INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Une telle composition thérapeutique peut comprendre un polynucléotide nu , comme par exemple un ADN double brin comprenant une cassette de régulation selon l'invention. L'utilisation d'ADN nu à visée thérapeutique ou vaccinale chez l'homme ou l'animal est par exemple décrie dans la demande N WO 90/11092 (VICAL Inc. ), dans la demande N WO 95/11307 (Intitut Pasteur, INSERM, Université d'Ottawa), ainsi que dans les articles de Tacson et al. (1996) ou encore Huygen et al. (1996). De telles compositions thérapeutiques sont préférentiellement administrées par voie locale, principalement intra-musculaire.
Selon un mode avantageux de la présente invention, un vecteur recombinant rétroviral selon l'invention est utilisé pour transformer des cellules de mammifères, préférentiellement des cellules musculaires.
Les cellules musculaires du patient à traiter peuvent être transfectées in vitro, puis réimplantées chez le patient, dans le muscle ou dans un autre compartiment ou tissu de l'organisme selon la maladie à traiter. Dans ce cas, les cellules musculaires transfectées //; vilro peuvent, préalablement à leur réimplantation chez le patient, être ensemencées sur un support ou implant que ces cellules vont d'abord coloniser avant introduction de l'implant dans le corps du patient.
Un implant pouvant avantageusement être utilisé peut être constitué d'un support biocompatible destiné à l'ancrage des cellules transfectées, associé à un composé permettant la gélification des cellules sur cet implant. Un tel support biocompatible est avantageusement constitué de corail ou de poudre d'os ou encore de fibres polymères synthétiques, par exemple des fibres de polytétrafluoroéthylène (demande de brevet français N 97 04 700 - Danos et al.).
En conséquence, la présente invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle contient une quantité pharmaceutiquement efficace d'une cassette, d'un vecteur ou d'un hôte cellulaire selon l'invention, éventuellement associé à un ou plusieurs excipients pharmaceutiquement compatibles.
L'invention vise aussi l'utilisation d'une cassette, d'un vecteur ou d'un hôte cellulaire selon l'invention pour la fabrication d'un médicament à usage humain ou vétérinaire.
La cassette de régulation selon l'invention a permis aux inventeurs de réaliser des animaux transgéniques contenant une telle cassette de régulation.
En particulier, les inventeurs ont mis au point des souris transgéniques contenant dans leurs cellules une cassette de régulation comprenant à la fois la séquence de régulation intronique, la séquence de régulation 3' et le promoteur MLC3F, ces éléments régulateurs contrôlant l'expression d'un acide nucléique hétérologue A titre illustratif d'animaux transgéniques entrant dans la portée de la présente invention, les inventeurs ont réalisé des souris transgéniques comprenant une cassette de régulation dans laquelle l'acide nucléique hétérologue code pour un gène rapporteur, en l'occurence le gène de la beta-galactosidase associé avec une séquence de localisation nucléaire (nLacZ).
Des animaux transgéniques tels que décrits ci-dessus peuvent avantageusement être utiles comme modèles expérimentaux destinés à l'étude de pathologics particulières liées à une déficience ou une aberration de l'expression d'un gène endogène, par exemple d'un gène fortement et/ou exclusivement exprimé naturellement dans les cellules musculaires, et encore plus particulièrement dans les cellules des fibres rapides des muscles.
L'invention a donc aussi pour objet un animal transgénique caractérisé en ce que ses cellules somatiques et/ou ses cellules germinales comprennent une cassette de régulation ou un vecteur recombinant selon l'invention.
Selon un mode de réalisation particulier, l'animal transgénique peut être obtenu par introduction dans les cellules de l'animal à un stade de développement précoce embryonnaire, par exemple ne dépassant pas 64 cellules (stade blastocyte), d'une cassette de régulation de l'invention, dans des conditions permettant l'expression des propriétés fonctionnelles de ladite cassette de régulation.
L'intégration dans des cellules de la cassette de régulation de l'invention est avantageusement réalisée dans les premiers stades de développement embryonnaire, et ce afin d'assurer chez l'animal développé la transformation de l'ensemble ou de la presque totalité de ces cellules, y compris de ses cellules germinales.
Différentes techniques sont disponibles pour réaliser l'insertion d'une cassette de régulation selon l'invention au niveau des cellules d'un embryon animal. A cet égard, on fait notamment référence à la description donnée dans les exemples de la présente description ou à la publication de Brinster et al. (1985) ou encore au brevet européen N 0 419 621 (Institut Pasteur).
Un animal intéressant dans le cadre de l'invention peut être l'animal résultant du développement de l'embryon que l'on a transformé pour y introduire la cassette de régulation d'intérêt. Il peut s'agir également d'un descendant d'un tel animal.
Des animaux intéressants dans le cadre de l'invention sont, par exemple, des mammifères et en particulier des rongeurs tels que des souris ou des rats. On pourra également avoir recours à des animaux appartenant aux espèces bovines, ovines ou porcines.
L'invention a pour objet également un procédé d'obtention d'un animal transgénique comprenant dans ses cellules somatiques et/ou dans ses cellules germinales une cassette de régulation selon l'invention, ledit procédé comprenant une étape d'introduction d'une cassette de régulation ou d'un vecteur selon l'invention, dans les
cellules de l'animal, à un stade précoce du développement embryonnaire, par exemple ne dépassant pas 64 cellules (stade blastocyte).
Un polynucléotide thérapeutique nu tel que défini ci-dessus peut être injecté dans l'hôte après couplage avec des composés capables de faciliter la pénétration de celui-ci dans les cellules ou encore son transport jusqu'au noyau cellulaire. Les produits conjugués résultants peuvent être encapsulés dans des microparticules, comme décrit dans la demande N WO 94/27238 (Medisorb Technologies International).
Selon un autre aspect des compositions thérapeutiques selon l'invention, l'ADN nu ou polynucléotide thérapeutique est introduit dans les cellules de l'hôte après
complexation avec du DEAE-dextran (Pagano et al., 1967) ou avec des protéines nucléaires (Kaneda et al., 1989), avec des lipides (Felgner et al., 1987) ou encore encapsulés dans des liposomes (Fralcy et al., 1980).
Dans un autre mode de réalisation d'une composition thérapeutique selon l'invention, le polynucléotide thérapeutique peut être inclus dans un système de transfection comprenant des polypeptides facilitant sa pénétration dans les cellules hôtes, comme décrit dans la demande N WO 95/10534 (Seikagaku Corporation).
Le polynucléotide thérapeutique ou le vecteur recombinant de l'invention peut avantageusement être administré sous la forme d'un gel qui facilite sa transfection dans les cellules. Une telle composition sous forme de gel peut être un complexe de poly-Llysine et de lactose, tel que décrit par Midoux et al. (1993) ou encore le Poloxamer 407TM, tel que décrit par Pastore et al. (1994). Le polynucléotide thérapeutique selon l'invention peut également se présenter en suspension dans une solution tampon pharmaceutiquement compatible ou encore associé à des liposomes.
Ainsi, le polynucléotide thérapeutique et le vecteur recombinant sont utiles pour la préparation de compositions pharmaceutiques destinées à apporter une cassette de régulation selon l'invention au niveau du site de l'injection.
La quantité de vecteur ou de polynucléotide thérapeutique à injecter peut varier en fonction du site de l'injection. A titre illustratif d'une dose thérapeutiquement efficace, il sera injecté une quantité variant de 0,1à 100 g de polynucléotide thérapeutique ou de vecteur recombinant chez l'homme ou l'animal Dans un autre mode de réalisation du polynucléotide thérapeutique de l'invention, ledit polynucléotide peut être introduit in vitro dans une cellule hôte, de préférence une cellule musculaire, et préférentiellement une cellule hôte préalablement prélevée chez le patient à traiter. Dans une étape ultérieure du procédé, les cellules ayant été transformées avec le polynucléotide thérapeutique selon l'invention sont réimplantées dans le corps du patient de manière à ce que le polypeptide ou l'ARN d'intérêt soit produit dans le corps du patient, soit localement, soit de manière systémique.
Dans encore un autre mode de réalisation d'un vecteur recombinant selon l'invention, ce dernier peut comprendre des séquences permettant la recombinaison homologue chez l'organisme traité, spécifique du gène à remplacer, lesdites séquences étant placées en amont et en aval de la cassette de régulation selon l'invention. Du fait de la présence de telles séquences, le gène non désiré, présent dans l'organisme traité, sera remplacé par le gène porté par le vecteur recombinant où la cassette de régulation dont on recherche l'expression dans l'organisme hôte. Une telle méthode de recombinaison
homologue peut être du type de celle décrite par Le Mouellic et al. (1990) ou encore dans la demande PCT N WO 91/06667.
Selon un autre aspect d'un vecteur recombinant selon l'invention, ledit vecteur peut être un vecteur dérivé d'un adénovirus. Des adénovirus adaptés à la mise en oeuvre de la présente invention sont en particulier ceux décrits par Feldman et al. (1996), Ohno et al. (1994) ou encore dans la demande de brevet français N 94 03 151 (Institut Pasteur, INSERM). Un autre adénovirus recombinant utilisable dans la préparation d'une composition thérapeutique est l'adénovirus décrit par Ohwada et al. (1996) ou l'adénovirus humain de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou encore un adénovirus d'origine animale, tel que décrit dans la demande de brevet français N 93 05 954 (Danos et al.).
Parmi les adénovirus d'origine animale, peuvent être cités les adénovirus d'origine canine (CAV2, souche Manhattan ; adénovirus A26/61 [ATCC N VR-800] ), d'origine bovine, d'origine murine (tel que Mavl ; Beard et al., 1980) ou encore d'origine simienne (SAV).
D'autres adénovirus recombinants de l'invention consistent en des adénovirus défectifs qui peuvent être préparés selon une technique bien connue de l'homme du métier, par exemple la technique décrite par Levrero et al. (1991) ou par Graham (1984) ou encore dans la demande de brevet européen N 0 185 573 ou dans la demande N WO 95/14785.
Les vecteurs adénoviraux classiquement utilisés conservent plus de 80 % du matériel génétique viral parental. Les systèmes vecteurs dits de seconde génération contiennent les séquences minimales de régulation, d'empaquetage et de réplication adénovirale et peuvent être utilisés avantageusement dans le cadre de l'invention pour l'expression de polynucléotides hétérologues de grande taille. Ces vecteurs sont appelés pseudo-adénovirus (PAV) et ont été décrits notamment dans la demande PCT N WO 94/12649.
D'autres vecteurs recombinants utilisables dans le cadre de la présente invention sont les adénovirus associés ou AAV, qui sont des virus naturellement défectifs nécessitant, pour leur réplication, la présence d'un autre virus dit virus auxilliaire tel qu'un adnéovirus ou un virus de l'Herpès. De tels adénovirus associés sont par exemple décrits par Muzyczka et al. (1992), Flotte et al. (1992), Samulski et al. (1989), McLaughlin et al. (1989) ou encore par Halbert et al. (1995).
Selon un autre aspect de l'invention, un vecteur recombinant de l'invention utilisable dans un procédé de thérapie cellulaire somatique consiste en un vecteur rétroviral, par exemple le vecteur décrit dans la demande N WO 92/15676, un vecteur
dérivé du rétrovirus Mo-MuLV, tel que décrit par Roth et al. (1996), ou celui décrit dans la demande N WO 94/24298 (Institut Pasteur).
Fait aussi partie de l'invention un animal transgénique tel qu'obtenu par introduction dans les cellules de l'animal à un stade de développement précoce embryonnaire, par exemple ne dépassant pas 64 cellules, une cassette de régulation ou un vecteur recombinant selon l'invention.
L'invention concerne également un procédé d'utilisation d'une cassette de régulation selon l'invention, caractérisé en ce que : a) on insère facultativement ladite cassette de régulation dans un vecteur d'expression ; b) on introduit la cassette de régulation ou le vecteur recombinant obtenu à l'étape a) dans une cellule eucaryote, telle qu'une cellule embryonnaire ou encore une cellule musculaire de mammifère.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans les exemples et les figures suivants : FIGURES Figure 1 (a) Structure du locus MLCIF/3F murin, montrant la structure exon-intron, les profils d'épissage de MLC1F (ligne ombrée) et MLC3F (ligne discontinue), ainsi que les positions respectives de la séquence activatrice intronique (boîte ombrée) et de la séquence activatrice 3' (boîte vide).
(b) Constructions d'ADN contenant une séquence codant pour la protéine de fusion MLC3F-nlacZ contenant différentes associations entre la séquence activatrice intronique et la séquence activatrice 3'. La séquence nlacZ est clonée en phase avec l'exon 2 spécifique de MLC3F (Kelly et al., 1995).
(c) Valeurs de l'activité beta-galactosidase dans des cellules de myotube C2/7 (moyenne et écart-type) observées avec les constructions 3F-rrlacZ présentées figure 1 b après transfection transitoire. Les valeurs d'activité beta-galactosidase sont exprimées par rapport au niveau d'activité observée avec la construction 3F-nlacZ-9 (fixé arbitrairement à la valeur 100).
Figure 2 (a) L'effet de synergie requiert des séquences du promoteur MLC3F. Valeurs d'activité beta-galactosidase dans des myotubes C2/7 transfectés avec des constructions MLC1F-rrlacZ. Les valeurs sont exprimées par rapport au niveau d'activité observée avec la construction 1 F-nlacZ-1.6 (arbitrairement fixé à la valeur 1).
Les valeurs absolues d'activité beta-galactosidase des cultures de cellules transfectées avec les constructions 1F-nlacZ sont plus faibles que celles des cultures de cellules transfectées avec les constructions 3F-nlncZ représentées à la figure 1 (b) Activité de la séquence activatricc intronique et de la séquence activatrice 3' sur la transcription partir du promoteur hétérologue TK. Les valeurs d'activité CAT sont représentées par rapport à l'activité observée avec la construction TK-CAT (arbitrairement fixée à 1). Sont représentées les valeurs moyennes de plusieurs expériences ainsi que la valeur de l'écart-type.
Figure 3 : Analyse quantitative de l'expression du transgène dans les tissus adultes des souris ayant reçu la construction 3F-nlacZ-E9.
(a) Les valeurs moyennes et l'écart-type (SEM) des valeurs d'activité betagalactosidase sont indiquées pour différents tissus adultes des lignées de souris transgéniques à E9-8 et E9-13. Les activités sont exprimées, en ordonnées, sur une échelle logarithmique des unités lumineuses relatives (rlu) par g d'extrait protéique purifié à partir du muscle squelettique (exlcensor digitorum fongus (EDL), soleus (SOL), masseter superficiel (MASS), rein (KID) et muscle venticulaire gauche cardiaque (LV). Au moins quatre adultes (2-6 mois) hétérozygotes ont été testés par lignée de souris transgénique. Les valeurs d'activités dans les muscles EDL et SOL ont été déterminées pour deux muscles pour chaque animal testé et sont représentées comme la moyenne +/l'écart-type (SEM) d'au moins huit muscles. Les valeurs de bruit de fond d'activité betagalactosidase dans les souris adultes non transgéniques sont indiquées par des lignes brisées et représentent les extrêmes supérieur et inférieur (pour KID et EDL, respectivement).
(b) Analyse northern de l'accumulation des ARNm de MLC3F endogène et transgénique dans les muscles EDL de souris transgéniques de différentes lignées ayant reçu une construction contenant le promoteur MLC3F et respectivement : - la séquence activatrice 3' (2E) ; - la séquence activatrice intronique et la séquence activatrice 3' (E9) , - aucune des deux séquences activatrices.
Piste 1 : lignée 1 de souris contenant la construction MLC3F-nlacZ-2E ; Piste 2 : lignée 2 de souris contenant la construction MLC3F-nlacZ-2E ; Piste 3 : lignée 8 de souris contenant la construction MLC3F-n/acZ-E9 ; Piste 4 : lignée 13 de souris contenant la construction MLC3F-ulacZ-E9 , Piste 5 lignée 5 de souris contenant la construction MLC3F-/;tocZ-2 ; Piste 6 : lignée 8 de souris contenant la construction MLC3F-nlacZ-2 ;
Piste 7 : lignée 1 de souris contenant la construction MLC3F-nlacZ-2 ; Piste 8 : lignée de souris non transgénique témoin négatif; Piste 9 : acides nucléiques marqueurs.
La sonde nucléique 5'UTR hybride de façon équivalente avec les transcrits MLC3F provenant du transgène (Tg) et avec les transcrits endogènes (endog).
(c) Comparaison des valeurs d'activité beta-galactosidase dans différentes lignées de souris 3F-nlacZ, ces valeurs étant exprimées par nombre de copies du transgène dans les muscles EDL (C) ; et (d) dans les muscles cardiaques du ventricule gauche.
Figure 4 : Analyse quantitative de l'expression du transgène dans les embryons à 12,5 jours (E12,5).
(a) Les valeurs moyennes d'activité beta-galactosidase (+/- SEM) sont exprimées, en ordonnées, comme le nombre d'unités lumineuses relatives (rlu) par g d'extrait protéique des pattes antérieures (FL), des pattes postérieures (HL), du tronc sans tube neural (T) et des ventricules (H). Au moins 7 embryons provenant de deux génitrices différentes ont été testés, à l'exception des embryons de la lignée 8 3F-nlacZE9 et de la lignée 9-a 3F-nlacZ-E9 (analyse de 5 embryons provenant d'une génitrice unique pour ces lignées). Les valeurs de bruit de fond d'activité beta-galactosidase dans les embryons non transgéniques sont indiquées par des lignes brisées et représentent les extrêmes supérieur et inférieur (respectivement T et H).
Stéarate de glycérol et Stéarate PEG 100 6,0 % Alcool oléique 1,5 % Stéarate de glycérol 2,0 % Steareth-2 2,0 % Beurre de Karité 3,0 % Diméthicone 4,0 % Triglycéride caprylique/caprique 8,0 % Propylparaben 0,1 % Acétate de tocophérol 0,1 % Fraction B :
Eau 60,8 % Elastab 388 (Laboratoires Sérobiologiques) 2,5 % Extrait (methanol 80 %) de Byrsonima verbascifolia 1,5 % Extrait éthanolique d'Astrocaryum vulgare 1,5 % Propylène glycol 5,0 % FractionC : Polyacrylamide et Isoparaffine et Laureth 7 2,0 %
Le procédé de fabrication de cette émulsion consiste à préparer séparément les fractions A et B à 75 C, à ajouter la fraction A dans la fraction B sous agitation turbine à 75 C, à laisser refroidir le mélange à 50 C, à ajouter ensuite la fraction C et, enfin, à refroidir le mélange final à température ambiante.
5 10 15 20 25 Un produit cosmétique sous forme de crème de jour anti-rides et anti-vieillissement multiactive pourra, par exemple, présenter la composition pondérale suivante : Fraction A :
Stéarate de glycérol 14,0 % Octyldodécanol 16,0 % Adipate de dibutyle 6,0 % Ceteareth 12 1,5 % Ceteareth 20 1,5 % Fraction B :
Propylène glycol 5,0 % Extrait aqueux d'Inga bourgoni 3,25 % Extrait (éthanol 50 %) de Sabicea cinerea 1,0 % Extrait éthanolique d'Eperua falcata 0,75 % Elastab 4112 (Laboratoires Sérobiologiques) 0,4 % Eau 50,6 % Fraction C :
Parfum 0,3 %
Le procédé de fabrication de cette crème consiste à préparer séparément les fractions A et B à 80 C sous agitation, à ajouter la fraction A dans la fraction B sous agitation turbine, à laisser refroidir le mélange à 45 C, à ajouter ensuite la fraction C et enfin à ramener le mélange final à température ambiante.
Le domaine de la présente invention est celui de la séparation chirale et plus particulièrement des composés utiles à cette fin. Ces composés, possédant des propriétés de résolution chirale, constituent les phases stationnaires chirales (PSC) utilisées dans les techniques chromatographiques de séparation d'énantiomères, par exemple la chromatographie liquide haute performance. Les performances des PSC en reconnaissance et en rétention chirale sélective sont au coeur de ces techniques de séparation.
La présente invention concerne de nouveaux esters de composés polyhydroxylés, de préférence de polysaccharides, susceptibles d'être utilisés comme phases stationnaires chirales (PSC), mais également comme moyens d'enrichissement chiral et comme systèmes médicamenteux à libération prolongée et contrôlée de principes actifs chiraux enrichis.
L'invention a également pour objet la préparation de ces nouveaux esters de polysaccharides chiraux.
La présente invention vise, par ailleurs, per se : # de nouveaux moyens d'enrichissement chiral, # de nouveaux systèmes médicamenteux de libération prolongée et contrôlée de principes actifs, # et de nouvelles phases stationnaires chirales ; comprenant les esters polysaccharidiques chiraux selon l'invention.
Depuis quelques années, les composés optiquement actifs font l'objet d'un vif intérêt dans de nombreux domaines dont ceux relatifs aux produits pharmaceutiques, aux produits naturels, aux produits agrochimiques, aux cristaux liquides ferro-électriques, etc.. Cette tendance est allée de pair avec le développement des techniques de préparation, de purification et d'analyse des énantiomères.
S'agissant plus spécialement du domaine pharmaceutique, le fait que les systèmes vivants soient constitués de molécules et macromolécules chirales, telles que les protéines, les acides nucléiques et les polysaccharides, entraîne une sensibilité variable de ces organismes vivants vis-à-vis de médicaments chiraux selon que le principe actif est un énantiomère pur et/ou un racémique. C'est ainsi que sont apparus les médicaments chiraux comprenant un seul isomère optique à titre de principe(s) actifs).
Ces médicaments chiraux sont souvent plus efficaces sous forme énantiomériquement pure que sous forme racémique. L'investigation détaillée de la pharmacocinétique, de la physiologie, de la toxicologie et de l'activité métabolique des médicaments chiraux,
de la résistance mécanique du feuillard constituant la majeure partie du ruban de scie.
Cependant, dans les machines à scier de type connu, la productivité est limitée par la tendance au glissement du ruban de scie au contact du volant motorisé
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lorsqu'on augmente la puissance du motoréducteur d'entraînement du volant motorisé. Cette limitation est particulièrement sensible lorsque l'on utilise, au lieu d'un ruban de scie en acier rapide, un ruban de scie avec des pointes de dents en carbure de tungstène. On constate alors que, malgré l'augmentation ou le doublement de la puissance d'entraînement du volant motorisé, la productivité est limitée par le glissement sur le volant motorisé, quelle que soit la tension appliquée au ruban de scie et quelle que soit laugmentation de puissance du motoréducteur d'entraînement L'invention a pour but de remédier à ces inconvénients, en proposant un nouveau dispositif dans lequel la surface d'entraînement du ruban de scie est augmentée, tout en maintenant celui-ci sous la tension requise voisine de la limite de
la résistance mécanique du feuillard du ruban de scie.
L'invention a pour objet un dispositif pour le sciage des métaux par ruban de scie du type comportant: un ensemble mobile de travail comprenant le ruban de scie et son dispositif d'entraînement, ainsi que des moyens d'amenée de métaux en barres sous ledit ensemble mobile en vue de leur sciage, caractérisé en ce que rensemble mobile de travail comporte au moins deux volants motorisés d'entraînement du ruban de scie situés de part et d'autre du passage des barres à scier, de manière à augmenter
la surface d'entraînement du ruban de scie tout en maintenant celui-ci sous tension.