INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Mesure de la zone de proportionnalité en fonction des protéines : Le binding est réalisé selon le modèle classique : Le milieu d'incubation est préparé à partir de tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à température ambiante (pH optimum). On fait varier la quantité protéique (0.07 mg à 0.4 mg par tube). La concentration en acide xanthurénique tritié ([3H]-AX) est de 200 nM et pour l'étude de la liaison non spécifique on utilise une concentration de 2 mM d'acide xanthurénique non tritié (AX). Le milieu d'incubation contient 200 pM de CuC. La soustraction entre liaison totale et liaison non spécifique donne la liaison spécifique qui varie en fonction de la quantité protéique : jusqu'à une quantité protéique de 0.25 mg par tube on reste dans la zone de proportionnalité (Figure 16). Pour les expériences ultérieures, on travaillera entre 0.10 à 0.25 mg de protéines par tube.
Mesure de l'effet dose du cuivre sur le binding de l'acide xanthurénique Le binding est réalisé selon le modèle classique : Le milieu d'incubation est préparé à partir de tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à température ambiante (pH optimum). On fait varier la concentration en cuivre (CuCI2) de 3. 10-7 M à 3. 10-4 M.
La concentration en acide xanthurénique tritié ( [H]-AX) est de 400 nM (et 20 pM d'acide xanthurénique) et pour l'étude de la liaison non spécifique on utilise une concentration de 2 mM d'acide xanthurénique non tritié (AX). On obtient une courbe effet dose dont l'analyse au logiciel Graphpad Prism nous donne une EC50 (concentration efficace 50) à 33. 4 uM avec un coefficient de Hill de 1.8 (Figure 17).
Expérience de saturation, mesure réelle du Kd et Bmax Le binding est réalisé dans du tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à température ambiante en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.10 à 0.25 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié et soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale) soit de l'acide xanthurénique non radiomarqué à 2
mM (pour la détermination de la liaison non spécifique). Le temps d'incubation est de 25 min. puis on procède à la filtration.
On fait varier la concentration en acide xanthurénique tritié de façon croissante afin d'arriver à une occupation des sites de liaison maximale (plateau de saturation). On réalise la même chose en présence d'un excès d'acide xanthurénique non radiomarqué afin de déterminer la liaison non spécifique du [H]-AX. Ainsi en soustrayant la liaison totale de la liaison non spécifique on obtient la liaison spécifique de l'acide xanthurénique à son (ou ses) site (s) de binding. L'analyse au logiciel Graphpad Prism permet de déterminer l'affinité de l'acide xanthurénique pour son (ou ses) site (s) de liaison : le Kd est de 7. 56 uM + 0. 8, uM. De même le logiciel Graphpad Prism permet de déterminer le nombre de sites de liaison présents sur une préparation de membranes d'origine synaptique obtenues à partir de cerveaux entiers de rat : le Bmax est de 581.8 pmol/mg de protéines 33 pmol/mg de protéines (Figure 18).
Expérience de compétition, mesure d'une CI50 (concentration inhibitrice 50) Le binding est réalisé dans du tampon Tris Maléate 50 mM pH 6.5 à température ambiante en présence de membranes synaptiques (quantité protéique variant de 0.1 à 0.3 mg par tube), d'acide xanthurénique tritié (200 nM) et soit du tampon (pour la détermination de la liaison totale), soit des concentrations variables d'AX non radiomarqué (10-3 M à 10-10 M).
L'analyse au logiciel Graphpad Prism permet de déterminer la CI50 qui représente la concentration de la molécule qui bloque 50 % du binding de l'acide xanthurénique. L'expérience de compétition entre le [3H]-AX et l'AX non radiomarqué, permet d'obtenir une courbe de déplacement dont l'analyse au logiciel Graphpad Prism nous donne un modèle de liaison à deux sites, une CI50 à 1 uM et une Cet50 à 114 utv) (Figure 19).
. Etude de la distribution régionale des sites de liaison de XA dans le cerveau de rat par autoradiographie quantitative suivie d'analyse d'images.
Méthode : trois cerveaux de rat males Wistar adultes sont rapidement extraits après décapitation de l'animal et congelés dans de l'isopentane maintenu à 0 C par de la carboglace. Les divers cerveaux sont ensuite sectionnés à l'aide d'un cryostat en coupes de 20 um d'épaisseur. Ces coupes sont étalées sur des lamelles de verre qui sont ensuite rapidement séchées à l'air froid. Les lamelles, assemblées sur un cadre, sont ensuite incubées pendant 10 minutes dans un tampon PIPES 50 mM, pH 7.4, maintenu à 0 C par de la glace. Les lamelles sont ensuite trempées pendant 20 minutes dans le même tampon, contenant en plus 200 nM de XA radioactif. Après trois bref lavages de chacun 10 secondes dans le tampon PIPES dépourvu de ligand radioactif, les coupes sont séchées par un courant d'air froid.
Elles sont ensuite exposées à l'obscurité contre un film sensible au tritium. Après 2 mois d'exposition dans des cassettes hermétiques, les films dont développés et les niveaux de gris sont numérisés et comparés à une échelle de radioactivité tritium arbitraire, calibrée en Curie par gramme d'équivalent tissu (Amersham). Les résultats, qui représentent à un facteur près, la répartition des densités des récepteurs XA dans les diverses régions du cerveau de rat, sont données dans le tableau ci-joint.
Schématiquement, les cellules sont mise en culture, dans un milieu de culture classique DMEMc + 10% SVF pendant des périodes de 24 heures pour le FH et d'une semaine pour les KH. Après élimination du tampon et deux rinçages successifs par une solution tampon phosphate, les cellules sont irradiées avec des UV-B sous un niveau d'énergie standardisé à 50 mJ. cm-2.
Le tampon est alors rapidement éliminé et remplacé par un milieu de culture identique à celui utilisé en début d'expérience mais contenant les extraits à tester aux concentrations pré-requises ou du DMSO pour la série contrôle. Après 24 heures, le milieu de culture est récolté et la détermination de sa concentration en IL-6 est réalisé au moyen d'une méthode Elisa standard.
Une série supplémentaire est réalisée selon le même protocole si ce n'est l'absence d'irradiation UV-B, afin de déterminer le taux de base et de contrôle la stabilité du système étudié. Enfin, les essais sont réalisés en triplicate.
Le tableau suivant montre les résultats (moyenne + SEM des pourcentages de variations par rapport aux tests réalisés sans exposition aux UV) obtenus au cours de 5 essais indépendants.
Produit testé [c] FH KH % de variation % de variation Aucun - + 439% ~ 11 + 450 % ~ 15 0,01 % + 455 % ~ 14 + 461 % ~ 15 Acide oléanolique 0, 03 % + 437 % i 12 + 444 % i 14 0, 1% +441% 18 +450% 14 0, 01 +356% 18 +388% 10 NDGA 0, 04% +155% 9 +201% 10 0,1 % + 87 % ~ 7 + 91 % ~ 14 Acide oléanolique0,03 % +acidenordihydroguaiarétique0, 04% +47% 4 +58% 4 Ces résultats démontrent clairement que : > L'acide nordihydroguaiarétique présente un remarquable effet anti- inflammatoire sur les deux lignées cellulaires étudiées puisqu'on observe dans nos conditions (FH et KH) une inhibition de respectivement 19 % (+ 356% vs + 439%) et de 14% (+ 388% vs + 450%) à seulement 0,01%. De plus, cet effet est spécifique puisqu'il est dépendant de la concentration.
> L'acide oléanolique utilisé seul ne présente aucune activité sur ce test.
> Sur les deux lignées cellulaires, il y a une synergie évidente entre les effets lorsque les deux produits sont utilisés en association puisque l'on observe respectivement une inhibition de 90 % (+ 47 % vs + 439% sur les FH) et de 87 % (+ 58% vs +450 % sur les KH), ce qui largement supérieur à la somme des effets individuels observés sur le même test aux mêmes concentrations.
Exemple 8 : Effet antiproliférateur sur kératinocytes-in vitro Principe et réalisation du test : comme la quantité d'ADN est fixe d'une cellule à l'autre, la mesure de la quantité globale d'ADN correspond à mesurer le nombre de cellules utilisées pour cette mesure. Ce principe permet de ne pas utiliser en routine des méthodologies plus fines mais très lourdes. Différentes techniques ont été développées sur la base de ce protocole dont notamment celle utilisée ici : en se
liant à l'ADN, selon une stoechiométrie constante et connu, le fluorophore Hoechst 33258 présente d'une part une fluorescence augmentée mais également un décalage de son spectre d'émission de 492 nm à 458 nm. Par comparaison à des gammes de calibration préalablement établies, le suivi combiné de ces deux paramètres permet de quantifier la quantité d'ADN présente dans les échantillons cellulaires étudiés.
Schématiquement, les kératinocytes (KH) humains normaux sont mis en culture, dans un milieu de culture classique DMEMc + 10% SVF pendant une semaine., en l'absence de produit à tester (série témoin afin de déterminer la prolifération cellulaire de base dans le système étudié) ou en présence des produits à tester, seuls ou en association. Le fluorophore Hoechst 33258 est ajouté en fin de manipulation, avant le prélèvement des aliquotes de cellules pour le dosage.
Les essais sont réalisés en triplicate au cours de trois essais indépendants entre eux.
Résultats : le tableau suivant montre les pourcentages d'inhibition (moyenne SEM) sur les quantités d'ADN (et donc sur nombre le cellules présentes observées au cours de cinq essais indépendants).
Produit testé [c] % d'inhibition 0, 01% 0, 9% 1, 0 Acide oléanolique 0, 03 % 1,1 % f 1,6 0, 1 % 0, 7% 0, 7 0, 01 10, 2 % f 1, 5 NDGA 0, 04 % 22, 3 % f 1, 9 0, 1 % 29, 9 % f 1, 7 Acide olëanoUque 0, 03 % +acide nordihydroguaiarétique 0, 04 % 41, 7 % + 3, 4 Ces résultats démontrent clairement que : > L'acide nordihydroguaiarétique inhibe fortement la prolifération des kératinocytes puisqu'on observe dans nos conditions une inhibition de 10 % à seulement 0, 01%. De plus, cet effet est spécifique puisqu'il est dépendant de la concentration.
> Il y a une synergie évidente entre les effets lorsque les deux produits sont utilisés en association puisque l'inhibition observée (41,7 %) est largement supérieure à la somme des effets individuels observés sur le même test aux mêmes concentrations puisque la somme des effets atteint seulement 23,4 %.
Exemple 9 : Effet anti-bactérien contre le Corynébactérium acnes - in vitro Principe et réalisation du test : On incorpore dans une gélose (Biomérieux) en surfusion, coulée dans une boite de Pétri, 1 ml du prémix de l'exemple n 1 ou de ces composants à tester à la concentration équivalente à 5% du prémix. La boite est agitée pour bien homogénéiser le produit dans la gélose. On dépose 10 l d'une suspension de bactéries à étudier diluée respectivement pour contenir environ 104 et 105 bactéries/ml sur la gélose gélifiée, à température ambiante. Ensuite les boites sont incubées pendant 24 et 48 heures à 37 C et observées visuellement.
Méthode : - Une cryobille de E. coli est introduite dans un tube de 9 ml de bouillon tryptone soja et incubée à 370C durant 18-24 heures.
L'étape d'agglutination est effectuée comme suit : - On mélange dans des tubes, 1 ml de globules rouges, 50 jul de E. coli (culture pure) et 125 gl de lectine, - Les tubes sont agités manuellement durant 5 minutes à température ambiante - On effectue une filtration sur un filtre de porosité 5 Mm.
La deuxième étape de lyse est alors effectuée : - On ajoute 900 yl de tampon de lyse à 100 gl du filtrat après agglutination, On maintient l'ensemble 15 minutes à température ambiante, On effectue des dilutions en série : 4 dilutions 1/10 On filtre 100 gel de l'échantillon ainsi obtenu sur une membrane CB04, - On effectue un marquage des bactéries avec un substrat estérasique et des globules rouges avec un anticorps anti-Glycophorine-PE (appendix 2) - On dénombre les bactéries et les globules rouges avec l'Analyseur.
Le tableau 9 ci-dessous montre les résultats obtenus avec le dénombrement des bactéries effectué après
l'étape d'agglutination des globules rouges avec la lectine suivie de l'étape de lyse.
récupération Dénombrement Dénombrement des des des bactéries globules bactéries (%) rouges E. coli Globules 441 3582 NCTC rouges 10 449 4188 9001 E. coli Globules 261 161 Lectine Lyse 68 NCTC rouges 10 348 180 9001
Après agglutination la concentration en globules rouges a été réduite de 1,5 log.
Soixante huit (68) % des bactéries sont récupérées après ces deux étapes.
IV. AGENTS DE MARQUAGE Exemple 1. Substrat estérasique ChemChrome V6 Des solutions de marquage peuvent être préparées à partir d'un substrat estérasique et utilisées dans le procédé de détection de l'invention selon le protocole suivant a) Préparation - 10 sil du substrat estérasique ChemChrome V6 par millilitre de tampon ChemSol B16 (500 gl de solution de marquage par membrane) - cette solution est conservée à 40C à l'abri de la lumière au maximum 4 heures.
b) Utilisation Introduire un tampon de marquage dans une boîte de Pétri de 33 mm de diamètre.
Distribuer 500 III de la solution de marquage sur le tampon.
Placer la membrane CB04 sur la rampe de filtration. Filtrer 100 III de l'échantillon à analyser.
Placer la membrane sur le tampon.
Incuber durant 15 minutes à 37 C.
Exemple 2. Anticorps marqué.
L'invention selon ses différents aspects a notamment pour objectif de pallier ces inconvénients de l'art antérieur.
Plus précisément, un objectif de l'invention est d'optimiser la transmission de données vers plusieurs destinataires sur des liens de communications pouvant
avoir une gigue en fonction du destinataire, les données étant mémorisées dans une FIFO.
Un autre objectif de l'invention est d'optimiser l'espace mémoire de type FIFO globalement nécessaire à l'envoi d'un même ensemble de données vers plusieurs destinataires.
Encore un autre objectif de l'invention est de fournir un procédé et un dispositif de gestion de FIFOs permettant de transmettre simultanément à plusieurs destinataires des données mémorisées dans une même FIFO, les données transmises à deux destinataires distincts n'étant pas nécessairement identiques à un instant donné.
Dans ce but, l'invention propose un procédé de gestion d'une mémoire FIFO comprenant un ensemble de cases mémoire, dont l'accès en écriture est contrôlé à l'aide d'un pointeur d'écriture, chacune des données étant susceptible d'être lue par au moins deux destinataires, le procédé comprenant une étape d'association un pointeur de lecture de la FIFO à chacun des destinataires.
Ces pointeurs de lecture peuvent être gérés indépendamment les uns des autres, et deux destinataires distincts peuvent donc être associés à deux pointeurs de lecture pointant sur des adresses de la FIFO différentes. Cela permet de gérer efficacement les décalages entre destinataires.
On note qu'on entend ici par donnée notamment une information pouvant comprendre un ou plusieurs éléments binaires, voire un ensemble d'informations de taille relativement importante.
On note qu'un destinataire est, par exemple, un dispositif, un élément de dispositif ou une application particulière.
En outre, les données devant être lues par plusieurs destinataires ne sont pas nécessairement dupliquées.
Selon une caractéristique particulière, le procédé est remarquable en ce qu'il comprend en outre : - une étape de requête de lecture par un destinataire demandeur ;
une étape de lecture d'une donnée écrite dans la FIFO pointée par le pointeur de lecture associé au destinataire demandeur après réception de la requête ; et - une étape de mise à jour du pointeur de lecture associé au destinataire demandeur.
Ainsi, les requêtes de lecture peuvent être émises indépendamment par chacun des destinataires en fonction notamment du débit ou du taux de charge sur le lien de communication et/ou du type de gestion de flux.
En outre, l'invention permet à chacun des destinataires de lire à sa propre vitesse et selon ses propres besoins les données mémorisées.
Selon une caractéristique particulière, le procédé est remarquable en ce que la FIFO est mise en ouvre dans une mémoire à ports multiples permettant la lecture simultanée de données distinctes par au moins deux des destinataires.
Ainsi, la lecture de données est optimisée et n'est pas ralentie si un destinataire est plus lent que les autres.
La réaction est conduite à une température comprise entre-50 C et 100 C, de préférence entre - 200C et 20 C.
D'un point de vue pratique, on met en oeuvre l'amine racémique, le solvant organique et généralement, on ajoute le réactif de résolution progressivement.
On conduit le plus souvent la réaction sous pression atmosphérique.
On obtient le stéréomère en solution.
On le sépare d'une manière classique, par exemple on effectue un lavage à l'aide d'un acide, de préférence l'acide chlorhydrique, en solution aqueuse, par exemple 0,5 à 2 M.
On récupère le produit souhaité par cristallisation, distillation ou tout autre moyen, par exemple une chromatographie sur colonne.
EXEMPLES On donne ci-après des exemples de préparation des nouvelles sulfonamides ainsi qu'un mode opératoire général de transfert d'acétyle énantiosélectif sur un mélange racémique d'amines (résolution cinétique).
Avant de détailler les exemples, on donne un mode opératoire pour préparer le (18, 28) -1, 2-bis (trifluorométhane sulfonamido) cyclohexane utilisé dans les exemples suivants.
D'une manière analogue, on prépare le (lus, 2S)-1, 2bis (trifluorométhanesulfonamido) -1, 2-diphényléthane.
Préparation du (lus, 2S)-1, 2-bis (trifluorométhane sulfonamido) cyclohexane.
Dans un ballon tricol de 100 ml, muni d'une ampoule à addition, d'une sonde de tempéraure et d'un barreau aimanté avec agitation par un agitateur magnétique, on charge :
- 1 g (8,75 mmol) de (lys, 2S)-1, 2-cyclohexanediamine, - 2, 94 mL (17,5 mmol) d'anhydride de trifluorométhanesulfonyle, - 1, 58 mL (11,38 mmol) de triéthylamine - 20 mL de dichlorométhane.
On commence par charger la diamine et le dichlorométhane, puis l'on établit une athmosphère de gaz inerte (azote).
Le mélange réactionnel est ensuite refroidi à une température de 00C à l'aide d'une bain de glace.
On coule lentement l'agent de sulfonylation au moyen d'une ampoule à addition, puis le mélange réactionnel est laissé remonter à température ambiante sous agitation pendant deux heures.
Au bout des deux heures, une solution saturée de chlorure d'ammonium est introduite dans le milieu, et la phase organique est extraite, puis lavée plusieurs fois à l'aide d'une solution saturée de chlorure de sodium.
Ces buts sont atteints par l'utilisation du matériau selon l'invention qui comprend au moins deux couches d'isolant à base de laine minérale, une couche dite inférieure destinée à être en contact avec une surface support, notamment une chape ou un bac acier, et une couche dite supérieure plus éloignée de la surface support, où la couche inférieure est constituée essentiellement de laine de verre de densité, mv1, comprise entre 50 et 120 kg/m3 et d'épaisseur, e1, comprise entre 50 et 200 mm, où la couche supérieure est constituée essentiellement de laine minérale, notamment laine de verre et/ou laine de roche, et de densité, mv2, comprise entre 100 et 250 kg/m3 et d'épaisseur, e2, comprise entre 10 et 50 mm, et où le rapport des masses volumiques des couches supérieure et inférieure respecte le rapport : mv2/mv1 # 1,5.
On note que chacune des couches, inférieure et/ou supérieure, peut ellemême comprendre une pluralité de couches élémentaires de masse volumique sensiblement voisine et qu'il faut alors considérer les caractéristiques, de l'ensemble de la couche inférieure et/ou supérieure, pour la masse volumique comme résultant de la moyenne des masses volumiques des couches élémentaires et pour l'épaisseur comme la somme des épaisseurs de couches élémentaires.
On entend de manière usuelle par laine de verre une laine constituée de fibres minérales et le plus souvent d'un liant, notamment de type formophenolique, lesdites fibres minérales étant obtenues par un procédé de centrifugation interne qui permet d'obtenir des fibres longues avec un taux d'infibrés très faible.
On entend de manière usuelle par laine de roche une laine constituée de fibres minérales et le plus souvent d'un liant, lesdites fibres minérales étant obtenues par un procédé de centrifugation externe qui produit des fibres plus courtes que les fibres de verre et un taux d'infibrés, nommés grains, assez élevé.
Usuellement les fibres de verre sont obtenues à partir de compositions fondues de silico-boro-sodo-calciques et les fibres de roche à partir de compositions fondues silico-calciques riches en fer.
De manière préférée, la masse volumique moyenne du matériau selon l'invention est inférieure ou égale à 120 kg/m3.
De manière préférée, la masse volumique, mv1, de la couche inférieure est supérieure ou égale à 60 kg/m3 et/ou notamment inférieure ou égale à 100 kg/m3 voire à 80 kg/m3.
De manière préférée, l'épaisseur, e1, de la couche inférieure est supérieure ou égale à 60 mm, voire supérieure ou égale à 80 mm et/ou inférieure ou égale à 150 mm, voire inférieure ou égale à 120 mm.
De manière préférée, la masse volumique, mv2, de la couche supérieure, est supérieure ou égale à 120 kg/m3 et/ou inférieure ou égale à 200 kg/m3, voire inférieure ou égale à 150 kg/m3.
De manière préférée, l'épaisseur, e2, de la couche inférieure est supérieure ou égale à 15 mm et/ou inférieure ou égale à 30 mm, voire à 20 mm.
Selon une variante de l'invention, le rapport des épaisseurs des couches inférieure et supérieure respectent le rapport e1/e2 > 3, voire e1/e2 > 5.
De manière préférée, la couche inférieure est constituée de laine de verre comprenant un liant formophénolique réticulé dont la teneur en poids relatif à l'ensemble de la couche est comprise entre 5 et 12 %.
De manière préférée, la couche supérieure est constituée de laine de verre comprenant un liant formophénolique réticulé dont la teneur en poids relatif à l'ensemble de la couche est comprise entre 5 et 12 %.
Avantageusement les couches inférieure et supérieure sont disposées de manière à ce que le bord des plaques d'une couche est situé en regard avec une surface pleine de l'autre couche afin d'éviter des ponts thermiques susceptibles d'apparaître si les bords des plaques des différentes couches sont en regard les uns des autres.
On obtient ainsi un matériau léger qui présente des propriétés remarquables et convient parfaitement pour des utilisations d'isolation de toit par l'extérieur.
Il présente la propriété remarquable d'être beaucoup moins sensible à l'estampage et/ou à l'impact que les matériaux connus.
Les globules rouges présentent également quelques propriétés d'agglutination.
Le procédé de concentration de germes pathogènes selon l'invention comporte une deuxième étape de
réduction de la concentration des populations des cellules majoritaires dans le sang, à savoir les plaquettes et les globules rouges, consistant à lyser les cellules isolées non agrégées lors de la première étape d'agrégation.
Cette deuxième étape de réduction de la concentration des populations des cellules sanguines permet une réduction de l'ordre de 4 log (depuis 109 à 105 cellules/ml) en ce qui concerne la concentration des plaquettes et de l'ordre de 5 log (depuis 1010 à 105) en ce qui concerne la concentration des globules rouges. La récupération des bactéries à l'issue de cette deuxième étape est supérieure à 50%.
Plus précisément l'invention a pour objet un procédé de concentration de germes contaminants éventuellement présents dans un produit sanguin comprenant des cellules sanguines, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) on soumet un échantillon dudit produit sanguin à un traitement d'agrégation des cellules sanguines, b) on élimine les agrégats formés à l'étape (a) par passage de l'échantillon traité sur un premier filtre laissant passer les germes contaminants mais pas les agrégats de cellules, c) on lyse sélectivement les cellules résiduelles du filtrat obtenu à l'étape (b), d) on récupère les germes contaminants par passage du lysat de l'étape (c) sur un second filtre laissant passer les débris cellulaires.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de l'invention comprend une étape supplémentaire d'analyse du second filtre pour détecter les germes contaminants éventuellement retenus.