INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les expressions utilisées dans la description et les revendications ont la signification suivante : - "vecteur" signifie un système d'expression, par exemple des projectiles enrobés d'ADN, des véhicules de transit à base d'acides nucléiques, des molécules d'acide nucléique adaptées pour livrer de l'acide nucléique, et de l'ADN circulaire autoréplicant autonome, par exemple plasmides, cosmides, phagemides, etc. Si un micro-organisme ou une culture cellulaire recombinant est décrit comme hôte d'un "vecteur
d'expression", ceci peut inclure également de l'ADN circulaire extrachromosomique (tel que par exemple de l'ADN mitochondrial ou chloroplastique), de l'ADN ayant été intégré au(x) chromosome(s) hôte(s), le vecteur pouvant être soit répliqué de manière stable par les cellules pendant la mitose en tant que structure autonome, intégré au génome de l'hôte, soit maintenu dans le noyau ou le cytoplasme de l'hôte.
- le plus souvent, les vecteurs utilisés pour la transformation génétique existent sous forme de plasmides. Dans ce cas, le "plasmide" est une molécule d'ADN circulaire autonome capable de réplication dans une cellule. Si un micro-organisme ou culture cellulaire recombinante est décrit comme hôte d'un plasmide "d'expression", ceci comprend à la fois des molécules d'ADN circulaires extrachromosomiques et de l'ADN ayant été intégré au(x) chromosome(s) hôte (s). Si le plasmide est maintenu par une cellule hôte, le plasmide est soit répliqué de manière stable par les cellules pendant la mitose en tant que structure autonome, soit intégré au génome de l'hôte ; - "propre" signifie que le vecteur ne comprend que des séquences indispensables à sa fonctionnalité et porte une séquence d'acide nucléique ne comprenant que des éléments indispensables à l'expression de la cellule hôte; - "acide nucléique" signifie ADN ou ARN ; - "séquence d'acide nucléique" signifie un oligomère ou polymère, simple ou double brin, de bases nucléotidiques lues à partir de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', et comprend des plasmides autoréplicants, des gènes, des polymères d'ADN, ou d'ARN, infectieux ou non, et de l'ADN, ou l'ARN, fonctionnel ou non-fonctionnel. Dans la notation nucléotidique utilisée dans la présente demande, sauf mention particulière, l'extrémité gauche d'une séquence nucléotidique simple brin est l'extrémité 5' ; - "séquence d'acide nucléique dérivée" signifie que la séquence dérive directement ou indirectement de la séquence à laquelle il est fait référence, par exemple par substitution, délétion, addition, mutation, fragmentation, et/ou synthèse d'un ou plusieurs nucléotides ; - "promoteur" signifie une région d'acide nucléique en
amont du codon de démarrage de la traduction et qui est impliquée dans la reconnaissance et la liaison de l'ARN polymérase et d'autres protéines pour la transcription ; - "promoteur végétal" est un promoteur capable d'initier la transcription dans des cellules végétales ; - "promoteur constitutif" est un promoteur capable d'exprimer des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans tous ou pratiquement tous les tissus de l'organisme hôte pendant tout le développement dudit organisme ; - "promoteur tissulaire spécifique" est un promoteur capable d'exprimer de manière sélective, des séquences d'acides nucléiques liées de manière opérationnelle audit promoteur, dans certains tissus spécifiques de l'organisme hôte ; - "liées de manière opérationnelle" signifie la liaison d'un élément fonctionnel ou régulateur, par exemple un promoteur, à la séquence d'acide nucléique, ou gène, à exprimer qui code pour une protéine à produire, de telle sorte que cet élément influence la transcription de la séquence d'acide nucléique liée; - "cassette d'expression" signifie des séquences nucléotidiques capables de diriger l'expression d'une séquence d'acide nucléique, ou d'un gène, codant pour un polypeptide à produire dans un organisme hôte compatible avec de telles séquences. De telles cassettes incluent au moins un promoteur et un signal de terminaison de la transcription, et optionnellement d'autres facteurs nécessaires ou utiles à l'expression ; - "séquence hétérologue" ou "séquence d'acide nucléique hétérologue" signifie une séquence provenant d'une source, ou d'une espèce, étrangère à son environnement, ou si elle provient du même environnement, a été modifiée par rapport à sa forme originale. La modification de la séquence d'acide nucléique peut avoir lieu par exemple par traitement de l'acide nucléique avec une enzyme de restriction pour générer un fragment d'acide nucléique capable d'être lié de manière opérationnelle à un promoteur. La modification peut également avoir lieu par le biais de techniques comme la mutagenèse dirigée ;
- "boîte" signifie une séquence d'acide nucléique à laquelle une fonction régulatrice est imputée ; - "like" signifie que la boîte et/ou la séquence d'acide nucléique à laquelle ce terme est associé, comporte une certaine identité de séquence ou un consensus avec une boîte et/ou une séquence d'acide nucléique connue dite de référence, de préférence une identité de séquence d'au moins 50%, de manière plus préférée une identité de séquence d'au moins 75%, et plus particulièrement une identité de séquence d'au moins 90% avec la séquence de référence. Le pourcentage d'identité de séquence est calculée sur la base d'une fenêtre de comparaison d'au moins 6 bases nucléotidiques. La détermination d'une fenêtre de comparaison peut être effectuée en utilisant des algorithmes d'alignement de séquences pour déterminer une homologie avec une séquence de référence, par exemple l'algorithme d'homologie locale, l'algorithme d'alignement d'homologie, et l'algorithme de recherche de similitude, ces algorithmes existant également sous forme informatique, connus sous les noms GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA. Le pourcentage d'identité de séquence est obtenue en comparant la séquence de référence avec la boîte et/ou la séquence d'acide nucléique ; - "située" signifie la position sur une séquence d'acide nucléique d'un élément identifié, tel qu'une "boîte", un site de restriction, ou un codon ayant une fonction particulière. La position qui est donnée par un chiffre se réfère à la position du début de l'élément dans la séquence d'acide nucléique, dans le sens de la lecture de cette dernière, c'est-à-dire dans le sens 5'->3' ; - "plante transgénique" signifie une plante ayant été obtenue par des techniques de manipulation génétique, et couvre les plantes entières obtenues, leur progéniture, ainsi que les organes végétaux, par exemple les racines, les tiges et les feuilles, obtenus par ces techniques. Les plantes transgéniques selon la présente invention peuvent avoir différents niveau de ploïdie, et peuvent notamment être polyploïdes, diploïdes, et haploïdes ; - "propagule" signifie un amas ou une association de
cellules végétales, structuré(e) ou non, permettant la régénération d'une plante entière, par exemples des explants, des cals, des tiges, des feuilles, des racines, des boutures, et même des semences.
La demanderesse de la présente invention a réussi, et ce de manière surprenante, à produire des vecteurs synthétiques propres, en particulier des plasmides binaires, de séquence nucléotidique entièrement connue, de petite taille, permettant de pallier les inconvénients cités précédemment, et notamment présentant un fort taux de réplication par rapport aux vecteurs existants les plus couramment utilisés. Par ailleurs, la demanderesse a réussi en même temps à produire une gamme de vecteurs de manière à pouvoir choisir celui qu'il convient d'utiliser selon l'application envisagée et l'environnement de sa mise en #uvre, et ainsi de pouvoir mieux contrôler le taux d'expression d'un gène à exprimer codant pour un polypeptide à produire.
En outre, dans certains des vecteurs selon l'invention, chacun des éléments ou composants fonctionnels peut être isolé par simple digestion enzymatique.
Un objet de la présente invention est donc un vecteur synthétique propre ne renfermant que les éléments indispensables à sa fonctionnalité et à la transgénèse d'une cellule, et notamment d'une cellule végétale.
Selon un mode d'exécution préféré, le vecteur comprend, comme éléments indispensables à sa fonctionnalité et à la transgénèse d'une cellule, et liés de manière opérationnelle : - au moins une séquence d'acide nucléique codant pour au moins une première origine de réplication, de préférence un ori RK2, et plus préférentiellement au moins un ori V de pRK2 de Escherichia coli à large spectre d'hôtes ; - au moins une séquence d'acide nucléique codant pour un agent de sélection, de préférence un gène de résistance aux antibiotiques, plus préférentiellement le gène npt III conférant la résistance à la kanamycine dans les bactéries ; - un locus trfA codant pour au moins une protéine permettant d'augmenter le taux de réplication du plasmide, de
préférence issu de pRK2, et plus préférentiellement codant pour les protéines P285 et P382.
Selon un mode d'exécution plus préféré le vecteur comprend la séquence d'acide nucléique identifiée sous le numéro SEQ.ID01. Plus préférentiellement encore, le vecteur consiste en un plasmide simple pMRT1105 dont la séquence d'acide nucléique est identifiée sous le numéro SEQ.ID01.
Selon un autre mode d'exécution préféré, le vecteur comporte au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une deuxième origine de réplication, de préférence un ori d'Escherichia coli, et plus préférentiellement un ori ColEI.
Plus préférentiellement, le vecteur comprend la séquence d'acide nucléique identifiée sous le numéro SEQ. ID02, et encore plus préférentiellement, le vecteur consiste en un plasmide simple pMRT1106 dont la séquence d'acide nucléique est identifiée sous le numéro SEQ.ID02.
De manière préférée, le vecteur synthétique selon l'invention comprend une région constituée par au moins une séquence d'acide nucléique contenant plusieurs sites de restriction enzymatique uniques appelés collectivement site de clonage multiple (MCS).
Selon un mode d'exécution préféré, le vecteur comporte en outre une séquence d'acide nucléique codant pour un ADN-T comportant une bordure droite RB et une bordure gauche LB, permettant au vecteur de fonctionner comme un plasmide binaire.
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A cet effet, l'invention a pour objet un procédé du type précité, caractérisé en ce que ladite valeur instantanée est estimée à partir d'une forme quadratique dépendant de deux fonctions dépendant respectivement de deux dérivées par rapport au temps d'ordres différents de ladite grandeur représentative mesurée, et d'une valeur représentative de la position du piston dans le cylindre du moteur à chaque instant et établie à partir de ladite grandeur représentative mesurée, les coefficients de ladite forme quadratique étant déterminés à partir de mesures expérimentales de ladite variable caractéristique et de ladite grandeur représentative du mouvement de l'arbre du moteur.
En variante, le procédé comporte l'une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : - ladite valeur représentative de la position du piston dans le cylindre est prise égale au volume du cylindre considéré à l'instant donné élevé à
une puissance donnée, le volume du cylindre étant déterminé à partir de ladite grandeur représentative mesurée ; - ladite puissance est comprise entre-3 et -1 ; - ladite puissance donnée est exprimée à chaque instant comme une combinaison linéaire de grandeurs disponibles représentatives du fonctionnement du moteur ; - les deux fonctions dépendant respectivement de deux dérivées par rapport au temps d'ordres différents de ladite grandeur représentative mesurée sont la fluctuation de la vitesse angulaire de rotation de l'arbre du moteur et l'accélération angulaire de l'arbre du moteur ; - les coefficients de ladite forme quadratique sont exprimés à chaque instant sous la forme d'une combinaison linéaire de grandeurs disponibles représentatives du fonctionnement du moteur; - lesdites grandeurs disponibles représentatives du fonctionnement du moteur comporte l'une au moins des grandeurs parmi le régime du moteur, la charge du moteur, le taux de recirculation des gaz d'échappement dans le moteur, et l'avance à l'allumage ou à l'injection ; - les coefficients de la forme quadratique sont déterminés par corrélation entre la variable caractéristique mesurée expérimentalement et les deux fonctions dépendant respectivement des deux dérivées d'ordres différents et la valeur représentative de la position du piston ; et - l'analyse de corrélation s'effectue par minimisation d'une erreur quadratique entre la valeur instantanée estimée par la forme quadratique cherchée et la valeur instantanée de la variable caractéristique mesurée expérimentalement.
L'invention a en outre pour objet un dispositif d'estimation de la valeur instantanée d'une variable caractéristique du fonctionnement d'un moteur à combustion interne, telle que la pression dans un cylindre du moteur ou le couple sur l'arbre du moteur, comportant un capteur de mesure d'une grandeur représentative du mouvement de l'arbre du moteur à chaque instant, telle que la position angulaire ou la vitesse angulaire, et des moyens de calcul de l'estimation de ladite valeur instantanée en fonction de la grandeur représentative mesurée, caractérisé en ce que les moyens de calcul sont
adaptés pour estimer ladite valeur instantanée à partir d'une forme quadratique dépendante de deux fonctions dépendant respectivement de deux dérivées par rapport au temps d'ordres différents de ladite grandeur représentative mesurée, et d'une valeur représentative de la position du piston dans le cylindre du moteur à chaque instant et établie à partir de ladite grandeur représentative mesurée, les coefficients de ladite forme quadratique étant déterminés à partir de mesures expérimentales de ladite variable caractéristique et de ladite grandeur représentative du mouvement de l'arbre du moteur.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins sur lesquels : La figure 1 est une vue synthétique d'un mode de mise en #uvre du dispositif selon l'invention ; La figure 2 est un graphique montrant l'évolution, en fonction des cycles d'un moteur, de la pression mesurée dans chaque cylindre et de la pression estimée dans ces cylindres par le procédé selon l'invention ; et La figure 3 est un graphique montrant l'évolution, en fonction des cycles d'un moteur, du couple du moteur mesuré pour chaque cylindre et du couple du moteur estimé pour ces cylindres par le procédé selon l'invention.
Sur la figure 1 est représenté un moteur à combustion interne 10, tel qu'un moteur à explosion. L'invention peut toutefois être mise en #uvre avec un moteur Diesel.
Comme connu en soi, le moteur 10 est associé à une unité 12 de contrôle du moteur. L'unité 12 est adaptée pour recueillir les valeurs instantanées de grandeurs représentatives du fonctionnement du moteur. Ces grandeurs sont mesurées directement sur le moteur par l'intermédiaire de capteurs.
En outre, l'unité de contrôle du moteur 12 est adaptée pour assurer la commande du moteur, par pilotage des actionneurs de commande de celuici. En particulier, et comme connu en soi, l'unité de contrôle du moteur 12 est adaptée pour assurer une régulation de certains paramètres de fonctionnement du moteur en fonction de consignes imposées par l'utilisateur. Plus
précisément, l'unité de contrôle du moteur 12 assure la régulation du régime du moteur noté N, de sa charge notée C, du taux de recirculation des gaz d'échappement couramment désigné par taux d'EGR et de l'avance à l'alumage ou à l'injection noté AA. La valeur du taux d'EGR est désignée par EGR dans la suite.
Ces différentes quantités rendues accessibles par l'unité 12 sont désignées dans la suite par l'expression générale "grandeurs disponibles représentatives du fonctionnement du moteur".
Le moteur représenté sur la figure 1 est associé à un dispositif d'estimation de la valeur instantanée de la pression P dans un cylindre du moteur et du couple sur l'arbre du moteur. Ce dispositif d'estimation comporte des moyens de calcul 14 auxquels sont reliés un capteur 16 de mesure d'une grandeur représentative du mouvement de l'arbre du moteur à chaque instant. Ce capteur est par exemple un capteur optique ou électromagnétique monté à l'extrémité du vilebrequin du moteur. Suivant sa nature, le capteur 16 adresse aux moyens de calcul 14 la position angulaire # du vilebrequin, et/ou la vitesse angulaire de rotation de celui-ci. Dans l'exemple considéré, la grandeur représentative mesurée par le capteur 16 est supposée être la vitesse angulaire de rotation du vilebrequin notée #. Toutefois, avantageusement, le capteur 16 mesure à la fois la position angulaire # et la vitesse angulaire # et transmet ces deux valeurs aux moyens de calcul 14.
Les moyens de calcul 14 sont en outre reliés à l'unité de contrôle du moteur 12 afin de recevoir des grandeurs disponibles représentatives du fonctionnement du moteur, et notamment le régime N, la charge C, le taux d'EGR et l'avance à l'allumage AA.
Les moyens de calcul 14 comportent un module de conditionnement et de différenciation du signal 18 recevant en entrée la valeur instantanée de la vitesse de rotation du moteur*? issue du capteur 16. Le module 18 de conditionnement et de différenciation produit en sortie trois variables intermédiaires notées fe, B et #. fe est une grandeur représentative de la position du piston considéré du moteur à un instant donné. 0 est la fluctuation de la vitesse angulaire du
vilebrequin et 9 est l'accélération angulaire du vilebrequin. Le calcul des variables intermédiaires sera détaillé dans la suite de la description.
Le module de conditionnement et de différenciation 18 est relié à un module 20 d'évaluation de la pression et du couple instantané. Ce module d'évaluation 20 reçoit en entrée les trois variables intermédiaires f#, # et # issues du module de conditionnement et de différenciation 18. Il reçoit en outre de l'unité de contrôle moteur 12 le régime N, la charge C, le taux d'EGR et l'avance à l'allumage AA.
Ces cals ont été obtenus à partir d'embryons immatures de génotype HI, II ou (A188 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (Maize handbook, 1994, Freeling M and Walbot V (eds), pp 665-671). Les cals ainsi obtenus ont été multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les 15 jours sur le milieu d'initiation.
Des plantules ont été régénérées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989). Ces plantes ont ensuite été acclimatées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.
12. 2.2. Transformation génétique du maïs par le canon à particules L'obtention et la régénération des lignées cellulaires nécessaires à la transformation sont décrites en 12.2.1.
* Le procédé, qui met en jeu le canon à particules pour la transformation génétique, est décrit par Finer et al. (1992).
Les cellules cibles sont des fragments de cals d'une surface de 10 à 20 mm2. Ces fragments ont été déposés sur milieu d'initiation supplémenté en mannitol 0,2 M et sorbitol 0,2 M pendant 4 heures avant bombardement.
Les particules de tungstène (M10) et les plasmides de transformation ont été co-précipités en suivant le protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées ont été projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon à particule selon le protocole de Finer et al. (1992).
Les cals bombardés ont été placés à l'obscurité à 27 C.
Après 24 heures, le premier repiquage a lieu suivi de repiquages tous les 15 jours pendant 3 mois sur milieu d'initiation additionné de l'agent sélectif adéquat pour ne retenir que les cals transformés. Puis, ces cals ont été cultivés en présence de l'agent sélectif pour régénérer des plantules transformées comme décrit en 12. 2.1. Les plantules obtenues ont été acclimatées et transférées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.
12. 2.3. Transformation génétique du maïs par Agrobacterium tumefaciens La technique utilisée est décrite par Ishida et al.
(1996). Des embryons immatures de 1,0 à 1,2 mm de long (9 à 14 jours après pollinisation) ont été lavés dans le milieu LS-inf, puis immergés dans la suspension d'agrobactéries, préparée comme décrit par Ishida et al. (1996), soumis au vortex pendant 30 sec., et incubés à température ambiante pendant 5 min. Les
embryons immatures ainsi traités ont été cultivés sur milieu LS-AS à l'obscurité à 25 C pendant 3 jours, puis transférés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 5 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, à l'obscurité à 25 C pendant 2 semaines et enfin, placés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 10 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, à l'obscurité à 25 C pendant 3 semaines. Les cals de type I ainsi générés ont été isolés , fragmentés et transférés sur milieu LSD 1,5 supplémenté en phosphinotricine à 10 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, à l'obscurité à 25 C pendant 3 semaines. Puis, les cals de type I, qui ont proliféré, ont été isolés et placés sur milieu LSZ supplémenté en phosphinotricine à 5 mg/1 et céfotaxime à 250 mg/1, sous photopériode 16 heures lumière/ 8 heures obscurité à 25 C pendant 2 à 3 semaines. Les plantules régénérées ont ensuite été transférées sur milieu LSF sous photopériode 16 heures lumière/ 8 heures obscurité à 25 C pendant 1 à 2 semaines, puis, en phytotron et en serre.
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