INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La présente invention concerne une composition d'extraits total ou enrichi, à partir de Fabacées, notamment du genre Psophocarpus, comme Psophocarpus tetragonolobus, pour des préparations dermo-cosmétiques, nutraceutiques, vétérinaires et pharmaceutiques et ayant des propriétés anti-inflammatoires, anti-virales et anticarcinogènes. Ces compositions selon l'invention sont particulièrement appropriées pour les peaux sensibles (rougeurs, irritations) grâce aux propriétés anti-inflammatoires qui procurent un rôle apaisant et protecteur au niveau de la peau. Les propriétés anticarcinogènes de certains triterpènes permettent d'utiliser ces extraits comme agents protecteurs de l'organisme. Citons par exemple la peau en cas de brûlures solaires....
La présente invention concerne également l'utilisation d'extrait total ou enrichi en triterpènes de Psophocarpus sp, comme agents anti-inflammatoires, anti-viraux et anticarcinogènes, ainsi qu'une composition cosmétique, dermatologique ou pharmaceutique
comprenant l'un des dits agents et leur utilisation comme agents protecteurs, ainsi que pour les problèmes capillaires et liés aux articulations.
Un autre but de l'invention est également de fournir un procédé d'obtention d'extraits de Psophocarpus sp, enrichis dans des proportions variables selon le type d'extrait, en principe actif de type triterpènes pour les propriétés mentionnées précédemment.
Ainsi, trois formules d'extraction/purification peuvent être retenues : (i) un extrait total de la plante, (ii) un extrait visant à concentrer les triperpènes et enfin, (iii) l'obtention de triterpènes pures. Chacun de ces trois produits revendique les mêmes applications biologiques, puisque quelque soit la formule, la phospholipase A2 sera inhibée.
Par la suite, le terme extrait de Psophocarpus sp , doit s'entendre comme extrait de cellules de Psophocarpus sp et plus précisément comme extrait de cellules d'au moins un végétal du genre Psophocarpus sp de la famille des Fabacées . Ledit matériel peut être obtenu par culture in vitro ou in vivo. Par culture in vitro, on entend l'ensemble des techniques connues de l'homme du métier qui permettent de manière artificielle l'obtention d'un végétal ou d'une partie d'un végétal. Par culture in vivo, on entend l'ensemble des techniques de cultures qui permettent d'obtenir un végétal ou une partie d'un végétal. Ainsi, l'extrait peut être un extrait d'organe (racine, tige, feuille, écorce), voire de cellules d'organe, d'au moins une plante du genre Psophocarpus sp de la famille des Fabacées, ou encore un extrait de cellules indifférenciées d'au moins une telle plante.
Toute méthode d'extraction ou de purification connue de l'homme du métier peut être utilisée selon l'invention telles que des techniques de macération ou par d'autres procédés comme, par exemple, la simple décoction, la lixiviation, l'extraction sous reflux, l'extraction au moyen d'ultrasons ou de micro-ondes ou enfin des techniques à contre-courant, avec l'utilisation de divers solvants. On peut, en particulier, citer les extraits alcooliques, notamment éthanoliques, propylène glycol... et les extraits hydroalcooliques, mais aussi l'eau, les cétones, les esters, les éthers, les polyols, les solvants chlorés et les mélanges d'au moins deux des solvants précités. Conformément à la présente invention, le procédé d'obtention d'extraits de Psophocarpus s p sont caractérisés en ce que l'on effectue les opérations successives suivantes :
Extrait total : Dans une première étape, on broie le matériel végétal (racine par exemple) frais, congelé ou sec dans une solution aqueuse, dans une seconde étape, on filtre la solution aqueuse qui est finalement stérilisée. Cette solution aqueuse correspond à l'extrait. Cet extrait peut ensuite être séché (évaporation, lyophilisation). Dans une variante de ce procédé, on utilise dans la première étape une solution alcoolique (méthanol, éthanol...) ou hydroalcoolique. L'extrait ainsi obtenu peut être évaporé à sec, le résidu étant utilisé tel quel ou après purification. Ces solutions, aqueuses, alcooliques ou hydroalcooliques, peuvent également être soumises à hydrolyse acide afin de cliver les saponosides et ne récupérer que les aglycones correspondants.
L'invention a donc pour objet l'utilisation d'un extrait de Psophocarpus sp de la famille des Fabacées comme agent anti-inflammatoire, anti-viral et anti-carcinogène dans des compositions dermocosmétiques et pharmaceutiques. Cet agent a pour objet la protection des tissus et organes contre les problèmes inflammatoires, infectieux et tumoraux, puisque de tels extraits contiennent des inhibiteurs de phospholipase A2, appartenant à la famille phytochimique des saponosides et plus précisément des triterpènes. Il est à noter que d'autres familles phytochimiques interviennent dans l'effet anti-inflammatoire via l'inhibition d'autres cibles biologiques de l'inflammation comme les cyclooxygénases, les lypoxygénases.... Cela explique que l'extrait total pourra être préféré pour exprimer toute l'activité anti-inflammatoire de la plante.
Extrait sélectif enrichi de façon variable en triterpènes : Cet exemple correspond à l'extraction industrielle de l'acide bétulinique à partir de 500 kg de racine de Psophocarpus tetragonolobus. Le mode opératoire et les conditions sont les suivantes : - Broyer la racine de pois asperge (Psophocarpus tetragonolobus) jusqu'à obtenir une granulométrie inférieure à 1 mm.
- Placer le broyat dans le réacteur imprégner de toluène de manière à ce que le toluène recouvre la totalité de la masse.
- Après macération et filtration, placer le broyat dans l'extracteur en présence de 3 à 5 volumes de toluène.
- Porter à ébullition (température ébullition : 111 C) pendant 8 heures.
Les polymères conditionneurs cationiques ou amphotères convenables sont, de manière avantageuse, choisis parmi ceux déjà connus en soi comme améliorant les propriétés cosmétiques des cheveux, à savoir notamment ceux décrits dans les brevets et demandes de brevets EP 337 354, FR 2 270 846, FR 2 383 660, FR 2 598 611, FR 2 470 596, FR 2 519 863, FR 2 788 974, et FR 2 788 976.
Ainsi, on peut citer : (1) les copolymères d'acrylamide et de diméthyl-amino-éthyl méthacrylate quaternisé au sulfate de diméthyle ou avec un halogénure de diméthyle (Hercofloc de Hercules) ; copolymères d'acrylamide et de chlorure de méthacryloyloxy-éthyltriméthylammonium (Bina Quat P 100 de Ciba Geigy) ; copolymère d'acrylamide et de méthosulfate de méthacryloyloxy-éthyl-triméthylammonium (Reten de Hercules) ; les copolymères vinylpyrrolidone/acrylate ou méthacrylate de dialkylaminoalkyle quaternisés ou non (gamme Gafquat d'ISP ; Copolymer 845,958 et 937 d'ISP) ; les terpolymères méthacrylate de diméthyl amino éthyle/vinylcaprolactame/vinylpyrrolidone (Gaffix VC 713 d'ISP) ; les copolymères vinylpyrrolidone/méthacrylamidopropyl diméthylamine
(Styleze CC 10 d'ISP) ; les copolymères vinylpyrrolidone/méthacrylamide de diméthyl-aminopropyle quaternisés (Gafquat HS 100 d'ISP) ; (2) les dérivés d'éthers de cellulose comportant des groupements ammonium quaternaire tels que décrits dans FR 1 492 597. Ces polymères sont également définis dans le dictionnaire CTFA comme des ammonium quaternaires d'hydroxyéthylcellulose ayant réagi avec un époxyde substitué par un groupement triméthylammonium ; (3) les dérivés de cellulose cationiques tels que les copolymères de cellulose ou les dérivés de cellulose greffés avec un monomère hydrosoluble d'ammonium quaternaire, et décrits notamment dans US 4,131,576, tels que les hydroxyalkylcelluloses, comme les hydroxyméthyl-, hydroxyéthyl- ou hydroxypropylcelluloses greffées notamment avec un sel de méthacryloyléthyl triméthylammonium, de méthacrylamido propyl-triméthylammonium, de diméthyldiallylammonium ; (4) les polysaccharides cationiques décrits plus particulièrement dans les brevets US 3,589,578, US 4,031,307, tels que les gommes de guar contenant des groupements cationiques trialkylammonium. On utilise par exemple des gommes de guar modifiées par un sel, comme le chlorure notamment, de 2,3-époxypropyl triméthylammonium ; (5) les polymères constitués de motifs pipérazinyle et de radicaux divalents alkylène ou hydroxyalkylène à chaînes droites ou ramifiées, éventuellement interrompues par des atomes d'oxygène,
de soufre, d'azote ou par des cycles aromatiques ou hétérocycliques, ainsi que les produits d'oxydation et/ou de quaternisation de ces polymères. De tels polymères sont notamment décrits dans FR 2 162 025, FR 2 280 361 ; (6) les polyaminoamides solubles dans l'eau préparés en particulier par polycondensation d'un composé acide avec une polyamine, éventuellement réticulés, éventuellement alcoylés ou s'ils comportent une ou plusieurs fonctions amines tertiaires, quaternisées. Ces polymères sont notamment décrits dans FR 2 252 840 et FR 2 368 508 ; (7) les dérivés de polyaminoamides résultant de la condensation de polyalkylènes polyamines avec des acides polycarboxyliques suivie d'une alcoylation par des agents bifonctionnels. On peut citer par exemple les polymères acide adipiquedialkylamino hydroxyalkyl dialkylène triamine dans lesquels le radical alkyle est en C1-C4. De tels polymères sont notamment décrits dans FR 1 583 363 ; (8) les polymères obtenus par réaction d'une polyalkylène polyamine comportant deux groupements amine primaire et au moins un groupement amine secondaire avec un acide dicarboxylique choisi parmi l'acide diglycolique et les acides dicarboxyliques aliphatiques saturés en C3-C8, puis avec l'épichlorhydrine. De tels polymères sont notamment décrits dans US 3,227,615, US 2,961,347 ; (9) les cyclopolymères d'alkyl diallyl amine ou de dialkyl diallyl ammonium, sous forme d'homopolymères ou de copolymères, tels que décrits
dans FR 2 080 759 et dans son certificat d'addition n 2 190 406 ; (10) les polymères de diammonium quaternaire tels que décrits dans FR 2 320 330, FR 2 270 846, FR 2 316 271, FR 2 336 434, FR 2 413 907, US 2,273,780, US 2,375,853, US 2,388,614, US 2,454,547, US 3,206,462, US 2,261,002, US 2,271,378, US 3,874,870, US 4,001,432, US 3,929,990, US 3,966,904, US 4,005,193, US 4,025,617, US 4,025,627, US 4,025,653, US 4,026,945, US 4,027,020; par exemple, on peut citer ceux comprenant les motifs récurrents suivants: dans laquelle les radicaux R1, R2, R3 et R4, identiques ou différents, désignent un radical alkyle ou hydroxyalkyle en C1-C4, n et p sont des nombres entiers variant de 2 à 20 et, X- est un anion dérivé d'un acide minéral ou organique ; (11) les polymères de poly(ammonium quaternaire) constitués de motifs récurrents de formule : dans laquelle p désigne un nombre entier variant de 1 à 6 environ, D peut être nul ou peut représenter un groupement -(CH2)r -CO- dans lequel r désigne un nombre
égal à 4 ou à 7, X- est un anion. De tels polymères peuvent être préparés selon les procédés décrits dans US 4,157,388, US 4,702,906, US 4,719,282, EP 122 324 ; (12) les polymères quaternaires de vinylpyrrolidone et de vinylimidazole ; (13) les polyamines du type polyéthylèneglycol (15) Tallow Polyamine (dénomination du dictionnaire CTFA) ; (14) les polymères réticulés de sels de méthacryloyloxyalkyl (C1-C4) trialkyl (C1-C4)ammonium tels que les polymères obtenus par homopolymérisation du diméthylaminoéthylméthacrylate quaternisé par le chlorure de méthyle, ou par copolymérisation de l'acrylamide avec le diméthylaminoéthylméthacrylate quaternisé par le chlorure de méthyle, l'homo ou la copolymérisation étant suivie d'une réticulation par un composé à insaturation oléfinique, en particulier le méthylène bis acrylamide. On peut plus particulièrement utiliser un copolymère réticulé acrylamide/chlorure de méthacryloyloxyéthyl triméthylammonium (20/80 en poids) sous forme de dispersion contenant 50% en poids dudit copolymère dans de l'huile minérale (Salcare SC 92 de Ciba). On peut également utiliser un homopolymère réticulé du chlorure de méthacryloyl oxyéthyl triméthylammonium contenant environ 50% en poids de l'homopolymère dans de l'huile minérale ou dans un ester liquide (Salcare SC 95, SC 96 de Ciba).
D'autres polymères conditionneurs cationiques utilisables dans le cadre de l'invention sont des polyalkylèneimines, en particulier des polyéthylèneimines, des polymères contenant des motifs
vinylpyridine ou vinylpyridinium, des condensats de polyamines et d'épichlorhydrine, des polyuréylènes quaternaires et les dérivés de la chitine.
Le ou les polymères conditionneurs substantifs amphotères susceptibles d'être présents dans la composition oxydante peuvent, eux, notamment être choisis parmi ceux comportant des motifs K et M répartis statistiquement dans la chaîne polymère, où K désigne un motif dérivant d'un monomère comportant au moins un atome d'azote basique et M désigne un motif dérivant d'un monomère acide comportant un ou plusieurs groupements carboxyliques ou sulfoniques ; bien K et M peuvent désigner des groupements dérivant de monomères zwittérioniques de carboxybétaïnes ou de sulfobétaïnes ; ou encore K et M désignent une chaîne polymère cationique comportant des groupements amine primaire, secondaire, tertiaire ou quaternaire, dans laquelle au moins l'un des groupements amine porte un groupement carboxylique ou sulfonique relié par l'intermédiaire d'un radical hydrocarboné ; bien K et M font partie d'une chaîne d'un polymère à motif éthylène [alpha],ss-dicarboxylique dont l'un des groupements carboxyliques a réagi avec une polyamine comportant un ou plusieurs groupements amine primaire ou secondaire.
Les polymères conditionneurs amphotères répondant à la définition donnée ci-dessus plus particulièrement préférés, sont choisis parmi les polymères suivants : (1) les polymères résultant de la copolymérisation d'un monomère dérivé d'un composé vinylique portant un groupement carboxylique tel que
plus particulièrement l'acide (méth)acrylique, l'acide maléique, l'acide alpha-chloracrylique, ou encore un sel de dialkyldiallylammonium tel que le chlorure de diméthyldiallylammonium, et d'un monomère basique dérivé d'un composé vinylique substitué contenant au moins un atome basique tel que plus particulièrement les dialkyl-amino-alkyl-méthacrylate et acrylate, les dialkyl-amino-alkyl-méthacrylamide et acrylamide, comme décrits dans US 3,836,537. On peut citer le copolymère acrylate de sodium/chlorure d'acrylamido propyl triméthyl ammonium (Polyquart KE 3033 de Cognis), le copolymère acide acrylique/chlorure de diméthyldiallyl ammonium (Merquat 280,295, Plus 3330, de Nalco) ; (2) les polymères comportant des motifs dérivant : a) d'au moins un monomère choisi parmi les (méth)acrylamides N-substitués par un radical alkyle, notamment en C2-C12, b) d'au moins un monomère acide contenant un ou plusieurs groupements carboxyliques réactifs (par exemple acides (méth)acrylique, crotonique, itaconique, et les monoesters des acides ou anhydrides maléique, fumarique), et c) d'au moins un monomère basique tel que des esters à substituant amine primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire des acides (méth)acrylique, fumarique, maléique, et le produit de quaternisation du méthacrylate de diméthylamino-éthyle avec le sulfate de diméthyle ou diéthyle.
(3, C-3 a,(3, C-4 a,(3, C-5 a,/3); 20,8, 20,7, 20,6, 20,5 (8*C-COÇH3); 17,3 (C-6 anomère a); 17,2 (C-6 anomère P).
SM (ESI+/30eV) m/z : 371 [M+K]+; 355 [M+Na]+; 296 [M-OAc+Na]+.
2,3,4-tri-O-acéiyl-a-L-rhamnopyranoside de 17-(cholest-5-èn-3-yloxy)- 3,6,9,12,15-pentaoxaheptadécyle 7 A une solution de 1,2,3,4-tétra-O-acétyl-L-rhamnopyranoside 6 (96mg, 0.29 mmole) et du composé 17-(cholest-5-èn-3p-yloxy)-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadécan-1-ol 3 (245mg, 0.38 mmole) dissous dans du dichlorométhane anhydre (2 ml) est additionné goutte à goutte l'éthérate de trifluorure de bore (0.3 ml, 1,94 mmoles). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 3 heures. Il est ensuite lavé avec une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur du sulfate de sodium anhydre puis concentrée sous vide. Le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice [éluant : gradient de méthanol (0-5%) dans du dichlorométhane] pour conduire au surfactant acétylé 7 sous forme d'huile incolore (Rdt=25%).
Rf 0,58 (CH2C12/MeOH 9/1). [[alpha]]D 40,6(c=l,CHCl3).
RMN 1H (CDC13, 200MHz) ô (ppm) : 5,29-5,23 (3H, m, H-2, H-3, H-6') ; 5,04 (1H, dd, J4-5=9,8Hz, J4-3=9,8Hz, H-4) ; 4,76 (1H, s, H-l) ; 3,91 (1H, dd, Js=9,9Hz, Js~6=6,lHz, H-5) ; 3,84-3,51 (24H, m, H-CH20) ; 3,22-3,11 (1H, m, H-3') ; (9H, s, H- COCH3) ; 1,2 (3H, d, J6-5=6,4Hz, H-6) ; 0,98 (3H, s, H-19') ; 0,9 (3H, d, J2r-2o-=6,6Hz; H-21') ; 0,85 (6H, d, Jzb-2s=6,6Hz, H-26', H-27') ; 0,66 (3H, s, H-18'). RMN 13C (CDCl3, 50MHz)
# (ppm): 170,169,9, 169,8 (3*C-COCH3) ; 141 (C-5') ; 121,5 (C-6'); 97,6 (C-1) ; 79,5 (C-3') ; 71,2 (C-4) ; 70,9 (C-3) ; 70,8 (C-2) ; 70,6, 70,5,70,1, 69,9 (4*C-CH20) ; 69,2 (C-5) ; 67,3,67,1, 66,3 (3*C-CH20) ; 56,8 (C-14') ; 56,2 (C-17') ; 50,2 (C-9') ; 42,3 (C-13') ; 39,8 (C-16') ; 39,5 (C-24') ; 39 (C-4') ; 37,3 (C-l') ; 36,9 (C-10') ; 36,2 (C-22') ; 35,8 (C-20') ; 32 (C-7') ; 31,9 (C-8') ; 28,4 (C-2') ; 28,2 (C-12') ; 28 (C-25') ; 24,3 (C-15') ; 23,8 (C-23') ; 22,8 (C-27') ; 22,5 (C-26') ; 21,1 (C-11') ; 20,8, 20,7, 20,6 (3*C-COCH3) ; 19,3 (C-19') ; 18,7 (C-21') ; 17,4 (C-6) ; 11,8 (C-18').
SM (FAB+/NOBA) m/z : 945 [M+Na]+ ; 923 [M+H]+ ; 369 [M-HEG+H]+. a-L-rhamnopyranoside de 17-(cholest-5-en-3p-yloxy)-3,6,9,12,15- pentaoxaheptadécyle 8 Le 2,3,4-tri-O-acétyl-a-L-rhamnopyranoside de 17-(cholest-5-èn-3p- yloxy)-3,6,9,12,15-pentaoxaheptadécyle 7 (lOOmg, 0. 12 mmole) et le méthanolate de sodium (24mg, 0,43 mmole) sont dissous dans du méthanol. Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à température ambiante pendant 2 heures. Après l'ajout d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 2N, le méthanol est évaporé sous pression réduite puis la solution est extraite au dichlorométhane puis lavée avec une solution aqueuse saturée de chlorure de sodium. La phase organique est séchée sur du sulfate de sodium anhydre puis concentrée sous vide. Le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice [éluant : gradient de méthanol (0-5%) dans du dichlorométhane] pour conduire au surfactant 8 sous forme de mousse blanche collante (Rdt=65%).
Rf 0,25 (CH2Cl2/MeOH 95/5).
[UID -38(c=l,01,CHCl3).
RMN'H (CDC13, 200MHz) ô (ppm) : 5,33 (1H, d, J6~=S,lHz, H-6') ; 4,83 (1H, s, H-l) ; 3,95 (1H, m, H-5) ; (25H, m, H-CH20, H-2) ; 3,52-3,38 (2H, m, H-3, H-4) ;
3,29-3,12 (1H, m, H-3') ; (3H, d, J6-5=6,2Hz, H-6) ; 0,98 (3H, s, H-19') ; 0,9 (3H, d, J2l~Zp≥6,6Hz; H-21') ; 0,85 (6H, d, J26>~ZS=6,6Hz, H-26', H-27') ; 0,66 (3H, s, H- 18').
RMN 13C (CDC13, 50MHz) 8 (ppm) : 140,9 (C-5') ; 121,6 (C-6') ; 99,9 (C-l); 79,6 (C-3'); 73,4 (C-4) ; 71,7 (C-3) ; 70,9 (C-2) ; 70,8,70,6; 70,5,70,4; 70,2 (5*C-CH20); 67,9 (C- 5); 67,2 (C-CH20); 66,6 (C-CH20); 56,8 (C-14') ; 56,2 (C-17'); 50,2 (C-9') ; 42,3 (C- 13'); 39,8 (C-16') ; 39,5 (C-24'); 39 (C-4') ; 37,2 (C-l'); 36,9 (C-10') ; 36,2 (C-22'); 35,8 (C-20') ; 31,9 (C-7', C-8'); 28,3 (C-2'); 28,2 (C-12') ; 28 (C-25') ; 24,3 (C-15'); 23,8 (C-23') ; 22,8 (C-27'); 22,6 (C-26'); 21,1 (C-11'); 19,4 (C-19') ; 18,7 (C-21'); 17,6 (C-6); 11,9 (C-18').
SM (FAB+/NOBA) m/z : 835 [M+K]+; 819 [M+Na]+; 369 [M-HEG+H]+.
B/ Synthèse des glycosides amphiphiles 16, 17,18 et 20 avec une partie lipophile de type cannabinoïde Préparation des dérivés bromés 10, 13 et 15
L-rhamnopyranoside de 3,6,8-trioxanonanyle 9 A une solution de L- (+)-rhamnose 27,4 mmoles) et de tri(éthylèneglycol) (llml, 82,3 mmoles) dans du tétrahydrofurane (100 ml) est additionné de l'acide p-toluènesulfonique (6,8g, 35,7 mmoles). Le mélange réactionnel est laissé sous agitation à 60 C pendant 3 jours. Après addition de carbonate de sodium anhydre en poudre, le mélange est filtré sur célite et le filtrat concentré sous pression réduite. Le résidu brut obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice [éluant : gradient de méthanol (1-10%) dans du dichlorométhane] pour conduire au L-rhamnopyranoside de 3,6,8-trioxanonanyle 9 sous forme d'huile incolore (Rdt=68%, anomères [alpha]/ss 95/5).
Rf 0,55 (CH2Cl2/MeOH 8/2).
Au sens de l'invention, les expressions inhiber l'effet d'un agoniste et diminuer l'effet d'un agoniste sont équivalentes.
Tous les RCPG-III connus à ce jour ont la particularité d'être constitués de deux domaines protéiques distincts : un domaine extracellulaire appelé Venus flytrap , responsable de la liaison des ligands naturels (ligands orthostériques), et un domaine membranaire heptahélice responsable du couplage aux protéines G et cible des régulateurs allostériques (Pin et al., 2003) (Figure 1). Ces deux domaines sont séparés par une région riche en cystéines.
Une deuxième caractéristique spécifique des RCPG-III réside dans leur capacité à former des dimères constitutifs, souvent reliés entre eux par au moins un pont disulfure.
La construction d'un récepteur calcium recombinant, tronqué de son domaine extracellulaire, a été décrite par Ray et Northup (2002). Les auteurs ont ainsi démontré que, à l'instar du domaine extracellulaire, le domaine transmembranaire heptahélice contient un ou plusieurs sites de liaison des ions calcium. Cependant, l'activation du récepteur recombinant par les ions calcium n'a été détectée qu'en présence d'un régulateur allostérique tel que la poly-L-arginine ou le composé phénylalkylaminé NPS 568.
Les régulateurs allostériques positifs ou négatifs des RCPG-III jusque-là décrits ont été identifiés par des techniques de criblage à haut débit.
Les "calcimimétiques" ont été mis en évidence pour leur capacité à réguler l'activité du récepteur calcium (Nemeth et al., 1998 ; Hammerland et al., 1998 ; Hammerland étal., 1999) Des régulateurs positifs du récepteur GABAB (Urwyler et al., 2001), du récepteur mGlu1 (Knoflach et al., 2001), mais aussi des récepteurs mGlu5, mGlu2 et mGlu4 ont été présentés lors du congrès mGlu2002 (Taormina, Sicile, Italie, septembre 2002).
Selon les techniques de criblage à haut débit utilisées jusqu'à présent, des chimiothèques sont criblées grâce à des tests fonctionnels réalisés au moyen de lignées cellulaires exprimant un RCPG-III de façon stable. Les composés présents dans la chimiothèque sont testés pour leur capacité à potentialiser l'effet d'une concentration donnée d'agoniste.
Cependant, une telle approche se heurte à des difficultés multiples.
En premier lieu, il est nécessaire d'obtenir des lignées cellulaires exprimant ces récepteurs de manière stable. Or, il s'agit là d'une étape délicate, surtout dans le cas des récepteurs du glutamate, dans la mesure où cet acide aminé est présent dans tous les milieux de culture, ainsi que dans le sérum. Il est de surcroît produit par la plupart des lignées cellulaires. En conséquence, il s'avère en pratique difficile, voire impossible, d'abaisser la concentration du glutamate dans le milieu de culture à un niveau suffisamment faible pour que les récepteurs ne soient pas activés par le glutamate environnant.
Pour remédier à ce problème, le groupe Eli Lilly & Co a développé une lignée cellulaire qui exprime un transporteur à haute affinité du glutamate (cellules RGT établies sur la base d'une lignée AV12) (Kingston et al., 1998 ; Schoepp et al., 1997). Les cellules ainsi mises au point contrôlent la concentration extracellulaire du glutamate. Elles maintiennent cette concentration à des valeurs suffisamment faibles pour que les récepteurs exprimés ne soient pas activés en permanence par le glutamate présent dans le milieu. Ceci facilite l'établissement de lignées
exprimant les récepteurs de façon stable. Cependant, un tel système présente des inconvénients. En effet, parmi les composés testés, certains peuvent être pris en charge par le transporteur du glutamate et transportés dans les cellules, ce qui peut abaisser leur concentration et prévenir leur action normale sur les récepteurs. En outre, la capacité de certaines des molécules testées à inhiber le transporteur du glutamate peut entraîner des difficultés dans la mise en #uvre du test de criblage.
En pareil cas, la concentration en glutamate croît, ce qui se traduit par une augmentation artéfactuelle de l'activité du récepteur. Le composé apparaît alors comme un régulateur allostérique positif du récepteur, et ce, même s'il n'en est pas véritablement un. Un crible secondaire est donc nécessaire.