INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
5D.6 et 7 forment la structure du support mobile comme sur le dés -sin 1 " VUE DE COTE EN COUPE ". Le fonctionnement de cet ensemble mobile est éxpliqué sur le déssin 1-3 par les figures 1 et 2. La structure érigée en édifice est superposée sur les éléments 1.1A.
6 et 7. La mobilité de 1.1A.6 et 7 gère la charge des sollicitations longitudinales et transversales.
Selon le déssin O " VUE D'ENSEi1BlE ", l'assemblage des éléments 1.1A.6.7.2.2A.5A.53.5C et 5D reçoivent une poussée de charge du haut vers la base dans le sens vertical de l'attraction terrèstre.
Il supporte la charge sans compréssion verticale. Il s'agit du pil -ier-pivot à rotules.
Selon le déssin 1-2 " DssIODLATION EN SIORTISSEDjEIfT ", la modific -ation permettant la modulation en amortissement ne fait subir au -cune transformation aux éléments 1.1A.6.7.2.2A. L'ordre d'assemb -lage reprend celui du pilier-pivot à rotules. Dans la gorge 8.8A.
( partie hachurée ) on remarque le montage supplémentaire d'un mécanisme-ressort constituant la modulation en amortissement. La figure 3 du déssin 1-3 représente la cinématique du mouvement. La particularité se situe dans la longueur des mécanismes-ressorts.
Ils sont supérieurs à ceux du pilier-pivot à rotules. Le disposit -if du déssin 1-2 se positionne perpendiculairement à la base dont le r81e consiste à faire la complémentarité dans les effets des poussées longitudinales et transversales. Il maintient par compré -ssion pour certains et étirement pour les autres l'équilibre de la charge rapportée en édifice. La modulation en amortissement gère en position horizontale les trois dimensions. Le pilier-pivot à rotul -es gère en position verticale deux dimensions.
les dispositifs 1 et 1A sont des cales intèrmédiaires en parties égales entre la structure rapportée en édifice et le dispositif mobile 2.2A.6.7.5A.5B.5C et 5D. les cales intermédiaires ont la même fonction pour le pilier-pivot à rotules que pour la modulati -on en amortissement sans subir de quelconques modifications. Les éléments 1 et 1A sont symétriques et formés d'une demi-sphère con -cave chacune. Elles sont perforées comme sur le déssin 1 " VUE DE COTE EN COUPE " 3 et 3A. le serrage du dispositif 1 et 1A est réa -lisé par un système traditionnel vis-boulons.Le rapprochement de 1 et 1A permet d'enserrer la demi-sphère du dispositif 7 et bloqu -er la structure mobile 2.2A.6.7.5A.5B.5C et 5D entre la base et la structure superposée en édifice comme sur les déssins O et 1.
L'invention se rapporte également à l'utilisation de ce type de lignée cellulaire pour produire des adénovirus selon l'invention ou des AAVs.
La présente invention a également pour objet un procédé de préparation d'adénovirus comportant au moins un de leurs gènes dont l'expression est sous contrôle d'un promoteur inductible par la tétracycline.
Une première méthode consiste à transfecter l'ADN du virus recombinant défectif préparé in vitro (soit par ligature, soit sous forme de plasmide) dans une lignée cellulaire compétente, c'est-à-dire portant en trans toutes les fonctions nécessaires à la complémentation du virus, et un activateur de transcription. Ces fonctions sont préférentiellement intégrées dans le génome de la cellule, ce qui permet d'éviter les risques de recombinaison, et confère une stabilité accrue à la lignée cellulaire.
Ensuite, les vecteurs qui se sont multipliés en présence d'une quantité suffisante en tétracycline ou l'un de ses analogues, sont récupérés, purifiés et amplifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire.
Selon une variante de mise en oeuvre, il est possible de préparer in vitro, soit par ligature, soit sous forme de plasmide, 1'ADN du virus recombinant défectif portant les délétions appropriées, un ou plusieurs gènes viraux sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline et un ou des gènes thérapeutiques. Les suppressions sont généralement réalisées sur l'ADN du virus recombinant défectif, par mise en oeuvre de digestions au moyen d'enzymes de restriction appropriées, puis ligatures, selon les techniques de biologie moléculaire, ainsi qu'illustré dans les exemples. Les gènes viraux ou thérapeutiques et le promoteur inductible peuvent ensuite être insérés dans cet ADN par clivage enzymatique puis ligature, au niveau des régions sélectionnées et dans l'orientation choisie.L'ADN ainsi obtenu, qui porte donc les délétions appropriées, un ou plusieurs gènes viraux sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline et un ou des gènes thérapeutiques permet de générer directement l'adénovirus recombinant revendiqué.
Il est également possible de préparer le virus recombinant en étapes successives, permettant l'introduction successive des gènes hétérologues et du promoteur inductible. Ainsi, I'ADN d'un premier virus recombinant portant les délétions appropriées (ou une partie desdites délétions) et un promoteur inductible comme par exemple Op2/Tk est construit, par ligature ou sous forme de plasmide. Cet ADN est ensuite utilisé pour générer un premier virus recombinant portant lesdites délétions avec un promoteur inductible. L'ADN de ce premier virus est ensuite isolé et co-transfecté avec un second plasmide ou l'ADN d'un second virus recombinant défectif portant les délétions appropriées notamment une délétion dans la région El, une région permettant la recombinaison homologue et le cas échéant, un gène thérapeutique. Cette deuxième étape génère ainsi le virus recombinant selon l'invention.
La présente invention concerne également toute composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants tels que décrits précédemment.
Les compositions pharmaceutiques de l'invention peuvent être formulées en vue d'une administration par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc.
Les doses de virus utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée, du gène à exprimer, ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à toto pfu/ml. Le terme pfii ("plaque forming unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, et mesure, généralement après 5 jours, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Les adénovirus de l'invention peuvent être utilisés pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies. Ils sont particulièrement avantageux pour le traitement des pathologies hyperprolifératives (cancers, resténose, etc), par injection directe au niveau du site concerné. A cet égard, la présente invention concerne également une méthode pour la destruction de cellules prolifératives comprenant l'infection desdites cellules ou d'une partie d'entre-elles avec un vecteur adénoviral tel que défini ci-dessus. Dans le cas où le gène suicide est un gène conférant une sensibilité à un agent thérapeutique, la méthode de destruction selon l'invention comprend ensuite le traitement des cellules par ledit agent thérapeutique.Pour la mise en oeuvre de cette méthode, I'invention a également pour objet les produits comprenant un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant dans lequel le gène suicide est un gène conférant une sensibilité à un agent thérapeutique; et ledit agent thérapeutique, comme produit de combinaison pour une utilisation simultannée, séparée ou étalée dans le temps pour le traitement des pathologies hyperprolifératives.
Plus particulièrement, le gène suicide est un gène thymidine kinase et l'agent thérapeutique est le gancyclovir ou l'acyclovir ou un analogue.
Des vecteurs recombinants selon l'invention possédent des propriétés particulièrement attractives pour une utilisation en thérapie génique. Ces vecteurs combinent en effet des propriétés d'infection, de sécurité et de capacité de transfert de gènes très élevées.
La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples et figures qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Figure 1: Organisation génétique de l'adénovirus Ad5. La séquence complète de l'Ad5 est disponible sur base de données et permet à l'homme du métier de sélectionner ou de créer tout site de restriction, et ainsi d'isoler toute région du génome.
Le monomère diacide hydroxylé (HA) présente au moins un groupe hydroxyle fixé sur un ou plusieurs cycles aromatiques, lorsqu'il s'agit d'un monomère aromatique, ou sur la chaîne aliphatique, lorsqu'il s'agit d'un monomère aliphatique.
Parmi les monomères diacides hydroxylés (HA) on peut citer les acides ou anhydrides hydroxy-5 isophtalique, hydroxy4 isophtalique, hydroxy-4 phtalique, hydroxy-2 méthylsuccinique, hydroxyméthylglutarique, hydroxyglutarique ..., ou leurs diesters inférieurs (de méthyle, éthyle, propyle1 isopropyle, butyle).
Le monomère polyol (P) préférentiellement mis en oeuvre est le monoéthylène glycol etlou le glycérol.
Lesdits polyesters sulfonés hydrosolubles etlou hydrodispersables peuvent être obtenus par les procédés usuels d'esterification etlou transestérificaton et polycondensation, par exemple par réaction d'estérification etlcu transestèriilcaion , en présence d'un catalyseur d'estérification / transestérification, du monomère polyol (P) avec les différents monomères diacides, chaque diacide étant sous la forme acide, anhydride ou sous la forme d'un de ses diesters, et polycondensation des esters de polyols à pression réduite, en présence d'un catalyseur de polycondensation.
Selon un mode préférentiel de préparation, lesdits polyesters sulfonés hydrosolulees etlou hydrodispersables sont obtenus en réalisant les étapes successives suivantes: - une étape de transestérification (interéchange) entre d'une part le monornère diacide sulfoné (SA), sous forme de diester, et de 50 à 100s6 molaire, tout particulièrement de 30 à 90% molaire de la quantité totale du monomère diacide non sulfoné (A), sous forme de diester, et d'autre part une quantité de monomère polyol (P) correspondant à un rapport nombre de fonctions OH du monomère polyol (P) / nombre d'équivalents fonctions COOH desdits monomères (A) et (SA) sous forme diesters de rordre de 1,05 à 4, de préférence de l'ordre de 1,1 à 3,5, et tout particulièrement de rordre de 1,8 à 3,0 - une étape éventuelle d'estérification entre l'éventuelle quantité restante du monomère diacide non sulfoné (A), sous forme diacide ou anhydride, et une quantité de monomère polyol (P), correspondant à un rapport nombre de fonctions OH du monomère polyol (P) I nombre de fonctions COOH du monomère diacide non sulfoné (A) sous forme diacide ou anhydridede l'ordre de 1,05 à 4, de préférence de rordre de 1,1 à 3,5, et tout particulièrement de l'ordre de 1,8 à 3,0 - une étape de polycondensation.
Les d'esters des acides dicarboxyliques non sulfonés (A) et sulfonés (SA) mis en oeuvre à rétape de transesterification (interéchange) sont de préférence des d'esters méthyliques.
L'étape d'interéchange est effectuée à une température supérieure ou égale à 130"C, de préférence de l'ordre 140 à 220"C et tout particulièrement de rordre de 180 à 220"C ; à cette température le méthanol (cas préférentiel des diesters méthyliques) formé est éliminé du milieu réactionnel de préférence par distillation. Cette opération drinteréchange est de préférence réalisée en présence d'un catalysez de transestérification métallique, notamment d'un carboxylate métallique, tel que acétate de manganèse, racétate de zinc, I'acétate de cobalt ou l'acétate de calcium, ou drun titanate organique ou minéral, tel que le titanate de butyle, le titanate de nitriio-2,2",2"- triéthyle (ou aminotriéthanolate de titane) ou le titanate de calcium. Les catalyseurs préférés sont les titanates organiques ; ils sont mis en oeuvre en quantités de l'ordre d'au moins 0,001% en poids exprimé en titane, de préférence de rordre de 0,002% à 0,02% en poids de titane par rapport au poids de réactifs présents.
La durée de l'opération d'interéchange est de 1 à 4 heures ; elle est généralement de rordre de 2 à 3 heures.
Lorsque plus de 90% de la quantité théorique de méthanol a été distillée, le polyol excédentaire est éliminé en portant la température du milieu réactionnel à 230"C.
L'opération d' estérification est réalisée par ajout dans le milieu réactionnel, de le fraction restante du monomère diacide non sulfoné (A), sous forme d'acide, et de la fraction restante du monomère polyol (P), préalablement mis en suspension, à une température correspondant à celle de la fin de la température d'interéchange ; la période d'introduction est de l'ordre de 1 heure.
Cette opération d'estérification est réalisée à une température de rordre de 230 à 280"C, de préférence de l'ordre de 250 à 260"C, en présence d'un catalyseur du meme type que celui de transestérification; les catalyseurs préférés sont les titanates organiques; ils sont mis en oeuvre en quantités de l'ordre d'au moins 0,001% en poids exprimé en titane, de préférence de l'ordre de 0,002% à 0,02% en poids de titane par rapport au poids de réactifs introduits à l'étape d'estérification ; la réaction s'effectue avec élimination d'eau qui est soutirée du réacteur en même temps que le polyol en excès.
L'opération de polycondensation est de préférence réalisée à une température de lordre de 230 à 280"C, de préférence de l'ordre de 240 à 260 C, dans un autre réacteur préalablement porté à cette température et progressivement mis sous vide jusqu'à une pression qui peut aller jusqu'à 10 Pa ; une réduction de pression jusqu'à 10 millibar environ dure de l'ordre de 40 minutes.
L'opération de polycondensation se déroule avec élimination de molécules de polyol, cette opération est stoppée lorsque le couple moteur de rarbre d'agitation indique une valeur équivalente à environ 0,5 à 5 mètres.newton pour une température de 250"C de la masse réactionnelle et une vitesse d'agitation de 80 tours / minute d'un mobile en forme d'ancre dans un réacteur de 7,5 litres ; le couplemètre utilisé est de type KYOWA, dont la gamme de mesure est comprise entre 0 et 100 mètres.newton .
Le vide est ensuite cassé à l'azote, et le polymère est coulé dans une lingotière; après refroidissement, le polymère est broyé.
Les polyesters sulfonés préférentiels sont susceptibles d'être obtenus à partir - d'acide téréphtalique (au), sous forme de diester (de préférence de méthyle), et d'acide isophtalique (A2) sous forme de diacide ou d'anhydride, ou d'acide téréphtalique (Al) sous forme de diester (de préférence de méthyle), et drun acide téréphtalique hydroxylé ou isophtalique hydroxylé (HA), sous forme de diacide ou d'anhydride, éventuellement en mélange avec de acide isophtalique (A2), sous forme de diacide ou d'anhydride, selon un rapport molaire (A1)/CA1)+CA2), (A1)I(A1)+(HA) ou (Ai )I(A1 )+(HA)+(A2) de l'ordre de 100/100 à 50/100, de préférence de rordre de 90/100 à 70/100 [en tant que monomère (A) ou monomères (A) et (HA)] - d'acide sulfoisophtalique, sous forme de diester (de préférence de méthyle [en tant que monomère (SA)] - de monoéthylène glycol et/ou de glycérol [en tant que monomère polyol (P)1 lls peuvent être préparés selon le procédé préférentiel ci dessus décrit, par réalisation des étapes successives suivantes: - une étape de transestérification (interéchange) entre d'une part le diester (de préférence de méthyle) de l'acide téréphtalique (Al) et le diester (de préférence de méthyle) de racide sulfoisophtalique (SA) et d'autre part du monoéthylène glycol etlou du glycérol (P), le rapport nombre de fonctions OH de (P) / nombre d'équivalents fonctions COOH de (A1)+(SA) étant de l'ordre de 1,05 à 4, de préférence de rordre de 1,1 à 3,5, et tout particulièrement de l'ordre de 1,8 à 3 - une étape d'estérification entre l'acide isophtalique (A2) et/ou l'acide hydroxy iso- ou tere-phtalique (HA) et d'autre part du monoéthylène glycol et/ou du glycérol (P), le rapport nombre de fonctions OH de (P) / nombre de fonctions COOH de (A2) +/ou (HA) étant de l'ordre de 1,05 à 4, de préférence de rordre de 1,1 à 3,5, et tout particulièrement de l'ordre de 1,8 à 3 - une étape de polycondensation.
Les polyesters sulfonés faisant l'objet de rinvention, sont tout particulièrement intéressant comme agents anti-salissures etlou anti-redéposWon et éventuellement détergents dans des compositions détergentes, dans des compositions de rinçage, d'adoucissage ou de traitement antissalissure (wfinishing"), pour le lavage avec ou sans prétraitement, le rinçage, I'adoucissage ou le traitement antisalissure de textiles, notamment à base de polyesters.
Ceci est schématiquement illustré par la figure 3 sur laquelle les flèches représentent les correspondances établies entre les billes d'une image à l'autre.
On numérote ces billes sur les images successives en gardant le même numéro pour la même bille dont on peut suivre la position d'une image à l'autre.
Pour suivre une bille d'une image à l'autre, on procède de la manière suivante.
Pour une bille donnée dans une image donnée, l'utilisation des contraintes épipolaires fournit un certain nombre de billes susceptibles d'être appariées avec la bille considérée.
On sélectionne une bille parmi celles-ci en faisant appel aux autres images de la séquence.
On est par exemple capable de suivre une bille numérotée B1 sur les images I1 à I3, une autre bille numérotée B2 sur ces images I1 à I3 ainsi qu'une autre bille numérotée B3 sur ces mêmes images.
On peut également suivre, mais seulement sur les images I3 et I4, une bille à laquelle on donne le numéro B4.
On voit également sur l'image I1 une bille référencée B que l'on ne retrouve sur aucune autre image.
En conséquence, on n'utilise pas cette bille B.
On obtient donc une liste des billes mais il est à noter qu'on a peut-être plus de billes dans cette liste qu'en réalité car la même bille peut être référencée sous plusieurs numéros différents.
Au moyen de cette liste, on détermine la position (trois coordonnées) par rapport au repère R de la figure 1 de chacune des billes du fantôme flexible.
Plus précisément, on détermine la position approximative moyenne, en trois dimensions, d'une bille à l'aide d'un ensemble de vues successives où l'on a pu suivre l'image de cette bille.
Cette détermination, réalisée par une méthode connue, est schématiquement illustrée par la figure 4 sur laquelle on voit trois positions successives F1, F2 et F3 du foyer de la source S de la figure 1 et les positions successives correspondantes D1, D2 et D3 du détecteur D, conduisant à des images sur lesquelles on a pu suivre l'image d'une bille b.
Les projections de cette bille b sur le détecteur portent les références successives bl, b2 et b3.
La figure 5 illustre schématiquement la reprojection d'une bille à partir d'une position approximative de celle-ci.
Plus précisément, on voit sur la figure 5, pour l'image numéro j, la projection Pij de cette bille dont la position réelle dans l'espace porte la référence Bi et a les coordonnées xi, yi et z1 dans le repère R.
Cette vanne 7 peut, comme dans l'exemple précédent, être intégrée dans le circuit de gaz 2 d'un moteur à combustion interne 3.
La vanne 7 comporte comme précédemment une tête de commande 10 qui est fixée au moyen d'une bague sertissable 30 sur un corps de vanne 20, le corps de vanne 20 étant luimême fixé à une conduite 50 au moyen d'une bague sertissable supplémentaire 40.
La tête de commande 10 est similaire à celle déjà décrite en regard de la figure 2, et ne sera donc pas décrite à nouveau en détail ici, cette tête de commande comportant comme précédemment une enceinte rigide 14 qui délimite une chambre 17 communiquant avec des moyens d'aspiration 17b, une membrane souple 18, un ressort 19, une tige de commande 12 dotée d'une plaque d'appui 12b pour le ressort 19, un organe d'obturation 11 et une pièce de guidage 13.
Comme dans l'exemple précédent, la tête d'actionnement 10 peut être maintenue assemblée indépendamment du corps de vanne 20 au moyen d'une bague de sertissage 30 qui est similaire à celle décrite en regard des figures 2 et 3 mais qui se distingue de celle des figures 2 et 3 par le fait qu'elle ne comporte pas de paroi latérale 34 axiale, la portée annulaire 31 de cette bague étant prolongée directement vers l'intérieur par des pattes élastiques 35 qui appuient sur la pièce de guidage 13.
En ce qui concerne le corps de vanne 20, il comporte comme dans l'exemple décrit ci-dessus un passage intérieur 21 qui relie entre eux deux orifices 22 et 23, ces orifices pouvant être isolés l'un de l'autre par application de l'organe d'obturation 11 contre un siège annulaire 24, l'organe d'obturation 11 étant sollicité contre son siège 24 par le ressort 19, et étant écarté de ce siège lorsqu'une dépression suffisante est créée dans la chambre 17.
Toutefois, le corps de vanne 20 se distingue de celui décrit précédemment par le fait que l'orifice 23 et le siège annulaire 24 ne sont pas directement réalisés dans le corps de vanne 20, mais dans une rondelle rigide 28 qui est rapportée à une extrémité ouverte 20a du corps de vanne, l'orifice 23 étant ménagé au centre de la rondelle 28 et le siège annulaire 24 étant situé sur la face de la rondelle 28 qui est dirigée vers l'intérieur du corps de vanne 20. Ce siège annulaire 24 peut éventuellement consister en un joint annulaire en élastomère qui est disposé dans une gorge également annulaire de la face de la rondelle 28 qui est dirigée vers l'intérieur du corps de vanne 20.
De plus, l'extrémité ouverte 20a du corps de vanne se prolonge radialement vers l'extérieur par une bride annulaire 29 qui forme une face annulaire sensiblement plane 29a (en l'occurrence plane par morceaux puisqu'elle forme un gradin) dirigée vers la conduite 50.
La conduite 50 comporte elle-même une extrémité ouverte 51 en regard de l'extrémité ouverte 20a du corps de vanne, et ladite conduite 50 se prolonge radialement vers l'extérieur par une bride annulaire 22 au niveau de ladite extrémité ouverte 21.
Cette bride 22 forme une face annulaire 23 sensiblement plane qui est disposée en regard de la face annulaire 29a susmentionnée et qui peut éventuellement comporter une gorge annulaire dans laquelle peut être logé un joint annulaire en élastomère.
Le corps de vanne 20 est fixé à la conduite 50 par la bague sertissable 40 qui, comme la bague 30, est de préférence réalisée d'une seule pièce par découpage et matriçage à partir d'une tôle unique.
Cette bague 40 comporte une portée annulaire plane 41 interposée entre les faces 29a et 53 susmentionnées, et cette portée annulaire 41 se prolonge vers l'extérieur par des pattes 42 et 43 rabattues alternativement vers le haut et vers le bas pour être serties sur la bride 29 du corps de vanne et sur la bride 52 de la conduite 50.
Dès lors que les pattes 42 sont serties sur la bride 29, une partie intérieure de la portée annulaire 41 maintient la périphérie de la rondelle 28 en contact étanche avec une partie radialement intérieure de la face annulaire 29a.
De plus, la portée annulaire 41 se prolonge radialement vers l'intérieur par une coupelle ajourée 44 dans laquelle sont contenus un organe de clapet 45 et un ressort hélicoïdal 46.
L'organe de clapet 45 peut par exemple consister en une plaque rigide en forme de disque qui présente un diamètre supérieur au diamètre de l'orifice 23 et qui est disposée en correspondance avec cet orifice.
Le ressort hélicoïdal 46 est monté entre le fond de la coupelle ajourée 44. Ainsi, l'organe de clapet 45 est sollicité par le ressort 46 vers une position où il obture l'orifice 23 en s'appliquant sur un siège de clapet 47 annulaire qui est formé autour de l'orifice 23, sur la face de la rondelle 28 tournée vers l'extérieur du corps de vanne 20.
De cette façon, lorsque l'organe d'obturation 11 est écarté de son siège 24, l'organe de clapet 45 empêche tout déplacement de gaz de l'orifice 23 vers l'orifice 22, et permet seulement un déplacement de gaz de l'orifice 22 vers l'orifice 23, l'organe de clapet 45 s'écartant alors légèrement de son siège 47 contre la force du ressort 46.
d'avancement du véhicule.