INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
cellules en présence de 9, 4 pM de D609 induit une inhibition presque totale de la production des céramides et des DAG de 95% et de 80% du niveau stimulé, respectivement. A la concentration de 30 uM le D609 a permis une inhibition complète de la production des céramides et une inhibition de 65% des DAG produits. Un traitement des cellules par les deux agents combinés induit un effet équivalent au D609 30 uM : la surproduction des céramides est totalement bloquée et 70% des DAG produits sous AGE-méthylglyoxal sont inhibés. b) Conclusion.
Une incubation des péricytes avec du D609, plus particulièrement à la concentration de 9, 4 uM, induit une inhibition parallèle de la production stimulée des céramides et des DAG. Ce résultat permet donc de conclure que la formation des DAG est bien liée à l'activation d'une phosphatidylcholine-phospholipase C couplée à une sphingomyélinase acide, ce qui valide la voie de production des céramides et des DAG envisagée précédemment.
Toutefois, malgré une inhibition complète des céramides et des DAG, les cellules ne sont que partiellement protégées de l'apoptose induite par les AGEméthylglyoxal, ceci suggère l'existence d'une seconde voie de signalisation parallèle à la production des céramides et des DAG et menant à l'apoptose des péricytes.
La figure 15 montre la voie de signalisation menant à l'apoptose des péricytes.
Les AGE-méthylglyoxal, probablement par l'intermédiaire d'un récepteur spécifique aux AGE, induisent un stress oxydant qui peut être situé au carrefour de deux voies de transduction de signal menant à l'apoptose des péricytes. Effectivement, un traitement des cellules avec de la N-acétyl-L-Cystéine bloque complètement la production stimulée des céramides et des DAG et inhibe
totalement l'apoptose des péricytes induite par les AGEméthylglyoxal.
Les travaux de recherche ont alors consisté à définir une cible enzymatique située en amont des céramides et des DAG et qui pourrait également se trouver au carrefour des deux voies de signalisation.
IV-IMPLICATION DE CASPASES : LES PROTEASES SPECIFIQUES DE L'APOPTOSE.
Des études récentes ont mis en évidence qu'une série de protéases de la famille des ICE (Interleukin-1 Converting Enzyme) renommées caspases (Cytosolic Asparte- Specific Cysteine Protases) jouaient un rôle clef dans la transduction des signaux apoptotiques. En fonction du critère de comparaison, différentes classifications de ces protéases ont été proposées : - Selon leur temps d'implication dans la voie de signalisation de l'apoptose, ces enzymes ont été classées en deux groupes : les caspases initiatrices, activées au cours la phase d'initiation de l'apoptose (caspases-2,8, 10) et les caspases effectrices, pouvant être activées en cascade par des caspases initiatrices, impliquées dans la phase d'exécution de l'apoptose qui se caractérise par des atteintes biochimiques et morphologiques de la cellule (caspases-3,6, 7,9) (Nunez et al, 1998 ; Stennicke et al, 1998 ; Alnemri, 1999).
- En revanche, sur la base de leur spécificité de substrat, les caspases ont pu être classées différemment en trois sous groupes :, le groupe I constitué des caspases- 1,4, 5 (enzymes décrits comme étant impliqués dans les réponses inflammatoires), le groupe II constitué des caspases-2,3, 7 et le groupe III constitué des caspases-6, 8,9, 10. Alors que les protéases du groupe II exigent un
résidu aspartate aussi bien en première qu'en quatrième position du site de clivage protéolytique (XDXXD), les protéases du groupe III sont plus tolérantes vis-à-vis du quatrième résidu aminoacide, tout en présentant une préférence pour les acides aminés aliphatiques (XE [I/T/H/V] D) (Thornberry et al, 1997 ; Garcia-Calvo et al, 1998).
- Enfin une analyse phylogénétique des caspases a permis de définir trois sous-familles : les ICE-like protéases (famille des caspases-l) regroupant les caspases- 1,4, 5, 11, les IchII-like protéases (famille des caspases-2) regroupant les caspases-2,9 et les CPP (cysteine protein protease) 32-like protéases (famille des caspases-3) regroupant les caspases-3,6, 7,8, 10 (Alnemri et al, 1996 ; Duan et al, 1996a, 1996b).
Les caspases sont inhibées de façon spécifique in vitro et in vivo par des peptides synthétiques (le plus souvent des tétrapeptides) rendus perméables aux cellules par des groupements chimiques bloquant les fonctions NH2 et COOH terminales et mimant le site de clivage de leur substrat respectif.
Différents peptides inhibiteurs synthétiques ont été testés afin de vérifier si des caspases initiatrices et/ou effectrices étaient impliquées dans l'apoptose des péricytes induite par les AGE-méthylglyoxal.
Trois peptides décrits comme des inhibiteurs spécifiques d'une protéase ont été testés : - le peptide z-VDVAD-fmk inhibiteur spécifique de la caspase-2 initiatrice, - le peptide z-IETD-fmk inhibiteur spécifique de la caspase-8, - le peptide z-LEHD-fmk inhibiteur spécifique de la caspase-9.
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En conséquence, la lampe peut facilement donner la quantité de lumière nécessaire à la distribution de lumière tout en permettant la réflexion directe de lumière par
l'ouverture 18B à l'aide des éléments réflecteurs 14As.
La figure 10 est un schéma analogue à la figure 7, représentant une seconde variante du second mode de réalisation. Comme l'indique la figure 10, un panneau translucide
18 diffère de celui de la première variante.
Dans le panneau translucide 18 de la seconde variante, une région proche de l'axe optique Ax qui constitue l'ouverture 18B de la première variante a une partie plane verticale 18C qui n'est pas semi-transparente. Ainsi, le panneau translucide 18 s'étend horizontalement avec une
forme trapézoïdale de façon générale en coupe longitudinale.
Plusieurs éléments 18Cs de lentille sont formés dans
toute la région de la surface arrière de la partie non semi-
transparente 18C (partie centrale en direction verticale).
Chaque élément de lentille 18Cs a une forme en oeil de
poisson.
Grâce à la construction précitée, il est possible d'obtenir pratiquement le même fonctionnement et les mêmes avantages qu'avec la première variante, avec en outre les
avantages suivants.
Comme la partie non semi-transparente 18C ayant les éléments de lentille 18Cs est dans une région du panneau translucide 18 proche de l'axe optique Ax, l'intérieur de la lampe ne peut pas être vu nettement à travers la partie 18C qui n'est pas semi-transparente, aussi bien lorsque la lampe fonctionne que lorsqu'elle ne fonctionne pas. De plus, l'aspect de la lampe peut être modifié selon que la lampe fonctionne ou non, mais d'une manière différente de celles du premier et du second mode de réalisation. En outre, par réglage convenable de la configuration
de la surface de chaque élément de lentille 18Cs, la distri-
bution de lumière peut être facilement réglée.
On calcule alors la fréquence de mutation qui est le rapport du nombre de colonies révertantes sur le nombre de colonies viables X/Y et la fréquence de mutation relative (FMR) qui est le rapport de la fréquence mutation (FMsusp=Xsusp/Ysusp) de la suspension irradiée mais traitée avec le principe actif selon la présente invention, sur la fréquence de mutation du témoin irradié mais non traité (FMtém = Xtém/Ytém,).
Les résultats sont regroupés dans les tableaux des figures 3A et 3B respectivement pour la Salmonella typhimurium et l 'Escherichia coli.
Le principe actif présente un potentiel anti-mutagène ' à vis des mutations induites par des UVA, UVB et UVC.
3/ Effet de protection de l'ADN L'étude vise à déterminer l'effet génoprotecteur du principe actif selon la présente invention.
A cet effet, on effectue un test in vitro dit test 3D (Damaged DNA Detection) et commercialisé par la société française "SFRI laboratoire" pour détecter les agents génotoxiques en repérant les lésions l'ADN en reproduisant in vitro le processus de réparation desdites lésions.
Dans ce test, des cellules HELA sont mises en culture puis incubées avec 2 ou 4% de principe actif . Une agression est réalisée au moyen d'une solution d'eau oxygénée.
Les cellules sont ensuite lysées puis l'ADN génomique récupéré et analysé. test 3D consiste en une réparation des lésions par des complexes protéiques spécifiques à la réparation. Un nucléotide marqué à biotine est incorporé dans l'ADN lors de la resynthèse.
reconnaissance de la biotine au moyen d'une molécule d'avidine couplée à une peroxydase puis une révélation par addition substrat chimiluminescent de la peroxydase.
Un luminomètre permet ensuite de détecter et de mesurer l'intensité de cette luminescence.
Les résultats montrent un pourcentage d'inhibition de l'effet lésionnel de 22% et de 75% respectivement pour des doses de principe actif de 2 et 4% sur des cellules HELA.
Le principe actif selon la présente invention possède bien une activité anti-lésion importante.
4l Effet sur l'apparition-de cellules coup de soleil Les cellules "coup de soleil" ou "sunburn cells" sont des kératinocytes dyskératosiques de l'épiderme qui apparaissent après une irradiation aux UV. Ces cellules présentent des lésions de l'ADN et sont en apoptose Le protocole opératoire prévoit d'une part de conserver des témoins non irradiés et d'autre part d'irradier aux UVA et UVB des expiants mis en présence de 5 et 7% de principe actif selon la présente invention.
Après rinçage et fixation, coupe histologique et coloration les cellules "coup de soleil", c'est à dire les kératinocytes apoptotiques, sont comptées au microscope.
On constate un pourcentage de réduction de 49% et de 63 du rapport du nombre de cellules "coup de soleil" par rapport au témoin irradie.
La peau se trouve ainsi protégée des effets délétères des radicaux libres induits par les UV.
51 Effet protecteur de fibroblastes et de kératinoc tes soums à es #V Des kératinocytes et des fibroblastes sont cultivés dans des milieux adaptés.
La présente invention a aussi pour objet une méthode de transfert in vivo d'un transgène d'intérêt, consistant à coadministrer et coexprimer dans un tissu ou une cellule cible, un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, ainsi qu'un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique dudit transcrit d'intérêt. Selon cette méthode, l'expression du transgène d'intérêt ou l'activité du transcrit d'intérêt est inhibée de manière constitutive, et peut être restaurée en inhibant l'activité du transcrit inhibiteur par l'administration d'un agent externe répresseur, et/ou en administrant un agent externe susceptible de conduire à l'induction de l'activité du transcrit d'intérêt.
La présente invention a également pour objet une méthode destinée à réduire l'expression résiduelle d'un transgène d'intérêt in vivo, qui consiste à coinjecter et à coexprimer les séquences codant pour le transcrit d'intérêt et pour son transcrit inhibiteur spécifique.
La présente invention a en outre pour objet une nouvelle association administrée in vivo et susceptible d'être utilisée dans le procédé selon l'invention. Celle-ci comporte un acide nucléique comprenant la séquence d'un transgène d'intérêt codant pour un transcrit d'intérêt ou transcrit utile, et un acide nucléique comprenant une séquence d'un transgène inhibiteur codant pour un transcrit inhibiteur spécifique du transcrit d'intérêt, chacune des séquences étant sous le contrôle d'un promoteur transcriptionnel, et l'activité du transcrit d'intérêt et/ou du transcrit inhibiteur pouvant être régulée par un agent externe.
On entend par transgène d'intérêt, toute molécule d'acide nucléique exogène, codant pour un produit biologique, à savoir soit un transcrit d'intérêt ou utile tel qu'un ARNm, un ARNr, un ARNt, un ribozyme, ou un aptazyme, soit une protéine, un polypeptide, ou un peptide d'intérêt
thérapeutique ou expérimental. Selon l'invention, le transgène d'intérêt inclut un ADNg, un ADNc, des ADN naturels ou obtenus totalement ou partiellement par synthèse chimique.
On entend par transcrit d'intérêt ou transcrit utile, un ARN produit par transcription à partir du transgène d'intérêt comme défini précédemment. Le transcrit d'intérêt peut se présenter sous la forme d'un ARNm et être traduit en une protéine ou un peptide thérapeutique à action intracellulaire ou sécrétée. Alternativement, le transcrit d'intérêt ou transcrit utile peut se présenter sous la forme d'un ARN ayant une activité biologique intrinsèque tel qu'un aptazyme, un ribozyme, un ARN antisens, ou un ARN capable d'interagir avec les constituants des cellules transfectées, comme par exemple un ARN ribosomique (ARNr), un ARN de transfert (ARNt), ou un aptamère.
On entend par transgène inhibiteur, toute molécule d'acide nucléique exogène, susceptible de produire par transcription, un transcrit inhibiteur ayant pour cible le transcrit d'intérêt. Selon l'invention, le transgène inhibiteur inclut un ADNg, un ADNc, des ADN naturels ou obtenus totalement ou partiellement par synthèse chimique.
On entend par transcrit inhibiteur spécifique, un ARN qui peut se présenter sous la forme d'un ARN antisens, d'un ribozyme, d'un ARN capable de former une triple hélice, et qui a une certaine complémentarité ou spécificité avec le transcrit d'intérêt.
Le transcrit est dit inhibiteur dans la mesure où il est capable d'inhiber efficacement et constitutivement le transcrit d'intérêt, avec lequel il est coexprimé dans le tissu ou la cellule cible, soit au niveau traductionnel, en bloquant la traduction du transcrit d'intérêt de type ARNm, soit au niveau de son activité biologique, en bloquant l'interaction du transcrit d'intérêt
ARNr, ARNt, ou aptamère avec les constituants cellulaires, soit en bloquant l'interaction du transcrit d'intérêt de type aptazyme, ribozyme, ou ARN antisens avec une séquence nucléique cible, soit encore en diminuant la concentration du transcrit d'intérêt par dégradation enzymatique. Ce transcrit inhibiteur est par ailleurs dit répressible, c'est à dire qu'il peut faire lui-même l'objet d'une inhibition par l'intermédiaire d'un agent répresseur externe.
On entend par activité du transcrit d'intérêt, soit sa traduction en une protéine ou un peptide d'intérêt thérapeutique ou expérimental, lorsque le transcrit d'intérêt se présente sous la forme d'un ARNm, soit son activité biologique lorsque le transcrit d'intérêt se présente sous la forme d'un aptazyme, d'un ribozyme, ou d'un ARN antisens, soit encore son interaction avec les constituants cellulaires, lorsque le transcrit d'intérêt se présente sous la forme d'un ARN ribosomique, d'un ARN de transfert, ou d'un aptamère.
On entend par agent externe, tout agent chimique, et de préférence pharmacologique, ou physique tel que la chaleur, administrable par voies entérales ou parentérales, ayant une faible toxicité, et présentant une activité d'inhibition ou d'activation de l'expression d'un gène.
Une des caractéristiques avantageuses du procédé de régulation par inhibition réversible selon la présente invention réside dans sa capacité à bloquer efficacement de manière constitutive l'expression d'un transgène d'intérêt in vivo ou l'activité du transcrit d'intérêt ou utile, et à rétablir cette expression lorsque cela est souhaité pour des raisons cliniques ou expérimentales. Ce système repose sur la coinjection et la coexpression d'un transgène d'intérêt et de son transcrit inhibiteur spécifique in vivo, et la possibilité de réguler efficacement le transgène d'intérêt, soit par inhibition de son transcrit inhibiteur spécifique, soit par activation du transcrit d'intérêt,
soit encore par activation du transcrit d'intérêt et inhibition concomitante de son transcrit inhibiteur spécifique.
Selon un premier mode de réalisation de la présente invention, le transcrit inhibiteur est inhibé par un agent répresseur externe, afin de lever l'inhibition du transcrit d'intérêt et de rétablir indirectement l'activité du transcrit d'intérêt ou un niveau biologique suffisant du transcrit d'intérêt.
L'inhibition du transcrit inhibiteur peut être obtenue en plaçant la séquence du transgène inhibiteur codant pour le transcrit inhibiteur sous le contrôle d'un promoteur répressible ou sensible à un agent répresseur externe. On peut utiliser par exemple le système de répression par la tétracycline (TrRS) qui dérive de l'opéron de résistance à la tétracycline de E.coli (Gossen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 89 (1992), 5547-5551). Ce système utilise l'affinité du répresseur tet (tetR) pour la séquence de l'opérateur tet (tetO), l'affinité du tetR pour la tétracycline, ainsi que l'activité ubiquitaire du transactivateur du virus de l'herpès VP16 dans les cellules eucaryotes. Ce système de régulation TrRS fonctionne donc grâce à un transactivateur (tTA) chimérique qui résulte de la fusion de l'extrémité C- terminale de VP16 avec l'extrémité C-terminale de la protéine tetR.
lampe selon l'invention a un meilleur aspect esthétique.
En outre, dans ce mode de réalisation, une partie du panneau translucide 18 est formée par l'ouverture 18B. En conséquence, la luminosité obtenue en avant de l'ouverture 18B n'est pas réduite, contrairement au cas de la lumière émise vers l'avant à travers la partie semi-transparente 18A. En outre, l'ouverture 18B est formée dans une région proche de l'axe optique Ax du panneau translucide 18 qui contribue marginalement à la réflexion de la partie de paroi
perpendiculaire 14B. En conséquence, la lampe peut facile-
ment donner une distribution suffisante de lumière tout en
conservant l'image réfléchie de la partie de paroi perpen-
diculaire 14B.
La figure 9 est un schéma analogue à celui de la figure 7, mais représentant une première variante du second mode de réalisation.
Sur la figure 9, la construction des éléments réflec-
teurs 14As formés dans la partie 14A de réflecteur est
différente de celle du second mode de réalisation.
Ainsi, chaque élément réflecteur 14As a une surface courbe convexe correspondant à un paraboloïde dont l'axe central est l'axe optique Ax et le foyer se trouve à
l'emplacement du filament 12a sur l'axe optique Ax.
Cependant la surface courbe convexe de chaque élément réflecteur 14As a une configuration telle que la partie d'extrémité du côté de la périphérie externe de la surface courbe est décalée vers l'avant par rapport à la surface courbe convexe du second mode de réalisation. En outre, l'élément 14As réfléchit la lumière de manière diffuse depuis le filament 12a plus près de l'axe optique Ax que dans le second mode de réalisation. Plus précisément, l'élément 14As renvoie la lumière dans une plage allant de la direction d'un axe parallèle à l'axe optique Ax à une
direction diagonale vers l'axe optique Ax.
Grâce à cette construction, une plus grande quantité de lumière peut être émise vers l'avant par l'ouverture 18B en faisant parvenir une partie de la lumière réfléchie de chaque élément réflecteur 14As au point E d'observation par l'oeil qui est en avant dans la direction de l'axe optique
L'invention couvre également un procédé de lutte contre vieillissement cutané, qui consiste à disposer préventivement sur la peau telle composition cosmétique. Les différentes figures annexées regroupent les résultats obtenus lors des différents essais de caractérisation du principe actif extrait et de son activité.
- la figure 1 montre un état sur plaque des résultats de chimiluminescence des oxydations des différentes protéines, - la figure 2 montre un tableau des atténuations du taux d'oxydation, et - les figures 3A et 3B montrent les effets contre les mutations induites par les rayonnements UV dans le cas de Salmonella typhimurium et d'Escherichia coli.
Le procédé d'extraction selon la présente invention est maintenant décrit en détail, suivi de la caractérisation du principe actif et des tests.
I/ PROCEDE D'EXTRACTION Le procédé d'extraction du principe actif selon la présente invention consiste en la succession des étapes suivantes - réduction en poudre fine de téguments séchés de pomme, - solubilisation de cette poudre avec un minimum de 8% en volume de poudre dans une solution aqueuse, - hydrolyses enzymatiques conjointes des sucres et des protéines, - chauffage, plus particulièrement pendant une durée de 20 à 6 heures, à une température comprise entre 50 et 80 C, permettant l'inactivation totale des enzymes, - concentration éventuelle de la solution obtenue, - filtration stérilisante pour retenir les micro-organismes, levures, moisissures ainsi que la flore mésophile totale.
La solution peut être concentrée sans que cela soit une nécessité ou même être lyophilisée ou atomisée.
II/ CARACTERISATION DU PRINCIPE ACTIF Le principe actif issu de ce procédé se caractérise par la composition suivante et par les caractéristiques suivantes 1 / Matière sèche Le taux de matière sèche est supérieur à 100 g/1, notamment compris entre 100 et 300 g/1 et plus particulièrement entre140 et 200 g/1. Cette plage est déterminée par passage à l'étuve à 105 C jusqu'à obtention poids constant.
2/ pH La valeur du pH est comprise entre 4,0 et 10,0 plus particulièrement entre 5,0 et 7,0, obtenue par la méthode potentiométrique, à température ambiante.
3/ Teneur en sucres totaux La teneur en sucres totaux est obtenue par la méthode de DUBOIS (DUBOIS M & al, (1956) Analytical Chemistry, 28, N 3 p 350-356).
En présence de phénol et d'acide sulfurique concentré, les sucres réducteurs donnent un composé jaune-orangé.
Après refroidissement, la Densité Optique est lue au spectrophotomètre à 490 nm.
Une courbe test est établie avec une gamme étalon d'une combinaison de 1/3 de mannose, 1/3 de glucose et 1/3 de galactose, avec des concentrations de 25 à 100 ,ug/I.
Les valeurs du taux de sucre sont lues sur la courbe directement et dans le cas du principe actif selon la présente invention, on obtient des valeurs de sucres totaux comprises entre 40 et 300 g/1, préférentiellement entre 80 et 160 g/l.
41 Polyphénols totaux Les composés phénoliques forment des complexes colorés en présence de ferricyanure de potassium, dont l'intensité peut-être détectée à 5 nm. Ceci permet de déterminer la quantité de composés phénoliques une courbe étalon. Cette courbe est obtenue à partir d'une gamme étalon d'acide gallique allant de 40 à 120 mg/I.
La valeur obtenue est comprise entre 900 et 2 000 mg/I 51 Stabilité Le principe actif obtenu est stable à un pH supérieur à 4,0. Le principe actif est stable à la température jusqu'à 80 C.