INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
De manière non représentée, les planches à aiguilles 18 sont reliées chacune à un mécanisme de type connu pour les aiguilleteuses, destiné à animer ces planches à aiguilles d'un mouvement alternatif de va-et-vient 24 selon une direction perpendiculaire aux faces de guidage 3 de table 2. Ce mouvement fait alternativement pénétrer les aiguilles 19 entre les lamelles 4 jusqu'au delà de la face de guidage 3 opposée à la planche à aiguilles 18 considérée, puis ressortir les aiguilles de la table à lamelles 2.
La figure 4 illustre que les lamelles 4 d'un même motif peuvent être réalisées d'un seul bloc avec un support commun 26 situé amont.
La figure 5 illustre des ponts de fibres 27 réalisés chacun par le travail des aiguilles 19 dans l'un des intervalles 22 entre deux lamelles voisines. Chaque pont 27 visible la figure 5 correspond à une rangée de ponts ou ligne de liaison entre les deux nappes, orientée longitudinalement par rapport à la direction de défilement nappes le long de la table 2. La pénétration des aiguilles 19 dans la table 2 entraîne des fibres de la nappe 8 la plus proche de la planche à aiguilles considérée et vient entrelacer ces fibres avec celles de l'autre nappe 8. La pénétration des aiguilles de part et autre de la table peut être simultanée si les aiguilles sont décalées d'une planche à l'autre, ou au contraire alternée auquel cas les aiguilles des deux planches peuvent être exactement alignées. Pendant la pénetration des aiguilles, les surfaces de guidage 3 définies par les bords des lamelles empêchent les nappes 8 d'être entraînées par les aiguilles. Lors du mouvement de retrait des aiguilles 19, ce sont les contreplaques 14 qui empêchent les nappes 8 d'être entraînées par les aiguilles 19.
Un composant intercalaire 28 est inséré entre les deux nappes 8 dans les couloirs 23 définis entre les motifs de lamelles 4. Ainsi, comme représenté bas de la figure 2, ce composant 28 se retrouve dans le produit 16 prisonnier d'une part entre les nappes 8 et autre part entre les groupes de ponts 27 ont été formés par aiguilletage.
Conformément à l'invention, le constituant intercalaire 28 est composé d'enveloppes renfermant un flans l'exemple qui est plus précisément représenté, ces enveloppes ont la forme de billes de relativement petite dimension, de l'ordre du millimètre ou de quelques millimètres, qui sont hermétiques, libres les unes par rapport aux autres, et envoyées en vrac, par gravité, dans les couloirs 23 de manière à remplir ceux-ci.
Pour le guidage des billes 28, la table 2 est montée de manière jointive entre deux plaques 29 étendant jusqu'à la zone 31 où arrivent les deux nappes 8, juste en amont des deux contreplaques 14. Grâce à la réunion des lamelles 4 d'un même motif figure 4) en un support unique 26 dans région située entre les plaques 29, les billes ne peuvent pas venir se loger dans les intervalles d'aiguilletage 22 entre les lamelles 4 d'un même motif.
La figure 5 représente en partie droite produit obtenu en coupe transversale avec les groupes de ponts 27 et les billes 28.
L'article 16 ainsi obtenu peut par exemple être soumis à un traitement imperméabilisant pour former une paroi flottante une structure gonflable, ou servir de paroi à la fois structurelle et thermiquement isolante.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent concernant la préparation de protéines chimères formées par une protéine ClpG et le peptide STa et la mise en évidence que les protéines chimères ClpG-STh sont associées à une forte activité entérotoxique comparable à celle de la toxine naturelle STa.
A - MATÉRIEL ET MÉTHODES.
1) Souches bactériennes et plasmides.
Les différentes souches bactériennes utilisées au cours de ce travail sont présentées dans le tableau 1 ci-dessous.
Souches Génotypes/Caractéristiques DH5a F- supE44, (argF-lacZYA) U169 (#80 lacz#M15), hsdR17 (rk-, mk+) , recAl, endAl, gyrA96 (Nalr) , thil, relAl
B41 Souche d'ETEC d'origine bovine (0101:K-:H-, K99, F41) produisant STa.
JCB570 AraD139# (araABC-Leu) 7679, galU, galK, # (lac) X74, rpsL, thi, phoR, zih 12::TnlO JCB571 JCB570 dsbA::kan1 JCB819 JCB570 (malF-lacZ102) dsbB::kan1 JCB818 JCB570 (malF-lacZ102) dsbA::kanl, dsbB::kanl
La souche B41 est une souche sauvage de référence productrice de toxine STp. Les souches JCB571, JCB818, JCB819 dérivées de JCB570 sont mutées dans le système Dsb impliqué dans la formation des ponts disulfures. Les bactéries sont cultivées à 37 C en milieu LB (Luria Bertani) liquide ou gélosé supplémenté avec les antibiotiques appropriés : ampicilline (Ap), 50 ug/ml ; chloramphénicol (Cm), 25 ug/ml ; tétracycline (Tc), 12,5 ug/ml ; streptomycine (Sm) 50 ug/ml.
Les différents plasmides utilisés dans ce travail sont décrits dans le tableau 2 ci-dessous.
Plasmides Génotype/Caractéristiques pHSG575 Vecteur de clonage à faible nombre de copies ; origine de réplication pSC101, CmR pEH524 pHSG575 avec l'opéron clp codant pour les fimbriae CS31A pDSPH524 pEH524 délété du gène clpG pSK+ Vecteur de clonage pBluescript SK(+) ; origine de réplication pColEl, ApR pDEV41155 pSK+ avec clpG entre EcoRV et XbaI pHPCOH838 pDEV41155 avec un codon GTT juste avant le dernier codon de clpG pSTN24 pHPCOH838 avec STh dans SphI pSTC22 pHPCOH838 avec STh entre les sites HpaI de clpG et XbaI du vecteur pProSTC28 pSTC22 avec STh entre les sites HpaI et SmaI pSTC17 pSTC22 délété du fragment HpaI/SmaI pEHSTN24 pEH524 avec clpG-STh de pSTN24 à la place de clpG pEHSTC22 pEH524 avec clpG-STh de pSTC22 à la place de clpG pEHProSTC28 pEH524 avec clpG-STh de pProSTC28 à la place de clpG pSelect-1 Vecteur de clonage ; origine de réplication pColEl, TcR pSXIOS pSelect-1 avec clpG dans lequel les sites SpeI et BglII ont été créés pSTVIOS pSXIOS avec STh inséré dans SpeI pSTVD41 pSTVIOS délété du fragment BamHI/BglII pEHSTVD41 pEH524 avec clpG-STh de pSTVD10S à la place de clpG pTrc99A Vecteur d'expression possédant le promoteur inductible Ptrc ; origine de réplication pColEl, ApR, LacIq, rrnB pTrcSTN24 pTrc99A avec clpG-STh de pSTN24 pTrcProSTC28 pTrc99A avec clpG-STh de pProSTC28 pSTCDMl pHPC0838 avec STh mutée pour l'entérotoxicité entre les sites HpaI de clpG et XbaI du vecteur pSPGST1 pHPC0838 avec STh entre Sphl et HpaI pSTE531 pSTN24 avec l'ADN duplex E531/E351 (Tableau 10) dans PstI pSTDG17 pSTE531 délété du fragment SnaBI/HpaI pSTDG126 pHPC0838 avec STh entre SphI et HpaI pGMSTC7 pSTC22 avec l'ADN duplex GMCST3/GMCST5 (Tableau 10) entre SphI et HpaI pGMSTC71 pGMSTC7 délété du fragment HpaI/HpaI pGMSTC710 pGMSTC7 délété du fragment Hpal/Smal
PGMSTC13 pProSTC28 avec l'ADN duplex GMCST3/GMCST5 (Tableau 10) entre SphI et HpaI pGMTSTC13/19 pGMSTC13 délété du fragment HpaI/HpaI GMSTC13/28 GMSTC13 délété du fra ent EcoRIlEcoRI
Le plasmide pEH524 portant l'opéron clp contient tous les gènes nécessaires à la biogénèse de CS31A. Le plasmide pDSPH524 est un dérivé de pEH524 dans lequel le gène clpG a été entièrement délété. Les plasmides pDEV41155 et pSXlOS dérivent respectivement des vecteurs pBluescript SK (Stratagene) et pSelect 1 (Promega) dans lesquels seul le gène clpG a été cloné. Le plasmide pSX10S possède un site de restriction unique SpeI créé par mutagénèse dirigée. L'asparagine 203 de ClpG est ainsi substituée par une thréonine. Le plasmide pHPC0838 dérive de pDEV41155 par substitution du site de restriction unique AflIII en un site unique BglII, par création d'un site unique HpaI et par addition d'un résidu valine entre les deux derniers résidus (tyrosine et asparagine) C-terminaux de ClpG. Afin de pouvoir contrôler l'expression des différentes protéines hybrides, les gènes de fusion ont été placés en aval du promoteur Ptrc inductible par l'IPTG (isopropyl-i3-D-thiogalactopyranoside) dans le vecteur d'expression pTrc99A. L'induction est réalisée avec 2 mM d'IPTG.
2) Purification des plasmides (kit Qiagen).
Cent millilitres de milieu LB liquide contenant les antibiotiques appropriés sont ensemencés avec 500 l
C, D). Les surnageants de culture liquide sont concentrés dix fois (A) et le surnageant des bactéries DH5a (pEH524) obtenu sur milieu gélosé est dilué cinq fois (B piste 1). L'immunodétection est réalisée après migration sur gel de polyacrylamide à 15 % en conditions dénaturantes soit avec l'anticorps polyclonal anti-ClpG (A, B) soit avec les anticorps monoclonaux anti-STa 11C (C) ou 20C1 (D). Dans ces derniers cas (C,D), la réaction colorimétrique est amplifiée à l'aide d'un anticorps secondaire couplé à la biotine qui est reconnue par la streptavidine conjuguée à la péroxydase. La flèche horizontale indique la position de la protéine ClpG (- 29 kDa).
Les profils électrophorétiques des protéines issues de cultures sur milieu gélosé (Figure 3B) ou liquide (Figure 3A) sont identiques. Cependant, la comparaison de la production d'hybrides dans différentes conditions de culture montre que, pour un même volume de surnageant, la quantité de protéines recombinantes recueillies en conditions de cultures liquides (Figure 3A) est plus faible qu'en conditions de cultures sur milieu gélosé (Figure 3B).
Par conséquent, les surnageants obtenus à partir de cultures sur milieu gélosé ont donc été préférentiellement utilisés pour la suite de cette étude.
Toutes les protéines chimères possédant STh insérée à l'extrémité N-terminale (Figure 3B, piste 2) ou C-terminale (Figure 3B, piste 3 à 5) de la protéine ClpG, sont sécrétées dans le milieu extracellulaire. Les hybrides
exprimés par pEHSTN24 (piste 2) et pEHSTC22 (piste 3) migrent sous forme d'une seule protéine de masse moléculaire supérieure à celle de ClpG (environ 29 kDa, piste 1), résultant, probablement, de la présence de STh.
Par contre, le profil électrophorétique des constructions pEHProSTC28 (piste 4) et [pSTCl7 + pDSPH524] (piste 5) montre deux bandes réagissant avec l'antisérum anti-ClpG (Figure 3B). La bande supérieure correspondrait à l'hybride entier alors que la bande inférieure, située au niveau de la sous-unité ClpG native, représenterait un dérivé clivé des hybrides (Figure 3A et B, pistes 4 et 5) . Il n'a pas été observé d'hybrides correspondant aux insertions de STh dans deux sites (acides aminés 202-204 et 204-215) de la région centrale variable V3 de ClpG ([pSTVlOS+pDSPH524] et pEHSTVD41) ce qui indique que ces deux sites ne sont pas compatibles avec la production et/ou la sécrétion des hybrides (pas montré). Pour cette raison, ces constructions n'ont pas fait l'objet d'autres études au cours de ce travail.
Les surnageants ont ensuite été testés pour leur réactivité envers les anticorps monoclonaux 11C et 20C1 dirigés contre la toxine STa (Figure 3C et D).
L'hybride exprimé par pEHSTN24 (piste 2) ne réagit avec aucun de ces anticorps ce qui suggère une faible accessibilité de STh à ces anticorps probablement suite à un changement de conformation de la toxine après fusion avec la protéine porteuse. Au contraire, la protéine codée
par pEHSTC22 (piste 3) et la protéine non clivée exprimée par pEHProSTC28 (piste 4) sont reconnues par les deux anticorps anti-STa. Par contre, le produit de dégradation de pEHProSTC28 (piste 4) n'est pas détecté avec les anticorps anti-STa ce qui laisse supposer qu'une partie de l'hybride codé par ce plasmide est clivée du côté Cterminal de ClpG libérant ainsi la portion STh. Par contre, les deux protéines exprimées par [pSTC17+pDSPH524] réagissent avec les deux anticorps anti-STa (piste 5). Le clivage de cet hybride pourrait donc se produire dans la région N-terminale de ClpG. Les protéines non clivées exprimées par pEHSTC22, pEHProSTC28 et [pSTC17+pDSPH524] représentent donc les hybrides entiers puisqu'elles sont reconnues à la fois par les anticorps anti-ClpG et par les anticorps anti-STa.
La figure 4 rapporte la présence des hybrides dans les surnageants de culture déterminée par ELISA "double sandwich". Les hybrides dans les surnageants de cultures réalisées sur milieu gélose sont détectés à l'aide des anticorps anti-ClpG et 11C dirigés respectivement contre les portions ClpG et STh de l'hybride. Le surnageant DH5[alpha] (pEH524) contenant du ClpG mais pas de toxine STh est utilisé comme témoin négatif et permet de mesurer les réactions aspécifiques.
Dans un premier temps, les protéines recombinantes sont fixées par la portion STh de l'hybride aux anticorps anti-11C de souris fixés sur la plaque de
microtitration. La partie ClpG libre de l'hybride est alors reconnue par l'antisérum de lapin anti-ClpG utilisé comme anticorps secondaire. La présence des hybrides ClpG-STh dans les échantillons est détectée après l'addition d'un antisérum de chèvre anti-IgG de lapin couplé à la péroxydase. Les résultats montrent la présence des protéines recombinantes dans tous les surnageants puisqu'elles sont reconnues à la fois par les anticorps anti-STa et anti-ClpG. Ces résultats confirment ceux observés par "Western" immunomarquage (Figure 3) et prouvent que le manque de réactivité de l'hybride exprimé par pEHSTN24 vis-à-vis des anticorps monoclonaux 11C et 20C1 (Figure 3) n'est pas dû à l'absence de la portion STh.
En effet, ces hybrides sont détectés par ELISA dans les échantillons peu dilués ce qui suggère une faible affinité des anticorps pour la protéine.
La présence des protéines recombinantes dans les surnageants pourrait résulter d'une lyse des bactéries.
Pour s'assurer que cela n'était pas le cas, nous avons mesuré l'activité S-galactosidase dans les surnageants de cultures et les lysats de E. coli DH5[alpha] hébergeant à la fois le vecteur pSK+ exprimant la S-galactosidase et l'un des plasmides recombinants dérivés de pEH524. L'activité ssgalactosidase était surtout associée aux lysats cellulaires et négligeable dans les surnageants.
L'ensemble de ces résultats met en évidence la grande permissivité des extrémités N- et C-terminales de la
-le terme radical hétérocyclique bicyclique désigne un radical saturé ou insaturé constitué de 8 à 12 chaînons tel que l'un ou plusieurs des chaînons représente un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote et notamment des groupes hétérocycliques condensés contenant au moins un hétéroatome choisi parmi le soufre, l'azote et l'oxygène, par exemple benzothiényle tel que 3-benzothiényle, benzothiazolyle, quinolyle, tetralone, benzofuryle, benzopyrrolyle, benzimidazolyle, benzoxazolyle, thionaphtyle, indolyle ou purinyle.
-Le terme radical carbocyclique ou hétérocyclique monocyclique ou bicyclique renfermant de 5 à 10 chaînons, saturé ou insaturé, contenant un ou plusieurs hétéroatomes identiques ou différents choisis parmi 0, N, NH ou S, et pouvant contenir un chaînon -C(0), regroupe les définitions indiquées ci-dessus d'une part pour le terme radical hétérocyclique monocyclique et d'autre part pour le terme radical hétérocyclique bicyclique, tous ces radicaux étant éventuellement substitués. On peut noter qu'un radical carbocyclique tel que défini ci-dessus est notamment le radical phényle et qu'un radical carbocyclique contenant un chaînon -C(0) est par exemple le radical tétralone.
-le terme alkylphényle désigne un radical phényle substitué par un ou plusieurs radicaux alkyle tels que définis cidessus linéaires ou ramifiés de préférence renfermant au plus 4 atomes de carbone les termes NH (alk) etN(alk)(alk) désigne un radical amino substitués respectivement par un ou deux radicaux alkyle, de tels radicaux alkyle étant linéaires ou ramifiés et
renfermant de préférence au plus 4 atomes de carbone le terme acylamino désigne les radicaux -C(O)-NH2, -C(O)-NH(alk) et -C (0) -N (alk) (alk) dans lesquels les radicaux NH(alk) et N(alk)(alk) ont la signification indiquée cidessus -le terme acyle désigne un radical R-C(O)- dans lequel R représente un radical choisi parmi l'atome d'hydrogène, les radicaux alkyle linéaire ou ramifié renfermant au plus 6 atomes de carbone, un radical phényle ou un radical pyrrolidinyle : le terme acyle désigne ainsi notamment les radicaux formyle, les radicaux acétyle, propionyle, butanoyle, pentanoyl, hexanoyl, benzoyle et pyrrolidinylcarbonyle le terme alkényle désigne des radicaux linéaire ou ramifié renfermant au plus 6 atomes de carbone : on peut citer notamment les radicaux vinyle, 1-propényle, allyle, butényle, 3-méthyle-2-butényle - le terme alkylthio désigne des radicaux linéaire ou ramifié renfermant au plus 6 atomes de carbone tels que notamment les radicaux méthylthio, éthylthio, propylthio, isopropylthio, butylthio, isobutylthio, sec-butylthio, tert-butylthio, pentylthio, isopentylthio, hexylthio ou encore isohexylthio ainsi que leurs isomères de position linéaires ou ramifiés : parmi ces radicaux alkylthio, on choisit de préférence parmi ceux cités ci-dessus, ceux qui renferment au plus 4 atomes de carbone Les acides aminés dits naturels ou dits non naturels sont connus de l'homme du métier et peuvent être trouvés dans des documents usuels tels que par exemple le document 'Amino Acids (1999), 16(3-4), 345-379.
Le ou les radicaux carboxy des produits de formule (1) peuvent être salifiés ou estérifiés par les groupements divers connus de l'homme du métier parmi lesquels on peut citer, par exemple :
-parmi les composés de salification, des bases minérales telles que, par exemple, un équivalent de sodium, de potassium, de lithium, de calcium, de magnésium ou d'ammonium ou des bases organiques telles que, par exemple, la méthylamine, la propylamine, la triméthylamine, la diéthylamine, la tri- éthylamine, la N,N-diméthyléthanolamine, le tris (hydroxyméthyl) amino méthane, l'éthanolamine, la pyridine, la picoline, la dicyclohexylamine, la morpholine, la benzylamine, la procaïne, la lysine, l'arginine, l'histidine, la N-méthylglucamine, -parmi les composés d'estérification, les radicaux alkyle pour former des groupes alcoxy carbonyle tel que, par exemple, méthoxycarbonyle, éthoxycarbonyle, tert-butoxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle, ces radicaux alkyles pouvant être substitués par des radicaux choisis par exemple parmi les atomes d'halogène, les radicaux hydroxyle, alcoxy, acyle, acyloxy, alkylthio, amino ou aryle comme, par exemple; dans les groupements chlorométhyle, hydroxypropyle, méthoxyméthyle, propionyloxyméthyle, méthylthiométhyle, diméthylaminoéthyle, benzyle ou phénéthyle.
Les sels d'addition avec les acides minéraux ou organi-ques des produits de formule (1) peuvent être, par exemple, les sels formés avec les acides chlorhydrique, bromhydrique, iodhydrique, nitrique, sulfurique, phosphorique, propionique, acétique, trifluoroacétique, formique, benzoïque, maléique, fumarique, succinique, tartrique, citrique, oxalique, glyoxylique, aspartique, ascorbique, les acides alcoylmonosulfoniques tels que par exemple l'acide méthanesulfonique, l'acide éthanesulfonique, l'acide propanesulfonique, les acides alcoyldisulfoniques tels que par exemple l'acide méthanedisulfonique, l'acide alpha, bêta- éthanedisulfonique, les acides arylmonosulfoniques tels que l'acide benzènesulfonique et les acides aryldisulfoniques.
On peut rappeler que la stéréoisomérie peut être définie dans
son sens large comme l'isomérie de composés ayant mêmes formules développées, mais dont les différents groupes sont disposés différemment dans l'espace, tels que notamment dans des cyclohexanes monosubstitués dont le substituant peut être en position axiale ou équatoriale, et les différentes conformations rotationnelles possibles des dérivés de l'éthane. Cependant, il existe un autre type de stéréoisomérie, dû aux arrangements spatiaux différents de substituants fixés, soit sur des doubles liaisons, soit sur des cycles, que l'on appelle souvent isomérie géométrique ou isomérie cis-trans. Le terme stéréoisomères est utilisé dans la présente demande dans son sens le plus large et concerne donc l'ensemble des composés indiqués ci-dessus.
On peut noter que l'on préfère les produits de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle les atomes de carbone indiqués par le signe * sont sous la configuration stéréochimique S.
On peut noter que dans les produits de formule (I) telle que définie ci-dessus, le troisième atome de carbone indiqué par le signe * sur la formule des produits de formule (I), ne possède évidemment pas de stéréochimie particulière R ou S lorsque R2 représente l'atome d'hydrogène.
La présente invention a ainsi plus particulièrement pour objet les produits de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle RI et R3 ont les significations indiquées à la revendication 1 et R2 représente le reste d'un acide aminé dit naturel à l'exception de l'acide aspartique, lesdits produits de formule (I) étant sous toutes les formes isomères possibles racémiques, énantiomères et diastéréoisomères, ainsi que les sels d'addition avec les acides minéraux et organiques ou avec les bases minérales et organiques desdits produits de formule (I).
La présente invention a ainsi encore plus particulièrement pour objet les produits de formule (I) telle que définie ci-
dessus dans laquelle RI et R3 ont les significations indiquées à la revendication 1 ou 2 et R2 et R7 sont tels que : soit R7 représente un atome d'hydrogène et R2 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle linéaire ou ramifié renfermant au plus 6 atomes de carbone éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux choisis parmi les radicaux amino ; acylamino; NH=C(NH2)-NH- ; mercapto ;alkylthio linéaire ou ramifié renfermant au plus 4 atomes de carbone ; hydroxyle ; alcoxy linéaire ou ramifié renfermant au plus 4 atomes de carbone ; imidazolyle ; indolyle ; phényle lui-même éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux choisis parmi les atomes d'halogène, le radical hydroxyle, un radical alcoxy linéaire ou ramifié renfermant au plus 4 atomes de carbone et le radical phénoxy lui-même éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux choisis parmi les atomes d'iode et le radical hydroxyle ; et le radical -C(O)-O-R8 dans lequel R8 représente un atome d'hydrogène ou un radical alkyle ou alkényle linéaire ou ramifié renfermant au plus 6 atomes de carbone, soit R2 et R7 forment ensemble avec les atomes d'azote et de carbone auxquels ils sont liés un cycle comprenant 5 à 7 chaînons éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux hydroxyle ou alcoxy linéaire ou ramifié renfermant au plus 4 atomes de carbone, lesdits produits de formule (I) étant sous toutes les formes isomères possibles racémiques, énantiomères et diastéréoisomères, ainsi que les sels d'addition avec les acides minéraux et organiques ou avec les bases minérales et organiques desdits produits de formule (I).
La présente invention a notamment pour objet les produits de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle RI et R3 ont les significations indiquées à l'une quelconque des revendications 1 à 3,
R2 et R7 sont tels que : soit R7 représente un atome d'hydrogène et R2 a la signification indiquée à la revendication 3 soit R2 et R7 forment ensemble avec les atomes d'azote et de carbone un cycle pyrrolidinyle éventuellement substitué par un ou plusieurs radicaux hydroxyle ou alcoxy linéaire ou ramifié renfermant au plus 4 atomes de carbone, lesdits produits de formule (I) étant sous toutes les formes isomères possibles racémiques, énantiomères et diastéréoisomères, ainsi que les sels d'addition avec les acides minéraux et organiques ou avec les bases minérales et organiques desdits produits de formule (I). lesdits produits de formule (I) étant sous toutes les formes isomères possibles racémiques, énantiomères et diastéréoisomères, ainsi que les sels d'addition avec les acides minéraux et organiques ou avec les bases minérales et organiques desdits produits de formule (I).
Le bromure d'isobutyroyle commence à se condenser en tête de colonne après environ 30 min d'introduction, il est alors soutiré en continu avec un débit moyen de 36,5 g/h.
En fin d'introduction des réactifs, la masse de bromure d'isobutyroyle extrait est de 91,4 g correspondant à 50,4 % de la quantité théorique. L'extraction du bromure d'isobutyroyle est poursuivi pendant 2 heures supplémentaires en augmentant progressivement la température du mélange réactionnel de 140 C à 170 C tout en réduisant la pression de 4.104 Pa à 104 Pa. On obtient ainsi une fraction supplémentaire de 80,2 g de chlorure d'ïsobutyroyle.