INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les conditions d'hybridations de fortes stringences décrites ci-dessus peuvent être adaptées par l'homme du métier pour les polynucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon les enseignements appropriés connus de l'homme du métier, notamment décrit dans Sambrook et al., (1989, Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor), Maniatis et al., 1982 (Molecular cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab. CSH, N. Y. USA ou l'une de ses récentes rééditions et dans Ausubel et al., Eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing and Wiley-Interscience, N.Y.) Par fragment nucléotidique , on entend d'une part tout fragment d'une séquence nucléotidique comprenant SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4 (et en particulier tout fragment de SEQ ID N 2 ou SEQ ID N 4), ou tout fragment de séquences homologues à ces séquences, lesdits fragments codant pour un peptide à activité
insecticide telle que définie précédemment. Ces fragments nucléotidiques présentent au moins 10 nucléotides, de préférence au moins 10,15, 30,45, 75,150, 300 nucléotides consécutifs de la séquence dont ils sont issus. Ces fragments nucléotidiques codent pour des peptides présentant une activité insecticide de préférence d'au moins 10,20, 30,50, 80,90%, voire plus de 100%, de l'activité insecticide des séquences SEQ ID N 3 et SEQ ID N 5 codées par les séquences à expression insecticide SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4. Pour tester cette activité insecticide, l'homme du métier dispose notamment de la méthode présentée dans les exemples détaillés décrits ci-après. Le présent document enseigne ainsi à l'homme du métier d'utiliser également les fragments ou les homologues définis précédemment, notamment d'utiliser les éléments fonctionnels de ces séquences qui déterminent l'expression insecticide, et donc de ne pas utiliser nécessairement les éléments non essentiels à cette expression. L'invention concerne ainsi selon un aspect les séquences nucléotidiques qui comprennent au moins un tel fragment et ont une activité insecticide.
Par fragments représentatifs selon l'invention on entend également des sondes ou amorces, qui peuvent être utilisées dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquences nucléiques. Ces procédés peuvent faire intervenir des techniques d'amplification du type PCR (décrite par exemple dans le document US 4,683,202) ou PCR like, comme par exemple les techniques connues de l'homme du métier SDA (Strand Displacement Amplification), TAS (Transcription-based Amplification System), NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification) LCR (Ligase Chain Reaction). Une sonde ou amorce se définit, au sens de l'invention, comme étant un fragment d'acide nucléique simple brin ou un fragment double brin dénaturé comprenant au moins 10 bases, de préférence au moins 15,30 bases, et possédant une spécificité d'hybridation dans des conditions déterminées pour former un complexe d'hybridation avec un acide nucléique cible.
De telles sondes seront en particulier utilisables dans des programmes de sélection assistée par marqueur, par exemple pour suivre l'intégration du gène de la toxine dans la plante transformée. Pour cela au moins une de ces sondes est marquée, par exemple par un isotope radioactif, puis mise en contact avec de l'ADN génomique de
la plante, préalablement digéré par des enzymes de restriction, dans des conditions permettant l'hybridation spécifique de la sonde marquée à l'ADN en question.
Par séquence nucléotidique modifiée, on entend toute séquence nucléotidique obtenue typiquement par mutagénèse selon des techniques appropriées, et comportant des modifications par rapport aux séquences nucléotidiques SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4, ou de séquences variantes (séquences nucléotidiques définies a) à e) précédemment) . Ces modifications peuvent entraîner selon une variante préférée une augmentation du niveau d'expression insecticide. On peut par exemple utiliser la mutagenèse dirigée site spécifique, décrite dans Upender et al., 1995, Biotechniques 18(1):29-30, ou des techniques de mutagénèse du type DNA shuffling décrite dans le document US 5 605 793. On peut par exemple obtenir des séquences mutées de SEQ ID N 2 et SEQ ID N 4, par délétions, et cribler des mutants actifs pour identifier des régions toutes particulièrement associées au niveau d'activité insecticide.
L'invention concerne selon un autre aspect un polypeptide insecticide codé par une séquence nucléotidique à expression insecticide telle que décrite précédemment.
L'invention concerne également les polypeptides choisis parmi : a) un polypeptide de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 ; b) un polypeptide homologue au polypeptide défini en a) comportant au moins 80 %, de préférence au moins 85 %, 87 %, 90 %, 95 % , 97 % 98 %, 99 % d'identité avec ledit polypeptide de a) ; c) un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence d'au moins 15,20, 23,25, 30,40, 50,100 amino-acides consécutifs d'un polypeptide défini en a), ou b); d) un polypeptide variant de polypeptide de séquences d'acides aminés défini en a), b), ou c) ; ledit polypeptide ayant une activité insecticide telle que décrite précédemment.
On emploie dans ce texte indifféremment le terme polypeptide insecticide ou toxine insecticide pour désigner un polypeptide selon l'invention ayant une activité insecticide (plus exactement biopesticide) telle que décrite précédemment. Le terme polypeptide est utilisé pour désigner également une protéine ou un peptide.
De préférence un polypeptide selon l'invention est un polypeptide constitué de la séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 ou d'une séquence possédant au moins 80 %
d'identité, de préférence au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % d'identité avec la SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 5 après alignement optimal. Par polypeptide dont la séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 85 %, 90 %, 95 %, 98 % et 99 % après alignement optimal avec une séquence de référence, on entend désigner les polypeptides présentant certaines modifications par rapport au polypeptide de référence, comme en particulier une ou plusieurs délétions, troncations, un allongement, une fusion chimérique, et/ou une ou plusieurs substitutions.
Par fragment de polypeptide, on entend désigner un polypeptide comportant au minimun 15 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 20,25, 30,40, 50,100 amino-acides consécutifs. Les fragments de polypeptide selon l'invention obtenus par clivage dudit polypeptide par une enzyme protéolytique, par un réactif chimique, ou encore en plaçant ledit polypeptide dans un environnement très acide font également partie de l' invention.
Dans le cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés consécutifs ou non consécutifs, peuvent être remplacés par des acides aminés équivalents .
L'expression acide aminé équivalent vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier les caractéristiques ou propriétés fonctionnelles essentielles souhaitées, en l'occurrence n'entraînant pas une perte de l'activité insecticide. Ces acides aminés équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les acides aminés auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité biologique croisée auxquels les différents polypeptides sont susceptibles de donner lieu. A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuées sans qu'il en résulte une modification approfondie des activités biologiques des polypeptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine, de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions. On entendra par polypeptide variant l'ensemble des polypeptides mutés pouvant exister naturellement, et qui correspondent notamment à des troncatures, substitutions, délétions et/ou additions de résidus d'amino-acides. Un
polypeptide variant, un polypeptide homologue ou un fragment de polypeptide selon l'invention possède au moins 10 %, de préférence au moins 20,30, 50, 80 , 90%, voire plus de 100,120, 150%, de l'activité insecticide des séquences SEQ ID N 3 et SEQ ID N 5.
La formulation détergente peut être mise en oeuvre, notamment en lave-linge, à raison de 0,5g/1 à 20g/l, de préférence de 2g/l à 10g/l pour réaliser des opérations de lavage à une température de l'ordre de 25 à 90 C.
Un deuxième mode de réalisation de l'invention, consiste en une formulation aqueuse liquide de rinçage du linge, mise en #uvre notamment en lave-linge. Celle-ci peut être mise en #uvre à raison de 0,2 à 10g/l, de préférence de 2 à 10g/l.
A côté dudit polymère dendritique (P), peuvent être présents d'autres constituants du type - associations d'agents tensioactifs cationiques (diester de triéthanolamine quaternisé par du diméthylsulfate, N-méthylimidazoline tallow ester méthyl sulfate, chlorure de dialkyldiméthylammonium, chlorure d'alkylbenzyldiméthylammonium, sulfate de méthyle et d'alkylimidazolinium, sulfate de méthyle et de méthyl-bis(alkylamidoéthyl)-2-hydroxyéthylammonium...) en quantité pouvant aller de 3 à 50%, de préférence de 4 à 30% de ladite formulation éventuellement associés à des tensioactifs non ioniques (alcools gras éthoxylés, alkylphénols éthoxylés ...) en quantité pouvant aller jusqu'à 3% ; - des polyorganosiloxanes (0,1à 10%) - azurants optiques (0,1 à 0,2%); - éventuellement agents anti-transfert de couleur (polyvinylpyrrolidone, polyvinyloxazolidone, polyméthacrylamide... 0,03 à 25%, de préférence 0,1 à 15%) - colorants, - parfums, - solvants, notamment des alcools (méthanol, éthanol, propanol, isopropanol, éthylèneglycol, glycérine), - limiteurs de mousse.
Un troisième mode de réalisation de l'invention, consiste en un additif de séchage du linge dans une machine séchante appropriée.
Ledit additif comprend un support solide flexible constitué par exemple par une bande de textile tissé ou non-tissé, une feuille de cellulose, imprégnée dudit pçolymère dendritique (P), ledit additif est introduit au séchage dans le linge humide à sécher à une température de l'ordre de 50 à 80 C pendant 10 à 60 minutes.
Un quatrième mode de réalisation de l'invention, consiste en une formulation de repassage, qui peut être pulvérisée directement sur le linge sec avant l'opération de repassage.
Ladite formulation peut en outre contenir des agents tensioactifs non-ioniques (de 0,5 à 5%) ou anioniques (de 0,5 à 5%), des parfums (0,1 à 3%), des dérivés cellulosiques (0,1 à 3%) comme l'amidon.
La masse molaire en poids est déterminée comme suit par chromatographie par exclusion de taille.
La mesure est effectuée dans une phase éluante composée de 70% en volume d'eau Millipore 18 megaohms et de 30% en volume de méthanol, contenant 0,1M de NaN03 ; elle est ajustée à pH 10 (1/1000 NH40H 25%).
Les caractéristiques de l'appareil sont les suivantes : - Colonnes chromatographiques : 1colonne Shodex SB806HQ (30cm, 5 m) et une colonne ASAHI GFA30 (60cm, 5 m).
D'une manière générale la taille augmente pour des quantités de Solutol HS15 décroissantes. Dans une même série, pour une quantité donnée de Solutol HS15, la taille augmente avec les proportions croissantes de DSPE-PEG ajoutées.
Exemple 5 : Contrôle de la taille pour des nanocapsules réalisées selon la méthode de post-insertion Lorsque l'on souhaite obtenir des temps de circulation particulièrement longs ou que l'on désire introduire des ligands, il faut avoir recours à la méthode de post-insertion telle que décrite au niveau de l'exemple 3. Ainsi, on génère au préalable des nanocapsules exemptes de DSPE-PEG pour lesquelles il est possible d'ajuster la taille en faisant varier le ratio massique entre le total des lipides et tensioactifs constituant la surface des particules
sur la totalité de tous les lipides et tensioactifs entrant dans la composition de la préparation (surface+cceur). Les relations entre ce rapport Lipides de la surface/total des lipides et la taille des nanocapsules obtenues, se prêtant à la méthode de post-insertion, est présenté sur la figure 2.
Les formulations présentées au niveau de la figure 2 ont été réalisées pour une quantité d'environ 1 g de lipides. Les quantités de HSPC, Labrafac cc et NaCI sont constantes et correspondent à celles employées au niveau de l'exemple 4. Les quantités de Solutol HS15 employées, les rapports Lipides de la surface/total des lipides (rapport S/T) correspondants sont reportés dans le tableau 5 ci-dessous.
Solutol HS15 Rapport S/T (mg) 400,6 48,6% 413,2 49,2% 445,9 50,9% 504,2 53,5%
Par la suite il est possible d'introduire le phospholipide pégylé DSPEPEG par le procédé de post-insertion afin d'obtenir les nanocapsules furtives conformes à l'invention. Le procédé de post-insertion est réalisé selon l'exemple 3 pour une proportion totale finale de 6 mol% en DSPE-PEG 2000 ou 5000.
Les tailles obtenues pour les formulations mères (série SM), exemptes de DSPE-PEG, ayant respectivement 504, 446 et 401 mg de Solutol HS15 et les formulations filles conformes à l'invention ayant fait l'objet d'une incorporation de DSPE-PEG 2000 et 5000 par ledit procédé de post-insertion sont représentées au niveau de la figure 3.
Ainsi, l'insertion de DSPE-PEG2ooo se traduit par une augmentation du diamètre de 7,2 nm en moyenne. L'augmentation de taille est plus marquée
pour le DSPE-PEGsooo qui présente une augmentation moyenne de 9,1 nm sur le diamètre des particules.
Sur la base de ces augmentations de diamètre, qui témoignent de l'insertion effective de phospholipides pégylé à la surface des nanocapsules lipidiques, et connaissant l'évolution de la taille des nanocapsules exemptes de PEG en fonction du rapport surface/lipides totaux (figure 2), il est possible d'adapter la taille des nanocapsules conformes à l'invention de manière à faciliter l'extravasation au niveau des fenestrations présentes au niveau de l'endothélium de capillaires tumoraux particuliers.
D) Résultats des études de furtivité menées in vivo avec les nanocapsules conformes à l'invention Exemple 6 : cinétique de disparition du vecteur (données comparatives PEG2000/ PEGsooo) La furtivité des nanocapsules conformes à l'invention a été évaluée dans une étude comparative entre une formulation de nanocapsules à base de 3,34 mol% de DSPE-PEG2ooo (courbe "2k-3,34") et une formulation de nanocapsules à base de DSPE-PEGsooo, dont la proportion molaire en DSPE-PEGsooo est de 1,41 mol% ("5k-1,41"). Ces formulations ont été réalisées selon ledit procédé classique tel que décrit au niveau des exemples 1 et 2.
Pour ce faire, des solutions de nanocapsules conformes à l'invention ont été injectées par voie intraveineuse à des rats mâles (Sprague-Dawley, 325g) à raison de 4 rats par formulation. Les doses de lipides injectées ont été choisies pour être environ 10 fois inférieures aux doses à partir desquelles des phénomènes de saturation du SPM peuvent avoir lieu (ce qui se traduirait par des temps de circulation prolongés en raison du débordement des capacités d'épuration). Ainsi une solution de nanocapsules
comprenant une quantité totale de lipides de 2 mg dans un volume de 400 l a été injectée à chaque rat.
Les nanocapsules conformes à l'invention ont préalablement été marquées avec un traceur radioactif tritié : le [3H]-Cholestérol Hexadécyl Ether qui est un marqueur non échangeable. La dose de marqueur radioactif représente 3 micro Curie (pCi) par rat. Neuf prélèvements sanguins successifs ont été effectués après l'injection des nanocapsules à 5,15 et 30 minutes, puis à 1,2,4,8,12 et 24 heures.
Les échantillons sanguins sont mis à digérer en présence de Soluene 350 (Canberra Packard, Mississauga, Canada) pendant une heure à 50 C.
et leurs C- gluco sides.
-tanins hydrolysables: généralement des esters d'un noyau carbodydrate (par
exemple, un monosaccharide ou un disaccharide) et d'un acide gallique.
Selon la présente invention, on utilise un extrait de plante riche en o polymères procyanidoliques, de dp au moins égal à 10, pour l'obtention d'une
composition destinée à inhiber des a-amylases -notamment l'a-amylase intestinale-.
L'invention repose ainsi sur la découverte réalisoe par les inventeurs de la
capacité des procyanidines à inhiber les a-amylases.
I1 est à noter que les procyanidines ainsi que les monomères de s flavan3-ol, et de façon générale les tanins (condensés ou hydrolysables), sont connus pour leur affinité vis-à-vis des protéines et pour former avec celles-ci des complexes insolubles. r} s 2836337 Ces composés ont révélé des activités antiseptiques, antivirales, véinotoniques, anticancéreuses, anti-inflammatoires, anti-âges, anticaries, immunorégulateurs... Par exemple, EP 0 472 531 propose des compositions à base de procyanidines pour traiter les infections virales (par exemple, l'herpès, la varicelle, l'hépatite A, le sida...), ou pour ralentir le vieillissement en protégeant le tissu conjonctif contre les enzymes qui le dégradent de façon naturelle (antiélastases et collagénases). Dans EP 2 695 390, il est suggéré de complexer des tanins, extraits de plante(s) connue(s) pour contenir des procyanidines, à des métaux de degré d'oxydation
au moins égal à 3 afn d'accro^ke leurs activités thérapeutiques.
o Toutefois, en dépit de l'abondance de connaissances accumulées pendant ces dernières décennies sur les procyanidines et leurs effets sur certaines enzymes, les inventeurs ont été les premiers à mettre en évidence une activité surprenante et inattendue d'inhibition des procyanidines vis-à-vis des a-amylases -notammentde
l'a-amylase intestinale-, euzyme particulière qui évolue dans un milieu de pH neutre.
s Par ailleurs, des tests comparatifs d'activité ont démontré une inhibition beaucoup plus intense avec des composés procyanidoliques de dp au moins égal à 10 (polymères procyanidoliques), qu'avec des oligomères, dimères ou monomères de flavan-3-ol. L'effcacité de l'inhibition des aamylases d'un extrait de procyanidines ré side ainsi es s entiellement au niveau des polymères procyanidoliques de dp au moins
o égal à 10.
Avantageusement, les extraits de plante utilisés selon l'invention sont des extraits de tanins condensés, riches en polymères procyanidoliques de dp au moins égal à 10. On conna^t actuellement de nombreuses sources végétales riches en tanins; elles sont d'ailleurs décrites dans des ouvrages tels que " Plantes thérapeutiques - Tradition, pratique offcinale, science et thérapeutique" (Editions Médicales Internationales 3éme édition, 1999), ou encore " Pharmacognosie, Phytochimie, Plantes
médicinales " (Editions Lavoisier TEC&DOC - 2ème édition, 1993).
r]
Comme pour le procédé d'hydrocyanation de composés à insaturation éthylénique, le système catalytique utilisé pour l'isomérisation peut être préparé avant son introduction dans la zone de réaction, par exemple par addition dans un solvant du ligand de formule (1), de la quantité appropriée de composé du métal de transition choisi et éventuellement du réducteur. Il est également possible de préparer le système catalytique "in situ" par simple addition de ces divers constituants dans le milieu réactionnel. La quantité de composé du métal de transition et plus particulièrement du nickel utilisée, ainsi que la quantité de ligand de formule (I) sont les mêmes que pour la réaction d'hydrocyanation.
Bien que la réaction d'isomérisation soit conduite généralement sans solvant, il peut être avantageux de rajouter un solvant organique inerte qui pourra être celui de l'extraction ultérieure C'est notamment le cas lorsqu'un tel solvant a été mis en oeuvre dans la réaction d'hydrocyanation du butadiène ayant servi à préparer le milieu soumis à la réaction d'isomérisation. De tels solvants peuvent être choisis parmi ceux qui ont été cités précédemment pour l'hydrocyanation.
La préparation de composés dinitriles par hydrocyanation d'une oléfine comme le butadiène peut être réalisée en utilisant un système catalytique conforme à l'invention pour les étapes de formation des mononitriles insaturés et l'étape d'isomérisation ci-dessus, la réaction d'hydrocyanation des mononitriles insaturés en dinitriles pouvant être mis en #uvre avec un système catalytique conforme à l'invention ou tout autre système catalytique déjà connu pour cette réaction.
De même, la réaction d'hydrocyanation de l'oléfine en mononitriles insaturés et l'isomérisation de ceux-ci peuvent être réalisées avec un système catalytique différent de celui de l'invention, l'étape d'hydrocyanation des mononitriles insaturés en dinitriles étant mis en #uvre avec un système catalytique conforme à l'invention.
L'invention a également pour objet des composés organophosphorés répondant à la formule générale1 suivante : Dans laquelle : T, T1 identiques ou différents représentent un atome de phosphore, d'arsenic ou d'antimoine R1, R2 , R3, R4 identiques ou différents représentent un radical aromatique, aliphatique ou cycloaliphatique substitué ou non comprenant un ou plusieurs cycles sous forme condensée ou non et pouvant comprendre un ou plusieurs hétéroatomes, les radicaux R1, et R2 d'une part, R3 et R4 d'autre part peuvent être reliés entre eux par une liaison covalente, une chaîne hydrocarbonée ou un hétéroatome ; U1, U2, U3, U4 identiques ou différents représentent un atome d'oxygène ou un radical de formule NR dans laquelle R désigne un radical monovalent alkyle, aryle, cycloalkyle, sulfonyle ou carbonylé, R5, R6 identiques ou différents représentent un groupe aryle ou cycloaliphatique pouvant comprendre des hétéroatomes et/ou un ou plusieurs cycles sous forme condensée ou non, substitués ou non; n est un nombre entier égal à 0 ou 1 ; L1, quand n est égal à 0, représente un radical divalent choisi dans le groupe comprenant les groupements NR7, PR8, SiRg R10, BR11, S , POR12, SO2, CO dans lesquels R7 a la signification de R indiquée ci-dessus, R8 et R12 peuvent représenter le radical OR13, et R8, Rg, R10, R11 R12 et R13 représentent des radicaux alkyles, aryles ou cycloalkyles ; L1, L2 quand n est égal à 1, identiques ou différents représentent une liaison covalente, un radical choisi dans le groupe comprenant les groupements 0, NR7, PR8, SiRg R10, BR11, S , POR12, SO2, CO, -CR14R15-, dans lesquels R7 a la signification de R indiquée ci-dessus, R8 et R12 peuvent représenter le radical OR13, et R8, Rg, R10, R11, R12, R13 , R14 et R15 représentent des radicaux alkyles, aryles ou cycloalkyles, R14 et R15 pouvant également représenter l'atome d'hydrogène.
Elles concernent notamment les composés organophosphorés listés dans le tableau Il cidessus.
Ces composés sont obtenus notamment par mélange d'une solution dans le toluène d'un composé diphénol répondant à la structure de formule suivante : Avec une solution toluènique d'une chlorophosphite de formules suivantes : R1 R2 O O # # P # CI et/ou R3 R4 # # P # CI Dans les formules ci-dessus les symboles ont les mêmes significations que dans la formule I.
Le mélange est maintenu sous agitation pendant plusieurs heures (de l'ordre de 8 à15 heures) à température ambiante (comprise entre 15 C et 30 C). Le composé organophosphoré est récupéré par exemple par filtration du mélange.
Ce mode opératoire de préparation est donné uniquement à titre d'exemple et indicatif.
D'autres procédés de fabrication peuvent être utilisés sans sortir du cadre de l'invention.
Par ailleurs, les phénols et chlorophosphites sont généralement disponibles commercialement ou peuvent être synthétisés par les procédés classiques et décrits d'obtention de ces composés.
AdN : adiponitrile. cod : 1,5-cyclooctadiène.
DN : dinitriles = AdN + MGN + ESN.
Le problème technique posé par la présente invention consiste à préparer de nouveaux peptides anti-bactériens dérivés de peptides d'insectes, plus particulièrement actifs contre les bactéries à Gram positif pharmacorésistantes, en s'affranchissant des contraintes précédemment décrites.