INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Des travaux antérieurs de l'équipe des Inventeurs ont montré que la protéine VP2, exprimée en absence de toutes les autres protéines virales, s'auto-assemble en particules morphologiquement identiques au c#ur [LABBE et al., Journal of Virology, 65,2946-2952, (1991) ]. Les protéines VP6 et VP2 peuvent s'assembler pour donner des particules pseudovirales (Virus Like Particles : VLP) dépourvues d'acide nucléique et donc non-infectieuses, [LABBE et al., Journal of Virology, 65,2946-2952, (1991)].
Les quatre protéines de la capside (VP2, VP6, VP7 et VP4) peuvent aussi s'assembler pour donner des particules pseudovirales. Les VLP contenant les quatre protéines de capside (VLP2/6/7/4) ont des propriétés semblables à celles des virus infectieux en ce qui concerne l'attachement sur des cellules sensibles [CRAWFORD et al., Journal of Virology, 68,5945-5922, (1994) ], et la pénétration intracellulaire [LIPRANDI et al., Virology, 237,430-438, (1997)].
Il a été proposé d'utiliser des pseudocapsides virales comme vecteurs de molécules d'intérêt biologique, notamment des peptides ou des acides nucléiques.
Par exemple, en vue de la préparation de vaccins, des protéines chimériques résultant de l'insertion de séquences de peptides antigéniques hétérologues dans la protéine HBcAg du virus HBV ont été obtenues. Ces protéines chimériques peuvent s'assembler en particules pseudovirales, à condition que la taille des séquences insérées ne soit pas trop importante. Dans le cas de séquences hétérologues de plus grande taille, les particules pseudovirales peuvent aussi être obtenues par assemblage d'unités constituées par les protéines chimériques avec des unités constituées par la protéine HBcAg [KOLETZKI et al., Journal of General Virology, 78,2049-2053, (1997)].
Des particules pseudovirales dérivées de papillomavirus ont également été utilisées pour l'encapsidation d'ADN hétérologue, et son introduction dans
une cellule-hôte [TOUZE et COURSAGET, Nucleic Acids Research., 26,1317-1323, (1998) ].
En ce qui concerne les rotavirus, REDMOND et al., [Molecular Immunology, 28,269-278, (1991)] ou FRENCHICK et al., [Vaccine, 10,783-791, (1992) ] décrivent l'utilisation de particules pseudovirales produites par assemblage d'unités VP6 de rotavirus, comme vecteurs de peptides antigéniques de petite taille, faiblement immunogènes. Le peptide antigénique dérivé de la protéine VP4 est fixé non covalement à VP6, de manière à être présenté à la surface externe de la particule. Les particules pseudovirales ainsi formées jouent un rôle d'immunoadjuvant, augmentant la réponse immunitaire vis-à-vis du peptide antigénique.
Cependant, la présentation du peptide antigénique à la surface externe de la particule, favorable à la réponse immunitaire contre ce peptide, présente en revanche l'inconvénient d'exposer celui-ci à la dégradation, notamment dans le cas d'administration in vivo.
Les Inventeurs sont maintenant parvenus à obtenir des particules pseudovirales dérivées de rotavirus, permettant l'encapsidation de protéines ou d'acide nucléique, leur administration in vivo, et leur vectorisation notamment vers les tissus ou cellules cibles des rotavirus, telles que les entérocytes.
Ils ont en effet constaté que la protéine VP2 entière ou délétée de son extrémité N-terminale, pouvait être fusionnée à une protéine hétérologue, et que des protéines chimériques ainsi obtenues pouvaient s'assembler entre elles, et/ou avec des protéines VP2 natives et/ou des protéines VP6, ainsi qu'avec les protéines externes VP7 et VP4 pour reconstituer des particules pseudovirales fonctionnelles, et notamment possédant des propriétés similaires à celles du virus pour ce qui concerne le ciblage et les interactions précoces avec la cellule.
La présente invention a pour objet une protéine de fusion comprenant une région A constituée par la protéine VP2 d'un rotavirus, ou par un fragment de ladite protéine comprenant au moins une séquence homologue de celle du fragment 121-880 de la protéine VP2 de la souche bovine RF
- Fécès : ils sont écrasés dans le tampon de lavage (200 ul/100 mg fécès) puis centrifugés pendant 10 min à 16000 g. Le surnageant est conservé à - 20 C.
Des dilutions sérielles des différents échantillons à tester sont réalisées dans du tampon anticorps et réparties à raison de 100 ul/puits sur les plaques ELISA recouvertes soit avec l'antigène ClpG (lug), soit avec la toxine STa (kit E. coli ST EIA) pour détecter respectivement les anticorps anti-ClpG et les anticorps anti-STa. Les complexes antigènes-anticorps sont détectés selon la procédure dite "classique" décrite au paragraphe 9 ci-dessus, après incubation des plaques avec des immunoglobulines de chèvre anti-IgG de lapin ou anti-Ig(A ou G) de souris (Nordic Immunological Laboratories) couplées à la péroxydase. Les titres anticorps, exprimés en loglo de l'inverse de la dilution, sont calculés à partir des valeurs d'absorbance lues à 405 nm déduites des valeurs obtenues après immunisation des animaux soit avec les bactéries DH5a (pDSPH524) vivantes, soit avec le surnageant correspondant.
17) Test de neutralisation.
Chaque sérum immun est incubé pendant 18 h à 4 C en présence, soit de la toxine STp purifiée (Calbiochem), soit des hybrides ClpG-STh (surnageants), soit des bactéries vivantes E. coli B41 productrices de STp. Puis 100 l du mélange sont administrés intragastriquement à des souriceaux nouveau-nés âgés de 3 jours. Après 3 h d'incubation, le rapport poids intestin/poids carcasse est alors calculé (cf. Matériel et Méthodes, ≈11). Des anticorps anti-STa décrits dans la littérature comme étant neutralisants ont été utilisés comme témoins positifs. Ces anticorps sont : les anticorps polyclonaux G108-8 et G104-6 et les anticorps monoclonaux ST1 :3, ST :G8 et 11C.
B - RÉSULTATS.
I - Construction et caractérisation des hybrides ClpG-STh.
1) Choix des régions et insertion de STh dans ClpG.
Des travaux récents ont prouvé que certaines régions de la sous-unité majeure ClpG pouvaient être modifiées sans que cela nuise à la biogénèse du polymère CS31A. Ainsi, des épitopes de nature et de tailles différentes, fusionnés à l'extrémité NH2-terminale ou insérés dans la région centrale variable V3 de ClpG (acides
aminés 186 à 221), sont exposés à la surface de la bactérie. Ces sites ont donc été choisis pour introduire l'entérotoxine STh dans ClpG. L'extrémité C-terminale de ClpG nous a également paru intéressante car de nombreux travaux ont montré que le blocage de l'extrémité Cterminale de STa pouvait être dommageable à la fois pour la sécrétion et l'antigénicité des hybrides.
Il a été fait le choix d'insérer différents "linkers" entre ClpG et STh pour avoir le maximum de chance d'obtenir des protéines hybrides qui soient exprimées et sécrétées à la surface bactérienne. En effet, différentes études ont montré que l'introduction de certains acides aminés, en particulier des résidus prolines, entre STa et la protéine porteuse augmentait la flexibilité et l'accessibilité de STa dans la molécule hybride.
Les plasmides et oligonucléotides utilisés dans ce travail sont présentés respectivement, dans les tableaux 2 et 3 et les différentes constructions décrites en détail ci-dessous sont schématisées dans la figure 1.
La figure 1 représente la structure des protéines de fusion ClpG-STh. Dans la figure 1, les acides aminés sont numérotés à partir de l'extrémité N-terminale de la protéine mature ClpG. Les séquences nucléotidiques et peptidiques relatives à ClpG sont en caractères gras. La portion STh de la protéine de fusion est représentée par un cadre coloré ST15 (YCCELCCNPACTGCY), ST16 (NYCCELCCNPACTGCY) et ST19 (NSSNYCCELCCNPACTGCY)
correspondent respectivement aux 15,16 et 19 derniers acides aminés de la toxine mature STh. Les sites de restriction sont soulignés et ceux perdus après clonage sont entre parenthèses. Les astérisques dénotent les sites de restriction créés par mutagénèse dirigée. La flèche verticale représente le site de clivage par la peptidase signal. La séquence nucléotidique de clpG est schématisée par un cadre et les vecteurs de clonage par un autre cadre.
Pour assurer une meilleure flexibilité de l'hybride au niveau de la jointure ClpG-STh, la toxine STh a été insérée à l'extrémité N-terminale de ClpG et séparée de la protéine porteuse par un "linker" de 6 acides aminés (PADPHA). Ainsi, le plasmide pSTN24 a été obtenu par insertion, dans le site SphI de pHPC0838, de l'oligonucléotide double brin Sth72N5/Sth72N3. Ce duplex code pour les quinze derniers acides aminés de l'entérotoxine STh. Après clonage, seul le site SphI en 5' est préservé. Le site de clivage initial (AHA:WT) du peptide signal a été converti en un site (AHA:AD) plus fréquemment présent chez E. coli.
Pour les mêmes raisons que celles explicitées au-dessus, un "linker" contenant deux prolines et une glycine (NPDNPG) a été placé entre ClpG et STh. Le plasmide pSTC22 a alors été réalisé par clonage de l'oligonucléotide double brin Sth69C5/Sth73C3 codant pour les 16 derniers acides aminés de STh entre les sites HpaI et Xbal de pHPC0838. Le site XbaI a été perdu lors du clonage. La
toxine STh est ainsi introduite après le résidu Tyr256 de ClpG. Afin de confirmer l'importance d'un tel " linker " entre la protéine porteuse et la toxine STa dans la sécrétion et l'antigénicité de l'hybride, le plasmide pSTCD17 a été réalisé par délétion du fragment HpaI/SmaI de pSTC22. Dans ce cas, ClpG et STh ne sont plus séparées que par un résidu glycine.
L'annexe est restreinte aux méthodes principales de ces objets : par exemple, les erreurs sont gérées tant au niveau de chaque objet qu'au niveau général du simulateur ;
relative importance du simulateur (en taille) impose un contrôle d'erreur à plusieurs niveaux.
On exposera maintenant le processus de traitement d'un appel dans le réseau simulé sur ordinateur, selon l'invention, en référence aux figures 6 à 8.
L'utilisateur a accès à tous les objets par une interface graphique.
Au départ (Figure 5), le simulateur 1000 va : - en 1002, lire les appels dans le fichier d'appel.
Il s'en sert pour créer une base d'objets appel (jeu d'essai).
- en 1004, lire la topologie du réseau dans un fichier de configuration.
Il s'en sert pour la création du réseau composé de noeuds et de liens entre ces noeuds.
Le réseau simulé est alors défini en sa structure. Ensuite: - en 1010, on déclenche l'initialisation du réseau Chaque noeud charge ses fichiers de configuration.
Le réseau simulé est prêt à fonctionner. Ensuite: - en 1020, on envoie chaque appel dans le réseau, - en 1050, on récupère chaque appel en sortie du réseau, - en 1052, on présente les résultats à l'opérateur.
Le cas échéant, en 1060 on modifie l'état du réseau, notamment ses paramètres, et l'on revient en 1010, ou l'on stoppe (1100).
Entre les étapes 1020 et 1050, le réseau va (figure 6): - en 1022, déterminer le prochain noeud d'entrée de l'appel (information contenue dans l'appel); en variante, le choix peut être donné à l'utilisateur, s'il y a plusieurs possibilités ; - en 1024, si l'appel sort du réseau, le rendre au simulateur ;
- sinon, en 1030, donner l'appel à ce noeud; - en 1040, récupérer l'appel en sortie du noeud, avec analyse des résultats obtenus; - en 1045, si l'appel est arrivé à destination, passer à la fin 1050, qui redonne l'appel au simulateur ; retourner en 1022.
Entre les étapes 1030 et 1040, le noeud va (figure 7): - en 1031, effectuer la phase de pré-analyse, - en 1032, effectuer la phase d'analyse, - en 1033, prendre différentes voies selon le résultat de l'analyse.
Ces voies sont: - en 1033A, le cas où l'on se trouve en fin de sélection, avec une terminaison anormale, qui voudrait, en mode réel, que l'on transmette à l'usager un message pré-enregistré ("film"), et/ou un signal audible d'alerte, par exemple. Dans ce cas, l'étape 1034 retourne le code de fin de sélection, représentatif de l'anomalie.
- en 1033B, le cas de fin normale d'acheminement, où l'on a atteint le poste ultime ("terminal") ou le PABX raccordé, l'appel étant arrivé à destination. Dans ce cas, l'étape 1035 retourne le code de fin ou "terminal".
A 100 ng de vecteur pDHB321.1 digéré par l'enzyme BamHl, 1 l de la solution d'adaptateur à 5 M est ajouté. La ligature du vecteur linéarisé et de l'adaptateur s'effectue dans un volume final de 10 l pendant 12 heures à 4 C. La réaction est alors arrêtée par dilution (ajout de 20 l d'eau) L'excès d'adaptateur est par la suite éliminé par un passage du mélange de ligature sur une colonne microspin S400 (Pharmacia, ref).
L'ADN des clones B1puc3 et Hpuc2 est digéré par l'enzyme Sphl Après inactivation de l'enzyme à 65 C pendant 20 minutes, un aliquote de chaque digestion (environ 100 ng) est utilisé pour réaliser une ligature avec le vecteur pDHB321 1+adaptateur. Ces constructions sont alors introduites dans la souche DH5a d'E. coli et sélectionnés sur un milieu L gélosé contenant 50 g/ml de kanamycine (résistance conférée par le vecteur binaire) les clones qui contiennent l'insert provenant des clones B1 et H (environ 9400 pb) sont appelés B1MT9 et HMTB respectivement. L'ADN plasmidique extrait de ces clones est ensuite utilisé pour transformer la souche GV3101 d'A. tumefaciens par choc thermique. Les colonies sont sélectionnées sur un milieu L gélosé contenant 25 g/ml de gentamycine (résistance conférée par le plasmide helper pMP90) et 50 g/ml de
kanamycine Les colonies d'A. tumefaciens transformées par l'ADN des clones B1MT9 et HMTB sont appelées B1 MT9.1 et HMTB2 respectivement.
Exemple 5) Expression des gènes RRS1-S et RRS1-R par des expériences de type Northern L'expression des gènes RRS1-S et RRS1-R a été étudiée dans des plantes non infectées par des expériences de type Northern. Après extraction de l'ARN total par la technique décrite par Lummerzheim (1993), les ARNs polyadénylés ont été purifiés par utilisation du Kit Dynabeads (Dynal, USA). Après dosage à 260 nm, les ARNms ont été déposés sur gel en condition dénaturante (Marco et al. 1990), puis transférés sur une membrane de nitrocellulose (Hybond N+, Amersham Pharmacia Biotech).
L'hybridation a été réalisée suivant le protocole donné par le fournisseur.
Exemple 6) Obtention des clones d'ADNc pleine longueur par RACE PCR L'obtention de clones d'ADNc pleine longueur a nécessité l'utilisation d'un kit de RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) PCR Les détails des protocoles expérimentaux présentés ci dessous sont valables pour les clones d'ADNc issus des écotype Col-5 et Nd-1 a. RACE PCR (amplification rapide des extrémités d'ADNc) Les extrémités 5' et 3' des clones d'ADNc ont été générés par RACE PCR en utilisant le kit " Smart Race cDNA Amplification " (Clontech, USA). Les ARN totaux ont été extraits à partir de plantules des écotypes Col- 5 et Nd-1 âgées de deux semaines suivant le protocole de Lummerzheim et al (1993) Les réactions de transcriptase reverse ont été réalisées sur 1 pg d'ARN totaux d'après les conditions fournies par le fabricant Les premiers brins des ADNc ont été synthétisés grâce aux amorces suivantes : - 5'CDS et SMART Il oligo (Clontech) pour l'obtention des extrémités 5'.
- 3'CDS (Clontech) pour l'obtention des extrémités 3'.
Les amorces oligonucléotidiques utilisées pour l'amplification de l'extrémité 5' des ADNc RRS1 (Col-5) et rrs1 (Nd-1) sont : - l'amorce universelle UPM (Universal Primer Mix, kit Smart Race) - l'amorce anti-sens RT4, spécifique des ADNc RRS1-S/RRS1-R (voir tableau 2) Les amorces oligonucléotidiques utilisées pour l'amplification de l'extrémité 3' des ADNc RRS1 (Col-5) et rrs1 (Nd-1) sont.
- l'amorce universelle UPM (Universal Primer Mix, kit Smart Race) - l'amorce RT6, spécifique des ADNc RRS1-S/RRS1-R (voir tableau 2) Les amorces RT4 et RT6 ont été choisies de sorte que les produits d'amplification des extrémités 5' et 3' aient en commun une région de 500 pb contenant un site unique de restriction BamHl.
Les conditions d'amplifications des extrémités 5' et 3'sont les suivantes -5 cycles (94 C pendant 30 secondes, 72 C pendant 5 minutes) -5 cycles (94 C pendant 30 secondes, 70 C pendant 30 secondes, 72 C pendant 5 minutes) -30 cycles (94 C pendant 30 secondes, 68 C pendant 30 secondes, 72 C pendant 5 minutes) La taille des produits d'amplification des extrémités 5' et 3' est de 3708 pb et 1230 pb pour Col-5 ; 3714 et 1231 pb pour Nd-1 respectivement.
Ces produits PCR ont été clonés dans le vecteur pGemT-easy (Promega).
Le séquençage de ces clones a permis de déterminer précisément le début (5') et la fin (3') de la région transcrite non traduite des clones d'ADNc issus des écotypes Col-5 et Nd-1. La taille des clones d'ADNc pleine longueur issus des plantes Col-5 et Nd-1 est respectivement de 4336 et 4343 pb. b. Obtention des clones d'ADNc pleine taille Des clones d'ADNc pleine taille ont été générés (soit 4336 et 4343 pb) en réalisant une double digestion BamHl (site unique) et Notl (site présent au niveau du site multiple de clonage du vecteur pGemT-easy) sur un mélange de 2 plasmides dans le but d'exciser les inserts correspondants
aux extrémités 5' et 3'. Les inserts 5' et 3' ont alors été ligaturés ensemble dans le plasmide pGemT-easy digéré par Notl et déphosphorylé. Après transformation de bactéries DH5a avec le mélange de ligature et étalement sur milieu sélectif (milieu L+ampicilline 50 ug/mL+ 0. 5 mM IPTG + 80 ug/mL X-Gal), les clones positifs contenant le clone d'ADNc pleine taille ont été sélectionnés en réalisant un criblage PCR sur colonies à l'aide des amorces K3 5 et RT2 (voir tableau 6) qui sont spécifiques de chacune des extrémités 5' et 3' respectivement.
Une seconde expérience de RACE PCR a été réalisée sur les premiers brins des ADNc issus de la réaction de transcriptase reverse décrite ci-dessus dans le but d'introduire deux sites de restriction Sali, l'un étant situé juste en amont du codon initiateur ATG (point d'initiation de la traduction), l'autre étant situé après le signal de polyadénylation Les deux couples d'amorces utilisés pour amplifier les extrémités 5' et 3' sont 5'RRSall/ RT8 et 3'RRSall/ RT7 respectivement.
Les conditions d'amplification, le clonage des produits PCR ainsi que la méthode d'obtention des clones d'ADNc pleine longueur sont les mêmes que celles décrites précédemment si ce n'est que le site unique de restriction commun aux extrémités 5' et 3' est un site Aflll L'introduction de sites Sali de part et d'autre de la séquence du clone d'ADNc a pour but de faciliter son clonage dans différents types de vecteurs Exemple 7) Expérience d'échange de domaine par obtention de clones chimères RRS1-S/RRS1-R L'ADN plasmidique utilisé pour réaliser les expériences d'échange de domaine provient des clones génomiques B1puc3 et Hpuc2 décrits précédemment. Ces 2 plasmides sont digérés par l'enzyme BamHl dont le site de restriction est localisé dans la région présentant des similitudes avec un gène de résistance (5'eme exon). Cette digestion génère 2 fragments, l'un de 4881 pb (clone B1puc3 contenant le gène RRS1-S) contenant la partie 5' du clone génomique (promoteur et partie codante du gène RRS1-S jusqu'au niveau du 5ieme exon) et un fragment de 7180 pb (clone B1 puc3) contenant quant à lui la partie 3' du clone génomique (4512 pb contenant la fin de la région présentant des similitudes avec le gène de résistance, la région
similaire au gène codant un facteur de transcription de type WRKY et la région 3' transcrite non traduite ; 2668 pb de vecteur plasmidique pUC19) La taille des fragments générés par la digestion BamHl du plasmide Hpuc2 est du même ordre de grandeur que celle des fragments obtenus par digestion BamHl du plasmide B1puc3.
L'extraction est conduite à 250 bar et 60 C avec un solvant constitué de dioxyde de carbone injecté en pied de colonne à un débit de 20 kg/h et d'éthanol injecté entre le premier et le deuxième étage la colonne à un débit de 3kg/h. Après une période equilibre de deux heures, l'extrait récupéré en tête de colonne est enrichi en lipides polaires les moins polaires de classe des sphingolipides et MGDG avec la composition lipidique suivante Sphingolipides (céramides) : 8 MGDG : 82 % Glycosphingolipides : $ DGDG : 4 En pied de colonne, raffinat est récupéré sous forme d'une dispersion stable de lipides polaires considérablement enrichie en lipides les plus polaires de la classe des DGDG et phospholipides dans un mélange eau/éthanol, avec la composition lipidique suivante Glycosphingolipides : 13% DGDG : 59 Phospholipides 5) Obtention d'une ---De riche en alvcolipides DGDG .
La dispersion raffinat ci-dessus en (3) est injectée en tête de colonne à un debit de 1 kg/h. L'extraction est conduite à 250 bar et 60 C avec un solvant constitué de dioxyde carbone injecté en pied de colonne à un débit de 20 kg/h et d'éthanol injecté entre le premier et le deuxième étage la colonne à un débit de 3 kg/h.
Après une période equilibre de deux heures, l'extrait récupéré en tête de colonne est enrichi en lipides polaires les moins polaires de classe des sphingolipides et MGDG avec ela composition lipidique suivante Sphingolipides : 40 MGDG : 54 $ DGDG : 6 % En pied de colonne est récupérée une dispersion de lipides polaires dans un mélange eau/éthanol avec la composition lipidique suivante
Glycosphingolipides : 4 % DGDG : 96 %
L'invention concerne un procédé de séparation d'un composé chimique ou biologique présent dans un mélange de composés similaires, par diffusion dans un milieu approprié tel qu'un gel.
Les méthodes connues de séparation d'un composé présent dans un mélange comprennent en général l'application d'une réaction chimique (au sens large) et/ou d'un ensemble de forces extérieures au mélange de composés. Par exemple, les chromatographies d'affinité permettent d'extraire d'un mélange les molécules les plus retenues ou les molécules les moins retenues vis-à-vis des sites d'interaction liés au support chromotographique, car ces molécules occupent des positions privilégiées, en tête et en queue d'élution. Toutefois, notamment quand le mélange contient une dizaine ou plus de composés similaires, il est difficile d'isoler des composés à affinité intermédiaire, très difficile d'isoler des composés à affinité quantitativement définie, et impossible de séparer des composés dont les affinités seraient identiques, mais qui auraient des constantes cinétiques d'interaction distinctes.
Le problème de la séparation de composés présents dans un mélange et ayant des constantes cinétiques d'interaction pour une cible donnée qui sont arbitrairement définies par un opérateur, se pose notamment dans le cadre du développement de nouveaux traitements thérapeutiques reposant sur l'optimisation de l'interaction de molécules avec des cibles d'intérêt biologique convenablement choisies (séquences génomiques, protéines, ... et dans le domaine de la chimie combinatoire, où les molécules testées sont souvent obtenues sous la forme de "mélanges contrâlésIl de molécules similaires. La présente invention a notamment pour but d'apporter à ce problème une solution simple, efficace et relativement facile à mettre en #uvre. Elle propose à cet effet un procédé de séparation d'un composé chimique ou biologique dans un mélange de composés similaires, par diffusion dans un milieu tel qu'un gel, ce procédé comprenant une étape d'introduction du mélange de composés dans le milieu, caractérisé en ce qu'il consiste : - à utiliser un milieu contenant un composant P qui réagit avec les composes Ci du mélange pour donner des produits Qi, les réactions Ci + P --> Qi étant réversibles et ayant des constantes cinétiques kj,i dans le sens de l'obtention des produits Qi et k2,i dans le sens inverse, et - les composés Ci ayant une charge électrique, à appliquer un champ électrique variant périodiquement dans le temps au milieu contenant ledit mélange de composés Ci, la période du champ électrique et la concentration du composant P dans le milieu étant déterminées en fonction des constantes cinétiques kl, k2 du composé C à séparer pour établir des conditions de résonance entre les réactions précitées et le champ électrique, pour lesquelles le coefficient de diffusion apparent du composé C dans le milieu est à une valeur maximale.