INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'acétylcholinestérase de gymnote a été utilisée dans le développement de tests de type ELISA pour la détection et la quantification de substances variées en phase homogène ou hétérogène (Grassi et al., 1989 ; Pradelles et al., 1989 ; Creminon et al. 1993 ; Volland et al., 1994 ; Grassi et al., 1996, Brevet européen nO 0 139 552 au nom du Commissariat à l'Energie Atomique, France).
Des tests mettant en oeuvre l'AChE peuvent ainsi être adaptés à la concentration de la substance à rechercher dans un échantillon, sans nécessiter la répétition du test, simplement en déterminant les temps de réaction pour lesquels une lecture colorimétrique sera effectuée. De fortes concentrations de la substance recherchée seront détectées rapidement après quelques minutes de réaction enzymatique, alors que de faibles concentrations de cette substance pourront être détectées pour des temps d'incubation plus longs pouvant aller jusqu'à 24 h ou 48 h.
Bien que représentant une enzyme réunissant de nombreuses caractéristiques de l'enzyme idéale décrite ciavant, l'AChE de gymnote présente des inconvénients qui n'ont jamais été surmontés jusqu'à présent.
Tout d'abord, l'AChE de gymnote est obtenue par purification protéique à partir de l'organisme naturel, ce qui représente une méthode longue et coûteuse et qui, de surcroît, ne peut garantir la production d'une protéine oui serait purifiée à homogénéité et qui serait, en outre, dépourvue de produits contaminants non apparentés susceptibles de, gêner l'activité enzymatique ou d'interférer avec le test de détection dans lequel elle est mise en oeuvre. En particulier, les techniques de purification de l'AChE nécessitent l'utilisation de détergents, tels que le Triton X-100 ou le Brj-.96, ou encore de protéases, ce qui conduit à des préparations contenant une partie de la protéine solubilisée ayant une conformation aitérée ou étant partiellement protéolysée.
En second lieu, il est difficile d'obtenir une enzyme monomérique et enzymatiquement active à partir de l'AChE de gymnote, qui est naturellement tétramérique.
De plus, la structure de l'AChE de gymnote, ainsi que la plupart des autres AChE multimériques décrites jusqu'à présent, contient un segment T du côté C-terminal. La structure du peptide T est bien conservée parmi les AChE, sa longueur est de 40 acides aminés, avec une succession d'acides aminés aromatiques. La nature de la séquence peptidique T , l'espacement des acides aminés aromatiques ainsi que le fait que les acides aminés aromatiques se superposent sur un côté de l'hélice, indiquent une organisation structurale sous forme d'une hélice alpha amphiphile, pouvant être associée avec des protéines structurales dépourvues d'activité enzymatique, ce qui rend ces protéines, peu ou pas du tout solubles en solution.
De plus, l-'AChE de gymnote, ainsi que la plupart des autres formes moléculaires de l'AChE, exceptée l'AChE de venin de serpent, est associée aux membranes biologiques et à d'autres structures cellulaires ou peri-cellulaires (par exemple, membranes basales) de sorte qu'un traitement à haute force ionique ou en présence de détergent est nécessaire pour solubiliser cette enzyme.
En outre, la présentation de l'AChE de gymnote sous forme tétramérique, et en conséquence le haut poids moléculaire de cette protéine (240 kDa) , conduit à l'obtention de conjugués utilisables en diagnostic d'un poids moléculaire d'au moins 300 kDa, possédant un faible coefficient de diffusion dans l'échantillon à tester et donc une cinétique de réaction assez lente.
Afin de remédier aux inconvénients des enzymes constitutives des traceurs enzymatiques de l'art antérieur, les inventeurs ont cherché à réaliser des traceurs enzymatiques incorporant une forme d'acétylcholinestérase, catalytiquement active, dont l'activité catalytique est du même ordre de grandeur que celle de l'acétylcholinestérase de gymnote. précédemment décrite, qui est présentée sous une forme de monomère soluble en solution, de manière à favoriser l'obtention d'une cinétique de réaction élevée.
Plus particulièrement, les inventeurs se sont attachés à mettre au point un traceur enzymatique réunissant à la fois des caractéristiques d'activité spécifique et de constante catalytique élevées, qui soit stable longtemps, qui puisse être obtenu facilement, en grande quantité et à un coût réduit, qui soit capable de modifier des substrats stables, peu coûteux et dont les produits de la réaction enzymatique sont détectés dans une large gamme de concentration.
Pour atteindre ce but, les inventeurs ont construit un polypeptide de fusion entre une acétylcholinestérase monomérique, dépourvue de peptide T , et un récepteur protéique ayant une affinité pour une molécule ligand à rechercher dans un échantillon, de faible poids moléculaire ayant une constante et une cinétique catalytique élevées, et qui peut être purifié en une seule étape sur une colonne de chromatographie d'affinité.
Par acétylcholinestérase monomérique aux fins de la présente invention, on entend un polypeptide purifié présentant l'activité catalytique d'hydrolyse de l'acétylcholine caractéristique de ces enzymes regroupées, selon la nomenclature internationale, dans le groupe EC 3.1.1.7, dont l'activité catalytique est observée lorsque l'enzyme libre est sous la forme d'un monomère.
Répond notamment à la définition ci-dessus un polypeptide purifié, soluble en solution saline, représentant l'une des sous-unités catalytiques d'une acétylcholinestérase multimérique dépourvue du peptide T .
Le but de l'invention est de proposer une composition qui comprend du fer et un composé qui améliore son assimilation. De ce fait, puisque les quantités sont diminuées de façon générale et les quantités non absorbées sont également minimisées, les effets secondaires se trouvent réduits d'autant. De plus, le composé qui favorise l'assimilation permet aussi d'améliorer la tolérance par une limitation des effets secondaires.
A cet effet, la présente composition alimentaire ou médicamenteuse comprenant du fer ayant des caractéristiques améliorées d'assimilation par l'organisme humain en vue d'une lutte contre les carences en fer, se caractérise en ce qu'elle comprend en combinaison, au moins - un produit transportant le fer et ayant au moins un effet bifidogène, et - un sel de fer.
Ce produit transporteur du fer et à effet bifidogène est de la lactoferrine ou un prébiotique.
Selon une autre caractéristique, le produit ayant au moins un effet bifidogène est une combinaison de la lactoferrine et d'un prébiotique, par exemple un fructo-oligosaccharide.
Le sel de fer utilisé est avantageusement du chlorure ferrique.
La lactoferrine peut être saturée en fer.
L'invention est maintenant décrite ci-après sur la base de plusieurs exemples de préparation qui incluent toutes un composé choisi parmi les protéines, notamment la lactoferrine et/ou un prébiotique.
La lactoferrine est une protéine présente dans le lait des mammifères, notamment chez la femme et dans d'autres sources telles que l'oeuf.
Une composition selon l'invention, particulièrement efficace consiste à associer du fer sous forme de sel avec de la lactoferrine. Plus spécifiquement encore, le sel retenu est du chlorure ferrique.
L'invention couvre aussi des préparations particulières adaptées.
On constate que la lactoferrine a un effet antioxydant vis à vis du fer sous forme de sel et une effet anti-bactérien vis à vis des bactéries pathogènes.
Ces deux effets sont complétés par un troisième, la lactoferrine présente un effet bifidogène qui favorise l'implantation et le développement dans le tube digestif des Bifidobactéries symbiotiques qui à leur tour créent une barrière et gênent l'implantation et le développement des bactéries pathogènes.
On constate que cette composition permet de limiter de façon certaine les effets secondaires indésirables habituellement liés à la prise de fer.
Cette composition peut être complétée par association de molécules ou micro-organismes qui possèdent des propriétés similaires ou complémentaires.
C'est par exemple le cas du lactose qui sert de substrat pour le développement des Bifidobactéries.
Ainsi, une composition particulièrement adaptée consiste à préparer une poudre soluble à reconstituer, un sirop, un comprimé, une capsule ou une gélule avec les dosages adaptés pour des prises de - îijg à 10 g/jour de sel de fer - 0.1/1g à 20 g/jour de lactoferrine Une formule adaptée est indiquée ci-après Chlorure ferrique : 7 mg Lactoferrine 10 O mg support : qsp (quantité suffisante pour) arôme : qsp Une composition améliorée consiste à substituer à la lactoferrine, au moins un prébiotique qui favorise l'implantation et le développement d'un type de micro-organisme symbiotique et s'oppose à l'implantation des bactéries Gram-pathogènes. Le sel de fer est conservé.
En outre, il apparaît que les stries formées sur le voyant peuvent présenter, selon le redressement qu'ils sont à même d'assurer, des coefficients de transmission
de la lumière qui peuvent varier dans une large mesure.
Ceci contribue également à donner à un feu de signalisation connu du type à ballon, malgré le travail effectué par ce dernier, une homogénéité qui reste
perfectible.
La présente invention vise à pallier ces limitations de l'état de la technique et à réaliser un feu de signalisation qui puisse comporter un voyant présentant un galbe important et des aménagements de déviation optique présentant des coefficients de transmission sensiblement différents les uns des autres, tout en présentant au niveau dudit voyant une homogénéité d'éclairement qui puisse être bien contrôlée, et qui en
particulier puisse être homogène sur une large étendue.
Ainsi la présente invention propose un feu de signalisation pour véhicule automobile, comprenant une source lumineuse, une plaque optique possédant des aménagements optiques aptes à redresser la lumière issue de la région de la source pour qu'elle se propage avec une direction moyenne généralement parallèle à un axe optique horizontal, ainsi qu'un ballon récupérateur et répartiteur de flux interposé entre la source et la plaque optique et apte à assurer une répartition donnée de la lumière sur la surface interne de la plaque optique dans au moins une direction donnée, caractérisé en ce que la plaque optique est galbée et possède des aménagements optiques présentant des coefficients de transmission de la lumière différents les uns des autres, et en ce que le ballon assure une répartition donnée de la lumière qui tient compte desdits coefficients de transmission différents de manière à obtenir une évolution de l'éclairement en sortie de ladite plaque, selon ladite
direction donnée, qui réponde à une loi prédéterminée.
Avantageusement, lesdits aménagements optiques possèdent des coefficients de transmission qui évoluent par sauts en fonction de leur position selon ladite direction donnée, et la répartition donnée de la lumière par le ballon évolue également par sauts selon ladite
direction donnée.
En outre, il est préférable, dans une forme de réalisation particulière, que dans au moins une zone de ladite plaque, les coefficients de transmission des aménagements optiques varient progressivement et que dans ladite zone, la répartition donnée de la lumière soit apte à compenser cette variation progressive de manière à assurer dans cette zone un niveau d'éclairement
essentiellement constant.
Selon un autre aspect, l'invention propose un procédé de fabrication d'un feu de signalisation de véhicule automobile, ce feu comprenant une source lumineuse, une plaque optique galbée possédant des premiers aménagements optiques aptes à redresser la lumière issue de la région de la source pour qu'elle se propage avec une direction moyenne généralement parallèle à un axe optique horizontal, lesdits premiers aménagements optiques possédant différents coefficients de transmission de la lumière, ainsi qu'un ballon récupérateur et répartiteur de flux interposé entre la source et la plaque optique et comportant des seconds aménagements optiques aptes à assurer une répartition donnée de la lumière sur la surface interne de la plaque optique dans au moins une direction donnée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: - établir une loi d'évolution des coefficients de transmission desdits aménagements optiques en fonction d'au moins une de leurs coordonnées sur la plaque optique, - établir une loi souhaitée d'évolution de l'éclairement du feu en fonction de la ou desdites coordonnées sur la plaque optique, - établir par combinaison desdites lois une relation entre l'orientation d'un rayon issu de la source et incident sur lesdits seconds aménagements optiques et ladite coordonnée au moins, - définir la géométrie desdits seconds aménagements optiques en fonction de ladite relation, - fabriquer en utilisant ladite géométrie un moule pour ledit ballon, et
- mouler le ballon à l'aide dudit moule.
L'étape de définition consiste avantageusement à définir en succession une pluralité de seconds aménagements optiques adjacents en fonctions des lois de
la réfraction et/ou de la réflexion totale.
On peut citer comme exemple de prébiotique un fructo-oligosaccharide à effet bifidogène qui favorise l'implantation des Bifidobactéries et qui s'oppose au développement d'E.Coli.
De plus, le métabolisme fermentaire des Bifidobactéries est réducteur, ce qui diminue le pouvoir oxydant du fer.
Cette composition peut faire l'objet de différentes formes galéniques en fonction des types d'ingestion, la voie orale étant préférée et dans ce cas, il convient d'adapter la forme à l'utilisateur final, nourrisson, enfant, adolescent ou adulte.
Ainsi, une composition particulièrement adaptée consiste à préparer une poudre soluble à reconstituer, un sirop, un comprimé, une capsule ou une gélule avec les dosages adaptés pour des prises de - 1,ug à 10 g/jour de sel de fer - 0,1,ug à 20 g/jour de prébiotique Une formule adaptée est indiquée ci-après chlorure ferrique : 7 mg fructo-oligosaccharide :1 200 mg support : qsp (quantité suffisante pour) arôme : qsp Une composition encore améliorée consiste à associer la lactoferrine et un prébiotique à un sel de fer. L'effet anti-bactérien de la lactoferrine est renforcé par le prébiotique ajouté mais simultanément, on obtient l'effet antioxydant de la lactoferrine qui manque aux prébiotiques. En effet, la lactoferrine se lie au fer libre, ce qui lui évite d'être oxydant.
L'absorption du fer est ainsi facilitée, sans augmenter inutilement les doses et en réduisant d'autant les effets secondaires.
Ainsi, une composition particulièrement adaptée consiste à préparer une poudre soluble à reconstituer, un sirop, un comprimé, une capsule ou une gélule avec les dosages adaptés pour des prises de - iijg à 10 g/jour de sel de fer - 0,1 g à 20 g/jour de lactoferrine - 0,1 g à 20 g/jour de prébiotique Une formule adaptée est indiquée ci-après chlorure ferrique : 7 mg lactoferrine : 10 mg fructo-oligosaccharide : i 200 mg support : qsp (quantité suffisante pour) arôme : qsp
Polypeptide de fusion comprenant une acétylcholinesterase monomérique liee a un récepteur protéique et polynucléotide codant pour un tel polypeptide. Application à la détection de molécules ligand.
La présente invention concerne un polypeptide de fusion comprenant un premier polypeptide constitué d'une acétylcholinestérase monomérique, lié de façon covalente à un second polypeptide constitué d'un récepteur protéique.
L'invention a aussi pour objet un polynucléotide codant pour un tel polypeptide de fusion, un vecteur de clonage et/ou d'expression contenant un tel polynucléotide ainsi qu'un hôte cellulaire recombinant contenant un tel vecteur.
L'invention vise également un procédé de détection d'une molécule ligand dans un échantillon à l'aide a'un polypeptide de fusion selon l'invention ainsi qu'une trousse de diagnostic pour la mise en oeuvre du procédé de détection selon l'invention.
Dans la présente description, les termes acét.ylcholinestérase et AChE seront Indifferemment employés pour désigner cette enzyme.
Depuis leur apparition il y a 20 ans, les techniques immunoen.zyrnatiques occupent une place prépondérante dans le domaine du dosage in vitro de nombreuses substances biologiques. L'utilisation d'un support solide favcrisant l'immobilisation de l'un des mmunoréactifs a révolutionné la reconnaissance fine d'un élément parfois peu représenté dans un échantillon biologique (Engvall et al., 1971 VanWeeman et al., 1971 ; Avraméas et al., 1971). Ces techniques sont aujourd'hui très largement mises en oeuvre dans de nombreux secteurs industri.el.s tels que notamment l'analyse des effluents industriels ou domestiques, l'analyse de la qualité de l'eau potable, de la qualité des produits agro-alimentaires et également en biologie clinique humaine ou vétérinaire dans des domaines aussi divers que l'hormonologie, les maladies auto-immunes, les marqueurs tumoraux ou les maladies infectieuses.
Le dosage d'analytes dans un échantillon à tester se fait principalement au moyen de traceurs enzymatiques constitués d'un antigène, un haptène ou tout ou partie d'un anticorps lié, de façon covalente, à une enzyme dont l'activité catalytique est détectable.
Afin de permettre un développement de tests fiables et reproductibles, une enzyme appropriée doit satisfaire les critères suivants - son activité spécifique doit être élevée pour des faibles concentrations de substrat et sa constante catalytique doit être également élevée - les produits résultant de l'activité catalytique de l'enzyme doivent pouvoir être détectés par spectro photométrie - cette enzyme doit avoir une bonne stabilité, quelle que soit la nature du milieu constituant l'échantillon à tester et doit ainsi rester biologiquement active dans une large gamme de conditions de pH, de force ionique et/ou de température - l'enzyme doit pouvoir être obtenue facilement, en grande quantité et à un coût réduit - le cas échéant, l'enzyme doit contenir des groupes réactifs libres par lesquels elle pourra être liée de manière covalente à d'autres protéines (haptènes, protéines) - elle doit être stable durant une conservation de longue durée - l'enzyme ne doit pas interagir de façon non spécifique avec une phase solide ou avec d'autres protéines - les substrats utilisés pour la détection colorimétrique doivent être stables, peu coûteux et les produits de réaction doivent pouvoir être détectés dans une large gamme de concentration.
Aujourd'hui, quatre enzymes sont couramment utilisées comme constituants de traceurs enzymatiques 1) La peroxydase de raifort est l'enzyme la plus utilisée, du fait de ses caractéristiques avantageuses de cinétique enzymatique rapide et de ses limites de détection comprises entre 10-14 et 10-17 M. Cependant, cette enzyme est peu stable et son activité enzymatique est rapidement inhibée par les produits de réaction, ce qui limite le temps d'incubation de l'enzyme avec son substrat. Elle est aussi très sensible aux métaux et est facilement inactivée par certains milieux comme l'urine.
Enfin, il peut y avoir une interférence avec des peroxydases présentes dans l'échantillon à doser.
De façon préférée, ladite relation est: s = kl(s).k2(s).O o s est une coordonnée curviligne de la plaque galbée; kl(s) est ladite loi d'évolution de l'éclairement; k2(s) est ladite loi d'évolution des coefficients de transmission; et 0 est un angle, mesuré par rapport à une référence, définissant ladite orientation d'un rayon issu de la source. D'autres aspects, buts et avantages de la présente invention apparaîtront mieux à la lecture de la
préférées de celle-ci, donnée à titre d'exemple et faite en référence aux dessins annexés, sur lesquels: la figure 1 est une vue schématique en coupe horizontale d'un feu de signalisation selon la présente invention, la figure 2 est une vue schématique en coupe verticale du feu de signalisation de la figure 1, la figure 3 est une vue en perspective d'un ballon de traitement optique appartenant au feu de signalisation des figures 1 et 2, les figures 4a à 4c sont des vues de détail illustrant trois types d'aménagements optiques d'une plaque intermédiaire d'un feu de signalisation selon l'invention et leurs comportements optiques respectifs, et les figures 5a à 5d illustrent différents comportements optiques de feux de signalisation de l'invention en matière d'éclairement de leur plage éclairante. En référence aux figures 1 à 3, on a représenté un feu de signalisation qui comprend un boîtier ou socle 40 fermé par une glace ou voyant 50, une lampe 10 à filament incandescent 12 montée dans le socle, une plaque optique intermédiaire 20 s'étendent essentiellement le long du voyant et un ballon de traitement optique 30 généralement
cylindrique entourant étroitement la lampe 10.
On observe ici que le voyant 50 et la plaque 20, qui s'étendent à distance essentiellement constante l'un de l'autre, adoptent une forme galbée, dont la concavité est
tournée vers l'intérieur.
On observe également que le feu possède une largeur très importante et une hauteur réduite, pour donner lieu à une plage éclairante horizontale très allongée, ce qui est intéressant notamment sur le plan du style et de
l'encombrement.
Le ballon 30 comporte des aménagements optiques intérieurs, en forme de stries généralement circulaires 34 épousant la face intérieure du ballon, et dont la forme en section verticale correspond à celle d'une lentille cylindrique de Fresnel, ces aménagements étant aptes à redresser les rayons lumineux émis par le filament 12 vers le haut et vers le bas de manière telle qu'ils se propagent dans des plans généralement horizontaux (voir figure 2). Ces aménagements 34 n'ont en revanche sensiblement pas d'effet sur la répartition
horizontale du rayonnement.
Le ballon 30 comporte sur sa face externe des aménagements 32 destinés à assurer une répartition horizontale déterminée de la lumière en direction de la plaque optique 20, ceci de manière à ce que les variations de l'éclairement du feu horizontalement le long de sa plage éclairante répondent à une loi
prédéterminée comme on le verra en détail plus loin.
La plaque 20 comporte quant à elle des aménagements optiques soit internes (22), soit externes (23), destinés à redresser la lumière issue du ballon 30 de manière à ce qu'elle se propage avec une direction moyenne parallèle à l'axe du feu, noté x-x, correspondant en général à l'axe
longitudinal du véhicule.
Selon un aspect essentiel de l'invention, on tient compte d'une part du galbe de la plaque 20, et d'autre part de certaines propriétés de transmission lumineuse par celui-ci, pour réaliser la loi de répartition
horizontale de la lumière par les aménagements 32.
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