INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le procédé selon l'invention consiste à effectuer les étapes suivantes : a) on mélange sous agitation un sel métallique MAn, éventuellement un métal M au degré d'oxydation zéro, un ligand L, au moins un liquide ionique, un solvant organique, le composé halogénocarboné ZX et le nitroxyde (II) selon un rapport molaire ZX/nitroxyde (II) allant de 1 à 1,5 et, de préférence voisin de 1 ; b) on maintient le milieu réactionnel sous agitation à une température comprise entre 20 C et 90 C et, de préférence, à une température allant de 20 C à 35 C jusqu'à disparition complète du nitroxyde (II) ; puis c) on arrête l'agitation, on décante, on récupère la phase organique qui est éventuellement lavée à l'eau puis, d) on isole l'alcoxyamine (1) de la phase organique par évaporation du solvant organique sous pression réduite, et e) éventuellement, la phase liquide ionique est recyclée au moins une fois avec régénération de l'espèce active du métal M(Mn).
Selon la présente invention, le nombre de recyclages de la phase liquide ionique n'est pas limitatif. De préférence, on recyclera la phase liquide ionique un nombre de fois allant de 1 à 10.
Selon la présente invention, on désigne par liquides ioniques des sels organiques liquides aux températures de réaction.
A titre d'illustration de sels organiques utilisables selon la présente invention, on citera les sels d'ammonium, de pyridinium, d'imidazolium, de triazolium, de guanidinium, de phosphonium ou de sulfonium. L'anion peut être entre autres un halogénure comme Ci, Br-,I- un halogénure d'étain comme SnCl3-, un halogénure de germanium comme GeCl3-, un halogénure de gallium comme GaCl3-, un halogénure d'aluminium comme AIC14-, AI2CI7", A13CIlo-, un halogénure de métal de transition comme CuCl2-, un fluorure de bore, d'antimoine ou de phosphore comme BF4, SbF6ou PF6-, un carboxylate comme CF3CO2-, un sulfonate comme CF3S03 ou FS03-, un amidure comme (CF 3S02)2N-, un tétralkyl- ou tétraarylborure comme B(C6F5)4. Le cation et l'anion du sel ou du mélange de sels seront choisi de façon appropriée pour avoir un liquide à température de réaction. Eventuellement, le liquide ionique pourra contenir de l'eau. Selon la présente invention, on utilisera de
préférence les sels de N,N'-dialkylimidazolium. Comme exemple de tels sels, on citera : - le chlorure de 1-butyl-3-méthylimidazolium, le chlorure de 1-propyl-3-méthylimidazolium, - le bromure de 1-propyl-3-méthylimidazolium.
Le solvant organique est choisi de façon à avoir un système biphasique avec le (ou les) liquide(s) ionique (s). De préférence, le solvant organique sera choisi parmi les hydrocarbures aliphatiques ou aromatiques, ou bien parmi les éthers. On utilisera tout particulièrement le toluène.
Selon la présente invention, M représente de préférence Cu(l), Fe(II), Ni%'11) et, tout particulièrement Cu(l).
L'espèce active du métal M, ci-après Mn, est générée à partir d'un sel métallique, de préférence un halogénure métallique MnXn. Elle peut également être générée in situ selon une réaction redox de type : dans laquelle l'exposant du métal M représente le degré d'oxydation dudit métal, M représente le métal M au degré d'oxydation zéro et n = 1 ou 2.
Globalement, le ratio Mn/RX doit être au moins égal à 1.
de garnissage et présentant une dureté sensiblement supérieure à celle des autres éléments.
Suivant un autre mode de réalisation, le garnissage intérieur de la semelle est constitué d'air, de préférence légèrement comprimé, introduit dans la semelle après assemblage et solidarisation des coquilles.
Avantageusement, la coquille supérieure devant recevoir la tige de l'article chaussant est munie d'un rebord périphérique en saillie définissant un creux servant de logement à une première.
En variante, la coquille supérieure est évidée au droit de la future première et la solidarisation de cette dernière ainsi que de la tige est avantageusement réalisée par une couture liant les bords en regard respectivement de la coquille, de la première et de la tige.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description qui va suivre d'un mode de réalisation d'un article chaussant selon l'invention, description donnée à titre d'exemple uniquement et en regard des dessins annexés sur lesquels : - la figure 1 est une vue en élévation latérale de deux coquilles superposées, avant assemblage ; - la figure 2 est une vue de dessus de la coquille inférieure de la figure 1 ; - la figure 3 est une vue en élévation latérale de la coquille de la figure 2 avec son garnissage intérieur ; - la figure 4 est une vue de dessus de la coquille supérieure de la figure 1 ; - la figure 5 est une vue en perspective d'une mule réalisée conformément à l'invention ; - la figure 6 est une vue en perspective d'une variante de réalisation d'une coquille supérieure ; - la figure 7 est une vue en coupe suivant le plan VII de la coquille de la figure 6 ; - la figure 8 est une vue en coupe suivant le plan VIII de la coquille de la figure 6 ;
- la figure 9 illustre la liaison par couture d'une coquille du type de la figure 6 avec une première et une tige ; - la figure 10 est une vue en perspective d'une autre variante de réalisation d'une paire de coquilles selon l'invention, et - la figure 11 est une coupe partielle des coquilles de la figure 10 au droit des rebords en regard.
Sur la figure 1, on a représenté en vue latérale et en position superposée, prêtes à être assemblées, deux coquilles de semelle, respectivement supérieure 1 a et inférieure 1 b, conformes à l'invention.
Chaque coquille 1 a, 1 b est une coque creuse à paroi relativement mince, réalisée par moulage sous pression d'une matière thermoplastique appropriée, notamment un matériau élastomère, par exemple un PVC.
Les coquilles pa, db présentent un contour et un galbe appropriés en sorte par exemple de définir une semelle d'épaisseur sensiblement supérieure en partie arrière pour former un talon, comme on peut l'observer sur la figure 1.
Ces contours et galbes peuvent bien entendu varier dans de larges mesures.
Le bord de la paroi de chaque coquille 1 a, 1 b est rabattu vers l'extérieur de manière régulière et sur tout le pourtour des coquilles pour former deux rebords continus 2a, 2b identiques et en regard l'un de l'autre lorsque les deux coquilles 1 a, 1 b sont plaquées l'une sur l'autre, comme illustré par la figure 1.
Les coquilles 1a, 1b sont solidarisées dans cette position, par couture, collage ou soudage haute fréquence selon le type d'article chaussant à réaliser et le matériau des coquilles.
Le matériau des coquilles 1 a, 1 b est identique ou différent.
L'assemblage des coquilles définit un espace intérieur qui est muni d'un matériau compressible occupant généralement tout ledit espace.
Il peut s'agir d'un ou plusieurs matériaux, de même nature ou non, constituant un ou plusieurs éléments positionnés de manière appropriée.
Par exemple, avant assemblage des coquilles 1 a, 1 b, la coquille inférieure 1 b peut être garnie (figure 2) d'un talon 3 épousant la partie arrière de la coquille et faisant saillie (figure 3) hors de la coquille.
La figure 8B illustre le niveau de protéine soluble ICAM-1 sérique, exprimé en nanogramme par ml, chez les patients ayant survécu (cercle plein) et chez les patients ayant décédé (cercle vide).
EXEMPLE 1 : Préparation des anticorps monoclonaux se liant spécifiquement sur la réa ion N-terminale de la protéine ESM-1 produite par les cellules eucaryotes.
Afin d'obtenir des anticorps monoclonaux anti-ESM-1 dirigés contre la région N-terminale de la protéine ESM-1 riche en résidus cystéine, la forme native de la protéine ESM-1 produite par la lignée cellulaire CHO transfectée par un vecteur d'expression contenant un insert d'ADN codant pour la protéine ESM-1 a été purifiée.
La séquence d'ADNc codant pour la protéine ESM-1 est référencée comme la séquence SEQ ID N02 du listage de séquences. l'ADNc de ESM-1 est inséré dans le vecteur d'expression eucaryote pcDNA3 (In vitrogen) puis transfecté dans les cellules CHO avec la lipofectamine (Gibco) selon les recommendantuions du fabricant. 48 h apres la transfection les cellules sont repiquées en presence d'un agent de selection (G418, Gibco) à la dose de 1000 microgramme/ml). Après deux semaines de sélection les cellules CHO résistantes au G418 sont clonées par dilution limite. Des clones exprimant ESM-1 sont ensuite selectionnés et appelés CHO-ESM (déposé à la CNCM).
Pour la production, les cellules CHO-ESM sont cultivées en suspension dans un milieu conditionné sans serum de veau foetal (milieu CHO SFM Il, Gibco). Le surnageant est ajusté à pH 8 et passé sur une colonne de DEAE-sépharose (Pharmacia). La colonne est lavée avec un tampon 50 mM Tris, pH 8,0. 2 M NaCI. La pmolécule ESM-1 est éluée dans un tampon 50 mM Tris, pH 8,1 M NaCI. L'éluat est ensuite dilué au 1 : 4 dans un tampon 50 mM Tris, pH 8 et incubé en présence d'anticorps monoclonal anti-ESM-1 (MEC4) immobilisé sur agarose (Biorad). Après une nuit d'icubation à 4 C sous agitation, les billes d'agarose sont lavées avec le tampon 50 mM Tris, pH 8,0. 2 M NaCI. ESM-1 est élué avec 3 M MgCI2. L'éluat est concentré et dialysé dans le tampon 50 mM Tris, pH 8, 0.5 M NaCI et stocké à-70 C.
Des souris Balb/C ont été immunisées par injection de 10 lug de protéine ESM-1 recombinante purifiée par souris, selon un protocole d'immunisation standard en présence d'adjuvant de Freund.
Les cellules d'hybridomes sécrétant les anticorps monoclonaux anti-ESM-1 ont été obtenues par fusion, criblage et sous-clonage selon la technique décrite par BECHARD et al. (2000).
Cinq clones cellulaires d'hybridome ont été obtenus et ont été désignés génériquement MEC ( Mouse Monoclonal Antibody to ESM-1 produced by CHO Cells ).
Quatre des hybridomes sélectionnés sont d'isotype IgG1, k respectivement les hybridomes désignés MEC4, MECS, MEC15 et MEC36.
L'un des hybridomes est l'isotype IgM, k, l'hybridome MEC11.
Les clones cellulaires d'hybridomes ont été cultivés dans du milieu de culture en l'absence de sérum et les anticorps anti-ESM-1 ont été purifiés par chromatographie sur colonne de protéine G-Sépharose commercialisée par la Société Pharmacia (UPSALA, Suède).
EXEMPLE 2 : Sélection des anticorps monoclonaux dirigés spécifiquement contre la partie N-terminale de la protéine ESM-1 produite par les cellules de la lignée CHO.
Les anticorps MEC, de classe IgG1, K sont sélectionnés par la persistance d'une liaison forte des anticorps de la série MEC à ESM/Fc en présence d'anticorps MEP d'isotype différent et à la concentration finale de 1 ug/mt. Les tests sont réalisés par ELISA selon les exemples précédemments décrits pour la sélection des anticorps MEP et MEC, (notamment par les expériences d'immuno-détection par compétition décrites par LASSALLE et al. (1996).
EXEMPLE 3 : Test d'immuno-détection de la protéine ESM-1 selon l'invention.
Le test d'immuno-détection consiste en un test immunoenzymatique du type sandwich dont les caractéristiques générales sont identiques à celui décrit par BECHARD et al. (2000).
- une deuxième région capable de former une triple-hélice avec la double- helice ainsi formée ou avec une partie de celle-ci, et - un ou deux bras reliant les deux régions, chacune des régions pouvant être continue ou interrompue.
De préférence le polynucléotide selon ce mode de réalisation particulier possède une longueur supérieure à 10 bases, et, plus préférentiellement, supérieure à 15 bases. Cette longueur est adaptée par l'homme du métier en fonction de la longueur de l'acide nucléique du transgène d'intérêt ciblé en simple-brin ou du transcrit d'intérêt, de manière à assurer la stabilité, la spécificité et la sélectivité du transcrit inhibiteur triple hélice.
Comme précédemment décrit, le procédé selon la présente invention permet le transfert de gènes étrangers ou exogènes et le contrôle de leur expression de manière efficace et réversible. Ceci est avantageux lorsque le produit thérapeutique du transgène d'intérêt a une action optimale dans une certaine plage de concentration bien définie et devient toxique au dehors de cette plage de concentration (Dranoff et al. Proc. Natl.Acad.Sci.
(1993) 3539-3543 ; Schmidt et al., Proc.Natl.Acad.Sci., 92 (1995) 4711- 4714; Naffakh et al., Mol.Med.Today, 2 (1996) 343-348). Par ailleurs, certaines applications cliniques nécessitent une régulation précise de l'expression du transgène d'intérêt à des niveaux biologiques ou thérapeutiques prédéfinis, en vue d'optimiser son activité in vivo.
De plus, le procédé de régulation négative réversible selon la présente invention est particulièrement utile lorsque l'expression d'un transgène d'intérêt ou l'activité du transcrit d'intérêt doit être maintenue à
son minimum, voire même éteinte sur de longues périodes et qu'une induction rapide est requise à des moments précis, que ce soit pour des besoins thérapeutiques ou expérimentaux.
Le procédé de contrôle de l'expression d'un gène exogène par inhibition réversible selon l'invention permet de contrôler l'expression de tout transgène ayant un intérêt expérimental dont on souhaite étudier la fonction in vivo, l'implication dans les mécanismes moléculaires ou dans la signalisation cellulaire tels que par exemple des récepteurs, des facteurs de transcription, des transporteurs, etc, ou encore tout transgène d'intérêt codant notamment pour un produit d'intérêt thérapeutique, qu'il s'agisse d'un peptide, polypeptide, protéine, acide ribonucléiques, etc. Plus particulièrement, le transgène d'intérêt est une séquence d'ADN (ADNc, ADNg, ADN synthétique, humain, animal, végétal, etc. ) codant pour un produit protéique.
Le transcrit d'intérêt peut être une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308. Le transcrit d'intérêt peut être également un ARN ligand (W091/19813).
La présente invention est particulièrement adaptée à l'expression de séquences codant pour des facteurs toxiques. Il peut s'agir en particulier de poisons pour les cellules (toxine diphtérique, toxine pseudomonas, ricine A, etc) de produit induisant une sensibilité à un agent externe (gènes suicides : Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc) ou encore de gènes capables d'induire la mort cellulaire (Grb3-3) (W096/07981), ScFv anti-ras (W094/29446), etc). Ce système est donc particulièrement adapté à des
stratégies de thérapies antitumorales par exemple, pour l'expression de cytokines, interférons, TNF ou TGF par exemple, dont la production incontrôlée peut avoir des effets secondaires très marqués.
Ce système est aussi particulièrement adapté pour des stratégies de thérapies géniques telles que l'angiogenèse utilisant un gène d'un facteur de croissance comme par exemple le FGF ou le VEGF. Il est adapté pour le contrôle de l'expression d'hormone telle que erythropoiétine ou encore d'anti-cytokines telles que le récepteur soluble du TNF-a utilisé à des fins de thérapies anti-inflammatoires.
Selon le procédé de la présente invention, l'association de l'acide nucléique comprenant la séquence du transgène d'intérêt codant pour le transcrit d'intérêt et de l'acide nucléique comprenant la séquence codant pour le transcrit inhibiteur est transférée simultanément dans le tissu ou la cellule cible pour permettre leur coexpression. Différentes techniques physiques ou mécaniques existent pour effectuer le transfert de ces acides nucléiques, telles que par exemples l'injection, la technique balistique, l'électroporation, l'électroperméabilisation, l'électrotransfert, la sonoporation, les techniques utilisant les champs électriques, les microondes, la chaleur, la pression hydrostatique, ou toute combinaison appropriée de ces techniques (Budker et al., J. Gen. Medicine, 2 (2000) 76-88). De préférence, l'association des acides nucléiques est introduite par injection et électrotransfert, c'est à dire par l'action d'un champ électrique. La technique d'électrotransfert est notamment décrite dans les demandes W099/01157 et W099/01158 et par Aihara et al., Nat. Biotechnol. 16 (9) (1998) 867-870 ; Mir et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 96 (1999), 4262-4267 ; Rizzuto et al., Proc.
Natl. Acad. Sci., 96 (1999) 6417-6422. Les molécules d'acides nucléiques que l'on souhaite transférer peuvent être administrées par exemple par voie directe dans.. le tissu ou par voie topique ou systémique, puis une ou
plusieurs impulsions électriques d'une intensité comprise entre 1 et 800 Volts/cm, de préférence entre 20 et 200 Volts/cm sont appliquées.
Alternativement, l'association des acides nucléiques selon la présente invention peut être injectée sous forme d'ADN nu selon la technique décrite dans la demande WO 90/11092. Elle peut également être administrée sous forme complexée avec un agent chimique ou biochimique.
En tant qu'agent chimique ou biochimique, on peut citer par exemple la lipofectamine, qui s'associe avec l'ADN en formant des vésicules appelées lipoplexes, ainsi que d'autres polymères tels que le DEAE-dextran (Pagano et al., J. Virol. 1 (1967) 891), la polyamidoamine (PAMAM), la polylysine, le polyéthylenimine (PEI), le polyvinylpyrrolidone (PVP), et le polyvinylalcool (PVA), etc, voire les protéines virales qui s'associent pour former des virosomes (Schoen et al., Gen Ther, 6 (1999), 5424-5431), ou les molécules dérivées des protéines virales (Kichler et al., J Viral, 74 (2000) 5424-5431).
Lot 4 : 9 souris injectées avec 30 g de plasmide pXL3010 + ET; Lot 5 : 9 souris injectées avec 30 g de plasmide pXL3010 + ET; Figure 10 A : Activitésrelatives de la SeAP in vitro mesurées après transfection de cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants avec ou sans traitement ultérieur de tétracycline: Colonne 1 : 1 g pXL3010 + 1 g pXL3296 (vide) Colonne 2: 1 g pXL3010 + 0.5 g pXL3296 (vide) + 0.5 g pSeAPantisens Colonne 3 : 1 g pXL3010 + 1 g pSeAPantisens Colonne 4 : 1 g pXL3010 + 0.5 g pTetSeAPantisens + 0.5 g pTet-tTAk sans tétracycline Colonne 5 : 1 g pXL3010 + 0.5 g pTetSeAPantisens + 0.5 g pTet-tTAk avec tétracycline (1 mg/ml) Colonne 6 : 1 g pXL3010 + 1 g pTetSeAPantisens + 0.5 g pTet-tTAk sans tétracycline Colonne 7 : 1 g pXL3010 + 1 g pTetSeAPantisens + 0.5 g pTet-tTAk avec tétracycline (1 mg/ml) Figure 10B: Activités relatives de la SeAP in vitro mesurées après transfection des cellules NIH3T3 avec les plasmides suivants avec ou sans traitement ultérieur de tétracycline: Colonne 1 : 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pXL3296 (vide) Colonne 2 : 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pSeAPantisens Colonne 3 : 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pTetSeAPantisens sans tétracycline Colonne 4: 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pTetSeAPantisens avec tétracycline (1 mg/ml) Colonne 5 : 0. 5 g pXL3010 + 2.5 g pXL3296 (vide)
Colonne 6: 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 2.5 g pTetSeAPantisens sans tétracycline Colonne 7 : 0. 5 g pXL3010 + 0.5 g pTet-tTAk + 2.5 g pTetSeAPantisens avec tétracycline (1 mg/ml) FIGURE 11 : Activités relatives de la luciférase 24h après cotransfection des cellules NIH 3T3 (80000 cellules par puits) avec les plasmides suivants (0.7 ou 1.1 g d'ADN par puits) avec ou sans administration de tétracycline: 1 : 0. 1 g pXL3031 + 0.3 g pTet-tTAk + 0.3 g pXL3296.
2 : 0.1 g pXL3031 + 0.3 g pTet-tTAk + 0.3 g pLucAntisens.
3 : 0. 1 g pXL3031 + 0.3 g pTet-tTAk + 0.3 g pTetLucAntisens sans tétracycline.
4 : 0. 1 g pXL3031 + 0.3 g pTet-tTAk + 0.3 g pTetLucAntisens avec tétracycline (1 mg/ml).
5 : 1 g pXL3031 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pXL3296.
6 : 0. 1 g pXL3031 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pTetLucAntisens sans tétracycline.
7 : 0. 1 g pXL3031 + 0.5 g pTet-tTAk + 0.5 g pTetLucAntisens avec tétracycline (1 mg/ml).
FIGURE 12A : Taux relatifs de SeAP circulante in vivo après coinjection en intramusculaire de souris SCID femelles de 6 semaines des plasmides suivants avec ou sans administration de tétracycline à des intervalles de temps variables : Lot 1 : souris injectées avec 20 g de plasmide pXL3010 + 40 g pTet- tTAk ; Lot 2 : 10 souris injectées avec 20 g de plasmide pXL3010 + 20 g pTet- tTAk + 20 g pSeAPantisens ;
Lot 3 : souris injectées avec 20 g de plasmide pXL3010 +20 g pTet- tTAk + 20 g pTetSeAPantisens ; FIGURE 12B : Taux relatifs de SeAP circulante in vivo après coinjection en intramusculaire de souris SCID femelles de 6 semaines des plasmides suivants avec ou sans administration de tétracycline à des intervalles de temps variables : Lot 1 : 10 souris injectées avec 20 ug de plasmide pXL3010 + 20 g pTet- tTAk + 20 g pSeAPantisens ; Lot 2 : 10 souris injectées avec 20 g de plasmide pXL3010 +20 g pTet- tTAk + 20 ug pTetSeAPantisens ; Lot 3 : lot 2 + boisson à la tétracycline (2mg/ml + 2 mg/ml de sucrose) pendant 9 jours. Puis arrêt de la tétracycline au 10léme jour. Remise sous tétracycline au 22ème jour (injection IP tous les deux jours, 500 g/souris), et arrêt au 30ème jour. Remise sous doxycycline au 63ième jour (400 mg/l dans la boisson).
EXEMPLES EXEMPLE 1: Construction des plasmides portant l'amplificateur/promoteur précoce du Cytomegalovirus (CMV) 1. 1 Plasmide pXL3031 (plasmide luciferase) Le plasmide pXL3031 est également un plasmide pCOR décrit dans pCOR (Soubrier et al., Gen Ther, 6, (1999) 1482-1488) et comprend notamment le rapporteur luciférase sous contrôle du promoteur CMV. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1A.
1.2 Plasmide pXL3010 (plasmide SeAP) Le plasmide pXL3010 a été construit par ligation dans un fragment Mlul/Sall de pGL3-basic (Promega), d'un fragment Mlul/Sphl de pCDNA3-basic (Invitrogen) contenant le promoteur précoce du cytomegalovirus humain (hCMV-IE), le gène SeAP extrait de pSeAP-basic (Clontech) avec Sphl/Clal et un fragment Clal/Sall contenant le signal de poly-adénylation tardif du virus simian (polyA SV40) amplifié à partir de pGL3-basic par une réaction de polymérisation en chaîne avec les amorces suivantes (5'- ATGCATCGATGGCCGCTTCGAGCAGACATG-3' et 5'-ATGCGTCGACTCTA GCCGATTTTACCACATTTGTAGAGG-3'). Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1 B.
1.3 Plasmide pSeAPantisens (plasmide SeAP antisens dans pCOR) Un fragment d'ADN contenant le gène de la SeAP est préparé par ACP en utilisant le plasmide pXL3010 comme matrice et les oligonucléotides 1 (5' CGAGCATGCTGCTGCTGCTGCTGCTGCTGGGCC 3') et 2 (5' GGGTCTA GATTAACCCGGGTGCGCGGCGTCGGT 3') comme amorces.
Ces oligonucléotides sont situés respectivement aux positions 765-797 et
2290-2267 sur le plasmide pXL3010. Ce fragment a été ensuite digéré par les enzymes de restriction Xbal et Sphl, purifié sur gel d'agarose 0.8%, extrait à l'aide du kit Jetsorb, puis cloné en orientation antisens par rapport du promoteur CMV dans le plasmide pXL3296, préalablement digéré par Sphl et Xbal, pour obtenir le plasmide pSeAPantisens. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1 C.
1.4 Plasmide pXL3296 (plasmide pCOR vide) Le plasmide pXL3296 est un plasmide pCOR (Soubrier et al., Gen Ther, 6, (1999) 1482-1488) et comporte l'ori y de R6K, la cassette d'expression de l'ARNt suppresseur Phénylalanine (sup Phe), ainsi qu'une partie -522/+72 du enhancer/promoteur précoce du virus CMV. Une représentation schématique de ce plasmide est présentée à la figure 1 D.
Exemple 1 : Préparation d'un sol de TIO, 1. Hydrolyse On ajoute successivement à 394,7 g d'une solution d'oxychlorure de titane à 1,9 mol/kg : - 42, 02 g d'acide chlorhydrique à 36 %, - 4, 73 g d'acide citrique, - 547, 1 g d'eau épurée, - 11, 36 g (0,2 % en poids par rapport au TiO2) de germes d'anatase présentant une taille comprise entre 5 et 6 nm.
Le mélange est porté à ébullition et y est maintenu pendant 3 h.
La suspension obtenue est diluée 10 fois puis lavée par dialyse à l'eau jusqu'à élimination complète des chlorures et obtention d'un pH égal à 3. On obtient ainsi une dispersion de TiO2 à 5 g/I.
On obtient une dispersion aqueuse comprenant des particules de diamètre 25 nm mesuré par MET. L'analyse par diffraction X indique que les particules sont à base de dioxyde de titane uniquement sous forme anatase à 80 % en poids. Les particules obtenues sont poreuses.