INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La répartition granulométrique des particules enrobées E3 obtenues par application de l'enrobage protecteur sur les granules E2, est indiquée dans le Tableau 7 : Tableau 7
Ouverture de maille E3 >0.500mm 15.8% 0.425mm-0.500mm 41. 2% 0.355mm-0.425mm 38. 4% 0.250mm-0.355mm 4. 6%
On établit un profil de dissolution comparatif entre les granules enrobés E2 et E3 dans les conditions suivantes : - appareil : USP type II - vitesse des pales : 100 tours par minute
- volume : 900 ml - température: 37.0 C ~0.5 C - détection : UV directe à 272 nm - milieu de dissolution :HCl 0. 01 N (pH = 2) Les résultats enregistrés sont réunis dans le Tableau 8 : Tableau 8
Théophylline libérée (%(w/w) Temps (heure) E2 E3 1 12 10 2 21 16 4 36 34 6 48 49 8 57 60 10 63 68 Conclusion De l'examen des résultats réunis dans le Tableau 8, il résulte que l'application de l'enrobage protecteur sur les granules enrobés E2, n'en modifie pas de façon significative le profil de dissolution.
Exemple 4 : Comprimés orodispersibles comprenant de la théophylline comme principe actif.
Compression On utilise une machine à comprimer alternative "Manesty F3 press" équipée de poinçons POLO de 12mm de diamètre.
dans lequel les vitesses de dissociation sont identiques en présence et en absence d'effecteur, mais dont les amplitudes (et donc les concentrations fractionnelles des divers états confonnationnels) diffèrent. On obtiendra ainsi des rapports de concentration [Repos]/[Actif] qui différeront lorsque l'agoniste seul est présent et lorsque l'agoniste et l'effecteur allostérique sont présents tous deux. De la même manière, l'expérience peut être conduite avec un antagoniste : dans ce cas, l'effet des effecteurs allostériques sera de signe opposé à celui qui est observé pour un agoniste.
Si on effectue une dissociation après association à l'équilibre, on pourra révéler cette différence d'affinité entre R et A par une cinétique de dissociation présentant un décours temporel monoexponentiel (0,01# Loc # 100) ou biexponentiel pour Loc > 100 ou Loc < 0,01. Dans le cas où la cinétique est biexponentielle, elle est décrite à l'aide de 2 constantes de vitesse et de 2 amplitudes, et le rapport des 2 amplitudes correspond à la concentration fractionnelle de chacun des états. Lorsque la cinétique de dissociation est biexponentielle, on enregistre la somme des évènements de dissociation de chacun des états confonnationnels.
De même que précédemment, dans le cas des effecteurs, on peut décrire les affinités relatives KR et KA pour respectivement R et A de la manière suivante, avec c = KA/KR: Affinité pour État de repos État actif c Effecteur positif moins bonne meilleure c Effecteur négatif meilleure moins bonne c # 1 Dans cette description, un effecteur positif déplace l'équilibre R # A en faveur de A car son affinité est meilleure pour A que pour R. Inversement, l'effecteur négatif déplace l'équilibre vers R.
Ainsi, dans le cas où il existe deux états, à savoir un état actif et un état de repos, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la cinétique de dissociation du complexe formé entre ledit récepteur et l'un de ses ligands (agoniste), en présence dudit effecteur, est plus lente que la cinétique de dissociation du complexe formé entre ledit récepteur et ledit ligand, en l'absence dudit effecteur, ce qui implique que l'effecteur allostérique est un effecteur positif. Dans ce
mode de réalisation préféré de l'invention, le ligand est un agoniste : il déplace donc l'équilibre R # A vers A (état actif du récepteur) pour lequel il a une affinité plus élevée et donc une vitesse de dissociation plus lente, tandis que l'effecteur allostérique déplace aussi l'équilibre vers A, ce qui a pour effet d'augmenter l'amplitude de la dissociation lente et de diminuer l'amplitude de la dissociation rapide.
Dans le cas où il existe deux états, à savoir un état actif et un état de repos, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la cinétique de dissociation du complexe formé entre ledit récepteur et l'un de ses ligands (agoniste), en présence dudit effecteur, est plus rapide que la cinétique de dissociation du complexe formé entre ledit récepteur et ledit ligand, en l'absence dudit effecteur, ce qui implique que l'effecteur allostérique est un effecteur négatif. Dans ce mode de réalisation préféré de l'invention, le ligand est un agoniste : il déplace donc l'équilibre R # A vers A (état actif du récepteur) pour lequel il a une affinité plus élevée et donc une vitesse de dissociation plus lente, tandis que l'effecteur allostérique déplace aussi l'équilibre vers R, ce qui a pour effet de diminuer l'amplitude de la dissociation lente et d'augmenter l'amplitude de la dissociation rapide.
Dans le cas où il existe deux états, à savoir un état actif et un état de repos, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la cinétique de dissociation du complexe formé entre ledit récepteur et l'un de ses ligands, en présence dudit effecteur, est plus lente que la cinétique de dissociation du complexe formé entre ledit récepteur et ledit ligand, en l'absence dudit effecteur, ce qui implique que l'effecteur allostérique est un effecteur négatif. Dans ce mode de réalisation préféré de l'invention, le ligand est un antagoniste : il déplace donc l'équilibre R # A vers R (état de repos du récepteur) pour lequel il a une affinité plus élevée et donc une vitesse de dissociation plus lente, tandis que l'effecteur allostérique stabilise l'état de repos, ce qui a pour effet d'augmenter l'amplitude de la dissociation lente, tout en diminuant l' amplitude de la dissociation rapide.
Dans le cas où il existe deux états, à savoir un état actif et un état de repos, la présente invention concerne un procédé tel que défini ci-dessus, caractérisé en ce que la cinétique de dissociation du complexe formé entre ledit récepteur et l'un de ses ligands, en présence dudit effecteur, est plus rapide que la cinétique de dissociation du complexe formé entre ledit récepteur et ledit ligand, en l'absence dudit effecteur, ce qui implique que l'effecteur allostérique est un effecteur positif. Dans ce mode de réalisation préféré
de l'invention, le ligand est un antagoniste : il déplace donc l'équilibre R # A vers R (état de repos du récepteur) pour lequel il a une affinité plus élevée et donc une vitesse de dissociation plus lente, tandis que l'effecteur allostérique stabilise l'état actif, ce qui a pour effet de diminuer l' amplitude de la dissociation lente, et d'augmenter l' amplitude de la dissociation rapide.
Dans le cas où le récepteur peut adopter un nombre de conformations supérieur à deux, il convient d'identifier les conformations occupées par le ligand fluorescent afin de déterminer sur quels équilibres conformationnels porte l'effet de l'agent allostérique supposé.
Ainsi, s'il existe trois états conformationnels R (repos), A (actif) et D (désensibilisé), l'agoniste peut occuper les états A et D tandis que l'antagoniste se liera de manière préférentielle à l'état R ou à l'état D. Il en résultera des effets de nature différente de l'agent allostérique selon que l'on utilisera un agoniste fluorescent ou une antagoniste fluorescent dans les expériences de mesure de liaison. L'effecteur positif (qui stabilise A) réduira la liaison de l'agoniste à l'état D. Il y aura augmentation de la vitesse de dissociation par disparition d'une fraction des récepteurs dans l'état D qui généralement lie l'agoniste avec une affinité plus grande que l'état A.
De la même manière, si il existe deux états actifs Al et A2, un effecteur stabilisant Al aura pour effet de réduire la liaison à A2 (et diminuera les réponses qui y sont associées) tandis qu'il augmentera la liaison à Al (et potentialisera les réponses qui y sont associées). Dans ce cas, on observera une augmentation de la vitesse de dissociation de l'agoniste fluorescent.
L'analyse des cinétiques d'association du ligand est plus complexe. Elle dépend en effet du système expérimental analysé. Pour certains récepteurs, et dans certaines conditions expérimentales, il est possible d'observer des cinétiques d'association multiexponentielles. Dans ces cas, la cinétique la plus rapide reflète l'interaction bimoléculaire du ligand (agoniste ou antagoniste) avec le récepteur, tandis que les cinétiques plus lentes peuvent refléter des interconversions conformationnelles qui prennent place plus lentement. Si cela est observé expérimentalement, il est alors possible d'analyser les amplitudes des cinétiques lentes et d'observer des variations de ces amplitudes en présence d'un effecteur allostérique. Ces variations refléteront la stabilisation différentielle des divers états conformationnels par l'effecteur allostérique.
Dans d'autres cas défavorables, les interconversions conformationnelles sont cinétiquement invisibles car plus rapides que la cinétique d'association bimoléculaire du
ligand avec le récepteur. L'effet d'un effecteur allostérique sur la vitesse d'association n'est alors pas détectable expérimentalement.
L'analyse des réponses est une manière de suivre l'état actif du récepteur. En effet, on définit l'état actif comme un état conformationnel doté de la capacité de produire la réponse biologique. L'analyse des réponses doit porter sur plusieurs paramètres : L'un des paramètres les plus simples à évaluer est l'amplitude de la réponse.
Lait écrémé.
6) Méthodes : 6.1) Méthodes de physiologie végétale 6. 1. 1) Conditions de culture > Culture en terre Les cultures en terre ont été réalisées dans un mélange de terreau horticole et de vermiculite, stérilisé par un autoclavage à 125 C pendant 20 minutes. Les plantes ont été cultivées dans une chambre de culture, à 20-22 C, en lumière continue.
> Culture in vitro Pour la culture in vitro, les graines ont été stérilisées sous hotte à flux laminaire, par incubation dans un produit stérilisant (Domestos, Unilever) à 10% (v/v) dans de l'eau distillée stérile, pendant 10 minutes. Puis elles sont rincées 5 fois dans de l'eau distillée stérile. Les graines sont ensuite mises à germer dans des boîtes de Pétri (20 x 100 mm) contenant du milieu gélosé MS, avec ou sans antibiotique. Les plantes ont été cultivées dans une chambre de culture, à 20-22 C, en jours continus.
6. 2) Méthodes de biologie moléculaire 6. 2. 1) Manipulation de l'ADN 6. 2. 1. A) Méthodes d'extraction > ADN plasmidique L'ADN bactérien plasmidique a été extrait selon une procédure de lyse alcaline et purifié à l'aide de deux kits différents selon la quantité de plasmide requise : le kit "High Pure Plasmid isolation Kit" de Boehringer Mannheim a été utilisé pour réaliser des mini-préparations de plasmides (environ 20 g) à partir de 5 ml de culture saturée (E. coli souche DH5a). Ce kit utilise une colonne de silice pour retenir l'ADN. Le kit "WizardTM Plus Midiprep DNA Purification System" de Promega a été utilisé pour extraire de plus grandes quantités de plasmide (environ 100 g pour les plasmides à grand nombre de copies) à partir de 50 ml de culture saturée (E. coli souche DHSa) Ce kit utilise une colonne d'hydrochlorure de guanidine pour retenir l'ADN.
> ADN génomique Méthode Dellaporta : cette méthode a été employée pour extraire rapidement et facilement de nombreux lots d'ADN génomique destinés à la vérification PCR des plantes transgéniques. Ce protocole, décrit par Dellaporta (Dellaporta et al., PMB, 1983,1, 19-21), a été adapté à de plus petits volumes pour être réalisable en tubes de 500 l. Chaque extrait a été obtenu à partir de 2 à 4 feuilles (selon leur taille) d'une même plante d'Arabidopsis thaliana.
6.2.1.b) Réaction de Polymérisation en Chaîne (PCR) :
> Sur l'ADN plasmidique ou génomique, après extraction : Les réactions sont réalisées dans des tubes de 500 l, dans un volume final de 25 l : "mix" : mélange des constituants suivants, préparé pour toutes les réactions PCR : 10 pmoles de chacun des deux oligonucléotides spécifiques, 11 M de chaque dNTP, 2,5 l d'un tampon 10x, fourni par la compagnie commercialisant la polymérase, 1,25 mM de MgCl2 (ou MgS04, selon l'enzyme utilisée), 1 unité de d'ADN-polymérase thermostable, ADN matrice (fonction de la polymérase employée et du type d'ADN matrice), qsp 25 (il d'eau dessalée, déionisée et stérile.
Pour les réactions PCR classiques ne nécessitant pas l'obtention d'un produit de séquence strictement identique à celle de la matrice, les polymérases d'ADN thermostables Dynazyme (Ozyme), Taq (Promega) et Tfl (Promega) ont été utilisées.
Dans ce cas, 5 ng d'ADN plasmidique ou 200 ng d'ADN génomique suffisent à la réalisation de l'expérience.
Pour obtenir un fragment amplifié dont la séquence est identique à celle de la matrice, l'enzyme de fidélité Pfu (Stratagène) a été utilisée. Cette enzyme requiert une quantité de matrice plus importante : classiquement 100 à 150 ng de plasmide ont été utilisés, selon les recommandations du fournisseur. Dans le cas d'une matrice d'ADN génomique, 500 à 1000 ng ont été utilisés.
Enfin, lorsqu'un produit PCR de taille supérieure à 2 kb était attendu, la PfuTurboTM (Stratagène) a été choisie. Les quantités d'ADN matrice utilisées sont alors de 10 ng pour l'ADN plasmidique et environ 500 ng pour l'ADN génomique.
Les conditions de réaction sont :
Dénaturation 93 C, 3 min Dénaturation 93 C, 1 min Hybridation entre 48 et 55 C, 1 min Elongation 72 C, variable** Extension finale 72 C, 10 min **variable selon le couple d'amorces Tfl et PfuTurboTM : 1 min/kb à amplifier Pfu : 2 à 3 min/kb à amplifier Le nombre n de cycles PCR est compris entre 30 et 40 pour les réactions mettant en jeu la Dynazyme (Ozyme), la Taq (Promega) et la Tfl (Promega). Pour les réactions réalisées avec les enzymes de fidélité, le nombre de cycles est plus faible (jusqu'à 25), de façon à limiter les erreurs.
> Sur l'ADN plasmidique contenu dans des cellules bactériennes : L'amplification d'une séquence plasmidique peut directement se faire à partir de colonies bactériennes, ceci pour rechercher les colonies correspondant aux bactéries recombinantes (ayant effectivement intégré le plasmide contenant l'insert d'intérêt) Le "mix" PCR (même composition que celle donnée ci-dessus) est préparé et réparti par 25 l dans plusieurs tubes de 500 l. L'enzyme utilisée est la Dynazyme (Ozyme), la Taq (Promega) ou la Tfl (Promega).
Les colonies sont prélevées à la surface du milieu de culture solide à l'aide de tout outil de prélèvement approprié (cône, loupe, etc. ), repiquées sur une boite neuve contenant du milieu de culture LB solide, et l'outil de prélèvement est plongé dans le "mix" et brièvement agité.
Les conditions PCR sont les mêmes que celles données précédemment.
après le listage payé de plus faible rang. De préférence, des listages non payés sont affichés uniquement lorsque le nombre de listages pouvant remplir les quarante emplacements de la page de résultats de recherche est insuffisant. Les listages non payés sont créés par un moteur de recherche utilisant une base de données distribuées objet et des algorithmes de recherche de texte connus dans la technique.
Un exemple d'un tel moteur de recherche peut être exploité par Inktomi Corporation. La requête de recherche originale saisie par la personne distante est utilisée pour la création de listages non payés par le moteur de recherche classique.
On peut noter d'après ce qui précède que les modes de réalisation actuellement décrits concernent un procédé et un appareil perfectionnés de commande d'affichage des résultats de recherche dans une liste de résultats de recherche. Le système a été perfectionné par addition d'une interface XML au serveur de gestion de comptes et aux ordinateurs des clients. La communication entre le serveur et les clients pour la commande des listages de recherche d'un ou plusieurs annonceurs s'effectue en fonction d'un ou plusieurs schémas XML prédéterminés. Les schémas définissent les paramètres et valeurs pour cibles de données utilisées pour la gestion des comptes d'annonceur et des listages de recherche. De cette manière, les groupes de listages de recherche de plusieurs annonceurs peuvent être gérés efficacement par un utilisateur unique. En outre, les opérations automatiques peuvent être spécifiées pour la remise à jour des listages de recherche, pour l'obtention de l'état du marché, pour la réception d'informations de compte et pour la production de rapports. Le système et le procédé décrits peuvent être utilisés à la fois par les annonceurs pour la gestion de leurs propres comptes et de leurs propres listages de recherche et par des tiers pour la gestion des comptes et listages de recherche d'un ou plusieurs annonceurs.
Un avantage de l'invention est d'assurer des communications bidirectionnelles fiables des requêtes et réponses entre un client ayant un outil d'enchère pour gestion de
comptes et un serveur d'outil d'enchère de gestion de comptes par utilisation d'interfaces XML complémentaires à la fois du côté du client et du serveur. Un autre avantage de l'invention est qu'elle permet la réalisation sur un réseau distribué d'une interface sécurisée courante de serveur extérieur destinée à être utilisée par des systèmes clients d'annonceur pour l'exécution de fonctions de gestion de comptes avec un marché commercial en ligne, comprenant la récupération de listages de recherche, la récupération de l'état du marché, la récupération d'un ensemble d'identificateurs de comptes d'un ou plusieurs annonceurs, la modification d'une enchère ou d'un autre paramètre d'un ou plusieurs listages de recherche, l'addition d'un ou plusieurs listages de recherche associés à un annonceur, et la suppression d'un ou plusieurs listages de recherche associés à un annonceur. Un autre avantage de l'invention est qu'elle permet l'automatisation de ces fonctions de gestion de comptes par utilisation d'un schéma commun pour la création des requêtes au serveur et d'un autre schéma commun pour la compréhension des réponses provenant du serveur.
Bien entendu, diverses modifications peuvent être apportées par l'homme de l'art aux systèmes, procédés, outils, ordinateurs et supports qui viennent d'être décrits uniquement à titre d'exemple non limitatif sans sortir du cadre de l'invention.
ANNEXE A : de requêtes Obtient identités des comptes (utilisateur normal) xmlrs.xsi="http-//%4ww.w3,org/2()01/XMLSChema-instanCe" version="1. 0" username="testacct" password="fictionalpass"> Obtient identités des comptes (utilisateur administrateur) xmlns;xsi="http://www.w3.org/2001/XMLSchema-instance" version="1.0" username="testadminuser" password="ficticnalpass"> Obtient les listages z get all listings by search terra --> url="http://www.gotO.COm"/>
Obtient état du marché xmlns :xsi="http: //wwk. w3 , org/ 2 00 1/XMLS chaîna-instance" version="1.0" username="testacct" password="fictionalpass"> Etablit listages xmlns:xsl="http://www.w3.org/2001/XMLSchema-instance" version="1. 0" username="testacct^ password--"fictionalpass">
ANNEXE B : exemples de réponses du serveur Obtient identités de comptes (utilisateur normal) Obtient identités de comptes (utilisateur administrateur) xsi:noNamespaceSchemaLocation="dtc,xsd" success="true"> Obtient listages xmlns:xsi="http:l/www.w3.org/2001/XMLSChema-instance" xsi:noNamespaceSchemaLocation="dtc.xsd" success="true"> listing listingID="29153391" url="http://mappedtocouponurl.com/" searchTerm="best web site for coupon" bid="C.13" title="Title mapped to 'coupon' description="Dese mapped to 'coupon'"
market="US" online="true"/> s2archTerm="gototest123456789" bid="0.05" title="test" description="test,"market="US" online="true"/> Obtient état du marché free!" siteHost="www~coolsavings.com" bid="0.39" currency="USD" /> at ClipACoupon!" description-"lt's totally free! Enroll now to print free money saving coupons when you want or need them. Print free coupons or receive great online deals from our local and national marchants." si teHost="www. ci ipacoupon.com" bid="0.27" currency="USD" /> <Listing rank="3" title="The Online Coupon Resource" description-"Click here to visit lOOGreatCoupons.com. We can help to save you money on
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Les échantillons séchés sont repris dans 200pl d'eau et testés à 3 dilutions différentes : 40 l, 25 l et 16 l de ces échantillons sont distribués dans les plaques de test avant ajout de 180ul d'inoculum par puits. Les microplaques sont incubées à 30 C durant 16 à 18h, puis la densité optique (DO) des puits est mesurée à 595 nm. Les résultats sont interprétés en calculant le pourcentage de pousse pour chaque puits selon la formule : %Pousse=(DO puits - DO du TS)/(DO du TP - DO du TS)*100 où DO du TP= DO du témoin de pousse (inoculum seul), DO du TS= DO du témoin de stérilité (milieu de culture sans bactéries) et DO puits = DO du puits dont on souhaite calculer le pourcentage de pousse (inoculum + défensine d'insecte hybride). Les défensines d'insectes hybrides sont considérées comme actives lorsque le pourcentage de pousse est inférieur ou égal à 10.
C) Activités anti-bactériennes in vitro.
Les activités anti-bactériennes de chacune des défensines d'insectes hybrides (ETD-P) ont été évaluées par détermination de l'IC90 (Inhibition de Croissance > à 90%). Les activités de chacune des défensines hybrides sont comparées à celles de la défensine du 1) Isolement.
Les clones de défensines hybrides d'intérêt, identifiées selon le protocole précédemment décrit dans la
partie B), sont repris d'un des stocks de microplaques 384 puits conservées à -80 C (partie B), paragraphe 1)). Un ensemencement est réalisé sur une gélose YNBG Casamino acides agar et placée dans un incubateur à 30 C pendant 48 à 72 heures. Après observation de l'état de pousse des levures, une colonie est isolée, étalée sur une boîte YNBG Casamino acides agar et incubée pendant 24 à 48 heures à 30 C. L'expression est contrôlée par PCR.
2) Production.
Une préculture est préparée par mise en suspension d'une colonie dans 4mL de milieu Kapeli puis la préculture est incubée pendant 18 à 24 heures à 30 C sous agitation.
50mL de milieu Kapeli sont répartis dans des fioles de 500mL.
La DO des précultures est mesurée à une dilution au 1/100ème (990 L d'eau + 10 L de préculture homogénéisée) pour déterminer la DO de la préculture non diluée. La préculture est ensuite diluée de façon à obtenir une solution de DO=0.05 selon la formule : d=0.05/DO préculture non diluée. Un volume de la préculture, défini selon la formule V (préculture) =50/d, est ajouté aux 50mL de milieu Kapeli pour obtenir une solution de DO=0.05. Les fioles sont mises à incuber à 30 C pendant 48H sous agitation (250rpm/min).
La culture obtenue est centrifugée dans des tubes coniques à centrifuger 50mL pendant 15min à 4000tr/min. Le surnageant est transvasé dans un autre tube 50mL et est purifié avec le Sep-pack , sur Oasis HLB lg de phase selon les étapes suivantes : Equilibrage de la phase avec 15mL de méthanol pur, lavage avec 15mL de mélange eau/TFA 0.05%, chargement du surnageant à purifier, lavage avec 15mL de mélange eau/TFA 0.05% et élution avec lOmL de
mélange eau/Acétonitrile 60%/TFA 0. 05%. Le mélange Acétonitrile/H20 est évaporé sous vide (30 C, 9 mbars, 24 heures) puis les échantillons sont repris dans 400uL d'eau et disposés sur un agitateur.
4) Quantification et contrôle de masse en vue des tests d'activité.
La quantification et le contrôle de masse est réalisé selon le protocole précédemment décrit dans la partie B), paragraphe 5).
5) Détermination des IC90.