INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
2/Extraction On procède ensuite à deux extractions successives à partir de 35 kilos de pulpe de myrtilles avec chaque fois 210 litres de méthanol (soit 1 volume de pulpe pour 6 volumes de solution d'extraction) pendant vingt minutes à température ambiante. En fin d'extraction, on presse la pulpe de sorte à récupérer la fraction méthanolique. On évapore ensuite le méthanol sous vide, la température de l'extrait étant égale alors à 22 C. 3/Purrfcation On reprend ensuite le concentrât avec 70 litres d'eau déminéralisée (soit un
volume de pulpe pour 2 volumes d'eau).
L'extrait aqueux ainsi obtenu est ensuite stocké à une température
inférieure à 15 C pendant une nuit.
On procède ensuite à la filtration de la solution sur une toile inox 50 micromètres.
Puis on charge une résine macroréticulée, par exemple la résine XAD761 commercialisée par ROHM & HAAS avec l'extrait aqueux. On utilise en pratique
litres de résine.
Une fois la résine chargée, on la rince avec 105 litres d'eau déminéralisée
(soit un volume de pulpe pour 3 volumes d'eau déminéralisée).
On procède ensuite à l'élution de la résine par 200 litres d'éthanol à 40 %.
On concentre ensuite l'éluat sous vide, la température de l'extrait étant alors comprise entre 26 et 31 C.
Pour obtenir une poudre, on atomise ensuite l'éluat.
La teneur en anthocyanosides de l'extrait final est égale à 50.46 % du
poids final soit 53.50 % en poids de matière sèche.
Ces résultats sont exprimés par rapport au chlorure de cyanidine, étalon considéré pour l'analyse HPLC, référence 0909S, Fournisseur: Extrasynthèse.
On note que la quantité résiduelle de solvant dans l'extrait final est: * 0 ppm pour le butanol, * inférieure à 3000 ppm pour le méthanol,
d'éthanol dont la concentration en éthanol est comprise entre 10 et 90 %, avantageusement voisine de 40 %.
L'éluat obtenu est concentré sous température contrôlée aux environs de
C, puis séché par lyophilisation ou encore atomisation de sorte à obtenir une poudre.
On observe par ailleurs que la poudre obtenue contient une quantité résiduelle de solvant alcoolique très faible, inférieure à 3 000 ppm pour le méthanol, (si la purification est effectuée à partir d'un extrait méthanolique) et
inférieur à 2000 ppm pour l'éthanol. Ces solvants résiduels sont identifiés par CPG et sont les seuls contenus dans la poudre finale.
L'invention se rapporte également à l'extrait susceptible d'être obtenu par
le procédé de purification ci-avant décrit.
En outre, par son titre élevé en anthocyanosides originels et sa faible teneur en solvants résiduels, l'extrait pourra être utilisé dans toute composition cosmétique, pharmaceutique et diététique. Il pourra également être utilisé dans les
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compositions, les aliments enrichis et les compléments alimentaires.
L'invention et les avantages qui en découlent ressortiront mieux des exemples de réalisation suivants, à l'appui des figures annexées dans lesquelles: - la figure I est une comparaison d'un chromatogramme HPLC de l'extrait final obtenu selon l'exemple 1 par rapport à celui du fruit et celui de la pulpe d'origine; - la figure 2 est une comparaison identique effectuée à partir de l'extrait
obtenu selon l'exemple 2.
Les deux exemples qui suivent se rapportent à l'extraction d'anthocyanosides à partir de pulpe de myrtille.
1/Séparation de la pulpe On presse 125 kilos de myrtilles originaire de Lithuanie par tout moyen
connu. A l'issue du pressage, on sépare la pulpe représentant 52,24 kilos et le jus représentant 71,48 kilos.
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3 dict begin IDeferredMediaSelection true def 2 array astore /PageSize exch def /ImagingBBox null def currentdict end setpagedevice " *End *ParamCustomPageSize Width : points 256 842 *ParamCustomPageSize Height : points 420 1224 *ParamCustomPageSize WidthOffset : points 0 0 *ParamCustomPageSize HeightOffset : points 0 0 *ParamCustomPageSize Orientation : 5 int 0 0 % % *% =================== End of CustomPageSize *% ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ *% System Management - Commented Out *%====================================== *% *% *% THE END OF PPD FILE %%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%%
REVENDICATIONS 1. Procédé de génération d'une sortie d'un document électronique sur un dispositif de sortie, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes mises en #uvre par ordinateur consistant à : obtenir un premier matériau de sortie (514A, 514B) à partir d'une première source du dispositif de sortie (510) ; obtenir un second matériau de sortie (516) à partir d'une seconde source du dispositif de sortie (512) ; générer une sortie d'une ou de plusieurs pages du document électronique sur le premier matériau de sortie ; etintercaler de manière automatique le second matériau de sortie avant ou après chacune des pages sur le premier matériau de sortie lorsque les pages sont émises en sortie.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend en outre les étapes consistant à sélectionner un dispositif de sortie et un pilote (506) associé parmi une pluralité de dispositifs de sortie disponibles.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les étapes consistant à obtenir un premier matériau de sortie et à obtenir un second matériau de sortie comprennent les étapes consistant à sélectionner un premier plateau de source de papier (510) et un second plateau de source de papier (512) du dispositif de sortie parmi une pluralité de plateaux de source de papier disponibles.
4. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'étape consistant à générer une sortie comprend l'étape consistant à imprimer les pages du document électronique en utilisant le premier plateau de source de papier (510) et en ce que l'étape consistant à réaliser un intercalage de manière automatique comprend l'étape consistant à faire passer de manière automatique une feuille vierge (516) depuis le second plateau de source de papier (512) au travers du
La présente invention concerne d'une façon générale
les feux de signalisation de véhicules automobiles.
Il existe de nos jours une préoccupation croissante quant à la réalisation d'un feu de signalisation, qui, lorsqu'il est allumé, présente une plage éclairante aussi homogène que possible, et ceci pour des positions
d'observation quelconques dans le champ lumineux du feu.
Ainsi les défauts courants des feux de signalisation équipés d'une source unique (lampe à filament) coopérant avec un miroir arrière récupérateur sont un surcroît d'intensité lumineuse dans la région du voyant située au droit de la lampe, exposée à la densité de flux lumineux la plus grande. Lorsque l'on utilise des aménagements optiques de type lentille de Fresnel en coopération avec la lampe, le même type de problème est rencontré, la région centrale de la lentille émettant une densité de flux sensiblement supérieure à sa région périphérique. On connait en outre par le document FR-A-2 614 969 au nom de la Demanderesse un feu de signalisation conçu pour offrir, sur une largeur substantielle mais sur une hauteur limitée (feu allongé), une intensité lumineuse de sa plage éclairante relativement homogène. Il comporte à cet effet une lampe à filament coopérant avec un ballon de répartition angulaire de la lumière, qui l'entoure étroitement, et une plaque optique de redressement renvoyant sensiblement dans l'axe du feu le rayonnement
reçu du ballon.
Toutefois, ce feu connu ne résout pas complètement le problème des inhomogénéités, en ce sens que les aménagements de redressement de la lumière prévus sur la plaque présentent des coefficients de transmission de la lumière qui varient beaucoup d'un lieu à l'autre, et en particulier selon l'importance du redressement demandé, si bien qu'en définitive, un tel feu conserve une densité de flux lumineux sensiblement plus importante au droit de la lampe que vers les bords latéraux de la lampe. Au surplus, les enseignements de ce document s'appliquent limitativement à un feu de faible hauteur, et ne donnent aucune indication permettant de traiter le cas d'un feu dont la plage éclairante présente non seulement une largeur substantielle, mais également une
* inférieure à 2000 ppm pour l'éthanol.
On a représenté à la figure 1, les résultats d'un chromatogramme effectué en HPLC de l'extrait final (1) par rapport à celui du fruit (2) et de la pulpe
d'origine (3).
Comme le montre ce chromatogramme, le profil des anthocyanosides extraits est identique à celui des anthocyanosides natifs présents dans la pulpe ou
dans le fruit d'origine, laissant présager ainsi que les caractéristiques physico-
9 chimiques des anthocyanosides ne sont pas altérées tout au long du procédé
d'extraction et de purification.
On peut donc penser que l'extrait obtenu, dont la composition en anthocyanosides est identique à celle présente dans le fruit originel garde toutes les qualités reconnues du fruit.
On reproduit l'exemple 1 à partir d'un second lot de myrtilles d'origine polonaise.
On observe que la concentration d'anthocyanosides obtenue est égale à
49,1 % en poids de l'extrait final, soit 52,01 % en poids de matière sèche.
La quantité résiduelle de solvants est: * 0 ppm pour le butanol, * inférieure à 3000 ppm pour le méthanol,
De même que précédemment, la figure 2 représente le chromatogramme HPLC de la pulpe du fruit et de l'extrait obtenu.
On observe de façon identique que le profil des anthocyanosides contenus dans l'extrait (4) est identique à celui contenu dans la pulpe (5) et le fruit (6).
De plus, on observe que la combinaison des différentes étapes du procédé, et notamment l'étape de refroidissement suivie de la filtration et du passage sur
résine, conduit, de façon tout à fait surprenante, à augmenter considérablement le titre d'anthocyanosides extrait dans l'extrait sec final. Pour une température de 5 l'extrait aqueux supérieure à 15 C, on n'obtient pas une purification suffisante des anthocyanosides.
Dans une première forme de réalisation de l'invention, le procédé de purification est effectué sur un extrait alcoolique de fruit rouge obtenu selon le procédé suivant: - on sépare tout d'abord la pulpe des fruits rouges entiers; - on met ensuite ladite pulpe au contact d'une solution d'extraction alcoolique; - puis, on sépare la phase solide de la phase liquide; - enfin, on évapore sous vide la majeure partie de l'alcool résiduel
contenu dans la phase liquide, afin d'obtenir un concentrât alcoolique.
Avantageusement, le solvant utilisé pour l'extraction alcoolique est choisi dans le groupe comprenant le méthanol, l'éthanol, le butanol et l'acétone.
En pratique, l'extraction alcoolique est effectuée à température ambiante en au moins deux étapes successives, chacune étant d'une durée de 20 minutes. Le
solvant est ensuite évaporé. En outre, on peut prévoir également d'effectuer l'extraction des anthocyanosides non pas à partir de la seule pulpe, mais à partir25 des fruits entiers.
De plus, la séparation phase solide/phase liquide peut être effectuée par tout moyen connu, notamment centrifugation.
Selon une seconde forme de réalisation de l'invention, le procédé de purification est effectué à partir d'extraits de fruits rouges disponibles dans le commerce ou d'extrait d'anthocyanosides prépurifiés, présentés chacun sous forme liquide ou de poudre. Dans ce cas, l'extrait de fruit ou l'extrait prépurifié peut alors être repris avant l'étape de purification, au choix par de l'alcool, notamment du
méthanol, ou de l'eau.
Dans le procédé de purification de l'invention, le refroidissement de l'extrait de fruit rouge est effectué avantageusement jusqu'à ce que la température
dudit extrait soit homogène et inférieure à 10 C, de préférence inférieure à 5 C,5 cette température étant maintenue pendant au moins douze heures.
Concernant l'étape de filtration de l'extrait aqueux, celle-ci peut être effectuée sur filtre cellulose, toile inox avec un seuil de coupure compris entre 0 et
micromètres ou équivalent.
Comme déjà dit, le perméat issu de l'étape de filtration est ensuite chargé sur une résine macroréticulée adsorbante.
Par ailleurs, afin d'augmenter d'avantage le titre et la concentration d'anthocyanosides dans l'extrait final, la solution alcoolique avec laquelle on élue les anthocyanosides de la résine est préférentiellement une solution aqueuse
Le plasmide pl F-lIlacZ-I.6I a été soumis à une digestion par les enzymes SacII et HindIII, et le fragment de 2 kb résultant a été sous-cloné dans le plasmide pIF-nlacZ- 1.6E pour donner naissance au plasmide p 1 F-nlacZ-l .6IE.
Plasmides pTK-CAT-IE, pTK-CAT-IrcvE et pTK-CAT-E : la construction des plasmides pTK-CAT-I et pTK-CAT-Irev a été décite par Kelly et al. (1997). Un fragment de 260 pb contenant la séquence activatrice 3' a été sous-cloné au niveau du site Kpnl localisé en 3' par rapport à la séquence poly(A) de SV40, pour donner respectivement naissance aux plasmides pTK-CAT-IE, pTK-CAT-IrevE et pTK-CAT-E, dans lesquels la séquence activatrice 3' se retrouve dans la même orientation, par raport au promoteur, que dans la séquence génomique.
2. Cultures cellulaires et transfections Des cellules de la lignée C2/7 ont été cultivées et transfectées au stade myoblaste, comme décrit par Kelly et al. (1995). Les myoblastes ont été récupérés 24 heures après l'étape de transfection et les myotubes 2 à 3 jours après incubation des cellules dans le mlieu de culture de différentiation (2 % de sérum de veau foetal).
Les cellules de la lignée de fibroblastes NIH 3T3 ont été cultivées dans du milieu de culture DMEM en présence de 7 % de sérum de veau foetal et transfectées selon le même mode opératoire que les cellules C2/7, mais à un degré de confluence élevé (approximativement 75 % de confluence).
Les tests de détection de l'activité beta-galactosidase ont été réalisés comme décrit dans l'ouvrage de Sambrook et al. (1989) ou en utilisant le test de marquage fluorescent Galactolight (Tropix, Bcdford, Massachusctts) scion les indications du fabricant (Jain et Magrath, 1991), à partir de 0,2 à 7 % d'un extrait cellulaire préparé à partir d'une boîte de culture de 6 cm de diamètre.
Les tests de détection de l'activité CAT ont été réalisés sur 0,2 à 5 % d'extraits cellulaires (Biben et al., 1994).
Les valeurs d'activités beta-galactosidase et CAT ont été normalisées, pour la détermination de l'efficacité de transfection, en évaluant l'activité luciférase à partir d'un vecteur RSV-luciférase co-transfecté (à partir de 10 à 20 % d'extrait cellulaire). Les valeurs représentées correspondent à la moyenne accompagnée de l'écart-type ( standard error of the mean ou SEM) d'au moins quatre expériences réalisées avec plus d'une préparation de plasmide de chacune des constructions. Le test de Student a été utilisé afin de déterminer si les différences entre les différentes valeurs moyennes sont significatives.
3. Obtention des souris transgéniques Les souris transgéniques 3F-nlacZ-2E et 3F-n/acZ-9 ont été décrites par Kelly et al. (1995, 1997). L'insert du plasmide p3F-nlacZ-E9 a été excisé en tant que fragment SacII-SmaI et purifié par électrophorèse sur gel puis passage sur une colonne de chromatographie ElutipTM (Schleicher et Schuell), avant micro-injection. Les souris transgéniques ont été obtenues par micro-injection des fragments d'ADN purifiés, à une concentration de 700 à 1 000 copies de plasmide par pl, dans des oeufs fertilisés de souris de la génération F2 issues d'un croisement C57BL/6J x SJL, selon les techniques conventionnelles (Hogan et al., 1994). Les oeufs injectés ont été réimplantés dans des femelles dans des mères adoptives pseudo-gestantes (C57BL/6 x CBA) de génération FI.
4. Identification et analyse des souris transgéniques Les souris transgéniques ont été identifiées et analysées comme décrit par Kelly et al. (1995 et 1997). Le nombre de copies du transgène a été déterminé à l'aide d'un PhosphorimagerTM (Molecular Dynamics). Deux lignées indépendantes de souris 3F- nlacZ-E9 (E9-8 et E9-13) ont été obtenues ; ces deux lignées de souris hemizygotes ont des nombres de copies du transgène respectivement de 2 et 1 copies.
L'activité beta-galactosidase dans les souris transgéniques a été quantifiée selon la technique décrite par Kelly et al. (1997), à l'aide d'un test chimiluminescent (Galactolight, Tropix). L'activité beta-galactosidase est exprimée en unités lumineuses
relatives ( relative light units ou rlu) / 60 min/ug d'extrait. Des témoins de contrôle de concentrations de beta-galactosidase purifiée (714 U/mg, Sigma) ont été systématiquement inclus dans les tests afin d'évaluer la linéarité et la reproductibilité de ces derniers.
En vue d'obtenir les extraits d'embryons de souris au stade E 12.5, les régions embryonnaires ont été disséquées dans un volume de 100 l de milieu TGD (Biben et al., 1994) désagrégées par pipetage répété à l'aide d'un embout de pipette de 200 l, puis lysées par trois cycles de congélation-décongélation. Les échantillons ont été centrifugés à 1 500 t/min pendant 5 min et le surnageant a été traité selon la même méthode que pour les tissus adultes.
L'ARN EDL total a été isolé selon la technique décrite par Chomezynski et Sacchi (1987). Une quantité de 10 g d'ARN EDL total a été analysé par analyse northern blot, comme décrit par Mason et al. (1993), en utilisant une sonde oligonucléotidique de la région 5' UTR du gène MLC3F de souris ; les filtres ont été analysés à l'aide d'un appareil Phosphorimager#.
Exemples Exemple 1 : Démonstration que la séquence activatricc intronique et la séquence activatrice 3' agissent de manière synergique importante dans le muscle squelettique de la souris transgénique adulte.
Les rôles individuels des séquences activatrice 3' et intronique sur la transcription du promoteur MLC3F ont été étudiés chez les souris transgéniques (Kelly et al , 1995 ; McGrew et al., 1996 ; Kelly et al., 1997). En vue de rechercher les interactions entre les deux séquences activatrices in vivo, deux lignées de souris transgéniques ont été réalisées, contenant les deux séquences activatrices (construction 3F-nlacZ-E9).
Deux aspects de l'activité du transgène ont été recherchés : (i) le profil d'expression temporel et spatial de l'activité du transgène a été suivi durant le développement embryonaire et foetal, et (ii) les niveaux d'activité du gène rapporteur ont été quantifiés dans différents tissus adultes en utilisant un test chimioluminescent d'activité beta-galactosidase.
Dans les souris transgéniques 3F-nlacZ-E9, comme dans les souris contenant chacune des séquences activatrices seules (constructions 3F-nlacZ-2E et 3F-rrlacZ-9), de hauts niveaux d'expression du transgène sont observés dans les muscles striés squelettiques (EDL et masseter) et cardiaque (ventricule gauche), et un niveau identique au niveau basal dans les reins (Fig. 3a). L'activité du transgène dans le muscle