INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les produits particulièrement préférés pour une utilisation selon l'invention seront donc les suivants : - le disulfure de bis-1,1'-[7-(2-amino-1-oxo-3-thiopropyl)-8-(cyclohexylméthyl)-2-(2- méthoxyphényl)-5,6,7,8-tétrahydroimidazo[1,2a]pyrazine ; - le disulfure de bis-l,l'-7-(2-amino-l-oxo-3-thiopropyl-(2-(l-naphtyl)-8-(2- méthylpropyl)-5,6,7,8-tétrahydroimidazo[l ,2a]pyrazin-7-yle) ; - le composé de formule : - la 7-(2-amino-1-oxo-3-thiopropyl)-8-(cyclohexylméthyl)-2-(2-méthylphényl)-5,6,7,8- tétrahydroimidazo[l,2a]pyrazine ; - la 7-(2-amino-1-oxo-3-thiopropyl)-8-(cyclohexylméthyl)-2-phényl-5,6,7,8- tétrahydroimidazo[1,2a]pyrazine ; - la 7-(2-amino-l-oxo-3-thiopropyl)-2-(2-méthoxyphényl)-8-(phénylméthoxy)méthyl- 5,6,7,8-tétrahydroimidazo[1,2a]pyrazine ; - la 7-(2-amino-l-oxo-3-thiopropyl)-2-(2-méthoxyphényl)-8-(l-phénylméthoxyéthyl- 5,6,7,8-tétrahydroimidazo(1,2a]pyrazine ; - la 7-(2-amino-1-oxo-3-thiopropyl)-2-(2-méthoxyphényl)-8-(phénoxyéthyl)-5,6,7,8- tétrahydroimidazo[l,2a]pyrazine ; - la 7-(2-amino-1-oxo-3-thiopropyl)-2-(2-méthyoxyphényl)-8-(phénoxyéthyl)-5,6,7,8- tétrahydro-imidazo[1,2a]pyrazine, ou sa forme dimérique ;
- et la 7-(2-amino-1-oxo-3-thiopropyl}-2-(2-méthoxyphényl)-8-(phénylsulfonyléthyl)- 5,6,7,8-létrahydroimidazo[ l,2a]pyrazine ; - ou un sel pharmaceutiquement acceptable d'un de ces derniers.
De même, l'invention concerne plus particulièrement l'utilisation des composés précédement cités pour préparer un médicament destiné à traiter le choléra, le sarcome de Kaposi, le Syndrome Immuno-Déficitaire Acquis (SIDA), la diarrhée du voyageur, les adénomes hyperfonctionnels de la thyroïde, la puberté précoce familiale masculine.
Les composés de formule générale (A) et leur préparation sont décrits dans la demande de brevet WO 97/30053 ou dans les exemples ci-après. Les composés de formule générale (B) et leur préparation sont décrits dans la demande de brevet WO 96/21456.
Les compositions pharmaceutiques comprenant un composé de l'invention peuvent être sous forme de solides, par exemple des poudres, des granules, des comprimés, des gélules, des liposomes ou des suppositoires. Les supports solides appropriés peuvent être, par exemple, le phosphate de calcium, le stéarate de magnésium, le talc, les sucres, le lactose, la dextrine, l'amidon, la gélatine, la cellulose, la cellulose de méthyle, la cellulose carboxyméthyle de sodium, la polyvinylpyrrolidine et la cire.
Les compositions pharmaceutiques comprenant un composé de l'invention peuvent aussi se présenter sous forme liquide, par exemple, des solutions, des émulsions, des suspensions ou des sirops. Les supports liquides appropriés peuvent être, par exemple, l'eau, les solvants organiques tels que le glycérol ou les glycols, de même que leurs mélanges, dans des proportions variées, dans l'eau.
L'administration d'un médicament selon l'invention pourra se faire par voie topique, orale, parentérale, par injection (intramusculaire, sous-cutanée, intraveineuse,etc.), etc.
Dans la méthode de renforcement de l'activité anti-tumorale de remèdes bruts, on grille tout d'abord par des rayons dans l'infrarouge lointain des champignons contenant P-glucane, on leur ajoute ensuite des micro-organismes tels que "Koji", etc. et on les soumet à fermentation dans des conditions prédéterminées d'humidité et de température. Lorsque l'étape de fermentation est terminée, le produit résultant est transformé de façon appropriée en une fine poudre et cette fine poudre est revêtue d'un composant huileux obtenu en comprimant et en pressant du sésame qui a été grillé par des rayons dans l'infrarouge lointain pour préparer un agent huileux.
En ce qui concerne les champignons autres que l'agaricus, on n'observe pas de différence aussi significative dans l'efficacité, qu'ils soient utilisés à l'état brut ou à l'état séché qui était jusqu'ici prévu dans la médecine chinoise, lorsqu'on leur applique la méthode de renforcement de l'activité anti-tumorale de la présente invention ; de ce fait, dans le présent exemple, on utilise des produits séchés en ce qui concerne PORIA (BUKURYO), POLYPORUS (CHOREIMAITAKE, Polyporus umbellatus FRIES), champignon maitake (noir, MAITAKE, Grifola frondosu Dickson), champignon matsutake (MATSUTAKE, Tricholoma matsutake) et champignon shiitake (SHIITAKE, Cortinellus Shiitake).
D'autre part, le champignon maitake (MAITAKE, Grifola frondosu Dickson) obtenu en Chine est mentionné comme POLYPORUS (CHOREIMAITAKE, Polyporus umbellatus FRIES) dans la présente spécification et il est distingué du champignon maitake mentionné ci-dessus (noir) lorsque c'est nécessaire. En particulier, on utilise principalement une racine dans POLYPORUS (CHOREIMAITAKE, Polyporus umbellatus FRIES) .
La première étape de la méthode de renforcement de l'activité anti-tumorale du présent exemple est une étape de grillage par rayons dans l'infrarouge lointain, étape dans laquelle les divers types de champignons mentionnés ci-dessus sont grillés en étant soumis à des rayons dans l'infrarouge lointain. Les rayons dans l'infrarouge lointain utilisés dans cette étape de grillage sont de préférence des rayons dans l'infrarouge lointain ayant une longueur d'onde d'environ 4 à 14 pm. Les champignons sont grillés en utilisant un appareil tel qu'une poêle, un four, etc. sur la surface intérieure duquel est appliqué un revêtement céramique qui rayonne dans l'infrarouge lointain avec une longueur d'onde dans cette plage ; un tel appareil, tel qu'une poêle, un four, etc. peut être préparé en mélangeant de la poudre céramique rayonnant dans l'infrarouge lointain avec du gravier, du sable, etc. d'oxydes métalliques.
Comme méthode de grillage, celle-ci n'est pas limitée à la méthode mentionnée ci-dessus et on peut utiliser toute méthode pour autant qu'elle facilite la libération du p-glucane des champignons. Par exemple, comme source de rayons dans l'infrarouge lointain à utiliser pour le grillage, outre les appareils mentionnés ci-dessus, on peut utiliser d'autres appareils pour autant qu'ils comprennent un matériau qui rayonne des rayons dans l'infrarouge lointain avec une longueur d'onde de 4 à 14 pm, tel que la fibre d'onde électromagnétique de platine, etc.
Selon l'invention, le ou les polymères cationiques peuvent représenter de 0,005 % à 10 % en poids, de préférence de 0,01% à 5 % en poids, et encore plus préférentiellement de 0,1 % à 3 % en poids, du poids total de la composition finale.
Les compositions de l'invention peuvent contenir en outre avantageusement au moins un autre agent tensioactif choisis parmi les agents tensioactifs anioniques de type phosphate, sulfonate et/ou sulfate, ne comprenant pas de fonction carboxylique, les tensioactifs amphotères, les tensioactifs non-ioniques, les tensioactifs cationiques ou leurs mélanges.
Les tensioactifs additionnels convenant à la mise en oeuvre de la présente invention sont notamment les suivants : (i) Tensioactif (s) anionique(s) ne comprenant pas de fonction carboxylique.
A titre d'exemple, on peut citer les sels (en particulier sels alcalins, notamment de sodium, sels d'ammonium, sels d'amines, sels d'aminoalcools ou sels de magnésium) des composés suivants les alkylsulfates, les alkyléthersulfates, alkylamidoéthersulfates, alkylarylpolyéthersulfates, monoglycérides sulfates ; les alkylsulfonates, alkylphosphates, alkylamidesulfonates, alkylarylsulfonates, a-oléfinesulfonates, paraffine-sulfonates ; les alkylétherphosphates; les alkyl sulfosuccinamates, les acyl iséthionates, les acyltaurates, le radical alkyle de tous ces différents composés comportant de préférence de 8 à 24 atomes de carbone, et le radical aryl désignant de préférence un groupement phényle ou benzyle, et leurs mélanges (ii) Tensioactif (s) non ionique(s) : Les agents tensioactifs non-ioniques sont, eux aussi, des composés bien connus en soi (voir notamment à cet égard "Handbook of Surfactants" par M. R. PORTER, éditions Blackie & Son (Glasgow and London), 1991, pp 116-178) et leur nature ne revêt pas, dans le cadre de la présente invention, de caractère critique. Ainsi, ils peuvent être notamment choisis parmi (liste non limitative) les alcools, les alpha-diols, les alkylphénols ou les acides gras polyéthoxylés, polypropoxylés ou polyglycérolés, ayant une chaîne grasse comportant par exemple 8 à 18 atomes de carbone, le nombre de groupements oxyde d'éthylène ou oxyde de propylène pouvant aller notamment de 2 à 50 et le nombre de groupements glycérol pouvant aller notamment de 2 à 30. On peut également citer les copolymères d'oxyde d'éthylène et de propylène, les condensats d'oxyde d'éthylène et de propylène sur des alcools gras ; les amides gras polyéthoxylés ayant de préférence de 2 à 30 moles d'oxyde d'éthylène, les amides gras polyglycérolés comportant en moyenne 1 à 5 groupements glycérol et en particulier 1,5 à 4 , les amines grasses polyéthoxylées ayant de préférence 2 à 30 moles d'oxyde d'éthylène ; les esters d'acides gras du sorbitan oxyéthylénés ayant de 2 à 30 moles d'oxyde d'éthylène ; les esters d'acides gras du sucrose, les esters d'acides gras du polyéthylèneglycol, les alkylpolyglycosides, les dérivés de N-alkyl glucamine, les oxydes d'amines tels que les oxydes d'alkyl (C10 C14) amines ou les oxydes de N-acylaminopropylmorpholine. On notera que les
alkylpolyglycosides constituent des tensioactifs non-ioniques rentrant particulièrement bien dans le cadre de la présente invention.
(iii) Tensioactif (s) amphotère (s): Les agents tensioactifs amphotères additionnels peuvent être notamment (liste non limitative) des dérivés d'amines secondaires ou tertiaires aliphatiques, dans lesquels le radical aliphatique est une chaîne linéaire ou ramifiée comportant 8 à 22 atomes de carbone et contenant au moins un groupe anionique hydrosolubilisant (par exemple carboxylate, sulfonate, sulfate, phosphate ou phosphonate) ; on peut citer encore les alkyl (C8-C20) bétaines, les sulfobétaïnes, les alkyl (C8-C20) amidoalkyl (Ci-Ce) bétaïnes ou les alkyl (Ca-C2o) amidoalkyl (Ci-Ce) sulfobétaïnes.
Parmi les dérivés d'amines, on peut citer les produits commercialisés sous les dénomination MIRANOL, tels que décrits dans les brevets US-2 528 378 et US-2 781 354 et de structures : R2 -CONHCH2CH2 -N(R3)(R4)(CH2COO-) (2) dans laquelle R2 désigne un radical alkyle dérivé d'un acide R2-COOH présent dans l'huile de coprah hydrolysée, un radical heptyle, nonyle ou undécyle, R3 désigne un groupement bêta-hydroxyéthyle et R4 un groupement carboxyméthyle ; et Rs-CONHCH2CH2-N(B)(C) (3) dans laquelle B représente -CH2CH20X', C représente -(CH2)z -Y', avec z = 1 ou 2, X' désigne le groupement -CH2CH2-COOH ou un atome d'hydrogène Y' désigne -COOH ou le radical -CH2 - CHOH - S03H R5 désigne un radical alkyle d'un acide Rg -COOH présent dans l'huile de coprah ou dans l'huile de lin hydrolysée, un radical alkyle, notamment en C7, Cg, C11 ou C13, un radical alkyle en C17 et sa forme iso, un radical C17 insaturé.
Ces composés sont classés dans le dictionnaire CTFA, 5ème édition, 1993, sous les dénominations Disodium Cocoamphodiacetate, Disodium Lauroamphodiacetate, Disodium Caprylamphodiacetate, Disodium Capryloamphodiacetate, Disodium Cocoamphodipropionate, Disodium Lauroamphodipropionate, Disodium Caprylamphodipropionate, Disodium Capryloamphodipropionate, Lauroamphodipropionic acid, Cocoamphodipropionic acid.
A titre d'exemple on peut citer le cocoamphodiacetate commercialisé sous la dénomination commerciale MIRANOL C2M concentré par la société RHONE POULENC.
Parmi les tensioactifs anioniques, on préfère utiliser les sels d'alkyléthersulfates en C8-C14 et plus particulièrement ceux en C12-C14. Ces sels comprennent notamment de 2 à 5 groupements d'oxyde d'éthylène. On utilise de préférence un agent tensioactif anionique choisi parmi les alkyl (C12-C14)éthersulfates de sodium, de triéthanolamine ou d'ammonium oxyéthylénés à environ 2,2 moles d'oxyde d'éthylène.
Selon la présente invention, on préfère plus particulièrement utiliser les agents tensioactifs amphotères appartenant au groupe des bétaines tels que les alkylbétaïnes en particulier la cocoylbétaïne commercialisée sous la dénomination DEHYTON AB 30 en solution aqueuse à 30 % de MA par la société HENKEL ou les alkylamidobétaines telles que la TEGOBETAINE# F50 commercialisée par la société GLODSCHMIDT.
Le (s) agent (s) tensioactif (s) anionique (s) de type carboxylate sont généralement présents à raison de 3 à 50 % en poids, de préférence de 3 à 20 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
Le (s) agent (s) tensioactif (s) anionique (s) ne contenant pas de groupement carboxylate sont généralement présents à raison de 1 à 30 % en poids, de préférence de 3 à 15 % en poids, par rapport au poids total de la composition.
Le (s) agent (s) tensioactif (s) amphotère (s) ou non ioniques sont généralement présents à raison de 0,5 à environ 15% en poids, de préférence de 1 à 5% en poids, par rapport au poids total de la composition.
Le rapport en poids tensioactifs de type carboxylate/totalité des tensioactifs peut varier de 0,1à 1 et de préférence de 0,2 à 1.
Dans la composition selon la présente invention, la totalité des tensioactifs détergents représente généralement de 3 à 50% en poids et de préférence de 5 à 30% en poids par rapport au poids total de la composition.
L'image supplémentaire g0 est identique à celle considérée à l'étape E4 précédemment décrite, et est par exemple une image uniformément grise.
Si la réponse est négative à l'étape E91, cette dernière est suivie de l'étape E93, de même que l'étape E92 est suivie de l'étape E93. L'étape E93 est l'initialisation du paramètre m à 1, pour considérer le premier bloc à reconstruire. Les blocs sont de préférence traités dans le même ordre qu'à la compression, ce qui évite d'avoir à mémoriser et à traiter un indice, ou des coordonnées, pour repérer les blocs.
L'étape suivante E94 est la division de l'image de référence 9n-1 en blocs de pixels adjacents, qui sont les blocs source mémorisés en mémoire 55.
L'étape E94 est identique à l'étape 35. L'étape suivante E95 est la sélection de blocs source Dn 1,m,1 à Dn 1,m,K dans l'image de référence gn-i, relativement au bloc à reconstruire ARnm. L'image de référence est sélectionnée de la même manière que pour le codage, avec les mêmes variantes possibles. Selon le mode préféré de réalisation, L'image de référence 9n.i est l'image décodée précédant l'image f'. Les blocs source sont sélectionnés de la même manière que pour le codage (étape E35), avec les mêmes variantes possibles.
L'étape E95 est suivie de l'étape E96 à laquelle la transformation Tn,m définie par les fonctions an m,k et bn,m est appliquée aux blocs source Dn 1,m,1 à Dn-1,m,K sélectionnés à l'étape précédente E95, selon la formule: ARn,m Ck ( a n,m,k X Dn-1,m,k ) + bn,m.
L'étape E96 a pour résultat le bloc décodé ARn,m mémorisé en mémoire 55.
L'étape suivante E97 est un test pour déterminer si le bloc qui vient d'être décompressé est le dernier de l'image en cours de décompression. Si ce n'est pas le cas, l'étape E97 est suivie de l'étape E98 à laquelle le paramètre m est incrémenté de une unité pour considérer le bloc suivant. L'étape E98 est suivie de l'étape E95 précédemment décrite.
Lorsque tous les blocs de l'image en cours ont été décompressés, L'étape E97 est suivie de l'étape E99 à laquelle l'image décompressée gn est reconstruite et par exemple affichée sur un écran, et/ou mémorisée. De manière générale, L'étape E99 est le transfert de l'image 9n aux moyens utilisateurs 6.
L'étape E10 de décodage d'une image en mode intra-image est détaillée en référence à la figure 15 sous la forme d'un algorithme comportant des étapes E101 <RTI
A partir de l'étape suivante E103, on considère la forme compressée hni de l'image. L'étape E103 est la lecture de la forme compressée hin, et l'initialisation du paramètre m à 1, pour considérer le premier bloc à reconstruire. Les blocs sont de préférence traités dans le même ordre qu'à la compression, ce qui évite d'avoir à mémoriser et à traiter un indice, ou des coordonnées, pour repérer les blocs.
L'étape suivante E104 est la division de l'image de référence pi 1n en blocs de pixels adjacents, qui sont les blocs source mémorisés en mémoire 55.
L'étape E104 est identique à l'étape E46. L'étape suivante E105 est la sélection de blocs source Dn,m,1i-1 à Dn,m,Ki-1 dans l'image de référence p11 n, relativement au bloc à reconstruire ARn,mi de l'image à décompresser hin. L'image de référence est sélectionnée de la même manière que pour le codage. Selon le mode préféré de réalisation, L'image de référence pni-1 est l'image décodée précédent l'image pin. Les blocs source sont sélectionnés de la même manière que pour le codage, avec les mêmes variantes possibles.
L'étape E105 est suivie de l'étape E106 à laquelle la transformation Tn,mi définie par les paramètres an,m,ki et bn,mi est appliquée aux blocs source D1 n,m,11 à il n,mK sélectionnés à l'étape précédente E105, selon la formule: ARinm Ck ( an,m,ki x Dn,m,ki-1 ) + b'n.m.
L'étape E106 a pour résultat le bloc décompressé ARinm mémorisé en mémoire 55.
L'étape suivante E107 est un test pour déterminer si le bloc qui vient d'être décompressé est le dernier de l'image en cours de décompression. Si ce n'est pas le cas, l'étape E107 est suivie de l'étape E108 à laquelle le paramètre m est incrémenté de une unité pour considérer le bloc suivant. L'étape E108 est suivie de l'étape E105 précédemment décrite.
Lorsque tous les blocs de l'image en cours ont été décompressés, L'étape E107 est suivie de l'étape E109 à laquelle l'image décompressée Pin est reconstruite et par exemple affichée sur un écran, et/ou mémorisée. De manière générale, L'étape E109 est le transfert de l'image pin aux moyens utilisateurs 6.
Le phare selon l'invention a ainsi l'avantage que grâce à l'utilisation de la lumière émise aussi par la source
de lumière additionnelle servant à la production de la lu-
mière de délimitation, on améliore l'éclairage de l'élément.
Selon d'autres caractéristiques de l'invention: * l'une au moins des sources de lumière additionnelles est disposée sur une zone de bordure qui fait saillie sur le bord antérieur du réflecteur qui est tourné dans le sens de sortie de la lumière, perpendiculairement au sens de sortie de la lumière, * les profils optiques de l'élément sont constitués en forme d'anneau pour former au moins une lentille de Fresnel, * les profils optiques en forme d'anneaux sont constitués au moins approximativement de façon concentrique à au moins l'une des sources de lumière additionnelles, * les profils optiques en forme d'anneaux sont constitués au moins approximativement de façon concentrique à la source de lumière, * on dispose sur au moins une partie du trajet des rayons de la lumière qui est passée à travers l'élément une couche au moins en partie réfléchissante qui est tournée dans le sens de sortie de la lumière, e on dispose sur au moins une partie du trajet des rayons de
la lumière qui est passée à travers l'élément d'autres pro-
fils optiques qui dévient la lumière qui les traverse, et * celle-ci éclaire une zone en avant du véhicule au dessus de la limite du clairobscur de la lumière réfléchie par le réflecteur et qui est passée à travers la lentille. Dessins La présente invention va être décrite ci-après plus en détail à partir de plusieurs exemples de réalisation représentés sur les dessins annexés dans lesquels: * la figure 1 montre, en coupe longitudinale verticale, un phare selon un premier exemple de réalisation; * la figure 2 montre le phare selon une vue dans le sens de la flèche II de la figure 1, * la figure 3 montre le phare selon une vue dans le sens de la flèche II de la figure 1, correspondant à un exemple de réalisation modifié; * la figure 4 montre le phare selon un deuxième exemple de réalisation dans une coupe longitudinale verticale;
* la figure 5 montre le phare correspondant à un mode de réa-
lisation modifié, selon une coupe longitudinale verticale; et * la figure 6 montre un écran de mesure disposé en avant du
phare et éclairé par la lumière émise par le phare.
Un phare, représenté sur les figures 1 à 5, pour des véhicules tels qu'en particulier des véhicules à moteur, est construit selon le principe de projection de la lumière et sert à produire au moins la lumière des feux de croisement du véhicule. Le phare présente un réflecteur 10 en matière plastique ou en métal, dans lequel est insérée une source de lumière 12 placée dans la zone de son sommet. La source de
lumière 12 peut être une lampe à incandescence, une lampe lu-
minescente à gaz, ou autre lampe appropriée. On a disposé,
après le réflecteur 10 vu dans le sens de la sortie de la lu-
mière, une lentille 16 en verre ou en matière plastique qui
peut par exemple présenter un côté plan 18 tourné vers le ré-
Pour la transformation, un aliquot a été décongelé et 50 fil ont été prélevés puis transférés dans un tube de 15 ml.
Un à 10 g d'ADN plasmidique pBII, préparé à l'exemple 2 à partir de la souche E. coli DH5aMRC ont été mis en solution dans 5 à 10 /il de tampon TE (Tris HC1 10 mM pH 7,5, EDTA 1 mM) puis déposés sur la paroi du tube incliné auquel a été ensuite ajouté 0,5 ml d'une solution de PEG 3350 dans le tampon PT préparée extemporanément à partir d'une solution aqueuse à 50 % que l'on dilue au demi dans le tampon 2 x PT.
Après dilution avec 3 à 5 ml de tampon PT puis centrifugation à 2500 rpm pendant 15 mn, le culot a été dissocié dans 0,5 ml de tampon PT et la suspension de protoplastes transformés ainsi obtenue a été immédiatement répartie sur 2 ou 3 boites R2T2 très sèches (3 h sous une hotte à flux laminaire). Les boites ont été ensuite incubées à 32 C pendant 16 à 24 h jusqu'à apparition du voile de régénération des protoplastes.
A partir d'une solution stock de thiostrepton (Sigma) à 50 mg/ml dans le DMSO, une quantité appropriée a été diluée dans 0,5 à 1 ml d'eau puis étalée sur les boites de façon à obtenir une concentration finale de 20 g de thiostrepton/ml de gélose. Après absorption complète de l'antibiotique, les boîtes ont été incubées à 32 C pendant 3 à 4 jours, ce qui permet la visualisation des transformants. Les boîtes ont encore été incubées plusieurs jours jusqu'à développement
complet des spores.
La sélection des intégrants correspondant au premier événement de recombinaison (figure 4) a été réalisée par réplication des boîtes sporulées à l'aide de velours ou par étalement d'une suspension des spores sur des boîtes R2T2 contenant du thiostrepton puis incubation à 32 C, ce qui permet la croissance des clones d'intégrants potentiels.
Pour la sélection de clones ayant subi un deuxième événement de recombinaison (figure 4), 5 à 10 clones résistants au thiostrepton obtenus ci-dessus ont été mis en culture dans 8 ml de milieu liquide TSB à 30 C pendant 3 à 4 jours. 50 à 100 fil ont été prélevés et remis en culture dans les mêmes conditions. Après 4 cycles successifs de dilution et culture destinés à favoriser la perte du marqueur de résistance au thiostrepton, des protoplastes ont été préparées à partir des cellules comme indiqué ci-dessus, de façon à chasser le plasmide. Les protoplastes ont ensuite été étalés sur des boîtes R2T2 de façon à obtenir des colonies individualisées dont la sensibilité au thiostrepton a été déterminée par réplique sur des boîtes R2T2 contenant du thiostrepton.
Parmi les colonies sensibles au thiostrepton, la sélection des mutants ayant le phénotype ery- a été réalisée par antibiogramme sur la souche B. pumilus ATCC 14884 sensible à l'érythromycine. La souche B. pumilus a été utilisée comme souche indicatrice pour évaluer la production d'érythromycine dans des essais biologiques par antibiogramme. Les colonies ont été étalées à l'anse de platine sur des boîtes R2T2, puis incubées pendant 3 à 4 jours à 30 C. Des zones d'agar où le mutant a poussé à confluence ont ensuite été prélevées à l'emporte pièce puis placées sur des boîtes A-Merck recouvertes d'une surcouche de 4 ml de 0,5 x A Merck (Antibiotic agar N 1 Merck) inoculée d'une suspension de spores de B. pumilus, puis incubées une nuit à 37 C.