INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Dans l'exemple de la figure 11 on a choisi de placer un commutateur optique 62 du genre 1x4 qui commute le signal d'entrée S sur chacune des voies d'analyse comportant un extracteur. L'avantage d'un tel commutateur est qu'il permet d'analyser la totalité du signal sur chacune des voies. Il n'y a donc pas de perte de puissance.
Il convient cependant de noter que la mesure ne se fait pas instantanément : les plages de balayage des extracteurs sont interrogées successivement.
A la place du commutateur on peut utiliser une suite de coupleurs ou tout autre système de division d'une onde optique guidée.
Dans le cas des coupleurs, pour une association de 2n extracteurs, il faut utiliser 2n - 1
coupleurs.
Les milieux de culture utilisables selon l'invention sont ceux généralement connus de l'homme du métier. On peut citer à titre d'exemples les milieux de Gamborg, Murashige et Skoog, Heller, White etc.... On trouvera dans "Plant Culture Média : formulationsand uses" de E. F. George, DJM Puttock et H.J George (Exegetics Ltd 1987, tome 1 & 2) des descriptions complètes de ces milieux.
Préférentiellement selon l'invention on prépare les cellules végétales dédifférenciées cultivées sur milieu de Murashige et Skoog.
Etat de la technique On connaît par le document FR 2795637 une composition cosmétique contenant un extrait de cellules végétales dédifférenciées pour éviter les problèmes d'odeur. Cette composition contient un extrait de cellules végétales dédifférenciées mais non élicitées, de sorte que cette composition est pauvre en métabolites secondaires ou en phytoalexines, voire est sensiblement exempte de tels composés. De plus ce document décrit l'utilisation d'extrait aqueux obtenus après broyage des cellules dans leur milieu de culture puis élimination des particules en suspension avec une perte inévitable des métabolites liés aux particules en suspension. Afin
d'éliminer les protéases et notamment les oxydases ce document préconise également l'emploi de filtres capturant les molécules d'un poids moléculaire supérieur à 100. 000 daltons perdant ainsi dans l'extrait final tous les métabolites supérieurs à ce poids et qui peuvent s'avérer d'un grand intérêt pour l'industrie cosmétique. De plus afin d'éliminer les problèmes dus à l'oxydation le document préconise l'ajout de stabilisants, notamment la cystèine et/ ou des dérivés soufrés ce qui entraîne nécessairement une pureté moindre de l'extrait avec des étapes subséquentes de filtration. Les méthodes décrites dans ce document nécessitent la mise en oeuvre de moyens compliqués pour l'obtention d'extraits dont, tant la pureté ( nombreux additifs), que la qualité et la concentration ( en métabolites ) n'est pas optimale. De plus les nombreuses étapes nécessaires à l'obtention des extraits de ce procédé induisent des coûts élevés et le risque de contaminations de part les nombreuses manipulations et additifs.
On connaît les cultures de cellules dédifférenciées, d'autre part on connaît les mécanismes d'élicitation de ces cellules suivi d'étapes d'extractions et de filtrations diverses suivis de lyophilisation afin d'incorporer les extraits obtenus dans une préparation cosmétique ou pharmaceutique.
De nos jours, malgré les compétences et le savoir faire des industries dans le domaine de l'extraction végétale, et malgré les progrès de la chimie organique, plusieurs étapes d'extraction sont indispensables pour obtenir une matière première végétale.
Plusieurs inconvénients sont imputés à ces extractions : - perte de la structure tertiaire des molécules isolées, - présence des différents solvants au niveau du produit fini, - hétérogénéité des substrats nécessitant des extractions fines faisant appel à des solvants de plus en plus toxiques,
- qualité de l'extrait en fonction de l'état physiologique de la plante au moment de la récolte, - production de l'extrait limitée en fonction des saisons, Face à ces facteurs limitants et au regain d'intérêt des consommateurs pour tout ce qui est d'origine naturelle, plusieurs tentatives d'obtention de cellules ont été réalisées. Ainsi, à ce jour, deux procédés majeurs ont été exploités : - La culture de cellules à partir d'organismes unicellulaires ou de microorganismes, technique peu originale se basant sur la reproduction des conditions de vie normale. Cependant ces organismes sont primitifs et ne développent pas de métabolisme secondaire, source des principes actifs les plus intéressants.
- L'obtention des cellules à partir de fruits (cellules fraîches) après digestion enzymatique. Les limites de ce procédé résident dans le fait que les fruits ne sont pas aseptiques et qu'ils peuvent contenir des résidus de pesticides (fongicides, herbicides, insecticides,...). D'autre part, les enzymes (cellulases, pectinases,... ) utilisées en quantité importante (2%, P/P) pour la digestion des parois végétales et l'obtention des cellules sans paroi (protoplastes) se retrouvent dans le produit fini. Par ailleurs, les enzymes utilisées peuvent altérer la qualité des métabolites. Enfin, l'utilisation de cette technique permet seulement de récupérer des protoplastes (cellules sans paroi cellulaire), structures fragiles ne pouvant pas orienter leur métabolisme.
L'inventeur a développé une technologie innovante et maîtrisée, garantissant la qualité et l'authenticité des produits. Il s'agit de la mise en culture de cellules de plantes supérieures dédifférenciées.
En effet, et pour la première fois, un procédé industriel permet d'obtenir des cellules à partir de plantes supérieures par un processus sans aucune modification de leur patrimoine génétique, permettant à la cellule de garder ses caractéristiques physiologiques.
Le maintien des différentes souches est assuré par repiquages réguliers, avec une maîtrise totale des différentes conditions de culture.
L'intérêt de ce procédé et qu'il permet la culture de cellules végétales dédifférenciées en grands volumes tout en répondant aux besoins de l'industrie, notamment : - Le respect de la structure tertiaire des molécules, - L'absence de solvant et de résidus, - L'homogénéité des substrats, - La production continue indépendamment du cycle des saisons, - La conservation des caractéristiques biologiques et physiologiques sans ajout de conservateur, - L'absence totale de polluants, - La production standardisée et reproductible quant à la qualité et la concentration des métabolites, - L'utilisation de ces suspensions végétales après lyophilisation directe. Cette technique permet l'obtention d'une poudre très fine pouvant être dispersée dans des compositions cosmétiques (crèmes, pommades, lotions...). Ces cellules sont susceptibles de libérer directement les principes actifs qu'elles contiennent, sans
passage par une extraction à l'aide de solvants organiques (élimination des risques de résidus).
- L'utilisation des extraits cellulaires uniquement après sonification et centrifugation.
Cette technologie apporte une alternative utile et innovante aux extractions conventionnelles par solvants. La possibilité d'orienter de manière naturelle (élicitation) la synthèse des métabolites sans porter atteinte à l'intégrité génétique des cellules, représente une garantie de qualité et d'authenticité.
Cet appareil fonctionnait comme suit. Les produits d'amplification, marqués par l'amorce fluorescente, ont été mélangés à un tampon dénaturant (formamide) et à un standard de taille interne. Ce mélange a ensuite été dénaturé (chauffage 3 min à 95 C) puis déposé dans l'appareil.
Ce dépôt a été chargé électriquement 5 sec à 15 kV, puis a migré dans un capillaire soumis à un champ électrique important (15 kV). Le capillaire était éclairé au niveau d'une fenêtre par un faisceau laser. Le rayonnement lumineux émis par la molécule fluorescente sous l'impact du faisceau laser a été capté par une caméra numérique CDD puis analysé par un logiciel informatique GeneScan@. La quantité de produit présente dans le dépôt était proportionnelle à l'intensité du rayonnement émis. Sa taille a été calculée à partir de la durée de migration du produit lors de l'électrophorèse capillaire jusqu'à la fenêtre du faisceau laser.
Un exemple de tracé est fourni à la Figure 3.
1-6- Détermination d'un déséquilibre allélique En théorie, un DA se traduit par la modification du rapport 1/1 des deux allèles présents initialement dans la cellule (soit disparition, soit duplication d'un allèle).
Une difficulté était posée par le fait que le culot urinaire contenait des cellules tumorales, mais également des cellules normales provenant de la desquamation de l'urothélium sain. Les proportions respectives de ces deux populations cellulaires étaient variables. Dans ces conditions, un DA se manifestait par des modifications relativement peu sensibles du rapport de hauteur des pics relatifs aux deux allèles. L'importance de ces modifications était proportionnelle au pourcentage de cellules d'origine tumorale dans le culot urinaire et dépendait également du type d'anomalies responsable du DA.
Il était donc nécessaire de définir des critères permettant de décider si une modification du rapport était significative et correspondait effectivement à un DA, ou bien s'il s'agissait d'une différence non significative liée à des variations expérimentales.
Des calculs statistiques ont été pratiqués et sont rapportés dans la partie Il-Résultats suivante. L'ensemble des résultats a été géré, et les calculs effectués à l'aide du logiciel ACCESS (Microsoft).
Il-Résultats 11-1-Mode de calcul des déséquilibres alléliques Deux modes de calculs différents ont été utilisés.
11-1-1) Définition de critères propres à chaque marqueur La détermination d'un DA reposait sur la comparaison des rapports Rf et RI de hauteur des deux pics correspondant aux deux allèles du marqueur considéré, respectivement dans le sang et les urines.
Les rapports ici visés ont été rendus symétriques par rapport à 1 en passant en logarithme népérien.
Pour chaque marqueur, les variables LnRf se sont révélées obéir à une loi normale. En conséquence, une moyenne et un écart-type expérimental des LnRf, appelés respectivement m (LnRf) et s (LnRf), ont été déterminés pour chaque marqueur.
Ainsi, en choisissant un risque d'erreur de première espèce a de 0,1 %, un intervalle de normalité a été défini pour la valeur LnR,, comme étant : LnRf [3 x s (LnRf)].
LnRf étant une variable individuelle aléatoire mesurée expérimentalement, la moyenne m (LnRf) lui a été préférée pour les calculs afin de limiter les fluctuations expérimentales.
La définition de l'intervalle de normalité à 99,9 % était donc : LnR, compris entre [m (LnRf) 3 x s (LnRf)] Le Tableau IX suivant indique, pour chaque marqueur, le nombre d'ADN informatifs (Le., ADN hétérozygotes) ayant servi à déterminer la distribution des LnRf, m (LnRf) et s (LnRf).
Tableau IX
nombre d'ADN marqueur informatifs m (LnRf) s (LnRf) 17 34 0, 0483 0, 0193 18 38 0, 0000 0,0521 22 55 0,0572 0,0351 116 39 0,1518 0,0347 118 39-0, 1009 0,0281 390 44 0,0668 0,0189 402 53 0,0742 0,0200 471 46 0,0418 0,0563 516 49 0,0460 0,0188 561 40-0, 0412 0,0257 562 42 0,0387 0,0355 663 43 0,0085 0,0212 671 36 0,0088 0,0130 682 22 0,0767 0,0220 686 30-0, 0289 0,0268 714 58-0, 0106 0,0172 752 41 0,0217 0,0150 894 35-0, 0093 0,0184
L'étape de rinçage est de préférence réalisée à l'aide d'un solvant organique tel que le dichlorométhane ou le tetrahydrofurane puis à l'aide d'un alcool inférieur tel que l'éthanol.
Le séchage des dendrilames peut par exemple être effectué à l'air comprimé, sous courant d'azote ou bien encore par centrifugation.
Les dendrilames ainsi obtenues peuvent ensuite être stockées et/ou directement utilisées pour l'immobilisation et/ou la synthèse in situ de molécules, en particulier de molécules biologiques.
Les dendrilames conformes à l'Invention peuvent en particulier être stockées pendant au moins deux mois, sans qu'aucune altération des fonctions situées à la périphérie des dendrimères ne se produise.
La présente Invention a donc également pour objet l'utilisation d'un support solide fonctionnalisé par des dendrimères phosphorés conformes à l'Invention (dendrilames), comme support pour l'immobilisation et/ou la synthèse in situ de molécules d'intérêt telles que par exemple des molécules d'acide nucléique (oligonucléotides, produits PCR...), des lipides, des protéines (peptides, enzymes, anticorps, ...) ou leurs partenaires moléculaires.
L'Invention a aussi pour objet une biopuce caractérisée par le fait qu'elle est constituée d'un support solide comportant au moins une surface fonctionnalisée par des dendrimères phosphorés sur lesquels sont fixées de façon covalente des molécules d'intérêt telles que des acides nucléiques (oligonucléotides, produits PCR...), des lipides, des protéines (peptides, enzymes, anticorps, ...) ou leurs partenaires moléculaires.
Selon l'Invention, de telles biopuces sont appelées dendripuces .
De telles dendripuces possèdent un bruit de fond très bas et une intensité de signal élevée par exemple après hybridation d'acides nucléiques avec des cibles fluorescentes. Ces "dendripuces" présentent l'avantage d'être réutilisables sans perte significative du signal mais surtout sans augmentation du bruit de fond. Ceci entraîne une réduction significative des coûts d'analyse et permet d'obtenir des données statistiques fiables pour une analyse donnée. Ces dendripuces sont de plus
obtenues en peu d'étapes de synthèse (trois à cinq) ; se déroulant dans des conditions opératoires non contraignantes, de manière contrôlée et reproductible.
Par ailleurs, du fait de la structure même des dendrimères, ces dendripuces présentent l'avantage de posséder de multiples points d'ancrage sur la surface d'une part et sur les molécules d'intérêt d'autre part, le tout garantissant une excellente stabilité de l'ensemble support-dendrimères-molécules d'intérêt.
Un autre objet de l'Invention est un procédé de préparation d'une dendripuce telle que définie ci-dessus, caractérisé par le fait qu'il consiste à mettre en contact un support solide ayant au moins une surface fonctionnalisée par des dendrimères phosphorés comportant à leur périphérie des fonctions aptes à permettre la fixation covalente de molécules d'intérêt avec une solution tampon renfermant des molécules d'intérêt préalablement fonctionnalisées par, ou comportant déjà, un ou plusieurs groupements aptes à former une liaison covalente avec lesdites fonctions périphériques des dendrimères.
Selon une première forme de réalisation de ce procédé, et lorsque les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions aldéhydes, alors les molécules d'intérêt sont de préférence préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions amine, ou sont préalablement fonctionnalisées par une ou plusieurs fonctions oxyamine (-ONH2) ou hydrazine (-NH-NH2), et de manière plus générale par toute fonction susceptible de réagir avec une fonction aldéhyde.
Aussi, dans ce cas, les molécules d'intérêt (acides nucléiques aminés, oligonucléotides de tailles variables ou produits PCR), sont déposés sur les "dendrilames" en utilisant, par exemple, le tampon phosphate 0,3 M, pH 9. Lorsque les molécules d'intérêt sont préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions amine, cette étape est suivie d'une réduction des fonctions imines présentes entre les acides nucléiques et les dendrimères d'une part et entre les dendrimères et le support d'autre part (voir Schéma D ci-après). Cette étape de réduction permet également de réduire les fonctions aldéhydes résiduelles en alcool rendant la surface hydrophile. De plus, les alcools ne peuvent pas entraîner de réaction non spécifique avec les cibles marquées (pas d'augmentation du bruit de fond).
SCHÉMA D
Selon une deuxième forme de réalisation de ce procédé, et lorsque les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions thiol, alors les molécules d'intérêt sont de préférence préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà, une ou plusieurs fonctions thiol (pour permettre la création d'un pont disulfure), ou sont préalablement fonctionnalisées par une ou plusieurs fonctions iodoacétamido (-NHCO-CH2-I), et de manière plus générale, par toute fonction susceptible de réagir avec une fonction thiol. Ce type de fonctionnalisation est particulièrement adapté aux supports solides comportant une surface de type silicium ou en or. Dans le cas d'un lien disulfure établi entre le support et les sondes nucléiques, la surface peut être régénérée par une étape de réduction. La surface thiol ainsi obtenue peut être à nouveau "rechargée" avec d'autres séquences oligonucléotidiques ou avec des protéines.
Selon une troisième forme de réalisation de ce procédé, et lorsque les fonctions périphériques des dendrimères utilisés sont des fonctions amines, alors les molécules d'intérêt sont préalablement fonctionnalisées par, ou contiennent déjà une ou plusieurs fonctions aldéhyde, a-oxoaldéhyde, -COOR,-NCS, -NHS, et de
Dans le cas contraire, un"dépassement inférieur"DI (underflow en anglais) de la partie OPn+i survient comme montré à la figure 3. Pour surmonter ce défaut,
certains vérificateurs vérifient initialement, avant l'implémentation d'une méthode Mn+l sur la pile PI qu'un dépassement inférieur ne surviendra jamais en testant tous les chemins possibles dans la méthode avant son exécution afin que tout empilement dans la partie supérieure OPn+l ne soit pas suivi d'un dépilement plus grand jusqu'à atteindre la partie de données de machine DM+l. Si le test de l'un des chemins signale un dépassement inférieur, le vérificateur VER refuse la méthode Mn+l et signale une erreur.
Cependant, il arrive parfois que les fonctions du vérificateur soient écartées par une introduction malveillante de pseudocodes dans l'applet AP.
L'applet non vérifiée est alors téléchargée dans la carte à puce. Dans ce cas, tout excès d'empilement de méthode au-dessus de la pile PI dans l'espace mémoire EM provoque un débordement DB. Si l'exécution d'une méthode Mn+l cause un dépassement inférieur DI après dépilage de la partie d'opérande OP+i, des données de machine dans la partie DMn+l sont atteintes, ce qui modifie le contexte de la méthode invoquante Mn.
Les données de machine virtuelle dans la partie DMn du cadre Cn de chaque méthode ne doivent pas être modifiées et être sujettes à des attaques par l'implémentation d'apples par des développeurs peu scrupuleux. Par le biais particulièrement d'un dépassement inférieur, les données de machine virtuelle peuvent être modifiées pour retourner à la méthode exécutée avec des paramètres choisis, par exemple pour exécuter des codes choisis avec un contexte déterminé.
L'invention vise à remédier aux conséquences de ces attaques particulièrement lorsque les méthodes d'applet ne sont pas préalablement vérifiées avant leur implémentation dans la mémoire de données échangées dans un objet électronique portable.
A cette fin, un espace mémoire alloué à une pile de cadres de données d'application téléchargée dans un objet électronique portable, chaque cadre comportant successivement au moins une partie de données de machine et une partie d'opérande ayant une longueur variable lors de l'exécution du code associé au cadre, est caractérisé en ce qu'il est composé d'un premier espace mémoire alloué à l'empilement des parties de données de machine, et d'un deuxième espace mémoire alloué à l'empilement des parties d'opérandes, les premier et deuxième espaces mémoires étant disjoints et ayant des pointeurs indépendants.
Même lorsque l'applet constituant l'application téléchargée et comprenant les méthodes dont les parties sont réparties dans les premier et deuxième espaces mémoires, n'est pas vérifiée, tout code "malicieux"introduit dans l'une des parties d'opérande de l'applet incluses dans le deuxième espace mémoire n'aura aucune conséquence sur les parties de données de machine virtuelle sensibles dans le premier espace mémoire.
En général, chaque cadre (frame) d'une méthode peut contenir une partie de variable locale. Dans cette réalisation, le deuxième espace mémoire contient les parties de variable locale empilées alternativement avec les parties d'opérande.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement à la
lecture de la description suivante de plusieurs réalisations préférées de l'invention en référence aux dessins annexés correspondants dans lesquels : - la figure 1 est un bloc-diagramme schématique déjà commenté d'une carte à puce liée à un terminal d'accueil ; - les figures 2 et 3 montrent schématiquement des piles dans un espace mémoire alloué à des méthodes d'applet respectivement lors d'un débordement et d'un dépassement inférieur, selon la technique antérieure déjà commentée ; et - la figure 4 montre schématiquement deux espaces mémoires alloués à des méthodes d'applet selon l'invention.
Selon une réalisation préférée de l'invention, l'objet électronique portable est une carte à puce CP telle que décrite précédemment en référence à la figure 1, à l'exception de l'organisation de l'espace mémoire alloué à des cadres (frames) de données Cn contenant des méthodes Mn d'une applet compilée téléchargée AP dans la mémoire MDE de type RAM de la carte.
Comme montré à la figure 4, l'espace mémoire est selon l'invention scindé en deux espaces mémoires disjoints EM1 et EM2. Les pointeurs PP1 et PP2 des espaces mémoires EM1 et EM2 sont complètement indépendants : le pointeur PP1 ne peut pas atteindre l'espace EM2 et le pointeur PP2 ne peut pas atteindre l'espace EM1. Tout débordement (overflow) ou dépassement inférieur (underflow) dans l'un des espaces mémoires EM1 et EM2 ne peut pas influencer le contenu de l'autre espace mémoire. Dans la figure 4 sont seulement représentés trois cadres Con-1, Cn et Cn+l de méthodes Mon-1, Mn et Mn+l en haut d'une pile
de l'applet AP, chaque cadre comportant une partie de variable locale VL-i, VLn, VL+l, une partie de données de machine virtuelle Din-1, DM, DM+i et une partie d'opérande Pn-lt OPn, OPn+1.
Le premier espace mémoire EM1 est propre à recevoir les données sensibles à protéger constituées par les parties de données de machine virtuelle DMn des cadres Cn des méthodes Mn d'applets.
Le deuxième espace mémoire EM2 est disponible pour les premières parties VLn contenant des variables locales des méthodes Mn et ayant des tailles fixes respectives et pour les troisièmes parties OPn contenant des opérandes des méthodes Mn et ayant des tailles variables respectives, dans les cadres d'applet Cn. La taille T2 du deuxième espace mémoire EM2 est bien souvent plus grande que la taille Tl du premier espace mémoire EM1.
Génération Nombre de fonctions Taille (A) 1 12 30 2 24 45 3 48 60 4 96 75 5 192 90 6 384 105 7 768 120
La présente Invention a également pour objet un procédé de préparation d'un support solide conforme à l'Invention (dendrilame), caractérisé par le fait qu'il comprend une étape de formation d'une liaison covalente entre des dendrimères phosphorés possédant un noyau central qui contient au moins deux groupements fonctionnels, lesdits dendrimères comportant à leur périphérie plusieurs fonctions aptes à permettre leur fixation sur ladite surface et la fixation ou la synthèse in situ de molécules d'intérêt, et la surface fonctionnalisée ou non d'un support solide
pour obtenir un support solide fonctionnalisé de façon covalente par lesdits dendrimères.
Selon une première forme de réalisation du procédé conforme à l'Invention, les dendrimères comportent à leur périphérie des fonctions permettant l'accrochage direct par l'intermédiaire d'une liaison covalente de ces derniers sur la surface non préalablement fonctionnalisée dudit support solide. C'est le cas, en particulier, lorsque les dendrimères comportent à leur périphérie des fonctions thiol et que le support solide comprend une surface d'or.
Selon une seconde forme de réalisation du procédé conforme à l'Invention, et lorsque la surface du support solide utilisé ne comprend pas de fonctions compatibles avec les fonctions périphériques du dendrimères utilisé, il est alors nécessaire de fonctionnaliser préalablement ladite surface au moyen de fonctions aptes à permettre la fixation covalente desdits dendrimères.