INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
2) Synthèse des intermédiaires (III) : La préparation des intermédiaires de formule générale (III), schéma 1. 4, dans lesquels R2 est tel que défini ci-dessus et Y = -(CH2)p-, avec p = 0, est effectuée à partir des dérivés de l'acide N-Cbz aspartique de formule générale (111.1) dont l'accès est décrit dans la littérature (J. Med Chem. (1973) 16 (11), 1277-1280). Par chauffage de ces intermédiaires en présence de trioxanne et d'une quantité catalytique d'APTS au reflux d'un solvant tel que, par exemple, le toluène, (Synthesis (1989) 7,542-544) on obtient les dérivés d'oxazolidinone de formule générale(III.2). La réduction de la fonction acide est alors effectuée à l'aide de B2H6.THF dans le THF telle que décrite dans Chem Pharm.
Bull. (1995) 43 (10), 1683-1691 et conduit aux alcools de formule générale (111.3). Ceuxci sont ensuite traités en milieu basique, et l'intermédiaire (111.4) ainsi généré est cyclisé à l'aide d'un agent de déshydratation classique tel que, par exemple, le Dicyclohexylcarbodiimide pour obtenir la lactone substituée de formule générale (111.5).
L'intermédiaire de formule générale (III) est obtenu après coupure du carbamate de benzyle à l'aide de Pd/C sous atmosphère d'hydrogène.
Schéma 1.4
3) Synthèse des intermédiaires (V) : Les intermédiaires de formule générale (V) (schéma 2. 1), dans lesquels A, X, Y, R53 et R54 sont tels que décrits ci-dessus, sont préparés classiquement par condensation peptidique des acides de formule générale (II), précédemment décrits, avec les aminoesters commerciaux de formule générale (V.l). Les acides carboxyliques de formule générale (V) sont obtenus après saponification des esters intermédiaires de formule générale (V.2).
Partie expérimentale Les exemples suivants sont présentés pour illustrer les procédures ci-dessus et ne doivent en aucun cas être considérés comme une limite à la portée de l'invention. Exemple 1 : (2/?)-6-hydroxy-iV-[(35)-2-hydroxytétrahydro-3-furanyl]-2,5,7,8-tétraméthyl- 3,4-dihydro-2H-chromène-2-carboxamide : 1.1) (2/?)-6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthyI-N-[(35)-2-oxotétrahydro-3-ruranyl]- 3,4-dihydro-2H-chromène-2-carboxamide : Une solution de 1,82 g (7,27 mmoles) de (R)-Trolox et de 1,18 g (7,27 mmoles) de 1,1'-carbonyldiimidazole (CDI) dans 15 ml de THF anhydre est agitée 1 heure à 23 C, avant l'addition d'une solution de 1 g (7,27 mmoles) du chlorhydrate de (S)-2-amino- 4-butyrolactone et de 1.27 ml (7,27 mmoles) de N,N-diisopropyléthylamine (DIEA) dans
15 ml de DMF anhydre. Le mélange réactionnel est agité pendant 15 heures à 23 C et finalement concentré à sec sous vide. Le résidu est dissous dans 100 ml d'AcOEt et la solution organique est lavée successivement par 50 ml d'HCl IN aqueux, 50 ml d'H20, 50 ml d'une solution aqueuse saturée de NaHC03, 50 ml d'H2O et finalement 50 ml de saumure. Après séchage sur MgS04, la solution organique est filtrée et concentrée à sec sous vide. Le résidu est repris par 50 ml d'EtzO, agité et filtré. Après rinçage par 2 x 25 ml d'EtO, la poudre blanche obtenue est séchée sous vide. Point de fusion : 195-196 C.
1.2) (2/?)-6-hydroxy-iV-[(35)-2-hydroxytétrahydro-3-furanyl]-2,5,7,8-tétraméthyI- 3,4-dihydro-2H-chromène-2-carboxamide : Dans un tricol, sous atmosphère d'Argon, on dissout 1,53 g (4,59 mmoles) de l'intermédiaire 1. 1 dans 75 ml de THF anhydre. L'ensemble est refroidi à -78 C, avant l'introduction, goutte-à-goutte, au moyen d'une ampoule à addition, de 18,4 ml (18,4 mmoles) d'une solution 1M de DIBAL dans CH2Cl2. Après 3 heures d'agitation à -78 C, la réaction est stoppée par l'introduction lente de 10 ml de MeOH. Une fois revenu à 20 C, le mélange réactionnel est versé dans 150 ml d'une solution de sel de Rochelle sous agitation vigoureuse. L'agitation est maintenue jusqu'à apparition de deux phases.
L'ensemble est décanté et la phase aqueuse est réextraite par 2 fois 50 ml de CH2Cl2. Les phases organiques sont rassemblées et lavées successivement par 50 ml d'H2O et 50 ml de saumure. Après séchage sur MgSO4 et filtration, le solvant est évaporé sous vide et le résidu est purifié sur une colonne de silice (éluant : Heptane/AcOEt : 2/8). On obtient une poudre blanche. Point de fusion 67-70 C.
Les exemples 2 à 11 illustrent des composés susceptibles d'être préparés selon les schémas de synthèse précédemment décrits.
Exemple 2 : 2-[3,5-di(tert-butyl)-4-hydroxyphénoxy]-N-(2-hydroxytétrahydro- 3-furanyl)acétamide Exemple 3 : N-I-(2-hydroxytétrahydro-3-furanyl)-N-4-(I-méthyl-2,3-dihydro-IH-indol- 5-yl)succinamide Exemple 4 : N-1-(4-anilinophényl)-N-3-(2-hydroxytétrahydro-3-furanyl)-
2-isopropylmalonamide Exemple 5 : N-1-(4-anilinophényl)-N-3-(2-hydroxytétrahydro-3-furanyl)isophthalamide Exemple 6 : N-1-(4-anilinophényl)-N-4-(2-hydroxytétrahydro-3-furanyl)terephthalamide Exemple 7 : N-1-(4-anilinophényl)-N-2-(2-hydroxytétrahydro-3-furanyl)phthalamide Exemple 8 : N-{l-[(4-benzyl-5-hydroxy-l,3-oxazolidin-3-yl)carbonyl]-2-méthylpropyl}- 6-hydroxy-2,5,7,8-tétramethyl-2-chromanecarboxamide Exemple 9 : N-(4-anilinophényl)-N'-{1-[(4-benzyl-5-hydroxy-1,3-oxazolidin- 3-yl)carbonylJ-2-méthylpropyl }urée Exemple 10 : N-{1-[(4-benzyl-5-oxo-1,3-oxazolidin-3-yl)carbonyl]-2-méthylpropyl}- 2-[3,5-di (tert-bu ty l)-4- hy droxyphénoxy] acétam ide Exemple 11 : 6-hydroxy-2.5.7.8-tétramethyl-N-{2-méthyl-l-[(3-oxo-l-pyrrolidinyl) carbonyl]propyl}-2-chromanecarboxamide Etude pharmacologique des produits de l'invention Etude des effets sur la Calpaine I porcine : La méthode utilisée est celle décrite par Mallya et coll. (Biochemical and biophysical research communications 248 293-296 (1998). L'activité calpain in vitro est suivie par la mesure de la fluorescence due à la dégradation d'un substrat artificiel de l'enzyme SucLY-AMC (Suc-Leu-Tyr-aminométhylcoumarine). L'aminométhylcoumarine libérée fluoresce à 460 nm sous une excitation à 380 nm. Les inhibiteurs testés sont dissous dans du DMSO à 40 fois la concentration finale. 5 \il de solution sont déposés dans une plaque 96 puits à paroi noire. 175 l/puits de tampon de réaction contenant la calpain I et son substrat sont alors ajoutés. La réaction est démarrée par l'ajout de 20 \il de CaClz 50 mM.
Le monoperoxyphtalate de magnésium, dont la molécule a été pour la première fois décrite dans le document EP- 0 027 693, correspond à une poudre soluble en milieu aqueux, ce à raison de 80 g/1 à 20 C, de formule suivante : celui-ci se présente, en règle générale, sous forme hydratée, en particulier hexahydratée.
Le monoperoxyphtalate de magnésium est actuellement notamment utilisé en tant qu'agent de blanchiment (libérateur d'oxygène) en particulier pour le blanchiment des tissus.
L'utilisation du monoperoxyphtalate de magnésium en tant qu'agent désinfectant, notamment dans le domaine médical ou vétérinaire, a également été proposée conformément au document GB-2 137 882 selon ce document, il est connu que le monoperoxyphtalate de magnésium présente une activité bactéricide, mais il n'y est pas fait allusion à des proprié- tés virucides ; plus, les concentrations préconisées pour obtenir une activité bactéricide sont relativement élevées, à savoir au moins 400 ppm d'oxygène actif (Avox) soit 0,67 % de monoperoxyphtalate de magnésium et, de préférence, une quantité supérieure à 2 000 ppm, c'est-à-dire 3,33 % de monoperoxyphtalate de magnésium.
Conformément à l'invention, on a vérifié l'activité bactéricide du monoperoxyphtalate de magnésium vis-à-vis de souches bactériennes fréquentes dans les élevages, à savoir les souches suivantes . Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Enteroccocus hirae, ce en appliquant les conditions expérimentales qui répondent aux
exigences d'homologation d'un désinfectant à usage agricole qui sont définies par la norme NF-T 72-301 (temps de contact 5 min. température 20 C, conditions de saleté : eau dure à 30 f, matière organique = albumine 1 % + extraits de levures 1 %).
Il est à noter que conformément aux exigences en matière d'homologation (norme NF-T 72-171) une substance est considérée comme active à une concentration d'emploi donnée lorsqu'elle permet de réduire le titre bactérien d'au moins 105, soit 5 Log.
L'évaluation de l'activité bactéricide du monoperoxyphtalate de magnésium sur les souches testées a donné les résultats rassemblés dans le tableau 1 ci-dessous : Tableau 1
Concentration active en monoperoxyphtalate de Equivalence Souches magnésium Avox (réduction > 105 Log) ~~~~~~~~~~~~~ Pseudomonas aeruginosa (CIP A22) # 5 000 ppm # 300 ppm Escherichia coli (CIP 53 154) # 2 500 ppm # 150 ppm Staphylococcus aureus (CIP 53 154) # 7 500 ppm # 450 ppm Enterococcus hirae (CIP 58 55) # 5 000 ppm # 300 ppm
On a ainsi pu déterminer que dans les conditions requises, le monoperoxyphtalate de magnésium s'est montré efficace sur les souches testées à une concentration de 7 500 ppm (soit 450 ppm d'oxygène libre).
Conformément à l'invention, on a également eu l'idée de vérifier si dans les conditions d'homologation susmentionnées, le monoperoxyphtalate de magnésium présentait également une activité virucide en particulier vis-à-vis de virus rencontrés en médecine vétérinaire. Selon les normes en
vigueur, une substance est considérée comme virucide lorsqu'elle permet de réduire le titre viral d'au moins 103, c'est-à-dire de 3 Log.
Ce test a été effectué sur le virus de la maladie de Talfan (enterovirus non enveloppé, à ARN). On a ainsi pu déterminer que, dans les conditions requises, le monoperoxyphtalate de magnésium présente une activité virucide à partir d'une concentration de 1 500 ppm.
On a, par ailleurs, vérifié que le monopéroxyphtalate de magnésium est non corrosif à température ambiante et à des concentrations de 1 000 à 10 000 ppm en présence de matières plastiques (Plexiglas, polycarbonates, PVC, polyéthylène, polypropylène, linoléum, caoutchoucs synthétiques, ...) de céramiques (dalles en grès cérame ou en terre cuite, mortier au ciment, ...) ou encore de métaux (acier, fer galvanisé, aluminium, ...) .
De plus, la faible toxicité et l'innocuité écologique du monoperoxyphtalate de magnésium sont mises en lumière par les données rassemblées dans le tableau 2 cidessous :
Toxicité aiguë LD50 (voie orale, 2300 MG/kg de poids par voie orale rat) vif Toxicité aiguë LD50 (voie dermi- 2000 mg/kg de poids par voie dermique que, lapin) vif Toxicité aiguë LD50 (voie nasale, Par inhalation rat) 0,84 mg/1 Effets toxiques (alimentation de > 620 mg/kg de Toxicité moyenne rats de laboratoire poids vif pendant 90 jours) Non mutagène selon Propriétés Mutagèle test de AMES nés (norme n ...) Toxicité chez le LC50 (7 jours, 38,5 mg :1 poisson truite arc en ciel) ~~~~~ Biodégradabilité > 83 % (10-20 mg/1) selon le test de Sturm (norme n OCDE 301 B)
Japan, 40, 2380 (1967), b) lorsque R représente un radical carbamoyle ou alkylcarbamoyle, on opère selon les méthodes classiques de transformation des acides en amide connues de l'homme du métier et qui n'altèrent pas le reste de la molécule, par exemple par traitement avec de l'ammoniac ou avec une amine primaire convenable (pour R représentant un radical alkylcarbamoyle), C - Préparation en phase solide, seconde variante Selon une autre variante, la synthèse en phase solide peut être effectuée comme suit : 1) Sur une résine classique de type résine de Wang substituée par un atome de brome ou d'iode ou par un groupe hydroxy, ou toute autre résine analogue convenable, on greffe l'acide 3-nitro-4-aminobenzoïque commercial, de façon à obtenir la résine substituée de formule générale (XIV) : Lorsque la résine de départ est substituée par un atome d'halogène, le couplage est effectué en présence d'un sel de césium et d'une base non-nucléophile dans la N- éthyldiisopropylamine, dans un solvant aprotique convenable. A titre de base non nucléophile, on peut par exemple utiliser les amines tertiaires, du carbonate de calcium ou encore du dicarbonate de sodium. Encore plus préférentiellement, les bases utilisées sont des amines tertiaires, par exemple la triéthylamine (TEA) ou la N- éthyldiisopropylamine (DIEA). Les solvants convenables peuvent être choisis parmi la N-méthylpyrrolidinone ou la diméthylformamide.
2) A la résine substituée de formule générale (XIV) obtenue à l'étape précédente, on ajoute du chlorure de 4-fluoro-3-nitrobenzylcarbonyle et on obtient ainsi la résine substituée de formule générale (XV) suivante :
Le couplage est effectué selon les méthodes de couplage peptidique classiques (Bodanski M., Principles and Practices of Peptide Synthesis, Ed. Springe-Verlag) ou par toute méthode analogue connue de l'homme du métier. Notamment, la réaction s'effectue généralement en présence d'une base non-nucléophile dans des solvants aprotiques convenables, à température comprise entre 0 et 100 C, le pH étant ajusté entre 9 et 11.
A titre d'exemple, le chloroforme, la diméthylformamide, la méthylpyrrolidone, l'acétonitrile, le dichlorométhane, le toluène ou le benzène peuvent être utilisés comme solvant.
Les bases non-nucléophiles employées sont préférentiellement des amines tertiaires, du carbonate de calcium ou du dicarbonate de sodium. Encore plus préférentiellement, les bases utilisées sont des amines tertiaires comme par exemple la triéthylamine (TEA) ou le N-éthyldiisopropylamine.
Avantageusement, le couplage peptidique est effectué entre 0 et 50 C, et de préférence entre 10 et 30 C.
Le chlorure de 4-fluoro-3-nitrobenzylcarbonyle est obtenu a partir de l'acide commercial correspondant selon toute méthode connue de l'homme du métier pour obtenir un halogénure d'acyle à partir d'un acide. Par exemple, on peut opérer par action du chlorure de thionyle à température comprise entre 70 C et 90 C environ.
3) Puis, l'atome de fluor de la résine substituée de formule générale (XV) obtenue à l'étape précédente est transformé en fonction amine, de façon à obtenir une résine substituée de formule générale (XVI) :
L'amination est opérée selon les méthodes classiques connues de l'homme du métier pour transformer un atome d'halogène en fonction amino, par exemple par substitution nucléophile en opérant en présence d'ammoniac dans un solvant convenable, par exemple le N,N-diméthylformamide.
4) les étapes 2) et 3) telles que décrites ci-dessus sont répétées successivement encore n-2 fois de telle sorte que l'on obtient une résine substituée de formule générale (XVII) :
5) On condense ensuite sur la résine substituée de formule générale (XVII) obtenue précédemment un dérivé d'halogénure d'acyle de formule générale (XVIII) : où Hal représente un atome d'halogène choisi parmi le chlore, le brome, l'iode ou le fluor, et R' est tel que défini précédemment, afin d'obtenir une résine substituée de formule générale (XIX) :
Le couplage est effectué selon les méth@ @des de couplage peptidique classiques (Bodanski M., Principles and Practices of Peptide Synthesis, Ed. Springe-Verlag) ou par toute méthode analogue connue de l'homme du métier. Notamment, la réaction s'effectue généralement en présence d'une base non-nucléophile dans des solvants aprotiques convenables, à température compile entre 0 et 100 C, le pH étant ajusté entre 9 et 11.
A titre d'exemple, le chloroforme, la dimethylformamide, la méthylpyrrolidone, l'acétonitrile, le dichlorométhane, le toluène et le benzène peuvent être utilisés comme solvant.
Les bases non-nucléophiles employées sont p@ @@érentiellement des amines tertiaires, du carbonate de calcium ou du dicarbonate de s@ dium. Encore plus préférentiellement, les bases utilisées sont des amines tertiaires comme par exemple la triéthylamine (TEA) ou le N-éthyldiisopropylamine.
Le dérivé d'halogénure d'acyle de formule generale (XVIII) est soit commercial, soit est obtenu a partir de l'acide correspondant @ @ toute méthode connue de l'homme du métier pour obtenir un halogénure d'acyle partir d'un acide. Par exemple, on peut opérer par action du chlorure de thionyle à température comprise entre 70 C et 90 C environ.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à l'aide de la description qui suit faite en regard des dessins annexés qui représentent : La figure 1 un tableau représentant une partition de la matrice de contrôle A.
Les figures 2 et 3 des groupements des m2 sous matrices de gauche du tableau de la figure 1 en une sous matrice MxM et n-m sousmatrices MxP.
Les figures 4 et 5 une matrice de contrôle A obtenue respectivement selon une première et une deuxième variante d'exécution du procédé selon l'invention.
Les figures 6 à 9 une matrice de passage pour le calcul des symboles de redondance.
Pour la mise en #uvre du procédé selon l'invention la matrice de contrôle, A, est subdivisée comme le montre la figure 1 en n sous-matrices de M lignes et P colonnes ou m x n sous-matrices carrées de P lignes et P colonnes telles que N=nP et M=mP et n et m premiers entre eux.
Les m2 sous-matrices de gauche sont ensuite regroupées comme le montre la figure 2 en une sous-matrice M x M (ceci permettra de simplifier grandement l'algorithme de codage) et les autres en n - m sous-matrices M x P .
Le procédé de construction est décrit ci - après selon deux variantes, selon que m est égal à 1 ou t.
Les valeurs différentes de m ne sont pas à envisager ici, à cause de la condition "a" qui exige que tr soit entier. En effet, tr = t N / M, soit encore t n / m. n et m étant premiers entre eux, m doit diviser t et ne peut donc être qu'égal à 1 ou t pour t premier et petit (vrai pour les faibles valeurs de t, à savoir 3, 5, 7).
Dans la première variante où m = 1 (codes de redondance r / (r - 1)),le procédé selon l'invention est valable pour les codes de taux de redondance N/K de la forme r / (r - 1), où le nombre de symboles de redondance est exactement N /r (r entier). Dans ce cas, M est égal à P et le tableau de la figure 2 se résume au tableau de la figure 3. Le procédé consiste alors à chercher n séquences de longueur M comportant t "1"et (M -t) "0".
Ces séquences notées ci-après w[0..n-1]r sont obtenues par : - une autocorrélation cyclique égale à 0,1, ou t (la séquence i décalée ne coïncide avec elle-même non décalée qu'en 0 ou 1 point) telle que pour tout i = O...n-1 : #k=0 M-1 w[i][k] w [i][k] = t (par définition) #K=0 M-1 w[i][k] w[i][(k + p) modulo M] = 0 ou 1, pour p = 1..M-1 - une intercorrélation cyclique égale à 0 ou 1 (la séquence i décalée ou non ne coïncide avec la séquence j qu'en 0 ou 1 point) telle que pour toute paire {i, j} où i = O...n-1 et j = O...n-1 sont différents :
L'algorithme de calcul des séquences w est très simple : il détermine successivement les positions pos[0][0...t-1], pos[1][0...t-1], pos[n-1 ][O...t- 1], où ces séquences possèdent un "1", en commen- ant par pos[x][0] = 0, pos[x][1]= 1, ..., pos[x][t-1]= t-1, et en les modifiant pour satisfaire les conditions d'autocorrélation et intercorrélation.
Pour t = 3, les boucles de calcul mises en #uvre sont montrées à l'annexe 1.
Cet algorithme échoue lorsque n est trop grand compte tenu de M : peu de "petits" codes sont trouvés, mais ceci est de peu d'importance car on cherche généralement des codes de grande taille (N 100).
Les colonnes de la matrice A sont alors tout simplement les vecteurs w permutés circulairement : - kème sous-matrice (k = O...n-1) A[ligne][colonne] = w[k][(ligne - (colonne - k P)) modulo M] Avec : ligne = O...M-1 et colonne = kP...(k + 1) P - 1 Ainsi, chaque ligne de A comporte exactement t valeurs non nulles dans chacune des n sous-matrices, soit un total de n = tr.
Un exemple de matrice A, obtenue par ce procédé pour un code LDPC(75,50, t=3, tr=9) de redondance 3 / 2 (r = n = 3) avec P = 25 est montré à la figure 4. Selon le tableau représenté on peut constater que: w[0][i] = 1 pour i = 0, 1, 3 w[1][i] = 1 pour i = 0, 4, 9 w[2][i] = 1 pour i = 0, 6,13 La construction proposée garantit que : - chaque colonne comporte exactement t valeurs non nulles (par définition des w) - chaque ligne comporte exactement tr valeurs non nulles (grâce aux propriétés d'autocorrélation et intercorrélation des w) - toute paire de colonnes distinctes a au maximum une valeur non nulle commune (idem)
- toute paire de lignes distinctes a au maximum une valeur non nulle commune (idem) Selon une deuxième variante inspirée de la précédente correspondant au cas où m=t le procédé selon l'invention recherche n - m + 1 séquences de longueur M comportant t "1"et (M -t) "0", séquences notées w[O..n-m].
4.6. Construction du plasmide binaire pMRT1182.
Le plasmide binaire pMRT1182 a été obtenu par insertion du fragment promoteur PrD35S CaMV et de la séquence uidA-lV2/term-:ios dans le plasmide binaire pMRi'lîl.
PrD35S CaMV a été isolé en digérant 10 ug du plasmide pJIT163# successivement par Kpnl et par Hir.dIII pendant 1 h à 37 C. Le fragment de 743 pb correspondant à PrD35S Camp a été séparé sur gel d'agarose à 0,8%, puis purifié à laide du Kit QIAquick Gel Extraction . La séquence uidA-IV2/term-nos a été obtenue par la digestion de 4 ug de plasmide pMRT1092 avec HindIII et EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment de 2,2 kb correspondant à la séquence uidA-IV2/term-nos a été séparé sur gei a'agarose à 0,8%, puis purifié à l'aide du Kit QIAquicK Gel Extraction . En parallèle, 10 pg de plasmide binaire pTRT 11s ont été digérés successivement par KpnI et EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment vecteur linéarisé a ensuite été déphcsphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d' intestin de veau (New England Biolabs) en présence de tampon 3 (IX), pendant 1 h à 37 C.
La ligation a été réalisée en présence de 100 ng de plasmide binaire, 50 ng du fragment PrD35S CaMV et. 50 ni du
fragment correspondant, à la séquence uiû:-1'~~,':rro-::s dans ur. volume réactionnel de 20 uj, en présence du tampon T4 ADN ligase (1X) et 400 unités d'enzyme T4 ADN ligase (leva Engiand Biolabs). L' incubation a été réalisée par cycles PCR dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du milieu réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en Kanamycine (50 ng/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
Le plasmide résultant a été appelé pMRT1182 et a été transféré dans la souche d'Agroacterium tumefaciens LBA4404 selon le protocole décrit précédemment en section 4.1 de l'exemple 4. Le clone d'agrobactérie obtenu a été appelé A1182.
Construction du plasmide binaire pMRT1207 contenant le promoteur MPrll39 (SEQ. ID13) , utilisé lors de la transformation stable du Mais.
Le plasmide binaire pMRT1207 a été obtenu par insertion de la cassette d'expression MPr]139 (SEQ.ID13) !uiàA-IV2/term-nos de pMRT 1139 dans le site HpaI du plasmide binaire pMRT1195 (Demande de brevet FR 99 '. ' 12 non publiée).
Pour ce faire, 7 ug de plasmide pXRT1139 ont été digérés successivement par EcoRI et XmnI pendant 1 h à 37 C. La cassette d'expression a ensuite été isolée sur un gel d'agarose à 0,7% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et soumis à l'action de 20 U du fragment Kïenow (new England Biolabs) pendant 30 min. à 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 pl de tampon MgCl2 (500 mM) et de 6 nul de DIT (1M).
En parallèle, 5 g de plasmide binaire pMRT1195 ont été digérés par HpaI pendant 1 h à 37 C. Le fragment vecteur linéarisé a ensuite été déphosphorylé par 4(: eT de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Eioldbs) en présence de tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h.
La ligation a été réalisée avec 100 ng de la cassette
Ij'e, Kanamycine (50 mg/1), a été extrait seL.::..~1 méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.