INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'invention concerne également toute méthode de criblage de ligands de la protéine MabA, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - mise en présence de la protéine MabA recombinante sous forme purifiée, ou d'une protéine recombinante dérivée de la protéine MabA telles que définies ci-dessus, - détection de l'éventuelle liaison entre ladite protéine, et le ligand testé par mesure, après excitation de fluorescence, notamment à 300 nm, de l'intensité de fluorescence de ladite protéine émise entre 300 et 400 nm (correspondant essentiellement à l'émission de fluorescence de l' unique tryptophane W145), et comparaison de l' intensité de fluorescence émise dans un essai en absence de ligand, la fixation d'un ligand dans le site actif MabA étant caractérisée par un quenching de fluorescence.
L'invention a également pour objet toute méthode de criblage de ligands inhibiteurs de la protéine MabA, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - mise en présence de la protéine MabA recombinante sous forme purifiée, ou d'une protéine recombinante dérivée de la protéine MabA telles que définies ci-dessus, dans un milieu réactionnel comprenant un substrat, tel qu'un dérivé p-cétoacyl défini ci-dessus, le coenzyme NADPH, et le ligand testé, - détection d'un pouvoir inhibiteur potentiel du ligand testé, par mesure de l'activité enzymatique de ladite protéine par mesure cinétique de l'absorbance, notamment à 340 nm, et comparaison de la pente de la courbe de densité optique en fonction du temps avec la pente obtenue dans un essai en absence de ligand. ' L'invention concerne également toute méthode de criblage de ligands de la protéine MabA, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - mise en présence de la protéine MabA recombinante sous forme purifiée, ou d'une protéine recombinante dérivée de la protéine MabA telles que définies ci-dessus, avec le ligand testé,
- analyse de la structure tridimensionnelle du complexe formé en phase soluble entre ladite protéine et ledit ligand, notamment par RMN, et par fluorescence.
L'invention a plus particulièrement pour objet toute méthode de criblage de ligands de la protéine MabA, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes suivantes : - co-cristallisation du ligand testé et de la protéine MabA recombinante sous forme purifiée, ou d'une protéine recombinante dérivée de la protéine MabA telles que définies cidessus, notamment dans les conditions de cristallisation définies ci-dessus, de manière à obtenir des cristaux susmentionnés, - ou, trempage des cristaux de la protéine MabA ou d'une protéine dérivée telles que définies ci-dessus, dans des solutions optimisées contenant des ligands potentiels, - analyse de la structure tridimensionnelle des cristaux susmentionnés, notamment par diffraction des rayons X (en vue de sélectionner les ligands ayant une capacité optimale d'occupation et de blocage du site actif desdites protéines).
L'invention concerne également l'utilisation des coordonnées de la structure tridimensionnelle de la protéine MabA recombinante sous forme purifiée, ou d'une protéine recombinante dérivée de la protéine MabA telles que définies ci-dessus, lesdites coordonnées étant représentées sur les figures 1 à 3, le cas échéant en association avec les coordonnées du site actif de ces protéines telles que définies ci-dessus, pour la mise en #uvre de méthodes de conception ou de criblage de ligands de la protéine MabA, assistée par ordinateur.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet toute méthode de conception ou de criblage de ligands de la protéine MabA, assistée par ordinateur, comprenant l'utilisation des coordonnées de la structure tridimensionnelle de la protéine MabA recombinante sous forme purifiée, ou d'une protéine recombinante dérivée de la protéine MabA telles que définies ci-dessus, lesdites coordonnées étant représentées sur les figures 1 à 3, pour cribler in silico des chimiothèques virtuelles de ligands potentiels', à l'aide de logiciels informatiques appropriés, et la détection et l'optimisation structurale rationnelle des molécules susceptibles de se lier à ladite protéine.
L'invention a également pour objet toute méthode de conception rationnelle assistée par ordinateur telle que définie ci-dessus, effectuée à partir d'inhibiteurs connus de MabA ou d'inhibiteurs de protéines homologues à MabA (de la même famille structurale des SDR ou RED, et présentant un taux d'identité supérieur à 10% avec MabA sur l'ensemble de la séquence
peptidique), pour lesquels la structure tridimensionnelle fine du complexe entre ledit inhibiteur et la protéine MabA recombinante sous forme purifiée, ou une protéine recombinante dérivée de la protéine MabA, telles que définies ci-dessus, a été déterminée, et optimisation structurale rationnelle desdits inhibiteurs. Nous avons montré que l'activité de MabA était inhibée in vitro par un adduit INH-NADP (H). mécanisme d'action de l'isoniazide (INH) sur MabA est similaire au mécanisme d'action de l'isoniazide sur la protéine InhA, cible de l'INH. D'autres protéines faisant partie de la super-famille des RED ont une structure tridimensionnelle comparable à celle de MabA, dont une stéroïde deshydrogénase (PDB1HSD), des tropinone réductases (ex : PDB1AE1), une trihydroxynaphthalène réductase (PDB1YBV) et une mannitol deshydrogénase (PDB1H5Q), et ont été co-cristallisées avec des inhibiteurs.
Les acides aminés conservés entre AChEl et AChE2 sont indiqués en gris. Les acides aminés spécifiques dAChE2 sont indiqués en noir. Les 3 résidus représentant la triade catalytique (S200, E327 et H44o) sont encadrés. Le site de liaison à la choline (W84) est souligné. Les cercles représentent la position des 14 résidus aromatiques bordant la gorge du site actif dans l'AChE de Torpedo, dont 10 sont présents dans toutes les AChEl et AChE2 (cercles pleins), les autres n'étant pas conservés (cercles vides).
Trois liaisons disulfures intramoléculaires entre des résidus cystéines sont indiquées. La flèche horizontale indique la position du fragment K (amplifié à l'aide des amorces PdirAGSG et PrevAGSG). La région hypervariable d'AChE2 qui est absente dans AChEl est entourée.
- la figure 2 illustre la détection génétique des moustiques résistants aux organophosphorés et/ou aux carbamates par PCR-RFLP : . la figure 2 A représente la comparaison de la séquence en acides aminés du fragment K de différentes espèces de moustiques : Pip (Culex pipiens), Ae alb (Aedes albopictus), Ae aeg (Aedes aegypti), An alb (Anopheles albimanus), An gamb (Anopheles gambiae), An fun (Anopheles funestus), An nil (Anopheles nili), An sac (Anopheles sacharovi), An pse (Anopheles pseudopunctipennis). Les acides aminés variants sont grisés. Les séquences suivantes sont identiques: An. darlingi et An. albimanus; An. sundaicus, An. gambiae et An. arbiensis ; An. moucheti, An. funestus et An. minimus; An. stephensi et An. saccharovi.
. la figure 2B illustre la comparaison des séquences nucléotidiques correspondant au fragment K des souches sensibles (S-LAB) et résistantes (SR). Les nucléotides variants sont grisés (t # c en position 3 ; a # g en position 84 : lesite.EcoRI (gaattc) situé autour de cette position, utilisé pour l'analyse PCR-RFLP, est
présent uniquement dans la souche S-LAB ; c# t en position 173). La figure 2C illustre les profils de restriction obtenus après électrophorèse en gel d'agarose des produits de digestion par EcoRI, du fragment K amplifié par PCR. La souche homozygote sensible S-LAB présente un profil caractérisé par 2 bandes (214 pb et 106 pb), la souche homozygote résistante présente un profil caractérisé par une seul bande de 320 pb et les moustiques résistants issus du croisement en retour présentent un profil hétérozygote caractérisé par 3 bandes (320 pb, 214 pb et 106 pb).
- la figure 3 illustre l'arbre phylogénétique des protéines AChE.
L'analyse phylogénétique a été réalisée à partir de 47 séquences de protéines AChE de 35 espèces différentes provenant de la base de données ESTHER (http://www.ensam.inra.fr/cgi-bin/ace/index). Les séquences ont été alignées et un arbre a été construit comme décrit à l'exemple 1. Seuls les n#uds correspondant à des valeurs de "bootstrap" > 50% (c'est à dire des scores supérieurs à 500) sont indiqués.
L'échelle représente une divergence de 10 %. Agam: An. gambiae ; Aeg : Aedes aegypti ; Aste : Anophèles stephensi; Cp : Culex pipiens; Dmel : Drosophila melanogaster: Lcup: Lucilia cuprina: Mdom : Musca domestica: Ldec : Leptinotarsa decemlineata; Amel: Apis mellifera: Ncin : Nephotettix cincticeps ; Sgra : Schizaphis graminum ; Rapp : Rhipicephalus appendiculatus ; Bmic : Boophilus microplus; Bdec : Boophilus decoloratus; Hsap: Homo sapiens ; Btau: Bos taurus ; Fcat : Felix catus ; Ocun : Oryctolagus cunhiculus ; Rnor : Rattus norvegicus ; Mmus : Mus musculus ; Ggal: Gallus gallus ; Drer : Danio reno ; Eele : Electrophorus electricus ; Tamr: Torpedo marmorata ; Tcal: Torpedo californica ; Bfas: Bungarus fasciatus ; Mglu : Myxine glutinosa ; Bflo: Branchiostoma floridae ; Blan : Branchiostoma lanceolatum ; Cint : Ciona intestinalis ; Csav : Ciona savignyi ; Celé: Caenorhabditis elegans ; Cbrig : Caenorhabditis briggsae ; Dviv: Dictyocaulus viviparus; Lopa : Loligo opalescens.
- la figure 4 illustre le cladogramme des protéines AChEl et AChE2.
Les séquences des protéines AChEl et AChE2 ont été traitées comme à la figure 1. La séquence Bmic a été ajoutée comme séquence externe pour définir l'origine de l'arbre.
Les cadres marqués d'une astérisque représentent les protéines codées par un gène qui ségrège avec la résistance aux insecticides. Les cadres vides représentent les protéines codées par un gène qui ne ségrègue pas avec la résistance aux insecticides. L'échelle correspond à une divergence de 10 %.
- la figure 5 illustre la comparaison des séquences en acides aminés de la protéine AChEl de C. pipiens, entre une souche sensible (S-LAB) et une souche résistante (SR) aux insecticides. L'unique mutation glycine 247(119) # sérine 247(119) (indiquée en grisée) est responsable de la résistance aux insecticides chez les moustiques de l'espèce C. pipiens ; elle correspond à la substitution de la glycine située en position 247 de la séquence de l'AChEl de C. pipiens (ou en position 119, en référence à la séquence de l'AChE du poisson torpille), par une sérine.
- les figures 6A et 6B illustrent la comparaison des séquences nucléotidiques codant pour la protéine AChEl de C. pipiens, entre une souche sensible (S-LAB) et une souche résistante (SR) aux insecticides ; toutes les mutations sont silencieuses à l'exception de la mutation en position 739 (G #A) qui entraîne, d'une part la substitution du codon glycine (GGC) en position 247 de la séquence de la protéine AchEl de la souche sensible (S-LAB) par un codon sérine (AGC) responsable de la résistance aux insecticides dans la souche SR, et d'autre part, l'apparition d'un site Alu I (AGCT) dans la séquence de la souche résistante, utile pour la détection de la mutation. La mutation (G - A) en position 739 de la séquence nucléotidique et la mutation glycine # sérine en position 247 de la séquence en acides aminés sont indiquées en grisé. Les séquences des amorces utilisées pour détecter la mutation en position 739 (amorce Ex3dir et Ex3rev), ainsi que le site Alu I sont indiqués en gras et soulignés.
- la figure 7 (A, B et C) illustre la structure tridimensionnelle de l'AchEl de C. pipiens, obtenue par modélisation moléculaire à partir de la structure de l'AchE du poisson torpille : La figure 7A illustre (i) la structure globale des deux protéines et (ii) et l'encombrement stérique des liaisons de Van der Waals de la sérine 200 et de l'histidine 440 du site catalytique de l'enzyme, ainsi que celui de l'acide aminé en position 119 qui est muté dans les cas de résistance ; le résidu en position 119 est proche des résidu S200 et H440 du site catalytique.
Les figures 7B et 7C illustrent la comparaison de l'encombrement stérique des liaisons de Van der Waals des acides aminés glycine (figure 7C) et sérine (figure 7B) en position 119, de respectivement la souche sensible et résistante.
L'encombrement de la chaîne latérale de la Sérine en position 119 dans la souche
Les tests d'activité de la protéine MabA, et par conséquent les tests d'inhibition par des inhibiteurs potentiels, peuvent être suivis de'façon aisée et rapide, par spectrophotométrie, en suivant l'oxydation du coenzyme de réduction, le NADPH, à 340 nm. Les constantes d'inhibition (ICso et Ki) et le mécanisme d'inhibition (inhibition compétitive, non compétitive, incompétitive) pour chaque molécule peuvent en être déduits. De plus, des tests de fixation spécifique de ligands au site actif de MabA peuvent être réalisés également de façon aisée et rapide, par spectrofluorimétrie. La présence de l'unique résidu Trp de la protéine dans le site actif permet, par excitation à 303 nm, de détecter, à partir de la variation d'intensité d'émission de fluorescence au maximum d'émission, la fixation d'un ligand et d'en déduire la constante de
dissociation (Kd). De façon similaire, des expériences de FRET (Fluorescence Résonance Energy Transfert) peuvent être réalisées en présence du coenzyme, le NADPH, permettant d'en conclure si le ligand occupe ou non le site de fixation du NADPH (compétition de fixation). La simplicité de ces méthodes de mesure, et les volumes relativement faibles qu'elles requièrent, permettront une miniaturisation des tests d'inhibition ou de fixation de ligand, pour le criblage automatique à haut débit de chimiothèques, grâce à un automate doté d'un spectrophotomètre ou d'un spectrofluorimètre.
La comparaison de la structure de MabA avec celle de la protéine InhA, protéine de la même super-famille structurale (RED) et appartenant au même complexe enzymatique (voir cidessus), a permis de suggérer un effet inhibiteur de l'isoniazide sur l'activité de MabA et de mettre en évidence la forme active de l'isoniazide (antituberculeux), l'adduit INH-NADP (H). fixation de l'adduit et l'inhibition de l'activité de MabA a ensuite été confirmée expérimentalement. De la même manière, grâce à une forte similarité de structure avec d'autres protéines, qui ont été ou seront cristallisées avec des ligands (par exemple, des dérivés de stéroïdes, co-cristallisés avec des stéroïdes deshydrogénases), la conception rationnelle d'inhibiteurs potentiels de MabA pourra être réalisée rapidement.
La protéine MabA présente un intérêt particulier en tant que cible d'antibiotiques antimycobactériens. En..effet, elle fait partie du même système enzymatique-que la protéine InhA, cible du médicament antituberculeux de 1ère ligne, l'isoniazide. D'autre part, jusqu'à ce jour, il n'a pas été mis en évidence de protéine homologue à MabA dans les cellules animales. De plus, la comparaison avec les protéines homologues, trouvées chez les bactéries ou les plantes, a fait ressortir des propriétés particulières de MabA, qui sont liées à sa fonction, puisqu'elle utilise des substrats à longue chaîne. Ces particularités se reflètent dans la structure de son site actif, ce qui permet d'envisager la conception d'inhibiteurs spécifiques à MabA (notamment, en terme d'encombrement et de caractère hydrophobe), et donc d'antibiotiques à spectre étroit. Ainsi, ces différents points apportent à MabA des critères de crédibilité pharmacologique.
Ainsi, la présente invention a principalement pour but : - la recherche et la conception de médicaments efficaces contre les infections mycobactériennes opportunistes (M. avium, M. kansasii, M. fortuitum, M. chelonae...) posant des problèmes dans les hôpitaux (stérilisation des instruments médicaux), et dans les cas d'immunodéfiscience humaine (SIDA, prise d'immunosuppresseurs lors d'une greffe, dans le cas de cancers, etc...).
- la recherche et la conception de médicaments efficaces contre les infections tuberculeuses, notamment de médicaments qui soient efficaces sur les souches de M. tuberculosis résistantes aux antibiotiques utilisés actuellement en thérapie antituberculeuse, et qui se propagent dans des populations à risque (milieu carcéral, milieux économiquement défavorisés, etc...).
- la recherche et la conception de médicaments efficaces contre d'autres infections bactériennes, en prenant comme cibles moléculaires des protéines homologues à MabA.
La présente invention a principalement pour objet la protéine MabA, encore désignée protéine FabGl, recombinante sous forme purifiée, ou les protéines recombinantes dérivées de la protéine MabA par mutation d'un ou plusieurs acides aminés, lesdites protéines dérivées étant sous forme purifiée, et ayant une activité p-cétoacyl réductase NADPH dépendante.
L'invention a plus particulièrement pour objet la protéine MabA recombinante purifiée, ladite protéine étant une protéine de mycobactéries, telle que Mycobacterium tuberculosis, et plus particulièrement de M. tuberculosis souche H37Rv.
L'invention a également pour objet la protéine MabA recombinante ou les protéines recombinantes dérivées susmentionnées, sous forme purifiée, telles qu' obtenues par transformation de souches d'E. coli avec un plasmide contenant une séquence comprenant le gène codant pour la protéine MabA, ou comprenant une séquence codant pour une protéine dérivée de MabA telle que définie ci-dessus, suivie par une étape de purification au cours de laquelle : - les bactéries E. coli recombinantes susmentionnées sont lavées dans un tampon de lavage, puis reprises dans un tampon de lyse, et lysées par un cycle de congélation décongélation en présence d' inhibiteurs de protéases et du lysozyme; - après traitement par la DNAse 1 et la RNAse A, en présence de MgCl2, et centrifugation, le surnageant de lyse des bactéries obtenu à l'étape précédente, auquel est additionné 10% (v/v) de glycérol, ou du NADP+ 400 M, est déposé sur une colonne de résine Ni-NTA agarose, - après plusieurs lavages avec du tampon à 5 mM puis 50 mM imidazole, la protéine MabA, ou la protéine dérivée, est éluée avec le tampon d'élution.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la protéine MabA recombinante ou les protéines recombinantes dérivées susmentionnées, sous forme purifiée, sont obtenues selon le
procédé décrit ci-dessus dans lequel les différents tampons de lavage des bactéries, de lyse, de lavage, et d'élution, sont les suivants : - tampon de lavage des bactéries : phosphate de potassium 10 mM, pH 7,8, - tampon de lyse : phosphate de potassium 50 mM, pH 7,8 contenant 500 mM de NaCl, 5 mM d'imidazole, - tampon de lavage : phosphate de potassium 50 mM, pH 7,8 contenant 500 mM de NaCl, 5 et 50 mM d'imidazole, - tampon d'élution: phosphate de potassium 50 mM, pH 7,8 contenant 500 mM de NaCl, et 175 mM d'imidazole.
Avantageusement, les protéines obtenues à l'aide des tampons susmentionnés, sont utilisées dans le cadre d'études de cinétique enzymatique pour le criblage de ligands selon les méthodes décrites ci-après.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la protéine MabA recombinante ou les protéines recombinantes dérivées susmentionnées, sous forme purifiée, sont obtenues selon le procédé décrit ci-dessus dans lequel les différents tampons de lavage des bactéries, de lyse, de lavage, et d'élution, sont les suivants : - tampon de lavage des bactéries : Tris 10 mM, pH8,0, - tampon de lyse : . 50 mM tampon Tris, pH 8,0, supplémenté avec 300 mM LiS04 et 5 mM imidazole ; . ou 50 mM tampon Tris, pH 8,0, supplémenté avec 300 mM KC1 et 5 mM imidazole, - tampon de lavage : . 50 mM tampon Tris, pH 8,0, supplémenté avec 300 mM LiS04 et 5 ou 50 mM imidazole, . ou 50 mM tampon Tris, pH 8,0, supplémenté avec 300 mM KC1 et 5 ou 50 mM imidazole.
- tampon d'élution: . 20 mM MES buffer, pH6.4, LiS04 300mM et 175-750 mM imidazole; . ou 20 mM tampon PIPES, pH 8,0, supplémenté avec 300 mM KC1 et 175-750 mM imidazole, 1 mM DTT étant ajouté à ces tampons dans le cas de la protéine MabA sauvage.
Avantageusement, les protéines obtenues à l'aide des tampons susmentionnés, sont utilisées dans le cadre d'études de cristallographie pour la conception et le criblage de ligands selon les méthodes décrites ci-après.
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L' angle 43 correspond ici a ['angle d'inclinaison 39 du
trenchant de ton' 16 d'une dent de coupe 15 qui suit.
Le tron,con de ton' 22 est incline par rapport a la direction longitudinale 9 de la chaine, d'un angle 35 lo qui correspond a ['angle d'inclinaison 35 du tron,con plan 19 du limiteur de profondeur 18. Le cote 47 du tronc,on de ton' 22 eloigne du tron,con lateral 21, est incline d'un angle 52 par rapport au plan 33 du corps de base 14. L' angle 52 stouvre a l'encontre du sens de marche 8. Le rapport de ['angle 52 relativement a l' angle 35 dont est incline le tron,con de ton' 22 par rapport a la direction longitudinale 9 de la chalne dans le plan 33 du corps de base 14, correspond ici sensiblement au rapport de l' angle 31 dont est inclinee la dent de coupe 15 par rapport au plan du corps de base, relativement a l' angle 36 dont est inclinee la dent de coupe dans le plan du corps de base, par
rapport a la direction longitudinale 9 de la chaine.
Ainsi, la distance d'espacement 46 entre la dent de coupe 15 et le limiteur de profondeur 18, perpendiculairement a la direction longitudinale 9 de la chalne, reste constante lors d'un reaffutage. La longueur 55 du tron,con lateral 21, dans la zone du corps de base 14, est de preference egale a ou plus grande que la longueur 38 du tronc,on de ton' 22 sur le cote 56 dirige vers le tron,con lateral 21. Le limiteur de profondeur 18 est attache sur son cote de grande largeur. Sur les figures 16 a 19 est represente un detail d'une chaine de scie 5, dans laquelle le
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