INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
On voit bien sur la figure 3, qui est une coupe transversale du support montré aux figures 1 et 2 au niveau de la zone translucide formée par le film de polyester 12, que le support 1 selon l'invention ne nécessite la mise en oeuvre que de deux épaisseurs, à savoir le film de polyester 12 et le pavé d'encre à gratter 14.
L'invention est également relative à un procédé pour la production de l'un des polypeptides de séquences SEQ D N 1 à SEQ ID N 11 ou d'un
fragment peptidique ou d'un variant de ce dernier, ladite méthode comprenant les étapes de : a) insérer un acide nucléique codant pour ledit polypeptide dans un vecteur approprié ; b) cultiver, dans un milieu de culture approprié, une cellule hôte préalablement transformée ou transfecter avec le vecteur recombinant de l'étape a) ; c) récupérer le milieu de culture conditionné ou lyser la cellule hôte, par exemple par sonication ou par choc osmotique ; d) séparer et purifier à partir dudit milieu de culture ou encore à partir des Iysats cellulaires obtenus à l'étape c), ledit polypeptide ; e) le cas échéant, caractériser le polypeptide recombinant produit.
Font également partie de l'invention des polypeptides dits " homologues" à l'un quelconque des polypeptides de séquences d'acides aminés SEQ ID N01 à SEQ ID ? 11, ou de leurs fragments ou variants.
On entendra par acide aminé équivalent selon la présente invention, par exemple remplacement d'un résidu sous la forme L par un résidu sous la forme D ou encore le remplacement d'un acide glutamique (E) par un acide
pyro-glutamique selon des techniques bien connues de l'homme du métier. A titre illustratif, la synthèse de peptide contenant au moins un résidu sous la forme D est décrite par KOCH (1977).
Font également partie de l'invention des polypeptides comprenant au moins une liaison non peptidique telle qu'une liaison rétro-inverso (NHCO), une liaison carba (CH2CH2) ou encore une liaison cétométhylène (CO-CH2).
De préférence, les polypeptides selon l'invention comprenant une ou plusieurs additions, délétions, substitutions d'au moins un acide aminé conserveront leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides non modifiés. Ces polypeptides conserveront également leur capacité à reconnaître leur substrat spécifique et/ou partenaires potentiels avec lesquels ils se lient.
Anticorps Les polypeptides selon l'invention, en particulier les polypeptides de séquences en acides aminés SEQ ID N01 à SEQ ID N011 ou les fragments et les variants de ces derniers ainsi que les peptides homologues peuvent être utilisés pour la préparation d'anticorps.
C'est donc plus particulièrement ce type d'échelle de sécurité à partie relevable par pivotement que l'invention vise à perfectionner afin d'en accroître la fiabilité et le caractère sécuritaire et d'écarter les inconvénients précités des échelles de ce type actuellement connues, en faisant en sorte en outre que la structure des échelles ne soit pas modifiée de façon sensible et que les moyens mis en oeuvre soient aussi simples et peu coûteux que possible de sorte que les perfectionnements proposés par l'invention n'aient pas d'incidence notable sur le coût de ces échelles ainsi perfectionnées et que lesdits perfectionnements puissent être mis en oeuvre non seulement dans des échelles neuves en cours de fabrication, mais puissent aussi être appliqués à des échelles préexistantes.
A ces fins, une échelle de sécurité telle que mentionnée plus haut se caractérise, étant agencée conformément à l'invention, en ce que lesdits moyens d'accrochage de la partie mobile relevée comprennent : - une première pièce d'accrochage solidaire d'une partie fixe de l'échelle et présentant un premier bras qui se projette en direction de la partie mobile de l'échelle lorsque celle-ci est en position relevée et qui possède une terminaison en forme de premier crochet en retour vers la base dudit premier bras, et
- une seconde pièce d'accrochage solidaire de la partie mobile de l'échelle et présentant un second bras qui se projette en direction de la partie fixe de l'échelle lorsque la partie mobile est en position relevée et qui possède une terminaison en forme de second crochet en retour vers la base dudit second bras, - lesdits premier et second crochets étant inversés l'un par rapport à l'autre et étant propres à s'accrocher l'un dans l'autre quand la partie mobile de l'échelle est amenée en position relevée, - au moins un des premier et second bras étant élastiquement déformable transversalement de manière que les premier et second crochets puissent sélectivement s'accrocher l'un dans l'autre quand la partie mobile de l'échelle est relevée ou être dégagés l'un de l'autre quand la partie mobile de l'échelle doit être abaissée.
Grâce à l'agencement conforme à l'invention, la partie mobile de l'échelle, lorsqu'elle est retenue en position relevée, ne peut pas être abaissée par une simple traction : il est nécessaire, d'une part, de repousser la partie mobile avec une main de manière à dégager les deux crochets l'un de l'autre, puis, d'autre part, de saisir de l'autre main le bras flexible et de le tirer transversalement afin que le crochet correspondant soit mis hors d'alignement vis-à-vis de l'autre crochet : alors seulement, la partie mobile peut être abaissée en étant retenue par la main qui l'avait initialement repoussée. Autrement dit, d'une part, on réalise un accrochage verrouillé positivement de la partie relevée de l'échelle et, d'autre part, on s'affranchit ainsi des risques de manoeuvre intempestive ou inintentionnelle et l'on écarte les risques d'accident.
Dans un mode de réalisation préféré, c'est le premier bras appartenant à ladite première pièce solidaire de la partie fixe de l'échelle qui est élastiquement déformable transversalement.
De façon avantageuse, la manoeuvre du bras flexible sera facilitée si le bras élastiquement déformable transversalement est muni de moyens de préhension manuelle. Dans un exemple simple de réalisation, les moyens de préhension manuelle sont constitués par une portion du bras élastiquement déformable transversalement qui possède une hauteur supérieure à celle de la portion en regard de l'autre bras afin de pouvoir être facilement saisie entre le pouce et l'index et être soumise à une traction transversale.
De façon intéressante au moins pour certaines conditions d'utilisation, les premier et second bras comportent des portions respectives propres à se chevaucher mutuellement lorsqu'ils sont accrochés l'un dans l'autre et lesdites portions se chevauchant sont agencées pour autoriser un verrouillage des crochets mutuellement coopérants ; lesdites portions aptes à se chevaucher des deux bras peuvent alors avantageusement présenter respectivement deux lumières qui sont mutuellement alignées quand les deux crochets sont en prise de sorte qu'un organe de verrouillage, tel qu'un cadenas, peut être engagé dans ces lumières alignées.
Dans un exemple concret de réalisation, la susdite première pièce est conformée avec une forme générale en U dont le fond est agencé en bague ouverte enserrant un montant fixe de l'échelle vers le haut de celui-ci : celle des branches du U qui constitue le bras flexible déformable élastiquement transversalement présente une
meilleure flexibilité et est donc plus facilement manoeuvrable.
De même, il est intéressant que la susdite seconde pièce comprenne une bague annulaire enserrant un montant de la partie mobile de l'échelle et que le second bras se projette approximativement radialement à partir de cette bague : on constitue ainsi une pièce monobloc plus simple à fabriquer.
On peut avoir intérêt à prévoir des moyens élastiques interposés entre les deux parties fixe et mobile de l'échelle pour repousser celles-ci l'une de l'autre lorsque la partie mobile est dans sa position relevée, afin de maintenir alors les deux crochets positivement en prise l'un avec l'autre. On évite ainsi des oscillations de la partie mobile de l'échelle qui peuvent être bruyantes, par exemple sous l'action du vent.
On peut également prévoir au moins un capot amovible de protection propre à coiffer au moins la seconde pièce de ladite partie mobile de l'échelle lorsque celle-ci est abaissée en position d'utilisation, ceci aussi bien pour protéger ladite seconde pièce mobile contre d'éventuels chocs susceptibles de l'endommager que pour éviter que des personnes puissent se blesser en heurtant cette pièce saillante.
De façon économique, les susdites première et seconde pièces des moyens d'accrochage sont constituées en matière plastique et peuvent ainsi être fabriquées par moulage de façon économique.
Les dispositions conformes à l'invention qui viennent d'être exposées peuvent trouver application pour de nombreux domaines. Toutefois, une application qui semble devoir être particulièrement intéressante concerne les piscines, et plus spécifiquement les piscines hors-sol
pour lesquelles sont prévues des échelles spécifiques en forme générale de double échelle qui chevauche la paroi de la piscine : dans ce cas, c'est la demi-échelle extérieure à la piscine qui est équipée conformément aux enseignements de l'invention.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée qui suit de certains de ses modes de réalisation préférés donnés uniquement à titre d'exemples nullement limitatifs. Dans cette description, on se réfère aux dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 est une vue d'ensemble en perspective d'une échelle, en l'occurrence d'une échelle pour piscine hors-sol, équipée conformément à l'invention et montrée avec sa partie mobile en position relevée ; - les figures 2A à 2E sont des vues schématiques de dessus d'un mode de réalisation simple des moyens d'accrochage conformes à l'invention, montrés dans diverses positions ; - les figures 3A à 3D sont des vues schématiques d'un mode de réalisation préféré des moyens d'accrochage conformes à l'invention, montrés respectivement en vue de dessus non accrochés, en vue de devant accrochés, en vue de dessus accrochés et en vue de derrière accrochés ; et - la figure 4 est une vue en coupe partielle d'un agencement perfectionné d'un des crochets du mode de réalisation préféré des figures 3A à 3D.
La GFP ( Green Fluorescent Protein ) est une protéine de 27 kDa qui est synthétisée par une méduse du Pacifique (Aequora Victoria) et qui émet une fluorescence verte lorsque l'animal est soumis à un stress [Prasher, 1992]. Cette protéine a pu être purifiée et son gène identifié. La séquence codant pour la GFP peut être clonée en
phase avec des séquences codant pour des protéines très diverses. La GFP garde ses propriétés de fluorescence lorsqu'elle est liée à d'autres protéines, ce qui permet une étude aisée de nombreux phénomènes dus aux protéines auxquelles la GFP est liée, comme par exemple l'étude de la migration cellulaire ou de la migration d'une protéine à l'intérieur des différents compartiments cellulaires. Certaines mutations de la GFP au niveau des acides aminés formant le fluorophore ou interagissant avec ce fluorophore ont permis d'identifier des mutants ayant des caractéristiques de fluorescence propres [Ellenberg, 1999 ; Pollock, 1999]. En particulier, les protéines CFP, pour Cyan Fluorescent Protein (excitation 440 nm ; émission 480 nm) et YFP, pour Yellow Fluorescent Protein (excitation 514 nm ; émission 530 nm) ont été isolées. Ces deux protéines peuvent être en théorie reliées par un phénomène de FRET. Effectivement, il existe un recouvrement entre le spectre d'émission de CFP (la molécule donneuse) et le spectre d'excitation de YFP (la molécule accepteuse).
Lorsque ces deux protéines sont assez proches l'une de l'autre et lorsque CFP est excitée à sa longueur d'onde d'excitation, CFP peut transférer son énergie d'activation à YFP qui peut ensuite émettre une lumière à 535 nm. Les séquences correspondant aux sites d'autolyse de la calpaine 3 précédemment mentionnées seront donc clonées entre les séquences CFP et YFP. Ce système sera utilisé pour détecter la calpaine 3 en produisant en cellules vivantes des protéines chimères au sein desquelles CFP sera reliée à YFP par un peptide clivable par la calpaine 3.
L'invention a également pour objet une séquence d'ADN codant pour un peptide couplé à au moins une protéine fluorescente, ledit peptide contenant au moins une séquence d'acides aminés apte à être clivée par la calpaine 3. Dans une forme de réalisation préférée, la séquence d'ADN code pour les peptides suivants : CFP-sitel-YFP ; CFP-site 2- YFP ; CFP-site 3-YFP L'invention concerne également un vecteur contenant ladite séquence d'ADN et un promoteur permettant d'induire l'expression de la séquence d'ADN dans une cellule
hôte. Un tel vecteur est par exemple le plasmide pTOM développé par le Demandeur, directement dérivé du plasmide décrit dans [Vanderklish 2000]. Elle se rapporte également à une cellule hôte transformée par ledit vecteur.
L'invention concerne également une méthode de détection in vitro de l'activité de la calpaine 3 dans un échantillon biologique selon lequel : dans une première étape, on met en contact ledit échantillon biologique avec le peptide précédemment décrit, dans une seconde étape, on détecte la présence ou l'absence de clivage dudit peptide par la calpaine 3 par mesure de l'intensité de la réaction colorimétrique ou fluorimétrique.
La première étape peut revêtir différentes formes selon que la détection est effectuée sur un échantillon biologique constitué de soit cellules vivantes, soit d'un extrait cellulaire, les cellules étant d'origine animale ou humaine, soit d'un tissu.
Lorsque l'échantillon est constitué de cellules vivantes, le contact avec le peptide peut se faire de deux manières. Dans un premier mode de réalisation, le peptide est mis directement au contact de la cellule de sorte qu'il doit présenter des propriétés de perméabilité suffisante pour pénétrer dans la cellule. La perméabilité du peptide sera déterminée en fonction de la nature de la molécule rapporteuse. Dans un second mode de réalisation, l'échantillon biologique correspond à des cellules hôtes transfectées par un vecteur codant pour la séquence d'ADN correspondant au peptide de l'invention, les molécules rapporteuses correspondant alors à des protéines permettant l'émission d'un signal fluorescent.
Lorsque l'échantillon se présente sous forme d'un extrait cellulaire, le peptide est simplement mis au contact dudit extrait.
La détection de l'activité peut aussi se faire, comme déjà dit, directement sur coupes de tissus. En pratique l'échantillon biologique (organe, partie d'organe par exemple biopsies musculaires) est alors prélevé puis congelé rapidement dans de l'isopentane
refroidi à l'azote liquide. Il est conservé à-80 C jusqu'à utilisation. Des coupes de 5 ai 5 am sont réalisées à l'aide d'un cryostat et déposées sur une lame de verre. Les coupes sont conservées aussi à-80 C si elles ne sont pas utilisées immédiatement. La détection de l'activité de la calpaine peut être réalisée en déposant directement le peptide sur la lame.
Dans un mode de réalisation avantageux, le peptide présente à chacune de ses extrémités respectivement une molécule fluorogénique donneuse et une molécule fluorogénique accepteuse, l'intensité de la réaction fluorogénique étant déterminée par FRET. Ainsi, si la calpaine n'est pas active dans les cellules, un phénomène de FRET se produit. En revanche, si la calpaine est active, elle clive le peptide et le phénomène de FRET est alors diminué.
La méthode de détection de l'activité de la calpaine 3 trouve une application avantageuse pour le diagnostic in vitro de la LGMD2A. En conséquence, l'invention concerne également l'utilisation de la méthode de détection ci-avant décrite pour le diagnostic in vitro de LGMD2A.
L'invention concerne également une méthode de criblage de substances inhibitrices ou activatrices de la calpaine 3. Ladite méthode peut revêtir deux modes de réalisation différents.
Selon un premier mode de réalisation, la méthode consiste : - à préparer un échantillon biologique traité avec ladite substance, - puis à mettre en contact ledit échantillon ainsi traité avec le peptide de l'invention, - et à détecter la présence ou l'absence d'une réaction colorimétrique ou fluorométrique, signant respectivement la présence ou l'absence d'une substance activatrice ou inhibitrice de la calpaine 3.
L'échantillon biologique peut se présenter sous forme de cellules, d'extraits cellulaires ou encore de tissus. La préparation de l'échantillon biologique contenant le peptide est ensuite effectuée par mélange de l'échantillon traité (cellule, extrait cellulaire ou
Compte-tenu de la présence d'une seule substitution d'un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence SEQ ID N05, le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID ? 6 possède des caractéristiques très similaires à celles décrites ci-dessus pour le polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID ? 5.
L'invention a donc encore pour objet le polypeptide comprenant la séquence d'acides aminés SEQ ID ? 5 ou SEQ ID N06 ainsi qu'un polypeptide possédant au moins 95% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID N05 ou SEQ ID N'6, ou un fragment ou un variant de celui-ci.
Un fragment d'un polypeptide ISUM2A selon l'invention comprend au moins 10,15, 20,25, 30,40, 50,60, 70,80, 90,100, 120,130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquence SEQ ID N05 ou SEQ ID ? 6.
Fait également partie de l'invention, un polypeptide comprenant 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 130, 135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide de séquence SEQ ID N05 ou SEQ ID ? 6.
L'invention est également relative à un polypeptide comprenant une séquence en acides aminés ayant au moins 95% d'identité en acides
aminés avec la séquence d'un polypeptide ISUM2A de séquence SEQ ID ? 5 ou SEQ ID D ? 6.
Avantageusement, fait aussi partie de l'invention un polypeptide ayant au moins 96%, 97%, 98%, 99%, 99,1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99,5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en acides aminés avec la séquence d'un polypeptide de séquence SEQ ID N05 ou SEQ ID N'6, ou un fragment peptidique de ce dernier.
Un autre objet de l'invention consiste en un polypeptide comprenant des modifications d'acides aminés de 1,2, 3,4 ou 5 substitutions, additions ou délétions d'un acide aminé par rapport à la séquence d'acides aminés d'un polypeptide de séquence SEQ ID ? 5 ou SEQ ID ? 6 ou encore d'un fragment ou d'un variant de celui-ci.
Un polypeptide selon l'invention peut être obtenu par recombinaison génétique selon des techniques bien connues de l'homme du métier, par exemple des techniques décrites dans AUSUBEL et al.
De préférence, les polypeptides variants d'un polypeptide selon l'invention conservent leur capacité à être reconnus par des anticorps dirigés contre les polypeptides de séquences SEQ ID N05 ou 6.
Un polypeptide codé par le gène Isum2A selon l'invention, tel qu'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID N05 ou 6, ou encore un variant ou un fragment peptidique de ce dernier est utile notamment pour la préparation d'anticorps destinés à la détection de la présence et/ou de l'expression d'un polypeptide de séquences SEQ ID N05 ou 6 ou d'un fragment peptidique de ce dernier dans un échantillon.
Outre la détection de la présence d'un polypeptide codé par le gène Isum2A ou encore d'un fragment peptidique d'un tel polypeptide dans un échantillon, des anticorps dirigés contre ces polypeptides sont utilisés pour quantifier la synthèse d'un polypeptide de séquences SEQ ID D ? 5 ou 6, par exemple dans des cellules d'une plante, et déterminer ainsi le développement de l'embryon.
traitées soit avec la zidovuidine (AZT, panels A et C) ou la lamivudine (3TC, panels B et D), selon la technique décrite plus loin, dans le paragraphe matériel et méthodes. Pour le patient I, les échantillons ont été testés à 0 (+), 9 (*) et 18 (0) mois après le traitement, et, pour le patient 2, à 0 (+) et 27 (.) mois après le traitement.
I-Matériel et méthodes I. 1-Amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR).
L'ARN est isolé à partir du plasma des patients au moyen d'une trousse Roche Amplicor z (Roche Diagnostics, 38242 Meylan Cedex, France), et les gènes d'intérêt sont isolés au moyen d'une transcriptase inverse et une réaction PCR subséquente.
L'amplification de la région codant pour la transcriptase inverse (RT) est effectuée au moyen des amorces externes MJ3 (5'AGT AGG ACC TAC ACC TGT CA 3') (Séquence SEQ ID No : 5, en annexe) et RT-EXT (5'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (Séquence SEQ ID No : 6, en annexe) et des amorces internes A35 (5'TTG GTT GCA TAA ATT TTC CCA TTA GTC CTA TT 3') (Séquence SEQ ID No : 7, en annexe) et RT-IN (5'TTC CCA ATG CAT ATT GTG AG 3') (Séquence SEQ ID No : 8, en annexe) avec un cycle initial à 50 C (30 minutes) et à 940C (2 minutes), suivi de 40 cycles à 94 C (30 secondes), 550C (30 secondes) et 68 C (90 secondes) et une étape finale d'extension à 980C durant 10 minutes. Ceci amplifie un produit de 1530 pb qui s'étend au-delà du codon 93 de la région codant de la protéase et au-delà du codon 503 de la région codant de la polymérase (pol).
Le plasmide délété en transcriptase inverse est construit par une modification du pNL4-3xc~env muté pour porter des sites de restriction SnaBI uniques dans la position 3872 et de Nru 1 dans la position 3892.
La séquence du génotype HD5 x HD7 (Fig. 1) émane des deux sous-clones L211c1 (fragment Xhol de 9 kb) et L211 c2 (fragment Xhol de 6 kb).
La séquence du génotype A188 (Fig. 2) provient des clones L157a (PCR avec les amorces Isum2b (SEO ID N018) et Isum2e (SEQ ID N020)), L223a (genomic walk, voir ci-dessus) et L223c (genomic walk, voir cidessus). b) Séquences ADNc La séquence ADNc partiel du génotype A188 (SEQ ID N 4, fig. 3) provient des clones L158a et L254 (fig. 4). Le premier a été obtenu par RTPCR sur embryons de 12 JAP avec les amorces Isum2b (SEQ ID N 18) et Isum 2c (SEQ ID N019), le deuxième par RT-PCR sur albumen de 7JAP avec les amorces Isum2a (SEQ ID N 17) et isum2l (SEQ ID N 22).
La séquence ADNc du génotype HD5 x HD7 (SEQ ID N03, fig. 2) a été obtenue à partir de la séquence génomique (SEO ID N01) en utilisant
l'EST Isum2 (ci-dessus) pour déterminer la limite 5'du premier exon et la limite 3'du dernier exon.
Le Tableau 4 ci-dessous détaille les différentes amorces utilisées dans cet exemple.
Tableau 4 : Amorces utilisées 1 1 1
Nom Séquence 5'vers 3'SEQ ID Utilisation AT Mu16 TCYATAATGGCAATTATCTC 8 produit AIMS adapMseI GATGAGTCCTGAGTAAN 9 produit AIMS GW3 GAAACTGGAAAGGCGAAATGGAGGGACG 10 L223c GW3b GCTCGATAGGTTTATTGTGATAACGTTGCTGG 11 L223c GW4 GTCCCTCCATTTCGCCTTTCCAGTTTCC 12 L223a, GW4b CCAGCAACGTTATCACAATAAACCTATCGAGC 13 L223a Mu 15 GAGAAGCCAACGCCAWCGCCTCYATTTCGTC 14 produit AIMS APQ GGATCCTAATACGACTCACTATAGGGC 15 tout "genomic walk" AP2 CTATAGGGCTCGAGCGGC 16 tout "genomic wa1k" Isum2a CTACCCGCAGCCAGCCTCGCATTCC 17 L254 Isum2b GGCGGGGAAGAAGGGCTACAAGATGAAGAC 18 MAG, L158al, L157a Isum2c IGCCAAGAAGAACACCAAGCGCAAGAAGAG 19 MAG a Isum2e CGATCTGCTGGCCATATCCTAAGAG 20 L158A1, L157a Isum2k CATCTTCGAGAGCCTCTTCTTGCG 21 MAG Isum21 CTTCATCTTGTAGCCCTTCTTCCCCG 22 L254 8516g GCACCCGTAACATTGTCGTAGTC 23 MAG OMuA CTTCGTCCATAATGGCAATTATCTC 24 MAG
EMAG signifie"Machine à genes".
EXEMPLE 2 : Construction d'un vecteur comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide ISUM2A placé sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur inductible du type represseur.
Le système d'expression décrit dans cet exemple constitue une illustration du système d'expression Il résumé dans le tableau 3 et dont le principe de fonctionnement général est détaillé dans la description.
Ce système d'expression implique la construction de deux vecteurs, respectivement : (i) le vecteur pRDP5, qui contient le gène isum2A placé sous le contrôle de la séquence TRE reconnue par l'activateur tTA ; et (ii) le vecteur pRDP4, qui contient le gène de l'activateur tTA, actif en absence de tétracycline, placé sous le contrôle du promoteur actinel du riz, qui est un promoteur fort et constitutif chez les monocotylédones.