INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
A la fin de l'incubation de l'ensemble des réactifs (microsphères et traceurs) avec l'échantillon biologique, lorsque les réactions ligand/anti-ligand se sont réalisées, on procède alors à la mesure des paramètres caractéristiques, par exemple aux longueurs d'onde F1 et F2. Ces mesures sont faites à l'aide des appareils et techniques de détermination de la nature et de la quantité de particules habituellement utilisées dans l'état de la technique, c'est-à-dire principalement les cytomètres de flux. On peut, par exemple, citer les techniques et instruments décrits notamment dans les brevets US-A-3 925 018 et US-A-l 561 042. On peut également citer les cytomètres statiques à balayage LASER tels que celui proposé par la Société COMPUCYTE (Cambridge MA USA) et décrit dans les brevets USA 5 072 382 ; 5 107 422 ;5 202 230 ; 5 427 910 et 5 523 207. De tels appareils sont capable s d'analyser individuellement et successivement plus de 103 particules par seconde. Ces instruments doivent être munis d'au moins deux détecteurs aux longueurs d'onde d'émission des composés F1 et F2 et éventuellement d'un détecteur de lumière diffractée permettant de détecter la taille des particules.
La réalisation de l'invention s'opère en deux étapes: - La première étape, ou étape d'étalonnage , consiste en l'établissement du lien entre chaque sous-catégorie de microsphère de calibration Cal1, ...,Calp et une concentration d'analyte. Pour cela l'ensemble des réactifs, microsphères de calibration Cal1,...,Calp et microsphères de dosages (Dos), est incubé avec successivement des concentrations étalon CO1, COn d'analyte et les traceurs correspondants. Si le réglage de l'appareil est stable et les conditions d'incubations strictement identiques on peut tracer la fonction d'interpolation qui lie le signal de mesure F2 aux concentrations d'analyte. On utilise ensuite cette fonction pour associer à chaque signal issu des microsphères de calibration une concentration d'analyte C1, ... Cp. Le tableau suivant résume l'ensemble des opérations
Concentration Signaux de Signaux des concentrations des étalons référence Construction microsphères interpolées de calibrations CO1 F2 (CO1) de la fonction F2(Cal1) C1 CO2 F2 (CO2) F2 (Cal2) C2 d'interpolation COn F2 (COn) F2 (Calp) Cp Le résultat de l'opération est l'association des concentrations Cl, ...Cp aux calibrateurs Cal1, ...Calp. On note que le nombre de calibrateurs p n'a pas raison d'être identique au nombre d'étalons n. Si le réglage de l'instrument n'est pas suffisamment stable, on peut rechercher par la méthode des essais et des erreurs la concentration d'analyte C1 qui donne sur les microsphères de dosage le même signal que les microsphères de calibration Cal1 avec le traceur qui lui est associé, puis de même pour C2 et Cal2, etc...
On remarque aussi que l'opération peut être répétée pour plusieurs analytes, ainsi à une même série de calibrateurs pourra correspondre autant de tables de valeurs de concentration qu'il y a d'analytes dont on souhaite la détermination, ce qui ouvre la possibilité d'une calibration commune dans un système multianalytique.
- La deuxième étape, ou étape de calibration , est celle qui s'opère chez l'utilisateur terminal. Le même mélange de microsphères Cal1,...Calp et Dos et les traceurs correspondants sont incubés avec l'échantillon inconnu, on enregistre les signaux F'2(Call)...F'2(Calp), qui n'ont aucune raison d'être les mêmes que ceux déterminés dans la phase 1, s'agissant d'un appareil différent et de conditions d'incubation qui peuvent aussi différer. Les signaux recueillis restent néanmoins associés aux concentrations d'analytes et peuvent être exploités pour tracer une fonction d'interpolation qui sert ensuite à calculer la concentration de l'échantillon inconnu
Microsphères Concentra- Signaux de Signaux Concentration de tion calibration de interpolée calibrations associée l'inconnu Cal1 C1 F'2(Call) Fonction d'interpo- F2 C lation Calp Cp F'2(Calp) Le système peut fonctionner en mode multianalytique si l'on dispose de plusieurs catégories de microsphères de dosage Dos 1, Dos2, Dos3, correspondant à des analytes différentes. Les signaux des calibrateurs sont traduits en autant de fonctions d'interpolation qu'il y a d'analytes, au moyen des tables de concentration qui leur sont associées. Il est à noter que les schémas réactionnels peuvent être complètement différents d'un analyte à l'autre, les fonctions d'interpolation pouvant être croissantes ou décroissantes selon qu'il s'agit d'un schéma sandwich ou d'un schéma compétition .
Dans une réalisation particulière de l'invention, on utilisera la comparaison des signaux obtenus sur les microsphères de calibration lors de l'étalonnage dans le laboratoire du fabricant (étape 1), et lors de la mise en oeuvre du dosage chez l'utilisateur (étape 2) de façon à corriger les signaux obtenus sur les microsphères de dosages dans cette dernière étape. Dans ce cas, la détermination de la concentration en analyte inconnu s'effectuera grâce la fonction d'interpolation construite lors de la première étape chez le fabricant.
Un exemple de ce mode de calcul, donné dans le cas d'un calibration correspondant à l'art antérieur, est décrit en détail par M.J. Lynch dans Journal of Bioluminescence and Chimiluminescence, vol4, pp615-619, 1989 .
Une réalisation particulière de l'invention concerne les dosages de type sandwich à calibration homologue évoqués en i) ci-dessus, dans lesquels le système de dosage exploite au moins deux sites présents sur l'analyte, comme par exemple un dosage mettant en jeu deux anticorps monoclonaux liant deux épitopes distincts de l'analyte à doser ou un antigène déterminé et un anticorps anti-immunoglobuline, pour le dosage d'immunoglobulines spécifiques. Le système de calibration sera alors avantageusement constitué par une population de microsphères de calibration différentiable par le paramètre Fl et comportant à sa surface une quantité fixe de l'analyte considéré. Dans le cas où le système de dosage est formé par deux anti-ligands, I'un lié à la surface des microsphères de dosages, l'autre sous forme de traceur, il est important que sur les microsphéres de calibration, I'analyte soit modifié (notamment par masquage ou délétion) de façon à rendre inaccessible le site reconnu par les microsphères de dosages. Dans cette réalisation particulière, le traceur permet à la fois la mesure et la calibration, car lors de l'incubation simultanée de ces deux catégories de microsphères avec l'échantillon à doser et avec l'anticorps traceur, ce dernier vient se lier à la surface des microsphères de calibration et de mesure.
La fixation de l'anticorps traceur sur les microsphères de mesure est fonction de la concentration d'antigène présente dans l'échantillon à doser alors que la fixation de l'anticorps traceur sur les microsphères de calibration est fixe et proportionnelle à la quantité de sites d'analyte que l'on aura préalablement liés en surface.
Dans une autre réalisation de l'invention, où la première catégorie de microsphères de calibration est constituée d'une seule sous-catégorie, la quantité de traceur se liant aux microsphères de calibration produit un signal de fluorescence exactement placé au point de coupure qui détermine si l'échantillon dosé est positif ou négatif pour l'analyte mesuré, par exemple pour la présence ou l'absence d'anticorps anti-pathogène (micro-organisme infectieux), anti-soi (tissus, hormone, protéines nucléaires), anti-allergène (pollens) ou d'antigène viral tel que l'antigène Hbs ou encore de marqueurs de cancers tels que des molécules solubles de la famille des antigènes carbohydrates. Ainsi, l'intensité du signal porté par les microsphères de mesure peut être qualifiée de positive ou de négative en toute exactitude. De même que la fixation non spécifique d'immunoglobuline irrelevante, qui ne manque pas d'interférer dans les dosages de sérologie, peut être quantifiée exactement sur les microsphères de calibration.
La présente demande a encore pour objet les réactifs et les kits de dosages qui permettent la réalisation de l'invention, c'est à dire la mesure de concentrations d'analytes dans un tube avec un étalonnage interne. Les réactifs et kits correspondent aux différents modes de réalisation de l'invention.
La présente demande a donc encore pour objet un kit de dosage mettant en jeu le procédé d'étalonnage tel que défini ciaessus, comportant - des microsphères de calibration - des microsphères de dosage - un traceur de calibration - un traceur de dosage (servant aussi de traceur de calibration pour la modalité i), pour les modalités ii), iii) et iiii) et - une table de correspondance microsphères de calibration données numériques nécessaires à l'interprétation d'un signal mesuré.
Ces données numériques peuvent être la concentration d'analyte.
Ces données peuvent aussi correspondre au niveau de fluorescence d'étalonnage ainsi qu'aux paramètres de l'équation d'interpolation de référence obtenue lors de l'étalonnage de la méthode pour chaque analyte.
Une suspension de 17,52 g de chlorure d'aluminium dans un mélange de 100 ml de CC14 et 100 mi de DCM est refroidie à +4 C sous azote, on ajoute goutte à goutte 10,4 g de chlorure d'acétyle puis une solution de 20 g de 2,5-diméthoxytoluène dans 20 ml de DCM. Après 4 heures d'agitation à +4 C; le milieu réactionnel est versé sur de la glace additionnée de quelques mi d'HCl concentré et on laisse sous agitation 30 minutes. On décante, extrait au DCM, les phases organiques réunies sont lavées par une solution aqueuse à 5 % de NaCO3, on sèche sur MgSO4 et évapore. Le produit cristallise, on triture dans 150 ml d'heptane, filtre puis lave à l'heptane pour obtenir 21,03 g du composé attendu, F = 75-77 C.
B) 2-Amino-4-(2,5-diméthoxy-4-méthylphényl)thiazole.
Une solution de 21,03 g du composé de l'étape précédente dans 300 ml de DCM est traitée goutte à goutte par une solution de 17,35 g de brome dans 70 ml de DCM. Après décantation, la phase organique est lavée à l'eau, séchée sur MgSO4 puis évaporée. On reprend par 200 ml d'éthanol absolu puis ajoute 15,2 g de thiourée et chauffe une nuit à retlux.
On refroidit au bain de glace, filtre les cristaux formés, puis on reprend les cristaux par une solution aqueuse de Na2CO3 à 5 % puis on extrait à AcOEt. On décante, sèche la phase organique sur Na2SO4 puis on cvap()re. On triture le résidu dans l'heptane puis on filtre pour obtenir 17.74 g du composé attendu sous forme cristalline, F = 191-192 C.
C) 4-(2,5-Diméthoxy-4-méthylphényl)-2-(2,5-diméthylpyrrol-1 yl)thiazole.
Dans 300 ml de benzène, on solubilise 17,74 g du composé de l'étape précédente, 2(),3 g de 2,5-hexanedione et 8,51 g d'acide acétique. Après 24 heures de distillation azéotropique, le milieu réactionnel est versé sur de l'eau puis on neutralise par une solution aqueuse de Na2CO3 à 5 ';S. On décante puis on extrait par AcOEt. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2SO4 puis évaporées. Le résidu est chromatographié sur silice en éluant au DCM pour donner 19,46 g du composé attendu qui cristallise dans l'heptane, F = 92-93 C.
D) 5-(Cyclohexylméthylthio)-4-(2,5-diméthoxy-4-méthylphényl)-2-(2,5 diméthylpyrrol- 1-yl)thiazole.
Une solution de 3,28 g du composé de l'étape précédente dans 80 ml de THF anhydre est refroidie à -30 C puis traitée par 8 ml de nbutyllithium 1,6 M dans l'hexane. Après 30 minutes à -30 C, on ajoute 650 mg de soufre en fleur. On laisse revenir à TA puis on ajoute 3,4 g de tosylate de cyclohexylméthanol en solution dans 10 ml de THF anhydre, on laisse sous agitation 2 heures à TA. Le milieu réactionnel est versé sur de l'eau puis on extrait à l'éther, sèche sur Na2SO4 et évapore. Le résidu est chromatographié sur silice H en éluant au toluène. On obtient 1,1 g du composé attendu, F = 117-1180C.
E) 2-Amino-5-cyclohexylméthylthio-4-(2,5-diméthoxy-4 méthylphényl)thiazole.
On chauffe pendant 36 heures à retlux un mélange contenant 1,1 g du composé de l'étape précédente, 30 ml d'éthanol, 4,5 ml d'eau et 3,7 g de chlorhydrate d'hydroxylamine. Après évaporation, on reprend le milieu par une solution aqueuse de Na2CO3 à S % puis on extrait au DCM, sèche sur MgSO4, et évapore puis le résidu est chromatographié sur silice en éluant par DCM/AcOlEt (70/30 ; v/v). On obtient 0,78 g du composé attendu, F = 111-112 C.
PREPARATION -1.8 2-Amino-5-cycloheptyléthyl-4-(2,5-diméthoxy-4méthylphényl)thiazole.
A) Ester éthylique de l'acide 4-cycloheptylidènebut-2-énoique.
On solubilise 6,7 ml d'ester éthylique d'acide A- (diéthoxyphosphoryl)but-2-énoique dans 7 ml de diméthoxyéthane puis on verse sur 1,3 5 d'hydrure de sodium à 60 % dans 10 ml de diméthoxyéthane. Après 45 minutes sous agitation, on refroidit à 1() C puis on ajoute goutte à goutte 3,2 ml de cycloheptanone et on laisse revenir à TA. Après 4 heures sous agitation, on verse sur de l'eau froide puis extrait à l'éther, sèche et évapore. Le résidu est chromatographié sur silice en éluant au DCM. On obtient 1,9 g du composé attendu.
B) Ester éthylique de l'acide 4-cycloheptylbutanoïque.
La totalité du composé de l'étape précédente est hydrogéné à température ambiante et à pression atmosphérique dans 20 ml d'EtOH, en présence de 19() mg de Pd/C à 10 %. On obtient 1,9 g du composé attendu.
C) Acide 4-cycloheptylbutanoïque.
On peut ainsi multiplier le nombre de couples de réactifs pour doser le nombre d'analytes différents souhaité.
Dans un mode préféré de mise en oeuvre de l'invention, on incube ensemble toutes les catégories de microsphères avec l'échantillon; ; dans un autre mode préféré de mise en oeuvre de l'invention on mélange toutes les catégories de microsphères avec l'échantillon dès le début de la mise en oeuvre.
Lors de la mise en oeuvre du procédé, par exemple un mélange de microsphères comprenant la catégorie des microsphères de calibration ainsi que la ou les catégories de microsphères de dosages d'analytes que l'on souhaite mettre en oeuvre, est incubée dans l'échantillon inconnu en présence de l'anti-ligand du système de calibration et des anti-ligands correspondant aux catégories de microsphères précitées. Les réactions ligand/anti-ligands sont réalisées de façon simultanée ainsi que l'analyse subséquente des signaux.
De cette manière, chaque dosage d'échantillon génère d'une part, pour les microsphères de calibration, une série de signaux d'intensité discrète, en fonction de la quantité de ligands El présente à la surface des souscatégories de microsphéres de calibration, et d'autre part, sur chaque catégorie de microsphères réservée au(x) dosage(s), un signal unique qui est fonction de la quantité de substance inconnue que l'on souhaite déterminer.
Le résultat final établissant la concentration d'analyte dans l'échantillon est obtenu en exploitant les valeurs numériques des intensités de fluorescence F2 mesurées de façon simultanée sur les microsphères de dosage et de calibration.
La détection des interactions ligand/anti-ligands de calibration ou de mesure se fera soit directement par marquage fluorescent des anti-ligands correspondants, soit indirectement par un réactif fluorescent liant les anti-ligand ou les ligands liés à la surface des microsphères de calibcation ou de mesure.
Dans des conditions préférentielles de mise en oeuvre du procédé cidessus décrit, la première catégorie de microsphères comprend au moins deux sous-catégories de microsphères, ces deux sous-catégories se distinguant l'une de l'autre par leur quantité de sites ligands El.
La présente invention a notamment pour objet un procédé ci-dessus dans lequel l'on met en oeuvre l'une des modalités suivantes : i), ii), iii); i), ii) iiii); ii),iii),iiii); i),iii),iiii); i),ii); ii),iii); iii), iiii); i), iii); i); iii; iiii); ii),iiii); ii. Certaines des modalités i), ii), iii) et iiii) procédé ci-dessus peuvent être combinées dans la même mise en oeuvre du procédé, comme on l'a déjà indiqué.
Selon l'invention, l'étalonnage est de préférence réalisé simultanément à la détermination même du signal de mesure d'un analyte en utilisant un même système de détection et les fluorescences sont analysées sur chaque microsphère successivement, par le système de détection, en sorte que les mesures effectuées sur l'ensemble des microsphères de calibration et sur l'ensemble des microsphères de dosage mises en jeu lors du dosage d'un échantillon, soient statistiquement équivalentes ou qu'en d'autres termes les fluctuations du détecteur soient compensées par la survenue aléatoire des microsphères devant le détecteur, quelle que soit leur catégorie, dans un intervalle de temps donné.
Par interaction spécifique ligand/anti-ligand , I'on entend une interaction de l'analyte, ou du composé servant à la calibration (ligand) avec une molécule partenaire (anti-ligand) qui ne réagit avec aucun autre constituant du milieu réactionnel (d'incubation).
Par procédé de dosage , on entend de manière non limitative, les immunodosages d'analytes en sandwich, mettant en jeu chacun une paire d'anticorps spécifiques de l'analyte dont l'un est marqué (dosage de la thyréostimuline par exemple), les immunodosages par compétition, mettant en jeu soit un anticorps anti-analyte lié à la surface des microsphères et l'analyte marqué en traceur, soit l'analyte lié à la surface des microsphères et l'anticorps anti-analyte marqué en traceur (dosage de la thyroxine,ou de l'oestradiol par exemple). D'autres systèmes de dosages mettant en jeu les interactions d'acides nucléiques synthétiques et d'acides nucléiques naturels ayant subi ou non une étape d'amplification enzymatique peuvent être avantageusement étalonnés selon la présente invention.
Par analyte , I'on entend par exemple un sucre, un polypeptide, une protéine, et plus particulièrement une hormone telle que celle appartenant aux groupes des hormones thyroïdiennes (thyroxine, triiodothyronine), des hormones stéroïdes (cortisol, oestradiol, testostérone, ...etc.), des neurohormones (histamine, sérotonine, catécholamines, métanéphrines. . etc).
L'analyte peut être un polypeptide tel que par exemple une hormone hypophysaire comme l'hormone thyréostimuline (TSH), ou encore l'hormone de croissance (hGH), la corticotropine (ACTH), la parathormone (PTH), la somatotropine (hGH). L'analyte peut être plus particulièrement une cytokine telle que celles appartenant aux diverses familles de molécules endogènes comme les chemokines, lymphokines, monokines, interleukines, interférons, facteurs de colonisation, facteurs de croissance, ou neuro-peptides, et plus particulièrement l'interféron-a (IFN-a), I'interféron-p (I FN-p), I'interféron-y, (IFNy), I'interleukine-l (IL-1), I'interleukine-2 (IL-2), I'interleukine-3 (lL-3), I'interleukine4 (IL4), I'interleukine-5 (IL-5), I'interleukine-6 (IL-6), I'interleukine10 (IL-lO), le tumor necrosis factor (TNF), le transforming growth factor-ss (TGFp), les colony-stimulating factors (CSF) tels que le granulocyte macrophagestimulating factor (GM-CFS) et le macrophage stimulating factor (M-CSF), le facteur de croissance épithélial (EGF), la somatostatine, les endorphines, les divers "releasing factors" ou "inhibitory factors" tels que le TRF. L'analyte peut également être un médiateur intra-cellulaire comme par exemple l'adénosine 3', 5'-monophosphate cyclique (cAMP) ou la guanosine 3', 5'-monophosphate cyclique (cGMP).
L'analyte peut être aussi une protéine constituante d'une particule virale comme par exemple la protéine p24 du virus HIV ou la protéine de surface du virus de l'hépatite B. L'analyte peut être aussi un médicament ou un de ses métabolites. Ce médicament peut être par exemple la théophylline, la digoxine, le méthotrexate ou la cyclosporine. L'analyte peut être représenté par une population d'anticorps présents dans l'échantillon comme par exemple les anticorps anti-organismes infectieux, les anticorps anti-constituants des particules virales HIE1, HIV2, ou des anticorps de type IgE ou lgG4 antiallergène comme les anticorps anti-acariens ou les anticorps anti-pollens ou encore les anticorps anti-constituants du soi comme les anticorps anti-insuline, anti-récepteur de la TSH, anti-thyroperoxidase, anti-constituants nucléaires (anti-RO/SSA, anti-RNP, ...etc) ou anti-tissus (anti-mitochondries, anti-estomac, ...etc).
L'analyte peut-être aussi une séquence de DNA ou de RNA représentant le génome lui-même ou un transcript de ce même génome d'un virus comme par exemple le virus HIV ou HCV ou représentant celui d'une bacterie comme par exemple Mycobacterium tuberculosis ou Chlamydiae trachomatis ou représentant un oncogène résultant d'une modification du génome humain comme par exemple l'oncogène BCR/abl présent lors de la leucémie myélomateuse chronique.
Par "site ligand " I'on entend dans le cadre de la présente invention non seulement un épitope tel un fragment peptidique, mais encore plus généralement un site capable d'interagir spécifiquement avec un composé particulier pour former un couple ligand/anti-ligand. Le modèle le plus connu de couple ligand/anti-ligand est le couple antigène/anticorps mais on peut citer aussi les interactions acides nucléiques/acides nucléiques complémentaires, les interactions enzyme/inhibiteur,...etc. On peut citer par exemple à titre de site ligand de type antigène un site hapténique ou encore un peptide comportant de 5 à 50 acides aminés ou un sucre. Dans les acides nucléiques, on peut citer aussi un fragment de molécule d'ADN ou d'ARN comportant de 5 à 50 nucléosides.
- le feu est dépourvu de moyens récupérateurs de flux, et la partie centrale de l'écran comporte des moyens pour redresser la lumière issue directement de la lampe à la fois horizontalement et verticalement.
D'autres aspects, buts et avantages de la présente invention apparaîtront mieux à la lecture de la description détaillée suivante d'une forme de réalisation préférée de celle-ci, donnée à titre d'exemple et faite en référence au dessin annexé, sur lequel la figure 1 est une vue en coupe verticale axiale d'une partie d'un feu de signalisation selon l'invention, illustrant la propagation de rayons lumineux lorsque le feu est allumé, la figure 2 est une vue analogue à la figure 1, illstrant la propagation de rayons lumineux lorsque le feu est éteint, et la figure 3 est une vue en coupe verticale axiale d'un feu selon une variante de réalisation de l'invention.
En référence tout d'abord aux figures 1 et 2, on a représenté un feu de signalisation qui comprend une lampe à filament 10 de type classique, avec un bulbe 11 abritant un filament 13 et un culot 12, un voyant 20 et un ballon de traitement optique 30 entourant la lampe.
Le feu comporte également, de façon classique et non illustrée, un socle sur lequel est prévu un porte lampe. il s'agit en l'espèce d'un feu clignotant, devant émettre une lumière ambre et devant présenter un aspect incolore lorsqu'il est éteint.
La teinte ambre de la lumière est donnée par le bulbe 11, qui est soit coloré dans la masse, soit pourvu d'un revêtement translucide ou d'une coupelle hémisphérique translucide appliqué sur lavant du bulbe.
Le voyant 20 est quant à lui incolore.
Le ballon 30 de traitement optique comporte dans le présent exemple une paroi frontale 31 formant fenêtre de sortie de lumière et une paroi latérale opaque 32, de forme générale tronconique creuse, entourant entièrement la lampe 10.
La paroi frontale 31 est transparente incolore, en forme de portion de sphère convexe sur l'extérieur, et comporte sur sa face interne des aménagements optiques 31a destinés à corriger la trajectoire de la lumière issue du filament 13. En l'espèce, ces aménagements optiques comprennent une pluralité de pavés déviateurs à facettes planes ou courbes, destinés à redresser la lumière horizontalement et verticalement vers la direction générale d'émission X-X, tout en lui conservant une certaine divergence horizontalement et verticalement afin de satisfaire à la photométrie désirée.
Le feu selon la présente invention est préférentiellement dépourvu de récupérateur de flux arrière, seul le rayonnement direct du filament vers la fenêtre de sortie 31 étant utilisé.
Si nécessaire, des aménagements optiques (non représentés) peuvent également être prévus sur le voyant 20, la photométrie du faisceau résultant alors des effets combinés de la déviation par les aménagements de la paroi frontale 31 du ballon et de la déviation par les aménagements du voyant, d'une façon classique en soi.