INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Selon une première variante de première réalisation, la validation @ de versement n'est transmise en réponse à un message d'invitation à sélectionner un versement depuis le moyen recueil vers le terminal que lorsque la partie de solde doit décrémenter le solde, et est suivie de la transmission d'un message de demande de partie de solde à verser depuis le moyen de recueil vers le terminal et de la transmission de la partie de solde sélectionnée depuis le terminal vers le moyen de recueil. Une autre validation de versement n'est transmise en réponse au message d'invitation à sélectionner un versement que lorsque tout le solde est à prélever.
Ledit établissement de la communication peut résulter d'un appel volontaire du moyen de recueil par le terminal, lequel appel précède une identification de la carte par le moyen de recueil lorsque la carte est sans microcircuit.
Selon une deuxième variante de la première réalisation, le message d'invitation à verser n'est transmis depuis lé moyen de recueil vers le terminal que lorsque le solde est inférieur à un seuil prédéterminé afin que soit proposé systématiquement à l'usager un versement aux bonnes oeuvres, avant l'épuisement du solde de sa carte prépayée. Au contraire, une communication téléphonique depuis le terminal peut être poursuivie lorsque le solde est supérieur au seuil, ou après un refus de versement de solde transmis depuis le terminal vers le moyen de recueil. Pour cette deuxième variante ledit établissement de communication peut résulter d'une prise de ligne téléphonique par le terminal, puis d appel automatique du moyen de recueil par un moyen de raccordement téléphonique du terminal lorsque le solde est inférieur au seuil. Lorsque la carte est une carte prépayée à micro circuit contenant le solde et doit être introduite dans le terminal pour l'établissement de la communication, le moyen de recueil comprend un serveur contenant ledit compteur dédié au recueil des parties de solde et un moyen raccordant le serveur au terminal pour recevoir le solde de la carte dès 1 établissement de la communication, détecter la validation de versement, décrémenter le solde avec la partie de solde en un solde décrémenté et transmettre solde décrémenté à la carte à travers le terminal et la partie de solde au serveur.
Lorsque la carte est une carte prépayée sans microcircuit ayant un numéro d'identification qui doit être composé dans le terminal, ou être généré automatiquement depuis le terminal, pour identifier la carte par le moyen de recueil, le moyen recueil comprend un serveur contenant ledit compteur dédié au recueil des parties de solde et gérant le solde de la carte pour détecter la validation de versement après réception d'un numéro de versement du serveur depuis le terminal, décrémenter le solde et incrémenter le compteur. Selon une deuxième réalisation, les étapes de décrémenter et d'incrémenter sont cycliques au cours d'une communication téléphonique depuis le terminal, et exécutées chaque fois qu'un décrément prédéterminé de solde est consommé. De cette manière, des parties de solde en tant que dons sont versées systématiquement et très souvent périodiquement au cours d'une communication téléphonique sans aucune intervention de l'usager de la carte.
Lorsque la carte est une carte à microcircuit, les étapes de décrémenter et d'incrémenter peuvent être exécutées cycliquement dans un moyen de raccordement téléphonique interne ou externe au terminal et le solde peut être transmis de la carte au moyen de raccordement après ledit établissement.
Les étapes de décrémenter et d'incrémenter ne sont exécutées de préférence qu'en réponse à un indicateur de versement qui est transmis par la carte au moyen de recueil lorsque la carte est carte à microcircuit, ou qui est lue en correspondance à un numéro d'identification de la carte dans moyen de recueil lorsque la carte est une carte sans micro circuit. L'indicateur de versement signale au moyen de recueil l'approbation préalable de l'usager de la carte, lors de l'achat de celle-ci, au versement cyclique de parties de solde en faveur de bonnes oeuvres. Ainsi, pour une première utilisation de la carte, le procédé comprend de préférence après l'établissement de la communication, une sélection au moins de l'un des paramètres incluant le décrément, la partie de solde et l'identité de l'entité pour laquelle la partie de solde est recueillie, en réponse à un message d'invitation à participer aux versements transmis par le moyen de recueil vers le terminal. A la suite de la sélection, ledit au moins paramètre sélectionné et l'indicateur de versement à associer à la carte sont enregistrés dans le moyen recueil et, lorsque la carte est une carte à micro circuit sont également enregistrés dans la carte.
Par exemple, la première utilisation de la carte est détectée par le moyen de recueil lorsqu'un crédit initial lu dans la carte ou dans le moyen de recueil est égal au solde de la carte.
Dans la deuxième réalisation, le moyen de recueil peut être un moyen pour-raccorder le terminal à un commutateur téléphonique, ou être le terminal lui-même, le compteur dans le moyen de recueil accumulant les parties de solde pouvant être vidé périodiquement dans un serveur appartenant aux bonnes oeuvres bénéficiaires. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante de plusieurs réalisations préférées de l'invention en référence aux dessins annexés correspondants dans lesquels - figure 1 est un bloc-diagramme schématique de la liaison entre un publiphone à carte téléphonique et un serveur de versement aux bonnes oeuvres , - la figure 2 est un algorithme du procédé selon une première réalisation de l'invention pour versement volontaire de solde par carte prépayée à microcircuit ; - la figure 3 est un algorithme selon une première variante de la première réalisation de procédé montrée à la figure 2, pour versement volontaire de partie de solde ; - la figure 4 est un algorithme selon une deuxième variante de deuxième réalisation de procédé montrée à la figure 2, pour versement par sollicitation systématique ; - la figure 5 est algorithme du procédé selon une deuxième réalisation de l'invention pour versement cyclique par carte prépayée à microcircuit et - la figure 6 détaille une partie de l'algorithme de la figure 5, pour une première utilisation de carte. . Les cartes prépayees mises en oeuvre par l'invention sont de deux types, selon qu'elles sont avec un microcircuit ou sans microcircuit.
Une carte du premier type est une carte contenant un microcircuit, dite également carte non virtuelle, dans laquelle des unités de prestation ou de produit prépayées lors de l'achat de la carte sont mémorisées et correspondent ensemble à un crédit CR.
Une carte du deuxieme type est une carte ne contenant pas de micro circuit de type processeur, dite également carte virtuelle, les unités associées à la carte étant incluses dans une zone de mémoire qui est localisée dans un serveur connecté à un réseau de télécommunication. Le deuxième type comprend également des cartes prépayées incluant une mémoire ROM ayant préenregistré un numéro d'identification de la carte et un numéro d'appel de serveur de versement bonnes oeuvres, afin que ces deux numéros soient lus automatiquement par un publiphone, après insertion de la carte dans celui- ci, ce qui évite la composition longue de ces deux numéros par l'usager de la carte. Pour les deux types, les unités sont effacées dans le microcircuit ou dans le serveur au fur et à mesure des achats de prestation ou de produit avec la carte, un solde d'unités SO associé à la carte, initialement égal au crédit CR, diminuant ainsi à chaque achat.
Le procédé de versement de l'invention est décrit ci-après selon deux réalisations. Dans la première réalisation, tout ou partie du solde d'unités de prestation ou de produit SO associé à la carte est versé à des bonnes oeuvres par une action volontaire déclenchée par le possesseur de la carte. Dans la deuxième réalisation, le versement s'effectue au fur et à mesure de la consommation des unités prépayees. Ainsi, dans cette deuxième réalisation, le versement est réalisé par exemple à raison de NBO = 1 unité toutes les DE = 25 unités consommées A titre d'exemple préféré auquel référence est faite dans la suite, les unités d'une carte prépayée donnent accès à une prestation, en l'occurrence un service téléphonique ; ainsi une unité une unité téléphonique, mais peut être une autre fraction de service, telle que quelques secondes de communication par exemple. figure 1 montre schématiquement les moyens essentiels intervenant dans une communication téléphonique entre une carte téléphonique prépayée à microcircuit CA, dite télécarte, selon le premier type, un serveur SE dédié à une application de versement à des bonnes oeuvres et doté d'une messagerie vocale et au moins d'un compteur d'unités téléphoniques CBO recueillant des unités téléphoniques comme dons destinés aux bonnes oeuvres. Les moyens essentiels sont une station d'accueil de carte prépayée, telle qu'un terminal téléphonique public PU par exemple du type publiphone (marque deposée) ou une borne multimédia publique, dans laquelle est introduite la carte CA, une unité de raccordement UR reliée au publiphone par une ligne teléphonique d'usager LT, et un commutateur téléphonique à autonomie d'acheminement CO reliant l'unité de raccordement au serveur SE et inclus dans un réseau de télécommunication RE, tel que le réseau téléphonique commuté. Les messages produits par le serveur peuvent être vocaux ou le cas échéant de type texte et affichables dans le publiphone L'unité de raccordement UR dessert plusieurs publiphones qui lui sont rattachés. Elle assure un certain nombre de fonctions intermédiaires vis-à-vis des publiphones et d'un système de gestion technique des publiphones.
Outre le raccordement de publiphones au réseau téléphonique avec télé-alimentation ceux-ci, 1 unité de raccordement UR assure le traitement en temps réel de communications de départ depuis les publiphones rattachés pour contrôler moyen de paiement, tel que carte prépayée. L'unité de raccordement assure également le contrôle d opérations de gestion des publiphones rattachés, en relation avec un système de gestion de publiphone SGP à plusieurs serveurs.
L'invention a également pour objet l'application du procédé tel que défini ci-dessus, à la détection ou au criblage de molécules, telles que définies ci-dessus, susceptibles de pouvoir être utilisées en tant que médicaments dans le traitement de pathologies liées à un dysfonctionnement du processus de polymérisation de l'actine dans le cadre de la formation du cytosquelette d' actine, ou susceptibles d'avoir un effet cytotoxique correspondant à une inhibition ou une stimulation de la formation du cytosquelette d'actine.
L'invention a également pour objet une trousse ou kit pour la mise en #uvre d'un procédé susmentionné, comprenant - un réactiftel que défini ci-dessus, - le cas échéant un composé marqué défini ci-dessus permettant de visualiser la polymérisation de l'actine, notamment de l'actine marquée par fluorescence, - le cas échéant un milieu approprié contenant les éléments nécessaires à la polymérisation de l'actine, notamment un extrait de surnageant cellulaire tel que défini ci- dessus.
L'invention sera davantage illustrée à l'aide de la description détaillée qui suit de la préparation de microsphères enduites d'un fragment peptidique de l'invention, et de la détection de la polymérisation de l'actine à la surface de ces microsphères dans un extrait de surnageant cellulaire.
I) Matériel et méthodes La séquence codant pour le domaine WH2/A de la protéine WASP humaine (à savoir le fragment de 99 acides aminés délimité par les acides aminés situés aux positions 404 et 502 de la figure 1, encore désigné peptide SEQ ID NO 4), et celle codant pour l'épitope
myc9ElO ont été amplifiées par PCR. L'épitope myc fusionné à la portion carboxy- terminale de la protéine sert d'étiquette moléculaire, permettant la détection de la protéine par des approches immunologiques sans avoir besoin d'un anticorps anti WASP. Cette séquence d'ADN a été introduit dans le vecteur pGEX2T (Pharmacia), en aval de la séquence codant pour la glutathione-S-transferase (GST), générant le plasmide WH2/A- pGEX2T. Le domaine GST a été choisi dans ce travail car il facilite la purification de la protéine recombinante, et il a été montré que ce domaine n'inhibe pas la capacité de polymériser l'actine de la protéine GST-VCA dérivée de N-WASP dans un test d'actine pyrène (Rohatgi et al., 1999). La Figure 3 montre l'organisation en domaines de GST- WH2. Cette protéine recombinante est composée de domaines GST et WH2/A, de 237 et 99 résidus, respectivement et d'un épitope myc9E10 de 9 résidus.
La purification et caractérisation de la protéine GST-WH2/A ont été effectuées de la manière suivante.
Des bactéries E. coli (souche BL21) ont été transformées avec le plasmide WH211- pGEX2T. Les bactéries ont été cultivées dans du milieu LB standard contenant l'antibiotique ampicilline pour maintenir sous pression de sélection les bactéries comportant le plasmide. Les bactéries ont été cultivées en suspension à 37 C jusqu'à ce que la culture atteigne une densité optique de 0. 8 à 600 nm. Ensuite, l'isopropylthio-B-D-galactoside (IPTG) a été ajouté au milieu à une concentration finale de 1 mM pour induire la production de la protéine. Après 2 heures, les bactéries ont été collectées par centrifugation et les culots ont été stockés à -80 C. Les culots ont été décongelés et ajoutés à du tampon d'extraction (solution saline tamponnée au phosphate pH 7. 2, 200 NaCl, 2 mM EDTA (acide ethylènediamine tetra acide), contenant 1 g/ml de chacun des inhibiteurs de protéase suivants, leupeptine, benzamidine, pepstatine, à un rapport de 1 gr de culot par 10 volumes de tampon d'extraction. La suspension a été soniquée jusqu'à ce que elle ne soit plus visqueuse. L'extrait a été centrifugé à 20. 000 x g pendant 10 minutes à 4 C et le surnageant contenant la protéine GST-WH2/A a été conservé. La protéine GST-WH2/A a été purifiée à partir de l'extrait bactérien par chromatographie d'affinité sur résine couplée à la Glutathione (Pharmacia) et éluée avec 20 mM glutathione réduit selon les recommandations des fabricants. La purification a été confirmée par analyse de la GST- WH2/A par électrophorèse sur gel d'acrylamide. La présence de l'épitope myc dans la
séquence GST-WH2/A a été confirmée par empreinte immunologique avec un anticorps dirigé contre cet épitope.
La protéine GST-WH2/A a été absorbée sur des billes latex de 500 nm (Polyscience Inc, 400 Valley Road, Warrington Pa, USA) suivant les instructions des fabricants. Ces billes, ajoutées aux extraits préparés à partir de cellules, sont capables de polymériser l'actine de façon suffisante pour entraîner le mouvement de ces billes.
B) Applications 1) Les applications des billes GST-WH2/A et de l'essai de polymérisation de l'actine cellulaire Le mouvement cellulaire dépendant du cytosquelette d'actine intervient lors du développement embryonnaire, de la réponse immunitaire et de la réparation de blessures.
Toutefois, le mécanisme moléculaire par lequel le cytosquelette participe dans les processus physiologiques ou physio-pathologiques demeure mal compris. Ceci est dû au fait que peu de systèmes expérimentaux in vitro sont disponibles pour étudier ces processus.
La présente invention propose un essai in vitro pour tester la polymérisation de l'actine à la surface de billes, et montre que ce système reproduit les caractéristiques essentielles de la polymérisation de l'actine dans les cellules de l'Homme. Par exemple, ces billes recrutent des protéines importantes pour la polymérisation de l'actine dans les cellules, tels que le complexe Arp2/3 et la cofiline. De plus, les composants recrutés à la surface des billes sont des cibles pour les voies de signalisation impliquant des tyrosine kinases. Grâce à ce système in vitro, il est maintenant possible d'étudier les conditions nécessaires à la polymérisation de l'actine dans la cellule, un processus qui jusqu'à présent n'était pas accessible à une manipulation expérimentale directe. a) Procédé de criblage de composants anti-métastatiques Actuellement, des drogues anti-métastatiques ayant comme cible le cytosquelette d'actine n'ont pas pu être développées, puis que des tests simples permettant de cribler des banques de produits chimiques n'étaient pas disponibles. Les billes de la présente invention " miment " le cytosquelette dynamique de cellules en mouvement et constituent donc un essai idéal pour rechercher des molécules qui affectant la dynamique du cytosquelette. Les
produits chimiques ainsi identifiés serviront ensuite pour développer des médicaments destinés au traitement des cancers métastatiques. b) Procédé de criblage d'antibiotiques anti-parasites Le système des billes décrit ici, repose sur des protéines humaines qui sont nécessaires à la polymérisation de l'actine dans les cellules humaines. Toutefois, ces protéines sont conservées durant l'évolution, de la levure à l'Homme, en passant par les amibes. Malgré la conservation de leur fonction de base, ces protéines présentent également des divergences au niveau de leur séquence primaire, suggérant des différences fonctionnelles notables. De façon analogue aux cancers métastatiques, le cytosquelette d'actine des parasites est rarement la cible des drogues utilisées dans le traitement des parasitoses, malgré le rôle important qu'il joue lors du cycle infectieux de nombreux parasites (les amibes par exemple). Il est concevable, que des drogues qui n'affectent le cytosquelette d'actine humain que lorsqu'elles sont utilisées à forte concentration, affectent celui des parasites à des concentrations beaucoup plus faibles. C'est pourquoi, grâce à la nature universelle de l'évolution du cytosquelette d'actine, le système des billes de la présente invention permet également de rechercher des drogues utilisables dans le traitement de parasitoses. c) Détection d'effets secondaires de médicaments Dans un autre test, les billes servent à vérifier et à confirmer que des médicaments n'ont pas d'effets secondaires sur la polymérisation d'actine cellulaire. Ainsi il est possible d'éviter les conséquences désastreuses de traitements médicamenteux qui affectent de façon non intentionnelle la migration cellulaire pendant le développement de l'embryon chez la femme enceinte. Par exemple, après quelles années d'utilisation, il a été montré que les propriétés tératogènes de l'acide valproïque, une drogue anti-épileptique, sont dues à ses effets secondaires sur le cytosquelette d'actine.
2) procédure pour cribler des molécules affectant la polymérisation d'actine cellulaire Les essais de criblage les plus effectifs pour tester des drogues nouvelles ont les propriétés suivantes : sont simples, bon marché et rapides. Le test de polymérisation d'actine cellulaire de la présente invention a toutes ces caractéristiques. Les billes de 200- 500 nm peuvent être produites en absorbant la protéine recombinante GST-WH2/A purifiée
à leur surface. Une fois préparées, les billes sont stables pour plusieurs mois à 4 C. Les billes sont ensuite ajoutées à des extraits préparés à partir de surnageants de cellules en culture lysées. Le volume d'extrait nécessaire pour une expérience est de l'ordre de quelques microlitres, réduisant le coût de l'expérience. Ces extraits ont l'avantage de pouvoir être produits en quantité importante et stockés à long terme, à -80 C. Avant l'addition des billes, un dérivé fluorescent de l'actine (l'actine-rhodamine commerciale) est ajouté à l'extrait afin de visualiser la polymérisation de l'actine par microscopie à épifluorescence. La polymérisation de l'actine est observée 15 min après l'addition des billes, se traduisant par une accumulation de l'actine fluorescente autour des billes. En partant d'un stock de réactifs standardisés, l'expérience prend moins de 30 min et une personne est capable de traiter plusieurs échantillons en parallèle. Cette procédure peut être automatisée, permettant le criblage rapide d'un nombre important d'échantillons.
Afin d'identifier des composants actifs, il est nécessaire de tester les produits chimiques à des concentrations variables. Les inventeurs montré que les quantités faibles des solvants servant à dissoudre ces produits (eau, éthanol, dimethylsulphoxide) ne perturbent pas le système de l'invention. De plus, cet essai de criblage a été validé en montrant qu'il est sensible aux drogues inhibant la polymérisation de l'actine actuellement connues, telles que la latrunculine et la cytochalasine D.
Le mélange des 2 diastéréoisomères (formes A) 1-{(R*)-(4-chlorophényl)[4- (hydroxyméthyl)phényl]méthyl}-3-[(R)-(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl-mé-
thyl)]azétidin-3-ol et 1-{(R*)-(4-chlorophényl)[4-(hydroxyméthyl)phényl] méthyl}-3-[(S)-(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl-méthyl)]azétidin-3-ol, peut être préparé en opérant de la façon suivante : A une solution maintenue sous argon et refroidie à -30 C de 0,58 g du mélange des 2 diastéréoisomères (formes A) 3-acétoxy-1 -{(R*)-(4-chlorophényl)[4-(méthoxycarbonyl)phényl] méthyl}-3-[(R)-(3,5-difluorophényl) méthylsulfonyl-méthyl)]azétidine, et 3- acétoxy-1-{(R*)-(4-chlorophényl)[4-(méthoxycarbonyl)phényl]méthyl}-3-[(S)- (3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl- méthyl)]azétidine, dans 10 cm3 de toluène anhydre, on ajoute 1,6 cm3 d'une solution 1,5M dans le toluène d'hydrure de diisobutylaluminium. Après 15 minutes d'agitation à -30 C, on ajoute à nouveau 1,0 cm3 de cette même solution d'hydrure, puis laisse le mélange revenir à 0 C. Après 30 minutes d'agitation, le mélange agité est additionné de 3 cm3 d'eau et 6 cm3 d'hydroxyde de sodium 1 N puis extrait par 25 cm3 de dichlorométhane. La phase organique est lavée par 5 cm3 d'eau, 5 cm3 de saumure, puis séchée sur sulfate de magnésium et concentrée à sec sous pression réduite (2,7 kPa). Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (granulométrie 0,06-0,200 mm, diamètre 1,2 cm, hauteur 30 cm), sous une pression de 0,1 bar d'argon en éluant avec un mélange cyclohexane et acétate d'éthyle (50/50 en volumes) et en recueillant des fractions de 30 cm3. Les fractions 4 à 12 sont réunies puis concentrées à sec sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 0,42 g du mélange des 2 diastéréoisomères (formes A) 1-{(R*)-(4-chlorophényl)[4- {hydroxyméthyl)phényl]méthyl}-3-[(R)-(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl-mé- thyl)]azétidin-3-ol, et 1 -{(R*)-(4-chlorophényl)[4-(hydroxyméthyl phényl]méthyl}-3-[(S)-(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl-méthyl)]azétidin-3-ol, sous la forme d'une laque blanche.
Le mélange des 2 diastéréoisomères (formes A) 3-acétoxy-1-{(R*)-(4- chlorophényl)[4-(méthoxycarbonyl)phényl]méthyl}-3-[(R)-(3,5-difluorophényl) méthylsulfonyl-méthyl)]azétidine, et 3-acétoxy-1-{(R*)-(4-chlorophényl)[4- (méthoxycarbonyl) phé nyl] méthyl}-3-[ (S )-( 3, 5-difl uorophé nyl) méthylsulfonyl-