INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
32 Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gin Leu Arg 1 5 10 15 Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala Lys His Glu Arg Ile Glu 20 25 30 Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser 35 40 45 Asp Ser Glu Asp Asp Ser Glu Phe Asp Glu Val Asp Trp Leu Glu 50 55 60 33 150 ADN Séquence artificielle Description de la séquence artificielle : de la protéine Scarl humaine CDS (1)..(150) 33 gcc agg agt gtg cta ctg gaa gca ata cga aaa ggt att cag cta cgc 48 Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gin Leu Arg 1 5 10 15 aaa gta gaa gag cag cgt gaa cag gaa gct aag cat gaa cgc att gaa 96 Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala Lys His Glu Arg Ile Glu 20 25 30 aac gat gtt gcc acc atc ctg tct cgc cgt att gct gtt gaa tat agt 144 Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser 35 40 45 gat tcg 150 Asp Ser 50 34 50 PRT Séquence artificielle Description de la séquence artificielle : de la protéine Scarl humaine 34 Ala Arg Ser Val Leu Leu Glu Ala Ile Arg Lys Gly Ile Gin Leu Arg 1 5 10 15 Lys Val Glu Glu Gin Arg Glu Gin Glu Ala Lys His Glu Arg Ile Glu 20 25 30
Asn Asp Val Ala Thr Ile Leu Ser Arg Arg Ile Ala Val Glu Tyr Ser 35 40 45 Asp Ser 50 35 2069 ADN Mus musculus CDS (25)..(1584) 35 agcaggacta aggcagaagg cage atg aat agt ggc cet ggc cet gta gga 51 Met Asn Ser Gly Pro Gly Pro Val Gly 1 5 ggc agg cet ggg gga cga ggg gga cca gcc gtt cag cag aac att cet 99 Gly Arg Pro Gly Gly Arg Gly Gly Pro Ala Val Gin Gin Asn Ile Pro 10 15 20 25 tcc aac ctc ctc cag gac cat gaa aac cag aga ctc ttt gag ctt ctt 147 Ser Asn Leu Leu Gin Asp His Glu Asn Gin Arg Leu Phe Glu Leu Leu 30 35 40 ggc cga aaa tgc tgg aca ctg gct acc aca gtt gtt cag ctc tac ctg 195 Gly Arg Lys Cys Trp Thr Leu Ala Thr Thr Val Val Gin Leu Tyr Leu 45 50 55 gca ctg ccc cet gga gct gag cac tgg acc atg gaa cac tgc ggg gct 243 Ala Leu Pro Pro Gly Ala Glu His Trp Thr Met Glu His Cys Gly Ala 60 65 70 gtg tgc ttc gtg aag gat aac cet cag aag tcc tac ttc atc cgc ctt 291 Val Cys Phe Val Lys Asp Asn Pro Gin Lys Ser Tyr Phe Ile Arg Leu 75 80 85 tat gcg cta cag gct ggt cgg cta ctc tgg gaa cag gag ctg tac tct 339 Tyr Ala Leu Gin Ala Gly Arg Leu Leu Trp Glu Gin Glu Leu Tyr Ser 90 95 100 105 cag ctg gtt tat ctc act ccc acc ccg ttc ttc cac act ttt gct gga 387 Gin Leu Val Tyr Leu Thr Pro Thr Pro Phe Phe His Thr Phe Ala Gly 110 115 120 gat gac tgt caa gta gga ctg aac ttt gcg gat gag agt gaa gcc cag 435 Asp Asp Cys Gin Val Gly Leu Asn Phe Ala Asp Glu Ser Glu Ala Gln 125 130 135 gcc ttc cgg gcc ttg gtg cag gag aag ata caa aaa agg aat cag agg 483 Ala Phe Arg Ala Leu Val Gin Glu Lys Ile Gin Lys Arg Asn Gin Arg 140 145 150 caa agc gga gaa aga cgc cag cta cca cca cca cca gca cca atc aat 531 Gin Ser Gly Glu Arg Arg Gin Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Ile Asn 155 160 165
gag gag aga aga gga ggg ctc cca cet gtg ccc cca cac ccg ggt gga 579 Glu Glu Arg Arg Gly Gly Leu Pro Pro Val Pro Pro His Pro Gly Gly 170 175 180 185 gat cat ggg ggc cca tca ggt ggt cca cta tct cta gga ctt gtg acg 627 Asp His Gly Gly Pro Ser Gly Gly Pro Leu Ser Leu Gly Leu Val Thr 190 195 200 gtc gac att cag aac cet gac atc aca agt tca cga tac cgt ggg ctc 675 Val Asp Ile Gin Asn Pro Asp Ile Thr Ser Ser Arg Tyr Arg Gly Leu 205 210 215 cet gca cet ggc cet ggc cca act gat aag aaa cgc tca ggg aaa aag 723 Pro Ala Pro Gly Pro Gly Pro Thr Asp Lys Lys Arg Ser Gly Lys Lys 220 225 230 aag atc agc aaa gct gat atc gga gca ccg agt gga ttc aaa cat gtc 771 Lys Ile Ser Lys Ala Asp Ile Gly Ala Pro Ser Gly Phe Lys His Val 235 240 245 agc cac gtg ggc tgg gat ccc cag aat gga ttt gat gtg aac aac cta 819 Ser His Val Gly Trp Asp Pro Gin Asn Gly Phe Asp Val Asn Asn Leu 250 255 260 265 gac ccg gat ctg cgg agc ttg ttc tcc agg gca gga atc agc gag gcc 867 Asp Pro Asp Leu Arg Ser Leu Phe Ser Arg Ala Gly Ile Ser Glu Ala 270 275 280 cag ctc act gac gca gag acc tcc aag ctc atc tac gat ttt att gag 915 Gin Leu Thr Asp Ala Glu Thr Ser Lys Leu Ile Tyr Asp Phe Ile Glu 285 290 295 gac cag gga ggt cta gag gct gtc cgg cag gag atg agg cgc caa gag 963 Asp Gin Gly Gly Leu Glu Ala Val Arg Gin Glu Met Arg Arg Gin Glu 300 305 310 cca ctc cca cca cet ccg ccg cca tgc aga gga gga gga gga gga gga 1011 Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cys Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly 315 320 325 gga gga gga gga gga gga gga gga gga gga gga ggc cag cet ctg aga 1059 Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gin Pro Leu Arg 330 335 340 345 cet cet gtt ttg ggg agt aat aag ggt cgc tca cet cca ctg ccc cet 1107 Pro Pro Val Leu Gly Ser Asn Lys Gly Arg Ser Pro Pro Leu Pro Pro 350 355 360 gta cet atg ggg ggt gcc cca cet cca cca aca cca cga ggg ccc cca 1155 Val Pro Met Gly Gly Ala Pro Pro Pro Pro Thr Pro Arg Gly Pro Pro 365 370 375 cca cca ggc cga ggg ggt cet cet cca cca ccc cet cca gcc act gga 1203 Pro Pro Gly Arg Gly Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Ala Thr Gly 380 385 390 cga tct gga cca cca cet cet cca ctc cet gga gct ggg gga cca cca 1251 Arg Ser Gly Pro Pro Pro Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Gly Pro Pro 395 400 405
gca ccg cca cca cca cca cca cca cca cca cet cca ccc tgc cet ggg 1299 Ala Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Cys Pro Gly 410 415 420 425 agt gga ccc gcc cet ccc ccg ctc cet cet act cca gtg tct ggg ggg 1347 Ser Gly Pro Ala Pro Pro Pro Leu Pro Pro Thr Pro Val Ser Gly Gly 430 435 440 age cca gca cet ggt ggg ggc cgg ggt gca ctt ttg gac caa atc cgg 1395 Ser Pro Ala Pro Gly Gly Gly Arg Gly Ala Leu Leu Asp Gin Ile Arg 445 450 455 cag gga att cag ctg aac aag acc cet gga gct cta gag aac tca gta 1443 Gin Gly Ile Gin Leu Asn Lys Thr Pro Gly Ala Leu Glu Asn Ser Val 460 465 470 cag caa cca ccc gcg cag cag tca gaa ggc cta gta ggt gcc ctg atg 1491 Gin Gin Pro Pro Ala Gin Gin Ser Glu Gly Leu Val Gly Ala Leu Met 475 480 485 cat gtc atg cag aag agg agt aga gtc atc cat tcc tca gat gaa ggg 1539 His Val Met Gin Lys Arg Ser Arg Val Ile His Ser Ser Asp Glu Gly 490 495 500 505 gag gat cag acc ggc gag gat gaa gag gat gat gaa tgg gat gac 1584 Glu Asp Gin Thr Gly Glu Asp Glu Glu Asp Asp Glu Trp Asp Asp 510 515 520 taaagtcatc ttccttccag caagccagtt cctctccaca ctcactctgc catctagatt 1644 ctgctcccgc tggcagcttc ccaattcacc tgttggggaa cctcataccc aatctaaagt 1704 acacatgacg tcacctttca cctctcataa ctcagggatg aaacaggata aaattgagtc 1764 tatgtgtctg agtgtgtgtt cattcacatc ctaaatgagt agtttgggtt tctttccctc 1824 acagtccctt ttggctttga tcttgctttg tgtgttttta ttgagccttt cacaagtatg 1884 atctattatt cctttaagat ttcagccata gccgggtgtg gtggcgcacg cctttaattc 1944 cagcagaagg gaggcagagg caggtggatt tctgagttcg agaccagcct ggtctacaga 2004 gtgagttcca ggacagccag ggctatacag agaaaccctg tctcaaaaaa ccaaaaaaaa 2064 aaaaa 2069 36 520 PRT Mus musculus 36 Met Asn Ser Gly Pro Gly Pro Val Gly Gly Arg Pro Gly Gly Arg Gly 1 5 10 15 Gly Pro Ala Val Gin Gin Asn Ile Pro Ser Asn Leu Leu Gin Asp His 20 25 30 Glu Asn Gin Arg Leu Phe Glu Leu Leu Gly Arg Lys Cys Trp Thr Leu 35 40 45
Ala Thr Thr Val Val Gin Leu Tyr Leu Ala Leu Pro Pro Gly Ala Glu 50 55 60 His Trp Thr Met Glu His Cys Gly Ala Val Cys Phe Val Lys Asp Asn 65 70 75 80 Pro Gin Lys Ser Tyr Phe Ile Arg Leu Tyr Ala Leu Gin Ala Gly Arg 85 90 95 Leu Leu Trp Glu Gin Glu Leu Tyr Ser Gin Leu Val Tyr Leu Thr Pro 100 105 110 Thr Pro Phe Phe His Thr Phe Ala Gly Asp Asp Cys Gin Val Gly Leu 115 120 125 Asn" Phe Ala Asp Glu Ser Glu Ala Gin Ala Phe Arg Ala Leu Val Gin 130 135 140 Glu Lys Ile Gin Lys Arg Asn Gin Arg Gin Ser Gly Glu Arg Arg Gin 145 150 155 160 Leu Pro Pro Pro Pro Ala Pro Ile Asn Glu Glu Arg Arg Gly Gly Leu 165 170 175 Pro Pro Val Pro Pro His Pro Gly Gly Asp His Gly Gly Pro Ser Gly 180 185 190 Gly Pro Leu Ser Leu Gly Leu Val Thr Val Asp Ile Gin Asn Pro Asp 195 200 205 Ile Thr Ser Ser Arg Tyr Arg Gly Leu Pro Ala Pro Gly Pro Gly Pro 210 215 220 Thr Asp Lys Lys Arg Ser Gly Lys Lys Lys Ile Ser Lys Ala Asp Ile 225 230 235 240 Gly Ala Pro Ser Gly Phe Lys His Val Ser His Val Gly Trp Asp Pro 245 250 255 Gin Asn Gly Phe Asp Val Asn Asn Leu Asp Pro Asp Leu Arg Ser Leu 260 265 270 Phe Ser Arg Ala Gly Ile Ser Glu Ala Gin Leu Thr Asp Ala Glu Thr 275 280 285 Ser Lys Leu Ile Tyr Asp Phe Ile Glu Asp Gin Gly Gly Leu Glu Ala 290 295 300 Val Arg Gin Glu Met Arg Arg Gin Glu Pro Leu Pro Pro Pro Pro Pro 305 310 315 320 Pro Cys Arg Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly 325 330 335 Gly Gly Gly Gly Gly Gin Pro Leu Arg Pro Pro Val Leu Gly Ser Asn 340 345 350 Lys Gly Arg Ser Pro Pro Leu Pro Pro Val Pro Met Gly Gly Ala Pro 355 360 365
centrée à sec sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 14,4 g de 3acétoxy-1-[bis-(4-chlorophényl)méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)(méthylsulfonyl) méthyl)méthyl sulfonylméthyl-(RS)]azétidine sous forme d'une huile jaune [Spectre de R.M.N'H (400 MHz, CDCI3, # en ppm) : 2,79 (s : 3H); 3,04 (AB, J = 9 Hz : 2H); 3,27 (d, J = 9 Hz : 1 H); 3,45 (s : 1 H); 3,81 (d, J = 9 Hz : 1 H); 4,32 (s : 1 H); 4,49 (s : 1 H); 6,88 (tt, J = 9 et 2,5 Hz : 1 H); de 7,20 à 7,35 (mt : 10H)].
La 1-[bis(4-chlorophényl)méthyl]azétidin-3-one peut être préparée selon le mode opératoire suivant : à une solution de 5,0 cm3 de chlorure d'oxalyle dans 73 cm3 de dichlorométhane refroidie à -78 C, on additionne une solution de 8,1 cm3 de diméthylsulfoxyde dans 17,6 cm3 de dichlorométhane. Après 0,5 heure à -78 C, on coule une solution de 16,0 g de 1-[bis(4chlorophényl)méthyl]azétidin-3-ol dissous dans 50 cm3 de dichlorométhane.
Après 5 heures à -78 C, 26,6 cm3 de triéthylamine sont ajoutés goutte à goutte et on laisse le mélange réactionnel revenir à température ambiante.
Après 16 heures, le mélange réactionnel est lavé par 4 fois 200 cm3 d'eau puis par 200 cm3 d'une solution saturée de chlorure de sodium, séché sur sulfate de magnésium, filtré et concentré à sec sous pression réduite (2,7 kPa). Le résidu obtenu est chromatographié sur colonne de gel de silice (granulométrie 0,04-0,06 mm, diamètre 9,2 cm, hauteur 21 cm), sous une pression de 0,5 bar d'argon avec un mélange d'acétate d'éthyle et cyclohexane (40/60 en volumes) comme éluants et en recueillant des fractions de 200 cm3. Les fractions 15 à 25 sont réunies puis concentrées à sec sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 8,9 g de 1-[bis(4-chlorophényl)méthyl]azétidin-3-one sous forme de cristaux jaunes pâle fondants à 111 C.
Le 1-[bis(4-chlorophényl)méthyl]azétidin-3-ol peut être préparée selon le mode opératoire décrit par KATRITZKY A. R. et coll., J. Heterocycl. Chem., (1994), 271 en partant de 35,5 g de chlorhydrate de [bis(4-
chlorophényl)méthyl]amine et 11,0 cm3 d'épichlorhydrine. On isole 9,0 g de 1- [bis(4-chlorophényl)méthyl]azétidin-3-ol.
Le chlorhydrate de [bis(4-chlorophényl)méthyl]amine peut être préparé selon la méthode décrite par GRISAR M. et coll., J. Med. Chem., 885 (1973).
Exemple 2 Les (-)-1-[bis(4-chlorophényl)méthyl)]-3-[(3,5-difluorophényl)(méthyl- sulfonyl)méthyl]-azétidine et (+)-1-[bis(4-chlorophényl)méthyl)]-3-[(3,5difluorophényl)(méthylsulfonyl)méthyl]-azétidine peuvent être préparées par séparation CLHP sur colonne chirale CHIRALPAK AS (granulométrie 20 m, hauteur 23 cm, diamètre 6 cm) de 0,52 g du racémate préparé à l'exemple 1.
En éluant avec le mélange heptane/éthanol (90/10) avec un débit de 80 cm 3/min et après avoir concentrées les fractions collectées à sec sous pression réduite (2,7 kPa), on obtient 110 mg de (-)-1-[bis(4- chlorophényl}méthyl)]-3-[(3,5-difluorophényl)(méthylsulfonyl)méthyl]-azétidine [[alpha]D] = -6,3 (C = 0,5M dans méthanol) sous la forme d'un solide blanc fondant à 178 C et 134 mg de (+)-1-[bis(4-chlorophényl)méthyl)]-3-[(3,5- difluorophényl) (méthylsulfonyl)méthyl]-azétidine [[alpha]D] = +5,8 (C = 0,5M dans méthanol) sous la forme d'un solide blanc fondant à 178 C.
Exemple 3 Le mélange des 2 diastéréoisomères formes A 1-[4-[(R*)-(4-chlorophényl)-{3- [(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthyl-(R)]azétidin-1-yl}méthyl]benzyl] pyrrolidine et 1-[4-[(R*)-(4-chlorophényl)-{3-[(3,5-difluorophényl)- méthylsulfonyl-méthyl-(S)]azétidin-1-yl}méthyl]benzyljpyrrolidine peut être préparé en opérant de la façon suivante : A une solution de 60 mg de 1-(R*)- [4-(4-chlorophényl)-{3-[(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl-méthylène]azétidin- 1-yl}méthyl)benzyl]pyrrolidine, isomère forme A dans 2 cm3 d'éthanol et 2 cm3 de dichlorométhane, on ajoute 20 mg d'hydroborure de sodium. Après
20 heures d'agitation à 20 C, on ajoute 0,25 cm3 d'eau, 20 cm3 de dichlorométhane, agite, et sèche le mélange sur sulfate de magnésium, puis filtre et concentre à sec sous pression réduite (2,7 kPa). Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (granulométrie 0,063- 0,200 mm, hauteur 7 cm, diamètre 1 cm), en éluant sous une pression de 0,1 bar d'argon avec du dichlorométhane puis avec un mélange de dichlorométhane et de méthanol (95/5 en volumes) et en recueillant des fractions de 5 cm3. Les fractions 13 à 18 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 38 mg du mélange des 2 diastéréoisomères formes A 1-[4-[(R*)-(4-chlorophényl)-{3-[(3,5- difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthyl-(R)]azétidin-1-yl}méthyl]benzyl] pyrrolidine, et 1-[4-[(R*)-(4-chlorophényl)-{3-[(3,5-difluorophényl)-méthyl- sulfonyl-méthyl-(S)]azétidin-1-yl}méthyl]benzyl]pyrrolidine, sous la forme d'une meringue blanche [Spectre de R.M.N 1H (400 MHz, CDCI3, # en ppm) : 1,77 (mt : 4H); de 2,40 à 2,60 (mt : 5H); 2,67 (s : 3H); de 3,10 à 3,25 (mt : 2H); 3,38 (mt : 1 H); de 3,50 à 3,70 (mt : 3H); 4,24 (s: 1 H); 4,25 (d, J = 11 Hz : 1 H); 6,83 (t large, J = 9 Hz : 1 H); 6,94 (mt : 2H); de 7,10 à 7,35 (mt : 8H)].
La 1-(R*)-[4-(4-chlorophényl)-{3-[(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl- méthylène]azétidin-1-yl}méthyl)benzyl]pyrrolidine, isomère forme A, peut être préparée en opérant de la façon suivante : A une solution de 0,32 g de 1- {(R*)-[4-(chlorométhyl)phényl]-(4-chlorophényl)méthyl}-3-[(3,5- difluorophényl)méthylsulfonyl-méthylène]azétidine, isomère forme A et 5 mg d'iodure de sodium dans 10 cm3 de dichlorométhane, on ajoute 50 mm3 de pyrrolidine. Après 20 heures d'agitation à 20 C, on ajoute au mélange 50 mm3 de pyrrolidine, agite pendant 8 heures puis ajoute à nouveau 50 mm3 de pyrrolidine et agite pendant 20 heures à 20 C. On lave le mélange réactionnel par de l'eau puis sèche la phase organique sur sulfate de magnésium, concentre à sec sous vide (2,7 kPa). Le résidu obtenu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (granulométrie 0,06-
0,200 mm, diamètre 1,2 cm, hauteur 30 cm), sous une pression de 0,1 bar d'argon en éluant avec du dichlorométhane puis avec un mélange dichlorométhane et méthanol (97,5/2,5 en volumes) et en recueillant des fractions de 3 cm3. Les fractions 12 à 40 sont réunies puis concentrées à sec sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 0,18 g de 1-(R*)-[4-(4- chlorophényl)-{3-[(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl-méthylène]azétidin-1- yl}méthyl)benzyl]pyrrolidine, isomère forme A, sous la forme d'une meringue blanche [a]2 365nm = -22,5 +/- 0,7 (c = 0,5 %; dichlorométhane) [Spectre de R. M.N. 'H (300 MHz, CDCI3, # en ppm) : 1,78(mt : 4H); 2,51 (mt : 4H); 2,81 (s : 3H); 3,58 (s : 2H); 3,84 (mt : 2H); 4,33 (mt : 2H); 4,50 (s : 1 H); 6,84 (tt, J = 9 et 2,5 Hz : 1 H); 6,98 (mt : 2H); de 7,20 à 7,40 (mt : 8H)].
La 1-{(R*)-[(4-chlorométhyl)phényl](4-chlorophényl)méthyl}-3-[(3,5- difluorophényl)méthyl-sulfonyl-méthylène]azétidine, isomère forme A, peut être préparée en opérant de la façon suivante : A une solution de 28,0 g du mélange des 2 diastéréoisomères (formes A) 1-{(R*)-[(4- chlorométhyl)phényl]-(4-chlorophényl)méthyl}-3-[(R)-(3,5-difluorophényl) méthylsulfonyl-méthyl)]azétidin-3-ol, et 1-{(R*)-[(4-chlorométhyl)phényl]-(4- chlorophényl)méthyl}-3-[(S)-(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl-méthyl] azétidin-3-ol, de 32 g de 4-diméthylaminopyridine, dans 500 cm3 de dichlorométhane, on ajoute 12,4 cm3 de chlorure de méthylsulfonyle. Après une heure d'agitation à 10 C, puis une heure à 20 C, le mélange réactionnel est lavé par 500 cm 3 d'eau, la phase organique séchée sur sulfate de magnésium et concentrée à sec sous pression réduite (2,7 kPa). Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (granulométrie 0,06- 0,200 mm, diamètre 6 cm, hauteur 30 cm), sous une pression de 0,2 bar d'argon en éluant avec du dichlorométhane et en recueillant des fractions de 250 cm3. Les fractions 9 à 25 sont réunies puis concentrées à sec sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 6,3 g de 1-{(R*)-[4- (chlorométhyl)phényl]-(4-chlorophényl)méthyl}-3-[(3,5-difluorophé-
nyl)méthylsulfonyl-méthylène]azétidine, isomère forme A, sous la forme d'une meringue blanche.
Le mélange des 2 diastéréoisomères (formes A) 1-{(R*)-[4-(chlorométhyl) phényl](4-chlorophényl)méthyl}-3-[(R)-(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl- méthyl)]azétidin-3-ol, et 1 -{(R*)-[4-(chlorométhyl)phényl](4-chlorophényl) méthyl}-3-[(S)-(3,5-difluorophényl)méthy-sulfonyl-méthyl)]azétidin-3-ol, peut être préparé en opérant de la façon suivante : A une solution de 0,20 g du mélange des 2 diastéréoisomères (formes A) 1-{(R*)-(4-chlorophényl)[4- (hydroxyméthyl)phényl]méthyl}-3-[(R)-(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl- méthyl)]azétidin-3-ol, et 1-{(R*)-(4-chlorophényl)[4-(hydroxyméthyl)phényl] méthyl}-3-[(S)-(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl-méthyl)]azétidin-3-ol, dans 10 cm3 de dichlorométhane, on ajoute 6 cm3 de chlorure de thionyle. Après 20 heures d'agitation à 20 C, on ajoute au mélange réactionnel 5 cm3 d'une solution aqueuse saturée d'hydrogénocarbonate de sodium, puis agite pendant 15 minutes. Le mélange est décanté, la phase organique est lavée avec de l'eau, séchée sur sulfate de magnésium, puis concentrée à sec sous pression réduite (2,7 kPa). Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (granulométrie 0,04-0,06 mm, diamètre 1,0 cm, hauteur 20 cm), sous une pression de 0,2 bar d'argon en éluant avec un mélange cyclohexane et acétate d'éthyle (75/25 en volumes) et en recueillant des fractions de 20 cm3. Les fractions 4 à 7 sont réunies puis concentrées à sec sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 0,17 g du mélange des 2 diastéréoisomères (formes A) 1-{(R*)-[4-(chlorométhyl)phényl]-(4-chlorophé- nyl)méthyl}-3-[(R)-(3,5-difluorophényl)méthylsulfonyl-méthyl)]azétidin-3-ol et 1-{(R*)-[4-(chlorométhyl)phényl]-(4-chlorophényl)méthyl}-3-[(S)-(3,5- difluorophényl)méthylsulfonyl-méthyl]azétidin-3-ol, sous la forme d'une meringue blanche.
Il a été considéré que le choix du peptide comprenant les acides aminés 46 à 56 (NKSGPESMNSS) de la pro-STh naturelle comme jonction entre ClpG et STh pouvait représenter la meilleure articulation pour favoriser un repliement conformationnel proche de celui de la toxine libre. Pour cela, le plasmide pProSTC28 a été obtenu en insérant entre les sites HpaI et SmaI de pSTC22 un oligonucléotide double brin (Sth33PC5/Sth33PC3) codant pour les acides aminés 46 à 53 (NKSGPESM) de la protéine ProSTa3 suivis des trois premiers acides aminés (NSS) de la toxine STh mature. Un résidu glycine sépare le tripeptide NSS et le reste de la séquence STh.
STh a également été introduite dans la région centrale variable V3 de la protéine ClpG. Pour cela, le plasmide pSTVIOS a été créé par insertion de l'oligonucléotide de synthèse double brin Sth69V3/Sth69V5, codant pour la toxine mature STh entière, dans le site SpeI de pSXlOS. Un autre type d'insertion dans V3, représenté par le plasmide pSTVD41, a été obtenu par délétion du
fragment BamHI/BglII de pSTVIOS codant pour les acides aminés 204 à 215 de ClpG (Figure 1).
Six hybrides différents comprenant une séquence étrangère de 17 à 28 acides aminés ont été ainsi génétiquement construits. Une chimère possède STh à l'extrémité N-terminale de ClpG, deux chimères possèdent STh dans la région centrale V3, et trois autres, à l'extrémité C-terminale.
Pour pallier une éventuelle instabilité ou toxicité des constructions génétiques dues à un niveau d'expression trop élevé lié au nombre de copies multiples des plasmides, il a été essayé de réintroduire dans l'opéron clp porté par le plasmide pEH524 les gènes de fusion clpG-sth à la place du gène clpG sauvage.
La figure 2 représente le sous clonage des différents gènes de fusion de l'opéron clp. Dans la figure 2, les blocs représentent les différents gènes de l'opéron clp contenus dans le fragment HindIII/EcoRI de 8,5 kb. La partie noircie de chaque bloc désigne la séquence signal.
La flèche horizontale indique le sens de la transcription.
Les noms des gènes sont indiqués en dessous de chaque bloc.
Le gène clpG a été remplacé dans l'opéron clp par les différents gènes de fusion provenant des plasmides pSTN24 (1), pSTC22 (2), pProSTC28 (3) et pSTVD41 (4).
Ainsi, les plasmides pEHSTN24 et pEHSTC22 ont été obtenus en remplaçant le fragment SwaI/HpaI de pEH524 respectivement par les fragments EcoRV/Ec1136II de pSTN24
et pSTC22. Les plasmides pEHProSTC28 et pEHSTVD41 ont été construits en substituant le fragment MunI/HpaI de pEH524 respectivement par les fragments MunI/Ecl136II de pProSTC28 et pSTVD41. De nombreuses tentatives pour placer les gènes de fusion portés par pSTCl7 et pSTVIOS dans l'opéron clp sont restées vaines. Par conséquent, ces deux plasmides ont été les seuls à être transcomplémentés avec le plasmide pDSPH524 (Tableau 2).
Toutes les constructions génétiques ont été vérifiées par séquençage après purification des ADN recombinants.
2) Détection des hybrides dans le milieu extracellulaire.
La présence des protéines hybrides dans le milieu extracellulaire a été étudiée à partir de surnageants issus de cultures en milieu solide ou liquide des bactéries DH5[alpha] recombinantes hébergeant les plasmides présentés dans le tableau 2.
La figure 3 représente l'analyse réalisée par "Western" immunomarquage en conditions dénaturantes (SDSPAGE), en utilisant l'antisérum anti-ClpG (Figure 3A et B) et différents anticorps monoclonaux (11C, 20C1) dirigés contre la toxine STa (Figure 3C et D).
L'antigénicité des protéines de fusion a été analysée à partir des surnageants des bactéries DH5a recombinantes cultivées en milieu liquide (A) ou gélosé (B,
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus contenus dans l'outil logiciel de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison, Wisconsin De manière tout à fait préférée, le pourcentage d'identité entre deux séquences est effectué à l'aide du logiciel BLAST (version BLAST 2. 06 de Septembre 1998), en utilisant exclusivement les paramètres par défaut (S F ALTSCHUL et al., (1990). SF ALTSCHUL et al.,1997).
La séquence génomique du gène RRS1-R est référencée comme la séquence SEQ ID N 1.
Un autre objet de l'invention est un acide nucléique qui comprend ou est constitué de la séquence SEQ ID N 1.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 15 nucléotides consécutifs du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 Chacun des acides nucléiques génomiques selon la présente invention peut être aisément obtenu par l'homme du métier qui en connaît sa séquence nucléotidique divulguée dans la présente description
L'homme du métier peut également reproduire un quelconque des acides nucléiques génomiques selon l'invention en construisant, sur la base des séquences divulguées dans la présente description, des amorces oligonucléotidiques capables d'amplifier tout ou partie de ces acides nucléiques à partir d'un génome de plante, préférence d'un génome d'Arabidopsis thaliana, ou encore à partir d'une banque de vecteurs (YACS, BACS, cosmides) contenant des inserts génomiques d'une plante, et préférentiellement d'Arabidopsis thaliana.
Après amplification à l'aide des amorces appropriées, les différents acides nucléiques amplifiés sont alors soumis à une étape de ligation dans un vecteur plasmidique en vue d'obtenir l'acide nucléique génomique désiré, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Par ailleurs, l'isolement du fragment d'ADN contenant l'insert génomique désiré peut être obtenu par sous-clonage à partir d'une banque (YACS, BACS, cosmides) contenant des inserts génomiques d'une plante, et préférentiellement d'Arabidopsis thaliana.
La séquence du gène RRS1-R comprend sept exons et six introns, ainsi que des régions potentiellement régulatrices localisées respectivement du côté 5' du premier exon et du côté 3' du dernier exon, les caractéristiques structurales de ces exons et introns étant détaillées dans les tableaux 1 et 2 ci-après TABLEAU 1: Séquence des exons du gène RRSI-R