INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
émise par le 32p ou le 3H est ensuite comptée dans chaque pot. La radioactivité émise par la solution mère de [9, 10- 3H]-triacylglycérol est également comptée, ce qui permet de calculer le rendement de la réaction pour chaque échantillon. Les quantités de céramides et diacylglycérols présentes dans chaque échantillon sont alors déterminées après extrapolation à partir de la gamme-étalon, en tenant compte du rendement, et rapportées à la quantité de protéines totales.
PARTIE B : RÉSULTATS.
1-EFFETS DES AGE-METHYLGLYOXAL SUR LES PERICYTES RETINIENS DE BOEUF.
Lors de travaux antérieurs in vitro, l'effet toxique d'AGE-glucose sur la prolifération des péricytes rétiniens a été mise en évidence (Ruggiero-Lopez et al, 1997).
L'étude s'est plus particulièrement intéressée aux effets des AGE-méthylglyoxal sur les péricytes rétiniens. Le méthylglyoxal semble en effet prendre toute son importance dans le diabète. Il s'agit d'un dicarbonyle dont la concentration sanguine est fortement augmentée chez le diabétique (McLellan et al, 1994). De plus, les produits avancés de glycation dérivant du méthylglyoxal ont été décrits comme les modifications chimiques majeures observées au cours de maladies chroniques comme le diabète (Degenhardt et al, 1998).
Les BRP ont été cultivés pendant deux passages (environ 15 jours) en présence des AGE-méthylglyoxal afin de mimer la chronicité d'un environnement diabétique, l'objectif de l'étude étant dans un premier temps de tester si les AGE-méthylglyoxal induisent l'apoptose des péricytes
et si ce phénomène est associé à une production accrue de céramides et de DAG.
1) Apoptose des péricytes en réponse aux AGEméthylglyoxal.
L'apoptose a été détectée et quantifiée par un marquage à l'annexine V et à l'iodure de propidium dans les BRP cultivés pendant deux passages avec 2 uM d'AGEméthylglyoxal ou leur contrôle (voir Matériel et Méthodes). Cette technique met en évidence la translocation de la phosphatidylsérine du feuillet interne vers le feuillet externe de la membrane plasmique, phénomène biochimique caractéristique de la phase précoce de l'apoptose.
L'annexine V, marquée à la fluorescéine, colore en vert les membranes plasmiques des cellules apoptotiques et nécrotiques mais seules les cellules nécrotiques, dont la membrane plasmique a perdu son intégrité, sont perméables à l'iodure de propidium qui colore leur noyau en rouge. La figure 4 rapporte l'effet des AGE-méthylglyoxal sur l'apoptose des péricytes rétiniens de boeuf. Les cellules ont été cultivées pendant deux passages (15 jours environ) en présence de 2 uM d'AGE-méthylgIyoxal ou de BSA-contrôle.
Les résultats sont exprimés en % de cellules apoptotiques dans la population cellulaire totale.
La proportion des cellules apoptotiques représente 8,9 1, 1% (moyenne SEM, n=10, p < 0,05) du total des péricytes cultivés avec 2 uM d'AGE-méthylgIyoxal contre seulement 2,9 0, 34% des cellules cultivées avec 2 uM BSA-contrôle. Ainsi les AGE-méthylglyoxal induisent une augmentation environ d'un facteur 3 en moyenne du taux d'apoptose dans les péricytes. Aucune cellule nécrotique n'a été observée.
2) Production de céramides et de DAG dans les péricytes.
côtés sont tangents au bord circulaire de la cavité 24.
On connait des surfaces aptes à réfléchir le faisceau de la lampe-ville 20 comme précité, par exemple un
paraboloide de révolution focalisé sur le filament 28.
La lampe-ville 20 n'est ici associée à aucune lentille.
Certaines zones du réflecteur 16 sont aptes à réfléchir des rayons émis par les deux filaments 14, 28. C'est le cas notamment des zones 34, 36 audessus et au-dessous de la lampe-ville 20 et de la zone 38
située à l'opposé de celle-ci, près de la lampe 12.
Le dispositif de signalisation 6 est ici contigu au dispositif d'éclairage 4 et placé au-dessus de
celui-ci.
Le réflecteur 16 associé à la signalisation et
celui associé à l'éclairage sont ici d'une seule pièce.
L'ensemble comporte en outre une glace ainsi qu'un
boîtier classiques non illustrés.
On a illustré un deuxième mode de réalisation de l'invention à la figure 6. Ce mode de réalisation est
très proche du précédent à de nombreux égards.
Toutefois, cette fois la cavité 24 est si profonde et la lampe-ville 20 si enfoncée dans cette cavité qu'elle n'émet plus de rayons en direction de la face réfléchissante 16 du réflecteur. La cavité 24 est cette fois obturée par une lentille de Fresnel 40 connue en soi, focalisée sur le filament de la lampe-ville et qui
transforme le faisceau à rayons divergents de la lampe-
Les fragments préférés seront ceux situés dans la partie Nterminale de la molécule compris entre les acides aminés 1 et 1097 et la séquence ID n 1, ou les fragments obtenus par substitution.
La composition immunostimulant selon l'invention peut être avantageusement utilisée pour renforcer les défenses immunitaires d'un organisme dans toute situation pathologique ou prophylactique où celle-ci est nécessaire.
Le véhicule pharmaceutique est choisi en fonction du mode d'administration choisi. Outre les voies systémiques, la FHA ou les fragments de celles-ci tels que définis plus haut se prêtent particulièrement à une administration par voie orale ou par voie mucosale, et peuvent donc être
associés aux différents véhicules ou excipients adaptés à ces voies d'administration.
L'invention porte enfin sur un médicament pour l'immunothérapie comprenant la FHA ou un fragment de celle-ci.
Les résultats décrits dans la partie expérimentale ci-après ont été obtenus par administration par voie intra-nasale de souris avec un adjuvant ou avec un immunostimulant selon l'invention. Lorsqu'une composition immunogène comprenant sous forme non liée la FHA ou un fragment de celleci est un antigène, les trois antigènes utilisés dans des conditions expérimentales décrites ci-après sont la Sm28 GST décrite ci-avant, la glutathion S-transférase de Schistosoma haematobium (Sh28 GST), et l'hémocyanine de Megathura Crenulata.
Les inventeurs ont ainsi mis en évidence que l'administration intranasale de l'antigène avec la FHA, ou un fragment dérivé de la FHA tel le FHA44 constitué de la séquence d'acides aminés 1 à 1097 de la FHA, présentait les propriétés suivantes : a) dans des conditions où l'antigène seul n'est pas capable d'induire une réponse sérique significative, la présence de FHA ou d'un fragment de celle-ci a permis d'induire l'induction d'une réponse immune spécifique chez 7 souris sur 9. De plus, l'induction d'une réponse immune dirigée contre l'antigène n'est pas corrélée avec une réponse dirigée contre la FHA. b) de manière surprenante, la protéine tronquée FHA44 ayant un poids moléculaire presque trois fois inférieur à celui de la FHA entière induit un niveau de production d'anticorps sériques en moyenne trois fois supérieur à la réponse observée en présence de la FHA entière. La partie N-terminale de la FHA conserve donc les propriétés adjuvantes de la molécule entière. c) le fragment N-terminal de la FHA (FHA44) a une activité adjuvante pour les IgA sérique et pour les IgA spécifiques dans les liquides de
lavage broncho-alvéolaires (BALF). L'analyse des anticorps présents dans les liquides de lavage broncho-alvéolaires (BALF) indique de manière surprenante que la FHA entière a un effet adjuvant sur la production d'IgA non spécifiques de l'antigène au niveau broncho-alvéolaire alors qu'il n'y a pas d'effets significatifs sur la quantité totale d'IgG.
Il apparaît donc que les fragments de la FHA, plus particulièrement ceux situés dans la partie N-terminale et qui sont normalement peu accessibles dans la FHA entière ont un effet important comme adjuvants et immunostimulants pour la stimulation de la réponse immunitaire de type mucosale. Ce type de réponse est apte à protéger l'organisme hôte contre des infections parasitaires ou bactériennes par les tissus muqueux tels le tractus respiratoire. d) les résultats exposés ci-après indiquent que cette activité adjuvante de la FHA et de la FHA44 s'expriment au moins vis-à-vis de trois antigènes différents et dans deux souches de souris différentes.
En outre, cette activité adjuvante persiste par voie systémique : des souris immunisées par voie sous-cutanée par l'antigène seul ou l'antigène et l'adjuvant de l'invention deux fois à deux semaines d'intervalle répondent mieux dans le cas où l'adjuvant est présent. e) si des souris préalablement vaccinées, par exemple par le DTCoq, sont immunisés par voie nasale deux mois plus tard avec un antigène et l'adjuvant de l'invention deux fois à deux semaines d'intervalle, il apparaît que la vaccination Dtcoq qui provoque l'apparition d'anticorps anti-FHA, n'a pas empêché l'induction d'une réponse dirigée contre l'antigène. f) la FHA44 induit des taux massifs d'IgA et d'IgG totaux dans les sécrétions, qui ne peuvent être uniquement corrélés à l'apparition des anticorps spécifiques, ce qui est l'indice d'un effet immunostimulant.
Les résultats exposés plus en détails ci-après montrent à l'évidence que l'adjuvanticité de la FHA libre ou des fragments de la FHA libre est une
activité intrinsèque de ces molécules, qui est indépendante d'une liaison physique à l'antigène au sens défini ci-avant ; autrement dit, l'activité adjuvante de ces molécules n'est pas liée à une fonction de vectorisation de l'antigène par la FHA ou les fragments de celle-ci. En d'autres termes, la FHA ou le fragment de la FHA peuvent constituer des adjuvants dans des compositions immunogènes ou dans des vaccins et ne possèdent aucune action de ciblage de l'antigène vers les cellules immuno-compétentes.
La FHA, et encore plus particulièrement des polypeptides dérivés de la FHA, tels que la FHA44, constituent donc de nouveaux adjuvants efficaces par voie mucosale représentant une alternative avantageuse aux adjuvants de l'état de la technique, qu'il s'agisse d'adjuvants sous forme particulaire tels que les liposomes, les microsphères, les ISCOMs qui sont tous des structures globulaires synthétiques encapsulant l'antigène administré, ou encore aux micro-organismes recombinants exprimant un antigène d'intérêt.
En outre, la FHA ou un polypeptide dérivé de la FHA se caractérise par une totale innocuité, au contraire des adjuvants muqueux les plus efficaces actuellement connus que sont les toxines bactériennes, telles que la toxine cholérique, la toxine de E. coli et la toxine de Bordetella pertussis.
L'identification selon l'invention de la FHA ou d'une partie de la protéine FHA en tant qu'adjuvant de la réponse immunitaire, notamment de la réponse immunitaire mucosale, vient donc combler un réel besoin dans l'état de la technique, d'un adjuvant muqueux efficace et dépourvu de toute toxicité.
De plus, l'activité adjuvante de la FHA et de la FHA44 n'est pas restreinte ou dépendante d'un haplotype donné d'antigène d'histocompatibilité. Au contraire, l'adjuvanticité de ces protéines est observée quel que soit l'haplotype de MHC, comme le démontrent les expériences réalisées sur des souris génétiquement hétérogènes, comme les souris " Outbred ", telles que les souris OF1.
Toutefois, si ces systèmes d'expression constitutive permettent d'obtenir de bons niveaux d'expression d'un transgène d'intérêt transféré, ils n'offrent pas la possibilité de moduler le niveau d'expression du transgène.
Par ailleurs, dans le cas des systèmes inductibles actuels, l'on observe généralement une expression résiduelle souvent trop élevée du transgène d'intérêt, qui peut provoquer une certaine toxicité, incompatible avec une application thérapeutique ou expérimentale.
Or, la possibilité d'exercer un contrôle efficace, particulièrement d'inhibition, du transgène d'intérêt peut s'avérer déterminante pour le succès de certaines expérimentations ou de la thérapie, notamment lorsque l'expression du transgène s'accompagne d'effets secondaires, par exemple de cytotoxicité. C'est notamment le cas de certaines cytokines, comme le TNF-a, IL-2, IL-4, IL-12, IL-18, GM-CSF (Agha-Mohammadi, et al.,
J.Clin.lnvest, 105 (2000) 1173-1176), des anticoagulants, des anticorps, de certains activateurs enzymatiques de substances actives (Springer et al., J.Clin.lnvest., 105 (2000) 1161-1167), des molécules cancerotoxiques ou encore des hormones.
Différents systèmes artificiels de contrôle de l'expression ont été conçus dans l'art antérieur. Un premier système utilise une protéine régulatrice désignée LAP (Lac Activator Protein) construite par fusion du répresseur Lac de E. coli avec le domaine transactivateur de VP16 du virus de l'herpès (HSV). LAP est notamment susceptible d'activer, en absence d'isopropyl ss-D-thiogalactoside (IPTG) un promoteur minimum précoce de SV40, comprenant en amont ou en aval de l'unité de transcription, les séquences de l'opérateur lac, alors qu'en présence d'IPTG, l'activation du promoteur est inhibée (Labow et al., Mol.Cell.Biol., 10 (1990) 3343-3356).
Un autre système utilise une protéine transactivatrice contrôlée par la tétracycline, qui a été construite par fusion du répresseur Tet de E. coli avec le domaine transactivateur de VP16 de HSV, de sorte notamment à activer, en absence de tétracycline, la transcription d'un promoteur minimum comprenant les séquences de l'opérateur tet de réponse à la tétracycline, cette activation pouvant être inhibée en présence de tétracycline d'un de ses dérivés (Gossen et al, Proc Natl Acad Sci USA, 89, (1992) 5547-5551 ; et al, Science, 268 (1995) 1766-1769).
Ces systèmes de régulation négative souffrent néanmoins d'une expression résiduelle encore trop élevée à l'état inhibé, qui limite leur efficacité ainsi que leurs utilisations in vivo. De plus, ces systèmes nécessitent l'apport d'un agent répresseur, tel que la tétracycline ou l'IPTG, ce qui est contraignant lorsque seule une expression périodique du transgène d'intérêt est requise.
D'autres systèmes d'inhibition de l'expression de gènes qui utilisent des acides nucléiques recombinants, tels que des oligonucléotides antisens (W083/01451) ou des ARN antisens complémentaires d'un gène endogène cible (McCall, Biochim Biophys Acta, 1397(1) (1998), 65-72) ont été développés.
Ceux-ci ont été jusqu'à présent uniquement utilisés pour la régulation de gènes endogènes. Bien qu'ils permettent d'obtenir une inhibition d'environ 60 à 90% lorsqu'ils sont testés in vitro, ils sont largement inefficaces pour la régulation de gènes endogènes in vivo, de sorte que leur développement a été mis de côté, malgré leur faible toxicité et l'absence d'immunogénicité.
De manière surprenante, les demandeurs ont découvert que si, l'inhibition d'un gène exogène ou transgène par un ARN antisens complémentaire in vitro était du même ordre que celle obtenue par un ARN antisens complémentaire d'un gène endogène, c'est à dire très insatisfaisante, l'inhibition de ce même gène exogène par son transcrit antisens complémentaire devenait particulièrement forte lorsqu'elle était réalisée in vivo.
Les demandeurs, ont par ailleurs découvert, que cette inhibition n'était pas reproduite en injectant et en exprimant dans un premier temps le transgène seul, puis en injectant dans un second temps, la séquence codant pour son transcrit inhibiteur, mais qu'il était au contraire nécessaire de coinjecter et de coexprimer les acides nucléiques comprenant les séquences du transcrit antisens inhibiteur et du transgène afin d'obtenir une inhibition efficace de ce dernier in vivo.
Les demandeurs ont enfin découvert que le transgène pouvait non seulement être efficacement inhibé par son ARN antisens, mais également
qu'il était possible de rétablir un niveau d'expression biologiquement efficace du transgène, et ainsi de contrôler l'expression de ce dernier par l'intermédiaire de son transcrit inhibiteur spécifique de type antisens.
La présente invention a pour objet un nouveau procédé de régulation in vivo de l'expression d'un transgène d'intérêt qui consiste à : - introduire simultanément dans un tissu ou une cellule cible, un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, ainsi qu'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt, lesdites séquences étant chacune sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit inhibiteur et/ou du transcrit d'intérêt pouvant être régulée par un agent externe, - coexprimer lesdits acides nucléiques dans le tissu ou la cellule cible afin de permettre l'inhibition constitutive de l'activité du transcrit d'intérêt par le transcrit inhibiteur.
Dans une étape supplémentaire du procédé selon l'invention, l'on administre au tissu ou à la cellule cible, un agent externe dit répresseur, conduisant à inhiber l'activité du transcrit inhibiteur et ainsi à restaurer une activité du transcrit d'intérêt, proportionnellement à la quantité de l'agent répresseur externe utilisé.
De manière alternative ou additionnelle, l'on administre au tissu ou à la cellule cible, un agent externe dit activateur, conduisant à accroître l'activité du transcrit d'intérêt. Ainsi, une activité du transcrit d'intérêt peut être restaurée proportionnellement à la quantité de l'agent activateur externe utilisé.
Seuls les tests phénotypiques, qui mesurent directement dans le milieu de culture la modification de la caractéristique phénotypique du virus, telle que l'inhibition de l'activité virale, par exemple en présence de composés inhibiteurs de ladite activité virale, fournissent un indice quantitatif de la résistance.
D'autres caractéristiques phénotypiques dont l'analyse s'avère intéressant, notamment d'un point de vue médical, sont celles qui confèrent à un virus sa résistance vis-à-vis des agents inhibiteurs susceptibles de bloquer au moins un mécanisme impliqué dans l'activité virale, celles qui confèrent à un virus sa capacité réplicative, celles qui confèrent à un virus son tropisme envers des cibles particulières ou encore celles qui confèrent à un virus son aptitude à être neutralisé par des molécules, tels des anticorps, des chimiokines ou des inhibiteurs.
Parmi les caractéristiques phénotypiques du virus VIH dont l'analyse présente un intérêt particulier du point de vue médical, se trouvent celles liées à l'expression des gènes, susceptibles de subir au moins une mutation, situés dans les régions GAG, ENV, ou POL du génome viral, telles que celles ci-dessous énumérées :
l Infectivité, capacité réplicative et virulence.
Ces caractéristiques phénotypiques des virus VIH peuvent être liées à la fonction de toutes les régions du génome virale, qu'il s'agisse des parties codant pour des protéines ou des régions intervenant dans les différents mécanismes ou étapes du cycle réplicatif viral. En particulier il est important d'évaluer l'effet produit par les mutations dans le gènes codant pour la protéase, la transcriptase inverse, l'intégrase ou l'enveloppe sur la réplication des virus et tout particulièrement chez les virus ayant développé une résistance aux agents antiviraux.
Son analyse permet de mesurer la capacité réplicative d'un virus, aussi appelée infectivité ou "fitness".
II Susceptibilité/Résistance aux inhibiteurs de transcriptase inverse.
Cette caractéristique phénotypique des virus VIH est liée à l'expression d'une partie de la région POL codant pour la transcriptase inverse.
Son analyse permet l'ajustement des traitements antirétroviraux par les analogues nucléosidiques ou les inhibiteurs de transcriptase inverse non nucléosidiques (NNRTI).
III Susceptibilité/Résistance aux inhibiteurs d'intégrase.
Cette caractéristique phénotypique des virus VIH est liée à l'expression d'une partie de la région POL codant pour l'intégrase.
Son analyse fournit des indications pour l'ajustement des traitements antirétroviraux par les inhibiteurs d'intégrases.
IV. Susceptibilité/Résistance aux inhibiteurs d'entrée du virus dans la cellule cible.
Cette caractéristique phénotypique des virus VIH est liée à l'expression de la glycoprotéine d'enveloppe du VIH et en particulier à l'expression de la sous-unité transmembranaire de ladite glycoprotéine codée par une partie du gène ENV.
L'analyse de cette caractéristique phénotypique permet la mise en évidence de l'action des agents inhibiteurs qui bloquent la fusion de la membrane virale avec la membrane de la cellule cible.
V Susceptibilité/Résistance aux inhibiteurs ciblant les corécepteurs des virus VIH.
ceux formés avec des bases organiques telles que l'isopropylamine, la triméthylamine, le 2-éthylaminoéthanol, l'histidine, ou encore la procaïne.
Une composition vaccinale selon l'invention comprend une quantité d'adjuvant et d'antigène efficace du point de vue immunogène et/ou thérapeutique. La quantité d'adjuvant et d'antigène dépendra de l'individu à traiter, c'est-à-dire de la capacité du système immunitaire de l'individu considéré à développer une réponse immunitaire, ainsi que du degré de protection requis.
Avantageusement, une composition vaccinale selon l'invention comprendra une dose de FHA ou d'une partie de la protéine FHA comprise entre 0,1 et 1000 g, avantageusement entre 10 et 300 g, et de manière tout à fait préférée entre 20 et 150 g, La quantité d'immunogène ou d'antigène incluse dans une composition vaccinale selon l'invention dépendra à la fois de l'individu à traiter, du type et de la nature de l'antigène d'intérêt.
A titre illustratif, une composition vaccinale selon l'invention comprendra de 0,1 à 1000 g d'antigène ou d'immunogène, de préférence de 1 à 300 g et de manière tout à fait préférée de 10 à 50 g d'antigène ou d'immunogène.
De manière préférée, une composition vaccinale selon l'invention sera administrée une première fois, puis un rappel sera réalisé quelques mois après l'administration initiale.
La quantité de FHA, ou de partie de la protéine FHA, et d'antigène inclus dans une composition vaccinale selon l'invention peuvent être adaptées pour l'obtention d'une bonne réponse immunitaire, par exemple en suivant la prolifération in vitro de lymphocytes du sang périphérique (PBL) cultivés en présence de l'antigène ou de l'immunogène, et tout particulièrement en
mesurant les niveaux de cytokines sécrétés par les lymphocytes immuns, ou en évaluant les titres en anticorps de type sérique et/ou mucosal produits.
De tels tests peuvent être réalisés en utilisant des marqueurs classiques tels que des marqueurs isotopiques, ou encore des marqueurs non-radioactifs tels que des enzymes ou des molécules fluorescentes, De telles techniques sont bien connues de l'homme du métier et sont notamment décrites dans les brevets US N 3,791,932; 4,174,384 et 3,949,064.
Les titres en anticorps de type sérique et/ou mucosal peuvent être mesurés comme indiqué dans les exemples 1 à 3 ci-après.
Selon un mode particulier de réalisation des compositions vaccinales selon .l'invention, de telles compositions comprendront, outre une quantité adjuvante efficace d'une protéine FHA ou d'une partie de la protéine FHA, une quantité immunologiquement efficace d'au moins deux antigènes ou immunogènes, par exemple de trois à vingt antigènes ou immunogènes différents, et de manière préférée de trois à dix antigènes ou immunogènes différents.
La présente invention porte enfin sur une méthode de vaccination ou de stimulation de l'immunité cellulaire consistant à utiliser comme adjuvant de vaccination et/ou de stimulation de l'immunité la FHA ou un fragment de celle-ci tels que définis plus haut. Un tel adjuvant est administré dans une composition sous forme libre c'est-à-dire non physiquement liée à l'antigène ou aux antigènes pour lesquels l'on souhaite stimuler une réponse immunitaire.
L'antigène ou les antigènes contre lesquels on souhaite obtenir une réponse sont administrés seuls, ou en association avec l'adjuvant, sans toutefois être liés physiquement à ce dernier. Ces compositions peuvent contenir en outre des éléments de formulation adaptés à l'administration choisie.
Dans cette méthode selon l'invention, l'adjuvant, le ou les antigènes peuvent être également être administrés de façon simultanée mais dans des compositions différentes, ou séquentiellement dans le temps. En particulier, la composition selon l'invention peut être administrée ultérieurement à une première vaccination ou un premier traitement, afin de réactiver la réponse immunitaire contre l'antigène ou les antigènes.