INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
photodurcissable. Des pièces moulées comprenant des assemblages composites, lorsqu'elles sont préparées en utilisant les nouveuax composés, possèdent un niveau élevée de stabilité et de résistance mécanique. On peut aussi employer les nouveaux composés comme agents photodurcissables dans des compositions de moulage, d'imprégnation et de revêtement telles que décrites, par exemple, par le fascicule de brevet EP 7086. Des exemples de telles compositions sont des résines de revêtement gel qui sont soumises à des exigences sévères en ce qui concerne l'activité de durcissement et la résistance au jaunissement, et des moulage renforcés aux fibres, par exemple, des panneaux lumineux qui sont planes ou présentent des ondulations en longueur ou en largeur. Des techniques de préparation de tels moulages, telles que stratification manuelle, stratification par pulvérisation, coulée centrifuge ou enroulement filamentaire sont décrites, par exemple, par P.H. Selden dans "Glasfaserverstârkte Kunststoffe", page 610, Springer Verlag Berlin-Heidelberg-New York 1967. Des exemples d'articles pouvant être produits par ces techniques sont des bateaux, des panneaux de fibres ou des panneaux de particules avec un revêtement double face de plastique renforcé aux fibres de verre, des tuyaux, des containers etc. D'autres exemples de composition de moulage, d'imprégnation et de revêtement sont des revêtements gel en résine UP pour des moulages contenant des fibres de verre (GRP), tels que des feuilles ondulées et du papier stratifié. Des stratifiées de papier peuvent être à base de résines d'urée ou de résines de mélamine. Avant la préparation du stratifié, on prépare le revêtement gel sur un support (par exemple un film).
On peut aussi utiliser les nouvelles compositions photodurcissables pour des résines à couler ou pour enrobage d'articles, par exemple des composants électroniques etc.
On peut utiliser les compositions et les composés
conformes à l'invention pour la production d'hologrammes, de guides d'ondes, de valves optiques, où l'on bénéficie de l'avantage de la différence entre les indices de réfraction des zones irradiées et non irradiées.
L'utilisation des compositions photodurcissables pour des techniques d'imagerie et pour la production optique de supports d'information est aussi importante.
Dans de telles applications, comme nous l'avons déjà décrit plus haut, on irradie la couche appliquée (humide ou sèche) sur le support selon un modèle, par exemple à travers un photomasque, par des rayons UV ou la lumière visible, et on élimine les zones non exposées de la couche par un traitement avec un révélateur. On peut aussi appliquer la couche photodurcissable sur un métal par électrodéposition. Les zones exposées sont devenues polymères par réticulation, et de ce fait insolubles, restent sur le support. Une coloration appropriée révèle des images visibles. Dans le cas où le support est une couche métallisée, on peut éliminer le métal, suite à l'exposition et au développement, par décapage des zones n'ayant pas été exposées ou renforcées par électrodéposition. De cette façon, il est possible de produire des circuits électroniques et des photorésists.
Par contre, il a été nécessaire de prolonger le temps d'incubation de 1 heure à 37 C pour obtenir une réponse similaire à celle du système purifié. Il est possible que les bactéries de la flore associée, les cellules du prélèvement et/ou le mucus des sécrétions retardent la concentration des bactéries dans le gel ayant une signification clinique. Ce retard est visualisé par une zone de déchets présente en surface du gel après centrifugation. Le temps d'incubation nécessaire à une réaction positive est de ce fait un peu plus long.
L'hydrolyse du MUN fait apparaître une fluorescence bleue, qui peut être détectée ou visualisée (mesure non quantitative), par exemple, à l'aide d'une lampe U.V.
Celle du PNP fait apparaître une couleur jaune franche, visible à l'oeil nu.
Les résultats observés s'interprètent de la façon suivante : # l'absence de fluorescence bleue confirme l'absence de bactéries produisant une neuraminidase, et donc l'absence de Streptococcus pneumoniae.
# L'apparition d'une fluorescence bleue témoigne de la présence d'une bactérie produisant une neuraminidase, faisant ainsi suspecter la présence de Streptococcus pneumoniae.
# La présence d'une fluorescence associée à l'absence d'une couleur jaune, indiquant l'absence de bactéries produisant de la phosphatase, permet de confirmer la présence de Streptococcus pneumoniae.
# Inversement, l'apparition d'une couleur jaune associée à la fluorescence, témoigne de la présence d'une bactérie produisant également une phosphatase et écarte donc un diagnostic de Streptococcuspneumoniae.
La présente invention a également pour objet un kit pour la mise en #uvre de la méthode telle que décrite ci-dessus, comprenant un tube gel dont le fond a une partie capillaire dans laquelle est logée la phase de révélation, caractérisé en ce que ladite phase de révélation contient : - un substrat Si spécifique de la neuraminidase induisant en présence de celle-ci une variation de mesure optique détectable, et, - un substrat S2 spécifique de la phosphatase, induisant en présence de celle-ci une variation de mesure optique détectable distincte et indépendante de celle induite par Si.
Préférentiellement, Si est un substrat fluorogène et S2 un substrat chromogène, et plus préférentiellement Si est l'acide 4-Methylumbelliferyl-a-D-N-Acétylneuraminique (MUN) ou l'un de ses sels, et S2 est le paranitrophényl phosphate (PNP).
La présente invention a enfin pour objet l'utilisation de l'acide 4-Methylumbelliferyl-aD-N-Acetylneuraminique (MUN) ou l'un de ses sels dans une méthode d'identification présomptive de Streptococcus pneumoniae dans un échantillon biologique, ledit échantillon biologique étant choisi au sein du groupe constitué par les colonies isolées
de streptocoques a hémolytiques sur gélose au sang, les bouillons d'hémoculture positifs à cocci à Gram positif dont l'aspect évoque un streptocoque ou un pneumocoque, les prélèvements broncho-pulmonaires ou les expectorations.
Plus particulièrement, la méthode est réalisée en système tube gel tel que défini précédemment.
Le principe général du mode opératoire de la méthode de dépistage d'un microorganisme dans le système tube-gel est décrit dans W096/29427, ainsi que dans les notices des kits tels que : # SCREEN GEL Uri : détection des bactéries urinaires, # SCREEN GEL Coli : identification d'Escherichia coli en urines et bouillons d'hémoculture, # HEMOFAST MRSA : identification de staphylococcus aureus en bouillons d'hémoculture et détection de la sensibilité à la méticilline.
Les produits précités, ainsi que leur notice descriptive, sont disponibles chez International Microbio (83870 SIGNES, FRANCE).
Dans le contexte de la présente invention, on préconise pour l'utilisation de la méthode tube-gel, de traiter les échantillons comme indiqué ci-après : # Colonies isolées : Colonies de cocci à Gram positif dont l'aspect évoque un streptocoque, d'aspect morphologique identique et fraîchement isolées (18-24 h à 37 C) sur gélose Columbia ou Trypticase-soja additionnée de 5 % de sang de mouton ou de sang de cheval, sous CO2 ou en anaérobiose.
Préparation de l'inoculum :
La figure 1 représente une courbe d'efficacité en fonction de la dose de GABA et 3-APMPA sur le récepteur B du GABA de Drosophila constitué des polypeptides conformes à l'invention avec des séquences d'amino-acides selon SEQ ID N : 2 et SEQ ID N : 4, exprimé dans des ovocytes de Xenopus.
La figure 2 illustre le couplage fonctionnel des D-GABA-B récepteurs R1/R2 co-exprimés constitués des polypeptides conformes à l'invention avec des séquences d'amino-acides selon SEQ ID N : 2 et SEQ ID N : 4 au système intracellulaire AMPc. Des cellules HEK293 Luc transfectées avec les D-GABA-B récepteurs R1/R2 (D-GABA Rl/2) et des cellules témoins non transfectées (témoins) ont été stimulées avec de la forskoline seule, de la forskoline et du GABA ainsi que du GABA seul et la concentration intracellulaire en AMPc a été mesurée. Les cellules transfectées avec les D-GABA-B récepteurs Rl/2 montrent une nette réduction de la réponse de l'AMPc induite par la forskoline, tandis que les cellules témoins ne réagissent pas.
Exemples : Exemple 1 Isolement des séquences polynucléotidiques décrites.
La manipulation de polynucléotides a été effectuée selon des méthodes classiques de la technologie de recombinaison de l'ADN (Sambrook et al., 1989). Le traitement bio-informatique de séquences de nucléotides et de protéines a été effectué avec le progiciel GCG version
9.1 (GCG Genetics Computer Group, Inc., Madison Wisconsin, Etats-Unis d'Amérique).
Exemple 2 Génération des vecteurs d'expression Les domaines de séquences de SEQ ID N : 1, SEQ ID N : 3 et SEQ ID N : 5 ont été amplifiés au moyen de la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) et incorporés par clonage au vecteur pcDNA3. 1/Neo (Invitrogen, Groningen).
Expression hétérologue Des cellules HEK293 ont été cultivées en milieu Eagles modifié Dulbeccos contenant 10 % de sérum foetal de veau en présence de 5 % de CO2 et à une température de 37 C. Pour le transfert de gènes, on s'est servi de MBS (Stratagene, La Jolla, Etats-Unis d'Amérique) selon les indications du fabricant. Les cellules ont été ensemencées à diverses densités dans des plaques de microtitrage 24 heures à 48 heures après le transfert des gènes. Les cellules génétiquement modifiées ont été sélectionnées pendant 3 à 4 semaines par croissance en milieu Eagles modifié Dulbeccos contenant 10 % de sérum foetal de veau et 700 g/ml de généticine (G418, Life Technologies, Karlsruhe) comme marqueur de sélection. Les clones individuels résistants ont été analysés de la manière décrite ci-dessous.
L'expression fonctionnelle des récepteurs B du GABA provenant d'insectes a été effectuée également dans des ovocytes de Xenopus. A cet effet, des canaux calcium activables par la protéine G (GIRK1 et GIRK4) ont été coexprimés afin de mesurer l'activation des récepteurs B du GABA (White et al., 1998).
Mesures d'AMPc Pour déterminer la concentration en AMPc, on a utilisé des souches de cellules HEK293. D'une part, les cellules HEK293 ont co-exprimé de façon stable les deux récepteurs D-GABA-B RI et D-GABA-B R2 (D-GABA Rl/2) de
Drosophila melanogaster. D'autre part, des cellules témoins non transfectées ont été incluses dans le test (témoins) .
Les cellules ont été ensemencées à une densité de 20 000 cellules par cavité dans des plaques à 96 puits. Des cellules témoins ont été maintenues en incubation pendant 48 heures à 37 C jusqu'à une densité cellulaire d'environ 80 % dans un milieu de culture (DMEM, 10 % de sérum foetal de veau, pénicilline et streptomycine, 50 U/ml et 50 g/ml (Life Technologies)) et des cellules exprimant les récepteurs D-GABA Rl/2 dans un milieu de sélection (milieu de culture additionné de 0,5 mg/ml de généticine (G418, Life Technologies)). Ensuite, le milieu a été enlevé et les cellules ont été lavées une fois avec du milieu DMEM sans additions. Après une période d'incubation de 30 minutes en présence d'IBMX (300 M) à 37 C, on a effectué une stimulation de 30 minutes avec du GABA (100 M) et/ou de la forskoline (10 M) à 37 C. Toutes les étapes d'incubation ont été conduites en milieu DMEM (Life Technologies) sans additions. Ensuite, on a procédé à l'élimination du milieu de stimulation et à une lyse des cellules avec 50 l de HCl (0,1 N) par cavité. Les cellules ont été lysées pendant 20 minutes à la température ambiante sous agitation par secousses et les concentrations en AMPc des lysats cellulaires ont été déterminées en triple exemplaire avec le kit d'immuno-essai enzymatique (EIA) AK-200 (Biomol, Hamburg, Allemagne) en suivant les consignes du fabricant.
Mesures des ovocytes 1. Préparation des ovocytes Les ovocytes provenaient d'une grenouille Xenopus laevis femelle adulte (Firme Horst Kâhler, Hamburg, Allemagne). Les grenouilles ont été maintenues dans un réservoir de grandes dimensions avec circulation d'eau à une température de l'eau de 20-24 C. Des parties de l'ovaire de grenouille ont été prélevées sous anesthésie totale par une petite incision pratiquée dans l'abdomen (environ 1 cm). Ensuite l'ovaire a été traité sous
agitation constante par secousses pendant environ 140 minutes dans 25 ml de collagénase (Typ I, C-0130, SIGMAALDRICH CHEMIE GmbH, Deisenhofen, Allemagne ; 355 U/ml, en solution de Barth sans calcium avec ajustement en mM : NaCl 88, KC1 1, MgS04 0,82, NaHC03 2,4, chlorhydrate de Tris 5, pH 7,4. Les ovocytes ont ensuite été lavés avec de la solution de Barth sans calcium. Des ovocytes au stade de maturation V (Dumont, 1972) ont seuls été choisis pour la suite du traitement et ont été transférés dans des plaques de microtitrage (plaques MicroWellTM Nunc, n de catalogue 245128 + 263339 (couvercle), Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden, Allemagne), chargées de solution de Barth (en mM : NaCl 88, KC1 1, MgS04 0,82, Ca(NO3)2 0,33, CaCl2 0,41, NaHC03 2,4, chlorhydrate de Tris 5, pH 7,4) ainsi que de gentamicine (sulfate de gentamicine, G-3632, SIGMA-ALDRICH CHEMIE GmbH, Deisenhofen, Allemagne ; 100 U/ml). Les ovocytes ont ensuite été conservés à 19,2 C dans un incubateurrefroidisseur (type KB 53, WTB Binder Labortechnik GmbH, Tuttlingen, Allemagne).
2. Injection des ovocytes On a préparé des électrodes d'injection ayant un diamètre de 10-15 m avec un système de pipetage (type L/M- 3P-A, List-electronic, Darmstadt-Eberstadt, Allemagne).
Avant l'injection, on a décongelé des fractions aliquotes contenant respectivement du D-GABA-B-ADN et du GIRK1/4-ADN et on les a diluées avec de l'eau à une concentration finale de 10 ng/l. Les sondes d'ADN ont été centrifugées pendant 120 secondes à 3200xg (type Biofuge 13, Heraeus Instruments GmbH, Hanau, Allemagne). Ensuite, on a utilisé comme tuyau de transfert, un tuyau en polyéthylène étiré afin de remplir les pipettes par derrière. Les électrodes d'injection ont été fixées à une unité de translation X, Y, Z (centre de traitement EP1090, isel-automation, Eiterfeld, Allemagne). A l'aide d'un ordinateur Macintosh, on a fait arriver des ovocytes dans les cavités des plaques de microtitrage et en exerçant de courtes pressions (0,5-3,0
bars, 3-6 secondes), on a injecté dans les ovocytes environ 50 ml de solution d'ADN.
Ainsi, après initialisation de la fonction de filtrage du point d'accès sans fil 102, aucune trame en provenance du réseau filaire 104 n'est transmise le milieu radio tant qu'aucune connexion radio n'est établie un adaptateur de terminal sans fil 101 avec le point d'accès sans fil 102.
La figure 5A représente les traitements exécutés par le microprocesseur 403 du point d'accès 102 lorsque, au cours d'une étape 500, connexion radio est reçue par le point d'accès 102 de la part d'un des adaptateurs de terminal sans fil 101, cet adaptateur étant désigné ici par ATi.
Le microprocesseur 403 effectue alors une opération d'activation qui consiste à mettre à la valeur VRAI l'élément situé à la position correspondant à l'adaptateur ATi dans le tableau "Lire Adresse" de la RAM Cet élément est noté Lire Adresse[ATi] sur la figure 5A. Cette opération a pour effet d'activer le mode d'apprentissage automatique de l'adresse.
La figure 5B représente les traitements exécutés par le microprocesseur 403 du point d'accès 102 lorsque, au cours d'une étape 502, paquet de données est reçu sur une connexion radio de la part de l'adaptateur ATi.
Le microprocesseur 403 effectue alors un test 503 sur la valeur de l'elément du tableau "Lire Adresse" situé à la position correspondant à l'adaptateur ATi.
Si cet élément vaut VRAI alors une opération de lecture, mise à jour et désactivation 504 décrite ci-après est effectuée.
Si cet élément vaut FAUX, le microprocesseur 403 exécute alors directement une opération de transmission 505 décrite ci-après. Si l'élément vaut VRAI, l'opération de lecture, mise à jour et désactivation 504 consiste à lire l'adresse source 202 (voir figure 2) paquet reçu (c'est-à-dire l'adresse MAC du terminal de communication qui émis le paquet), puis à mettre à jour le filtre du point d'accès sans fil 102 avec cette nouvelle adresse. Si aucune adresse n'était précédemment associée à l'adaptateur ATi dans le filtre, cette adresse est alors initialisée avec valeur de l'adresse source du paquet en cours de traitement. Si une adresse était déjà associée à l'adaptateur ATi, cette adresse reste inchangée dans le cas où l'adresse lue dans le paquet reçu lui est identique. Dans le cas contraire, cette adresse est alors remplacée par la nouvelle adresse lue dans le paquet en cours de traitement.
Ensuite, le microprocesseur 403 désactive la fonction d'apprentissage automatique de l'adresse, en mettant à FAUX, dans la mémoire vive 405, l'élément du tableau "Lire Adresse" correspondant à l'adaptateur ATi.
La phase de traitement correspondant à l'apprentissage automatique de l'adresse du terminal associé à l'adaptateur sans fil ATi est alors terminée. L'opération de transmission 505, qui consiste à transmettre le paquet au contrôleur Ethernet 402, est ensuite exécutée. Le contrôleur Ethernet 402 se charge ensuite de transmettre ce paquet sur le réseau filaire 104.
Les traitements qui viennent d'être décrits en liaison avec les figures 5A et 5B permettent - d'activer 1e mode d'apprentissage de l'adresse d'un terminal à chaque fois qu'une nouvelle connexion radio est établie entre le point d'accès et un terminal, par l'intermédiaire de l'adaptateur sans fil de ce dernier, - de désactiver le mode d'apprentissage de l'adresse dès que l'adresse terminal a été lue à partir de l'adresse source du premier paquet reçu sur connexion donnée.
Ainsi, la lecture de l'adresse source ne s'effectue que sur premier paquet reçu sur une connexion radio donnée, ce qui diminue le temps de traitement paquets suivants. La figure 6A représente les traitements effectués le microprocesseur 303 de l'adaptateur de terminal sans fil 101 après la mise sous tension.
Après une phase d'initialisation 600, décrite plus loin en liaison avec avec la figure 7A, le microprocesseur 303 vérifie l'état de l'activité lien Ethernet au cours d'un test 601, en testant la valeur de la variable "Lien EthemeP' contenue dans la mémoire vive 305. Si le test 601 positif ("Lien Ethemef' = ACTIF), cela signifie qu'il y a bien un terminal de communication actif (c'est-à-dire mis sous tension) connecté à l'adaptateur de terminal. opération de connexion 602 est alors effectuée, qui consiste à établir connexion radio entre l'adaptateur 101 et le point d'accès Si le test 601 est négatif, il ne se passe rien tant le lien Ethernet ne devient pas actif.
La figure 6B représente les traitements effectués par le microprocesseur 303 de l'adaptateur de terminal sans fil 101 après que le contrôleur Ethernet 302 a signalé au microprocesseur 303 un changement de l'état du lien Ethernet, ce changement d'état étant signalé par la mise à la valeur VRAI de la variable "Modification" contenue dans un registre de la mémoire vive 305 (étape 603).
Le microprocesseur effectue alors un test 604, pour connaître la valeur de variable "Lien EthemeY'. Le résultat du test 604 est positif lorsque le lien Ethernet est passé de l'état inactif à l'état actif. Si le test 604 est positif, une opération de connexion 605, qui consiste à établir une connexion avec le point d'accès 102, est alors effectuée. Si le résultat du test 604 est négatif, une opération déconnexion 606, qui consiste à rompre la connexion établie avec le point d'accès 102, est effectuée.
Après l'une quelconque des opérations de connexion 605 ou de déconnexion 606, le microprocesseur 303 effectue une étape de mise à jour 607, qui consiste à remettre la variable "Modification" à FAUX, indiquant que la prise en compte du changement d'état a été effectuée et permettant d'attendre une nouvelle notification du changement du lien Ethernet.
traitements qui viennent d'être décrits en liaison avec les figures 6A et 6B permettent - de détecter en temps réel la présence ou l'absence d'un terminal actif (mis sous tension) connecté à un adaptateur de terminal 101, et de n'établir une connexion radio avec le point d'accès que lorsqu'il y a un terminal actif connecté à l'adaptateur de terminal 101.
Pour 16 des 20 sols, le rendement le plus élevé a été obtenu à pH 10,0, alors que pour les quatre autres sols le plus haut rendement a été obtenu à pH 9,0. Cependant, à pH 10,0, des quantités plus grandes de matériel humique ont été libérées, comparées à pH 9,0 (résultats non présentés). En conséquence, le pH 9,0 a été choisi pour toutes les expériences présentées ci-dessous.
2. 2 EFFICACITE DES PROTOCOLES D'EXTRACTION D'ADN : L'ADNtotal des organismes indigènes du sol a été extrait et quantifié de manière à évaluer l'efficacité de nombreux protocoles de lyse cellulaire in situ. Des échantillons des sols 1-6 (tableau 1) ont été traités selon les protocoles n 1 à 5 décrits dans la section Matériel et Méthodes (figure 1).
Après l'extraction d'ADN, les suspensions de sols ont été précipitées avec de l'isopropanol, et des fractions aliquotes des culots remis en suspension ont été analysées par électrophorèse sur gel , dans une première étape, afin d'estimer la qualité et la quantité de l'ADN libéré.
Cependant, la couleur de l'extrait d'ADN devenait de plus en plus sombre au fur et à mesure du nombre croissant d'étapes de lyse, du fait de la co-extraction de composés, tels que les acides humiques, avec l'ADN.
Certains de ces extraits bruts de couleur sombre ne migrent pas de la manière attendue dans les gels d'agarose.
En conséquence, les solutions d'ADN brut ont été purifiées (protocole B) avant quantification. Les électrophorèses sur gel des solutions purifiées obtenues après les différents traitements de lyse sont exemplifiées sur le sol n 3 (figure 2).
Une comparaison visuelle au rayonnement ultra-violet des intensités de l'ADN coloré a permis une estimation semi-quantitative de l'efficacité des traitements. De plus, la présence de profils de migration de tailles multiples de fragments (bandes discrètes) d'ADN et la disparition des fragments longs indique qu'une dégradation de l'ADN a eu lieu.
Aucun ADN n'a pu être extrait du sol argileux n 5.
* Une quantification plus précise de l'ADN de tous les sols, extrait selon les protocoles n 1 à 5, a été réalisée par hybridation sur tache (Dot Blot) sans étape d'amplification PCR préalable et en utilisant une sonde oligonucléotidique complémentaire d'une séquence hautement conservée de la région d'ADNr 16S (sonde FGPS 431, tableau 2).
L'ADN a été détecté dans les extraits de tous les sols après chacune des différentes étapes de lyse, à l'exception du sol argileux n 5.
Les résultats concordent avec les estimations réalisées après gel d'électrophorèse.
Afin de comparer avec une méthode indépendante pour la quantification, l'ADN extrait selon le protocole n 2 (tous les sols sauf le sol n 5) a été également quantifié en utilisant une méthode colorimétrique de détection de l'ADN (RICHARD, 1974).
On a trouvé une bonne corrélation (r = 0,88) entre l'ADN quantifié en utilisant cette technique colorimétrique et les résultats obtenus par hybridation de type Dot Blot/radio-imagerie, confirmant
l'hypothèse selon laquelle le nombre de copies moyen des bactéries du sol (rrn) est de 7.
L'hybridation (Dot Blot) a montré que les quantités d'ADN extracellulaires, comme déterminé par extraction sans traitement de lyse (protocole n 1), allait de 4ug/g pour le sol acide (n 6) à 36 g/g pour le sol n 3 (tableau 3).
Le broyage du sol (protocole n 2 ) a augmenté les quantités d'ADN extrait à partir de tous les sols (p.ex. 26 g/g de sol) pour le sol n 6 et 59 g/g de sol (pour le sol n 3) (tableau 3 ; figure 2).
Comme on peut le constater au vu de ces courbes, la réalisation angle sur les bords de la pale permet d'éviter d'avoir un couple négati tout en conservant un coefficient de couple élevé. Le bord d'attaque et le bord de fuite peuvent prendre n'importe quelle forme pour autant que les critères mentionnés précédemment concernant l'angle a et les surfaces des zones za et z, soient respectés.