INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
mélange diphasique issu du refroidisseur condenseur 3.3 à environ amené au séparateur 4.3 via la conduite 28. L'eau condensée évacuée du séparateur 4.3 par la conduite 29 alors que la phase gazeuse est disponible dans la conduite 30 pour alimenter une unité avale de purification de CO et de recyclage d'H2 et de L'installation de la Figure est optimisée dans la mesure où chacun des échangeurs de chaleur 2.1, 2.2 2.3 utilisé l'énergie calorifique dissipée lors du refroidissement des flux gazeux sortant des réacteurs 1.1, 1.2 et 1.3 pour le chauffage des flux gazeux récupérés en sortie des condenseurs 4.1, 4.2 et 4.3.
Les compositions des mélanges gazeux en différents points de l'installation sont reportés dans le tableau 3 ci-dessous, en pourcentages molaires.
TABLEAU3 Constituants 116l' 111811 "2611 1130" du mélange CO 18,81 24,96 26,22 C02 33,33 18,40 14,99 15,74 H2 66,67 55,60 54,94 57,70 H20 7,19 5,11 0,34 La Figure 4 est une coupe schématique d'un réacteur 69 pour la mise en oeuvre d'un procédé selon l'invention, dans lequel les étapes consistant à traiter le mélange gazeux à une température de 300-6500 C en présence du catalyseur ZnO-Cr2O3 et à éliminer l'eau formée, sont réalisées de façon concomitante.
Le réacteur 69 est constitué d'une enceinte close 70 à axe vertical, fermée par une enveloppe externe 71 équipée, tout le long de l'enceinte, d'un moyen de refroidissement 72 dans lequel circule un liquide de refroidissement. A l'intérieur de l'enceinte close 70 est disposé un lit catalytique 73 garni d'un catalyseur à base de ZnO et de Cr203 et comprenant pas de fer. Le lit catalytique 73, de forme cylindrique, est disposé sein du réacteur 69, le long de son axe vertical, et est isolé du reste de l'enceinte par des grilles 74 et 75 en ses parties supérieure et inférieure et par une couche de matériau thermoisolant 76, perméable à la vapeur d'eau, sur toute sa surface latérale. Un échangeur de chaleur 77 positionné le long de l'axe du réacteur, au sein du lit catalytique, dans lequel circule un fluide caloporteur, fournit la chaleur nécessaire pour compenser les pertes thermiques vers l'enceinte 71 et la chaleur nécessaire à la réaction endothermique.
Ledit échangeur de chaleur 77, disposé le long de l'axe vertical du réacteur 69 et dans lequel circule un liquide de chauffage, traverse part en part le lit catalytique 73. Plus précisément, le serpentin de chauffage traverse l'extrémité supérieure de la double enveloppe 71, puis la grille 75, débouche dans le lit catalytique 73 qu'il traverse. Le serpentin de chauffage 77 traverse la grille 74 à l'extrémite inférieure du lit catalytique, puis l'extrémité inférieure de la double enveloppe Le réacteur comprend en outre une conduite d'alimentation 78 en charge gazeuse, laquelle traverse l'extrémité supérieure de la double enveloppe 71, le long de l'axe central du lit catalytique. Les parois latérales de la conduite 78 s'évasent en forme de cône au-dessus de la grille 75 de façon à distribuer la charge gazeuse la totalité de la section du lit catalytique. De même, le réacteur comprend une conduite d'évacuation 79 du mélange gazeux prenant naissance juste au-dessous de la grille 74, située à l'extrémité inférieure du lit catalytique, traversant la double enveloppe 71 à son extrémité inférieure et dont la forme est exactement symétrique à celle de la conduite 78.
Le matériau isolant 76 et la double enveloppe 71 délimitent une enceinte annulaire 80 destinée à la récupération de l'eau formée. A l'extrémité inférieure de l'enceinte annulaire 80, une conduite 81 d'évacuation de l'eau traverse la double enveloppe 71.
En cours de production, le réacteur 69 est alimenté en continu en mélange gazeux à base d'hydrogène et d'anhydride carbonique par la conduite 78. Le mélange gazeux circule à travers le lit catalytique 73 où il est amené à réagir, le lit catalytique étant maintenu en permanence à une température de 300-650" C au moyen de l'échangeur de chaleur 77.
La vapeur d'eau formée près de la surface latérale du lit catalytique traverse le matériau isolant 76 et vient se condenser à la surface interne de la double enveloppe 71. Un gradient de pression partielle de vapeur d'eau apparaît dans la direction radiale perpendiculaire à l'axe vertical du lit catalytique. Sous l'effet ce gradient de pression partielle, la vapeur d'eau formée au sein du lit catalytique migre jusqu'à l'enceinte annulaire 80 où elle est condensée. L'eau formée ainsi évacuée au fur et à mesure de sa formation.
Ainsi, le gaz récupéré par la conduite 79 est pratiquement débarassé de la vapeur d'eau formée pendant la réaction.
Pour la mise en oeuvre de ce mode de réalisation particulier, l'homme métier pourra développer un matériau thermoisolant spécifique, perméable à vapeur d'eau, ou utiliser les matériaux appropriés disponibles dans la technique.
Exemple 32 La (RS)-{1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)- méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-3-yl}-éthyl-amine peut être préparée selon l'exemple 29 à partir de 50 mg de 1-[bis(4-chlorophényl)-méthyl)]-3-[(3,5difluorophényl)-(méthylsulfonyl)-méthylène]-azétidine, 0,5 cm3 de dichlorométhane, et 0,3 cm3 d'une solution d'éthylamine dans le tétrahydrofuranne (solution 2M). On obtient la (RS)-{1-[bis-(4-chlorophényl)- méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthylJ-azétidin-3-yl}-éthyl- amine sous forme d'une gomme jaune [Spectre de R.M.N. 1H (300 MHz, CDC13, 8 en ppm) : 1,22 (t, J = 7 Hz : de 2,70 à 2,85 (mt : 2H); 2,77 (s : 3H); de 2,95 à 3,10 (mf : 1H); 3,05 (d, J = 8,5 Hz : 1H); 3,17 (d, J = 8,5 Hz : 1 H); 3,33 (d, J = 8,5 Hz : 1 H); 3,40 (d, J = 8,5 Hz : 1 H); 4,30 (s : 1 H); 4,54 (s : 1 H); 6,89 (tt, J = 9 et 2,5 Hz : 1 H); de 7,15 à 7,30 (mt : 8H); 7,34 (mt : 2H].
Exemple 33 La (RS)-N-{1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)- méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-3-yl}-N',N'-diméthyl-ethane-1,2-diamine peut être préparée selon l'exemple 29 à partir de 50 mg de 1-[bis(4-chlorophényl)- méthyl)]-3-[(3,5-difluorophényl)-(méthylsulfonyl)-méthylène]-azétidine , 0,5 cm3 de dichlorométhane, et 0,0659 cm3 de N,N-diméthyléthylènediamine. On obtient la (RS)-N-{1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)- mëthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-3-yl}-N',N'-diméthyl-ethane-1,2-diamine sous forme d'une meringue blanche [Spectre de R.M.N 1H (300 MHz, CDCl3, # en ppm) : 2,32 (s : 6H); 2,53 (t, J = 6 Hz : 2,79 (s : 3H); 2,94 (t, J = 6 Hz : 2H); 3,06 (d, J = 8,5 Hz : 1 H); 3,16 (d, J = 8,5 Hz : 1 H); 3,30 (d, J = 8,5 Hz : 1 H); 3,41 (d, J = 8,5 Hz : 1 H); 4,30 (s : 1 H); 4,55 (s : 1 H); 6,88 (tt, J = 9 et 2,5 Hz : 1 H); 7,21 (s : 4H); 7,24 (s : 4H); 7,34 (mt : 2H)].
Exemple 34 La (RS)-1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)-méthanesulfonyl-méthyl]-3-méthyl-azétidine peut être préparée de la manière suivante : A une suspension de 400 mg de magnésium en tournures dans 2,5 cm3 de diéthyléther anhydre, est ajouté, sous atmosphère d'argon, à une température voisine de 24 C, quelques gouttes d'iodure de méthyle pur puis 1 cm3 d'iodure de méthyle en solution dans 22,5 cm3 de diéthyléther. La suspension obtenue est agitée 30 minutes à une température voisine de 24 C, puis refroidie à une température voisine de 0 C par un mélange glace + eau. On ajoute, à une température voisine de 0 C, 1,65 g de complexe CuBr.Me2S, puis le mélange réactionnel est agité 15 minutes à une température voisine de 0 C. A la suspension jaune obtenue est ajoutée, à une température voisine de 0 C, une solution de 0,5 g de 1-[bis(4- chlorophényl)-méthyl)]-3-[(3,5-difluorophényl)-(méthylsulfonyl)-méthylène]- azétidine dans un mélange de 1 cm3 de tétrahydrofuranne et 1 cm3 de diéthyléther. La suspension obtenue est agitée 4 heures à une température voisine de 0 C, puis à une température voisine de 25 C pendant 16 heures. La suspension noire obtenue est diluée avec 100 cm3 d'acétate d'éthyle et 15 cm3 d'une solution aqueuse saturée en chlorure d'ammonium. Le mélange réactionnel est filtré sur verre fritté garni de Célite, le résidu solide est rincé avec de l'acétate d'éthyle puis de l'eau. Après décantation du filtrat, la phase organique est séparée, lavée avec de 10 cm3 d'eau, 10 cm3 d'une solution aqueuse saturée en chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium, filtré sur verre fritté, et concentrée sous pression réduite (20 mbar) à une température voisine de 43 C. On obtient ainsi 550 mg d'une meringue orangée qui est purifiée par chromatographie préparative sur couche mince de silice [14 plaques préparatives Merck Kieselgel 60F254 ; 20x20 cm ; épaisseur 0,5 mm; dépôt en solution dans le dichlorométhane], en éluant par un mélange méthanol-dichlorométhane (0,5-99,5 en volumes). Après élution de la zone correspondant au produit recherché par un mélange méthanol-
dichlorométhane (15-85 en volumes), filtration sur verre fritté, puis évaporation des solvants sous pression réduite à une température voisine de 40 C, on obtient 290 mg d'une meringue blanche qui est dissoute dans 15 cm3 de dichlorométhane anhydre et mise en réaction avec 500 mg de résine thiophénol (fournisseur Argonaut, 1,45 mMol/g) et 1 g de résine éthylène-diamine (0.8mMol/g) pendant 38 heures à une température voisine de 20 C. La suspension est filtrée sur verre fritté, les résines sont rincées avec du dichlorométhane, et le filtrat est concentré sous pression réduite (5 mbar) à une température voisine de 43 C. On obtient 272,8 mg d'une meringue blanche qui est dissoute dans 2 cm3 de dichlorométhane et mise en réaction avec 1 cm3 d'éthylènediamine pendant 72 heures à une température voisine de 24 C. Le résidu brut obtenu est repris avec 50 cm3 d'acétate d'éthyle et 10 cm3 d'eau. Après décantation, la phase organique est lavée avec 10 cm3 d'un solution aqueuse d'acide chlorhydrique 1 N, 10 cm3 d'une solution aqueuse saturée en hydrogénocarbonate de sodium, 10 cm3 d'eau, 10 cm3 d'une solution aqueuse saturée en chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée sur verre fritté, et concentrée sous pression réduite (8 mbar) à une température voisine de 42 C. On obtient 263,4 mg d'une meringue jaune-pâle qui est purifiée par chromatographie préparative sur couche mince de silice [7 plaques préparatives Merck Kieselgel 60F254; 20x20 cm ; épaisseur 0,5 mm ; en solution dans le dichlorométhane], en éluant par un mélange méthanol-dichlorométhane (0,5-99,5 en volumes).
Après élution de la zone correspondant au produit recherché par un mélange méthanol-dichlorométhane (15-85 en volumes), filtration sur verre fritté, puis évaporation des solvants sous pression réduite à une température voisine de 40 C, on obtient 191,4 mg de (RS)-1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-[(3,5- difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthyl]-3-méthyl-azétidine sous forme d'une meringue blanche [Spectre de R.M.N 1H (300 MHz, CDCl3, # en ppm) : (s : 3H); 2,67 (s : 3H); 2,74 (d large, J = 7,5 Hz : 1 H); 2,93 (d, J = 7,5 Hz :
1 H); 3,21 (d large, J = 7,5 Hz : 1 H); 3,46 (d, J = 7,5 Hz : 1 H); 4,33 (s large : 2H); 6,87 (tt, J = 9 et 2,5 Hz : 1 H); 7,12 (mt : 2H); de 7,15 à 7,35 (mt : 8H].
Exemple 35 La (RS)-1-(2-{1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)- méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-3-ylsulfanyl}-éthyl)-4-méthyl-pipérazine peut être préparée de la manière suivante : A une solution de 99 mg de 1 -[bis(4chlorophényl)-méthyl)]-3-[(3,5-difluorophényl)-(méthylsulfonyl)-méthylène]azétidine dans 2 cm3 de dichlorométhane, à une température voisine de 20 C, on ajoute 128 mg de 1-(éthanethiol-2-yl)-4-méthyl-pipérazine. Après une nuit d'agitation à une température voisine de 20 C, on ajoute 706 mg de résine de Merrifield (1,7 mMol/g). Après une nuit d'agitation à une température voisine de 20 C, la suspension est filtrée, et la résine est rincée avec 2 fois 1 cm3 de dichlorométhane. Le filtrat est concentré sous pression réduite. On obtient ainsi 125 mg d'une huile blanche que l'on purifie par chromatographie sur silice (13 cm3 de silice 0,06-0,2 mm), en éluant avec un mélange méthanol-dichlorométhane (0-100 puis 5-95 en volumes). Les fractions ne contenant que le produit cherché sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite. On obtient ainsi 62 mg de (RS)-1-(2-{1-[bis-(4- chlorophényl)-méthyl]-3-[{3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin- 3-ylsulfanyl}-éthyl)-4-méthyl-pipérazine sous forme de cristaux blancs [Spectre de R.M.N 1H (300 MHz, (CD3)2SO d6, # en ppm) : 2,15 (s : 3H); 2,30 et 2,41 (2mfs : 8H); 2,55 (mt : 2H); 2,85 (s : 3H); 3,02 (mt : 2H); 3,09 (d, J = 8,5 Hz : 1 H); 3,38 (d, J = 8,5 Hz :1H); 3,42 (d, J = 8,5 Hz : 1 H); 3,79 (d, J = 8,5 Hz : 1 H); 4,68 (s : 1 H); 5,37 (s : 1 H); de 7,30 à 7,50 (mt : 11H)].
Exemple 36 La (RS)-(2-{1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)- méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-3-ylsulfanyl}-éthyl)-diméthyl-amine peut être préparée en opérant comme dans l'exemple 35, à partir de 99 mg de 1-
[bis(4-chlorophényl)-méthyl)]-3-[(3,5-difluorophényl)-(méthylsulfonyl)- méthylène]-azétidine , 2 cm3 de dichlorométhane, 84 mg 2-(diméthylamino)- éthanethiol, et 706 mg de résine de Merrifield (1,7 mMol/g). On obtient ainsi 36 mg (RS)-(2-il -[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)- méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-3-ylsulfanyl}-éthyl)-diméthyl-amine sous forme de poudre blanc cassé.
Exemple 37 La (RS)-{1-[[4-(chlorométhyl)phényl]-(4-chlorophényl)méthyl]-3-[(3,5- difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-3-yl}-éthyl-amine peut être préparée de la manière suivante: Une solution de 40 mg de (RS)-{1-[[4- (chlorométhyl)phényl]-(4-chlorophényl)méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)- méthylsulfonyl-méthylène]-azétidine dans 0,1125 cm3 d'éthylamine (solution 2M dans le tétahydrofuranne), contenant un grain d'iodure de sodium, est agitée à une température voisine de 20 C pendant 2 heures, puis diluée avec 20 cm3 d'acétate d'éthyle et 5 cm3 d'une solution aqueuse saturée en hydrogénocarbonate de sodium. La phase organique séparée est lavée avec 5 cm3 d'eau, 5 cm3 d'une solution aqueuse saturée en chlorure de sodium, séchée sur sulfate de magnésium, filtrée sur verre fritté, et concentrée sous pression réduite (15 mbar) à une température voisine de 40 C. L'huile jaune obtenue est purifiée par chromatographie préparative sur couche mince de silice [2 plaques préparatives Merck Kieselgel 60F254 ; 20x20 cm ; épaisseur 0,5 mm ; en solution dans le dichlorométhane], en éluant par un mélange méthanol-dichlorométhane (3-97 en volumes). Après élution de la zone correspondant au produit recherché par un mélange méthanoldichlorométhane (15-85 en volumes), filtration sur verre fritté, puis évaporation des solvants sous pression réduite à une température voisine de 40 C, on obtient 17 mg de (RS)-{1-[[4-(chlorométhyl)phényl]-(4chlorophényl)méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-
3-yl}-éthyl-amine sous forme d'un solide blanc [Spectre de R.M.N. 1H (400 MHz, (CD3)2SO d6, # en ppm) : 1,11 (t, J = 7 Hz : de 2,10 à 3,55 (mt : 8H); 2,95 (s : 3H); 4,44 (s : 1 H); 5,09 (s : 1 H); de 7,10 à 7,55 (mt : 11 H)].
La (RS)-{1-[[4-(chlorométhyl)phényl]-(4-chlorophényl)méthyl]-3-[(3,5- difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthylène]-azétidine peut être préparée de la manière suivante : A une solution de 590 mg de (RS)-[4-((4-Chlorophényl)-{3- [(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthylene]-azétidin-1-yl}-méthyl)-phényl]- méthanol dans 5 cm3 de dichlorométhane anhydre, on ajoute, à une température voisine de de 21 C, 0,525 cm3 de N,N-diisopropyl-éthylamine puis 0,19 cm3 de chlorure de méthane sulfonyle. Après 1 heure à une température voisine de 21 C, on ajoute 2 cm3 d'un mélange méthanol/dichlorométhane (2,5/97,5 en volumes), puis après 5 minutes, le mélange réactionnel est concentré sous pression réduite (20mbar) à une température voisine de 40 C. La meringue jaune obtenue est purifiée par chromatographie sur silice (50 g de silice 0,06-0,2 mm contenus dans une colonne de diamètre 3 cm), en éluant avec un mélange méthanol/dichlorométhane (0/100 puis 1/99 en volumes) en recueillant des fractions de 10 cm3. Les fractions ne contenant que le produit cherché sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite. On obtient ainsi 421,2 mg de (RS)-{1-[[4-(chlorométhyl)phényl]-(4-chlorophényl)méthyl]-3- [(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthylène]-azétidine sous forme d'une meringue jaune.
Le RS)-[4-((4-Chlorophényl)-{3-[(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl- méthylene]-azétidin-1-yl}-méthyl)-phényl]-méthanol peut être préparé de la manière suivante : A une solution de 420 mg de (RS)-4-((4-chlorophényl)-{3- [(3,5-difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthylène]azétidin-1-yl}méthyl)- benzaldéhyde dans 7 cm3 de méthanol, refroidie à une température voisine de 0 C (glace + eau) sont ajoutés par portions 49 mg de tétrahydroborure de sodium. Après 2 heures à une température voisine de 0 C, le milieu
réactionnel est concentré sous pression réduite (15 mbar) à une température voisine de 35 C. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur silice (40 g de silice 0,06-0,2 mm contenus dans une colonne de diamètre 3 cm), en éluant avec un mélange méthanol/dichlorométhane (1/99 puis 2,5/97,5 en volumes) en recueillant des fractions de 10 cm3. Les fractions ne contenant que le produit cherché sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite. On obtient ainsi 418 mg de RS)-[4-((4-Chlorophényl)-{3-[(3,5- difluorophényl)-méthylsulfonyl-méthylene]-azétidin-1-yl}-méthyl)-phényl]- méthanol sous forme d'une meringue blanche.
Exemple 38 La (RS)-{1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-[(3,5-bis-trifluorométhyl-phényl)- méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-3-yl}-isobutyl-amine peut être préparée selon l'exemple 29 à partir de 50 mg de 1-[bis(4-chlorophényl)-méthyl)]-3-[(3,5-bis- trifluorométhyl-phényl)-(méthylsulfonyl)-méthylène]-azétidine, 0,5 cm3 de dichlorométhane, et 0,05 cm3 d'isobutylamine. On obtient 57 mg de la (RS) - {1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-[(3,5-bis-trifluorométhyl-phényl)- méthylsulfonyl-méthyl]-azétidin-3-yl}-isobutyl-amine sous forme d'une meringue jaune-pâle [Spectre de R.M.N 1H (300 MHz, CDCl3, 8 en ppm) : 1,01 (d, J = 7,5 Hz : 6H); 1,76 (mt : 1 H); 2,47 (dd, J = 10,5 et 7,5 Hz : H); de 2,75 à 2,85 (mt : 1 H); 2,79 (s : 3H); 2,82 (dd, J = 10,5 et 5,5 Hz : H); 3,00 (d, J = 9 Hz : 1 H); 3,10 (d, J = 9 Hz : 1 H); 3,31 (d, J = 9 Hz : 1 H); 3,40 (d, J = 9 Hz : 1 H); 4,30 (s : 1 H); 4,74 (s : 1 H); 7,13 (d, J = 8,5 Hz : 2H); de 7,15 à 7,25 (mt : 6H); 7,96 (s large : 1 H); 8,31 (s large :2H)].
Exemple 39 La (RS)-1-[bis-(4-chlorophényl)-méthyl]-3-cyano-3-[(3,5-difluorophényl)- méthylsulfonyl-méthyl]-azétidine peut être préparée de la manière suivante : A une solution de 99 mg de 1-[bis(4-chlorophényl)-méthyl)]-3-[(3,5- difluorophényl)-(méthylsulfonyl)-méthylène]-azétidine dans 2,5 cm3 de
Elles peuvent également être utilisées pour protéger et stabiliser un court segment d'ARN, par exemple une portion du génome d'un virus à ARN. Les particules ainsi construites miment ledit virus à ARN, mais sont absolument non-infectieuses. Elles peuvent être utilisées en tant que témoin positif (traceur) parfaitement calibré dans tout le processus de détection dudit virus, par exemple dans un but de diagnostic, ou de contrôle de l'épuration d'un fluide biologique (par exemple, sérum), ou d'un aliment (par exemple, coquillage). En particulier, lors d'une détection par RT-PCR, il est possible de choisir le fragment d'ARN traceur de façon à ce qu'il soit amplifié à l'aide des mêmes amorces que le virus à détecter, mais qu'il s'en différencie soit par une légère différence de taille, soit par l'adition ou la suppression d'un site pour une endonuléase de restriction.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de préparation et d'utilisation de particules pseudovirales conformes à l'invention. Il doit être bien entendu toutefois que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'Invention dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : CONSTRUCTION DE PARTICULES PSEUDOVIRALES COMPRENANT UNE PROTEINE HETEROLOGUE FUSIONNEE AVEC UN MUTANT DE DELETION DE LA PROTEINE VP2 Le plasmide pBSRF2 [LABBE et al., Journal of Virology, 65,2946-2952, (1991)] constitué par la séquence complète du gène de la protéine VP2 du rotavirus bovin (souche RF), insérée dans le plasmide pBluescript (STRATAGENE) est utilisé comme matériel de départ.
Un plasmide codant un mutant de VP2 (VP2A92) dépourvu des 92 premiers acides aminés, est construit à partir de pBSRF2, selon le protocole décrit par ZENG et al.
[Journal of Virology, 72,201-208, (1998)]. Ce plasmide dénommé pBS2C24A, est utilisé pour la construction de
plasmides codant des protéines chimériques conformes à l'invention.
Une construction constituée par la séquence codante de VP2A92 précédée du lieur TCTAGAGGATCC a été insérée dans le vecteur pBluescript (STRATAGENE) et dénommée . pBSJA16. Cette même construction a été aussi insérée dans les vecteurs pCDNA3 (INVITROGEN), pVL1392 (INVITROGEN), et pFastBac (LIFE TECHNOLOGY) ce qui conduit aux plasmides dénommés respectivement pCDNA3JA16, pVL1392JA16 et pFastbacJA16. i) Construction des vecteurs de transfert Fusion avec différents fragments de la protéine F du virus respiratoire syncitial (VRS) Le plasmide pRSVFA codant pour l'intégralité de la protéine F du VRS (sérotype A souche Long) a été décrit par WERTZ et al. [Journal of Virology, 60,293-301, (1987) ].
* Un fragment d'ADN (construction J100) correspondant à la séquence codant les acides aminés 189290 de la protéine F du virus respiratoire syncitial (VRS), flanquée des sites de restriction SalI et XbaI est obtenu par PCR à partir du plasmide pRSVFA, à l'aide des amplimères : deb189 . 5'GAATTCGTCGACATGAGCAAAGTGTTAGACCTCA3' et fin290 : 5'CTTAAGTCTAGATGATAGAGTAACTTTGCTGTC3' Ce fragment est inséré dans pBSJA16 entre les sites SalI et XbaI. L'ensemble de cette construction est ensuite transféré dans pFastBac entre les sites SalI et KpnI. Le plasmide obtenu est dénommé pFastBac190-289JA16.
* Un fragment d'ADN (construction J261) correspondant à la séquence codant les acides aminés 190-450 de la protéine F du virus respiratoire syncitial (VRS), obtenu par PCR et flanqué des sites de restriction SalI et XbaI a été inséré dans pFastbacJA16 aux sites SalI et XbaI.
Le plasmide obtenu est dénommé : pFastbac190-450JA16.
* Un fragment d'ADN (construction J61) correspondant à la séquence codant les acides aminés 215-275 de la protéine F du virus respiratoire syncitial (VRS), flanquée des sites de restriction SphI et BamHI est obtenu
par PCR à partir du plasmide pRSVFA, à l'aide des amplimères : 5'GCATGCGTCGACATGTCAAATATAGAAACTGTG3' et 5'GGATCCTCTAGAGGACATTAACTTCTTCTG3' * Un fragment d'ADN (construction J21) correspondant à la séquence codant les acides aminés 420-440 de la protéine F du virus respiratoire syncitial (VRS), flanquée des sites de restriction SphI et BamHI est obtenu par PCR à partir du plasmide pRSVFA, à l'aide des amplimères : GCATGCGTCGACATGACTAAATGTACAGCATCC et GGATCCTCTAGAATCGCACCCGTTAGAAAA.
Ces 2 derniers fragments ont été introduits dans le plasmide pBSRF2A92 puis transférés dans pVL1392 (PHARMINGEN). Ces plasmides obtenus ont été dénommés respectivement pVLJA61 et pVLJA21.
Fusion avec la Green Fluorescent Protein (GFP) Un fragment d'ADN correspondant à la séquence codant la GFP (longue de 265 acides aminés), est obtenue à partir du plasmide pEGFPCl (CLONTECH) par l'action séquentielle des enzymes suivantes : NheI, polymérase de Klenow, XbaI.
Cette construction est introduite entre les sites NotI (rendu franc par le fragment de Klenow de Pol I) et XbaI du plasmide pVL1392JA16, situés en amont de la séquence codant VP2A92. Le plasmide obtenu est dénommé pVLJA16PEGFPCl.
Ces différentes constructions sont schématisées sur la Figure 1. ii) Construction des baculovirus recombinants exprimant les protéines chimériques : Chacun des plasmides de transfert décrits ci-dessus est utilisé pour co-transfecter des cellules Sf9 de Spodoptera frugiperda avec de l'ADN linéarisé du baculovirus AcNPV. Les baculovirus recombinants sont criblés par la méthode des dilutions limites.
séquence signal de ClpG ont été réalisées (Figure 11). Ces dernières ont pour but d'obtenir des plasmides recombinants qui diffèrent des plasmides pSTN24, pSTC22, pProSTC28 et pSTC17 (Figure 1) seulement par l'absence du gène clpG.