INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'augmentation de la quantité de 5-défensines sur la peau humaine contribue donc à préserver l'écosystème microbien cutané, en évitant des invasions trop fortes de certaines espèces qui peuvent être pathogènes (Staphy/ococcus aureus), ce qui permet de conserver une peau protégée et plus saine. Pour ce faire, deux stratégies peuvent être envisagées: - Soit l'application par voie topique de peptides synthétiques présentant des séquences ou des structures analogues à celles des peptides antibiotiques connus et décrits par l'homme de l'art.
- Soit l'induction provoquée des défensines par l'application par voie topique ou par voie orale d'un actif capable de stimuler la synthèse de 15 ces peptides au sein des cellules naturellement sécrétrices.
A l'exception des cytokines précédemrnent citées (TNFa, IFNy, IL1), peu de produits ont été décrits pour leur capacité d'induction des p- défensines, excepté chez l'animal, où la L-Isoleucine induit l'expression de hBD3 dans des lignées de cellules épithéliales rénales bovines (Fehlbaum P. et al., An essential amino acid induces epitheliall p.- defensin expression. PNAS 2000; 97: 12723-12728; Brevet W00168085 Anderson M. et al., Method for stimulation of defensin production. 20-09- 2001). Chez l'homme, il a été montré que la différenciation des kératinocytes stirnule la production de hBD2 (Liu AY. Et al., Human (3- defensin-2 production in keratinocytes is regulated by interleukin-1, bacteria and the state of clifferentiation. J Invest Dermato/ 2002; 118: 275-281).
Les études concernant la présence des défensines hBD2 et hBD3 dans la peau, ont été réalisées sur des coupes de peau, des expiants, des cellules en cultures ou des peaux reconstruites. L'augmentation de la quantité de défensines peut être visualisée par différentes techniques, mais aucune de ces techniques n'a été à ce jour appliquée à la recherche par screening, d'un principe actif capable de stimuler de façon quantitative hBD2 et hBD3 dans les cellules humaines. En effet, les techniques classiquement utilisées par l'homme de l'art ne sont pas applicables au problème soulevé à savoir la recherche de principes actifs capables de stimuler les défensines humaines de façon quantitativement prouvée (absence d'anticorps commerciaux ce qui induit l'impossibilité d'effectuer des dosages quantitatifs de protéines par des méthodes de type ELISA; méthodes de biologie moléculaire de type hybridation in situ, transfert de Northern, RT-PCR, qui sont plus qualitatives que quantitatives; modèles de cellules humaines en culture tridimensionnelle très complexes et non utilisables dans des méthodes de screening).
Un tel dosage sera mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention.
BUTS DE l'INVENTION Le but des inventeurs était de trouver des principes actifs capables d'induire l'expression des [i-défensines de type 2 et/ou de type 3 sans induire de réactions inflammatoires, et par exemple, sans stimuler de façon trop importante la sécrétion de molécules habituellement exprimées dans le cas de réactions inflammatoires.
En effet, jusqu'à présent, toutes les molécules décrites pour leur capacité de stimulation des défensines chez l'homme (TNFa, IL1, LPS, bactéries, IFNy...), ont des propriétés pro-inflammatoires; elles stimulent des cytokines de l'inflammation telles que ILia, IL8 ou MIP3a.
Ainsi, l'invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir un principe actif capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines, de type 2 et/ou des bêta-défensines humaines de type 3, sans entraîner de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s) ou d'intolérance(s).
L'invention a pour but de résoudre le nouveau problème technique consistant à fournir un principe actif capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 et/ou des bêta-défensines humaines de type 3 sans stimuler ou sensiblement sans stimuler la synthèse, directe ou indirecte, de molécules proinflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend la sélection des principes actifs stimulant l'expression des bêta-défensines humaines précitées et ne stimulant pas ou sensiblement pas de façon concomitante au moins une molécule pro-inflammatoire ou au moins une molécule habituellement co-exprimée lors de processus inflammatoires, telles que IL1, IL8, MIP3a.
Avantageusement ladite méthode de criblage comprend les étapes suivantes: - La mise en contact des principes actifs potentiels à cribler avec des kératinocytes humains normaux, en monocouche, en milieu défini sans sérum et enrichi en calcium, par exemple en réalisant parallèlement un témoin non traité et deux témoins positifs (TNFa pour hBD2 et IFNy pour hBD3) ; L'extraction puis le dosage des ARN totaux sur un spectrophotomètre, de manière préférée à des longueurs d'onde de 260 et 280 nm; ces ARN sont éventuellement dilués; - Une RT-PCR sur l'actine, la hBD2 et la hBD3 est réalisée sur l'ARNtotal initial; La rétro-transcription de l'ARNtotal puis l'amplification du produit rétrotranscrit (ADNc), qui est effectuée par exemple dans un thermocycleur et suit un programme d'amplification, qui est éventuellement commun pour l'actine, hBD2 et hBD3; Le mélange des produits d'amplification de hBD2, hBD3 et de l'actine, puis l'ajout d'un mélange tampon de charge et d'eau (2/3), la solution finale étant déposée sur gel précoulé d'agarose contenant du bromure d'éthidium. Les échantillons migrent et les bandes obtenues par cette technique sont visualisées sous UV, de préférence en chambre noire et photographiées numériquement. Les bandes sont analysées dans cette étape pour quantifier leur l'intensité. Le niveau basal d'expression des défensines (témoin non traité) n'étant pas détectable, les rapports d'intensité des bandes hBD2/actine et hBD3/actine peuvent être comparés par exemple à ceux obtenus pour le térnoin positif (traité par le TNFa pour hBD2 et l'IFNy pour hBD3), ce qui permet de mettre en évidence une éventuelle stimulation de l'expression de la f3-défensine considérée; Avantageusement, cette méthode de criblage comprend une étape supplémentaire: - La sélection des principes actifs potentiels à cribler ayant exercé un effet sur l'expression des (3-défensines de type 2 et/ou de type 3; les surnageants correspondants à ces actifs sont testés pour doser les taux de molécules habituellement co-exprimées lors de processus pro- inflammatoires telles que MIP3a, IL1 et IL8 sécrétées dans le milieu de culture sous l'effet des actifs; par exemple les taux sont alors rapportés à la concentration en ARN dosée, afin de comparer les résultats entre eux.
Avantageusement, ladite méthode de criblage permet de mettre en évidence qu'un principe actif capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte de 5-défensines humaines de type 2 et/ou de type 3, peut simultanément ne pas ou sensiblement pas stimuler la synthèse, directe ou indirecte, de molécules pro-inflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoires, lorsqu'il est choisi parmi la racine d'armoise, la vergerette du Canada, l'écorce de sureau, l'herniaire, le jus d'ananas, la menthe poivrée, l'Arequier, le cacaoyer, le quinoa, l'arnica, le boldo, la salsepareille, la feuille de noyer, la fleur d'hibiscus, le potiron, le tournesol, la pivoine, le millepertuis, Ile marronnier dinde ou l'un de leurs extraits; l'acide jasmonique ou la vitamine A, leurs dérivés et leurs précurseurs; l'alpha-MSH ou un des peptides constituant l'alpha-MSH ou une structure chimique mimant un de ces peptides; les esters de l'isoleucine; le calcium ou tous les sels organiques ou minéraux de calcium. L'invention concerne, selon un septième aspect, l'utilisation d'un principe actif pour la fabrication d'une composition cosmétique destinée à exercer une activité bactéricide et/oufongicide sur les tissus traités, notamment sur la peau, sur les muqueuses, sur les phanères ou le cuir chevelu. Dans le cas du cuir chevelu, ladite composition cosmétique peut être utilisée pour prévenir ou traiter les états pelliculaires.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, les principes actifs objets de l'invention, peuvent être associés à d'autres substances cosmétiquement actives pour renforcer la protection des peaux fragilisées lors des processus de vieillissement et/ou soumises à des stress dus à l'environnement et/ou aux conditions climatiques (froid, UV....) et/ou à des procédés de nettoyage ne respectant pas l'écosystème cutané. Les compositions résultant de l'invention peuvent se présenter sous toutes les 1 6 formes galéniques utilisées en cosmétique et peuvent être notamment sous forme d'une solution aqueuse éventuellement gélifiée, d'une dispersion du type lotion éventuellement biphasée, d'une émulsion de type eau/huile ou huile/eau ou d'une émulsion triple ou d'une dispersion vésiculaire. Cette composition peut se présenter sous un aspect sec ou être plus ou moins fluide ou avoir l'aspect d'une crème blanche ou colorée, d'un sérum, d'une mousse. Elle peut éventuellement être appliquée sur la peau sous forme d'aérosol ou de stick. Elle peut être 'utilisée comme produit de soin et/ou comme produit de maquillage pour la peau et/ou comme produit de nettoyage pour la peau, les muqueuses, les phanères et le cuir chevelu. De façon connue, la composition résultant de l'invention peut contenir également tous les adjuvants utilisables en cosmétique tels que les gélifiants, les actifs, les conservateurs, les huiles, les solvants, les antioxydants, les parfums, les charges, les pigments, les filtres, les absorbeurs d'odeur et les matières colorantes.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un principe actif stimulant l'expression, directe ou indirecte, des bêta-défensines humaines de type 2 (hBD2) et/ou des bêta-défensines humaines de type 3 (hBD3) et n'entraînant pas de réactions iinflammatoire(s), d'irritation(s) ou d'intolérance(s) pour fabriquer une composition dans le domaine des tissus reconstruits, de façon à utiliser l'action bactéricide des bêtadéfensines cutanées dans la construction d'épidermes et de peaux reconstruites et dans le maintien en survie de biopsies cutanées.
Avantageusement ladite composition, comprenant au moins un agent microbiocide et/ou microbiostatique, est notamment utilisable dans le domaine pharmaceutique, de façon à combiner l'action bactéricide des bêtadéfensines cutanées avec l'action de ces agents, notamment pour le traitement des pathologies liées à une composante microbienne comme les états pelliculaires, l'acné, le vitiligo, les dermatites et autres pathologies de la peau, des muqueuses, du cuir chevelu et des phanères dont les ongles, à composantes microbiennes.
Les inventeurs ont utilisé des méthodes d'analyses mettant en évidence la synthèse, directe ou indirecte, de molécule(s) proinflammatoire(s) ou de molécule(s) habituellement c:o-exprimée(s) lors de processus inflammatoire(s), de manière à pouvoir mettre en évidence la ou les réactions inflammatoire(s), d'irritation(s), ou d'intolérance(s).
L'invention peut être mise en oeuvre de manière différente pour mettre en évidence le ou les réactions inflammatoire(s), d'irritation(s), ou d'intolérance(s), par exemple en évaluant les sensations de picotements, de gênes, de tiraillements ressentis par les individus lors de l'application sur le tissu à traiter.
Selon encore une autre caractéristique avantageuse de l'invention applicable pour l'un quelconque de ces aspects, on sélectionne un principe actif qui est capable de stimuler l'expression, directe ou indirecte de bêta- défensine(s) humaine(s) de type 2 et/ou de type 3 et ne stimulant pas simultanément ou sensiblement pas la synthèse, directe ou indirecte, de molécules pro-inflammatoires ou de molécules habituellement co-exprimées lors de processus inflammatoire, par exemple une cytokine pro- inflammatoire ou au moins une cytokine habituellement co-exprimée lors de processus inflammatoire(s), telle que II_1, IL8, MIP3a.
18 DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
La méthode de la présente invention développée par les inventeurs permet de sélectionner par criblage puis d'identifier des principes actifs capables d'augmenter la quantité d'ARNm des défensines hBD2 et/ou hBD3 dans les cellules épidermiques, caractérisés en ce que lesdits principes actifs n'entraînent pas ou sensiblement pas de réactions inflammatoire(s), d'irritation(s) ou d'intolérance(s).
La méthode de criblage comprend notamment les étapes suivantes: Des cellules épithéliales humaines normales, de préférence des kératinocytes humains normaux, sont cultivées en rnonocouche en milieu défini sans sérum, la concentration en calcium étant comprise de préférence entre 0 et 100 mM, de préférence 1,7mM. A un certain degré de confluence des cultures cellulaires, de préférence compris entre 75 et 95%, de préférence 80% les cellules sont mises en contact avec les principes actifs potentiels à cribler, pendant une durée comprise entre 6 et 48 h, de préférence pendant 16 h. Il peut être effectué en parallèle, la réalisation d'au moins un témoin non traité et d'au moins un témoin positif, de préférence sur la même plaque de culture, ce qui facilite la réalisation du criblage. Les témoins positifs sont le TNFa pour hBD2 et IFNy pour hBD3 et remplacent le principe actif potentiel à cribler; avantageusement leurs concentrations sont comprises entre 1 et 500 ng/ml, de préférence 100 ng/ml. Après cette mise en contact, les surnageants sont collectés et les cellules peuvent être congelées à sec par exemple à -80 C après un rinçage au PBS (Phosphate Buffer Saline). Les ARN totaux sont extraits et dosés par spectrophotométrie, de préférence à 260 et 280 nm, puis la concentration de ces ARN totaux est de préférence diluée à une concentration comprise entre 2 et 50 ng/ml, de préférence 5 ng/ml. La RT- PCR qualitative est réalisée sur l'actine, hBD2 et hBD3. Les amorces sont issues de la littérature (pour hBD2: Harder J. et al., A peptide antibiotic from human skin. Nature 1997; 387: 861; pour hBD3 et actine: Harder 3. et al., Isolation and characterization of human f3-defensin-3, a novel human inducible peptide antibiotic. J Bic)/ Cham 2001; 276: 5707- 5713) et sont: Actine sens: 5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3' (SEQ ID N 1) antisens: 5'-CTCCTfAATGTCACGCACGATTTC-3' (SEQ ID N 2) hBD2 sens: 5'CCAGCCATCAGCCATGAGGGT-3' (SEQ ID N 3) antisens: 5'-GGAGCCCTITCTGAATCCGC:A3' (SEQ ID N 4) hBD3 sens: 5'-AGCCTAGCAGCTATGAGGATC-3' (SEQ ID N 5) antisens: 5'-CTTCGGCAGCATTTTCGGCCA-3' (SEQ ID N 6) Les séquences des primers utilisées pour la RT-PCR peuvent être différentes de celles citées à condition de rester spécifiques des gènes étudiés (actine, hBD2 et hBD3).
La figure 2 représente, selon une vue en perspective, un exemple du manchon rigide 8 du dispositif de l'invention. Le manchon rigide 8 a un corps de forme allongée. Dans un exemple préféré, la longueur du manchon 8 est de l'ordre de 15 à 20 cm. La longueur du manchon est à moduler en fonction du positionnement de l'ampoule 10 dans le projecteur. Le corps du manchon rigide 8 comporte une cavité creuse et débouchante, dans laquelle peut s'insérer un autre élément, à savoir le support flexible. Autrement dit, le manchon rigide 8 a une forme oblongue, par exemple cylindrique, qui sert de guide au support flexible.
Le manchon rigide 8 est réalisé dans un matériau rigide, par exemple du plastique ou du métal.
Le manchon rigide 8 comporte deux faces f1 et f2, opposées l'une à l'autre. Chaque face f1 et f2 du manchon rigide 8 comporte au moins un contact électrique, respectivement, 13 et 14. Ces contacts électriques 13 et 14 se situent, de préférence, à proximité de la sortie S du manchon rigide 8. Ces deux contacts électriques 13 et 14 assurent une liaison électrique entre une source d'alimentation électrique (non représentée) et le support flexible du porte lampe.
Les contacts électriques 13 et 14 peuvent être reliés à une source d'alimentation électrique à l'aide de fils électriques, respectivement, 15 et 16. Ces fils électriques 15 et 16 sont constitués d'un ou de plusieurs brins d'un matériau métallique conducteur. Ces fils électriques 15 et 16 sont destinés à établir une liaison électrique entre, respectivement, les contacts électriques 13 et 14 et la source d'alimentation électrique.
Pour maintenir ces fils électriques 15 et 16, le manchon rigide 8 peut comporter un ou plusieurs moyens d'attache 17. Un moyen d'attache 17 peut consister en une série de crochets 17a, 17b, 17c. Chaque crochet 17a, 17b, 17c est dans cet exemple un élément en forme de L. D'autres formes sont possibles, notamment des formes en anneau avec ouverture. Plusieurs crochets, par exemple 3, sont placés tête bêche les uns par rapport aux autres. Les crochets 17a, 17b, 17c sont de préférence rigides. Ils peuvent être réalisés dans le même matériau que le corps du manchon. Les crochets 17a, 17b, 17c sont positionnés le long du manchon rigide 8. Ils peuvent être placés à différents emplacements sur le manchon rigide 8, par exemple de part et d'autre du support 18.
Dans l'exemple de la figure 2, le manchon rigide 8 comporte deux moyens d'attache de trois crochets chacun. Les six crochets 17 ont pour rôle de rassembler, de maintenir et de plaquer les fils électriques 15 et 16 le long du manchon rigide 8.
Le manchon rigide 8 comporte un support 18 rigide. II se présente sous la forme d'un élément saillant radialement par rapport à la direction principale longitudinale du manchon. Ce support 18 est de préférence, équidistant des faces f1 et f2 du manchon rigide 8. Le support 18 peut être réalisé dans le même matériau que le corps du manchon rigide 8. Il est destiné à supporter le manchon rigide 8. II est apte à subir des efforts, notamment des efforts dus aux vibrations du véhicule. Les crochets 17 et le support 18 peuvent également être conçus de façon à faire partie d'une même pièce que l'on vient rapporter sur le corps du manchon 8.
Dans un exemple préféré, le support 18 est implanté au centre du manchon rigide et il comporte une tige rigide 19, dont une extrémité est fixée sur le corps du manchon rigide 8. Un pied 20 est fixé sur une autre extrémité de la tige 19. Ce pied 20 peut être de forme plate de sorte qu'il peut reposer sur la paroi inférieure 2a du boîtier 2 du dispositif d'éclairage. Le pied 20 peut comporter une lame ressort 21 en appui sur la paroi 2a du boîtier. Cette lame ressort 21 a pour rôle d'amortir les vibrations provenant du déplacement du véhicule, pour maintenir le corps du manchon rigide en place, notamment face à la glace de protection du boîtier du dispositif d'éclairage.
Le manchon rigide 8 comporte, sur l'entrée E, une languette de fixation 22. La languette de fixation 22 est une pièce rigide, comportant un orifice 23. Cet orifice 23 est destiné à être traversé par un élément de fixation, du type vis ou rivet, permettant de fixer le manchon rigide 8 sur le boîtier. Le manchon rigide 8 est fixé de manière définitive sur le boîtier du dispositif d'éclairage au moyen de la languette de fixation 22. La languette de fixation 22 est, de préférence, située sur une face du manchon 8 opposée à celle du support 18.
Le manchon rigide 8 comporte, sur son entrée E, au moins une fente 24. Dans l'exemple de la figure 2, le manchon rigide 8 comporte quatre fentes, dont deux sont visibles sur la figure 2, à savoir les fentes 24 et 25 de la face f1. Plus précisément, chaque face f1 et f2 du manchon rigide 8 comporte deux fentes, telles que 24 et 25. Les fentes 24 et 25 sont des rainures étroites formées dans la zone d'entrée E du manchon rigide 8. Entre les deux fentes 24 et 25, le manchon rigide 8 comporte un orifice 27, dont le rôle sera décrit ultérieurement.
La figure 3 représente, selon une vue en perspective, un exemple d'un support flexible 9 du dispositif de l'invention. Le support flexible 9 comporte une tête rigide 30 située à une extrémité el du support flexible 9. Cette tête rigide 30 comporte un socle 31 destiné à supporter une ampoule (non représentée sur la figure 3). Autrement dit, le socle 31 forme une base sur laquelle est fixée une ampoule.
Le support flexible 9 comporte deux faces f3 et f4, opposées l'une à l'autre. Chaque face f3 et f4 du support flexible 9 comporte au moins un contact électrique, respectivement, 32 et 33. Ces contacts électriques 32 et 33 se situent, de préférence, sur la tête 30 du support flexible 9. Ces deux contacts électriques 32 et 33 sont en regard l'un de l'autre; ils assurent une liaison électrique entre l'ampoule 10 et les contacts électriques 13 et 14 du manchon rigide 8.
Le support flexible 9 comporte une queue rigide 34, située à une extrémité e2 dudit support flexible. La queue 34 du support flexible 9 comporte un embout de préhension 35. Cet embout de préhension 35 permet une meilleure prise en main, pour l'utilisateur, lorsqu'il retire ou met en place le support flexible dans le manchon rigide.
La queue 34 du support flexible comporte au moins une nervure 36. De préférence, le support flexible 9 comporte autant de nervures 36 qu'il y a de fentes 24 et 25 sur le manchon rigide 8. Chaque nervure est destinée à être introduite dans une fente du manchon 8. Par exemple, il comporte deux nervures 36 et 37 sur chaque faces f3 et f4 du support flexible 9. Les nervures 36, 37 sont des parties saillantes, rectilignes, formées sur la queue rigide 34 du support flexible 9. Sur la figure 3, la vue en perspective du support flexible 9 montre trois nervures 36 et 37 sur la face f3 et 38 sur la face f4.
Le support flexible 9 peut comporter au moins un clip de fixation 39. Ce clip de fixation 39 est un ergot apte à s'emboîter dans l'orifice 27 du manchon rigide 8.. Ce clip 39 peut être placé entre les deux nervures 36 et 37 du support flexible 9. Le clip de fixation 39 et l'orifice 27 forment un système de verrouillage du support flexible 9 dans le manchon rigide 8, qui sera décrit plus en détail ultérieurement.
La tête 3C) et la queue 34 du support flexible 9 sont reliées par l'intermédiaire d'un corps flexible, ou corps souple, 40. Ce corps souple 40 a une forme allongée de dimensions adaptées à la cavité du manchon rigide 8.
La plaque de renfort peut ainsi être sertie sur le circuit conducteur. La présente invention n'est toutefois pas limitée par la manière dont la plaque de renfort est fixée sur le circuit conducteur.
Le ou les pions de sertissage ont avantageusement une direction sensiblement perpendiculaire au circuit conducteur, mais la présente invention n'est pas limitée par la présence ni la par la forme des pions de sertissage.
En variante l'agencement peut être inverse c'est-à-dire que la plaque 20 de renfort peut comprendre au moins un pion de sertissage, une ouverture du circuit conducteur étant destinée à recevoir un pion de sertissage lorsque la plaque de renfort est repliée sur le circuit conducteur Le dispositif support est avantageusement à base de polypropylène, de polytéréphtalate de butylène ou de polyamide, mais tout autre matériau permettant de réaliser la plaque de renfort et le circuit conducteur en une seule pièce peut également être utilisé.
La présente invention a également pour objet un procédé de fabrication d'un dispositif support pour un dispositif de signalisation et/ou d'éclairage destiné à un véhicule automobile. Le dispositif support comprend un circuit conducteur pour recevoir au moins une source lumineuse. Le dispositif support comprend également une plaque de renfort permettant de maintenir au moins une lame de contact métallique sur le circuit conducteur. Le procédé selon la présente invention comprend une étape de moulage en une seule pièce de la plaque de renfort et du circuit conducteur.
Le procédé de fabrication selon la présente invention comprend 10 avantageusement une étape de repli de la plaque de renfort sur le circuit conducteur (ou réciproquement).
La plaque support est ainsi relativement dégagée avant le repli de la plaque de renfort, ce qui permet une manipulation aisée, par exemple pour poser les lames de contact sur le circuit conducteur. La plaque de renfort est ensuite repliée sur le circuit conducteur, permettant par là de maintenir les lames de contact posées au préalable.