INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
- Van Gent,D.C., Vink,C., Oude Groeneger,A.A.M. and Plasterk,R.H.A. (1993) Complementation between HIV integrase proteins mutated in different domains.
EMBO J., 12, 3261-3267.
- Vink,C., Oude Groeneger,A.A.M. and Plasterk,R.H.A. (1993) Identification of the catalytic and DNA-binding region of the human immunodeficiency virus type 1 integrase protein. Nucleic Acids Res., 21, 1419-1425.
Les cellules COS ont été transfectées avec 5 yg du vecteur pCDNA3 contenant le gène chimère AChE-scFv, en utilisant la méthode au DEAE-dextran, comme décrit par Bon et Massoulié (1997).
Les cellules sont ensuite mises en culture pendant 5 jours à 370C puis récupérées par centrifugation (4000 t/min pendant 10 min) . Le surnageant de culture est séparé et conservé. Les cellules sont remises en suspension dans 500 yl de tampon phosphate (PBS) contenant des inhibiteurs de protéases, puis soumis à une sonication pendant 90 sec.
Les cellules intactes ont été récupérées par centrifugation et le surnageant de centrifugation (contenant l'extrait cellulaire soniqué) est séparé et conservé à 40C.
C) Purification de la protéine de fusion.
La protéine de fusion AChE-scFv a été purifiée par chromatographie d'affinité, comme décrit par Cousin et al.
(1996b) ou Frobert et al. (1997). Un gel de chromatographie d'affinité pour l'AChE a été préparé en couplant le ligand m-carboxyphényldiméthyléthyle au support de chromatographie EAH Sepharose 4B (Massoulié et al., 1976). Le surnageant de culture des cellules COS (3 ml) a été dialysé contre une solution de phosphate de potassium à 0,1 M à pH 7,4, puis chargé sur une colonne contenant 1 ml de gel d'affinité et équilibré avec un tampon identique au tampon de dialyse. La colonne est lavée avec 2 ml du tampon d'équilibrage, puis avec 2 ml de solution de NaCl à 0,25 M dans le tampon d'équilibrage.
L'échantillon est élué avec 2 ml de solution NaCl à 0,25 M, décaméthonium à 20 mM, phosphate de potassium à 0,1 M à pH 7,4. Les fractions d'élution contenant une activité AChE ont été réunies puis dialysées contre une solution tampon de phosphate de potassium à 0,05 M à pH 7,4 pendant 72 heures à une température de 40C.
D) Mesure de l'activité AChE.
L'activité acétylcholinestérase a été déterminée par colorimétrie, selon la technique décrite par Ellman et al. en 1961.
E) Détection de la protéine de fusion par ELISA.
Les puits de plaques de microtitration ont été incubés avec la sous-unité CA de la crotoxine (100 yl par puits dans une solution de PBS contenant une concentration de l Hg/ml de CA) pendant 2 heures à 370C. Les sites libres de la surface des puits de microplaques sont ensuite saturés en incubant chacun d'entre eux avec 100 Ul d'une solution de PBS (tampon PBS-Tween-SAB) contenant 3 W de sérum albumine bovine (SAB) et 0,1 k de Tween-20.
Les surnageants de cultures des cellules COS et les extraits cellulaires ont fait l'objet de dilutions en série dans du tampon PBS-Tween-SAB. Une fraction aliquote de 100 pl de chaque dilution est ajoutée dans chacun des puits et les plaques de microtitration ont été incubées pendant 1 heure à 370C.
Deux méthodes de détection ont été utilisées - l'activité acétylcholinestérase (AChE) a été mesurée en ajoutant 100 ssl de réactif d'Ellman par puits de microplaque et en déterminant la densité optique à 415 nm après des temps d'incubation variables - la protéine de fusion a été détectée en ajoutant, dans chacun des puits, 100 Hl d'une solution au 1/500 ème de l'anticorps monoclonal 9E10, spécifique du polypeptide cmyc, dans du tampon PBS-Tween-SAB et en incubant durant 1 heure à 370C. Les puits de microplaques sont ensuite lavés avec une solution de PBS contenant 20 k de Tween-20 (tampon PBS-Tween), puis incubés avec un anticorps anti igG de souris conjugué à la péroxydase. La microplaque est ensuite à nouveau lavée, incubée avec le substrat ophénylènediamine (OPD) et l'activité enzymatique est calculée à partir des mesures de densité optique à 490 nm.
F) Affinité de la protéine de fusion.
La protéine de fusion AChE-scFv a été incubée pendant une nuit à 40C, à la dilution appropriée (comme déterminée par les expériences d'ELISA direct) avec plusieurs concentrations de sous-unité CA de la crotoxine. Des fractions aliquotes de 100 Ul ont été transférées dans les puits d'une plaque de microtitration préalablement incubée avec la sous-unité CA, et la plaque a été soumise à une incubation de 30 min à 370C. La plaque a ensuite été lavée avec du tampon PBS-Tween et l'activité AChE résiduelle a été déterminée comme décrit précédemment, après incubation de la plaque pendant 4 heures à 370C.
G) Analyse de la protéine de fusion par électrophorèse.
L'invention vise en outre les dérivés solubles d'un polypeptide selon l'invention dans lequel les acides aminés 71 à 323 sont conservés et au moins l'un des acides aminés 22 à 70 peut être remplacé ou supprimé, ou dans lequel les acides aminés 22 à 161 sont conservés et au moins l'un des acides aminés 162 à 323 peut être remplacé ou supprimé, la numérotation des acides aminés (aa) faisant référence à la numérotation de la séquence d'aa SEQ ID NO 2.
L'invention comprend particulièrement les polypeptides selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils sont capables de se lier à un virus, de préférence le virus HIV, et en ce qu'ils sont capables d'inhiber la pénétration dudit virus dans les cellules cibles habituelles dudit virus.
Tout particulièrement, on préfère les polypeptides selon l'invention, caractérisés en ce qu'il s'agit de polypeptides dans lesquels au moins l'un des acides aminés 61 à 63 de la séquence SEQ ID NO 2 est modifié ou supprimé.
Font aussi partie de l'invention, les polynucléotides caractérisés en ce qu'ils codent pour un polypeptide selon l'invention, en particulier un polypeptide tel que défini ci-dessus.
L'invention a également pour objet des polynucléotides utilisables comme amorce, caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi les polynucléotides selon 1' invention.
En particulier, on préfère les polynucléotides utilisables comme amorce selon l'invention, caractérisés en ce que leur séquence est choisie parmi les séquences suivantes a) GGC TTT GGC CAT GGG GCT CGG GGA GCA, b) CGC CAG GCT CCC GCC CCG CGC CGT GCA, c) GGG GAG GAA GAG GAG GAG GAA, d) GCC CCG CTA GAA GGG GAA CTC GCA GAC, et e) une séquence comprise entre le nucléotide en position nt 180 et le nucléotide en position nt 1151 ou nt 1153, extrémités incluses, de la séquence SEQ ID NO 1.
L'invention concerne aussi des polynucléotides utilisables comme sonde, caractérisés en ce qu'ils sont choisis parmi les polynucléotides selon l'invention, lesdits polynucléotides pouvant être marqués par un composé radioactif ou par un composé non radioactif.
Parmi ces polynucléotides utilisables comme sonde selon l'invention, on préfère ceux caractérisés en ce que leur séquence est choisie parmi les séquences suivantes a) AGGCGCGGTGCACGGCGCGGGGCGGGAGCCTGGCGC, b) ATGGAGGCGCTCACTCGGTACCTGCGCGCGGCGCTC, et c) une séquence comprise entre le nucléotide en position nt 180 et le nucléotide en position nt 1151 ou nt 1153, extrémités incluses, de la séquence SEQ ID NO 1.
L'invention comprend l'utilisation d'un polynucléotide nucléique selon l'invention pour la détection et/ou l'amplification de séquences nucléiques.
Selon l'invention, les fragments de polynucléotides pouvant être utilisés comme sonde ou comme amorce dans des procédés de détection, d'identification, de dosage ou d'amplification de séquence nucléique, présenteront une taille minimale de 8 bases, de préférence de 15 bases, et de manière plus préférée 30 bases.
Les polynucléotides selon l'invention peuvent ainsi être utilisés comme amorce et/ou sonde dans des procédés mettant en oeuvre notamment la technique PCR (réaction en chaîne à la polymérase) (Erlich, 1989 ; Innis et al., 1990, et, Rolfs et al., 1991).
Cette technique nécessite le choix de paires d'oligonucléotides encadrant le fragment qui doit être amplifié.
On peut, par exemple, se référer à la technique décrite dans le brevet américain U.S. NO 4,683,202.
Les fragments amplifiés peuvent être identifiés, par exemple après une électrophorèse en gel d'agarose ou de polyacrylamide, ou après une technique chromatographique comme la filtration sur gel ou la chromatographie échangeuse d'ions. La spécificité de l'amplification peut être contrôlée par hybridation moléculaire en utilisant comme sonde les séquences nucléotidiques de polynucléotides de l'invention, des plasmides contenant ces séquences ou leurs produits d'amplification.
Les fragments nucléotidiques amplifiés peuvent être utilisés comme réactifs dans des réactions d'hybridation afin de mettre en évidence la présence, dans un échantillon biologique, d'un acide nucléique cible de séquence complémentaire à celle desdits fragments nucléotidiques amplifiés.
Ces sondes peuvent être marquées ou non par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives, telles que des enzymes ou des éléments fluorescents.
L'activation de l'élément de retenue 150, provoquant l'extension du verrou 150a, permet de limiter la rotation de l'élément 120 à une position correspondant à la rainure d'enclenchement de la 3e et la 4e vitesse.
Donc, lorsque l'accumulateur de force 140 est soumis à une force résultant d'une manoeuvre vers la position neutre de la boîte, l'élément 120 est tourné par l'accumulateur de force 140, constitué par un ressort de torsion par exemple, à la position correspondant à la rainure à laquelle sont coordonnées les 3e et 4e. Si ni l'élément de retenue 150 ni l'élément de retenue 151 n'est activé, une manoeuvre de la boîte à la position neutre, provoque l'application d'une force à l'accumulateur 140, lequel tourne alors l'élément 120 à la position correspondant à la rainure de la coulisse de changement de vitesse 108 à laquelle sont coordonnées la 5e d'un côté et la 6e ou la marche arrière AR de l'autre côté.
L'élément 120 présente une face de contact 120a qui peut être amenée, par l'accumulateur de force 140, à s'appliquer contre une face de contact antagoniste 160a d'un élément de sélection sous la forme d'un levier 160.
La rotation de l'élément 120 produit ainsi la rotation du levier de sélection 160 contre la force d'un accumulateur de force 170, constitué par un ressort (de traction) par exemple, et une sélection de rainure d'enclenchement peut être effectuée. A cet effet, une tête 161 du levier 160 pénètre entre deux joues 162a, 162b de la coulisse de transmission 105, de sorte qu'une inclinaison du levier de sélection 160 provoque la rotation de cette coulisse et aussi, par conséquent, celle de l'axe central de changement de vitesse 106.
Le mouvement de la coulisse de transmission 105 et de l'axe central 106 en direction de la position neutre de la boîte s'accompagne, par l'intermédiaire de la bielle 110, de l'armement ou de la charge de l'accumulateur de force 140, lequel fait partie d'un mécanisme de précontrainte 120, 140, 111. Pendant que l'élément 111 effectue un mouvement rotatif, l'élément de butée 120 est retenu par l'intermédiaire du levier de sélection 160, de l'axe central 106 et de la coulisse de changement de vitesse 108, de sorte que le ressort de précontrainte 140 est armé.
Lorsque le doigt 107 devient librement dépla çable dans la direction de sélection à la position neutre de la boîte, l'accumulateur de force 140 se détend et fait tourner l'axe central 106 à l'encontre de la force du ressort 170 dans la rainure d'enclenchement à laquelle sont coordonnées la 3e et la 4e ou à la rainure à laquelle sont coordonnées la 5e d'un côté et la 6e ou la marche arrière AR de l'autre côté. L'amenée du doigt 107, lors de la sélection, correspondant dans cet exemple à une rotation de l'axe central 106, à la rainure suivante seulement ou à une rainure située plus loin, dépend de l'élément de retenue, 150 ou 151, qui a été activé.
Pendant la suite de la manoeuvre de changement de vitesse, le mécanisme de précontrainte 120, 140, 111 est ramené par l'intermédiaire de la bielle 110 à sa position initiale une fois que la vitesse désirée a été engagée. Lors de la rotation en arrière ainsi produite, la face 120a de l'élément 120 s'écarte de la face 160a du levier de sélection 160, mais ce dernier est retenu par la coulisse de changement de vitesse 108 à la position qu'il a atteint et ne peut plus s'incliner en sens inverse pour revenir à sa position initiale.
Le rappel à partir d'une rainure d'enclenchement supérieure (par exemple à partir de la rainure à laquelle sont coordonnées la 3e et la 4e), s'effectue par l'accumulateur de force 170, agissant comme un ressort de rappel. Dans ce cas aussi, les éléments de retenue 150, 151 limitent, lorsqu'ils sont actionnés, le rappel à la rainure désirée de la boîte de vitesses. L'accumulateur de force 170 présente, à ses deux extrémités, des points d'attaque de force qui sont reliés d'un côté à une barrette d'attache de l'élément de sélection 160 et, de l'autre côté, à un point fixe du carter de la boîte.
Lors d'une manoeuvre de la boîte à l'intérieur d'une rainure d'enclenchement, donc, par exemple, pour passer de la lre à la 2e, l'élément de retenue 151 est activé, ce qui autorise seulement une manoeuvre dans la rainure de la lre et de la 2e. Pour une manoeuvre dans la rainure de la 3e et de la 4e, par exemple pour passer de la 3e à la 4e, le mouvement de l'élément de butée 120 est limité par l'élément de retenue 150.
Au cours de ces manoeuvres, l'énergie accumulée dans l'accumulateur de force est de nouveau libérée à l'enclenchement d'une vitesse.
Les éléments de retenue sont réalisables sous la forme d'aimants de blocage possédant une tige - formant verrou - déplaçable par un champ magnétique. Les éléments de retenue sont également réalisables sous la forme d'aimants à échelons, auquel cas il est opportun de prévoir, à la place de deux aimants, un seul aimant à échelons ou paliers dont la tige formant armature peut être amenée à plusieurs positions.
Les éléments de retenue sont réalisables aussi sous la forme d'un moteur électrique pourvu d'un élément de verrouillage constitué par exemple par une broche filetée, auquel cas une rotation de l'arbre du moteur provoque une extension ou une rétraction axiale de la broche par un mouvement de vissage.
En référence aux figures 3a à 9c, on décrira ci-après un dispositif selon l'invention, de même qu'un procédé selon l'invention mettant en oeuvre un tel dispositif; seront décrites en particulier deux fonctions, en particulier le dégagement/engagement d'une vitesse à l'intérieur d'une rainure d'enclenchement et la sélection d'une rainure d'enclenchement de la boîte de vitesses.
Dans la description suivante, une fonction continue (fonction principale), telle que le dégagement/engagement ou la sélection, est exécutée directement par l'entraînement de l'actionneur de commande. Une seconde fonction (fonction annexe) qui en est indépendante, telle que la sélection ou le dégagement/engagement, établit des positions distinctes.
Au moment de l'exécution de la fonction annexe, celle-ci reçoit son énergie non pas de l'entraînement de la fonction principale, mais d'un accumulateur d'énergie ou de force, constitué par un ressort par exemple.
Plus exactement, l'énergie pour l'exécution de la fonction annexe est avantageusement prélevée dans une phase temporelle non-critique de l'entraînement de la fonction principale et stockée temporairement dans un accumulateur d'énergie. Quand la fonction annexe doit ensuite être exécutée, l'énergie est de nouveau retirée de cet accumulateur.
Les vecteurs selon l'invention, caractérisés en ce qu'ils comportent les éléments permettant l'expression et/ou la sécrétion desdites séquences dans une cellule hôte, font également partie de l'invention.
Ces vecteurs sont utiles pour transformer des cellules hôtes afin de cloner ou d'exprimer les séquences nucléotidiques de l'invention.
Des vecteurs particuliers sont par exemple des vecteurs d'origine virale ou plasmidique.
Parmi ces vecteurs, on préfère ceux de la série pGEX (Pharmacia) pour l'expression dans les bactéries ou pSHT (Giordanengo, V. et al., 1997. Cloning and expression of CDNA for a human Gal (pl-3) GalNAc a2,3-sialyltransferase from the CEM-T cell line. Eur. J. Biochem. 247 : 558-566) pour l'expression en système eucaryote.
L'invention comprend en outre les cellules hôtes, notamment les cellules eucaryotes et procaryotes, caractérisées en ce qu'elles sont transformées par les vecteurs selon l'invention.
De préférence, les cellules hôtes sont transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant selon l'invention.
L'hôte cellulaire peut être choisi parmi les cellules bactériennes (Olins et Lee, 1993), mais également les cellules de levure (Buckholz, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards et Aruffo, 1993), et notamment les cellules d'ovaires de hamster chinois (CHO), mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre des baculovirus par exemple (Luckow, 1993).
Un hôte cellulaire préféré pour l'expression des polypeptides de l'invention est constitué par les cellules procaryotes E. coli JM109 ou eucaryotes CEM.
L'invention concerne également l'utilisation d'une séquence d'acide nucléique ou d'un polynucléotide selon l'invention pour la production de polypeptides recombinants.
Les polypeptides obtenus par synthèse chimique et pouvant comporter des acides aminés non naturels correspondant auxdits polypeptides recombinants, sont également compris dans l'invention.
Cette méthode de synthèse consiste à condenser successivement deux-à-deux les acides aminés successifs dans l'ordre requis, ou à condenser des acides aminés et des fragments préalablement formés et contenant déjà plusieurs acides aminés dans l'ordre approprié, ou encore plusieurs fragments préalablement ainsi préparés, étant entendu que l'on aura eu soin de protéger au préalable toutes les fonctions réactives portées par ces acides aminés ou fragments, à l'exception des fonctions amines de l'un et carboxyles de l'autre ou vice-versa, qui doivent normalement intervenir dans la formation des liaisons peptidiques, notamment après activation de la fonction carboxyle, selon les méthodes bien connues dans la synthèse des peptides.
Ces polypeptides peuvent être produits à partir de séquences d'acide nucléique ou de polynucléotides selon l'invention, et selon les techniques de production de polypeptides recombinants connues de l'homme du métier.
Dans ce cas, la séquence d'acide nucléique utilisée est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans un hôte cellulaire.
Un système efficace de production d'un polypeptide recombinant nécessite de disposer d'un vecteur, par exemple d'origine plasmidique ou virale, et d'une cellule hôte compatible.
Les procédés de préparation d'un polypeptide, caractérisés en ce qu'ils mettent en oeuvre un vecteur selon l'invention, font partie de l'invention.
Le vecteur doit comporter un promoteur, des signaux d'initiation et de terminaison de la traduction, ainsi que des régions appropriées de régulation de la transcription.
En particulier, l'utilisation de promoteurs de type LTR des HIV-1 ou HIV-2 pourra être préconisée à cause de leur inductibilité par les protéines régulatrices de ces virus (telles que Tat), rendant ainsi l'expression de la (des) protéine (s) d'intérêt, sous contrôle de l'infection virale elle-même. Il doit pouvoir être maintenu de façon stable dans la cellule et peut éventuellement posséder des signaux particuliers spécifiant la sécrétion du polypeptide traduit.
Ces différents signaux de contrôle sont choisis en fonction de l'hôte cellulaire utilisé. A cet effet, les séquences d'acide nucléique selon l'invention peuvent être insérées dans des vecteurs à réplication autonome au sein de l'hôte choisi, ou des vecteurs intégratifs de l'hôte choisi.
De tels vecteurs seront préparés selon les méthodes couramment utilisées par l'homme du métier, et les clones en résultant peuvent être introduits dans un hôte approprié par des méthodes standard, telles que par exemple la lipofection, l'électroporation, le choc thermique.
L'invention vise en outre les cellules hôtes transformées par les vecteurs précédents. Ces cellules peuvent être obtenues par l'introduction dans des cellules hôtes d'une séquence nucléotidique insérée dans un vecteur tel que défini ci-dessus, puis la mise en culture desdites cellules dans des conditions permettant la réplication et/ou l'expression de la séquence nucléotidique transfectée.
Le procédé de préparation d'un polypeptide de l'invention sous forme recombinante est lui-même compris dans la présente invention, et se caractérise en ce que l'on cultive les cellules transformées dans des conditions permettant l'expression d'un polypeptide recombinant de séquence d'acide nucléique selon l'invention, et que l'on récupère ledit polypeptide recombinant.
Les polypeptides recombinants, caractérisés en ce qu'ils sont susceptibles d'être obtenus par lesdits procédés de préparation selon l'invention, font également partie de l'invention.
Les polypeptides recombinants obtenus comme indiqué ci-dessous, peuvent aussi bien se présenter sous forme glycosylée que non glycosylée et peuvent présenter ou non la structure tertiaire naturelle.
Les procédés de purification de polypeptide recombinant utilisés sont connus de l'homme du métier. Le polypeptide recombinant peut être purifié à partir de lysats et extraits cellulaires, du surnageant du milieu de culture, par des méthodes utilisées individuellement ou en combinaison, telles que le fractionnement, les méthodes de chromatographie, les techniques d'immuno-affinité à l'aide d'anticorps mono ou polyclonaux spécifiques, etc.
Une variante préférée consiste à produire un polypeptide recombinant fusionné à une protéine porteuse (protéine chimère). L'avantage de ce système est qu'il permet une stabilisation et une diminution de la protéolyse du produit recombinant, une augmentation de la solubilité au cours de la renaturation in vitro et/ou une simplification de la purification lorsque le partenaire de fusion possède une affinité pour un ligand spécifique.
Les polypeptides selon l'invention permettent de préparer des anticorps monoclonaux ou polyclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent spécifiquement les polypeptides selon l'invention. Les anticorps monoclonaux pourront avantageusement être préparés à partir d'hybridomes selon la technique décrite par Kohler et Milstein en 1975. Les anticorps polyclonaux pourront être préparés, par exemple par immunisation d'un animal, en particulier une souris, avec un polypeptide selon l'invention associé à un adjuvant de la réponse immunitaire, puis purification des anticorps spécifiques contenus dans le sérum des animaux immunisés sur une colonne d'affinité sur laquelle a préalablement été fixé le polypeptide ayant servi d'antigène. Les anticorps polyclonaux selon l'invention peuvent aussi être préparés par purification sur une colonne d'affinité, sur laquelle a préalablement été immobilisé un polypeptide selon l'invention.
L'invention a également pour objet des anticorps mono ou polyclonaux, leurs fragments, tels que Fab ou F(ab')2, ou anticorps chimériques, caractérisés en ce qu'ils sont capables de reconnaître spécifiquement un polypeptide selon 1' invention.
Les anticorps de l'invention pourront également être marqués de la même manière que décrit précédemment pour les sondes nucléiques de l'invention tel qu'un marquage de type enzymatique, fluorescent ou radioactif.
Par ailleurs, outre leur utilisation pour la purification des polypeptides, les anticorps de l'invention, en particulier les anticorps monoclonaux, peuvent également être utilisés pour la détection de ces polypeptides dans un échantillon biologique.
Piste de droite : AChE du venin de Bungarus fasciatus, purifiée par chromatographie d'affinité.
Figure 5 : Carte du plasmide pCDNA3 contenant l'insert de séquence SEQ ID N04 et déposé à la CNCM le 30 octobre 1997 sous le numéro I-1938.