INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Selon un autre aspect de l'invention, la FHA ou un fragment de la FHA est utilisable comme principe actif dans la préparation d'une composition immunostimulante.
Par immunostimulant(e), on entend la propriété de stimuler les immunoglobulines totales, notamment les IgG ou les IgA totales. Cette propriété se différencie de celle d'adjuvant pour laquelle seules les immunoglobulines spécifiques d'un antigène donné sont stimulées.
L'invention porte ainsi sur une composition imunostimulante contenant comme principe actif la FHA ou un fragment de celle-ci et un véhicule pharmaceutique compatible avec une administration à l'homme ou à l'animal.
Figure 1A. Gel d'immuno-empreinte de la protéine ESM-1 de différents types cellulaires exprimant cette protéine.
L'immuno-précipitation de ESM-1 à partir des surnageants de culture des cellules SVI (1), 293-ESM (2) et CHO-ESM (3) a été réalisée
avec l'anticorps MEP19 lorsque cela est indiqué, ou avec un anticorps témoin. Les flèches indiquent la bande spécifique de ESM-1. La forme native de ESM-1 est représentée par une bande diffuse aux alentours de 50 kD.
Figure 1B. Absence de détection de la protéine purifiée ESM-1 avec le bleu de coomassie.
5 ug de protéine ESM-1 purifiée à partir des cellules SVI ont été chargés sur un gel SDS-PAGE à 15% et colorés au bleu de coomassie afin de détecter le corps peptidique de la molécule. Les flèches indiquent l'absence de détection de ESM-1.
Figure 1C. Détection de la protéine ESM-1 purifiée avec le bleu alcian.
5 ug de protéine ESM-1 purifiée à partir des cellules SVI ont été chargés sur un gel SDS-PAGE à 15% et ont été révélés par coloration au bleu alcian afin de détecter le corps glycanique de la molécule. La flèche indique la protéine ESM-1.
La figure 2 illustre le poids moléculaire apparent des corps peptidique et glycanique de ESM-1.
Figure 2A. Analyse par mutation du site de fixation de 0glycosylation.
Deux sites putatifs de O-glycosylation (tréonine 120 et sérine 137) ont été substitués par un résidu alanine par mutagénèse dirigée. La protéine ESM-1 sauvage (WT pour WHd-Type ), tes mutants de ESM-1 T120A et S137A) ainsi que les témoins négatifs (MOCK) ont été transfectés dans les cellules 293 et les surnageants de culture cellulaire ainsi que les Iysats cellulaires ont été analysés par immuno-empreinte (Western-Biot) à l'aide de l'anticorps monoclonal MEP14. Les flèches indiquent les bandes spécifiques.
Figure 2B. Effet d'un traitement à la protéinase K sur ESM-1. La protéine ESM-1 purifiée à partir des cellules SVI (1) et 293-ESM (2) a été digérée par la protéinase K et chargée sur un gel SDS-PAGE 15%. La flèche supérieure indique la forme sauvage de la protéine ESM-1 non traitée et la flèche inférieure indique la protéine ESM-1 digérée par la protéinase K.
La figure 3 illustre les effets de chondroïtinases spécifiques sur ESM-1.
Figure 3A. Traitement de la protéine ESM-1 sauvage purifiée avec la chondroïtinase ABC.
La protéine ESM-1 sécrétée a été purifiée par chromatographie d'échanges d'ions, suivie d'une chromatographie d'immuno-affinité à partir de surnageants de cultures de cellules SVI (1), 293-ESM (2) et à partir de plasma humain (3), puis digérée ou non par la chondroïtinase ABC. 50 ng de la protéine digérée ont été chargés sur un gel SDS-PAGE à 15% puis analysés par immuno-empreinte (Western-Blot). La flèche supérieure indique les formes non digérées de ESM-1 et la flèche inférieure indique les formes digérées de ESM-1.
Figure 3B. Traitement de la protéine ESM-1 sauvage purifiée avec la chondroïtinase B.
La protéine ESM-1 purifiée à partir de surnageants de culture des cellules SVI (1) et 293-ESM (2) ont été digérés ou non par la chondroïtinase. Les protéines ont été chargées sur un gel SDS-PAGE à 15%. La flèche supérieure indique les différentes formes de ESM-1 non digérées autour de 50 kD et la flèche inférieure indique les différentes formes de la protéine ESM-1 digérée, autour de 22 kD.
appropriée, car il se contente d'éclater les nouvelles fonctions créées en un réseau de blocs de fonctions existants ce qui, d'une part, interdit l'introduction de nouveaux types de données ou de paramètres traités, et d'autre part n'optimise en rien l'exécution sur cible et accroît les problèmes évoqués ci-dessus.
E)-L'incapacité de mixer simplement dans la même sémantique les fonctions suivantes : - des fonctions d'automatismes dont le cycle d'exécution soit n'est pas contraint au strict déterminisme temporel, comme c'est le cas du SFC ou du GRAFCET , - des fonctions contraintes par les règles du contrôle-commande, donc par des échantillonnages de signaux qui doivent respecter le théorème de Shannon, - des fonctions contraites par une exécution temps réel rapide strictement déterministe ("time triggered") comme le SAO de EADS, le tout s'éxécutant sur une plateforme logicielle dont le mode d'exécution est soit "event driven", soit ni"time triggered", ni"event driven".
La présente invention a pour objet un procédé de codage de langage graphique d'automatisme pour son exécution en temps réel sur une plate-forme numérique, procédé qui permette d'intégrer facilement dans l'atelier logiciel des outils extérieurs, ainsi que ses propres outils, même complexes, qui permette de reconstruire le graphe initial, d'enrichir simplement les blocs de fonctions du graphe initial, et de mixer diverses fonctions d'automatisme à cycle d'exécution de différents types.
Le procédé conforme à l'invention est caractérisé en ce que le codage comprend au moins deux séquences d'instructions"context free"ordonnées suivant l'ordre de précédence dégagé par l'analyse du graphe, la première séquence étant une séquence d'initialisation, la deuxième comportant une suite d'instructions ordonnées temporellement, qui sont exécutées à période constante, chaque instruction de cette suite étant caractérisée par un code opératoire qui ne représente qu'une seule fonction, par un numéro unique dans le graphe distinguant chaque bloc fonctionnel du graphe, et par un ensemble'opérandes appartenant à l'une au moins des
catégories suivantes : variables d'entrée, variables de sortie, paramètres de sortie, variables internes et paramètres internes.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description détaillée d'un exemple de mise en oeuvre, pris à titre d'exemple non limitatif et illustré par le dessin annexé, sur lequel la figure unique est un graphe simplifié de quelques fonctions élémentaires d'automatisme, établi selon le procédé de l'invention.
Le procédé de codage de l'invention permet de réaliser un graphe mélangeant indifféremment des fonctions d'automatisme (pouvant utiliser un langage approprié tel que FBD , SFC ou Grafcet par exemple), des fonctions de contrôle-commande strictement déterministes ou non (conçues à l'aide d'un langage tel que SAO ou un autre langage utilisant des schémas-blocs ou bien des fonctions de transfert diverses) et des fonctions de simulation (traduites en un langage tel que Bondgraph ...) Pour pouvoir regrouper sous une même syntaxe de graphe l'ensemble des langages décrits ci-dessus, en respectant leur sémantique propre, il convient d'autoriser dans le graphe FBD (norme EN1131-3) les deux modes de connexion suivants : 1 )-Une sortie d'une fonction peut être re-bouclée sur une entrée d'une autre fonction ou de la même fonction (On notera qu'en SAO , ceci se traduit par l'introduction d'un retard d'un cycle entre la sortie et l'entrée).
- 20) -Une entrée peut ne pas être connectée : dans ce cas on initialise cette entrée à une valeur constante neutre pour l'algorithme de ladite fonction. En outre, il n'existe en aucun cas de données variables ou de constantes présentées en tant que telles dans le graphe. Toute donnée variable ou constante appartient à une fonction, que ce soit une fonction d'entrée, de sortie ou intermédiaire.
Il résulte de ces conditions que toute fonction d'automatisme, de contrôle-commande"context free"doit se traduire par un sous-programme en langage quelconque utilisant des variables d'entrée, des variables de sortie, des
paramètres de sortie, des variables de travail (internes) volatiles et des variables de travail rémanentes.
Les variables de travail sont utilisées lors de chaque exécution de la fonction. Elles n'ont donc pas à être vues de l'interface d'appel et sont seulement connues et déclarées dans le code de la fonction. Elles sont considérées comme des données locales au sous-progamme.
Il suffit d'appliquer dans le codage de la fonction les règles de portabilité vers toute cible et de déterminisme appliquées au langage haut niveau utilisé (C, Ada,...) pour obtenir un code source portable et déterministe en temps d'exécution et en encombrement mémoire.
Dans la mesure où l'outil de mise au point et de monitoring a la capacité de lire ou de modifier simplement chacun des autres opérandes de la fonction (entrées, sorties, paramètres et données de travail rémanentes), ces données sont implantées dans le langage qui sert à programmer les fonctions comme des variables globales rémanentes.
Pour adresser un tel opérande, le mode d'adressage en langage binaire est très variable suivant le code exécutable cible et les traductions effectuées par le compilateur/éditeur de liens associés à la cible. Aussi, pour assurer la portabilité totale, il faut définir l'adresse de ces paramètres comme des déplacements en octets ou en bits vis-à-vis du début d'une ou de plusieurs zones de mémoire. Les déplacements en octets ou en bits sont des notions universelles à tous les circuits intégrés numériques existants.
Pour pouvoir définir combien de zones mémoire sont alors nécessaires et quelles sont leurs caractéristiques, seule la catégorie des variables est utile.
Une variable de la catégorie : variable d'entrée, de sortie ou variable de travail rémanente : a)-Est lue et modifiée à chaque pas de calcul de la boucle d'exécution de l'automatisme ou du contrôle-commande, donc elle ne peut être placée ni en mémoire PROM, EPROM, ou EEPROM (écriture impossible ou très contraignante) ni en mémoire flash (le nombre de cycles d'écriture d'une mémoire flash est limité dans le temps !)
Il a ainsi été montré selon la présente invention, que la protéine FHA ou un fragment de la protéine FHA se comportait en tant que composé adjuvant capable d'initier ou d'accroître la réponse immunitaire à l'encontre de différents antigènes ou immunogènes de structures diverses, reconnues différemment par les cellules du système immunitaire.
L'objectif de l'addition d'un adjuvant à un antigène dans une composition est de provoquer ou stimuler la réponse immunitaire tant dans ses phases primaires (production d'IgM) que dans ses phases secondaires à savoir la production des IgG au niveau de l'immunité cellulaire systémique, ou des IgA au niveau de l'immunité mucosale. Celle-ci est particulièrement importante dans le cas de développement d'une immunité anti-infectieuse. En effet, l'adhérence des micro-organismes aux membranes des cellules épithéliales des muqueuses est la première étape de l'infection virale et de la colonisation bactérienne. Les anticorps de type IgA peuvent empêcher cette adhérence en recouvrant le micro-organisme (coating). Ils offrent ainsi une protection au niveau des sécrétions externes comme les larmes, la salive ou les sécrétions nasales ainsi qu'au niveau du mucus intestinal et pulmonaire. Il est donc facile de concevoir que si la FHA ou le fragment de la FHA selon l'invention produisent une stimulation de la réponse IgA, l'impact sur la mise au point de compositions immunogènes ou de vaccins est important.
Ainsi, une composition immunogène comprenant l'adjuvant selon l'invention et un immunogène ou un antigène est caractérisée en ce que le rapport en poids de l'adjuvant et de l'immunogène est compris entre 10-4 et 104, de préférence entre 0,03 et 300 et de manière préférée entre 0,4 et 5.
Comme il a été dit plus haut, et démontré ci-après, l'adjuvant est administrable séparément de l'antigène dans le temps ou selon différentes voies d'administration, ou associés dans une composition immunogène.
Dans l'un et l'autre cas, l'antigène peut être d'origine bactérienne, virale ou parasitaire. Il peut également s'agir d'un antigène spécifique de cellules cancéreuses, tel l'antigène de carcinome embryonnaire (ACE).
Quand l'antigène est d'origine bactérienne, il peut s'agir notamment d'antigènes de Bordetella, de Shigella, de Neisseria, de Borrelia, des toxines ou toxoïdes diphtériques, tétaniques ou cholériques.
Quand il est d'origine parasitaire, il peut par exemple être un . antigène de Plasmodium, des Schistosoma ou de Toxoplasma.
Un autre objet de l'invention consiste en une composition vaccinale, caractérisée en ce qu'elle comprend une composition adjuvante telle que décrite ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement compatible.
La préparation de compositions vaccinales contenant un polypeptide en tant que molécule immunogène ou antigénique est bien connue de l'homme du métier et est en particulier illustrée dans les brevets US N 4,608,251; 4,601,903 ; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792 et 4,578,770.
De telles compositions vaccinales sont préparées sous la forme de solutions liquides ou de suspensions injectables ou encore sous une forme solide, par exemple lyophilisée, adaptée à la mise en solution préalablement à l'injection. La FHA ou la partie de la FHA utilisée comme adjuvant ainsi que l'antigène ou l'immunogène seront en général mélangés à des excipients pharmaceutiquement compatibles, tels que de l'eau, un tampon salin, du dextrose, du glycérol, de l'éthanol, ou des mélanges de ces derniers.
Une composition vaccinale selon l'invention peut également contenir de faibles quantités de substances auxiliaires telles que des agents mouillants ou émulsifiants, ou encore des agents tampons.
Les compositions vaccinales selon l'invention sont formulées de telle manière à les adapter à une administration par voie .nasale, par voie orale, par voie sous-cutanée ou par voie intraveineuse, intradermique, intramusculaire, vaginale, rectale, oculaire ou auriculaire.
Le choix des substances auxiliaires sera guidé par le mode d'administration choisi. Un mode d'administration préféré sera l'administration nasale ou orale.
La FHA ou la partie de la FHA et l'antigène d'intérêt peuvent être formulés, au sein d'une composition vaccinale selon l'invention, sous une forme neutre ou saline.
Des sels pharmaceutiquement compatibles comprennent des sels d'addition acide (formés avec les groupes amino libres du peptide) ou encore ceux formés avec des acides inorganiques tels que par exemple les acides chlorhydrique et phosphorique ou encore ceux formés avec des acides organiques tels que l'acide acétique, oxalique, tartrique et mandélique.
Des sels formés avec les groupes carboxy libres peuvent également être dérivés de bases inorganiques telles que par exemple des hydroxydes de sodium, potassium, ammonium, calcium ou ferrique, ou encore
Il est important de noter toutefois qu'un organisme vivant est un tout et doit être pris comme tel. Ainsi, afin de pouvoir se développer et exhiber ses propriétés, tout organisme a besoin d'interactions entre les différentes voies métaboliques. Ainsi, la classification énoncée ci-dessus ne doit pas être considérée comme limitative, un gène pouvant être impliqué dans deux voies métaboliques distinctes.
La présente invention a également pour objet les séquences nucléotidiques et/ou de polypeptides selon l'invention, caractérisées en ce que lesdites séquences sont enregistrées sur un support d'enregistrement dont la forme et la nature facilitent la lecture, l'analyse et/ou l'exploitation de ladite ou desdites séquence (s).
Ces supports peuvent également contenir d'autres informations extraites de la présente invention, notamment les analogies avec des séquences déjà connues, et/ou des informations concernant les séquences nucléotidiques et/ou de polypeptides d'autres microorganismes afin de faciliter l'analyse comparative et l'exploitation des résultats obtenus.
Parmi cesdits supports d'enregistrement, on préfère en particulier les supports lisibles par un ordinateur, tels les supports magnétiques, optiques, électriques ou hybrides, en particulier les disquettes informatiques, les CD-ROM, les serveurs informatiques. De tels supports d'enregistrement sont également objet de l'invention.
Les supports d'enregistrement selon l'invention, avec les informations apportées, sont très utiles pour le choix d'amorces ou de sondes nucléotidiques pour la détermination de gènes dans Listeria innocua ou monocytogenes 4b ou souches proches de cet organisme. De même, l'utilisation de ces supports pour l'étude du polymorphisme génétique de souches proches de Listeria innocua ou monocytogenes 4b, en particulier par la détermination des régions de colinéarité, est
très utile dans la mesure où ces supports fournissent non seulement la séquence nucléotidique du génome de Listeria innocua ou monocytogenes 4b, mais également l'organisation génomique dans ladite séquence. Ainsi, les utilisations de supports d'enregistrement selon l'invention sont également des objets de l'invention.
L'analyse d'homologie entre différentes séquences s'effectue en effet avantageusement à l'aide de logiciels de comparaison de séquences, tels le logiciel Blast, ou les logiciels de la trousse GCG, décrits précédemment.
L'invention vise également les vecteurs de clonage et/ou d'expression, qui contiennent une séquence nucléotidique selon l'invention.
Les vecteurs selon l'invention comportent de préférence des éléments qui permettent l'expression et/ou la sécrétion des séquences nucléotidiques dans une cellule hôte déterminée.
Le vecteur doit alors comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule hôte et peut éventuellement posséder des signaux particuliers qui spécifient la sécrétion de la protéine traduite. Ces différents éléments sont choisis et optimisés par l'homme du métier en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou être des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
De tels vecteurs sont préparés par des méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standards, telle que la lipofection, l'électroporation, le choc thermique, ou des méthodes chimiques.
Les vecteurs selon l'invention sont par exemple des vecteurs d'origine plasmidique ou virale. Ils sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques selon l'invention.
L'invention comprend également les cellules hôtes transformées par un vecteur selon l'invention.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes, par exemple les cellules bactériennes mais également les cellules de levure ou les cellules animales, en particulier les cellules de mammifères. On peut également utiliser des cellules d'insectes ou des cellules de plantes. Les cellules hôtes préférées selon l'invention sont en particulier les cellules procaryotes, de préférence les bactéries appartenant au genre Listeria, à l'espèce Listeria innocua ou monocytogenes 4b, ou les microorganismes associés à l'espèce Listeria innocua y ou monocytogenes 4b. L'invention concerne également les végétaux et les animaux, excepté l'homme, qui comprennent une cellule transformée selon l'invention. Les cellules transformées selon l'invention sont utilisables dans des procédés de préparation de polypeptides recombinants selon l'invention. Les procédés de préparation d'un polypeptide selon l'invention sous forme recombinante, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre un vecteur et/ou une cellule transformée par un vecteur selon l'invention sont eux-mêmes compris dans la présente invention. De préférence, on cultive une cellule transformée par un vecteur selon l'invention dans des conditions qui permettent l'expression dudit polypeptide et on récupère ledit peptide recombinant.
Ainsi qu'il a été dit, l'hôte cellulaire peut être choisi parmi des systèmes procaryotes ou eucaryotes. En particulier, il est possible d'identifier des séquences nucléotidiques selon l'invention, facilitant la sécrétion dans un tel système procaryote ou eucaryote. Un vecteur selon l'invention portant une telle séquence peut donc être avantageusement utilisé pour la production de protéines recombinantes, destinées à être sécrétées. En effet, la purification de ces protéines recombinantes d'intérêt sera facilité par le fait qu'elles sont présentent dans le surnageant de la culture cellulaire plutôt qu'à l'intérieur des cellules hôtes.
On peut également préparer les polypeptides selon l'invention par synthèse chimique. Un tel procédé de préparation est également un objet de l'invention.
forme"interne cible" (qui, grâce au respect des règles de codage portable, a la même structure sous toute cible et simulateur). Evidemment, le caractère context free de l'instruction d'initialisation et son unicité pour un doublet (type, catégorie) d'une variable fait que sur toute cible ou simulateur le sous-programme associé à cette fonction est à même de comprendre le type de ses paramètres d'appel et de comprendre le format de la constante à placer.
Pour réaliser l'initialisation des paramètres de différentes catégories (sortie et interne), on peut choisir de construire la zone binaire cible représentant les constantes et les valeurs des paramètres, dans leur ordre d'implantation sur la cible, avec recopie de cette zone à chaque initialisation de programme exécutable et sauvegarde sous réserve d'énergie à chaque détection d'une chute de tension d'alimentation de cible. Ainsi, la récupération de modifications dynamiques des paramètres en EEPROM ou en mémoire Flash durant des phases de monitoring, de mise au point ou de paramétrage devient possible. On peut aussi utiliser une méthode mixte alliant les deux principes : une initialisation par séquence d'instructions exécutable sur la première initialisation suivant le chargement programme exécutable sur la cible, puis réaliser des recopies de zone lors des arrêts alimentation/mise sous tension.
On peut aussi, quand la cible ne contient que des mémoires RAM et EPROM ou PROM ou ROM, appliquer une technique d'initialisation unique par séquence regroupant les instructions d'initialisation exécutables systématiquement en prélude à l'exécution en boucle des instructions du programme exécutable représentant le graphe. Dans ce cas, on ne peut pas modifier dynamiquement la valeur des paramètres sur la cible en dehors des phases de chargement du programme exécutable et du programme d'initialisation associé.
Si les types des données se limitent à des caractères HASCH 7,8, ou Unicode, ou à des nombres entiers en puissance de 2 (booléen, entier signé, entier non signé, fixe accompagné de sa précision absolue), la portabilité de ces données et de ces constantes entre deux cibles est vérifiée (sous réserve de prise en compte des mécanismes de représentation des nombres sur 2 octets ou plus : Big Endian, Little Endian). Si on introduit le type flottant, le format du type flottant, , le choix du
mode d'arrondi et de comparaison (par exemple en format flottant IEEE) cassent la portabilité. La notion de précision relative introduite dans les calculs est la seule qui permette d'assurer la portabilité. L'alignement et le volume de réservation des données peuvent être choisis pour assurer la portabilité.