Un volume de 200 1 de virion purifié selon le protocole décrit ci-dessus et contenant une activité transcriptase inverse d'environ 1-5 millions de dpm est décongelé à 370C jusqu'à apparition d'une phase liquide, puis placé sur de la glace. Un tampon 5 fois concentré a été préparé avec les composants suivants:Tris-HCl pH 8,2, 500 mM; NaCl 75 mM; MgC12 25 mM; DTT 75 mM et NP 40 0,10 % ; 100 41 de tampon 5X + 25 1 d'une solution de dATP 100mM + 25 Cil d'une solution de dTTP 100 mM + 25 1 d'une solution de dGTP 100 mM + 25 41 d'une solution de dCTP 100 mM + 100 41 d'eau distillée stérile + 200 41 de la suspension de virions (activité T.I. de 5 millions de DPM) dans le PBS ont été mélangés et incubés à 420C pendant 3 heures. Après cette incubation le mélange réactionnel est directement ajouté à un mélange tamponné phénol/chloroforme/alcool isoamylique (Sigma ref.P 3803); la phase aqueuse est collectée et un volume d'eau distillée stérile est ajouté à la phase organique pour ré-extraire le matériel nucléique résiduel. Les phases aqueuses collectées sont regroupées et les acides nucléiques contenus sont précipités par addition d'acétate de sodium 3M, pH 5,2 au 1/10 de volume + 2 volumes d'éthanol + 1 p1 de glycogène (Boehringer-Mannheim ref. 901 393) et mise à -20 C de l'échantillon pendant 4h ou la nuit à +40C. Le précipité obtenu après centrifugation est ensuite lavé avec de l'méthanol à 70% et resuspendu dans 60 ml d'eau distillée.Les produits de cette réaction ont ensuite été purifiés, clonés et séquencés selon le protocole décrit ci-après: des ADN bouts francs avec des adénines non-appariées aux extrémités ont été générés: une réaction de "remplissage" a d'abord été effectuée: 25 41 de la solution d'ADN précédemment purifiée ont été mélangés avec 2 41 d'une solution 2,5 mM contenant, en quantité equimolaire, dATP + dGTP + dTTP + dCTP / 1 ssl d'ADN polymérase T4 (Boehringer-Mannheim ref. 1004 786) / 5 ssl de 10X "incubation buffer for restriction enzyme" (Boehringer Mannheim ref. 1417 975) / 1 l d'une solution à 1 % de sérum-albumine bovine / 16 41 d'eau distillée stérile.Ce mélange a été incubé 20 minutes à 11 C. 50 1 de tampon TE et 1 41 de glycogène (Boehringer-Mannheim ref. 901 393) y ont été ajoutés avant extraction des acides nucléiques avec du phénol/chloroforme/alcool isoamylique (Sigma ref. P 3803), et précipitation à l'acétate de sodium comme décrit précédemment. L'ADN précipité après centrifugation est resuspendu dans 10 p1 de tampon 10 mM Tris pH 7,5. Puis, 5 p1 de cette suspension ont été mélangés avec 2041 de tampon Taq 5X, 20 41 de 5mM dATP, 1 41 (SU) de Taq ADN polymérase (AmplitaqTM) et 54 41 d'eau distillée stérile. Ce mélange est incubé 2 h à 750C avec un film d'huile à la surface de la solution.L'ADN en suspension dans la solution aqueuse prélevée en dessous du film d'huile après incubation est précipité comme décrit précédemment et resuspendu dans 2 p1 d'eau distillée stérile. L'ADN obtenu a été inséré dans un plamide à l'aide du kit TA cloningTM. Les 2 41 de solution d'ADN ont été mélangés avec 5 41 d'eau distillée stérile, 1ss1 d'un tampon de ligation 10 fois concentré "10X LIGATION BUFFER", 2 41 de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) et 1 41 de "TA DNA LIGASE". Ce mélange a été incubé une nuit à 120C. Les étapes suivantes ont été réalisées conformément au instructions du kit TA Clonings (British Biotechnology).A la fin de la procédure, les colonies blanches de bactéries recombinantes (white) ont été repiquées pour être cultivées et permettre l'extraction des plasmides incorporés selon la procédure dite de "miniprep" (17). La préparation de plasmide de chaque colonie recombinante a été coupée par une enzyme de restriction appropriée et analysée sur gel d'agarose. Les plasmides possédant un insert détecté sous lumière W après marquage du gel au bromure d'éthidium, ont été sélectionnés pour le séquençage de l'insert, après hybridation avec une amorce complémentaire du promoteur Sp6 présent sur le plasmide de clonage du TA cloning kits.La réaction préalable au séquençage a ensuite été effectuée selon la méthode préconisée pour l'utilisation du kit de séquençage "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) et le séquençage automatique a été réalisé avec l'appareil "Automatic Sequencer, modèle 373 A" Applied Biosystems, selon les instructions du fabricant.