INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Un vecteur recombinant selon l'invention est indifféremment un vecteur de clonage, un vecteur d'expression, ou plus spécifiquement un vecteur d'insertion, un vecteur de transformation ou un vecteur d'intégration Il peut s'agir d'un vecteur d'origine bactérienne ou virale Selon un premier mode de réalisation, un vecteur recombinant selon l'invention est utilisé dans le but d'amplifier l'acide nucléique qui y est inséré après transformation de transfection de l'hôte cellulaire désiré Selon un second mode de réalisation, il s'agit d'un vecteur d'expression comprenant, outre un acide nucléique codant pour un polypeptide conforme à l'invention, en particulier les polypeptides codés par les gènes RRS1-R et RRS1-S, des séquences régulatrices permettant d'en diriger la transcription et/ou la traduction Selon un mode de réalisation avantageux, un vecteur recombinant selon l'invention comprendra notamment les éléments suivants: 1) des éléments de régulation de l'expression de l'acide nucléique du gène RRS1-R ou du gène RRS1-S à insérer, tels que des promoteurs et des séquences activatrices ( enhancers ); 2) la séquence comprise dans l'acide nucléique du gène RRS1-R ou RRS1-S conforme à l'invention à insérer dans un tel vecteur, ladite séquence étant placée sous le contrôle des signaux de régulation décrits en (1) , et 3) des séquences d'initiation et d'arrêt de la transcription appropriée.
En outre, les vecteurs recombinants selon l'invention pourront inclure une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification ou leur expression est recherchée ainsi que des marqueurs de sélection.
Dans un mode de réalisation particulier, un vecteur recombinant selon l'invention comprend un polynucléotide antisens ou un polynucléotide homopurine ou homopyridine, tel que défini précédemment, le cas échéant placé sous le contrôle des séquences de régulation appropriées permettant d'en assurer l'expression dans une cellule hôte ou une plante choisie. Un tel vecteur recombinant est utilisé de préférence pour inhiber l'expression du gène RRS1-S dans la cellule ou dans la plante.
Selon un autre mode de réalisation particulier, un vecteur recombinant selon l'invention comprend un polynucléotide codant pour le polypeptide RRS1-R ou un polypeptide ayant au moins 40% d'identité en acide aminé avec ce dernier et conservant l'activité biologique de RRS1-R, placé sous le contrôle de séquence (s) régulation permettant une expression à haut niveau de RRS1-R ou de son homologue dans une cellule hôte ou dans une plante choisie. Un tel vecteur recombinant est utile pour permettre un haut niveau d'expression de RRS1-R chez une plante .
Selon un aspect avantageux, un tel vecteur recombinant est un vecteur intégratif permettant l'insertion de multiples copies de la séquence codante de RRS1-R dans le génome d'une plante A titre d'exemple, les promoteurs bactériens pourront être les promoteurs Lacl, LacZ, les promoteurs de l'ARN polymérase du bactériophage T3 ou T7, les promoteurs PR, ou PL du phage lambda.
Des promoteurs pour l'expression d'un acide nucléique de RRS1-R ou RRS1-S selon l'invention dans les plantes sont le promoteur CaMV 35 S du virus de la mosaïque du chou-fleur Odell et al., (1985) ou encore le promoteur du gène de lactine 1 du riz McElroy et al (1990).
D'autres promoteurs utiles à l'homme du métier pour l'expression d'un polynucléotide d'intérêt dans les plantes sont décrits dans les brevets n US 5,750,866 et US n 5,633,363.
De manière générale, pour le choix d'un promoteur adapté, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) précité ou encore aux techniques décrites par Fuller et al. (1996), et Ausubel et al. (1989).
Les vecteurs bactériens préférés selon l'invention sont par exemple les vecteurs pBR 322 (ATCC N 37017) ou encore des vecteurs tels pAA223- 3 (Pharmacia Uppsala, Suède) et pGEM1 (Promega Biotech, Madison, WU, USA) et pUC19 (commercialisé par Boehringer Mannheim, Germany).
On peut encore citer d'autres vecteurs commercialisés tels que les vecteurs pQE70, pQE60, pQE9 (Qiagen, psuX 174, pBluescript SA, pNH8A, pMH16A, pMH18A, pMH46A, pWLNEO, pSG2CAT, pOG44, pXTI, pSG (Stratagene)
Il peut s'agir également de vecteurs de type baculovirus tel que le vecteur pVL1392/1393 (Pharmingen) utilisé pour transfecter les cellules de la lignée Sf9 (ATC N CRL 1711) dénvée de Spodoptera frugidera.
Préférentiellement, on aura recours à des vecteurs spécialement adaptés pour l'expression de séquence d'intérêt dans des cellules de plantes, tels que les vecteurs suivants: # vecteur pBIN19 (Bevan et al , Nucleic Acids Research, Vol. 12:8711-8721, commercialisé par la Société Clotench , Palo Alto, Californie, USA); # vecteur pB101 (Jefferson 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5- 387-405, commercialisé par la Société Clotench); # vecteur pBI121 (Jefferson et al. 1987, Plant Molecular Biology Reporter, vol. 5:387:405, commercialisé par la Société Clotench); ' vecteur pEGFP (Cormack BP et al. , 1996, commercialisé par la Société Clotench); # vecteurs SLJ75515 et SLJ75516 (don du Dr. J. Jones, The Sainsbury Laboratory, Norwich, UK); # vecteurs pDHB321 (don du Dr. Bouchez, INRA Versailles, France) # vecteurs pAOV, pOV2, pSOV, pSOV2, pkMB et pSMB (Mylne et al., 1996).
Pour permettre l'expression des polynucléotides selon l'invention, ces vecteurs doivent être introduits dans une cellule hôte. L'introduction des polynucléotides selon l'invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l'homme du métier pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires.
L'invention a en outre pour objet une cellule hôte transformée avec un acide nucléique ou par un vecteur recombinant selon l'invention.
Une telle cellule hôte transformée est préférentiellement d'origine procaryote ou eucaryote, notamment bactérienne, fongique ou végétale.
Ainsi, peuvent être notamment utilisées des cellules bactériennes de différentes de E. coli ou encore d'Agrobacterium tumefaciens De manière préférée, la cellule hôte transformée est une cellule de plante ou encore un protoplaste de plante.
fragment de 10,7 kb, obtenu par la digestion du fragment de 10,7 kb par les enzymes Xbal et ScaI et le clonage aux sites XbaI et SmaI du vecteur pBin+, a également permis d'induire l' inactivation post-transcriptionnelle des gènes Nia2. Ce fragment XbaI-Scal correspond au gène SGS2 dont il est question dans ce brevet. Par analyse informatique l'ORF de SGS2 a pu être prédite. La séquence du cDNA contenant l'ORF du gène SGS2 et donc la position des séquences promotrices, terminatrices et introniques de SGS2 ont été vérifiées. Pour cela nous avons d'abord réalisé une réaction de reverse-transcription à partir d'ARN total d'Arabidopsis thaliana. Puis nous avons réalisé 2 réactions de PCR successives sur ce pool de cDNA : d'abord à l'aide du couple de primers p29Fl (CAGCCTTATCATGTGGGGG) et P29R1 (CAGATACATGGCAGAGTGGCC) puis du couple de primers p29F8 (GTTTAGGCCGTGCTGTCAACC) et P29R4 (GGGTCTGTGCTTTCTTCTGAGG). Le fragment issu de cette dernière PCR a été séquence. Les primers p29Flet P29Rlsont situés aux 2 extrémités de l'ORF de SGS2. Les primers p29F8 et P29R4 sont situés de part et d'autre de l'intron de SGS2.
En utilisant le logiciel BLAST une recherche de séquences homologues à SGS2 dans les bases de données a été effectuée. Au niveau nucléotidique les seules séquences présentant une homologie significative (supérieure à 70% sur une longueur d'au moins 50 nucléotides) sont des séquences issues du génôme d'Arahidopsis : - une séquence issue de la section 27 du chromosome 2 (numéro d'accession : gbAC007289) partage 82% d'homologie avec la région comprise entre les nucléotides 1 et 332 du cDNA SGS2; - une séquence issue de la section 27 du chromosome 2 (numéro d'accession : gbAC007289) partage 85% d'homologie avec la région comprise entre les nucléotides 577 et 858 du cDNA SGS2; - une séquence issue de la section 55 du chromosome 2 (numéro d'accession : gbAC006250) partage 82% d'homologie avec la région comprise entre les nucléotides 1 et 249 du cDNA SGS2; - une séquence issue du chromosome 5 (numéro d'accession : dbjAB024037) partage 87% d'homologie avec la région comprise entre les nucléotides 1 et 114 du cDNA SGS2; - une séquence issue du chromosome 4 (numéro d'accession : gbAF058825) partage 87% d'homologie avec la région comprise entre les nucléotides 1 et 114 du cDNA SGS2.
Au niveau de la protéine des homologies réduites ont été trouvées avec un certain nombre de protéines appartenant à différents règnes. En effet, parmi les séquences homologues à SGS2 on trouve : - des séquences de génomes animaux : trois séquences chez Caenorhabditis elegans (embZ78419, embZ48334, embZ81571) et 1 chez Dictyostelium discoideum (gbAFl 17611).
- des séquences de génomes de champignons : séquence chez Neurospora crassa: QDE1 (embAJ133528), ), 1 chez Phanerochaete chrysosporium (embZ31373) et 1 chez Schizosaccharomyces pombe (embZ98533).
- des séquences de génomes de plantes : séquence chez Lycopersicon esculentum (embY10403), 1 chez Nicotiana tabacum (embAJOl 1576), 1 chez Petunia x hybrida (embAJOl 1979), 1 chez Triticum aestivum (embAJOl 1978), et cinq dont trois en cluster chez Arabidopsis thaliana (giAF080120, embAJO 11977, cluster gbACC005169).
La protéine présentant la plus forte homologie avec SGS2 est une RNA-dependentRNA-polymerase de tomate (Lycopersicon esculentum). Une partie de la séquence en acides aminés de cette protéine (embY10403) présente une homologie de 36% avec la séquence comprise entre les acides aminés 131 et 1170 de SGS2. Toutes les autres protéines homologues à SGS2 présentent une homologie plus faible (homologie sur une zone plus réduite et/ou de pourcentage inférieur). La protéine QDE1 de Neurospora crassa (AJ133528) impliqué dans un phénomène analogue à la PTGS (appelle quelling ) ne présente ainsi qu'une homologie de 24% avec la séquence comprise entre les acides aminés 529 et 878 de SGS2.
Il est à signaler que parmi l'ensemble des séquences homologues à SGS2 on en dénombre 5 issues du génôme d'Arabidopsis dont au moins une a été démontrée expérimentalement comme étant transcrite (numéro embAJOl 1977). Pour chacune de ces 5 séquences homologues à SGS2, il est statistiquement certain qu'il existe au moins un mutant sgs2 parmi les 23 isolés pour lequel la séquence homologue considérée n'est pas mutée. Ceci montre que bien que présentant une homologie avec SGS2, ces 5 séquences ne remplissent pas la même fonction que SGS2.
Exemple 2 Analyse des mutants sgs2 La séquence du gène SGS2 a été déterminée dans 11mutants sgs2. Une réaction de PCR a été effectuée sur l'ADN génomique de ces 5 mutants afin d'amplifier toute l'ORF du gène SGS2. Les fragments amplifiés ont ensuite été séquences.
Onze mutations ponctuelles distinctes ont ainsi été identifiés chez les différents mutants sgs2. Ces mutations correspondent à 7 changements d'acides aminés, trois codons stop et une délétion d'un nucléotide entraînant un changement de cadre ouvert de lecture.
Les différentes mutations observés chez les mutants sgs2 sont représentés dans la figure 1.
L'acide aminé marqué en gras indique la position de la mutation dans le polypeptide SGS2.
* indique la présence d'un codon stop, ' indique la délétion d'un nucléotide associé à un changement de cadre ouvert de lecture et () indique un nouvel acide aminé substitué à l'acide aminé marqué en gras.
Exemple 3 Construction de cassettes d'expression pour la surexpression et l'inhibition de SGS2 Construction d'une cassette d'expression permettant la surexpression de la protéine SGS2
Pour surexprimer la protéine SGS2 on réalise une réaction de type PCR sur de l'ADN complémentaire d'Arabidopsis thaliana en utilisant comme amorces les oligonucléotidiques suivants : p29F2' : CAGGAGAAATGGGGTCAGAGG p29R2' : ACCTTTTAGAGACGCTGAGC La séquence nucléotidique ainsi obtenue est ensuite traitée avec l'enzyme klenow pour générer aux extrémités de la séquence amplifiée des extrémités franches . Puis la séquence est clonée entre le promoteur 35S et le terminateur du virus de la mosaique du chou-fleur. Par exemple cette séquence pourra être clonée au site Smal du vecteur pRTIOO (Tôpfer et al., Nucleic Acid Research, 15 (14), 5890, 1987). Pour la surexpression de SGS2 on choisira les clones tels que la séquence correspondant à p29F2 se situe près du promoteur 3 5 S.
Construction d'une cassette d'expression permettant l'inhibition de SGS2 Pour inhiber l'expression de SGS2, on réalise une construction telle que le gène SGS2 soit placé en position anti-sens entre le promoteur 35S et le terminateur du virus de la mosaique du chou-fleur. Cette construction peut être réalisée par exemple en choisissant, dans le clonage décrit ci-dessus, les clones tels que la séquence correspondant à p29R2 soit située près du promoteur 35S. Cette construction AsSGS2 permet l'expression d'un ARNm anti-sens de l'ARNm de SGS2. Cependant, compte tenu de la présence dans le génôme d'Arabidopsis de séquence nucléotidiques présentant une homologie de séquence supérieure à 80% avec la partie 5' du gène SGS2, cette construction AsSGS2 pourrait conduire à l'inhibition d'autres gènes (ce niveau d'homologie est atteint avec les régions du cDNA de SGS2 allant des nucléotides 1 à 332 et 577 à 858). Pour inhiber spécifiquement le gène SGS2 on cherche donc préférentiellement à construire un gène exprimant l'ARNm de SGS2 délèté de sa région 5', en orientation anti-sens (appelé Assgs2A5'). Par exemple, on digère un clone AsSGS2 par l'enzymes BamHI ce qui libère les 749 premiers nucléotides de SGS2 et on réalise ensuite un réaction de ligation sur le produit de la digestion.
Exemple 4 Transformation des plantes Les cassettes d'expression construites tel qu'il est décrit ci-dessus sont ensuite introduites dans un vecteur binaire pour permettre leur introduction via Agrobacterium tumefaciens dans les plantes. Le vecteur binaire utilisé est le plasmide pBIN+ (Van Engelen et al., Transgenic Research 4,288-290, 1995). Ceci est réalisé en digérant les constructions obtenues ci-dessus par l'enzyme SphI (qui libère les cassettes d'expression) et en liguant le produit de cette digestion au plasmide pBIN+ digéré par l'enzyme SphI.
La Figure 3 représente sous forme de schéma logique les étapes d'un mode de réalisation conforme à la présente invention.
À l'étape 310, une image de test et une image de référence, d'une structure semi-conductrice par exemple, sont acquises en utilisant des techniques classiques d'acquisition d'images. Les images peuvent aussi être acquises en utilisant un système d'acquisition par imagerie pas à pas, ou step-and-image selon le terme anglo-saxon.
À l'étape 320, les images de test et de référence sont alignées pour mettre en concordance des pixels correspondants des deux images.
Diverses techniques d'alignement peuvent être utilisées dans le cadre de la présente invention. L'étape d'alignement est nécessaire pour assurer que chaque particularité de l'image de test est comparée à une particularité équivalente de l'image de référence.
L'étape 320 est en outre illustrée aux Figures 4A à 4C. La Figure 4A représente une image de test 410 qui comprend des pixels 411 à 416.
Chaque pixel est défini par son niveau de gris et par son emplacement sur l'image. Par exemple, le pixel 413 est à l'emplacement i = 10 et j = 30, appelé emplacement (10, 30). Le niveau de gris du pixel 413 est ici de 50 à titre d'illustration. La table 1 fournit les coordonnées de l'emplacement et le niveau de gris, pour chaque pixel de l'image de test 410, tandis que la table 2 fournit la même information pour les pixels 421 à 426 de l'image de référence 420 de la Figure 4B.
Pixel Emplacement (i,j) Niveau de gris 411 (10, 10) 100 412 (10, 20) 150 413 (10, 30) 50 414 (20, 30) 180 415 (20, 20) 200 416 (20,10) 250 TABLEAU 2
Pixel Emplacement (i,j) Niveau de gris 421 (10, 10) 100 422 (10, 20) 150 423 (10, 30) 50 424 (20, 30) 150 425 (20, 20) 100 426 (20, 10) 0
La Figure 4C illustre graphiquement l'alignement de l'image de test 410 et de l'image de référence 420. L'emplacement 431 de pixels alignés comprend les pixels 411 et 421, l'emplacement 432 de pixels alignés comprend les pixels 412 et 422, etc.
Dès lors que les images de test et de référence ont été alignées, la correspondance de pixel à pixel entre l'image de test et l'image de référence est connue.
À l'étape 330 de la Figure 3, un tracé bidimensionnel, appelé aussi "2D", de dispersion est créé en traçant, pour chaque emplacement de pixels alignés, le niveau de gris d'un pixel provenant de l'image de test en fonction du niveau de gris du pixel correspondant de l'image de référence. En utilisant comme exemple la Figure 4C, le niveau de gris du pixel 411 est tracé en fonction du niveau de gris du pixel 421, le niveau de gris du pixel 412 est tracé en fonction du niveau de gris du pixel 422, et ainsi de suite.
Mettre en #uvre l'étape 330 pour les emplacements 431 à 436 fournit les données représentées au Tableau 3. Le tracé de dispersion bidimensionnel résultant 500 est représenté à la Figure 5.
Niveau de gris Emplacement de Niveau de gris Niveau de gris Coordonnées
pixels alignés d'image de test d'image de (!:gns r gris)
- un nombre d'Abbe élevé, allant de 35 à 45, afin d'éviter des aberrations chromatiques, - une absence de couleur après polymérisation, en particulier un faible indice de jaune et une absence de jaunissement au cours du temps, - une bonne résistance aux chocs (en particulier le verre non revêtu doit de préférence passer avec succès le test FDA de chute de billes), - une bonne résistance à l' action des contraintes statiques, - une bonne résistance à l' abrasion, - une bonne aptitude aux traitements divers (dépôt de revêtements durs, anti-reflets, primaires d'adhérence et/ou anti-chocs,..), et en particulier une bonne aptitude à la coloration, - une bonne aptitude aux traitements de surfaçage et de débordage , sans que la géométrie globale du verre soit altérée au cours de ces opérations, - un faible taux d'absorption d'eau.
Un second objet de l'invention est de fournir des compositions qui puissent être aisément et rapidement polymérisées, en particulier qu'elles puissent être polymérisées par des techniques de photopolymérisation ou des techniques mixtes de photopolymérisation et de polymérisation thermique permettant de réduire les temps de cycle de fabrication des lentilles.
La composition de monomères polymérisables selon l'invention comprend : (a) au moins 40 parties en poids, de préférence au moins 50 et mieux encore au moins 55 parties en poids d'au moins un monomère thio(méth)acrylate; (b) au moins un monomère à haut nombre d'Abbe; (c) au plus 20 parties en poids d'un monomère polyvinylique aromatique ; et (d) au moins un polythiol ; pour 100 parties en poids de (a), (b), (c) et (d).
De préférence, le ou les monomères à haut nombre d'Abbe représentent 10 à 40 parties en poids, préférentiellement 10 à 30, et le polythiol 5 à 20 parties en poids pour 100 parties en poids du mélange des
monomères (a), (b), (c) et (d).
De préférence, le polythiol représente au plus 20 parties en poids et mieux au plus 15 parties en poids pour 100 parties en poids de (a), (b), (c) et (d).
En outre, les compositions polymérisables peuvent comprendre, pour 100 parties du mélange de monomères de (a), (b), (c) et (d), jusqu'à 30 parties en poids d'au moins un autre monomère copolymérisable, différent des monomères de (a), (b), (c) et (d). Préférentiellement, l'autre comonomère polymérisable représente pas plus de 20 parties en poids et mieux pas plus de 10 parties en poids pour 100 parties du mélange de monomères de (a), (b), (c) et (d). De préférence, cet autre monomère copolymérisable est un monomère copolymérisable par voie radicalaire.
Un des intérêts des compositions selon l'invention réside dans le fait que ces compositions peuvent être aisément et rapidement photopolymérisées.
Le monomère ou mélange de monomères du constituant (a) de la composition selon l'invention, englobe tout monomère comportant au moins une fonction thioacrylate ou thiométhacrylate.
Dans la présente description et les revendications, on entend par fonction thio(méth)acrylate un groupe fonctionnel de formule : dans lequel R1 représente H ou -CH3.
De préférence, les monomères du constituant (a) répondent à la formule : dans laquelle : R représente un radical hydrocarboné aliphatique, linéaire ou ramifié, monovalent ou polyvalent, ou un groupement aromatique monovalent ou polyvalent directement lié à l'atome de soufre du ou des groupements thio (méth)acrylates parun noyau aromatique ou par l'intermédiaire d'une chaîne alkyle linéaire, le radical R pouvant
comporter dans sa chaîne un ou plusieurs groupes choisis parmi -O-, -S-, -c- .
O R1 représente l'hydrogène ou -CH3; et n est un entier de 1 à 6, de préférence de 1 à 3.
Parmi les radicaux R monovalents, on peut citer les radicaux alkyle, linéaires ou ramifiés, de C1 à C5, les radicaux de formule : dans laquelle : R2 et R3 sont, indépendamment l'un de l'autre, H ou un radical alkyle, linéaire ou ramifié en C1-C5; R4 est un radical alkyle, linéaire ou ramifié en C1-C5, un radical aralkyle en C7-C10 ou un radical aryle en C6-C12, éventuellement substitué, en particulier par des groupes alkyle et/ou halogène ; m est un entier de 1 à 4.
Parmi les radicaux R monovalents préférés, on peut citer : C2H5SCH2CH2- ;
Des monomères de formule (I) pour lesquels n=1 et tels que définis ci-dessus, sont décrits, entre autres, dans les brevets US-A-
En outre, comme l'irradiation par le faisceau laser peut être réalisée avec une faible énergie d'irradiation, il n'existe aucun risque de changement de couleur la gorge par jaunissement ou ni formation de mousse dans la gorge. L'aspect de la lampe peut donc être meilleur.
La marque formée à la surface de la glace avant peut avoir des points d'intersection (points de coin ou rac cords). Comme l'énergie d'irradiation du faisceau laser se concentre aux points d'intersection, de la fumée peut être produite à ces points. En conséquence, si les gorges sont formées afin qu'elles s'interrompent aux emplacements des points d'intersection, il est possible d'éviter produc tion de fumée aux points d'intersection lors de l'irradia tion par le faisceau laser. Il est donc possible d'empêcher l'adhérence des particules de fumée à la surface de la glace avant.
Un film dur de revêtement est souvent formé à la surface externe de la glace avant pour empêcher la dété rioration de celle-ci. Dans le cas où une marque est formée à la surface interne de la glace, si l'irradiation par le faisceau laser est réalisée après l'application à la glace de la couche dure de revêtement, il est possible d'empêcher le contact d'un dispositif de montage destiné à supporter la glace avant avec celle-ci et la rayure de la surface externe de la glace avant, puisque le film dur de revêtement a été formé.
En outre, lorsque la glace avant est formée d'une résine de polycarbonate, lorsqu'une marque est réalisée à sa surface interne, l'irradiation par le faisceau laser est réalisée à un état dans lequel la surface interne de la glace avant est tournée vers le bas. Ainsi, même si la fumée est produite par l'énergie de projection du faisceau laser, comme les particules de fumée produites par la résine de polycarbonate sont plus lourdes que l'air, elles des cendent. Il est donc possible d'empêcher l'adhérence des particules de fumée à la surface de la glace avant.