INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Ce dispositif comprend deux lentilles convergentes 48 et 50 qui ont respectivement des distances focales F1 et F2. Le point A1 du miroir 20 se trouve au foyer de la lentille 48. Le dispositif d'inspection 46 est placé du côté de la face-arrière du miroir 20 (face opposée à celle ou se trouve la multicouche réflectrice 28).
I1 convient de noter que chaque dispositif 46 pourrait être placé du côté de la multicouche du miroir correspondant mais l'inspection serait moins commode du fait de la présence de l'autre miroir.
Stone, B. B. et al. (1996). Mol. and Cell. Probes, 10 :359-370.
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LISTAGE DE SEQUENCE ADEREGEM POLYPEPTIDE ICBP90 ET SES FRAGMENTS ET POLYNUCLEOTIDES CODANT LESDITS POLYPEPTIDES ET APPLICATIONS AU DIAGNOSTIC ET AU TRAITEMENT DU CANCER D18243 11 PatentIn Vers. 2.0 1 2382 ADN Homo sapiens CDS (1)..(2382) 1 atg tgg atc cag gtt cgg acc atg gat ggg agg cag acc cac acg gtg 48 Met Trp Ile Gin Val Arg Thr Met Asp Gly Arg Gin Thr His Thr Val 1 5 10 15 gac tcg ctg tcc agg ctg acc aag gtg gag gag ctg agg cgg aag atc 96 Asp Ser Leu Ser Arg Leu Thr Lys Val Glu Glu Leu Arg Arg Lys Ile 20 25 30 cag gag ctg ttc cac gtg gag cca ggc ctg cag agg ctg ttc tac agg 144 Gin Glu Leu Phe His Val Glu Pro Gly Leu Gin Arg Leu Phe Tyr Arg 35 40 45 ggc aaa cag atg gag gac ggc cat acc ctc ttc gac tac gag gtc cgc 192 Gly Lys Gln Met Glu Asp Gly His Thr Leu Phe Asp Tyr Glu Val Arg 50 55 60 ctg aat gac acc atc cag ctc ctg gtc cgc cag agc ctc gtg ctc ccc 240 Leu Asn Asp Thr Ile Gln Leu Leu Val Arg Gln Ser Leu Val Leu Pro 65 70 75 80 cac age acc aag gag cgg gac tcc gag ctc tcc gac acc gac tcc ggc 288 His Ser Thr Lys Glu Arg Asp Ser Glu Leu Ser Asp Thr Asp Ser Gly 85 90 95 tgc tgc ctg ggc cag agt gag tca gac aag tcc tcc ace cac ggt gag 336 Cys Cys Leu Gly Gin Ser Glu Ser Asp Lys Ser Ser Thr His Gly Glu 100 105 110 gcg gcc gcc gag act gac agc agg cca gcc gat gag gac atg tgg gat 384 Ala Ala Ala Glu Thr Asp Ser Arg Pro Ala Asp Glu Asp Met Trp Asp 115 120 125 gag acg gaa ttg ggg ctg tac aag gtc aat gag tac gtc gat gct cgg 432 Glu Thr Glu Leu Gly Leu Tyr Lys Val Asn Glu Tyr Val Asp Ala Arg 130 135 140 gac acg aac atg ggg gcg tgg ttt gag gcg cag gtg gtc agg gtg acg 480 Asp Thr Asn Met Gly Ala Trp Phe Glu Ala Gin Val Val Arg Val Thr
145 150 155 160 cgg aag gcc ccc tcc cgg gac gag ccc tgc agc tcc acg tcc agg ccg 528 Arg Lys Ala Pro Ser Arg Asp Glu Pro Cys Ser Ser Thr Ser Arg Pro 165 170 175 gcg ctg gag gag gac gtc att tac cac gtg aaa tac gac gac tac ccg 576 Ala Leu Glu Glu Asp Val Ile Tyr His Val Lys Tyr Asp Asp Tyr Pro -180 185 190 gag aac ggc gtg gtc cag atg aac tcc agg gac gtc cga gcg cgc gcc 624 Glu Asn Gly Val Val Gln Met Asn Ser Arg Asp Val Arg Ala Arg Ala 195 200 205 cgc ace atc atc aag tgg cag gac ctg gag gtg ggc cag gtg gtc atg 672 Arg Thr Ile Ile Lys Trp Gln Asp Leu Glu Val Gly Gln Val Val Met 210 215 220 etc aac tac aac ccc gac aac ccc aag gag cgg ggc ttc tgg tac gac 720 Leu Asn Tyr Asn Pro Asp Asn Pro Lys Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Asp 225 230 235 240 gcg gag atc tcc agg aag cgc gag acc agg acg gcg cgg gaa ctc tac 768 Ala Glu Ile Ser Arg Lys Arg Glu Thr Arg Thr Ala Arg Glu Leu Tyr 245 250 255 gcc aac gtg gtg ctg ggg gat gat tct ctg aac gac tgt cgg atc atc 816 Ala Asn Val Val Leu Gly Asp Asp Ser Leu Asn Asp Cys Arg Ile Ile 260 265 270 ttc gtg gac gaa gtc ttc aag att gag cgg ccg ggt gaa ggg agc ccc 864 Phe Val Asp Glu Val Phe Lys Ile Glu Arg Pro Gly Glu Gly Ser Pro 275 280 285 atg gtt gac aac ccc atg aga cgg aag agc ggg ccg tcc tgc aag cac 912 Met Val Asp Asn Pro Met Arg Arg Lys Ser Gly Pro Ser Cys Lys His 290 295 300 tgc aag gac gac gtg aac aga ctc tgc agg gtc tgc gcc tgc cac ctg 960 Cys Lys Asp Asp Val Asn Arg Leu Cys Arg Val Cys Ala Cys His Leu 305 310 315 320 tgc ggg ggc cgg cag gac ccc gac aag cag ctc atg tgc gat gag tgc 1008 Cys Gly Gly Arg Gln Asp Pro Asp Lys Gln Leu Met Cys Asp Glu Cys 325 330 335 gac atg gcc ttc cac atc tac tgc ctg gac ccg ccc ctc agc agt gtt 1056 Asp Met Ala Phe His Ile Tyr Cys Leu Asp Pro Pro Leu Ser Ser Val 340 345 350 ccc agc gag gac gag tgg tac tgc cet gag tgc cgg aat gat gcc agc 1104 Pro Ser Glu Asp Glu Trp Tyr Cys Pro Glu Cys Arg Asn Asp Ala Ser 355 360 365 gag gtg gta ctg gcg gga gag cgg ctg aga gag agc aag aag aat gcg 1152 Glu Val Val Leu Ala Gly Glu Arg Leu Arg Glu Ser Lys Lys Asn Ala 370 375 380 aag atg gcc tcg gcc aca tcg tcc tca cag cgg gac tgg ggc aag ggc 1200 Lys Met Ala Ser Ala Thr Ser Ser Ser Gln Arg Asp Trp Gly Lys Gly 385 390 395 400
atg gcc tgt gtg ggc cgc acc aag gaa tgt acc atc gtc ccg tcc aac 1248 Met Ala Cys Val Gly Arg Thr Lys Glu Cys Thr Ile Val Pro Ser Asn 405 410 415 cac tac gga ccc atc ccg ggg atc ccc gtg ggc acc atg tgg cgg ttc 1296 His Tyr Gly Pro Ile Pro Gly Ile Pro Val Gly Thr Met Trp Arg Phe 420 425 430 cga gtc cag-gtc agc gag tcg ggt gtc cat cgg ccc cac gtg gct ggc 1344 Arg Val Gln Val Ser Glu Ser Gly Val His Arg Pro His Val Ala Gly 435 440 445 atc cat ggc cgg agc aac gac gga tcg tac tcc cta gtc ctg gcg ggg 1392 Ile His Gly Arg Ser Asn Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Val Leu Ala Gly 450 455 460 ggc tat gag gat gat gtg gac cat ggg aat ttt ttc aca tac acg ggt 1440 Gly Tyr Glu Asp Asp Val Asp His Gly Asn Phe Phe Thr Tyr Thr Gly '465 470 475 480 agt ggt ggt cga gat ctt tcc ggc aac aag agg acc gcg gaa cag tct 1488 Ser Gly Gly Arg Asp Leu Ser Gly Asn Lys Arg Thr Ala Glu Gln Ser 485 490 495 tgt gat cag aaa ctc acc aac acc aac agg gcg ctg gct ctc aac tgc 1536 Cys Asp Gln Lys Leu Thr Asn Thr Asn Arg Ala Leu Ala Leu Asn Cys 500 505 510 ttt gct ccc atc aat gac caa gaa ggg gcc gag gcc aag gac tgg cgg 1584 Phe Ala Pro Ile Asn Asp Gln Glu Gly Ala Glu Ala Lys Asp Trp Arg 515 520 525 tcg ggg aag ccg gtc agg gtg gtg cgc aat gtc aag ggt ggc aag aat 1632 Ser Gly Lys Pro Val Arg Val Val Arg Asn Val Lys Gly Gly Lys Asn 530 535 540 agc aag tac gcc ccc gct gag ggc aac cgc tac gat ggc atc tac aag 1680 Ser Lys Tyr Ala Pro Ala Glu Gly Asn Arg Tyr Asp Gly Ile Tyr Lys 545 550 555 560 gtt gtg aaa tac tgg ccc gag aag ggg aag tcc ggg ttt ctc gtg tgg 1728 Val Val Lys Tyr Trp Pro Glu Lys Gly Lys Ser Gly Phe Leu Val Trp 565 570 575 cgc tac ctt ctg cgg agg gac gat gat gag cet ggc cet tgg acg aag 1776 Arg Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Asp Asp Glu Pro Gly Pro Trp Thr Lys 580 585 590 gag ggg aag gac cgg atc aag aag ctg ggg ctg acc atg cag tat cca 1824 Glu Gly Lys Asp Arg Ile Lys Lys Leu Gly Leu Thr Met Gln Tyr Pro 595 600 605 gaa ggc tac ctg gaa gcc ctg gcc aac cga gag cga gag aag gag aac 1872 Glu Gly Tyr Leu Glu Ala Leu Ala Asn Arg Glu Arg Glu Lys Glu Asn 610 615 620 agc aag agg gag gag gag gag cag cag gag ggg ggc ttc gcg tcc ccc 1920 Ser Lys Arg Glu Glu Glu Glu Gin Gin Glu Gly Gly Phe Ala Ser Pro 625 630 635 640 agg acg ggc aag ggc aag tgg aag cgg aag tcg gca gga ggt ggc ccg 1968 Arg Thr Gly Lys Gly Lys Trp Lys Arg Lys Ser Ala Gly Gly Gly Pro
645 650 655 agc agg gcc ggg tcc ccg cgc cgg aca tcc aag aaa ace aag gtg gag 2016 Ser Arg Ala Gly Ser Pro Arg Arg Thr Ser Lys Lys Thr Lys Val Glu 660 665 670 ccc tac agt ctc acg gcc cag cag agc agc ctc atc aga gag gac aag 2064 Pro Tyr Ser Leu Thr Ala Gin Gin Ser Ser Leu Ile Arg Glu Asp Lys 675- 680 685 ag aac gcc aag ctg tgg aat gag gtc ctg gcg tca ctc aag gac cgg 2112 Ser Asn Ala Lys Leu Trp Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Lys Asp Arg 690 695 700 ccg gcg agc ggc agc ccg ttc cag ttg ttc ctg agt aaa gtg gag gag 2160 Pro Ala Ser Gly Ser Pro Phe Gin Leu Phe Leu Ser Lys Val Glu Glu 705 710 715 720 acg ttc cag tgt atc tgc tgt cag gag ctg gtg ttc cgg ccc atc acg 2208 Thr Phe Gin Cys Ile Cys Cys Gin Glu Leu Val Phe Arg Pro Ile Thr 725 730 735 acc gtg tgc cag cac aac gtg tgc aag gac tgc ctg gac aga tcc ttt 2256 Thr Val Cys Gin His Asn Val Cys Lys Asp Cys Leu Asp Arg Ser Phe 740 745 750 cgg gca cag gtg ttc agc tgc cet gcc tgc cgc tac gac ctg ggc cgc 2304 Arg Ala Gin Val Phe Ser Cys Pro Ala Cys Arg Tyr Asp Leu Gly Arg 755 760 765 agc tat gcc atg cag gtg aac cag cet ctg cag
* ace gtc ctc aac cag 2352 Ser Tyr Ala Met Gin Val Asn Gin Pro Leu Gin Thr Val Leu Asn Gin 770 775 780 ctc ttc ccc ggc tac ggc aat ggc cgg tga 2382 Leu Phe Pro Gly Tyr Gly Asn Gly Arg 785 790 2 793 PRT Homo sapiens 2 Met Trp Ile Gin Val Arg Thr Met Asp Gly Arg Gin Thr His Thr Val 1 5 10 15 Asp Ser Leu Ser Arg Leu Thr Lys Val Glu Glu Leu Arg Arg Lys Ile 20 25 30 Gin Glu Leu Phe His Val Glu Pro Gly Leu Gin Arg Leu Phe Tyr Arg 35 40 45 Gly Lys Gin Met Glu Asp Gly His Thr Leu Phe Asp Tyr Glu Val Arg 50 55 60 Leu as Asp Thr Ile Gin Leu Leu Val Arg Gin Ser Leu Val Leu Pro 65 70 75 80 His Ser Thr Lys Glu Arg Asp Ser Glu Leu Ser Asp Thr Asp Ser Gly 85 90 ' 95
Cys Cys Leu Gly Gln Ser Glu Ser Asp Lys Ser Ser Thr His Gly Glu 100 105 110 Ala Ala Ala Glu Thr Asp Ser Arg Pro Ala Asp Glu Asp Met Trp Asp 115 120 125 Glu Thr Glu Leu Gly Leu Tyr Lys Val Asn Glu Tyr Val Asp Ala Arg 130 135 140 Asp Thr Asn Met Gly Ala Trp Phe Glu Ala Gln Val Val Arg Val Thr 145 150 155 160 Arg Lys Ala Pro Ser Arg Asp Glu Pro Cys Ser Ser Thr Ser Arg Pro 165 170 175 Ala Leu Glu Glu Asp Val Ile Tyr His Val Lys Tyr Asp Asp Tyr Pro 180 185 190 Glu Asn Gly Val Val Gln Met Asn Ser Arg Asp Val Arg Ala Arg Ala 195 200 205 Arg Thr Ile Ile Lys Trp Gln Asp Leu Glu Val Gly Gln Val Val Met 210 215 220 Leu Asn Tyr Asn Pro Asp Asn Pro Lys Glu Arg Gly Phe Trp Tyr Asp 225 230 235 240 Ala Glu Ile Ser Arg Lys Arg Glu Thr Arg Thr Ala Arg Glu Leu Tyr 245 250 255 Ala Asn Val Val Leu Gly Asp Asp Ser Leu Asn Asp Cys Arg Ile Ile 260 265 270 Phe Val Asp Glu Val Phe Lys Ile Glu Arg Pro Gly Glu Gly Ser Pro 275 280 285 Met Val Asp Asn Pro Met Arg Arg Lys Ser Gly Pro Ser Cys Lys His 290 295 300 Cys Lys Asp Asp Val Asn Arg Leu Cys Arg Val Cys Ala Cys His Leu 305 310 315 320 Cys Gly Gly Arg Gln Asp Pro Asp Lys Gln Leu Met Cys Asp Glu Cys 325 330 335 Asp Met Ala Phe His Ile Tyr Cys Leu Asp Pro Pro Leu Ser Ser Val 340 345 350 Pro Ser Glu Asp Glu Trp Tyr Cys Pro Glu Cys Arg Asn Asp Ala Ser 355 360 365 Glu Val Val Leu Ala Gly Glu Arg Leu Arg Glu Ser Lys Lys Asn Ala 370 375 380 Lys Met Ala Ser Ala Thr Ser Ser Ser Gin Arg Asp Trp Gly Lys Gly 385 390 395 ' 400 Met Ala Cys Val Gly Arg Thr Lys Glu Cys Thr Ile Val Pro Ser Asn 405 410 415 His Tyr Gly Pro Ile Pro Gly Ile Pro Val Gly Thr Met Trp Arg Phe
420 425 430 Arg Val Gin Val Ser Glu Ser Gly Val His Arg Pro His Val Ala Gly 435 440 445 Ile His Gly Arg Ser Asn Asp Gly Ser Tyr Ser Leu Val Leu Ala Gly 450 455 460 Gly Tyr Glu-Asp Asp Val Asp His Gly Asn Phe Phe Thr Tyr Thr Gly 465 470 475 480 Ser Gly Gly Arg Asp Leu Ser Gly Asn Lys Arg Thr Ala Glu Gin Ser 485 490 495 Cys Asp Gin Lys Leu Thr Asn Thr Asn Arg Ala Leu Ala Leu Asn Cys 500 505 510 Phe Ala Pro Ile Asn Asp Gin Glu Gly Ala Glu Ala Lys Asp Trp Arg 515 520 525 Ser Gly Lys Pro Val Arg Val Val Arg Asn Val Lys Gly Gly Lys Asn 530 535 540 Ser Lys Tyr Ala Pro Ala Glu Gly Asn Arg Tyr Asp Gly Ile Tyr Lys 545 550 555 560 Val Val Lys Tyr Trp Pro Glu Lys Gly Lys Ser Gly Phe Leu Val Trp 565 570 575 Arg Tyr Leu Leu Arg Arg Asp Asp Asp Glu Pro Gly Pro Trp Thr Lys 580 585 590 Glu Gly Lys Asp Arg Ile Lys Lys Leu Gly Leu Thr Met Gin Tyr Pro 595 600 605 Glu Gly Tyr Leu Glu Ala Leu Ala Asn Arg Glu Arg Glu Lys Glu Asn 610 615 620 Ser Lys Arg Glu Glu Glu Glu Gin Gin Glu Gly Gly Phe Ala Ser Pro 625 630 635 640 Arg Thr Gly Lys Gly Lys Trp Lys Arg Lys Ser Ala Gly Gly Gly Pro 645 650 655 Ser Arg Ala Gly Ser Pro Arg Arg Thr Ser Lys Lys Thr Lys Val Glu 660 665 670 Pro Tyr Ser Leu Thr Ala Gin Gin Ser Ser Leu Ile Arg Glu Asp Lys 675 680 685 Ser Asn Ala Lys Leu Trp Asn Glu Val Leu Ala Ser Leu Lys Asp Arg 690 695 700 Pro Ala Ser Gly Ser Pro Phe Gin Leu Phe Leu Ser Lys Val Glu Glu 705 710 715 720 Thr Phe Gin Cys Ile Cys Cys Gln Glu Leu Val Phe Arg Pro Ile Thr 725 730 735 Thr Val Cys Gin His Asn Val Cys Lys Asp Cys Leu Asp Arg Ser Phe 740 745 750
Arg Ala Gin Val Phe Ser Cys Pro Ala Cys Arg Tyr Asp Leu Gly Arg 755 760 765 Ser Tyr Ala Met Gln Val Asn Gin Pro Leu Gln Thr Val Leu Asn Gln 770 775 780 Leu Phe Pro Gly Tyr Gly Asn Gly Arg 785 790 3 45 ADN Homo sapiens CDS (1)..(45) 3 acc cac ggt gag gcg gcc gcc gag act gac agc agg cca gcc gat 45 Thr His Gly Glu Ala Ala Ala Glu Thr Asp Ser Arg Pro Ala Asp 1 5 10 15 4 15 PRT Homo sapiens 4 Thr His Gly Glu Ala Ala Ala Glu Thr Asp Ser Arg Pro Ala Asp 1 5 10 15 5 78 ADN Homo sapiens CDS (1)..(78) 5 atg gtt gac aac ccc atg aga cgg aag agc ggg ccg tcc tgc aag cac 48 Met Val Asp Asn Pro Met Arg Arg Lys Ser Gly Pro Ser Cys Lys His 1 5 10 15 tgc aag gac gac gtg aac aga ctc tgc agc 78 Cys Lys Asp Asp Val Asn Arg Leu Cys Ser 20 25 6 26 PRT Homo sapiens 6 Met Val Asp Asn Pro Met Arg Arg Lys Ser Gly Pro Ser Cys Lys His 1 5 10 15
Ce nombre peut être choisi en fonction de la position (ou profondeur dans le "spanning tree", connu en terminologie anglo-saxonne sous le terme d'arbre d'extension) du noeud dans l'arbre que constitue le réseau de communication 10 selon l'invention.
La variable nb (i) est une valeur caractéristique du noeud Ni et varie suivant la position de ce noeud dans l'arborescence.
La valeur NB_ITER_INIT est une variable locale qui est initialisée avec la variable nb (i).
On choisit la valeur de nb (i) égale à "2i+1" avec i = 0, ..., N.
- La valeur CTOT INIT représente la moyenne effectuée sur les valeurs CMES .
- CmdlnitMsg(CINIT(i)) correspond à une commande envoyée aux noeuds inférieurs dans l'arbre que constitue le réseau pour leur communiquer la valeur CINIT(i) (valeur d'initialisation des registres des noeuds considérés) et permettre le lancement de la procédure d'initialisation au niveau de ces noeuds.
La figure 5a représente une phase. d'initialisation mise en oeuvre au niveau du noeud Ni-1 (noeud racine), ainsi que dans chacun des autres noeuds du réseau.
La première étape S, de cette phase d'initialisation consiste à mettre la valeur CREFMAX à une valeur fixée par défaut, CREF INIT. Cette valeur est par exemple égale à 3071 impulsions d'horloge.
Au cours de cette même étape la valeur NB_ITER_INIT est fixée à une valeur inférieure à nb(i-1), permettant ainsi d'effectuer un moyennage de la valeur Ci,,i, en fonction de la position du n#ud dans l'arbre.
Toujours selon cette même étape, la valeur CTOT INIT est fixée à zéro.
L'étape suivante S2 consiste à effectuer un test sur la valeur de CREF par rapport à la valeur zéro. Par exemple, la valeur C,ef est incrémentée à la fréquence de l'horloge transmise au n#ud considéré et la valeur C,,,es est incrémentée à la fréquence de l'horloge du noeud considéré.
Tant que cette valeur n'est pas égale à zéro, alors cette étape est renouvelée et la durée de toutes ces étapes S2 mises bout à bout constitue une période de mesure.
Au contraire, lorsque le nombre d'impulsions d'horloge émises par l'horloge interne du noeud Ni-1 passe de 3071 à la valeur 0, alors l'étape S2 est suivie de l'étape S3, au cours de laquelle on procède à une lecture de la valeur CMES- Cette valeur correspond au nombre d'impulsions d'horloge émises par l'horloge interne du noeud Ni-1.
L'étape S3 consiste également à additionner la valeur CMES aux valeurs précédemment cumulées et la valeur qui en résulte est notée CTOT INIT- Le nombre NB ITER INIT est alors décrémenté de une unité à chaque boucle.
L'étape suivante S4 consiste à effectuer un test sur la valeur NB_ITER_INIT par rapport à la valeur zéro. Lorsque ce nombre n'est pas égal à zéro alors la phase d'initialisation prévoit de se, replacer à l'étape S2.
Au contraire, lorsque ce nombre est égal à zéro, signifiant ainsi que l'on a effectué nb(i-1) boucles, alors l'étape S4 est suivie d'une étape S5 au cours de laquelle on détermine une valeur d'initialisation notée CIN,T(;_,> et qui est égale au rapport de la valeur CTOT INIT sur la variable nb(i-1).
Figure 3 : Localisationnucléaire de la protéine endogène Nous avons utilisé des cellules HeLa pour examiner l'expression endogène de la protéine ICBP90 in situ à l'aide de l'anticorps 1RC1C-10 et d'un anticorps secondaire antisouris couplé au fluorochrome CY3. Le marquage est localisé exclusivement dans le noyau. Le nucléole et le cytoplasme ne sont pas marqués.
Figure 4 : de l'ICBP59 endogène dans les cellules en prolifération
Nous avons observé la protéine endogène sur des coupes en paraffine d'appendice humain. Après déparaffinage et prétraitement par chauffage en tampon acide (démasquage des sites antigéniques), les coupes sont incubées pendant 16 heures avec l'anticorps 1RC1C-10 dilué au 1/-10000 (concentration initiale de 2 mg/ml). La révélation se fait par mise en contact avec un anticorps secondaire biotinylé, puis incubation avec le complexe streptavidine-péroxydase. Une contre coloration des noyaux à l'hématoxyline de Harris est également réalisée.
Le marquage par 1RC1C-10 est localisé essentiellement dans des zones de prolifération cellulaire. Les cellules marquées se trouvent dans les cryptes glandulaires (CG) ainsi que dans les zones germinatives (ger).
Figure 5 : Expression de ICBP-59 dans divers tissus humains Nous avons évalué le niveau d'expression de l'ARNm correspondant à ICBP59 sur un dot blot d'ARN comportant 50 tissus humains différents. Le blot a été hybridé pendant 16 heures à 68 C avec une sonde d'ADNc radioactive (32P) de 679 pb dans une solution d'hybridation ExpressHyb (Clontech). Après lavages, on réalise une révélation par autoradiographie (exposition une semaine à 80 C). Les tissus présentant le plus haut niveau d'expression sont le thymus adulte et f#tal, ainsi que la moelle osseuse adulte et le foie foetal.
Figure 6 : Séquence nucléotidique de ICBP90 L'ADNc codant pour ICBP90 comporte 2379 pb. Les portions de séquence indiquées en gras sont celles qui n'apparaissent pas dans les bases de données d'EST humains (human dbest). Les autres parties de la séquence existent dans diverses EST: de 1 à 325 : EST n AI083773. de 367 à 865 : EST n AA811055. de 940 à 1857 : EST n AA488755, EST n AA 129794 et EST n AA354253.
Figure 7 : Séquence protéique de ICBP90 La séquence en acides aminés de ICBP90 est déduite par traduction de la séquence nucléotidique de la figure 6. ICBP90 comporte 793 résidus et présente un poids moléculaire théorique de 89,758 kDa. Le pKi est de 7,7. Les acides aminés indiqués en gras correspondent à ICBP-59.
EXEMPLE 1 : EN EVIDENCE D'UNE NOUVELLE PROTEINE DE LIAISON A LA SEQUENCE ICB 1.1. Construction reportrice pour le criblage de la banque Le système du simple hybride est une technique puissante qui permet de détecter in vivo chez la levure l'interaction de protéines avec des séquences d'ADN spécifiques en criblant des banques d'ADNc. Ceci permet d'évaluer directement l'ADNc correspondant de la protéine à lier.
Plusieurs études ont permis d'identifier la nouvelle protéine dans cette méthode. Ces méthodes décrivent très bien les protocoles utilisés (Inouye et al., 1994 ; Wang et Reed, 1993).
Brièvement, les oligonucléotides suivants ont été synthétisés 5'- AATTCGATTGGTTCTGATTGGTTCTGATTGGTTCTT-3 ' et 5'CTAGAAGAACCAATCAGAACCAATCAGAACCAATCG-3'. Ces nucléotides sont ensuites hybridés. Selon les instructions du fabricant (Clontech, Palo Alto, CA), la construction reportrice cible possède trois copies en tandem de la séquence ICB2 (ICB2X3). Comme mentionné plus haut, une copie de ICB2 est soulignée et les séquences CCAAT sont représentées en gras. Pour déterminer la spécificité de liaison des protéines à la boîte ICB, les oligonucléotides suivants qui contiennent trois copies en tandem de la boîte GC1(GC1X3) et également présents dans le promoteur ont été synthétisés et hybridés: 5'- AATTCGGGGCGGGGCCGGGGCGGGGCCGGGGCGGGGCT-3' 5'- CTAGAGCCCCGCCCCGGCCCCGCCCCGGCCCCGCCCCGG-3'
Les fragments d'ADN cible résultant sont clonés dans le polylinker d'un plasmide intégratif pHISi-1 (Clontech) par ligation des extrémités cohésives au niveau du site EcoRI et XbaI, en amont du promoteur minimal du gène his3. La souche de levure YM4271 (Clontech) est utilisée pour la transformation et des colonies de levure ayant intégrées le plasmide dans leur génome sont sélectionnées sur un milieu synthétique Dropout ne contenant pas d'histidine. Deux clones ont été isolés : un pour ICB2 et un pour la boite GC1.
1. 2. Criblage de la banque Une banque d'ADNc de la lignée cellulaire Jurkat clonée au site d'EcoRI du polylinker en aval de GAL4-AD du vecteur pGAD 10 (Clontech) est utilisée pour le criblage selon les instructions du fabricant. Des clones positifs sont sélectionnés puis cultivés sur un milieu sélectif déplété en histidine et en leucine. L'ADN plasmidique de ces clones est récupéré et introduit par électroporation dans des bactéries Escherichia coli XLl-blue. Le séquençage des inserts a été réalisé sur une matrice d'ADN plasmidique purifiée à partir d'une culture d'1,5 ml utilisant un kit de mini préparation (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Une banque d'ADNc de thymus humain cloné dans #gt 10 (Clontech) a été criblée par hybridation sur une plaque, pour récupérer un ADNc codant la partie N-terminale de la protéine.
1. 3. Découverte de ICBP-59 Les ADNc de quatre clones ayant rempli les critères de sélection du système simple hybride ont été séquences, et les profils analysés à l'aide de bases de données informatiques (Genbank, EMBL, PDB, Swissprot) afin de déterminer la nature des protéines codées. Deux clones correspondent à des protéines ribosomales (hRS12 et hRS4), un à une sérine-thréonine kinase (STPLK-1) et le quatrième à une protéine humaine d'un poids moléculaire théorique de 59 kDa (calculé à partir de la séquence traduite) et non répertoriée.
Les ADNc, codant pour hRS4, hRS12 et ICBP-59 et obtenus par digestion par EcoRI des clones positifs obtenus dans le vecteur pGAD 10, ont été clonés au site EcoRI du vecteur d'expression pGEX-4T- 1 (Pharmacia). Les ADN recombinants sont ensuite transformés dans une souche d'Escherichia coli adaptée (BL21). 500 ml de culture du clone sélectionné ont été utilisés lorsque une densité optique de 0,5 a été atteinte. La surexpression des protéines d'intérêt a été induite par l'IPTG (lmM) pendant 2h à 37 C. Le vecteur pGEX-4T-1 conduit à l'obtention de grandes quantités de protéines sous forme fusionnée à la glutathion-S-transférase (GST). Les protéines de fusion avec la glutathione-S-transférase (GST) sont ensuite purifiées en utilisant des billes de sépharose couplé au glutathion (Pharmacia) suivi par une coupure durant la nuit avec de la thrombine (0,05 U/ml) à 4 C (Pharmacia).
Pour tester l'aptitude de la protéine de poids moléculaire de 59 kDa à lier spécifiquement les boites ICB1et/ou ICB2, trois copies en tandem de ICB2 (ICB2X3, séquences décrites précédemment) ont été marquées au niveau terminal au phosphore 32P en utilisant la polynucléotide kinase T4 (New England Biolabs) et du [y32P]ATP (160 mCi/mmol, ICN Irvine, CA, USA). Pour examiner la spécificité de la liaison, des oligonucléotides contenant seulement une copie de la boite CCAAT ont été synthétisés : ICB 1: 5'-AGTCAGGGATTGGCTGGTCTG-3'; 5'- CAGACCAGCCAATCCCTGACT-3' ICB2 : 5'-AAGCTACGATTGGTTCTTCTG-3'; 5'-CAGAAGAACCAATCGTAGCTT-3'.
La protéine ICBP-59 purifiée (1 g) est incubée avec 1 ng d'oligonucléotide marqué à son extrémité terminale par du phosphore 32P dans 12% de glycérol, 12 mM d'HEPES-NaOH (pH 7,9), 60 mM KCI, 4 mM Tris-HCI (pH 7,9), 100 ng BSA, 0,6 mM DTT et 100 ng de poly(dI/dC) dans 20 fil (Inouye et al., 199-1). Après 30 minutes d'incubation à température ambiance, le mixte réactionnel est chargé
En ce qui concerne la comparaison des registres, la valeur C,f devrait être en théorie remplacée par la valeur Ch, (;) afin de tenir compte d'une éventuelle dérive de valeur élevée qui serait évaluée durant la procédure d'in itialisation.
Cette modification de la durée TO) du cycle propre au noeud N(i) est effectuée en modifiant le nombre d'impulsions d'horloge générées par l'horloge interne du N(i) et qui sont contenues dans la durée du cycle ou période de référence T(;).
Comme représenté sur la figure 7, le procédé selon l'invention comporte également une étape de transmission du noeud N(i) vers le noeud N(i+1) indiquant à ce dernier que la valeur T(;) du cycle du noeud N(i) a été modifiée par ajout d'une impulsion d'horloge.