INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le dosage des protéines est effectué par la méthode de Lowry et al. (1951) en utilisant l'albumine de sérum bovin comme standard. Le dosage de l'activité enzymatique de l'enzyme malique est réalisé par la méthode de Mori et Shiio (1987) Le dosage de l'activité enzymatique de la glutamate deshydrogénase est réalisé par la méthode de Meers et al (1970).
Les dosages enzymatiques effectués sur une préparation protéique de la souche 2262 transformée par pMF22 prouvent que l'enzyme malique y est bien surexprimé (Tableau III) Tableau III: activités spécifiques en nmol/min/mg protéines
Souches Activité spécifique enzyme malique ATCC 17965 27,7 C glutamicum2262 6,3 C glutamicum2262 (pMF22) 300
Le gène malE cloné codant l'enzyme malique de C. glutamicum ATCC 17965, mis sous contrôle du promoteur Ptrc et porté par le plasmide pMF22 est surexprimé d'un facteur 50 chez C. glutamicum 2262.
Concernant, les cylindres y, l'ouverture des soupapes associées à chacun des cylindres s'opère classiquement pendant les deux tours vilebrequin (ou 720 ) que dure le cycle moteur.
L'ouverture des soupapes d'admission 7 des cylindres y est opérée principalement pendant le premier temps moteur dit"admission"s'opérant lors de la première course descendante du piston (de 0 à 180 ). Les instants de début d'ouverture et de fermeture qui délimitent la durée d'ouverture des soupapes d'admission, se positionnent avec un calage précis, adapté au point de fonctionnement du moteur, par rapport respectivement au Point Mort Haut (0 ) et au point Mort Bas (180 ). Ce calage tient compte de la compensation de puissance à fournir, liée à la déconnexion du ou des cylindres a, de façon à maintenir les memes performances du moteur.
L'ouverture des soupapes d'échappement 8 des cylindres y est opérée principalement pendant le quatrième temps moteur dit"échappement"pendant la course ascendante du piston (de 540 à 720 ). Cette phase suit les temps dits"compression" (de 180 à 360 ) et "détente" (de 360 à 540 ) pendant lesquels les soupapes demeurent fermées. Les instants de début d'ouverture et de fermeture qui délimitent la durée d'ouverture des soupapes d'échappement, se positionnent également avec un calage précis, adapté au point de fonctionnement du moteur, par rapport respectivement au Point Mort Bas (540 ) et au point Mort Haut (720 ).
Concernant le ou les cylindres du groupe a, ceuxci fonctionnent comme une pompe selon un cycle deux temps : ils aspirent le mélange carburé présent à l'admission dans un premier temps et le refoule à l'échappement dans un second temps.
La difficulté est toutefois d'arriver à admettre les faibles quantité de mélange carburé requis pour les réactions exothermiques de post-combustion. En effet, les distributions non mécaniques connues à ce jour, n'autorisent pas des durées d'ouverture aussi courtes que voulues. Il existe en effet, une durée minimale d'ouverture de l'ordre de quelques millisecondes. Cette durée minimale d'ouverture correspond donc, suivant le régime de fonctionnement du moteur, à un angle d'ouverture qui peut dépasser plusieurs dizaines de degrés vilebrequin et donc à une quantité de gaz admis relativement importante.
Pour obtenir, le dosage souhaité et ce, quelle que soit la durée minimale d'ouverture des soupapes d'admission 7 imposée par la technologie des actuateurs, l'ouverture des soupapes d'admission 7 des cylindres a est, selon l'invention, étalée sur les trois premiers demi-tours vilebrequin. Les deux premiers demi-tours (de 0 à 360 ) Xont pour effet, respectivement, d'opérer le remplissage en air du cylindre pendant la course descendante du piston (0 -180 ), puis de refouler à l'admission tout cet air lors de la course ascendante suivante (180 -360 ).
Ces deux premiers demi-tours sont donc globalement sans incidence sur la quantité finale de mélange carburé admise. Seule la plage d'ouverture s'étalant pendant le troisième demi-tour, c'est-à-dire lors de la seconde course descendante du piston (de 360 à 540 ), affecte réellement le niveau de remplissage en mélange carburé des cylindres a qui sera effectivement refoulé à l'échappement, lors de l'ouverture des soupapes d'échappement.
Ainsi, en ouvrant les soupapes d'admission des cylindres a sur plus de 360 d'angle vilebrequin, il devient possible de doser avec précision la quantité de mélange carburé admise et ce, quel que soit le temps minimale d'ouverture des soupapes.
Considérons en effet, un point de fonctionnement donné pour lequel, la plage d'ouverture minimale (liée à la technologie des actuateurs) soit de 30 et que la quantité de mélange carburé devant tre admise (pour tre transférée ensuite à l'échappement) corresponde à une plage d'ouverture de 15 , et bien suivant l'invention, cette quantité est obtenue grâce à une plage d'ouverture de 375 , les premiers 360'6tant sans effet sur le remplissage du cylindre, seuls comptant les derniers 15 .
Les instants de début d'ouverture et de fermeture qui délimitent la durée d'ouverture des soupapes d'admission, se positionnent avec un calage précis, adapté au point de fonctionnement du moteur, par rapport respectivement aux deux Point Mort Haut consécutifs.
Compte tenu de cette ouverture des soupapes d'admission s'étalant sur trois demi-tours moteur, l'injection du carburant nécessaire à la préparation du mélange carburé devant tre injecté à l'échappement, est opérée de façon séquentielle phasée en fin de phase admission c'est-à-dire au voisinage du second Point Mort Haut et ce pour éviter tout refoulement de carburant à l'admission.
Le dosage du carburant est déterminé pour que la richesse du mélange carburé permette d'obtenir la réaction la plus exothermique possible et générant le moins de substances polluantes possible. Cette richesse des cylindres de groupe a est par exemple réglée à la stoechiométrie.
L'ouverture des soupapes d'échappement 8 des cylindres a est opérée classiquement pendant le quatrième demi-tour moteur correspondant à la seconde course ascendante du piston (540 -720 ). Les instants de début d'ouverture et de fermeture qui délimitent la durée d'ouverture des soupapes d'échappement, se positionnent également avec un calage précis, adapté au point de fonctionnement du moteur, par rapport respectivement au Point Mort Bas et au point Mort Haut. Pendant cette phase d'ouverture des soupapes d'échappement, le mélange carburé remplissant le cylindre est refoulé à l'échappement où il va se mélanger avec le flux des gaz d'échappement issus des autres cylindres et réagir dans des réactions exothermiques au niveau du pot catalytique.
De préférence toutefois, l'ouverture des soupapes d'échappement des cylindres a est effectué avec une avance à l'ouverture relativement importante (début d'ouverture des soupapes d'échappement opérée avant le Point Mort Bas (540 ) mais après seulement la fermeture des soupapes d'admission). Cette ouverture anticipée des soupapes d'échappement permet d'admettre une quantité prédéterminée de gaz d'échappement et de les mélanger au mélange carburé admis, ce qui augmente la température et améliore la préparation du mélange carburé et donc favorise sa combustion ultérieure.
En se reportant à la figure 4, on a représenté la seconde variante selon laquelle le mélange carburé transféré à l'échappement est allumé par l'intermédiaire de la bougie d'allumage.
Etant donné que le mélange carburé est allumé, il n'est plus nécessaire d'attendre que les gaz d'échappement soient suffisamment chauds pour déclencher la réaction de post combustion. L'étape IME peut donc tre déclenchée après une période tl réduite, correspondant par exemple à un simple seuil temporel.
Rf (dichlorométhane 70 / méthanol 30) = 0,65.
RMN 1H (chloroforme-d), 8 : 2,43 (t, 2H, 2H-4', J=6,9Hz) ; 1,97 (t, 2H, 2H-2, J=7,2Hz) ; 1,42 (m, 2H, 2H-3) ; 1,14 (s, 9H, 9H-2') .
RMN 13C (chloroforme-d), S : 172,91 (C-l) ; 80,13 (C-l') ; 41,53 (C-4) ; 33,00 (C-2) ; 29,04 (3C-2') ; 28,10 (C-3).
Spectre de masse (matrice GT) : FAB+ : 160 (M-H)+ ; 104 (M-[C(CH3)3)]+2H); 57 (C(CH3)3)+.
FAB- : 158 (M-H)' LR. (dichlorométhane, cm-'), v : 2977 ; 2936 (C sp2 et sp3) ; 2868 ; 2253 ; 1725 (C=0) ; 1368; 1158; 938; 735.
EXEMPLE XVIII 3'-azido-3'-désoxy-5'-O-(4"'-amino-1 "'-butanoate de tert-butyl)-4"'-carbonyll thymidine 18 : A une solution d'AZT (60mg ; 0,225 mmol ; eq) dans du DMF (3ml), sous agitation magnétique et azote, on ajoute du N,N carbonyldümidazole (38mg, 0,236 mmol ; 1,05eq). Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 2h, puis on ajoute par l'ampoule à brome le composé 17 (37,5mg ; 0,236mmol ; 1,05eq) dans du DMF anhydre (lml). Après 15h à température ambiante, le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est dilué dans 5ml de CH2Cl2 lavé avec 2x3ml d'une solution aqueuse d'acide citrique à 5 % puis avec 2x3ml d'une solution aqueuse de NaHC03 à 5% et 2x3ml d'H20. Les phases aqueuses sont extraites avec 2x5ml de CH2Cl2. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2S04, filtrées et évaporées sous pression réduite. Le résidu est purifié sur plaque préparative d'imm d'épaisseur (éluant : hexane 15% dans de l'AcOEt ) pour conduire au composé 18 (66 mg ; 65%).
Rf (dichlorométhane 90 / méthanol 10) = 0,47.
RMN 1H (chloroforme-d), # : 9,53 (s, 1H, H-3) ; 7,16 (d, 1H, H-6, J=l,lHz) ; 6,03 (t, 1H, H-l', J=6,4Hz) ; 5,38 (t, 1H, NH-6' carbamate, J=5,6Hz) ; 4,3-4,1 (m,3H, H-5', 5", H- 3') ; 3,99 (m, 1H, H-4') ; 3,16 (q, 2H, 2H-7', J=6,5Hz) ; 2,5-2,3 (m, 2H, H-2',2") ; 2,21 (t, 2H, 2H-9', J=7,IHz) ; 1,84 (s,3H, CH3 en position 5) ; 1,72(m, 2H, 2H-8') ; 1,35 (s, 9H, 9H- 12').
RMN I3C (chloroforme-d), 8 : 172,82 (C-10') ; 164,00 (C-4) ; 155,87 (C-6') ; 150,40 (C-2) ; 135,64 (C-6) ; 111,35 (C-5) ; 85,79 (C-l') ; 82,32 (C-4') ; 80,86 (C-11') ; 63,94 (C-5') ; 60,95 (C-3') ; 40,86 (C-7') ; 37,61 (C-2') ; 32,96 (C-9') ; 28,19 (3C-12') ; 25,11 (C-8') ; 12,74 (CH3 en position 5).
Spectre de masse (matrice GT) : FAB+ : 397 (M-[C(CH3)3)]+2H)+ ; 127 (B+2H)+ ; 57 (C(CH3)3)+.
FAB- : 451 (M-H)- ; 903 (2M-H)- ; 125 (B)-.
I.R. (dichlorométhane, cm-'), v : 3329 (NH) ; 2968 (C sp2 et sp3) ; 2103 (N3) ; 1705 (C=0) ; 1258 ; 738.
EXEMPLE XIX 3'-azido-3'-désoxy-5'-O-(4"'-amino-1"'-butanoyl)-4"'-carbonyl)thymidine 19 A une solution de 18 (40 mg ; 0,088mmol ; leq) dans CH2CI2 (2ml), sous agitation magnétique et azote, on ajoute à la seringue du TFA (170ul ; 2,21 mmol ; 25eq). Après 14h à température ambiante, le mélange réactionnel est évaporé sous pression réduite. Le résidu obtenu est dilué dans 2ml de CH2C12, puis lavé avec 2x2ml d'une solution aqueuse d'acide citrique à 5%. Cette phase aqueuse est extraite avec 2x2ml de CH2Cl2. Les phases organiques réunies sont séchées sur Na2S04, filtrées et évaporées sous pression réduite pour conduire au composé 19 (33mg ; 94%).
Rf (dichlorométhane 90 / méthanol 10) = 0,22.
RMN 1H (méthanol-d4), 8 : 7,32 (s, 1H, H-6) ; 6,05 (t, lI H-l', J=6,7Hz) ; 4,3-4, l(m, 3H, H-5', 5", H-3') ; 3,98 (q, 1H, H-4', J=4,OHz) ; 3,08 (m, 2H, 2H-7') ; 2,4-2,3(m, 2H, H-2', 2") ; 2,25 (t, 2H, 2H-9', J=7,4Hz) ; 1,81 (s, 3H, CH3 en position 5) ; 1,70 (m, 2H, 2h-8').
RMN13C (méthanol-d4), # : 177,21 (C-10') ; 161,07 (C-4) ; 154,95 (C-6') ; 150,32 (C-2) ; 136,20 (C-6) ; 110,87 (C-5) ; 85,51 (C-l') ; 83,05 (C-4') ; 63,37 (C-5') ; 61,12 (C-3') ; 40,12 (C-7') ; 37,60 (C-2') ; 33,02 (C-9') ; 25,92 (C-8') ; 12,50 (CH3 en position 5).
L'invention a également pour objet une composition vaccinale à usage humain comprenant au moins un antigène vaccinal caractérisée en ce qu'elle comprend en outre au moins un oligonucléotide capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire possédant au moins une séquence 5' T T N1 N2 T T 3' dans laquelle T signifie Thymine et, N1 et N2 peuvent chacun représenter l'Adénine, la Thymine, la Cytosine ou la Guanine, l'oligonucléotide étant dépourvu de séquence dinucléotidique CG dans laquelle la Cytosine C ne serait pas méthylée.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, en référence aux figures 1 à 11qui illustrent les résultats obtenus lors des tests décrits aux exemples 2 à 7 En particulier, les Figures 1 et 2 indiquent le nombre de Coups par Minutes obtenus dans le test de l'Exemple .
Les Figures 3 et 5 indiquent le pourcentage de cellules CD20+ exprimant le marqueur CD25, pour les oligonucléotides obtenus selon l'exemple 1. De même, les Figures 4 et 6 indiquent le pourcentage de cellules CD20+ exprimant le marqueur CD86.
La Figure 7 indique le nombre de Coups par Minute obtenus dans le test de l'exemple 4.
La Figure 8 indique le pourcentage de cellules CD20+ exprimant le marqueur CD25, pour les oligonucléotides obtenus selon l'exemple 4 De même, la Figure 9 indique le pourcentage de cellules CD20+ exprimant le marqueur CD86.
La Figure 10 indique le nombre de spots mesurés pour la sécrétion d'Interféron y par des cellules stimulées en présence des oligonucléotides ayant les séquences 9 à 12 décrites à l'Exemple 4 La Figure 11 indique le nombre de spots mesurés pour la sécrétion d'IL 10 par des cellules stimulées en présence des oligonucléotides ayant les séquences 9 à 12 décrites à l' Exemple4.
Par oligonucléotide au sens de la présente invention, on entend un polynucléotide comprenant au moins 6 nucléotides. En effet, contrairement à l'enseignement de l'article intitulé "CpG motifs in bacterial DNA trigger direct Bcell activation", Krieg et al., Nature 1995, on a remarqué qu'il n'était pas nécessaire que l'oligonucléotide ait au moins 8 nucléotides. Par contre, la limite supérieure de la taille des oligonucléotides n'est pas vraiment déterminée. On peut cependant noter que, plus l'oligonucléotide sera long, plus sa purification sera difficile à effectuer lors des étapes de synthèse , et plus le prix de revient en sera élevé. D'autre part, il est probable qu'un oligonucléotide de grande longueur aura plus de difficultés à pénétrer dans les cellules. Aussi, pour les besoins de la présente invention, on considère qu'une limitation de la taille de l'oligonucléotide à 100 nucléotides est appropriée. Cet oligonucléotide est de préférence un oligonucléotide simple brin; il peut s'agir d'un oligodésoxyribonucléotide ou d'un oligoribonucléotide. On a obtenu de particulièrement bons résultats en utilisant un oligodésoxyribonucléotide. Les oligonucléotides convenant aux fins de l'invention peuvent se présenter sous forme de phosphodiester ou, afin d'être plus stables, sous forme de phosphorothioates ou d'hybrides phosphodiester / phosphorothioates Les oligonucléotides phosphorothioates sont ceux préférés.
L'oligonucléotide selon l'invention est capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire. Cette stimulation est appréciée notamment par la lymphoprolifération ou par l'expression de marqueurs d'activation, tels que les marqueurs CD25 et CD86 des lymphocytes B Il est possible de sélectionner les oligonucléotides d'intérêt au moyen de tests différents de ceux proposés dans la présente demande, à condition cependant qu'il s'agisse de tests évaluant la capacité de stimulation de cellules humaines, et non pas comme dans la plupart des documents de l'art antérieur, de tests évaluant la capacité de la stimulation de cellules murines. Il serait notamment possible de tester l'expression d'autres marqueurs d'activation des lymphocytes B tels que les marqueurs CD69 ou CD56, ou l'expression de marqueurs de prolifération tels que le marqueur KI67, des tests relatifs à l'augmentation des marqueurs
d'activation et de maturation des cellules dendritiques pourraient également être utilisés. De même, des tests permettant l'appréciation de l'augmentation de production de certaines cytokines telles que par exemple IL6, IL12, IL10, IFNy, TNFa. peuvent également être utilisés.
Selon une caractéristique de l'invention, l'oligonucléotide comprend au moins une séquence nucléotidique 5' T T N1 N2 T T 3' dans laquelle T signifie Thymine et, N1 et N2 peuvent représenter chacun l'Adénine, la Thymine, la Cytosine ou la Guanine. Cette formule couvre ainsi 16 possibilités. Cette séquence peut être 5' terminale, 3' terminale ou être entourée par d'autres nucléotides. Elle peut être unique ou répétée plusieurs fois à l'identique à l'intérieur d'un même oligonucléotide. Un oligonucléotide selon l'invention peut également comprendre plusieurs séquences différentes correspondant chacune au motif 5' T T N1 N2 T T 3'.
Selon l'invention, l'oligonucléotide ne comporte pas de séquence palindromique. Malgré cette absence de séquence palindromique, un tel oligonucléotide est capable de stimuler des cellules humaines du système immunitaire Selon une caractéristique, l'oligonucléotide selon l'invention est dépourvu de dinucléotide CG dans lequel la Cytosine n'est pas méthylée. Cette exclusion s'applique également au motif N1N2. La capacité des oligonucléotides de l'art antérieur à être immunostimulants a presque toujours été interprétée comme liée à la présence de motifs CpG non méthylés (Cf. notamment l'article de Krieg et al dans Nature d'avril 1995 cité ci-dessus), cette interprétation étant en cohérence avec l'observation selon laquelle la fréquence de ce dinucléotide était 4 fois plus importante dans le génome des bactéries et des virus que dans celui des vertébrés. De façon surprenante, on a maintenant trouvé que des oligonucléotides entièrement dépourvus de ce motif dinucléotidique étaient cependant parfaitement capables de stimuler le système immunitaire humain.
Selon un mode particulier de réalisation de la présente invention, le motif N1N2 correspond au dinucléotide AG, dans lequel A signifie Adénine et G signifie Guanine.
Selon une caractéristique avantageuse, le motif 5' TTAGTT 3' est répété au moins une fois dans l'oligonucléotide, et de préférence au moins 2 fois De préférence encore, les motifs répétés sont séparés par au moins un nucléotide N3, qui représente l'Adénine, la Cytosine, la Guanine ou la Thymine. A l'intérieur d'un oligonucléotide, ce nucléotide de séparation peut être toujours le même, ou être différent à chaque fois. De préférence, le nucléotide séparant les 2 premiers motifs TTAGTT de l'oligonucléotide, (lorsque l'on considère le sens de lecture 5'3') est constitué par la Cytosine.
De façon particulière, les oligonucléotides dont les séquences nucléotidiques répondent à la formule 5' TTAGTTCTTAGTTN3TTAGTT 3', dans laquelle N3 représente A, T, C ou G, sont ceux préférés au sens de la présente invention Selon une caractéristique particulière, l'oligonucléotide selon l'invention est dépourvu ou appauvri en séquence nucléotidique capable d'inhiber les cellules du système immunitaire humain. En effet, afin d'obtenir un effet global immunostimulant, si des motifs inhibiteurs ou neutralisants tels que, par exemple, ceux décrits dans la demande WO 98/52 581 sont présents, il faut que leur effet soit supprimé ou réduit, grâce à la présence d'une séquence à effet immunostimulant plus prononcé, ou grâce à la présence d'un plus grand nombre de séquences 5'TTN, N2TT3'.
La présente invention a également pour objet un adjuvant vaccinal comprenant au moins un oligonucléotide immunostimulant ayant au moins un motif 5' T T N1 N2 T T 3' tel que mentionné ci-dessus. Par adjuvant vaccinal, on entend un produit qui permet d'accroître ou de modifier la réponse du système immunitaire d'un organisme vis à vis de l'administration d'un antigène. En particulier, il peut s'agir d'une augmentation de la réponse humorale ou de la réponse cellulaire.
L'action d'un adjuvant vaccinal peut également être, non pas une augmentation de la réponse qui se produirait en l'absence d'adjuvant, mais une orientation différente de la réponse produite : par exemple, orientation vers une réponse cellulaire plutôt qu'une réponse humorale, production de certaines cytokines plutôt que d'autres, production de certains types ou sous-types d'anticorps plutôt que d'autres, stimulation de certaines cellules plutôt que d'autres, etc...
Exemple 3 : Impact de l'amplification du gène malE sur la production de la L-lysine en fermenteur Dans le but d'étudier l'influence de la surexpression de l'enzyme malique sur la production de la L-lysine, la souche ATCC 21253 a été transformée par électroporation avec le plasmide pMF22 (Ptrc-malE) et le plasmide témoin pCGL243 La souche de C. glutamicum ATCC21253 a été utilisée par Vallino et Stephanopoulos (1993) pour produire de la L-lysine.
Les souches ATCC21253 (pMF22) et ATCC21253 (pCGL243) ont été étudiées en fermenteur en suivant le protocole de fermentation décrit par Vallino et Stephanopoulos (1993) 3.1-Préculture Les souches sont maintenues sur boîte de Pétri sur milieu BHI (Brain Heart Infusion, Bouillon coeur cervelle) gélosé en présence de 25 mg/l d'antibiotique pour garantir le maintien des plasmides Le milieu de préculture est le milieu PMB Il est autoclavé à 121 C en trois parties: Une solution A contenant 20 g de glucose, 1, 14g de citrate trisodique dihydrate, 55 mg de CaCl2, 200 mg de MgS04-7H20, 20 mg de FeS04-7H20, Ig de NaCl, 10 ml de la solution de sels 100x, le tout porté à 800 ml avec de l'eau distillée et ajusté à pH 5,0 avec HCl.
Une solution B contenant 8 g de K2HP04, 1g de KH2P04, 150 mg de thréonine, 100 mg de leucine, 40 mg de méthionine, 0,5 mg de biotine, 1 mg de thiamine-HCI, dans 100 ml d'eau distillée.
Une solution C contenant 5 g de (NH4) 2S04 dans 100 ml d'eau distillée.
La solution de sels 100x contient : 200 mg/1 de FeCl--6H20, 200 mg/1 MnS04-H20, 50 mg/1 ZnS04-7 H20, 20 mgil CuC12-2H20, 20 mgll Na2B407-10H20, 10 mg/1 (NH4) 6MO7024-4H20, ajusté à pH 1,5 avec HCI.
Pour maintenir le plasmide, 25 mg/1 de kanamycine sont ajoutés à la préculture.
Les fioles de préculture sont inoculées à partir d'un tube gélosé de chacune des souches ATCC21253 (pMF22) et ATCC21253 (pCGL243). Les précultures sont incubées 16H à 32 C sous agitation à 200 t/min.
3.2-Culture Les cultures sont inoculées à 10% v/v par les précultures Le milieu utilisé est le PMB Les conditions de culture sont les mêmes que celles de la préculture Les cultures sont arrêtées après 16H d'âge La densité optique obtenue est de 20 à 660 nm.
3. 3-Fermentation Les fermentations sont effectuées dans des fermenteurs de laboratoire de 31 (ADI Biotech) à 30 C avec une aération de 60 1/H sous une pression relative de 0,2 bars Le pH est contrôlé à 7,00 par l'ajout d'ammoniac gazeux. L'agitation est fixée à 800 t/min en début de fermentation puis augmentée jusqu'à 1200 t/min pour éviter la limitation en oxygène.
Le milieu de fermentation est le milieu FM4 préparé en deux solutions La solution A contient 1500g de glucose, 10g d'acide citrique, 6g de MgS04-7H20, 500 mg de FeS04-7H20, 20g de NaCl, 1g de CaCl2, 200 ml de la solution de sels
minéraux 100x, 10 ml de polypropylène glycol 2000, dans 7 1 d'eau distillée ajustée à pH4,0.
La solution B contient : de K2HP04, 20g de KH2PO4, 7,33g de thréonine, 15g de leucine, 6g de méthionine, 10 mg de biotine, 20 mg de thiamine-HCI, 400 g de (NH4) 2S04, dans 2 1 d'eau distillée.
Les deux solutions sont autoclavées séparément pendant 30 min à 121 C.
Dans chaque fermenteur on ajoute aseptiquement 700 ml de la solution A, 200 ml de la solution B et 100 ml de la culture obtenue à l'étape précédente comme inoculum.
Une dose équivalente à 25 mg/1 de kanamycine stérilisée par filtration est ajoutée avant inoculation.
La fermentation est effectuée en mode semi-continu (fed-batch) Une alimentation en glucose à 500 g/1 est effectuée entre 12H et 42H d'âge La densité optique du milieu évolue comme indiqué à la figure 6.
Cette ligne d'échappement 15 comporte notamment un pot catalytique 16 traitant par conversion catalytique les substances toxiques contenues dans les gaz d'échappement.
Le calculateur électronique 14 est quant à lui constitué classiquement par un calculateur du type comportant une unité centrale CPU, une mémoire vive RAM, des mémoires mortes ROM et EEPROM, des convertisseurs analogiques-numériques et différentes interfaces d'entrées et de sorties. Il reçoit des signaux d'entrée relatifs au fonctionnement du moteur, il effectue des opérations et génère des signaux de sortie à destination notamment des bougies 6, des injecteurs 4 ainsi que des actuateurs électromagnétiques 7'et 8'commandant respectivement l'ouverture des soupapes d'admission 7 et d'échappement 8.