INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
II est à noter que la dissymétrie de surcharge peut n'être pas totale, c'est à dire tout d'un côté et rien de l'autre, mais peut être mise en oeuvre de façon moins déséquilibrée, c'est à dire une partie très substantielle de la masse globale d'un côté et le reste de l'autre côté, selon le type d'aéronef, les conditions de vol, etc...
L'ajout de masse sur un ou chaque côté de voilure, peut être constitué d'un ou plusieurs éléments séparés, par exemple d'un alliage à base de tungstène , de formes et dimensions adaptées aux endroits récepteurs.
L'invention a pour objet de proposer des moyens permettant de discriminer les cellules cibles de la thérapie génique. Il est essentiel, pour certaines applications en thérapie génique, de garantir que le transfert de gène n'aura eu lieu que dans les cellules à traiter et pas dans d'autres catégories cellulaires. Par exemple, quand on souhaite conférer un avantage sélectif à des cellules normales vis-à-vis d'une chimiothérapie, il est impératif que le gène transféré conférant cet avantage n'ait pas été introduit dans des cellules cancéreuses.
L'invention a pour objet un mécanisme à deux étapes, dans lequel la deuxième étape est conditionnée par la réalisation de la première étape.
L' invention a pour objet une alternative intéressante sur le plan des performances du ciblage, notamment puisqu'elle combine la reconnaissance spécifique de la cellule cible et l'entrée dans la cellule cible associée à un mécanisme rétroviral naturel, connu pour son efficacité.
L'invention a plus particulièrement pour objet un mécanisme de ciblage à deux étapes - la première étape permettant la reconnaissance d'une molécule de surface ciblée par l'intermédiaire du nouveau domaine de liaison N-terminal, inséré dans une glycoprotéine d'enveloppe, - la deuxième étape permettant la reconnaissance, conditionnelle, d'un récepteur rétroviral normal par l'intermédiaire d'un domaine propre à la glycoprotéine d'enveloppe initiale et ainsi, autorisant un relais dans le processus d'entrée de la particule virale dans la cellule, le terme "conditionnel" signifiant que le relais dans le mécanisme d'entrée ne peut être effectué que si la particule virale a préalablement interagi avec la molécule de surface initiale qui, elle, garantit que l'infection est réellement ciblée.
L'invention a pour objet de nouveaux peptides permettant la réalisation de la première étape dans un mécanisme à deux étapes et jouant le rôle de "masquage" vis-à-vis de la deuxième étape, tant que la première étape n'a pas eu lieu et permettant la deuxième étape, c'est-à-dire jouant le rôle de démasquage vis-à-vis de la deuxième étape si, et seulement si, la première étape a eu lieu.
La présente invention a également pour objet la construction de glycoprotéines d'enveloppe chimériques utilisant ces nouveaux peptides.
L'invention concerne l'utilisation d'un peptide en vue d'un transfert de gènes dans une cellule eucaryote cible, lequel peptide présente d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement environ 20 acides aminés, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 1800 ("p-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type ss ("polyproline p-turn helix"), dans une construction polypeptidique contenant, du côté N-terminal (en amont) dudit peptide, un domaine protéique N-terminal (amont) susceptible de reconnaître une molécule de surface ciblée ou un antigène exprimé sur une surface cellulaire, notamment un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur ladite cellule eucaryote, et du côté C-terminal (en aval) dudit peptide, un domaine protéique C-terminal (aval) susceptible de reconnaître un récepteur approprié (récepteur auxiliaire) situé sur la susdite cellule eucaryote, lequel peptide est capable de faciliter ou d'inhiber l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire, l'inhibition de cette interaction ayant lieu tant que le domaine protéique N-terminal (amont) n'a pas interagi avec le récepteur ciblé et la favorisation de l'interaction entre le domaine protéique C-terminal (aval) et le récepteur auxiliaire ayant lieu lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a interagi avec le récepteur ciblé.
Dans le cas d'un peptide de 20 acides aminés (APRO défini ci-après), cette hélice polyproline à repliement de type ss contient 4 repliements 13 et donc 4 spires, et est par ailleurs incompatible avec une structure secondaire en hélice a ou en feuillet ss. De façon avantageuse, l'hélice polyproline à repliement de type ss placée entre les deux domaines de la protéine chimère (domaine N-terminal et domaine auxiliaire) possède intrinsèquement , 1) une force élastomérique, 2) la propriété de s' auto-assembler avec d'autres hélices polyproline, probablement en relation avec la nature trimère de l'enveloppe, 3) la propriété de transmettre au domaine auxiliaire une déformation induite par la liaison du domaine N-terminal avec son récepteur, provoquant l'activation du domaine auxiliaire.
L'invention vise généralement également tout mécanisme en deux étapes, la deuxième étape ne pouvant être réalisée que si la première étape a eu lieu, et concerne par exemple un mécanisme enzymatique impliquant une protéine chimère et ne devant intervenir que si la protéine chimère a été capable de reconnaître son substrat.
L'expression "domaine protéique N-terminal (amont) susceptible de reconnaître une molécule de surface ciblée, ou un antigène exprimé sur une surface cellulaire", signifie que 1) l'on peut caractériser l'interaction entre ce domaine protéique N-terminal et la molécule de surface ciblée par une constante de dissociation (de l'ordre du nanomolaire en ce qui concerne l'interaction glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale sauvage et récepteur rétroviral); 2) la forme soluble de ce domaine protéique N-terminal (c'est-à-dire non associée dans la construction de la glycoprotéine d'enveloppe chimère) possède des caractéristiques de liaison similaires à ce même domaine protéique quand il est inséré en position N-terminale dans la glycoprotéine d'enveloppe chimère 3) la glycoprotéine d'enveloppe chimère contenant le domaine protéique N-terminal peut être caractérisée selon des techniques classiques en virologie (exemple : test de liaison, cf. "Exemples").
Comme exemple de molécule de surface ciblée ou d'antigène exprimé sur une surface cellulaire, on peut citer - marqueurs de différenciation des divers lignages hématopoïétiques, en particulier marqueurs exprimés sur les cellules précoces et/ou les cellules souches hématopoïétiques (exemple : CD34), - marqueurs exprimés sur les cellules tumorales (exemple : antigènes carcino-embryonnaires), - marqueurs présents spécifiquement sur des tissus différenciés divers (exemple : récepteur de facteurs de croissance, d'hormones peptidiques).
Comme exemple de molécule de surface ciblée, on peut citer notamment un récepteur qui sera dans la suite désigné par récepteur ciblé.
Pour les commodités de langage, dans ce qui suit, on englobera par l'expression "récepteur ciblé" toute molécule de surface ciblée ou tout antigène exprimé sur une surface cellulaire.
L'expression "domaine protéique C-terminal (aval) susceptible de reconnaître un récepteur approprié (récepteur auxiliaire)" signifie que le domaine protéique C-terminal peut interagir avec le récepteur auxiliaire, cette interaction étant caractérisée par une constante de dissociation qui est de l'ordre du nanomolaire si le domaine protéique C-terminal est dérivée d'une glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale et si le récepteur auxiliaire est le récepteur rétroviral utilisé par cette même glycoprotéine, cette interaction permettant de déclencher le processus fusiogénique dans un mécanisme strictement similaire au processus naturel, c'est-à-dire en dehors du contexte d'une glycoprotéine d'enveloppe chimère.
Le peptide qui fait l'objet de l'invention est tel que, placé entre deux domaines protéiques, (un domaine protéique N-terminal par rapport audit peptide et un domaine protéique C-terminal par rapport audit peptide), il peut induire la fonction du domaine protéique C-terminal (par exemple la liaison si telle est la fonction de ce domaine C-terminal) si, et seulement si, le domaine protéique N-terminal a été mobilisé dans sa fonction (par exemple la liaison).
La non induction de la fonction du domaine protéique C-terminal par le peptide de l'invention correspond au mécanisme de "masquage" du peptide de l'invention, tandis que l'induction de la fonction du domaine protéique C-terminal par le peptide de l'invention correspond au mécanisme de "démasquage" du peptide de l'invention. C'est pourquoi, dans la suite du texte, on désignera le peptide de l'invention également par "peptide masquant/démasquant".
Bien entendu, la distinction entre certaines spécificités pourra etre effectuée, si désiré, à l'aide d'autres sondes utilisées comme sondes supplémentaires, comme le montre aisément l'examen des tableaux 1 et 2 annexés.
Les nouvelles sondes de l'invention comprennent aussi les sondes HRP I et HRP 2 qui seront définies ci-après.
Dans les séquences des sondes oligonucléotidiques décrites ci-dessus, I symbolise l'inosine. L'inosine est un nucléotide non naturel utilisé dans certaines sondes de l'invention, pour augmenter le pouvoir discriminant d'une sonde en déstabilisant davantage les hybrides que forme cette sonde avec des séquences d'acide nucléique non strictement identiques à celle de la cible recherchée dans l'échantillon avec cette sonde.
Dans la description de la présente demande, les appellations arbitraires comprenant un nombre suivi d'une lettre, telles que 23A, 26A, 26B, etc., ou des lettres suivies d'un chiffre (telles que HRP 1), désignent globalement toutes les sondes ainsi définies (celles comprenant uniquement la séquence soulignée et celles comprenant en outre une ou deux bases supplémentaires non soulignées), sauf dans la partie expérimentale ci-après et dans les tableaux annexés où ces appellations désignent uniquement les sondes ayant la séquence optimale soulignée.
La présente invention a aussi pour objet un procédé pour déterminer au moins partiellement le typage DQB 1 d'un acide nucléique présent dans un échantillon, dans lequel on effectue des essais d'hybridation, selon les méthodes connues, dudit acide nucléique de l'échantillon avec des sondes oligonucléotidiques, et dans lequel on retient comme essais positifs les essais pour lesquels on observe effectivement une hybridation à une température unique égale à 37+2 C, lesdites sondes oligonucléotidiques comprenant au moins une sonde choisie dans le groupe consistant en TG CGT TAT GTG ACC AGA (26B), GTG CGT CTT GTG ACC AGA (26C), GT CTT GTA ACC AGA CAC AT (26D), CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT (26F), CGT CTT GTG AGC AGA AGC AT (26E), GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G (23 A), G TAC CGG GCA GTG ACG C (49A), G ACG CCG CTG GGI CCG CCT G (55A), G GAG GGI ACC CIG GCl GAG T (70A), TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C (70B), ou leurs complémentaires, étant entendu que lesdites sondes contiennent au minimum la séquence soulignée et peuvent contenir en outre une ou deux bases supplémentaires choisies, en respectant la continuité de la séquence, parmi les bases non soulignées.
L'invention concerne également un procédé tel que défini précédemment, dans lequel on effectue en outre des essais d'hybridation de l'acide nucléique de l'échantillon avec au moins une des sondes suivantes ACC AGA CAC ATC TAT AAC CG (26A), spécificités DQBI reconnues: 0501, 0502, 05031, 05032, 0603, 0604, 0607, 0608, GG CCT GTT GCC GAG TAC T (57A), spécificités DQBI reconnues: 0501, 0604, 06051, 0606, 0608, 0609, CGG CCT AGC GCC GAG TAC T (57B), spécificités DQB1 reconnues: 0502, 0504, CGG CCT GAT GCC GAG TAC (57C); spécificités DQBI reconnues: 05032, 0602, 0603, 0607, et éventuellement GC GAC GTG GAG GTG TAC CG (45A), spécificités DQBI reconnues: 0301, 0304, A GAG GAG GAC GTG CGC TT (37A), spécificités DQB1 reconnues: 06011, 06012, ou leurs complémentaires.
Bien entendu, les essais retenus comme positifs sont encore ceux indiqués précédemment.
Dans le procédé de l'invention, les conditions d'hybridation utilisées sont évidemment des conditions prédéterminées telles que l'hybridation avec chaque sonde ne se produise, à la température unique choisie, que si la cible contient une séquence parfaitement complémentaire de celle de ladite sonde. Ces conditions peuvent être déterminées par de simples expériences de routine. La cible est bien entendu l'acide nucléique présent dans l'échantillon et contenant des régions polymorphes de gènes HLA DQ d'un individu.
Les spécialistes comprendront aisément que les diverses sondes utilisables dans le procédé de l'invention peuvent être, selon les techniques choisies, soit des sondes marquées, soit des sondes couplées à un ligand destiné à faciliter leur fixation sur un support solide, soit encore des sondes déjà fixées sur un support solide. En particulier, les sondes peuvent être soit immobilisées, soit immobilisables, selon les méthodes connues, sur des supports solides, et sont alors utilisables comme sondes de capture.
Selon un mode de réalisation particulier, on effectue les essais d'hybridation en utilisant les sondes indiquées ci-dessus comme sondes de capture, c'est-à-dire fixées à un support solide.
Pour révéler la présence éventuelle d'acide nucléique, fixé sur le support solide par hybridation avec une sonde de capture donnée, on peut utiliser une sonde de détection marquée capable de s'hybrider avec une région de la cible autre que celle reconnue par ladite sonde de capture. On peut utiliser notamment des sondes de détection choisies parmi les suivantes (la partie soulignée correspond comme précédemment à la séquence minimale) GG ACG GAG CGC GTG CG (HRP1), C ATC TAT AAC CGA GA (HRP2), CGC TTC GAC AGC GAC GTG G (HRP3).
L'examen du tableau I annexé permet de déterminer aisément lesquelles, parmi ces sondes de détection, sont utilisables avec une sonde de capture donnée.
Selon le procédé de l'invention, l'identification d'un allèle peut être déduite à partir d'un modèle de liaison d'un ensemble de sondes, chaque sonde individuelle de l'ensemble étant spécifique de différentes parties du gène HLA DQ. Grâce au choix de plusieurs sondes, le procédé de typage par oligonucléotides de la présente invention permet d'identifier si désiré tous les alléles DQB 1 Au cas où de nouveaux alléles seraient découverts, ceux-ci seraient alors répertoriés dans un registre de séquence HLA Classe II, permettant d'actualiser la collection de sondes spécifiques à l'aide de sondes supplémentaires, et donc d'adapter la méthodologie à la détection de tout nouvel allèle.
Pour rationaliser le typage HLA Classe II complet, on peut effectuer tout d'abord une première étape de typage DQB, lequel permet, avec un nombre déterminé de sondes, d'identifier les principales spécificités HLA DQB.
Cette étape est souvent suffisante pour un grand nombre d'applications cliniques.
Toutefois, la présente invention permet également une deuxième étape du typage DQB qui, avec un nombre plus important de sondes, permet de reconnaître toutes les spécificités HLA DQB connues à ce jour.
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Dans la seconde partie B de la machine d'extrusion 1, on effectue au moins un pressage et une filtration pour récupérer le liquide encore contenu dans la matière sortant de la première partie A et dans la troisième partie C de ladite machine d'extrusion 1, on comprime et on extrude le résidu sec de la matière.
La teneur en liquide résiduel dans le résidu sec sortant de la machine d'extrusion est inférieure à 15%.
Les paramètres opératoires de mise en oeuvre de la machine d'extrusion 1 selon l'invention varient en fonction du type de la matière.
Ces paramètres déterminent l'efficacité de la séparation solide/liquide, c'est à dire l'efficacité de l'extraction du liquide.
Conrne paramètre, on peut retenir le débit d'alimentation de la matière, la configuration des vis, la vitesse de rotation des vis, la configuration de la filière, les surfaces filtrantes ménagées dans les fourreaux et la température des moyens de chauffage.
le débit d'alimentation de la matière influe sur le taux de remplissage des vis et ce débit est contrôlé, par exemple, par le doseur 5 pondérale ou volumétrique.
Par ailleurs, la configuration des vis détermine l'état de transformation de la matière et par conséquent les caractéristiques physiques et physico-chimiques du produit au cours des différentes phases de traitement.
En particulier dans les zones de pressage et de filtration, la configuration des mono-vis influe sur la dynamique de pressage et sur le taux de compression.
Ainsi, avec la rotation des vis, la configuration de ces vis fixe le taux de pressage qui est égal au rapport de la quantité de matière à presser contenue dans un pas de vis sur le temps nécessaire pour effectuer une rotation complète de ce pas.
La vitesse de rotation des vis détermine pour un débit donné, le temps de séjour de la matière au sein de la zone considérée qui contribue au conditionnement de cette matière à l'entrée de la zone de pressage et de filtration.
D'autre part, la configuration de la filière se transcrit par trois éléments, l'entrefer, l'insert et la conicité des pointes des mono-vis.
L'entrefer permet de créer une retenue de matière plus ou moins importante au niveau de la filière.
L'entrefer agit donc sur le temps de séjour de la matière et l'insert permet de recréer une retenue de matière en aval de cet entrefer.
Pour modifier 1 'écoulement de la matière à la sortie de la filière, il est possible de faire varier la conicité des pointes des mono-vis, le diamètre et/ou la longueur du canal d'évacuation de l'insert.
Cet élément permet donc d'agir sur le temps de séjour de la matière, mais aussi sur le temps de pressage de cette matière au sein de l'entrefer et sur son degré d'écrasement.
La conicité des pointes des mono-vis permet de modifier l'écoulement dans l'entrefer et de modifier la pression dans la filière.
Le protocole de typage utilise les sondes de capture indiquées ci-après et, selon les cas, les sondes de détection HRPI, HRP2 ou HRP3.
La méthode décrite permet de typer les 10 ADN testés. Quelques résultats de typage sont donnés ci-après à titre d'illustration.
Cas n" 1 Sondes DO x 1000 (492 nm) 26A 15 49A 12 57B 38 57C 12 37A 12 26B 100 26C 1309 26D 10 26F 18 70A 32 26E 55A 316 70B 12 23A 13 **** signifie : saturation Résultat : Le patient est DQB1*0201 ou 0202/0302 ou 0303 Cas n 2 Sondes DO x 1000 (492 nm) 26A 887 49A 12 57B 459 57C 11 37A 57 26B 80 26C 10 26D 14 26F 10 70A 14 26E 11 55A 11 70B 688 23A 302 Résultat : Le patient est DQB1*0502/0401 Tableau 1
I . . . . . .-f;i. , I ! I i i i I i ii o i i i i i i i i i $ i ! 7 i i i g Wi i iiii ~ fil i- ii 'o 20 30 III AGA GAC Ta i GAG GAT TTC GTG TAC CAG TTT AAG i TGC TAC | ACG GAG CGC GTG CGT. GTG A AGA CAC ATC TAT AAC CGA DQBI*0S02 -.------- 26A DQBI*0S031 w. s s S . O i i; É)GGÉÈ T o - ;I1 DQI'O5OII i a ~~~~ iX i 26B ZIZI C A --T -. T DQBi '0602 A 26C --T a -A--I----- DQAI'0003 A --T a -A -.
DQBI'O6O4 A - --T a --A DQSI'O6O.'I A -. T DQ9I'o6O. z z zz -. z |6 6 > 2 a 0 Z F F e > A Lw T le e s~ A -. 26D--T a -A - DQBI'06O A -. -- -T a -A -. 26A Xi i -. 2 B ~r i 0 Z | g E i " é i | i!iiiiiiiiiiiiii DQBI'030I -. C A - 26B -T TA DQBl'0302 - A- -Ta - - T -. - - 26C 21 ! i i ! ! i i i i .5 .: i I i i I I i i i I i i e; ; - A i I ; i i i T i -. .-- - DQBIO2 i i i i-. i, i i i i: i i i i i, i L! 1 t E i i Z ! i i i i ! . . i i i i i i, i " " W ! EJ . é g i i . ! i E i i é é R R R R R oe eo Fo o, > o, Fo o XoO o 2 2 R e R F F P F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F F iF g m m m m m m m m m m m m m m g g g g g g g g Tableau 1 - suite -
5 1 : 57A 5 O G GAG TAC y COC | OAC GTO 000 aTO C CaO , OTO AC CCG CAG CCT OTT Oc C T TOc AAC AOC CAO AAO O GTC ao i i: t t t i i i I t i . !: i i i I i l; i I DQBI.o3031 -- - -T -G AC DOS! *03032 - T --- 5?C DQBI*06OII G-. - -T --G - -AC - DQBI t i i i i i i i i i i i: J Iol 5 , F ~ i . t i t C AC | i - i | A t DOSIO2 C- -. -C - - A DOS!*0504 C- - - -G 57A - DOB!w)603 -C --C --G 57c --- DOB!*050 i ... i i t --- -- t t i t i I i DOI*05O9 . . G - 5?A DQSI*0201 AT -A -T z z g i CC ; 4 ! i w 9 y ti ; tt DOS!*0202 AT i CC i i --- ! i t t é DOB!*0304 CA -- - - 5A - --. c 5A DOBI*030I A 0 n -~~~~~ le v w w w v ; s DOBI*0302 ! ! i i } t i I t i i i DOBI*03032 -CA - T --- c : -.
DOBI*0303 C T -- c -- C- C - -.
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