INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les régions correspondant aux régions hypervariables de la chaîne lourde (VH1, VH2, VH3) et de la chaîne légère (VLl, VL2, VL3) du domaine peptidique scFv sont soulignées en gras.
Figure 2 : Fonction du traceur immunoenzymatique AChE-scFv.
(A) Le milieu de culture des cellules COS transfectées a été incubé pendant 1 heure à 37 C dans une plaque de microtitration sur laquelle a été préalablement immobilisée la sous-unité CA de la crotoxine. La plaque a ensuite été lavée puis incubée pendant 1 heure à 37 C avec l'anticorps monoclonal 9E10, spécifique du peptide cMyc.
Le test ELISA a été réalisé comme décrit dans la section Matériel et Méthodes. (Q > pcBi ; (C) pC-AChE-scFv.
(B) L'extrait cellulaire des cellules COS transfectées a été incubé pendant 1 heure à 37 C dans une plaque de microtitration sur laquelle a été préalablement immobilisée la sous-unité CA de la crotoxine. La plaque a ensuite été lavée, le milieu de test AChE a été ajouté et la réaction a été poursuivie pendant 4 heures à 37 C. (O) pcBi; (z) pC AChE-scFv.
Figure 3 : Affinité de la protéine de fusion AChE-scFv pour la sous-unité CA de la crotoxine.
Le milieu de culture des cellules COS transfectées avec le gène chimère a été préparé à la dilution 15800 et incubé pendant une nuit à 4 C avec différentes concentrations de la sous-unité CA. Des fractions aliquotes de 100 pl ont ensuite été transférées dans les puits d'une plaque de microtitration sur laquelle a été préalablement immobilisée la sous-unité CA de la crotoxine. La plaque est ensuite incubée pendant 30 minutes à la température du laboratoire, lavée, puis l'activité AChE est mesurée par la méthode d'Ellman.
Figure 4 : Electrophorèse de la protéine de fusion purifiée par chromatographie d'affinité.
Des protéines, dénaturées en présence de SDS à 1 , de mercaptoéthanol à 0,1 M, ont été déposées sur un gel de polyacrylamide à 12 k et soumises à une électrophorèse.
Après migration, le gel d'électrophorèse a été coloré au bleu de Coomassie.
Les protéines marqueurs de poids moléculaire suivants sont symbolisés sur le côté droit de la photographie du gel phosphorylase B, 94 kDa ; sérumalbumine bovine, 67 kDa ovalbumine, 43 kDa ; anhydrase carbonique, 30 kDa.
Piste de gauche : protéine de fusion AChE-scFv purifiée par chromatographie d'affinité.
Les marques prégravées servant à la synchronisation du lecteur-enregistreur de disque optique numérique sont par exemple réduites à une marque unique de durée égale à 4 / fp.
Par la suite, pour simplifier la description de l'invention et sans en diminuer la portée, seul le cas particulier de la marque unique de synchronisation sera considéré, même s'il est courant d'utiliser au moins deux marques prégravées créant un intervalle de temps qui est interdit par le code de modulation utilisé pour l'enregistrement des données de l'utilisateur.
Habituellement seuls les fronts montants des signaux s et u sont utilisés dans le comparateur de phase 2 si bien qu'une variation de durée du signal s modifie la phase relative du signal u par rapport à celle du signal s. Une amélioration de cette méthode pourrait consister à utiliser non plus le signal u, mais un signal u' constitué de deux fenêtres u'1 et U'2 toutes les deux de même durée et centrées respectivement sur le front montant du signal u et sur son front descendant. Un signal d'erreur de boucle de phase e est alors obtenu en effectuant les opérations suivantes, montrées à la figure 1: intégration d'une tension de référence entre l'instant d'occurrence du front montant du signal u'1 et l'instant d'occurrence du front montant du signal s, ajout à la tension obtenue de l'intégration d'une tension opposée à ladite tension de référence entre l'instant d'occurrence du front montant du signal s et l'instant d'occurrence du front descendant du signal u'1, maintien de la tension obtenue et ajout à ladite tension maintenue de l'intégration de ladite tension de référence entre l'instant d'occurrence du front montant du signal u'2 et l'instant d'occurrence du front descendant du signal s, ajout à la tension obtenue de l'intégration d'une tension opposée à ladite tension de référence entre l'instant d'occurrence du front descendant du signal s et l'instant d'occurrence du front descendant du signal ut2 et maintien de cette tension. Cette méthode permet d'éliminer l'erreur de phase du signal u' par rapport au signal s due à une variation de durée du signal s, la boucle d'asservissement rephasant le milieu du signal u' par rapport au milieu du signal s. Cette méthode permet de surcroît d'éliminer les signaux s erronés, dus aux défauts locaux du disque, dont au moins un front n'est pas dans la fenêtre correspondante u'l ou u2 .
Néanmoins, dans le cas de certains disques réenregistrables utilisant la technique dite du changement de phase ou dans le cas de certains disques enregistrables une seule fois dits WORM, la détermination d'un seuil est délicate, car lesdits disques fournissent un signal de lecture qui ne présente pas une valeur moyenne nulle et ladite valeur moyenne peut varier considérablement lorsque l'on passe d'une zone des données de l'utilisateur enregistrée à une zone non encore enregistrée. Cette détermination du seuil peut être particulièrement délicate, voire parfois impossible, lors de l'initialisation du lecteur-enregistreur de disque optique numérique, après sa mise en fonctionnement et avant que la synchronisation et le rephasage de l'horloge hp ne soient acquis, et par suite nécessite un temps important pour effectuer ladite acquisition de synchronisation et de rephasage et finir l'initialisation dudit lecteur-enregistreur de disque optique numérique. On préfère donc chercher, dans le cadre de l'invention, une méthode de synchronisation et de rephasage de l'horloge hp par rapport au signal r ne nécessitant pas l'utilisation d'un seuil de mise en forme dudit signal r. Dans ce but, dans le cadre de l'invention, on effectue un échantillonnage du signal r issu des marques prégravées du disque destinées à la synchronisation du lecteur-enregistreur à l'aide d'un couple v de signaux d'échantillonnage, synchrone de l'horloge hp , dont le chronogramme est montré à la figure 3, les centres des deux signaux dudit couple v de signaux d'échantillonnage étant séparés par un intervalle de temps T sensiblement constant et égal à la durée du signal r, durée mesurée par exemple au niveau des points d'inflexion de la courbe représentative du signal r, soit environ à la mihauteur dudit signal r. Si rl et r2 sont les amplitudes respectives du premier échantillon et du deuxième échantillon du signal r, on réalise un comparateur de phase entre l'horloge hp qui est à l'origine du couple v de signaux d'échantillonnage et le signal r, en effectuant la différence Ar = rl - r2 : en effet, si ledit couple v est en avance de phase sur le signal r, comme cela est montré à la figure 3a, rl r2 et Ar > 0.
La convergence de la synchronisation et du rephasage du couple v de signaux d'échantillonnage par rapport aux signaux issus de la lecture des marques prégravées est rapide. Ladite convergence est d'autant plus rapide que l'intervalle de temps T du couple v - donc la durée du signal r - n'existe pas dans le signal lu provenant de la lecture des marques gravées sur le disque, marques prégravées autres que les marques dont la lecture fournit le signal r et marques post-gravées lors de l'enregistrement des données de l'utilisateur, ou que tout au moins le spectre du signal r n'apparaît que très faiblement dans le signal provenant de la lecture de toutes les marques gravées sur le disque autres que celles dont la lecture fournit le signal r. Une autre solution, permettant une convergence très rapide de ladite synchronisation et dudit rephasage, consiste en l'exécution des opérations de synchronisation et de rephasage dans une zone spécifique du disque ne contenant que les marques prégravées ; cependant ce choix rallonge le temps global d'initialisation du lecteur-enregistreur et n'est donc pas retenu. Le fait que l'asservissement de l'horloge hp en fréquence et en phase soit réalisé dans un seul comparateur de phase explique le fait que l'on parle de la stabilisation d'une boucle d'asservissement de phase.
Concernant la constance de l'intervalle de temps T, il est utile de rappeler quelques notions relatives aux différents types de disques optiques auxquelles l'invention s'applique. Si le disque, entraîné à vitesse angulaire constante, présente des marques gravées homologues de longueur angulaire constante sur toute son étendue - disque connu sous le vocable CAV -, l'intervalle de temps T reste constant sur toute l'étendue du disque.
Si le disque, entraîné à vitesse angulaire constante, est composé de zones annulaires concentriques dans chacune desquelles les marques gravées homologues présentent des longueurs angulaires constantes, et si, dans sa partie la plus intérieure, chaque zone annulaire présente des marques gravées homologues dont la longueur linéaire est sensiblement la même dans toutes les zones annulaires - disque connu sous le vocable ZCAV -, l'intervalle de temps T reste constant dans chaque zone annulaire, mais varie d'une zone annulaire à l'autre (en même temps que les horloges du lecteur-enregistreur). Si le disque est de type CAV pour ses marques prégravées et de type ZCAV pour ses marques enregistrées représentant les données de l'utilisateur, l'intervalle de temps T reste constant sur toute l'étendue du disque. Si le disque présente des marques gravées holomogues de longueur linéaire constante sur toute son étendue et s'il est entraîné à une vitesse angulaire inversement proportionnelle à la distance à son centre de la zone en cours de lecture ou d'écriture - disque connu sous le vocable CLV -, l'intervalle de temps T reste constant sur toute l'étendue du disque. Dans la suite on ne se préoccupe pas du type de disque, CAV, ZCAV ou CLV, et l'on considère que l'intervalle de temps T est constant, ou du moins constant par rapport à l'horloge du lecteur-enregistreur qui permet de le générer.
Le gain de la boucle d'asservissement de phase et donc sa stabilité dépendent de la constance de la valeur que prend la grandeur Ar / T autour de Ar = 0; la constance de ladite grandeur dépend en particulier directement de la répétitivité de la forme des flancs des marques prégravées dont la lecture fournit le signal r, qui peut varier d'un disque à l'autre et au cours d'un même disque Pour assurer une bonne stabilité de la boucle d'asservissement de phase, il faut pouvoir corriger son gain pour tenir compte des variations de la grandeur Ar / X et de la variation de toute autre grandeur ayant le même effet.
Avant de décrire cette caractéristique majeure de l'invention, il est nécessaire de définir quelques grandeurs utilisées dans le cadre de l'invention. De façon générale, une boucle d'asservissement, représentée à la figure 4, qui est aussi bien la boucle d'asservissement de phase considérée jusqu'à présent que toute autre boucle d'asservissement, reçoit un signal d'entrée E, qui est transmis à un élément soustracteur 10.
La branche directe de la boucle d'asservissement reçoit la sortie de l'élément soustracteur 10 ; ladite branche directe est constituée de façon symbolique d'un élément unique 11 de fonction de transfert A, A étant une fonction complexe de la fréquence ; l'élément 11 peut inclure de façon habituelle un filtre de correction de la boucle d'asservissement. En sortie de l'élément 11 est fourni le signal S de sortie de la boucle d'asservissement. Le signal S est transmis à la branche de réaction, qui est constituée de façon symbolique d'un élément unique 12 de fonction de transfert B, B étant une fonction complexe de la fréquence. Le signal S x B = S1 de sortie de ladite branche de réaction est transmis à l'élément soustracteur 10. L'élément soustracteur 10 fournit à la branche principale le signal d'erreur de boucle = E - S1. Le produit A x B = T est la fonction de transfert en boucle ouverte de la boucle d'asservissement. Dans le cas de la boucle d'asservissement de phase d'un lecteurenregistreur de disque optique numérique, le signal E est la phase du milieu du signal r, la grandeur S1 est la phase du milieu du couple v de signaux d'échantillonnage, le signal d'erreur de boucle est la différence Ar des échantillons r1 et r2 prélevés sur le signal r, ladite différence étant sensiblement proportionnelle à la différence de phase entre le milieu du signal r et le milieu du couple v de signaux d'échantillonnage et le signal S est l'horloge hp.
Pour permettre la description de la caractéristique majeure de l'invention, il faut décrire plus précisément la fonction de transfert T de la boucle d'asservissement qui vient d'être décrite. On considère la courbe représentative, montrée à la figure 5, de la fonction de transfert T de la boucle d'asservissement représentée de façon usuelle dans le plan de Nyquist en portant sa composante réelle Re(T) en abscisse et sa composante imaginaire Im(T) en ordonnée ; on considère le point O (O ; 0) origine des coordonnées et le point C de coordonnées (-1 ; 0), point correspondant à la condition d'oscillation de la boucle d'asservissement. On considère plus particulièrement la portion de la courbe représentative de la fonction de transfert T, située dans le quadrant correspondant à Re(T) Im(T) T étant une fonction de la fréquence, le point M correspond à une fréquence donnée f. Dans la mesure où la boucle d'asservissement de phase est corrigée de façon satisfaisante, la portion considérée de la courbe représentative de la fonction de transfert T traverse le quadrant considéré avec une pente moyenne grossièrement de l'ordre de 1 et passe à une distance minimale imposée du point C, ladite distance minimale caractérisant la stabilité de la boucle d'asservissement. La portion considérée de la courbe représentative de la fonction de transfert T, dans ledit quadrant où l'on effectue de préférence la correction de phase de la boucle d'asservissement, est tangente à une demi-droite A issue de O, demi-droite dont la pente est grossièrement de l'ordre de 1: dans cette zone la courbe représentative de la fonction de transfert T est à gauche et au-dessus de ladite demi-droite A. Les vecteurs CO, OM et z = CO + OM représentent respectivement les nombres complexes 1, T et 1 + T.
Dans la boucle d'asservissement, qui vient d'être décrite et qui est montrée à la figure 4, on a : E = E > < X (I(1 + B x A) = # x (1 + T), soit E / = 1 + T et par suite le vecteur X1 représente le nombre complexe E / g. Si l'on connaît la composante complexe de E de fréquence donnée f et si l'on mesure la composante complexe de E de fréquence donnée f, on connaît le nombre complexe (composante complexe de fréquence f de E / composante complexe de fréquence f de ), donc le point M ; la composante de E pouvant être prise comme référence de phase, ladite composante de fréquence f de E peut alors être prise réelle.
Lorsque des éléments constitutifs de la boucle d'asservissement ou des éléments situés en amont de ladite boucle d'asservissement entraînent par leur variation, en les prenant tous globalement en compte, une variation de la fonction de transfert T de ladite boucle d'asservissement qui se limite à une multiplication de ladite fonction de transfert par un nombre réel positif k, la courbe représentative de ladite fonction de transfert T dans le plan de Nyquist subit une homothétie de centre O et de rapport k qui la transforme en la courbe représentative de la fonction de transfert T' et en particulier le point M est transformé en un point M', avec OM' / OM = k ; simultanément varie. Stabiliser le fonctionnement de la boucle d'asservissement - maintenir constant le gain de ladite boucle d'asservissement - revient à rendre invariante la fonction de transfert T et, puisque sa courbe représentative dans le plan de Nyquist est supposée subir une simple homothétie, revient à rendre invariant l'un des points de sa courbe représentative, en particulier à ramener le point M', correspondant à la fréquence donnée f, vers sa position nominale M.
La connaissance de la composante complexe de fréquence f de E et la mesure de la composante complexe de fréquence f de permettent à tout instant de connaître le point M' et, M étant donné, de connaître le rapport k. Si l'on multiplie la fonction de transfert A de la branche principale de la boucle d'asservissement - en n'importe quel point de ladite branche principale - par le facteur de correction réel positif 1 / k, la fonction de transfert est gardée invariante et le fonctionnement de la boucle d'asservissement est stabilisé. De façon à connaître les composantes de fréquence donnée f, respectivement de E et de , avec un rapport signal à bruit suffisant, il est habituellement nécessaire d'introduire un signal extérieur d'amplitude connue à la fréquence donnée f et éventuellement de faire cette introduction ainsi que la mesure de la composante de fréquence donnée f de E à un instant où la boucle n'est pas utilisée, quoique dans ses conditions normales de fonctionnement. La fréquence f est choisie bien entendu en dehors de toute éventuelle raie discrète liée au fonctionnement normal de la boucle d'asservissement.
Dans le cas où la variation de gain de la boucle ne serait que sensiblement réelle positive, cas qui pourrait se rencontrer par exemple lors de l'apparition d'une légère saturation d'un amplificateur et qui correspondrait à un nombre k ayant une composante réelle positive et une composante imaginaire petite par rapport à sa composante réelle, et en conservant une correction qui resterait par exemple une multiplication du gain de la boucle par un facteur de correction 1/(rye k) ou 1/lkl on aboutirait à une correction imparfaite du gain de la boucle, M' n'étant pas tout à fait ramené à sa position nominale M, correction qui resterait néanmoins une optimisation. Par la suite on ne considérera qu'un nombre k purement réel.
- le second groupe de miroirs est mobile en rotation autour d'un axe orthogonal au plan de ces deux axes.
L'ensemble des deux groupes de miroirs a alors l'effet de faire effectuer une rotation au faisceau représenté dans un plan de fréquence, l'angle de rotation étant le double de l'angle entre les deux axes de symétrie. Un tel dispositif est utilisé dans les modes de réalisation 4 et 5 et est décrit en 8.1.4.2.
3.18. Objectifs de microscope adaptés.
Les objectifs de microscope classiques sont prévus pour fonctionner avec un liquide d'immersion et une lamelle couvre-objet d'indice proche de celui du verre. Ceci est sans importance dans le cas ou on observe des échantillons bidimensionnels. Cependant, dans le cas ou on observe des échantillons épais et d'indice fortement différent de celui du verre, par exemple des échantillons en phase aqueuse, l'aberration sphérique engendrée peut être telle qu'elle dégrade fortement l'image, malgré les algorithmes de compensation de l'aberration utilisés.
Selon une version de l'invention, ce problème est résolu en utilisant un objectif prévu pour fonctionner avec un liquide d'immersion dont l'indice est égal ou proche de l'indice moyen de l'échantillon observé. L'objectif peut être dimensionné par des méthodes usuelles de calcul optique, les critères de dimensionnement différant des critères usuels par le fait que l'indice du liquide d'immersion, que l'on appellera indice nominal de l'objectif, a été modifié. Si l'échantillon observé est constitué essentiellement d'eau, la conception peut être facilitée par l'utilisation d'une lame couvre-objet en Teflon.
3. 19. Méthode de traitement des données dans le cas d'une mémoire vive limitée Les calculs de représentation fréquentielle tridimensionnelle mettent en oeuvre des quantités importantes de données. Ces données étant normalement accédées dans un ordre aléatoire, elles ne peuvent
pas être stockées pendant les calculs sur un support à accès séquentiel comme un disque dur et doivent être stockées sur un support à accès aléatoire comme une mémoire interne d'ordinateur (RAM).
Selon une version avantageuse de l'invention, adaptée au cas ou le système ne dispose pas de suffisamment de mémoire vive pour pouvoir stocker l'ensemble des données, l'algorithme de calcul est modifié de manière à traiter les données bloc par bloc, un bloc correspondant à une quantité importante de données qui peuvent alors être stockées séquentiellement sur un support à accès séquentiel et chargées en mémoire centrale uniquement pendant le temps de traitement dudit bloc. A cette fin: - L'algorithme modifié effectue dans un espace tridimensionnel des traitements plan horizontal par plan horizontal, chaque plan horizontal étant stocké sur le support à accès séquentiel en un seul bloc.
- Afin de pouvoir effectuer également des traitements suivant la dimension verticale, l'algorithme intègre des phases d'échange d'axes qui permettent de ramener provisoirement l'axe vertical dans un plan horizontal.
- La procédure d'échange d'axes opère bloc par bloc, les blocs ayant généralement des dimensions égales ou proches selon les deux axes à échanger et ayant pour taille en octets la taille maximale qui puisse être stockée en mémoire centrale du système (mémoire RAM à accès aléatoire).
Cette méthode est mise en oeuvre dans le mode de réalisation 1 et décrite au paragraphe 5.21.
3. 20. Images générées par le microscope.
Les représentations tridimensionnelles générées par le présent microscope peuvent être stockées et transmises sous forme d'un tableau à trois dimensions de nombres complexes. Selon une version de l'invention, il est possible de générer à partir de ce tableau des coupes ou des projections bidimensionnelles représentant soit l'indice soit l'absorbtivité dans l'objet.
3. 21. Système de positionnement des éléments optiques.
Les modes de réalisation décrits nécessitent l'utilisation de nombreux positionneurs de bonne précision. Ces positionneurs sont des éléments coûteux peu adaptés à une fabrication en série et susceptibles de se dérégler avec le temps.
Selon une version de l'invention, ce problème est réglé en utilisant lors de la fabrication du microscope des positionneurs amovibles, chaque élément étant positionné puis fixé par un liant, par exemple une colle, et le positionneur étant retiré après solidification définitive du liant.
La Fig. 50 décrit la procédure (3401). Ses étapes essentielles sont: - (3501): calcul de la représentation fréquentielle corrigée. A partir du tableau Frec [i,j] le programme calcule une représentation corrigée en utilisant:
Npix $Npix ou ic et jc sont les indices centrés soit: ic = /' # , je = j On vérifie alors, à une constante près indépendante dei etj: n, ic jc A nv x-+y-i7C-J+a[i,j]u+b[i,j]v Â 0 0 Le programme génère la représentation fréquentielle corrigée de la manière suivante:
ou yx) = 0 quand Ixl : et y(x) = 1 quand Ixl z , et Au = # , Ou = vlag ' 2 2 upixels vpixels a[i,j] et b[i,j] représentent respectivement les fréquences suivant u et v de la fonction corrigée obtenue. On vérifie que ces fréquences ont toutes deux un signe constant. La multiplication par les fonctions y permet d'annuler les éléments pour lesquels ces fréquences sont trop élevées et d'éviter ainsi les repliements de spectre qui empêcheraient la convergence de l'algorithme.
- (3502) : une transformation de Fourier inverse du tableau Fcor est effectuée.
- (3503): max est la valeur maximale du module sur le tableau Fcor [l,j] On note imax etjmax les coordonnées du pixel en lequel le maximum est atteint. On a alors: - (3504): la partie centrale du tableau Fcor [i,j] est extraite. On crée ainsi un tableau Fa [i, j] de dimensions NaxNa avec par exemple Na =16: - (3505): une transformée de Fourier directe est effectuée sur le tableau Fa - (3506) : le tableau Fa est complété par des zéros et on obtient un tableau Fb de dimensions Nb x Nb avec par exemple Nb =512. et Fb[i,j]= 0 sinon.
- (3507) : la transformation de Fourier inverse du tableau Fb est effectuée.
- (3508): xbar,ybar,max sont calculés par les formules: IFblll2i imax ="J lFb j]12 :IFb[i,j]12 IFbleI2j jmax I,J Jmax = :IFb[i,j]\2 max = Fb [imax, jmax]1 xbar n, N N Cimax- N61 pix Nb 2 ybar K0A Na jmoec - Nb ybar = nyN 0 plX Nb jmax- 2 - (3509):la représentation fréquentielle suivante, de dimensions Nc x Nc avec par exemple Nc =4096, est calculée :