INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
C'est pourquoi, dans un mode de réalisation tout à fait préféré de la présente invention, le polypeptide de fusion est obtenu directement comme produit d'expressIon recombinant d'un polynucléotide comprenant, dans une phase de lecture unique, une séquence codant pour le polypeptide de fusion en tant que tel.
Un tel mode de réalisation du polypeptide de fusion selon l'invention par fusion de gènes permet la production d'un polypeptide recombinant, ce qui évite ainsi les difficultés évoquées plus haut, liées à la préparation purement chimique des traceurs enzymatiques et, parmi celles-ci, la détérioration des activités des capacités imunologiques ou enzymatiques pouvant survenir au cours du couplage chimique. Certains traceurs immunoenzymatiques ont déjà été préparés selon une telle technique, comme par exemple la réalisation d'un polypeptide de fusion entre un fragment Fab d'anticorps monoclonal et une phosphatase alcaline sous forme dimérique. A titre illustratif, Ducancel et al., en 1993, ont obtenu une protéine de fusion contenant deux fragments scFv, dérivés d'un anticorps monoclonal dirigé contre la toxine-alpha du venin de Naja ni gri colis, liés de manière covalente à la phosphatase alcaline de E. coli. La protéine de fusion recombinante résultante a une affinité pour l'antigène significativement réduite par rapport à l'anticorps monoclonal natif. En outre, l'immunoconjugué recombinant de Ducancel et al., contrairement au polypeptide de fusion selon l'invention qui est monovalent, possède une structure bi-fonctionnelle contenant à la fois deux sous-unités de la phosphatase alcaline et deux fragments scFv.
De plus, les protéines de fusion enzyme-fragment d'anticorps de l'art antérieur sont toutes des molécules de haut poids moléculaire, ce qui leur confère un coefficient de diffusion très faible et une cinétique enzymatique résultante peu compatible avec la sensibilité de détection recherchée pour la réalisation de réactifs d'Immuno- détection commercialisables. A titre d'exemple illustratif, la protéine de fusion recombinante décrite par Ducancel et al. a un poids moléculaire supérieur à 250 kDa.
Au contraire des protéines de fusion recombinantes décrites dans l'état de la technique, le faible poids moléculaire de l'AChE monomérique qui lui est constitutive (72 kDa pour l'AChE de B. fasciatus), permet de réaliser de manière reproductible un polypeptide de fusion recombinant monovalent d'un poids moléculaire d'environ 100 à 150 kDa et possédant une capacité de détection très élevée.
En conséquence, l'invention a également pour objet un polypeptide de fusion recombinant ayant la structure précédemment décrite des polypeptides de fusion selon l'invention.
De préférence, la séquence codant l'acétyl- cholinestérase, ou un variant biologiquement actif de celle-ci, est placée du côté 5' du polynucléotide codant le polypeptide de fusion.
Plus particulièrement, l'invention vise un polypeptide de fusion recombinant caractérisé en ce que la partie polypeptidique constituée par l'acétylcholinestérase est codée par le polynucléotide de séquence SEQ ID N"3 suivante ATGCCCTCCT GCCAGCCTGG CAAGATGCCT GCGCCGTGGC CTTGGTGGCT CCAGCTCCTC 60 CTTTGCATCC CGTCCTGTGT AGCGGTTTTG CCCGGCCGGG CAGGCGAGCT GAAAGTGTCC 120 ACCCAGACTG GCTCGGTGCG TGGCCTGAGC CTGCCGGTTC TCGACGGCCA CGTCTCGGCC 180 TTCCTAGGCA TCCCCTTTGC GGAGCCTCCC CTGGGCAGGA TGCGCTTCCT GCGCCCTGAG 240 CCCGTCAAGC CCTGGCAGCA CGTCCTGGAC GCCACTTCCT ACAAGCCCGC CTGCTACCAG 300 ATGGTGGACA CCAGCTACCC AGGCTTCCAG GGCACGGAGA TGTGGAACCC CAACCGGGGC 360 ATGAGCGAGG ACTGCCTCTA CCTCAACATC TGGGTGCCCT CCCCGCGCCC CAAGGATGCC 420 CCCGTCCTGG TCTGGATCTA CGGAGGGGGC TTCTACAGCG GCGCTGCCTC CCTGGACGTC 480 TATGACGGCC GCTTCCTGAC CTACACGCAG AACGTCATCC TGGTCTCCCT CAGCTACCGT 540 GTGGGGGCCT TCGGCTTTTT GGGCCTCCCG GGAAGTCCAG AGGCCCCGGG AAACATGGG AACCCCCAGG AGTTGATTGA CGAGGAGTGG TCCGTCCTGC CCTACAAGAG CATTTTCCGC 960 TTCCCCTTCG TCCCGGTCAT TGACGGGGAC TTCTTTCCAG ATACCCCCGA GGCCATGCTG 1020 AGCTCGGGCA ACTTCAAGGA GACCCAGGTG TTGCTGGGCG TGGTGAAGGA CGAGGGCTCC 1080 TACTTCCTGA TCTACGGGCT GCCTGGCTTC AGCAAGGACA ACGAGAGCCT CATCAGCCGG 1140 GCCGACTTCC TGGAAGGGGT GCGGATGAGC GTGCCCCACG CCAACGACAT CGCCACTGAT 1200 GCCGTGGTGC TGCAATACAC TGACTGGCAG GACCAGGACA ACAGGGAGAA GAACCGGGAG. 1260 GCCCTGGACG ACATCGTGGG AGACCACAAC GTCATCTGCC CGGTCGTGCA GTTCGCCAAC 1320 GACTACGCCA AGCGCAACAG CAAGGTGTAC GCCTACCTGT TTGACCACCG GGCCTCCAAC 1380 CTCCTCTGGC CCCCCTGGAT GGGGGTCCCC CATGGCTACG AGATCGAGTT TGTCTTTGGA 1440 TTGCCGCTCA ACGACAGCCT GAACTACACG CCCCAAGAGA AGGAGCTGAG CCGCAGAATG 1500 ATGCGCTACT GGGCCAACTT CGCCCGGACA GGGAACCCCA CCGACCCTGC CGATAAGAGC 1560 GGGGCCTGGC CCACCTACAC CGCCTCCCAG CCGCAGTATG TCCAGCTCAA CACCCAGCCG 1620 CTGGCCACCC AACCCAGCCT GCGGGCCCAG ATCTGCGCCT TCTGGAACCA CTTCCTCCCC 1680 AAACTGCTGA ACGCCACA 1698 A titre illustratif d'un mode particulier de réalisation du polypeptide de fusion selon l'invention, les inventeurs ont réalisé une construction génétique comprenant successivement, de l'extrémité 5' vers l'extrémité 3', une séquence codant pour l'AChE de Bungarus fasciatus, une séquence codant pour le peptide cMyc (polypeptide oncogène d'origine humaine) et une séquence codant pour la partie variable simple chaîne (scFv) d'un anticorps monoclonal dirigé contre la sous-unité non catalytique (CA) de la crotoxine, principale toxine retrouvée dans le venin du crotale originaire d'Amérique du Sud. La région d'acide nucléique codant pour la partie variable de la chaîne lourde (VH) du fragment scFv et la région d'acide nucléique codant pour la partie variable de la chaîne légère (VL) du fragment scFv sont reliées entre elles par un fragment polynucléotidique codant pour un peptide de liaison, ledit peptide de liaison étant souligné en trait pointillé sur la Figure 1B. Ce peptide de liaison est destiné à assurer un positionnement adéquat de la chaîne lourde par rapport à la chaîne légère dans le polypeptide de fusion final, afin que ce dernier ait une affinité pour la sous-unité CA de la crotoxine comparable à celle observée pour l'anticorps monoclonal natif.
L'invention a donc également pour objet un polynucléotide caractérisé en ce qu'il code pour un polypeptide de fusion selon l'invention.
En particulier, un polynucléotide tel que défini cidessus comprendra une séquence codant pour une acétylcholinestérase monomérique ou pour un variant biologiquement actif d'une acétylcholinestérase.
Plus particulièrement, un tel polynucléotide comprendra la séquence SEQ ID N03 décrite ci-dessus codant pour l'acétylcholinestérase retrouvée dans le venin du serpent Bungarus fasciatus.
La séquence caractérisant les polynucléotides selon l'invention peut être optimisée, selon le type d'organisme hôte dans lequel l'expression du polypeptide de fusion est désirée et donc l'usage des codons spécifique à l'organisme considéré (cellules de mammifère ou d'insecte, cellules de plante, bactérie, notamment) . Pour les bactéries et les plantes, respectivement, l'usage générai des codons peut être retrouvé dans la demande de brevet européen NO EP0 359 472 (Mycogen).
En conséquence, constitue aussi un objet de l'invention un vecteur de clonage et/ou d'expression contenant un polynucléotide codant pour un polypeptide de fusion tel que défini ci-dessus.
Avantageusement, un tel vecteur comprendra, en outre, les signaux d'expression et/ou de régulation de la transcription et de la traduction nécessaires à une expression optimale du polypeptide de fusion dans l'hôte cellulaire choisi, ces signaux d'expression et/ou de régulation devant être, au sein du vecteur recombinant, liés de manière fonctionnelle au polynucléotide codant pour le polypeptide de fusion selon l'invention.
Par signaux d'expression et/ou de régulation liés de manière fonctionnelle à un polynucléotide codant pour un polypeptide de fusion selon l'invention, on entend des séquences de régulation permettant l'expression du polynucléotide codant dans l'hôte cellulaire recombinant choisi.
Snedecor (analyse de la variance monofactorielle sur les lectures de base).
L'activité analgésique centrale non morphinique est évaluée en calculant le pourcentage d'allongement du temps par rapport au seuil initial de réaction selon la formule suivante: (Tr - Ti) x 100 % allongement - (TrTi x100 Ti' Tr représentant le temps moyen de réaction déterminé sur l'ensemble du lot considéré et
Ti représentant le temps initial.
L'existence de cette activité analgésique centrale non morphinique de ces extraits ou composés a également été vérifiée par la recherche d'un antagonisme à l'aide d'un antagoniste spécifique des récepteurs centraux impliqués
dans les phénomènes nociceptifs.
La présente invention va maintenant être illustrée par les exemples
suivants qui ne présentent aucun caractère limitatif.
Exemple 1: Extraction/purification de la géraniine L'isolement de la géraniine a été réalisé à partir de l'extrait sec acétonique de feuilles de Geranium robert (80 g) par extractions liquide-liquide
successives à l'éther, puis à l'acétate d'éthyle dans une ampoule à décanter.
L'extrait à l'acétate d'éthyle, ainsi obtenu ou "brut de géraniine non purifié" (12 g) a été analysé qualitativement par Chromatographie sur Couche Mince (CCM) sur gel de silice et chromatographié sur colonne Sephadex LH 20 (5x50 cm) afin de séparer quantitativement la géraniine des flavonoiïdes et des autres composés. Dans ce cas l'élution est réalisée par un gradient eau-méthanol (H20 100 %, McOH 30 %, MeOH 60 %, MeOH 100 %o) en recueillant des
fractions de 200 à 800 ml.
Un contrôle par CCM sur gel de silice de la pureté et de la nature des
différentes fractions gouverne le changement de polarité de l'éluant.
Le bilan de fractionnement sur colonne est donné dans le tableau 1 ciaprès.
Bilan du fractionnement sur colonne de l'extrait à l'acétate d'éthyle: purification de la géraniine Fractions Eluant Composés Fractions Eluant Composés H20O 100% MeOH 100% 1 600 ml 21 200 ml 2 600 ml Composés 22 200 ml Flavonoides 3 600 ml divers de 23 200 ml (traces) 4 600 ml forte 24 200 ml + autres 600 ml polarité 25 200 ml composés 6 700 ml 26 200 ml 3,7 1 27 200 ml 28 200 ml MeOH 30% 29 200 ml 7 500 ml 30 200 ml Géraniine 8 500 ml 31 200 ml 9 200 ml Autrcs 32 200 ml 500 ml composés + 33 200 ml il11 500 ml (traces de 34 200 ml Composés 12 500 ml flavonoïdes) 35 200 ml divers de 13 500 ml 36 200 ml faible 14 800 ml 37 200 ml polarité 4,0 1 38 1 1il 4,41 MeOH 60% Acétone oo100% 500 ml 16 500 ml Flavonoïdes 39 1,25 1 Non contrôlé 17 500 ml en très forte 18 500 ml proportion 19 500 ml 500 ml 3,0 1 L'analyse par CCM de la composition des fractions 28 à 32 révèle la présence d'un composé fortement majoritaire: tache sombre d'atténuation de
Ce signal de rétroaction représente une rétroaction qui est fondée sur l'équilibre énergétique et utilise des signaux de tension uniquement pour la rétroaction.
Il y a également un signal de compensation considérable qui est généré à partir de la tension de référence, ses dérivées et l'impédance de charge nominale. L'impédance de charge réelle peut varier par rapport à cette valeur. Cette variation entraîne uniquement une erreur de poursuite mineure.
En ce qui concerne la précompensation, considérons un convertisseur de compensation ayant un filtre à quatre pôles, tel que représenté sur la figure 11. La tension souhaitée à la sortie est définie comme étant V et est une variable connue. Cette valeur est continue et peut être dérivée jusqu'à un ordre arbitraire. Le courant de charge est connu nominalement. La valeur des inductances et des capacités est connue et constante.
En outre, toutes les tensions sont considérées comme étant mesurables et tous les courants ne peuvent pas être mesurés. La tension pouvant être directement commandée indépendamment du retard du filtre est la tension de commutation V. La tension de commutation est établie directement par l'action PWM. Une tension de référence Vff peut être définie comme étant la tension de référence pour ce noeud.
Pour conserver une fréquence de commutation fixe, on utilise un circuit PWM classique. Le signal de commande analogique PWM (Sig) est choisi de façon à entraîner la tension au niveau du noeud de commutation V w pour qu'elle soit égale à Vff . En présence du bruit de commutation, ceci peut être effectué grâce à des intégrales, de sorte que l'intégrale de Vsw poursuive l'intégrale de Vff. Ainsi, Sig est défini par l'équation suivante
En régime permanent, la pente de Sig est déterminée presque complètement par l'intégrale de la tension de commutation V,,,,,. En supposant que la valeur moyenne de Vr soit égale à Vin/2, , la pente de signal moyenne peut être calculée. La pente de rampe correspond au rapport de l'amplitude de rampe sur la durée du cycle de commutation. En supposant que le signal de rampe soit égal à l'unité, le signal de commande Sig est mis à l'échelle pour répondre au critère de pente égale. L'expression est calculée par précompensation de la façon suivante.
où les coefficients a, b, c et d sont donnés par les équations suivantes a = L2 + L1 et b = L1(C1 + C2) + L2C2 R c = 2 1 1 et d = L1L2C1C2 (2 4) R Ce signal de rétroaction représente un système de précompensation uniquement qui utilise la tension de commutation uniquement pour la commande. L'inductance actuelle, la capacité et l'impédance de charge peuvent varier par rapport à leurs valeurs nominales. Ces variations peuvent entraîner des erreurs de poursuite.
Le fait de calculer des dérivées d'ordre supérieur augmente la complexité du système et la sensibilité au bruit. Des approximations de signaux peuvent être effectuées et celles-ci éliminent les termes correspondant à c et d. Des corrections de a et b sont compensées de la façon suivante. La fréquence angulaire nominale nX est choisie au centre du spectre de signaux. La dérivée du quatrième ordre peut subir une approximation en termes de la dérivée du deuxième ordre en utilisant cette fréquence nominale. De la même manière, la dérivée du troisième ordre peut subir une approximation par la dérivée du premier ordre en utilisant la fréquence nominale. a' = a - c((#nom) et b' = b - d(#nom) (25) L'expression de la tension de précompensation Vif dans le domaine temporel est ainsi simplifiée et donne Vff = Vr + a' Vr + b' Vr (26) L'enveloppe RF de sortie doit poursuivre l'enveloppe RF d'entrée. Puisque le PA RF n'est pas un dispositif linéaire, même si l'enveloppe exacte est générée au niveau de la sortie de l'alimentation à découpage, l'enveloppe de sortie RF du PA n'est pas exacte. Cette non-linéarité entraîne un grossissement spectral du signal RF ce qui est indésirable. Pour linéariser le PA RF, un détecteur de sortie peut être utilisé pour renvoyer l'enveloppe RF de sortie à l'unité asservie et de compensation. Puisque le PA RF est un dispositif à haute vitesse, le retard dû à celui-ci est négligeable comparé au retard de l'alimentation à découpage. L'enveloppe RF de sortie peut être considérée comme étant une version mise à l'échelle de la tension de sortie de l'alimentation à découpage. Ainsi, le système obtenu est le même que lorsqu'on introduit une rétroaction de sortie dans l'équation de commande. La rétroaction par action intégrale a été choisie ici pour réduire la rétroaction à haute fréquence.
L'ajout de la rétroaction de sortie modifie la performance de poursuite du convertisseur de puissance.
Le filtre de sortie a été choisi de façon à être un filtre passe-bas se comportant bien sans sonnerie au démarrage. Ceci entraîne l'apparition d'une réponse de poursuite optimale. Pour garder la même performance, les composants du filtre peuvent être ajustés pour obtenir la même performance avec une rétroaction de sortie. La tension du commutateur (Vsw) est exprimée en termes de la tension de sortie donnant l'équation suivante
Un filtre passe-bas modifié avec les composants L1', C1', L2', C2' doit être conçu pour avoir la réponse globale en tant que filtre original sans rétroaction de sortie. En mettant en équation les termes de l'équation ci-dessus appliquée au cas où il n'y a pas de rétroaction de sortie, on obtient les équations suivantes.
L1,+L2, = (L1 + L2) (I + k) et L1'(C1'+C2')+L2'C2'=(L1(C1+C2)+L2C2 L1'+C1'C2'= (L1C1C2) (I+k) et LI'L2'C1'C2'=(L1L2C1C2(I+k) (30) En résolvant les équations simultanées, les modifications suivantes pour C1 et L1 sont obtenues, tandis que C2 et L2 restent inchangés.
Ll ' tel + k) + kL2 et C1' = C1L1(1+k) (31) L1(1+k) k12 La valeur typique de k est environ égale à l'unité. Ceci pondère l'enveloppe de sortie RF à peu près de la même façon que la tension de commutation.
Ceci entraîne une linéarisation significative de la sortie RF. Une valeur plus grande de k est possible mais modifie largement le filtre de sortie.
L'ondulation de sortie est en outre réduite d'un facteur de (l+k) qui correspond à 6 dB pour le cas où k est égal à l'unité.
Pour la configuration du filtre de sortie, considérons un filtre de Legendre du quatrième ordre normalisé pour une impédance de sortie de 3S2 à 160 kHz.
d. Test du bécher On administre les principes actifs au temps tO selon deux modes
d'administration: par voie intra-péritonéale et par voie orale.
Pour la voie intra-péritonéale, les principes actifs, mis en suspension extemporanément dans la carboxyméthylcellulose (CMC) 0,1% dans l'eau, sont injectés à raison de 10 ml/kg. Pour la voie orale, les principes actifs, mis en suspension extemporanément dans la CMC 0,1% dans l'eau, sont administrés par
sonde intra-gastrique à raison de 20 ml/kg.
, 60 et 90 minutes après l'injection par voie intra-péritonéale ou 45, et 135 minutes après administration par voie orale, on place les souris dans les béchers au bain-marie et on détermine les seuils de réaction ou temps de réaction
après traitement, appelés tr.
Il est important pour la bonne marche de l'essai de retirer les souris dès que 30 secondes de contact dans le bécher sont atteintes (brûlure). Arbitrairement,
ce chiffre correspond à une analgésie totale.
e. Traitement statistique des résultats On réalise la moyenne de l'ensemble des temps (ti et tr) obtenus pour les souris traitées par le même produit. On obtient ainsi les temps moyens Tr et Ti, respectivement, qui seront utilisés pour calculer le pourcentage d'allongement, et
leur écart type ac et a, respectivement.
A chacun des différents temps de lecture, les moyennes Ti et Tr sont comparées par le test des moyennes appariées de Student grâce à la formule suivante Ti - Tr TSident = i r O r
ni et nr représentant le nombre de valeurs de ti et tr.
On lit ensuit T sur la table de Student présentant p<0,001, p<0,01 et p<0,05 comme seuil de probabilité en fonction du nombre de degré de liberté (ddl = 1). On considère qu'il y a unc différence significative entre les deux mesures moyennes Ti et Tr pour le seuil de probabilité choisi lorsque T est supérieur à la
valeur indiquée dans le tableau.
f. Résultats On a mesuré le pourcentage d'allongement du temps de réaction après administration des extraits aqueux ou acétoniques de Geranium robert ou thunbergii par comparaison au chlorhydrate dc morphine (ce dernier composé, administré sous forme de suspension dans la CMC à 0,1 % dans l'eau, constitue le
témoin positif).
Cela n'exclut pas qu'une délétion puisse également être localisée dans un ou plusieurs autres segments de cette région du polypeptide de fusion.
Danse cas d'une substitution, un ou plusieurs acides aminés -consécutifs ou non consécutifs- sont remplacés par des acides aminés équivalents . L'expression acide aminé équivalent vise ici à désigner tout acide aminé susceptible d'être substitué à l'un des acides aminés de la structure de base sans cependant modifier essentiellement les propriétés catalytiques des peptides correspondants.
Ces aminoacides équivalents peuvent être déterminés soit en s'appuyant sur leur homologie de structure avec les aminoacides auxquels ils se substituent, soit sur les résultats des essais d'activité acétylcholinestérase.
A titre d'exemple, on mentionnera les possibilités de substitutions susceptibles d'être effectuéns sans qu'il en résulte une modification approfondie de l'activité acétylcholinestérase des peptides modifiés correspondants, les remplacements, par exemple, de la leucine par la valine ou l'isoleucine,' de l'acide aspartique par l'acide glutamique, de la glutamine par l'asparagine, de l'arginine par la lysine etc., les substitutions inverses étant naturellement envisageables dans les mêmes conditions.
Ainsi, un acide aminé appartenant à une classe particulière d'acides aminés pourra être remplacé par un acide aminé différent appartenant à la même classe, comme illustré dans le Tableau 1 ci-après.
Tableau 1 : Les différentes classes d'acides aminés Classe d'acide aminé Exemples d'acides aminés Non polaire A, V, L, I, P, G, F, W Polaire non chargé M, S, T, C, Y, N, Q Acide D, E Basique K, R, H Par récepteur protéique au sens de la présente invention, on entend un polypeptide d'origine naturelle, obtenu par synthèse chimique ou par recombinaison génétique et ayant une affinité pour un ligand, de telle manière que ce polypeptide se lie spécifiquement, au moins par des liaisons dites faibles (liaisons électrostatiques, liaisons hydrogènes, forces de Van der Waals, forces électrostatiques ou encore liaisons hydrophobes), à la molécule dite molécule ligand du récepteur considéré. Par affinité, on entend la valeur de la constante d'association intrinsèque, K, dont la formule de calcul est la suivante [Récepteur-Ligand] K = , [Récepteur] x [Ligand] dans laquelle [Récepteur-Ligand] représente la concentration du complexe polypeptide de fusion avec sa molécule ligand, [Récepteur] représente la concentration du polypeptide de fusion selon l'invention sous forme libre et [Ligand] représente la concentration de la molécule Ligand selon l'invention sous forme libre.
La valeur de l'affinité du récepteur protéique pour son ligand n'est pas une caractéristique technique déterminante des polypeptides de fusion selon l'invention.
Une forte affinité du récepteur protéique pour son ligand ne sera pas requise lorsque l'échantillon à tester n'est pas un milieu complexe au sein duquel peuvent se former des complexes non spécifiques de molécules contenues dans l'échantillon avec le traceur enzymatique constitué par le polypeptide de fusion.
La définition ci-dessus d!un récepteur protéique selon l'invention inclut des molécules protéiques qui sont considérées généralement par l'homme du métier comme des ligands d'un récepteur. Entrent dans cette catégorie les hormones, qui sont reconnues par leur(s) récepteur(s) respectif(s), comme par exemple la LHRH ou encore l'hormone de croissance.
Une molécule ligand selon l'invention est définie de telle sorte qu'elle possède une affinité pour le récepteur protéique précédemment décrit. Une telle molécule ligand peut représenter un analyte de nature quelconque, protéique (par exemple un récepteur de médiateur endogène ou encore une enzyme biologiquement active ou inactivée), ou non protéique, dont on recherche la présence dans un échantillon. La molécule ligand peut être elle-même une molécule de marquage, par exemple un anticorps couplé à la biotine ou à l'avidine.
Par polypeptide de fusion au sens de la présente invention, on entend une molécule protéique comprenant un premier polypeptide ayant une activité d'acétylcholinestérase monomérique et comprenant en outre au moins un second polypeptide représentant un récepteur protéique, le premier et le second polypeptide étant liés entre eux, directement ou indirectemént, de manière covalente, soit que le polypeptide de fusion résulte d'un couplage chimique entre les deux polypeptides de départ, soit du fait que le polypeptide de fusion représente le produit d'expression dlun acide nucléique codant, dans une phase de lecture ouverte unique, les deux polypeptides de départ, étant entendu, en outre, que le premier et le second polypeptide peuvent être indifféremment orientés l'un par rapport à l'autre au sein du polypeptide dé fusion.
Par échantillon au sens de l'invention, on entend un milieu liquide ou un matériau solide susceptible de contenir une molécule ligand telle que définie ci-dessus.
Un tel échantillon peut être d'origine biologique tel que notamment du sérum, du plasma, une coupe de tissu biologique (par exemple une biopsie) ou encore l'urine.