INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
(1994), 13779-13784]. Les carcinomes pulmonaires à petites cellules sont un exemple parmi de nombreuses tumeurs humaines surexprimant IGF-1 ou IGF-II à une fréquence très élevée (>80 %) [Quinn et coll., J. Biol. Chem. 271 (1996), 11477-11483]. La signalisation par le système IGF semble être également requise pour l'activité transformante de certains oncogènes. Des fibroblastes foetaux présentant une rupture du gène d'IGF-lR ne peuvent pas être transformés par l'antigène T de SV40, Ha-ras activé, une association des deux [SE11 et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 11217-11221 ; et coll., Mol. Cell. Biol. 14 (1994), 3604-3612], et de même la protéine E5 du papillomavirus bovin n'est plus transformante [Morrione et coll., J. Virol. 69 (1995), 5300-5303]. Une interférence avec le système IGF/IGF-1R s'est également révélée inverser le phénotype transformé et inhiber la croissance tumorale [Trojan et coll., Science 259 (1993), 94-97 ; et coll., Cancer Res. 54 (1994), 5531-5534; Prager et coll., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 2181-2185; Resnicoff et coll., Cancer Res. 54 (1994), 2218-2222; Resnicoff et coll., Cancer Res. 54 (1994), 4848-4850; Resnicoff et coll., Cancer Res. 55 (1995), 2463-2469]. Par exemple, chez des souris auxquelles ont été injectées des cellules d'adénocarcinome de la prostate de rat (PA-III) transfectées avec de l'ADNc antisens (729 pb) d'IGF-lR, il apparaît des tumeurs 90 % plus petites que celles des témoins, ou ces souris restaient exemptes de tumeurs après 60 jours d'observation [Burfeind et coll., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 93 (1996), 7263-7268]. La protection due à IGF-1R contre l'apoptose est indépendante de l'expression de gène et de la synthèse de protéine de novo. L'IGF exerce donc probablement sa fonction anti-apoptose par l'intermédiaire de l'activation de médiateurs cytosoliques préformés.
On a décrit certains substrats de signalisation qui se lient à l'IGF-lR (par exemple IRS-I, SHC, la p85 PI3 kinase, etc., pour les détails voir plus loin). Toutefois, aucun de ces transducteurs n'est spécifique de l'IGF-lR et ne pourrait donc être exclusivement responsable des caractéristiques biologiques particulières de l'IGF-lR par comparaison à d'autres tyrosine kinases de récepteurs, y compris le récepteur de l'insuline. Cela indique qu'il pourrait exister des cibles particulières de l'IGF-lR (ou au moins de la sous-famille des récepteurs d'IGF) qui provoquent la survie et s'opposent à l'apoptose, et sont par conséquent des cibles pharmaceutiques de choix pour la thérapie anticancéreuse.
De plus, le gène de cette invention inclut un gène qui code le polypeptide précurseur de PSK décrit ci-dessus et qui consiste en une séquence de bases qui s'hybride dans des conditions strictes ou stringentes avec la séquence de bases appelée séquence n . 2 dans la liste de séquences annexée.
La prolifération d'une cellule végétale peut être stimulée par incorporation d'un gène qui code la préprophytosulfokine bien qu'une cellule végétale où un certain gène exogène est incorporé ait tendance à voir sa vitesse de prolifération diminuer. Par conséquent, la différenciation cellulaire et la régénération d'une plantule peuvent être accomplies par incorporation du gène qui code la préprophytosulfokine. De plus, une amélioration de la croissance d'une plante peut être obtenue par incorporation du gène. Le gène selon cette invention peut être incorporé dans plusieurs plantes. Les plantes décrites dessous sont des plantes préférables pour l'incorporation du gène. Ce sont des plantes monocotylédones comme le riz, le maïs, l'asperge et le blé ou des plantes dicotylédones comme l'arabidopsis, le tabac, la carotte, le soja, la tomate et la
pomme de terre. Les techniques communes connues peuvent être adoptées pour produire un transformant. A titre d'exemple de vecteur disponible, on peut citer pAct-nos/Hmz. Un tel vecteur peut être introduit dans Agrobacterium, par exemple, et un transformant peut être produit par infection d'un cal ou d'une jeune plante.
D'autres objets et avantages de l'invention deviendront plus apparents à la lecture de la description détaillée qui suit et se réfère aux dessins annexés dans lesquels : La figure 1 montre la séquence de bases du gène OsPSK et la séquence d'acides aminés correspondante.
La figure 2 montre la détection d'analogues de PSK qui existent dans un milieu conditionné de cellules Oc de riz transformées, par chromatographie liquide-spectrométrie de masse (CL-SM).
La figure 3 montre des cellules Oc du riz non transformées après deux semaines de culture.
La figure 4 montre des cellules Oc de riz où le gène OsPSK est incorporé dans l'orientation sens, après deux semaines de culture.
La figure 5 montre des cellules Oc de riz où le gène OsPSK est incorporé dans l'orientation antisens, après deux semaines de culture.
La figure 6 représente un transfert de Western montrant la détection du gène OsPSK dans des cellules Oc du riz où le gène est incorporé dans l'orientation sens et dans l'orientation antisens.
La figure 7 représente un transfert de Western montrant l'expression du gène OsPSK dans des cellules Oc du riz au bout de 3,7, 10 et 14 jours.
La figure 8 représente un transfert de Western montrant l'expression du gène OsPSK dans des cellules Oc du riz où le gène est incorporé dans l'orientation sens et dans l'orientation antisens.
La figure 9 représente un transfert de Western montrant l'expression du gène OsPSK dans des plants de riz, examinée sur plusieurs parties d'un corps végétal.
La figure 10 représente un transfert de Western montrant le nombre de copies du gène OsPSK, examiné après traitement avec diverses enzymes de restriction.
La figure 11 représente un transfert de Western montrant la conservation du gène OsPSK examinée sur Arabidopsis thaliana, Asparagus officinalis, Daucus carota et Zinnia elegans.
Un criblage a été exécuté comme décrit au-dessous, sur une banque d'ADNc construite à partir de cellules Oc du riz avec des sondes constituées par un mélange d'oligonucléotides, pour tenir compte de la dégénérescence du code génétique, qui correspondent à la séquence d'acides aminés de PSK. L'ARN poly (A) + a été purifié avec une colonne d'oligo (dT) à partir de cellules Oc cultivées pendant 10 jours. Une banque d'ADNc a été construite avec le kit de synthèse d'ADNc ZAP (Stratagene, La Jolla, CA). Quatre-vingt-seize types d'oligonucléotides 15-mères qui correspondent à la séquence d'acides aminés de PSK-a ont été synthétisés, marqués avec [y - 32P]ATP avec un kit de kination (Toyobo, Osaka), et utilisés pour cribler la banque d'ADNc par hybridation sur plages à 25 C dans une solution qui contient 6X de citrate de sodium salin (SSC), 20 mM de NaH2P04, 0,4% de SDS, 5X de solution de Denhardt et 500 mg/1 d'ADN de sperme de saumon. Les filtres ont été lavés plusieurs fois avec 6X SSC et 0,1% SDS à 25 C pendant une heure. A titre de résultat, trois clones d' ADNc s'hybridaient avec les sondes.
Les plasmides pBluescript qui contiennent les inserts positifs ont été excisés et introduits dans la souche SOLR de Escherichia coli. Les inserts sousclonés ont été séquences avec le kit de séquençage Big Dye Terminator Cycle et l'analyseur génétique PRISME ABI 310 (Applied Biosystems, Foster, CA) conformément aux protocoles du fabricant. Le résultat a montré qu'un clone d'ADNc code le précurseur de phytosulfokine. L'ADNc ainsi obtenu est appelé OsPSK.
A titre d'illustration de ligands L représentés par la formule (IV), on citera : - la tris[2-(diméthylamino)éthyl]amine : - la N, N, N', N', N" - pentaméthyldiéthylènetriamine (PMDETA) : - la N,N,N',N'-tétraméthyléthylènediamine : - la 1,1, 4,7, 10, 10-hexaméthyltriéthylènetétramine (HMTETA) : les polyamines cycliques telles que : - le 1 ,4,7-triméthyl-1,4,7-triazacyclononane, - le 1,5,9-triméthyl-1,5,9-triazacyclododécane, - le 1,4,8,1 1-tétraméthyl-1,4,8,1 1-tétraazacyclotétradécane.
On utilisera de préférence la PMDETA.
Le procédé selon l'invention consiste à mélanger sous agitation un sel métallique MA, le ligand L, le composé ZX et le nitroxyde (II) dans un solvant organique qui est, de préférence, un hydrocarbure aromatique tel que le benzène, le toluène, les xylènes ou un chlorure d'alkyle tel que CH2CI2 ou bien un éther.
Le degré d'oxydation de l'espèce active du métal M est égal à 1 (MI).
Selon la présente invention, cette espèce active peut être ajoutée telle quelle au milieu réactionnel de préférence sous forme d'un halogénure métallique M'A.
L'halogénure métallique préféré est CuBr.
L'espèce active peut être également générée in situ selon la réaction REDOX : @MIIA + M # 2MIA à partir d'un sel métallique MIIA dans lequel le métal M est au degré d'oxydation 2 (M")et du même métal au degré d'oxydation zéro (M ).
Selon cette variante, l'halogénure métallique MIIA préféré est CuBr2.
Selon une autre variante, on peut également introduire dans le milieu réactionnel un sel métallique MA dans lequel le métal M est au degré d'oxydation 1 (M'A) et le même métal M au degré d'oxydation zéro (M ).
Le ligand L est utilisé selon un rapport molaire L/M' allant de 1 à 5 et, de préférence, allant de 1 à 2.
Le rapport molaire ZX/nitroxyde (II) va de 1 à 1,4 et, de préférence est voisin de 1.
Le mélange réactionnel est agité ensuite à une température comprise entre 20 C et 90 C, et, de préférence, voisine de la température ambiante.
On opère sous atmosphère de gaz inerte tel que l'azote ou l'argon et de préférence à pression atmosphérique.
Les durées de réaction sont très courtes. La fin de réaction peut être contrôlée par disparition des réactifs par des méthodes chromatographiques (CPG, HPLC, CCM). La réaction terminée, le précipité éventuellement obtenu est filtré, rincé avec de préférence le même solvant utilisé pendant la réaction puis la phase organique est lavée avec de l'eau jusqu'à ce que les phases aqueuses extraites deviennent incolores.
Le solvant organique est éliminé sous pression réduite de préférence à température ambiante et on récupère l'alcoxyamine.
Les alcoxyamines peuvent être caractérisées par analyse élémentaire, HPLC, IR et RMN.
Le recherche de l'expression sélective d'un gène d'intérêt dans un tissu particulier nécessite l'identification, puis l'utilisation d'éléments régulateurs de l'expression de ce gène dans le tissu cible. C'est un but essentiel dans la mise au point de procédés de thérapie génique somatique que d'identifier de nouveaux éléments régulateurs capables de diriger l'expression d'un gène déterminé d'intérêt thérapeutique dans un tissu ou organe spécifique, éventuellement choisi en fonction de la nature de la pathologie à prévenir ou à traiter.
Le tissu musculaire, plus particulièrement le tissu musculaire strié, constitue une cible de choix en vue de l'expression d'un gène hétérologue. La masse musculaire représente en effet environ 70 % du poids total du corps, chez l'homme. En particulier, le muscle est constitué d'une masse tissulaire stable dans laquelle les cellules participant à la contraction se renouvellent très lentement, et donc dans laquelle des cellules génétiquement modifiées exprimant un acide nucléique d'intérêt thérapeutique ou vaccinal sont susceptibles de rester vivantes et physiologiquement actives pendant une longue durée, et dans tous les cas pendant une durée d'au moins plusieurs mois. Du fait de son fort niveau de vascularisation, le muscle squelettique représente un tissu idéal pour la diffusion systémique de molécules d'intérêt thérapeutique ou vaccinal.
Lorsque l'expression d'un gène d'intérêt dans le muscle est recherchée, un premier problème à résoudre consiste en l'identification de polynucléotides possédant une activité promotrice préférentiellement dans les cellules musculaires. Un tel polynucléotide à activité promotrice spécifique des cellules musculaires est représenté, par exemple, par le promoteur du gène de la desmine, ou encore un promoteur de l'un des gènes de l'actine, de la troponine ou de la tropomyosine.
Un second problème technique consiste en l'identification de polynucléotides susceptibles de réguler positivement l'activité promotrice spécifique de tissu d'un polynucléotide placé à proximité du gène hétérologue dont on recherche l'expression En d'autres termes, il est souhaitable d'obtenir un haut niveau d'expression de l'acide nucléique hétérologue d'intérêt, par la mise en évidence et l'isolement de séquences dites activatrices , capables d'augmenter le niveau d'expression du gène d'intérêt dans le muscle.
Un exemple de tels éléments régulateurs peut être ceux du gène de la desmine, il a été identifié dans l'état de la technique une séquence de 280 paires de bases localisée, dans le génome, en amont de ce gène et qui a un effet amplificateur de l'expression de la desmine in vivo. L'identification d'une telle séquence activatrice a permis la réalisation de constructions d'ADN comprenant cette séquence activatrice en association avec un gène hétérologue, par exemple des cytokines ou encore des protéines antigéniques (demande PCT N WO 96/26284 - Paulin et al.). De telles constructions d'ADN ont permis la mise au point de différents vecteurs utilisables dans des procédés de thérapie génique somatique à visée préventive ou curative.
Plus récemment, ont été isolés des éléments régulateurs de l'expression d'un gène codant pour deux protéines musculaires, les chaînes légères de la myosine dans la fibre rapide, ces protéines étant codées par le locus MLCIF/3F chez la souris et chez l'homme.
Les analyses de l'expression des gènes appartenant à la famille des chaînes légères alcalines de la myosine (MLC) ont permis d'observer des profils d'expression variés des gènes spécifiques du muscle in vivo (Barton et al , 1989). Chez les oiseaux et les mammifères, le gène MLC1F/3F code deux isoformes de la MLC retrouvées dans les fibres musculaires en développement et les fibres rapides chez l'adulte. Les isoformes MLC IF et MLC3F diffèrent à leur extrémité N-terminale du fait de l'existence de deux exons distincts et d'un événement d'épissage alternatif (Nabeshima et al., 1984 ; Periasamy et al., 1984 ; Robert et al., 1984). Les régions régulatrices de l'expression du promoteur MLC IF ont été étudiées par Donoghue et al (1988), Rosenthal et al. (1989) et Rao et al. (1996) Les transcrits du gène MLC3F sont également retrouvés dans le muscle cardiaque (Kelly et al., 1995).
Le premier des éléments régulateurs du gène MLC 1 F/3F à avoir été identifié est localisé dans le génome en aval du gène MLC1F/3F. Il s'agit d'une séquence, dite séquence activatrice 3' , qui a été décrite pour conférer un haut niveau d'expression du promoteur MLC IF in vitro dans les cellules musculaires en culture et dans les souris
transgéniques, où il est actif dans les embryons dès 9,5 jours (E9,5) dans le myotomc, et dans les muscles des pattes en formation dès les embryons de 11,5 jours (CI 1,5), semblable à l'accumulation des transcrits endogènes de MLCIF (Donoghuc et al , 1988 , Rosenthal et al., 1989 ; Grieshammcr et al., 1992) La séquence activatrice 3' active de manière précoce la transcription du gène MLC3F dans le muscle squelettique, au moment de l'activation du promoteur du gène MLCIF, et ne confère donc pas une spécificité d'expresssion attendue in vivo du gène MLC3F au cours du développement embryonnaire, cette spécificité d'expression n'étant pas conférée non plus par le promoteur MLC3F lui-même (Kelly et al., 1995).
Une seconde séquence activatrice du gène MLC1F/3F, d'une longueur de 800 paires de bases, a été localisée dans le premier intron de ce gène. Cette séquence sera désignée dans la description comme la séquence activatrice intronique (Kelly et al., 1997).
Dans les souris transgéniques, la séquence activatrice 3' et la séquence activatrice intronique sont actives seules dans le muscle squelettique adulte. En revanche, la séquence activatrice intronique n'est pas fonctionnelle dans les cellules musculaires embryonnaires (E9-E 13,5), et active l'expression d'un transgène durant la myogénèse foetale (E13,5-naissance), ce qui coïncide avec un haut niveau d'accumulation des transcrits MLC3F endogènes.
De manière générale, les interactions entre différents modules activateurs de la transcription ont été étudiées, dans l'état de la technique, sur la base d'études de transgénèse, pour quelques gènes d'oursin et de drosophile. Ces études ont révélé la remarquable complexité des systèmes de régulation agissant en cis (Arnone et al , 1997).
Par ailleurs, d'autres gènes spécifiques du muscle contiennent plus d'une séquence activatrice, chacune des séquences activatrices pouvant réguler des sousensembles distincts de spécificités transcriptionnelles (Johnson et al., 1989 ; Gremke et al., 1993 ; Biben et al., 1994 ; Zhu et al., 1995).
Un effet de coopération in vivo entre une séquence activatrice et une seconde région polynucléotidique a été observé dans le muscle strié, chez des souris transgéniques ayant reçu une construction d'ADN (MCK-CAT) contenant les régions régulatrices du gène de la créatine kinase du muscle (MCK) placées en amont du gène de la chloramphénicol acétyltransférase (CAT). Les résultats d'expression du gène CAT ont permis d'observer qu'une séquence activatrice localisée à l'extrémité 5' du gène MCK interagit avec une région polynucléotidique située immédiatement en amont du promoteur, afin de diriger l'activité transcriptionnelle à la fois dans le muscle squelettique
et dans le muscle cardiaque, et ceci à un niveau plus important que le niveau d'activité observé chez des souris transgéniques hébergeant une construction d'ADN ne contenant que l'une de ces deux séquences (Donovicl et al., 1996). La région polynucléotidique située immédiatement en amont du promoteur a une longueur d'environ )I kilobasc, au sein de laquelle il a été isolé une séquence proximale, d'une longueur de 358 paires de bases, dans laquelle les caractéristiques d'une séquence activatrice n'ont pas été retrouvées, située en amont du site d'initiation de la transcription du gène MCK. Cette séquence de 358 pb est, du moins en partie, responsable de l'effet de coopération observé (Shield et al., 1996). Ces auteurs ont envisagé l'utilisation de telles séquences régulatrices dans des constructions de vecteurs destinés à la thérapie génique. En revanche, l'effet de coopération entre ces séquences régulatrices n'a pas été observé in vitro dans les cellules du muscle squelettique (Donoviel et al., 1996).
Un effet de synergie entre deux séquences activatrices a été observé, mais uniquement in vitro, dans des lignées de cellules B, au niveau du locus codant pour la chaîne légère d'immunoglobuline de type kappa (Blasquez et al., 1992 ; Fulton et al., 1993) : un haut niveau de transcription à partir du promoteur de la région variable de la chaîne de type kappa est dépendant d'un effet de synergie entre deux séquences activatrices qui sont activées de manière différentielle dans les lignées cellulaires, représentant des différents stades de maturation des cellules B (Fulton et al., 1993).
Préférentiellement, une cassette de régulation telle que définie précédemment contiendra également un polynucléotide comprenant tout ou une partie du promoteur du
gène MLC3F, ledit promoteur étant décrit notamment par Nabeshima et al (1984 ; poulet), par Periasamy et al. ( 1984 ; rat), par Robert et al. ( 1984 ; souris) et par Scidel et al. (1989 ; homme), ledit polynucléotide constituant une cible pour la fonction d'activatcur de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 et/ou de la séquence SEQ ID N 2.
Ainsi, un plasmide contenant la séquence activatrice intronique SEQ ID N 2 de 800 paires de bases, le promoteur du gène MLC3F, le gène nlacZ et la séquence activatrice 3', est capable d'induire un niveau d'expression de la beta-galactosidase plus important, par rapport au niveau d'expression d'un plasmide de construction similaire mais qui ne comporte que l'une des deux séquences activatrices. Un tel plasmide est par exemple le plasmide 3F-nlacZ-9E, le plasmide 3F-Il/acZ-E9 ou encore le plasmide 3FIlln'CZ-2IE, ces plasmides étant décrits dans les exemples ci-après.
Les inventeurs ont montré que la localisation de la séquence activatrice 3' dans les constructions plasmidiques selon l'invention, par rapport à la fois au promoteur et à l'acide nucléique hétérologue d'intérêt était indifférente. A titre d'exemple, la séquence activatrice 3' est localisée du côté 3', par rapport au gène rapporteur nlacZ, dans les plasmides 3F-nlacZ-9E, et 3F-nlacZ-2IE alors que cette même séquence est placée du côté 5', par rapport à la séquence activatrice intronique, dans le plasmide 3F-tilac7.-E9. Les résultats présentés sur la Figure 1C montrent que les niveaux d'expression de la beta-galactosidase sont pratiquement identiques dans les cellules myogéniques contenant l'un quelconque de ces trois plasmides.
Par ailleurs, la distance nucléotidique entre la séquence activatrice intronique et le site d'initiation de la transcription, dans la cassette de régulation selon l'invention, peut être de longueur très variée. Cette distance est d'environ 2 kilobases pour le plasmide 3F-nlacZ-2IE, alors qu'elle est d'environ 4,2 kilobases pour les plasmides 3F-nlacZ-9E et 3F-tilac7-E9.
La région promotrice utilisée dans les expériences ci-dessus est représentée par le polynucléotide de séquence SEQ ID N 3 telle que décrite dans la liste des séquences ciaprès.
L'utilisation d'autres séquences plus courtes provenant de la région promotrice - 2kb en combinaison avec ces activateurs a également démontré une activité maximale en présence des deux éléments activateurs. Une telle région à l'intérieur de la séquence promotrice est représentée par le polynucléotide de séquence SEQ ID N 4 telle que décrite dans la liste des séquences ci-après.
Ainsi, l'invention a aussi pour objet une cassette selon l'invention, caractérisée en ce que le polynucléotide comprenant une partie du promoteur MLC3F est choisi dans le groupe d'acides nucléiques constitué de : a) un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N 3 ou un polynucléotide dérivé présentant, par rapport au polynucléotide de séquence SEQ ID N 3, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides, ledit acide nucléique constituant une cible pour la fonction d'activateur de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 et/ou de la séquence SEQ ID N 2, ou de b) un acide nucléique comprenant le polynucléotide de séquence SEQ ID N 4 ou un polynucléotide dérivé présentant, par rapport au polynucléotide de séquence SEQ ID N 4, une ou plusieurs substitutions, délétions ou additions de nucléotides, ledit acide nucléique constituant une cible pour la fonction d'activateur de la transcription de la séquence SEQ ID N 1 et/ou de la séquence SEQ ID N 2.
Plus généralement, le choix d'un promoteur adéquat par l'homme du métier pourra aussi être guidé par l'ouvrage de Sambrook de 1989. A titre d'exemple, un promoteur musculaire utilisable dans une cassette de régulation selon l'invention est le promoteur de la desmine, tel que décrit par Bolmont et al. (1990) ou par Li et al. (1989).
L'invention concerne également une cassette de régulation selon l'invention, caractérisée en ce qu'elle contient un acide nucléique hétérologue d'intérêt choisie dans le groupe constitué de : a) un acide nucléique hétérologue codant pour un polypeptide hétérologue ; b) un acide nucléique hétérologue codant un un ARN sens ou antisens.
Dans un mode de réalisation particulier d'une cassette de régulation selon l'invention, le polynucléotide à fonction de promoteur décrit ci-dessus, est placé en amont de l'acide nucléique hétérologue.
Selon un autre aspect de la cassette de régulation selon l'invention, le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou le polynucléotide dérivé du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 est placé en amont du polynucléotide comprenant tout ou partie du promoteur MLC3F.
Selon encore un autre aspect de la cassette de régulation selon l'invention, le polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 ou le polynucléotide dérivé du polynucléotide
de séquence SEQ ID N 1 est placé en amont du polynucléotide à fonction de promoteur et de la partie du promoteur MLC3F.