INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Avantageusement, le temps de réaction de l'hydrolyse poussée (31) est supérieur ou égal à 5 min, de préférence à 10 min. Mais, il va de soi que, de toutes façons, le terme de cette réaction (31) dépendra du moment où la totalité des groupes -SiX seront hydrolysés. Il appartient à l'homme du métier d'apprécier et de déterminer ce moment, afin de minimaliser la durée du procédé industriel.
Suivant une modalité avantageuse de l'invention, l'étape (31) se déroule à une température supérieure ou égale à 60 C, de préférence comprise entre 70 et 100" C et, plus préférentiellement encore entre 80 et 90" C.
Avantageusement, F3 présente une teneur en halogène résiduel de types HX et -SiX inférieure ou égale à 60 ppm, de préférence inférieure ou égale à 30 ppm, à noter que la teneur en halogène résiduel de type sSiX est généralement inférieure à 1 ppm. La réaction est complète.
On préfère encore, selon les spécificités du protocole de lyse utilisé, notamment lorsqu'on ajoute des billes de plus gros diamètre, que le temps de mise en mouvement de type vortex soit d'environ 2 minutes.
Dans un sixième mode de réalisation selon l'invention, les cellules sont des bactéries.
Un second objet de l'invention est l'utilisation du lysat obtenu par le procédé décrit ci-dessus, notamment pour une détection et/ou une quantification de molécules d'acides nucléiques ou une amplification, directe ou après purification des molécules d'ADN et/ou d'ARN.
Ainsi, après amplification, on peut détecter au moins 1.102 cellules/ml.
Toutefois, l'utilisation du procédé de l'invention n'est pas limité aux techniques précitées.
Un troisième objet de l'invention est un contenant à usage unique, pour la mise en oeuvre d'un procédé décrit précédemment, caractérisé en ce qu'il comprend une charge d'un matériau particulaire adaptée, en fonction d'une quantité prédéterminée de l'échantillon biologique, à la mise en oeuvre directe du procédé décrit précédemment.
Par "échantillon biologique", on entend tout échantillon, prélèvement ou fraction d'un matériel biologique, simple ou complexe, par exemple un tissu vivant ou un liquide ou fluide corporel. Cet échantilon biologique contient au moins un micro-organisme à lyser, avec ou sans traitement préalable de la structure comprenant ledit micro-organisme, par exemple destruction de l'organisation du tissu.
Par "micro-organisme", on entend tout matériau biologique, comprenant naturellement une membrane ou enveloppe fermée, un ou plusieurs composés biologiques d'intérêt renfermé à l'intérieur de ladite membrane ou enveloppe, par exemple protéiques et/ou nucléiques. A titre d'exemple, on peut citer bien entendu les microorganismes procaryotes, tels que les bactéries et archaebactéries, les micro-organismes eucaryotes tels que les cellules végétales ou animales et les champignons, également différents tissus vivants, et par extension des particules virales.
Par le terme " lyse ", on entend tout processus permettant de rompre la membrane ou l'enveloppe précitée pour libérer le ou les composés biologiques d'intérêt sous forme totale ou partielle.
Par " composé biologique ", on entend tout constituant du micro-organisme, libéré de manière partielle ou totale par l'étape de lyse, comprenant un matériel biologique, notamment nucléique ou peptidique, d'intérêt, au sens où ce dernier est ensuite traité, notamment analysé ou détecté.
Les figures et les exemples qui suivent permettent d'illuster l'objet de l'invention, mais ne limitent en rien la portée de celle-ci.
La figure 1 illustre le pourcentage de lyse (en ordonnées) en fonction du diamètre des billes (en abscisse) et de la composition du mélange (nature et proportion des billes).
" SI " signifie " solution initiale " et représente le témoin qui n'a pas été lysé.
A : Billes de verre de 1 à 50 pm B : Billes de verre de 50 à 100 pm C : Billes de verre de 90 à 150 pm D : Billes de verre 100 pm E : Billes de zirconium 100 pm F : Billes de zirconium 500 pm G : Mélange 50/50 de billes de zirconium de 100 et 500 Hm.
La figure 2 illustre la quantité d'acides nucléiques de S.epidermidis détectée (en ordonnées) en fonction du diamètre des billes (en abscisse).
Au sens de l'invention il convient d'entendre par l'expression "montés en parallèle", un montage des ventilateurs 6 leur permettant d'additionner le flux individuel de refoulement qu'ils produisent pour constituer un flux résultant correspondant alors à la somme de leurs flux individuels pour former le flux d'air vertical résultant de l'installation et s'échappant par la sortie d'air 4.
L'installation conforme à l'invention comporte également une unité de raccordement d'air 7 interposée entre chaque ventilateur 6 et l'entrée d'air 3, chaque ventilateur 6 étant connecté directement à l'unité de raccordement 7.
Afin de conserver à l'ensemble de l'installation un encombrement et une hauteur limités, chaque ventilateur 6 est monté avec son axe d'aspiration et de refoulement perpendiculaire au flux d'air vertical de sustentation. L'unité de raccordement 7, formé par une gaine ou un conduit classique métallique de section variable ou constante, assure le raccordement des ventilateurs 6 à l'entrée d'air 3 en passant et s'étendant sous la chambre de vol 1 selon un premier tronçon sensiblement horizontal 10, puis en formant un coude à 90" sous et au droit de ladite chambre pour se terminer par un tronçon sensiblement vertical 9.
Une telle disposition permet de bénéficier d'une puissance de ventilation importante sans pour autant augmenter l'encombrement et la hauteur totale de l'installation.
Dans la première variante de réalisation conforme à l'invention et montrée aux figures 1 et 2, les ventilateurs 6 sont montés en parallèle et selon une disposition en étoile autour de l'aire de sustentation dont l'axe de symétrie est représentée par l'axe de symétrie longitudinal S de la cheminée 2.
Avantageusement, les ventilateurs 6, formés de ventilateurs de type axial classique, de diamètre moyen hors tout ne dépassant pas 2 mètres environ, sont disposés avec leur axe de rotation, et par conséquent d'aspiration et de refoulement, horizontal, I'ensemble desdits ventilateurs étant disposés, de préférence, sur un seul étage.
Avantageusement, chaque ventilateur 6 est associé à un dispositif réducteur de bruit 13, ou insonorisant, monté en aval et/ou en amont dudit ventilateur.
De manière classique et bien connue dans la technique considérée, les dispositifs réducteurs de bruit sont constitués de lits à absorption formés par un enrobage du ventilateur par une couche de matelas de laine de roche ou de verre, le dispositif étant complété par une couverture métallique perforée.
D'autres dispositifs réducteurs de bruit 13 sont bien évidemment envisageables à titre d'alternative.
Dans la variante de réalisation en étoile montrée aux figures 1 et 2, chaque ventilateur 6 est raccordé par sa sortie de refoulement 6A au premier tronçon 10, I'ensemble de l'unité de raccordement pouvant être avantageusement formée d'une série de tronçons démontables dont le tronçon terminal est lui-même susceptible d'être connecté à la portion en coude terminal 9 relié à l'embase de la cheminée 2. Le coude terminal 9 peut lui-même être avantageusement réalisé en un ou plusieurs modules de raccordement, avantageusement équipés de guides d'air 14 (figure 2) euxmêmes coudés. La présence de ces guides d'air 14 permet d'assurer une répartition de la vitesse d'air aussi constante que possible sur l'aire de la section de raccordement. Tel que cela est montré à la figure 2 la section de l'unité de raccordement 7 est de section variable croissante en direction de la cheminée 2, mais il est également envisageable de réaliser une section essentiellement constante voire convergente en direction de et jusqu'à l'embase de la cheminée 2.
Tel que cela est montré en particulier à la figure 2, I'ensemble de ces équipements incluant l'unité de ventilation 5 ainsi que l'unité de raccordement 7 est situé sous un plancher 15 surélevé par rapport au sol 16 d'une hauteur H et s'étendant sensiblement parallèlement au sol 16, au niveau de la base de la cheminée 2 ou légèrement au-dessus.
L'installation conforme à l'invention étant destinée en priorité à être transportée et montée, puis démontée dans des salles de spectacles dont le volume et la hauteur totale sont limités, il est particulièrement important de limiter la hauteur H qui en pratique ne peut dépasser 3 à 4 mètres. En effet au-delà de telles valeurs le volume restant libre au-dessus de l'extrémité supérieure de la cheminée 2 est trop limité ou voire insuffisante, la visibilité pour les spectateurs étant par ailleurs réduite. En conséquence pour maintenir la hauteur du plancher 15 en-deça de la valeur limite voisine de 4 mètres et tout en conservant une aire de sustentation suffisamment importante, par exemple de l'ordre de 7 à 20 m2, et en moyenne de l'ordre de 12 m2, pour que plusieurs personnes puissent simultanément flotter dans l'air, le diamètre des ventilateurs 6 doit être limité tout en permettant d'assurer un débit suffisant de sustentation de l'ordre au minimum de 380 à 400 m3 par seconde. Pour que ces conditions optimales et nécessaires soient réunies dans l'installation, il importe que le plancher 15 entourant la cheminée 2 et recouvrant au moins une partie de l'unité de raccordement 7, et éventuellement également l'unité de ventilation 6, ait une hauteur H qui soit supérieure ou égale à celle de l'unité de ventilation 6 et comprise entre 0,5 x D et 1,5 x D, et de préférence voisine de la valeur D, la valeur D étant égale au diamètre de la cheminée 2.
En pratique, I'aire de la section du jet d'air correspondant sensiblement à l'aire de sustentation délimitée par les parois de la cheminée 2 doit être au minimum équivalente à un diamètre de 3 mètres pour permettre l'évolution libre d'un ou plusieurs parachutistes. Elle peut bien évidemment être largement supérieure, le diamètre D pouvant être de l'ordre de 4 à 5 mètres.
Dans le cas de grands diamètres, la limitation porte alors essentiellement sur la réalisation de l'installation et sur la puissance requise par le système de ventilation. Dans des réalisations de la taille de l'installation conforme à l'invention l'emploi d'un simple ventilateur de forte puissance ainsi que son transport seraient incompatibles avec le but recherché à savoir celui de pouvoir transporter et installer de manière non permanente une installation de vol libre de forte capacité.
Pour compléter l'installation conforme à l'invention, la cheminée sera avantageusement entourée d'une structure annulaire 20, reposant sur le plancher 15 et formée d'une membrane ou d'un matelas souple ou gonflable afin d'assurer la sécurité du parachutiste en cas de chute à l'extérieur du jet d'air. De manière également classique, la sécurité des parachutistes est en outre assurée par le montage d'un filet de protection 21 tendu dans la cheminée 2 au-dessus de l'entrée d'air 3. La présence du filet 21 permet d'amortir toute chute fortuite du parachutiste à l'intérieur de la cheminée 2.
Pour améliorer la maîtrise du jet d'air de sustentation il est possible de prévoir d'équiper la cheminée 2 d'un diffuseur 4A dans la partie terminale de la cheminée afin de réduire la vitesse d'éjection de l'air en champ libre et de limiter en conséquence la perte d'énergie associée. Avantageusement le diffuseur 4A sera conformé d'une manière telle que son diamètre extérieur croît progressivement selon une courbure divergente.
Chromatographie sur Concanavaline A-Sépharose.
Un extrait en tampon TENP40 a été directement injecté, avec un débit de 0,5 ml/minute, sur une colonne de Concanavaline A sépharose 4B (ConA Sepharose, Sigma) qui avait été équilibrée au préalable avec du tampon de lavage: Tris cul 20 mM pH 7,4 contenant 0,2 M de NaCI. Après lavage, avec un débit de 1 ml/minute, avec 15 ml de ce tampon, les protéines adsorbées ont été éluées avec un débit de 0,5 ml/minute avec du méthyl-a-D mannopyranoside (Sigma) dilué à 0,5 M dans le tampon de lavage. Les protéines ont ensuite été séparées par PAGE-SDS et analysées comme décrit plus haut.
Résultats Les protéines d'un extrait en tampon TENP40, contenant la cornéodesmosine de 52-56 kD, ont été traitées par diverses glycosidases et analysées en immunotransfert avec deux anticorps monoclonaux dirigés contre le polypeptide.
La coloration des protéines totales de l'extrait n'a pas montré de dégradation apparente durant l'incubation. Le traitement par la N-glycosidase F a induit une diminution d'environ 5 kDa du poids moléculaire apparent de la cornéodesmosine. Ce résultat suggère très fortement une N-glycosylation. Au contraire, les traitements avec l'endo-a-N-acétylgalactosaminidase et/ou la neuraminidase n'ont pas modifié la migration du la cornéodesmosine. Pour confirmer ce résultat, la cornéodesmosine humaine a été purifiée par affinité et analysée à l'aide de lectines biotinylées. L'agglutinine de germe de blé (WGA) a fortement lié la protéine purifiée, à l'inverse des autres lectines testées qui ne l'ont pas ou très faiblement reconnue. De plus, la cornéodesmosine s'est liée à de la concanavaline A couplée à une matrice de sépharose. Elle a pu être éluée avec le méthyl a-D-mannopyranoside, sucre spécifique de cette lectine, à la concentration de 0,5 M, ce qui prouve la spécificité de la liaison.
Purification de la cornéodesmosine: Après clivage dermo-épidermique, I'épiderme a été homogénéisé dans un tampon TEA: Tris-HCI 40 mM pH 7,5; EDTA 10 mM; aprotinine 10 ugiml et 4-(2aminoéthyl)-benzènesulfonyl fluoride (Interchim, Paris, France) utilisé à 0,8 mM.
L'homogénat a été centrifugé pendant 15 minutes à 15000 g. Le surnageant a été clarifié par filtration sur des filtres dont le diamètre des pores est de 0,45 um (Puradisc TM 25 AS; Whatman, Clifton, NJ), et injecté avec un débit de 0,3 ml/minute sur une colonne échangeuse d'an ion (Hi Trap Q, Pharmacia LKB) qui avait été équilibrée dans le tampon de lavage: Tris-HCI 20 mM pH 7,5. Les protéines non retenues (soit environ 5% des protéines totales de l'extrait) ont été directement injectées au même débit sur une colonne d'affinité préparée comme suit: environ 2 mg de l'anticorps monoclonal F28-27 ont été couplés à 1 ml de matrice de Sépharose 4B activée par des groupements N-hydroxysuccinimide (HiTrap-NHS), comme cela est préconisé par le fabricant Pharmacia LKB. La colonne a été lavée de façon exhaustive avec un débit de 1 ml/minute avec le tampon de lavage en présence puis en absence de 1 M de NaCI. Les protéines immunoadsorbées ont été éluées avec un débit de 0,3 ml/minute avec 0,2 M de glycine à pH 2,5; le pH des fractions éluées a été immédiatement neutralisé avec du Tris base à la concentration de 2 M. Les protéines des différentes fractions ont été analysées en immunotransfert avec l'anticorps monoclonal G36-19, ou avec l'anticorps monoclonal de contrôle, MOPC-21. Les fractions contenant les protéines ainsi éluées ont été mélangées, puis lyophilisées. Les protéines du Iyophilisat ont été analysées comme décrit plus haut, par électrophorèse monoou bidimensionelle. La cornéodesmosine a été ensuite découpée du gel afin d'être séquencée.
La cornéodesmosine de 52-56 kDa a été purifiée par une chromatographie d'échange d'anions suivie d'une chromatographie d'affinité. La totalité de la cornéodesmosine extraite s'est liée de façon spécifique sur la colonne d'affinité, dont elle a pu être éluée en présence de glycine. La coloration au Protogold des protéines transférées montre le haut degré de purification obtenu, puisque la cornéodesmosine est largement majoritaire dans ces fractions. Des résultats similaires ont été obtenus, lorsque la chromatographie d'affinité était réalisée sur une matrice couplée avec l'anticorps monoclonal F28-27 ou avec l'anticorps monoclonal G36-19. Une analyse en gel bidimensionel a confirmé le point isoélectrique basique de la cornéodesmosine purifiée et a montré qu'elle est la seule protéine éluée présentant un poids moléculaire apparent de 52-56 kDa. La cornéodesmosine ainsi purifiée a été séparée par électrophorèse et la bande du gel contenant cette protéine a été découpée, puis la protéine a été séquencée.
Instabilite du polypeptide purifié: Au cours de ses nombreux essais pour purifier la cornéodesmosine, la demanderesse s'est heurtée à deux problèmes majeurs : (1) la faible proportion de cette protéine parmi les protéines épidermiques et (2) son instabilité, due vraisemblablement à sa grande sensibilité à l'action des protéases.
Différents tests ont été mis en oeuvre pour tenter de stabiliser la cornéodesmosine : adjonction de zinc (inhibiteur de l'enzyme chymotrypsique de la couche cornée), d'agents réducteurs (ss-mercaptoéthanol ou dithiothréitol), d'agents dénaturants (SDS), de glycérol, d'inhibiteurs spécifiques des protéases à sérine (PMSF, aprotinine) ou d'un cocktail d'inhibiteurs de diverses protéases (aprotinine, leupeptine, pepstatine, benzamidine, phénanthroline, PMSF) ou suppression des étapes de congélation / décongélation. Finalement, I'absence des étapes de congélation/décongélation, la présence de 2% de SDS ou la présence du cocktail d'inhibiteurs, et de préférence une combinaison de ces conditions, se sont révélées les plus efficaces pour stabiliser la cornéodesmosine.
Construction d'une banque d'expression d'épiderme humain: Le clonage de I'ADNc de la cornéodesmosine humaine ne pouvait pas être réalisé à partir des banques d'expression préexistantes. En effet, celles-ci ont été produites soit à partir d'épiderme de souris, soit à partir de kératinocytes humains cultivés en monocouche, conditions qui ne permettent pas l'expression des gènes caractéristiques de la différenciation terminale épidermique. La demanderesse a donc construit une banque d'expression épidermique humaine.
Extraction d'acides ribonucléiques (ARN) poly(A)t d'épiderme humain Elle a été réalisée à partir de prélèvements de peau mammaire, déchets chirurgicaux obtenus après chirurgie plastique. Le tissu adipeux sous-cutané a été disséqué, puis des lambeaux de peau ont été découpés à l'aide d'un dermatome et incubés 2 heures à 37"C, dans une solution de trypsine (solution A, Gibco BRL), face épidermique vers le haut. Le clivage dermo-épidermique a été alors réalisé avec des pinces. Les feuillets épidermiques obtenus ont été rincés dans un tampon phosphate (PBS, pH 7,4). L'extraction des ARN poly(A)+ a été réalisée selon le protocole proposé dans le coffret "mRNA purification kit" commercialisé par Dynal (Oslo), après homogénéisation des feuillets à l'aide d'un "Turax", directement dans le tampon fourni (Lysis/Binding buffer). Le principe de ce coffret utilise l'affinité des ARN messagers (ARNm) comportant une extrémité poly(A) pour des billes magnétiques recouvertes d'oligo(dT)25. Après 5 minutes d'incubation à température ambiante dans le lysat, les billes ont été isolées avec un aimant et soumises à 3 lavages. Les ARN poly(A)+ élués par incubation des billes à 65"C pendant 2 minutes dans une solution 2 mM EDTA, pH 8, ont été dosés en utilisant le coffret colorimétrique "DNA DipStick" commercialisé par Invitrogen (San Diego, CA).
Construction de la banque.
La banque a été construite avec le coffret "ZAP Express cDNA Gigapack II Gold cloning kit" commercialisé par Stratagene (La Jolla, CA), en suivant le protocole proposé par le fournisseur. Les ADN complémentaires (ADNc) ont été synthétisés à partir de 2 ug d'ARN poly(A)+, avec la transcriptase inverse du virus de la leucémie murine de Moloney (MMLV-RT), en utilisant des amorces oligo(dT)18 comprenant un site de restriction pour l'enzyme Xhol et en présence de 5-méthyl cytidine triphosphate. La synthèse du second brin a été réalisée par I'ADN polymérase I de E. col i, et les extrémités des ADNc ont été rendues franches avec la pfu polymérase recombinante. Après addition d'adaptateurs EcoR I (ADN ligase de T4), et phosphorylation des extrémités 5' (polynucléotide kinase de T4), les ADNc ont été soumis à une digestion par l'enzyme Xho I. La sélection des ADNc de taille supérieure à 500 paires de bases a été réalisée avec une colonne de Sephacryl S-500. La ligation des ADNc avec les deux bras du phage ZAP Express a été réalisée avec la ligase du phage T4. L'encapsulation du phage recombinant a été réalisée avec les extraits "Gigapack II Gold Packaging Extract" fournis par Stratagene. La souche XL-1 blue MRF' de E. coli a été utilisée pour la titration et l'étalement de la banque.
Cette banque a été réalisée à partir de 2 pg d'ARNm, extraits d'un fragment d'épiderme humain dans les heures suivant son prélèvement, par clonage unidirectionnel dans le phage ZAP Express. Elle est constituée d'environ 2x105 clones indépendants.
On voit sur celle-ci la cathode à micropointe(s) 4, une seule micropointe 6 étant représentée et reposant sur une couche conductrice 38 mise à la masse.
Cette couche 38 repose elle-même sur un substrat 40 par exemple en silicium.
On voit aussi la grille 16 percée en regard de la micropointe et électriquement isolée de la couche 38 par une couche 42 de SiO2.
On voit également l'anode 10 du tube à rayons X ainsi que des moyens 44 permettant d'appliquer une tension appropriée variable positive à la grille 16 par rapport à la micropointe 6 et des moyens 46 permettant d'appliquer une haute tension appropriée positive à l'anode 10 par rapport à la micropointe.
Une résistance 48 de valeur r est montée entre la masse et la borne négative des moyens 46 d'application de la haute tension à l'anode.
Le système de régulation comprend un amplificateur opérationnel 50 qui commande les moyens d'application de tension 44 en fonction d'une valeur de tension de référence R fixée par les utilisateurs et de l'image en tension du courant circulant dans la résistance 48.
Plus précisément, les électrons entrant dans l'anode 10 correspondent à un courant d'intensité 1.
Celui-ci provient de la masse, passe par la résistance 48 et par l'alimentation (moyens d'application) 46.
Aux bornes de la résistance 48 existe une tension V égale à r.i.
Cette tension V est envoyée à l'amplificateur opérationnel 50 et ce dernier compare cette tension V a la tension de référence R correspondant au courant désiré par l'utilisateur.
Ce système de régulation est connu.
Les exemples de l'invention qui ont été décrits en faisant référence aux figures 1 à 4 utilisent des anodes planes.
Cependant on ne sortirait pas du cadre de l'invention en utilisant des anodes d'un autre type par exemple des anodes tournantes de forme cylindrique.
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La présente invention concerne le domaine de la cosmétologie et de la dermatologie et a pour objet l'utilisation, pour des applications cosmétiques dermatologiques et/ou pharmaceutiques, d'une huile extraite du fruit du safoutier (Dacryodes edulis, également appelé Pachylobus edulis), ainsi qu'un produit et/ou une composition cosmétique et/ou pharmaceutique pour la peau, les muqueuses
On pourrait par exemple déposer une couche de polymère photosensible sur la couche-tampon inférieure 48 puis graver le réseau de diffraction sur celle-ci par photoblanchiment en utilisant un masque, deux faisceaux lumineux interfèrant l'un avec l'autre ou un faisceau lumineux de très faible diamètre que l'on déplacerait par rapport à la couche-tampon 48 ou réciproquement.
A ce sujet on consultera le document (5).
La structure que l'on voit sur la figure 3 est semblable à celle que l'on voit sur la figure 1 mais une différence essentielle entre les deux réside dans les fonctions des réseaux de diffraction référencés 16 sur la figure 1 et 39 sur la figure 3.
Dans le cas de la figure 1, le réseau de diffraction 16 permet le couplage d'une onde lumineuse incidente (faisceau lumineux FI) alors que, dans le cas de la figure 3, le réseau de diffraction 39 permet au contraire le découplage d'une onde lumineuse guidée 34.
On voit également sur la figure 3 un moyen de couplage d'une onde lumineuse dans la couche active 32.
Dans l'exemple représenté, ce moyen ce couplage est un réseau de diffraction 54 qui est formé au niveau de la face inférieure de la couche active 32, en une extrémité de celle-ci.
Une onde lumineuse 56 qui arrive vers cette extrémité est ainsi couplée dans la couche active 32 pour ensuite se propager dans celle-ci et y être guidée.