INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Tout d'abord, une fois injectés, les exosomes pourraient activer directement les lymphocytes T de l'hôte, spécifiques de la tumeur. De cette façon, une expansion clonale de lymphocytes T spécifiques de la tumeur ou un "priming" de cellules T pourrait avoir lieu. Une deuxième hypothèse implique une interaction directe des exosomes injectés avec les cellules dendritiques de l'hôte. Ceci pourrait alors stimuler la réponse anti-tumorale. Afin de vérifier cette deuxième hypothèse, on a suivi la croissance de tumeurs dans des souris injectées en intraveineuse avec des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse chargées avec des exosomes de cellules tumorales. Des souris DBA/2 (IFFA CREDO, Orléans, France) ont ainsi été injectées avec deux fois (5x105) la dose tumorigène minimale de cellules de mastocytome P8 15. Dix jours après, chaque animal a été injecté avec 5x105 cellules dendritiques chargées, et de ce fait sensibilisées, avec 9 g d'exosomes. La taille moyenne des tumeurs dans ces conditions diminue de façon significative en comparaison avec des groupes de souris injectées avec du PBS ou avec des cellules dendritiques chargées d'exosomes de cellules d'une tumeur contrôle MC38. En effet, plus de 60% des animaux traités ne présentent plus de tumeur à la fin de l'expérience. De plus, des récidives n'ont pas été observées à long terme (dans 80% à 100% des cas). Il est intéressant de constater qu'une telle dose sous-optimale d'exosomes injectée en intradermique n'a pas d'effet, ce qui suggère que les cellules dendritiques peuvent préparer les exosomes contenant les antigènes tumoraux de façon plus efficace que les cellules dendritiques du derme ou les cellules de Langerhans. On a obtenu des résultats similaires avec le modèle de cellules de la tumeur du sein TS/A.
Les résultats obtenus dans le cadre de l'invention montrent que les exosomes de cellules tumorales sensibilisent les cellules dendritiques de façon efficace. Ces cellules, ainsi sensibilisées, ont la capacité d'induire des réponses anti-tumorales puissantes in vivo, et cela dans le cas de différentes tumeurs. Ces résultats suggèrent que les effets anti-tumoraux observés après l'inoculation directe d'exosomes in vivo sont dus à la sensibilisation des cellules dendritiques de l'hôte. D'une façon remarquable, I'effet est observé après une seule injection de cellules dendritiques sensibilisées. La majorité des souris traitées montrent une régression tumorale complète ou une survie prolongée (de 60 jours contre 20 jours dans le contrôle) due à la régression tumorale.
Les vésicules membranaires de cellules présentatrices d'antigène, les cellules dendritiques qui ont été incubées avec les exosomes tumoraux, constituent des vésicules immunogènes puissantes pour l'immunisation antitumorale. Elles apportent l'avantage d'éviter l'étape d'injection in vivo des cellules dendritiques entières dont elles proviennent. En effet, la thérapie cellulaire dendritique n'offre pas la certitude du phénotype stable de la cellule injectée. En administrant un produit stable sécrété par ces cellules, c'est-à-dire les vésicules membranaires sus-décrites, on offre à l'hôte porteur de tumeurs une garantie d'efficacité et de pouvoir immunisant. Ainsi, on montre sur la figure 9 que 0,6 jg de ces vésicules membranaires, appelées DexTexFON (c'est-à-dire exosome provenant de cellules dendritiques incubées avec des exosomes provenant de cellules tumorales FON), permettent de stimuler directement la prolifération et la sécrétion d'IFNy de clones LT8 spécifiques de MART-1 et c'est ce que ne peut pas faire 0,6 g d'exosomes provenant de cellules dendritiques incubées avec des exosomes de cellules tumorales NUN : DexTexNUN (NUN étant une tumeur du rein, HLAA2 négative, MART-1 négative).
La méthode de sensibilisation des cellules présentatrices de 1' invention possède différents avantages par rapport aux méthodes de l'art antérieur i) elle ne nécessite pas la connaissance préalable d'antigènes tumoraux ; ceci est particulièrement important puisque des antigènes tumoraux ne sont pas connus dans la très grande majorité des tumeurs ii) le procédé de l'invention peut être appliqué à n'importe quelle tumeur produisant des exosomes ; sur plus de 15 lignées de cellules tumorales testées à ce jour, une seule ne produit pas d'exosomes (une des six lignées de mélanome testées).
iii) cette méthode ne dépend pas de l'haplotppe du CMII du patient et des cellules tumorales, puisque les antigènes tumoraux présents dans les exosomes sont re-apprétés et présentés aux lymphocytes T par les molécules du CMII des cellules présentatrices d'antigènes du patient iv) le procédé de l'invention peut en principe être efficace entre tumeurs d'origines différentes, puisqu'il existe des antigènes tumoraux communs non seulement à un type particulier de tumeur (MART-1 par exemple dans le mélanome), mais aussi des antigènes communs à des tumeurs complètement différentes (comme les molécules impliquées dans la tumorigenèse, p53 par exemple) v) l'utilisation d'exosomes peut aussi se révéler efficace dans le traitement de tumeurs exprimant de faibles niveaux de molécules de classe I du CMH, ou n'en exprimant pas du tout (ces tumeurs représentent 40-50% des cancers métastatiques humains). En effet, les exosomes permettent le transfert d'antigènes intacts entre cellules tumorales et CD, ces antigènes étant ensuite présentés aux lymphocytes T par les molécules du CMII de la CD. Les résultats préliminaires montrent que les exosomes permettent d'induire le rejet de tumeurs murines exprimant de faibles niveaux de molécules de classe I du CMII (comme MCA101, S. Rosenberg, NCI, Bethesda, U.S.A.). Ceci est probablement du au fait que les niveaux d'expression de molécules du CMII nécessaires à l'induction d'une réponse immunitaire efficace sont beaucoup plus élevés que ceux nécessaires lors de la phase effectrice (cytotoxicité cellulaire) vi) les exosomes seuls constituent en eux-mêmes, par leur pouvoir immunogène une modalité de vaccination prophylactique ou thérapeutique nouvelle et efficace.
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En outre, étant donné que le désoxydant en poudre a une mauvaise aptitude au conditionnement, il se produit des irrégularités dans la quantité du conditionnement, ou une distribution irrégulière du désoxydant. Par conséquent, le désoxydant en poudre ne convient pas à la fabrication de la feuille désoxydante.
Le second procédé est préférable, en ce sens qu'il répartit le désoxydant de façon uniforme. Cependant, il reste quelques problèmes que l'on décrit ci-dessous.
Tout d'abord, étant donné que le second procédé utilise aussi le désoxydant en poudre, il soulève des problèmes similaires à ceux du premier.
En outre, étant donné que des particules du désoxydant en poudre sont fixées par un agent adhésif, le contact avec l'air est largement bloqué par. cet agent. I1 en résulte que l'effet de désoxydation souhaité est obtenu moins facilement, ce qui se traduit par une diminution de la fiabilité, par une non-uniformité de la qualité du produit, un aspect peu pratique du produit, etc. Tout ce qui précède peut être considéré comme un défaut déterminant.
En d'autres termes, il est très difficile de répartir uniformément les particules du désoxydant en poudre sur la surface de l'agent adhésif de façon que l'état d'exposition des particules à l'air soit uniforme.
Si l'on doit y parvenir, les étapes de la fabrication deviennent inévitablement compliquées, ce qui se traduit par une faible productivité, et des coûts de fabrication extrêmement élevés.
Le troisième procédé que l'on décrit ci-dessus implique le mélange d'un désoxydant ayant un diamètre des particules d'environ 1 à 50 Am dans une résine, puis l'étirage du mélange du désoxydant et de la résine de façon à rendre le mélange poreux. Cependant, les parties du mélange qui deviennent poreuses par étirage ne se trouvent pas nécessairement là où le désoxydant est présent. Par conséquent, une partie du désoxydant est enfouie soit partiellement, soit totalement dans la résine, ce qui se traduit par un contact extrêmement mauvais avec l'air. En conséquence, comme dans le cas du second procédé que l'on décrit ci-dessus, on obtient moins facilement l'effet de désoxydation que l'on désire, ce qui se traduit par une diminution de la fiabilité, par la nonuniformité de la qualité du produit, l'aspect peu pratique du produit, etc. Tout ceci peut être considéré comme un défaut déterminant.
Le quatrième procédé que l'on décrit ci-dessus implique une feuille absorbant l'oxygène qui est fabriquée de la façon suivante. On prépare une composition de résine constituée de 15 à 70 % en poids d'une résine thermoplastique, et de 30 à 85 % en poids d'un désoxydant à base de fer, sous la forme d'une feuille ayant une épaisseur de 30 Fm à 5 mm, que l'on étire alors au moins mono-directionnellement avec un facteur d'étirage de 1,5 à 8 (que l'on désigne ci-après par feuille A). Alors, on dispose une couche de résine ayant un taux de perméation de l'oxygène de 10 000 cm3/m2/jour à une température de 23 C (que l'on désigne ci-après par couche B), soit sur un côté, soit sur les deux côtés de la feuille A. Comme dans le troisième procédé, les parties de la feuille qui deviennent poreuses sous l'effet de l'étirage ne sont pas nécessairement celles où le désoxydant est présent. Par conséquent, une partie du désoxydant est enfouie soit partiellement soit totalement dans la résine, ce qui se traduit par un contact extrêmement mauvais avec l'air. En conséquence, comme dans le cas du second procédé que l'on décrit ci-dessus, on obtient moins facilement l'effet de désoxydation souhaité, ce qui se traduit par une diminution de la fiabilité, par une non-uniformité de la qualité du produit, par l'aspect peu pratique du produit, etc. Tout ceci peut être considéré comme un défaut déterminant.
Dans le procédé ci-dessus, la feuille A est disposée sur la couche B par adhésion thermique ou en plaçant une couche de colle entre les deux. On a également proposé un procédé dans lequel la feuille A et la couche B sont laminées par co-extrusion, ou par laminage avant étirage, et les deux sont ensuite étirées ensemble.
Cependant, étant donné que les pores de la feuille A sont bloqués par la couche B lors du laminage sur la feuille A, le contact entre le désoxydant et l'air est encore plus mauvais.
Dans le but de résoudre les problèmes techniques décrits ci-dessus, la demanderesse a procédé à des études poussées sur un désoxydant et une feuille désoxydante, qui permettent : d'éviter une perte de la capacité de désoxydation due à une réaction d'oxydation indésirée pendant la fabrication, et la détérioration résultante de la qualité du désoxydant en inhibant la réaction d'oxydation du désoxydant ; d'éviter les difficultés associées à la coagulation du désoxydant en inhibant la coagulation ; de produire une feuille fine désoxydante à une cadence de production élevée ; et d'éviter le déplacement du désoxydant ou sa distribution irrégulière à l'intérieur d'un sachet en le répartissant de manière uniforme, puis en l'y fixant, de sorte que la réaction de désoxydation (réaction d'oxydation) par le désoxydant s 'effectue uniformément.
Les études montrent que le principe de la désoxydation par un désoxydant du type présenté dans le présent mémoire est la réaction d'oxydation d'une poudre métallique avec l'oxygène de l'air. Elles montrent également que la quantité de la teneur en eau a un effet particulièrement élevé sur la vitesse de réaction de la désoxydation (réaction d'oxydation).
Plus spécifiquement, si la teneur en eau est importante, la réaction d'oxydation est considérablement retardée. Si la réaction doit être accélérée, il est nécessaire d'avoir une certaine humidité. Si une certaine humidité est présente, la fourniture de l'air (oxygène) à la poudre métallique est effectuée de manière appropriée, et la réaction d'oxydation se produit régulièrement.
Cependant, si la teneur en eau est trop élevée, l'eau agit en couche barrière, et la fourniture de l'air à la poudre métallique diminue, ce qui retarde considérablement la réaction d'oxydation.
S'agissant des découvertes que l'on vient d'exposer, la demanderesse a fait des études poussées sur un désoxydant relativement stable lorsqu'il est exposé à l'air.
En conséquence, elle a trouvé que, si un désoxydant est réalisé sous la forme d'un liquide visqueux contenant une poudre métallique, un agent rendant adhésif et de l'eau comme constituants essentiels où la poudre métallique est un constituant réactif, la poudre devient alors revêtue d'eau ou d'un gel qui a absorbé l'eau. Cela arrête la fourniture d'air au désoxydant. En outre, étant donné que le désoxydant n'est pas sous la forme d'une poudre mais d'un liquide visqueux, l'aire de la surface du désoxydant est extrêmement petite, et cela arrête aussi la fourniture d'air au désoxydant. I1 en résulte que la réaction d'oxydation entre le désoxydant et l'air est supprimée, et qu'on obtient la stabilité du désoxydant dans l'air.
La figure 3 illustre une situation dans laquelle les cages 10 a sont remplies d'animaux, comme symbolisé par un doublc trait diagonal.
On comprend que, par suite du poids du chargement sur ce côté, la carrosserie du véhicule s'incline. Par rapport à un objet de référence fixe R situé en hauteur, du côté opposé, on observe un éloignement de cette face latérale de la carrossene. Ce phénomène ressort clairement de la comparaison des figures 2 et 3, qui montrent l'accroissement de la distance e entre ladite face et l'objet de référence R, cette côte passant e 1 à e 2 On comprendra, dans la suite de la description, comment le dispositif selon l'invention permet de s'adapter à cette inclinaison variable de la carrosserie du véhicule de collecte.
En référence à la figure 4, nous allons maintenant décrire le dispositif selon l'invention.
Ce dispositif comprend un châssis horizontal 2, de forme allongée, monté sur roues 21. Ce châssis constitue une remorque, destinée à être tractée par un véhicule auto-moteur, notamment par un tracteur agricole.
L'avant de cette remorque, c'est-à-dire son extrémité par laquelle elle est destinée à être attelée, correspond au côté droit de la figure 4.
Sur ce même côté, le châssis possède une paire de pieds d'appui au sol 22 (dont l'un seulement est visible sur la vue de face de la figure 4).
Les pieds 22 permettent d'immobiliser la remorque en position de travail ils sont, bien-sûr, escamotables en vue du transport.
Sur ce châssis 2 est monté un convoyeur allongé 6 qui est articulé autour d'un axe transversal 20 à l'extrémité arrière du châssis (extrémité opposée aux pieds 22).
Le convoyeur 6 comporte un bâti fait de poutrelles soudées les unes aux autres, et supportant une bande sans fin mobile 9, qui n'est pas visible sur la figure 4, mais sera décrite plus loin en référence aux figures 9 et 10. Cette bande transporteuse possède un brin supérieur et qui se déplace vers la gauche vers la droite si on considère la figure 4, tandis que le brin retour inférieur se déplace en sens inverse.
Les extrémités amont et aval du convoyeur correspondent donc aux extrémités de gauche et de droite, respectivement, de la figure 4.
Le convoyeur 6 est composé de plusieurs parties, désignées de l'amont vers l'aval par les références 64, 60, et 61.
La partie 64 est articulée par rapport au châssis 2 et à la partie 60, autour dudit axe 20. Elle est légèrement inclinée vers l'arrière de manière à reposer au sol S par son extrémité amont, par l'intermédiaire d'une cale 640. Ainsi, I'entrée du convoyeur se situe à faible hauteur du sol.
La partie 61 est télescopique, et peut se déplacer axialement, sur une course donnée par rapport à la partie 60, à l'intérieur de laquelle elle pénètre partiellement.
L'extrémité aval 610 de la partie 61 est légèrement inclinée par rapport au reste de cette partie ; elle forme un angle aigu dirigé légèrement vers le bas par rapport au reste du convoyeur, à la sortie de celui-ci. Cette inclinaison permet de faciliter la transition du convoyeur au camion collecteur.
Au niveau de cette portion aval 610, le convoyeur porte une paire de nacelles 7, situées de chaque côté du convoyeur, comme cela est particulièrement visible sur le plan de détail de la figure 7.
Chacune de ces nacelles 7 a 7 b est articulée librement par un axe 70 sur le bâti de la partie 61.
Dans un premier temps, les cellules A549 en culture sont placées en présence de quantités croissantes de polymères non complexé. Ces quantités correspondent aux quantités nécessaires pour former des complexes avec 4 pg d'ADN et pour obtenir des rapports N/P allant de 2,5 à 30 eq.
Les résultats (figure 8) montrent que les PAM/0,5G et PAM/0,7G sont beaucoup moins toxiques à l'égard des cellules que le polymère PAM non substitués (Remarque: 100% de viabilité correspond aux cellules n'ayant subi aucun traitement).
Dans un second temps, une série d'expériences similaires a été réalisée avec les mêmes polymères sous une forme de complexe polymères cationique/ADN (4pg de plasmide) Les taux de viabilité cellulaires présentées sur la figure 9 confirment que les complexes polymère cationique/ADN selon l'invention sont très faiblement toxiques à l'égard des cellules.
La viabilité cellulaire observée avec la PAM/0,7G à 30 équivalents est supérieure à 70%. Ceci est très prometteur pour les essais in vivo pour lesquelles les quantités d'ADN et par conséquent de polymère, à utiliser peuvent être importantes..
NOUVEAU PROCÉDÉ DE SENSIBILISATION DE CELLULES PRÉSENTATRICES D'ANTIGENE ET NOUVEAUX MOYENS POUR LA MISE EN OEUVRE DU PROCÉDÉ.
L'invention a pour objet un nouveau procédé de sensibilisation de cellules présentatrices d'antigène et de nouveaux moyens pour la mise en oeuvre du procédé.
Depuis la démonstration de l'existence de lymphocytes T cytotoxiques CD8+ spécifiques d'antigènes tumoraux présentés dans le contexte des molécules de classe I du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) (Rosenberg et coll., 1996; Boon, 1992), plusieurs laboratoires ont pu montrer que l'immunothérapie anti-tumorale est une stratégie thérapeutique efficace dans les modèles animaux (Pardoll, 1995). Le principe de l'immunothérapie est d'induire une réponse immunitaire efficace contre des antigènes spécifiques de tumeurs. A ce jour, cela a pu être effectué de différentes façons. Tout d'abord, des cellules tumorales exprimant des molécules de costimulation recombinantes et/ou des cytokines immunomodulatrices sont capables de stimuler des réponses anti-tumorales capables d'éradiquer des tumeurs solides in vivo (Zitvogel et coll., 1996 [a]). De même, des peptides dérivés d'antigènes tumoraux (ou d'antigènes exogènes exprimés dans les cellules tumorales) injectés sous différentes formes chimiques y compris l'utilisation de liposomes comme vecteurs, sont capables de faire régresser des tumeurs (Pardoll, 1995). Finalement, des cellules présentatrices d'antigènes professionnelles, comme les cellules dendritiques sensibilisées avec des peptides dérivés d'antigènes tumoraux, re-injectées in vivo induisent des réponses anti-tumorales puissantes, ainsi que la régression de tumeurs solides établies de la souris (Mayordomo et coll., 1995).
L'immunothérapie basée sur l'utilisation des cellules dendritiques a pu montrer son efficacité dans les études réalisées chez la souris. De ce fait, cette thérapie a été récemment transposée en clinique. Aux Etats-Unis, des essais sont actuellement en cours afin de démontrer que des cellules dendritiques chargées de peptides tumoraux augmentent de façon significative la fréquence de cellules T cytotoxiques spécifiques (CTL). Une limitation majeure à cette approche est la sensibilisation des cellules dendritiques avec des peptides dérivés d'antigènes tumoraux. En effet, dans la majorité des tumeurs, des antigènes spécifiques n'ont pas été identifiés. Des antigènes spécifiques de la tumeur sont seulement connus dans des cas de tumeurs induites par des virus (carcinome du col utérin), dans des cas de mélanome (antigènes du soi, antigènes mutés, antigènes de différentiation) ou dans un petit pourcentage de tumeurs du sein (oncogènes, ou produits de gènes supresseurs de tumeur ayant subi des mutations). Cependant, l'implication directe de ces peptides ou antigènes tumoraux dans l'élimination des tumeurs chez l'homme reste à démontrer. Des méthodes nouvelles de sensibilisation des cellules présentatrices d'antigènes telles que les cellules dendritiques s'avèrent nécessaires. Ces méthodes ont pour but d'induire des réponses anti-tumorales spécifiques dans le contexte des molécules de classe I et de classe H du CMH.
La plupart des méthodes de sensibilisation de cellules dendritiques mises en oeuvre à présent utilisent des peptides correspondant à des épitopes présentés en association avec les molécules de classe I et identifiés dans les cellules tumorales grâce à des clones de CTLs spécifiques de la tumeur. Cependant, ces méthodes ne sont vraisemblablement pas optimales car elles ne tiennent pas compte des épitopes reconnus dans le contexte des molécules de classe II qui sont critiques pour la prolifération des lymphocytes T auxiliaires nécessaires à l'obtention des réponses cytotoxiques optimales. De plus, des épitopes présentés par les cellules tumorales et ceux présentés par les cellules présentatrices d'antigènes (comme par exemple les cellules dendritiques), ne sont probablement pas les mêmes. Finalement, des peptides tumoraux reconnus par les CTL sont seulement disponibles pour un petit pourcentage de patients ayant des molécules de classe I d'haplotype approprié.
La méthode de sensibilisation idéale, de façon à pouvoir être appliquée à n'importe quelle tumeur avec un risque minimale d'immunosélection, ne doit pas être restreinte à un petit nombre d'antigènes tumoraux identifiés. De même, une telle méthode devrait utiliser des antigènes protéiques intactes plutôt que des peptides, afin de permettre à la cellule dendritique de les préparer et de présenter la combinaison adéquate de peptides en association avec les molécules de classe I et de classe II, et cela pour tout individu.
Récemment, Gilboa et collaborateurs (Boczkowsky et coll., 1996) ont pu montrer que des ARN messagers préparés à partir de biopsies de tumeurs chargés dans des cellules dendritiques peuvent avoir un effet anti-tumoral in vivo. Cependant, les ARN sont très instables et la quantité d'ARN potentiellement intéressant comparé à 1'ARN total est vraisemblablement très faible. Zitvogel et coll. (Zitvogel et coll., 1996 [b]) ont montré que des peptides tumoraux préparés à partir d'un éluat acide de tumeurs (éluat peptidique acide : EPA) peuvent être utilisés pour charger des cellules dendritiques. Ces cellules ainsi chargées, une fois injectées, ont la capacité de faire régresser des tumeurs. Cependant, dans le cas de tumeurs n'exprimant pas de molécules de classe I et qui représentent la majorité des tumeurs humaines métastatiques, dans le cas de tumeurs qui ne peuvent pas être dissociées en une suspension cellulaire, l'approche utilisant les éluats acides n'est pas très efficace et n'est pas reproductible.
De plus, dans le brevet US 5.030.621, on décrit la préparation d'un vaccin humain contre la cancer à partir de cultures de cellules tumorales.