INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Pour confirmer que le gène OsPSK code effectivement PSK, des cellules Oc du riz ont été transformées avec un ADNc d'OsPSK muté. Les ADNc mutés utilisés pour la transformation sont conçus pour produire de la PSK-a ou de la PSK-p mutée où la thréonine, localisée à la quatrième place du peptide, est remplacée par la sérine. La PSK-a obtenue est appelée [Ser4]PSK-a et la PSK-P est appelée [Ser4]PSK-ss. Les séquences de [Ser4]PSK-a et [Ser4]PSK-ss sont présentées ci-dessous.
[Ser4]PSK-a: Y(S03H)IY(S03H)SQ [Ser4]PSK-(3: Y(S03H)IY(S03H)S Une amorce 22-mère (5'-CATCTTGGGAGTAGATATAATC-3') a été synthétisée et utilisée pour obtenir l'ADNc de préprophytosulfokine muté décrit ci-dessus avec un kit de mutagenèse in vitro (Takara, Tokyo). Le plasmide pActnos/Hmz qui contient des gènes de résistance à la kanamycine et à l'hygromycine pour la sélection de transformants a été employé comme vecteur binaire pour la
transformation de cellules Oc. L' ADNc de type sauvage ou muté concernant la sérine a été excisé avec Sma 1 et Eco RV et inséré dans le site Sma I du vecteur.
L'expression des gènes chimères était sous le contrôle du promoteur de l'actine du riz incorporé dans le vecteur binaire. Les constructions ont été utilisées pour transformer la souche d'Agrobacterium LBA4404 par appariement triparental (procédé de transfert d'un plasmide binaire de E. coli à Agrobacterium par coculture de E. coli contenant le plasmide binaire, de E. coli auxiliaire contenant un plasmide auxiliaire (pRK2013) et de l'organisme receveur Agrobacterium), et la transformation de cellules Oc à médiation par Agrobacterium a été exécutée.
Les quantités de PSK-a et de ses analogues, libérées dans le milieu par la souche de type sauvage ou le transformant, ont été mesurées par analyse par chromatographie liquide/ spectrométrie de masse (CL/SM). Un milieu conditionné (MC) obtenu à partir de cellules Oc de type sauvage ou transformées cultivées pendant 14 jours a été chromatographié sur une colonne de DEAE Sephadex A- 25. Les PSK-a et PSK-p contenues dans les fractions de 800 et 1200 mM de KCl ont été adsorbées sur des cartouches Sep-PakVac, éluées avec de l'acétonitrile à 30% qui contient 0,1% d'acide trifluoroacétique, et lyophilisées. Les spectres de masse ont été obtenus avec un spectromètre de masse VG Platform Quadruple Fisons avec ionisation à électropulvérisation (ou électrospray) connecté à un système de CLHP Jasco PU980. Les fractions qui contiennent les PSK ont été dissoutes dans 200 l d'eau et séparées sur une colonne de CLHP en phase inverse (4,6 x 250 mm) avec de l'acétonitrile à 10% qui contient 0,1% d'acide trifluoroacétique à 1,0 ml/min. Les ions pseudomoléculaires de PSK ont été surveillés par balayage toutes les 1,9 s en mode de surveillance sélectif à l'égard des ions. Les séquences d'acides aminés des peptides ont été déterminées par un sequenceur Applied Biosystems modèle 490.
Le résultat de l'analyse quantitative d'analogues de PSK exécutée par CL-SM comme décrit ci-dessus est montré dans la Fig. 2. Dans la Fig. 2 les pics qui correspondent à [Ser4] PSK-a (temps de rétention 6,9 min), PSK-a (temps de rétention 8,0 min), [Ser4] PSK-(3 (temps de rétention 9,0 min) et PSK-P (temps de rétention 12,7 min) ont été détectés dans le liquide d'élution provenant du milieu conditionné des cellules Oc transgéniques contenant l'ADNc muté. En outre, les peptides contenus dans les fractions correspondantes ont été séquences et il a été confirmé qu'il s'agissait bien de [Ser4] PSK-a et de [Ser4] PSK-P, ce qui est en faveur de l'hypothèse selon laquelle l'ADNc OsPSK code la préprophytosulfokine et PSK-P est un produit de dégradation enzymatique de PSK-a.
En outre, l'ADNc OsPSK a été introduit dans l'orientation sens et dans l'orientation antisens dans des cellules Oc avec le même vecteur binaire. Puis les quantités de PSK-a et de PSK-P ont été analysées par CL-SM. Les cellules Oc témoins ou transformées (0,8 g) ont été placées dans 100 ml de milieu frais et les quantités de PSK-a et de ses analogues ont été déterminées par analyse au bout d'une semaine de culture.
Les résultats indiqués par la valeur moyenne de trois expériences indépendantes sont montrés dans Tableau 1 avec les écarts-types (unité de concentration nM). La PSK-a et la PSK-p accumulées dans le milieu conditionné du transformant sens étaient 1,6 fois plus concentrées que dans le témoin.
L'augmentation de la sécrétion de PSK s'est révélée être due à l'introduction du gène. Les quantités de PSK-a et de PSK-p accumulées dans le milieu conditionné du transformant antisens était inférieures à 60% du niveau témoin moyen, ce qui indique une baisse de la sécrétion de PSK. D'autre part, la quantité totale de [Ser4]PSK-a et de [Ser4]PSK-P était égale à 34% de PSK-a et de PSK-P de type sauvage seulement, ce qui suggère que le remplacement d'acides aminés peut diminuer l'efficacité de la maturation et/ou de la modification.
Accumulation de PSK dans du milieu conditionné par des cellules Oc témoins ou transgéniques
type cellulaire PSK-a PSK-P [SER4]PSK-a [SER4]PSK-ss témoin 12,6+1,1 332,7+20,1 0 0 antisens 7,3+0,4 175,8+15,4 0 0 sens 21,0+1,9 555,7+31,1 0 0 mutant [Ser4] 11,5+0,9 302,5+15,8 3,1+0,3 105,2+8,9
L'effet du gène OsPSK sur la prolifération cellulaire a été étudié. Le résultat a montré que les cellules transgéniques sens S2 se divisaient approximativement deux fois plus vite (Fig. 4) que le témoin (Fig. 3), tandis que les transformants antisens A2 ralentissaient leurs activités mitogènes cellulaires (Fig. 5). De plus, le fait de munir les transformants antisens de PSK-a permettait de rétablir en partie leurs activités mitogènes (38-64%), ce qui indique que le gène OsPSK favorise la division des cellules végétales.
Ce dispositif d'entrée présente typiquement deux degrés de liberté suivant deux axes, soit un premier axe (par exemple, l'axe x) et un second axe (par exemple l'axe y), ce qui permet au dispositif de spécifier des positions dans un plan.
L'invention est rapportée à l'utilisation du système d'ordinateur 400 pour traiter les pages d'un document. Selon un mode de réalisation de l'invention, le traitement de pages d'un document est assuré par le système d'ordinateur 400 en réponse au fait que le processeur 404 exécute une ou plusieurs séquences d'une ou de plusieurs instructions contenues dans une mémoire principale 406. Ces instructions peuvent être lues dans la mémoire principale 406 à partir d'un autre support lisible par ordinateur tel que le dispositif de stockage 410. L'exécution des séquences d'instructions contenues dans la mémoire principale 406 a pour effet que le processeur 404 réalise les étapes de processus décrites ici. Selon d'autres modes de réalisation, des circuits câblés en dur peuvent être utilisés en lieu et place d'instructions de logiciel pour la mise en oeuvre de l'invention ou peuvent être utilisés en combinaison avec ces mêmes instructions de logiciel. Par conséquent, les modes de réalisation de l'invention ne sont pas limités à une quelconque combinaison spécifique d'un circuit constitué par des composants matériels et d'un logiciel.
L'expression "support lisible par ordinateur" telle qu'utilisée ici se réfère à un quelconque support qui participe à l'application d'instructions sur le processeur 404 en vue d'une exécution. Un tel support peut prendre de nombreuses formes incluant des supports non volatiles, des supports volatiles et des supports de transmission sans qu'on soit limité à ceux-ci. Les supports non volatiles incluent par exemple des disques optiques ou magnétiques tels qu'un dispositif de stockage 410. Les
supports volatiles incluent une mémoire dynamique telle que la mémoire principale 406. Les supports de transmission incluent des câbles coaxiaux, un fil de cuivre et des optiques à fibres, y compris les fils qui constituent le bus 402. Les supports de transmission peuvent également prendre la forme d'ondes acoustiques ou lumineuses telles que celles générées pendant des communications de données par ondes radio et par infrarouges.
Des formes classiques de supports lisibles par ordinateur incluent par exemple un disque souple, un disque flexible, un disque dur, une bande magnétique ou tout autre support magnétique, un CD-ROM, n'importe quel autre support optique, des cartes perforées, du papier en bande, tout autre support physique muni de motifs constitués par des trous, une RAM, une PROM ou ROM programmable, une EPROM ou ROM programmable et effaçable, une EPROM FLASH, toute autre puce mémoire ou cartouche, une onde d'entreprise de télécommunication comme décrit ci-après ou tout autre support à partir duquel un ordinateur peut réaliser une lecture.
Diverses formes de supports lisibles par ordinateur peuvent être mises en jeu lors de la mise en oeuvre d'une ou de plusieurs séquences d'une ou de plusieurs instructions sur le processeur 404 en vue d'une exécution. Par exemple, les instructions peuvent être initialement supportées sur un disque magnétique d'un ordinateur à distance.
L'ordinateur à distance peut charger les instructions dans sa mémoire dynamique et peut envoyer les instructions sur une ligne téléphonique en utilisant un modem. Un modem local pour le système d'ordinateur 400 peut recevoir les données sur la ligne téléphonique et peut utiliser un émetteur infrarouge pour convertir les données selon un signal infrarouge. Un détecteur infrarouge peur recevoir les données transportées par le signal infrarouge et un circuit approprié peut placer les données sur le bus 402. Le bus 402 transporte les données jusqu'à la mémoire principale 406 depuis laquelle le processeur 404 retrouve les instructions et les exécute. Les instructions qui sont reçues par la mémoire principale 406 peuvent optionnellement êtres stockées dans le
dispositif de stockage 410 soit avant, soit après leur exécution par le processeur 404.
Le système d'ordinateur 400 inclut également une interface de communication 418 qui est couplée au bus 402. L'interface de communication 418 réalise une communication de données bidirectionnelle par couplage à une liaison de réseau 420 qui est connectée à un réseau local 422. Par exemple, l'interface de communication 418 peut être une carte de réseau numérique à intégration de services (ISDN ou RNIS) ou un modem pour assurer une connexion de communication de données sur un type correspondant de ligne téléphonique. En tant qu'autre exemple, l'interface de communication 418 peut être une carte de réseau local (LAN ou RLE) afin d'assurer une connexion de communication de données sur un LAN compatible. Des liaisons sans fil peuvent également être mises en #uvre. Dans n'importe quelle mise en #uvre de ce type, l'interface de communication 418 envoie et reçoit des signaux électriques, électromagnétiques ou optiques qui transportent des trains de données numériques représentant divers types d'information.
La liaison de réseau 420 assure typiquement une communication de données par l'intermédiaire d'un ou de plusieurs réseaux jusqu'à d'autres dispositifs de données. Par exemple, la liaison de réseau 420 peut assurer une connexion par l'intermédiaire d'un réseau local 422 jusqu'à un ordinateur hôte 424 ou jusqu'à un équipement de données qui est activé par un fournisseur de service Internet (ISP) 426. L'ISP 426 à son tour assure des services de communication de données par l'intermédiaire du réseau de communication de données par paquets mondial maintenant classiquement appelé "Internet" 428. Le réseau local 422 et Internet 428 utilisent tous deux des signaux électriques, électromagnétique ou optiques qui transportent des trains de données numériques. Les signaux qui traversent les divers réseaux et les signaux sur la liaison de réseau 420 et au travers de l'interface de communication 418, lesquels signaux transportent les données numériques jusque sur le système d'ordinateur 400 et depuis celui-ci, sont des formes présentées
à titre d'exemple d'ondes d'entreprise de télécommunication qui transportent l'information.
Le système d'ordinateur 400 peut envoyer des messages et recevoir des données, y compris un code de programme, par l'intermédiaire du ou des réseaux, de la liaison de réseau 420 et de l'interface de communication 418. Selon l'exemple d'Internet, un serveur 430 peut transmettre un code requis pour un programme d'application par l'intermédiaire d'Internet 428, de l'ISP 426, du réseau local 422 et de l'interface de communication 418. Conformément à l'invention, une application déchargée de ce type assure le traitement de pages d'un document comme décrit ici.
Le code reçu peut être exécuté par le processeur 404 lorsqu'il est reçu et/ou peut être stocké dans le dispositif de stockage 410 ou dans tout autre stockage non volatile en vue d'une exécution ultérieure. De cette manière, le système d'ordinateur 400 peut obtenir un code d'application sous la forme d'une onde d'entreprise de télécommunication.
Dans la description présentée ci-avant, l'invention a été décrite par référence à ses modes de réalisation spécifiques. Il sera cependant bien évident que diverses modifications et variantes peuvent être apportées sans que l'on s'écarte ni de l'esprit plus large, ni du cadre plus large de l'invention. La description et les dessins sont par conséquent destinés à être considérés dans un sens illustratif au lieu de l'être dans un sens restrictif.
ANNEXE Copyright 1996-98 Ricoh Corporation and Ricoh Company, Ltd.
*PPD-Adobe : "4. 3" *% Adobe Systems PostScript (R) Description File *% Copyright 1996 Ricoh Corporation.
La thérapie génique somatique implique la mise en oeuvre de moyens destinés à corriger un défaut ou une anomalie génétique (mutation, expression déficiente d'un gène etc. ) ou encore à permettre la production in vivo d'un polypeptide (par exemple un antigène) ou d'un ARN non synthétisé naturellement par l'organisme hôte, ces moyens permettant l'introduction d'un polynucléotide contenant au moins une copie du polynucléotide dont l'expression est recherchée chez ledit organisme hôte. Ledit polynucléotide dit thérapeutique peut être introduit in vitro dans une cellule prélablement prélevée chez l'organisme hôte à traiter, la cellule modifiée étant ensuite réintroduite dans ledit organisme hôte, directement in vivo, en général dans le tissu cible Dans le cas où le polynucléotide thérapeutique code pour un polypeptide, ledit polypeptide peut être indifféremment un polypeptide destiné à une diffusion systémique ou un polypeptide dont l'action biologique est recherchée au niveau du muscle lui-même.
Dans le cas d'une libération systémique, le polypeptide peut être de toute nature et en particulier de nature immunogène, lorsqu'une immunisation de l'individu hôte est désirée. Dans le cas d'une action locale, le polypeptide sera de préférence un polypeptide destiné à corriger un défaut génétique s'exprimant principalement, voire exclusivement au niveau du muscle. Dans ce dernier cas, le polypeptide d'intérêt thérapeutique peut être une protéine musculaire, telle que la myosine, la dystrophine ou encore une protéine de structure tissulaire telle que le collagène ou l'élastine.
De manière générale, ledit polypeptide peut être une ou plusieurs protéines présentant un intérêt thérapeutique ou immunothérapeutique, telles que des protéines d'intérêt immunothérapeutique, par exemple des interleukines, les facteurs de croissance des fibroblastes (FGFs) ou le NGF ( Nerve Growth Factor ). Parmi les polypeptides
d'intérêt, on peut aussi citer l'interféron alpha, l'interféron beta, l'interféron gamma, les interleukines (IL-1à IL-16), le facteur stimulant les colonies de monocytes/macrophages (CSF-1 ou MCSF), le facteur stimulant la formation de colonies de granulocytes (GCSF), le facteur stimulant la formation de colonies mixtes granulocytes/macrophages (GM-CSF), le facteur inhibiteur de leucémie (LIF), le facteur de nécrose tumorale (TNF alpha), la lymphotoxine (LT ou TNF beta), le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), le facteur de croissance des cellules endothéliales vasculaires (VEC-GF), l'érythropoïétine, le TGF beta (pour Transforming growth factor bela ), le TGF alpha, le facteur de croissance des cellules B (BCGF), le facteur inhibiteur de la migration des macrophages (MIF) ou encore la protéine-1 chemoattractive pour les monocytes ( Monocyte Chemoattractant Protem-1 ou MCP-1).
D'autres protéines d'intérêt sont également l'insuline, le Facteur IX et l'hormone de croissance, préférentiellement d'origine humaine.
Le polypeptide d'intérêt thérapeutique peut également être une protéine induisant une réponse immunitaire telle que décrite dans la demande WO 90/11092, et en particulier un antigène viral telle que la glycoprotéine gp 120 ou la protéine Nef du VIH (virus de l'immunodéficience humaine).
Parmi les antigènes d'intérêt vaccinal susceptibles d'être produits par recombinaison génétique en utilisant une cassette de régulation selon l'invention, sont compris les antigènes suivants : a) l'antigène ESAT-6 qui est considéré comme un antigène majeur de M. luberculosis, décrit notamment par Sorensen et al. (1995) ; b) la protéine de 45/45 kD de M. iuberculosis, décrite dans la demande PCT/FR 96/0166 ; c) l'antigène de surface du virus de l'hépatite B (Ag Hbs) décrit dans le brevet français N 79 21 811 ; d) tout ou une partie de certaines glycoprotéines de HIV-1 ou HIV-2. Les séquences génomiques du virus HIV-1 sont décrites dans les demandes de brevet GB 8324800, EP 84401834 ou encore EP 85905513 ; les séquences génomiques du virus HIV-2 sont décrites dans la demande de brevet EP 87400151.
L'acide nucléique hétérologue contenu dans une cassette de régulation selon l'invention peut également coder pour un polynucléotide, en particulier un ARN d'intérêt thérapeutique, tel qu'un ARN sens ou antisens. Par exemple, un tel ARN peut être l'ARN antisens de la protéine p53 ou un ARN tel que décrit dans la demande WO 90/11092, au nom de la société VICAL ou encore décrit par Sczakiel et al. (1995).
De préférence, les polynucléotides antisens sont choisis parmi des polynucléotides d'une longueur d'environ 15à 1000 paires de bases, en particulier de 15 à 200 paires de bases, lesdits polynucléotides étant avantageusement choisis parmi les polynucléotides complémentaires de l'extrémité 5' de la séquence codante du gène dont l'inhibition de l'expression est recherchée.
A titre illustratif, un autre ARN antisens codé par l'acide nucléique hétérologue constitutif d'une cassette de régulation selon l'invention est un ARN hybridant avec l'extrémité 5' de la séquence codante du gène de l'Insulin-like Growth Factor II (IGFH), comme décrit par Montarras et al. (1996).
Un autre objet de l'invention concerne un vecteur d'expression recombinant destiné à la production in vitro d'un polypeptide d'intérêt, notamment d'intérêt thérapeutique ou vaccinal tel que défini ci-dessus, à partir d'une culture de cellules eucaryotes ledit vecteur recombinant comprenant une cassette de régulation selon l'invention.
Avantageusement, un tel vecteur comprendra, en outre, les signaux de régulation de la traduction nécessaires à une expression optimale du polypeptide de fusion dans l'hôte cellulaire choisi, ces signaux de régulation devant être, au sein du vecteur recombinant, liés de manière fonctionnelle au polynucléotide codant pour le polypeptide selon l'invention. Un tel vecteur comprendra un signal de début de traduction et un site de liaison aux ribosomes (séquence Shine-Dalgarno). En outre, un site de terminaison de la transcription fonctionnel chez l'hôte cellulaire recombinant choisi peut être, si nécessaire, inséré en aval du codon d'arrêt de la traduction de la séquence codante, afin d'obtenir des transcrits de la taille la plus réduite possible et ainsi favoriser l'expression du polynucléotide codant pour le polypeptide de fusion selon l'invention.
Les vecteurs d'expression suivants peuvent être utilisés : - vecteurs pour cellules eucaryotes : pWLneo, pSV2cat, pOG44, pXT1, pSG (commercialisés par Stratagene); pSVK3, pBPV, pMSG, pSVL (commercialisés par Pharmacia), pCDNA3 (commercialisé par Invitrogen) ; - un vecteur adénoviral ; - un vecteur d'adénovirus associé ; - un vecteur pseudo-adénoviral ; - un vecteur rétroviral.
Un vecteur recombinant contenant une cassette de régulation selon l'invention est le plasmide pMLC3F-rrlacZ-2IE contenu dans la souche de E. coli déposée le
13/02/1998 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes sous le N 1-1983.
L'invention concerne en outre tout hôte cellulaire recombinant, procaryote ou cucaryotc, comprenant une cassette de régulation ou un vecteur recombinant selon l'invention.
régions pour ses fruits: de petites baies noires.
Les feuilles, outre des traces d'huile essentielle riche en cymène, renferment de nombreux flavonoïdes, prodelphinidols dimères et trimères qui contribuent à
l'activité anti-âge de la composition de l'invention.
Les Pins, de la famille des Pinacées, presque tous localisés dans l'hémisphère nord, sont très connus pour leur production, dans des canaux sécréteurs, de térébenthine. La térébenthine et son essence sont de puissants modificateurs des sécrétions trachéo-bronchiques par leur action fluidifiante, expectorante et antiseptique. Mais ces conifères sont aussi réputés pour leur huile essentielle riche
en pinène, utilisée en parfumerie.
On peut citer, à titre d'exemple, le pin sylvestre (Pinus silvestris), le pin noir ou le pin d'Autriche (Pinus austriaca), indigènes en France, mais aussi, le pin maritime (Pinus maritima), originaire des pays méditerranéens, etc. Le pin préféré utilisé dans la composition de l'invention est le Pin sylvestre, souvent renommé Pin d'Auvergne ou Pin d'Ecosse. Les flavonoïdes et les acides organiques qu'il renferme, notamment au niveau de l'écorce o la concentration est
plus importante, contribuent à l'activité "anti-âge" de la composition de l'invention.
Deux groupes de tanins sont habituellement identifiés chez les végétaux supérieurs: - les tanins hydrolysables, dérivés de l'acide gallique et l'acide ellagique, - les tanins condensés, dérivés des catéchines, qui renferment la classe d'actifs
constituée par les oligomères proanthocyanidoliques, encore appelés les OPC.
La plupart des OPC ont une capacité de complexation avec différents radicaux libres, ce qui a pour effet de stabiliser ces radicaux libres et donc de les rendre moins
nocifs pour l'organisme.
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Dans la plupart des molécules organiques, les atomes voisins sont liés les uns aux autres par des liaisons covalentes, c'est-à-dire fondées sur!'appariement naturel des électrons de vecteur magnétique ou "spin" opposé. Lors d'une irradiation, de l'exposition à une source d'énergie lumineuse ou thermique d'intensité suffisante, ou de réactions chimiques d'oxydoréduction, le couple électronique peut être rompu. La molécule ou l'atome se trouve de ce fait porter un ou plusieurs électrons "célibataires" sur son orbitale externe et est désigné sous le terme de "radical libre". La tendance naturelle des électrons non appariés à interagir avec les électrons de molécules ou d'atomes voisins, pour reformer des liaisons chimiques covalentes, confère aux radicaux libres une très grande instabilité, une extrême réactivité et la capacité de déclencher la néoformation et la propagation en chaîne d'autres espèces radicalaires. C'est ce processus de transfert et de propagation des radicaux libres que l'on désigne parfois sous le terme évocateur de "cascade radicalaire", et qui, au sein de la matière vivante, peut aboutir à la destruction
partielle ou complète des structures cellulaires et tissulaires avoisinantes.
En fait, une partie des radicaux libres sont produits selon un processus physiologique normal au cours des réactions métaboliques de la cellule: respiration mitochondriale, phagocytose, détoxication, etc. Mais les polluants comme les hydrocarbures polycycliques du tabac, les rayonnements solaires ou les
inflammations, favorisent l'apparition excessive de radicaux libres.
Les figures 6 à 8 représentent, chacune dans une première position de rangement et une seconde position d'utilisation, des variantes de réalisation.
Dans l'exemple représenté en figure 6, le dispositif comprend un boîtier muni d'un couvercle permettant de protéger le produit de lavage en dehors des périodes d'utilisation.