INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Selon un second aspect, l'organisme multicellulaire végétal est transformé avec une ou plusieurs copies d'un polynucléotides codant pour la protéine RRS1-R ou pour un polypeptide ayant au moins 40% d'identité en acide aminé avec le polypeptide RRS1-R et conservant l'activité biologique permettant de conférer un phénotype de résistance à R solanacearum à l'organisme transformé.
L'invention a encore pour objet une plante transgénique, c'est-àdire une plante transformée comprenant, préférentiellement sous une forme intégrée dans son génome, un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S et préférentiellement un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyrimidine ou encore un acide nucléique codant pour le polypeptide RRS1-S ou un polypeptide homologue, ledit acide nucléique ayant été inséré dans le génome de la plante par transformation avec un aide nucléique de RRS1-R ou RRS1-S ou un vecteur recombinant selon l'invention.
Préférentiellement, une plante transformée selon l'invention est un colza, un tabac, un maïs, une tomate, une pomme de terre ou Arabidopsis thaliana.
Selon un premier aspect, les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus présentent une expression réduite, une expression indétectable ou une absence d'expression du gène RRS1-S et sont ainsi susceptibles de présenter une résistance accrue à des pathogènes tels que R. solanacearum.
Selon un second aspect, les plantes transgéniques telles que définies ci-dessus ont la propriété d'exprimer fortement le polypeptide RRS1R et de posséder en conséquence un phénotype de résistance à différents pathogènes, et tout particulièrement à des pathogènes bactériens tels que R solanacearum.
L'invention a en outre pour objet un procédé d'obtention d'une plante transgénique transformée avec un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes. a) obtention d'une cellule hôte recombinante végétale telle que définie ci-dessus; b) régénération d'une plante entière à partir de la cellule hôte végétale transformée obtenue à l'étape a); c) sélection des plantes obtenues à l'étape b) ayant intégré l'acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S d'intérêt L'invention est également relative à un procédé d'obtention d'une plante transgénique, transformée avec un acide nucléique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) transformer une cellule de plante avec un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S ou avec un vecteur recombinant selon l'invention; b) régénérer une plante entière à partir de cellules de plantes transformées obtenues à l'étape a);
c) sélectionner les plantes ayant intégré l'acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S d'intérêt.
L'invention concerne aussi un procédé d'obtention d'une plante transformée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes: a) obtention d'une cellule hôte d'Agrobacterium tumefaciens transformée avec un acide nucléique ou un vecteur recombinant selon l'invention, b) transformation de la plante choisie par infection avec des cellules d'Agrobacterium tumefaciens obtenues à l'étape a); c) sélection des plantes ayant intégré l'acide nucléique selon l'invention L'un quelconque des procédés d'obtention d'une plante transgénique ci-dessus décrit peut en outre comporter les étapes additionnelles suivantes d) croisement entre elles des deux plantes transformées telles qu'obtenues à l'étape c); e) sélection des plantes homozygotes pour le transgène.
Selon un autre aspect, l'un quelconque des procédés ci-dessus décrits pourra en outre comprendre les étapes suivantes: f) croisement d'une plante transformée obtenue à l'étape c) avec une plante de la même espèce; g) sélection des plantes issues du croisement de l'étape d) ayant conservé le transgène.
L'homme du métier est capable de mettre en oeuvre de nombreux procédés de l'état de la technique afin d'obtenir des plantes transformées avec un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S selon l'invention.
L'homme du métier pourra se référer avantageusement à la technique décrite par BECHTOLD et al. (1993) afin de transformer une plante à l'aide de la bactérie Agrobacterium tumefaciens Les techniques utilisées dans d'autres types de vecteurs peuvent également être utilisées telles que les techniques décrites par BOUCHEZ et al. (1993) ou encore par HORSCH et al (1984).
L'invention a en outre pour objet une plante transformée telle qu'obtenue selon l'un quelconque des procédés d'obtention décrits cidessus.
L'invention concerne également une semence de plante dont les cellules constitutives comprennent un acide nucléique du gène RRS1-R ou du gène RRS1-S selon l'invention qui a été artificiellement insérée dans leur génome L'invention a encore pour objet une semence d'une plante transgénique telle que définie ci-avant.
Un autre objet de l'invention consiste en l'utilisation d'un acide nucléique du gène RRS1-R ou du gène RRS1-S selon l'invention pour l'expression in vitro ou in vivo, de préférence in planta de la protéine RRS1-R ou RRS1-S ou d'un fragment peptidique de celle-ci.
Cette récupération est effectuée en consultant une page correspondante dont l'URL est typiquement de la forme suivante http:ll127.0.01:80801download. html (3), dans laquelle http:11127.0.0.1:8080 est l'adresse URL de rebouclage proprement dite, telle qu'elle a été définie par la relation (1), et "download.html" page "HTML" à obtenir. Cette requête met en ceuvre une session entre 'agents apparies comme il a été décrit en regard des figures 2 à 4, selon un premier aspect de l'invention.
La carte à puce 2a envoie le formulaire "download.html" lors d'une deuxième étape, toujours par ouvertures de sessions entre agents intelligents apparies, selon le procédé de l'invention. Le formulaire obtenu peut être affiché sur un écran 5a par l'intermédiaire du navigateur 10 et est référencé sur la figure qui illustre schématiquement ce processus. Ce formulaire constitue une page d'accueil pour l'abonné désirant s'enregistrer sur un serveur d'annuaire SA;. La carte à puce 2a se comporte alors comme un serveur "WEB".
page P peut comporter, de façon usuelle, différents éléments type graphique et/ou de type texte, ainsi que des éléments interactifs de commande (bouton type dit "radio", cases à cocher, zones d'entrées de données, ).
va supposer, dans un premier temps, que la carte à puce 2a offre, à son porteur (non représenté), la possibilité de s'enregistrer sur un serveur d'annuaire unique, que l'on peut appeler SA", et selon un profil unique d'abonne, que l'on peut appeler PA,,. On suppose également que profil unique PA, est enregistré dans la carte à puce 2a. Dans cette hypothèse, le formulaire P (c'est-à-dire la page d'accueil) affiché sur l'écran 5a, peut se réduire à une présentation minimale, dont la figure 7B illustre un exemple possible: formulaire P,.
Le formulaire P, comprend diverses zones de textes, sous la reférence unique Zr. Ces zones affichent typiquement le nom "xxx" du serveur d'annuaire (SA" ), l'action proposée "enregistrement' et diverses aides (par exemple "cliquer ici"). Puisque l'on a supposé que les données du profil d'abonné étaient enregistrées dans la carte à puce 2a, il suffit de prévoir un bouton d'envoi BS. Le fait pour l'abonné de cliquer sur ce bouton à l'aide d'une souris (figure 2A: 6b) ou d'appuyer sur la touche "entree" d'un clavier (figure 2A : 6a) déclenche l'envoi du formulaire vers la carte à puce 2a. Dans une autre variante procédé selon l'invention, les données afférentes au profil de l'abonné sont saisies directement par celui-ci. Dans cette hypothèse, le formulaire est plus complexe. La figure 7C illustre un exemple possible de formulaire, référencé II comprend une première zone de texte fixe Zt ,, similaire à celle de la figure 7B (Zt) et une ou plusieurs zone(s) de saisie de données, sous la réference unique Zt 2. On prévoit comme précédemment un bouton d'envoi mais aussi avantageusement un bouton B,e, de ré-initialisation du formulaire qui permet d'effacer les données saisies en cas d'erreur. La ou les zones saisies de données Zt 2 peu(ven)t être du type dit "TEXTAREA" en langage "HTML" et présenter une facilité dite d' "ascenseur" pour l'affichage déroulant de textes longs. Le code "HTML" nécessaire pour programmer un tel formulaire est bien connu en soi et est à 1a portée de l'homme de métier. II n'est pas nécessaire de le détailler plus avant. On peut cependant indiquer qu'il contient notamment une ligne de code en langage "HTML" se présente typiquement sous la forme (4) dans laquelle http:11127.0.01:8080 l'URL de rebouclage de la relation (1), le cgi-smart" le répertoire "CGI" précite contenant un script "pe" associé à une des applications stockées dans la carte à puce 2a, référencée par exemple Ae. Cette application permet l'enregistrement de l'abonné sur l'annuaire SA,, avec le profil PA". Cette action s'effectue de la manière décrite en regard des figures 5 et 6, par mise en ceuvre des fonctionnalités offertes par la carte à puce 2a, "CGI", d'une part, et client/serveur, d'autre part. L'application Ae se comporte comme un client. Dans le premier cas (figure 7B), il n'est pas nécessaire de passer des paramètres à la carte à puce 2a. effet, les données de profil d'abonné PA" sont uniques et enregistrées dans carte à puce 2a. Dans second cas (figure 7C), les données saisies sont passées en tant que parametres à la carte à puce 2a, sous la forme d'une requête "HTTP".
La figure 7D illustre schématiquement le processus global de phase d'enregistrement d'un abonné sur un serveur d'annuaire SA", via réseau Internet RI.
La réference unique SwEB regroupe différents modules ont été explicités en regard des figures 5 et 6, modules permettant à la carte a puce 2a d'offrir les fonctionnalités combinées de client/serveur WEB et de passerelle "CGI". On a egalement supposé que l'application AB permettant la mise en ceuvre du protocole d'enregistrement "PE" était associée à un agent traducteur de script dédie Ate. II s'agit d'une configuration conforme à celle illustrée par la figure 6. Cependant, comme il a été indiqué, la traduction des scripts peut s'effectuer d'autres manières (par l'agent "WEB" 232a,), etc. L'envoi du formulaire, ouverture de sessions entre agents appariés, va permettre d'activer l'application Ae, par l'intermédiaire de l'agent traducteur de script Ate.
Lors d'une étape ultérieure, l'application Ae pose une requête "HTTP" par ouverture sessions entre paires d'agents, notamment impliquant un agent de type "réseau" (figure 6 : 132). La requête est transmise à un serveur d'annuaîre SA;, avec passage de paramètres. Les paramètres sont constitués notamment des données de profil abonné, de façon à permettre son enregistrement dans l'annuaire. L'adresse "URL" du serveur d'annuaire est obtenue à partir d'un profil d'abonné enregistré dans la carte à puce 2a ou à partir de donnees saisies dans le formulaire P2 (figure 7C).
A priori, le processus d'enregistrement est terminé à ce stade. II peut cependant comprendre une ou plusieurs étapes supplémentaires. de ces étapes peut consister en l'envoi par l'annuaire d'un accusé de réception, sous la forme d'une requête "HTTP" adressant la carte à puce 2a. L'accusé de reception peut comprendre une information indiquant que l'inscription s'est déroulée de façon satisfaisante, ou au contraire un code d'erreur. Dans ce dernier cas, le processus d'enregistrement doit être répété. Le serveur peut requérir l'envoi de données manquantes ou la ré-émission de données incorrectes ou corrompues. La demande d'enregistrement peut également être rejetée, notamment si la limite de validité de l'abonnement est dépassée. Dans une variante préférée du procédé selon l'invention, il possible, pour un abonné, de s'enregistrer sur plusieurs annuaires différents. Dans cette variante de réalisation, il est en général nécessaire de disposer également de plusieurs protocoles d'enregistrement. Pour ce faire, plusieurs applications associées à ces protocoles sont stockées dans la carte à puce 2a, l'on peut référencer Aa,, ..., A & , ... A,,, en admettant que le nombre maximum de protocoles distincts est n. Comme précédemment, les données associées aux profils d'abonné, que l'on référencera PA,, ..., PA;, ..., PA, peuvent être stockées dans la carte à puce 2a, ou au contraire fournis, au coup par coup, par l'abonne Ion une méthode similaire à ce qui à été décrit en regard de la figure 7C, isie dans un formulaire approprié. q est le nombre maximum de profils d'abonné disponibles. On notera que q n'est pas forcément égal à n. En effet un serveur d'annuaire donné, que l'on référencera arbitrairement SA;, peut accepter plusieurs occurrences distinctes d'un même abonné, d'une D'autre part, plusieurs serveurs d'abonné, bien que distincts, peuvent accepter un même profil d'abonné et éventuellement partager un protocole d'enregistrement commun. Quelle que soit la méthode utilisée pour effectuer la selection tout ou partie des serveurs d'annuaires, les paramètres passés à carte a puce 2a doivent permettre de sélectionner un ou plusieurs profils d'abonné, à PAD, et en " iver une ou plusieurs adresses "URL". Les actions demandees, par les parametres passés à la carte à puce 2a, sont typiquement du type ?sai=enr+pai (5), avec " le nom du serveur d'annuaire d'indice arbitraire i parmi les n possibles, "enr" l'action requise d'enregistrement proprement dit et ." le profil d'abonne à utiliser parmi les q possibles.
ou plusieurs requêtes "HTTP" sont posées et transmises aux serveurs d'annuaires concernés, que l'on référencera SAA à SA", 'il existe n serveurs d'annuaire sélectionnables. Le choix présenté sur la page d'accueil P est naturellement fonction la carte à puce 2a insérée dans le lecteur 3. Les choix présentés dépendent droits qui sont accordés à l'abonné possesseur de la carte à puce notamment des abonnements souscrits à des services donnés et de leurs périodes de validité. Une deuxième phase du procédé selon l'invention, c'est-à-dire localisation, sur le réseau Internet, d'un abonné associé à un identifiant quelconque peut se dérouler de façon très similaire à la phase d'enregistrement. Pour ce faire, il est nécessaire d'interroger un ou plusieurs serveur(s) d'annuaire(s). II est nécessaire aussi de disposer d'au moins un protocole "PL" spécifique localisation de cet abonné. Enfin, s'il existe plusieurs serveurs d'annuaires interrogeables, SA, à SA,, il est généralement nécessaire également, comme dans le cas de l'enregistrement, de disposer de plusieurs protocoles localisation distincts. protocoles de localisation peuvent être mis en #uvre à l'aide d'applications stockées dans la carte à puce 2a. processus de localisation se déroule de façon tout à fait similaire à celui l'enregistrement de l'abonné sur un ou plusieurs serveurs d'annuaire La seule exception notable est qu'un profil d'abonné PAJ n' plus explicitement requis. II suffit de fournir à la carte à puce 2a l'identifiant l'abonne recherché et l'adresse du serveur d'annuaire SA;, ou pour le moins des paramètres permettant à l'application associée à l'un des protocoles de localisation déterminer cette adresse "URL". Un profil d'abonné PA; peut toutefois être utilisé pour en dériver automatiquement l'adresse "URL" du serveur d'annuaire SA; à l'aide duquel lequel un abonné appelant désire localiser un abonné appelé. Comme il a été indiqué, l'identifiant de l'abonne recherché peut être son adresse e-mel, adresse qui se présente typiquement sous la forme suivante pseudo@fournisseur. com (6), avec "pseudo" le nom d'utilisateur de messagerie de l'abonné ou plus généralement un pseudonyme, et "fournisseur. com" le nom et le suffixe prestataire service Internet ".com" pouvant être remplace selon les cas par divers suffixes : ".fr", ".net", etc.).
La figure 8 illustre les principales étapes de la phase de localisation d'un abonne avec lequel on veut établir une communication téléphonique par interrogation d'un annuaire SA Dans une première étape, la carte à puce 2a adressée par le navigateur du terminal 1, via les couches 13 et 23a. récupère, par une commande type "GET" par exemple, un formulaire de chargement à partir de la carte à puce 2a sous la forme d'une page d'accueil réferencée P'. Cette page d'accueil peut prendre différents aspects, similaires notamment à ceux décrits en regard la figure 7C. Selon qu'il y ait un ou plusieurs choix possibles, l'abonné selectionne un ou plusieurs serveurs d'annuaires et fournit des données d'identification de l'abonné recherché. Sur la figure 8, on a supposé qu'un seul serveur d'annuaire SA; était interrogeable.
La page est transmise sous forme d'une requête "HTTP" à la carte à puce 2a et interprétée par un agent traducteur de script Atf associé à une application de mise en oeuvre du protocole "PL". Par double mécanisme client/serveur "WEB" et "CGI" (module référencé comme précédemment), une requête du type http 27.0.0.1I? sa,--loc+pseudo@fournisseur (7), est interpretee par la carte à puce 2a comme une demande de localisation de l'abonné dont l'identifiant est (6) sur le serveur d'annuaire SA;.
requête "HTTP" est transmise à ce serveur qui renvoie les informations demandées, dans la mesure où elles sont disponibles. II recherche dans sa base de données une adresse "IF correspondant aux données d'identification reçues. En cas de succès, c'est-à-dire si l'abonné demandeur est effectivement enregistré, si cet abonné a le droit d'obtenir cette adresse et si les données reçues sont correctes, les données retransmises comprennent l'adresse "1P" de l'abonné recherché, ce qui permet de le localiser.
Ces différentes étapes mettent en ceuvre des sessions entre agents appariés, selon un des aspects de l'invention. On peut également stocker dans la carte à puce 2a plusieurs applications, chacune étant destinée à la mise en oeuvre d'un protocole de localisation distinct, a priori associé à un serveur d'annuaire également distinct.
Dans une variante préférée du procédé selon l'invention, on stocke dans la carte à puce 2a des applications permettant la mise en oeuvre plusieurs protocoles d'enregistrement, plusieurs protocoles de localisation et fichiers de données pour l'enregistrement de plusieurs profils d'abonne. Cette disposition avantageuse permet de transformer la carte à puce 2a en base de données portable multi-annuaire.
Dans une autre variante encore du procédé selon l'invention l'utilisation d'une carte à puce 2a permet une authentification robuste de son possesseur, lors de la phase d'enregistrement et/ou de la phase de localisation. effet, il est possible stocker des données de sécurité dans la carte à puce reste propriété son possesseur. De telles donnés de sécurité peuvent être constituées des clés de chiffrage.
Font également partie de l'invention les sondes et amorces nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stnngence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8.
Par conditions d'hybridation de forte stnngence au sens de l'invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes: - l'ADN à tester est immobilisé sur des membranes de type HybondN+ (Amersham, Buckingamshire, Royaume-Uni) selon les instructions du fabriquant, en présence de 0,4 M NaOH pendant une nuit, - les membranes sont lavées avec un tampon 5 x SSC (1 x SSC et correspond à 0,15 M NaCI + 0,015 M citrate de sodium), puis les membranes sont traitées aux UV à 312 nm pendant 3 minutes, puis préhybridées pendant au moins 4 heures à 65 C dans un tampon d'hybridation (6 x SSC, 5 x Denhardt's, 100 g d'ADN simple brin de thymus de veau/ml et 0,5% de SDS [poids/volume]).
Les sondes sont ajoutées aux membranes et incubées à 65 C pendant une nuit.
Après l'étape d'hybridation, les membranes sont lavées dans 500 ml d'un tampon 2 x SSC, 1% SDS (poids/volume) à température du laboratoire pendant 30 minutes; - un second lavage est opéré dans 500 ml d'un tampon 0,1 x SSC, 0,1 % SDS (poids/volume) pendant 15 minutes à 42 C Les conditions d'hybridation décrites ci-dessus sont adaptées à l'hybridation dans des conditions de forte stringence, une molécule d'acide nucléique d'une longueur de 300 à 400 nucléotides.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de AUSUBEL et al; (1989).
Les sondes ou les amorces nucléotidiques selon l'invention comprennent au moins 15 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8 ou de sa séquence complémentaire, d'un acide nucléique ayant au moins 40% d'identité en nucléotide avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8 ou de sa séquence complémentaire ou encore d'un acide nucléique hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stnngence, avec une séquence choisie parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8 ou de sa séquence complémentaire.
De préférence, des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention ont une longueur d'au moins 15,20, 25,30, 35,40, 50,75, 100, 150,200, 300, 400 ou 500 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, en particulier d'un acide nucléique de séquence nucléotidique choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8, ou d'un acide nucléique de séquence complémentaire.
Selon un autre aspect une sonde ou une amorce du nucléotidique selon l'invention consistera et/ou comprendra des fragments d'une longueur de 15, 20, 25, 30,35, 40, 50,75, 100, 150, 200, 300, 400 ou 500 nucléotides
consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, plus particulièrement d'un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8, ou d'un acide nucléique de séquences complémentaires.
Des exemples d'amorces et de couples d'amorces permettant d'amplifier différentes régions du gène RRS1-R sont par exemple les séquences SEQ ID N 11à SEQ ID N 61 représentées au tableau 6.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon les techniques telles que les méthodes de phosphodiester de Narang et al. (1979) ou de Brown et al. (1979) précitées.
Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris des sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peuvent être marquées , si désiré, en incorporant un marqueur détectable par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32P,3H,35S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigènine) ou encore des ligands tels que la biotine.
Le marquage d'un acide nucléique est réalisé de préférence par incorporation de molécules marquées au sein de ces nucléotides par extension d'amorces, ou bien par ajout sur les extrémités 5' ou 3'.
Des exemples de marquage non radioactif de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet FR 78 19 175 ou encore dans les articles de URDEA et al. (1988), ou SANCHEZ-PESCADOR et al (1988).
A titre d'exemple, une telle photoinscription peut être réalisée sur un film de polymethyl métacrylate substitué avec le colorant classiquement connu sous le dénomination DR1 ("disperse red one" selon la terminologie anglo-saxonne généralement utilisée).
Le taux de substitution est par exemple de 0,3 par monomère du polymère.
Ce matériau est solubilisé dans un solvant 112 trichloro éthylène (avec une concentration pondérale de 10%) puis, les couches du matériau photosensible sont déposées à la tournette, à 2000 tours/minutes, sur un substrat de verre, jusqu'à obtenir une épaisseur de film de l'ordre de 1 p,m.
La photo-inscription s'effectue alors au moyen d'un montage du type de celui représenté sur la figure 1.
Ce montage comporte une source laser 1 qui est en l'occurrence un laser YAG pulsé, d'impulsions de largeur de l'ordre de la picoseconde, de 10 Hz de fréquence et d'une énergie de quelques mJ.