INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les moyens d'articulation utilisés selon l'invention sont mieux visibles sur les figures 11 et 12, sur lesquelles les moyens élastiques ne sont pas encore adaptés sur les mors 1 et 4. Ces moyens d'articulation 7 comprennent, sur le premier mors 1, deux premiers ergots perforés 9 et 10, parallèles et espacés l'un de l'autre selon un écartement E de stabilisation. Les moyens d'articulation 7 comprennent, sur le second mors 4, deux seconds ergots perforés 11 et 12, parallèles et espacés l'un de l'autre selon un écartement approprié pour s'engager de part et d'autre des premiers ergots perforés 9 et 10. Un arbre de liaison 13, orienté selon l'axe d'articulation 8, traverse les quatre ergots perforés pour relier les mors 1 et 4.
Comme on le voit sur la figure 1, les moyens d'articulation 7 comprennent en outre un ressort 14 en fil élastique enroulé en hélice autour de l'axe d'articulation s et comportant deux extrémités radialement dépassantes telle que la seconde extrémité 15. Le ressort 14 sollicite, par ses extrémités radialement dépassantes, le premier mors 1 et le second mors 4 en pivotement l'un par rapport à l'autre autour de l'axe d'articulation 8.
Le ressort 14 est logé dans un boîtier 16, rapporté entre les premiers ergots perforés 9 et 10 et solidarisé au premier mors 1.
Les médicaments de l'invention peuvent être également utilisés à raison de 100 ,ug pour les traitements de vaccinations prophylactiques.
Les objectifs visés par l'utilisation des médicaments de l'invention sont - l'hypersensibilité retardée (tests chez les cancéreux), ou - la thérapie prophylactique, ou - l'utilisation dans le cadre de la détection de la fréquence des précurseurs lymphocytaires spécifiques cytotoxiques ou sécréteurs d'interféron par la technique de dilution limite.
Il s'agit d'utiliser les cellules dendritiques autologues ou allogéniques préincubées avec les exosomes tumoraux de l'invention, comme cibles de lymphocytes périphériques de sujets porteurs de la tumeur, avant, pendant et après traitement antitumoral (traitement classique ou immunisation active spécifique).
L'invention concerne également l'utilisation d'un exosome dérivé de cellules tumorales tel que défini ci-dessus, ou d'une cellule présentatrice d'antigène chargée en exosome telle que définie ci-dessus, ou d'une vésicule membranaire telle que définie ci-dessus, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement de tumeurs, solides et hématopolétiques.
L'invention concerne également l'utilisation d'un exosome dérivé de cellules tumorales telles que définies ci-dessus ou d'une cellule présentatrice d'antigène chargé en exosome telle que définie ci-dessus, ou d'une vésicule membranaire telle que définie ciilessus dans le cadre d'un test d'hypersensibilité retardée du cancer ou encore comme outil diagnostique de recherche de fréquence de précurseurs lymphocytaires spécifiques cytotoxiques.
Comme tumeurs solides, on peut citer : le cancer du rein, du sein, les mélanomes, sarcomes, etc...
Comme tumeurs hématopolétiques, on peut citer : les leucémies, les lymphomes malins hodgkiniens ou non hodgkiniens.
L'invention concerne également l'utilisation d'un exosome dérivé de cellules tumorales, ou d'une fraction ou d'un composant constitutif d'un exosome dérivé de cellules tumorales tel que défini ci-dessus, ou d'une vésicule membranaire telle que définie ci-dessus, pour l'amélioration de l'efficacité d'un liposome synthétique pour le transfert de matériel biologique dans une cellule in vitro ou in vivo.
L'invention concerne également la création d'une banque d'exosomes dérivés de cellules tumorales de type histologique commun ou différent.
Cellesci sont composées de mélanges d'exosomes faits à partir de lignées de cellules tumorales pour un type de cancer donné. Ces banques d'exosomes peuvent permettre de sensibiliser des cellules présentatrices d'antigène, notamment des cellules dendritiques, contre toutes les tumeurs de ce type.
L'invention concerne également des mélanges d'exosomes.
On peut citer par exemple des mélanges d'exosomes tumoraux pour des tumeurs génétiquement reliées (cancer du sein et de l'ovaire) ou présentant des mutations p53, p16 connues (cancer du sein, sarcome).
On peut également mentionner des mélanges d'exosomes tumoraux avec des exosomes provenant de cellules immortalisées et transfectées pour exprimer des molécules de co-stimulation, des molécules d'adhésion, des chemokines attractantes (qui ne sont pas normalement exprimées sur les exosomes tumoraux sauf exception).
Tableau 1. Production d'exosomes par des lignées de cellules tumorales murines et humaines
Lignées de Exosomes cellules (yg/2x108 tumorales cellules/18 h) Murines MCA101 172 P815 163 MC38 120 L1210 150 TS/A 160 Humaines (mélanomes) VIO* 80 FON 90 MZ2-2 18 Humaines (néphromes) RCC NUN* 120 RCC JOUA* 18 RCC MEG* 10 RCC GIAM* 100 Les cellules de lignées tumorales ont été incubées pendant 24 h à une densité de un million de cellules par millilitre. Les exosomes ont ensuite été préparés (voir exemple) à partir des milieux de culture par ultracentrifugation différentielle. La concentration en protéines exosomales est mesurée par le test de Bradford (BioRad Protein Assay [BioRad]).
MZ2-2 est décrite dans Traversari et al. (1992) Les * signifient que les différentes lignées primaires ont été établies et caractérisées dans le laboratoire de biologie clinique de l'Institut Gustave Roussy et sont accessibles sur demande.
L'invention permet donc d'obtenir une grande quantité de métabolites à partir de la culture in vitro d'organes végétaux. En effet, la synthèse par les organes végétaux des métabolites, la perméabilisation des organes végétaux, l'excrétion des métabolites et leur récupération peuvent être réalisées plusieurs fois à partir des mêmes organes végétaux. Le rendement de ce type de réaction est donc très élevé et le procédé est de ce fait tout à fait approprié pour une utilisation industrielle.
Le cycle d'étapes a à f peut être répété au moins une fois, de préférence de 1 à 10 fois et plus préférentiel- lement encore de 2 à 5 fois.
Dans la présente demande par "organes végétaux" on entend les organes de plantes supérieures, leurs cellules ainsi que les plantes en totalité.
Ainsi, dans le procéde selon l'invention, tout organe végétal peut être mis en oeuvre en culture in vitro.
A titre d'exemple peuvent être mentionnés notamment, les cellules, les cals, les bourgeons, les racines, les tiges, les feuilles, les écorces, les embryons et les plantes entières. Les racines sont utilisées préférentiellement.
Pour obtenir un développement spécifique des seules racines d'une plante, on transforme génétiquement cette plante par Agrobacterium rhizogenes. Des cultures indéfinies de racines chevelues (hairy roots) sont ainsi obtenues. Ces racines peuvent egalement être transformées génétiquement par des gènes d'intérêt. Pour ce type de culture, il est fait référence à l'article précité C.R. Acad. Sci. Paris, Sciences de la Vie, 1995 ; 318: 593-3 et à la thèse Ducrocq 1994 précitée.
Les organes végétaux utilisés sont ceux de plantes supérieures choisies dans les familles productrices de métabolites primaires et secondaires, par exemple les Solanacées, les Papavéracées, les Rutacées, les Erythroxylacees ou les Taxacées.
Les métabolites primaires et secondaires produits par les organes végétaux selon l'invention sont des molecu- les à forte valeur ajoutée, utilisées notamment dans les industries alimentaire, cosmétique et pharmaceutique.
Des exemples de telles molécules sont les alcaloïdes tropaniques tels que notamment l'hyoscyamine, l'atropine et la scopolamine ou autres alcaloïdes tels que notamment l'ajmaciline, la catharanthine, la vinblastine, la quinine, la vincristine et la cinchonine, ou les glucosides ou autres métabolites primaires ou secondaires.
Une etape importante du procédé selon l'invention consiste à perméabiliser les organes végétaux afin qu'ils libèrent dans leur milieu de culture les métabolites qu' ils ont synthétisés. Cette étape de perméabilisation est realisée par addition d'un agent de perméabilisation.
L'agent de permeabilisation est un composé qui doit permettre la perméabilisation au moins partielle des organes végétaux et qui ne doit pas conduire à une perméabilisation irréversible. Conformement à l'invention, un tel agent de perméabilisation est choisi parmi les esters d'acide gras polyoxyéthylénés contenant en particulier les esters d'acide laurique ou de ses dérivés, plus particulièrement parmi les polyoxyéthylènes sorbitan contenant de l'acide laurique ou ses derivés. On peut citer à titre d'exemple le monolaurate de sorbitan vendu sous la marque Tween 20. L'agent de perméabilisation est ajouté au milieu de culture à une concentration comprise entre 1 et 5 %, de preference 3 % en volume par rapport au volume total du milieu réactionnel.
Les étapes de perméabilisation et d'addition d'au moins un précurseur sont réalisées dans un ordre indifférent ou simultanément, de préférence simultanément.
Les précurseurs utilisés sont des intermédiaires de synthèse des métabolites primaires et secondaires. Parmi ces précurseurs, on peut citer, notamment, l'ornithine, l'arginine et la phénylalanine. Ces précurseurs sont utilisés seuls ou en combinaison. De préférence, on utilise la phénylalanine. Ces précurseurs sont ajoutés au milieu de culture à une concentration comprise entre 10-4 et 10-3 mole/l, de préférence entre 0,5.10-3 et 10-3 mole/l.
Dans le procédé selon l'invention, la première incubation permet aux organes végétaux de synthétiser et d'excréter dans le milieu de culture les métabolites synthétisés. La durée de cette incubation est comprise entre 15 et 24 heures, de préférence entre 16 et 20 heures, et plus préférentiellement encore entre 16 et 18 heures.
L'incubation suivante permet aux organes végétaux de synthétiser à nouveau des métabolites. La durée de cette incubation est bien entendu fonction de la nature des organes végétaux et des végétaux utilisés, elle est comprise entre 4 et 8 jours, de préférence entre 4 et 6 jours, et plus préférentiellement encore de 4 jours.
L'étape d'extraction des métabolites excrétes dans le milieu de culture consiste 8 : - soutirer le milieu de culture du réacteur, - séparer sur une colonne de séparation les métabolites du milieu de culture contenant l'agent de perméabili sation, - rincer au moins une fois les organes végétaux, - separer sur une colonne de séparation les métabolites des solutions de rinçage, - récupérer les métabolites par solution des colonnes de séparation.
LEGENDES DES FIGURES Figures 1A et 1B. Morphologie des endosomes multi-vésiculaires et des exosomes dérivés de cellules TS/A.
A. Sections ultrafines des cellules TS/A analysées par microscopie électronique.
Détail du cytoplasme montrant un compartiment endosomal contenant des vésicules de 60-80 nm de diamètre.
B. Préparation d'exosomes de cellules TS/A analysées en microscopie électronique par la technique sur vésicule intacte (Raposo et al. (1996). Les préparations d'exosomes contiennent une population majoritaire de vésicules de 60-80 nm de diamètre, de taille et morphologie similaires aux vésicules internes des endosomes multivésiculaires montrés en A.
Figures 2A et 2B. Présence de différents marqueurs de la voie endocytique dans les exosomes de cellules tumorales.
A. Deux microgrammes de protéines exosomales (Exos) ou 2x105 cellules tumorales ont été analysés par Western blot à l'aide d'anticorps monoclonaux spécifiques de : molécules de classe I du CMII (Machold Robert P. et al. (1995) "Peptide Influences the Folding and Intracellular Transport of Free Major Histocompatibility Complex Class I Heavy Chains" J. Exp. Med. 181:1111-1122), récepteur de la transferrine (TfR)(anticorps correspondant étant H68.4 décrit dans Biochimica et Biophysica Acta (1992) 1136(1):28-34), Lamp 1 et 2 (rat anti-mouse monoclonal antibodies, Pharmingen) et Calnexine (Hebert Daniel N. et al. (1995) "Glucose Trimming and Reglycosylation Determine Glycoprotein Association with Calnexin in the Endoplasmic Reticulum" Cell 81:425433).
B. Dix microgrammes de protéines exosomales d'une lignée de cellules de mélanome (FON) ou 10 yg de protéines totales des mêmes cellules ont été analysés par Western blot à l'aide d'un anticorps anti-MART-l (Marincola F. et al. (1996) "Analysis of expression of the melanoma associated antigens MART-1 and gap100 in metastatic melanoma cell lines and in "in situ" lesions" Journal of Immunotherapy 19:192-205).
Figure 3. Les exosomes dérivés d'une lignée tumorale MART-1 positive (FON) stimulent un clone T spécifique de MART-1.
Vingt mille cellules du clone T LT8 (ou LT12, résultats non montrés) ont été incubées avec des exosomes dérivés de FON (lignées de cellules MART-1 et HLA-A2 positive) ou GIAM (cellules d'une lignée de néphrome, MART-1 négative) comme contrôle négatif pendant 48 h. La production de TNFss par les cellules du clone T a été mesurée par essai biologique avec les cellules WEHI (Espavik et al.). Les exosomes induisent la production d'IFNy par le clone T, révélant ainsi la présence de complexes HLA-A2/peptide dérivés de MART-1 à la surface des exosomes.
- "LT8+TexGIAM" correspond à des clones T LT8 incubés en présence d'exosomes dérivés de cellules tumorales GIAM - "LT8+TexFON" correspond à des clones T LT8 incubés en présence d'exosomes dérivés de cellules tumorales FON - "LT8+TumFON" correspond à des clones T LT8 incubés en présence de cellules tumorales FON.
En abscisses, on a représenté les cellules conditionnées et en ordonnées la quantité produite de TNFss (pg/ml).
Figure 4. Les exosomes de cellules P815 exprimant la ssGal stimulent des splénocytes de souris immunisées par des adénovirus PGal recombinants.
Des splénocytes (105) de souris BALB/c immunisées 2 mois avant avec 106 pfu adénovirus recombinant PGal ayant rejeté une tumeur exprimant ssGal ont été incubés avec des exosomes dérivés des cellules P815 (diamants vides) ou des cellules P815-ss Gal (carrés pleins ). Les splénocytes non incubés en exosomes donnent le bruit de fond symbolisé par des points pleins (e). Après 5 jours de culture, 1 yCi de thymidine tritiée a été ajouté par puits de culture. L'incorporation de tritium dans l'ADN cellulaire a été mesurée 18 h plus tard. Les résultats significativement différents d'après la méthode exacte de Fisher sont marqués *.
En abscisses, on a représenté la quantité en exosomes dérivés des cellules tumorales P815 (pg/ml) et en ordonnées les coups par minute (CPM).
Figure 5. L'antigène tumoral MART-1 contenu dans des exosomes peut être présenté aux lymphocytes T par des cellules dendritiques.
Des exosomes à doses croissantes dérivés des lignées de cellules tumorales FON (MART-1+, HLA-A2+, Al-) et MZ2-2 (MART-1+, HLA-A2-, A1+) ont été incubés avec les clones (20 000 cellules par puits (plaques de 96 puits) T LT12 (spécifique de HLA-A2/peptide de MART-1) en présence de cellules dendritiques HLA-A2 + dérivées de macrophages circulants (DCA2) (Sallusto, F. and Lanzavecchia A., 1994, Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by GMCSF et IL4 and down regulated by TNFa. J.
Le champ LIF 27 comporte des informations supplémentaires dont l'organisation est libre. Le champ DIF 28 comporte, d'une part, des informations sur l'information représentative d'image diffusée et, d'autre part, des informations relatives au traitement des adresses personnelles, soit, dans l'ordre, des informations qui représentent successivement - I'année et la semaine courante, en deux octets - le type de média fax, logiciel, en un octet - le numéro de document, information valant FF par défaut, en un octet - le numéro de diffusion, information valant FF par défaut, en un octet - le numéro de page, information valant FF par défaut, en un octet - le nombre de diffusion restante, information valant FF par défaut, en un octet - le nombre de pages restantes, information valant FF par défaut, en un octet - une annexe 00 pour décrire une extension SPI-PAI, en un octet - la longueur des trames TAL 01 pour 64 octets, 04 pour 256 octets (voir figure 15), en un octet - le numéro de la dernière trame TAL utile, en un octet - le numéro de la première trame TAL de redondance, en un octet - le nombre d'adresses dans la dernière trame utile, en un octet et - une annexe, information valant FF par défaut, en un octet.
En figure 15, on observe, en première ligne, la structure d'une liste d'adresses, dans laquelle se succèdent les champs de synchronisation 46, de liste d'adresses 47, de bourrage 48, de redondance 49 et RCP 50 ("Return to Control for Partial page", en anglais). La liste d'adresses 47 contient des données représentatives d'identificateurs, ou adresse, qui sont chacun uniquement liés à un terminal de réception de données.
La deuxième ligne détaille - la liste d'adresses qui comporte les champs TAL 51 numérotés '0' à 'T', dont le dernier comporte les informations de bourrage du champ 48, - le champ de redondance 49 qui comporte les champs TAL 54 numérotés de 'U' à '255' et - le champ RCP 50 qui comporte des sous-champs RCP 52. Les champs TAL 51 correspondent chacun à un signal numérique véhiculant la liste des adresses personnelles PA des dispositifs de réception autorisés à traiter le message diffusé.
On observe, à nouveau, en figure 15 qu'en mode BECM (initiales des mots anglais utilisés par l'homme du métier "Bloc Error Correction Mode"), une partie des trames TAL véhiculent de l'information de redondance de la même manière que les trames FCD de la figure 8.
La partie gauche de la cinquième ligne de la figure 15 illustre la succession de champs qui constituent un champ TAL 51, à l'exception cependant du dernier qui est illustré en troisième ligne un champ F 1, un champ A 2, un champ C 3, un champ FCF1 4, un champ FCF2 5, un champ d'adresses 53 ne contenant que des informations représentatives d'adresses, un champ FCS 7 (figure 7) et un champ F 8.
La troisiéme ligne de la figure 15 illustre la succession de champs qui constituent le dernier champ TAL 51, numéroté 'T': un champ F 1, un champ A 2, un champ C 3, un champ FCF1 4, un champ FCF2 5, un champ d'adresses 53 contenant des informations représentatives d'adresses, un champ de bourrage 55, un champ FCS 7 (figure 3) et un champ F 8.
La quatrième ligne de la figure 15 illustre la succession de champs qui constituent un champ TAL 54 un champ F 1, un champ A 2, un champ C 3, un champ FCF1 4, un champ FCF2 5, un champ de redondances 56 ne contenant que des informations permettant de corriger des erreurs de transmission des adresses présentes dans les champs TAL 51, un champ FCS 7 (figure 3) et un champ F 8.
La partie droite de la cinquième ligne illustre les champs successifs qui constituent un sous-champ RCP un champ F 1, un champ A 2, un champ C 3, un champ FCF1 4, un champ FCS 7 (figure 3) et un champ F 8.
Afin de permettre la réception de la diffusion par un groupe d'utilisateurs identifiés individuellement, le champ de contrôle secondaire 26 de la trame SPI, trame de démarrage, illustrée en figure 14, doit être positionné à la valeur PAI. Dans ce cas, le champ LIF contient des informations qui n'interviennent pas dans la définition de l'adresse. Le format de l'information du champ DIF est complété avec des informations de format relatives à la liste d'adresses. La trame SPI est immédiatement suivie de la liste d'adresses, transmise sous forme de bloc au format BECM, format identique à celui utilisé pour les blocs de données, constitué de trames TAL ("Terminal Address List" en anglais).
En regard des figures 9 et 15, on observe que les symboles d'information d'adresse sont traités de manière similaire aux symboles d'information primaire.
La trame de commande, présentée en première ligne de figure 16 comporte un champ F 1, un champ A 2, un champ C 3, un champ de contrôle primaire à la valeur MOC 57 ("Management Oriented Command" en anglais), un champ de contrôle secondaire à la valeur SNR 58 ("Set New Right" en anglais), un champ UG 30, un champ de date DATE 31, un champ FCS 7 (figure 3) et un champ F 8. Le champ MOC 57 correspond à un signal numérique permettant de gérer les terminaux par des commandes diffusées. Le champ SNR 58 correspond à un signal numérique de type MOC dit "MOC SNR" permettant d'ajouter un terminal à un groupe d'utilisateurs UG. Cette trame est illustrée en figure 16.
La commande représentée par le champ MOC 57, transmise en phase A, est a priori indépendante du procédé d'adressage. Une description des différents champs de cette commande est donnée figure 16, pour définir la nouvelle appartenance d'un récepteur à un groupe d'utilisateurs et figure 17 pour définir l'ancienne appartenance d'un récepteur à un groupe d'utilisateurs par modification du contenu de la zone mémoire RIGHT~UGI 492.
Le champ UGI 30, présenté en deuxième ligne de la figure 16 contient, sur vingt octets, des informations d'identification de groupe d'utilisateurs, c'est-à-dire un identificateur de fournisseur et un identificateur de service offert.
Le champ date DATE 31, représenté en troisième ligne de la figure 16, contient sur quatre octets des informations qui représentent - I'année et la semaine courante, sur deux octets - le prochain numéro de document, sur un octet et - une annexe, information valant FF par défaut, sur un octet.
La trame de commande présentée en première ligne de figure 17 comporte un champ F 1, un champ A 2, un champ C 3, un champ MOC 57, un champ de contrôle secondaire à la valeur ROR 59 ("Reset Old Right", en anglais), un champ UG 32, un champ de date DATE 33, un champ FCS 7 (figure 3) et un champ F 8. Le champ ROR 59 est un champ de type MOC, dit "MOC-ROR", permettant de retirer un terminal d'un groupe d'utilisateur UG.
Le champ UGI 32, présenté en deuxième ligne de la figure 17 contient, sur vingt octets, des informations d'identification de groupe d'utilisateurs, c'est-à-dire un identificateur de source, de fournisseur, et un identificateur de service offert.
Si l'on se réfère à la figure 1, une machine électrique motrice de l'invention comprend deux moteurs alternatifs 1 et 2 dont les stators sont référencés respectivement la et 2a, et les rotors sont référencés Ib, 2b. Le stator la du premier moteur 1 est alimenté par une batterie d'accumulateurs 5, par l'intermédiaire d'un convertisseur à variation de fréquence 3 du type onduleur. Ce convertisseur 3 permet de transformer une tension continue à son entrée en un système de tensions alternatives 3a, qui alimente le stator la, et dont la fréquence F, est réglable. De manière similaire, le stator 2a du second moteur 2 est alimenté par la même batterie 5, par l'intermédiaire d'un convertisseur à variation de fréquence 4 transformant une tension continue à son entrée en un système de tensions alternatives 4a de fréquence réglable F2.
Le rotor lb du premier moteur est couplé mécaniquement à une masse schématisée (M) sur la figure 1. Il s'agira par exemple d'un véhicule automobile, dont le mécanisme d'entraînement des roues est couplé au rotor lb par une chaîne de transmission cinématique connue. Le rotor 2b du second moteur 2 comporte en bout d'arbre une masse (m), et constitue avec cette masse un volant d'inertie.