INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les filtres organiques peuvent notamment être choisis parmi : les anthranilates, en particulier l'anthranilate de menthyle ; les benzophénones, en particulier la benzophénone-1, la benzophénone-3, la benzophénone-5, la benzophénone-6, la benzophénone-8, la benzophénone-9, la benzophénone-12, et préférentiellement la Benzophénone-2 (Oxybenzone), ou la Benzophénone-4 (Uvinul MS40 disponible chez B.A.S.F.) ; les benzylidènes-camphres, en particulier le 3-benzylidène-camphre, l'acide benzylidènecampho-sulfonique, le benzalkoniumméthosulfate de camphre, le polyacrylamidométhylbenzylidène camphre, l'acide téréphthalylidène di-camphre sulfonique, et préférentiellement le 4-méthylbenzylidène camphre (Eusolex 6300 disponible chez Merck) ; les benzimidazoles, en particulier le benzimidazilate (Neo Heliopan AP disponible chez Haarmann et Reimer), ou l'acide phénylbenzimidazole sulfonique (Eusolex 232 disponible chez Merck) ; les benzotriazoles, en particulier le drométrizole trisiloxane, ou le méthylène bis-benzotriazolyltétraméthylbutylphénol (Tinosorb M disponible chez Ciba) ; les cinnamates, en particulier le cinoxate, le DEA méthoxycinnamate, le méthylcinnamate de diisopropyle, le glycéryl éthylhexanoate de diméthoxycinnamate, le méthoxycinnamate d'isopropyle, le cinnamate d'isoamyle, et préférentiellement l'éthocrylène (Uvinul N35 disponible chez B.A.S.F.), l'octylméthoxycinnamate (Parsol MCX disponible chez Hoffmann La Roche), ou l'octocrylène (Uvinul 539 disponible chez B.A.S.F.) ; les dibenzoylméthanes, en particulier le butyl méthoxydibenzoylméthane (Parsol 1789) ; les imidazolines, en particulier l'éthylhexyl diméthoxybenzylidène dioxoimidazoline ; les PABA, en particulier l'éthyl Dihydroxypropyl PABA, l'éthylhexyldiméthyl PABA, le glycéryl PABA, le PABA, le PEG-25 PABA, et préférentiellement la diéthylhexylbutamido-triazone (Uvasorb HEB disponible chez 3V Sigma), l'éthylhexyltriazone (Uvinul T150 disponible chez B.A.S.F.), ou l'éthyl PABA (benzocaïne) ; les salicylates, en particulier le salicyclate de dipropylèneglycol, le salicylate d'éthylhexyle, l'homosalate, ou le TEA salicylate ; les triazines, en particulier l'anisotriazine (Tinosorb S disponible chez Ciba) ; le drometrizole trisiloxane.
Les filtres inorganiques sont de préférence constitués d'oxyde de zinc et/ou de dioxyde de titane, de préférence de taille nanométrique, éventuellement enrobés d'alumine et/ou d'acide stéarique.
L1, L3 quand n est égal à 0, représente un radical divalent choisi dans le groupe comprenant les groupements NR7, PR8, SiR9 R10, BR11, S , POR12, S02, CO dans lesquels R7 a la signification de R indiquée ci-dessus, R8 et R12 peuvent représenter le radical OR,3, et R8, R9, R10, R11 R12 et R13 représentent des radicaux alkyles, aryles ou cycloalkyles ; L1, L2 , L3, L4 quand n est égal à 1, identiques ou différents représentent une liaison covalente, un radical choisi dans le groupe comprenant les groupements 0, NR7, PR8, SiR9 R10, BR11, S , POR12, SO2, CO, -CR14R15-, dans lesquels R7 a la signification de R indiquée cidessus, R8 et R12 peuvent représenter le radical OR,3, et R8, Rg, R10, R11 R12, R13, R14 et R15 représentent des radicaux alkyles ou aryles, cycloalkyles, R14 et R15 pouvant également représenter l'atome d'hydrogène.
Q représente un radical aromatique ou cycloaliphatique substitué ou non comprenant un ou plusieurs cycles sous forme condensée ou non et pouvant comprendre des hétéroatomes, ou un radical de formule générale Il suivante : '\.R/L5 / 17L 1R,8 s dans laquelle : Ri7, R18, L5, L6 et m ont les significations respectivement de Ri, R2, L1, L2 et n ci-dessus.
L'invention a également pour objet les composés dont les formules sont listés dans le tableau Il ci-dessus.
Ces composés sont obtenus notamment par mélange d'une solution dans le toluène d'un composé diphénol répondant à la structure de formule suivante : HO OH Q Avec une solution toluènique d'une chlorophosphite de formule suivante :
Dans les formules ci-dessus les symboles ont les mêmes significations que dans la formule I.
Ce mode opératoire de préparation est donné uniquement à tire d'example et indicatif.
La surface de reflexion 24 stetend globalement dans un plan transversal a l'axe optique A-A, passant par le centre S de la
source lumineuse 14.
o La surface de reflexion 24 a la forme d'une couronne centree sur l'axe optique A-A, qui comprend une partie annulaire interieure 28, optiquement neutre, et une partie annulaire exterieure 30. Les deux parties annulaires 28, 30 vent contenues
globalement dans un meme plan transversal.
La partie annulaire interieure 28 est plane et elle s'etend transversalement vers l'exterieur, depuis le bord peripherique 32 de la surface d'entree 22, jusqu'au bord peripherique interieur 34
de la partie annulaire exterieure 30.
La partie annulaire exterieure 30 est formee d'une serie de
so couronnes reflechissantes 36 coaxiales suivant l'axe optique A-A.
La partie annulaire exterieure 30 est concue globalement
selon le meme principe qu'une lentille du type a echelons.
La generatrice de chaque couronne reflechissante 36 est un segment de droite qui est incline vers ['avant et vers l'axe
Les couronnes reflechissantes 36 vent echelonnees radialement vers ltexterieur, deux couronnes reflechissantes 36 successives etant separees par une couronne optiquement neutre 38. La generatrice de chaque couronne neutre 38 est ici un
segment de droite qui est incline vers ['avant et vers l'exterieur.
o Se lon le mode de real isation rep rese nte ic i, les generatrices des couronnes reflechissantes 36 vent sensiblement paralleles, et la longueur de ces generatrices decrot
progressivement lorsque lton s'eloigne de l'axe A-A.
Dans ce qui suit, on considère de façon non exhaustive deux cas d'accord, à savoir un accord obtenu par un élément Peltier et un accord obtenu par un élément piézo-électrique. Des alliages à mémoire de forme peuvent aussi être utilisés, de même que tout
système fondé sur la déformation d'un objet par exemple par courbure ou par flexion.
2. 1) Accord en température Le moyen généralement employé pour la transduction thermique est un élément Peltier. Un refroidisseur thermique à élément Peltier peut être considéré comme une pompe à chaleur.
Lorsque les thermocouples qui le constituent sont reliés à une source de courant continu, il engendre un transfert de chaleur de l'un de ses côtés vers l'autre. Une face se refroidit donc pendant que l'autre s'échauffe. Une variation de température AT est ainsi obtenue entre une face et l'autre. En inversant le courant, la répartition des températures s'inverse aussi.
La variation de température AT reste cependant limitée. Une valeur typique maximale est égale à 70 C d'où une accordabilité ## égale à 0,8nm.
Des éléments Peltier sont disponibles auprès de la Société DLK.
Du fait de ses faibles capacités, l'élément Peltier est plus généralement utilisé pour stabiliser un montage en température. L'accordabilité des réseaux utilise ainsi préférentiellement des transducteurs piézo-électriques, plus rapides que les transducteurs thermiques.
2. 2) Accord en allongement Un transducteur piézo-électrique est formé à partir de matériaux céramiques qui ont des propriétés piézo-électriques : sous l'effet d'un champ électrique sa structure céramique se déforme. Un composant tel
qu'une fibre optique, qui est fixé au transducteur, subit donc un allongement (ou une compression) accompagné d'une certaine force.
L'allongement relatif et la force appliqués sont liés, pour une tension donnée, par une relation linéaire qui est définie par deux points caractéristiques : - la force de blocage Fb à une tension donnée, qui correspond à la force maximale développée par le transducteur piézo-électrique quand celui-ci est bloqué en allongement, et - l'allongement maximum ALmax à une tension donnée, pour un transucteur piézo-électrique libre de toute contrainte.
Le transducteur piézo-électrique et la fibre optique étant reliés l'un à l'autre, il faut considérer les performances de l'actionneur en rapport avec les limitations de la fibre optique.
Cette fibre optique admet également une courbe d'évolution de son allongement en fonction de la force appliquée. Si ces deux grandeurs interviennent suivant le même axe (généralement l'axe de la fibre) on a la relation : où E et s sont respectivement le module d'Young et la section de la fibre.
On en déduit : F=ExsxE.
A partir d'une limite fixée pour on peut donc trouver la limite correspondante pour F.
Les courbes relatives au transducteur piézo-électrique et à la fibre définissent ainsi un point de fonctionnement permettant de prédire l'accordabilité d'un réseau de Bragg. Le travail développé est maximum lorsque le point de fonctionnement correspond au point médian de la courbe du transducteur piézo-électrique.
Des transducteurs piézo-électriques sont disponibles auprès de la Société Piezo Systems, Inc.
Formulation B : amino-2 méthyl-2 propane di-ol-1,3 0,21 cire de Carnauba 5,77
D-Panthénol 0,50 oxyde de fer noir (CI:77499) 3,00 bleu d'outremer (CI:77007) 4.14 hydroxyéthyl cellulose quaternisée par chlorure de 2,3 époxypropyl triméthyl ammonium 0,10 hydroxyéthyl cellulose 0,88 mélange de polydiméthylsiloxane et de silice hydratée 0,15 poly méthacrylate de sodium dans l'eau à 25 % non stabilisé 5,00 gomme arabique ; polysaccharides ; arabinose/galactose/rhamnose/acide glucuronique 3,38 monostéarate de glycéryle oxyéthylène (30 OE) 1,00 P-hydroxybenzoate de propyle 0,20 P-hydroxybenzoate de méthyle 0,25 polydiméthylsiloxane oxyéthylène (20 OE) oxypropylène (20 OP)(DP : 170 - viscosité : 1000 CST) 0,20 copolymère acrylate d'éthyle/méthacrylate de méthyle (80/20) réticulé, en dispersion aqueuse à 50 % 4,00 copolymère acrylamide/acrylamido-2-méthyl propane sulfonate de sodium en émulsion inverse à 40 % dans polysorbate 80/I-C16 3,50 monostéarate de glycéryle oxyéthylène (200 OE) 3,00 huile de Jojoba (Simmondsia Chinensis) isomérisée TRANS de TF 45 C 23,28 eau déminéralisée stérilisée qsp 100 % La formulation ainsi obtenue s'applique particulièrement bien sur les cils. On obtient ainsi une texture glissante.
Formulation C : amino-2 méthyl-2 propane di-ol-1,3 0,21 acide stéarique (cl6-18:50/50) 2,49
cire de Carnauba 3,00 D-panthénol 0,50 phénoxy-2 éthanol 0,50 oxyde de fer noir (CI:77499) 3,00 bleu d'outremer (CI:77007) 4,14 hydroxyéthyl cellulose quaternisée par chlorure de 2,3 époxypropyl triméthyl ammonium 0,10 hydroxyéthyl cellulose 0,88 mélange de polydiméthylsiloxane et de silice hydratée 0,15 poly méthacrylate de sodium dans l'eau à 25 % non stabilisé 5,00 gomme arabique ; polysaccharides ; arabinose/galactose/rhamnose/acide glucuronique 3,38 cire d'abeille blanche, pure 2,50 Glycérine 3,00 P-hydroxybenzoate de propyle 0,20 P-hydroxybenzoate de méthyle 0,25 tri-éthanolamine à 99 % 1,02 polydiméthylsiloxane oxyéthylène (20 OE) oxypropylène (20 OP)(DP : 170 - viscosité : 1000 CST) 0,20 huile de Jojoba hydrogénée 6,27 copolymère acrylate d'éthyle/méthacrylate de méthyle (80/20) réticulé, en dispersion aqueuse a 50 % 4,00 copolymère acrylamide/acrylamido-2-méthyl propane sulfonate de sodium en émulsion inverse à 40 % dans polysorbate 80/I-C16 2,00 monostéarate de gylcéryle oxyéthylénée (200 OE) 3,00 huile de Jojoba (Simmondsia Chinensis) isomérisée TRANS de TF 45 C 6,27 eau déminéralisée stérilisée qsp 100 % La formule permet d'obtenir un maquillage satisfaisant et une bonne séparation des cils.
Formulation D : amino-2 méthyl-2 propane di-ol-1,3 0,21 acide stéarique (C16-18:50/50) 2,49 cire de Carnauba 3,00 D-Panthénol 0,50 phenoxy-2 éthanol 0,50 oxyde de fer noir (CI:77499) 3,00 bleu d'outremer (CI:77007) 4,14 hydroxyéthyl cellulose quaternisée par chlorure de 2,3 époxypropyl triméthyl ammonium 0,10 hydroxyéthyl cellulose 0,88 mélange de polydiméthylsiloxane et de silice hydratée 0,15 poly méthacrylate de sodium dans l'eau à 25 % non stabilisé 5,00 gomme arabique ; polysaccharides ; arabinose/galactose/rhamnose/acide glucuronique 3,38 cire d'abeille blanche, pure 6,50 Glycérine 2,00 P-hydroxybenzoate de propyle 0,20 P-hydroxybenzoate de méthyle 0,25 tri-éthanolamine à 99 % 1,02 polydiméthylsiloxane oxyéthylène (20 OE) oxypropylène (20 OP)(DP : 170 - viscosité : 1000 CST) 0,20 huile de Jojoba hydrogénée 6,27 copolymère acrylate d'éthyle/méthacrylate de méthyle (80/20) réticulé, en dispersion aqueuse à 50 % 4,00 copolymère acrylamide/acrylamido-2-méthyl propane sulfonate de sodium en émulsion inverse à 40 % dans polysorbate 80/I-C16 2,00 monostéarate de glycéryle oxyéthyléné (200 OE) 3,00 huile de Jojoba (Simmondsia Chinensis) isomérisée TRANS de TF 45 C 6,27 eau déminéralisée stérilisée qsp 100 %
La formulation possède une texture crémeuse particulièrement appropriée à l'application par brosse et permet d'obtenir un maquillage épais des cils (mascara chargeant).
Formulation E : amino-2 méthyl-2 propane di-ol-1,3 0,21 acide stéarique (C16-18:50/50) 2,49 cire de Carnauba 3,00 D-Panthénol 0,50 phenoxy-2 éthanol 0,50 oxyde de fer noir (CI:77499) 3,00 bleu d'outremer (CI:77007) 4,14 hydroxyéthyl cellulose quaternisée par chlorure de 2,3 époxypropyl triméthyl ammonium 0,10 hydroxyéthyl cellulose 0,88 mélange de polydiméthylsiloxane et de silice hydratée 0,15 poly méthacrylate de sodium dans l'eau à 25 % non stabilisé 5,00 gomme arabique ; polysaccharides ; arabinose/galactose/rhamnose/acide glucuronique 3,38 cire d'abeille blanche, pure 5,50 Glycérine 3,00 P-hydroxybenzoate de propyle 0,20 P-hydroxybenzoate de méthyle 0,25 tri-ethanolamine à 99 % 1,02 polydiméthylsiloxane oxyéthyléné (20 OE) oxypropylène (20 OP)(DP : 170 - viscosité : 1000 CST) 0,20 huile de Jojoba hydrogénée 6,27 copolymère acrylate d'éthyle/méthacrylate de méthyle (80/20) réticulé, en dispersion aqueuse à 50 % 4,00 copolymère acrylamide/acrylamido-2-méthyl propane sulfonate
de sodium en émulsion inverse à 40 % dans polysorbate 80/I-C16 2,00 monostéarate de glycéryle oxyéthyléné (200 OE) 3,00 huile de Jojoba (Simmondsia Chinensis) isomérisée TRANS de TF 45 C 6,27 eau déminéralisée stérilisée qsp 100 % Cette formule possède de bonnes propriétés chargeantes ( maquillage épais) et de séparation des cils. Elle possède une texture glissante convenant tout particulièrement à l'application sur les cils.
T.A non ionique Stéarate de triéthanolamine Polymère gélifiant Cire (%ni) (%m) (%m) (%m) ,V :/'r' ####'. '. 'wij. ##;",#=#.>!. r1# Cire de Cires de Carnauba Jojoba PEG PEG Acide Triéthanolamine Simulgel Cire d'abeille hydrogénés 30-GS 200 GS stéarique 99% 600 isomérisées A 3,00 2,49 1,02 2,00 5,77 - 15,77 1,00 3,00 - - 3,50 5,77 23,28 C 3,00 2,49 1,02 2,00 3,00 2,50 12,54
3,00 2,49 1,02 2,00 3,00 1 -54 D 3900 2,49 1,02 2,00 3,00 6,50 12,54
3,00 2,49 1,02 2,00 3,00 5,50 12,54
Matière Module de Contrainte Angle de perte Taille des particules de cire
L'invention a notamment pour objet l'utilisation des adénovirus conformes à l'invention, pour la préparation de compositions immunogènes ou vaccinales, ou de médicaments destinés à la thérapie génique ou au traitement du cancer, ainsi que pour la production de protéines recombinantes.
Ledit médicament ou ladite composition peuvent être administrés chez des animaux, notamment des mammifères, en particulier des carnivores domestiques ou sauvages, tels que le chat, le chien ou le renard, ou bien chez l'Homme.
Les adénovirus recombinants conformes à l'invention sont particulièrement bien adaptés aux utilisations thérapeutiques, par exemple vaccinales, chez l'homme et l'animal. En effet, contrairement aux adénovirus recombinants non-réplicatifs dont le génome est présent en faible nombre de copies par cellule et rapidement éliminé dans les cellules en division active, les adénovirus recombinants conformes à l'invention, réplicatifs ou pseudoréplicatifs, se multiplient de façon importante dans le noyau des cellules transduites permettant de transduire efficacement aussi bien des cellules quiescentes que des cellules en division active comme les cellules tumorales. En outre, les adénovirus pseudo-réplicatifs conformes à l'invention qui ne produisent aucune particule infectieuse présentent une grande biosécurité et permettent en outre
d'induire une forte réponse immune lors d'injections de rappel.
Des adénovirus recombinants conformes à l'invention, par exemple ceux dérivés de l' adénovirus canin, ont des applications pour la vaccination et le traitement du cancer chez les carnivores domestiques ou sauvages, notamment le chat, le chien ou le renard. En outre, du fait d'un tropisme d'hôte propre, ces adénovirus canins peuvent être utilisés en thérapie génique humaine, en particulier pour cibler des tissus différents de ceux qui peuvent être transduits par les vecteurs humains, par exemple des cellules du système nerveux central.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de Description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs illustrant la construction et la préparation d'un adénovirus recombinant conforme à l'invention, et son utilisation pour l'expression de gènes d'intérêt, notamment pour la vaccination.
EXEMPLE 1 : DES ADENOVIRUS CAV 311-319, CAV 311- 439 ET CAV 311-401 1) Construction des plasmides recombinants Les plasmides suivants ont été construits en utilisant les protocoles classiques de préparation, de clonage et d'analyse de l'ADN tels que ceux décrits dans Carrent Protocols in Molecular Biology (Frederick M. AUSUBEL, 2000, Wiley and son Inc, Library of Congress, USA) a) Plasmide pCav2 contenant la séquence complète du génome de l'adénovirus canin de type 2 (Cav2) Ce plasmide est construit par recombinaison homologue dans E. coli, de manière analogue au procédé de préparation d'adénovirus humains, décrit dans CHARTIER et a 1 . , précité.
Les principales étapes de construction de ce plasmide sont présentées à la Figure 1.
De manière plus précise, les extrémités gauche et droite du génome de la souche Manhattan de Cav2 correspondant aux séquences des positions 1 à 1060 (fragment A) et 29323-
31323(fragment B) sont amplifiées séparément par PCR à partir de l'ADN génomique de la souche Manhattan de Cav2 (APPEL et al., Am. J. Vet. Res., 34,543-550, 1973), à l'aide des amorces suivantes : FragmentA 5'-TTGGCGCGCCCATCATCAATAATATACAGGAC-3' (SEQ ID NO: 1) 5'-GCTCTAGACCTGCCCAAACATTTAACC-3' (SEQ ID NO: 2) Fragment B 5'-TTGGCGCGCCCATCATCAATAATATACAGGAC-3' (SEQ ID NO: 1) 5'-GCTCTAGAGGGTGATTATTAACAACGTC-3' (SEQ ID NO: 3) Les fragments A et B obtenus sont clonés séparément dans le plasmide pCR2.1 (TA Cloning System, INVITROGEN) pour donner respectivement les plasmides pCR2.1/ITR gauche et pCR2. 1/ITR droit. Le plasmide pCR2.1/ITR gauche est digéré par BamHI et XbaI et le fragment de 1111 pb ainsi généré est cloné entre les sites BamHI et XbaI du plasmide pPolyII AmpR (GenBank M18128, LATHE et al., Gene, 57,193-201, 1987) pour donner le plasmide dénommé pPolyII/ITR gauche. Le plasmide pCR2.1/ITR droit est clivé par BamHI, traité par la polymérase de Klenow, puis clivé par XbaI ; le fragment de 2052 pb ainsi généré est cloné entre les sites XbaI et PvuII du plasmide pPolyII/ITR gauche pour donner le plasmide pPolyII.ITRs.Cav2. Ce plasmide contient les extrémités gauche et droite du génome de la souche Manhattan de Cav2 clonées sous forme d'un fragment AscI-AscI de 3073 pb comprenant un site XbaI en position 1066 dudit fragment, permettant de linéariser le plasmide au niveau du site d'insertion de l'ADN.
L'ADN génomique de la souche Manhattan de Cav2 et l'ADN de pPolyII.ITRs.Cav2 linéarisé au site Xbal sont cotransformés dans la souche d'E. coli BJ5183 recBC sbcBC (HANAHAN et al., J. Mol. Biol. , 166,557-580, 1983). Un plasmide recombinant de 33425 pb, dénommé pCav2, est isolé à partir des colonies résistantes à l'ampicilline.
Le plasmide pCav2 contient le génome complet de Cav2 (souche Manhattan) cloné sous forme d'un fragment de 31331 pb flanqué de deux sites Ascl qui sont uniques dans ce plasmide, ces sites étant absents dans le génome de Cav2
(souches Manhattan et Toronto) ainsi que dans celui de la souche d'adénovirus ovin OAV. b) Plasmides navettes b~) pNavette/311-439/CMVeGFP Ce plasmide de 6111 pb dérive du plasmide pBluescript KS (STRATAGENE) par insertion des séquences de Cav2 en amont et en aval de la délétion 312-438 (UpRecSeq 1- 311 et DownRecSeq 439-1060), de part et d'autre d'une cassette d'expression du gène rapporteur GFP.
Ce plasmide est construit selon les étapes suivantes : 1 ) un fragment C correspondant à la séquence des positions 1 à 311 (UpRecSeq) de Cav2, est amplifié par-PCR à l'aide des amorces : 5'-TTGGCGCCCATCATCAATAATATACAGGAC-3'(SEQ ID NO: 1) 5'-CCGACGTCGACCATAAACTTTGACATTAGCCG-3 (SEQ ID NO: 4).
Le produit d'amplification PCR est cloné dans le plasmide pCR2.1 pour donner le plasmide pCR2.1/UpRecSeq (1- 311).
2 ) un fragment D correspondant à la séquence des positions 439 à 1060 (DownRecSeq) de Cav2, est amplifié par PCR à l'aide des amorces : 5'-GCTCTAGAGCGAAGATCTCCAACAGCAATACACTCTTG-3' (SEQ ID NO: 5) 5'-GCTCTAGACCTGCCCAAACATTTAACC-3' (SEQ ID NO: 2).
Le substrat ADN selon la présente invention présentant le site de coupure à tester est distribué dans chaque puit. Chaque puit doit présenter des conditions compatibles avec l'activité de l'endonucléase criblée. Le substrat peut être ajouté accompagné du tampon de clivage.
Lorsque le substrat ADN porte la cassette d'expression pour l'endonucléase, il suffit de distribuer les différents substrats ADN codant pour une endonucléase dans les puits, de produire l'endonucléase par un système d'expression in vitro, et de permettre la coupure des sites par l'endonucléase produite.
Une discrimination est ensuite faite entre les substrats ADN coupés ou non aux deux sites.
Cette discrimination peut être faite par dégradation différentielle ou déplétion du substrat ADN non coupé ou par amplification sélective du substrat ADN coupé.
Le substrat ADN restant est ensuite détecté directement ou après une étape d'amplification par PCR.
En conséquence, l'invention concerne une méthode de criblage permettant d'identifier parmi une banque de séquences codantes pour des endonucléases, présentant un type de coupure décalée, la ou les endonucléase (s) de couper un site de coupure déterminé comprenant les étapes suivantes : 1) fournir ladite banque de séquences codantes pour des endonucléases ; 2) fournir un substrat ADN double-brin comprenant deux sites de coupure; 3) distribuer chaque séquence codante de ladite banque dans des récipients; 4) exprimer l'endonucléase codée par la séquence codante en présence dudit substrat ADN dans des conditions propices à l'activité de coupure ; 5) discriminer les substrats ADN coupés aux deux sites et les substrats ADN non coupés aux deux sites ; 6) détecter le substrat ADN coupé aux deux sites; la détection dudit substrat ADN coupé révélant l'activité de clivage et permettant d'identifier la ou les endonucléase (s) de couper ledit site de coupure déterminé.
L'étape 4) d'expression de l'endonucléase peut être faite in vivo ou in vitro. Lorsqu'elle est faite in vivo, une étape de purification de l'endonucléase est nécessaire avant l'étape 5). De préférence, ladite endonucléase est produite par un système de transcription/traduction couplée in vitro.
Cependant les deux sites de coupures peuvent également être différents.
Dans un mode de réalisation préféré, la discrimination consiste en la dégradation du substrat ADN non coupé aux deux sites par une exonucléase incapable de dégrader le substrat ADN coupé aux deux sites. Facultativement, ladite exonucléase est inactivée avant l'étape 6) de détection. Lorsque ladite endonucléase possède un type de coupure décalée, plus particulièrement d'au moins 4 nucléotides, générant une extrémité 3' sortante, ladite exonucléase est de préférence l'exonucléase III. Lorsque ladite endonucléase possède un type de coupure décalée, plus particulièrement d'au moins 4 nucléotides, générant une extrémité 5' sortante, ladite exonucléase est de préférence l'exonucléase Lambda.
Dans un autre mode de réalisation, la discrimination consiste en la séparation des substrats ADN coupés et non coupés. De préférence, ledit substrat ADN initial porte à au moins une de ses extrémités, de préférence aux deux, un ligand et ladite séparation est faite avec la cible du ligand immobilisée sur un support solide. De préférence, le ligand, la cible et le support solide sont respectivement la biotine, la streptavidine et une bille paramagnétique.