INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
pathogènes, provoquent simultanément une élimination de ceux-ci.
Cette élimination conduit presque systématiquement à une sous-évaluation de la présence desdits germes dans le produit sanguin testé, et donc à une augmentation du risque sanitaire.
La demanderesse a donc conçu une nouvelle méthode rapide et sensible pour détecter une contamination d'un produit sanguin ou dérivé, par de tels germes pathogènes.
Le procédé selon l'invention est remarquable en ce qu'il est réalisé directement sur un échantillon issu d'un produit sanguin prélevé chez un sujet, sans traitement ou dilution préliminaire.
Le procédé de détection de germes pathogènes développée par la Demanderesse consiste essentiellement à concentrer sélectivement lesdits germes pathogènes, puis à les détecter, une fois concentrés, par des techniques connues de l'homme du métier.
La concentration sélective des germes pathogènes est effectuée par élimination séquentielle ou simultanée des différentes populations de cellules sanguines présentes dans un échantillon d'un produit sanguin.
Le procédé de concentration de germes pathogènes selon l'invention comporte une première étape de concentration des germes pathogènes consistant à réduire la concentration des populations des cellules sanguines au moyen d'une agrégation sélective de celles-ci, suivie d'une filtration afin de recueillir dans le filtrat les germes pathogènes concentrés non agrégés et de retenir sur le filtre les agrégats de cellules sanguines.
On entend par agrégation, au sens de la présente invention, toute action conduisant à la formation d'agrégats cellulaires, et on entend par agrégat cellulaire tout groupement de cellules comportant plus de deux cellules et dont la taille est supérieure à celle d'une cellule isolée. Au sens de la présente invention, un agrégat peut être obtenu soit par agrégation, telle que l'agrégation des plaquettes subséquente à leur activation, une agglutination, telle que l'agglutination des globules rouges obtenue lors que ceux-ci se trouvent en présence de molécules spécifiques, comme les lectines érythrospécifiques, soit un rapprochement des cellules induit par un changement de la charge électrostatique de leurs membranes ou encore d'autres mécanismes d'adhésion ou de rapprochement cellulaire conduisant au regroupement de plus de deux cellules.
Selon des modes de mise en oeuvre préférés, l'agrégation des différentes populations de cellules sanguines peut être effectuée à l'aide de composés induisant l'agrégation plaquettaire, ou bien à l'aide de composés induisant l'agglutination spécifique des globules rouges.
On connaît par exemple que, en présence de certains composés, les plaquettes ont la capacité de s'agréger. Ces agrégats peuvent être facilement séparés des germes pathogènes par filtration.
Selon une caractéristique particulière, le procédé est remarquable en ce qu'il comprend une étape de mise à jour d'un statut associé à chaque partie de la FIFO lors d'une étape d'écriture de données dans la partie de la FIFO et lors d'une étape de lecture de l'ensemble des données écrites dans la partie de la FIFO et en ce qu'au moins une étape faisant partie du groupe comprenant : l'étape de vérification ; - la sous-étape de d'autorisation ; et - la sous-étape de saut ; prend en compte le statut mis àjour.
Ainsi, la simple prise en compte d'un statut de lecture et d'écriture associée à des parties de la FIFO permet une gestion de FIFO aisée.
Selon une caractéristique particulière, le procédé est remarquable en ce que la FIFO est découpée en pages comprenant chacune un nombre prédéterminé de données élémentaires.
Selon une caractéristique particulière, le procédé est remarquable en ce que la FIFO est initialisée avec un nombre initial de pages prédéterminé lors de sa création et qu'à l'issue de l'étape de modification, elle est susceptible de contenir un nombre de pages inférieur ou supérieur au nombre initial de pages.
Selon une caractéristique particulière, le procédé est remarquable en ce que l'étape de modification de la taille de la FIFO est mise en ouvre après une étape de requête de modification de la taille de la FIFO faisant partie du groupe comprenant : des détections d'un seuil de remplissage ;
des données de protocoles spécifiques ; - des mesures d'amplitude de gigue dans le flux de données.
Ainsi, l'invention permet avantageusement la modification de la taille d'une FIFO en fonction de son usage pour certaines applications (notamment de type vidéo et/ou émissions vers un bus IEEE1355). Elle permet notamment d'anticiper le besoin de modification de FIFO dans le but d'empêcher l'exécution de sous-programmes d'exception FIFO pleine et dans le but d'optimiser l'attribution des pages entre les FIFO requérant une plus grande taille et celles devenant surdimensionnées ;...) en fonction de différents critères.
L'invention concerne également un dispositif de gestion d'une mémoire comprenant un ensemble d'au moins une FIFO de taille variable dont l'accès est contrôlé à l'aide d'un pointeur d'écriture et au moins un pointeur de lecture, remarquable en ce qu'il comprend des moyens de modification de la taille d'une des FIFOs appartenant à l'ensemble par retrait ou ajout d'un bloc d'au moins une case mémoire, le bloc étant placé à un emplacement déterminé de la FIFO, indépendant de la position des pointeurs de lecture et d'écriture de la FIFO.
Selon une caractéristique particulière, le dispositif est remarquable en ce que les moyens de modification comprennent, pour une diminution de la taille de la FIFO : des moyens de vérification qu'au moins une partie du bloc ne contient pas de données écrites qui n'ont pas été lues par leur ou leurs destinataires ; et - des moyens de diminution de la taille de la FIFO permettant le retrait de la partie du bloc que les moyens de vérification ont confirmé qu'il ne contient pas de données écrites et non lues.
Selon une caractéristique particulière, le dispositif est remarquable en ce que la FIFO a un début et une fin déterminés et que l'emplacement déterminé coï ncide, avant le retrait, avec la fin de la FIFO lorsque les moyens de modification mettent en ouvre une diminution de la taille de la FIFO.
Selon une caractéristique particulière, le dispositif est remarquable en ce que les moyens de modification comprennent, pour une augmentation de la taille de la FIFO : des moyens d'augmentation de la taille de la FIFO permettant l'ajout de la partie du bloc ; et - des moyens d'autorisation de lecture si la partie ajoutée du bloc contient au moins une donnée écrite après l'ajout ; et/ou - des moyens de saut de la partie du bloc par un ou des pointeurs de lecture si la partie ajoutée ne contient pas de donnée écrite après l'ajout.
Selon une caractéristique particulière, le dispositif est remarquable en ce que la FIFO a un début et une fin déterminés et que l'emplacement coï ncide, après l'ajout, avec la fin de la FIFO lorsque les moyens de modification mettent en ouvre une augmentation de la taille de la FIFO.
Selon une caractéristique particulière, le dispositif est remarquable en ce qu'il comprend des moyens de mise à jour dun statut associé à chaque partie de la FIFO lors d'une écriture de données dans la partie de la FIFO et lors d'une lecture de l'ensemble des données écrites dans la partie de la FIFO et en ce qu'au moins des moyens faisant partie du groupe comprenant : les moyens de vérification ; les moyens d'autorisation ; et les moyens de saut ; prennent en compte le statut mis àjour.
Selon une caractéristique particulière, le dispositif est remarquable en ce que la FIFO est découpée en pages comprenant chacune un nombre prédéterminé de données élémentaires.
Selon une caractéristique particulière, le dispositif est remarquable en ce que la FIFO est initialisée avec un nombre initial de pages prédéterminé lors de sa création et qu'à l'issue d'une modification de taille, elle est susceptible de contenir un nombre de pages inférieur ou supérieur au nombre initial de pages.
Selon une caractéristique particulière, le dispositif est remarquable en ce que les moyens de modification de la taille de la FIFO sont mise en ouvre après une requête de modification de la taille de la FIFO faisant partie du groupe comprenant : - des détections d'un seuil de remplissage ; - des données de protocoles spécifiques ; des mesures d'amplitude de gigue dans le flux de données.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré, le dispositif de l'invention comprend des moyens de connexion (6) étanches et stériles pour relier la poche contenant le produit sanguin au premier réservoir (1) stérile.
Avantageusement, la connexion (6) étanche et stérile reliant la poche contenant le produit sanguin au premier réservoir stérile est munie d'une valve anti-retour (7).
Selon un autre mode de réalisation préférée, le dispositif de l'invention comprend des moyens d'échantillonnage d'un volume déterminé du produit sanguin directement à partir d'une poche de stockage dudit produit vers ledit premier réservoir (1).
Avantageusement, le premier réservoir (1) étanche et stérile du dispositif de l'invention est muni d'un système d'aspiration (8) de l'échantillon, et de préférence ledit système d'aspiration est un piston.
Selon un autre mode de mise en oeuvre préféré, le deuxième filtre (4) du dispositif de l'invention est inclus dans un support de membrane composé de deux parties pouvant être dissociées permettant de récupérer ledit filtre.
Avantageusement le dispositif de l'invention est clos et stérile.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples qui suivent et des figures en annexe dans lesquelles : - la figure 1 illustre le dénombrement des plaquettes après avoir mis en contact les concentrés plaquettaires avec différentes concentrations de thrombine.
La figure 2 illustre l'agrégation des plaquettes en présence d'ADP.
La figure 3 montre le dénombrement des plaquettes en présence d'anticorps CD9.
- La figure 4 montre la courbe dose réponse obtenue en présence de concentrations croissantes d'anticorps CD9 La figure 5 illustre l'agglutination de globules rouges en présence de la lectine Phaseolus vulgaris utilisée à une concentration de 200 g/ml - La figure 6 montre les effets de la solution de lyse sur la récupération de différents germes pathogènes dans des cultures pures.
- La figure 7 montre l'effet de la solution de lyse sur différents échantillons de plaquettes.
- La figure 8 illustre l'effet de la lyse sur deux échantillons différents de concentrés de globules rouges.
La figure 9 illustre une mise en oeuvre particulière du dispositif de concentration des germes pathogènes de l'invention, comprenant : - un premier réservoir (1) étanche et stérile, - un deuxième réservoir (2) étanche et stérile, - un premier filtre stérile (3) placé entre le premier réservoir (1) et le deuxième réservoir (2), - un deuxième filtre stérile (4) placé en aval du deuxième réservoir (2) des moyens de connexion (5) étanches et stériles placés, entre le premier réservoir (1) et le premier filtre (3), entre le premier filtre (3) et le deuxième réservoir (2) et entre le deuxième réservoir (2) et le deuxième filtre (4). des moyens de connexion (6) étanches et stériles pour relier la poche contenant le produit sanguin au premier réservoir (1). une valve anti-retour (7) placée dans la connexion (6) reliant la poche contenant le produit sanguin au premier réservoir 1.
- un système d'aspiration de l'échantillon (8).
RESULTATS EXPERIMENTAUX I. CONCENTRATION DE GERMES PATHOGENES AU MOYEN D'UNE ETAPE D'AGREGATION I. 1 Agrégation des plaquettes.
Exemple 1. Agrégation avec un aqoniste fort : la thrombine.
Les étapes a et b s'effectuent généralement au sein d'un solvant inerte tel que le tétrahydrofuranne, le dioxanne, un solvant chloré (dichlorométhane, chloroforme par exemple), en présence d'une amine telle qu'une trialkylamine (triéthylamine par exemple), à une température comprise entre 5 C et 20 C.
Les composés de formule (1) pour lesquels R représente un radical CHR46 et R46 représente un radical-N (R47)-SO2-R49 pour lequel R47 est un radical Het3 ou Ar3 peuvent être préparés selon le schéma réactionnel suivant :
Dans ces formules R4, R3 et R49 ont les mêmes significations que dans la formule (I), Rd représente un radical Ar3 ou Het3 (Het3 et Ar3 ayant les mêmes significations que dans la formule (1)) et Ms représente un radical méthylsulfonyloxy.
L'étape a s'effectue généralement au sein d'un solvant inerte tel que le tétrahydrofuranne, en présence de triphénylphosphine et de diéthylazodicarboxylate, à une température comprise entre 0 C et la température d'ébullition du milieu réactionnel.
L'étape b s'effectue généralement au sein d'un solvant inerte tel que le tétrahydrofuranne, le dioxanne, un solvant chloré (dichlorométhane, chloroforme par exemple), à une température comprise entre 15 C et 30 C, en présence d'une base telle qu'une trialkyamine (triéthylamine, dipropyléthylamine par exemple) ou au sein de la pyridine, à une température entre 0 C et 30 C.
L'étape c s'effectue de préférence, au sein d'un solvant inerte tel que le dioxanne, en présence de CSC03, au reflux du mélange réactionnel.
Les dérivés pour lesquels Rd représente un hétérocycle azoté N-oxydé peuvent être réduits composé non oxydé selon la méthode décrite par SANGHANEL E. Et coll., Synthesis 1375 (1996).
Les dérivés Rd-NH-S02R49 peuvent être obtenus selon le schéma réactionnel suivant Dans ces formules Hal représente un atome d'halogène et Rd représente un radical Het3 ou Ar3. La réaction s'effectue au sein d'un solvant inerte tel que le tétrahydrofuranne, le dioxanne, un solvant chloré (dichlorométhane, chloroforme par exemple), à une température comprise entre 15 C et 30 C, en présence d'une base telle qu'une trialkyamine (triéthylamine, dipropyléthylamine par exemple) ou au sein de la pyridine, à une température comprise entre 0 C et 30 C.
Les dérivés pour lesquels Rd représente un hétérocycle azoté N-oxydé peuvent être obtenus selon la méthode décrite par RHIE R., Heterocycles, 41 (2) 323 (1995).
Les composés de formule (I) pour lesquels R représente un radical CHR46 et R46 représente un radical-N (R47)-SO2-R49 pour lequel R47 est un radical pipérid-4-yle éventuellement substitué sur l'azote par un radical alkyle peuvent également être préparés selon le schéma réactionnel suivant :
Dans ces formules R4, R3 et R49 ont les mêmes significations que dans la formule (1), alk représente un radical alkyle et Re représente un radical tert-butylcarbonyloxy.
L'étape a s'effectue au sein d'un solvant inerte tel qu'un solvant chloré (dichlorométhane par exemple), en présence d'un hydrure tel que le triacétoxyborohydrure de sodium et d'acide acétique, à une température comprise entre 0 C et la température d'ébullition du milieu réactionnel.
L'étape b s'effectue généralement au sein d'un solvant inerte tel que le tétrahydrofuranne, le dioxanne, un solvant chloré (dichlorométhane, chloroforme par exemple), en présence d'une amine telle qu'une trialkylamine (triéthylamine par exemple), à une température comprise entre 5 C et 20 C.
L'étape c s'effectue au moyen d'acide chlorhydrique, au sein du dioxanne, à une température comprise entre 0 C et la température d'ébullition du milieu réactionnel.
L'étape d s'effectue par tout moyen connu de l'homme de l'art pour alkyler une amine sans toucher au reste de la molécule. On peut par exemple utiliser un halogènure d'alkyle, en présence d'une base organique telle que la triéthylamine, un hydroxyde de métal alcalin (soude, potasse par exemple), éventuellement en présence de bromure de tétrabutylammonium, au sein d'un solvant inerte tel que le diméthylsulfoxyde, le diméthylformamide ou la pyridine, à une température comprise entre 20 et 50 C.
Les composés de formule (1) pour lesquels R représente un radical CHR46 et R46 représente un radical-N (R47)-SO2-R49 pour lequel R47 est un radical phényle substitué par un radical pyrrolid-1-yle peuvent également être préparés par action de pyrrolidine sur un composé de formule (1) correspondant pour lequel R46 représente un radical-N (R47) S02R49 pour lequel R47 est un radical phényle substitué par un atome d'halogène.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique codant pour un"fragment"d'un polypeptide possédant au moins 95% d'identité en nucléotides avec un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID ? 5 ou SEQ ID N06.
L'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un fragment d'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID ? 5 ou SEQ ID N06.
Un polypeptide ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence comprend au moins 96%, 97%, 98%, 99%, 99, 1%, 99,2%, 99,3%, 99,4%, 99, 5%, 99,6%, 99,7%, 99,8% ou 99,9% d'identité en acides aminés avec le polypeptide de référence.
Sont englobés dans la définition d'un polypeptide ayant au moins 95% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence selon l'invention, les polypeptides dits"variants". Par"variant"d'un polypeptide selon l'invention, on entend un polypeptide dont la séquence en acides aminés comprend une ou plusieurs substitutions, additions ou délétions d'au moins un résidu d'acide aminé, par rapport à la séquence d'acides aminés du polypeptide de référence, étant entendu que les substitutions d'acides aminés peuvent être de nature conservative ou non conservative.
Un variant d'un polypeptide de référence selon l'invention consiste en un polypeptide qui conserve la fonction ou l'activité biologique du polypeptide de référence et/ou qui est reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide de référence. Ces variants polypeptidiques peuvent résulter de variations alléliques caractérisées par des différences dans les séquences nucléotidiques du gène codant pour ces polypeptides. De tels variants polypeptides peuvent aussi résulter d'épissages alternatifs ou de modifications post-traductionnelles.
Par"fragment"d'un polypeptide de référence selon l'invention, on entend un polypeptide possédant au moins 10, 15,20, 25,30, 40,50, 60, 70,80, 90,100, 110,120, 130,135 ou 140 acides aminés consécutifs d'un polypeptide tel que défini dans la présente description.
SONDES ET AMORCES SELON L'INVENTION Les acides nucléiques selon l'invention, et en particulier les séquences nucléotidiques SEQ ID N01 à SEQ ID N'4, leurs fragments d'au moins 12 nucléotides, les séquences ayant au moins 95% d'identité en nucléotides avec au moins une partie des séquences SEQ ID N01 à SEQ ID N"4, ainsi que les acides nucléiques de séquence complémentaire, sont utiles pour la détection de la présence d'au moins une copie d'une séquence nucléotidique du gène Isum2A ou encore d'un fragment ou d'un variant allélique de cette dernière dans un échantillon.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N01 à SEQ ID N04.
Les conditions d'hybridation ci-dessous sont mises en oeuvre pour l'hybridation d'un acide nucléique, sonde ou amorce, de 20 bases de longueur.
Le niveau et la spécificité d'hybridation dépend de différents paramètres, tels que : a) la pureté de la préparation de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; b) la composition en bases de la sonde ou de l'amorce, les paires de base G-C possédant une plus grande stabilité thermique que les paires de bases A-T ou A-U ; c) la longueur de la séquence de bases homologues entre la sonde ou l'amorce et l'acide nucléique ; d) la force ionique : le taux d'hybridation augmente avec l'accroissement de la force ionique et la durée du temps d'incubation ; e) la température d'incubation ;
f) la concentration de l'acide nucléique sur lequel la sonde ou l'amorce doit s'hybrider ; g) la présence d'agents dénaturants tels que des agents favorisant la rupture des liaisons hydrogène, comme le formamide ou l'urée, qui accroissent la stringence de l'hybridation ; h) le temps d'incubation, le taux d'hybridation augmentant avec la durée de l'incubation ; i) la présence d'agents d'exclusion de volume, tels que le dextran ou le sulfate de dextran, qui augmentent le taux d'hybridation du fait qu'ils accroissent les concentrations effectives de la sonde ou l'amorce et de l'acide nucléique qui doit s'hybrider, au sein de la préparation.
Par conditions d'hybridation de forte stringence selon l'invention, on entend des conditions d'hybridation telles que l'on se place à une température d'hybridation de 50C au-dessous du Tm.
Dans ces exemples, les X représentent les bases azotées constituant l'ADN contigu au site de restriction et qui n'interviennent pas dans le site de restriction. Dans la présente, ces bases azotées constituent les séquences internes propres à chaque fragment d'ADN obtenu après digestion par l'enzyme. Cet
exemple montre que l'enzyme de restriction Hae III coupe l'ADN avec des extrémités franches, et que les enzymes EcoRI ou PstI coupent l'ADN avec des extrémités cohésives.
Outre les enzymes précités, on peut utiliser, à titre d'exemple, EcoR I, Aat II, Sno I, Bgl II, Bln I, Bse AI, Cla I.
Selon la présente invention, le choix de l'enzyme de restriction utilisée sera fonction du nombre souhaité de fragments générés à partir de l'ADN de l'organisme dont on souhaite fabriquer l'empreinte. En effet, le nombre de fragments générés par la digestion par l'enzyme de restriction ne doit pas être trop élevé afin de ne pas saturer la puce de la présente invention après amplification.
Les inventeurs ont déterminé que le rapport nombre de fragments amplifiés/nombre de sondes ou plots de la puce se situe avantageusement entre 0,2. et 0, 05, de préférence entre 0,5. et 0,01. Le nombre de fragments générés par digestion de 11 ADN dl un organisme par une enzyme de restriction peut être déterminé facilement par la méthode AFLP [11].
Lorsqu'une seule enzyme de restriction est utilisée les enzymes de restriction générant entre 106 et 102 fragments de restriction, de toute préférence entre 104 et 103 fragments de restriction de taille amplifiable, de préférence de 500 à 1000 paires de bases, seront particulièrement préférés selon la présente invention.
Selon l'invention, le choix de l'enzyme de restriction utilisée peut aussi être fonction de la
quantité de bases azotées constituant le reste de séquence du site de restriction après coupure par l'enzyme. En effet, comme exposé ci-dessus, il est préférable que le reste de séquence du site de restriction ait une longueur suffisante pour obtenir une hybridation spécifique et stable entre le reste du site de restriction et sa séquence complémentaire sur chaque sonde. Le reste de séquence peut toutefois être complété par un oligonucléotide adaptateur comme exposé ci-dessous.
L'enzyme de restriction peut aussi être choisie en fonction du type de coupure, franche ou cohésive, qu'il génère en coupant l'ADN. Une coupure cohésive est préférée lorsqu'un adaptateur est lié aux fragments comme exposé ci-dessous.
L'étape de digestion enzymatique peut être effectuée par les méthodes classiques de digestion enzymatique mettant en oeuvre les enzymes de restriction. Par exemple, l'ouvrage de Sambrook J, Firtsch E. F., Maniatis T., 1989 Molecular cloning : a laboratory manual 2nd edition, New-York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, cold Spring Harbor, New-YorK décrit des méthodes utilisables dans le procédé de la présente invention. En général, on utilise les conditions indiquées par le fabricant fournisseur de l'enzyme de restriction.
Outre les raisons exposées ci-dessus, le choix de l'enzyme de restriction utilisé peut également être fonction de sa disponibilité sur le marché, de son coût, des conditions de son utilisation et du protocole de préparation de la collection de fragments etc.