INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
En outre, afin d'être le plus proche possible de la situation in vivo, il est nécessaire de disposer de cellules provenant de divers endothélia capillaires, représentatifs des lieux où les tissus subissent l'invasion des cellules inflammatoires, lymphoïdes et autres cellules circulantes normales ou malignes. Le procédé selon l'invention est remarquable en ce qu'il permet précisément de préparer des lignées immortalisées de cellules endothéliales humaines de tissus et organes humains très divers. De plus, ce procédé offre l'avantage de pouvoir préparer des quantités suffisantes de lignées cellulaires immortalisées stables dans leurs caractères physiologiques de manière à réaliser des expériences reproductibles.
De nombreux travaux ont été réalisés dans l'art antérieur pour obtenir des lignées de cellules endothéliales qui soient stables et proches de la situation in vivo. Ces lignées sont, pour la plupart, des lignées obtenues par transformation spontanée (8), après activation (9). Mais on a également décrit dans
l'art antérieur des lignées cellulaires immortalisées par transfection avec un plasmide contenant un fragment immortalisant d'un oncogène viral, comme l' oncogène T de SV40, avantageusement associé à un gène de sélection, comme le gène néo de résistance à la néomycine. Ainsi, la demande de brevet internationale PCT publiée sous le numéro WO 97/40139 décrit des lignées immortalisées de cellules rétiniennes, et la demande de brevet internationale PCT publiée sous le numéro WO 93/06222 décrit des lignées de cellules endothéliales cérébrales immortalisées. Mais ces travaux ne concernent pas des lignées cellulaires endothéliales immortalisées humaines, qui seules permettent de se rapprocher de la situation de l'endothélium humain in vivo.
La présente invention concerne donc des lignées immortalisées de cellules endothéliales de mammifère caractérisées en ce qu'elles comprennent un premier acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire avantageusement associé à au moins un gène de sélection, et un second acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire différent du premier avantageusement associé à au moins un gène de sélection.
Des lignées immortalisées de cellules endothéliales de mammifère préférées selon l'invention sont caractérisées en ce que le premier acide nucléique contient un fragment immortalisant de l'oncogène T de SV40, avantageusement associé à un gène de sélection, et le second acide nucléique contient un fragment immortalisant de l'oncogène ras, avantageusement associé à un gène de sélection.
Les gènes de sélection sont par exemple, le gène de résistance à la génétycine ou le gène de résistance à l'hygromycine.
Les lignées immortalisées de cellules endothéliales selon l'invention dérivent de culture primaire de cellules de veinules post capillaires de tissus lymphoïdes, de capillaires de tissus non lymphoïdes et de vaisseaux. Les lignées humaines sont de préférences établies à partir de tissus inflammés ou provenant de sujets atteints de cancer. Les lignées suivantes conformes à l'invention ont été obtenues et caractérisées : - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HPLNEC. B3, provenant de ganglions cervicaux, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 17 Décembre 1998 sous le No. 1-2102, - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HPLNEC.S1R1, provenant de ganglions inguinaux déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 22 Juin 1999 sous le No. 1-2104, - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HPLNEC. J6B, provenant de ganglions périphériques (cancer ovarien) déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Microorganismes tenue par l'Institut Pasteur le 17 Décembre 1998 sous le No. 1-2103, - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HPLNEC. Mel, provenant de ganglions mésentériques (patient porteur d'un mélanome), déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de
Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 17 Décembre 1998 sous le No. 1-2101, - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HAPEC-S1, provenant d'un appendice inflammé, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l' Institut Pasteur le 22 Juin 1999 sous le No. 1-2100, - lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HLMEC, provenant d'un tissu pulmonaire inflammé, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 22 Juin 1999 1998 sous le No.
1-2241.
- lignée de cellules endothéliales humaines immortalisées, dénommées HSKMEC.1, provenant de la peau, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 16 Juillet 1999 sous le No. 1-2250, lignée de cellules de cerveau humain immortalisées, dénommées HPLNEC. B3, provenant d'un patient porteur d'un glioblastome, déposée auprès de la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes tenue par l'Institut Pasteur le 16 Juillet 1999 sous le No. 1-2249.
Mais l'invention concerne des lignées de cellules endothéliales immortalisées de tout tissu humain ou animal, permettant de disposer d'outils représentatifs d'organes très différents (poumon, peau, intestin, cerveau, utérus, foie, rate, etc...) rendant possibles des comparaisons entre tissus et mammifères différents.
Les travaux de recherche réalisés par les inventeurs chez la souris ont permis de comprendre
Les exemples 5 et 6 concernent notamment l'utilisation des dendrimères b ou c comme supports solubles en synthèse organique selon le schéma de la figure 10.
Les conditions réactionnelles du schéma indiqué à la figure 10 sont résumées ci-après.
Par formation de liaison ester, on lie aux dendrimères, possédant six ou neuf fonctions terminales, les acides ortho ou para iodobenzoïques, avec un excès de réactifs (Acides, DCC). A la fin de la réaction, on concentre simplement le DMF, on resolubilise dans le minimum de dichlorométhane et on passe la solution sur cartouches de Sephadex LH-20 elle-même gonflée dans le dichlorométhane. La couleur rouge vif du dendrimère permet de suivre la purification à travers la cartouche, on limite ainsi l'utilisation du solvant. Cette purification ne dure qu'une vingtaine de minutes, une fois la cartouche conditionnée.
On peut ensuite continuer la synthèse avec les dendrimères purifiés. Suivant la réaction modèle de Suzuki, on utilise deux acides boroniques, dans les conditions classiques de cette réaction, mais avec également un excès de réactifs. Après réaction, une étape d'extraction permet d'éliminer le catalyseur et les sels. On procède ensuite de la même façon pour la purification en passant une solution dans CH2Cl2/MeOH sur les cartouches où le gel est gonflé dans le même solvant.
Après le clivage du dendrimère et de l'acide final, on procède à la séparation du dendrimère de l'acide formé selon diverses conditions réactionnelles par exemple à l'aide de résines basiques telles que PTBD et Amberlyst A-26. On peut noter que le dendrimère à 9 fonctions alcool terminales étant peu soluble dans le CH2C12 (le dendrimère à 6 fonctions terminales y est soluble), on peut également simplement procéder à la salification de l'acide en milieu basique, puis à l'extraction par CH2C12. Le dendrimère, se trouvant à l'interface ou en solution organique est facilement éliminé par filtration. La phase aqueuse est alors acidifiée et on extrait l'acide avec de l'acétate d'éthyle.
La présente invention concerne également l'utilisation des produits de formule (P-Y) telle que définie ci-dessus à titre de dendrimères colorés comme supports solubles en synthèse organique.
Ainsi on peut noter que lors d'une telle utilisation des produits de formule (P-Y) tels que définis ci-dessus comme supports solubles en synthèse organique, on préfère les produits de formule (P-Y) de la présente invention dans lesquels Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent un résidu obtenu après réaction avec un Linker tel que défini ci-dessus.
En effet, un tel Linker est d'une part lié au dendrimère et d'autre part sert d'ancrage à la molécule synthétisée lors de la synthèse organique pour laquelle le dendrimère sert de support soluble. De cette structure, il résulte que la coupure permettant de libérer du dendrimère la molécule synthétisée lors de la synthèse organique se fait plus facilement que le linker est lié plus solidement au reste de dendrimère et ainsi notamment lorsque le linker étant solidement lié au reste de dendrimère par une liaison covalente : notamment dans les produits de la présente invention, le Linker est lié au dendrimère par une réaction d'amidification ou par une réaction d'éthérification.
A titre d'exemples on indique ci-après deux schémas selon lesquels respectivement les Linker Ll tel que défini cidessus et L2', qui correspond à L2 dans lequel la fonction hydroxyle-OH est protégée en-OAc, s'accrochent à un dendrimère D de formule (P-Y) telle que définie ci-dessus dans lequel Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent respectivement NH2 ou OH pour donner un autre dendrimère de formule (P-Y) selon la présente invention dans lequel Y1, Y2, Y3 et Y4 représentent un résidu obtenu après réaction avec un linker Ll ou L2' tels que définis ci-dessus.
D-NH2 + HO-CO-CH2-0-phényl-CH20H (Ll)-> D-NH-CO-CH2-phényl-CH20H D-OH + HO-phényl-CH20Ac(L2) # D-O-phényl-CH20Ac La présente invention concerne tout particulièrement l'utilisation des dendrimères a, b, c et d tels que définis ci-dessus à titre de dendrimères colorés comme supports solubles en synthèse organique.
Lors de l'utilisation d'un dendrimère pour la synthèse de molécules, on peut noter tout particulièrement l'effica-
cité de purification des réactions par chromatographie d'exclusion stérique. Cette méthode de purification est efficace notamment en ce qu'elle permet de se dispenser d'extractions dans beaucoup de réactions, le temps de purification est très court (environ 20 min), les quantités de solvant sont faibles et l'automatisation par détecteur UV est inutile.
La synthèse de molécules en solution réalisée par l'utilisation de dendrimères comme supports solubles est donc une technique complétant toutes celles déjà utilisées en chimie combinatoire.
Dans le cadre de la présente invention, on a trouvé qu'en augmentant la longueur de la chaîne et en insérant des fonctions éther, moins réactives, plutôt que des fonctions amides, le dendrimère peut être utilisé dans de plus larges conditions et être soluble dans les solvants ordinaires.
L'encombrement est alors moins important, ce qui permet d'obtenir des réactions plus complètes au niveau de l'accrochage du linker 14. On peut encore noter qu'il convient d'éviter d'utiliser les dendrimères dans des conditions qui pourraient altérer ces dendrimères tels que certains réactifs attaquant le groupement nitro ou des conditions basiques trop fortes.
La présente invention concerne donc tout particulièrement des dendrimères de formule P-Y tels que définis cidessus dans lesquels les chaînes qui constituent le dendrimère sont d'une longueur telle que ni représente notamment 2 ou 3 mais également 3 ou 4 ou encore 5 ou 6 et n2 représente notamment 0 ou 1 mais également 2 ou 3.
Les capteurs 15 et 16 de CO/COV et de H20 sont disposés sous un capot. permettant un balayage en alternance, soit directement par l'air ambiant, soit après passage à travers la cartouche 12.
La cartouche 12 de rétention sélective des composés organiques volatils peut être réalisée en utilisant du permanganate de potassium.
Les aldéhydes, cétones, alcools en effet, réagissent avec le permanganate de potass' et sont arrêtés, par oxydation, d'une manière quantitative ; les composés benzéniques sont retenus, a priori, par adsorption ; Le débit d'air à épurer doit être faible de manière à assurer un temps de contact suffisant pour un piégeage complet, dans la pratique, débit de 0,3 1/min et une cartouche de 200 mm sont utilisables. Un débit inférieur permet réduire la dimension de la cartouche sans affecter autonomie. De l'oxyde d'aluminium activé (alumine A1203) en billes microporeuses de 2 mm à 5 de diamètre, est utilisé comme support du composé actif constitué de permanganate de potassium (KMn04). Pour obtenir une préparation pour 100 g, réalise très simplement l'imprégnation par immersion de 100 g d'alumine dans une solution aqueuse acidifiée (H2SO4 10-2N) à 60 g/1 de permanganate de potassium. Après essorage, les billes d'alumine sont séchées à 60-70 C pendant 4 h environ et conservées à l'abri de 1 air, ce traitement permet d'obtenir une alumine renfermant 5% en masse de KMn04. 100 g de cette préparation permettent de remplir 6 cartouches de 200 mm/diamètre 20 mm.
La pompe 17 peut être une pompe à membrane de type WISA utilisée dans des analyseurs de gaz, séparée des capteurs pour raisons d'encombrement ; mais ce peut également être une pompe de plus petite dimension pouvant être aisément disposée dans le boîtier de mesure.
La durée du cycle du signal de commande de l'électrovanne 13, fourni par le séquenceur 14, peut être choisie entre 30 secondes et trois heures, par exemple 5 minutes.
Le circuit 18 de traitement des signaux de sortie délivrés par les capteurs 15, 16, 20, 21 est réalisé à l'aide d'une centrale d'acquisition AOIP 70 I voies couplées à un ordinateur de type PC ; le traitement mathématique des signaux étant effectué à l'aide d'un logiciel de EXCEL. I1 est également possible d'utiliser des microprocesseurs intégrés au dispositif de l'invention.
Dans cet exemple de réalisation, on a effectué les mesures suivantes.
Mesure du dioxyde d'azote (N02) La mesure est effectuée par exposition du capteur 20 de N02 au flux 'air échantillonné.
Comme illustré la figure 2 le capteur 20 offre une réponse au dioxyde d'azote dans un domaine de concentration relativement étroit (0 à 200 ppb), mais adapté aux niveaux rencontrés dans les locaux considérés, avec une assez bonne sélectivité qui permet une exploitation directe du signal.
L'incidence du sur la mesure du N02, effective pour des rapports de concentrations CO/NO2 élevés (supérieurs à ) a pu être négligée sans induire d'erreurs importantes.
Mesure de l'humidité (H20 La mesure de est effectuée grâce au capteur 16 qui offre une bonne sensibilité et une bonne sélectivité à l'eau ; sa réponse est liée à la teneur pondérale en eau (exprimée en masse/m3 ou en ppm), et non à l'humidité relative de l'air. Le C0, le C02, les NOx et les COV sont sans influence sur la mesure dans les domaines concernés par 1 air ambiant.
La réponse de ce capteur 16, illustrée sur figure 3, est utilisée à la fois pour la mesure de la teneur en eau mais également pour corriger l'influence de cette dernière sur la réponse au et aux COV du capteur 15.
Mesures associées du C0, de H20 et des COV Les teneurs en C0, H20 et COV sont mesurées à l'aide des deux capteurs 15 et 16.
L'évaluation des teneurs en CO et en Composés Organiques Volatils (COV) est effectuée à 1 aide du capteur 15 multipolluants qui offre une bonne sensibilité aux COV mais nécessite une correction de 1 influence de la teneur en eau effectuée grâce au second capteur 16 spécifique de l'eau.
A l'intérieur des locaux, les COV sont présents à de très faibles concentrations en regard des teneurs en composés potentiellement interférants tels CO ou H20 qui rendent très aléatoires les corrections par voie purement mathématique. Cette fficulté est contournée en réalisant un piégeage sélectif des COV à l'aide de la cartouche 12, en amont du capteur 15, et en admettant en alternance ce capteur 15 de l'air épuré et de l'air à analyser. Les interférants majeurs ne sont pas arrêtés la différence des signaux permeé d'accéder avec une bonne sensibilité à la teneur en COV. Les domaines concernés sont les suivants . H20 : 5000 à 25000 ppm CO : 0 à 25 ppm COV totaux : quelques dizaines de ppb ' 1 ppm. En opérant par différences calculées sur les signaux stabilisés au cours de chaque séquence, il est possible d'accéder à la concentration composé masqué tout en s'affranchissant des teneurs composés interférants ainsi que des dérives de zéro du capteur.
Les deux capteurs associés 15 et 16 permettent donc, selon la période d'échantillonnage du signal, d'accéder aux trois paramètres suivants avec une bonne précision - la teneur en eau de l'air ambiant, - la teneur en CO de l'air ambiant sur un échantillon débarrassé des COV, - la teneur en COV, en opérant par différence des signaux.
Enfin, la cytométrie donne un moyen de quantification rapide et surtout statistique de la reconnaissance cellule-cellule car elle permet une mesure efficace du nombre de cellules circulantes ayant adhéré par cellule endothéliale.
L'invention concerne encore les procédés de criblage de substances capables de traiter et/ou prévenir des maladies impliquant des phénomènes d'adhérence intercellulaire, tels que les cancers, les inflammation ou les infections virales, consistant à mettre en contact lesdites substances avec une ou plusieurs lignées selon l'invention et à mesurer et/ou observer par tout moyen approprié les effets de ces substances sur le comportement et/ou les propriétés des dites lignées.
L'invention se rapporte donc à un kit pour l'étude de l'adhérence intercellulaire comme les phénomènes invasifs cités ci-dessus, caractérisé en ce
qu'il comprend des compartiments contenant au moins une lignée cellulaire endothéliale selon l'invention, ainsi que les réactifs adéquats, comme les milieux marqueurs et fixateurs utiles pour les comptages ultérieurs.
L'invention concerne enfin l'utilisation d'une substance influant l'adhérence et donc le recrutement cellulaire identifié avec le modèle ou le kit de l'invention ou encore selon le procédé de criblage selon l'invention, pour la fabrication d'un médicament destiné au traitement et/ou à la prévention des maladies impliquant des phénomènes d'adhérence intercellulaire, tels que les cancers, les inflammations ou les infections virales.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans la description qui suit concernant des exemples de préparation et d'utilisation des lignées de cellules endothéliales immortalisées de l'invention et qui se réfèrent aux dessins en annexe dans lesquels : La figure 1 représente la détection du facteur de von Willebrand dans des lignées de cellules endothéliales par cytométrie de flux. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 30 minutes à 37 C avec des anticorps polyclonaux de lapin anti-facteur de von Willebrand humain. La liaison par incubation est détectée en présence d'anticorps de chèvre anti-immunoglobuline de lapin marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC).
Des histogrammes témoins sont obtenus en utilisant du sérum de lapin non immun dans la première étape. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément.
La figure 2 montre la détection de la production d'enzyme de conversion de l'angiotensine
(ACE) dans des lignées de cellules endothéliales immortalisées. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 30 minutes à 37 C (a) soit en présence d'anticorps polyclonaux de chèvre anti-enzyme de conversion de l'angiotensine pulmonaire de lapin, soit, pour obtenir des histogrammes témoins en présence de sérum de chèvre non immun inactivé ; (b) après fixation, la liaison est détectée par une deuxième incubation en présence d'anticorps de lapin antiimmunoglobuline de chèvre marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément.
La figure 3 représente la détection de la sélectine E intracellulaire dans des lignées de cellules endothéliales immortalisées. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 1 heure à 37 C (a) soit en présence d'anticorps de rat antiCD62 E (IgG2a de rat), soit, à titre de témoins isotypiques, en présence d'IgG2a de rat ; (b) la liaison est détectée par une deuxième incubation pendant 30 minutes à 4 C en présence d'anticorps de chèvre antiimmunoglobuline de rat marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément.
La figure 4 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène CD34. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de souris antiCD34 ou d'IgGl en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de rat anti-immunoglobuline de souris marqué au FITC. Les
données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément.
La figure 5 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène CDl5s sialyl-Lewis X. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de souris anti-CD15s ou d'IgGl en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de rat anti-immunoglobuline de souris marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément.
La figure 6 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène PNAd.JGl. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de rat anti-PNAd ou d'IgGl en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de souris anti-immunoglobuline de rat marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément.
La figure 7 représente des cellules endothéliales typant pour l'expression en surface de l'antigène MECA 79- GlyCAM-1. Les cellules endothéliales recueillies sont fixées et perméabilisées avec de la collagénase puis marquées par incubation pendant 45 minutes à 37 C en présence (1) d'anticorps monoclonal de rat anti-MECA 79 ou d'IgM de rat en tant que témoin isotypique puis, après fixation, la liaison
est détectée par une incubation de 30 minutes à 4 C en présence (2) d'anticorps de souris anti-immunoglobuline de rat marqué au FITC. Les données sont des histogrammes représentatifs typiques issus de trois expériences réalisées séparément.
On procède comme au stade 1 ci-dessus en utilisant le produit 17 obtenu au stade 2 ci-dessus à la place du produit 9. On obtient ainsi le produit attendu sous forme de cristaux rouges (Rdt = 71 %) Analyses : CCM : Rf = 0,43 dans CH2Cl2/MeOH = 9:1 IR : dans CHC13 Absorption NH/OH 1638 et 1682 cm-1 Absorptions C=O 1518 et 1590 cm-1 Bande Amide II + Absorptions du noyau aromatique + Absorption N02 Stade 4 : produit 13 On procède à la déprotection des groupements Boc du Produit 12 obtenu au stade 3 ci-dessus en procédant comme au stade 4 de l'exemple 1 pour obtenir le produit 7. On utilise 160 eq HCl (Rdt = Q). On obtient ainsi le produit attendu sous forme d cristaux violets.
Stade 5 : produit 15
On procède comme au stade 12 de l'exemple 1 à partir du produit 13 obtenu au stade 4 ci-dessus.
On obtient ainsi le produit attendu sous forme de cristaux rouges (Rdt = 64 %).
Analyses : CCM : Rf = 0,51 dans CH2Cl2/MeOH = 9:1 IR : dans CHC13 3436 cm-1 Absorption NH associé 1651,1674 et 1735 cm-1 Absorptions C=O 1514,1536 et 1595 cm-1 Bande Amide II + Absorptions du noyau aromatique + Absorption N02 Stade 6 : dendrimère a On procède comme au stade 13 de l'exemple 1 à partir du produit 15 obtenu au stade 5 ci-dessus. On obtient ainsi le produit attendu.