INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Ed. CSHLP, 2001) et sont incubés 1min à 95 C puis 10min à 45 C. Ensuite 20ng d'oligonucléotides (2pl) sont ligués dans 100ng de vecteur pDH51 en utilisant les sites BamHI/Pstl (Sambrook et al., 2001). Le produit de ligation est transformé dans E.coli XL1-B (Stratagène) en utilisant une méthode chimique (Sambrook et al., 2001) Les transformants sont sélectionnés sur l'antibiotique ampicilline. La présence de l'insert peut être directement identifiée dans les transformants par l'absence de couleur bleue sur milieu contenant le substrat X-GAL (Sambrook et al., 2001). Cinq transformants indépendants sont utilisés pour extraire le plasmide avec le kit commercial High pure plasmid Isolation kit (Roche/Boehringer). La présence de l'insert est vérifiée par restriction avec l'enzyme EcoRI (Sambrook et al, 2001). La fidélité de séquence des constructions est vérifiée pour la présence de la séquence SUP25 par séquençage (Sambrook et al., 2001) en utilisant une amorce appariant le promoteur 35S [op35S52 : CTTCGTCAACATGGTGGAGC] : (SEQ ID NO : 30) ou le terminateur 35#S [oter35 : CTAGCTAGAGGATCGATCC] : (SEQ ID NO : 31).
6. 3) Transfert du transgène dans un vecteur binaire de transformation.
Le transgène est ensuite sous-cloné dans le site EcoRI de la région T-DNA du plasmide binaire pZP111(Hajdukiewicz P, et al., The small, versatile pPZP family of Agrobacterium binary vectors for plant transformation. Plant Mol Biol., 1994, (6) : 989-94. ), contenant un gène de sélection NPTII
conférant aux plantes une résistance à l'antibiotique kanamycine. Le plasmide contient également un gène de sélection aadA pour la sélection chloramphénicol dans E.coli ou Agrobacterium. Le produit de ligation est transformé dans E.coli XL1-B (Stratagène) en utilisant une méthode chimique (Sambrook et al., 2001). Les transformants sont sélectionnés sur milieu LB (Sambrook et al., 2001) + 25mg/1 chloramphénicol. La présence de l'insert dans le plasmide pZP111 peut être directement identifiée dans les transformants bactériens par l'absence de couleur bleue sur milieu contenant le substrat X-GAL (Sambrook et al., 2001).
6. 4) Transfert du vecteur binaire dans Agrobacterium.
Une souche positive est sélectionnée, le plasmide est purifié en utilisant le kit commercial High pure plasmid Isolation kit (Roche/Boehringer). La souche désarmée d'Agrobacterium tumefaciens C58C1 (Koncz C. et Schell, J., The promoter of TI-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chaemeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector, Mol. Gen. Genet., 204 : 383-396) est rendue compétente puis transformée par électroporation (Shen WJ. et Forde BG., Efficient transformation of Agrobacterium spp. by high voltage electroporation.
Nucleic Acids Res. 1989, 17(20) : 8385) avec le plasmide binaire contenant la construction d'ADN-T. Après 3 jours de culture à 28 C, les colonies résistantes au chloramphénicol 25 mg/l, Rifampicine 50 mg/l, Gentamycine 25 mg/l, sont confirmées positives par PCR utilisant des amorces détectant le promoteur 35S [op35S52 : CTTCGTCAACATGGTGGAGC] (SEQ ID NO : 30) et le terminateur 35#S [oter35 : CTAGCTAGAGGATCGATCC] (SEQ ID NO : 31) (Sambrook et al 2001).
6. 5) Obtention de plantes transgéniques.
L'accumulation d'AMPc intracellulaire est déterminée à différentes concentrations de NKA. L'antagoniste H8565 déplace la courbe concentration-réponse de NKA vers des valeurs plus élevées sans affecter l'intensité de la réponse maximale
(triangles noirs). Le ligand 805 (carrés et triangles gris) diminue l'intensité de la réponse maximale sans affecter l'ECso (concentration efficace à 50%) de la NKA pour la réponse.
La figure 9B représente la concentration efficace à 50% de la réponse maximale d'AMP cyclique à la NKA. Cette EC50 augmente en présence d'antagoniste compétitif tandis qu'elle n'est pas modifiée de manière significative en présence de 10 et 50 M de 805.
La figure 9C représente l'inhibition de la réponse maximale d'AMPc induite par la NKA en présence de concentration croissante de 805. L'abscisse représente le logarithme de la concentration en 805 et l'ordonnée la valeur maximale de la production d'AMP cyclique. La constante d'inhibition KI est de l'ordre de 6 M.
Les Figures 10A, 10B, 10C, 10D et 10E illustrent l'effet de 805 sur les réponses calciques associée au récepteur EGFP-NK2R dans les cellules HEK 293.
Dans les figures 10A, 10B et 10C, on a représenté la fluorescence de l'INDO-1à 400 nm en fonction du temps en secondes.
Les réponses sont enregistrées à l'aide de la sonde fluorescente sensible au calcium INDO-1. Pour chaque concentration d'agoniste NKA (lnM, 5 nM et 1 M) on mesure une réponse contrôle (cercle blanc) et une réponse en présence de 50 M de 805 (cercle noir)(figures 10A, 10B et 10C). Dans tous les cas, on note une augmentation de la durée de la réponse calcique en présence de 805, sans effet significatif sur l'amplitude ou sur la cinétique de mise en place de la réponse.
La figure 10D indique les variations de réponses calciques obtenues pour une concentration d'agoniste fixe (5 nM de NKA) et des concentrations variables (10 et 50 M) de 805. On a représenté la concentration en calcium normalisée en fonction du temps en secondes. La courbe avec les cercles blancs correspond à une mesure effectuée en présence de 5 nM de NKA et sans 805 ; courbe avec les cercles noirs correspond à une mesure effectuée en présence de 5 nM de NKA et de 10 M de 805 ; la courbe avec les carrés noirs correspond à une mesure effectuée en présence de 5 nM de NKA et de 50 M de 805.
Dans tous les cas on note une augmentation de la durée de la réponse calcique en présence de 805.
La figure 10E présente une quantification du temps de demi retour (temps requis pour que la concentration de calcium soit la moitié de sa valeur maximale) à la valeur initiale de la réponse calcique enregistrée en présence de 0,10 et 50 M de 805.
Les figures 11A, 11B, 11C, 11D, 11E, 11F et 11G illustrent l'effet de 805 sur la liaison de neurokinine tronquée fluorescente (NKA4-10 TR7) marquée avec le groupe fluorescent Texas red et la réponse calcique associée.
Dans les figures 11A à 11D, les réponses calciques à 106 (figure 11A), 50,3 (figure 11 B), 26,5(figure 11 C) et 10, 6 nM (figure 11 D) de NKA4-10 TR7 (NKA4-10 marquée en position 7 par le Texas Red) sont enregistrées en double, en absence (courbes avec les cercles blancs) et en présence de 20 M de 805 (courbes avec les cercles noirs). On a représenté la concentration en calcium normalisée en fonction du temps en secondes. On note que 805 provoque une augmentation de l'amplitude de la réponse calcique, et une persistance du signal.
Le figure 11E représente la relation entre l'amplitude de la réponse calcique et la concentration d'agoniste. On a représenté l'amplitude du pic calcium normalisé par rapport à la concentration de calcium extracellulaire, en fonction de la concentration en NKA4-10 TR7. La courbe avec les carrés noirs correspond à la mesure témoin et (sans 805) et la courbe avec les triangles correspond à la mesure effectuée en présence de 20 M de 805.
La figure 11F représente la dissociation de la liaison de NKA 4-10 TR7. L'axe des abscisses représente le temps en secondes et l'axe des ordonnées représente la fluorescence. Le complexe formé entre le récepteur EGFP-NK2R et la NKA4-10 TR7 (106 nM) est renversé (à 10 C) par la NKA non fluorescente (20 M) en absence et en présence de 10 M de 805. L'analyse de la cinétique de dissociation fait apparaître deux relaxations monoexponentielles dont les constantes de vitesses (0,05 sec-' et 0,013 sec-1) sont identiques en présence et en absence de 805, mais dont les amplitudes relatives changent de manière à ce que la dissociation lente représente 42% du signal total dans le contrôle et 12% du signal total en présence de 805.
Dans la figure 11G, on a représenté le pourcentage d'amplitude de la dissociation rapide de NKA 4-10 TR7 en fonction du logarithme de la concentration en 805.
L'amplitude de la dissociation rapide de NKA 4-10 TR7 est mesurée en présence de concentrations variables de 805. La dissociation rapide représente environ 40% de la
En conséquence, on peut construire des fils d'argent perpendiculairement aux fils atomiques de Si (voir le document [5] ) .
Ceci est extrêmement important pour construire des réseaux artificiels à l'échelle sous nano-métrique, qui peuvent être très utiles en nano- électronique.
On peut remplacer l'argent par d'autres métaux à bande d pleine, tels que l'or ou le cuivre, ou par des métaux de type jellium, tels que l'aluminium.
On rappelle qu'un métal de type jellium est un métal dont le gaz d'électrons est sensiblement homogène et dont les charges ioniques positives sont sensiblement "étalées" ("smeared") dans la totalité du volume du métal pour donner un fond ("background") positif et uniforme.
On peut aussi remplacer l'argent par des métaux de transition tel que Mo, W, Ta, Nb, Co, Fe, Mn, Cr, Ti par exemple.
Avec les métaux ayant des caractéristiques magnétiques, l'invention permet de doper ou de fabriquer des nanostructures ayant, par exemple, des propriétés magnétiques intéressantes en électronique de spin.
On peut aussi remplacer l'argent par d'autres métaux tels que les métaux alcalins, qui sont des catalyseurs remarquables pour les réactions de surface avec des molécules organiques ou inorganiques (voir les documents [1] et [2] ) .
On peut donc provoquer des réactions à l'échelle atomique et favoriser une passivation très localisée, par exemple par oxydation, nitruration ou oxynitruration, ou une fabrication de silicones aux échelles atomiques ou moléculaires.
Les métaux alcalins ont aussi la propriété remarquable d'abaisser considérablement le travail de sortie des électrons, et d'atteindre le régime d'électro-affinité négative, c'est-à-dire de constituer des émetteurs naturels d'électrons. La présente invention permet à cette émission de se faire à partir de nanostructures de métaux alcalins (Cs, Rb, K ou Na par exemple).
Au lieu d'utiliser une évaporation sous vide pour déposer le métal, on peut faire cette évaporation à plus haute pression, dans une atmosphère inerte (gaz rare, etc ......) .
En ce qui concerne le deuxième exemple, on précise que le procédé objet de l'invention permet de contrôler sélectivement la migration ou la désorption des atomes du métal (par exemple l'argent) en agissant sur la température. Une variation de cette dernière agit sur le mouvement des dimères Si-Si sur SiC ou provoque ce mouvement.
Dans une variante de ce deuxième exemple, on prépare la surface de SiC cubique, terminée Si (3-SiC(100) c (4x2) et sans les lignes atomiques de silicium, on dépose le métal et l'on fait le recuit en dessous de la température de désorption totale du métal.
On obtient ainsi, comme précédemment, des fils atomiques du métal et/ou des bandes unidimensionnelles nanométriques de ce métal. Ces fils atomiques et ces bandes unidimensionnelles sont parallèles les uns aux autres et sont perpendiculaires à la direction selon laquelle on formerait les rangées parallèles de dimères Si-Si.
Dans un autre exemple de l'invention, on passive localement une surface préparée d'un échantillon de SiC cubique au moyen d'hydrogène et l'on forme les fils atomiques et/ou les bandes unidimensionnelles du métal dans les zones non passivées.
La figure 4 est une vue de dessus schématique de la surface 14 passivée localement et comportant ainsi des zones passivées, telle que la zone 15, et des zones non passivées 16 et 18. Les lignes atomiques parallèles de silicium, qui sont présentes dans ces zones 16 et 18, ont la référence 20. On voit aussi les fils atomiques 22 de métal et les bandes unidimensionnelles 24 de ce métal, qui sont formés dans ces zones, perpendiculairement aux lignes 20.
Pour passiver localement la surface, on recouvre les zones que l'on ne veut pas passiver d'une couche de résine photosensible ("photoresist layer") et l'on élimine cette dernière après passivation des zones non recouvertes.
ainsi que de fixation sur ce flanc 55 peuvent être choisis, mais on a illustré un choix préféré à cet égard, particulièrement avantageux en ce qu'il permet d'utiliser un joint à lèvre 64 du commerce, à savoir par exemple un joint dit V-RING NITRILE , élastique en particulier en flexion, en compression et en extension circonférentielle et habituellement utilisé pour la réalisation d'étanchéités tournantes contre les poussières, les projection d'huile, et/ou autres produits similaires.
Ainsi, de façon connue en elle-même, le joint à lèvre 64 illustré à la figure 3 comporte, outre la lèvre 67, un talon 69 également annulaire de révolution autour de l'axe 53 et auquel la lèvre 67 se raccorde solidairement, par réalisation en une seule pièce, par sa partie de fixation 66, c'est-à-dire par sa partie la plus proche de l'axe 53 et la plus éloignée de la face de fond 56 de la cavité 52.
Ce talon 69 est délimité vers l'axe 53 par une face périphérique intérieure 70 cylindrique de révolution autour de cet axe 53 par rapport auquel elle présente, avant le montage du joint à lèvre 69 dans la cavité 52, un diamètre inférieur à celui du flanc 55 de la cavité 52, si bien que le joint 64 est monté sur ce flanc 55 en précontrainte d'extension élastique circonférentielle et s'applique donc par sa face 70, sur le flanc 55 de la cavité 52, sous une pression provoquant à la fois une étanchéification mutuelle à l'air, à l'eau et aux poussières et une solidarisation mutuelle par friction.
Dans le sens d'un éloignement par rapport à l'axe 53, le talon 69 est délimité par une face périphérique extérieure 71 cylindrique de révolution autour de l'axe
53 avec un diamètre qui, même dans cet état d'extension circonférentielle, est inférieur à celui du flanc 54 de la cavité 52 de façon à laisser un libre passage, notamment pour l'air s'échappant de l'intérieur du bloc optique 3, entre le talon 69 et le flanc 54 de la cavité 52.
Cette face périphérique extérieure 71 du talon 69 est raccordée à la lèvre 67, au niveau de la partie de fixation 66 de celle-ci, c'est-à-dire dans sa zone la plus proche de l'axe 53, par une face frontale 72 tronconique de révolution autour de l'axe 53 mais d'obliquité inverse de celle de la partie d'obturation 67 par rapport à cet axe 53, et à la face périphérique intérieure 70 du talon 69 par une face frontale 73 annulaire de révolution autour de l'axe 53, plane et perpendiculaire à cet axe.
Suivant l'axe 53, la cavité 52 et le joint 64 sont dimensionnés de telle sorte que la face frontale 73 soit située dans un même plan géométrique que la face 51 de la paroi de fond 33, ce qui permet, comme on l'a illustré à la figure 3, de compléter la retenue du talon 69 en place sur le flanc 55 de la cavité 52 au moyen d'une rondelle 74 plate, perpendiculaire à l'axe 53, que l'on applique à plat sur une zone de la face 51 située plus près de l'axe 53 que de la cavité 52 et sur la face frontale 73 du talon 64 et que l'on fixe de façon solidaire et de préférence amovible sur la paroi de fond 33, par exemple dans la partie de celle-ci située centralement en référence à l'axe 53.
Plus précisément, à cet effet, la rondelle 74 est délimitée par deux faces frontales 75,76 planes,
mutuellement parallèles, en forme de disque perpendiculaire à l'axe 53, à raison d'une face frontale 75 tournée dans un sens longitudinal allant de l'extrémité 23 du manchon 9 vers l'extrémité 20 de celuici et d'une face 76 tournée en sens opposé, et par un chant 77 est tourné dans le sens d'un éloignement par rapport à l'axe 53 et cylindrique de révolution autour de l'axe 53 avec un diamètre intermédiaire entre celui de la face périphérique extérieure 71 du talon 64 et celui du flanc 54 de la cavité 52, lequel chant 77 est tourné dans le sens d'un éloignement par rapport à l'axe 53 et raccorde mutuellement les deux faces frontales 75 et 76.
La rondelle est appliquée à plat, par sa face 75, sur la partie de la face 51 la plus proche de l'axe 53, entre ce dernier et le flanc 55 de la cavité 52 et la relation précitée entre les diamètres respectifs du chant 77 et du flanc 54 de la cavité 52 assure la subsistance, entre eux, d'une fente 78 annulaire de révolution autour de l'axe 53, autorisant en particulier un libre passage de l'air sortant du bloc optique 3, vers l'extérieur de la cavité 52.
La fixation de la rondelle 74 sur la paroi de fond 33 du capuchon 11 peut être assurée par divers moyens, mais on a illustré un moyen particulièrement simple et économique consistant en un clipsage de la rondelle 74 dans une zone de celle-ci située à proximité immédiate de l'axe 53.
Plus précisément, dans l'exemple illustré, la zone de la face 51 située plus près de l'axe 3 que la cavité 52 est creusée d'un trou borgne 79, de révolution autour de l'axe 53, et à l'intérieur de ce trou borgne 79
fait saillie, suivant l'axe 3, jusqu'au plan géométrique précité de la face 51, un tenon 80, présentant une forme de révolution autour de l'axe 53. La rondelle 74, lorsqu'elle est en appui par sa face 75 sur la zone de la face 51 située au plus près de l'axe 53 que la cavité 52, enserre élastiquement ce tenon 60, radialement en référence à l'axe 53, par une jupe 81, annulaire de révolution autour de l'axe 53, qu'elle présente en saillie sur sa face 75 à l'intérieur borgne 79, tout autour du tenon 80.
Ce mode de montage et de solidarisation de la rondelle 74 avec la paroi de fond 33 peut être remplacé par des modes de montage plus fermes, par exemple par un vissage, mais s'est révélé suffisant compte tenu de ce que, par ailleurs, le talon 74 tend à rester fixé à l'intérieur de la cavité 52 par friction sur le flanc 55 de celle-ci, comme on l'a précédemment décrit. Par rapport à d'autres modes de montage tels qu'un vissage, ce mode de montage de la rondelle 74 présente l'avantage d'une grande simplicité d'intervention lorsque, lors d'opérations de maintenance, on change le joint 133.
De façon générale, d'autres modes de réalisation de la soupape unidirectionnelle 82 ainsi constituée par le joint à lèvre 64 dans cet exemple pourront être choisis sans que l'on sorte pour autant du cadre de la présente invention, de même que d'autres emplacements pourront être choisis, sur le bloc optique 3 mais de préférence à l'intérieur du capot 2, pour la soupape unidirectionnelle 82, dès lors que sera conservée la dissociation, caractéristique de la présente invention, entre cette soupape 82 et les moyens, ici constitués par
le joint 133, assurant l'étanchéité entre le capuchon 11 et le manchon 9, ou tout autre moyen intermédiaire de montage du capuchon 11 sur le réflecteur 6.
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- Le brevet L'Oréal (WO 99/ 32078) concerne l'utilisation d'au moins une auxine en tant qu'agent favorisant la synthèse des lipides de la peau, le terme auxine correspondant à des composés naturels ou synthétiques tels l'acide 3-indolacétique, l'acide p-naphtoxyacétique...
Tous ces travaux concernent exclusivement les auxines. A la connaissance de la demanderesse, aucune étude n'a permis à ce jour de suggérer que les autres catégories de substances de croissance végétales, notamment les gibbérellines, les cytokinines et l'acide abscissique, incorporées seules ou en mélange ou encore associées aux auxines, pouvaient être avantageusement utilisées pour les soins de la peau.
La découverte importante du présent brevet est le fait que l'association des deux extraits préparés selon l'invention à partir des algues marines avantageusement choisies : Ascophyllum nodosum et Halopteris scoparia ne contient pas uniquement des dérivés auxiniques indoliques mais renferme toute une variété de phytohormones marines en plus de ces dérivés auxiniques, notamment des gibbérellines, des cytokinines et de l'acide abscissique.
L'association de ces deux extraits permet, par un effet de synergie, de renforcer leur activité phytohormonale marine et d' optimiser les propriétés physiologiques de stimulation à la fois au niveau cellulaire et au niveau des défenses endogènes.
Les études réalisées par les inventeurs ont permis de mettre en évidence un certain nombre d'actions biochimiques, notamment enzymatiques, surprenantes du mélange de ces deux extraits algaux, ce qui a permis d'envisager son utilisation dans des produits cosmétiques et pharmaceutiques, notamment dermatologiques.
Quelques exemples vont illustrer l'invention, sans que cela soit limitatif quant aux autres activités cosmétiques et dermocosmétiques qui ont été mises en évidence au cours du développement de cette association d'extraits algaux, objet du présent brevet.
Exemple n 1 : Obtention des extraits d'algues et de leur mélange selon l'invention.