INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'invention a encore pour objet un acide nucléique comprenant la séquence nucléotidique SEQ D ? 5, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention a également trait à un acide nucléique consistant en la séquence nucléotidique SEQ D ? 5 ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
pathogènes ou encore la signalisation ainsi que les acides nucléiques codant pour de telles protéines, qui peuvent être placés sous le contrôle de promoteurs, le cas échéant de promoteurs inductibles, permettant de modifier la qualité ou la quantité des métabolites transférés de la plante mère vers l'albumen en développement ou encore d'accroître la résistance de la plante ainsi transformée à certains pathogènes ou d'influencer le développement de l'embryon ou de l'albumen.
DESCRIPTION DE L'INVENTION Le demandeur a ainsi montré selon l'invention que deux gènes très fortement homologues, respectivement désignés DD1-a et DD1-b, étaient exprimés de manière spécifique dans la zone de transfert du grain en développement chez le maïs et a isolé et caractérisé ces séquences ainsi que celles des protéines codées par les gènes DD1-a et DD1-b.
Le demandeur a également caractérisé les séquences régulatrices localisées en amont des deux gènes.
Les séquences nucléotidiques des gènes DD1-a et DD1-b possèdent moins de 60% d'homologie avec les séquences des gènes BETL décrites par HUEROS et al. précédemment cités.
En outre, les gènes DD1-a et DD1-b sont exprimés plus précocement (Jour 7 après pollinisation) que les gènes BETL (Jour 10 après pollinisation).
Les résultats d'hybridation in situ et d'amplification par RT-PCR montrent que les gènes DD1-a et DD1-b sont exprimés avant la visualisation histochimique d'une zone basale de transfert de l'albumen complètement formée et définie.
L'expression forte et précoce des gènes DD1-a et DD1-b contrôlée par leurs séquences régulatrices respectives, montre que ces deux gènes sont d'un grand intérêt industriel pour modifier les qualités et les caractéristiques de la zone de transfert qui est reconnue comme l'élément clef du remplissage du grain.
ACIDES NUCLEIQUES DES GENES DD1-a et DD1-b SELON L'INVENTION.
Les séquences nucléotidiques des deux gènes DD1-a et DD1-b comprennent chacune, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3', (i) la séquence régulatrice permettant l'expression spécifique du gène dans la zone de transfert, (ii) une séquence codante comprenant les exons et les introns du gène et (iii) une séquence non codante en aval du dernier exon du gène.
La séquence du gène DD1-a selon l'invention est référencée comme la séquence SEQ ID N 1 du listage de séquences.
La séquence du gène DD1-b selon l'invention est référencée comme la séquence SEQ ID D ? 2 du listage de séquences.
Ainsi, un premier objet de l'invention consiste en un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec une séquence nucléotidique choisie parmi les séquences SEQ ID NO1 et SEQ ID NO2, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique.
L'invention concerne aussi un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Selon l'invention, toute technique classique de biologie moléculaire, de microbiologie et d'ADN recombinant connue de l'homme du métier peut être utilisée. De telles techniques sont décrites par exemple par SAMBROOK et al. (1989), GLOVER (1985), GAIT (1984), HAMES et HIGGINS (1985a), HAMES et HIGGINS (1984), BERBAL (1984) et AUSUBEL et al. (1994).
De manière préférée, tout acide nucléique et tout polypeptide selon l'invention se présentent sous une forme isolée ou purifiée.
Le terme isolé au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante est isolé.
Suivant une variante de réalisation, les ouvertures sont constituées par des entailles s'ouvrant sur un bord.
Suivant un détail particulier, en regard des ouvertures, la plaque comporte des inscriptions correspondant à la valeur des pièces de monnaie.
Enfin, les inscriptions sont en Braille.
L'invention va maintenant être décrite avec plus de détails en se référant à des modes de réalisation particu- liers donnés à titre d'exemple seulement et représentés aux dessins annexés, dans lesquels : Figure 1 est une vue en plan d'un dispositif, selon l'invention.
Figure 2 et figure 3 sont des vues en perspective montrant l'utilisation du dispositif pour la vérification de billets.
Figure 4 montre en plan une variante de réalisation.
Figure 5 est une vue partielle en perspective montrant l'utilisation du dispositif de la figure 4 pour la vérification d'une pièce.
Figure 6 montre en plan un dernier mode de réalisation.
Aux figures 1,2 et 3 on a représenté un premier mode de réalisation d'un dispositif qui est réalisé à partir d'une plaque 1, par exemple, de matière plastique semirigide, d'un flan de carton ou même d'une plaquette métallique.
La plaque est découpée pour présenter une forme rectangulaire avec deux petits côtés 2 et 3 et deux grands côtés 4 et 5.
Au voisinage du petit côté 2 sont pratiquées deux fentes parallèles 6 et 7 délimitant deux languettes 8 et 9,
la languette 8 débordant légèrement le grand côté 5 et la languette 9 étant légèrement plus longue que la lan- guette 8.
Dans la plaque 1 sont pratiqués des trous 11 à 18 dont les diamètres sont différents et correspondent, chacun, au diamètre d'une pièce de monnaie.
En regard de chaque trou sont portées deux inscriptions 20 et 21 correspondant à la valeur de la pièce, l'une de ces inscriptions étant en Braille.
Pour la vérification d'une pièce, il suffit de placer celle-ci dans le trou correspondant sans jeu, le malvoyant pouvant lire en Braille la valeur.
Les figures 2 et 3 montrent, schématiquement en perspective, la vérification des billets.
(c) isolement des protéines MT produites, la majorité des protéines MT comprenant un groupe prosthétique à ion Zn lié.
Les protéines MT sont des protéines ayant une forte tendance à l'oxydation, quand elles se présentent sous leur forme apoprotéine, c'est à dire sans groupement prosthétique à ion d'un métal lourd lié.
Au contraire, les MT comportant un tel groupement prosthétique à ion d'un métal lourd lié sont très stables et peuvent être efficacement utilisées pour un traitement extra-cellulaire.
En conséquence, un avantage par rapport aux compositions de la technique antérieure, dans lesquelles la plus grande partie des protéines MT se présentent sous leur forme apoprotéine, réside dans le fait que les protéines MT d'une composition telle que décrite dans l'invention se présentent sous une forme beaucoup plus stable. Cela est particulièrement vrai quand la composition doit être utilisée pour une protection externe. Ici, la composition est placée par exemple directement sur la peau, et les protéines MT sont donc dans un environnement extra-cellulaire, ce qui rend la forme apoprotéine de la MT très sensible à l'oxydation.
Les protéines MT ont des affinités différentes pour différents métaux lourds. L'échelle de cette affinité est la suivante : Zn<Pb<Cd<Cu<Ag<Hg<Bi. En conséquence, un complexe MT-Zn va en présence d'ions Cd libérer le Zn et le remplacer par Cd pour donner un complexe Mt-Cd. On sait que tous les métaux lourds Pb, Cd, Cu, Ag, Hg et Bi sont présents dans l'atmosphère, et on sait qu'ils sont nocifs pour l'homme et l'animal. Au contraire, Zn est l'un des éléments les plus abondants dans l'organisme, et joue un rôle avantageux fondamental pour ce dernier.
Si les protéines MT sont purifiées directement à partir d'une plante (par exemple comme suggéré dans la demande EP 242799 A2) ou d'un tissu provenant d'autres sources naturelles, telles que les animaux et les microorganismes (comme suggéré par exemple dans ES 2087652 T3, colonne 2, lignes 53-59), on obtiendra un mélange de protéines MT, en ce sens qu'un certain nombre de ces dernières vont se présenter sous leur forme apoprotéine, tandis que d'autres vont avoir des ions Pb, Cd, Cu, Ag, Hg ou Bi liés, certaines d'entre elles pouvant avoir des ions Zn liés. La majorité de ces protéines MT purifiées ne va manifestement pas avoir d'ions Zn liés, entre autres en
raison de l'échelle d'affinité présentée ci-dessus.
En conséquence, un avantage par rapport aux compositions de la technique antérieure, qui comprennent des protéines MT purifiées directement à partir d'une source naturelle, est que les protéines MT d'une composition telle que décrite dans l'invention peuvent efficacement jouer le rôle d'une source de Zn pour l'organisme, c'est-àdire que les protéines MT vont libérer le Zn pendant la capture des métaux lourds nocifs Pb, Cd, Cu, Ag, Hg et Bi (voir l'échelle d'affinité ci-dessus).
Dans les compositions cosmétiques dans lesquelles les ions Zn représentent une partie distincte de la solution de la composition, le pH doit être maintenu à une valeur de pH acide relativement fort, pour maintenir les ions en solution. Ce n'est pas le cas avec une composition telle que décrite dans l'invention, qui peut parfaitement avoir un pH proche de la neutralité, c'est-à-dire un pH de 5 à 6,5 ou de préférence de 5,5 à 6. Il est naturellement avantageux que, par exemple, une composition cosmétique ait un pH proche du neutre.
Dans un deuxième aspect, l'invention concerne l'utilisation de la composition telle que décrite, pour la protection cosmétique externe de tissus humains ou animaux contre (a) un contact par des métaux lourds et/ou (b) un rayonnement UV, par administration topique de la composition sur les tissus.
L'invention concerne en outre un procédé de production de la composition décrite dans l'invention, et l'utilisation de protéines métallothionéines (MT), ou la majorité des protéines MT comprennent un groupe prosthétique à ion Zn lié, et que l'on peut obtenir par un procédé correspondant au premier aspect de l'invention, pour préparer une composition cosmétique et/ou pharmaceutique sous forme d'un gel, d'une crème, d'un onguent, d'un savon ou d'une lotion corporelle pour protection externe de tissus humains ou animaux (a) contre un contact par des métaux lourds et/ou (b) des rayonnements UV.
Un dernier aspect concerne une protéine MT isolée, telle que celle qui peut être obtenue par une technique de recombinaison destinée à préparer la MT telle que décrite dans l'invention.
Définitions : Avant d'étudier des formes de réalisation détaillées de l'invention, une définition va être fournie de termes spécifiques
concernant les principaux aspects de l'invention.
L'expression "composition cosmétique et/ou pharmaceutique" désigne dans l'invention une composition pouvant être utilisée pour la protection externe de tissus humains ou animaux (a) contre un contact par des métaux lourds et/ou (b) des rayonnements ultraviolets, c'est-àdire qu'elle doit pouvoir être appliquée sur les tissus externes, tels par exemple que la peau. L'homme de métier connaît les ingrédients convenant à cette fin.
L'expression "métallothionéines (MT)" : les MT sont isolées de tissus animaux, de plantes et de micro-organismes. Ce sont des protéines non globulaires, situées en position intracellulaire, essentiellement dans le cytoplasme, et elles ont été isolées chez les mammifères en de très grandes quantités, à partir des tissus parenchymateux du foie, des reins et des intestins.
Cellule de production : L'homme de métier a à sa disposition de nombreuses cellules de production convenant en particulier à l'expression hétérologue d'un gène présentant un intérêt. On peut utiliser dans l'invention l'une quelconque d'entre elles. La cellule de production peut être par exemple un microorganisme monocellulaire, par exemple un procaryote, ou un microorganisme non-monocellulaire, par exemple un eucaryote.
A titre d'exemples préférés de cellules eucaryotes, on peut citer les cellules fongiques filamenteuses. Les champignons filamenteux comprennent toutes les formes filamenteuse des subdivisions Eumycota et Oomycota (telles que définies par Hawksworth et al., 1995, ci-dessus). Dans une forme de réalisation particulièrement préférée, la cellule fongique filamenteuse est une cellule de l'une des espèces suivantes, mais sans limitation, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium et Trichoderma, ou un téléomorphe ou synonyme de ces derniers. En particulier, la cellule peut appartenir à une espèce de Trichoderma, de préférence Trichoderma harzianum ou Trichoderma reesei, ou à une espèce d'Aspergillus, tout spécialement Aspergillus oryzae ou Aspergillus niger, ou à une espèce de Fusarium, tout spécialement un Fusarium sp. ayant la caractéristique d'identification Fusarium ATCC 20334, comme décrit plus en détail
dans la demande PCT/US/95/07743.
Les cellules fongiques peuvent être transformées par un processus impliquant la formation d'un protoplaste, la transformation des protoplastes, et la régénération de la paroi cellulaire d'une manière connue en soi. Des modes opératoires convenant à la transformation de cellules hôtes Aspergillus sont décrites dans EP 238 023 et Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 81 :1470-1474. Un procédé convenant à la transformation de l'espèce fusarium est décrit par Malardier et al., 1989, Gene 78 :147-156, ou dans la demande de brevet US simultanément pendante déposée sous le N de série 08/269 449.
Une autre cellule de production eucaryote préférée est constituée d'une cellule de levure, telle que Saccharomyces cerevisiae. Voir Becker et Guarente, dans Abelson J. N. et Simon M.I., eds, Guide to Yeast Genetics ADN Molecular Biology, Methods in Enzymology, volume 194, page 182-187, Académie Press. In., New York ; Ito et al., 1983, pour une description plus poussée de cellules de levure appropriées.
Parmi les cellules procaryotes préférées, on peut citer une cellule provenant de souches gramme positives, notamment les espèces de Bacillus telles que Bacillus subtilis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans, Bacillu lautus, Bacillus thurigiensis, ou en particulier Bacillus licheniformis.
Voir Current Protocols in Molecular Biology, Hohn Wiley ADN Sons, Inc., NY, 1987 ; Bacillus subtilis ADN Other Gram-Positive Bacteria, Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington D. C., pour une description plus poussée de cellules appropriées de Bacillus.
La cellule de production procaryote la plus préférée est une cellule de E. coli, et une forme de réalisation de l'invention concerne la composition cosmétique et/ou pharmaceutique telle que décrite, dans laquelle la cellule de production est une cellule de E. coli, et l'isolement de la MT produite est effectué par séparation des cellules de E. coli du milieu, suivie d'une lyse des cellules et d'un isolement des protéines MT comprises dans le lysat cellulaire. Voir Hannig G. et Makrides S., Strategies for optimizing heterologous protein expression in E. coli,
Trends in Biotechnology, Février 1998,16, page 54-60 , pour plus de détails concernant E. coli en tant que cellule de production.
Produit de synthèse d'ADN (ou vecteur d'expression) qui comprend une séquence d'ADN codant pour une MT présentant un intérêt : Un produit de synthèse d'ADN (ou vecteur d'expression) peut être par exemple un vecteur tel qu'un plasmide, qui après transformation dans la cellule de production est maintenu en tant que vecteur extrachromosomique à auto-réplication, ou encore le vecteur s'intègre luimême dans le chromosome de la cellule de production pour que le vecteur soit maintenu en tant qu'intégrant chromosomique. L'homme de métier dispose de nombreux systèmes pour introduire un gène présentant un intérêt dans une cellule de production, et référence est faite aux documents ci-dessus, en liaison avec les cellules de production préférées spécifiques, pour identifier les systèmes convenant à la cellule de production spécifiquement choisie.
La cellule de production doit être capable de produire la MT.
Le fait que la cellule synthétisée doive être capable de produire la MT exige généralement que la cellule de production comprenne des éléments tels qu'un promoteur approprié, un terminateur de transcription, des éléments affectant l'initiation de la traduction et des terminateurs de traduction. Tous ces éléments sont bien connus de l'homme de métier, et ce dernier dispose en outre d'éléments supplémentaires correspondant à la cellule de production choisie. Une fois de plus, référence est faite aux documents ci-dessus, en liaison avec les cellules de production préférées particulières, dans le but d'identifier les systèmes spécifiques convenant à la cellule de production spécifique choisie.
Etape (b) : culture de la cellule de production dans un milieu approprié, pendant un laps de temps approprié, dans des conditions appropriées dans lesquelles la cellule produit la MT : L'homme de métier dispose de nombreux milieux appropriés, et il connaît les paramètres temps, température, etc., qui garantissent le succès de la production de la protéine MT. Référence est faite aux documents ci-dessus en liaison avec les cellules de production préférées spécifiques, dans le but d'identifier les conditions de culture et les milieux appropriés et les milieux particuliers convenant à la
cellule de production spécifique choisie.
Etape (c) : isolement des protéines MT produites, la majorité des protéines MT comprenant un groupement prosthétique à ions Zn liés.
L'homme de métier dispose d'un certain nombre de stratégies pour isoler les protéines MT, et le choix d'une protéine MT appropriée particulière est une affaire de routine et peut dépendre de certains facteurs, notamment du sort de la MT, selon qu'elle est sécrétée dans le milieu ou maintenue en situation intracellulaire dans la cellule de production.
En général, les différences entre l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant sont réduites de telle sorte que l'acide nucléique de référence et l'acide nucléique variant ont des séquences nucléotidiques
très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Les modifications nucléotidiques présentes dans un acide nucléique variant peuvent être silencieuses, ce qui signifie qu'elles n'affectent pas la séquence d'acides aminés qui peut être codée par cet acide nucléique variant.
Les modifications de nucléotides dans l'acide nucléique variant peuvent aussi résulter en des substitutions, additions ou délétions d'un ou plusieurs acides aminés dans la séquence du polypeptide qui peut être codé par cet acide nucléique variant.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention comportant une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la même fonction ou la même activité biologique que le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
De manière tout à fait préférée, un acide nucléique variant selon l'invention et qui comporte une phase de lecture ouverte, code pour un polypeptide qui conserve la capacité d'être reconnu par des anticorps dirigés contre le polypeptide codé par l'acide nucléique de référence.
Par fragment d'un acide nucléique selon l'invention, on entend une séquence nucléotidique d'une longueur réduite par rapport à l'acide nucléique de référence, le fragment d'acide nucléique possédant une séquence nucléotidique identique à la séquence nucléotidique de l'acide nucléique de référence sur la partie commune. De tels fragments d'un acide nucléique selon l'invention possèdent au moins 12,15, 18,25, 30,35, 40,45, 50,60, 100,150, 200,300, 400,500, 1000,2000, 3000 ou 4000 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de référence, la longueur maximale en nucléotides d'un fragment d'un acide nucléique selon l'invention étant bien entendu limitée par la longueur maximale en nucléotides de l'acide nucléique de référence.
ACIDES NUCLEIQUES DU GENE DD1-a Comme indiqué ci-dessus, l'acide nucléique génomique du gène DD1-a est référencé comme la séquence nucléotidique SEQ ID NO1 du listage de séquences.
En conséquence, la présente invention a pour objet un acide nucléique comprenant un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité
en nucléotide avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO1, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique.
Fait également partie de l'invention un acide nucléique de séquence complémentaire à l'acide nucléique tel que défini ci-dessus.
Un autre objet de l'invention est un acide nucléique consistant en un polynucléotide possédant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID NO1, ou avec un fragment de cette séquence nucléotidique, ainsi qu'un acide nucléique de séquence complémentaire.
L'invention est aussi relative à un acide nucléique comprenant au moins 12, de préférence au moins 15 et de manière tout à fait préférée au moins 20 nucléotides consécutifs de l'acide nucléique de séquence SEQ ID NO1, étant entendu qu'un tel acide nucléique englobe dans sa définition des fragments d'un acide nucléique selon l'invention tel que défini dans la présente description.
La séquence du gène DD1-a telle que décrite dans la séquence SEQ ID NO1 comprend, de l'extrémité 5'vers l'extrémité 3', respectivement : a) la séquence régulatrice du gène DD1-a permettant l'expression de la protéine DD1-a dans la zone de transfert du grain en développement ; b) une région dite codante qui comprend les exons et les introns du gène DD1-a ; et (c) une région non codante localisée en aval de la région codante et susceptible de contenir des éléments de régulation de l'expression du gène DD1-a.
La région régulatrice du gène DD1-a débute au nucléotide en position 1 et se termine au nucléotide en position 3598 de la séquence SEQ tDN 1.
La région non codante localisée en aval de la région codante du gène DD1-a débute au nucléotide en position 6541 et se termine au nucléotide en position 7159 de la séquence nucléotidique SEQ ID ? 1.
La séquence du gène DD1-a comprend aussi cinq exons et quatre introns, dont les caractéristiques structurales sont détaillées respectivement dans les tableaux 1 et 2 ci-après.
Revenons à la figure 9 pour mettre en évidence des possibilités offertes par l'invention. Observons le transistor dans le plan de coupe transversale de la figure 9 et considérons axe 8 de ce plan, cet axe étant sensiblement parallèle à la surface du substrat 18 et orienté vers la droite de la figure 9. Étant donné que la grille est protégée par les espaceurs 42 et 44, l'écart 0 entre projection l'extrémité droite E de la grille cet axe et 'extrémité droite 0 du drain (origine de l'axe 8), écart qui est positif dans l'exemple de la figure 9, pourrait être nul, voire négatif, en formant les évidements 46 et 48 (figure 3) de telle façon qu'ils 'enfoncent suffisamment sous l'ensemble isolant 28.
La figure 10 est une vue de dessus schématique et partielle d'un schéma d'implantation un exemple de transistor MOS vertical à grille métallique selon l'invention.
Sur la figure 10, on voit la source 100, le drain 102 et la grille 104 du transistor. Les références 106, 108 et 110 représentent respectivement le contact de drain, un contact de grille et un contact de source. La référence 112 représente le pré-contact de drain et la référence 114 représente un pilier de silicium qui correspond à l'ensemble de ce qui est référencé 28 y compris (42 et 44) sur la figure Le substrat sur lequel est formé ce transistor n'est pas représenté.