INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Ce procédé consiste à traiter, en milieu aqueux dans lequel il est immergé, un article textile coloré, formé de matériaux cellulosiques, en le mettant en contact avec une enzyme cellulolytique et de la perlite thermiquement expansée. Ces deux composés sont présents en une quantité suffisante pour être susceptible de modifier l'état de surface et/ou la teinte par une double action biochimique d'hydrolyse et d'abrasion mécanique.
Une composition utile pour la mise en oeuvre du procédé est également proposée qui comporte comme composants l'enzyme cellulolytique, la perlite expansée et un agent tampon pour le réglage du pH du milieu de traitement, et éventuellement un agent dispersant et/ou un agent chélatant.
Toutefois, ce document ne décrit pas clairement la forme sous laquelle cette composition se présente ni comment elle est mise en oeuvre.
Au travers de la description et de l'illustration qui en sont faites, il apparait que la composition qui est préparée par le mélange physique de divers composés ne peut pas être un mélange homogène aisément obtenu, mais plus vraisemblablement un mélange hétérogène de composés physiquement différents les uns des autres, en particulier par leur densité et leur granulométrie. Cette hétérogénéité s'accuse encore plus lors du transport de la composition conditionnée, du site de production au site d'utilisation, avec l'apparition, sous l'action de vibrations, d'un phénomène de séparation et de regroupement sélectif des composés par l'effet de leurs différences, en particulier de densités et granulométries.
C'est pourquoi la mise en oeuvre de la composition telle que décrite apparat à l'utilisateur devoir se faire seulement par l'introduction séparée des divers composés dans le milieu aqueux de traitement où est immergé l'article textile à traiter.
Natl. Acad. Sci. USA, 86: 3828-3832; Broxmeyer, H.E., Hangoe, G., & BR Cooper, S. (1992) Bone Marrow Transplant., 9: 7-10). In vitro, les données de différents laboratoires (Broxmeyer, H.E., Hangoe, G., Cooper, S., Ribeiro, R.C., Graves, V., Yoder, M., Wagner, J., Vadhan-Raj, S., Benninger, L., Rubinstein, P., & Broun, E.R. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 41094113; Lu, L., Xiao, M., Shen, R.-N., Grisby, S., & Broxmeyer, H.E. (1993) Blood, 81: 4148; Hows, J.M., Bradley, B.A., Marsh, J.C.W., Luft, T., Coutinho, L., Testa, N.G., & Dexter, T.M. (1992) Lancet, 340: 73-76; Cardoso, A.A., Li, M.L., Batard, P., Hatzfeld, A., Brown, E.L., Levesque, J.-P., Sookdeo, H., Panterne, B., Sansilvestri, P., Clark, S.C., & Hatzfeld, J.
(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8707-8711) suggèrent que le sang de cordon ombilical a une capacité supérieure pour générer les progéniteurs en culture, à celle de la moelle osseuse, et par conséquent, que le sang de cordon ombilical pourrait être suffisant pour effectuer des greffes de tissus hématopolétiques sur des receveurs adultes.
Cependant, à ce jour, un transfert de gène rapide dans l'ensemble (totalité) du compartiment de la cellule souche hématopofétique ou de toute autre cellule souche ou somatique au repos, (cet état de repos étant également désigné par "quiescence" ou comme correspondant à la phase Go), n'était pas obtenu de façon satisfaisante.
Le transfert de gène dans des cellules activées à partir d'un état de repos, notamment des cellules souches hématopolétiques activées à partir d'un état de repos, est l'un des aspects de l'invention.
L'invention a également pour objet des cellules à l'état de repos, notamment des cellules souches hématopolétiques à l'état de repos, contenant un gène hétérologue.
L'invention a également pour objet du tissu hématopolétique contenant un gène hétérologue susceptible de constituer des greffons à long terme.
L'invention concerne des cellules, notamment des cellules souches hématopolétiques, contenant dans leur génome tout ou partie d'un gène hétérologue.
L'invention concerne des cellules, notamment des cellules souches hématopolétiques, contenant tout ou partie d'un gène hétérologue dans leur génome, susceptibles d'être obtenues selon le procédé comprenant les étapes suivantes: - la préstimulation de cellules au repos, notamment de cellules souches hématopolétiques au repos dans un milieu contenant:: * des moyens de blocage d'au moins un inhibiteur du cycle cellulaire des dites cellules, notamment des dites cellules souches hématopolétiques, pendant une durée suffisante pour libérer les cellules, notamment les cellules souches hématopolétiques, de leur état de repos, et n'excédant pas de préférence 72 h, et est notamment inférieure à environ 20 h, et est de préférence d'environ 1 h à 15 h, et * des substances, notamment des cytokines, pour permettre l'activation d'un cycle cellulaire et/ou ultérieurement la traversée d'au moins un cycle cellulaire, - I'étape de transfert par la mise en présence des cellules, notamment des cellules souches hématopolétiques, obtenues à l'étape précédente avec tout ou partie d'un gène hétérologue, dans un milieu permettant le transfert de tout ou partie du gène hétérologue dans le génome des cellules, notamment des cellules souches hématopolétiques, pour obtenir des cellules, notamment des cellules souches hématopolétiques, comportant tout ou partie d'un gène hétérologue, - la récupération éventuelle des cellules, notamment des cellules souches hématopolétiques, obtenues à l'étape précédente.
L'invention concerne plus particulièrement des cellules souches hématopolétiques contenant dans leur génome tout ou partie d'un gène hétérologue et ayant un potentiel de multiplication in vitro égal ou supérieur à 106 et un potentiel de différenciation susceptible de couvrir tous les lignages hématopolétiques.
Les cellules souches hématopolétiques sont définies comme des cellules au repos pouvant donner naissance à tous les lignages hématopolétiques et aux cellules en dérivant. Quelle que soit l'origine des cellules souches (foie foetal, moelle foetale, sang de cordon ombilical, moelle adulte, sang périphérique) leur potentiel de prolifération est toujours très élevé: une cellule donnant naissance à plus de 1 à 20 x 106 cellules in vitro. Ce nombre peut être plus élevé si l'on utilise de nouvelles cytokines et des bioréacteurs.
Les cellules souches hématopolétiques peuvent provenir d'échantillon de moelle osseuse originaire d'une ponction de la crête illiaque sur des donneurs de moelle osseuse.
Les cellules souches hématopolétiques peuvent également être récupérées à partir de sang de cordon ombilical prélevé immédiatement après la naissance, de foie ou de moelle foetale de sang périphérique ou de tout autre organe du système hématopoiétique.
Un potentiel de multiplication égal ou supérieur à 106 signifie qu'une cellule souche hématopoïétique peut donner, dans des conditions appropriées, 106 cellules souches.
Le potentiel de multiplication des cellules souches hématopolétiques de l'invention peut atteindre 1 à 20 x 106 cellules en milieu StemGEM* et en culture traditionnelle. Cette valeur peut être élevée si l'on utilise de nouvelles cytokines et des bioréacteurs.
Par lignages hématopolétiques, on désigne l'ensemble des cellules donnant naissance à l'un des différents types cellulaires du sang.
Par cellules au repos susceptibles de rentrer dans le cadre de l'invention, on désigne des cellules qui ne se multiplient pas en situation physiologique ordinaire et sont susceptibles d'être activées en culture. Comme exemple, on peut citer: les cellules du foie, du cerveau ou les cellules souches hématopolétiques qui restent pour la majorité d'entre elles au repos chez l'individu normal.
Effluent à 180 g/l 1,3 mg/l traiter (U238) Effluent traité 0,22 g/l 1 g/l IU238 Pourcentage 99,8 % 99,9% d'uranium 238 fixé par le gel de silice La limite de détection de cette technique lors de cet essai est de 0,03 pg/l.
Essai 5 : Saturation d'une colonne remplie de silice par fixation d'une solution d'uranium, de cérium et d'europium Dans cet essai, on traite 1,4 1 d'un effluent contenant - 53 mg/l environ d'uranium, - 45 mg/l environ de cérium, et - 17 mg/l environ d'europium.
Le cérium et l'europium permettent de modéliser le comportement du plutonium et l'américium.
On effectue des prélèvements réguliers à la sortie de la colonne de gel de silice et les solutions obtenues ainsi que l'effluent initial sont analysés par spectrométrie d'émission à plasma. Par ailleurs, les cations précédemment fixés sont élués par un volume d'acide nitrique 2N correspondant sensiblement au volume de la colonne. Les résultats sont illustrés sur la figure 4 jointe représentant l'évolution de la concentration des différents cations à la sortie de la colonne, en fonction du volume d'effluent initial écoulé. Les résultats sont également donnés dans le tableau ci-dessous.
Volume Ce Eu U 0 0 0 0 50 0 0 0 100 0 0 0 150 5,2 0 0 200 36,6 5,68 0 250 45,56 13,29 0,3 300 44,3 18 2 350 0 44,5 17,76 14 400 42,1 16,88 18,5 450 43,5 16,34 30,2 500 44 17,16 38,1 550 44,1 17,97 42 600 43,5 16,88 44 650 42,9 17,05 50 700 44 17,3 53 750 44,5 16,4 52 800 44,2 16,9 52,2 900 44,1 17,04 52,6 1000 43,9 17,4 52,9 1100 44 17 52,4 1200 44,5 16,7 51,8 1300 44,4 16,5 51,6 1400 43,8 17,1 51,9 On constate que la limite de saturation de la colonne de gel de silice est d'environ 100 ml de solution pour l'europium et le cérium et de 200 ml pour l'uranium. Le cation éluant le premier est détecté après l'écoulement d'une centaine de millilitres. Ce volume correspond à la fixation d'environ 15 mg de cations (uranium, cérium et europium) pour 30 g de gel de silice contenus dans la colonne. L'élution des différents cations fixés par une solution d'acide nitrique, a permis de récupérer près de 100% des métaux et ainsi de régénérer totalement la colonne.
Essai 6 : fixation du plutonium 239 et de 1 'américium 241 présents dans un effluent réel provenant d'une tour d'évaporation industrielle Dans cet essai, on traite 15 1 d'un effluent contenant 62 Bq/m3 de plutonium 239 et 213 Bq/m3 d'américium 241. Les effluents avant et après passage sur la colonne de gel de silice sont analysés par comptage a. L'effluent obtenu contient 4 Bq/m3 de plutonium et 14 Bq/m3 d'américium. Le gel de silice retient donc respectivement 93,5% du plutonium et 93,4% d'américium.
On constate que la quasi-totalité des actinides présents dans l'effluent avant le traitement a été fixée sur le gel de silice et que l'effluent après le passage sur la colonne, est partiellement épuré en éléments émetteurs a.
Essai 7 : analyse de divers cations présents dans les effluents avant et après le passage sur une colonne de gel de silice Une analyse quantitative et qualitative de cations présents en solution avant et après le passage sur une colonne de gel de silice a été effectuée afin de déterminer les différents éléments susceptibles d'être retenus par le gel de silice. Les cations testés étaient les suivants : Na, Mg, Ca, Sr, Ba, Si, Al, Ga, Pb, Hg, Ti, Cr, Mn, Fe, Ni, Cu, Zn, Cd, Ta et Au.
Les résultats obtenus sont illustrés sur le tableau 1 ci-après.
Eléments Na Mg Ca Sr Ba Teneur du cation dans la 400 2 71 0,06 0,7 solution mère (mg/l) Teneur du cation dans la 395 1,8 73 0,06 0,6 solution après passage sur le gel de silice (mg/l) Eléments Si Al Sa Pb Hg Teneur du cation dans la 13 1,12 0,02 0,17 0,03 solution mère (mg/l) Teneur du cation dans la 47 1,09 0,02 0,15 0,03 solution après passage sur le gel de silice (mg/l) Eléments Ti Cr Mn Fe Ni Teneur du cation dans la 0,36 0,05 0,04 4,6 0,06 solution mère (mg/l) Teneur du cation dans la 0,34 0,03 0,04 4,07 0,06 solution après passage sur le gel de silice (mg/l) Eléments Cu Zn Cd Ta Au Teneur du cation dans la 1,16 4,1 0,08 1,8 0,03 solution mère (mg/l) Teneur du cation dans la 1,02 3,65 0,06 0,03 LD solution après passage sur le gel de silice (mg/l) L.D. : limite de détection proche de 0,01 mg/l.
On constate que seuls certains éléments comme le cuivre, le zinc, le tantale et l'or et dans une moindre mesure le fer, sont piégés par le gel de silice. Par contre, les éléments alcalins et alcalino-terreux, toujours présents dans les effluents (et notamment le sodium) ne sont pas piégés par la silice. Ceci permet d'éviter que la colonne ne soit trop rapidement saturée et perde son efficacité.
Essai 8 : essai sur des effluents alcalins fortement chargés en plutonium et en américium Dans cet essai, on traite 1/2 litre d'une solution fortement chargée contenant 19 840 kBq/m3 de plutonium 239 et 750 kBq/m3 d'américium 241. L'effluent initial et l'effluent obtenu après passage sur le gel de silice sont analysés par comptage a. L'effluent traité présente une concentration de 2477 kBq/m3 de plutonium 239 et de 87 kBq/m3 d'américium 241. Le facteur d'appauvrissement est de 8 pour le plutonium et de 8,6 pour l'américium.
En outre, une analyse qualitative et quantitative des cations présents dans l'effluent initial et dans l'effluent obtenu après traitement sur le gel de silice a été réalisée. L'analyse a été effectuée par torche à plasma. Les résultats sont illustrés dans le tableau 2.
Cations Teneur en cations Teneur en cations dans dans l'effluent à l'effluent traité traiter Na X 50000 " 50000 Mg 1 1 Ca 2 2
Tableau 4 . Performances éDuratoires de l'installation selon l'invention (aramètres bactériologiques)
Abatte ENTREE (Matières brutes) SORTIE (Bassin A) ment mov. min max. n mov. min. max n Germes totaux (nb cellules / ml) 1.6.107 100 8.8.107 11 9.8.107 6.8.105 1.7.109 22 0 Coliformes totaux (nb cellules/ ml) 4.104 135 2.105 11 2.106 55 2.5.107 22 0 Streptocoques fécaux (nb cellules) 6.104 140 3.6.105 11 7.6.103 5 8.104 22 1 log /ml) Au vu de ces résultats, on peut conclure que le procédé n'a pas d'effet significatif sur la réduction du nombre de germes tests.
L'efficacité de la fosse de décantation-digestion montée en parallèle sur le bassin A est montrée par les résultats suivants (sur les 42 derniers jours de fonctionnement, tableau 5).
Tableau 5 : Efficacité de la fosse de décantationdigestion
Rende ENTREE FOSSE SORTLE FOSSE ment (=sorue bassin A) mov. min. max. n mov. min. max. n DCO brute (mg/l) 1100 480 1509 6 516 323 659 5 53 % DCO filuée (mg/l) 270 188 347 6 280 201 357 5 -4% MES (mg/l) 2720 2100 3500 6 281 126 440 5 90 % La fosse permet donc de diminuer considérablement la charge en solide et en matières organiques au sein du bassin à haut rendement.Par ailleurs, la digestion des solides organiques mise en évidence par l'augmentation de la DCO soluble permet d'accélérer le processus général de biodégradation (les produits solubles sont plus facilement assimilables). La mise en parallèle de cette fosse est donc indispensable au bon fonctionnement de l'installation.
Le tableau 6 permet de montrer l'efficacité de la fosse septique de décantation-digestion par comparaison des effluents de sortie des bassins A (avec fosse) et B (sans fosse) à partir de la mise en service de la fosse (jour 260 à 411).
Tableau 6 : Influence de la fosse sur le fonctionnement de l'installation
BASSIN A BASSIN B Efficaci té % (*) mov. min. max. n moy. min. max. n MES (mg/l) 6530 2100 20100 20 25210 15200 49700 19 87 DCO brule (mats) 5082 480 19140 21 25495 16563 37951 19 87 DCO filtrée (mg/l) 540 188 876 21 1056 666 1682 19 68 (*) Efficacité du bassin A par rapport au bassin B calculée sur les moyennes.
De tout ce qui précède, il ressort que l'installation conforme à l'invention permet de traiter les matières de vidange domestiques par voie biologique.
Il y a donc une élimination et non transfert de la pollution. Les MES dans l'effluent de sortie étant essentiellement de la biomasse algale, les taux d'épuration obtenus permettent un rejet tout à fait compatible avec un traitement en station d'épuration collective classique.
De plus, l'installation conforme à l'invention fonctionne sans prétraitement, sans ajout de réactifs, sans aération artificielle.
Les boues produites sont essentiellement algales et sont méthanisées dans la fosse. Lors de leur éventuelle extraction, elles seront donc fortement minéralisées (stabilisées).
Les débits d'alimentation sont tels qu'ils sont, dans notre région et pendant la plus grade partie de l'année, compensés par l'évaporation, il n'y a donc pratiquement aucun rejet pendant les périodes estivales.
Seuls deux moteurs fonctionnent en continu (roue à aube et pompe de recirculation), limitant les causes de panne.
Lors de l'étude, les consommations suivantes ont été relevées (tableau 7).
Tableau 7 : Consommation énergétique de l'installation conforme à l'invention
Les matériaux composites selon l'invention sont obtenus par mélange du ciment tel que décrit précédemment, avec les fibres.
Le mélange se fait dans les mêmes conditions de préparation du ciment et ne seront donc pas reprises ici.
La composition ainsi obtenue est coulée dans un moule approprié, pour donner des dalles ou des panneaux.
Les produits moulés sont ensuite mis à sécher, d'une façon avantageuse à une température voisine de la température ambiante.
Les matériaux composites selon l'invention peuvent être utilisés notamment pour donner des panneaux de façade. L'avantage de ces matériaux réside dans leur vitesse de fabrication, et principalement dans leur vitesse de séchage.
EXEMPLES Méthodes de contrôle des propriétés du ciment Mesure de l'ouvrabilite L'ouvrabilité est mesurée à l'aide d'une table à secousse sur mortier normalisé (NFP 15403). Le mortier est introduit dans un moule tronconique puis démoulé et secoué à l'aide de la table à secousse. L'ouvrabilité est le rapport du diamètre du moule tronconnique sur celui du mortier après effondrement. II s'exprime en pourcentage.
Mesure du temps de pense Le temps de pris est mesuré à l'aide d'un appareil type Vicat automatique selon la norme NFP 15431.
Mesure des pronrietés mecanlaues On réalise des éprouvettes prismatiques (4X4X16 cm3) en coulant le mortier ou le coulis dans des moules standards en acier doux. Ces éprouvettes sont démoules 1 heure après le temps de prise et séchées à température ambiante. Les propriétés mécaniques sont testées sur ces éprouvettes.
Les essais sont réalisés en flexion en trois points (NFP 18407) sur six demiéprouvettes et en compression (NFP 15451) sur six demi-éprouvettes à l'aide d'une machine d'essai hydraulique (200 kN).
Mesure de la ductilité La ductilité est estimée à partir des enregistrements force/déplacement obtenus pour les essais de flexion.
Mesure de l'adhésion Un revêtement de 1 cm est réalisé à partir du mortier ou le coulis à tester sur une dalle en béton. A un jour, on effectue ensuite un carottage du revêtement sec, et on colle un plot métallique dans le trou laissé par le carottage. Le plot est ensuite arraché à I'aide d'un arrachemètre: la force appliquée pour une surface de 20 à 25 cm2 détermine la valeur de l'adhésion.
Exemple comparatif 1: mortier phosphomagnésien standard On prépare un mortier phosphomagnésien à partir des constituants suivants: - 25 % de phase liante constituée de: 48,5 % en poids de phosphate monoammonique, 48,5 % en poids d'oxyde de magnésium, . 3 % en poids d'acide borique qui est un agent retardant, - 75 % de sable normalisé CEN 31196-1 dont les particules élémentaires ont une taille comprise entre 100 et 500 um.
On prépare différents mortiers à différentes teneurs en eau par mélange des matériaux définis ci-dessus avec de l'eau. Le mélange est réalisé de la manière suivante : on malaxe à l'aide d'un malaxeur type HOBART les matériaux à l'état sec pendant 30 s à petite vitesse (60 tr/min), puis on ajoute l'eau dans la proportion souhaitée. Ensuite, on continue à malaxer pendant 1 min 30 à petite vitesse puis 1 min 30 à grande vitesse (120 tr/min).
On mesure l'ouvrabilité, la densité, le temps de prise de ces mortiers ainsi que les propriétés mécaniques obtenues. Les résultats sont rassemblés dans les tableaux 1 et 2.
Les amorces utilisées sont les suivantes: amorce 5', identifiée par SEQ ID N014 S'GTAGTTCGATGTAGAAAGCG 3' amorce 3', identifiée par SEQ ID N015 5' GCATCCGGCAACTGCACG 3.
La PCR est effectuée selon une succession de 35 cycles enchaînant, après l'étape de synthèse de 1'ADNc, 1 min, à 940C, 1 min, à 540C et 1 min, à 720C.
L'ARN total extrait de différents types de cellules selon la technique décrite par P.Chomzynski et N.
Sacchi (Analytical Biochemistry 1987;162,156-159) sans traitement par 1'ADNase, a été utilisé dans cette réaction RT-PCR.
Dans la figure 15, sont présentés les résultats de PCR à partir d'une photographie sous lumière ultraviolette d'un gel d'agarose imprégné de bromure d'éthidium, dans lequel on a effectué une électrophorèse des produits d'amplification PCR déposés séparément dans les différents puits.
Le puits numéro 1 contient un mélange de marqueurs de poids moléculaire ADN et les puits 2 à 9 représentent, dans l'ordre les produits amplifiés à partir des ARN totaux des cellules suivantes: 2-LM7PC (ECACC n093010817); 3-PLI2 (ECACC n092072201); 4-cellules de médulloblastome humain; 5-MRC-5 (Fibroblastes humains de poumons embryonnaires); 6cellules mononuclées sanguines huamines de donneur sain; 7- cellules provenant d'un mélange de lignées lymphoblastoïdes B dérivées du sang périphérique de différents patients atteints de SEP; 8- cellules provenant d'une lignée lymphoblastoïde B dérivée du sang périphérique d'un patient atteint de SEP; 9- témoin ne contenant pas d'acides nucléiques (témoin "eau").
On peut constater l'existence d'une bande d'ADN spécifique d'environ 700 paires de bases, correspondant à la taille attendue, amplifiée dans les échantillons provenant de patients atteints de SEP (LM7PC, PLI2, lignées de lymphocytes B) et non dans les cellules testées provenant des témoins non-atteints de SEP (MRCS, cellules mononuclées sanguines et médulloblastome).
EXEMPLE 9: DETECTION DE SEQUENCES SPECIFIQUES MSRV-1 et MSRV-2 DANS DIFFERENTS ECHANTILLONS DE PLASMA PROVENANT DE PATIENTS ATTEINTS DE SEP OU DE TEMOINS La même technique RT-PCR que celle décrite dans l'exemple 8 a été utilisée pour détecter les génomes MSRV1 et MSRV-2 dans des plasmas obtenus après prélèvement de sang sur EDTA de patients atteints de SEP et de témoins non-SEP.
L'extraction des ARN de plasma a été effectuée selon la technique décrite par P.Chomzynski et N. Sacchi (Analytical Biochemistry, 1987, 162, 156-159), après addition d'un volume du tampon contenant du guanidinium thiocyanate à 5 ml de plasma gardé congelé à -8O0C après recueil.
Pour MSRV-2, la PCR a été effectuée dans les mêmes conditions et avec les mêmes amorces que celles décrites dans l'exemple 8.
Pour MSRV-1, l'amplification a été effectuée en deux étapes. De plus, l'échantillon d'acides nucléiques est préalablement traité par 1'ADNase et un contrôle PCR sans RT (transcriptase inverse AMV) est effectué sur les deux étapes d'amplification de manière à vérifier que l'amplification RT-PCR provient exclusivement de 1'ARN MSRV-1. En cas de contrôle sans RT positif, l'échantillon aliquoté d'ARN de départ est à nouveau traité par 1'ADNase et amplifié à nouveau.
La première étape de RT-PCR MSRV-1 est effectuée selon une variante du procédé d'amplification d'ARN tel que décrit dans la demande de brevet nO EP-A-O 569 272.
Notamment, l'étape de synthèse d'ADNc est effectuée à 420C pendant une heure et l'amplification se déroule sur 40 cycles, avec une température d'hybridation des amorces ("annealing") de 530C. Le volume réactionnel est de 100 1.
Les amorces utilisées pour cette première étape sont les suivantes: amorce 5', identifiée par SEQ ID N016 5' AGGAGTAAGGAAACCCAACGGAC 3' amorce 3' S'TAAGAGTTGCACAAGTGCG 3', identifiée par SEQ ID N017 Après cette étape, 10 1 du produit d'amplification est prélevé et utilisé pour réaliser une deuxième amplification PCR dite "nichée" avec des amorces situées à l'intérieur de la région déjà amplifiée. Cette deuxième étape se déroule sur 35 cycles,avec une température d'hybridation des amorces ("annealing") de 530C. Le volume réactionnel est de 100 1.
Les amorces utilisées pour cette deuxième étape sont les suivantes: amorce 5', identifiée par SEQ ID N018 5'TCAGGGATAGCCCCCATCTAT 3' amorce 3', identifiée par SEQ ID N019 5' AACCCTTTGCCACTACATCAATTT 3'.
Dans les figures 17 et 18, sont présentés les résultats de PCR à partir de photographies sous lumière ultra-violette de gels d'agarose imprégnés de bromure d'éthidium, dans lesquels on a effectué une électrophorèse des produits d'amplification PCR déposés séparément dans les différents puits.