INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
référence à la figure 2E, l'utilisateur sélectionne"personnaliser". En référence à la figure 2F, l'utilisateur valide la rubrique"expiration". Selon l'invention, en référence à la figure 2G, l'utilisateur choisit la durée avant blocage. Il peut choisir par exemple le nombre de jours qui s'écouleront entre l'activation de l'antivol et le blocage automatique du téléphone. Il est à noter que cette durée peut également être choisie de façon récurrente sur une plus longue période : ainsi le blocage peut être programmer pour survenir régulièrement le quinze et le trente de chaque mois.
Le nombre de jours est choisi parmi un, trois, une semaine, un, trois jours, une semaine, un mois ect...
En référence à la figure 2H, l'expiration du fonctionnement est ici fixée par l'utilisateur à une semaine.
Il est à remarquer que toute mise hors service de l'antivol remet à zéro le compteur d'échéance de fonctionnement du téléphone.
Les paramètres ainsi programmés sont enregistrés par le téléphone dans une mémoire appropriée de ce dernier. Une boucle permet de vérifier si tous les paramètres de contrôle d'accès sont correctement programmés.
Avantageusement, l'utilisateur peut choisir un mode de protection associé à la programmation du paramètre de contrôle d'accès (ici la date d'expiration) (figure 21). Ce mode de protection, comme décrit plus en détail ci-après, permet le déblocage de l'antivol selon l'invention.
En référence à la figure 2J, il peut choisir comme mode de protection un code secret, une carte à puce ou la combinaison code + carte.
En référence à la figure 2K, l'utilisateur a choisi ici le mode de protection correspondant à la carte à puce.
En référence à la figure 21, l'utilisateur introduit sa carte à puce dans le lecteur du portable correspondant.
1. 3 poly(benzyl glutamate)so-propyl-poly(acide lactique)2o: Du N-carboxyanhydride de L-glutamate de benzyle (8,68g, 33,0 mmol) est introduit dans un ballon. Le polylactide déprotégé (lg, 0,66 mmol) est solubilisé dans du dichlorométhane fraîchement distillé (40ml) puis introduit par canule. Le milieu réactionnel est placé sous agitation magnétique pendant trois heures à température ambiante. Le solvant est évaporé au rotavapor puis le polymère est séché sous vide primaire. Rendement: 85%. Caractérisations : RMN 1H (TFA d) : 8 = 1,55 ppm (m, 6H, CH3), 1,95 ppm (m, 2H, CH2CH2C=O), 2,35 ppm (m, 2H, CH2CH2C=O), 4,60 ppm (m, 1H, O=CCHNH), 5,0ppm (m, 2H, CH), 5,25 ppm (m, 2H, CH2Ph), 7,10 ppm (m, 5H, Ph). RMN 13C (DMSO d6) : 8 = 17 ppm (CH3), 27 ppm (CH2CH2COO), 30 ppm (CH2CH?COO), 52 ppm (O=CCHNH), 66 ppm (CH2Ph), 128-136 ppm (Ph), 168- 170 ppm (OC=O), 172 ppm (NC=O).
1. 4 poly(acide glutamique)so-propyl-poly(acide lactique)20: Le copolymère (5g, 20mmol d'ester de benzyle) est introduit dans un ballon et solubilisé dans l'acide trifluoroacétique (44ml, 0,57mol) à 10 C. On introduit l'acide méthane sulfonique (44ml, 0,68mol) et l'anisole (llml, 0,10mol) sous courant d'azote et on laisse le milieu réactionnel trois heures sous agitation. Le polymère est précipité dans un large excès d'éther éthylique froid, récupéré par filtration, lavé avec de l'éther éthylique et séché sous vide. Rendement : 99%. Caractérisations : RMN 'H (TFA d) : 8 = 1,55 ppm (m, 6H, CH3), 1,95 ppm (m, 2H, CH2CH2C=O), 2,35 ppm (m, 2H, CH2CH2C=O), 4,60 ppm (m, 1H, O=CCHNH), 5,0ppm (m, 2H, CH). RMN 13C (DMSO d6) : 8 = 17 ppm (CH3), 27 ppm (CH?CH2COOH), 30 ppm (CH2CH2COOH), 52 ppm (OCÇHNH), 69 ppm (CH), 168-170 ppm (O=CO), 172 ppm (O=CNH).
Exemple 2 : poly(acide lactique)3o-bloc-(acide glutamique)80 2. 1 BOC-aminopropyl-poly(acide lactique)30 : Le L-lactide (5g, 34,70mmol, Aldrich 16101-127) est introduit en boîte à gants sous atmosphère d'azote dans un ballon préalablement flammé. Le toluène, fraîchement distillé (27ml) est introduit par canule dans le ballon que l'on place sous agitation magnétique pendant une heure à 80 C. Le ter-butoxycarbonyl aminopropanol (0,40g, 2,30mmol, Fluka 381029/1) et le toluène fraîchement distillé (23ml) sont introduits dans un ballon préalablement flammé et placé sous agitation magnétique dans un bain à -10 C. La solution de
diéthylzinc dans le toluène (l,Oml, l,15mmol, 1,1M, Aldrich 72560-099) est introduite goutte-à-goutte dans cette solution. Le milieu réactionnel est alors laissé sous agitation magnétique à température ambiante. Au bout d'une heure on introduit la solution de L-lactide sous courant d'azote dans le milieu réactionnel que l'on place alors à 80 C sous agitation pendant une heure. La polymérisation est terminée par un ajout de 4ml d'acide acétique en solution dans le toluène (10%). Le milieu réactionnel est alors concentré à l'évaporateur rotatif et précipité dans un large excès de méthanol froid. Le polymère précipité est récupéré par filtration puis séché sous vide primaire. Rendement : 98%. Caractérisations : Tg : 30-37 C. RMN 1H (CDC13) : # = 1,4 ppm (s, 9H, CCH3), 1,55 ppm (d, 6H, 3J=7,lHz, CHCH3), 1,85 ppm (q, 2H, 3J=6,3Hz, CH2CH2CH2), 3,1 ppm (q, 2H, 3J=6,2Hz, CHzNH), 4,15 ppm (t, 2H, 3J=6,OHz, CH20), 4,35 ppm (q, 1H, 3J=6,9Hz, CH3CHOH), 4,8 ppm (m, 1H, NH), 5,15 ppm (q, 2H, 3J=7,lHz, CHCH3). RMN 13C (CDC13) : 8 = 17 ppm (2C, CHCH3), 20,7 ppm (1C, CH3CHOH), 28,7 ppm (3C, CH3C), 29,5 ppm (CH2CH2CH2), 37,5 ppm (CH2NH), 63,5 ppm (CH20), 67 ppm (CH3CHOH), 69,5 ppm (2C, CH), 156 ppm (NHC=O), 170 ppm (CHC(O)O).
2. 2 aminopropyl-poly(acide lactique)30 . Le polylactide (4g, l,85mmol) et le dichlorométhane fraîchement distillé (45ml) sont introduits sous courant d'azote dans un ballon préalablement flammé et relié à un bulleur. On introduit l'acide trifluoroacétique (8ml, O,lmol, Sigma 19H3648) et on place la solution sous agitation à température ambiante pendant une demi-heure, jusqu'à ce que le dégagement de CO2 soit terminé. On évapore les solvants du milieu réactionnel à l'évaporateur rotatif. On solubilise le polylactide dans 40ml de dichlorométhane.
Cette phase organique est lavée deux fois par 40ml de NaHC03 en solution aqueuse (5%) puis deux fois par 40ml d'eau distillée jusqu'à ce que le pH des eaux de lavage soit neutre. La phase organique est alors séchée sur MgS04 puis filtrée. Le solvant est évaporé à l'évaporateur rotatif, puis le polymère est séché sous vide primaire.
Rendement : 95%. Caractérisations : RMN 1H (CDC13) : #= 1,55 ppm (d, 6H, 3J=7,lHz, CH3), 1,85 ppm (q, 2H, 3J=6,3Hz, CH2CH2CH2), 2,8 ppm (q, 2H, 3J=6,2Hz, CH2NH2), 4,15 ppm (t, 2H, 3J=6,OHz, CH20), 4,35ppm (q, 1H, 3J=6,9Hz, CH3CHOH), 5,15 ppm (q, 2H, 3J=7,lHz, CH).
2. 3 poly(benzyl glutamate)so-propyl-poly(acide lactique)30: Du N-carboxyanhydride de L-glutamate de benzyle (9,74g, 37,Ommol) fourni par Flamel Technologies est pesé et introduit en boîte à gants sous atmosphère d'azote dans un ballon
préalablement flammé. Le polylactide déprotégé (1g, 0,46mmol) est solubilisé dans du dichlorométhane fraîchement distillé (45ml) puis introduit par canule. Le milieu réactionnel est placé sous agitation magnétique pendant trois heures à température ambiante. Le solvant est évaporé au rotavapor puis le polymère est séché sous vide primaire. Rendement : 85%. Caractérisations: RMN 1H (TFA d) : 8 = 1,55 ppm (m, 6H, CH3), 1,95 ppm (m, 2H, CH2CH2C=O), 2,35ppm (m, 2H, CH2CH2C=O), 4,60 ppm (m, 1H, O=CCHNH), 5,0ppm (m, 2H, CH), 5,25 ppm (m, 2H, CH2Ph), 7,10 ppm (m, 5H, Ph). RMN 13C (DMSO d6) : 8 = 17 ppm (CH3), 27 ppm (CH2CH2COO), 30 ppm (CH2CH2COO), 52 ppm (O=CÇHNH), 66 ppm (CH2Ph), 128-136 ppm (Ph), 168-170 ppm (OC=O), 172 ppm (NC=O).
2. 4 poly(acide glutamique)8o-propyl-poly(acide lactique)3o: Le copolymère (5g, 20,3mmol d'ester de benzyle) est introduit sous courant d'azote dans un ballon préalablement flammé. Il est solubilisé dans l'acide trifluoroacétique (44ml, 0,57mol). La solution est alors placée sous agitation à 10 C. On introduit l'acide méthane sulfonique (44ml, 0,68mol) et l'anisole (llml, O,lOmol) sous courant d'azote. On laisse le milieu réactionnel trois heures sous agitation à 10 C, puis on le précipite dans un large excès d'éther éthylique froid. Le polymère précipité est récupéré par filtration, lavé avec de l'éther éthylique et séché sous vide primaire.
Rendement : 99%. Caractérisations :RMN 1H (TFA d) : 8 = 1,55 ppm (m, 6H, CH3), 1,95 ppm (m, 2H, CHzCH2C=O), 2,35 ppm (m, 2H, CH2CH::>C=O), 4,60 ppm (m, 1H, O=CÇHNH), 5,0ppm (m, 2H, CH). RMN 13C (DMSO d6) : 8 = 17 ppm (CH3), 27 ppm (CH?CH2COOH), 30 ppm (CH2CH2cOOH), 52 ppm (OCCHNH), 69 ppm (CH), 168-170 ppm (O=CO), 172 ppm (O=CNH).
Exemple 3 : poly(acidelactique)so-bloc-(acide glutamique)50 3. 1 BOC-aminopropyl-poly(acide lactique)50: Le L-lactide (5g, 34,70mmol, Aldrich 16101-127) est pesé et introduit en boîte à gants sous atmosphère d'azote dans un ballon préalablement flammé. Le toluène, fraîchement distillé (27ml) est introduit par canule dans le ballon que l'on place sous agitation magnétique pendant une heure à 80 C. Le ter-butoxycarbonyl aminopropanol (0,24g, l,38mmol, Fluka 381029/1) et le toluène fraîchement distillé (23ml) sont introduits dans un ballon préalablement flammé et placé sous agitation magnétique dans un bain à -10 C. La solution de diéthylzinc dans le toluène (0,63ml, 0,69mmol, 1,1M, Aldrich 72560-
099) est introduite goutte-à-goutte dans cette solution. Le milieu réactionnel est alors laissé sous agitation magnétique à température ambiante. Au bout d'une heure on introduit la solution de L-lactide sous courant d'azote dans le milieu réactionnel que l'on place alors à 80 C sous agitation pendant une heure. La polymérisation est terminée par un ajout de 4ml d'acide acétique en solution dans le toluène (10%). Le milieu réactionnel est alors concentré à l'évaporateur rotatif et précipité dans un large excès de méthanol froid. Le polymère précipité est récupéré par filtration puis séché sous vide primaire. Rendement : 98%. Caractérisations : Tg : 30-37 C. RMN 1H (CDC13) : 8 = 1,4 ppm (s, 9H, CCH3), 1,55 ppm (d, 6H, 3J=7,lHz, CHCH3), 1,85 ppm (q, 2H, 3J=6,3Hz, CH2CH2CH2), 3,1 ppm (q, 2H, 3J=6,2Hz, CH2NH), 4,15 ppm (t, 2H, 3J=6,OHz, CH2O), 4,35 ppm (q, 1H, 3J=6,9Hz, CH3CHOH), 4,8 ppm (m, 1H, NH), 5,15 ppm (q, 2H, 3J=7,lHz, CHCH3). RMN 13C (CDCL3) : 8 = 17 ppm (2C, CHCH3), 20,7 ppm (1C, CHCHOH), 28,7 ppm (3C, CH3C), 29,5 ppm (CH2CH2CH2), 37,5 ppm (CH2NH), 63,5 ppm (CH20), 67 ppm (CH3CHOH), 69,5 ppm (2C, CH), 156 ppm (NHC=O), 170 ppm (CHC(O)O).
3. 2 aminopropyl-poly(acide lactique)50: Le polylactide (4g, l,llmmol) et le dichlorométhane fraîchement distillé (45ml) sont introduits sous courant d'azote dans un ballon préalablement flammé et relié à un bulleur. On introduit l'acide trifluoroacétique (8ml, O,lmol, Sigma 19H3648) et on place la solution sous agitation à température ambiante pendant une demi-heure, jusqu'à ce que le dégagement de CO2 soit terminé. On évapore les solvants du milieu réactionnel à l'évaporateur rotatif. On solubilise le polylactide dans 40ml de dichlorométhane.
Rendement : 95%. Caractérisations : RMN 'H (CDC13) : # = 1,55 ppm (d, 6H, 3J=7,lHz, CH3), 1,85 ppm (q, 2H, 3J=6,3Hz, CH2CH2CH2), 2,8 ppm (q, 2H, 3J=6,2Hz, CH2NH2), 4,15 ppm (t, 2H, 3J=6,OHz, CH2O), 4,35 ppm (q, 1H, 3J=6,9Hz, CH3CHOH), 5,15 ppm (q, 2H, 3J=7,lHz, CH).
En effet, des études toxicologiques ont permis de mettre en évidence que les sels de chrome de valence VI, tels que les ions chromate Cr042-, les ions bichromate Cr2O72- présentent une toxicité très élevée vis-à-vis de l'homme et des animaux.
Ainsi, l'acide chromique H2Cr04 et ses sels, solubles notamment dans le suc gastrique, peuvent provoquer des dermatoses et des ulcérations chez les individus qui les manipulent.
Le dichromate de potassium peut se révéler mortel à des doses de 0,25 à 0,30 g et peut engendrer des troubles gastriques et des entérites.
Les ions chromate ou bichromate se révèlent être également des poisons méthémoglobinisants.
Selon l'invention, on a trouvé que les dérivés de cyclodextrine et les polymères de per(3,6anhydro)cyclodextrine, ladite cyclodextrine répondant aux formules (I) et (II) données ci-dessus, présentent une spécificité élevée pour les anions à base de chrome ou de manganèse, du fait qu'ils présentent pour ces métaux une capacité de complexation avec des rendements très élevés.
En particulier, un dérivé de per(3,6anhydro)cyclodextrine répondant à la formule (I), efficace pour la mise en #uvre de ce procédé, est le dérivé pour lequel tous les R1 représentent OCONHR2, R2 ayant la même définition que celle donnée précédemment et n est égal à 6. Plus précisément, R2 peut représenter un radical hexyle ou éthyle.
Un polymère conforme à la présente invention, pouvant être mis en #uvre efficacement dans le cadre du procédé de fixation, est un polymère, pour lequel n est égal à 6, R5 et R6 représentent tous les deux H et m est égal à 6.
Grâce à ces composés, on peut séparer les anions à base de chrome et de manganèse du milieu environnant sous forme de complexe.
Aussi, l'invention a également pour objet les complexes d'un ion choisi parmi CrO42-, Cr2O72-, Mn04avec un dérivé de per(3,6-anhydro)cyclodextrine de formule (I) ou (II) décrits ci-dessus ou avec un polymère tel que défini précédemment.
De préférence, le complexe d'un ion choisi parmi CrO42-, Cr2O72-, Mn04-, lorsque le dérivé de peranhydrocyclodextrine répond à la formule (I), est tel que tous les R1 représentent le groupe -0-CO-NHR2et n est égal à 6.
Pour mettre en #uvre le procédé de séparation d'ions de l'invention, on peut utiliser le dérivé de per(3,6-anhydro)cyclodextrine de formule (I) ou (II) ou les polymères de per(3,6anhydro)cyclodextrine et de diisocyanate décrits cidessus sous forme de solution aqueuse ou de solution organique.
Lorsque le milieu contenant les ions à séparer ou à fixer est une solution aqueuse, on peut dissoudre le dérivé de cyclodextrine dans un solvant organique immiscible avec la solution aqueuse pour former le complexe dans la solution organique et le séparer facilement de la solution aqueuse.
On peut aussi utiliser le dérivé de cyclodextrine ou les polymères en solution aqueuse, notamment pour assurer la décontamination des êtres vivants ou encore en préparation dans des pansements (gels d'agarose).
En effet, ces composés sont biocompatibles et peuvent donc être administrés à l'homme et à l'animal pour assurer la fixation du chrome et manganèse sous forme de complexe et éviter ainsi leur interaction avec les organes du corps humain ou animal.
Aussi, l'invention a également pour objet une composition pharmaceutique pour la décontamination en chrome et en manganèse d'un être vivant, caractérisée en ce qu'elle comprend un dérivé de per(3,6-anhydro)cyclodextrine répondant à l'une des formules (I) et (II), définies ci-dessus ou un polymère de per(3,6-anhydro)cyclodextrine et de diisocyanate tel que décrit ci-dessus.
De préférence, le dérivé utilisé dans cette composition est tel que tous les R1 représentent le groupe -0-CO-NHR2 et n est égal à 6.
Le c#ur des nanocapsules conformes à l'invention est donc composé d'une phase grasse dont la composition variable permet d'ajuster la capacité des nanocapsules à solubiliser un anticancéreux donné.
1) Traitement des tumeurs solides et circulantes La présente invention est utilisable en premier lieu dans des thérapies anticancéreuses par voie sanguine. les nanocapsules conformes à l'invention pourront faire l'objet d'une utilisation pour le traitement des tumeurs solides chez l'Homme.
Par ailleurs, pour le traitement des tumeurs circulantes de type leucémie ou lymphome. En effet, tel qu'il a été mentionné précédemment, le ciblage de cellules tumorales circulantes ne peut être obtenu que si les particules du système colloïdal présentent des caractéristiques de furtivité susceptibles de favoriser les rencontres avec les cellules tumorales avant toute capture par les cellules du SPM circulantes ou du foie. Ainsi, les nanocapsules conformes à l'invention sont particulièrement adaptées pour le traitement des tumeurs circulantes.
Ces nanocapsules pourraient également avoir des capacités de ciblage actif au moyen du couplage de ligands ayant une affinité spécifique pour des molécules de type récepteur se trouvant à la surface des cellules cancéreuses.
Avantageusement, les nanocapsules lipidiques furtives objets de la présente invention portent à leur surface des ligands spécifiques leur conférant des capacités de ciblage actif de cellules ayant des récepteurs pour ces ligands, notamment les cellules tumorales.
De préférence, le ligand sera choisi pour ne pas stimuler, ou légèrement stimuler, les phénomènes d'élimination des particules.
Avantageusement, ledit ligand est de type saccharide ou oligosaccharide, vitamine ou encore de type oligopeptide, fragment d'anticorps ou anticorps monoclonal.
Les ligands de type saccharide ou oligosaccharide, vitamine (folate, riboflavine) et même de type oligopeptide, fragment d'anticorps ou anticorps monoclonal, pourront être avantageusement utilisés. Ainsi, lesdits ligands seront préalablement couplés à l'extrémité réactive de molécules de type phospholipide pégylé activé ou tout autre lipide susceptible de comprendre
une partie hydrophobe, pouvant s'ancrer dans la surface des nanocapsules, une chaîne hydrophile de type poly(éthylène glycol) et une fonction chimique réactive au bout de cette chaîne hydrophile. Ces ligands, une fois fixés au bout de ces chaînes seront alors introduits de manière préférentielle par la technique de post-insertion telle que décrite plus loin. Le procédé de postinsertion rend en effet possible l'introduction d'un type de ligand particulier ou de ligands de natures différentes présentant diverses spécificités susceptibles de conférer un ensemble de propriétés particulières au vecteur conforme à l'invention.
2) Traitement des tissus inflammés (arthrite notamment) et infectés On peut également prévoir d'utiliser les nanocapsules conformes à la présente invention dans le but de traiter des inflammations et/ou des infections des tissus, notamment chez l'Homme. En effet, comme cela a été décrit plus haut, lors des inflammations tissulaires ou des infections, les capillaires irriguant la zone sujette à l'inflammation font l'objet d'une perméabilité accrue. Cette perméabilité temporaire peut être exploitée au même titre que pour le traitement des tumeurs solides en utilisant le phénomène d'extravasation pour apporter au tissu inflammé des substances bio actives capables de réduire ou d'éliminer les causes et/ou les conséquences de l'inflammation. Ainsi, on peut prévoir notamment le transport par les nanocapsules conformes à l'invention de principes actifs destinés à l'atténuation de l'inflammation comme des anti-inflammatoires, des antalgiques ou des antibiotiques par exemple. Dans le cas de l'arthrite par exemple qui correspond à une inflammation de certaines articulations, on procédera préférentiellement à une injection intra articulaire des nanocapsules conformes à l'invention. En effet, on favorise ainsi le ciblage du vecteur directement sur son site d'action et on limite par ailleurs la déperdition par dilution des nanocapsules dans l'ensemble de la circulation sanguine. Par ailleurs, les propriétés de furtivité des nanocapsules conformes à l'invention devraient leur permettre de ne pas être reconnues et
éliminées des sites inflammatoires par le grand nombre de cellules du SPM et du systèmes immunitaire présentes sur ces lieux.
La présente invention a également pour objet les compositions pharmaceutiques comprenant les nanocapsules selon la présente invention qui contiennent un ou plusieurs principes actifs. Ces compositions pharmaceutiques sont avantageusement sous la forme de suspension aqueuse colloïdale contenant lesdites nanocapsules.
Un tel vecteur peut être administré par voie parentérale et notamment par voie intraveineuse, intra artérielle, intra péritonéale, et intra musculaire, mais également, on peut prévoir de l'injecter par voie sous-cutanée. En effet, la voie sous-cutanée permettra d'atteindre les vaisseaux lymphatiques qui pourraient assurer l'accumulation des nanocapsules selon l'invention au niveau des ganglions lymphatiques. Cette voie d'accès est donc particulièrement importante pour le traitement des affections ganglionnaires et plus particulièrement des tumeurs ganglionnaires.
3) Détoxification Avantageusement, les nanocapsules lipidiques objets de la présent invention peuvent être utilisées pour la capture de molécules hydrophobes présentes dans la circulation sanguine suite à une intoxication.
A la suite d'intoxications aiguës à un principe actif de nature hydrophobe des nanocapsules lipidiques furtives non chargées en actif pourraient être administrées par voie intraveineuse. Ainsi, grâce à leur temps de circulation prolongé et à leur c#ur lipidique hydrophobe, les nanocapsules conformes à l'invention pourraient capter les principes actifs présents dans la circulation sanguine de manière à en diminuer la concentration libre et par conséquent leur toxicité. Par la suite, ces principes actifs seraient relargués progressivement avec la dégradation du vecteur à des concentrations inférieures aux concentrations libres toxiques.
4) Filtration stérilisante Enfin, les nanocapsules selon la présente invention présente l'avantage de pouvoir être stérilisées par filtration stérilisante sur filtre d'un diamètre de 0,45pm et même de 0,22pm, étape qui peut avoir lieu directement après l'étape de trempe finale du procédé décrit ci-après. En effet, la demanderesse a constaté que les nanocapsules selon l'invention étaient suffisamment solides en suspension pour être passées sur ce type de filtre, sans subir d'altération majeure et surtout sans perdre leur capacité de furtivité et de biodégradabilité. Cette caractéristique permet un emploi facile et sécurisé desdites nanocapsules pour l'usage parentéral, ce qui en fait un vecteur de choix pour une utilisation massive, industrielle ou hospitalière par exemple.
DISCRIMINATION PAR AMPLIFICATION SELECTIVE La discrimination entre le substrat ADN coupé et non coupé peut également être faite par amplification sélective du substrat ADN coupé (FIGURE 3).
Pour effectuer cette amplification sélective, le substrat ADN coupé est incubé en présence d'adaptateurs permettant d'introduire une ou des séquence (s) présente (s) le substrat
ADN. Ces séquences non présentes dans le substrat servent pour l'hybridation des amorces utilisées pour l'amplification sélective des substrats ADN coupés. Les adaptateurs sont conçus de telle sorte qu'ils peuvent interagir uniquement avec les substrats ADN coupés.
Lorsque ce mode de discrimination est utilisé dans une méthode de sélection, la séquence non-présente sur le substrat ADN de l'adaptateur doit varier à chaque tour de sélection.
Dans un premier mode de réalisation de l'amplification sélective, le substrat ADN coupé possède des extrémités non cohésives (FIGURE 3A). Plus particulièrement, les nucléotides des extrémités sortantes du substrat ADN ne sont pas être complémentaires. Les adaptateurs sont de préférence des oligonucléotides double-brins capables de s'hybrider aux extrémités sortantes générées par la coupure de l'endonucléase. Ces adaptateurs sont liés covalemment au substrat ADN par l'action d'une ligase. Ces adaptateurs permettent d'introduire une séquence non présente sur le substrat ADN. Cette séquence s'hybride avec les amorces de PCR et permet donc une amplification sélective par PCR.
Il est important que les adaptateurs ne puissent s'hybrider entre eux pour former un produit très court qui concurrencerait les substrats ADN pour l'amplification par PCR. Pour cela, les nucléotides des extrémités sortantes du substrat ADN ne doivent pas être complémentaires et donc cohésives.
Dans un deuxième mode de réalisation de l'amplification sélective, le substrat ADN coupé possède des extrémités 3' sortantes (FIGURE 3B). Dans ce mode de réalisation, les adaptateurs sont des oligonucléotides simple-brins portant un didéoxynucléotide à son extrémité 3' et dont les extrémités 3' sont complémentaires des extrémités 3' sortantes du substrat ADN. Une extension des extrémités 3'à basse température est ensuite faite en utilisant l'adaptateur comme matrice.
Cette extension permet l'introduction d'une séquence non contenue dans le substrat ADN sur laquelle s'hybride l'amorce utilisée pour l'amplification sélective du substrat ADN coupé.