INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le polypeptide hybride comprend trois motifs R1 de formule KKAAPA et deux motifs R2 de formule KKAAAKK, lesquels motifs sont strictement ceux décrits dans la molécule HBHA. Il est clair néanmoins que l'acide aminé lysine peut être substitué de façon conservative par l'arginine, ces deux acides aminés ayant les mêmes propriétés cationiques, et l'acide aminé alanine peut être substitué par tout type d'acide aminé et de la façon préférée par la leucine, l'isoleucine ou la valine. Les motifs R1 ou R2 peuvent être contigus ou séparés par un espaceur. A titre d'exemple, le polypeptide APA, qui constitue l'espaceur entre les deux motifs R2 de la protéine native HBHA, peut être utilisé. Néanmoins, la longueur et la nature de cet espaceur ne sont pas déterminantes dans les propriétés fonctionnelles du polypeptide hybride que l'on souhaite purifier.
La présente invention porte également sur des vecteurs d'expression pour la production d'une protéine recombinante comprenant : a) une séquence d'acide nucléique codant pour un polypeptide hybride comprenant ladite protéine, au moins un motif constitué de la séquence R1 de formule :X1X2Y1Y2PY3, entre 0 et cinq motifs constitués de la séquence R2 de formule : X1X2Y1Y2YX3X4 dans lesquelles X1 à X4 représentent indifféremment K (Lys) R (Arg) , etY1 à Y3 représentent n'importe quel acide aminé, mais de préférence A(Ala), L (Leu), I(Ileu), V(Val) et P représente une proline, le nombre de motifs R1 et R2 et leur
combinaison étant choisi en fonction de l'affinité recherchée entre le polypeptide et le support solide porteur de polysaccharides sulfatés, sachant que quand le nombre de R2 est égal à 0, le nombre de R1 est au moins égal à 2, b) les séquences régulatrices permettant l'expression de ladite séquence dans une cellule hôte.
Dans le vecteur d'expression, les polynucléotides codant pour R1 et/ou R2 peuvent être, soit en amont c'est-à-dire du côté 5', ou en aval, c'est-à-dire du côté 3' de la séquence codant pour la protéine ou le polypeptide d'intérêt.
Les vecteurs d'expression et la méthode d'obtention du polypeptide hybride sont également réalisés par des méthodes classiques bien connues de l'homme du métier. A titre d'exemple, le domaine C terminal de la HBHA porteur des séquences codant pour les motifs R1 et R2 est amplifié par PCR à partir d'un plasmide porteur du gène HBHA tel que décrit dans (1) puis ligaturé au gène codant pour la protéine que l'on souhaite purifier après digestion par les enzymes de restriction appropriées. L'amplification des motifs codant pour 1 à 5 R1 ou 0 à 5 R2 est réalisée aisément en ayant recours à des amorces d'amplification placées de façon à amplifier spécifiquement l'ensemble 3 R1, 2 R1, 1 R1, 3 R1 + 2 R2,1 R1 + 2R2 etc. Les amplicons obtenus peuvent ensuite être dupliqués à volonté sur le polypeptide de fusion. Les techniques de base pour constituer des plasmides porteurs du polypeptide hybride sont décrites dans Current Protocols in Molecular Biology, F. M. Ausubel et al.
Ed. John Wiley and Sons, New York, 1990.
Le gène fusionné que l'on souhaite exprimer via un polypeptide de fusion peut être n'importe quel gène d'intérêt ; néanmoins, vu les propriétés de rendement, de pureté et de conditions non dénaturantes utilisées pour ce procédé de purification par affinité, il semble particulièrement approprié pour la production d'antigènes vaccinants ou de protéines d'intérêt
thérapeutique. Il est en effet connu que l'un des freins au développement pharmaceutique de médicaments comprenant comme principe actif des protéines ou polypeptides recombinants est la difficulté de la mise en oeuvre du procédé industriel de purification.
L'invention porte également sur les polypeptides hybrides obtenus après expression chez un hôte cellulaire d'un vecteur recombinant porteur des séquences codant pour la protéine que l'on souhaite obtenir et pour le nombre de motifs R1 et R2 préalablement choisis.
L'invention porte également sur un procédé de production et de purification d'une protéine par chromatographie d'affinité utilisant un support solide auquel est greffé un polysaccharide sulfaté ou tout analogue fonctionnel synthétique, ledit polypeptide hybride comprenant une séquence protéique dont l'obtention à l'état purifié est recherchée, au motif un motif R1 et entre 0 et 5 motifs R2 tels que définis plus haut. Dans le procédé selon l'invention, le nombre de motifs R1 est choisi en fonction de l'affinité recherchée entre ledit polypeptide hybride et le ligand, l'affinité augmentant avec le nombre de motifs R1. A titre d'exemple, quand le polypeptide hybride comprend 3 R1 et 2 R2, la force ionique d'élution du support est de 300 mM. Quand les peptides comprennent 1 R1 et 2 R2, cette force ionique n'est plus que de 100 mM. Les résultats plus détaillés sont exposés dans les exemples ci-après.
Dans le procédé de l'invention, après avoir choisi le nombre de motifs R1 et R2 qui permettra la purification optimale, on construit un vecteur d'expression susceptible d'exprimer ce polypeptide hybride et porteur des séquences codant pour la protéine que l'on cherche à purifier et pour le nombre de motifs choisis. De façon préférée, les motifs R1 et R2 sont respectivement de formule KKAAPA et KKAAAKK. Les motifs peuvent être contigus ou séparés de préférence par des espaceurs à dominante cationique. Ils peuvent être dans la partie N- ou C-terminale de la protéine hybride.
L'invention porte en fait sur l'utilisation des motifs répétés de la partie carboxy-terminale de la HBHA comme label moléculaire, dans la fabrication par recombinaison génétique in vitro de polypeptides hybrides comportant une séquence protéique ou polypeptidique que l'on souhaite purifier par chromatographie d'affinité.
La densité des particules de lipoprotéine est inversement proportionnelle à leur taille, leur densité reflétant les quantités relatives de lipides non polaires de faible densité contenues dans le noyau et de protéines de surface de haute densité présentes.
Parmi les lipoprotéines de grande taille on connaît les chylomicrons, sécrétés par les entérocytes, dans lesquels l'apo B-48 est majoritaire, et les VLDL, sécrétées par les hépatocytes, qui contiennent la protéine apo B-100.
Les classes de lipoprotéines les plus petites, LDL et HDL, contiennent majoritairement des esters de cholestérol dans leur noyau. Les formes matures de ces particules ne sont pas sécrétées directement à partir des cellules mais sont plus particulièrement produites par des voies métaboliques au sein du plasma sanguin.
Les particules LDL représentent les produits finaux du métabolisme des particules VLDL.
Certains composants des particules HDL sont dérivés à partir des chylomicrons.
Ainsi, les lipoprotéines de haute densité (HDL) sont l'une des quatre classes majeures de lipoprotéines qui circulent dans le plasma sanguin .
Ces lipoprotéines sont impliquées dans différentes voies métaboliques telles que le transport lipidique, la formation des acides biliaires, la stéroïdogénèse, la prolifération cellulaire et en outre interfèrent avec les systèmes de protéinase plasmatique.
Les HDL sont de parfaits accepteurs de cholestérol libre et, en combinaison avec les protéines de transfert d'ester de cholestérol (CETP), la lipoprotéine lipase (LPL), la lipase hépatique (HL) et la lécithine : cholestérol acyltransférase (LCAT), jouent un rôle majeur dans le transport inverse du cholestérol, c'est à dire le transport du cholestérol en excès dans les cellules périphériques vers le foie pour son élimination de l'organisme sous forme d'acide biliaire.
Les HDL ne transportent pas seulement le cholestérol des cellules périphériques vers le foie mais le distribuent également aux cellules productrices de stéroïdes ou aux cellules périphériques appauvries en cholestérol.
Les précurseurs des HDL sont sécrétés sous forme discoidale à partir de l'intestin et du foie, à partir desquels les particules sphériques sont formées grâce à la formation d'esters de cholestérol qui migrent au c#ur de la particule lipoprotéique.
Les particules naissantes de HDL contiennent des apo A-I et apo A-IV, alors que les particules de HDL hépatiques naissantes sont riches en apo A-I, apo E et apo A-II.
La partie lipidique de ces particules consiste en des phospholipides et de petites quantités de cholestérol libre et de triglycéride.
Il a été démontré que les HDL jouent un rôle central dans le transport du cholestérol des tissus périphériques vers le foie.
L'excès de cholestérol non estérifié des cellules périphériques riches en cholestérol est capté par les HDL et subit une estérification par l'action de la LCAT. Ces HDL enrichies en esters de cholestérol sont captées par des protéines de liaison ou récepteurs des HDL à la surface des hépatocytes et y délivrent leurs esters de cholestérol.
Le rôle protecteur des HDL dans le transport inverse du cholestérol est confirmée par les études épidémiologiques démontrant une relation inverse entre les concentrations de cholestérol dans ces HDL et le risque d'apparition de maladies coronariennes, ou encore par des observations selon lesquelles les HDL acceptent efficacement les excès de cholestérol intracellulaire à partir de types cellulaires variés.
Les lipoprotéines athérogènes sont ingérées par les macrophages ou cellules périphériques et dégradées dans les lysosomes.
La présente invention a pour objet deux tuiles complémentaires de bordure de toit destinées à donner à un toit réalisé avec des tuiles à double ondulation et à emboîtement, l'apparence d'un toit en tuiles canal.
Les toits en tuiles semi-coniques dites tuiles canal sont très anciens, surtout sur tout le pourtour de la mer Méditerranée. Ils sont constitués par des tuiles légèrement coniques qui sont placées en position inversée, les tuiles dites de courant étant mises en place de façon à présenter leur face concave et les tuiles dites de couvert étant déposées en présentant leur face convexe, à cheval sur deux tuiles de courant. Les tuiles de courant créent un canal pour assurer l'écoulement des eaux de pluie et les tuiles de couvert empêchent l'eau de pluie de pénétrer dans l'espace séparant les tuiles de courant.
Les toits ainsi réalisés ont un très bel aspect esthétique, mais ne peuvent être posés que sur des toits à faible pente, afin d'éviter que les tuiles ne glissent les unes sur les autres sous l'effet de leur poids et cette faible pente les rend très sensibles au vent. En effet, le vent peut s'immiscer sous les tuiles et d'une part les déplacer, d'autre part refouler la pluie qui passe alors entre les tuiles et donc traverse le toit.
On a donc imaginé, à partir du 19ème siècle, des tuiles à emboîtement dites aussi tuiles mécaniques, c'est-à-dire des tuiles qui s'emboîtent les unes sur les autres ce qui évite tout déplacement intempestif de ces tuiles. Ces tuiles comportent, en plus, dans leurs parties emboîtées, des rainures ou nervures qui assurent l'étanchéité tout en guidant l'écoulement des eaux. Un des exemples les plus connus de ce genre de tuile est la tuile dite Marseillaise .
La tuile Marseillaise permet d'obtenir un toit étanche et stable dans le temps, mais elle n'est pas très esthétique.
On a alors proposé un autre type de tuile, dite tuile romane , qui est une tuile à emboîtement en deux parties : une partie convexe et une partie plane. La partie plane comporte sur son contour les moyens d'emboîtement sur lesquels vont s'emboîter le rebord convexe de la tuile adjacente, ainsi que l'extrémité de la tuile située au-dessus et sert à l'écoulement des eaux de pluie. Cette tuile donne entièrement satisfaction au point de vue technique et a fait l'objet de nombreux dépôts de Modèles, par exemple le Modèle n 139.438 du 13 septembre 1973 au nom des Ets LARTIGUE et DUMAS, ou n 186.896 du 23 janvier 1981 au nom de la Société LAMBERT CERAMIQUES.
Mais, l'apparence extérieure d'un toit fait avec de telles tuiles n'est pas réellement satisfaisante car la partie plate est apparente ce qui fait qu'un toit fait avec de telles tuiles ne ressemble qu'imparfaitement à un toit fait à l'ancienne, avec des tuiles canal.
Ce problème d'aspect esthétique a été résolu par la demanderesse au moyen de son Modèle n 822.377 du 28 mai 1982.
La tuile décrite dans ce modèle est une tuile à double courbure, c'est-à-dire que la partie plate des Modèles antérieurement connus est remplacée par une partie concave.
La tuile comporte alors une partie convexe tronconique, à côté de laquelle se trouve une partie concave légèrement tronconique, d'orientation inverse, et, sur le contour de cette partie conico-concave, les moyens usuels d'emboîtement et d'étanchéité.
Cette tuile présente tous les avantages des tuiles romanes à emboîtement connues et donne, en plus, au toit une apparence très voisine de celle des toits anciens en tuiles canal.
L'amélioration esthétique est considérable ; de sorte que cette tuile à double ondulation concave-convexe, que l'on appelle double canal , connaît un grand succès.
Mais, il demeure un léger défaut d'apparence à la lisière inférieure du toit. Alors que sur toute la surface du toit l'apparence est celle d'un assemblage de tuiles canal, au rebord inférieur du toit on voit bien qu'il n'en est rien et que le toit est fait avec des tuiles à emboîtement.
Le but de la présente invention, est de supprimer cet inconvénient en réalisant la première rangée de tuiles d'un toit, fait avec des tuiles double canal, avec des tuiles spéciales lui donnant l'apparence d'un assemblage de tuiles canal. Dans un premier temps, on a pensé qu'il suffisait de disposer au rebord inférieur du toit une rangée de tuiles canal de type classique, c'est-à-dire des tuiles de courant chevauchées par des tuiles de couvert. Mais alors, il s'est avéré presque impossible de continuer le toit avec des double canal, car la liaison entre la rangée de tuiles canal et la première rangée de tuiles double canal à emboîtement se fait mal et laisse des espaces vides dans lesquels le vent va s'engouffrer en poussant la pluie, de sorte que le toit ainsi réalisé n'est pas étanche à sa partie inférieure.
On a proposé d'utiliser, pour faire la première rangée d'un toit, deux tuiles analogues à des tuiles canal, la tuile de courant ayant son extrémité recouverte munie d'un plateau plat rectangulaire d'une largeur supérieure à celle de la tuile et comportant des nervures sur ses trois côtés, la tuile de couvert étant munie à son extrémité supérieure d'un ergot central.
De telles tuiles donnent bien l'illusion de tuiles canal, mais elles ne peuvent s'adapter qu'à des tuiles à emboîtement du type tuiles romanes dont la partie plate vient se reposer et s'emboîter sur le plateau plat de la tuile de courant : de telles tuiles sont impuissantes à s'adapter à des tuiles à emboîtement à double ondulation convexe-concave c'est-à-dire à des tuiles double canal.
Dans le domaine papetier, les besoins de rentabilité économique font que l'on assiste de plus en plus à : l'utilisation de pâtes issues de fibres cellulosiques de récupération FCR -) et à la détérioration de la qualité de ces FCR en rai-son du nombre toujours croissant de recyclages de " vieux papiers ", et - la fermeture systématique des circuits et donc à l'enrichissement des eaux de fabrication en matières en suspension ou solubles, organiques et minérales, et notamment en espèces anioniques, communément appelées #1 anionic trash "' qui perturbent la fixation de l'amidon cationique sur la fibre.
Ces phénomènes se traduisent par une baisse inéluctable de l'efficacité des amidons, notamment cationiques, et de la solidité des papiers ainsi que par une augmentation quasi-systématique des besoins d'épuration des eaux d'égouttage des machines à papier ou " eaux sous toile ".
Pour pallier ces problèmes, il a été préconisé de faire appel à des amidons amphotères, à savoir contenant à la fois des groupements cationiques et anioniques comme décrit dans les brevets FR 2.289.674 ou EP 257.338. Cependant, la complexité et le coût de préparation de ces amidons, leurs performances insuffisantes et/ou leurs potentialités d'application limitées, en réduisent l'intérêt industriel.
Il a également été exploité des techniques dites duales "" par lesquelles on introduit successivement, dans un ordre quelconque, un polymère cationique et un composé anionique d'origine minérale ou organique. Une telle technique mettant en #uvre de manière obligatoirement séparée un amidon cationique et un amidon anionique est notamment décrite dans le brevet EP 282.415 au nom de la Demanderesse. Ce procédé permet une bonne fixation des amidons mais a pour principal inconvénient d'imposer en pratique l'installation de deux unités de cuisson, l'une pour solubiliser 1 ` amidon cationique, l' autre pour solubiliser l'amidon anionique. En outre, la quantité totale d'amidons fixés à la cellulose n'est pas toujours suffisante pour conférer au papier les caractéristiques physiques souhaitées.
Par ailleurs, la technique duale utilisant un dérivé silicique comme composant anionique (brevet EP 41.056) a dû être perfectionnée au cours du temps en vue de répondre aux exigences (techniques, économiques et/ou réglementaires) toujours plus pressantes auxquelles sont confrontées les papeteries. Ces perfectionnements, décrits par exemple dans les brevets EP 349.366 et EP 490.425, améliorent généralement la rétention des charges et des fibres. Ils sont cependant complexes et ne permettent pas toujours d'augmenter ou de rendre acceptables les caractéristiques physiques du papier, notamment lorsque celui-ci a été fabriqué dans des conditions difficiles (taux élevé de FCR et/ou circuit très fermé).
C'est pourquoi on applique généralement un traitement de surface à l'une au moins des deux faces d'un tel papier, en vue d'accroître la proportion d'amidon, natif ou modifié, entrant dans la constitution du produit fini.
Cependant, cette opération de surfaçage entraîne un surcoût lié à l'équipement et à 1ropération supplémentaire de séchage qu'il induit ainsi qu'une diminution très importante (généralement 15 à 25 %) de la vitesse des machines et donc de leur productivité.
Récemment, il a été proposé par le brevet JP 08296193-A de mettre en #uvre au sein de la suspension fibreuse un " complexe polyionique d'amidon amphotère ". Ce procédé permettrait de préparer des cartons offrant des propriétés améliorées de désagrégation et d'aptitude au contrecollage et ce, sans nuire à la bonne marche des machines à papier. Il apparaît cependant que pour obtenir des complexes dispersibles et uniformes, et donc véritablement efficaces 1) le pH de la suspension aqueuse d'amidons cationique et anionique doit obligatoirement être ajusté entre pH 3 et 6, de préférence entre pH 4 et 5 par ajoût d'acide minéral ou organique et 2) la suspension acidifiée ainsi obtenue doit obligatoirement être gélatinisée sur un cuiseur fonctionnant en continu. Pour éviter ou diminuer les propriétés floculantes du complexe, il est également conseillé de limiter le degré de substitution (" DS ") de lamidon anionique à une valeur au plus égale à 0,05.
En suite de quoi, le procédé préconisé est compliqué de mise en #uvre, notamment en vue d'obtenir les complexes souhaités.
Il a désormais été trouvé qu'il était possible d'améliorer la performance d'un tel procédé et ce, tout en le rendant plus simple et, en particulier, sans rendre obligatoire l'étape précitée d'ajustement du pH de la suspension d'amidons, avant cuisson.
La Société Demanderesse a notamment constaté qu'en sélectionnant soigneusement la nature de la matière amylacée anionique utilisée dans un tel procédé, il était possible d'améliorer encore la fixation des amidons et/ou la rétention des fibres et charges au sein de la structure plane résultante ainsi que les caractéristiques physiques de cette structure. Ceci, sans devoir impérativement mettre en #uvre les conditions de pH et de cuisson rendues nécessaires par les enseignements du brevet JP 08296193-A précité.
De manière plus précise, la présente invention a pour objet une nouvelle composition pour la fabrication de structures planes, caractérisée par le fait qurelle contient au moins une matière amylacée cationique et au moins une matière amylacée sulfonée.
Par matière amylacée "' au sens de la présente invention, on entend notamment les amidons, d'origine naturelle ou hybride, y compris ceux issus de mutations ou manipulations génétiques. Ces amidons natifs peuvent notamment être issus de pomme de terre, de pomme de terre à haute teneur en amylopectine (pomme de terre waxy), de mais, de blé, de maïs à haute teneur en amylose, de riz, de pois ou de manioc, des coupes ou fractions qui peuvent être faites ou obtenues telles que l'amylose, l'amylopectine, les coupes granulométriques connues de l'homme de l'art sous les vocables d' amidon de blé " A " et amidon de blé N% B /1, et les mélanges quelconques d'au moins deux quelconques des produits susmentionnés, par exemple un mélange d'amidon de maïs et de fécule de pomme de terre. Les matières amylacées peuvent également consister en des farines ou autres mélanges contenant amidon(s) et protéine (s) végétale (s) , le composant " amidon (s) " étant majoritaire.
Par " matière amylacée on entend également, en particulier, les amidons susdécrits qui ont subi l'une au moins des opérations de fluidification, notamment chimique et/ou enzymatique, de prégélatinisation ou de solubilisation, notamment thermique et/ou chimique. Ainsi toute matière amylacée, fluidifiée ou non, contenue dans la composition selon l'invention peut se trouver à l'état granulaire non gonflé (amidon cru) , à l'état granulaire à différents stades de gonflement (amidon prégélatinisé) et/ou à l'état solubilisé.
Les matières amylacées cationiques utilisables selon l'invention peuvent avoir été obtenues par n'importe lequel des procédés connus de cationisation en milieu aqueux, en milieu solvant ou en phase sèche dès lors que ce procédé permet à un ou plusieurs groupement(s) azoté(s) de nature électropositive de se fixer sur une matière amylacée. Ces groupements azotés peuvent notamment renfermer un atome d'azote tertiaire ou quaternaire. Le taux d'a-zote fixé présenté par ces matières amylacées cationiques peut se situer dans une large gamme, en particulier entre 0,1 et 3 % environ. Selon une variante de l'invention, ce taux d'azote fixé et au moins égal à 0,5 %, de préférence compris entre 0,6 et 2 %, ces pourcentages étant exprimés en poids d'azote par rapport au poids sec de la matière amylacée cationique.
Les matières amylacées anioniques sélectionnées selon l'invention peuvent avoir été obtenues par n'importe lequel des procédés connus, en une ou plusieurs étapes, de sulfonation et notamment de préparation d'amidons sulfocarboxylés, sulfoalcoylés ou sulfoalcénylés.
On utilise de préférence les oligomères d'isobutylène de poids moléculaire inférieur à 1000 et leurs mélange avec des polyisobutylènes de poids moléculaire supérieur à 1000 et de préférence compris entre 1000 et 15000.
A titre d'exemples de poly-a-oléfines utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut plus particulièrement mentionner les polyisobutènes vendus sous le nom de PERMETHYL 99 A, 101 A , 102 A , 104 A (n=16) et 106 A (n=38) par la Société PRESPERSE Inc, ou bien encore les produits vendus sous le nom de ARLAMOL HD (n=3) par la Société ICI (n désignant le degré de polymérisation), - de type polydécène, hydrogéné ou non.
De tels produits sont vendus par exemple sous les dénominations ETHYLFLO par la société ETHYL CORP., et d'ARLAMOL PAO par la société ICI.
Selon la présente invention, les composés de type céramide sont notamment les céramides et/ou les glycocéramides et/ou les pseudocéramides et/ou les néocéramides, naturelles ou synthétiques.
Des composés de type céramide sont par exemple décrits dans les demandes de brevet DE4424530, DE4424533, DE4402929, DE4420736, W095/23807, W094/07844, EP-A-0646572, W095/16665, FR-2 673 179, EP-A-0227994 et WO 94/07844, W094/24097, W094/10131 dont les enseignements sont ici inclus à titre de référence.