INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le promoteur MPrl200 (SEQ.ID19) a été construis par clonage dans le vecteur pGEM3Z-1 (décrit dans la section 2. 1 de l'exemple 2), des deux fragments promoteurs suivants : - Le fragment 5' MPrl200 (SEQ.ID19) , synthétisé par FCR, a été amplifié à partir de 5 ng d'ADN matrice pMRT1139 (décrit dans la section 3.9 de l'exemple 3) à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides 5' T.Cg.=,A'l'1CCTCgACTgq 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3' possédant le site de restriction Xoal, en présence de 50 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase (IX) et de 2 U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs). La réaction d'amplification par FCR. a été réalisée canes le thermocycleur GeneAmp PCR System 9730 .
Après une dénaturation à 94 C pendant 10 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 53 C fendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72'" C pendant min. Le
fragment d'ADN issu de 1 ' amplif icaLion PCP a 6:~,'; Isolé sur un gel d'agarose à 1 . 5 ci l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolysé par Ecc21 perdant 1 h à z..
Le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l'action de 20 U du fragment Ken()'d (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en prése nce de 60 nmoles de chacun des dNTPs, ic 12 . de tampon Tris-HCL 500 r1. pH 7.5 - MgC12 500 rr H et 6 un de DIT à ; M purs digéré par XbaI pendant 1 h à 37 C.
- Le fragment 3' MPrl200 (SEQ.1D19) , synthétisé par PCR, a été amplifié à partir de 5 ng d'ADN matrice pMKT1138 à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 cligàés:,=~yrnuc iéctp des 5' ATCggAATTCTAgACgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' contenant le site de restriction EcoRI et XbaI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI, en présence de 50 nmcles de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase ( 1X; et de U de Vent ADN polymérase (New England Biolabs) dans le t herrT:ccyc 1 eu r GeneAmp PCR System 9700 dans les mêmes conditions que le fragment 5' MPr120C (SEQ.ID19) . Le fragment d'ADN issu de l'amplification FCR a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5 à l'aide du Kilt Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolyse successivement par Xbal et BamHI pendant 1 h à 37 C.
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 ng du fragment 5' MPrl200 (SEQ.ID19) , 5C ng du fragment 3' MPrl200 (SEQ,ID19) ainsi traités et 50 ng de plasmide pGem3Z-l dans un mélange réactionnel ce 10 ul, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de 14 ADN ligase (New England 3io- abs) , dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment. Des bâcher Les Eseh?rjchi(1 coli Di-15a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu 1B supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à Laide de 10 pmoles de chacun des e,1::.qüdé,c;'.::':"":G21éu'::.ides 5' ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' dans le thermocycleur
GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1200 et la séquence promotrice MPrl200 (SEQ.ID19) schématisée dans à zing. IV a été vérifiée par séquençage.
3.11. Construction du promoteur MPrl213 (SEQ. ID20) .
Le promoteur MPrl213 (SEQ.ID20) résulte de l'insertion en amont de la position-225 pb de MPR1128 :SEQ.ID04) (décrit dans la sect ion 2.2 de l'exemple 2), d'une séquence de 79 pb qui inclue la duplication de la boîte Céréale du promoteur du gène de glutenine de haut poids moléculaire codant pour la sous-unité Bx7 (PrHMWG-Bx7) du blé hexaploïde 7riLicum aestivum L. cv Cheyenne (Anderson et al., 1998).
Le promoteur MPrl213 (SEQ.ID20) a été construit par clonage dans le vecteur pGEM3Z-l (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2), des deux fragments promoteurs suivants : - Le fragment 5' MPrl213 (SEQ. ID20) , synthétisé par PCR, a été amplifié à partir de 5 ng d'ADK matrice pMRT1139 (décrit dans la section 3.9 de l'exemple 3) à l'aide de 100 prr.eles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides 5' TACgAATTCCTCgACATgg 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3' possédant le site ce restriction Xbal, en présence de 50 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase (IX) et de 2 U de Vent ADN polymérase (new England Biolabs). La réaction d'amplificaticn par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94 C pendant 1C mien., l'ADK a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le fragment d'ADN issu de l'amplification PCR a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolysé par EcoRI pendant 1 h à 37 C,. Le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, ce 12 l de tampon
Tris-HCL 500 rrI pH '7.5 - MgCl2 z00 ma et 6 [il de L.T à 1 M et digéré par XbaI pendant 1 h à 37 C. - Le fragment 3' MPr1213 (SEQ.ID20) , obtenu par hydrolyse de 5 ug du plasmide pMRT1183 (décrit dans la section 2. 5 de l'exemple 2) avec les enzymes de restriction Xbal et BamHI, a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System .
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 zig fragment 5' MPrl213 (SEQ.ID20) , 50 ng du fragment 3' MPrl213 (SEQ.ID20) ainsi traités et 50 ng de piasmide pGem3Z-l dans un mélange réactionnel de 10 l, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase (New England Biolabs), dans le thermccycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à laide de 10 pmoles de chacun des 2 oligodésozynucléot ides 5' TACgAATTCCTCgACATgg 3' et 5' gCTCTAgAgCAAATCTACggCCACTC 3' dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 , comme décrit précédemment.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRTl)13 et la séquence promotrice MPrl213 (SEQ.ID20) schématisée dans la Fig. IV a été vérifiée par séquençage.
Suite au bombardement, les albumens ont été laissées dans les mêmes dispositions et ont été incubés 24 h à l'obscurité dans une chambre de culture à 26 C, afin de permettre l'expression transitoire des transgènes introduits dans les cellules.
6. 3.2. Bombardement des tissus foliaires de tabac et expression transitoire.
Le bombardement des feuilles de tabac a été effectué de la même manière que le bombardement des albumens de maïs, à deux exceptions près : - les échantillons ont été bombardés par des particules d'or de 1 m de diamètre, - les échantillons ont été placés à 9 cm de la zone d'accélération des billes.
Après bombardement les feuilles ont été laissées dans les mêmes dispositions et ont été incubées 46 n en chambre de culture (température constante de 25 C, pnotopériode 16 h lumière 8 h obscurité) afin de permettre l'expression transitoire des transgènes introduits dans les cellules.
6.4. Révélation et évaluation de l'activité des différents promoteurs par coloration histochimique.
6.4.1. Révélation de l'expression B-glucuronidase.
Une révélation de l'expression de la j-g':uCL:rOnirj3.3R a
été réalisée par coloration histochimique comme décrit pdr Jeffersson et al. (1937). Suite à la période d'incubation en chambre de culture, les extraits végétaux ont été incubés en présence du substrat X-Gluc de la 3-,lcur .riuase ( 5-bromc, 4-chloro, 3-indolyl glucuronide 500 mg/1), dans du tampon phosphate 0,1 M, Triton X100 à 0,05%, pH 7,0, pendant z4 h à 37 C.
Après coloration, les albumens de mais ont directement été analysés ou conservés stérilement à 4 C plusieurs semaines, alors que les feuilles de tabac ont été dépigmentées par deux passages successifs dans des bains d'éthanol à 95% pendant respectivement 3 et 12 h, puis rincées dans l'eau distillée et séchées à plat entre deux feuilles de cellophane.
L'activité promotrice des différentes constructions a été évaluée par l'estimation du nombre et de l'intensité des points bleus révélés sur chaque extrait végétal.
6.4.2. Evaluation qualitative de l'activité des promoteurs dans l'albumen de maïs.
La révélation histochimique de l'expression de la (3-glucuronidase a permis didentifier trois catégories de promoteurs : - Les albumens bombardés par la construction pMRT1197, pMRT1126, pMRT1127 et pMRT1199 présentent systématiquement un nombre de points bleus inférieur à 10. La présence de spots bleus sur les albumens transformés avec la construction pMRT1197, indique que la séquence de 96 pb de M?rll97 (SEQ.ID16) constitue la séquence promotrice minimale du promoteur HMWG-Dx5 , SEQ. 1D01 ) , capable de diriger une activité *.ranscriptionnelle de base dans l' albumen de maïs. L' absence de spots bleus sur les albumens bombardés par la construction pMFRT1.44, laquelle est dépourvue de séquence promotrice (témoin négatif), témoigne de la fonctionnalité des promoteurs regroupés dans cette catégorie.
- Les albumens bombardés par les constructions pMRT1128, pMRT1213, pMRT1216, pMRT1217, pMRT1136, pMRT1137, pMRT1135 et pMRT1138 présentent en moyenne un nombre de points bleus équivalent aux albumens transformés par les constructions
pIRI'1! i. : (PrHMWG-Dx5 (SEQ. ID01) ) et pMRTL21b ;ry-zéïne, témoin positif).
- Enfin, Les albumens bombardés par les constructions, pMRT1130, pMRT1131, pMRT1139 et part, 12 présentent une coloration bleue intense et diffuse qui rend difficile le comptage du nombre de points bleus, mais laisse suggérer que les promoteurs MPrll30 (SEQ.ID05) , MPrll31 (SF.Q.ICC6) MPrll39 (SEQ.ID13) et MPrl200 (SEQ.ID19) sont très fortement actifs dans l'albumen de maïs 12 jours après pollinisation.
6.4.3. Evaluation quantitative de l'activité des promoteurs dans les feuilles de tabac.
Enfin, un autre objet ae la présente invention est une méthode d'obtention d'une plante transgénique, ou d'une prcpagule telles que définies précédemment, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer une cellule végétale avec un vecteur comprenant au moins un promoteur ou au moins une séquence d'acide nucléique promotrice telle que définie précédemment ; - sélectionner la cellule végétale ayant intégré le promoteur ou la séquence d'acide nucléique promotrice ; - propager la cellule végétale transformée et sélectionnée, soit en culture, soit par régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques.
DESCRIPTION DES FIGURES L'invention sera mieux comprise par la description détaillée des différents modes de réalisation donnée ci-après à titre d'exemples non limitatifs, et en se référant au dessin en annexe, dans lequel : - les Figures I, II, III et IV représentent de manière schématique des constructions de promoteurs synthétiques et chimériques conformes à l'invention. Dans la Figure 1, il s'agit de constructions comportant une série de délétions en partant du promoteur entier provenant du gène Dx5 de blé e'; codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé, ainsi qu'une série de constructions comportant des répétitions d'éléments comportant une boite "enhancer" combinée à une boîte "C;-"" Le;" ; - la Figure II représente de manière schématique des
constructions d'autres promoteurs synthétiques et chimériques conformes à l'invention contenant des insertions d'éléments régulateurs et/ou fonctionnels comportant des boites "as2/3s1" combinées ; - la Figure III représente de manière schématique des constructions d'autres promoteurs synthétiques et chimériques conformes a l'invention, contenant des insertions d'éléments régulateurs et/ou fonctionnels comportant des 'Les "as2/as2/asl" combinées ; - la Figure IV représente de manière schématique des constructions d'autres promoteurs synthétiques et chimériques conformes à l'invention, contenant des insertions d'éléments régulateurs et/ou fonctionnels comportant des boites "céréales" combinées, provenant du gène Bx7 codant pour une gluténine à haut poids moléculaire de blé, seules ou en comoinaison avec des boîtes "as2/asl", ainsi qu'une construction comportant une boite "GC riche" ; - la Figure V représente des photographies de feuilles de tabac ayant été transformées avec des vecteurs contenant les promoteurs ou séquences d'acide nucléique précédemment décrits, liés de manière fonctionnelle au gène codant pour GUS (bêta-glucuronidase) , et après révé lation histochimique, les points bleus indiquant la présence des cellules transformées par lesdites constructions, et donc l'activité du promoteur ; - les Figures VI et VII représente un graphique comparant l'activité promotrice relative aux différentes constructions après expression transitoire dans des albumens de mais. Trois jours après bombardement les feuilles sont broyées puis l'extrait brut clarifié par centrifugation. L'activité 1-glucuror.idase et l'activité luciférase sont mesurées par fluorimétrie sur un aliquote de l'extrait brut, puis le rapport activité GUS/ activité LUC est déterminé. Les histogrammes correspondent à la moyenne des rapports pour une même construction +/- Erreur Standard à la Moyenne (SEM).
Dans la description détaillée qui suit, les traitements enzymatiques effectués avec les enzymes de restriction et les
enzymes de modification de l'AL'N or.t été réduises soi on les recommandations du fournisseur New England "1ia's. Suite à chaque traitement enzymatique, l'ADN a systématiquement été purifié 3 l'aide des Kits QIAquick PCR Purir ioat i-n (Q1AGEN: ou Concert Rapid PCR Purification System 1,::::;18C:0 F3RL Life Technologies), ou si précisé, à l'aide des Kits QIAqJ1.\.'k Gel Extraction (QIAGEN) ou Concert Rapid Cet Extraction System (GIBCO BRL Life Technologies) selon les indications des fournisseurs. Le Thermocycleur GeneAmp FOR System 9700 utilisé est commercialisé par Perkin Elmer Tipp ~ ' Jd Ricsyste:T1.s.
EXEMPLES Exemple 1 Constructions à but comparatif (témoins).
Pour permettre 1 Ci. comparaison des promoteurs chimériques décrits dans ce brevet, le gène uidA codant la 5-glucuroni:xase (Jefferson et al., 1986) contenant la séquence de l'intron IV2 du gène ST-LS1 de la patatine de pomme de terre (Vancanneyt et al., 1990) (uidA-IV2) a été placé sous contrôle de l'un des promoteurs de référence, et du terminateur du gène de la nopaline synthase (term-nos) d'Agrobacterium tumefacie;.3 dans le plasmide pGEM3Z commercialisé par Promega Corp. (Madiscn, USA).
1.1. Construction du témoin négatif pMRT1144.
Le plasmide pMRT1144, dépourvu de toute séquence promotrice, sert de témoin négatif. Il dérive du plasmide pGEM3Z dans lequel la séquence uidA-IV2/term-nos a été introduite.
Dans un premier temps, 5 g du plasmide pBI221 (Clonetech, CA, USA) ont été digérés pendant : h à 37 C par les enzymes de restriction EcoRI et BamHI. La séquence L; i d.4 sous contrôle du terminateur de la nopaline synthase a ensuite été isolée sur un gel d'agarose à 0.8% à l'aide d'.. Kit QIAquicr~ Gel Extraction .
En parallèle, 5 ug de plasmide pGEM3Z ont été digérés par le couple d'enzymes de restriction EcoRI et BamHT pendant @ h à 37 C. Le fragment vecteur a ensuite été isolé sur un gel d'agarose à 0.8% à l'aide du Kit QIAquick Gel Extraction , déphcsphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d'intestin de
veau i New England Biolaos) en présence de tampon 3 (LX) à 37"C pendant 1 n.
La réaction de ligation a été réa':" ::-"';'2 avec 50 ng du fragment uidA-IV2/term-nos et 100 ng de- piasmide r suivantes . 30 sec. à 30 C, 30 sec. à JOGe et 30 sec. à 3::oC. Des bactéries Escherichia coli DH5a, renoues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu Luria-Bertani (LB, bactotryptone 10 g/1, extrait de levure 5 g/1, NaC1 10 g/1, pH 7. et Agar-Agar 15 g/1) supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon La méthode de lyse alcaline (Birnboin et Doly, 1983) et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide résultant a été appelé pGEM3Z/uidA/term-nos.
Dans un deuxième temps, afin d'insérer l'intron IV2 de 192 pb du gène de la patatine de pomme de terre dans la séquence codante uidi'i de pGEM3Z/ uidA/ terra- nos, une portier, interne de ce gène (fragment SnaBI/BstBI de 710 pb) a été excisé puis remplacé par la séquence équivalente contenant l'intrcn IV2 (fragment SnaBI/BstBI de 902 pb).
Pour ce faire, 10 ug du plasmide pr tM3Zi u d./terrr,-~ ont été digérés pendant 1 h à 37C par SnaBL (site de restriction situé à la position +383 pb or. aval ou ûr i nitiateur ATG du gène uidA) puis pendant 1 h à 6:)" par BstBl (site localisé à la position +1093 pb) . Le plasmide ainsi déléfé du fragment de 710 pb a été isolé sur un gel d'agarose à 0,8% à l'aide du Kit QIAquick Gel Extract ion , déphosphery Lé par 40 U de phosphatase alcaline d'intestin de veau (New Englar.d Biolabs) en présence de tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h.
Le fragment BstBI/SnaBI de 902 pb correspondant .à la séquence de l'intron IV2 suivie de la séquence uidA, été
promotrice située en amont: du nuciéotide 5 pb et constitue le promoteur HMWG-Cx5 (SEQ.ID01) minimal étudié ,.Jans ce brevet.
Pour ce faire, 5 pela de plasmide piRI l7 ont été digérée successivement pendant 1 h à 37 C par Bal et Ncol. Le vecteur pMRTll83 ainsi délété du fragment Xbal/tJ.I du promoteur MPrlL83 a été isolé sur un gel d'agarose A 3,8% à l'''}C10 du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New England B:o..:.3bs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 n[1l~)!..'3 de chacun des dNTPs, de 12 ul de tampon Tris-HCL 500 mM pH 7.5 - MgCi2 sec mM et 6 ul de DTT à 1 M.
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 ng de plasmide ainsi modifié dans un mélange réac-- de 10 psi, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 ADN ligase (New England Biolabs) dans le thermocycleur GeneArnp PCR System 9700 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escherichia coli DHSa, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique ces clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1) a été extrait selon la métnode delyse alcaline et vérifié par digestions enzymatiques.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT119"' et la séquencepromotrice MPrll97 (SEQ.ID16) est schématisée dans la Fig.
2. 7. Construction du promoteur MPrll98 (SEQ. ID17) .
Le promoteur MPrll98 (SEQ.ID17) dérive du promoteur ".'F,1 1 ' (SEQ.ID04) (décrit dans la section 2.2 de L'exemple 2) par délétion de la séquence promotrice interne s'étendant de la position-59 à la position-135 pb, laquelle est dépourvue des éléments cis-activateurs identifiés précédemment. Il a été construit par fusion, au niveau du site de restriction Nicol de pMRT1183 (décrit dans a section 2.5 ce l'exemple 2), d' un fragment amplifié par PCR à partir do 5 ng d'ADN matrice pMRT1128 à l'aide de 100 pmoles de chacun des
,-) iyc',J>2::3v:-:.r:Lcléol iJl:3 5' AICygA4.j' rC''AgA':'.j'"..JAT'J AgTggCTTTAgl.,: 3' contenant les sites de restriction EccRI et XbaI et 5' CATgCCATggCCAACACAAAAgAAgCTgg 3' possédant le site de restriction Ncol, en présence de 50 nmoj.es ae chacun des dNTPs, de tampon ADN polymérase Vent ( 1X) et de 2 U d' ADN polymérase Vent (New England 3ic;lab-, . La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur Gene}\Elp PCR System 9700 . Après une dénaturât ion à 94 C, pendant 10 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes ae dénaturation à 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et o'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min . Le fragment d'ADN issu de l'amplification a été isolé sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolyse successivement par Ncol et Xbal, pendant 1 h à 37 C.
En paraiLèlele, le fragment vecteur a été préparé à partir du plasmide pMRT1183 par délétion ce la région promotrice de MPrll83 située en 5' du site de restriction Ncol. Pour ce faire, 5 ug de plasmide pMRTHS3 ont été digérés successivement pendant 1 h à 37 C par Xbal et NcoI et le fragment vecteur de pMRT1183 a été isolé sur un gel d'agarose à 0.8% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System , avant d'être déphosphorylé par 40 U de phosphatase alcaline d' intestin de veau (New Englanû Biolabs) en présence ae tampon 3 (IX) à 37 C pendant 1 h.
La réaction de ligation a été réalisée avec 50 ng du fragment promotejr et 100 ng de plasmide ainsi traites dans un mélange réactLonnel de 10 pi, en présence du tampon T4 ADN ligase 1:; et de 400 unités de T4 ADN ligase (New Engiand Bi. labs),d.-r.s le thermocycleur GeneAmp PCR System 97C0 , comme décrit précédemment. Des bactéries Escheri ,--:J"] 1 :1 'L] 2 DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LE supplémenté en ampiciiline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse
alcaline et analysé par olgestions enzymatiques.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRTl19; et la séquence promotrice MPr1198 (SEQ.ID17) schématisée dans la Fig. 1 a été vérifiée par séquençage.
2.8. Construction du promoteur MPr1216 (SEQ. ID21) .
Le promoteur MPr1216 (SEQ.ID21) dérive de M?R112b' ':;Q.=CC'4:\ (décrit dans la section 2. 2 de l'exemple 2) par duplication de la séquence s'étendant des nucléotides -22b à-136 pb, laquelle comporte la boite G et l'élément activateur.
Il a été construit par clonage dans le vecteur pGEK3Z-l (décrit dans la section 2. 1 de l'exempte 2), des deux fragments promoteurs suivants : - Le fragment 5' MPr1216 (SEQ. ID21) , synthétisé par PCR, a été amplifié à partir de 5 ng d'ADN matrice pMRTH28 à l'aide de 100 pmoles de chacun des 2 oligodéscxynucléotides 5' ATCggAATTCgCCgATTACgTggCTTTAgC 3' contenant le site de restriction EcoRI et 5' gCTCTAgACCAACACAAAAgAAgCTgg 3' possédant le site de restriction Xbal, en présence de 50 nmoles de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase (1X) et de 2 U de Vent AUN polymérase (New England BiolaDS). La réaction d'amplification par PCR a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturation à 94C pendant 10 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturat ion à 94C pendant min., d'hybridation à 55 C pendant 1 min. et d'élongation à 72 C pendant 1 min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le fragment d'ADN issu de l'amplification PCR a été isolé sur un gel " gC1è::"'Y'3C à 1.5% a l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System et hydrolyse par EcoRI pendant 1 h à 37 C. le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l' action de 20 U du fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 60 nmoles de chacun des dNTPs, de 12 pi de tampon Tris-HCL 5CC mM pH 7 . 5 MgC12 500 llM et 6 pi de DTT à 1 M et digéré par Xbal pendant 1 h à 5 1 c .
- Le fragment 3' MPrl216 (SEQ.ID21) , obt0I1. par l'hydrolyse
je 1) ug du plasmide pIRT1183 avec les .:fI:':'1.L'2 de restriction Xbal et BarnHI, a été isolé sur ur. gel d' agar G à 1.:)% à l'aide du Kit Concert Rapid Gel Extraction System .
Les composés phosphorés polyhydroxylés qui peuvent être utilisés sont notamment les composés mentionnés dans le brevet US 3 639 542. Les composés phosphorés polyhydroxylés préférés sont obtenus à partir d'oxydes d'alkylène et d'acides du phosphore ayant une équivalence en P2O5 d'environ 72 à 95 %.
Des polyacétals convenables qui peuvent être condensés avec des oxydes d'alkylène sont notamment les produits de la réaction du formaldéhyde ou d'un autre aldéhyde convenable avec un alcool dihydroxylé ou un oxyde d'alkylène tels que ceux mentionnés ci-dessus.