INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les cellules HBLlOOrasl ont été ensemencées dans des plaques de 96 puits à une concentration de 4.103 cellules par puits dans 50 iil de milieu supplémenté de 7% de sérum de veau fétal inactivé à la chaleur, d'antibiotiques et de glutamine. Lorsque les cellules adhèrent au puits de culture (généralement au bout de 2 à 3 jours), les antisens encapsulés sont ajoutés, dans chaque puits, à deux fois la concentration finale dans 50 p1 de milieu de culture, résultant dans un volume final de 100 Cll par puits.Les antisens encapsulés ajoutés sont les suivants: - AS-Val (R5 : SEQ ID n" 10): Cffigure 2, ligne 1; - AS-Gly (SEQ ID n" 14: 5'-CACCGÇCGGCGC), dirigé contre l'ARNm de Ha-ras normal : Cf figure 2, ligne 2; - INV-Val (SEQ ID n" 15), correspondant à l'antisens AS-Val, mais dans l'orientation inverse: Cf figure 2, ligne 3; - AS-Val complexé au CTAB, mais non encapsulé: Cf figure 2, ligne 4; - mélange de AS-Val libre et d'un antisens non-spécifique de 20 mer (SEQ ID n" 16: 5'-CCCTCCTACCGCGTGCGAC) encapsulé: Cf figure 2, ligne 5.
Après 72 heures d'incubation à 370C dans une atmosphère humidifiée contenant 5% de C02, les cellules ont été comptées au moyen d'un hèmocytomètre.
La viabilité cellulaire, examinée au même moment par coloration au bleu trypan, est supérieure à 95% pour les cellules traitées et non traitées.
Les résultats obtenus sont présentés sur la figure 2. Ils sont exprimés sous forme de pourcentage d'inhibition de la croissance selon la formule suivante: 100 x (Nn-N) / (Nn-NO), dans laquelle NO est le nombre de cellules présentes au départ, Nn est le nombre de cellules non traitées après n jours de croissance, et N est le nombre de cellules traitées après n jours.
Ces résultats montrent que: - avec l'antisens AS-Val adsorbé à des nanoparticules, on obtient une inhibition de la prolifération des cellules HBLlOOrasl à des concentrations très basses (50 à 200 nM).
Ces concentrations sont environ 100 fois plus faibles que celles auxquelles l'antisens non encapsulé est actif.
- l'antisens AS-Val est spécifique des cellules contenant ras muté puisque aucun effet n'est observé sur les cellules HBLlOOnéo. De même, l'antisens dirigé contre le gène normal (AS-Gly), l'oligonucléotide de séquence inversée (INV) et l'oligonucléotide non-spécifique (NS) n'ont pas d'effet sur la prolifération des cellules HBL100ras1.
- l'antisens AS-Val complexé au CTAB, mais sans nanoparticule ne produit qu'un effet très limité, montrant que les deux éléments (antisens + nanoparticule) sont essentiels pour obtenir l'effet recherché. Ceci est confirmé par l'absne d'effet observé en présence de l'antisens AS-Val libre et d'un antiseens non-spécifique encapsulé. Ce dernier résultat indique également que le complexe antisens- nanoparticle doit être formé préalablement à l'administration pour que l'effet recherché se produise.
Ces résultats montrent donc que les composition de l'invention présentent une sélectivité et une activité très importantes. L'effet maximum pour une seule injection d'antisens a été observé trois jours après ajout de l'antisens à la culture.
Exemple 3 : Etude comparée de la pénétration cellulaire (figure 3) Cet exemple montre que les antisens selon l'invention possèdent, outre leurs grandes sélectivité et efficacité, une capacité de pénétration cellulaire nettement améliorée par rapport aux antisens classiques.
Pour mesurer la quantité d'antisens incorporée dans les cellules HBL100 (rasl et néo); les cellules ont été traitées avec des antisns, libres ou encapsulés, marqués en 5' au phosphore 32. Plus précisément, les cellules HBL100rasl (5.105) ont été étalées sur 2 ml de milieu complet pour chaque mesure. Lersque les cellules deviennent adhérentes, 5.106 cpm d'antisens et 400 pmoles d'oligonucléotide portera ont été ajoutés, seuls ou après adsorption sur nanoparticules comme décrit précédemment. Après les périodes d'incubation indiquées (Cf figure 3), les cellules sont récoltées et la radioactivité totale est mesurée (1) dans le milieu de culture et (2) dans la fraction comportant les débris cellulaires.Les antisens ont ensuite été extraits des lysats cellulaires comme décrit précédemment Ceichmann-Weinberg et al., Gene 72 (1988) 297), puis analysés en électrophorèse sur gel dénaturant contenant 20% de polyacrylamide pour analyser les antisens incorporés intracellulairement.
PROCEDE DE PREPARATION DE COMPOSITIONS OBTENUES A PARTIR DE MOUSSES DE POLYURETHANNES, COMPOSITIONS RESULTANTES ET UTIUSATION DE CELLES-CI La présente invention a pour objet un procédé de préparation de compositions obtenues à partir de mousses de polyuréthannes. Elle conceme de même les compositions susceptibles d'être obtenues par mise en oeuvre d'un tel procédé ainsi que l'utilisation de ces dernières pour l'obtention de mousses de polyuréthannes.
La revalorisation des mousses de polyuréthannes connaît un essor particulièrement important depuis quelques années. En effet, d'une part, le tonnage mondial annuel de production de mousses élevé et d'autre part, le coût des matières premières employées pour fabriquer ces mousses, rendent intéressant économiquement le recyclage de ces matériaux.
Plusieurs voies sont connues et étudiées actuellement.
La première consiste à incinérer les mousses, préalablement compactées et broyées, pour en utiliser l'énergie dégagée. En effet, les mousses de polyuréthannes présentent une énergie récupérable équivalente à celle du charbon. L'inconvénient majeur de ce procédé est qu'il ne permet, bien entendu, pas la récupération des réactifs ou dérivés utilisés pour l'obtention des mousses de polyuréthanne.
Une autre méthode consiste à les recycler telles quelles, en tant que charge, lors de la préparation de nouvelles mousses. Dans ce cas, les mousses à recycler sont broyées finement et introduites dans la composition à base de polyol et de polyisocyanate. L'inconvénient de ce procédé est que la quantité de mousses recyclées, employées comme charge, est limitée et ne dépasse pas 10 à 15 %, sous peine d'obtenir des propriétés non satisfaisantes de la mousses résultante.
II est par ailleurs connu de recycler des mousses de polyuréthannes en mélangeant cellesci, sous la forme de particules fines avec un liant choisi parmi des prépolymères de polyuréthanne ou de polyisocyanates, tels que le méthylénediphényl diisocyanate. Une fois le mélange effectué, la composition est injectée dans un moue et comprimée à chaud pour obtenir finalement un matériau de densité élevée, qui trouve certaines applications dans l'isolement phonique, les revêtements (gymnase), rameublement (appui-tate, accoudoir), I'automobile (pare-chocs). Ainsi, ce procédé ne permet de préparer que des polyuréthannes utilisables dans un domaine d'application relativement limité et ne donne notamment pas accès à des mousses souples de faible densité.
Des procédés de recyclage de mousses consistant à effectuer une dépolymérisation chimique, pour récupérer le polyol et l'amine correspondants, ont été étudiés. D'une façon générale, la mousse est tout d'abord compactée et broyée. Elle est par la suite mise en contact avec différents réactifs, tel que l'eau, les alcools et plus particulièrement le glycol, les amines, comme l'éthanolamine, ou encore les lactames, dans des quantités telles que la totalité du polymère est transformée pour donner les monomères correspondants.
Le problème engendré par de tels procédés ne se situe pas véritablement au niveau de la réaction de dépolymérisation mais plutôt à celui de la séparation ultérieure des produits obtenus. En effet, selon la méthode employée, on retrouve dans le mélange le polyol, Ramie, des composés du type urée, I'agent de dépolymérisation, bien souvent utilisé en excès, ainsi que tous les additifs entrant à l'origine dans la composition de la mousse. II est donc aisé de comprendre que l'obtention du polyol, de ramine ou de l'isocyanate, sous forme pure, en vue de leur réutilisation dans la préparation de nouvelles mousses, est très compliquée par la présence de tous les composés du mélange réactionnel issu de la réaction de dépolymérisation.
La présente invention a donc pour objet un procédé de recyclage des mousses de polyuréthanne ne présentant pas les inconvénients des procédés mentionnés ci-dessus.
Ainsi, le procédé selon l'invention permet d'obtenir une composition à base d'oligomêres issus du polyuréthanne de départ, liés à un polyol ; composition directement utilisable pour préparer des mousses de polyuréthannes.
Par ailleurs, le procédé selon l'invention rend possible un recyclage des mousses jusqu'à 40 %, sans que l'on constate par ailleurs d'effet néfaste de telles quantités recyclées sur les propriétés des mousses obtenues à partir de ces compositions.
De plus, il n'est pas nécessaire de mettre en oeuvre des procédés complexes et coûteux de séparation des additifs présents à l'origine dans les mousses, ou des sous produits, avant d'introduire ces compositions dans un nouveau procédé de préparation de mousses.
En outre, les mousses de polyuréthannes obtenues à partir des compositions selon Invention présentent des propriétés au moins aussi bonnes que celles des mousses préparées sans matériau recyclé. Par conséquent, le procédé selon Invention permet d'accéder à des mousses dont les domaines d'applications sont aussi étendus que ceux des mousses d'origine.
Ainsi, la présente invention a pour objet un procédé de préparation dune composition utilisable pour l'obtention de mousses de polyuréthannes consistant à faire réagir, en milieu anhydre, une mousse de polyuréthanne avec un polyol, la quaritité de mousse étant inférieure à 40 % en poids par rapport à la masse totale de polyol et de mousse de polyuréthanne.
Un autre objet de la présente invention est constitué par des compositions susceptibles d'être obtenues par ce procédé.
Enfin, rutilisation de telles compositions pour obtention de mousses de polyuréthanne par réaction de ladite composition avec un polyisocyanate, en présence, le cas échéant, d'un agent d'expansion, est un dernier objet de l'invention.
Le dispositif de contrôle est constitué d'un boîtier (1) renfermant un logiciel, d'un capteur kilométrique (2), d'une carte mémoire (3), d'un boîtier de télécommande (4), d'un clavier (5), d'un afficheur (6) et de deux voyants (7).
Fonctionnement du dispositif: La manoeuvre de la clé de contact du véhicule donne une impulsion au logiciel intégré dans le boîtier (1). De ce fait, l'heure, la date et le kilométrage du véhicule sont enregistrés dans la carte mémoire (3). Tant que le véhicule roule, le capteur (2) comptabilise le nombre de kilomètres effectués et ce, jusqu'à l'arrêt complet du véhicule. Dés lors, l'heure, la date et le kilométrage sont de nouveau enregistrés dans la carte mémoire (3). Le véhicule arrêté, un des voyants (7), clignote pour que l'utilisateur choisisse le mode correspondant à son arrêt. Plusieurs modes sont intégrés dans le logiciel tels que: Visite à client, bureau, repas, repos, fin de journée, week-end ou réparations. D'autre modes peuvent être disponibles, en option, et sont faits en fonction de l'activité de l'utilisateur et de la société qui l'emploie.
Pour exemple d'un mode choisi: "Visite d'un client", l'utilisateur entre un code (D0210) par l'intermédiaire du clavier (5), code reconnu par le logiciel et celui de la société, éventuellement un clavier "AZERTI" peut être raccordé au logiciel intégré pour permettre à l'utilisateur d'enregistré un message correspondant au client visité, l'information se lit sur l'afficheur (6), il suffit d'appuyer sur la touche "valide" du clavier (5) pour l'enregistrer dans la carte mémoire (3), ainsi que toutes les autres informations et données de la journée.
La journée terminée, la carte mémoire (3) est récupérée dans le boltier (1), pour etre lue par l'intermédiaire d'un lecteur relié à un ordinateur: de ce fait, un rapport détaillé de la journée ainsi que plusieurs croquis, graphiques peuvent être imprimés. Ces données peuvent être cumulées pour être imprimées toutes les semaines ou tous les mois.
APPAREIL DE RADIOTHERAPIE UTILISANT UN au ACCELERATEUR LINEAIRE D'ELECTRONS A TRES HAUTE FREQUENCE ET DES MOYENS DE PROTECTION HORS CHAMP UTILE DESCRIPTION DOMAINE TECHNIQUE La présente invention concerne un appareil de radiothérapie utilisant un accélérateur linéaire d'électrons et des moyens de protection hors champ utile.
Il s'agit de moyens de protection des utilisateurs (dont le patient) de l'appareil vis-à-vis des rayons X, qui atténuent ces rayons (en dehors du faisceau correspondant au champ utile de traitement du patient).
La présente invention s'applique notamment au traitement de tumeurs.
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE On connaît déjà des appareils comprenant - une source de rayons X qui est montée sur un support capable de tourner autour d'un patient à traiter par radiothérapie, et - des moyens de protection des utilisateurs de l'appareil vis-à-vis des rayons X.
On connaît en particulier un tel appareil de radiothérapie muni de moyens d'examen du patient par tomographie, grâce au document suivant auquel on se reportera (1) T. Rock Mackie et al., "Tomotherapy : A new concept for the delivery of dynamic conformal radiotherapy", Med. Phys. 20(6), Nov/Dec 1993.
Dans cet appareil, les moyens de tomographie sont montés sur le support tournant et la source de rayons X comprend - un accélérateur linéaire d'électrons et - des moyens de production d'un faisceau de rayons X à partir du faisceau d'électrons fourni par l'accélérateur.
Tous ces appareils connus de radiothérapie présentent des inconvénients de poids et d'encombrement.
Ces inconvénients résultent - d'une part, de la nécessité de faire tourner autour du patient la source de rayons X, et, dans le cas de l'appareil décrit dans le document (1), des moyens d'examen par tomographie du patient et - d'autre part, de la lourdeur des moyens de protection des utilisateurs vis-à-vis des rayons X (hors champ utile) EXPOSE DE L'INVENTION La présente invention a pour but de remédier aux inconvénients précédents.
Elle a a pour objet un appareil de radiothérapie comprenant - un accélérateur linéaire d'électrons apte à fournir un faisceau d'électrons et comprenant une source d'électrons, une structure accélératrice linéaire apte à accélérer, grâce à de l'énergie fournie par des micro-ondes, les électrons émis par la source, et des moyens d'alimentation de la structure accélératrice en micro-ondes, - une cible prévue pour recevoir le faisceau d'électrons fourni par l'accélérateur et pour produire un faisceau de rayons X à partir de ce faisceau d'électrons, - des moyens de collimation de ce faisceau de rayons X, - un support tournant sur lequel sont montés l'accélérateur, les moyens de production du faisceau de rayons X et les moyens de collimation, et - des moyens de protection des utilisateurs de l'appareil vis-à-vis des rayons X, cet appareil étant caractérisé en ce que la fréquence des micro-ondes est supérieure à 3 GHz et en ce que les moyens de protection vis-à-vis des rayons X comprennent un élément qui est apte à atténuer les rayons X et dans lequel se trouvent la cible et au moins l'extrémité de la structure accélératrice, extrémité par où sort le faisceau d'électrons.
Le choix d'une telle fréquence supérieure à 3 GHz permet d'utiliser une source d'électrons accélérés de volume actif très faible.
Le choix de la fréquence permet, pour une énergie donnée des électrons et une longueur donnée de la structure accélératrice - d'abaisser la puissance des moyens d'alimentation de cette structure accélératrice en micro-ondes, - d'utiliser des moyens d'alimentation plus légers et moins encombrants et - de transmettre aisément la puissance électrique requise depuis un générateur fixe jusqu'aux moyens d'alimentation de la structure qui sont montés sur le support tournant, par exemple à l'aide de contacts électriques glissants.
De plus, le fait de placer l'extrémité de la structure accélératrice dans les moyens de protection vis-à-vis des rayons X conduit à un raccourcissement de la longueur de l'accélérateur en dehors de ces moyens de protection.
xylosus portant différents vecteurs navettes.
EXEMPLES EXEMPLE 1 n Construction de G2 Dar assemblage de ozènes synthétiques Le gène codant pour la région en amino-acides 130-230 de la glycoprotéine G du virus RS, nommé G2, où nous avons en plus changé deux résidus Cys en position 173 et 186 en Ser par rapport à la séquence d'origine, est obtenu par les techniques d'assemblage de gènes en phase solide (Stahl S. et coL, 1993. BioTechniques, 14:424-434). La séquence des oligonucléotides a été optimisée en combinant les codons usuels de bactéries telles que Ecoli et Staphylococcus.
Les oligonucléotides ont été synthétisés par la chimie des phosphoramidites sur le synthétiseur d'ADN automatique (Gene Assembler Plus, Pharmacia Biotech) selon les recommandations du constructeur. Les oligonucléotides à fixer en phase solide sont biotinylés en extrémité 5' par le réactif Biotin-on phosphoramidite (Clontech). Les autres oligonucléotides sont phosphorylés en 5' par le réactif Phosphate-on amidite (Clontech) selon le protocole de Clontech. Les oligonucléotides sont déprotégés et sont purifiés selon les recommandations de Pharmacia. Les oligonucléotides biotinylés sont purifiés par chromatographie liquide sur phase réverse (colonne PEP RPC, Pharmacia).
Le gène est assemblé en deux parties : G2am (amont) de l'aa 130 à 177 avec deux sites de restriction BamHI et PstI en 5' et 3' du gène, G2av (aval) de l'aa 177 à 230 avec deux sites de restriction PstI et BamHI en 5' et en 3' du gène. Le gène G2 est reconstitué en ligaturant les deux fragments G2am et G2av par le site PstI.
a) Assemblage de gène de G2am (FIGURE 1): Dans un micro tube, deux oligonucléotides complémentaires dont l'un est biotinylé en 5': TH1B = 5'-Biotin-CCGGATCCT ATGACCGTGA A-3' et THZ = 5'-GTTTTTGGTT TTCACGGTCA TAGGATCCGG-3' sont hybridés et immobilisés sur des billes magnétiques couplées à la streptavidine (Dynal, Oslo, Norway). Le double brin immobilisé comprend un site de restriction BamHI et le brin complémentaire à celui qui est biotinylé possède 6 à 15 nucléotides de dépassement de son côté 5' (phosphorylé) permettant à l'oligonucléotide suivant de venir s'hybrider.L'hybridation de ce dernier oligonucléotide est effectuée en élevant la température du milieu à 70 C pour éviter la formation de structures secondaires. La ligature est faite en ajoutant de la T4 DNA ligase (Gibco BRL). Ainsi le gène est construit successivement en prenant la précaution à chaque cycle de rincer le support solide afin d'éliminer l'excès d'oligonucléotides non liés avant d'ajouter l'oligonucléotide suivant. Le dernier double brin ligaturé contient un site de restriction PstI.
Le double brin est ensuite libéré de son support solide en le digérant avec les enzymes de restrictions BamHI et Pstl puis ligaturé dans le vecteur de clonage et de séquençage prit28 (Hultman et col., 1988, Nucleosides Nucleotides 7:629-638) digéré par les mêmes enzymes : le vecteur résultant est pRIT28G2am de taille 3067pb. La séquence nucléotique de G2am est déterminée par séquençage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem).
b) Assemblage de nène de G2av (FIGURE 1): De la même manière le gène G2av est assemblé en phase solide sur billes magnétiques par les deux premiers oligonucléotides complémentaires dont l'un est biotinylé en 5': TH13B = (5'-Biotin-TGTGAAGCTT AGTCGACCGG TTTG-3') et TH12 = (5'-GCCGACCACC AAACCGGTCG ACTAAGCTTC ACA-3'), ainsi de suite. Le double brin est libéré du support solide par digestion enzymatique successivement par PstI et Hindi!!, cloné dans pRIT28 : le vecteur résultant est nommé pRIT28G2av de taille 3091pb. La séquence nucléotique de G2av est déterminée par séquençage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem).
c) Construction du gène G2 = G2am + G2av: Les deux fragments G2am et G2av sont ligaturés par le site de restriction PstI et le gène constitué est cloné dans pRIT28 par les sites BamHI en 5' et HindIII en 3': le vecteur résultant est nommé pRIT28G2 de taille 3220pb. La séquence nucléotique de G2 est déterminée par séquençage d'ADN sur le séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2 est digéré par BamHI et HindI!! et cloné dans le vecteur navette : pSE'G2BBXM (7666 pb) (FIGURE 3).
Liste des oligonucléotides nécessaires pour l'assemblage de gènes G2 BamHI TH1B (20mer) : 5'-Biotin-CCGGATCCT ATGACCGTGAA A-3' BamHI TH2 (30mer) : 5'-GTTTTTGGTT TTCACGGTCA TAGGATCCGG-3' TH3 (28mer) : 5'-AACCAAAAAC ACCACGACCA CCCAGACC-3' TH4 (31mer) : 5'-GTTTGCTCGG CTGGGTCTGG GTGGTCGTGG-3' TH5 (31mer) : 5'-CAGCCGAGCA AACCGACCAC CAAACAGCGTC-3' TH6 (29mer) : 5'-CGGTTTGTTC TGACGCTGTT TGGTGGTCG-3' TH7 (29mer) : 5'-AGAACAAACC GCCGAACAAA CCGAACAAC-3' TH8 (34mer) : 5'-CTTCGAAATG GAAATCGTTG TTCGGTTTGT TCGG-3' TH9 (27mer) : 5'-GATTTCCATT TCGAAGTGTT CAACTTC-3' Pst I TH10 (33mer) : 5'-TGCGCAGAT GCTGCTCGGC ACGAAGTlGA ACA-3' Pst I TH11 (22mer) : 5'-GTGCCGAGCA GCATCTGCAG CA-3' HindIII TH12 (33mer) : 5'-GCCGACCACC AAACCGGTCG ACTAAGCTTC ACA-3' HindIII TH13B (19mer) : 5'-Biotin-CCCTGTGAAG CTTGGTTTG-3' TH14 (32mer): 5'-CATAAACCGC AGACCACCAA ACCGAAAGAA GT-3' TH15 (32mer) : 5'-GTGGTCGGCA CTTCTTTCGG TTTGGTGGTC TG-3' TH16 (31mer) : 5'-AAAACCGACC TTCAAAACCA CCAAAAAAGA T-3' TH17 (31mer) : 5'-CGGTTTATGA TCTTTTTTGG TGGTTTTGAA G-3' TH18 (30mer) : 5'-GGGCAAAAAA ACCACGACCA AACCGACCAA-3' TH19 (31mer) : 5'-GTCGGTTTTT TGGTCGGTTT GGTCGTGGTT T-3' TH20 (34mer): 5'-GGGGCGATCAG CAAACGTATC CCGAACAAAA AACC-3' TH21 (33mer) : 5'-TTTTGCCCGG TTTTTTGTTC GGGATACGTT TGC-3' Pstl TH22(25mer) : 5'-ATC TGCAGCAACA ACCCGACCTG CT-3' Pst I TH23 (34mer) : 5'-TGATCGCCCA GCAGGTCGGG TTGTTGCTGC AGAT-3' II) Construction de G2sub par mutagénèse dirigée: Le fragment de gène où les quatre résidus Phenylalanine en position 163, 165, 168 et 170 sont remplacés par des Sérines, est généré par amplification génique (PCR), à partir du gène G2 inséré dans le vecteur pRIT28, en utilisant comme couples d'amorces RIT27/TNG73 et RIT28/TNG72 (voir FIGURE 2.(1)).Les amorces TNG72 et TNG73 sont complémentaires d'une région de 19 nucléotides renfermant trois des quatres Phénylalanine Rit27 : 5'-GCTTCCGGCT CGTATGTTGT GTG-3' Rit28 : 5'-AAAGGGGGAT GTGCTGCAAG GCG-3' TNG72 5'- C CAT TGC GAA GTG TGC AAC TCC GTG CCG AGC AG-3' TNG73 3'-GC TTG CTA AGG GTA AGG CTT CAC AGG TTG-5' D'une part, l'amorce TNG73 introduit les trois premières mutations (TTC en TCC) sur le fragment en amont amplifié avec RIT27. D'autre part l'amorce TNG72 introduit les trois dernières mutations (TTC en TCC) sur le fragment en aval amplifié avec RIT28. Cinq cycles de températures (96 c, 15 sec; 50 c, 1 min; 72 c, 1 min) suivis de vingt cycles (96 c. 15 sec; 60 c.
15 sec; 72 c, 15 sec) Les deux fragments amplifiés sont mélangés dans un seul tube dilué dans du tampon de PCR sans amorces et la réaction d'extension est faite en cinq cycles de températures (96 c, 15 sec; 54 c, 30 sec; 72'c, 1 min). Le produit d'extension est dilué à 1/100 dans du tampon PCR contenant les amorces RIT27 et RIT28 et l'amplification génique est faite en 30 cycles de températures (96 c, 15 sec; 54 c, 15 sec; 72 c, 30 sec).
Le fragment est ensuite digéré avec les enzymes de restrictions BamHI/HindIII et cloné dans le vecteur prit28 digéré par les mêmes enzymes: pRIT28G2sub. La séquence nucléotique de G2Sub est déterminée par séquençage d'ADN sur l'appareil de séquenceur automatique ABI, selon les recomandations du constructeur (Applied Biosystem). Le fragment G2sub est digéré par BamHI et HindllI et cloné dans le vecteur navette pSE'GZsubBBXM (7666 pb)(FIGURE 3).
ffl Construction de G2del: (voir FIGURE 2.(2)) De la même manière, le fragment de gène G2 délété de la partie renfermant les 4 résidus Phénylalanine de l'aa 162 à l'aa 170 est généré par PCR en deux fragments: en amont avec les amorces RIT27/TH48 d'une part et en aval avec RIT28/THll d'autre part. Les amorces TH11 et TH48 sont complémentaires de 13 nucléotides.