INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Il existe différents mécanismes susceptibles d'affecter la processivité de la reverse transcriptase ayant en commun d'empêcher l'addition du nucléoside triphosphate à la chaîne naissante, c'est-à-dire la réaction conduisant au lien phosphoester entre le phosphate en 5' du nucléotide entrant et le groupement OH en 3' du nucléotide terminal de la chaîne naissante On peut citer les mécanismes suivants 1- mécanisme stérique' a) - le nucléotide triphosphate au site actif est trop éloigné ou se présente mal stériquement par rapport au 3'OH de la chaîne naissante, ce dernier occupant une position normale dans la RT, le motif du désordre étant inhérent au site actif et/ou au nucléotide triphosphate, apparié ou non selon un appariement Watson-Crick ou non Watson-Crick ; b) - le nucléotide triphosphate au site actif est trop éloigné ou se présente mal stériquement par rapport au 3'OH de la chaîne naissante, ce dernier occupant une position anormale dans la RT, du fait par exemple d'une conformation anormale de la double-hélice engagée dans la RT ; c) - le jeu qu'autorise la RT au site actif éloigne le nucléotide triphosphate du groupement 3'OH, tous deux étant positionnés correctement par ailleurs
Ce mécanisme stérique est possible du fait de la flexibilité des RT , en effet, la distance entre le phosphate gamma du nucléotide et l'extrémité 3'OH du brin naissant n'est pas figée. De plus, le domaine qui "couvre" la double hélice (sortante) présente un certain degré de liberté par rapport au site catalytique et par rapport au domaine en contact avec le brin matrice entrant dans l'enzyme (par exemple HIV-1), enfin, pour les RT dont le mécanisme catalytique est connu (par exemple HIV-1), un dysfonctionnement de la translocation du nucléotide à incorporer du site d'entrée vers le site catalytique aboutissant à empêcher l'addition du nucléotide peut également affecter la processivité. Les analogues de nucléotides peuvent agir sur la processivité mettant en jeu une distance et/ou une présentation spatiale inappropriée (s) de l'extrémité 3'OH du brin naissant par rapport au nucléotide modifié au site actif et/ou la base matrice, ce qui peut conduire à une délétion ou une insertion d'une base, selon que la modification réduit ou augmente la distance et/ou la présentation spatiale, de façon à ignorer une base matrice ou insérer une base dépourvue de base matrice. Distance et présentation spatiale sont contrôlées entre autres par la conformation précise de la double hélice de environ 20 paires de bases couverte par la RT, conformation qui dépend de la séquence et/ou de la présence de analogues de nucléotides, ainsi que par la rigidité ou la flexibilité du nucléotide triphosphate modifié qui se situe au site actif 2- mécanisme cinétique : Une pause prolongée, due par exemple à une concentration trop faible de nucléotide triphosphate, conduit l'enzyme à quitter la chaîne naissante Les RT sont, en général, bien moins processives que les ADN- ou ARN-polymérases et ont une tendance spontanée à se dissocier du complexe de reverse-transcripion Plus la durée d'une pause de la reverse transcriptase (pour un motif quelconque) est longue, plus la dissociation est probable et donc plus la processivité au site de pause diminue Les analogues de nucléotides permettent de prendre le contrôle de la processivité selon des mécanismes semblables à ceux exposés ci-dessus pour les nucléotides normaux, mais avec une démultiplication contrôlée des effets de l'un et/ou l'autre des divers facteurs mentionnés, selon la modification présente sur les analogues de nucléotides
La présente invention concerne l'utilisation d'analogues nucléotidiques caractérisés en ce que lesdits analogues nucléotidiques : - diminuent de façon contrôler la fidélité de la reverse transcription et/ou abaissent de façon contrôlée la processivité de la reverse transcriptase et/ou en diminuent de façon contrôlée le temps de pause de la reverse transcriptase , - augmentent de façon contrôlée la fidélité de la reverse transcription et/ou augmente de façon contrôlée la processivité de la reverse transcriptase et/ou allonge de façon contrôlée le temps de pause de la reverse transcriptase.
Parmi les affections faisant intervenir la reverse-transcriptase, il y a celles provoquées par les reverse-transcriptases des virus rétroides Parmi les affections provoquées par les virus rétroides qui peuvent être traitées par les analogues nucléotidiques utilisés selon la présente invention il faut citer, les virus rétroides qui infectent l'homme et/ou les animaux et/ou les végétaux notamment les virus rétroïdes qui infectent les cellules humaines et/ou animales, et qui appartiennent plus particulièrement au groupe des lentivirus, des oncovirus à ARN, des spumavirus et des hépadnavirus Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le lentivirus est choisi parmi le groupe composé du virus de l'immunodéficience humaine (HIV), et de préférence du virus de l'immunodéficience humaine de type 1 (HIV-1) et les virus de la leucémie des cellules T humaines (HTLV).
Selon un autre mode préféré de réalisation de l'invention, l'utilisation de l'analogues nucléotidiques selon la présente invention est caractérisée en ce que l'hépadnavirus est le virus de l'hépatite B (HBV). L'HBV est un virus à ADN mais dont le génôme passe sous une forme ARN lors de sa réplication , il y a ensuite reverse transcription pour donner naissance à l'ADN génomique La présente invention concerne l'utilisation des analogues de nucléotides tels que décrits précédemment et tels que lorsqu'ils sont incorporés par la reverse-transcriptase dans la chaîne polynucléotidique, ils introduisent des mésappariements On entend désigner par mésappariements, tous appariements qui ne respectent pas très précisément les appariements Watson-Crick. Dans la présente invention, on entend désigner par appariement Watson-Crick, désigné WC ci-après, l'appariement défini par des liaisons hydrogène suivantes (schéma 1) : a) pour les appariements adénine (A)-uracyle (U) ou thymine (T)
1) N6 de A donneur de H6 à l'accepteur 04 de U ou T 2) N 1 de A accepteur de H3 du donneur N3 de U ou T b) pour les appariements guanine (G)-cytidine (C) 1) 06 de G accepteur de H4 du donneur N4 de C 2) NI de G donneur de Hl à l'accepteur N3 de C 3) N2 de G donneur de H2 à l'accepteur 02 de C Tous appariements qui ne respectent pas très précisément ces liaisons hydrogène entre ces 5 nucléotides, soit qu'ils ne les respectent que partiellement, soit qu'ils les respectent mais avec d'autres liaisons H en sus, soit qu'ils ne les impliquent pas, soit que l'un et/ou l'autre des partenaires de la paire ne font pas partie de ces 5 nucléotides (exemple nucléotide avec purine dont le N7 a été remplacé par C7), définissent l'ensemble des appariements désignés dans la présente invention comme "mésappariements" . Ainsi, les exemples (schéma 2) illustrent de manière non limitative certains mésappariements impliquant les 5 nucléotides normaux- 1 ) l'appariement A-T "reverse WC" " N6 de A donneur de H6 à l'accepteur 02 de T NIde A accepteur de H3 du donneur N3 de T 2) l'appariement A-T "Hoogsteen" N6 de A donneur de H6 à l'accepteur 04 de T N 7 de A accepteur de H3 du donneur N3 de U ou T 3) l'appariement A-T "reverse Hoogsteen" N6 de A donneur de H6 à l'accepteur 02 de T N 7 de A accepteur de H3 du donneur N3 de T 4) l'appariement "wobble" G ou l-U ou T NIde G ou 1 donneur de Hlà l'accepteur 02 de U ou T 06 de G ou 1 accepteur de H3 du donneur N3 de U ou T Il faut également mentionner que les bases normales peuvent se présenter sous forme de tautomères, keto ou énol pour G et T, amino ou imino pour A et C ; les fréquences des formes énol et imino sont faibles mais non nuls (de l'ordre de 10-2 à 10' ). Ces tautomères ont des caractéristiques de donneurs et accepteurs de protons propres (schéma 3) et peuvent donner lieu à des appariements tels T-G(énol), T(énol)-G, A (imino)-C ou A-C (imino) 4).
Watson Crick (A-T) Reverse Watson Crick (A-T) Hoogsteen (T#A) Reverse Hoogsteen (T'A) Wobble (G-T) Guanine (Anti) .Adenine (Syn) Schéma 2
Guanine Adenlne Thymlno Cytoslno Schéma 3
Enfin, les bases normales sont suceptibles de s'ioniser Ainsi A s'ionise facilement en A (+) pH acide, C en C (+) G en G (-) T en T (-) forment ainsi les paires C-A (+), C (+)-G, (schéma 5).
Toutes ces possibilités d'appariement Watson-Crick et de mésappariements décrites ci-dessus pour les nucléotides de bases "normales" (ou conventionnelles) (A,T,U,G,C) sont concevables également avec ceux des analogues de nucléotides de la présente invention, avec des probabilités (barrière énergétique à surmonter) et des stabilités (profondeur du puits de potentiel) d'appariement variables (en plus ou en moins) par rapport aux nucléotides normaux, ainsi que des qualités diverses de substrats pour l'enzyme La présente invention concerne notamment l'utilisation d'analogues nucléotidiques incorporés par la reverse-transcriptase dans la chaine polynucléotidique et qui s'apparient selon un appariement de type Wobble. Selon la présente invention, on entend désigner par appariement de type Wobble des appariements violant la règle des appariements de type Watson-Crick tels que définis précédemment. Dans les appariements de type Wobble, deux bases sont liées par des liaisons hydrogènes différentes de celles de la paire de bases Watson-Crick, résultant ainsi de relations spatiales différentes. La liaison glycosidique est de manière caractéristique en configuration ANTI La position d'une des bases par rapport à sa base complémentaire est décalée (glissée) dans le plan plat des noyaux aromatiques et des liaisons hydrogènes (Saenger, 1984).
effet, après traitement d'un code, ces ressources sont libérées et rendues disponibles pour le code suivant. De plus, une seconde décomposition temporelle consiste à ne déter miner qu'une seule des caractéristiques fonctionnelles à la fois.
L'analyse est par conséquent décomposée en trois phases. 1) Détermination du décalage, 2) Détermination du gain, 3) Détermination des non-linéarités.
Lors de l'application de ces trois phases, on a choisi un stimulus d'en trée triangulaire permettant de minimiser les ressources de calcul nécessaires à l'exploitation de l'histogramme.
Dans la première phase, seuls les codes extrêmes sont exploités pour déterminer le décalage.
Décalage = k, [p(2") - p(1)] k, étant une constante connue.
Dans la deuxième phase, seule une partie des codes du milieu sont exploités séquentiellement pour déterminer le gain. étant une constante connue, étant une constante connue dépendant du nombre bits du con vertisseur.
Dans la troisième phase, chaque code est traité séquentiellement. On obtient ainsi la non-linéarité différentielle NLD(i) associée à chaque code i. NLD(i) = k3 p(i) étant une constante connue.
plus, le cumul séquentiel de NLD permet d'obtenir non-linéarité intégrale NLI(i) associée à chaque code i Finalement, le bilan des ressources matérielles nécessaires à l'appli cation de technique suivant l'invention est le suivant.
détection de la présence d'un code en sortie peut, etre réalisée à l'aide d'un simple comparateur et d'un compteur pour positionner code de réfé rence. Les différents traitements ne font intervenir que opérations sim ples qui peuvent être implantées à l'aide d'un compteur-décompteur.
La gestion des trois phases de test est assurée un contrôleur peu complexe.
Le schéma de principe d'une implantation possible d'un module de test suivant l'invention est représenté à la figure 2.
Ce module qui est en fait le module d'analyse schéma de la figure 1, comporte un compteur-comparateur 10 à n entrées 1 ln connectées aux sorties correspondantes du CAN (non représenté) et representant le code de sortie à 8 bits de celui-ci.
II comporte en outre une entrée d'effacement ou mise à zéro 12, une entrée d'horloge 13, une entrée de contrôle 14 et une entree d'établissement 15.
II comporte de plus des sorties 16 reliées à trois entrées outB2, outB6, outB8, 17a,17b,17c d'un contrôleur 20 et une sortie 21 reliée à une entrée 22 du contrôleur 20.
Le contrôleur 20 comporte en outre une entrée reliée aux sorties du CAN, une sortie d'effacement 24 reliée à l'entrée du compteur- comparateur 10, une sortie code suivant 25 connectée à l'entree d'horloge 13, une sortie contrôle 26 connectée à l'entrée de contrôle 14 circuit 10 et une sortie d'établissement 27 connectée à l'entrée d'établissement 5 du compteur- comparateur 10.
Le contrôleur comporte en outre une entrée d'horloge ck28, une en trée d'effacement clear 29, une entrée de début 30, et une entree de fin 31.
De telles séquences nucléotidiques d'intérêt peuvent être obtenues selon des techniques bien connues de l'homme du métier telles que l'utilisation d'enzymes de restriction, dont l'utilisation est décrite en détail dans l'ouvrage de SAMBROOK et al. (1989) ou encore par amplification sélective de la séquence cible d'intérêt, par exemple par PCR.
Font également partie de l'invention les acides nucléiques hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec un acide nucléique choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ ID N 5.
Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de la présente invention, on entend les conditions d'hybridation suivantes: - préhybridation des filtres pendant 8 heures à 65 C dans un tampon composé de 6 x SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% FICOLL, 0,02% SAB et 500 g/ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé; - hybridation des filtres pendant 48 heures à 65 C en présence de tampon 1 x SSC correspondant à 0,15 M de NaCI et 0,05 M de citrate de sodium; - trois lavages des filtres dans une solution contenant un tampon 2 x SSC et 0,1 % SDS à 68 C pendant 15'.
Les conditions de forte stringence définies ci-dessus sont adaptées à l'hybridation d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur de 20 nucléotides.
Il va sans dire que ces conditions d'hybridation doivent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Les conditions convenables d'hybridation peuvent par exemple être adaptées selon l'enseignement contenu dans l'ouvrage de HAMES & HIGGINS (1985) ou encore dans l'ouvrage de SAMBROOK et al; (1989).
Font également partie de l'invention les acides nucléiques comprenant au moins 20 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ ID N 5.
De tels acides nucléiques comprennent avantageusement 20,25, 30,35, 40,50, 100,150, 200 à 250,300, 400,500 nucléotides consécutifs d'un polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ ID N 5.
De tels acides nucléiques peuvent comprendre par exemple 20,25, 30, 35,40, 50,100, 150,200, 250,300, 400 ou 500 nucléotides consécutifs d'un
polynucléotide choisi parmi les séquences nucléotidiques SEQ ID N 1 à SEQ ID N 5.
De tels acides nucléiques peuvent être notamment utiles en tant que sondes ou amorces nucléotidiques afin de détecter la présence de l'une quelconque des séquences nucléotidiques de SEQ ID N 1 à SEQ ID N 5 dans un échantillon.
De telles sondes ou amorces nucléotidiques peuvent être notamment utiles afin de mesurer l'expression de l'un quelconque des produits de transcription des régions codantes orf11, orf12 ou dhat selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
Afin d'améliorer encore la capacité des hôtes cellulaires transformés avec un acide nucléique selon l'invention à produire le 1,3 propanediol à partir de glucose, un tel hôte cellulaire recombinant pourra en outre être transformé avec un ou plusieurs gènes codant pour une ou plusieurs enzymes aptes à catalyser la transformation du glucose en glycérol.
Un couple d'enzymes capable d'effectuer la transformation du glucose en glycérol est par exemple une glycérol-3-phosphate déshydrogénase et une glycérol-3-phosphatase.
Ainsi, un acide nucléique selon l'invention pourra comprendre, outre les séquences codant respectivement pour la glycérol déshydratase indépendante du coenzyme B12 et la 1,3-propanediol déshydrogénase (dhaT), un troisième acide nucléique codant pour une glycérol-3-phosphate déshydrogénase et un quatrième acide nucléique codant pour une glycérol-3-phosphatase.
Pourront être employés en particulier un acide nucléique codant pour la gpd1 glycérol-3-phosphate déshydrogénase et un quatrième acide nucléique codant pour la gpp2 glycérol-3-phosphatase.
1 : digestion de la paroi bactérienne - On transvase le contenu de chaque erlenmeyer dans des pots spécifiques pour la centrifugeuse réfrigérante et on centrifuge 15 min. à 4000 trs.min.-' à 4 C. On élimine le surnageant, on ajoute 2 ml de solution I (contenant du lysozyme) par pot, on homogénéise et on laisse agir 5 min. à température du laboratoire.
- On ajoute 4 ml de solution Il par pot, on agite pour avoir une consistance visqueuse et on laisse agir 5 min. dans la glace.
- On ajoute 3 ml de solution III par pot, on homogénéise et on laisse agir 15 min. dans la glace.
- On centrifuge 15 min. à 8000 trs.min.-' à 4 C, on filtre le surnageant de chaque pot et on le transvase dans des tubes en verre.
2 : précipitation alcoolique.
- On ajoute 4,5 ml de 2-propanol par tube et on laisse 30 min. à - 80 C.
- On centrifuge 20 min. à 12500 trs.min-' à 4 C (en prenant soin de mettre les tubes dans des réducteurs de protection en caoutchouc), on élimine le surnageant et on égoutte les tubes sur du papier filtre.
- On sèche pour éliminer toutes traces d'alcool.
3 : digestion enzymatique.
- On reprend les culots d'ADN avec 3 ml d'eau distillée.
- RNase : on ajoute 10 l de Rnase par tube et on laisse agir 30 min. au bain-marie 37 C. Ici, la RNase permet la digestion de l'ARN bactérien.
- Protéinase K : ajoute 10 l de protéinase K par tube et on laisse agir 30 min. au bain-marie 37 C. Cette réaction enzymatique permet la digestion de toutes les protéines.
4 : Ultracentrifugation en gradient de chlorure de césium.
Dans chaque tube, on ajoute : - 3,75 g de CsCI (chlorure de césium), - 1 NI de BET (bromure d'éthidium), les tubes sont ultracentrifugés à 50.103 trs.min-1 à 20 C pendant une nuit. On obtient alors un anneau d'ADN rose visible sous la lumière ultra violette.
- On récupère délicatement l'anneau d'ADN recombinant rose (dans des tubes de 10 ml) à l'aide d'une seringue, en piquant sous l'anneau et en aspirant doucement. On ajoute un volume d'eau distillée stérile par tube et on complète à 10 ml avec de l'alcool isoamylique. On homogénéise par des retournements énergiques pendant 3 min.
- On centrifuge 5 min. à 3000 trs.min.-1 à 15 C (afin d'éliminer tout le BET par l'alcool isoamylique) et on récupère les plasmides recombinants avec une pipette Pasteur munie d'une poire (on utilise une pipette par tube).
b) on met le mélange aqueux de l'étape (a) en contact avec un milieu basique pour former un mélange réactionnel dont le pH est maintenu à un pH basique, c) à l'issue de l'étape (b), on récupère un précipité ou une dispersion colloïdale aqueuse, d) on met en contact soit la dispersion colloïdale aqueuse de l'étape (c) soit le précipité récupéré dans l'étape (c) qui est éventuellement redispersé, avec au moins un acide et un diluant, pour obtenir une dispersion colloïdale organique La première étape du procédé (étape a) consiste à préparer un mélange aqueux, sous forme habituellement d'une solution ou dispersion, d'élément(s) rentrant dans la composition des particules que l'on cherche à obtenir. Ce mélange comprend au moins un sel soluble, de préférence un acétate et/ou un nitrate de terre rare et éventuellement au moins un sel d'un élément (E) choisi dans le groupe IIA, IVA, VIIA, VIII, IB, IIB, IIIB, et IVB de la classification périodique des éléments.
L'étape suivante (étape b) consiste à mettre en contact le mélange aqueux précité avec un milieu basique. Par milieu basique on entend tout milieu présentant un pH supérieur à 7. Le milieu basique sera habituellement une solution aqueuse contenant une base. On peut utiliser notamment comme base, les produits du type hydroxyde On peut citer les hydroxydes alcalins ou alcalino-terreux On peut aussi utiliser les amines secondaires, tertiaires, ou quaternaires Toutefois, les amines et l'ammoniaque peuvent être préférés dans la mesure ou ils diminuent les risques de pollution par les cations alcalins ou alcalino-terreux. On peut aussi mentionner l'urée La mise en contact du mélange précité et du milieu basique se fait dans des conditions telles que le pH du mélange réactionnel que l'on forme reste basique et invariable. Ainsi, on maintient le pH du mélange réactionnel à une valeur d'au moins 7, plus particulièrement d'au moins 7,5, et encore plus particulièrement comprise entre 7,5 et 10,5.
La mise en contact du mélange aqueux et du milieu basique peut se faire par introduction du mélange précité dans le milieu basique Il est possible de réaliser la mise en contact en continu, la condition de pH étant réalisée en réglant les débits respectifs du mélange et de milieu basique.
Il est possible, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, de travailler dans des conditions telles que lors de la mise en contact du mélange avec le milieu basique on maintienne constant le pH du milieu réactionnel ainsi formé. De telles conditions peuvent être obtenues en ajoutant lors de l'introduction du mélange dans le milieu basique une quantité supplémentaire de base au mélange réactionnel formé.
La mise en contact se fait habituellement à température ambiante. Cette mise en contact peut avantageusement être réalisée sous atmosphère d'air ou d'azote ou d'un mélange azote-air.
A l'issue de la réaction, on récupère un précipité ou une dispersion colloïdale aqueuse (étape c).
Dans le cas d'obtention d'un précipité, on peut éventuellement séparer ce précipité de ses eaux mères par filtration, centrifugation ou tout autre moyen connu de l'homme de l'art permettant une telle séparation Le précipité sera avantageusement sous forme humide Le produit séparé peut être lavé.
De préférence, le précipité n'est pas soumise à une étape de séchage ou de lyophilisation ou toute opération de ce type.
Dans la suite du procédé, le précipité peut être utilisé tel quel, où éventuellement après remise en suspension aqueuse.
La dispersion colloïdale aqueuse directement issue de l'étape (b), le précipité séparé de ses eaux mères encore sous sa forme humide, ou le précipité remis en suspension aqueuse, est ensuite mise en contact avec au moins un acide et un diluant, tels que définis précédemment (étape d).
La concentration en oxydes totaux (oxydes d'éléments de terres rares et d'élément (E)) de la dispersion colloïdale aqueuse employée dans l'étape (d), peut varier entre 20 g/1 à 300g/l, de préférence entre 50 g/1 et 150 g/l.
Lorsque dans l'étape (d) le précipité est utilisé sous sa forme humide, la proportion en oxydes dudit précipité peut varier entre 10 à 50 % en poids par rapport à la masse du précipité humide. Les pourcentages en oxydes totaux peuvent être déterminés par pertes au feu, par exemple par calcination à 1000 C.
Pour obtenir une dispersion colloïdale organique dans l'étape (d), on met en contact soit la dispersion colloïdale aqueuse de l'étape (c) soit le précipité éventuellement redispersé, avec au moins un acide et un diluant. La quantité d'acide à incorporer peut être défini par le rapport molaire r . r = nombre de mole d'acide nombre de mole d'éléments de terre (s) Ce rapport molaire peut être compris 0,2 et 0,8, de préférence entre 0,3 et 0,6 La quantité de diluant à incorporer est ajustée de manière à obtenir une concentration en oxydes totaux telle que mentionnée plus haut.
A ce stade, il peut être avantageux d'ajouter dans la phase organique un agent promoteur dont la fonction est d'accélérer le transfert des particules de composé (s) dela phase aqueuse à la phase organique et d'améliorer la stabilité des dispersions colloïdales organiques obtenues.
A titre d'agent promoteur, on peut utiliser les composés à fonction alcool et tout particulièrement des alcools aliphatiques linéaires ou ramifiés ayant de 6 à 12 atomes
de carbone. Comme exemples spécifiques, on peut citer l'éthyl-2 hexanol, le décanol, le dodécanol ou leurs mélanges.