INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Parmi ces polyalkylsiloxanes, on peut citer à titre non limitatif les produits commerciaux suivants - les huiles SILBIONE des séries 47 et 70 047 ou les huiles MIRASIL commercialisées par RHONE POULENC telles que par exemple l'huile 70 047 V 500 000; - les huiles de la série MIRASIL commercialisées par la société RHONE POULENC; - les huiles de la série 200 de la société DOW CORNING telles que plus particulièrement la DC200 de viscosité 60 000 Cst; - les huiles VISCASIL de GENERAL ELECTRIC et certaines huiles des séries SF (SF 96, SF 18) de GENERAL ELECTRIC.
On peut également citer les polydiméthylsiloxanes à groupements terminaux diméthylsilanol (Dimethiconol selon la dénomination CTFA) tels que les huiles de la série 48 de la société RHONE POULENC Dans cette classe de polyalkylsiloxanes, on peut également citer les produits commercialisés sous les dénominations "ABIL WAX 9800 et 9801" par la société GOLDSCHMIDT qui sont des polyalkyl (C,-C20) siloxanes.
Pour fixer le module électronique dans le corps de carte, on peut déposer quelques gouttes d'adhésif, du type cyanoacrylate par exemple, dans la cavité, puis insérer ledit module dans ladite cavité, et enfin exercer une force de pressage sur le module électronique.
La mise en contact forcé du module et du corps de carte permet d'obtenir un film d'adhésif mince et homogène. Cependant, les déformations résiduelles du module électronique, découpé par exemple d'une bande continue par un dispositif poinçon matrice, et de la cavité réalisée par moulage par exemple, s'opposent, une fois la force de pressage relachée, à l'immobilité de l'assemblage, condition essentielle pour obtenir les pleines performances de l'adhésif.
Le temps de polymérisation au bout duquel les performances mécaniques sont supérieures à 80% de celles obtenues avec un temps de pressage très long est voisin de 60 secondes.
D'une manière générale, la capacité horaire de production du procédé diminue lorsque le temps de pressage augmente.
C'est pourquoi le temps de pressage choisi doit réaliser un compromis entre les performances mécaniques du joint d'adhésif et la capacité horaire de production. I1 ne doit pas être trop court pour ne pas hypothéquer la qualité du collage, mais il ne doit pas être trop long pour assurer une cadence de production suffisante.
Toutefois, cette solution de compromis n'est pas satisfaisante car un changement de matériaux, une variation des états de surface et des conditions atmosphériques modifient la réaction de l'adhésif et peut entrainer des amorces de décollement, on sait en particulier que l'humidité favorise le démarrage de la polymérisation. Il en résulte que le suivi statistique du procédé d'insertion connu n'est pas possible et que de grandes quantités de cartes doivent être testées afin de garantir le collage.
Aussi, le problème technique à résoudre par l'objet de la présente invention est de proposer un procédé d'insertion d'un module électronique sur un substrat thermoplastique dans une cavité aménagée dans un corps de carte à mémoire électronique en matériau thermoplastique, procédé qui réaliserait un temps de pressage équivalent infini, tout en diminuant le temps d'insertion à quelques centaines de milliseconde et en optimisant les performances mécaniques de l'adhésif.
La solution au problème technique posé est obtenue, selon la présente invention, du fait que ledit procédé comporte les étapes consistant à a)déposer dans ladite cavité un adhésif destiné à coller le substrat thermoplastique du module électronique sur le matériau thermoplastique du corps de carte, b)disposer le module électronique dans la cavité, c)appliquer, simultanément, une force de pressage sur le module électronique, et une énergie ultrasonore sur le matériau thermoplastique de la cavité en contact avec le substrat thermoplastique du module électronique.
Ainsi, on comprend que l'énergie ultrasonore soude de façon définitive le substrat thermoplastique du module dans la cavité, ce qui a pour effet de maintenir la force de pressage pendant un temps infini et donc de permettre une polymérisation dans des conditions idéales conduisant à des performances mecaniques optimales du joint d'adhésif. Par contre, l'immobilisation de la carte au poste de pressage/soudure aux ultrasons peut être limitée au seul temps nécessaire pour réaliser la soudure qui, compte tenu des faibles quantités de matière mises en jeu, est très court, de l'ordre de quelques dixièmes de seconde. La polymérisation complète sous pression de l'adhésif, qui peut atteindre des durées voisines de 60 secondes, s'effectue en temps masqué au cours des étapes suivantes de fabrication de la carte.
On voit donc que, tout en réduisant la duree de l'opération d'insertion, le procédé conforme à l'invention permet d'atteindre les pleines performances mécaniques de I'adhésif, ceci sans remettre en cause de manière fondamentale le matériel existant et avec l'avantage de diminuer le taux de prélèvements de test de conformité.
Selon un mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention, il est prevu que, préalablement à l'étape a), on amenage dans ladite cavité des concentrateurs d'énergie ultrasonore, destinés à venir en contact avec le substrat thermoplastique du module électronique.
Le rôle desdits concentrateurs d'énergie est de réduire le niveau d'énergie ultrasonore nécessaire au soudage du module dans la cavité à une valeur inférieure à 100 millijoule. De ce fait, l'état de surface au dos de la carte n'est pas détérioré.
Ajoutons enfin que, selon le mode de fabrication de la carte, les concentrateurs d'énergie ultrasonore sont réalisés par moulage, avec le corps de carte ou par usinage, avec la cavité. Dans une variante, lesdits concentrateurs seront sur le module électronique La description qui va suivre, en regard des dessins annexés, donnés à titre d'exemples non limitatifs, fera bien comprendre en quoi consiste l'invention et comment elle peut être réalisée.
La figure 1 est une vue en coupe partielle d'un corps de carte avant insertion du module électronique.
La figure la est une vue de dessus du corps de carte de la figure 1.
La figure 2 est une vue en coupe partielle du corps de carte de la figure 1 pendant l'insertion du module électronique.
EXEMPLE 1 : PREPARATION DE BACULOVIRUS RECOMBINANTS EXPRIMANT UN RECEPTEUR COUPLE AUX PROTEINES G Un baculovirus recombinant exprimant ss2AR est obtenu en clonant une séquence d'ADN constituée par l'ADNc de ss2AR en fusion avec l'épitope c-myc, obtenue comme décrit par MOUILLAC et al. [J. Biol. Chem., 267, 21733-21737 (1992)], au site NheI du vecteur de transfection/recombinaison pJVNheI(commercialisé par la société INVITROGEN). Ce vecteur a été transfecté avec le génome linéarisé d'un baculovirus AcMNPV (commercialisé par la société INVITROGEN) dans des cellules Sf9 ; le baculovirus recombinant obtenu de la sorte est dénommé cmyc-2AR.
De la même manière, on a cloné la séquence codant pour le récepteur muscarinique M1 et la séquence codant pour le récepteur dopaminergique D1 [respectivement décrites par ALLARD et al. Nucleic Acid Research, 15, p 10604, (1987) et par DEARRY et al., Nature, 347, p 72, (1990)] pour obtenir les baculovirus recombinants (respectivement dénommés M1-R et D1-R) exprimant ces récepteurs.
a) Culture et infection des cellules, et récolte des baculovirus extracellulaires Des cellules Sf9 sont cultivées à 27 0C dans des flacons de culture en suspension de 100 ml (BELLCO GLASS) en milieu de GRACE supplémenté (GIBCO) contenant 10% de sérum de veau foetal (FBS), et 0,001% d'acide pluronique. 60 ml de suspension de cellules (2x106/ml) sont infectées avec le baculovirus recombinant exprimant ss2AR, D1, ou M1, à une multiplicité d'infection variant entre 2 et 5.
Les cellules sont récoltées par centrifugation à 500 x g pendant 5 min. à 40C.
Les particules virales sont isolées après récolte des cellules, par centrifugation du surnageant de culture à 45,000xg pendant 20 min. à 40C. Les culots obtenus sont resuspendus à 40C dans un volume de tampon phosphate salin (PBS) égal à 1/10éme du volume de la culture initiale, et centrifugés à 500xg, pendant 5 minutes à 40C ; le surnageant de cette centrifugation à 500xg est à nouveau centrifugé à 45,000xg pendant 20 mm à 40C.
b) Purification des particules de baculovirus sur gradient de saccharose Le culot de particules virales obtenu à partir de 100 ml de cultures de cellules Sf9 infectées par le baculovirus recombinant exprimant B2AR, M1, ou D1, est resuspendu dans 1,2 ml de solution TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,4), en présence d'inhibiteurs de protéases).
La suspension est déposée au sommet d'un tube contenant un gradient linéaire (25%-56%) de saccharose en solution TE. Les tubes sont centrifugés à 100,000xg pendant 90 minutes. Le gradient est collecté du sommet au fond du tube, en 20 fractions. La première fraction a un volume de 1,4 ml, et les 19 autres sont de 500R1.
EXEMPLE 2 : MISE EN EVIDENCE DE L'ACTIVITE ss2AR DANS LES BACULOVIRUS RECOMBINANTS EXTRACELLULAIRES Les cellules Sf9 infectées par le baculovirus recombinant exprimant ss2AR sont mises en culture, et les baculovirus sont récoltés comme décrit à l'exemple 1 a), 24 heures, 48 heures, 72 heures, 96 heures, et 120 heures après l'infection.
L'activité des récepteurs ss2AR est évaluée par des mesures de saturation et de liaison compétitive effectuées comme décrit par BOUVIER et al.[Mol.
Pharmacol. 33 :133-139 (1982)] en utilisant du [l25I]- iodocyanopindolol ([1251]ICYP) comme ligand marqué.
Les culots de particules virales obtenus sont resuspendus à 40C dans le tampon qui sera utilisé pour la réaction. Des aliquotes de cette supension de particules virales, correspondant à 0,2 à 1 Rg de protéines sont mélangés avec 5 à 350 pM de radioligand [125I]ICYP dans un volume final de soogl. La liaison non-spécifique est évaluée en utilisant 10 wu d'alprénolol.
Dans ces conditions, l'activité ss2AR est détectée dans les surnageants des cultures cellulaires à partir de 48 heures après l'infection, atteint son maximum 72 heures après l'infection, et reste constante jusqu'à 120 heures après l'infection.
Ces résultats sont illustrés par la Figure 1.
Cette figure montre également les résultats obtenus, dans les mêmes conditions expérimentales, sur des surnageants de cultures de cellules infectées à la fois avec le baculovirus recombinant c-myc-B2AR, et un baculovirus recombinant exprimant la protéine Gag de HIV ( - = ss2AR ; = ss2AR + Gag). On constate que contrairement à ce qui était initialement attendu, la présence de la protéine Gag n'augmente pas la quantité de ss2AR dans les surnageants de culture.
On constate également que l'activité ss2AR détectée dans les surnageants ne provient pas de la lyse cellulaire, dans la mesure où cette activité apparaît 48 heures après l'infection, c'est à dire à un moment où la majorité des cellules infectées sont encore viables, et n'augmente pas entre 72 et 120 heures après l'infection, malgré la lyse cellulaire importante qui se produit à ce moment là.
La nature des particules du surnageant portant l'activité ss2AR a été vérifiée par microscopie électronique, après marquage de ces particules à l'aide d'un anticorps dirigé contre l'antigène c-myc, ou d'un anticorps dirigé contre le récepteur ss2AR. Il a ainsi été constaté que les particules reconnues par l'un ou l'autre de ces anticorps sont des bâtonnets de 15 x 100 nm, ce qui correspond à des baculovirus extracellulaires.
La solution aqueuse ajoutée à l'étape (b) est de préférence de l'eau, et est ajoutée au mélange des deux constituants dans une proportion d'environ 100 à 2000 Al par mg desdits premier et deuxième constituants.
Selon une forme préférée de mise en oeuvre du procédé de l'invention, le mélange de l'étape (a) est réalisée et maintenue jusqu'à l'étape (b) à une température de l'ordre de 30 à 500C.
Le procédé de l'invention peut comprendre également l'addition d'un troisième constituant neutre, avantageusement de nature lipidique, à l'étape (a) Dans un procédé selon l'invention où la substance biologiquement active globalement anionique en solution est choisie parmi les acides nucléiques double ou simple brin, les chromosomes ou partie de chromosomes, les séquences d'ADN ou d'ARN, les oligonucléotides et oligonucléotides antisens et les ribozymes, on ajoute celle-ci à l'étape (c) dans une proportion comprise entre environ 10 et 500 Ag par mg des premier et deuxième constituants.
Un mode de réalisation préféré du procédé de l'invention consiste à l'étape (a) à reprendre un film d'un phospholipide cationique ou anionique avec une solution alcoolique de volume minimal de phospholipide de charge opposée à celle du film dans un solvant hydrophile aprotique, avantageusement 1 'éthanol.
Ainsi dans le cas où le film est constitué d'un phospholipide cationique, l'étape (a) du procédé de l'invention consiste à reprendre celui-ci avec une solution alcoolique d'un phospholipide anionique. A l'inverse, dans le cas où le film est constitué d'un phospholipide anionique, l'étape (a) du procédé de l'invention consiste à reprendre celui-ci avec une solution alcoolique d'un phospholipide cationique.
Avantageusement, la solution alcoolique de phospholipide de charge opposée à celle du film de l'étape (a) est choisi parmi les solvants hydrophiles aprotiques comme l'éthanol, l'isopropanol, l'éthylène glycol, le propylène glycol, le glycérol, le DMSO, l'acétone, l'acétonitrile.
Les premier, deuxième et troisième constituant mis en oeuvre dans le procédé de l'invention, sont similaires à ceux définis précédemment pour les complexes et vésicules de l'invention.
Les vésicules de l'invention sont préparés conformément aux étapes (a) et (b) du procédé décrit ciavant. Dans le but de maintenir le rapport éthanol/lipoplex le plus bas possible pour des raisons pharmacologiques de toxicité, tout en conservant les propriétés du solvant pour la mobilité membranaire, la présente invention propose un procédé optimal de préparation des vésicules de l'invention comprenant les étapes suivantes - on sèche sous vide en film du DOGS, - on dissout ce film avec une solution alcoolique de cardiolipine: étape (a) ci-dessus, - pour parfaire et assurer la dissolution complète, on tiédit, - on ajoute un excès d'eau : étape (b) cidessus.
De manière plus précise, 1 mg de DOGS est séché puis dissous avec 50 A1 de solution éthanolique de cardiolipine à 10 mg/ml. De préférence, le rapport constituant cationique (DOGS) /constituant anionique (cardiolipine) est de l'ordre de 0,05 à 10 (p/p).
La préparation des Neutraplexes peut être réalisée extemporanément à partir de préparations de vésicules stockées à 40C après l'étape b) . De préférence, la substance biologiquement active, plus particulièrement un acide nucléique est ajouté aux vésicules aux concentrations de l'ordre de 10 à 500 Rg par mg de vésicules et de 10 à 2000 Rg/ml de préparation finale.
Des préparations dérivées de celles de l'invention peuvent être obtenues par l'ajout à l'une au moins des étapes (a) à (c) ou après l'étape (c), de composés dont les propriétés sont connues pour améliorer le potentiel de transport des lipoplexes en général - Stabilisation de la structure membranaire, par exemple avec du Cholestérol.
- Augmentation de la circulation plasmatique, par exemple avec des dérivés à base de PEG (polyéthyleneglycol).
- Ciblage cellulaire par l'addition de ligands ou anticorps.
- Protection de la structure de 1'ADN, par exemple avec des histones ou des nucléoprotéines.
- Déroulement de l'ADN pour la transcription, par exemple avec de la Topoisomerase ou d'autres facteurs de transcription.
Un aspect remarquable du procédé de l'invention est fondé sur l'utilisation d'éthanol au cours de la formulation. Outre ses propriétés de solvant, l'éthanol présente l'intérêt d'être aussi un détergent remplissant un rôle tensioactif. L'éthanol facilite ainsi la mobilité à l'intérieur hydrophobique des membranes phospholipidiques, et il est retenu dans la bicouche phospholipidique constituée d'un composé cationique et d'un composé anionique. Dans le cas où la substance active est un acide nucléique, l'éthanol semble aussi faciliter le glissement et l'enveloppement de l'acide nucléique fortement anionique sur les faces extérieures et intérieures à polarité cationique de la bicouche des vésicules dans un équilibre thermodynamique.
De manière surprenante, on a maintenant découvert que, même si une réponse Th2 ne nuit pas, il est aussi nécessaire d'induire une forte réponse Thl. En effet, des résultats expérimentaux démontrent maintenant qu'un effet protecteur peut être corrélé plus aisément avec une réponse Thl qu'avec une réponse Th2.
Contrairement à ce qui était initialement recherché (D'Elios et al, J. Immunol.
(1997) 158 : 962), la présente demande révèle donc l'importance d'induire une réponse Thl de type inflammatoire au moment de l'immunisation, sans laquelle on ne peut observer d'effet protecteur.
On peut parvenir à induire une réponse Thl à l'encontre d'Helicobacter en jouant sur un certain nombre de facteurs, comme par exemple le type d'adjuvant. On a en effet mis en évidence qu'en utilisant certains adjuvants on peut obtenir un taux de protection similaire ou supérieur à celui observé lorsque l'on utilise la voie muqueuse et des adjuvants tels que les toxines bactériennes.
En conséquence, la présente invention a pour objet: (a) L'usage conjoint d'un agent immunogène dérivé d'Helicobacter et d'un composé capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type T helper 1 (Th 1) à l'encontre d'Helicobacter, dans la fabrication d'un médicament destiné à être administrée par voie systémique pour prévenir ou traiter une infection à Helicobacler.
(b) Une composition pharmaceutique qui comprend un agent immunogène dérivé d'Helicobacter et au moins un composé (capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type T-helper 1 (Th 1) à l'encontre d'Helicobacter) sélectionné parmi (i) des saponines purifiées à partir d'un extrait de Quillaja saponaria; (ii) des lipides cationiques qui sont des inhibiteurs faibles de la protéine kinase C et ont une structure qui inclut un groupe lipophilique dérivé du cholestérol, un groupe de liaison selectionné parmi les carboxyamides et les carbamoyls, un bras espaceur consistant en une chaîne alkyle linéaire, branchée ou non, de 1 à 20 atomes de carbone, et un groupe amine cationique sélectionné parmi les amines primaires, secondaires, tertiaires et quaternaires ; et (iii) des glycolipopeptides de formule (I): dans laquelle: R' représente un reste alkyle saturé ou insaturé une ou plusieurs fois et comportant de 1 à 50 atomes de carbone, de préférence I à 20 atomes de carbone, X représente -CH2-, -O- ou R2 représente un atome d'hydrogène ou un reste alkyle saturé ou insaturé une ou plusieurs fois et comportant de 1 à 50 atomes de carbone,de préférence I à 20 atomes de carbone, R3, R4 et R5 représentent chacun, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène ou un reste acyl-CO-R6, dans lequel R6 représente un reste alkyle ayant de 1 à 10 atomes de carbone, R7 représente un atome d'hydrogène, un groupe alkyle en C,-C7, hydroxyméthyle, I-hydroxyéthyle, mercaptoméphyle, 2 (méthylthio)-éthyle, 3-aminopropyle, 3-uréido-propyle, 3 guanidylpropyle, 4-aminobutyle, carboxyméthyle, carbamoylméthyle, 2-carboxéthyle, 2-carbamoyléthyle, benzyle, 4-hydroxybenzyle, 3-indolylméthyle ou 4 imidazolylméthyle, R8 représente un atome d'hydrogène ou un groupe méthyle, et R9 représente un atome d'hydrogène, un groupe acétyle, benzoyle, trichloracétyle, trifluoracétyle, méthoxycarbonyle, t butyloxycarbonyle ou benzyloxycarbonyle, et R7 et R8 peuvent, quand ils sont pris ensemble, représenter un groupe -CH2-CH2-CH2-.
(c) L'usage d'un agent immunogène dérivé d'Helicobacter et d'au moins un composé sélectionné parmi les composés (i) à (iii) cités ci dessus, dans la fabrication d'une composition pharmaceutique capable d'induire une réponse immune de type T-helper 1 (Th 1) à l'encontre d'Helicobacter ; et (d) Une méthode pour prévenir ou traiter une infection promue par un microorganisme capable d'infecter la muqueuse gastro-duodénale d'un mammifère e.g., une infection à Helicobacter, selon laquelle on administre au mammifère par voie systémique, en une ou plusieurs fois, une composition contenant au moins un agent immunogène dérivé dudit microorganisme e.g.
d'Helicobacter et au moins un composé capable de favoriser l'induction d'une réponse immune de type T-helper 1 (Thl) à l'encontre e.g., d'Helicobacter.
(e) Une méthode pour prévenir ou traiter une infection promue par un microorganisme capable d'infecter la muqueuse gastro-duodénale d'un mammifère e.g., une infection à Helicobacter, selon laquelle on administre au mammifère, en une ou plusieurs fois, une composition contenant au moins un agent immunogène dérivé dudit microorganisme e.g. d'Helicobacter et au moins un composé sélectionné parmi les composés (i) à (iii) cités ci dessus, et par laquelle une réponse immunitaire de type Thl est induite à l'encontre e.g.
d'Helicobacter.
On peut mettre en évidence l'induction d'une réponse Thl utile aux fins de la présente invention en estimant l'importance relative de la réponse Thl par rapport à la réponse Th2, en comparant par exemple les taux d'IgG2a et d'IgOl induits chez la souris à l'encontre d'Helicobacter, qui témoignent respectivement de la mise en oeuvre des réponses Thl et Th2. En effet, la réponse Thl que l'on recherche est généralèment accompagnée d'une réponse Th2. Néanmoins, on considère que la réponse Th2 ne doit pas être significativement prédominante par rapport à la réponse Thl. Les taux d'IgG2a et d'IgG1 induits chez la souris peuvent être appréciés de manière conventionnelle à l'aide d'un test ELISA, à condition que les tests utilisés pour chacun des deux sous isotypes soient de même sensibilité et en particulier que les anticorps anti-IgG2a et anti-IgG1 soient de même affinité.
Les quantités d'IgG2a et d'IgG1 peuvent être notamment mesurées à l'aide d'un test ELISA identique ou similaire à celui décrit ci-après. Les puits d'une plaque ELISA en polycarbonate sont enduits avec 100 pl d'un extrait bactérien d'Helicobacter e.g. H. pylori à environ 10 ,ug/ml dans du tampon carbonate. La plaque ELISA est incubée 2 heures à 37"C puis une nuit à 40C. La plaque est lavée avec du tampon PBS (phosphate buffer saline) contenant 0.05 % de Tween 20 (tampon PBS / Tween). Les puits sont saturés avec 250 pI de PBS contenant 1 % de serum albumine bovine afin d'empêcher la liaison non-spécifique des anticorps.
Après une heure d'incubation à 37"C, la plaque est lavée avec le tampon PBS / Tween. L'antisérum prélevé chez la souris, un certain nombre de jours après que cette dernière ait reçu la composition destinée à l'induction d'une réponse immune de type Thl à l'encontre d'Helicobacter, est dilué en série dans du tampon PBS / Tween. 100 Cil des dilutions sont ajoutés dans les puits. La plaque est incubée 90 minutes à 37 C, lavée et évaluée selon des procédures standard. Par exemple, on utilise un anticorps de chèvre anti-IgG2a ou anti-IgG1 de souris couplé à une enzyme telle que la peroxydase. L'incubation en présence de cet anticorps est poursuivie 90 minutes à 37"C. On lave la plaque puis la réaction est développée avec le substrat approprié (par exemple de l'O-phenyldiamine dihydrochloride lorsque l'enzyme utilisée est la peroxydase). La réaction est évaluée par colorimétrie (en mesurant l'absorbance par spectrophotométrie). Le titre de l'antisérum en IgG2a ou en IgGI correspond à l'inverse de la dilution donnant une absorbance de 1,5 à 490 nm.
L'induction d'une réponse Thl utile aux fins de la présente invention est marquée par un rapport des titres ELISA IgG2a: IgGI chez la souris qui doit être supérieur à 1/100, 1/50 ou 1/20, avantageusement supérieur à 1/10, de préférence supérieur à 1/3, de manière tout à fait préférée, supérieur à 1/2, 5 ou 10. Lorsque ce rapport est aux alentours de 1, on parle alors de réponse Thl / Th2 mixte ou équilibrée. Lorsque le rapport est supérieur ou égal à 5, on peut alors parler de réponse Thl prépondérante.