INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Rein f + Muscle + + Foie f i Poumon + + Placenta f + Cerveau i + Coeur + + Fibrobl. nég. ++ 1résultats publiés par A. Hiraoka et al. (1997) 2nt, non testé La protéine SCGF n'est pas visualisée. Elle a été partiellement purifiée sur DEAE Séphacel. Son poids moléculaire minimal est annoncé estimé à 29 kDa, et ne tient pas compte des chaînes O-glycanniques attendues dans les régions riches en prolines-sérines/thréonines. Par contre, la LVBL a été visualisée dans de nombreux systèmes cellulaires avec un poids moléculaire d'environ 47 kDa.
Elle a été purifiée à cette taille après précipitation par la lectine Jacaline, ce qui prouve bien la présence de chaînes O-glycanniques. Elle a été microséquencée sur plusieurs peptides qui ont été retrouvés sur le ADNc cloné.
Les propriétés décrites pour la SCGF sont celles d'une protéine co-stimulatrice, testée en conjonction avec l'érythropoiétine ou le granulocyte/macrophage colonystimulating factor.
Le peptide manquant de la SCGF (correspondant à la séquence aa 198-275 du polypeptide LVBL) et, en conséquence, la perte d'une partie importante du domaine Lectine de type C, ne permet pas à la SCGF de supporter les propriétés antivirales du polypeptide LVBL. Par contre, le polypeptide LVBL qui inclut totalement la SCGF, en particulier le domaine RGD et le domaine Leucine-Zipper (formation d'oligomères) , conserve les propriétés de liaison de la protéine SCGF aux intégrines. De nombreux travaux ont montré que les intégrines étaient capables d'induire des signaux tels que : modifications de flux calcique, action sur les canaux à protons, phosphorylation sur tyrosine et sérine/thréonine, modifications du métabolisme des phosphoinositides, activation des MAPkinases, activation de gènes (Yamada et al. 1995 ; Dedhar et ai. 1995) . Toutes ces activités se recoupent en fait avec celles des facteurs de croissance et expliquent que le polypeptide LVBL, qui inclut la protéine SCGF, puisse déclencher la transduction de signaux qui peuvent se traduire par la stimulation de la prolifération de cellules en présence de leur facteur de croissance et comme observée par A. Hiraoka et coll. (1997).
L'analyse de la séquence de la LVBL fait apparaître une organisation de molécule bi-fonctionnelle : un domaine CRD, COOH-terminal et un domaine NH2-terminal comportant un site RGD (potentiellement interactif avec des molécules d'ahésion du type intégrines). Ces deux domaines sont séparés par une région charnière rigidifiée par une condensation de chaînes O-glycanniques. De plus, l'autre domaine central, du type Leucine-Zipper, permet de prédire loligomérisation de la LVBL, propriété constante des molécules connues pour contenir un domaine CRD (Drickamer, 1993 ; Gabius, 1997). La Figure 5 montre un alignement, en acides aminés, de la LVBL avec trois molécules connues : le CD23 (low-affinity Fcg receptor), la MBL (Mannose binding lectin) et la Tétranectine. On remarque les acides aminés conservés dans le domaine CRD, ainsi que la richesse et la relative conservation des leucines.
I1 faut noter la présence d'un domaine Leucine-Zipper aligné entre le CD23 et la LVBL. De façon intéressante, la MBL et la LVBL présentent une assez bonne homologie de leur CRD (23 W).
La MBL est connue pour former des trimères par l'intermédiaire des hélices collagène-like de sa région NH2-terminale puis des bouquets de trimères grâce aux cystéines retrouvées dans la même région (Turner, 1996).
Elle ne présente pas de région riche en leucines correspondant au domaine Leucine-Zipper de la LVBL qui sert précisément à ltoligomérisation de cette dernière. On observe également pour ces deux protéines une correspondance de leur région charnière possédant une condensation de sites O-glycanniques. Ces différentes observations amènent à postuler pour la LVBL un rôle de molécule présentatrice et plus particulièrement de molécule opsonisante. Sa fonction pourrait donc l'apparenter à la famille des Collectines (Holmskov et al., 1994), bien qu'elle en diffère, par son domaine RGD notamment. La MBL a été décrite pour remplir de telles fonctions vis-à-vis d'agents pathogènes variés tels que bactéries, levures, et virus, notamment le HIV (Erzekowitz et al., 1989) et les myxovirus influenza (Hartshorm et al., 1993). La MBL se lie à des structures polymannosylées via son CRD. Une haute affinité de cette liaison est assurée grâce à l'oligomérisation de sous-unités MBL. Les complexes formés entre MBL et agents pathogènes activent le complément et sont reconnus par les monocytes-macrophages qui peuvent les phagocyter (Turner, 1996). Enfin, le site RGD présent sur la région NH2-terminale devrait assurer la liaison du complexe virus-LVBL à des cellules qui expriment les intégrines correspondantes, et déclencher alors l'activation cellulaire aboutissant à la phagocytose. Il faut souligner ici que les Northern Blots ont montré la quasi absence de transcrits LVBL dans les lignées monocytaires. Les monocytes-macrophages pourraient être les cellules cibles des molécules LVBL conjuguées à des particules infectieuses.
Exemple 7 : Spécificité oligosaccharidique du CRD de la LVBL Bien qu'il ait été montré que le CD23 (molécule de surface du lymphocyte B, bien connue en tant que récepteur à activité Lectine de type C) puisse lier les immunoglobulines E déglycosylées (Vercelli et al., 1989), le motif de liaison attendu pour le CRD de la LVBL devrait logiquement être une structure saccharidique. Des résultats préliminaires ont montré que la LVBL ne reconnaissait pas le mannane (polymannose), structure par ailleurs reconnue par plusieurs collectines dont la MBL (Holmskov et al., 1994).
Exemple 8 : Production d'anticorps monoclonaux anti LVBL Des souris Balb/c ont été immunisées avec le peptide ARGAEREWEGGAQEE (Arga), qui correspond à la région NH2terminale de la LVBL. Après fusion entre cellules spléniques et NS1, et sélection des clones hybrides en milieu HAT, un screening, réalisé à l'aide de la technique ELISA, a permis d'isoler plusieurs clones sécréteurs d'anticorps dirigés contre le peptide. Des lapins sont également en cours d'immunisation avec le peptide Arga et avec la protéine entière précipitée à partir des surnageants de cellules 7H1 à l'aide de la lectine Jacaline et ensuite purifiée sur gel de polyacrylamide. Ces anticorps monoclonaux et polyclonaux serviront à caractériser l'expression de la LVBL dans différents systèmes cellulaires et à purifier la LVBL sur colonnes d'affinité.
Ils serviront également à réaliser le dosage de la LVBL dans les sérums et différents liquides biologiques de sujets infectés ou non par différents agents pathogènes et permettront ainsi l'ouverture de nouvelles investigations biologiques dans le domaine de l'infectiologie.
Exemple 9 : Production de LVBL purifiée et recombinante Des travaux de biologie moléculaire sont entrepris afin d'obtenir différentes protéines de fusion à partir de la LVBL. La LVBL complète ainsi que les fragments COOHterminal (domaine RGD) et NH2-terminal (domaine Lectine) seront fusionnés d'une part à la Glutathione S-transférase en utilisant les vecteurs pGEX (Pharmacia) pour expression en système procaryote et d'autre part à un motif polyhistidine en utilisant le vecteur pSHT-His (pSHT qui a été modifié en introduisant la séquence correspondant au peptide 6xHis) . Les constructions réalisées dans le vecteur pSHT-His permettront d'exprimer et de purifier la LVBL ainsi que ses fragments en système eucaryote et d'obtenir des protéines normalement glycosylées. En fonction des résultats obtenus par d'autres auteurs avec la MBL (Weis et al., 1991 ; Weis et al., 1992), il est néanmoins attendu que les protéines recombinantes exprimées dans les bactéries puissent être actives.
Exemple 10 : Activité anti-HIV des surnageants LVBL+ sur les cellules P4 Pour caractériser cette activité, la lignée P4 en cycle infectieux unique a été utilisée. Cette lignée provient de cellules HeLa transduites pour l'expression de la molécule CD4 et ainsi infectables par HIV. Elle possède en outre le gène bactérien Lac Z intégré et placé sous contrôle du promoteur LTR du HIV-1 (Charneau et al., 1992) qui peut donc être activée par la protéine Tat du HIV.
L'un des buts de la présente invention est de remédier aux divers inconvénients ci-dessus.
Les perfectionnements, selon l'invention, visent le montage de bonnettes dans des boîtiers de feux de signalisation de véhicules automobiles du type comprenant un corps divisé en compartiments et fermé par une glace, au moins un compartiment présentant une ouverture pour le passage d'une lampe correspondant à une fonction du feu et dans laquelle vient se fixer une bonnette colorée transparente comportant, à une extrémité, deux pattes élastiques avec des saillies externes pour former eieb crochets, ladite bonnette étant fixée par l'engagement des crochets dans l'ouverture dont les saillies externes coopèrent avec une surface d'appui de la face externe dudit compartiment, lesdits perfectionnements étant caractérisés en ce que la surface d'appui de la face externe du compartiment est délimitée par deux butées séparées par une distance supérieure à la largeur des saillies externes des crochets afin qu'on puisse faire légèrement pivoter la bonnette après l'engagement des crochets.
Ainsi, après avoir posé la bonnette, l'ouvrier, par simple pivotement de celle-ci, pourra vérifier qu'elle est parfaitement fixée et qu'elle ne peut se désaccoupler intempestivement.
De préférence, le compartiment, au voisinage de l'ouverture, présente des barrettes de guidage des crochets.
Suivant encore un détail constructif, les barrettes de guidage des crochets comportent des rampes permettant de faciliter la mise en place de la bonnette.
Suivant encore un détail constructif, la surface d'appui de la face externe du compartiment présente, sur une partie de sa longueur, une légère surépaisseur. Ainsi, après avoir engagé les crochets de la bonnette dans l'ouver- ture, on doit légèrement forcer pour la faire pivoter de sorte qu'elle se trouve bloquée.
Suivant une variante, la surface d'appui comporte, en un point intermédiaire de sa longueur, un cran en saillie. Ainsi, lors du pivotement de la bonnette, les crochets devront franchir le cran, ce qui constitue une sécurité supplémentaire.
Suivant une dernière caractéristique, l'ouverture est bordée par un léger enfoncement sur lequel vient porter l'extrémité de la bonnette pourvue des crochets.
L'invention va maintenant être décrite avec plus de détails en se référant à un mode de réalisation particulier donné à titre d'exemple seulement et représenté aux dessins annexés, dans lesquels Figure 1 est une vue en perspective d'une bonnette de feu de véhicule automobile.
Figure 2 est une vue en élévation d'un boîtier d'un feu de signalisation de véhicule automobile.
Figure 3 est une vue en perspective à plus grande échelle d'un compartiment du boîtier.
Figure 4 est une vue en perspective d'une partie de l'arrière du boîtier.
Figure 5 et figure 6 sont des vues en plan du montage de la bonnette.
A la figure 1, on a représenté en perspective une bonnette 1 qui est réalisée en une matière plastique transparente colorée. Cette balonnette présente un corps 2 sensiblement tronconique dont la petite base est fermée par une calotte sphérique 3 pourvue d'une optique, la grande base 4, ouverte pour recevoir une lampe, comporte deux pattes élastiques S décalées angulairement de 1800 et pourvues de saillies 6 afin de former des crochets 7.
La figure 2 montre un boîtier 10 d'un feu arrière de véhicule automobile qui est divisé en trois compartiments 11, 12 et 13, le compartiment 11 correspondant à la fonction clignotant, le compartiment 12 à la fonction recul et le compartiment 13 aux fonctions stop, lanterne catadioptre.
Les compartiments 11 et 12 sont percés d'une ouverture 14 pour le passage d'une lampe et reçoivent, chacun, une bonnette 1.
L'infection de ces cellules par le HIV (pénétration du virus, insertion et transcription du DNA proviral, puis traduction des protéines virales) peut donc être évaluée par l'activité Q-galacosidase, soit en comptant les cellules colorées en bleu après adjonction du substrat ONPG, soit en dosant l'activité enzymatique totale sur les lysats cellulaires. De plus, l'ajout d'AZT, quelques heures après infection, permet d'arrêter l'infection en cycle unique et d'évaluer ainsi la proportion de cellules initialement infectées. Les cellules P4 sont infectées par un lot infectieux HIV BRU titré, préalablement incubé ou non en présence d'un surnageant LVBL. Après 1 heure de contact, les cellules sont remises en culture pendant 7 heures. A ce stade, on ajoute 1'AZT (50 UM) au milieu de culture. Après 48 h, les cellules sont lysées et l'activité Q-galactosidase est dosée en présence d'ONPG. Comme le montre la Figure 6, les surnageants de lignées cellulaires qui expriment la LVBL inhibent l'infection des cellules P4 dans une proportion de 50 W à 80 %, alors que les surnageants des cellules THP-1, qui ne l'expriment pratiquement pas, n'interfèrent pas avec l'infection HIV.
Exemple 11 : Activité facilitante de la LVBL sur l'infection des cellules THP-1 par le HIV Les cellules THP-1 ont été infectées par la. souche HIV-1 BRU après que le lot infectieux ait été préincubé ou non avec un surnageant LVBL. 7 heures plus tard, 1'AZT (50 tiM) est ajouté au milieu de culture. Aux jours J + 3 et J + 5, des dosages de p24 virale (COULTER HIV-1 p24 Antigen Assay [Retrovirology Coulter Co., Hialeh, FL]) ont été réalisés. Les résultats présentés sur le Tableau 2 montre une production virale deux fois plus importante lorsque l'infection HIV a été réalisée après contact avec un surnageant LVBL Tableau 2 : Production d'antigènes p24-HIV-l par les cellules CEM et THP-1, en présence ou non d'un surnageant LVBL+. Le lot infectieux est préincubé ou non avec le surnageant, une heure avant infection des cellules. La production d'antigènes p24 est ensuite dosée dans le milieu de culture. A noter que les milieux de culture sont renouvelés après 3 jours.
CEM CEM THP-1 THP-1 + Surnageant 3 jours 440* 316 412 5 jours 416 29 58 8 jours 415 19 | 36 *exprimé en ng/ml La préparation d'une forme tronquée ou modifiée de la LVBL, telle qu'une forme ne comportant pas de domaine RGD, devrait permettre l'obtention d'une molécule thérapeutique d'origine humaine capable de se lier à différents virus, sans les faire pénétrer dans les cellules cibles habituelles, et donc de se comporter comme un anticorps neutralisant.
Exemple 12 : Production et activité anti-HIV de la LVBL en système cellulaire ectopique (lignée 293) Une activité anti-HIV peut être mise en évidence dans les surnageants des lignées qui sécrètent la LVBL par comparaison avec l'absence d'activité des surnageants des lignées qui n'expriment pas cette protéine.
Afin de confirmer que la LVBL est bien la protéine responsable de cette activité, le système classique d'expression protéique a été utilisé sous la dépendance d'une transfection de l'ADNc correspondant. Cette méthode permet de corréler l'apparition d'une propriété nouvelle dans une lignée cellulaire (qui en est dépourvue), avec l'entrée d'un gène nouveau introduit par transfection (Seed B., 1987, Nature 329 : 840-842).
L'absence de transcription de la LVBL dans la lignée 293 (ATCC CRL-1573, rein embryonnaire humain) a tout d'abord été assurée. Pour cela, les ARNm ont été isolés, puis transférés et la membrane a été préhybridée puis hybridée, selon les techniques déjà décrites. La sonde utilisée était la LVBL pleine taille, préalablement excisée du recombinant pcDNA3-LVBL. Comme le montre la Figure 7, la lignée 293 parentale n'exprime aucun ARN messager correspondant à la LVBL.
I1 a été ensuite procédé à la transfection du recombinant pleine taille pcDNA3-LVBL dans la lignée 293.
La technique pratiquée était celle utilisant le phosphate de calcium, à l'aide du kit"Transfection MBS Mammalian Kit" (Catalog #200388, Revision #017002) , selon les recommandations du fournisseur (Stra ta gene, La Jolla, CA 92037, USA).
Les propriétés du vecteur d'expression pcDNA3 (fourni par Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA 92008, USA), dans lequel la banque d'ADNc de la lignée CEM > I/NP avait été construite, ont pu ainsi être mises à profit. Ce vecteur permet l'insertion des ADNc sous le contrôle du promoteur fort du gène IEA du cytomegalovirus, en amont du domaine de polyadénnylation (Figure 8) de l'hormone de croissance bovine (BGH). Ce vecteur autorise ainsi l'expression des ADNc en système eucaryote. Le vecteur comporte également le gène de résistance à la néomycine (ou G418) (Figure 8), et permet donc la sélection de transfectants stables en présence de cet antibiotique.
Les cellules 293 transfectées ont donc été soumises à la sélection par le G418, et après quatre semaines de culture, trois clones stablement établis (Tfl, Tf2 et Tf4) ont pu être sélectionnés. Ces clones sont entretenus en milieu RPMI 1640, additionné de 5 de sérum de veau foetal et de G418 (1 mg/ml). Il sont régulièrement subcultivés à raison de divisions au 1/3, 2 fois par semaine.
Comme le montre la Figure 7, les clones Tfl, Tf2 et Tf4 expriment les ARNm LVBL. Leur taille (1,7 kb) est supérieure à celle de 1,35 kb des ARN naturels, tels qu'ils sont observés dans les lignées lymphoblastiques analysées précédemment. Sachant que l'ADNc de la LVBL inséré dans le recombinant utilisé correspond à la pleine taille de l'ARNm naturel (1,35 kb), la différence de taille observée ne peut s'expliquer que par l'arrêt de transcription au niveau du site pA de la BGH, situé en aval du site pA de la LVBL (cf.
Figure 8).
Pour vérifier la présence de la protéine LVBL dans les surnageants des trois clones stables, nous avons choisi les techniques de marquage au 35su42~ et celle spécifique d'immunoprécipitation en mettant à profit le sérum polyclonal de lapin Argara préparé contre le peptide ARGAEREWEGGAQEE qui correspond à la région NH2-terminale de la protéine LVBL. Les techniques classiques d'incorporation de sulfate radioactif, de lyse cellulaire et d'immunoprécipitation ont été décrites dans les publications du laboratoire (Lefebvre et al., J. Exp. Med., 1994).
* Comme le montre la Figure 9, la protéine LVBL est bien retrouvée à la fois dans les lysats cellulaires et dans les surnageants de culture des trois clones 293 transfectés stables Tfl, Tf2 et Tf4 (pistes 2-4, 9-11 de la Figure 9).
Le lysat cellulaire et le surnageant de culture de la lignée 293 parentale sont négatifs (Figure 9, pistes 1 et 8) . D'autres résultats en cours d'étude sont également visibles sur cette Figure. Il s'agit de l'expression de la LVBL après transfection du recombinant pcDNA3-LVBL dans la lignée humaine COS-7 (ATCC CRL-1651), (Figure 9, pistes 6 et 13). On peut constater que 1) à partir des surnageants de culture de la lignée CEM1/NP, le sérum spécifique anti-LVBL précipite deux formes de cette protéine : la PS0 régulièrement précipitée par la jacaline dans les tests antérieurs, et une forme plus courte de 40 kDa environ (piste 14) ; par contre, seule la P50 semble être présente dans le lysat cellulaire correspondant (piste 7), 2) la forme P50 de la LVBL semble être seule présente dans les lysats des clones 293 transfectés Tfl, Tf2 et Tf4 (pistes 2-4), 3) de façon inattendue, le sérum anti-LVBL précipite deux autres formes plus courtes de LVBL : environ P39 et P37 (pistes 9-11) à partir des surnageants de culture des clones 293 transfectés, 4) les surnageants de culture des cellules COS-7 transfectées contiennent les quatre formes P50, P40, P39 et P37 de la LVBL (piste 13), alors que les lysats cellulaires correspondants ne contiennent que la P50 (piste 6).
L'interprétation que l'on peut proposer à propos des variations de taille de la LVBL est la suivante l'apparition dans certains surnageants de culture de plusieurs formes de LVBL plus courtes que la P50 présente dans les lysats cellulaires fait évoquer un phénomène de "processing" faisant intervenir plusieurs protéases différemment exprimées selon les systèmes cellulaires.
Ensuite, des informations sélectionnées dans les codes d'adresse et/ou clé sont copiés notamment dans le support tel que carte à puce.
Pour la déconfiguration, dans les fichiers d'initialisation sont retirés, c'est-à-dire effacés, les entrées. Puis est effectué l'effacement des fichiers produits lors de l'utilisation de l'application.
Dans un deuxième exemple de courrier électronique appelé Netscape (R), la configuration prévoit la recherche dans la base de registre d'un fichier d'initialisation contenant les codes "PATH" d'installation Si ces codes ou clé existent, elles sont saisies.
Ensuite, des informations sélectionnées dans les codes d'adresse et/ou clé sont copiés.
Pour la déconfiguration, il est procédé comme exposé plus haut.
Dans un exemple d'utilisation sur le réseau internet pour le courrier électronique, le procédé suit notamment les étapes suivantes.
La configuration prévoit la recherche dans la base de registre d'un fichier d'initialisation appelé "clé INTERNET MAIL".
Lorsque cette clé est présente, les racines de codes d'adresse dits "PATH" d'installation que la clé contient sont spécifiés dans un répertoire temporaire d'une application d'exploitation à interface graphique telle que Windows (R) dans sa version 1995.
Ensuite, des informations sélectionnées dans les codes d'adresse et/ou clé sont copiés dans les différentes entrées de la base de registre, depuis le support tel que carte à puce.
Pour la déconfiguration, dans les fichiers d'initialisation sont retirés, c'est-à-dire effacés, les entrées. Puis est effectué l'effacement des fichiers produits lors de l'utilisation de l'application de courrier électronique par internet.
Il va de soi que pour d'autres applications, telles que traitement de texte, tableur, gestionnaire de base de données, ou analogues, des étapes similaires peuvent être prévues, pour simplifier et rendre plus rapide un accès à ces applications, et leur configuration notamment en fonction de préférences ou accès antérieurs de 1 'utilisateur.
Un procédé généralement dit de mémorisation d'informations sur un support tel que carte à puce est maintenant décrit.
Les cartes à puces ou à microprocesseurs actuellement répandues sur le marché ne possèdent pas une taille ou capacité de mémoire suffisante pour enregistrer par exemple des paramètres discriminants nécessaires à la configuration et/ou à la personnalisation d'applications, comme cela vient d'être exposé.
Il a aussi été souligné qu'avec les cartes actuellement répandues sur le marché, les temps d'accès, notamment en écriture, sont relativement longs.
De manière antagoniste, le volume des fichiers mis en oeuvre pour le fonctionnement des applications est en constante augmentation.
I1 est donc de plus en plus difficile de pouvoir enregistrer sur un support tel que carte à puce, des ensembles de données numérisées permettant l'exécution de procédés tels qu'exposés.
Enfin, l'un des replis débouche dans une échancrure.
L'invention va maintenant être décrite avec plus de détails en se référant à un mode de réalisation particulier donné à titre d'exemple seulement et représenté aux dessins annexés, dans lesquels Figure 1 montre en perspective schématique un ensemble de signalisation arrière d'un véhicule automobile.
Figure 2 montre en perspective le réflecteur du feu arrière anti-brouillard.
Figure 3 est encore une vue en perspective du réflecteur.
Figure 4 est une vue en élévation de face du réflecteur.
Figure 5 est une vue en élévation de côté du réflecteur de la figure 4.
Figure 6 est une vue en élévation de côté du réflecteur de la figure 4.
Figure 7 est une vue en plan de dessus du réflecteur de la figure 4.
Figure 8 est une vue en plan de dessous du réflecteur de la figure 4.
Figure 9 et figure 10 sont des vues schématiques, en section, suivant les lignes 9-9 et 10-10 de la figure 4 montrant le fonctionnement du réflecteur, selon l'invention.
Figure ll et figure 12 sont des vues schématiques, en section, suivant les lignes 11-11 et 12-12 de la figure 4 montrant le fonctionnement du réflecteur selon l'invention.
A la figure 1, on a représenté schématiquement l'arrière d'un véhicule automobile 1 avec un ensemble de signalisation arrière 2 présentant une glace 3 avec différentes colorations correspondant à la réglementation.