INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les céramides et les DAG ont été également dosés dans les BRP cultivés en présence de N-acétyl-LCystéine (voir figure 7). Les céramides et les DAG ont été dosés comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. Les résultats, exprimés en % d'inhibition de production stimulée de céramides et de DAG, sont la moyenne de 2 expériences indépendantes. L'ajout de 10 uM de N-acétyl-LCystéine dans le milieu de culture inhibe totalement la production de céramides et de DAG induite par les AGEméthylglyoxal (-100%). En revanche, un traitement des cellules par 50 uM de N-acétyl-L-Cystéine n'induit qu'une inhibition partielle de cette surproduction (-60% de la surproduction des céramides et-70% de la surproduction de DAG). Cet effet partiel peut probablement être expliqué par un effet prooxydant d'un antioxydant employé à une concentration trop élevée.
L'inhibition complète de l'apoptose induite des péricytes cultivés en présence de 10 uM de N-acétyl-LCystéine a été associée à une inhibition parallèle totale de la surproduction des céramides et des DAG, ceci suggère donc que les AGE-méthylglyoxal induisent un stress oxydant situé en amont de la production de céramides et des DAG ainsi que de l'apoptose des péricytes.
3) Effets de divers antioxydants sur l'apoptose des péricytes en réponse aux AGE-méthylglyoxal.
L'effet protecteur de la Na-acétyl-L-Cystéine sur la disparition des péricytes en réponse aux AGE-
méthylglyoxal a été confirmé en testant différents antioxydants. La figure 8 rapporte les effets des antioxydants sur l'apoptose des péricytes en réponse aux AGE-méthylglyoxal. Les résultats, exprimés en % d'inhibition de l'apoptose induite, sont la moyenne de 3 expériences indépendantes sauf pour la coelentéramine (2 expériences indépendantes).
L'ajout dans le milieu de culture d'acide lipoïque aux concentrations de 7 uM et de 14 uM inhibe respectivement de 88% et de 75% l'apoptose (annexine V, voir Matériel et Méthodes) des péricytes induite par les AGE. Une incubation des cellules avec 5 uM et 10 uM d'ebselen bloque respectivement à 94% et 88% l'apoptose induite par les AGE-méthylglyoxal. En revanche, un traitement des péricytes avec 2 uM de coelentéramine et 2 uM de zéaxanthine ne permet qu'une inhibition partielle de l'apoptose induite de 60% et de 50 % respectivement. Cet effet modéré des deux antioxydants liposolubles peut être expliqué par le fait que ces deux agents n'ont pas pu être testés à des concentrations plus élevées : un effet véhicule (le DMSO) a été observé sur l'apoptose des péricytes en réponse aux AGE-méthylglyoxal.
Une incubation des péricytes avec différents antioxydants permet de protéger les cellules de l'apoptose. Ce résultat confirme bien l'induction d'un stress oxydant dans la voie de signalisation de l'apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal.
III-VOIES DE PRODUCTION DES CERAMIDES ET DES DAG ACTIVEES DANS LES PERICYTES RETINIENS EN REPONSE AUX AGE-METHYLGLYOXAL.
Les travaux réalisés dans le cadre de l'invention ont également consisté à définir les voies
métaboliques de production des céramides et des DAG activées dans les péricytes cultivés avec des AGE- méthylglyoxal.
Il s'agissait notamment de déterminer les différentes voies possibles de production des céramides. D'une part, les céramides peuvent être issus de la voie de biosynthèse de novo. Deux intermédiaires métaboliques, la sphingosine et la sphinganine sont acétylés par une sphinganine-acyl-transférase pour former des céramides.
Les céramides peuvent être également le produit d'hydrolyse enzymatique : ils peuvent être issus d'une part du pool de sphingomyélines et d'autre part du pool de glycosphingolipides (céramides liés à une ou plusieurs chaînes glycanniques) (Mathias et al, 1998 ; Okasaki et al., 1998).
De même, les voies de production des DAG sont de deux types. Ils peuvent provenir d'une activation de la voie de biosynthèse de novo, ou alors être issus d'hydrolyses enzymatiques : les DAG peuvent être libérés à partir d'un pool de phosphatidylinositolbisphosphates ou d'un pool de phosphatidylcholines sous l'action de phospholipases spécifiques.
Les voies de production de ces deux intermédiaires métaboliques ont été explorées selon une approche pharmacologique. Les cellules ont été cultivées en présence de différents inhibiteurs enzymatiques, dont les effets ont été analysés d'une part sur l'apoptose induite et d'autre part sur la production stimulée de céramides et de DAG en réponse aux AGE-méthylglyoxal.
1) La Voie de production des céramides activée dans les péricytes. a) Implication d'une sphinganine-acyltransférase.
La figure 14 représente l'effet du D609 sur la production stimulée de céramides et de DAG dans les BRP induites par les AGE-méthylglyoxal.
La figure 15 représente la voie de signalisation menant à l'apoptose des péricytes envisagée sur la base de l'invention.
La figure 16 représente l'effet des peptides inhibiteurs de caspases sur l'apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal.
La figure 17 représente l'effet des peptides inhibiteurs de caspases z-VAD-FMK, z-LEHD-fmk et z-DEVD-FMK (50 uM) sur la production stimulée de céramides et de DAG dans les BRP induites par les AGE-méthylglyoxal.
La figure 18 représente la voie de signalisation menant à l'apoptose des péricytes envisagée sur la base de l'invention.
PARTIE A : MATERIEL ET METHODES. l - Matériel. 1) Réactifs.
Tous les produits pour la culture cellulaire proviennent de Sigma (France) sauf le SVF (Gibco, France), la collagénase IA et la collagénase/dispase (BoehringerMannheim, France). Tous les autres réactifs sont purs pour analyse et ont été achetés chez Sigma (France), sauf les plaques de silice (silica gel 60 G, Merck), la DAG kinase et les céramides (Tebu, France). Les colonnes PD-10 proviennent de Pharmacia (Suède). Le kit de marquage à l'annexine-V provient de Boehringer-Mannheim (France). La N-acétyl-L-cystéine, la désipramine, l'acide lipoïque et l'ebselen proviennent de Sigma (France). Les peptides inhibiteurs de caspases proviennent de Calbiochem (France), la fumonisine Bl et le D609 proviennent de Biomol (France).
Préparation des solutions d'agents pharmacologiques : Les solutions sont stérilisées au moyen d'un filtre acrodisc stérile 0, 2 um (Gellman Science).
La solution mère de 1 uM de N-acétyl-L-cystéine est préparée extemporanément : 163,2 mg sont repris dans 1 ml de DMEM puis la solution est filtrée stérilement.
Une solution mère de coelentéramine à 1,2 mM dans l'éthanol est préparée extemporanément et ajoutée aux cellules à la concentration finale de 2 uM.
La zéaxanthine est dissoute dans du DMSO stérile à la concentration de 1,2 mM et ajoutée aux cellules à la concentration de 2 uM.
Une solution stock de 10 mM d'ebselen est préparée à partir de 2,74 g de produit repris dans 1 ml
d'éthanol puis la solution est aliquotée et conservée à - 20OC.
La solution mère de 100 mM de désipramine est préparée extemporanément : 30,3 mg sont repris dans 1 ml d'eau distillée puis la solution est filtrée stérilement.
Une solution mère de 1 mM de fumonisine Bl est préparée à partir de 1 mg repris dans 1378 ul d'eau distillée puis la solution est stérilisée, aliquotée, congelée à-180 C et conservée à -20oC.
La solution mère de 9,4 mM de D609 est préparée extemporanément : 1 mg de D609 est repris dans 400 ul d'eau distillée puis la solution est filtrée stérilement.
v-Ri4 représente un atome d'hydrogène ou un atome d'halogène tel que le fluor, un radical alkyle en Ci-C4, monohydroxyalkyle en Ci-C4, polyhydroxyalkyle en C2-C4, aminoalkyle en Ci-C4, cyanoalkyle en Ci-C4 ou alcoxy (Ci-C4) alkyte (Ci-C4).
Parmi les para-aminophénols de formule (111) ci-dessus, on peut plus particulièrement citer le para-aminophénol, le 4-amino-3-méthyl-phénol, le 4-amino-3-fluoro-phénol, le 4amino-3-hydroxyméthyl-phénol, le 4-amino-2-méthyl-phénol, le 4-amino-2hydroxyméthyl-phénol, le 4-amino-2-méthoxyméthyl-phénol, le 4-amino-2-aminométhylphénol, le 4-amino-2- (p-hydroxyéthyl-aminométhyl)-phénol, et leurs sels d'addition avec un acide.
- (IV) les ortho-aminophénols utilisables à titre de bases d'oxydation dans le cadre de la présente l'invention, sont notamment choisis parmi le 2-amino-phénol, le 2-amino-1- hydroxy-5-méthyl-benzène, le 2-amino-1-hydroxy-6-méthyl-benzène, le 5-acétamido-2amino-phénol, et leurs sels d'addition avec un acide.
Parmi les dérivés pyridiniques, on peut plus particulièrement citer les composés décrits par exemple dans les brevets GB 1 026 978 et GB 1 153 196, comme la 2,5-diaminopyridine, la 2- (4-méthoxyphényl) amino-3-amino-pyridine, la 2,3-diamino-6-méthoxypyridine, la 2-(ss-méthoxyéthyl)amino-3-amino-6-méthoxy pyridine, la 3,4-diaminopyridine, et leurs sels d'addition avec un acide.
Parmi les dérivés pyrimidiniques, on peut plus particulièrement citer les composés décrits par exemple dans les brevets allemand DE 2 359 399 ou japonais JP 88-169 571 et JP 91-10659 ou demandes de brevet WO 96/15765, comme la 2,4, 5,6-tétra-aminopyrimidine, la 4-hydroxy-2,5, 6-triaminopyrimidine, la 2-hydroxy- 4,5, 6-triaminopyrimidine, la 2,4-dihydroxy-5, 6-diaminopyrimidine, la 2,5, 6-triaminopyrimidine, et les dérivés pyrazolo-pyrimidiniques tels ceux mentionnés dans la demande de brevet FR-A-2 750 048 et parmi lesquels on peut citer la pyrazol- [1, 5-a]-pyrimidine-3, 7-diamine ; la 2, 5-diméthyl-pyrazolo-[1, 5-a]-pyrimidine-3, 7 -diamine,
------------------la pyrazolo- [1, 5-a]-pyrimidine-3, 5-diamine ; la 2, 7-diméthyl-pyrazolo- [1, 5-a]-pyrimidine- 3, 5-diamine ; ! e 3-amino-pyrazo) o- [1, 5-a]-pyrimidin-7-oi ; ! e 3-amino-pyrazoio- [1, 5-a]pyrimidin-5-ol ; le 2- (3-am ! no pyrazoio- [1, 5-a]-pyrimidin-7-y) amino)-éthanoi ; ! e 2- (7amino-pyrazolo- [1, 5-a]-pyrimidin-3-ylamino)-éthanol ; le 2- [ (3-amino-pyrazolo [1, 5a] pyrimidin-7-yl)- (2-hydroxy-éthyl)-amino]-éthanol ; ! e 2- [ (7-am ! no-pyrazoto [1, 5a] pyrimidin-3-yl)- (2-hydroxy-éthyl)-amino]-éthanol ; la 5, 6-diméthyl-pyrazolo- [1, 5-a]- pyrimidine-3,7-diamine; la 2,6-diméthyl-pyrazolo-[1,5-a-pyrimidine-3,7-diamine ; la 2, 5, N7, N7-tetraméthyl-pyrazolo-[1,5-a]-pyrimidine-3,7-diamine; la 3-amino-5-méthyl- 7-imidazolylpropylamino pyrazolo-[1,5-a]-pyrimidine; et leurs sels d'addition et leurs formes tautomères, lorsqu'il existe un équilibre tautomérique et leurs sels d'addition avec un acide.
Parmi les dérivés pyrazoliques, on peut plus particulièrement citer les composés décrits dans les brevets DE 3 843 892, DE 4 133 957 et demandes de brevet WO 94/08969, WO 94/08970, FR-A-2 733 749 et DE 195 43 988 comme le 4, 5-diamino-1-méthyl- pyrazol, le 3, 4-diamino-pyrazole, le 4, 5-diamino-1- (4'-chlorobenzyl)-pyrazole, le 4, 5- diamino-1, 3-diméthyl-pyrazole, le 4, 5-diamino-3-méthyl-1-phényl pyrazoie, ie 4, 5Y diamino 1-méthyl-3-phényl-pyrazole, le 4-amino-1, 3-diméthyl-5-hydrazino-pyrazole, le 1-benzyl-4, 5-diamino-3-méthyl-pyrazole, le 4, 5-diamino-3-tert-butyl-1-méthyl pyrazole, le 4, 5-diamino-1-tert-butyl-3-méthyl-pyrazole, le 4,5-diamino-1- (ss-hydroxyéthyl)-3méthyl pyrazole, le 4,5-diamino-1- (ss-hydroxyéthyl) -pyrazole, 4, 5-diamino-1-éthyl-3méthyl-pyrazole, le 4,5-diamino-1-éthyl-3- (4'-méthoxyphényl)-pyrazole, le 4,5-diamino- 1-éthyl-3-hydroxyméthyl-pyrazole, le 4, 5-diamino-3-hydroxyméthyl-1-méthyl-pyrazole, le 4,5-diamino-3-hydroxyméthyl-1-isopropyl-pyrazole, le4, 5-diamino-3-méthyl-1-isopropyl- pyrazole, le 4-amino-5- (2'-aminoéthy !) amino-1, 3-diméthyl-pyrazole, le 3,4, 5-triaminopyrazole, le 1-méthyl-3, 4, 5-triamino-pyrazole, le 3, 5-diamino-1-méthyl-4-méthylamino- pyrazole, le 3,5-diamino-4- (ss-hydroxyéthyl) amino-1-méthyl-pyrazole, leurs sels d'addition avec un acide.
Généralement, les bases d'oxydation représentent de préférence de 0, 0005 à 12% en poids environ du poids total de la composition et encore plus préférentiellement de 0, 005 à 8% en poids environ de ce poids.
-------------------------------------- Par conséquent, dans le premier compartiment du kit où l'on préconise d'utiliser une teinture d'oxydation classique, on trouvera au moins une base d'oxydation et au moins un coupleur.
Ces coupleurs sont plus particulièrement choisis parmi le 2,4-diamino- 1- (P-hydroxyéthyloxy)-benzène, le 2-méthyl-5-amino-phénol, le 5-N- (sshydroxyéthyl) amino-2-méthyl-phénol, le 3-amino-phénol, le 1, 3-dihydroxy-benzène, le 1, 3-dihydroxy-2-méthyl-benzène, le 4-chloro-1, 3-dihydroxy-benzène, le 2-amino4- (phydroxyéthytamino)-1-méthoxy-benzène, te 1, 3-diamino-benzène, le 1, 3-bis- (2, 4diaminophénoxy)-propane, le sésamol, le 1-amino-2-méthoxy-4, 5-méthylènedioxy benzène, l'a-naphtol, le 1-acétoxy-2-méthyl-naphtalène, le 2-méthyl-1-naphtol, le 6-hydroxy indole, le 4-hydroxy indole, le 4-hydroxy N-méthyl indole, la 6-hydroxy indoline, la 2, 6-dihydroxy 4-méthyl pyridine, le 1-H 3-méthyl pyrazol 5-one, le 1-phényl 3-méthyl pyrazole 5-one, la 2-amino 3-hydroxypyridine, le 3, 6-diméthyl-pyrazolo-[3, 2c]-1, 2, 4-triazole, le 2, 6-diméthyl-pyrazolo-[1, 5-b]-1, 2, 4-triazole et leurs sels d'addition avec un acide.
Généralement le ou les coupleurs représentent de préférence de 0,0001 à 15% en poids environ du poids total de la composition tinctoriale et encore plus préférentiellement de 0, 001 à 10% environ.
Les colorations obtenues avec les teintures d'oxydation classiques peuvent être nuancées par l'adjonction de colorants directs ; on pourra donc en outre également introduire au moins un colorant direct dans le premier compartiment du kit ou dans un autre compartiment séparé.
Une solution stock de 30 mM du peptide z-VADFMK, z-DEVD-fmk, z-AEVD-fmk, z-VDVAD-fmk, z-IETD-fmk et z-LEHD-fmk est préparée à partir de 1 mg de produit stérile repris dans respectivement 70,50, 54,45, 51 et 42 pi de DMSO stérile. La solution de chaque inhibiteur est aliquotée en volumes adéquats, puis congelée à -20OC.
2) Appareils.
Les dosages spectrophotométriques ont été réalisés grâce au lecteur de plaque 96 puits iEMS Reader MF (Labsystems). Le fluorimètre (type LS 50B) provient de Perkin-Elmer. L'appareil à sonication (modèle B 15) provient de Branson. La détection de l'apoptose a été réalisée sous un microscope à fluorescence Axioplan de Carl Zeiss avec un filtre Zeiss IV, no 9 (excitation : 450-490 nm ; émission > 520 nm).
II-Méthodes.
1) Culture des cellules microvasculaires rétiniennes bovines (Lecomte et al, 1996).
Les yeux de boeufs, fraîchement énucléés, sont transportés de l'abattoir sur de la glace, immédiatement débarrassés des tissus extraoculaires et placés dans du tampon PBS. Toutes les manipulations sont ensuite effectuées de façon stérile, sous hotte à flux laminaire.
Deux yeux sont nécessaires pour chaque boîte de cellules à ensemencer. Les yeux sont plongés brièvement dans de l'éthanol à 70% puis rincés dans du milieu HBSS (sans Ca2+ ni Mg2+). Ils sont disséqués 5 mm postérieur à la cornée, la chambre antérieure de l'oeil avec le cristallin, ainsi que le vitré contenu dans le globe oculaire, sont enlevés.
La rétine neuronale est décollée du globe oculaire, coupée au niveau du nerf optique et placée dans du tampon HBSS à 4 oc. Ce tampon est préparé à partir de HBSS sans Mg2+ ni Ca2+ contenant 10 mM d'HEPES à pH 7,4, 100 U/ml de pénicilline et 100 ug/ml de streptomycine. Après 10 min d'oxygénation (95% d'02 ; 5% de CO2), de la BSA à 22% est ajoutée jusqu'à une concentration finale de 0,5% ; le pH est alors ajusté à 7,4 avec quelques gouttes de Na OH (en suivant le virage de l'indicateur rouge phénol). Les cellules pigmentaires contaminantes sont éliminées et les rétines, par lot de deux, sont placées dans 10 ml de tampon HBSS propre sur de la glace. Les rétines sont émincées avec des ciseaux (morceaux d'environ 2 mm), homogénéisées (Dounce 15 ml, piston A) avant d'être centrifugées (300 g, 5 min, 4OC).
Culture des péricytes (BRP) : Deux rétines de boeuf sont utilisées pour chaque boîte (6 cm de diamètre) à ensemencer. Chaque lot de deux rétines est traité et homogénéisé comme décrit précédemment dans 10 ml de tampon HBSS à 4 C. L'homogénat est centrifugé (300 g, 5 min, 4 C) et le culot est resuspendu dans 5 ml d'une solution enzymatique de collagénase/dispase. Cette solution de collagénase/dispase (1 mg/ml) préparée dans du milieu HBSS sans Mg2+ ni Ca contenant 10 mM d'HEPES à pH
7, 4, 100 U/ml de pénicilline et 100 ug/ml de streptomycine, est ensuite oxygénée pendant 10 min et le pH est ajusté à 7,4 avant addition de TLCK (147 ng/ml) et de DNase (200 U/ml). La digestion est poursuivie pendant 20 min à 37 C et le culot cellulaire est resuspendu à la main à la miincubation. La suspension est alors filtrée sur un filtre nylon de mailles de 70 um, stérile. Les fragments de microvaisseaux contenus sur le filtre sont récupérés dans du tampon HBSS (le filtre est rincé deux fois), centrifugés (300 g, 5 min, 4 C) et lavés une fois dans le même tampon. Après centrifugation (300 g, 5 min, 4OC), les fragments de microvaisseaux sont resuspendus dans 3 ml de DMEM contenant 10% de SVF, 2 mM de glutamine et les antibiotiques. Les fragments de microvaisseaux sont ensemencés dans une boîte de Pétri (6 cm de diamètre) enduite avec 100 ug de fibronectine (4 ug/cm) dans 2 ml de DMEM pendant 3-4 heures à 37 C (Su & Gillies, 1992). Après avoir laissé les microvaisseaux s'attacher pendant 3 heures à 37OC, le milieu et les débris qui n'ont pas adhéré à la matrice sont éliminés et 3 ml du milieu de culture sont ajoutés. Ce milieu est constitué par du DMEM avec 10% de sérum de veau foetal (SVF), 80 ug/ml d'héparine, la glutamine et les antibiotiques. Les cellules sont maintenues dans un incubateur à 37OC, sous une atmosphère d'air humidifiée contenant 5% de C02. Le milieu de culture est renouvelé au bout de 24 heures puis toutes les 48 heures jusqu'à ce qu'elles atteignent la confluence.
A confluence, le milieu de culture est éliminé et les cellules sont trypsinées avec 1 ml d'une solution à 0,5% de trypsine et 0,2% d'EDTA jusqu'à ce que les cellules s'arrondissent (environ 5 minutes) après examen au microscope à contraste de phase. La trypsine est alors inactivée avec 2 ml de milieu de culture contenant du sérum et les cellules sont récupérées puis centrifugées (180 g, 3
min, 4OC). Les cellules, sous-cultivées dans un rapport 1 : 3, sont ensemencées dans trois boîtes (6 cm de diamètre) recouvertes de fibronectine et cultivées dans le même milieu.
2) Culture des péricytes en présence de produits avancés de glycation (AGE).
Les effets des AGE sont testés sur un même lot de cellules (BRP issus de la même culture primaire).
Lorsqu'ils sont à confluence, les BRP en culture primaire sont trypsinés. Après les avoir laissés s'attacher 4 heures à 37OC, le milieu et les débris cellulaires qui n'ont pas adhéré à la matrice sont éliminés et le milieu de culture (10% de SVF pour les BRP) est ajouté. Afin de tester les effets des AGE, une solution d'AGE (ou son contrôle) est ajoutée au milieu de culture jusqu'à une concentration de 20 pM. Les cultures sont ainsi poursuivies pendant 1 ou 2 passages avec les agents, soit 7 et 15 jours respectivement pour les BRP.
Préparation des AGE : Des"AGE-méthylglyoxal"ont été préparés en incubant 7,2 mg/ml de BSA et 100 mM de méthylglyoxal pendant 50 heures à 37 C (Westwood & Thornalley, 1995). La BSA-contrôle a été obtenue en incubant de l'albumine dans les mêmes conditions mais sans méthylglyoxal. Les protéines glyquées ont été caractérisées par leur fluorescence (370- 440 nm), leur fixation à des cellules endothéliales en culture, des phagocytes mononucléaires et le RAGE purifié (Yan et al., 1994).
En absence de tétracycline, la partie tetR du transactivateur tTA se fixe sur une séquence de régulation comprenant par exemple des séquences répétées (2,7, ou 10 répétitions) de l'opérateur de la tétracycline, et placé en amont d'un promoteur transcriptionnel minimum par exemple du Cytomegalovirus humain (hCMV), et active la transcription du transgène inhibiteur et la production du transcrit inhibiteur, assurant une inhibition constitutive efficace du transcrit d'intérêt. En présence de tétracycline, celle-ci se fixe sur la partie tetR du transactivateur chimérique tTA, provoque un changement de sa conformation ainsi qu'une perte d'affinité pour les séquences répétées de l'opérateur de réponse à la
tétracycline (tetO). Il en résulte alors une inhibition de la production du transcrit inhibiteur à partir du transgène inhibiteur et le rétablissement d'un niveau d'expression du transgène d'intérêt ou de l'activité du transcrit d'intérêt.
Les séquences régulatrices comprenant les séquences répétées de tetO sont avantageusement intégrées au sein d'un amplificateur/promoteur tissu-spécifique ou peuvent être utilisées en remplacement de certaines séquences amplificatrices (Rose et al., J.Biol. Chem. 272 (1997) 4735-4739 ; Agha-Mohammadi et al, Gene Ther, 5 (1998) 76-84). Ce système confère ainsi non seulement un ciblage temporel de la régulation du transgène d'intérêt, mais également spatial.
De préférence, la séquence codante pour le transactivateur tTA et le promoteur TrRS conduisant la transcription du transcrit inhibiteur sont portés sur une seule molécule d'acide nucléique. Cette dernière peut comprendre par exemple la séquence codant pour tTA sous le contrôle d'un promoteur viral ou tissu-spécifique, puis la cassette du promoteur répressible par la tétracycline (TrRS) liée de manière fonctionnelle avec la séquence codant pour le transcrit inhibiteur (O'Brien et al., Gène, 184 (1997) 115-120).
Une organisation alternative de type bicistronique comprenant la cassette d'expression TrRS liée fonctionnellement à la séquence codant pour un transcrit inhibiteur, suivie d'une séquence IRES (Internai Ribosome Entry Site) et d'une séquence codante pour le tTA, ou vice versa, peut être également utilisée. Encore un autre exemple d'organisation comprend un promoteur bidirectionnel qui conduit l'expression du tTA est du transcrit inhibiteur. En absence de tétracycline, le tTA est exprimé et active la transcription du transgène inhibiteur en un transcrit inhibiteur, qui vient à son tour inhiber le transcrit utile ou d'intérêt (Liang et al., Gène Ther., 3 (1996) 350-356).
L'agent répresseur externe utilisé selon ce premier mode de réalisation, peut être la tétracycline ou l'un de ses analogues tels que la doxycycline, l'anhydrotétracycline, ou l'oxytétracycline (Agha-Mohammadi et al., Gène Ther, 4 (1997) 993-997) susceptibles de conduire à une inhibition de la transcription du transgène inhibiteur, et donc de l'activité du transcrit inhibiteur. L'administration de tétracycline ou d'un de ses analogues permet de lever l'inhibition par le transcrit inhibiteur et ainsi de rétablir un niveau biologiquement efficace du transcrit d'intérêt. Le niveau d'expression du transcrit d'intérêt peut être avantageusement corrélé avec la quantité de tétracycline ou de l'analogue administrée, dans la mesure où les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques de la tétracycline et de ses analogues sont bien connues de l'homme du métier, et se trouvent entre autres détaillées dans le Vidal, et dans le chapitre "Antimicrobial Agents : Tetracyclines" dans :Goodman and Gilaman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9ème Ed., Joel G. Hardman, Alfred Goodman Gilamn, Lee E.
Limbird Ed.
Par ailleurs, du fait de la forte affinité de la tétracycline pour la protéine tetR, la tétracycline ou un analogue de celle-ci peut être utilisé à de faibles concentrations et par conséquent les effets secondaires sont minimes.
De manière encore plus préférentielle, la séquence du transgène inhibiteur est placé sous le contrôle d'un promoteur minimal dérivé du promoteur du gène de la thymidine kinase (TK) ou du CMV humain en amont duquel se trouve une séquence régulatrice telle que décrite notamment dans W096/30512.
L'inhibition du transcrit inhibiteur peut également être obtenue par insertion au sein de sa séquence ou de ses extrémités 5' ou 3', de @ séquences particulières telles que les aptamères qui sont décrits dans la