Les constructions des différents plasmides via l'utilisation de techniques d'ADN recombinant (Sambrook et al., 1989) dérivent de pBIOC4. Ce plasmide binaire dérive de pGA492 (An, 1986) qui contient entre les bordures droite et gauche; issues du plasmide pTiT37 d'Agrobacterium tumefaciens, sur son ADN de transfert, les séquences suivantes:: le promoteur constitutif du gène nos codant pour la nopaline synthase (Depicker et al., 1982), la séquence codante du gène nptII codant pour la néomycine phosphotransférase II (Berg et Berg, 1983) délétée de la région des 8 premiers codons dont le codon initiateur méthionine ATG et fusionnée à la séquence des 14 premiers codons de la séquence codante du gène nos (Depicker et al., 1982), la séquence codante du gène nos dépourvue de la région des 14 premiers codons, le terminateur nos (Depicker et al., 1982), une région contenant des sites multiples de clonage (encore désignée polylinker) (HindIII-XbaI-SacI-HpaI-KpnI-ClaI-BglII) précédant le gène cat codant pour la chloramphénicol acétyltransférase (Close et Rodriguez, 1982) et les séquences terminatrices du gène 6 du plasmide pTiA6 d'Agrobacterium tumefaciens (Liu et al., 1993).Pour éliminer la quasi-totalité de la séquence codante du gène cat, le plasmide pGA492 a été doublement digéré par SacI (site de restriction du polylinker) et par ScaI (site de restriction présent dans la séquence du gène cat) puis soumis à l'action de l'enzyme T4 DNA polymérase (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant. La ligation du plasmide modifié (20 ng) a été réalisée dans un milieu réactionnel de 10 jl contenant 1 111 du tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham); 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983).L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 12 ,ug/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Puis, le site de restriction HindIII de l'ADN plasmidique du clone retenu a été modifié en un site de restriction EcoRI à l'aide d'un adaptateur HindIII-EcoRI phosphorylé (Stratagene Cloning Systems).Pour réaliser cette modification, 500 ng d'ADN plasmidique du clone retenu ont été digérés par Hindîli, déphosphorylés par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant et coprécipités en présence de 1500 ng d'ADN adaptateur HindIII-EcoRI, 1/10 volume d'acétate de sodium 3M pH 4,8 et 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min. Après centrifugation à 12000 g pendant 30 min., 1'ADN précipité a été lavé à l'éthanol 70%, séché, repris dans 8 yI d'eau, porté à 65"C pendant 10 min., puis ligué en présence de 1 'il de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures.Après inactivation de la T4 DNA ligase à 65"C pendant 10 min., le mélange réactionnel de ligation a été digéré par EcoRI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), précipité en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugé à 12000 g pendant 30 min., lavé à l'éthanol 70%, séché, puis ligué comme décrit ci-dessus. Les bactéries Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983).L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 12 yg/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par HindIII et EcoRI notamment. Le plasmide binaire résultant, qui ne possède plus que les 9 derniers codons de la séquence codante du gène cat et dont le site EcoRI est unique, a été appelé pBIOC4.