INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Dans un ballon à 4 cols de capacité 1 litres muni d'un réfrigérant et d'un agitateur à pales téflon (polytétrafluoroéthylène) actionné par un moteur, on introduit, après avoir purgé longuement le système avec de l'argon, 256 ml d'alcool isopropyl (IPA). Après la mise en route de l'agitation (150 tours/minute), on charge 50 g de carboxyméthyle guar. On obtient une dispersion homogène puis on charge 71 g d'une solution aqueuse de soude à 9.36% (soit 0.165 mole de soude). Le milieu est laissé sous agitation agitation pendant 30 minutes puis on recharge 228 ml d'IPA et 28 g d'une solution aqueuse de soude à 23.6% (soit 0.165 mole de soude). 24 g de chlorure de diméthylaminoéthyl (soit 0.167 mole) sont alors ajouté. La masse réactionnelle est ensuite chauffée à 65 C à l'aide d'un bain thermostaté et on laisse dans ces conditions pendant 3h30. Après ce temps, le chauffage est arrêté et la masse réactionnelle refroidie à 25 C.
Le DS en fonction amine est égal à 0.07 et le rapport molaire entre les fonctions anioniques et les fonctions cationiques est égal à 23/1.
Dans ces compositions pharmaceutiques, le principe actif est avantageusement présent à des doses physiologiquement efficaces.
Ces compositions pharmaceutiques peuvent être, par exemple, solides ou liquides et se présenter sous les formes pharmaceutiques couramment utilisées en médecine humaine, comme par exemple les comprimés simples ou dragéifiés, les gélules, les granulés, les caramels, les suppositoires et de préférence les préparations injectables et les poudres pour injectables. Ces formes pharmaceutiques peuvent être préparées selon les méthodes usuelles.
Le ou les principes actifs peuvent y être incorporés à des excipients habituellement employés dans ces compositions pharmaceutiques, tels que le talc, la gomme arabique, le lactose, l'amidon, le dextrose, le glycérol, l'éthanol, le stéarate de magnésium, le beurre de cacao, les véhicules aqueux ou non, les corps gras d'origine animale ou végétale, les dérivés paraffiniques,
les glycols, les divers agents mouillants, dispersants ou émulsifiants, les conservateurs.
Le ou les principes actifs conforme à l'invention peuvent être employés seul ou en combinaison avec d'autres composés, tels que des composés thérapeutiques tels que d'autres IFNs a, voire d'autres cytokines comme l'interleukine, par exemple.
Les différentes formulations des compositions pharmaceutiques sont adaptées suivant le mode d'administration.
Les compositions pharmaceutiques peuvent être administrées par les différentes voies d'administration connues de l'homme du métier.
L'invention a également pour objet une composition de diagnostic qui renferment au moins un composé précité, tel qu'un polypeptide conforme à l'invention, un polynucléotide conforme à l'invention, un vecteur recombinant défini précédemment, une cellule hôte définie précédemment, un anticorps défini précédemment et/ou un agent activateur et/ou inhibiteur d'un polypeptide conforme à l'invention, à titre de principe actif, ainsi qu'un excipient approprié pharmaceutiquement acceptable.
Les excipients appropriés utilisés dans la composition de diagnostic sont généralement des tampons et des conservateurs.
La présente invention a également pour objet l'utilisation : a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent activateur défini précédemment et/ou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide selon l'invention, et/ou c) d'un polynucléotide selon l'invention, et/ou d) d'une cellule hôte du sujet à traiter, définie précédemment, pour préparer un médicament destiné à augmenter l'expression ou l'activité chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention.
Ainsi, pour traiter un sujet qui a besoin d'une augmentation de l'expression ou de l'activité d'un polypeptide de l'invention, plusieurs méthodes sont possibles.
Il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un polypeptide de l'invention et/ou d'un agent activateur et/ou activé tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
Il est également possible d'augmenter la production endogène d'un polypeptide de l'invention par administration au sujet d'un polynucléotide selon l'invention. Par exemple, ce polynucléotide peut être inséré dans un vecteur rétroviral d'expression. Un tel vecteur peut être isolé à partir de cellules ayant été infectées par un vecteur de plasmide rétroviral contenant de l'ARN codant pour le polypeptide de l'invention, de telle façon pour que les cellules transduites produisent des particules virales infectieuses contenant le gène d'intérêt. Voir Gene Therapy and other Molecular Genetic-based Therapeutic Approaches, Chapter 20, in Human Molecular Genetics, Strachan and Read, BIOS Scientifics Publishers Ltd (1996).
Il est également possible d'administrer au sujet des cellules hôtes lui appartenant, ces cellules hôtes ayant été prélevées et modifiées, au préalable, de façon à exprimer le polypeptide de l'invention, comme décrit précédemment.
La présente invention concerne également l'utilisation a) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur défini précédemment, et/ou b) d'une quantité thérapeutiquement efficace d'un anticorps immunospécifique défini précédemment, et/ou c) d'un polynucléotide permettant d'inhiber l'expression d'un polynucléotide conforme à l'invention, pour préparer un médicament destiné à diminuer l'expression ou l'activité, chez un sujet, d'un polypeptide conforme à l'invention.
Ainsi, il est possible d'administrer au sujet une quantité thérapeutiquement efficace d'un agent inhibiteur et/ou d'un anticorps tels que définis précédemment, éventuellement en combinaison, avec un excipient pharmaceutiquement acceptable.
de repère quelconque, par exemple le fond du récipient. En ce sens, le dispositif objet de l'invention peut également constituer un dispositif de mesure absolue de niveau.
On précise en outre qu'il est possible d'adapter la taille des spires de toute bobine utilisée dans l'invention pour capter le champ magnétique, en fonction des contraintes rencontrées.
On peut, par exemple, élargir le secteur angulaire des spires pour obtenir une meilleure sensibilité de mesure ou faire la moyenne de perturbations angulaires locales.
Dans les exemples des figures 1 à 3, on a considéré des transducteurs magnétiques constitués de bobines.
Cependant, l'invention n'est pas limitée à l'utilisation de telles bobines : on peut utiliser, à la place de celles-ci, des transducteurs magnétiques par exemple constitués de magnéto-résistances ou de transducteurs à effet Hall en adaptant les moyens d'amplification, de démodulation et de traitement 14- 16-18 ou 64-68-72 et 66-70-74 à de tels transducteurs magnétiques.
De plus, dans les exemples, on a considéré des couples de transducteurs magnétiques identiques.
Cependant, l'invention n'est pas limitée à cela : on peut utiliser, dans l'invention, un ou plusieurs capteurs de champ magnétique comprenant chacun un couple de transducteurs magnétiques (par
exemple un couple de bobines) différents l'un de l'autre et adapter les moyens d'amplification, de démodulation et de traitement à de tels couples de transducteurs.
Domaine de l'invention La présente invention concerne un nécessaire ou trousse de détection de la protéine ESM-1 dans un échantillon. Elle est également relative à un procédé de détection de la protéine ESM-1 dans un échantillon mettant en oeuvre un tel nécessaire ou une telle trousse.
La trousse et le procédé de détection de la protéine ESM-1 selon l'invention sont industriellement applicables notamment à la quantification de la protéine ESM-1 dans des échantillons biologiques, tout particulièrement d'échantillons biologiques provenant de patients dont on suspecte une altération des parois vasculaires endothéliales.
Etat de la technique La protéine ESM-1 (pour Endothelial-cell-Specific Molecule 1))) est une protéine principalement exprimée par les cellules endothéliales et majoritairement par les cellules endothéliales vasculaires. La protéine ESM-1 a été décrite pour la première fois par LASSALLE et al. (1996).
L'ARN messager de ESM-1 code pour un polypeptide de 184 acides aminés dont la séquence est décrite dans la figure 1 de l'article de LASSALLE et al. (1996).
La protéine ESM-1 retrouvée dans les lysats cellulaires des cellules endothéliales humaines possède un poids moléculaire apparent de 20 kDa. La forme sécrétée de la protéine ESM-1 possède un poids moléculaire apparent de 50 kDa, indiquant que la protéine ESM-1 sécrétée a subi des modifications post-traductionnelles.
L'utilisation d'anticorps monoclonaux pour détecter la protéine ESM-1 est décrite dans la demande de brevet français publiée sous le n 2. 775.691 ainsi que dans l'article de BECHARD et al. (2000). Ces anticorps monoclonaux ont été préparés par immunisation de souris avec un antigène constitué de la séquence allant de l'acide aminé en position 79 jusqu'à l'acide aminé en position 184 de la protéine ESM-1 qui a été fusionnée à la protéine GST (glutathione-S-transferase). Trois familles d'anticorps monoclonaux avaient été caractérisées, ces familles d'anticorps se fixant respectivement sur les déterminants antigéniques AgD1 79P-99C
(anticorps MEP 01, MEP 06 et MEP 21), AgD2 119 S-139V (anticorps MEP 08 et MEP13) etAgD3 159G-184R (anticorps MEP 04, MEP 14 et MEP19).
BECHARD et al. (2000) décrivent la mise au point d'un test immunoenzymatique du type sandwich mettant en oeuvre les anticorps monoclonaux MEP 19 et MEP 21 pour réaliser un test de détection de la protéine ESM-1 dans un échantillon. Ce test a permis aux auteurs de montrer une forte production de protéine ESM-1 dans le sérum de patients hospitalisés pour un choc septique. Les résultats présentés à la figure 4 de cet article montrent que le test de détection utilisant les anticorps MEP 19 et MEP 21 permet de détecter une concentration de protéine ESM-1 supérieure à 4 nanogrammes par millilitre.
Par"antigène conjugué"on entend au sens de la présente invention un antigène (tel que Pal, FarCys, NO-Cys, etc.) couplé à une molécule porteuse, de préférence la sérum albumin bovine, soit directement soit par l'intermédiaire de glutaraldéhyde ou d'anhydride glutarique. Un tel couplage est réalisé de manière bien connue de l'homme du métier, par exemple comme décrit dans Boullerne et al., 1995, 1996 ; Geffard et al., 1998.
Les antigènes bactériens sont obtenus par sonication de cultures des bactéries indiquées dans le Tableau 1.
Le fluide biologique peut être, en particulier : un sérum, un plasma, du sang total, de !'urins, un liquide cérébrospinal.
Le procédé mis en oeuvre peut être avantageusement du type "sandwich".
Les complexes éventuellement formés peuvent être mis en évidence à l'aide d'un anticorps anti-immunoglobuline A ou M humaine, couplé à un marqueur, par exemple un marqueur fluorescent, le système biotine/streptavidine, un élément (radio) isotopique ou une enzyme.
Le procédé conforme à l'invention est avantageusement mis en oeuvre à l'aide d'un support solide convenable.
Comme support solide, on peut utiliser tout dispositif adapté à la manipulation de suspensions cellulaires et préférentiellement des tubes, des supports magnétiques particulaires ou des plaques rigides ou souples de microtitration en polyéthylène, polystyrène, chlorure de polyvinyle ou nitrocellulose comportant des micropuits.
Lorsqu'on utilise une plaque de microtitration préactivée ayant des terminaisons NH2, il n'est pas nécessaire de"coupler"les antigènes à une molécule porteuse.
L'expression"un anticorps couplé à un élément (radio) isotopique"signifie que l'anticorps porte, soit sur un élément propre de sa structure, par exemple les résidus de tyrosine constitutifs, soit sur un radical approprié qui lui a été fixé, un isotope radioactif permettant de le doser par comptage de la radioactivité qui lui est associée.
Lorsque l'anticorps est couplé à une enzyme celle-ci, associée à l'emploi de réactifs appropriés, permet une mesure quantitative de cet anticorps.
Le substrat et les réactifs sont choisis de sorte que le produit final de la réaction ou de la séquence des réactions provoquées par l'enzyme et mettant en oeuvre ces substances soit : - ou bien une substance colorée ou fluorescente qui diffuse dans le milieu liquide environnant les cellules et qui fait l'objet de la
mesure finale spectrophotométrique ou fluorimétrique, respectivement, - ou bien une substance colorée insoluble qui se dépose sur les cellules et les parois sur lesquelles elles sont fixées et qui peut faire l'objet, soit d'une mesure photométrique par réflexion, soit d'une évaluation à l'oeil éventuellement par rapport à une gamme de teintes étalonnées.
Lorsque l'on utilise un élément radio-isotopique, comme par exemple l'iode 125, la radioactivité associée à l'échantillon est comptée dans un compteur gamma selon toute modalité appropriée.
Lorsque l'on utilise une enzyme, l'apparition d'un produit coloré ou fluorescent est obtenue en ajoutant au support solide une solution contenant le substrat de l'enzyme et un ou plusieurs réactifs auxiliaires permettant d'obtenir finalement comme produit de réaction, soit un produit coloré soluble dans le milieu, soit un produit coloré insoluble, soit un produit fluorescent soluble, comme cela a été expliqué précédemment. On mesure ensuite le signal lumineux provenant des échantillons ainsi traités, à l'aide de l'appareillage adapté à chaque cas : photomètre en transmission ou en réflexion ou fluorimètre respectivement. Lorsque le support solide est une plaque de microtitration, la lecture du signal lumineux peut être effectuée séquentiellement dans tous les puits d'une même plaque par l'emploi de lecteurs automatisés d'usage courant dans les laboratoires de biologie.
On peut utiliser comme enzyme la phosphatase alcaline, dont les substrats préférentiels sont le paranitrophénylphosphate pour une lecture finale spectrophotométrique ou le méthyl-4- umbelliférylphosphate pour une lecture fluorométrique ou le bromo- 5-chloro-4-indolyl-3-phosphate pour obtenir un produit de réaction coloré insoluble. On peut de même utiliser comme enzyme la ss-
galactosidase dont les substrats préférentiels seront alors l'orthon itrophényl-ss-D-galactopyranoside.
Le flux 35 est composé de 42,97 % d'azote, de 57,02 % de méthane et de 0,01 % d'éthane.
Le flux 36, qui est composé de 6,79 % d'azote, 85,83 % de méthane, 4,97 % d'éthane, 1,71 % de propane, 0,27 % d'isobutane et de 0,44 % de n-butane, est séparé dans le ballon V2 en la deuxième fraction de tête 12 (1609 kmol/h), et en la deuxième fraction de pied 13 (34285 kmol/h).
Le flux 12 (45,58 % d'azote, 54,4 % de méthane et 0,02 % d'éthane) est réchauffé jusqu'à 33 C dans l'échangeur El, pour fournir un flux 37 qui alimente, à 4,9 bar, le compresseur Kl à l'étage à moyenne pression 14.
Le flux 13 (4, 97 % d'azote, 87,30 % de méthane, 5,20 % d'éthane, 1,79 % de propane, 0,28 % d'isobutane et de 0,46 % de n-butane) est refroidi dans l'échangeur thermique E2 pour fournir le flux 20 à -157OC et 4,6 bar. Ce dernier est détendu dans la vanne 28 pour l'obtention du flux 29 à -165, 21 oC et 1, 15 bar, qui est introduit dans la colonne Cl.
La colonne Cl produit en tête la première fraction de tête 3 (4032 kmol/h) à -165, 13OC. La fraction 3 (41,73 % d'azote et 58,27 % de méthane) est réchauffée dans l'échangeur El pour donner le flux 41 à -63, 7OC et 1,05 bar. Le flux 41 alimente l'aspiration basse pression 15 du compresseur Kl.
La colonne Cl produit la première fraction de pied 4 à -159, 01OC et 1, 15 bar avec un débit de 30253 kmol/h.
Cette fraction 4 (0,07 % d'azote, 91,17 % de méthane, 5,90 % d'éthane, 2,03 % de propane, 0,32 % d'isobutane et de 0,52 % de n-butane) est pompée par la pompe Pl pour fournir une fraction 39 à 4,15 bar et -158, 86OC, puis quitte l'installation.
La colonne Cl est équipée du rebouilleur de fond de colonne 16, qui refroidit le flux 13 pour l'obtention du flux 20.
Le compresseur Kl produit le flux compressé 5 à 37 C et 29 bar avec un débit de 11341 kmol/h. Ce flux de gaz combustible 5 (42,90 % d'azote et 57,09 % de méthane) est séparé en un flux 40, qui représente 3041 kmol/h, qui quitte l'installation, et en un flux 6, qui représente 8300 kmol/h, qui est compressé dans le compresseur XK1.
Le compresseur XK1 produit le flux comprimé 7 à 68, 18 C et 39,7 bar. Le flux 7 est refroidi à 37 C dans l'échangeur à eau 24, puis est séparé en les flux 8 et 9.
Le flux 8 (5700 kmol/h) est refroidi dans l'échangeur El pour donner le flux 25 à -74OC et 38,9 bar.
Le flux 9 (2600 kmol/h) est refroidi dans l'échangeur El pour donner le flux 22 à -155OC et 38,4 bar. Ce dernier est ensuite détendu dans la vanne 23 pour fournir le flux 35 à -168OC et 5,1 bar.
Le flux 25 est détendu dans la turbine de détente XI qui produit la fraction 10 à une température de -139, 7OC et une pression de 8,0 bar. Cette fraction 10 est ensuite réchauffée dans l'échangeur El qui produit la fraction 26 à une température de 32 C et une pression de 7, 8 bar.
La fraction 26 alimente le compresseur Kl sur l'étage à moyenne pression 11. Le compresseur K1 et le détendeur XI ont les performances suivantes :
Unité de déazotation
puissance du compresseur Ksi 22007 ka puissance du détendeur XI 2700 kW
De préférence, un acide nucléique selon l'invention sera sous une forme isolée eVou purifiée.
Fait également partie de l'invention tout fragment"biotogiquement actif" d'un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Selon encore un autre aspect, l'invention concerne un acide nucléique ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec un acide nucléique tel que défini ci-dessus.
En particulier, cet acide nucléique peut être d'origine murine, et est constitué d'un polynucléotide de séquence nucléotidique SEQ ID NO : 4 comprenant de l'extrémité 5'vers 3' : - une région non transcrite d'environ 1, 2 Kb localisé en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7 murin, et - la séquence partielle du premier exon du gène ABCA7.
La région d'environ 1,2Kb localisée en amont du site d'initiation de la transcription du gène ABCA7, et comprenant le promoteur de base et de multiples éléments régulateurs de la transcription est comprise également dans la séquence identifiée comme la SEQ ID NO : 5 selon l'invention.
L'invention englobe également un acide nucléique caractérisé en ce qu'il hybride, dans des conditions de forte stringence, avec l'un quelconque des acides nucléiques selon l'invention.
L'invention concerne aussi un acide nucléique ayant au moins 80%, avantageusement 90%, de préférence 95% et de manière tout à fait préférée 98%
d'identité en nucléotides avec un acide nucléique comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi dans le groupe constitué des séquences nucléotidiques SEQ ID D ? 1 à SEQ ID ? 5.
ANALYSE DETAILLEE DES SEQUENCES SEQ ID ? : 2 ET SEQ ID ? : 5 Selon une caractéristique principale, l'acide nucléique de séquence SEQ ID N02, compris dans l'acide nucléique régulateur du gène humain ABCA7 de séquence SEQ ID NO1, comprend les éléments constitutifs d'un promoteur de base, respectivement une boîte"TATA"dégénérée (TTAAG) localisée 30pb en amont du point d'initiation de la transcription. De même, une boite"TATA"dégénérée (TTAAA) a été localisée 30pb en amont du point d'initiation de la transcription, sur l'acide nucléique murin de séquence SEQ ID NO : 5, compris dans l'acide nucléique régulateur du gène murin ABCA7 de séquence SEQ ID NO : 4. Les boites"TATA" sur les promoteurs des gènes humain et murin ABCA7 ainsi que la position des points d'initiation de la transcription sont représentés sur la Figure 1.
Les séquences régulatrices SEQ ID N 2 et SEO ID N 5 comprennent également de nombreux sites de fixation de divers facteurs de transcription susceptibles de réguler positivement ou négativement l'activité du promoteur de base.
Ainsi, les différentes séquences caractéristiques des sites de fixation de divers facteurs de transcription dans les séquences SEQ ID D ? 2 et SEQ ID ? 5 ont été identifiées par les inventeurs de la manière détaillée ci-après.
Les séquences SEQ ID N02 et SEQ ID D ? 5 ont été utilisées comme séquences de référence et traitées selon les algorithmes des logiciels Matlnspector (Quandt et al., Nue ! Acid Res (1995) 23 (23), 4878-4884) et comparées aux données répertoriées dans plusieurs bases de données telles que Transfac et la présence ainsi que la localisation des différentes sites caractéristiques des séquences SEO ID N 2 et 5, et particulièrement les sites de liaison des facteurs de transcription ont été déterminés selon des méthodes bien connues de l'homme du métier.
Plus particulièrement, une analyse détaillée a été réalisée en utilisant les logiciels NNPP (Reese et al. J. Comput Biol. (1997) 4 (3) 311-23), TSSG, et TSSW (Soloryev et al., I., Ismb (1995), 5,294-302), sur les 1,1 kb et 1,2Kb en amont du site
d'initiation respectivement des séquences SEQ ID N 2 et 5, a permis d'identifier 193 et 233 sites putatifs de liaison aux facteurs de transcription, chez l'homme et la souris lors de la première étape de la recherche. Ceux-ci sont répertoriés dans les tableaux 1 et 2. Après compilation et filtrage comme décrit ci-dessus, et comparaison des séquences régulatrices humaine et murine, deux modules communs aux séquences régulatrices humaine et murine ont été déterminés, et 5 et 3 sites de fixation possibles de facteurs de transcription différents ont été retenus respectivement dans les modules 1 et 2 sur les séquences humaine et murine. La position avec les scores de filtration des sites de fixation aux facteurs de transcription identifiés dans les 1111 pb de la séquence SEQ ID ? 2 selon l'invention, ainsi que dans les 1220 pb de la séquence SEQ ID NO : 5 selon l'invention, sont présentés dans le tableau 3. Les différents sites de fixation ont été aussi schématiquement représentés dans la figure 1.
Les positions des nucléotides de début de chacun des sites de fixation aux facteurs de transcription sont désignées en référence à la numérotation des nucléotides des séquences SEQ D ? 2 et NO : 5 par rapport au point +1 d'initiation de la transcription, contenu dans les séquences SEQ ID NO1 et NO4, telle que représentée sur la figure 1.
La Figure 2 représente la séquence SEQ ID NO : 1, qui contient la séquence SEQ ID N 2. Le premier nucléotide en position 5'de la séquence de la Figure 2 est également le premier nucléotide en position 5'de l'une des séquences nucléiques SEQ ID N 1 et SEQ ID NO 2. Sur la Figure 2, les sites de fixation aux facteurs de transcription sont illustrés en caractères gras qui délimitent leurs positions respectives, et leurs désignations respectives sont indiquées au-dessus de chacune des boîtes correspondantes. La numérotation des nucléotides de la séquence représentée à la figure 2 a été effectuée par rapport au site d'initiation de la transcription, numéroté"+1", le nucléotide en 5'du nucléotide +1 étant lui-même numéroté"-1".
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES et HIGGINS (1985) (Nucleic acid Hybridization iapractical Approach, Hames and Higgins Ed., IRL Press, Oxford) ou encore dans l'ouvrage de F. AUSUBEL et al (1999) (Currents Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y).
Par"transformation"au sens de l'invention, on entend l'introduction d'un acide nucléique (ou d'un vecteur recombinant) dans une cellule hôte. Le terme " transformation)) englobe également une situation dans laquelle le génotype d'une cellule a été modifié par un acide nucléique exogène, et que cette cellule ainsi transformée exprime ledit acide nucléique exogène, par exemple sous la forme d'un polypeptide recombinant ou encore sous la forme d'un acide nucléique sens ou antisens.