INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
l'exception de A53 L'extension d'une amorce ayant à son extrémité 3' un dIMP est modifiée par rapport à l'extension à partir d'un dGMP, surtout sur C49 qui présente une très forte diminution du taux de terminaison et C20 dont l'intensité augmente en présence de dITP. Les deux autres sites C21 et C51ne présentent pas de variation significative de leur taux de terminaison. De façon surprenante, des sites de terminaison, ne présentant pas de résidu C dans leur environnement matriciel proche, présentent des variations dans le taux de terminaison, en particulier à la sortie de la suite de 6A où l'intensité est en moyenne doublée.
# L'échange de dGTP et de dATP respectivement par c7dGTP et c7dATP conduit à une augmentation de la terminaison de la polymérisation à partir de brins néosynthétisés ayant à leur extrémité 3' une base modifiée, à l'exception de C21et de C49 dans le cas de c7dGTP. Les sites localisés avant l'incorporation de bases modifiées, présentent une augmentation du taux de terminaison dans le cas de c7dGTP, à l'exception de A50. La variation des taux de terminaison induite par le changement de dATP par c7dATP est plus complexe . alors qu'au niveau de A41, le taux de terminaison est augmenté de près de 7 fois en présence de c7dATP, sur A75 elle diminue de près de 2 fois et sur A35 elle reste stable Certains sites non localisés sur ou avant l'incorporation de bases modifiées présentent une différence de taux de terminaison par rapport à la base "naturelle". La plupart de ces sites voient leur taux de terminaison diminuer en présence de c7dNTP au lieu de dNTP, à l'exception de G23 et A77 dans le cas de c7dGTP Ces positions ont la particularité de précéder l'incorporation d'un résidu C sur la matrice, alors que tous les autres sites qui présentent une diminution de l'intensité de terminaison, précèdent l'incorporation d'une pyrimidine ou d'un T à l'exception de G31Dans le cas de c7dATP, la première base modifiée à être incorporée dans le brin polymérisé est en position T36, en amont de cette position, la terminaison de la polymérisation catalysée par la reverse transcriptase de HIV-1 n'est pas modifiée qu'il y ait dATP ou c7dATP dans le milieu réactionnel Les quatre analogues étudiés ont des effets contrastés sur la polymérisation : L'échange de dTTP par dUTP ne modifie que très peu les taux d'arrêts, avec un tendance générale à la diminution surtout au niveau de 6A
L'échange de dGTP par dITP introduit des arrêts nouveaux importants et en général une augmentation conséquente des taux de terminaison en début d'élongation, autour de +50 et surtout après 6A.
L'échange de dGTP par c7dGTP introduit deux sites nouveaux importants et une augmentation importante en début d'élongation, puis une tendance nette à la diminution du taux de terminaison.
L'échange de dATP par c7dATP a globalement peu d'effet, sauf une augmentation importante devant T (matrice)42 trois nouveaux sites, dont l'un sur la dernière base d'un triplet T (matrice)61-63, où s'arrêtent pratiquement la moitié des complexes d'élongation. La terminaison au niveau des 6A est peu affectée. Il semble que c'est l'accumulation locale de T qui conduit à augmenter la terminaison.
Bien que fréquents, les arrêts devant les sites où la base modifiée est demandée ne sont pas systématiques, que cette demande intervienne de façon isolée ou non.
Globalement les analogues (sauf dUTP) augmentent les taux de terminaison dès l'initiation de l'élongation.
2. 2. Identification des sites de terminaison avec le fragment de Klenow Globalement la présence des analogues de base réduit l'efficacité de la polymérisation du fragment de Klenow, rendant la détection des sites de terminaison difficilement décelable au-delà de la position +55, c'est la raison pour laquelle nous n'avons représenté dans les différentes figures qui suivent que les sites de terminaison localisés entre les position +20 et +55.
2.2.1. Identification des sites de terminaison en présence de dUTP (Figure 2.6) L'échange de dTTP par dUTP augmente de façon significative le taux de terminaison de la plupart des sites qui précédent l'incorporation du dUMP au sein du brin néosynthétisé, à l'exception de G40. A part G34, les sites de terminaison en présence de dUTP ne sont plus décelables entre 31 et 45 2. 2.2. Identification des sites de terminaison en présence de dITP (Figure 2. 7) Les augmentations des taux de terminaison des sites localisés avant l'incorporation d'un dITP (A24, C28, G32, T36 et A50) sont en général plus fortes que
ceux où le dITP vient d'être incorporé (29, C33, C51). Il y a moins d'arrêt au niveau de C25, C37 et C49 : sites ont la particularité de précéder l'incorporation de A ou T au sein du brin polymérisé, alors que tous les autres sites précédent l'incorporation d'un G ou d'un C, à l'exception de C29 qui a la particularité d'être précédé de l'incorporation de 2 dIMP 2.2.3. Identification des sites de terminaison en présence de c7dGTP (Figure 2. 8) Tous les arrêts sur les sites où le c7dGMP est incorporé dans le brin polymérisé sont en augmentation par rapport à la réaction avec le dGTP, ainsi que (mais dans une moindre mesure) les sites précédant l'incorporation du c7dGMP, à l'exception de C32 dont le taux de terminaison diminue de 26% en présence de c7dGTP. D'autres sites non localisés en amont ou sur des sites d'insertion du c7dGMP présentent également des variations du taux de terminaison.
2.2.4. Identification des sites de terminaison en présence de c7dA TP (Figure 2. 9) Il y a augmentation des taux de terminaison en 3 vagues, au début de l'élongation, après 1 tour d'hélice et 3 tours d'hélice. Il n'y a aucune corrélation avec la présence de T sur le brin matrice Les sites de terminaison compris entre les 3 vagues observées avec le dATP, ne donnent pas lieu à des arrêts avec l'analogue c7dATP 2.2.5. Comparaison du taux de terminaison suivant l'analogue (Figure 2.10) Comme nous pouvons le voir sur la figure 2 10, les effets des 4 analogues sont importants en début d'élongation et jusqu'à environ +40, les arrêts augmentent ou diminuent tour à tour. La région +50 est le siège de très importantes augmentations avec les 4 analogues Exemple 3 : Comparaison de l'influence de la présence des analogues de bases sur la terminaison de la synthèse catalysée par les deux enzymes 3.1. Récapitulation de l'influence du dUTP sur la terminaison avec le fragment de klenow de l'ADN polymérase et la reverse transcriptase de HIV-1 (Figure 3. 1)
Ces dernières années différentes méthodes moléculaires de détection et d'identification ont été publiées qui concernaient Aspergillus fumigatus. Ces méthodes étaient basées sur la détection d'ADN nucléaire ou d'ADN mitochondrial à l'aide de sondes nucléiques (fragments d'ADN) ou par amplification selon la méthode de polymérisation en chaîne (PCR) (Bretagne et al., 1995, Journal of Clinical Microbiology, 33,1164-1168). Ces méthodes de détection et d'identification ne permettent pas généralement de différencier des groupes au sein de l'espèce Aspergillus fumigatus. Seule la sonde " clone # 3. 9 Afutl " (Girardin et al., 1994, Journal of Clinical Microbiology, 32,684-690 ; Neuveglise et al., 1996, Nucleic Acid Research, 8,1428-1434 ) conduit à la différenciation des individus au sein de
cette espèce. Cependant la mise en #uvre de cette sonde est assez délicate et fastidieuse. Pour permettre une caractérisation infraspécifique des souches d'A. fumigatus il faut recourir à des méthodes de typage comme la méthode RAPD dont la reproductibilité est souvent médiocre ou à l'utilisation du polymorphisme des séquences de type microsatellite, etc...
En résumé les méthodes disponibles pour la détection, l'identification et le typage des souches de champignons et en particulier de l'espèce A. fumigatus sont longues et fastidieuses ou ne permettent pas de combiner dans un essai rapide et fable détection-identification et caractérisation infra-spécifique des souches d'A. fumigatus. Par ailleurs, toute nouvelle séquence nucléique pouvant servir de sonde ou de cible pour procéder à la détection, à l'identification ou au typage des souches de champignons et notamment de l'espèce A. fumigatus, présente un intérêt évident pour une application dans le domaine du diagnostic médical ou agro-alimentaire. Dans la littérature il n'est pas proposé d'utiliser une région (séquences) bien localisée de l'ADN mitochondrial pour détecter-identifier voir caractériser au niveau infra-spécifique les champignons et en particulier A. fumigatus.
Brève description de l'invention : Dans cet état de la technique, l'un des objectifs essentiels de la présente invention est de fournir des séquences nucléiques spécifiques pour les champignons, et en particulier pour Aspergillusfumigatus, et présentes au niveau du génome mitochondrial des souches, pouvant servir de sondes et/ou de cibles pour la détection, l'identification et/ou la caractérisation infra-spécifique des souches notamment d'A. fumigatus. Ces séquences sont choisies dans une région bien définie de l'ADN mitochondrial.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir des séquences nucléiques (AFM-RS1 : Aspergillus fumigatus mitochondrial repeated séquence 1 et SEQ ID : / (AFOS-1) : Aspergillus fumigatus optional séquence 1), qui permettent à la fois une détection spécifique et une identification infra-spécifique des souches d'A. fumigatus de manière performante, fiable et reproductible.
Un autre objectif de la présente invention est que ces séquences nucléiques si elles sont utilisées comme sondes sont dirigées contre des séquences cibles de l'ADN mitochondrial d'A. fumigatus.
Un autre objectif de la présente invention est d'utiliser ces séquences nucléiques comme cibles pour la détection et l'identification des souches d'A, fumigatus par exemple pour une détection par amplification moléculaire.
Un autre objectif de la présente invention est d'utiliser ces séquences nucléiques pour réaliser des recombinaisons site spécifique, par exemple afin d'incorporer une séquence nucléotidique (eg : un gène) dans le génome mitochondrial par exemple d' A. fumigatus.
Ces objectifs sont atteints par l'invention qui concerne, tout d'abord, des séquences nucléiques, utilisables comme sondes ou comme cibles, notamment de détection et d'identification spécifique et/ou infra-spécifique des champignons choisis parmi les outils génétiques (ou apparentés) suivants : - au moins une partie du fragment FI d'environ 5200 pb d'acide nucléique de l'ADN mitochondrial et caractérisé en ce qu'elle est bornée par le gène de l'ARN de transfert ARNt- Met et par le gène de la cytochrome oxydase Coxl, ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence.
Ces séquences nucléiques, notamment de détection, et d'identification spécifique et/ou infraspécifique des champignons et en particulier d'A. fumigatus sont caractérisés en ce qu'elles sont choisies parmi les outils génétiques (ou apparentés) suivants : - au moins une partie de la séquence du fragment d'environ 2500 pb d'acide nucléique de l'ADN mitochondrial et caractérisée en ce qu'elle est localisée entre le gène de l'ARN de transfert ARNtMet et le gène de l'ARN de transfert ARNt -His, ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence.
En outre, selon une réalisation préférée de l'invention, ces séquences nucléiques, notamment de détection et d'identification spécifique et/ou infra-spécifique des souches d'Aspergillus fumigatus, sont caractérisées en ce qu'elles correspondent au-moins à une partie de la séquence SEQ ID NO : 1/ (AFMBoxl) ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire.
Selon un premier mode de cette réalisation préférée, les dites séquences sont caractérisées en ce qu'elles correspondent au-moins à une partie à la séquence SEQ ID NO : 2/ (AFM-RS1) ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence.
Selon un deuxième mode de cette réalisation préférée, ces séquences sont caractérisées en ce qu'elles correspondent au-moins à une partie à la séquence SEQ ID NO : 3 / (AFOS-1) ou d'un analogue de cette séquence ou d'une séquence complémentaire de cette séquence.
L'invention concerne également un procédé de détection et d'identification des champignons caractérisés en ce qu'il consiste à mettre en #uvre comme sonde une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
Selon ce procédé : - on libère l'ADN total (ADNt) des souches à étudier - on soumet éventuellement cet ADNt à une digestion enzymatique, avec au moins une enzyme de restriction,
- on dénature l'ADNt, éventuellement digéré, par exemple par traitement thermique, - on met en présence l'ADNt ainsi dénaturé, avec la sonde dotée d'au-moins un marqueur, de façon à réaliser l'hybridation, - on élimine l'ADN et la sonde non hybridés, et on révèle l'hybridation à l'aide du marqueur.
Le terme purifié ne nécessite pas que le matériel soit présent sous une forme de pureté absolue, exclusif de la présence d'autres composés. Il s'agit plutôt d'une définition relative.
Un polynucléotide est à l'état purifié après purification du matériel de départ ou du matériel naturel d'au moins un ordre de grandeur, de préférence deux ou trois et préférentiellement quatre ou cinq ordres de grandeur.
Aux fins de la présente description, l'expression séquence nucléotique peut être employée pour désigner indifféremment un polynucléotide ou un acide nucléique. L'expression séquence nucléotidique englobe le matériel génétique lui-même et n'est donc pas restreinte à l'information concernant sa séquence.
L'invention est également relative à un acide nucléique codant pour les deux sous-unités protéiques de la glycérol déshydratase indépendante du coenzyme B12 de Clostridium butyricum.
Préférentiellement, un tel acide nucléique est caractérisé en ce qu'il comprend un premier polynucléotide ayant au moins 50% d'identité en nucléotides avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 et un second
polynucléotide ayant au moins 50% d'identité en nucléotides avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N 2.
Selon un mode de réalisation particulier, un tel acide nucléique codant pour les deux sous-unités protéiques de la glycérol déshydratase indépendante du coenzyme B12 comprendra en outre une séquence à fonction de promoteur, fonctionnelle dans la cellule hôte dans laquelle l'expression des polynucléotides codant pour les deux sous-unités de cette enzyme est recherchée.
Une telle séquence nucléotidique promotrice de la transcription peut être la séquence promotrice SEQ ID N 3 ou une séquence ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec cette dernière.
L'invention a également pour objet un acide nucléique à fonction de promoteur bactérien, notamment chez Clostridium butyricum, comprenant un polynucléotide ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec la séquence SEQ ID N 3, ou un polynucléotide de séquence complémentaire.
Comme déjà mentionné plus haut, une organisation en opéron unique permet, chez la bactérie Clostridium butyricum, la synthèse d'un produit de transcription (ARN messager) comprenant à la fois les séquences codant pour les deux sous-unités protéiques de la glycérol déshydratase indépendante du coenzyme B12, qui catalyse la transformation du glycérol en 3hydroxypropionaldéhyde (3-HPA) et la 1,3-propanediol déshydrogénase (DHAT) qui catalyse la transformation du 3-HPA en 1,3-propanediol.
L'invention concerne donc également un acide nucléique comprenant tout ou partie d'un polynucléotide codant une 1,3-propanediol déshydrogénase ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N 4, ou un polynucléotide séquence complémentaire.
Dans un mode de réalisation particulier d'un acide nucléique purifié ou isolé selon l'invention, il peut être avantageux de pouvoir inclure dans une même séquence les acides nucléiques codant respectivement pour les deux sous-unités protéiques de la glycérol déshydrogénase et pour la 1,3-propanediol déshydrogénase, un tel acide nucléique codant alors pour les deux enzymes susceptibles de catalyser la totalité des étapes de bioconversion du glycérol en 1,3-propanediol.
En conséquence, l'invention est également relative à un acide nucléique comprenant, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3' :
a) un premier acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend un premier polynucléotide ayant au moins 50% d'identité en nucléotides avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 et un second polynucléotide ayant au moins 50% d'identité en nucléotides avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N 2; b) un second acide nucléique comprenant un polynucléotide codant une 1,3-propanediol déshydrogénase ayant au moins 80% d'identité en nucléotides avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N 4 .
Les séquences nucléotidiques codant respectivement pour la glycérol déshydratase et la 1,3-propanediol déshydrogénase de l'acide nucléique cidessus décrit, pourront en outre être avantageusement placées sous le contrôle d'une séquence promotrice appropriée, telle que la séquence SEQ ID N 3 ou de toute autre séquence promotrice fonctionnelle dans la cellule hôte dans laquelle leur expression est recherchée.
Un acide nucléique répondant à la définition ci-dessus est par exemple le polynucléotide de séquence SEQ ID N 5 ou encore un polynucléotide ayant au moins 50% d'identité en nucléotides avec le polynucléotide de séquence SEQ ID N 5.
# BECHTOLD N. , Ellis J. PELLETIER G., 1993. Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of adult Arabidopsis thaliana plants. C.R.
Acad. Sci. Paris 316: 1194-1199.
# BOUCHEZ D., CAMILLERI C., CABOCHE M. 1993. A binary vector based on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana. C.R. Acad. Sci. Paris 316 : 1188-1193.# BEVAN M. 1984. Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acid Research 12 : 8711-21.# BRUNAK S. ENGELBRECHT, J. and KNUDSEN, S.: Prediction of human mRNA Donor and Acceptor Sites from the DNA séquence.
Journal of Molecular Biology, (1991), 220, 49-65.
# BURGE, C. and KARLIN, S. (1997). Prediction of complete gene structures in human genomic DNA. J. Mol. Biol. 268,78-94, BURGE, C. B. (1998). Modeling dependencies in pre-mRNA splicing signais. In
SALZBERG, S. SEARLS, D. and KASIF; S. eds. Computational methods in molecular biology. Elsevier Science, Amsterdam, pp. 127-163.
# BOUCHEZ D. , VITTORIOSO P., COURTIAL B. CAMILLERI C., 1996. Kanamycin Rescue : Asimple technique for the recovery of T-DNA flanking séquences. Plant Mol. Biol. Rep. 14 : 115-123.# BOUCHEZ D. CAMILLERI C., CABOCHE M. , 1993. A binary vector based on Basta resistance for in planta transformation of Arabidopsis thaliana. C. R. Acad. Sci. Paris 316 : 1188-1193.# CRAWFORD, N. M. and GLASS, A. D.M. 1998. Molecular and physiological aspects of nitrate uptake in plants. Trends in Plant Science, 3,389-395.
# CORMACK , B. P. VALDIVIA, R. H. FALKOW, S. (1996), FACS- optimized mutants of the freen fluorescent protein (GFP) Gene 173 : 33-38.
# JEFFERSON R. A., 1987. Assaying chimeric genes in plants: the Gus gene fusion system. Plant Mol. Biol. Rep.5: 387.
# HEBSGAARD S. M., P.G. KORMING, N. TOLSTRUP, J. ENGELBRECHT, P. ROUZE, S. BRUNAK: Splice site prediction in Arabidopsis thaliana DNA by combining local and global séquence information. Nucleic Acids Research, (1996), Vo1.24, N 17, 3439-3452.
. HEIM U. WEBER H., BAUMLEIN H. WOBUS U. 1993. A sucrosesynthase gene of Vicia faba L. Expression pattern in developing seeds
in relation to starch synthesis and metabolic regulation. Planta 191 : 3494-501.
# HESSE, H. SONNEWALD, K. and WILLNITZER, L. (1995). Cloning and expression analysis of sucrose-phosphate synthase from sugar beet (Beta vulgaris L. ) Mol. Gen. Genet, 247,515-520).
# HWANG et al., (1995). An Arabidopsis thaliana root spécifie kinase homolog is induced by dehydration, ABA, and NaCI. Plant J.8: 37-43.
. HWANG I., GOODMAN, H. M. (1995). An Arabidopsis thaliana root spécifie kinase homolog is induced by deshydration, ABA, and NaCI, The Plant Journal, 8,37-43).
# LEAH, R. TOMMERUP, H. SVENDSEN, I. and MUNDY, Y. (1991).
Le système pris comme exemple et représenté sur la figure 2 comprend donc une installation téléphonique EP (privée selon cet exemple) équipée de plusieurs postes téléphoniques 10 reliés à un autocommutateur 20.
L'autocommutateur 20 est relié par une ligne téléphonique LT au réseau de téléphonie commuté RTC, portant la référence R1 sur le schéma.- En outre, cet autocommutateur 20 est relié par un lien L CTI au serveur CTI 30.
Le serveur 30 est relié à un terminal distant 40, serveur de données. Les communications entre le terminal distant et le serveur CTI se font par une ligne de transmission numérique selon le protocole TCP/IP. Le terminal distant 40 est accessible à travers les réseaux de téléphonie mobile R2 ou le réseau de transmission de données numériques RNIS R3. Cet accès est réalisable respectivement au moyen de terminaux de télécommunication tels que les postes de téléphonie mobile 11 ou de terminaux de téléphonie 13A ou de transmission de données 13B.
Un utilisateur distant va utiliser son poste de téléphonie mobile 11 pour envoyer, conformément à l'invention, un message court SMS directement vers le terminal serveur distant qui l'interprétera pour ordonner de mettre en #uvre le service demandé Le serveur CTI 30 transmettra alors cette demande à l'autocommutateur 20 (PABX) via le protocole approprié du lien CTI. Le poste 10 de l'utilisateur sera donc renvoyé vers le numéro indiqué par ledit utilisateur.
Ainsi, un utilisateur va utiliser la fonction d'envoi de messages courts de son terminal GSM pour pouvoir piloter le renvoi à distance d'un poste téléphonique de l'entreprise vers le numéro de son GSM par exemple.
Un utilisateur pourra avantageusement pré- programmer les messages courts de demandes de renvoi sur son terminal GSM et appeler cette fonction au moment voulu grâce au menu du service de messages courts.
Ainsi un message court est envoyé à partir du terminal GSM vers le terminal serveur distant 40 qui est apte à recevoir ces messages courts. Ce terminal lit le message court et l'interprète. Le message court se présente sous la forme d'une suite de champs d'information nécessaires à l'activation du service demandé. Cette action prend seulement quelques secondes, le temps d'envoyer le message court SMS à partir du terminal GSM.
Dans le cas d'un renvoi de poste, un message court sera constitué par exemple de champs contenant des paramètres de commande suivants séparés éventuellement par un champ neutre ( de type *): - le numéro du poste de l'utilisateur dans l'entreprise (exemple saisie de quatre chiffres), - un mot de passe personnel afin d'authentifier l'utilisateur (exemple quatre chiffres), - le type de renvoi souhaité (sous la forme d'un code correspondant à la fonction renvoi activé ou désactivé), - le numéro de renvoi vers lequel les appels destinés au poste de l'entreprise sont renvoyés. Le message court est envoyé au numéro du serveur distant 40.
Exemple de messages courts 9191*1234*2*1234567890*. Le terminal serveur distant 40 peut aussi utiliser une fonction offerte par les services de téléphonie actuels d'identification de l'appelant pour identifier l'utilisateur et donc connaître le numéro de poste de l'utilisateur dans l'entreprise. Dans ce cas le message court ne contiendra pas le numéro de poste de l'utilisateur et sera alors . de type **1234*2*1234567890*.
Ainsi, selon le système qui vient d'être décrit cela prendra environ 10 secondes à l'utilisateur pour envoyer les informations et réaliser la fonction de renvoi.
Le terminal serveur distant 40 peut acquitter la demande reçue. Dans ce cas le serveur émettra un message court d'acquittement au terminal 11 ou 13A, 13B.
on vient de voir en détail comment le système permet rapidement de configurer à distance les renvois d'un poste téléphonique rattaché à un autocommutateur privé d'une entreprise.
Quelques autres services peuvent ainsi être obtenus. En effet, on pourra avoir le service de rappel automatique (Call back en terminologie anglosaxonne) qui permet à un utilisateur qui se trouve à l'extérieur de son entreprise, de se faire rappeler aux frais de l'entreprise afin de communiquer avec un correspondant au moyen de son terminal téléphonique.