INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Ce mode de réalisation peut permettre de détecter à la fois les ligands de la protéine intervenant au cours de la transcription, ceux de l'ARN polymérase et également ceux du complexe formé entre ladite protéine et l'ARN polymérase. Ce mode de réalisation est très stringent pour les molécules qui inhibent l'association entre l'ARN polymérase et ladite protéine et peut également permettre de rechercher des composés qui dissocient le complexe formé entre l'ARN polymérase et ladite protéine.
Un procédé de détection avantageux de l'invention est un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel on ajoute le composé soumis au procédé de détection préalablement incubé avec la protéine intervenant au cours de la transcription à l'ARN polymérase déposée sur un support.
Ce mode de réalisation peut permettre de détecter à la fois les ligands de la protéine intervenant au cours de la transcription, ceux de l'ARN polymérase et également ceux du complexe formé entre ladite protéine et l'ARN polymérase. Ce mode de réalisation peut faciliter ainsi la liaison dudit composé avec ladite protéine avant
l'incubation avec l'ARN polymérase et permet de rechercher des ligands de ladite protéine. Il peut servir à sélectionner les meilleurs ligands de l'ARN polymérase qui sont, dans ce cas, cinétiquement désavantagés.
Un procédé de détection avantageux est un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel on ajoute l'un après l'autre le composé soumis au procédé de détection et l'ARN polymérase à la protéine intervenant au cours de la transcription déposée sur un support.
Le dépôt de la protéine intervenant au cours de la transcription sur un support puis l'addition successive du composé soumis au procédé de détection et l'ARN polymérase, peut permettre de détecter les composés inhibant uniquement la protéine intervenant au cours de la transcription. En effet, si le composé tel que défini ci-dessus ne se fixe pas sur la protéine telle que définie ci-dessus, il est éliminé lors du lavage qui a eu lieu avant l'addition de l'ARN polymérase.
Un procédé de détection avantageux est un procédé tel que défini ci-dessus, dans lequel on ajoute l'un après l'autre le composé soumis au procédé de détection et la protéine intervenant au cours de la transcription à l'ARN polymérase déposée sur un support.
Le dépôt de l'ARN polymérase sur un support puis l'addition successive du composé soumis au procédé de détection et de la protéine intervenant au cours de la transcription, peut permettre de détecter les composés inhibant uniquement l'ARN polymérase. En effet, si le composé tel que défini ci-dessus ne se fixe pas sur l'ARN polymérase, il est éliminé lors du lavage qui a lieu avant l'addition de la protéine telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel, au moment de l'étape d'incubation de l'ARN polymérase avec une protéine intervenant au cours de la transcription et avec un composé soumis au procédé de détection, une liaison se forme : - soit entre ledit composé et entre l'ARN polymérase, - soit entre ledit composé et entre ladite protéine, - soit entre ledit composé, entre ladite protéine et entre l'ARN polymérase.
Lorsqu'une liaison se forme entre ledit composé et entre l'ARN polymérase, si le composé soumis au procédé de détection se fixe dans la région du site de complexation de ladite protéine, ledit composé empêche la protéine intervenant au cours de la transcription de se complexer à l'ARN polymérase tandis que la fixation dudit composé à côté du site de complexation de ladite protéine entraîne un changement de conformation et empêche également la complexation entre ladite protéine et l'ARN polymérase.
Lorsqu'une liaison se forme entre ledit composé et entre ladite protéine, si ledit composé se fixe dans la région du site de complexation de l'ARN polymérase, ledit
composé empêche l'ARN polymérase de se complexer à ladite protéine tandis que la fixation dudit composé à côté du site de complexation de l'ARN polymérase entraîne un changement de conformation et empêche également la complexation entre ladite protéine et l'ARN polymérase.
Lorsqu'une liaison se forme entre ledit composé, entre ladite protéine et entre l'ARN polymérase, soit ledit composé lie l'ARN polymérase engagée dans le complexe avec ladite protéine et favorise la dissociation, soit le composé lie ladite protéine, change sa conformation et force la dissociation.
L'invention concerne un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel, au cours de l'étape de détection de la variation significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et la protéine intervenant au cours de la transcription, on utilise un anticorps anti-ARN polymérase.
Avantageusement, le ou chaque tronçon de lame en saillie a une
forme de bossage.
De préférence, le support présente une ouverture traversante au
droit du ou de chaque tronçon en saillie.
Ainsi, il est possible durant le refroidissement d'introduire à travers cette ouverture un outil permettant de donner au tronçon en saillie la forme la plus adaptée pour limiter au mieux les problèmes susceptibles d'être
engendrés durant le refroidissement de la pièce.
Le feu selon l'invention pourra en outre présenter au moins l'une quelconque des caractéristiques suivantes: - le support forme au moins une douille de réception d'une lampe; - I'une des lames s'étend au centre de la douille; - au moins une des lames est réalisée dans un métal la rendant apte à former un ressort de maintien de la lampe dans la douille; - la ou chaque douille présente un premier côté permettant d'introduire la lampe dans la douille, et un deuxième côté opposé au premier côté et présentant une ouverture apte à laisser voir la lampe reçue dans la douille - la ou chaque douille comprend des parties électriquement conductrices respectivement d'une seule pièce avec certaines des lames; et - le support comporte un boîtier de connexion à un connecteur du véhicule. On prévoit également selon l'invention un porte-lampe pour feu de véhicule comportant un support électriquement isolant présentant une plus grande dimension suivant une première direction et des lames électriquement conductrices reliées au support et formées de tronçons de lames, dans lequel les lames ou les tronçons de lames qui s'étendent parallèlement à la première direction et les lames ou les tronçons de lames qui s'étendent parallèlement à une deuxième direction perpendiculaire à la première direction forment une majorité des lames ou des tronçons de lames
On prévoit par ailleurs selon l'invention un procédé de fabrication d'un feu de signalisation pour véhicule comprenant les étapes consistant à: fournir des lames de porte-lampe de feu, ces lames étant électriquement conductrices et formées de tronçons de lames; et - surmouler sur les lames un support du porte-lampe, ce support étant électriquement isolant et présentant une plus grande dimension suivant une première direction, les lames étant agencées de sorte que les lames ou les tronçons de lames qui s'étendent parallèlement à la première direction et les lames ou les tronçons de lames qui s'étendent parallèlement à une deuxième direction perpendiculaire à la première direction forment une
majorité des lames ou des tronçons de lames du support.
Le procédé selon l'invention pourra en outre présenter au moins l'une quelconque des caractéristiques suivantes: - au cours d'une étape de refroidissement faisant suite au surmoulage, on déforme localement au moins un des tronçons en lui donnant une forme non plane pour qu'il s'étende en saillie du support; et - durant le surmoulage, on ménage dans le support une ouverture traversante en regard du ou de chaque tronçon destiné à être déformé, puis à l'issue du surmoulage, on introduit un outil dans la ou chaque ouverture
pour déformer le tronçon.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront
encore dans la description qui va suivre d'un mode préféré de réalisation
donné à titre d'exemple non limitatif. Aux dessins annexes: - les figures i et 2 sont deux vues en perspective respectivement de dessus et de dessous d'un porte-lampe d'un feu selon un mode préféré de lo réalisation de l'invention; - la figure 3 est une vue à plus grande échelle d'un détail du porte-lampe de la figure 1; - les figures 4 et 5 sont deux vues en perspective illustrant deux variantes de réalisation d'une douille du porte-lampe de la figure 1; et - les figures 6 et 7 sont deux vues en perspective d'un détail du porte-lampe de la figure 1 et illustrent respectivement deux étapes de la fabrication. On a illustré aux figures 1 à 3, un porte-lampe 2 d'un feu selon un mode préféré de réalisation de l'invention. Ce porte-lampe comporte un support 4 de forme générale plane bien qu'il présente un certain nombre de reliefs sur chacune de ses deux faces principales. Le support 4 s'étend principalement selon une direction correspondant à sa longueur et désignée par la direction 6 sur la figure 1. Le support est réalisé dans une matière électriquement isolante telle qu'un polymère technique comme une résine polyacétal (POM). Une telle résine ne nécessite pas l'assemblage ultérieur d'un boîtier connecteur spécifique sur le porte-lampe afin de répondre à une exigence sévérisée de tenue à l'arrachement du porte-lampe. Le support 4
est réalisé par injection comme on le verra plus loin.
- on en déduit, lorsqu'il y a une variation significative telle que définie ci-dessus, qu'il y a eu formation d'une liaison entre le susdit composé et l'ARN polymérase, ce qui correspond à une modulation de la complexation entre l'ARN polymérase et la protéine intervenant au cours de la transcription.
Par"modulation de la complexation entre l'ARN polymérase et la protéine intervenant au cours de la transcription", on comprend à la fois l'activation et l'inhibition de ladite complexation.
L'invention concerne également un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel : - on adsorbe la protéine intervenant au cours de la transcription sur un support, - on incube ledit support avec l'ARN polymérase et avec le composé soumis au procédé de détection, ce qui conduit à la formation d'un complexe entre l'ARN polymérase et ladite protéine et la formation éventuelle d'une liaison entre l'ARN polymérase et le susdit composé, - on incube ledit support avec un anticorps anti-ARN polymérase, - on détecte, par un test de complexation, la variation significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et la susdite protéine par rapport à une valeur de contrôle correspondant à la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et la susdite protéine en l'absence de tout inhibiteur, et - on en déduit, lorsqu'il y a une variation significative telle que définie ci-dessus, qu'il y a eu formation d'une liaison entre le susdit composé et l'ARN polymérase, ce qui correspond à une inhibition de la complexation entre l'ARN polymérase et la protéine intervenant au cours de la transcription.
L'invention concerne un kit ou une trousse de détection d'un composé modulateur, notamment d'un composé inhibiteur, de la complexation entre l'ARN polymérase et une protéine intervenant au cours de la transcription comprenant : - une ou des protéines intervenant au cours de la transcription, ladite protéine pouvant être sous forme de protéine de fusion et étant notamment : - soit la protéine a0 ou une protéine équivalente, - soit la protéine NusA ou une protéine équivalente, - soit des fragments d'une de ces deux protéines, - FARN polymérase, - des milieux ou des tampons nécessaires à la dilution, - éventuellement des moyens de lavage, - des milieux ou des tampons permettant la formation d'un complexe entre l'ARN polymérase et la protéine intervenant au cours de la transcription et la formation d'une liaison entre l'ARN polymérase et le composé modulateur,
- des moyens de détection de la variation de la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et entre la protéine intervenant au cours de la transcription.
L'invention concerne également un kit ou une trousse de détection d'un composé inhibiteur, de la complexation entre l'ARN polymérase et une protéine intervenant au cours de la transcription comprenant : - une ou des protéines intervenant au cours de la transcription, - l'ARN polymérase, - des milieux ou des tampons nécessaires à la dilution, - des moyens de lavage, - des milieux ou des tampons permettant la formation d'un complexe entre l'ARN polymérase et la protéine intervenant au cours de la transcription et la formation d'une liaison entre l'ARN polymérase et le composé inhibiteur, - des moyens de détection de la variation de la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et entre la protéine intervenant au cours de la transcription.
Les milieux ou les tampons nécessaires à la dilution sont par exemple : - du PBS (137 mM NaCI, 2, 7 mM KCI, 4, 3 mM Na2HPO4, 1, 4 mM K2HPO4), - du PBS Tween BSA (0, 1% Tween 20, 1% BSA dans du PBS), Un moyen de lavage approprié est par exemple du PBS Tween (0, 1% Tween dans du PBS). Ainsi, on effectue trois lavages avec du PBS Tween.
Les moyens de détection de la variation de la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et entre la protéine intervenant au cours de la transcription s'effectuent par exemple en utilisant : - un anticorps antipolymérase fluorescent, ou - un anticorps antipolymérase marqué à la phosphatase alcaline ou à la peroxydase, ou - de la polymérase biotinylée, ou - un anticorps radiomarqué ou des protéines radiomarquées.
L'invention concerne un kit ou une trousse de détection tels que définis ci-dessus, qui comprend un support sur lequel est adsorbée la protéine intervenant au cours de la transcription, ladite protéine pouvant être sous forme de protéine de fusion et étant notamment : - soit la protéine cy ou une protéine équivalente, - soit la protéine NusA ou une protéine équivalente, - soit des fragments d'une de ces deux protéines, L'invention concerne un kit ou une trousse de détection tels que définis ci-dessus, qui comprend un support sur lequel est adsorbée l'ARN polymérase.
PARTIE EXPERIMENTALE L'invention a pour objet une nouvelle méthode qui permet le criblage d'une zone d'interaction de deux protéines indispensables à la vie de la cellule afin de limiter les résistances par mutation de la cible.
L'invention a pour objet le criblage de banques de produits chimiques de synthèse ou de produits naturels, même contaminés par des activités RNases ou DNases.
MATERIEL ET METHODES Détection de la liaison sigma70-polymérase Les protéines sigma70 et l'ARN polymérase d'E. coli sont exprimées et purifiées dans des conditions standards (Burgess et al., Biochemistry, 1975, Oct 21 ; 14 (21) : 4634-8 ; Burgess R., Methods Enzymol 1996 ; 273 : 145-9). La protéine sigma70 est stockée à-80 C dans (20 mM tris HCI pH 8 ; 5 M chlorure de guanidine ; 10 mM ss- mercaptoéthanol ; 50% de glycérol à une concentration de 100 uM). L'ARN polymérase minimum est stockée à-80 C dans (20 mM tris HCI pH 8,100 mM KCI, 10 mM ss-mercaptoéthanol, 50% glycérol) à une concentration de 1 uM. L'anticorps monoclonal antipolymérase a été obtenu et purifié par des techniques classiques (Short Protocols in Molecular Biology 2 d edition, John Wiley & Son) puis a été couplé chimiquement à la peroxydase activée (Boehringer Mannheim Biochemica réf.
1428861) selon les recommandations du fournisseur.
Le test est basé sur l'adsorption de sigma70 sur une plaque d'ELISA pendant 12 heures à 4 C (6 pmoles de protéine diluée dans 100 ul de PBS par puits, sur des plaques Nunc-immuno plate, Maxisorp. ). Les dilutions de protéine et les tampons ont été optimisés pour réduire la liaison non spécifique de l'ARN polymérase. Après lavage de la plaque avec du PBS 0, 1% tween20, la plaque est saturée avec 200 ul de PBS 0, 1% tween20, 1% BSA puis est incubée pendant 1 heure à température ambiante avec de l'ARN polymérase d'E. coli (0,25 pmole d'ARN polymérase minimum dans 100 ul de PBS 0,1% tween 20,1% BSA, 10 mM MgCh) en présence ou en l'absence d'un inhibiteur éventuel. La plaque est ensuite lavée puis est incubée avec un anticorps antiARN polymérase couplé à la peroxydase pendant 30 minutes à température ambiante. Le complexe sigma70-ARN polymérase anticorps est détecté avec un substrat de la peroxydase, l'O-phénylènediamine, ou un autre moyen approprié.
Alternativement, un autre protocole a été utilisé. Ce test est basé sur l'adsorption d'ARN polymérase minimum sur une plaque d'ELISA pendant 12 heures à 4 C (0, 5 pmoles de protéine diluée dans 100 u. l de PBS par puits sur des plaques Nunc-immuno plate Maxisorp). Après lavage de la plaque avec du PBS 0, 1% tween20, la plaque est saturée avec 200 jul de PBS 0, 1% tween20, 1% BSA, puis est incubée pendant 1 heure à température ambiante avec sigma70 comportant une étiquette polyhistidine C-terminale (1 pmole de sigma70 dans 100 u. l de PBS 0,1% tween20, 1% BSA, 10 mM MgCl2) en présence ou en l'absence d'un inhibiteur éventuel. La plaque est ensuite lavée puis est incubée avec un anticorps étiquette polyhistidine couplé à la peroxydase (Sigma réf.
A7058 dilué au 1/2000 (v/v)) pendant 30 minutes à température ambiante. Le complexe sigma70-ARN polymérase anticorps est détecté avec un substrat de la peroxydase, 1'0- phénylènediamine ou un autre moyen approprié.
*L'utilisation des amorces de séquences SEQ ID N 20 à 25 dans des réactions d'amplification est décrite à l'exemple 1.
Une amorce ou une sonde nucléotidique selon l'invention peut être préparée par toute méthode adaptée bien connue de l'homme du métier, y compris par clonage et action d'enzymes de restriction ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de NARANG et al. (1979) ou de BROWN et al. (1979), la méthode au diéthylphosphoramidites de BEAUCAGE et al. (1980) ou encore la technique sur support solide décrite dans le brevet européen noEP 0 707 592. Chacun des acides nucléiques selon l'invention, y compris les sondes et amorces oligonucléotidiques décrites ci-dessus, peut être marqué, si désiré, en incorporant une molécule détectable, c'est-à-dire un marqueur détectable, par des moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques.
Par exemple, de tels marqueurs peuvent consister en des isotopes radioactifs (32p 3H, 35S), des molécules fluorescentes (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène, digoxigénine) ou encore des ligands tels que la biotine.
De manière avantageuse, les sondes selon l'invention peuvent avoir des caractéristiques structurelles de nature à permettre une amplification du signal, telles que les sondes décrites par URDEA et al ; (1991) ou encore dans le brevet européen n EP 0 225 807 (Chiron).
Les sondes oligonucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées notamment dans des hybridations de type Southern à l'ADN
génomique du gène DD1-a ou du gène DD1-b ou encore dans des hybridations à l'ARN messager de l'un quelconque des deux gènes lorsque l'expression du transcrit correspondant est recherchée dans un échantillon.
Une sonde particulière selon l'invention est par exemple la sonde de séquence SEQ ID ? 26 ou encore la sonde de séquence SEQ ID NO29.
Des sondes ou amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être immobilisées sur un support solide. De tels supports solides sont bien connus de l'homme du métier et comprennent des surfaces des puits de plaques de micro-titration, des billes de polystyrène, des billes magnétiques, des bandes de nitrocellulose ou encore des microparticles telles que des particules de latex.
En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il comprend au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus, en particulier d'un acide nucléique de séquences nucléotidiques SEQ ID NO1 à SEQ ID ? 8.
L'invention est également relative à un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique caractérisé en ce qu'il consiste en un polynucléotide d'au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique selon l'invention, de manière tout à fait préférée d'un acide nucléique de séquences choisies parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID àSEQ ID N 8.
Un tel acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce est par exemple l'acide nucléique comprenant et/ou consistant dans un acide nucléique choisi parmi les séquences SEQ ID N 13 à SEQ ID NO17.
Un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique pour la détection ou l'amplification d'une séquence génomique, de l'ARNm ou de l'ADNc du gène DD1-a peut en outre être caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences suivantes : a) les séquences nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence SEQ tDN 1 ; et b) les séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence SEQ ID NO1.
L'invention concerne un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel la protéine intervenant au cours de la transcription a un poids moléculaire supérieur à environ 15 kDa ou est une protéine de fusion entre une protéine de poids moléculaire inférieur à 15 kDa et une autre protéine, telle que la GST (glutathione S transférase).
Des exemples de telles protéines comprennent notamment des domaines du facteur sigma sous forme de fusion GST, et les protéines Gp33 ou 55 du bactériophage T4 sous forme de fusion GST.
L'invention concerne un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel les concentrations de l'ARN polymérase sont comprises d'environ 1 fmole à environ 100 pmole/essai, notamment d'environ 1 fmole à environ 10 pmole/essai, celles de la protéine intervenant au cours de la transcription d'environ 10 fmole à environ 500 pmole/essai et celles du composé soumis au procédé de détection d'environ 1 pM à environ 1 uM, notamment d'environ 1 nM à environ 1 u. M.
Les gammes de concentrations inférieures à la concentration la plus faible correspondent à la limite de détection tandis que les gammes de concentrations supérieures à la concentration la plus forte favorisent une liaison non spécifique et demandent trop de quantité de protéine, ce qui est très défavorable concernant les concentrations de composé soumis au procédé de détection, qu'il est nécessaire d'ajouter pour observer l'effet inhibiteur.
L'invention concerne un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel l'ARN polymérase utilisée provient de cellules procaryotes, notamment d'E. coli.
L'invention concerne un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel la protéine intervenant au cours de la transcription intervient soit au cours de l'étape d'initiation de la transcription, soit au cours de l'étape d'élongation, soit au cours de l'étape de terminaison de la transcription.
Par"intervenant au cours de l'étape d'initiation de la transcription", on entend une protéine qui se lie à l'ARN polymérase, lui confère une spécificité pour un promoteur et permet l'initiation de la transcription.
Des exemples de protéines intervenant au cours de l'initiation sont notamment la famille des facteurs sigma, notamment le facteur sigma 70, ainsi que les protéines Gp33, Gp45 et Gp55 du bactériophage T4.
Par"intervenant au cours de l'étape d'élongation de la transcription", on entend une protéine qui se lie à l'ARN polymérase et change sa vitesse d'élongation.
Des exemples de protéines intervenant au cours de l'élongation sont notamment les protéines NusA, greA et greB.
Par"intervenant au cours de l'étape de terminaison de la transcription", on entend une protéine qui change le site de terminaison de la transcription.
Des exemples de protéines intervenant au cours de la terminaison sont notamment les protéines NusA, NusB, NusG, Rho ou la protéine N du bactériophage lambda.
L'invention concerne un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel la protéine intervenant au cours de la transcription est : - soit la protéine a0 ou une protéine équivalente, Par protéine équivalente, on comprend toute protéine qui lie l'ARN polymérase, lui confère une spécificité pour un promoteur et permet l'initiation.