INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
l'invention comme ci-dessus définie, qui ne comprendrait que 5 ou 6 répétitions de la séquence de fixation de la protéine pi. Grâce à ces origines de réplication fonctionnelles sans CpG, les inventeurs ont pu construire différents plasmides, qui, de manière remarquable, ont conservé leurs fonctions de vecteurs de transfection. La présente demande vise ainsi tout plasmide qui comprend une origine de réplication selon l'invention. De tels plasmides peuvent en outre comprendre un gène sans CpG selon l'invention et/ou un promoteur sans CpG selon l'invention et/ou un terminateur de transcription sans CpG, ou une unité transcriptionnelle selon l'invention. Les plasmides selon l'invention présentent donc l'avantage de pouvoir ne présenter aucun CpG dans leur structure, tout en étant toujours capables d'assurer les fonctions de vecteurs d'Expression. (-). Des exemples de tels plasmides sont donnés dans les exemples ci-dessous. La présente demande vise plus particulièrement tout plasmide de SEQ ID No. 14 (Figure 15).
Entre également dans le champ de la présente demande toute cellule transformée par au moins un élément sélectionné parmi le groupe constitué par les gènes sans CpG selon l'invention, les promoteurs sans CpG selon l'invention, les origines de réplication sans CpG selon l'invention, les plasmides sans CpG selon l'invention. Une telle cellule selon l'invention peut en outre comprendre un gène codant pour une protéine pi, tel que pir sauvage ou pir muté pirl 16.
Avantageusement, une cellule transformée selon l'invention est une cellule d'E. coli.
Pour répliquer en un nombre suffisant de copies fonctionnelles un plasmide selon l'invention, l'homme du métier a à sa disposition de nombreuses bactéries, telles que par exemple les E. coli K12 qui sont classiquement utilisées à des fins de réplication plasmidique. Or, La souche originelle K12 d'E. coli possède une méthylase de l'ADN, qui introduit un groupement méthyl sur toutes les cytosines placées dans le contexte CC (A/T) GG des ADN génomique et plasmidique de la bactérie. L'ensemble des diverses souches de la lignée K12 possède cette activité du fait d'une méthylase codée par le gène dcm (Palmer B. R. et Marinus M. G. (1994) Gene 143,1-12). Dans la mesure où la méthylation des ADN plasmidiques préparés à partir des souches dc d'E. coli entraîne une modification de la molécule d'ADN non voulue pour le transfert de gènes en cellules eucaryotes, les inventeurs ont mis au point une souche qui permette à la fois le fonctionnement des plasmides avec l'origine R6K gamma sans CpG conformément à l'invention, et l'obtention d'ADN plasmidique dépourvu de méthylation sur les sites dem. Pour cela, un nouveau gène a été
construit par les inventeurs en délétant le gène dcm de la position +3 après l'ATG à la position- 14 avant le TGA dans le gène dcm d'une souche pirl 16 (cf. exemple 10 ci-dessous).
Le gène dcm est situé dans une région chromosomique dont la séquence peut être obtenue via GenBank avec le numéro d'accession D90835 (cloneKohara #344 : 43, 5-43, 9 min).
Une délétion dans le gène (-) apporte l'avantage supplémentaire d'éviter toute réversion du gène c vers la forme sauvage. Des souches mutantes dcm- ont ainsi été produites par les inventeurs ; elles 1 : 1 ne présentent aucun phénotype négatif qui pourrait altérer la croissance des bactéries ou modifier la qualité et la quantité de l'ADN plasmidique. Plus particulièrement, une souche optimisée d'E. coli a été construite par inactivation ciblée du gène dcm à partir d'une souche parente e exprimant une protéine pi mutée en un site conduisant à l'augmentation du nombre de copies des plasmides sans CpG. Cette souche optimisée permet une production de qualité et en abondance des ADN plasmidiques objets de cette invention dépourvus de CpG et exempts de méthylation sur les cytosines des sites dcm. La présente demande vise donc toute cellule comprenant un gène codant pour la protéine pi, qui est transformée par le gène dcm délétée selon l'invention, et toute méthode de réplication de plasmides qui comprend la transformation d'une telle cellule par un plasmide, et la culture de la cellule transformée dans des conditions adaptées à la réplication de ce plasmide. Entre également dans le champ de la présente demande tout kit de production de plasmides, qui comprend au moins une cellule selon l'invention. Ces kits sont particulièrement adaptés à la réplication de plasmides selon l'invention, afin d'éviter que ces plasmides dont le structure est dépourvue de CpG soit par ailleurs lors de leur réplication méthylés en CC (A/T) GG.
L'invention fournit ainsi un ensemble complet de moyens de transformation dépourvus de CpG : gènes sans CpG, promoteurs sans CpG, unités transcriptionnelles sans CpG, origines de réplication pour plasmide sans CpG, plasmides sans CpG, cellules optimisées pour la réplication de plasmides sans méthylation de cytosines. Ces nouveaux moyens trouvent des applications directes pour la transformation génétique de cellules à visée biotechnologique ou médicale. De tels produits sont en effet exceptionnellement bien adaptés à la réalisation de compositions vaccinales à ADN destinées à l'homme ou l'animal. (-) L'invention est illustrée par les exemples suivants, dans lesquels il est fait référence aux figures : Figure 1 : séquence du gène Sh ble ACpG (sans CpG), - Figure 2 : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du gène Sh ble ACpG, - Figure 3 : séquence du gène Hph ACpG,
Figure 4 : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du gène Hph ACpG, - Figure 5 séquence du gène Bsr ACpG, Figure liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du gène Bsr ACpG, - Figure séquence du gène Pac ACpG, - Figure 8 liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du gène Pac ACpG, 1 1 - Figure : séquence du gène LacZ ACpG, - Figure 10A : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du premiers tiers du gène LacZ ACpG, - Figure 10B : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du deuxième tiers du 'ID gène LacZ ACpG, Figure 10C : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage du troisième tiers du 1 gène LacZ ACpG, - Figure 11 : séquence du promoteur EM7 (1-), des oligonucléotides dégénérés (2-) ID In utilisés pour construire le promoteur EM2K dépourvu de CpG (3-), - Figure 12 : séquence de l'origine de réplication R6K gamma M2A, - Figure 13 : liste des oligonucléotides utilisés pour l'assemblage de l'origine de z : l réplication R6K gamma M2A, - Figure 14 : séquence de l'origine R6K gamma du plasmide pGTR6Kneoc9 délimitée par les sites Pack, - Figure 15 : séquence du plasmide pSh-LacZACpG, - Figure 16 : carte du plasmide pShACpG, - Figure 17 : carte du plasmide pSh-LacZACpG.
EXEMPLE 1 : Construction du gène Sh ble de résistance à la Zéocine dépourvu de CpG.
Le gène Sh ble ACpG dont la séquence présentée en figure 1 (position 3 à 377 de SEQ ID No. 1) a été synthétisé à partir d'un assemblage d'oligonucléotides chevauchants (taille 20-40 pb) dont les séquences sont données dans la figure 2. La méthode d'assemblage se fait en trois étapes, la première consiste en la phosphorylation des oligonucléotides du brin codant, dans une deuxième étape l'ensemble des oligonucléotides des deux brins sont associés par hybridation et ligation et, ZD dans la dernière étape, le gène est amplifié par PCR. Cette méthode a été utilisée avec succès pour
la synthèse de tous les gènes synthétiques mentionnés dans les exemples 1, 2, 3, 4, 5. La méthode 1 1 est détaillée pour le gène Sh ble ACpG : Les 10 oligonucléotides de OL26199 à OL27099 (figure 2) correspondant au brin codant sont phosphorylés selon la procédure suivante : 1 fll de chacun des oligonucléotides repris dans de l'eau c à 250 flM sont mélangés dans un microtube contenant 15 al d'eau pour amener la solution finale à une concentration de 100 picomoles par microlitre. On mélange ensuite 5 ul de cette solution à c 10 ul de tampon de la polynucléotide-Kinase concentré 10 fois, 0, 4 ul d'une solution d'ATP 50mM, 85 ul d'eau et 1 ul de l'enzyme (à 10 u/ul) et le tout est incubé 4'heures à 37 C (solution A).
Une solution des oligonucléotides du brin non codant est constituée en mélangeant 1 ul de chaque 1 oligonucléotide (OL27199 à OL28199 ; cf. figure 2) et 1 ul de l'oligonucléotide OL26099 (figure 1 2) dans laquelle on ajoute 43 III d'eau afin d'obtenir une solution finale à 54 picomoles par III (solution B).
L'assemblage du gène est réalisé d'abord en mélangeant 10 III de la solution A, 1 l de la solution B, 6 III d'une solution de KC1 à 100 mM, 3 III d'une solution de NP-40 à 0,5%, 4 fll d'une solution de MgC12 à 50 mM, 3 l d'une solution d'ATP à 10 mM et 7,5 III de ligase Pfu (30 unités) puis le mélange est chauffé dans un thermocycleur programmable 3 minutes à 95 C puis 3 minutes à 80 C avant de subir 3 cycles d'une minute à 95 C, suivie d'un passage de 95 C à 700C en 1 minute, puis d'un passage de 70 C à 55 C en 1 heure et enfin 2 heures à 55 C. Puis le mélange des oligonucléotides assemblés est amplifié avec les amorces OL26099 et OL27199.
Pour résoudre ce problème, l'invention propose une composition cosmétique, notamment capillaire, comprenant des particules solides comprenant au moins un composé inorganique, dans un milieu cosmétiquement acceptable, caractérisée par le fait que : (l) le composé inorganique est choisi parmi : (i) les oxydes des éléments des colonnes 1, 2 et 3 de la classification périodique, dont le numéro atomique est inférieur à 58 ; (ii) les carbures, nitrures, borures, sulfures et hydroxydes des éléments des colonnes 1 à 12 de la classification périodique ; (iii) les sels inorganiques dont le cation est constitué par des éléments des colonnes 1 à 12 de la classification périodique et dont l'anion ne contient pas dans sa structure d'atome d'aluminium, de silicium ou de chrome ; (2) la solubilité du composé inorganique, dans l'eau désionisée, à 25OC, à pression atmosphérique normale, est inférieure à 10 mg/1 ; (3) la taille primaire moyenne en nombre des particules est comprise entre 1 nm et 1 film.
Un autre objet de la présente invention concerne l'utilisation de telles compositions cosmétiques pour donner du gonflant aux cheveux.
Le terme solubilié s'entend au sens défini à la section 4 du Hanbook of Chemistry and Physics, 75ème édition ISBN 0-8193-0475-X.
Au sens de la présente invention, on entend par (sel inorganique)), un sel pour lequel l'anion ne contient pas, à l'état non hydraté, l'association d'au moins un atome de carbone et d'au moins un atome d'hydrogène.
De préférence, la solubilité du composé inorganique, dans l'eau désionisée, à 25OC, à pression atmosphérique normale, est inférieure à 1 mg/litre.
Le terme classification périodique utilisé dans la présente invention désigne la classification des corps simples, établie par Mendeléef.
De préférence, la taille primaire moyenne en nombre des particules est comprise entre 1 nm et à 500 nm, et encore plus préférentiellement comprise entre 10 nm et 300 nm.
En tant qu'oxyde (i) des éléments des colonnes 1, 2 et 3, on utilise avantageusement un oxyde choisi parmi l'oxyde de béryllium (BeO) ou l'oxyde d'yttrium (Y2O3), l'oxyde de magnésium.
En tant que composé (ii), on utilise avantageusement : - les sulfures de manganèse (MnS), d'argent (Ag2S), de molybdène (MoS,), de fer (FeS2), de tungstène (WS2), de zinc (ZnS), de bismuth (Bi2S3)et de cuivre (CuS) ; - les carbures de chrome (Cr3C2), de manganèse (Mn3C), de molybdène (MoC, Mo2C), de titane (TiC), de tungstène (WC, W2C) et d'yttrium (YC2) ; - les borures de baryum (BaB6), de calcium (CaB6), de magnésium (MgB2), de manganèse (MnB2, Mn2B, MnB), molybdène (Mo2B, Mo2Bs), titane (TiB2) et tungstène (WB, W2B, W2B5) ;
les nitrures de chrome (CrN, Cr2N), de cuivre (Cu3N), de magnésium (Mg} N2), de N molybdène (MoN, MoN2), de titane (TiN) et de tungstène (W2N, WN2) ; les hydroxydes de magnésium, de bismuth et de manganèse.
En tant que sels inorganiques insolubles (iii), on utilise avantageusement un sel choisi parmi les phosphates ou hydrogénophosphates, les carbonates, les fluorures, les iodures, les bromures, les chlorures, les molybdates, les iodates, les sulfates, les nitrates, les sulfites, les bromates, les titanates et les tungstates.
A titre d'exemple, on peut citer, comme composé (iii) préféré le tungstate de calcium, le titanate de baryum, le titanate de strontium, l'iodure de cuivre, le thiocyanate de cuivre, le carbonate de plomb, l'hydrogénosulfate de plomb, l'orthophosphate d'argent, le thiocyanate d'argent et l'iodure de thallium.
Dans les compositions cosmétiques selon l'invention, les particules solides comprenant au moins un composé inorganique sont, avantageusement, présentes à une concentration comprise entre 0, 0001% et 30 %, de préférence entre 0, 001% et 5%, et encore plus préférentiellement entre 0, 01% et 1%, en poids, par rapport au poids total de la composition.
Les compositions de l'invention peuvent également comprendre d'autres types de particules.
Côté interrupteur K, celui-ci voit à ses bornes une tension Vo correspondant à la tension Vs majorée de la tension VDL et diminuée de la chute de tension dans l'enroulement Ll. La tension VL dans l'inductance L est en effet nulle dans cette période comme on le verra par la suite en relation avec la fin des chronogram-
mes. Les diodes Dl et D2 sont bloquées et les courants qui les traversent sont, par conséquent, nuls. Le courant IK dans l'in- terrupteur K ouvert est, bien entendu, nul.
A l'instant tlO, on commande la fermeture de l'interrupteur K. On entre donc dans une phase B de début de fermeture dont le schéma équivalent est représenté en figure 7B. Par rapport à la figure 7A, la seule différence est que l'inductance L en série avec l'interrupteur K fermé (court-circuit) est intercalée entre le point 4 et la masse 5. Le di/dt à la fermeture de l'interrupteur K est essentiellement fonction de l'inductance L.
En effet, ce di/dt dépend de la tension Es, die la tension VE, de la mutuelle inductance du circuit magnétique et des inductances à vide Lll et L22 du transformateur constitué par les enroulements principal LO, et secondaires Ll et L2. En raison du rapport de spires choisi, la valeur LU est très grande devant la valeur L22. La mutuelle inductance est par ailleurs faible devant la valeur Lll. Il en découle que la pente (di/dt) est, en première approximation, égale à VS/L. Le courant IDL dans la diode DL décroît donc avec cette pente jusqu'à un instant tl2. Comme on a recours à une jonction PN, la diode présente une zone de charges recouvrées. Par conséquent, le courant IDL s'annule à un instant tll, intermédiaire entre les instants tlO et tl2. Cet instant tll correspond à l'instant où le courant dans le commutateur K atteint la valeur Io. Entre les instants tlO et tl2, les diodes Dl et D2 restent bloquées. La tension VL aux bornes de l'inductance L devient approximativement égale à la tension VS.
A l'instant tl2, le courant dans la diode DL atteint la valeur IRM correspondant au maximum de charges recouvrées. A partir de l'instant tl2, les charges recouvrées par la diode DL diminuent. La diode DL se comporte alors comme une capacité. Le schéma équivalent de cette phase de fonctionnement C est représenté en figure 7C où la diode DL a été symbolisée sous la forme d'un condensateur. Le reste reprend les éléments de la figure 7B.
Comme le nombre de spires de l'inductance Ll est faible devant le nombre de spires de l'inductance LO, la tension VL, à ses bornes
est faible. Il en découle que la capacité constituée par la diode DL se charge en négatif. Ce phénomène est illustré en figure 6B par une poursuite de la décroissance du courant IDL jusqu'à un instant tl3 en forme de charge de capacité. Le courant décroît jusqu'à un courant Ir conditionné par l'inductance L2. En effet, la tension VL qui décroît pendant cette phase C devient négative jusqu'à rendre la diode D2 passante lorsque la tension VL devient suffisamment négative (instant tal3). Côté diode DL, la tension VDL atteint, à l'instant t13, la valeur- (Vg + VL1 + VL2 + VD2)- La tension VL atteint, à l'instant tl3, la valeur - (VK + VL2 + VD2)- A l'instant tl3 où la diode D2 devient passante, le courant IDL dans la diode DL s'interrompt brutalement et le courant correspondant est réinj ecté dans l'inductance L2. Le courant en excès (Ir) donne l'amplitude maximale du courant dans l'inductance L2. Ce courant dépend des nombres de spires NO et N2 des inductances LO et L2. A partir de l'instant tl3, on assiste à une conduction de la diode D2 (phase D). Le schéma équivalent est illustré en figure 7D. Comme la diode DL est bloquée, le condensateur CO est déconnecté. Le circuit magnétique est, pendant la phase D, dissocié de la charge Q. La diode D2 sert alors d'élément de roue libre pour transférer l'énergie stockée par l'inductance L dans le circuit magnétique par l'intermédiaire de l'enroulement L2. Les tensions aux bornes de la diode DL et de l'inductance L restent inchangées. De même, l'interrupteur K étant fermé, la tension à ses bornes est nulle. La diode Dl est bloquée. Quand le courant est intégralement transféré dans le circuit magnétique par l'inductance L2, le courant dans celle-ci s'annule (instant tl4), ce qui provoque le blocage naturel de la diode D2, c'est-à-dire avec un di/dt faible. L'enroulement L2 permet la décroissance du courant dans l'interrupteur K en transférant l'énergie au circuit magnétique qui le restituera par l'inductance LO. Entre les instants tl3 et tl4, le courant dans l'interrupteur K décroît depuis le niveau Io + Ir jusqu'au niveau Io.
A l'instant tl4, la tension aux bornes de l'inductance L s'annule, l'ensemble de l'énergie qu'elle contenait ayant été transférée dans le circuit magnétique. La tension aux bornes de la diode DL remonte légèrement tout en restant négative et prend une valeur- (VP + Voll) + VL + VK. On se souviendra que les tensions VL et VK sont alors négligeables (considérées comme nulles) par rapport aux tensions Vs et Voll.
A partir de l'instant tl4, on entre dans une phase E où l'interrupteur est fermé et où la commutation est terminée. Le schéma équivalent est représenté en figure 7E. Il comprend uniquement la source 6, les inductances LO et L, et l'interrupteur K. Le courant IK est stable au niveau Io de même que la tension VDL, la diode de roue libre étant bloquée. La tension aux bornes de l'interrupteur K est, bien entendu, nulle de même que la tension aux bornes de l'inductance L et les courants dans les diodes Dl et D2. Pendant la phase E, l'inductance LO se trouve chargée à travers l'inductance L et l'interrupteur K.
A un instant tl5 où l'on provoque l'ouverture de l'interrupteur K, on impose, grâce à la présence de l'enroulement Ll, une tension négative aux bornes de l'inductance L. On notera que, dans ce cas, il n'est pas nécessaire de contrôler le di/dt à l'ouverture du transistor (de façon classique). Le courant s'interrompt brutalement dans l'interrupteur K. L'inversion de la tension aux bornes de l'inductance Ll provoque l'évacuation, par la diode Dl, de l'énergie stockée pendant la phase E dans l'inductance L. A l'instant tl5, le courant ID1 prend donc brusquement la valeur Io et ce courant décroît jusqu'à s'annuler à un instant tl6. La pente de décroissance du courant ID, est fonction de la valeur de l'inductance L et correspond approximativement à VLl/L. Le courant dans l'inductance L s'annule à l'instant tl6 et tout le courant accumulé dans l'enroulement LO circule alors par l'enroulement Ll et la diode DL. Le schéma équivalent de la phase F est illustré en figure 7F. On notera que les diodes DL et Dl conduisent en même temps, mais le courant dans la diode DL part de zéro à l'instant tl5.
A l'instant t16, on se retrouve dans la phase A où l'interrupteur est ouvert.
Un avantage de la présente invention est qu'elle permet de récupérer les pertes liées à la commutation de fermeture de l'interrupteur de puissance pour les réinjecter dans la charge grâce au circuit magnétique. La réinjection du courant dans le convertisseur, pendant la phase D de commutation en fermeture de l'interrupteur, permet de diminuer le rapport cyclique. Le contrôleur (circuit de commande de l'interrupteur K) diminue généralement automatiquement ce rapport cyclique grâce à un moyen de régulation qui ne fait pas l'objet de l'invention. On voit donc apparaître ici une amélioration considérable du rendement du convertisseur.
Un autre avantage de la présente invention est que la solution proposée est particulièrement simple. Par rapport au circuit classique de la figure 4, on économise un interrupteur de puissance et, surtout, un circuit de commande complexe.
Un autre avantage de l'invention est qu'elle ne nécessite aucune modification du circuit de commande de l'interrupteur de puissance, pourvu que celui-ci effectue (ce qui est généralement le cas) une régulation.
La mise en oeuvre de l'invention requiert d'ajouter un circuit magnétique LO, Ll, L2 qui peut être obtenu au moyen d'une seule inductance à trois enroulements. Un tel circuit magnétique est considérablement moins coûteux que la complexité nécessaire du circuit de commande de la figure 4 et qu'une diode sans charges recouvrées. A cet égard, on notera que la solution d'une diode sans charges recouvrées ne permet pas de récupérer les pertes dans l'interrupteur.
La figure 8 représente un autre mode de réalisation d'un circuit 10'd'aide à la commutation de l'invention, appliqué à un convertisseur abaisseur de tension. Le schéma de la figure 8 est à rapprocher de celui de la figure 2. Par rapport au schéma de la figure 2, on intercale l'inductance L entre le point 41 ei l'interrupteur K. L'inductance L2 en série avec la diode D2 est
Les dendrimères (du grec dendron = arbre) sont des molécules polymères "arborescentes", c'est-à-dire très ramifiées inventées par D. A. Tomalia et son équipe au début des années 90 (Donald A. Tomalia et al., Angewandte Chemie, Int. Engl. Ed., vol. 29, n 2, pages 138 - 175). Il s'agit de structures construites autour d'un motif central généralement polyvalent. Autour de ce motif central, sont enchaînés, selon une structure parfaitement déterminée, des motifs ramifiés d'allongement de chaîne donnant ainsi naissance à des macromolécules symétriques, monodispersées ayant une structure chimique et stéréochimique bien définie. Des dendrimères de type polyamidoamine sont commercialisés par exemple sous la dénomination STARBUST par la société DENDRITECH.
Les polymères hyperramifiés sont des polycondensats, généralement de type polyester, polyamide ou polyéthylèneamine, obtenus à partir de monomères multifonctionnels, qui ont une structure arborescente similaire à celle des dendrimères mais beaucoup moins régulière que celle-ci (voir par exemple WO-A-93/17060 et WO 96/12754).
La société PERSTORP commercialise sous la dénomination BOLTORN des polyesters hyperramifiés. On trouvera sous la dénomination COMBURST de la société DENDRITECH des polyéthylèneamines hyperramifiées. Des poly (esteramide) hyperramifiés à extrémités hydroxyle sont commercialisés par la société DSM sous la dénomination HYBRANE .
Ces dendrimères et polymères hyperramifiés estérifiés ou amidifiés par l'acide acrylique et/ou méthacrylique se distinguent des polymères décrits sous les points a) à h) ci-dessus par le très grand nombre de doubles liaisons éthyléniques présentes. Cette fonctionnalité élevée, le plus souvent supérieure à 5, les rend particulièrement utiles en leur permettant de jouer un rôle de "n#ud de réticulation", c'est-à-dire de site de réticulation multiple.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, on utilisera par conséquent ces polymères dendritiques et hyperramifiés en association avec un ou plusieurs des polymères et/ou oligomères a) à h) ci-dessus.
Comme autres polymères utilisables selon l'invention, on peut également utiliser un polyène associé à un polythiol.