INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Des thiols aliphatiques appropriés qui peuvent être condensés avec des oxydes d'alkylène sont notamment les alcanethiols comprenant au moins deux radicaux thiol tels que le 1,2-éthanedithiol, le 1,2propanedithiol, le 1,3- propanedithiol et le 1,6-hexanedithiol, outre les alkènethiols, comme le 2-butène-1,4-dithiol et les alkynethiols, comme le 3-hexyne-1,6-dithiol.
Des amines appropriées qui peuvent être condensées avec des oxydes d'alkylène sont notamment les amines aromatiques, comme l'aniline, l'o-chloroaniline, la p-aminoaniline, le 1,5-diaminonaphtalène, la méthylènedianiline, les produits de condensation de l'aniline et du formaldéhyde et le 2,4-diaminotoluène, outre les amines aliphatiques, comme la méthylamine, la triisopropanolamine, l'éthylènediamine, la 1,3propylènediamine, la 1,4-butylènediamine et la 1,3-butylènediamine.
Les polyols contenant des groupements esters peuvent également convenir. Ces polyols sont préparés par réaction d'un oxyde d'alkylène avec un anhydride d'acide dicarboxylique et un composé contenant des atomes d'hydrogène actifs. On peut se reporter aux brevets US 3 585 185, US 3 639 541 et US 3 639 542 pour une description détaillée de la méthode de préparation.
Les polyols insaturés pouvant être utilisés dans la présente invention peuvent être préparés par réaction de tout polyol classique, tel que ceux définis précédemment, avec un composé organique comprenant à la fois au moins une insaturation éthylénique et un radical hydroxyle, carboxyle, époxyde ou anhydride. En variante, les polyols peuvent être préparés à partir d'un composé comprenant à la fois au moins une insaturation éthylénique et un radical hydroxyle, carboxyle, anhydride ou époxyde comme réactif intervenant dans la synthèse du polyol. Des exemples de tels composés organiques sont les acides et anhydrides polycarboxyliques insaturés, comme l'acide ou l'anhydride maléique, l'acide ou l'anhydride fumarique, l'acide ou l'anhydride crotonique, l'anhydride propénylsuccinique et les acides ou anhydrides maléiques halogénés, les alcools polyhydroxylés insaturés, comme le 2-butène-1,4diol, l'éther allylique du glycérol, l'éther allylique du triméthylolpropane, l'éther allylique du pentaérythritol, l'éther vinylique du pentaérythritol, l'éther diallylique du pentaérythritol et le 1-butène-3,4-diol, outre les époxydes insaturés, comme le 3,4-époxyde du 1-vinylcyclohexane, le monoxyde de butadiène, l'éther glycidylique de vinyle ou 1-vinyloxy-2,3- époxypropane, le méthacrylate de glycidyle et l'oxyde de 3allyloxypropylène ou éther glycidylique d'allyle. Lorsqu'un acide ou anhydride polycarboxylique sert à incorporer une insaturation dans les polyols, il est nécessaire de faire réagir le polyol insaturé avec un oxyde d'alkylène, qui est de préférence l'oxyde d'éthylène ou de propylène, pour remplacer les radicaux carboxyle par des radicaux hydroxyle avant l'utilisation conformément à l'invention. La quantité d'oxyde d'alkylène utilisée est de nature à abaisser l'indice d'acide du polyol insaturé à environ 1 au maximum.
Pour la préparation de polyols insaturés utilisables dans le procédé suivant l'invention, la quantité de composé organique, rapportée à 1 mole de polyol, est d'environ 0,1 à 3,0 moles et de préférence de 0,30 à 1,5 moles.
La préparation de polyols insaturés utilisés suivant l'invention est effectuée suivant les procédés classiques, tels que ceux décrits dans les brevets US 3 275 606 et US 3 280 077. En règle générale, il est nécessaire que la température de réaction soit de 0 à 130 C. Les catalyseurs tant acides, comme les acides de Lewis, que basiques, comme les hydroxydes de métaux alcalins, peuvent convenir. De plus, une réaction sans catalyse peut être effectuée à une température de 50 à 200 C.
En outre, les polyols insaturés obtenus par la polymérisation radicalaire des diènes peuvent convenir. On peut citer notamment les polyols préparés en polymérisant le polybutadiène ou l'isoprène avec éventuellement un ou plusieurs monomère(s) éthyléniques insaturé (s) avec un amorceur radicalaire tel que par exemple le peroxyde d'hydrogène.
Le procédé de l'invention peut être effectué en présence d'un agent de transfert de chaîne, notamment les alkylmercaptans avec le radical alkyle ayant de 1 à 20 atomes de carbone. La quantité d'agent de transfert de chaîne mise en jeu est généralement comprise entre 0 et 2 % en poids du ou des monomère(s) éthylénique(s) insaturé (s) à polymériser.
Le procédé conforme à l'invention peut être mis en oeuvre en introduisant tous les réactifs dans un réacteur, lequel est ensuite porté à la température de polymérisation. Le procédé peut également être mis en #uvre par apport simultané du ou des monomère(s) éthylénique(s) insaturé (s) et de l'ester d'acide azocarboxylique liquide au polyol à vitesse constante. Suivant un mode préféré du procédé, le réacteur contenant le polyol est d'abord mis sous azote, puis porté à la température de polymérisation et ensuite le ou les monomère (s) éthylénique(s) insaturé (s), éventuellement en mélange avec l'agent de transfert de chaîne, et l'ester d'acide azocarboxylique éventuellement en solution dans une fraction du polyol, sont introduits simultanément et à vitesse constante. Après la fin de l'introduction du ou des monomère (s), porte le réacteur à la
température de cuisson avec injection d'une fraction d'ester d'acide azocarboxylique afin de consommer les monomères résiduels. Pendant toute la durée des opérations le réacteur est sous balayage d'azote.
Suivant une variante du procédé, l'ester d'acide azocarboxylique peut être introduit en semi-continu tout au long de la polymérisation.
Outre l'avantage d'être liquide à une température comprise entre -20 et 27 C, les esters d'acides carboxyliques utilisés sont extrêmement solubles dans les polyols et autres milieux organiques. De plus, ils ne génèrent ni des sous produits toxiques, ni même des composés cyanés.
Les dispersions de copolymères ainsi obtenues sont stables, transparentes et aptes à être utilisées dans la fabrication des polyuréthanes.
PARTIE EXPERIMENTALE Produits : DEAB : Diéthyl 2,2'-azobisisobutyrate Arcol 1 000 P : Polyol de polyoxypropylène de Lyondell contenant 0,02 meq/g d'insaturation, d'indice d'OH 110 mg KOH/g Arcol polyol 1025 : polyol de polyoxypropylène de Lyondell contenant 50 meq/Kg d'insaturation, d'indice d'OH 28,5 mg KOH/g.
Par ailleurs, l'apparition de traces inacceptables sur certains vêtements et notamment sur les cols de chemisier peut écarter certaines femmes de l'utilisation de ce type de maquillage.
Un autre inconvénient de ces compositions réside dans le problème de migration. On a en effet constaté que certaines compositions avaient tendance à se propager à l'intérieur des ridules et/ou des rides de la peau, dans le cas des fonds de teint ; dans les ridules qui entourent les lèvres, dans le cas des rouges à lèvres; dans les plis de la paupière, dans le cas des fards à paupières. On a également constaté, dans le cas notamment des fards à paupières, l'apparition de stries dans le maquillage, générées par les mouvements des paupières.
Depuis plusieurs années, de nombreux cosméticiens se sont intéressés aux compositions cosmétiques, notamment de rouges à lèvres, de fonds de teint ou en-
core de produits de maquillage du corps 'sans transfert'. Ainsi, les produits de maquillage dits 'sans transfert' actuels sont souvent obtenus par formation d'un film de polymères par évaporation d'un solvant.
Toutefois, si on sait maintenant que l'association d'huiles volatiles avec certains composés siliconés permet d'obtenir un résultat 'sans transfert' satisfaisant, elle présente néanmoins l'inconvénient de conduire, après évaporation des volatils, à un film dont le confort n'est pas optimal.
Il en résulte que les produits de maquillage actuels dits 'sans transfert' sont souvent peu confortables après séchage et présentent souvent un film sec non hydratant.
Par ailleurs, il est particulièrement intéressant de disposer en cosmétique de produits sous forme de sticks dans la mesure où de tels produits sont très pratiques à utiliser, ils sont facilement transportables, le produit ne risque pas de couler.
Or, les sticks classiques sont souvent formulés à base de cires et présentent certains inconvénients outre ceux déjà décrits ci-dessus : ils ont un caractère gras qui n'est pas apprécié par les utilisateurs et ils manquent de fraîcheur à l'application.
En outre, il est difficile d'y introduire des actifs hydrophiles.
Pour apporter de l'hydratation, du confort et de la fraîcheur, on cherche donc de plus en plus à faire des sticks de maquillage comprenant une phase aqueuse. Il est bien sûr connu de faire des sticks non gras tels que les sticks déodorants mais ces derniers sont souvent formulés avec des savons tels que des stéarates de soude ou de triéthanolamine comme agent gélifiant et ils présentent ainsi un pH basique agressif pour la peau et de mauvaise compatibilité avec les pigments de maquillage.
La demande française de n de dépôt 9811361 décrit des gels solides aqueux présentant de bonnes propriétés sans transfert. Toutefois, ces gels sont particuliè- rement inconfortables. Ils sont rêches. Après séchage, le film peut se craqueler au frottement et on peut ressentir des phénomènes de tiraillement et de déssèche- ment de la peau.
Il subsiste donc le besoin de produits, notamment de maquillage, qui transfèrent peu ou pas du tout (c'est-à-dire de produits 'sans transfert') tout en possédant de bonnes propriétés cosmétiques, notamment des propriétés de glissant à l'application, ainsi que des qualités de douceur, d'hydratation et de confort après maquillage (non tiraillement et non déssèchement).
Or, la Demanderesse a trouvé de manière surprenante qu'en combinant un agent gélifiant hydrophile particulier de type polyester sulfoné à une suspension
aqueuse d'une poudre de caoutchouc de silicone particulière, il était possible de réaliser un gel, notamment solide, de maquillage 'sans transfert' présentant d'excellentes qualités de confort, de douceur, de couvrance et de non friabilité du film et dont l'effet fraîcheur persiste dans le temps.
- La faible activité de MPri i98 ( EQ. C;1 î ) comparée à celle de MPR1128 (SEQ.ID04) indique que la séquence de ?rHMKG-Dx5 (SEQ.ID01) s'étendant des nucléon ides -59 à -135, bien que dépourvue d'éléments cis-activateurs putatifs, joue un rôle prépondérant dans l'activité du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) . Ce résultat laisse supposer que la fonctionnalité et par conséquent, l'accessibilité des facteurs trans-activateurs sur la boîte G et sur l'élément activateur, dépendent de la distance qui les sépare de la bo-te
TATA.
- La duplication de la séquence de MPR1128 (SEQ.IDC4) s' étendant des nucléotides -136 à -225, laquelle abrite la boîte G et l'élément activateur, confère au promoteur MPr1216 (SEQ.ID21) une activité f3-91ucuronidase au moins aussi élevée que celle dirigée par PrHMWG-Ox5 (SEQ.TD01) . Par contre, la triplication de cette même séquence dans le promoteur MPrl217 (SEQ.ID22) ne présente pas deffet additif supplémentaire. le groupe II renferme les promoteurs, MPrll28, MPrl213 (SEQ.ID20) , MPrll99 (SEQ.ID18) , MPrll36 (SEQ.ID10) , MPr1137 (SEQ.ID11) , MPr1138 (SEQ.ID12) , MPr1131 (SEQ.ID06) , MPrll35 (SEQ.ID09) , MPrll30 (SEQ.ID05) , MPrll39 (SEQ.ID13) , MPrl200 (SEQ.ID19) , le promoteur de référence HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) et le promoteur y-zéïne qui sert de témoin positif (Fig. VII). De la même manière que pour les promoteurs du groupe I, les résultats des dosages luminométriques permettent de dégager plusieurs constatations : - la fusion des séquences activatrices as-2 (Lam et Chua, 1989) et as-1 (Lam et al., 1989) du CaMV 35S, à la position -65 pb du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.I'O1) et des promoteurs HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) dérivés, pctentiaiise très fortement l'activité des promoteurs MPr1130 (SEQ.ID05) , MPrll31 (SEQ.ID06) , MPrll36 (SEQ.ID10) , MPr1137 (SEQ.ID11) , M?rll35 (SEQ.ID09) et MPrll38 (SEQ.ID12) résultants. A titre indicatif, les promoteurs MPrll31 (SEQ.ID06) et MPrll30 (SEQ.ID05) sont respectivement 3. 2 et 3.8 fois plus actifs que le promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) .
- les séquences activatrices ans-2 et as-1 du CaMV 35S agissent en synergie avec les éléments cis-act ivateurs du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) . La diminution progressive de l'activité des promoteurs MPrll31 (SEQ.ID36) , MPr1138 (SEQ.ID12) , MPrll37 (SEQ.ID11) et MPril36 I D 1 1-ul qui coïncide respectivement avec les délétions 5' progressives du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.ID01) en témoigne. - la comparaison des promoteurs MPrll30 (SEQ.ID05) et MPrll35 (SEQ.ID09) avec les promoteurs MPr1131 (SEQ.ID06) et
MFrll33 (Sr'Q.ID12) respect! vénerie , indique que 'La duplication de la séquence activatrice as-2 du CaMV 35S n'engendre pas un effet activateur additif significatif.
- la fusion des boîtes céréales du promoteur du gène de gluténine de haut poids moléculaire codant pour la sous-unité Bx7 du blé hexaploïde Tri ti cum aestlvum L.cv :nwr,n, (Andersen et al., 1998) en amont des promoteurs :- promoteurs MPrll39 (SEQ.ID13) et 2IPr-rC!0 (SEQ.ID19) résultants. A titre indicatif, l'activité de MPrll39 ,SEQ.ID13) et de MPrl200 (SEQ. ID19) est environ 5.5 fois plus élevée que celle du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ.TD01) .
- La faible activité du promoteur MPrl213 (SEQ.ID2C) , lequel correspond à la fusion des boites céréales en amont du promoteur MPrll28, laisse suggérer que les boites céréales agissent en synergie avec les séquences activatrices as-2 et as-1 du CaMV 35S pour potentialiser l'activité des promoteurs MPrll39 (SEQ.ID13) et MPrl200 (SEQ.ID19) .
- Enfin, la fusion de l'élément: GC-riche de la région intergénique du virus des stries du mais (MSV) en amont du promoteur MPR1128 (SEQ.ID04) ne contribue pas à augmenter l'activité du promoteur MPr1199 (SEQ.IDlb) résultant. Au contraire, l'élément GC-riche semble conférer un effet légèrement inhibiteur.
En conclusion, les promoteurs MPrll39 (SQ.IDi3) et MPrl200 (SEQ.ID19) étant respectivement et 3,9 fois plus actifs que le promoteur Pry-zéïne, lequel est communément utilisé en biotechnologie végétale pour diriger l'expression des protéines à des taux élevés, sont incontestablement des outils puissants capables d'améliorer le taux d'expression ces protéines hétérologues dans l'albumen de maïs. Par ailleurs, il est à noter que les promoteurs MPrll30 (SEQ.ID05) , MPr1131 (SEQ.ID06) , MPrll35 (SEQ.ID09) , MPrll38 (,2E:Q.ID12) , MPrll37 (SEQ.ID11) et MPrll36 (SEQ. ID10) confèrent une activité de la (3-glucuronidase dans lalbumen de maïs au moins aussi importante que celle obtenue avec le promoteur Pry-r.éine. Enfin, les
promoteurs defficacité moindre sont également Liés [::.t'ô::. éo ô3r: L 5 dans la mesure où ils peuvent être utilisés pour assurer le contrôle de l' expression de gènes de résistance ou de gènes codant pour des protéines enzymatiques.
Expression et évaluations de l'activité des différents promoteurs en expression stable dans le maïs et le tabac.
7.1. Transformation génique stable du maïs par Agrobacterium tumefaciens.
La technique utilisée est décrite par Ishida et al.
(Il 996) . Des embryons immatures de 1,0 à ],2 mm de long (9 à 14 jours après pollinisation) ont été lavés dans le milieu LS-inf, puis immergés dans la suspension d'agrobactéries, préparée comme décrit par Ishida et al. (1996), soumis au vortex pendant 30 sec., et incubés à température ambiante pendant 5 min. Les embryons immatures ainsi traités ont été cultivés sur milieu LS-AS à l'obscurité à 25 C pendant 3 jours, puis transférés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 5 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, à l'obscurité à 25 C pendant 2 semaines et enfin, placés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 10 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/l, à l'obscurité à 25 C pendant 3 semaines. Les cals de type I ainsi générés ont été isolés , fragmentés et transférés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 10 mg/l et céfotaxime à 250 mg/l, à l'obscurité à 25 C per.dant 3 semaines. Puis, les cals de type I, qui ont proliféré, ont été isolés et placés sur milieu LSZ supplémenté en phosphinotricine à 5 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, sous photopériode 16 heures lumière 8 heures obscurité à 25 C pendant 2 à 3 semaines. Les plant aies régénérées ont ensuite été transférées sur milieu LSF sous photopériode 16 heures lumière/ 8 heures obscurité à 25 C pendant 1 à 2 semaines, puis, en phytotron et en serre.
7.2. Transformation génique stable du tabac par Agrobacterium tumefaciens.
cycle, i' él..ngatic=: a été poursuivie " -;, 0, pendant. 5 min.
Le fragment d'ADN issu de l'amplification a été isolé sur un gel d'agarose à 1 . 5 à l'aide du Kit QIAqvicr~ Gel Extraction , hydrolyse par EcoRI pendant 1 h a 37 C et soumis à l'action de 20 U du fragment Klenow (New E:1g lr:nd Riolabs) pendant 30 min à 37 C en présence de 6 nnoies de chacun des dNTPs, de 1 ul de tampon Tris-HCL 500 n0J: pH 7\5 - KgC12 soc, ma et 6 pl de DTT à 1 M. L'ADN ainsi traité a ensuite été digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C.
La ligation a été réalisée avec 100 ng du fragment promoteur MPR1126 (SEQ.ID04)ainsi traité et 50 ng de ; 16 C dans un mélange réactionnel de 70 pi, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 400 unités de T4 AUN ligase (New England Biolabs). Des bactéries 'sc'-ri n~ia coi DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1)., a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et analysé par digestions enzymatiques.
Le plasmide obtenu a été appelé p1RT11'H et la séquence promotrice Merl128 (SEQ.ID04) schématisée dans la Fig. 1 a été vérifiée par séquençage.
2. 3. Construction du promoteur MPrll27 (SEQ.ID03) .
Le promoteur MPrll27 (SEQ.ID03) dérive du promoteur HMWG-Dx5 (SEQ, l DO 1) par délétion de la séquence située en amont du nucléotide -205, laquelle comporte les deux ooltes prolamines lise , les deux boîtes GATA et la boite Cl . Le fragment promoteur a été amplifié par PCR et traicé 1e la même manière que le promoteur MPR1128 (SEQ.ID04) (décrit d-ms la section 2.2 de l'exemple 2) excepté que les 2 oligooésoxynucléotides utilisés sont 5' ATCGGGAATTCGCAGACTGTCCAAAAA'7C 3' contenant le site de restriction FcoRT et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT112 et la séquence
promotrice M?rll2/ (s Q. ID03) schématisée -:r.s a h'ig. I a été vérifiée par séquençage.
2. 4. Construction du promoteur MPrll26 (SEQ. ID02) .
Le promoteur MPrll26 (SEQ.ID02) dérive du pi-moteur HMWG-D-5 (SF,Q.-tDo1) par délétion de la séquence située en airont du nucléotide -142, laquelle comporte les deux boites prc;laninF'. traité de la même manière que le promoteur MPR1.12 (SEQ.ID04) (décrit dans la section 2.2 de l'exemple 2; pxrepté que les 2 oiigodéso:ynucléotides utilisés sont ATCGGAATTCGTGTTGGCAAACTGC 3' contenant le si Le de restriction EcoRI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' possédant le site de restriction BamHI.
Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1126 et la séquence promotrice MPrll26 (SEQ.ID02) schématisée dans la Fie. I a été vérifiée par séquençage.
2. 5. Construction du promoteur intermédiaire MPrll83.
Le promoteur MPrll83 résulte de l'insertion d'un site ae restriction Xbal en amont du promoteur MP-R112Ô (SEQ.lD04j (décrit à la section 2. 2 de l'exemple @). Le fragment promoteur a été amplifié par PCR à partir ase 5 r.g d'ADN matrice pMRT1128 à l'aide de 100 VrlCle3 de cnacun des ''JI igodésoxyn;1cléot ides 5' ATCggllli TTCT l-~g;'~Cg'-:(:cl-,-:;:-=- \C9':'9'gT rTAgC 3' contenant les sites de restriction EcoRI et XbaI et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' p D s s le site de restriction BamHI, en présence de 53 rDC 1 é::?:'" .de chacun des dNTPs, de tampon Vent ADN polymérase :1X) , le 1 de Vent ADN polymérase (New England Blolabs;. La réaction d'amplification par PCR a été réalisée ari,-5 le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturât ion à 94 C pendant 5 min., l'ADN a été soumis à 3C cycles constitués chacun des étapes de dénaturation a 94 C pendant 1 min., d'hybridation à 50 C pendant 1 miu. et ;':,n,ai; -~ à 7 'C pendant min. 30 sec. Lors du dernier cycle, l'Ôlc,;;q3ti,,:,r; :ci été poursuivie à 72 C pendant 5 min.
Le fragment d'ADN issu de l' arnçJ-"-if,--:dt.vn C" oté isolé sur un gel d'agarose à 1.5% à l'aiae du Kit C(l1Ce2:'L Rapid Gel Extraction System et hydrolysé par EcoRI pendant 1 h à 37 C. Le fragment d'ADN a ensuite été soumis à l'action de 20 U dù fragment Klenow (New England Biolabs) pendant 30 mis à 37 C en présence de 6C nmoles de chacun ces iNTPs, de 12 ul de tampon Tris-HCL 500 mM pH 7.5 - MgCi2 500 rr~" et 6 pi ae DIT à i M et digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C. La ligation a été réalisée avec 100 ng du fragment promoteur MPrll*3 ainsi traité et 50 ng de plasmide pGem3Z-l (décrit dans la section 2.1 de l'exemple 2) pendant 1 nuit à 16 C dans un mélange réactionnel de 10 pi, en présence du tampon T4 ADN ligase (IX) et de 4C0 unités de T4 ADN 1 Lgase (New England Bioiabs). Des bactéries Escherichia coii DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la totalité du mélange réactionnel de ligation. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu L8 supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été analysé par PCR à l'aide de 25 pmoles de chacun des 2 oligodésoxynucléotides ATCggAATTCgCAgCCATggTCCTgAACC 3' et 5' TACggATCCCCggggATCTCTAgTTTgTggTgC 3' , en présence de 15 nmoles de chacun des dNTPs, du tampon Taq ADN polymérase (IX), de 75 nmoles de MgCl2 et de l, 25 U de Taq ADN polymérase (Promega Corp.) dans un volume réactionnel de 53 pi. La réaction d'amplification a été réalisée dans le thernocycleur GeneAmp PCR System 9700 . Après une dénaturatior à 94 C pendant 3 min., l'ADN a été soumis à 25 cycles constitués chacun des étapes de dénaturation à 94 C pendant 30 se\, d'hybridation à 55 C pendant: 1 min. et d'élongation à 7? C, pendant 1 min. Lors du dernier cycle, l'élongation a été poursuivie à 72 C pendant 5 min. Le plasmide obtenu a été appelé pMRTll33 et la séquence promotrice MPr1183 a été vérifiée par séquençage.
2.6. Construction du promoteur MPrll97 (SEQ.ID16) .
Le promoteur MPrll97 (SEQ.ID16) dérive d≤ TfPrliS 3 (décria à la section 2 . 5 de l'exemple 2) par une délécion de la séquence
Si les informations introduites par l'utilisateur ne sont pas complètes cohérentes (étape 15), un message d'erreur est affiché sur l'écran de l'utilisateur (étape 16) et le formulaire de saisie est à nouveau affiché.
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Ainsi, par exemple l'identifiant correspond au nom de l'utilisateur et le mot passe est de la forme / dans lequel est un signe choisi aléatoirement parmi les signes tels que #, %, *, !, ? _ et /.
est le numéro du jour de l'inscription, de 001 à 366, est une lettre de l'alphabet choisie aléatoirement, et est un nombre incrémental de 6 chiffres.
L'ensemble des informations saisies par l'utilisateur, ainsi que son identifiant et son mot de passe sont ensuite enregistrés dans la base de données 20 par l'ordinateur 7 (étape 18). Puis l'identifiant et le mot de passe sont affichés sur l'écran de l'ordinateur 7 (étape 19), avec une adresse de site partenaire ou la liste complète des adresses des ces sites, fournie par le calculateur du site de suivi d'accès 1. On peut prévoir également la génération et l'envoi automatique d'un message par courrier électronique à l'adresse indiquée par l'utilisateur. De cette manière si l'utilisateur n'a pas indiqué une adresse de courrier électronique correcte, il ne peut pas recevoir son identifiant et son mot de passe, nécessaires pour être inscrit. Avantageusement, cette transmission par courrier électronique est effectuée avec demande d'accusé de réception, de manière à pouvoir retirer de la base de données 20 les informations concernant l'utilisateur ' le message n'a pas été reçu ou a été transmis à une adresse qui n'existe pas.