INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Dans la station serveur, le processus débute à l'étape 600 par la réception de la requête de modification de configuration par le gestionnaire de configuration 42 du dispositif-serveur 40. A l'étape suivante (602), la donnée d'identification de l'imprimante ("I") est extraite de la requête. Puis, le profil de configuration contenant la configuration modifiée est extrait de la requête (étape 604). II s'agira, par exemple, d'un objet informatique du type de l'objet informatique XML "config2" mentionné supra.
A l'étape 606, le profil de configuration reçu est stocké dans son lieu de stockage dans une base de données de profils (non représentée) associée à
la station serveur. Le profil de configuration est stocké en "écrasant" les données relatives à ce profil stockées précédemment au même emplacement mémoire. Ainsi, dans le cadre de l'exemple de profil "config2", cet emplacement mémoire est défini par l'adresse URL (uniform resource locator) suivante " http://oceania/object/printer1/config2.xml " qui est définie dans un champ particulier (href) de l'objet XML constituant le profil. Dans cet exemple, le profil de configuration "config2" sera stocké dans un fichier "config2.xml" contenu dans une ressource mémoire (par exemple un disque dur) du serveur d'impression connu par le réseau sous le nom "oceania".
Ainsi, au travers des étapes 604 et 606, le gestionnaire de configuration 42 a mis à jour la configuration courante de l'imprimante dans le cadre du profil de configuration applicable, en réponse à la requête ( étape 600) reçue de la station cliente.
A l'étape suivante (608), la configuration mise à jour, contenue dans le profil de configuration stocké précédemment (étape 606), est utilisé pour configurer le pilote d'impression stocké dans le serveur.
L'étape suivante, 610, est une étape d'attente, au cours de laquelle le gestionnaire d'impression 48 attend de recevoir, de la station cliente, les ordres graphiques relatifs au document à imprimer (fig. 4, étape 436).
Stade 5: 2,3,5,6-tétrahydro-IH cyclobutafJindole-6-carbonitrile 3,43 g du produit obtenu au stade 4 sont solubilisés dans 55 ml d'acide acétique. Dans le milieu réactionnel refroidi à 13 C, sont ajoutés, par portions, en 5 minutes, 3,84 g de cyanoborohydrure de sodium. Après retour à température ambiante, l'agitation est maintenue pendant 2 heures, puis le milieu réactionnel est refroidi à 0 C et amené à pH = 11 par addition d'une solution de soude (45 g dans 250 ml d'eau). La solution laiteuse obtenue est extraite à l'éther. Les phases organiques sont lavées, séchées et concentrées pour conduire au produit attendu.
Point de fusion : 85-87 C (M. K.) PREPARATION 2 : 2,3,6,7-Tétrahydro-lH-cyclobuta [el indole-7-carbonitrile Stade 1 : 6,7 Dilrydro-3H cyclobutaeJindole-7 carbonitrile Le produit est obtenu selon le procédé du stade 4 de la préparation 1 en utilisant comme substrat le régioisomère obtenu au stade 3 de la préparation 1. Stade 2 : 2,3,6,7 Tétrahydro-IH-cyclobutafejindole-7 carbonitrile Le produit est obtenu, à partir du composé obtenu au stade 1, selon le procédé du stade 5 de la préparation 1.
PREPARATION 3 : 2,3,5,6-Tétrahydro-1H-cyclobuta[f]indole Stade 1 : 4-(2,2 Diméthoxyéthyl)aminoJbenzocyclobutane Une solution de 1 g du produit obtenu au stade 1 de la préparation 1, dans 20 ml de tétrahydrofurane et 0,22 ml d'éthanol anhydre est ajoutée, à -70 C, à 40 ml d'ammoniac liquide. 322 mg de sodium sont alors ajoutés par portions, et l'agitation est maintenue à -70 C pendant 20 minutes. La réaction est stoppée par addition de 1,72 g de NH4CI, et on
laisse tout l'ammoniac s'évaporer. Le milieu réactionnel est repris par une solution saturée en NH4CI puis extrait à l'éther. La phase organique est ensuite séchée puis concentrée pour conduire au produit attendu.
Stade 2 : 2,3,5,6-Tétrahydro-1H-cyclobuta[f]indole Le produit est obtenu selon le procédé de la préparation 1, des stades 2 à 5.
Point de fusion : 68-70 C PREPARATION 4 : 2,3,5,6-Tétrahydro-1H eyclobuta[f]indol-6-ylméthanol Stade 1: 5-Amino-1-benzocyclobutanecarboxylate de méthyle 9,74 g de 5-nitro-l-benzocyclobutanecarboxylate de méthyle sont mis à hydrogéner, à température ambiante et pression atmosphérique, en présence de Pd/C à 10 % pendant 6 h 30. Après filtration et concentration sous pression réduite, le produit attendu est isolé.
Stade 2 : S ;((2,2 piméthoxyéthyl)aminoj-1-benzocyclobutanecarboxylate de méthyle Le produit est obtenu, à partir du composé du stade précédent, selon le procédé du stade 1 de la préparation 1.
Stade 3 : 5-fl (2,2-iméthoxyéthyl)-N (méthylsulfonyl)aminoJ 1-benzocyclo- butanecarboxylate de méthyle Le produit est obtenu, à partir du composé du stade précédent, selon le procédé du stade 2 de la préparation 1.
Stade 4 : l-(Méthylsulfonyl)-5,6-dihydro-lH-cyclobuta[f]indole-6-carboxylate de méthyle Le produit est obtenu, à partir du composé du stade précédent, selon le procédé du stade 3 de la préparation 1.
Stade 5 : fl-(Méthylsuyonyt)-5,6-dihydro-IH-cyclobutafflindol-6-yllmétilanoi Sur une suspension de 0,42 g d'hydrure de lithium et aluminium dans 7 ml de tétrahydrofurane, maintenue à 0 C, est ajoutée, goutte à goutte, une solution de 1,6 g du produit obtenu au stade 4 dans 20 ml de tétrahydrofurane. Après 20 minutes, le milieu réactionnel est hydrolysé par 0,3 ml d'eau, 0,23 ml de soude à 20 %, puis 1,05 ml d'eau. Après filtration des sels, le filtrat est concentré sous pression réduite pour conduire au produit attendu.
Stade 6 : 5,6 Dihydro-II cyclobutafJindol 6 ylmethanol Le produit est obtenu, à partir du composé du stade précédent, selon le procédé du stade 4 de la préparation 1. Stade 7: 2,3,5,6-Tétrahydro-1F cyclobutafjindol-6 ylméthanol Le produit est obtenu, à partir du composé du stade précédent, selon le procédé du stade 5 de la préparation 1. Le composé est isolé après une chromatographie sur gel de silice (dichlorométhane/éthanol : 97/3).
PREPARATION 5 : 2,3,6,7-Tétrahydro-lfT-cyclobuta[]indol-7-ylméthanol Stade 1 : 6-Acétyl-1-benzocyclobutanecarbonitrile Une solution composée de 55,94 g de 6-trifluoroacétyl-l-benzocyclobutanecarbonitrile dans 600 ml de pyridine est dégazée à l'azote pendant 15 minutes ; 30,5 ml de
triéthylamine, 117,44 ml de butylvinyléther, 2,25 g de 1,3-bis-(diphénylphosphino)propane et 1,02 g d'acétate de palladium sont ajoutés et le milieu réactionnel est porté au reflux pendant 2 heures. 400 ml d'acide chlorhydrique IN sont ensuite introduits goutte à goutte en 1 heure, et après 3 heures d'agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est extrait à l'éther. Les phases organiques sont lavées, séchées et concentrées pour conduire à un résidu qui est purifié par chromatographie sur gel de silice (dichlorométhane : 100 %) permettant d'isoler le produit attendu.
Point de fusion : 55-59 C Stade 2 : 6-Hydroxyiminoéthyl-l-benzocyclobutanecarbonitrile 10,07 g du produit du stade 1 et 6,13 g de chlorhydrate d'hydroxylamine dans 200 ml de pyridine sont agités à température ambiante pendant 19 heures. Après évaporation de la pyridine, l'huile jaune obtenue est reprise par du dichlorométhane et de l'eau. La phase organique est séparée, séchée et concentrée permettant d'isoler le produit attendu.
Point de fusion : 108-110 C Stade 3 : N-(1-Cyanobenzocyclobutan-6-yl)acétamide A une solution de 8,9 g du produit obtenu au stade 2 dans 160 ml d'éther, refroidie à 0 C, sont ajoutés en quatre fois 9,96 g de PC15. Après 2 heures d'agitation à 0 C, le milieu réactionnel est ramené à température ambiante pendant 12 heures, puis versé sur un mélange eau/glace et agité pendant 20 minutes. Après décantation et extraction à l'éther, les phases organiques réunies sont séchées puis concentrées sous pression réduite pour conduire au produit attendu.
Point de fusion : Stade 4 : 6-Amino-1-benzocyclobutanecarboxylate d'éthyle Un courant d'HCl gazeux est introduit jusqu'à saturation d'une solution de 5,04 g du produit obtenu au stade 3 dans 400 ml d'éthanol anhydre à 0 C. Le milieu réactionnel est ensuite porté à reflux pendant 18 heures. Après concentration du solvant, le résidu est
La figure 2 illustre l'élément El affiché dans la zone Z1 après avoir été chargé.
L'affichage de cet élément Elest effectuée dans la zone Z1afin de pouvoir recouvrir par la suite l'affichage de certains éléments de la page interactive (et plus précisément l'élément E2) quand ceux-ci seront chargés.
L'approche adoptée, qui va maintenant être décrite plus en détail en référence à la figure 3, est la suivante : dès la fin du chargement des éléments E2 et E5 initialement nécessaires à l'exécution de la page interactive P, tout ou partie de la zone Zl dans laquelle doit être affiché l'élément Elsert de zone sensible , de manière à ce que, quand le pointeur d'une souris (ou tout autre périphérique d'entrée de la machine constituant un dispositif de pointage) entre dans cette zone Z1 (et sans qu'un clic de souris ne soit nécessaire), l'affichage de l'élément Elest automatiquement remplacé par celui de l'élément E2.
suite, il ne souhaite plus voir l'élément Elaffiché. Ce moyen peut par exemple être un sous-élément d'interactivité dans E2 ou El.
Ainsi, une forme de réalisation du procédé de mutagenèse selon l'invention comprend les étapes suivantes a) on prépare une matrice constituée d'un plasmide contenant le gène cible et un gène de résistance, b) on prépare une série équimoléculaire d'oligonucléotides présentant une séquence complémentaire d'une région différente du gène cible et au moins une mutation placée au centre de la séquence de l'oligonucléotide, l'ensemble des oligonucléotides de la série couvrant tout ou partie de la séquence dudit gène cible, c) on mélange la série d'oligonucléotides préparer à l'étape (b) avec le plasmide de l'étape (a) selon un rapport molaire de chaque olignonucléotide par rapport au plasmide compris entre 0,01 et 100 et de préférence entre 0,1 et 10, d) on dénature le mélange de l'étape (c) par la température de façon à obtenir une matrice simple brin, e) on le mélange de l'étape (d) à une température permettant l'hybridation des oligonucléotides sur la matrice, f) on ajoute au mélange au moins une polymérase, son tampon et ses cofacteurs, et une quantité suffisante de chacun des nucléotides triphosphates, pour permettre la réplication des brins de la matrice à partir de n'importe lequel des oligonucléotides, g) éventuellement on répète les étapes (d), (e) et (f),
h) on sélectionne par tout moyen approprié les produits de l'étape (f) ou (g) ayant subi la réplication, i) on transforme les produits sélectionnés à l'étape (h) dans des bactéries compétentes, et l'on sélectionne les produits portant un plasmide sur un milieu sélectif correspondant à un gène de résistance porté par le plasmide de l'étape (a).
Avantageusement, l'étape (h) ci-dessus consiste à soumettre les produits de l'étape (f) à l'action d'une enzyme de restriction sélectionnant les produits ayant subi la réplication, comme l'enzyme DpnI.
Les oligonucléotides peuvent être phosphorylés à leur extrémité 5' lorsqu'à l'étape (f) on ajoute une ligase, avantageusement une ligase thermostable.
Le procédé de mutagenèse selon l'invention est particulièrement utile pour mesurer l'activité biologique des protéines mutées codées par les gènes cibles mutés. En conséquence, le gène cible est une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine d'intérêt avec ou sans ses propres séquences de régulation. Si le gène cible ne comprend pas les séquences de régulation, comme un promoteur, celles-ci sont présentes au niveau du plasmide.
L'invention concerne donc aussi un procédé de mutagenèse d'une protéine cible, caractérisé en ce qu'il comprend la préparation d'une banque d'expression de gènes mutés à partir d'un gène cible codant pour ladite protéine selon le procédé de mutagenèse décrit précédemment, puis l'expression desdits gènes mutés pour produire une banque de protéines mutées, et éventuellement le criblage desdites protéines mutées pour une fonction désirée, avantageusement par rapport à la protéine cible.
L'invention permet donc la réalisation d'un procédé de sélection de protéines mutées présentant une
activité modifiée par rapport à la même protéine non mutée, ou du gène muté correspondant à ladite protéine mutée, comprenant un procédé de mutagenèse ci-dessus, puis après le criblage desdites protéines mutées pour une fonction désirée, avantageusement par rapport à la protéine cible, la sélection de la protéine mutée présentant la fonction désirée, et éventuellement le séquençage du gène muté correspondant à ladite protéine mutée.
Ces procédés de mutagenèse d'une protéine cible ou de sélection d'une protéine mutée ou du gène correspondant selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils comprennent la préparation d'une banque d'expression de gènes mutés à partir d'un gène cible codant pour ladite protéine, puis les étapes suivantes j) on incube le milieu sélectif à la température adéquate pendant le temps suffisant à la pousse de colonies bactériennes individuelles, k) on ensemence des cultures de bactéries individuelles à partir des colonies de l'étape (j), 1) on effectue des préparations d'ADN plasmidique des cultures de l'étape (k), m) on mesure l'activité biologique associée à chaque préparation d'ADN plasmidique de l'étape (1) et on compare le résultat obtenu par rapport à celui mesuré en utilisant l'ADN plasmidique non muté.
n) éventuellement, on séquence les préparations d'ADN plasmidique ayant permis d'observer des modifications significatives de l'activité biologique. L'invention a également pour objet une série d'oligonucléotides mutés par rapport à un gène cible comme défini précédemment.
L'invention a encore pour objet une banque de gènes mutés susceptibles d'être obtenue par un procédé décrit précédemment caractérisée en ce que chaque mutation différente est présente en moyenne dans moins de 1/5 des
gènes de la banque et de préférence en moyenne dans environ 1/N des gènes de la banque, avec N supérieur à 5, de préférence avec N compris entre environ 5 et 106 et tout préférentiellement avec N compris entre 50 et 500. De préférence, cette banque est obtenue, conformément au procédé de l'invention, grâce à la mise en oeuvre de N oligonucléotides avec N supérieur à 5, de préférence avec N compris entre environ 5 et 106 et tout préférentiellement avec N compris entre 50 et 500. D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront des exemples qui suivent donnés à titre non limitatif et des dessins en annexe dans lesquels La figure 1 représente une répartition des oligonucléotides mutants sur la séquence de la molécule CD4. Chacun des oligonucléotides contient trois mutations au maximum, représentées ici par la brisure de la ligne de la flèche, localisées en son centre, destinées à changer le codon visé en Alanine. Les oligonucléotides se chevauchent les uns les autres, et sont représentés ici sur trois niveaux par mesure de clarté. Dans l'exemple de la figure 1, 24 oligonucléotides mutants seulement sont représentés. Dans l'exemple 1 ci-après, 95 oligonucléotides ont été utilisés simultanément. Dans cet exemple, les oligonucléotides portant les mutations sont tous de même orientation.
La figure 2 est un résumé schématique des étapes du procédé de mutagenèse selon l'invention à partir des oligonucléotides mutants de la figure 1. Les mutations dans les molécules d'ADN sont représentées par une barre verticale. Les lettres signifient - (a) polymérisation (polymérase, dNTP, Tampon et cofacteurs) ; - (b) digestion par DpnI pour éliminer les matrices initiales ; - (c) transformation de bactéries compétentes puis étalement sur milieu sélectif ;
- (d) ensemencement de cultures bactériennes à partir des colonies isolées puis préparation d'ADN plasmidique.
- (e) test phénotypique puis sélection et séquençage des mutants ayant le phénotype recherché.
La figure 3 représente un exemple de construction d'oligonucléotides mutants à partir de demi- oligonucléotides comprenant une ligation par la T4 ligase.
La figure 4 donne des exemples de représentation schématique des oligonucléotides contenant des bases dégénérées au niveau des points de mutation. La lettre N signifie que n'importe laquelle des 4 bases peut être présente à ce endroit. Ainsi l'oligonucléotide concerné est en réalité constitué d'un mélange de 4N espèces moléculaires. Exemple 1 : Alanine Scannina.
Un gène codant pour la molécule CD4 a été introduit dans le vecteur SK+. Les 95 premiers codons de ce gène ont été la cible d'une réaction de mutagenèse massive selon la technique de l'invention.
Pour ce faire, une série de 95 oligonucléotides de 21 bases ont été synthétisés. Chacun de ces oligonucléotides était complémentaire d'une séquence du gène CD4 centrée sur un codon. Ainsi, le premier oligonucléotide était homologue d'une séquence centrée sur le codon 1. I1 était parfaitement homologue à 9 bases de chaque côté dudit codon, et contenait 3 mutations, destinées à transformer le premier codon en codon Alanine (Figure 1).
De même, le second oligonucléotide était centré sur le second codon et contenait trois mutations adjacentes en son milieu. Les 95 oligonucléotides, chevauchants entre eux et tous de même orientation, étaient ensuite mélangés de façon équimolaire et phosphorylés en utilisant le kinase de T4 dans des conditions standards d'utilisation.
La réaction suivante a ensuite été réalisée
Matrice SK-CD4 (250 ug/ p1) : 1 Pl
MIX des 95 oligonucléotides 5'P (0,5 uM chacun) 2 u1 dNTP Triphosphates (2,5 mM) 10 u1 Tampon 10X de Pfu Polymérase 2,5 u1 ATP 10 mM 0,5 u1 Pfu Polymérase (2,5 U / u1) 1 u1 Pfu Ligase (4 U / u1) 1 u1 H20 7 u1 Total 25 u1 Lé mélange a été soumis à une réaction de 12 cycles de température [(94 C, 1') ;(35 C, 1') , (68 C, 20')].
Le mélange réactionnel a ensuite été soumis à une digestion par 5 unités de l'enzyme DpnI dans des conditions de tampon adaptées, pendant 30' à 37 C.
Des bactéries compétentes ont été transformées par ce mélange en utilisant un protocole de choc thermique, et étalées sur une boite de pétri contenant l'agent sélectif.
Le lendemain, un millier de bactéries étaient obtenues. Un schéma résumant les étapes de la technique est proposé en figure 2.
A ce stade, un test statistique de quelques molécules d'ADN de la banque a été réalisé pour mesurer le taux d'intégration des mutations, c'est-à-dire le remplacement d'un des 95 codons par un codon Alanine. Cet examen révélait que la fréquence d'incorporation de chaque oligonucléotide était voisine de 1%, ce qui était dans ce cas la valeur recherchée (1/N avec N=95).
Les molécules mutantes ont ensuite été amplifiées par culture bactérienne et préparation d'ADN plasmidique. Chacun des lots d'ADN plasmidique, correspondant à un type unique de molécule mutante, a été utilisé pour transfecter des cellules eucaryotes, et celles- ci ont été testées pour le maintien ou la perte des épitopes
portés par la molécule CD4, cette activité étant mesurée par la liaison d'un anticorps anti-CD4.
Exemple 2 : Valine scanning en utilisant la reconstruction des oligonucléotides reconstruits à partir de demi oliaonucléotides.
Une série de 11 oligonucléotides ont été chacun reconstruits à partir de deux demi -oligonucléotides double brin. La ligation des deux demi-oligonucléotides a été effectuée par une réaction utilisant la T4 ligase. Seul un des deux demi -oligonucléotides étant phosphorylé au niveau d'une de ses extrémités S', cette réaction avait pour effet de permettre l'obtention d'un seul oligonucléotide complet, composé de 18 bases (8 de chaque côté parfaitement homologues, et deux en son milieu invariablement constituées des nucléotides GT (figure 3).
Ces mutations, destinées à remplacer les deux premiers nucléotides de n'importe quel codon, permettent de remplacer ce codon par un codon Valine. En effet, le code génétique étant dégénéré, les codons valine peuvent s'écrire sous la forme GTN, où N représente n'importe laquelle des quatre bases.
Rf = 0,35 (CH2C12/MeOH/AcOH/eau 90/10/1/1) RMN (DMSO) 1,84 (m) CH2 ; 1,96 (m) CH2 ; 2,52 (masqué) CH2 ; 2,95 (m) 3,15 (m) CH2 AB ; 3, 34 (si) 2 x CH2 ; 3, 72 (s) OCH3 ; 3, 94 (m) CH2 ; 4,48 (m) CH ; 6,82-7,16 AA'BB' ; 6,59 (m)-6,80 (masqué)-7,09 H aromatique ; 9,04-8,95-11,60 les NH.
SM 495+ - [M+H] + EXEMPLE 4b : N-[5-méthyl-lH-benzimidazol-2-yl]- O-[4-oxo-4- [(1,4,5,6-tétrahydro-2-pyrimidinyl)amino]butyl]-L-tyrosine N-[[(2-amino-4-méthylphényl)amino]thioxométhyl]-O-(4-éthoxy- 4-oxobutyl)-L-tyrosinate de (1,1-diméthyl éthyle) (4-3b) On mélange l'aminoester 4-2 (351 mg, 1 mmole) dans 20 ml de THF avec l'isothiocyanate de 4-méthyl-2-nitrophényle
(194 mg), agite une heure à température ambiante, évapore sous pression réduite, puis ajoute le SnCl2 (380 mg puis 190 mg, 3 mmoles) dans 10 ml de DMF et agite 2 heures à température ambiante. On évapore ensuite sous pression réduite et reprend avec le mélange eau/NaHC03/AcOEt, décante, sèche la phase organique puis évapore à sec sous pression réduite. On obtient 550 mg de produit brut.
IR (CHC13) NH complexe 3280 cm-1, C=O 1727 cm-1 ; Système conjugué + Aromatique 1632,1610, 1593,1571, 1513 cm-1.
O-(4-éthoxy-4-oxobutyl)-N-[5-méthyl-1H-benzimidazol-2-yl]-L- tyrosinate de (1,1-diméthyl éthyle) (4-4b) On ajoute 70 mg de HgCl2 à l'amino thiourée 4-3b (55 mg) dans 5 ml de DMF et 0,5 ml de TEA, agite 2 heures à température ambiante, évapore sous pression réduite et reprend avec le mélange eau/NaHC03/AcOEt, décante, sèche sur Na2SO4 la phase organique et évapore à sec sous pression réduite. On obtient 45 mg de produit 4-4b brut.
IR (CHC13) NH complexe 3280 cm-1, C=O 1727 cm-1 ; Système conjugué + hétérocycle + Aromatique 1671,1638, 1594,1513, 1491 cm-1. N-[5-méthyl-1H-benzimidazol-2-yl]-0-[4-oxo-4-[(1,4,5,6- tétrahydro-2-pyrimidinyl)amino]butyl]-L-tyrosinate de (1,1diméthyl éthyle) (4-5b) A une solution de l'ester 4-4b (45 mg) dans 5 ml de CH2C12 on ajoute 45 mg de 2-amino-1,4,5,6-tétrahydropyrimidine, agite 4 heures à température ambiante, évapore sous pression réduite puis purifie par chromatographie en éluant avec un mélange CH2C12/MeOH 90/10. On obtient 23 mg de 4-5b attendu.
IR (CHC13) NH complexe 3250 cm-1 ; C=0 1729,1713 cm-1 ; C=O C=N 1687, 1660, 1637 cm-1 ; Système conjugué + Aromatique 1611,1599, 1575, 1539, 1512 cm-1.
N-[5-méthyl-1H-benzimidazol-2-yl]- 0-[4-oxo-4-[(1,4,5,6tétrahydro-2-pyrimidinyl)amino]butyl]-L-tyrosine (4-6b) On ajoute 1 ml d'acide trifluoroacétique à 20 mg d'ester 4-5b dans 3 ml de dichlorométhane, agite 5 heures à tempéra-
ture ambiante puis ajoute du toluène. On évapore ensuite sous pression réduite, reprend avec du dichlorométhane et cristallise par addition d'un mélange de Et20/pentane. On obtient 15 mg de 4-6b.
Rf = 0,30 (CH2C12/MeOH/AcOH/eau 90/10/1/1) RMN (DMSO) 1,84 (m) CH2 ; 3, 34 (si) 2 x CH2 ; 1, 95 (qunint) CH2 ; 2, 52 (masqué) CH2 ; 3,93 (t) CH2;2,34 (s) Ph-CH3 ; 3,20 (dd) 2,98 (dd) Ph-CH2 ; 4,53 (m) CH ; 6,81-7,17 AA'BB' ; 7,09 (s) -6, 92 (m)-7,17 (masqué) H aromatique ; 9,11 (si) NH du cycle à 6 ; 11,72 2H NH.
SM 479+ = [M+H]
EXEMPLE 5 : O-[4-oxo-4-[(1,4,5,6-tétrahydro-2-pyrimidinyl) amino]butyl]-N-(1-(phénylméthyl)-1H-tétrazol-5-yl]-L-tyrosine
0-(4-éthoxy-4-oxobutyl)-N-[1-(phénylméthyl)-lH-tétrazol-5- yl]-L-tyrosinate de (1,1-diméthyl éthyle) (5-1).
Une solution d'aminoester 4-2 (325 mg, 0,92 mmole) et de 5-fluoro-l-(phénylméthyl)-lH-tétrazole (170 mg, 0,95 mmole) dans 15 ml de pyridine est chauffée à 100 C pendant 2 heures.
On évapore ensuite sous pression réduite jusqu'à obtention d'un extrait sec que l'on purifie par chromatographie en éluant avec le mélange heptane/AcOEt 50/50. On obtient 270 mg de produit 5-1 attendu.
IR (CHC13) NH 3394 cm-1 ; C=O 1728 cm-1 ; Hétérocycle + Aromatique 1603, 1512,1498 cm-1 O-[4-oxo-4-[(1,4,5,6-tétrahydro-2-pyrimidinyl)amino]butyl]-N- [1-(phénylméthyl)-lH-tétrazol-5-yl]-L-tyrosinate de (1,1- diméthyl éthyle) (5-2) On mélange l'ester 5-1 (150 mg) avec le 2-amino-1,4,5,6tétrahydropyrimidine (42 mg) dans 5 ml de CH2C12 et agite à température ambiante pendant 24 heures. On évapore ensuite sous pression réduite et purifie l'extrait sec obtenu par chromatographie en éluant avec le mélange CH2C12/MeOH/eau/AcOH 90/10/1/1. On obtient 40 mg de produit 5-2 attendu.