INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La figure 11 représente la structure des fusions entre la séquence signal de clpG et différentes portions de sth. Les séquences nucléotidiques issues des constructions présentées dans la figure 1 sont en caractères gras. La portion STh de la protéine de fusion est colorée en bleu : ST15 (YCCELCCNPACTGCY), ST16 (NYCCELCCNPACTGCY) et ST19 (NSSNYCCELCCNPACTGCY) correspondent respectivement aux 15,16 et 19 acides aminés C-terminaux de la toxine STh mature. Les sites de restrictions des enzymes sont soulignés. SSc1pG, séquence signal de clpG.
Le plasmide pSPGST1 a été obtenu par insertion de l'oligonucléotide double brin SPGST3/SPGST5 entre les sites SphI et HpaI du plasmide pHPC0838 (Figure 1). Ce plasmide, ainsi dépourvu du gène c1pG, porte l'oligonucléotide codant pour la toxine STh mature placé immédiatement après la séquence signal de clpG. Une autre construction appelée pSTE531 a été réalisée par insertion de l'oligonucléotide double brin E351/E531 dans le site PstI du plasmide pSTN24. Les sites HindIII, PacI et SnaBI nouvellement introduits changent les acides aminés PADPHA présents entre STh et ClpG dans pSTN24 en PASLINYV. La délétion du fragment SnaBI/HpaI de pSTE531 conduit au
plasmide pSTDG17 qui correspond au plasmide pSTN24 sans le gène clpG et avec l'hexapeptide PASLIN au lieu de PADPHA en C-terminal de STh. Après vérification du clonage par séquençage, il s'est avéré que l'enzyme de restriction SnaBI n'avait pas coupé au site TAC/GTA mais au site TA/CGTA. Cette modification a entraîné un décalage du cadre de lecture générant ainsi un codon stop TAA prématuré. La substitution du fragment SphI/HpaI de pHPC0838 par l'ADN duplex synthétique STNDG2/STNDG1 aboutissant au plasmide pSTDG126 permet d'avoir l'équivalent de pSTN24 délété de clpG avec l'extrémité C-terminale libre de la toxine. Les plasmides pGMSTC7 et pGMSTC13 dérivent respectivement des plasmides pSTC22 et pProSTC28. Dans ces cas, l'oligonucléotide double brin GMCST3/GMCST5 a été introduit entre les sites SphI et HpaI de pSTC22 et de pProSTC28.
Dans le but d'éliminer progressivement les acides aminés présents entre le peptide signal de ClpG et la toxine STh, les fragments HpaI/HpaI et HpaI/SmaI de pGMSTC7 ont été délétés pour aboutir respectivement aux plasmides pGMSTC71 et pGMSTC710. Finalement, les plasmides pGMSTC71 et pGMSTC710 diffèrent respectivement de pSTC22 et pSTC17 uniquement par l'absence du gène c1pG. De même, les constructions pGMSCT13/19 et pGMSTC13/28 ont été obtenues respectivement après délétion du fragment HpaI/HpaI ou EcoRI/EcoRI de pGMSTC13. Seul pGMSTC13/19 correspond au plasmide pProSTC28 délété du gène clpG.
Ces différentes constructions ont été vérifiées par séquençage et introduites dans les différentes souches mutées pour les protéines DsbA et/ou DsbB, avant d'être testées pour leur activité entérotoxique et leur sécrétion dans le milieu extracellulaire. La figure 12 représente la sécrétion et la toxicité des hybrides correspondant aux différentes fusions entre le peptide signal de ClpG et STh.
Sur la figure 12, on observe l'accumulation du fluide intestinal par les surnageants non dilués provenant de cultures en milieu solide des bactéries recombinantes. La sécrétion des hybrides a été déterminée par lecture de l'absorbance à 490 nm des plaques ELISA recouvertes par la toxine ST (kit E. coli ST EIA, Oxoid) comme indiqué dans la figure 6. + ou-, présence ou absence de sécrétion. I/C, moyenne établie à partir d'un groupe de 3 à 9 souriceaux par échantillon. Un I/C > 0,09 est considéré comme positif.
Les résultats montrent que la toxine STh mature précédée par la séquence signal de ClpG suffit à induire, dans la majorité des cas, la sécrétion de la toxine biologiquement active et ceci indépendamment du système Dsb. Seule la protéine de fusion codée par pSTDG17 n'est pas détectée dans le milieu extracellulaire, contrairement à celle codée par pSTN24 qui diffère de la précédente essentiellement par la présence de ClpG et de l'hexapeptide PADPHA au lieu de PASLIN à l'extrémité C-terminale de STh.
La présence de cet hexapeptide (PASLIN) en aval de STh (pSTDG17) semble donc inhiber la sécrétion de la toxine
puisque sa suppression (pSTDGl26) rétablit la fonction sécrétoire (Figure 12). Cependant, lorsque la protéine ClpG (257 acides aminés) et les six acides aminés (PADPHA) entre ClpG et STh sont présents à l'extrémité C-terminale de STh (pSTN24), l'hybride est sécrété. Ceci suggère que le couplage de ClpG à l'extrémité C-terminale de STh favoriserait le passage de STh à travers la membrane externe. Par contre, toutes les protéines hybrides présentant la partie C-terminale de STh libre sont sécrétées dans le milieu extracellulaire sous une forme biologiquement active, quelle que soit la séquence peptidique placée entre la séquence signal de ClpG et la toxine STh. Ces résultats indiquent que - Un peptide signal hétérologue tel que celui de ClpG peut être suffisant pour exporter la toxine STh seule jusqu'au périplasme de E. coli . Ceci suggère que STh, une fois dans cet espace cellulaire, est capable par elle-même de transloquer à travers la membrane externe.
- La sécrétion de la toxine STh seule est influencée par la nature de la séquence peptidique hétérologue présente à son extrémité C-terminale, mais pas à son extrémité N-terminale.
- ClpG n'est pas nécessaire à la sécrétion de STh quand l'extrémité C-terminale de celle-ci est libre.
- ClpG n'est pas impliquée dans la formation des ponts disulfures, ni dans les souches dsb+, ni dans les souches dsb-, puisque la toxine STh seule fusionnée au
peptide signal de ClpG demeure biologiquement active lorsqu'elle est sécrétée.
3) Etat d'oxydoréduction des protéines hybrides.
La figure 13 présente l'état d'oxydoréduction d'une protéine hybride produite par les souches dsb+ et dsb- dans les compartiments extracellulaires (A) et intracellulaires (B). Les surnageants issus de cultures liquides (25 ml) en phase stationnaire (A) ou exponentielle (B) traités (+) ou non (-) avec 100 mM de DTT avant précipitation au TCA 5% final. Le culot est repris dans un tampon contenant (+) ou non (-) 10 mM d'AMS. Après migration sur gel de polyacrylamide (12%) en conditions non réductrices, les protéines sont révélées par Western immunomarquage en utilisant l'anticorps de lapin anti-ClpG, des anticorps de chèvre anti-IgG de lapin couplés à la biotine et la strptavidine conjuguée à la peroxydase. Red signifie forme réduite et ox forme oxydée. Cox est le témoin d'oxydation correspondant à l'hybride extracellulaire produit par une souche dsb+ hébergeant le plasmide pEHProSTC28.
Dans ce cas l'élément El reste affiché aussi longtemps que le pointeur n'est pas sorti de la zone Zl, puis à nouveau entré dans celle-ci ; c'est seulement dans ce dernier cas que l'élément El est remplacé par les éléments E2 et E5 sur l'écran d'affichage.
On va présenter ci-après une approche de streaming pour l'élément E1, qui dans le présent exemple est constitué par deux sous-éléments E 1.1et E 1.2.
Plutôt que d'attendre la fin du chargement complet de l'élément El, les parties distinctes E1.1 et E1.2 de l'élément El(qui peuvent être par exemple principalement du texte) peuvent être chargées et affichées successivement, dans l'ordre de lecture.
En variante, le comportement des différentes parties de l'élément El peuvent être dissociées, selon les règles énoncées ci-dessous et décrites en référence aux figures 9 à 12, sur lesquelles chaque fenêtre a pour but de montrer d'une part les nouveaux éléments affichés en réaction à l'action de déplacement du pointeur de la souris présentée dans la fenêtre immédiatement précédente, le cas échéant, d'autre part une nouvelle action de déplacement de la souris dont l'effet est montré dans la fenêtre suivante, le cas échéant : Règle 1 Il s'agit ici d'un simple rappel du principe déjà énoncé dans le paragraphe Cas 2 : Le pointeur de la souris se trouve initialement dans Z1 : Dans le cas où, au moment de la fin du chargement des éléments E2 et E5 de la page interactive P, le pointeur de la souris se trouve dans la zone Z1, les déplacements du pointeur n'ont pas d'effet tant que le pointeur n'est pas amené en dehors de la zone Zl (c'est-à-dire
introduit dans la zone Z2) puis retourné ensuite dans la zone Z1. Ceci est illustré sur la figure 9.
Règle 2 Le déplacement du pointeur de la souris, de la zone Z2 à la zone Zl, déclenche le remplacement de l'affichage du seul sous-élément touché par le sous-élément correspondant de la page interactive. Dans l'exemple illustré sur la figure 10, l'entrée du pointeur dans la région affectée au sous-élément E1.1 de l'élément Elprovoquera son remplacement par un sous-élément E2. 1 de l'élément E2, tandis que l'autre sous-élément E1.2 de l'élément El restera intact.
Règle 3 Cette règle aborde la réversibilité du comportement défini par la règle 2 : le pointeur revient ensuite dans la zone Z2, même en étant passé par d'autres régions entre-temps, mais à condition d'avoir automatiquement défait les remplacements causés entre-temps, l'affichage de l'élément E2. 1 est remplacé par celui de l'élément E1.1. Ceci est illustré sur la figure 10.
Les schémas des figures 11 et 12 présentent d'autres exemples de mise en #uvre de la réversibilité, tels que décrits ci-dessous : Règle Le déplacement du pointeur de la souris de la région occupée par le sous-élément E2. 1 à la région occupée par le sous-élément E1.2 déclenche le remplacement de l'affichage du sous- élément E1.2 par celui du sous-élément correspondant E2. 2 de la page interactive.
Règle 5 Cette règle décrit une forme de réversibilité de la règle 4 : le pointeur retourne de la région du sous-élément E2. 2 à à la région du sous-élément E2. 1, même en étant passé par d'autres régions entre-temps mais à condition d'avoir automatiquement défait les remplacements causés entre-temps, l'affichage du sous-élément E2. 2 est remplacé par celui du sous-élément E1.2. Ceci est illustré sur la figure 11.
Supposons qu'après le parcours suivant du pointeur de la souris : Z2 # E1.1(qui devient E2.1) -E1.2 (qui devient E2.2) le pointeur de la souris soit amené de la région occupée par le sous-élément E2. 2 jusque dans la zone Z2. Ceci, du fait qu'il ne s'agit pas un retour au sens de la Règle 3, n'engendre pas le remplacement du sous-élément E2. 2 par le sous-élément E 1.2.
Règle 6 Cette règle consiste à rendre l'opération ci-dessus réversible : si le pointeur retourne de la zone Z2 à la région occupée par le sous-élément E2. 2, même en étant passé par d'autres zones entre-temps mais à condition d'avoir automatiquement défait les remplacements causés entre- temps et si le retour s'effectue avant un seuil temporel donné, l'opération est considérée comme étant défaite. Ceci est illustré sur la figure 12. Cette forme de réalisation permet avantageusement de ne plus appeler les sous-éléments constituant l'élément initial El lorsqu'une période de temps prédéterminée s'est écoulée pendant laquelle l'utilisateur est resté sur les sous-éléments de l'élément E2, ce qui est révélateur par exemple d'un début de travail de l'utilisateur sur l'élément E2.
Section 3 - Exemples d'applications du présent chapitre Dans le cadre d'applications Internet ou autres, le procédé selon l'invention peut être complété par exemple par des éléments présentés dans le diagramme de la figure 13. Les informations portés par les éléments qui y sont représentés sont par exemple les suivantes : Elément El : texte (et le cas échéant image et/ou son, etc) introductif ou d'accueil, l'essentiel étant que sont chargement soit relativement rapide comparativement aux éléments E2 et E5 (constituant par exemple la page principale du site) ;
Section 3 - Création de liens ajoutés dans des Répertoires On connaît déjà dans l'état de la technique le concept dit de marque-page ou signet qui permet à un individu de mémoriser des liens vers ses pages favorites sur la Toile, un tel concept étant présent dans les navigateurs Internet courants. Ces derniers permettent de ranger les liens mémorisés dans des répertoires qui peuvent former une structure arborescente de répertoires et de sous-répertoires.
En effet :
- l'utilisateur peut ranger dans un répertoire non seulement un lien (vers une page), mais aussi un lien ajouté (entre deux pages).
Par exemple, dans le répertoire mes boissons favorites sur la page coca (marque déposée) peut se trouver un lien ajouté vers la page pepsi (marque déposée) alors que dans le répertoire mes styles de management préférés sur la même page coca peut ne pas se trouver de lien ajouté vers la page pepsi . (Voir l'exemple à la fin de cette section et la figure 51).
Dans les choix de conception adoptés dans toute la suite de la description : - chaque lien ajouté appartient à un répertoire et un seul : un répertoire courant existe toujours, et c'est dans ce répertoire que les liens vers des pages et leurs liens ajoutés sont insérés par défaut ; si aucun répertoire n'est sélectionné par l'utilisateur pour être le répertoire courant, un premier répertoire courant lui est fourni par défaut quand il accède à une page et lui associe un premier lien ajouté.
- l'utilisateur peut sélectionner plusieurs répertoires comme étant répertoires courants ; les liens ajoutés visualisés pour une page courante sont alors constitués par l'union des liens
ajoutés situés dans ces répertoires ; un nouveau lien ajouté inséré l'est dans chacun de ces répertoires ; enfin on verra dans la section Détection de Répertoires Proches que la recherche de répertoires proches se fera également sur la base de l'union des liens ajoutés situés dans ces répertoires.
Ceci est illustré sur la figure 218.
Gestion des blocages mutuels II demeure cependant des cas dits de blocage mutuel où des clients peuvent s'attendre les uns les autres à cause de demande de verrous.
Considérons par exemple, en référence aux figures 222 et 223, deux clients CIet C2.
Exemple 84 La (RS)-5-((4-chlorophényl)-{3-[(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthyl]- azétidin-1-yl}-méthyl)-pyrimidine peut être préparée de la manière suivante : Un mélange de 50 mg 5-[bromo-(4-chlorophényl)-méthyl]-pyrimidine, 52,6 mg de chlorhydrate de (RS)-3-[(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthyl]azétidine, 44 mg d'iodure de potassium et 73 mg de carbonate de potassium dans 2 cm3 d'acétonitrile, est chauffé environ 5 heures au reflux du solvant.
Après refroidissement jusqu'à une température voisine de 20 C, le milieu réactionnel est purifié par dépôt direct sur chromatographie préparative sur couche mince de silice [2 plaques préparatives Merck Kieselgel 60F254 ; 20x20 cm ; épaisseur 0,5 mm], en éluant par un mélange méthanoldichlorométhane (2,5-97,5 en volumes). Après élution de la zone correspondant au produit recherché par un mélange méthanoldichlorométhane (10-90 en volumes), filtration sur verre fritté, puis évaporation des solvants sous pression réduite à une température voisine de 40 C, on obtient un premier mélange de diastéréoisomères, soit 8 mg de (RS)-5-((4-chlorophényl)-{3-[(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthyl]- azétidin-1-yl}-méthyl)-pyrimidine sous forme d'une meringue jaune, et un second mélange de diastéréoisomères, soit 6 mg de (RS)-5-((4- chlorophényl)-{3-[(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-1-yl}- méthyl)-pyrimidine sous forme d'une meringue jaune.
Le premier mélange de diastéréoisomères possède les caractéristiques sont les suivantes : Spectre de R.M.N. 1H (300 MHz, CDC13, # en ppm) : (t large, J = 7 Hz : H); 2,66 (s : 3H); 3,24 (t large, J = 7 Hz : 2H); 3,41 (mt : 1 H); 3,66 (t large, J = 7 Hz : 1 H); 4,28 (d, J = 11,5 Hz : 1 H); 4,33 (s large: 1 H); 6,84 (t large, J = 9 Hz : 1 H); 6,95 (mt : 2H); de 7,25 à 7,35 (mt : 4H); 8,71 (s large : 2H); 9,08 (s large : 1 H).
Le second mélange de diastéréoisomères possède les caractéristiques sont les suivantes : Spectre de R.M.N. 1H (300 MHz, CDC13, 8 en ppm) : (t, J = 7 Hz : 1 H); 2,66 (s : 3H); 3,24 (t large, J = 7 Hz : 3,43 (mt : 1 H); 3,65 (t large, J = 7 Hz : H); 4,28 (d, J = 11,5 Hz : 1 H); 4,33 (s : 1 H); 6,85 (tt, J = 9 et 2 Hz : 1 H); 6,96 (mt : 2H); de 7,25 à 7,35 (mt : 4H); 8,69 (s : 2H); 9,06 (s : 1 H).
La 5-[bromo-(4-chlorophényl)-méthyl]-pyrimidine peut être préparé de la manière suivante : A une solution de 205 mg de (4-chlorophényl)-pyrimidin-5- yl-méthanol dans 1 cm3 de tétrachlorure de carbone et 1 cm3 de dchlorométhane, sous atmosphère inerte d'argon, à une température voisine de 0 C, on ajoute 0,36 cm3 de bromure de thionyle. Après 2,5 heures à une température voisine de 0 C, le milieu réactionnel est ramené à une température voisine de 20 C, concentré sous pression réduite, et coévaporé avec quelques cm3 de toluène. Le liquide brun obtenu est repris avec 10 cm3 de dichlorométhane, lavé avec 5 cm3 d'une solution aqueuse saturée en dithionite de sodium, puis avec de l'eau. Après décantation, la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée, et concentrée à sec sous pression réduite. On obtient ainsi 227 mg d'un liquide visqueux beige qui est repris avec un minimum de dichlorométhane et purifié par chromatographie préparative sur couche mince de silice [2 plaques préparatives Merck Kieselgel 60F254 ; 20x20 cm ; épaisseur 0,5 mm], en éluant par un mélange méthanol-dichlorométhane (2,5-97,5 en volumes).
Après élution de la zone correspondant au produit recherché par un mélange
méthanol-dichlorométhane (10-90 en volumes), filtration sur verre fritté, puis évaporation des solvants sous pression réduite à une température voisine de 40 C, on obtient 51 mg de 5-[bromo-(4-chlorophényl)-méthyl]-pyrimidine sous forme d'une meringue jaune.
Le (4-chlorophényl)-pyrimidin-5-yl-méthanol peut être préparé en opérant du manière semblable à l'exemple 83 : à une solution de 636 mg de 5bromopyrimidine, dans 10 cm3 de tétrahydrofuranne, sous atmosphère inerte d'argon, à une température voisine de -78 C, sont ajoutés goutte à goutte 2,5 cm3 de n.butyl lithium (solution 1,6 M dans l'hexane). Après 10 minutes à une température voisine de -78 C, on ajoute goutte à goutte une solution de 562 mg de 4-chlorobenzaldéhyde dans 1 cm3 de tétrahydrofuranne. Après 30 minutes d'agitation à une température voisine de -78 C, on laisse remonter lentement la température du milieu réactionnel jusqu'à une température voisine de 20 C, et on ajoute successivement 15 cm3 d'une solution aqueuse saturée en chlorure d'ammonium, 60 cm3 d'acétate d'éthyle et 10 cm3 d'eau. La phase aqueuse est extraite avec 15 cm3 d'acétate d'éthyle, les phases organiques sont rassemblées, séchées sur sulfate de magnésium, filtrées sur verre fritté, et concentrées sous pression réduite (20 mbar) à une température voisine de 44 C. L'essentiel de l'huile orange obtenue (1,09 g) est purifiée par chromatographie sur colonne de diamètre 30 mn garnie de 60 g de silice moyenne (0,063-0,200mm) à pression atmosphérique en éluant avec un gradient méthanol/dichlorométhane (0/100 à 7/93 en volumes). Les fractions ne contenant que le produit cherché sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite. On obtient ainsi 293 mg de (4-chlorophényl)-pyrimidin-5-yl-méthanol sous forme d'une huile jaune.
Exemple 85 L'ester phénolique de l'acide 4-({1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-azétidin-3- ylidene}-méthylsulfonyl-méthyl)-3,6-dihydro-2H-pyridine-1-carbothioïque peut être préparé de la façon suivante : A une solution de 0,23 g de l'ester
phénolique de l'acide 4-({1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-hydroxy-azétidin- 3-yl}-méthylsulfonyl-méthyl)-3,6-dihydro-2H-pyridine-1-carbothioïque dans 5 cm3dichlorométhane on ajoute 0,140 g de 4-diméthylamino-pyridine puis 0,042 cm3 de chlorure de méthane sulfonyle. Le mélange réactionnel est agité 20 heures à 20 C, puis dilué par 10 cm3 d'eau. Après décantation, la phase organique est successivement lavée avec 100 cm3 d'eau et 100 cm3 d'une solution saturée de NaCI, séchée sur sulfate de magnésium et concentrée à sec à 40 C sous 2,7 kPa. L'huile obtenue est triturée pendant 45 minutes dans 50 cm3 d'éther diisopropylique. Le solide formé est filtré fournissant 120 mg de l'ester phénolique de l'acide 4-({1-[bis-(4- chlorophényl)-méthyl]-azétidin-3-ylidene}-méthylsulfonyl-méthyl)-3,6-dihydro- 2H-pyridine-1-carbothioïque sous forme d'un solide beige fondant à 184 C [Spectre de R.M.N. 1H (400 MHz, CDC13, 8 en ppm) : (mf : 2H) ; (s : 3H) ; 3,90 (mf : 2H) ; 4,04 (t, J = 5,5 Hz : 1 H) ; 4,24 (mt : 3H) ; (mf : 2H) ; 4,60 (mt : 1 H) ; 5,90 (mf : 1 H) ; 7,05 à 7,50 (mt : 13H)].
L'ester phénolique de l'acide 4-({1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-hydroxy- azétidin-3-yl}-méthylsulfonyl-méthyl)-3,6-dihydro-2H-pyridine-1-carbothioïque est préparé de la façon suivante : A un mélange de 0,72 g de l'ester phénolique de l'acide 4-méthylsulfonylméthyl-3,6-dihydro-2H-pyridine-1carbothioïque et de 0,708 g de 1-[bis(4-chlorophényl)méthyl]azétidin-3-one dans 15 cm3 de tétrahydrofuranne sec refroidi sous atmosphère inerte à - 78 C on ajoute 0,52 g de tertiobutylate de potassium. Le mélange réactionnel est agité à -78 C pendant 4 heures puis on ajoute 0,354 g de 1-[bis(4chlorophényl)méthyl]azétidin-3-one. Après deux heures à -78 C, on laisse revenir la température à 20 C. Le mélange réactionnel est dilué dans 100 cm3d'eau puis le tétrahydrofuranne est évaporé sous 2,7 kPa à 40 C. La phase aqueuse est extraite par deux fois 100 cm3 d'acétate d'éthyle. Les extraits organiques sont combinés et séchés sur sulfate de magnésium, concentrés sous 2,7kPa à 40 C. Le résidu obtenu est chromatographié sur silice (200g de silice, Amicon, 20-45 m de porosité 60Angstroem, colonne
de 5 cm de diamètre) en éluant avec un mélange cyclohexane : acétate d'éthyle (6 : 4 en volume). Les fractions de Rf=11/64 (cyclohexane : acétate d'éthyle 6: 4, plaque de silice, Merck référence 1.05719, Merck KGaA, 64271 Darmstatd, Allemagne) sont réunies et concentrées sous 2,7 kPa à 40 C pour conduire à 240 mg de l'ester phénolique de l'acide 4-({1-[bis-(4- chlorophényl)-méthyl]-3-hydroxy-azétidin-3-yl}-méthylsulfonyl-méthyl)-3,6- dihydro-2H-pyridine-1-carbothioïque.
L'ester phénolique de l'acide 4-méthylsulfonylméthyl-3,6-dihydro-2H-pyridine- 1-carbothioïque peut être préparé de la façon suivante : A une solution de 1 g de 1-benzyl-4-méthylsulfonylméthyl-1,2,3,6-tétrahydro-pyridine dans 10 cm3 de dichlorométhane sous atmosphère d'argon, on ajoute 0,778 cm3 de thiochloroformiate de phényle. La solution prend instantanément une couleur ambrée très foncée. Le mélange réactionnel est agité pendant 4 heures à 21 C puis dilué dans 100 cm3 de dichlorométhane. Le milieu organique est lavé par 2 fois 50 cm3 d'eau, séché sur sulfate de magnésium et évaporé à sec à 40 C sous 2,7 kPa . Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur cartouche de silice (référence SIL-020-005, FlashPack, Jones Chromatography Limited, New Road, Hengoed, Mid Glamorgan, CF82 8AU, Royaume Uni) en éluant avec un mélange de cyclohexane : d'acétate d'éthyle 6 : 4 (10 cm3/min, fractions de 5 cm3). Les fractions de Rf=12/74 (cyclohexane : acetate d'éthyle 1 :1, plaque de silice, Merck référence 1. 05719, Merck KGaA, 64271 Darmstatd, Allemagne) sont réunies et concentrées sous 2,7 kPa à 40 C pour conduire à 700 mg de l'ester phénolique de l'acide 4-méthylsulfonylméthyl-3,6-dihydro-2H-pyridine-1carbothioïque.
La 1-benzyl-4-méthylsulfonylméthyl-1,2,3,6-tétrahydro-pyridine peut être préparé de la façon suivante : A une solution de 17,6 g de bromure de 1benzyl-4-méthylsulfonylméthyl-pyridinium dans 700 cm3 d'eau refroidie à 5 C, on ajoute goutte à goutte en une heure une solution de 5,14 g de
borohydrure de sodium et de 25 g de carbonate de sodium dans 700 cm3 d'eau en ne dépassant pas une température de 5 C dans le milieu réactionnel. Le milieu réactionnel est agité pendant quatre heures à 0 C puis on laisse revenir à température ambiante pendant la nuit. Le solide jaune formé est isolé par filtration et séché sous 2,7 kPa, fournissant 9,6 g de 1benzyl-4-méthylsulfonylméthyl-1,2,3,6-tétrahydro-pyridine ayant un Rf de 44/81 (dichlorométhane : méthanol, 95 : 5 en volumes, plaque de silice, Merck référence 1. 05719, Merck KGaA, 64271 Darmstatd, Allemagne).