INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
2 5 Lorsque le moto-réducteur (1) transmet l'effort au pignon (18), ia chaine (3) se déplace entrainant avec elle l'ensemble flasque chariot (5), entraineur (4),
rondelles (22), roulement (6), vis (10), écrou (11), qui forment le chariot.
La liaison chaine avec chariot est réalisée par deux goupilles (13).
A l'autre extrémité de l'armature, la rotation de la chaine est assurée par une roue 3 0 libre (30). Cette roue libre (30) est maintenue par un ensemble vis (23), rondelle (26), écrou (25) sur un tendeur (27). Ce tendeur (27) possède une lumière qui lui permet de coulisser sur une bride (28). Le tendeur (27) est maintenu sur la bride
(28) par un ensemble vis (24),écrou et rondelles.
Le réglage de la tension est effectué par un tirant (29). La rotation des écrous sur 3 5 le tirant (29) fait coulisser le tendeur (27) sur la bride (28), ce qui a pour effet de
tendre la chaine.
-3 La liaison chariot avec la porte est effectuée par un entraineur (4). Un axe (23) est
fixé sur l'entraineur (4) par une goupille (13), voir fig.7.
Sur cet axe (23), est ajusté un coulisseau (24) qui a un mouvement libre de translation de façon à admettre un défaut d'alignement entre l'armature (8), fixée au plafond ou sur le linteau, et le rail de guidoge de la porte. Le coulisseau (24), entraine la vis (14);I'ajustement entre ces deux pièces est libre de façon à tolérer des défauts de niveau entre l'armature (8) et le rail de guidage
de la porte.
La vis (14) est solidaire du chariot (9), elle est maintenue sur le chariot par deux
écrous (15).
Cette technique de RT-PCR en temps réel est la méthode actuellement préférée qui permet de donner des résultats quantifiables de différences d'expression des ARNm.
Une étude de la cytotoxicité des actifs retenus sur des doses croissantes de 0,001% à 10 %, de préférence de 0,01 % à 10 %, est réalisée. Une viabilité doit être fixée, elle est de préférence supérieure à 65 %, et de manière encore plus préférée à 75%. Cette viabilité fixe la limite de concentration non cytotoxique.
Les principes actifs potentiels à cribler sont alors testés sur plusieurs concentrations, allant de préférence de 0,001% à la concentration
limite non cytotoxique, sur des cellules épithéliales normales, de préférence kératinocytes humains normaux, en monocouche, en milieu défini sans sérum tel qu'il est décrit précédemment.
Les surnageants sont alors collectés et les cellules sont éventuellement congelées à sec à -80 C après un rinçage au PBS. Les ARN totaux sont extraits et dilués dans la même plage de concentration que précédemment citée. Ces ARN dilués serviront à la RT-PCR quantitative sur l'actine, hBD2 et hBD3.
Cette technique est réalisée de préférence sur les mêmes quantités que précédemment d'ARN initial, de préférence à l'aide d'un kit en une étape contenant du SYBR Green, cependant le système de RT-PCR peut être basé sur une autre technique que le SYBR Green, tel que par exemple Scorpion, Molecular beacons#, sondes TaqmanTM, etc., avantageusement dans un thermocycleur à fluorescence avec les mêmes amorces que précédemment, où il est effectué un programme d'amplification, qui peut être identique à celui précédent.
La réalisation d'une étude des courbes de fusion permet de vérifier la spécificité des produits amplifiés. La courbe de fluorescence en fonction du nombre de cycles donne la valeur C (T) au nombre de cycles nécessaires pour avoir un décollement du signal de fluorescence.
Plus un ARNm est exprimé, plus le C (T) sera faible. Un calcul des Sgène=(1/2)cm pour chaque ARN permet de tenir compte de l'augmentation exponentielle du nombre de copies lors de l'amplification. Les rapports de Sgène hBD2/Sgène actine, et Sgène hBD3/Sgène actine peuvent être éventuellement comparés au témoin non traité et donner ainsi le pourcentage de stimulation obtenu.
Les témoins non traités peuvent être identiques à ceux de la première étape de la méthode de criblage de la présente invention.
Les surnageants des principes actifs potentiels à cribler ayant confirmé leur capacité d'induction des défensines sont testés éventuellement par Kit ELISA pour doser les taux de MIP3a, IL8 et ILla.
De préférence, ces dosages sont réalisés sur le surnageant. Les taux sont rapportés à la concentration d'ARN dosé de chaque échantillon. Il peut être ainsi confirmé le caractère non-inflammatoire des actifs sélectionnés et/ou trouver la dose optimale de stimulation des défensines sans induction de la sécrétion des molécules de l'inflammation.
La présente invention concerne également les principes actifs testés par cette méthode de criblage puisque le but principal des inventeurs était de trouver des principes actifs capables d'induire l'expression des ssdéfensines de type 2 et/ou de type 3 sans stimuler ladite sécrétion des molécules.
Dans une optique de criblage (ou de screening), une culture de cellules épithéliales humaines normales, de préférence des kératinocytes normaux est privilégiée lorsqu'elle est effectuée sur des plaques de 96 puits. L'expression des défensines hBD2 et hBD3 est très faible dans des kératinocytes basaux indifférenciés et elle varie beaucoup en fonction du donneur et du lieu de prélèvement des cellules. hBD2 est notamment retrouvée dans 100% des échantillons issus de peau de visage ou de prépuce, et dans seulement 50% des peaux de chirurgie abdominale ou mammaire (Ali RS et al., Expression of the peptide antibiotics hBDl and hBD2 in normal human skin. J Invest Dermatol 2001 ; 117 :106-111).
La présente invention permet de fournir un modèle reproductible, permettant de tester une large panoplie de principes actifs potentiels à cribler et de détecter l'expression des ARNm de hBD2 et hBD3.
La présente invention concerne un système de culture de kératinocytes en milieu défini en calcium. La différenciation induite par ces
conditions de culture permet d'augmenter le niveau basal d'expression des ARNm des défensines hBD2 et hBD3 et donc de faciliter la détection de leur stimulation.
Une préculture dans 4 ml de milieu LB, est obtenue par ensemencement d'une colonie de Staphylococcus aureus (souche
clinique 21, sensible à : amoxicilline, pristinamycine, érythromycine, péfloxacine, sulfaméthoxazole, triméthoprime, kanamycine, acide fusidique, fosfomycine, gentamycine, amikacine, rifampicine, oxacilline, teicoplanine, chloramphénicol, imipénème, vancomycine et méthicilline.; Don de l'Institut de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg), et incubée à 37 C sous agitation pendant 16h.
200 l de cette préculture sont distribués dans 8 tubes de 4 ml de milieu LB, puis incubés 4h à 37 C sous agitation pour obtenir la solution primaire. Un inoculum est réalisé par dilution de cette solution primaire (environ au 1/100ème), de manière à obtenir une concentration en Staphylococcus aureus de 1,1.106 bactéries/ml. Les concentrations sont calculées par mesure de la DO à 600 nm de la solution primaire selon la formule : en Staphylococcus aureus = 5,25.108 x DO - 3. 107 (pour des DO allant de 0,05 à 0,3 environ) et contrôlées via une dilution en cascade (10-1, 10-2, 10-3,... ) de la suspension à 2.106/ml et comptage des Unités Formant Colonies (UFC) après étalement de 100 L des dilutions 10-6, 10-5 et 10-4 sur des boîtes LB agar. Après incubation à 30 C pendant 16 à 18 heures, les colonies sont dénombrées (UFC/ml).
Les échantillons séchés sont repris dans 200ul d'eau et testés à 3 dilutions différentes : 40 l, 25 l et 16 l de ces échantillons sont distribués dans les plaques de test avant ajout de 180ul d'inoculum par puits. Les microplaques sont incubées à 30 C durant 16 à 18h, puis la densité optique (DO) des puits est mesurée à 595 nm. Les résultats sont interprétés en calculant le pourcentage de pousse pour chaque puits selon la formule : %Pousse=(DO puits - DO du TS)/ (DO duTP - DO du TS)*100 où DO du TP= DO du témoin de pousse
(inoculum seul), DO du TS= DO du témoin de stérilité (milieu de culture sans bactéries) et DO puits = DO du puits dont on souhaite calculer le pourcentage de pousse (inoculum + défensine d'insecte recombinée). Les défensines d'insectes recombinées sont considérées comme actives lorsque le pourcentage de pousse est inférieur ou égal à 10.
Les polynucléotides double brin recombinés ETD-P1255, ETDP1263, ETD-P1268, ETD-P1354, ETD-P1364, ETD-P1377, ETD-P1447 et ETD-P1449 sont décrits dans la liste de séquence sous les identificateurs de séquences SEQ ID NO : 99 à 106.
Les défensines d'insectes recombinées ETD-P1255, ETD-P1263, ETD-P1268, ETD-P1354, ETD-P1364, ETD-P1377, ETD-P1447 et ETDP1449 sont décrites dans la liste de séquence sous les identificateurs de séquences SEQ ID NO : 107 à 114.
Les activités anti-bactériennes de chacune des défensines d'insectes recombinées (ETD-P) ont été évaluées par détermination de l'IC90 (Inhibition de Croissance > à 90%) . Les activités de chacune des défensines recombinantes sont comparées à celles de la défensine du diptère Anopheles gambiae, testée dans les mêmes conditions.
1) Isolement des clones d'intérêt.
Les clones de défensines d'insectes recombinées d'intérêt, identifiées selon le protocole précédemment décrit dans la partie B), sont repris dans l'un des stock de microplaques 384 puits conservés à -80 C (partie B), paragraphe 1)). Un ensemencement sur une gélose YNBG Casamino acides agar est réalisé et placé dans un incubateur à 30 C pendant 48 à 72 heures. Après observation de l'état de pousse des levures, une colonie est isolée, étalée sur une boîte
YNBG Casamino acides agar et incubée pendant 24 à 48 heures à 30 C. L'expression est contrôlée par PCR.
Une préculture est préparée par mise en suspension d'une colonie dans 4mL de milieu Kapeli puis incubée pendant 18 à 24 heures à 30 C sous agitation.
o aux enseignements de l'invention.
Le feu de signalisation 10 comporte, comme dans le premier mode de réalisation, une diode électroluminescente 14 de forte puissance qui est montée sur une platine de support 16, et une pièce optique 12 qui est montée sur un support (non
représenté) du feu de signalisation 10, à l'avant de la diode 14.
Comme on peut le voir, notamment sur la figure 9, la pièce optique 12 a globalement une forme de révolution autour de l'axe
optique A-A sur lequel est agencé la diode 14.
La pièce optique 12 a globalement la forme d'une calotte o sphérique qui est évidée à l'arrière et qui comporte ici deux pattes de support 110, 112, diamétralement opposées, s'étendant dans un plan radial à partir de l'extrémité axiale arrière 114 de la pièce
Les pattes de support 110, 112 sont par exemple similaires aux portions d'appui 34 des pattes 28, 30, 32 de la pièce optique
12 du premier mode de réalisation.
La face arrière concave (vers l'avant) 116 de la pièce optique 12 a la forme d'un récupérateur de flux du type à optique de Fresnel, bien connu de l'état de la technique. Pour plus de précisions, on pourra se reporter notamment au document FR-A
2.507.741, qui décrit un récupérateur de flux de ce type.
La face arrière 116 a donc la forme d'une lentille de
oFresnel, ou lentille à échelons.
Comme on peut le voir, notamment sur la figure 10, la face arrière 116 comporte ici une partie centrale 118 qui est constituée
d'une série de dioptres annulaires convergents 120.
Les dioptres convergents 120 de la partie centrale 118 sont étagés radialement vers l'extérieur et axialement vers l'arrière. Ils collectent les rayons lumineux émis par la diode 14 selon un angle solide, centré sur l'axe optique A-A, ayant une
Comme sels de pyrazolium utilisables dans la présente invention, on peut notamment citer ceux de formule (II) : dans laquelle : R1 et X- a la même signification que ci-dessus, et R6, R7 et R8, identiques ou différents, représentent chacun un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle comportant de 1 à 5 atomes de carbone et de préférence de 1 à 4 atomes de carbone.
Comme exemples de sels de pyridinium pouvant être utilisés dans la composition de l'invention, on peut notamment citer ceux de formule (III) : dans laquelle R6, R7, et X- sont tels que définis ci-dessus, et R9 représente un groupe alkyle comportant de 1 à 8 atomes de carbone, et de préférence de 1 à 4 atomes de carbone. et plus particulièrement les sels de N-butylpyrdinium.
Comme sels de pyrimidinium utilisables dans la présente invention, on peut notamment citer ceux de formules (IV) et (IV') : dans lesquelles R1, R6, R7, et X- sont tels que définis ci-dessus.
D'autres sels organiques existent sous la forme de cations non hétérocycliques tels que les sels de tétra-alkylphosphonium de point de fusion inférieur à 60 C.
Comme sels de tétra-alkylphosphonium utilisables dans la présente invention, on peut notamment citer ceux de formule (V) :
dans laquelle R10, R11, R12 et R13, identiques ou différents, représentent un groupe alkyle comportant de 1 à 18 atomes de carbone et de préférence de 1 à 14 atomes de carbone, et X- représente un anion.
L'anion présent dans le sel organique, représenté par X-, peut être tout anion bien connu dans la technique, et en particulier un ion chlorure (CI-), un ion bromure (Br-), un ion tétrachloroaluminate (AlCl4-), un ion tétrachloronickel (NiCl4-), un ion perchlorate (C104-), , un ion nitrate (N03-), un ion nitrite (N02-), un ion sulfate (S042-), un ion méthylsulfate (CH3S04-), un ion tétrafluoroborate (BF4'), un ion hexafluorophosphate (PF6-), un ion hexafluoroantimonate (SbF6-), un ion triflate [TfO] (CF3S02-) un ion nonaflate [NfO] (CF3(CF2)3S02-), un ion bis(trifyl)amide [Tf2N] (CF3S02)2N-), un ion trifluoroacétate [TA] (CF3C02-), un ion heptafluorobutanoate [HB] (CF3(CF2)3C02-), un ion acétate (CH3C02-), un ion trifluoroacétate (CF3C02-), ou un ion trifluorométhanesulfonate (CF3S03-).
Parmi les anions cités ci-dessus, on préfère tout particulièrement les ions chlorure, bromure, sulfate, acétate, tétrafluoroborate, hexafluorophosphate, triflate, nonaflate, bis (trifyl)amide et heptafluorobutanoate.
A titre d'exemples de sel organique utilisés dans le cadre de la présente invention, on peut notamment citer les sels organiques suivants : le chlorure de 1-éthyl-3-méthylimidazolium, le bromure de 1-éthyl-3-méthylimidazolium, le chlorure de 1-butyl-3-méthylimidazolium, le chlorure de 1-hexyl-3-méthylimidazolium, le chlorure de 1-méthyl-3-octylimidazolium, le chlorure de 1-décyl-3-méthylimidazolium, le bromure de 1-décyl-3-méthylimidazolium, le chlorure de 1-dodécyl-3-méthylimidazolium, le chlorure de 1-méthyl-3-tétradécylimidazolium, le chlorure de 4-méthyl-N-butyl-pyridinium, le chlorure de 3-méthyl-N-butylpyridinium,
le chlorure de 4-méthyl-N-hexylpyridinium, le tétrafluoroborate de l-éthyl-3-méthylimidazolium, le tétrafluoroborate de 1-butyl-3-méthylimidazolium, le tétrafluoroborate de 1-pentyl-3-méthylimidazolium, le tétrafluoroborate de 1-hexyl-3-méthylimidazolium, le tétrafluoroborate de 1-heptyl-3-méthylimidazolium, le tétrafluoroborate de 1-octyl-3-méthylimidazolium, le tétrafluoroborate de 1-nonyl-3-méthylimidazolium, le tétrafluoroborate de 1-décyl-3-méthylimidazolium, le tétrafluoroborate de 4-méthyl-N-butylpyridinium, le tétrafluoroborate de 1-hexyl-3-éthylimidazolium, l'hexafluorophosphate de l-éthyl-3-méthylimidazolium, l'hexafluorophosphate de 1-butyl-3-méthylimidazolium, l'hexafluorophosphate de 1-pentyl-3-méthylimidazolium, l'hexafluorophosphate de 1-hexyl-3-méthylimidazolium, l'hexafluorophosphate de 1-heptyl-3-méthylimidazolium, l'hexafluorophosphate de 1-octyl-3-méthylimidazolium, l'hexafluorophosphate de 1-nonyl-3-méthylimidazolium, l'hexafluorophosphate de 1-décyl-3-méthylimidazolium, le méthylsulfate de 1,3-diméthylimidazolium, le méthylsulfate de 1-méthyl-3-butylimidazolium, le nitrate de l-éthyl-3-méthylimidazolium, le nitrite de l-éthyl-3-méthylimidazolium, l'acétate de l-éthyl-3-méthylimidazolium, le sulfate de l-éthyl-3-méthylimidazolium, les triflates de l-éthyl-3méthylimidazolium, les nonaflates de l-éthyl-3-méthylimidazolium, le bis (trifyl)amide del-éthyl-3-méthylimidazolium, le bromure de 1-butylpyridinium, le trifluorométhanesulfonate de 1-butylpyrimidinium, le trifluorométhanesulfonate de 1-hexylpyrimidinium, le trifluoroacétate de l-éthyl-3-méthylimidazolium, le chlorure de trihexyl-tétradécyl-phosphonium, le chlorure de tributyl-tétradécyl-phosphonium,
le tétrafluoroborate de l-éthyl-2-méthylpyrazolium, et le tétrafluoroborate de 1-méthyl-3-butylpyrimidinium.
Il est possible de modifier la chimie des sels organiques telle qu'elle a été décrite précédemment pour faire varier leur solubilité.
Pour conserver le caractère fusible à basse température de ces sels, il est préférable de modifier plus spécifiquement les chaînes alkyle constituant en partie les sels organiques. Dans ce cadre, on peut citer, à titre d'exemple, l'éthérification de la chaîne alkyle des sels de la famille des l-alkyl-3-méthylimidazolium qui permet d'obtenir les composés de formules suivantes :
Une telle modification chimique donne ou renforce pour le sel organique le caractère hydrosoluble, sans perdre le caractère fusible à basse température du sel. Une telle modification chimique peut également permettre de faire gélifier les sels organiques par association avec des sucres amphiphiles et d'obtenir ce que l'on appelle des ionogels. De telles propriétés sont décrites dans l'article "Spontaneous Self assembly of glycolipid bilayer Membranes in Sugarphilic Ionic Liquids and formation of Ionogels" publié par N.
Kimizuka et T Nakashima (Langmuir 17,6759-6761, (2001)).
Le sel organique ou le mélange de sels organiques tels que décrits ci-dessus, est présent dans les compositions cosmétiques de l'invention, en une concentration comprise entre 0,00001% et 99,9999% en poids, de préférence entre 0,01% et 50% en poids, et mieux encore entre 0,1% et 30% en poids, par rapport au poids total de la composition.
Pour réaliser les expérimentations décrites dans cet exemple, on utilise un pressurat de fruit de Hippophae
rhamnoides dépulpé par décantation, qui contient encore quelques résidus solides qui ont tendance à décanter dans le temps.
On prépare 24 heures avant le jour de l'expérimentation la solution substrat qui est une solution d'acide hyaluronique 25 mg dans 10 ml de tampon acétate de sodium 9.103 M (solubilisée ensuite à 4 C sous agitation pendant 12 heures au moins).
Le jour de l'expérimentation, on prépare : une solution enzymatique de hyaluronidase 22 mg dans 10 ml de tampon (conservée à 4 C), une solution de Borax 1,22 mg dans 5 ml de tampon (solubilisation par chauffage doux), une solution de p. diméthyl amino benzaldéhyde 10 g dans 100 ml d'un mélange acide acétique/acide chlorhydrique (88- 12) et une solution d'héparine (inhibiteur de référence) : 0,135% dans du tampon pH4 (conservée à 4 C).
Le mélange réactionnel est préparé dans des tubes à hémolyse et ce à 10 C. Chaque tube contient 1200 jJl de solution substrat d'acide hyaluronique, 450 l de solution enzymatique de hyaluronidase, de 10 à 300 l de pressurat de fruit de Hippophae rhamnoides dépulpé à tester et du tampon pH4 précédemment préparé (2250 (il QSP). c) Mode opératoire On place les tubes dans un bain-marie à 37 C pendant 45 min. La réaction colorimétrique se déroule dans des tubes en verre sur 500 l du mélange réactionnel. Puis on ajoute à froid dans chaque tube de 500 l à 100 (il de la solution de Borax précédemment préparée. Les tubes sont placés au bain-marie à 100 C 3 min, puis refroidis. On ajoute enfin à froid sous agitation et à intervalles de temps réguliers (30 secondes) 3 ml de solution de 4 diméthyl benzaldéhyde.
Après avoir laissé la coloration se développer à froid pendant 30 min, on lit toutes les 30 secondes chaque tube l'un après l'autre à 585 nm. d) Résultats : Les valeurs des CI 50 sont déduites à partir du volume de demi inhibition, mesuré graphiquement.
CI 50=C(%) x*vol (ml)/vol total, le volume total du mélange réactionnel étant de 2250 L, soit 2,25 ml.
- Pourcentage d'inhibition de 100 l de pressurat dépulpé testé : 64,5%.
- Calcul de l'activité de l'échantillon : L'activité de l'échantillon, exprimée en unité d'absorbance, est calculée par rapport à l'inhibiteur de référence : Activité hyaluronidase=Ci 50 (référence)/Ci 50 (essai)*100 Il y a bien inhibition de l'activité enzymatique en présence de l'extrait de pressurat dépulpé de fruit de Hippophae rhamnoides.
La CI 50 de l'extrait testé est de 3,55%.
L'activité anti-hyaluronidase mesurée pour l'extrait est de 0,113 UA.
Exemple 4 : Activité anti-tyrosinase d'un extrait de pressurat dépulpé de fruit de Hipp ophae rhamnoides La tyrosine est une enzyme qui contrôle l'hydroxylation de la tyrosine en DOPA et l'oxydation de la
DOPA en DOPAchrome, détectable au spectrophotomètre (max= 475 nm).
Pour réaliser la cinétique décrite dans cet exemple, on utilise un pressurat de fruit de Hippophae rhamnoides dépulpé par décantation, qui contient encore quelques résidus solides qui ont tendance à décanter dans le temps.
Les acides nucléiques simples brins EM351, EM357 et EM363 sont utilisés pour reconstituer des séquences permettant l'insertion des séquences nucléidiques simples brins assemblées dans l'étape (a) du procédé, dans le vecteur d'expression et de sécrétion de levure S. cerevisiae pEM105. L'acide nucléique simple brin EM357 est également utilisé en tant qu'amorce dans l'étape (b) du procédé.
2) Etape d'assemblage (a) du procédé.
L'étape (a) d'assemblage est réalisée par PCR comme l'expose la figure 4 en annexe. Les acides nucléiques simples brins EM351, EM357 et EM363 sont utilisés à une concentration
de 10 picomoles dans un volume réactionnel final de 60 l. Des mélanges de séquences nucléotidiques simples brins chevauchants sont utilisés à raison de 10 picomoles pour chacune des séries de séquences nucléotidiques simples brins suivantes : 0,31 picomoles par séquence nucléotidique simple brin constituée ou comportant un segment nucléotidique interne codant une séquence en acides aminés d'une des régions variables n 1 d'une des défensines d'insectes de la population de départ ; 0,36 picomoles par séquence nucléotidique simple brin constituée ou comportant un segment nucléotidique interne codant une séquence en acides aminés d'une des régions variables n 2 d'une des défensines d'insectes de la population de départ et 0,30 picomoles par séquence nucléotidique simple brin constituée ou comportant un segment nucléotidique interne codant une séquence en acides aminés d'une des régions variables n 3 d'une des défensines d'insectes de la population de départ .
La réaction de PCR d'assemblage débute par la dénaturation à une température de 94 C pendant 3 minutes. Les étapes suivantes sont répétées 5 fois : i) dénaturation à une température de 94 C pendant 45secondes, ii) hybridation à une température de 50 C pendant 45 secondes, iii) extension en présence d'une polymérase à une température de 72 C pendant 45 secondes.
A l'issu de l'étape (a), on obtient des polynucléotides doubles brins recombinés qui comprennent à leurs extrémités 5' (brin codant) la fin de la séquence pro du facteur MF[alpha]1 de
S.cerevisiae et à leurs extrémités 3' (brin codant) le début de la séquence du terminateur de transcription du gène PGK1.
Les polynucléotides doubles brins recombinés issus de l'étape (a) d'assemblage sont ensuite amplifiés en présence de 2 des amorces EM349 (SEQ ID NO : 98) et EM357 (SEQ ID NO :97) (Figure 4). Ces deux amorces comprennent une séquence complémentaire respectivement de chacune des extrémités des polynucléotides doubles brins recombinés issus de l'étape (a) et une séquence de 30 nucléotides complémentaires des extrémités du vecteur d'expression de levure S. cerevisiae pEM105 linéarisé.
L'étape (b) du procédé de l'invention débute par la dénaturation à une température de 94 C pendant 3 minutes. Les étapes suivantes sont répétées 25 fois : i) dénaturation à une température de 94 C pendant 45 secondes, ii) hybridation à une température de 60 C pendant 45 secondes, iii) extension en présence d'une polymérase à une température de 72 C pendant 45 secondes.