INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
2) il existerait également une corrélation entre le pronostic du neuroblastome et le rapport des catécholamines VMA (vanilmandelic acid)/ HVA (homovanillic acid), au moment du diagnostic. Dans les stades avancés, une excrétion urinaire élevée d'HVA et basse de VMA, voire normale, signerait un mauvais pronostic (Laug et al Pediatrics. 1978 ; 62(1):77-83).
3) l'augmentation de la ferritine sérique dans les neuroblastomes est également considérée comme un facteur de mauvais pronostic (Evans et al, Cancer.
1987 ; 59(11):1853-9).
4) le taux de LDH (lactate deshydrogénase) pourrait également être un facteur de pronostic indépendant et prédominant pour les stades localisés I à III chez l'enfant de plus d'un an, et de façon moins importante chez l'enfant de moins d'un an avec un stade IV (Berthold et al, Am J Pediatr Hematol Oncol. 1994 ; 16 (2):107-15).
Toutefois, la corrélation entre l'amplification de l'oncogène N-myc et le pronostic du neuroblastome n'est pas absolue (Maris & Matthay, J Clin Oncol, 1999, 17(7) : 2264-2279). De plus la LDH et la ferritine étant deux facteurs corrélés entre eux, la fiabilité de ces facteurs pour le pronostic du neuroblastome reste discutée (Berthold et al, 1992, Am J Pediatr Hamtol Oncol, 14(3) : 207-215). Enfin, l'utilisation du rapport VMA/HVA donne une sensibilité et une spécificité insuffisantes pour le pronostic du neuroblastome.
La présente invention se propose de résoudre l'ensemble des inconvénients de l'état de la technique en présentant un nouvel outil de pronostic du neuroblastome.
D'une manière surprenante, les inventeurs ont mis en évidence que le pronostic d'un neuroblastome peut être déterminé par l'analyse de l'expression de gènes cibles sélectionnés parmi 37 gènes tel que présenté dans le tableau 1 ci après, qui sont exprimés différentiellement selon que le patient soit de bon ou de mauvais pronostic.
Tableau 1 - liste des 37 gènes cibles selon l'invention
La stringence est définie notamment en fonction de la composition en bases des deux fragments nucléotidiques, ainsi que par le degré de mésappariement entre deux fragments nucléotidiques. La stringence peut également être fonction des paramètres de la réaction, tels que la concentration et le type d'espèces ioniques présentes dans la solution d'hybridation, la nature et la concentration d'agents dénaturants et/ou la température d'hybridation. Toutes ces données sont bien connues et les conditions appropriées peuvent être déterminées par l'homme du métier. En général, selon la longueur des fragments nucléotidiques que l'on souhaite hybrider, la température
d'hybridation est comprise entre environ 20 et 70 C, en particulier entre 35 et 65 C dans une solution saline à une concentration d'environ 0,5 à 1 M. Une séquence, ou fragment nucléotidique, ou oligonucléotide, ou polynucléotide, est un enchaînement de motifs nucléotidiques assemblés entre eux par des liaisons ester phosphorique, caractérisé par la séquence informationnelle des acides nucléiques naturels, susceptibles de s'hybrider à un fragment nucléotidique, l'enchaînement pouvant contenir des monomères de structures différentes et être obtenu à partir d'une molécule d'acide nucléique naturelle et/ou par recombinaison génétique et/ou par synthèse chimique. Un motif est dérivé d'un monomère qui peut être un nucléotide naturel d'acide nucléique dont les éléments constitutifs sont un sucre, un groupement phosphate et une base azotée ; dans l'ADN le sucre est le désoxy-2-ribose, dans l'ARN le sucre est le ribose ; selon qu'il s'agisse de l'ADN ou l'ARN, la base azotée est choisie parmi l'adénine, la guanine, l'uracile, la cytosine, la thymine ; ou bien le monomère est un nucléotide modifié dans l'un au moins des trois éléments constitutifs ; à titre d'exemple, la modification peut intervenir soit au niveau des bases, avec des bases modifiées telles que l'inosine, la méthyl-5désoxycytidine, la désoxyuridine, la diméthylamino-5désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5désoxyuridine ou toute autre base modifiée capable d'hybridation, soit au niveau du sucre, par exemple le remplacement d'au moins un désoxyribose par un polyamide (P. E. Nielsen et al, Science, 254, 1497-1500 (1991), soit encore au niveau du groupement phosphate, par exemple son remplacement par des esters notamment choisis parmi les diphosphates, alkyl- et aryl-phosphonates et phosphorothioates.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le réactif spécifique comprend au moins une amorce d'amplification. Au sens de la présente invention, on entend par amorce d'amplification, un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, préférentiellement de 15 à 30 motifs nucléiques permettant l'initiation d'une polymérisation enzymatique, telle que notamment une réaction d'amplification enzymatique. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'amorce d'amplification comprend une séquence choisie parmi les SEQ ID N 38 à 41 et SEQ ID N 44 à 45. Par réaction d'amplification enzymatique, on entend un
processus générant de multiples copies d'un fragment nucléotidique par l'action d'au moins une enzyme. De telles réactions d'amplification sont bien connues de l'homme du métier et on peut citer notamment les techniques suivantes : PCR (Polymerase Chain Reaction), telle que décrite dans les brevets US 4,683,195, US 4,683,202 et US 4,800,159, LCR (Ligase Chain Reaction), exposée par exemple dans la demande de brevet EP 0 201 184, - RCR (Repair Chain Reaction), décrite dans la demande de brevet WO 90/01069, - 3SR (Self Sustained Séquence Replication) avec la demande de brevet WO 90/06995, - NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) avec la demande de brevet WO 91/02818, et TMA (Transcription Mediated Amplification) avec le brevet US 5,399,491.
Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR, le réactif spécifique comprend au moins 2 amorces d'amplification, spécifiques d'un gène cible, et permettent l'amplification du matériel spécifique du gène cible. Le matériel spécifique du gène cible comprend alors préférentiellement un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse d'ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible) ou un ARN complémentaire obtenu par transcription des ADNc spécifique d'un gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible).
Lorsque l'amplification enzymatique est une PCR réalisée après une réaction de transcription reverse, on parle de RT-PCR.
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, le réactif spécifique de l'étape b) comprend préférentiellement une sonde d'hybridation.
Par sonde d'hybridation, on entend un fragment nucléotidique comprenant de 5 à 100 motifs nucléiques, notamment de 10 à 35 motifs nucléiques, possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec le matériel spécifique d'un gène cible. Dans la présente invention, le matériel spécifique du gène cible peut être une séquence nucléotidique comprise dans un ARN messager issu du gène cible (on parle alors d'ARNm spécifique du
gène cible), une séquence nucléotidique comprise dans un ADN complémentaire obtenu par transcription inverse dudit ARN messager (on parle alors d'ADNc spécifique du gène cible), ou encore une séquence nucléotidique comprise dans un ARN complémentaire obtenu par transcription dudit ADNc tel que décrit précédemment (on parlera alors d'ARNc spécifique du gène cible). La sonde d'hybridation peut comprendre un marqueur permettant sa détection. Par détection on entend soit une détection directe par une méthode physique, soit une détection indirecte par une méthode de détection à l'aide d'un marqueur. De nombreuses méthodes de détection existent pour la détection des acides nucléiques. [Voir par exemple Kricka et al., Clinical Chemistry, 1999, n 45 (4), p. 453-458 ou Keller G.H. et al., DNA Probes, 2nd Ed., Stockton Press, 1993, sections 5 et 6, p. 173-249]. Par marqueur, on entend un traceur capable d'engendrer un signal que l'on peut détecter.
Une liste non limitative de ces traceurs comprend les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence ou luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la beta galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase ; chromophores comme les composés fluorescents, luminescents ou colorants ; les groupements à densité électronique détectables par microscopie électronique ou par leurs propriétés électriques comme la conductivité, par les méthodes d'ampérométrie ou de voltamétrie, ou par des mesures d'impédance ; les groupements détectables par des méthodes optiques comme la diffraction, la résonance plasmon de surface, la variation d'angle de contact ou par des méthodes physiques comme la spectroscopie de force atomique, l'effet tunnel, etc. ; les molécules radioactives comme 32P, 35S ou 1251.
Au sens de la présente invention, la sonde d'hybridation peut être une sonde dite de détection. Dans ce cas, la sonde dite de détection est marquée au moyen d'un marqueur tel que défini précédemment. La sonde d'hybridation peut être également une sonde dite de capture. Dans ce cas, la sonde dite de capture est immobilisée ou immobilisable sur un support solide par tout moyen approprié, c'est-à-dire directement ou indirectement, par exemple par covalence ou adsorption. Comme support solide, on peut utiliser des matériaux de synthèse ou des matériaux naturels, éventuellement modifiés chimiquement, notamment les polysaccharides tels que les
matériaux à base de cellulose, par exemple du papier, des dérivés de cellulose tels que l'acétate de cellulose et la nitrocellulose ou le dextrane, des polymères, des copolymères, notamment à base de monomères du type styrène, des fibres naturelles telles que le coton, et des fibres synthétiques telles que le nylon ; des matériaux minéraux tels que la silice, le quartz, des verres, des céramiques ; des latex ; des particules magnétiques ; des dérivés métalliques, des gels etc. Le support solide peut être sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une membrane comme décrit dans la demande WO-A-94/12670, d'une particule. On peut également immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. En particulier, on peut utiliser comme support une biopuce sur laquelle peuvent être immobilisées un grand nombre de sondes. Par biopuce, on entend un support solide de dimension réduite où sont fixée une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. Le concept de biopuce, ou puce à ADN, date du début des années 90. Il repose sur une technologie pluridisciplinaire intégrant la micro- électronique, la chimie des acides nucléiques, l'analyse d'images et l'informatique.
Le principe de fonctionnement repose sur un fondement de la biologie moléculaire : le phénomène d'hybridation, c'est-à-dire l'appariement par complémentarité des bases de deux séquences d'ADN et/ou d'ARN. La méthode des biopuces repose sur l'emploi de sondes de capture fixées sur un support solide sur lesquelles on fait agir un échantillon de fragments nucléotidiques cibles marqués directement ou indirectement avec des fluorochromes. Les sondes de capture sont positionnées de manière spécifique sur le support ou puce et chaque hybridation donne une information particulière, en relation avec le fragment nucléotidique cible. Les informations obtenues sont cumulatives, et permettent par exemple de quantifier le niveau d'expression d'un gène ou de plusieurs gènes cibles. Pour analyser l'expression d'un gène cible, on peut alors réaliser une biopuce portant de très nombreuses sondes qui correspondent à tout ou partie du gène cible, qui est transcrit en ARNm. On hybride alors par exemple les ADNc ou les ARNc spécifiques d'un gène cible que l'on souhaite analyser sur des sondes de capture spécifique. Après hybridation, le support ou puce est lavé (e), les complexes ADNc ou ARNc marquées/ sondes de capture sont révélés par un ligand de forte affinité lié par
exemple à un marqueur de type fluorochrome. La fluorescence est lue par exemple par un scanner et l'analyse de la fluorescence est traitée par informatique. On peut citer à titre indicatif, les puces à ADN mises au point par la société Affymetrix ("Accessing Genetic Information with High-Density DNA arrays", M. Chee et al., Science, 1996,274, 610-614. "Light-generated oligonucleotide arrays for rapide DNA séquence analysis", A. Caviani Pease et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, 91, 5022-5026), pour les diagnostics moléculaires. Dans cette technologie, les sondes de capture sont généralement de tailles réduites, autour de 25 nucléotides. D'autres exemples de biopuces sont donnés dans les publications de G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n 16, p. 40-44 ; Ginot, Human Mutation, 1997, n 10, p.l- 10 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n l(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n 22 (15), p. 2915-2921 ; Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n 16, p. 541-546 ou dans les brevets US-A-4,981,783, US-A- 5,700,637, US-A-5,445,934, US-A-5,744,305 et US-A-5,807,522. La caractéristique principale du support solide doit être de conserver les caractéristiques d'hybridation des sondes de capture sur les fragments nucléotidiques cibles tout en générant un bruit de fond minimum pour la méthode de détection.
Pour l'immobilisation des sondes sur le support, on distingue trois grands types de fabrication.
Il y a, tout d'abord, une première technique qui consiste en un dépôt de sondes pré-synthétisées. La fixation des sondes se fait par transfert direct, au moyen de micropipettes, de micro-pointes ou par un dispositif de type jet d'encre. Cette technique permet la fixation de sondes de taille allant de quelques bases (5 à 10) jusqu'à des tailles relativement importantes de 60 bases (impression) à quelques centaines de bases (micro-déposition) : L'impression est une adaptation du procédé utilisé par les imprimantes à jet d'encre. Elle repose sur la propulsion de très petites sphères de fluide (volume <1 ni) et à un rythme pouvant atteindre 4000 gouttes/secondes. L'impression n'implique aucun contact entre le système libérant le fluide et la surface sur laquelle il est déposé.
Chaque premier transistor 28 reçoit sur sa grille de commande un courant de référence IREF issu d'un générateur de courant 36, lequel constitue une partie de l'amplificateur de lecture 12 par ailleurs utilisé en mode normal de fonctionnement de la mémoire 110. Le générateur de courant 36 comprend, de manière classique, un source de courant constant 38 reliée d'une part à la masse et d'autre part à la grille et au drain d'un transistor MOS 40, celui-ci étant monté en diode. La source de ce transistor est relié à une tension d'alimentation est constitue le transistor symétrique vis-à-vis des premiers transistors 28. La sortie du courant IREF est prise au noeud commun entre le transistor 40 et le générateur de courant 38.
De la sorte, chacun des N circuits élémentaires constitue un générateur de courant capable de contribuer un courant de IREF à la sortie 34 du courant de lecture Ilect. L'activation de la sortie IREF d'un circuit élémentaire 26-i (pour 1# i# N) est commandé par le niveau logique d'un signal EPIi présenté à la grille de son transistor de commutation 32. S'agissant d'un transistor PMOS, la sortie IREF sera active lorsque le signal EPIi=0 et bloquée lorsque EPIi=l.
Comme le montre la figure 7, les N signaux EPIi sont fournis sur N sorties parallèles (parallèles) des étages respectifs d'un registre à décalage 42 à N étages, respectivement ED1 à EDN. Ce registre comprend par ailleurs une entrée série Eser, une sortie série Ser pour une fonction de registre du type FIFO, ainsi qu'une entrée d'horloge Clk permettant de cadencer
l'avancement des données numériques le long des étages successifs ED1 à EDN du registre 42.
Comme le montre la figure 8, le générateur de tension programmable 20 est conçu comme l'homologue, en termes de tension, du générateur de courant programmable 18.
Il comprend deux blocs principaux : - un bloc 46 de générateurs de tensions de référence, qui comprend M étages identiques, respectivement 48-1 à 48-M, chaque étage ayant une sortie, respectivement 50-1 à 50-M qui fournit une tension qui lui est spécifique. Cette tension est égale à une tension de référence VREF multipliée par un entier allant de 1 à M, de sorte que chaque étage 48-j (pour 1# j# M) produit à sortie 50-j une tension égale à j. VREF.
- un bloc de commutateurs programmables 52, qui comprend M commutateurs individuels, respectivement 54- 1 à 54M. Chaque commutateur 54-j comporte une entrée reliée à la sortie 50-j d'un étage respectif 48-j du bloc 46 de générateurs de tension et une sortie 56, mise en commun avec toutes les autres sorties de commutateur. Cette sortie commune 56, qui constitue la sortie du générateur de tensions programmable 44, est reliée sélectivement à la grille d'un transistor FGT d'une cellule via le circuit de routage.
Chaque étage 48-j du bloc de générateurs de tension 46 comprend un premier et un second transistors en série 58 et 60, la source du premier étant reliée au drain du second à un neud commun qui constitue la sortie 50-j de l'étage. Ces deux transistors 58 et 60 sont par ailleurs reliés entre eux par leur grille. Le drain du premier transistor 58 est relié à une tension d'entrée VEN et la source du second transistor 60 est reliée à un potentiel prédéterminé.
Cette configuration est dimensionnée de sorte que chaque étage 48-j produise sa tension spécifique précitée de j. VREF.
Chaque commutateur individuel 54-j du bloc de commutateurs programmables 52 comprend un premier et un second transistors en parallèle 62 et 64, de polarité opposée, chacun relié par sa source/son drain à la sortie respective 50-j d'un étage 48-j du générateur de tensions et par son drain/sa source à la sortie commune 56. Les premier et second transistors 62 et 64 d'un commutateur 54-j fonctionnent en logique complémentaire de manière à ouvrir la connexion entre la sortie 50-j et la sortie commune 56 lorsque leurs grilles ce commande sont à une tension de logique 1 et fermer cette connexion dans le cas contraire.
Les grilles des premier et second transistors 62 et 64 du bloc de commutateurs programmables 52 sont reliées à des sorties parallèles respectives EPV1 à EPVM d'un registre à décalage 66 à M étages, respectivement EU1 à EUM.
Comme le montre la figure 9, ce registre comporte une entrée d'horloge Clk pour le cadencement de la propagation des données, une entrée série EVser et une sortie série SVser, de manière analogue au registre 42 de la figure 7. Bien entendu, les registres à décalage 42 et 66 peuvent être matériellement un même registre à reconfigurable pour sortir les soit les signaux EPI1EPIN, soit les signaux EPV1-EPVM.
Il sera maintenant décrit le fonctionnement du premier mode de réalisation.
Dans les conditions normales de fonctionnement du composant, la tension de commande de grille du transistor FGT est fixée à une valeur dans une plage entre OV et la tension de seuil de cellule effacée de manière à distinguer entre un état d'écriture (où la
cellule conduit le courant de lecture) et un état d'effacement (où la cellule ne conduit pas le courant de lecture).
Or, dans les conditions de test fonctionnel, la tension de grille doit être variable afin de reproduire d'une par la tension de seuil de cellule vierge, désignée VTvierge, et d'autre part la tension de seuil de cellule effacée, désignée VTeff' Il est à noter que l'on utilise partiellement la même structure pour extraire à la fois la tension de seuil VTvierged'une cellule vierge et la tension de seuil VTeff d'une cellule effacée. Les seules différences concernent la tension de polarisation Vin, qui peut être positionnée à deux valeurs différentes : - une valeur de surtension Vboost, produite par le générateur de surtension 22 (cf. figure 5), pour extraire la valeur de tension seuil d'une cellule effacée VTeff' Pour plus d'informations concernant cette valeur de surtension, on peut se référer à l'article de T. Tanzawa et al. "Optimization of wordline booster circuits for single power supply flash memories", IEEE J. of Solid State Circuits, Vo1.32, No.8, pp.1091-1098, août 1999 ; - la tension d'alimentation Vdd pour extraire la valeur de tension de seuil VTvierge d'une cellule vierge.
Lorsque le au moins un réactif spécifique mis en contact l'étape b) du procédé selon l'invention comprend au moins une sonde d'hybridation, on peut également déterminer l'expression d'un gène cible de la manière suivante:
1) après avoir extrait, comme matériel biologique, les ARN totaux d'un échantillon biologique telle que présentée précédemment, on réalise une étape de transcription reverse, telle que décrite précédemment afin d'obtenir les ADNc des ARNm du matériel biologique. On réalise ensuite la polymérisation de l'ARN complémentaire du ADNc par l'utilisation d'une enzyme polymerase de type T7 polymérase qui fonctionnent sous la dépendance d'un promoteur et qui permettent d'obtenir, à partir d'une matrice d'ADN, l'ARN complémentaire. On obtient alors les ARNc des ADNc des ARNm spécifiques du gène cible (on parle alors d'ARNc spécifique du gène cible) et les ARNc des ADNc des ARNm non spécifiques du gène cible.
2) on met en contact tous les ARNc avec un support, sur lequel sont immobilisées des sondes de capture spécifiques du gène cible dont on souhaite analyser l'expression, afin de réaliser une réaction d'hybridation entre les ARNc spécifiques du gène cible et les sondes de capture, les ARNc non spécifiques du gène cible ne s'hybridant pas sur les sondes de capture. Lorsque l'on souhaite analyser simultanément l'expression de plusieurs gènes cibles, on peut immobiliser sur le support plusieurs sondes de capture différentes, chacune étant spécifique d'un gène cible. La réaction d'hybridation peut également être précédée d'une étape de marquage et/ou de clivage des ARNc spécifiques du gène cible telles que décrites précédemment.
3) on réalise ensuite une étape de détection de la réaction d'hybridation. La détection peut être réalisée par la mise en contact du support sur lequel sont hybridées les sondes de capture spécifiques du gène cible avec l'ARNc spécifique du gène cible avec une sonde dite de détection, marquée par un marqueur, et on détecte le signal émis par le marqueur. Lorsque l'ARNc spécifiques du gène cible a été préalablement marqué par un marqueur, on détecte directement le signal émis par le marqueur. L'utilisation d'ARNc est particulièrement avantageux lorsqu'on utilise un support de type biopuce sur lequel est hybridés un grand nombre de sondes.
L'analyse de l'expression d'un gène cible choisi parmi l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 37 permet alors de disposer d'un outil pour le pronostic du neuroblatome. On
peut par exemple analyser l'expression d'un gène cible chez un patient dont on ne connaît pas le pronostic, et comparer avec des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients de bon pronostic et des valeurs d'expression moyenne connues du gène cible de patients de mauvais pronostic. Ceci permet de déterminer si le patient est de bon ou de mauvais pronostic afin de lui proposer un traitement adapté.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, lors de l'étape b) on met en contact le matériel biologique avec au moins 37 réactifs spécifiques choisis parmi les réactifs spécifiques des gènes cibles présentant une séquence nucléique ayant l'une quelconque des SEQ ID N 1 à 37 et on détermine, lors de l'étape c, l'expression d'au moins 37 desdits gènes cibles.