Le plasmide pBIOC22 a été digéré totalement par BglII et partiellement par HindIII afin de supprimer la séquence codant le polypeptide Leu-Phe-Gly Lys (4 premiers acides aminés) de la protéine LGC mature. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide signal PS de 23 acides aminés (ATG AAA GCC TTC ACA CTC GCT CTC TTC TTA GCT CTT TCC CTC TAT CTC CTG CCC AAT CCA GCC CAT TCC) fusionnée à celle des 4 premiers codons de la séquence codant pour la protéine LGC mature ("PS4 premiers codons de LGC mature"). La séquence "PS4 premiers codons de LGC mature" a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pMAT103 (Matsuoka et Nakamura, 1991) à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides suivants 5' caggagatctgATG AAA GCC TTCACA CTC GC 3' et 5' G ATG AAG CTT TCC AAA CAA GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G 3', en suivant le protocole d'amplification PCR décrit ci-dessus dans le paragraphe I.Après double digestion enzymatique par BglII et HindIII, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugés à 12000 g pendant 30 min., lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC22 doublement digéré par BgllI et HindIII, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant.La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 ,ul en présence de 1 y1 de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 50 yg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction.L'ADN plasmidique de certains clones retenus a été vérifiée par séquençage à l'aide du kit de séquençage T7TM commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Les séquences du PS et de LGC mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouverte. La séquence de clivage entre les séquences du PS et de LGC mature est Ser-Leu. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC23. A partir de pBIOC23, le fragment BglII-XbaI portant la séquence de PS-LGC a été isolé par double digestion enzymatique par BglII et XbaI, purification par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélution (Sambrook et al., 1989), précipitation alcoolique, séchage.Puis, ce fragment d'ADN a été traité par l'enzyme Klenow selon les recommandations du fabricant et ligué à l'ADN plasmidique de pBIOC21 digéré au site HindIII, traité à la Klenow et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant. La ligation a été réalisée avec 20 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 200 ng de fragments d'ADN contenant PS-LGC décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 20 y1 en présence de 2 iil de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 yI de 50% polyéthylène glycol 8000 et de 5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures.Les bactéries Escherichia coli DH5 Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977).