INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
* Ainsi, il y a une corrélation directe entre l'apparition de l'activité entérotoxique des hybrides et l'oxydation par l'air des groupements sulfhydryls libres créés préalablement en conditions réductrices. Par contre,
les bactéries recombinantes cultivées en présence de ssmercaptoéthanol puis lavées avec du PBS induisent une accumulation de fluides intestinaux chez les souriceaux nouveau-nés (Figure 9B). Ceci suggère fortement qu'une synthèse de novo des protéines hybrides peut se faire in vivo ou qu'il existe in vivo des conditions environnementales propices à la formation des ponts disulfures.
Afin de vérifier plus précisément si la formation des ponts disulfures avait bien lieu au niveau de la portion STh de l'hybride, nous avons déterminé in vitro l'état d'oxydoréduction des protéines hybrides dans les surnageants de cultures prélevés en phase stationnaire et présentant une activité entérotoxique. La migration sur gel de polyacrylamide en conditions non réductrices de ces surnageants traités avec des combinaisons différentes de DTT et d'AMS permet de visualiser distinctement les protéines hybrides sous forme réduite et sous forme oxydée après immunomarquage avec les anticorps anti-ClpG.
La figure 10 représente l'état d'oxydoréduction des protéines hybrides. Les bactéries recombinantes ont été cultivées sur milieu gélosée. Les surnageants sont (+) ou non (-) traités avec 100 mM de DTT avant précipitation au TCA 5% final. Le culot est repris dans un tampon contenant (+) ou non (-) 10 mM d'AMS. Après migration sur gel de polyacrylamide à 12 % en conditions non réductrices, les protéines sont révélées avec
l'anticorps anti-ClpG (A et B, a) ou avec le mélange d'anticorps anti-ST 11C+ 20C1 (B, b). La réaction colorimétrique est révélée après l'utilisation des anticorps anti-IgG de lapin ou des anticorps anti-IgG de souris couplés à la biotine et de la streptavidine conjuguée à la peroxydase. Red signifie forme réduite et ox forme oxydée. La fixation de chaque molécule d'AMS sur les protéines réduites retarde leur migration et les formes oxydées, qui ne réagissent pas avec l'AMS, migrent plus rapidement (cf. Matériel et Méthodes, 14). L'analyse des surnageants traités seulement avec l'AMS (piste 3) ou additionnellement avec le DTT (piste 2) montre clairement que les hybrides présents dans le milieu extracellulaire sont oxydés (piste 4) . Ceci est confirmé par les profils électrophorétiques des formes réduites non couplées à l'AMS (piste 1) qui sont indiscernables des formes oxydées (pistes 3 et 4). En effet, tous les hybrides, traités simultanément avec le DTT et l'AMS, sont retardés dans leur migration alors qu'aucun changement n'est observable en présence d'AMS sans DTT. En sachant que la protéine ClpG est dépourvue de résidus cystéines, ces résultats indiquent que l'AMS s'est lié chimiquement aux groupes sulfhydryls de la STh. Afin de vérifier que la forme oxydée des hybrides possède la portion STh, nous avons analysé la réactivité d'un seul surnageant, qui a été choisi comme exemple, vis- à-vis d'un mélange d'anticorps monoclonaux anti-STa (Figure 10 B,b). Les résultats confirment que la forme oxydée
contient la portion STh et, par conséquent, que les ponts disulfures sont formés au niveau de STh. Par contre, la forme réduite ne réagit pas avec les anticorps anti-STa, probablement par perte des propriétés antigéniques de STh provoquée par un changement sévère de la structure conformationnelle de la toxine.
Il apparaît donc que la fusion génétique de STh aux extrémités permissives N- et C-terminales de la protéine porteuse ClpG a permis d'obtenir quatre hybrides ClpG-STh qui sont sécrétés in vitro et in vivo dans le milieu extracellulaire sous forme de monomères biologiquement actifs. La portion STh des hybrides est affectée dans ses propriétés antigéniques lorsqu'elle est fusionnée à l'extrémité N-terminale de ClpG ou lorsqu'elle est soumise à un environnement défavorable à la formation de ses ponts disulfures. Ces derniers se sont révélés indispensables à l'activité entérotoxique, mais pas au passage des hybrides à travers la membrane externe des bactéries.
II - Mécanisme de sécrétion des hybrides.
1) Rôle des protéines DsbA et DsbB.
Pour une communication avec le réseau Internet, la quantité d'information est préalablement détectée au niveau du protocole applicatif, typiquement dans l'en-tête d'un paquet inclus dans un message dont la taille est sensiblement égale à la quantité d'information.
Le procédé d'allocation de canaux conforme à l'invention est mis en oeuvre dans une unité de commande d'un terminal notamment pour liaisons numériques avec un réseau de données public.
D'autres caractéristiques et avantages la présente invention apparaîtront plus clairement ' la lecture de la description suivante de plusieurs réalisations préférées de l'invention en référence aux dessins annexés correspondants dans lesquels - la figure 1 montre deux graphes de variation de coût de communication téléphonique en fonction de quantité d'information à transmettre respectivement selon l'invention et selon la technique antérieure ; - la figure 2 est un algorithme d'allocation de canaux de transmission selon l'invention ; et - la figure 3 est un bloc-diagramme fonctionnel schématique d'une unité de commande numérique mettant en oeuvre le procédé d'allocation de canaux selon l'invention dans un terminal.
L'invention repose sur une facturation une liaison de type communication téléphonique de départ, dite également communication sortante, dans un canal de transmission fondée sur un prix de base PB et un prix par unité de temps PU. Le prix de base PB comprend le coût de la connexion du canal au réseau téléphonique commuté, c'est-à-dire l'établissement de la liaison à travers ce canal, et un crédit-temps prédéterminé de communication CT. Le prix unitaire PU intervient après l'expiration du crédit-temps pour facturer la durée restante de la communication dans le canal. Par exemple, les valeurs PB, CT et PU sont les suivantes pour une communication téléphonique locale : PB = 0,74 FF pour au plus CT = 3 mn, et PU = 0,28 FF/mn pour une plage d'heures pleines de 8h à 19h et PU = 0,14 FF/mn pour une plage d'heures creuses. Les paramètres PB, CT et PU varient en fonction du numéro de l'appelé. Dans la suite, on se référera à une communication locale pour liaison d'un terminal d'usager à un travers un centre de commutation téléphonique, local a priori, donnant accès au réseau Internet.
A titre d'exemple, il est supposé qu'un terminal d'usager dispose comme ressource de transmission, d'une ligne de transmission avec un accès de base 2B + D d'un réseau numérique à intégration de services RNIS, et donc de N = 2 canaux de transmission Bl et B2 à 64 kbit/s (ou kbit/s), soit un débit par canal de DE = 8 koctet/s.
En référence au graphe de coût CC(X) en trait plein I relatif à l'invention dans la figure 1, le coût d'une communication établie sur un canal B1 pour transmettre une quantite d'information X exprimée ici en koctet, par exemple représentative de la taille d'un fichier à transmettre, est PB si la duree de la communication est inférieure au crédit-temps, soit pour X/DE CT.
Lorsque la communication est établie sur N = 2 canaux, le coût de celle ci est 2PB si X/(2DE) CT.
Selon l'invention, un premier seuil de quantité d'information SE1 est défini à l'intersection des droites d'équations CC = PB + PU(X/DE - CT) pour un canal, et CC = 2PB pour deux canaux, soit SE1 = DE(PB/PU + CT).
Typiquement, avec les tarifs en vigueur actuellement, le seuil SE1 est de 3 Moctets dans la plage des heures pleines HP et de 6 Moctets en tarif réduit pendant la plage des heures creuses HC, pour prendre un deuxième canal B2.
Dans la figure 1 est également representé un graphe en trait mixte TA indiquant la variation CC (X) selon la technique antérieure. La partie hachurée indique l'économie notable apportée par l'invention particulièrement lorsque la quantité d'information à transmettre est inférieure au premier seuil Par exemple, un fichier de X = 250 koctets est à transférer. Selon la technique antérieure, ce fichier est transmis d'abord dans un seul canal B1 pendant RE = 30 s, soit une quantité de RE.DE = 30.8 = 240 koctets. Il reste 250 - 240 = 10 koctets à transmettre dans les deux canaux B1 et B2 pendant 10/(2.8) seconde, c'est-à-dire pendant moins d'une seconde, ce qui engendre un coût de la communication CC égal à 2PB augmenté de la durée d'inertie à la libération de la ressource suite à un constat de faible trafic, correspondant à au moins à deux crédits-temps très peu utilisés. Selon l'invention, le premier canal B1 est seulement utilisé pendant une durée de 250/8 = 31,25 seconde qui est inférieure au crédit-temps CT et, une économie au moins d'un prix de base PB est ainsi acquise par rapport à la technique antérieure.
Selon le procédé de l'invention présentée ci- après, l'usager a le choix soit en privilégiant la rapidité de la communication par sélection systématique des canaux, comme dans le premier exemple, soit en privilégiant le coût de la communication comme dans le deuxième exemple.
L'objectif d'optimisation d'utilisation des ressources de l'invention repose sur la prise instantanée de ressource, dès qu'une quantité d'information à transmettre est connue, sans retard de décision RE pour occuper le deuxième canal B2 selon la technique antérieure, ainsi que sur la libération instantanée de ressource des que la quantité d'information est transmise. quantité d'information X est systématiquement connue a priori dans le contexte Internet avant le transfert de celle-ci, et est par exemple un courrier électronique à recevoir.
Selon la technique antérieure, la durée pour transférer un fichier de X koctets est égale à RE + (X - DE.RE) / (2DE) où RE désigne le retard induit par l'inertie de la décision, retard de 30 secondes dans des cas concrets rencontrés pour que terminal décide de requérir un deuxième canal réseau. Lorsque la quantité d'information X est supérieure à SE1 et la durée est inférieure à CT, ou en variante lorsque la quantité X doit être transmise le plus rapidement possible, l'invention requiert une durée de transmission de X/(2DE). La technique antérieure présente une durée de communication plus longue de RE + (X - DE.RE)/(2DE) - X/(2DE) = RE/2, soit 15 secondes. Par exemple, pour transférer un fichier de X = 3 Moctets, taille courante d'un fichier de musique MP3 équivalant à 3 minutes en qualité Compact Disque CD, l'invention nécessite une durée de transfert de X/(2DE) = 3000/(2.8) = 187,5 secondes, soit un gain de temps de 15/187,5 = 8% par rapport à la technique antérieure. Ainsi, comme montré à la figure 2, procédé de l'invention présentant principalement neuf étapes E1 à E9, comprend après une première étape initiale E1 pour acquérir une quantité d'information X à recevoir, une deuxième étape initiale E2 proposant un choix à l'usager selon qu'il souhaite ou non privilégier le débit de la communication départ.
I1 est supposé dans la figure 2 que la ressource mise à la disposition du terminal d'usager est de N canaux de transmission Bl à BN avec >_ 2. Par exemple, le terminal est une plate-forme de commutation privée PABX avec un accès primaire de N = 30 canaux B1 à B30 à 8 koctet/s.
Le choix entre débit et coût de communication à l'étape E2 ne se substitue pas à 'observation d'écoulement de trafic dans le centre commutation téléphonique local qui peut être dépendant d'effets d'engorgement de réseau ou de saturation de trafic. Ce choix s'ajoute en complément à l'observation de trafic pour anticiper au mieux la prise des canaux.
Si à l'étape E2, des économies de coût de communication sont choisies selon l'invention, l'une de plusieurs plages horaires est sélectionnée automatiquement en fonction de l'instant où la communication de départ est demandee à l'étape suivante E3. Par exemple, M = 2 plages horaires sont envisagées, une première plage pour les heures pleines HP et une deuxième plage pour les heures creuses HC.
Les mors de sertissage 42 et 43 présentent dans leur partie inférieure et à l'extrémité opposée à celle portant l'empreinte 49, une encoche 50 dirigée vers le bas.
En ce qui concerne le mors 42 dit mors mobile , l'encoche 50 coopère avec une lame à ressort 51 disposée à l'une des extrémités de la rainure 40 ménagée dans la paroi 37 de la cassette 3. En ce qui concerne le mors 43 dit mors fixe , ce dernier coopère avec une vis de réglage micrométrique 52 disposé dans la paroi 38 qui vient en contact avec l'extrémité dudit mors se trouvant à l'opposé de celle portant l'empreinte 49.
On remarque que les mors 42 et 43 formant l'outil de sertissage 4 de chaque cassette 3, sont de profil identique pour être disposés, soit dans la rainure 40, soit dans la rainure 41, sans pour autant changer le fonctionnement de la machine à sertir.
La vis micrométrique 52 permet de régler parfaitement la valeur désirée de sertissage du fil dans l'aiguille chirurgicale. Lorsque la valeur de sertissage pour un diamètre d'aiguille chirurgicale est obtenue, il suffit de bloquer la vis micrométrique 52 par l'intermédiaire de la vis de blocage 53.
La paroi 38 présente dans sa partie inférieure, et en dessous du fond 36, un talon 54 qui est prévu pour coopérer avec la rainure 30 du socle 24, lors du montage de la cassette 3 sur ce dernier.
Lorsque la cassette 3 réglée pour un diamètre d'aiguille chirurgicale est montée sur le socle 24, on constate que le poussoir 32 du dispositif de commande 31 se trouve en face du mors mobile 42 de l'outil de sertissage 4.
La cassette 3 est retenue sur le socle 24 par l'intermédiaire de la vis de serrage 34 qui coopère avec un trou fileté, non représenté, mais ménagé dans le fond 36. La vis de serrage 34 permet également la fixation du socle 24 au moyen du sabot 35 sur la traverse inclinée 7.
On comprend aisément de la description précédente le fonctionnement de la machine à sertir 1 qui consiste à avoir plusieurs cassettes 3 préréglées en fonction du diamètre de l'aiguille chirurgicale et de la force de sertissage recherchée.
Ainsi, lorsqu'une cassette 3 est montée et fixée sur le socle 24 des moyens de commande 5 de la machine 1, il est nécessaire de procéder aux réglages des mors 42, 43 et du guide-fil 48.
Le réglage du guide-fil 48 est obtenu à l'aide des vis de réglage 47 pour les déplacements verticaux, et de la vis 55 pour les déplacements horizontaux. La position du guide-fil 48 doit être ajustée en fonction de la toile de l'aiguille pour que l'empreinte 56 soit correctement placée par rapport au trou borgne ou chas de l'aiguille retenue dans l'empreinte 49 des mors 42 et 43.
Le réglage des outils 4 est obtenu par une série de tests consistant à sertir des fils de suture dans le chas ou le trou borgne des aiguilles chirurgicales, jusqu'à la valeur de sertissage désirée. L'opérateur présente à l'aide de sa main gauche une aiguille dont la pointe est tournée vers le haut, tandis que le chas ou trou borgne, est placé à l'intérieur des empreintes 49 des mors 42 et 43, et en appui contre le guide-fil 48.
L'opérateur présente à l'aide de sa main droite un fil de suture dans l'empreinte 56 du guide-fil 48 pour l'introduire dans le chas ou trou borgne de l'aiguille. L'introduction du fil de suture dans l'aiguille est améliorée en utilisant le dispositif de vision binoculaire 16 et d'une lampe flexible 57.
Lorsque le fil de suture est introduit dans l'aiguille chirurgicale, l'opérateur actionne les moyens de commande 5 par l'intermédiaire d'une pédale à pied qui agit, soit directement sur le dispositif de commande 31 et le poussoir 32, soit sur les moyens de pression 25 qui sont constitués, par exemple, d'un vérin pneumatique ou électrique.
Le poussoir 32 est déplacé en translation pour venir pousser le mors 42 qui, par l'intermédiaire de son empreinte 49 et celle du mors 43, permet la déformation des diamètres externe et interne de l'aiguille, pour effectuer le premier sertissage du fil de suture à l'intérieur du chas ou du trou borgne.
Le second sertissage est obtenu de la même manière que précédemment, mais après une rotation de 90 degrés de l'aiguille de façon à orienter sa pointe en direction de l'opérateur.
Lorsque le sertissage de l'aiguille est réalisé, il est nécessaire de contrôler sa valeur au moyen d'un appareil de test qui permet de réaliser des contrôles de dessertissage destructif et non-destructif.
L'état d'oxydoréduction de l'hybride ClpG-STh extracellulaire sécrété par les mutants dsbA' et dsbB hébergeant le plasmide pProSTC28 a été analysé à partir de surnageants de cultures liquides en phase stationnaire (figure 13A). Le traitement des surnageants avec le DTT et l'AMS (piste 1) permet de positionner la forme réduite de
l'hybride sur les immuno-empreintes. L'analyse du surnageant traité uniquement avec l'AMS (piste 2) montre clairement que l'hybride présent dans le milieu extracellulaire (piste 3) est oxydé puisqu'il ne se lie pas à l'AMS. Ces résultats sont en accord avec ceux relatifs à la toxicité des hybrides (Tableau 8). L'état d'oxydoréduction de la même protéine de fusion dans le compartiment intracellulaire des souches dsbA+ dsbB+ et dsbA- dsbB' a aussi été déterminé après avoir précipité au TCA 25 ml d'une culture fraîche prélevée à DO550nm = 0,5 (figure 13B) . Le témoin réduit (piste 2) correspond à une culture réalisée en présence de 5 mM de DTT. La migration sur gel de polyacrylamide des échantillons non chauffés exempts d'agents réducteurs indique que la protéine hybride se présente sous une forme réduite indépendamment de la mutation dsb (pistes 1 et 3). Toutes ces observations sont en défaveur de la formation des ponts disulfures dans le compartiment intracellulaire des cellules Dsb+ ou Dsb-, mais suggèrent que ceux-ci sont vraisemblablement créés au fur et à mesure de l'exportation des hybrides vers le milieu extracellulaire. Ceci expliquerait le pouvoir toxique des surnageants provenant des souches Dsb-et la non toxicité des lysats cellulaires provenant des souches Dsb+.
Afin de confirmer cette hypothèse, le fragment KpnI/BglII de pProSTC28 (figure 1) a été inséré entre les sites KpnI/BamHI du plasmide pTrc99A (Tableau 2). Ainsi, le gène de fusion porté par pProSTC28 a été placé sous le
contrôle du promoteur Ptrc inductible par l'IPTG. Le plasmide ainsi obtenu, pTrcProSTC28, a été introduit dans les souches dsbA+ (JCB570) et dsbA' (JCB571). Ces deux souches ont été cultivées en milieu LB liquide jusqu'à DO550 nm = 0,5. La culture est ensuite divisée en deux. Une moitié contient 2 mM d'IPTG pour permettre l'induction du promoteur Ptrc contrôlant la production de l'hybride.
L'autre moitié, sans IPTG, est utilisée comme témoin négatif d'expression et de sécrétion de l'hybride. Du surnageant de culture (25 ml) est récolté à différents temps. Deux millilitres ont été conservés pour tester leur entérotoxicité dans le test du souriceau nouveau-né. Le reste a été précipité au TCA et additionné d'AMS.
La figure 14 présente la maturation des protéines hybrides au cours de leur sécrétion par des souches dsb+ et dsb-. Les bactéries dsbA' (A) ou dsbA+ (B) contenant le plasmide pTrcProSTC28 sont cultivées en milieu liquide avec (+) ou sans (-) 2 mM d'IPTG. Un aliquot (2 ml) de surnageant est prélevé à différents temps pour analyser son activité entérotoxique (A,a et B, a). Chaque histogramme représente la moyenne des rapports I/C de 3 à 5 souriceaux.
Une réponse > 0,09 est considérée comme positive. A chaque temps et pour chaque condition, 25 ml de surnageant sont traités (+) ou non (-) avec 100 mM de DTT avant précipitaion au TCA (5% final). Le culot est repris dans un tampon contenant (+) ou non (-) 10 mM d'AMS. Après migration sur gel de polyacrylamide à 12% en conditions non
réductrices, les protéines sont révélées par Western immunomarquage avec l'anticorps anti-ClpG (A, b ; B, b etc) ou avec un mélange d'anticorps monoclonaux anti-Sta 11C + 20C1 (A,c). La figure B,b ne permettant pas de voir clairement les différents profils protéiques, une deuxième série d'expériences analogues a été réalisée uniquement pour les temps de croissance compris entre 90 et 115 minutes (B,c). Les immuno-empreintes sont visualisées par l'utilisation d'anticorps secondaires couplés à la biotine et de la streptavidine conjuguée à la péroxydase. Les étoiles (#) et (#) indiquent respectivement la forme réduite et la forme oxydée de l'hybride. Le rond (#) désigne probablement une autre forme oxydée de l'hybride.
Red signifie forme réduite et ox forme oxydée. Cox est le témoin d'oxydation correspondant à l'hybride extracellulaire produit par une souche dsb+ hébergeant le plasmide pEHProSTC18. O.n. signifie culture overnight .
Dans la souche JCB571, une bande située au niveau de la forme réduite et une autre située au niveau de la forme oxydée de la protéine hybride sont observées avec l'antisérum anti-ClpG dès 15 min de culture en présence d'IPTG (figure 14A, b, piste 1). Aucune bande n'est détectée sans induction par l'IPTG, même après 115 min de culture (figure 14A, b, piste 7). Seule la forme oxydée est révélée après traitement avec l'AMS d'une culture d'une nuit en présence d'IPTG (figure 14A, b, piste 9) et seules ces formes sont détectées par les anticorps monoclonaux
anti-ST 11C et 20C1 (figure 14A, c) comme cela a déj à été montré antérieurement (Figure 10B). L'hybride détecté après 15 à 20 min de culture en présence d'IPTG est toxique (figure 14A, a). Aucune activité toxique n'est décelée dans les surnageants des cultures non induites.
Dans la souche JCB570 (figure 14B), les formes réduites et oxydées de l'hybride apparaissent respectivement 15 min et 90 min après l'ajout de l'IPTG (figure 14B, b, piste 4 et c, piste 1). L'apparition de la forme oxydée, qui traduit la présence des ponts disulfures, est corrélée avec l'acquisition du pouvoir toxique du surnageant (figure 14B, a). La bande intermédiaire (figure 14B, b et c) pourrait correspondre à une deuxième forme oxydée de la protéine comme le laissent suggérer les doublets protéiques réagissant avec les anticorps anti-STa (figure 14A, c, piste 4) et l'absence de cette bande en présence de DTT et d'AMS (figure 14B, c, piste 3).
L'ensemble de ces résultats démontre que l'hybride passe à travers la membrane externe de la bactérie Dsb+ ou Dsb- sous forme réduite. Les ponts disulfures se forment alors progressivement au fur et à mesure de la sécrétion des hybrides réduits dans le milieu extracellulaire, probablement par l'action de l'oxygène de l'air, comme cela a été démontré précédemment (Figure 9).
Le système Dsb périplasmique n'est donc pas impliqué dans la formation des ponts disulfures de la portion STh des hybrides.
4) Réduction de l'insuline par la toxine STa. Les résultats rapportés précédemment désignent l'oxygène de l'air comme l'un des candidats possibles responsables de l'oxydation des hybrides ClpG-STh in vitro, et par conséquent de la formation des ponts disulfures dans le milieu extracellulaire. Cependant, la teneur en oxygène dans la lumière intestinale est faible. Il est donc concevable qu'un système plus efficace puisse intervenir in vivo pour oxyder les groupements thiols de la portion STh des hybrides à l'extérieur de la cellule bactérienne. La séquence peptidique de STh contient deux fois le motif CysX-X-Cys connu pour être un site actif caractéristique des protéines ayant une activité oxydoréductase impliquée dans les échanges thiols-ponts disulfures. La portion STh des hybrides pourrait donc être capable d'échanger des ponts disulfures avec d'autres protéines. Cette hypothèse a été vérifiée en testant la capacité de la STh libre ou couplée à ClpG à catalyser in vitro la réduction des ponts disulfures de l'insuline par le DTT. La figure 15 représente la réduction de l'insuline catalysée par différentes protéines en présence de DTT.
Les surnageants sont obtenus à partir de cultures sur milieu solide en phase stationnaire. La souche JCB818 (pTrcSTN24) a été cultivée en présence (+) ou en absence (-) de 2 mM d'IPTG.
Un lien peut être construit en exploitant uniquement les liens de composition, nous les appellerons liens de base . La figure 173 en montre un exemple. Sur cette figure, le chemin menant de D à C est formé à partir des liens de composition D B, B~A et A~C. Un tel chemin (définissant un lien de base) est porté par l'objet au sein d'une variable structurée que nous appellerons port .