INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
P CMV : promoteur du cytomegalvirus P T7 : promoteur du bactériophage T7 P SP6 : promoteur pSP6 ColE1 : origine de réplication fonctionnelle dans Escherichia coli provenant du plasmide pUCi9 SV40 polyA : site de polyadénylation ; Amp R : gène de la beta lactamase conférant un phénotype de résistance à l'ampiciiine P SV40 ori : origine de réplication de SV40 pour une expression épisomale transitoire dans des cellules exprimant l'antigène T de SV40.
Les promoteurs P T7 et P SP6 sont localisés de part et d'autre du site de clonage multiple détaillé sur la figure et orientés en sens opposés.
Le polynucléotide de séquence SEQ ID N04, sous une forme double brin est inséré, dans le sens 5' vers 3', entre le site EcoRI et le site NotI du site de clonage multiple représenté sur cette Figure. En conséquence, les sites EcoRV et BstXI situés entre les sites EcoRI et NotI sont supprimés au moment de l'introduction de l'insert de séquence SEQ ID N 4.
Matériel et Méthodes I. Matériel L'acétylthiocholine et l'acide 5-5'-dithio-bis(2nitrobenzoïque) sont commercialisés par Sigma (St Louis, Missouri, USA).
Les enzymes utilisées pour la construction des plasmides sont commercialisées par Boehringer-Mannheim (Allemagne) et par Promega Biotech (Madison, USA).
L'anticorps monoclonal 9E10 anti-cmyc est commercialisé par Pharmingen (San Diego, USA).
La crotoxine ainsi que la sous-unité CA de la crotoxine ont été purifiés à partir du venin de Crotalus durissus terri fi cus comme décrit précédemment (Hendon et al., 1971 ; Faure et al., 1991).
Les autres réactifs et les solvants de haute pureté sont respectivement commercialisés par Merck (Darmstadt, Allemagne), Sigma (St Louis, Missouri, USA) et par Prolabo (Paris, France). Les plaques de microtitration ont été obtenues auprès de Nunc (Roskilde, Danemark).
Il. Méthodes A) Production du gene chimérique codant l'AChE et le scFv.
Un ADNc codant l'AChE du venin de B. fasciatus a été isolé à partir d'une banque d'ADNc clonée dans le plasmide pT3T7 (Pharmacia), cette banque d'ADNc ayant été construite après digestion par les enzymes EcoRI et NotI (Cousin et ai., 1996a) . Un fragment codant le domaine catalytique (allant du nucléotide en position 204 au nucléotide en position 1946 de la séquence décrite par Cousin et al., 1996a) a été introduit entre les sites EcoRI et NotI du plasmide pcDNA3 (Invitrogen) résultant en le plasmide pCB1, plasmide qui a été utilisé comme témoin négatif (Cousin et al., 1996a). Le gène chimère a été obtenu par réaction PCR, en utilisant une amorce aller de séquence identique à la séquence allant du nucléotide en position nit1641 au nucléotide nt1664 inclus de la séquence décrite par Cousin et ai. (1996a) (5'-GGATTGCCGCTCAACGACAGCCTG-3') et une amorce retour hybridant avec la séquence complémentaire de la séquence allant du nucléotide en position nt 1946 au nucléotide en position nt 1884 de la séquence décrite par Cousin et al. (1996a) (3' TTTGACGACTTGCGGTGTCTTGTTTTTGAGTAGAGTCTTCTCCTAGACTTACGCCGGGT CGGCCGGTAC-5') du gène de l'AChE de B. fasciatus. Cette dernière amorce comprend, du côté 5', et dans le sens 3' vers 5', une séquence complémentaire de la séquence codant pour le peptide cMyc ainsi qu'une séquence complémentaire de la séquence reconnue par l'enzyme de restriction SfiI sur le brin codant. La région codant pour le peptide cMyc ainsi que le site de restriction SfiI sont ainsi ajoutés à cette étape. L'amplicon résultant contient donc la séquence codante du polypeptide cMyc et le site de restriction SfiI.
Le fragment amplifié est cloné dans pGEM-T. Ce fragment contient l'extrémité 3' de l'AChE fusionné avec la séquence codante de cmyc et le site sfiI. Ce plasmide est digéré par BGlII et NotI (le site NotI est dans le vecteur pGEM-T) et le fraqment est transféré dans pT3T7 à la place du fragment Bgl.II-notI d'AChE. On obtient alors le vecteur pT3T7-AChE-cmyc.
* Le plasmide résultant est ensuite digéré par BamHI et NotI, et le fragment obtenu est introduit dans le vecteur pCB1 (à la place du fragment AChE correspondant).
Le gène codant scFv I12, le fragment de l'anticorps spécifique de la sous-unité CA de la crotoxine, est ensuite introduit entre les sites SfiI et NotI du fragment pC-AChEcMyc afin d'obtenir la construction pC-AChE-scFv, un plasmide qui contient le gène chimère (Fig. l).
B) Transfection dans les cellules COS.
Toutes les rétrogradations, par exemple les changements de vitesse 2 - 1, 3 - 2, 4 - 3, 5 - 4, se déroulent de façon analogue à ce qui vient d'être indiqué pour le changement de vitesse AR - 1, étant entendu que la position des butées doit être commandée pour définir la rétrogradation. La rainure visée ou à atteindre, est toujours définie d'abord par le positionnement de M1 et M2, et la position désirée est établie ensuite par les forces des ressorts. Toutefois, la pièce de pression D1 forme toujours la butée pour l'axe de changement de vitesse WS1, lequel est toujours poussé vers la gauche par le ressort F2 lors de rétrogradations. Au passage à des vitesses supérieures, l'accumulateur fournit, comme décrit dans les exemples, l'énergie pour la sélection par le ressort F1.
La course d'actionnement ou de manoeuvre nécessaire pour charger l'accumulateur d'énergie 140, dans l'exemple selon la figure 2, est de préférence plus petite, ce qui peut être obtenu par le choix approprié des rapports de transmission et de la conception des pièces, que la course à partir du plan neutre jusqu'au point de synchronisation de la boîte de vitesses.
Les revendications déposées conjointement avec la demande sont des propositions de formulation sans préjudice pour l'obtention d'une protection plus étendue. La demanderesse se réserve la possibilité de revendiquer encore d'autres caractéristiques, jusqu'à présent divulguées seulement dans la description et/ou sur les dessins.
Les revendications dépendantes se rapportent au développement de l'objet de la revendication principale par les caractéristiques de la revendication dépendante concernée; elles ne doivent pas être comprises comme une renonciation à l'obtention d'une protection autonome de l'objet des caractéristiques des revendications dépendantes en question.
Les objets de ces revendications dépendantes forment cependant aussi des inventions autonomes dont la réalisation est indépendante des objets des précédentes revendications dépendantes.
L'invention n'est pas non plus limitée aux exemples de réalisation de la description. De nombreux changements et de nombreuses modifications sont au contraire possibles dans le cadre de l'invention. Il s'agit en particulier de variantes, éléments et combinaisons et/ou matériaux qui, par exemple par combinaison ou changement de différentes caractéristiques ou de différents éléments ou étapes de procédés décrits en liaison avec la description générale, les modes de réalisation ainsi que les revendications et contenus dans les dessins, ont une valeur inventive et peuvent conduire, par des caractéristiques susceptibles d'être combinées, à un nouvel objet ou à de nouvelles étapes de procédés ou de suites d'étapes de procédés, y compris dans la mesure où ils ou elles concernent des procédés de fabrication, de contrôle et de fonctionnement.
La présente invention vise un réflecteur pour feu de véhicules et plus particulièrement un réflecteur pour feu arrière anti-brouillard.
Les réflecteurs présentent une surface interne réfléchissante parfaitement polie et, par conséquent, sont relativement onéreux.
On sait réaliser des réflecteurs dont la surface réfléchissante est constituée par le dépôt d'une simple couche d'une peinture réfléchissante. Mais de tels réflecteurs, beaucoup moins onéreux, ont des performances très médiocres et ne peuvent pas être utilisés pour de nombreuses applications dans l'automobile lorsque, notamment, on doit obtenir une certaine densité lumineuse.
L'un des buts de la présente invention est de réaliser un réflecteur qui comporte une surface réfléchissante constituée par une simple couche d'une peinture réfléchissante et qui permet d'avoir néanmoins des performances suffisantes pour de nombreuses utilisations dans l'automobile.
Le réflecteur, selon l'invention, est du type disposé dans un compartiment d'un ensemble de signalisation et masqué par une glace colorée et dans lequel s'étend une lampe à incandescence, et est caractérisé en ce qu'il comprend quatre secteurs formant deux demi-réflecteurs de révolution à génératrices spiralées enroulés au même niveau autour d'un axe commun de révolution.
Grâce à cette disposition, on obtient des faisceaux convergents vers une zone déterminée et ayant, dans cette zone, une densité importante, bien que la surface réfléchissante n'ait pas la qualité des surfaces métallisées.
Un tel réflecteur fait appel à la technique de l'optique fluide décrite dans le brevet français n" 2 689 961.
De préférence, le réflecteur comprend deux secteurs médians cylindriques à génératrice spiralée et à directrice verticale situés, l'un, dans une zone intermédiaire de l'un des demi-réflecteurs et, l'autre, dans une zone intermédiaire de l'autre demi-réflecteur.
Suivant une autre caractéristique, le réflecteur comprend, entre les deux demi-réflecteurs, des conduits d'évacuation thermique.
Suivant un détail constructif, les conduits d'évacuation thermique sont formés par des replis du réflecteur.
L'invention vise également les fragments nucléotidiques susceptibles d'être obtenus par amplification à l'aide d'amorces selon l'invention.
D'autres techniques d'amplification de l'acide nucléique cible peuvent être avantageusement employées comme alternative à la PCR (PCR-like) à l'aide de couple d'amorces de séquences nucléotidiques selon l'invention.
Par PCR-like on entendra désigner toutes les méthodes mettant en oeuvre des reproductions directes ou indirectes des séquences d'acides nucléiques, ou bien dans lesquelles les systèmes de marquage ont été amplifiés, ces techniques sont bien entendu connues, en général il s'agit de l'amplification de 1'ADN par une polymérase ; lorsque l'échantillon d'origine est un ARN il convient préalablement d'effectuer une transcription réverse. I1 existe actuellement de très nombreux procédés permettant cette amplification, comme par exemple - la technique SDA (Strand Displacement Amplification) ou technique d'amplification à déplacement de brin (Walker et al., 1992) - la technique TAS (Transcription-based Amplification System), décrite par Kwoh et al. en 1989 - la technique 3SR (Self-Sustained Sequence Replication), décrite par Guatelli et al. en 1990 - la technique NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), décrite par Kievitis et al. en 1991 - la technique TMA (Transcription Mediated Amplification) - la technique LCR (Ligase Chain Reaction), décrite par Landegren et al. en 1988 et perfectionnée par Barany et al. en 1991, qui emploie une ligase thermostable - la technique de RCR (Repair Chain Rection), décrite par Segev en 1992 - la technique CPR (Cycling Probe Reaction), décrite par Duck et al. en 1990 - la technique d'amplification à la Q-béta-réplicase, décrite par Miele et al. en 1983 et perfectionnée notamment par Chu et al. en 1986, Lizardi et al. en 1988, puis par Burg et al. ainsi que par Stone et al. en 1996.
Dans le cas où le polynucléotide cible à détecter est un ARN, par exemple un ARNm, on utilisera avantageusement, préalablement à la mise en oeuvre d'une réaction d'amplification à l'aide des amorces selon l'invention ou à la mise en oeuvre d'un procédé de détection à l'aide des sondes de l'invention, une enzyme de type transcriptase inverse afin d'obtenir un ADNc à partir de 1'ARN contenu dans l'échantillon biologique. L'ADNc obtenu servira alors de cible pour les amorces ou les sondes mises en oeuvre dans le procédé d'amplification ou de détection selon 1' invention.
Les sondes nucléotidiques selon l'invention hybrident spécifiquement avec une molécule d'ADN ou d'ARN de polynucléotide selon l'invention, plus particulièrement avec la séquence SEQ ID NO 1 codant pour le polypeptide PVDL, dans des conditions d'hybridation de forte stringence telles que données sous forme d'exemple précédemment.
Les séquences non marquées peuvent être utilisées directement comme sonde, cependant les séquences sont généralement marquées par un élément radioactif comme 32P, 35S, 3H ou 125in ou par une molécule non radioactive comme la biotine, la digoxigénine, la 5-bromo-désoxyuridine ou la fluorescéine, pour obtenir des sondes utilisables pour de nombreuses applications.
Des exemples de marquage non radioactifs de sondes sont décrits, par exemple, dans le brevet français NO 78 10 975 ou par Urdea et al. ou par Sanchez-Pescador et al. en 1988.
Dans ce dernier cas, on pourra aussi utiliser l'une des méthodes de marquage décrites dans les brevets FR2 422 956 et FR-2 518 755.
La technique d'hybridation peut être réalisée de manières diverses (Matthews et al., 1988). La méthode la plus générale consiste à immobiliser l'acide nucléique extrait des cellules de différents tissus ou de cellules en culture sur un support (tel que nitrocellulose, nylon, polystyrène) et à incuber, dans des conditions bien définies, l'acide nucléique cible immobilisé avec la sonde.
Après l'hybridation, l'excès de sonde est éliminé et les molécules hybrides formées sont détectées par la méthode appropriée (mesure de la radioactivité, de la fluorescence ou de l'activité enzymatique liée à la sonde).
Avantageusement, les sondes nucléotidiques marquées selon l'invention peuvent avoir une structure telle qu'elles rendent possible une amplification du signal radioactif ou non radioactif. Un système d'amplification répondant à la définition ci-dessus comprendra des sondes de détection sous la forme d'un ADN ramifié, branché ( branched DNA ) telles que celles décrites par Urdea et al. en 1991. Selon cette technique, on utilisera avantageusement plusieurs types de sondes notamment une sonde de capture, afin d'immobiliser l'ADN ou 1'ARN cible sur un support, et une sonde de détection. La sonde de détection lie un ADN branché présentant une structure ramifiée. L'ADN branché, à son tour, est capable de fixer des sondes oligonucléotidiques qui sont elles-mêmes couplées à des molécules de phosphatase alcaline. Puis l'activité de cette enzyme est mise en évidence grâce à un substrat chimioluminescent, par exemple un dérivé du dioxétane-phosphate.
Selon un autre mode de mise en oeuvre des sondes nucléiques selon l'invention, ces dernières peuvent être utilisées comme sonde de capture. Dans ce cas, une sonde, dite sonde de capture , est immobilisée sur un support et sert à capturer par hybridation spécifique l'acide nucléique cible obtenu à partir de l'échantillon biologique à tester et l'acide nucléique cible est ensuite détecté grâce à une seconde sonde, dite sonde de détection , marquée par un élément facilement détectable.
Les fragments oligonucléotidiques peuvent être obtenus à partir des séquences selon l'invention, par coupure avec des enzymes de restriction, ou par synthèse chimique selon les méthodes classiques, par exemple selon la méthode décrite dans le brevet européen NO EP-O 305 929 (Millipore Corporation).
L'invention comprend en outre les oligonucléotides sens ou antisens, caractérisés en ce que leur séquence nucléique est choisie parmi une séquence d'acide nucléique selon l'invention.
Parmi les fragments d'acides nucléiques intéressants, il faut citer en particulier les oligonucléotides antisens, c'est-à-dire dont la structure assure, par hybridation avec la séquence cible, une inhibition de l'expression du produit correspondant. Il faut également citer les oligonucléotides sens qui, par interaction avec des protéines impliquées dans la régulation de l'expression du produit correspondant, induiront soit une inhibition, soit une activation de cette expression.
L'invention comprend également les vecteurs recombinants de clonage, et/ou d'expression, caractérisés en ce qu'ils contiennent une séquence d'acide nucléique de polynucléotide selon l'invention.
Les tiges de butée M1 et M2 pour limiter la position ou le mouvement de D1 laissent seulement passer la butée ménagée sur D1 lorsque l'élément de commande concerné occupe sa position de repos, prévue notamment en haut.
Dans le dispositif 300 selon l'exemple de réalisation montré par la figure 3b, on a seulement prévu une tige de butée M dont la position est variable et qui peut être commandée par un entraînement. La commande de cette tige possède plus exactement deux échelons, de sorte que la tige peut être amenée à trois positions. Les échelons correspondent aux butées prévues sur la pièce de pression à gradins Sud1. Ce dispositif est capable d'exécuter les mêmes fonctions, à savoir le dégagement/engagement et/ou la sélection, que le dispositif 200 selon la figure 3a.
La position de repos de l'accumulateur d'énergie correspond avantageusement à la position du doigt WF1 dans la rainure d'enclenchement à laquelle sont coordonnées les 1re et 2e vitesses. Selon un autre exemple de réalisation avantageux, cette position de repos peut également être coordonnée à une autre rainure d'enclenchement, par exemple à celle de la Se et de la marche arrière AR. L'accumulateur d'énergie, formé par exemple par le ressort F1, est tiré par le levier H1 à une position correspondant à cette rainure lorsqu'une vitesse est enclenchée ou engagée dans la boîte de vitesses, donc lorsque le doigt WF1 est arrivé dans une extrémité de la rainure concernée, c'est-à-dire celle à laquelle sont coordonnées la 1re et la 2 vitesses dans l'exemple de la figure 3b. Le ressort F1 possède alors une précontrainte de base, laquelle est engendrée du fait que le ressort, emprisonné avec la pièce de pression D1 ou SD1 dans l'agrafe S1 représentée sous le ressort et cette pièce, est disposé sous précontrainte dans cette agrafe et ne peut pas se détendre complètement.
Au cas où l'accumulateur de force est tendu (comprimé) davantage par un raccourcissement de la course ou de l'espace dans lequel est logé cet accumulateur d'une quantité correspondant à la distance séparant deux rainures d'enclenchement voisines (ce qui représenté la charge ou l'armement de l'accumulateur d'énergie), il devient capable de comprimer le ressort F2 d'au moins une quantité égale. Dans le cas d'un déplacement de l'accumulateur, dû par exemple à la précontrainte, sur une course correspondant au double de la distance entre deux rainures voisines, l'accumulateur peut également comprimer le ressort de rappel F2 d'au moins une quantité ou sur une distance égale.
Les figures 4a à 4c illustrent les étapes d'une manoeuvre de changement de vitesse automatisée, réalisée au moyen du dispositif 200 selon la figure 3a. Il s'agit plus exactement du passage de la ire à la 2e. Une telle manoeuvre ne demande pas de changement de la rainure d'enclenchement, donc de sélection.
Quand la îre est enclenchée, figure 4a, le ressort F1 présente sa précontrainte de base, les deux butées Ml et M2 ou au moins la butée Ml sont ou est étendue(s) à sa position de repos en bas et la pièce de pression Dl est appliquée contre la première butée Ml. L'accumulateur d'énergie ne peut donc pas se mouvoir dans son ensemble. En dehors de la précontrainte de base, il n'y a essentiellement pas d'énergie supplémentaire emmagasinée dans l'accumulateur à ressort.
Au dégagement de la ire, voir la figure 4b, c'est-à-dire au mouvement du doigt WFl à partir de la position représentée sur la figure 4a, par suite de la rotation du levier Hla et du déplacement de la tringle vl couplée au doigt <RTI
La pièce de pression D1 ne peut pas s'écarter ou être déplacée parce que la butée Ml empêche son mouvement. Le ressort de rappel F2 maintient donc l'axe de changement de vitesse WS1 avec le doigt WF1 au niveau de la rainure d'enclenchement de la ire et de la 2e, même si la coulisse de changement de vitesse, désignée ici par KUL, permet à présent, dans son plan médian, correspondant à la zone neutre N de la boîte de vitesses, la sortie de ladite rainure.
Pendant la poursuite du mouvement, de la zone neutre à la 2e, voir la figure 4c, le ressort F1 est de nouveau détendu et restitue l'essentiel de l'énergie accumulée au levier H1. Cette énergie est donc utilisable pour le soutien de la fonction principale de l'entraine- ment du levier H1.
Les figures Sa à 5c illustrent les étapes d'un changement de vitesse automatisé, effectué au moyen du dispositif 200, consistant plus particulièrement en un passage de la 2e à la 3e. Au cours de cette manoeuvre, il se produit, à la position neutre N, un changement de rainure d'enclenchement, c'est-à-dire une sélection pour passer à une rainure voisine, en direction de la rainure à laquelle sont coordonnées la 5e et la marche arrière AR.
Avant que ne commence le dégagement de la 2e par la rotation du levier Hla, H1 par l'entraînement, la tige de butée M1 est amenée à la position de repos en haut; la tige de butée M2 reste à sa position de repos en bas. Comme M2 est dans sa position de repos inférieure, D1 peut se déplacer seulement jusqu'à venir s'appliquer contre la butée M2. Au dégagement de la 2e, le ressort F1 est tendu par une course correspondant à la distance entre deux rainures voisines. Avant que la position neutre N ne soit atteinte, la coulisse KUL maintient le doigt WF1 encore dans la rainure 1 - 2. Quand la coulisse permet, dans la zone neutre N, le changement de rainure d'enclenchement, c'est-à-dire la sélection, D1 est poussée, par la détente partielle du ressort Fi, lequel s'appuie sur H1, contre la butée M2, ce qui correspond à la position du doigt WF1 dans la rainure 3 - 4 désirée. Une force est appliquée en même temps au ressort F2, lequel est de ce fait comprimé au moins en partie. Quand la 3e est ensuite enclenchée, F1 restitue de nouveau la moitié ou une autre partie de l'énergie accumulée parce que la précontrainte correspondait à l'énergie nécessaire à l'avance jusqu'à la deuxième rainure suivante, mais l'avance était limitée par la butée M2 à la distance de la rainure voisine. La force exercée à présent par le ressort de rappel F2, est supportée par la coulisse par exemple.
Les figures 6a à 6c illustrent les étapes d'un changement de vitesse automatisé, effectué au moyen du dispositif 200, consistant plus particulièrement en un passage de la 3e à la 4e. Un changement de rainure, donc une sélection, n'est pas nécessaire à cet effet. Les butées M1, M2 sont positionnées comme pour le passage de la 2e à la 3e (M1 en haut, M2 en bas). L'accumulateur d'énergie F1 est déplacé vers la droite d'une course correspondant à la distance entre deux rainures voisines parce que H1 exerce une poussée sur F1 et que l'accumulateur dans son ensemble peut s'écarter jusqu'à ce que la pièce de pression D1 s'applique contre M2. Une fois que D1 est appliquée contre M2, la poursuite du mouvement du levier H1 entraîne la charge de l'accumulateur d'énergie d'une quantité d'énergie égale à celle nécessaire au déplacement sur la distance entre deux rainures voisines (l'accumulateur d'énergie a été poussé dans son ensemble, faut-il le rappeler, par le levier H1 sur le trajet à partir de la première rainure). Comme le ressort F2 pousse à présent l'axe de changement de vitesse WS1 contre la pièce de pression D1, il n'y pas non plus de changement de rainure, pendant la manoeuvre de changement de vitesse, quand la coulisse autorise une sélection.
Comme l'accumulateur d'énergie F1 n'était pas obligé de délivrer de l'énergie pour la sélection, il restitue dans ce cas l'énergie accumulée, correspondant à la course jusqu'à une rainure voisine.