INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
pyrazolo-[1, 5-a]-pyrimidine-3, 7 -diamine ; la pyrazolo-[1, S-a]-pyrimidine-3, S-diamine, la 2, 7 -diméthyl-pyrazolo-[1, 5-a]-pyrimidine-3, S-diamine, le 3-amino-pyrazolo-[1, S-a]- pyrimidin-7-ol ; le 3-amino-pyrazolo- [1, 5-a]-pyrimidin-5-ol ; le 2- (3-amino pyrazolo- [1, 5-a]- pyrimidin-7-ylamino)-éthanol; le 2-(7-amino-pyrazolo-[,5-a]-pyrimidin-3-ylamino)-éthanol; le 2- [ (3-amino-pyrazolo [1, 5-a] pyrimidin-7-yl)- (2-hydroxy-éthyl)-amino]-éthanol ; le 2- [ (7amino-pyrazolo[1,5-a]pyrimidin-3-yl)-(2-hydroxy-éthl)-amino]éthanol ; la 5, 6-diméthyl- pyrazolo-[1,5-a]-pyrimidine-3,7-diamine ; la 2, 6-diméthyl-pyrazolo-[1, 5-a]-pyrimidine-3, 7- diamine ; la 2, 5, N7, N7-tetraméthyl-pyrazolo-[1, S-a]-pyrimidine-3, 7-diamine ; la 3-amino-5- méthyl-7-imidazolylpropylaminor-pyrazolo-[1,5-a]-pyrimnidine ; et leurs sels d'addition et leurs formes tautomères, lorsqu'il existe un équilibre tautomérique et leurs sels d'addition avec un acide.
Parmi les dérivés pyrazoliques, on peut plus particulièrement citer les composés décrits dans les brevets DE 3 843 892, DE 4 133 957 et demandes de brevet WO 94/08969, WO 94/08970, FR-A-2 733 749 et DE 195 43 988 comme le 4, 5-diamino-1-méthyl- pyrazole, le 3, 4-diamino-pyrazole, le 4, 5-diamino-1- (4'-chlorobenzyl)-pyrazole, le 4, 5diamino 1, 3-diméthyl-pyrazole, le 4, 5-diamino-3-méthyl-1-phényl-pyrazole, le 4, 5-diamino 1-méthyl-3-phényl-pyrazole, le 4-amino-1, 3-diméthyl-S-hydrazino-pyrazole, le 1-benzyl- 4, 5-diamino-3-méthyl-pyrazole, le 4, 5-diamino-3-tert-butyl-1-méthyl-pyrazole, le 4, 5diamino-1-tert-butyl-3-méthyl-pyrazole, le 4, 5-diamino-1- (ss-hydroxyéthyl)-3-méthyl pyrazole, le 4, 5-diamino-1-(ss-hydroxyéthyl)-pyrazole, le 4, 5-diamino-1-éthyl-3-méthyl- pyrazole, l le 4, 5-diamino-1-éthyl-3-(4'-méthoxyphényl)-pyrazole, le 4,5-diamino-1-éthyl-3hydroxyméthyl-pyrazole, le 4, S-diamino-3-hydroxyméthyl-1-méthyl-pyrazole, le 4, 5- diamino-3-hydroxyméthyl-1-isopropyl-pyrazole, le 4, 5-diamino-3-méthyl-1-isopropyl- pyrazole, le 4-amino-5-(2'-aminoéthyl) amino-1, 3-diméthyl-pyrazole, le 3,4, 5-triaminopyrazole, le 1-méthyl-3, 4, 5-triamino-pyrazole, le 3, 5-diamino-1-méthyl-4-méthylamino- pyrazole, le 3, 5-diamino-4-(ss-hydroxyéthyl)amino-1-méthyl-pyrazole, et leurs sels d'addition avec un acide.
Selon la présente invention, les bases d'oxydation représentent de préférence de 0, 0005 à 12% en poids environ du poids total de la composition ne comprenant pas l'oxydant et encore plus préférentiellement de 0, 005 à 8% en poids environ de ce poids.
Les coupleurs utilisables dans la composition de teinture selon l'invention sont ceux classiquement utilisés dans les compositions de teinture d'oxydation, c'est-à-dire les méta-aminophénols, les méta-phénylènediamines, les métadiphénols, les naphtols et les
coupleurs hétérocycliques tels que par exemple les dérivés indoliques, les dérivés indoliniques, le sésamol et ses dérivés, les dérivés pyridiniques, les dérivés pyrazolotriazoles, les pyrazolones, les indazoles, les benzimidazoles, les benzothiazoles, les benzoxazoles, les 1, 3-benzodioxoles, les quinolines et leurs sels d'addition avec un acide.
Ces coupleurs sont plus particulièrement choisis parmi le 2,4-diamino l- (p-hydroxyéthyioxy)- benzène, le 2-méthyl-5-amino-phénol, le 5-N- (ss-hydroxyéthyl) amino-2-méthyl-phénol, le 3amino-phénol, le 1, 3-dihydr, oxy-benzèneL le 1, 3-dihydroxy-2-méthyl-benzène, le 4-chloro- 1,3-dihydroxy-benzène, le 2-amino 4- (P-hydroxyéthylamino)-l-méthoxy-benzène, le 1,3- diamino-benzène, le 1, 3-bis- (2, 4-diaminophénoxy)-propane, le sésamol, ie 1-amino-2méthoxy-4, 5-méthylènedioxy benzène, l'a-naphtol, le 6-hydroxy-indole, le 4-hydroxy-indole, le 4-hydroxy-N-ss-hydroxyéthyl-indole, la 6-hydroxy-indoline, la 2, 6-dihydroxy-4-méthylpyridine, le 1-H-3-méthyl-pyrazole-5-one, le 1-phényl-3-méthyl-pyrazole-5-one, la 2-amino-3hydroxypyridine, le 3, 6-diméthyl-pyrazolo-[3, 2-c]-1, 2, 4-triazole, le 2, 6-dirnéthyl-pyrazolo-[1, 5b]-1, 2, 4-triazole et leurs sels d'addition avec un acide.
Lorsqu'ils sont présents, ces coupleurs représentent de préférence de 0,0001 à 10% en poids environ du poids total de la composition ne comprenant pas l'oxydant, et encore plus préférentiellement de 0,005 à 5% en poids environ.
La composition tinctoriale conforme à l'invention peut en outre comprendre un ou plusieurs colorants directs notamment pour modifier les nuances en les enrichissant de reflets. Ces colorants directs peuvent notamment être choisis parmi les colorants nitrés, azoïques ou anthraquinoniques, neutres, cationiques ou anioniques, classiquement utilisés ou ceux décrits notamment dans les demandes de brevet FR-2782450,2782451, 2782452 et EP-1025834, dans la proportion pondérale d'environ 0,001 à 20% et de préférence de 0,01 à 10% du poids total de la composition.
La composition prête à l'emploi selon l'invention peut également comprendre dans la composition colorante et/ou la composition oxydante des agents d'ajustement de la rhéologie tels que les amides d'acides gras (diéthanol-ou monoéthanol-amide de coprah,
monoéthanolamide d'acide alkyl éther carboxylique oxyéthyléné), les épaississants cellulosiques (hydroxyéthycellulose, hydroxypropylcellulose, carboxyméthylcellulose..), la gomme de guar et ses dérivés (hydroxypropylguar..), les gommes d'origine microbienne (gomme de xanthane, gomme de scléroglucane..), les homopolymères réticulés d'acide acrylique ou d'acide acrylamidopropanesulfonique et les polymères associatifs tels que décrits ci-dessous.
Polymères associatifs utilisables selon l'invention Les polymères associatifs sont des polymères hydrosolubles capables, dans un milieu aqueux, de s'associer réversible ment entre eux ou avec d'autres molécules.
Les scléroglucanes sont représentés par exemple par les produits vendus sous la dénomination ACTIGUM CS par la société SANOFI BIO INDUSTRIES et en particulier ACTIGUM CS 11 et sous la dénomination AMIGEL par la société ALBAN MULLER INTERNATIONAL. D'autres scléroglucanes tels que celui traité au glyoxal dans la demande de brevet français ? 2633940 peuvent également être utilisés. Les Xanthanes sont représentés par exemple par les produits vendus sous les dénominations KELTROL, KELTROL T, KELTROL TF, KELTROL BT, KELTROL RD, KELTROL CG par la société NUTRASWEET KELCO, ou sous les dénominations RHODICARE S, RHODICARE H par la société RHODIA CHIMIE.
Parmi les gommes d'origine végétale, on peut citer celles issues d'exudats végétaux telles que les gommes Aabique, gomme Ghatti, gomme Karaya, Tragacanthe, Carrageenane, Agar et Caroube On peut également utiliser les pectines, les alginates et les amidons.
Polymères amphiphiles ou"associatifs" : Parmi les polymères comportant au moins une chaîne qrasse et de type anionique, on peut citer :
- (1) ceux comportant au moins un motif hydrophile, et au moins un motif éther d'allyle à chaîne grasse, plus particulièrement ceux dont le motif hydrophile est constitué par un monomère anionique insaturé éthylénique, plus particulièrement encore par un acide carboxylique vinylique et tout particulièrement par un acide acrylique ou un acide méthacrylique ou les mélanges de ceux ci, et dont le motif éther d'allyle à chaîne grasse correspond au monomère de formule (XV) suivante : CH2 = C R'CH2 0 Bn R (XV) dans laquelle R'désigne H ou CH3, B désigne le radical éthylèneoxy, n est nul ou désigne un entier allant de 1 à 100, R désigne un radical hydrocarboné choisi parmi les radicaux alkyl, arylalkyle, aryle, alkylaryle, cycloalkyle, comprenant de 8 à 30 atomes de carbone, de préférence 10 à 24, et plus particulièrement encore de 12 à 18 atomes de carbone. Un motif de formule (XV) plus particulièrement préféré est un motif dans lequel R'désigne H, n est égal à 10, et R désigne un radical stéaryl (Cis).
Parmi ces polymères épaississants anioniques à chaîne grasse, on préfère particulièrement selon l'invention, les polymères formés à partir de 20 à 60% en poids d'acide acrylique et/ou d'acide méthacrylique, de 5 à 60% en poids de (méth) acrylates d'alkyles inférieurs, de 2 à 50% en poids d'éther d'allyl à chaîne grasse de formule (XV), et de 0 à 1% en poids d'un agent réticulant qui est un monomère insaturé polyéthylénique copolymérisable bien connu, comme le phtalate de diallyle, le (méth) acrylate d'allyl, le divinylbenzène, le diméthacrylate de (poly) éthylèneglycol, et le méthylène-bis-acrylamide.
De préférence, ces polymères sont choisis parmi ceux dont le motif hydrophile de type acide carboxylique insaturé oléfinique correspond au monomère de formule (XVI) suivante : dans laquelle, Ri désigne H ou CH3 ou C2Hs, c'est-à-dire des motifs acide acrylique, acide méthacrylique ou acide éthacrylique, et dont le motif hydrophobe de type ester d'alkyl (Cic-Cao) d'acide carboxylique insaturé correspond au monomère de formule (XVII) suivante : dans laquelle, R2 désigne H ou CH3 ou C2H5 (c'est-à-dire des motifs acrylates, méthacrylates ou éthacrylates) et de préférence H (motifs acrylates) ou CH3 (motifs méthacrylates), R3 désignant un radical alkyle en Cic-Cso, et de préférence en C-Csz.
Des esters d'alkyles (CWC3o) d'acides carboxyliques insaturés conformes à l'invention comprennent par exemple, l'acrylate de lauryle, l'acrylate de stéaryle, l'acrylate de décyle, l'acrylate d'isodécyle, l'acrylate de dodécyle, et les méthacrylates correspondants, le méthacrylate de lauryl, le méthacrylate de stéaryle, le méthacrylate de décyle, le méthacrylate d'isodécyle, et le méthacrylate de dodécyle.
Parmi ce type de polymères épaississants anioniques à chaîne grasse, on utilisera plus particulièrement des polymères formés à partir d'un mélange de monomères comprenant : (i) essentiellement de l'acide acrylique, (ii) un ester de formule (XVI) décrite ci-dessus et dans laquelle R2 désigne H ou CH3, R3 désignant un radical alkyle ayant de 12 à 22 atomes de carbone, (iii) et un agent réticulant, qui est un monomère insaturé polyéthylénique copolymérisable bien connu, comme le phtalate de diallyl, le (méth) acrylate d'allyl, le divinylbenzène, le diméthacrylate de (poly) éthylèneglycol, et le méthylène-bisacrylamide.
Parmi ce type de polymères épaississants anioniques à chaîne grasse, on utilisera plus particulièrement ceux constitués de 95 à 60% en poids d'acide acrylique (motif hydrophile), 4 à 40% en poids d'acrylate d'alkyles en Cic-Cso (motif hydrophobe), et 0 à
- Exemple 93 : 3-Méthylbut-2-énylpyrophosphonate de triammonium (82) : Rdt==61% Rif=0, 15 (5 : 5, ammoniaque 27% : isopropanol)
RMN'H (D20), 5 (ppm) : 1, 44 (d, J4-2 5, 2 Hz, 3H, H-4) ; 1, 55 (d, J5-2 3, 8 Hz, 3H, H-5) ; 2, 33 (dd, JI-p 21, 7 Hz, JI-2 7, 8 Hz, 2H, H-l) ; 5, 02 (m, 1H, H-2).
RMN 3tp (D20), ≈(ppm) :-7, 0 (d, Jas"26, 0 Hz, P-P) ; 16, 9 (d, P-a).
RMN 13C (D20), 5 (ppm) : 17, 66 (lC, C-5) ; 25, 42 (lC, C-4) ; 28, 90 (d, J1-P 136, 3 Hz, 1C, C-l) ; 114, 91 (d, J2-p 10, 8 Hz, lC, C-2) ; 136, 63 (d, J3-P 14, 5 Hz, lC, C- 3).
SM FAB > 0 m/z (GT) : 231 [M-3NH4+4H]+.
- Exemple 94 : 3-Méthylbut-3-énylpyrophosphonate de triammonium (83) : Rdt=61% Rf=0, 16 (5 : 5, ammoniaque 27% : isopropanol) RMN'H (D20), S (ppm) : 1, 50 (s, 3H, H-5) ; 1, 62-1, 75 (m, 2H, H-2) ; 1, 95-2, 15 (m, 2H, H-I) ; 4,45-4, 65 (m, 2H, H-5).
RMN 31P (D2O), #(ppm) : -8, 4 (d, Jss-α 25,0 Hz, P-ss) ; 21,2 (d, P-a).
RMN 13C (D2O), (ppm) : 21, 78 (1C, C-5) ; 26, 62 (d, Jl-P 137, 0 Hz, 1C, C-l) ; 31, 15 (d, - ? 3, 9 Hz, 1C, C-2) ; 109, 40 (1C, C-4) ; 147, 75 (d, -p 18, 5 Hz, IC, C-3).
- Exemple 95 : Allylpyrophosphonate de triammonium (84) :
Rdt=40% Rf=0, 22 (5 : 5, ammoniaque 27% : isopropanol) RMN 1H (D2O), # (ppm) : 2,52 (dd, JI-p 21,7 Hz, JI-2 7,48 Hz, 2H, H-l) ; 4,92- 5, 12 (m, 2H, H-3) ; 5,62-5, 90 (m, IH, H-2).
RMN 31p (D20), 8 (ppm) :-6, 8 (d, Jss-α 24,3 Hz, P-ss) ; 14,9 (d, P-a) RMN 13C (D20), S (ppm) : 34, 28 (d, JI-p 133, 5 Hz, 1C, C-l) ; 118, 54 (d, J3-P 13, 9 Hz, 1C,C-3) ; 131, 53 (d, J2-P 10,8 Hz, lC, C-2).
SM FAB > 0 m/z (GT) : 203 [M-3NH4+4Ht - Exemple 96 : 3-Méthylbut-3-ényltriphosphonate de tétraammonium (85) :
Rdt=15% Rf=0, 10 (5 : 5, ammoniaque 27% : isopropanol) RMN'H (D20), 8 (ppm) : 1,51 (s, 3H, H-5) ; 1,60-1, 72 (m, 2H, H-2) ; 1, 92-2, 13 (m, 2H, H-l) ; 4,45-4, 60 (2m, 2H, H-4).
RMN 31p (D20), ≈(ppm) :-21, 2 (dd, Jp 24, 0 Hz, Jp-y 21, 2 Hz, P-ss) ;-6, 1 (d, P-y) ; 21, 3 (d, P-a).
RMN 13C (D2O), 8 (ppm) : 21, 83 (1C, C-5) ; 26, 77 (d, . p 137, 1 Hz, 1C, C-1) ; 31, 21 (d, J2-P 3,9 Hz, 1C, C-2) ; 109,40 (1 C, C-4) ; 147,82 (d, J3-p 18,5 Hz, 1C, C-3).
les métaux nobles tels que l'or, l'argent, le cuivre ou leurs alliages.
Dans une variante, ils peuvent être réalisés dans un matériau magnétique tel que le cobalt, le fer, le nickel ou leurs alliages.
Quant au matériau diélectrique ou semiconducteur de la couche discontinue, il peut être magnétique ou amagnétique. Ce n'est pas une jonction tunnel. Son rôle est de dévier le courant qui circule dans l'empilement pour qu'il se concentre au niveau des ponts.
L'une des couches magnétiques peut avoir sa direction d'aimantation fixée par association d'une couche antiferromagnétique disposée au-delà de la couche magnétique à direction d'aimantation fixe par rapport à la couche diélectrique ou semi-conductrice avec les ponts électriquement conducteurs.
Au moins l'une des couches magnétiques peut être formée d'un empilement de couches intermédiaires.
Notamment, la couche magnétique à direction d'aimantation fixe peut être formée d'une couche intermédiaire électriquement conductrice amagnétique encadrée par deux couches intermédiaires magnétiques.
La couche diélectrique ou semi-conductrice discontinue peut être réalisée à base d'oxyde, de nitrure, de semi-conducteur.
Les moyens pour faire circuler un courant électrique peuvent comporter deux électrodes qui prennent en sandwich la vanne de spin.
Au moins une couche tampon peut être insérée entre l'une des électrodes et la vanne de spin.
La vanne de spin peut être simple ou duale.
La présente invention concerne aussi une tête magnétique de lecture qui comporte un dispositif magnétorésistif ainsi défini.
La présente invention concerne aussi une mémoire comprenant une matrice de points mémoire, chacun des points mémoire comportant un dispositif magnétorésistif ainsi défini.
La présente invention concerne aussi un procédé de réalisation d'un dispositif magnétorésistif à vanne de spin. Il comporte les étapes suivantes : réalisation, pour faire la vanne de spin, d'un empilement de couches parmi lesquelles au moins deux couches magnétiques dont l'orientation relative de leur direction d'aimantation peut varier peut sous l'effet d'un champ magnétique, réalisation de moyens pour faire circuler un courant dans la vanne de spin transversalement au plan des couches, réalisation au sein de l'empilement d'au moins une couche diélectrique ou semi-conductrice discontinue avec des ponts électriquement conducteurs traversant l'épaisseur de la couche, ces derniers étant destinés à concentrer localement le courant qui circule transversalement dans l'empilement.
La couche diélectrique ou semi-conductrice avec les ponts électriquement conducteurs peut être réalisée par dépôt d'une couche mince de matériau diélectrique ou semi-conducteur incluant des particules métalliques.
Ces particules métalliques se regroupent pour former les ponts.
Dans une variante, la couche diélectrique ou semi-conductrice avec les ponts électriquement conducteurs peut être réalisée en traitant localement une couche électriquement conductrice se trouvant dans l'empilement pour la rendre diélectrique ou semiconductrice. Le traitement peut avoir lieu en cours de dépôt ou en fin de dépôt de la couche électriquement conductrice.
Le recuit peut être effectué par différentes techniques. De préférence, le recuit est réalisé par un mode de chauffage rapide, obtenu, par exemple, avec la technique du recuit thermique rapide (communément désigné par l'abbréviation RTA pour Rapid Thermal Annealing ).
Selon l'invention, le film constitué par le dépôt d'au moins une couche, permet, à l'issue du procédé, d'obtenir un film à base de PZT cristallisé dans un système unique pérovskite.
L'invention va maintenant être décrite en référence aux exemples suivants donnés à titre illustratif et non limitatif.
L'exemple qui suit illustre, dans un premier temps la préparation d'un sol de PZT de formule (PbZro. 52Tio. 4s03) à partir d'un précurseur à base de plomb, l'acétate de plomb et à partir de précurseur de titane et de zirconium, sous forme d'alcoxydes.
Les alcoxydes de zirconium et de titane utilisés sont le n-propoxyde de zirconium commercial de concentration 70% en poids dans le propanol et
l'isopropoxyde de titane. L'acétate de plomb est sous forme de trihydrate.
La viscosité est suivie à l'aide d'un viscosimètre à tube capillaire ou à cylindre tournant pour une température de l'ordre de 200C.
Selon ce mode particulier de réalisation, la préparation dudit sol comporte une phase préliminaire de préparation d'un sol déshydraté à base de plomb. a) Préparation du sol déshydraté à base de plomb.
Dans un ballon surmonté d'un montage de distillation, on pèse 751.07 g (1.98 mol) d'acétate de plomb trihydraté et 330 g (5.32 mol) d'éthylène glycol. On homogénéise le mélange à environ 70 oc de manière à permettre une dissolution de l'acétate de plomb. La température de la solution homogène obtenue est alors augmentée pour déshydrater le précurseur à base de plomb par distillation. On recueille 120 g de distillat et la concentration en plomb du sol est de l'ordre de 2.06 mol/kg. b) Préparation du sol stabilisé de formule Pb Zro. 52Tio. 4s03.
Sous balayage d'argon, dans 264 g (330 ml) de n- propanol, on additionne sous agitation 225.13 g (0.792 mol) d'isopropoxyde de titane et on ajoute 401.52 g (0.858 mol) de n-propoxyde de zirconium à 70 % dans du n-propanol puis 458.7 g (412.5 ml) d'éthylène glycol.
On laisse sous agitation 20 minutes à température ambiante.
Dans un tricol, on pèse 1.815 mol de sol de précurseur de plomb préalablement préparé soit un excès de 10 %-pour pallier la perte d'oxyde de plomb (PbO) lors du traitement thermique des films. Sous courant d'argon, on additionne rapidement le sol à base de Ti/Zr sous forte agitation (600 t/min). A la fin de l'addition, on place un réfrigérant surmonté d'une garde dessicante et on arrête le balayage d'argon.~ ~On chauffe au reflux pendant 2 heures (101 C). Au cours de la montée en température, on diminue l'agitation à 250 tours/min. On obtient après reflux un sol mixte concentré qui a une concentration de l'ordre de 26 % en équivalent massique PZT. Le sol mixte est conservé à température ambiante sans agitation, jusqu'à obtention d'une viscosité constante en fonction du temps de vieillissement. Dans cet exemple de réalisation, le précurseur est maintenu 1 semaine à température ambiante sans agitation. Ensuite, le sol mixte concentré est dilué à 20 % en équivalent massique PZT, soit à une concentration de 0.75 M, par addition d'éthylène glycol.
Afin de confirmer la nécessité de respecter cette période de mûrissement, la figure 1 montre l'évolution en fonction du temps de la mesure thermostatée (à 20 C) de la viscosité de la solution PZT à 26 % en masse. Ainsi, on observe sur la figure 1 une nette évolution de la viscosité du sol PZT, en fonction du temps. Cette évolution traduit, notamment, l'augmentation du degré de polymérisation des espèces
en solution avec le temps de mûrissement. Au delà d'une semaine de mûrissement, la viscosité du sol mixte tend à se stabiliser pour atteindre finalement une asymptote horizontale, correspondant à une viscosité constante de l'ordre de 74 centipoises. La solution peut alors être diluée, ce qui a pour effet de figer définitivement à la même valeur de viscosité la solution résultante.
Pour extraire et purifier l'héparine à partir du lysat cellulaire, séparer les chaînes polysaccharidiques du noyau serglycine, et séparer les chaînes d'héparine des autres GAGs présents dans le milieu d'extraction, on pourra utiliser des méthodes similaires à celles utilisées dans le cadre de l'extraction et la purification d'héparine à partir de tissus animaux, qui sont connues en elles-mêmes, et décrites dans des ouvrages généraux, tels que le manuel de DUCLOS, cité ci-dessus).
A titre d'exemples non-limitatifs, pour séparer l'héparine des acides nucléiques et des protéines cellulaires, et la solubiliser, c'est à dire rompre les liaisons avec le noyau serglycine :
- on peut soumettre le lysat cellulaire à une ou plusieurs digestions enzymatiques (pronase, trypsine, papaïne, etc...) ; - les liaisons héparine-protéine peuvent être hydrolysées en milieu alcalin, en présence de sulfates ou de chlorures ; - on peut également effectuer un traitement en milieu acide (par exemple par de l'acide trichloracétique à froid) pour détruire les acides nucléiques et les protéines provenant des cellules, complété par l'utilisation d'une solution ionique qui permet de dissocier les interactions GAGs-protéines ; on peut également effectuer une extraction par la guanidine, après hydrolyse enzymatique ; pour purifier l'héparine solubilisée, on peut par exemple la précipiter par l'acétate de potassium, par un ammonium quaternaire, par l'acétone, etc.
Ces étapes de purification peuvent avantageusement être complétées ou remplacées par une ou plusieurs étapes de chromatographie, notamment de chromatographie d'échange d'anions.
La présente invention a également pour objet les préparations d'héparine susceptibles d'être obtenues à partir de cultures de mastocytes en mettant en oeuvre un procédé selon l'invention.
Les préparations d'héparine conformes à l'invention, qui possèdent des propriétés biologiques comparables à celles des préparations d'héparine obtenues dans l'art antérieur à partir de tissus animaux, peuvent être utilisées dans toutes les applications usuelles de l'héparine.
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation d'héparine à partir de cultures de mastocytes et de caractérisation de l'héparine obtenue.
EXEMPLE 1 : EXTRACTION D'HEPARIN A PARTIR DE CULTURES DE MASTOCYTES Culture des mastocytes Une lignée de mastocytes de foie foetal de porc, et une lignée de mastocytes de foie foetal de porc transfectées par l'antigène T du virus SV40 des (lignées CNCM 1-2735 et CNCM 1-2736, respectivement), ont été utilisées ; Les cellules sont ensemencées à raison de 105 à 5 X 105 cellules/ml, dans du milieu MEMa complet en présence d'IL3 porcine (2 ng/ml) et de SCF porcin (80 ng/ml).
Les cultures sont réalisées en boîte de culture ou en suspension en flacon de 1 litre de type spinner . La croissance cellulaire est suivie journellement pendant 4 à 12 jours. La production d'héparine est suivie en parallèle, par l'analyse des glycosaminoglycanes produits en culture.
Les résultats sont présentés dans les Figures 1 à 5.
Les Figures 1, 2 et 3 illustrent la croissance des mastocytes de foie en culture statique en boîte (Figure 1 ; ensemencement initial :. : 1 x 105 cellules ; N : 2 x 105 cellules) et en suspension en flacon (Figure 2), et la croissance des mastocytes de foie transfectés en suspension en flacon (Figure 3).
Dans ces expérimentations, les cultures en suspension en flacon présentent une densité cellulaire maximale allant d'environ 8 x 105 (pour les cellules non transfectées) à environ 1, 5 x 106 cellules/ml (pour les cellules transfectées). Le temps de doublement, calculé pendant la phase exponentielle de croissance, est compris entre 24 et 48 heures.
Purification des glycosaminoglycanes Les cellules subissent une hydrolyse en milieu alcalin en présence de sel afin de rompre les protéoglycanes et éviter les interactions GAGs/protéines de types ioniques.
Ce traitement comprend les étapes suivantes : 1. Traitement par la soude en milieu salin : cette étape vise à détruire les cellules et à couper les liaisons entre l'héparine et sa protéine mère.
L'étape comprend l'ajout de 100 l de NaOH 1 M et de 800 fJLl de NaCl 0,5 M à un culot de 106 cellules. Le mélange ainsi obtenu est chauffé au bain-marie à 800C pendant 30 minutes puis soniqué pendant 5 minutes avant d'être neutralisé avec du HCl 1 N.
2. Extraction : l'échantillon hydrolyse est déposé sur une colonne de résine échangeuse d'anions (SAX, Varian), qui retient l'héparine. La colonne est lavée trois fois en tampon Tris/HCl pH 7,4, NaCl 0,5 M afin d'éliminer les protéines et les autres GAGs, notamment le dermatane.