INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'homme du métier peut avantageusement se référer aux méthodes de production et d'utilisation de polynucléotides antisens inhibant ou bloquant l'expression de gènes associés au développement de cancers, telles que les techniques décrites dans le brevet US N05, 582,986 qui divulgue des oligonucléotides antisens pour l'inhibition du gène ras, la technique décrite par HOLT et al. (1988) qui décrit des oligonucléotides antisens s'hybridant spécifiquement avec les ARNs messagers l'oncogène c-myb ou encore la technique décrite par WICKSTRON et al. (1988) qui décrit des oligonucléotides antisens hybridant spécifiquement avec l'ARN messager du gène c-myc.
D'autres techniques d'utilisation de polynucléotides antisens utilisables par l'homme du métier sont celles de SALE et al. (1995) ainsi que celle de GAO et al. (1996).
PROCEDE DE SELECTION D'UN COMPOSE ANTAGONISTE DE LA PROTEINE ESM-1 Un composé antagoniste de la protéine ESM-1 selon l'invention peut être sélectionné par l'homme du métier pour sa capacité à inhiber le développement d'une tumeur induite par la protéine ESM-1 in vivo.
non limitatif en référence aux dessins annexés sur lesquels: - La Figure 1 représente une vue en coupe d'un dispositif de signalisation pour véhicule automobile, incorporant un dispositif de retour latéral dans une première application de la présente invention; - La Figure 2 représente une vue schématique en coupe du dispositif de retour latéral de la Figure 1; - La Figure 3 représente une vue schématique en perspective du dispositif de la Figure 1 - La Figure 4 représente une vue en perspective du dispositif de la Figure 3, en place dans un véhicule automobile; - La Figure 5 représente une vue analogue à celle de la Figure 2 d'un deuxième mode de réalisation; - La Figure 6 représente une vue schématique d'une variante de réalisation du dispositif de la Figure 2; - La Figure 7 représente une vue schématique de la variante de la Figure 6 appliquée au mode de réalisation de la Figure 5; - La Figure 8 représente une variante de réalisation du dispositif de la Figure 1
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- La Figure 9 représente une vue en coupe schématique du dispositif de la présente inven-
tion dans une deuxième application, et
- La Figure 10 représente une variante de réalisation du dispositif de la Figure 9.
On a représenté sur la Figure 1, selon un plan de coupe, le retour latéral d'un dispositif de signalisation pour véhicule automobile, tel que décrit dans le document FR-B-2 732 932 précité. Ce retour latéral, désigné dans son ensemble par la référence 10, comprend une glace 12 et une partie de socle ou de boîtier 14. Un tel dispositif de signalisation est fixé sur une
carrosserie d'automobile 16, de manière à ce que la surface de la glace 12 et celle de la carros-
serie 16 soient situées aussi bien que possible dans le prolongement l'une de l'autre. Les
moyens de fixation 18 du retour latéral du dispositif de signalisation sont décrits dans le do-
cument FR-B-2 732 932 précité, et ne font pas partie de la présente invention.
On conçoit donc bien que l'aménagement d'un feu de rappel latéral dans la zone com-
prise entre la glace 12 et le boîtier 14 pourra poser de nombreux problèmes d'implantation pour éviter toute interférence avec la glace 12, le boîtier 14, la carrosserie 16 et les moyens de
fixation 18.
Conformément à la présente invention, ces problèmes sont résolus grâce à un dispositif de signalisation de conception nouvelle, ce dispositif ayant une épaisseur faible en regard de
sa longueur et de sa hauteur.
La présente invention a pour objet une méthode d'induction, de stimulation ou d'augmentation d'une réponse immunitaire cellulaire cytotoxique chez un mammifère. Plus particulièrement, l'invention concerne la préparation d'une composition de vaccin thérapeutique permettant de lutter contre des cellules malignes ou des cellules infectées par des agents pathogène ou infectieux.
La Demanderesse a développé son expertise dans la préparation de vecteurs particulaires synthétiques, désignés aussi ci-après"BVSM*".
Un premier type de BVSM, et son procédé de préparation, ont été décrits dans le brevet européen No. 344 040. Il s'agit de particules comprenant de l'intérieur vers l'extérieur : un noyau central hydrophile non liquide constitué d'une matrice de polysaccharides ou d'oligosaccharides naturellement ou chimiquement réticulés, pouvant être modifiés par des groupements ioniques divers ; - une couche d'acides gras greffés par des liaisons covalentes au noyau une ou plusieurs couches lipidiques constituées notamment de phospholipides.
Les développements de cette première génération de BVSM ont conduit la Demanderesse à concevoir et préparer
de nouveaux types, aux propriétés améliorées notamment en fonction des principes actifs transportés.
Le savoir-faire dont dispose aujourd'hui la Demanderesse sur la préparation des BVSM lui permet de disposer d'une gamme étendue de ces vecteurs.
Des BVSM sont formés d'un polymère hydrophile réticulé, préférentiellement des polysaccharides, sous forme de gel nanoparticulaire, ces BVSM sont dits de type PSC (ou NPS en français).
Acta (1997), 1327,32-40). Ceci permet de travailler les
molécules biologiques, particulièrement fragiles, dans des conditions optimales.
Les BVSM protègent les molécules biologiques de la dégradation (Prieur R. et al. Vaccine (1996) Vol 14, ? 6 pp. 511-520 Combination of HCMV recombinant IE1 protein with 80 nm cationic biovectors : protection from proteolysis and potentiation of présentation to CD4+ T-cell clones in vitro).
Il a aussi été montré que les BVSM augmentent l'activité biologique de peptides et de protéines comme des enzymes, des antigènes, etc....
Les BVSM sont connus pour être utilisés comme transporteurs de substances actives, par exemple peptides, antigènes ou oligonucléotides. Dans cette utilisation, il y a formation d'un réel complexe entre le BVSM et la substance active, comme des interactions ioniques entre le noyau cationique du BVSM et l'oligonucléotide anionique. Il y a donc formation d'un conjugué ionique stable dans un milieu biologique. Dans ce type de préparation, le rapport substance active/BVSM est de 5 à 10 % et le rendement d'association mesuré est supérieur à 90 %.
Selon un premier aspect, un procédé de sélection d'un composé antagoniste de la protéine ESM-1 comprend les étapes suivantes : a) injecter à un animal des cellules capables de former des tumeurs en présence de la protéine ESM-1, lesdites cellules étant transfectées ou transformées par un acide nucléique capable d'exprimer la protéine ESM-1 in vivo ; b) administrer à cet animal un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1 ; c) comparer la formation de tumeurs chez un premier animal tel qu'obtenu à la fin de l'étape b) et chez un second animal tel qu'obtenu à la fin de l'étape a) ; et d) sélectionner le composé candidat capable d'inhiber ou de bloquer la formation de tumeurs chez le premier animal.
De préférence, l'animal mis en oeuvre dans le procédé de sélection ci-dessus est un mammifère non humain, avantageusement un rongeur, et de manière tout à fait préférée un rat, un cobaye, un cochon diode ou une souris.
Avantageusement, la lignée cellulaire capable de former des tumeurs chez l'animal en présence de la protéine ESM-1 est la lignée HEK 293 (ATCC NOCRL 1573).
Selon un autre aspect, un composé antagoniste de la protéine ESM-1 selon l'invention peut être sélectionné selon un procédé permettant de mettre en évidence la fixation d'un composé candidat sur la protéine ESM-1. Un tel procédé de sélection d'un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1 comprend les étapes suivantes : a) fournir un polypeptide consistant en la protéine ESM-1 ou un fragment peptidique de cette protéine ;
b) mettre en contact ledit polypeptide avec le composé candidat à tester ; c) détecter les complexes formés entre ledit polypeptide et le composé candidat ; d) sélectionner les composés candidats se fixant sur le polypeptide constitué de la protéine ESM-1 ou d'un fragment de cette protéine.
Par fragment de la protéine ESM-1, on entend un polypeptide comprenant au moins 20, de préférence au moins 30,35, 40,50, 55,60, 65,70, 75, 80,85, 90,95, 100, 110, 120, 130,140 ou 150 acides aminés consécutifs du polypeptide ESM-1 de séquence SEQ ID N 1 et comprenant la séquence allant du résidu proline en position 133 jusqu'au résidu valine en position 138 de la SEQ ID ? 1.
L'invention est également relative à une trousse ou kit pour la sélection d'un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1, cette trousse ou kit comprenant : a) une préparation purifiée d'un polypeptide constitué de la protéine ESM-1 ou d'un fragment de cette protéine ; b) le cas échéant, des moyens de détection d'un complexe formé entre le polypeptide et le composé candidat à tester.
Le procédé de détection d'un complexe formé entre le polypeptide dérivé de la protéine ESM-1 et le composé candidat peut-être réalisé par diverses techniques, telles que par microdialyse couplée à une méthode HPLC comme décrit par WANG et al. (1997) ou l'électrophorèse capillaire d'affinité comme décrit par BOUSH et al. (1997).
Un composé candidat peut être de toute nature, et notamment le produit final d'un procédé de chimie combinatoire.
A. COMPOSES CANDIDATS OBTENUS A PARTIR DE BANQUES DE PEPTIDES Un composé candidat antagoniste de la protéine ESM-1 peut être sélectionné selon le procédé ci-dessus en tant que produit d'expression d'un insert d'ADN contenu dans un vecteur de phage selon la technique décrite par PARMLEY & SMITH (1988). Dans ce type de banques
peptidiques, les inserts d'ADN codent pour des peptides de 8 à 20 acides aminés de longueur, comme cela est décrit par OLDENBURG KR et al.
(1992), VALADON P et al. (1996), LUCAS AH (1994), WESTERINK (1995), FELICI et al. (1991).
Selon ce mode de réalisation particulier, les phages recombinants exprimant une protéine capable de se fixer sur le polypeptide constitué de la protéine ESM-1 ou un fragment de celle-ci est retenu et le complexe formé entre la protéine ESM-1 ou un fragment de celle-ci et le phage recombinant peut être ultérieurement immunoprécipité par un anticorps monoclonal ou polyclonal anti-ESM-1.
B. COMPOSE CANDIDA OBTENU PAR DES EXPERIENCES DE COMPETITION Les composés candidats antagonistes de la protéine ESM-1 peuvent être également sélectionnés en ce qu'ils se fixent sur la protéine ESM-1, ou sur un fragment polypeptidique de celle-ci, en compétition avec un composé antagoniste de la protéine ESM-1 sélectionné antérieurement tels que l'un des anticorps anti-ESM-1 décrits ci-dessus, et tout particulièrement l'anticorps monoclonal sécrété par la lignée d'hybridome MEP08 déposée le 19 Novembre 1997 auprès de la CNCM sous le no d'accès 1-1941.
De telles expériences de compétition sont par exemple décrites dans l'article de BECHARD et al. (2000).
C. COMPOSES CANDIDATS ANTAGONISTES DE LA PROTEINE ESM-1 SELECTIONNES PAR CHROMATOGRAPHIE D'AFFINITE.
1. 3-Plasmides Les clones moléculaires du VIH-1 utilisés dans la méthode d'analyse dérivent de pNL4-3.
Le plasmide délété en transcriptase inverse est construit par une modification du pNL4-3xcAenv muté pour porter des sites de restriction SnaBI uniques dans la position 3872 et de Nru I dans la position 3892.
Les enzymes Ba I et SnaB I sont utilisées pour retirer la région codant pour la transcriptase inverse (entre les positions 2618 et 2872) et la linéarisation du plasmide résultant pSRT est effectuée au moyen de l'enzyme Nu 1. L'expression de la glycoprotéine d'enveloppe VSV-G dans les cellules transfectées est assuré par le plasmide pVSV qui contient la séquence codante vsv-g sous le contrôle d'un promoteur CMV.
1. 4-Cultures cellulaires.
Des cellules HeLa, 293 T et P4 sont cultivées dans du milieu DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (SVF), 50 UI/ml de pénicilline et 50 g/ml de streptomycine. Les cellules P4 son des cellules Hela-CD4, LTR-LacZ dans lesquelles l'expression de la betagalactosidase est strictement inductible par la protéine Tat transactivateur du VIH, permettant par conséquent, une quantification précise de l'infectivité ou de la
capacité réplicative des virus VIH-I basée sur un cycle unique de réplication (Charneau, P., Mirambeau, G., Roux, P., Paulous, S., Buc, H. and Clavel, F. (1994) HIV-1 reverse transcription. A termination step at the center of the genome". J Mol Biol 241 (5), 651-62. ). Les cellules P4 sont cultivées en présence de 500 yg/ml de geneticine.
II. -Détermination de la susceptibilité d'un virus VIH à un inhibiteur de Transcription inverse.
(RTI).
La détermination de la susceptibilité d'un virus VIH à un inhibiteur de transcriptase inverse est effectuée de la manière suivante : des cellules 293 T sont transfectées avec 7,5 Mg de plasmide pSRT linéarisé par NruI, 0,1 Mg du plasmide pVSV-G et 0,5 et 1 Mg du produit issu de la réaction PCR de la transcription inverse de VIH. Le précipité de transfection est retiré des cellules après 18 heures d'incubation et du milieu de croissance frais est ajouté. Après 24 heures de culture, le surnageant est clarifié par centrifugation (500 g, 15 minutes) et transféré sur des cellules indicatrices P4 lesquelles ont été pré-incubées avec des dilutions sériées d'un inhibiteur de la transcriptase inverse, dans de puits triplicatas, durant quatre heures. La gamme de concentrations d'inhibiteur utilisée varie selon les composés. Le signal produit par l'activation du gène marqueur a été développé avec du CPRG durant 48 heures, comme pour l'analyse de la susceptibilité à un inhibiteur de transcriptase inverse et l'indice ICso a été calculé en utilisant l'équation d'effet médian.
III-Optimisation de la méthode d'analyse pour déterminer la susceptibilité d'un virus VIH aux inhibiteurs de transcriptase inverse.
Le plasmide pSRT portant une délétion dans la région codant pour pol allant du codon 24 de la transcriptase inverse (base 2618) au codon 432 de la transcriptase inverse (base 3872) inclut toutes les mutations associées à un phénomène de résistance connus à ce jour. Les séquences homologues du produit transcriptase inverse issu de PCR s'étendent 88 paires de base en amont et 186 bases en aval de la délétion dans pSRT. Les transfections pour la détermination de la susceptibilité aux inhibiteurs de la transcriptase inverse sont effectuées avec une lignée cellulaire 293T ayant une forte capacité à être transfectée plutôt qu'avec des cellules HeLa. Ceci ne constitue pas un problème car les cellules sont éliminées du surnagent contenant le virus par centrifugation avant le transfert de cellules P4.
Les conditions de transfert sont optimisées au moyen d'un test en échiquier. La variation du ratio du plasmide/produit issu de PCR ne modifie significativement la quantité de p24 ou de transcriptase inverse produites ou la vitesse de réaction avec CPRG. Etant donné que le plasmide circulaire, pVSV-G semble être extrêmement toxique pour les cellules 293T, la quantité de celui-ci a été réduite de 3 g à 0, 1 Mg dans le mélange de transfection, conduisant à des rendements élevés en p24 ( > 20 ng/ml comparé à 9,8 ng/ml).
Etant donné que les phases précoces de la réplication du virus, incluant la transcription inverse, se produisent dans les cellules P4 indicatrices dans ce type de détermination, ce sont ces cellules qui sont traitées avec des dilutions en série des inhibiteurs de la transcriptase inverse.
Les gammes de concentration d'inhibiteur utilisées sont choisies en fonction de la toxicité cellulaire de chaque composé et du ratio ICso/ICgo pour la susceptibilité des isolats résistants (Tableau 1). Par exemple, comme l'indice IC50 pour l'abacavir pour les cellules P4 est d'environ 250 MM alors que l'indice ICso pour ce composé pour la souche native du virus est d'environ 3 MM, la détection de la résistance est limitée par la toxicité. Une gamme de quatre dilutions en série, commençant à 200 MM a été utilisée pour l'abacavir, permettant la détection de jusqu'à 60 fois plus de résistance.
D'autre part, puisque la toxicité de l'AZT pour les cellules P4 est élevée ( > 300 MM) alors que l'indice ICso est considérablement inférieur, une gamme plus large de dilutions a été utilisée (dilution en série 1/10 à partir de 5 MM) de manière a permettre la détection de niveaux élevés de résistance (jusqu'à 100 fois).
Pour la transcriptase inverse RVA, l'indice ICso est utilisé plutôt que l'indice ICgo car la détection de l'indice ICgo pour les virus résistants pourrait demander des niveaux de composé toxiques pour la plupart d'inhibiteurs de transcriptase inverse.
La figure 2 montre un schéma de communication illustrant la mise en oeuvre du protocole de communication selon l'invention dans une structure locale.
Tel que représenté sur la figure 2 le terminal local TLOC 21 est équipé de deux lecteurs de carte 22 et 23 pour lesquels les couches de protocole de terminal pour accéder à ces lecteurs ne sont pas représentées. Le terminal 21, par son lecteur 22 disposant des couches ISO 7816-3/4, PCPA et PCINV (protocole de communication selon l'invention), dialogue avec la carte pro-active 20 dite initiatrice par définition et disposant des mêmes couches ISO 7816-3/4, PCPA et PCINV par l'intermédiaire du lien 61 (supportant en l'espèce une session de communication selon l'invention). De même le terminal 21 par son lecteur 23 disposant des couches ISO 7816-3/4, PCPA et PCINV dialogue avec la carte pro-active CPA-2 24 disposant des mêmes couches ISO 7816-3/4, PCPA et PCINV par l'intermédiaire du lien 62 (supportant en l'espèce une autre session de communication selon l'invention distincte de la session supportée par le lien 61). Le terminal 21 comporte également les protocoles et procédures (représentés par les doubles flèches 223 et 225) adaptées pour gérer et réaliser la résolution des adresses, l'établissement des connexions, les transferts et les conversions de protocoles entre le lecteur 22 de la carte initiatrice 20 et une application terminal 220 APPLI (TLOC) d'une part (double flèche 223) et entre les deux lecteurs 22 et 23 d'autre part (double flèche 225).
Dans la configuration représentée le terminal 21 dispose de l'application APPLI (TLOC) 220, par exemple un serveur Web utilisant sur le lien 61 une session de communication de la carte pro-active CFA 20 pour afficher des données sur le terminal 21 ou pour gérer l'interface utilisateur de ce terminal.
De plus le lien 62 est utilisé pour le dialogue entre les deux cartes pro-actives CFA 20 et CPA-2 24, par exemple entre les applications APPLI (CPA) 200 et APPLI (CPA-2) 240, les liens 61 et 62 supportant chacun une session de communication selon l'invention, ces sessions étant distinctes l'une de l'autre.
Enfin le terminal 21 après reconfiguration du lecteur 23 peut aussi acheminer des données vers l'application 250 de la carte CISO 25 seulement conforme ou compatible ISO 7816-3/4 par une session établie sur le lien 61 entre la carte pro-active CFA 20 et le terminal TLOC 21. Dans ce cas circuleront sur le lien 61 des données de type APDU sur session et sur le lien 63 des données de type APDU strict, ce dernier lien ne supportant que des données dans le mode APDU strict (sans session).
La figure 3 montre un schéma de communication illustrant la mise en oeuvre du protocole de communication selon l'invention dans une structure de réseau externe.
Tel que représenté sur la figure 3 le terminal local TLOC 31 est équipé d'un lecteur de carte 32 et d'une interface réseau 33 pour lesquels les couches de protocole de terminal pour accéder à ce lecteur ou à cette interface réseau ne sont pas représentées. Le terminal local 31 par son lecteur 32 disposant des couches ISO 7816-3/4, PCPA et PCINV (protocole de communication selon l'invention) dialogue avec la carte pro-active CFA 30 dite initiatrice
par définition et disposant des mêmes couches ISO 7816- 3/4, PCPA et PCINV par l'intermédiaire du lien 71 (supportant en l'espèce une ou plusieurs sessions de communication selon l'invention). De même le terminal 31, par son interface réseau 33 disposant de la pile réseau TCP/X25 dialogue au travers de la pile réseau TCP/X25 de l'interface réseau 35 avec un terminal distant TDIS 34 par l'intermédiaire du lien 72 (supportant en l'espèce une session de communication réseau).
Le terminal distant 34, par son lecteur de carte 36 disposant des couches ISO 7816-3/4, PCPA et PCINV (protocole de communication selon l'invention), dialogue avec la carte réseau pro-active CPA-3 37 disposant des mêmes couches ISO 7816-3/4, PCPA et PCINV par l'intermédiaire du lien 73 (supportant en l'espèce une ou plusieurs sessions de communication selon l'invention).
Le terminal local 31 et le terminal distant 34 comportent chacun les protocoles et procédures (représentés par les doubles flèches 310 et 320) adaptées pour gérer et réaliser la résolution des adresses, l'établissement des connexions, les transferts et les conversions de protocoles entre chaque lecteur 32,36 de carte proactive et la pile réseau TCP/X25 correspondante des interfaces réseau 33,35. Dans cette configuration les terminaux 31,34 disposent chacun d'un équipement ou d'une application logicielle faisant fonction de proxy 310,320 qui fait la conversion de protocole entre le protocole de l'invention PCINV et les protocoles réseau.
Ainsi les deux cartes pro-actives 30,37 [ou les deux applications carte APPLI (CPA) 300 et APPLI (CPA-3) 340] peuvent se connecter et dialoguer directement entre elles, les liens 71 et 73 supportant chacun une session
selon l'invention et le lien 72 supportant une session réseau. Dans une autre variante de structure de réseau non représentée dans laquelle la carte pro-active 37 est remplacée par une carte classique seulement conforme ou compatible ISO 7816-3/4, le terminal distant comporte un équipement proxy distant pour effectuer la conversion entre protocole réseau et le protocole APDU, permettant ainsi une connexion en session de la carte locale proactive vers la carte classique par l'intermédiaire de deux sessions distinctes (une session selon l'invention entre la carte pro-active et le terminal local et une session réseau entre les deux terminaux) suivie d'un transfert de données en mode APDU entre le terminal distant et la carte classique.
Bien entendu il est possible dans le cadre de l'invention d'utiliser des terminaux mixtes (non représentés) combinant les deux types de structures locale et distante, chaque terminal possédant au moins deux lecteurs de carte dont au moins un est équipé de la couche du protocole selon l'invention PCINV et au moins une carte réseau permettant le dialogue entre toutes les cartes à puce sur lecteur associées localement ou à distance. De même les lecteurs de carte physiques locaux ou distants susceptibles de dialoguer entre eux ou avec la carte initiatrice peuvent être remplacés par des lecteurs virtuels pour autant que ces lecteurs supportent la compatibilité ISO 7816-3/4 ou sont capables d'émuler ou de supporter le protocole ISO 7816-3/4 ainsi qu'il a été présenté ci-avant dans le préambule du présent exposé.
Après avoir présenté le protocole de communication de l'invention dans son concept le plus large (en
particulier non nécessairement limité à l'environnement GSM) et notamment plusieurs modes de mises en oeuvre et/ou d'utilisation de ce protocole en structure locale et en réseau externe, il convient d'exposer l'implémentation du protocole selon l'invention au niveau de l'extension des commandes pro-actives de carte ou de lecteur de carte d'un protocole de type PCPA. A titre d'exemple non limitatif on décrira ci-après un mode préférentiel d'implémentation selon l'invention dans l'environnement GSM, les cartes pro-actives CFA (capables d'initier des actions de la carte vers le terminal) étant choisies du type SIM pro-active avec pour protocole de commandes pro-actives PCPA le protocole selon la spécification GSM 11. 14/classe a et pour terminal d'accueil un terminal compatible GSM.
D'une façon générale, les cartes à microprocesseur SIM (Subscriber Identity Module) sont définies par les spécifications GSM tout en étant compatibles avec les normes ISO 7816-3/4. Ces cartes comportent une zone de personnalisation, en l'espèce d'identité d'un abonné, l'IMSI, (International Mobile Subscriber Identity). Les cartes SIM trouvent leur application la plus courante dans les terminaux mobiles de radiotéléphonie compatible GSM.