INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les silicones organo modifiées utilisables conformément à l'invention sont des silicones telles que définies précédemment et comportant dans leur structure un
ou plusieurs groupements organofonctionnels fixés par l'intermédiaire d'un radical hydrocarboné.
Parmi les silicones organomodifiées autres que celles de formule (1) ou (II), on peut citer les polyorganosiloxanes comportant : - des groupements polyéthylèneoxy et/ou polypropylèneoxy comportant éventuellement des groupements alkyle en C6-C24 tels que les produits dénommés diméthicone copolyol commercialisé par la société DOW CORNING sous la dénomination DC 1248 et l'alkyl (C12) méthicone copolyol commercialisée par la société DOW CORNING sous la dénomination Q2 5200 ; - des groupements aminés substitués ou non comme les produits commercialisés sous la dénomination GP 4 Silicone Fluid et GP 7100 par la société GENESEE ou les produits commercialisés sous les dénominations Q2 8220 et DOW CORNING 929 ou 939 par la société DOW CORNING. Les groupements aminés substitués sont en particulier des groupements aminoalkyl en C1-C4 ; - des groupements thiols comme les produits commercialisés sous les dénominations"GP 72 A"et"GP 71"de GENESEE ; - des groupements alcoxylés comme le produit commercialisé sous la dénomination "SILICONE COPOL YMER F-755" par SWS SILICONES et ABIL WAX 2428,2434 et 2440 par la société GOLDSCHMIDT ; - des groupements hydroxylés comme les polyorganosiloxanes à fonction hydroxyalkyl décrits dans la demande de brevet français FR-A-85 16334 des groupements acyloxyalkyle tels que par exemple les polyorganosiloxanes décrits dans le brevet US-A-4957732.
- une culture de mastocytes issus de cellules souches du foie foetal de porc et immortalisés par l'oncogène T du virus SV40, déposée auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2736.
- une culture de mastocytes issus de cellules souches de la moelle osseuse d'un foetus de porc et immortalisés par l'oncogène T du virus SV40, déposée auprès de la CNCM le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2734.
Toutes ces cellules peuvent être maintenues en culture dans les conditions définies ci-dessus.
Le maintien en culture ne nécessite toutefois pas la présence d'IL-3, et le SCF peut être utilisé à des doses plus faibles que celles utilisées pour l'obtention des cultures. Ainsi on peut utiliser le SCF à des concentrations à partir de 2 ng/ml, de préférence à des concentrations de 5 à 100 ng/ml, avantageusement de 8 à 80 ng/ml. Ces cellules peuvent également être maintenues en culture en l'absence de SCF et d'IL-3 pendant environ 2 mois.
Les mastocytes conformes à l'invention peuvent notamment être utilisés comme modèles pour étudier l'activation mastocytaire en réponse à un allergène, ou à un
parasite. Ils présentent un intérêt tout particulier en tant que modèle in vitro pour l'étude des mécanismes immunitaires qui sont impliqués dans l'acquisition d'une immunité protectrice vis-à-vis de nématodes parasites. A titre d'exemple, on citera l'étude des mécanismes impliqués dans la mise en place d'une immunité locale après l'infestation des cellules épithéliales intestinales par Trichinella.
Les mastocytes conformes à l'invention peuvent également être utilisées pour identifier les antigènes intervenant dans l'activation des mastocytes non seulement chez le porc, mais également chez d'autres animaux, y compris l'homme, en particulier dans le cadre du criblage d'antigènes potentiellement utilisables pour l'obtention de vaccins ou de réactifs de diagnostic. On peut notamment tester ainsi des antigènes recombinants ou synthétiques, sur la base de leur capacité à activer in vitro ces mastocytes.
Dans le cas de Trichinella par exemple, ces antigènes peuvent avoir des applications pour le diagnostic des trichinelloses animales (diagnostic précoce de la trichinellose des suidés), ou pour le développement de vaccins (par exemple vaccination par voie mucosale).
La présente invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non-limitatifs décrivant l'obtention et la culture de populations et de lignées de mastocytes porcins conformes à l'invention.
EXEMPLE 1 : ISOLEMENT DE POPULATIONS PURES DE MASTOCYTES A PARTIR DE MOELLE OU DE FOIE DE FOETUS DE PORC Prélèvement et mise en culture des cellules Les prélèvements ont été réalisés à partir de 7 foetus d'une truie Meishan au 77ème j our de gestation ; 7 foies et 8 fémurs ont été prélevés.
Récolte des cellules du foie Les foies ont été broyés et les cellules individualisées avec 20 ml de trypsine 0,5% EDTA 5 mM, dans un bain marie à 37 C pendant 15 mn. Après incubation, une
filtration sur des gazes stériles a été réalisée en effectuant plusieurs rinçages avec du milieu DMEM (GIBCO), supplémenté en SVF à 15%, Pénicilline/Streptomycine 100 U/ml, Glutamine 2 mM (milieu DMEM complet).
Après une centrifugation de 5 mn à 1000 g, un gradient de ficoll a été utilisé afin d'éliminer les hématies ; le culot est repris dans 25 ml de milieu DMEM pour 17 ml de ficoll. Une centrifugation a été effectuée à 1500 g pendant 25 mn, l'anneau de cellules blanches est ensuite prélevé et rincé deux fois en milieu DMEM complet.
Le culot a été ensuite récupéré dans 10 ml de milieu MEM a (GIBCO) et une numération cellulaire a été réalisée (soit 2. 106 cellules/ml).
Les cellules ont été ensemencées, à raison de 4. 106 cellules/ml, dans une flasque avec 5 ml de milieu MEM a supplémenté en SVF (sérum de veau foetal) à 15%, Pénicilline/Streptomycine 100 U/ml, Glutamine 2 mM, PGE2 (prostaglandine E, Sigma) à 1 uM final (milieu MEM a complet), en présence d'IL3 (2 ng/ml) et de SCF (80 ng/ml) porcins recombinants (BIOTRANSPLANT).
Récolte des cellules de la moelle osseuse Les fémurs de foetus ont été coupés à l'aide de ciseaux à chaque extrémité et la moelle osseuse a été récoltée par perfusion à l'aide d'une seringue contenant du PBS.
- des groupements anioniques du type carboxylique comme par exemple dans les produits décrits dans le brevet EP 186 507 de la société CHISSO CORPORATION, ou de type alkylcarboxyliques comme ceux présents dans le produit X-22-3701E de la société SHIN-ETSU ; 2-hydroxyalkylsulfonate ; 2hydroxyalkylthiosulfate tels que les produits commercialisés par la société GOLDSCHMIDT sous les dénominations "ABIL S201" et "ABIL S255".
Selon l'invention, on peut également utiliser des silicones comprenant une portion polysiloxane et une portion constituée d'une chaîne organique non-siliconée, l'une des deux portions constituant la chaîne principale du polymère l'autre étant greffée sur la dite chaîne principale. Ces polymères sont par exemple décrits dans les demandes de brevet EP-A-412704, EP-A-412707, EP-A-640 105 et WO 95/00578, EP-A-582152 et WO 93/23009 et les brevets US 4, 693,935, US 4,728, 571 et US 4,972, 037. Ces polymères sont de préférence anioniques ou non ioniques.
Les silicones particulièrement préférés conformément à l'invention sont : - les silicones non volatiles choisies dans la famille des polyalkylsiloxanes à groupements terminaux triméthylsilyle telles que les huiles ayant une viscosité comprise entre 0,2 et 2,5 m2/s à 250 C telles que les huiles de la séries DC200 de DOW CORNING en particulier celle de viscosité 60 000 cSt, des séries SILBIONE 70047 et 47 et plus particulièrement l'huile 70 047 V 500 000 commercialisées par la société RHODIA CHIMIE, les polyalkylsiloxanes à groupements terminaux diméthylsilanol tels que les diméthiconol ou les polyalkylarylsiloxanes tels que l'huile SILBIONE 70641 V 200 commercialisée par la société RHODIA CHIMIE ; - la résine d'organopolysiloxane commercialisée sous la dénomination DOW CORNING 593 ; - les polysiloxanes à groupements aminés tels que les amodiméthicones autres que celles de formule (1) ou (II), ou les triméthylsilylamodiméthicone ; Selon l'invention, la ou les agents conditionneurs insolubles dans l'eau peuvent représenter de 0,001 % à 20 % en poids, de préférence de 0,01 % à 10% en poids et plus particulièrement de 0,1 à 3% en poids par rapport au poids total de la composition finale.
dans lesquelles : R1 et R2, identiques ou différents, représentent hydrogène ou un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone et de préférence méthyle ou éthyle ; R3, identiques ou différents, désignent un atome d'hydrogène ou un radical CH3 ; A, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle, linéaire ou ramifié, de 1 à 6 atomes de carbone, de préférence 2 ou 3 atomes de carbone ou un groupe hydroxyalkyl de 1 à 4 atomes de carbone ; R4, R5, R6, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle ayant de 1 à 18 atomes de carbone ou un radical benzyle et de préférence un groupe alkyle ayant de 1 à 6 atomes de carbone ; X désigne un anion dérivé d'un acide minéral ou organique tel que un anion méthosulfate ou un halogénure tel que chlorure ou bromure.
Afin d'avoir un effet antagoniste maximal, les Inventeurs ont défini un ensemble de peptides couvrant la partie C-terminale de 17 acides aminés du récepteur de la FSH codée par l'exon 1 dont le dernier acide aminé correspond à la jonction exonl-exon2, de séquence suivante (SEQ ID NO. 7) : SKVTEIPSDLPRNAIEL Cette séquence de 17 acides aminés est codée par la séquence suivante en nucléotides (SEQ ID NO. 6) : agc aag gtg aca gag att cct tct gac ctc ccg agg aat gcc att gaa ctg La mise en oeuvre d'un mélange de séquences permet d'être le moins restrictif possible par rapport aux différents contrôles immunogénétiques de la réponse anticorps. Il existe également un contrôle sexe spécifique puisque les Inventeurs ont observé des réponses plus importantes chez les mâles que chez les femelles avec le mélange de trois peptides utilisé.
Les combinaisons possibles de peptides sont nombreuses et dépendent du système de présentation.
Toutefois, en considérant des longueurs de dix résidus adaptés au système phage ou aux peptides de synthèse couplés, on peut faire un mélange des 8 peptides possibles couvrant la séquence de 17 acides aminés considérée dans l'invention : SKVTEIPSDL (SEQ ID NO. 9) KVTEIPSDLP (SEQ ID NO. 11) VTEIPSDLPR (SEQ ID NO. 13)
TEIPSDLPRN (SEQ ID NO. 15) EIPSDLPRNA (SEQ ID NO. 17) IPSDLPRNAI (SEQ ID NO. 19) PSDLPRNAIE (SEQ ID NO. 21) SDLPRNAIEL (SEQ ID NO. 23) Ces peptides sont codés respectivement par les oligonucléotides suivants : agc aag gtg aca gag att cct tct gac ctc (SEQ ID NO. 8) aag gtg aca gag att cct tct gac ctc ccg (SEQ ID NO. 10) gtg aca gag att cct tct gac ctc ccg agg (SEQ ID NO. 12) aca gag att cct tct gac ctc ccg agg aat (SEQ ID NO. 14) gag att cct tct gac ctc ccg agg aat gcc (SEQ ID NO. 16) att cct tct gac ctc ccg agg aat gcc att (SEQ ID NO. 18) cct tct gac ctc ccg agg aat gcc att gaa (SEQ ID NO. 20) tct gac ctc ccg agg aat gcc att gaa ctg (SEQ ID NO. 22) Les compositions de l'invention peuvent comprendre l'ensemble complet de peptides définis ci-dessus par rapport à la séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur à la FSH, mais elles peuvent aussi ne contenir qu'un sous-ensemble de 50% ou plus de cet ensemble dès lors que les peptides du sous-ensemble couvrent substantiellement toute la longueur d'une séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur à la FSH et de préférence la partie C-terminale de la séquence peptidique codée par l'exon 1 d'un récepteur à la FSH.
Dans la composition pharmaceutique contraceptive selon l'invention, tout ou partie des peptides de l'ensemble ou du sous-ensemble peut être présent en plus d'un exemplaire avantageusement en deux ou trois exemplaires.
Un ensemble ou un sous-ensemble de peptides mis en oeuvre dans les compositions selon l'invention comprend
plus de 5 peptides, de préférence plus de 10 peptides différents, selon la longueur de chacun desdits peptides. La longueur moyenne des peptides d'un ensemble ou d'un sous-ensemble est de préférence de l'ordre de 10 résidus d'acides aminés.
Les compositions de l'invention sont remarquables en ce que leur effet sur la spermatogenèse est temporaire. Cette réversibilité tient au fait qu'en l'absence de rappel, les taux d'anticorps compétitifs baissent et laissent agir à nouveau l'hormone qui ré-induit la formation de gamètes.
Le ou les peptides des compositions de l'invention présentent généralement un caractère faiblement immunogène, ils sont donc avantageusement associés dans lesdites compositions avec un adjuvant.
Avantageusement, l'adjuvant est constitué par un système de présentation des peptides.
Un premier exemple de réalisation d'un tel système de présentation est constitué par un ou plusieurs vecteurs d'expression, comme un vecteur viral, comprenant une ou plusieurs séquences polynucléotidiques codant un ou plusieurs peptides identiques ou différents. Les peptides peuvent être exprimés sous forme de produits de fusion en un ou plusieurs exemplaires.
L'invention a donc aussi pour objet ce (s) vecteur (s) d'expression ou un hôte ou un ensemble d'hôtes transformé (s) par ce (s) vecteur (s) d'expression et les compositions les comprenant.
A titre d'exemples de vecteurs d'expression et d'hôtes, on peut citer les phages filamenteux, le récepteur des phages ou pili des bactéries E. coli mâles, ou tout autre microorganisme recombinable capable de présenter des peptides au système immunitaire et dont l'injection ou
l'utilisation comme antigène est physiologiquement neutre ou bénéfique.
Le système de phages utilisé chez le singe dans le cadre des travaux de l'invention est intéressant même pour une application humaine, car il est : - efficace, le phage est par lui-même un adjuvant, - très peu coûteux, et - sans effet secondaire ou toxique, puisque l'homme est immunisé contre ces phages.
Mais tout système recombinant présentant plusieurs des avantages ci-dessus est utilisable dans le cadre de l'invention.
L'obtention de cultures in vitro de mastocytes humains s'est avérée plus difficile. Des cultures de cellules de moelle osseuse ou de cordon ombilical en présence d'IL3 ont conduit à l'apparition de granulocytes basophiles (TADOKORO et al., J. Exp. Med., 158,857-871, 1983). La co-culture de cellules de cordon ombilical humain avec des
fibroblastes 3T3 de souris a toutefois permis d'obtenir des mastocytes matures après quatre semaines de culture (ISHIZAKA et al., Current Opinion in Immunology, 5,937-943, 1993 ; FURITSU et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86,10039-10043, 1989). Il a ensuite été montré (ISHIZAKA et al., publication précitée) que la différenciation et la prolifération des. mastocytes humains in vitro dépend du ligand c-kit (également dénommé SCF pour : Stem Cells Factor ) produit par les cellules 3T3.
Les cultures de mastocytes constituent un outil utile pour l'étude des mécanismes impliqués dans différents phénomènes inflammatoires et/ou immunitaires, par exemple dans le cadre de la réponse allergique, ou de la réponse immunitaire à l'agression par divers pathogènes, notamment des parasites. Cependant on n'a jusqu'à présent réussi à différencier et maintenir in vitro des cultures de mastocytes que dans le cas des cellules humaines ou de rongeurs ; en outre on ne dispose actuellement que d'un petit nombre de lignées de mastocytes.
La présente invention a pour but de fournir des cultures de mastocytes provenant du porc, et des lignées de mastocytes issues de ces cultures. En effet, outre son intérêt économique, le porc constitue un modèle de plus en plus utilisé dans le cadre d'études physiologiques et cliniques. D'autre part, le porc héberge des parasites transmissibles à l'homme (Trichinella, cysticerques, toxoplasme), et l'étude du rôle joué par les mastocytes dans les mécanismes de défense vis-à-vis de ceux-ci, présente un grand intérêt du point de vue de la santé animale et de la santé publique (prophylaxie médicale).
Des études précédentes ont montré que l'établissement de lignées de mastocytes humains et de rongeurs uniquement isolées à partir de tumeurs (mastocytomes) nécessitait la présence d'une seule cytokine spécifique dans le milieu de culture.
La présence de mastocytomes de porc est une éventualité extrêmement rare, ce qui a interdit à ce jour, l'obtention de lignées de mastocytes de cette espèce.
Les Inventeurs sont maintenant parvenus à mettre au point une méthode de culture, en présence de 2 cytokines spécifiques, permettant l'obtention, à partir de précurseurs hématopoïétiques du foie ou de la moelle osseuse, d'une population pure de mastocytes porcins, et son maintien en culture pendant une très longue durée.
Ils sont en outre parvenus à obtenir, à partir de cette culture, des cellules immortalisées, conservant les caractéristiques des mastocytes d'origine.
La présente invention a en conséquence pour objet un procédé d'obtention d'une culture de mastocytes porcins caractérisé en ce qu'il comprend la mise en culture de cellules souches obtenues à partir du foie ou de la moelle osseuse d'un foetus de porc, dans un milieu comprenant au moins 0,2 ng/ml, avantageusement de 0,5 à 10 ng/ml, de préférence de 1 à 5 ng/ml, et de manière tout à fait préférée environ 2 ng/ml d'IL-3 porcin, et au moins 8 ng/ml, avantageusement de 20 à 200 ng/ml, de préférence de 40 à 120 ng/ml, et de manière tout à fait préférée environ 80 ng/ml de SCF porcin.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, les cellules sont maintenues en culture dans ce milieu pendant au moins 60 à 70 jours pour obtenir 100% de mastocytes.
Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré de la présente invention, ledit procédé comprend en outre la transformation de ladite culture par un oncogène immortalisant.
La présente invention a également pour objet une culture de mastocytes porcins susceptible d'être obtenue par le procédé conforme à l'invention.
Au moins 90%, de préférence au moins 95%, et de manière tout à fait préférée au moins 99% des cellules de cette culture présentent les caractéristiques suivantes :
- elles renferment des granulations contenant de l'histamine et de l'héparine ; elles expriment le récepteur c-kit et le récepteur des IgE.
La présente invention englobe également les souspopulations, clones, ou lignées de mastocytes pouvant être obtenus à partir des cultures de mastocytes porcins conformes à l'invention, immortalisés ou non.
La présente invention a ainsi plus particulièrement pour objet : une culture de mastocytes non-immortalisés issus de cellules souches du foie foetal de porc, déposée auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, Institut Pasteur, 26 rue du Docteur Roux, 75724 PARIS CEDEX 15, France) le 17 octobre 2001, sous le numéro 1-2735.
29/05/2000 : Dernier rappel et interruption de la vaccination.
10/11/2000 : Reprise des rappels deux fois par mois pour la phase de vaccination 2.
Le degré d'immunisation des animaux a été suivi par le dosage des anticorps circulants dirigés contre les vecteurs phages. Des travaux préliminaires ont établi que l'immunité contre le vecteur est une mesure proportionnelle de l'immunité contre le peptide exposé par le phage et contre le récepteur. Des techniques d'ELISA directes ou indirectes ont été employées, selon que les phages aient été adsorbés par le plastique des microplaques de 96 puits, ou qu'ils aient été liés par des anticorps anti-phages M13 préalablement adsorbés. Plusieurs dilutions de sérum (volumes de 0, 1 ml dans du PBS additionné de BSA à 1%) ont été incubés pendant une heure à 37 C dans les puits recouverts de phages. Après trois lavages des puits au PBS sans BSA, des anticorps anti-espèces biotinylés et une solution de streptavidine couplée à la peroxydase (dilutions au 1/1000ème) ont été incubés pendant une heure à 37 C. Après lavage des puits, un substrat coloré de la peroxydase a permis la mesure d'une densité optique relative, et le calcul d'un titre anticorps pour chaque antisérum. Plusieurs contrôles ont été effectués pour chaque essai pour la mesure des bruits de fond : sérum d'animaux non immuns, absence de sérum dans les puits et absence d'anticorps secondaires.
4) Paramètres endocrines.
Les taux de testostérone, d'oestradiol et de progestérone circulant dans le sérum des animaux ont été évalués en utilisant des essais radioimmunologiques (RIA) spécifiques.
La testostérone matinale et vespérale a été dosée à intervalles réguliers pour tous les singes mâles dès après le début du traitement vaccinal. Les dosages d'oestradiol et de progestérone chez les femelles ont permis
de mesurer la durée des cycles ovariens, la durée moyenne des cycles chez la femelle Macaca radiata étant identique à celui de la femme.
5) Spermatogenèse, études de fertilité et de comportement.
Des échantillons de sperme ont été obtenus toutes les deux semaines pendant les 14 mois de l'expérience par électroéjaculation. L'évaluation de la production en spermatozoïdes par éjaculat a été effectuée par une méthode d'examen microscopique selon le protocole préconisé par l'OMS.
Pour tester la fertilité des singes mâles vaccinés ou non vaccinés, les femelles partenaires présentant un cycle régulier, ont été suivies pour la production d'oestradiol tous les jours entre les jours 7 et 10 du cycle. Une femelle avec un taux d'oestradiol circulant au moins égal à 250 pg/ml (jour 7,8, 9 ou 10 du cycle) est mise en couple avec un mâle du jour 10 au jour 16 du cycle menstruel. La fécondation et la grossesse est ensuite suivie par le dosage quotidien de la progestérone jusqu'au jour 30, puis, par la suite, par échographie.
Le nombre d'accouplements (libido et comportement sexuel) a été évalué pour quelques couples par l'utilisation de caméras vidéo, ces singes ayant un comportement sexuel perturbé (inhibé) par la présence humaine.
II-Résultats.
1) Immunité.
Les animaux ont été immunisés contre des phages dont environ 20% des protéines de surface présentent un décapeptide du récepteur de FSH comme défini précédemment.
Pour des raisons techniques (indisponibilité des peptides,
non reproductibilité des Elisas anti-peptides) la mesure de la proportion d'anticorps effectivement dirigés contre le peptide de récepteur présenté à la surface du phage est impossible en routine. De même, la proportion d'anticorps efficaces, c'est-à-dire ayant une activité antagoniste en se liant au récepteur, ne pourra s'évaluer que dans un système cellulaire recombinant in vitro, comme décrit par Abdennebi et al. (Journal of Molecular Endocrinology (1999) 22, Apr 22 (2) : 151-159), après purification par chromatographie d'affinité de la fraction d'immunoglobuline présente dans les antisérums.
1-Matériel et méthodes.
1) Animaux.
Les expériences ont été effectuées sur des singes Macaques (Macaca radiata) adultes des deux sexes (10 mâles et 10 femelles). Cinq singes de chaque sexe ont été vaccinés, les dix autres ayant servi de témoins. Tous les animaux utilisés sont issus de l'élevage interne de l'Institut Indien des Sciences de Bangalore. Ils sont donc régulièrement suivis par un personnel spécialisé, dont un vétérinaire chargé de contrôler l'absence de pathologies infectieuses et parasitaires. Avant d'être recrutés dans le protocole, tous les animaux ont été testés pour les paramètres endocrines et pour leur fertilité. Pour les femelles, les taux de 17 bêta-oestradiol et de progestérone ont été dosés sur une durée d'au moins trois cycles. Pour les mâles, la production de spermatozoïdes, ainsi que le rythme et la régularité des variations circadiennes de testostérone ont été mesurés. Des mesures de poids et de volume testiculaire ont également été effectuées. Des observations des comportements sociaux et sexuels des animaux immuns et témoins ont été réalisées sur toute la durée de l'expérience.
2) Construction de phages recombinants présentant à leur surface des fragments du récepteur de la FSH.
Les vecteurs utilisés sont des phages filamenteux recombinants de type fd. Ces vecteurs ont été conçus pour la construction de banques de séquences peptidiques aléatoires, permettant de sélectionner et/ou d'identifier des peptides se liant avec une forte affinité à des cibles diverses (anticorps, récepteurs, enzymes, etc...). Ces phages sont composés d'un ADN circulaire
d'environ 10 kilobases entourés d'une dizaine de protéines.