INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le programme parcourt ensuite l'ensemble des quintuplets (l,p,q,i,j). Il calcule pour chacun d'entre eux k= TK [l] ni = i -lmcpck, p,q + NP, nj = j - jmaxk,p,q + Nn Il prend pour chacun de ces nombres l'entier le plus proche puis il effectue: Etape 3 : cette étape consiste en une modification du tableau Fhp,q. Le programme parcourt l'ensemble des (l,p,q). Pour chaque valeur de ce triplet, le programme effectue les opérations 1 à 3 suivantes: opération 1: le programme initialise à 0 les nombres nom et denom opération 2 : le programme parcourt l'ensemble des valeurs de (ni,nj) en testant la condition Kn p.q ni,nj,1-KnP,9ni,nj,0I2 2 opération 3 : le programme effectue:
9. 19.2. Phase d'imagerie La phase d'imagerie diffère de celle utilisée en 7.17.2. par la méthode de recalage de phase. Le recalage en phase est içi effectué par rapport à la partie de la représentation fréquentielle de l'objet caractérisée par les tableaux calculés dans la phase préliminaire, et non par rapport au point image de l'onde d'éclairage, à des valeurs préenregistrées de l'onde d'éclairage ou à des images de référence.
Les étapes 1,2,3 suivantes remplacent les étapes 1 et 2 définies en 7.17.2.
Etape 1 : le programme effectue, pour toutes les valeurs de k,p,q,i,j: Etape 2 : étape consiste à établir le coefficient complexe caractérisant, pour chaque représentation bidimensionnelle, le décalage de phase et d'intensité entre cette représentation bidimensionnelle et la portion de représentation tridimensionnelle caractérisée par les tableaux Knp,q et Fhp,q.Ce coefficient complexe, pour la représentation caractérisée par les indices k,p,q, s'exprime sous la forme nomk,p,q Il denomk, p,q est obtenu en effectuant une boucle sur l'ensemble des indices (kp, q, ij, 1). Pour chaque (kp, q, ij, 1) : -le programme calcule: ni = i - tmaxk, p,q + Nt"x nj = j-jmaxkpq + N plX -Il teste la condition: IKn p,q [ni,nj, 1]- nkl2 lim avec par exemple lim=1. -Si la condition est vraie, le programme effectue alors les opérations Etape 3 : cette étape constitue le recalage en phase proprement dit. Le programme effectue:
9.20. Réalisation d'images tridimensionnelles suivant une méthode simplifiée.
On peut se limiter, pour générer l'image tridimensionnelle de l'objet, à la représentation Fo,odéfinie en 7. 17. Ceci revient, dans la procédure décrite en 7. 17.2., à adopter des tableaux IBp,q nuls pour tout couple (p, q) # (0,0) .
Les étapes 9.11. à 9.17 peuvent alors être supprimées. La présente méthode diffère en outre de la précédente par la méthode utilisée pour régler la position des objectifs avant utilisation et par l'algorithme de superposition des images.
9. 20.1. Réglage des objectifs et du miroir (5113).
Ce réglage peut être effectué avec une lame transparente à condition de ne pas déplacer les objectif après réglage, quand on introduit l'objet. Si des objectifs prévus pour fonctionner sans liquide d'immersion ni lame couvre-objet sont prévus (indice nominal égal à 1) et si l'échantillon est peu épais ou d'indice moyen proche de 1, il peut également être effectué en l'abscence d'objet. Pendant cette étape on utilise les faisceaux FEG et FRD.
Il est nécessaire que le miroir (5113) soit amovible et puisse être remplacé par une plaque absorbante en tout point sauf en un point central ou est placé un réflecteur de faible dimension. La dimension de ce réflecteur doit être d'environ D ou D est le diamètre du faisceau incident sur le miroir 2Npix (5113). Cette plaque doit être provisoirement placée sur le miroir de manière à ce que le réflecteur occupe à peu près le centre du faisceau incident sur le miroir. Le positionneur du miroir doit être lui-même fixé sur un positionneur trois axes en translation.
Ce réglage doit être effectué immédiatement après la série de réglages décrite en 9. 5. et les objectifs ne doivent plus être déplacés ensuite. Il comporte les étapes suivantes: étape 1: on remplace le miroir par la plaque absorbante étape 2 : en utilisant uniquement le faisceau FRD, on déplace le miroir en translation de manière à ce que l'image produite sur le CCD (4339) soit ponctuelle et centrée. étape 3: en utilisant uniquement le faisceau FEG, on déplace les objectifs de manière à ce que l'image produite sur le CCD (4339) soit ponctuelle et centrée. étape 4: on peut alors remettre en place le miroir.
Pour obtenir la constante K, on réalise l'image d'un micromètre objectif pour lequel les distances réelles sont connues, puis on applique la formule ci-dessus.
Ceci est réalisé en utilisant un programme de focalisation qui sera réutilisé ultérieurement à chaque fois qu'une focalisation sur un échantillon est nécessaire avant la prise d'image tridimensionnelle.
L'algorithme de ce programme se trouve sur la figure 14. Ses étapes principales sont: (1000) : Le programme acquiert une image par la procédure acquiert images de la Fig.13. On obtient donc un tableau d'entiers (type unsigned char pour 8 bits) 1[p, c, i, jl ou l'indice p variant de 0 à 2 correspond à l'état de phase, l'indice c variant de 0 à 1 correspond à l'état du commutateur (0=ouvert, 1=fermé) et les indices i et jvariant de 0 à hpix-1 et de 0 à vpix-1 correspondent aux coordonnées du pixel.
(1001): Un tableau de booléensFli, j] est généré: il est initialisé à 0, puis pour chaque pixel, la valeur maximale atteinte par 7[,0,/,y] sur les trois images correspondant à la position ouverte du commutateur est calculée. Si cette valeur est égale à 255 (valeur la plus élevée du numériseur), les images correspondant à la position fermée du commutateur doivent être utilisées dans le calcul de la fréquence associée au pixel et à ses 8 voisins immédiats, et le tableau .1 î if Li, JI est mis à 1 pour ces 9 pixels.
(1002) : la représentation fréquentielle S[i,j] de nombres complexes est générée: pour chaque pixel, la valeur est générée selon les équations suivantes: r Si H[i,j] vaut 1, la valeur complexe ainsi obtenue est donc multipliée par le nombre complexe rapport moy obtenu lors de l'opération de calibration du commutateur pour donner la valeur finale de l'élément de tableau S[i,j], afin de tenir compte du décalage de phase et de l'absorption induits par le commutateur.
(1003) : Le programme limite le tableau S à des dimensions de 512x512. Le programme effectue ensuite optionnellement l'une ou l'autre, ou aucune, des deux opérations suivantes: - un moyennage sur une largeur de 2, qui ramène le tableau S à un tableau S' de dimensions 256x256 avec S'[i,j] = S[2i,2 j] + S[2i + 1,2j] + S[2i,2j + 1] + S[2i + 1,2j + 1] .Ce moyennage, couplé à une réduction de l'ouverture du diaphragme (114), permet de diminuer le diamètre de la zone observée et de réduire le temps de calcul. Il est équivalent à un filtrage passe-bas suivi d'un sous-échantillonnage.
- une limitation de l'ensemble des fréquences observées à un carré de 256x256 pixels avec S'[i,j] = S[128 + 1,128 + je . Ceci permet de diminuer le temps de calcul au prix d'une réduction de la résolution.
Toutefois dans le cas présent le programme n'effectue aucune de ces deux opérations.
(1004) : Le programme effectue alors la transformée de Fourier inverse du tableau ainsi obtenu.
(1005) : Il affiche le résultat sur l'écran, en extrayant le module, la partie réelle ou la partie imaginaire.Dans le cas présent il affichera le module. Quelle que soit la variable affichée, le tableau de nombre réels correspondant est d'abord normalisé, soit par rapport à la valeur moyenne, soit par rapport à la valeur maximale. Le programme écrit également sur disque le fichier de réels correspondant. Lorsque la partie réelle ou la partie imaginaire sont représentées, il est essentiel que le point d'impact du faisceau direct soit bien en (256,256) sur l' image de taille 512 x 512, faute de quoi une modulation devient visible.
Lorsque le module est représenté, le point d'impact exact du faisceau direct n'influence pas notablement le résultat.
(1006) :Le programme recommence alors l'acquisition d'une nouvelle image, opérant donc en continu. Il s'arrête sur instruction de l'opérateur.
Pour obtenir l'image du micromètre, l'objectifest d'abord mis en position à peu près focalisée, le micromètre ayant été introduit comme objet. Dans un premier temps l'onde de référence est supprimée, les diaphragmes sont ouverts au maximum, et le programme de visualisation directe en temps réel de l'image reçue sur le capteur est lancé, les filtres en (103) et le rotateur de polarisation étant réglés pour laisser passer suffisamment d'intensité pour saturer assez largement le capteur au point d'impact direct du faisceau.
L'objet est alors déplacé à dans le plan horizontal à l'aide du positionneur correspondant jusqu'à ce que l'image constituée de nombreux points intenses alignés, caractéristique du micromètre, apparaisse. Le micromètre est alors correctement positionné sous l'objectif.
Les diaphragmes en (107) et (114) sont alors réglés pour une ouverture d'environ 8 mm. Les filtres en (103) sont alors réglés pour que le maximum d'intensité sur le CCD soit à un niveau d'environ le quart de la valeur maximale du digitaliseur, soit 256/4=64. L'onde de référence est réintroduite. Le programme de focalisation est alors lancé. Le diaphragme (114) doit être ajusté de manière à être clairement visible sur l'image affichée, tout en étant aussi ouvert que possible. Si l'image n'est pas bien centrée, on peut améliorer le centrage soit en modifiant l'orientation du miroir (116), auquel cas il peut être nécessaire de réajuster l'orientation du miroir (121), soit en modifiant la position du diaphragme (114). Le diaphragme en (107) doit être ajusté pour que la zone observée apparaisse uniformément éclairée. Le programme de focalisation est alors arrêté, l'onde de référence est supprimée et l'intensité du faisceau est réajustée comme précédemment. L'onde de référence est alors réintroduite et le programme de focalisation relancé.
L'objectif de microscope est alors déplacé par le dispositif de focalisation de manière à obtenir une bonne image du micromètre. Pour faciliter la focalisation, on a intérêt à visualiser une partie du micromètre ou des traits de différentes longueurs sont présents. Ceci limite les 'fausses focalisations' dues à des phénomènes d'interférences en avant du micromètre. Entre deux déplacements il est nécessaire de lâcher le dispositifde focalisation manuel pour obtenir une image non perturbée par les vibrations. Lorsque une bonne image a été obtenue, le programme est arrêté et l'image obtenue est utilisée pour obtenir la distance en nombre de pixels entre deux traits, la distance métrique entre ces traits étant connue. Si la distance entre deux graduations séparées par D,.eel micromètres est sur l'image ainsi obtenue de Dp,x pixels, si l'indice nominal de l'objectif est nv (en général, nv =1,5) et si la longueur d'onde du laser dans le vide est;'
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé de dialyse forcée différentielle et donc sélective pour un ou plusieurs solutés.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé de dialyse simple, rapide et économique.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé de dialyse sélective et rapide qui permette de s'affranchir du recours à de grandes quantités de dialysats jusqu'alors utiles pour générer des gradients de concentration nécessaires à la diffusion passive.
Un autre objectif essentiel de la présente invention est de fournir un procédé de dialyse simple, sélectif, rapide, économique et applicable notamment en hémodialyse de manière performante.
Un autre objecfif essentiel de la présente invention est de fournir un dispositif de dialyse propre à permettre notamment la mise en oeuvre du procédé susvisé.
Un autre objectif essentiel de l'invention est de fournir un dispositif de dialyse simple, économique, sélectif et rapide.
S'étant fixé ces objectifs, les inventeurs ont eu le mérite de mettre en évidence, après de longues et laborieuses recherches et expérimentations, qu'il était possible d'atteindre ces objectifs en stimulant et en optimisant le phénomène de diffusion passive, par mise en oeuvre d'un système de pompage enzymatique auxiliaire. Ce mécanisme auxiliaire original, découvert par les inventeurs, repose sur l'intervention d'au moins une enzyme spécifique du soluté considéré et disposée sur la face d'une membrane poreuse opposée à celle qui est en regard du compartiment liquide que l'on cherche à appauvrir en soluté par diffusion transmembranaire. Un tel système enzymatique peut comprendre au moins un couple d'enzymes inverses, l'une des enzymes du couple étant fixée d'un côté de la membrane, tandis que l'autre enzyme est immobilisée de l'autre côté de cette membrane, ces enzymes étant, en outre, éventuellement contenues dans le milieu liquide des compartiments, à l'exclusion de la membrane enzymatique poreuse de diffusion. Ce système se comporte comme une pompe qui génère et maintient un écart de concentration en soluté(s) à transférer entre les deux compartiments. n en résulte que la présente invention concerne tout d'abord un procédé de dialyse assistée par pompage enzymatique d'au moins un soluté S au travers d'au moins une membrane poreuse séparant au moins en partie deux compartiments liquides Cl et Cll, (S étant référencé SI dans Cl et S, dans CH), cette dialyse s'opérant du compartiment liquide Cl que l'on vise à appauvrir en S, vers le compartiment liquide CII destiné conséquemment à s'enrichir en S, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement et successivement ou non: à mettre en oeuvre au moins une membrane poreuse comprenant sur et/ou dans sa face Fn en regard de CII au moins une enzyme Eα apte à catalyser la réaction de transformation du soluté Sll en soluté produit primaire S,n; à mettre en mouvement au moins le liquide de C11 (dialysat), et de préférence également celui de Cl > en prévoyant au moins une couche de diffusion dll non-turbulente, attenante à la face F11 de la membrane porteuse de Eα et en regard de Cll, et en réglant l'épaisseur edII de cette couche de diffusion dll de manière que em em # edII # 10.em, de préférence # edII # 3.em ; 10 2 em étant l'épaisseur de la membrane; et à faire en sorte que les conditions opératoires soient telles qu'interviennent: * la transformation enzymatique par Eα de SII en SαII, * et corrélativement la diffusion de Sl, au travers de la membrane du compartiment C1 vers le compartiment Cll, notamment sous l'effet d'un pompage enzymatique, induit par la réaction
Le principe technique novateur qui gouverne le procédé conforme à l'invention, peut être assimilé à un mécanisme de pompage enzymatique permettant de transférer un soluté S dans un compartiment (I) liquide de départ, vers un compartiment (II) liquide d'arrivée, par transport actif au travers d'une membrane poreuse enzymatique. Le soluté S s'accumule ainsi et se concentre dans le compartiment d'arrivée, et ce même si la concentration du soluté dans ce dernier est supérieure à celle de S dans le compartiment de départ. Qui plus est, le pompage enzymatique selon l'invention a pour effet de maintenir un écart de concentration dS = [Su]-[St] > 0.
Un tel procédé de pompage enzymatique est particulièrement avantageux puisqu'il permet une élimination rapide et sélective d'un ou plusieurs solutés d'un compartiment liquide Cl, par exemple le sang (hémodialyse), et ce sans mise en oeuvre de grands volumes de dialysat Cn sans consommation exagérée d'energie. Cette pompe enzymatique ne nécessite essentiellement que de l'énergie chimique, qui peut être apportée, par exemple, par des molécules à liaison riche en énergie, telles que l'adénosine triphosphate (ATP). n est à noter que le gain cinétique procuré par l'invention, reste compatible avec le seuil de durée en deçà duquel on génère un stress sanguin dans l'application hémodialyse.
Ceci est lié au fait que les couches de diffusion non-turbulentes propres au procédé selon l'invention, limitent quelque peu les vitesses de circulation du sang et du dialysat lors de l'hémodialyse.
La mise au point du procédé selon l'invention trouve racine, notamment, dans la compréhension du phénomène de transport actif propre aux membranes biologiques. Cette nouvelle théorie scientifique sur les transports transmembranaires biologiques apporte du sang nouveau à l'état des connaissances scientifiques en la matière. Ce dernier peut se résumer en la théorie basée sur les pores et en la théorie fondée sur la transformation conformationnelle des protéines des membranes biologiques.
La démarche nouvelle et innovante selon l'invention a donc consisté, dans un premier temps, à comprendre et expliquer le phénomène biologique et, dans un deuxième temps, à le reproduire (mimétisme) en l'adaptant aux spécifications médicales ou industrielles de séparationlélimination concentration de composés chimiques, en particulier à des fins d'élimination et d'isolement de composés toxiques, ou à des fins de récupération de molécules à haute valeur ajoutée : chimique, pharmaceutique, cosmétique ou autres.
Conformément à une caractéristique préférée de l'invention, on sélectionne d'une part, l'enzyme E qui régit la production de Sa et, d'autre part, la membrane poreuse, de manière à ce que cette dernière soit impérméable à Sall et empêche ainsi, au moins partiellement, la diffùsion de Sarx de C11 vers Cl; San et la membrane étant ainsi, de préférence, des entités de charges électriques de même signe.
Le caractère électriquement chargé de Sall résulte de l'action de l'enzyme Ea sur le substrat neutre Sll.
La charge électrique des faces de la membrane poreuse peut être obtenue par exemple, en immobilisant, sur la membrane, les enzymes Eα et Ess et des polyaminoacides dont les pK confèrent à la membrane, pour un pH donné, des charges négatives ou positives. Ainsi, dans le cas où le polyaminoacide est e.g. la polylysine, alors la membrane est chargée positivement à pH 9, tandis qu'avec un polyaminoacide correspondant e.g. à un polyglutamate, la membrane est chargée négativement à pH 9.
Selon une alternative, on peut choisir des membranes dont le potentiel zéta au pH optimum est adapté à des conditions données du procédé de l'invention.
Transformation in vitro des lignées cellulaires B (B-LCL) Les lignées cellulaires B (B-LCL) ont été obtenues en incubant des dilutions en séries de PBMC à l'aide du surnageant de la lignée cellulaire S 594. Cette lignée est infectée par le virus de l'herpès du babouin qui immortalise les cellules (herpès virus papio). Les B-LCL ont été ensuite cultivées dans du milieu de culture complémenté avec 10% de FCS.
Test de relarquaqe du chrome.
Des cellules cibles ont été sensibilisées avec les peptides. 106 cellules B-LCL ont été incubées soit durant la nuit soit durant 1 heure, respectivement avec des peptides longs ou courts (gamme de concentration 10-5 M-103M) à 37"C dans une atmosphère humidifiée à 5% de CO2. Afin d'obtenir les cellules cibles présentant les produits du gène SlVmac, les B LCL ont été incubés à une concentration de 106 cellules/ml avec un virus de la vaccine recombinante (20 PFU/cellule) durant dix huit heures dans les mêmes conditions. Les BLCL ont été ensuite lavées et marquées avec 100pm Ci Na25'CrO4 (NEN Life Science Products, Courtaboeuf Les Ullis, France) durant 1 heure, lavées deux fois et utilisées comme cellules cibles.
Le relarguage du 51Cr a été effectué dans des plaques de microtitration.
L'activité cytolytique des lignées cellules anti-SIV a été mesurée en mélangeant 5 x 103 cellules cibles marquées au chrome avec des cellules effectrices, dans des rapports cellules effectrices/cellules cibles divers, dans un volume final de 200 ul/puits. Les plaques ont été incubées durant 4 heures à 37"C, puis 100 ul de surnageant ont été pris dans chaque puits et analysés dans un compteur de rayonnement gamma.
Le relarguage spontané du chrome a été déterminé en incubant les cellules cibles avec du milieu seul. II n'excède jamais 20% du chrome total incorporé.
Le relarguage spécifique du chrome a été mesuré de la manière suivante: 100 x (cpm expérimentaux - cpm spontané)/(cpm maximum-cpm spontané).
La variation à l'intérieur d'un échantillon n'excède jamais plus de 5%. b) Résultats La figure 4 illustre la réponse T auxiliaire des huit macaques.
Les figures 5 a 1 1 illustrent la réponse cytotoxique des macaques.
Les résultats des immunisations avec divers peptides sont résumés dans le tableau 13.
Ils montrent que sept des huit macaques testés reconnaissent divers peptides, les macaques ne109, 129 et 127 montrant une réponse particulièrement importante.
L'efficacité de l'induction d'une réponse CTL confirme que les CPA des animaux ont pu capturer et présenter un ou plusieurs épitopes CTL,et simultanément l'épitope auxiliaire fort présent dans l'anatoxine tétanique et reconnu par certains des animaux.
EXEMPLE 3 : Préparation d'un mélanqe de lipopeptides (Lot HG 1) en vue d'un essai clinique chez l'homme.
Un mélange de lipopeptides a été défini en vue de la réalisation d'un essai clinique (VAC10), associant au sein de micelles le même peptide TT à des séquences choisies sur le principe de sélection développé pour VAC04 (existence d'un ou plusieurs épitopes CTL par séquence).
- la cystéine du peptide NEF117 a été remplacée par une Leucine après synthèse et essai sur test cellulaire de plusieurs analogues du nonapeptide épitope CTL renfermant cet acide aminé, il a en effet été observé que ce remplacement était possible; cette modification permet d'éviter les problèmes de stabilité dus à la formation de pont disulfure.
- le peptide GAG 17 a été choisi parmi d'autres candidats pour son caractère nettement tensioactif cationique susceptible d'aider au maintien en solution des autres peptides, et en particulier de GAG253, toujours présent dans le mélange, en raison de son immunogénicité chez l'homme.
G-#ITICE D'ENTREE DES FILS ELECTRIQUES DANS LE COUP DE LA BUSE.
H-#NDUrr ETAN(-(IPÔ7), LE FAISCEAU DE COMMANDE D'OUVERTURE.
I-PARTIE DE PIflCTICN DE RENTREE DES AILETTES .DANS LEUR POSITION D'OUVERTURE.
J-CORP PRINCIPAL DE LA BUSE.
K-ORIFICE D'ENTREE DU FAISCEAU ELECTRIQUE DE COMMANDE.
DESSIN 3/4.
SCHEMA D'ORIENTATION DE L'ORIFICE DE SORTIE DES JETS LAVANTS.
A-AXE CENTRALE.SERVANT Au JOINT DE CACUTCHJ DE PIVOT. ,.nnTt.R B-JO7NT EN CPOLTPCI-I7iJ ' LE T VA1VT,RELIE AUX AILE'S,DE FPIX( sss.
LE DEBTT DE SORTIF DE5 JEZ'S LAVAIfiS,rIAIS SERVPNI' EGALEI' FUJR DE3JfB1RJER LES OR1FICF5 DE SORTIES. C-PARTIE RETRACTANTE DES AILETTES. D-CCNDUTT DES FILS ELECTRIQUES POUR L'ACTION DE L' AXEX CENTRALE. E-ORIFICE D'OUVERTURE DES FILS DE FONCTIONNEMENT ELECTRIQUE. F -IDMJ1'A'l'EUR DE FONCTIONNEMENT DROITE/GAUCHE. G--aJvt;1UI'ATI1JR DE FONCTIONNEMENT HAUT/BAS. H-MOTEUR ELECTRIQUE DE FONCTIONNEMENT DU CONCEPT. I-RELAIS DE PROTECTION DU SYSTEME.
DESSIN 4/4. SCHEMA REPRESENTANT L'ACTION D'OUVERTURE DU DIAPRPI3HE , ET DF LA MJDIF'ICATIC1 D' EJEO'L'IC1 DE PRODUIT LAVANT, AINSI QUE DE LA DESOBSTRUATICN DES BUSES.
A-CORP PRINCIPAL DE LA BUSE.
B-CONDUTT LAVANT.
C-JOINT ENSERRANT LE CONDUIT LAVANT RELIE LUI MEME, AUX AILETTES.
D-AILITTES û1 DIAPERPE, L1E DERNIERES S.OUVRENT.ELLES ETIRENT LE JOINT VERS LF HAUT .CAR CE DERNIER ENSERRE LE CU4=,DE CETTE ACTION DEJOULF SOIT LA DEDB3'mUATICN DES BUSES.SOIT EN RFGIJGF EN NAPPE.CETTE ACTICN S'EFFECTUE PAR LE BIAIS DILATATION DE L'ORIFICE DE SORTIF.ET LORSQUE L'CNT VEUX AVOIR #### PUISSANT IL SUFFIT D'ACTIONNER LES AILETTES DANS LE SENS CX1'IDWRE, CF.LLFr-CI ENSERRE LF JOINT AU MAXIMUM ET PROCURE UN JET FIN ET PUISSANT. rr)VRRTFS F-PARTIE RETRACTANTE DU UIAP, 00T1iNïVAM' LES AILETTES, LORSQU'ELLES scur aNERI'E3.