INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
On remarque que les silanes aminés et salifiés améliorent nettement l'adhérence sur tissu de verre. Le silane aminé et salifié 6. 2 améliore aussi l'adhérence sur tissu en polyester.
Le test du pelage à 180 sur support fibreux est une mesure de l'adhérence d'émulsions de PA. La procédure de ce test est la suivante : 1. Principe Mesure de la force nécessaire pour décoller 2 bandes de supports enduits du mélange à tester et réticulées sur les supports fibreux.
2. Réactifs Utilisation de Bleu de Méthylène pour faciliter le repérage de la superposition des deux lamelles de tissu enduites (non indispensable à la mesure).
3. Appareillage - 1 presse chauffante : fixer la température des plateaux à 120 C.
- 2 étuves : une à 80 C et une à 160 C.
- installation pour application par mode sérigraphique (utilisation d'une toile de mailles de diamètre- 200 m).
- 1 Balance.
Selon une troisième méthode, on met en présence le solide pulvérulent (polylactide/polyAAI), tel que décrit supra en tant que produit et par ses caractéristiques d'obtention, avec une phase liquide (aqueuse ou non) contenant le PA.
Conformément à l'étape facultative-9)-, on élimine les impuretés (sels) ainsi que le solvant, par tout traitement de séparation physique approprié, par exemple par diafiltration (dialyse), filtration, modification pH, chromatographie...
Cela conduit à une suspension (de préférence aqueuse) de particules structurées qui peut être concentrée [étape -10)-], par exemple par distillation ou tout autre moyen physique convenable : ultrafiltration, centrifugation.
Pour séparer à l'étape -11)-, les particules de leur milieu liquide de suspension, on élimine, éventuellement, la phase aqueuse, par exemple par séchage (e. g. à l'étuve), par lyophilisation ou tout autre moyen physique convenable : ultrafiltration, centrifugation.
On récupère, à l'issue de cette étape -11)-, un solide pulvérulent, de couleur blanche.
Il est à noter que la mise en #uvre des étapes-1)-, -2) -, -3) -, -4) -, -5) -, -6) -, -7) -, et éventuellement-8)- du procédé ci-dessus correspondent à une préparation d'une suspension colloïdale de particules submicroniques et à fort taux de chargement en PA.
Lors de cette préparation de suspension colloïdale, les copolymères amphiphiles polylactide et/ou polyglycolide et/ou polycaprolactone-poly(AAI) de l'étape-6)- sont placés dans un milieu aqueux dans lequel au moins une partie des PAHC est soluble et au moins une partie des AANO est insoluble. Les copolymères PAHC/polyAAI existent sous forme de nanoparticules dans ce milieu aqueux.
Une alternative pour préparer la suspension de PV selon l'invention consiste à mettre en présence le solide pulvérulent, tel que décrit ci-dessus en tant que produit et par son procédé d'obtention, avec un milieu aqueux, non-solvantt des AAI.
Compte tenu de la taille nanométrique des particules, la suspension peut être filtrée sur des filtres de stérilisation, ce qui permet d'obtenir, aisément et à moindre coût, des liquides médicamenteux injectables stériles. Le fait de pouvoir, grâce à l'invention, faire subir à la suspension de particules une filtration stérilisante, est un atout important.
La présente invention vise, également, de nouveaux produits intermédiaires du procédé décrit ci-dessus, caractérisés en ce qu'ils sont constitués par des copolymères PAHC-polyAAI précurseurs de particules.
Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne une suspension et/ou un solide pulvérulent, tels que définis ci-dessus et/ou tels qu'obtenus par le procédé présenté supra, cette suspension et ce solide comprenant au moins un principe actif hydrophile, choisi, de préférence, parmi : # les vaccins ; # les protéines et/ou les peptides, parmi lesquels les plus préférentiellement retenus sont : les hémoglobines, les cytochromes, les albumines, les interférons, les cytokines, les antigènes, les anticorps, l'érythropoïétine, l'insuline, les hormones de croissance, les facteurs VIII et IX, les interleukines ou leurs mélanges, les facteurs stimulants de l'hématopoïèse ; # les polysaccharides, l'héparine étant plus particulièrement sélectionnée ; # les acides nucléiques et, préférablement, les oligonucléotides d'ARN et/ou d'ADN,
# des molécules non peptido-protéiques appartenant à diverses classes de chimiothérapie anticancéreuses et, en particulier, les anthracyclines et les taxoïdes ; # et leurs mélanges.
Enfin, l'invention concerne une spécialité pharmaceutique, nutritionnelle, phytosanitaire ou cosmétique, caractérisée en ce qu'elle comporte une suspension et/ou du solide pulvérulent chargé (s) PA hydrophile et tels que définis ci-dessus.
L'invention vise en outre la mise à profit des propriétés anti-bactériennes des peptides de l'invention pour prévenir et/ou traiter les infections bactériennes, en particulier contre les bactéries à Gram positif tant chez l'homme et l'animal que chez les plantes. L'invention concerne donc avantageusement l'utilisation des peptides de l'invention à titre de médicament en thérapie humaine et animale. Elle concerne également l'utilisation des peptides de l'invention pour le traitement des plantes contre les infections bactériennes, en appliquant le ou les peptides de l'invention directement sur les plantes.
L'invention concerne aussi une composition antibactérienne comprenant au moins un peptide de l'invention avantageusement associé dans ladite composition à un véhicule acceptable. La composition agit plus particulièrement contre les bactéries à Gram positif. Lorsque la composition est appliquée à la thérapie humaine, les bactéries Gram positif sont de préférence de genre Staphylococcus en particulier Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis, de genre Streptococcus en
particulier Streptococcus pneumoniae, de genre Enterococcus en particulier Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium ou de genre Mycobacterium en particulier Mycobacterium tuberculosis. Par véhicule , on entend selon la présente invention, toute substance qui est ajoutée au (x) de l'invention pour favoriser le transport du ou des peptides, éviter leur dégradation substantielle dans ladite composition et préserver leurs propriétés anti-bactériennes. Le véhicule est choisi en fonction du type d'application de la composition.
Notamment, lorsque la composition est appliquée à un usage pharmaceutique en santé humaine et animale, le véhicule est un véhicule pharmaceutiquement acceptable adapté à une administration du ou des peptides de l'invention par voie topique, per os ou par injection. Lorsque la composition est appliquée à un usage cosmétique, le véhicule est un véhicule cosmétiquement acceptable adapté à une administration sur la peau ou les phanères. Lorsque la composition est appliquée à un usage agrochimique, le véhicule est un véhicule agrochimiquement acceptable adapté à une administration sur les plantes ou à proximité des plantes sans les dégrader.
Les peptides ou la composition de l'invention présentent également un intérêt dans l'industrie agroalimentaire. Leur utilisation permet notamment d'empêcher la contamination par les germes bactériens, en particulier à Gram positif pendant leur fabrication et après leur fabrication pour leur conservation.
Dans l'industrie phytosanitaire, les peptides ou la composition de l'invention peuvent également être utilisé pour la fabrication des produits phytosanitaires en lieu et place des produits usuels.
Les défensines d'insectes hybrides de la présente invention présentent l'avantage d'être préparés rapidement
tout en conservant la conformation native de type cs[alpha]ss caractéristique des défensines d'insectes dont ells sont issues. Les étapes de culture et/ou collecte d'insectes, d'induction de synthèse biologique de peptides antimicrobiens par blessure septique ou injection à chacun d'eux d'une faible dose de bactérie et d'extraction étant désormais inutiles, l'utilisateur gagne d'autant plus de temps que le procédé développé par la demanderesse lui permet aussi d'accélérer l'évolution artificielle des gènes codant les défensines d'insectes.
L'analyse de l'état de la technique dans le domaine des peptides anti-microbiens d'insectes ne permettait pas quant à elle de déduire que les défensines d'insectes hybrides de l'invention présenteraient un spectre d'activité semblable à celui des défensines d'insectes à partir desquelles elles sont issues. L'état de l'art antérieur enseigne au contraire que des peptides structuralement proches peuvent présenter un spectre d'activité différent. Notamment, les défensines d'insectes et l'héliomicine qui sont tous les 2 des peptides présentant une structure tridimentionnelle de type CSap et qui comprennent 3 ponts disulfures intramoléculaires, présentent un spectre d'action totalement divergent. L'héliomicine présente en effet essentiellement des propriétés antifongiques (W099/53053) alors que les défensines d'insectes ont une action spécifiquement dirigée contre les bactéries à Gram positif.
D'autres avantages et caractéristiques du procédé de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation de défensines d'insectes hydrides présentant des propriétés anti-bactériennes et dans lesquels il sera fait référence aux dessins en annexe dans lesquels :
-La figure 1 représente l'alignement des séquences peptidiques de 40 défensines d'insectes ; -La figure 2 représente la modélisation de la structure tridimensionnelle de la défensine du diptère Anopheles gambiae ; -La figure 3 représente la liste des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants utilisées à l'étape (a) d'assemblage; -La figure 4 représente la construction d'une banque de défensines d'insectes hybrides; -La figure 5 représente le vecteur d'expression de levure S. cerevisiae pEM105 ; -La figure 6 représente les activités in vitro (IC90 g/ml) des défensines d'insectes hybrides contre Staphylococcus aureus ; -La figure 7 représente l'efficacité in vivo (pourcentage de survie et les scores moyens de santé par rapport aux jours post-infection) des défensines d'insectes hybrides ETD-P1255, ETD-P1263 et ETD-P1268 dans le modèle murin de péritonite à Staphylococcus aureus méthicilline-sensible avec administration par voie intra-péritonéale; -La figure 8 représente l'efficacité in vivo (pourcentage de survie et les scores moyens de santé par rapport aux jours post-infection) des défensines d'insectes hybrides ETD-P1255, ETD-P1263 et ETD-P1268 dans le modèle murin de péritonite à Staphylococcus aureus méthicilline-sensible avec administration par voie intra-veineuse; -La figure 9 représente l'efficacité in vivo (pourcentage de survie et les scores moyens de santé par rapport aux jours post-infection) de la défensine
d'insecte hybride ETD-P1263 dans le modèle murin de péritonite à Staphylococcus aureus méthicilline- résistant avec administration par voie intra- péritonéale.
Exemple 1 : Préparation d'une banque de défensines d'insectes hybrides présentant des propriétés antibactériennes améliorées.
A) Construction de la banque de défensines d'insectes hybrides.
1) Choix des séquences nucléotidiques simples brins chevauchants et des acides nucléiques simples brins utilisés dans l'étape (a) du procédé.
La figure 1 en annexe représente l'alignement des séquences peptidiques de 40 défensines d'insectes (31 décrites dans la littérature et 9 nouvellement isolées par la demanderesse selon un procédé conventionnel connu de l'homme du métier, notifiées (*) ) issues de 6 ordres d'insectes différents. L'analyse de l'alignement a permis de révéler la présence de 3 régions variables (en caractères gras, figure 1) séparées par des régions substantiellement conservées. 32 séquences différentes ont été identifiées pour la région variable n 1, 28 pour la région variable n 2 et 33 pour la région variable n 3.
Et a contrario, on peut souhaiter éviter de brancher certains éléments optionnels pour certains modes.
Le branchement des différents éléments optionnels sur le dispositif définit une configuration du dispositif. Et le dispositif peut ainsi être
configuré de différentes manières, en fonction des éléments optionnels branchés.
Diagnostic de configuration L'invention met en #uvre une étape de diagnostic de la configuration du dispositif, pour établir la liste des éléments optionnels qui sont effectivement branchés sur le dispositif.
Concernant la fréquence de réalisation d'un tel diagnostic : # Cette étape de diagnostic peut être mise en #uvre à chaque mise sous tension du dispositif, # Elle peut également être mise en #uvre lors de toute nouvelle sélection d'un mode, # Et elle peut également être mise en #uvre périodiquement de manière systématique, à des fins de vérification de la bonne configuration du dispositif, # On précise que les solutions mentionnées ci-dessus peuvent être combinées.
Cette étape de diagnostic peut être réalisée automatiquement, par des moyens de diagnostic automatique du dispositif.
Dans ce cas, lesdits moyens de diagnostic automatique sont programmés pour effectuer le diagnostic de configuration lorsque cela est désiré (voir différentes possibilités de fréquence de réalisation du diagnostic ci-dessus).
De tels moyens de diagnostic automatique permettent de déterminer automatiquement quels sont les éléments optionnels qui sont branchés correctement sur le dispositif.
Dans le cas décrit ici les éléments optionnels comprennent la valve expiratoire et le flexible de prise de pression proximale.
Pour détecter le bon branchement d'une valve expiratoire, ces moyens de diagnostic automatique peuvent effectuer les opérations suivantes :
# fixation d'une consigne de pression à atteindre au niveau de la valve expiratoire, # commande de la source de pression du dispositif (la turbine dans le cas décrit ici) pour atteindre cette consigne au niveau de la valve expiratoire, > on précise à cet égard que la valve expiratoire est commandée pneumatiquement par le flexible de commande mentionné plus haut, ce flexible étant alimenté par la source de pression du dispositif, # mesure d'une caractéristique de ladite source de pression lorsque la consigne est atteinte, > Cette caractéristique peut par exemple être une énergie consommée par la turbine pour fournir dans la conduite une pression permettant d'atteindre la pression de consigne au niveau de la valve expiratoire, # déduction, en fonction de ladite caractéristique, de la présence d'un branchement correct d'une valve expiratoire, > si la turbine n'a consommé qu'une énergie faible pour permettre d'atteindre la pression de consigne au niveau de la valve expiratoire, cela signifie que la valve expiratoire est bien branchée. Si l'énergie consommée est importante, le branchement n'est pas effectué, ou il est défectueux.
> On a dans ce cas prédéfini et mémorisé dans le dispositif deux plages de valeurs d'énergie consommée par la turbine pour déterminer respectivement un domaine correspondant à une valve correctement branchée, et un domaine correspondant à un défaut de branchement de valve.
Les moyens de diagnostic automatique comprennent donc dans ce cas des moyens permettant de réaliser ces différentes opérations. De tels moyens sont reliés à la mémoire et aux programmes mentionnés plus haut.
Pour détecter le bon branchement d'un flexible de prise de pression proximale, les moyens de diagnostic automatique comprennent : 3 Un capteur de pression au niveau de la connexion pour le flexible de prise de pression proximale,
> Ce capteur indique la pression proximale lorsque le flexible est branché.
Cette pression proximale correspond lorsque le flexible est branché à la pression au niveau de la conduite, en prenant en compte une perte de charge (qui est fonction entre autres de la longueur de conduite entre la prise de pression de conduite et la prise de pression proximale), > En l'absence de flexible, le capteur de pression proximale indique une pression faible, # Des moyens de comparaison des valeurs de la pression au niveau de la conduite et de la pression proximale, # Des moyens permettant d'établir en fonction de cette comparaison si un flexible de prise de pression proximale est bien branché sur le dispositif.
3) Troisième étape : Préactivation Les lames silanisées sont placées dans une solution aqueuse de potasse (8 %) pendant 5 minutes, sous agitation à température ambiante. Elles sont ensuite rincées avec de l'eau milliQ (3 lavages de 5 minutes chacun) avant d'être séchées sous courant d'azote.
4) Quatrième étape : Fonctionnalisation avec les dendrimères Les lames préactivées sont placées dans une solution de dendrimères G4 tel que décrit ci-dessus à l'exemple 1 (0,1 % dans du dichlorométhane) pendant 7 heures sous agitation à température ambiante. Elles sont ensuite lavées avec du dichlorométhane (2 lavages de 5 minutes chacun) puis avec de l'éthanol (1 lavage de 5 minutes) avant d'être séchées sous courant d'azote.
On obtient ainsi un support solide fonctionnalisé par des dendrimères phosphorés à fonctions aldéhydes (dendrilame : DL-B-G4). Cette dendrilame peut ensuite être utilisée pour l'immobilisation de molécules d'intérêt.
EXEMPLE 3 PRÉPARATION DE BIOPUCES A PARTIR DES DENDRILAMES PRÉPARÉES AUX EXEMPLES 1 ET 2 : "DENDRIPUCES" 1) Dépôt des oligonucléotides a) Oliaonucléotides utilisés Oligonucléotide ON1 : 35 mer-amine ayant la séquence SEQ ID N 1 suivante : 5' -GTG-ATC-GTT-GTA-TCG-AGG-AAT-ACT-CCG-ATA-CCATT ~3', modifié en position 5' par un groupement - NH2-(CH2)6-.
Cet oligonucléotide, qui est modifié à son extrémité 5' par un bras à 6 carbones terminé par une fonction amine (Eurogentec, Belgique), permet la réaction avec les fonctions aldéhydes présentes sur la dendrilame telle que décrite ci-dessus aux exemples 1 et 2.
Oligonucléotide ON2 : 35 mer-oxyamine ayant la séquence SEQ ID N 1décrite ci-dessus et modifié en position 5' par un - H2NO-(CH2)6-.
La séquence SEQ ID N 1 des oligonucléotides ON1 et ON2 correspond à une partie du gène GPH1 de la levure Saccharomyces cerevisiae.
Les dépôts des oligonucléotides ont été effectués en utilisant le robot Eurogridder (Eurogentec, Seraing, Belgique) et ont été espacés de 200 m. b) Dépôts sur les dendrilames On utilise les dendrilames DL-A-G3, DL-A-G4, DL-A-G5 et DL-BG4 telles que préparées ci-dessus aux exemples 1 et 2.
Sur les dendrilames DL-A-G3, DL-A-G4, DL-A-G5 préparées à l'exemple 1, les oligonucléotides ON1 sont déposés dans un tampon phosphate 0,3 M (pH 9) contenant des quantités croissantes de diméthylsulfoxide (DMSO) (0 ; 10 ; 30 ;40 ou 50 %, v/v) en utilisant le robot Eurogridder (Eurogentec, Belgique). Les volumes déposés sont de 2 ni et les concentrations varient de 1 M à 10 m (1 ; 2 ; 5 et 10 M). Après dépôt les lames sont laissées pendant une nuit à température ambiante.
Elles sont ensuite immergées dans une solution aqueuse de borohydrure de sodium (NaBH4, 3,5 mg/mL) (étape de réduction des fonctions imines) et sont agitées pendant 3 heures à température ambiante. Elles sont rincées avec de l'eau MilliQ (3 lavages de 5 minutes chacun) et sont séchées sous courant d'azote ou par centrifugation. On obtient les dendripuces (DP) suivantes DP1-A-G3 ; DP1-A-G4 et DP1-A-G5.
Sur les dendrilames DL-B-G4 préparées à l'exemple 2, les oligonucléotides ON1 sont déposés dans le tampon phosphate 0,3 M (pH 9) en utilisant le robot de dépôt. Les volumes déposés sont de 2 ni et la concentration est de 10 M. Après dépôt les lames sont laissées pendant une nuit à une température ambiante. Elles sont ensuite immergées dans une solution aqueuse de borohydrure de sodium (NaBH4, 3,5 mg/mL) (étape de réduction des fonctions imines) et sont agitées pendant 3 heures à température ambiante. Elles sont rincées avec de l'eau MilliQ (3 lavages de 5 minutes chacun) et sont séchées sous courant d'azote ou par centrifugation. On obtient des dendripuces DP1-B-G4.
Les oligonucléotides ON2 ont également été déposés sur les dendrilames préparées à l'exemple 2.
Pour ce faire, les oligonucléotides ON2 sont déposés dans l'eau MilliQ. Les volumes déposés sont de 0,2 l et les concentrations varient de 1 M à 10 M (1 M, 5 M et 10 M). Sur la même lame les oligonucléotides ON1 ont été
déposés dans le tampon phosphate 0,3 M dans les mêmes conditions de volume et de concentration. Les lames sont laissées pendant 7 heures à température ambiante. Elles sont ensuite immergées dans une solution aqueuse de borohydrure de sodium (NaBH4, 3,5 mg/mL) et sont agitées pendant 3 heures à température ambiante. Elles sont ensuite rincées avec de l'eau MilliQ (1 lavage de 5 minutes), avec une solution aqueuse de dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,2 % (1 lavage de 5 minutes) et à nouveau avec de l'eau (5minutes). Elles sont enfin séchées sous courant d'azote. On obtient des dendripuces DP2-B-G4.
On obtient ainsi différentes sortes de biopuces correspondant à des dendrilames sur lesquelles ont été fixés des oligonucléotides ("dendripuces"). Ces dendripuces peuvent ensuite être utilisées dans des réactions d'hybridation.
EXEMPLE 4 : HYBRIDATION 1) Matériel et méthodes 1-a) Tampons utilisés Les différents tampons utilisés lors des étapes d'hybridation sont reportés ci-dessous ; ils ont été préparés à partir des différentes solutions commerciales suivantes : - 20 x SSC (citrate de sodium 0,3 M ; NaCl 3 M, pH environ 7 ; - 20 x SSPE (Tampon Phosphate 0,2 M, 2,98 M NaCl, 0,02 M EDTA, pH environ 7,4 ; Sigma), - 50 x Solution de Denhardt (Sigma), - ADN saumon (9,9 mg/mL, Sigma).
A titre purement indicatif et nullement limitatif, le dépôt d'argent a lieu dans une enceinte où la pression est inférieure à 2x10-8Pa et vaut par exemple 6x10-9Pa; la distance entre la surface et la source d'argent vaut environ 15cm; le courant traversant la source d'argent pendant le dépôt vaut 4A;
le temps de dépôt est compris entre 2 minutes et 8 minutes (8 minutes correspondant à environ une monocouche d'argent ); le dépôt a lieu en laissant l'échantillon de SiC à température ambiante (environ 20 C). Les recuits nécessaires sont faits à environ 500 C. En faisant varier la température de recuit, on peut jouer sur la vitesse de migration des atomes de métal (la vitesse de migration augmente avec la température) et sur la quantité de métal désorbé (qui augmente avec la température) et donc jouer sur la taille des agrégats et sur leur espacement.
Il convient de noter que l'argent s'évapore complètement grâce à un court recuit à environ 700 C, pendant quelques dizaines de secondes.
On donne maintenant un deuxième exemple du procédé objet de l'invention, permettant de fabriquer des bandes unidimensionnelles d'argent ou des fils d'argent.
On commence par préparer une surface de carbure de silicium cubique, terminée Si -SiC(100) c (4x2), c'est-à-dire une surface de SiC en phase cubique p-SiC(lOO), cette surface étant terminée Si et reconstruite c(4x2).
En outre, sur cette surface reposent des lignes atomiques de silicium auto-organisées qui sont parallèles, ces lignes formant des rangées de dimères Si-Si.
On se référera au document [5] où l'on explique comment obtenir des chaînes rectilignes de dimères Si-Si (lignes atomiques) à la surface d'un substrat monocristallin de SiC en phase cubique (3-SiC(100) que l'on a transformé pour que sa surface soit terminée 3x2 puis que l'on a convenablement recuit.
Alors, par des recuits thermiques à 1100 C, on transforme cette surface de symétrie 3x2 jusqu'à ce qu'elle présente une organisation à l'échelle atomique (reconstruction) de symétrie c(4x2).
Sur la surface Si -SiC(lOO) c (4x2) ainsi obtenue, on dépose de l'argent dans les mêmes conditions que dans le premier exemple.
On constate que, à la température ambiante, les atomes d'argent diffusent lentement sur la surface, le long des rangées de dimères, en donnant des fils atomiques du métal, parallèles à ces rangées.
La figure 2 est une vue de dessus schématique de la surface 6 portant les rangées parallèles 8 de dimères Si-Si et les fils atomiques du métal 9, qui sont parallèles à ces rangées.
Quand la surface est couverte d'argent, on procède à un recuit en dessous de la température de désorption totale de l'argent (700 C).
La couche d'argent est désorbée de façon sélective et les atomes restant sur la surface s'organisent pour faire des bandes unidimensionnelles parallèles d'argent, de taille nanométrique, ou des fils atomiques parallèles d'argent. La direction de ces fils atomiques et de ces bandes unidimensionnelles est perpendiculaire aux rangées de dimères.