INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Or, après d'importantes recherches menées sur la question, la Demanderesse vient maintenant de découvrir qu'il est possible d'obtenir des compositions de décoloration prêtes à l'emploi qui ne coulent pas et restent donc bien localisées au point d'application, et qui permettent aussi d'obtenir des décolorations puissantes et homogènes tout en laissant les cheveux moins rèches si on introduit dans la composition une quantité efficace d'un polymère à squelette aminoplaste-éther.
La présente invention a ainsi pour objet une composition prête à l'emploi pour la décoloration des fibres kératiniques, en particulier des fibres kératiniques humaines, telles que les cheveux, comprenant, dans un milieu approprié pour la décoloration, au moins un agent oxydant, qui est caractérisée par le fait qu'elle contient en outre au moins un polymère à squelette aminoplaste-éther.
Selon l'invention, ladite composition est anhydre ou aqueuse.
De préférence selon l'invention, le polymère à squelette aminoplaste-éther est présent dans au moins une composition aqueuse que l'on mélange au moment de l'emploi avec une composition anhydre sous forme de poudre ou de crème contenant au moins un agent oxydant.
Plus préférentiellement encore, l'une de ces compositions aqueuses mélangée à la composition anhydre renferme du peroxyde d'hydrogène.
L'invention vise également un procédé de décoloration des fibres kératiniques, et en particulier des fibres kératiniques humaines telles que les cheveux utilisant la composition de décoloration prête à l'emploi telle que décrite selon l'invention.
Ainsi, un dispositif à deux compartiments comprend un premier compartiment contenant au moins une poudre ou une crème anhydre ou une composition aqueuse, et le deuxième compartiment une composition aqueuse, l'un au moins des deux compartiments contenant au moins un agent oxydant et l'un au moins des deux compartiments contenant au moins un polymère à squelette aminoplaste-éther.
Un autre kit à plusieurs compartiments peut être constitué d'un premier compartiment contenant une poudre ou une crème anhydre et de deux autres compartiments contenant chacun une composition aqueuse, l'un au moins des
trois compartiments contenant au moins un agent oxydant et l'un au moins des trois compartiments contenant au moins un polymère à squelette aminoplaste- éther.
Dans le mode de réalisation décrit, mais non limitatif, le résultat recherché est obtenu avec un répartiteur dont les caractéristiques sont les ordres de grandeur suivants Pour un diamètre du tube d'arrivée du flux air-gaz de section (SI) : - La section (S2) de la base du répartiteur (11) est (S2) = (SI) x 6 avec une fourchette de (SI) x 4 à (SI) x 6.
- L'angle au sommet est de 60' Pour une surface de révolution (S3) de l'enceinte de diffusion (12) - La surface de révolution (S4) du répartiteur (11) est (S4) x 1/4 avec une fourchette de (S3) x 1/4 à (S3) x 115.
et pour la surface de révolution S4 du répartiteur (11), le pourcentage de perforation est de (S4) x 40 % avec des trous de diamètre de 2 mm et dans une fourchette de 3 à 3,5 mm2 de section unitaire.
N.13 : Cette enceinte de répartition (11) n'est jamais en contact par sa face externe avec le mélange enflammé. Contrairement au cône intérieur solidaire du tube, décrit dans le brevet EP 0382286B 1 au nom du déposant, il ne remplit pas la même fonction. C'est pourquoi, la taille du diamètre des perforations du répartiteur (11) peut être très sensiblement plus grande afin de ne pas être un obstacle au libre passage des poussières de l'air ambiant et d'un flux en très basse pression.
Il faut noter aussi que l'espace intérieur compris entre le répartiteur (11) et l'enceinte de diffusion (12) est une zone "froide". Ce qui présente l'avantage d'une température modérée du flux air-gaz et donc d'une densité non perturbée, ainsi que d'une température du plateau (16) sensiblement plus basse que celle, très élevée de la surface (14) d'émission infrarouge.
De ce fait, le tube (17) d'arrivée du flux air-gaz et, en amont, les composants classiques tels que venturi, buse d'entrée d'air primaire, porte injecteur, injecteur, valve de sécurité etc... n'ont pas à souffrir, par conduction, d'une chaleur élevée.
- Enceinte (12) : c'est l'enceinte de diffusion du flux air-gaz reçu de façon homogène en quantité et direction du répartiteur (11).
C'est aussi la barrière anti-retour de flamme (prise de feu à l'injecteur et combustion interne).
- les orifices selon lesquels cette enceinte est ajourée ont, dans cette optique une section unitaire comprise entre 0,70 et 0,50 MM2 . En effet, la faible vitesse d'éjection du flux air-gaz diffusé à travers ces orifices rend imprudent une section plus importante au regard de la fonction anti-retour de flamme.
- dans une autre optique, dont il doit être tenu compte, ces orifices doivent avoir une section minimale de 0,50 mm 2 : en effet, cette enceinte (12) assurant aussi, comme indiqué précédemment, une première pyrolyse des poussières d'ambiance grâce a sa température de l'ordre de 700' C, il convient de contre-carrer la propension des cendres minérales des poussières pyrolisées à s'agréger au pourtour des orifices. Une section unitaire trop faible de ces orifices, d'une part, gênerait l'élimination de ces cendres, et de l'autre, diminuerait l'efficacité de la fonction de diffusion.
- la fonction anti-retour de flamme de cette enceinte(l 2) conduit par ailleurs à une fixation étanche de la base de cette enceinte (l 2) au plateau supérieur (l 6) et à la même étanchéité au niveau des sutures de mise en forme de sa paroi de révolution.
- enfin : sur le plan du ratio de surface de révolution (12) par rapport à l'enceinte de répartition (11), la construction doit être telle que : Surface (12) surface (11) x 4 avec une fourchette de (11) x 4 à (11) x 5. Sur le plan du ratio de la surface ajourée : Surface ajourée de (12) surface ajourée de (11) x 2,5 avec une fourchette de (11) x 2 à (l 1) x 3. - Enceinte (13) : c'est l'enceinte de protection thermique et de premier confinement intercalée entre l'enceinte (12) de diffusion et de barrière anti-retour de flamme et l'enceinte (14) d'émission infrarouge. Il faut noter que l'enceinte (14) ayant comme décrit plus loin, une surface ajourée identique à celle de l'enceinte (12) se comporte elle-même comme une première barrière anti-retour de flamme mais d'une sécurité insuffisante en raison de sa haute température. L'interposition entre ces 2 enceintes (14) et (12) de l'enceinte (13) multiplie la sécurité anti-retour de flamme en abaissant la température de l'enceinte (12) à environ 700' C maximum.
- Par contre, elle contribue à élever la température d'émission de l'enceinte (1 4), l'espace entre les enceintes (l 3) et (1 4) étant le siège d'un effet en retour de la chaleur de l'enceinte (1 4), ce qui augmente le pouvoir émissif de cette dernière.
N.13 : L'utilité de cette enceinte (13) de précaution en protection thermique de l'enceinte (12), croît avec la diminution de la pression nominale du gaz devant alimenter l'émetteur objet de la présente description. Plus la vitesse de diffusion est faible, plus le risque de retour de flamme sur une enceinte (1 2), trop chaude et non protégée, augmente.
Cette utilité croît aussi et surtout lorsque l'émetteur est utilisé dans un environnement sujet à des courants d'air. L'action mécanique de ces perturbations de l'air extérieur est en mesure de provoquer, sans la paroi de protection (13), un souffle rabattant capable de traverser la paroi de l'enceinte (12) et de provoquer ainsi une combustion interne. En résumé, - si la pression du gaz est suffisante et si l'environnement est une ambiance parfaitement stable il peut être envisagé de ne pas disposer une enceinte (l 3) entre les enceintes (l 2) et (l 4).
- si les conditions de pression et d'environnement indiquées ci-dessus ne sont pas fermement assurées, il est contre-indiqué de ne pas prévoir l'enceinte (l 3) de protection thermique et de premier confinement.
Pour les autres exemples de la présente demande indiqués sur les tableaux de la figure 4 pour lesquels l'acide aminé concerné est un acide aminé autre que la Leu, on procède à l'étape 1 de la synthèse de ces produits également de la même façon que pour l'exemple 1 décrit ci-après dans la partie expérimentale en utilisant à la place de Fmoc-Leu, le composé de formule (VIb) correspondant à l'acide aminé concerné soit. les Fmoc acides aminés suivants : Fmoc-L-Glu(Alloc); FmocGly; Fmoc-Ala; Fmoc-Val; Fmoc-Phe et Fmoc-Tyr(OtBu) : on obtient ainsi respectivement des produits finals dans lesquels le reste d'acide aminé est un reste de Glu ou Glu(Alloc), Gly, Ala, Val, Phe ou Tyr(OtBu) .
Pour les autres exemples de la présente demande indiqués sur les tableaux de la figure 4 pour lesquels l'acide aminé concerné est la tyrosine, on procède comme indiqué ci-après à la préparation de l'exemple 3, en utilisant le produit de formule (VI) Fmoc-Tyr(OtBu) pour obtenir le produit final de formule (I) correspondant dans lequel le radical hydroxyle est sous forme terbutoxy : on libère ensuite sur le produit de formule (I) ainsi obtenu, la fonction hydroxyle afin d'obtenir un nouveau produit de formule (I) dans lequel le reste d'acide aminé est alors un reste de tyrosine. La déprotection de tels dérivés de formule (I) où R2= (tBuO)PhCH2 peut être réalisée par exemple par la méthode classique à l'acide trifluoroacétique en mélange 50/50 avec du dichlorométhane. Le schéma d'une telle réaction est indiqué ci-après.
Les exemples donnés dans les tableaux de la figure 4 décrite ci-après illustrent le procédé décrit ci-dessus mais ne limitent en aucun cas la présente invention.
Les exemples décrits à la partie expérimentale de la présente demande qui sont donc les exemples 1 à 3 des tableaux de la figure 4, donnent des exemples de réalisation de la présente invention qui illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
Partie expérimentale Exemple 1 : 3-[ 9(S)- benzoylamino -6,10-dioxo- 1,2,3,4,7,8,9,10- octahydro -6H-pyridazino[1,2a][1,2]diazepine-1(S)-carboxamide]-5-méthyl-1-benzoyloxyhexane-2-one Etape 1 : N-Fmoc-3-amino-l-diazo-5-méthyl-hexane-2-one A une suspension de 3. 52g de Fmoc-Leucine (11. 3 mmoles) dans 35 ml de dichlorométhane sont additionnés successivement sous azote et à -10 C , 1.3 ml de 4-méthyl-morpholine (11.9
mmoles; 1. 05 équ. ) et goutte à goutte, 1. 5 ml de de chloroformate d'isobutyle (11. 6 mmoles; 1. 03 équ. ). Le mélange réactionnel devient limpide, puis un précipité de chlohydrate de 4-méthyl-morpholine apparaît. Après 1 heure d'agitation à -10 C, le précipité est filtré.
La solution résultante est refroidie à -10 C, puis, sous azote, 75ml (19. 1 mmoles, 2équ. ) de solution 0.3M de diazométhane dans CH2C12 sont additionnés.
La température est ramené progressivement à TA . Après 1 heure de réaction à TA le mélange est versé dans 100 ml de solution saturée de bicarbonate de sodium. La phase organique est lavée à l'eau (100 ml), sèchée sur sulfate de magnésium, puis concentrée à sec. Le brut est directement chromatographié sur 500g de silice en utilisant CH2C12/AcOEt 95/5. On isole 2. 6g (rdt= 65%) d'un solide jaunâtre).
MS : MH+378 RMN H1 (CDC13) (250MHz) 0. 95 (6H;d ;2CH3), 1. 40 à 1.85(3H ;2m ; 1CH et 1CH2) 4.18(lH,t,CH Fmoc), 4.4 à 4.55(2H ;m ;1CH et 1CHN2), 5.28(lH,dl,NHCO), 4.42(2H ;dl ;CH2 Fmoc), 5.12(1H ;sl ; CHN2), 6. 90 à 7.45(9H ;m ;H aromatiques), 7.55(2H ;tl ;H aromatiques), 7.77(2H ;dl ;H aromatiques) Etape 2 : a) ester méthylique de l'acide 9(S)- benzoylamino -6,10dioxo-1,2,3,4,7,8,9,10- octahydro -6H-pyridazino[1,2- a] [1, 2] diazepine-1 (S) -carboxylique A une solution de 500 mg d'amine il) (1,96 mmoles) dans 12 ml
de CH2C12, est,additionnée, à 0 C sous azote, successivement 0,68 ml de diisopropylethylamine (2 mmoles ; équi. ) suivie de 0,26 ml de chlorure de benzoyl (2,16 mmoles, 1. 1 équi.).
La température est ramenée à TA. Après 1 heure d'agitation, 12 ml d'HCl lN sont additionnées. Le mélange est décanté et la phase organique successivement lavée avec 12 ml de solution saturée de NaCl et 12 ml de solution saturée de bicarbonate de sodium. La solution organique est sèchée sur sulfate de magnésium puis concentrée à sec. On isole 0,424 mg (rdt =54%) de benzoylamino-pyrazépate de méthyl.
MS : [MH] - 358 ; MH+ 360 ; MNa+ 382 b) l'acide 9(S)- benzoylamino -6,10-dioxo-1,2,3,4,7,8,9,10octahydro -6H-pyridazino[1,2-a][1,2]diazepine-1(S)carboxylique A une solution de 424 mg (1,18 mmole) de 9(S)- benzoylamino- octahydro-6,10-dioxo-6H-pyridainzo[1,2-a][1,2]diazepine-1(S)- carboxylique methyl ester dans 10 ml de méthanol est aditionné 99 mg d'hydoxyde de lithium (2,36 mmoles ; à 0 C. La température est remontée à TA puis la réaction maintenue 1 nuit. La solution est concentrée au rotavapor jusqu'à 5 ml. 5 ml d'eau sont additionnés et le pH de la solution est ajustée à 1 par addition de quelques gouttes d'HCl concentré. Le mélange est extrait par 2X5ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée par 5 ml d'une solution saturée de NaCl, sèchée sur MgS04 et concentrée à
sec. On obtient 305 mg d'acide 9(S)- benzoylamino-octahydro- 6,10-dioxo-6H-pyridazino [1,2-a][1,2]diazepine-1(S)carboxylique (rdt = 75%).
MS : [MH]' 344, MH+346, MNa+ 368 RMN-H1 (CDC13) (300MHz) : 1,76(2H ;m ;CH 2) , 1,96 et 2,35(2H ;2m ;CH2), 1,97 et 2,84(2H ;2m ;CH2) , 2,41 et3,48(2H ;2m ;CH2), 4,96 et 4.68(2H ;m et dl ;CH2), 5,17(1H ;m ;CHN), 5,47(1H ;dd ;CHC02H), 7,26(1H ;d ;CONH), 7,38 à 7,53(3H ;m ; H aromatiques), 7,81(2H ;dl ;2H aromatiques) Etape 3 : 3-[9(S)- benzoylamino -6,10-dioxo- 1,2,3,4,7,8,9,10- octahydro -6H-pyridazino[1,2- a] [1,2] diazepine-1 (S) -carboxamide] -5-méthyl-l-diazo-hexane-2- one 378mg(l mmole) de N-Fmoc-3-amino-l-diazo-5-méthyl-hexane-2one en solution dans 3.5ml de CH2C12 est traitée par 0.31ml de DBU(2.lmmole ; 2. 1 équi.) à 0 C sous azote. Après une heure de réaction la solution est déposée sur une colonne de silice (40g) et éluée rapidement par une solution de CH2C12/méthanol 90/10. L'huile jaune obtenue (198mg, rdt=100%) est solubilisée dans 3. 5 ml de CH2C12 puis 0,35 g (lmmole) d'acide obtenu à l'étape 2 b) et ajoute . 625mg de TBTU(l.lmmole ; 1. 1 équi. ) suivi de 0.35ml de DIEA(2mmoles ; 2équi) sont successivement additionnés sous azote à 0 C . La réaction est maintenue 1 nuit à TA puis le milieu réactionnel
versé dans 20ml de solution saturée de NaHC03 et extrait par 2X10ml d'acétate d'éthyle. Les phases organiques rassemblées sont lavées à l'eau (20ml) puis avec 20ml de solution saturée de KHS03. La solution est sèchée sur MgS04 et concentrée à sec. On isole 244mg d'une mousse (rdt=50%).
MS : [M+Na]505 ; MH+ -N2 455 ; MH+ 483 RMN-H1 (CDC13) (300MHz) : 0.95 (6H ;dd ;2CH3), 1.56(2H ;m ;CH2), 1.69(1H ;m ;CH), 4.53(2H ;m ;CH2 ; 6.40(lH;dl;NH), 1.66(2H ;m ;CH2), 1.92(2H ;m ;CH2), 1. 90 et 2.90(2H ;2m,CH2) ; 2. 39 et3.24(2H ;ldd et ldt ; CH2), 3. 01 et 4.66(2H ;ldt et 1m ;CH2), 4.66(1H;td ;CH), 5.17(1H ;m ;CH) , 7.02(lH,d ;NH), 5.40(1H ;sl ;CHN2 ), 7.46(2H ;dd ;2H aromatiques méta), 7.51(1H ;m ; H aromatique en para), 7.81(2H ;dd ;H aromatiques en ortho).
4. Répliquer la transition qui a permis de détecter le conflit (ici le passage de l'objet 02 de l'état SI à l'état S4) 5. Reprendre le traitement du séquenceur à partir de la dernière position stable.
*Les liens ajoutés qui lui sont ainsi suggérés doivent être distingués de ceux qu'il avait lui-même ajoutés, de manière à ce qu'il puisse sélectivement les accepter et les refuser. Dans ce but, les liens ajoutés peuvent se trouver dans un parmi plusieurs modes différents: Suggéré , Accepté , Refus et Gelé (ce dernier mode étant décrit plus loin dans la section Liens en mode Gelé ).
La figure 8 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène MECA 367- MadCAM-1. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de rat anti-MECA 367 ou d'IgGl de rat en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de souris anti-immunoglobuline de rat marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément.
La figure 9 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène HECA452 - CLA. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de rat anti-HECA452 ou d'IgM de rat en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de souris anti-immunoglobuline de rat marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément.
La figure 10 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène CD54 ICAM-1. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45
minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de souris anti-CD54 ou d'IgGl de souris en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de rat anti-immunoglobuline de souris marqué au FITC . Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément.
I - MATERIELS ET METHODES.
1) Isolement et culture des cellules endothéliales microvasculaires.
Les cellules endothéliales microvasculaires provenant de ganglions périphériques (Ager, 1987) ont été isolées selon la technique établie mise au point par Bizouarne ( Bizouarne, 1993 a-b). Cette technique consiste à désinfecter les ganglions de patients néoplasiques avec de la Bétadine (ASTA Médica, Mérignac, France) diluée au 1/10 (V/V) dans du PBSc (solution saline tamponnée phosphate (PBS) supplémentée avec du CaCl2 1 mM et du MgCl2 0,5 mM) pendant 10 minutes à la température ambiante (Tamb). Ensuite, le tissu est découpé en petits morceaux au moyen d'un scalpel, et lavé soigneusement avec du PBSc puis soumis pendant 1 à 2 heures à 37 C à une digestion enzymatique par un mélange de collagénase type I (1 mg/ml, Gibco BRL) et de dispase (1 mg/ml, Gibco BRL) dans du PBSc. Après traitement enzymatique, les cellules sont lavées à deux reprises avec du PBSc. Les cultures cellulaires sont démarrées dans des boîtes Primaria (Falcon, Becton Dickinson, Grenoble, France) dans du milieu OptiMEM (Gibco BRL) en présence de sérum de veau f#tal (SVF) à 3 % (fourni par Dutscher, France). Au bout de 1 à 2 heures, les cellules non adhérentes sont éliminées et
soumises à une deuxième étape d'adhérence dans les mêmes conditions. Au bout de 5 à 7 jours, le milieu est supplémenté avec 5 % de SVF. Avant que les cultures primaires atteignent un stade de confluence monocouche, elles sont transférees dans des boîtes de culture tissulaire en vue de leur transfection. Dans le cas de la lignée HOMEC.J6B, les cellules provenant de l'épanchement pleural sont directement ensemencées dans les boîtes Primaria et la procédure d'adhérence évoquée plus haut leur est appliquée.
2) Immortalisation et sélection des cellules endothéliales.
Les cultures de cellules endothéliales microvasculaires d'origine humaine provenant de tissus enflammés (Bizouarne et al., 1993b ; Gerritsen et al., 1996) sont plaquées dans des boîtes Primaria, le cas échéant passées une fois pour s'occuper des cellules à croissance exponentielle et transfectées avec le plasmide pSV3-néo (ATCC, Rockville, MD, USA) contenant la région précoce SV40 complète et le gène de résistance à la généticine et, simultanément ou successivement, avec un plasmide pBM6ras contenant l'oncogène ras et le gène de résistance à l'hygromycine (Uemura et al., 1992), aimablement fourni par le Pr. E. Hébert (CBM, Orléans, France). La transfection est réalisée de la manière décrite ci-dessus en utilisant une technique à base de liposomes cationiques avec du réactif lipofectine (Gibco BRL, Gaithersburg, USA) et les plasmides précités (Bizouarne et al., 1993a). La lipofectine (1 à 10 ug/ml) et les plasmides (1 à 6 ug/ml) sont mélangés dans du milieu de croissance OptiMEM exempt de sérum et d'antibiotique et puis laissés au repos pendant 15 minutes à la température ambiante afin de former des complexes.
Chaque lignée est le résultat de l'étude de différentes concentrations de la lipofectine et des plasmides et de différents rapports entre eux. Ensuite, des des cultures de cellules endothéliales préalablement lavées avec du milieu OptiMEM exempt de sérum et incubées pendant 1 heure avant lavage sont incubées dans la solution contenant le complexe. Après 24 heures d'incubation, 5 % de SVF (V/V) sont ajoutés et la culture est poursuivie pendant 24 heures. Le mimieu est alors remplacé par du milieu OptiMEM complet contenant du SVF à 5 % et des antibiotiques. On laisse la culture croître pendant 7 à 14 jours jusqu'à l'apparition de colonies de cellules proliférant rapidement. La sélection des cellules transfectées par la généticine (Gibco BRL, Gaithersburg, USA) commence avec des doses d'antibiotique faibles (20 à 50 ug/ml) qui sont augmentées ensuite progressivement à 500-600 ug/ml. La sélection par l'hygromycine (Gibco) est alors mise en #uvre en ajoutant une concentration d'antibiotique de 20 ug/ml qui est augmentée jusqu'à la concentration nécessaire pour tuer les cellules témoins (normalement voisine de 100 ug/ml). Une fois sélectionnées, les cellules sont clonées en utilisant la méthode de dilution limitante, le pool cellulaire de travail étant conservé par stockage dans de l'azote liquide. On teste les lignées transformées pour rechercher la présence du gène SV40 T et un niveau élevé d'oncogène ras par une analyse Northern Blot de la manière décrite (Bizouarne et al., 1993a). On les teste également pour rechercher l'expression d'antigène anti-T par les anticorps anti-T (fournis par le Dr M. Nachtigal, Université de Caroline du Nord, USA) et la liaison protéine/anticorps anti-ras.
Des taux élevés d'oncogène ras indiquent, conjointement avec la résistance à l'hygromycine, que la transfection par le plasmide correspondant est stable.
3) Caractérisation des lignées de cellules endothéliales humaines. a) Marqueurs de cellules endothéliales exprimés par des lignées de cellules endothéliales humaines:maraueurs généraux.
- Facteur de von Willebrand (vWf) : Des cellules de la boîte de culture sont détachées avec de la collagénase (1 mg/ml) dans du PBSc contenant 1 % (m/V) de sérum albumine bovine (SAB) (Sepracor, France), du PBSc, de la SAB, pendant 15 à 30 minutes à 37 C puis les cellules sont lavées avec du PBSc-SAB, fixées et perméabilisées pendant 45 à 60 minutes à la température ambiante avec du paraformaldéhyde à 1,0 % (m/V) (Merck, Darmstadt, Allemagne) et une solution de saponine à 0,1 % (m/V) (Gibco BRL) dans du PBSc. Après un lavage soigneux dans du PBSc, un anticorps polyclonal de lapin anti-vWf humain V5899 (aimablement fourni par le Dr C. Mazurier du Centre de Transfusion Sanguine de Lille, France) est ajouté dilué dans du PBSc à la concentration de 2,0 à 10 mg/ml. Les cellules sont incubées pendant 30 minutes à la température ambiante. Comme témoin, du sérum de lapin normal à 3 % inactivé par la chaleur est utilisé. Après lavage, de l'anticorps secondaire de chèvre antiimmunoglobulines de lapin fluorescéiné (Institut Pasteur, Marnes-la-Coquette, France) est ajouté dilué au 1/50 dans du PBSc-SAB. Les cellules sont alors incubées pendant 30 minutes de plus à la température ambiante, lavées et remises en suspension pour analyse par cytométrie de flux.
- Détection de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE) : L'anticorps polyclonal de chèvre anti-enzyme de conversion de l'angiotensine pulmonaire de lapin (anti-ACE) a été fourni par le Dr R. L. Soffer (Cornell