INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
nucléique capable d'être lié de manière opérationnelle à un promoteur. La modification peut également avoir lieu par le biais de techniques comme la mutagenèse dirigée ; - "boîte" signifie une séquence d'acide nucléique a laquelle une fonction régulatrice est imputée ; - "like" signifie que la boite et/ou la séquence d'acide nucléique à laquelle ce terme est associé, comporte une certaine identité de séquence ou un consensus avec une boîte et/ou une séquence d'acide nucléique connue dite de référence, de préférence une identité de séquence d'au moins 50%, de manière plus préférée une identité de séquence d'au moins 75%, et plus particulièrement une identité de séquence d'au moins 90% avec la séquence de référence. Le pourcentage d'identité de séquence est calculée sur la base d'une fenêtre de comparaison d'au moins 6 bases nucléotidiques. La détermination d'une fenêtre de comparaison peut être effectuée en utilisant des algorithmes d'alignement de séquences pour déterminer une homologie avec une séquence de référence, par exemple l'algorithme d'homologie locale, l'algorithme d'alignement d'homologie, et l'algorithme de recherche de similitude, ces algorithmes existant également sous forme informatique, connus sous les noms GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA. Le pourcentage d'identité de séquence est obtenue en comparant la séquence de référence avec la boîte et/ou la séquence d'acide nucléique ; - "située" signifie la position sur une séquence d'acide nucléique d'un élément identifié, tel qu'une "boîte", un site de restriction, ou un codon ayant une fonction particulière. La position qui est donnée par un chiffre se réfère à la position du début de l'élément dans la séquence d'acide nucléique, dans le sens de la lecture de cette dernière, c'est-à-dire dans le sens 5'->3' ; - "plante transgénique" signifie une plante ayant été obtenue par des techniques de manipulation génétique, et couvre les plantes entières obtenues, leur progéniture, ainsi que les organes végétaux, par exemple les racines, les tiges et les feuilles, obtenus par ces techniques. Les plantes transgéniques selon la présente invention peuvent avoir différents niveau de ploïdie, et
peuvent notamment être polyploïde, diploïde, et haploïde ; - "propagule" signifie un amas ou une association de cellules végétales, structuré(e) ou non, permettant la régénération d'une plante entière, par exemples des explants, des cals, des tiges, des feuilles, des racines, des boutures, et même des semences.
Par conséquent, un objet de la présente invention est un promoteur chimérique d'expression comprenant au moins une séquence d'acide nucléique, dérivée d'un premier promoteur végétal comportant une région promotrice de l'expression vasculaire végétal, ladite région promotrice vasculaire végétale étant remplacée par une séquence d'acide nucléique, dérivée d'un deuxième promoteur végétal et comportant une région promotrice de l'expression dans des tissus verts végétaux.
Les peptides selon l'invention peuvent également être préparés par les techniques classiques, dans le domaine de la synthèse des peptides.
Cette synthèse peut être réalisée en solution homogène ou en phase solide.
Les procédés de purification de polypeptide recombinant utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut
être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono ou poiyclonaux spécifiques, etc.
Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine porteuse (protéine chimère).
L'invention concerne également un anticorps monoclonal ou polyclonal et ses fragments, caractérisés en ce qu'ils lient spécifiquement un polypeptide selon l'invention. Les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps simple chaîne font également partie de l'invention. Les fragments d'anticorps selon l'invention sont de préférence des fragments Fab ou F(ab')2.
Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les inventeurs ont employé cette technique pour obtenir un hybridome produisant un nouvel anticorps monoclonal hautement spécifique d'un épitope de la protéine ICBP90.
Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par
purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé un polypeptide selon l'invention.
L'invention porte également sur un anticorps monoclonal spécifique de la protéine ICBP90 humaine et capable d'inhiber l'interaction entre ICBP90 et -la séquence d'ADN sur laquelle se lie spécifiquement la protéine ICBP90. Selon un autre mode de réalisation, l'anticorps monoclonal selon l'invention et spécifique de la protéine ICBP90 humaine est capable d'inhiber l'interaction entre ICBP90 et les protéines avec lesquelles ICBP90 interagit, lesdites protéines étant de préférence ICBP90 elle-même ou des protéines du complexe transcriptionnel. Par protéines du complexe transcriptionnel, on entend désigner toutes les protéines intervenant dans la réaction de la transcription que se soit l'initiation, l'élongation ou la terminaison de la transcription.
Les anticorps de l'invention pourront également être marqués de la même manière que décrit précédemment pour les sondes nucléiques de l'invention et de manière préférée avec un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif.
Plus généralement, les anticorps de l'invention peuvent être avantageusement mis en oeuvre dans toute situation où l'expression d'un polypeptide selon l'invention doit être observée, et plus particulièrement en immunocytochimie, en immunohistochimie ou dans des expériences de western blotting .
Ainsi, l'invention concerne une méthode de détection et/ou de dosage d'un polypeptide selon l'invention, dans un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes de
Selon une variante de l'invention, le promoteur halogéné est introduit dans le mélange réactionnel, partiellement ou totalement, sous la forme d'un précurseur. Dans un tel cas, ledit précurseur se présente généralement sous la forme d'un composé susceptible de libérer dans le milieu réactionnel, le radical hydrocarboné du promoteur halogéné précité, sous l'action d'un halogène ou de l'acide halogénohydrique notamment, ces derniers composés étant présents dans le milieu ou bien introduits dans ce but.
A titre d'exemples non limitatifs de précurseurs convenables, on peut citer les composés choisis parmi le méthanol, le diméthyléther, l'acétate de méthyle ou le formiate de méthyle, utilisés seuls ou en mélange.
La quantité de promoteur halogéné présent dans le mélange réactionnel est avantageusement inférieure ou égale à 20 %, rapporté au poids total dudit mélange. De préférence, la teneur en promoteur halogéné est inférieure ou égale à 15 %.
Il est à noter que si le promoteur précité est introduit partiellement ou totalement, sous la forme d'un précurseur, la quantité de précurseur ou de mélange promoteur/précurseur est telle qu'elle permette d'obtenir une quantité équivalente à celle mentionnée ci-dessus.
Outre ces composés, le milieu réactionnel contient de l'eau, de l'acide formique, du formiate de méthyle, de l'acétate de méthyle et de l'acide acétique, dans des proportions pondérales préférées définies ci-dessous, de préférence maintenues simultanément.
La teneur en eau est de préférence inférieure à 5 % en poids par rapport au milieu réactionnel, de préférence inférieure à 2 %.
La teneur en acide formique est de préférence inférieure à 15 % en poids du milieu réactionnel, de préférence inférieure à 12 %.
La teneur en formiate de méthyle est de préférence maintenue inférieure à 20 % en poids du milieu par rapport au milieu réactionnel.
Selon un mode particulier de l'invention, la teneur en acétate de méthyle est inférieure à 40 % en poids, de préférence inférieure à 20 %.
La teneur en acide acétique n'est pas inférieure à 25 % dans le milieu réactionnel.
Le procédé selon l'invention peut être mis en oeuvre en présence d'iodures sous forme soluble dans le milieu réactionnel. Les iodures peuvent être introduits en tant que tels dans le milieu réactionnel mais aussi sous la forme de composés susceptibles de former des iodures solubles.
Par iodures, on entend des espèces ioniques, c'est-à-dire ne comprenant pas les iodures covalents (tels que notamment le promoteur halogéné) ni l'acide lodhydrique.
Ainsi, les iodures introduits dans ledit milieu, en tant que tels, sont choisis parmi les iodures minéraux ou organiques.
A titre d'iodures minéraux, on peut citer principalement les iodures de métaux alcalino-terreux ou alcalins, ces derniers étant préférés. On peut citer parmi ceux-ci l'iodure de potassium, l'iodure de lithium, l'iodure de sodium.
A titre d'iodures organiques, on peut citer les composés organiques, comprenant au moins un groupe organo-phosphoré et/ou au moins un groupe organo-azoté, réagissant avec des composés à base d'iode, pour donner des espèces ioniques renfermant cet halogène. A titre d'exemple, on peut mentionner l'iodure de tétraphényl phosphonium, l'iodure de N-méthyltriéthyl ammonium.
A titre de composés susceptibles de former des iodures solubles dans le milieu réactionnel, on peut citer par exemple les carboxylates, les hydroxydes de métaux alcalins ou alcalino-terreux, tels que l'acétate de lithium, la potasse, la soude notamment.
Parmi les amorces ou sondes oligonucléotidiques d'intérêt, on peut notamment citer les oligonucléotides comprenant les séquences SEQ ID n 12 à SEQ ID n 20 ou leurs séquences complémentaires.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent en outre être utilisées pour transformer des cellules cibles et leur faire exprimer un peptide possédant l'activité biologique de la sorbine.
L'invention a donc également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un acide nucléique selon l'invention codant pour un peptide possédant l'activité biologique de la sorbine, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable, ladite composition étant destinée à être utilisée en thérapie génique. L'acide nucléique d'intérêt, de préférence inséré dans un vecteur, peut être administré sous forme nue ou en association avec au moins un agent facilitant la transfection dudit acide nucléique.
A partir des séquences d'ADNc clonées, les auteurs de la présente invention ont pu en déduire la séquence d'acides aminés des peptides codés par ces séquences d'ADNc.
La séquence SEQ ID n 2 est la séquence d'acides aminés de la sorbine porcine.
La séquence SEQ ID n 4 est la séquence d'acides aminés de la sorbine humaine de forme courte, codée par la séquence nucléotidique SEQ ID n 3 obtenue à partir d'ARN de gros intestin normal par RT-PCR.
Les auteurs de la présente invention ont comparé la séquence protéique de la sorbine porcine traduite à partir de l'ADNc (SEQ ID n 2) avec la séquence de la sorbine obtenue par séquençage protéique (WO 89/06241). Il s'est avérée que la séquence de la sorbine disponible jusqu'à présente, obtenue par séquençage protéique (automatique ou manuel), contenait des erreurs. Les corrections sont les suivantes: remplacement W16T et remplacements D35K et W112R.
La présente invention a donc pour objet un peptide recombinant possédant l'activité biologique de la sorbine et comprenant la séquence d'acides aminés choisie parmi les séquences SEQ ID n 2, SEQ ID n 4 et SEQ ID n 11.
Sont également compris dans l'invention les peptides homologues des peptides de séquence SEQ ID n 2 ou n 4.
Par peptide homologue , on entend tout peptide ayant une séquence d'acides aminés qui diffère des séquences SEQ ID n 2 ou n 4 par substitution, délétion et/ou insertion d'un acide aminé ou d'un nombre réduit d'acides aminés, à des positions telles que ces modifications ne portent pas significativement atteinte à l'activité biologique de la sorbine. Est exclu de cette définition des peptides homologues, le peptide ayant la séquence obtenue par séquençage automatique tel que représenté figure 1.
Lesdites substitutions sont de préférence des substitutions conservatives, c'est-à-dire des substitutions d'acides aminés de même classe, tels que des substitutions d'acides aminés aux chaînes latérales non chargées (tels que l'asparagine, la glutamine, la serine, la thréonine, et la tyrosine), d'acides aminés aux chaînes latérales basiques (tels que la lysine, l'arginine, et l'histidine), d'acides aminés aux chaînes latérales acides (tels que l'acide aspartique et l'acide glutamique) ; d'acides aminés aux chaînes latérales apolaires (tels que la glycine, l'alanine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la proline, la phénylalanine, la méthionine, le tryptophane, et la cystéine).
De préférence, une telle séquence d'acides aminés homologue est identique à au moins 85 %, de préférence au moins 95 % des séquences SEQ ID n 2 ou n 4.
L'homologie est généralement déterminée en utilisant un logiciel d'analyse de séquence (par exemple, Séquence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Des séquences d'acides aminés similaires sont alignées pour obtenir le maximum de degré d'homologie (i.e. identité). A cette fin, il peut être nécessaire d'introduire de manière artificielle des espaces ( gaps ) dans la séquence. Une fois l'alignement optimal réalisé, le degré d'homologie (i.e. identité) est établi par enregistrement de toutes les positions pour lesquelles les acides aminés des deux séquences comparées sont identiques, par rapport au nombre total de positions.
Les séquences nucléotidiques selon l'invention peuvent par ailleurs être utilisées pour la production de polypeptides recombinants possédant l'activité biologique de la sorbine tels que précédemment définis.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir des séquences nucléotidiques définies ci-dessus, selon des techniques de production de produits recombinants connues de l'homme du métier.
Selon un mode de réalisation de l'invention, la séquence nucléotidique peut être insérée dans un vecteur d'expression, dans lequel elle est liée de manière opérante à des éléments permettant la régulation de son expression, tels que notamment des promoteurs et/ou terminateurs de transcription.
Les plasmides JxnAS-TK-pGL3 diffèrent des plasmides JxnS-TK-pGL3 par l'orientation des sites J présents dans le promoteur inductible. Un fragment d'ADN, contenant un ou plusieurs sites J du promoteur du gène de l'ApoA-II humaine, a été amplifié par ACP en utilisant le plasmide J3TKpGL3 comme matrice et les oligonucléotides 3RDA37 et 4RDA48 comme amorces. Ce fragment a été digéré par Sali et Nhel puis a été cloné, dans le sens inverse de la transcription du promoteur minimal TK (AS), dans le plasmide FTKpGL3 préalablement digéré par Xhol et Nhel pour obtenir les plasmides Jx1AS-TK-pGL3, Jx2AS-TK-pGL3 et Jx3AS-TK-pGL3, selon le nombre de sites J présents. Une représentation schématique du plasmide Jx3AS-TK-pGL3 est présentée dans la figure 3.
Le fragment d'ADN, amplifié par ACP en utilisant le plasmide J3TKpGL3 et les oligonucléotides 3RDA37 et 4RDA48 comme amorces, digéré par Kpnl et Spel, a également été cloné dans l'orientation antisens (AS) dans le plasmide Jx3ASTK-pGL3 préalablement digéré par Kpnl et Nhel pour obtenir les plasmides Jx4ASTK-pGL3 et Jx5AS-TK-pGL3 selon le nombre de sites J présents.
1. 4. Plasmides DR1xnS-TK-pGL3.
Ces plasmides contiennent, comme élément de réponse aux PPAR (PPRE), une séquence consensus (AGGTCA A AGGTCA , SEQ ID NO: 5) appelée DR1
consensus. Un fragment d'ADN, contenant un ou plusieurs sites DR1 consensus, a été amplifié par ACP en utilisant les oligonucléotides 1 RDA69 (5' ACG TGT CGA CAC TAG TCA AAA CTA GGT CAA AGG TCA CGG AAA ACT AGG TCA AAG GTC ACG GAA AAC TAG 3' ; SEQ ID NO: 6) et 2RDA64 (5' CGA TGG TAC CCT CGA GCA ATG TGC TAG CCG TGA CCT TTG ACC TAG TTT TCC GTG ACC TTT GAC C 3' ; SEQ ID NO: 7) comme amorces. Ce fragment a été digéré par Xhol et Spel puis a été cloné, dans l'orientation sens, dans le plasmide FTKpGL3 préalablement digéré par Xhol et Nhel pour obtenir les plasmides DR1 x2S-TKpGL3 et DR1 x3S-TK-pGL3, selon le nombre de sites DR1 consensus présents.
Une représentation schématique du plasmide DR1x3S-TK-pGL3 est présentée dans la figure 4.
Le fragment d'ADN, amplifié par ACP en utilisant les oligonucléotides 1 RDA69 et 2RDA64 comme amorces, digéré par Xhol et Spel, a également été cloné dans le plasmide DR1x3S-TK-pGL3 préalablement digéré par Xhol et Nhel pour obtenir les plasmides DR1 x5S-TK-pGL3, DR1 x6S-TK-pGL3 et DR1 x7S-TKpGL3, selon le nombre de sites DR1 consensus présents.
1.5. Plasmides DR1xnAS-TK-pGL3.
Les plasmides DR1xnAS-TK-pGL3 diffèrent des plasmides DR1xnS-TK-pGL3 par l'orientation des sites DR1 consensus présents dans le promoteur inductible. Un fragment d'ADN, contenant une ou plusieurs séquences DR1 consensus, a été amplifié par ACP en utilisant les oligonucléotides 1 RDA69 et 2RDA64 comme amorces. Ce fragment a été digéré par Sali et Nhel puis a été cloné, dans l'orientation antisens, dans le plasmide FTKpGL3 préalablement digéré par Xhol et Nhel pour obtenir les plasmides DR1x2AS-TK-pGL3 et DR1x3AS-TK-pGL3, selon le nombre de sites DR1 consensus présents. Une représentation schématique du plasmide DR1 x3AS-TK-pGL3 est présentée dans la figure 5.
Le fragment d'ADN, amplifié par ACP en utilisant les oligonucléotides 1 RDA69 et 2RDA64 comme amorces, digéré par Kpnl et Spel, a également été cloné dans le plasmide DR1x3AS-TK-pGL3 préalablement digéré par Kpnl et Nhel pour obtenir les plasmides DR1x5AS-TK-pGL3 et DR1x6AS-TK-pGL3 selon le nombre de sites DR1 consensus présents.
EXEMPLE 2 : Spécificité des PPAR pour différents éléments de réponse.
2.1. Système utilisant hPPARg2.
L'activité des promoteurs inductibles, en utilisant hPPARg2 comme régulateur transcriptionnel, a été évaluée en transfection transitoire dans des myoblastes de souris (figure 6). Les résultats montrent que, selon l'élément de réponse utilisé (PPRE), l'induction par le ligand de hPPARg2 (BRL49653) et l'activité finale après activation varient. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant des sites J comme PPRE. De plus, l'orientation du PPRE est également importante. Dans le cas du site J, l'orientation AS est plus favorable (Panneau c).
2. 2. Système utilisant hPPARa.
Les résultats obtenus avec hPPARa comme régulateur transcriptionnel, sont rassemblés dans la figure 7. Contrairement au hPPARg2, c'est le DR1 consensus qui est le meilleur PPRE pour hPPARa (Panneaux d et e) Ces résultats montrent donc (1) la fonctionnalité des plasmides de l'invention et (2) que selon le PPAR choisi dans le système inductible, il est important de sélectionner le PPRE le plus adapté au régulateur transcriptionnel. Ce choix peut influencer le facteur d'induction dû à la présence du ligand mais également le
niveau d'activité atteint après induction. Il est bien entendu que d'autres PPRE peuvent être utilisés dans le système de l'invention.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description d'exemples de réalisation donnés ci-après, à titre purement indicatif et nullement limitatif, en faisant référence aux dessins annexés sur lesquels : la figure 1 illustre schématiquement un premier mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, à émission verticale,
# la figure 2 illustre schématiquement un deuxième mode de réalisation particulier, à émission par la tranche, # la figure 3 montre un spectre de gain pour une diode laser conforme à l'invention, à émission par la tranche, # la figure 4 montre l'évolution d'un diagramme de bande d'une portion d'un super-réseau piézoélectrique lorsqu'on y injecte des porteurs de charge, # la figure 5 est un diagramme de bande montrant des niveaux quantiques confinés dans un super-réseau piézoélectrique, # la figure 6 est un diagramme de bande d'un super- réseau piézoélectrique sur lequel on a symbolisé différents temps utilisés pour estimer le temps de réponse d'un dispositif conforme à l'invention, # la figure 7 est un diagramme de bande correspondant à deux périodes d'un super-réseau piézoélectrique contenant des puits quantiques ( quantum wells ), # la figure 8 est un diagramme de bande correspondant à trois périodes d'un super-réseau piézoélectrique avec une bande interdite différente pour les deux matériaux du super-réseau, # la figure 9 est un diagramme de bande de conduction correspondant à un exemple de diode conforme à l'invention, à émission verticale, contenant une zone active formée de puits quantiques et incluse dans un super-réseau piézoélectrique, et # la figure 10 est un diagramme de bande de conduction correspondant à un exemple de diode conforme à
l'invention, à émission par la tranche, contenant une zone active formée de puits quantiques et un super- réseau piézoélectrique inclus dans une structure à confinement d'indice du genre hétérostructure à confinement séparé.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS Comparons d'abord l'invention aux dispositif connus par le document [2].
Un dispositif conforme à l'invention, du genre VCSEL ou LED à émission verticale, se distingue des diodes connues par le document [2] par son processus de fabrication beaucoup plus simple et par sa vitesse de commutation beaucoup plus élevée, du fait de son principe de fonctionnement radicalement différent.
De plus, on peut réaliser un tel dispositif conforme à l'invention n'utilisant qu'un seul courant de commande, ce qui simplifie grandement l'intégration de ce dispositif dans des systèmes optoélectroniques.
L'accordabilité d'un tel dispositif vaut environ 10 nm et son temps de réponse vaut environ 1 nanoseconde.
Un dispositif semiconducteur émetteur de lumière conforme à l'invention, à émission verticale, est schématiquement représenté sur la figure 1. Ce dispositif comprend une microcavité résonante 2 formée sur un substrat semiconducteur 3 de type N et délimitée par un miroir inférieur 4 en matériau semiconducteur de type N, en contact avec le substrat, et par un miroir supérieur 6 en matériau semiconducteur de type P à
travers lequel est émis le rayonnement 8 engendré dans le dispositif. Bien entendu, d'autres associations de dopages sont envisageables, par exemple en inversant les zones de types N et P.
La microcavité contient une zone active 10 (milieu à gain positif) comprenant un ou une pluralité de puits quantiques ( quantum wells ) et, de part et d'autre de cette zone, un espaceur 12 en matériau semiconducteur.
En outre un ou une pluralité de superréseaux en matériau semiconducteur piézoélectrique, appelés SR-P dans la suite, sont inclus dans l'espaceur, par exemple entre la zone active 10 et le miroir 4 et/ou entre cette zone 10 et le miroir 6.
La zone active 10 n'est pas forcément au centre de la microcavité mais elle est de préférence placée sur un ventre du champ électromagnétique stationnaire établi dans la microcavité résonante 10.
Au lieu de cela, la zone active pourrait être répartie à plusieurs endroits de la microcavité et placée sur plusieurs des ventres du champ électromagnétique.
On voit aussi sur la figure 1 une électrode 16 en contact avec le substrat 3 et mise à la masse et une autre électrode 18 en contact avec le miroir supérieur 6 et reliée à une source de tension négative variable 20. Cela permet de polariser en direct (et de façon variable) la diode que constitue le dispositif de la figure 1 et d'injecter des porteurs de charge dans le ou les SR-P.
Le fonctionnement de ce dispositif, qui est accordable en longueur d'onde, est fondé sur