INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Avantageusement la raquette de l'invention comporte une pluralité d'éléments oscillants qui sont disposés les uns à côté des autres sur une plaquette support, et le logement correspondant à la dite plaquette se présente sous la forme d'une rainure disposée selon l'axe longitudinal du manche. Le demandeur a en effet constaté que l'amortissement de l'amplitude des vibrations était largement en fonction du nombre d'éléments oscillants. Dans un exemple préféré de réalisation, il s'est agi d'une plaquette support de douze blocs de gel mou de polyuréthanne surmontés de feuilles de plomb, chaque bloc se présentant sous la configuration d'un parallélépipède rectangle ayant une longueur de l'ordre de 8 mm, une largeur de 5 mm et une épaisseur de l'ordre de 2 à 3 mm pour un poids de 0,1 g, tandis que la feuille de plomb avait une épaisseur de 0,2 mm pour un poids de 0,1 g.
En vue d'amortir préférentiellement les vibrations en flexion du premier type, la raquette comporte une rainure, pourvue d'une pluralité d'éléments oscillants formée dans le plan horizontal c'est-à-dire le plan général du tamis. En vue d'amortir préférentiellement les vibrations en flexion du deuxième type, la raquette comporte une rainure, pourvue d'éléments oscillants, formée dans le plan vertical c'est-à-dire le plan perpendiculaire au tamis.
Dans une version préférée de réalisation, le manche de la raquette a en section transversale une forme octogonale et comporte quatre rainures servant de logements à quatre plaquettes pourvues d'éléments oscillants, deux dans les faces opposées de l'octogone parallèles au plan horizontal du tamis et deux dans les faces opposées de l'octogone perpendiculaires au plan horizontal du tamis.
Le demandeur a constaté que les amplitudes de vibrations présentent des pics en fonction de certaines fréquences. De manière à optimaliser la diminution de l'amplitude de ces vibrations, la fréquence propre à chaque élément oscillant est déterminé pour correspondre à la fréquence d'un de ces pics.
Dans la version préférée ci-dessus, les éléments oscillants se trouvant dans un logement dont le fond est dans un plan parallèle au plan du tamis ont une fréquence propre comprise entre 100 et 180 Hz tandis que les éléments oscillants disposés dans un logement dont le fond est dans un plan perpendiculaire à celui du tamis ont une fréquence propre comprise entre 120 et 200 Hz.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va être faite d'un exemple préféré de réalisation illustré dans lequel - la figure 1 est une représentation partielle en perspective d'une raquette de tennis, - la figure 2 est une représentation schématique en coupe du premier type de vibrations en flexion, - la figure 3 est une représentation schématique en plan du deuxième type de vibrations en flexion, - la figure 4 est une représentation partielle en perspective d'une plaquette support dans laquelle sont disposés quatre éléments oscillants, - la figure 5 est une représentation schématique en coupe longitudinale du manche d'une raquette équipée d'une plaquette sur laquelle sont disposés huit éléments oscillants, - la figure 6 est une représentation schématique partielle en coupe transversale du manche d'une raquette équipée de plaquettes disposées dans des plans perpendiculaires.
Une raquette de tennis 1 comme illustrée à la figure 1 comporte un cadre 2 de forme ovale dans lequel sont tendues des cordes 3 formant le tamis 4, un manche 5, recouvert d'un grip 6 et, dans l'exemple illustré une pièce intermédiaire 7 en forme de fourche reliant le manche 5 au cadre 2. En pratique le manche 5, la pièce intermédiaire 7 et le cadre 2 sont réalisés à partir d'un seul élément tubulaire, selon une technique connue par ailleurs. Le manche est constitué de l'assemblage des deux extrémités de cet élément tubulaire et recouvert par le grip 6.
Lorsque la balle de tennis vient frapper le tamis 4, L'énergie dégagée par cet impact se traduit notamment par la formation de vibrations dans toute la raquette 1. Les figures 2 et 3 illustrent les deux modes de vibrations, en flexion, d'une raquette sous l'effet de cet impact.
L'invention concerne également l'utilisation d'un polypeptide ou d'un mélange tels que décrits précédemment dans une composition cosmétique ou pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à renforcer la cohésion intercornéocytaire et/ou induire l'épaississement de la couche cornée. Elle a trait aussi à un procédé de traitement cosmétique destiné à renforcer la cohésion intercornéocytaire et/ou induire l'épaississement de la couche cornée, caractérisé par le fait que l'on applique sur la peau du sujet à traiter une composition telle que décrite précédemment.
L'analyse de la séquence primaire en acides aminés de la protéine selon l'invention montre qu'elle présente des sites de reconnaissance et de fixation pour des protéases connues ou des sites spécifiques de clivage par des agents chimiques. On peut citer comme exemple les sites pour la Chymotrypsine, la Cathépsine, la protéinase K, la Subtilisine, la protéase V8, la Thermolysine, la Thrombine, la Trypsine, la Papaïne, la Pepsine, la Proline-Endopeptidase, I'Endoprotéinase GluC, I'Endoprotéinase LysC, 'Endoprotéinase AspN, I'Endoprotéinase ArgC (Clostripaïne), la Myxobacter ALI 17, I'Elastase, I'enzyme chymotrypsique de la couche cornée, le bromure de cyanogène, le Nchlorosuccinimide ou encore les sites spécifiques de l'hydrolyse acide (70% d'acide formique, 7M Guanidine-HCI, 40"C, 24h).
La cohésion intercornéocytaire est apparemment due à l'existence, dans la couche cornée, de polypeptides spécifiques des structures impliquées dans la jonction intercornéocytaire comme en particulier le polypeptide de l'invention. On a vu que certaines pathologies hyperkératosiques pourraient être liées à un excès de cohésion intercornéocytaire, dû en particulier au polypeptide de l'invention.
Un autre objet de l'invention est de proposer un procédé de traitement cosmétique pour lutter contre les excès de cohésion intercornéocytaire et donc pour augmenter la desquamation et en particulier les excès dûs au polypeptide de l'invention, procédé qui consiste à appliquer sur la peau une composition cosmétique comprenant au moins une protéase présentant un site spécifique de reconnaissance etlou de fixation et de coupure au sein de la séquence primaire d'acides aminés du polypeptide de l'invention.
Ainsi, I'invention a pour objet une composition cosmétique ou pharmaceutique comprenant, dans un milieu physiologiquement acceptable, une quantité efficace d'au moins une protéase active sur le polypeptide de l'invention, choisie parmi l'Endoprotéinase LysC, I'Endoprotéinase GluC, la Proline-Endopeptidase, la Thrombine, la Pepsine, la Myxobacter AL117 et I'Elastase.
Ces protéases peuvent être isolées à partir de plantes, d'animaux, de bactéries, de virus ou de champignons.
Le polypeptide de l'invention peut être glycolysé. Ainsi, la composition telle que définie précédemment peut contenir en outre une glycosidase qui peut être choisie parmi celles isolées de plantes, d'animaux, de champignon ou encore de micro-organismes, en particulier de bactéries. On citera à titre d'exemple les neuraminidases, les mannosidases, les galactosidases, les glucosidases, les N-acétylglucosaminidases et les N-acétylgalactosaminidases.
Comme vu précédemment certaines pathologies se caractérisent par la production d'une couche cornée épidermique épaissie et par une desquamation anormale, c'est-à-dire par une hyperkératose qui peut survenir dans tout territoire anatomique cutané, dans divers contextes cliniques et dont le substratum physiopathologique et la cause peuvent être variés.
L'invention a également pour objet un procédé de traitement cosmétique pour lutter contre les excès de cohésion intercornéocytaire consistant en l'application sur la peau d'une composition cosmétique comprenant une protéase telle que définie précédemment.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une protéase, telle que définie précédemment, destinée à traiter par exemple la xérose (ou sécheresse cutanée), les ichthyoses, le psoriasis, l'hyperkératose de certaines lésions tumorales bénignes ou malignes, les kératoses réactionnelles.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une protéase, telle que définie précédemment, destinée à traiter les pathologies se caractérisant par une transdifférenciation ou métaplasie, au niveau de muqueuses, malpighiennes ou non, mais normalement non cornifiées, qui deviennent cornifiées comme par exemple la leukokératose du col utérin au cours du prolapsus, les leukokératoses buccales, ou encore les lésions tumorales hyperkératosiques bénignes ou malignesdes muqueuses malpighiennes.
On sait qu'une protéine est synthétisée dans les cellules à partir d'une matrice d'acides désoxyribonucléiques codant pour ladite protéine. On sait également que le code génétique est dégénéré. Ainsi, la séquence d'acides aminés du polypeptide de l'invention peut être issue de différentes séquences d'acides désoxyribonucléiques, naturelles ou synthétiques. Par séquence d'acides désoxyribonucléiques synthétique, on entend ici toute séquence obtenue chimiquement ou par manipulation génétique.
Lesdites séquences d'acides désoxyribonucléiques peuvent être issues de toutes origines possibles à savoir soit animale, en particulier de mammifères et encore plus particulièrement humaine, soit végétale, soit de micro-organismes (virus, phages, bactéries entre autres) ou encore de champignons, sans préjuger du fait qu'elles soient présentes de manière naturelle ou non dans ledit organisme d'origine.
La demanderesse a isolé, purifié et séquencé par des techniques de biologie moléculaire en particulier le criblage de banques d'expression d'acides désoxyribonucléiques complémentaires préparées à partir d'épiderme humain, un fragment d'acides désoxyribonucléiques codant pour le polypeptide de l'invention.
L'invention a donc également pour objet toutes séquences d'acides désoxyribonucléiques, naturelles ou synthétiques, dont tout ou partie code pour la séquence primaire d'acides aminés du polypeptide de l'invention.
Au cours de ces travaux, la demanderesse a pu isoler et purifier une séquence d'acides désoxyribonucléiques codant pour la séquence primaire d'acides aminés du polypeptide de l'invention à partir de peau humaine.
La quantité de polyol mise en oeuvre est en général comprise entre 0,05 et 5 g pour 100 g de polymère. Plus particulièrement elle est inférieure à 2 g pour 100 g de résine.
On peut éventuellement incorporer dans la formulation des composés du type des phosphites organiques, comme par exemple, les phosphites de trialkyle, d'aryle, de triaryle, de dialkylaryle, ou de diarylalkyle, pour lesquels le terme alkyle désigne des groupements hydrocarbonés de monoalcools ou de polyols en Cg-C22, et le terme aryle désigne des groupements aromatiques de phénol ou de phénol substitué par des groupements alkyles en C6-C12. On peut de même utiliser des phosphites de calcium, comme par exemple des composés du type Ca(HP03).(H20) ainsi que des complexes phosphite - hydroxy - aluminium - calcium.
La teneur en additif de ce type est habituellement comprise entre 0,1 et 2 g pour 100 g de résine.
Les formulations peuvent de même comprendre au moins un aluminosilicate de métal alcalin, cristallin, synthétique, présentant une teneur en eau comprise entre 13 et 25 % en poids, de composition 0,7-1M20.AI203.1,3-2,4SiO2 dans laquelle M représente un métal alcalin tel que notamment le sodium. Conviennent notamment les zéolites de type NaA, telles que décrites dans le brevet US 4 590 233.
La teneur en ce type de composés varie généralement entre 0,1 et 5 g pour 100 g de résine.
Les formulations peuvent aussi comprendre des composés du type des époxydes.
Ces composés sont généralement choisis parmi les polyglycérides époxydés, ou les esters d'acides gras époxydés, tels que les huiles époxydées de lin, de soja ou de poisson.
La quantité de composés de ce type varie habituellement entre 0,5 et 10 g pour 100 g de résine.
D'autres additifs classiques peuvent compléter la formulation, selon l'application à laquelle elle est destinée.
En règle générale, la formulation peut comprendre des antioxydants phénoliques, des agents anti-UV tels que les 2-hydroxybenzophénones, les 2-hydroxybenzotriazoles ou les amines stériquement encombrées, connues habituellement sous le terme Hals.
La teneur en ce type d'additif varie généralement entre 0,05 et 3 9 pour 100 g de résine.
Si nécessaire, on peut aussi utiliser des lubrifiants qui vont faciliter la mise en oeuvre, choisis notamment parmi les monostéarates de glycérol ou encore le propylène glycol, les acides gras ou leurs esters, les cires montanates, les cires de poyîéthylène ou leur dérivés oxydés, les paraffines, les savons métalliques, les huiles polyméthylsiloxanes fonctionnalisées comme par exemple les huiles r hydroxypropylénées.
La quantité de lubrifiant entrant dans la formulation à base de polymère halogéné varie en général entre 0,05 et 2 g pour 100 g de résine.
La formulation peut aussi comprendre des plastifiants choisis parmi les phtalates d'alkyle. Les composés les plus généralement utilisés sont choisis parmi le phtalate de di (éthyl- 2 - hexyle), les esters de diacides linéaires en C6 C6-C121 les triméllitates ou encore les phosphates esters.
La quantité d'agent plastifiant employée dans les formulations, varie dans un large domaine, en fonction du caractère rigide ou souple du polymère final. A titre indicatif, la teneur varie de 0 à 100 g pour 100 g de polymère.
La préparation des formulations peut être faite par tout moyen connu de l'homme du métier.
Selon un autre mode de réalisation préféré de la présente invention, les 6 résidus cystéine de la région (B) sont disposés selon la séquence (III) suivante C S1 C S2 C C S3 C C dans laquelle C représente une cystéine, S représente un acide aminé ou une séquence peptidique de 2 ou 3 acides aminés, S2 représente une séquence peptidique de 10 acides aminés, S3 représente une séquence peptidique de 5 acides aminés.
La présente Invention englobe également des peptides comprenant ou constitués par des fragments d'au moins 5 acides aminés d'une penaeidine telle que définie ci-dessus, et en particulier des peptides comprenant ou constitués par la région (A) et/ou la région (B), ainsi que des peptides comprenant ou constitués par les séquences (I) ou (II) et/ou (III) Selon un mode de réalisation préféré d'un peptide conforme à l'invention, son extrémité N-terminale est bloquée par un résidu d'acide pyroglutamique, et/ou son extrémité C-terminale est amidée.
A titre d'illustration de l'objet de la présente invention, les caractéristiques de 3 penaeidines isolées à partir de l'hémolymphe de la crevette Penaeus vannamei, dénommées ci-après penaeidine 1, penaeidine 2, et penaeidine 3, sont plus spécifiquement indiquées cidessous.
Les séquences de ces 3 peptides (code 1 lettre) sont représentées sur les figures la (penaeidine 1), lb (penaeidine 2), et lc (penaeidine 3) l'alignement des 3 séquences est représenté sur la figure ld : les séquences conservées sont encadrées. La figure 2 représente une séquence d'ADNc de la penaeidine 2 et la séquence peptidique (code 3 lettres) correspondante ; la figure 3A représente une séquence d'ADNc de la penaeidine 3 et la séquence peptidique (code 3 lettres) correspondante ; la figure 3B représente les séquences peptidiques (code 1 lettre) d'autres isoformes de la penaeidine 3 : les variations de séquence sont encadrées.
Ces penaeidines ne présentent aucune homologie significative avec les peptides anti-microbiens connus dans l'art antérieur, et définissent un nouveau groupe de peptides anti-microbiens.
Les penaeidines 1 et 2 comprennent 50 acides aminés, et ont une masse moléculaire d'environ 5,5 kDa la penaeidine 3 comprend 62 acides aminés et sa masse moléculaire est d'environ 6,6 kDa.
Ce sont des peptides cationiques, possédant une charge nette positive de 7 pour les penaeidines 1 et 2, et de 8 pour la penaeidine 3 ; leurs points isoélectriques calculés varient de 9,34 pour les penaeidines 1 et 2, à 9,84 pour la penaeidine 3.
Les 3 peptides ont un domaine N-terminal riche en proline, et un domaine C-terminal comprenant 6 résidus cystéine formant trois ponts disulfure intramoléculaires, et où les 4 résidus cystéine les plus proches de l'extrémité C-terminale sont organisés en 2 doublets séparés par 5 résidus.
Les cystéines les plus centrales sont respectivement séparées par un, deux ou trois résidus dans les penaeidines 1, 2, et 3.
L'extrémité N-terminale de la penaeidine 3 est bloquée par un résidu d'acide pyroglutamique. Le blocage par des résidus similaires a déjà été observé chez d'autres peptides anti-microbiens.
L'extrémité C-terminale des penaeidines 2 et 3 est amidée. Une telle amidation C-terminale a déjà été observée pour certains peptides anti-microbiens d'autres invertébrés marins (tachyplésines de Limule), ainsi que pour les cécropines d'insectes et les magainines d'amphibiens. Une telle modification renforce la stabilité de la molécule, et il semble qu'elle augmente l'activité anti-microbienne.
Les penaeidines possèdent une stabilité élevée, et sont en particulier très résistantes à la protéolyse. Elles sont essentiellement actives contre les bactéries à Gram positif, et présentent également une activité contre les bactéries à Gram négatif ; elles possèdent en outre des propriétés fongicides.
Les penaeidines et leurs fragments, tels que définis ci-dessus, peuvent être obtenus par exemple par extraction à partir des animaux qui les produisent, et également par synthèse peptidique, ou avantageusement, par génie génétique, en exprimant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une penaeidine ou un fragment de celle-ci, dans une cellule hôte appropriée.
La présente Invention englobe également des acides nucléiques comprenant un segment d'au moins 10 pb, et de préférence au moins 18 pb du gène d'une penaeidine.
Des acides nucléiques conformes à l'invention, et en particulier des ADNc de penaeidine, ou des portions de ceux-ci peuvent être obtenus par criblage de banques d'acide nucléique à l'aide d'oligonucléotides dérivés des séquences représentées sur les figures 1, 2, ou 3, ou de leurs séquences complémentaires.
Des acides nucléiques conformes à l'invention englobent également des cassettes d'expression, comprenant au moins une séquence d'acide nucléique codant pour une penaeidine ou un fragment de celle-ci, sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur approprié.
2. Vecteurs convenant à une transformation autre qu'avec Agrobacterium Une transformation n'utilisant pas Agrobacterium tumefaciens évite d'utiliser des séquences d'ADN-T dans le vecteur de transformation choisi, de sorte que des vecteurs ne comportant pas ces séquences peuvent être utilisés, en plus des vecteurs tels ceux qui sont décrits ci-dessus et qui contiennent des séquences d'ADN-T. Les techniques de transformation qui ne se fondent pas sur Agrobacterium comprennent une transformation par bombardement de particules, l'absorption de protoplastes (par exemple PEG et électroporation), et la micro-injection.
Le choix du vecteur dépend grandement du choix préféré de l'espèce soumise à transformation. a. pCIB3064 Le pCIB3064 est un vecteur dérivé du pUC, pouvant être utilisé dans les techniques de transfert direct de gènes en combinaison avec une sélection par l'herbicide basta (ou phosphinothricine). Le plasmide pCIB246 comprend le promoteur 35S du CaMV, en fusion opérationnelle avec le gène GUS de E. coli et le terminateur de transcription 35S du CaMV, et est décrit dans la demande PCT publiée sous le numéro WO 93/07278. Le promoteur 35S de ce vecteur contient deux séquences ATG, dans la direction 5' à partir du site de départ. Ces sites sont mutés par utilisation de techniques classiques d'amplification PCR, de façon à éliminer les ATG et produire les sites de restriction SspI et PvuII. Les nouveaux sites de restriction sont situés à 96 et 37 pb du site SalI unique, et à 101 et à 42 pb du site effectif de départ. Le dérivé obtenu du pCIB246 est appelé pCIB3025. Le gène GUS est ensuite excisé du pCIB3025 par digestion par SalI et SacI, les sites terminaux reçoivent des extrémités franches et sont religaturées pour produire le plasmide pCIB3060. Le plasmide pJIT82 est obtenu auprès de John Innes Center, Norwich, et le fragment SmaI de 400 pb contenant le gène bar provenant de Streptomyces viridochromogenes est excisé et inséré dans le site HpaI du pCIB3060 (Thomson et al., EMBO J 6:2519-2523 (1987)). Ce pCIB3064 ainsi produit comprend le gène bar sous le contrôle du promoteur 35S du CaMV et le promoteur de sélection vis-à-vis des herbicides, un gène de résistance à l'ampicilline (pour sélection dans E. coli) et un lieur multisite, comportant les sites uniques SphI, Psti, HindIII et PainHi. Ce vecteur permet le clonage de cassettes d'expression de végétaux contenant leurs propres signaux régulateurs. b. pSOG19 et pSOG35 Le pSOG35 est un vecteur de transformation qui utilise la dihydrofolate-réductase (DFR) du gène de E. coli en tant que marqueur sélectionnable conférant une résistance au méthotrexate. On utilise une amplification PCR pour amplifier le promoteur 35S (-800 pb), l'intron 6 provenant du gène Acide du maïs (-550 pb), et 18 pb de la séquence de tête non traduite GUS provenant du pSOG10. Un fragment de 250 pb, qui code le gène de type Il de la dihydrofolate-réductase de E. coli est lui aussi amplifié par amplification PCR, et ces deux fragments PCR sont assemblés à un fragment SacI-PstI provenant du pB1221 (Clontech), qui comprend le squelette du vecteur pUC19 et le terminateur de la nopaline-synthase. L'assemblage de ces fragments produit le pSOG19, qui contient le promoteur 35S en fusion avec la séquence de l'intron 6, la séquence de tête GUS, le gène du DHFR et le terminateur de la nopaline-synthase. Le replacement de la séquence de tête GUS dans le pSOG19 par la séquence de tête provenant du virus de la marbrure chlorotique du maïs (MCMV) produit le vecteur pSOG35. Le pSOG19 et le pSOG35 portent le gène du pUC de résistance à l'ampicilline et possèdent les sites HindIII, SphI, PstI et EcoRi, qui permettent le clonage de substances étrangères.
B. Exigences portant sur la synthèse de cassettes d'expression végétale Les séquences géniques que l'on veut exprimer dans les plantes transgéniques sont d'abord assemblées en cassettes d'expression, en arrière d'un promoteur approprié de niveau élevé d'expression, et en amont d'un terminateur approprié de transcription. Ces cassettes d'expression peuvent ensuite être facilement transférées dans les vecteurs de transformation végétale décrits cidessus.