INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de l'obtention de la protéine MabA recombinante, et des protéines MabA C (60)V, et C (60)V / S (144)L, forme purifiée, de leurs propriétés enzymatiques, ainsi que des cristaux de ces protéines et de leurs coordonnées atomiques.
PARTIE EXPERIMENTALE La tuberculose, maladie infectieuse provoquée par Mycobacterium tuberculosis, demeure la cause majeure de mortalité dans le monde due à un agent infectieux unique. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé, 8 millions de cas de tuberculose apparaissent chaque année, résultant dans 3 millions de décès (Dolin et al., 1994). Alors qu'elle a toujours posé un grave problème de santé publique dans les pays en voie de développement, la tuberculose réapparaît dans les pays développés. Les conditions précaires de certains groupes dans la société et la détérioration des systèmes de santé, conséquences de la crise économique mondiale, ont favorisé cette recrudescence de la tuberculose. De même, l'endémie de l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et l'apparition de souches de M. tuberculosis résistantes à un ou plusieurs antibiotiques ont aussi fortement contribué à ce phénomène (Barnes et al., 1991).
L'émergence de la tuberculose multi-résistante, définie comme la résistance aux deux antibiotiques qui sont à la base du traitement antituberculeux, isoniazide (Rimifon, INH) et rifampicine (RMP), est une menace pour le contrôle de la tuberculose. Les patients infectés par les souches résistantes à plusieurs antibiotiques sont extrêmement difficiles à soigner et le traitement nécessaire est toxique et coûteux. Jusqu' à 30% de l' ensemble des isolats cliniques de
M. tuberculosis résistants le sont à l'isoniazide (Cohn et al., 1997). Il est donc important de mieux comprendre les mécanismes de résistance à l'isoniazide mis en place par les mycobactéries afin de pouvoir, d'une part, élaborer des techniques rapides permettant la détection des résistances et, d'autre part, développer de nouveaux agents anti-mycobactériens qui soient efficaces contre les souches résistantes.
A partir de nombreux travaux réalisés sur l'isoniazide, une cible directe de cet antibiotique a pu être identifiée : s'agit d'un métabolisme spécifique des mycobactéries, la biosynthèse des acides mycoliques [(Winder & Collins, 1970); (Takayama et al., 1972); (Quémard et al., 1991) ].
Ces acides gras à très longue chaîne sont des constituants majeurs et caractéristiques de l'enveloppe mycobactérienne. Grâce à l'utilisation des outils de biologie moléculaire chez M. tuberculosis, une cible moléculaire de l'isoniazide, la protéine InhA, impliquée probablement dans la voie de biosynthèse des acides mycoliques a été caractérisée [(Banerjee et al., 1994); (Quémard et al., 1995) ]. InhA appartient à un système enzymatique responsable de l'élongation des acides gras (Marrakchi et al., 2000). Ce système contenant la protéine InhA, cible de l'isoniazide, participe à la biosynthèse des acides mycoliques et représente de ce fait un complexe enzymatique dont les composantes sont intéressantes à étudier, en tant que cibles potentielles de nouveaux antibiotiques antituberculeux. Nous avons donc étudié les propriétés biochimiques de MabA, une des protéines du complexe contenant InhA. La modélisation moléculaire de la structure tridimensionnelle de cette protéine, qui catalyse la réduction de dérivés p-cétoacyles, a montré que MabA et InhA font partie de la même famille structurale. L'étude de l'effet de l'isoniazide sur l'activité enzymatique de MabA suggère que l'antibiotique inhibe la protéine par un mécanisme similaire à l' action sur InhA. Ainsi, MabA représente une cible intéressante pour la conception d'inhibiteurs de la biosynthèse d'acides gras chez les mycobactéries.
Dans le cadre des travaux de la présente invention, le gène mabA de M. tuberculosis a été cloné chez E. coli, dans un vecteur d'expression. La protéine est produite en grande quantité par cette souche recombinante, en tant que protéine de fusion possédant une étiquette poly-Histidine en N-terminal. La purification de la protéine est effectuée en une seule étape par chromatographie sur colonne, donnant plusieurs mg de protéine purifiée. Un monomère sauvage de MabA possède 247 acides aminés et a une taille de 25,7 kDa ; le monomère de fusion est de 27,7 kDa. Plusieurs méthodes expérimentales (ultracentrifugation analytique, perméation sur gel, diffusion de la lumière, cristallographie...) nous ont permis de montrer que la protéine native était
principalement tétramérique, provenant de l'auto-association de deux dimères. Des propriétés physico-chimiques (stabilité dans différents milieux tampons, à différentes températures, spectres d'émission de fluorescence...) et les principales propriétés enzymatiques de MabA (Kd, Km et kcat pour le coenzyme et des substrats -ss-cétoacyl-CoA- de différentes longueurs de chaîne) ont été déterminées. La protéine recombinante purifiée est fonctionnelle ; c'est une ss-cétoacyl réductase, NADPH-dépendante, et spécifique de substrats à longue chaîne (C12-C20). Nous avons montré que MabA faisait partie du système d'élongation d'acide gras mycobactérien, FAS-II, et catalyse la 2ème étape du cycle d'élongation.
La structure tridimensionnelle de la protéine MabA a été résolue par cristallographie à 2,05 de résolution après mise au point des conditions de cryostabilisation des cristaux. MabA fait partie de la super-famille structurale des protéines SDR (Short-Chain Reductases) ou RED (Reductases, Epimerases, Dehydrogenases). Elle est homologue aux KARs (ketoacyl-ACP reductases), mais représente un membre particulier de cette famille, par la structure de la poche de fixation du substrat. Celle-ci a un caractère plus hydrophobe que celle des protéines homologues. La présence du résidu tryptophane unique dans la poche de fixation du substrat nous a permis de réaliser des expériences de spectroscopie de fluorescence, qui ont mis en évidence une affinité plus marquée de MabA pour des substrats à longue chaîne (C8-C20) par rapport au substrat en C4. Ces résultats, qui corrèlent avec les données de cinétique enzymatique, mettent en évidence une relation structure-fonction entre l'hydrophobicité du site de fixation du substrat et l'affinité de MabA pour des substrats inhabituellement longs chez les bactéries.
Les propriétés distinctes de MabA par rapport aux autres protéines homologues en font une cible de choix pour la conception d'antibiotiques potentiels. Cette conception va faire appel à plusieurs démarches parallèles : 1. la conception rationnelle à partir d'inhibiteurs connus de MabA ou de protéines homologues 2. le criblage à haut débit de chimiothèques virtuelles 3. le criblage à haut débit de chimiothèques réelles.
Nous avons montré que l'activité de MabA était inhibée in vitro par un adduit INHNADP (H). Ce mécanisme d'action de l'isoniazide (INH) sur MabA est similaire au mécanisme d'action de l'isoniazide sur la protéine InhA, cible de l'INH. D'autres protéines faisant partie de la super-famille des RED ont une structure tridimensionnelle comparable à celle de MabA, dont une stéroïde deshydrogénase (PDB1HSD), des tropinone réductases (ex : PDB1AE1), une
trihydroxynaphthalène réductase (PDB1YBV) et une mannitol deshydrogénase (PDB1H5Q).
Ainsi, la démarche (1) est basée sur l'utilisation de la structure des ligands (ex : dérivés de l'isoniazide, stéroïdes) de ces différentes protéines pour la conception d'autres inhibiteurs potentiels de MabA, de structures dérivées. La conception rationnelle implique bien-sûr l'utilisation de la structure cristalline de MabA et de la méthode de docking moléculaire assistée par ordinateur. De la même manière, si les démarches (2) et (3) apportent de nouveaux types de ligands potentiels, ceux-ci pourront être la base de nouvelles conceptions rationnelles.
L'invention procure donc une démarche conceptuelle pour le développement d'inhibiteurs de l'activité de la protéine MabA. D'autre part, elle offre une méthode de validation expérimentale d'une part, de la fixation spécifique de ces molécules au site actif de MabA (spectroscopie de fluorescence) et d'autre part, du pouvoir inhibiteur de ces molécules par un test enzymatique simple (cinétique enzymatique par suivi par spectrophotomètrie).
I) ETUDE DE LA PROTEINE MABA Nous avons montré que le système d'élongation FAS-II contient la protéine InhA, une cible de l'isoniazide. De plus, le fait que ce, système soit vraisemblablement impliqué dans la biosynthèse des acides mycoliques, composés spécifiques des mycobactéries, fait de FAS-II une cible de choix pour des agents anti-mycobactériens. L'étude des enzymes qui composent ce système est donc une approche intéressante pour rechercher de nouvelles cibles d'antibiotiques.
La forte inhibition de l'activité de FAS-II par l'isoniazide, et surtout le fait qu'aucun intermédiaire de biosynthèse, et en particulier les substrats de InhA, ne s'accumulent sous l'effet de l'INH suggèrent qu'il pourrait exister une autre cible de l'antibiotique en plus de InhA. La protéine MabA, codée par un gène contigu à inhA sur le chromosome de M. tuberculosis, fait probablement partie du même système enzymatique que InhA. Plusieurs données laissent supposer que MabA pourrait être une cible de l'isoniazide. D'une part, des mutations ponctuelles dans la région promotrice du locus mabA-inhA d'isolats cliniques de M. tuberculosis entraînent la surproduction des protéines en aval et corrèlent avec un phénotype de résistance à l'INH. Ceci suggère qu'en plus de la surproduction de InhA, induite par ces mutations, la surproduction de MabA pourrait également participer à la résistance, si cette protéine interagit avec l'isoniazide.
N1248-1267 DRBl*0101, 1501, 0401, 0404 1101, 1302,0701,0802,0901 N1248-1261 DRB1*0101, 15 01, 0401, 0404,
0405, 1101, 1302,0802,0901
N1253-1272 DRB1*0101, 0401, 1101, 701, 1501,
1302,0802,0901 N 1388-1407 AUCUN
N1450 1469 AUCUN
Dans l'article aux noms de Diepolder et al.. précité, les Auteurs ont en effet étudié pour 5 peptides de la protéine NS3. la capacité à lier des molécules HLA II fréquemment rencontrées. De fait. ils ont montré que l'épitope NS3 1248-1261 ou des peptides variants (1242-1261 et 1248-1267) présentent une capacité de liaison pour 9 à 10 allèles HLA-DR à savoir : DRB1*0101. 1501. 0401, 0404, 0405, 110 1, 1302, 0802, 0901 et DRB5*0101. En revanche. les peptides 1388-1407 et 1450-1469 sont inactifs.
Dans l'article de Lamonaca et al.. précité, les Auteurs ont également montré, par des tests de liaison, que le peptide Core 21-40 se lie à DRB 1 * 1501 et que le peptide NS3 1253-1272 se lie à DRBI*0101. 0401, 1101. 701, 1501, 1302, 0802, 0901.
Il ressort de ce qui précède qu'aucun peptide du VHC se liant aux molécules HLA II les plus fréquemment rencontrées dans la population caucasienne, n'a été identifié pour la protéine C qui est la plus conservée et donc particulièrement adaptée à la vaccination contre les différents génotypes du VHC. En outre, parmi les peptides de la protéine NS3 ayant une activité de stimulation de lymphocytes T qui ont été étudiés, un seul peptide se lie aux molécules HLA II les plus fréquemment rencontrées dans la population caucasienne.
Il existe un nombre important de molécules HLA II dont la répartition n'est pas homogène dans le monde. Ainsi. dans une population donnée un ensemble d'allèles regroupe à lui seul l'essentiel des allèles de la population. Par exemple en France qui est une population caractéristique de la population caucasienne (USA, Europe), seuls 7 allèles du locus DRB1 dépassent les 5 %. Il s'agit des allèles DRBI*0101, DRBI*0301, DRBl*0401. DRB1*0701, DRBl*1101, DRBl*1301 et DRB 1 * 1501 qui représentent à eux seuls 64% de la population. Ces mêmes allèles sont les plus abondants allèles HLA-DR dans les autres populations caucasiennes.
Leur fréquence varie entre 53% (en Espagne) à 82% (au Danemark). Pour les EtatsUnis et le Canada, ils représentent respectivement 58 et 55% des allèles de la population. Les molécules HLA-DRB3. -DRB4 et DRB5 qui sont des molécules HLA-DR dont la chaîne p n'est pas codée par le gène DRB 1 sont présentes également avec des fréquences alléliques importantes. car elles sont moins polymorphes que les molécules DRB1. Leur fréquence allélique est en effet de 9. 2% pour DRB3*0101,
28,4% pour DRB4*0101 et 7,9% pour DRB5*0101. Elles couvrent donc à elles seules 45% de la fréquence allélique. Enfin, les molécules HLA-DP4 qui regroupent les molécules codées par les allèles DPB 1 *0401 et DPB 1 *0402 sont les molécules HLA II les plus abondantes en Europe et aux Etats-Unis. Leur fréquence allélique est en effet de 40 % et #1 % respectivement, ce qui signifie qu'elles sont l'une ou l'autre trouvées chez environ 76% des individus. Les peptides présents dans une séquence peptidique et qui lient l'ensemble de ces allèles inclus donc les épitopes T de la majorité de la population.
C'est pourquoi les Inventeurs se sont donnés pour but de pourvoir à un ensemble de peptides aptes à être incorporés dans une composition immunogène et à stimuler des lymphocytes T CD4+ anti-VHC, chez la majorité des individus cauca- siens européens ou d'Amérique du Nord, pour induire effectivement une réponse proliférative spécifique contre des composants du virus.
Un tel ensemble a pour propriété d'être efficace chez un grand nombre de sujets, alors que les peptides de l'art antérieur sont actifs chez quelques individus et sont inactifs chez la majorité des autres individus, parce que ces derniers ne reconnaissent pas les protéines du VHC par les mêmes déterminants.
Pour ce faire, les Inventeurs ont identifié les séquences de peptides issus des protéines C et NS3 du VHC restreints aux molécules HLA II prépondérantes dans les populations caucasiennes et ils ont montré que les peptides issus de la protéine C, de préférence associés à des peptides issus de la protéine NS3, induisent effectivement une réponse immunogène et protectrice chez un grand nombre d'individus.
En outre, ces peptides qui reconnaissent des lymphocytes T spécifiques d'HCV chez les patients infectés, sont utiles pour le diagnostic de l'état immunitaire de ces patients vis-à-vis du virus de l'hépatite C.
La présente invention a en conséquence pour objet un mélange de peptides, caractérisé en ce qu'il inclut au moins deux peptides différents issus du virus de l'hépatite C (VHC). dont l'un au moins est un peptide issu de la protéine C, se liant à au moins quatre molécules HLA II différentes dont la fréquence allélique est supérieure à 5 % dans la population caucasienne, avec une activité de liaison < 1000 nM.
Selon un troisième aspect particulier d'un hétérocomplexe immunogène de l'invention, dans lequel la molécule protéique porteuse induit à la fois la production de lymphocytes T auxiliaires ( T helper ) lymphocytes T cytotoxiques et de lymphocytes B spécifiques de la molécule protéique porteuse, ladite molécule protéique porteuse (ii) est choisie parmi les protéines CEA, p53, Di12, CaSm, OSA et ETS2.
Selon un quatrième aspect particulier d'un produit immunogène de l'invention, dans lequel la molécule protéique porteuse induit, outre la différenciation de lymphocytes T auxiliaires ( T helper ) la production d'anticorps dirigés contre la molécule protéique porteuse, ladite molécule protéique porteuse (ii) est choisie parmi les protéines Bet v 1, Der p 1 et Fel d 1.
Dans un produit immunogène de l'invention, les hétérocomplexes protéiques immunogènes préférés sont choisis parmi les hétéro complexes suivants, dans lesquels les protéines antigéniques (i), d'une part et la molécule porteuse protéique (ii), d'autre part, sont respectivement : a) (i) IL-4 et (ii) KLH ; b) (i) interféron alpha et (ii) KLH ; c) (i) VEGF et (ii) KLH ; d) (i) IL-1 0 et (ii) KLH ; e) (i) interféron alpha et (ii) gp160 de VIH1 f) (i) IL-4 et (ii) l'antigène allergène Bet v 1 ; g) (i) le VEGF et (ii) la protéine E7 d'un Papillomavirus. h) (i) la protéine Tat inactivée de VIH1 et (ii) la protéine gp 120 de VIH1.
Procédé de préparation d'un produit immunogène comprenant des hétérocomplexes protéiques immunogènes de l'invention
L'invention a encore pour objet un procédé de préparation d'un produit immunogène comprenant des hétérocomplexes immunogènes tels que définis ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) incuber les protéines antigéniques (i) et la molécule porteuse (ii) dans un rapport molaire (i) : (ii) de 5::1 à 50::1, en présence d'un agent chimique de liaison; b) récupérer le produit immunogène comprenant les hétérocomplexes immunogènes préparé à l'étape a); De préférence, l'agent chimique de liaison est le glutaraldéhyde.
De manière tout à fait préférée, le procédé est en outre caractérisé en ce que l'étape a) est suivie d'une étape de stabilisation du produit comprenant les hétérocomplexes immunogènes par le formaldéhyde, préalablement à l'étape b) de récupération des hétérocomplexes.
De préférence, lorsque le glutaraldéhyde est utilisé comme agent chimique de liaison, il est présent dans le milieu réactionnel de couplage à une concentration finale comprise entre 0,02 M et 0,03M, de préférence à la concentration finale de 0,026M.
La réaction de couplage avec le glutaraldéhyde est avantageusement réalisée, pendant 20 minutes à 60 minutes de préférence 30 minutes, à température allant de 20 à 25 C.
Après l'étape de couplage, le glutaraldéhyde en excès est éliminé, par exemple par dialyse à l'aide d'une membrane de dialyse ayant un seuil de coupure de 3 kDa. L'étape de dialyse est avantageusement réalisée à 4 C, dans un tampon ajusté à pH 7,6.
Pour stabiliser le produit comprenant les hétérocomplexes protéiques préparer à l'étape a), ledit produit peut être traité en solution par le formaldéhyde, par exemple par du formaldéhyde à la concentration finale de 3 mM. La réaction de stabilisation a avantageusement une durée comprise entre 12 et 48 heures, de préférence entre 20 et 30 heures et est de manière tout à fait préférée d'une durée de 24 heures. La réaction de stabilisation par le formaldéhyde est avantageusement stoppée par addition de glycine, de préférence à la concentration de 0,1 M, pendant 1 heure et à une température comprise entre 20 et 25 C.
Les compositions comprenant un produit immunoqène comprenant des hétérocomplexes protéiques immunogènes de l'invention La présente invention a aussi pour objet une composition comprenant un produit immunogène tel que défini ci-dessus.
L'invention est également relative à une composition pharmaceutique comprenant un produit immunogène protéique tel que défini ci-dessus.
L'invention a encore pour objet une composition immunogène caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un produit immunogène tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Elle a également trait à une composition vaccinale caractérisée en ce qu'elle comprend, à titre de principe actif, un produit immunogène tel que défini ci-dessus, en association avec un ou plusieurs excipients physiologiquement compatibles.
Selon les objectifs poursuivis, on utilise des adjuvants systémiques ou des adjuvants mucosaux. Par exemple, on utilise de préférence un adjuvant mucosal pour prévenir les cancers des tissus épithéliaux et on utilise de préférence des adjuvants systémiques pour prévenir ou traiter les infections par des virus, tels que par HIV1 et HTLV1, ou encore pour prévenir ou traiter les allergies.
L'huile volatile peut être présente dans la composition selon l'invention en une teneur allant de 0,1 % à 60 % en poids, de préférence de 0,1 % à 30 % en poids par rapport au poids total de la composition.
dénominations Miglyol 810,812 et 818 par la société Dynamit Nobel, - les éthers de synthèse ayant de 10 à 40 atomes de carbone ; - les hydrocarbures linéaires ou ramifiés, d'origine minérale ou synthétique tels que la vaseline, les polydécènes, le polyisobutène hydrogéné tel que le parléam, le squalane, et leurs mélanges; - les esters de synthèse comme les huiles de formule R1COOR2 dans laquelle RI représente le reste d'un acide gras linéaire ou ramifié comportant de 1 à 40 atomes de carbone et R2 représente une chaîne hydrocarbonée notamment ramifiée contenant de 1 à 40 atomes de carbone à condition que R5 + R6 soit > 10, comme par exemple l'huile de Purcellin (octanoate de cétostéaryle), le myristate d'isopropyle, le palmitate d'isopropyle, le benzoate d'alcool en C12 à C15, le laurate d'hexyle, l'adipate de diisopropyle, l'isononanoate d'isononyle, le palmitate de 2-éthyl-hexyle, l'isostéarate d'isostéarate, des octanoates, décanoates ou ricinoléates d'alcools ou de polyalcools comme le dioctanoate de propylène glycol ; les esters hydroxylés comme le lactate d'isostéaryle, le malate de diisostéaryle ; et les esters du pentaérythritol ; - les alcools gras liquides à température ambiante à chaîne carbonée ramifiée et/ou insaturée ayant de 12 à 26 atomes de carbone comme l'octyl dodécanol, l'alcool isostéarylique, l'alcool oléique, le 2-hexyldécanol, le 2-butyloctanol, le 2undécylpentadécanol ; - les acides gras supérieurs tels que l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide linolénique ; et leurs mélanges.
ou toute séquence dérivée par dégénérescence du code génétique et codant pour la protéine C(60)V / S (144)L.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique recombinante comprenant la séquence nucléotidique codant pour la protéine MabA, ou comprenant une séquence nucléotidique codant pour une protéine dérivée de la protéine MabA, telles que définies ci- dessus, en association avec les éléments nécessaires à la transcription de cette séquence, notamment avec un promoteur et un terminateur de transcription.
L'invention a également pour objet tout vecteur, notamment plasmide, contenant une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne également les cellules hôtes transformées par un vecteur susmentionné, lesdites cellules étant choisies notamment parmi les bactéries telles que E. coli, ou tout autre micro-organisme utilisé pour la production de protéines.
L'invention a également pour objet un procédé de préparation de la protéine MabA recombinante sous forme purifiée, ou de protéines recombinantes dérivées de la protéine MabA, telles que définies ci-dessus, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - transformation de cellules à l'aide d'un vecteur recombinant susmentionné, @ - mise en culture des cellules ainsi transformées, et récupération desdites protéines produites par lesdites cellules, - purification desdites protéines selon le procédé décrit de purification décrit ci-dessus.
L'invention concerne également l'utilisation de la protéine MabA recombinante sous forme purifiée, ou de protéines recombinantes dérivées de la protéine MabA telles que définies ci-dessus, ou de cristaux susmentionnés, pour la mise en #uvre de méthodes de conception ou de criblage de ligands de la protéine MabA, et plus particulièrement de molécules susceptibles de se lier spécifiquement au niveau du site actif de la protéine MabA, et d'inhiber l'activité enzymatique de cette dernière.
L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée, de la protéine MabA recombinante sous forme purifiée, ou de protéines recombinantes dérivées de la protéine MabA telles que définies ci-dessus, ou de cristaux susmentionnés, pour la mise en #uvre de méthodes de conception ou de criblage de ligands de la protéine MabA susceptibles d'être utilisés dans des compositions pharmaceutiques, notamment dans le cadre du traitement de
pathologies liées à des infections mycobactériennes, telles que la tuberculose liée à l' infection par Mycobacterium tuberculosis, ou par Mycobacterium africanium, ou la lèpre liée à l' infection par Mycobacterium leprae, ou les mycobactérioses liées à l' infection par des mycobactéries opportunistes, telles que Mycobacterium avium, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium chelonae.