INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
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Section 11- Contenants et contenus
conservant le site de fixation de la toxine et contient un stabilisateur.
- Un contrôle positif : standard lyophilisé contenant du récepteur GC-C purifié à une concentration donnée qui sera dilué avec de l'eau avant emploi.
- La protéine chimère ClpG-STh purifiée, lyophilisée et quantifiée.
- Des anticorps primaires concentrés en solution contenant des IgG sériques polyclonaux (lapin, chèvre ou autres) ou monoclonaux (souris) anti-ClpG ou anti-hybride ClpG-STh qui seront dilués avec du tampon anticorps au dernier moment.
- Des anticorps secondaires concentrés en solution contenant des IgG polyclonaux (l'origine animale dépendant de celle des anticorps primaires) conjugués à la péroxydase.
- Un tampon de blocage : tampon Tris HCI avec BSA ou sérum normal (lapin, chèvre, souris ou autres suivant l'origine de l'anticorps primaire et secondaire utilisés dans la suite du test).
- Un tampon de lavage.
- Un Tampon anticorps.
- Un tampon stop : 0,3 M acide sulfurique.
- La péroxydase substrat A : ophenylenediamine ou diaminobenzidine déshydraté.
- La péroxydase substrat B : solution de péroxyde d'hydrogène.
Mais l'invention permet aussi d'envisager l'utilisation des protéines de fusion ClpG-STh en immunohistochimie sur coupes congelées ou sur coupes en paraffine de tissus d'organes extraintestinaux (ganglions, foie, rein, rate,....) chez des malades atteints de cancer colorectal afin de mettre en évidence le récepteur GC-C à l'intérieur ou à la surface des cellules tumorales métastatiques. A l'aide des anticorps primaires polyclonaux ou monoclonaux anti-ClpG ou anti-hybride ClpG-STh préalablement marqués (Péroxydase, fluorochromes, biotine, etc...) soit directement soit indirectement par des anticorps secondaires anti-corps primaires, il est possible de visualiser en microscopie électronique la présence de cellules tumorales, d'estimer leur proportion, et ainsi d'évaluer le degré de prolifération cellulaire (degré de malignité et extension). L'avantage de ce système s'appuie sur la reconnaissance Toxine STh/Récepteur GC-C qui est plus sensible que la reconnaissance Récepteur GCC/Anticorps anti-récepteur habituellement mise à profit dans ce genre d'approche immunohistochimique.
L'invention trouve principalement son application dans le domaine du diagnostic, mais elle présente également des applications thérapeutiques en matière de traitement des métastases d'origine colique. En effet, comme indiqué précédemment, la toxine STa pénètre dans les entérocytes après s'être fixée sur son récepteur
GC-C (Urbanski, R. et al., 1995, Biochim. Biophys. Acta, 1245 : 29-36), et l'on peut donc utiliser le peptide STa comme véhicule pour internaliser le conjugué de l'invention. Dans ce cas, la molécule active, plus particulièrement une protéine active, est un agent thérapeutique anti-cancéreux ayant avantageusement une activité : - anti-cancéreuse spécifique des cellules tumorales, c'est à dire capable de les tuer sans affecter les cellules saines, - uniquement sur les cellules en cours de multiplication, - capable de diffuser à distance à partir d'une cellule tumorale réceptrice sur d'autres cellules cancéreuses périphériques n'ayant pas incorporé l'agent thérapeutique.
Un exemple d'un tel agent thérapeutique est la thymidine kinase du type 1 du virus herpès. La protéine chimère peut être administrée par voie systémique de façon à cibler sélectivement les cellules rectocoliques tumorales extra-intestinales et de les éliminer sélectivement après internalisation de la protéine chimère via le récepteur GCC. C'est donc le caractère toxique déterminé par la structure tridimensionnelle du peptide STa qui va permettre cette action sélective. La très petite taille du peptide STa, son absence d'immunogénicité et sa grande sélectivité pour son récepteur confère au peptide STa un intérêt tout
particulier pour vectoriser des agents actifs dans les métastases colorectales. L'existence de souches Smad3 de souris transgéniques capables de développer spécifiquement un cancer colorectal permet de disposer d'un outil complémentaire pour l'étude expérimentale des applications thérapeutiques de l'invention (Zhu, Y. et al., 1998, Cell., 94 : 703-14).
Le 1-[bis(3-fluorophényl)méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)(méthylsulfonyl) méthyl-(RS)]azétidin-3-ol peut être préparé en opérant de la façon suivante : A un mélange refroidi à -60 C de diisopropylamine et de 10 cm3 de tétrahydrofuranne, on coule en 10 minutes 3,65 cm3 d'une solution 1,6M de n-butyllithium dans l'hexane, agite pendant 10 minutes à -30 C puis refroidit à -70 C. On ajoute ensuite en 20 minutes une solution de 1,2 g de (3,5difluorobenzyl)méthylsulfone dans 30 cm3 de tétrahydrofuranne. Après 30 minutes d'agitation à -70 C, le mélange est additionné en 30 minutes d'une solution de 1,5 g de 1-[bis(3-fluorophényl)méthyl]azétidin-3-one dans 10 cm3 de tétrahydrofuranne. Après 2 heures d'agitation à -70 C, le mélange réactionnel est ramené à température ordinaire, puis additionné de 20 cm3 d'une solution aqueuse saturée de chlorure d'ammonium et de 100 cm3 de dichlorométhane. Le mélange est décanté, la phase organique est lavée avec de l'eau, puis séchée sur sulfate de magnésium, filtrée, et concentrée à sec sous pression réduite (2,7 kPa). Le résidu est chromatographié sur une colonne de gel de silice (granulométrie 0,06-0,200 mm, diamètre 3,2 cm, hauteur 30 cm), en éluant sous une pression de 1 bar d'argon avec un mélange d'acétate d'éthyle et cyclohexane (20/80 en volumes) et en recueillant des fractions de 60 cm3. Les fractions 9 à 20 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 1,95 g de 1- [bis(3-fluorophényl)méthyl]-3-[(3,5-difluorophényl)(méthylsulfonyl)méthyl- (RS)]azétidin-3-ol, sous la forme d'un solide blanc, fondant à 170 C (décomposition).
La 1-[bis(3-fluorophényl)méthyl]azétidin-3-one peut être préparée en opérant comme il est décrit dans l'exemple 1 (méthode 2), à partir de 0,7 cm3 de
chlorure d'oxalyle, 16 cm3 de dichlorométhane, 1,12 cm3 de diméthylsulfoxyde, 2 g de 1-[bis(3-flurophényl)méthyl]azétidin-3-ol, et de 3,7 cm3 de triéthylamine. On obtient 1,55 g de 1-[bis(3fluorophényl)méthyl]azétidin-3-one, sous la forme d'une huile qui cristallise à 20 C.
Le 1-[bis(3-fluorophényl)méthyl]azétidin-3-ol peut être préparé en opérant comme il est décrit par KATRITSKY A. R. dans J. Heterocycl. Chem, 31,271 (1994), à partir de 4,9 g de [bis(3-fluorophényl)méthyl]amine et 1,78 cm3 d'épichlorhydrine.
La [bis(3-fluorophényl)méthyl]amine peut être préparée de la façon suivante : à une suspension de 1,27 g d'hydrure de lithium et d'aluminium dans 80 cm3 de tétrahydrofuranne, on coule sous atmosphère d'argon en 30 minutes une solution de 5,17 g de 3,3'-difluorobenzophénone oxime dans 30 cm3 de tétrahydrofuranne. Après 5 heures d'agitation au reflux, on ajoute successivement 1,3 cm3 d'eau, 1,3 cm3 de soude 4N, 2,6 cm3 d'eau puis 50 cm3 d'acétate d'éthyle. Après séchage sur sulfate de magnésium et concentration à sec sous pression réduite (2,7 kPa), on obtient 4,9 g de [bis(3-fluorophényl)méthyl]amine, sous la forme d'une huile jaune.
La 3-3'-difluorobenzophénone oxime peut être préparée selon le mode opératoire suivant : dans une solution de 5,0 g de 3,3'-difluorobenzophénone dans 10 cm3 d'éthanol, on coule goutte à goutte une solution de 1,6 g de chlorhydrate d'hydroxylamine dans 8 cm3 d'eau, puis ajoute par petites fractions 1,2 g de soude en pastilles. Le mélange réactionnel, porté au reflux pendant 10 minutes est refroidi à 20 C puis acidifié par 7,5 cm3 d'acide chlorhydrique 4N. Le précipité huileux obtenu une fois trituré devient un solide blanc que l'on filtre, lave par de l'eau puis sèche à 35 C sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 5,17 g de 3,3'-difluorobenzophénone oxime, sous la forme d'un solide blanc.
Exemple 8 La 1-[bis-( 4-chlorophényl)méthyl]-3-(RS)-{[3-azétidin-1-yl-phényl]méthyl- sulfonyl-méthyl}azétidine peut être préparée en opérant comme il est décrit dans l'exemple 3, à partir de 0,10 g de 1-[bis-(4-chlorophényl)méthyl]-3- [(azétidin-1-yl-phényl)-méthylsulfonyl-méthylène]azétidine, de 2 cm3 de méthanol, de 2 cm3 de dichlorométhane, et de 30 mg d'hydroborure de sodium, en agitant pendant 24 heures à 20 C. Le produit brut est chromatographié sur une colonne de gel de silice (granulométrie 0,063-0,200 mm, hauteur 7 cm, diamètre 1 cm), en éluant sous une pression de 0,1 bar d'argon avec du dichlorométhane et en recueillant des fractions de 4 cm3.
Les fractions 5 à 10 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 20 mg de 1-[bis-(4-chlorophényl)méthyl]-3-(RS)-{[3- azétidin-1-yl-phényl]méthylsulfonyl-méthyl}azétidine, sous la forme d'une laque blanc cassé [Spectre de R.M.N 1H (300 MHz, CDC13, # en ppm) : (mt : 2H); de 2,50 à 2,65 (mt : 1 H); 2,60 (s : 3H); 3,20 (mt : 2H); 3,47 (mt : 1 H); 3,66 (t large, J = 7 Hz : 1 H); 3,89 (t large, J = 7,5 Hz : 4,20 (d, J = 11 Hz : 1 H); 4,26 (s : 1 H); de 6,35 à 6,50 (mt : 2H); 6,67 (d large, J = 7,5 Hz : 1 H); de 7,10 à 7,40 (mt : 9H)].
La 1-[bis-(4-chlorophényl)méthyl]-3-[(azétidin-1-yl-phényl)-méthylsulfonyl- méthylène]azétidine peut être préparée en opérant en opérant comme il est décrit dans l'exemple 6, à partir de 0,83 g de 1-[bis-(4-chlorophényl)méthyl]- 3-[(azétidin-1-yl-phényl)-méthylsulfonyl-méthyl-(RS)]azétidine-3-ol, de 20 cm3 de dichlorométhane, de 0,18 cm 3 de chlorure de méthylsulfonyle, et de 0,75 g de 4-diméthylaminopyridine. On obtient 0,40 g de 1-[bis-(4-chlorophényl) méthyl]-3-[(azétidin-1-yl-phényl)-méthylsulfonyl-méthylène]azétidine, sous la forme d'une meringue blanche.
Le 1 -[bis-(4-chlorophényl)méthyl]-3-[(azétidin-1 -yl-phényl)-méthylsulfonyl- méthyl-(RS)]azétidine-3-ol peut être préparé en opérant comme il est décrit dans l'exemple 5, à partir de 1,55 g de 1-(3-méthylsulfonylméthyl-
phényl)azétidine, de 5,2 cm3 de solution 1,6M de n-butyllithium dans l'hexane, de 30 cm3 de tétrahydrofuranne et de 2,11 g de 1-[bis-(4chlorophényl)méthyl]azétidin-3-one. On obtient 0,83 g de 1-[bis-(4chlorophényl)méthyl]-3-[(azétidin-1-yl-phényl)-méthylsulfonyl-méthyl- (RS)]azétidine-3-ol, sous la forme d'un solide ocre, fondant à 172 C.
La 1-(3-méthylsulfonylméthyl-phényl)azétidine peut être préparée en opérant de la façon suivante : A un mélange refroidi à 0 C de 10 cm3 d'eau, de 5 cm3 d'acide acétique, 1,5 cm3 d'acide sulfurique 36N, et de 6,15 g d'oxone, on ajoute une solution de 1,9 g de 1-(3-méthylsulfanylméthyl-phényl)azétidine dans 10 cm3 d'éthanol. Après 20 heures d'agitation à 20 C, le mélange réactionnel est additionné de 100 cm3 d'eau, 100 cm3 d'acétate d'éthyle, puis est neutralisé en agitant avec de l'hydrogénocarbonate de sodium. Le mélange obtenu est décanté, la phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, puis filtrée et concentrée à sec sous pression réduite (2,7 kPa).
On obtient 1,55 g de 1-[3-(méthylsulfonylméthyl)-phényl]azétidine, sous la forme d'une gomme brun clair.
La 1-[3-(méthylsuifonylméthyl)-phényl]azétidine peut être préparée en opérant de la façon suivante : A une solution de 4,6 g de 1 -iodo-3- (méthylsulfanylméthyl)-benzène, dans 60 cm3 de tétrahydrofuranne, on ajoute sous argon 2,57 g de tertbutylate de potassium, 0,64 g de chlorure de 1,1'bis-(diphénylphosphino)ferrocènyl palladium, 1,49 g de 1,1'-bis- (diphénylphosphino)ferrocène, 0,12 g d'iodure de cuivre, et 2,0 g d'azétidine.
Après 3 heures de chauffage à la température du reflux, le mélange réactionnel est refroidi à température ordinaire, et filtré sur célite, en lavant celle ci ensuite avec 150 cm3 d'acétate d'éthyle. Le filtrat et le lavage réunis sont acidifiés avec 120 cm3 d'acide chlorhydrique 1 N, puis décantés. La phase aqueuse est additionnée de 60 cm3 d'acétate d'éthyle, puis est alcalinisée avec de l'hydrogénocarbonate de sodium et le mélange est décanté. La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée, et
concentrée à sec sous pression réduite (2,7 kPa). Le résidu est est chromatographié sur une colonne de gel de silice (granulométrie 0,06- 0,200 mm, diamètre 3,5 cm, hauteur 50 cm), en éluant sous une pression de 0,5 bar d'argon avec un mélange d'acétate d'éthyle et cyclohexane (20/80 en volumes) et en recueillant des fractions de 100 cm3. Les fractions 1 à 3 sont réunies et concentrées à sec sous pression réduite (2,7 kPa). On obtient 1,9 g de 1-[3-(méthylsulfanylméthyl)-phényl]azétidine, sous la forme d'une huile.
- Notion depremier cycle Lorsqu'on considère l'ensemble des cycles d'une application, on se rend compte qu'il existe des cycles tout particuliers : ceux qui sont initiés par l'utilisateur. On parlera dans ce cas là de premiers cycles.
Leur déroulement est de ce fait parallèle et ils peuvent entrer en conflit les uns avec les autres si jamaisils passent par les mêmes objets.
- Mécanisme mis en oeuvre Dans cette approche, chaque objet qui effectue une transition due à l'utilisateur prévient le Séquenceur à l'aide de l'événement BOFC (BeginOfFirstCycle : début de premier cycle). Une fois le premier cycle terminé (on est revenu au premier objet par retour d'appel de méthode), l'objet prévient le Séquenceur que le premier cycle est terminé à l'aide de l'événement EOFC (EndOfFirstCycle : fin de premier cycle).
Souche Milieu Solide Milieu liquide plasmide CS31Aa I/Cb %c U/1010 I/C % U/1010 bactéries bactéries JCB570dsbA+dsbB+ pEH524d + 0,062 ~ 0,020 0 nte nt nt nt pEHSTN24 + 0,102 0,019 75 0,8 0,065 0,008 0 ndf pEHSTC22 + 0,124 0,021 100 1,0 0,061 0,008 0 nd pEHProSTC28 + 0,142 0,010 100 3,6 0,066 0,030 0 nd pSTC17+pDSPH524 + 0,129 0,041 75 2,7 0,096 0,033 25 216 pSTN24- 0,131 0,031 100 3,5 0,166 0,033 75 233 pSTC22- 0,149 0,008 100 3,6 0,150 ~ 0,012 100 1082 pProSTC28- 0,154 0,012 100 8,3 0,153 0,019 100 1082 pSTC17 - 0,1610,009 100 5,3 0,161 0,019 100 900 JCB571dsA-dsbB+ pEH524 + 0,059 0,003 0 nt nt nt nt pEHSTN24 + 0,122 0,029 100 1,0 0,074 0,010 0 nd pEHSTC22 + 0,1270,038 90 2,0 0,066 0,012 0 nd pEHProSTC28 + 0,135 0,033 100 7,9 0,081 0,018 25 nd pSTC17+pDSPH524 + 0,137 0,030 100 5,8 0,156 0,049 75 800 pSTN24 - 0,143 0,012 100 5,3 0,1500,013 100 847 pSTC22- 0,126 0,008 100 18,2 0,148 0,037 100 1165 pProSTC28- 0,141 0,011 100 13,7 0,136 0,025 100 2041 pSTC17 - 0,133 0,020 100 11,9 0,151 ~ 0,020 100 1429 JCB819dsbA+dsbBpEH524 + 0,061 0,001 0 nt nt nt nt pEHSTN24 + 0,164 0,009 100 3,7 0,073 ~ 0,003 0 nd , pEHSTC22 + 0,139 0,036 100 1,1 0,0640,004 0 nd pEHProSTC28 + 0,134 0,020 100 2,4 0,058 0,002 0 nd pSTC17+pDSPH524 + 0,139 0,037 100 1,4 0,144 0,004 100 139 pSTN24- 0,1500,025 100 3,4 0,131 0,028 100 694 pSTC22- 0,141 0,017 100 9,1 0,170 0,010 100 723 pProSTC28 - 0,134 0,023 100 16,9 0,140 0,029 100 1136 , pSTC17 - 0,137 ~ 0,024 100 17,0 0,1510,026 100 1037 JCB818dsbA-dsb BpEH524 + 0,061 ~ 0,007 0 nt nt nt nt pEHSTN24 + 0,113 0,036 75 2,9 0,065 0,011 0 nd pEHSTC22 + 0,134 0,043 75 6,3 0,070 0,027 25 nd pEHProSTC28 + 0,115 0,021 100 2,1 0,075 0,015 12 nd pSTC17+pDSPH524 + 0,092 0,025 75 nd 0,085 0,021 37 505 pSTN24 - 0,167 ~ 0,006 100 10,0 0,157 0,073 100 806
pSTC22 - 0,143 t 0,026 100 10,1 0,161 t 0,007 100 1364
pProSTC28- 0,166 0,014 100 15,6 0,157 0,039 100 2263 pSTC17 - 0,160 0,008 100 16,7 0,145 ~ 0,025 100 614
a + ou -, présence ou absence des gènes annexes de l'opéron clp b I/C, rapport du poids de l'intestin/poids de la carcasse. Chaque valeur représente la moyenne des rapports I/C de 3 à 14 souriceaux ( écart type). Une réponse ? 0,09 est considérée comme positive. c %, pourcentage déterminé par le rapport du nombre de souriceaux malades/nombre total de souriceaux testés. d témoin négatif de toxicité e nt, non testé. f nd, non détectable.
Le tableau 8 ci-dessus rapporte l'effet des mutations dsbA et dsbB sur l'activité entérotoxique des protéines recombinantes.
Le système Dsb est fréquemment impliqué dans la formation des ponts disulfures de nombreuses protéines bactériennes dont la toxine STa. Afin de déterminer son rôle dans la formation des ponts disulfures de la portion STh présente dans les hybrides, les différents plasmides recombinants ont été transférés dans la souche JCB570 (dsbA+dsbB+) et dans les souches dérivées JCB571 (dsbA- dsbB+), JCB819 (dsbA+dsbB-) et JCB 818 (dsbA- dsbB-) (Tableau 8). L'activité entérotoxique des surnageants obtenus à partir de cultures réalisées en milieu liquide ou gélosé a alors été déterminée (Tableau 8). Les résultats indiquent
que tous les surnageants provenant de cultures en milieu gélosé de souches dsb+ ou dsb-, avec ou sans les gènes annexes de l'opéron clp, induisent une accumulation de fluides intestinaux chez les souriceaux nouveau-nés et présentent une activité entérotoxique comparable.
Cependant, excepté pour les extraits correspondant à la construction [pSTC17 + pDSPH524], aucune activité entérotoxique n'est détectée dans les surnageants de culture en milieu liquide des souches possédant les gènes clp annexes. Ceci pourrait être attribuable à une production et/ou sécrétion différentielles de ces hybrides, résultant à la fois : - des caractéristiques du plasmide vecteur transportant les gènes de fusion - des propriétés de la souche bactérienne hôte hébergeant le plasmide recombinant - de l'influence ou non des gènes clp annexes selon le plasmide et la souche hôte utilisée.
Avec les souches dsb+ ou dsb- dérivées de la souche de E. coli JCB570 cultivée en milieu liquide, l'activité entérotoxique (ou la sécrétion) est plus importante en absence qu'en présence des gènes clp annexes.
Les résultats sont inversés avec la souche DH5[alpha] cultivée dans les mêmes conditions. Il est clair aussi que tous les surnageants provenant de cultures en milieu liquide des souches dsb+ ou dsb- présentent une activité entérotoxique 40 à 300 fois supérieure aux surnageants homologues issus
de cultures en milieu solide. Cette différence peut s'expliquer par une meilleure oxygénation des cultures liquides soumises à une agitation continue. Une autre donnée intéressante est que les mutants dsb- révèlent une entérotoxicité au moins aussi élevée que la souche dsb+ isogénique.
En résumé, l'ensemble de ces résultats met en évidence les conclusions suivantes : - les gènes clp autres que clpG ne semblent pas intervenir dans la sécrétion et l'entérotoxicité des hybrides ClpG-STh produits par les souches dsb+ et dsb-.
- le système Dsb responsable de la formation périplasmique des ponts disulfures de la toxine STa naturelle n'est pas impliqué dans celle des ponts disulfures de nos hybrides.
2) Rôle de ClpG.
Le monomère ClpG non modifié ne peut être exporté à la surface de la bactérie qu'en présence des protéines annexes impliquées dans la biogénèse des fimbriae CS31A. Cependant, les hybrides ClpG-STh issus de bactéries dépourvues d'un système CS31A fonctionnel passent à travers la membrane externe pour être libérés dans le milieu extracellulaire sous une forme biologiquement active. Afin de déterminer le rôle de ClpG dans ce processus, différentes constructions possédant l'oligonucléotide codant pour STh fusionné en phase directement après la
- Visualisation des résultats : Lesrésultats sont affichés par une matrice, dont les colonnes sont les attributs résultats sélectionnés, et les lignes les instances qui vérifient la requête.
Une requête sauvegarde peut également être exécutée en mode programme, via une Programmatic Interface.
Rappelons la définition d'un contexte de requête. Le contexte d'une requête se définit comme étant l'ensemble des paramètres décrivant tous les éléments d'une requête : - filtres - classes - attributs - opérateurs - variables, etc.
Considérons V une variable définie sur une classe X. Dans l'exemple illustré, la classe X peut être la classe Inventaire, la classe Réseau ou la classe Equipement. On qualifiera d'interne toute variable définie sur la classe X et d'externe toute variable définie sur d'autres classes que la classe X.
Une variable V peut avoir la forme suivante :
V = att1... F(att2)... W... G (Z) où att1, att2 sont des attributs de la classe X, W, Z sont des variables internes ou externes à la classe X F, G sont des fonctions qui s'appliquent sur des variables est un opérateur arithmétique quelconque.
Rappelons qu'un filtre est un ensemble d'expressions basées sur les valeurs des attributs d'une classe donnée. Un filtre peut être décomposé en plusieurs expressions qui peuvent être combinées par l'intermédiaire des opérateurs booléen AND, OR, NOT connus de l'homme du métier.
Revenons à l'écriture d'une variable : V = att1... F(att2)... W... G (Z) où att1, att2 sont des attributs de la classe X, la classe X pouvant être indifféremment la classe INVENTAIRE, la classe RESEAU ou la classe EQUIPEMENT, et att1, att2 pouvant être indifféremment des attributs de l'une des classes, W, Z sont des variables internes ou externes à la classe X, F, G sont des fonctions qui s'appliquent sur des variables, 70 fonctions sont disponibles incluant les agrégats SCIL (MIN, MAX, SUM, AVG,...), des fonctions sur Listes (List, Ulist, ..), des fonctions booléennes (AND, OR, NOT, ..), des comparateurs ensemblistes ( ÉQUAL, ALL~GREATHER, IS~IN, IS-NOT~IN, ,..), .. et est un opérateur arithmétique quelconque.
L'évaluation des variables sur exécution d'une requête satisfait à des règles précises suivantes.
La variable V est calculée pour chaque instance de la classe X (Règle 1).
Soient Vi la valeur calculée de la variable V pour l'instance Xi de la classe X, et Pi l'instance père de l'instance Xi. Entre autres, pour chaque valeur Vi calculée de l'instance Xi : - l'attribut att1 est évalué avec la valeur d'attribut att1 de l'instance Xi (Règle 2), - la fonction F (att2) calculée avec (règle 3)
- la valeur de l'attribut att2 de l'instance Xi si F n'est pas une fonction d'agrégation - ou la liste des valeurs de l'attribut att2 des instances Xi subordonnées à Pi si F est une fonction d'agrégation.
- W sera évaluée avec (Règle 4) - la valeur Wi calculée si W est une variable interne, - ou la première valeur calculée de W pour une instance compatible à l'instance Xi si W est une variable externe conformément à la première solution.
- G(Z) sera évaluée avec (Règle 5) - la liste des valeurs de Z calculées pour l'ensemble des instances compatibles à Xi si Z est externe, - ou la valeur Zi calculée si Z est interne.
L'étape b s'effectue en présence de triéthylamine, au sein d'un solvant inerte tel qu'un éther (tétrahydrofuranne par exemple), à une température voisine de 0 C.
L'étape c s'effectue au moyen d'ammoniaque liquide dans le méthanol, en autoclave à une température voisine de 60 .
L'étape d s'effectue généralement au sein d'un solvant inerte tel qu'un solvant halogéné (dichlorométhane par exemple) ou le tétrahydrofuranne, en présence d'une base organique telle que la triéthylamine, la diméthylaminopyridine, à une température voisine de 20 C.
L'étape e s'effectue par toute méthode connue de l'homme de l'art permettant de passer d'un acide ou un dérivé réactif de cet acide à un carboxamide sans toucher au reste de la molécule et notamment les méthodes préférées décrites précédemment.