INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
consistant en le promoteur 35S du CaMV, l'ep35S du CaMV, le promoteur du gène de la plastocyanine du pois, ses zones "enhancers" et dérivés, le promoteur "High Molecular Weight Glutenin" (HMWG) de blé, le promoteur CsVMV du "Cassava Vein Mosaic Virus", le promoteur CoYMV du "Commelina Yellow Mottle Virus", les promoteurs chimériques des promoteurs CsVMV et CoYMV, ainsi que leurs dérivés.
De préférence, le terminateur d'expression est choisi parmi les terminateurs fonctionnels dans une cellule végétale, et de préférence est un terminateur 35S ou nos.
Selon encore un autre mode d'exécution préféré, le vecteur comprend au moins une séquence d'acide nucléique codant pour un agent de sélection, fonctionnel dans une cellule végétale, de préférence au moins une séquence d'acide codant pour un gène de résistance aux antibiotiques, et/ou un gène de résistance aux herbicides.
De manière préférée, la séquence codant pour un agent de sélection est une séquence codant pour le gène de résistance bar ( bialaphos resistance ) ou pat ( phosphinothricine acétyltransferase ), ou encore une séquence codant pour le gène de résistance nptII, muté ou sauvage. Plus préférentiellement encore, la séquence d'acide nucléique codant pour l'agent de sélection se situe près de la bordure gauche de l'ADN-T.
Selon un autre mode d'exécution préféré de la présente invention, le vecteur comporte au moins une cassette d'expression comprenant une séquence d'acide nucléique promotrice d'expression liée de manière opérationnelle à une séquence d'acide nucléique à exprimer codant pour un polypeptide à produire, elle même liée à une séquence d'acide nucléique de terminaison de transcription. De manière préférée, le polypeptide à produire est une enzyme ou protéine ou dérivé de ces dernières possédant une activité in vitro et/ou chez l'homme et/ou chez l'animal, ladite activité comprenant une activité digestive, pancréatique, biliaire, antivirale, anti-inflammatoire, pulmonaire, anti-microbienne, nutritive, cosmétique, structurelle, sanguine, cardio-vasculaire, ophtalmique, antigénique, immunostimulante, et cérébrale. Des
exemples de telles protéines sont par exemple les insulines, les interférons, les lipases gastriques, pancréatiques, ou biliaires, les élastases, les antiprotéases telles que l'alpha-1 antitrypsine, les protéines structurantes comme le collagène, les transferrines comme la lactoferrine, les protéines dérivées du sang, comme l'hémoglobine, l'albumine humaine, et les cofacteurs sanguins, et les antioxydants comme la superoxyde dismutase, Selon un mode d'exécution particulièrement préféré de l'invention, le vecteur se présente sous forme d'un plasmide binaire, linéaire ou circulaire, choisi dans le groupe consistant en les séquences d'acide nucléique identifiées sous les numéros SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ. ID05, SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ.ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ. ID12, SEQ. ID13, SEQ. ID14, SEQ. ID15, SEQ. ID16, SEQ. ID17, SEQ. ID18, SEQ. ID19, SEQ. ID20, SEQ. ID21, et SEQ.ID22.
Selon un mode d'exécution particulièrement avantageux, chaque composant fonctionnel du vecteur peut être clivé indépendamment des autres composants. De préférence, chaque composant fonctionnel peut être clivé indépendamment des autre composants par digestion enzymatique au niveau d'un premier site de restriction unique et un deuxième site de restriction unique présents dans 1 vecteur.
Un autre objet de la présente invention est une séquence d'acide nucléique isolée, caractérisée en ce qu'elle correspond à une séquence d'acide nucléique choisie dans le groupe consistant en les séquences d'acide nucléique identifiées sous les numéros SEQ.ID01, SEQ. ID02, SEQ.ID03, SEQ.ID04, SEQ. ID05, SEQ. ID06, SEQ. ID07, SEQ. ID08, SEQ.ID09, SEQ.ID10, SEQ.ID11, SEQ. ID12, SEQ. ID13, SEQ. ID14, SEQ. ID15, SEQ. ID16, SEQ. ID17, SEQ. ID18, SEQ. ID19, SEQ. ID20, SEQ. ID21, et SEQ.ID22.
Encore un autre objet de la présente invention est une cellule contenant un vecteur ou une séquence d'acide nucléique tels que décrits précédemment. De préférence, la cellule est une cellule végétale.
Encore un autre objet de la présente invention est une plante transgénique ayant intégré de manière stable dans son
génome un vecteur ou une séquence d'acide nucléique tels que décrits précédemment. De préférence, la plante est choisie parmi les espèces dicotylédones, telles que la pomme de terre, le tabac, le coton, la laitue, la tomate, le melon, le concombre, le pois, le colza, la betterave, ou le tournesol, ou les espèces monocotylédones, telles que le blé, l'orge, l'avoine, le riz, ou le maïs.
Encore un autre objet de la présente invention est une propagule d'une plante transgénique telle que décrite précédemment. De préférence, la propagule est une semence.
Encore un autre objet de la présente invention est une méthode d'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour un polypeptide à produire, dans une cellule, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer la cellule avec un vecteur ou une séquence d'acide nucléique tels que décrits précédemment; - faire une culture de la cellule dans des conditions permettant l'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou gène, codant pour le polypeptide à produire. De préférence, la cellule est une cellule procaryote ou eucaryote. De manière plus préférée, la cellule est une cellule choisie dans le groupe consistant en les cellules microbiennes, les cellules fongiques, les cellules d'insectes, les cellules animales, et les cellules végétales. Encore plus préférentiellement, la cellule est une cellule végétale.
Encore un autre objet selon la présente invention est une méthode d'obtention d'une plante transgénique ou d'une propagule telles que décrites précédemment, caractérisée en ce qu'elle comprend les étapes consistant à : - transformer une cellule végétale avec un vecteur comprenant ou une séquence d'acide nucléique selon l'une quelconque des revendications 1 à 24 ; - sélectionner la cellule végétale ayant intégré le vecteur ou la séquence d'acide nucléique ; - propager la cellule végétale transformée et sélectionnée, soit en culture, soit par régénération de plantes entières chimériques ou transgéniques.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, la partie creuse entre les dents de la lame a une forme arrondie. Selon un mode de réalisation de la présente invention, la lame a une forme arrondie.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le dispositif comprend un moyen de détection automatique du bourrage de papier qui surviendrait dans la partie aval à la lame.
Selon un mode de réalisation de la présente invention, le guide papier supérieur possède une partie cylindrique sur une portion aval à la lame pour faciliter le virage à angle serré du papier.
La présente invention prévoit aussi d'utiliser le dis positif ci-dessus dans tout appareil imprimant et distribuant des reçus ou tickets à partir d'une bande continue de papier.
Ces objets, caractéristiques et avantages, ainsi que d'autres de la présente invention seront exposés en détail dans la description suivante de modes de réalisation particuliers faite à titre non-limitatif en relation avec les figures jointes parmi lesquelles la figure 1 représente une vue en coupe de côté d'un dispositif selon l'invention dans une première phase de fonction nement ; la figure 2 représente une vue en coupe de côté d'un dispositif selon l'invention au moment du découpage du papier ; la figure 3 représente une vue en coupe de côté d'un dispositif selon l'invention juste après la phase de découpage du papier ; la figure 4a représente une vue de dessous d'une lame selon l'invention ; la figure 4b représente une coupe de côté d'une lame selon l'invention ; et la figure 5 représente une vue en coupe d'un dispositif selon l'invention dans le cas de bourrage du papier.
Selon le mode de réalisation de l'invention représenté à la figure 1, le dispositif comprend une lame 1 fixée sur un support 2, une pièce 3 de dégagement du papier au niveau de la lame 1, des guides papier supérieur 4 et inférieur 5. Un capteur 6 pour détecter une mauvaise position éventuelle du papier dans la zone 7 à travers un trou 8. Le dispositif est monté dans un appareil dont les parois 10 sont représentées et à travers lesquelles une ouverture il a été prévue pour la sortie du papier. Le papier vierge est stocké sous la forme d'un rouleau 12 commandé par un moteur piloté par l'imprimante 13.
Le principe de fonctionnement est le suivant : lors de la phase d'impression du papier, le moteur déroule la bande de papier à la vitesse exigée par l'impression puis s'arrête lorsque la partie imprimée a dépassé la lame 1 et se trouve en partie dans la zone 7, délimitée par le support de lame 2 et par le guide supérieur 4, et en partie à l'extérieur de l'appareil. A ce moment, l'extrémité 14 du papier dépasse, comme l'illustre la figure 1. Un utilisateur peut alors tirer sur cette extrémité 14, tandis que le papier est bloqué par l'imprimante. Le papier se plie alors selon un angle aigu a, comme l'illustre la figure 2, puis est découpé comme l1illustre la figure 3. L'utilisateur récupère alors son ticket.
Un des premiers problèmes à résoudre est d'éviter tout déroulement du papier du rouleau 12 lors de la traction sur l'extrémité 14 du papier pour récupérer le ticket après la phase d'impression. Ce résultat est assuré si toute traction sur l'extrémité 14 du papier, quelle que soit sa direction, entraîne le découpage du papier par la lame 1. Cela est réalisé d'une part par le fait que l'angle du papier au niveau de la lame au moment de la traction est un angle aigu (voir figure 2) . D' autre part, la forme de la lame est prévue pour optimiser sa fonction coupante.
La lame 1 représentée en vue de dessous à la figure 4a et en vue en coupe à la figure 4b se caractérise par son épais seur, son matériau, son affûtage et sa forme.
L'épaisseur de la lame est par exemple de 0.8 mm ce qui est une dimension standard pour ce genre d'application. Elle est dans un matériau de résistance importante au découpage. Par exemple, un acier nommé acier rapide M2 peut être utilisé.
L'angle d'affûtage ne doit être ni trop important car la lame serait fragile et vite usée par le papier abrasif, ni trop faible pour rendre la lame suffisamment coupante sans exiger un effort trop important. C'est pourquoi dans la réalisation décrite de l'invention, un angle de 25 degrés a été choisi (figure 4b) . Un angle entre 15 et 30 degrés conviendrait aussi. Cet affûtage est réalisé sur la face inférieure 15 de la lame car sinon le papier pourrait glisser sur la partie pentue et lisse que représenterait un affûtage sur la face supérieure 16. De plus, en plaçant l'affûtage de cette façon, il en résulte une bavure sur la partie du ticket découpé 17 et non sur l'extrémité 18 du papier restant dans l'appareil (figure 3), ce qui limite les risques de bourrage par un blocage sous la lame par exemple lors de la prochaine impression.
La lame est dentée, ce qui facilite l'initiation de la découpe par la pénétration progressive des dents dans la bande de papier. Pour optimiser la fonction précédente, la partie creuse (23) entre les dents possède une forme arrondie et non triangu laire comme c'est couramment le cas dans la technique. La lame a globalement une forme arrondie. Cela assure en toutes circons tances un contact en seulement un point ou deux entre le papier et la lame. Cette caractéristique, s'ajoutant à la forme des dents, permet de faciliter au maximum l'initiation du découpage. De plus, cette configuration permet d'obtenir des situations équivalentes que le papier soit saisi sur sa partie latérale ou sur la partie centrale de l'extrémité 14, et que la composante horizontale de la force de traction soit perpendiculaire à la paroi 10 ou non. Dans tous ces cas, une force de traction du papier relativement faible et constante sera suffisante. Le nombre de dents a été fixé pour obtenir une coupe franche et esthétiquement agréable. Entre 15 et 25 dents pour une largeur de 10 cm peuvent être utilisées pour remplir la fonction de décou page recherchée et décrite ci-dessus.
La lame est fixée par soudure par point sur le support 2 composé de deux parties planes perpendiculaires. La lame est placée à l'extrémité de la partie horizontale. L'autre partie plane de ce support, perpendiculaire, se monte sur la paroi 10 de l'appareil. Cette configuration assure la position de la lame 1 perpendiculaire à la paroi 10 de l'appareil. Ce choix permet le meilleur rendement de découpage dans le cas d'une traction per pendiculaire à la paroi 10, qui est la plus probable car la plus naturelle. I1 faut noter que la distance entre la lame 1 et la paroi 10 peut être très variable. Elle est choisie en fonction du volume de l'appareil et de la longueur nécessaire pour chaque ticket. Le guide papier supérieur 4 s'adapte bien sûr à cette longueur. Dans la réalisation décrite, elle est de 30 man.
La pièce 3 de dégagement du papier au niveau de la lame 1 est une lame élastique souple, qui remplit les deux fonctions suivantes # lors de la phase de découpage, elle s'efface sous la force de traction exercée sur le papier pour laisser le papier entrer en contact avec la lame (figure 2).
# après le découpage, elle se détend pour éloigner l'extrémité 18 (figure 3) de la bande de papier de la lame et éviter que le papier ne se bloque sous la lame lors de sa prochaine pro gression.
Elle doit s'effacer pour un effort d'environ 150 g. Pour cela, on peut utiliser un inox 304 d'épaisseur 0.1 mm. Elle est montée sur la face horizontale et inférieure du support 3. Dans sa position de repos, son extrémité dépasse de 0.5 mm de l'extrémité des dents centrales de la lame, qui sont les plus éloignées.
L'invention vise par ailleurs une amorce nucléotidique, utilisable notamment pour la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) ou tout autre amplification (TMA, QB, etc...), caractérisée en ce qu'elle est constituée par une séquence telle que définie ci-dessus.
L'invention concerne enfin un réactif de détection/identification des champignons comprenant au moins une sonde correspondant aux séquences ou à l'amorce telles que définies ci-dessus.
Description détaillée de l'invention : Il est donc du mérite des inventeurs cités dans la présente demande d'avoir pu isoler et caractériser un certain nombre de séquences d'acides nucléiques provenant du génome mitochondrial chez les champignons et en particulier chez l'espèce A. fumigatus et ayant une structure tout à fait particulière et qui " de facto " constituent de véritables marqueurs non seulement d'espèce mais qui permettent également la division infra-spécifique des espèces en sous groupes majeurs. Ces séquences sont situées au niveau de l'ADN mitochondrial entre le gène de l'ARN de transfert Met-ARNt et le gène de la cytochrome oxydase Coxl, par exemple chez A. fumigatus. En particulier, les inventeurs ont pu isoler et caractériser une séquence spécifique de toutes les souches d' A. fumigatus , la séquence SEQID NO : 2/(AFM-RS1) qui est présente dans le génome mitochondrial des souches de cette espèce et une séquence SEQIDNO:3 /(AFOS-1) qui est une séquence optionnelle présente uniquement chez les souches d'A.fumigatus du groupe haplotype I et qui constituent la séquence SEQ ID NO: 1/(AFM-Box1).
Il relève également du mérite des inventeurs d'avoir proposé des outils génétiques ou apparentés constitués par les susdites séquences pour la détection et l'identification inter-espèce des champignons de l'espèce A. fumigatus.
Il relève encore du mérite des inventeurs d'avoir montré que la séquence SEQ ID NO:/(AFOS-1) n'était présente que chez certaines souches de l'espèce A. fumigatus, situation très originale et inattendue, permettant ainsi la distinction infra-spécifique des souches au sein de cette espèce en haplotypes mitochondriaux différents.
Il relève du mérite des inventeurs d'avoir imaginé d'utiliser cette particularité de la séquence SEQ ID, NO : 3/(AFOS-1) d'être présente ou absente, selon les souches, du génome mitochondrial d'A.
fumigatus pour distinguer les souches entre elles à un niveau infra-spécifique par exemple en réalisant une amplification de la région bordante contenant SEQIDNO : 2 /(AFM-RS1) et/ou SEQ ID NO : 2/(AFM- RS1) et SEQIDNO: 3 /(AFOS-1).
Enfin il relève du mérite des inventeurs d'avoir démontré que les séquences SEQIDNO:2(AFM- RS1) et SEQIDNO : 3/ (AFOS-1) étaient impliquées dans des phénomènes de recombinaison homologue site spécifique qui entraînent l'insertion et/ou la délétion de l'élément optionnel SEQIDNO:3/ (AFOS-1) compris entre deux séquences SEQ ID NO:2/(AFM-RS1).
Cette démonstration implique qu'il est possible d'utiliser les séquences SEQ ID NO:2 (AFM-RS1) et/ou SEQIDNO : 3 (AFOS-1) pour réaliser des recombinaisons par exemple site spécifique, par exemple avec un vecteur de transformation incluant tout ou partie des séquences citées, pour transformer le génome mitochondrial par exemple d'A. fumigatus.
A titre d'illustration et d'exemple nous pouvons présenter les résultats suivants qui ne sont pas limitatifs : Description des figures : # La figure 1 montre les profils d'hybridation selon Southern après digestion EcoRI de l'ADN total des souches d'Aspergillus fumigatus LML 03 et CBS 144-89 avec les sondes nucléiques : ADNmt purifié de la souche LML 03 (panel A), SEQ ID NO : 1 / (AFM-Boxl) (panel B) et SEQ ID NO:2/ (AFM-RS1) (panel C).
# La figure 2 montre l'organisation et les cartes de restriction des fragments d'ADNmt F1 (5,148-pb) (panel A) et F2 (4,080-pb) (panel B) provenant respectivement des souches d'Aspergillus fumigatus LML 03 et CBS 144-89.
# La figure 3 montre les profils d'amplification PCR obtenus avec la paire d'amorces AfT7/PaSp6 sur l'ADNt des souches d'Aspergillus fumigatus LML 03 et CBS 144-89.
# La figure 4 montre les séquences de la région variable contenant SEQIDNO : 1 / (AFM-Boxl) délimitée par les amorces PatSp6/AfT7 pour les fragments FI (panel A) et F2 (panel B).
# La figure 5 montre l'alignement des séquences répétées de 194-bp d'origine mitochondriale SEQID NO: 2 / (AFM-RSla), AFM-RSlb et AFM-RS1cappartenant respectivement aux souches d'Aspergillus fumigatus LML 03 et CBS 144-89.
La figure 6 montre les profils d'hybridation en dot-blot obtenus avec les différentes sondes nucléiques : SEQIDN01 / (AFM-Boxl), 1263-pb (panel A), SEQIDNO:2/(AFOS-1), 875-pb (panel B) et SEQIDNO:3/ (AFM-RS1), 194-pb (panel C).
I. Détection et caractérisation de deux haplotypes mitochondriaux chez Aspergillus fumigatus Nous avons analysé les polymorphismes de taille de restriction des génomes mitochondriaux de deux souches représentatives d'A. fumigatus qui présentaient des profils d'hybridation selon Southern différents (Fig. 1, panel A). Les échantillons d'ADNt (5 g) ont été digérés avec l'enzyme EcoRI. Les fragments de restriction ont été séparés par électrophorèse en gel d'agarose à 0,8% (m/v) à 40 V pendant 18h, et transférés sur membrane en nylon positivement chargée. La membrane à été sondée séparément avec environ 100 ng de chacune des sondes nucléiques marquées à la peroxydase, et les hybridations ont été révélées par chimioluminescence. L'ADN du phage lambda digéré par HindIII et EcoRi a servi de standard, et les tailles des fragments de restriction sont indiquées en Kilo-paires de bases (kpb).
Très généralement, le taux de terminaison avec dUTP est plus faible qu'avec dTTP. Les sites qui présentent une diminution de plus de la moitié de leur taux de terminaison en présence de dUTP au lieu de dTTP, sont au nombre de 7, dont 6 ont la particularité de succéder à l'incorporation de dUMP ( c'est-à-dire que les sites sont positionnés sur un résidu A sur la matrice : A26, A35, A50, A53, A75 et A77), le septième s'arrête sur un résidu G en position 52 qui précède l'incorporation d'un U D'autres sites de terminaison situés juste en amont d'un résidu A sur la matrice ont tendance également à voir leur taux d'avortement diminuer, mais de façon moins importante : C49, T76 et G78. Certains sites, non localisés en amont ou sur un résidu A voient leur intensité augmenter : G22 et C52.
2.1.2. Identification des sites de terminaison en présence de dITP (Figure 2.2) En général, le taux d'arrêt est plus fort avec dITP par rapport à dGTP Le changement de dGTP par dITP, un de ses analogues, lors de la réaction catalysée par la reverse transcriptase de HIV-1 (Figure 2. 2) dans le milieu réactionnel conduit à une augmentation importante (d'un facteur proche de 4) des taux de terminaison de 10 sites Sur ces 10 sites, 5 précédent l'incorporation du dITP dans le brin polymérisé (C20, A24, G27, G32 et A50), 4 sont situés dans le quadruplet juste à la sortie de l'homo-oligomère (dA) 6 et le dernier est situé sur le résidu G22 Mais d'autres sites voient leur intensité diminuer en présence de dITP parmi lesquels les résidus G31, A35, A41, G82, C49 et A53, les trois premiers sites n'ont pas dans leur environnement matriciel proche de résidu C, tandis que C49 est un site d'incorporation du dITP et A53 est localisé en amont d'un résidu C Deux sites nouveaux apparaissent . devant C25 et C39 de la matrice 2.1.3. Identification des sites de terminaison en présence de c7dGTP (Figure 2.3) Sur les 18 sites de terminaison obtenus en présence des bases "normales", 6 sont augmentés considérablement (jusqu'à 3,5 fois), d'autres sont diminués jusqu'à 10 fois et 4 sites nouveaux apparaissent Certains sites de terminaison non détectables avec dGTP, sont mis en évidence avec c7dGTP, certains de ces sites pouvant atteindre des pourcentages considérablement élevés : ces sites sont localisés au niveau des bases G32, C33, C28 et C29, le premier site précède l'incorporation de c7dGTP, tandis que les trois
derniers sites cités sont en position où c7dGTP est incorporé dans le brin polymérisé Le taux de terminaison est augmenté en face de la plupart des C sur la matrice sauf C21 et C49 qui présentent respectivement 10 % et 90% de diminution.
D'autres sites voient leur intensité augmenter, mais dans une moindre mesure en face de A53 ( qui précède l'incorporation du c7dGTP) et G22 et A77, ce dernier étant localisé à la sortie de la suite de 6A. D'autres sites voient leur taux de terminaison diminuer alors qu'ils ne sont localisés ni sur un site d'insertion de c7dGMP ou d'extension suivant cette insertion 2.1.4. Identification des sites de terminaison en présence de c7dATP (Figure 2.4) Les taux de terminaison en présence de c7dATP au lieu de dATP ont des comportements contrastés : certains des sites, observés avec dATP voient leur intensité augmenter de façon remarquable ; en face de A41(x7) et T76 (x2). D'autres, au contraire, diminuent (face aux bases A50, A53, G52 et A75). Le plus remarquable est l'apparition de sites de terminaison nouveaux face à T39, T62 et surtout T63 qui arrête près de la moitié des complexes d'élongation Le site fortement augmenté (face à A41) précède l'incorporation de c7dATP. Les 3 sites nouveaux sont des sites d'incorporation de c7dATP consécutifs mais d'autres sites consécutifs ne donnent pas lieu à des arrêts (T45 et T46 par exemple) 2.1.5. Comparaison des sites de terminaison suivant l'analogue utilisé. (Figure 2.5) Les variations des taux de terminaison avec les différents analogues par rapport aux taux obtenus en présence des bases "normales" sont résumées dans la figure 2.5.
Chaque analogue de base induit des modifications dans les taux de terminaison de la polymérisation catalysée par la reverse transcriptase de HIV-1 # L'échange de dTTP par dUTP diminue de façon, en général, modestement (maximum 5%) le taux de terminaison de la plupart des sites localisés avant et après l'incorporation du dUTP. Sont principalement concernées les bases en aval de la position 50 et les 6A # Le dITP induit une augmentation forte de la terminaison, sauf en 2 sites ( en 49 et 82, où il y a un peu moins d'arrêts) Tous les sites de terminaison sont localisés avant l'incorporation du dIMP, c'est-à-dire situés avant un résidu C sur la matrice à