INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le redresseur 12 a une structure telle qu'une diode du côté plus d1, et une diode du côté moins d2, qui sont connectées en série, une diode du côté plus et une diode du côté moins d22 qui sont connectées en série, une diode du côté plus d,3 et une diode du côté moins d23 qui sont connectées en série, et une diode du côté plus d,4 et une diode côté moins qui sont connectées en série, sont connectées en parallèle entre une borne de sortie B et la masse. De même, comme le montre la figure 7, le bobinage de stator 16 est connecté au redresseur 12 de telle sorte que la partie de commencement de bobinage 30a du bobinage est connectée entre la diode du côté plus d1, et la diode du côté moins d2, qui sont connectées en série, la partie de commencement de bobinage du bobinage 31 est connectée entre la diode du côté plus d,2 et la diode du côté moins d22 qui sont connectées en série, la partie de commencement de bobinage 32a du bobinage 32 est connectée entre la diode du côte plus d,3 et la diode du côté moins d23 qui sont connectées en série, et le point neutre est connecté entre la diode du côté plus d,4 et la diode du côté moins d24 qui sont connectées en série, respectivement.
Dans la génératrice de courant alternatif destinée à un véhicule ainsi structurée, si la vitesse de rotation est basse, une tension égale à 3,5 fois une tension induite monophasée est développée entre les fils. De même, si la vitesse de rotation est élevée, bien que le flux magnétique principal soit affaibli par un courant alternatif triphasé qui passe dans les trois bobinages monophasés 30, 31 et 32, étant donné qu'il reste une force électromotrice d'harmonique tertiaire plus élevée, cette génératrice est utilisée avec la diode connectée au point neutre.
Elle permet également d'aider à la mise en place d'essais thérapeutiques efficaces en améliorant la sélection des patients.
Une autre application de grand intérêt concerne le criblage pharmacologique pour la sélection de médicaments efficaces contre les pathologies neurodégénératives de type Alzheimer. Ainsi, les molécules sélectionnées sont caractérisées en ce qu'elles sont capables de modifier le profil Alzheimer évoqué ci-dessus, en conduisant à une diminution voire à une disparition des marqueurs APP-Cter.
L'invention permet ainsi de réaliser un criblage pharmacologique rapide et pertinent de molécules d'intérêt.
L'invention vise également un kit de diagnostic de la transformation pathologique de APP, caractérisé en ce qu'il comprend un anticorps polyclonal ou monoclonal dirigé contre la région carboxy-terminale de l'APP et/ou un ou plusieurs anticorps monoclonaux anti-fragment carboxy-terminal de l'APP.
Ces anticorps sont utilisables dans un dosage immuno-chimique par exemple en ELISA, Western blot, dot blot. Les kits selon l'invention renfermeront donc avantageusement les éléments nécessaires pour la réalisation de tels dosages.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront dans les exemples qui suivent, avec référence aux figures 1 à 10, qui représentent, respectivement, - les photos d'empreintes Western de . tissu cérébral humain (1-D) (figures 1A et 1B), . tissu cérébral humain (2-D) (figures 2A à 2C), . tissu cérébral de souris transgéniques (figures 3A et 3B), . tissus cérébral de souris (2-D) (figure 4), - une synthèse des profils 2-D de fragments APP-Cter dans les souris, le tissu cérébral humain et les lymphocytes humains (respectivement figures 5A, SB, 5C), - les photos d'empreintes Western de . lignées CHO transfectées (figure 6), . modèle cellulaire de type neuronal (figure 7), . lymphocytes humains (figure 8), - la caractérisation des fragments APP-Cter avec un anticorps polyclonal anti- Ap-N-terminal (figure 9), et - l'indice de transformation pathologique (figure 10).
MATERIELS ET METHODES Anticorps Production de l'anticorps polyclonal APP-Cter-C17 Un anticorps polyclonal dirigé contre la partie carboxy-terminale de l'APP a été produit selon le protocole d'immunisation décrit par Vaitukaitis et al, (4). Des lapins New Zealand ont été immunisés avec un peptide comprenant les 17 derniers acides aminés de la séquence de l'APP humaine, correspondant à son extrémité carboxy-terminale. Le peptide a été couplé par covalence à l'ovalbumine. 200 g d'immunogène ont été injectés toutes les deux semaines.
Avant l'injection, la solution d'immunogène a été complétée avec 1 volume d'adjuvant complet de Freund lors du 1er rappel et lors des rappels suivants, avec de l'adjuvant incomplet de Freund à la place de l'adjuvant complet. Le sang a été prélevé une semaine après la 4ème injection et une semaine après chaque injection suivante. Le sérum pur a été obtenu après coagulation du
sang et centrifugation 10 min à 2000g. On a ajouté au sérum pur 1 volume de glycérol et on a conservé le mélange à -20 C.
Purification de l'anticorps APP-Cter-C17 1 mg de peptide utilisé pour l'immunisation a été couplé à une matrice NHSFast Flow Sepharose (Amersham-Pharmacia Biotech) suivant les instructions du fabricant. On a mis en contact la matrice couplée avec 200 microgrammes de sérum pur dilué dans un volume de tampon de liaison 2X (50 mM Tris pH 8,0 ; 300 mM NaCI et 0,1 % (v/v) de Tween-20) et on a agité doucement jusqu'au lendemain à 4 C. On a fait passer la totalité des solutions sur une colonne PD-10. On a lavé la matrice avec 10 volumes de tampon de liaison.
L'anticorps purifié a été élue avec 2 volumes de tampon acétate à pH 3,5. La concentration en protéine a été déterminée à l'aide du kit de quantification de protéine BCA de Pierce.
Echantillons Echantillons de tissu cérébral humain et murin Les échantillons de tissu cérébral, obtenus après autopsie ou biopsie et conservés à -80 C, ont été disséqués à l'aide d'un atlas anatomique, puis homogénéisés avec un potter en Téflon@ dans 10 volumes de tampon de lyse 1D IX (50 mM Tris-HCl pH 6,8 ; 4mM EDTA ; 5% (p/v) de SDS, 10 % (v/v) de glycérol, 2 % (v/v) de ss-mercaptoéthanol et 0,05% Bleu de Bromophénol) pour une analyse 1-D. Les échantillons ont été portés à 100 C pendant 10 minutes puis maintenus à -80 C jusqu'à leur utilisation. Pour une analyse 2-D, le tissu est homogénéisé dans un tampon Tris-HCl 10 mM pH 6,8, puis complémenté avec un volume de tampon 2-D 2X (14M urée ; 4M thiourée ; 0,4% Pharmalytes 3-10 (p/v) ; 8% (v/v) Triton X-100 ; 10 mM de dithiothréitol ; 0,1% Bleu de Bromophénol) et stocké à -80 C jusqu'à utilisation. Pour les échantillons de tissu cérébral de rongeur, le cerveau a été prélevé rapidement après la mort de l'animal et traité de la même manière que les échantillons humains.
On a préparé des échantillons de tissu cérébral murin en suivant le même protocole que pour les échantillons de tissu cérébral humain. On a utilisé des échantillons de tissu cérébral de souris non transgéniques et de souris transgéniques avec le gène APP humain de type sauvage (APPwt) ou le gène humain APP muté aux codons 670 et 671 (APPsw). Cette mutation de l'APP est liée à une forme familiale de la maladie d'Alzheimer, appelée mutation suédoise(5). D'autres échantillons ont été également utilisés, comprenant des souris non transgéniques, et différentes lignées de souris transgéniques avec le gène APPwt et APPsw. On a également utilisé un échantillon de tissu cérébral murin qui correspondait à la souris transgénique développée par Hsiao K. et al.(6).
Echantillons de tissu cérébral après fractionnement protéique Les échantillons de tissu cérébral ont été homogénéisés selon un ratio 1/10 (p/v) dans du tampon Tris-HCl 10 mM pH 6,8 puis centrifugés à 100 000 g pendant 1 heure à 4 C. Le surnageant (SI) a été conservé et le culot réhomogénéisé dans le même tampon complémenté avec 0,5 % (v/v) de Triton X- 100. Une étape supplémentaire de centrifugation a été effectuée dans les mêmes conditions. Les surnageants (SIet S2) et le culot ont été conservés à - 80 C jusqu'à leur utilisation. La fraction enrichie en fragments APP-Cter correspond à la fraction S2.
Selon la technique biochimique utilisée, on a ajouté aux surnageants, au moment de l'utilisation, les tampons correspondants : volume de tampon de lyse 1-D 2X (100 mM Tris-HCl pH 6,8 ; 8mM EDTA ; 10% (p/v) de SDS ; 20 % (v/v) de glycérol ; 4 % (v/v) de P-mercaptoéthanol et 0,1% Bleu de Bromophénol) pour une étude par électrophorèse monodimensionnelle (1-D) ou 1 volume de tampon de lyse 2-D 2X (14M urée ; 4M thiourée ; 0,4% Pharmalytes 3-10 (p/v) ; 8% (v/v) Triton X-100 ; 10 mM de dithiothréitol ; 0,1% Bleu de Bromophénol) pour une étude par électrophorèse bidimensionnelle (2-D).
Echantillons de cultures cellulaires CHO (hamster) ou SKNSH SY5Y (humain) Les cellules sont transfectées de manière stable avec le gène APP humain de type sauvage ou le gène APP humain portant la mutation suédoise. Le culot de
L'insertion d'une seule copie du plasmide dans le gène cible est vérifiée par PCR. Les recombinants obtenus sont cultivés en milieu MRS [DE MAN et al., Journal of Applied Bacteriology, 23,130-135, (1960)] pendant 100 générations, en conditions non-sélectives (c'est à dire en l'absence d'érythromycine), ce qui permet la perte de la résistance à l'érythromycine, lors d'un second crossing-over. Si ce second crossing-over intervient du même côté du site prévu pour la mutation, le caractère sauvage est restauré ; en revanche, si le second crossing-over intervient de l'autre côté du site prévu pour la mutation, la région du chromosome portant le caractère sauvage située entre les emplacements des deux crossing-over est échangée avec la région mutée.
Les mutants construits de cette manière ne contiennent aucun ADN exogène ou plasmidique, puisque les dérivés de pRV300 utilisés ne peuvent pas se répliquer de façon autonome chez Lactobacillus sakei.
Dans un premier temps, une délétion a été introduite dans l'opéron lacLM qui code la ss-galactosidase, afin de vérifier que le système lac-PTS est fonctionnel dans RV332, et afin d'éliminer une activité ss-galactosidase potentielle, qui interférerait avec les mesures d'activité P-p-galactosidase.
La souche résultante, dénommée RV3001 a ensuite été utilisée pour la construction des souches mutantes suivantes : - RV3003, dans laquelle l'expression de l'opéron lac est rendue constitutive par l'inactivation du répresseur, par une délétion dans lac ; - RV3005, dans laquelle l'enzyme générale EI du système PTS est inactivée par une mutation du gène ptsI, entraînant le remplacement de l'histidine en position 190 par une alanine, et résultant en un phénotype Lac- [STENTZ et ZAGOREC, 1999, publication précitée] ; - RV3007, la voie du tagatose-6P est inactivée par une délétion dans le gène lack codant la tagatose-6P kinase, résultant en un phénotype Lac- ; RV3008 dans laquelle l'enzyme spécifique EIIBC est inactivée par une délétion dans le gène lacE codant cette enzyme, résultant en un phénotype Lac-.
Les délétions ont été effectuées de manière à ce que les cadres de lecture situés en aval demeurent en phase, afin d'éviter tout effet de polarité sur la traduction des gènes en 3'de la délétion.
En outre, un mutant de la souche RV332 (RV3004) dans lequel l'enzyme générale EI du système PTS est inactivée a été construit, par mutation du gène ptsI, identique à celle effectuée sur la souche mutante RV3005 ; un phénotype Lac-de cette souche permet de vérifier que le métabolisme du lactose chez RV332 dépend uniquement de l'activité du système lac-PTS.
Les caractéristiques de ces mutants sont récapitulées dans le Tableau II ci-après.
TABLEAU) !
Souche Génotype RV 332 sauvage RV 3001 l/acLM RV 3003 #LacLM#lacR RV 3004 ptsi Hl 90A RV 3005 A/acLMpts/H190A RV 3007 #lacLM# lacB RV 3008 #lacLM# lacE Caractérisation des mutants lac.
Les souches mutantes ont été caractérisées par leur comportement de croissance sur milieu chimiquement défini, (MCD) [LAURET et al., Appl. Environ. Microbiol., 62, 1922-1927, (1996)], supplémenté avec soit du glucose, du lactose ou du galactose.
Les résultats des expérimentations sont illustrés ci-après dans les Tableaux III (cultures avec glucose), IV, (cultures avec lactose), et V (cultures avec galactose). TABLEAU II
SOUCHES TEMPS DE DO FINALE pH FINAL GENERATION (minutes) RV 332 100 0, 7 4, 7 RV 3001 100 0, 7 4, 7 RV 3003 100 0, 7 4, 7 RV 3004 200 0, 5 5, 3 RV 3005 200 0, 5 5, 3 RV 3007 90 0,7 4,7 RV 3008 100 0, 7 4, 7 TABLEAU IV
SOUCHES TEMPS DE DO FINALE pH FINAL GENERATION (minutes) RV 332 nd 0, 6 4, 6 RV 3001 nd 0, 6 4, 6 RV 3 003 100 0, 6 4, 8 nd : non déterminé TABLEAU V
SOUCHES TEMPS DE DO FINALE pH FINAL GENERATION (minutes) RV 332 231 0,32 5, 2 RV 3001 151 0, 30 5, 3 RV 3003 147 0, 36 5, 2 RV 3004 147 0, 60 5, 0 RV 3005 169 0, 60 5, 0 RV 3007 350 0, 38 5, 0 RV 3008 350 0, 20 5, 5
Parallèlement, les activités ss-galactosidase et P-ss-galactosidase de ces souches ont été mesurées : les résultats sont illustrés par le Tableau VI ci-dessous.
Le principe général des procédés de criblage selon l'invention est le suivant : Les cellules en culture expriment une protéine de fusion codée par les séquences portées sur le plasmide recombinant. Ladite protéine de fusion est donc constituée au moins d'un domaine de liaison à l'ADN, d'un domaine d'activation transcriptionnelle et d'un polypeptide codé par une séquence nucléotidique, nommé X. La fixation de la protéine de fusion via son domaine de liaison à l'ADN sur le promoteur du gène rapporteur et/ou de sélection permet le recrutement des éléments de la machinerie transcriptionnelle au promoteur, via son domaine d'activation transcriptionnelle et la transcription des gènes rapporteur et/ou de sélection. Néanmoins, l'expression du gène rapporteur et/ou du gène de sélection n'est théoriquement possible que si la protéine de fusion est stable et localisée au noyau. Par conséquent, le niveau d'expression du gène rapporteur ou du gène de sélection reflète directement le niveau d'expression au noyau de la protéine de fusion. De plus, des variations du niveau d'expression du gène rapporteur ou du gène de sélection en réponse à un stimulus spécifique reflètent directement un contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse au stimulus spécifique.
Ainsi, un des avantages d'un procédé de l'invention est qu'il permet d'identifier des séquences nucléotidiques codant des domaines impliqués dans le contrôle de la translocation nucléo-cytoplasmique d'une protéine donnée en réponse à un stimulus spécifique.
L'invention porte ainsi sur un procédé de criblage de séquences nucléotidiques pour l'identification de nouvelles protéines et/ou de nouveaux polypeptides dont la répartition nucléo-cytoplasmique est modifiée en réponse à un stimulus spécifique caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : (a) La culture en parallèle de clones isolés des cellules transformées par des plasmides ou des banques de plasmides telles que décrits ci-dessus ; (b) l'application ou non de un ou plusieurs stimuli aux clones cultivés ; (c) l'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif, ladite croissance étant dépendante de l'expression du gène de sélection, et/ou l'évaluation de l'expression du gène rapporteur en fonction de l'application ou non du ou des stimuli ; (d) la sélection et l'isolement d'un groupe de clones dont les niveaux d'expression du gène rapporteur et/ou de sélection sont modifiés sous l'effet de l'application du ou des stimuli ; (e) le cas échéant, la sélection et l'isolement d'un sous-groupe de clones selon l'expression nucléaire du marqueur de la localisation cellulaire ; (f) l'identification des séquences nucléotidiques codant les protéines et/ou les polypeptides dont la répartition nucléo- cytoplasmique est modifiée en réponse à un stimulus spécifique et exprimés dans les cellules sélectionnées en d) ou e).
Tout type de stimulus tel que défini précédemment peut être appliqué dans le procédé de l'invention. Des exemples de stimuli, sont les stress thermique, stress osmotique, stress oxydatif, stress aux UV ou à d'autres rayons, la carence nutritionnelle, la présence d'un produit toxique ou d'un produit dans des concentrations inhabituelles le rendant toxique, en particulier des métaux lourds et des agents mutagènes, l'application d'une substance dans des concentrations actives ; cette liste des stimuli n'étant pas limitative et, le choix du stimulus dépendant du type de séquences recherchées par le procédé de criblage mis en #uvre.
Selon le mode de réalisation du procédé, on appliquera un ou plusieurs stimuli particuliers sur chaque clone.
Dans un mode de réalisation préféré employant des cellules appropriées, les clones individuels sont repiqués et cultivés sur milieu solide en boite de pétri. Des cellules appropriées pour la culture sur milieu solide sont des cellules de levure. Les boîtes sont ensuite répliquées sur plusieurs boîtes différentes, puis un stimulus spécifique est appliqué par boîte, de manière à tester en parallèle plusieurs stimuli par clone cellulaire et au moins une boîte est mise à incuber en absence de stimulus.
Dans un autre mode de réalisation du procédé, les clones sont cultivées en micro-plaques en milieu liquide, à raison de un clone par puits.
Chaque culture est ensuite ré-inoculée de manière à obtenir plusieurs micro-plaques contenant les mêmes séries de clones en culture. Un stimulus spécifique est appliqué par micro-plaque, de manière à tester en parallèle plusieurs stimuli par clone cellulaire et au moins une micro-plaque est mise à incuber en absence de stimulus.
L'évaluation de la croissance des clones sur milieu sélectif à l'étape c) du procédé peut être estimée à l'oeil ou se faire par exemple à l'aide d'un test mesurant la turbidité, par spectrophotométrie par exemple.
Dans un mode de réalisation préféré, les clones sont issus de la transformation d'une souche de Saccharomyces cerevisiae portant le gène LEU2 comme gène de sélection. Après repiquage et réplique, les clones sont cultivés sur milieu sélectif ne contenant pas de leucine La croissance des clones est alors dépendante du niveau d'expression du gène LEU2.
L'évaluation de l'expression du gène rapporteur est mise en oeuvre dans un mode préféré de réalisation du procédé par un test enzymatique en présence de substrats chromogéniques, l'intensité de la réaction pouvant être évaluée à l'oeil ou par spectrophotométrie. Des tests mesurant une intensité de fluorescence par fluorimétrie ou une intensité de radioactivité à l'aide de compteur à scintillation peuvent aussi être utilisés et choisis selon le gène rapporteur utilisé dans les cellules employées pour le procédé. De manière générale, tout type de tests simple à mettre en #uvre et conduisant à une quantification rapide des niveaux d'expression du gène rapporteur peut être utilisé dans le procédé.
Dans un autre mode de réalisation, les clones sont issus de la transformation de Saccharomyces cerevisiae portant le gène rapporteur lacZ. Après repiquage et sélection, les clones sont cultivés sur milieu solide contenant le substrat chromogènique 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-p-Dgalactopyranoside, X-gal. L'intensité de la coloration bleue des colonies sur boîte reflète alors le niveau d'expression du gène lacZ.
Un changement du niveau d'expression du gène rapporteur et/ou du gène de sélection en réponse à l'application d'un stimulus spécifique n'est pas nécessairement lié à une modification de la localisation nucléaire de la protéine. Il peut aussi être liée à un effet du stimulus sur la stabilité ou la fonctionnalité de la protéine de fusion exprimée par les séquences portées sur le plasmide recombinant. Afin de différencier les séquences sélectivement impliquées dans le contrôle de la translocation nucléocytoplasmique de celles impliquées dans un autre mode de régulation post-
traductionnelle, le procédé de l'invention peut comprendre une étape de sélection des cellules pour lesquelles une modification de la localisation cellulaire de la protéine de fusion en réponse à un stimulus spécifique est validée à l'aide de la détection de la localisation cellulaire, nucléaire ou cytoplasmique du marqueur de la localisation cellulaire.
Le procédé permet ainsi de sélectionner différents types de protéines selon le mode de sélection des clones. Différents modes de sélections sont possibles : Dans un premier mode, on sélectionne les clones dont l'expression du gène rapporteur et/ou de sélection est activée uniquement lors de l'application du stimulus. Ces clones permettent l'identification de protéines dont la localisation passe du cytoplasme au noyau lors de l'application du stimulus.
Dans un second mode, on sélectionne les clones dont l'expression du gène rapporteur et/ou de sélection est activée uniquement en absence de stimulus. Ces clones permettent l'identification de protéines dont la localisation passe du noyau au cytoplasme lors de l'application du stimulus.
En fait il n'est généralement pas nécessaire d'effectuer le codage complet de ces échantillons, on se limite aux modules nécessaires pour mettre à jour les mémoires.
Cette mise à jour peut s'effectuer au moment de la production des échantillons de remplacement, ce qui répartit la complexité sur toute la zone d'effacement, mais se cumule avec la procédure de synthèse décrite précédemment .
Lorsque la structure de codage le permet, on peut aussi limiter la procédure ci-dessus à une zone intermédiaire au début de la période de données valides succédant à une période effacée, la procédure de mise à jour se cumulant alors avec l'opération de décodage.
5. 2. Description d'exemples de réalisation particuliers Des exemples particuliers de mise en oeuvre possible sont donnés ci-après. Le cas des codeurs par transformée de type TDAC ou TCDM ([MAHIEUX]) est en particulier abordé.
5.2.1 Description du dispositif Système de codage/décodage numérique par transformée de type TDAC.
Codeur en bande élargie (50-7000 Hz) à 24 kb/s ou 32 kb/s.
Trame de 20 ms (320 échantillons).
Fenêtres de 40 ms (640 échantillons) avec additionrecouvrements de 20 ms. Une trame binaire contient les paramètres codés obtenus par la transformation TDAC sur une fenêtre. Après le décodage de ces paramètres, en faisant la transformation inverse TDAC, on obtient une
trame de sortie de 20 ms qui est la somme de la deuxième moitié de la fenêtre précédente et la première moitié de la fenêtre actuelle. Sur la figure 4, il a été marqué en gras les deux parties de fenêtres utilisées pour la reconstruction de la trame n (en temporel). Ainsi, une trame binaire perdue perturbe la reconstruction de deux trames consécutives (l'actuelle et la suivante, figure 5). Par contre, en faisant correctement le remplacement des paramètres perdus, on peut récupérer les parties de l'information provenant de la trame binaire précédente et suivante (figure 6), pour la reconstruction de ces deux trames.
5. 2.2 Mise en oeuvre Toutes les opérations décrites ci-dessous sont mises en oeuvre à la réception, conformément aux figures 1 et 2, soit au sein du module de dissimulation des trames effacées qui communique avec le décodeur, soit dans le décodeur lui même (mise à jour des mémoires du décodeur).
5. 2.2.1 En période valide Correspondant au paragraphe 5.1.2, on met à jour la mémoire des échantillons décodés. Cette mémoire est utilisée pour les analyses LPC et LTP du signal passé dans le cas d'un effacement d'une trame binaire. Dans l'exemple présenté ici, l'analyse LPC est faite sur une période de signal de 20 ms (320 échantillons). En général, l'analyse LTP nécessite plus d'échantillons à mémoriser. Dans notre exemple, pour pouvoir faire
l'analyse LTP correctement, le nombre des échantillons mémorisés est égal à deux fois la valeur maximale du pitch. Par exemple, si la valeur maximale du pitch MaxPitch est fixée à 320 échantillons (50 Hz, 20 ms), les derniers 640 échantillons seront mémorisés (40 ms du signal). On calcule également l'énergie des trames valides et on les stocke dans un tampon circulaire de longueur de 5 s. Lorsqu'une trame effacée est détectée, on compare l'énergie de la dernière trame valide au maximum et au minimum de ce tampon circulaire pour connaître son énergie relative.