INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'invention concerne un procédé de détection d'un composé modulateur de la complexation entre l'ARN polymérase et une protéine intervenant au cours de la transcription, dans lequel : - on incube un mélange comprenant l'ARN polymérase, une protéine intervenant au cours de la transcription et le composé soumis au procédé de détection, l'étape d'incubation étant effectuée dans des conditions permettant : * la formation d'un complexe entre l'ARN polymérase et la susdite protéine et, . la formation d'une liaison d'une part entre le susdit composé et d'autre part l'ARN polymérase et/ou la protéine intervenant au cours de la transcription, - on détecte, par un test de complexation, la variation significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et la susdite protéine par rapport à une valeur de contrôle correspondant à la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et la susdite protéine en l'absence de tout modulateur, et - on en déduit, lorsqu'il y a une variation significative telle que définie ci-dessus, qu'il y a eu liaison entre d'une part le susdit composé et d'autre part l'ARN polymérase et/ou la protéine intervenant au cours de la transcription, ce qui se traduit par une modulation de la complexation entre l'ARN polymérase et la protéine intervenant au cours de la transcription.
Par"protéine intervenant au cours de la transcription", on désigne tout facteur protéique qui interagit physiquement avec l'ARN polymérase (a2, ss, ss') et modifie son activité transcriptionnelle.
On désigne par"composé modulateur de la complexation entre l'ARN polymérase et une protéine intervenant au cours de la transcription" : - soit un composé qui provoque une diminution de la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et la protéine intervenant au cours de la transcription, - soit au contraire un composé qui provoque une augmentation de la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et la protéine intervenant au cours de la transcription.
Dans ce qui suit, on désigne par partenaires les deux éléments qui constituent le complexe. On désigne par premier partenaire celui qui apparaît en premier lieu dans le mélange et par deuxième partenaire celui qui intervient chronologiquement après le premier partenaire. Dans le cas très particulier de l'addition simultanée des deux éléments qui constituent le complexe, il va de soi que les deux partenaires correspondent indifféremment au premier partenaire et au deuxième partenaire.
Par"test de complexation", on comprend une technique de révélation quantitative du complexe formé entre l'ARN polymérase et la protéine intervenant au cours de la transcription.
De façon avantageuse, ce test implique le marquage moléculaire d'au moins un des partenaires, à savoir l'ARN polymérase et/ou ladite protéine, par une substance. Ce marquage permet une mesure physique quantitative directe ou indirecte, par émission ou consommation de signal, spontanément ou après addition d'un substrat ou d'un signal.
De façon avantageuse, ce test n'implique pas la présence, pour le complexe formé entre l'ARN polymérase et ladite protéine, d'une propriété physico-chimique particulière, telle que la taille moléculaire ou le point iso-électrique. Par conséquent, ce test est différent d'une chromatographie, qu'il s'agisse d'une technique par filtration/exclusion ou par effet de charge.
Le marquage, tel que mentionné ci-dessus, peut s'effectuer en utilisant notamment un élément radioactif, un élément fluorescent, un élément luminescent, une enzyme, de la biotine pour une révélation indirecte par de l'avidine marquée, etc...
Selon un deuxième mode de mise en oeuvre particulier, le composant est un support auxiliaire d'alignement de fibre (s) optiques (s).
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, on couple ce support auxiliaire d'alignement à d'un composant optoélectronique comprenant au moins une zone active, le logement du support auxiliaire d'alignement étant formé de façon à se trouver en regard de cette zone active lorsque le support auxiliaire d'alignement est couplé au composant optoélectronique.
Dans ce cas, l'extrémité de la fibre optique peut être placée dans le logement avant, ou après, le couplage du support auxiliaire d'alignement au composant optoélectronique.
Dans un exemple de l'invention, on forme le composant (en particulier lorsqu'il s'agit d'un support auxiliaire d'alignement) en plusieurs exemplaires, sur un même substrat, on forme ensuite les entailles pour tous ces exemplaires puis on sépare ces exemplaires les uns des autres.
Selon un mode de mise en oeuvre particulier du procédé objet de l'invention, dans le cas où le composant est un composant optoélectronique, on forme ce composant optoélectronique en plusieurs exemplaires sur un même substrat, on forme ensuite les entailles pour tous ces exemplaires, on sépare ces exemplaires les uns des autres, on les hybride, du côté de leurs deuxièmes faces, à un circuit électronique de commande et l'on place les extrémités respectives de fibres optiques dans les logements formés sur les exemplaires, ces logements étant prévus pour recevoir ces extrémités.
Cependant, selon un mode de mise en oeuvre préféré, on forme le composant optoélectronique en plusieurs exemplaires sur un même substrat, on sépare ces exemplaires les uns des autres, on les hybride, du côté de leurs deuxièmes faces, à un circuit électronique de commande, on forme ensuite les entailles pour tous les exemplaires ainsi hybridés et l'on place les extrémités respectives de fibres optiques dans les logements formés sur les exemplaires,
ces logements étant prévus pour recevoir ces extrémités.
Dans l'invention, le substrat peut être transparent à la lumière destinée à être reçue ou émise par la fibre optique ou, au contraire, opaque à cette lumière.
Dans ce dernier cas, on forme en outre (avant ou après les entailles) un trou prévu pour faire déboucher le logement sur la deuxième face du substrat.
Ce trou peut être formé au moyen d'un laser.
Dans l'invention, les entailles sont, quant à elles, de préférence formées au moyen d'une machine de découpage, comprenant une scie à lame rotative.
La présente invention a également pour objet un dispositif d'alignement passif d'au moins un composant et d'au moins une fibre optique, le composant comprenant un substrat qui a des première et deuxième faces opposées, ce dispositif étant caractérisé en ce qu'il comprend au moins deux entailles formées dans le substrat à partir de la première face de celui-ci, ces deux entailles formant une croix et définissant, par leur intersection, un logement qui est prévu pour recevoir une extrémité de la fibre optique.
Selon un mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, le composant est un composant optoélectronique qui est hybridé, du côté de la deuxième face du substrat, à un circuit électronique de commande.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description d'exemples de réalisation donnés ci-après, à titre purement indicatif et nullement limitatif, en faisant référence aux dessins annexés sur lesquels : 'la figure 1A est une vue en coupe schématique d'un mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention en cours de fabrication, utilisant un substrat transparent à la lumière émise ou captée par les fibres optiques destinées à être couplées à ce dispositif, 'la figure 1B est une vue de dessus schématique du dispositif de la figure 1A, 'la figure 1C est une vue de dessus schématique agrandie d'une partie du dispositif de la figure 1A, au niveau d'un logement que l'on a formé dans le substrat, * la figure 1D est une vue en coupe schématique du dispositif de la figure 1A, dans lequel les fibres optiques sont couplées aux zones actives que comporte le dispositif, 'la figure 2A est une vue en coupe schématique d'un autre mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention en cours de fabrication, utilisant un substrat qui n'est pas transparent à la lumière émise ou captée par les fibres optiques destinées à être couplées à ce dispositif, 'la figure 2B est une vue de dessus schématique du dispositif de la figure 2A,
'la figure 2C est une vue de dessus schématique agrandie d'une partie du dispositif de la figure 2A, au niveau d'un logement que l'on a formé dans le substrat, 'la figure 2D est une vue en coupe schématique du dispositif de la figure 2A, dans lequel les fibres optiques sont couplées aux zones actives que comporte le dispositif, 'la figure 3A est une vue en coupe schématique d'un support intermédiaire d'alignement, muni de fibres optiques, et d'un composant optoélectronique, que l'on souhaite connecter l'un à l'autre, 'la figure 3B est une vue en coupe schématique de ce support intermédiaire d'alignement en cours de fabrication conformément à l'invention, 'la figure 3C est une vue de dessus schématique du support intermédiaire d'alignement de la figure 3B, et 'la figure 3D est une vue en coupe schématique du support intermédiaire d'alignement et du composant optoélectronique de la figure 3A, lorsqu'ils sont connectés l'un à l'autre.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Le dispositif conforme à l'invention, qui est schématiquement représenté sur la figure 1A, comprend un composant optoélectronique 2. Ce composant optoélectronique comporte un substrat 4 ainsi qu'une ou plusieurs zones actives, telles que les zones actives 6, qui sont formées dans le substrat 4, à partir d'une face de celui-ci, et sont chacune destinées à émettre
ou à détecter de la lumière. Le substrat 4 est transparent à cette lumière.
On précise que les zones actives 6 émettent de la lumière vers la face opposée à celle à partir de laquelle on a formé ces zones actives 8 ou détectent de la lumière provenant de cette face opposée.
Cette dernière est appelée face arrière ou face supérieure tandis que la face à partir de laquelle sont formées les zones actives 6 est appelée face avant ou face inférieure .
Le composant optoélectronique 2 est monté, par l'intermédiaire de sa face inférieure, sur un circuit de commande 8, au moyen de billes de brasure ( solder balls ) 10, puis enrobé de résine (référence 11).
Un tel assemblage peut être obtenu, en plusieurs exemplaires, par hybridation puis enrobage collectif, au moyen de résine, de composants optoélectroniques du genre du composant 2, sur une plaque entière de silicium comportant des ces circuits de commande de l'ensemble de ces composants.
A ce sujet on se reportera au document suivant : [3] US 5 574 285 A (F. Marion, A. Guiga, M. Boitel et G. Gaude), Electromagnetic radiation detector and its production process , correspondant à la demande de brevet français nO 94 00115 du 7 janvier 1994.
Dans l'exemple de la figure 1A, on souhaite aligner des fibres optiques ou, plus précisément, les coeurs ( cores ) de ces fibres avec les zones actives 6 qui constituent par exemple des émetteurs planar de lumière, du genre VCSEL.
Conformément à l'invention, on forme des logements pour les fibres sur la face supérieure du substrat 4 du composant optoélectronique 2 (ou de chaque composant optoélectronique si l'on a hybridé plusieurs composants au circuit de commande).
Pour obtenir ces logements, on forme des entailles ou rainures sur le substrat 4.
Pour ce faire, il suffit d'utiliser une simple machine de découpage comprenant une scie dont on aperçoit la lame rotative 12 sur la figure 1A.
Plus précisément, au moyen de cette machine, on forme des entailles croisées dans le substrat, à partir de la face supérieure de ce dernier, comme on le voit sur la figure 1B.
Dans l'exemple représenté, on forme une première entaille 14, qui passe au-dessus des trois zones actives, et trois autres entailles 16,18 et 20 qui passent respectivement au-dessus de ces trois zones actives, sont perpendiculaires à cette entaille 14 et forment ainsi trois croix avec cette dernière.
Par leurs trois intersections, les entailles 14,16, 18 et 20 définissent trois logements (borgnes) 22,24 et 26 qui s'étendent dans le substrat 4, perpendiculairement à la face supérieure de ce dernier, et sont respectivement disposés en regard des zones actives.
Chaque logement forme sensiblement un prisme dont la base est un carré (voir figures 1A et 1B). L'axe X (figure 1D) de ce logement est perpendiculaire à la face supérieure du substrat 4, contient l'intersection des diagonales de ce carré et rencontre la zone active correspondante.
Il convient de noter que, lorsque que tous les composants optoélectroniques sont hybridés sur la plaque de silicium mentionnée plus haut, ces composants sont positionnés à mieux que 1 um, comme cela est connu dans l'art antérieur. Il'suffit alors de former des entailles précises, alignées sur des marques d'alignement préalablement faites à la surface du circuit de commande, pour que ces entailles soient également alignées par rapport aux zones actives des composants optoélectroniques hybridés sur cette surface.
Chaque logement est destiné à recevoir l'extrémité d'une fibre optique pour coupler optiquement cette dernière à la zone active correspondant à ce logement.
On obtient cet assemblage connu en formant un trou de guidage dans le substrat du VCSEL.
Dans l'invention, comme dans l'art antérieur, on cherche à résoudre le problème du couplage direct et précis entre au moins une fibre optique et au moins un composant optoélectronique (émetteur ou détecteur), par exemple du genre planar actif, ce couplage étant passif.
Le document [1] montre comment on peut aligner passivement des fibres optiques et des dispositifs optoélectroniques (VCSEL) en perçant des trous de guidage dans le substrat qui porte les dispositifs et en glissant des fibres optiques dans ces trous.
Or, il s'agit d'un substrat fait de GaAs et donc fragile, qui risque de se casser en cours de fabrication des dispositifs s'il est percé au préalable, ou qui risque de se casser lors des
opérations finales de fabrication de l'ensemble si ce substrat est percé après la formation des dispositifs. be plus, ce substrat en GaAs, fragilisé par les trous, est susceptible de se casser lors de l'introduction des fibres optiques.
EXPOSÉ DE L'INVENTION Un but de la présente invention est de remédier aux inconvénients précédents.
L'invention propose de former au moins un logement, constituant un guide d'alignement, directement sur un composant, de telle manière que l'on puisse aligner une fibre optique et le composant sans support ni cale auxiliaire d'alignement.
Dans un'mode de réalisation particulier de l'invention, où l'on veut connecter des fibres optiques avec une ou plusieurs puces ( chips ) optoélectroniques, on propose de former des guides d'alignement dans le substrat de chaque puce, après hybridation de cette puce (ou ces puces) sur le circuit de commande de celle (s)-ci.
Pour la formation des guides d'alignement et la mise en place des fibres, l'ensemble puce (s)circuit de commande est plus résistant que les puces seules.
De façon précise, la présente invention a pour objet un procédé d'alignement passif d'au moins un composant et d'au moins une fibre optique, le composant comprenant un substrat qui a des première et deuxième
faces opposées, ce procédé étant caractérisé en ce que : - on forme au moins deux entailles dans le substrat, à partir de la première face de ce substrat, ces deux entailles formant une croix et définissant, par leur intersection, un logement qui est prévu pour recevoir une extrémité de la fibre optique, et - on place cette extrémité dans le logement.
Selon un premier mode de mise en oeuvre particulier du procédé objet de l'invention, le composant est un composant optoélectronique comprenant au moins une zone active formée du côté de la deuxième face du substrat, cette zone active étant destinée à émettre ou recevoir une lumière et devant être optiquement couplée à la fibre optique, et l'on forme les entailles de façon que le logement se trouve en regard de la zone active du composant optoélectronique.
Ce composant optoélectronique comprend, par exemple, au moins un laser à émission par la surface et à cavité verticale, formé par la zone active.
A. 8. CRIBLAGE DE BANQUE D'ADN GNOMIQUE Une banque d'ADN génomique contenue dans le phage lambda EMBL3 SP6/T7 (Stratagene) a été étalée à la densité de 1,5 x 105 plages de lyse par boîte, sur 10 boîtes, puis transférée sur membrane Hybond N, selon la technique décrite par SAMBROOK et al. (1989). Les membranes ont été hybridées avec la sonde de séquence SEQ ID no 29 provenant d'un clone d'ADN génomique partiel du gène DD1-b marqué radioactivement. Après révélation des membranes en autoradiographie, les plages de lyse donnant un signal ont été prélevées sur les boîtes et étalées à une densité moindre, ainsi deux fois de suite afin d'obtenir un clone unique par boîte, sous forme de plages isolées. Les ADN ont alors été préparés selon SAMBROOK et al.
A. 9.-CARTOGRAPHIE La cartographie a été réalisée comme décrit par BURR et BURR (1991). L'ADN génomique des lignées parentales Co159, Tx303, Cm37 et T232 a été digéré par les enzymes de restriction suivantes : BamHI, EcoRI, Hindlll, EcoRV, Pstl, Xbal, Sad, Spel, Xhol, Sall, Pvull, et Clal, et transféré sur membrane de nylon (voir paragraphe A. 4). Une sonde marquée radioactivement, correspondant à un clone d'ADN génomique partiel du gène DD1-b de séquence SEQ ID NO29, a été utilisée pour identifier des polymorphismes de longueur des fragments de restriction.
Un polymorphisme a été observé avec la digestion par EcoRI de l'ADN des deux parents Co 159 et Tx303 et l'ADN génomique de 41 descendants Co159xTx303 a donc été digéré par EcoRI. Selon que la digestion a conduit à l'obtention du même polymorphisme que le parent Tx303 ou que le parent Co159, un score de 1 ou de 2 a été respectivement attribué à l'individu. Pour les individus chez qui la discrimination n'a pas été possible, il a été attribué un x.
Ces résultats ont permis de déterminer la position des gènes sur la carte génétique du maïs, à l'aide du programme Map Maker.
B-RESULTATS B. 1. PROFIL D'EXPRESSION DES GENES DD1 Afin d'obtenir des profils d'expression spatio-temporelle précis des gènes DD1, la technique de RT-PCR a été utilisée avec les oligonucléotides du tableau 10 et la séquence SEQ ID N 26 comme sonde. Les résultats des RT-PCR relatifs à l'albumen et aux tissus témoins sont représentés sur la figure 13.
Le gène DD1 (figure 13) n'est pas exprimé dans les tissus végétatifs, mais présente une fenêtre d'expression très étroite dans l'albumen, située entre 7 et 9 JAP. A 12 JAP, on peut encore observer un signal très faible, qui disparaît totalement à 15 JAP. L'expression de DD1 est donc spécifique de la phase précoce du développement de l'albumen. La sonde DD1 donne également un signal dans la piste du marqueur de taille, car de petites régions du vecteur de clonage présentes aux extrémités de la sonde sont homologues aux séquences du marqueur.
B. 2 CARACTERISATION DE DD1 B. 2.1 PROFIL D'EXPRESSION TISSULAIRE DE DD1 Afin de préciser le profil d'expression tissulaire de DD1, nous avons réalisé des hybridations in situ sur des coupes longitudinales de grains de maïs de 7,9, 12 et 15 JAP. Avec une sonde antisens, on observe un signal restreint à la zone de transfert de l'albumen. Ce signal est fort à 7 et à 9 JAP (figures 14a et 14c, puis plus faible à 12 JAP (figure 14e), indiquant une diminution du niveau d'expression de l'ARN correspondant au gène DD1. A 15 JAP, on n'observe plus aucun signal (figure 14g), ni dans la zone de transfert, ni dans le reste du grain. Une sonde sens, utilisée comme contrôle négatif, ne donne qu'un signal diffus qui correspond au bruit de fond (figures 14b, d f h). Ceci confirme les résultats obtenus par RT-PCR : le gène DD1 est exprimé lors du développement précoce du grain de maïs, entre 7 et 12 JAP, et son expression est localisée dans la zone de transfert de l'albumen, à la base du grain.
B-2. 2. CLONAGE DE L'ADNC DU GENE DD1-B Afin d'obtenir la séquence d'ADNc de DD1, nous avons effectué une RACE-PCR vers chaque extrémité du gène. Après DNA gel blot des produits des deux réactions, on obtient plusieurs bandes après hybridation avec la sonde DD1 (SEQ ID NO26) entre 0,4 et 0,8 kb pour la réaction 5', et entre 0,4 kb et 0,6 kb pour la réaction 3'. Les produits de ces deux réactions ont été clonés et séquencés. Toutes les séquences correspondaient au gène désigné plus tard comme DD1-b.
B-2. 3 SEQUENCE DE DD1
Les séquences des produits des réactions 5'et 3'étant chevauchantes, une séquence consensus de 1075 pb a été obtenue sur la base des clones les plus longs vers chaque extrémité. Cette séquence contient un cadre ouvert de lecture de 858 pb, et plusieurs sites de polyadénylation. Elle code pour une protéine de 286 acides aminés, très hydrophile, qui comporte néanmoins un domaine hydrophobe dans sa partie N-terminale. La séquence d'ADNc ne révèle aucune homologie significative avec les bases de données de séquences.
B. 2. 4- CLONES GENOMIQUES DE DD1 Pour élucider la structure intron/exon et avoir accès au promoteur, il était nécessaire de disposer de clones génomiques. L'amplicon DD1 (SEQ ID NO26, (382 pb) semblait trop petit pour produire une bonne sonde utilisable pour le criblage de banque et la cartographie. Aussi, une amplification par PCR sur ADN génomique a été réalisée, à l'aide des mêmes amorces (SEQ ID N 20 et SEQ ID NO21) que celles utilisées pour la RT-PCR (tableau 10). L'obtention de deux produits de taille supérieure à celle des produits de la RT-PCR a montré qu'il existe dans l'ADN génomique au moins un intron entre les deux amorces spécifiques. Ces deux fragments, d'environ 1,2 kb et 1,5 kb, ont été clonés puis entièrement séquencés. Leurs séquences exoniques comme introniques sont très homologues. Le plus grand fragment contient deux insertions, de 49 et 282 pb, ainsi que 26 délétions ponctuelles. Ceci est une première indication de la présence de deux gènes DD1-a (produit de 1,5 kb) et DD1-b (produit de 1,2 kb) dans le génome du maïs.
Disposant de clones suffisamment longs, une banque d'ADN génomique a été cribléee utilisant comme sonde le fragment d'environ 1,2 kb de DD1-b (SEQ ID NO29). Ce fragment présente suffisamment d'homologie avec le fragment d'environ 1,5 kb de DD1-a pour lui permettre de s'hybrider
avec les deux gènes, mais ne contient pas les insertions qui pourraient correspondre à des séquences répétées, et donc s'hybrider avec d'autres parties du génome sans relation avec les gènes DD1.
Lors du premier criblage, trente clones positifs en autoradiographie ont été obtenus. Les plages de lyse correspondantes ont été prélevées et testées par PCR pour la présence des fragments de 1,5 kb (DD1-a) ou de 1,2 kb (DD1-b). Pour le deuxième tour de criblage, nous avons retenu 3 clones donnant un fragment PCR de 1,5 kb, 2 clones donnant une bande de 1,2 kb, ainsi que 7 clones ne présentant pas de fragment d'amplification. Après hybridation, 8 de ces 12 clones émettaient des signaux, notamment tous ceux qui avaient répondu en PCR. Nous avons donc étalé à nouveau ces clones pour obtenir des plages de lyse isolées. Pour chaque clone, l'ADN d'une plage a été isolé et digéré par les enzymes Sall, Xbal, ainsi que par les deux enzymes simultanément. Une fois hybridées, les membranes de ces digestions nous ont permis d'identifier des fragments de restriction contenant au moins une partie de DD1. Pour un clone lambda DD1-a et un clone lambda DD1-b les fragments de restriction ont été sous-clonés, et les différents types de sous-clones ont été séquencés.
Les séquences obtenues sont répertoriées ici comme SEQ ID NO1 et SEQ ID N 2. Elles contiennent les régions régulatrices, les régions codantes et des régions en aval des gènes DD1-a et DD1-b.
Après inactivation de la reverse transcriptase par chauffage à 95 C pendant 5 min, 2 ut de la réaction de transcription inverse ont été amplifiés par la Taq polymérase avec le tampon fourni par le fabricant (Pharmacia).
Les couples d'amorces sens/antisens présentés dans le tableau 10 ont été utilisés à une concentration finale de 1 pM. La réaction a été réalisée dans un amplificateur PCR Perkin Elmer DNA Thermal Cycler 2400 de la façon
suivante : après dénaturation de l'ADN 2 min à 94"C, les échantillons ont subit 30 cycles de 30 s de dénaturation à 94 oC/45 s d'hybridation à 55OC/1 min d'élongation à 72OC.