INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Ces buts sont atteints selon l'invention grâce à des anticorps purifiés reconnaissant spécifiquement une protéine nitrosylée, et avantageusement des composés résultant de la conjugaison de NO avec ses transporteurs.
Parmi-ceux-ci, l'invention concerne tout particulièrement des anticorps purifiés dirigés contre les albumines nitrosylés. On entend dans ce qui suit par protéine nitrosylée, également les peptides et polypeptides nitrosylés et plus généralement tout conjugués antigénique nitrosilé.
Les anticorps de l'invention présentent de nombreux avantages, notamment en ce qui concerne leur rapidité d'action et leur efficacité sur des molécules nytrosylées déjà formées et actives. En outre, leur capacité de diffusion dans un organisme est limitée aux propriétés physicochimiques des immunoglobulines. Outre leur efficacité, les anticorps de l'invention présentent l davantage d'être très spécifiques et non toxiques.
Les anticorps sont des macromolécules élaborées par les organismes en réponse à la présence d'une substance étrangère. Des anticorps d'origine animale ont té utilisés de longue date en thérapeutique humaine. Par exemple, le sérum de cheval a été utilisé comme anticorps antitétanique après immunisation de celui-ci par la toxine tétanique.
Les travaux de recherche ayant conduit à la présente invention ont débuté par l'induction d'anticorps polyclonaux dirigés contre une protéine nitrosylée, normalement plus stable in vivo qu'un acide aminé nitrosylé. En outre, les différentes réponses immunes ont été étudiées en modifiant non seulement les épi topes et Leur présentation mais aussi l'espèce animale. L'invention concerne également un ensemble d'anticorps polyclonaux précédents obtenus en injectant à un animal un immunogène décrit ci-après. Puis, dans un second temps, des anticorps monoclonaux ont été préparés selon les méthodes classiques de fusion cellulaire.
NO possède une grande affinité pour la cystéine et la tyrosine et en s'y fixant. I1 est impliqué dans des multiples fonctions qui pourraient être liées à des processus de transport, de stockage, et finalement de relargage de NO au niveau de ses sites d'action.
Des anticorps polyclonaux et monoclonaux ont été réalisés en utilisant différentes molécules antigéniques nitrosylées. Pour les rendre immunogéniques, les acides aminés (haptènes) ont été couplés à des protéines porteuses par l'intermédiaire de différents agents couplants. Ainsi, l'albumine, qui est la protéine la plus abondante du plasma, stocke et transporte le NO, et il a été montré que cette albumine nitrosylée possède une activité vaso-dilatatrice importante et également cytotoxique et cytostatique. Cette propriété de l'albumine est due à a présence d'une cystéine dont l'affinité pour le NO est élevée. Les travaux de recherche réalisés par les Inventeurs et rapportés ci-après, ont permis de préparer des anticorps poly et mono-clonaux dirigés contre des conjugués de NO et de résidus d'acide aminés, la cystéine, le tyrosine et le tryptophane, eux-mêmes couplés a une protéine porteuse, la sérum albumine humaine ou bovine. Puis, les anticorps spécifiques de la sérum albumine nitrosylée ont été sélectionnés et ont été utilisés pour reconnaître et neutraliser certaines des propriétés de ce conjugué in vitro.
En synthétisant plusieurs formes d'immunogènes, les Inventeurs ont montré que ces composés sont uffisamment stables pour induire une réponse immune et cluse celle ci est spécifiquement dirigée contre l'épitope nitrosylé correspondant. La possibilité d'induire ces anticorps et l'intervention de nitrosothiols et de cystéine dans les mécanismes de vasodilatation (Ignarro et aJ , 1981) , ont amené les Inventeurs à rechercher existence de dérivés nitrosylés in vitro et in vivo et à bloquer leurs effets.
L'invention concerne aussi les immunogènes pour la préparation des anticorps définis ci-dessus. Ces immunogènes sont constitués d'un acide aminé nitrosylé couplé à une protéine porteuse. La synthèse de ces immunogènes est réalisée par exemple en couplant l'haptène L-tyrosine (Tyr) ou L-cystéine-N-acétylée (Cys) à une protéine porteuse telles que la sérum albumine bovine (SAB) ou la sérum albumine humaine (SAH) par la carbodiimide. Puis, les conjugués obtenus sont nitrosylés par un donneur de NO comme le nitrite de sodium (NaNO2) en milieu acide L'utilisation de différents agents couplants tels que la carbodiimide, le glutaralgéhyde (G) ou t'anhydride succinique (AS) et de protéines, peptides ou polypeptides porteurs distincts, permet d'obtenir des épi topes associés à la nitrosylation de conformation différente.
Ces immunogènes peuvent également être constitués d'une protéine dont la séquence possède un résidu d'acide aminé capable d'être nitrosylé comme l'albumine qui possède une cystéine.
Dans les immunogènes de l'invention ci-dessus, on entend par protéine porteuse également les peptides et polypeptides.
GA3- intérieure de la turbine.
GA4- ailettes de la turbine.
GA5- l'arbre d'alternateur .
GA6- sortie de gaz en HA.
(Voir FIG 14) GB ALTERNATEUR Pour convertir l'action mécanique de GA et GC en énergie électrique ; celle ci est envoyée en J afin de pouvoir faire fonctionner le véhicule.
GBI les fils électriques en J ( Voir FIG 15) GC TURBINE D'AZOTE Pour convertir l'énergie thermique apportée par l'azote.
GCI- tuyau d'azote à chauffer.
GC2- accès de haute pression ,buse.
GC3- intérieur de la turbine.
GC4- l'arbre d'alternateur.
GC5- ailettes de turbine.
GC6- sortie de gaz à HG.
(Voir FIG 16) HA REDUCTION DE LA CHALEUR DU GAZ BRÛLE.
HAI- accès vide de l'échappement du gaz qui sort de la turbine.
HA2- accès du liquide de refroidissement du gaz d'échappement.
HA3- radiateur à refroidir et liquéfier la vapeur d'eau et gaz d' échappement.
L'ARNm de C-22 n'a pas pu être détecté par analyse Northern Blot dans plusieurs régions du cerveau telles que le cortex frontal , le cerveau moyen et le thalamus chez l'adulte et le rat âgé de plus de deux ans.
De plus, on n'a pas pu détecter l'ARNm de C-22 dans des tissus non neuronaux, tels que le coeur, le poumon, le foie, le rein chez des rats d'une semaine et des rats adultes.
Les données sur le profil de l'expression l'ARNm de C-22 suggèrent un rôle prépondérant de la protéine C-22 dans le développement du cerveau.
EXEMPLE 5 Immunoempreinte de POP-66: Des anticorps contre quatre des peptides séquencés (cf.
exemple 1) ont été produits. Deux des sérums se sont avérés particulièrement intéressants.
L'un contient des anticorps (Ac anti-pep3) qui reconnaissent plusieurs membres de la famille ULIP en éléctrophorèse à deux dimensions d'extraits protéiques de cerveau de rat nouveau né (figure 2) et sur électrophorèse à une dimension (figure 3). Un autre anticorps (Ac anti-pep4) reconnaît en Western Blot une seule bande de 66 kDa susceptible de correspondre à un seul membre de la famille (figure 3).
EXEMPLE 6 Immunohistochimie: Les préparations de tissus pour l'immunohistochimie sont obtenues à partir de cerveaux de rats nouveaux-nés et de cerveaux humains post-mortem, fixés à 4" C dans du paraformaldéhyde à 4 % et 0,2 % d'acide picrique dilués dans du tampon phosphate (0,1 M, pH =7,4), puis cryoprotégés.
L'immunocytochimie peut être réalisée par la technique d'immunofluorescence indirecte. Des coupes de 12 pm d'épaisseur sont réalisées au cryostat puis montées sur lame recouverte de gélatine, traitées pendant 2 heures dans du tampon PBS et 1 % de sérumalbumine bovine (BSA) avec 0,1 % de Triton X100 et incubées 12 h avec le sérum de patients anti-CV2 dans du PBS-1% BSA à température ambiante (dilution du sérum 1/100). Après plusieurs lavages avec PBS-1 % BSA, les coupes sont incubées pendant 2 h avec un anti-sérum anti-humain de lapin conjugué à la fluorescéine diluée à 1 % (Dakopatts) dans du PBS-1 % BSA. Après lavage dans le PBS les lames sont examinées au microscope. Les coupes contrôle sont incubées avec soit l'anti sérum IgG anti-humain conjugué à la fiuorescéine seule, soit le PBS-1 % BSA seul, soit le sérum de patient seul, soit enfin le sérum contrôle (patients non atteint de SNP) et anticorps conjugué à la fluorescéine à la même dilution.
Pour confirmer l'immunofluorescence on peut utiliser le marquage indirect par immunoperoxydase. Les coupes de tissus congelés fixés au paraformaldéhyde sont incubées avec 0,3 % d'H202 (pour détruire l'activité peroxydase intrinsèque) et 10 % de sérum normal de lapin (pour éviter la liaison non spécifique des IgG de lapin) ou 1 % BSA.
Après incubation 12 h avec des sérums de patients dilués à 1/1000 et lavage, les coupes sont incubées 2 h avec de l'anti sérum IgG anti-humain de lapin biotinylé dilué à 1/1000 dans PBS-1% BSA. Les IgG humains liés sont visualisés par incubation avec un complexe avidine-biotineperoxydase (Vectastain ABC complex, Vector) et développés avec 0,05 % DAB (Sigma). Les coupes contrôle sont obtenues avec des sérums de 15 patients sans SNP selon le même protocole.
A - Localisation des protéines de la famille ULIP à l'aide d'anticorps antipeptides: Un marquage immunohistochimique a été réalisé sur coupe de cerveaux de rats nouveaux-nés et adultes. L'anticorps antipeptide-3 reconnaît un (des) antigènes présent(s) dans plusieurs types cellulaires sur coupe de cerveaux de rats nouveau-nés et adultes (fig. 4). Comme le sérum anti-CV2 de patient, les anticorps anti-peptide-4 ne permettent la mise en évidence d'aucun antigène sur coupe de cerveau de rat nouveau né alors qu'ils marquent spécifiquement une sous-population d'oligodendrocytes dans le cerveau de rat adulte (fig. 4).
B - Expression de POP-66 au cours du développement normal du cerveau: La figure 5 montre que les cellules nerveuses prolifératives des zones progénitrices du système nerveux mises en évidence par l'accumulation de bromodéoxyuridine (BrdU) n'expriment pas POP-66 alors que les cellules non prolifératives qui correspondent aux cellules nerveuses en différenciation ou en migration l'expriment.
EXEMPLE 7 Rôle de POP-66 dans la survie neuronale: La figure 6 permet de comparer des coupes de cerveaux humains de patients sains et de patients atteints de SNP. Chez les patients atteints d'un SNP et présentant des anticorps circulant anti-CV2, on observe une disparition des neurones du gyrus dentatus et des neurones pyramidaux (bande de cellules centrale), ainsi qu'une réaction astrocytaire intense.
EXEMPLE 8 Caractérisation de la protéine POP-66 - Identification avec ULIP-4: Matériels et méthodes a) Purification partielle d'ULIP-1 ULIP-1 partiellement purifiée a été obtenue à partir de cerveaux de souris nouveaux-nés par trois étapes de purification. Ces cerveaux ont été homogénéisés dans 4 volumes de tampon d'homogénéisation (25 mM phosphate de sodium, pH 7,8,1 mM EGTA, 10 ,ug/ml de leupeptine, 25 ,ug/ml d'aprotinine, et 10 ,ug/ml de pepstaine.
Les homogénats ont été centrifugés pendant 10 minutes à 400 x g. Les culots ont été resuspendus dans 2 volumes de tampon d'homogénéisation, homogénéisés, et de nouveau centrifugés. Les surnageants issus des deux centrifugations ont été rassemblés, soniqués et centrifugés pendant 1 heure à 100.000 x g. Le surnageant (S2) a été chargé sur une colonne CL6B de DEAE-Sepharose (1,75 cm2 x 26 cm) équilibré avec 100 ml de tampon A (25 mM de phosphate de sodium, pH 7,8,1 mM d'EGTA) à une flux de 30 ml par heure. Les protéines ont été éluées dans 300 ml d'un gradient linéaire de chlorure de sodium 0-250 mM dans du tampon A et des échantillons de 5 ml ont été recueillis. Les fractions contenant ULIP ont été collectées et du sulfate d'ammonium solide a été ajouté jusqu'à 20 % de saturation. Ce pool a été chargé sur une colonne CL4B de phényl-Sepharose (1,75 cm2 x 22 cm) qui a été préalablement équilibré avec 100 ml de tampon B (10 mM de phosphate de sodium, pH 7,8, 1 mM d'EGTA) contenant 20 % de sulfate d'ammonium saturé. Les protéines ont été éluées dans un gradient linéaire décroissant de 20 à 0 % de sulfate d'ammonium saturé dans du tampon B. Les fractions contenant ULIP ont été recueillies, dialysées deux fois contre 20 volumes de tampon A. Les protéines ont été concentrées sur une petite (10 ml) colonne Cl6B de DEAE-Sepharose et éluées avec 400 mM de chlorure de sodium dans du tampon A. L'éluat a été dessalé sur une colonne Sephadex G-25 (NAP-10) et concentré dans un volume final de 0,5 ml par évaporation. Dans la dernière étape de purification, la fraction concentrée a été chromatographiée en trois étapes successives, sur deux colonnes de FPLC (Fast Protein Liquid Chromotagraphy) Superose 12 montées en série, dans du tampon C (50 mM de phosphate de sodium, pH 7,2, 150 mM de chlorure de sodium) à un débit de 0,3 ml/minute. Les fractions (0,6 ml) ont été recueillies et les fractions enrichies en ULIP ont été analysées. La présence d'ULIP dans les étapes successives de purification a été testée par un Western Blot à une dimension en utilisant un anticorps anti-stathmine capable de réactivité croisée. Les protéines ont été quantifiées selon la méthode de Bradford.
b) Miaration sur ael d'électroDhorèse: Une électrophorèse à une dimension a été effectuée sur des gels de polyacrylamide 13 % selon la méthode de Laemmli. Les électrophorèses PAGE à deux dimensions ont été effectuées tel que décrit précédemment. Les gels d'isoélectrofocalisation contenaient 2 % d'ampholines total, pH 6-8 et 3-10 selon un rapport de 4 :1. La seconde dimension avait été menée sur des gels d'acrylamide à 10 %. Les protéines ont été soit soumises à une immuno-empreinte soit colorées par l'argent.
La partie transversale du bras 35 est mue en deux points différents par deux tirants 44
et 45 qui se rejoignent, en leur autre extrémité, par des lumières ovoïdes sur une pe-
tite tige 43 qui est portée par la deuxième platine 9. Lorsqu' une pression est exercée avec le brin inférieur de la chaîne, sur du bois, c' est le tirant 44 qui libère le rotor et à l'inverse, losque la pression est réalisée avec le brin supérieur c' est le tirant 45 qui tire sur le bras 35, pour délivrer le rotor. L' extrémité de la partie transversale du bras 35, proche des tirants possède une protubérance pour retenir 1' extrémité d' un ressort 52, lequel a son autre extrémité fixée par un crochet sur une patte 46 située sur le côté du 1 5 carter, laquelle patte 46 est fixée sur ce dernier par tout moyen approprié. Cette patte 46 porte un ergot qui permet de la faire pivoter manuellement, sur un axe 47, lui per- mettant de parcourir un angle de 200 environ, jusqu' d une butée 48 d' arrêt et de
blocage, qui empêche tout retournement inopiné sur 1' arrière.
Le deuxième bras 40 de forme rectiligne et plate est disposé sur la partie du bras 35, côté carter, et a une ouverture circulaire en son extrémité dans laquelle passe un tube 49 retenu sur ledit bras 40 par le pourtour d' une coiffe 50 ( fig. 10). Le tube 49 s' em- boîte dans un logement cylindrique 51 formé par le retournement de 1' une des deux extrémités de la pièce circulaire 42 et 1' autre extrémité de cette dernière est prolongée25 par la tige 41. La tige 41 traverse, par des trous concordants et prévus à cet effet, dans un premier temps, le logement cylindrique 51 et le tube 49 puis est bloquée sur
I' extrémité voisine du bras 35 avec un écrou. L' extrémité du bras 35 a une forme ar-
rondie pour épouser le pourtour du logement cylindrique 51 afin d' offrir une bonne
retenue de la tige 41.
En position d' attente, autrement dit quand la tronçonneuse ne scie pas, le guide
chaîne 8 est posté sur un alignement médian par rapport à ses deux positions de tra-
vail, c' est à dire à égale distance entre sa position haute et sa position basse. Cette
position médlane ou d' attente est maintenue par la traction du ressort 52 par 1' entre-
mise du bras 35 et de la platine 9. Simultanément quand la tronçonneuse passe en position d' attente, le ressort 52 exerce une traction sur 1' extrémité du bras 35 qui pivote sur le carter, en son coude 37 et par ce mouvement 1' autre partie dudit bras 35 tire par son extrémité sur la tige 41, -8- provoquant le resserrement de la pièce circulaire 42 autour du rotor qui arrête tout naturellement la rotation de la chaîne. Dans le cas inverse, lorsqu' une pression est exercée sur du bois avec le guide chaîne, pour le sciage, ladite pression fait pivoter la première platine 1 sur 1' épaulement du carter qui ceinture 1' ouverture du passage05 de 1' arbre du vilebrequin, comme décrit ci-devant. La platine 1 a un débattement correspondant à la longueur de la fenêtre cintrée 10 et aux lumières ovoïde des deux tirants 44 et 45. La platine 1 entraîne le guide chaîne et la deuxième platine 9, ainsi cette dernière par le truchement des deux tirants 44 et 45, provoque une extension du ressort 52 et le desserrage de la pièce circulaire 42 pour libérer le rotor et la chaine.10 Le carter 3 porte deux tampons 54 en téflon, lesquels sont emmanchés sur ledit carter,
pour éviter une éventuelle usure occasionnée par le frottement de la première platine lors de son oscillation sur le carter. La platine 1 possède un orifice 55 positionné à un endroit approprié pour lubrifier le guide chaîne.15 Une pression manuelle sur un ergot 57 qui est fixé sur le bras 25, provoque l avance- ment de la pièce de tension 23 dans la glissière et a pour effet de rapprocher le gui-
de chiaîne de 1' arbre du vilebrequin et donc de diminuer la tension de la chaîne; cette manoeuvre facilite la pose et la dépose de la chaîne.
Selon un montage différent de 1' exemple de réalisation décrit ci-avant, sans se dé- partir de l' invention, le rotor 19 se situe avant le guide chaîne 8, dans 1' ordre d' a-
E5- soupapes d'accès à la chambre dc combustion.
E6- tuyau de carburant à préchauffage.
E7- appareil du préchauffage du carburant.
E8- piston de la pompe de carburant d'injection à la chambre de combustion.
E9- cylindre de chambre de combustion.
E 10- tuyau de la chambre de combustion.
El 1- injecteur du carburant à la chambre de combustion direct.
E12- point d'injection du carburant.
E13- fil électrique E14- bougie.
E15- point de l'allumage.
E16- piston et tige assemblés.
E17- ressort à retirer E16.
E18- piston à poussée hydraulique.
El9- fluide hydraulique (qui sert à pousser les pistons).
E20- réservoir hydraulique.
E21- cylindre hydraulique.
La quatrième technique utilise des interféromètres de Mach-Zehnder équilibrés ou des coupleurs 1008 avec un réseau de Bragg photo-inscrit de façon identique sur les deux bras. La lumière est injectée au port 1 et émise au port 3 (100E de couplage) pour toutes les longueur d'onde distinctes de la longueur d'onde de Bragg ; la lumière à la longueur d'onde de Bragg est réfléchie sélectivement au port 2.
A ce sujet, on consultera par exemple le document (29) d'où sont tirées les références de la description précédente.
Trois sortes de matériaux sont utilisées pour réaliser les composants utilisés dans les quatre techniques précédentes : verre, silice sur silicium et semi-conducteurs de type InP.
En particulier, des réseaux gravés et des PHASARs ont été réalisés en optique intégrée sur du silicium tandis que des démultiplexeurs à interféromètres ont été réalisés en optique intégrée sur du silicium ou sur du verre.
Aucune de ces quatre techniques connues ne permet de déterminer directement les longueurs d'onde de Bragg avec la précision souhaitée.
En outre, ces techniques nécessitent un compromis entre diaphonie ( cross talk ) et espace spectral occupé.
La diaphonie, c'est-à-dire le couplage lumineux entre les sorties, doit être minimisée car elle contribue à fausser les mesures de longueur d'onde.
Typiquement, une diaphonie de -25 dB à -30 dB est recherchée et l'occupation spectrale est déduite en conséquence.
Dans le cas d'un réseau de diffraction en optique intégrée sur silicium, le couplage lumineux entre les sorties est induit par la diffusion dans le guide (à cause des imperfections de gravure) et par le couplage entre les guides de sortie lorsque ceux-ci sont trop rapprochés.
Entre les centres de deux canaux spectraux adjacents, la diaphonie est typiquement de l'ordre de -20 dB à -35 dB tandis qu'elle n'est plus que de -1G dB à -15 dB à l'intersection des fonctions de transfert correspondant à ces canaux (à la moitié de la période spectrale) Dans le cas du PHASAR, les caractéristiques de diaphonie et d'espace spectral occupé sont parmi les meilleures.
Typiquement, une diaphonie meilleure que -30 dB est atteinte dans le cas du document (11), pour une occupation spectrale de 0,8 nm et une période de 2 nm, avec 60 guides déphaseurs et un ordre de diffraction égal à 60.
Dans le cas des interféromètres de Mach Zehnder, la diaphonie dépend de la précision d'ajustement des coupleurs de séparation (coupleurs 3 dB).
A titre d'exemple, dans le document (8) est décrit un démultiplexeur qui est constitué de trois interféromètres formés à partir de coupleurs 3,1 dB (au lieu de coupleurs 3 dB) et qui est caractérisé par une diaphonie d'environ -20 dB.
Dans le document (4) est également proposé un démultiplexeur qui inclut un dispositif de collimation de la lumière à analyser et une série de filtres passe-bande montés en cascade et associés à des photodétecteurs.
Le principal inconvénient de ce démultiplexeur est d'être conçu pour fonctionner en espace libre.
De ce fait, la reproductibilité et la fiabilité des mesures ainsi que la robustesse et l'intégration de ce démultiplexeur sont insuffisantes pour une application aux micro-systèmes.
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La réticulation peut également être effectuée par tout procédé connu de l'homme du métier dans ce domaine de la technique et permettant de réticuler, densifier le polymère inorganique selon l'invention tel qu'irradiation par un faisceau laser ou encore par un faisceau d'électrons ou d'ions ou une énergie microonde.
La densification par insolation par les ultraviolets améliore l'état de surface du film et donne des couches beaucoup plus mouillables en particulier juste après insolation.
Le traitement de densification-réticulation par insolation par les ultraviolets présente en outre l'avantage important, voire décisif, d'une durée nettement plus courte que le traitement thermique et ce même s' il doit être suivi d'une étape dite de recuit thermique qui améliore généralement significativement la densification de la couche de Ta205.
A titre d'exemple, on effectue selon l'invention une insolation sous les UV d'une durée de quelques minutes au maximum, de préférence égale ou inférieure à 5 minutes au lieu de 30 minutes en général pour une réticulation-densification par traitement thermique à 150 C.
D'autre part le traitement de densificationréticulation par les UV est plus facile à mettre en oeuvre, nécessite moins de matériels, et évite les délais de montée et descente en température.
La troisième étape du procédé qui consiste par exemple en ces deux traitements 11 et 13, permet de réticuler le réseau polymérique d'oxy-hydroxyde de tantale et ainsi de densifier la couche. Ce traitement entraîne une meilleure tenue mécanique du film et une augmentation de l'indice de réfraction par rapport à une couche équivalente n'ayant pas subit un tel traitement.