INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
squelettique des souris transgéniques ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9 est extrêmement forte, équivalente à 1,5 - 2 x 10-3 unités d'activités enzymatiques (ou 2- 3 ng de protéine beta-galactosidase à 714 U/mg de la société Sigma) par microgramme d'extrait total. Le niveau d'activité beta-galactosidasc, exprimée par nombre de copies du transgène, est au moins 10 fois plus grand que dans les souris transgéniques ayant reçu l'une quelconque parmi les constructions 3F-II/acZ-2 ou 3F-ulacZ-9 (Fig 3c). Les éléments activateurs 3' et intronique ont donc un effet synergique et induisent un niveau de transcription maximal à partir du promoteur MLC3F dans le muscle squelettique adulte.
Le niveau des transcrits dans le muscle EDL adulte a été déterminé par analyse northern blot en utilisant une sonde 5'UTR commune aux transcrits endogènes et du transgène : le niveau de l'ARNm du transgène dans les deux lignées de souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9 (contenant respectivement une et deux copies du transgène) est comparable, exprimé par nombre de copies du transgène, au niveau des transcrits MLC3F endogènes (Fig. 3b).
Une analyse à l'aide d'un appareil Phosphorimager a révélé que la quantité d'ARNm originaire du transgène présent dans les muscles EDL des souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9 (exprimée par copie du transgène) est en fait le double de la quantité d'ARNm MLC3F endogène (exprimée par allèle), comparée à l/8ème de la quantité d'ARNm endogène dans les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-2e - lignée 1 (qui contient approximativement 7 copies du transgène ; résultats non représentés). Ces résultats suggèrent que l'association des deux éléments régulateurs inclus dans la construction du transgène comprend tous les éléments nécessaires pour l'expression du promoteur MLC3F endogène dans le muscle squelettique.
En revanche, dans le muscle strié cardiaque, la présence des deux séquences activatrices n'induit pas l'augmentation de l'expression du gène rapporteur au-delà du niveau observé chez les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-2, c'est-à-dire contenant le promoteur MLC2F seul (Fig. 3d). Ce dernier résultat confirme que l'effet synergique induit par les deux séquences activatrices, en plus de leur effet activateur de base, est spécifique du muscle squelettique.
D'autres caractéristiques de l'expression du transgène 3F-nlacZ-E9 sont communes avec l'expression des transgènes 3F-filacZ-2E et 3F-ulacZ-9 : la comparaison de l'activité du transgène dans les muscles contenant des fibres rapides de type IIB (EDL) et de type IIA ou des fibres lentes de type I (soleus) démontre que les souris
ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9 conserve un profil d'expression du transgène spécifique des fibres rapides.
Exempte 2 : Expression de la synergie dans l'embryon et citez l'adulte Dans le muscle squelettique adulte, l'activité de la séquence activatrice intronique et de la séquence activatrice 3' est tout à fait comparable. A titre d'exemple, ces deux séquences induisent un haut niveau d'expression spécifique du muscle d'un gène rapporteur, et confèrent un profil d'expression ciblé sur les fibres musculaires rapides (Kelly et al., 1997). La différence principale observée dans l'expression du gène rapporteur entre les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-9 et les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-2E réside dans leur réponse au programme de développement myogénique squelettique embryonnaire. Les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ- 2E ont une expression activée de nlacZ dans l'embryon à 9 jours (E9), alors que les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-9 ne présentent pas d'activation de l'expression du transgène dans le muscle squelettique avant le jour 13,5 (E13,5). Les souris transgéniques contenant les deux séquences activatrices ont une expression du gène rapporteur activée dès les embryons à 9 jours (E9), ce qui suggère que la séquence activatrice 3' constitue un élément d'activation dominant régulant l'expression génique dans le muscle squelettique embryonnaire. De plus, aux stades précédant la régulation positive de la transcription du gène MLC3F endogène pendant le développement foetal, on observe un faible niveau de transcription à partir de ce promoteur dès les embryons à 9 jours (E9).
Les inventeurs ont cherché à déterminer si l'effet de synergie entre la séquence activatrice intronique et la séquence activatrice 3' avait lieu, dans le muscle de l'embryon, avant l'activation des transgènes ne contenant que la séquence activatrice intronique. Dans ce but, l'expression de l'activité beta-galactosidase a été quantifiée dans des extraits de pattes antérieures, de pattes postérieures, de la région du tronc (en excluant les structures axiales) et du coeur d'embryons à 12,5 jours (El 2,5 - Fig 4a).
Dans le muscle squelettique des souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9, les valeurs d'activité beta-galactosidase, exprimées par nombre de copies du transgène, sont approximativement de 1,5 fois les valeurs retrouvées dans les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-2E, alors que le transgène n'est pas activé à ce stade dans le muscle squelettique des souris contenant la construction 3F-nlacZ-9 (Fig 4b). Au jour 12,5, les deux séquences activatrices n'agissent donc pas de manière synergique au niveau du muscle squelettique. Les valeurs d'activité beta-galactosidase, exprimées par nombre de copies du transgène, dans le muscle EDL adulte sont comparées sur la figure
4c avec les valeurs d'activité retrouvées dans les pattes postérieures de l'embryon. L'augmentation de l'expression du transgène de la construction 3F-nlacZ-2E entre les différents temps pourraient refléter à la fois une régulation positive de l'activité du transgène et le fait que le muscle squelettique différencie comprend seulement une souspopulation de cellules de patte postérieure à 12,5 jours, comparé avec une représentation de presque toutes les cellules dans le muscle EDL adulte.
Il y a cependant un rapport d'expression du transgène 10 fois plus grand chez les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9 (rapport approximatif EDL/E12,5 de 100), comparé au rapport observé chez les souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-2E (rapport approximatif EDITE 12,de 10). Ce rapport d'expression dans la patte postérieure entre le muscle EDL adulte et l'embryon à 12,5 jours est indépendant du nombre de copies du transgène.
Les résultats des inventeurs obtenus avec les souris transgéniques démontrent que la différence entre l'activité beta-galactosidase de la patte postérieure embryonnaire et adulte est 10 fois plus grande lorsque les deux séquences activatrices sont présentes que lorsque seule la séquence activatrice 3' est présente dans le transgène, ce qui suggère que l'augmentation substantielle du niveau de transcription de MLC3F endogène est le résultat d'une activation tardive de la séquence activatrice intronique à El 3,5.
Exemple 3 : Evaluation de l'action synergique in vitro de la séquence activatrice intronique et de la séquence activatrice 3' sur la transcription à partir du promoteur MLC3F.
Il a été montré que le haut niveau de transcription du gène MLC 1 F/3F à partir du promoteur MLC3F est dépendant indifféremment de l'une quelconque des deux séquences activatrices situées respectivement 4,2 kb en amont et 15kb en aval du site de début de transcription du promoteur MLC3F (Kelly et al., 1995 ; McGrew et al., 1996 ; Kelly et al., 1997). L'addition d'une séquence activatrice 3' de 260 pb ou d'une séquence activatrice intronique de 800 pb accroît le niveau de transcription d'une région de 4 kb contenant deux segments de 2 kb situés respectivemnt du côté 5' et du côté 3' du site de début de transcription du gène MLC3F dans les myotubes différenciés ; dans les myoblastes, ces constructions ont des niveaux d'activités faibles (Kelly et al., 1997).
L'activité du promoteur MLC3F dans des constructions plasmidiques contenant les deux séquences activatrices a été évaluée.
(b) Niveaux d'expression exprimés par nombre de copies du transgène, montrant que le niveau d'activité dans le muscle squelettique par nombre de copies du transgène est approximativement équivalent dans les embryons 3F-nlacZ-2E et 3F-nlacZ-E9.
(c) Comparaison des activités du transgène dans les extraits protéiques obtenus à partir de pattes postérieures d'embryons à 12,5 jours (HL - E12,5) et de muscle EDL provenant de souris adulte.
Figure 5 : Comparaison des séquences activatrices 3' de la souris, du rat et de l'homme.
Les deux flèches en gras placées au-dessus de la séquence de souris désignent respectivement les extrémités 5' et 3' de la séquence activatrice 3' comprise dans les plasmides de l'invention.
Les cadres délimitent des séquences qui sont la cible des facteurs de transcription spécifiques du muscle.
La séquence du rat est décrite par Donoghue et al., 1988.
La séquence de l'homme est décrite par Rosenthal et al., 1990.
Figure 6 Carte de la construction de la cassette de régulation contenue dans le plasmide pMLC3F-rrlacZ-2IE, déposé à la CNCM le 13/02/1998, sous le numéro d'accès 1-1983.
Matériels et Méthodes 1. Contruction des plasmidcs Les plasmides p3F-rrlacZ-2, p3F-rrlacZ-9, p3F-nlacZ-2I et p3F-///
Plasmide p3F-nlacZ-E9 : une séquence activatrice 3' de 260 paires de bases (Kelly et al., 1995) a été sous-clonée dans le plasmide p3F-tilac7.-9 préalablement partiellement digéré par l'enzyme BamHI, pour donner naissance au plasmide p3F- nlacZ-E9 contenant la séquence activatrice en position 3' à l'extrémité 5' de l'insert du plasmide p3F-nlacZ-9.
Plasmide p3F-nlacZ-9E : la séquence activatrice 3' (Kelly et al., 1995) a été sous-clonée dans le plasmide p3F-nlacZ-9 linéarisé par l'enzyme Kpnl pour donner naissance au plasmide p3F-nlacZ-9E, ce plasmide contenant la séquence activatrice en 3' localisée à l'extrémité 3' de l'insert du plasmide p3F-nlacZ-9.
Plasmide p3F=nlacZ-5 : la séquence activatrice 3' (Kelly et al , 1995) a été sousclonée dans le plasmide p3F-nlacZ-5 linéarisé par l'enzyme BamHI pour donner naissance au plasmide p3F-nlacZ-5E, ce plasmide contenant les éléments régulateurs placés dans une orientation identique à celle qu'ils ont initialement dans le génome.
Plasmides p3F-nlacZ-21 et p3F-iilacZ-21E : la séquence activatrice intronique de 800 paires de bases (contenue dans le plasmide p800, décrit par Kelly et al., 1997) a été placée en position 5' par rapport aux promoteurs MLCIF et MLC3F, dans des constructions contenant ou ne contenant pas la séquence activatrice 3' : - l'insert de 7 kb du plasmide p3F-nlacZ-2 a été isolé et sous-cloné dans le plasmide p800 clivé par l'enzyme Kpnl pour donner naissance au plasmide p3F-nlacZ- 21; - l'insert de 7,3 kb du plasmide p3F-nlacZ-2E a été isolé et sous-cloné dans le plasmide p800 clivé par l'enzyme Kpnl pour donner naissance au plasmide p3F-nlacZ- 2IE (Fig. 6).
Plasmide plF-n/ocZ-1.6 : les oligonucléotides 1 et 2 contenant un site Hpal et le premier exon du gène MLC1F ont été annelés et introduits dans le plasmide pBluescript digéré par les enzymes BamHI et Ncol, pour donner naissance au plasmide pIFBN. Le plasmide pIFBN a été digéré par les enzymes Hpal et BamHI et fusionné au
fragment BamHl-Hpal de 1,7 kb du plasmide pB3 contenant le promoteur et le premier exon du gène MLC 1 F (Daubas et al., 1988), pour donner naissance au plasmide p 1 FBN- 1.6 contenant le polynucléotide de 1,6 kb situé en amont du site de début de transcription du gène MLCIF. Le plasmide plFBN-1.6 a été digéré par l'enzyme KpnI et partiellement digéré par l'enzyme Ncol, puis fusionné à un fragment Ncol-Kpnl contenant la séquence tilacZ-SV40poly(A), afin de donner naissance au plasmide pl FnlacZ-1.6. Dans le plasmide p\V-n/acZ-\ .6, le codon ATG du gène nlacZ suit, en phase, la séquence codant pour les trois premiers acides aminés de MLC1F.
- Oligonucléotide 1 : (5'-GATCCGATCCTTCTTTTGTTAACCCATCCTTTTAATCAAAATGGCACC-3') - Oligonucléotide 2 : (5'-CATGGGTGCCATTTTGATTAAAAGGATGGGTTAACAAAAGAAGGATCG-3') Plasmides plF-nlacZ-1.6I et pIF-nlacZ-1.6IE : la séquence activatrice 3' de 260 pb a été sous-clonée, dans la même orientation que dans la séquence génomique, dans le plasmide pIF-nlacZ-1.6 préalablement partiellement digéré par l'enzyme BamHI, pour donner naissance au plasmide pl F-nlacZ-1.6I.
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Il devra aussi améliorer la "glissance " entre le métal déformé et l'outil, ce qui se traduit par de faibles valeurs des coefficients de friction statique et dynamique.
Si ces propriétés apparaissent comme étant le minimum exigible, il faut, en outre, que le lubrifiant soit conçu de telle manière qu'il adhère très fortement au métal à déformer, pour éviter le risque de rupture du film lubrifiant. On comprend, en effet, que si ce film lubrifiant était rompu par endroits, cela conduirait à se retrouver dans des conditions de frottement métal sur métal, se traduisant par des arrachements et par des soudures métal/outil, rendant l'opération impraticable.
Toutes ces propriétés réunies dans un lubrifiant destiné aux opérations de déformation plastique des métaux, permettraient la réalisation d'un travail dans des conditions de contraintes mécaniques, de pression, de glissement, de striction et de température, beaucoup moins pénalisantes que par les moyens actuellement connus. Cela devrait se traduire par une diminution des contraintes de remise à niveau de déformabilité acceptable des métaux à traiter, particulièrement des fréquences de traitements de recuits ou d'hypertrempes. Il s'ensuivrait un bilan économique significativement plus satisfaisant.
Or, à ce jour, pour réaliser les opérations de déformation plastique des métaux et alliages et pour obtenir une adhérence satisfaisante des lubrifiants utilisés, on doit procéder à des traitements chimiques des pièces à déformer, suivant une succession d'opérations distinctes.
Ces traitements conduisent à la formation d'un revêtement, dit de conversion, obtenu à partir de solutions acides telles que de phosphatation, ou d'oxalation dans le cas d'alliages inoxydables.
Les revêtements constitués par des phosphates, ou des oxalates métalliques, se présentent sous forme cristalline, bien adhérents, constituant un réseau cristallin à l'intérieur duquel les lubrifiants appliqués seront maintenus, par simple action physique, durant l'opération de déformation. On observe qu'en l'état, il n'y a pas de combinaison chimique entre le métal et le lubrifiant.
Ces traitements, quoique parfaitement maîtrisés, présentent un certain nombre d'inconvénients, principalement liés à leur impact sur l'environnement.
En cours d'application, il y a production de quantités très importantes d'effluents contaminés par des métaux lourds, par des phosphates, de nature acide, grands consommateurs d'eau et d'énergie.
Les solutions de traitement fortement acides occupent des volumes importants, de même qu'une emprise au sol non négligeable, avec de fortes contraintes de génie civil.
A titre d'exemple, on peut citer les documents suivants qui illustrent l'Etat de la Technique : # GB 1 122 404 qui décrit des produits dont certains peuvent être considérés comme proches de ceux qui sont utilisés avec l'invention, mais qui ne prévoit pas la présence d'un liant filmogène et qui n'explicite aucune application évoquant de près ou de loin le problème de la déformation plastique des métaux.
# EP 0 704 465 qui décrit un produit anticorrosion ne contenant aucun composant lubrifiant et, à ce titre étranger à la présente invention qui concerne, précisément, une composition contenant des lubrifiants favorisant la déformation plastique des métaux.