INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
# "substrat induisant une variation de mesure optique détectable" : produit qui sous l'action d'une enzyme spécifique provoque un changement de couleur du milieu, apprécié soit à l'#il nu, soit au moyen d'un appareil. Le substrat peut ainsi produire un changement de couleur dans le spectre visible, ou un changement de fluorescence ou de luminescence.
# "variation de mesure optique distincte et indépendante" : variation de mesure optique produite par l'un des substrats qui se différencie de celle produite par le second, qui n'a pas d'interférence avec celle-ci et se lit indépendamment.
De façon avantageuse, les groupements organiques de l'huile (h) sont des groupes alkyle, de préférence en C1-C6 ; cycloalkyle, de préférence en C3-C8, aryle, de préférence en C6-C10 (et par exemple phényle) ; ou alcényle en C2-C6 (par exemple allyle ou vinyle) ; lesdits groupes étant éventuellement substitués par hydroxyle et/ou amino (éventuellement substitué), et/ou halogéno, et/ou cyano.
Les substituants du groupe amino sont par exemple alkyle, tel que (C1C10)alkyle ; alcényle, tel que (C2-C8)alcényle ; aryle, tel que (C6-C10)aryle ; cycloalkyle, tel que (C3-C8)cycloalkyle.
Un groupe préféré de composants (h) est constitué des huiles de formule :
dans laquelle n est un entier supérieur ou égal à 10, R, et R2 identiques ou différents représentent -OH ; alkyle, notamment (C1-C6)alkyle ; cycloalkyle, notamment (C3-C8)cycloalkyle alcényle, notamment (C2-C6)alcényle , cycloalcényle, notamment (C5-C8)cycloalcényle ; ou amino.
De manière préférée, R, et R2 sont indépendamment choisis parmi (Ci- C6)alkyle (tel que méthyle) ; (C6-C10)aryle, et par exemple phényle ; (C2- C8)alcényle (tel que vinyle) ; ou bien encore amino ; (C1-C6)alkylamino ; ou di(C1C6)-alkylamino ; chacun des groupes alkyle et aryle étant éventuellement substitué par halogéno (et de préférence fluoro) ou cyano.
Les huiles (h) les plus utilisées, du fait de leur disponibilité dans les produits industriels, sont celles pour lesquelles R, et R2 sont indépendamment choisis parmi méthyle, éthyle, propyle, phényle, vinyle et 3,3,3-trifluoropropyle. De manière préférée, 80% en nombre de ces radicaux sont des radicaux méthyle.
En pratique, on privilégiera, en tant qu'huile (h), les [alpha],#- dihydroxypolydiméthylsiloxanes portant aux extrémités des motifs (CH3)2(OH)SiO1/2.
Dans le cadre de la présente invention, on peut spécialement utiliser les les a.m-dihydroxypotydiorganositoxanes préparés par le procédé de polymérisation anionique décrit dans les brevets américains précités : US 2 891 920 et surtout US 3 294 725 (cités comme référence).
Le constituant (h), quand il est présent, est utilisé à raison de 0,5 à 30% en poids, et de préférence de 1 à 10% en poids, par rapport au poids total de la composition.
La composition lubrifiante selon la présente invention peut contenir aussi un ou plusieurs ingrédients additionnels tels que des polymères filmogènes, des lubrifiants complémentaires et des agents anti-friction, des agents de coalescence, des agents mouillants ou dispersants, des agents d'évacuation de l'air, des agents anti-mousse, des épaississants, des stabilisants, des conservateurs tels que des biocides, des antifongiques en quantités pouvant varier considérablement, par exemple, entre 0,2 et 50% en poids de la composition.
A titre de polymère filmogène, on peut citer par exemple les copolymères styrène-acrylique.
Des exemples d'épaississants sont les épaississants cellulosiques (carboxyméthylcellulose), acryliques, polyuréthane, les gommes hydrocolldidales (gomme xanthane) et leurs mélanges.
En tant qu'agent de coalescence, on pourra utiliser les glycols et/ou les coupes pétrolières aliphatiques (fractions de distillation du pétrole).
Des agents mouillants ou dispersàbles utilisables dans le cadre de l'invention sont par exemple les phosphates et/ou les polyacryliques, tels que par exemple l'hexamétaphosphate de sodium et les polyacrylates de sodium.
Les compositions de l'invention peuvent être préparées de façon conventionnelle par mise en oeuvre des méthodes classiques de l'état de la technique.
Un premier procédé consiste à mettre en émulsion dans une phase aqueuse comprenant l'ensemble des constituants hydrosolubles, un mélange des constituants lipophiles (a), (b), (c), (d) et éventuellement (h), en présence du tensioactif (e).
Lorsque l'on désire construire une banque d'ADN à partir d'un échantillon de l'environnement, en particulier à partir d'un échantillon de sol, il est avantageux de vérifier la qualité et la diversité de la source d'ADN extrait et purifié préalablement à son insertion dans des vecteurs appropriés.
L'objectif d'une telle caractérisation moléculaire de l'ADN extrait et purifié est d'obtenir des profils représentant les proportions des différents taxons bactériens présents dans cet extrait d'ADN. La caractérisation moléculaire de l'ADN extrait et purifié permet de déterminer si des artefacts ont été introduits lors de la mise en oeuvre des différentes étapes d'extraction et de purification et, le cas échéant, si la diversité d'origine de l'ADN extrait et purifié est représentative de la diversité microbienne présente initialement dans l'échantillon, notamment dans l'échantillon de sol.
A la connaissance du demandeur, il est recouru dans l'état de la technique à des procédés d'hybridation quantitative mettant en oeuvre des sondes oligonucléotidiques spécifiques de différents groupes bactériens, appliqués directement à l'ADN extrait de l'environnement.
Malheureusement, une telle approche est peu sensible et ne permet pas de détecter des genres ou des groupes taxonomiques présents en faible abondance.
L'état de la technique décrit aussi des procédés de PCR quantitative, telle que la MPN-PCR ou encore la PCR quantitative par compétition. Toutefois, ces techniques présentent d'importants inconvénients.
Ainsi, la MPN-PCR est d'une utilisation complexe du fait de la multiplication des dilutions et des répétitions qui la rend inappropriée pour un grand nombre d'échantillons ou de couples d'amorces.
Par ailleurs, la PCR quantitative par compétition est d'une mise en oeuvre difficile du fait de la nécessité de construire un compétiteur spécifique à l'ADN cible qui, en outre, n'induit pas de biais ou d'artefacts dans la compétition proprement dite.
Il est ainsi proposé selon l'invention un procédé de précriblage d'une banque d'ADN provenant d'un échantillon de l'environnement qui est à la fois rapide, simple et fiable et permet de tester la qualité de l'ADN préalablement extrait et purifié et de déterminer ainsi l'intérêt de construire une banque de clones préparés à partir de cet ADN purifié de départ.
3. Vecteurs pour le clonage de l'ADN extrait et purifié à partir d'un échantillon de l'environnement.
De nombreux vecteurs ont déjà été décrits dans l'état de la technique afin de cloner de l'ADN préalablement extrait d'un échantillon de l'environnement.
Ainsi, selon la description de la demande internationale n WO 99/20.799, peuvent être utilisés des vecteurs viraux, des phages, des plasmides, des phagemides, des cosmides, des phosmides, des vecteurs du type BAC (chromosome artificiel bactérien) ou encore le bactériophage P1, des vecteurs de type PAC (chromosome artificiel basé sur le bactériophage P1), des vecteurs du type YAC (chromosome artificiel de levure), des plasmides de levure ou tout autre vecteur capable de maintenir et d'exprimer de manière stable un ADN génomique.
L'exemple 1 de la demande PCT n WO 99/20.799 décrit la construction d'une banque d'ADN génomique par clonage dans un vecteur du type BAC.
A la connaissance du demandeur, aucune banque d'ADN provenant d'un échantillon de l'environnement n'avait encore été effectivement réalisée avec des vecteurs de type conjugatif, une telle technique étant rendue pour la première fois accessible et reproductible par l'homme du métier grâce à l'enseignement de la présente invention.
4. Hôtes cellulaires Dans l'état de la technique, de nombreuses cellules hôtes ont été décrites comme pouvant être utilisées afin d'héberger les vecteurs contenant les inserts d'ADN provenant de l'ADN extrait et purifié à partir d'un échantillon de l'environnement.
Ainsi, la demande PCT N WO 99/20.799 cite de nombreux hôtes cellulaires appropriés, tels que Escherichia coli, en particulier la souche DH 10B ou encore la souche 294 (ATCC 31446, la souche E. coli B, E.
Coli X 1776 (ATCC N 31 537), E.coli DH5 a et E.coli W3110 (ATCC n 27.325).
EXEMPLE 9 Réduction de l'acétophénone.
On utilise le même milieu réducteur que l'exemple 5 dont on reproduit le mode opératoire en modifiant le rapport substrat / catalyseur.
On effectue donc la réduction sur 1 mmole d'acétophénone au lieu de 10 mmoles dans l'exemple 5 en gardant toute chose égale par ailleurs.
On obtient, au bout de 21 heures à 22 C, 99% du 1-phényléthanol avec un excès énantiomérique de 92% en faveur de l'isomère S.
Il apparaît que l'augmentation du rapport catalyseur/substrat n'a pas d'incidence significative sur l'énantiosélectivité de la réduction.
EXEMPLES 10 ET 11 Réduction de l'acétophénone.
On utilise le même milieu réducteur que l'exemple 5 dont on reproduit le mode opératoire mais en modifiant la nature du complexe
métallique. Le complexe retenu est ligandé avec le (1 S, 2S) N- trifluorométhanesulfonyl-1,2-cyclohexanediamine.
Tableau 3 Ref Complexe Durée Rendement e.e.
Ex. métallique 10 [Cp*lrCy2 96 h 52 90 11 [Cp'RhCh]2 72 h 86 89 5 [RuCl2(p-cymène)] 72 h 85 91 Les résultats sont comparables en terme d'énantiosélectivité.
EXEMPLES 12 ET 13 Réduction de la 3',4'-diméthoxyacétophénone.
On utilise le même milieu réducteur que l'exemple 5 dont on reproduit le mode opératoire en utilisant soit le ligand préparé dans l'exemple 1, soit le ligand préparé dans l'exemple 3.
La durée est mentionnée dans le tableau ci-après. On dose le produit formé à savoir le (R)-3',4'-diméthoxy-1-phényléthanol par chromatographie liquide haute performance.
Les résultats obtenus sont consignés dans le tableau 4 ci-après :
Tableau 4 Ref Ligand Rendement e.e. ex.
H 12 NHS02CF3 93% 75% NH2 Ph NHS02CF3 87% 13 NHSOCFs 87% 80% Ph H = NH2 EXEMPLE 14 Préparation des dérivés p-keto-a-acide aminé 1a, 1 b.
bien de la couche pelable et de la couche-écran de protection contre l'oxygène. Usuellement, on applique dessus une couche de couverture amovible d'une résine synthétique par stratification en vue de fournir une protection au cours de la manipulation. De plus, on peut aussi appliquer une structure stratifiée, où une couche de résine thermoplastique soluble en milieu alcalin et une couche intermédiaire sont fournies sur un support temporaire, puis on applique dessus une couche de composition de résine photosensible (JP 5-173320-A).
* Dans la pratique, on enlève la couche de couverture précitée et on aplique la couche de composition de résine photosensible par stratification sur un support permanent. Ensuite, on effectue le pelage entre cette couche et un support temporaire lorsqu'une couche-écran de protection contre l'oxygène et une couche pelable sont fournies, entre la couche pelable et la couche-écran de protection contre l'oxygène lorsque la couche pelable et la couche-écran de protection contre l'oxygène sont fournies, et entre le support temporaire et la couche de composition de résine photosensible lorsque soit la couche pelable, soit la couche-écran de protection contre l'oxygène n'est pas fournie, et le support temporaire est éliminé.
On peut utiliser un support métallique, de verre, de céramique et un film de résine synthétique comme support pour un filtre coloré. On donne une préférence particulière au verre et à un film de résine synthétique qui est trasparent et possède une excellente stabilité dimensionnelle.
L'épaisseur de la couche de composition de résine photosensible est usuellement de 0. 1 à 50 microns, en particulier de 1 à 5 microns.
On peut utiliser une solution aqueuse diluée d'une substance alcaline comme révélateur pour la composition de résine photosensible de la présente invention, si la composition contient une résine soluble en milieu alcalin
ou des monomères ou oligomères solubles en milieu alcalin, et de plus, on ajoute également une solution de révélateur préparée par ajout d'une petite quantité d'un solvant organique miscible à l'eau.
Des exemples de matières alcalines comprennent des hydroxydes de métaux alcalins (par exemple l'hydroxyde de sodium et l'hydroxyde de potassium), des carbonates de métaux alcalins (par exemple, le carbonate de sodium et le carbonate de potassium), des bicarbonates de métaux alcalins (par exemple, le bicarbonate de sodium et le bicarbonate de potassium), des silicates de métaux alcalins (par exemple, le silicate de sodium et le silicate de potassium), des métasilicates (par exemple, le métasilicate de sodium et le métasilicate de potassium), la triéthanolamine, la diéthanolamine, la monoéthanolamine, la morpholine, des hydroxydes de tétraalkylammonium (par exemple, l'hydroxyde de tétraméthylammonium) ou le phosphate trisodique. La concetration en substance alcaline est de 0. 01 à 30 % en masse et le pH est de préférence de 8 à 14.
Des solvants organiques appropriés qui sont miscibles à l'eau comprennent le méthanol, l'éthanol, le 2-propanol, le 1-propanol, le butanol, l'alcool diacétonique, l'éther monométhylique de l'éthylène- glycol, l'éther monoéthylique de l'éthylène-glycol, l'éther mono-n-butylique de l'éthylène-glycol, l'éther diméthylique du diéthylène-glycol, le monométhyléther- acétate du propylène-glycol, le 3-éthoxypropionate d'éthyle, le 3-méthoxypropionate de méthyle, l'acétate de n-butyle, l'alcohool benzylique, l'acétone, la méthyl- éthylcétone, la cyclopentanone, la cyclohexanone, la 2- heptanone, la 2-pentanone, l'epsilon-caprolactone, la gamma-butyrolactone, le diméthylformamide, le diméthyl- acétamide, l'amide de l'acide hexaméthylphosphorique, le lactate d'éthyle, le lactate de méthyle, l'epsilon- caprolactame et la N-méthylpyrrolidone. La concentration en solvant organique miscible à l'eau est de 0.1 à 30 %
en masse.
De plus, on peut ajouter un agent de surface courant. La concentration en agent de surface est de préférence de 0. 001 à 10 % en masse.
On peut aussi développer la composition de résine photosensible de la présente invention avec des solvants organiques, y compris des mélanges de deux ou plusieurs solvants ne contenant pas de composés alcalins. Des solvants appropriés comprennent le méthanol, l'éthanol, le 2-propanol, le 1-propanol, le butanol, l'acool diacétonique, l'éther monométhylique de l'éthylène glycol, l'éther monoéthylique de l'éthylène glycol, l'éther mono-n-butylique de l'éthylène glycol, l'éther diméthylique du diéthylène glycol, le monométhyléther- acétate du propylène-glycol, le 3-éthoxypropionate d'éthyle, le 3-méthoxypropionate de méthyle, l'acétate de n-butyle, l'alcohol benzylique, l'acétone, la méthyléthylcétone, la cyclopentanone, la cyclohexanone, la 2-heptanone, la 2-pentanone, l'epsilon-caprolactone, la gamma-butyrolactone, le diméthylformamide, le diméthylacétamide, l'amide de l'acide hexaméthyl- phosphorique, le lactate d'éthyle, le lactate de méthyle, l'epsilon-caprolactame et la N-méthyl-pyrrolidinone.
Facultativement, on peut ajouter à ces solvants de l'eau en une quantité telle que la solution obtenue soit toujours claire et qu'une solubilité suffisante des régions non exposées de la composition photosensible soit maintenue.
On peut utiliser le révélateur sous toute forme connue de l'homme du métier, par exemple sous forme de solution du bain, puddle ou d'atomiseur. Afin d'éliminer la portion non durcie de la couche de composition de résine photosensible, on peut employer des combinaisons de procédés, telles que le brossage avec une brosse rotative ou frottement avec une éponge humide.
Usuellement, la température du révélateur est de préférence la température ambiante ou se trouve dans le
domaine d'environ la température ambiante à 40 C. La durée de développement varie en fonction du type spécifique de la composition de résine photosensible, de l'alcalinité et de la température du révélateur et du type et de la concentration en solvant organique au cas où il a été ajouté. Usuellement, elle va de 10 secondes à 2 minutes. Le processus de développement peut être suivi par une opération de rinçage.
De préférence, on met en oeuvre un traitement thermique final après le processus de développement. Par conséquent, on chauffe dans un four électrique et un sécheur un support portant une couche qui est photopolymérisée by exposition (nommée ci-après couche durcie par irradiation), ou on irradie la couche durcie par irradiation avec une lampe infrarouge ou on la chauffe sur une plaque chaude. La température et la durée de chauffage dépendent de la composition utilisée et de l'épaisseur de la couche formée. En général, on applique le traitement thermique de préférence à une température d'environ 120 C à environ 250 C, pendant environ 5 à environ 60 minutes.
Toujours préférentiellement, la concentration du substrat est comprise entre 10 et 500 mg/1, préférentiellement entre 30 et 150 mg/1, et encore plus préférentiellement est de 50 mg/1.
La présente invention concerne donc un nouveau substrat faiblement coloré initialement qui prend une coloration particulière en présence, d'une part, d'un microorganisme ou d'une enzyme dont on veut détecter la présence, d'autre part et éventuellement, d'un cation. L'invention concerne également les utilisations qui peuvent être faites de ce substrat, ainsi qu'une composition contenant ce substrat.
La présence de cations est particulièrement intéressante, néanmoins il est possible de s'en passer ; dans ce cas, on peut préférentiellement utiliser une composition ayant un pH alcalin. Il est également possible de cumuler les deux conditions, c'est-à-dire la présence de cations et un pH alcalin.
Lorsque le cation utilisé varie, les colonies de micro-organismes testées donnent des colorations différentes. Ces cations, tels que Fer, Manganèse, Etain et Aluminium, sont utilisés à très faibles concentrations afin d'éviter ou de minimiser l'inhibition due à des ions libres présents dans l'échantillon testé.
Cependant des concentrations plus élevées de certains ions métalliques donne une inhibition sélective qui peut être utilisée pour sélectionner des espèces microbiennes particulières, ce qui constitue un avantage supplémentaire.
SYNTHESE DES SUBSTRATS : 1 ) Synthèse de l'Alizarine-2-j!-D-glucoside : Selon Robertson et al. (J. Chem. Soc. (1930), 1136 et (1933), 1167), l'Alizarine est glycosylée spécifiquement au niveau du groupement Hydroxyle en position 2, même s'il est possible d'effectuer cette fixation sur la position 1. Néanmoins, la couplage en position 2 est plus aisée.
Ce substrat est préparé en utilisant la méthode décrite par Robertson (1933) mais modifiée. Un échantillon de 6 g d'Alizarine est suspendu dans 70 ml d'Acétone et mélangé avec 70 ml d'Hydroxyde de Potassium à 0,28 mol/1 afin de former un sel. A ceci est associé un mélange de 40 ml contenant dans un rapport 1:1de l'Ether et de l'Acétone, contenant 6,6 g d'Acéto-bromo-glucose. On agite environ 14 heures. On ajoute ensuite 7 ml d'Hydroxyde de potassium à 1,25 mol/1, suivi de l'ajout de 15 ml à 0,6 mol/1 Acéto-bromo-glucose dans l'Acétone. Le prémélange est encore agité une dizaine d'heures. L'Ether et l'Acétone sont retirés sous pression réduite et le pH est ramené à environ 5,5 par addition d'Acide acétique glacé. Le mélange et l'Alizarine n'ayant pas réagi sont filtrés puis lavés à l'eau, pour ensuite être séchés toute la nuit à 50 C.
On obtient ainsi un solide jaune qui est mis en suspension dans 70 ml d'Acide acétique glacé et reflué pendant 5 minutes. Ceci permet de refroidir puis de filtrer et enfin de laver à l'Acide acétique. Le filtrat est ensuite mis de côté pendant une heure et séparé de l'Alizarine restante. Cette procédure est répétée à 10 C afin d'obtenir un filtrat jaune foncé.
Ce que l'on obtient est séché et dissous dans 200 ml de Méthane dichlorique et on ajoute ensuite 2 ml de Triéthylamine. Un Oxyde d'Aluminium est prémélangé dans la solution jusqu'à ce qu'un échantillon test montre qu'il ne reste pas d'Alizarine par chromatographie sur couche mince (CCM). L'Oxyde d'Aluminium est retiré et la solution restante est évaporée par mise en rotation afin de produire un solide jaune. Ce
solide est recristallisé à partir d'Ethanol chaud en présence de quelques gouttes d'Acide acétique pour obtenir 2,02 g de Tétraacétyl-glucoside d'Alizarine.
Une quantité de 1,1 g du Tétraacétyl-gucoside d'Alizarine est remis en suspension dans 60 ml d'Ethanol, on y ajoute 30 ml d'Hydroxyde de Sodium aqueux à 0,125 mol/1 pour produire une solution rouge. Cet état est maintenu pendant 10 minutes à 65 C puis refroidi à 0 C. Le sel de Sodium de l'Alizarine glycosylée rouge est ensuite retiré par filtration à vide, lavé avec l'Ether puis séché. Ce procédé permet d'obtenir 0,9 g de sel de Sodium d'Alizarine-2-p-D-glucoside. On peut purifier ce produit selon des techniques connue de l'homme du métier pour obtenir de l'Alizarine-2--D-glucoside. 2 ) Synthèse de l'Alizarine-2--D-galactoside : Ce substrat est également préparé en utilisant la méthode décrite par Robertson (1933) mais modifiée. Un échantillon de 6 g d'Alizarine est suspendu dans 70 ml d'Acétone et mélangé avec 70 ml d'Hydroxyde de Potassium à 0,28 mol/1 afin de former un sel. A ceci est associé un mélange de 40 ml contenant dans un rapport 1:11 de l'Ether et de l'Acétone, contenant 6,6 g d'Acéto-bromo-galactose. On agite environ 14 heures. On ajoute ensuite 7 ml d'Hydroxyde de Potassium à 1,25 mol/1, suivi de l'ajout de 15 ml à 0,6 mol/1 d'Acéto-bromo-galactoside dans l'Acétone. Le prémélange est encore agité une dizaine d'heures. L'Ether et l'Acétone sont retirés sous pression réduite et le pH est ramené à environ 5,5 par addition d'Acide acétique glacé. Le mélange et l'Alizarine n'ayant pas réagi sont filtrés puis lavés à l'eau, pour ensuite être séchés toute la nuit à 50 C.
Ce que l'on obtient est dissous dans 200 ml de Méthane dichlorique et on ajoute ensuite 2 ml de Triéthylamine. Un Oxyde d'Aluminium est ajouté dans la solution jusqu'à ce qu'un échantillon test montre qu'il ne reste pas d'Alizarine par CCM.
L'Oxyde d'Aluminium est retiré et la solution restante est évaporée par mise en rotation afin de produire un solide jaune. Ce solide est recristallisé à partir d'Ethanol chaud en présence de quelques gouttes d'Acide acétique pour obtenir 1,96 g de Tétraacétylgalactoside d'Alizarine.
Une quantité de 1,1 g de Tétraacétyl-galactoside d'Alizarine est remis en suspension dans 60 ml d'Ethanol, on y ajoute 30 ml d'Hydroxyde de Sodium aqueux à 0,125 mol/1 pour produire une solution rouge. Cet état est maintenu pendant 10 minutes à 65 C puis refroidi à 0 C. Le sel de Sodium de l'Alizarine glycosylée rouge est ensuite retiré par filtration à vide, lavé avec l'Ether puis séché. Ce procédé permet d'obtenir 0,86 g de sel de Sodium d'Alizarine-2-p-D-galactoside sous forme de poudre rouge microcristalline.
3 ) Synthèse de la Alizarine-2-acétate : Ce substrat est préparé par une technique bien connue de l'homme du métier.
Deux grammes d'Alizarine sont dissous dans 5 ml de Pyridine et traités par un mélange de 2,5 ml d'Anhydride acétique et 5 ml de Pyridine. Après 16 heures à température ambiante, la solution jaune est versée dans 100 ml d'Acide chlorhydrique contenant de la glace. Le précipité d'Acétate est retiré par filtration aspirante et lavé à l'eau. La recristallisation d'Acétone aqueux permet d'obtenir 1,4 g de Alizarine-2-acétate sous la forme de cristaux jaunes.
Ce fragment est obtenu par PCR. A partir d'un fragment portant les extrémités cohésives (cos) de # (bactériophage lambda ou cosmide pHC79), une amplification par PCR est réalisée à l'aide des
oligonucléotides correspondant aux séquences -50/+130 par rapport au site cos. Ces oligonucléotides contiennent en outre les sites de clonage Nsil, compatible Pstl, Xhol, compatible Sali, EcoRV, " bout franc ".
L'addition des sites rares Swal et Pacl permet d'isoler et/ou de cartographier l'insert cloné.
Le fragment PCR est borné par un site Pstl à l'extrémité 5' et par un site Hindi à l'extrémité 3', permettant le clonage dans le vecteur pOSV010 (Figure 12) prélablement digéré par les enzymes Nsil et EcoRV, provoquant la délétion du répresseur laclq.