INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
1995), incubées au préalable pendant 3 h avec les exosomes de P815. Les tumeurs ont été mesurées et les résultats analysés comme décrit dans la figure 6. Les exosomes de P815 ont sensibilisé les cellules dendritiques pour induire le rejet des tumeurs établies. Du fait de la faible dose en exosomes injectée en intradermique, les exosomes n'ont pas eu d'effet significatif sur la croissance tumorale. L'insert montre le pourcentage de souris sans tumeur (en ordonnées), la barre pleine correspondant uniquement aux groupes d'animaux de type carrés pleins, l'abscisse correspondant aux jours. Ces souris n'ont pas développé de tumeur après ré-injection du double de la dose tumorale minimum, montrant qu'elles avaient développé une immunité antitumorale. Les symboles utilisés dans la figure sont les suivants Q : cellules dendritiques incubées avec des exosomes témoins, : cellules dendritiques incubées avec des exosomes P815, A: exosomes P815 en intradermique, X : animaux non traités.
En abscisses, on a indiqué les jours et en ordonnées le volume moyen de la tumeur.
Figures 8A, 8B et 8C. Des agents chimiothérapeutiques/cytotoxiques et l'irradiation peuvent stimuler l'exocytose des exosomes tumoraux.
La leucémie murine L1210 et la lignée de cancer du rein primitif humain GIAM ont été utilisées (figure 8C). Deux millions de cellules tumorales ont été incubées en présence de quantités croissantes de 5 Fu (pour L1210) ou de cis-platinum (CDDP) (pour GIAM) par ml pendant 16 heures.
Le surnageant a été récupéré, puis a fait l'objet d'ultra-centrifugations différentielles comme sus-décrit dans le tableau 1.
GIAM a aussi été incubée en IL-2 1000 U/ml, ou en dexamethasone (104 M), ou irradiée à 10.000 rads.
Les parties suivantes traitent des protocoles utilisés pour déclarer les périphériques sur les points d'accès. Le paragraphe 3.4.1 traite du processus de déclaration de nouveaux périphériques, y compris des processus de synchronisation, d'authentification et de négociation de service. Le paragraphe 3.4.2 traite des événements qui peuvent provoquer l'annulation automatique de la déclaration d'un périphérique par le système.
Enfin, le paragraphe 3.4.3 traite d'un processus rationalisé de redéclaration de périphériques connus dans le système.
Pour qu'un périphérique puisse acquérir un nouveau système et accéder à un service, il doit être capable de se synchroniser avec un point d'accès, de rejeter les points d'accès qui ne lui appartiennent pas et enfin d'identifier le point d'accès du client comme étant le sien. Le point d'accès du client et le périphérique sont supposés partager un même NIP, qui est unique au nouveau périphérique. Dans des systèmes sûrs, le point d'accès et le périphérique sont supposés partager également un même CSP. La méthode d'introduction du NIP et du CSP dans le point d'accès est laissée à la discrétion du fabricant.
La figure 27, numéro 2700, illustre un automate fini possible qu'un périphérique peut suivre lors de la synchronisation avec un nouveau système. La figure 28, numéro 2800, représente le schéma de séquence des messages du processus de déclaration. Le périphérique commence par rechercher le modèle de synchronisation sur une fréquence initiale (2802). Si aucun modèle de synchronisation n'est détecté dans le temps TP301, le périphérique change systématiquement de fréquences et recommence à chercher le modèle de synchronisation. Si une séquence de synchronisation est détectée, le périphérique envoie une demande de déclaration sur un bloc d'accès en conflit disponible. Dans le temps TA302 (équivalent à TP302), le point d'accès (2704) doit répondre par une attribution de déclaration ou un rejet de déclaration. Si le périphérique est rejeté, il change de fréquence et recommence à chercher le modèle de synchronisation.
Lorsqu'un périphérique est accepté par un point d'accès, il reçoit du point d'accès son adresse de base, la table de sauts de fréquence et l'indice de code de cryptage dans l'attribution de déclaration. L'attribution de déclaration inclut également une identification spécifique au système qui identifie de manière unique le point d'accès et une identification de périphérique attribuée par le système, qui peut être utilisée pour les redéclarations suivantes afin d'identifier de manière unique le système et le périphérique.
Un périphérique authentifie le réseau en émettant un message d'interrogation d'authenticité contenant un nombre aléatoire qui doit être associé au CSP en utilisant un algorithme d'authentification de façon à produire une réponse d'authenticité. La réponse est communiquée au périphérique dans le message de réponse du point d'accès. Le périphérique compare la réponse à une réponse générée localement et si elles correspondent, le point d'accès a été authentifié. De même, le point d'accès peut authentifier le réseau à l'aide de la même paire de messages d'interrogation et de réponse d'authenticité. Il faut noter que cela n'est pas le cas si le CSP est transmis par l'interface radio, le gardant secret.
L'étape suivante du processus de déclaration est la phase de négociation de service. Le périphérique lance le processus en envoyant un message de configuration de service au point d'accès. Le message de configuration de service contient un ou plusieurs éléments d'information de demande d'initialisation d'application. Les informations de demande d'initialisation d'application contiennent un identificateur spécifique à l'application qui identifie de manière unique l'application et le réglage requis de l'application. Chaque demande d'initialisation d'application est transmise à l'application installée, qui interprète les informations et génère une réponse contenant les réglages de l'application sous forme d'éléments d'information d'attribution d'application. La fonction DMF ajoute un identificateur court d'application d'un octet pour référence ultérieure à l'application. Si l'application identifiée est disponible, la fonction DMF génère un élément d'information application non disponible en réponse à la demande d'initialisation. Toutes les réponses d'application sont combinées et transmises au périphérique dans un message d'attribution d'application.
Si le périphérique n'est satisfait par aucune attribution d'application, il envoie une autre configuration de service contenant d'autres réglages d'application. Ce processus se poursuit jusqu à ce que le périphérique reçoive un ensemble de paramètres qui lui convienne ou choisisse de ne pas avoir recours aux services d'une application. A ce stade, le périphérique met fin au processus de négociation en envoyant une fin de négociation de service contenant les identifications d'application de l'application qu'il a choisie. Les identifications d'application omises sont supposées rejetées et, donc, le point d'accès peut libérer toutes les ressources précédemment négociées associées aux applications rejetées.
Lors du processus de négociation de service, le point d'accès détermine un mode d'attente approprié en fonction des exigences de temps de latence des applications choisies par un périphérique. Le mode d'attente est généralement transmis dans l'élément d'information d'attribution d'application, mais peut être réattribué à chaque fois qu'un périphérique est déclaré dans le système. A la fin du processus de négociation, le périphérique entre en mode d'attente à faible consommation d'énergie. Il quitte le mode d'attente lorsqu'il exécute un transfert isochrone ou asynchrone, puis revient en mode d'attente lorsque les transferts sont terminés.
Pendant le déroulement normal des opérations, de nombreux événements peuvent entraîner une annulation de la déclaration d'un périphérique par le point d'accès ou peuvent faire supposer au périphérique qu'il n'est plus déclaré. En général, ces événements sont tous liés à la détection d'une dégradation de la qualité du signal qui peut être provoquée par de nombreux facteurs. Par exemple, le périphérique peut être sorti de la plage ou avoir été masqué. Il se peut aussi que la batterie du périphérique soit déchargée ou que le périphérique soit hors tension. Quelle qu'en soit la cause, une annulation de la déclaration d'un périphérique n'est pas un événement catastrophique et le périphérique peut rapidement être de nouveau déclaré, lorsque la cause de la dégradation de la qualité du signal est éliminée, en utilisant le processus décrit au paragraphe 3.4.3 Redéclaration des périphériques.
Une dégradation de la qualité du signal est détectée par des erreurs dans l'exécution du protocole.
Par exemple, le fait de ne pas accuser réception de plusieurs appels ou interrogations successifs est une raison pour le point d'accès d'abandonner le périphérique. De même, un périphérique rencontrant plusieurs intervalles d'interrogation sans être interrogé peut supposer que le point d'accès a annulé sa déclaration. D'autres événements garantissant l'annulation de la déclaration sont par exemple une panne brusque et prolongée du transfert isochrone ou l'incapacité d'un périphérique à décoder un nombre important de salves AB successives.
Un point d'accès annule la déclaration d'un périphérique lorsque les compteurs NA203 et NA204 sont dépassés. La déclaration d'un périphérique est également annulée lorsque la minuterie TA205 a expiré. Enfin, un périphérique peut ne plus être déclaré s'il n'a pas exécuté la redéclaration exigée par le mode d'attente DRX.
Un périphérique tente de se redéclarer auprès d'un système lorsque les minuteries NP202 et NP203 ont été dépassées. Un périphérique tente également de se redéclarer lorsque la minuterie TP205 a expiré. Enfin, un périphérique peut se redéclarer conformément aux exigences du mode d'attente DRX.
Le processus de redéclaration se déroule régulièrement pendant le fonctionnement normal du protocole et peut être exécuté de manière adéquate.
La figure 29, numéro 2900, est un organigramme du processus de redéclaration. L'organigramme a deux entrées, une pour les périphériques actuellement synchronisés avec le système et une pour les périphériques qui ne sont pas synchronisés. Le processus est similaire au processus de déclaration normal en ce que la recherche de fréquence est utilisée et est suivie d'une demande de déclaration. Cependant, le processus de redéclaration permet à un point d'accès, qui identifie un périphérique familier, de répondre par une attribution de déclaration contenant une identification de périphérique identique à celle émise lors de la déclaration initiale.
Les différents éléments constitutifs du mécanisme sont dimensionnés et positionnés de telle manière que le doigt 41 (et, corrélativement l'extrémité 610 du convoyeur) reste constamment sensiblement dans le même plan vertical, quel que soit le degré d'extension du vérin 33.
A l'avant du chariot, de chaque côté, est prévue une patte 300 dirigée vers le haut, sur laquelle est articulée, autour d'un axe 50, une tige de liaison 5. Son extrémité opposée est articulée sur une biellette 42 qui peut pivoter autour de l'axe 41 mentionné plus haut.
Cette biellette 42 se prolonge, au-delà de l'axe 51, par une partie en débord portant un point d'attache 420 pour un câble de traction 8. L'autre extrémité du câble 8 est accroché, par un point 710, à la patte 71 de la nacelle 7.
Le poids de la nacelle tend constamment à la faire tourner - vers le bas et vers l'aval - autour de l'axe 70, mais elle est retenue par le câble, et maintenue dans une position dressée (fond horizontal).
Selon une caractéristique remarquable, les distances entre les points 40- 50 d'une part et 41 - 51 d'autre part, ainsi que leurs directions X et Y, respectivement, d'autre part, sont identiques.
Les points 40, 50, 51, 41, forment donc les quatres côtés d'un parallélogramme déformable, et les axes X, Y restent constamment parallèles l'un à l'autre quelle que soit l'inclinaison Q du convoyeur par rapport au châssis.
De la même manière, les points 70 et 710 sont choisis de telle façon que leur orientation Z soit la même que l'orientation Y, et que leur écartement mutuel soit le même que celui des points 41 et 420.
Ce sont donc les trois directions X Y et Z qui restent constamment parallèles, quel que soit le degré de pivotement du convoyeur.
Le convoyeur 6 présente un capotage qui recouvre sa partie supérieure pour constituer un tunnel. Ce capotage est formé d'une ossature métallique sur laquelle sont fixées des plaques en matière synthétique, par exemple en polyester.
Selon une caractéristique avantageuse, la hauteur du tunnel décroît d'une extrémité à l'autre du convoyeur.
Sur la figure 4 on a représenté ce capotage en traits interrompus mixtes. La partie amont 64 présente un capotage 600 de hauteur relativement grande, un peu supérieure à la taille des dindes ou dindons.
La partie 60 possède une première partie de capotage 600' de hauteur décroissante, le "toit" du tunnel convergeant vers le bas, puis une seconde partie 601 de hauteur constante. La partie télescopique 61 est équipé d'un capotage 602 de hauteur réduite. Bien entendu, ce dernier est adapté pour pouvoir coulisser à l'intérieur du capotage 601 lors du télescopage de la partie 61.
De même, les capotages 600 et 600' autorisent le débattement angulaire relatif des parties 64 et 60.
Le rôle de ce tunnel est d'obliger les dindes ou dindons à se coucher progressivement sur le convoyeur au cours de leur transport par celui-ci, de telle manière que les opérateurs présents dans les nacelles 7 puissent les prélever plus facilement par les pattes lorsqu'ils arrivent à l'extrémité aval.
Sur la figure 4, le dispositif est représenté en position de travail pour l'approvisionnement d'une cage 10 située en haut du camion. L'angle d'inclinaison Q i que forme le convoyeur par rapport au châssis horizontal 2 est relativement grand, par exemple de l'ordre de 30".
En position de rangement, cet angle est de quelques degrés seulement, le convoyeur étant rabattu vers le bas sur le châssis 2. Sur la figure 8 on a représenté en traits interrompus le mécanisme à parallélogramme déformable dans cette position escamotée, la face supérieure de la portion de convoyeur 60 y étant symbolisée par un trait mixte fort. Dans cette position, les vérins 33 sont rétractés.
- PAM/0.SG 10 mM (NH2): Poids Moléculaire 50860,4 Une mole de PAM/0.5G correspond à 295,7 moles de fonctions amines NH2 non substituées. 45,5 mg de PAM/0.5G (0,9 pirole et donc 264 pmole de NH2) sont mis en solutions dans 26,4 mL d'eau bidistillée pour obtenir une solution 10 mM (NH2)- - PAM/0.7G 10 mM (NH2): Poids Moléculaire 57720,6 Une mole de PAM/0.7G correspond à 177,4 moles de fonctions amines NH2 non substituées. Afin d'obtenir une solution 10 mM (NH) 58 mg de PAM/0.5G (0,9 pmole et donc 160 punole de NH2) sont mis en solutions dans 16 mL d'eau bidistillée.
5 . Préparation des complexes ADN/ polymères (PAM/0.5G ou PAM/0.7G) Dans deux tubes Eppendorf de 1,5 ml, les quantités nécessaires (voir tableau ci-dessous) de polymère et de plasmide sont respectivement diluées dans 150 pl de NaCl ou 150 pl de HEPES 20 mM pH 7,5. La solution est mélangée au vortex puis centrifugée. Après 10 min, les deux solutions sont mélangées et le mélange est placé à température ambiante. Après 10 min d'incubation, les complexes formés peuvent être utilisés pour la transfection de cellules.
nombre 2,5 5 d'équivalents (eq.) Volume de solution 1,5 pl/2 pg* 3 pl/2 pg* de polymère 10 mM (NH2) 3 pl/4 pg* 6 pl/4 pg*
* : Quantité de plasmide.
La proportion d'amines protonées du polymère à pH donné, n'étant pas connue de manière exacte, les complexes analysés sont exprimés en équivalents (eq) d'azote par rapport au phosphate de l'ADN (N/P). Ainsi un équivalent représentera la quantité de polymère nécessaire pour avoir un azote par groupement phosphate de l'ADN (Felgner et al.,1997, Human Gene Therapy, 8, 511-512).
6 . Transfection 100 pl du complexe obtenu au point 5 sont versés sur les cellules distribuées en multi-puits comme décrit précédemment, préalablement rincées avec du milieu frais sans sérum. Après 2 à 3 h, le milieu est substitué par du milieu complété avec 10% de Sérum de Veau Foetal. Le taux d'expression du gène luciférase est mesuré après 48 h. Pour cela, les cellules transfectées sont lysées dans un tampon de lyse (Promega). Les débris cellulaires sont ensuite éliminés par centifugation et l'activité luciférase (en RLU/min, Unité de lumière relative par minute) est mesurée sur 20 pl de surnageant conformément aux instructions du fournisseur (Promega) en ajoutant 100 pl de réactif et en mesurant l'activité par luminescence. La quantité de protéine totale est, par ailleurs, déterminée par la méthode colorimétrique d'acide bicinchoninique BCA (Smith et al., 1985, Anal. Biochem., 150, 76-85 Pierce) à partir d'un aliquote de surnageant. Ceci permet d'exprimer l'activité luciférase en RLU par milligramme de protéine extraite des cellules.
7 . Transfection en présence de chloroquine 100 AM: Selon une variante de la technique de transfection proposée ci-dessus, Le volume nécessaire d'une solution 10 mM de chloroquine est ajouté au milieu de culture juste avant l'addition du complexe ADN/polymère de manière à obtenir une concentration finale par puits de 100 AM.
B - RESULTATS Exemple 1: Transfert de gène dans les cellules A549 et influence de la charge du complexe ADN/polymère cationique.
Dans un premier temps, différents complexes sont formés selon le protocole exposé plus haut en ajoutant deux quantités différentes de PAM/0,5G 10mM ou de PAM/0,7G 10 mM à une quantité fixe de plasmide (2pu), afin d'obtenir différents ratios N/P (équivalents ; 2.5 ou 5 eq). Ceci permet d'étudier si la charge totale du complexe formé par interactions éléctrostatiques entre les amines du polymère cationique analysé et les phosphates de l'ADN plasmidique joue un rôle sur l'efficacité de la transfection. Les résultats (figure 3) montrent que les PAMs glycolilées à 50% ou à 70% sont capables de transférer efficacement l'ADN dans les cellules, même à faible équivalent de charge. On peut par ailleurs noter que la présence de chloroquine (100 WM) permet d'améliorer l'efficacité de trans fection.
Exemple 2: Effet de la quantité d'ADN sur l'efficacité de la transfection.
Les complexes pour cette série d'expériences sont formés en mélangeant des quantités croissantes d'ADN plasmidique (2, 4 ou 6 pg) et des quantités variables de PAM/0,SG ou de PAM/0,7G afin d'obtenir des ratios N/P de 1.5 eq, 2.5 eq ou 5 eq. Les résultats obtenus (figure 4) après transfection des cellules A549 avec ces différents complexes montrent que les polymères PAM/0,5G et PAM/0,7G permettent une transfection efficace des cellules, avec ou sans chloroquine, quelle que soit la quantité d'ADN. Il est en outre intéressant de noter que la chloroquine n'est pas indispensable pour obtenir un taux d'efficacité performant lorsque l'on utilise pour la transfection un complexe ADN/PAM/0,7G préparé à partir de 4 Hg d'ADN et à 5 équivalents de charge.
Exemple 3: Transfert de gène dans les cellules MRC5 Il est connu que l'efficacité du transfert de gène par utilisation de vecteurs non-viraux peut varier notamment en fonction du type cellulaire considéré. Nous avons donc testé notre système de transfection sur un autre type cellulaire tumoral, les MRC5, considérées comme des cellules difficilement transfectables (Boussif et al., 1996, Gene Therapy, 3, 1010 1017). Les complexes ont été préparés comme décrit précédemment en mélangeant des quantités variables d'ADN plasmidique (2 ou 4 pg) et des quantités variables de polymères cationiques PAM/0,5G ou PAM/0,7G de façon à obtenir des valeurs d'équivalents de charge de 2.5 ou de 5 eq. Par ailleurs, les transfections ont été réalisées en présence ou en l'absence de chloroquine (100M) Les résultats présentés à la figure 5 montrent que les cellules MRC5 sont transfectées efficacement dans les conditions expérimentales testées.
Exemple 4: Comparaison des efficacités de transfection des PAM/0,7G et PLL/0,7G Afin de montrer l'importance de la nature chimique du polymère, les efficacités de transfection du PAM/0,7G à celles observées avec un analogue obtenu à partir de la polylysine (PLL) dont 70% des fonctions NH2 libres ont été glycolilées comme décrit en A.1. (Figure 6).
La transfection des cellules A549 a été réalisée comme décrit précédemment en utilisant des complexes ADN/polymère cationique pour lesquels ledit polymère est du PAM/0,7G ou du PLL/0,7G ou de la polylysine non susbstituée. En outre, ces complexes ont été préparés avec différentes quantités d'ADN (2 ou 4pu), et en faisant varier le rapport N/P (2.5 ou 5 eq).
Les résultats obtenus (figure 7) montrent que la substitution à 70% du polymère PLL ne permet pas d'améliorer les faibles taux d'expression observés avec la polylysine non-modifiée (PLL) qui sont de 50 à 100 fois plus faibles que ceux observés dans des conditions identiques avec la PAM/0,7G.
Exemple 5: Cytotoxicité des polymères et des complexes ADN/Polymère La cytoxicité des polymères PAM substitué et non substitué a été analysée en réalisant un test colorimétrique au MTT (bromure du 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) (Mossman T., 1983, Journal of Immunological Methods, 65, 55-63).
On fait toumer le mélangeur pendant 15 minutes afin d'avoir une solution homogène; on verse 10 g de colorant, par exemple jaune orange du type W 797, fabriqué par WACKHERR.
On laisse tourner le mélangeur pendant 5 minutes pour que la solution du produit développeur de racines prenne une couleur jaune homogène. Puis on verse dans la solution à l'intérieur du mélangeur 10 kg de substance hydrophile telle que celles à base de tiges de maïs ou de bagasse de canne à sucre issu des exemples 1, 2 ou 6, et on fait tourner le mélangeur pendant 20 minutes afin que la totalité de la solution de l'agent développeur de racines soit absorbée d'une manière complète et homogène par la substance hydrophile.
On envoie le mélange dans un séchoir à air chaud à 20"C jusqu'à ce que la quantité d'eau retenue dans le mélange soit abaissée à 5%. Ainsi on obtient 10,762 kg environ de granulés du troisième groupe du produit de l'invention.
On prend un quatrième mélangeur d'une capacité de 120 litres et on verse dans ce mélangeur 1,5 litre d'eau et 150 g d'agent correcteur de la salinité tel que celui fabriqué au Japon sous la dénomination POSISEL par la société NIPPON EUROTEC, ce produit étant à base d'une céramique et obtenu par le frittage du chlorure de fer bivalent et trivalent (Fe2, Fe3, CL5).
On fait tourner le mélangeur avec l'ensemble pendant 15 minutes afin d'avoir une solution homogène. On verse 10 g de colorant, par exemple bleu du type FD'C Bleu N W092, fabriqué par WACKHERR, et on laisse le mélangeur tourner pendant 5 minutes encore pour que la solution de l'agent correcteur de salinité prenne une couleur bleu homogène. Puis on verse dans la solution 10 kg de substance hydrophile à base de pâte à carton issue de l'exemple 4. On fait tourner le mélangeur contenant la solution et la substance hydrophile pendant 20 minutes afin d'obtenir un mélange dans lequel l'agent correcteur de la salinité a été complètement absorbé par la substance hydrophile. On envoie le mélange dans un séchoir à air chaud à 40"C jusqu'à ce que la quantité d'eau retenue soit abaissée à 5% en poids sec du produit. On obtient ainsi 10,657 kg environ de granulés de quatrième groupe composant du premier produit de l'invention. On envoie cette quantité dans le mélangeur final afin qu'elle soit mélangée avec les granulés des groupes précédents.
On verse dans un cinquième mélangeur identique au précédent une quantité de 1,5 litres d'eau et 0,5 kg d'herbicide du type désherbant systémique fabriqué sous la dénomination OURAGAN par SOPRA, et qui contient 10 g/l sulfosate.
On fait tourner l'ensemble dans ce mélangeur pendant 15 minutes afin d'obtenir une solution homogène, puis on verse 10 g du colorant, par exemple marron, dans la solution d'herbicide et on laisse tourner encore le mélangeur pendant 5 minutes afin que la solution de l'herbicide prenne une couleur marron très homogène.