INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
- soit la protéine NusA ou une protéine équivalente, Par protéine équivalente, on comprend toute protéine ayant entre 22 et 100% d'identité de séquence avec celle de la protéine NusA d'E. coli (Swiss Prot P03003).
- soit des fragments d'une de ces deux protéines, - soit une de ces deux protéines sous forme de protéine de fusion, - soit des fragments d'une de ces deux protéines sous forme de protéine de fusion.
L'invention concerne un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel : - on adsorbe la protéine intervenant au cours de la transcription sur un support, - on incube ledit support avec l'ARN polymérase et avec le composé soumis au procédé de détection, ce qui conduit à la formation d'un complexe entre l'ARN polymérase et ladite protéine et la formation éventuelle d'une liaison entre l'ARN polymérase et le susdit composé, - on incube ledit support avec un anticorps anti-ARN polymérase, - on détecte, par un test de complexation, la variation significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et la susdite protéine par rapport à une valeur de contrôle correspondant à la quantité de complexe formé entre l'ARN polymérase et la susdite protéine en l'absence de tout modulateur, et
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VECTEURS RECOMBINANT CONTENANT UN ACIDE NUCLEIQUE CODANT POUR UN POLYPEPTIDE SELON L'INVENTION.
Un autre objet de l'invention, consiste en un vecteur recombinant de clonage et/ou d'expression contenant une séquence codante du gène DD1-a ou du gène DD1-b, placé sous le contrôle d'une séquence régulatrice appropriée fonctionnelle dans l'organisme hôte dans lequel l'expression d'un polypeptide selon l'invention est recherchée.
Il a été montré selon l'invention qu'un polypeptide codé par le gène DD1-a ou le gène DD1-b est exprimé spécifiquement dans les cellules de la zone de transfert du grain en développement et est ainsi susceptible d'être impliqué dans le transfert des métabolites de la plante mère vers l'albumen, ou encore d'être impliqué dans la défense de la plante envers divers pathogènes végétaux, de constituer un signal pour le développement de l'albumen et/ou de l'embryon comme c'est le cas des gènes codant pour les protéines BETL1 à BETL4 décrits par HUEROS et al. (1999b).
Ainsi, l'invention a encore pour objet un vecteur d'expression recombinant comprenant : a) un acide nucléique régulateur de l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans un organisme hôte déterminé ; et
b) un polynucléotide d'intérêt codant pour un polypeptide selon l'invention, préférentiellement un acide nucléique de séquences SEQ ID NO1, 2,5, 6,7 ou 8.
Afin d'améliorer la qualité ou la quantité des métabolites présents dans l'albumen du grain mature, ou encore d'augmenter la résistance d'une plante à divers pathogènes végétaux, il est donc utile de surexprimer un acide nucléique codant pour un polypeptide codé par le gène DD1-a ou par le gèneDD1-b.
Le cas échéant, la séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut être une séquence régulatrice inductible par un métabolite particulier, tel que : - une séquence régulatrice inductible par les glucocorticoïdes telle que décrite par AOYMA et al. (1997) ou telle que décrit par McNELLYS et al.
(1998) ; - une séquence régulatrice inductible par l'éthanol, telle que celle décrite par SALTER et al. (1998) ou encore telle que décrite par KADDICK et al ; (1998) ; - une séquence régulatrice inductible par la tétracycline telle que celle commercialisée par la Société CLONTECH.
La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut comprendre un promoteur constitutif, tel que : - le promoteur 35S, ou avantageusement le promoteur constitutif double 35S (pd35S) du CaMV, décrits dans l'article de KAY ET6 AL. (1987) ; - le promoteur actine du riz suivi de l'intron actine de riz (PAR-LAR) contenu dans le plasmide pAct-1-F4 décrit par McELROY et-al. (1991) ; - le promoteur pUbi1 du gène codant- pour l'ubiquitine 1 de maïs (CHRISTENSEN et aL, (1992).
La séquence régulatrice capable de contrôler l'acide nucléique codant pour un polypeptide selon l'invention peut aussi diriger une
expression de l'acide nucléique d'intérêt spécifiquement dans certains tissus, comme la graine, la feuille ou la racine. Il peut s'agir notamment des séquences régulatrices suivantes : - un promoteur tissu spécifique comme le promoteur HMWG de blé ou d'orge, ou encore le promoteur pCRU du gène de la cruciférine de radis, qui permettent tous trois une expression de la protéine d'intérêt dans les graines (ROBERTS et al. (1989) ; ANDERSON O. D. et al. (1989) ; DEPIGNY-THIS et al. (1992) ; - les promoteurs PGEA1 et PGEA6 correspondant à la région 5' non codante des gènes de la protéine de réserve de graines, GEA1 et GEA6 respectivement d'Arabidopsis thaliana (AUBIER et al., (1993) et permettant une expression spécifique dans les graines ; - le promoteur du gène de zéine de maïs (Pzéine) contenu dans le plasmide p63, et permettant l'expression dans l'albumen des semences de maïs (REINA et al., 1990) ; - des promoteurs spécifiques de régions ou de tissus particuliers des plantes, et plus particulièrement des promoteurs spécifiques des graines (DATLA, R. et al., 1997), notamment les promoteurs de la napine (EP 255 378), de la phaseoline, de la glutenine, de l'héliantinine (WO 92/17580), de l'albumine (WO 98/45460), de l'oélosine (WO 98/45461), de l'ATS1 ou de l'ATS3 (PCT/US 98/06978, déposée le 20 Octobre 1998, incorporée ici par référence) ; - promoteurs spécifiques des tissus feuilles ou racines.
caractéristiques générales des vecteurs recombinants selon l'invention.
Par vecteur au sens de la présente invention, on entendra une molécule d'ADN ou d'ARN circulaire ou linéaire qui est indifféremment sous forme simple brin ou double brin.
Selon un autre aspect, un acide nucléique utilisable en tant que sonde ou amorce nucléotidique pour la détection ou l'amplification d'une séquence génomique, de l'ARNm ou de l'ADNc du gène DD1-b, peut être caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences suivantes : a) les séquences nucléotidiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique de séquence SEQ ID D ? 2 ; et b) les séquences comprenant au moins 12 nucléotides consécutifs d'un acide nucléique de séquence SEQ ID ? 2.
La présente invention concerne également un procédé de détection de la présence d'un acide nucléique du gène DD1-a ou DD1-b dans un échantillon, ladite méthode comprenant les étapes de : 1) mettre en contact une sonde ou une pluralité de sondes nucléotidiques selon l'invention avec l'échantillon à tester ; 2) détecter le complexe éventuellement formé entre la ou les sondes et l'acide nucléique présent dans l'échantillon.
Selon un mode de réalisation particulier du kit de détection décrit cidessus, un tel kit comprendra une pluralité de sondes oligonucléotidiques conformes à l'invention qui vont être utilisées pour détecter des séquences cibles d'intérêt du gène DD1-a ou du gène DD1-b ou alternativement détecter des mutations dans les régions codantes ou les régions non codantes du gène DD1-a ou DD1-b, plus particulièrement des acides nucléiques de séquence SEQ ID NO1 à SEQ ID ? 8 ou les acides nucléiques de séquence complémentaire.
Une séquence cible peut être par exemple une séquence comprise dans un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou DD1-b ou encore une séquence comprise dans une région codante génomique ou de l'ADNc de l'un ou l'autre de ces gènes ou encore une séquence commune aux gènes DD1-a ou DD1-b.
Les amorces nucléotidiques selon l'invention peuvent être utilisées pour amplifier un fragment nucléotidique quelconque (ADNg, ADNc, ARNm)
du gène DD1-a ou du gène DD1-b, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquence SEQ ID NO1 à SEQ ID NOS, ou encore un fragment ou un variant de ces séquences.
Un autre objet de l'invention concerne un procédé pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement d'un acide nucléique de séquence SEQ ID NO1 à SEQ ID NOS ou un fragment ou un variant allélique de celui-ci contenu dans un échantillon, ledit procédé comprenant les étapes de : a) mettre en contact l'échantillon dans lequel la présence de l'acide nucléique cible est suspectée avec une paire d'amorces nucléotidiques dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3' de la région de l'acide nucléique cible du gène DD1-a ou du gène DD1-b dont l'amplification est recherchée, en présence des réactifs nécessaires à la réaction d'amplification ; et b) détection de l'acide nucléique éventuellement amplifié.
L'invention a en outre pour objet un nécessaire ou kit pour l'amplification d'un acide nucléique selon l'invention, et plus particulièrement tout ou partie d'un acide nucléique de séquences SEQ ID NO1 à 8, ledit nécessaire ou kit comprenant : a) un couple d'amorces nucléotidiques conforme à l'invention, dont la position d'hybridation est localisée respectivement du côté 5'et du côté 3' de l'acide nucléique cible du gène DD1-a ou du gène DD1-b dont l'amplification est recherchée ; b) le cas échéant, les réactifs nécessaires à la réaction d'amplification.
Selon un mode de réalisation préféré, des amorces selon l'invention comprennent tout ou partie d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID ? 13 à SEQ ID NO 17.
VECTEURS RECOMBINANT SELON L'INVENTION Selon encore un autre aspect, l'invention concerne des vecteurs recombinants de clonage et/ou d'expression comprenant l'un quelconque des acides nucléiques définis ci-dessus.
VECTEURS RECOMBINANTS COMPRENANT UN ACIDE NUCLEIQUE REGULATEUR DU GENE DD1-a OU DU GENE DD1-b.
Un autre objet de l'invention consiste en des vecteurs recombinants dans lesquels a été insérée une séquence régulatrice du gène DD1-a ou du gène DD1-b ou encore un fragment d'une telle séquence régulatrice, telle que les fragments définis dans la présente description.
Avantageusement, un vecteur recombinant selon l'invention pourra comprendre un acide nucléique régulateur de séquence SEQ ID ? 3 ou SEQ ID ? 4 ou encore un fragment de la séquence SEQ ID ? 3 ou SEQ ID ? 4 capable de diriger l'expression d'un gène d'intérêt placé sous son contrôle dans les cellules d'une plante, et de manière tout à fait préférée dans les cellules de la zone de transfert d'un grain en développement.
Font ainsi partie de l'invention des vecteurs recombinants pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans la zone de transfert d'un grain de végétal en développement comprenant : a) un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b tel que défini dans la présente description ; et b) un polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide nucléique régulateur défini en a).
Préférentiellement, le polynucléotide d'intérêt placé sous le contrôle de l'acide régulateur du gène DD1-a ou DD1-b est un acide nucléique codant pour une protéine impliquée dans le transfert de métabolites vers l'albumen en développement d'un grain de plante.
Les polynucléotides d'intérêt préférés ont été décrits précédemment dans la description.
Le polynucléotide d'intérêt peut consister en un polynucléotide codant pour un polypeptide détectable, ou polypeptide marqueur tel par exemple un polynucléotide codant pour la protéine GUS ou encore pour une protéine fluorescente, telle que la protéine GFP (Green Fluorescent Protein) ou YFP (Yellow Fluorescent Protein).
Un vecteur qui peut être mis en oeuvre pour l'introduction d'un acide nucléique régulateur selon l'invention capable de contrôler un polynucléotide d'intérêt est le plasmide L127a5 représenté à la figure 7 ; Des vecteurs recombinants dans lesquels ont été introduits un acide nucléique régulateur du gène DD1-a ou du gène DD1-b selon l'invention localisés en amont d'un polynucléotide d'intérêt sont par exemple le vecteur recombinant L246a représenté à la figure 8, le vecteur L246b représenté à la figure 9, le vecteur L247a représenté à la figure 10 et le vecteur L247b représenté à la figure 11.
Le vecteur L246a comprend un acide nucléique d'environ 3 kb de la séquence régulatrice du gène DD1-a localisé en amont du gène rapporteur GUS. Le vecteur L246a est contenu dans la souche de Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le nO d'accès 1-2567.
Le vecteur recombinant L246b comprend un acide nucléique régulateur d'environ 1 kb du gène DD1-a, plus précisément un acide nucléique allant du nucléotide en position 2585 jusqu'au nucléotide en position 3595 de la séquence nucléotidique SEQ ID ? 3.
Le vecteur L 247a contient un acide nucléique régulateur d'environ 2,5 kb du gène DD1-b. Le vecteur L247a est contenu dans la souche de
Escherichia coli déposée à la CNCM le 4 Octobre 2000 sous le n'd'accès 1- 2568.
Le vecteur L247b comprend un acide nucléique régulateur d'environ 1,6 kb de la séquence du gène DD1-b, plus précisément un acide nucléique régulateur allant du nucléotide en position 1204 au nucléotide en position 2813 de la séquence nucléotidique SEQ ID D ? 4.
L'invention a encore pour objet un vecteur recombinant caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les vecteurs L246a, L246b, L247a et L247b. Pour l'ensemble des vecteurs L246a, L246b, L247a et L247b, l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a et du gène DD1-b est localisé en amont du gène marqueur GUS, dont il contrôle l'expression.
L'invention va maintenant être décrite avec plus de détails en se référant à un mode de réalisation particulier donné à titre d'exemple seulement et représenté aux dessins annexés, dans lesquels Figure 1 est une vue en perspective d'un dispositif, selon l'invention. Figure 2 montre en perspective la clé de verrouillage. Figure 3 montre en perspective le dispositif monté, selon l'invention. Figure 4 est également une vue en perspective, le dispositif étant verrouillé. Figure 5 montre en perspective le chargeur utilisable pour le montage sur des pistes d'une série de dispositifs, selon l'invention. Figure 6 montre le chargeur garni. Figure 7 montre l'ensemble monté, le chargeur étant retiré. Figure 8 est une vue en plan schématique montrant le montage d'un dispositif dans le chargeur. Figure 9 est une vue en coupe suivant la ligne 9-9 de la figure 8.
Figure 10 est une vue en plan similaire à la figure 8, le chargeur étant verrouillé. Figure 11 est une vue en coupe suivant la ligne 11-11 de la figure 10. Le dispositif, selon l'invention, comprend un élément principal 1 désigné dans son ensemble par la référence 1 et une clavette 2 (voir figure 1). L'élément 1 est réalisé en un métal bon conducteur de l'électricité convenablement découpé et plié pour présenter, à une extrémité, une âme avec des pattes 3 destinées à être serties sur 1a gaine d'un conducteur et des pattes 4 destinées à être rabattues et serties sur une extrémité dénudée dudit conducteur, ladite âme 5 étant solidaire d'un corps à section en U 6 dont deux côtés 6a et 6b sont prolongés par deux branches 7 et 8 s'étendant sensiblement parallèlement. La branche 7 est prolongée par une barrette 9 inclinée vers l'intérieur et terminée par un organe de contact 11 présentant une section en forme d'arc de cercle. La branche 8 est conformée de la même manière que la branche 7 et est prolongée par une barrette 10 terminée par un organe de contact 12 à section en arc de cercle. Les côtés 6a et 6b comportent, chacun, une saillie 13, tandis que les branches 7 et 8, au voisinage desdites saillies, sont pourvues latéralement respectivement de butées 14 et 15.
Au voisinage des barrettes 9 et 10, sur la face externe des branches 7 et 8, sont formées des bossages respectivement 17 et 18. Les organes de contact 11 et 12, au voisinage de leur extrémité libre, présentent des crevés 20 et 22 respectivement, tandis qu'au voisinage des barrettes 9 et 10 sont formées des butées latérales 19 et 21 respectivement. La clavette 2 (voir figure 2) est réalisée en un matériau doué d'une bonne élasticité et est conformée de manière à présenter une partie en U avec une âme 30, deux ailes 31 et 32 prolongées respectivement par des retours 33 et 34. Les retours 33 et 34 sont découpées pour former deux organes d'appui 35 et 36 respectivement entre lesquels s'étendent des bords 44 et 45, tandis qu'au voisinage de leur extrémité libre, ils présentent des ouvertures respectivement 37 et 38. Le bord libre 40 du retour 33 est plié vers l'intérieur, le bord libre 41 du retour 34 étant, également, plié vers l'intérieur. L'aile 31 de la clavette est prolongée par une plaquette de verrouillage 42 présentant, sur sa face tournée en regard du retour 33, un bossage 43. L'aile 32 comporte une plaquette de verrouillage 44 avec un bossage 45 sur sa face tournée en regard du retour 34.
La clavette 2 est montée entre les branches 7 et 8 de manière que le retour 33 coopère avec la surface externe de la branche 7, le retour 34 portant contre la surface externe de 1a branche 8, les ailes 31 et 32 s'insérant entre lesdites branches 7 et 8. Comme on le voit à la figure 3, la clavette 2 peut occuper une position de repos dans laquelle elle est maintenue par les bossages 17 et 18 qui sont engagés dans les ouvertures 37 et 38. Dans cette position, les organes de contact 11 et 12 peuvent jouer librement. Ces organes 11 et 12 sont destinés à s'engager dans un trou 51 pratiqué dans une piste d'un circuit 50 moyennant leur déformation élastique. L'engagement dans 1e trou 51 est limité, d'un côté du circuit par les butées latérales 19 et 21, tandis que du côté opposé, lesdits organes 11 et 12 sont retenus par les crevés 20, 22. Comme on le voit à la figure 4, lorsque 1e dispositif 1 est mis en place dans le trou 51, on commande le déplacement vertical de 1a clavette 2 jusqu'à ce que les retours 33 et 34 viennent porter contre le circuit 50. Durant ce déplacement vertical qui s'effectue moyennant une certaine friction, les plaquettes de verrouillage 42, 44, dort l'écartement au repos est supérieur à la distance séparant les faces internes des organes de contact 11, 12, viennent coopérer avec celles-ci et tendent, par conséquent, à les écarter ce qui permet d'assurer un parfait verrouillage et une bonne liaison électrique. En fin de course, les bords 43 et 45 viennent s'insérer sous les bossages 17 et 18 de sorte que le dispositif est définitivement bloqué.