INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Plus particulièrement la présente invention a pour objet un gène de fusion comprenant dans le sens 5'-- > 3': - un fragment d'ADN codant pour la recombinase Cre du bactériophage P1; - un fragment d'ADN codant pour tout ou partie de la région charnière D du récepteur nucléaire des glucocorticoïdes, région située entre le domaine DBD et le domaine LBD, et - le fragment d'ADN codant pour le domaine de liaison du ligand (LBD) modifié, notamment muté, du récepteur nucléaire des glucocorticoïdes selon l'invention.
Et plus particulièrement encore, la présente invention a pour objet, un gène de fusion, caractérisé en ce qu'il a pour séquence, une séquence codant pour la séquence d'acides aminés de L'IDES n" 2 comprenant - les acides aminés 1 à 343 qui correspondent à la recombinaison Cre; - les acides aminés 346 à 377 qui correspondent à la région C terminale de la région D du récepteur humain des glucocorticoïdes; - les acides aminés 378 à G23 qui correspondent au LBD [GR(1747/T)].
Dans un mode de réalisation particulier, le gène de fusion a substantiellement pour séquence, la séquence Cre-LBD[GR(1747/T)] telle que représentée dans L'IDES n 2 dont les acides aminés 626 à G67 correspondent à la région F du récepteur humain des oestrogènes.
La présente invention a également pour objet un vecteur d'expression de la protéine dc fusion codée par le gène dc fusion selon l'invention, dans des cellules hôtes animales notamment de mammifères, caractérisé en ce qu'il comporte le gène de fusion selon l'invention, placé sous le contrôle d'éléments d'expression assurant son expression dans lesdites cellules hôtes. Le vecteur d'expression de la protéine de fusion peut également être un vecteur d'intégration dans le génome des cellules hôtes.
Dans les vecteurs selon l'invention, pour exprimer le récepteur, le LBD ou la protéine de fusion selon l'invention, il faut que les fragments d'ADN codant pour ces molécules soient placées sous le controle de séquence de régulation, notamment des séquences promotrices/ enhancer. On peut utiliser en particulier des séquences promotrices/enhancer du virus SV40.
La présente invention a en outre pour objet un procédé de recombinaison, notamment d'excision, insertion, inversion ou translocation conditionnelle au niveau d'un fragment d'ADN contenant un ou deux sites de reconnaissance spécifique d'une protéine recombinase dans des cellules hotes humaines ou animales, notamment de mammifères, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes dans lesquelles 1) on introduit une protéine de fusion selon l'invention ou un vecteur d'expression de ladite proteine de fusion selon l'invention dans lesdites cellules hôtes dans des conditions permettant l'expression de la protéine dc fusion selon l'invention et, 2) on complexe ladite protéine de fusion avec undit ligand glucocorticoïde s! nthétique, en mettant ledit ligand en présence desdites cellules hôtes.
La présente invention fournit donc un procédé de délétion conditionnelle d'un fragment d'ADN dans lequel on met en oeuvre un procédé d'excision selon l'invention, et dans lequel ledit fragment d'ADN à exciser est intégré entre deux sites de reconnaissance de protéine recombinase orientés en répétition directe. En particulier, ledit fragment d'ADN peut être choisi de telle sorte que l'excision dudit fragment d'ADN a pour effet, l'inactivation dudit gène. L'excision dudit fragment d'ADN peut également permettre la synthèse d'une protéine fonctionnelle, si ledit fragment contient par exemple un codon stop ou un signal de polyadenylation.
Dans le mode préféré de réalisation selon l'invention, lesdits sites de reconnaissance spécifique de la protéine recombinase sont les sites loxP et ladite protéine recombinase est la protéine Cre du bactériophage P1.
Ledit fragment d'ADN que l'on veut recombiner, notamment exciser et le ou lesdits sites de reconnaissance spécifiques d'une protéine recombinase peuvent être portés par un vecteur plasmidique ou viral, ou intégrés dans le chromosome des cellules hôtes.
L'intégration d'un gène portant des sites loxP dans un génome peut être aléatoire ou ciblée, En particulier, I'intégration des sites de reconnaissance spécifique de la protéine recombinase, notamment du ou des sites loxP pour la recombinase Cre, peut se faire par recombinaison homologue du gène comportant ledit fragment d'ADN à exciser ou inverser (2 sites loxP) ou respectivement inserer ou transloquer (1 site loxP) avec undit gène modifié comportant ledit fragment d'ADN à exciser flanqué en 5' et/ou 3' par le ou lesdits sites de reconnaissance de recombinase en fonction de l'application désirée, notamment les sites loxP.
On a construit une protéine chimérique, Cre-LBD[GR(1747/T)l de L'IDES n" 2, composée de la recombinase Cre fusionnée au LBD de GR (1747/T). La protéine de fusion Cre-LBD[GR(1747/T)] permet de réaliser une recombinaison entre des sites loup, dans une cellule de mammifère, suite à un traitement par des glucocorticoïdes synthétiques. En l'absence de traitement, ou en présence de concentrations de glucocorticoïdes naturels allant jusqu'à 10-6 NI aucune excision n'est observée.Cette chimère est capable d'exciser les séquences d'ADN situées entre des sites loxP intégrés préalablement dans le génome de cellules F9 (embryocarcinome de souris) ou présents sur un plasmide après transfection de ces cellules avec un vecteur exprimant Cre LBD[GR(1747/T)], suite à un traitement à la Dex à 10-6 NI ou 10-7 NI, alors qu'à de telles concentrations, le cortisol n'induit pas d'activité recombinase. Comme on l'a déjà mentionné, le vecteur d'expression de Cre-LBD[GR(1747/T)] peut également être un vecteur d'intégration dans le génome des cellules hôtes.
Ce système permet donc de libérer l'activité recombinase de protéine chimérique à un moment donné et choisi. La protéine de fusion Cre-LBD[CR(l747/T)j peut étre exprimée dans des cellules contenant des sites loxP, sans modifier le locus contenant les sites loxP. La recombinaison au niveau des sites loxP a lieu uniquement après traitement aux glucocorticoïdes synthétiques. De plus en exprimant la protéine de fusion Cre-LBD[GR(1747/T)] dans un animal sous le controle d'un promoteur à spécificité cellulaire, on peut obtenir une recombinaison entre des sites loxP, spécifiquement dans ces cellules.
La présente invention a également pour objet un vecteur de transfert d'un fragment d'ADN dans des cellules hotes humaines ou animales, notamment mammifères, caractérisé en ce qu'il comporte undit fragment d'ADN à transférer comprenant des sites de reconnaissance spécifiques de la recombinase, notamment deux sites loxl > , orientés à répétitions directe et une cassette d'expression d'un gène de fusion selon l'invention. De façon appropriée les deux sites sont placés à chaque extrémité dudit fragment d'ADN.
De préférence, le gène de fusion est placé sous le controle d'éléments d'expression spécifiques des cellules hôtes, en particulier, il comporte la séquence du plasmide pCre-LlJD[GIt(1747/1)1 de l'ILS n 3.
Dans le procédé d'excision selon l'invention, ledit fragment d'ADN à exciser peut être transféré dans les cellules hôtes a-ant, en même temps, ou après l'étape d'introduction de la protéine de fusion ou d'un vecteur de transfert.
Le vecteur de transfert selon l'invention peut entre, un vecteur plasmidique ou un vecteur viral. Le mode de transfert varie en fonction du type de cellule cible et de l'efficacité recherchée.
Dans le même temps, la couche centrale microporeuse permet d'empêcher le passage de micro-organismes, tout en assurant une excellente pénétration par l'air, d'où la fonction d'une barrière bactérienne très efficace.
Dans tous les cas, le tissu ainsi constitué présente encore d'autres particularités dont l'invention permet de tirer grand profit dans les propriétés de l'article de protection de literie en faisant application.
Dans un tel article, le tissu se présente sous une épaisseur faible, globalement de l'ordre du dixième de millimètre (de 0,1 à 0,7 mm), mais en bandes de grandes dimensions, généralement de l'ordre de 0,5 à 3 mètres dans le sens de la largeur comme dans le sens de la longueur.
On a pu alors observer que l'ensemble est aisément pliable, pour être aisément transporté, manipulé et emballé sous faible volume et faible poids. Mais aussi, une fois déployé, il s'applique très bien sur l'élément de literie qu'il protège et il n'a pas la moindre tendance à se froisser. L'absence de variations dimensionnelles et l'absence de tout peluchage pendant toute la durée utile représentent des avantages supplémentaires qui sont loin d'être négligeables.
Par ailleurs, le confort est assuré à la fois par le fait qu'il n'apparaît pas de plis restant permanents, par l'absence de rétractabilité, par la souplesse naturelle du tissu, par le fait que ses couches extérieures entraînent une certaine compressibilité en épaisseur.
Pour illustrer plus en détail la mise en oeuvre de l'invention, on s'intéresse ici spécialement au cas des alèses faites pour protéger les matelas.
C'est en fait dans ce cas que l'invention est la plus utile, encore qu'elle peut aussi trouver application sous forme de housse d'oreiller, housse de traversin, mais on sait que l'absence de transparence aux liquides présente alors moins d'importance.
Pour être complète, l'alèse suivant l'invention combine la matière choisie comme tissu avec une mise en forme permettant de la retenir sur les bords d'un matelas.
il est à signaler à ce sujet que grâce à l'invention, on n'a plus à craindre de variations dimensionnelles du tissu, pas même en cours d'usage.
Une capacité de fixation au matelas peut être apportée en rapportant un simple panneau réalisé en ladite matière au moyen de quatre rubans élastiques que l'on fixe de manière lâche en ses quatre angles pour pouvoir les glisser sous le matelas.
L'alèse peut également prendre la forme de ce que l'on appelle dans le métier une housse, par le fait qu'elle présente tant une largeur qu'une longueur supérieures à celles du matelas et que les quatre angles droits sont munis de cordons élastiques fronçant localement le tissu de sorte à former des rabats sur tout son pourtour.
Suivant une autre forme de réalisation, qui ne demande pas l'emploi de fils ou rubans élastiques, un panneau de tissu réalisé en ladite matière est cousu, aux deux extrémités de sa longueur, pour former d'une part une têtière se rabattant autour de la tête du matelas et d'autre part un rabat venant s'adapter au pied du matelas. Dans ce cas, les bords du matelas se trouvent eux-mêmes protégés par les côtés longs du panneau.
Suivant une variante de mise en oeuvre de l'invention, la mise en forme d'un panneau en un tissu tel que choisi préférentiellement, donc à base de résine organique synthétique, et notamment à base de polyesters tels que les résines de polypropylène, est réalisée en remplaçant les coutures par des soudures à chaud.
Pour constituer ledit tissu, l'invention prévoit d'utiliser en particulier des matières qui ont été précédemment proposées dans le commerce, mais pour d'autres applications qui n'en tirent pas les mêmes bénéfices.
Une matière convenant avantageusement pour l'application objet de l'invention est constituée d'une série de couches empilées parmi lesquelles se trouvent - une couche médiane à base de polyester à structure microporeuse, plus particulièrement réalisée sous la forme d'une mousse à partir de la résine liquide, sous une densité de l'ordre de 15 à 25 g/m2 - deux couches extérieures encadrant la couche centrale, qui sont chacune constituées de fibres de polypropylène liées entre elles sans tissage, sous une densité de l'ordre de 35 à 55 g/m2 - la cohésion des fibres dans les couches extérieures étant assurée, en même temps que la cohésion des trois couches entre elles, par un thermo-soudage suivant un réseau de points de collage qui comporte par exemple de 15 000 à 30 000 points de soudure par mètre carré, avec une pénétration de fusion sur 25 à 30 % de l'épaisseur de chaque couche extérieure.
Le cas échéant, une opération de thermo-soudage assurant une pénétration plus profonde améliore la cohésion entre les couches extérieures et la couche centrale.
On définit ainsi le produit de formule (I) qui peut s'écrire ((2,3)3H)-propionyl-b-ET-1 (19-35) ou ((2,3)3H)-prop-b-ET-1 (19-35).
La présente invention a aussi pour objet un procédé de préparation des produits de formule (I), telle que définie ci-dessus, caractérisé en ce que l'on soumet un produit de formule (III) Z1-Z2-Ile-Ile-Trp-Val-Z3-Thr-Pro-Glu-His-Val-Val Pro-Tyr-Gly-Leu-Gly-Ser-Z4-Z5-Z6-COOH (III) dans laquelle Z11 Z2, Z3, Z4, Z5 et Z6 ont les significations indiquées ci-dessus, à une réaction d'acylation par un dérivé réactif de l'acide carboxylique de formule X-COOH dans laquelle X a la signification indiquée ci-dessus.
Le dérivé réactif de l'acide carboxylique de formule X-COOR dans lequel R représente par exemple le radical succinimidyle, un radical norbornène ou encore tout composé d'estérification du radical carboxy, peut être trouvé dans le commerce, tel que notamment le N-succinimidyle-(2,3)3H-propionate, ou encore préparé selon les méthodes usuelles connues de l'homme du métier. Le radical X peut ainsi renfermer un ou plusieurs atomes de tritium.
On peut citer par exemple parmi les composés X-COOR, le composé N-hydroxy-5-norbornène- (2,3) -dicarboximide-propionate formé à partir de l'acide N-hydroxy-5-norbornène-(2,3)dicarboximide et de l'acide propionique, qui peut ainsi selon le marquage de l'acide propionique, comporter 1 à 5 atomes de tritium et notamment 4 ou 2.
La réaction d'acylation du produit de formule (III) en produit de formule (I) peut être réalisée dans les conditions usuelles connues de l'homme du métier.
La b-ET-1 (19-35) utilisée comme produit de départ peut être préparée selon les méthodes usuelles telles que notamment par un synthétiseur automatique en phase solide tel que le modèle, par exemple, 431A de Applied Biosystems utilisant la technologie Fmoc, tel que décrit dans la référence ATHERTON, E. et SHEPPARD, R.C. (1989) Solid phase peptide synthesis : a pratical approach, IRL Press, Oxford. Un tel procédé est illustré ci-après au point I de la partie expérimentale.
La présente invention a particulièrement pour objet l'utilisation d'un produit de formule (I), telle que définie ci-dessus, pour l'identification des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'endothéline.
La présente invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation telle que définie ci-dessus d'un produit radioactif de formule (I) telle que définie ci-dessus, caractérisée en ce que l'on met en contact l'enzyme de conversion de l'endothéline, un produit P dont on veut déterminer l'activité inhibitrice de l'enzyme de conversion de l'endo- théline, et le produit de formule (I) telle que définie cidessus ; et après incubation, l'on arrête la réaction de clivage, extrait sélectivement le produit formé de formule (Il) dans laquelle X, Z1 et Z2 ont les significations indiquées ci-dessus, et détermine par comptage l'activité inhibitrice du produit P à tester.
Le produit P tel que défini ci-dessus auquel on applique le test défini ci-dessus pour déterminer son activité inhibitrice de l'ECE peut être de nature diverse, sans limitation, et par exemple, peut être choisi parmi les phosphonimides, les phosphamides et les dérivés de ces produits, ou encore les inhibiteurs de métalloprotéinases tels que les dérivés thiol, carboxylates ou hydroxamates.
On peut également citer comme produit P le phosphoramidon (domaine public) que l'on appelle ici Pi et le N-(phényléthylphosphonyl)-Leu-Trp (TAKEDA) que l'on appelle ici P2, dont les activités inhibitrices de l'ECE sont connues et auxquels peut être appliqué le test de la présente invention, ainsi qu'il est montré ci-après au point II de la partie expérimentale.
L'ECE peut être obtenu, par exemple, selon les préparation et purification à partir de poumon de rat comme indiqué dans la référence : Takahashi M., Matsushita Y., Iijima Y.
and Tanzawa K. (1993) J. Biol. Chem. 268, 21394-21398.
La présente invention a tout particulièrement pour objet l'utilisation telle que définie ci-dessus caractérisée en ce que le produit solvant utilisé pour arrêter la réaction de clivage et extraire sélectivement le produit de formule (II), telle que définie ci-dessus est l'acétate d'éthyle.
La présente invention a encore plus particulièrement pour objet l'utilisation telle que définie ci-dessus caractérisée en ce que l'on utilise un produit de formule (I) telle que définie ci-dessus dans laquelle représente de préférence un radical 3H-propionyle et notamment (2,3) 3H-propionyle.
On obtient ainsi le produit de formule (II) telle que définie ci-dessus dans laquelle représente le radical 3H-propionyle et qui peut s'écrire 3H-prop-b-ET-l (19-21).
Le test tel que défini ci-dessus peut notamment avoir pour produit de départ le produit de formule (I) 3H-prop-b-ET-l (19-35) pour obtenir le produit de formule (Il) 3H-prop-b-ET-l (19-21) dont on détermine la quantité par comptage de sa radioactivité.
Selon le premier mode de réalisation, les prélèvements sont effectués en commençant par le milieu le plus dilué, puis en prélevant des fractions de milieux de plus en plus concentrés. Bien entendu, cela peut être effectué avec un même de moyen de prélèvement, comme expliqué précédemment. Ce premier mode de réalisation implique toutefois l'utilisation de nombreux conteneurs, de très nombreuses manipulations ainsi que le stockage d'au moins une fraction des milieux obtenus aux différents stades de dilution.
Selon le second mode de réalisation, on effectue les prélèvements au fur et à mesure des dilutions et on utilise, à chaque prélèvement, un moyen de prélèvement non contaminé. Ce second mode de réalisation permet d'éviter le stockage des milieux obtenus aux différents stades de dilution, mais implique l'utilisation de nombreux moyens de prélèvement, ou le nettoyage du moyen de prélèvement à chaque utilisation. En outre, il implique également de très nombreuses manipulations ainsi que l'utilisation de nombreux conteneurs.
Ainsi, le procédé connu présente donc d'importants inconvénients. En outre, un tel procédé est très difficilement automatisable.
On a maintenant découvert que, de façon surprenante, il est possible de réaliser des dilutions successives dans un conteneur unique en n'introduisant qu'une erreur négligeable dans la détermination. Autrement dit, cette méthode conserve aux échantillons dilués la caractéristique d'être représentatifs, aux facteurs de dilution près, de l'échantillon initial, à condition bien entendu de n'opérer que sur des échantillons de viscosité suffisamment faible, car les produits trop visqueux, sont difficiles à homogénéiser et, ayant tendance à adhérer aux parois des conteneurs et moyens de prélèvements, risquent de conduire à des erreurs importantes. Naturellement, si l'échantillon à analyser est trop visqueux, il est d'abord dilué pour être facilement manipulable, comme on l'a toujours fait, par de simples manipulations de routine.
La présente invention a donc pour objet un procédé pour une détermination qualitative et/ou quantitative d'un analyte présent dans un échantillon, dans lequel on réalise des dilutions successives dudit échantillon et on effectue une détermination sur au moins une partie desdites dilutions, caractérisé par le fait que l'on effectue lesdites dilutions successives dans un conteneur unique sans lavages, ni rinçages intermédiaires dudit conteneur.
Par "détermination qualitative", on entend la recherche et/ou l'identification d'un ou plusieurs analytes éventuellement présents dans l'échantillon.
Par "détermination quantitative", on entend l'évaluation de la concentration en analyte(s) présent(s) dans l'échantillon.
La méthode d'analyse ainsi que les moyens d'analyse utilisés dépendent bien entendu du type de détermination souhaitée ainsi que de l'analyte recherché. Ainsi, par exemple, lorsque l'analyte recherché est un microorganisme, on peut procéder à un dénombrement par spectrophotométrie ou à l'oeil nu après culture d'un échantillon dilué sur un milieu et dans les conditions connues, ou encore par des immunoessais à l'aide d'anticorps appropriés. Lorsque l'analyte est un composé chimique, sa détermination peut être effectuée selon les méthodes connues de la chimie analytique.
Selon un mode d'exécution particulier, le procédé défini précédemment comprend les étapes consistant à (a) obtenir dans ledit conteneur une solution ou dispersion d'un échantillon à analyser dans une quantité prédéterminée d'un liquide de dilution, ladite solution ou dispersion constituant un échantillon de départ, (b) prélever dans ledit conteneur une partie dudit échantillon de départ obtenu à l'issue de l'étape (a) et, éventuellement acheminer, à l'aide de moyens de transfert, au moins une partie de la quantité prélevée, vers des moyens d'analyse qualitative et/ou quantitative, (c) introduire dans ledit conteneur une quantité déterminée d'un liquide de dilution de façon à obtenir un échantillon plus dilué, et (d) recommencer à partir de l'étape (b) autant de fois que nécessaire en utilisant à chaque fois comme échantillon de départ, celui obtenu à l'issue de l'étape (c) immédiatement précédente, étant entendu que l'acheminement vers des moyens d'analyse, suivi de l'étape de détermination qualitative ou quantitative, est réalisé au moins une fois.
Bien entendu, pour la dernière dilution que l'on réalise, il n'est pas nécessaire d'effectuer l'étape (c) après l'étape (b). En outre, il va de soi que l'étape (d) est réalisée au moins une fois.
Le conteneur utilisé dans le procédé selon l'invention peut être réalisé en tout matériau approprié, généralement inerte vis-àvis de l'échantillon que l'on souhaite analyser ainsi que vis-à-vis de l'analyte. Parmi les matériaux constitutifs dudit conteneur, on peut notamment citer le verre, le téflon, l'acier ou l'inox. Le conteneur peut avoir toute forme appropriée, notamment la forme d'un erlenmeyer, d'un ballon, d'un tube, etc.
La taille du conteneur est choisie en fonction des quantités que l'on souhaite traiter, qui peuvent varier par exemple de 0,1 à 100 ml.
L'échantillon peut être dilué à l'aide d'un ou plusieurs liquides de dilution. Parmi les liquides de dilution pouvant être utilisés dans le procédé de l'invention, on peut notamment citer l'eau, les alcools, les mélanges hydroalcooliques, les huiles, les milieux de culture biologiques. Dans le cas d'une analyse bactériologique ou analogue, les liquides de dilution peuvent contenir des agents tels que par exemple des tensio-actifs, capables de neutraliser les agents conservateurs éventuellement présents dans l'échantillon à analyser.
Dans ce cas, on peut n'utiliser l'agent neutralisant que pour la première dilution.
Les liquides de dilution peuvent être introduits dans le conteneur à l'aide de différents moyens d'introduction tels qu'une pipette, un tube relié à une source de liquide de dilution, et éventuellement à une pompe, à une vanne et/ou à un robinet.
Le conteneur peut être muni de moyens d'introduction d'un liquide de dilution, par exemple un tube.
Les articles de protection des éléments de literie que l'on utilise à ce jour sont réalisés en une matière constituée pour être lavable. Il s'agit des alèses, housses d'oreillers, housses de traversins de type courant.
Dans des domaines d'application où les mêmes lits peuvent être utilisés d'un jour à l'autre par des personnes différentes, comme c'est le cas dans les hôtels ou dans les appartements en location meublée proposés en séjours saisonniers, ces articles ne donnent pas entière satisfaction en matière d'hygiène. Ils demandent à passer en machine à laver à chaque changement de locataire et, même après plusieurs lavages, il est fort difficile de retrouver une blancheur immaculée qui serait seule agréable pour le locataire ou l'utilisateur suivant.
En particulier, on peut observer que les alèses classiques, réalisées en molleton de coton et/ou de fibres synthétiques, deviennent grises et pelucheuses, et que, si les taches sont atténuées par le lavage, il en subsiste néanmoins des traces.