INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le composé diffusant peut être toute huile de faible masse moléculaire, par exemple de masse moléculaire inférieure ou égale à 100000, de préférence inférieure ou égale à 20000. Ce composé diffusant peut être choisi parmi les polyisobutylènes, les lanolines, les résines hydrocarbonées aliphatiques ou aromatiques, les résines terpéniques et leurs mélanges, les résines de type résines tackifiantes hydrocarbonées aliphatiques ou aromatiques; il est au moins partiellement compatible avec le matériau pro-adhésif.
dans laquelle : R1 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C4, monohydroxyalkyle en C1-C4, polyhydroxyalkyle en C2-C4 alcoxy(C1-C4)alkyle(C1-C4), alkyle en C1-C4 substitué par un groupement azoté, phényle ou 4'-aminophényle ; R2 représente un atome d'hydrogène, un radical alkyle en C1-C4, monohydroxyalkyle en C1-C4 ou polyhydroxyalkyle en C2-C4, alcoxy(C1-C4)alkyle(C1-C4) ou alkyle en C1-C4 substitué par un groupement azoté ; R3 représente un atome d'hydrogène, un atome d'halogène tel qu'un atome de chlore, un radical alkyle en C1-C4, sulfo, carboxy, monohydroxyalkyle en C1-C4 ou hydroxyalcoxy en C1-C4, acétylaminoalcoxy en C1-C4, mésylaminoalcoxy en C1-C4 ou carbamoylaminoalcoxy en C1-C4, R4 représente un atome d'hydrogène, d'halogène ou un radical alkyle en C1-C4 ; R1 et R2 peuvent également former avec l'atome d'azote qui les porte un hétérocycle azoté à 5 ou 6 chaînons éventuellement substitué par un ou plusieurs groupements alkyle, hydroxy ou uréido.
Parmi les groupements azotés de la formule (1) ci-dessus, on peut citer notamment les radicaux amino, monoaikyi(Ci-C4)amino, dialkyl(Cl-C4)amino, trialkyl(C,-C4)amino, monohydroxyalkyl(C1-C4)amino, imidazolinium et ammonium.
Parmi les paraphénylènediamines de formule (I) ci-dessus, on peut plus particulièrement citer la paraphénylènediamine, la paratoluylènediamine, la 2-chloroparaphénylènediamine, la 2,3-diméthyl-paraphénylènediamine, la 2,6-diméthylparaphénylènediamine, la 2,6-diéthyl-paraphénylènediamine, la 2,5-diméthylparaphénylènediamine, la N,N-diméthyl-paraphénylènediamine, la N,N-diéthylparaphénylènediamine, la N,N-dipropyl-paraphénylènediamine, la 4-amino-N,N-diéthyl- 3-méthyl-aniline, la N,N-bis-((3-hydroxyéthyl)-paraphénylènediamine, la 4-N,N-bis-(p-
hydroxyéthyl)amino-2-méthyl-aniline, la 4-N,N-bis-(ss-hydroxyéthyl)-amino 2-chloroaniline, la 2-p-hydroxyéthyl-paraphénylènediamine, la 2-fluoro-paraphénylènediamine, la 2-isopropyl-paraphénylènediamine, la N-(ss-hydroxypropyl)-paraphénylènediamine, la 2-hydroxyméthyl-paraphénylènediamine, la N,N-diméthyl-3-méthylparaphénylènediamine, la N,N-(éthyl,p-hydroxyéthyl)-paraphénylènediamine, la N-(ss,[gamma]- dihydroxypropyl)-paraphénylènediamine, la N-(4'-aminophényl)-paraphénylènediamine, la N-phényl-paraphénylènediamine, la 2-ss-hydroxyéthyloxy-paraphénylènediamine, la 2-p-acétylaminoéthyloxy-paraphénylènediamine, la N-(ss-méthoxyéthyl)- paraphénylènediamine, 2-méthyl-1-N-3-hydroxyéthyl-paraphénylènediamine, et leurs sels d'addition avec un acide.
Parmi les paraphénylènediamines de formule (I) ci-dessus, on préfère tout particulièrement la paraphénylènediamine, la paratoluylènediamine, la 2-isopropylparaphénylènediamine, la 2-p-hydroxyéthyl-paraphénylènediamine, la 2-p-hydroxyéthyloxy-paraphénylènediamine, la 2,6-diméthyl-paraphénylène-diamine, la 2,6-diéthyl-paraphénylènediamine, la 2,3-diméthyl-paraphénylènediamine, la N,N-bis- (P-hydroxyéthyl)-paraphénylènediamine, la 2-chloro-paraphénylènediamine, et leurs sels d'addition avec un acide.
Parmi les bases doubles utilisables à titre de bases d'oxydation dans les compositions tinctoriales conformes à l'invention, on peut notamment citer les composés répondant à la formule (II) suivante, et leurs sels d'addition avec un acide : dans laquelle :
- Z1 et Z2, identiques ou différents, représentent un radical hydroxyle ou -NH2 pouvant être substitué par un radical alkyle en C1-C4 ou par un bras de liaison Y ; - le bras de liaison Y représente une chaîne alkylène comportant de 1 à 14 atomes de carbone, linéaire ou ramifiée pouvant être interrompue ou terminée par un ou plusieurs groupements azotés et/ou par un ou plusieurs hétéroatomes tels que des atomes d'oxygène, de soufre ou d'azote, et éventuellement substituée par un ou plusieurs radicaux hydroxyle ou alcoxy en Ci-Ce ; - R5 et R6 représentent un atome d'hydrogène ou d'halogène, un radical alkyle en C1- C4, monohydroxyalkyle en C1-C4, polyhydroxyalkyle en C2-C4, aminoalkyle en C1-C4 ou un bras de liaison Y ; - R7, R8, Rg, R10, R11 et R12, identiques ou différents, représentent un atome d'hydrogène, un bras de liaison Y ou un radical alkyle en C1-C4 ; étant entendu que les composés de formule (II) ne comportent qu'un seul bras de liaison Y par molécule.
Parmi les bases doubles de formules (II) ci-dessus, on peut plus particulièrement citer le N,N'-bis-(-hydroxyéthyl) N,N'-bis-(4'-aminophényl) 1,3-diamino propanol, la N,N'-bis- (ss-hydroxyéthyl) N,N'-bis-(4'-aminophényl) éthylènediamine, la N,N'-bis-(4- aminophényl) tétraméthylènediamine, la N,N'-bis-(ss-hydroxyéthyl) N,N'-bis-(4- aminophényl) tétraméthylènediamine, la N,N'-bis-(4-méthyl-aminophényl) tétraméthylènediamine, la N,N'-bis-(éthyl) N,N'-bis- (4'-amino, 3'-méthylphényl) éthylènediamine, le 1,8-bis- (2,5-diaminophénoxy)-3,5-dioxaoctane, et leurs sels d'addition avec un acide.
- (III) les para-aminophénols répondant à la formule (III) suivante, et leurs sels d'addition avec un acide :
dans laquelle : R13 représente un atome d'hydrogène,un atome d'halogène tel que le fluor, un radical alkyle en C1-C4, monohydroxyalkyle en C1-C4, alcoxy(C1-C4)alkyle(C1-C4) ou aminoalkyle en C1-C4, ou hydroxyalkyl(C1-C4)aminoalkyle en C1-C4.
R14 représente un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène tel que le fluor, un radical alkyle en C1-C4, monohydroxyalkyle en C1-C4, polyhydroxyalkyle en C2-C4, aminoalkyle en C1-C4, cyanoalkyle en C1-C4 ou alcoxy(C1-C4)alkyle(C1-C4).
Parmi les para-aminophénols de formule (III) ci-dessus, on peut plus particulièrement citer le para-aminophénol, le 4-amino-3-méthyl-phénol, le 4-amino-3-fluoro-phénol, le 4amino-3-hydroxyméthyl-phénol, le 4-amino-2-méthyl-phénol, le 4-amino-2hydroxyméthyl-phénol, le 4-amino-2-méthoxyméthyl-phénol, le 4-amino-2-aminométhylphénol, le 4-amino-2-(ss-hydroxyéthyl-aminométhyl)-phénol, et leurs sels d'addition avec un acide.
- (IV) les ortho-aminophénols utilisables à titre de bases d'oxydation dans le cadre de la présente l'invention, sont notamment choisis parmi le 2-amino-phénol, le 2-amino-1hydroxy-5-méthyl-benzène, le 2-amino-1-hydroxy-6-méthyl-benzène, le 5-acétamido-2amino-phénol, et leurs sels d'addition avec un acide.
2. 3. Séquençage complet du locus inséré dans le chromosome d'E. coli 0157:H7 La séquence du locus inséré dans le chromosome d'E. coli 0157:H7 a été complétée à partir du produit d'amplification obtenu avec les amorces sens P388D (position 4205 à 4230 du fragment de 4,4kb de pSP26, tableau I) et antisens P388P (positions 93436 à 93460 d'E. coli nonpathogène de type K12, tableau I).
La réaction de PCR est réalisée dans un volume final de 100 l contenant, 3 fil d'ADN total purifié comme décrit à l'exemple 1, 10 l de tampon PCR 10 fois concentré (100 mM Tris HC1 pH 8,5, 250 mM KC1, 50 mM (NH4)2 SO4, 20 mM MgSO4), 200 M de chaque désoxynucléotide, 600 nM de chaque amorce et 2, 5 UI de polymérase à ADN PWO (ROCHE MOLECULAR) .
L'amplification PCR est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 2 min est suivie de 30 cycles alternant une étape de dénaturation à 94 C pendant 40 s, une étape d'hybridation des amorces à 69 C, pendant 40 s et une étape d'extension à 72 C,
pendant 50 s et une étape finale d'élongation est effectuée à 72 C pendant 10 min.
Ces amorces n'amplifient aucune séquence d'E. coli non-pathogène de type K12, en revanche un produit d'amplification de 1299 pb dénommé Amp 388P/388D, (figure 1) est amplifié à partir de l'ADN d'E. coli 0157:H7 (souche EDL 933) .
La disposition relative des différents fragments séquences est illustrée à la figure 1.
La séquence du produit d'amplification de 1299 pb montre que les 413 pb de son extrémité 3' présentent 92% d'identité avec la séquence d'E. coli non-pathogène (positions 93848 à 93436, en référence à la séquence du génome d'E.coli non pathogène de type K12, Genbank U82664).
Les séquences du produit d'amplification de 1299 pb et du fragment de 4,4 kb de pSP26 ont permis d'identifier une nouvelle séquence de 5478 pb (SEQ ID NO : 1), dans E. coli 0157:H7. Cette séquence contient un petit locus de 2634 pb (positions 2457 à 5090 de la séquence de 5478 pb) inséré dans le chromosome d' E. coli 0157:H7, flanqué de part et d'autre part des séquences conservées d'E. coli non pathogènes. Ce locus dénommé SILO,57 (Small Inserted Locus in STEC 0157) est présenté dans la liste en annexe sous le numéro SEQ ID NO : 2.
La séquence de SILO157 ne présente aucune homologie avec une séquence connue et possède un contenu en G+C de 44, 4%, qui est nettement plus faible que celui de l'ensemble du génome d'E. coli (50,8%, BLATTNER et al., 1997, Science, 277 : 1453-1474). Ce locus est inséré entre les positions 93848 et 93849, en référence à la séquence du génome d'E.coli non pathogène de type K12, Genbank U82664).
De façon remarquable, dans les colibacilles entérohémorragiques de sérotype 0157:H7, ce locus est précisément inséré entre les codons stop de 2 phases ouvertes de lecture (Genbank AAB40241, homologue à la phase ouverte de lecture HI0293 d'Haemophilus influenzae et Genbank AAB40242) qui sont en orientation opposée. En revanche, dans la séquence d'E. coli non-pathogène de type K12, les codons stop de ces 2 phases ouvertes de lecture sont directement joints.
3. Analyse des phases ouvertes de lecture potentielles du locus SILO157 Le locus SILO,.57 comprend 4 phases ouvertes de lecture potentielles de plus de 100 acides aminés, dénommées respectivement IHP1 (Inserted Hypothetical Protein 1), IHP2 (Inserted Hypothetical Protein 2), IHP3 (Inserted Hypothetical Protein 3) et IHP4 (Inserted Hypothetical Protein 4), correspondant respectivement à des protéines de 338 (SEQ ID NO : 18), 140 (SEQ ID NO : 20), 120 (SEQ ID NO : 22) et 159 (SEQ ID NO : 24) acides aminés. Le brin positif code IHP1 (nucléotides des positions 3364 à 4380 de la séquence de 5478 pb, SEQ ID NO :17) et IHP2 (nucléotides des positions 4465 à 4887 de la séquence de 5478 pb SEQ ID NO : 19), dans la même phase, et le brin négatif code IHP3 (nucléotides des positions 2997 à 2635 de la séquence de 5478 pb SEQ ID NO : 21) et IHP4 (nucléotides des positions 4002 à 3523 de la séquence de 5478 pb SEQ ID NO : 23), dans la même phase.
L'analyse de la protéine IHP1, à l'aide des programmes PSORT et BLAST indique respectivement la présence d'une séquence N-terminale clivable de 23 acides aminés, et des homologies avec des protéines de membrane et des adhésines bactériennes. En particulier, on peut noter des homologies avec les protéines suivantes ; une adhésine/invasive potentielle de Neisseria meningitidis (Genbank AAF 42321 et Genbank AAF41395), l'invasine Yopl de Yersinia pseudotuberculosis (Genbank CAA32088), l'adhésine YadA de Yersinia enterocolitica (Genbank CAA32086), l'adhésine HIA (Genbank AAC43721) et la protéine HSF (produit du locus de fibrille, dénommé locus hsf, numéro d'accession Genbank AAC44560) d'Haemophilus influenzae, la flagelline E-1 de Salmonelle rubislaw (Genbank CAA28190) et l'autolysine/adhésine de la protéine de surface Aas de Staphylococcus saprophyticus (Genbank CAA03852).
L'analyse de la protéine IHP2 indique la présence d'une séquence N-terminale clivable de 27 acides aminés et peu d'homologie avec des protéines connues, mis à part avec la protéine YCCF de Bacillus subtilis (Genbank CAB12066).
IHP3 présente des homologies avec un transporteur rénal humain du sodium, dépendant du phosphate (Genbank AAA36354), ainsi qu'avec la transposase de Bacillus thuringiensis (Genbank Q99335).
IHP4 ne présente pas d'homologie avec des protéines connues.
L'ensemble de ces résultats montre que la souche d'E.coli entérohémorragique 0157:H7 contient un petit locus (SILO,57) inséré dans son chromosome. L'insertion de ce locus est spécifique des souches d'E. coli productrices de shigatoxines de sérotype 0157 (STEC-0157) et comprend 4 phases ouvertes de lecture potentielles dont une (IHP1) code vraisemblablement pour une protéine membranaire de surface de type adhésine qui pourrait jouer un rôle dans la pathogénicité des STEC de sérotype 0157.
Souches Nombre Nombre de souches positives en PCR/nombre de souches testees d'E. coli de souches non-STEC Total :55 P388F/P388G P388F/P388D P388P/P388L P388UP388M P388P/P388D (élongation 40s) 0157-H- 2 1 0/2 0/2 2/2 0/2 0/2 0157:ND 40 0/40 0/40 40/40 0/40 0/40 0157:H19 2 0/2 0/2 2/2 0/2 0/2 026 3a 0/3 0/3 3/3 0/3 0/3 055 3b 3/3 3/3 0/3 3/3 3/3 0103 1 0/1 0/1 1/1 0/1 0/1 0111 2c 0/2 0/2 2/2 0/2 0/2 0127:H6 1d 1/1 0/1 0/1 0/1 0/1
(E2348/69)~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
0128:H2 1e 0/1 0/1 1/1 0/1 0/1 a : 2 souches sur 3 sont des EPEC b : les 3 souches sont des EPEC c:1 souche sur 2 est une souche d'E. colientéroaggrégative d : Cette souche est la souche de référence des EPEC e : cette souche est un EPEC TABLEAU V :
Autres Nombre Nombre de souches positives en PCR/nombre de souches testées bactéries de souches , 1 Total:7 P388F/P388G P388F/P388D P388P/P388L P388L/P388M P388P/P388D (élongation 40s) Enterobacter 1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 Citrobacter 1 0/1 0/1 0/1 0/1 0/1 Hafnia alvei , 5 0/5 0/5 0/5 0/5 0/5
Ces résultats montrent que : - toutes les souches de colibacilles productrices de shiga-toxines de sérotype 0157 (56 souches de STEC de sérotype 0157 testées dont 38 souches de sérotype 0157:H7 incluant 4 souches guéries du plasmide de 60 Mda, 1 souche de sérotype 0157:H- et 17 autres souches de STEC de sérotype 0157 (5 0157:NM (Non Mobile) et 12 0157 : ND (Non Déterminé)] sont amplifiés par les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G. En outre, l'observation d'un produit d'amplification dans les souches d'E. coli 0157:H7 guéries du plasmide de 60 MDa confirme également la localisation chromosomique du locus SIL0157.
- les souches de colibacilles productrices de shiga-toxines d'autres sérotypes (30 sérotypes différents testés sur un total de 93 souches) ne sont pas amplifiés avec les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G. En particulier les sérotypes 0145,077 et 079 qui sont amplifiés
avec les amorces P388C/P388D ne sont pas amplifiés avec ces deux couples d'amorces.
- aucune des souches de sérotype 0157 non productrices de shiga-toxines (44 souches testées) n'est amplifiée avec les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G, 7 souches de 3 autres genres bactériens dont celles qui donnent des réactions croisées avec 0157 par les techniques immunologiques (Citrobacter et Hafnia alvei) ne sont pas amplifiées avec les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G, les souches d'E. coli de sérotype 055 (STEC et non-STEC) sont également amplifiées avec les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G, ce qui s'explique par l'origine clonale des sérotypes 055 et 0157 qui a été clairement démontrée (FENG et al., 1998, J. Infect. Dis., 177 :1750-1753 ; WHITTAM et al., 1993, Infect. Immun., 61 : 1619-1629). les souches d'E. coli non productrices de shiga-toxines d'autres sérotypes (non-STEC et non-0157 ; sérotypes testés sur un total de 8 souches) ne sont pas amplifiés par les couples d'amorces P388F/P388D et P388F/P388G, à l'exception d'0127:H6 qui est amplifié avec le couple P388F/P388G mais pas avec le couple P388F/P388D.
L'ensemble des résultats démontre que les deux couples d'amorces P388F/P388G et P388F/P388D permettent de détecter l'ensemble des souches de colibacilles productrices de shiga-toxines de sérotype 0157. Le couple P388F/P388D présente cependant une spécificité plus élevée que le couple P388F/P388G.
EXEMPLE 3 : ANALYSE DE LA CONSERVATION DU SITE D'INSERTION DU LOCUS SILO,57 DANS E. COLI ET MISE EN EVIDENCE D'UN LOCUS HOMOLOGUE DANS LE GROUPE DES COLIBACILLES ENTEROPATHOGENES (EPEC) 1. Analyse de la conservation du site d'insertion du locus SILO,57 dans E. coli La conservation du site d'insertion du locus SILO,57 a été étudiée par PCR dans les 211 souches de bactéries analysées à l'exemple 2, à l'aide des 3 couples d'amorces suivants : les couples P388L/P388M et P388P/P388D qui amplifient respectivement les jonctions gauches et droites du locus SILO157 et le couple P388P/P388L qui amplifie un produit de 682 pb dans toutes les souches d'E. coli non pathogènes comme la souche K12 (Figure 1).
Les réactions sont préparées selon le protocole décrit à l'exemple 1 et l'amplification PCR est réalisée dans les conditions suivantes : une étape initiale de dénaturation à 94 C pendant 10 min est suivie de 35 cycles alternant une étape de dénaturation à 94 C pendant 40 s, une étape d'hybridation des amorces à 65 C, pendant 40 s et une étape d'extension à 72 C, pendant 50 s et une étape finale d'élongation est effectuée à 72 C pendant 10 min.
Les séquences des amorces utilisées et la taille des fragments attendus avec les STEC-0157 ou avec la souche E. coli K12 sont présentées respectivement dans les tableaux VI et VII ci-dessous. Dans le tableau VI les positions dans SILO,57 sont relatives au fragment de de 5478 pb (SEQ ID NO : 1) et les positions dans E.coli K12 sont relatives à la séquence Genbank U82664.
TABLEAU VI :: ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
Amorce Position Position numéro dans dans E. séquence SILO157 coli K12 P388M 2606-2581 absente 5'-GGCGGAGGCGGCCTACGGTTTTGGCG-3' SEQ ID NO 4 P388P 5503-5479 93436-93460 5'-GAACGATGAACATCAGCGATGTAGC-3' SEQ ID NO.9
P388L 2188-2213 94117-94092 5'-CGCTGCTCGCCGCCTGGCTGTGGTGG-3' 1 SEQ ID NO:3
Lesdites mutations de chaque oligonucléotide peuvent être choisies parmi des délétions et/ ou des insertions de un ou plusieurs nucléotide(s).
Une forme particulière de mutations consiste à utiliser des oligonucléotides dégénérés. C'est-à-dire que chaque oligonucléotide de la série est présent en plusieurs exemplaires, chaque exemplaire possédant un nucléotide différent au niveau de la ou desdites mutation(s).
Une autre forme particulière de mutation consiste en ce que chaque mutation est du type permettant d'introduire un codon identique dans chaque oligonucléotide ou un codon correspondant au même acide aminé, en substitution du codon original du gène cible. Avantageusement, ledit codon correspond à un acide aminé choisi dans le groupe comprenant Ala, Val, Gly, Leu, Ile.
Le procédé de l'invention peut être décrit plus précisément à l'aide des étapes suivantes - On prépare la matrice, de préférence un plasmide contenant le fragment d'ADN à muter.
- On synthétise les oligonucléotides mutants différents de préférence entre 5 et 106, et plus préférentiellement entre 50 et 500, puis à mélanger
l'ensemble des oligonucléotides mutants. La concentration finale de chacun des oligonucléotides dans le mélange est ainsi divisée lors de cette étape par le nombre d'oligonucléotides.
- On ajoute à la matrice, c'est-à-dire au plasmide contenant le fragment d'ADN à muter, à une concentration telle que le rapport entre le nombre de molécules de matrice et le nombre de molécules de chacun des oligonucléotides mutants soit compris entre 0,01 et 100, et de préférence entre 0,1 et 10.
- On dénature la matrice par la chaleur (environ 95 C), de façon à disposer temporairement d'ADN simple brin. Lors du retour à une température plus basse, certains ou tous les oligonucléotides présents dans le mélange se fixent sur la matrice au niveau de leur site d'homologie.
- On ajoute tous les éléments nécessaires à réaliser une réplication de la matrice à partir des oligonucléotides mutants, et notamment une polymérase, le tampon permettant son activité, des nucléotides triphosphates en quantité suffisante, les éventuels cofacteurs nécessaires. La réaction de réplication a ensuite lieu dans les conditions de température correspondant à l'activité maximale de la polymérase. Éventuellement, une ligase peut être ajoutée lors de l'étape de réplication, de façon à ce que les brins d'ADN néosynthétisés se liguent au niveau de l'extrémité 5' d'un autre oligonucléotide, lié sur la matrice en 3' du premier. Dans ce cas, les oligonucléotides sont préalablement phosphorylés.
- Éventuellement, on répète les étapes de dénaturation et de réplication plusieurs fois. Dans ce cas, il est préférable que la polymérase soit thermostable, afin d'éviter la nécessité de rajouter de l'enzyme à chaque cycle. A l'issue de cette réaction, les molécules d'ADN présentes dans le mélange sont de plusieurs types - d'une part, il reste de la matrice initiale double brin n'ayant pas été efficacement répliquée,
- d'autre part, une partie des molécules a été répliquée, c'est-à-dire qu'elles contiennent un brin d'origine et un brin néosynthétisé à partir d'une ou de plusieurs amorces que constituent les oligonucléotides mutants.
- On soumet le mélange obtenu à la digestion par l'enzyme DpnI, ou une autre enzyme de restriction permettant de supprimer les molécules d'ADN méthylés sur les deux brins et de conserver celles qui ne sont pas méthylés ou hémi- méthylés.
- On transforme des bactéries compétentes par le mélange précédent, ces bactéries sont ensuite étalées sur un milieu contenant un agent sélectif de façon à sélectionner les bactéries ayant intégré un plasmide. Les molécules d'ADN qui ont été clivées à l'étape précédente sont éliminées car la présence d'un plasmide circulaire complet est indispensable à la survie de la bactérie en milieu sélectif.
- On prélève individuellement les colonies bactériennes obtenues et on les utilise pour ensemencer un milieu nutritif sélectif. Une préparation d'ADN plasmidique de ces cultures est ensuite réalisée afin d'isoler une grande quantité d'ADN plasmidique potentiellement mutant. Un examen des différentes molécules d'ADN plasmidiques à ce stade permet de calculer le taux moyen d'incorporation de chaque oligonucléotide, et de vérifier que celui-ci est voisin de la valeur recherchée (généralement 1/N).
- Éventuellement, on teste l'activité biologique correspondant aux différents lots de préparations plasmidiques mutantes. L'activité mesurée peut être supérieure à celle du fragment non muté, égale, ou inférieure. Dans le cas où l'activité est modifiée, le plasmide correspondant est séquencé de façon à pouvoir localiser la position de la mutation introduite. Dans un mode de réalisation préféré, on teste l'activité biologique correspondant aux molécules mutantes, et on compare cette mesure à celle de l'activité biologique correspondant à la molécule d'ADN plasmidique non mutée. Lorsque l'observation
de ces mesures fait apparaître une différence significative, les molécules mutantes sont séquencées afin de mettre en évidence la position de la mutation à l'origine de cette modification d'activité. L'ordre de ces deux dernières étapes est inversé par rapport aux techniques habituelles de mutagenèse dirigée, qui impliquent généralement l'obtention et la vérification de la molécule mutante préalablement au test de son activité biologique.
Moy SEM Av TTT Pdt TTT Ap TTT Stats av/pdt Stats av/ap Stats pdt/ap
Témoin 84 4 775 63 :!: 6 NS 0,0148 NS -
Kava 250 78 5 45 4 52 5 0,0002 0,0035 NS Kava 500 76 ~ 6 41 6 46 ~ 0,0010 0,0115 NS pour la consommation totale de liquide
Moy SEM Av TTT Pdt TTT Ap TTT Stats av/pdt Stats av/ap Stats pdt/ap Témoin 133 9 ni 10 140 ~ 111 NS NS NS
Kava250 155 12 142 12 145 16 NS NS NS
Kava500 155 ~ 14 144 Il 130 10 NS NS NS
Si l'on calcule la diminution en pourcentage de la consommation d'alcool des animaux entre les périodes avant et après traitement et que l'on dénombre ceux dont le pourcentage est > à 50% (valeur arbitraire), on remarque que 4 animaux sont dans ce cas dans le groupe Kava 500 mg/kg et 1 dans le groupe 250 mg/kg.