INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'élimination de l'excès, par exemple d'acide chlorhydrique (si X = Cl), peut se faire par évaporation c'est-à-dire que l'on élimine du mélange TaCl5, l'excès d'acide chlorhydrique et l'éthanol par évaporation sous pression réduite, par exemple 10-2 mbar. On obtient un solide blanc correspondant à du TaCl2(OEt)3, le résidu est ensuite partiellement redissous dans l'éthanol pour donner une solution par exemple de 5 à 10%, de préférence à 7 % en équivalent massique Ta205. La dissolution est totale après par exemple un reflux de 4 heures à 800C. Après filtration du mélange, on obtient une solution limpide et transparente de pH voisin de 2.
Exemple 1 : Préparation de vésicules NxlD de composition DOGS/cardioliine.
1 mg de lipopolyamine cationique DOGS solubilisé dans l'méthanol est évaporé jusqu'à séchage dans un tube en verre borosilicaté à fond rond sous rotation. Le film lipidique sec obtenu est resuspendu dans 50 F1 d'une solution de cardiolipine dans méthanol (10 mg/ml). Le rapport DOGS/cardiolipine est de 0.5. La resuspension est favorisée par une légère agitation et par chauffage du tube dans un bain à 30-50 C pendant 15 min. Ensuite 350 1ll d'eau desionisée et stérile sont ajoutés rapidement à la solution lipidique et le mélange est légèrement agité par vortex. La préparation peut être stockée à 4C .
Exemple 2 # Préparation de Neutraplexe Nx1D/pDNA de composition DOGS/cardiolilDine/pDNA.
Une préparation DOGS/cardiolipine est diluée au tiers dans une solution 150 mM NaCl (25 Cil de préparation dans 50 ,ul de solution 150 mM NaC1) et laissée à température ambiante pendant 15 min. 30 Ag de pDNA dilué dans un tampon (60 ,ul) sont ajoutés rapidement à la préparation et le mélange est légèrement agité puis homogénéisé. La préparation de lipoplex ainsi obtenue est incubée une heure à température ambiante et stockée à 4C . Les complexes ainsi obtenus sont de charge neutre : ce sont des Neutraplexes.
Exemple 3 : Préparation de vésicules Nx2D de comnosition DOGS/DOPE/cardiolipine.
1 mg de lipopolyamine cationique DOGS et 1 mg de DOPE solubilisés dans ltéthanol sont évaporés jusqu'à séchage dans un tube en verre borosilicaté à fond rond sous rotation. Le film lipidique sec obtenu est resuspendu dans 50 1ll d'une solution de cardiolipine dans l'éthanol (10 mg/ml). Le rapport poids DOGS/DOPE/cardiolipine étant de 1/1/0.5. La resuspension est favorisée par une légère agitation et par chauffage du tube dans un bain à 30-50 C pendant 15 min. Ensuite 350 l d'eau desionisée et stérile sont ajoutés rapidement à la solution lipidique et le mélange est légèrement agité par vortex. La préparation peut être stockée à 4CO Exemple 4 : Préparation de Neutratlexes Nx2D/pDNA de comtosition DOGS/DOPE/cardiolisine/sDNA.
Une préparation DOGS/DOPE/cardiolipine est diluée au tiers dans une solution 150 mM NaCl (25 A1 de préparation dans 50 A1 de solution 150 mM NaCl) et laissée à température ambiante pendant 15 min. 30 Ag de pDNA dilué dans un tampon (70 F1) sont ajoutés rapidement à la préparation et le mélange est légèrement agités puis homogénéisé. La préparation de lipoplex ainsi obtenu est incubée une heure à température ambiante et stockée à 4CO. Les complexes ainsi obtenus sont de charge neutre. Si plus 30 Fg de pDNA sont ajoutés, les complexes sont de charge négative.
Exemple 5 : Optimisation de la formulation des Neutraplexes.
Plusieurs types de formulations ont été testés pour obtenir une suspens ion stable et homogène de vésicules résultant du mélange d'un lipide cationique (DOGS) et d'un lipide anionique (cardiolipine = CL). Les formulations comparées sont: A = Suspension film lipidique dans l'eau.
B = Suspension film lipidique dans 1 'éthanol.
C = Mélange de lipides cationiques et anioniques dans une solution éthanolique.
D = Suspension film lipide cationique avec une solution éthanolique de lipide anionique Le tableau 1 ci-dessous rapporte les résultats obtenus à partir des formulations ci-dessus en utilisant divers lipides et une concentration fixe d'ADN de 30 Ag d'ADN/60 g de DOGS.
Lipides Rapport Formulation Suspension Suspension lipides vésicules des des vésicules Neutraplexes DOGS/CL 1/1 A impossible impossible B impossible impossible 1/0,5 A impossible impossible B aggrégation impossible C mauvaise impossible solubilité D oui oui 1/0,2 A impossible impossible D oui oui C C oui Non déterminée DOGS/DOPE 1/1/1 A impossible impossible /CL B a ré ation impossible 1/1/0,5 A impossible impossible B aggrégation impossible D oui oui 1/1/0,2 D oui oui 1/1/0,1 D oui oui Le tableau 1 montre que seulement la formulation D, consistant à ajouter de la cardiolipine dans une solution éthanolique (EtOH) à un film lipidique sec de lipide cationique permet l'obtention d'une suspension de vésicules et la formation de Neutraplexes stables et homogènes in fine.
Exemple 38 : 5-éthyl-9-fluoro-4,5-dihydro-5-hydroxy-10-méthyl- 12-morpholinométhyl-1H oxepino[3',4' :6,7]indolizino[1,2-b]quinoléine- 3,15(4H,13H)-dione On applique à la 3-fluoro-4-méthylaniline la procédure décrite par les exemples 30.a., 30.b. et 30.c. pour donner du 2-chloro-4-chlorométhyl-7-fluoro-6-méthyl- 3-quinoléinecarboxylate d'éthyle qui est traité selon la procédure de l'exemple 30.d., en utilisant la morpholine au lieu de la N-méthylpipérazine, puis réduit selon la méthode de l'exemple 30.e. en quinoléineméthanol correspondant. Ce dernier est couplé au composé (M) comme décrit dans l'étape 11.j. de l'exemple 11. Le produit de couplage résultant est cyclisé selon la procédure de l'étape 11.k. On obtient un solide jaune, p.f. > 260 C.
RMN-1H (DMSO + CDC13): 1,00 (t, 3H); 2,02 (q, 2H); 2,57 (s, 3H); 2,60 (s, 4H); 3,23 (d, 1H); 3,45 (d, 1H); 3,75 (s, 4H); 4,11 (s, 2H); 5,44 (s, 2H); 5,47 (d, 1H); 5,65 (d, 1H); 7,62 (s, 1H); 7,73 (d, 1H); 8,24 (d, 1H).
RMN-C13 (CF3CO2D) : 8,35 ; 13,93 ; 16,01; 22,24 ; 25,29 ; 38,18 ; 43,42 54,19; 56,04; 56,74; 64,16; 65,09 ; 77,48 ; 108,29; 108,57; 128,07 ; 128,70; 129,90; 135,64; 138,03; 139,86; 141,10; 141,56; 147,78; 158,30; 161,87; 178,72.
IR (KBr) 117; 1609; 1654; 1750; 3437.
Exemple 39 : 5-éthyl-9-fluoro-4,5-dihydro-5-hydroxy-10-méthyl 12-piperidinométhyl-1H-oxepino [3',4':6,7] indolizino [1,2-b] quinoléine-3,15(4H,13H)-dione On applique à la 3-fluoro-4-méthylaniline la procédure décrite par les exemples 30.a., 30.b. et 30.c. pour donner du 2-chloro-4-chlorométhyl-7-fluoro-6-méthyl3-quinoléinecarboxylate d'éthyle qui est traité selon la procédure de l'exemple 30.d., en utilisant la pipéridine au lieu de la N-méthylpipérazine, puis réduit selon la méthode de l'exemple 30.e. en quinoléineméthanol correspondant. Ce dernier est couplé au composé (M) comme décrit dans l'étape 11.j. de l'exemple 11. Le produit de couplage résultant est cyclisé selon la procédure de l'étape 11.k. On obtient un solide jaune, p.f. > 260 C.
RMN-1H (CF3CO2D): 1,09 (s, 3H); 1,70 (t, 1H); 2,03 (m, 5H); 2,25 (s, 2H); 2,70 (s, 3H); 3,54 (d, 3H); 3,88 (d, 1H); 4,01 (se, 2H); 5,30 (q, 2H); 5,65 (d, 1H); 5,96 (d, 1H); 6,10 (s, 2H); 8,16 (d, 1H); 8,35 (s, 1H); 8,61 (s, 1H).
RMN-C13 (CF3CO2D): 8,47 ; 16,07 ; 20,93 ; 22,18;24,76; 38,28 ; 43,53 ; 54,30; 56,12 ; 58,33 ; 64,24 ; 77,56; 108,37 ; 111,30; 128,20 ; 129,02 ; 129,98 135,60; 138,29; 139,90; 141,60; 142,26; 147,57; 158,28; 161,90; 167,63; 170,31; 178,82.
IR (KBr): 1605; ; 1657 ; 1728; 3399.
Exemple 40 : 8-éthyl-2,3,8,9-tétrahydro-8-hydroxy-16-(4-méthyl pipérazinométhyl)-l0H,12H-[1,4] dioxino [2,3-g] oxepino [3',4':6,7] indolizino [1,2-b] quinoléine-10,13[15H] dione On applique à la 3,4-éthylènedioxyaniline la procédure décrite par les exemples 30.a., 30.b. et 30.c. pour donner du 2-chloro-4-chlorométhyl-6,7-éthylènedioxy- 3-quinoléinecarboxylate d'éthyle qui est traité selon la procédure de l'exemple 30.d. avec la N-méthylpipérazine, puis réduit selon la méthode de l'exemple 30.e. en quinoléineméthanol correspondant. Ce dernier est couplé au composé (M) comme décrit dans l'étape 11.j. de l'exemple 11. Le produit de couplage résultant est cyclisé selon la procédure de l'étape 11.k. On obtient un solide jaune, p.f. > 260 C.
RMN-1H (DMSO): 0,92 (t, 3H); 1,89 (q, 2H); 2,16 (s, 3H); 2,50 (m, 8H); 3,12 (d, 1H); 3,50 (d, 1H); 3,95 (s, 2H); 4,47 (s, 4H); 5,19 (q, 2H); 5,43 (d, 1H); 5,56 (d, 1H); 7,35 (s, 1H); 7,54 (s, 1H); 7,76 (s, 1H).
RMN-C13 (DMSO): 8,45 ; 24,80 ; 36,51; 42,48 ; 45,90 ; 50,45 ; 52,98 ; 54,91; 56,10; 61,44; 64,43 ; 73,30; 99,03 ; 109,46; 113,51; 121,95 ; 123,51; 127,76; 137,99; 145,00; 145,14; 145,27; 147,24; 150,53; 155,99; 159,18 172,27; 177,00.
IR (KBr): 1656; 1743 ; 3422.
Exemple 41 : 9-chloro-5-éthyl-10-fluoro-4,5-dihydro-5-hydroxy- 12-morpholinométhyl-1H oxepino[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinoléine 3,15(4H,13H)-dione On applique à la 3-chloro-4-fluoroaniline la procédure décrite par les exemples 30.a., 30.b. et 30.c. pour donner du 2,7-dichloro-4-chlorométhyl-6-fluoro- 3-quinoléinecarboxylate d'éthyle qui est traité selon la procédure de l'exemple 30.d., en utilisant la morpholine au lieu de la N-méthylpipérazine, puis réduit selon la méthode de l'exemple 30.e. en quinoléineméthanol correspondant. Ce dernier est couplé au composé (M) comme décrit dans l'étape 1 i j. de l'exemple 11. Le produit de couplage résultant est cyclisé selon la procédure de l'étape 1 1.k. On obtient un solide beige, p.f. > 250 C.
RMN-1H (CF3COOD) : 1,09 (t, 3H); 2,30 (m, 2H); 3,50 (d, 1H); 3,90 (d, 1H); 3,98 (d, 4H); 4,36 (s, 4H); 5,38 (q, 2H); 5,64 (d, 1H); 5,96 (d, 1H); 6,23 (q, 2H); 8,57 (d, 1H); 8,60 (s, 1H); 8,85 (d, 1H).
RMN-C13 (CF3COOD) : 8,10; 37,80 ; 43,11; 54,31; 55,78 ; 63,75 ; 65,11; 77,06; 128,28 ; 129,55 ; 130,33 ; 136,26 ; 137,11; 138,40 ; 139,67 ; 139,85 148,58 ; 157,54 ; 159,74; 161,31; 178,00.
IR (KBr) : 848 ; 1042; 1230; 1609; 1658; 1750; 3310; 3387.
Ces tentatives reposent généralement sur l'addition d'éléments réactifs dans la composition de l'alliage.
Ainsi, FR-A-2 699 932 décrit un alliage à base de cobalt renfermant du rhénium, pouvant comprendre en outre notamment du niobium, de l'yttrium ou autres terres rares, du bore et/ou du hafnium. US-A-4 765 81 7 décrit un alliage à base de cobalt, chrome, nickel, tungstène comprenant également du bore et du hafnium. FR-A-2 576 914 utilise également du hafnium. EP-A-O 317 579 décrit un alliage renfermant du bore et exempt de hafnium, mais contenant de l'yttrium. US-A-3 933 484 concerne aussi un alliage renfermant du bore. US-A-3 984 240 et US-A-3 980 473 décrivent l'utilisation d'yttrium et dysprosium.
Ces éléments sont très coûteux et leur mauvais rendement d'incorporation oblige généralement à les surdoser lors de l'élaboration de l'alliage, ce qui augmente d'autant plus la part des matières premières dans le coût du matériau. A cet égard, on note que nombre de ces documents enseignent d'utiliser des teneurs élevées en chrome (de l'ordre de 35 à 36 %) également coûteux.
La présence de ces éléments de très forte réactivité impose de préparer l'alliage par la technologie délicate de fusion et coulée sous vide, avec un appareillage nécessitant un investissement important.
Par ailleurs, ces alliages présentent encore un risque marqué de fragilité à haute température en milieu corrosif tel que le verre fondu.
II persiste donc le besoin d'un nouvel alliage ayant de bonnes propriétés mécaniques à haute température, en particulier en milieu oxydant et/ou corrosif tel que le verre fondu, qui soit en outre facile et relativement peu coûteux à élaborer.
Ce but, ainsi que d'autres qui apparaîtront par la suite, a été atteint par l'invention grâce à un alliage comprenant essentiellement les éléments suivants, les proportions étant indiquées en pourcentage pondéral de l'alliage Cr 26 à 34 % Ni 6à12% W 4à8% Ta 2à4 % C 0,2 à 0,5 % Fe moins de 3 % Si moins de 1 % Mn moins de 0,5 % Zr moins de 0,1 % le reste étant constitué par du cobalt et des impuretés inévitables, le rapport molaire du tantale par rapport au carbone étant de l'ordre de 0,4 à 1.
L'invention permet, grâce à une sélection très précise des proportions des éléments constitutifs de l'alliage, plus particulièrement carbone et tantale, d'optimiser le mode de renforcement de l'alliage. Ainsi on peut dire de façon générale que, bien que l'alliage selon l'invention présente une teneur en carbone relativement faible par rapport à l'art antérieur, le renforcement par précipitation de carbures a pu être amélioré en optimisant la répartition des carbures au sein du matériau.
La description qui va suivre donne plus de détails sur l'importance des constituants de l'alliage et de leurs proportions respectives.
Le cobalt, qui constitue la base de l'alliage selon l'invention, apporte de par son caractère réfractaire (point de fusion égal à 1 4950C) une résistance mécanique intrinsèque à haute température de la matrice.
Le nickel, présent dans l'alliage sous forme d'une solution solide en tant qu'élément stabilisant la structure cristalline du cobalt, est utilisé dans la gamme de proportions habituelles de l'ordre de 6 à 1 2 %, avantageusement de 8 à 10 % en poids de l'alliage.
Le chrome contribue à la résistance mécanique intrinsèque de la matrice dans laquelle il est présent en partie en solution solide. Il contribue également au renforcement de l'alliage sous forme de carbures de type M23 C6 avec M = (Cr,W) présents aux joints de grains, où ils empêchent le glissement grain sur grain, et à l'intérieur des grains sous forme d'une dispersion fine, où ils apportent une résistance au fluage intragranulaire. Sous toutes ses formes, le chrome contribue à la résistance à la corrosion en tant que précurseur d'oxyde de chrome formant une couche protectrice à la surface exposée au milieu oxydant. Une quantité minimale de chrome est nécessaire pour la formation et le maintien de cette couche protectrice. Une teneur en chrome trop élevée est cependant néfaste à la résistance mécanique et à la ténacité aux températures élevées, car elle conduit à une rigidité trop élevée et une aptitude à l'allongement sous contrainte trop faible incompatible avec les contraintes à haute température.
De façon générale, la teneur en chrome d'un alliage selon l'invention sera de 26 à 34 % en poids, de préférence de l'ordre de 28 à 32 % en poids, avantageusement d'environ 29 à 30 % en poids.
Le tungstène participe avec le chrome à la formation des carbures (Cr,W)23C6 intergranulaires et intragranulaires, mais se trouve aussi en solution solide dans la matrice dont cet atome lourd distord localement le réseau cristallin et gêne, voire bloque, la progression des dislocations quand le matériau est soumis à un effort mécanique. Une quantité minimale est souhaitable en liaison avec la teneur en chrome, pour favoriser les carbures de type M23C6 aux dépends des carbures de chrome Cr7C3 qui sont moins stables à haute température. Si cet élément a des effets bénéfiques sur la résistance mécanique, il présente néanmoins l'inconvénient de s'oxyder à haute température sous la forme de composés très volatils tels que W03. Une quantité trop élevée de tungstène dans l'alliage se traduit par un comportement en corrosion généralement insatisfaisant.
Un bon compromis est atteint selon l'invention avec une teneur en tungstène de l'ordre de 4 à 8 % en poids, de préférence de l'ordre de 5 à 7 % en poids, avantageusement de l'ordre de 5,5 à 6,5 % en poids.
Le tantale également présent en solution solide dans la matrice de cobalt apporte une contribution complémentaire à la résistance intrinsèque de la matrice, de façon similaire au tungstène. II est capable en outre de former avec le carbone des carbures TaC présents aux joints de grains qui apportent un renforcement intergranulaire, en complément des carbures (Cr,W)23C6, en particulier à très haute température (par exemple de l'ordre de 1100 C) en raison de leur plus grande stabilité à haute température. La présence de tantale dans l'alliage selon l'invention a également un effet bénéfique sur la résistance à la corrosion.
On va maintenant décrire la formation de la caisse selon le mode de réalisation de l'invention plus particulièrement décrit ici en référence aux figures 1, 5 et 7.
Le flan 1 est disposé à plat, les doubles rabats ouverts étant préalablement encollés en totalité ou par l'intermédiaire de lignes ou de points de colle 18.
Les feuilles 16 sont alors amenées, successivement ou simultanément, de façon à ce que les bordures d'extrémité 17 reposent sur les lignes de colle du premier rabat et/ou éventuellement sur l'ensemble du double rabat, auquel cas des lignes de colle complémentaires seront nécessaires sur le film plastique lui-même.
Le double rabat est ensuite replié sur liri-melme e mis en pression de façon à prendre en sandwl .) l'extrémité 17 des feuilles 16, le second rabat se collant sur le film en matériau plastique qui se colle lui-même sur le premier rabat.
L'ensemble est ensuite amené sous un mandrin pour être conformé en caisse par exemple comme décrit dans le brevet FR-A-2.629.012.
Ainsi, la caisse est montée automatiquement par rabattement autour d'un mandrin des volets, des rabats et des doubles rabats après insertion ou mise en place des films plastiques dans les doubles rabats, le volet d'extrémité 2 de la suite de volets et la languette 7 d'une part et les rabats adjacents 10 et 11 d'autre part étant fixés entre eux par collage pour former la demi-caisse de la figure 5.
Les deux feuilles s'échappent respectivement à partir des bords libres d'extrémité 15 sensiblement en contact avec les premières lignes de pliage 9 pour s'étendre vers l'extérieur.
La charge est ensuite placée à l'intérieur puis les deux feuilles thermoplastiques sont refermées sur le charge.
Elles sont alors et par exemple fixées au niveau :le leur extrémité 40 par thermo-soudage.
L' ensemble passe ensuite dans un four chauffant permettant la rétractation des feuilles themo- rétractables sur la charge pour obtenir l'emballage de la figure 7.
Le couvercle 41 est ensuite mis en place et permet de compléter la caisse qui, après fixation du couvercle par exemple par ruban adhésif, est envoyée, par exemple par la poste.
Comme il va de soi et comme il résulte d'ailleurs de ce qui précède, la présente invention n'est pas limitée aux modes de réalisation plus particulièrement décrits. Elle en embrasse au contraire toutes les variantes et notamment celles où les bords ou tranches au niveau des doubles lignes de pliage 14 des doubles rabats ne sont pas jointifs une fois la caisse formée, ce qui permet d'économiser du carton.
Cette disposition est notamment applicable dans le cas de charge moins importante, par exemple de l'ordre de deux kilogrammes.
L'invention concerne l'utilisation des protéines dénommées ULIP/POP dans le diagnostic et la thérapie des cancers et des syndromes neurologiques paranéoplasiques.
Les syndromes neurologiques paranéoplasiques (SNP) surviennent à l'occasion d'un cancer, souvent avant sa découverte et ne sont liés ni à la prolifération tumorale elle-même (envahissement direct, métastases) ni à la thérapie. Leur fréquence est globalement estimée à environ 1 % des cancers. Plusieurs tableaux cliniques ont été depuis longtemps individualisés (encéphalomyélite, neuropathie sensitive de Denny Brown, atrophie cérébelleuse, encéphalite limbique, opsoclonus, ..) correspondant en fait à l'atteinte soit élective soit préférentielle de certains groupes de neurones. La fréquence des cellules inflammatoires au voisinage des lésions avait fait évoquer depuis de nombreuses années la possibilité d'un processus auto-immun ou viral. La mise en évidence, plus récente, d'auto-anticorps dans le sérum et le liquide céphalorachidien (LCR) de patients souffrant de SNP, spécifiques du type de tumeur et du type de neurones qui dégénèrent, a relancé l'hypothèse d'une participation de l'auto-immunité dans la genèse de cette pathologie (Graus et al., 1985; Greenlee et al., 1983).
Outre la présence d'un titre élevé de ces anticorps dans le sang et le LCR des patients, il existe plusieurs arguments suggérant que les SNP relèvent de mécanismes auto-immuns. Ainsi, les antigènes reconnus dans le système nerveux central sont aussi présents dans les tumeurs des patients (Anderson et al., 1987). Au sein du tissu tumoral, on retrouve des anticorps spécifiquement dirigés contre ces antigènes ainsi que des lymphocytes B et T (Hetzel et al., 1990).
Le fragment obtenu après PCR, a été linéarisé par Bam HI et HindIII et sous-cloné dans les vecteurs d'expression pET28C et pET21C (NOVAGEN) linéarisé par Bam HI et Hind III. Le séquençage de l'ADN du fragment de 1077 pb du clone 2 dans les deux vecteurs d'expression a été realisé selon la méthode préconisée pour l'utilisation du kit de séquençage "PRISMTm Ready Reaction Amplitaqs FS, DyeDeoxyTM Terminator" (Applied Biosystems, ref. 402119) et le séquençage automatique a été réalisé sur les appareils 373 A et 377 Applied Biosystems, selon les instructions du fabricant.
L'expression de la séquence nucléotidique du fragment de 1077 pb du clone 2 par les vecteurs d'expression pET28C et pET2lC sont identifiées par respectivement SEQ ID NO: 135 et SEQ ID NO: 137.
EXEMPLE 6: EXPRESSION DU CLONE 2 CHEZ ESCHERICHIA COLI Les constructions pET28c-clone 2 (1077 pb) et pET2lC-clone 2 (1077 pb) synthétisent, dans la souche bactérienne BL21 (DE3), une protéine en fusion N- et Cterminale pour le vecteur pET28C et C-Terminale pour le vecteur pET21C avec 6 Histidines, de masse moléculaire apparente d'environ 45 kDa, mise en évidence par électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS-PAGE (SDS = Dodecyl Sulfate de Sodium) (Laemmli, 1970 (1)). La réactivité de la protéine a été mise en évidence vis à vis d'un anticorps monoclonal anti-Histidine (DIANOVA) par la technique de Western blot (Towbin et al., 1979 (2)).
Les protéines recombinantes pET28c-clone 2 (1077 pb) et pET21C-clone 2 (1077 pb) ont été visualisées en SDS-PAGE dans la fraction insoluble après digestion enzymatique des extraits bactériens avec 50 41 de lysozyme (10 mg/ml) et lyse par ultrasons.
Les propriétés antigéniques des antigènes recombinants pET28C-clone 2 (1077 pb) et pET21C-clone 2 (1077 pb) ont été testées par Westen Blot () après solubilisation du culot bactérien avec 2% SDS et 50 mM ss- mercaptoéthanol. Après incubation avec les sérums de patients atteints de sclérose en plaques, les sérums des témoins neurologiques et les sérums de témoins de centre de transfusion sanguine (CTS), les immunocomplexes ont été detectés à l'aide d'un sérum de chèvre anti-IgG et anti IgM humaines, couplé à la phosphatase alcaline.
Les résultats sont présentés dans le tableau ciaprès.
TABLEAU Réactivite de sérums atteints de sclérose en plaques et témoins avec la protéine recombinante MSRV-1 gag clone 2 (1077 pb) = pET21C-clone 2 (1077 pb) et pET28C-clone 2 (1077 pb)a MALADIE NOMBRE NOMBRE D'INDIVIDUS TESTES D'INDIVIDUS POSITIFS SEP 15 6 2(+++), 2(++), 2(+) TEMOINS NEUROLOGIQUES 2 1(+++) TEMOINS SAINS (CTS) 22 (a) Les bandelettes contenant 1,5 ssg d'antigène recombinant pET-gag clone 2 (1077 pb) présentent une réactivité contre de sérums dilués au 1/100.
L'interprétation de Western Blot est basée sur la présence ou absence d'une bande pET-gag clone 2 (1077 pb) spécifique sur les bandelettes. Des contrôles positifs et négatifs sont inclus dans chaque expérience.
Ces résultats montrent que, dans les conditions techniques utilisées, environ 40% des sérums humains atteints de sclérose en plaques testés réagissent avec les protéines recombinantes pET28C-clone 2 (1077 pb) et pET21C-clone 2 (1077 pb). Une réactivité a été observée sur un témoin neurologique et il est intéressant de noter que les ARN extraits à partir de ce sérum, après l'étape de transcriptase inverse, sont aussi amplifiés par PCR dans la région pol. Ceci suggère que des personnes n'ayant pas déclaré une SEP peuvent également héberger et exprimer ce virus. Par contre, un témoin (donneur CTS) apparemment sain, possède des anticorps anti-gag (clone 2, 1077 pb).
Ce qui est compatible avec un immunité acquise contre MSRV-1 en dehors d'une maladie autoimmune associée déclarée.
EXEMPLE 7: OBTENTION D'UN CLONE LB13 CONTENANT EN 3' UNE PARTIE HOMOLOGUE AU CLONE 2 CORRESPONDANT AU GENE GAG ET EN 5' UNE PARTIE HOMOLOGUE AU CLONE 5M6 CORRESPONDANT À LA RÉGION LTR U5.