INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de: - mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester; - détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de détection selon l'invention, la ou les sondes oligonucléotidiques sont immobilisées sur un support Selon un autre aspect, les sondes oligonucléotidiques comprennent un marqueur détectable.
L'invention concerne en outre un nécessaire ou kit pour la détection de la présence d'un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S dans un échantillon, ledit nécessaire comprenant: a) une ou plusieurs sondes nucléotidiques, telles que décrites cidessus; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'hybridation
Selon un premier aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que la ou les sondes sont immobilisées sur un support Selon un second aspect, le nécessaire ou kit de détection est caractérisé en ce que les sondes oligonucléotides comprennent un marqueur détectable Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit cidessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui pourront être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt du gène RRS1-R ou RRS1-S ou encore détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes du gène RRS1-R, plus particulièrement des acides nucléiques des séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8 où les acides nucléiques de séquences complémentaires.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm) de RRS1-R ou RRS1-S, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S, et plus particulièrement un acide nucléique de séquence SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8 ou un fragment ou encore un acide nucléique de séquence complémentaire à ce dernier, contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de . a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible de RRS1-R ou RRS1-S dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification et; b) détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
Selon le procédé d'amplification ci-dessus, on réalise au moins un cycle d'amplification de l'acide nucléique contenu dans l'échantillon
préalablement à la détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié, de préférence au moins 10, et de manière tout à fait préférée au moins 20, cycles d'amplification.
Pour mettre en oeuvre le procédé d'amplification ci-dessus, on aura avantageusement recours à l'une quelconque des amorces nucléotidiques précédemment décrites L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID N 1 à SEQ ID N 8, ledit nécessaire ou kit comprenant a) un couple d'amorces nucléotidiques conformes à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5' et du coté 3' de l'acide nucléique cible du gène RRS1-R ou RRS1-S dont l'amplification est recherchée; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Un tel nécessaire ou kit d'amplification comprendra avantageusement au moins une paire d'amorces nucléotidiques telle que précédemment décrite Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi des séquences nucléotidiques SEQ ID N 11à SEQ ID N 61 Le demandeur a montré que les plantes portant le gène RRS1-R présentaient un phénotype de résistance à R. solanacearum. En outre, le demandeur a également montré que l'insertion du gène RRS1-R ou encore de l'ADNc du gène RRS1-R dans le génome d'une plante initialement sensible à R. solanacearum confère à cette plante un phénotype de résistance à ce pathogène.
L'invention a également trait à des procédés et des moyens destinés à inhiber ou bloquer l'expression du gène RRS1-S retrouvée chez les plantes sensibles à R.solanacearum, notamment en vue d'accroître leur
Parmi les gènes conférant de nouvelles propriétés agronomiques aux plantes transformées, on peut citer les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, ceux conférant une résistance à certains insectes, ceux conférant une tolérance à certaines
maladies, etc. De tels gènes sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071 et WO 95/06128.
Parmi les gènes conférant une tolérance à certains herbicides, on peut citer le gène Bar conférant une tolérance au bialaphos, le gène codant pour une EPSPS appropriée conférant une résistance aux herbicides ayant l'EPSPS comme cible comme le glyphosate et ses sels (US 4,535,060, US 4,769,061, US 5,094,945, US 4,940,835, US 5,188,642, US 4,971,908, US 5,145,783, US 5,310,667, US 5,312,910, US 5,627,061, US 5,633,435, FR 2 736 926), le gène codant pour la glyphosate oxydoréductase (US 5,463,175), ou encore un gène codant pour une HPPD conférant une tolérance aux herbicides ayant pour cible l'HPPD comme les isoxazoles, notamment l'isoxafutole (FR 95 06800, FR 95 13570), les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631) ou les tricétones, notamment la sulcotrione (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195). De tels gènes codant pour une HPPD conférant une tolérance aux herbicides ayant pour cible l'HPPD sont décrits dans la demande de brevet WO 96/38567.
Parmi les protéines d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux insectes, on citera plus particulièrement les protéines Bt largement décrites dans la littérature et bien connues de l'homme du métier. On citera aussi les protéines extraites de bactéries comme Photorabdus (WO 97/17432 & WO 98/08932).
Parmi les protéines ou peptides d'intérêt conférant de nouvelles propriétés de résistance aux maladies on citera notamment les chitinases, les glucanases, l'oxalate oxydase, toutes ces protéines et leurs séquences codantes étant largement décrites dans la littérature, ou encore les peptides antibactériens et/ou antifongiques, en particulier les peptides de moins de 100 acides aminés riches en cystéines comme les thionines ou défensines de plantes, et plus particulièrement les peptides lytiques de toutes origines comprenant un ou plusieurs ponts disulfures entre les cystéines et des régions comprenant des acides aminés basiques, notamment les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998).
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la protéine ou peptide d'intérêt est choisi parmi les peptides éliciteurs fongiques, en particulier les élicitines (Kamoun & al., 1993 ; & al., 1995).
On peut également citer les gènes modifiant la constitution des plantes modifiées, en particulier la teneur et la qualité de certains acides gras essentiels (EP 666 918) ou encore la teneur et la qualité des protéines, en particuliers dans les feuilles et/ou les graines desdites plantes. On citera en particulier les gènes codant pour des protéines enrichies en acides aminés soufrés (Korit et al., Eur. J. Biochem. 195 :329-334, WO 98/20133 ; WO 97/41239 ; WO 95/31554 ; WO 94/20828 ; WO 92/14822). Ces protéines enrichies en acides aminés soufrés auront également pour fonction de piéger et stocker la cystéine et/ou la méthionine excédentaire, permettant d'éviter les problèmes éventuels de toxicité liés à une surproduction de ces acides aminés soufrés en les piégeant. On peut citer
également des gènes codant pour des peptides riches en acides aminés soufrés et plus particulièrement en cystéines, les dits peptides ayant également une activité antibactérienne et/ou antifongique. On citera plus particulièrement les défensines de plantes, de même que les peptides lytiques de toute origine, et plus particulièrement les peptides lytiques suivants : l'androctonine (WO 97/30082 et PCT/FR98/01814, déposée le 18 août 1998) ou la drosomicine (PCT/FR98/01462, déposée le 8 juillet 1998).
Toutes les méthodes ou opérations décrites ci-dessous dans les exemples sont données à titre d'exemples et correspondent à un choix, effectué parmi les différentes méthodes disponibles pour parvenir au même résultat. Ce choix n'a aucune incidence sur la qualité du résultat et par conséquent, toute méthode adaptée peut être utilisée par l'homme de l'art pour parvenir au même résultat. La plupart des méthodes d'ingénierie des fragments d'ADN sont décrites dans "Current Protocols in Molecular Biology" Volumes 1 et 2, Ausubel F.M. et al ou dans Sambrook et al 1989.
Exemples Exemple 1 Isolement et identification du gène SGS2 d'Arabidopsis L'obtention des mutants sgs2 est décrite de façon détaillée dans Elmayan et al.
(Plant Cell 10 :1747-1757, La lignée de départ était la lignée L1. L1 est une lignée transgénique obtenue par transformation de plantes de l'écotype Columbia par la construction 23b (Elmayan et Vaucheret, Plant J. 9 :787-797, 1996). La lignée Ll ne comporte qu'un seul locus transgénique. L'activité glucuronidase dans la lignée L1est de 4000 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de protéines totales dans les premiers jours du développement. Cette activité décroît ensuite très rapidement pour devenir inférieure à 5 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de protéines totales 11jours après la germination. L'inactivation de l'expression du transgène 35S-uidA est post-transcriptionnelle, ainsi que l'ont démontré les expériences de "run-on" mettant en évidence une forte transcription du transgène 35S-uidA dans les plantes L1 montrant une très faible activité GUS (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757, 1998). Pour l'obtention de plantes mutantes de la lignée Ll, 3000 graines de la lignée L1 ont été imbibées 16 heures dans une solution d'EMS (ethyl methanesulfonate) à 0,4%. Les graines ont ensuite été semées et les plantes obtenues ont été cultivées en serre jusqu'à obtenir des graines d'autofécondation. Celles-ci ont été à nouveau semées en serre et dans les plantes obtenues, l'activité GUS a été mesurée 1 mois après la germination. Les plantes présentant une activité élevée à ce stade ont été à la fois croisées avec des plantes de l'écotype Columbia (pour vérifier que le locus transgénique reste sensible à l'inactivation post-transcriptionnelle), rétrocroisées avec la lignée L1(pour évaluer l'état de récessivité vs
dominance des mutations obtenues) et croisées entre elles (pour classer les différents mutants obtenus en groupe de complémentation, chaque groupe définissant un gène). 23 mutants indépendants sgs2 ont ainsi été isolés. Ces 23 mutations sont récessives. L'activité GUS dans ces 23 lignées mutantes, 1 mois après germination, est comprise entre 2500 et 3500 nmol de 4-methylumbelliferone par minute et par microgramme de protéines totales.
Pour confirmer que les mutations sgs2 affectent l'expression du transgène 35S-GUS au niveau transcriptionnel, l'activité GUS, l'accumulation de l'ARNm et le taux de transcription ont été mesurés par des tests fluorimétriques, par l'analyse de blots d'ARNm et par des expériences de "run-on". L'activité GUS est multipliée par un facteur de 300 dans les mutants sgs2 par rapport à la lignée L1alors que l'accumulation de l'ARNm est multipliée par un facteur de 250. Le taux de transcription n'est que multiplié par un facteur de 1.8 par rapport à la lignée L1. Pour vérifier que les mutations sgs2 protégeaient de l'inactivation post-transcriptionnelle d'un autre gène que le gène uidA, un des mutants sgs2 (nommé sgs2-1) a été croisé avec la lignée 2a3 (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757, 1998). La lignée 2a3 est une lignée transgénique d'Arabidopsis thaliana résultant de la transformation d'une plante de l'écotype Columbia par la construction 2a (Elmayan et al., Plant Cell 10:1747-1757, 1998) contenant la partie transcrite du gène NIA2 d'Arabidopsis codant la nitrate reductase sous le contrôle du promoteur 35S et le gène de résistance à l'hygromycine hpt. Toutes les plantes de la lignée 2a3 homozygotes pour la construction 2a présentent une inactivation post-transcriptionnelle des gènes Nia2 (transgéniques et endogènes) conduisant à la chlorose de la plante puis à sa mort. Lorsque le locus transgénique 2a3 est à l'état hétérozygote, seule une partie des plantes subissent l'inactivation post-transcriptionnelle. Le stade à laquelle se met en place cette inactivation est variable d'une plante à l'autre. Chez certaines plantes l'inactivation est suffisamment tardive pour permettre la production de pollen et de graines. Les plantes hybrides issues du croisement entre le mutant sgs2-1 et la lignée 2a3 ont été cultivées en serre et les graines d'autofécondation ont été récoltées. Celles-ci ont été semées en serre et les plantes obtenues ne présentant pas de chlorose ont été conservées pour récolter leur graines d'autofécondation. Nous avons alors semé les différents lots de graines sur un milieu gélosé contenant 20mg/l d'hygromycine. Parmi ceux-ci, certains ne donnaient que des plantes résistantes à l'hygromycine et ne montrant aucun signe de chlorose tout au long de leur développement. Parmi ces lignées résistantes à l'inactivation post-transcriptionnelle des gènes de nitrate réductase, certaines étaient également homozygotes pour la construction 23b. Nous avons également montré que les plantes de toutes ces lignées présentaient une activité GUS élevée tout au long de leur développement. Ces résultats montrent donc que la mutation sgs2, non seulement protège de l'inactivation posttranscriptionnelle du transgène 35S-uidA mais également des transgènes et gènes endogènes NIA2. Certaines de ces lignées résistantes à l'inactivation posttranscriptionnelle des gènes de nitrate réductase et homozygote pour le locus 2a3 ne possédaient plus la construction 23b. Ces plantes ont été nommées sgs2-1 2a3.
Afin de déterminer le rôle biologique du gène correspondant aux mutations sgs2, des mutant sgs2-1 ont été inoculées avec le virus de la mosaïque du concombre (CMV) souche I17F. Sur les plantes sauvages, l'infection par cette souche virale conduit à des plantes dont le développement est plus lent et altérée : de la rosette plus petites, hampe florale longue mais très souple, fertilité réduite mais non nulle. Chez les mutants sgs2-1, l'infection par cette souche virale conduit à une altération accrue du développement : les plantes ont un port particulièrement buissonnant, les feuilles de la rosette sont petites et vrillées, la hampe florale atteint en fin de développement une taille de l'ordre de 5 cm, les plantes sont complètement stériles. Ces expériences montrent donc que le gène correspondant aux mutations sgs2 permet de limiter les effets négatifs sur le développement causés par l'infection du virus CMV.
Quatre mutants sgs2-1, sgs2-2, sgs2-3, sgs2-4 ont été croisés avec des plantes de l'écotype Landsberg. Sur ces plantes hybrides (FI) résultant de ces croisements, les graines d'autofécondation ont été récoltées. Ces graines ont été semées in vitro sur un milieu gélosé contenant 50 mg/1 de kanamycine afin de sélectionner les plantes (F2) possédant le transgène 23b. Ces plantes résistantes à la kanamycine ont été repiquées et cultivées en serre. L'activité GUS dans ces plantes a été mesurée à différents stades de leur développement. Seules les plantes présentant une activité GUS élevée tout au long du développement (et donc homozygote pour la mutation sgs2) ont été conservées et les graines d'autofécondation ont été récoltées. Pour chacune des 4 mutations, plus de 100 lignées F2 homozygotes pour la mutation ont été ainsi obtenues. Les graines d'autofécondation de chacune de ces lignées ont été semées en serre et pour chaque lignée un pool de plantes a été récolté afin d'en extraire l'ADN. Ces ADN ont été utilisés pour localiser les mutations sgs2 sur le génome d'Arabidopsis. Ces analyses ont montré que les mutations sgs2 étaient situées entre, d'une part un marqueur CAPS issu de l'extrémité T7 du clone BAC F2K15 et d'autre part un marqueur RFLP issu de l'extrémité sp6 du clone BAC T9C5. La région du génome d'Arabidopsis thaliana délimitée par ces 2 marqueurs contient la totalité de l'insert du clone BAC T9C5. La séquence complète du BAC T9C5 étant connue, nous avons réalisé des sous-clones de ce BAC dans le vecteur binaire pBin+.
Les plasmides résultants ont été introduits dans E. coli puis dans la souche d'Agrobacterium tumefaciens C58pMP90. Les souches bactériennes résultantes ont été utilisées pour transformer des plantes des lignées sgs2-1 2a3. En particulier un fragment de 10,7 kb libéré par la digestion enzymatique de T9C5 par les enzymes KpnI et XhoI a permis d'induire dans 92 des 96 plantes de la lignée sgs2-1 2a3 transformées par ce fragment une chlorose caractéristique de l' inactivation post-transcriptionnelle des gènes Nia2 (transgéniques et endogènes). Sur 2 de ces plantes nous avons pu montrer par hybridation de type northern en utilisant comme sonde le gène NIA2 d'Arabidopsis thaliana, que cette chlorose résultait de la non accumulation des transcrits des gènes de nitrate réductase (transgéniques et endogènes) et donc était due à l'inactivation posttranscriptionnelle des gènes de nitrate réductase. Par la suite un sous-clone de 6,9 kb de ce
Dans le présent exemple de réalisation, le dispositif fixation 14 est constitué de liaisons vissées 15 symétri ques par rapport au plan central longitudinal il et espacées suivant la direction longitudinale de la plaque de montage 1 ou du ski 3. Dans l'exemple concret, il est prévu quatre de ces liaisons vissées 15 respectivement dans la zone de cha cune des surfaces latérales longitudinales 16, 17 de la pla- de montage 1, des liaisons vissées étant associées par paires à une zone de fixation ou de mâchoire avant 18 et une zone de fixation ou de machoire arrière 19.
En ce qui concerne leur structure, ces liaisons vissées sont agencées différemment, au moins l'une étant réalisée suivant le principe technique d'un appui fixe et au moins une autre suivant le principe technique d'un appui libre, afin de permettre une compensation de longueur entre la pla- que de montage 1 et le ski 3. Une telle compensation de lon gueur est nécessaire pour éviter une formation de contrain tes entre la plaque de montage 1 et le ski 3 et elle permet un comportement de flexion sans obstacle du ski 3 dans le cadre de ses propriétés préfixées et dues à la structure. Dans le cas de la liaison vissée 15 réalisée sous forme d'appui fixe, l'élément de fixation 13 traverse la plaque de montage 1 dans la zone de fixation avant 18, dans un trou 22 adapté au diamètre 20 d'une vis 21. Dans le cas de la liai son vissée 15 réalisée sous forme d'appui libre qui est si tuée dans la zone de fixation avant 18, un passage 23 ménagé dans la plaque de montage 1 pour la vis 21 est réalisé sous forme d'un trou allongé 24 s'étendant suivant la direction longitudinale de la plaque de montage 1. Ainsi que cela est connu par l'état de la technique, il est encore en outre possible d'entourer les vis 21 de bagues d'entretoisement disposées entre les surfaces 4 et une surface d'épaulement d'une tête de vis, afin de permettre un glissement libre pour la compensation de longueur.
Dans la zone des liaisons vissées 14, il est prévu des évidements 25 ménagés en retrait, en forme de rainure, qui s'étendent à partir des surfaces latérales longitudinales 16, 17 en direction du plan central longitudinal 11 et qui forment une surface de base 26 s'étendant parallèlement à la surface de montage 5 et sont délimités par une surface fron tale 27 approximativement parallèle au plan central longitu dinal 11 et située à distance de celui-ci. La profondeur 28 des évidements est inférieure à une épaisseur minimale 29 de la plaque de montage 1. Des surfaces latérales 30 des évide ments 25 s'étendent en faisant un angle avec un axe central longitudinal 31 de la plaque de montage 1 qui est situé dans le plan central longitudinal 11. De préférence, les surfaces latérales 30 des évidements 25 ménagés dans la zone de fixa tion avant 18 s'étendent d'une manière inclinée à partir des surfaces latérales longitudinales 16, 17 en direction d'une surface frontale avant 32 et les surfaces latérales 30 des évidements 25 ménagés dans la zone de fixation arrière 19 s'étendent d'une manière inclinée en direction d'une surface frontale arrière 33 de la plaque de montage 1, l'angle d'inclinaison 34 que les surfaces latérales 30 font avec l'axe central longitudinal 31 étant inférieur à 90 et de préférence compris entre 50 et 80 . Les trous 22 ou passa ges 23 prévus pour les éléments de fixation 13 sont ménagés dans la zone de la surface de base 26 des évidements 25 et leurs axes centraux 35 s'étendent perpendiculairement à la surface de base 26, tandis que des lamages 36 sont prévus dans la surface de base 26 pour loger en profondeur les tê tes 37 des vis 21.
Les évidements 25 en forme de rainure ont une section transversale en T dans un plan s'étendant parallèlement au plan central longitudinal 11, la largeur 38 étant plus grande dans la zone de la surface de base 26 que dans la zone de la surface de montage 5. I1 en résulte une partie en contre-dépouille qui est d'une part obtenue gràce à la forme en T en section transversale, décrite, des évidements 25, mais qui est d'autre part également possible grâce à une in clinaison l'une par rapport à l'autre des surfaces latérales 30.
Des éléments insérables 39 sont disposés, à la façon de coulisseaux, dans les évidements 25 ainsi réalisés, ces éléments insérables ayant une hauteur 40 qui correspond à la profondeur 28 des évidements 25. Les éléments insérables 39 s'étendent à partir des surfaces frontales 27 des évidements 25 en direction des surfaces latérales longitudinales 16, 17 de la plaque de montage 1 et viennent au niveau de ces der nières. Une partie en saillie 44, en forme de barrette, qui coïncide avec la section transversale en T des évidements 25 s'étend au-delà des surfaces latérales 41, 42 et de la sur face frontale 43 située du côté du plan central longitudinal 11. Du fait de l'angle d'inclinaison 34, la longueur 45 des surfaces latérales 41, 42 est supérieure à la distance 46, mesurée perpendiculairement à l'axe central longitudinal 32, que les surfaces frontales 27 des évidements 25 présentent par rapport aux surfaces latérales longitudinales 16, 17 de la plaque de montage 1. La distance 46 vaut approximative ment un quart à un tiers de la largeur totale 47 de la pla que de montage 1, cette largeur totale 47 étant légèrement inférieure ou égale à la largeur 48 du dispositif de glisse 2 ou du ski 3 dans la zone de montage de la plaque 1. L'épaisseur 29 de la plaque de montage 1 est comprise approximativement entre 15 mm et 30 mm, et vaut en particu lier 22 mm. La profondeur 28 des évidements 25, qui corres pond la hauteur 40 des éléments insérables 39, est com prise entre approximativement 8 mm et 12 mm et vaut en par ticulier 10 mm.