INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
d) la séquence allant du nucléotide en position 1294 jusqu'au nucléotide en position 1431 de la séquence SEQ ID NOS, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; e) la séquence allant du nucléotide en position 2600 jusqu'au nucléotide en position 3149 de la séquence SEQ ID NOS, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; f) la séquence allant du nucléotide en position 198 jusqu'au nucléotide en position 907 de la séquence SEQ ID NOS, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; g) la séquence allant du nucléotide en position 1088 jusqu'au nucléotide en position 1160 de la séquence SEQ ID NOS, ou un acide nucléique de séquence complémentaire ; et h) la séquence allant du nucléotide en position 1215 jusqu'au nucléotide en position 1293 de la séquence SEQ ID n 5 ; i) la séquence allant du nucléotide en position 1432 jusqu'au nucléotide en position 2599 de la séquence SEQ ID N 5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'acide nucléique de séquence SEQ ID NOS est représenté à la figure 1, dans laquelle sont également détaillées les positions des différents exons et introns du gène DD1-a.
Il a été montré selon l'invention que le gène DD1-a est transcrit sous la forme d'un ARN messager qui a été partiellement isolé et caractérisé. Cet ARN messager comporte un cadre de lecture ouvert codant partiellement pour la protéine DD1-a.
L'ADNc partiel du gène DD1-a a une longueur de 782 nucléotides et est référencé comme la séquence SEQ ID 7 du listage de séquences.
Un autre objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO ?, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO7 ou un fragment de cette séquence nucléotidique ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique précité.
L'invention a encore pour objet un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend la séquence nucléotidique SEQ ID ? 7 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique constitué de la séquence nucléotidique SEQ ID NO ?, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Le gène DD1-a code pour un polypeptide de 304 acides aminés de longueur possédant un degré d'identité en acides aminés d'environ 90% par rapport à la séquence en acides aminés du polypeptide codé par le gène DD1-b selon l'invention, après alignement des deux séquences.
Le polypeptide codé par l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO1 ou SEQ ID NOS du gène DD1-a est référencé comme la séquence SEQ ID ? 9 du listage de séquences. Ce polypeptide est aussi codé par l'ADNc résultant de la transcription du gène DD1-a.
En conséquence, l'invention est également relative à un acide nucléique codant pour un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en acides aminés avec la séquence SEQ ID ? 9.
L'invention a également trait à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour le polypeptide de séquence SEQ ID D ? 9.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique codant pour un fragment d'un polypeptide possédant au moins 80% d'identité en nucléotide avec un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID ? 9.
L'invention concerne aussi un acide nucléique codant pour un fragment d'un polypeptide de séquence en acides aminés SEQ ID ? 9.
Un polypeptide ayant au moins 80% d'identité en acides aminés avec un polypeptide de référence comprend au moins 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% au moins 99,5% d'identité en acides aminés avec le polypeptide de référence.
Enzymes pour manipulations d'ADN Sauf mention contraire, toutes les enzymes destinées à des manipulations de l'ADN, telles par exemple que les endonucléases de restriction, les ligases, les polymérases pour PCR, etc., sont obtenues auprès de New England Biolabs, Inc.
Exemple 1 Synthèse d'un plasmide comprenant une séquence codant pour la métallothionéine-IIA humaine fusionnée à un peptide de glutathionS-transférase pour obtenir un produit de fusion MT-IIA-GST : On obtient l'ADNc de la MT-IIA humaine par transcription
inverse d'un ARNm pouvant être obtenu d'après Karin & Richards ; Nature 299:797-802 (1982), et aimablement fournis par eux (Department of Genetics, Australian National University). La séquence d'acides aminés de la MT-IIA humaine est présentée entre les positions 1 et 61 de la séquence SEQ ID N 2. L'ADNc de la MT-IIA est clone dans le plasmide pUC13 (qui possède une origine de réplication de E. coli), en étant inséré entre les sites HindIII et BamHI à l'intérieur de son lieur multisites.
La MT-IIA est clonée dans le vecteur d'expression pGEX-4Tl (pour la séquence complète, voir le numéro d'identification Genbank XXU 13853 ) . Le vecteur pGEX-4Tl comprend le promoteur tac inductible par 11PTG, le gène de résistance à l'ampicilline et un lieur multisites pour cloner des gènes dans le cadre de lecture de l'extrémité 3' du gène codant pour l'enzyme glutathion-S-transférase (GST) de Shistosoma japonicium. Ledit gène de la GST comprend la séquence polypeptidique allant des positions 1 à 218 de la séquence SEQ ID N 1.
Le polypeptide de fusion ainsi obtenu possède la GST en tant que partie N-terminale, la mT-IIA en tant que partie C-teminale, avec fusion par une séquence polypeptidique comprenant un site de clivage par le facteur Xa.
Dans le cas présent, les étapes sont les suivantes : 1. Amplification PCR de l'ADNc de la mT-IIA et introduction de sites appropriés de restriction par l'intermédiaire d'amorces pour PCR.
2. Purification du fragment PCR.
3. Digestion du fragment PCT et du vecteur de clonage.
4. Transformation.
5. Détection des clones transformés.
6. Séquençage.
La matrice d'ADN servant à la réaction PCR est un mini-prep plasmidique de la MT-IIA, cloné dans le pUC13. Les oligonucléotides (amorces pour PCR) utilisés sont préparés par Amersham-Pharmacia Biotech. Ces séquences sont spécifiques de la MT-IIA et introduisent les sites de restriction BamHI-SalI pendant l'amplification PCR. La réaction PCR est réalisée sous forme d'une réaction Hot Start à départ chaud.
Le fragment PCR obtenu est purifié par électrophorèse sur gel (agarose à 1 %) et est digéré par les enzymes de restriction BamHI et
SalI. Le vecteur pGEX-4Tl est digéré par ces mêmes enzymes. Le fragment PCR est ligaturé dans le vecteur, transformé en cellules compétentes de E. coli DH5a, et les clones positifs (c'est-à-dire comprenant le gène de la MT-IIA) sont vérifiés par une carte de digestion par des enzymes de restriction. Finalement, on vérifie par séquençage d'ADN la séquence du gène de la MT-IIA d'un clone positif (ayant un plasmide pGEX-4T1-MT-IIA).
Exemple 2 Expression et purification par recombinaison du produit de fusion MT-IIA-GST de l'exemple 1 On utilise un fermenteur automatique Biostat U (Braun Bioteech), qui est couplé à un système de récupération de masse cellulaire automatique, Westfalia Separator (Braun Biotech). Ce dernier possède une centrifugeuse (modèle CSA-1-06-475) commandée par un programme (TVE-OP 76/0).
La fermentation est effectuée comme suit : 1. Incubation jusqu'au lendemain, dans un milieu LB avec ampicilline à 37 C, d'un clone de E. coli comprenant un plasmide pGEX-4Tl-MT-2A ; 2. Ensemencement, par cette culture, d'un nouveau milieu LB avec ampicilline ; 3. Croissance jusqu'à une densité d'environ 108 cellules par millilitre de milieu à 37 C ; 4. Induction par IPTG ; 5. Addition de ZnCl2 ; 6. Incubation pendant 3 heures, calculées à partir du moment de l'induction ; 7. Interruption de la croissance de la culture et récupération de la masse cellulaire ; 8. Centrifugation à 7700 g pendant 10 minutes pour éliminer le reste du milieu de culture cellulaire et récupération de la masse cellulaire, qui est utilisée pour purifier la protéine MT-IIA-GST.
Voir "Bongers J. et al ; Micromolar protein concentrations ADN metalloprotein stoichiometries obtained by inductively-coupledplasma-emission-spectrometry détermination of sulphur ; Chem. 60:2683-2686 (1988)" pour plus de détails concernant la méthode ICPAES.
L'Expression "groupement prosthétique" désigne un groupe chimique non protéique (par exemple, un atome métallique) lié à une protéine, comme c'est le cas avec de nombreuses protéines formant habituellement une partie du site actif, et essentiel pour l'activité biologique.
Le terme "apoprotéine" désigne la partie protéique de la protéine restant après élimination du groupement prosthétique.
L'expression "techniques de recombinaison d'ADN" de l'étape (a) du premier aspect désigne des techniques de génétique moléculaire, comprenant l'analyse par les enzymes de restriction, le clonage de l'ADN, l'hybridation de l'ADN, l'amplification PCR, le séquençage de l'ADN, etc., qui sont utilisés pour produire et exploiter des ADN recombinants.
L'expression "le milieu comprend des ions Zn en une quantité molaire suffisante pour garantir que la majorité des protéines MT produites comprennent un groupement prosthétique à ion Zn lié" de l'étape (b) du premier aspect doit être comprise comme signifiant que le milieu comprend une quantité d'ions Zn suffisante pour arriver à l'effet selon lequel la majorité des protéines MT produites vont comprendre un groupement prosthétique à ion Zn lié. L'homme de métier sait
comment ajuster la quantité d'ions Zn sur la base de la quantité de protéines MT produites à l'intérieur de la cellule de production choisie.
D'une manière générale, la quantité molaire des ions Zn doit de préférence être au moins proche de la quantité molaire de la MT produite, plus préférablement la quantité molaire des ions Zn doit être au moins trois fois supérieure à la quantité molaire de la MT produite et, de façon plus préférée, la quantité molaire des ions Zn doit être au moins cent fois supérieure à la quantité molaire de la MT produite. Les ions Zn peuvent de préférence être ajoutés au milieu sous forme par exemple de ZnCl2, de ZnI2 ou de Zn(N03)2.6H20, ou de composés chimiques analogues.
L'expression le milieu ne comprend essentiellement pas d'ions Pb, Cd, Cu, Ag, Hg ou Bi de l'étape (b) du premier aspect doit être comprise en relation avec l'expression immédiatement ci-dessus, en ce sens que le milieu peut comprendre une petite quantité de ces ions, mais ils ne doivent pas être présents en une quantité qui va affecter le résultat recherché global, selon lequel la majorité des protéines MT produites doivent comprendre un groupement prosthétique à ion Zn lié. L'homme de métier, en se fondant sur ses connaissances générales, sait comment effectuer l'ajustement. De préférence, aucun des ions Pb, Cd, Cu, Ag, Hg ou Bi ne doit être présent dans le milieu en une quantité molaire supérieure à 10 % de la quantité molaire de la MT produite, plus préférablement aucun des ions Pb, Cd, Cu, Ag, Hg ou Bi ne doit être présent dans le milieu en une quantité molaire supérieure à 1 % de la quantité molaire de la MT produite, et encore plus préférablement aucun des ions Pb, Cd, Cu, Ag, Hg ou Bi ne doit être présent dans le milieu en une quantité molaire dépassant 0,1% de la quantité molaire de la MT produite.
L'expression isolement des protéines MT produites de l'étape (c) du premier aspect signifie que les protéines MT sont de préférence isolées jusqu'à une pureté d'au moins environ 10 %, plus préférablement jusqu'à une pureté d'au moins environ 40 % et de façon encore plus préférée jusqu'à une pureté d'environ 95 %, telle que déterminée par SDS-PAGE. L'expression isolement des protéines MT produites peut s'exprimer aussi par purification des protéines MT produites .
Des formes de mise en #uvre de la présente invention sont
décrites ci-dessous, sous forme d'exemple (s) seulement.Description détaillée de l'invention : Composition cosmétique et/ou pharmaceutique : La composition doit pouvoir être utilisée pour la protection externe des tissus humains ou animaux (a) contre un contact par un métal lourd et/ou (b) contre un rayonnement ultraviolet, c'est-à-dire qu'elle doit pouvoir être avantageusement placée sur les tissus externes, tels que la peau. L'homme de métier sait d'une manière générale incorporer les ingrédients appropriés à cette fin.
Il est préférable que les compositions de l'invention soient formulées sous forme de gels, de crèmes, de pommades ou de lotions pour le corps. En outre, il est envisagé que les compositions de l'invention soient formulées de façon à être appliquées sur les parties exposées du corps sous forme d'une crème barrière ou d'un fond de teint, qui de préférence peut comprendre un colorant et/ou un parfum inertes d'un point de vue dermatologique.
On préfère tout spécialement que les compositions soient formulées sous forme d'un mélange filmogène résistant à l'eau, qui peut comprendre par exemple des huiles, des cires, des huiles de silicone ou d'autres matériaux excipients hydrophobes inertes analogues. Il est naturellement souhaitable que ces matériaux n'interagissent pas avec les groupes sulfhydrile des protéines MT. Les compositions sont de préférence résistantes à l'eau et sont de préférence capables de rester sur la peau tout au long des activités normales du jour, tout en pouvant être éliminées simplement par lavage avec un détergent, tel qu'un savon.
Des formes de réalisation de l'invention concernent : - la composition cosmétique et/ou pharmaceutique telle que décrite ici, qui comprend en outre un excipient inerte d'un point de vue physiologique et convenant à une administration topique ; - la composition cosmétique et/ou pharmaceutique telle que décrite ici, cette composition comprenant de 0,0000001 à 10 % (en poids) du polypeptide MT, de préférence de 0,000001 à 5 % en poids du polypeptide MT, plus préférablement de 0,000005 à 1 % (en poids) du polypeptide MT, et encore plus préférablement de 0,000005 à 0,0005 % (en poids) du polypeptide MT ; et/ou - la composition cosmétique et/ou pharmaceutique telle que
décrite ici, la composition étant un gel pour le bain, un savon liquide, un shampoing, un shampoing conditionnant, un tonique capillaire, un baume après rasage, une lotion solaire (de préférence de protection moyenne), un tonique pour le visage, une lotion humectante, un gelcrème, une crème de maquillage, un fond de teint ou un tonique pour la peau.
Un procédé de technique par recombinaison, permettant d'obtenir un échantillon de protéines métallothionéines (MT), où la majorité des protéines MT comprennent un groupement prosthétique à ion Zn lié, comprend : Etape (a) : construction, par des techniques de recombinaison d'ADN , d'une cellule de production comprenant un produit de synthèse d'ADN qui comprend une séquence d'ADN codant pour une MT présentant un intérêt et qui est capable de produire la MT.
Dans les joints universels homocinétiques de type tripode, une rotation de l'élément de joint extérieur 10 produit, par constitution, trois nutations de l'élément tripode 20 autour du centre de l'élément de joint exterieur 10. Ici, la quantité d'excentricité représentée par le symbole e [figure 17(A))] augmente proportionnellement à l'angle de fonctionnement (0). Bien que les trois tourillons 22 soient espacés de 120 les uns des au tres, la présence de l'angle de fonctionnement (0) fait basculer les tou rillons comme représenté à la figure 17(B). Plus spécifiquement, en se référant au tourillon vertical 22 représenté dans le haut du schéma, les deux autres tourillons 22 sont légèrement en déclin par rapport leurs axes pour l'angle de fonctionnement zéro, comme représenté par les lignes en traits-points. Par exemple, un angle de fonctionnement (0) d'environ 23 produit un déclin de l'ordre de 2 -3 . Ce déclin peut être facilement toléré par la courbure des parties d'arc 32a sur les périphéries intérieures 32e des anneaux de support 32. Par suite, on peut éviter que les pressions de surface à l'endroit des parties de contact entre les tourillons 22 et les anneaux de support 32, deviennent trop élevées.
Soit dit en passant, la figure 17(B) est une représentation schématique des trois tourillons 22 de l'élément tripode 20 vu depuis le côté gauche de la figure 17(A), les lignes en trait plein représentant les tourillons individuels. Le joint universel homocinétique de ce mode de réalisation utilise également des moyens de suppression de basculement identiques à ceux de l'une des configurations représentées dans les figures 22-25, ou encore deux ou plusieurs de ces moyens en combinaison, de façon que les basculements des ensembles de galets A dans la section transversale perpendiculaire à l'axe du joint, soient supprimés pour assu rer un roulement doux des galets 34. Soit dit en passant, la structure re présentée à la figure 21 peut être adoptée pour les moyens de verrouillage des ensembles de galets A.
La présente invention concerne un élément fileté tubulaire mâle ou femelle d'un joint fileté tubulaire particulièrement apte à résister sollicitations tant statiques que cycliques.
La présente invention concerne aussi un joint filete tubulaire particulièrement apte à résister aux sollicitations tant statiques que cycliques.
Les joints filetés tubulaires comprennent un élément fileté mâle en extrémité d'un premier tube et un élément fileté femelle en extrémité d'un second tube qui peut être un tube de grande longueur ou un manchon. Ces joints filetés sont notamment utilisés pour constituer des colonnes de tubes de cuvelage ou de production ou des trains de type de forage pour des puits d'hydrocarbures pour des puits similaires tels que, par exemple, des puits pour la géothermie.
L'American Petroleum Institute (API) définit dans spécification API 5B des joints filetés entre tubes de cuvelage ou entre tubes production avec notamment des filetages coniques à filets triangulaires arrondis ou trapézoïdaux.
D'autres types de joint filetés sont également connus qui mettent en oeuvre des filetages cylindriques ou coniques à double étage : voir par exemple le brevet US 4 521 042.
Jusqu'à il y a peu de temps, les tubes de cuvelage ou de production devaient essentiellement être capables de résister aux différentes combinaisons de sollicitations statiques, (traction, compression axiales, flexion plane, pression intérieure ou extérieure) malgré leur épaisseur limitée résultent de la nécessité pour pouvoir exploiter un puits profond d'enfiler les unes dans les autres diverses colonnes de diamètres différents.
Au contraire, les tiges de forage qui ne sont utilisées que pour creuser les puits sont soumises à des sollicitations cycliques importantes mais par contre ne sont pas soumises à des exigences d'encombrement, un seul train de tiges d'un diamètre donné étant descendu à un moment donné. Les sollicitations cycliques, si elles ne sont pas strictement limitées, conduisent en service à des ruptures par fatigue initiées à la racine des filets généralement du côté des flancs porteurs qui sont sous charge.
Ce lieu préférentiel d'amorçage des fissures de fatigue traduit une concentration de contraintes au raccordement entre flanc porteur et fond de filet.
Pour améliorer la résistance aux sollicitations cycliques, il est nécessaire de reduire le niveau des contraintes maximales en réduisant le niveau général de contraintes sur le flanc porteur et en réalisant un raccordement le moins anguleux possible entre flanc porteur fond de filet.
La spécification API 7D définit des tiges de forages avec des filetages coniques robustes adaptés aux sollicitations en service. Les filets selon API 7D sont forme triangulaire très arrondie avec des flancs porteurs et d'engagement disposés chacun à 30 par rapport à la normale à l'axe de l'élément fileté.
On rappelle que le flanc porteur est celui qui est disposé sur chaque filet du côté opposé ' l'extrémité libre de l'élément. Cette définition sera utilisée tout au long du présent document.
Le fond de filet est arrondi selon un arc de cercle de rayon 0,97 mm (0,038") centré dans l'axe du fond du filet ; cet arc de cercle se raccorde tangentiellement aux flancs. L'angle de 60 entre flancs de filet résultant de la forme triangulaire des filets permet de faire passer un arc de cercle de rayon notable.
Les sommets de filets sont tronqués de manière à éviter toute interférence radiale entre sommets de filet et fonds de filet du filetage conjugué.
La hauteur des filets ainsi tronqués est de 3,08 mm (0,121") ce qui correspond au double de la hauteur des filets de joints filetés selon API 5B. moyens peuvent néanmoins se trouver insuffisants puisque le brevet 549 754 décrit un profil de filetage modifié par rapport à la spécification API 7D pour tiges de forage qui le rend apte à réduire encore les concentrations de contraintes.
de MT sans la séquence stabilisante supplémentaire, et plus préférablement un échantillon de MT à laquelle est fusionné le polypeptide supplémentaire a au moins quatre fois plus de protéines MT ayant conservé leur groupement prosthétique à ion Zn lié qu'un échantillon de MT sans polypeptide supplémentaire fusionné.
De préférence, la MT est fusionnée à la séquence polypeptidique supplémentaire, de sorte que le polypeptide de fusion possède le polypeptide supplémentaire au niveau du site N-terminal, et la MT au niveau du site C-terminal du produit de fusion.
Tout spécialement, la séquence polypeptidique supplémentaire capable de stabiliser la MT comprend une séquence de l'enzyme glutathion-S-transférase (GST). L'enzyme GST porte le numéro 2.5.1.18 de la classification des enzymes (E.C.), et catalyse la réaction RX + glutathion # HX + R-S-G .
A la date du dépôt, la base de données enzymes de SWISSPROT, disponible pour le public, comprenait un certain nombre de séquences appropriées d'enzymes GST, telles que (les noms d'entrée de SWISS-PROT sont soulignés) : GST2 HUMAN ; P46434, GT1 ONCVO : P30112, GT26 FASHE ; P15964, GT26 SCHMA ; Q28035, GTA1 BOVIN ; Q09596, GTA1 CAEEL ; Q08392, GTA1 CHICK ; P08263, GTA1HUMAN ; et P13745, GTA1MOUSE.
La GST préférée est une enzyme GST de Schistosoma japonicum, ou un analogue de cette dernière à séquence apparentée. Cette enzyme porte la référence SWISS-PROT P08515, GT26 SCHJA , la séquence polypeptidique va des positions 1 à 218 de la séquence SEQ ID N 1, et est celle qui est utilisée dans un exemple de travail ci-après (voir cidessous).
En conséquence, dans une forme de réalisation de l'invention, la séquence polypeptidique supplémentaire capable de stabiliser la MT est une enzyme présentant une activité de GST, choisie dans l'ensemble comprenant : (a) un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés telle que ressortant des positions 1 à 218 de la séquence SEC ID N 1 ; (b) un analogue du polypeptide défini en (a), qui a une homologie d'au moins 70 % avec ledit peptide ; et (c) un fragment de (a) ou (b).
En relation avec ce qui précède, un autre aspect de l'invention
concerne un polypeptide de fusion isolé comprenant (i) un polypeptide de protéine métallothionéine (MT) comprenant un groupement prosthétique à ion Zn lié fusionné à (ii) une séquence polypeptidique de l'enzyme GST choisie dans le groupe consistant en : (a) un polypeptide comprenant une séquence d'acides aminés telle que ressortant des positions 1 à 218 de la séquence SEC ID N 1 ; (b) un analogue du polypeptide défini en (a), qui a une homologie d'au moins 70 % avec ledit peptide ; et (c) un fragment de (a) ou (b) .
En outre, il est préférable que la MT soit une MT de la classe I, de préférence de la classe I humaine, et en particulier la MT de la classe I humaine MT-II ou un analogue à séquence apparentée. La référence SWISS-PROT correspondante est nom d'entrée MT2 HUMAN ; N d'accès primaire P02795 , la séquence polypeptidique est présentée de la position 1 à la position 61 de la séquence SEQ ID N 2, et elle est utilisée dans un exemple de travail de l'invention (voir ci-dessous). La MT-II humaine peut aussi être appelée MT-IIA humaine.