INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
IR (cm-1) : 3482 ; 2974 ; 2926 ; 2855 ; 1671 (V C=O lactame) ; 1500 ; 1302 HPLC (UV) : 98 % Exemple 13 5-(2-chlorophényl)-l)3,4,5,6,7,8,9-octahydro-l-(2-phényléthyl)-2H-pyrido[4',3T:4)5] thieno[2,3-e]-1,4-diazépine-2-one On solubilise le S-(2-chlorophényl)-1,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-2-oxo-1-(2-phényléthyl)-8H- pyrido[4',3':4,5]thiéno[2,3-e]-1,4-diazépine-8-carboxylate de t-butyle (0,5 g, 0,93 mmol) dans du dichlorométhane anhydre (10 ml). On ajoute l'acide trifluoroacétique (3 ml) et on agite à une température voisine de 20 C pendant deux heures. On évapore les solvants en reprenant plusieurs fois avec du toluène. Un mélange de solvant (éther-dichlorométhane-acétone 30-0,5-0,5 ml) est ajouté puis le mélange réactionnel est agité deux heures jusqu'à précipitation. Après filtration sur fritté, lavage à l'éther puis séchage sous vide, on obtient le produit souhaité sous forme d'une poudre jaune (0,34 g, 85 %) Point de fusion : 128-130 C HPLC MS : % à 270 nm (MH+ trouvée 438,1 ; théorie 438,14) Exemple 14 5-(2-chlorophényl)-1,2,3,4,5,6,7,9-octahydro-N-(4-méthoxy-2-nitro-phényl)-2-oxo-1- (2-pentyl)-8H-pyrido[4',3':4,5]thiéno[2,3-e]-1,4-diazépine-8-carbothioamide On ajoute de l'acide acétique (0,5 ml) sur 0,16 g de 5-(2-chlorophényl)- 1,2,3,6,7,9-hexahydro-N-(4-méthoxy-2-nitrophényl)-2-oxo-1-(2-pentyl)-8H-pyrido[4',3':4,5] thieno [2,3-e]-1,4-diazépine-8-carbothioamide (0,26 mmol). On ajoute à cette suspension jaune de l'éthanol (3,5 ml) puis on rajoute goutte à goutte de l'acide acétique (1 ml) et enfin du cyanoborohydrure de sodium (0,033 g, 0,52 mmol). Le mélange réactionnel est agité pendant une heure puis on chauffe une heure à 40 C jusqu' à solubilisation. On agite ensuite 2 heures à
22 C. Le milieu réactionnel est versé dans de l'eau glacée (30 ml). On agite, filtre puis lave abondamment à l'eau. On sèche sous vide sans chauffer et on obtient le produit souhaité sous forme d'une poudre orange (0,145 g, 83 %) Point de fusion : partir de 90 C HPLC MS : % à 240 nm (M trouvée 614,1 ; MH+ théorie 614,17) D'autres composés, obtenus selon des procédés analogues à ceux décrits dans les exemples 1 à 14, sont présentés ci-dessous. Les exemples 15 à 46 illustrent les composés dans lesquels A---B représente-C=N- ; les exemples 47 à 61 illustrent les composés dans lesquels A---B représente -C-N (R5)-.
Les radicaux RI ; R'1 ; Y ; Rz ; R'3a ; R3b ; X ; n ; R'4 ; R"4 ainsi que le point de fusion (en C complété éventuellement par l'état du composé (bl : base libre ; sel (TFA) ; sh : sel (HCI) ; * état amorphe) ont respectivement les significations suivantes : ex .15 : H ; - ; - ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; O ; 2 ; H ; Phe ; 84-88 (* bl) ; ex 16 : H ; - ; - ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; O ; 0 ; H ; phénylcarbonyle ; 132-134 (bl) ; ex 17 : H ; - ; - ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; O ; 0 ; H ; Phe ; 135-136 (bl) ; ex 18 : H ; - ; - ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; O ; 0 ; H ; cyclohexyle ; 189-190 (bl) ; ex 19 : H ; - ; - ; 2-CI-Phe H ; H ; O ; 4 ; H ; H ; 144-150 (bl) ; ex 20 : H ; - ; - ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; O ; 2 ; Phe ; Phe ; 104-108 (bl) ; ex 21 : H ; - ; - ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; O ; 2 ; Me ; Me ; 74-77 (* bl) ; ex 22 : H ; - ; - ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; O ; 0 ; H ; adamantyle ; 222-230 (sh) ; ex 23 : H ; - ; - ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; O ; 1 ; H ; pyridyle ; 82 (* bl) ; ex24:H;-;-;Phe;H;H;O; 1 ; H ; Phe ; >80 (* bl) ; ex 25 : H ; - ; - ; 4-Cl-Phe ; H ; H ; 0 ; 1 ; H ; Phe ;118-120 (bl) ; ex26:H;-;-;2-F-Phe;H;H;O; 1 ; H ; Phe ; >85 (* bl) ex27:H;-;-;4-F-Phe;H;H;O; 1 ; H ; Phe ; >70 (* bl) ex 28 : H ; - ; - ; 2-Me-Phe ; H ; H ; O ; 1 ; H ; Phe ; 80-82 (* bl) ; ex 29 : H ; - ; - ; t-butyle ; H ; H ; O ; 1 ; H ; Phe ; 160-162 (sh) ;
ex 30 : H ; - ; - ; 2-CI-Phe ; H ; H ; S ; 1 ; H ; Phe ; ex 31 : R'1-NH-C(Y)- ; 2-NO2-4-MeO-Phe ; S ; 2-CI-Phe; H; H; O ; 2; H; Phe ; 141-143 ; ex 32 : R'1-NH-C(Y)- ; 2-N02-4-MeO-Phe; S ; 2-CI-Phe ; H ; H ; O ; 0 ; H ; phénylcarbonyle ; 182-184 ; ex 33 : R'l-NH-C(Y)- 2-N02-4-MeO-Phe; S; 2-Cl-Phe ; H; H; 0; 0; H; Phe ; 190-192 ; ex 34 : R'rNH-C(Y)- ; 2-N02-4-MeO-Phe ; S ; 2-Cl-Phe H; H; 0; 4; H; H ; 158-160 ; ex 35 : R'rNH-C(Y)- ; 2-N02-4-MeO-Phe ; S ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; 0; 0 ; H ; cyclohexyle ; 183-184 ; ex 36 : R'l-NH-C(Y)- ; 2-N02-4-MeO-Phe ; S ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; 0; 2 ; Phe ; Phe ; 156-158 ; ex 37 : R', -NH-C(Y)- ; 2-NO2-4-MeO-Phe ; S ; 2-CI-Phe ; H ; H ; O ; 2 ; Me ; Me ; 149-154 ; ex 38 : R'1-NH-C(Y)- ; 2-N02-4-MeO-Phe ; S ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; 0; 0 ; H ; adamantyle ; 210-214 ; ex 39 : R'i-NH-C(Y)- ; 2-N02-4-MeO-Phe ; S ; 2-Cl-Phe ; H ; H ; 0; 1 ; H ; pyridyle ; 131 ; ex 40 : R'l-NH-C(Y)- ; 2-N02-4-MeO-Phe ; S ; Phe ; H ; H ; 0; 1 ; H ; Phe ; 148-150 ; ex 41 : R'!-NH-C(Y)- ; 2-N02-4-MeO-Phe ; S ; 4-Cl-Phe ; H ; H ; 0 ; 1 ; H ; Phe ; >130 (*) ex 42 : R'rNH-C(Y)- ; 2-N02-4-MeO-Phe ; S ; 2-F-Phe ; H ; H ; 0 ; 1 ; H ; Phe ; >122 (*) ; ex 43: R'i-NH-C(Y)- ; 2-N02-4-MeO-Phe; S; 4-F-Phe ; H; H; 0; 1; H; Phe; 108-110 ; ex 44 : R'rNH-C(Y)- ; 2-F3C-Phe ; O ; 4-F-Phe ; H ; H ; O ; 1 ; H ; Phe ; >85 (*) ;
Une manière d'obtenir cela est de faire en sorte que les états fondamentaux des bandes de valence et de conduction de l'hétérostructure soient dans la couche de puits quantique actif.
Le troisième mode de réalisation préféré de l'invention, qui est schématiquement illustré par la figure 3, est essentiellement un prolongement du deuxième et a le même principe de fonctionnement.
La différence entre les hétérostructures des figures 2 et 3 réside dans le fait que celle de la figure 3 contient plus d'une barrière piézoélectrique et plus d'un puits quantique de collection de l'un et l'autre côté du puits quantique actif.
Dans l'exemple de la figure 3 on trouve successivement, de gauche à droite, la couche de confinement C2, une couche de puits quantique de collection CQW11, une couche de barrière piézoélectrique PB11, une autre couche de puits quantique de collection CQW12, une autre couche de barrière piézoélectrique PB12, la couche de puits quantique actif AQW puis une couche de barrière piézoélectrique PB21, une couche de puits quantique de collection CQW21, une autre couche de barrière piézoélectrique PB22, une autre couche de puits quantique de collection CQW22 et la couche de confinement C3. Le substrat et les autres couches de confinement ne sont pas représentés.
A titre purement indicatif et nullement limitatif on a également indiqué sur la figure 3 des exemples de valeurs numériques pour les épaisseurs z des différentes couches (exprimées en nanomètres), en prenant l'origine de l'axe z au milieu de la couche AQW, ainsi que pour les énergies E relatives à la bande de valence et à la bande de conduction de l'hétérostructure (exprimées en meV).
On précise que les flèches FI de la figure 2 indiquent le processus de séparation des porteurs dans les barrières piézo électriques. Il en est de même pour la figure 3.
Les flèches F2 de cette figure 3 indiquent, quant à elles, le processus de transfert, par effet tunnel, des porteurs de charge, des puits de collection au puits actif.
L'amélioration résultant de l'hétérostructure de la figure 3 par rapport à celle de la figure 2 réside dans le fait que l'on réduit l'épaisseur de chaque couche de barrière piézoélectrique tout en conservant, pour l'ensemble des couches de barrières piézoélectriques, une épaisseur totale suffisamment grande pour avoir une séparation efficace des charges. De ce fait on augmente fortement la probabilité d'effet tunnel des porteurs des puits quantiques de collection.
Il est en effet préférable et plus simple de commander les temps d'échappement des porteurs des puits quantiques de collection par un processus indépendant de la température, à savoir l'effet tunnel, au lieu de les commander par un processus dépendant fortement de la température, à savoir l'émission thermoionique.
Ajoutons que dans le cas des figures 2 et 3, on a supposé l'introduction des porteurs de charge homogène dans la zone active. Ainsi, le côté, par rapport au puits actif, où s'accumulent les électrons dépend principalement du sens du champ piézo-électrique des barrières (côté gauche dans les exemples des figures 2 et 3). Donc, dans le cas d'une diode laser, il n' y a pas à spécifier le côté (N) où sont injectés les électrons ni le côté (P) où sont injectés les trous.
Les couches de barrières piézoélectriques et les couches de puits quantiques de collection de l'hétérostructure de la figure 3 peuvent être faites de semiconducteurs légèrement différents.
Dans l'exemple de la figure 3, la largeur de bande interdite des puits quantiques de collection CQW11 et CQW22 a été prise supérieure à celle des puits quantiques de collection CQW12 et CQW21 afin d'obtenir des conditions énergétiques favorables pour l'effet tunnel.
Comme on l'a vu plus haut, à part le cas où le spectre du rayonnement laser est commandé directement par le courant injecté dans la diode laser, on peut considérer des applications où il est intéressant de rendre ce courant constant et de commander la modulation de longueur #0 par un faisceau laser auxiliaire qui peut être pulsé ou continu. Ceci est possible pour des diodes construites selon l'enseignement des deuxième et troisième modes de réalisation particuliers.
Les conditions que ce faisceau laser auxiliaire doit remplir sont les suivantes :
(a) l'énergie des photons de ce faisceau auxiliaire doit être supérieure à la largeur de bande interdite des couches de barrières piézoélectriques et (b) l'intensité de ce faisceau doit être suffisamment élevée pour induire optiquement les charges de l'hétérostructure.
On précise que ce faisceau laser auxiliaire est dirigé sur la zone active responsable de l'émission laser et absorbé par cette zone.
Le promoteur MPrll08 (Fig. IV) a été créé en fusionnant la séquence de 72 pb, s'étendant de la position-641 pb à la position-569 pb de petE prom (SEQ. ID01) portant les motifs "as-1 like" et "nos enhancer like" à la séquence promotrice minimale de 187 pb de MPrl098 (position-128 à +59 pb, SEQ.ID04) par la technique de lb-PCR.
L'ADN simple brin continu a été formé à l'aide des oligodésoxynucléotides "sens" suivants : - SI = 5' TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAG AGGATCCCCG 3' (SEQ. ID12) - S2 = 5' CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTC TCTCTTTCGA 3' (SEQ.ID13) - S3 = 5' CATAATTTGAACACTCTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCACATATTCTTCCACACAT CTTAGCCA 3' (SEQ. ID14) - S4 = 5' GGAATCTGCAGTTGAACACGTACAAACTTACGTCATTTGTGCATGCAGAAGCATAGAGCT GAGCACACAATT 3' (SEQ.ID15) Cent pmol des oligodésoxynucléotides SI, S2 et S3 ont été phosphorylés en 5' par l'action de 15 unités de kinase (Amersham) en présence de 5 l du tampon kinase 10X (Amersham) et 500 pmol d'ATP (Sigma), pendant 30 minutes à 37 C. Les oligodésoxynucléotides phosphorylés ont été purifiés par
extraction par un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25: 24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24:1 v/v), avant d'être précipités par 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 20 min puis centrifugés à 16060 g pendant 30 min. Les oligodésoxynucléotides précipités ont été lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis remis en suspension dans de l'eau à une concentration de 10 pmol/pl.
Pour relier les oligodésoxynucléotides "sens", les oligodésoxynucléotides "guides" suivants ont été utilisés: - Gl= 5' TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA 3' (SEQ.ID18) - G2= 5' GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG 3' (SEQ.ID19) - G3= 5' CAGAGTGTTCAAATTATGAATTGTGTGCTCAGC 3' (SEQ. ID20) Pour réaliser la réaction LCR, 10 pmol des oligodésoxynucléotides sens SI phosphorylé, S2 phosphorylé, S3 phosphorylé et S4 ont été ligaturés en présence de 10 pmol des oligodésoxynucléotides guides Gl, G2 et G3,5 l du tampon ADN ligase Taq 10X (New England Biolabs) et 40 unités d'ADN Ligase Taq (New England Biolabs). La réaction de ligation a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer, Norwalk, USA). Elle est constituée d'un cycle d'l min à 94 C, et de 8 cycles identiques constitués chacun de la succession des étapes suivantes : 1 min à 65 C, 1 min à 57 C, 1 min à 52 C, 1 min à 48 C, 1 min à 43 C, et enfin 10 min à 37 C.
Puis, le mélange réactionnel de ligation a été purifié sur colonne Qiaquick selon les recommandations du fournisseur.
Enfin, l'amplification PCR de l'ADN simple brin obtenu a été réalisée dans un thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 en présence de 100 pmol de chacune des amorces oligodésoxynucléotidiques 5' GGAATCTGCAGTTGAACACGT 3' et 5 CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3', 50 nmol de chacun des dNTP, 10 l de tampon ADN polymérase Vent 10X (New England Biolabs), et 2 unités d'ADN polymérase Vent (New England Biolabs). L'ADN a été dénaturé pendant 5 min à 94 C, soumis à 25 cycles constitués chacun de 30 sec de dénaturation à 95 C, de 30 sec d'hybridation
à 56 C, et d'1 min d'élongation à 72 C, puis l'élongation à 72 C a été poursuivie pendant 5 min.
Les fragments d'ADN du milieu réactionnel ont été digérés par 20 unités de BamHI pendant 45 min à 37 C, puis par 20 unités de PstI pendant 1 h à 37 C, et enfin purifiés sur colonne Qiaquick. Ils ont été insérés dans le plasmide pGEM3Z-petE/IV2 digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C, puis par PstI pendant 1 h à 37 C, soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, purifié sur colonne d'affinité Qiaquick, déphosphorylé pendant 1 h à 37 C en présence de 12 l de "tampon 3" 10X (New England Biolabs) et de 5000 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (CIP, New England Biolabs), et enfin purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Pour réaliser la ligation, 25 ng de du plasmide traité comme décrit ci-dessus ont été mis en présence de 100 ng des fragments d'ADN obtenus par PCR, en présence de 1,2 l du tampon ADN ligase T4 10X (New England Biolabs) et 400 unités d'enzyme ADN ligase T4 (New England Biolabs) pendant 1 nuit à 18 C. Des bactéries Escherichia coli DH5a, rendues préalablement compétentes, ont été transformées par la moitié du mélange réactionnel de ligation. l'ADN des clones obtenus, sélectionnés sur milieu LB supplémenté en ampicilline (50 mg/1), a été extrait selon la méthode de lyse alcaline, et analysé par digestions enzymatiques. Deux plasmides pMRT1108 et pMRT1109 résultants ont été séquences. Le plasmide pMRT1108 contient le promoteur attendu (SEQ.ID05), tandis que le plasmide pMRT1109 est porteur du promoteur MPrll09 (SEQ. ID06) qui diffère de MPrll08 par une délétion de 33 pb dans la région 5' non traduite, 11 pb en aval du point +1 (Fig. IV).
3. 2. Construction du promoteur MPr1110.
Le promoteur MPrlllO a été créé en insérant à la position-99 pb de MPrl098 (SEQ.ID04), un motif de 18 pb contenant une boîte "G" (s'étendant des positions - 204 pb à - 186 pb de petE prom, SEQ.ID01) et en fusionnant à ce promoteur minimal modifié une séquence de 44 pb du promoteur de l'ARN 35S du virus de la mosaïque du choux fleur (CaMV) contenant les motifs as-2 et as-1
(Lam, 1989 ; et al., 1989) (Fig. IV). MPrlllO a été synthétisé par la technique de lb-PCR.
L'ADN simple brin continu a été formé à l'aide des oligodésoxynucléotides "sens" suivants : - SI = 5' TTCCCTTCAAACACATACAAATTCAGTAGAGAAGAAACTCATTACTCTTGAGAAACCTAG AGGATCCCCG 3' (SEQ. ID12) - S2 = 5' CACAAAAACCCAATCCACATCTTTATCATCCATTCTATAAAAAATCACCTTCTGTGTGTC TCTCTTTCGA 3' (SEQ. ID13) - S5 = 5' CTGTGGCACATCTACATTATCTAAATCTAAGCCACGTCGGAGGATAACATATTCTTCCAC ACATCTTAGCCA 3' (SEQ. ID16) - S6 = 5' CATGCTGCAGACTAGTGGATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGGATGACGCATGCC ACT 3' (SEQ. ID17) Cent pmol des oligodésoxynucléotides Sl, S2 et S5 ont été phosphorylés en 5' grâce à l'action de 15 unités de kinase (Amersham) en présence de 5 ul du tampon kinase 10X (Amersham) et 500 pmol d'ATP (Sigma), pendant 30 min à 37 C. Les oligodésoxynucléotides phosphorylés ont été purifiés par extraction par un volume de phénol, puis un volume de phénol : chloroforme : alcool isoamylique (25: 24:1 v/v/v) et enfin un volume de chloroforme : alcool isoamylique (24:1 v/v), avant d'être précipités par 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 20 min puis centrifugés à 16060 g pendant 30 min. Les oligodésoxynucléotides précipités ont été lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis remis en suspension dans de l'eau à une concentration de 10 pmol/pl.
Pour relier les oligodésoxynucléotides "sens", les oligodésoxynucléotides "guides" suivants ont été utilisés: - Gl= 5' TGTGTTTGAAGGGAATCGAAAGAGAGACACA 3' (SEQ.ID19) - G2= 5' GATTGGGTTTTTGTGTGGCTAAGATGTGTG 3' (SEQ.ID20) - G4= 5' TGTAGATGTGCCACAGAGTGGCATGCGT 3' (SEQ. ID22) Pour réaliser la réaction LCR, 10 pmol des
oligodésoxynucléotides sens SI phosphorylé, S2 phosphorylé, S5 phosphorylé et S6 ont été ligaturés en présence de 10 pmol des oligodésoxynucléotides guides Gl, G2 et G4,5 l du tampon ADN ligase Taq 10X et 40 unités d'ADN Ligase Taq (New England Biolabs). La réaction de ligation a été réalisée dans le thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 (Perkin Elmer, Norwalk, USA). Elle est constituée d'un cycle d'1 min à 94 C, et de 8 cycles identiques constitués chacun de la succession des étapes suivantes : 1 min à 65 C, 1 min à 57 C, 1 min à 52 C, 1 min à 48 C, 1 min à 43 C, et enfin 10 min à 37 C. Puis, le mélange réactionnel de ligation a été purifié sur colonne Qiaquick selon les recommandations du fournisseur.
Enfin, l'amplification PCR de l'ADN simple brin obtenu a été réalisée dans un thermocycleur GeneAmp PCR System 9700 en présence de 100 pmol de chacune des amorces oligodésoxynucléotidiques 5' CATGCTGCAGACTAGTGGATT 3', et 5' CGGGGATCCTCTAGGTTTCT 3', de 50 nmol de chacun des dNTP, de 10 l de tampon ADN polymérase Vent 10X (New England Biolabs), et de 2 unités d'ADN polymérase Vent (New England Biolabs). l'ADN a été dénaturé pendant 5 min à 94 C, soumis à 25 cycles constitués chacun de 30 sec de dénaturation à 95 C, de 30 sec d'hybridation à 56 C, et d'1 min d'élongation à 72 C, puis l'élongation à 72 C a été poursuivie pendant 5 min.
Les fragments d'ADN du milieu réactionnel ont été digérés par 20 unités de BamHI pendant 45 min à 37 C puis par 20 unités de PstI pendant 1 h à 37 C, et enfin purifiés sur colonne Qiaquick. Ils ont été insérés dans le plasmide pGem3Z-petE /IV2 digéré par BamHI pendant 1 h à 37 C, puis par PstI pendant 1 h à 37 C, soumis à l'électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, purifié sur colonne d'affinité Qiaquick, déphosphorylé pendant 1 h à 37 C en présence de 12 l de "tampon 3" 10X (New England Biolabs) et de 5000 unités de phosphatase alcaline d'intestin de veau (CIP, New England Biolabs), et enfin purifié sur colonne d'affinité Qiaquick. Pour réaliser la ligation, 25 ng de plasmide traité comme décrit ci-dessus ont été mis en présence de 100 ng des
semaines après leur acclimatation en serre. Pour chaque plante, trois échantillons de feuille ont été prélevés, sur une feuille "âgée" (située au rang foliaire basal), sur une feuille mature (située au rang foliaire médian), et sur une feuille jeune (située à l'apex).
Chaque échantillon a été broyé dans l'azote liquide dans un mortier, puis la poudre a été resuspendue dans du tampon d'extraction (Tris Phosphate 25 mM pH 7,8, Dithiothréitol 2 mM, acide 1,2-diaminocyclohexane, N,N,N',N'-tétracétique 2 mM, glycérol 10 %, Triton X100 1 %) à raison d'1 ml de tampon pour 200 mg de tissu. Le mélange a été homogénéisé puis incubé pendant 15 min dans la glace avant d'être clarifié par centrifugation pendant 5 min à 16060 g.
L'activité GUS a été mesurée sur 20 l d'extrait brut clarifié de feuille à l'aide du kit de détection "GUS-Light chemiluminescent reporter gene assay" (Tropix Inc., Bedford, USA) selon les recommandations du fournisseur. La mesure de l'émission de lumière à été effectuée à l'aide d'un luminomètre Lumat LB 9507 (EGG-Berthold, Bad Wildbad, Allemagne).
La quantité de protéine totales présentes dans l'extrait brut a été mesurée selon la technique de Bradford (1976), en utilisant le réactif "Bio-Rad protein assay" (Bio-Rad, München, Allemagne).
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(ii) Les éthers allyliques d'alcools gras formant les motifs hydrophobes des polymères amphiphiles anioniques de la présente invention correspondent à la formule (I) CH2=CR'CH2-O-Bn-R dans laquelle
R' représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, B représente un groupe éthylèneoxy, n est un nombre entier valant entre 0 et 100, R représente un groupe hydrocarboné choisi parmi les restes alkyle, arylalkyle, aryle, alkylaryle ou cycloalkyle comportant de 8 à 30 atomes de carbone, de préférence de 10 à 24 atomes de carbone, et plus particulièrement de 12 à 18 atomes de carbone.
Des polymères amphiphiles anioniques du type décrit ci-dessus sont décrits par exemple dans les brevets US-3 915 921 et US-4 509 949 (copolymères d'acide (éth/méth) acrylique et de (éth/méth)acrylates d'alkyle en CIO-30), ou dans le brevet EP-0 216 479 B2 (copolymères d'acide (éth/méth)acrylique et d'éthers allyliques d'alcools gras).
On peut citer à titre d'exemples de polymères préférés : - les polymères réticulés d'acide acrylique et d'acrylate d'alkyle en CIO-30, tels que les polymères commercialisés sous les dénominations PEMULEN TRI, PEMULEN TR2 et CARBOPOL 1382 par la société GOODRICH, et - le polymère réticulé d'acide acrylique et de méthacrylate d'alkyle en CIO-30, tel que le CARBOPOL ETD 2020 commercialisé par la société GOODRICH.
Ces polymères amphiphiles non ioniques et/ ou anioniques comportant au moins une chaîne grasse sont utilisés à raison de 0,01à 10 % en poids, de préférence à raison de 0,1à 5 % en poids par rapport à la compo-
sition décolorante aqueuse.
Comme indiqué ci-dessus, la composition décolorante aqueuse contient également au moins un agent alcalin, au moins un sel peroxygéné, au moins un solvant hydrosoluble et du peroxyde d'hydrogène.
Ledit agent alcalin est choisi parmi l'ammoniaque et les amines organiques telles que la mono-, di- ou triéthanolamine, le 2-amino-2méthyl-1-propanol, le diaminopropane, les hydroxyalkylamines et les éthylènediamines oxyéthylénées et/ou oxypropylénées.
Les sels peroxygénés sont choisis parmi les persulfates, les percarbonates et les perborates d'ammonium ou de métaux alcalins.
Les compositions de l'invention contiennent de 2 % à 20 % en poids et de préférence de 4 à 15 % en poids de sel peroxygéné.
Au sens de la présente invention, on entend par "solvants hydrosolubles" des solvants solubles à plus de 5 % en poids dans l'eau à 25 C.
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