INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
On peut avantageusement utiliser, à cet effet, un échangeur de cations fort SCX (Strong Cation Exchanger, c'est-à-dire une résine dont les groupes actifs sont des groupes SO3 , telle qu'à titre d'exemple la résine SCX com mercialisée par la Société WHATMAN sous la dénomination pARTISIL. On peut, toutefois, également envisager de mettre en oeuvre un échangeur de cations faible WCX (Weak Cation Exchanger), dans lequel les groupes S03 sont remplacés par des groupes COO . De même, la silice peut être remplacée par un support polymérique ou recouverte de polymère.
Dans ces résines, les groupes S03 ou COO attirent les ions chargés positivement, c'est-à-dire bloquent les cations.
On a, également pu mettre en oeuvre à cet effet une phase stationnaire particulière en carbone graphitisé poreux (CGP) telle que celle commercialisée par la société HYPERSIL sous la dénomination HYPERCARt3.
Les pâtes énumérées sur le tableau 18 ont été préparées et étudiées pour déterminer le caractère collant.
TABLEAU 18 Pâte préparée pour étudier le caractère collant
Pâte n Pâte TUX/kg de farine BGU/kg de farine 1 Témoin 0 0 Z TXU 7500 0 3 TXU + BGU 7500 158 - 4 TXU 15000 0 5 TXU + BGU 15000 316
Les pâtes énumérées sur le tableau 18 ont donné les résultats de caractère collant figurant sur le tableau 19.
TABLEAU 19 Résultats de caractère collant de la pâte avec de la xylanase et de la pâte avec de la xylanase + glucanase "Pâte N " désigne la pâte N sur le tableau 18 Stik 10 indique les résultats de mesure du caractère collant au bout de 10 minutes Stik 45 indique les mesures après 45 minutes de repos
Pâte n Stik~10, Ecart- Stik~45, Ecartg x s type g x s type 1 4,5 0,342 5,11 0,552 2 5,29 0,619 8,62 0,607 3 5,47 0,663 9,38 0,832 4 8,61 0, 408 9,15 0,418 5 8,73 0,35 10,19 0,857
Comme permet de le constater le tableau 19, l'addition d'endo-ss-1,4-glucanase à la pâte provoque une
augmentation du caractère collant de la pâte. Les résultats figurant sur le tableau 19 sont illustrés sur la figure 31.
RESUME En résumé, la présente invention propose, et les exemples illustrent, ce qui suit : a. L'isolement d'un inhibiteur d'endo-ss-1,4-xylanase endogène à partir de farine de blé. b. La caractérisation d'un inhibiteur d'endo--1,4- xylanase endogène isolé à partir de farine blé. c. La caractérisation de l'effet de l'inhibiteur d'-endo- -1,4-xylanase endogène sur différentes xylanases. d. Un moyen pour sélectionner des xylanases non influencées de manière néfaste par l'inhibiteur d'endo-(3- 1,4-xylanase endogène. e. Un moyen pour sélectionner des xylanases non influencées de manière néfaste par des inhibiteurs d'endo- P-l,4-xylanase. f. Des xylanases qui permettent d'obtenir une pâte présentant un volume avantageux et un caractère collant acceptable, comparativement à des pâtes comprenant des xylanases fongiques. g. Une méthode pour sélectionner les xylanases et/ou les soumettre à une mutation en utilisant un inhibiteur d'endo-ss-1,4-xylanase endogène, et l'utilisation de ces xylanases ou mutants ou de leurs mutants dans la production de pâtes. h. Un produit alimentaire préparé avec les xylanases de la présente invention.
Toutes les publications mentionnées dans le mémoire descriptif ci-dessus sont citées à titre de référence dans le présent mémoire.
LISTE DES SEQUENCES Les pages suivantes présentent une série de listes de séquences - comprenant les séquences suivantes : SEQ ID N 1 - séquence d'amino-acides de l'inhibiteur SEQ ID N 2 - séquence d'amino-acides de l'inhibiteur SEQ ID N 3 - séquence d'amino-acides d'une xylanase de type sauvage (R) SEQ ID N 4 - séquence de nucléotides d'une xylanase de type sauvage (R) SEQ ID N 5 - séquence d'amino-acides d'une xylanase de type sauvage (D) SED ID N 6 - séquence de nucléotides d'une xylanase de type sauvage (D) SEQ ID N 7 - séquence d'amino-acides d'une xylanase mutante (XM1) SEQ ID N 8 - séquence de nucléotides d'une xylanase mutante (XM1) SEQ ID N 9 - séquence d'amino-acides d'une xylanase mutante (XM2) SEQ ID N 10 - séquence de nucléotides d'une xylanase mutante (XM2) SEQ ID N 11 - séquence d'amino-acides d'une xylanase mutante (XM3) SEQ ID N 12 - séquence de nucléotides d'une xylanase mutante (XM3) SEQ ID N 13- séquence d'amino-acides de l'inhibiteur SEQ ID N 14 - séquence d'amino-acides de l'inhibiteur SEQ ID N 15- séquence d'amino-acides de l'inhibiteur SEQ ID N 16- séquence d'amino-acides de l'inhibiteur SEQ ID N 17 - séquence d'amino-acides de l'inhibiteur
SEQ ID N 18- séquence d'amino-acides de l'inhibiteur SEQ ID N 19- séquence d'amino-acides de l'inhibiteur Notes : Pour XM1, XM2 et Xm3 - on a introduit des modifications (représentées) dans la séquence de nucléotides et la séquence o'amino-acides par mutation dirigée du gène. Le gène muté peut être exprimé dans E. coli, dans Bacillus ou dans n'importe quel organisme de choix.
SEQ ID N 1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12131415161718192021 22232425
L A V V A R A V K D V A P F G V X Y D T K T L G N 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 N L G G Y A V P N Q L G L L D G G X D W T M X K 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 N S M V D V K SEQ ID NO. 2
1 2 - 3 4 5 6 7 18 9 10 il 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22232425
Fincher et Stone (1986) indiquent que 70 % des polysaccharides présents dans la paroi cellulaire de l'endosperme consistent en arabinoxylane. Une caractéristique intéressante de l'arabinoxylane et son aptitude à se lier à l'eau. Une partie de l'arabinoxylane consiste en pentosane insoluble dans l'eau et une partie consiste en pentosane soluble dans l'eau (PSE). Des résultats expérimentaux ont montré une corrélation entre la dégradation du PIE en polymères hydrosolubles de haut poids moléculaire (HPM) et le volume du pain.
Au cours de la préparation d'un produit de boulangerie, on sait que l'utilisation d'une xylanase à une dose convenable peut avoir pour résultat une formulation de pâte plus stable (qui comprend habituellement du sel, de la farine, de la levure et de l'eau) et un meilleur volume, par exemple, du pain levé.
A cet égard, une xylanase très efficace pour augmenter le volume du pain devrait solubliser le PIE en provoquant un accroissement de viscosité de la pâte liquide sans une dégradation supplémentaire du PSE en oligomères de xylose. Il est considéré que 'cette dégradation du PIE en PSE de bas poids moléculaire (BPM) est néfaste pour les propriétés de la pâte et peut engendrer un caractère collant (Rouau et al et McCleary (1986) International Journal of Biological Macro Molecules, 8, 349-354).
Le document US-A-5 306 633 décrit une xylanase obtenue à partir d'une souche de Bacillus subtilis.
Manifestement, cette xylanase peut améliorer la consistance et augmenter le volume du pain et de produits de cuisson contenant cette xylanase.
Une autre xylanase provenant de Bacillus subtilis a été isolée et séquencée (voir Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M. Jurasek, L. et Yaguchi, M. A xylanase gene from Bacillus subtilis : nculeotide séquence and comparison with B. pumilus ene, Arch. Microbiol. 144, 201- 206 (1986) ) .
Il a été considéré depuis un certain temps maintenant que des xylanases bactériennes produisaient une pâte très collante. En conséquence, on s'attend habituellement à ce que les xylanases de Bacillus subtilis - par exemple celle du document US-A-5 306 633, produisent une pâte très collante.
Des enzymes de l'art antérieur qui ont engendré un caractère collant ont dû être utilisées en des quantités soigneusement ajustées de telle sorte que le caractère
collant n'ait pas sur la manipulation un effet néfaste à un degré tel qu'une manipulation commerciale efficace soit entravée. Cependant, la nécessité d'ajuster avec soin la dose a empêché l'addition de xylanase directement à la farine avant la production de la pâte. Il a été donc nécessaire avec les systèmes de l'art antérieur d'ajouter la xylanase d'une manière très régulée au cours de la production de la pâte.
A ce jour, des xylanases fongiques ont été utilisées habituellement dans la cuisson au four. Par exemple, J Maat et al. (Xylans and Xylanases, édités par J Visser et al, 349-360, Xylanases and their application in bakery) font connaître une P-l,4-xylanase produite par une souche d'Aspergillus Niger variété awarmori. Suivant ces auteurs, la xylanase fongique est efficace pour accroître le volume spécifique des pains, sans avoir un effet secondaire négatif sur la manipulation de la pâte (caractère collant de la pâte) tel que celui pouvant être observé avec des xylanases dérivées d'autres sources fongiques ou de sources bactériennes.
Il a été proposé par W Debyser et al., (J. Am. Soc.
Brew. Chem. 55 (4), 1997, Arabinoxylan Solubilization and Inhibition of the Barely Malt Xylanolytic System by Wheat During Mashing with Wheat Wholemeal Adjunt : Evidence for a New Class of Enzyme Inhibitors in Wheat) que des inhibiteurs de xylanases peuvent être présents dans le blé. L'inhibiteur décrit par W Debyser et al. n'a pas isolé. En outre, il n'a pas été indiqué par W Debyser et al. si l'inhibiteur était endogène ou bien microbiologique. En outre, aucun résultat chimique n'a été présenté pour cet inhibiteur.
La présence d'un inhibiteur de xylanases dans la farine de blé a été récemment examinée par X Rouau et A Surget, (Journal of Cereal Science, 28 (1998) 63-70, Evidence fort the Presence of a Pentosanase Inhibitor in Wheat Flours). Comme dans le cas de Debyser et al., Rouau
et Surget ont considéré qu'ils ont mis en évidence l'existence d'un composé thermolabile dans la fraction soluble de farines de blé, qui limitait l'action d'une pentosanase ajoutée. Egalement comme dans le cas de Debyser et al., ces auteurs n'ont pas isolé d'inhibiteur et ont été incapables de conclure si l'inhibiteur était endogène ou s'il était d'origine microbiologique. De manière similaire, aucun résultat chimique n'a été présenté pour cet inhibiteur.
Ainsi, un problème connu dans ce domaine consiste en la façon de préparer des produits cuits au four à partir d'une pâte n'ayant pas des propriétés de manipulation néfastes. Un problème plus particulier consiste en la manière de produire une pâte qui soit non collante c'est-à-dire une pâte qui ne soit pas suffisamment collante pour poser des problèmes de manipulation et de transformation.
La présente invention a pour objet de proposer une solution à ces problèmes.
#PF 204-205 C (AcOEt) #1H RMN (250 MHz, DMSO-ds): d 3. 63 (s, 3H, NCH3), 3,89 (s, 3H, OCH3), 3. 90 (s, 3H, OCH3), 6. 46 (d, 1 H, J = 1.9 Hz, HAr), 6. 54 (d, 1 H, J = 1.9 Hz, HAr), 6. 76 (d, 2H, J = 8.5 Hz, HAr), 7. 48 (d, 2H, J = 8.5 Hz, HAr), 7. 93 (s, 1 H, HAr). 9. 47 (s, 1 H, OH).
.13C RMN (62.90 MHz, DMSO-ds): d 30. 5, 56. 1, 56.5, 91.3, 93 4, 105. 3, 115. 2 (2), 126. 5, 128. 4, 129.2, 130.2 (2), 141. 7, 157.4 (2), 161. 4, 162.5.
#SM: m/z 312 (M+1)+ -Anal. calculé pour C18H17N04: C, 69.44 ; 5.50 ; 4.50. Trouvé: C, 6965; H, 5.59 ; N, 4.60.
EXEMPLE 7 : 5,7-Dihydroxy-3-(4-hydroxyphényl)-1-méthyl-1,2-dihydro-2- quinolinone (Composé 9) 1. Méthode A : atmosphère inerte, 200 mg (0,61 mmol) de composé 7 sont solubilisés dans 15 ml d'acide acétique. Une solution commerciale de HBr 48% dans l'eau (1 ml) est additionnée goutte à goutte (réaction exothermique) au mélange réactionnel. La solution finale est agitée à reflux pendant 3 jours. Après refroidissement, la réaction est diluée par addition d'eau, puis neutralisée avec une
solution d'hydroxyde de sodium à 10% (pH= 6-7). Le produit est extrait par du dichlorométhane (deux fois). La phase organique est séchée sur MgS04, puis évaporée sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de silice (éluant CH2CI2/MeOH 9:1) pour donner 61 mg (35%) du composé 9.
2. Méthode B : atmosphère inerte, 1,0 g (3,1 mmol) de composé 7 est solubilisé dans 15 ml de dichlorométhane. A 0 C, 1,81 ml (19,0 mmol, 6 eq) de tribromure de bore sont additionnés goutte à goutte (réaction exothermique) au mélange réactionnel. La solution finale est agitée à température ambiante pendant 18 h. La réaction est hydrolysée par addition (goutte à goutte) d'eau, puis neutralisée avec une solution d'hydroxyde de sodium à 10% (pH= 6-7). Le produit est extrait par du dichlorométhane (deux fois). La phase organique est séchée sur MgS04, puis évaporée sous pression réduite. Le résidu obtenu est purifié sur colonne de silice (éluant CH2Cl2/MeOH 9:1) pour donner 688 mg (76%) du composé 9.
. PF > 280 C (AcOEt) #1H RMN (250 MHz, DMSOd-6): d 3,53 (s, 3H, CH3), 6. 25 (s, 2H, HAr), 6. 76 (d, 2H, J = 8.8 Hz, HAr), 7. 47 (d, 2H, J = 8. 8 Hz, HAr), 7. 92 (s, 1 H, HAr), 9. 42 (s, 1 H, OH), 10.00 (s, 1 H, OH), 10. 35 (s, 1 H, OH).
.13C RMN (62.90 MHz, DMSOd-6): d 29. 7, 91. 8, 96. 5, 103. 5, 114. 7 (2), 124.3, 128.4, 129.7 (3), 141 7,155.9, 156. 7, 160. 6, 161. 1.
#SM (ionspray) : m/z 284 (M+1)+ -Anal. calculé pour C16H13N04. C, 67.84 ; 4.63 ; 4. 94. Trouvé : 67.68; H, 4.46 ; N, 4.78.
EXEMPLE 8 : 5,7-Diméthoxy-3-(4-méthoxyphényl)-1-méthyl-1,2-dihydro-2- quinolinethione (Composé 10)
Sous atmosphère d'azote, 500 mg (1,5 mmol) de composé 7 sont solubilisés dans 30 ml de toluène. A ce mélange réactionnel est ajouté 870 mg (2,1 mmol, 1,4 eq) de réactif de Lawesson. La réaction est portée à reflux pendant 12 h. Après refroidissement, le solvant est évaporé. Le résidu obtenu est purifié par chromatographie sur colonne de silice (AcOEt/EP 3 :7) donner 376 mg (72%) du composé 10.
#PF 176-177 C (AcOEt/EP) #IR (KBr) 1613, 1570,1512 cm-1 #1H RMN (250 MHz, CDCI3): d 3,84 (s, 3H, OCH3), 3. 91 (s, 3H, OCH3), 3. 95 (s, 3H, OCH3), 4. 39 (s, 3H, NCH3), 6. 39 (d, 1 H, J = 2. 0 Hz, HAr), 6. 56 (d, 1 H, J = 2. 0 Hz, HAr), 6. 93 (d, 2H, J = 7. 5 Hz, HAr), 7. 43 (d, 2H, J = 7.5 Hz, HAr), 7. 97 (s, 1 H, HAr).
.13C RMN (62. 90 MHz, CDCI3): d 39. 5, 55. 2, 55. 6, 55. 9, 91. 1, 94. 6, 109.9, 113 1 (2), 126. 6, 130. 8 (2), 134.3, 138.6, 142.7, 157. 6, 158.8, 162. 7, 184. 5.
#SM: m/z342(M+1)+ -Anal. calculé pour C19H19NO3S: C, 66.84 ; 5.61 ; 4. 10. Trouvé : 66.70 ; 5.53; N, 4. 03.
EXEMPLE 9 : 2-[5,7-Diméthoxy-3-(4-hydroxyphényl)-2-oxo-1,2-dihydro-1- quinolinyl]acétate d'éthyle (Composé 11)
Sous atmosphère d'azote, 1,0 g (3,2 mmol) de composé 1 est solubilisé dans 30 ml de N,N-diméthylformamide (DMF) anhydre. A 0 C, 115 mg (4,8 mmol, 1,5 eq) de NaH, préalablement lavés dans de l'éther de pétrole, sont additionnés par petites portions à la solution réactionnelle (réaction exothermique). Une solution de bromoacétate d'éthyle (0,72 ml, 6,4 mmol, 2 eq) dans 5 ml de DMF est ajoutée au milieu. La réaction est chauffée pendant 2-3 h à 90 C. Après refroidissement, de l'eau est versée sur le mélange réactionnel, puis celui-ci est agitée pendant 15 min. La solution est extraite par
ment, parallèlement à la direction Y, le long d'une poutre 144 ayant une position fixe en direction X, immédiatement en amont du déflecteur 74. Le chariot 142 est guidé par la poutre 144 et est en prise avec une vis sans
fin 144a parallèle à la poutre 144 et entraînée par un moteur 146.
A une extrémité de la poutre 144 est monté un rouleau 148 de film adhésif 150. Le chariot 142 porte un support de pince 152 susceptible de venir en prise latéralement avec le film adhésif 150 et un galet presseur
154. La pince 152 est montée sur son support en étant mobile horizon-
talement en direction Y entre une position rétractée et une position de préhension, sous la commande d'un actionneur. La pince 152 et le galet 154 sont mobiles verticalement entre une position relevée et une position abaissée en étant fixés aux extrémités des tiges de deux actionneursrespectifs 152a, 154a. En sortie du rouleau de stockage 148, le film adhésif 150 passe successivement entre les lames d'un dispositif de coupe 156 et sous un applicateur 158. Ce dernier est formé par un rouleau mobile verticalement entre une position relevée et une position
abaissée en étant fixé à l'extrémité d'un actionneur 158a.
Un cycle de dépose d'une bandelette transversale de film adhésif comprend les opérations suivantes. La pince 152, le galet 154 et lI'applicateur 158 étant en position relevée, la pince 152 dévide le film , en étant en prise avec l'extrémité de celui-ci, par déplacement du
chariot 142 dans un sens (aller) sous la commande du moteur 146.
Lorsque le film adhésif 150 a été dévidé sur toute la largeur du matelas, au-dessus de celui-ci, la pince 152, le galet 154 et l'applicateur 158 sont abaissés pour amener le film adhésif 150 au contact du film 32. La pince 152 est alors ouverte, rétractée et relevée et le déplacement du chariot 142 est commandé dans l'autre sens (retour) au moyen du moteur 146. Lors de ce trajet retour, le galet presseur en position abaissée applique la bandelette de film adhésif sur le film 32. Lorsque le chariot est revenu en position initiale, la pince 152 est amenée en position de préhension pour
saisir le film 150 entre le rouleau 148 et le dispositif de coupe 156.
Ensuite, le dispositif de coupe est actionné, et le galet 154 et l'applicateur 158 sont relevés. Un nouveau cycle peut alors être réalisé en déplaçant
le chariot 142 sur son trajet aller.
Chaque bandelette de film adhésif est déposée entre deux pas d'avance du matelas. L'intervalle entre bandelettes en direction Y est choisi pour assurer que chaque contour découpé est recouvert par deux bandelettes au moins. Cet intervalle peut être régulier, ou adapté aux dimensions des différents contours en direction Y. Les Figures 11 et 12 montrent encore un autre mode de réalisation d'un dispositif de formation d'attaches localisées. Comme dans le mode de réalisation précédent, ce dispositif 160 est porté par un
chariot 162 distinct de celui supportant la tête de coupe.
Le chariot 162 est mobile transversalement, parallèlement à la direction Y, le long d'une poutre 164 ayant une position fixe en direction X, immédiatement en amont du déflecteur 74. Le chariot 162 est guidé par la poutre 164 et est en prise avec une vis sans fin 164a parallèle à la
poutre 164 et entraînée par un moteur 166.
On a ensuite analysé l'éluant à la sortie de la colonne avec le DEDL.
Le chromatogramme obtenu est représenté sur la figure 2 sur laquelle le premier pic correspondant à un temps de rétention de 1,22 min. représente les cations qui sortent en volume mort, tandis que les pics suivants, correspondant respectivement à des temps de rétention de 3,23 ; 4,20 et 6,12 min., représentent les chlorures, les nitrates et les sulfates.
Exemple 3 : Analyse d'anions sur une résine en carbone sra- Dhitisé poreux On a analysé une eau minérale (de l'eau de Perrier) sur une colonne HYPERCARBs 5 ym (4,6 X 100 mm).
Après injection de l'eau à analyser, on a fait passer sur cette colonne une phase mobile constituée par une solution renfermant 30 mM/l d'acide formique et 20 mM/l d'ammoniaque, ce avec un débit de 0,5 ml/min..
Le chromatogramme obtenu est représenté sur la figure 3 sur laquelle le premier pic correspondant à un temps de rétention de 2,482 min. représente les cations qui sortent quasi instantanément tandis que les pics suivants correspondant respectivement à des temps de rétention de 3,372 ; 3,978 et 5,777 min. représentent les chlorures, les sulfates et les nitrates.
Exemple 4 : Préconcentration d'anions sur une résine en car bone graphitisé poreux Cet exemple a été mis en oeuvre avec des conditions d'analyse identiques à celles de l'exemple 3.
On a fait passer, sur 200 mg d'une résine HYPERCARBe 10 ml d'une solution renfermant 5 ppm d'ions SO4 et on a débloqué le concentrat d'anions sulfate retenu sur cette résine avec 1 ml de solution éluante renfermant de l'acide formique et de l'ammoniaque ; on a ensuite analysé cet éluant à l'aide du DEDL en sortie de colonne.
Le chromatogramme obtenu est représenté sur la figure 4A dans laquelle le pic correspondant à un temps de rétention de 3,837 représente les ions SO4 dont la concentration est d'environ 37 ppm.
Dans un but comparatif, on a analysé des solutions étalons de sulfate de sodium ayant des concentrations de 30 et 40 ppm en sulfate, ce toujours dans les mêmes conditions que celles choisies dans l'exemple 3.
Les chromatogrammes obtenus sont représentés sur les figures 4B et 4C dans lesquelles le premier pic correspondant à un temps de rétention de 2,233 ou 2,25 min. repré- sente le sodium tandis que le second pic correspondant à des temps de rétention de 3,94 ou 3,958 min. représente l'ion sulfate.
Il est à noter qu'une préconcentration de 100 % revient à doser 50 ppm de S04 alors que l'on n'en a obtenu que 37 ppm, ce qui signifie que l'on a eu 74 % de préconcentration.
Exemple 5 : Analvse des anions en présence ou en l'absence des cations associés On a analysé une solution étalon renfermant 25 ppm de Na2 SO4 dans des conditions identiques à celles choisies dans l'exemple 3.
Des polynucléotides tels qu'un polynucléotide d'ADN et des amorces conformes à la présente invention peuvent être produits par recombinaison, par synthèse ou par n'importe quel autre moyen disponible à l'homme de l'art.
Ils peuvent également être clonés par des techniques classiques.
En général, des amorces sont produites par des moyens de synthèse, comprenant une production par étapes de la séquence d'acide nucléique désirée, à raison d'un nucléotide à la fois. Des techniques pour y parvenir en utilisant des moyens atomatisés sont aisément disponibles dans ce domaine.
Des polynucléotides plus longs sont généralement produits en utilisant des moyens recombinants, par exemple en utilisant une technique de clonage par PCR (réaction en chaîne avec une polymérase). Une telle technique comprend la préparation d'une paire d'amorces (par exemple d'environ 15 à 30 nucléotides) pour une région du gène d'inhibiteur d'endo-ss-1,4-xylanse que l'on désire cloner, la mise des amorces en contact avec i'ARNm ou l'ADNc obtenu à partir d'une cellule fongique, végétale ou procaryotique, la conduite d'une réaction en chaîne avec une polymérase dans des conditions qui provoquent l'amplification de la région désirée, l'isolement du fragment amplifié (par exemple en purifiant le mélange réactionnel sur un gel d'agarose) et la séparation de l'ADN amplifié. Les amorces peuvent être conçues de manière à contenir des sites de reconnaissance d'enzymes de restriction convenables de telle sorte que l'ADN amplifié puisse être cloné dans un vecteur de clonage convenable.
Séquences régulatrices De préférence, le polynucléotide de la présente invention est lié de manière fonctionnelle à une séquence régulatrice qui est capable de provoquer l'expression de la séquence codante, par exemple par la cellule hôte choisie. A titre d'exemple, la présente invention comprend un vecteur renfermant le polynucléotide de la présente invention lié de manière fonctionnelle à une telle séquence régulatrice, ce qui signifie que le vecteur est un vecteur d'expression.
L'expression "lié de manière fonctionnelle" désigne une juxtaposition dans laquelle les constituants décrits sont en relation leur permettant de jouer le rôle envisagé. Une séquence régulatrice "lié de manière fonctionnelle" à une séquence codante est liée par ligation de telle sorte que l'expression de la séquence codante soit réalisée dans des conditions compatibles avec les séquences de régulation.
L'expression "séquences régulatrices" désigne des promoteurs et activateurs et d'autres signaux de régulation d'expression.
Le terme "promoteur" est utilisé suivant sa définition usuelle dans ce domaine et désigne par exemple un site de liaison d'ARN-polymérase.
Une expression accrue du polynucléotide codant pour le polypeptide de la présente invention peut également être réalisée par la sélection de régions régulatrices hétérologues, par exemple de régions de promoteur, de leader de sécrétion et de terminateur, servant à accroître l'expression et, si cela est désiré, les taux de sécrétion de la protéine intéressante par l'hôte choisi pour l'expression et/ou à provoquer la régulation inductible de l'expression du polypeptide de la présente invention.
De préférence, la séquence de nucléotides de la présente invention peut être liée de manière fonctionnelle à au moins un promoteur.