INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
6) Analyse du clone positif Pour identifier le clone contenant le gène ss2- adrénergique canin en entier, c'est-à-dire l'ADNc correspondant à la région codante pour toute la protéine, lfADN du phage kD1 a été préparé. Cet ADN a été coupé ensuite par l'enzyme de restriction EcoRI afin de vérifier la taille de l'insert. Il y a en effet lieu de noter que deux fragments ont été obtenus : un de 2,4 kb et un de 0,25 kb, ce qui laisse supposer la présence d'un site EcoRI propre au gène ss2-adrénergique canin, car le site EcoRI est unique sur le vecteur X gt 11.
7) Sous-clonage des fragments EcoRI dans un vecteur M13 Les fragments EcoRI du clone kD1 ont été souscloné dans un bactériophage M13 (M13 tg 131) approprié pour faire le séquençage ; de cette manière, l'on obtient 4 sous-clones - un clone comportant l'insert de 2,4 kb du brin sens, appelé "H", - un clone comportant l'insert de 2,4 kb du brin anti-sens, appelé "D3", - un clone comportant l'insert de 0,25 kb du brin sens, appelé "16,4", et - un clone comportant l'insert de 0,25 kb du brin anti-sens, appelé "16,2".
8) Séquençage du gène ss2-adrénergique canin Les 4 sous-clones ont été entièrement séquencés à l'aide du kit Sequenase version 2.0 (Amersham United States Biochemical réf. 70770). La séquence a été réalisée en utilisant des amorces spécifiques, qui s'hybrident sur le brin sens (H et 16,4) ou sur le brin antisens (D3 et 16,2). Ces amorces sont représentées par les séquences suivantes - amorces sens : SEQ ID NO:27SEQ ID NO:36 - amorces sens : SEQ ID NO:37SEQ ID NO:46.
Les résultats obtenus à partir de la séquence des fragments EccRi, montrent la séquence nucléotidique du récepteur ss2-adrénergique canin (1248 pb) et des régions non-codantes (168 pb en 5' et 1262 pb en 3').
Les sites de restriction uniques contenus dans le fragment de 2679 pb sont positionnés sur les figures 11 et 12.
La comparaison des régions codantes des gènes ss2-adrénergique canin et humain et des rongeurs (hamster, rat, souris), indique une forte homologie (87%) (figure 13).
La séquence ss2-adrénergique canine code pour une protéine de 415 acides aminés SEQ ID NO:2 et porte les caractéristiques structurales des récepteurs ss- adrénergiques, notamment les sept régions hydrophobes qui correspondent probablement à des segments transmembranaires. Dans la partie extracellulaire (el) on trouve deux sites de glycosylation (NRS et NGS) communs aux autres récepteurs ss2-adrénergiques.
La partie C-terminale intracellulaire (i4) est plus conservée entre les récepteurs ss2-adrénergiques qu'entre les récepteurs ss3-adrénergiques. Toutefois, la séquence humaine révèle une absence de 6 résidus en position 360. Trois résidus sont absents dans la séquence ss2- adrénergique canin en position 391 comparée aux autres séquences ss2-adrénergiques. La figure 13 montre la comparaison en acides aminés des différents récepteurs B2 adrénergiques.
9) Vérification de la présence du site EcoRI interne au gène Pour vérifier que les deux fragments EcoRI composent le gène ss2-adrénergique canin, une amplification PCR a été réalisée sur l'ADN du phage kD1 avec des amorces s'hybridant de part et d'autre du site EcoRI (SEQ ID NO:35 et SEQ ID NO:37). Un fragment de 720 pb a ainsi pu être amplifié. Après sous-clonage dans le vecteur M13 tg 130 (clone nO 2) et séquençage de ce fragment, la certitude que le site EcoRI se trouve en position 2427 sur la séquence a été apportée.
10) Préparation d'une sonde spécifique du gène ss2-adrénergique canin: Le fragment EcoRI de 2427 pb du clone "H" a été purifié et utilisé comme sonde. Ce fragment d'ADN a été radiomarqué, comme décrit plus haut, par la méthode du Random Priming. La sonde ainsi préparée a été utilisée dans des expériences d'hybridation d'ADN génomique (Southern Blot), pour estimer sa spécificité vis-à-vis du gène ss2-adrénergique. L'ADN génomique canin a été coupé par les enzymes de restriction suivantes EcoRI, Hind III, Bam HI, Xba I. Après séparation des fragments dans un champ électrophorétique sur gel d'agarose à 0,7 %, 1'ADN a été transféré sur une membrane de nylon (Amersham, Hybond N+). Cette membrane a été hybridée avec la sonde EcoRI puis lavée à faible stringence et ensuite autoradiographiée.
Les résultats indiquent, pour la coupure EcoRI, un fragment de 8 à 8,5 kb, pour la coupure BamHI un fragment d'environ 20 kb, pour la coupure XbaI un fragment de 7,5 à 8 kb et pour la coupure Hind III un fragment de 4 kb. La présence d'une bande unique pour chaque coupure indique qu'il n'y a pas, dans le génome canin, d'autres séquences hautement homologues au gène ss2-adrénergique.
Exemple 5 : Construction d'un vecteur pour l'expression du récepteur ss2-adrénergique canin.
La carte de restriction du gène ss2- adrénergique canin (figures 11 et 12) indique la présence d'un site de coupure par l'enzyme Nae I, en position 154, soit 15 pb en amont de la région codante du gène ss2- adrénergique canin. L'ADN du clone M13 - H a été digéré avec les enzymes Nae I et EcoRI, pour libérer le fragment de 2273 pb contenant la région codante du gène ss2- adrénergique canin et une partie de la région 3' nontraduite. Ce fragment d'ADN a été purifié, puis inséré dans le vecteur d'expression pcDNA 3 (Invitrogene), aux sites de coupure Bam HI et EcoRI. Comme les extrémités Nae I d'une part et Bam HI d'autre part, ne sont pas compatibles, les extrémités Bam HI du vecteur ont été traitées avec le fragment Klenow de la polymérase I, de façon à obtenir des bouts francs (Maniatis et al., Molecular Cloning, 2ème édition, pages 5.40 à 5.43). La coupure Nae I génère des bouts francs et après ligation, on a ainsi obtenu le plasmide recombinant pcDNA 3/rss2- adrénergique canin (sous-clone 41). Le gène du récepteur ss2-adrénergique canin se trouve alors sous dépendance du promoteur fort CMV (cytomegalovirus), qui assure une surexpress ion du gène une fois introduit dans les cellules de mammifères.
Exemple 6 : Etude de l'expression du récepteur ss2 canin dans les cellules CHO-K1.
La Figure 2 est une vue en perspective d'une demi paire de lunettes et du profilé en U, avant sa fixation.
La Figure 3 est une vue de dessus du profilé.
Sur la figure 2, on a représenté une demi paire de lunettes, ou demi monture (1). Cette demi monture (1) comprend un support (2) de verre (3).
Ce support est de forme ovale, de préférence, mais il peut être rond ou même rectangulaire. De plus, ce support (2) peut être plan ou courbe, selon l'esthétique recherchée.
La demi monture (1) comporte une barre (4) qui sert à raccorder le support 2 avec le second support de verre (non représenté).
La barre supérieure (4) repose sur le nez de l'utilisateur lorsqu'il porte les lunettes.
La demi monture (1) comporte une branche (5) latérale qui est sensiblement perpendiculaire au plan général dans lequel se trouve le support (2) de verre (3), quand les lunettes sont portées. La branche latérale 5 a une longueur sensiblement de 12 cm. Elle est rectiligne sur une longueur d'environ 8 cm et courbe sur le reste de sa longueur. La partie courbe ( non représentée sur la Figure ) est destinée à être posée sur l'oreille de l'utilisateur.
La branche latérale (5) est en général plane et comporte des faces, dont seule une face est visible sur la Figure, un bord supérieur (6) et un bord inférieur (7).
La branche latérale (5) peut pivoter autour d'un axe perpendiculaire à son axe longitudinal YY et sensiblement parallèle au plan général du support (2) et du verre (3). L'axe de pivotement permet de replier la branche (5) vers le support (2), en exerçant une force sur la branche (5), dans le sens de la Flèche F., lorsque l'utilisateur a enlevé les lunettes et qu'il désire les ranger, par exemple dans un étui approprié.
Cet axe de pivotement Xx est une charnière. Celle-ci peut être de différentes sortes, selon la monture. Par exemple, comme représenté sur la Figure 2, la charnière (8) est éloignée du support (2), d'une distance variable selon le type de lunette. La charnière peut aussi être adjacente au support (2). La charnière peut incorporer un dispositif amortisseur comme cela est connu qui constitue une épaisseur supplémentaire.
Les lunettes sont placées sur des présentoirs, dans les magasins, et sont en position dépliée, à savoir la branche (5) et la branche symétrique non représentée, sont sensiblement perpendiculaires au plan du support (2) de verre (3).
Pour éviter que le client potentiel ne vole les lunettes, le dispositif selon l'invention empêche de plier les branches.
Le dispositif selon l'invention est constitué d'un profilé (9) en U, en matière rigide, comme représenté sur les Figures 1 et 2. Par exemple, cette matière peut être synthétique, comme du PVC, ou peut être métallique, ou en come. Le profilé (9) en U comporte une base (10) et deux ailes (11, 12), parallèles entre elles et perpendiculaires à la base (10).
On place le profilé (9) sur la branche lorsqu'elle est dépliée, de façon qu'une face interne (13), des ailes (11, 12) soit placée respectivement contre une face externe de la branche (5). La base (10) du profilé en U est placée contre le bord inférieur (7) de la branche (5). On peut prévoir aussi de placer la base (10) contre le bord supérieur (6) de la branche (5).
Des moyens de fixation (14) permettent de maintenir le profilé (9) sur la branche (5). Ces moyens de fixation (14) ont plusieurs fonctions.
Une première fonction des moyens de fixation (14) est de maintenir le profilé (9) sur la branche (5), pour qu'il ne coulisse pas le long de l'axe longitudinal YY de la branche (5).
Sur les particules ainsi obtenues, on fixe de la sérumalbumine bovine pour ensuite procéder à l'isolement d'anticorps dirigés contre la sérum albumine bovine, présents dans un échantillon.
L'inconvénient de ces particules survient à l'étape de leur séparation : ces particules incorporent une faible proportion de charge magnétique et sont en outre de tailles très variables, limitant considérablement l'efficacité d'un champ magnétique appliqué pour séparer les particules. Ainsi pour assurer une séparation aussi efficiente que possible de ces particules dans l'échantillon, les auteurs ont recours à une thermoflocculation selon laquelle on augmente la température de l'échantillon, qui intervient pour compléter l'action d'un champ magnétique.
La nécessité d'une technique de séparation complémentaire résulte des particules obtenues qui présentent les inconvénients suivants - proportions de charge magnétique incorporée faibles, - répartition non homogène de la charge magnétique, et - obtention de particules non monodisperses.
Les particules de l'invention sont destinées à l'isolement de molécules biologiques, essentiellement par l'application d'un champ magnétique, indépendamment de toutes variations de température, pH, force ionique.
Les particules superparamagnétiques et monodisperses de l'invention ont une taille prédéterminée comprise entre 0,1 et 10 pm et comprennent - un noyau à base d'un premier polymère, - une couche interne dite couche magnétique, recouvrant le noyau, à base d'un second polymère et dans laquelle est distribué un matériau magnétique, et - une couche externe, dite couche d'encapsulation, éventuellement fonctionnalisée, recouvrant la couche magnétique, à base d'un troisième polymère et susceptible d'interagir avec au moins une molécule biologique, au moins le second polymère étant thermosensible et présentant une température critique inférieure de solubilité (LCST) prédéterminée comprise entre 15 et 650C, et de préférence entre 25 et 50 Oc.
Avantageusement, le second polymère est obtenu par polymérisation de (1) un monomère hydrosoluble, d'acrylamide ou d'un dérivé d'acrylamide, tel que le Nisopropylacrylamide (NIPAM), (2) au moins un agent de réticulation, tel que le N,N-méthylène bisacrylamide, et (3) au moins un monomère fonctionnel, cationique et hydrosoluble, différent du monomère (1), tel que chlorure de 2-aminoéthyl-méthacrylate. Un second polymère préféré est le PNIPAM [poly-(N-isopropylacrylamide)].
Le premier polymère peut être identique au second polymère ou différent du second polymère, dans ce dernier cas le premier polymère sera de préférence un polymère à caractère hydrophobe, et en particulier un polystyrène ou un polyméthacrylate de méthyle.
Le troisième polymère est un polymère compatible avec le second polymère et est choisi parmi les polymères hydrophiles, en particulier les dérivés acrylamides et de préférence le PNIPAM. Lorsque ce troisième polymère est fonctionnalisé, il porte un ou plusieurs groupes fonctionnels choisis parmi les fonctions carboxylique, aldéhydique, thiol et amine.
Un second objet de l'invention est un procédé d'obtention de particules telles que définies précédemment, qui comprend les étapes suivantes - selon une étape (a) dite étape d'obtention du premier polymère, on obtient par polymérisation du ou des monomères appropriés, le premier polymère, - selon une étape (b) dite étape d'obtention du second polymère, on obtient un sol du second polymère, par polymérisation en phase aqueuse de (1) un monomère hydrosoluble, d'acrylamide ou d'un dérivé d'acrylamide, (2) au moins un agent de réticulation et (3) au moins un monomère fonctionnel, cationique et hydrosoluble, différent du monomère (1), - selon une étape (c) dite d'adsorption du matériau magnétique, on met en contact le matériau magnétique avec les premier et second polymères, à une température inférieure à la LCST du second polymère, - selon une étape (d) dite d'obtention de la couche magnétique, on porte le mélange réactionnel obtenu selon (c) à une température supérieure à la LCST du second polymère, - selon une étape (e) dite d'encapsulation, on met en contact, en phase aqueuse, le mélange obtenu selon (d) avec le ou les monomères appropriés pour l'obtention par polymérisation du troisième polymère.
Les étapes (a) et (b) sont, selon une variante du procédé, effectuées simultanément, en particulier mais de manière non limitative quand le premier polymère est identique au second polymère.
Pour l'étape (b) et éventuellement l'étape (a) les réactifs de polymérisation sont de préférence sélectionnés comme suit - le monomère (1) est de préférence choisi parmi les N-alkylacrylamides et les N,N-dialkylacrylamides, en particulier parmi le N-isopropylacrylamide, le Néthylméthacrylamide, N-n-propylacrylamide, le N-npropylméthacrylamide, N-isopropylméthacrylamide, le Ncyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le Nméthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-npropylacrylamide, le monomère (1) étant de préférence le N-isopropylacrylamide (NIPAM), - le ou les monomères fonctionnels (3) sont choisis parmi les dérivés acryliques et méthacryliques, le chlorure de 2-aminoéthyl-méthacrylate (AEM), les dérivés de N-vinyl-pyridine, les dérivés de trialkylammonium et les dérivés de chlorure d'isothiouronium, et éventuellement - l'agent de réticulation (2) est hydrosoluble et est choisi parmi le N,N-méthylène bisacrylamide (MBA), l'éthylène glycol diméthacrylate.
Pour l'étape (c), l'adsorption du matériau magnétique sur le second polymère résulte d'interactions électrostatiques entre des particules de charges opposées.
Le milieu réactionnel pour l'adsorption est une phase aqueuse dont les paramètres force ionique et pH sont contrôlés.
L'invention concerne en outre les applications des particules définies ci-dessus. Ainsi les particules sont notamment utilisables pour capturer puis séparer, dans un échantillon liquide, au moins une molécule biologique, notamment choisie parmi les protéines, les anticorps, les fragments d'anticorps, les antigènes, les polypeptides, les enzymes, les haptènes, les acides nucléiques et les fragments d'acides nucléiques. La ou les molécules biologiques sont fixées sur les particules par adsorption ou par liaison covalente, directement ou indirectement, et dans ce dernier cas, par l'intermédiaire d'un ligand par exemple.
Des exemples d'utilisations particulières des particules de l'invention sont les suivantes - utilisation comme traceur après concentration magnétique sur une phase solide dans ce cas, la particule est comptée après balayage de la surface par une pointe de microscope de force atomique ou après observation microscopique directe, ou avec une caméra ; les particules magnétiques peuvent être détectées du fait de leur charge métallique et mesurées avec un magnétomètre ou tout système de type lecteur de carte de crédit ; pour faciliter la concentration des particules sur la surface, un aimant permanent ou un électroaimant peut être disposé au-dessous ou au-dessus de la surface utilisée pour la détection ; la concentration magnétique sera préférentiellement effectuée si l'on utilise un nombre limité de particules, par exemple la quantité suffisante pour recouvrir une à dix fois la surface si le processus est statique et une quantité éventuellement plus importante si la concentration est dynamique par circulation contrôlée de liquide sur la surface réactive - utilisations des particules couplées à un ligand biologique approprié dans un protocole réactionnel d'agglutination ; la taille des particules peut être suivie directement dans le milieu ou après attraction magnétique - utilisation des particules pour vectoriser des réactifs dans un dispositif de type capillaire, un jeu d'électroaimants permettant le déplacement des particules - utilisation des particules pour créer des voies préférentielles et/ou obstruer des canaux de distribution de liquide - utilisation des particules pour transporter jusqu'à leurs cibles des substances thérapeutiques le principe actif est adsorbé ou transitoirement couplé par covalence sur la surface de la particule, un champ magnétique approprié est appliqué pour entraîner le déplacement de l'ensemble particule-substance thérapeutique.
Un autre objet de l'invention est un procédé pour isoler, dans un échantillon liquide, au moins une molécule biologique, selon lequel - on dispose de particules selon l'invention, - on met en contact ledit échantillon avec lesdites particules, par incubation, - on applique un champ magnétique au mélange obtenu, - on sépare les particules de l'échantillon.
Ce problème est particulièrement ennuyeux si la diffusion donne une approximation du premier rayon qui arrive, tel que représenté sur le profil de retard de puissance 1510. Par exemple, un premier rayon 1530 du signal reçu peut arriver avant la crête 1520 du signal.
Afin de surmonter ces inconvénients, le dispositif de recherche peut être programmé pour effectuer un balayage plus tôt afin de trouver les rayons arrivant les premiers se trouvant encore dans la limite du seuil fixé à partir de la crête. En fixant le récepteur de corrélation à un endroit ne correspondant pas à la crête, un deuxième corrélateur peut parfois être verrouillé sur un deuxième rayon 1540 de façon à obtenir une certaine diversité de signaux, le premier rayon 1530 et le deuxième rayon 1540 pouvant donner un meilleur résultat combiné que la corrélation avec la crête 1520. Pour estimer le temps de propagation le plus court et par conséquent la meilleure position, le premier rayon 1530 fournit une meilleure estimation que si on utilisait uniquement un niveau de puissance.
La figure 16 illustre un état dans lequel deux bases reçoivent un signal depuis l'abonné 1690 mais, du fait d'un blocage le long du chemin 1663, le signal est faible et n'est pas détecté par le site 1611 dans la direction correcte, mais, en revanche, une réflexion fait en sorte que le chemin entre 1661 et 1641 est plus fort et l'angle estimé, tel que représenté par 1631. La distance prévue 1660 est fonction de la distance des chemins 1661 + 1662, qui place l'estimation au-delà de la position réelle de l'abonné 1690. Pour le site 1610, l'estimation de la distance 1650 et l'angle 1630 se trouvent dans les limites de la précision définies par un chemin direct. Dans ce cas, les informations provenant des deux sites de base 1610, 1611 s'avèrent contradictoires et un calcul simple de la position n'est donc pas possible. Une estimation de position en 1691 semblerait appropriée sur la base des estimations de distance 1650 et 1660 et de l'angle 1631 bien que l'angle 1630 contredise cette affirmation. La véritable position 1690 est indiquée par la distance 1650 et l'angle 1630 mais les autres entrées ne l'acceptent pas. Pour cette situation, un procédé de récupération et d'estimation d'erreur est très souhaitable.
Puisque les réflexions rendent en général uniquement des distances de propagation mesurées plus longues, on donne plus de poids à des distances plus courtes. En analysant chaque chemin afin de trouver la potentialité des réflecteurs forts, la probabilité de voir une réflexion est déterminée. De plus, le risque d'être confronté à des chemins bloqués s'ajoute à l'analyse permettant d'améliorer l'estimation du véritable chemin et donc de la meilleure estimation de position.
Le chemin dans la direction de 1631 est balayé à partir d'une base de données d'obstacles générée précédemment, qui sont sensés être capables de générer une réflexion spéculaire forte. Ce chemin est contrôlé, de même que tout le rayon, et on détermine que la position 1695 est la position ayant de grandes chances de présenter une réflexion spéculaire forte. En calculant les distances, on trouve que la position 1690 est une position valide pour les chemins 1661 et 1662.
On remarque en outre que le chemin 1663 est bloqué à un degré significatif qui est également stocké dans une base de données enregistrée précédemment. Lorsqu'on contrôle l'autre site, on ne rencontre pas d'obstacle sur le chemin entre 1610 et 1690, ce qui indique que ce chemin est fiable. Ainsi, en analysant les entrées disponibles, on détermine que la position 1690 correspond à la meilleure estimation de la véritable position de l'unité d'abonné.
Un exemple d'un tel procédé de récupération et d'estimation d'erreur va maintenant être décrit.
Etape n01 : déterminer l'estimation de position en fonction de chaque site en utilisant la portée et l'angle d'arrivée à la base estimés.
Etape n02 : déterminer si toutes les entrées sont complémentaires et si c'est le cas, calculer l'estimation de position comportant toutes les entrées au degré des informations fournies par chacune.
Etape n03 : si ce n'est pas le cas, commencer les étapes de récupération et d'estimation d'erreur.
Etapes de récupération et d'estimation d'erreur Etape n01 : pour chaque site, analyser le chemin dans la direction indiquée par les informations d'angle afin de déterminer la potentialité des réflecteurs forts, tel qu'enregistré précédemment dans une base de données.
Etape n02 : pour le site n'ayant pas de réflecteurs connus, supposer que l'estimation de position est bonne et poursuivre.
Etape n03 : faire vérifier les résultats par un autre site. Vérifier les réflecteurs dans la direction indiquée et déterminer s'il existe un chemin présentant la bonne longueur et arrivant selon l'angle approprié, étant donnés les réflecteurs potentiels indiqués. Si c'est le cas, on vérifie l'estimation de position.
Sinon, la vérification n'est pas possible et une incertitude existe jusqu a ce qu'un autre procédé la lève, par exemple une poursuite d'abonné. Lors d'une étape intermédiaire, l'estimation de position donnée par le site ayant la portée la plus courte peut être suggérée comme étant la position correcte, mais les deux positions peuvent être utilisées aux mêmes fins avec des degrés de fiabilité donnés, jusqu'à ce qu'une meilleure solution soit proposée. Les spécialistes de la technique comprendront qu'un procédé semblable peut être utilisé en utilisant le procédé TDOA plutôt que les mesures de temps absolu.