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METHODE DE DETECTION ET/OU DE QUANTIFICATION DE VARIANTS MINORITAIRES AU SEIN D'UNE POPULATION VIRALE HETÉROGÈNE DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE. La présente invention concerne une méthode de detection et/ou de quantification de variants minoritaires sein d'une population virale hétérogène dans des échantillons biologiques. La présente invention s'applique plus particulièrement à la détection et/ou la quantification de variants minoritaires du virus d'immunodéficience humaine (VIH).
Des procédés de préparation cellulaire myoblastique et leur utilisation en thérapie cellulaire sont décrits dans l'état de la technique (4, 18,19, 20, 21). La majorité des procédés comprennent : - une étape de prélèvement des tissus musculaires par biopsie, - une étape d'éminçage,
une étape de dissociation des fibres musculaires par action enzymatique, une étape de séparation des cellules individualisées par filtration, une étape de sélection des cellules myoblastiques par clonage ou par tri cellulaire.
La sélection des cellules myoblastiques peut se faire par le clonage des cellules et la caractérisation ultérieure des clones obtenus par cytofluorimétrie puis sélection des cellules musculaires squelettiques exprimant l'antigène CD56 (7). Une méthode directe de tri des cellules myoblastiques exprimant l'antigène CD56 par cytofluorimétrie de flux et ses avantages pour l'obtention d'une culture pure de myoblastes sont décrits dans l'état de la technique (21).
Les cellules conservées sont ensuite cultivées dans un milieu de culture modifié et spécialement adapté pour la culture des myoblastes (23).
La présente invention résulte de l'observation que les cellules issues du tissu musculaire squelettique présentent un potentiel de régénération de nombreux tissus en fonction de leur degré de différenciation. L'invention proposée permet donc de fournir des populations cellulaires bien caractérisées d'origine musculaire, adaptées et spécialement préparées pour leur utilisation souhaitée en thérapie cellulaire.
La présente invention fournit un procédé d'obtention d'une population cellulaire comprenant un type cellulaire dominant, à partir d'une biopsie de tissu musculaire, pour la préparation d'un produit de thérapie cellulaire apte à l'administration humaine, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) prélèvement et éminçage d'une biopsie musculaire dans un milieu nutritif,
b) dissociation enzymatique des fibres et des cellules musculaires et séparation des cellules individualisées par filtration, c) mise en culture des cellules d'origine musculaire ainsi obtenues dans un réacteur de culture de cellules adhérentes en présence d'un milieu de croissance et/ou de différenciation suivie le cas échéant d'une ou plusieurs phases d'expansion, d) identification des types cellulaires présents aux différents stades de la culture par l'analyse de marqueurs cellulaires spécifiques, e) choix du stade de culture pendant lequel le type cellulaire recherché est en proportion dominante dans la population de cellules, f) récolte d'une population de cellules au stade de culture choisi en e), g) le cas échéant, congélation des cellules prélevées à l'étape choisie pour la préparation du produit de thérapie cellulaire.
Les termes population cellulaire ou population de cellules signifient toute population de cellules non pures, contenant en général un type cellulaire dominant et un ou plusieurs types cellulaires minoritaires. Le type cellulaire dominant est le type cellulaire dont la proportion dans la population de cellules est la plus élevée. Préférentiellement, un type cellulaire dominant est le type cellulaire dont la proportion dans la population de cellules dépasse 50%. Un produit de thérapie cellulaire apte à l'administration humaine comprend une solution isotonique dans laquelle les cellules sont resuspendues. Cette solution doit être exempte des composants toxiques présents dans les milieux de congélation. Un tel composant est, par exemple, le DMSO.
La biopsie musculaire est réalisée par prélèvement de cubes de 2 à 4 cm de coté. A titre d'exemple, 3 grammes de tissu prélevé permettent
d'obtenir après expansion entre 400 et 800 millions de cellules. Le tissu musculaire prélevé est un tissu musculaire squelettique, préférentiellement prélevé chez l'adulte, le jeune adulte, l'adolescent ou l'enfant Dans une forme de réalisation de l'invention, le tissu musculaire prélevé est un tissu musculaire squelettique foetal.
L'éminçage consiste à découper la biopsie à l'aide de ciseaux fins en sections d'une taille de préférence inférieure à 0,5 mm placées dans un milieu de culture adapté. L'éminçage est essentiel pour permettre une dissociation enzymatique efficace.
Les tissus musculaires sont constitués de fibres musculaires. Les cellules satellites sont situées sous la lame basale des fibres musculaires.
L'étape de dissociation des fibres musculaires et de décollement des cellules satellites est donc une étape nécessaire pour leur isolement.
L'étape de dissociation consiste en l'utilisation d'enzymes de digestion de la matrice extracellulaire, elle peut être complétée par une dissociation mécanique par aspiration et refoulement de la suspension au travers d'une pipette.
Le choix des enzymes et leurs concentrations utilisées pour la dissociation des fibres musculaires et des cellules satellites de l'éminçat est guidé par l'étude de leur efficacité enzymatique, les critères recherchés sont une concentration d'enzyme la moins élevée possible et un temps d'incubation minimal pour une efficacité similaire. Le rendement en cellules obtenues après filtration dépend en partie de la qualité de l'étape de dissociation enzymatique. Des enzymes de digestion utilisables dans le procédé de l'invention seules ou en association sont par exemple : toutes les collagénases, incluant les types IA, S et H partiellement purifiées, ainsi que la forme purifiée commercialisée sous le nom de Libérase par Roche- Boehringer,
les trypsines, de toutes origines, en solution dans des tampons contenant ou non de l'EDTA, les dispases (aussi connues sous le nom de protéases), la pronase, les élastases, ou encore, les hyaluronidases.
La présente invention se propose de remédier à ces inconvénients et de fournir un perfectionnement aux
revêtements à base de panneaux modulaires qui permettent une pose simple, rapide et économique.
Un autre objectif est de fournir un tel perfectionnement qui autorise un démontage rapide d'un ou, plusieurs, ou de la totalité des panneaux d'un revêtement.
Un autre objectif de l'invention est de permettre la pose et la dépose de ces revêtements sans utiliser d'outil spécifique.
Un autre objectif de l'invention est de réaliser un tel perfectionnement, tel qu'il ne soit pas nécessaire d'attendre le durcissement d'un fixateur pour pouvoir marcher sur le revêtement ou l'utiliser autrement.
Un autre objectif de l'invention est d'assurer facilement une bonne isolation phonique.
Un autre objectif, encore, est de réaliser un tel perfectionnement dans lequel il soit facile de jointoyer les panneaux du revêtement, par exemple pour améliorer l'hygiène ou faciliter le nettoyage.
Un autre objectif encore, est de pouvoir prévoir facilement des revêtements ayant des panneaux à effets décoratifs ainsi que de modifier facilement l'aspect décoratif d'un revêtement.
Un autre objectif encore de l'invention est de fournir un procédé permettant la réalisation de tels revêtements, avec ces différents avantages, sur des surfaces brutes, ajourées ou ne présentant pas une planéité convenable.
L'invention a pour objet un perfectionnement aux revêtements de sol ou autres parois, constitués d'éléments ou panneaux plats modulaires, caractérisé en ce que le revêtement comporte un support intermédiaire périodique, constitué par exemple de lambourdes ou profilés, espacés au pas des panneaux, ainsi qu'une
pluralité de panneaux fixés sur les éléments de ce support, la fixation étant assurée par des clips reliés aux panneaux ou aux éléments de support par des moyens de solidarisation, et clippables dans des gorges ou sur des reliefs présentés par lesdits éléments de support ou panneaux.
Par clip on entend des moyens de blocage de forme, de préférence, mais pas obligatoirement déformables ou élastiques.
De préférence les moyens de solidarisation du clip sont portés par les panneaux et les rainures ou reliefs par les éléments de support.
Le cas échéant, ces moyens de solidarisation peuvent permettre un déplacement effectué par l'opérateur du clip par rapport au panneau ou élément qui le porte de façon à pouvoir ajuster la position du clip par rapport au panneau ou élément.
Les moyens de solidarisation peuvent, par exemple, associer une ou plusieurs rainures en queue d'aronde, présentées, par exemple, par une surface du panneau, rainures dans lesquelles on introduit un ou plusieurs clips, dont les moyens de clippage élastique ou non, par exemple des ailes, émergent de la rainure et dont une base est agencée pour rester immobilisée dans la rainure, au moins dans la direction perpendiculaire au plan du revêtement.
De préférence le revêtement comporte, soit sur la surface du panneau destiné à être appliqué sur le support, soit, de préférence, sur les éléments de support, un revêtement d'un matériau d'isolation phonique, par exemple, une mousse polyuréthane.
riau sur la face postérieure de la glace 20. Un tel matériau peut être constitué par exemple par de la peinture, un encrage, une sérigraphie ou une métallisation; - sur la Figure 4C, la partie de décoration 24 est formée par un insert noyé dans la masse de la glace 20 entre ses faces postérieure et antérieure;
- sur la Figure 4D, la partie de décoration 24 est formée par un dépôt d'une couche de maté-
riau sur la face antérieure de la glace 20. Un tel matériau peut être constitué comme sur la
Figure 4B par exemple par de la peinture, un encrage, une sérigraphie ou une métallisa-
tion, et - sur la Figure 4E, la partie de décoration 24 est formée par collage sur la face antérieure de
la glace 20 d'un motif adhésif ou autocollant.
Dans tous les cas, la glace de protection 20 étant par essence en matériau transparent,
cette partie de décoration 24 sera visible de l'extérieur de la glace 20, ainsi qu'on l'a repré-
senté sur la Figure 3, o l'on voit le dispositif d'éclairage de la Figure 1, mais qui est cette fois muni de la partie de décoration 24 sur la partie supérieure de la glace de protection 20. Plus précisément, la partie de décoration 24 comporte une face avant 26, visible par un observateur extérieur, et une face arrière 28, tournée vers l'intérieur du dispositif et invisible de l'extérieur. Les faces avant 26 et arrière 28 peuvent ainsi jouer des rôles totalement différents, et donc être différentes. Elles peuvent par exemple comporter des motifs différents et/ou des couleurs différentes. Dans la variante de réalisation représentée sur les Figures 4B et 4D, les
faces avant 26 et arrière 28 pourront par exemple résulter de deux dépôts successifs et diffé-
rents, de peinture, d'encrage, de sérigraphie ou de métallisation, pourvu qu'ils soient compati-
bles l'un avec l'autre.
La face avant 26, vue directement dans les directions E par un observateur extérieur, peut contribuer à l'esthétique extérieure du dispositif d'éclairage ou du véhicule automobile, ou comporter des indications destinées à l'identification de ce dispositif, ou encore l'indication du constructeur du véhicule ou du fabricant du dispositif d'éclairage. Elle pourra
par exemple être métallisée de manière à être réfléchissante.
Par contre, la face arrière 28 est cachée à la vue d'un observateur extérieur et remplit une fonction totalement différente. En effet, lorsque la source lumineuse 16 est éteinte, cette face arrière 28 est éclairée par la lumière ambiante régnant à l'extérieur du dispositif d'éclairage et y pénétrant à travers la glace de protection 20. Il en résulte qu'elle diffuse des rayons lumineux dans toutes les directions I vers l'intérieur du dispositif d'éclairage. Une
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Les plasmides codant pour l'IL 10 (50 à 200 pg/dose) sont mis en suspension dans 0,2 à 1 ml de PBS pour administration intramusculaire.
Exemple 3: Vaccin à base de l'immunogène p53 destinée à induire une réaction immunitaire de type mucosale avec formation préférentielle d'anticorps anti p53 de classe IgA .
L'immunogène p53 (20 à 100 pg/dose) est inclus dans un gel de phosphate de calcium en présence ou non d'adjuvant LT (5 à 20 ug/dose) pour l'instillation intra nasale. La préparation est administrée par voie intranasale soit sous forme de gouttes nasales, soit sous forme d'un gel par addition de carbopol.
Exemple 4 : Vaccin à base de l'immunogène IL10destinée à induire une réaction immunitaire de type réaction mucosale avec formation préférentielle d'anticorps anti IL10de classe IgA : On a préparé des micro sphères de PLG contenant l'immunogène (100 à 300pg/dose) et un mutant de la toxine LT (5-25ug/dose) L'inclusion de l'IL 10 et du LT est réalisée dans les micro sphères biodégradables selon le protocole de Baras B. et al (Baras B. et al, Single-dose mucosal immunization with biodegradable microparticles containing a Schistosoma mansoni antigen. Infect Immun. (1999) 67:2643-8).
Exemple 5 :Vaccin à base de l'immunogène plasmidique IFNy pour vaccination ADN de type mucosale Les plasmides d' IFNy (100-500pg/dose) en présence de LT (5- 20pg/dose) sont inclus dans des micro sphères de PLG selon le protocole décrit par Baras B. et al. L'administration par voie orale se fait par gavage ou par ingestion de capsules gastrorésistantes contenant les micro sphères et un excipient à base d'alginate.
Les immunogènes servant à la préparation des vaccins ci-dessus ont été préparés comme suit :
Préparation 1 : Immunogène anti IL6 Immunogène IL6 dérivé de la cytokine recombinante IL6 par traitement au formol suivi d'un traitement par le glutaraldéhyde : A 1 ml d'une solution d'IL6 à 1 mg/ml dans du tampon phosphate stérile. on ajoute 28 l d'une solution de formol (35 %) dilué au 1/10 dans du tampon phosphate stérile Après addition de merthiolate au 1/10.000, le mélange est placé 9 jours à l'étuve à 37 C. Il est ensuite additionné de glutaraldéhyde à la concentration 0,0026 M. Après 3 minutes, le mélange est additionné de 100 l de glycine à 50 mg/ml pour bloquer les groupements aldéhydiques en excès et il est dialysé contre un grand volume de tampon phosphate. L'immunogène est ainsi stabilisé.
Caractéristiques de l'IL6 L'antigénicité de la cytokine recombinante IL6 traitée par rapport à celle de la protéine recombinante native a été mesurée à l'aide d'un test ELISA de R&D (D6050) :la cytokine recombinante IL6 détoxiquée présente une antigénicité égale à l'antigénicité de la protéine native correspondante.
L'absence de toxicité in vitro est mesurée par un test de prolifération cellulaire. Des cellules mononucléées du sang périphérique humain sont cultivés en présence du superantigène SEB et en présence d'une dose de la protéine recombinante IL6 native ou détoxiquée correspondant à 10 fois et 30 fois la dose physiologique de la cytokine native. La prolifération cellulaire est exprimée en % de prolifération cellulaire [cpm (coups par minute) contrôle/cpm échantillon] x 100). Le contrôle correspond à une concentration de protéine recombinante utilisée égale à 0. Les résultats sont présentés dans le tableau suivant :
% de prolifération cellulaire IL6 native 0 ng/ml 100 IL6 native 30 ng/ml 98 IL6 traitée 30 ng/ml 95
L'IL6 traitée utilisée à des doses 10 fois et 30 fois supérieures aux doses physiologiques ne modifie pas la prolifération des cellules mononucléées du sang périphérique humain activés par le SEB.
Préparation 2 : Immunogène anti p53 L'immunogène p53 a été détoxiqué par traitement au formol selon le protocole décrit par Ramon (Ramon G, Sur le pouvoir floculant et les propriétés immunisantes d'une toxine diphtérique rendue anatoxique (anatoxine). C.r. hebd. Scéances Acad. Sci. (1923) 177 1338-1340), suivi d'un traitement au glutaraldéhyde de la protéine p53 recombinante (sc-4246, Santa Cruz) dans les conditions suivantes :à 10 l d'une solution de p53 native à 1 mg/ml, on ajoute 3 l d'une solution de formol dilué au 1/100 dans du tampon phosphate stérile.
Le mélange est placé 2 jours à l'étuve à 37 C. Il est ensuite additionné de 25 l de glutaraldéhyde au 1/100. Après 15 minutes de réaction à température de laboratoire, on ajoute 2 l de glycine 2M pour bloquer les groupements aldéhydiques en excès.
Caractéristique de l'immunogène p53 L'antigénicité de la protéine recombinante p53 traitée par rapport à celle de la protéine recombinante native a été mesurée à l'aide d'un test ELISA d'Amersham Pharmacia Biotech (p53 Rapid Format Pantropic Human ELISA, VQIA26) : Les protéines p53 native et traitée présentent une antigénicité équivalente.
Absence de toxicité in vitro : la protéine p53 traitée utilisée à des doses dix fois et 30 fois supérieures aux doses physiologiques (0,5 à 5 ng/ml) ne modifie pas la prolifération de cellules mononucléées du sang périphérique humain activées par le SEB ou par les anticorps anti CD3. La mesure de la prolifération a été réalisée par le test à la 3H-thymidine.
Préparation 3 :Immunogène anti VEGF L'immunogène VEGF dérivé de VEGF (293-VE-010; R&D) est obtenu par traitement à la glutaraldéhyde dans les conditions suivantes :à 100 l d'une solution de VEGF natif à 5 pg/ml dans du tampon phosphate, on ajoute 5 l d'une solution de glutaraldéhyde dilué au 1/500 dans du tampon phosphate
Les pistes 6 à 8 correspondent à des contrôles négatifs de l'expérience dans lesquels une PCR sans reverse transcription préalable a été réalisée.
Exemple 3.7 : Spécificité des transcrits inhibiteur de type antisens Les résultats d'une série de cotransfections croisées d'un plasmide codant pour la SeAP (pXL3010) et d'un plasmide codant pour l'antisens de la SeAP (pSeAPantisens) ou de la Luciférase (pLucAntisens) et inversement des cotransfections d'un plasmide codant pour la luciférase (pXL3031) et d'un
plasmide codant pour l'antisens de la SeAP (pSeAPantisens) ou de la Luciférase (pLucAntisens), sont présentés aux figures 5A et 5B.
Ces résultats démontrent clairement qu'il n'y a pas de réactions croisées aspécifiques, à savoir que l'antisens de la SeAP n'a pas d'effet sur l'expression de la luciférase, et de même que l'antisens de la luciférase n'a pas d'effet sur l'expression de la SeAP. Ces résultats montrent également que l'inhibition observée ne peut pas être attribuée à la coexpression de séquences sens et antisens quelconques, mais nécessite au contraire la coexpression d'un transcrit antisens pour une séquence sens spécifique.
EXEMPLE 4 : Absence d'inhibition in vivo de l'expression de la SeAP par l'antisens de SeAP lorsque celui-ci est injecté 22 jours après le gène rapporteur SeAP sens Exemple 4. 1 Electrotransfert dans le muscle squelettique Les souris SCID agées de 6 semaines sont d'abord anesthésiées par un mélange Kétamine/Xylazine (250 l/souris). Les différents plasmides en solution dans du NaCI 150mM, sont ensuite injectés en intramusculaire dans le muscle tibial cranial des souris. L'injection est suivie d'une série de pulses électriques : 8 pulses de 20 ms, 200 V/cm, 1 Hz (Mir et al., PNAS, 96 (1999) 4262-67). La quantité de SeAP circulante est suivie régulièrement par des prélèvements sanguins et dosages de l'activité phosphatase à l'aide du kit Phospha-Light (Tropix).
Exemple 4.2: Comparaison du pourcentage d'inhibition du transcrit inhibiteur de type antisens lorsque celui-ci est coinjecté avec le gène rapporteur SeAP ou postinjecté 22 jours après l'injection du gène SeAP Les résultats, rassemblés en figure 6, montrent que l'injection du plasmide pSeAPantisens ne conduit pas à une inhibition efficace du gène rapporteur de la SeAP (pXL3010) injecté 22 jours auparavant. En effet, plus de 20 jours
après l'injection du transcrit antisens, l'expression observée de la SeAP n'a diminué que de 60% (lot 1, figure 6).
Ceci indique donc bien que le transcrit antisens ne peut inhiber efficacement le gène exogène SeAP préalablement administré, alors que ce dernier a été reconnu comme restant stable et fonctionnel pendant environ 9 mois après injection et électrotransfert in vivo (Mir et al., PNAS, 96 (8) (1999) 4262- 4267 ; Mir et al., C R Acad Sci III, 321(11) (1998) 893-899). Une expression résiduelle d'environ 30% du gène exogène de la SeAP est en effet observée.
Par contre, la figure 6 montre clairement qu'une coinjection du transcrit inhibiteur de type antisens et de la séquence sens du gène rapporteur exogène de la SeAP confère une très forte inhibition de l'expression de la SeAP, puisque l'on ne peut détecter aucune expression résiduelle de ce gène. La coexpression du gène sens et antisens de la SeAP permet d'abolir l'expression du gène rapporteur SeAP in vivo (lot 2, figure 6).
L'injection d'antisens seul en tant que contrôle ne confère aucune activité (lot 3, figure 6).
Exemple 4.3 : Vérification de l'expression in vivo des transcrits sens et antisens Les muscles des souris ont été prélevés, broyés, et les ARN totaux ont été extraits. Des réactions de RT-PCR ont été effectuées en suivant le protocole précédemment décrit à l'Exemple 3. 6. Les produits de la réaction ont été séparés sur gel d'agarose et visualisés au bromure d'éthydium.
Une photographie de ce gel qui est présentée à la figure 7A, montre que les deux ARN sens et antisens sont exprimés dans les muscles de souris qui ont subi une première injection de plasmides pXL3010, et une injection ultérieure de plasmide portant la séquence du transcrit inhibiteur de type antisens pSeAPantisens (pistes 2 et 3)...
Au contraire lorsque l'on a effectué une co-injection du pXL3010 et pSeAPantisens, seul l'ARN antisens est présent, l'ARNm de la SeAP n'est pas détecté (pistes 4 et 5). Ceci confirme bien l'efficacité de l'inhibition obtenue par co-injection de la séquence sens et de son transcrit inhibiteur antisens.