INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
- Rf représente (i) un atome d'halogène, de préférence le fluor, (ii) un radical alkyle de préférence en C1 à C12 ou cycloalkyle de préférence en C3 à C12, mono-, poly- ou per-halogéné dont la chaîne halogénoalkyle est éventuellement interrompue par un ou plusieurs atome (s) d'oxygène ou de soufre, (iii) un radical aryle, de préférence en C6 à C12' substitué par au moins un radical alkyle halogéné tel que défini en (ii), (iv) un radical aryle, mono-, poly- ou per-halogéné de préférence en C6 à C12, ou (v) un radical choisi parmi RA-CF2-, RA-CF2-CF2-, RA-CF2-CF(CF3)-, CF3-C(RA)F- et (CF3)RA- avec RA représentant un atome d'hydrogène ou possédant l'une quelconque des significations données ci-dessous pour RB et Rc, - Y représente un groupement OH, SH, NH2, NHRB ou NRBRC, avec RB et Rc différents d'un atome d'hydrogène et représentant indépendamment l'un de l'autre un radical choisi parmi : (i) une chaîne alkyle, de préférence en C1 à C10, éventuellement interrompue par un ou plusieurs atome(s) d'oxygène ou de soufre ou fonction (s) carbonyle et éventuellement substituée par un ou plusieurs atomes d'halogène ou groupes carboxyle, (ii) une chaîne alcényle, de préférence en C2 à C10, éventuellement interrompue par un ou plusieurs atome (s) ou de soufre ou fonction(s) carbonyle et éventuellement substituée par un ou plusieurs atome(s) d'halogène ou groupe(s) carboxyle ; (iii) un groupe aryle, de préférence en C6 à C12, éventuellement substitué par un ou plusieurs atome (s) d'halogène ou groupe(s) alkyle ou alcényle ; (iv) un groupe arylalkyle, de préférence en C7 à C15, éventuellement substitué par un ou plusieurs atome(s) d'halogène ; (v) un groupe arylalcényle, de préférence en C8 à C15, éventuellement substitué par un ou plusieurs atome (s) d'halogène ;
- A symbolise un squelette de formule générale la ou Ib. dans lesquelles - R' et R" représentent indépendamment l'un de l'autre un radical hydrocarboné ayant de 1 à 20 atomes de carbone qui peut être un radical aliphatique acyclique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié ; un radical cycloaliphatique saturé, insaturé, aromatique, monocyclique ou polycyclique incorporant ou non un ou plusieurs hétéroatomes sous réserve que lorsque B représente un groupement SO2, n a pour valeur zéro, Rf représente un groupement CF3, Y représente un groupement NH2 alors R' et R" ne représentent pas simultanément un noyau phényle non substitué ; ledit radical cycloaliphatique étant le cas échéant porteur d'un radical aliphatique saturé ou insaturé, linéaire ou ramifié avec la chaîne alkyle pouvant être interrompue par un ou plusieurs atomes d'oxygène et/ou fonction carbonyle et le cas échéant substituée de préférence en fin de chaîne par un radical cyclique aromatique ou non ;lesdits radicaux pouvant le cas échéant être substitués par un ou plusieurs atomes d'halogène, de préférence le fluor et/ou un ou plusieurs radicaux alkyles en C1 à Ce de préférence en C1 à C4 ou encore les deux substituants R' et R" sont liés entre eux de manière à constituer un radical cycloaliphatique tel que défini ci-dessus, - X représente un groupement méthylène le cas échéant substitué, - n est un entier variant de zéro à 3, et
- Ar, et Ar2 symbolisent, indépendamment l'un de l'autre deux cycles aromatiques substitués ou non, condensés ou non et portant le cas échéant un ou plusieurs hétéroatomes, de préférence en Ce à C12 et pouvant former des systèmes ortho ou ortho et péri-condensés entre eux, - x et y repèrent respectivement les deux liaisons établies entre le squelette symbolisé par A et les groupements amino et Y et ses dérivés.
Au sens de la présente invention, on entend couvrir sous le terme dérivés notamment les sels organiques ou minéraux des composés de formule 1 de même que leurs mélanges racémiques et leurs isomères optiquement actifs.
De manière inattendue et en contradiction avec les résultats publiés avec le dérivé trifluorométhanesulfonyle de la formule A, évoqués précédemment, les inventeurs ont mis en évidence que la présence d'un groupement fortement électroattracteur au niveau de la ou de l'une des fonctions amines permettait d'améliorer significativement les réductions asymétriques de cétones lorsqu'elles sont catalysées par les complexes métalliques correspondants.
La cinétique de la réaction est significativement augmentée et l'énantiomère attendu est récupéré avec un taux de conversion supérieur pour un rendement énantiomérique équivalent.
C'est ainsi que le groupement électroattracteur s'avère tout particulièrement efficace lorsqu'il comprend dans sa structure au moins un atome d'halogène et plus préférentiellement un atome de fluor.
Selon l'invention, le groupement électroattracteur figurant sur l'atome d'azote de la fonction amine de la formule générale I, est représenté par un groupement BRf dans lequel Rf représente (i) un atome d'halogène, de préférence le fluor, (ii) un radical alkyle en C1 à C10 ou cycloalkyle en C3 à C10 mono-, poly- ou per-halogéné, (iii) un radical phényle substitué par au moins un radical alkyle en C1 à C4 mono-, poly- ou per- halogéné, ou
(iv) un radical aryle mono-, poly- ou perhalogéné en C6.
Plus préférentiellement, Rf représente un radical CF3, C4F9 ou un radical phényle substitué par un ou plusieurs atomes d'halogène de préférence de fluor, ou par un ou plusieurs groupements alkyle en C1-C2 mono-, poly- ou per- fluoré.
Les composés dans lesquels B représente SO2 sont particulièrement intéressants.
Comme exemple préféré de groupements Y, on peut plus particulièrement citer les radicaux NH2 et NHRB, avec RB tel que défini précédemment.
Dans les formules générales précédentes et qui suivent, le ou les atomes d'halogène mentionnés à titre de substituant sont de préférence représentés par un atome de fluor.
Selon une première variante de l'invention, les composés de formule générale # répondent à la formule générale l'b dans laquelle : Rf, (x), (y) et Y sont tels que définis précédemment et Ar1 et Ar2 figurent ensemble un groupement aromatique.
Dans l'exposé qui suit de la présente invention, on entend par aromatique la notion classique d'aromaticité telle que définie dans la littérature, notamment par J. March Advanced Organic Chemistry , 4ème ed., John Wiley & Sons, 1992, pp 40 et suivantes. Dans le cadre de la présente invention, le dérivé aromatique peut être monocyclique ou polycyclique.
En utilisant les données publiées par Tercero et al. (J Biol Chem.
1996; 271,1579-90), les clones contenant la totalité de la voie de biosynthèse ont été identifiés, après hybridation avec des sondes appropriées. Certains cosmides intégratifs et replicatifs présentent après digestion Clal-EcoRV un fragment de 12360 paires de bases, ce qui laisse supposer un insert contenant la totalité de la voie de biosynthèse de la puromycine.
4) - Vérification de la production de puromycine par les clones résistants (Rhône-Poulenc). a) Matériels et Méthodes
Souches et conditions de culture : Trois clones résistants ont été sélectionnés pour vérifier la production de puromycine. Ils correspondent aux recombinants de S. lividans contenant un insert dans le vecteur intégratif pOS7001 (G 20) ou un insert dans le vecteur réplicatif (G21 et G22).
Des souches de référence ont été utilisées pour s'assurer que les milieux de culture utilisés permettaient cette production. Il s'agit de la souche sauvage S. alboniger ATCC 12461, productrice de puromycine et de la souche recombinante S. lividans contenant le cluster complet de la puromycine cloné dans le plasmide pRCP11(Lacalle et al, 1992, the EMBO journal, 11, 785-792) (G23).
Les souches sont ensemencés dans un milieu de culture dont la composition est la suivante : Peptone bactériologique Organotechnie 5 g/l de milieu final Extrait de levure Springer 5 Extrait de viande Liebig 5 Glucose Prolabo 15 CaC03 (1) Prolabo 3 NaCI Prolabo 5 Agar (2) Difco 1 (1) Les 3g de carbonate sont mélangés à 200ml d'eau distillée puis stérilisés à part. L'addition se faisant après stérilisation.
(2) L'agar est préalablement fondu dans 100ml d'eau distillée avant d'être ajouté aux autres ingrédients du milieu pH ajusté à 7,2 avant stérilisation stérilisation 25 minutes à 121 C
50 g/l d'hygromycine et 5 g/l de thiostrepton sont ajoutés au milieu après stérilisation de façon à maintenir une pression de sélection des clones contenant un insert grâce au gène marqueur présent sur le vecteur ( le gène de résistance au thiostrepton étant porté par le plasmide pRCP11).
50 ml de milieu de culture liquide, répartis en erlenmeyers de 250 ml, sont ensemencés avec 2 ml de suspension aqueuse de spores et de mycelium de chacune des souches. Les cultures sont incubées pendant 4 jours à 28 C avec une agitation de 220 trs/mn.50 ml de milieux de production, répartis en erlenmeyers de 250 ml, sont ensuite ensemencés avec 2 ml de ces pré-cultures. Le milieu de production utilisé est un milieu industriel optimisé pour la production de pristinamycine (milieu RPR 201). Les cultures sont incubées à 28 C, avec une agitation de 220trs/mn. Après différents temps d'incubation, un erlenmeyer de chaque culture est amené à pH 11 puis extrait par 2 fois 1 volume de dichlorométhane. La phase organique est concentrée à sec sous pression réduite, puis l'extrait est repris par 10 l de méthanol. 100 l de la solution méthanolique sont analysés en CLHP munie d'un détecteur à barrette de diodes dans un système gradient eau-acétonitrile 0,05% TFA VA/ sur colonne C18 pour la détection de la puromycine. b) Résultats Les analyses HPLC comparatives à partir des cultures des différentes souches montrent la production de puromycine dans la culture de la souche sauvage à partir de 24 h d'incubation. Une production, bien que plus faible, est aussi nettement détectée à partir de 48 h dans la culture du clone G20 contenant le cosmide pOS7001 (figure 23). La puromycine a également été détecté à l'état de trace dans le clone G23 contenant l'opéron complet codant pour le composé dans le plasmide pRCP11. Néanmoins, aucune production n'a été observée dans les cultures des
clones G21 et G22 contenant le cosmide pOS700R. Les résultats sont reportés sur la Figure 23. c) Conclusions Les résultats obtenus permettent de démontrer l'efficacité du système de clonage développé dans le cosmide pOS7001 pour exprimer chez un hôte hétérologue tel que S. lividans une voie de biosynthèse complète sous le contrôle de séquences régulatrices qui lui sont propres. D'autre part, ces données valident également le criblage des banques obtenues sur la base de la résistance des clones à la puromycine puisqu'il a conduit à identifier parmi un petit nombre de clones, un recombinant capable d'exprimer la voie de biosynthèse associée au gène de résistance. L'absence de production de puromycine chez les autres clones peut probablement s"expliquer par le clonage d'une partie seulement de l'opéron contenant le gène de résistance mais dépourvue de certaines séquences de régulation, transduction ou transcription nécessaires à la synthèse du composé.
EXEMPLE 10 : - CLONAGE D'ADN DU SOLDANS DES VECTEURS 1) - Préparation de l'ADN du sol à cloner Les différents fragments d'ADN doivent être purifiées selon leur destination : Cosmides La taille des molécules doit être comprise entre 30 et 40kb. Or , l'ADN extrait du sol est hétérogène en taille et comprend des molécules atteignant 200 ou 300kb. Afin d'homogénéiser les tailles, l'ADN est cassé mécaniquement par passage de la solution à travers une aiguille de 0,4mm de diamètre. Les fragments d'une taille voisine de 30kb ne sont pas affectés par ces passages répétés à travers une aiguille et il n'est
donc pas nécessaire de faire une séparation par la taille surtout que l'empaquetage dans les particules élimine automatiquement les inserts courts.
BACs Préparation de l'ADN L'ADN du sol est séparé par electrophorèse en champ pulsé (type CHEF) dans des conditions telles que les fragments compris entre 100 et 300kb sont concentrés dans une bande d'environ 5mm. Ceci est obtenu en réalisant la migration dans un gel à 0,7% d'agarose normal ou 1% d'agarose à bas point de fusion avec un temps de pulsation de 100 secondes pendant 20 heures et à une température de 10 C.
Récupération de l'ADN Deux méthodes sont utilisées, leur choix dépend de la taille des molécules que l'on veut isoler, soit jusqu'à 150kb soit au dessus.
- Jusqu'à 150kb La porosité d'un gel à 0,7% d'agarose permet la sortie de l'ADN par électroélution à condition d'absence totale de bromure d'ethidium. Cet ADN est ensuite manipulé avec des instruments de pipetage à orifice agrandi et hydrophobe pour éviter la fragmentation mécanique des molécules.
- Entre 100 et 300kb La bande contenant les fragments d'une taille entre 100 et 300kb est découpée. Pour la migration un gel d'agarose à 1% et à bas point de fusion est utilisé. Cette propriété permet de fondre le gel à une température supportable pour l'ADN de 65 C et de le digérer ensuite par l'agarase (Agarase commercialisée par la société Boehringer) à une température de 45 C suivant les prescriptions du fournisseur.
Cette voie de synthèse A est particulièrement efficace lorsque R5 est un groupement de type alkyle.
Le SCHEMA 2 représente la voie de synthèse B.
Lorsque l'amine de départ est secondaire on utilise la variante B1 et lorsqu'elle est primaire, la variante B2.
SCHEMA 2 Voie B1 Voie B2 Par la voie B1,l'aminotriazole (I) est préparé par condensation d'une phénylhydrazine (III) avec une N-acyl-S-méthylisothiourée (VI). Lorsque la phénylhydrazine (III) est salifiée par exemple sous forme chlorhydrate, la réaction peut être conduite par chauffage de préférence dans le toluène ou le xylène en présence d'une base comme la triéthylamine. Lorsque la phénylhydrazine (ni) est sous forme base, on utilise de préférence comme solvant le toluène, le xylène ou le diméthylsulfoxyde.
La N-acyl-S-méthyl-isothiourée (VI) est obtenue à partir de la N-acyl-thiourée (VU) par S-méthylation par le iodométhane dans un solvant comme le dichlorométhane ou le tétrahydrofurane après action d'une base de préférence l'hydrure de sodium.
La N-acyl-thiourée (VII) est obtenue par addition de l'amine secondaire (V) sur l'isothiocyanate d'acyle R4CONCS. Les conditions opératoires, température et solvant, sont variables selon la réactivité des amines. Les solvants utilisés peuvent être l'acétone, le dichlorométhane, le benzène, le toluène...
L'isothiocyanate d'acyle R4CONCS est préparé préalablement par réaction entre un halogènure d'acyle R4COCI et un thiocyanate alcalin (thiocyanate d'ammonium par exemple) dans l'acétone en général.
Par la voie B2, l'aminotriazole (I) est préparé à partir d'un aminotriazole NH (VIII), par une réaction d'alkylation avec un composé de formule R5X (X représentant l'halogène).
Les conditions opératoires varient selon la réactivité de l'amine secondaire et de l'halogénure. Les systèmes utilisés peuvent être : hydrure de sodium/DMF, hydrure de potassium/benzène/éther couronne, ter-butylate alcalin/DMSO ...
Les conditions de synthèse pour la préparation de l'aminotriazole NH (VIII) à partir de l'amine primaire (XI) par les intermédiaires N-alcylthiourée (X) puis N-acyl-S-méthylisothiourée (IX) sont semblables à celles décrites pour la voie B1.
Les composés de formule (I) sont salifiés en général sous forme de chlorhydrate cristallisé ou concrété dans un solvant (ou un mélange de solvant) comme le pentane, l'éther diisopropylique, l'éther diéthylique.
Les amines primaires et secondaires utilisées, lorsqu'elles présentent un carbone asymétrique (R6 = CH(R8)R7) peuvent être sous forme racémique ou énantiomère.
Les composés de formule (I), ci-dessus comprennent également ceux dans lesquels un ou plusieurs atomes d'hydrogène ou de carbone ont été remplacés par leur isotope radioactif par exemple le tritium ou le carbone-14. De tels composés marqués sont utiles dans les travaux de recherche, de métabolisme ou de pharmacocinétique, ou encore dans des essais biochimiques en tant que ligands de récepteur.
Les composés de la présente invention ont fait l'objet d'études biochimiques et pharmacologiques. Ils possèdent des propriétés pharmacologiques fort intéressantes.
Les composés de l'invention déplacent, à des concentrations inférieures à 10 M, la liaison du CRF ou de peptides apparentés iodés (urotensine, sauvagine) par exemple 125I-Tyr CRF, aux récepteurs présents sur membranes de cerveau ou sur des cellules en culture, selon la méthode décrite par E. B. De Souza (J. Neurosci., 1987,7, 1 , 88- 100).
Le CRF est un neuropeptide qui contrôle l'activité de l'axe hypothalamo-hypophysosurrénalien. Ce facteur est responsable des réponses endocrines et comportementales liées au stress.
Dans un ballon de 25 ml, muni d'un barreau aimanté avec agitation par un agitateur magnétique, on charge :
- 10 mmoles d' acétophénone - 0.05 mmole de [RuCI2(p-cymène)]2 - 0.1 mmole de ligand - 2 ml d'acide formique - 3 ml de triéthylamine.
On dose le produit formé à savoir le (1 S)-1-phényléthanol par chromatographie en phase gazeuse.
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 1 ci-après : Ce tableau rend également compte de la réduction de l'acétophénone en présence d'un ligand non conforme à la présente invention, le (1S,2S)-N-tosyl-1,2-cyclohexanediamine.
Tableau 1 Exemple ligand durée Rendement e.e.
H .NHSOzCFg 5 jY | .NHSOzCFa 72 h 85 % 91 % NH2 Ph H Ph H NHSOZCF3 45 h 99 % 93 % Ph H NH 2 Témoin H NHS02--( J CH3 38 h 1 % H NH2 On note que seuls les ligands portant des atomes de fluor sur le carbone en a du groupement sulfonyle sont efficaces.
EXEMPLES 7 ET 8 Réduction de l'acétophénone.
On utilise le même milieu réducteur que l'exemple 5 dont on reproduit le mode opératoire en modifiant la température.
Les résultats sont consignés dans le tableau suivant :
Exemple Température Durée Rendement e.e.
7 5 C 15 jours 27% 92 % 8 50 C 5 h 99% 88%
Il s'avère possible d'augmenter la vitesse de réaction par chauffage du milieu réactionnel sans porter préjudice au rendement énantiomérique.
segments 51 d'évaluation formés sur la surface 50 d'éva-
luation peuvent avoir une forme d'arrangement dans les directions de séparation qui sont l'axe X et l'axe Y, comme dans le mode de réalisation précité (voir figure 7), ou ils peuvent aussi être constitués par les segments d'évaluation 51 en forme de secteur correspondant à la structure de la
surface réfléchissante 10a.
Le procédé précité de détermination de surface réflé-
chissante peut aussi s'appliquer à diverses formes de segments, autres que celles qu'on a indiquées. Le procédé précité peut aussi s'appliquer non seulement aux types de lampes indiqués mais aussi à des réflecteurs convenant non seulement à des lampes constituant des feux de position,
mais aussi à divers types de lampes pour véhicules.
Le procédé de détermination de surface réfléchissante du réflecteur de lampe pour véhicule selon l'invention, décrit en détail précédemment, peut être utilisé comme procédé de détermination de la surface réfléchissante d'un
réflecteur ayant un défaut réduit d'uniformité de la distri-
bution optique sur toute sa surface pendant les périodes de fonctionnement de la lampe. Plus précisément, l'évaluation de la forme de la surface utilisée pour la détermination (ou la conception) de la forme de la surface réfléchissante n'est pas réalisée après la détermination de la forme de la surface réfléchissante, mais la forme de la surface est sélectionnée par exécution des deux étapes d'évaluation par des procédés différents dans les deux étapes, c'est-à-dire que l'évaluation en fonction des conditions fonctionnelles,
telles que les angles d'incidence de la lumière ou ana-
logues, est utilisée dans l'étape de détermination de la surface formée librement qui est la forme fondamentale, et
l'évaluation des régions de réflexion de lumière est réali-
sée dans l'étape de création de la surface réfléchissante
avec affectation de plusieurs éléments de surface réfléchis-
sante. Cette disposition réduit le défaut d'uniformité de la distribution de lumière à la surface pendant les périodes de fonctionnement de la lampe du véhicule ayant le réflecteur réalisé avec la forme résultante de surface réfléchissante. Cette disposition simplifie aussi les étapes de conception donnant la forme de la surface réfléchissante, si bien que
le rendement de conception est accru.
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6. E-ssa-1-de-surc-h-arge.en.cont-i-pu Ensuite, en activant l'alimentation en courant continu 51 connectee aux divers chargeurs 50, on a effectué l'essai de surcharge suivant.
façon détaillée, les batteries ont été chacune soumises, de manière continue, à une charge sous courant constant d'une intensité de 500 mA (1 C) pendant 4 h (la quantité d'électricité chargée correspondant à 400 % de la capacite de la batterie). Pendant la charge, on a mesuré la tension de chacune des batteries à des intervalles de temps prédéterminés (une certaine capacité de charge). On a représenté graphiquement ces mesures en portant la capacité de charge en abscisse et la tension de la batterie (V) en ordonnée. Les résultats sont présentés sur figures 5 à 7. On a mesuré la variation d'épaisseur, avant et après l'essai de surcharge, de chacune des batteries d'accumulation au lithium A, B, X Y. Après l'essai de surcharge, on a également soumis chacune des batteries d'accumulation au lithium A, B, X et Y à un essai de décharge. Les résultats sont présentés dans tableau 1 ci-dessous.