INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
LSIMS, mode positif: m/z thioglycerol + NaCI, 363 (M+Na)+ ; thioglycerol + KF, 379 (M+K)+. 1H RMN (CDCl3) 6 7,51-7,33 (m, 5H, Ph), 5,52 (s, 1H, C6H5Ch), 4,45 (d, 1H, J = 9,8Hz, H-1), 3,64 (s, 3H, OCH3), 3,62 (s, 3H, OCH3), 2,78-2,68 (m, 2H, SCH2CH3), 1,31 (t, 3H, J =2,7Hz, SCH2CH3).
Anal. Calculée pour C17H24O5S (340,44): C, 59,98 ; H, 7,11; S, 9,42.
Trouvé : C, 59,91 ; H, 7,15 ; S, 8,96.
PREPARATION 54 2-(Triméthylsilyl)éthyl 4,6-O-benzylidène-2,3-di-O-méthyl-α-D-glucopy- ranoside (60).
On dissout le composé 59 (23,0 g, 67,5 mmol) et le 2 (triméthylsilyl)éthanol (19,4 ml, 135 mmol) dans un mélange d'éther éthylique et de dichlorométhane 2 : 1 (345 ml) et ajoute du tamis moléculaire 4 À (11 g). On laisse agiter 1 heure à 25 C, ajoute du N-iodosuccinimide (49,7 g, 220 mmol), puis, à 0 C, du triflate d'argent (2,20 g, 8,78 mmol). On laisse agiter pendant 20 minutes (CCM) puis ajoute de l'hydrogénocarbonate de sodium solide. On dilue avec du dichlorométhane, filtre sur Cérite, lave successivement avec une solution aqueuse 1M de thiosulfate de sodium, de l'eau, sèche et évapore à sec. On purifie sur une colonne de silice (cyclohexane/acétate d'éthyle 15:1 puis S :1) pour obtenir 60 ss (4,20 g, 15 %) et 60 a (8,40 g, 31 %).
composé 60a. [a]D + 96 (c = 0,4, dichlorométhane). ESIMS, mode positif : m/z, 419 (M+Na)+ ; 435 (M+K)+. 1H RMN (CDCl3) # 7,52-7,35 (m, 5H, Ph), 5,54 (s, 1H, C6H5CH), 4,98 (d, 1H, J = 3,7Hz, H-1), 3,64 (s, 3H, OCH3), 3,62 (s, 3H, OCH3), 1,24-0,96 (m, 2H, OCH2CHoSi(CH3)3), 0,00 (s, 9H, OCH2CH2Si(CH3)3) .
Anal. Calculée pour C20H3206S (396,56): C, 60,58 ; H, 8,13. Trouvé C, 60,26; H, 8,39.
PREPARATION 55 2-(Triméthylsilyl)éthyl 6-O-benzyl-2,3-di-O-méthyl-α-D-glucopyranoside (61).
Le fonctionnement du dispositif illustré sur la figure 1 et précédemment décrit est essentiellement le suivant.
La pompe électrique 30 débite à sa sortie un débit de carburant QK La consommation du moteur étant référencée Qxn, le débit de retour QR issu du régulateur 80 et dirigé vers le gicleur 42 est égal à QP Le débit à la sortie 47 de la pompe à jet 40 est égal à la somme du débit Ca aspiré dans le réservoir principal 10 par le conduit 52 et du débit injecté Q.
Enfin, le cas échéant, la réserve secondaire 20 débite par l'ouverture 23 prévue dans sa paroi supérieure 22 un débit de carburant égal à Ca+QR-CP.
On notera que la structure de puisage conforme à la présente invention munie d'un venturi vertical permet d'interdire la vidange du bol de réserve 20 sans dégrader les performances d'aspiration.
En effet, le corps 41 de la pompe à jet 40 étant disposé verticalement, celle-ci ne risque pas de vidanger la réserve secondaire 20 pour un niveau de carburant inférieur au bord libre de la sortie 47 de la pompe à jet.
En outre, le déflecteur 60 conforme à la présente invention permet de palier aux problèmes d'amorçage du venturi connus sur certaines pompes à jet classiques.
En effet, en pratique, on constate que dans certaines dispositions le jet seul d'une pompe à effet venturi n'est pas capable de créer une dépression suffisante dans le venturi pour permettre l'amorçage du col lorsque celui-ci est initialement vidangé (lorsque le niveau de carburant dans le réservoir principal est faible).
Au contraire, le déflecteur 60 conforme à la présente invention, possédant une cavité 61 placée en regard de la sortie 47 du venturi, permet de réfléchir, comme on l'a illustré sur la figure 2, le jet issu du gicleur, dans le venturi, pour faciliter la montée de carburant dans le corps 41 de la pompe jusqu'à l'entrée du tube mélangeur 46.
On notera que dans le cadre de la présente invention, il est important que la cavité centrale 61 du déflecteur soit coaxiale avec le gicleur 42, et plus précisément avec le jet issu de ce gicleur 42, ainsi que de préférence à la sortie 47 de la pompe à jet. En effet, si cette condition n'est pas respectée, l'efficacité du déflecteur 60 est pénalisée et il devient nécessaire d'augmenter sensiblement le débit retour QR pour atteindre les mêmes performances. En revanche, si ladite condition est respectée, le jet réfléchi sur la cavité centrale 61 du déflecteur 60 est renvoyé vers l'intérieur du tube venturi de la pompe à jet 40.
A titre d'exemple non limitatif, pour un gicleur 43 ayant un diamètre de sortie de 2mm, le diamètre de la cavité centrale 61 du déflecteur 60 est de l'ordre de Smm, cette cavité est parfaitement coaxiale à la sortie 47, et la distance, en projection verticale, entre le sommet de la sortie 47 de la pompe à jet et le bord inférieur de la nervure 63 défini entre les deux cavités 61, 62 est de l'ordre de 3mm. Une telle disposition conduit à un débit d'amorçage QR requis de l'ordre de 20e/h.
On a illustré sur la figure 2 une première phase de fonctionnement, correspondant à une phase d'amorçage, dans laquelle la cavité centrale 61 du déflecteur 60 retourne vers la chambre interne 44 de la pompe à jet 40, l'intégralité du carburant issue de la sortie 47.
On a illustré sur la figure 3 une phase ultérieure de fonctionnement, après amorçage, pour laquelle le carburant s'écoule vers l'extérieur, dans la réserve secondaire 20, par l'espace annulaire défini entre la sortie 47 de la pompe à jet 40 et le déflecteur 60. Au cours de cette phase, le carburant est dévié radialement vers l'extérieur par la seconde cavité annulaire 62, puis dévié vers le bas à la périphérie du déflecteur.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée au mode de réalisation particulier qui vient d'être décrit mais s'étend à toute variante conforme à son esprit.
Ainsi par exemple, l'entrée du conduit 52 qui communique avec l'entrée d'aspiration 50 de la pompe à jet 40 peut être munie d'un préfiltre.
PROCEDE DE SYNTHESE DE L'ACIDE MERCAPTO-3 PROPIONIQUE La présente invention concerne la préparation de l'acide mercapto-3-propionique (MPA), par addition de l'hydrogène sulfuré à l'acide acrylique (AA), selon la réaction (1) H2S + CH2 = CH-COOH o HS-CH2-CH2-COOH (1) Le MPA formé peut réagir sur l'AA présent dans le milieu réactionnel pour donner l'acide thio-3,3'dipropionique (TDPA) selon la réaction (2) HS-CH2-CH2-COOH + CH2 = CH-COOH o S(CH2-CH2-COOH)2 (2) Le brevet US 5 008 432 décrit 11 addition de H2S à des composés insaturés tels l'acrylate de méthyle ou l'acide acrylique.
Cette addition est réalisée en présence d'un catalyseur basique choisi parmi l'oxyde de magnésium et les résines échangeuses d'anions basiques. Ces résines sont choisies parmi celles ayant, comme groupe fonctionnel, des amines tertiaires ou des hydroxydes d'ammonium quaternaires.
Selon d'autres caractéristiques de l'invention - les moyens de basculement et de déplacement du tiroir sont formés, de chaque côté dudit tiroir, par une biellette articulée à l'une de ses extrémités sur le support fixe et comportant à son extrémité libre un pion coopérant avec une lumière sensiblement verticale ménagée à l'avant de la face latérale correspondante du tiroir, un organe élastique dont une extrémité est reliée au support fixe et dont l'autre extrémité est reliée audit pion et un galet monté libre en rotation à l'arrière de ladite face latérale et coopérant avec une lumière sensiblement horizontale ménagée dans le support fixe, - la lumière ménagée à l'avant de la face latérale correspondante du tiroir présente une courbure dirigée vers le fond dudit tiroir, - la lumière ménagée dans le support fixe présente une courbure dirigée vers le haut, - l'organe élastique est formé par un ressort, - la longueur de travail sous traction du ressort est inférieure à sa longueur d' extension maximale située sur une droite passant par le point d'articulation de ce ressort sur le support fixe et le point d'articulation de la biellette sur ledit support fixe.
L'invention sera mieux comprise à l'aide de la description qui va suivre, donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés, sur lesquels - la Fig. 1 est une vue schématique en perspective de la boîte à gants selon l'invention, en position d'ouverture, - la Fig. 2 est une vue schématique de côté de la boîte à gants selon l'invention en position fermée, - les Figs. 3 et 4 sont des vues schématiques montrant les deux positions d'ouverture de la boîte à gants selon l'invention.
Comme représenté sur les figures, la boîte à gants désignée dans son ensemble par la référence 1 se compose d'un tiroir 2 muni d'une façade 3 et délimitant un espace interne 4 de rangement.
Le tiroir 2 est disposé à l'intérieur d'un logement 5 ménagé dans un support fixe 6 constitué par exemple par un tableau de bord d'un véhicule automobile.
Le tiroir 2 comprend deux faces 7 latérales et opposées et un fond 8.
La boîte à gants 1 comporte des moyens de basculement du tiroir 2 et du couvercle 3 entre une position de fermeture (Fig. 2) et une position d'ouverture partielle (Fig. 3) et de déplacement en translation sensiblement horizontalement dudit tiroir 2 et dudit couvercle 3 entre une position d'ouverture partielle et une position d'ouverture totale (Fig. 4) dégageant l'espace interne 4 de dérangement.
Les moyens de basculement et de déplacement du tiroir 2 sont constitués par deux mécanismes identiques disposés chacun d'un côté dudit tiroir 2.
Comme représenté sur les Figs. 1 et 2, ces moyens de basculement et de déplacement du tiroir 2 sont formés, tout d'abord, par une biellette 10 articulée à l'une 10a de ses extrémités sur le support fixe 6 et comportant à son extrémité libre lOb un pion 11 coopérant avec une lumière 12 sensiblement verticale ménagée à l'avant de la face latérale 7 correspondante du tiroir 2.
La lumière 12 présente une courbure dirigée vers le fond du tiroir 2.
Par ailleurs, les moyens de basculement et de déplacement du tiroir 2 comprennent, d'une part, un organe élastique 13 dont une extrémité 13a est reliée au support fixe 6 et dont l'extrémité 13b est reliée au pion 11 et, d'autre part, un galet 14 monté libre en rotation à l'arrière de la face latérale 7 correspondante et coopérant avec une lumière 15 sensiblement horizontale ménagée sur le support fixe 6.
La lumière 15 présente une courbure dirigée vers le haut.
De préférence, l'organe élastique 13 est formé par un ressort.
Ainsi que représenté sur la Fig. 2, la longueur de travail Lt sous traction du ressort 13 est inférieure à sa longueur d'extension maximale Le située sur une droite D passant par le point d'articulation 13a de ce ressort 13 sur le support fixe 6 et le point d'articulation 10a de la biellette 10 sur ledit support fixe 6.
Pour ouvrir la boîte à gants 1, le passager déverrouille cette boîte à gants 1 ce qui provoque un mouvement de rotation par effet de gravité du tiroir 2.
Ce mouvement de rotation est centré sur l'axe du galet 14 et le tiroir 2 est maintenu en position d'ouverture partielle, comme représentée à la Fig. 3, par le pion 11 qui est en butée au fond de la lumière 12 sous l'effet de la traction exercée par le ressort 13 sur la biellette 10.
Le mouvement de rotation du tiroir 2 est interrompu lorsque la lumière 12 ménagée sur la face latérale 7 correspondante dudit tiroir 2 vient en butée sur le pion 11 de la biellette 10.
Les extrémités du ruban conducteur 8 sont solidaires respectivement de connecteurs 86 et 87 ; ces connecteurs ont une orientation axiale, I'un, le connecteur 86, étant dirigé vers le haut et l'autre, le connecteur 87, étant dirigé vers le bas ; le connecteur 86 est adapté à traverser une cheminée 61 axiale que comporte en saillie le couvercle 6 et qui s'étend à partir de la face supérieure de celui-ci ; ainsi, le connecteur 86, lorsqu'il est mis en place dans la cheminée 61, est solidaire en rotation de celle-ci ; la cheminée 61 est l'organe par lequel le contacteur tournant est entraîné en rotation par le volant du véhicule.
Le moyeu 2, doté d'un manchon 23, est monté tourillonnant sur le boîtier 7 à la faveur d'une portée cylindrique 21 qu'il présente et qui est adaptée à coopérer avec le bord du trou central 70 du boîtier 7. Un rebord transversal 22 borde la portée cylindrique 21 et constitue pour le moyeu 2 une butée axiale en coopération avec la face extérieure du fond 74 du boîtier 7.
Le manchon 23 du moyeu 2 est muni de deux échancrures longitudinales 24 destinées à recevoir des tétons d'entraînement 62 prévus sur la face interne d'une jupe 63 que porte le flasque annulaire 64 du couvercle 6.
Sur sa face opposée à celle qui porte la cheminée 61 ; la jupe 63 est fendue en 65 pour le passage de l'extrémité pliée 81 du ruban 8 pour sa liaison au connecteur 86.
En bout du manchon 23 du moyeu 2 est prévu un retour 25 à section triangulaire pour l'accrochage par ce retour 25 du bord supérieur de la jupe 63 du couvercle 6.
Ainsi, lorsque le connecteur tournant est assemblé, le moyeu 2 et le couvercle 6 sont attelés axialement et en rotation.
Le rotor 5 est globalement en forme d'anneau et comporte une jupe périphérique annulaire 52 d'orientation axiale raccordée par l'une de ses branches (sa branche inférieure - figures 2, 3 ou 7) à un flasque transversal 54. Ce flasque 54 porte d'un seul tenant en saillie axiale dans sa partie inférieure, du côté opposé à sa jupe 52, un pivot 53 destiné à recevoir le pignon 4.
On notera que l'extrémité libre de la jupe 63 du couvercle 6 permet un montage rotatif du rotor 5 par coopération, avec ladite extrémité libre, du bord intérieur de l'ouverture centrale 56 du flasque 54 du rotor 5, en sorte qu'un espace existe entre la jupe 63 et l'alésage interne de la jupe 52 pour logement du ruban et enroulement de celui-ci autour de la jupe 63.
La jupe 52 est fendue en 51 pour passage du ruban 8, la profondeur de la fente 51 étant fonction de la hauteur du ruban 8.
L'un des pans délimitant la fente 51 est arrondi en 55 pour permettre le retournement du ruban 8 sans blesser celui-ci de manière décrite ci-après.
L'arrondi s'étend entre la jupe 52 et la jupe 63.
On notera que le moyeu 2 présente également en saillie à sa périphérie externe une denture 20 formée à la faveur d'une surépaisseur que présente le moyeu à sa périphérie externe au niveau de son flasque.
Ainsi, le train d'engrenages épicycloïdal comporte ici les dentures 40, 20 et le pignon 4 monté rotatif sur le pion 53 de forme cylindrique et formant ainsi un tourillon solidaire du rotor 5.
Le pignon 4 entraîne à rotation le rotor 5 pas à pas en coopération avec la denture menante 20 du moyeu 2 et la denture fixe 40 du boîtier 7.
La conjugaison des trois éléments 40, 20, 4 forme un train d'engrenages épicycloidal ayant un rapport multiplicateur permettant d'avoir un ruban de faible longueur.
Ainsi qu'on l'aura compris, le nombre de dents de la denture 20 du moyeu 2 est défini pour obtenir le rapport multiplicateur adapté aux dimensions du contacteur tournant, en sorte que la denture 20 peut être ou non continue.
On observe également que la perméabilité à l'eau et aux gaz des bétons des essais 1 et 2 est réduite par rapport à celles des essais comparatifs 1 et 2, ce qui conduit à une plus grande durabilité par résistance à la carbonatation, aux attaques par les eaux agressives, En outre, l'adhérence du béton sur un support est améliorée du fait de la présence de la suspension de silice et du latex, ainsi que la résistance à l'abrasion (diminution du poussiérage).
On observe également une diminution du nombre de fissures due à une amélioration de la rétention d'eau.
Exemple d'application 2 : Réalisation d'une composition cimentaire à teneur en eau élevée (ou coulis) Cet exemple vise à mettre en évidence l'effet de synergie produit par la suspension de silice et le latex sur les propriétés rhéologiques et de stabilité de pâtes cimentaires à teneur en eau élevée.
Une première série d'essais non conformes à l'invention est réalisée, montrant que la silice ou le latex seuls ne résolvent pas les problèmes posés par ces coulis, que l'on compare à deux essais selon l'invention.
Essai comparatif 1 On prépare un coulis comprenant une suspension de silice préparée de la même manière que dans l'exemple de préparation A, mais sans ajouter de latex.
Il répond à la formule suivante - ciment HTS 100 g - fluidifiant (Melmentplast N40) 2,5 g * - retardateur de prise 0,8 g * (Melretard) - suspension aqueuse de silice à 23 8 d'extrait sec 5 g - eau 24 g * commercialisés par CIA Le rapport eau/ciment est donc de 0,28.
Dans un bécher agité par une pale on introduit l'eau, le fluidifiant et le retardateur, puis l'on ajoute sous agitation le ciment pendant 3 minutes. La suspension de silice est alors introduite sous agitation que l'on poursuit pendant 10 minutes.
Essai comparatif 2 On prépare de la même façon un coulis similaire où le rapport eau/ciment est de 0,35.
Essai comparatif 3 On prépare un coulis répondant à la formule suivante - ciment HTS 100 g - fluidifiant (Melmentplast) 2,5 g - retardateur (Melretard) 0,8 g - latex styrène-butadiène en suspension aqueuse à 50 % (SB 112) 5g - eau 25 g Le rapport eau/ciment est donc de 0,28. La préparation est analogue à l'essai comparatif 1, le latex étant introduit en lieu et place de la suspension de silice.
Essai 1 Selon l'invention, on prépare un coulis répondant à la formule - ciment HTS 100 g - fluidifiant (Melmentplast) 2,5 g - retardateur (Melretard) 0,8 g - suspension aqueuse de l'exemple A 9,6 g soit : silice (poids sec ) : 1 g latex (poids sec) : 2,5 g - eau 22 g Le rapport eau/ciment est de 0,28. La préparation est analogue à celle des essais comparatifs.
Essai 2 On prépare un coulis analogue à celui de l'essai 1 où la teneur en eau est ajustée pour obtenir un rapport eau/ciment de 0,35.
Ces cinq compositions sont soumises aux mesures rhéologiques suivantes effectuées sur un appareil RHEOMAT 115 équipé d'une cellule MS DIN 145. On soumet le coulis à un cisaillement croissant de O à 1000 s-l en 1 minute, puis à un cisaillement constant de 1000 s-' pendant 1 minute, et l'on fait décroître le cisaillement jusqu'à O s-l en 1 minute, tout en mesurant sa viscosité.
On relève la viscosité finale.
L'aptitude à la ségrégation et au ressuage est évaluée - en mode statique : on observe l'aspect d'une éprouvette remplie de 200 ml de coulis, sur une durée de 24 heures; - en mode dynamique sous pression : on dispose une quantité donnée de coulis dans un filtre API au-dessus duquel on impose une pression d'air de 7.105 Pa ; on mesure la quantité d'eau expulsée de la pâte et l'on mesure après dessication à 160 C l'extrait sec de la partie supérieure (côté air) et de la partie inférieure (côté filtre) du gâteau de filtration obtenu.
L'extrait sec du prélèvement inférieur ou supérieur du gâteau est défini par la formule masse totale du prélèvement - masse d'eau du prélèvement extrait sec = x 100 masse totale du prélèvement Un écart entre les deux valeurs est indicatif d'un gâteau hétérogène, un extrait sec inférieur plus élevé que l'extrait sec supérieur signifiant une ségrégation.
Les résultats sont exprimés par les valeurs suivantes - le pourcentage d'eau recueillie par filtration quantité d'eau recueillie Er = ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ x 100 quantité de coulis initiale - la teneur en eau du gâteau après filtration eau initiale - eau recueillie par filtration Tf = ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ x 100 masse du gâteau filtré par rapport à la teneur en eau initiale du coulis Ti avec eau initiale Ti = ~~~~~~~~~~~~~~~~~~~ x 100 masse du gâteau initial Les résultats sont rassemblés dans le Tableau 2 ci-dessous.
La souche de Ml est Ml 8064 (XN collection) et celle de Nc, Nc 32165 (XN collection).
Techniques de génétique moléculaire Sauf indication contraire, les techniques et réactifs utilisés correspondent à ceux recommandés par Sambrook et al (Sambrook et al 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Les oligodésoxynucléotides utilisés dans cette étude sont les suivants RBaml2, GATCCTCGGTGA; RBam24, AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGAG; JBam12, GATCCGTTCATG; JBAM24, ACCGACGTCGACTATCCATGAACG; REcol2, AATTCTCGGTGA; REco24, AGCACTCTCCAGCCTCTCACCGAG; JEcol2, AATTCGTTCATG; JEco24, ACCGACGTCGACTATCCATGAACG; NEcol2, AATTCTCCCTCG; NEco24, AGGCAACTGTGCTATCCGAGGGAG.
Transferts sur membranes (Southern blots) Les transferts sur membranes ont été réalisés par transferts capillaires sur des membranes en nylon chargées positivement (Boehringer Mannheim). Les hybridations ont été réalisées à 650C dans une solution comprenant NaPi 0,5M pH7,2/EDTA lmM/SDS 7%/ BSA 1%. Les lavages des membranes ont été réalisées dans une solution comprenant NaPi 40mM pH7,2/EDTA lmM/SDS 1%. Le lavage final a été réalisé à 650C pendant 5 min.
La sonde frp, obtenue avec des oligonucléotides basés sur la séquence de frpA correspond à 2,4 kb de l'extrémité 5' du gène de la souche Z2491. Les sondes opc et rotamase correspondant aux gènes entiers sont produites à partir de la souche Z2491 en utilisant des oligonucléotides réalisés sur la base de séquences publiées. Les sondes pilC1 et ppk (polyphosphate kinase) correspondent aux inserts des plasmides pJL1 et pBluePPK6001, respectivement.
Exemple 1 : Réalisation de banques d'ADN présents chez Nm et absents chez Ng. a. Banque "MboI" Réalisation - L'ADN de Nm Z2491 a été clivé par l'endonucléase MboI et soumis à deux itérations d'une méthode, appelée ci-après CDA (Comprehensive Difference Analysis). Cette méthode comprend une hybridation soustractive en présence d'un excès d'ADN cisaillé de Ng MSll et une amplification par PCR de celles des séquences méningococciques qui, étant absentes de ou ne présentant pas d'homologie significative avec l'ADN de Ng MSîl, pouvaient se ré-anneler.
L'ADN chromosomique de la souche Ng MSll est cisaillé de manière aléatoire par passages répétés à travers une seringue hypodermique jusqu a obtention de fragments dont la taille s'échelonne de 3 à 10 kb. Ces fragments d'ADN sont purifiés par extraction phénolique.
L'ADN chromosomique de la souche Nm Z2491 est, quant à lui, clivé par l'endonucléase de restriction MboI. Ces fragments d'ADN (20 ug) sont ligaturés à 10 nmoles des oligonucléotides annelés RBaml2 et RBam24. Les amorces en excès sont éliminées par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2% à bas point de fusion. La partie du gel contenant des fragments amplifiés de taille supérieure à 200 pb est excisée et digérée par la 13-agarase. Ces fragments sont purifiés par extraction phénolique.
Afin de réaliser une hybridation soustractive (première itération), 0,2 ug dlADN Nm, ligaturé aux oligonucléotides RBam, est mélangé à 40 ug d'ADN Ng dans un volume total de 8 ml d'un tampon EE 3X (un tampon EE 1X est composé de N-(2-hydroxyéthyl) pipérazine-N'-(acide sulphonique propane 3) 10 mM et d'EDTA 1 mM, son pH est de 8.0). Cette solution est recouverte d'huile minérale et llADN est dénaturé par chauffage à 1000C pendant 2 min. 2 ul de NaCl 5M sont ajoutés et on laisse le mélange s'hybrider à 55"C pendant 48h. Le mélange réactionnel est dilué à 1/10 dans une solution préchauffée composée de NaCl et de tampon EE, puis immédiatement placé sur de la glace.
10 ul de cette dilution sont ajoutés à 400 ul de mélange réactionnel pour PCR (Tris.HCl pH9.0 10mM; KCl 50 mM; MgCl2 1,5 mM; Triton X100 0,1 %; 0,25 mM de chacun des quatre désoxynucléotides triphosphate ; Taq polymérase 50 unités par ml) . Le mélange est incubé pendant 3 min à 70"C pour compléter les extrémités des fragments ré-annelés d'ADN méningococciques.
Après dénaturation à 94"C pendant 5 min et addition de l'oligonucléotide RBam24 à raison de 0,1 nmole par 100 ul, les hydridations sont amplifiées par PCR (30 cycles de 1 min à 940C, 1 min à 700C et 3 min à 720C suivis par 1 min à 940C et 10 min à 720C; Perkin-Elmer GeneAmp 9600).
Les fragments méningococciques amplifiés sont séparés sur gel des amorces et des ADN gonococciques de hauts poids moléculaires. Ils sont digérés par MboI et de nouveaux oligonucléotides JBaml2 et JBam24 leur sont ligaturés. Ces ADN ligaturés sont à nouveau purifiés sur gel et extraits au phénol.
Une seconde itération d'hybridation soustractive est réalisée sur 40 ug dlADN Ng cisaillé de manière aléatoire et 25 ng dlADN ligaturé aux oligonucléotides JBam tel qu'obtenu à l'issue de la première itération d'hybridation soustractive. Lors de cette seconde itération, l'amplification de llADN Nm auto-annelé est réalisée à l'aide de lloligonucléotide Jbam24.