INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Certains matériaux utilisés, soit pour la tige, soit pour la doublure, sont réalisés en matériaux multicouches 16. Cela permet d'associer à un matériau 14, de type mousse tel que décrit précédemment, au moins une couche externe 70, 71, qui différé de part sa propriété du matériau 14. Le matériau 14 de la tige pourra être avantageusement associé à une couche externe 70, positionnée à l'extérieur du chausson, qui possède une bonne résistance à l'abrasion comme des textiles de type polyamide ou polyuréthane. De même, le matériau 14 de la doublure pourra être avantageusement associé à une couche externe 71, positionnée à l'intérieur du chausson, qui procure un contact agréable pour la peau, qui soit antiallergique.
Le matériau multicouche 16 précédemment décrit peut être obtenu à la fabrication, au niveau de la stratification, par des moyens mécaniques 72 qui résistent au décollement dans le fluide chaud lavage. Ces moyens mécaniques 72 sont conformes à ceux précédemment décrits, et notamment par flammage sous réserve de compatibilité entre les matières à assembler. effet, cette compatibilité entre matière permet l'établissement spontané et naturel des liaisons chimiques au niveau moléculaire comme précédemment décrit.
Un autre mode de réalisation, non illustré, consiste à utiliser un procédé bi-injection pour fixer l'élément de calage à la face interne de la tige. C'est-à-dire que le matériau constitutif de l'élément calage est injecté, dans un moule, de façon quasi-simultané avec le matériau constituant la tige. Les deux matériaux, compatibles chimiquement, sont intimement mélangés au niveau du contact, car ils sont en fusion. L'accroche mécanique obtenue au moment du refroidissement est renforcée par l'établissement de liaisons chimiques naturelles fait de la compatibilité chimique des deux matériaux.
On peut également utiliser un procédé de sur-injection. Le matériau constitutif l'élément de calage est injecté sur le matériau de la tige qui a plus ou moins refroidi. Au contact du matériau injecté, qui est chaud, le matériau de la tige fond localement, au niveau la zone de contact, ce qui assure une accroche mécanique par mélange localement des deux matières. Cette accroche est ensuite renforcée par des liaisons chimiques moléculaires naturelles du fait de la compatibilité chimique des deux matériaux.
Les figures 6a, 6b, 6c illustrent des variantes de construction, relatives au premier mode de réalisation, qui précisent différents moyens permettant de fixer par couture l'élément de calage 20 à la tige 0 sans endommager ledit élément de calage 20. En effet, si l'élément calage 20 est réalisé en matériau mécaniquement peu résistant, la couture 3 risque à plus ou moins long terme de cisailler l'élément de calage 20 qui alors au lavage se décollera de la tige 0. Les coutures 3 illustrées aux figures 6a, 6b correspondent aux coutures 3x, 3y, 3z précédemment référencées.
Des moyens de repérage auxiliaires peuvent être placés à proximité du faisceau de motifs pour faciliter ou améliorer un alignement ultérieur. Cette réalisation intervient avantageusement pendant l'étape de gravure anisotrope du faisceau de motifs gravés.
Pour obtenir une bonne précision du repérage, les moyens de repérage auxiliaires peuvent comporter un ou plusieurs ensembles de marques en forme d'échelles graduées.
Plus particulièrement, un ensemble de marques peut prendre la forme d'une portion de rapporteur.
Il est préférable qu'au moins une marque-et qu'au moins un rayon du faisceau de motifs soient dans le prolongement radial l'un de l'autre.
Avantageusement les marques d'un ensemble peuvent être disposées en arc de cercle et couvrir un secteur angulaire plus important que celui du faisceau de motifs, le centre du secteur angulaire des marques de l'ensemble étant confondu avec celui du faisceau de motifs.
On peut envisager que l'étape de réalisation des moyens de repérage auxiliaires ait lieu après l'étape de révélation de la direction cristalline. Les moyens de repérage auxiliaires pourraient prendre la forme d'une ou plusieurs marques réalisées selon la direction cristalline révélée.
La direction cristalline repérée par le procédé de l'invention peut être utilisée pour effectuer un alignement avec un autre matériau cristallin. Cet alignement peut conduire à la mise en coïncidence des deux directions cristallines ou à un décalage relatif rendu très précis grâce aux moyens de repérage auxiliaires. On peut aussi utiliser cette direction lors d'un positionnement d'un masque de photolithographie sur le matériau cristallin.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui suit, illustrée par les figures des dessins annexés. Cette description est donnée à titre illustratif et non limitatif.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La figure 1 illustre un procédé de repérage, selon l'art antérieur, d'une direction cristalline d'un matériau cristallin.
La figure 2 montre un motif gravé et l'ouverture d'un masque qui l'a généré.
Les figures 3A et 3B montrent respectivement un masque avec un faisceau d'ouvertures circulaire et le faisceau de motifs gravés obtenu à travers le masque avec le procédé objet de l'invention.
Les figures 4A et 4B montrent respectivement un masque utilisable pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention et une vue partielle du faisceau de motifs gravés et des moyens de repérage.
Les figures 5A à 5E sont des coupes d'une plaquette de silicium sur isolant au cours du procédé de repérage selon l'invention.
Les figures 6A à 6D sont des coupes d'une plaquette de silicium au cours du procédé de repérage selon l'invention La figure 7 montre deux plaquettes à assembler l'une à l'autre, une direction cristalline ayant été repérée au niveau de chacune d'entre elles par le procédé selon l'invention.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS On se réfère à la figure 2 qui va permettre d'expliquer le principe de la gravure anisotrope dans un matériau cristallin. Cette gravure anisotrope est caractérisée par le fait qu'elle ne se fait pas à la même vitesse dans toutes les directions cristallines du matériau cristallin. Par exemple pour le silicium, la direction cristalline correspond à la vitesse de gravure par KOH la plus lente, vient ensuite la direction .
En particulier, pour une surface de silicium orientée , c'est la direction , intersection des plans avec les plans qui se surgrave le plus lentement, vient ensuite la direction , intersection des plans avec les plans .
De manière préférée, l'étape de dissociation se fait en deux temps ; une première incubation en présence de collagénase et une deuxième incubation en présence de trypsine. Lorsque la libérase est utilisée, des concentrations d'utilisation dans l'éminçat particulièrement efficaces se situent entre 0. 05 à 2 mg/ml. Le temps d'incubation à 37 C pour de telles concentrations étant choisi alors dans une gamme de temps s'étalant de 15 minutes à 2 heures.
Après neutralisation de l'activité enzymatique, par addition de sérum de veau foetal, de sérum humain autologue, ou de sérum humain allologue provenant d'un groupe compatible, le produit de digestion est ensuite filtré sur tamis, sous pression de la gravité afin d'éliminer les fibres non dissociées et recueillir les cellules décollées des fibres musculaires. De manière préférée, une étape de filtration sera réalisée en deux temps : Une étape de filtration sur un tamis de 100 m, puis une seconde étape sur un tamis de 40 m.
Les cellules recueillies après filtration sont transvasées dans un réacteur de culture en présence d'un milieu dont la composition permet leur croissance ou/et leur différenciation. La composition du milieu est choisie en fonction du type cellulaire dominant souhaité en fin de culture. Les milieux de culture utilisés contiennent un ou plusieurs facteurs de croissance et/ou de différenciation dont le rôle est de diriger les cellules progénitrices vers une voie de différenciation spécifique et de les faire
proliférer. A titre d'exemple de facteurs de croissance, on peut citer les facteurs de croissance des fibroblastes, bFGF, aFGF, FGF6, le facteur de croissance des hépatocytes, HGF/SF, de l'épiderme, EGF et les différents facteurs caractérisés tels IGF-1, PDGF, LIF, VEGF, SCF, TGFb, TNFa, IL- 6, IL-15, NGF, la neuréguline, la thrombopoïétine et l'hormone de croissance. On peut les associer à différentes hormones ou molécules actives qui peuvent entrer dans la composition des milieux, telles que les glucocorticoïdes (naturels ou hémi-synthétiques, i.e. l'hydrocortisone, la dexaméthasone, la prednisolone ou la triamcinolone), les progéstagènes et dérivés (progestérone), les oestrogènes et dérivés (oestradiol), les androgène et dérivés (testostérone), les minéralocarticoïdes et dérivés (aldostérone), les hormones LH, LH-RH, FSH et TSH, les hormones thyroïdiennes T3, T4, l'acide rétinoïque et ses dérivés, la calcitonine, les prostaglandines E2 et F2/alpha ou l'hormone parathyroïdienne.
Les cellules sont ensuite mises en culture dans un réacteur adapté pour la culture de cellules adhérentes. Afin de s'affranchir des contraintes de contrôles de la vitesse d'agitation, de sa régularité et de l'homogénéité des préparations, le réacteur de culture est de préférence statique. Il doit présenter une grande surface de culture par rapport aux supports classiques (boites de Pétri, flasques) de manière à récolter en quelques jours une population cellulaire importante. Un exemple d'un tel réacteur de culture est le dispositif de culture en plateaux (simple, double et/ou multi- étagé).
Le dispositif de culture utilisé dans le procédé permet de plus l'échantillonnage des cellules de manière stérile afin de réaliser les prélèvements nécessaires à l'identification des types cellulaires présents aux différents stades de la culture par analyse de marqueurs spécifiques. Il permet la vidange des milieux, le lavage et le décollement des cellules et enfin leur récolte de manière stérile.
De manière préférée, des poches sont utilisées et des tubulures stériles spécialement adaptées relient les poches au réacteur pour permettre les transvasements des milieux ou la récolte des cellules. Ce dispositif permet ainsi de réaliser un grand nombre d'opérations en système clos. Selon la population cellulaire souhaitée, le nombre de jours de culture varie de 0 à 30 jours.
La culture peut néanmoins être poursuivie par des techniques classiques d'expansion ou de perfusion pendant une durée pouvant atteindre plusieurs mois.
Afin d'augmenter le nombre de cellules récoltées, une ou plusieurs phases d'expansion sont possibles. Les phases d'expansion comprennent une étape de décollement des cellules, de lavage des cellules et de remise en culture sur une plus grande surface de culture, les solutions et enzymes utilisées pour réaliser ces étapes étant bien connues de l'homme du métier.
Une cinétique de différenciation est réalisée dans le procédé de l'invention par l'identification des types cellulaires présents dans les populations de cellules obtenues aux différents stades de la culture, Cette identification est réalisée à partir d'échantillons prélevés lors de la mise en culture, au cours de la culture et lors de la récolte des cellules. La caractérisation des populations cellulaires peut aussi porter sur une culture de cellules réalisée en parallèle à plus petite échelle mais dans des conditions identiques ou équivalentes en terme de milieu de culture, de dispositif et de procédé de réalisation des phases d'expansion. La caractérisation des populations cellulaires porte sur les cellules adhérentes ou les cellules présentes dans le surnageant. Les différents stades de la culture sont comptés en jours à partir du jour de mise en culture en réacteur jusqu'à l'apparition des premières cellules différenciées ou l'obtention d'un degré de confluence des cellules d'au moins 60%. La caractérisation des populations de cellules a pour fonction l'identification de
l'ensemble des types cellulaires et de leurs proportions en fonction du stade de la culture. Elle permet en particulier de mettre en évidence les types cellulaires dominants en fonction du stade de la culture. Le procédé de l'invention propose ainsi un moyen de choisir une population cellulaire en fonction des caractéristiques des différents types cellulaires présents dans la population et de l'objectif de thérapie cellulaire recherché.
Cette caractérisation est réalisée par l'analyse de marqueurs cellulaires par cytofluorimétrie de flux ou FACS, après marquage des antigènes de surfaces ou de tout antigène spécifique des différents types cellulaires à analyser. Dans le présent texte, le terme marqueurs cellulaires indique tout antigène cellulaire permettant d'apporter des informations à lui seul ou en combinaison avec d'autres marqueurs sur un type cellulaire. Tout type de marqueur cellulaire peut être utilisé par le procédé, le choix des marqueurs utilisés sera guidé par le choix des types cellulaires que l'on souhaite caractériser.
Toute technique apte à caractériser un antigène cellulaire peut être mise en oeuvre dans le procédé de l'invention. On peut citer à titre d'exemple sans être limitatif, le Western Blot ou l'immunocytochimie. Les techniques permettant la caractérisation des ARN messagers codant lesdits antigènes sont utilisables de manière équivalente.
Dans un mode de réalisation de l'invention, les marqueurs cellulaires analysés pour l'identification des types cellulaires sont spécifiquement choisis parmi les marqueurs suivants : CD10, CD13, CD15, CD16, CD34, CD38, CD40, CD44, CD45, CD56, CD71, CD80, CD117 ou encore les structures suivantes, CD138, HLA-Classe I, HLA-classe II, VLA3, VLA5, VLA6, ICAM-1, VCAM et la desmine. De manière préférée, les marqueurs CD10, CD13, CD15, CD34, CD44, CD56 et CD117 et la desmine sont utilisés. La présence de ces marqueurs est identifiée par l'utilisation d'anticorps monoclonaux spécifiques. Le tableau 1, ci-après fourni dans la
partie expérimentale, indique, pour chacun des marqueurs, les types cellulaires exprimant classiquement les antigènes correspondants. Il est à noter que ces marqueurs cellulaires ont été développés initialement pour la caractérisation du système immuno-hématologique. Une originalité de l'invention consiste en l'utilisation de ces marqueurs pour la caractérisation des cellules d'origine musculaire aux différentes étapes de la culture ou de l'expansion.
Le procédé de l'invention est donc mis en #uvre grâce à l'analyse de marqueurs cellulaires non classiquement utilisés dans la caractérisation des cellules issues de tissus musculaires. Ces marqueurs cellulaires sont par exemple CD10, CD13, CD15, CD34, CD44, CD45 et CD117.
Le surnageant est éliminé par aspiration. Le culot est ensuite repris dans 10 ml de milieu C. 100 l de volume est prélevé pour comptage. Une
aliquote est réservée pour estimation de la viabilité par cytofluorimétrie (iodure de propidium).
A. 2.3 Mise en culture des cellules et phases d'expansion des cultures Après déconditionnement, les cellules sont transvasées dans le dispositif de culture. Le dispositif de culture est un plateau de culture (Nunc Single Tray) d'une surface de 600 cm2. Le remplissage du plateau se fait par un orifice prévu à cet effet et obturé par un bouchon stérile à usage unique. Les cultures sont incubées à 37 C dans une enceinte saturée en humidité en atmosphère contrôlée air-C02 (95%-5%).
Le lendemain de la mise en culture, un premier lavage est réalisé afin d'éliminer les cellules mortes et les débris musculaires. Une poche vide est connectée à l'un des deux orifices du dispositif de culture. Une poche contenant la solution D est connectée de la même façon à l'autre orifice. Le milieu est éliminé par gravité et remplacé par 50 ml de solution D. Le flacon est rincé par agitation manuelle douce. Le milieu est de nouveau éliminé par gravité. La poche contenant le milieu D est remplacée par une poche contenant 120 ml de milieu C qui sont ajoutés à la culture. Le milieu C est renouvelé au bout de 120 heures. L'expansion est décidée lorsque le degré de confluence des cellules atteint 60% à 70% ou lorsque les premiers myotubes apparaissent (environ 8 jours après la mise en culture).
Après vidange du milieu, les cellules sont lavées par agitation manuelle douce à l'aide de 50 ml de solution D. La solution D est vidangée puis 20 ml de solution de trypsine irradiée (0. 25%) sont ajoutés. Le flacon est mis à incuber 5 minutes à 37 C. Les cellules sont récoltées dans une poche de 40 ml. L'action de la trypsine est neutralisée par l'addition de 10% de sérum de veau foetal. Le sérum est injecté à l'intérieur de la poche à l'aide d'une seringue. Les cellules sont centrifugées. Le surnageant est éliminé par
transvasement dans une autre poche de vidange, reliée par un connecteur stérile. Le culot est remis en suspension dans 30 ml de milieu C pour lavage des cellules puis les cellules sont centrifugées. Le surnageant est éliminé par transvasement dans une autre poche de vidange, reliée par un connecteur stérile. Le culot cellulaire est resuspendu dans 20 ml de milieu C. Un aliquot est prélevé pour numération et analyse des populations. La viabilité est estimée à l'aide d'un cytofluorimètre. Les cellules sont ensuite transférées dans une poche contenant 500 ml de milieu C, puis ensemencées dans deux unités double-plateaux (double-tray de Nunc) d'une surface totale de 1200 cm2. Les cellules sont mises à incuber Une troisième expansion est décidée lorsque le degré de confluence des cellules atteint 60% à 70% ou lorsque les premiers myotubes apparaissent.
Pour cette série d'expansions, les boîtes multi-étagées de 10 plateaux (multi-tray de Nunc) sont utilisées. Après vidange du milieu, les cellules sont lavées à l'aide de 100 ml de solution D. Le décollement de la couche cellulaire et la dissociation enzymatique des cellules sont réalisés après vidange de la solution de lavage par l'addition de 50 ml de trypsine irradiée (0. 25%) dans chaque plateau. Les préparations sont mises à incuber 5 minutes à 37 C. Les cellules sont récoltées dans une poche stérile de 500 ml. L'action de la trypsine est neutralisée par l'addition de 10% en volume de sérum de veau foetal ou de sérum autologue. Les cellules sont centrifugées et le surnageant est éliminé par connexion à une poche de vidange.
Le culot cellulaire est resuspendu dans 50 ml de milieu C puis transféré dans un flacon contenant 1200 ml de milieu C par un connecteur stérile.
Une boîte de culture de 10 plateaux multi-étagés (multi-tray de Nunc) est ensemencée avec 1100 ml de la préparation cellulaire. Le contrôle visuel de la croissance en plateaux multi-étagés est impossible. Par conséquent, une boite de culture Nunc stérile simple plateau (single-tray) est ensemencée aussi avec 110 ml de la préparation cellulaire. Ce dernier
plateau permet un contrôle visuel quotidien de la culture et de l'état de confluence des cellules. Les cellules sont ensuite mises à incuber. La culture dure de 3 à 5 jours. La veille de la récolte des cellules, le milieu est éliminé par vidange dans une poche stérile et remplacé par un volume équivalent de milieu E. La récolte finale est décidée lorsque le degré de confluence des cellules atteint 90% ou lorsque les premiers myotubes apparaissent.
A. 2.4 identification des types cellulaires présents aux différents stades de la culture par l'analyse de marqueurs cellulaires spécifiques La caractérisation est basée sur l'analyse par cytofluorimétrie de flux (FACS). Des anticorps dirigés contre les antigènes humains de surface cellulaire suivants ont été utilisés : CD5, CD10, CD11, CD13, CD14, CD15, CD16, CD18, CD19, CD20, CD28, CD31, CD34, CD38, CD40, CD40- ligand, CD44, CD45, CD56, CD62, CD71, CD80, CD86, CD90, CD105, CD117, CD138. Des anticorps dirigés contre les structures antigéniques suivantes ont aussi été utilisés: CD138, HLA-Classe I, HLA-DR, ELAM, ICAM, LECAM, Stro-1, S-endo-1, VCAM, VLA2, VLA3, VLA4, VLA5, VLA6.
L'analyse de l'expression de la desmine, protéine intracellulaire est réalisée de la manière suivante : Après mise en suspension dans du PBS, les cellules sont fixées et perméabilisées par l'addition de 10 volumes de méthanol à 4 C pendant 5 minutes, puis centrifugées. Après lavage du méthanol résiduel et centrifugation, les cellules sont reprises dans du PBS contenant l'anticorps dirigé contre la desmine (Dako, clone D33, 1/100) et incubées durant 15 minutes. Après lavage et centrifugation, les cellules sont incubées durant 15 minutes en présence de l'anticorps secondaire dirigé contre l'anticorps primaire, couplé à un fluorophore. Après lavage et centrifugation, les
cellules sont analysées par FACS. Le tableau 1 ci-après présente les caractéristiques des marqueurs principaux utilisés et les types cellulaires correspondants (types cellulaires).
CARACTERISTIQUES CLASSIQUES DES MARQUEURS UTILISES
MARQUEUR TYPES CELLULAIRES CD10 lymphocytes préB neutrophiles CD13 monocytes, cellules myéloides CD15 monocytes, macrophages, granulocytes, éosinophiles CD16 NK, sous pop lymphocytes T, neutrophiles CD34 progéniteurs CD38 LT activités, cellule souche, sous pop. L T,B,NK CD40 lymphocytes T CD4+ activés CD44 Anti HCAM CD45 leucocytes CD56 NK, sous pop Lymphocytes T CD71 cellules proliférantes CD117 progéniteurs HLA CL1 antigène MHC classe 1 HLA CL2 antigène MHC classe 2 VLA3 lymphocytes B VLA5 lymphocytes T mémoire, monocytes, plaquettes VLA6 thymocytes, lymphocytes T mémoire, monocytes DESMINE cellules musculaires Tableau 1 : Présentation de certains marqueurs cellulaires utilisés dans le procédé et les types cellulaires les exprimant.
L'analyse des populations cellulaires est réalisée aux différents stades de culture .
A cet effet, la feuille supérieure 18 subit un traitement adapté en ligne, lors de la fabrication de la couche 1, ou bien chez le fournisseur. En outre, cette feuille peut posséder des propriétés cosmétiques et/ou dermatologiques.
Elle peut notamment recevoir une lotion cosmétique afin d'éviter que la peau de l'utilisateur subisse des irritations.
La feuille inférieure 19 est également réalisée dans un matériau non-tissé hydrophobe et comporte dans la partie 20 en regard du matelas absorbant 17 un film en matériau plastique qui est imperméable aux liquides et qui est rapporté sur le matériau non-tissé. En variante, le film en matériau plastique s'étend sur toute la surface de la feuille inférieure 19.
Par ailleurs, la portion élastifiée 15 des deuxièmes volets 6 est située à l'opposé de la partie de fixation 14, au niveau de l'extrémité libre dudit volet qui s'étend jusqu'au dessus du matelas absorbant 17. La portion élastifiée des deuxièmes volets 6 comprend au moins un élastique 28 et de préférence deux ou trois.
Ces élastiques 28 sont emprisonnés dans un retour 29 situé au niveau de l'extrémité libre des deuxièmes volets 6. Le retour 29 est obtenu par pliage du matériau non-tissé et s'étend sur la majeure partie de la longueur de la couche 1. Les élastiques 28 sont également de section transversale circulaire ou rectrangulaire et sont fixés à l'état tendu.
En variante, le retour 29 s'étend sur toute la hauteur des deuxièmes volets 6, jusqu'au niveau de la partie de fixation 14 de ces volets.
Dans encore une autre variante, les élastiques 28 sont pris en sandwich entre le matériau non-tissé de base des deuxièmes volets 6 et un matériau non-tissé supplémentaire qui est rapporté et solidarisé avec le matériau nontissé de base.
Comme le montre plus particulièrement la figure 3, les volets 5 et 6 sont solidarisés sur toute leur surface avec la feuille supérieure 18 dans les parties avant 22 et arrière 23 de la couche 1. Ainsi, les volets 5 et 6 ne peuvent pas être écartés de la feuille supérieure 18 dans les parties avant 22 et arrière 23.
Par ailleurs, des attaches 30 sont fixées dans les parties latérales 3,4, au niveau de l'extrémité arrière 23. Ces attaches portent par exemple des crochets aptes à coopérer avec des boucles portées par une bande (non