INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
que l'on met en réaction, lorsqu'on le souhaite, avec un composé de formule (IX) : R'-Z (IX) dans laquelle R' représente un groupement alkyle (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, (éventuellement substitué par un groupement aryle ou NR9R10 dans laquelle R9 et R10, identiques ou différents, représentent chacun un groupement alkyle (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, ou forment ensemble avec l'atome d'azote qui les porte un hétérocycle azoté) ou alkényle (Ci-Ce) linéaire ou ramifié, et Z représente un groupement partant tel que, par exemple, un atome d'halogène ou un groupement mésylate, tosylate ou trifluorométhanesulfonate, pour conduire au composé de formule (X) : dans laquelle R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8 et R' ont la même signification que précédemment, composés de formule (VIII) ou (X) que l'on met en réaction avec un composé de formule (XI) : H2NXR9 (XI) dans laquelle X et R9 ont la même signification que dans la formule (I), pour conduire au composé de formule (I) que l'on purifie, le cas échéant, selon une technique classique de purification, dont on sépare, si on le souhaite, les isomères selon une technique classique de séparation, et que l'on transforme, si on le souhaite, en ses sels d'addition à un acide ou à une base pharmaceutiquement acceptable.
Le composé de formule (XI) peut être obtenu à partir du composé de formule (XII) : R9-XH (XII) dans laquelle X et R9 ont la même signification que précédemment,
selon le procédé décrit dans Synthesis 1976, pp. 682-683 ou dans Synthesis 1980, pp. 461.
Les préparations A à E conduisent à des intermédiaires de synthèse, utiles pour la préparation des composés de l'invention.
Préparation A : 5-(2-Diméthylaminoéthoxy)-2-nitro-benzaldéhyde A 20 mmoles de carbonate de potassium en suspension dans un mélange de diméthylformamide et d'éther isopropylique sont additionnées, au goutte à goutte, 10 mmoles de 5-hydroxy-2-nitro-benzaldéhyde en solution dans le diméthylformamide, puis le mélange réactionnel est porté au reflux pendant 2 heures. Après retour à température ambiante, 10 mmoles de chlorhydrate de 2-chloro-N, N-diméthyléthanamine sont ajoutées au goutte à goutte, puis le mélange réactionnel est à nouveau porté au reflux pendant une nuit. Après retour à température ambiante, le mélange est filtré et les solvants du filtrat sont évaporés pour conduire au produit attendu sous la forme d'une huile.
Préparation B : 2-Nitro-5-[2-(pipéridin-l-yl)-éthoxy]-benzaldéhyde Le produit attendu est obtenu selon le procédé décrit dans la préparation A à partir de 5-hydroxy-2-nitro-benzaldéhyde et de chlorhydrate de 1-(2-chloroéthyl)-pipéridine.
Préparation C : 2-Nitro-5-(pyrrolidin-l-yl-éthoxy)-benzaldéhyde Le produit attendu est obtenu selon le procédé décrit dans la préparation A à partir de 5-hydroxy-2-nitro-benzaldéhyde et de 1-(2-chloroéthyl)-pyrrolidine. Préparation D : 5- [N -(2-Diméthylaminoéthyl)- N-méthylamino ]-2-nitro-benzaldéhyde Le produit attendu est obtenu selon le procédé décrit dans la préparation A à partir de 5-amino-2-nitro-benzaldéhyde et de chlorhydrate de 2-chloro-N,N-diméthyléthanamine. Préparation E : 5-(2-Diéthylaminoéthoxy)-2-nitro-benzaldébyde Le produit attendu est obtenu selon le procédé décrit dans la préparation A à partir de 5-hydroxy-2-nitro-benzaldéhyde et de chlorhydrate de 2-chloro-N,N-diéthyléthanamine.
EXEMPLE 1 : (10 Z)-8-(2-Diméthylaminoéthoxy)-2,3-diméthoxy-indéno[l,2-b]indol -10(5H)-one C?-(1-phényl-2-propynyI)oxime, chlorhydrate
Médicaments et traitements des maladies La présente invention a pour objet un médicament renfermant, à titre de principe actif, un polypeptide conforme à l'invention.
L'invention concerne encore l'utilisation d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
L'invention concerne également l'utilisation d'un polypeptide, d'un polynucléotide, d'un vecteur recombinant, d'une cellule hôte et/ou d'un anticorps tels que définis précédemment, pour la fabrication d'un médicament destiné - à la prévention ou au traitement de l'anémie, tout particulièrement chez les patients dialysés en insuffisance rénale, ainsi que l'anémie consécutive à des Infections chroniques, des processus Inflammatoires, des radiothérapies, et des chimiothérapies, et - à augmenter la production de sang autologue, notamment chez les patients participants à un programme de prélèvement autologue différé afin d'éviter . ne utllisation de sang homologue
L'invention concerne encore l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention, d'un vecteur recombinant défini précédemment, d'une cellule hôte définie précédemment, d'un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, pour la fabrication d'un médicament destinée à la prévention ou au traitement de différents dérèglements et/ou maladies humaines, tels que les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les myélomes, les tumeurs cancéreuses ou non, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses en particulier les infections virales comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie en particulier chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les verrues génitales ou vénériennes, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Le dosage d'un polypeptide et des autres composés de l'invention, utiles en tant que principe actif, dépend du choix du composé, du mode
d'administration, de la nature de la formulation, de la nature du sujet et du jugement du médecin.
Lorsqu'il est utilisé comme principe actif, un polypeptide conforme à l'invention est généralement administré à des doses comprises entre 1 et 300 unités/kg du sujet.
Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le dextrose, le glycérol, l'éthanol, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques, les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Le ou les principes actifs conforme à l'invention peuvent être employés seul ou en combinaison avec d'autres composés, tels que des composés thérapeutiques tels d'autres cytokines comme l'interleukine ou les interférons, par exemple.
Creighton, New York, 1993, POST-TRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, New York, 1983, Seifter et a !."Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth. Enzymol. (1990) 182 : 626-646 et Rattan et al."Protein Synthesis : Post-translational Modifications and Aging", Ann NY Acad Sci (1992) 663 : 48-62.
On entend par"polynucléotide isolé"ou"polypeptide isolé"un polynucléotide ou un polypeptide tel que défini précédemment qui est isolé du corps humain ou autrement produit par un procédé technique.
On entend par"identité", la mesure d'identité d'une séquence nucléotidique ou polypeptidique.
L'identité est un terme bien connu de l'homme du métier et de la littérature. Voir COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., Ed., Oxford University Press, New York, 1998 ; BIOCOMPUTING INFORMATICS AND GENOME PROJECT, Smith, D. W., Ed., Academic Press, New York, 1993 ; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. M. and Griffin H. G., Ed, Humana Press, New Jersey, 1994 ; et SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987.
Les méthodes communément employées pour déterminer l'identité et la similarité entre deux séquences sont également bien décrites dans la littérature. Voir GUIDE TO HUGE COMPUTER, Martin J. Bishop, Ed, Academic Press, San Diego, 1994, et Carillo H. and Lipton D., Siam J Applied Math (1988) 48 : 1073.
Un polynucléotide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec la séquence nucléotidique ID SEQ No 1 est un polynucléotide qui comporte au plus 5 points de mutation modifiés sur 100 nucléotides, par rapport à ladite séquence.
Ces points de mutation peuvent être une (ou plusieurs) substitution (s), addition (s) et/ou délétion (s) d'un (ou plusieurs) nucléotide (s).
De même, un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec la séquence d'acides aminés ID SEQ No 2 est un polypeptide
qui comporte au plus 5 points de mutation sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence.
Ces points de mutation peuvent être une (ou plusieurs) substitution (s), addition (s) et/ou délétion (s) d'un (ou plusieurs) acide (s) aminé (s).
Les polynucléotides et les polypeptides conformes à l'invention qui ne sont pas totalement identique avec respectivement la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou la séquence d'acides aminés ID SEQ NO2, étant entendu que ces séquences comportent au moins un des polymorphismes de type SNP conformes à l'invention, sont considérés comme des variants de ces séquences.
Habituellement, un polynucléotide conforme à l'invention possède la même ou pratiquement la même activité biologique que la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 comportant au moins un des polymorphismes de type SNP conformes à l'invention.
De même, un polypeptide conforme à l'invention possède habituellement la même ou pratiquement la même activité biologique que la séquence d'acides aminés ID SEQ N 2 comportant au moins un des polymorphismes de type SNP conformes à l'invention.
Un variant, selon l'invention, peut être obtenu, par exemple, par mutagenèse dirigée ou par synthèse directe.
On entend par"polymorphisme de type SNP", toute variation naturelle d'une base dans une séquence nucléotidique.
On entend par"polymorphisme de type SNP fonctionnel", un polymorphisme de type SNP qui a pour conséquence de modifier la fonctionnalité d'un polynucléotide ou d'un polypeptide codé par ce polynucléotide.
De même, un polypeptide ayant, par exemple, une identité d'au moins 95 % avec la séquence d'acides aminés ID SEQ No 2 est un polypeptide qui comporte au plus 5 points de mutation sur 100 acides aminés, par rapport à ladite séquence.
Les polynucléotides et les polypeptides conformes à l'invention qui ne sont pas totalement identique avec respectivement la séquence nucléotidique ID SEQ N 1 ou la séquence d'acides aminés ID SEQ NO2, étant entendu que ces séquences comportent le polymorphisme de type SNP de l'invention, sont considérés comme des variants de ces séquences.
Habituellement un polynucléotide conforme à l'invention possède la même, ou pratiquement la même activité biologique, que la séquence nucléotidique ID SEQ NO1 comportant au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : c973a, g1011c, t1049a, t1155a, a1204g.
De même, habituellement un polypeptide conforme à l'invention possède la même, ou pratiquement la même activité biologique que la séquence d'acides aminés ID SEQ ? 2 comportant au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : Q102K, Q114H, V127D, C162stop, K179E.
La fonctionnalité d'un polypeptide conforme à l'invention ou d'un polynucléotide codant pour ce polypeptide peut consister en une augmentation, une diminution ou une suppression de l'activité biologique, voire un changement de nature total ou partiel de l'activité biologique soit du polypeptide
codé par la séquence nucléotidique du gène sauvage de référence soit de cette dernière séquence nucléotidique.
Polynucléotide La présente invention a pour premier objet un polynucléotide isolé comprenant : a) une séquence nucléotidique ayant au moins 80 % d'identité, préférentiellement au moins 90 % d'identité, plus préférentiellement au moins 95 % d'identité et encore plus préférentiellement au moins 99 % d'identité avec la séquence ID SEQ No 1 ou sa séquence codante (du nucléotide 670 au nucléotide 1239), sous réserve que cette séquence nucléotidique comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - c973a, - g1011c, - t1049a, - t1155a, - a1204g ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
Le polynucléotide conforme à l'invention peut ainsi comporter un ou plusieurs polymorphisme (s) de type SNP fonctionnel (s) défini (s) précédemment, comme par exemple l'association des polymorphismes g 1011 c et t1049a.
La présente invention concerne également un polynucléotide isolé comprenant : a) la séquence nucléotidique ID SEQ NO 1 ou sa séquence codante sous réserve que chacune de ces séquences comporte au moins l'un des polymorphismes de type SNP suivants : - c973a,
- g1011c, - t1049a, - t1155a, - a1204g ; ou b) une séquence nucléotidique complémentaire à une séquence nucléotidique sous a).
Après la dernière étape dans le thermocycleur, la plaque est directement placée sur un lecteur de fluorescence polarisée de type Analyst@ HT de LJL Biosystems Inc.. La plaque est lue à l'aide du logiciel Criterion Host (D en utilisant deux méthodes. La première permet de lire la base marquée en Tamra en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 550-10 nm, émission 580-10 nm) et la seconde permet de lire la base marquée en R110 en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifiques de ce fluorophore (excitation 490-10 nm, émission 520- 10 nm). Dans les deux cas, un miroir double dichroïque (R110/Tamra) est utilisé et les autres paramètres de lecture sont : Z-height : 1,5 mm Attenuator : out Temps d'intégration : 100,000 usée.
Raw data units : counts/sec Switch polarization : by well Plate settling time : 0 msec PMT setup : Smart Read (+), sensitivity 2 Dynamic polarizer : emission Static polarizer : S
Un fichier résultat est alors obtenu contenant les valeurs calculées de mP pour le filtre Tamra et celle pour le filtre Ri 10. Ces valeurs de mP sont calculées à partir des valeurs d'intensité obtenues sur le plan parallèle (/ et sur le plan perpendiculaire (#) d'après la formule suivante : mP =1000 (//-g)/ (//+gJl).
Dans ce calcul, la valeur sur le filtre. 1 est pondérée d'un facteur g.
Etapes 4) et 5) Interprétation de la lecture et détermination des génotypes.
Les valeurs de mP sont reportées sur un graphe à l'aide du logiciel Excel de Microsoft Inc., et/ou du logiciel Allele Caller# développé par LJL Biosystems Inc..
En abscisse est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Tamra, en ordonnée est indiquée la valeur de mP de la base marquée au Ri 10. Une forte valeur de mP indique que la base marquée avec ce fluorophore est incorporée et, inversement, une faible valeur de mP révèle l'absence d'incorporation de cette base.
On obtient jusqu'à 3 groupes homogènes de séquences nucléotidiques ayant des génotypes différents, comme indiqué dans la Figure 12.
L'utilisation du logiciel Allele Caller@ permet, une fois le repérage des différents groupes réalisé, d'extraire directement le génotype défini pour chaque individu sous forme d'un tableau.
Les séquences des deux amorces de miniséquençage nécessaires pour le génotypage ont été déterminées. Ces amorces sont sélectionnées pour correspondre à une vingtaine voire une trentaine de nucléotides placés juste en amont du site polymorphe. Du fait que le produit de PCR contenant un SNP est un produit d'ADN double brin, le génotypage peut donc se faire soit sur le brin sens soit sur le brin antisens. Les amorces sélectionnées sont fabriquées par Life Technologies Inc.
Les amorces du miniséquençage sont les suivantes :
Amorce sens : (E) : agcctgcgtgatacaggagg Amorce antisens : (F) : ggggagtctcttccacccca Le miniséquençage du polymorphisme de type SNP t1049a a d'abord été validé sur 16 échantillons, puis génotypé sur l'ensemble de la population d'individus composée de 239 individus et 7 blancs.
Conditions de miniséquençage testées : Condition No 1 : Amorce sens + ddATP-R110 + ddTTP-Tamra Condition No 2 : Amorce sens + ddTTP-R110 + ddATP-Tamra Condition ? 3 : Amorce antisens + ddTTP-R110 + ddATP-Tamra Condition ? 4 : Amorce antisens + ddATP-R110 + ddTTP-Tamra Ces 4 conditions ont été testées et la condition N 4 a été retenue pour le génotypage.
B) Résultats Après la réalisation complète du processus de génotypage, la détermination des génotypes des individus de la population d'individus pour le SNP fonctionnel étudié ici a été réalisée à l'aide du graphe représenté sur la Figure 12.
Ce génotype est en théorie soit homozygote TT, soit hétérozygote TA, soit homozygote AA chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote AA n'est pas détecté dans la population d'individus.
Ces chambres de culture sont stérilisées avant toute utilisation. Une solution de paraformaldehyde à 4 % dans un tampon physiologique (Phosphate Buffer Saline) peut être utilisée à cet effet. Tout autre type de stérilisation ne faisant pas intervenir la chaleur peut également être utilisé (rayon gamma, oxyde d'éthylène, etc. ). Les chambres sont par exemple plongées dans cette solution de paraformaldehyde à 4 % pendant 4 heures, puis rincées plusieurs fois dans de l'eau distillée.
L'invention propose un procédé avantageux de préparation d'une telle chambre de culture, comprenant les étapes suivantes : a) stériliser la chambre de culture,
b) mélanger, à 0 C, une solution de collagène de type 1 dans de l'acide acétique avec une solution physiologique concentrée et avec une solution de soude dans des proportions permettant d'obtenir une matrice de collagène ayant un pH et une concentration osmotique physiologique, c) éventuellement, mélanger à 0OC la solution obtenue à l'étape b), avant qu'elle ne gélifie, avec de l'extrait de tumeur EHS de souris dans des proportions de 1/2 à 1/5, d) couler la solution obtenue en b) ou c) dans les chambres de culture stérilisée, et, gélifier le mélange à 37 C pendant 1 heure, e) éventuellement, couler une deuxième couche du mélange obtenu en b) ou c) sur la première couche de collagène gélifié obtenu en d) lorsque cette dernière est polymérisée. f) Eventuellement, couler une deuxième couche du mélange obtenu en b) ou c) dans le compartiment opposé à la première couche de collagène gélifié.
La quantité de solution obtenue en b) ou en c) dépend de la taille de la chambre.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le collagène de type 1 en solution dans de l'acide acétique à 0, 1%, à la concentration désirée, est mélangé à 0OC, dans du milieu de culture DMEM concentré 10 fois sans bicarbonate et dans une solution de soude à 0,1 N contenant du bicarbonate concentré 10 fois (35 g par litre) dans les proportions 8/1/1. Lors de l'étape d) du procédé ci-dessus décrit, on coule entre 10 et 200 ut de la solution obtenue en b) contenant 1/5 d'extrait de tumeur EHS de souris pour des chambres de culture d'une surface de 0,6 à 1,2 cm2.
Une caractéristique de la chambre de culture selon l'invention concerne le filtre séparant les deux compartiments de la chambre qui doit être imprégné d'une matrice biologique telle que décrite précédemment.
Procédés de préparation de tissus reconstitués
La présente invention décrit ainsi pour la première fois un procédé de préparation d'un tissu reconstitué dans une chambre de culture selon l'invention, comprenant les étapes suivantes : a) ensemencer le premier type cellulaire du tissu à reconstituer dans le premier compartiment de la chambre de culture, b) après un délai nécessaire pour permettre l'adhésion de cellules à la membrane et, le cas échéant, la formation d'un amas cellulaire suffisant, ensemencer le deuxième type cellulaire dans le deuxième compartiment de cette chambre, et c) maintenir les cellules en culture pendant un délai suffisant pour permettre l'organisation cellulaire caractéristique du tissu et l'innervation des cellules cibles par les cellules nerveuses, de préférence de 5 à 30 jours.
Selon un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, les cellules en culture sont placées dans une étuve à 37 C environ contenant 2 à 7,5% de C02 en atmosphère saturée en eau.
Selon un autre mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, le premier type cellulaire ensemencé correspond à la population de cellules cibles.
Dans le modèle épiderme-neurones sensitifs, la dépolarisation des neurones sensitifs peut être augmentée, par exemple par l'adjonction de KCI au milieu de culture, de préférence après le dixième jour de maintien des cellules en culture et d'une manière encore plus préférée après le douzième jour.
Dans le modèle nerf-muscle, l'activité électrique des neurones et la fréquence des contractions des fibres musculaires peut-être stimulée par l'adjonction de KCI ou de toute autre molécule modifiant l'activité électrique, au milieu de culture de préférence après le cinquième jour de maintien des cellules en culture et d'une manière préférée après trois semaines de culture.
Selon un autre mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, les deux types cellulaires sont ensemencés à une densité cellulaire fonction du type cellulaire et adaptée à la surface des compartiments.
Les cellules mises en culture peuvent être des kératinocytes de mammifères et le tissu à reconstituer, à l'aide de ces cellules, un épiderme innervé. Dans ce cas, la densité cellulaire des kératinocytes est de 200000 à 600000 cellules par cm2 et celle des neurones est de 50000 à 300000 cellules par cm2. De préférence, le nombre de kératinocytes, dans une chambre de culture dont la surface est de 0,6 cm2 est d'environ 250 000 cellules et celle des cellules nerveuses est d'environ 100 000 cellules.
La présente invention décrit ainsi pour la première fois un procédé de préparation d'un épiderme reconstitué dans une chambre de culture selon l'invention, comprenant les étapes suivantes : a) ensemencer une population de cellules comprenant des kératinocytes à la densité cellulaire adaptée à la surface de la chambre de culture, dans le premier compartiment de celle-ci, b) placer les cellules dans une étuve à 37 C environ contenant 2 à 10% de C02 en atmosphère saturée en eau, pendant 24 heures environ, c) retourner la chambre et ensemencer les neurones sensitifs à la densité cellulaire adaptée à la surface de cette chambre, dans le deuxième compartiment de celle-ci, d) placer la chambre dans une étuve à 37 C environ contenant 2 à 10% de CO2 en atmosphère saturée en eau, e) au deuxième jour de culture des kératinocytes environ, retourner la chambre une deuxième fois et éliminer le milieu de culture côté kératinocytes, et f) maintenir les cellules en culture pendant 13 à 17 jours environ, en interface air-liquide, dans une étuve à 37 C environ, contenant 2 à 10% de CO2 en atmosphère saturée en eau.