INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Pour confirmer la présence de la cassette d'expression, et en particulier du gène de toxine insecticide, selon l'invention dans les plantes régénérées, on peut utiliser un grand nombre de techniques appropriées, par exemple l'analyse PCR ou des techniques d'hybridation Southern blot, pour déterminer la structure de l'ADN recombinant, la détection de l'ARN transcrit à partir de l'ADN du gène d'intérêt exprimé dans des cellules de plantes transformées, des techniques de repérage de la production de protéines codées par le gène d'intérêt, telles que l'électrophorèse de protéines sur gel, des techniques Western blot.
Les plantes transformées selon les méthodes décrites peuvent être des monocotylédones ou des dicotylédones, notamment le maïs, le blé, l'orge, le sorgho, la pomme de terre, le pois, le soja, le tabac, le colza, la tomate, le tournesol, le coton, le riz, le haricot, le chou-fleur, le brocoli, la laitue, le radis, le céleri, l'épinard, l'oignon, l'ail, la carotte, la pomme, la poire, le melon, la cerise, la pêche, l'abricot, la framboise, la fraise, l'ananas, l'avocat, la banane, la canne à sucre.
L'homme du métier sera en outre capable d'augmenter le niveau de production par les plantes transformées en augmentant le contenu en base GC des séquences codantes. En outre l'homme du métier utilisera des séquences le cas échéant modifiées pour obtenir une expression appropriée selon qu'il s'agisse de plantes monocotylédones ou dicotylédones.
Selon un autre aspect l'invention a pour objet une composition pour la lutte contre des insectes nuisibles ainsi que des procédés mettant en #uvre de telles compositions, ces compositions comprenant une toxine insecticide ou composé insecticide selon l'invention telle que décrite précédemment. Par composition insecticide on entend comprenant comme matière active une quantité efficace non
phytotoxique de toxine insecticide selon l'invention en association avec un support solide ou liquide, acceptable en agriculture et/ou un agent tensioactif également acceptable en agriculture.
Au sein des différentes variantes de compositions insecticides selon la présente invention, le composé insecticide est mis en #uvre dans des quantités efficaces mais non phytotoxiques. Par quantité efficace et non phytotoxique, on entend une quantité de matière active suffisante pour permettre le contrôle ou la destruction des insectes présents ou susceptibles d'apparaître sur les cultures, et n'entraînant pour lesdites cultures aucun symptôme notable de phytotoxicité. Une telle quantité est susceptible de varier dans de larges limites selon l'insecte à combattre, le type de culture, les conditions climatiques, et les composés compris dans la composition insecticide selon l'invention. Cette quantité peut aisément être déterminée par des essais systématiques au champ, à la portée de l'homme du métier.
Selon une réalisation, une composition insecticide au moins une cellule hôte telle que décrite précédemment.
Pour leur emploi dans la pratique, les différentes compositions insecticides selon l'invention sont typiquement associées à un support, solide ou liquide, utilisable dans le domaine de l'agriculture, et éventuellement à au moins un agent tensioactif et/ou un ou plusieurs agents auxiliaires.
En particulier, comme supports, sont utilisables les supports inertes et usuels ; de même que, comme agents tensioactifs, sont utilisables les agents tensioactifs usuels dans le domaine de la mise en formulation de compositions destinées à des usages en agriculture, notamment pour le traitement ou la protection des cultures.
Les compositions insecticides selon l'invention comprennent typiquement entre 0,00001 et 100%, de préférence entre 0,001 et 80%, de composé insecticide. Les proportions et pourcentages employées ou décrits dans ce texte sont des proportions ou pourcentages en poids.
Par le terme support, dans le présent exposé, on désigne une matière organique ou minérale, naturelle ou synthétique, avec laquelle la matière active est associée pour faciliter son application, notamment sur la plante, ou encore sur des graines ou sur le sol. Ce support est donc généralement inerte et il doit être acceptable en agriculture,
notamment par la plante traitée. Le support éventuellement mis en #uvre pour la formulation de compositions selon l'invention peut être solide ou liquide.
Pour les composés A11, Gll, 801,803, 804,805, CV1-80, CV1-81, CV1-84, CV1-85, CV1-93, CV1-122, CV1-123 et CV1-135, on utilise du chloroacétonitrile.
Pour les composés 806 et CV1-97, on utilise du bromo ou du chloroacétate d'éthyle ou de méthyle.
Pour les composés H4, H10 et 807, on utilise du bromo ou du chloroacétamide.
Pour le composé 808, on utilise du bromure ou du chlorure de propargyle.
Concernant le composé CV1-135, il est obtenu selon un mode opératoire particulier, tel que décrit ci-après : r # On dissout dans l'acétonitrile le 4-bromobenzonitrile de formule : NC Br ainsi que le catalyseur PdCl2(PPh3)2, de l'iodure de cuivre Cul, la base NEt3 et du phénylacétylène. Le milieu réactionnel est chauffé pendant une nuit à 50-60 C. On évapore en fin de réaction et on purifie par chromatographie sur colonne de silice.
Ce mode opératoire correspond au schéma réactionnel suivant :
II - Mode de préparation des composés de la famille II : Le 5-phényl 2-benzylaminothiazole est obtenu au départ du 5-phényl-2aminothiazole par condensation avec le benzaldéhyde, suivie d'une hydrogénation. Le composé obtenu et ensuite alkylé par le chloroacétonitrile (voir mode opératoire I).
Le composé F3 est obtenu selon le schéma réactionnel suivant :
A une solution de 5-phényl-2-aminobenzylthiazole (1 éq) dans le DMF refroidi à 0 C est ajouté du NaH (1,3 éq). Le milieu réactionnel est-agité pendant 15 minutes puis le chloroacétonitrile (1 éq) est ajouté gouttes à gouttes. L'agitation est poursuivie à température ambiante pendant 8 heures, la solution est ensuite diluée par l'eau. Après extraction à l'acétate d'éthyle, la phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre et est évaporée. Le brut réactionnel est purifié par chromatographie sur gel de silice (AcOEt 1/ Hexane 2).
On obtient donc ainsi par exemple le composé 809 : ((5-phényl-thiazol-2-yl)-JV-benzyl)acétonitrile C18H15N3S (305,40 g.mol-1) sous la forme d'une poudre beige, selon le schéma réactionnel suivant : RMN 1H (CDCl3, 200 MHz) : 4,42 (s, 2H) ; 4,70 (s, 2H) ; 7,30-7,51 (m, 11H)
DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L'INVENTION Dans sa réalisation préférée, le développement de l'invention utilise l'ADNc codant pour la protéine fluorescente verte (Prasher et al., 1992) de la méduse aequorea victoria, préférentiellement les mutants EYFP, EGFP et ECPF de cette protéine optimisée pour leur expression dans les organismes hôtes préférés, les cellules mammifères.
L'ADNc peut être modifié pour coder pour un variant dans lequel un ou plusieurs acides aminés sont substitués, insérés ou délétés afin de permettre sa fusion, en N ou en C-terminal avec le gène codant pour un récepteur.
Le récepteur peut être choisi parmi : . 1) les récepteurs de neurotransmetteurs couplés à des protéines G structurellement reliés aux récepteurs adrénergiques et récepteurs métabotropiques du glutamate tels que présentés dans la liste actualisées annuellement et éditée dans les bases de données GPCRdb (http://www.gcrdb.uthscsa.edu ou http://www.gpcr.org), ensembl (http://www.ensembl.org) entre autres.
2) les récepteurs-canaux structurellement reliés aux récepteurs nicotiniques, aux récepteurs de glutamate et aux récepteurs de l'ATP, tels que présentés dans la liste actualisées annuellement et éditée dans les bases de données GPCRdb (http://www.gcrdb.uthscsa.edu ou http://www.gpcr.org), ensembl (http://www.ensembl.org) entre autres.
3) les récepteurs nucléaires possédant un domaine d'interaction avec l'ADN structurellement reliés au récepteur des stéroïdes (Mangelsdorf et al., 1995 ; et al., 1996).
4) les récepteurs de la membrane plasmique à activité tyrosine kinase structurellement reliés au récepteur de l'insuline (Yarden, Y. and Ullrich, A., 1988).
... RECEPTION DE L'ENSEMBLE D'IDENTITES DE COMPTES Il est possible que l'utilisateur ne connaisse pas l'ensemble des identités de comptes nécessaires aux commandes ultérieures. Cette fonction permet la transmission d'une requête pour une liste. Les administrateurs doivent
donner un nom d'utilisateur pour lequel ils veulent recevoir les identités de compte. Par exemple : Normalement, les utilisateurs non administrateurs ne donnent pas leur nom d'utilisateur puisque le serveur en dispose déjà dans la balise DTCRequest : Si un utilisateur non administrateur spécifie un nom d'utilisateur dtcUsername, il est rejeté avec un code d'erreur indiquant qu'il ne dispose pas de la permission.
La réponse à la requête précitée aurait l'aspect suivant : ActiQnslespons 'lActionsesponse> Le champ de marché est une énumération (définie dans le schéma) indiquant à quel marché appartient le compte.
RECUPERATION DES LISTAGES Pour que les caractéristiques d'un listage soient modifiées, l'utilisateur doit d'abord transmettre une requête de récupération du listage. Toute requête de listages est contenue dans la balise XML d'actions "Actions". La balise d'actions contient l'identité de comptes pour
toutes les requêtes et commandes contenues qui peuvent être transmises. L'identité de comptes est validée d'après la liste des identités de comptes pour un utilisateur normal.
Les administrateurs peuvent travailler sur n'importe quel ensemble d'identités de comptes.
Il est possible d'acquérir un ensemble de listages d'après certains critères ou, lorsqu'aucun critère n'est spécifié, tous les listages de l'identité de compte spéci- fiés sont obtenus. Le nombre maximal de listages renvoyés, lorsque l'attribut de nombre maximal n'est pas spécifié, est égal à 40. Lorsqu'aucun index initial n'est spécifié, la liste commence avec le résultat 1. Cette fonction par défaut ne donne pas le rang actuel pour chaque listage. Pour que ces informations soient obtenues, l'attribut indiquant l'inclusion du rang doit être spécifié avec une valeur élevée. On considère maintenant des exemples.
1) Recevoir tous les listages (jusqu'au nombre maximal) pour l'identité de comptes 12345.
2) Recevoir tous les listages jusqu'à un nombre maximal de 10 dont le terme de recherche contient "car" pour l'identité de compte 12345.
3) Recevoir tous les listages permis au maximum ayant une enchère comprise entre 0,05 et 0,10 avec l'information de rang actuel
D'autres critères valides de recherche comprennent : l'adresse URL le titre la description Les critères de recherche qui ne reposent pas sur l'enchère donnent un accord lorsque la chaîne est contenue dans le champ du listage de recherche. Les critères de recherche reposant sur l'enchère sélectionnent les listages dont l'enchère est supérieure ou égale à l'enchère spécifiée dans l'attribut d'enchère inférieure lowBid ou est inférieure ou égale à l'enchère spécifiée dans l'attribut d'enchère supérieure highBid.
Lorsque l'exécution est satisfaisante, la réponse obtenue est analogue à la suivante : L'identité de listages doit être utilisée pour se référer à une adresse de ligne particulière lors du change- ment de caractéristiques avec une requête d'établissement de listages (décrite dans la suite).
OBTENTION DE L'ETAT DU MARCHE La fonction d'obtention de l'état du marché GetMarketStat est destinée à donner un instantané de l'état actuel du terme de recherche particulier. Ceci peut être utile pour l'observation des différences d'enchère entre les rangs différents afin que l'enchère puisse être changée de manière correspondante. La fonction comporte une identité de marché (nécessaire) et un terme de recherche (nécessaire) et renvoie l'état de marché tel qu'indiqué par le site du client "Overture". Par exemple, la demande porte sur les listages actuels classés de 1 à 5 sur le marché des Etats- Unis d'Amérique et le terme de recherche "cars".
La réponse est analogue à la réponse suivante.
bid="0.37" currency=",1SD" l> ETABLISSEMENT DE L'ENCHERE POUR UN LISTAGE Dans un mode de réalisation, l'interface XML ne permet que des changements d'enchères fixes en une seule fois pour un listage particulier. D'autres modes de réalisation permettent la modification d'autres champs, d'autres comportements des enchères, etc.
Pour le changement de l'enchère, l'utilisateur place une balise d'action avec le numéro de compte qui contient le listage ou les listages à changer. L'attribut d'identité de comptes est validé après le nom d'utilisateur et le mot de passe donnés dans les étapes précédentes. Dans la balise d'établissement de listages, l'identité de listage, donnée dans la réponse d'obtention de listage, est spécifiée.
Cette matière colorante est généralement présente à raison de 0,01 à 45 % du poids total de la composition, de préférence de 2 à 30 % et mieux de 5 à 20 %.
Les colorants liposolubles sont, par exemple, le rouge Soudan, le DC Red 17, le DC Green 6, le P-carotène, l'huile de soja, le brun Soudan, le DC Yellow 11, le DC Violet 2, le DC orange 5, le jaune quinoléine. Ils peuvent représenter de 0 à 20 % du poids de la composition et mieux de 0,1 à 6 %.
Les pigments peuvent être blancs ou colorés, minéraux et/ou organiques, enrobés ou non. On peut citer, parmi les pigments minéraux, le dioxyde de titane, éventuellement traité en surface, les oxydes de zirconium ou de cérium, ainsi que les oxydes de fer ou de chrome, le violet de manganèse, le bleu outremer, l'hydrate de chrome et le bleu ferrique. Parmi les pigments organiques, on peut citer le noir de carbone, les pigments de type D & C, et les laques à base de carmin de cochenille, de baryum, strontium, calcium, aluminium. Les pigments peuvent représenter de 0 à 45 % du poids total de la composition, et mieux de 2 à 25%.
Les pigments nacrés peuvent être choisis parmi les pigments nacrés blancs, tels que le mica recouvert de titane ou d'oxychlorure de bismuth, les pigments nacrés colorés tels que le mica titane avec des oxydes de fer, le mica titane avec notamment du bleu ferrique ou de l'oxyde de chrome, le mica titane avec un pigment organique du type précité, ainsi que les pigments nacrés à base d'oxychlorure de bismuth. Ils peuvent représenter de 0 à 25 % du poids total de la composition et mieux de 0,1à 20 %.
La composition selon l'invention peut se présenter sous forme de solution, de dispersion ou d'émulsion. Lorsque c'est une émulsion, elle peut se présenter
sous forme d'une émulsion huile-dans-eau (H/E) ou eau-dans-huile (E/H) ou d'une émulsion multiple.
On entend ici par émulsion aussi bien des dispersions sans émulsifiants que des dispersions comportant des émulsionnants ou encore des dispersions stabilisées par des particules solides ou par des sphérules lipidiques de type ionique ou non ionique.
Les émulsionnants sont choisis parmi les émulsionnants amphotères, anioniques, cationiques ou non ioniques, utilisés seuls ou en mélange. Ils sont choisis de manière appropriée suivant l'émulsion à obtenir : émulsions eau-dansl'huile (E/H) ou huile-dans-eau (H/E).
Pour les émulsions huile-dans-eau (H/E), on peut citer par exemple les émulsionnants suivants: * comme émulsionnants amphotères, les N-acyl-aminoacides tels que les N- alkylaminoacétates et le cocoamphodiacétate disodique et les oxydes d'amines tels que l'oxyde de stéaramine; * comme émulsionnants anioniques, les acylglutamates tels que le "disodium hydrogenated tallow glutamate" (Amisoft HS-21# commercialisé par la société AJINOMOTO) ; acides carboxyliques et leurs sels tels que le stéarate de sodium ; les esters phosphoriques et leurs sels tels que le "DEA oleth-10 phosphate" ; les sulfosuccinates tels que le "Disodium PEG-5 citrate lauryl sulfosuccinate" et le "Disodium ricinoleamido MEA sulfosuccinate" ; * comme émulsionnants cationiques, les alkyl-imidazolidinium tels que l'éthosulfate d'isostéaryl-éthylimidonium ; les sels d'ammonium tels que le chlorure de N,N,N-triméthyl-l-docosanaminium (Behentrimonium chloride); * comme émulsionnants non ioniques, les esters et éthers d'oses tels que le stéarate de sucrose, le cocoate de sucrose, et le mélange de stéarate de sorbitan et de cocoate de sucrose commercialisé par la société ICI sous la dénomination Arlatone 2121 ; les esters de polyol, notamment de glycérol ou de sorbitol, tels que le stéarate de glycéryle, le stéarate de polyglycéryl-2, le stéarate de sorbitan ; les éthers de glycérol ; les éthers oxyéthylénés et/ou oxypropylénés, tels que l'éther oxyéthyléné, oxypropyléné de l'alcool laurique à 25 groupes oxyéthylénés et 25 groupes oxypropylénés (nom CTFA "PPG-25
Iaureth-25") et l'éther oxyéthyléné du mélange d'alcools gras en C12-C15 comportant 7 groupes oxyéthylénés (nom CTFA " C12-C15 Pareth-7") ; les polymères d'éthylène glycol, tels que le PEG-100, et leurs mélanges.
On peut utiliser un ou plusieurs de ces émulsionnants.
Pour les émulsions eau-dans-huile (E/H), on peut citer comme exemple d'émulsionnants, les esters gras de polyol, notamment de glycérol ou de sorbitol, et notamment les esters isostéariques, oléiques et ricinoléiques de polyol, tels que le mélange de petrolatum, d'oléate de polyglycéryl-3, d'isostéarate de glycéryle, l'huile de ricin hydrogénée et d'ozokérite, vendu sous la dénomination Protegin W# par la société GOLDSCHMIDT, l'isostéarate de sorbitan, le di-isostéarate de polyglycéryle, le sesqui-isostéarate de polyglycéryle-2 ; les esters et éthers d'oses tels que le "Methyl glucose dioléate" ; les esters gras tels que le lanolate de magnésium ; les diméthicone copolyols et alkyl-diméthicone copolyols tels que le laurylméthicone copolyol vendu sous la dénomination Dow Coming 5200 Formulation Aid par la société DOW CORNING et le Cétyl diméthicone copolyol vendu sous la dénomination Abil EM 90 par la société GOLDSCHMIDT ; et leurs mélanges.
Les émulsionnants peuvent être introduits tels quels ou sous forme de mélange avec d'autres émulsionnants et/ou avec d'autres composés tels que des alcools gras ou des huiles.
La nature de la phase huileuse de la composition de l'invention n'est pas critique et peut comprendre au moins une des huiles citées plus haut, ainsi que des corps gras, autres que les huiles, choisis parmi les acides gras et les alcools gras, les cires et leurs mélanges. La phase huileuse représente de préférence 1 à 70 % en poids du poids total de la composition.
Les alcools gras sont par exemple l'alcool stéarylique, l'alcool cétylique et l'alcool cétéarylique.
Pour les cires utilisées, on citera plus particulièrement celles ayant un point de fusion de 30 à 140 C et mieux 40 à 140 C comme la cire d'abeille, la cire de carnauba, l'ozokérite, les cires de polyéthylène, les cires microcristallines et les cires de silicone.
Le promoteur peut être n'importe quelle séquence d'ADN susceptible de promouvoir une activité transcriptionnelle dans la cellule hôte choisie et peut être dérivé de gène homologues ou hétérologues à la cellule hôte.
Des exemples de promoteurs convenant pour l'expression du récepteur fusionné avec le GFP ou du ligand fusionné avec la GFP dans des cellules mammifères sont le
promoteur du virus simien SV40 (Subramani et al., 1981), le promoteur du virus du sarcome de Rous (RSV), le promoteur du cytomegalovirus (CMV) ou le promoteur tardif majeur de l'adéno virus (AdMLP).
Exemples de promoteurs pour cellules d'insectes : Promoteur de la polyhédrine (US 4,745,051 ; Vasuvedan et al., 1992) le promoteur P10 (Vlack et al., 1988), le promoteur du gène précoce 1 du baculovirus (US 5,155,037 ; US 5,162,222).
Exemples de promoteurs pour levures : Promoteurs des gènes de la glycolyse (Hitzeman et al., 1980 ; Alber et Kawasaki, 1982), des gènes des alcool deshydrogénases (Young et al., 1982).
Exemples de promoteurs pour bactéries : Des exemples de promoteurs pour l'expression dans la bactérie peuvent être des promoteurs constitutifs comme le promoteur de la polymérase T7, ou des promoteurs inductibles comme par exemple le promoteur pL du phage lambda (Current Protocols in Molecular Biology, op.cit.).
Exemples de promoteurs pour champignons filamenteux : Les promoteurs utilisables sont par exemple le promoteur ADH3 (McKnight et al., 1985) ou le promoteur tpiA. D'autres promoteurs utiles peuvent être dérivés des gènes codant pour l'aspartate protéinase de Rhizomucor miehei, l'alpha-amylase neutre de Aspergillus niger, de l'acétamidase de Aspergillus nidulans, de la TAKA amylase de Aspergillus oryzae ou le promoteur de la glucoamylase de Aspergillus awamori.
Le vecteur pourra par ailleurs contenir : - des séquences de polyadénylation, comme par exemple celles de SV40 ou de la région Elb 5 de l'adénovirus, - des séquences activatrices (enhancer) de la transcription (l'activateur de SV40), - des séquences de réplication comme par exemple les séquences de réplication de SV40 ou du virus Epstein Barr, pour les cellules mammifères ou l'origine et les gènes de réplication REP 1-3 du plasmide 2 , pour les levures, - des marqueurs de sélection, à savoir des gènes conférant une résistance à un antibiotique (néomycine, zéocine, hygromycine, ampicilline, kanamycine, tétracycline,
chloramphénicol...) ou permettant la compensation d'un défaut (gène codant pour la dihydrofolate réductase permettant la résistance au méthotrexate, ou gène TPI de S. pombe décrit par Russell (1985).
La cellule hôte peut être n'importe quelle cellule capable d'exprimer la construction d'ADN insérée dans un vecteur approprié.
Les cellules peuvent être notamment des bactéries, des levures, des champignons et des cellules eucaryotes supérieures comme par exemple des cellules mammifères.
Des exemples de cellules bactériennes capables d'exprimer les constructions d'ADN sont : - des bactéries gram-positives telles que les souches de Bacillus comme B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. strearothermophilus, B. thurigiensis ou des. souches de Streptomyces comme S. lividans, S murinus, - des bactéries gram-négatives telles Escherichia coli.
La transformation des bactéries peut être effectuée par transformation protoplastique ou par transformation de bactéries compétentes (Current Protocols in Molecular Biology, op.cit.).
Exemples de cellules eucaryotes : Lignées cellulaires HEK 293, HeLa, cultures primaires, cellules COS (par exemple ATCC CRL 1650), BHK (par exemple ATCC CRL 1632) CHO (par exemple ATCC CCL 61).
Les méthodes d'introduction de l'ADN dans ces cellules (transfection, lipofection, électroporation etc. ) sont décrites dans Current Protocols in Molecular Biology, op.cit.
Exemples de cellules de levures : Saccharomyces, S. cerevisiae, S. kluyveri, Kluiveromyces, K. lactis, Hansenula, H. polymorpha, Pichia, P. pastoris, transformées par introduction d'ADN hétérologue selon les protocoles décrits dans Current Protocols in Molecular Biology, op.cit.
Les cellules transformées sont sélectionnées par un phénotype déterminé par un marqueur de résistance, généralement à une drogue, ou par leur capacité à proliférer en l'absence d'un nutriment particulier.
Exemples de champignons filamenteux : Les souches Aspergillus (A. oryzae, A. nidulans, A. niger), Neurospora, Fusarium, Trichoderma. L'utilisation de Aspergillus pour l'expression de protéines est décrite dans EP 272 277 ou EP 230 023 ou EP 184 438.
Exemples de cellules d'insectes : On peut citer les lignées de Lepidoptera e. g. Spodoptera frugiperda (Sf9) ou Trichoplusia ni (Tni). Les méthodes de transformation (infection en particulier) sont décrites dans Current Protocols in Molecular Biology (op.cit.).
LES LIGANDS Les ligands interagissant avec le récepteur peuvent être de n'importe quelle origine (naturelle, synthétique, semi-synthétique, recombinante), et de n'importe quelle structure (chimique, peptidique, protéique). Ils peuvent être naturellement fluorescents (ou porteurs d'un chromophore) ou peuvent nécessiter soit une réaction chimique permettant le greffage d'un groupe fluorescent (ou d'un précurseur de groupe fluorescent) ou d'un chromophore, soit une construction d'ADN conduisant à la fusion du ligand avec la GFP et permettant l'expression du ligand ainsi rendu fluorescent.