INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Selon une caractéristique de l'invention, les moyens de classement comprennent des critères mémorisés concernant des ondes P rétrogrades, et comprennent un algo- rithme logiciel pour distinguer des ondes P rétrogrades vis-à-vis ondes P sinusoïdales naturelles comparaison des valeurs minimale et maximale aux critères Selon une caractéristique de l'invention, les moyens de classement comprennent des moyens pour distinguer les unes autres au moins deux -parmi ondes sui vantes : ondes R de champ lointain, ondes P intrinsèques, ondes P réponse appelée, ondes P rétrogrades, contractions auriculaires stimulées ondes P sinusales, ondes R de réponse appelée, et ondes R.
Selon une caractéristique de 'invention, les moyens formant électrodes comprennent moyens pour acquérir des signaux ventriculaires, et les moyens de clas sement comprennent des moyens pour classer ondes dites PVC.
Selon une caractéristique de l'invention, le sys tème comporte en outre des moyens pour déclencher une réponse prédéterminée par le système de stimulateur en réponse à la détection d'une condition prédéterminée du coeur.
Selon une caractéristique de 1 invention, les moyens de déclenchement d'une réponse prédéterminée sont connectés de façon opérationnelle à des moyens pour déli vrer la réponse prédéterminée.
Selon une caractéristique de 1 invention, les moyens pour délivrer la réponse prédéterminée sont sélec tionnés dans le groupe comprenant un dispositif d'admi nistration cardiaque localisée d'une thérapie utilisant un médicament, au moins une électrode de stimulation intracar- diaque, au moins une électrode de défibrillation intracar- diaque et un dispositif d'administration intracardiaque localisé d'une génothérapie.
Selon une caractéristique de l'invention, la condition prédéterminée du coeur est l'ischémie ou la car diomyopathie, et les moyens de contrôle et de détection comprennent en outre des moyens pour établir une distinc tion entre des ondes R de champ lointain ou des ondes R correspondant à un état d'ischémie ou de cardiomyopathie du coeur du patient, et des ondes R de champ lointain ou des ondes R correspondant à un état de non-ischémie ou non- cardiomyopathie du coeur du patient.
Selon une caractéristique de l'invention, les moyens de contrÔle-et de détection comprennent en outre des moyens pour établir une différenciation entre des signaux classés sur la base de paramètres d'ondes.
Par l'expression un temps court il faut entendre environ 14 jours.
L'invention a encore pour objet une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain à grandes cellules, dénommée H460M, exprimant la protéine fluorescente choisie dans le groupe constitué par : - la protéine fluorescente verte (GFP) [9,10], la protéine fluorescente bleue (BFP) [11], la protéine fluorescentejaune (RSGF ou EGFP) [12, 13], GFPUV [14, 13], ou - des variants dérivés de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, par addition, délétion ou substitution d'un ou plusieurs acides aminés, sous réserve que ces variants conservent la propriété de fluorescence, ou - des fragments de la GFP, la BFP, la RSGF, la EGFP, la GFPUV, ou des fragments des susdits variants, sous réserve que ces fragments conservent la propriété de fluorescence.
L'expression carcinome pulmonaire humain à grandes cellules peut être remplacée par carcinome pulmonaire humain indifférencié à grandes cellules et désigne des cellules tumorales, généralement de reconnaissance aisée, qui sont de très grande taille, dotées d'un noyau volumineux, fréquemment polylobé, monstrueux, nucléolé.
Selon un mode de réalisation avantageux, l'invention a pour objet une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain telle que définie ci-dessus et exprimant la protéine fluorescente verte GFP.
La lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain H460M, exprimant la protéine fluorescente verte GFP, sera dénommée clone H460MGFP , lignée cellulaire H460MGFP , ou H460MGFP .
Les cellules provenant de la lignée cellulaire H460M pourront être dénommées cellules H460M .
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire H460MGFP selon l'invention, est telle que déposée auprès de la Collection Nationale de Microorganismes (C. N.C.M) à Paris, le 23 juin 1999, sous le numéro I. 2242.
La lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain H460M, présente la particularité de métastasier de manière importante et spontanée dans les souris nude : ces métastases miment exactement le tropisme de celles observées chez l'homme au cours de cette pathologie.
Selon un mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire selon l'invention de carcinome pulmonaire humain H460M telle que définie ci-dessus, exprimant notamment la protéine fluorescente GFP, est caractérisée en ce qu'elle est : - stable pendant au moins 90 jours in vitro et pendant au moins 49 jours in vivo, - capable de former des métastases pulmonaires spontanées fluorescentes.
Le test in vitro permettant de vérifier la stabilité de la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain vis-à-vis de la protéine fluorescente est tel que décrit précédemment.
Le test in vivo permettant de vérifier la stabilité consiste à injecter H460MGFP, en une quantité d'environ 5.106 cellules, de façon sous-cutanée dans chaque flanc des souris nude athymique , à sacrifier lesdites souris à des temps variables, à exciser les tumeurs primaires, à récupérer et observer les poumons au microscope inversé à fluorescence. L'intensité de l'expression de la GFP permet de suivre la stabilité du gène de la GFP dans les cellules.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la lignée cellulaire selon l'invention de carcinome pulmonaire humain H460M telle que définie ci-dessus, exprimant la protéine fluorescente GFP, est caractérisée en ce qu'elle : - exprime de façon constitutive une protéine fluorescente, - est stable pour ladite protéine, - est capable de produire, après injection chez un animal et sans implantation orthotopique, un nombre important de métastases pulmonaires spontanées fluorescentes, variant d'environ 1 à environ 700, en un temps relativement court, variant d'environ 2 à environ 7 semaines après ladite injection chez l'animal, - exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable.
De façon avantageuse, la quantité de cellules injectées exprimant une protéine fluorescente, notamment H460MGFP, est d'environ 107 cellules par animal.
La présente invention a également pour objet une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce qu'elle exprime en outre au moins une protéine thérapeutique, notamment choisie dans le groupe constitué par les inhibiteurs de protéases tels que les protéines de la famille de l'inhibiteur inter-a de la trypsine, les protéines de la famille des métalloprotéases et leurs inhibiteurs, les protéines de la famille des cystéines protéases et leurs inhibiteurs, les protéines de la famille des aspartates protéases et leurs inhibiteurs, les protéines liant l'acide
hyaluronique (hyaladérines), ou dans le groupe des facteurs intervenant dans la néovascularisation et/ou la croissance tumorale, ou dans le groupe des protéines d'adhésion à la matrice extracellulaire.
Les inhibiteurs de protéases jouent un rôle protecteur important au cours de l'invasion tumorale en empêchant la protéolyse de dégrader la matrice extracellulaire (MEC). De ce fait, l'invasion tumorale est moins importante, ce qui limite la formation des métastases.
Après une électrophorèse réalisée avec 5 à 10 g d'ARN total dénaturé (sur un gel dénaturant à 1% en agarose), on fait un transfert de ceux-ci sur un filtre de Nylon (Hybond N Amersham) en présence de tampon phosphate. Le transfert dure une nuit à température du laboratoire et se fait grâce au phénomène de capillarité.
Préhybridation et hybridation.
La membrane est séchée durant 3 heures à 80 C avant l'hybridation pour fixer l'ADN, de manière irréversible.
Dans un sac plastique scellé (contenant la membrane) on introduit 10 ml de solution d'hybridation avec 150 l d'ADN de sperme de saumon dénaturé (2 min. à 80 C). On incube le sac 3 à 6 heures à 42 C sous agitation.
- Hybridation : On ouvre le sac avec précaution et on introduit 50 l de sonde dénaturée (2 min. à 80 C) et marquée au [alpha]32P-dCTP. On incube une nuit à l'étuve 42 C, sous agitation.
Lavages.
Après hybridation, le mélange est éliminé du sac plastique et le filtre est lavé dans différents bains : - 1 rinçage rapide dans une solution de 2XSSC à température ambiante.
- 1 rinçage dans une solution de 2XSSC à 65 C durant 45 min.
- 1 rinçage de 45 min. à 65 C sous agitation dans une solution de 2XSSC + SDS 0,5 %.
- 1 rinçage de 45 min. à 65 C sous agitation dans une solution de 0,2XSSC + SDS 0,5 %.
Révélation par autoradiographie.
Le filtre est ensuite séché et exposé pour autoradiographie sur film (Hyper film-MP, Amersham) dans une cassette avec un écran intensificateur. L'exposition dure de quelques heures à plusieurs jours à -80 C.
RESULTATS Les auteurs de la présente invention ont réalisé un criblage de la banque d'expression de cDNA sur le duodénum et le jéjunum de porc avec un antiserum anti sorbine. Ce criblage n'a pas permis de continuer la recherche dans cette banque. En revanche, l'amplification par RT-PCR en présence d'amorces dégénérées dans les régions les moins dégénérées, s'est révélée positive en donnant plusieurs fragments amplifiés à partir d'ARN de jéjunum et de duodénum . Tous ces fragments ont été clonés, séquences et comparés
avec les banques de données. Les auteurs de la présente invention ont fait varier les différents paramètres de la PCR pour optimiser la spécificité des amorces. Ceci a permis d'amplifier une partie de la séquence de la sorbine. Le fragment de la sorbine confirmé par séquençage a servi ensuite comme sonde pour cribler la banque d'expression réalisée à partir des même ARN. Plusieurs clones ont été purifiés et séquences.
Le clonage de l'ADNc de la sorbine a permis de rectifier la séquence protéique de la sorbine, dans sa région N terminale (fig. 1).
Le milieu réactionnel aqueux est préparé par addition de 12 g de H3P04, 58 mg de NaBr et 5 mg de Br2 dans 1 000 cm3 d'eau déminéralisée. Le réacteur est pressurisé par injection d'un débit choisi d'oxygène dans la phase gazeuse continue. La pression reste constante grâce à un régulateur de pression. Le milieu liquide est porté à la température choisie par circulation d'eau thermostatée dans le faisceau de tubes de refroidissement.
L'agitation est réglée à 1 900 t/min et des débits choisis d'oxygène et d'hydrogène sont injectés dans la phase liquide au centre de la turbine inférieure.
On mesure le débit et la teneur en hydrogène du mélange gazeux sortant du régulateur de pression. Après l'écoulement du temps de réaction prévu, on coupe l'arrivée d'hydrogène et d'oxygène dans le milieu réactionnel aqueux et on maintient l'injection d'oxygène dans la phase gazeuse continue jusqu'à disparition de l'hydrogène dans cette dernière. On coupe alors l'arrivée d'oxygène et on décomprime le réacteur.
La solution aqueuse de peroxyde d'hydrogène est pesée et séparée du catalyseur par filtration sur un filtre Millipore .
Cette solution est ensuite dosée par iodométrie pour déterminer la concentration en H202. La sélectivité en H202 est définie comme étant le pourcentage du nombre de moles d'H202 formées sur le nombre de moles d'H2 consommées.
Le taux de conversion est défini comme étant le pourcentage du volume d'H2 consommé sur le volume d'H2 introduit.
Les résultats catalytiques pour chaque essai sont résumés dans le Tableau I.
Enfin, les brevets US 5 128 114 et US 5 352 645 décrivent une méthode de préparation des catalyseurs à base de palladium ou platine- palladium supporté sur des microsphères uniformes, non-agglomérées et poreuses de silice, résistant â l'attrition grâce à l'utilisation de citrate d'ammonium ou d'urée comme additif et aptes à la fabrication directe du peroxyde d'hydrogène. L'exemple 12 du brevet US 5 128 114 décrit la préparation en deux étapes d'un catalyseur supporté contenant environ 0,05 % en poids de platine et 1 % en poids de palladium sur des microsphères poreuses de silice. Le support est d'abord préparé par atomisation d'un mélange de silice Ludox AS 40 et d'urée, puis calciné à 650 C sous azote. Ce support est ensuite ajouté à une solution de Pt et Pd, préalablement préparée par dissolution de H2PtC16 et PdCl2 dans l'eau, portée à une température comprise entre 60 et 70 C et acidifiée par de l'HCI concentré jusqu'à l'obtention d'un pH d'environ 1,2. Le mélange résultant est agité, puis atomisé et enfin, la poudre obtenue est réduite sous courant d'hydrogène à 300 C. La préparation du catalyseur supporté suivant l'exemple 15 du brevet US 5 352 645 est similaire à celle décrite à l'exemple 12 du brevet US 5 128 114 avec toutefois une différence. En effet, le mélange résultant, au lieu d'être atomisé, est séché sous vide à 100 C pendant toute une nuit, puis le solide séché est réduit sous courant d'hydrogène à 100 C. Des cristallites métalliques de l'ordre de 30 à 50 Â ont ainsi été obtenues.
La Société déposante a mis au point un catalyseur supporté à base d'au moins un métal choisi dans le groupe M formé de palladium, platine, ruthénium, rhodium, d'iridium, d'osmium, d'holmium et d'or et, en particulier, un catalyseur bimétallique supporté. Le catalyseur bimétallique supporté est en général constitué d'un métal du groupe M majoritaire et d'un métal du groupe M minoritaire. Le métal majoritaire représente environ 0,1 à 10 % en poids du catalyseur et de préférence entre 0,5 à 1 % en poids. Le métal minoritaire représente environ 0,001 à 0,1 % en poids du catalyseur et de préférence entre 0,01 et 0,05 %.
- On étale sur chaque lame une goutte de poly-L-lysine (à 1% diluée dans de l'eau distillée) à l'aide d'une autre lame comme un frottis. On fait sécher les lames à l'air (à l'abri de la poussière) et on les incube une nuit à l'étuve 60 C.
111-3- Préparation des coupes. a) Traitement du bloc.
On fait des coupes sériées avec le pancréas sain, le vipôme et le carcinoïde intestinal. Celles-ci sont réalisées au microtome à 3-4 m, avec un couteau jetable. Puis, elles sont recueillies sur les lames propres traitées à la poly-L-lysine, en déposant une goutte d'eau distillée stérile à la surface de celle-ci. Ensuite, on égoutte l'excès d'eau et on sèche 1 heure sur une platine chauffante. On incube les lames une nuit à l'étuve 60 C. Par la suite, on peut soit les traiter soit les conserver sur un portoir emballé dans de l'aluminium et mis à 37 C. b) Déparaffinage et réhydratation des coupes.
But : débarrasser le tissu du milieu d'inclusion.
Technique : les coupes sont plongées dans des bains d'alcool de degré croissant : - 3 fois 5 min. dans du xylène, - 2 fois 2 min. dans l'éthanol 100 , - 2 fois 2 min. dans l'éthanol 95 , - réhydratées 2 fois 5 min. dans du PBS (phosphate buffer saline à 150 mmol.l-1).
c) Prétraitements.
Ils servent essentiellement à améliorer le rapport signal/bruit de fond et la réponse d'hybridation. Il en existe un certain nombre dont : * Hydrolyse chimique.
But : elle permet de dénaturer l'ADN pour rendre l'ARNm plus accessible à la sonde.
Technique : On trempe les lames dans un bain-marie d'HCL 0,2N pendant 12 min. et on rince 2 fois 5 min. dans du PBS.
* Hydrolyse enzymatique à la protéinase K.
But : ce traitement permet la digestion de toutes les protéines, ce qui entraîne alors une perméabilisation du matériel et augmente la pénétration de la sonde dans le tissu.
Technique : les lames sont trempées dans 100 ml de protéinase K (à 10 g.ml-1 dans du Tris EDTA pH 7,4) pendant 10 min. à 37 C.
* Blocage des peroxydases endogènes.
* But : éviter l'interaction des peroxydases tissulaires avec l'utilisation de la strepatvidine peroxydase biotinylée, lors de la révélation.
Technique : les lames sont plongées 5 min. dans H202 (à 3% dans du PBS) et rincées 2 fois 5 min. dans du PBS. d) Contrôle par les RNases.
But : il s'agit de réaliser un témoin négatif qui permettra d'affirmer, lors de l'étude des résultats, que le signal observé sur les lames ne correspond pas à un artefact.
Dans ce premier mode de réalisation, le rebord 26-1 supérieur présente une ouverture 30-1.
La fiche 12-1 comprend un boîtier de forme conjuguée de celle de l'embase et prévue pour y pénétrer, ceci de façon connue. La fiche porte aussi une tête 32-1 qui reste extérieure à l'embase dans laquelle est reçue cette fiche, même après insertion totale.
Cette tête est munie de deux paires 34-1 de pions 36-1 d'insertion et de verrouillage dans ce premier mode de réalisation. Ces pions sont en saillie latéralement et alignés suivant une direction également perpendiculaire à la direction 24-1 d'insertion de la fiche.
L'étrier 14-1 a une forme en U, pris dans un plan perpendiculaire à la direction 24-1 générale d'insertion. On distingue deux branches 38-1 et 40-1 latérales et un fond 42-1.
Dans le mode de réalisation présenté, il est aussi ménage deux paires 44-1 de rampes 46-1. Ces rampes sont inclinées d'un angle donné par rapport au sens général d'insertion. Chaque rampe comporte une entrée 48-1 à son extrémité aval par rapport au sens 24-1 d'insertion et un logement 50-1 de verrouillage à son extrémité amont.
L'étrier comprend en outre des éléments de guidage 1, en l'occurrence quatre languettes 54-1.
L'étrier est mobile en translation suivant une direction indiquée par la flèche 56-1, perpendiculaire à la direction 24-1 générale d'insertion.
La mise en oeuvre de ce mode de réalisation est obtenue par la succession d'opérations décrites ci-après.
L'étrier est monté, généralement en fabrication, sur la fiche. A cet effet, les pions 36-1 des moyens d'insertion et de verrouillage sont introduits dans les entrées 48-1 de chacune des rampes 46-1 respectives. II est possible de prévoir là tout moyen susceptible de maintenir l'étrier en place, en position d'attente.
Dans cette position, l'ensemble fiche/étrier est approché de l'embase jusqu'à introduction de l'extrémité de la fiche.
Les deux languettes 54-1, amont, considérées dans le sens de déplacement de l'étrier, passent à travers l'ouverture 30-1 du rebord 26-1 supérieur de la rainure 22-1.
Les deux languettes 54-1 aval sont également dans l'alignement de cette rainure.
L'étrier peut alors être déplacé en translation suivant le sens de déplacement 56-1, ce qui force l'insertion de la fiche dans l'embase par le déplacement dans le sens 24-1 des pions 36-1 de la fiche, ceci par la forme même des rampes 46-1. Lorsque les pions 36-1 arrivent en pied de rampe, le déplacement la fiche par rapport à l'embase est terminé et l'insertion est totale.
L'étrier peut encore être déplacé par rapport à l'ensemble fiche/embase pour venir placer les pions dans les logements 50-1 de verrouillage.
La position finale du connecteur est représentée sur la figure 1 B.
Sur les figures 2A et 2B, on retrouve les éléments identiques avec l'indice "-2". Les différences d'agencement de ce mode de réalisation consistent en des éléments 52-2 de guidage différents dans la forme mais identiques dans la fonction puisqu'il s'agit non pas de languettes mais de pions 54-2.
L'un des buts de l'invention est de fournir un modèle in vivo mimant le développement de métastases pulmonaires, et permettant notamment de ne pas avoir recours à l'implantation orthotopique.
Un autre but de l'invention est de fournir un modèle in vivo permettant d'étudier les toutes premières étapes du développement et de la progression des métastases (micro-et macrométastases) pulmonaires.
L'invention a également pour but de fournir un modèle in vivo permettant une évaluation rapide et sensible (exacte) de l'efficacité d'agents thérapeutiques in vivo.
De façon générale, l'invention concerne une lignée cellulaire hautement métastasiante intégrant un gène rapporteur facilement détectable, et son utilisation pour fournir un modèle in vivo particulièrement approprié pour l'étude de la progression de métastases pulmonaires lors du cancer du poumon.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de la lignée cellulaire NCI-H460, présentant les propriétés suivantes : - elle exprime de façon constitutive une protéine fluorescente, - elle est stable vis-à-vis de ladite protéine, - elle est capable de produire, après avoir été injectée chez un animal, sans implantation orthotopique, des métastases pulmonaires, spontanées, fluorescentes,
- elle exprime la protéine fluorescente en quantité suffisante pour qu'une seule micrométastase présente chez ledit animal soit détectable, pour cribler de façon précoce des médicaments actifs sur des métastases pulmonaires.
Par lignée cellulaire , on entend une culture de cellule(s) immortalisée (s).
Par carcinome on entend une tumeur épithéliale maligne.
Par lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain , on entend une culture de cellule(s) épithéliale(s) pulmonaire (s) maligne (s) immortalisée (s) d'origine humaine.
La lignée cellulaire NCI-H460, décrite dans un premier temps comme une lignée cellulaire d'adénocarcinome (tumeur maligne développée au dépens d'un épithélium glandulaire), s'est révélée être une lignée de carcinome pulmonaire à larges cellules avec des propriétés neuroendocrines. Ladite lignée a été obtenue à partir d'un liquide pleural d'un patient atteint d'un cancer du poumon à larges cellules.
Une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, qui exprime de façon constitutive une protéine fluorescente signifie que le gène codant ladite protéine est intégré dans le génome de la cellule et est transmis de génération en génération. Le terme constitutif est utilisé à l'opposé de transitoire.
Une lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain est stable vis-à-vis de la protéine fluorescente qu'elle exprime, lorsque des cellules provenant de la lignée cellulaire de cancer humain du poumon ont été transfectées de façon stable par le gène codant ladite protéine fluorescente.
Un test permettant de vérifier la stabilité de la lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain vis-à-vis de la protéine fluorescente consiste à cultiver la ligné pendant plusieurs passages in vitro (environ 15passages pour une période d'environ 90 jours), sans antibiotique (géniticine, G418 sulfate, Life technologies) et vérifier régulièrement l'expression de la protéine GFP au microscope à fluorescence et la présence de l'ARNm de ladite protéine par le transfert d'ARN (Northem-blot).
La lignée cellulaire de carcinome pulmonaire humain, notamment dérivée de NCI-H460, exprimant une protéine fluorescente, est désigné dans ce qui suit soit par clone , soit par cellule transfectée par le gène de la protéine fluorescente .
Par métastase , on désigne les foyers secondaires d'une affection (par exemple telle que les cancers), disséminés par voie lymphatique ou sanguine à partir d'un foyer primitif. Selon l'invention, le terme métastase englobe les métastases présentes dans les différentes phases de développement d'une affection telle que le cancer et désigne aussi bien les micrométastases que les macrométastases.
Lors du développement d'une affection il y a, dans un premier temps, formation de micrométastases, puis dans un deuxième temps, formation de macrométastases : cellule (micrométastase) se multiplie pour donner une macrométastase (jusqu'à plusieurs millions de cellules).
Selon encore un autre mode de réalisation du dispositif selon l'invention, les moyens de calcul calculent en outre les grandeurs de modification pour modifier par addition les valeurs de base des premier et deuxième coefficients d'amortissement virtuel des amortisseurs virtuels latéraux et angulaires lorsque la différence maximale entre les accélérations latérales vers la gauche et vers la droite de la caisse du véhicule pendant la moitié d'une période de cycle d'un roulis harmonique de la caisse du véhicule dépasse une valeur de seuil prédéterminée à cet effet.