Il correspond à une duplication des séquences activant la transcription situées en amont de l'élément TATA du promoteur 35S naturel (Kay et al., 1987); 2. la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA 35S, qui correspond à la région 3' non codante de la séquence du virus à ADN bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S Les constructions des différents plasmides via l'utilisation de techniques d'ADN recombinant dérivent de pBIOC4. Ce plasmide binaire dérive de pGA492 (An et al, 1986) qui contient entre les bordures droite et gauche; issues du plasmide pTiT37 d'Agiobacteltni tumefaciens, sur son ADN de transfert, les séquences suivantes: le promoteur constitutif du gènenos de la nopaline synthase, la séquence codante du gène nptII codant pour la néomycine phosphotranstérase II délétée de la région des 8 premiers codons dont le codon initiateur méthionine ATG et fusionnée à la séquence des 14 premiers codons de la séquence codante du gène nos, la séquence codante du gène nos dépourvue de la région des 14 premiers codons, le terminateur nos, une région contenant des sites multiples de clonage (encore désignée polylinker) (HindIII-XbaI-SacI-HpaI-KpnI-ClaI-BglII) précédant le gène cat codant pour la chloramphénicol et les séquences terminatrices du gène 6 du plasmide pTiA6 d'Ag'.ohacteùmi' tumefaciens (Liu et ai., 1993). Pour éliminer la quasi-totalité de la séquence codante du gène cat, le plasmide pGA492 a été doublement digéré par SacI (site de restriction du polylinker) et par ScaI (site de restriction présent dans la séquence du gène cat) puis soumis à l'action de l'enzyme T4 DNA polymérase (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant. La ligation du plasmide modifié (20 ngy) a été réalisée dans un milieu réactionnel de 10 Ill contenant 1 l du tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham); 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14 C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5α rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan et al., 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 12 ,ug/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Puis, le site de restriction HindIII de l'ADN plasmidique du clone retenu a été modifié en un site de restriction EcoRI à l'aide d'un adaptateur HindlII-EcoRI phosphorylé (Stratagene Cloning Systems). Pour réaliser cette modification, 500 ng d'ADN plasmidique du clone retenu ont été digérés par HindIII, déphosphorylés par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant et coprécipités en présence de 1500 ng d'ADN adaptateur HindîlI-EcoRI, 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min. Après centrifugation à 12000 g pendant 30 min., I'ADN précipité a été lavé à l'etllanol 70%, séché, repris dans 8 l d'eau, porté à 65 C pendant 10 min., puis ligué en présence de I l de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et 2,5 U d HindIII et SalI du polylinker. Pour supprimer cet ATG et obtenir le plasmide pJIT163A, I'ADN plasmidique pJIT163 a été digéré doublement par HindIII et SalI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué, précipité en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,5 volumes méthanol absolu à -80"C pendant 30 min., centrifugé à 12000 g pendant 30 min., lavé à méthanol 70%, séché, soumis à l'action de l'enzyme Klenow (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant, déprotéinisé par extraction avec 1 volume de phénol: chlorofonne: alcool isoamylique (25:24:1) puis 1 volume de chloroforme: alcool isoamylique (24:1), précipité en présence de 1/10 volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugé à 12000 g pendant 30 min., lavé à 'éthanol 70%, séché, et enfin, ligué en présence de I 1ll du tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries Eschezichia coli DHSa rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 pg/ml ampicilline a été extrait selon la méthode de la lyse et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Pour isoler la cassette d'expression constituée du promoteur Pd35S et du terminateur polyA 35S (fragment SacI XhoI), I'ADN plasmidique du clone pJIT 163n retenu a été digéré par SacI et XhoI.