INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Ce génotype est en théorie soit homozygote GG, soit hétérozygote GA, soit homozygote AA chez les individus testés. En réalité et comme montré ci-dessous, le génotype homozygote AA n'est pas détecté dans la population d'individus.
Les résultats des contrôles, de la répartition des génotypes déterminés dans la population d'individus et le calcul des différentes fréquences alléliques pour ce polymorphisme de type SNP fonctionnel sont présentés dans les tableaux suivants :
Nombre d'individus Nombre de blanc Pourcentage de testés génotypes testés validés réussite 239 238 7 7 99,6
POPULATION Fréquence allélique Génotype AA Génotype AG Génotype GG N % % 95 % IC N % N % N % Afro Américain 50 20,9 0 - - 0 0 0 0 50 100 Amérindien du Sud Ouest 5 2,1 0 - - 0 0 0 0 5 100 Sud Américain (Andes) 10 4,2 5,0 - - 0 0 0 0 9 100 Caribéen 10 4,2 0 0,0 14,6 0 0 1 10,0 9 90 Caucasien 50 20,9 0 - - 0 0 0 0 50 100 Chinois 10 4,2 0 - - 0 0 0 0 10 100 Grec 8 3,3 0 - - 0 0 0 0 9 100 Ibérien 10 4,2 0 - - 0 0 0 0 10 100 Italien 10 4,2 0 - - 0 0 0 0 10 100 Japonais 10 4,2 0 - - 0 0 0 0 10 100 Mexicain 10 4,2 0 - - 0 0 0 0 10 100 Moyen-Orient 20 8,4 0 - - 0 0 0 0 20 100 Individus du Pacifique 7 2,9 0 - - 0 0 0 0 7 100 Indo-Pakistanais 9 3,8 0 - - 0 0 0 0 9 100 Sud Américain 10 4, 2 0 - - 0 0 0 0 10 100 Asie du Sud 10 4,2 0 - - 0 0 0 0 10 100 Total 239 100 % 0,210 0,0 0,6 0 0 1 0,4 238 99,6
Les niveaux de production de la protéine ABCA7 peuvent être déterminés par immunoprécipitation ou immunochimie en utilisant un anticorps qui reconnaît spécifiquement la protéine ABCA7.
Selon une autre méthode de criblage d'une molécule ou substance candidate modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, une construction nucléotidique telle que définie ci-dessus, comprenant un acide nucléique régulateur selon l'invention ainsi qu'un polynucléotide rapporteur placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur, est utilisée, ledit acide nucléique régulateur comprenant au moins un promoteur de base et au moins un élément
régulateur de l'une des séquences SEQ ID N 1 à SEQ ID N 3. Le polynucléotide rapporteur peut être un gène codant pour une protéine détectable, tel qu'un gène codant pour une luciférase.
Selon un tel procédé de criblage, les cellules sont transfectées avec la construction polynucléotidique contenant l'acide nucléique régulateur selon l'invention et le polynucléotide rapporteur, de manière stable ou transitoire.
Les cellules transformées sont ensuite incubées en présence ou en l'absence de la molécule ou de la substance candidate à tester pendant un temps suffisant, puis le niveau d'expression du gène rapporteur est déterminé. Les composés qui induisent un changement statistiquement significatif de l'expression du gène rapporteur (soit une augmentation, soit au contraire une diminution de l'expression du gène rapporteur) sont ensuite identifiés et, le cas échéant, sélectionnés.
Ainsi t'invention a encore pour objet un procédé pour le criblage in vitro d'une molécule ou d'une substance modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, notamment modulant la transcription du polynucléotide rapporteur constitutif d'une construction polynucléotidique selon l'invention, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes consistant à : a) mettre en culture une cellule hôte recombinante comprenant un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention ; b) incuber la cellule hôte recombinante avec la substance ou molécule à tester ; c) détecter l'expression du polynucléotide d'intérêt ; d) comparer les résultats obtenus à l'étape c) avec les résultats obtenus lorsque la cellule hôte recombinante est mise en culture en l'absence de la molécule ou substance candidate à tester.
L'invention concerne aussi un kit ou nécessaire pour le criblage in vitro d'une molécule ou d'une substance candidate capable de moduler l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, comprenant : a) une cellule hôte transformée avec une construction polynucléotidique telle que définie ci-dessus, comprenant un polynucléotide rapporteur d'intérêt placé sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention ; et
b) le cas échéant, des moyens de détection de l'expression du polynucléotide rapporteur d'intérêt.
De préférence, le polynucléotide rapporteur d'intérêt est la séquence codante d'une luciférase. Dans ce cas, l'acide nucléique régulateur selon l'invention est inséré dans un vecteur, en amont de la séquence codant pour la luciférase. Il peut s'agir par exemple du vecteur pGL3-basic (pGL3-b) commercialisé par la Société PROMEGA (Madison, Wisconsin, Etats-Unis).
Dans ce cas, le vecteur recombinant comprenant la séquence codante de la luciférase placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention est transfecté dans les cellules hôtes recombinantes dont l'activité luciférase est ensuite déterminée après mise en culture en présence ou non de la substance ou de la molécule candidate à tester.
On peut dans ce cas utiliser comme témoins des vecteurs pGL3-b contenant soit le promoteur du cytomégalovirus (CMV), le promoteur ApoAI ou encore aucun promoteur. Pour le test d'activité luciférase, les cellules transfectées sont lavées avec un tampon PBS et Iysées avec 500 al de tampon de lyse (50 mM tris, 150 mM NaCI, 0, 02% d'azide de sodium, 1% de NP-40, 100 ug/mt de AEBSF et 5 ug/ml de leupeptine).
50 pl du Iysat cellulaire obtenu sont ensuite ajoutés à 100 um du substrat de la luciférase (Promega) et les mesures d'activité sont réalisées sur un lecteur spectrophotométrique de microplaque, 5 minutes après l'addition du Iysat cellulaire.
Les données sont exprimées en unités relatives d'activité luciférase. Les constructions polynucléotidiques produisant de hauts niveaux d'activité luciférase dans les cellules transfectées sont celles qui contiennent un acide nucléique régulateur selon l'invention compris dans la séquence SEQ ID N 1 qui est capable de stimuler la transcription.
Pour les mesures des niveaux d'expression d'ARN messager dans un procédé de criblage selon l'invention, on prépare tout d'abord des sondes spécifiques de l'ARN messager du polynucléotide rapporteur d'intérêt, par exemple à l'aide du kit multiprime labeling kit (commercialisé par la Société Amersham Life Sciences, Cleveland, Ohio, Etats-Unis). PROCEDE DE CRIBLAGE IN VIVO
Selon un autre aspect de l'invention, des compositions modulant l'activité d'un acide nucléique régulateur selon l'invention peuvent être identifiées in vivo, dans des animaux transgéniques non humains.
Selon une telle méthode, un animal transgénique non humain, par exemple une souris, est traité avec une molécule ou une substance candidate à tester, par exemple une substance ou molécule candidate auparavant sélectionnée par un procédé de criblage in vitro tel que défini ci-dessus.
Résultats-Phase 1 La gacyclidine induit un effet analgésique pendant les 30 premières minutes à la dose de 0,3 mg/kg, et pendant la première heure à la dose de 1 mg/kg. De manière intéressante, la gacyclidine n'induit d'effets moteurs qu'à la plus forte dose utilisée (1 mg/kg).
Phase 2 : Etude des capacités de la gacyclidine à s'opposer à l'hyperalgie induite par la naloxone lorsque celle-ci est administrée pendant l'effet analgésique du fentanyl.
Protocole-Phase 2 Le fentanyl est administré selon un protocole"mimant"son usage en chirurgie : 4 injections intraveineuses consécutives (toutes les 15 minutes) d'une dose de 40 ug/kg.
Chaque animal reçoit 3 types d'injection : la première injection (saline ou gacyclidine) est faite 30 minutes après la mesure du seuil nociceptif de base, la série d'injections de sérum physiologique ou de fentanyl (4 injections intraveineuses consécutives toutes les 15 minutes) est commencée 30 minutes après la première injection de sérum physiologique ou de gacyclidine, la troisième injection (naloxone dont le rôle est de bloquer les récepteurs opiacés) est réalisée 10 minutes après la dernière injection de fentanyl ; l'effet de la
naloxone sur le seuil nociceptif est apprécié 5 minutes après son injection, puis à 20 et 35 minutes, puis toutes les 30 minutes pendant deux heures.
3 séries expérimentales comprenant chacune 2 lots d'animaux de 12 rats sont constituées.
10 série expérimentale : l'lot : les animaux reçoivent successivement sérum physiologique, fentanyl (4 x 40 Ilglkg) puis naloxone (1 mg/kg s. c.).
2'lot : les animaux reçoivent successivement gacyclidine (0, 1 mg/kg), fentanyl (4 x 40 ug/kg) puis naloxone (1 mg/kg s. c.).
20 série expérimentale : l'lot : les animaux reçoivent successivement sérum physiologique, fentanyl (4 x 40 lig/kg) puis naloxone (1 mg/kg s. c.).
2'lot : les animaux reçoivent successivement gacyclidine (0, 3 mg/kg), fentanyl (4 x 40 ug/kg) puis naloxone (1 mg/kg s. c.).
30 série expérimentale : l'lot : les animaux reçoivent successivement sérum physiologique, fentanyl (4 x 40 ug/kg) puis naloxone (1 mg/kg s. c.).
2'lot : les animaux reçoivent successivement gacyclidine (1 mg/kg), fentanyl (4 x 40 ug/kg) puis naloxone (1 mg/kg s. c.).
L'ensemble des animaux des 3 séries expérimentales est préparé au cours d'une même phase. Le jour d'administration des substances pharmacologiques pour chaque série est décalé seulement de 3 jours afin de pouvoir suivre l'évolution du seuil nociceptif de manière quotidienne pendant plusieurs jours (au moins une semaine) suivant l'administration de ces substances, afin de pouvoir évaluer l'amplitude et la durée de l'hyperalgie induite par le fentanyl. La mesure du seuil nociceptif est réalisée pendant au moins 4 heures après injection de fentanyl, à raison d'une mesure toutes les 30 minutes, l'effet particulier de la naloxone étant mesuré 5 minutes après l'administration de cet antagoniste des récepteurs opiacés réalisée après la dernière injection de fentanyl.
Résultats-Phase 2 Les résultats sont présentés dans les graphiques ci-dessous (fig. 1-3).
La naloxone, injectée durant l'analgésie induite par le fentanyl, provoque une baisse importante du seuil nociceptif, au dessous des valeurs de base, confirmant que le fentanyl active un système facilitateur de la nociception. Cette activation est prévenue chez les animaux prétraités par la gacyclidine. Il est important de relever que même la dose la plus faible de gacyclidine (0,1 mglkg) qui n'induit per se ni effet analgésique ni effet moteur, prévient déjà totalement cet effet.
Phase 3 : Evaluation de l'effet potentialisateur de la gacyclidine sur l'effet analgésique de fentany I.
Au sens de l'invention, on définit le génotypage comme un procédé de détermination du génotype d'un individu ou d'une population d'individus.
On entend par "population d'individus", un groupe d'individus déterminés de façon aléatoire ou non. Ces individus peuvent être des humains, des animaux ou des plantes.
Les individus peuvent être choisis selon leur ethnie ou selon leur phénotype, notamment ceux qui sont atteints par les dérèglements et/ou maladies suivantes : les différents cancers comme, par exemple, les carcinomes, les mélanomes, les lymphomes, les leucémies et les cancers du foie, du cou, de la tête et des reins, les maladies cardiovasculaires, les maladies métaboliques telles que celles qui ne sont pas liées au système immunitaire comme, par exemple, l'obésité, les maladies infectieuses comme les hépatites B et C et le SIDA, les pneumonies, les colites ulcératives, les maladies du système nerveux central comme, par exemple, la maladie d'Alzheimer, la schizophrénie et la dépression, le rejet de greffe de tissus ou d'organes, la cicatrisation de blessures, l'anémie chez les patients dialysés, les allergies, l'asthme, les scléroses multiples, l'ostéoporose, le psoriasis, l'arthrite rhumatoïde, la maladie de Crohn, les maladies et les désordres auto-immuns, les désordres gastro-intestinaux ou encore les désordres liés aux traitements par chimiothérapie.
Le polymorphisme de type SNP fonctionnel conforme à l'invention est préférentiellement génotype dans une population d'individus.
Le génotypage peut être effectué par un miniséquençage avec des ddNTPs chauds (2 ddNTPs différents marqués par des fluorophores différents) et froids (2 ddNTPs non marqués), en liaison avec un lecteur de fluorescence polarisé. Le protocole de miniséquençage avec lecture de fluorescence polarisée (Technologie FP-TDI ou Fluorescence Polarization Template-direct Dye-Terminator Incorporation) est bien connu de l'homme du métier.
Il peut être réalisé sur un produit obtenu après amplification par réaction de polymérisation en chaîne (PCR) de l'ADN de chaque individu. Ce produit PCR est choisi pour couvrir la région génique du polynucléotide contenant le polymorphisme de type SNP étudié. Après la dernière étape dans le thermocycleur de la PCR, la plaque est alors placée sur un lecteur de fluorescence polarisée pour la lecture des bases marquées en utilisant les filtres d'excitation et d'émission spécifique des fluorophores. Les valeurs d'intensité des bases marquées sont reportées sur un graphe.
Les amorces respectivement sens et antisens pour l'amplification PCR, dans le cas du polymorphisme de type SNP de l'invention, peuvent comprendre par exemple les séquences nucléotidiques ID SEQ N 4 et ID SEQ N 5.
Ces séquences nucléotidiques permettent d'amplifier un fragment d'une longueur de 655 nucléotides, du nucléotide 470 au nucléotide 1124 dans la séquence nucléotidique ID SEQ N 1.
Une analyse statistique de la fréquence de chaque allèle (fréquence allélique) codé par le gène comportant le SNP dans la population d'individus est alors effectuée, ce qui permet de déterminer l'importance de leur impact et leur répartition dans les différents sous-groupes et notamment, le cas échéant, les diverses ethnies qui constituent cette population d'individus.
Les données de génotypage sont analysées pour estimer les fréquences de distributions des différents allèles observés dans les populations étudiées. Les calculs de fréquences alléliques peuvent être réalisés à l'aide de logiciels tels SAS-suite@ (SAS) ou SPLUS (MathSoft). La comparaison des distributions alléliques du polymorphisme de type SNP de l'invention au travers
des différentes ethnies de la population d'individus peut être réalisée au moyen des logiciels ARLEQUIN@ et SAS-suite@.
La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un polynucléotide conforme à l'invention pour la recherche d'une variation dans la séquence nucléotidique du gène IFNa-2 chez un individu.
Vecteur d'expression et cellule hôte La présente invention a aussi pour objet un vecteur recombinant comprenant au moins un polynucléotide conforme à l'invention.
De nombreux systèmes d'expression peuvent être utilisés, comme, par exemple, les chromosomes, les épisomes, les virus dérivés. Plus particulièrement, les vecteurs recombinants utilisés peuvent être dérivés de plasmides bactériens, de transposons, d'épisome de levure, d'éléments d'insertion, d'éléments chromosomiques de levures, de virus tels que les baculovirus, les papillonna virus comme SV40, les vaccinia virus, les adénovirus, les fox pox virus, les pseudorabies virus, les rétrovirus.
Ces vecteurs recombinants peuvent également être des dérivés de cosmides ou de phagemides. La séquence nucléotidique peut être insérée dans le vecteur recombinant d'expression par les méthodes bien connues de l'homme du métier, telles que, par exemple, celles qui sont décrites dans MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (supra) Sambrook et al..
Le vecteur recombinant peut comprendre des séquences nucléotidiques de contrôle de la régulation de l'expression du polynucléotide ainsi que des séquences nucléotidiques permettant l'expression et la transcription d'un polynucléotide de l'invention et la traduction d'un polypeptide de l'invention, ces séquences étant choisies en fonction des cellules hôtes mises en #uvre.
nucléique hétérologue d'intérêt. Ces vecteurs peuvent être réalisés à partir de différents types de rétrovirus tels que notamment le MoMuLV ("murine moloney leukemia virus" ; encore désigné MoMLV), ! e MSV ("murine moloney sarcoma virus"), le HaSV ("harvey sarcoma virus") ; le SNV ("spleen necrosis virus") ; le RSV ("rous sarcoma virus") ou encore le virus de Friend.
Pour construire des rétrovirus recombinants comportant une séquence codant pour la protéine ABCA7 placée sous le contrôle d'un acide nucléique régulateur selon l'invention, un plasmide comportant notamment les LTR, la séquence d'encapsidation et ladite séquence codante est généralement construit, puis utilisé pour transfecter une lignée cellulaire dite d'encapsidation, capable d'apporter en trans les fonctions rétrovirales déficientes dans le plasmide.
Généralement, les lignées d'encapsidation sont donc capables d'exprimer les gènes gag, pol et env. De telles lignées d'encapsidation ont été décrites dans l'art antérieur, et notamment la lignée PA317 (US 4,861, 719) ; la lignée PsiCRIP (WO 90/02806) et la lignée GP+envAm-12 (WO 89/07150). Par ailleurs, les rétrovirus recombinants peuvent comporter des modifications au niveau des LTR pour supprimer l'activité transcriptionnelle, ainsi que des séquences d'encapsidation étendues, comportant une partie du gène gag (Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639). Les rétrovirus recombinants produits sont ensuite purifiés par des techniques classiques.
Pour la mise en oeuvre de la présente invention, il est tout particulièrement avantageux d'utiliser un adénovirus recombinant défectif. Les résultats donnés ciaprès démontrent en effet les propriétés particulièrement intéressantes des adénovirus pour l'expression in vivo d'une protéine ayant une activité de médiateur du métabolisme des lipides. Les vecteurs adénoviraux selon l'invention sont particulièrement avantageux pour une administration directe in vivo d'une suspension purifiée, ou pour la transformation ex vivo de cellules, notamment autologues, en vue de leur implantation. De plus, les vecteurs adénoviraux selon l'invention présentent en outre des avantages importants, tels que notamment leur très haute efficacité d'infection, permettant de réaliser des infections à partir de faibles volumes de suspension virale.
Selon un autre mode particulièrement avantageux de mise en oeuvre de l'invention, on utilise une lignée productrice de vecteurs rétroviraux contenant un acide nucléique régulateur selon l'invention et la séquence codant pour la protéine ABCA7, pour une implantation in vivo. Les lignées utilisables à cet effet sont
notamment les cellules PA317 (US4,861, 719), PsiCrip (WO 90/02806) et GP+envAm-12 (US 5,278, 056), modifiées pour permettre la production d'un rétrovirus contenant une séquence nucléique codant pour une protéine ABCA7 selon l'invention. Par exemple des cellules souches totipotentes, précurseurs des lignées cellulaires sanguines, peuvent être prélevées et isolées chez le sujet. Ces cellules mises en culture peuvent être alors transfectées par le vecteur retroviral contenant la séquence codant pour la protéine ABCA7 sous le contrôle de son propre promoteur.
Ces cellules sont alors réintroduites chez le sujet. La différentiation de ces cellules sera à l'origine de cellules du tissu hématopoïétique exprimant la protéine ABCA7, notamment des lymphocytes T qui, participent à la signalisation de l'inflammation.
Avantageusement, dans les vecteurs de l'invention, la séquence codant pour la protéine ABCA7 est placée sous le contrôle d'un acide régulateur selon l'invention comprenant les éléments régulateurs permettant son expression dans les cellules infectées, et tout particulièrement les éléments régulateurs de type NFkappaB, CEBP, et GFI1.
* Comme indiqué ci-avant, la présente invention concerne également toute utilisation d'un virus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des pathologies liées au métabolisme des lipides ou encore au dysfonctionnement lié aux processus impliquant le système immunitaire et l'inflammation.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intra-occulaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection intraveineuse, telle que par exemple dans la veine porte du patient. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans la veine porte du patient est avantageuse car elle permet de cibler l'infection au niveau du foie et ainsi, de concentrer l'effet thérapeutique au niveau de cet organe.
Les doses de virus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du vecteur viral, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Concernant les rétrovirus, les compositions selon l'invention peuvent comporter directement les cellules productrices, en vue de leur implantation.
A cet égard, un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs virus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectées par ces virus. Il peut s'agir en particulier de cellules d'origine sanguine (cellules souches totipotentes ou précurseurs), fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules musculaires lisses et endothéliales, cellules gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires.
Celles-ci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham (Methods Ceil Biol (1980) 21a : 255). Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les virus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies (voir par exemple EP 228458, EP 289034, EP 400047, EP 456640).
Les cellules en culture sont ensuite infectées par les virus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire une protéine ABCA7 biologiquement active. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du
La pression à l'entrée du réacteur était d'environ 1,15 bar et la perte de charge à travers le réacteur était d'environ 0,15 bar.
La masse de catalyseur chargée était de 4,872 g, ce qui équivalait à une hauteur de 5 ml dans le réacteur.
Les résultats et conditions opératoires sont consignés dans le tableau 2 suivant, dans lequel : VVH signifie vitesse volumique horaire ; AA et Aac, COx et TTU ont les mêmes significations que dans le Tableau 1.