INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La fonctionnalité du script liée au bouton BP ou BM ayant été appelée, le script récupère à l'étape E3 les données du document hypertexte D1, c'est-à-dire au moins les données relatives à la zone d'image ZI1, nécessaires pour créer ultérieurement un deuxième document hypertexte D2 dont la présentation graphique Z12 est réduite ou agrandie par rapport à l'image ZI1. Ces données sont combinées à des variables locales des fonctions appelées pour déterminer à l'étape E4 la nouvelle taille de la présentation graphique Z12, en l'occurrence celle de la carte de France, qui est une taille agrandie ou réduite selon que le bouton BP ou BM a été sollicité. En l'espèce, les données sont la taille, hauteur et largeur de la "première" image ZI1 définie dans le premier document Dl transmis par le serveur et chargé dans le client, ainsi que les caractéristiques graphiques selon le format d'encodage de l'image, par exemple le format GIF (Graphics Interchange Format). Ces données sont incluses notamment dans les valeurs des attributs SRC, HEIGHT et WIDTH de la balise correspondant au document hypertexte D1 de la première image ZI1.
Par exemple, le premier document D1 correspond à la plus petite image à afficher inscrite dans une fenêtre d'écran de largeur W et hauteur H, si bien que des agrandissements d'image, ou zoom avant, peuvent être déduits en copiant chaque pixel de la plus petite image en fonction du pourcentage sélectionné par le bouton BP, puis dans des cycles suivants indifféremment par le bouton BP ou BM. Toutes les images issues de sollicitation des boutons BP et BM contiennent ainsi les pixels de l'image initiale ZII et peuvent être déduites chacune de la précédente. Au bas de la figure 1, une partie d'une deuxième image Z12 de taille (2W.2H) déduite de l'image ZI1 par un agrandissement de rapport 2 est inscrite dans la fenêtre W.H.
A la fin de l'étape E4, le client contient en mémoire les caractéristiques graphiques de la deuxième image Z12 dont la taille peut être plus grande ou plus petite que la taille fixe W.H de la fenêtre d'affichage. Une deuxième balise d'inclusion d'image est construite sur la base de la deuxième image déterminée Z12, et le deuxième document hypertexte D2 est créé avec pour présentation graphique la deuxième image Z12 qui diffère en taille avec la présentation graphique ZI1 du premier document hypertexte D1.
Le deuxième document hypertexte D2 étant établi, le premier document hypertexte D1 est alors effacé dans le client CL, par une commande d'écrasement "CLEAR" du script, à l'étape E5.
acidifiée (0,05% acide trifluoroacétique). Les fractions obtenues sont lyophilisées et reconstituées avec de l'eau ultrafiltrée avant d'être soumises à une chromatographie HPLC en phase inverse.
Toutes les étapes de purification HPLC ont été effectuées sur un système HPLC BECKMAN GOLD HPLC équipé d'un détecteur BECKMAN 168. L'élution est suivie par mesure de l'absorption UV à 225 nm.
Etape 1: les fractions éluées sur SEP-PAK à 40% d'acétonitrile sont déposées sur une colonne HPLC phase inverse SEPHASIL C18 (250 mm X 4,1 mm) (PHARMACIA).
L'élution est effectuée par un gradient linéaire de 5 à 50% d'acétonitrile dans l'eau acidifiée, pendant 90 min à un débit de 0,9 ml/min. Les fractions correspondant aux pics d'absorbance sont collectées dans des tubes de polypropylène (MICROSORB 75 X 12 mm, NUNC IMMUNOTUBES), séchées sous vide, et reconstituées avec de l'eau ultrafiltrée, préalablement au test de leur activité antimicrobienne.
Etape 2: Les fractions actives récupérées à l'issue de l'étape 1 sont déposées sur une colonne HPLC phase inverse SEPHASIL C8 (250 mm X 4,1 mm) (PHARMACIA).
L'élution est effectuée, à un débit de 0,9 ml/min, par un gradient linéaire de 20 à 30% d'acétonitrile dans l'eau acidifiée pendant 40 min.
Etape 3 : fractions actives récupérées à l'issue de l'étape 2, sont déposées sur une colonne SEPHASIL C18, (250 mm X 4,1mm) (PHARMACIA) en utilisant le gradient biphasique décrit dans l'étape 2, à un débit de 0,9 ml/min.
Etape 4 : dernière étape de purification est effectuée sur une colonne phase inverse DELTA PAK HPI C18 (2 X 150 mm) (WATERS ASSOCIATES) en utilisant le gradient biphasique décrit dans l'étape 2, à un débit de 0,3 ml/min.
EXEMPLE 2 : ACTIVITÉ ANTIMICROBIENNE DES PEPTIDES OBTENUS Micro-organismes utilisés: La liste des micro-organismes utilisés pour déterminer les activités anti-microbiennes de la Myticine a et de la Myticine b est indiquée ci-après, dans le Tableau 1 Essais antibactériens et détermination de la CMB: La concentration minimale bactéricide (CMB) des peptides a été déterminée selon le protocole décrit par HANCOCK et al. [http://www.interchg.ubc.ca/bobh/ methods.htm].
On effectue une série de dilutions successives au 1/2 des peptides dans une solution aqueuse contenant 0,01% d'acide acétique et 0,2% de sérum albumine bovine (BSA).
Des aliquotes de 10 l de chaque dilution sont incubées dans des plaques stériles de microtitation en polypropylène à 96 puits, en présence de 100 l de suspension bactérienne à une densité optique de départ A600 = 0,001 dans du milieu liquide MUELLER HINTON BROTH.
L'incubation est effectuée pendant 18 h à 37 C sous agitation, sauf dans le cas des bactéries marines, pour lesquelles l'incubation est effectuée à 25 C. La CMB est déterminée en étalant sur milieu solide MUELLER HINTON AGAR le contenu des puits correspondant aux 3 premières dilutions pour lesquelles on n'observe aucune croissance bactérienne, et en incubant à 37 C pendant 18 heures. La plus faible concentration de peptide qui prévient toute formation résiduelle de colonies correspond à la CMB.
Activité antifongique : L'activité antifongique a été déterminée par calcul de la CMI (concentration minimale inhibitrice) dans un test d'inhibition de croissance de Fusarium oxysporum en phase liquide, selon le protocole décrit par FELHBAUM et al [J. Biol. Chem., 269 :33159-63, (1994) ].
On effectue une série de dilutions successives au 1/2 des peptides, comme indiqué ci-dessus pour la détermination de l'activité antibactérienne.
801 de spores suspendues (concentration finale, 104 spores/ml) dans du milieu Potato Dextrose Broth (DIFCO) sont ajoutés à 10 l de solution de peptide dans des plaques stériles de microtitation en polypropylène à 96 puits. Le volume final est ajusté à 1001 par addition d'eau. L'inhibition de croissance est déterminée après une incubation de 24 heures à 25 C à l'obscurité, par observation au microscope et mesure de l'augmentation de la D0600. La valeur de la CMI correspond à un intervalle (a-b) de concentrations en peptide, où (a) représente la concentration la plus élevée à laquelle on observe une croissance, et (b) représente la concentration la plus faible qui induit 100% d'inhibition de croissance.
Activité anti-protozoaire Le protozoaire parasite des huîtres, Perkinsus marinus est cultivé en milieu DMEM (GIBCO), selon le protocole décrit par GAUTHIER et VASTA [J. Invertebr.
Les émetteurs et les récepteurs de lumière sont montés sur les circuits électroniques intégrés que l'on veut interconnecter et sont électriquement reliés à ces circuits.
On précise que les émetteurs sont généralement des lasers à émission par la surface à cavité verticale ( vertical cavity surface emission laser ) ou VCSEL qui n'occupent qu'une faible surface sur les substrats sur lesquels ils sont montés et ont un faible courant de seuil.
La figure 1 illustre schématiquement une interconnexion connue entre deux circuits électroniques intégrés 2 et 4. Un composant optoélectronique 6 est électriquement relié au circuit intégré 2 par l'intermédiaire de microbilles de soudure 8. Un autre composant optoélectronique 10 est électriquement relié au circuit intégré 4 par l'intermédiaire de microbilles de soudure 12. Un circuit optique 14 formé sur un substrat 15 et comprenant un guide d'onde optique 16 est prévu pour relier optiquement les composants opto électroniques 6 et 10 l'un à l'autre.
Le composant 6 est par exemple un émetteur de lumière tandis que le composant 10 est un récepteur de lumière. Des signaux électriques émis par le circuit 2 sont alors convertis en signaux lumineux par le composant 6. Ces signaux lumineux se propagent dans le guide d'onde optique 16 et sont détectés par le composant 10 qui reconvertit ces signaux lumineux en signaux électriques. Le circuit intégré 4 reçoit ces derniers. On dispose donc bien d'une interconnexion entre les circuits 2 et 4.
Cependant, les interconnexions optiques entre circuits électroniques intégrés du genre de l'interconnexion de la figure 1 présentent un inconvénient: ces interconnexions nécessitent une grande précision pour aligner , c'est-à-dire coupler optiquement, les canaux de liaisons optiques avec les émetteurs et les récepteurs de lumière. Par exemple, dans le cas de la figure 1, une précision importante est nécessaire pour le couplage optique entre le guide d'onde optique 14 et le composant 6 voire le composant 10. EXPOSÉ DE L'INVENTION La présente invention a pour but de remédier à l'inconvénient précédent en proposant une interconnexion de circuits électroniques intégrés qui est plus facile à réaliser que les interconnexions connues, mentionnées plus haut, car elle nécessite des alignements de moins grande précision.
Plus généralement, la présente invention concerne une connexion optique pour un circuit électronique intégré dont la réalisation utilise un couplage de type électrique, couplage qui nécessite une précision inférieure à celle d'un couplage optique.
De façon précise, la présente invention a pour objet une connexion optique pour un circuit électronique intégré, cette connexion optique étant caractérisée en ce qu'elle comprend un circuit optique formé sur un substrat et comprenant un guide d'onde optique et un composant optoélectronique qui est optiquement couplé au guide d'onde optique et a au moins l'une des deux fonctions de convertisseur électronique-optique et de convertisseur opto électronique et en ce que le circuit optique est relié au circuit électronique intégré par l'intermédiaire d'une liaison purement électrique entre le composant optoélectronique et le circuit électronique intégré de manière à convertir des signaux électriques émis par le circuit électronique intégré en signaux optiques qui se propagent alors dans le guide d'onde optique et/ou convertir de tels signaux optiques en signaux électriques qui sont alors reçus par le circuit électronique intégré.
La présente invention a également pour objet une connexion optique entre des premier et deuxième circuits électroniques intégrés, cette connexion optique étant caractérisée en ce qu'elle comprend un circuit optique formé sur un substrat et comprenant un guide d'onde optique et des premier et deuxième composants optoélectroniques qui sont optiquement couplés au guide d'onde optique, le premier composant optoélectronique ayant au moins l'une des deux fonctions de convertisseur électronique-optique et de convertisseur optoélectronique et le deuxième composant optoélectronique ayant au moins l'une des deux fonctions de convertisseur optoélectronique et de convertisseur électronique-optique et en ce que le circuit optique est relié aux premier et deuxième circuits électroniques intégrés par l'intermédiaire de liaisons purement électriques entre respectivement les premier et deuxième composants optoélectroniques et les premier et deuxième circuits électroniques intégrés de manière que des signaux électriques émis par le premier et/ou le deuxième circuit électronique intégré soient convertis en signaux optiques qui se propagent alors dans le guide d'onde optique et sont ensuite reconvertis en signaux électriques, ces derniers étant alors reçus par le deuxième et/ou le premier circuit électronique intégré. Les premier et deuxième circuits électroniques intégrés peuvent être respectivement formés sur des substrats différents ou, au contraire, sur le même substrat.
De préférence, le circuit optique et chaque circuit électronique intégré sont faits à partir de matériaux ayant sensiblement le même coefficient de dilatation thermique. Chaque liaison purement électrique peut être faite au moyen de microbilles d'un matériau fusible. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, chaque convertisseur électronique-optique est un laser comprenant une cavité résonante délimitée par deux miroirs qui sont formés sur le guide d'onde optique et un milieu amplificateur placé dans un évidement formé à travers ce guide d'onde optique entre les deux miroirs.
Les deux miroirs peuvent être des réseaux de Bragg qui sont photo-inscrits ou gravés sur le guide d'onde optique.
En variante, chaque miroir peut être une fente qui traverse le guide d'onde optique.
De préférence, l'espace compris entre le milieu amplificateur et la paroi de l'évidement contient un adaptateur d'indice optique, par exemple un fluide ou un gel. BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description d'exemples de réalisation donnés ci-après, à titre purement indicatif et nullement limitatif, en faisant référence aux dessins annexés sur lesquels 1 La figure 1 est une vue en coupe transversale schématique d'une interconnexion optique connue de deux circuits électroniques intégrés et a déjà été décrite, 1 La figure 2 est une vue en coupe transversale schématique d'une interconnexion optique de deux circuits électroniques intégrés, qui est réalisée conformément à la présente invention, et # Les figures 3, 4 et 5 sont des vues en coupe transversale schématiques d'autres interconnexions optiques effectuées conformément à l'invention. EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Dans la présente invention, on utilise les techniques de l'Optique intégrée pour réaliser des interconnexions optiques de circuits électroniques intégrés.
Un circuit optique intégré assure un lien physique entre ces circuits électroniques intégrés.
Les techniques de l'Optique intégrée permettent de réaliser, dans un empilement de couches gravées (éventuellement partiellement gravées), des guides d'onde optique dont les dimensions valent généralement quelques micromètres. Deux guides d'onde optique voisins sont susceptibles d'être sujets à une diaphotie qui est faible à partir du moment où la distance entre ces guides d'onde optique est supérieure à l'étendue du champ évanescent qui vaut généralement 10 um. De plus, la lumière ayant naturellement tendance à se propager en ligne droite, on peut former des croisements entre des guides d'ondes optiques avec de faibles pertes de croisement et peu de diaphotie. Les guides d'ondes optiques sont donc adaptés à la réalisation de liens pour les interconnexions optiques.
Les techniques de l'Optique intégrée peuvent être mises en ceuvre avec des matériaux tels que InP, AsGa, Si02 et Si. De tels matériaux sont utilisables dans la présente invention pour former le circuit optique.
Dans l'invention, il est avantageux d'utiliser des matériaux ayant sensiblement les mêmes coefficients de dilatation thermique pour réaliser le circuit optique et les circuits électroniques intégrés. Par exemple, si ces derniers sont en silicium, il est préférable de former le circuit optique également à partir du silicium.
Les Inventeurs ont maintenant mis en évidence de nouveaux peptides anti-microbiens produits par Mytilus galloprovincialis, qui sont différents des défensines MGD1, et des Mytilines précédemment connues.
La présente invention a pour objet des peptides anti-microbiens, dénommés ci-après : myticines qui possèdent les caractéristiques suivantes : - leur masse moléculaire est d'environ 4,5 kDa ; - leur pI est d'environ 8,7 ; - ils comprennent 8 résidus cystéine.
Selon un mode de réalisation préféré d'un peptide anti-microbien conforme à l'invention, il comprend la séquence (I) suivante (code 1 lettre) : HX1HX2CTSYX3CX4KFCGTAX5CTX6YX7CRX8LHX9GKX10CX11CX12HCSR ( I ) dans laquelle : Xi= P ou S, X2= V ou A, X3= Y ou W, X4= S ou G, X5= S ou G, X6= R ou H, X7= G ou L, X8= N ou V, X9= R ou P, X10= L ou M, X11= F ou A, X12= L ou H.
Avantageusement, un peptide conforme à l'invention comprend l'une des séquences (Ia) ou (Ib) suivantes (code 1 lettre) : HSHACTSYWCGKFCGTASCTHYLCRVLHPGKMCACVHCSR (la) HPHVCTSYYCSKFCGTAGCTRYGCRNLHRGKLCFCLHCSR (Ib) Les séquences (Ia) et (Ib) représentent les formes matures, isolées à partir de l'hémolymphe de Mytilus galloprovincialis, de 2 Myticines dénommées Myticine a et Myticine b, dont les ADNc ont également été clonés par les Inventeurs. A titre d'illustration de l'objet de la présente invention, les caractéristiques des Myticines a et b sont plus spécifiquement indiquées ci-après.
La séquence d'ADNc et la séquence polypeptidique de la Myticine a sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 1 et SEQ ID NO: 2. La séquence d'ADNc et la séquence polypeptidique de la Myticine b, sont représentées dans la liste de séquences en annexe sous les numéros SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4.
Le peptide actif de 40 acides aminés, correspondant à la séquence (I), et plus particulièrement à l'une des séquences (Ia) et (Ib) est flanqué d'une séquence signal de 20 acides aminés, et d'un peptide Cterminal de 36 acides aminés. La séquence signal permettrait l'adressage du produit de traduction vers le réticulum endoplasmique. Le peptide C-terminal permettrait ensuite l'adressage vers les granules cytoplasmiques dans lesquels les Myticines sont stockées sous forme mature et/ou la protection de la cellule contre une éventuelle activité cytolytique du peptide mature.
La masse moléculaire de la forme mature de la Myticine a est de 4438 Da ; masse moléculaire de la forme mature de la Myticine b est de 4562 Da.
Les Myticines ne présentent aucune homologie significative avec les peptides anti-microbiens connus dans l'art antérieur, et définissent un nouveau groupe de peptides anti-microbiens.
Les Myticines peuvent être obtenues par extraction à partir des mollusques qui les produisent, ou bien par synthèse peptidique, ou, avantageusement, par génie génétique, en exprimant au moins une séquence d'acide nucléique codant une Myticine, dans une cellule hôte appropriée.
La présente Invention englobe également des acides nucléiques comprenant une séquence codant une Myticine, tel que définie ci-dessus.
Des acides nucléiques conformes à l'invention, peuvent être obtenus par criblage de banques d'acide nucléique à l'aide d'oligonucléotides dérivés des séquences SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou de leurs séquences complémentaires. Les oligonucléotides utilisables dans ce but font également partie de l'objet de la présente invention ; avantageusement, ces oligonucléotides comprennent au moins 15 pb, et de préférence au moins 20 pb, de la portion codante de l'une des séquences SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou de son complémentaire.
Les acides nucléiques conformes à l'invention englobent également les cassettes d'expression, comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant une Myticine, placée sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
Par promoteur approprié on entend tout promoteur fonctionnel dans la cellule-hôte destinée à héberger la cassette d'expression. Il peut s'agir d'un promoteur constitutif ou d'un promoteur inductible ; peut également s'agir, dans le cas où la cassette est destinée à l'expression d'une Myticine chez un animal ou une plante, d'un promoteur tissu-spécifique.
Une cassette d'expression conforme à l'invention peut comprendre également au moins une séquence codant une séquence d'adressage appropriée ; ladite séquence d'adressage peut être choisie parmi celles qui sont naturellement associées aux Myticines, telles que les séquences signal et/ou les séquences Cterminales associées aux isoformes Myticine a et Myticine b décrites ci-dessus ; il est également possible de choisir une ou plusieurs séquences d'adressage hétérologues, fonctionnelles dans une cellule-hôte donnée : il peut s'agir notamment de séquences permettant l'adressage d'une Myticine vers un compartiment cellulaire déterminé, ou sa sécrétion dans le milieu de culture.
L'Invention a également pour objet : - des vecteurs recombinants caractérisés en ce qu'ils comprennent au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention, codant une Myticine, et en particulier des vecteurs comprenant une cassette d'expression telle que définie ci-dessus.
- des cellules procaryotes ou eucaryotes transformées par au moins une séquence d'acide nucléique conforme à l'invention. Il peut s'agir de cellules en culture, ou de cellules faisant partie d'un organisme pluricellulaire, animal ou plante. La séquence d'acide nucléique conforme à l'invention présente dans une cellule transformée peut être soit incorporée dans l'ADN chromosomique de ladite cellule, soit être portée par un vecteur extra-chromosomique.
Il est à noter qu'un polymorphisme de restriction existe au niveau du gène malE entre les deux souches de C. glutamicum testées
Séquence du gène et analyse Le fragment d'ADN de C. glrrtamicum porté par pMF 12 a été partiellement séquence par la méthode de Sanger et al. (1977). La séquence a été déterminée sur les deux brins sur une longueur de 2260 paires de bases (Fig 3) L'analyse de cette séquence conduit aux conclusions suivantes : - Une séquence de type promoteur (-35: TTTGCAAAT, -10: TACAGAT) a été détectée par comparaison avec des promoteurs connus de C. glutamicrrm (Patek et al., 1996)) - Une séquence de type terminateur (AGGCCCACAGAAGCAATTCTGTGGGCCT SEQ ID n 7) a été détectée par comparaison avec des terminateurs connus (Rosenberg et Court, 1979).
- Entre ces séquences, une phase ouverte de lecture majeure a été identifiée Elle mesure 1179 paires de bases, ce qui correspond à 393 codons (Fig 3) et code une protéine d'une masse moléculaire déduite de 40950 Daltons, ce qui est similaire à la masse moléculaire des enzymes maliques bactériennes connues.
Le biais d'utilisation des codons dans la phase ouverte de lecture putative est conforme à celui rencontré chez les gènes analysés de C. glrrtamicrrm (Malumbres et al., 1993), tout comme le pourcentage en G+C de la séquence analysée.
Les similarités entre les séquences selon l'invention et les séquences provenant d'autres microorganismes sont représentées dans le tableauci-dessous
Espèce % similarités % similarités acides aminés nucléotides MAIE de ATCC 17965 100 100
Bacillius stearothermophiltis (Kobayayashi et al, 1989) 69 46
Synechocystis sp. (Kaneko et al, 1996) 65 42
Streptococcits bovis (Kawai et al, 1996) 68 41,8
Bacillus subtilis (Lapidus et al, 1997) 63 41,2
Sinorhizobium meliloti 65 43,7
Leptospira interrogans 59 36 E. coli (Blattner et al, 1997) 64 42
Haemophilus influernae (Fleischmann et al, 1995) 63 38 Archaeoglobiisfiilgidiis (Klenk et al, 1997) 59 39,4
Pyrococcus horikoshii (Kawarabayasi et al, 1998) 56 36
Rickeilsia prowasekii (Andersson et al, 1998) 60 33,8 Leuconostoc mesenteroides (Bekal et al, 1998) 61 35,6 Au mieux, la séquence nucléotidique de la phase ouverte de lecture présente des similitudes avec les séquences des gènes malE de B. stearothermophilus (46% de similarité) et de S. bovis (41,8% de similarité). La séquence protéique déduite de la phase ouverte de lecture présente des similitudes fortes avec les enzymes correspondantes de B. stearothermophilus (69% de similarité) et de S. bovis (68% de similarité). Fonctionnalité chez Ecole du gène malE cloné Conditions de culture: Les bactéries sont cultivées une nuit à 37 C en milieu LB (Luria broth) contenant de l'ampicilline à 100 g/ml dans le cas de pMF12 Le culot bactérien de 2ml de culture est lavé deux fois en KCI 0,2%, repris par 1ml de tampon TrisTricarballylate 100mM pH7,8
Après 72H de fermentation, les milieux de fermentation sont récoltés et analysés Les résultats sont indiqués au tableau IV ci-dessous.
Tableau IV : Production de L-lysine en fermenteur ( résultats à 72H)
Souche D.O. 660nm Lys HCI g/1 Lys HCl, g Rendement g/g ATCC21253 (pCGL243) 40,3 27,1 31,2 16,2% (Témoin) ATCC21253 (pMF22) 40,2 29,2 34,2 18,0%
(Ptrc-/77</E)~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~
La souche transformée par le plasmide portant l'enzyme malique voit sa production de L-lysine augmentée de 9,6% en masse par rapport au témoin. Le rendement obtenu est majoré de 2,2 points, ce qui correspond à une amélioration relative de Il %.