INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La présente invention a aussi pour objet une molécule d'acide nucléique comprenant ou constituée par une séquence nucléique codant pour une protéine constituant un canal cationique neuronal sensible à l'amiloride et activé par les protons. Plus particulièrement 1 'invention conceme une molécule d'acide nucléique comprenant au moins une séquence codant pour la protéine constituant le canal ASIC dont la séquence en acides aminés est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEO ID No : 1 ou pour un dérivé fonctionnellement équivalent de cette protéine. Une molécule d'ADN comprenant la séquence codant pour la protéine ASIC est celle représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEO ID NO:1 ou sa séquence complémentaire. Une autre molécule d'ADN selon l'invention est celle représentée dans la liste de séquence en annexe sous le numéro SEO ID NO : 2 ou sous le numéro SEO ID NO : 3, ou leur séquence complémentaire.
Des molécules d'acide nucléique selon l'invention comprennent ou son constituées par - la séquence nucléique comprise entre les nucléotides 123 et 1700 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEO ID No : 1, ou sa séquence ccmplémentaire; - la séquence nucléique comprise entre les nucléotides 1 et 1542 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEO ID No : 2, ou sa séquence complémentaire - la séquence nucléique comprise entre les nucléotides 127 et 1663 de la séquence représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEO ID No : 3, ou sa séquence complémentaire; L'invention conceme également un vecteur comprenant au moins une molécule d'acide nucléique précédente, avantageusement associée à des séquences de contrôle adaptés, ainsi qu'un procédé de production ou d'expression dans un hôte cellulaire d'une protéine constituant un canal ionique selon 1' invention. La préparation de ces vecteurs ainsi que la production ou l'expression dans un hôte des canaux de l'invention peuvent être réalisées par les techniques de biologie moléculaire et de génie génétique bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple, un procédé d'expression d'un canal ionique selon l'invention consiste - à transférer une molécule d'acide nucléique de l'invention ou un vecteur contenant ladite molécule dans une cellule, - à cultiver ledit hôte cellulaire dans des conditions permettant l'expression de canaux ioniques de 1' invention.
L'hôte cellulaire mis en oeuvre dans les procédés précédents peut être choisi parmi les procaryotes ou les eucaryotes et notamment parmi les bactéries, les levures, les cellules de mammifères, de plantes ou 'inspectes.
Ces cellules sont utiles pour le criblage de substances capables de moduler la perception de l'acidité, tant en ce qui concerne la nociception que la transduction du goût. Ce criblage est effectué en mettant en contact des quantités variables d'une substance à tester avec des cellules exprimant les canaux ASIC, puis en mesurant, par tous moyens appropriés, les effets éventuels de ladite substance sur les courants desdits canaux. Des techniques électrophysiologiques permettent également ces études et font aussi l'objet de la présente invention dès lors qu'elles mettent en oeuvre les canaux ASIC ou leurs dérivés.
Ces criblages permettent d'identifier de nouveaux médicaments utiles dans le traitement ou la prévention de la douleur. Ils permettent également de rechercher des agents modulateurs du goût acide. En outre, ils permettent de rechercher des bloqueurs qui sont susceptibles d'inhiber des neurodégénéresences provoquées par hyperexpression de ces canaux. Les canaux ASIC ont en effet des propriétés de sélectivité ionique, notamment en ce qui concerne leur perméabilité sélective au sodium, potassium et calcium, qui les destinent à avoir des propriétés excitotoxiques lorsqu'ils sont hyperstimulés.
Une molécule d'acide nucléique codant pour une protéine constituant un canal ASIC ou un dérivé de celui-ci, ou un vecteur comprenant cette molécule d'acide nucléique ou encore une cellule exprimant des canaux ASIC, sont aussi utiles pour la préparation d'animaux transgéniques. Il peut s'agir d'animaux sur-exprimant lesdits canaux, mais surtout d'animaux dit "knock out", c'est à dire présentant une déficience en ces canaux; ces animaux transgéniques sont préparés par des méthodes connues de l'homme du métier, et permettent de disposer de modèles vivants pour l'étude de pathologies animales associées aux canaux ASIC.
Outre la propriété d'être activé par les protons et les applications décrites ci-dessus qui en résultent dans le domaine de la perception de l'acidité, le canal ASIC, du fait de sa parenté structurale avec le canal MDEO, est susceptible de se comporter comme une dégénérine neuronale à la suite de mutation.
La construction d'une souche Sac. erythraea dans laquelle le gène eryBII porte une délétion interne telle que celle introduite dans le plasmide pBIIA préparé à l'exemple 2 et le processus d'intégration ont été réalisés de la façon suivante La préparation des protoplastes a été réalisée selon la méthode décrite par Weber et Losick (1988), en utilisant du PEG 3350 (Sigma) au lieu de PEG 1000 et un tampon P modifié (dénommé PT) contenant MgCl2,6H2O 28 mM et sans PO4H2K au lieu des tampons P, L ou T décrits, selon les conditions opératoires suivantes Les cellules (au moins 108 spores) de Sac. erythraea ired variant" (dont un échantillon a été déposé à la CNCM le 16 juillet 1997 sous le numéro I-1902) ont été mises à pousser dans 50 ml de milieu TBS pendant 3 à 5 jours à 300C, puis lavées dans du sucrose à 10,3 t. Les cellules ont été remises en suspension dans 50 ml de tampon PT contenant 2 à 5 mg/ml de lysozyme (Sigma), puis incubées à 300C pendant 1 à 2 heures en désagrégeant les amas de mycélium toutes les 15 minutes jusqu'à conversion d'au moins 50 % du mycélium en protoplastes. Les protoplastes ont été lavés avec 50 ml de tampon PT, remis en suspension dans 12,5 à 25 ml du même tampon, congelés lentement puis stockés à -80 C par aliquots de 200 pl.
Pour la transformation, un aliquot a été decongelé et 50 jil ont été prélevés puis transférés dans un tube de 15 ml.
Un à 10 pg d'ADN plasmidique pBIIA, préparé à l'exemple 2 à partir de la souche E. coli DH5aMRC ont été mis en solution dans 5 à 10 ssl de tampon TE (Tris HCl 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM) puis déposés sur la paroi du tube incliné auquel a été ensuite ajouté 0,5 ml d'une solution de PEG 3350 dans le tampon PT préparée extemporanément à partir d'une solution aqueuse à 50 % que l'on dilue au demi dans le tampon 2 x PT.
Après dilution avec 3 à 5 ml de tampon PT puis centrifugation à 2500 rpm pendant 15 mn, le culot a été dissocié dans 0,5 ml de tampon PT et la suspension de protoplastes transformés ainsi obtenue a été immédiatement répartie sur 2 ou 3 boîtes R2T2 très sèches (3 h sous une hotte à flux laminaire). Les boîtes ont été ensuite incubées à 320C pendant 16 à 24 h jusqu'à apparition du voile de régénération des protoplastes.
A partir d'une solution stock de thiostrepton (Sigma) à 50 mg/ml dans le DMSO, une quantité appropriée a été diluée dans 0,5 à 1 ml d'eau puis étalée sur les boîtes de façon à obtenir une concentration finale de 20 Zg de thiostrepton/ml de gélose. Après absorption complète de l'antibiotique, les boîtes ont été incubées à 320C pendant 3 à 4 jours, ce qui permet la visualisation des transformants. Les boîtes ont encore été incubées plusieurs jours jusqu'à développement complet des spores.
La sélection des intégrants correspondant au premier événement de recombinaison (figure 4) a été réalisée par réplication des boites sporulées à l'aide de velours ou par étalement d'une suspension des spores sur des boîtes R2T2 contenant du thiostrepton puis incubation à 320C, ce qui permet la croissance des clones d'intégrants potentiels.
Pour la sélection de clones ayant subi un deuxième événement de recombinaison (figure 4), 5 à 10 clones résistants au thiostrepton obtenus ci-dessus ont été mis en culture dans 8 ml de milieu liquide TSB à 300C pendant 3 à 4 jours. 50 à 100 41 ont été prélevés et remis en culture dans les mêmes conditions. Après 4 cycles successifs de dilution et culture destinés à favoriser la perte du marqueur de résistance au thiostrepton, des protoplastes ont été préparées à partir des cellules comme indiqué ci-dessus, de façon à chasser le plasmide. Les protoplastes ont ensuite été étalés sur des boîtes R2T2 de façon à obtenir des colonies individualisées dont la sensibilité au thiostrepton a été déterminée par réplique sur des boites R2T2 contenant du thiostrepton.
Selon la position du deuxième événement de recombinaison par rapport au site de délétion (figure 4), on peut attendre que le phénotype des colonies sensibles au thiostrepton soit du type sauvage ou du type muté porteur de la délétion.
Parmi les colonies sensibles au thiostrepton, la sélection des mutants ayant le phénotype ery a été réalisée par antibiogramme sur la souche B. pumilus ATCC 14884 sensible à l'érythromycine. La souche B. pumilus a été utilisée comme souche indicatrice pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques par antibiogramme. Les colonies ont été étalées à l'anse de platine sur des boîtes R2T2, puis incubées pendant 3 à 4 jours à 300C. Des zones d'agar où le mutant a poussé à confluence ont ensuite été prélevées à l'emporte pièce puis placées sur des boîtes A-Merck recouvertes d'une surcouche de 4 ml de 0,5 x A Merck (Antibiotic agar N"1 Merck) inoculée d'une suspension de spores de B. pumilus, puis incubées une nuit à 37"C.
La présence de la délétion attendue dans le chromosome du mutant (délétion de 853 pb du nucléotide 8011 au nucléo tide 8863) a ensuite été confirmée par analyse génomique par Southern blot ainsi que par PCR de la façon suivante Pour l'analyse par Southern blot, le transfert d'ADN génomique, préalablement digéré avec l'enzyme de restriction appropriée, sur des membranes GeenscreenPlus (Dupont NEN) a été réalisé dans NaOH 0,4 M selon Ausubel et al. (1995). Les hybridations ont été effectuées en utilisant comme sonde l'oligonucléotide marqué à son extrémité 5' en utilisant du [Y32P]ATP (Amersham) et la polynucléotide kinase (Boehringer Mannheim) selon Sambroock et al. (1989), ayant la séquence suivante B2-S 5' TTGGCGAAGTCGACCAGGTC 3' correspondant à la région d'ADN du début du gène eryG située de la position 4118 à la position 4137 de la séquence déposée dans la base EMBL sous la référence X60379 et décrite par Haydock et al. (1991). Les hybridations ont été effectuées avec un tampon d'hybridation rapide (Amersham) et les conditions de lavage suivantes : 2 x 5 mn, 2 x SSC, 200C 30 mn, 2 x SSC, 650C ; 30 mn, 0,1 x SSC, 200C.
Par hybridation Southern sur l'ADN génomique isolé selon Hopwood et al. (1985) puis digéré par l'enzyme de restriction KpnI, une bande de 5,8 kb à partir de la souche sauvage "red variant" et une bande de 4,9 kb à partir du mutant BII92 ont été détectées. Les résultats montrés à la figure 15 indiquent la présence chez le mutant d'une délétion d'environ 900 pb dans cette région du chromosome.
Pour l'analyse par PCR ,un échantillon de 100 41 d'une culture de 3 jours en milieu TSB a été centrifugé. Le culot obtenu a été remis en suspension dans 10 41 de milieu TSB, puis utilisé pour l'amplification dans l'appareil genAmp PCR system 9600 (Perkin Elmer Cetus). Après chauffage de l'échantillon pendant 3 mn à 94dC, les conditions d'amplification suivantes ont été utilisées : 940C, 1 mn 550C, 1 mn ; 720C, 3 mn ; 30 cycles ; polymérase Ampli Taq (Perkin Elmer) en présence de diméthylsufoxyde 10 % (v/v) suivis d'une élongation de 3 mn à 72"C . L'amplification a été effectuée en utilisant 1'oligonucléotide B2S ci-dessus et l'oligonucléotide ayant la séquence suivante B2-R 5' GCCGCTCGGCACGGTGAACTTCA 3' correspondant à la séquence du brin complémentaire de la région d'ADN située de la position 8873 à la position 8892 de la séquence de la figure 2 à laquelle ont été ajoutés trois nucléotides à l'extrémité 5' et permettant d'encadrer par amplification PCR la région portant la délétion interne à l'ORF7.
L'analyse par amplification par PCR sur des cellules entières a permis de détecter une bande d'environ 1 kb dans la souche sauvage et une bande de 0,16 kb dans le mutant BII92 de façon identique au signal obtenu avec le plasmide pBIIA. Les résultats montrés à la figure 16 confirment que la délétion d'environ 900 pb détectée par l'analyse Southern est identique à celle portée par le plasmide pBIIA (853 pb).
La souche recombinante ainsi obtenue, désignée BII92, a été ensuite cultivée pour identifier les métabolites produits par la souche.
EXEMPLE 4 : fermentation de la souche BII92 et identification des métabolites secondaires produits.
Des extraits de bouillon de culture de la souche ont été analysés par chromatographie en couche mince (ccm) avec l'érythromycine A, l'érythronolide B et le 3-a-mycarosyl érythronolide B comme standards.
- Pour le lapin "T", l'avidité déterminée au demi-déplacement est de 1,1 x 10-8 M (figure 1, courbe 1) et pour le lapin "C", l'avidité est de 4,5x10-8 M.
La spécificité de chaque antisérum a été également évaluée par des expériences de compétition entre le conjugué NO-Tyr-SAB (pour l'antisérum "T"), ou NO-Cys-SAB (pour t'antisérum "C") et les analogues structuraux conjugués. Les courbes de déplacement ont été obtenues à partir des résultats des tests de compétitions avec les haptènes conjugués et qui n'ont pas été utilisés dan ns l n s immunisation. En utilisant le rapport B/Bo pour chacun des compétiteurs, les Inventeurs ont pu déterminer ?os spécificités correspondantes pour le lapin "T" le conjugué le mieux reconnu St l'immunogène qui a donné une avidité de 1,1 x 10-8 M.
es autres conjugués reconnus sont les suivants: le N()2 Tyr-SAB (ICso = 1,4 x 10-7 M); NO-Tyr-SA-SAB (ICso = 5 x 10-5 et le NO-Tryp-G-SAB (ICso = 3 x 10-6 M). La courbe 2 de la figure 5 montre aussi l'absence de la reconnaissance du Tyr-SAB par cet antisérum.
- Pour le lapin "C" l'immunogène NO-Cys-SAB et le conjugué NO-Cys(non acétylée)-SAB ont été reconnus avec une avidité de 4,5 x 10-8 M et une spécificité de ~ 10-6 M.
Tous les autres conjugués, nitrosylés (par exemple la NO-SAB) ou non, ne sont pas reconnus par l'Ac "T" ou l'Ac "C".
(IC50 est la concentration molaire du compétiteur donnant 50 % d 'inhibition).
Il convient aussi de remarquer que, des tests ELISA indirects ont montré une descrimination entre la NO-SAB et la SAB par les Ac polyclonaux "T" et "C". Les DO obtenues avec ces antisérums sont respectivement de l'ordre de 0,34 + 0,062 et 0,27 + 0,05. En revanche, en phase liquide, la NO-SAB n'a pas été reconnue ce qui pourrait etre expliqué par la modification confermatiennette de cette molécules en phase solide (test indirect) et phase liquide (test de compétition).
5) Discussion.
En se basant sur les travaux de Landsteiner, (1945); Goodman, (1975); Geffard et al., (1985b); et Mons e t Geffard, (1987) pour l'induction des antisérums contre les petites molécules, le développement d'Ac anti-NO (conjugué a été réalisé. La réactivité de NO avec les .Jroupements thiols pourrait expliquer, en partie, son ntervention dans différents processus biologiques (Girard tt Potier, 1993). En fait, il a été postulé que NO est rahilisé sous forme de S-nitrosothiol qui peut conserver s réactivité biologique. La présente étude immunologique t- est basée sur I > l'hypothèse de la stabilité des dérivés-NO.
Les Inventeurs ont utilisé différents conjugués nitrosylés }résumées transporteurs de NO (résidus aryls nitrosylés et -nitroso-Cys) . La caractérisation immunochimique des anti-NO-Tyr et anti-NO-Cys développés montre un pouvoir de discrimination différent de ces Ac pour les immunogènes correspondants. De plus, le titre spécifique optimal anti-Tyr nitrosylée a été observé après la 3ème immunisation, au bout de 1-2 mois (figure 3), alors que t'anti-Cys nitrosylée, ne présente pas d'évolution du titre avant une période de 2-3 mois (figure 4), et donne un titre optimal après la 5ème immunisation.
En ce qui concerne la spécificité de ces Ac préincubés avec d'autres conjugués présentant une analogie structurale avec le composé utilisé comme immunogène, on note également une différence dans les réponses obtenues avec ces deux Ac. Ainsi, 1'Ac "T" reconnait deux conjugués qui n'ont pas été utilisés dans l'immunisation, le N02-Tyr-SAB et le NO-Tryp-SAB, ce qui n'est pas le cas de t'Ac "C". Aucun des autres conjugués non nitrosylés n'a ete reconnu par ces deux Ac. Les réponses différentes observées avec ces deux types d'Ac pourraient également etre expliquées par les différences de structures Inoléculaires des immunogènes, leur stabilité dans le milieu biologique, leur métabolisme, ou bien par les modifications favorisées par les cellules présentatrices de l'antigène. Tous ces facteurs peuvent jouer un rôle fondamental dans la stimulation du système immunitaire et dans l'avidité de l'Ac induit.
Enfin, la reconnaissance de la NO-SAB synthétisée chimiquement par les Anticorps polyclonaux, ()nt amené les Inventeurs à utiliser cette forme de transport de NO dans des multiples applications in vitre, on utilisant les macrophages activés comme donneurs biologiques de NO.
III - DÉTECTION ET NEUTRALISATION DE DÉRIVÉS DE PcO PAR LES ANTICORPS POLYCLONAUX.
Les cellules macrophagiques jouent un rôle essentiel dans la réponse immunitaire. En effet, dès l'apparition d'une infection, elles peuvent intervenir dans la destruction du microorganisme, en le phagocytant.
De plus, les macrophages activés lors d'une réponse immunitaire spécifique exercent un effet microbicide cytotoxique sur des microorganismes intracellulaires (Ruskin et Remington, 1968). Une des voies métaboliques de t 'arginine est essentielle dans l'activation des macrophages et dans leur effet cytotoxique sur des cellules tumorales (Hibbs et al., 1987a) et cytostatique sur des espèces fongiques telle que Crypteseccus neoformans (Granger et al., 1988). Cette voie métabolique conduit à la synthèse de la L-citrulline et de NO à partir de l'arginine (Hibbs et al., 1987b; Hibbs et al., 1988), grâce à la iNOS. L'analogue structural de l'arginine, NMMA a ensuite été caractérisé comme inhibiteur compétitif de cette synthèse à partir des macrophages activés (Hibbs et al., 1987a, b; Drapier et Hibbs 1988; Hibbs et al., 1988).
Ce phénomène de cytotoxicité a été étudié essentiellement in vitro dans les macrophages murins et il existe maintenant un large consensus pour affirmer que la voie de biosynthèse L-arginine - > NO en est la base (Drapier, 1993).
La figure 2 représente le dispositif selon l'invention, montrant la protection de la main lorsqu'il y a écrasement de la ceinture.
La figure 4 représente en coupe un autre montage de la ceinture sur la tablette du trotteur.
La figure 5 représente le positionnement de la ceinture autour de la tablette du trotteur.
En référence à ce dessin, le dispositif comporte une ceinture en caoutchouc mousse (1), fixée sur la tablette (3) à l'aide d'étriers (2), en plastic, collés sous la tablette. La ceinture (1) est monobloc et amovible pour faciliter le nettoyage ou le remplacement. La ceinture (1) est tenue écartée de 2 centimètres du bord de la tablette (3) de par le fait de sa construction. Cet espace permet à l'enfant une préhension préférentielle sur la tablette elle-même, car plus rigide que la ceinture. Lors d'un choc avec un objet, d'une pression, en position de cisaillement, la ceinture enveloppe la main de l'enfant le protégeant ainsi d'une blessure. La ceinture aura une hauteur d'au moins 6 cm pour éviter le cisaillement aussi bien par le dessus que par le dessous de la tablette. Si la préhension se fait par le haut de la ceinture, celle-ci se couche évitant ainsi le coincement entre deux parties dures.
Procédé de pilotage d'un engin spatial avec perfectionnement du système de pointage et engin spatial ainsi piloté.
Cette invention concerne la commande d'attitude d'un engin spatial et, plus particulièrement, la commande d'attitude d'un engin spatial pendant le fonctionnement d'un propulseur de modification de vitesse.
Un engin spatial est souvent lancé sur une fusée qui place l'engin sur une orbite plus basse que l'orbite souhaitée. Pour que l'engin spatial atteigne l'orbite souhaitée, il peut être nécessaire de faire fonctionner un propulseur de modification de vitesse (delta-V ou AV) monté sur le corps de l'engin.
Quand un engin spatial à gyrostabilisation est accéléré par un propulseur de modification de vitesse comme un propulseur d'apogée à propergol liquide (LAE), le corps de l'engin qui tourne a une certaine rigidité gyroscopique qui tend à réduire les déviations de l'axe longitudinal du corps par rapport à la direction de pointage voulue. Dans ce contexte, la direction de pointage est la direction dans laquelle on souhaite la modification de vitesse. Toutefois, un engin spatial stabilisé suivant trois axes n'utilise pas la gyrostabilisation mais est stabilise par le fonctionnement d'un système de commande d'attitude qui utilise des dispositifs commandables de production de couple pour traire tourner le corps autour des trois axes de commande. Ces axes s(nt normalement appelés les axes de tangage, de roulis et de lacet.
Lorsqu'on fabrique un engin spatial, on fait très attenti(n à l'alignement des axes de poussée des différents propulseurs par rapport au centre d'inertie de l'engin, de manière à avoir le couple souhaité quand chaque propulseur est mis à feu. Dans le cas des propulseurs de commande d'attitude, les couples souhaités sont suivant les trois axes principaux. Dans le cas d'un propulseur dc modification dc vitesse le couple souhaité est nul suivant chacun de ces trois axes du corps Autrement dit, le propulseur de modification de vitesse impartit dc préférence une modification de vitesse uniquement dans la direction de son axe de poussée et, de manière idéale, n'exerce aucun couple sur Ic corps de l'engin spatial. Pour minimiser les couples appliqués au corps de l'engin spatial par le propulseur de modification de vitesse son axe de poussée est aligné aussi étroitement que possible sur le centre d'inertie du corps de l'engin.
En réalité, il est impossible de déterminer la position exacte du centre d'inertie du corps de l'engin spatial et d'aligner sur lui l'axe de poussée du propulseur de modification de vitesse. Il est cn outre difficile de déterminer l'axe de poussée exact du propulscur. Par conséquent, le fonctionnement du propulseur de moditication de vitesse produit toujours des couples non voulus qui tendent à faire toul-nel- L'engin et à l'éloigner de la direction de pointage souhaitéc.
L'attitude d'un engin spatial stabilisé suivant trois axes est commandée par son système de commande d'attitude, par exemple par actionnement de volants de réaction ou d'inertie, par crèati(n d'un couple magnétique ou par actionnement de propulseurs dc commande d'attitude. Les couples de perturbation provoqués par le fonctionne- ment du propulseur de modification de vitesse sont colligés par les couples produits par le système de commande d'attitude. Toutefois, du fait de la bande passante finie du système de commande d'attitude il y a un certain décalage entre le couple produit par le propulseur dc modification de vitesse et le couple opposé de correction produit par le système de commande d'attitude. Ce décalage se traduit par une erreur de pointage, qui existe ou se poursuit jusqu'à ce que le système de commande d'attitude exerce une commande qui contrecarre ttale- ment la perturbation et ré-aligne l'engin spatial avec les direcliolls de pointage voulues. Dans l'intervalle entre le début du fonctionnement du propulseur de modification de vitesse et la stabilisalion par le système de commande d'attitude, il apparaît une composante dc modi- fication de vitesse dans une direction non souhaitée, qui n'est pas corrigée par le système de commande d'attitude.
Des systèmes perfectionnés de commande d'engin spatial sont donc souhaités.