INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
1250 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 104 tgtagcaata catcagtggc agacgggtga gtaacacgtg ggaaccttcc tcgttgtacg 60 ggacaactca gggaaacttg agctaatacc gtatacgtcc gagaggagaa agatttatcg 120 caatgagacg ggcccgcgtc ggattagcta gttggtaagg taacggctta ccaaggcgac 180 gatccgtagc tgatctgaga ggatgatcag ccacactggg actgagacac ggcccagact 240 cctacgggag gcagcagtgg ggaatcttgg acaatgggcg caagcctgat ccagccatgc 300 cgcgtgagtg aagaaggcct tagggttgta aagctctttt gccagggacg ataatgacgg 360 tacctgagaa taagccccgg caaacttcgt gccagcagcc gcggtaatac gaagggggct 420 agcgttgttc ggatttactg ggcgtaaagc gcacgtaggc gggtcgttaa gtcaggggtg 480 aaatcccgga gctcaactcc ggaactgcct ttgatactgg cgaccttgag gctggaagag 540 gttagtggaa ttcccagtgt agaggtgaaa ttcgtagata ttgggaagaa caccagtggc 600 gaaggcggct aactggtcca gatctgacgc tgaggtgcga aagcgtgggg agcaaacagg 660 attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa ctatgggtgc tagctgtcag cgggcttgct 720 cgttggtggc gcagctaacg cattaagcac cccgcctggg gagtacggtc gcaagattaa 780 aacttaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc 840 aacgcgcaga accttaccaa cccttgacat cccgatcgcg gacaccagag atggagtcct 900 tcagttcggc tggatcggag acaggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gtcgtgagat 960 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc ctcgccttta gttgccatca tttagttggg 1020 cactctaaag ggactgccgg tgataagccg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcctca 1080 tggcccttac gggttgggct acacacgtgc tacaatggcg gtgacaatgg gcagctactt 1140 cgcaaggaga agctaatccc aaaaagccgt ctcagttcag attgcactct gcaactcggg 1200 tgcatgaagt tggaatcgct agtaatcgct aatcagcagg tagcggtgaa 1250 105 1302 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 105 ggcttcggct ccccggtaga gggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa tctgcctttg 60 ggtggggaat aacccttcga aagaggggct aataccgcat aacgcagcgg caccgaatgg 120 tgacagttgt taaagtgggg gatcgcaaga cctcacgcct gaagaggagc ccgcgcccga 180 ttagctagtt ggtgcggtaa tggcgtacca aggcggcgat cggtagccgg cctgagaggg 240 cggacggcca cactggcact gagagacggg ccagactcct acgggaggca gcagtgggga 300 attttgggca atgggcgcaa gcctgaccca gcaacgccgc gtgaaggacg aaatccctct 360 gggatgtaaa cttcgaaagt tggggaagaa atccgtgtga ggataatgca cacgggatga 420 cggtacccaa cgtaagcccc ggctaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtaggggg 480 caagcgttgt tcggaattac tgggcgtaaa gggcgcgtag gcggtacgac aagtctggag 540 tgaaagcccg gggctcaacc ccggaatgtc tttggaaact gtcgaacttg agtgcggaag 600 aggcatctgg aattcccagt gtagcggtga aatgcgtaga tattgggaag aacacctgag 660 gcgaaggcgg gatgctgggc cgacactgac gctgaggcgc gaaagccagg ggagcgaacg 720 ggattagata ccccggtagt cctggcccta aacgatggat acttggtgtg tggggttctc 780 gaagtccccg cgtgccggag caacgcggt aagtatcccg cctggggagt acggtcgcaa 840 ggctgaaact caaaggaatt gacggggacc cgcacaagcg gtggagcatg tggttcaatt 900 cgacgcaacg cgaagaacct tacctgggtt aaatcctacc tcgtcgcctc agagatgagg 960 tttcccttcg ggggaggtag gacggtgctg catggctgtc gtcagctcgt gccgtgaggt 1020 gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttaccacta gttgccagcg gttcggccgg 1080 gcactctatt gggactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1140 atggccttta tgtccagggc tacacacgtg ctacaatggc cggaacaaag cgcagcaaac 1200
ccgcgagggg gagccaatcg caaaaatccg gtctcagttc ggattggagt ctgcaactcg 1260 actccatgaa gttggaatcg ctagtaatcg cggatcagca tg 1302 106 1281 ADN Organime Inconnu Origine de la séquence :Organisme du sol 106 tgcttctctt gagagcggcg gacgggtgag taatgcctag gaatctgcct ggtagtgggg 60 gataacgttc ggaaacggac gctaataccg catacgtcct acgggagaaa gcaggggacc 120 ttcgggcctt gcgctatcag atgagcctag gtcggattag ctagttggtg aggtaatggc 180 tcaccaaggc gacgatccgt aactggtctg agaggatgat cagtcacact ggaactgaga 240 cacggtccag actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tggacaatgg gcgaaagcct 300 gatccagcca tgccgcgtgt gtgaagaagg tcttcggatt gtaaagcact ttaagttgga 360 aggaagggca gtaaattaat actttgctgt tttgacgtta ccgacagaat aagcaccggc 420 taactctgtg ccagcagccg cggtaataca gagggtgcaa gcgttaatcg gaattactgg 480 gcgtaaagcg cgcgtaggtg gtttgttaag ttggatgtga aatccccggg ctcaacctgg 540 gaactgcatt caaaactgac tgactagagt atggtagagg gtggtggaat ttcctgtgta 600 gcggtgaaat gcgtagatat aggaaggaac accagtggcg aaggcgacca cctggactaa 660 tactgacact gaggtgcgaa agcgtgggga gcaaacagga ttagataccc tggtagtcca 720 cgccgtaaac gatgtcaact agccgttgga agccttgagc ttttagtggc gcagctaacg 780 cattaagttg accgcctggg gagtacggcc gcaaggttaa aactcaaatg aattgagggg 840 ggcccgcaca agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag 900 gccttgacat ccaatgaact ttctagagat agattggtgc cttcgggaac attgagacag 960 gtgctgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgtaacgagc 1020 gcaacccttg tccttagtta ccagcacgac atggtgggca ctctaaggag actgccggtg 1080 acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca agtcatcatg gcccttacgg cctgggctac 1140 acacgtgcta caatggtcgg tacagagggt tgccaagccg cgaggtggag ctaatcccac 1200 aaaaccgatc gtagtccgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagtc ggaatcgcta 1260 gtaatcgcga atcagaaatg t 1281
L'invention concerne un procédé d'identification rapide de Streptococcus pneumoniae (pneumocoque) dans des échantillons biologiques et le kit correspondant.
Les infections à pneumocoque sont fréquentes et sont responsables d'une morbidité et d'une mortalité élevées. L'incidence annuelle des pneumonies à pneumocoque serait de 132 000 cas avec 12 000 décès en France environ (4).
Streptococcus pneumoniae est un germe commensal des voies aériennes supérieures qui peut être responsable de pneumopathies communautaires, d'otites aiguës moyennes, de méningites, de bactériémies et d'endocardites. Il atteint les personnes âgées et les jeunes enfants surtout (8).
Sa virulence est liée à la présence d'une capsule polyosidique qui s'oppose à la phagocytose. Souvent, le manque de signes cliniques a pour effet de retarder le diagnostic et conduit à une antibiothérapie différée.
L'identification du pneumocoque est orientée par ses caractères phénotypiques : des colonies, morphologie cellulaire, sensibilité à l'optochine et lyse par la bile (10,13).
La réponse par le test à l'optochine n'est disponible qu'en 48 h et l'interprétation est parfois délicate (5). L'identification est compliquée par l'interférence d'autres espèces commensales (7). De plus, certaines espèces comme S. mitis et S. oralis possèdent des gènes d'enzymes similaires à ceux de Streptococcus pneumoniae (11). La détermination des antigènes capsulaires par le test d'agglutination des particules de latex est rapide et simple mais elle présente des faux négatifs et des faux positifs.
L'identification du pneumocoque peut être confirmée par la détermination du sérotype capsulaire à l'aide d'anticorps ou par hybridation spécifique avec la sonde AccuProbe Streptococcus pneumoniae # Néanmoins, l'émergence de pneumocoques de sensibilité diminuée à la pénicilline (PSDP) et résistants aux macrolides, ainsi que l'apparition de souches multirésistantes posent un véritable problème de santé publique (2,6).
Il existe donc aujourd'hui un besoin d'un test rapide et facilement réalisable pour identifier le pneumocoque et le différencier des autres streptocoques oraux directement à partir de prélèvements.
L'invention propose un procédé permettant de détecter rapidement Streptococcus pneumoniae : - à partir de colonies isolées de streptocoques a hémolytiques sur gélose au sang (en 1 heure ou moins), - directement à partir des bouillons d'hémoculture positifs à cocci à Gram positif dont l'aspect évoque un streptocoque ou un pneumocoque (en 1 heure ou moins), - directement à partir des prélèvements broncho pulmonaires et des expectorations (en 2 heures environ), et de le différencier des autres streptocoques en 2 heures.
Cette liste n'est pas limitative, toute enzyme susceptible de déglycosyler le complexe selon l'invention peut être utilisée sous réserve que l'enzyme ou le mélange enzymatique sélectionné conduise à un complexe déglycosylé susceptible d'induire des anticorps neutralisant les isolats primaires. Cette caractéristique peut être aisément vérifiée à l'aide du test de neutralisation auquel il est fait référence dans l'exemple 4 ci-dessous. De préférence la déglycosylation du complexe est réalisé par utilisation d'une enzyme ou d'un mélange d'enzymes sélectionnée(s) dans le groupe consistant en : peptide N-glycosidase F, endoglycosydase F et sialidase de préférence par utilisation de PNGase F ou de sialidase.
Les paramètres de l'étape de glycosylation que sont le rapport enzyme/substrat, la température et le temps d'incubation du substrat avec l'enzyme sont sélectionnés de sorte que la déglycosylation entraîne une diminution de la masse moléculaire (MM) de la glycoprotéine de l'étape (a) représente 1 à 50% et plus avantageusement 20% tel que déterminé par SDS PAGE. Plus avantageusement on sélectionne les paramètres qui provoquent la diminution maximum du poids moléculaire du complexe glycoprotéine/CD4, tel que déterminé par électrophorèse sur gel d'acrylamide. Le rapport enzyme/substrat varie en fonction de l'activité spécifique de l'enzyme. A titre illustratif, les paramètres appropriés pour la déglycosylation d'un complexe gp160MN/LAI/ CD4 soluble par la sialidase présentant une activité de 30 unités sont de 1/116 (poids/poids) avec incubation du complexe pendant 3 heures à 37 C. Les conditions opératoires appropriées pour les différentes enzymes sont facilement déductibles par l'homme de l'art à partir de l'enseignement fourni ici et des renseignements contenus dans les fiches techniques accompagnant les enzymes.
La déglycosylation est mise en #uvre par addition à la préparation contenant la glycoprotéine d'enveloppe de l'enzyme en solution dans un tampon approprié pour son activité enzymatique. Le choix du tampon est à la portée de l'homme de l'art et il est généralement indiqué par le fournisseur. La réaction est mise en #uvre par mélange des deux protéines i.e. CD4 et glycoprotéine d'enveloppe à la température ambiante et sous agitation. La nature du tampon et les paramètres de la réaction de déglycosylation peuvent être facilement déterminés par l'homme de l'art à partir de l'enseignement fourni ici. Cette étape de déglycosylation est décrite plus en détails dans les exemples qui suivent.
Dans le cadre de la présente invention, on entend donc par complexe déglycosylé , un complexe glycosylé tel que défini ci-dessus qui, après sa formation (ie après l'association non-covalente des sous-unités glycoprotéine d'enveloppe et CD4) est soumis à une déglycosylation par voie enzymatique telle que définie ci-dessus. Une fois déglycosylé les complexes glycoprotéine d'enveloppe/CD4 en solution ont tendance à s'agréger formant ainsi des structures multimériques.
La présente invention a également pour objet une composition comprenant un mélange d'au moins deux complexes déglycosylés tels que définis ci-dessus.
Dans un tel cas de figure, ces complexes peuvent se différentier par exemple par la nature de la glycoprotéine d'enveloppe constitutive (par ex. les glycoproteines provenant de différentes souches ou isolats primaires, certaines pouvant correspondre également à des protéines hybrides) ou par le degré ou la nature de la déglycosylation ou par la nature du CD4. Tout mélange envisageable comprenant un ou plusieurs complexe est inclus dans la portée de la présente invention.
La présente invention a également pour objet les anticorps dirigés contre les complexes déglycosylés tels que décrits ci-dessus. La préparation de tels anticorps est mise en #uvre par les techniques classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et monoclonaux (Kohler G et al European Journal of lmmunology.
6(7):511-9, 1976 Jul) Ces anticorps sont particulièrement appropriés pour être utilisés dans un schéma d'immunisation passive.
La présente invention a également pour objet des vaccins utiles à des fins thérapeutiques et prophylactiques. Les vaccins selon la présente invention comprennent un complexe protéique déglycosylé tel que défini ci-dessus ou un mélange de complexes déglycosylés, un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable et éventuellement un adjuvant.
Le vaccin selon la présente invention peut donc contenir un seul type de complexe protéique déglycosylé ou un mélange de divers types de complexes déglycosylés. Dans un tel cas de figure, ces complexes peuvent se différentier par exemple par la nature de la glycoprotéine d'enveloppe constitutive (par ex. les glycoprotéines provenant de différentes souches ou isolats primaires, certaines pouvant correspondre également à des protéines hybrides) ou par le degré ou la nature de la déglycosylation ou par la nature du CD4. Tout mélange envisageable comprenant un ou plusieurs complexe est inclus dans la portée de la présente invention.
Selon un autre aspect, la présente invention comprend des anticorps anticomplexe protéique déglycosylé. Dans ce cas de figure également tout mélange d'anticorps, monoclonaux ou polyclonaux, dirigés contre différentes parties d'un même complexe déglycosylé ou contre différents complexes déglycosylés fait partie de la présente invention.
La quantité de complexe protéique déglycosylé dans le vaccin selon la présente invention dépend de nombreux paramètres comme le comprendra l'homme de l'art, tels que la nature du complexe, la voie d'administration et l'état de la personne à traiter (poids, age, état clinique, etc...). Une quantité appropriée est une quantité telle qu'une réponse immunitaire humorale ou cellulaire capable de neutraliser des isolats primaires du VIH est induite après administration de cette dernière. Les vaccins selon la présente invention peuvent également contenir un adjuvant. Tout adjuvant ou mélange d'adjuvants pharmaceutiquement acceptable peut être utilisé à cette fin. On peut citer à titre d'exemple les sels d'aluminium tels que l'hydroxyde d'aluminium ou le phosphate d'aluminium. Des agents auxiliaires classiques tels que agents mouillants, charges, émulsifiants, tampons etc. peuvent également être additionnés au vaccin selon l'invention.
Les vaccins selon la présente invention peuvent être préparés par tout procédé classique connu de l'homme de d'art. Classiquement les antigènes sont mélangés avec un support ou diluant pharmaceutiquement acceptable, tel que eau ou solution saline tamponnée au phosphate. Le support ou diluent va être sélectionné en fonction de forme galénique choisie, du mode et de la voie d'administration ainsi que de la pratique pharmaceutique. Les supports ou diluants appropriés ainsi que les exigences en matière de formulation pharmaceutique sont décrits en détails dans Remington's Pharmaceutical Sciences, représentant un ouvrage de référence dans ce domaine.
Les vaccins mentionnés ci-dessus peuvent être administrés par toute voie classique, habituellement utilisée dans le domaine des vaccins, telle que la voie parentérale (intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, etc..) L'administration peut être réalisée par l'injection d'une dose unique ou de doses répétées, par exemple à JO, à 1 mois, à 3 mois, à 6mois et à 12 mois. On utilisera de préférence les injections à JO , à 1 mois et à 3 mois.
La présente invention entend également couvrir le complexe déglycosylé tel que défini ci-dessus et le vaccin contenant un tel complexe ou mélange de complexes déglycosylés pour leur utilisation pour induire des anticorps neutralisant des isolats primaires du VIH ainsi que pour leur utilisation pour induire une réponse CTL contre le VIH.
La demanderesse a mis en évidence de façon surprenante que les complexes déglycosylés selon l'invention étaient capable après administration d'induire des anticorps susceptibles de neutraliser des isolats primaires du VIH.
Souches d'isolats cliniques F (MUN) J (PAL) # S. mitis 1 + 10' + 10' 2 + 1 h +lh 3 + 1 h +lh 4 + 30' + 30' # S. oralis + 1 h + 1 h # S. pyogènes - + 10' # S. sanguis 1 - 2 # S. milleri 1 - + 2 h # S. lactis cremoris - + 10' # S. haemolysans + 10' + 10' # Streptococcus spl (non identifié)- + 10' Streptococcus sp2 - + 30' Streptococcus sp3 - + 30' Streptococcus sp4 - + 30' # S. pneumoniae n = 3 souches + 10' n = 46 souches + 30' n = i souche + 1 h
B/ Bouillons d'hémoculture (n = 9).
Bouillons d'hémoculture Souche isolée du bouillon Décantés Non décantés 0,2 ml 0,5 ml 0,2 ml 0,5 ml # S. pneumoniae 1 F(MUN) +10' +10' J(PAL) ....
# S. pneumoniae 2 F(MUN) + 1 h + 1 h J (PAL) - - i i # S. pneumoniae 3 F(MUN) +lh J(PAL) # S. pneumoniae 4 F(MUN) + 1 h J(PAL) # S. pneumoniae 5 F (MUN) + 30' J (PAL) # S. sanguis F(MUN) (MUN) J(PAL) ....
# S. mitis F (MUN) + 10' J (PAL) + 2 h # Streptococcus sp (non identifié) F (MUN) ....
J (PAL)
# Association S. mitis + Streptococcus sp F (MUN) + 30' J (PAL) + 2 h i = illisible (trop de globules rouges).
Conclusion : Pour s'assurer une bonne sensibilité de détection de l'activité neuraminidase (substrat MUN) ou phosphatase (substrat PAL) : pas de risque de faux négatifs aux concentrations habituellement rencontrées en bactéries, il convient de réaliser la lecture de la fluorescence (F) après 1 h d'incubation et celle de la couleur jaune (J) après 2 h d'incubation.
En effet, une souche de S. milleri en système purifié et une souche de S. mitis en bouillon d'hémoculture n'ont été positives qu'en 2 h par le test PAL.
D'autre part, il est nécessaire de décanter les bouillons pour éliminer un maximum de globules rouges qui gênent la concentration bactérienne et retardent la réaction. Un volume de bouillon de 0,2 ml est suffisant pour obtenir une réaction positive.
Exemple n 5 : Détermination du volume d'aspirations bronchiques à déposer dans le tube-gel pour une bonne détection.
# Aspiration bronchiques et expectorations : Le test est réalisé à partir d'aspirations bronchiques prélevées de patients hospitalisés au CHG de Montbéliard. Ces aspirations ont été fluidifiées par le N-acétylcystéine dès réception du prélèvement et congelées à - 20 C après dilution au 1 :2 en milieu glycérolé. Il est aussi réalisé à partir d'expectorations prélevées de patients hospitalisés au CHG de Versailles et fluidifiées avant le test.
# Réactifs : Identiques à ceux utilisés dans les exemples précédents.
# Protocole : Utilisation de volumes variables de prélèvement traité et décongelé à 37 C : 50 à 200 l (soit 25 à 100 l de prélèvement traité) pour ensemencer les tubes. Lecture de la fluorescence et de la couleur jaune après 1 h et 2 h d'incubation à 37 C.
# Résultats : Lorsqu'on utilise 200 l de prélèvement décongelé (soit 100 ul de prélèvement traité), une zone de déchets importante recouvre le gel et gène la concentration des bactéries.
De plus, l'hémoglobine libérée par lyse des globules rouges gène la lecture. Les résultats obtenus avec 25 l et 50 l sont reportés dans le tableau A ci-dessous, ceux obtenus avec 50 l sur 50 prélèvements sont reportés dans le tableau B.
- la figure 2 représente une colonne pour la mise en oeuvre du procédé de fractionnement selon 'invention. Exemple 1 : Matériels . 1) Huiles .
Les mélanges de lipides utilisés sont huiles extraites du gluten de blé par les méthodes conventionnelles, dont les compositions massiques obtenues chromatographie en phase liquide, sont les suivantes HUILE 1 Triglycérides : 38 % Stérols : 4 Sphingolipides : 8,5 Monogalactosyldiglycérides (MGDG) : 10, Digalactosyldiglycérides (DGDG) : 25,5 Phospholipides : 13,8% Dont : Phosphatidyl-éthanolamine : 5,1 Phosphatidyl-choline : 5,4 % HUILE 2 Lipides neutres : 49 Sphingolipides : 9 % MGDG : 12 % DGDG : 30 % L'huile est mise en émulsion dans un mélange eau et d'éthanol par agitation mécanique, avec une composition massique de : 84 % d'eau, 10 % d'huile et 6 éthanol.
- Phase stationnaire silice non greffée, Nucleosil 100-5, 2 cartouches de 125x2 mm couplées précédées d'une précolonne remplie avec le même support (8x3mm) (Macherey-Nagel, Hoechst, Düren, Allemagne).
- Four à colonne, température de 30 C.
- Pompe à gradient quaternaire P1000XR, avec dégazeur à membrane sous pression partielle (Thermo Separation Products, San Jose,Californie, USA).
- Autoinjecteur Kontron autosampler 360 équipe d'un boucle d'injection de 5p1 (Kontron Instruments, Milan Italie). - Détecteur évaporatif à diffusion de la lumière Cunow DDL 11 (Eurosep, Cergy, France), température du tube évaporateur de 35 C et pression d'azote de 1 bar.
Après évaporation des solvants et dilution dans un mélange chloroforme /méthanol, 1/1 v/v, les extraits sont analysés avec le gradient suivant, à un débit de 0,4 ml/min. comme indiqué dans le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1 Temps Chloro- Chloroforme/ Chloroforme (min) forme Méthanol /Méthanol/Eau 60/40 60/34/6 0 100 0 _ 0 1 100 0 0 0 100 0 0 0 0 1 0 100 0 100 100 0 50 100 0 Exemples 2 Traitement de l'huile sur un contacteur en mode discontinu . 1) Extraction des lipides neutres de l'huile 1 . L'huile 1 est dispersée sous forme d'émulsion dans un mélange eau/éthanol avec les proportions eau/huile/éthanol 84/10/6.
50g de cette émulsion sont introduits dans le contacteur.
L'extraction est conduite avec un solvant constitué de dioxyde de carbone additionné 10 d'heptane, à une pression de 250 bar et une température de 60 C. Les séparateurs sont maintenus à une pression de 50 et une température de 50 C.
Le débit de solvant est de 2 kg/h. Après une durée d'extraction de deux heures, un extrait dans 'heptane est récupéré. Après évaporation du solvant, 2 g de lipides neutres sont récupérés. Le contacteur contient alors un système dispersé de lipides polaires contenant 2,9 g de lipides polaires avec la composition lipidique suivante - Sphingolipides : 14,5 ô dont 2 % de céramides et 12 5% de glycosphingolipides) - MGDG : 18,5 - DGDG : 45 - Phospholipides : 22 Cette suspension stable est parfaitement soutirable en l'état du contacteur. Des extractions successives peuvent être effectués directement sur cette émulsion de lipides polaires sans reprise de la charge. 2) Extraction des lipides neutres de l'huile 2 . L'huile 2 est dispersée sous forme d'émulsion dans un mélange eau/éthanol avec les proportions eau/huile/éthanol 84/10/6.
50g de cette émulsion sont introduits dans contacteur. L'extraction est conduite avec un solvant constitué de dioxyde de carbone additionné de 10% d'heptane à une pression de 250 bar et une température de 60 C.
Le débit de solvant est de 2 kg/h. Après une duree d'extraction de deux heures, un extrait dans l'heptane est récupéré. Après évaporation du solvant, 2,3 g de lipides neutres sont récupérés Le contacteur contient alors un système dispersé de lipides polaires dans un mélange eau/éthanol contenant 2,5 g de lipides polaires avec la composition suivante - Sphingolipides : 17,5 % dont 2,5 % de céramides et 15 % de glycosphingolipides - MGDG : 23,5 - DGDG : 5 9 $ Cette suspension stable est parfaitement soutirable en l'état du contacteur. Des extractions successives peuvent être effectués directement sur cette émulsion de lipides polaires sans reprise de la charge. 3) Obtention d'une coupe riche en sphinqolipides et MGDG.
Successivement à la manipulation décrite ci- dessus en (1), la dispersion déshuilée est soumise à une extraction conduite avec du dioxyde de carbone additionné de 5 % d'éthanol, à une pression 250 bar et une température de 60'C. Les séparateurs sont maintenus à une pression de 50 bar et une température de Le débit de solvant est de 2 kg/h. Après une durée d'extraction de trois heures, un extrait dans l'éthanol est récupéré. Après évaporation du solvant, 0,6 g de lipides polaires sont récupérés avec la composition suivante Sphingolipides (céramides) : 12 $ Monogalactosyldiglycerides : 88 % Le contacteur contient alors une suspension stable dans un mélange eau/éthanol contenant 2,2 g de lipides polaires avec la composition suivante Sphingolipides (glycosphingolipides) : 16 % DGDG : 57 % Phospholipides : 27% 4) Obtention d'une pe riche en glycolipides. La dispersion raffinat obtenue ci-dessus en (3) est soumise à une extraction conduite avec du dioxyde de carbone additionné de 12% d'éthanol, à une pression de 250 bar et une température de 60 C.
Pour réaliser cette étape d'acidification, ledit mélange est de préférence refroidi à une température inférieure à 15 C, et plus préférentiellement à une température de l'ordre de 10 C.
Un solvant organique est ensuite ajouté au milieu réactionnel afin d'extraire l'isomère (Z) recherché.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, on utilise de l'acétate d'éthyle ou d'autres solvants présentant des propriétés équivalentes de solvatation de l'isomère (Z).