INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Une amplification des transcrits du gène Gapdh a constitué le témoin positif de transcription inverse. En effet, ce gène code pour une enzyme impliquée dans la glycolyse, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase, dont l'expression est ubiquitaire et constitutive. Une amplification a également été réalisée en omettant les ARN, afin de disposer d'un témoin négatif attestant de l'absence d'ADN contaminant dans les réactifs.
A-6 ELONGATION D'AMORCES ( RACE-PCR ) Le kit Marathon cDNA Amplification a été utilisé pour obtenir des extrémités d'ADNc, en suivant les indications du fabricant (CLONTECH), à l'aide des amorces suivantes : TABLEAU 11 Séquences de 5'vers 3'des amorces utilisées pour la RACE-PCR
1 ) réaction d'ampliation 2 ) réaction d'amplication ( nested primer ) Amorce 5'RACE TTCACTAGTGTTTGAT CCACCCCAGGTTATGA CCCTGGCCAGTAGAAT ATCCAGCGTG (SEQ ID C (SEQ ID NO22) NO24) Amorce 3'RACE CCACTGGATGCTTTAA AAGATGATGGAGATTG CCTGGACTGTAATGGT GTGGCTACACTTTGGA (SEQ ID NO23) TA (SEQ ID NO25) Amorce 5'et CCATCCTAATACGACT ACTCACTATAGGGCTC adaptateur 3'RACE CACTATAGGGC (SEQ GAGCGGC (SEQ ID ID NO27) NO28)
Cette technique repose sur l'amplification de fragments d'ADNc aux extrémités desquels ont été ligués des adaptateurs. Les ADNc utilisés pour la réaction ont été préparés à partir d'ARN polyA+ extraits de la partie basale de grains de maïs de 7 JAP, comprenant l'embryon et la partie basale de l'albumen. Une première amplification a été effectuée entre une amorce spécifique de DD1 (contenant au moins 50% de GC ; température d'hybridation entre 65 et 70 C ; située à une extrémité du clone partiel) et une amorce située dans un adaptateur ligué à l'autre extrémité de l'ADNc servant de matrice. Les produits de cette réaction sont alors amplifiés avec une amorce spécifique située plus à l'intérieur de l'amplicon et une autre amorce de l'adaptateur.
Afin de disposer d'un témoin positif de la présence du gène DD1 parmi les ADNc utilisés, une amplification a été réalisée entre les deux amorces SEQ ID ? 20 et SEQ ID NO21. Le témoin négatif, qui vérifie l'absence d'ADN amplifiable dans les réactifs, a été obtenu en remplaçant les ADNc par de l'eau, puis en amplifiant par les amorces situées en 5'.
A. 7 HYBRIDATION IN SITU Les hybridations in situ ont été réalisées selon le protocole de COEN et al. (1990), avec les modifications décrites par BRADLEY et al.
(1993). Les principales étapes en sont, en résumé : A. 7. 1 PREPARATION DES TISSUS Les grains isolés ont été immergés dans une solution de fixation à 4% de paraformaldéhyde et infiltrés sous vide. Puis ils ont été déshydratés par des incubations successives dans des solutions éthyliques salées de degré croissant en éthanol. Les échantillons ont alors été imprégnés pendant plusieurs jours dans un mélange d'Histoclear Il (National
Diagnostics) et de paraffine (Paraplast Plus, Sherwood Medical Co) en concentration croissante. Ils ont ensuite été inclus dans de petits blocs de paraffine pure pour être coupés au microtome, en sections longitudinales et transversales de 7 um d'épaisseur. Ces coupes ont été fixées sur des lames Probe-On Plus préchargées positivement (Fisher Scientific).
A. 7. 2. FABRICATION DE SONDES MARQUEES A LA DIGOXINENINE Les sondes DD1 sens et antisens ont été obtenues par transcription in vitro d'un ADNc partiel du gène DD1 (SEQ ID N'26) clonie dans les deux orientations dans le vecteur pGEM-T-easy. Toutes les transcriptions in vitro ont été réalisées par la T7-ARN polymérase, en présence des nucléotides suivants : ATP, CTP et GTP 1 mM, UTP 0, 65 mM, et digoxinénine-11-UTP 0, 35 mM.
A. 7. 3. HYBRIDATION Les lames ont été hybridées avec la sonde pendant 16 h, à 55OC, dans un tampon d'hybridation contenant entre autre 50% de formamide.
Elles ont ensuite été rincées à 55 C dans une solution à 0, 1% de SDS et de concentration en SSC de 0, 1 x pendant 30 min, puis dans une solution à 50% de formamide et de concentration en SSC de 2x pendant deux fois 1 h 30 min, avec agitation lente.
A. 7. 4 REVELATION Après une incubation de 1 h 30 min avec une dilution 1/1000 d'anticorps anti-digoxigénine couplé à la phosphatase alcaline, les lames ont été révélées par une solution de NBT (nitroblue tetrazolium chloride) et BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolylphosphate p-toluidine salt), des substrats
chromogènes de la phosphatase alcaline. Elles ont ensuite été lavées dans des bains de 30 à 100% d'éthanol, et colorées au calcofluor à 0, 1%. Les photographies ont été faites sous un microscope avec un objectif Plan fluor 10/0, 30, à l'aide d'un appareil Nikon FDX 35 sur des pellicules Kodak Elite Chrome 100 ASA.
Les roues sont équipées du dispositif, deux par deux, et de chaque côté Le résultat obtenu est lié au nombre de roues équipées, l'effet produit étant d'autant plus important que toutes les roues sont pourvues du système L'exemple retenu et représenté sur les dessins est celui du patin à roues en ligne, mais le dispositif peut être adapté sur tout autre article de sport ou équipement de type skateboard)), notamment.
Fonctionnement les chocs produits par les inégalités du terrain d'évolution provoquent l'oscillement de la pièce (1) autour de l'axe (2), la lame (10) en amortissant les effets
UTILISATION DE POLYMERES ET D'OLIGOMERES DE XYLOGLUCANE, ET DE COMPOSES DERIVES, EN TANT QUE PRODUITS PHYTOSANITAIRES ET BIOFERTILISANTS La présente invention a pour objet de nouvelles utilisations de polymères ou d'oligomères de xyloglucane, ainsi que de composés dérivés, dans le domaine phytosanitaire, et celui de la biofertilisation.
Les parois cellulaires des fruits et des végétaux sont formés de polysaccharides, dont principalement la pectine, la cellulose et le xyloglucane qui intervient dans la mise en place des parois (Levy S et al., Plant J. 1997,11 (3) : 373-86). Le xyloglucane se retrouve également en grande quantité dans l'endosperme des graines des Dicotylédones.
Le xyloglucane est un polymère de 1, 4-P-glucane substitué différemment selon son origine. Chez les Dicotylédones, les substitutions des chaînes linéaires de 1, 4 P-Dglucane impliquent le plus souvent des ramifications de type 1, 6 a-D-xylosyl, ou 1, 6 a-D-xylose 1, 2 p-D-galactosyl, et du fucose peut être associé, en position terminale, au galactose, soit une ramification latérale de type 1,6 a-D-xylose 1,2 p-D-galactose 1,2 a-L-fucosyl. Toujours chez les Dicotylédones, le résidu fucose est absent de l'endosperme, et il peut être remplacé par le résidu a-L-arabinose, par exemple chez certaines Solanacées. Le xyloglucane des Monocotylédones diffère de celui des Dicotylédones par un taux plus faible de substitution par les résidus xylose, galactose et par l'absence de fucose. Le xyloglucane forme avec les microfibres de cellulose des structures pontées qui constituent l'ossature et assurent la flexibilité de la paroi cellulaire des végétaux (Pauly M, Albersheim P, Darvill A, York WS (1999) Plant J, 20 (6) : 629-39).
Le xyloglucane est un substrat d'endoxyloglucanases (Vincken JP, Beldman G, Voragen AG Carbohydr Res (1997) 13,298 (4) : 299-310) ou de xyloglucane endotransglycosylase (Steele NM, Fry SC, Biochem J (1999) 15,340, 1,207-211), à savoir d'activités enzymatiques aptes à modifier la structure des parois cellulaires au cours de l'élongation cellulaire, en période de germination, de fructification par exemple et qui sont dépendantes d'hormones notamment d'auxines (Hetherington PR et Fry S.
(1993) Plant Physiology, 103, 987-992), et de gibbérellines (Maclachlan G et Brady C (1994) Plant Physiol 105, 965-974).
Le xyloglucane, en particulier un oligomère fucosylé, le nonasaccharide XXFG (décrit dans Fry et al. (1993) Physiologia Plantarum, 89,1-3), est bien connu pour son effet antiauxinique (Mac Dougall CJ et Fry SC (1989) Plant Physiol 89,883-887). A l'opposé, des oligomères sans fucose mais avec du galactose comme les oligomères XXLG et XLLG ont un effet auxinique (Mc Dougall GJ et Fry SC (1990) Plant Physiology 93,1042-1048).
Par ailleurs, de nombreux signaux génèrent des espèces activées d'oxygène (on parle également de"burst oxydatif). Des espèces activées d'oxygène sont bien connues pour être libérées au cours des interactions plante-pathogène. Des oligosaccharides de diverse origine (acide polygalacturonique, chitosane, 0-glycanes..) ont été répertoriés pour leur capacité à générer un burst oxydatif (Low PS et Heinstein PF (1986) Arch.
Biochem. Biophys. 249,472-479 ; Rogers KR., Albert F, et Anderson AJ (1988) Plant Physiol 86,547-553 ; Apostol I, Heinstein PF et Low PS (1989) Plant Physiol 90,109- 116 ; Vera-Estrella R, Blumwald E et Higgins VJ (1992) Plant Physiol. 1208-1215 ; Bolwell GP, Butt VS, Davies DR et Zimmerlin A. (1995) Free Rad. Res. Comm. 23, 517-532 ; Orozco-Cardenas M et Ryan CA (1999) PNAS, 25,96, 11, 6553-655 ; NitaLazar M, Iwahara S, Takegawa K, Liénart Y (2000) J Plant Physiol, 156,306-311). Les enzymes NAD (P) H oxydo-reductases pour la libération d'anion superoxyde (Van Gestelen PV, Asard A, Caubergs RJ (1997) Plant Physiol 115, 543-550) et peroxydases pour la formation de peroxyde ou d'anion superoxyde ou de radicaux OH, sont impliquées (Baker CJ et Orlandi EW (1995) Ann. Rev. Phytopathol, 33,299-321 ; Chen SX et Schopfer P (1999) Eur Bioch 260, 726-735). D'autres signaux (acide salicylique, jasmonates, cGMP, NO...) génèrent aussi un burst (Chen Z, Malamy J, Henning J, Conrath U, Sanchez-Casas P, Silva H, Ricigliano J, Klessig DF (1995) Proc Naht ! Acad Sci USA, 92,4134-4137 ; Voros K, Feussner I, Kuhn H, Lee J, Graner A, Lobler M, Parthier B, Wastemack C Eur J Biochem (1998) 15,251, 36-44 ; Dumer J, et Klessig J, Wendehenne D, Klessig DF (1998) Proc Naht ! Acad Sci USA, 95,10328-10333 ; Dumer D et Klessig DF (1999) Current Opinion in Plant Biology, 2,369-374).
Des conditions extrêmes d'environnement (sécheresse, froid, UV, salinité...) déclenchent le même effet.
Le rôle majeur de H202 dans la génération du burst comme dans la régulation du stress oxydant repose : - sur sa formation par dismutation à partir de l'anion superoxyde (Bolwell GP, Davies DR, Gerrish C, Auh CK et Murphy TM (1998) Plant Physiol 116, 1379-1385), - sur son utilisation dans des séquences du métabolisme des acides gras Ci g (pour la peroxydation de lipides (Koch E, Meier BM, Eiben H-G, Slusarenko A (1992) Plant Physiol 99,571-576) ou pour la synthèse d'octadécanoïdes et de leurs dérivés dont certains comme les méthyl-jasmonates sont des métabolites à fonction hormonale, - sur sa fonction de substrat pour des enzyme peroxydase et catalase, propriété limitant l'accumulation de peroxyde toxique pour la cellule (Baker CJ, Harmon GL, Glazener JA et Orlandi EW (1995) Plant Physiol, 108,353-359).
Les espèces activées d'oxygène, l'anion superoxyde en particulier, contrôlent différentes voies métaboliques. Elles interviennent dans : - la biosynthèse des polyamines : des monoamines sont oxydées en aldéhydes avec production de NH3 et de peroxyde. L'oxydation de la L-arginine par la nitritesynthase aboutit à la formation d'un précurseur de polyamine (L-citrulline), - la synthèse de l'éthylène, - la synthèse des gibbérellines. Plus de 20 oxydases sont impliquées dans la régulation de la biosynthèse des gibbérellines.
Les espèces activées d'oxygène interviennent dans des étapes de transduction de signaux, parce qu'elles sont associées à l'activité de liaison de récepteurs ou à l'activité d'enzymes de transduction (Jabs T, Tschôpe M, Colling C, Hahlbrock K et Scheel D (1997) Proc Naht ! Acad Sci USA 29,94, 9,4800-4805 ; Dumer J, Wendehenne D, Klessig DF (1998) Proc Naht ! Acad Sci USA, 95,10328-10333).
Elles interviennent dans la régulation du potentiel redox cellulaire par l'intermédiaire des groupements thiols (conversion GSSG-GSH, cystine-cystéine, etc..).
A ce titre, elles contrôlent des processus de sénescence qui se manifestent à certaines phases de la floraison et de fructification dans différents organes.
Ces dispositifs étant relativement volumineux, le coût du transport est également important.
Un des résultats que l'invention vise à obtenir est un coffrage du type cité plus haut qui remédie à ces inconvénients.
A cet effet, l'invention a pour objet un tel coffrage comprenant une enveloppe mince en matériau sensiblement rigide de longueur développée sensiblement égale au périmètre du socle à couler et de largeur au moins égale à la hauteur du socle délimitant un volume de section polygonale dans lequel est coulé un matériau tel du béton, ce coffrage étant caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins un cadre de section interne égale à la section externe du polygone ceignant l'enveloppe mince et la maintenant en forme et - des moyens pour maintenir le cadre précité à un niveau du prisme distant de la base.
L'invention sera bien comprise à l'aide de la description ci-près faites à titre d'exemple non limitatif en regard du dessin ci-annexé qui représente schématiquement : - figure 1 : une vue en perspective d'un coffrage selon l'invention, - figure 2 : une vue selon ll-ll de la figure 1, - figure 3 : une vue développée de l'enveloppe du coffrage, - figure 4 : une vue en perspective d'un accessoire.
En se reportant au dessin, on voit que, pour ériger un socle en béton, on fait appel à un coffrage 1 comprenant une enveloppe 2 mince délimitant un volume prismatique dans lequel est coulé un matériau tel du béton.
Par volume prismatique, on comprendra tout volume à section polygonale.
Le coffrage 1 comprend : - une bande 2 mince de matériau sensiblement rigide de longueur sensiblement égale au périmètre du socle à couler et de largeur au moins égale à la hauteur du socle, - accessoirement mais non nécessairement, des moyens d'accrochage 3 d'une extrémité de la bande 2 sur l'autre extrémité pour former l'enveloppe du prisme.
La bande 2 peut être fractionnée en plusieurs morceaux.
Selon l'invention : - au moins un cadre 4 rigide de section interne égale à la section externe du polygone ceignant l'enveloppe mince et la maintenant en forme et
- des moyens 5 pour maintenir le cadre précité à un niveau du prisme distant de la base.
De préférence, on utilisera au moins deux cadres.
Pour obtenir un prisme à section polygonale, cette bande 2 de matériau mince présente transversalement des amorces 6 de pliage délimitant les différentes faces du prisme ou alors est composée de différentes feuilles montées jointives.
On peut éventuellement placer à l'intérieur du prisme une feuille continue assurant l'étanchéité.
L'utilisation d'une bande de matériau au lieu d'un prisme préformé et sa mise en forme sur place minimise les coûts de transport.
La présence de ces amorces 6 de pliage facilite la mise en forme des prismes.
A titre d'exemple, on a représenté une bande pour un socle à section rectangulaire.
Les moyens 3 d'accrochage des extrémités de la bande permettent, après mise en forme de la bande, de maintenir les extrémités bord à bord le temps d'engager les cadres 4 autour de l'enveloppe prismatique.
Les cadres 4 assurent la résistance à la poussée du béton lors de la coulée et surtout préservent la forme notamment lorsqu'elle est prismatique.
Le nombre de cadres sera variable et la distance entre deux cadres dépend de leur position par rapport à la base du coffrage.
Les cadres situés près de la base seront plus rapprochés que ceux situés plus près du sommet.
On peut relier les faces internes des cadres par des tendeurs.
Le matériau employé pour constituer l'enveloppe est une matière synthétique, tel un polypropylène, ou encore du carton dont la face tournée vers l'intérieur du volume recevant le béton est recouverte d'un film étanche.
Pour le maintien des cadres aux différents niveaux du coffrage, les cadres 4 présentent des ergots 5A orientés vers l'intérieur du cadre et en saillie, lesquels ergots 5A s'engage dans des lumières 5B réalisé sans l'épaisseur de la bande 2.
Dans une forme de réalisation, le cadre est constitué d'éléments longilignes assemblés entre eux par des moyens d'assemblage rapide et au moins deux des éléments longilignes dits éléments porteurs présentent des ergots 5A pour s'accrocher sur l'enveloppe et les autres éléments longilignes présentent des moyens d'ancrages sur ces éléments porteurs.
Dans le cas d'un prisme à quatre cotés, deux des cotés opposés du cadre sont des éléments porteurs ayant par exemple une section en L.
En position accrochée, le L est retourné. La base du L se trouve alors en partie supérieure.
Cette base du L constitue une face d'appui pour les autres éléments longilignes qui se présentent également sous la forme d'une cornière en L.
La face verticale de ces éléments longilignes est relativement large.
Un système de clavetage permet de réaliser le moyen d'assemblage rapide et de donner la rigidité du cadre.
Les moyens d'assemblage comprennent donc des lumières et des clavettes, les lumières étant réparties au long de l'axe longitudinal des quatre éléments. Ces lumières sont soit circulaires, soit en forme de croix pour placer la clavette dans n'importe quel sens.
Ces ergots 5A se présentent sous la forme de languettes de longueur supérieure à l'épaisseur de la bande obtenue par découpe partielle de l'une des faces de la cornière.
Dans une variante de réalisation, l'enveloppe prismatique présente au long d'au moins trois génératrices des perçages au travers desquels sont engagées des tiges (non représentées) qui, traversant le prisme dans un plan radial, soutiennent les cadres 4.
La figure 2 représente la séquence génomique codante du gène DD1-b. Cette séquence est identique à la séquence SEQ ID D ? 6. La ligne supérieure représente la séquence du brin codant et la ligne inférieure représente la séquence du brin non codant. Chacun des quatre exons du gène DD1-b est représenté par des boîtes.
La figure 3 représente la séquence partielle de l'ADNc correspondant au gène DD1-a.
La ligne supérieure représente la séquence nucléotidique du brin codant. La ligne inférieure représente la séquence d'acides aminés déduite.
La figure 4 représente la séquence de l'ADNc correspondant à un produit de transcription du gène DD1-b. Les régions 5'-UTR et 3'-UTR sont représentées par des flèches. La phase de lecture ouverte est représentée par une boîte. La boîte désignée DD1 AMPLICON est l'ADNC partiel de séquence SEQ ID N 26 à partir de laquelle les amorces destinées à l'élongation en 5' (5'RACE) et vers l'extrémité 3' (3'RACE) ont été conçues.
La ligne inférieure représente la séquence en acides aminés du polypeptide DD1-b de séquence SEQ ID NO12.
La figure 5 représente la séquence de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a de séquence SEQ ID ? 3. Les boîtes représentent les différents motifs caractéristiques d'une région régulatrice retrouvés dans cette séquence et qui sont définis de manière précise dans la description.
La figure 6 représente la séquence de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-b de séquence SEQ ID ? 4. Les boîtes représentent les différents motifs retrouvés dans cette séquence et qui sont définis plus précisément dans la description.
La figure 7 représente une carte du vecteur L 127a5 qui comprend la cassette d'expression inutilisée pour exprimer un gène d'intérêt sous le contrôle de différents fragments des acides nucléiques régulateurs des gènes DD1-a et DD1-b.
La figure 8 représente une carte du vecteur L 246a dans lequel le gène rapporteur GUS est placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 3 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a.
La figure 9 illustre une carte du vecteur L246b qui comprend le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 1 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-a.
La figure 10 représente une carte du vecteur L247a qui comprend le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 2,5 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-b.
La figure 11 représente une carte du vecteur L247b qui comprend le gène rapporteur GUS placé sous le contrôle d'un fragment d'environ 1,6 kb de l'acide nucléique régulateur du gène DD1-b.
La figure 12 représente un alignement entre les séquences en acides aminés du polypeptide DD1-a de séquence SEQ ID NO9, du polypeptide DD1-b de séquence SEQ ID N 11 et du polypeptide DD1-b de séquence SEQ ID NO12. La ligne supérieure représente une séquence en
acides aminés consensus. La seconde ligne représente la séquence en acides aminés déduite de la séquence partielle de l'ADNc codant pour DD1- a. La 3 ème ligne représente la séquence de la protéine DD1-a. Les deux lignes inférieures représentent les séquences en acides aminés des deux variants polypeptidiques de DD1-b de séquences SEQ ID NO11 et SEQ ID NO12.
La figure 13 illustre le profil d'expression des gènes DD1-a et DD1b. Après transcription inverse et amplification par PCR (RT-PCR), les ADN ont été transférés sur membrane puis hybridés avec la sonde de séquence SEQ ID NO26. L'expression a été visualisée à partir d'ADN amplifiés dans les tissus suivants : soies, épis, tiges ; feuilles ; racines et l'albumen à 7,9, 12 et 15 jours après pollinisation (JAP). La piste désignée M correspond au marqueurs moléculaires utilisés comme témoins.
La figure 14 illustre le profil d'expression tissulaire des gènes DD1-a et DD1-b réalisés à l'aide d'hybridation in situ sur des coupes longitudinales de grain de maïs de 7,9, 12 et 15 jours après pollinisation (JAP). a, b, 7 JAP ; c, d, 9 JAP et 12 JAP ; g, h15 JAP. a, c, e, g sonde DD1 antisens ; b, d, f, f témoin négatif (sonde DD1 sens).
EXEMPLE 1 : A-MATERIE ET METHODES A-1 LIGNEES VEGETALES Les plantes de la lignée A188 (GERDES et TRACY, 1993) ont été utilisées pour l'isolement d'ARN et pour la réalisation des hybridations in situ.
Les grains de ces plantes, obtenus par pollinisation à la main, ont été récoltés à différents stades compris entre 7 et 15 JAP. Les fragments d'ADN contenus dans la banque génomique criblée proviennent quant à eux de la
lignée hybride HD5xHD7. La cartographie a été réalisée grâce aux lignées recombinantes stables issues des croisements Co159xTx303 et Cm37xT232, (BROOKHAVEN NATIONAL LABORATORY, Upton, N. Y.
Etats-Unis). Toutes ces plantes ont été cultivées en serre, avec une période d'éclairement de 16 h, une humidité relative de 80%, et une alternance 24 C/19 C (jour/nuit).
A-2 CLONAGE L'ADN plasmidique a été préparé suivant le protocole de lyse alcaline décrit par SAMBROOK et al. (1989). Les digestions d'ADN génomique et plasmidique par des enzymes de restriction ont été réalisées selon les conseils des fabricants (GIBCO, BOEHRINGER MANNHEIM, PROMEGA). Les produits de digestion ou d'amplification par PCR ont été séparés par électrophorèse sur gel d'agarose dans du tampon TAE SAMBROOK et al. 1989). Les fragments de restriction ont été ligués dans le vecteur pBluescript et les produits PCR dans le vecteur pGEM-T-easy, à l'aide de la T4-DNA ligase suivant les conseils du fournisseur (Promega), en utilisant 50 ng de vecteur, et un rapport molaire insert/vecteur de l'ordre de 3/1. Ces constructions ont été introduites dans la souche bactérienne DH5a par transformation par choc thermique, selon le protocole de HANAHAN (1983).
A-3 SEQUENCAGE Les réactions de séquençage ont été réalisées soit à partir de minipréparations d'ADN plasmidique ayant subi une extraction volume à volume au phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25 : 24 : 1) pH 8 et une précipitation à l'éthanol, soit à partir de produits PCR purifiés à l'aide du kit QlAquick PCR purification (Qiagen). Les produits de la réaction dye terminator
obtenus avec le kit Thermo Sequenase (Amersham) ont migré sur un séqueneur automatique ABI 373 A (Applied Biosystems).
Les logiciels Sequencher 3.1. 1 (Gene Codes Corporation) et DNAstar (Laser Gene) ont permis d'analyser et d'assembler les séquences obtenues. Les bases de données ont été consultées avec le logiciel blast (Basic local Alignment S Tool, National Center for Biotechnology Information, ALTSCHUL et al., (1997). Des motifs de signature protéiques ont été recherchés dans les bases de données Prosite profiles , Prosite patterns , Pfam et Gribskov collection , disponibles sur le serveur de l'ISB (Institute of Swiss Bioinformatics).