INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'onduleur de tension triphasé est un convertisseur statique particulièrement dédié pour l'alimentation de machines à courant alternatif pour des systèmes qui demandent une bonne qualité d'entraînement (précision, linéarité, réponse transitoire, stabilité) dans une large zone de variation de vitesse et de régime de charge.
Traditionnellement, la structure d'onduleur de tension utilisée est composée par une seule cellule de commutation par phase, délivrant une tension de sortie avec un taux de distorsion harmonique dont on connaît les limites. Cet onduleur, appelé onduleur deux niveaux, se heurte toutefois à des limites technologiques liées à son principe de fonctionnement.
Une nouvelle structure d'onduleur de tension a été développée permettant une modulation de l'amplitude des impulsions. Cette structure multicellulaire, à cellules imbriquées, présente un caractère modulaire, permettant une amélioration remarquable de la qualité de la tension délivrée, qui augmente avec le nombre de cellules.
On peut considérer ces onduleurs multiniveaux série comme des convertisseurs numérique/analogique de forte puissance.
D'autre part, les processeurs numériques de signal actuels sont suffisamment rapides et précis pour qu'un contrôle direct du couple (DTC) de la machine à courant alternatif puisse être mis en oeuvre. Cette stratégie de contrôle consiste à agir directement sur l'état de l'onduleur, à partir d'informations sur les valeurs instantanées du couple et du flux de la machine.
Rapidement, cette stratégie de commande est apparue comme une innovation majeure permettant d'améliorer très sensiblement le temps de réponse de la commande du couple des machines à courant alternatif. De plus, le principe de base reste très simple puisqu'il consiste à choisir "directement" la configuration onduleur en fonction du signe de l'erreur de couple et du signe de l'erreur de flux, ce qui ne nécessite pas, en particulier, la présence d'un capteur de vitesse ou de position.
fragments d'ADN obtenus par PCR, en présence de 1,2 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'ADN ligase T4 (New England Biolabs) pendant 1 nuit à 18 C. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et a été analysé par digestions enzymatiques. La séquence promotrice MPrlllO portée par ce plasmide pMRT1110 a été vérifié par séquençage (SEQ.ID07).
3. 3. Construction du promoteur MPrllll.
Le promoteur MPrllll a été créé en insérant à la position-99 pb de MPrl098 (SEQ. ID04), un motif de 18 pb contenant une boîte "G" (s'étendant des positions - 204 pb à - 186 pb de petE prom, SEQ.ID01) et en fusionnant à ce promoteur minimal modifié une séquence de 58 pb correspondant à une duplication du motif as-2 (Lam et Chua, 1989) et au motif as-1 (Lam et al., 1989) du CaMV 35S. MPrllll (Fig. IV) a été synthétisé par la technique de lb-PCR.
L'ADN simple brin continu a été généré à l'aide des oligodésoxynucléotides sens suivants : - SI = 5' TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAG AGGATCCCCG 3' (SEQ. ID12) - S2 = 5' CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTC TCTCTTTCGA 3' (SEQ. ID13) - S5 = 5' CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCAC ACATCTTAGCCA 3' (SEQ. ID16) - S7 = 5' CATGCTGCAGACTAGTGATTGATGTGATATCAAGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTA AGGGATGACGCATGCCACT 3' (SEQ.ID18)
Cent pmol des oligodésoxynucléotides SI, S2 et S5 ont été phosphorylés en 5' grâce à l'action de 15 unités de kinase (Amersham) en présence de 5 l du tampon kinase 10X (Amersham) et 500 pmol d'ATP (Sigma), pendant 30 min à 37 C. Les oligodésoxynucléotides phosphorylés ont été purifiés par extraction par un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25: 24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : isoamylique (24:1 v/v), avant d'être précipités par 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 20 min puis centrifugés à 16060 g pendant 30 min. Les oligodésoxynucléotides précipités ont été lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis remis en suspension dans de l'eau à une concentration de 10 pmol/ul.
Pour relier les oligodésoxynucléotides "sens", les oligodésoxynucléotides "guides" suivants ont été utilisés: - Gl= 5' TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA 3' (SEQ.ID19) - G2= 5' GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG 3' (SEQ.ID20) - G4= 5' TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT 3' (SEQ. ID22) Pour réaliser la réaction LCR, 10 pmol des oligodésoxynucléotides sens SI phosphorylé, S2 phosphorylé, S5 phosphorylé et S7 ont été ligaturés en présence de 10 pmol des oligodésoxynucléotides guides Gl, G2 et G4,5 l du tampon ADN ligase Taq 10X (New England Biolabs) et 40 unités d'ADN ligase Taq (New England Biolabs). La réaction de ligation a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer, Norwalk, USA). Elle est constituée d'un cycle d'1 min à 94 C, et de 8 cycles identiques chacun composé de la succession des étapes suivantes : 1 min à 65 C, 1 min à 57 C, 1 min à 52 C, 1 min à 48 C, 1 min à 43 C, et enfin 10 min à 37 C. Puis, le mélange réactionnel de ligation a été purifié sur colonne Qiaquick selon les recommandations du fournisseur.
Enfin, l'amplification PCR de l'ADN simple brin obtenu a été réalisée dans un thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 en présence de 100 pmol de chacune des amorces oligodésoxynucléotidiques 5' CATGCTGCAGACTAGTGGATT 3', et
5' CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3', 50 nmol de chacun des dNTP, 10 l de tampon ADN polymérase Vent 10X (New England Biolabs), et 2 unités d'ADN polymérase Vent (New England Biolabs). l'ADN a été dénaturé pendant 5 min à 94 C, soumis à 25 cycles constitués chacun de 30 sec de dénaturation à 95 C, de 30 sec d'hybridation à 56 C, et d'1 min d'élongation à 72 C, puis l'élongation à 72 C a été poursuivie pendant 5 min.
Les fragments d'ADN du milieu réactionnel ont été digérés par 20 unités de BamHI pendant 45 min à 37 C, puis par 20 unités de PstI pendant 1 h à 37 C, et enfin purifiés sur colonne Qiaquick.
Ils ont été insérés dans le plasmide pGEM3Z-petE/IV2 digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C, puis par PstI pendant 1 h à 37 C, soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, purifié sur colonne d'affinité Qiaquick, déphosphorylé pendant 1 h à 37 C en présence de 12 l de "tampon 3" 10X (New England Biolabs) et de 5000 unités de phosphatase d'intestin de veau (CIP, New England Biolabs), et enfin purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Pour réaliser la ligation, 25 ng de plasmide traité comme décrit ci-dessus ont été mis en présence de 100 ng des fragments d'ADN obtenus par PCR, en présence de 1,2 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'ADN ligase T4 (New England Biolabs) pendant 1 nuit à 18 C. Des bactéries Escherichia coli DH5[alpha], rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline et a été analysé par digestions enzymatiques. Deux plasmides résultants, pMRT1111 et pMRT1112, ont été séquences. Le plasmide pMRT1111 contient le promoteur MPrllll attendu (SEQ. ID08), tandis que dans le plasmide pMRT1112, le promoteur MPrlll2 (Fig. IV) diffère de MPrllll par une délétion de 35 pb contenant la boîte "G" et s'étendant de la position-127 à la position-89 et une délétion de deux pb situées en position-78 et-76 (SEQ. ID09).
3. 4. Construction du promoteur MPrll53.
Le promoteur MPrll53 (Fig. IV) a été obtenu en fusionnant la séquence de 78 pb de petE prom, s'étendant de la position-582 à la position-510 pb (SEQ.ID01) et portant les motifs "as-1 like" et "nos enhancer like" à MPrl098 modifiée par adjonction du motif de 18 pb contenant la boîte "G".
Pour ce faire, le plasmide pMRTllll a été digéré par 20 unités de PstI et 1 unité de DraIII pendant 1 h à 37 C. Le plasmide ainsi délété du fragment de 72 pb, contenant les deux motifs "as-2" et le motif "as-1" du CaMV, a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, puis purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Le fragment PstI/DraIII de 78 pb contenant les deux motifs "as-1 like" et "nos enhancer like" de petE prom a été généré en digérant 10 ug de plasmide pMRT1108 par 20 unités de PstI et 1 unité de DraIII pendant 1 h à 37 C, puis isolé par électrophorèse sur gel d'agarose Nu-Sieve 3% (FMC, Rockland, USA) et enfin purifié sur colonne d'affinité Qiaquick.
La ligation a été réalisée avec 20 ng de vecteur pMRT1111 PstI/DraIII et 80 ng du fragment de 78 pb pendant 1 nuit à 18 C dans un milieu réactionnel de 10 ul en présence de 1,0 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme ADN ligase T4 (New England Biolabs). Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline, et analysé par digestions enzymatiques. Le plasmide obtenu a été appelé pMRT1153 et la séquence promotrice MPrll53 (SEQ. ID10) a été vérifiée par séquençage .
3. 5. Construction du promoteur Mprll43.
Le promoteur MPrll43 (Fig. IV) a été obtenu en délétant la séquence de 72 pb portant les motifs "as-2, as-2, as-1" de MPrllll.
La transformation de la phase lamellaire cristal-liquide en vésicules multilamellaires à structure en oignon pourra être facilitée en jouant sur le choix tensioactifs. On pourra, en particulier, choisir comme indiqué précédemment un tensioactif présentant une haute HLB et un agent tensioactif présentant une basse HLB.
Par ailleurs, certains tensioactifs sont particulièrement adaptés pour favoriser cette transformation. Ainsi, c'est le cas par exemple des poloxamères, et autres dérivés copolymères de l'oxyde d'éthylène et de l'oxyde de propylène éventuellement modifiés par adjonction de chaînes hydrophobes. Ces composés sont particulièrement intéressants car ils apportent à la fois l'adaptation des propriétés élastiques de la membrane de tensioactifs et sa stabilisation par effet stérique. On peut citer à titre d'exemples non exhaustifs la famille des Pluronics et Lutrols (BASF), les hydroxystéararate de polyéthylène (Solutols de BASF ou MRYJs de ICI).
Enfin selon un dernier aspect, I'invention concerne également un procédé pour améliorer la stabilité d'un produit actif et éviter sa dégradation, caractérisé en ce qu'il consiste à encapsuler ledit produit actif au sein de vésicules multilamellaires telles que définies précédemment, présentant une structure en oignon et constituées, de leur périphérie jusqu'à leur centre, de membranes sous forme de bicouches concentriques comprenant au moins un agent tensioactif, lesdites membranes étant séparées par un liquide interstitiel, lesdites vésicules incorporant en leur sein au moins un agent destiné à éviter la dégradation dudit produit actif.
Les exemples qui suivent donnés à titre purement illustratif de l'invention montrent comment il a été possible selon l'invention d'améliorer la stabilité de différents actifs réputés fragiles.
Ces exemples font également référence aux figures 1 et 2 - la figure 1, donnée en référence à l'exemple 1, donne les variations de la concentration en vitamine C non dégradée en fonction du temps pour une composition où la vitamine C est encapsulée en comparaison avec une composition où elle est libre ; et - la figure 2, donnée en référence à l'exemple 3, illustre la stabilisation de l'ascorbylphosphate de magnésium (APG) par co-encapsulation avec un agent modifiant son pH.
EXEMPLES Dans les exemples qui suivent, sauf indications contraires, les proportions sont données en pourcentages en poids.
Exemple 1 Vitamine C La vitamine C est très sensible à l'oxydation. La stabilisation a pu être obtenue par encapsulation dans des microvésicules multilamellaires, renforcées par un polymère naturel réticulé (pectine) et co-encapsulation d'additifs permettant la stabilisation : séquestrant éliminant les traces d'ions métalliques catalyseurs de I'oxydation (EDTA), anti-oxydant (bisulfite de sodium) en procédant comme indiqué ci-dessous : a) Formulation :
Composants A Polysorbate 60 24 oléate de sorbitan 20 Acétate de vitamine E ~ 5 Conservateur i
Composants B Eau 37,5 Acide éthylène diamine tétra acétique 0,08 bisulfite de sodium 0,82 pectine 1,6 Acide ascorbique 10 b) Mode opératoire: Les ingrédients B sont mélangés 30 min à température ambiante sous agitation dans l'ordre de la liste. On obtient un gel translucide.
Les ingrédients A sont mélangés à température ambiante sous agitation, puis le mélange B est ajouté en maintenant l'agitation et la température ambiante. L'agitation est maintenue 2 h.
On obtient une pâte épaisse, qu'il faut disperser à 50% dans une solution de chlorure de calcium, destinée à réticuler la pectine. Pour cela une solution aqueuse contenant 20 g/l de CaC12 est additionnée lentement à la pâte maintenue sous agitation. On obtient une dispersion fluide laiteuse, dont l'observation au microscope montre la présence de vésicules biréfringentes. c) Dosage La dispersion de vésicules est rediluée dans l'eau pour atteindre une teneur en vitamine C de 5%. Cette dispersion est placée en étuve à 450C pour suivre la stabilité. La teneur en vitamine C dans l'échantillon est mesurée par un dosage à l'iode.
Le résultat de la stabilisation est illustré par la courbe de la figure I donnant le taux de vitamine C en fonction du temps à 450C pour la dispersion de vésicules (notée "encapsulée" sur la figure 1) dont la préparation est décrite cidessus, en comparaison avec les résultats obtenus pour une simple dispersion de vitamine C à même concentration initiale dans l'eau (notée "libre" sur la figure).
On remarque que, alors que la solution de vitamine C se dégrade continuellement, la vitamine C encapsulée reste à 80% de sa quantité initiale pendant plus de 45 jours à 45"C.
Exemple 2 Vitamine A et vitamine E a) <RTI ID=13.3
Exemple 3 Ascorbvl phosphate de magnésium (APG) Ce composé est un dérivé de la vitamine C, plus stable que l'acide ascorbique, mais cependant peu stable en dessous de pH = 7,5. Cela pose un problème en cosmétique car le pH de la peau est de 5,5, et il est préférable que le produit cosmétique ait un pH voisin de celui de la peau.
Dans ce cas, I'encapsulation est effectuée dans des microvésicules de tensioactifs non-ioniques. L'APG est préalablement dissous dans un milieu tartrate de sodium, co-encapsulé dans les vésicules, apportant la stabilisation, en procédant comme indiqué ci-dessous. La courbe de dégradation à 45"C, de l'APG libre et encapsulé, à pH= 5,5 est donnée sur la figure 2 qui donne le pourcentage d'APG non dégradé en fonction du temps. a) Formulation :
HPLC (UV) : 99,4 % 2ème étape 5-(2-chlorophényl)-4-[7-[( 1,1 -diméthyléthoxycarbonyl)amino]- 1-oxo-heptyl]- 1,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-2-oxo-1-(2-phényléthyl)-8H-pyrido[4',3':4,5]thieno[2,3-e]- 1,4-diazépine-8-carboxylate de t-butyle On solubilise le produit obtenu lors de l'étape précédente (lg, 1,86 mmol) dans du 1,2-dichloro- éthane (20 ml). On ajoute de la résine N-cyclohexyl carbodiimide, du N'-méthyl polystyrène HI (2,3 g, 5,6 mmol) et du tétrahydrofurane (0,5 ml). On ajoute l'acide 7-[(I,I-diméthyléthoxy)carbonyl]amino-heptandfque (0,91 g, 3,7 mmol) et on agite 48 h à 23 C. La résine est filtrée. On évapore le solvant et on reprend le milieu réactionnel dans du dichlorométhane (30 ml). On ajoute de la résine basique échangeuse d'ion puis on agite durant 1 heure et on filtre. Après évaporation du solvant au rotavapor, on obtient le produit souhaité sous forme d'un solide blanc amorphe (1,2 g, 86 %).
RMN'H (400 MHz, CDC13, 3) : 1,15 (m) ; 1,25(m) ; 1,36 (s) ; 1,41 (s); 1,52 (m) ; 2,85 (m); 2,16 (m) ; 2,22-2,40 (m) ; 2,58 (m) ; 2,81 (m) ; 3,48 (m); 3,75 (m) ; 3,90 (m) ; 4,35 (m) ; 4,40-4,60 (m) ; 6,0-7,0 (m) ; 7,30 (m) ; 7,18-7,40 (m) IR (cm-1) : 3378 (V NH carbamate) ; 2974 ; 2930 ; 1700 (V C=O carbamates) ; 1676 (V C=O lactame) ;1391 ; 1168 ; 759 3ème étape 4-(7-amino-1 -oxo-heptyl)-5-(2-chlorophényl)-1,2,3,4,5,6,7,9-octahydro- l-(2-phényléthyl)- 8H-pyrido[4',3':4,5]thiéno[2,3-e]-1,4-diazepine-2-one On agite 4 h à 23 C une solution contenant le composé obtenu lors d'étape précédente ( 1 g, 1,3 mmol) et de l'acide trifluoroacétique (3 ml) dans 10 ml de dichlorométhane. On évapore le mélange réactionnel en reprennant avec du toluène (2 x 30 ml) et de l'éther (2 x 30 ml). On agite le résidu dans un mélange de solvant contenant éther-acétone-dichlorométhane (90-0,5-0,5) pendant 5 minutes. On filtre sur fritté puis on lave à l'éther. On obtient le produit souhaité sous forme d'une poudre blanche (1,0 g, 96 %).
Point de fusion : 149-152 C RMN'H (400 MHz, CDC13, #) : 1,20-1,57 (m) ; 1,86-2,25 (m) ; 2,56-2,79 (m) ; 2,91 (m) ; 3,30 (m) ; 3,79-3,91 (m) ; 4,27-4,37 (m) ; 6,07-6,63 (m) ; 6,63-6,99 (m) ; 7,01-7,76 (m) ; 9,45 (m).
Exemple 10 4-(7-amino- l-oxo-heptyl)-5-(2-chlorophényl)-1,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-N-(4-méthoxy- 2-nitrophényl)-2-oxo-1-(2-phényléthyl)-8H-pyrido[4',3':4,5]thieno[2,3-e]-1,4-diazépine- 8-carbothioamide On ajoute de la triéthylamine (0,22 ml, 1,5 mmol) à 0,5 g de 4-(7-amino-l-oxo-heptyl)- 5-(2-chlorophényl)-l,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-l-(2-phényléthyl)-8H-pyrido[4',3':4,5]thieno [2,3-e] -1,4-diazépine-2-one (0,63 mmol) dissout dans du dichlorométhane (12 ml). On ajoute ensuite du 4-méthoxy-2-nitro-phénylisothiocyanate (0,146 g, 0,69 mmol) et on agite une heure à 23 C puis on évapore le solvant au rotavapor. Après purification par chromatographie sur colonne de silice (éluant : dichlorométhane-méthanol-amoniaque : 98-2-0 à 95-5-0,5), on évapore les fractions contenant seulement le produit puis on ajoute un minimum de dichlorométhane puis une solution d'acide chlorhydrique 1M (0,2 ml). On agite à 23 C pendant 30 minutes puis on filtre sur fritté le produit obtenu. Après lavage à l'éther, on obtient le produit souhaité sous forme d'une poudre orange (0,12 g, 25 %).
Point de fusion : à partir de 160 C RMN'H (400 MHz, CDC13, #) : 1,32 (m); 1,57 (m); 1,9 (m); 2,10 (m); 2,33(m) ; 2,43-2,75 (m) ; 3,57-3,35 (m) ; 3,83 (m) ; 4,35 (m) ; 5,00 (m) ; 5,30 (m) ; 6,65 (m) ; 7,00 (m) ; 7,50-7,01 (m) ; 7,89 (m) ; 9,69 (m) IR (cm-1) : 3420 (V NH) ; 2930 ; 1670 ; 1664 ; 1655 ; 1649 ; 1532 ; 1348 HPLC (UV) : 96 % Exemple 11 5-(2-chlorophényl)-l,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-4-(3-méthyl-2-butenyl)-2-oxo-l-(2-phényl- éthyl)-8H-pyrido [4',3':4,5]thiéno[2, 3-e]-1,4-diazepine 1ère étape 5-(2-chlorophényl)-1,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-4-(3-méthyl-2-butenyl)-2-oxo-1-(2-phényl- éthyl)-8H-pyrido[4',3':4,5]thiéno[2,3-e]-1,4-diazépine-8-carboxylate de t-butyle On dissout 0,5 g de 5-(2-chlorophényl)-l,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-2-oxo-l-(2-phényléthyl)- 8H-pyrido[4',3':4,5]thiéno[2,3-e]-1,4-diazépine-8-carboxylate de t-butyle (1 mmol) dans du tétrahydrofurane anhydre (20 ml). On ajoute par portion l'hydrure de sodium dispersé à 60 % (0,028 g, 1,1mmol). On attend la fin du dégagement puis on ajoute goutte à goutte le 1-bromo- 3-méthyl-2-butène (0,125 ml, 1,1mmol). On agite 3 h à 23 C et on chauffe toute la nuit à 60 C puis on rajoute du dérivé halogéné (0,125 ml, 1,1mmol). On chauffe 48 h à 60 C. Le milieu réactionnel est versé dans une solution saturée en chlorure d'ammonium (30 ml) puis on ajoute de l'acétate d'éthyle (30 ml). Après décantation, la phase aqueuse est extraite avec de
l'acétate d'éthyle (30 ml). La phase organique est séchée sur sulfate de magnésium, filtrée et le solvant évaporé. Après purification par chromatographie sur colonne de silice (éluant : acétate d'éthyle-heptane : 20-80 à 50-50), les fractions contenant seulement le produit sont évaporées et on obtient le produit souhaité sous forme d'une poudre amorphe jaune pale (0,47 g, 79 %).
RMN'H (400 MHz, CDC13, 8) : 1,37 (s, 9H) ; 1,53 (s, 3H) ; 1,67 (s, 3H) ; 2,06-2,48 (m, 2H) ; 2,49 (m, 1H) ; 2,61 (m, 1H) ; 3,11 (m, 2H) ; 3,23 (m, 1H) ; 3,3 (m, 1H) ; 3,48 (m, 2H) ; 3,70 (m, 1H) ; 4,46 (m, 1H) ; 4,46 (m, 2H) ; 5,17 (m, 2H) ; 5,17 (m, 2 H) ; 7,17-7,55 (m, 9H).
IR (cm-') : 2974 ; 2926 ; 2855 ; 1697 (V C=O carbamate) ; 1676 (V C=O lactame) ; 1365 ; 1165 ; 750; 699 HPLC (UV) : 98,5 % 2ème étape 5-(2-chlorophényl)-1,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-4-(3-méthyl-2-butenyl)-1-(2-phényléthyl)-8Hpyrido[4',3':4,5]thiéno[2,3-e)-1,4-diazépine-2-one On dissout le composé obtenu lors de l'étape précédente (0,4 g, 0,65 mmol) dans du dichlorométhane (5 ml) puis on ajoute de l'acide trifluoroacétique (2 ml). On laisse agiter durant 2 h à 23 C puis on évapore le solvant et l'excès d'acide au rotavapor. Après purification par chromatographie sur colonne de silice (éluant : dichlorométhane-méthanol-amoniaque : 98-0-0 à 98-2-0,2), on évapore les fractions contenant seulement le produit. On reprend l'huile résiduelle dans de l'éther (20 ml). Après refroidissement, on ajoute de l'éther chlorhydrique 1 M (0,2 ml) et on agite 15 minutes le solide obtenu qui est ensuite filtré sur fritté et lavé à l'éther. On obtient le produit souhaité sous forme d'une poudre jaune pale (0,11g, 33 %).
Point de fusion : 114-118 C RMN'H (400 MHz, CDC13, 8): 1,55 (s, 3H) ; 1,69 (s, 3H) ; 2,3-2,65 (m, 4H) ; 3,14-3,40 (m, 7H) ; 3,68 (m, 1H) ; 3,97 (m, 1H) ; 4,27 (m, 2H) ; 5,14 (m, 2H) ; 7,16-7,56 (m, 9H) ; (m, 2H).
Exemple 12 5-(2-chlorophényl)-1,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-4-(3-méthyl-2-butenyl)-N-(4-méthoxy- 2-nitrophényl)-2-oxo-l-(2-phényléthyl)-8H-pyrido[4',3':4,5]thiéno[2,3-el-1,4-diazépine- 8-carbothioamide On solubilise 0,22 g de 5-(2-chlorophényl)-1,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-4-(3-méthyl-2-butenyl)- 1-(2-phényléthyl)-8H-pyrido[4',3':4,5]thiéno[2,3-eJ-1,4-diazépine-2-one (0,43 mmol) dans du dichlorométhane (2 ml) puis on ajoute le 4-méthoxy-2-nitro-phénylisothiocyanate (0,1 g,
0,48 mmol). Après agitation pendant 1 h à 23 C, le solvant est évaporé. Après purification par chromatographie sur colonne de silice (éluant : dichlorométhane-méthanol : à 99,5-0,5), les fractions contenant seulement le produit sont évaporées et le solide obtenu repris dans de l'isopentane (20 ml). On ajoute de l'éther (2 ml) puis on agite durant 20 minutes, filtre sur fritté et lave avec un minimun d'éther isopropylique et de l'isopentane. On obtient le produit souhaité sous forme d'une poudre jaune pâle (0,19 g, 61 %).
Point de fusion : 80-84 C RMN'H (400 MHz, CDC13, 8) : 1,55 (s, 3H) ; 1,69 (s, 3H) ; 2,25-2,67 (m, 3H) ; 3,07-3,26 (m, 4H) ; 3,70 (m, 1H) ; 3,84 (s, 3H) ; 3,96 (m, 2H) ; 4,10 (m, 1H) ; 5,00-5,18 (m, 4H) ; (m, 13H) ; (s, 1H).