INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les propriétaires de piscines privées ou les exploitants de piscines publiques utilisent une couverture, lorsque la piscine est en exploitation, pour deux raisons: par souci d'économie, en réduisant au maximum les déperditions calorifiques et en stoppant l'évaporation de l'eau, mais surtout par souci de sécurité, car malheureusement de nos jours l'une des premières causes de mortalité infantile dans les pays industrialisés est la noyade dans les piscines.
Les bâches en mousse plastique comparativement aux bâches à bulles, ont un excellent coefficient d'isolation car elles ne comportent pas de pont thermique, mais elles restent peu sécurisantes et n'arriveraient pas à supporter longtemps un enfant qui viendrait à chuter dans la piscine.
Les rideaux de lames rigides en plastique sont mécaniquement très résistants et remplissent tout à fait leur role de couverture de sécurité. Un ou même plusieurs enfants peuvent chuter ou volontairement marcher dessus sans aucune crainte. De nombreux modèles de lames plastiques offrent une plus ou moins bonne isolation thermique, ceci en fonction de leur système de crochets articulés présentant des ponts thermiques, ou de l'épaisseur de la lame plastique isolante.
Les bâches à bulles d'air, les bâches en mousse ainsi que les rideaux de lames rigides en plastique sont des couvertures flottantes dites d'été. Il existe une autre catégorie de couvertures dites d'hiver. La catégorie de couvertures dites d'hiver sert de protection contre les chutes accidentelles et empêche la piscine de se salir d'une façon trop importante. Les couvertures d'été ne peuvent servir de couvertures d'hiver et inversement. Certains fabriquants peu scrupuleux vendent des rideaux de lames en plastique faisant office soit-disant de couvertures d'été et d'hiver. Les lames plastiques des couvertures ne résistent pas ou très mal au gel.
Les lames plastiques prises dans la glace voient leur durée de vie réduite d'une façon très importante. L'investissement que représente l'achat d'une couverture à lames plastiques rigides doit normalement s'amortir sur de nombreuses années. Il faut prendre soin des lames plastiques afin qu'elles ne soient pas prématurément détériorées pour que la couverture reste fonctionnelle le plus longtemps possible afin de rentabiliser son achat.
Toutes les techniques de couvertures flottantes ayant la propriété d'être de sécurité, ou ne l'ayant pas présentent le même inconvénient; elles ne peuvent couvrir que des piscines rectangulaires ou de forme géométrique simple. Les piscines de forme sinueuse et de forme libre ne seront donc la majeure partie du temps pas couvertes et représenteront un danger de noyade permanent.
La présente invention résout les inconvénients de chaque technique de couverture flottante en proposant aux piscines de tous types et de toutes formes d'être couvertes par des particules de sécurité isothermes flottantes.
L'invention a pour but d'offrir une sécurité absolue et une isolation thermique très performante sans pont thermique quelle que soit la forme de la piscine, même sinueuse et comportant une île.
Les particules de sécurité isothermes flottantes formant la couverture sont indépendantes les unes des autres et peuvent de ce fait flotter librement et individuellement sur l'eau, elles se placent afin de recouvrir la totalité de la surface de la piscine quelle qu'en soit sa forme.
Les particules de sécurité isothermes flottantes recouvrant la totalité de la surface de la piscine constituent une isolation thermique sans aucun pont thermique et sont encastrées latéralement les unes dans les autres pour ne former qu'un seul ensemble.
La présente invention concerne aussi un procédé pour conférer un phénotype CIM à un végétal, par transformation du végétal à l'aide d'un vecteur recombinant comprenant un gène chimère qui par lui-même comprend un promoteur actif dans les végétaux et lié par liaison opérationnelle à une séquence codant le gène NIM1, où la protéine NIM1 codée est exprimée dans le végétal transformé en des quantités plus grandes que dans un végétal de type sauvage.
De plus, la présente invention concerne un procédé pour activer la résistance systémique acquise dans un végétal, par transformation du végétal à l'aide d'un vecteur recombinant comprenant un gène chimère, qui par luimême comprend un promoteur actif dans les végétaux, lié par liaison opérationnelle à une séquence codant le gène NIAI, où la protéine NIM1 codée est exprimée dans le végétal transformée en des quantités plus grandes que dans un végétal de type sauvage.
En outre, la présente invention concerne un procédé pour conférer une résistance à un large spectre de maladies à un végétal, par transformation du végétal à l'aide d'un vecteur recombinant comprenant un gène chimère qui par lui-même comprend un promoteur actif dans les végétaux, lié par liaison opérationnelle à une séquence codant le gène NIAI, où la protéine NIM1 codée est exprimée dans le végétal transformé en des quantités plus grandes que dans un végétal de type sauvage.
Un autre aspect de la présente invention exploite la prise en compte de ce que la voie de la SAR dans les végétaux présente des parallèles fonctionnels avec le schéma de régulation du NF-KB/IKB chez les mammifères et les mouches, ainsi que la découverte selon laquelle le gène NIMi produit est un homologue structural de la sous classe a du facteur IKB de transduction du signal chez un mammifère. Des mutations de 1'IKB ont été décrites, qui jouent le rôle de super-répresseurs ou de dominant-négatifs du schéma de régulation du NF-KB/IaB. La présente invention englobe des formes modifiées du gène NIM1 de type sauvage (SEQ NO:2), qui jouent le rôle de régulateurs dominant-négatifs de la voie de transduction du signal SAR. Ces formes modifiées du NIM1 confèrent le phénotype opposé aux végétaux transformés avec son aide, en tant que mutant niml ; les végétaux, par exemple ceux qui sont transformés par des formes modifiées de NIAI, présentent une expression du gène constitutif de la SAR et un phénotype CIM.
La présente invention porte aussi sur des molécules d'ADN qui s'hybrident à une molécule d'ADN selon la présente invention telle que définie ci-dessus, mais de préférence à une sonde oligonucléotidique pouvant être obtenue à partir de cette molécule d'ADN, comprenant une portion contiguë de la séquence codante pour lesdites formes modifiées du NiMi et ayant une longueur d'au moins 10 nucléotides, dans des conditions modérément stringentes.
Les facteurs qui affectent la stabilité des hybrides déterminent la stringence de l'hybridation. L'un de ses facteurs est la température de fusion T,,,,, qui peut être facilement calculée par la formule donnée dans DNA PROBES, George H. Keller et Mark M. Manak, Macmillan Publishers Ltd, 1993, Section one : Molecular Hybridization Technology, page 8 et suivantes.
La température préférée d'hybridation est de l'ordre d'environ 25"C inférieure à la température de fusion calculée Tm, et elle est de préférence comprise entre environ 12 et 150C en dessous de la température calculée de fusion T,,,,, et, dans le cas des oligonucléotides, elle est comprise dans l'intervalle d'environ 5 à 100C en dessous de la température de fusion T,.
Dans une forme de réalisation de la présente invention, le gène NIM1 est modifié, de façon que le produit codé comporte des alanines au lieu de sérines dans les positions d'acides aminés correspondant aux positions 5559 de la séquence d'acides aminés du NIM1 de type sauvage d'Arabidopsis (SEQ ID NO:3). Un exemple d'une forme de réalisation préférée de cette forme modifiée du gène NIM1, qui conduit à des changements de ces résidus sérine en résidus alanine, est présenté dans la séquence SEQ ID NO:22. Une forme exemplaire, dominant-négative, de la protéine NIM1, avec des alanines au lieu de sérines sur les positions d'acides aminés exemple d'une forme de réalisation préférée de cette forme modifiée du gène NIM1, qui code un produit génique ayant une délétion N-terminale, est présenté dans la séquence SEQ ID NO:24. Une forme exemplaire dominantnégative de la protéine NIM1 comportant une délétion Nterminale est présentée dans la séquence SEQ ID NO:25. La présente invention concerne aussi des formes modifiées d'allèles du NIAI, où la séquence codante d'un tel allèle s'hybride dans des conditions modérément stringentes à la séquence codante SEQ ID NO:24 ; on préfère en particulier les conditions suivantes : hybridation dans du BSA à 1 % ; NaPO4 520 mM, pH 7,2 ; laurylsulfate de sodium à 7 % EDTA 1 mM ; chlorure de sodium 250 mM à 55"C pendant 18 à 24 heures, et lavage dans 6XSSC pendant 15 minutes (X3), 3XSSC pendant 15 minutes (X1) à 550C. Dans ces formes de réalisation, des allèles du NIM1 qui s'hybrident à la séquence SEQ ID NO:24 dans les conditions ci-dessus sont modifiés de telle sorte que le produit codé possède une délétion N-terminale qui élimine les résidus de lysine susceptibles de servir en tant que sites potentiels d'ubiquitinisation, en plus des sérines sur les positions d'acides aminés correspondant aux positions 55 et 59 du produit génique de type sauvage.
Dans encore une autre forme de réalisation de la présente invention, le gène NIM1 est modifié de façon que le produit codé ait une troncation C-terminale, dont on pense qu'elle va conduire à une stabilité intrinsèque améliorée, par blocage de la phosphorylation constitutive des résidus de sérine et de thréonine sur le site Cterminal du produit génique de type sauvage. Un exemple d'une forme de réalisation préférée de cette forme modifiée du gène NIAI, qui code un produit génique ayant une délétion C-terminale, est présenté dans la séquence SEQ ID NO:26. Une forme exemplaire dominant-négative de la protéine NIM1 comportant une délétion C-terminale est présentée dans la séquence SEQ ID NO:27. La présente invention concerne aussi des formes modifiées d'allèles du NIM1, où la séquence codante d'un tel allèle s'hybride dans des conditions modérément stringentes à la séquence codante SEQ ID NO:26 ; on préfère en particulier les conditions suivantes : hybridation dans du BSA à 1 % ; NaPO4 520 rnM, pH 7,2 ; laurylsulfate de sodium à 7 % ; EDTA 1 mM ; chlorure de sodium 250 mM à 550C pendant 18 à 24 heures, et lavage dans 6XSSC pendant 15 minutes (X3), 3XSSC pendant 15 minutes (X1) à 55"C. Dans ces formes de réalisation, les allèles du NIM1 qui s'hybrident à la séquence SEQ ID NO:26 dans les conditions ci-dessus sont modifiés de telle sorte que le produit codé possède une délétion C-terminale qui élimine les résidus de sérine et de thréoline.
Dans encore une autre forme de réalisation de la présente invention, le gène NIM1 est modifié de sorte que le produit codé possède tant une délétion N-terminale et une troncation C-terminal, en conduisant aux avantages des deux formes de réalisation décrites ci-dessus de 1 'invention.
Une forme de réalisation préférée de l'invention représente une forme modifiée de la protéine NIM1, qui possède une troncation N-terminale d'acides aminés correspondant approximativement aux positions d'acides aminés 1-125 de la séquence SEQ ID NO:2 et une troncation Cterminale d'acides aminés correspondant approximativement aux positions d'acides aminés 522-593 de la séquence SEQ ID NO:3.
La séquence SEQ ID NO:28 présente un exemple d'une forme de réalisation préférée de cette forme modifiée du gène NIM1, qui code un produit génique comportant tant une délétion N-terminale qu'une délétion C-terminale. La séquence SEQ ID NO:29 présente une forme exemplaire dominant-négative de la protéine NIM1 comportant une délétion C-terminale. La présente invention concerne aussi des formes modifiées d'allèles du NIM1, où la séquence codante d'un tel allèle s'hybride dans des conditions modérément stringentes à la séquence codante SEQ ID NO:28 ; on préfère en particuler les conditions suivantes : hybridation dans du BSA à 1 % ; NaPO4 520 mM, pH 7,2 ; laurylsulfate de sodium à 7 % ; EDTA 1 mM ; chlorure de sodium 250 mM à 550C pendant 18 à 24 heures, et lavage dans 6XSSC pendant 15 minutes (X3), 3XSSC pendant 15 minutes (X1) à 550C. Dans ces formes de réalisation, des allèles du NIM1 qui s'hybrident à la séquence SEQ ID NO:28 dans les conditions ci-dessus sont modifiées de façon que le produit codé possède tant une délétion Nterminale, qui élimine les résidus de lysine susceptibles de servir de sites potentiels d'ubiquitinisation en plus des sérines sur les positions d'acides aminés correspondant aux positiosn 55 et 59 du produit génique de type sauvage, qu'une délétion C-terminale, qui élimine les résidus de sérine et de thréonine.
Dans encore une autre forme de réalisation de la présente invention, le gène NiMi est modifié de sorte que le produit codé soit essentiellement constitué uniquement de domaines ankyrine du produit génique du type sauvage.
On préfère une molécule d'ADN isolée, dans laquelle ladite forme modifiée de la protéine NIM1 est constituée essentiellement de motifs ankyrine correspondant approximativement aux positions d'acides aminés 103-362 de la séquence SEQ ID NO:3. Un exemple d'une forme de réalisation préférée de cette forme modifiée du gène NDM1, qui code les domaines ankyrine, est présenté dans la séquence SEQ ID NO:30. La séquence SEQ ID NO:31 présente une forme exemplaire, dominant-négative, de la protéine NIM1, constituée essentiellement et uniquement des domaines ankyrine. La présente invention porte aussi sur des formes modifiées d'allèles du MIMI, où la séquence codante d'un tel allèle s'hybride dans des conditions modérément stringentes à la séquence codante SEQ ID NO:30 ; on préfère en particulier les conditions suivantes : hybridation dans du BSA à 1 8 ; NaPO4 520 mM, pH 7,2 ; laurylsulfate de sodium à 7 % ; EDTA 1 mM ; chlorure de sodium 250 mM à 550C pendant 18 à 24 heures, et lavage dans 6XSSC pendant 15 minutes (X3), 3XSSC pendant 15 minutes (X1) à 550C. Dans ces formes de réalisation, les allèles du NIM1 qui s'hybrident à la séquence SEQ ID NO:30 dans les conditions ci-dessus sont modifiées de façon que le produit codé consiste essentiellement en domaines ankyrine du produit génique de type sauvage.
Ainsi, la présente invention concerne des molécules d'ADN codant des formes modifiées du gène NIM1, telles celles qui sont décrites ci-dessus, et toutes les molécules d'ADN qui s'y hybrident par utilisation de conditions modérément stringentes.
La présente invention concerne aussi un gène chimère comprenant un promoteur actif dans les végétaux, lié par liaison opérationnelle à l'une des formes modifiées décrites ci-dessus du gène NIM1, un vecteur recombinant comprenant ce gène chimère, où le vecteur peut être transformé dans des conditions stables dans une cellule hôte, ainsi qu'une cellule hôte transformée dans des conditions stables par un tel vecteur. De préférence, l'hôte est un végétal tel que l'une des cultures suivantes, importantes d'un point de vue agronomique ; riz, blé, orge, seigle, maïs, pomme de terre, carotte, patate douce, betterave à sucre, haricot, pois, chicorée, laitue, chou, chou-fleur, broccoli, navet, radis, épinard, asperge, oignon, ail, aubergine, poivre, céleri, carotte, courge, potiron, courgette, concombre, pomme, poire, coing, melon, prune, cerise, pêche, nectarine, abricot, fraise, raisin, framboise, mûre, ananas, avocat, papaye, mangue, banane, soja, tabac, tomate, sorgho et canne à sucre.
Le test 245 provoque un arrêt de fonctionnement du moyen de contrôle de communication en réception 137 tant que FIFOJRX 506 est vide.
Les neutrons prompts sont émis pendant la fission, donc pendant la durée d'impulsion d'irradiation gamma. Les photons gamma, donnent aussi naissance aux neutrons, par la réaction neutron-gamma (n, y) induite dans les différents éléments. I1 n'est pas possible de faire la distinction entre les neutrons prompts de fission et les neutrons provenant des réactions neutron-gamma (n, y).
La réaction photonucléaire des photons sur les noyaux actinides se déroule en deux étapes contenues dans un intervalle de temps de l'ordre de la picoseconde. Un photon est d'abord absorbé par le noyau. L'énergie absorbée provoque ensuite l'émission d'un photon ou d'une ou plusieurs particules. Lorsque l'énergie absorbée est supérieure au seuil de fission du noyau elle provoque par contre la fission de ce dernier.
La section efficace d'absorption d'un photon par le noyau atomique varie avec l'énergie du photon.
Pour des photons dont l'énergie est inférieure à 6 MeV environ, on observe des résonances d'absorption très étroites, d'une largeur de leV environ. Par contre, pour des photons avec des énergies supérieures à 10 MeV, on observe une résonance d'absorption très large de plusieurs MeV. L'énergie de résonance d'absorption pour les photons est respectivement de 12,26 MeV et 12,24 MeV pour l'uranium 238 et le plutonium 239.
L'énergie des photons utilisés pour irradier le corps radioactif est choisie suffisante pour provoquer une photofission des éléments actinides. En particulier, elle est choisie supérieure au seuil de photofission qui se situe à 6 MeV environ. Elle est choisie de préférence supérieure à 10 MeV et voisine de l'énergie de résonance d'absorption.
Le corps radioactif est de préférence irradié pendant un temps d'irradiation suffisamment long pour accumuler un nombre suffisant de produits de fission et pour obtenir, par conséquent, une émission significative des neutrons retardés. Cependant, il n'est pas nécessaire de prolonger inutilement l'irradiation. Ainsi, le temps d'irradiation est choisi de préférence de l'ordre de la période moyenne des neutrons retardés, soit de l'ordre de 10 à 20 secondes, par exemple.
Après l'irradiation du corps radioactif à examiner, on effectue un comptage des neutrons, de préférence dans un mode multiéchelle. Le mode multiéchelle consiste à compter le nombre de neutrons détectés dans des intervalles successifs de temps de largeur unitaire dt. Le nombre de neutrons comptés dans chaque intervalle de temps est enregistré. Le temps total de mesure ATm est tel que ATm=Ndt où N est le nombre d'intervalles de temps.
Les étapes d'irradiation et de comptage peuvent être éventuellement répétées plusieurs fois.
Une étape suivante du procédé consiste à établir, en fonction du comptage, une décroissance temporelle des neutrons émis, caractéristique de la matière fissile. La décroissance temporelle peut etre représentée sous la forme d'une courbe.
Cette étape peut comporter des calculs de correction des abondances relatives des groupes de neutrons retardés en fonction des conditions expérimentales et notamment des conditions d'irradiation. Les corrections sont sommairement décrites ci-après.
On rappelle que pour tous les éléments fissiles, les neutrons retardés sont classés en six groupes suivant leurs périodes de décroissance. Les valeurs de ces six périodes sont pratiquement constantes pour tous les éléments fissiles. Par contre, l'abondance relative de chaque groupe varie d'un isotope à l'autre. Dans le tableau 1 sont données à titre indicatif les périodes et les abondances relatives pour l'uranium 238 et le plutonium 239.
U U 238 Pu 239 GROUPE T1,2(s) ABONDANCE T1/2(s) ABONDANCE 1 52,38 0,013 53,75 0,038 2 21,58 0,137 22,29 0,280 3 5,00 0,1o2 5,19 ~- 0,216 4 1,93 0,388 2,09 0,328 5 0,493 0,225 0,549 0,103 6 0,172 0,075 0,216 0,035 L'évolution dans le temps du nombre de neutrons retardés émis par l'uranium 238 (pur) et le plutonium 239 (pur) est facilement calculable, à partir des données du tableau 1.
Ce nombre est calculé suivant la formule où ssk est l'abondance relative du groupe k des neutrons et xk est la constante de décroissance du groupe k.
Les abondances relatives des différents groupes des neutrons retardés correspondent aux valeurs à l'équilibre radioactif, c'est-à-dire des quantités accumulées après une irradiation très longue, d'une durée au moins égale à plusieurs fois la période la plus longue des groupes, soit au moins 5 à 10 minutes.
Or, selon un aspect particulier de l'invention on peut irradier le corps radioactif soit de façon continue soit par un train d'impulsions de photons.
Cette protéine HGF-TM fusionnée présente toute la séquence codant de l'HGF et pratiquement la séquence codante complète de TM, à l'exception des 6 premiers amino-acides de l'ectodomaine.
La chimère HGF-TM/Cla présente un codon d'arrêt inséré au niveau du site ClaI, site du gène TM, afin d'éliminer la queue cytoplasmique de la protéine HGF-TM.
Cette enveloppe protéique ne contient pas le motif de clivage SU-TM et par conséquent la fusion de membrane ne pourra pas s'effectuer.
Les deux constructions, HGF-TM et HGF-TM/Cla, ont été clonées dans une cassette d'expression de vecteurs et exprimées sous le contrôle de différents promoteurs comme le LTR rétroviral ou le promoteur du cytomégalovirus (figure 1).
Les constructions ont ensuite été cotransfectées dans des cellules LLZ- < p-CRIP par un plasmide exprimant le gène de la résistance à l'hygromycine B. Les cellules LLZ expriment le vecteur rétroviral reporter MFG-nlsLacZ et produisent des particules virales pouvant infecter des cellules hôtes de type amphotropique.
Des lignées stables exprimant la protéine chimérique ont été réalisées par sélection à l'hygromycine B pendant 3 semaines puis analysées.
Ces lignées peuvent produire des particules rétrovirales présentant des protéines d'enveloppes chimériques ou sauvages. Les cellules LLZ-(p-CRIP ont été également transfectées par le plasmide sélectionné seul puis ensuite cultivées pendant 3 semaines dans un milieu contenant de l'hygromycine B afin d'obtenir des cellules témoins de contrôle pour les expériences de transfection, en particulier des témoins présentant la même gamme de titre de particule virale et le même nombre de passages entre les cellules témoins de contrôle et les cellules exprimant l'enveloppe chimérique.
RYPpRARTON nw.s: PROTEINE D'ENVgTlnPPES CRTMRRTQTR.q Les lysats de cellules transfectées par les plasmides exprimant la protéine fusionnée TM-HGF ont été analysés par immunoblotting avec des anticorps polyclonaux anti-TM et des anticorps monoclonaux anti-HGF (figure 2).
Le précurseur Pr80 env et la protéine recombinante TM de 15 kDa ont été détectés dans les extraits cellulaires par le sérum anti-TM. Une protéine de 95 kDa a été spécifiquement détectée dans les extraits cellulaires de LHTCS par les anticorps monoclonaux anti-HGF. Le poids moléculaire de cette protéine reflète précisément la taille prédite pour la protéine d'enveloppe chimérique HGF-TM/Cla. Comme attendu, aucun hybride TM n'a été mis en évidence dans les culots de cellules témoins de contrôle.
Pour démontrer que la protéine chimérique a bien été transportée et orientée correctement dans la membrane cellulaire, on a analysé les 3 lignées cellulaires à l'aide ddu système FACS (o Fluorescence-Activated Cell Sorter ) en utilisant un anticorps monoclonal anti-HGF.
Les trois populations ont été marquées spécifiquement avec l'anticorps anti-HGF.
Afin de démontrer que les protéines fusionnées ont été incorporées dans les virions produits par ces cellules, les surnageants de cellules sont ultracentrifugés au moyen d'une centrifugeuse Beckman munie d'un rotor SW28 à 25000 tours/min pendant 1,5 heures à 40C. Les culots de virions obtenus sont ensuite analysés par immunoblotting en utilisant différents anticorps dirigés contre les protéines virales de structure : sérum polyclonal de chèvre anti-SU (Quality Biotech Inc. Camden N.J.) ; anticorps anti-protéine p30 de capside ; anticorps anti-TM. Résultats non représentés.
ETUDES DE L'INFECTION DE CELLULE SPECIFIQUE MDCK PAR LES PARTICULES VIRALES (Figure 4) Le titre en virus est déterminé par infection de fibroblastes murins N1H3T3 avec un surnageant de culture de cellules. Ces fibroblastes n'expriment pas le récepteur c-met.
Les cellules témoins de contrôle produisent 5.105 unités formant des colonies par ml de surnageant. Les particules virales présentant l'enveloppe sauvage et l'enveloppe chimérique fusionnées ne montrent pas de diminution du titre en virus. Ces résultats sont obtenus aussi bien pour la partie TM entière que pour la partie TM dont la queue cytoplasmique a été délétée.