INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Un tel acide nucléique peut aussi être utilisé pour la synthèse de sondes et d'amorces nucléotidiques destinées à la détection ou à l'amplification de séquences nucléotidiques comprises dans le gène DD1-b dans un échantillon, le cas échéant de séquences du gène DD1-b portant une ou plusieurs mutations, préférentiellement une ou plusieurs mutations de nature à modifier le génotype d'une plante portant un tel gène DD1-b muté, par exemple en modifiant la régulation du transfert de métabolites de la plante mère vers l'albumen en développement ou encore en modifiant la régulation de la réponse de la plante à un stress biotique tel que l'infection par un pathogène des végétaux.
TABLEAU 4 Séquences des introns du gène DD1-b
Exon no Position du nucléotide en 5'sur Position du nucléotide en 3'sur la SEQ ID NO2 la SEQ ID D ? 2 1 2997 3723 2 3904 4101 342405098
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide intronique du gène DD1-b, tels que les polynucléotides 1 à 3 décrits dans le tableau 4 ci-dessus, qui sont tous inclus dans l'acide nucléique de séquence SEQ ID ? 2.
Un tel acide nucléique peut être utilisé comme sonde ou amorce oligonucléotidique pour détecter la présence d'au moins une copie du gène DD1-b dans un échantillon, ou encore pour amplifier une séquence cible déterminée au sein du gène DD1-b.
La séquence nucléotidique du gène DD1-b essentiellement restreinte à la région codante comprenant les quatre exons et les trois introns du gène est référencée comme la séquence SEQ ID ? 6 du listage de séquence.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO6, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est également relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO6, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID NO6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique SEQ ID N 6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
La séquence nucléotidique SEQ ID ? 6 comprend notamment les séquences suivantes : a) la séquence de l'exon 1 du gène DD1-b allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 197 de la séquence SEQ ID ? 6 ; b) la séquence de l'exon 2 allant du nucléotide en position 925 jusqu'au nucléotide en position 1104 de la séquence SEQ ID ? 6 ; c) la séquence de l'exon 3 allant du nucléotide en position 1303 jusqu'au nucléotide en position 1440 de la séquence SEQ ID ? 6 ; d) la séquence de l'exon 4 allant du nucléotide en position 2300 jusqu'au nucléotide en position 2859 de la séquence SEQ ID ? 6 ;
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
Constitue un autre objet de l'invention un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique SEQ ID N 4, ainsi qu'un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID N 4.
L'invention est également relative à un acide nucléique comprenant un polynucléotide régulateur de l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt chez une plante, ledit polynucléotide régulateur comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 4, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique.
Par fragment d'un acide nucléique de l'une des séquences régulatrices du gène DD1-a ou DD1-b selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur en bases inférieure à celle de la séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 4 et conservant la capacité à diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans une plante.
De manière tout à fait préférée, un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention consiste en une séquence nucléotidique d'une longueur en bases inférieure à celle de la séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID ? 4 et conservant la capacité à diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement.
L'activité biologique d'un fragment d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 4 régulateur selon l'invention peut être aisément vérifiée par l'homme du métier, notamment à l'aide des constructions de vecteurs et des procédés de transformation de plantes avec ces derniers, tels que décrits dans les exemples de la présente description.
A titre illustratif, un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être obtenu par coupure enzymatique de l'un des acides nucléiques décrits ci-dessus, de manière préférée d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 4, à l'aide d'une exonucléase ou encore d'une endonucléase de restriction.
Notamment, un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peut être obtenu par exemple par délétion d'un ou plusieurs nucléotides du polynucléotide de séquence SEQ ID ? 3 OU SEQ ID ? 4 à l'aide de la technique à l'exonucléase lil, telle que décrite par exemple par AUSUBEL et al. (1989).
Un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention a avantageusement une longueur d'au moins 200,250, 300,400, 500,750, 1000,1200, 1500,2000 ou 2500 nucléotides, ou encore paires de bases (bp), s'il se présente sous la forme double brin.
Pour la mise en oeuvre d'enzymes de restriction aux fins d'obtenir des fragments d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de SAMBROOK et al.
Un fragment d'un acide nucléique régulateur selon l'invention pourra également être préparé par amplification spécifique du fragment d'intérêt à l'aide d'un couple d'amorces encadrant, respectivement du côté 5' et du côté 3', la séquence d'intérêt, par exemple à l'aide de la méthode PCR, telle que décrite notamment dans les brevets américains n US 4.683. 195, US 4.683. 202 et US 4.965. 188.
Par exemple, l'homme du métier peut obtenir un fragment de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a de séquence SEQ ID D ? 3 par amplification de la séquence SEQ ID ? 3 à l'aide de la paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID N 13 et SEQ ID N 17, ou encore avec la paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID N 14 et SEQ ID N 17.
L'homme du métier peut obtenir un fragment d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-b de séquence SEQ ID ? 4 en mettant en oeuvre une paire d'amorces respectivement de séquences SEQ ID N 15 et SEQ ID ? 17 ou encore une paire d'amorces de séquences respectives SEQ ID ? 16 et SEQ ID NO17.
Des fragments d'un acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID N 3 ou SEQ ID N 4 selon l'invention comprennent de préférence au
e) la séquence de l'intron 1 du gène DD1-b allant du nucléotide en position 198 jusqu'au nucléotide en position 924 de la séquence SEQ ID ? 6 ; f) la séquence de l'intron 2 allant du nucléotide en position 1105 jusqu'au nucléotide en position 1302 de la séquence SEQ ID ? 6 ; et g) la séquence de l'intron 3 allant du nucléotide en position 1441 jusqu'au nucléotide en position 2299 de la séquence SEQ ID ? 6.
En conséquence, l'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend l'une des séquences nucléotidiques suivantes : a) la séquence allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 197 de la séquence SEQ ID Ne6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; b) la séquence allant du nucléotide en position 925 jusqu'au nucléotide en position 1104 de la séquence SEQ ID Ne6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; c) la séquence allant du nucléotide en position 1303 jusqu'au nucléotide en position 1440 de la séquence SEQ ID Ne6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; et d) la séquence allant du nucléotide en position 2300 jusqu'au nucléotide en position 2659 de la séquence SEQ ID Ne6, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Les séquences nucléotidiques des introns 1,2 et 3 du gène DD1-b ainsi que leurs acides nucléiques de séquences complémentaire font également partie de l'invention.
Il a été montré selon l'invention que le gène DD1-b est transcrit sous la forme d'un ARN messager qui a été isolé et caractérisé. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert unique codant pour la protéine DD1-b d'une longueur de 286 acides aminés.
De part et d'autre du cadre ouvert de lecture, cet ARN messager comprend respectivement une région 5'non traduite (5'-UTR) et une région 3'non traduite (3'-UTR).
L'ADNc correspondant au produit de transcription du gène DD1-b peut être défini comme la séquence SEQ ID N 8 du listage de séquences.
Un ADNc dérivé de l'ARN messager du gène DD1-b de séquence nucléotidique SEQ ID ? 8 comprend respectivement : a) une séquence 5'-UTR allant du nucléotide en position 1 jusqu'au nucléotide en position 14 de la séquence SEQ ID ? 8 ; b) une phase ouverte de lecture allant du nucléotide en position 15, la base A du codon d'initiation de la traduction ATG, jusqu'au nucléotide en position 875, base G du codon TAG d'arrêt de la traduction de la séquence nucléotidique SEQ ID NO8, et qui correspond à la séquence codante de l'ARN messager du gène DD1-b ; et c) une région 3'UTR allant du nucléotide en position 876 jusqu'au nucléotide en position 1075 de la séquence SEQ ID ? 8.
En conséquence, un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO8, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID ? 8 ou un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a également trait à un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec la séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 15 jusqu'au nucléotide en position 875 de la séquence SEQ ID D ? 8.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique allant du nucléotide en position 15 jusqu'au nucléotide en position 875 de la séquence SEQ ID ? 8.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID ? 8 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID NO8, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Constitue aussi un objet de l'invention un acide nucléique défini par la séquence allant du nucléotide en position 15 jusqu'au nucléotide en position 875 de la séquence nucléotidique SEQ ID NO8, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Les séquences nucléotidiques génomiques SEQ ID ? 2 et SEQ ID ? 6 ainsi que l'ADNc de séquence SEQ ID ? 8 codent pour un polypeptide du gène DD1-b.
Il a été montré selon l'invention l'existence de variants polypeptidiques codés par le gène DD1-b, selon les souches de maïs desquelles ils proviennent, et qui possèdent entre eux environ 98% d'identité en acides nucléiques et qui possèdent une longueur de 286 acides aminés.
moins l'une des boîtes TATA référencées pour chacune de ces séquences dans le tableau 9 ci-dessus, et encore plus préférentiellement les trois boîtes TATA référencées dans ce tableau.
L'intérêt d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou DD1-b selon l'invention, comprenant la séquence SEQ ID D ? 3 ou SEQ ID NO4, ou encore un fragment de l'une de ces séquences, est d'inclure cet acide nucléique régulateur dans une construction d'ADN, ou cassette d'expression, comprenant également un polynucléotide d'intérêt dont l'expression spécifique est recherchée dans les cellules de la zone de transfert du grain.
L'invention a donc encore pour objet un acide nucléique comprenant une séquence nucléotidique d'intérêt placée sous le contrôle d'un polynucléotide régulateur tel que défini ci-dessus. Un tel acide nucléique peut être appelé cassette d'expression .
L'invention concerne encore un acide nucléique comprenant un polynucléotide régulateur tel que défini ci-avant, caractérisé en ce qu'il comprend en outre une séquence nucléotidique d'intérêt fonctionnellement associée au polynucléotide régulateur.
De manière générale, la séquence nucléotidique d'intérêt peut être toute séquence codant pour une protéine dont l'expression est recherchée dans une plante ou encore toute séquence codant pour un acide nucléique sens ou un acide nucléique antisens.
Dans un mode de réalisation préféré, la séquence nucléotidique d'intérêt code pour une protéine impliquée dans le transfert de métabolites vers l'albumen en développement d'un grain de plante.
L'invention a donc aussi pour objet l'utilisation d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b tel que défini ci-dessus dans des constructions nucléotidiques destinées à améliorer la qualité agronomique, alimentaire ou industrielle d'une plante, en contrôlant notamment la taille et/ou le développement de l'albumen du grain.
On peut par exemple rechercher une augmentation de la teneur en lysine et ainsi modifier qualitativement la composition en protéines de l'albumen. On peut aussi rechercher une modification du rapport amylose/amylopectine afin de modifier la qualité de l'amidon stocké dans l'albumen, ou encore une augmentation de la teneur en amidon et augmenter ainsi la taille de l'albumen par rapport à l'embryon.
Par la transformation de plantes avec de telles constructions nucléotidiques, on peut également rechercher une action précoce et spécifique sur le développement des tissus de l'albumen en utilisant, en tant que séquence nucléotidique d'intérêt, une séquence dérivée d'un gène stimulateur (p. ex. hormone telle qu'une cytokinine ou une auxine). L'expression d'une hormone sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou DD1-b chez une plante peut permettre de modifier les processus de cellularisation et, de façon corrélée, le développement de l'albumen (SCOTT et al., 1998).
On peut aussi utiliser des séquences nucléotidiques d'intérêt dérivées de gènes codant pour des transporteurs de nutriments (notamment des sucres) à l'interface plante/albumen, ou encore dérivées de gènes codant pour des inhibiteurs de ces transports, en vue d'une accumulation différentielles de nutriments dans l'albumen.
On peut également utiliser des séquences nucléotidiques d'intérêt codant pour des protéines d'intérêt thérapeutique, telle que l'hémoglobine ou le Facteur Veil.
Des exemples illustratifs, mais non limitatifs, de séquences nucléotidiques d'intérêt pouvant être placées sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur des gènes DD1-a ou DD1-b selon l'invention sont présentés ci-dessous.
Séquences nucléotidiques d'intérêt placées sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention a) Métabolisme des sucres De manière générale, la séquence nucléotidique d'intérêt peut coder pour l'une quelconque des enzymes impliquées dans le stockage des sucres dans l'albumen, telles que l'invertase, la saccharose phosphate synthase, la saccharose synthase, l'UDP-glucose pyrophosphorylase, l'ADP-glucose pyrophosphorylase, la"starch branching enzyme"ou la"starch synthase".
La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour un transporteur de sucrose ou un transporteur d'hexose dans la zone de transfert BETL afin d'améliorer soit le transfert des assimilats soit d'augmenter la teneur en hexose dans l'endosperme ou bien dans la zone de transfert elle-même. Dans ce dernier cas, il peut y avoir un accroissement de l'activité mitotique via une stimulation du cycle cellulaire, notamment parce que les promoteurs DDt-a et DD1-b sont très précoces. Des séquences codant pour des transporteurs de sucres sont par exemple celles codant pour le transporteur symplastique H+ de sucrose (AOKI et al., 1999) ou pour divers transporteurs de monosaccharides décrits dans la base de données Est ZmDB (GAI et al., 2000).
La séquence nucléotidique d'intérêt peut aussi coder pour une hexokinase telle que décrite par JANG et al., (1997) afin d'améliorer le remplissage du grain.
L'utilisation de l'invertase (EC 3.2. 1.26) permettrait un clivage plus efficace du saccharose en glucose et fructose et serait susceptible d'augmenter la vitesse de transport et aussi de favoriser l'obtention de grains plus gros, puisqu'il est observé que des plantes mutantes pour cette enzyme possède des grains très petits. On peut utiliser une séquence codant pour une invertase pariétale ou pour une invertase soluble. On peut par exemple utiliser les séquences dérivées des gènes Inc W1 (NO d'accès AF050129 de
Au cours du refroidissement, on dispose le porte-lampe sur une machine de redressement. Cette machine comporte des outils aptes à pénétrer dans les ouvertures 32 du support s'étendant au regard de certains tronçons des lames. S'étendant à travers le support, ces outils sollicitent localement les tronçons en direction opposée au support de façon à les déformer en leur donnant à chacun une forme de bossage. La figure 6 montre ainsi deux des tronçons avant déformation, tandis que la figure 7 montre les mêmes tronçons après déformation. Au cours de cette déformation, les tronçons acquièrent donc une forme non plane et s'étendent
en saillie de la face 14 du support et du plan général des lames.
Cette déformation locale de certaines des lames permet de compenser les différences de retrait lors du refroidissement, de sorte que la réalisation de
ces bossages supprime l'effet bilame et préserve la forme plane du porte-
lampe. Bien entendu, au cours de la réalisation des bossages, les lames coulissent sous les ponts de matière plastique 20. Ainsi, cette opération adapte la longueur de chaque lame lors du retrait de la matière plastique
dans le but d'obtenir une très haute qualité géométrique et dimensionnelle.
Les ouvertures 32 et les tronçons correspondant s'étendent principalement
suivant les deux directions 6 et 16, mais certaines s'étendent en oblique.
Cette adaptation de la longueur des lames effectue donc une correction dimensionnelle dans plusieurs directions afin de minimiser au mieux les
risques de déformation.
En l'espèce, on réalise avec un seul jeu d'outillage (un outillage de découpe du circuit plus un outillage de surmoulage) les versions conduite à gauche et conduite à droite du feu. La distinction entre les deux versions du produit n'est effectuée qu'à la fin du procédé de fabrication lors du Il contrôle électrique de la pièce. En effet, il est prévu à cet égard au niveau du connecteur 10 deux ponts métalliques 40 entre deux des lames 8, illustrés à la figure 1, qui ne sont pas découpés durant le surmoulage mais restent accessibles après injection de la matière plastique. L'un de ces deux ponts est découpé au choix pour réaliser la version conduite à gauche ou conduite à droite du porte-lampe. Ensuite, on réalise sur le produit le test de conformité électrique. Si ce test est concluant, une zone de la plaquette d'identification 30 est découpée à un endroit prédéterminé en face de la référence adéquate. Cette découpe est ensuite utilisée comme moyen de détrompage et interdit le montage d'un porte-lampe correspondant à un certain côté de conduite sur un socle de feu correspondant à l'autre côté de conduite. On peut également conformer chacune des douilles 12 de façon à obtenir un effet de détrompage du montage de chaque lampe dans la douille correspondante, dans le cas o chaque douille est destinée à recevoir une
lampe d'un modèle spécifique différent des autres douilles.
On pourra prévoir que l'ensemble des lames ou tronçons qui s'étendent parallèlement à la direction 6 et des lames ou tronçons qui s'étendent parallèlement à l'autre direction 16 forment une majorité des lames ou tronçons. On pourra prévoir que les lames ou tronçons qui s'étendent parallèlement à une seule de ces deux directions forment à elles
seules une majorité des lames ou tronçons.
Bien entendu, on pourra apporter à l'invention de nombreuses
modifications sans sortir du cadre de celle-ci.
Le support 4 comporte par ailleurs un connecteur 10 destiné à recevoir un boîtier de connexion du véhicule de façon à connecter le feu au véhicule en vue de son alimentation en courant électrique et de sa commande. Le support 4 présente des douilles 12 ici au nombre de quatre. Chacune des douilles est destinée à recevoir une lampe du feu, en l'espèce une lampe à baïonnette par exemple de type P21W, P21/5W, R5W ou PY21W. Les douilles comprennent un corps en matière plastique d'une
seule pièce avec le support 4.
Le porte-lampe 2 comporte des lames métalliques 8 aptes à connecter électriquement entre eux les différents organes associés au porte-lampe, en particulier le connecteur 10 et les lampes logées dans les douilles 12. Les lames 8 s'étendent principalement dans un plan unique commun et sont disposées contre la face supérieure 14 du support 4 comme le montre la figure 1. Chacune des lames 8 est formée d'une seule pièce et on distingue sur chaque lame différents tronçons, en particulier des tronçons rectilignes et des tronçons courbes. En l'espèce, la majorité des tronçons des lames s'étendent parallèlement à la direction 6 ou parallèlement à une direction 16 perpendiculaire à la direction 6 et parallèle au support. Il s'ensuit que la majorité des tronçons des lames s'étendent à angle droit les uns des autres. Seuls quelques rares tronçons s'étendent en oblique ou bien
présentent une courbure prononcée sur une grande longueur.
Chacune des douilles 12 comporte deux pièces métalliques qui sont en l'espèce formées d'une seule pièce avec deux respectives des lames 8. Ainsi, en référence à la figure 3, la douille 12 comporte un corps 18 de forme générale cylindrique ouvert à ses deux extrémités axiales. Ce corps cylindrique en matière plastique est surmoulé sur une pièce de contact métallique 21 destinée à venir en contact avec la face latérale du culot de la lampe et l'une des baïonnettes. La douille présente des découpes destinées à
la fixation et au positionnement des baïonnettes de la lampe.
Par ailleurs, la douille comporte une deuxième pièce de contact 22 sous la forme d'une languette s'étendant en continuité avec l'une des lames 8 dans le plan de celle-ci et dont l'extrémité s'étend au milieu de la douille en interceptant son axe, près de l'extrémité arrière de la douille. Cette pièce de contact 22 est destinée à venir en contact avec l'extrémité axiale du culot de
Comme on le voit, la douille est ouverte vers le dessus à son extrémité axiale pour la réception de la lampe dans la douille. Elle est en outre ouverte à l'arrière, à son autre extrémité axiale en partie inférieure du porte-lampe pour laisser voir l'intérieur de la douille depuis l'arrière du porte-lampe. Ultérieurement, lors du process d'assemblage du portelampe sur le socle du feu, la machine d'assemblage comprend des pions qui pénètrent à travers l'extrémité arrière des douilles de façon à vérifier la
présence et le verrouillage de chaque lampe dans la douille correspondante.
De la sorte, I'absence de lampe dans une douille ou le mauvais
positionnement de la lampe dans la douille peut être immédiatement détecté.