INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Amorce oligo dT modifiée (SEQ ID N 8) : S' GAC TCG AGT CGA CAT CGA (dT)17 3' Adaptateur d'amorce (SEQ ID N 9) : 5'GAC TCG AGT CGA CAT CG 3' Amorce spécifique de ZAMenv (SEQ ID N 10) : 5' TCA ACA GAA GAG CAC CC 3' (7642 ; 7658) 8) Analyse Dar RT- PCR 500 ng d'ARN poly(A)+ provenant de mouches adultes ont été transcrits en sens inverse pour donner les ADNc simple brin en utilisant le kit de synthèse d'ADNc simple brin provenant de BRL en suivant le protocole fourni par le fabricant. 2 l du réservoir d'ADNc ont été utilisés pour l'amplification PCR avec les oligonucléotides spécifiques 5U et ceux décrits ci-dessous.
Amorce El (SEQ ID N 11) : 5' TGG TGT ATG GTA CCG ATG GGT 3' (7971, 7991) Amorce E2 (SEQ ID N 12) : 5' TGT GAG TGT ATC CAG GTG 3' (7732 ; 7749) Amorce E3 (SEQ ID N 13) : 5' ATG TCG CAG TAG CTG GTC 3' (7437,7454) Amorce E4 (SEQ ID N 14) : 5' TGT CTT GTC TAA GAT GAG 3' (6706 ; 6723) Amorce E5 (SEQ ID N 15) : 5' CAT GTT GCC GGT GAC GAC 3' (6706 ; 6723) 9) Expérience de PCR inversée (inverse PCR) L'extraction de l'ADN des Charolles a été réalisée en utilisant une mouche selon la méthode de Gloor et Engels (1991). L'ADN a été traité par l'endonucléase de restriction HhaI. L'extrémité 3' du rétrogène Z4M a été identifiée par la méthode de PCR inversée (Gloor et al., 1983). ASO et SDO (Antisense Splice Oligonucleotide et Sense Deletion Oligonucleotide) a été utilisés comme amorce dans l'expérience de PCR.
Amorce ASO (SEQ ID N 16) : 5' CCC CAT GGC AAG ATA ATA GAA C 3' Amorce SDO (SEQ ID N 17) : 5' GTA CTT AAT ATA TAA AGG AAA CGG G 3' 10) Hvbridation in situ sur les chromosomes Dolytènes L'hybridation in situ sur les chromosomes polyténes des souches de D. melanogaster a été réalisée d'après la méthode décrite par Biémont (1994).
II- Résultats et discussion 1) Mise en évidence nar réversion phénotypique de l'existence de l'élément ZAM On a recherché un gène modifiant en trans l'expression de l'allèle wxR6 en réalisant une mutagenèse PM (Robertson et al., 1988) sur une lignée portant l'allèle wJR6 . Cet alléle est dû à l'insertion du facteur I (rétrotransposon de type LINE) dans le premier intron du gène white et donne un phénotype d'oeil marron orangé aux mouches (Lajoinie et al., 1995). Des lignées homozygotes ont été établies à partir de mouches issues de la mutagenèse et exhibant un changement de couleurs des yeux. Une de ces lignées portait une mutation sur le troisième chromosome qui supprimait partiellement le phénotype d'oeil marron-orangé wlR6 en brun foncé (Su78). Après plus de vingt générations, un mâle présentant un phénotype sauvage pour la couleur de l'oeil a été isolé. La cause de cette réversion a été génétiquement localisée sur le chromosome X à proximité du gène white. Par la technique de Southern blot, en utilisant de nombreux enzymes de restriction, on a trouvé que l'unité de transcription de l'allèle W'R6 était inchangée: chaque exon et intron était toujours présent. Il en était de même pour la carte de restriction du facteur I. Cependant, le locus white fut l'objet d'une insertion de 9 kb à environ 3 kb en amont du site d'initiation de la transcription du gène white entre les sites de restriction PstI et HpaI aux positions 6523 et 7305 respectivement selon O'Hare et al., 1984 (figure 2). Cette insertion de 9 kb est absente de ce site dans la souche wlR6 et dans les lignées utilisées pour la mutagenèse PM ou issues de la mutagenèse PM. Ce nouvel allèle de white fut nommé WlR6Rev, 2) L'insert de 9 kb est semblable à un élément rétroviral Dans le but d'isoler et de cloner l'élément inséré, des expériences de PCR ont été entreprises (V. supra, matériels et méthodes). Les oligonucléotides ol et o2, compris entre les sites de restriction PstI et HpaI, ont été utilisés comme amorce pour l'amplification (figure 3). La carte de restriction a été établie et vérifiée par southern blotting d'ADN génomique (figure 3A). Les produits obtenus par PCR ont été clonés en sous-fragments comprenant l'insertion complète (figure 3B). L'insertion présente la structure typique du rétrovirus gypsy (figure 3A), mais elle fait partie d'une famille clairement distincte des éléments transposables décrits jusqu'à ce jour chez D. melanogaster. On a appelé ce nouvel élément rétroviral ZAM.
ZAM possède à ces deux extrémités des longues répétitions terminales ( long terminal repeats, LTR) de 473 pb. Les deux LTR ont des répétitions inversées longues de 7 pb à leurs extrémités 5' et 3'. Les LTR 5' et 3' de Z4M, comme tout LTR de rétrovirus, sont bordés effectivement par un site de liaison d'amorce (primer binding site PBS) complémentaire d'un ARNt cellulaire et par une séquence poly-purine (polypurine tract PPT). Le PBS de ZAM a 12 pb complémentaires à l'extrémité 3' de l'ARNtser de D. melanogaster. L'analyse par ordinateur des LTR de ZAMen utilisant le logiciel BISANCE (Dessen et al., 1990) a montré deux motifs consensus forts du type TATA-box. Le premier motif se situe à la position 208 (TATAAA) et le second, qui correspond à une bolte TATA rétrovirale est localisé à la positon 312. Ce dernier possède une séquence signal qui correspond à un signal de polyadénylation potentiel. Le site d'insertion de 141V dans l'allèle wlR6Rcv montre une duplication cible de CGCGCG aux bornes de l'élément.
3) Analvse de la séquence de ZAM L'analyse de la séquence de ZAM, en utilisant le logiciel DNA strider (Marck, 1988), a démontré l'existence de trois phases ouvertes de lecture (open reading frame, ORF) qui codent pour des polypeptides similaires aux protéines GAG, POL, et ENV trouvées chez les rétrovirus de vertébrés tels que HIV1 ou MoMuLV (Morrow et al., 1994, Shinnick et al., 1981) ou chez les éléments rétroviraux tels que 297, 17.6, gpay, tom et TED. Dans tous les cas, les similarités s'étendent aux domaines d'acides aminés très conservés décrits chez les rétrovirus.
L'ORF1 de ZAM (figure 1) a une longueur de 343 acides aminés. Elle contient un domaine riche en Asparagine localisé dans la partie N-terminale et une région acide dans la partie C-terminale de la protéine comme décrit précédemment pour la plupart des éléments rétroviraux.
L'0RE2 de ZAM (figure 1) code pour une protéine de 1217 acides aminés qui comprend des séquences similaires à d'autres poly-protéines Pol (Xiong et Eickbush, 1990). L'analyse par le logiciel BLAST-X (Altschul et al., 1990) a révélé quatre domaines - Le domaine protéase (prt) comporte la courte séquence acide Aspartique Thréonine-Glycine (DTG), décrite comme le site actif des Aspartyl (acide) protéases par Rawlings et Barret, 1995.
- La réverse transcriptase (rt) caractérisée par le motif conservé, appelé YxDD box, qui correspond à son centre catalytique (Yuki et al., 1986).
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un vecteur conforme à l'invention pour réaliser une transgénèse ou pour la préparation d'un médicament destiné à la thérapie génique.
Figure 1 : Séquence complète du rétroélément ZAM de Drosophila melanogaster Sur cette séquence (correspondant à SEQ ID N" 1) sont notamment indiqués les sites de restriction, les trois cadres de lectures ORFI, ORF2 et ORF3 correspondant aux gènes gag, pol et env respectivement, ainsi que les séquences répétées (LTR et IR) Figure 2 : Structure de l'allèle W'R6Re' La structure de l'allèle WlR6Rev est présentée comme suit : les régions carrées noires indiquent les exons alors que les lignes fines les joignant indiquent les introns. Les exons 1 et 2 du gène white sont les seuls exons de white représentés. L'ADN en amont du gène est représenté par des tirets. Les sites d'insertion du facteur I et de la séquence 9kb sont indiqués par des triangles.
L'orientation du facteur I est indiquée par une flèche.
Figure 3 : Structure moléculaire et organisation de ZAM (A) Carte de restriction de l'insert 9kb. Les rectangles représentent les séquences répétées longues (Long Terminal Repeats LTRs), les lignes en pointillés représentent les régions non transcrites en amont de white. Organisation des gènes : les phases ouvertes de lecture de gag, pol et env sont symbolisées par des rectangles.
(B) Stratégie du sous-clonage de l'insertion. Les lignes noires représentent des fragments de l'insertion clonée dans le vecteur pBluescript ou amplifiée par PCR à longue matrice (Long Template PCR) P3. Les oligonucléotides utilisés pour l'amplification PCR de l'insertion complète (o1 et 02) ou du fragment P3 (5U et p2) sont symbolisés par des flèches.
Figure 4 : Alignement multiple de la séquence d'acides aminés déduite des régionspol Comparaison de la séquence partielle d'acides aminés des régions conservées de la protéase (A), de la réverse transcriptase (B), de la RNase H (C), de l'intégrase (D) de l'ORF de pol et d'une région conservée (E) de l'ORF de env.
Les acides aminés qui sont strictement conservés entre ZAM et les autres membres analysés sont indiqués par un signe +, alors que les acides aminés conservés dans certains éléments et similaires dans d'autres sont indiqués par une étoile. Les tirets indiquent des trous qui sont introduits pour préserver l'alignement. Abréviations MoMuLV pour Moloney Murine Leukemia Virus ; HIV2 pour Human Immunodeficiency Virus type 2.
Les numéros d'accession (pour pol et env respectivement) sont les suivants : TED, B36329 et C36329 , gvpsv, GNFFG1 et ENVI-DROME ; 297, B24872 et ENV2-DROME ; 17,6, GNFF17 et Y172-DROME ; tom, S34639 et S34640 ; MoMuLV, POL-MLVMO et HIV2 1072794.
Figure 5 : Expression et structure des transcrits de ZAM (A) Organisation de l'élément ZAM avec les localisations des différents ORFs.
(B) Structure des transcrits génomiques et sous-génomiques de l'élément ZAM. Les dessins schématiques montrent l'ARN génomique non-épissé et le transcrit ORF3 épissé. Les numéros correspondent aux nucléotides du site donneur de lépissage (531) et du site accepteur (6387), la position où la polyadénylation a eu lieu (8306) et le site où l'initiation de transcription a commencé (329). SU, El, E2, E3, E4 et ES sont les nucléotides utilisés pour les amplifications PCR et pour l'analyse de la séquence.
(C) Séquence nucléotidique des sites d'épissage de Z4M. Les deux séquences génomiques sont celles de la région leader et du début de ORF3. La séquence de l'ARN sous-génomique est celle provenant de l'amplification PCR de l'ADNc.
Figure 6 : Séquence d'acides aminés prédite du produit de l'épissage de ORF3 Le soulignement épais indique la localisation du peptide signal (SP) de la protéine précurseur et du domaine transmembranaire (TM). Les résidus asparagine (N) dans les sites de N-glycosylation conformément à la séquence consensus N-X-S/T sont dans des carrés. Un site putatif de clivage protéolytique et des résidus cystéine sont soulignés d'un trait épais. La flèche noire indique le site possible de clivage qui élimine le peptide signal.
Figure 7 : Formation du rétrogène Enveloppe (A) représente une structure simplifiée de ZAM ainsi que son ARNmenv. La PCR à longue matrice a été réalisée sur l'ADN génomique des souches à basse copie (Canton S et wxR6) et haute copie de ZAM (wlR6ReV et Charolles) en utilisant les oligonucléotides SU et El. Les deux cascades de formation de l'ADN enveloppe génomique qui est épissé et délété (Charolles) sont présentées dans (B) (formation du rétrogène) et dans (C) (formation du pseudogène). (B1) présente la structure du rétrogène ZAM identifié dans des souches Charolles. Les carrés vides et rayés représentent les LTRs complets et incomplets respectivement. ASO (Antisense Splice Oligonucleotide) et SDO (Sense Deletion Oligonucleotide) sont les amorces spécifiques utilisées pour les expériences de PCR inverse. ASO et SDO sont localisés respectivement à la jonction d'épissage (SJ) et au site de délétion (triangle). SD et SA sont respectivement les sites donneur et accepteur d'épissage. H symbolises le site d'action de l'endonucléase de restriction Hhal utilisée pour la PCR inverse.
L'invention ne se limite pas à la description ci-dessus. Les exemples ci-après permettrons de mieux la comprendre mais ils ne sont donnés qu'à titre illustratif.
EXEMPLE 1 : IDENTIFICATION ET ANALYSE DE L'ELEMENT ZAM I- Matériels et méthodes 1) Les stocks de mouches Les stocks de mouches sont maintenus sur un milieu nutritif maïsglucose-levure.à 20 C. Les souches des Charolles, SV-XX (WVl44, C(l)DX, yf), WIR6 et Canton S proviennent de la collection de l'lNSERM U384.
2) La DréDaration de l1ADN de Drosophile et le southern blottir L'extraction de l'ADN génomique a été réalisée à partir des souches de Drosophile selon le protocole de Udomkit et al., 1995. L'ADN a ensuite été transféré sur membrane Hybond N+ par capillarité dans une solution contenant 3,6 M NaCI, 0,2 M Na phosphate, 0,02 M EDTA pH 7,7. Après hybridation à 420C, les filtres ont été lavés dans 2X SSC, 0,1% SDS à 420C et dans 0,1X SSC, 0,1% SDS à 42 C. Les fragments utilisés comme sonde ont été purifiés par gel et marqués avec cL[32P]-dCTP par "random priming" (Stratagène).
La présente invention concerne l'identification et le séquençage complet d'un nouveau rétroélément appelé ZAM et identifié chez Drosophila melanogaster.
14Ma une taille de 8,4 kilobases et sa séquence est reportée dans SEQ ID N" 1. Comme les rétrovirus, ZAM est constitué de trois gènes gag, pol et env codant pour des protéines analogues à celles retrouvées chez les rétrovirus, à savoir respectivement la protéine de capside, les protéines à activité enzymatique (protéase, réverse transcriptase, Rnase H et intégrase) et la protéine d'enveloppe.
Les trois cadres de lecture (ORFs) sont encadrés par des régions répétées longues (LTRs). ZAM possède le site de liaison à l'ARN de transfert spécifique de la sérine (site PBS) dans sa région 5' et une région riche en polypurines à l'extrémité 3'. Ces deux régions sont utilisées pour le processus de transcription reverse.
La présente invention a donc notamment pour objet une séquence nucléotidique correspondant à : a) la séquence selon SEQ ID N" 1 en tout ou partie, ou b) une séquence s'hybridant avec la séquence selon a), ou c) une séquence présentant au moins 80 %, de préférence 90 % d'homologie avec une séquence selon a) ou b).
Plus particulièrement, cette séquence correspond à tout ou partie du rétroélément Z4M de Drosophila melanogaster.
Comme indiqué précédemment, le rétroélément ZAM comprend le gène d'une intégrase.
Cette intégrase rétrovirale est capable de diriger l'intégration d'une séquence d'acide nucléique dans une région spécifique d'un génome. Cette région spécifique est la séquence GCGC au niveau de laquelle, comme mentionné cidessus, I'intégrase conforme à la présente invention procède à l'intégration d'une séquence d'acide nucléique. Comme également précédemment indiqué, I'intégration d'une séquence d'acide nucléique peut être réalisée dans le but d'inactiver ou d'inhiber tout ou partie de l'expression d'un gène dans une cellule cible ; elle peut également comprendre un gène d'intérêt destiné à pallier une déficience totale ou partielle du gène correspondant natif.
La séquence de l'intégrase du rétroélément Z4M est reportée dans SEQ IDN02.
La présente invention a donc également pour objet une séquence nucléotidique correspondant à un gène comprenant a) la séquence selon SEQ ID N" 2 en tout ou partie, ou b) une séquence s'hybridant avec la séquence selon a), ou c) une séquence présentant au moins 80 %, de préférence 90 % d'homologie avec une séquence selon a) ou b), ou d) une séquence codant pour une protéine codée par un gène selon a), b) ou c) ou une protéine équivalente.
L'invention concerne donc également des séquences codant pour l'intégrase de Z1M compte tenu de la dégénérescence du code génétique et pour toute protéine équivalente. Par "protéine équivalente" à l'intégrase de Z4M, on entend une protéine qui, sans avoir une séquence et/ou une structure rigoureusement identique à l'intégrase de ZAM, présente une activité identique ou similaire à cette dernière ou produit les mêmes effets ; c'est notamment le cas de protéines délétées et/ou ayant subi des mutations ponctuelles.
De plus, l'étude de l'intégrase conforme à l'invention a montré qu'elle présentait toutes les caractéristiques des intégrases rétrovirales citées précédemment, à savoir un domaine HHCC du côté N-terminale, un domaine D, D-35-E dans sa partie médiane et une région riche en acides aminés basiques du côté C-terminal.
Comme indiqué précédemment, la séquence spécifique au niveau de laquelle intervient l'intégrase rétrovirale conforme à l'invention contient le tétranucléotide GCGC. Le système de fonctionnement de l'intégrase occasionne une duplication de cette séquence qui se retrouve donc de part et d'autre de la séquence intégrée dans le génome de la cellule hôte. A ce propos, il est a souligner que cette séquence contient le site de restriction Hha I (GCGC).
La présente invention a également pour objet un vecteur d'intégration d'une séquence d'acide nucléique, voire d'un gène d'intérêt, qui comprend outre la séquence d'acide nucléique à intégrer, une séquence d'acide nucléique nécessaire pour procéder à ladite intégration. Cette séquence est l'une des séquences nucléotidiques conforme à l'invention et de préférence une séquence correspondant à tout ou partie de ou présentant une forte homologie avec l'intégrase conforme à l'invention. En effet, la séquence d'acide nucléotidique correspondant à l'intégrase peut ne coder que pour une partie de celle-ci ou une forme mutée de celle-ci si le polypeptide résultant présente une activité identique ou similaire à celle de l'intégrase sauvage.
Les vecteurs susceptibles d'être mis en oeuvre dans le cadre de l'invention sont des vecteurs de type adénoviral, rétroviral, plasmidique ou tout transposon ou rétrotransposon susceptible de remplir la même fonction. Dans ce cas, il est clair que le vecteur conforme à l'invention, en plus, par exemple, de l'intégrase et de la séquence d'acide nucléique à intégrer, doit comprendre tous les éléments nécessaires à l'expression de l'intégrase dans la cellule hôte, que celle-ci soit eucaryote ou procaryote.
Dans le cadre de la présente invention, le vecteur peut également comprendre tout ou partie du rétroélément ZAM qui comprend déjà les éléments en question.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un vecteur conforme à l'invention ainsi qu'un support pharmaceutiquement acceptable.
En plus des applications ci-dessus exemplifiées, de très nombreux autres essais d'application ont été effectués avec succès sur des matériaux aussi divers que les encres (notamment celles utilisables en sérigraphie), la pierre, la porcelaine, la céramique, la peinture latex, les revêternents métalliques, etc...
Degré de blanc ou de noir: Voir Figure en annexe Pe?re de saturation Cette echelle des valeurs est hybride, dans le sens que les deux aspects (sa turation et'proximité du blanc/noir) se côtoient et, parfois, se chevauchent dans la description des couleurs.
Legende: "Moyen": Cette designation, au centre de l'échelle des valeurs, s'applique soit au degré. de saturation, soit au degré de proximité avec le blanc/noir, soit aux deux. Cette notion ne se comprend que dans le contexte des désigna tions, qui la précèdent et la suivent.
Couleur: Dans le système, lorsque la couleur est désignée uniquement par sa dénomi nation (ex.: bleu), indépendamment de tout qualificatif (ex.: bleu clair), c'est qu'elle est saturée au point de notre qu'identique à elle-meme, ni plus ni moins.
Reflet: Désigne une luminosité, comme une vapeur colorée, qui se reflète faible- ment avec la couleur et les tons.
Liste des mineraux naturels Légende: 3) nom du minéral; b) couleur à i'état de pierre; c) couleur å 1 'état de poudre; d) lieu de provenance.
Les associations qui ont été décrites entre chaque mode de réalisation ou variante d'exécution de l'étui de chaque mode de pliage sont préférées mais non limitatives.
Chacun des modes de réalisation des articles de la présente invention peut comprendre un mode particulier d'incorporation des produits. L'article objet de la présente invention peut être garni de lingettes ou de tout autre produit selon les procédés connus de l'homme du métier et ce à différents stades de l'élaboration de l'étui.
Ainsi, de manière illustrative mais non limitative, lorsque l'étui qui compose l'article est formé d'une feuille souple, il est possible de former un premier bord par pliage de la feuille, puis de former deux autres bords par soudure puis de remplir l'étui ainsi formé par le côté resté ouvert qui ne sera soudé qu'après remplissage de l'étui.
Selon la qualité des lingettes employées, l'imprégnation peut se faire de manière individuelle pour chaque lingette et donc avant la mise en place dans les étuis, ou de manière groupée à n'importe quelle étape du processus d'incorporation.
La présente invention concerne le rétroélément Z4M ainsi que son intégrase rétrovirale capable de diriger l'intégration d'une séquence d'acide nucléique dans une région spécifique d'un génome ainsi que les vecteurs comprenant, outre ladite séquence nucléique à intégrer, la séquence comprenant tout ou partie du susdit rétroélément ou de son intégrase ; I'invention concerne également l'utilisation de ces vecteurs.
L'invention s 'inscrit plus particulièrement dans les domaines de la transgénêse et de la thérapie génique.
Les techniques de génie génétique mettant en oeuvre des vecteurs viraux ont largement été développées ces dernières années, les vecteurs en question dérivant des rétrovirus, des adénovirus, des virus associés aux adénovirus, des virus herpétiques... La thérapie génique résulte de la mise en oeuvre de ces techniques réalisant la pénétration de l'ADN au sein d'une cellule hôte dans le but d'apporter un nouveau gène pour pallier l'insuffisance qualitative ou quantitative du gène d'origine, de moduler une expression génétique endogène ou de corriger précisément une anomalie d'un gène résultant d'une mutation.
L'une des techniques les plus utilisées à l'heure actuelle est celle faisant intervenir l'utilisation des vecteurs dérivés des rétrovirus. Les avantages apportés par ce type de vecteur sont en effet nombreux efficacité de pénétration du matériel génétique dans la cellule hote, système actif et efficace d'entrée dans le noyau de la cellule cible, expression génique relativement importante, potentialité à pouvoir cibler un type de cellules particulières grâce au contrôle de la liaison du vecteur à la cellule cible et ainsi permettre l'expression génique sous contrôle d'une spécificité tissulaire, et enfin ces vecteurs sont si largement mis en oeuvre qu'ils donnent lieu à une quantité importante de données disponibles tant expérimentales que cliniques.
Par ailleurs, les vecteurs dérivés des rétrovirus sont les plus utilisés pour le transfert de gène dans le cadre d'une thérapie génique car ils permettent d'intégrer au chromosome hôte des séquences thérapeutiques par des liaisons covalentes précises. Cependant, l'intégration de séquences dans un génome présente de nombreux risques pour l'hôte. Le système d'intégration rétroviral montre effectivement une très faible spécificité de site cible et les intégrations se font au hasard sur les chromosomes entraînant des mutations variées. L'intégration à proximité d'un proto-oncogène, par exemple, peut entraîner l'activation ectopique de gène à l'origine de cancers. A l'inverse, l'intégration rétrovirale peut aussi conduire à une inactivation du gène touché par l'insertion.
De récentes études concernant les sites d'intégration spécifique de séquences d'ADN par des éléments de type rétrovirus (rétrotransposons) suggèrent que cette nouvelle stratégie de thérapie génique empêcherait tout problème d'insertion mutagène par le ciblage de la séquence d'ADN du chromosome hôte où se produit l'insertion et le contrôle de l'intégration de la séquence.