INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'activité gus est exprimée en unités de fluorescence par minute et par : - 1 g de protéines (racines) - 20 g de protéines (feuilles) A 2,72 unités de fluorescence correspond 1 pmol du produit mu, qui est le produit de la catalyse enzymatique du substrat mug (4-méthyl-ss-D glucuronide) par GUS.
La figure 7 illustre le vecteur obtenu à la suite du Kanamycin rescue . La technique de kanamycine rescue utilise le vecteur P38 (a), qui comporte le début du gène Nptll de résistance à la kanamycine, jusqu'au site Pstl, en aval d'un promoteur IS50. Après digestion par Pstl du vecteur P38 et de l'ADN du transformant, ligation des deux et sélection sur kanamycine, on obtient le vecteur montré en b). L'insert 1 est le fragment Pstl obtenu à partir de l'ADN génomique du transformant: il comporte la région promotrice (SEQ ID N 1, nct 1 à 2149) accolée au fragment d'ADN-T délimité par le site d'insertion côté RB et le site Pstl situé dans le gène de la kanamycine (figure 8, nct 632 à 4279). Le gène de résistance à la kanamycine se trouve ainsi reconstitué et le vecteur recombinant est sélectionné sur kanamycine.
La figure 8 donne une représentation schématique de l'ADN-T de PGKB5 utilisé pour créer la collection de transformants de Versailles.
La figure 9 illustre la séquence de l'ADN-T de PGKB5, également référencée comme la séquence SEQ ID N 5.
- RB bordure de 24 pb : - gène gus : séquencegus sans promoteur : 638-2504 (ATG:638- 640, codon stop: 2444-2446), site de polyadénylation du gus: 3'nos: 2505- 2793, site EcoRI: AATT/C:2759-2763.
- gène KanR : nos: 4752-4480, séquence KanaR: 4479- 3490 (ATG: 4466-4464, codon stop : 3665-3663, site Pstl: CTGCA/G : 4275- 4280), site ocs3' : - gène PhosphinothricineR (bastaR) : promoteur 35S : séquence phosphinotricineR: 5890-6503 (ATG:5930-5932, codon stop: 6480-6482), site 3'g7 : - LB bordure de 24 pb : EXEMPLES: MATERIELS ET METHODES: 1 - Transformation (Bechtold N., Ellis J., Pelletier G. , 1993. Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C. R. Acad.
Sci. Paris 316 : 1194-1199. ) 6 mg de graines (soit environ 300 graines) d'Arabidopsis thaliana d'écotype Wassilevskija ont été semés sur des bacs de compost 40 x 30 cm.
Les bacs sont laissés 64 h à 4 C pour la germination, puis sont placés en serre (photopériode : 16h de jour, température : 15 C nuit / 25 C minimum jour) et arrosés avec la solution nutritive standard de Coïc et Lessaint (Coïc,
Y., Lessaint, C. 1971. Comment assurer une bonne nutrition en eau et ions minéraux en horticulture. Hortic. fr.8:11-14).
MP5-1 Agrobacterium est cultivé dans du milieu LB ( Luria-Bertani, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis,T. 1989. Molecular Cloning :A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, New York ) avec 50 mg/l de rifampicine, 100 mg/l de gentamycine et 200 mg/l de kanamycine, 14h à 28 C (jusqu'à A600=0. 8). Après centrifugation, le culot de bactéries est remis en suspension dans le milieu d'infiltration (MI), à un tiers du volume de culture initial (MI= macro et micro nutriments de Murashige et Skoog, contenant 10 g/l 6-benzylaminopurine et 5% sucrose (Murashige, T., Skoog, F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant 15 : 473-497). Des lots de 100 à 500 plantes de 3 à 4 semaines bien développées ont été extraits du sol, rincés à l'eau, immergés dans 21 de milieu MI contenant Agrobacterium dans une cloche à vide de 101 de contenance. Les plantes sont maintenues sous vide (104 Pa) pendant 20 mn. Toutes les manipulations des plantes traitées, jusqu'à leur récolte, ont été effectuées avec des gants en latex. Les plantes traitées ont été plantées dans un nouveau compost, à raison de 54 plantes par bac, puis incubées 2 jours sous un plastique pour prévenir toute déshydratation et pour faciliter l'enracinement. Quatre à six semaines après la plantation, la génération T1 a été récoltée en mélange. Les plants ont été sélectionnés sur du sable irrigué avec de l'eau contenant de l'herbicide Basta (5-10 mg/ml phosphinothricine). Deux mois plus tard, les graines T2 ont été récoltées individuellement et conservées pour les analyses ultérieures.
Typiquement, après chaque impulsion du laser de conditionnement, un composant optique est déplacé de 20% de la demi-largeur du faisceau issu de ce laser, soit environ 0,3 mm pour un faisceau de 1 mm de diamètre. Les lasers utilisés pour le conditionnement ont une cadence maximale de 100 Hz, ce qui conduit au mieux à 7 heures de balayage par palier de fluence.
Comme il faut environ quatre à cinq paliers pour atteindre la fluence nominale, le temps et donc le coût du conditionnement laser sont extrêmement importants. EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention a pour objet un dispositif de conditionnement laser susceptible de faire gagner un temps considérable pour ce conditionnement, par rapport au dispositif connu qui est mentionné plus haut.
De façon précise, la présente invention a pour objet un dispositif de conditionnement laser pour composants optiques, ce dispositif étant caractérisé en ce qu'il comprend - des moyens de maintien d'au moins deux composants optiques, destinés à recevoir simultanément un traitement de conditionnement laser, des premières faces respectives de ces composants étant tournées l'une vers l'autre et destinées à recevoir un faisceau laser de conditionnement, - un laser prévu pour émettre ce faisceau de façon que ce dernier se réfléchisse successivement sur ces premières faces respectives, au moins une fois sur chacune de celles-ci, et - des moyens de balayage relatif de ces premières faces par le faisceau laser.
Selon un mode de réalisation préféré du dispositif objet de l'invention, les moyens de maintien sont prévus pour maintenir les composants optiques selon des première et deuxième rangées qui sont parallèles à une première direction et comprennent chacune au moins l'un des composants, chaque composant de la première rangée présentant un décalage, suivant cette première direction, par rapport à un composant de la deuxième rangée.
De préférence, le nombre N de réflexions du faisceau laser sur la première face de chaque composant optique est au moins égal à 2.
Le décalage suivant la première direction et l'espacement entre les première et deuxième rangées peuvent être choisis égaux à L/(2N) où L est la longueur de chaque composant optique, comptée suivant cette première direction.
De préférence, le nombre M de composants optiques traités est pair.
Les composants optiques peuvent être des miroirs et, dans ce cas, l'angle d'incidence du faisceau laser de conditionnement sur chaque miroir est au moins égal à 45 .
Au lieu d'être des miroirs, ces composants optiques peuvent être des polariseurs et, dans ce cas, l'angle d'incidence du faisceau laser de conditionnement sur chaque polariseur est égal à un angle proche de l'angle nominal de ce polariseur.
Selon un mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, le faisceau laser de conditionnement est fixe e`t les moyens de balayage comprennent des moyens de déplacement de l'ensemble des composants optiques par rapport à ce faisceau suivant deux directions perpendiculaires.
Selon un autre mode de réalisation particulier, les composants optiques sont fixes et les moyens de balayage comprennent des moyens de déplacement du faisceau laser de conditionnement suivant deux directions perpendiculaires.
De préférence, le dispositif objet de l'invention comprend en outre des moyens d'observation des points des composants, qui reçoivent le faisceau laser de conditionnement.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ces moyens d'observation comprennent, pour chaque point de chaque composant, des moyens d'éclairage de ce point par une lumière de longueur d'onde différente de celle du faisceau laser de conditionnement et des moyens d'analyse de la lumière diffusée par le point ainsi éclairé. Les moyens d'observation peuvent être prévus pour observer chaque point à travers la deuxième face du composant correspondant à ce point.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description d'exemples de réalisation donnés ci-après, à titre purement indicatif et nullement limitatif, en faisant référence aux dessins annexés sur lesquels # la figure 1 est une vue de dessus schématique d'un dispositif connu de conditionnement laser et a déjà été décrite, # la figure 2 illustre schématiquement le balayage, par un faisceau laser, d'un miroir traité dans le dispositif de la figure 1 et a déjà été décrite, # la figure 3 est une vue de dessus schématique d'un mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, dans lequel le faisceau laser est fixe et les composants optiques traités mobiles, # les figures 4 et 5 illustrent schématiquement le balayage d'une partie d'un composant optique par un faisceau laser qui se réfléchit respectivement deux fois (figure 4) et quatre fois (figure 5) sur ce composant, le reste du composant étant également balayé du fait de ces réflexions, # la figure 6 est une vue schématique d'un dispositif d'inspection de la surface d'un composant optique traité dans un dispositif conforme à l'invention, la figure 7 est une vue de dessus schématique d'un autre mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, dans lequel le faisceau laser est également fixe et les composants optiques traités mobiles, et la figure 8 est une vue en perspective schématique d'un autre mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, dans lequel le faisceau laser est déplaçable et les composants optiques traités fixes. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Le dispositif conforme à l'invention, qui est schématiquement représenté en vue de dessus sur la figure 3, est destiné au conditionnement laser de composants optiques, par exemple des miroirs.
Dans l'exemple représenté sur cette figure, le dispositif sert à conditionner simulanément deux miroirs 20 et 22. Cependant, comme on le verra par exemple dans le cas de la figure 5, l'invention permet de traiter simultanément un nombre de miroirs supérieur à 2.
Le dispositif de la figure 3 comprend un support 24, sur lequel sont montés les deux miroirs 20 et 22 destinés à recevoir simultanément le traitement de conditionnement laser, ainsi qu'un laser 26 fonctionnant de préférence en mode pulsé et destiné à émettre un faisceau laser de conditionnement 27. Les miroirs 20 et 22 sont placés sur leur support 24 de façon à recevoir successivement ce faisceau 27. Chacun de ces deux miroirs comprend une multicouche diélectrique 28 formée sur un substrat 30 par exemple en verre. Les multicouches diélectriques des miroirs sont destinées à recevoir le traitement de conditionnement laser pour résister à un rayonnement laser qu'elles seront destinées à réfléchir lorsque les miroirs seront mis en place dans une installation pour laquelle ils ont été conçus. Le laser 26 est donc choisi pour émettre un faisceau de conditionnement 27 qui est également apte à se réfléchir sur ces multicouches diélectriques.
Les colonies ainsi produites après incubation sont transférées sur filtres de nitrocellulose et criblées au moyen de la sonde nucléotidique radiomarquée, selon les méthodes usuelles et les colonies hybridant avec la sonde sont isolées et sous clonées.
L'ADN des clones ainsi repéré est préparé et analysé par séquençage.
Les clones contenant les fragments correspondant à l'ADNc complet sont purifiés et reclonés dans le vecteur pcDNA3 selon les protocoles connus de l'homme de l'art et présentés par exemple dans F.Ausubel et al (1999) .
Différentes méthodes sont connues pour identifier les extrémités 5' et 3' du cDNA correspondant aux gènes décrits dans la présente demande. Ces méthodes incluent mais ne se limitent pas au clonage par hybridation, au clonage utilisant des protocoles similaires ou identiques à la 3' ou 5' RACE-PCR (Rapid Amplification of cDNA End-PCR) qui sont bien connues de l'homme de l'art.
Par exemple, on pourra utiliser le kit commercialisé par la société Clontech (Marathon ReadyTM cDNA kit , protocole référencé PT1156-1) ou alternativement une méthode similaire à la 5'RACE est disponible pour caractériser l'extrémité 5' manquante d'un cDNA (Fromont-Racine et al.
Nucleic Acid Res.21 (7) :1683-1684 (1993)). En bref, un oligonucléotide d'ARN est ligaturé à l'extrémité 5' d'une population d'ARNm. Après retrotranscription en cDNA, un jeu d'amorces spécifiques respectivement de l'adaptateur ligaturé en 5' et d'une séquence située en 3' du gène d'intérêt est utilisé en PCR pour amplifier la portion 5' du cDNA recherché.
Le fragment amplifié est ensuite utilisé pour reconstruire l'ADNc complet.
Exemple 3 : Analyse du profil d'expression génique pour la maladie de Tangier La vérification de la perte d'expression du gène candidat entraînant le phénotype cellulaire de Tangier peut-être déterminé par hydridation de ces séquences avec des sondes correspondant aux ARNm provenant de fibroblastes de sujets atteints ou non de la maladie, selon les méthodes décrites ci-dessous : 1. Préparation des ARN totaux, des ARNm poly(A)+ et de sondes de cDNA Les ARN totaux sont obtenus à partir de cultures cellulaires des fibroblastes de sujets normaux ou bien atteints de la maladie de Tangier par la méthode à l'isothiocyanate de guanidine(Chomczynski & Sacchi, 1987). Les ARNm poly(A)+ sont obtenus par chromatographie d'affinité sur colonnes d'oligo(dT)-cellulose (Sambrook et al., 1989) et les cDNA utilisés comme sondes sont obtenus par RT-PCR (DeRisi et al., 1997) avec des oligonucléotides marqués avec un produit fluorescent (Amersham Pharmacia Biotech ; CyDyeTM).
2. Hydridation et détection des niveaux d'expressions Les membranes de verre contenant les séquences présentées dans cette demande de brevet, correspondant au gène Tangier sont hydridées avec les sondes de cDNA, obtenues à partir des fibroblastes (lyer et al., 1999).
L'utilisation du système Amersham/molecular Dynamics (Avalanche MicroscannerTM) permet la quantification des expressions des produits de séquences sur le type cellulaire sain ou affecté.
Exemple 4 : Construction du vecteur d'expression dans des cellules de mammifères Le gène d'intérêt peut être exprimé dans des cellules de mammifères. Un vecteur d'expression eukaryote typique contient un promoteur qui permet l'initiation de la transcription de l'ARNm, une séquence codant pour la protéine, et les signaux requis pour la terminaison de la transcription et pour la polyadénylation du transcrit. Il contient aussi des signaux supplémentaires comme des enhancers, la séquence (de) Kozak et des séquences nécessaires pour l'épissage de l'ARNm. Une transcription efficace est obtenue avec les éléments early et late des promoteurs du virus SV40, les LTR rétroviraux ou le promoteur early du virus CMV.
Cependant des éléments cellulaires comme le promoteur de l'actine peuvent aussi être employés. De nombreux vecteurs d'expression peuvent être employés pour mettre en #uvre la présente invention comme le vecteur pcDNA3.
Exemple 5 : Production des polypeptides Le polypeptide correspondant au transcrit partiel du gène GS N XX ou au cDNA complet décrit dans l'Exemple 2 (clonage du cDNA complet) peut être facilement produit dans un système d'expression bactérienne, de cellules d'insectes en utilisant les vecteurs baculovirus ou encore dans des cellules de mammifères avec ou sans les vecteurs du virus de la vaccine. Toutes les méthodes sont aujourd'hui largement décrites et connues de l'homme de l'art. On en trouvera par exemple une description détaillée dans F.Ausubel et al. (1999).
Exemple 6 : Production d'un anticorps dérivé d'un polypeptide
Les anticorps dans la présente invention peuvent être préparés par différentes méthodes (Current Protocols In Molecular Biology Volume 1 edited by Frederick M. Ausubel, Roger Brent, Robert E. Kingston, David D.
Moore, J. G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl - Massachusetts General Hospital Harvard Medical School, chapitre 11). Par exemple, les cellules exprimant un polypeptide de la présente invention sont injectées dans un animal afin d'induire la production de serum contenant les anticorps. Dans une des méthodes décrites, les protéines sont préparées et purifiées afin d'éviter des contaminations. Une telle préparation est alors introduite dans l'animal dans le but de produire des antisera polyclonaux de plus grande activité.
De plus, les promoteurs décrits dans l'état de la technique, d'une part, ne permettent pas un haut niveau d'expression du polynucléotide d'intérêt, et d'autre part, ne sont pas actifs tout au long du développement de la plante.
Le besoin d'un promoteur végétal fort, spécifique des racines, et actif quel que soit le stade de développement de la plante, est désormais comblé selon la présente invention.
La demanderesse a ainsi isolé, à partir du génome végétal d'Arabidopsis thaliana, un nouveau promoteur capable de diriger l'expression d'un polynucléotide d'intérêt spécifiquement dans les racines d'une plante, ledit promoteur assurant un haut niveau d'expression du
polynucléotide d'intérêt à la fois dans l'épiderme, le cortex, le vaisseau ou l'endoderme ainsi que dans toutes les assises de la racine, ceci durant tous les stades de développement de la plante.
Ainsi, la présente invention est relative à un acide nucléique isolé caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide codant pour un promoteur végétal capable de diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine d'une plante, durant la totalité du développement de cette dernière, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
De préférence, un acide nucléique selon l'invention se présente sous une forme isolée ou purifiée.
Le terme isolé au sens de la présente invention désigne un matériel biologique qui a été soustrait à son environnement originel (l'environnement dans lequel il est localisé naturellement). Par exemple, un polynucléotide présent à l'état naturel dans une plante ou un animal n'est pas isolé. Le même polynucléotide séparé des acides nucléiques adjacents au sein desquels il est naturellement inséré dans le génome de la plante ou l'animal est isolé.
Le terme purifié ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusive de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence 2 ou 3 et préférentiellement 4 ou 5 ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression séquence nucléotidique peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression séquence nucléotidique englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
L'invention concerne également un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'un polynucléotide possédant au moins
80% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Le pourcentage d'identité de nucléotides entre deux séquences, au sens de la présente invention, peut être déterminé en comparant deux séquences alignées de manière optimale, à travers une fenêtre de comparaison. La partie de la séquence nucléotidique dans la fenêtre de comparaison peut ainsi comprendre des additions ou des délétions (par exemple des gaps ) par rapport à la séquence de référence (qui ne comprend pas ces additions ou ces délétions) de manière à obtenir un alignement optimal des deux séquences.
Le pourcentage est calculé en déterminant le nombre de positions auxquelles une base nucléique identique est observée pour les deux séquences comparées, puis en divisant le nombre de positions auxquelles il y a identité des deux bases par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison, puis en multipliant le résultat par 100 afin d'obtenir le pourcentage d'identité de séquence.
L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé de manière informatique à l'aide d'algorithmes connus (par exemple le logiciel FASTA de la Société WISCONSIN GENETICS SOFTWARE PACKAGE, GENETICS COMPUTER GROUP (GCG), 575 Science Doctor, Madison , Wis).
L'appareil de traitement est, par exemple, une imprimante. L'appareil de traitement est, par exemple, un serveur. L'appareil de traitement est, par exemple, un ordinateur. L'appareil de traitement est, par exemple, un télécopieur. L'appareil de traitement est, par exemple, un scanner. L'appareil de traitement est, par exemple, un magnétoscope. L'appareil de traitement est, par exemple, un décodeur (connu en terminologie anglo-saxonne sous le terme de "set top box"). L'appareil de traitement est, par exemple, un téléviseur. L'appareil de traitement est, par exemple, un caméscope. L'appareil de traitement est, par exemple, une caméra numérique. L'appareil de traitement est, par exemple, un appareil photographique numérique.
Selon un quatrième aspect, l'invention vise un réseau de communication, caractérisé en ce que ledit réseau comporte un dispositif de contrôle de la synchronisation conforme au bref exposé qui précède.
Selon un cinquième aspect, l'invention vise un réseau de communication, caractérisé en ce que ledit réseau comporte un appareil de traitement de données tel que brièvement exposé ci-dessus.
L'invention vise par ailleurs un moyen de stockage d'informations, éventuellement totalement ou partiellement amovible, lisible par un ordinateur ou un processeur contenant des instructions d'un programme informatique, caractérisé en ce qu'il permet la mise en oeuvre du procédé de contrôle de la synchronisation dans un réseau tel que brièvement exposé ci-dessus.
L'invention vise en outre un moyen de stockage d'informations lisible par un ordinateur ou un processeur contenant des données provenant de la mise en ceuvre du procédé de contrôle de la synchronisation dans un réseau de communication tel que brièvement exposé ci-dessus.
L'invention vise également une interface permettant de recevoir les instructions d'un programme informatique, caractérisé en ce qu'il permet la mise en oeuvre du procédé de contrôle de la synchronisation dans un réseau tel que brièvement exposé ci-dessus.