INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
7) Analyse en Immunoblot : Le transfert des protéines des gels de polyacrylamide aux membranes de nitrocellulose (BA 85 ; Schleicher & Schuell) a été réalisé par la méthode de Towbin et al. (8). Après immobilisation, la HBHA native, la HBHA recombinante, de même que les versions tronquées de la HBHA recombinante, la MBP et les protéines de fusion MBP-HBHA ont été testées avec des sérums humains dilués 100 fois, des anticorps monoclonaux anti-HBHA murins purifiés (mABs), du sérum de rat antiHBHA dilué 500 fois ou du sérum de lapin anti-MBP dilué 10. 000 fois. Les immuns complexes sont développés avec des anticorps de chèvre marqués à la phosphatase alcaline et dirigés contre les immunoglobulines G humaines, murines, de rat, de souris ou de lapin (ProtoBlot System ; Promega, Madison, Wis. ). Pour établir l'influence du dextrane (500 kDa, Sigma), du sulfate de dextrane (500 kDa, Sigma) et de l'héparine (3 kDa, Sigma) sur l'immunoréactivité des anticorps monoclonaux anti-HBHA, des membranes de nitrocellulose portant les antigènes immobilisés sont
incubées à température ambiante pendant une heure dans du PBS contenant 500 g/ml du polysaccharide à analyser. Après deux lavages pour enlever le polysaccharide non lié, les membranes sont testées avec des anticorps monoclonaux anti-HBHA, et développées comme décrit cidessus.
8. Concentrationsprotéiques : Les concentrations protéiques sont déterminées selon la méthode de Bradford (9) en utilisant l'albumine sérique bovine comme référence.
9. Plasmides utilisés dans cette étude : Tableau 1 :
Plasmide Caractères essentiels et origine pKK388-1 Vecteur d'expression contenant le promoteur trc et les séquences d'opérateur Ampr et TETr (Clontech) pKK-HBHA pKK388-1 contenant le gène codant la HBHA de M. bovis BCG HBHA et placé sous le contrôle du promoter trc (1) pET-24d (+) Vecteur d'expression contenant le promoteur T7, Kmr (Novagen) pET-HBHA pET-24d (+) contenant le gène codant la HBHA de M. bovis BCG et placé sous le contrôle du promoteur T7 (cette étude). pET-HBHA#C pET-HBHA délété des codons correspondant aux acides aminés 161 à 199 de la HBHA (cette étude). pET-HBHA#C+3R1 pET-HBHA délété des codons correspondant aux acides aminés 179 à 199 de la HBHA (cette étude).
pET-HBHAAC+2R1 pET-HBHA délété des codons correspondant aux acides aminés 173 à 199 de la HBHA (cette étude). pET-HBHA#C+1R1 pET-HBHA délété des codons correspondant aux acides aminés 167 à 199 de la HBHA (cette étude). pMAL-c Vecteur d'expression contenant le gène E. coli malE codant la MBP et placé sous le contrôle du promoteur tac, AmpR (New England Biolabs) pMAL+3R1+2R2 pMAL-c contenant une forme de fusion entre le gène malE codant et les codons 161 à 199 du gène codant la HBHA de M. bovis BCG pMAL+1R1+2R2 pMAL-c contenant une fusion en phase entre le gène malE et les codons 173 à 199 du gène codant la HBHA de M. bovis BCG.
10. Amorces PCR utilisées dans les expériences ci-après : Les séquences des oligonucléotides utilisées pour réaliser des amplifications par PCR de la partie 3' du gène de la HBHA de même que les fusions entre le gène codant la MBP de E. coli et les séquences codant les motifs R1 et R2 de la HBHA, et les protéines de fusion entre la protéine MBP de E. coli et les motifs R1 et R2 de la partie carboxyterminale de la HBHA sont donnés dans le tableau 2 ci-dessous ; les séquences de reconnaissance correspondant aux enzymes de restriction utilisées pour cloner les produits de PCR sont soulignées.
Tableau 2 :
Amont de HBHA (5') ATCTGTGTGGGCACTCGACCG (3') HBHAAC (Sacl) (5') TATAGAGCTCAGGCAGCTCGATGCCGACCAGCTTGGCG (3') HBHAAC + 1 R 1 (Sacl) (5') TATACGAGCTCCTAGGCCGGAGCGGCCTTCTGGCCGGA (3') HBHAAC +2/3 R1 (Sacl) (5') TATAGAGCTCCTAGGCCGGAGCAGCCTTCTTAGGCAGC (3') Amont E4 (EcoRI) (5') ATATGAATTCAAGAAGGCTGCTCCGGCCAAGAA (3') Aval E4 (Pstl) (5') CTCACGCCTGCAGACTATGCGGTTTGC (3')
II. RESULTATS EXPERIMENTAUX : A. Détermination des propriétés des motifs R1 et R2 de la HBHA native et recombinante : 1) Le sulfate de dextrane protège la HBHA recombinante d'une dégradation protéolytique rapide. Quand le gène codant la HBHA est exprimé dans E. coli XL1-Blue, la protéine recombinante est rapidement dégradée par digestion protéolytique, essentiellement au niveau de la région carboxyterminale qui contient les motifs répétés riches en lysine, c'est-à-dire les motifs R1 et R2 (1). Dans la mesure où la dégradation de la partie carboxyterminale de la HBHA recombinante est corrélée avec une réduction de l'affinité à l'héparine, elle suggère fortement une implication de ces motifs répétés dans l'interaction entre la protéine et les polysaccharides sulfatés. Afin de tester cette hypothèse et en même temps tenter de réduire la dégradation carboxyterminale de la HBHA, du sulfate de dextrane ou du dextrane est ajouté à la concentration de 500 g/ml à un lysat de E. coli XL1-Blue (pKK-HBHA) préparé à partir d'une culture
préalablement induite à l'IPTG. Comme indiqué dans la figure 1, le sulfate de dextrane, et non le dextrane, protège partiellement la rHBHA de la protéolyse au cours d'une incubation du lysat bactérien à 37 C. Cette observation suggère que, par sa liaison à l'extrémité carboxyterminale de la rHBHA, le polysaccharide sulfaté peut masquer les sites de clivage protéolytiques existant dans la séquence HBHA. Il a également été observé que la diminution de la concentration en sulfate de dextrane est corrélée avec une réduction de l'effet protecteur. En revanche, dans des conditions similaires, aucune inhibition de la dégradation de la HBHA n'est observée en utilisant l'héparine de 3 kDa, même à une concentration de 1 mg/ml. Ceci indique que la longueur des polysaccharides sulfatés peut être importante dans la protection de la rHBHA contre la dégradation protéolytique.
2) La rHBHA produite à un niveau élevé dans une souche de E. coli déficiente en protéases est beaucoup moins sensible à la dégradation protéolytique.
Pour limiter la dégradation de la rHBHA, la protéine a été produite sous le contrôle du promoteur T7 dans E. coli BL21 (DE3), souche défective pour la synthèse de la protéase cytoplasmique Lon ainsi que la protéase de membrane externe OmpT. Un fragment de restriction Ncol- Hindlll de 643 bp provenant du plasmide pKK-HBHA a été ligaturé dans le plasmide pET-24d+ préalablement digéré avec Ncol et Hindlll. Le plasmide résultant nommé pET-HBHA a été utilisé pour transformer E. coli BL21 (DE3) et la production de rHBHA fut induite par l'addition d'IPTG. La figure 2 montre les résultats obtenus en SDS-PAGE à partir de lysats cellulaires induits à l'IPTG et incubé à 37 C pendant 24 heures. Aucune dégradation significative de HBHA n'est observée pendant les 4 premières heures d'incubation alors que dans les mêmes conditions, toute la HBHA exprimée dans E. coli XL1-Blue est dégradée en un peptide de 19 kDa (1). Après 24 heures d'incubation à 37 C, moins de 50 % de la rHBHA est clivée dans
Puis la présence du gène incorporé dans les cellules transformées a été confirmée par transfert de Southern (Fig. 6). Dans la Fig. 6, chaque piste indique les échantillons suivants : W : eau seulement N : cellules Oc du riz non transformées AI-A4: cellules transformées antisens S1-S4: cellules transformées sens P : vecteur d'expression seulement Dans la Fig. 6, une bande de 0,5 kb qui correspond au gène OsPSK incorporé a été identifiée dans les cellules transformées sens S1-S4 et dans les cellules transformées antisens A2. La bande de l,6kb qui correspond au gène OsRacl endogène (gène de l'actine du riz qui existe de manière endogène dans les cellules Oc et qui est utilisé comme gène témoin du fait de son expression constitutive) a été observée dans les cellules transformées sens et dans les cellules transformées antisens.
La modification de l'expression du gène OsPSK qui se produit pendant la période de culture a été analysée par analyse par transfert de Northern exécutée par hybridation avec un ADNc de longueur intégrale marqué à 60 C. Dans la Fig. 7, la piste 1, la piste 2, la piste 3 et la piste 4 indiquent les résultats au bout de 3 jours, 7 jours, 10 jours et 14 jours, respectivement. Les résultats dans la Fig. 7 montrent que le gène OsPSK a été exprimé de façon continue dans les cellules Oc cultivées en fournissant PSK de manière continue et a permis aux cellules de proliférer rapidement. Surtout, le gène OsPSK a été exprimé le plus abondamment au bout de 10 à 14 jours. L'expression du gène OsPSK dans les cellules transformées a été confirmée dans la Fig. 8. L'expression du gène OsPSK dans les cellules transformées sens de la piste 1 a augmenté par rapport à celle des cellules non transformées (piste 3). D'autre part, l'expression dans les cellules transformées antisens diminuait (voie 2). De plus, la configuration de l'expression a été examinée sur un plant de riz (Fig. 9). La configuration montrée dans les pistes 1,2, 3,4, 5 indique les résultats pour la première feuille, la deuxième feuille, l'extrémité de la pousse, la racine latérale et la racine de la graine, respectivement. Une expression significative du gène dans l'extrémité de la pousse et la racine de la graine et une expression moindre dans les feuilles sont montrées dans la Fig. 9. Ces résultats indiquent que les régions à croissance active présentent une expression abondante du gène OsPSK.
Finalement, une analyse par transfert de Southern a été exécutée après traitement avec différentes enzymes de restriction. Les enzymes de restriction utilisées pour le traitement enzymatique de la Fig. 10 étaient Bam HI (Ba), Eco RI (Ec), Xba 1 (Xb) et Xho I (Xh). De multiples petites bandes ont été observées dans l'échantillon traité avec EcoR I, ce qui indique que le gène OsPSK peut appartenir à une famille de gènes multiples. Cependant, les multiples bandes qui s'hybrident issues de la digestion avec Eco RI ont pu être attribuées aux sites de restriction trouvés dans l'ADNc OsPSK. Pour le vérifier, le transfert a été testé de nouveau avec un fragment de 300 paires de bases provenant de l'extrémité 5 ' de l'ADNc OsPSK. Comme prévu, seule une bande (3,7 kilopaires de bases) s'est hybridée.
Par conséquent, il apparaît que la préprophytosulfokine est codée par un seul gène et non pas par des gènes multiples.
Pour déterminer si des homologues d'OsPSK sont trouvés dans d'autres espèces végétales, une analyse par transfert de Southern a été exécutée après un traitement avec des enzymes de la restriction comme décrit dans la Fig.
10. Les enzymes utilisées pour le traitement de la Fig. 11étaient Bam HI (Ba) et Eco RI (Ec), respectivement. Une analyse par transfert de Southern a été exécutée sur l'ADN génomique de quatre espèces dont on sait qu'elles produisent PSK, à savoir Arabidopsis thaliana (colonne 1), Asparagus officinalis (colonne 2), Daucus carota (colonne 3), et Zinnia elegans (colonne 4). Des homologues d'OsPSK ont été détectés dans les quatre espèces comme montré dans la Fig. 11, ce qui indique que le gène OsPSK est conservé dans les monocotylédones et les dicotylédones. Par conséquent, on suppose que l'incorporation du gène OsPSK est efficace dans différentes espèces de plantes.
Liste de séquences nom du demandeur : de l'université de Nagoya titre de l'invention : précurseur de phytosulfokine, gène le codant, cellule végétale contenant ce gène et procédé pour stimuler la prolifération des cellules végétales nombre total de séquences : 2 séquence n . 1 longueur de la séquence : acides aminés type de séquence : aminés organisme : cellule Oc de Oryza sativa L.
séquence:
MVNPGRTARA LCLLCLALLL LGQDTHSRKL LLQEKHSHGV GNGTTTTQEP SRENGGSTGS 60 NNNGQLQFDS AKWEEFHTDY IYTQDVKNP 89 séquence n . 2 longueur de la séquence : 725 bases type de séquence : organisme : cellule Oc de Oryza sativa L.
séquence: GAAGAAGCAG CAGCAAAAAA GTTGATCAGT TAATTAGCAA GTGTGTTCTT CTTTCTTTTG 60 GTGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGATCTCAG AATGGTGAAT CCAGGAAGAA 120 CAGCTAGGGC ACTCTGCCTC CTATGCCTTG CTCTCCTCCT GCTAGGTCAA GATACCCATT 180 CCAGGAAGCT CCTGTTGCAG GAGAAGCACA GCCATGGCGT CGGCAACGGC ACAACCACCA 240 CCCAGGAACC AAGCAGAGAG AATGGAGGAA GTACAGGTTC CAATAACAAT GGGCAGCTGC 300 AGTTTGATTC AGCCAAATGG GAAGAATTCC ACACGGATTA TATCTACACC CAAGATGTCA 360 AAAACCCATA ATGGCTGTTC ATTTATGATT TGAACTAGTA CTAGTAGCTT ATACCTTCTG 420 CGCGTCTTTT GTTCGTTTGG AGAGGGGATT TTCTTGGGAT TTAGCATATG AACTAATTAA 480 ATTAAATCCC AGGCAAATCC CACTCAGCCC ATTTTGTGCA GAAGTTGTCA GTGTGCACTG 540 TATAATTATT TAGTCATACA CAACTACTCC TGGTAACTAC TCCTATCTTC GATGAATTTT 600 CTGGTTTTGC CAGACGTGAC AATAGTCCAG TAGCATGCAG TACCCTCTCA GAATCCCTGT 660 AATTTTTAGC AAAAAAAAAA GGAAGAAAAG AAAAGAAGCT TCCCTACTAA AAAAAAAAAA 720 AAAAA 725
PROMOTEURS CHIMERIQUES D'EXPRESSION, CASSETTES D'EXPRESSION, PLASMIDES, VECTEURS, PLANTES ET SEMENCES TRANSGÉNIQUES LES CONTENANT ET LEURS METHODES D'OBTENTION.
[DESCRIPTION] La présente invention concerne des promoteurs chimériques d'expression, destinés notamment à une mise en oeuvre dans le domaine de la biotechnologie végétale.
De manière générale, les promoteurs d'expression sont connus dans le domaine de la biotechnologie et de la manipulation génétique. S'agissant plus particulièrement de la biotechnologie végétale, le taux d'expression d'un gène codant pour un polypeptide à produire dans une cellule hôte est souvent dépendant du promoteur utilisé. Les différents promoteurs utilisés couramment sont souvent limités à des applications ou des tissus particuliers, en raison de leur spécificité tissulaire ou puissance d'expression. On peut, par exemple, citer le promoteur 35S du virus de la mosaïque du chou-fleur comme un promoteur relativement fort, comparé par exemple au promoteur provenant du gène nos, ces deux promoteurs étant plus particulièrement utilisés dans le domaine de la biotechnologie végétale. Il existe donc un besoin pour de nouveaux promoteurs permettant de pallier les inconvénients de la mise en oeuvre des promoteurs actuels.
Une tentative de combler ce besoin a été rapportée dans la demande de brevet PCT, publiée sous le numéro WO 97/20056, qui décrit l'augmentation du taux d'expression géniques, en utilisant des "enhancers", (c'est-à-dire ayant un effet positif sur l'activité d'un promoteur), dans des promoteurs connus. Les séquences nucléotidiques des "enhancers" sont riches en bases A et T, la quantité totale de ces bases constituant plus de 50% de la séquence nucléotidique de "l'enhancer". En particulier, les déposants de cette demande préconisent l'utilisation d'une zone "enchancer" provenant du promoteur de la plastocyanine du pois.
Les expressions utilisées dans la description et les
revendications ont la signification suivante : - "acide nucléique" signifie ADN ou ARN ; - "séquence d'acide nucléique" signifie un oligomère ou polymère, simple ou double brin, de bases nucléotidiques lues à partir de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', et comprend des plasmides autoréplicants, des gènes, des polymères d'ADN, ou d'ARN, infectieux ou non, et de l'ADN, ou l'ARN, fonctionnel ou non-fonctionnel. Dans la notation nucléotidique utilisée dans la présente demande, sauf mention particulière, l'extrémité gauche d'une séquence nucléotidique simple brin est l'extrémité 5' ; - "séquence d'acide nucléique dérivée" signifie que la séquence dérive directement ou indirectement de la séquence à laquelle il est fait référence, par exemple par substitution, délétion, addition, mutation, fragmentation, et/ou synthèse d'un ou plusieurs nucléotides ; - "promoteur" ou "séquence d'acide nucléique promotrice" signifie une région d'acide nucléique en amont du codon de démarrage de la traduction et qui est impliquée dans la reconnaissance et la liaison de l'ARN polymérase et d'autres protéines pour la transcription ; - "promoteur végétal" est un promoteur capable d'initier la transcription dans des cellules végétales ; - "promoteur constitutif" est un promoteur capable d'exprimer des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans tous ou pratiquement tous les tissus de l'organisme hôte pendant tout le développement dudit organisme ; - "promoteur tissulaire spécifique" est un promoteur capable d'exprimer de manière sélective, des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans certains tissus spécifiques de l'organisme hôte ; - "liées de manière opérationnelle" signifie la liaison du promoteur, à la séquence d'acide nucléique, ou gène, à exprimer qui code pour une protéine à produire, de telle sorte que le promoteur influence positivement la transcription de la séquence
Après transformation de E. coli BL21 (DE3), la production des protéines recombinantes est induite par addition d'IPTG et analysée par SDS-PAGE et immunoblot avec l'anticorps monoclonal 3921 E4 ; les résultats sont présentés dans la figure 4.
Toutes les versions tronquées dans l'extrémité carboxyterminale de la rHBHA présentent une discordance entre leur poids moléculaire calculé et leur poids moléculaire apparent, ce qui confirme que les séquences répétées ne sont pas impliquées dans la migration électrophorétique aberrante déjà décrite dans (1). Le tableau 3 ci-dessous présente de manière comparée quelques propriétés des HBHA native, rHBHA, rHBHAAC, rHBHAAC + 3R1, rHBHAAC + 2R1, rHBHAAC + 1R1. Sont ainsi comparés la réactivité avec l'anticorps monoclonal 3921 E4, l'affinité pour l'héparine, le poids moléculaire calculé, le poids moléculaire apparent et la stabilité dans un lysat de E. coli BL21.
Tableau 3 :
HBHA rHBHA (b) rHBHA#C rHBHA#C rHBHA#C rHBHA#C +3R1 (c) + 2R1 (d) + 1 R1 (e) (f) Réactivité +++ +++ +++ + avec mAB 3921 E4 Affinité pour 300 mM 300 mM 100 mM 20 mM l'héparine (g) poids molé- 21,4 21,4 19,4 18,7 18,4 17,4 culaire calculé (kDa)
poids molé- 28 27 27,2 26,6 26 25,4 culaire apparent (kDa) Stabilité +++ +++ dégrada- dégrada- dégrada- +++ dans un tion par- tion par- tion parlysat de E. tielle tielle tielle coli BL21 (DE3) (a) HBHA native purifiée à partir du supernageant de culture M. bovis BCG (b) HBHA recombinante produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHA) (c) HBHA recombinante produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHAAC+3R1 ) (d) HBHA recombinante produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHAAC+2R1 ) (e) HBHA recombinante produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHMC+1R1) (f) HBHA recombinante produite par E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHMC) (g) concentration en NaCI requise pour supprimer toute interaction entre la protéine et une matrice d'héparine-sépharose équilibrée avec PBS.
Il apparaît clairement à l'examen de ce tableau que la rHBHAAC avec 1 à 3 motifs à R1 est moins stable dans E. coli BL21 (DE3) dans la mesure où une dégradation protéolytique significative de ces polypeptides recombinants est observée. Ceci indique que les séquences manquantes (motifs R2 et séquence VTQK) jouent un rôle protecteur contre la protéolyse (voir également figure 4, lignes C, D et E). L'analyse en immunoblot révèle que l'anticorps monoclonal 3921 E4 est incapable de reconnaître la rHBHAAC + 1 R1 et montre une faible réactivité avec rHBHAAC +2R1. Cependant, la réactivité de l'anticorps monoclonal 3921 E4 avec la rHBHAAC + 3R1 est au moins égale à celle observée avec la rHBHA entière. Ceci suggère que l'anticorps 3921 E4 reconnaît un épitope à cheval sur deux motifs R1 successifs.
Quand on mesure l'affinité de ces différentes constructions avec l'héparine immobilisée, il apparaît que rHBHAAC + 1 R1 comme rHBHAAC
n'est plus capable de se lier à l'héparine sépharose. En revanche, si deux motifs R1 sont présents, une faible affinité pour l'héparine est observée puisque le polypeptide (hybride) rHBHAAC + 2R1 se lie à l'héparine immobilisée mais le lien est complètement aboli par l'addition de 20 mM NaCI dans le tampon d'équilibrage. Il est enfin observé (voir tableau 3) que le passage de 2 à 3 motifs R1 permet d'augmenter significativement l'affinité pour l'héparine immobilisée puisque le décrochage de la rHBHAAC + 3R1 nécessite l'addition de 100 mM NaCI au tampon d'équilibrage. Ces résultats indiquent que le motif R1 est impliqué dans la liaison de la HBHA à l'héparine mais n'est pas suffisant pour conférer une affinité équivalente à celle de la rHBHA non tronquée.
B. 1. Production de protéines de fusion entre la MBP (Maltose Bindinq Protein) de E. coli et les motifs répétés R1 et R2 de la HBHA : Afin de déterminer si tous les déterminants moléculaires requis pour la liaison à l'héparine de la HBHA sont localisés dans la partie carboxyterminale de la molécule, les acides aminés 161 à 199 de la HBHA furent génétiquement fusionnés à l'extrémité carboxyterminale de la MBP de E. coli qui est incapable de se lier à l'héparine (10). Dans un premier temps, la région 3' du gène HBHA codant pour les motifs répétés a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pKK-HBHA en utilisant les oligonucléotides "Amont E4" et "Aval E4" (voir point 1. 9 du chapitre matériel et méthode). 35 cycles de dénaturation (1 min. à 94 C), hybridation (1 min. à 62 C), et extension (1 min. à 72 C) ont été réalisés.
Dans la mesure où l'oligonucléotide "Amont E4" a 2 sites d'hybridation sur l'ADN matrice, la PCR génère 2 produits de 222 bp et de 186 bp qui correspondent aux acides aminés 161 à 199 (3R1 + 2R2) de la HBHA, d'une part et 173 à 199 (1R1 + 2R2), d'autre part. Après digestion avec Eco-R1 et Pst-1, les fragments PCR sont ligaturés entre les sites Eco-R1 et Pst-1 du plasmide pMAL-c, générant ainsi les plasmides recombinants pMAL + 3R1 + 2R2 et pMAL + 1R1 + 2R2 qui sont utilisés pour transformer
les souches E. coli B834 et E. coli XL1-Blue.
Les productions des protéines de fusion MBP + 3R1 + 2R2 et MBP + 1 R1 + 2R2 sont induites comme précédemment par addition d'IPTG, et celles-ci sont analysées par SDS-PAGE et Immunoblot.
Le tableau 4 ci-dessous résume les résultats obtenus.
Tableau 4 :
HBHA native MBP (a) MBP+3R1+2R2 MBP+1R1+2R2 (b) (c) Réactivité avec - +++ +++ +++ le sérum antiMBP Réactivité avec +++ - +++ +++ mAB 3921 E4 Affinité pour 300 mM - 300 mM 100 mM l'héparine (d) Poids 21,3 50,5 45,9 44,7 moléculaire calculé (kDa) Poids 28 51 (e) 45 (e) 44 (e) moléculaire apparent (kDa) a) protéine de fixation du maltose (MBA) lié codée par pMAL-c b) protéine de fusion codée par pMal +3R1+2R2 c) protéine de fusion codée par pMal +1 R1+2R2 d) concentration de NaCI requis pour supprimer l'interaction avec de l'héparine- sépharose équilibrée avec du PBS e) poids moléculaire observé quand le protéine recombinante est produite par E. coli B834.
Lorsque le polypeptide hybride est produit dans E. coli B834, souche, nous le rappelons, qui est déficiente pour la synthèse des protéases Lon et OmpT, MBP+3R1+2R2 et MBP+1R1+2R2 ont un poids
La figure 4 représente également un gel SDS-PAGE et des analyses en immunoblot de formes recombinantes de HBHA présentant différentes délétions dans les motifs R1 et R2 de la partie
carboxyterminale. La ligne A représente un lysat de E. coli BL21 (DE3) (pET24d+) et constitue donc le témoin n'exprimant pas de HBHA. La ligne B est un lysat cellulaire de E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHA) exprimant la HBHA recombinante complète. La ligne C montre un lysat cellulaire de E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHAAC+ 3R1) exprimant une forme recombinante de HBHA ne possédant que les 3 motifs R1 de son domaine C-terminal.
La ligne D représente le résultat obtenu avec un lysat cellulaire des bactéries recombinantes exprimant HBHA A C + 2R1 (pET-HBHA A C + 2R 1). La ligne E est l'équivalent des précédentes sauf que un motif R1 a été ajouté (pET-HBHAAC + 1R1). La ligne F représente le lysat cellulaire des cellules E.coli BL21 (DE3) exprimant HBHAAC, c'est-à-dire qu'aucun motif R1 n'est exprimé. L'ensemble de ces lysats est obtenu à partir de cultures induites par l'IPTG. L'immunoblot utilise l'anticorps monoclonal 3921 E4.
Les poids moléculaires en kDa sont exprimés sur la ligne de gauche.
La figure 5 représente une analyse en SDS-PAGE de la maltose binding protein (MBP, ligne A) et de deux protéines hybrides entre la MBP et la partie carboxy-terminale de la HBHA (MBP + 3R1 + 3R2, ligne B et MBP + 1 R1 + 2R2, ligne C).
La ligne D représente le résultat obtenu avec E. coli BL21 (DE3) (pET-HBHAAC+2R1) exprimant une forme recombinante de HBHA ne possédant pas 2 motifs R1 de son domaine C-terminal.