INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment- la technique PCR (réaction en chaîne à la polymérase)(Erlich, 1989 ; Innis et al., 1990, et Rolfs et al., 1991). Cette technique nécessite le choix de paires d'amorces oligonucléotidiques encadrant le fragment qui doit être amplifié. On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. N 4 683 202. Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sonde les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention, des plasmides contenant ces séquences ou leurs produits d'amplification. Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
De plus, la durée de fermentation nécessaire à la détection d'une production de 1,3-propanediol était très longue (de 78 à 132 heures) et le niveau de production du 1,3-propanediol très faible.
Le brevet US N 5,686,276 au nom de DU PONT DE NEMOURS & COMPANY décrit un procédé permettant la bioconversion du D-glucose en 1,3propanediol par une souche de E.coli transformée par de l'ADN de cosmide originaire de Klebsiella pneumoniae. A nouveau, la production de 1,3-propanediol nécessite l'utilisation de milieux de culture adaptés aux cellules de E. coli transformée par un cosmide de Klebsiella pneumoniae contenant de la vitamine B12, par exemple à la concentration de 800 g/ml.
Les niveaux de production de 1,3-propanediol observés étaient très faibles, de l'ordre de 0,5 g/l à 10 g/l.
La présence de vitamine B12 dans le milieu de culture des cellules transformées avec l'ADN de Klebsiella pneumoniae des brevets US cités cidessus est obligatoire du fait que le coenzyme B12 est un cofacteur nécessaire à l'activité catalytique de la glycérol déshydratase de Klebsiella pneumoniae .
Le coenzyme B12, ou l'un quelconque de ces précurseurs, tel que la vitamine B12, est un composé excessivement.coûteux et peu stable, ce qui rend difficile, voire impossible, la transposition à l'échelle industrielle des procédés de conversion du glucose ou du glycérol en 1,3-propanediol par fermentation bactérienne à l'aide de telles souches.
En outre, le coenzyme B12 et ses précurseurs traversent difficilement les parois membranaires de certains micro-organismes, telles que les levures, ce qui nécessite la présence de très hautes concentrations de ces composés dans le milieu de culture afin qu'ils soient accessibles aux enzymes intracellulaires dont le coenzyme B12 est le cofacteur.
Par ailleurs, une alternative qui consisterait à introduire l'ADN codant pour les glycérol déshydratases connues, intervenant dans la conversion du glycérol en 1,3-propanediol, dans des bactéries synthétisant la vitamine B12 se heurterait à des obstacles techniques considérables.
En effet, seules certaines espèces bactériennes synthétisent naturellement la vitamine B12, telles que les bactéries Pseudomonas ou encore les propionibactéries, dont la génétique est très peu connue et qui sont donc peu aptes à subir des modifications génétiques.
D'autres bactéries synthétisant naturellement la vitamine B12, dont la génétique est mieux connue, telle que Klebsiella pneumoniae, présentent d'importants problèmes de toxicité, ce qui les rend peu aptes à une utilisation dans l'industrie.
Outre ce premier désavantage, seule une faible production de 1,3propanediol a pu être obtenue après transformation de Klebsiella pneumoniae. Ainsi, la demande PCT N WO 98/21 339 décrit des Klebsiella pneumoniae recombinantes exprimant à la fois les gènes de métabolisation du glucose en glycérol et les gènes de métabolisation du glycérol en 1,3-propanediol. La production de 1,3-propanediol observée à partir de glucose était faible, de l'ordre de 10g par litre.
Les obstacles techniques à la mise au point d'un procédé de bioconversion d'une substance carbonée en 1,3-propanediol mentionnés cidessus, ont été surmontés par l'invention.
Le demandeur a en effet isolé et caractérisé un acide nucléique qui code pour une glycérol déshydratase dont l'activité catalytique est indépendante de la présence de coenzyme B12 ou de l'un quelconque de ces précurseurs.
Les gènes codant pour la glycérol déshydratase indépendante du coenzyme B12 ont été isolés par le demandeur à partir du génome de la bactérie Clostridium butyricum VPI 1718. Ils codent pour une protéine dimérique constituée de deux sous-unités protéiques, respectivement les polypeptides ORF11 et ORF12.
Il a été montré selon l'invention que les séquences codant pour les polypeptides ORF11 et ORF12 sont localisées sur un opéron unique dans le génome de Clostridium butyricum, ledit opéron comprenant également, en aval de la séquence nucléique codant pour la sous-unité ORF12, une région codant pour une 1,3-propanediol déshydrogénase.
L'opéron selon l'invention comprend, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3, un promoteur de la transcription , la séquence orf11codant pour ORF11, la première sous-unité de la glycérol déshydratase indépendante du coenzyme B12, la séquence orf12, codant pour ORF12, la seconde sous-unité de la glycérol déshydratase et une séquence dhaT, codant pour une nouvelle 1,3-propanediol déshydrogénase (DHAT).
Ainsi, les séquences nucléiques codant pour les deux sous-unités protéiques de la glycérol déshydratase et pour la 1,3-propanediol déshydrogénase
Ce gaz est le monoxyde de carbone pour les essais 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8 A, B, C, D ; l'air pour les essais 6,9 et 10. On agite encore 20 secondes puis on isole le tube. On pèse le tube pour vérifier l'absence de fuite. On le place dans le four électrique et on chauffe le temps désiré, à la température désirée (130 ou 150'C), sans agitation, puis on arrête le chauffage et on refroidit le tube. On pèse à nouveau le tube pour vérifier l'absence de fuite, dans ce cas le test est validé. On effectue ensuite un examen visuel du tube et de son contenu : aspect, coloration, dépôt/précipité. On prélève les échantillons nécessaires pour effectuer les analyses sur les masses réactionnelles, avant (état initial) et après le déroulement du test de stabilité (état final).
1-4. Méthodes d'analyse - La concentration en iridium est mesurée par Spectroscopie Induite Couplée au Plasma (ICP, pour Inductive Coupled Plasma Spectroscopy) - la concentration en eau est déterminée par la méthode de Karl Fischer - la composition des produits organiques est mesurée par chromatographie en phase gazeuse - Le bilan iridium % en solution est calculé selon [k] finale x 100 , les bilans iridium sont à + 10 %. [Ir] initiale 1-5 Résultats 1-5. a# Tests de stabilité à 1300C Les conditions et les résultats des essais selon l'invention sont regroupés dans le tableau A ci-après. Les conditions et les résultats des essais comparatifs sont regroupés dans le tableau B ci-après.
Exemples 1 à 6 et A à D à 130'C et Tableaux A et B des résultats des tests de stabilité Les essais 1 à 6 correspondent à des essais selon l'invention. Les conditions et les résultats de ces essais sont donnés dans le tableau A ci-après.
Les essais A à D sont des exemples comparatifs et ne correspondent pas à des essais selon l'invention. Les conditions et résultats sont donnés dans le tableau B ci-après.
Dans les tableaux A et B, les résultats sont donnés pour chaque essai et pour chaque état initial et final. On précise dans ces tableaux : - la composition du mélange réactionnel en % pondéral en acide acétique (AcOH), acide formique (HCOOH), acétate de méthyle (AcOMe), formiate de méthyle (HCOOMe), iodure de méthyle (IC1-13), eau (1-120) - la teneur en iridium en ppm (mg/kg) - la pression absolue du gaz (PCO) en 105 Pa (ou bar) - la durée du chauffage à 130'C - le pourcentage d'iridium en solution après la période de chauffage. Analyse des tableaux A et B - Exploitation des résultats des essais 1 à 6 Dans tout ce qui va suivre, on appellera "composés formyles", l'ensemble acide formique + formiate de méthyle.
Exemples 1 et A, essais à 0,4 % d'eau Pour des teneurs initiales sensiblement identiques en acétate et iodure de méthyle (l 1 et 2 %) et en présence de 0,4 d'eau, après 120 min à 130'C, la stabilité de l'iridium dans l'exemple 1 est de 95 % contre 31 % dans l'exemple comparatif A.
La présence initiale de 13 % de "composés forrnyles" stabilise fortement le catalyseur.
Exemples 2 et B, essais en l'absence d'eau Dans l'exemple 2, les teneurs initiales sont proches de celles de l'exemple 1 ; en l'absence d'eau, après 15 min à 130'C, il n'y a pas de perte d'iridium. Dans des conditions sensiblement identiques, en l'absence d'eau et des Vicomposés formyles", l'exemple comparatif B voit la stabilité du catalyseur chuter à 72 %.
Exemple 3 : essai en l'absence d'eau Dans l'exemple 3, la diminution de la teneur initiale des "composés formyles" à 4,7 %, en l'absence d'eau, permet de conserver une remarquable stabilité de l'iridium après 15 min à 130'C (100 %).
Exemple 4 : essai à 16,7 % de "composés formyles" A l'inverse de l'essai 3, la teneur initiale en "composés formyles" est augmentée à 16,7 %. Après 60 min à 130'C, la stabilité de l'iridium est assurée- à 96 % en présence de seulement 0,3 % d'eau.
Exemple 5, C et D, essais à teneur en iodure de méthyle élevée Ces 3 essais sont réalisés à 130'C, 120 min sous une pression de monoxyde de carbone absolue de 2,2.105 Pa, conditions générales.
Dans l'exemple 5, en présence initiale de 5,7 % de "composés formyles", de 5,1 % d'iodure de méthyle, la stabilité de l'iridium est de 96 %.
En l'absence de "composés formyles" et pour des teneurs en eau et acétate de méthyle sensiblement équivalentes, les exemples comparatifs C et D montrent : - qu'en présence de faible teneur en iodure de méthyle initiale à 1,3 % (essai C), la stabilité de l'iridium est fortement dégradée 27 %, - l'augmentation de la teneur en iodure de méthyle initiale à 9 % (essai D) améliore la stabilité de l'iridium à 73 % (action connue de l'art antérieur) mais ne permet pas d'atteindre la stabilité de l'essai 5 (96 Exemple 6 en l'absence de monoxyde de carbone Cet essai est conduit sous air : en l'absence de CO après 60 min -à 130'C, la présence initiale de 5,3 % de "composés formyles" permet de maintenir une stabilité de l'iridium de 90 % à comparer aux bilans de stabilité de l'iridium dans les essais comparatifs qui sont : - de 31 % après 120 min (essai comparatif A) avec une composition initiale en iodure et acétate de méthyle identique à l'essai 6 - de 27 % après 120 min (essai comparatif C). 1-5. b# Tests de stabilité à 150'>C Le tableau C ci-après donne les résultats et les conditions d'essais de stabilité selon l'invention (7, 8, 9 et 10) et comparatif (E) réalisés à 150'C. Exemples 7, 8 et E à 150'C - Tableau C des résultats des tests de stabilité Les essais 7 et 8 correspondent à des essais selon l'invention.
L'essai E est un exemple comparatif et ne correspond pas à un essai selon l'invention.
Les essais sont réalisés dans les mêmes conditions que les exemples précédents sauf que la température de chauffage est de 150'C au lieu de 130'C. Les conditions et résultats de ces essais sont donnés dans le tableau C ci-après.
Pour des teneurs en eau sensiblement identiques entre 0,35 et 0,40 ces 3 essais montrent l'importance de la présence des "composés formyles" (teneurs initiales 6,3 % essai 7 - 13,2 % essai 8) sur la stabilité de l'iridium respectivement 93 et 99 % contre 40 % pour l'essai comparatif E réalisé en l'absence de ces mêmes composés.
Les résultats de la figure 8 montrent qu'une production significative de 1,3-propanediol est obtenue dès les premières heures de fermentation. Après 80 heures de fermentation, une production d'environ 4,5 g/l de 1,3-propanediol peut être observée.
La souche de contrôle E. coli DH5[alpha][pIMP1] cultivée sur le même milieu ne conduit pas à la production de 1,3-propanediol (Tableau 1).
TABLEAU 1 Production de 1,3-propanediol par des souches recombinantes cultivées à pH 6,5 en présence de glycérol dans des conditions anaérobies
1,3-propanediol (g/1) E. coli DH5[alpha] (pIMP1) 0 E. coli DH5[alpha] (pSPD5) 4,5 C. acetobutylicum DG1 (plMP1) pas de croissance C. acetobutylicum DG1 (pSPD5) 38
Les résultats du tableau 1 montrent qu'une production significative de 1,3-propanediol (environ 5gll) est obtenue avec la souche de Escherichia coli DH5a transfectée par le plasmide pSPD5, alors que la souche de E.coli transfectée avec le plasmide témoin pIMP1 ne produit pas de quantité détectable de 1,3-propanediol.
Avec la construction pSPD5, une quantité de 1,3-propanediol environ 7,6 fois supérieure est observée avec la souche Clostridium acétobutylicum par rapport à la souche de Escherichia coli DH5a. Ceci est due majoritairement au fait que les signaux de régulation du plasmide pSPD5 ont été optimisés pour l'expression de l'opéron 1,3-propanediol dans Clostridium acetobutylicum.
Des signaux de régulation, tels qu'un promoteur très actif chez Escherichia coli sont susceptibles de permettre l'obtention de quantité de 1,3propanediol aussi importante chez Escherichia coli que celle observée chez Clostridium acetobutylicum.
EXEMPLE 7 : de l'opéron 1,3-propanediol dans Clostridium butyricum sauvage cultivé sur glycérol.
La souche de Clostridium butyricum VPI 1718 a été mise en culture en présence de glycérol et la synthèse de 1,3-propanediol a été mesurée à des temps déterminés tout au long de la fermentation.
Les résultats sont représentés à la figure 9.
Les résultats de la figure 9 montrent qu'une production de 34 g/l de 1,3propanediol est observée au bout de 60 heures de fermentation.
Si l'on se reporte aux résultats représentés sur la figure 7, on peut observer que la production de 1,3-propanediol par la souche de Clostridium acetobutylicum DG1 transformée par le plasmide pSPD5 est beaucoup plus rapide (22 heures contre 60 heures) et supérieure à la production de 1,3propanediol obtenue avec la souche de Clostridium butyricum exprimant naturellement la glycérol déshydratase indépendante du coenzyme B12 et la 1,3propanediol déshydrogénase selon l'invention.
Par ailleurs, les niveaux d'activité catalytique, exprimés en unités par mg, de glycérol déshydratase et de 1,3-propanediol déhydrogénase ont été mesurés à la fois chez Clostridium acetobutylicum et chez Clostridium butyricum.
* Les résultats sont représentés dans le tableau 2 DG1[pSPD5] ci-après.
TABLEAU 2 Niveaux des enzymes impliquées dans la production de 1,3-propanediol dans les souches de C. acetobutylicum recombinantes et de C. butyricum
Glycérol 1,3-propanediol déshydratase déshydrogénase (Ulmg) (U/mg) C.acetobutylicum 3,5 2,4 DG1(PSPD5) croissance sur glycérol C.acetobutylicum 0,01 0,005 DG1 (pIMP1) croissance sur glucose C.butyricum 0,45 0,56 croissance sur glycérol
En amont des photodiodes 2 et 3, c'est-à-dire au-dessus de leur face de détection, on prévoit un filtre 5 propre à effectuer un filtrage spectral et spatial de la lumière ambiante. Par définition on appelle capteur l'ensemble constitué des photodiodes de détection et du filtre.
Les moyens de traitement, notamment le contrôleur 4, et les photodiodes 2 et 3 sont reliés à une seconde partie du dispositif, dite de commande manuelle, réalisée sous la forme d'un boîtier 6, par l'intermédiaire d'un câble multibrins 7. Ce boîtier 6 est alimenté en courant par une entrée/sortie 8 reliée au secteur. Bien entendu, le boîtier pourrait être autonome, et donc alimenté par une batterie rechargeable, ou par des piles.
Dans l'exemple illustré, le boîtier 6 et la première partie de détection de la lumière sont destinés à être implantés dans des lieux différents, bien que peu éloignés. Dans cet exemple, le boîtier 6 comporte une entrée/sortie 9 pour la commande manuelle du circuit d'éclairage local. De même, le microcontrôleur 4 comporte une entrée/sortie 26 intégrée dans le câble 7 pour la commande automatisée du circuit d'éclai rage local.
Le filtre 5 et le circuit imprimé 1, qui supporte les photo diodes 2 et 3 et le microcontrôleür 4, sont, dans l'exemple illustré, solidarisés à un support 10, réalisé, par exemple, dans un matériau à base d'aluminium. Plus précisément, les composants électriques et/ou électroniques 2, 3 et 4 sont donc logés à l'intérieur de la cavité 11 définie par le support 10, tandis que le filtre 5 est dimensionné de manière à fermer la cavité 11. Le filtre peut ainsi isoler des intempéries et de la pollution les composants électriques et/ou électroniques.
Comme cela est mieux illustré sur la figure 3, le filtre 5 est, de préférence, une optique munie d'au moins deux zones 12 et 13 permettant d'absorber des bandes spectrales de la lumière ambiante qui diffèrent entre elles. En fait, le filtre 5 est destiné à appliquer aux photodiodes de détection 2 et 3 deux flux de lumière tirés de la lumière locale et centrés sur deux longueurs d'ondes choisies, différentes, A1 et R2.
Les deux zones 12 et 13 sont donc destinées à absorber les longueurs d'ondes de la lumière ambiante qui se trouvent en dehors des plages spectrales qui sont sensiblement centrées sur les longueurs d'ondes A1 et A2. Préférentiellement, la plage de longueurs d'ondes entourant A,1 va de 420 à 500 nanomètres environ, et celle entourant A,2 va de 590 à 700 nanomètres environ. En d'autres termes, elles correspondent pour A1 à une dominante bleue et pour Â2 à une dominante rouge.
Les photodiodes de détection 2 et 3 présentent de préférence des plages spectrales de détection étendues sensiblement identiques, et incorporant les longueurs d'onde A1 et A2 respectivement fournies par les deux zones 12 et 13 du filtre. Ainsi, on pourra utiliser deux photodiodes fonction nant dans une plage de longueurs d'onde comprise entre environ 330 nm et environ 720 nm. Par exemple, on pourra utiliser les photodiodes en silicium planaire. de la Société VTB, centrées sur une longueur d'opde d'environ.580 nm, et référencées VTB8440B.
Mais cela n'est pas nécessaire. On pourra en effet utiliser. deux photodiodes de détection 2 et 3 présentant des plages spectrales de détection différentes, sensiblement centrées sur les deux longueurs d'ondes A,1 et X2, respectivement.
Pour obtenir les longueurs d'ondes choisies, les zones 12 et 13 du filtre 5 sont de préférence colorées en bleue et violet, respectivement. Ces couleurs sont obtenues, de préférence, par dépôt de couches filtrantes sur un support optique transparent 14, et plus préférentiellement encore par dépôt de couches d'encre.
De préférence, le support optique est réalisé dans un matériau de type polycarbonate, comme par exemple le LEXAN grainé fabriqué par la Société Général Electric. Ce support, d'environ 250 microns d'épaisseur, résiste très bien aux intempéries. I1 est par conséquent particulièrement adapté à la protection des composants électriques et/ou électroniques logés dans la cavité 11. Par ailleurs, pour colorer les zones filtrantes 12 et 13, on pourra utiliser les encres de la marque SERICOL. La Société française MARTIN GRAVURES réalise de tels filtres optiques.
Comme cela est illustré sur la figure 3, il est particulière ment avantageux que le filtre 5, ici optique, comporte au moins une troisième zone 15 assurant la transmission de signaux de télécommande au niveau de photodiodes de télécom mande 16 et 17 (voir figure 2), également implantées sur le circuit imprimé 1, couplées au microcontrôleur 4 et sur lesquelles on reviendra plus loin.
Préférentiellement, la troisième zone 15 est une zone colorée obtenue par le dépôt d'une couche d'encre du type de celles décrites précédemment, mais de couleur différente*, par exemple le rouge .
On va décrire maintenant plus en détail, en référence à la figure 4, le mode de fonctionnement du dispositif 'selon l'invention.
La Demanderesse s'est aperçue qu'aux heures de déclenchement (tombée du jour) et d'arrêt (lever du jour) des circuits d'éclairage public, la lumière ambiante présentait des caractéristiques particulières, et notamment des dominantes dans les longueurs d'ondes centrées sur le bleu (A1) et sur le rouge (A2). Selon que l'on se trouve avant la tombée de la nuit, ou après, ou bien avant le lever du jour ou après, le spectre de la lumière visible ambiante va donc présenter une dominante (en intensité) dans le bleu ou dans le rouge. Par conséquent, en cas de perturbation de la lumière ambiante, il va y avoir une modification de l'une au moins des intensités lumineuses habituelles des longueurs d'onde à dominantes bleue et rouge. Selon l'invention, ces modifications peuvent être quantifiées par les moyens de traitement, puis analysées de manière à déterminer si elles correspondent à une réelle perturbation, c'est-à-dire une perturbation passagère, ou bien à une modification durable de la lumière solaire ambiante, laquelle nécessite l'ouverture ou la fermeture du circuit d'éclairage local. La lumière ambiante arrive sur les deux photodiodes de détection 2 et 3 sous la forme de deux flux séparés spatiale- ment (filtrage spatial), et centrés respectivement sur les longueurs d'ondes .k1 et X2 (filtrage spectral). Ces flux donnent naissance à des premier S1 et second S2 signaux analogiques "bruts" qui sont transmis au microcontrôleur 4 via le circuit imprimé 1.
De préférence, le microcontrôleur 4 comporte un filtre numérique destiné à échantillonner les signaux analogiques bruts S1 et S2 avant qu'ils ne soient utilisés pour effec tuer, d'une part, une mesure d'intensité lumineuse, et d'autre part, une détection de perturbation lumineuse.
Le microcontrôleur 4 comporte un module de calcul, alimenté par le filtre numérique, et destiné à_ sommer les premier S1 et second S2 signaux échantillonnés, pour former un signal d'intensité lumineuse SI qui est alors comparé à un seuil d'intensité lumineuse Slim mémorisé et-de préférence modifia ble.
PROCEDE POUR L'EDITION DELOCALISEE DE PARTITIONS MUSICALES. La présente invention concerne le domaine de l'édition de partitions musicales, et plus particulièrement de l'édition de partition musicales numérisées.
L'édition de partitions musicales est traditionnellement réalisée par des techniques d'impressions classiques. Cela implique la gestion de stocks de partitions par les revendeurs, et pose des problèmes de disponibilité en raison du grand nombre de partitions musicales du répertoire, et du nombre relativement restreint de musiciens et de leur dispersion sur le territoire.
on a proposé dans l'état de la technique des systèmes informatiques d'impression de partitions musicales. A titre d'exemple, le brevet européen EP53393 décrit un système d'impression de partition musicale, comprenant : 1. un dispositif d'entrée de données musicales pour introduire des données sur une partition musicale dans ledit système ; 2. un dispositif de traitement de données pour traiter des données provenant dudit dispositif d'entrée de données musicales dans des codes de traitement prédéterminés 3 . une première mémoire pour mémoriser des codes de traitement émis par ledit dispositif de traitement de données ; 4. un dispositif de montage pour monter des sorties de la première mémoire selon un programme prédéterminé 5 . une seconde mémoire pour mémoriser des codes musicaux émis par ledit dispositif de montage ; une mémoire de caractères pour mémoriser des motifs d'impression correspondant auxdits codes musicaux, d'impression correspondant auxdits codes musicaux, 6. et une machine de photocomposition pour former une épreuve de ladite partition musicale en fonction des codes musicaux provenant de ladite seconde mémoire et des motifs d'impression provenant de ladite mémoire de caractères. Un tel équipement permet de simplifier et d'automatiser l'édition de partitions musicales, mais ne permet pas de répondre au problème de la diffusion optimale des partitions.
L'objet de la présente invention est de proposer un procédé permettant d'assurer la disponibilité instantanée de partitions musicales en tout lieu, avec une possibilité de personnalisation des partitions éditées.