INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La détection des anticorps dirigés contre les antigènes suivants : Pal, Ole, Myr, Pl, MAD, FarCys, Aze, NO-Cys, NO-Phe, Ig3 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie M), g5 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie M), Ig12 (anticorps d'isotypie A et d'isotypie Mt Ig 13 (anticorps d'isotypie M) et ! g19 (anticorps d'isotypie A), permet d'établir le diagnostic de la PR.
Dans la description et les revendications, on utilise les abréviations suivantes : SAB : sérum albumine bovine G : résidu de glutaraldéhyde AG : résidu d'anhydride glutarique PBS : tampon phosphate salé OPD : ortho-phénylènediamine H202 : eau oxygénée H2SO4: acide sulfurique PI : phosphatidylinositol CaCI2 : chlorure de calcium NaCI : chlorure de sodium DO : densité optique SAH : sérum albumine humaine SAH-EA : sérum albumine humaine sur laquelle est accrochée de l'éthylènediamine Ig : immunoglobuline Ach : acéty ! chotine Ole : acide oléique Pa ! : acide palmitique
Myr : acide myristique FarCys : Farnésyl cystéine MDA : malondialdéhyde (néo-épitope résultant de la lipoperoxydation) (avec R = protéine) NO-Cys : NO-cystéine (néoépitope dû à la nitrosylation de la cystéine) NO-Trp : NO-tryptophane (néoépitope dû à la nitrosylation du tryptophane) NO-Asn : NO-asparagine (néoépitope dû à la nitrosylation de l'asparagine)
NO-Tyr : NO-tyrosine (néoépitope dû à la nitrosylation de la tyrosine) NO2-Tyr : NO2-tyrosine (néoépitope dû à la formation de peroxynitrite : NO+0) NO-His : NO-histidine (néoépitope dû à la nitrosylation de !'histidin) NO-Phe : NO-phénylalanine (néoépitope dû à la nitrosylation de la phénylalanine) NO-Met : NO-méthionine (néoépitope dû à la nitrosylation de la méthionine)
NO-Arg : NO-arginine (néoépitope dû à la nitrosylation de l'arginine) NO-Cr : NO-créatine (néoépitope dû à la nitrosylation de la créatine)
Le transporteur ABCA4 a par ailleurs été associé aux maladies dégénératives et inflammatoires occulaires telles que la maladie récessive de Stargardt (Allikmets et al., 1997) et la dégénérescence de la région maculaire de la rétine liée à l'âge (AMD) (Allikmets et aL, Nat. Genet. 15 (1997) 236-246 ; Allikmets et al., Science, 277 (1997) 1805-1807 ; Cremers et al., Hum. Mol. Genet. (1998), 7 (3), 355-62 ; Martinez-Mir et al., Nat. Genet. 18 (1998) 11-12 ; Weng et aL, Cell (1999) 98 (1), 13-23).
Chez l'homme, un ADNc comprenant la totalité de la phase de lecture ouverte d'un nouveau membre de la sous famille A des transporteurs ABC ( ATP- Binding Cassette ) a été récemment cloné à partir d'ARN de macrophages humains, et est désigné ABCA7 (Kaminski et al., BBR, 273 (2000), 532-538).
La caractérisation de la séquence complète en acides aminés de ABCA7 indique que le produit protéique présente la structure générale caractéristique des transporteurs ABCA, en ce qu'elle comporte la structure symétrique comprenant les deux domaines transmembranaires et deux motifs NBF. En plus de ces motifs caractéristiques, la protéine ABCA7 présente d'autres motifs qui ont été récemment identifiés comme étant caractéristiques des transporteurs ABCA, à savoir la région HH1 et la région hot spot (Broccardo et al., Biochim. Biophys. Acta (1999) 1461, 395-404).
Comme les autres membres de la sous famille A des transporteurs ABC, la séquence de la protéine ABCA7 est hautement conservée chez la souris et chez l'homme, avec une identité inter-espèce de 79%. La protéine ABCA7 présente de plus une organisation intron-exon caractéristique des membres de la sous famille ABCA, ainsi qu'une forte homologe de séquence notamment avec les transporteurs humains ABCA1 et ABCA4, respectivement de 54% et de 49%.
Par ailleurs, la protéine transporteur ABCA7 semble présenter un profil de régulation dépendant des flux de stérol, similaire à celui des autres membres de la sous famille A, et notamment du transporteur ABCA1 (Langman et al., BBR Com ; 257 (1999), 29-33 ; Laucken et al., PNAS, 97 (2000) 817-822). Il a été en effet observé par Kaminski et al. (supra) une augmentation de l'expression de ABCA7 après incubation des macrophages humains en présence de lipoprotéines de faible densité acétylées (AcLDL) qui induisent une charge de stérol, ainsi qu'une diminution de l'expression en présence de l'accepteur de cholestérol HDL3 qui provoque une diminution de la charge en stérol.
D'autre part, ABCA7 présente comme les autres membres ABCA une certaine spécialisation de son expression tissulaire, le messager de ABCA7 étant présent de manière prédominante dans les tissus hématopoïétiques constitués par les lymphocytes, les granulocytes, le thymus, la rate, la moelle osseuse, ou les tissus foetaux, alors que l'expression de ABCA1 est prédominante dans les macrophages et le placenta, et que celle de ABCA4 est restreinte dans la rétine (Rust et al., Nat.
Genet, 22, (1999) 352-355).
L'ensemble des données précédemment exposées relatives à l'identité des séquences protéiques, au mécanisme de régulation et la spécificité de l'expression suggère que le gène ABCA7 constitue un autre transporteur de la sous famille A, et que celui-ci présente une fonction similaire ou même redondante à celle des autres transporteurs et notamment à celle du transporteur ABCA1. Ce transporteur interviendrait donc vraisemblablement en tant que médiateur dans le métabolisme des lipides, et il est très possible qu'il soit, au même titre que le transporteur ABCA1, responsable de certains dysfonctionnements ou déficiences métaboliques. Par ailleurs, la spécialisation de l'expression du transporteur ABCA7 indique vraisemblablement que ce dernier joue un rôle dans le transport transmembranaire (export) des lipides dans les tissus hématopoïétiques, et possiblement dans les
mécanismes de signalisation Iymphocytaires de l'immunité, par exemple dans le cas de la pathogenèse de l'athérosclérose comme l'indiquent Kaminski et al. (Supra).
Bien que l'expression du gène ABCA7 humain semble être régulée selon le type de cellule ou encore la situation métabolique d'un type cellulaire donné, la ou les séquences permettant de réguler ce gène n'étaient pas connues.
Or, il existe un besoin dans l'état de la technique d'identifier ces séquences régulatrices pour les raisons suivantes : a) Ces séquences sont susceptibles d'être mutées chez des patients atteints d'une pathologie liée à un déficit dans le transport des lipides, possibles substrats de la protéine ABCA7 ou chez les patients susceptibles de développer de telles pathologies.
La caractérisation des séquences régulatrices du gène ABCA7 humain permettrait de détecter des mutations chez des patients, en particulier de diagnostiquer les individus appartenant à des groupes familiaux à risques. En outre, l'isolement de ces séquences régulatrices rendrait possible la complémentation de la séquence mutée par une séquence fonctionnelle susceptible de pallier les dysfonctionnements métaboliques induits par la ou les mutations diagnostiquées, grâce à la construction de moyens thérapeutiques ciblés, tels que des moyens destinés à la thérapie génique. b) La caractérisation des séquences régulatrices du gène ABCA7 mettrait à la disposition de l'homme du métier des moyens aptes à permettre la construction par génie génétique puis l'expression de gènes déterminés dans les types cellulaires dans lesquels le gène ABCA7 est préférentiellement exprimé. c) Par ailleurs, certaines parties des séquences régulatrices du gène ABCA7 pourraient constituer des séquences promotrices constitutives à fort niveau d'expression, de nature à permettre la construction de moyens nouveaux pour l'expression de séquences déterminées dans les cellules, complétant un ensemble de moyens déjà existants.
Force est de constater que, malgré les efforts entrepris, les séquences régulatrices du gène ABCA7 étaient restées jusqu'à ce jour totalement inconnues.
Les inventeurs ont désormais isolé puis analysé un ADN génomique humain de 33,5kb comprenant les 46 exons du cadre ouvert de lecture du gène ABCA7 ainsi que la région non transcrite d'environ 1, 1 kb localisée du côté 5'de
l'exon 1, en amont du site +1 de transcription, et comprenant des signaux de régulation du gène ABCA7 humain.
Les inventeurs ont également isolé puis analysé un ADN génomique murin de 20Kb comprenant les 45 exons du cadre ouvert de lecture du gène ABCA7 ainsi que la région non transcrite d'environ 1,2Kb chez la souris localisée du côté 5'de l'exon 1, en amont du site +1 de transcription, et comprenant des signaux de régulation du gène ABCA7 murin. DEFINITION GENERALES Le terme"isolé"au sens de la présente invention désigne un matériel biologique (acide nucléique ou protéine) qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement).
Les paquets sortants vers le bus 41 sont transmis à travers le bus de transmission TxBus 70.
Les paquets sortants vers le bus 45 sont transmis à travers le bus interne de réception RxBus 80.
Le moyen 60 d'arbitrage est en charge de la gestion des accès en écriture sur le bus TxBus 70 contrôlant l'ouverture : de registres à trois états 1,2, 3 et 4 grâce à des signaux OpenTxr[O :/con Rx 40 pour les données issues des FIFO d'entrée 9, 10, 11 et 12 ; et
de registres à trois états 14 grâce à des signaux de contrôle OpenRxTS-onTx 33 pour les données issues de la mémoire 16.
Les opérations de lecture du bus TxBus 70 vers un port de sortie de l'interface 104 sont gérées par le moyen d'arbitrage 60 en fonction du signal de contrôle vers les FIFO associées à chaque port TxFIFOfull[0 :2] 43 et WriteTxFIFO[0 :2] 42.
Le moyen d'arbitrage 60 gère aussi les accès en écriture vers le bus RxBus 80 en contrôlant l'ouverture : de registres à trois états 5,6, 7 et 8 à travers des signaux OpenTxTs[O : 3 LonRx 39 pour les données issues des FIFO d'entrée 9,10, 11 et 12 ; et d'un registre à trois états 21 à travers des signaux de contrôle OpenRxTs~onRx 34 pour les données issues de la mémoire 15.
Le moyen d'arbitrage 60 effectue aussi les opérations de lecture de données sur le bus RxBus 80 pour une écriture vers l'une des mémoires d'assemblage 22,23 ou 24 (en anglais"assembly buffers"). L"'assembly buffer"sert de tampon pour la conversion des données entre le bus 80, sur lequel les données sont exprimées sur 18 bits (16 bits de données et 2 bits de contrôle), et les O~FIFOs 25, 26 et 27, dans lesquelles les données sont exprimées sur 34 bits) (32 bits de données et 2 bits de contrôle).
Ces tailles de bus sont liées à des contraintes physiques. Le module 84 transmet au moyen d'arbitrage 60 un signal de contrôle R x F/FO/MO ; 27 83, indiquant le degré de remplissage des FIFO 25, 26 et 27. Le moyen d'arbitrage 60 génère un signal de contrôle WriteO~FIFO[2 :0] 35 à destination d'un module 84 de contrôle des FIFO de sortie, en fonction du degré de remplissage des FIFOS 25,26 et 27.
Le moyen d'arbitrage 60 pour le multiplexage des données sur les bus 70 de transmission TxBus et 80 de réception RxBus utilise des signaux
46 de cycle EN-cycle [0 : 21. C'est le moyen 20 de génération de cycle, par exemple un compteur de Johnson, qui génère ces signaux 46.
Le traitement des données entrantes va maintenant être détaillé en fonction de l'origine de ces données : le bus 44 ; le bus 45.
Les données entrantes en provenance du bus 44 RxDI 7.'0/ou du bus 45 seront routées vers le commutateur pour aller : vers le bus 41 TxD0[17 :0] soit en direction de l'interface 104 ; ou vers le bus 45 soit en direction de la DPRAM 106.
Le traitement des données entrantes en provenance du bus 44 va maintenant être exposé.
Les échanges de données sur le bus 44 sont gérés à travers le moyen 18 de modification d'en-tête et le moyen de contrôle de FIFO 120 de l'interface série, grâce aux signaux de contrôle 51. Les signaux de contrôle 51 comprennent un signal d'écriture vers le moyen 18 de modification d'en-tête et des signaux de contrôle de flux du module 18, correspondant chacun à des ports d'entrées du moyen d'interfaçage 104.
Les morceaux de paquets entrant en provenance du bus 44 parviennent d'abord à un moyen de modification d'en-tête 18 pour un traitement relatif aux en-têtes de paquet.
Les morceaux de paquets sont ensuite stockés : dans la mémoire 15 lorsqu'ils sont adressés au bus de réception 80 Rebus ; et dans la mémoirel6 lorsqu'ils sont adressés au bus de transmission 70 TxBus.
Les amorces sont les suivantes : ID SEQ N 4 et ID SEQ N 5 Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 655 nucléotides, du nucléotide 470 au nucléotide 1124 de la séquence nucléotidique ID SEQ N 1.
Les amplifiats PCR serviront de matrice pour la réaction de miniséquençage.
Le volume réactionnel est de 5 l par échantillon comme décrit dans le tableau suivant :
Fournisseur Référence Réactif Conc. Vol. par Cône.
Initiale tube ( NI) finale Life Technologie Livré avec Taq Tampon (X) 10 0,5 1 Life Technologie Livré avec Taq MgS04 (mM) 50 0,2 2 AP Biotech 27-2035-03 dNTPs (mM) 10 0,1 0,2 Sur demande Amorce F ( pM) 10 0,1 0,2 ID SEQ N 4 Sur demande AmorceR ( M) 10 0,1 0,2 ID SEQ N 5 Life Technologie 11304-029 Taq platinium 5U/ l 0,02 0,1 U/ réaction H20 Qsp 5 l 1,98 ADN 2,5 ng/ l 2 5 ng/ réaction Volume total 5 l
Ces réactifs sont distribués dans une plaque PCR noire à 384 puits fournie par ABGene (ref :TF-0384-k). Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles de PCR : min à 94 C, suivi de 36 cycles composés de 3 étapes (15 sec. à 94 C, 30 sec. à 56 C, 1 min. à 68 C).
2) La PCR est ensuite purifiée à l'aide de deux enzymes que sont la phosphatase alcaline de crevette (ou Shrimp Alkaline Phosphatase SAP) et l'exonucléase I (Exo 1). La première de ces enzymes permet la déphosphorylation des dNTPs non incorporés au cours de la PCR, tandis que la seconde élimine les résidus simple brin d'ADN et donc les amorces non utilisées au cours de la PCR. Cette digestion se fait par addition dans la plaque de PCR d'un mélange réactionnel de 5 l par échantillon préparé comme décrit dans le tableau suivant :
Fournisseur Référence Réactif Conc. Vol. par Conc. initiale tube ( l) finale AP Biotech E70092X SAP U/ l 0,5 0,5/ réaction AP Biotech 070073Z Exo 10 U/ l 0,1 1/ réaction AP Biotech Fourni Tampon 10 0,5 1 avec SAP SAP (X) H20 Qsp 5 pl 3,9 PCR 5 l Vol total 10 l
Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Digestion SAP-EXO :45 min à 37 C, 15 min à 80 C.
3) L'étape d'élongation ou de miniséquençage est ensuite réalisée sur ce produit de PCR digéré, par addition d'un mélange réactionnel de 5 !-IL par échantillon préparé comme indiqué dans le tableau suivant :
Fournisseur Référence Réactif Initiale tube Cône.
Initiale tube finale Propre Tampon Elongation' 5 1 1 préparation (X) Life Amorce Miniseq 0,5 Technologies Sur demande ( M) 10 0,5 Technologies A ou B AP Biotech 27-2051 ddNTPs2 ( M) 2,5 025 0,125 Biotech (61,71,81)-01 2 non marques de chaque de chaque @ ddNTPs ( M) @ NEN Ne! 472/5 ddNTPs2 ( M) 2,5 0,25 0,125 et Ne! 492/5 2 marqués de chaque de chaque AP Biotech E79000Z Thermo-sequenase 3,2 U/ l 0,125 réaction H20 Qsp 5 l 3,125 PCR digérée 10 l Vol total 15 l 1 Le tampon élongation : Le tampon élongation 5X est composé de Tris-HCI pH 9 à 250 mM, de KCI à 250 mM, de NaCI à 25 mM, de MgCI2 à 10 mM et de glycérol à 40 % 2 ddNTPs :Pour les ddNTPs, un mélange des 4 bases est réalisé en fonction du polymorphisme étudié. Seulement les 2 bases d'intérêts (G/ A) composant le polymorphisme de type SNP fonctionnel portent un marquage, soit en Tamra, soit en R110. Le mélange de ddNTPs est composé de - 2,5 M de ddCTP non marqué, - 2,5 M de ddTTP non marqué, - 2,5 pM de ddGTP (1,825 pM de ddGTP non marqué et 0,625 M de ddGTP marqué au Tamra), - 2,5 M de ddATP (1,825 M de ddATP non marqué et 0,625 M de ddATP marqué au R110) Une fois remplie, la plaque est scellée, centrifugée puis placée dans un thermocycleur pour plaque 384 puits (Tetrad de MJ Research) et subit l'incubation suivante : Cycles d'élongation : 1 min. à 93 C, suivi de 35 cycles composés de 2 étapes (10 sec. à 93 C, 30 sec. à 55 C).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques
de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1,5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100,000 usée.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by well Plate settling time : 0 msec PMT setup : Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre R110. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle(//) et sur le plan perpendiculaire (#) d'après la formule suivante : mP = 1000(# - g#)/(# + g#).
Dans ce calcul, la valeur sur le filtre # est pondérée d'un facteur g.
Dans le cas où seul l'un des coeurs 10 ou 20 de l'extrémité d'une fibre bi- coeur 100 est utilisé, une fibre mono-coeur peut être directement connectée à la bi- coeur : par soudure ou collage, avec ou sans férule.
L'entrée et la sortie peuvent également se faire sur la même extrémité de la fibre bs-zur 100 (un composant à fonction de miroir étant placé à l'autre extrémité bi-coeur).
. Types de fibres mono-coeur et bi-coeur.
Le cecur ou la gaine des fibres mono-coeur 130,140, 130', 140'utilisées peuvent être du type standard (fibre de ligne), ou spéciales : fibres dopées, alliages de composants pour modifier l'indice et le coefficient d'absorption, fibres à maintien
de polarisation, à double gaine. Les fibres mono-coeur peuvent être constituées de tronçons de telles fibres soudées bout à bout.
De même le coeur ou la gaine d'une des fibres de la bs-zur 100 (ou les deux) peut être dopée par exemple par des ions terre rare ou autre. (Dans ce cas, des coupleurs peuvent permettre le multiplexage de longueurs d'onde de pompe et de signaux puis une amplification ou une conversion de fréquence ou un routage optique), résulter d'un alliage, à maintien de polarisation, à double gaine ou peuvent être constituées de sections de telles fibres soudés bout à bout.
. Types d'échange d'énergie dans la fibre bi-coeur.
Il peut s'agir d'un couplage entre les signaux se propageant dans les deux cours 10, 20. Le coupleur peut être réalisé par exemple par fusion-étirage local de la fibre bs-zur 100. Il peut y avoir une seule zone de couplage 102 dans le tronçon bs-zur 100. Il peut également y avoir plusieurs zones de couplage, par exemple deux zones de couplage (comme décrit précédemment selon un mode de réalisation préférentiel) : on forme alors un interféromètre de type Mach-Zender. La fibre bicoeur 100 peut également présenter un nombre de coupleurs supérieur à 2.
Un ou les deux cours 10,20 du tronçon bs-zur 100 peuvent être photoinscrits. On peut photo-inscrire de manière homogène (pour réaliser un déphasage), ou périodique (par exemple pour réaliser un réseau de Bragg).
Un (ou les deux) coeurs 10,20 de la fibre bs-zur 100 peuvent être dopés pour créer une amplification (ou une atténuation) des signaux, ou être un alliage pour modifier l'indice optique.
L'échange d'énergie peut résulter de phénomènes d'optique non linéaire liés à la propagation de signaux dans les deux coeurs (amplification, conversion de fréquence...).
. Type de guides planaires.
Les puces optiques 120,120'peuvent également comporter d'autres fonctions optiques que celles de connexion et d'écartement des guides d'ondes. Le tracé des guides peut permettre d'intégrer une fonction de coupleur (tels qu'illustrés sur la figure 5), d'amplificateur (tel qu'illustré sur le figure 6), de concentrateur (tel qu'illustré sur la figure 7), de diviseur, de commutateur ou la combinaison de plusieurs de ces fonctions.
La puce optique 120, 120'peut comporter une série de guides d'espacement variables (par exemple d, d + s,... d + ne) pour s'adapter exactement à l'espacement réel des coeurs 10,20 en extrémité du tronçon de fibre bs-zur 100. Les guides 122, 124 peuvent être ou non dans un même plan.
Une puce 120,120'peut comporter une série de guides pour se connecter à deux fibres bs-zur 100 (ou plus).
Dans ce dernier cas, les fibres bi-coeurs peuvent être matériellement distinctes ou regroupées dans une fibre commune. La puce peut par ailleurs assurer une fonction optique, par exemple de couplage, associant les signaux issus de fibres bi-coeurs différentes.
Après une durée déterminée, le niveau d'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention est déterminé et comparé à l'activité d'un animal transgénique non humain identique, par exemple une souris transgénique identique, qui n'a pas reçu la molécule ou la substance candidate.
L'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention fonctionnel dans l'animal transgénique peut être déterminée par diverses méthodes, par exemple la mesure des niveaux d'ARN messager correspondant aux polynucléotides rapporteurs d'intérêt placés sous le contrôle dudit acide nucléique régulateur par hybridation de type Northern, ou encore par hybridation in situ. ou encore par imagerie biophotonique non invasive (Xenogen Corporation).
Selon une alternative, l'activité de l'acide nucléique régulateur selon l'invention peut être déterminée en mesurant les niveaux d'expression de protéine codée par les polynucléotides rapporteurs d'intérêt, par exemple par immunohistochimie, dans le cas où le polynucléotide rapporteur d'intérêt comprend un cadre de lecture ouvert codant pour une protéine détectable par une telle technique.
Pour la mise en oeuvre d'un procédé de criblage in vivo d'une substance ou molécule candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, on préférera des mammifères non humains tels que des souris, des rats ou des cobayes ou des lapins qui ont leur génome modifié par l'insertion d'une construction polynucléotidique comprenant un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention.
Les animaux transgéniques selon l'invention comprennent le transgène, c'est-à-dire la construction polynucléotidique précitée, dans une pluralité de leurs cellules somatiques et/ou germinales.
La construction d'animaux transgéniques selon l'invention peut être réalisée selon des techniques classiques bien connues de l'homme du métier. L'homme du
métier pourra en particulier se référer à la production d'animaux transgéniques, et particulièrement à la production de souris transgéniques, telles que décrites dans les brevets US N'4, 873,191 (délivré le 10 Octobre 1989), US NO5, 464,764 (délivré le 7 Novembre 1995) et US 5,789, 215 (délivré le 4 Août 1998) le contenu de ces documents étant ici incorporé par référence.
En bref, une construction polynucléotidique comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle de ce dernier est insérée dans une lignée de cellules souches de type ES. L'insertion de la construction polynucléotidique est réalisée de préférence par électroporation, telle que décrite par Thomas et al. (1987, Cell, Vol. 51 : 503-512).
Les cellules ayant subi l'étape d'électroporation sont ensuite criblées pour la présence de la construction polynucléotidique (par exemple par sélection à l'aide de marqueurs, ou encore par PCR ou par analyse sur gel d'électrophorèse d'ADN de type Southern) afin de sélectionner les cellules positives ayant intégré la construction polynucléotidique exogène dans leur génome, le cas échéant à la suite d'un événement de recombinaison homologue. Une telle technique est par exemple décrite par MANSOUR et al. (Nature (1988) 336 : 348-352).