INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Dans le cas d'une composition selon l'invention comprenant au moins deux composés actifs définis précédemment, chacun d'eux est présent à des doses allant d'environ 10% à 80% des doses normalement administrées dans un régime de monothérapie comme décrit ci-dessus. Lors de l'amélioration de la condition d'un patient, une dose d'entretien d'un composé, d'une composition ou d'une combinaison concernée par cette invention peut être administrée, si nécessaire. De même, la dose ou la fréquence d'administration peut être réduite en fonction des symptômes, et si ceux-ci sont circonscrits à un niveau désiré, le traitement pourrait être interrompu. De la même manière, certains patients pourraient requérir un traitement intermittent sur le long-terme jusqu'à la récurrence de l'un ou l'autre symptôme de la rétinopathie.
Les formulations pour voie générale peuvent être très variées, comprimés, gélules, poudres, solutions,
comprenant le (s) agent (s) actif (s), les excipients, masqueurs de goût, tampons, agents conservateurs, connus de l'homme du métier et pharmaceutiquement acceptables. Les formes injectables comprennent le (s) principe (s) actif (s) dans un solvant de préférence aqueux, éventuellement avec un co-solvant pouvant abaisser la constante diélectrique du milieu, contenant un couple de sels qui tamponne le pH à des valeurs proches des valeurs physiologiques (pH 7,0 -7, 4) connus de l'homme du métier, et éventuellement un agent tensio-actif augmentant la solubilité du (des) principe (s) actif (s).
Une forme d'administration toute préférée selon l'invention, consiste en une application topique ou une injection oculaire. Cette forme d'application permet de limiter les effets systémiques généraux négatifs que pourrait engendrer l'usage prolongé d'inhibiteurs de caspases administrés par voie générale. Une composition pharmaceutique pour une application topique oculaire selon l'invention peut être formulée dans un onguent (pommade, gel ou solution) convenable contenant le (les) composé (s) actif (s), dissous ou en suspension dans un véhicule.
Ainsi, à titre d'exemple, il peut s'agir de gouttes oculaires, dont les véhicules pharmaceutiquement acceptables peuvent être du chlorure de sodium isotonique (0,9%, 308 mOsm/L) ou des solutions salines isotoniques comprenant du chlorure de sodium, du chlorure de potassium, du gluconate de potassium, du chlorure de calcium, de l'acide borique, du borate ou borax de sodium, du lactate de sodium, de l'hydrogénophosphate de sodium dihydraté et du dihydrogénophosphate de sodium dodécahydraté, du sorbitol, avec ou sans agents mimant la viscosité lacrymale tels que de l'hypromellose 4000 cP, du dextran, et des agents conservateurs comme de l'édetate de sodium, du bromure de benzododécinium, du mercurothiolate sodique, du
chlorure de benzalkonium, du parahydroxybenzoate de méthyle, du métabisulfite de sodium, du borate de phénylmercure. Ces composés sont donnés à titre d'exemples non limitatifs de réalisation de l'invention.
Dans le cas d'une pommade ou d'un gel ophtalmique, des polymères variés peuvent être utilisés, comme par exemple, le carbomère 980 NF (polymère de 4. 106 Da), le sorbitol, une huile par exemple de paraffine, le monostéarate de sorbitan, le polysorbate 60, la cire de cétyl esters, la cire de cetéaryl esters, la vaseline, le méthylcellulose, une graisse. D'autres principes émulsifiants connus de l'homme du métier peuvent rentrer dans ces compositions.
Une telle composition selon l'invention comprend par exemple entre 0,01 et 10% et de préférence entre 0,01 et 4% en poids desdits inhibiteurs, afin de limiter tout risque de réactions indésirables à long terme, et un passage systémique trop important pouvant mener à l'arrêt du traitement topique. Une administration typique selon l'invention est une administration dans le cul-de-sac conjonctival, par exemple une fois et jusqu'à quatre fois par jour, avec une préférence pour une ou deux applications journalières.
Un système d'administration de drogues de type Ocusert (Friederich, 1974), formé d'un réservoir de forme ellipsoïdale en gel de polyacrylate, butylcyanoacrylate ou pluronique F127 (Desai et Blanchard, 1998) ou encore de fibrine ou collagène (Rubin et al, 1973), par exemple, contenant un ou plusieurs des composés définis précédemment, maintenu entre deux couches de copolymères (méthylcellulose 15 cP ou hydroxypropylcellulose 80-120 cP (Desai et Blanchard, 1998) ), contrôlant l'administration du ou desdits composés dans le temps, et placé dans le cul-desac conjonctival, fait aussi partie de la présente
TM invention. Un morceau d'éponge de 5x2 ou 7x4 mm (Altomed mais aussi Weck"ou Merocel) imbibé par la solution contenant les composés actifs et placé pendant quelques minutes dans le cul-de-sac conjonctival peut aussi être envisagé pour l'application topique des produits (Wilkins et al, 2000).
Les compositions selon l'invention peuvent être aussi formulées dans des émulsions, où les composés définis précédemment sont encapsulés dans des goutelettes de l'ordre du micron (liposomes), par exemple dans de l'huile ou de la lécithine de soja, la gélatine (Vandervoort et Ludwig, 1999), la viscosité de la préparation peut être augmentée par l'addition de méthylcellulose ou de carmellose de sodium (Zurowska-Pryczkowska, 1999). Les composés peuvent aussi être encapsulé dans des hydroxypropyl-ss-cyclodextrines (solution à 5%, par exemple) de concentration variable mais pouvant aller aussi bas qu'un rapport molaire de un pour un par rapport au (x) principe (s) actif (s), ce qui augmenterait leur (s) biodisponibilité (s), leur (s) stabilité (s), et leur (s) solubilité (s) (Freedman et al, 1993).
L'invention concerne aussi l'utilisation d'oligonucléotides antisens complémentaires d'une partie d'une séquence polynucléotidique choisie parmi celle codant pour une caspase, la phosphatidylcholine-phospholipase C, la sphingomyélinase acide pour la préparation d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention de la rétinopathie diabétique.
En effet, les oligodéoxynucléotides phosphorothioates antisens offrent l'opportunité de moduler l'expression génique de gènes spécifiques et sont porteurs d'un potentiel énorme pour une application clinique.
La demande de brevet PCT publiée sous le numéro WO 96/06638 rapporte l'augmentation de l'immunogénicité d'un antigène, obtenue par un simple mélange antigène/BVSM. L'antigène est là aussi associé aux particules par des liaisons ioniques et/ou hydrophobes. Pour obtenir ce résultat, on incube par exemple 1 mg de protéine GST-e4 pour 10 mg de BVSM, ce qui permet d'obtenir des taux d'association moyens de 90 % quel que soit le type de BVSM
utilisé (Prieur R. et al. Vaccine (1996) Vol 14, ? 6 pp 511-520). Il faut noter que dans cette demande l'augmentation de l'immunogénicité d'un antigène concerne l'augmentation de la réponse CD4, T helper et/ou cytotoxique. Le mécanisme d'action soutenant cette propriété concerne l'amélioration de la pénétration cellulaire notamment dans les cellules présentatrice d'antigène par la voie de l'endocytose, voie majoritairement décrite comme une voie de présentation par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité, CMH II.
La Demanderesse a maintenant découvert que les BVSM permettent d'induire, de stimuler et d'augmenter l'expansion des lymphocytes TCD8 spécifiques d'un antigène, et présentent donc un intérêt remarquable pour la préparation de vaccins thérapeutiques. On entend par induction, l'apparition de TCD8 spécifiques chez un individu naïf. On entend par stimulation, aussi désigné restimulation, l'augmentation du nombre de TCD8 spécifiques chez un individu qui de façon naturelle ou par vaccination antérieure possède déjà des TCD8. Enfin, on entend par augmentation, aussi désignée potentialisation, le cas où l'association d'un antigène avec les BVSM permet d'augmenter le nombre de ces effecteurs TCD8 par rapport au nombre obtenu avec ce même antigène libre.
On peut rappeler que la réponse immunitaire est relayée par les cellules lymphocytaires notamment les cellules B et les lymphocytes T. Ces derniers peuvent être classés en deux sous-types sur la base entre autres de leur
expression des antigènes de surface CD4 et CD8. Les cellules TCD4 sont généralement impliquées dans les fonctions helper . En particulier, ils sécrètent des cytokines qui induisent la prolifération et la maturation des autres cellules lymphocytaires. Les cellules TCD8 correspondent (majoritairement exprimés, par rapport au TCD4) aux cellules impliquées lors d'une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique dite de type CTL. En particulier une activité cytotoxique directe a été décrite pour certains lymphocytes TCD4+.
Il existe deux types de réponse immunitaire effectrice : la réponse humorale due aux anticorps et la réponse cytotoxique due majoritairement aux lymphocytes TCD8. Une réponse cytotoxique efficace requiert la présentation des antigènes aux lymphocytes T cytotoxiques CD8+ (CTL) en association avec les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité CMH de classe I, mais aussi aux lymphocytes T auxiliaires CD4+ en association avec les molécules de classe II du CMH.
Bien que les anticorps mucosaux et systémiques soient considérés comme jouant un rôle majeur dans la prévention de certaines infections, l'induction d'une immunité à médiation cellulaire, incluant l'induction d'une réponse lymphocytaire T cytotoxique (CTL) est particulièrement nécessaire pour lutter contre les pathogènes intracellulaires (virus, bactéries ou parasites) et pour le contrôle des processus tumoraux. L'induction et la régulation des CTL sont dépendantes des cytokines (IL-2,
etc) produites par la sous population Thl des cellules helper CD4.
Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) jouent un rôle critique dans la clearance des pathogènes intracellulaires aussi bien que dans le contrôle des tumeurs. Les lymphocytes TCD8 reconnaissent les fragments peptidiques, issus de la dégradation intracellulaire de l'antigène, sous forme d'un complexe avec les molécules du CMH de classe I exprimé à la surface de la cellule. Cette reconnaissance entraîne la lyse des cellules portant le complexe CMH-peptide antigénique. Les CTL génèrent également différentes lymphokines (IFN-y et TNF-a) qui peuvent en complément être directement cytolytiques.
L'induction de CTL est donc considérée comme une composante essentielle de vaccins conçus pour la prévention et le traitement de ces maladies.
Parmi les traitements actuellement proposés pour lutter contre les cancers et les infections virales chroniques, la vaccination prend une place de plus en plus importante. L'objectif d'une vaccination thérapeutique est d'induire ou de restimuler in vivo une réponse immunitaire spécifique capable de détruire des cellules infectées ou des cellules tumorales. La réponse immune des patients doit être modulée de telle sorte qu'elle devienne efficace et induise une réponse à médiation cellulaire spécifique d'antigènes exprimés par exemple par la tumeur et capable d'éliminer les cellules cancéreuses (Chestnut R. W. & al.
Design and testing of peptide-based cytotoxic T-cellmediated immunotherapeutics to treat infectious diseases
and cancers in : Vaccine design, Vol 6 (Eds Powell M. F. and Newman M. J.) Plenum Press, New York, 1995, pp. 847- 874).
L'induction, la re-stimulation et l'expansion des CTL peuvent être obtenues par différentes approches, parmi lesquelles l'immunisation avec des peptides épitopes optimaux qui vont se lier aux molécules CMH classe I et être présentés aux récepteurs spécifiques des cellules T exprimés par les cellules TCD8. Cependant cette méthode ne s'adresse qu'à un seul peptide à la fois et nécessite la connaissance des épitopes dominants pour un antigène donné.
L'inclusion de ces épitopes dans des lipopeptides est une approche alternative qui permet, en plus de l'épitope TCD8+ l'introduction d'un peptide épitope TCD4+ dans le but d'apporter une réponse T auxiliaire pouvant jouer un rôle direct dans le contrôle d'une infection par exemple (cytokines anti-virales, activité cytotoxique directe) ou d'améliorer la réponse TCD8+ CTL, comme décrit dans les demandes de brevet européen No. 491 628 et PCT No. WO 99/51 630. La synthèse chimique de tels lipopeptides est cependant complexe et coûteuse.
L'injection d'un plasmide contenant un ADN codant, un antigène contre lequel une réponse immune est attendue est une nouvelle approche qui peut induire la stimulation de réponses humorales et cellulaires. Des réponses immunes chez l'animal ont été induites avec les gènes d'une variété d'agents infectieux. On peut citer par exemple un ADN plasmidique contenant un gène codant l'hemagglutinine d'influenza (Robinson H. L. and al.
Les différentes préparations ont ensuite été dessalées sur des colonnes PD-10 (2,5 ml des préparations sont filtrés et récupérés dans 3,5 ml de DMEM).
3) Dosage des protéines par coloration au noir amide sur membrane de nitrocellulose.
Les protéines sont dosées selon la méthode décrite par Schaffner & Weissmann (1973). Les échantillons à doser contenant les protéines sont complétés à 270 pi avec du PBS avant d'ajouter 30 pi de tampon Tris-HCl (1 M, pH 7,5) contenant 1% de SDS, puis 60 pi d'acide trichloroacétique à 60%. Ces solutions sont"vortexées", laissées 2 min à température ambiante pour la précipitation des protéines et filtrées chacune au niveau d'un repère préalablement noté, sur un filtre de nitrocellulose de 0,45 um, mouillé au TCA 6%. Une gamme étalon avec 0 à 27 ug de BSA est réalisée parallèlement. Tous les filtres sont ensuite immergés quelques minutes dans une solution de noir amide à 0,1% (w/v, dans méthanol : acide acétique : eau, 45 : 10 : 45, v/v/v). Les filtres sont alors rincés dans un bain d'eau puis dans la solution de décoloration (méthanol : acide acétique : eau, 90 : 2 : 8, v/v/v) jusqu'à ce que la membrane soit complètement blanche excepté au niveau des dépôts de protéines. Le filtre est séché, les dépôts sont découpés et le colorant fixé sur les protéines est élué par 1 ml de la solution d'élution (éthanol : eau : NaOH : EDTA, 100 : 100 : 0,1 : 1,9, v/v/w/w) (environ 10 min en"vortexant"régulièrement). La lecture se fait sur 300 pi de ces solutions (plaque 96 puits) à 620 nm et la quantification est réalisée grâce au logiciel Biolise.
4) Evaluation immunocytochimique de l'apoptose dans les péricytes cultivés en présence d'AGE.
L'apoptose est détectée et quantifiée dans les péricytes cultivés pendant deux passages avec 2 uM d'AGEméthylglyoxal ou de son contrôle en utilisant la technique de détection des cellules apoptotiques par l'annexine V et nécrotiques par l'iodure de propidium.
Coloration à l'annexine V :
La présence de phosphatidylsérine (PS) sur le feuillet externe de la membrane plasmique, caractéristique des cellules apoptotiques, peut être détectée grâce à l'annexine-V marquée à la fluorescéine. Cette protéine a en effet une très forte affinité pour la PS. Afin de distinguer les cellules apoptotiques des éventuelles cellules nécrotiques qui fixent également l'annexine-V, cette coloration est effectuée en présence d'un agent intercalant et colorant de l'ADN, l'iodure de propidium, similaire au bromure d'éthydium. Pour ce marquage, les péricytes doivent être sous-confluents (75% de confluence) et n'ont donc été cultivés que 12 jours environ avec les AGE-méthylglyoxal ou BSA-contrôle.
Les BRP (boîte de 3,5 cm de diamètre) sont rincés trois fois avec du PBS puis incubés pendant 10 min dans le noir avec 500 pi d'un tampon HEPES contenant 10 pi de la solution d'annexine-V marquée à la fluorescéine et 10 pi de la solution d'iodure de propidium fournies dans la trousse de dosage. Les cellules apoptotiques ainsi que les cellules nécrotiques ont fixé l'annexine-V et apparaissent donc vertes sous le microscope à fluorescence, mais seul le noyau des cellules nécrotiques est coloré en rouge par l'iodure de propidium. Le pourcentage de cellules nécrotiques et de cellules apoptotiques est déterminé sur 10 champs différents, soit sur 300 à 800 cellules au total.
5) Dosage des céramides et diacylglycérols (DAG).
Les céramides et les diacylglycérols sont mesurés, dans les péricytes cultivés pendant deux passages avec 2 uM d'AGE-méthylgIyoxal ou leur contrôle, selon la méthode décrite par Preiss et al. (1986). Cette méthode est basée sur la phosphorylation des céramides et des DAG par la diacylglycérol kinase (DAG-kinase) purifiée à partir
d'Echerischia coli en présence d'ATP marqué au 32p sur le phosphore y, selon le schéma représenté à la figure 3 en annexe.
Les péricytes (2 ou 3 boîtes de 6 cm de diamètre) sont rincés, récupérés par grattage au rubber policeman dans 0,5 ml d'eau sur glace et la boîte rincée par 0,5 ml supplémentaire (volume de 1 ml de suspension cellulaire) auquel sont ajoutés 10 ul d'une solution de [9, 10-3H]-triacylglycérol à 0, 5 pCi/ml.
5.1) Extraction des lipides totaux.
Les lipides totaux sont ensuite extraits par la méthode de Bligh and Dyer (1959). A cette suspension cellulaire (1 ml de PBS) sont ajoutés 3.75 ml d'un mélange chloroforme : méthanol (2 : 1, v/v) contenant 80 pi de BHT (5 mM) en solution dans l'éthanol. Les solutions sont ensuite "vortexées"30 sec et maintenues au repos 30 min minimum, puis 1, 25 ml de NaCl (0. 9%) et 1, 25 ml de chloroforme sont ajoutés pour séparer les phases. Après centrifugation (700 g, 5 min), la phase organique inférieure est prélevée et l'extraction de la phase aqueuse est répétée deux fois avec 1,5 ml de chloroforme. Les extraits lipidiques sont alors rassemblés et le chloroforme est évaporé sous courant d'azote. La phase aqueuse permet de doser les protéines totales par coloration au noir amide et la phase organique, est récupérée dans un tube Eppendorff puis évaporée sous azote.
5.2) Phosphorylation à la DAG kinase.
Une gamme étalon de céramides (25 à 2500 ng) et de DAG (25 à 25000 ng) contenant la même quantité de triacylglycérol marqué au tritium est réalisée en parallèle. Les lipides sont ensuite solubilisés dans 20 pi d'une solution de détergents (7,5% de n- octylglucopyranoside, 5 mM de cardiolipine et 1 mM de
Le dispositif de la figure 1 comprend aussi des moyens électroniques 18 de traitement des signaux fournis par les moyens de démodulation 16.
Ces moyens 18 comprennent par exemple une bascule (ou un trigger ) reliée à une ampoule (ou à une diode électroluminescente ou DEL) pour fournir un signal lorsque le niveau de l'axe Y est atteint par le liquide conducteur 2.
Le signal fourni par les moyens 18 est donc envoyé à des moyens de signalisation 20 (par exemple ampoule ou DEL) prévus pour fournir une alarme visuelle lorsque le niveau de l'axe Y est atteint.
En variante les moyens 18 sont reliés à des moyens de signalisation aptes à fournir une alarme sonore lorsque ce niveau est atteint.
L'exemple de l'invention, qui est schématiquement représenté sur la figure 2, est appliqué à un verre fondu 22 dont la résistivité électrique est comprise entre 0, 001 Q. m et 1 Q. m. Ce verre fondu est chauffé par induction directe dans un creuset froid 24 dont l'axe, qui est vertical, est noté x.
Ce creuset froid est sectorisé ; il est formé de tubes (non représentés) métalliques, par exemple en acier inoxydable, qui sont juxtaposés et électriquement isolés les uns des autres.
On voit sur la figure 2 la sole 28 qui constitue le fond du creuset. Cette sole 28 et le reste
du creuset 24 sont refroidis grâce à des moyens de circulation d'eau 30.
On voit aussi sur la figure 2 un inducteur 32, alimenté par une source de courant alternatif 34 et prévu pour chauffer le verre. Cet inducteur entoure le creuset 24 et l'axe de l'inducteur est aussi l'axe x.
La sectorisation du creuset le rend sensiblement transparent au champ magnétique engendré par l'inducteur 32.
On voit aussi, sur la figure 2, une buse de coulée 36 prévue pour la récupération du verre-fondu lorsque les moyens d'obturation 38 dont est munie la buse de coulée sont escamotés.
On voit en outre : - une mince couche 40 de verre figé, d'épaisseur comprise entre 5 mm et 10 mm, qui sépare le verre fondu du métal froid de la paroi interne du creuset, et - une couche 42 qui se trouve au-dessus du bain fondu et qui est formée de verre en cours de fusion.
La flèche 44 symbolise le remplissage du creuset et les flèches 46 symbolisent des mouvements de convection dans le verre fondu 22.
Les références 48 et 50 de la figure 2 désignent respectivement le niveau (horizontal) haut et le niveau (horizontal) bas de verre fondu dans le creuset. Une fois la fusion amorcée, il faut en effet veiller, lors des coulées, à garder un niveau de bain minimum pour que la fusion ne se désamorce pas.
Le dispositif conforme à l'invention de la figure 2 est destiné à détecter ces niveaux bas et
haut, mais peut être également destiné au suivi de l'évolution du niveau du matériau durant les opérations de remplissage et de vidage.
Les composés antagonistes de la protéine ESM-1 selon l'invention englobent ainsi un polynucléotide antisens capable de s'hybrider spécifiquement à une région déterminée du gène codant pour la protéine ESM-1 et capable d'inhiber ou de bloquer sa transcription et/ou sa traduction.
La séquence du gène humain ESM-1 est référencée sous le numéro d'accès AJ401 1091 et AJ401 1092 dans la base de données Genbank.
De préférence, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence complémentaire d'une séquence localisée dans la région de l'extrémité 5'de l'ADN du gène ESM-1, et de manière tout à fait préférée la proximité du codon d'initiation de la traduction (ATG) du gène ESM-1.
Selon un second mode de réalisation préférentiel, un polynucléotide antisens selon l'invention comprend une séquence complémentaire à l'une des séquences localisées au niveau des jonctions exon/intron du gène ESM-1 et de manière préférée des séquences correspondant à un site d'épissage.
Un polynucléotide antisens préféré selon l'invention comprend au moins 15 nucléotides consécutifs de l'ADNc codant pour ESM-1 ayant la séquence nucléotidique SEQ ID ? 2.
Aux fins de la présente invention, un premier polynucléotide est considéré comme étant complémentaire d'un second polynucléotide lorsque chaque base du premier nucléotide est appariée à la base complémentaire du second polynucléotide dont l'orientation est inversée.
Les bases complémentaires sont A et T (ou A et U), et C et G.
De manière générale, un polynucléotide antisens selon l'invention possède au moins 20,25, 30,35, 40,50, 75,100, 150,200, 300,400, 500, 1000 ou 2000 nucléotides consécutifs de l'ADNc de ESM-1 de séquence SEQ ID ? 2.
A titre illustratif, un polynucléotide antisens préféré selon l'invention consiste en un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique de l'ADNc de ESM-1 de séquence SEQ ID N 2.
Un polynucléotide antisens constituant un composé antagoniste de la protéine ESM-1 selon l'invention peut être préparé par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzyme de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen n EP-0 707 592.
De manière générale, les polynucléotides antisens doivent avoir une longueur et une température de fusion suffisante pour permettre la formation d'un hybride duplex intracellulaire ayant une stabilité suffisante pour inhiber l'expression de l'ARNm de ESM-1. Des stratégies pour construire les polynucléotides antisens sont notamment décrites par GREEN et al. (1986) et IZANT et WEINTRAUB (1984).
Des méthodes de construction de polynucléotides antisens sont également décrites par ROSSI et al (1991) ainsi que dans les demandes PCT NOWO 947/23. 026, WO 95/04141, WO 92/L18. 522 et dans la demande de brevet européen n EP 0 572 287.
D'autres méthodes de mise en oeuvre de polynucléotides antisens sont par exemple celles décrites par SCZAKIEL et al. (1995) ou encore celles décrites dans la demande PCT N WO 95/24.223.