INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
EXEMPLE III : UTILISATION DU GOSSYPOL COMME AGENT DE PONTAGE DES PROTEINES Le gossypol est un polyphénol naturellement présent dans les glandes à pigment présentes au niveau des organes du cotonnier de certaines variétés appelées pour ces raisons "glanded". Le gossypol est capable de former des bases de Schiff avec les groupements aminés libres des protéines.
Selon l'invention, le gossypol est placé dans des conditions favorables pour assurer le pontage intra et/ou intercaténaires protéiques de telle sorte que le film obtenu à partir de la préparation soit peu soluble dans l'eau. Sa solubilité dans l'eau (mesurée au bout d'un temps d'immersion de 24 heures dans de l'eau à 250C) est de l'ordre de 10 % (p/p: par rapport à la matière sèche sans tenir compte de la teneur en plastifiant). La résistance du film est fonction de sa teneur en gossypol.Un film qui renferme 1 % de gossypol à l'état lié résiste à une force de perforation de 1 N, tel que mesuré au moyen d'un appareil dit texturimètre de type fabriqué par la société RHEO TA.XT2 - 99, Route de Versailles - 91160 CHAMPLAN (FRANCE) équipé d'une sonde de 4 mm de diamètre. (le film renfermait 20 % de plastifiant et était conditionné avec une humidité relative de 56 t et présentait une épaisseur de 100 ssm).
Pour tirer partie de la réactivité du gossypol, il est préférable d'utiliser une matière première qui n'a pas été chauffée au cours d'un procédé technologique mis en oeuvre antérieurement.
Si l'on ne dispose pas d'amandes de variétés de cotonnier "glanded", il est possible d'ajouter au cours de la fabrication de la solution filmogène du gossypol sous forme libre.
Dans ce cas, la matière première utilisable pour faire le film sera indépendamment des amandes, des farines ou des tourteaux, par exemple.
Les films lipoprotéiques renfermant du gossypol sous forme liée possèdent de bonnes propriétés d'adhérence pour les tissus biologiques, de telle sorte qu'ils pourraient être utilisés dans le domaine médical comme pansement cutané ou comme succédané de la peau.
Les expérimentations in vivo sur le rat ont montré la capacité de ces films possédant un grammage de 20 à 40 mg/cm2 de favoriser la cicatrisation d'une plaie correspondant à une avulsion cutanée par comparaison avec l'emploi de tulle gras.
Un exemple de formulation d'un tel film peut être le suivant : la solution filmogène est réalisée à pH 10 en présence d'ammoniaque et de 30 % (p/v) d'amandes de variétés de cotonnier "glanded". Le mélange est porté à 400C et agité durant une heure. Il est ensuite centrifugé deux fois à 500 g durant 5 minutes.
Du glycérol est ajouté au surnageant à raison de 20 % (p/p) par rapport à la matière sèche de la solution.
La solution filmogène ainsi obtenue est coulée sur un support en polychlorure de vinyle recouvert d'un voile de gaze découpée en son milieu sur une surface de 15 cm2. La quantité de solution filmogène coulée est 2 calculée pour avoir un grammage de 30 mg/cm2.
EXEMPLE IV : ALKYLATION DES PROTEINES DE COTON PAR DU FORMOL Le formol réagit surtout avec des résidus E aminés de la lysine, les groupements sulfhydrile de la cystéine, phénolique de la tyrosine et imidazole de l'histidine pour former une base de Schiff. En général, le formol à 40 % (p/v) est ajouté goutte à goutte dans la solution filmogène centrifugée ou dans le mélange de matières premières à admettre dans l'extrudeur. Le temps d'incubation avant l'étalement de la solution filmogène ou l'extrusion du film peut être d'une minute ou davantage. La température de la solution peut être comprise entre 00C et 900C. La quantité de formol est ajoutée pour avoir un rapport molaire formol/(Lys, Cys, His, Tyr) préférentiellement compris entre 1 et 24. Il pourra cependant être supérieur.Par exemple, un film réalisé à partir d'une farine délipidée de graines de coton "glandless", de 100 Zm d'épaisseur, conditionné à 56 % d'humidité relative renfermant 20 % de plastifiant (p/p par rapport à la matière sèche) possède une résistance à la perforation de 8 N (mesurée avec le texturimètre précité) et une solubilité de 25 % (p/p /matière sèche, plastifiant non pris en compte). Un film ainsi obtenu est parfaitement transparent, jaune pâle, très souple, légèrement extensible mais peu élastique.
De tels films sont par exemple utilisables en tant qu'emballage.
Il est préférable d'utiliser des matières premières ne renfermant pas de gossypol si l'on veut mettre en oeuvre les réactions dirigées vers les groupements E aminés de la lysine.
Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires comme les ribozymes. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.
Le gène thérapeutique peut aussi être un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme une réponse immunitaire. Dans ce mode particulier de mise en oeuvre, I'invention permet donc la réalisation de vaccins permettant d'immuniser l'homme, notamment contre des microorganismes ou des virus. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).
Cette séquence d'acides nucléiques est de préférence présente au niveau des régions El, E3 ou E4, en supplément ou en remplacement de séquences délétées.
La présente invention a pour second objet principal un adénovirus comportant au moins un gène d'origine virale hétérologue dont l'expression est contrôlée par un promoteur inductible et plus préférentiellement un promoteur inductible à la tétracycline.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention le gène d'origine virale hétérologue est ou dérive d'un gène du génome d'un AAV ou un de ses homologues fonctionnels.
Les AAV sont des virus à ADN de taille relativement réduite, qui s'intègrent dans le génome des cellules qu'ils infectent, de manière stable et site-spécifique. Ils sont également capables d'infecter un large spectre de cellules, sans induire d'effet sur la croissance, la morphologie ou la différenciation cellulaires. Par ailleurs, ils ne semblent pas impliqués dans des pathologies chez l'homme. Le génome des AAV a été cloné, séquencé et caractérisé. Il comprend environ 4700 bases, et contient à chaque extrémité une région répétée inversée (ITR) de 145 bases environ, servant d'origine de réplication pour le virus.Le reste du génome est divisé en 2 régions essentielles portant les fonctions d'encapsidation: la partie gauche du génome, qui contient le gène rep impliqué dans la réplication virale et l'expression des gènes viraux; la partie droite du génome, qui contient le gène cap codant pour les protéines de capside du virus.
Trois promoteurs y ont été localisés et nommés selon leur position approximative en unités cartographiques p5, p19 et p40. Quatre protéines sont au moins synthétisées à partir de la région rep et ont été nommés d'après leur masse moléculaire apparente, Rep78, Rep68, Rep52 et Rep40. Les 2 mRNA transcrits à partir du promoteur p5 sont utilisés pour la synthèse de Rep78 et Rep68. Quant à Rep52 et Rep40 ils sont synthétisés à partir des messagers provenant du promoteur pl9. En ce qui concerne plus particulièrement le gène cap. il code pour les protéines d'enveloppe du virus (VPI, VP2 et VP3). VP3 est la protéine de capside majoritaire et sa séquence en acides aminés est contenue dans celles de deux protéines plus grandes mais moins abondantes VP1 et VP2 (faire un schéma).Ces gènes rep et cap ont été caractérisés et leur séquences respectives décrites dans la littérature (Srivastava et al., J. Virol. 45 (1983) 555).
L'utilisation de vecteurs dérivés des AAV pour le transfert de gènes in vitro et in vivo a été décrite dans la littérature (voir notamment WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US5,139,941, EP 488 528). Généralement, les constructions utilisées en thérapie génique contiennent une délétion des gènes rep et/ou cap qui sont remplacés par un gène d'intérêt.
Pour se répliquer, les AAV ont besoin de la présence d'un virus auxiliaire ("helper") capable de transcomplémenter les fonctions nécessaires à leur réplication . Il peut s'agir en particulier d'un adénovirus, d'un virus de l'herpès ou d'un virus de la vaccine. (En l'absence d'un tel virus auxiliaire, les AAV restent sous forme latente dans le génome des cellules infectées, mais ne peuvent se répliquer et ainsi produire des particules virales.) Classiquement, les AAV recombinants sont donc produits par cotransfection, dans un lignée cellulaire infectée par un virus auxiliaire humain (par exemple un adénovirus), d'un plasmide contenant le gène d'intérêt bordé de deux régions répétées inversées (ITR) d'AAV et d'un plasmide portant les gènes d'encapsidation (gènes rep et cap) d'AAV.La co-infection avec l'adénovirus démarre une cascade d'événements qui aboutissent à la production de titres élevés d'AAV et diminuent sensiblement la production d'adénovirus. Cette cascade démarre par la synthèse du produit du gène Ela qui induit la transcription à partir des promoteurs p5 et p19 et conduit à la synthèse d'une petite quantité de protéines Rep. Une ou plusieurs protéines Rep synthétisées à partir de p5 induisent alors la synthèse en quantité plus abondante d'ARNm à partir des 3 promoteurs à un niveau beaucoup plus important et d'une manière coordonnée. En absence d'adénovirus, le génome d'AAV est soit perdu soit intégré dans le chromosome de l'hôte. D'autres gènes que ElA de ladénovirus sont aussi nécessaires pour une expression efficace des gènes de l'AAV.
Avantageusement, la demanderesse a mis en évidence qu'il était possible de placer efficacement au moins l'expression d'un des gènes viraux de l'AAV sous contrôle d'un promoteur inductible dans un adénovirus et plus préférentiellement de contrôler l'expression des fonctions d'encapsidation d'AAV en particulier l'expression des gènes rep et/ou cap, ou de tout gène homologue fonctionnel.
Un homologue fonctionnel correspond à tout gène obtenu par modification (mutation, suppression, addition, etc) des gènes rep ou cap et présentant une activité de même nature. De tels gènes homologues fonctionnels peuvent également être des gènes obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques au moyen de sondes correspondant aux gènes rep ou cap. A titre de gène rep muté susceptible d'être contrôlé selon l'invention, on peut plus particulièrement citer son mutant inl 177 décrit dans la publication Y. Yang et al.,( (1992) Journal of virology, 6058-6069) et dérivant d'une insertion de sérines entre les codons 286 et 287.
Selon un mode préféré de l'invention, le promoteur inductible mis en oeuvre est un promoteur inductible à la tétracycline tel que défini précédemment.
Un tel adénovirus est avantageux à plusieurs titres: il simplifie considérablement sur le plan des manipulations, le procédé pour préparer des stocks en AAV. En effet, dans ce cas particulier, on met essentiellement en oeuvre que ledit adénovirus comportant les gènes rep et cap sous contrôle du promoteur inductible, un AAV recombinant et une lignée cellulaire adéquate. Enfin, les titres attendus en AAV à partir d'un tel adénovirus s'avèrent supérieurs à ceux obtenus selon un procédé classique.
Le promoteur inductible peut notamment être introduit en substitution d'un des promoteurs conduisant normalement l'expression du ou des gène(s) considéré(s) et en particulier en substitution du promoteur p5, p19 ou p40. Le promoteur p5 semblant être le plus impliqué dans le démarrage de la cascade d'événements conduisant à la production du virus, on procède plus préférentiellement à sa substitution par un promoteur inductible par la tétracycline de préférence de type Op2/Tk.
En conséquence, si la lentille ne correspond pas à ce que l'on souhaite, il suffit d'enlever la colle et de replacer une goutte de cette colle à l'extrémité de la fibre.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré du procédé objet de l'invention, le diamètre de l'extrémité de la fibre optique est réduit par attaque chimique de cette extrémité.
De préférence également, la goutte de colle est placée à l'extrémité de diamètre réduit en trempant cette extrémité dans la colle optique puis en l'en retirant.
Pour la mise en oeuvre de l'invention, on peut réduire le diamètre (extérieur) de l'extrémité de la fibre optique à une valeur de l'ordre de 10 pm à 30 um On peut utiliser une colle optique transparente à au moins une longueur d'onde appartenant au domaine allant de 1 um à 1,5 um.
On peut en outre également choisir une colle optique dont la viscosité est comprise dans l'intervalle allant de 4000 mPa.s à 10000 mPa.s.
La goutte de colle optique peut être solidifiée au moyen d'un rayonnement comme par exemple un rayonnement infrarouge ou un rayonnement ultraviolet ou tout autre moyen de solidification : polymérisation ou séchage par exemple.
BRÈVE DESCRIPTION DU DESSIN La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description d'exemples de réalisation donnés ci-après, à titre purement indicatif et nullement limitatif, en faisant référence à la figure unique annexée qui illustre schématiquement des étapes d'un mode de mise en oeuvre particulier du procédé objet de la présente invention.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ D'UN MODE DE RÉALISATION PARTICULIER Le procédé schématiquement illustré par cette figure vise à la formation d'une lentille à l'extrémité d'une fibre optique 2 par exemple en silice.
Cette fibre optique a par exemple un diamètre extérieur égal à 125 um.
Le coeur (non représenté) de la fibre a par exemple un diamètre de 7 um.
Selon le procédé illustré, on commence par cliver, perpendiculairement à l'axe X de la fibre 2, l'extrémité 4 de cette fibre, extrémité en laquelle on veut former la lentille.
On réduit ensuite le diamètre de cette extrémité de la fibre optique à une valeur souhaitée D, qui vaut par exemple 15 w.
On obtient cette réduction de diamètre par attaque chimique de l'extrémité 4 de la fibre optique.
Pour ce faire, on procède de la façon suivante On trempe l'extrémité de la fibre dans une solution tampon acide fluorhydrique-fluorure d'ammonium.
Après réduction du diamètre à la valeur D, l'extrémité 4 de la fibre optique 2 est trempée dans un récipient contenant une colle optique qui est transparente à 1,5 w et dont la viscosité est comprise entre 4000 mPa.s et 10000 mPa.s.
A titre purement indicatif et nullement limitatif, on utilise la colle commercialisée par la société Elco Produits sous la référence VITRALIT 4280.
De préférence les fibres sont liées entre elles et à la feuille y compris au niveau des parois internes des cratères.
Dans les cas où il existe des éléments fibrillés formant entretoises entre les deux parois internes qui se font face dans les zones de rétrécissement des cratères, correspondant aux zones de discontinuité, de préférence les fibres sont liées entre elles et aux éléments fibrillés.
La présence des fibres en surface de la feuille thermoplastique sur la face extérieure, en contact avec la peau de l'usager, donne au matériau de l'invention un toucher fibreux, plus agréable.
Selon une première version, le liage des fibres entre elles et sur la feuille est obtenu grâce à la seule thermoplasticité des matières qui les composent. Dans ce cas, il est préférable que les fibres soient en majorité des fibres thermoplastiques, de manière à ce que le matériau composite de l'invention ait une cohésion suffisante entre la feuille et les fibres.
De préférence la matière constitutive de la feuille et des fibres thermoplastiques est la même, par exemple du polyéthylène. Cependant la feuille peut être dans une autre matière telle que du polyamide ou du polypropylène, ou un mélange de polyoléfines. Les fibres thermoplastiques peuvent être en polypropylène.
Selon une seconde version, le liage des fibres entre elles et sur la feuille est obtenu grâce à la présence de colle, de préférence en combinaison avec la thermoplasticité des matières qui composent les fibres et la feuille. Dans ce cas il est possible de mettre en oeuvre des matières, ayant des points de fusion sensiblement différents.
La quantité de colle doit être relativement faible pour ne pas altérer la souplesse du matériau composite. Elle sera de préférence de 0,2 g/m2 à 5 g/m2 pour une quantité de fibres de 2 g/m2 à 20 g/m2 C'est un autre objet de l'invention que de proposer un procédé de fabrication du matériau plan composite fibreux précité. Ce procédé consiste a) à disperser une nappe de fibres majoritairement thermoplastiques, sur une feuille thermoplastique, éventuellement pré-enduit de colle, b) à présenter l'ensemble ainsi constitué sur une surface pourvue d'orifices, la forme périphérique de chaque orifice résultant de la superposition partielle de plusieurs formes géométriques, notamment cercle, ellipse, carré, polygone, c) à chauffer cet ensemble à une température proche de la température de ramollissement des matières thermoplastiques constitutives des fibres et de la feuille tout en créant une aspiration à travers les orifices, en sorte d'obtenir par claquage de la feuille au droit desdits orifices, des cratères dont la base a une forme périphérique qui comporte au moins une zone de discontinuité telle qu'en parcourant le pourtour de chaque cratère, la paroi interne présente une inclinaison non uniforme avec des angles d'inclinaison par rapport à la perpendiculaire au plan de la face extérieure de la feuille qui varient entre des valeurs positives et des valeurs négatives, cet angle étant négatif au moins dans la zone de discontinuité.
Le chauffage de l'ensemble feuille/fibres permet d'obtenir à la fois le ramollissement de la feuille thermoplastique dans la zone correspondant aux orifices mais également d'obtenir le liage des fibres entre elles et de la feuille au point de contact entre ces différents constituants. En particulier on observe que les parois des cratères formés lors du claquage de la feuille sous l'effet de l'aspiration à travers les orifices, constituent des zones de liaison privilégiées entre les fibres et avec la feuille.
La dispersion des fibres sous forme de nappe à la surface de la feuille thermoplastique peut être obtenue par tous moyens, notamment par pulvérisation de fibres selon la technique des fibres coupées ou SPUN ou encore la technique "soufflé-fondu" dénommée MELT-BLOWN.
Selon une version préférée, le procédé de fabrication est un procédé continu et la surface sur laquelle est présenté l'ensemble feuille/fibres est constituée par la surface périphérique d'un tambour rotatif équipé d'un système interne de mise en dépression.
Le chauffage de l'ensemble feuille/fibres peut notamment être réalisé à l'aide de panneaux radiants disposés au-dessus de la surface du tambour dans la portion de celui-ci , qui est équipée du système de mise en dépression.
Un matériau plan composite fibreux de l'invention peut encore être obtenu à l'aide d'un autre procédé , selon lequel on disperse une nappe de fibres thermoplastiques, sur une feuille thermoplastique perforée qui présente une multiplicité de cratères à zone de discontinuité, comme décrit précédemment, la dispersion des fibres étant réalisée au moins sur la face extérieure, lisse, de la feuille alors que les fibres sont à une température suffisante pour qu'elles adhèrent naturellement à la surface de la feuille après refroidissement de celle-ci.
Dans ce cas on obtient un recouvrement uniforme de la feuille par la nappe de fibres et un liage ponctuel des fibres entre elles et à la feuille, grâce à la seule thermoplasticité des matériaux, sur la surface de celle-ci, exclusion faite des cratères.
Pour être certain de l'accrochage des fibres entre elles et sur la surface de la feuille, une variante du procédé précité consiste à pré-enduire la face lisse de la feuille thermoplastique perforée à l'aide d'une colle, résistant à ladite température. De préférence, il s'agit d'une colle qui est également un polymère thermoplastique, applicable par la technique dénommé MELT-BLOWN.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va être faite d'un exemple de réalisation d'une feuille perforée présentant une multiplicité de cratères de forme oblongue à deux rétrécissements successifs, illustré par le dessin annexé dans lequel - la figure 1 est une vue schématique de dessus d'une partie de la feuille présentant un cratère - la figure 2 est une vue schématique en coupe de la feuille selon l'axe II-II - la figure 3 est une vue schématique de dessus d'une feuille illustrant la disposition en lignes et en rangées des cratères selon l'invention, - la figure 4 est une représentation schématique de l'installation de fabrication d'un matériau composite fibreux, comprenant la feuille perforée, - et la figure 5 est une vue schématique en coupe du matériau composite, comprenant une feuille perforée selon la figure 2.
La feuille thermoplastique perforée qui va être décrite est destinée à être mise en oeuvre dans une structure absorbante utilisable comme article d'hygiène, par exemple une couche-culotte ou une protection féminine. Bien sûr elle peut être utilisée dans d'autres applications, dans lesquelles seront mises à profit ses propriétés de transfert de liquides dans un sens et d'effet anti-retour dans l'autre.
Un mélange de ce phénol (0,3 g, 1,66 mmol), de 1 (triphénylméthyl) -4- (3-hydroxypropyl) imidazole (0,61 g, 1,66 mmol) et de triphénylphosphine (0,65 g ; 2,5 mmol 1,5 équiv.) dans 30 ml de THF anhydre est refroidi et agité pendant 10 min sous azote. 0,57 g de diéthylazodicarboxylate (2,5 mmol ; 1,5 équiv.), dissout dans 10 ml de THF récemment distillé, est ajouté lentement au mélange réactionnel et agité de façon continue à température ambiante pendant 16 heures. Après élimination du solvant sous pression réduite l'huile qui en résulte est purifiée par chromatographie en colonne (SiO2 ; éluant : éthylacétate : hexane 3 : 7).
L'huile purifiée est dissoute dans du THF (8 ml) et chauffée avec du HC1 2N à 80"C pendant 5 heures.
Après refroidissement, le THF est éliminé sous pression réduite et Ph3COH est extrait avec du diéthyléther. La phase acqueuse est neutralisée avec une solution de carbonate de potassium et le produit est extrait dans du chloroforme (3 x 100 ml). Les extraits chloroformiques réunis sont séchés et évaporés sous pression réduite pour donner une huile. Cette huile dans 2 ml de 2-propanol est convertie en oxalate et précipitée avec du diéthyléther. Le produit solide est collecté et purifié par HPLC préparative pour donner le sel de trifluoroacêtate sous forme de cristaux blancs, P. F.
169-171"C depuis le 2-propanol.
La RMN 1H et la HPLC montrent que ce composé contient 2 isomères (E/Z) en proportion 4 : 1.
HO CH3-C! (CH2)-OH CH,-CH.-C,,9$,OH /[ I I i) DEi,DTT:iF. ps, W Ph,C-;N CC, 24 Cl,nl,NO. 3 CF;Cûln -. (C'2 C=CH -C, n 2N 1- Ct C%,-C:i', ~~~~ - ''3 ,C=C-CP À) CH--,-CH (r) CHO, (i) PLC/'r
Ce composé este purifié par HPLC préparatoire et on obtient deux isoméres en ratio 4. 1 (E/Z).
- Méthode F A 2 g d'une solution de 2-(tert.-butyldiméthylsilyl)1-(diméthylsulfamoyl)imidazole (6,92 mmol) dans 20 ml de THF anhydre, refroidie et agitée sous azote à -78 C, on ajoute lentement 6 ml de n-butyllithium 1,5 M dans du THF à -78 C. Puis, on laisse le mélange se réchauffer jusqu'à 0 C. Une solution d'oxyde d'éthylène (3 g ; 0,068 mol 10 équiv) dans 10 ml de THF anhydre est ajoutée lentement à 0 C, et le mélange est agité pendant une nuit à la température de la pièce. Le mélange réactionnel est versé dans 50 ml d'eau et le THF est évacué sous pression réduite. Le produit est extrait avec du CHCl3 (3 x 150 ml), séché (Na2 S04) et concentré sous vide en laissant une huile brune.Cette dernière est purifiée par colonne de chromatographie (gel silice) en utilisant du diéthyléther : éther de pétrole 40-60 C (1 : 1) en tant qu'éluant, en donnant le composé hydroxyéthyle biprotégé (1,2 g ; 52% de rendement).