INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les Bifidobacterium sont de préférence ensemencés dans le substrat aqueux à raison de 1.104 à 4.109 unités formant colonies (UFC) par ml de substrat. Cet ensemencement peut s'effectuer par exemple par addition au substrat aqueux, dans des proportions adaptées, d'un concentré congelé de Bifidobacterium, ou d'une pré culture sur milieu permettant la croissance de bifidobactéries.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, le pH du substrat aqueux est maintenu à une valeur comprise entre 6 et 8 environ pendant toute la période d'incubation, et encore plus préférentiellement entre 6,5 et 7,5. Le maintien du pH est de préférence réalisé par une neutralisation en continu du substrat aqueux à l'aide d'un agent alcalinisant tel que décrit précédemment ou par une solution d'ammoniaque diluée (de préférence au demi).
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, la température du substrat est maintenue à une valeur comprise entre 37 et 40 C environ pendant toute la durée de l'incubation, celle-ci étant généralement comprise entre 10 et 20 heures.
Selon une forme de réalisation préférée du procédé conforme à l'Invention, les ingrédients du substrat aqueux sont présents dans les quantités suivantes : i) perméat de lactosérum : de 3 à 80 g environ et encore plus préférentiellement de 40 à 60 g environ, ii) hydrolysat de protéines de lactosérum : de 2 à 80 g environ et encore plus préférentiellement de 5 à 15g environ, iii) lactose : de 5 à 50 g environ et encore plus préférentiellement de 10 à 30 g environ, ces quantités étant données par litre dudit substrat aqueux.
Selon une forme de réalisation particulière de l'Invention, le substrat aqueux peut comprendre en outre au moins un ingrédient additionnel choisi parmi les extraits de levure, les sels tampon et le chlorhydrate de cystéine.
Lorsque le substrat aqueux comprend un sel tampon, celui-ci est préférentiellement choisi parmi le dihydrogénophosphate de sodium et le dihydrogénophosphate de potassium et représente alors de préférence de 0,5 à 5 g environ et encore plus préférentiellement de 1,5 à 3 g environ par litre de substrat aqueux.
Lorsque le substrat aqueux comprend un extrait de levure, celui-ci représente alors de préférence de 0,5 à 5 g environ, et encore plus préférentiellement de 1,5 à 3 g environ par litre de substrat aqueux.
Lorsque le substrat aqueux comprend du chlorhydrate de cystéine, celui-ci représente alors de préférence de 100 à 500 mg environ et encore plus préférentiellement de 200 à 400 mg environ par litre de substrat aqueux.
A la fin de la période d'incubation, l'élimination des Bifidobacterium du milieu de culture peut être réalisée par exemple par microfiltration ou par centrifugation du substrat aqueux. Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, l'élimination des Bifidobacterium du milieu de culture est réalisée par centrifugation du substrat aqueux, par exemple à une vitesse de 3000 g pendant une durée d'environ 1 heure.
Selon une forme de réalisation préférée de l'Invention, le procédé comporte en outre, après l'étape d'élimination des Bifidobacterium, une étape supplémentaire de destruction des activités enzymatiques résiduelles contenues dans le substrat aqueux après incubation, par exemple par un traitement thermique de celuici à une température d'environ 75 C pendant environ 3 minutes.
L'étape d'ultrafiltration du substrat aqueux est de préférence réalisée sur des membranes en polyéthersulfone, à une température inférieure à 60 C environ.
A la fin de l'étape d'ultrafiltration, le rétentat concentré ainsi obtenu est de préférence lavé plusieurs fois, par exemple à l'eau permutée avant d'être finalement reconcentré avant d'être déshydraté par exemple par lyophilisation.
Le tampon utilisé pour la mise en solution du rétentat déshydraté est de préférence choisi parmi les tampons présentant un pH compris entre 6 et 8 tels que par exemple le tampon Tris ajusté au pH voulu par ajout d'acide chlorhydrique.
La nature des gels utilisables pour réaliser la chromatographie d'exclusion n'est pas critique à partir du moment que ceux-ci présentent un seuil
d'exclusion de 600 kDa. A titre de gel on peut notamment utiliser les gels composés de dextrane et d'agarose réticulé tels que le produit vendu sous la dénomination commerciale Superdex@ 200 par la société Amersham Biosciences.
Dans le cas où le RCPG-III en cause possède, dans sa partie intracellulaire, un signal responsable de sa rétention dans le réticulum endoplasmique (Pagano et al., 2001), il convient au préalable de rendre ce signal non fonctionnel par mutation, selon des méthodes de
mutagénèse conventionnelles, connues de l'homme du métier, afin de permettre un adressage du RCPG-III à la membrane plasmique.
Il est avantageux de placer l'expression de l'acide nucléique codant le domaine membranaire du RCPG-III-#, ou la co-expression des acides nucléiques codant le signal d'adressage et le domaine membranaire du RCPG-III-#, sous le contrôle d'un promoteur fort porté par le vecteur recombinant.
A cet effet, l'homme du métier pourra utiliser n'importe quel promoteur transcriptionnel fort connu. Par exemple, un tel promoteur fort peut être le promoteur du cytomégalovirus (CMV ; voir Figure 2) ou celui du virus SV40.
De multiples vecteurs sont à la disposition de l'homme du métier pour construire le récepteur RCPG-III-#. Des vecteurs conventionnels appropriés sont, en particulier, les vecteurs pRK5-NHA (voir Partie Expérimentale infra), pcDNA3 (InVitrogene) et pCI (Promega).
En outre, aux fins de la mise en #uvre du procédé selon l'invention, l'homme du métier pourra utiliser, à titre de cellule hôte recombinante, n'importe quel type de cellule permettant l'expression hétérologue d'une protéine. L'homme du métier pourra notamment choisir parmi les cellules eucaryotes, telles que les cellules de levure, les cellules HEK293 et COS, et les cellules procaryotes, telles les cellules bactériennes.
Dans le contexte de la présente invention, le RCPG-III utilisé pour mettre en #uvre le procédé susvisé est choisi dans le groupe comprenant : - les récepteurs activés par le glutamate ; - les récepteurs activés par le GABA ; - les récepteurs activés par les ions calcium ; - les récepteurs putatifs de phéromones ; et - les récepteurs du goût.
En particulier, ledit RCPG-III est un récepteur activé par le glutamate, et de préférence, le récepteur mGlu5.
Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne les applications du procédé tel que décrit ci-dessus, dans divers domaines, notamment dans les domaines de la pharmacie, l'écologie et l'environnement, l'industrie agro-alimentaire, la recherche, etc...
Selon un premier mode de réalisation, l'invention vise l'application du procédé défini supra à l'identification et la sélection d'un composé utile dans le cadre d'un traitement prophylactique et/ou thérapeutique chez les mammifères, y compris l'homme.
De manière particulière, un tel composé peut convenir à la mise en #uvre d'un traitement concernant au moins une maladie parmi : - la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie, les troubles nerveux, la dépression, l'épilepsie, la psychose, la dépendance aux drogues (RCPG-III activés par le glutamate) ; - l'ostéoporose (RCPG-III activés par le calcium) ; - l'épilepsie, la douleur (RCPG-III activés par le GABA).
Selon un deuxième mode de réalisation, l'invention a trait à l'application du procédé décrit précédemment à l'identification et la sélection d'un composé utile dans le cadre d'un traitement destiné à augmenter ou, au contraire, à réduire la prolifération d'organismes vivants, tels les insectes et les vers, dont le génome contient au moins un RCPGIII (Parmentier et al., 1996 ; Pin et al., 2003).
Selon un troisième mode de réalisation, l'invention concerne plus précisément les récepteurs du goût. A cet égard, la présente invention a pour objet l'application du procédé ci-dessus à l'identification et la sélection d'un composé utile comme additif alimentaire.
En particulier, un tel additif alimentaire est destiné à conférer un goût sucré, tel un édulcorant, ou un goût umami.
Figure 1 : schéma de la structure générale d'un RCPG-III.
Les polymères associatifs de type non ionique utilisables selon l'invention sont choisis de préférence parmi : -(1) les celluloses modifiées par des groupements comportant au moins une chaîne grasse ; on peut citer à titre d'exemple : - les hydroxyéthylcelluloses modifiées par des groupements comportant au moins une chaîne grasse tels que des groupes alkyle, arylalkyle, alkylaryle, ou leurs mélanges, et dans lesquels les groupes alkyle sont de préférence en C8-C22, comme le produit NATROSOL PLUS GRADE 330 CS (alkyles en C16) vendu par la société AQUALON, ou le produit BERMOCOLL EHM 100# vendu par la société BEROL NOBEL, - celles modifiées par des groupes polyalkylène glycol éther d'alkyl phénol, tel que le produit AMERCELL POLYMER HM-1500 (polyéthylène glycol (15) éther de nonyl phénol) vendu par la société AMERCHOL.
-(4) les copolymères de méthacrylates ou d'acrylates d'alkyles en Ci-Cg et de monomères amphiphiles comportant au moins une chaîne grasse tels que par exemple le copolymère acrylate de méthyle/acrylate de stéaryle oxyéthyléné vendu par la société GOLDSCHMIDT sous la dénomination ANTIL 208#.
De préférence, les polyéthers polyuréthanes comportent au moins deux chaînes lipophiles hydrocarbonées, ayant de 6 à 30 atomes de carbone, séparées par une séquence hydrophile, les chaînes hydrocarbonées pouvant être des chaînes pendantes ou des chaînes en bout de séquence hydrophile. En particulier, il est possible qu'une ou plusieurs chaînes pendantes soient prévues. En outre, le polymère peut
comporter, une chaîne hydrocarbonée à un bout ou aux deux bouts d'une séquence hydrophile.
Les capsaicinodes peuvent être incorporés à la composition sous la forme de poudre du fruit séché ou de résine de capsicum (ou oléorésine).
La résine de capsicum peut contenir entre 3 et 50 % en poids, de 10 préférence entre 5 et 20 % en poids de capsaicinodes.
Les capsaicinodes sont avantageusement incorporés à la composition sous la forme de résine de capsicum.
Les capsaicinodes représentent avantageusement entre 0,02 et 5% en poids, de préférence 0,1 à 2 % en poids de la composition.
L'huile est avantageusement choisie parmi les huiles végétales telles que l'huile de soja, l'huile de tournesol, l'huile de mais, l'huile d'olive ou l'huile de noix et parmi les huiles minérales telles que l'huile de paraffine, ainsi que leurs mélanges.
La composition comprend avantageusement un ou plusieurs 20 composants physiologiquement actifs autres que les capsaicinoides.
Ces autres composants physiologiquement actifs représentent avantageusement 10 à 30 % en poids de la composition et peuvent être choisis parmi des stimulateurs de la thermogenèse ou du transit.
Les travaux scientifiques réalisés depuis plusieurs années ont permis 25 de démontrer que certains aliments ont la capacité de stimuler la thermogenèse: c'est notamment le cas de la caféine contenue dans le café et le thé. Par ailleurs, l'Ascophyllum nodosum est un stimulateur de transit.
Avantageusement, au moins un parmi les autres composants physiologiquement actifs est un végétal ou un extrait de celui-ci, choisi parmi 30 le thé vert, l'algue Ascophyllum nodosum, le maté, le guarana, l'éphédra ou le citrus aurantium, ainsi que leurs mélanges, et/ou une huile de tournesol riche en acide linoléique conjugué.
La composition selon la présente invention peut se présenter sous la forme d'une capsule molle ou dure. L'enveloppe des capsules molles ou dures est avantageusement en gélatine bovine, en gélatine de poisson, en hydroxypropylméthylcellulose ou en un autre polymère d'origine végétale ou animale.
Les capsules dures n'ayant pas un système de fermeture étanche, il est simplement nécessaire de mettre en oeuvre un procédé permettant de les étanchéifier (banderolage ou scellage interne).
La composition objet de la présente invention est préparée selon des 10 techniques classiques connues par l'homme du métier: 1) L'additif lipophile est incorporé à l'huile qui est chauffée à une température suffisante pour permettre de faire fondre complètement l'additif lipophile et obtenir un mélange homogène, 2) Après refroidissement à environ 50 OC, les autres composants tels que l'oléorésine de capsicum et composants stimulateurs de la thermogenèse sont incorporés à ce mélange sous agitation, 3) Le mélange ainsi obtenu est refroidi à une température comprise entre 25 et 40 OC, 4) On procède éventuellement au remplissage de capsules molles ou dures par ce mélange.
Telle que formulée, la composition objet de la présente invention ne présente avantageusement aucune sédimentation des autres composants 25 stimulateurs de la thermogenèse tels que l'extrait de thé vert ou bien stimulateur du transit tel que la poudre d'algue Ascophyllum.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de la composition comme aliment, complément alimentaire ou produit diététique (aliment destiné à une alimentation particulière).
La composition peut être notamment incorporée dans des aliments qui sont préparés industriellement ou artisanalement, tels que des huiles, du beurre, de la margarine, des pâtes à tartiner du chocolat. Elle peut aussi se présenter sous la forme d'une poudre à diluer dans l'eau ou de barres alimentaires.
La composition selon la présente invention est avantageusement utilisée pour stimuler la thermogenèse, éventuellement avec réduction d'appétit, sans qu'elle produise d'effet irritant sur la muqueuse gastrique.
L'invention s'étend également au procédé de préparation des composés de formule (I).
Le procédé de préparation des composés de formule (I) dans laquelle A représente un groupement NR4 ou A représente un atome d'azote et forme avec le groupement CHR3 adjacent le cycle -N dans lequel m représente 1, 2 ou 3, est caractérisé en ce que l'on utilise comme produit de départ un composé de formule (II) :
dans laquelle : R'1 représente un groupement alkoxy (C1-C6) linéaire ou ramifié, R'2 représente un atome d'hydrogène, d'halogène ou un groupement alkoxy (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, qui est : (a) soit mis en réaction avec le chlorure d'acide de formule (III) en présence d'une base, en milieu tétrahydrofurane ou acétonitrile : Cl - CH2 - (CH2)m- CH2 - COCI (III) dans laquelle m a la même signification que dans la formule (I), pour conduire au composé de formule (IV) : dans laquelle R'1 et R'2 sont tels que définis précédemment, qui est alors cyclisé en milieu basique, pour conduire au composé de formule (V) : dans laquelle R'1, R'2 et m sont tels que définis précédemment, qui subit éventuellement une réduction, en milieu alcoolique ou diméthylformamide, en présence de borohydrure de sodium, pour conduire au composé de formule (VI) :
dans laquelle R'1, R'2 et m sont tels que définis précédemment, composé de formule (V) ou (VI) qui subit l'action du tribromure de bore, pour conduire au composé de formule (VII) : dans laquelle R2 et m sont tels que définis précédemment, (b) soit cyclisé : # en présence d'une amidine de formule (VIII) : dans laquelle : R3 est tel un défini dans la formule (I), pour conduire au composé de formule (IX) : dans laquelle R'1, R'2, et R'3 ont la même signification que précédemment,
qui est : # ou bien réduit par un hydrure métallique, pour conduire au composé de formule (X) : dans laquelle R'1, R'2, et R'3 ont la même signification que précédemment, # ou bien alkylé par action d'une base forte en présence d'un agent d'alkylation R'4X dans lequel R'4 représente un groupement alkyle (Ci-Ce) linéaire ou ramifié et X un atome d'halogène, puis réduit, pour conduire au composé de formule (XI) : dans laquelle R'1, R'2, R3 et R'4 ont la même signification que précédemment, > en présence d'un aldéhyde de formule (XII) : dans laquelle R3 est tel que défini dans la formule (I), pour conduire au composé de formule (X) décrit précédemment, composé de formule (X) ou (XI), dont on transforme, le groupement R'1 et le groupement R'2 lorsque celui-ci représente un groupement alkoxy (C1-C6) linéaire ou ramifié, en groupements hydroxy, pour conduire au composé de formule (XIII) :
dans laquelle R2, R3 et R4 ont la même signification que dans la formule (I), composé de formule (VII) ou (XIII) que l'on fait réagir avec un dérivé d'acide boronique de formule (XIV) : dans laquelle R"1 représente un groupement cyano ou un hétéroaryle, pour conduire, (après transformation éventuelle du groupement R"1 quand celui-ci représente un groupement cyano en groupement tétrazolyle correspondant), au composé de formule (I/a1) ou (I/a2), cas particuliers des composés de formule (I) : dans laquelle R1, R2, R3 et R4 ont la même signification que dans la formule (I), dans laquelle R1, R2 et m ont la même signification que dans la formule (I),
composés de formule (Va,) ou (I/a2) : que l'on purifie le cas échéant selon une technique classique de purification, dont on sépare éventuellement les isomères selon une technique classique de séparation et que l'on transforme, si on le souhaite, en leurs sels d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable.
Le procédé de préparation des composés de formule (I) dans laquelle A représente un groupement CR4R5 est caractérisé en ce que l'on utilise comme produit de départ, un composé de formule (XV) : dans laquelle : R'1 représente un groupement alkoxy (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, R'2 représente un atome d'hydrogène, d'halogène ou un groupement alkoxy (C1-C6) linéaire ou ramifié, qui subit l'action de la chloroacétone en présence de diméthylformamide, pour conduire au composé de formule (XVI) : dans laquelle R'1 et R'2 ont la même signification que précédemment, qui subit un réarrangement en milieu basique, pour conduire au composé de formule (XVII) :
dans laquelle R'1 et R'2 ont la même signification que précédemment, qui est déacétylé par chauffage au reflux en milieu benzénique en présence d'un excès d'éthylèneglycol et d'une quantité catalytique d'acide p-toluène sulfonique, pour conduire au composé de formule (XVIII) : dans laquelle R'1 et R'2 ont la même signification que précédemment, qui subit une hydrolyse en milieu acide, pour conduire au composé de formule (XIXa) : dans laquelle R'1 et R'2 ont la même signification que précédemment, dont, éventuellement, selon la nature du groupement R3 que l'on souhaite obtenir, on protège l'atome d'azote par un groupement protecteur, puis, après traitement par une base forte, que l'on traite par un composé de formule R'3-P, dans laquelle R'3 représente un groupement alkyle (Ci-Ce) linéaire ou ramifié ou un groupement cycloalkyle (C3-C7) et P représente un groupe partant, pour conduire après déprotection de l'atome d'azote, au composé de formule (XIX'a) : dans laquelle R'1, R'2 et R'3 ont la même signification que précédemment,
composé de formule (XIXa) et (XIX'a) représentés par la formule (XIX) : dans laquelle R'1 et R'2 ont la même signification et R3 est tel que défini dans la formule (I), qui : - soit subit une réduction catalytique, pour conduire au composé de formule (XX) : dans laquelle R'1 et R'2 ont la même signification que précédemment, - soit est transformé en alcool par l'action d'une hydrure dont on transforme le groupement hydroxy en atome d'halogène par l'action d'un réactif approprié, pour conduire au composé de formule (XXI) : dans laquelle R'1 et R'2 ont la même signification que précédemment, R'5 représente un atome d'halogène, - soit subit l'action d'un organomagnésien R'4 MgBr dans lequel R'4 représente un groupement alkyle (C1-C6) linéaire ou ramifié, pour conduire au composé de formule (XIXb) :
dans laquelle R'1, R'2 et R'4 ont la même signification que précédemment, composé de formule (XIXb) : - ou bien qui subit une réduction catalytique, pour conduire au composé de formule (XXII) : dans laquelle R'1, R'2 et R'4 ont la même signification que précédemment, - ou bien dont on transforme le groupement hydroxy en atome d'halogène par l'action d'un réactif approprié, pour conduire au composé de formule (XXIII) : dans laquelle R'1, R'2 et R'4 ont la même signification que précédemment et R'5 représente un atome d'halogène, composé de formule (XX) à (XXIII) dont on transforme le groupement R'1 et le groupement R'2 lorsque celui-ci représente un groupement alkoxy (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, en groupements hydroxy, pour conduire au composé de formule (XXIV) : dans laquelle R2, R4 et R5 ont la même signification que dans la formule (I),
composé de formule (XXIV), que l'on fait réagir avec un dérivé d'acide boronique de formule (XIV) : dans laquelle R"1 représente un groupement cyano ou un hétéroaryle, pour conduire, (après transformation éventuelle du groupement R"1 quand celui-ci représente un groupement cyano en groupement tétrazolyle correspondant), au composé de formule (I/b), cas particuliers des composés de formule (I) : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5 ont la même signification que dans la formule (I), composé de formule (I/b), que l'on purifie le cas échéant selon une technique classique de purification, dont on sépare éventuellement les isomères selon une technique classique de séparation et que l'on transforme, si on le souhaite, en leurs sels d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable.
L'invention s'étend aussi aux compositions pharmaceutiques renfermant comme principe actif un composé de formule (I) avec un ou plusieurs excipients inertes, non toxiques et appropriés. Parmi les compositions pharmaceutiques selon l'invention, on pourra citer plus particulièrement celles qui conviennent pour l'administration orale, parentérale (intraveineuse ou sous-cutanée), nasale, les comprimés simples ou dragéifiés, les comprimés sublinguaux, les gélules, les tablettes, les suppositoires, les crèmes, les pommades, les gels dermiques, les préparations injectables, les suspensions buvables, etc...
La posologie utile est adaptable selon la nature et la sévérité de l'affection, la voie d'administration ainsi que l'âge et le poids du patient. Cette posologie varie de 1 à 500 mg par jour en une ou plusieurs prises.
Les exemples suivants illustrent l'invention mais ne la limitent en aucune façon.
Parmi les principes actifs et nutriments utilisables dans la présente invention, on peut citer en particulier : les vitamines, les hormones, les plasmides, les composés anti-cancéreux, les composés anti-inflammatoires, les cicatrisants, les antibactériens, les composés anti-fongiques, les vaccins, les anti-oxydants, les filtres solaires.
De façon à démontrer l'efficacité des tensioactifs de l'invention pour la reconnaissance et le ciblage des kératinocytes lorsque ces tensioactifs sont incorporés dans des liposomes on a procédé au marquage fluorescent de ces liposomes.
L'encapsulation de molécules fluorescentes dans les liposomes permet de mettre en évidence le phénomène de reconnaissance entre le récepteur présent à la surface de la cellule (lectine) et les liposomes marqués et de transférer la fluorescence dans les cellules cibles. Ce système est appliqué au transfert de principes actifs.
De façon plus détaillée le problème que l'on a cherché à résoudre est le ciblage spécifique des cellules externes de la peau (l'épiderme) et l'introduction, dans ces cellules d'un principe actif.
Le but de l'invention est de cibler les cellules épithéliales de la peau, les kératinocytes. Ces cellules possèdent des récepteurs membranaires spécifiques appelés lectines qui sont capables de reconnaître une entité osidique.
La reconnaissance entre les kératinocytes et les liposomes comprenant les tensioactifs de l'invention porteurs d'une tête polaire de type Lrhamnose ou L-fucose a été mise en évidence. Il a également été montré qu'un principe actif (molécules fluorescentes, médicaments, cosmétiques, arômes, parfums, gènes...), encapsulé dans ces liposomes, peut être transféré dans des kératinocytes et sur la partie externe de la peau (épiderme).
PARTIE EXPERIMENTALE Les tensioactifs, une fois synthétisés, ont été utilisés pour la préparation de grands liposomes dans lesquels sont encapsulées des molécules
fluorescences et des molécules bioactives. Les interactions de ces liposomes avec du tissu vivant et avec des cultures de kératinocytes ont ensuite été étudiées.