INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Kanamycin Rescue: A Simple technique for the recovery of T-DNA flanking séquences. Plant Mol Biol. Rep. 14 : - Extraction de l'ADN génomique De 0,5 à 0,75g de feuilles sont congelés rapidement dans l'azote liquide, broyés, en présence de polyclaTM, en fine poudre dans un mortier à l'aide d'un pilon, et la poudre est transférée avec l'azote liquide dans un tube "Oak Ridge", dans lequel sont ajoutés 15ml de tampon d'extraction (Tris 100mM, EDTA 50mM, NaC 1500mM, (3-mercaptoéthanol 10mM, pH8). Après addition de 1 ml de SDS 20%, les tubes sont incubés à 65 C pendant 10mn en agitant toutes les 3 à 4mn. 5ml d'acétate de potassium (5M) sont ajoutés et incubés à 0 C pendant au moins 20mn. Après centrifugation à 25000g (13000rpm) pendant 20mn, le surnageant est filtré à travers un filtre Miracloth (Calbiochem) dans un tube de 30ml contenant 10ml d'isopropanol et incubé à -20 C pendant 30mn. Après centrifugation à 20000g (10000 tpm) pendant 15mn, le culot d'ADN est séché en renversant le tube sur du papier absorbant pendant 10mn L'ADN est repris dans 0,7ml de TE 50/10 (Tris 50mM, EDTA 10mM pH8) auxquels sont ajoutés 5 l de RNAse (5mg/ml) et incubé à 37 C pendant 10mn. L'ADN est extrait par un volume égal de phénol/chloroforme 1/1 et précipité à l'isopropanol (1 volume)/ NaOAc (3M) (1/10 de volume). Le culot d'ADN est séché et repris dans 10 l de TE 10/1 (Tris 10mM, EDTA 1 mM, pH8).
- Clonage Première digestion. 0. 5 g d'ADN génomique d'Arabidopsis sont digérés avec Pstl (BRL life technologies, 95613, Cergy-Pontoise), précipités à l'ethanol (2. 5 volumes)/ NaOAc 3M (1/10 du volume) et remis en
suspension dans de l'eau. 2. 5 g du vecteur pResc38 sont digérés par PstI, déphosphorylés avec de la phosphatase alcaline d'intestin de veau (BRL), extraits avec un volume de phénol- chlorophorme (1/1) précipités à l'éthanol/ NaOAc, et remis en suspension dans de l'eau.
Première ligation. 0. 5 g d'ADN génomique digéré par Pstl et 2.5 g de pResc38 digéré par Pstl et déphosphorylé sont mis à liguer dans 100 l de volume total avec 5 unités de T4 ADN ligase (BRL), toute la nuit à12 C.
Deuxième digestion. Le mélange de ligation précédent est précipité à l'éthanol (2. 5 volumes)/ NH40Ac 8M (1/2 du volume), remis en suspension dans de l'eau, et complètement digéré avec un deuxième enzyme de restriction : Xbal, dans un volume total de 100 l en utilisant 20 unités d'enzyme de restriction. Le mélange est précipité à l'éthanol/NH40Ac et mis en suspension dans de l'eau.
Deuxième ligation. Afin de circulariser les molécules d'ADN, une deuxième ligation est réalisée sur le produit de la deuxième digestion avec une concentration d'ADN plus faible, dans un volume total de 200 l et en utilisant 5 unités de T4 ADN ligase. Le mélange est incubé toute la nuit à 12 C, puis précipité à l'éthanol/ NH40Ac, rincé 2 fois à l'éthanol 70% (v/v), séché, et repris dans 20 l d'eau.
- Transformation L'électroporation est réalisée grace à un appareil de type GenePulser (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) avec un voltage de 1,5 kV. Les cellules electrocompétentes DH10B electromax (BRL) sont rapidement décongelées puis placées sur la glace. Dans une cuvette d'electroporation froide (diamètre interélectrode de 1 mm, Bio-Rad), sont mélangés 2 l du produit de ligation précipité et 40 l de cellules compétentes. Après électroporation, 1 ml de milieu SOC froid (Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis,T. 1989. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. Cold Spring
Harbor, New York) est ajouté immédiatement. L'ensemble est transvasé dans un tube de culture de 13 ml et incubé 2h à 37 C sous agitation.
Un volume de 250 l de culture est étalé sur des boîtes de Pétri LBagar contenant 100 mg/l de carbenicilline et 50 mg/l de kanamycine et incubé à 37 C toute la nuit.
III - Clonage dans Pbin19 L'insert cloné dans le vecteur P38resc de "Kanamycin rescue" subit un clonage intermédiaire dans le vecteur Bluescript pBKS+ (Stratagène, San Diego CA92121) avant d'être cloné dans le vecteur binaire pBin19 en vue de la transformation des plantes. Ces clonages se font de manière directionnelle par double digestion EcoRI/Xbal.
Environ 250 ng de vecteur P38resc contenant l'insert et digéré par EcoRI et Xbal sont ligués avec environ 100 ng de vecteur KS+ digéré par les mêmes enzymes, non déphosphorylé, dans 40 l de volume final avec 10 U de T4 ADN ligase (BRL). Après incubation une nuit à 12 C, le mélange de ligation est précipité à l'éthanol/ NH40Ac, repris dans 10 l d'eau et utilisé pour électroporer des bactéries NM522 (BRL), rendues électrocompétentes suivant la technique décrite par Sambrook et al.,(1989). Les colonies positives blanches sont sélectionnées sur un milieu LB-agar contenant 40 mg/l de XGal, 8 mg/l d'IPTG (Genaxis Biotechnology, 78180, Montigny le Bretonneux) et 100mg/l de carbénicilline.
-Clonage dans pBin19.
L'insert contenu dans pBKS+, après digestion par EcoRI et Xbal, est purifié par électroélution à partir d'un gel d'agarose à 1%, selon la technique de Sambrook et al., (1989). Pour le clonage, 100ng de l'insert de 4. 3 kb et 100ng de vecteur pBin19 (12 kb) préalablement digéré par EcoRI
et Xbal (soit un rapport molaire insert/vecteur de 3/1) sont mélangés dans 40 l de volume total avec 10 l de ligase (BRL) et ligués sur la nuit à 12 C Après précipitation à l'éthanol/ NaOAc, le produit de ligation est repris dans 10 l d'eau et utilisé pour réaliser l'électroporation des bactéries NM522. La sélection des colonies positives se fait sur des boîtes de Pétri avec un milieu LB-agar contenant XGal et IPTG, comme ci-dessus et 50mg/1 de kanamycine.
On conçoit alors que l'installation d'analyse de la figure 1 permet le prélèvement d'échantillons gazeux en six points différents et leur distribution vers l'analyseur A, sous le contrôle de l'unité centrale 10 de commande des électrovannes, et ce, selon un ordre quelconque. En effet, l'unité centrale 10 pilote le prélèvement des différents points analysés, en dirigeant vers l'analyseur A, au travers du point -de rassemblement R, une source de gaz donnée, alors que les échantillons de gaz en provenance des autres sources sont dirigés vers les évents d'évacuation. Après analyse d'un échantillon, la source correspondante est alors dirigée vers son évacuation alors que l'électrovanne d'une autre source est activée pour procéder à son analyse, laissant les autres inactivées, c'est à dire en communication avec les évents d'évacuation.
Pour piloter le système, l'unité centrale 10 comporte, stocké en mémoire, un algorithme de pilotage des électrovannes trois voies. Ces dernières sont associées à des relais correspondants (non représentés) assurant l'alimentation des bobines de chaque électrovanne.
L'algorithme de pilotage comporte une modélisation du système d'analyse sous 1a forme d'une liste d'une partie au moins des équipements de l'installation surveillée affectés chacun d'une liste d'au moins un point de prélèvement, et une séquence d'analyse constituée d'une série de phases successives d'analyse au cours de chacune desquelles l'une des sources S,, ... , S6 est mise en communication avec l'analyseur A et ce, pendant une durée d'analyse prédéterminée.
On voit également sur la figure 1 que l'analyseur A est raccordé à l'unité centrale 10 de manière à visualiser et mémoriser les données issues de l'analyseur, comme décrit par la suite.
On notera que la modélisation du système et la séquence d'analyse stockées dans l'unité centrale 10 sont constituées par des éléments configurables et programmables, avant analyse, par l'utilisateur. Pour ce faire, l'unité centrale 10 est dotée d'un écran tactile 12 associé à un logiciel d'exploitation permettant de présenter à l'utilisateur un environnement lui permettant de configurer le système et d'élaborer la séquence d'analyse, sous la forme de fenêtres successives.
En effet, en se référant à la figure 2, pour la configuration préalable de l'installation et l'élaboration de la séquence d'analyse, l'unité centrale 10 provoque l'affichage, sur l'écran tactile 12, d'un écran de configuration 14 sur lequel apparaissent des fenêtres indiquant la liste des équipements de l'installation configurés, en particulier le type et le nom de l'équipement.
Dans la fenêtre correspondant au type d'équipements configurés, un icône est affiché indiquant à l'utilisateur si l'équipement considéré est de type multiplexé , c'est à dire s'il est sélectivement mis en communication avec l'analyseur A, ou s'il est de type déporté c'est à dire s'il est en communication constante avec l'analyseur A. Sur la figure 1, il est indiqué que l'équipement dénommé EQUI 1 est de type multiplexé alors que l'équipement dénommé EQUI 8 est de type déporté .
Sur cet écran de configuration 14, apparaît la liste des sources configurées sur chaque équipement sélectionné c'est à dire le nombre de points de prélèvement prévus pour chaque équipement.
On voit sur cette figure que l'équipement EQUI 1 est doté de six points de prélèvement S,, ..., S6.
On voit également sur cette figure que la sélection de l'une des sources (S,) permet la configuration de seuils de déclenchement d'alarmes ou de procédures de régulation, visibles sur les fenêtres intitulées 02 PPM .
On notera que l'écran de configuration représenté sur cette figure 2 permet la configuration de l'équipement EQUI 1 , constitué ici, par exemple, par un four, l'analyse effectuée dans l'analyseur A consistant à analyser la teneur en oxygène du mélange gazeux présent dans le four en six points d'analyse.
En poursuivant la description de l'écran de configuration 14, on voit sur cette figure 2 qu'une fenêtre intitulée Séquence permet de visualiser les sources intervenant dans la séquence d'analyse, seules les sources 2, 3 et 5 étant ici utilisées. La configuration du réseau d'acheminement de gaz est ici choisie pour que des voies 1, 3 et 4 soient définies dans le réseau pour la mise en communication successive des sources 2, 3 et 5 avec l'analyseur A.
L'écran 14 est complété par un ensemble d'icônes 16, 18, 20 et 22 permettant respectivement, lorsqu'ils sont actionnés, d'ajouter un équipement, de modifier un équipement sélectionné, en particulier les seuils, le nom de l'équipement,..., la suppression de toute la configuration, et la définition de la séquence d'analyse des équipements configurés.
Ainsi, en sélectionnant l'un des équipements, par exemple l'équipement EQUI 1 et en actionnant l'icône 18, il est possible de modifier la configuration de l'équipement, c'est à dire, en particulier, de modifier l'affectation des sources.
On voit en effet sur la figure 3 que cette action provoque l'affichage, par l'unité centrale 10, et sur l'écran tactile 12, d'un écran 24 illustrant les différentes caractéristiques de l'équipement sélectionné.
Comme on le voit, cet écran permet de nommer les voies d'analyse de l'analyseur A, c'est à dire de définir, pour chaque source, une voie d'acheminement de gaz, de définir les temps de purge et de prévoir des instants de synchronisation ( synchro ) correspondants à des phases optionnelles de mémorisation programmée des données délivrées par un analyseur.
Selon un premier mode de réalisation, l'impédance est une résistance. Selon un autre mode de réalisation, l'impédance est une inductance.
Pour limiter la tension aux bornes du premier condensateur, une diode Zener peut être reliée en parallèle au premier condensateur.
Pour limiter la tension aux bornes du second condensateur, une diode Zener peut être reliée en parallèle au second condensateur. La première tension utilisée pour l'alimentation des différents composants électroniques hors les relais de puissance doit être stable . A cet effet, on peut prévoir un système d'asservissement pour maintenir la première tension continue sensiblement constante en faisant varier l'intervalle entre les créneaux issus du hacheur.
La présente invention concerne aussi un compteur d'électricité comprenant une telle double alimentation.
Lz nréser`: inver"#on -ra mieux comnrisc à la lecture de 1a- description nul sis:`. donnée à titre iiiustratif et non limitatif en référence aux dessins annexés dans lesquels # la figure 1 représente schématiquement une double alimentation selon l'invention ; # la figure 2 représente schématiquement un système d'asservissement pour la double alimentation.
La figure 1 représente schématiquement une double alimentation selon l'invention. Un redresseur 10 est connecté au réseau de distribution d'électricité. A partir de la tension alternative du réseau, il délivre une tension continue, par exemple de 300 V. Les montages de redresseur de tension sont bien connus de l'Homme du Métier et ne sont donc pas décrits en détail ici.
Un hacheur 12 est relié à la sortie du redresseur 10. Un tel hacheur peut être par exemple du type de celui connu sous la marque Tiny Switch et commercialisé par la société Power Intégrations. Ce hacheur 12 transforme la tension continue délivrée par le redresseur 10 en une série de créneaux de tension de largeur égale à environ 2 fis, chacun des créneaux étant espacé du suivant par une période pouvant aller de 25 ps à 1 ms selon la puissance nécessaire. La valeur de cette période est commandable en fonction du courant absorbé par les composants du compteur et nous verrons plus loin le montage permettant d'effectuer cette commande.
Une diode 14 est connectée en parallèle à la sortie du hacheur 14. Elle permet d'assurer la continuité du courant lorsque le hacheur ne délivre pas de tension, c'est à dire dans l'intervalle entre deux créneaux de tension. Une première inductance 16, par exemple de 470 pH est reliée en série à la sortie du hacheur 12 et un bloc moyenneur 18 est relié à cette inductance.
Le bloc moyenneur (18) comprend un ensemble formé d'une seconde inductance 20 par exemple de 220 pH, reliée en série à un premier condensateur 22, ayant par exemple une capacité de 220 uF.
Cet ensemble est connecté d'une part à la première inductance 16 et à la masse électrique du compteur d'autre part de manière à ce que les inductances 16 et 20 forment un diviseur de tension inductif. La tension Vcc d'environ 5 V est délivrée aisy. borner, d>> premier condcnsatejir 22. _ .
Afin d'éviter toute surtension aux bornes du condensateur 22 provoquée par exemple par un dysfonctionnement, une diode Zener 24 est connectée en parallèle aux bornes du condensateur 22.
Par ailleurs, la tension Vcc servant à alimenter les différents composants électroniques du compteur d'électricité (non représenté), tels qu'afficheur ou microprocesseur, celle-ci est maintenue constante par un système d'asservissement 26 connecté aux bornes du premier condensateur 22 et relié à des entrées du hacheur 12.
Un système d'asservissement pouvant être utilisé dans le cadre de l'invention est représenté schématiquement en figure 2. Une diode Zener 28 est reliée en série à une résistance 30 par exemple de 220 S2.
Par ailleurs, l'ensemble constitué de la diode Zener 28 et résistance 30 est connecté en parallèle aux bornes du premier condensateur 22, la résistance 30 étant reliée à la masse électrique du compteur.
Une diode électroluminescente 32 est reliée aux bornes de la résistance 30 et la lumière émise commande la tension entre le collecteur et l'émetteur d'un transistor 34 du type bipolaire NPN, la diode et le transistor faisant avantageusement partie du même boitier du type de celui commercialisé par la société Siemens sous la référence SFH615.
Lorsque la tension Vcc diminue à la suite d'une consommation plus importante des composants du compteurs, le courant traversant la diode électroluminescente 32, et donc l'intensité de la lumière qu'elle émet, diminue. La tension délivrée par le transistor 34 diminue d'autant. Cette tension est appliquée sur des entrées appropriées du hacheur 12, qui adapte l'écart temporel entre chaque créneau de tension délivré en sortie de manière à maintenir la tension Vcc constante.
A titre d'illustration, le pourcentage d'identité de séquence pourra être effectué à l'aide du logiciel précité FASTA, en utilisant exclusivement les paramètres par défaut.
Ainsi, les différences nucléotidiques que peut comprendre un acide nucléique selon l'invention par rapport à la séquence nucléotidique SEQ ID N 1 peut résulter en des substitutions, délétions ou additions d'un ou plusieurs nucléotides consécutifs ou non.
Font également partie de l'invention des acides nucléiques comprenant tout ou partie d'un polynucléotide possédant au moins 85%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5%, ou encore 99,8% d'identité en nucléotides avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Selon un autre aspect, l'invention est également relative à un acide nucléique caractérisé en ce qu'il comprend tout ou partie d'un polynucléotide
hybridant, dans des conditions d'hybridation de forte stringence, avec la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, ou un acide nucléique de séquence complémentaire.
Par partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention, on entendra une séquence nucléotidique d'une longueur en bases inférieure à celle de la séquence SEQ ID N 1 et conservant la capacité à diriger l'expression d'une séquence nucléotidique d'intérêt dans les cellules de la racine d'une plante.
L'activité biologique d'une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention peut être aisément vérifiée par l'homme du métier, notamment à l'aide des constructions de vecteurs et des procédés de transformation de plantes avec ces derniers, tels que décrits dans les exemples.
A titre illustratif, une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention peut être obtenue par coupure enzymatique d'un acide nucléique tel que décrit ci-dessus, notamment un acide nucléique de séquence SEQ ID N 1, à l'aide d'endonucléases de restriction.
Une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention peut être aussi obtenue par exemple par délétion d'un ou plusieurs nucléotides du polynucléotide de séquence SEQ ID N 1 à l'aide de la technique à l'exonucléase III décrite dans les exemples. Un polynucléotide partie du promoteur végétal selon l'invention a avantageusement une longueur en nucléotides allant de 200, 250,300, 400,500, 750,100, 1200,1500 ou 2000 nucléotides (ou paire de bases s'il se présente sous la forme double brin).
L'homme du métier peut à cet effet utiliser la carte de restriction de la séquence nucléotidique SEQ ID N 1, représentée à la figure 1.
Pour la mise en oeuvre d'enzymes de restriction aux fins d'obtenir des fragments de polynucléotides correspondant à une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention, l'homme du métier pourra avantageusement se référer à l'ouvrage de Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2 ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York).
Une partie d'un polynucléotide promoteur selon l'invention pourra également être préparée par amplification spécifique du fragment d'intérêt à l'aide d'un couple d'amorces encadrant, respectivement du côté 5' et du côté
3', la séquence d'intérêt , par exemple à l'aide de la méthode PCR, telle que décrite notamment dans les brevets américains N US 4 683 195, US 4,683,202 et US 4,965,188.
Par conditions d'hybridation de forte stringence au sens de la présente invention, on entendra les conditions d'hybridation suivantes: ' préhybridation des filtres pendant 8 heures à 65 C dans un tampon composé de 6 x SSC, 50 mM Tris-HCI (pH 7. 5), 1 mM EDTA, 0,02% PVP, 0,02% Ficoll , 0,02% BSA, et 500 g par ml d'ADN de sperme de saumon dénaturé; # hybridation des filtres pendant 48 heures à 65 C en présence de tampon 1 x SSC correspondant à 0,15 M de NaCI et 0.05M de citrate de sodium ; # trois lavages des filtres dans une solution contenant 2 x SSC et 0,1 % SDS à 68 C pendant 15 minutes.
Les conditions d'hybridation décrites plus haut sont adaptées à l'hybridation, dans des conditions de forte stringence, d'une molécule d'acide nucléique d'une longueur de 20 nucléotides.
Il va sans dire que les conditions d'hybridation ci-dessus décrites doivent être adaptées en fonction de la longueur de l'acide nucléique dont l'hybridation est recherchée, selon des techniques bien connues de l'homme du métier.
L'invention remédie également au téléchargement d'un programme prédéterminé, telle que la librairie dynamique, que le navigateur demande à la suite de l'établissement d'une adresse de type URL à envoyer au serveur. A cet effet, un programme exécutable n'effectuant aucune action est chargé initialement dans le terminal client afin de le répertorier dans un tableau de types de média, et un fichier correspondant au programme exécutable dans le tableau de types de média est recherché en réponse à l'adresse de la librairie dynamique contenue dans la requête, puis le programme n'effectuant aucune action est exécuté. L'exécution d'un programme sans action inhibe ainsi la demande de téléchargement du navigateur.
En pratique, l'étape de charger peut comprendre un téléchargement du programme n'effectuant aucune action avec une page d'accueil depuis le serveur dans le terminal client. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaitront plus clairement à la lecture de la description suivante de plusieurs réalisations préférées de l'invention en référence à la figure unique annexée correspondante 1 qui est un algorithme d'une demande/réponse entre un terminal client et un serveur pour exécuter une fonction dans le serveur selon l'invention.
Une interface graphique interactive, appelée Webtop, est implantée dans un terminal d'un utilisateur et dans l'un des modules logiciels contenus en permanence en mémoire dans un serveur SEP, et appelées librairies (ou bibliothèques) dynamiques DLL (Dynamic Link Library). Le terminal d'utilisateur est appelé dans la suite "client" CL pour désigner les ressources logicielles et matérielles dans le terminal.
Comme montré schématiquement à la figure 1, le client CL et le serveur SER sont reliés notamment à travers un réseau de transmission de données à débit élevé, le réseau Internet WWW auquel on se référera, ou bien un réseau Intranet. Les messages échangés entre le client et le serveur sont des requêtes selon le protocole HTTP (Hypertext Transfer Protocol). Une requête est une adresse URL (Universal Ressource Locator) spécifiant notamment, à la suite du nom de protocole HTTP, le nom du serveur et le nom d'un document (répertoire et page) à afficher dans le client CL ou le nom d'une librairie de fonctions à traiter dans le serveur SER.
Afin de fixer le cadre de l'invention, il est rappelé ci-après quelques caractéristiques du serveur et du client, servant à la description d'une communication entre client et serveur lors du remplissage d'un formulaire par le client.
Le serveur SER a la possibilité de modifier un document existant avant de l'envoyer au client qui. l'a demandé. Le serveur consulte le document, cherche les instructions intégrées au document et les remplace par des objets demandés dans des instructions par le client CL. Les objets sont par exemple des lignes de texte, des images ou d'autres objets dynamiques interactifs qui sont créés au moment de la consultation du document. Cette technique est transparente pour l'utilisateur du terminal client CL qui ne visualise que le résultat d'une telle modification.
Cette technique est basée sur une plate-forme de logiciel, côté serveur, l'ASP (Active Server Pages), qui utilise des instructions intégrées dans les documents et également des petits programmes, des scripts exprimés par exemple dans le langage de programmation Javascript (marque déposée). Les scripts sont interprétés par un interpréteur qui est intégré dans le serveur SER. Ce type d'application Web dépend du système d'exploitation du serveur et est développé pour des accès à au moins une base de données BD.