lorsque le test se fait sur six heures, l'activité de clivage sur les 3 sites permet de différencier les types cellulaires +/+ et-/-.
Des tests d'activité ont également été réalisés sur des lysats de muscles de souris déficientes ou non en calpaïne 3. Les tests ont été faits à partir de lysats de quadriceps (Figure 7).
L'activité de clivage des sites 1 et 2 par les extraits de tissus +/+ est plus importante que celle des extraits de tissus-/-. L'activité de clivage du site 3 par les extraits de tissus-/-est plus importante que celle des extraits de tissus +/+. Ces expériences ont permis de montrer que les résultats obtenus à partir d'extraits tissulaires sont
similaires à ceux obtenus à partir d'extraits cellulaires. En particulier, une plus forte activité sur le site 3 par des extraits où la calpaïne 3 n'est pas présente est confirmée.
Cette activité serait donc vraisemblablement due à une autre protéase dont l'activité est activée en absence de calpaïne 3.
Réponse p04leelpurt[tll
PIM p 0 = carte mère, 1 = pim Périphérique u 1 (carte mère), 1 - 4 4 (périphériques) Relais r 1 - 4 4 Temps t 1 - 255 [niveau = observation~seulement] 3. 005 ETAPE DE PROGRAMME - FIXATION D'APPELS D'ALARME ~~~~~~~
Description Unité Plage Validation d'appels d'alarme P51e Nombre de chiffres d'argument = 1 Validation e 0 = invalidé 1 = valider les appels d'alarme vers télécopie 2 = valider les appels d'alarme vers modem 3 = valider les appels d'alarme vers connexion directe 4 = valider les appels d'alarme vers imprimante 5 = valider les appels d'alarme vers radiomessageur 6 = valider les appels d'alarme vers société d'intervention Réponse p05 ee e Commentaire : Si les appels d'alarme ne sont pas permis dans une zone géographique, la valeur "Appel d'Alarme" sera fixée par défaut à "Invalidé" et ne peut pas être changée.
[niveau = vendeur]
3. 005.1 ETAPE DE PROGRAMME - VERIFICATION D'APPELS D'ALARME
Description Unité Plage Validation d'appel d'alarme P5
Réponse p05 (ee je j~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
Validation e 0 = invalidé ~~~~~~~~~~~ 1 = valider les appels d'alarme
~~~~~~~~~~~ vers télécopie ~~~~~~~~
2 = valider les appels d'alarme vers modem 3 = valider les appels d'alarme
~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ vers connexion directe 4 = valider les appels d'alarme ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ vers imprimante ~~~~~~~~~
5 = valider les appels d'alarme vers radiomessageur 6 = valider les appels d'alarme vers société d'intervention [niveau = observation~seulement] 3. 006 ETAPE DE PROGRAMME - FIXATION D'IDENTIFICATEUR (ID) D'UNITE (POUR ID D'UNITE D'APPEL D'ALARME)
ID d'unité P6!elx[x] ou P6!ol
Nombre de chiffres d'argument > = Fixation/Restauration e 0 = restauration de l'ID d'unité à l'ID d'usine 1 = fixation de l'ID d'unité ID x 1-20 caractères (non nécessaire pour la restauration) Réponse p06 ee x [x] Commentaire : Si l'ID d'unité d'appel d'alarme n'est pas défini, l'ID d'usine est utilisé [niveau = vendeur]
3. 006.1 ETAPE DE PROGRAMME - VERIFICATION D'ID D'UNITE (ID D'UNITE D'APPEL D'ALARME)
L'invention est également relative à des vecteurs recombinants, de clonage ou d'expression, contenant un acide nucléique selon l'invention, le cas échéant sous le contrôle d'une séquence régulatrice permettant son expression dans une cellule hôte choisie.
Elle concerne aussi des cellule hôte recombinantes dans lesquelles a été artificiellement inséré un acide nucléique ou un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus.
L'invention a également pour objet un polypeptide à boîte F comprenant une séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID N01 à SEQ
ID N'17, un fragment ou un variant de ce polypeptide, ainsi que des anticorps dirigés contre ce polypeptide ou encore le fragment ou le variant de celui-ci..
Elle est également relative à des procédés de criblage acelulaires ou cellulaires de composés candidats interagissant avec un polypeptide à boîte F tel que défini ci-dessus.
Elle concerne aussi des procédés de criblages de composés candidats modulant la force de l'interaction entre un polypeptide à boîte F selon l'invention et une protéine appartenant à un complexe SCF.
Elle a encore pour objet une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un acide nucléique ou d'un vecteur recombinant tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles..
Elle concerne aussi une composition pharmaceutique comprenant une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'invention, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
DEFINITIONS GENERALES Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1984) et AUSUBEL et al. (1994).
De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présente sous une forme isolée ou purifiée.