INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Plant Journal 3 437-449 1993 7 aagcttgcat gcctgcagac tagtggattg atgtgatatc tccactgacg taagggatga 60 cgcatgccac tctgtggcac atctacatta tctaaatcta agccacgtcg gaggataaca 120 tattcttcca cacatcttag ccacacaaaa acccaatcca catctttatc atccattcta 180 taaaaaatca ccttctgtgt gtctctcttt cgattccctt caaacacata caaattcagt 240 agagaagaaa ctcattactc ttgagaaacc tagaggatcc 280 8 303 ADN Artificial Sequence promoter (1)..(303) Le promoteur MPrl 153 aété obtenu en fusionnant séquence de 78 pb du promoteur petE, s'étendant la position -582 à la position -510 pb à modifiée par adjonction de la boîte "G" Promoteur MPrl 1153 Last, D. I.
Plastocyanin is encoded by a single-copy gene in the pea haploid genome.
PlantMol. Biol.
Ainsi pour le mélange naturel d'histones Sigma, (C) = 1,5.10-11 mg/ng ADN/pb pour l'histone H2b Sigma, (C) = 1,5.10-12 mg/ng ADN/pb Par extrapolation, les inventeurs ont défini la loi suivante qui peut s'appliquer à toutes les protéines compactantes utilisées : (C) = 10-x mg/ng ADN/pb dans laquelle x est compris entre 8 et 15.
La valeure x est fonction de la nature de l'agent de compaction utilisé.
Pratiquement, l'efficacité du clonage est toujours améliorée si la concentration se trouve dans un intervalle encadrant la valeur ainsi définie de 20 à 1000%, et de manière préférée entre 33 à 200%.
Le procédé selon la présente invention se caractérise donc en ce que la concentration (C) en agent de compaction est determinée par la loi suivante : (C) = ( 10-x mg/ng ADN/pb ) X Y dans laquelle : x est compris entre 8 et 15, et de préférence entre 10 et 12,et Y varie entre 0,2 et 10, de préférence entre 0,33 et 2.
La présente invention est aussi relative à un kit pour la mise en #uvre de la méthode de préparation d'acides nucléiques recombinants de grande taille
circularisé telle que définie auparavant. Ce kit est constitué des éléments suivants : - Un tampon de ligation, - une ligase, - un agent de compaction.
Comme agent préférentiel de compaction, il sera utilisé soit un mélange d'histones, une histone isolée, ou toute autre protéine de condensation.
Une autre caractéristique de l'invention concerne les paramètres de mise en #uvre de la méthode et du kit objet de l'invention. La ligation est conduite dans les conditions usuelles, avec les modifications suivantes.
Les conditions usuelles dépendent de la ligase employée et des indications fournies par la société commercialisant l'enzyme. Pour la T4 DNA ligase commercialisée par NEB Biolabs, la ligase est employée avec un tampon : - 5mM Tris-Hcl - lmM MgC12 - lmM DTT - 0,1 mM ATP - 2,5 g/ml BSA Préalablement à la ligation, l'agent protéique est mis en solution dans le tampon de ligation contenant ou non du glycerol (ou dilué dans le milieu de ligation, s'il est fourni sous forme de solution). Il est incorporé dans le milieu de ligation dans les proportions définies par la loi indiquée auparavant.
De façon préférentielle, le kit comprend un agent stabilisant incorporé au milieu de ligation en même temps que la protéine, et destiné à empêcher la
dénaturation ,l'aggrégation et/ou l'adsorption de la protéine sur les parois du tube réactionnel à ces fortes dilutions. Il se présente donc sous la forme suivante : - un tampon de ligation, - une ligase, - un agent de compaction, - éventuellement un agent stabilisant pour la protéine.
De manière privilégiée, ce tampon de dilution est le glycérol ou tout composé présentant les mêmes caractéristiques.
Un kit préférentiel selon la présente invention se caractérise en ce que : - la ligase est la E.Coli T4 ligase, - le tampon de ligation correspondant, - l'agent de compaction est un mélange d'histones (ou un histone isolé), - l'agent stabilisant, s'il est présent, est du glycérol.
L'invention concerne aussi les recombinants de grande taille susceptibles d'être obtenus par le procédé décrit ci-dessus.
Un tel recombinant peut être constitué par : un vecteur pouvant contenir une origine de réplication, un gène de résistance pour la croissance et la sélection,... ; un insert pouvant être associé à un gène indicateur, un gène de résistance, ...
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture des exemples suivants, donnés à titre non limitatif, et concernant la construction d'un recombinant de grande taille au moyen de protéines compactant 1 'ADN, et de son clonage dans E.Coli et dans lequel les figures annexées représentent : Figure 1 : Complexation de la protéine au fragment fR4 dans les conditions de ligation, suivie par retardement de la migration électrophorétique du fragment en gel d'agarose 0,4%.
contrôleur ; le microprocesseur ERC-32 de la société MHS S. A. intègre un tel mécanisme.
- Méthode de programmation multiple ( Nversion programming ), associée aux architectures à redondance modulaire d'ordre N, qui permet de détecter également des erreurs de conception logicielle. Chaque calculateur dispose d'une version de logiciel qui a été développée spécifiquement à partir d'une spécification commune .
- Redondance temporelle : il s'agit soit d'avoir deux exécutions successives suivies d'une comparaison, soit d'avoir une seule exécution suivie du chargement d'un registre de commande puis de la relecture de celui-ci afin de réaliser une comparaison et une validation, tel le mécanisme armer puis tirer utilisé en spatial pour les commandes très critiques, par exemple le déclenchement des éléments pyrotechniques.
- Contrôle du temps d'exécution : des chiens de garde , compteurs de temps qui permettent de vérifier l'exécution en une durée bornée d'un logiciel, sont utilisés dans tous les calculateurs spatiaux. De plus, des contrôles plus fins du temps d'exécution peuvent être incorporés dans le logiciel : contrôle de la durée d'une tâche, durée maximale autorisée pour obtenir la réponse d'un éléments de communication, etc. Des logiciels permettent de positionner des contrôles sur la durée d'exécution des tâches.
- Vérification du flot de contrôle, par exemple contrôle du séquencement d'un microprocesseur.
Les chiens de garde permettent un contrôle grossier : détection d'un plantage dur. Un contrôle fin du flot d'instruction est possible avec un processeur de surveillance plus ou moins complexe. Le contrôle par
analyse de signature est particulièrement efficace et peu demandant en électronique. Ce concept a été intégré dans l'ERC-32 de la société MHS S. A. mais, pour être transparent à l'utilisateur, il a fallu développer un compilateur spécifique qui calcule les signatures de référence et les intègre dans le code.
- Contrôle de la validité de l'adressage d'un microprocesseur à partir des droits d'accès par pages/segments.
- Contrôle de vraisemblance : ce principe est utilisé dans les Systèmes de Contrôle d'Attitude et d'Orbite (ou SCAO) de satellites où l'on compare soit les données de plusieurs types de capteurs pour détecter des incohérences éventuelles, soit une donnée par rapport à une référence estimée grâce à un filtre prédictif sur les valeurs précédentes, soit une donnée par rapport à une plage d'appartenance prédéfinie. Les méthodes dites tolérance aux fautes basée sur le traitement algorithmique représentent une sous-classe des contrôles de vraisemblance, la vérification étant basée sur l'exécution d'un deuxième algorithme, par exemple l'algorithme inverse qui permet de retrouver les données initiales en partant des résultats obtenus si ceux-ci sont exempts d'erreurs.
- Contrôle structurel ou sémantique des données, nécessitant des structures de données relativement complexes.
- Concepts complémentaires de recouvrement d'erreurs, principalement des points de reprise pour les mécanismes décrits précédemment ne permettant pas de corriger les fautes : sauvegarde régulière de contextes et reprise à partir du dernier contexte sauvegardé.
Une autre possibilité du recouvrement d'erreurs réside en la réinsertion d'une ressource en
faute par transfusion d'un contexte sain dans un calculateur fautif, afin de retrouver la capacité initiale de détection/correction.
Il existe également des documents de l'art connu dans le domaine de la redondance temporelle.
Le document référencé [5] évoque la possibilité d'exécuter une tâche trois fois de suite et de voter le résultat.
La possibilité de réaliser un fonctionnement de type redondance modulaire d'ordre N en logiciel, est également mentionnée de façon théorique dans le document référencé [6].
Les histones sont les protéines les plus abondantes du noyau ; elles sont de petite taille (11 à 25 kDa) et possèdent un caractère très basique (pH>10). Il existe cinq types d'Histones appelés respectivement Hl, H2A, H2B, H3 et H4, et ces cinq types se retrouvent avec des variantes chez tous les eucaryotes (excépté Hl qui ne semble pas exister chez la levure, et qui est remplacé par l'histone H5 dans certains organismes). In vivo, H2a, H2b, H3 et H4 s'assemble sous forme d'octamère. L'ADN s'enroule deux fois autour du c#ur octamérique pour former une structure nucléosomique. L'histone Hl ne fait pas partie de ce noyau, mais sert à verrouiller l'ADN autour de l'octamère. Dans la cellule eucaryote, la compaction de l'ADN par les histones aurait notamment pour effet de rapprocher deux sites de régulation transcriptionnelle éloignés sur le chromosome, et de permettre la formation d'une boucle de chromatine par interaction directe entre ces sites. L'expression d'un gène peut ainsi être commandée à distance de ces gènes (Amouyal, Biochimie (1991), 73, p.1261-1268).
Selon l'invention, la ligation de l'insert et du vecteur d'origine est effectuée en présence de produits compactant l'ADN. Le vecteur d'insertion contient une origine de réplication et un gène de résistance pour la croissance et la sélection dans le type cellulaire considéré.
Les agents de compaction de l'ADN sont des protéines, des mélanges de protéines, ou des dérivés des protéines. Par le terme protéines, il faut entendre protéines naturelles et synthétiques.
Les produits compactant l'ADN sont des protéines ou tout agent présentant les mêmes propriétés, et plus particulièrement des protéines histones ou protéines apparentées. Outre les histones, l'agent de compaction de l'ADN peut être choisi parmi toutes les protéines connues pour compacter l'ADN, notamment les protéines d' enveloppe virales ou de phages et les protéines du chromoïde bactérien (HU, H-NS, ...) , tout mélange de ces composés, ou tout dérivés de ceux-ci.
Par conséquent, pour l'étape a) du procédé selon l'invention, l'agent de compaction de l'ADN est choisi parmi une histone, une protéine d'enveloppe virale ou de phage, une protéine du chromoïde bactérien, et/ou un mélange desdits agents de condensation.
De manière préférentielle, l'agent de compaction de l'ADN est un mélange d'histones.
La demanderesse a démontré qu'un mélange d'histones ou une histone isolément conduisaient à des résultats analogues. L'histone Hl, de structure différente, et n'étant pas une histone formant l'octamère, mais plutôt
une histone de verrouillage, utilisé isolément ne semble pas apporter d'aussi bons résultats que les autres histones.
Ceci s'explique car Hl, du fait de sa structure différente, ne se fixe pas sur l'ADN linéaire, mais se fixe de préférence sur de l'ADN superenroulé (Van Holde et al., Biophysical journal, 1997,72, p.1388-1395).
Dans un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les agents de compaction sont ajouté au milieu de ligation. Ce milieu comprend l'ADN en solution dans le tampon de ligation. La ligation est assurée par addition d'une enzyme de ligation au milieu de ligation.
De manière préférée, mais non limitative, la ligase utilisée est la E. Coli T4 DNA Ligase.
Une caractéristique de l'invention réside dans la concentration (C) d'agents de compaction présents dans le milieu de ligation.
Cette concentration (C) en agent de compaction est déterminée de façon à ne pas entraîner une rigidification de l'ADN. Si cela se produisait, l'ADN ne pourrait se courber, il ne pourrait y avoir contact entre les extrémités du vecteur finalisé, et la ligation serait empêchée.
Pour une protéine ou un mélange de protéines donné, la quantité d'agent de compaction est définie par calcul et testé par gel de retardement, de manière à ne pas saturer un fragment d'ADN-témoin en protéines.
Cette concentration (C) peut être exprimée en mg de protéines par nanogramme d'ADN total contenu dans le mélange de ligation et par paire de base de recombinant .
Elle dépend de la longueur d'ADN à liguer, et les inventeurs ont défini plusieurs lois, correspondant à chacun des agents protéiques employés:
Une recherche dans une base de données pour déterminer l'homologie avec les polypeptides séquences est restée négative. Aucun des polypeptides n'a été séquence ou décrit précédemment.
Effet de l'inhibiteur sur différentes xylanases Plusieurs essais ont été effectués pour étudier l'inhibition de différentes xylanases. Tout d'abord, on a considéré que la diminution d'activité de xylanase était due à une activité protéolytique dans l'extrait. En conséquence, différentes xylanases ont été mises en incubation avec différents volumes d'extrait "d'inhibiteur" (figure 19). Il a été constaté que les xylanases étaient inhibées à des degrés différents. Il a été trouvé également qu'il semblait exister une augmentation de l'inhibition en fonction de la concentration "d'inhibiteur".
Les résultats illustrés sur la figure 19 pourraient indiquer que la diminution était due à une protéolyse ou un inhibiteur. Cependant, des expériences dans le temps avec des concentrations constantes de xylanase et d'inhibiteur et les résultats précités dans le paragraphe "analyse de détermination d'activité de protéase" n'ont pas montré une réduction de l'activité en fonction du temps. Pour pouvoir effectuer la différence entre la protéase et l'inhibiteur, la cinétique réelle doit être déterminée (voir la "cinétique de l'inhibiteur").
Deux xylanases de Bacillus subtilis ont été étudiées de manière très approfondie en ce qui concerne leurs performances à la cuisson au four. Ces xylanases différaient quelque peu par leur fonctionnalité, ce qui signifie qu'une a donné un volume spécifique légèrement supérieur lors de la cuisson au four à des doses identiques. Une explication pourrait être une inhibition différente de leur activité dans la farine. Une expérience a été donc effectuée pour étudier ce phénomène. L'expérience a été répétée deux fois, en utilisant deux types différents de farine comme source d'inhibiteur (tableau 14).
TABLEAU 14 Inhibition de deux xylanases (980601 et 980603) par l'inhibiteur extrait de deux types de farine (98002 et 98026). L'inhibition est calculée par le pourcentage d'inhibition et par le pourcentage d'activité résiduelle, comparativement à un témoin à blanc
Farine 98002 98026 Inhibition, % 980601 67,03 75,04 980603 60,76 61,33 98002 98026 Avg Activité 980601 32,97 24,96 28,96 résiduelle, % 980603 39,24 38,67 38,96 Différence, % 25,65
L'essai montre que les deux xylanases sont inhibées à des degrés différents par l'inhibiteur. Les xylanases diffèrent de seulement 6-amino-acides.
Sur la base de la xylanase 980601, trois mutants de xylanase ont été préparés (XM1, XM2 et XM3). Ces mutants ont été analysés pour déterminer l'inhibition (figure 20).
Comme permet de le constater la figure 20, les trois mutants différent par leur activité résiduelle, ce qui signifie qu'ils sont inhibés à des degrés différents par l'inhibiteur de xylanase. Quatre (BX, Rohm, XMI et XM3) des cinq xylanases ont la même activité spécifique (approximativement 25000 TXU/mg de protéine). Il est prévu que XM2 ait la même activité spécifique.
La différence d'inhibition entre XM1 et XM2 est approximativement égale à 250 % (l'activité résiduelle de XM1 est 2,5 fois supérieure à l'activité résiduelle de XM2). Cette différence est due à un amino-acide. L'aminoacide 122 dans XM2 consistant en l'arginine est remplacé par l'asparagine, ce qui introduit une charge moins positive à proximité du site actif.
Cinétique de l'inhibiteur Une détermination de cinétique préliminaire simple a été effectuée, juste pour pouvoir déterminer si l'inhibiteur est compétitif ou non compétitif.
Différentes quantités de substrat ont été mises en incubation avec une concentration constante de xylanase et d'inhibiteur (figure 21).
Comme permet de le constater la figure 21, la valeur de Vmax pour la xylanase avec et sans inhibiteur est approximativement égale à 1,19. Cela indique que l'inhibition est compétitive.
Puisque les expériences de caractérisation préliminaire d'inhibiteur décrites ci-dessus ont indiqué une différence de K1 entre les xylanases étudiées, les valeurs de K1 de plusieurs xylanases ont été déterminées.
Comme permettent de le constater les résultats figurant
sur la figure 22, les valeurs de K1 ne diffèrent pas notablement entre les xylanases. Cela confirme les résultats indiqués par la caractérisation préliminaire simple de l'inhibiteur.
TABLEAU 7 Fractions provenant de la chromatographie d'échange de cations de 240 m] d'extrait d'inhibiteur filtré sur gel, analysé pour déterminer la présence d'inhibiteur de xylanase. Les essais de DO 1 et 2, respectivement, correspondent aux deux essais qui ont été effectués'sur la colonne. L'inhibiteur s'est révélé être présent dans les fractions [44-54].
Fraction n DO, essai 1 DO, essai 2 40 0,476 0,624 42 0,407 0,58 44 0,404 0,398 46 0, 22 0, 137 48 0,144 0, 107 50 0,198 0,126 52 0,302 0,208 54 0,395 0,435 56 0,457 0,495 58 0,463 0, 606
Le volume total d'inhibiteur provenant des essais d'échange d'ions était égal à 110 ml pour chaque essai. Ces deux fractions réunies ont été additionnées de (NH4)2SO4 à une concentration de 1,0 M et ont été appliquées à la colonne de HIC en deux essais. La fraction éluée a été déposée en taches pour déterminer la présence de l'inhibiteur, ce qui a donné un résultat négatif. Comme permettent de le constater la figure 5 et le tableau 8, la
totalité de l'inhibiteur s'est liée à la colonne et une bonne séparation a été obtenue.
L'analyse des fractions provenant de la chromatographie de HIC est présentée sur le tableau 8.
TABLEAU 8 Fractions provenant de la chromatographie de HIC de 147 ml d'extrait d'inhibiteur analysé pour déterminer la présence d'inhibiteur de xylanase. Les essais de DO 1 et 2, respectivement, correspondent aux deux essais qui ont été effectués sur la colonne. L'inhibiteur s'est révélé être présent dans les fractions [15-23]
Fraction n DO, essai 1 DO, essai 2 Témoin à blanc 0,469 0,659 12 0,462 0, 662 14 0,486 0,555 16 0,202 0,188 18 0,1 0,118 20 0, 102 0,146 22 0,242 0,193 24 0, 392 0, 502 26 0,485 0,6
Les fractions 17 et 18 provenant de la chromatographie HIC ont été concentrées approximativement deux fois et ont été appliquées à une colonne préparative de filtration sur gel (figure 6).
L'analyse des fractions provenant de la filtration préparative sur gel est présentée sur le tableau 9.
TABLEAU 9 Fractions provenant de la chromatographie préparative de filtration sur gel de 2 ml d'un échantillon d'inhibiteur concentré, analysé pour déterminer la présence d'inhibiteur de xylanase. L'inhibiteur s'est révélé être présent dans les fractions [31-33]
Fraction n DO, 590 nm 26 0,738 28 0,774 30 0, 645 32 0, 117 34 0,705 36 0,749 38 0,754 40 0,762 42 0,769 Analyse de l'activité de protéase Sur la base de l'analyse ci-dessus de l'inhibiteur de xylanase, il n'est pas possible d'établir que la diminution d'activité de xylanase, lors du mélange à l'extrait de farine, n'est pas due à une hydrolyse protéolytique de la xylanase. En conséquence, une xylanase purifiée était mise en incubation avec un extrait "d'inhibiteur". Comme permettent de le constater les figures 7 et 8, aucune hydrolyse ne semble se produire. Il existe un bruit de fond légèrement plus intense dans le chromatogramme avec l'inhibiteur actif (figure 8). Cependant, ce bruit de fond correspond au chromatogramme de l'inhibiteur seul (chromatogramme de l'inhibiteur non représenté). La différence de bruit de fond doit être due à une précipitation dans l'échantillon d'inhibiteur ayant subi une ébullition.
Caractérisation de l'inhibiteur Chromatographie analytique de filtration sur gel 100 l d'un échantillon d'inhibiteur concentré deux fois provenant de la fraction 18 dans le second essai de HIC ont été appliqués à une colonne analytique Superdex 75 10/30 de 24 ml (Pharmacia, Suède) (figure 9). L'éluat a été recueilli en fractions de 2 ml. Ces fractions ont été analysées pour la caractérisation de l'inhibiteur de xylanase (tableau 10).
TABLEAU 10 Fractions provenant de la chromatographie analytique de filtration sur gel de 100 l d'échantillon d'inhibiteur concentré analysé pour déterminer la présence d'inhibiteur de xylanase. L'inhibiteur s'est révélé être présent dans les fractions [6-7]
Fraction n DO 590 nm Témoin à blanc 0,613 6 0,233 7 0, 304 8 0, 51 9 0,569 10 0,565 11 0,652
Après filtration sur gel de l'échantillon d'inhibiteur concentré, un mélange de quatre protéines de poids moléculaires de référence a été appliqué à la colonne, en utilisant un mode opératoire exactement identique (chromatogramme non représenté). Sur le tableau 11, les poids moléculaires et les temps d'élution des protéines sont résumés.
TABLEAU 11 Protéines de référence utilisées pour la détermination du PM de l'inhibiteur. Les abréviations et les équations utilisées sont expliquées au-dessous du tableau
Ainsi, l'ensemble des données obtenues dans la levures montrent clairement que les deux protéines C-mbpl et C-fibuline2 sont des partenaires potentiels spécifiques des mutants oncogéniques de la protéine p53.
Exemple 4 - Interaction entre les protéines C-mbpl, C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine p53 en cellules mammifères Cet exemple décrit la construction de plasmides pour l'expression des différentes protéines en cellules mammifères et la caractérisation de l'interaction entre les protéines C-mbpl et C-fibuline2 et les différentes formes de la protéine p53 en cellules mammifères.
4-a Construction des plasmides d'expression des différentes protéines en cellules mammifères 4-a (i) Construction du vecteur d'expression pBFA 107 Cet exemple décrit la construction d'un vecteur permettant l'expression dans des cellules mammifères de protéines portant une étiquette dérivée de la protéine cmyc (acides aminés 410-419) et reconnue par l'anticorps 9E10 (Oncogene Science). Cette construction a été effectuée en utilisant comme vecteur de base le vecteur d'expression mammifère pSV2, décrit dans DNA Cloning, A practical approach Vol. 2, D. M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DC, 1985.
Le cDNA comprenant la séquence codant pour l'étiquette c-myc ainsi qu'un multisite de clonage (MCS) a été construit à partir des 4 oligonucléotides suivants : c-myc5'(SEQIDN 10): GATCCATGGAGCAGAAGCTGATCTCCGAGGAGGACCTGA c-myc3'(SEQIDN ll): GATCTCAGGTCCTCCTCGGAGATCAGCTTCTGCTCCATG MCS 5' (SEQ ID N 12): GATCTCGGTCGACCTGCATGCAATTCCCGGGTGCGGCCGCGAGCT MCS 3' (SEQ ID N 13): CGCGGCCGCACCCGGGAATTGCATGCAGGTCGACCGA Ces quatre oligonucléotides présentent des complémentarités deux à deux (c- myc 5' / c-myc 3', MCS 5' / MCS 3') et des complémentarités chevauchantes (c-myc 3' / MCS 5') permettant l'obtention de la séquence nucléotidique désirée par simple hybridation et ligation. Ces oligonucléotides ont été phosphorylés à l'aide de la T4 kinase, puis hybridés tous ensemble et insérés dans le vecteur d'expression pSV2 préalablement digéré par les enzymes de restriction Bgl II et Sac I. Le vecteur résultant est le vecteur pBFA 107.
4-a (ii) - Construction des plasmides d'expression des protéines C-mbpl et C- fibuline2 étiquetées Les cDNA codant pour les protéines C-mbpl et C-fibuline2 ont été extraits des plasmides TA-C-MBPI et TA-C-FIB2 et clonés dans le vecteur d'expression mammifère pBFA 107 en utilisant les sites de reconnaissance par les enzymes de restriction Sal I et Not I. On obtient ainsi les plasmides pBFA107-C-MBPlet pBFA107-C-FIB2
4-a (iii) Construction des plasmides d'expression des différentes formes de la protéine p53 Les cDNA codant pour les différentes formes de la protéine p53 (wt, H 175, H273 et G281) ont été insérés dans les vecteurs d'expression pSV2 et pcDNA3 (Invitrogen) en utilisant le site de reconnaissance par l'enzyme de restriction Bgl II.