C'est pourquoi la présente invention a pour objet un nouveau procédé d'étalonnage d'un système de dosage d'un analyte dans un échantillon biologique mettant en jeu une interaction spécifique de type ligand/anti-ligand telle qu'une interaction antigène/anticorps ou enzyme/inhibiteur ou encore acide nucléique/acide nucléique, dans un schéma réactionnel de type sandwich ou compétition , caractérisé en ce que l'on fait réagir un échantillon biologique renfermant le cas échéant l'analyte avec, - une première catégorie de microsphères appelées microsphères de calibration caractérisable par la taille, le spectre de fluorescence (F1) ou par l'intensité de sa fluorescence (F1), ces microsphères comportant un site ligand El, et de préférence formé de plusieurs sous-catégories se distinguant les unes des autres par la quantité de sites ligands El, et avec, - un traceur formé par un anti-ligand spécifique du site ligand E1 et couplé à un composé fluorophore F2 d'une fluorescence différente de celle (F1) qui peut caractériser les microsphères de calibration et avec - une seconde catégorie de microsphères, appelées microsphères de dosages, différente de la première catégorie de microsphères sur le plan ou de la taille, ou du spectre de fluorescence (F1) ou de l'intensité de la fluorescence (F1), et qui constitue le support de la réaction analytique, selon l'une des modalités de mise en oeuvre suivantes: i) dans le cas où l'analyte comprend un site El identique à celui porté par les microsphères de calibration, ladite seconde catégorie est couplée à un anti-ligand spécifique d'un site ligand E2 de l'analyte, et l'on utilise aussi dans la réaction un traceur anti-ligand El couplé au composé fluorophore F2 (calibration homologue), ii) ladite seconde catégorie est couplée à un anti-ligand spécifique d'un site ligand E2 de l'analyte, et l'on utilise aussi dans la réaction un antiligand spécifique d'un site E3 dudit analyte, cet anti-ligand étant couplé - soit au même composé fluorophore F2 (traceur direct), - soit au site ligand El utilisé sur les microsphères de calibration (traceur indirect), et l'on utilise en outre dans la réaction un traceur de révélation anti-ligand El couplé au composé fluorophore F2 (calibration hétérologue), iii) ladite seconde catégorie est couplée à un anti-ligand spécifique d'un site ligand E2 de l'analyte, et l'on utilise aussi dans la réaction un ligand qui est un analogue de l'analyte portant un site ligand E2, cet analogue étant couplé - soit au même composé fluorophore F2 (traceur direct), - soit au site ligand El utilisé sur les microsphères de calibration (traceur indirect), et l'on utilise en outre dans la réaction un traceur de révélation anti-ligand El couplé au composé fluorophore F2 (calibration hétérologue), iiii) ladite seconde catégorie est couplée à un analyte ou à un analogue de l'analyte portant un site ligand E2 et, I'on utilise aussi dans la réaction un anti-ligand E2, cet anti-ligand étant couplé - soit au même composé fluorophore F2 (traceur direct), - soit au site ligand El utilisé sur les microsphères de calibration (traceur indirect), et l'on utilise en outre dans la réaction un traceur de révélation anti-ligand El couplé au composé fluorophore F2 (calibration hétérolog . ue).