INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Aussi, la présente invention a pour objet une composition irisée pour application topique, comprenant au moins un polymère choisi parmi les polymères cationiques et les polymères amphotères, et des particules monodisperses de polymère en dispersion aqueuse, les dites particules ayant une taille moyenne en nombre allant de 50 à 300 nm.
On appelle taille moyenne en nombre le diamètre moyen en nombre des particules sphériques de polymère de la dispersion, cette taille étant la taille d'origine des particules avant leur mélange à d'autres constituants. En effet, la taille des particules peut être différente avant et après leur incorporation dans une composition, car, comme décrit ci-après, les particules peuvent être constituées de polymère comportant un monomère soluble ou gonflant dans les alcalins, si bien que les particules de polymère peuvent gonfler dans l'eau ou les alcalins après incorporation dans la composition à application topique.
1 Le produit d'amplification est purifié sur colonne Promega, digéré par les enzymes de restriction NcoI et NheI et cloné dans le plasmide pMODlLacZ (wt) linéarisé par NcoI et Nhel. Les séquences de l'ADN plasmidique de 2 clones résistants à la zéocine apparus après transformation de la souche d'Ecoli GT100 (disponible auprès de Invivogen) par le mélange de la ligation entre le fragment vecteur et le fragment PCR, ont été trouvées conformes à la séquence désirée présentée en Figure 1. Ce gène synthétique placé sous la dépendance du promoteur bactérien EM7 (vecteur pMODISh ACpG) confère une résistance à la zéocine identique à celle apportée par le même vecteur contenant le gène natif Sh ble avec la souche d'E coli réceptrice GT100.
EXEMPLE 2 : Construction du gène Hph de résistance à l'hygromycine dépourvu de CpG
Le gène synthétique Hph ACpG (séquence SEQ ID No. 3 présentée en Figure 3) a été construit selon la méthode décrite dans l'exemple 1. Les deux brins ont été synthétisés à l'aide d'oligonucléotides de 60 bases plus deux oligonucléotides de 30 bases avec une région chevauchante de 30 bases. L'assemblage des différents oligonucléotides présentés en Figure 4 a ID été réalisé par une PCR finale avec les oligonucléotides sens TTCAGCTGAGGAGGCACATC (SEQ ID No. 299) et reverse CTCAGGATCCGCTAGCTAAT (SEQ ID No. 300) selon les conditions expérimentales mentionnées dans l'exemple précédent.
Le fragment amplifié et purifié (1068 pb) a été ensuite digéré par les enzymes de restriction BspHI et Nhel et cloné dans le vecteur pMOD2 LacZ (wt) dans lequel le site NcoI de pMODl est remplacé par le site BspHI. La sélection des clones d'E. coli contenant ce vecteur recombinant a été effectuée sur milieu FastMedia Hygro Agar (Cayla). La séquence SEQ ID No. 3 de la figure 3 a été confirmée par séquençage sur les deux brins de l'ADN plasmidique de deux clones résistants à l'hygromycine. Ce gène synthétique placé sous la dépendance du promoteur bactérien 1 EM7 (vecteur pMOD2 Hph ACpG) confère une résistance à l'hygromycine B au moins égale à celle apportée par le même vecteur contenant le gène natif Hph avec la souche d'E. coli réceptrice GTIOO.
EXEMPLE 3 : Construction du gène Bsr de résistance à la blasticidine dépourvu de CpG.
Le gène Bsr ACpG dont la séquence est présentée en figure 5 (SEQ ID No. 5) a été synthétisé à ZD partir des oligonucléotides indiqués en 6 en suivant la méthode décrite dans l'exemple 1. Le mélange des oligonucléotides assemblés a été amplifié avec les amorces OL64 et OL76 (cf.
Figure 6). Le fragment amplifié et purifié a été ensuite digéré par les enzymes de restriction BspHI et Nhel et cloné dans le vecteur pMOD2 LacZ (wt). La sélection des clones d'Ecoli contenant ce vecteur recombinant a été effectuée sur milieu FastMedia Blasti Agar (Cayla). La séquence SEQ ID No. 5 de la figure 5 a été confirmée par séquençage sur les deux brins de l'ADN plasmidique de deux clones résistants à la blasticidine. Ce gène synthétique placé sous la dépendance du promoteur bactérien EM7 (vecteur pMOD2 Bsr ACpG) confère une résistance à la blasticidine identique à celle apportée par le même vecteur contenant le gène natif Bsr avec la souche d'Ecoli réceptrice GTIOO.
EXEMPLE 4 : Construction du gène Pac de résistance à la puromycine dépourvu de CpG
Le fragment BspHI-NheI (gène Pac ACpG ; SEQ ID No. 7) dont la séquence est présentée en figure 7 a été synthétisé par un assemblage des oligonucléotides indiqués en Figure 8.
Le mélange des oligonucléotides assemblés a été amplifié avec les amorces sens pur24 (AGGACCATCATGACTGAG ; SEQ ID No. 301) et reverse pur25 (ATCATGTCGAGCTAGCTC ; SEQ ID No. 302). Le fragment BspHI-NheI purifié a été cloné dans le plasmide pMOD2LacZ (wt) entre les sites BspHI et Nahe !. Les séquences de l'ADN plasmidique de 2 clones de la souche GT100 résistants à la puromycine apparus sur le milieu FastMedia puro Agar (Cayla) après transformation par le produit de la ligation entre le ID fragment vecteur et le fragment PCR, ont été trouvées conformes à la séquence désirée présentée en Figure 7. Le gène synthétique Pac ACpG placé sous la dépendance du promoteur bactérien c ID EM7 (vecteur pMOD2 Pac ACpG) confère une résistance à la puromycine légèrement supérieure à celle apportée par le même vecteur contenant le gène natif pac avec la souche réceptrice GT100 d'E. coli.
EXEMPLE 5 : Construction du gène LacZ dépourvu de CpG codant pour la ss-galactosidase d'E. coli Le gène synthétique LacZ ACpG (SEQ ID No. 9 présentée en Figure 9) a été construit selon la méthode décrite dans les exemples précédents. Compte-tenu de la taille du gène à réaliser (plus de 3000 pb), la construction a été effectuée en trois parties distinctes en conservant les sites de restriction EcoRV et SacI aux mêmes sites que sur la séquence native du gène lacZ. Pour chaque partie, les deux brins ont été synthétisés à l'aide d'oligonucléotides de 40 bases plus deux oligonucléotides de 20 bases avec une région chevauchante de 20 bases.
La première région correspond au fragment NcoI-EcoRV (Partie I), la deuxième région correspond au fragment EcoRV-SacI (Partie II) et la troisième région correspond au fragment SacI-NheI. L'assemblage des différents oligonucléotides présentés dans les figures 10A (oligonucléotides utilisés pour l'assemblage de la partie I), 10B (oligonucléotides utilisés pour l'assemblage de la partie II), 10C (oligonucléotides utilisés pour l'assemblage de la partie III), a été réalisé par PCR selon les mêmes conditions expérimentales énoncées dans les exemples précédents. Le clonage progressif des trois parties du gène synthétique a été effectué dans le vecteur pMOD 1 LacZ (wt). La fonctionnalité de chaque partie clonée ainsi que celle du gène synthétique complet présent sur le vecteur pMODl LacZ a été démontrée par la révélation de
l'activité ss-galactosidase sur milieu FastMedia Amp Xgal Agar (Cayla) des clones recombinants obtenus dans la souche MC1061ALac. Le gène synthétique complet LacZ ACpG mis sous la dépendance du promoteur EM7 donne 30% de moins d'activité ss-galactosidase (dosage luminométrique d'extraits protéiques de culture) par rapport à l'expression du gène natif 1 LacZ dans le même environnement plasmidique.
EXEMPLE 6 : Construction d'un promoteur constitutif fort d'E. coli dépourvu de CpG Le promoteur bactérien EM7 présent sur les vecteurs de type pMODl est un promoteur synthétique, constitutif et fort chez E. coli. Sa séquence qui contient 3 CpG (SEQ ID No. 297 en Figure 11) a servi de référence pour élaborer un promoteur bactérien dépourvu de CpG. Nous avons réalisé des oligonucléotides"linker"dégénérés à 4 endroits (indiqués W, D, W et H sur la séquence SEQ ID No. 298 en Figure 11) et compatibles avec les sites de restriction AseI et NcoI.
Ces différents oligos ont été hybridés et clonés dans le pMOD ShACpG entre les sites de restriction AseI et NcoI du promoteur EM7.
Après sélection des clones recombinants sur milieu FastMediaZeo Agar et détermination de la séquence promotrice du clone le plus résistant à la zéocine, nous avons retenu le promoteur EM2K (séquence SEQ ID No. 11 en Figure 11) comme promoteur bactérien dépourvu de CpG.
- hydrolyse entre 200C et 50 C et à pH acide en présence d'une- protéase, - séparation des phases soluble et insoluble par tout moyen ou toute combinaison de moyens, par exemple : décantation, filtration ou centrifugation, - filtration stérilisante pour atteindre une flore mésophile totale inférieure à 100 germes/g, et une absence de levures et de moisissures.
Le principe actif obtenu est caractérisé par les paramètres suivants : - un taux de matière sèche obtenu par passage dans une étuve à 105 C pendant 16 heures, compris entre 20 et 200 g/l, plus particulièrement compris entre 40 et 100 g/l.
- un pH mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante, compris entre 3,0 et 7,0, plus particulièrement entre 4,0 et 7,0.
- un taux de polyphénols totaux, exprimés en équivalent d'acide gallique compris entre 1,0 et 20,0 g/l, plus particulièrement entre 1,0 et 10,0 g/l et spécifiquement entre 1,0 et 5,0 g/l.
L'invention couvre aussi des traitements cosmétiques.
La description qui va suivre est faite en regard des dessins annexés sur lesquels les différentes figures représentent : - figure 1, un tableau de l'expression d'HSP 72 obtenu en présence du principe actif selon la présente invention, - figure 2, un tableau comparatif de l'expression d'HSP 72 en fonction de l'âge, - figure 3, un tableau des résultats des effets anti-rides - figure 4, un tableau des résultats de fatigabilité de la peau, - figure 5, un tableau de l'activité anti-radicalaire, - figure 6, un tableau du taux de protection vis-à-vis des agressions UVA/UVB, et - figure 7, un tableau des résultats obtenus par action du principe actif vis-à-vis des interleukines relâchées.
11 PROCEDE D'EXTRACTION :
Le procédé selon la présente invention consiste à réaliser la successiondes étapes suivantes : - solubilisation de Salix, salix alba ou salix purpura ou salix viminalis ou salix daphnoides ou salix fragiles ou salix pentandra dans de l'eau, - hydrolyse à 20 C environ et à pH acide, en présence d'une protéase, - décantation, - séparation des phases soluble et insoluble par tout moyen ou toute combinaison de moyens, par exemple : décantation, filtration ou centrifugation.
- concentration éventuelle de la fraction active d'au moins 30%, et - filtration stérilisante pour atteindre une flore mésophile totale inférieure à 100 germes/g, et une absence de levures et de moisissures, notamment par passage sur une membrane microporeuse à 0, 22 um.
2/CARACTERISATION DU PRINCIPE ACTIF OBTENU Taux de matière sèche : La matière sèche est obtenue par passage du principe actif extrait dans une étuve à 105 C pendant 16 heures. La quantité de matière sèche obtenue est comprise entre 20 et 200 g/l, plus particulièrement comprise entre 40 et lOOg/L Mesure du pH : Le pH est mesuré par la méthode potentiométrique à température ambiante. Le pH est compris entre 3,0 et 7,0, plus particulièrement entre 4,0 et 7,0.
Polyphénols totaux : La détermination est réalisée par réaction des polyphénols en présence de ferricyanure de potassium et par une détection consécutive des complexes colorés formés, à 715 nm.
On compare ensuite par rapport à un étalon d'acide gallique couvrant la plage concernée de mesures.
On obtient les résultats suivants exprimés en équivalent d'acide gallique : taux de polyphénols totaux compris entre 1,0 et 20,0 g/t, plus
particulièrement entre 1,0 et 10,0 g/l et spécifiquement un taux compris entre 1, 0 et 5, 0 g/1.
Stabilité : De plus, le principe actif, à des dosages compris entre 1 et 5 % en volumes, est tout à fait stable dans des milieux ayant un pH compris entre 2,0 et 10,0 et stable en température jusqu'à 80 C pendant plusieurs heures.
3/EFFETS DU PRINCIPE ACTIF SUR LA SYNTHESE DES HSP 72 L'étude est conduite sur des kératinocytes humains avec induction thermique et sans induction thermique.
Ce modèle dynamique repose sur la représentation interne du système, habituellement exprimée par les équations : F A A A fi = AX+ BU + (F-Y) A A y = ex + DU i
Dans ces équations, U représente le vecteur des entrées de la chaîne électromécanique, X représente un élément de l'espace d'état du système, Y représente le vecteur des sorties du système et A, B, C et D sont des matrices dont les coefficients sont des nombres A A réels. Les symboles X et représentent les valeurs estimées de X et Y obtenues par la mise en oeuvre du modèle.
Dans la pratique, l'observateur 18 peut notamment être constitué par un filtre de Kalman. Dans ce cas, les calculs s'effectuent de façon linéaire et en temps discret. Ce type d'observateur a notamment pour avantage d'être à variances minimales. Toutefois, tout autre observateur permettant d'obtenir des résultats comparables, tel qu'un filtre de Luenberger, peut être utilisé sans sortir du cadre de l'invention.
Afin d'assurer une représentation fidèle de l'état interne du système, le modèle prend en compte le modèle électromagnétique et le modèle mécanique de la chaîne électromécanique, ainsi que les perturbations intervenant sur le couple résistant appliqué à la charge.
Ainsi, la représentation de l'actionneur de couple 12 comprenant le convertisseur de puissance 16 et le moteur 14 est faite par un premier modèle d'état équivalent en continu, dont l'évolution libre est représentée par :
De façon comparable, la chaîne cinématique 13 est représentée par un deuxième modèle d'état
équivalent en continu, dont l'évolution libre est représentée par :
L'interconnexion des deux blocs ainsi définis conduit à représenter la chaîne électromécanique sous une forme dont l'évolution libre est représentée par : [Y 1 F. 1 C Dans cette relation, l'expression"couplagell2" désigne une matrice de coefficients de couplage entre l'actionneur de couple 12 et la chaîne cinématique 13.
Afin de prendre également en compte les perturbations du couple iL appliqué à la charge, on prend pour hypothèse que ri=0.
Le système peut alors être décliné sous la forme d'un modèle dynamique tel que la réponse à l'entrée consigne de couple F* peut être représentée par : [Ai COMpg COM/7/lage LA-rJ fY 1 FX 1 rxcc l 1/2 let2/3 LJ LJ - eL-loi loi loi FLL J [o] [o] [o] LrJ Dans cette relation, l'expression Il couplagelet2/3 Il désigne une matrice de coefficients de couplage entre l'ensemble formé par l'actionneur de couple 12 et la chaîne cinématique 13, et la charge 10.
Les coefficients des matrices de couplage Il couplagel/2 Il et"c < 3M'/a. l2/3" ainsi que les différents coefficients
des matrices Acc, AAE et B sont définis par l'homme du métier en fonction des caractéristiques respectives de la chaîne cinématique 13, de l'actionneur de couple 12 et des perturbations du couple résistant appliqué à la charge 10. On conçoit que cette opération découle de la simple mise en oeuvre des connaissances de base d'un spécialiste de l'automatique.
Comme on l'a représenté schématiquement sur la figure 3, le correcteur 20 résulte d'un correcteur robuste 38 d'ordre non entier, de type CRONE, dont la réalisation physique est assurée par un correcteur d'ordre entier 36, obtenu par approximation dans le domaine fréquentiel.
Le correcteur 38 d'ordre non entier est un correcteur de type CRONE de troisième génération, défini par : où Go (s) désigne la transmittance de l'ensemble constitué de la chaîne cinématique caractérisée par les valeurs nominales de ces paramètres et de l'observateur (Go (S) ==L (S)/r* (s)), et où la transmittance P (s) est caractérisée par - sign (b) sign S 1 s 1± (l+ r 1± úJh ss S = ('+ S I. b - L i±L i±L r,. r'' úJb " L Je, (J (Ob O) b, \, L, O) b/JC i/O) h f
les coefficients Vo, cob et fUh constituent les seuls coefficients de réglage du correcteur 38. En d'autre terme, le réglage du correcteur est effectué dès lors que les valeurs de ces trois coefficients sont établies. Cette caractéristique constitue un avantage essentiel de l'invention puisqu'elle autorise un réglage pratiquement aussi simple que dans le cas où l'on utilise un correcteur non robuste tel qu'un correcteur de type PI ou PID.
Conformément à l'approche CRONE : - le terme Yo permet un placement en gain, - le terme à l'exposant nb permet l'annulation d'erreurs statique ou de traînage, - le terme à l'exposant nh permet de réduire la sensibilité du correcteur aux bruits de mesure.
Les facteurs de bruit obtenus en utilisant une amplification Raman sont meilleurs que ceux que
l'on obtient avec des amplificateurs EDFA, ce qui permet de diminuer les puissances optiques transmises et donc de diminuer l'intervalle spectral entre canaux.
De surcroît, contrairement aux amplificateurs EDFA qui ne permettent d'amplifier que la bande C, les amplificateurs à effet Raman stimulé permettent d'amplifier une bande spectrale beaucoup plus large moyennant un assemblage adapté de lasers de pompage.
En théorie, un amplificateur Raman peut ainsi couvrir toutes les longueurs d'onde entre 1300 nm et 1660 nm, c'est-à-dire beaucoup plus que les bandes actuellement couvertes par les amplificateurs à fibres dopées.
Ainsi, le spectre actuel de transmission DWDM s'étend sur une centaine de nanomètres (bandes C et L) pour une séparation spectrale entre canaux de 0,8 nm. Or on pense pouvoir améliorer les amplificateurs TDFA pour la bande S, ce qui permettrait de couvrir une bande spectrale totale d'environ 150 nm (bandes S, C et L).
L'augmentation de capacité en DWDM rend donc prévisible l'apparition d'amplificateurs Raman qui sont compatibles avec le réseau optique existant et pour lesquels la gamme spectrale totale atteint plus de 350 nm, d'où un total de près de 900 canaux par fibre optique (pour une séparation entre canaux de 0,4 nm) au lieu d'à peine une centaine actuellement.
Afin de gérer efficacement la répartition des canaux de télécommunications, il est donc nécessaire d'utiliser des analyseurs de spectres optiques permettant de couvrir toute les gammes
spectrales mentionnées précédemment et d'identifier précisément les canaux pour en déduire leur occupation.
En particulier, il est important de disposer d'un analyseur de spectre optique afin de vérifier les attributions en longueur d'onde et de maintenir un faible taux d'erreur sur tous les canaux.
Il est également important de mesurer l'intensité des signaux optiques avec un bon rapport signal-sur-bruit.
Pour les opérateurs de télécommunications, il est souhaitable de concevoir un spectromètre compact, portable, à coût optimisé, permettant d'analyser le contenu spectral de la grille ITU et de vérifier la position en longueur d'onde (pour analyser une éventuelle dérive) ainsi que la puissance de chacun des canaux.
De plus, il est souhaitable que le pouvoir séparateur de ce spectromètre soit environ égal ou supérieur à 30000 et que la gamme de longueur d'onde observée permette de satisfaire au futur standard de bande passante (entre 120 nm et 180 nm). Le nombre total de points de mesure est donc au moins de l'ordre de 2400 à 3600 et de préférence proche de 7200.
Un tel spectromètre devient vital pour les futurs réseaux DWDM et serait largement utilisé pour des contrôles optiques en chaque noeud d'un réseau ( network ) comportant un injecteur-extracteur de longueur d'onde ( wavelength add-drop device ), un terminal ou un amplificateur.
Les dispositifs d'analyse spectrale commercialisés, permettant d'observer le spectre défini selon les normes définies par l'UIT, sont des
spectromètres à réseaux de diffraction ( diffraction gratings ) à simple ou double passage, des cavités interférométriques de Fabry-Perot à balayage en espace libre ou des spectromètres à Transformée de Fourier fondés sur des interféromètres de Michelson.
Tous ces dispositifs connus sont coûteux, encombrants et fragiles. De surcroît, leurs fréquences de travail sont environ égales ou inférieures à 100 Hz et ils ne permettent pas de garantir un pouvoir séparateur de plus de 30000 sur plus de 40 nm.
La peau est soumise à de nombreux stress et notamment ceux engendrés par la chaleur et les rayonnements UV, au cours d'expositions au soleil de trop longue durée et/ou de trop forte intensité.
Toutes les cellules des organismes vivants (hommes, animaux, plantes, bactéries) répondent notamment à ce type de stress par la synthèse de protéines spécifiques appelées protéines de choc thermique ou Heat Shock Proteins (HSP). Ces protéines constituent un système important de la protection cellulaire en biologie cutanée.
Les HSP sont classées en 5 classes selon leur poids moléculaire et leur homologie de séquence : HSP 110, HSP 90, HSP 70, HSP 60 et HSP 27.
La première fonction de ces protéines est celle de thermotolérance.
Ainsi, lorsque l'on soumet des kératinocytes à un traitement thermique d'une heure à 40 C ou 41 C, on provoque une augmentation du taux d'ARNm et de la synthèse des HSP.
Une telle réaction permet de limiter la dénaturation pendant le stress.
Ces protéines jouent un rôle prépondérant dans la construction et même la réparation des dommages induits.
Ces protéines assurent non seulement un rôle de protection mais aussi la reproduction de protéines fonctionnelles, le maintien des fonctions cellulaires et la restauration des fonctions métaboliques basiques, tout en permettant l'élimination des radicaux délétères.
Les HSP 70 représentent les protéines les plus étudiées car elles sont majoritairement synthétisées par les cellules eucaryotes.
On distingue dans cette catégorie deux formes l'une constitutive, HSP 73 ou 70 et une forme inductible, notamment sous les effets de stress, HSP 72.
On retrouve cette forme inductible dans les fibroblastes et les kératinocytes.
Les HSP 72 sont induites par la chaleur mais aussi par les UVB.
On sait aussi (Muramatsu. T & al, 1966, British Journal of Dermatology, 134 : 1035-1038) que l'inductibilité des HSP 72 diminue avec l'âge. Des études immunohistochimiques ont montré un niveau d'induction plus faible sur des explants de peau de donneurs âgés que sur des explants de donneurs Jeunes.
Dans le cas plus spécifique des fibroblastes, une étude récente (ConradGutsmann & al, 1998, Experimental cell research 241 : 404-413) a montré également que les fibroblastes de jeunes donneurs expriment des taux de HSP 72 plus élevés que des donneurs âgés, que ce soit avant ou après le stress thermique.
La présente invention a pour but de proposer un procédé d'extraction d'un principe actif à partir de salix qui est riche en polyphénols (type acides phénoliques), pour stimuler l'induction de HSP 72 avec un effet anti-âge et pour assurer la protection des cellules cutanées.
A cet effet, le procédé d'extraction d'un principe actif riche en polyphénols, notamment pour augmenter la production de HSP 72 face à des stress engendrés par la chaleur et/ou les rayonnements UVB, se caractérise en ce qu'il comprend la succession des étapes suivantes : - solubilisation de Salix, salix alba ou salix purpurea ou salix viminalis ou salix daphnoides ou salix fragilis ou salix pentandra dans de l'eau,
Dans le cas d'une chaîne électromécanique présentant des résonances multiples, on associe à cette transmittance autant de filtres de réjection qu'il existe de modes résonants, comme décrit au sous chapitre 3. 4 ("Cas des procédés résonants") dans l'ouvrage précité.
On obtient, de préférence, le correcteur d'ordre entier en effectuant une troncature fréquentielle en basse et haute fréquences, définie par des bornes fréquentielles basse #b et haute #h et en
calculant, par approximation sur cette plage de fréquences (Wb oh) 1 la transmittance équivalente d'ordre entier CN (s) 1 à partir de la relation : dans laquelle : avec col et 17 > 1, et où Co est le gain à fréquence nulle.