INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'idée de base de l'invention consiste à utiliser une glace optique 4 de conception différente et comportant des zones spécialisées conçues d'une manière telle que la partie supérieure de la glace optique 4 éclaire les points compris, typiquement, entre 0 et 50 bas sur la grille photométrique, tandis que la partie inférieure de la glace optique 4 éclaire les points compris, typiquement, entre 0 et 10 haut sur cette même grille photométrique, donc sans risque d'occultation par la visière 6 pour ces derniers.
Dans un premier mode de réalisation, la source lumineuse 3 est associée à un réflecteur parabolique et la glace optique 4 est configurée de la manière illustrée figure 2.
Plus précisément, on a représenté sur la figure 2, en coupe verticale, une glace optique 4 comprenant une pluralité de zones spécialisées, au nombre de quatre sur l'exemple illustré (ce nombre n'étant cependant en aucune façon limitatif).
Plus précisément, la moitié supérieure de la glace optique 4 comporte deux "motifs" optiques identiques dont chacun est constitué d'une bille 7 (assurant une fonction d'étalement) combinée à un prisme déviateur 8 (assurant une fonction de déviation), la bille étant formée sur l'une des faces 9 de la glace 4 et le prisme étant formé sur l'autre face 10 de cette même glace.
La moitié supérieure de la glace 4 comporte deux motifs de base ainsi constitués, formant ainsi une première zone 11. La courbure des billes 7 est calculée pour procurer un étalement du faisceau compris entre 10 et 300 en direction horizontale et verticale, et les angles < il et a2 des prismes 8 sont choisis de manière à procurer, typiquement, une déviation comprise entre 2 et 30 vers le bas (de préférence, les angles 1 et a2 sont égaux). Chaque motif de base (bille 7 et prisme 8) va ainsi procurer essentiellement un éclairement de la grille photométrique dans une zone comprise entre 0 et 50 bas.
La moitié inférieure de la glace 4 comprend quant à elle des motifs de base conçus, à l'opposé, pour éclairer le haut de la grille photométrique. De préférence, les deux motifs de cette moitié sont différents, le motif de la zone 12 possédant un prisme produisant une déviation moindre que le prisme de la zone 13, située la plus en bas. Typiquement, les courbures des billes sont les mêmes que pour la zone 11, tandis que le prisme de la zone 12 a un angle Q3 procurant une déviation de l'ordre de 2" à 30 vers le haut et le prisme de la zone 13 a un angle a4 procurant une déviation de l'ordre de 7" à 80 vers le haut.Ainsi, la zone 12 éclaire essentiellement les points compris entre 0 et 50 haut de la grille photométrique, tandis que la zone 13 éclaire essentiellement les points compris entre 0 et 10 haut de cette même grille.
Les figures 2a et 2b illustrent une première variante de réalisation de la figure 2 dans laquelle, au lieu de prévoir des billes 7 (remplissant la fonction d'étalement) sur l'une des faces de la glace et des prismes de déviation sur l'autre face, on forme des cylindres verticaux 20 sur la face interne et des cylindres horizontaux 21 adossés à des prismes horizontaux de déviation verticale sur la face externe de la glace 4. Cette variante simplifie l'usinage du moule.
La figure 3 illustre une autre variante de réalisation de la figure 2 dans laquelle, au lieu de prévoir les billes 7 (fonction d'étalement) sur l'une des faces de la glace 4 et les prismes (fonction de déviation) sur l'autre face, les deux éléments optiques, bille et prisme, sont combinés en une seule surface optique située d'un seul et même côté de la glace 4.
Bien entendu, dans ce cas, pour permettre une déviation dans le même sens, les angles a'1, a'2, - des prismes sont les inverses des angles al, a2, - des prismes de la figure 2.
Cette variante illustrée figure 3 permet en particulier de disposer d'une glace 4 présentant une face extérieure lisse, donc plus esthétique et moins sujette à l'accumulation de poussières.
De façon générale, dans ce premier mode de réalisation, qu'il s'agisse de la variante de la figure 2, de celle des figures 2a et 2b ou de celle de la figure 3, le nombre de motifs de base réalisé sur la glace optique 4 n'est pas limitatif, et l'on pourrait ainsi avoir un nombre plus élevé de ces motifs, par exemple de six ou huit au lieu de quatre, dès lors que la spécialisation des différentes zones telles que 11, 12 et 13 est conservée.
De même, en direction horizontale, chaque motif de base est répété identiquement sur toute la largeur du feu de signalisation.
La figure 4 illustre un second mode de réalisation dans laquelle on associe à la source lumineuse 3 un réflecteur non plus parabolique, mais sphérique 16.
Pour obtenir le même diagramme d'éclairement que celui du mode de réalisation précédent (diagramme que l'on ne réexposera pas), on utilise une glace optique 4 du type "champ de paillettes" disposée verticalement devant le réflecteur 16.
Un autre objet de l'invention concerne les compositions pham comprenant une composition telle que définie cidessus, en association avec un ou plusieurs diluants ou adjuvants pharmaceutiquement acceptables. Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées in vitro, ex vivo ou in vivo. In vitro, elles peuvent permettre de transférer à des lignées cellulaires des acides nucléiques antisens, par exemple dans le but d'étudier la régulation des protéines ras et la voie de signalisation ras-dépendante. Ex vivo, elles peuvent être utilisés pour le transfert thérapeutique d'acides nucléiques antisens anti-ras dans une cellule issue d'un organisme, en vue de conférer à ladite cellule une résistance aux oncogènes ras, avant sa réadministration à un organisme.In vivo, elles peuvent être utilisés pour l'administration directe d'acides nucléiques antisens anti-ras. En particulier, une administration intra-tumorale est tout à fait avantageuse puisqu'elle permet de délivrer efficacement et localement la composition active. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent donc un véhicule pharmaceu-tiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection intratumorale. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par additif selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables.
Les compositions selon l'invention étant capables de moduler l'activité des protéines ras oncogènes, elles permettent d'inhiber le processus de développement et peuvent ainsi être utilisées pour le traitement de différents cancers. De nomixeux cancers ont en effet été associés à la présence de protéines ras oncogéniques. Parmi les cancers renfermant le plus souvent des gènes ras mutés, on peut citer notamment les adénocarcinomes du pancréas, dont 90 o ont un oncogène Ki-ras muté sur le douzième codon (Almoguera et coll., Cell S (1988) 549), les adénocarcinames du colon et les cancers de la thyroïde (50tu), les cancers de la vessie (40tu, voir Alcishi et al., Int. J.Onc. 4 (1994) 85) ou les carcinomes du poumon et les leucémies myéloïdes (30%, Bos, J.L. Cancer Res. 49 (1989) 4682).
La présente invention sera décrite plus en détail avec les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.
Légende des figures Figure 1: Position sur leur cible (A) et efficacité d'hybridation (B) des antiseris 1-5.
Position sur leur cible (C) et efficacité d'hybridation (D) des antisens R1-R8.
Figure 2: Inhibition de la croissance des cellules HBL100rasl Figure 3: Etude comparée de la pénétration cellulaire Figure 4: Effet in vivo des ante sens sur le volume des tumeurs Matériels et Méthodes Synthese des acides nucléiques antisens simple-brin Les différents acides nucléiques utilisés ont été synthétisés en utilisant un synthétiseur automatique en phase solide (Applied Biosystems, Forster city, CA) selon la chimie des phosphoramidites. Les acides nucléiques ont ensuite été précipités deux fois à l'éthanol, lavés en présence de 75% d'éthanol, puis mis en solution dans l'eau.
Clivage par la RNase H Les expériences de clivage par la RNase H à partir d'extraits nucléaires de cellules HeLa (HeLa Scribe, Nuclear extract, Promega) ont été réalisées dans le mélange réactionnel (25 p1) contenant 40 mM Tris pH 7,9; 100 mM KC1; 2 mM MgC12; 0,8 p1 d'extrait nucléaire de HeLa, 2llg d'ADN transporur, 4 nM d'ARNm ras sauvage ou muté et 5 pM de chaque acide nucléique à tester. Les réactions ont été réalisées sans pré-mélangeage de l'ARNm et de l'acide nucléique à tester. Après traitement au phénol et précipitations, les produits de clivage par la RNase H ont été analysés par électrophorèse sur gel de séquençage polycarylamide (6%).Les gels ont ensuite été autoradiographés, et la quantité de matériel intact et de produit de clivage a été déterminée par densitométrie.
Lignées cellulaires utilisées - HBL1OOrasî : Cette lignée dérive de la lignée mammaire humaine HBL100 par transformation avec un plasmide pSV2 portant l'oncogène Ha-Ras humain EJ524.
Cette lignée exprime la forme sauvage de Ha-ras, ainsi que la forme portant la mutation ponctuelle G - > U en position 12, codant pour l'acide aminé valine au lieu d'une glycine (Ha-ras VAL12 (Lebeau et al., Oncogene 6 (1991) 1125).
- HBLlOOnéo: Cette lignée dérive également de la lignée mammaire humaine HBL100, par transformation avec un plasmide pSV2 témoin. Cette lignée exprime donc uniquement la forme sauvage de Ha-ras.
Préparation des nanoparticules Nanoparticules de polyisohexylcyanoacrylate Une suspension nanoparticulaire a été préparée par addition, sous agitation magnétique, delOO plitre d'isobutylcyanoacrylate ou d'isohexylcyanoacrylate à un milieu de polymérisation composé d'acide chlorhydrique (1 mM, pH = 3 ou 10 mM, pH = 2) et de 1 g/100 cm3 de dextran. La polymérisation des monomères cyanoacryliques s'effectue spontanément à une température voisine de 20"C. La polymérisation est totale après 2 heures en utilisant l'isobutylcyanoacrylate et après 6 heures en ueïimnt l'isohexylcyanoacrylate. Après neutralisation, 0,4 g/100 cm3 de poloxamer 188 est ajouté pour stabiliser les nanoparticules.
- Nanoparticules d'acide lactique-acide glycolique : 10 mg/cm3 d'lm copolymère d'acide lactique-acide glycolique contenant 75 to d'unités lactiques D et L et 25 % d'unités glycoliques sont mis en suspension dans un milieu contenant 10 mM de TRIS-HCl à pH = 7 et 0,5 % de lécithine. Après 12 heures d'incubation, les nanoparticules peuvent être séparées de la suspension.
Encapsulation des acides nucléiques dans les nanoparticules Les nanoparticules préparées ci-dessus à une concentration de 0,5 mg(cm3 sont incubées avec 500 pM d'acide nucléique, 500 tM de cation hydrophobe (par exemple le CTAB), dans un tampon Tris-HCl (10 mM, pH = 7) sans chlorure de sodium (Desmidt et al., Nucl. Acid. Res. 19 (1991) 4695). Après 6 à 8 heures d'incubation, les nanoparticules peuvent être séparées de la suspension ou bien la suspens ion peut être utilisée, après dilution, pour tester l'efficacité de l'acide nucléique adsorbé sur les cellules appropriées.
Généralement, quelques til de la suspension diluée (environ 100 fois dans l'eau distillée) sont ajoutés à 100 Crl du milieu de culture contenant les cellules, le nombre de p1 ajoutés étant calculé pour obtenir la concentration souhaitée en acide nucléique.
Exemples Exemple 1: Sélection de l'antisens 1.1. Effet de la longueur Cet exemple montre que la longueur peut avoir un impact important à la fois sur la sélectivité et sur l'affinité de l'antisens et que, contrairement à la tendance générale, l'utilisation d'antisens de taille limitée offre des avantages très importwits.
Les antisens suivants ont été synthétisés: - 5'-CACACCGACGGC (SEQ ID n" 1) - 12 mer - 5'-CACACCGACGGCG (SEQ ID n" 2) - 13 mer - 5'-CACACCGACGGCGC (SEQ ID n" 3) - 14 mer - 5'-CACACCGACGGCGCC (SEQ ID nO 4) - 15 mer - 5'-CCACACCGACGGCGCC (SEQ ID n" 5) - 16 mer La position de ces antisens vis-à-vis de la séquence cible (SEQ ID n" 6) est présentée sur la figure 1A. Les antisens correspondants dirigés contre le messager de ras normal ont également été synthétisés.
Pendant la phase chronique, la proportion des cellules myéloïdes, aussi bien matures qu'immatures, augmente comme résultat de l'expansion clonale de progéniteurs myéloïdes. La présence de cellules totalement différenciées indique que l'hématopoïèse associée à la phase chronique conserve encore certaines propriétés de différenciation. Par contre, à la phase de transformation aigüe, les cellules leucémiques bloquées au stade blastique ne sont plus capables d'arriver à la différenciation terminale.
La LMC est associée à une anomalie génétique spécifique, appelée chromosome Philadelphie. Il a par ailleurs été montré qu'il peut persister un contingent de cellules hématopoïétiques normales (ne contenant pas de chromosome Philadelphie), plus facile à mettre en évidence au stade initial de la maladie (Coulomel et al., N. Eng. J. Nled., 1983, 308:1493; Barnett et al., Bone Marrow Transplant., 1989, 4: 345; Verfaillie et al., Blood, 1992, 79: 1003). Le chromosome Philadelphie se caractérise au niveau moléculaire par la translocation du proto-oncogène c-abl du chromosome 9, sur le gène bcr du chromosome 22. Cette translocation provoque la formation d'un gène hybride bcr-abl qui peut être exprime.
Le proto-oncogène c-abl couvre au moins 230kb sur la bande 9q34.
Il contient 1 1 exons, le premier présentant deux formes différentes, la et lb. Deux messages c-abl sont donc transcrits, différant par leur extrémité 5'. Si l'exon la est utilisé, l'ARNm a une longueur de 6kb et comprend les exons lb puis 2 à 11. Les deux protéines synthétisées diffèrent de par leur extrémité N terminale (Shtivelman et al., Cell, 1986, 47: 277; Bernards et al., Mol Cell Biol, 1987, 7: 3231; Fainstein et al, Oncogène, 1989, 4: 1481).
Le gène bcr est situé sur la bande 22ql 1. La coupure se produit sur un petit segment de 5,8kb de ce gène, qui comporte, au total, environ 130kb (Heisterkamp et al., Nature, 1985, 315:9758).
La fusion des deux gènes bcr et c-abl, conduit à la formation d'un ARNm de 8,5kb, composé d'une extrémité 5' provenant du gène bcr et d'une extrémité 3' provenant du gène c-abl. La protéine résultante, de poids moléculaire 2lOkDa, a une activité tyrosine kinase accrue, par rapport à l'activité tyrosine kinase normale, de poids moléculaire 145kDa, codée par le gène c-abl (Konopka et al., Cell, 1984, 37: 1035; Kloetzer et al., Virology, 1985,140:230; Konopkaet ai., Proc Natl Acad Sci, 1985, 82: 1810).
Deux translocations différentes peuvent avoir lieu, provoquant les deux principaux types de jonction bcr-abl connus. La première juxtapose l'exon 2 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl ; elle a reçu les noms de "L6" ou b2a2". La deuxième juxtapose l'exon 3 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl ; elle a été appelée K-28" ou "b3a2". L'exon 3 du gène bcr code pour 25 acides aminés qui sont présents ou absents de la protéine résultante, selon le type de jonction. L'une de ces jonctions, ou les deux, sont détectées chez les patients atteints de LMC et présentant le chromosome Philadelphie (Shtivelman et al., Blook, 1986, 69: 971). Environ la moitié des patients présentent la jonction b2a2, tandis que l'autre moitié présente la jonction b3a2.
Chez les patients atteints de leucémie lymphoïde aigüe (ALL), une troisième translocation a été mise en évidence. Elle juxtapose l'exon 1 du gène bcr et l'exon 2 du gène c-abl, et a donc reçu le nom de "bla2" (Fanstein et al., Nature, 1987, 330: 386). Environ 50 % des patients atteints de ALL présentent la jonction bla2 ; 25 % la jonction b2a2 et 25 % la jonction b3a2. Ces trois différentes jonctions peuvent être identifiées grâce à la technique de polymérisation en chaîne (PCR) suivie d'hybridation avec des sondes spécifiques de chaque jonction (Kawasaki et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1988, 85: 5698).
Du point de vue clinique, la LMC progresse invariablement de la phase chronique vers la crise blastique. La première période se caractérise par l'augmentation des cellules myéloïdes matures et immatures, dans la moëlle osseuse et le sang (Koeffler et al., N Engl J Med, 1981, 304: 201). Cette augmentation ne serait pas dûe à la prolifération ni à la maturation plus rapide des cellules tumorales, mais plutôt, à la prolifération des cellules souches myéloïdes, dans la moëlle osseuse et dans le sang. La crise, ensuite, se caractérise par un arrêt de différenciation des cellules leucémiques, qui acquièrent pendant cette phase, un phénotype blasuque". Le début de la crise blastique marque la limite des possibilités thérapeutiques et la survie est, généralement, inférieure à quatre mois.
Les premiers traitements de la LMC en phase chronique utilisaient des agents alkylants, comme le busulfan, ou des inhibiteurs de synthèse de l'ADN, comme l'hydroxyurée. Bien que ces substances contrôlent efficacement la granulopoïèse excessive constatée dans les cas de LMC, elles ne sont guère spécifiques, inhibant la synthèse d'ADN aussi bien dans les cellules normales que dans les cellules leucémiques.
Des efforts visant à éliminer le clone leucémique par irradiation de la rate ou par splénectomie associés à une chimiothérapie intensive, ont eu pour résultat l'élimination temporaire des cellules présentant le chromosome Philadelphie chez un tiers des patients, mais n'ont pas réussi à enrayer le cours de la maladie.
Depuis 1985, l'interféron alpha est couramment utilisé avec une efficacité indéniable, au moins pour retarder la survenue de la phase aigüe.
La transplantation de moëlle osseuse allogénique permet à 40 % des patients traités durant la phase chronique, de survivre au-delà de cinq ans en rémission complète (Bergshell, J Cancer Res. Clin. Oncol., 1990, 116: 104), et probablement d'être guéris. La transplantation s'effectue après un traitement intensif, associant en règle générale une chimiothérapie lourde et une irradiation corporelle totale qui visent à éliminer les cellules leucémiques. Elles ne peut cependant être appliquée qu'aux malades ayant un membre de sa fratrie HLA identique, ce qui ne représente qu'une faible proportion de malades.
La transplantation de cellules hématopoïétiques autologues est de plus en plus utilisée en particulier chez les patients n'ayant pas de donneur HLA identique. A cet effet, les cellules de la moëlle osseuse sont prélevées, éventuellement "purgées" des cellules leucémiques grâce à des agents chimiques, puis, réintroduites chez le patient, qui a subi une chimiothérapie lourde, avec ou sans une irradiation totale. Même avec cette méthode, la transformation aiguë survient inéluctablement.
Les cellules sanguines ont leur origine dans la moëlle osseuse, siège, chez l'adulte de cellules "souches" hématopoïétiques. Les cellules souches hématopoïétiques sont des cellules indifférenciées, multipotentes, qui, selon le facteur de régulation avec lequel elles seront en contact, se différencieront en globules rouges, blancs ou plaquette. Les cellules hématopoïétiques sont une sous-population de cellules mononucléées, elle-même hétérogène dans sa composition. Les cellules hématopoïétiques sont plus ou moins engagées dans le processus de différenciation, et peuvent être distinguées les unes des autres par leur capacité fonctionnelle in vitro, et par l'expression d'antigènes à leur surface. Certains de ces antigènes sont exprimés par plusieurs populations de cellules ; d'autres sont spécifiques d'une lignée hématopoïétique donnée.
L'antigène CD34 est une protéine d'environ 115ka, dont le gène se situe sur le chromosome 1(lu) et qui est exprimée par les progéniteurs hématopoïétiques, myéloïdes et lymphoïdes. Son rôle n'est pas encore clairement élucidé, mais sa présence a été détectée sur 1 à 4 % des cellules mononucléées de moëlle osseuse normale, et sur les cellules leucémiques, de 30 à 60 % des leucémies aigües et de toutes les LMC.
La figure 3 est une vue agrandce de la région repérée 3 de la figure 1, montrant, à droite, une zone pourvue d'éléments pseudo-catadicpmricues et, à gauche,
une zone pourvue d'éléments catadicocriques vrais.
La figure 4 esc une vue arance de la région repérée 4 sur la figure 3, montrant le détail des
éléments catadioptriques et pseudo-catadioptriques.
La figure 5 est une coupe verticale, selon 5-5 de la figure 4, de la zone comprenant les éléments pseudo-catadioptriques. La figure 6 est une coupe norizontale, selon 6-6
de la figure 4, de cette même zone.
Sur les figures 1 et 2, la référence 10 désigne, de façon générale, un bloc de feux: de signalisation multifonctions comprenant, à l'interieur des compartiments d'un socle ou boîtier 12, une pluralité de sources lumineuses 14, l'ensemble étant clos par une
glace de fermeture monobloc 16.
Cette glace de fermeture définit des zones de fonctions différentes, avec: - une zone 18 à double fonction: fonction feu de position et fonction catadioptrique; - une zone 20 de feu stop; - une zone 22 de feu de position et feu antibrouillard; - une zone 24 de feu clignotant;
- une zone 26 de feu de -recul.
Ces diverses zones présentent, de manière en elle-même connue, des colorations différentes en fonction des prescriptions réglementaires en la matière, la couleur du faisceau émis pouvant éventuellement résulter de la couleur de la glace de fermeture 16 combinée à la couleur d'une bonnette telle que 28
coiffant certaines des lampes.
On a représenté plus en détail figures 3 et 4 les
régions contiguës des zones 18 et 20.
La zone 18, comme on l'a indiqué, est une zone procurant une fonction de rétroréflexion catadioptrique, et comporte à cet effet des bandes allongées horizontales 30 d'éléments catadioptriques 32 (figure 4). Ces éléments 32 sont par exemple des éléments tels que ceux décrits dans le FR-A-2 590 213, qui appartient à la demanderesse, c'est-à-dire des éléments en forme de trièdre trirectangle tronqué par des plans parallèles, de manière à donner à ces éléments un contour rectangulaire, les éléments 32 pouvant être orientés tête-bêche d'un élément à l'élément adjacent; on pourra
chambre de combustion 10.
Ainsi, lorsque le piston remonte en fin de phase de compression, une zone de gaz fortement concentrée en oxygène subsiste dans la cavité 11 à proximité de la
bougie d'allumage 28.
Un évidement 24 est formé dans la face supérieure 56 du piston 52, comme cela est illustré sur la figure 1, pour éviter que cette face ne vienne en contact avec la première soupape d'admission 20 lorsque le piston 52
est en position de point mort haut. Un évidement corres-
pondant est également prévu sous la soupape d'échappe-
ment. Lors de l'injection du carburant, qui a lieu durant la course de remontée du piston, la zone riche en essence
autour de la bougie d'allumage 28 se mélange principale-
ment à l'air, quelle que soit la quantité de gaz brûlés contenue par ailleurs dans le reste de la chambre de combustion, ce qui permet d'assurer le début de la combustion qui se propage ensuite dans un mélange pauvre
dans lequel la proportion de gaz brûlés à moins d'impor-
tance. La conception selon l'invention du moteur permet ainsi d'opérer une double stratification, c'est-à-dire une stratification de l'essence et une stratification des gaz brûlés qui est particulièrement optimale pour le fonctionnement du moteur et notamment pour la réduction
des oxydes d'azote.
La stratification des gaz brûlés permet de plus d'opérer une très forte recirculation des gaz brûlés et donc une réduction supplémentaire des émissions de polluants. Une telle application est représentée par le schéma
de la figure 3.
Sur cette figure, on voit que la chambre de combustion 10 est alimentée en air d'admission par un conduit principal amont d'admission 12 dans lequel peut être interposé un papillon 14 formant valve pour la
commande du débit de gaz frais d'admission.
De préférence, les dioptres 40a, 40b sont réalisés en verre. Si on le souhaite, ces dioptres peuvent être en un matériau apte à agir sur la répartition spectrale de la
lumière, selon les enseignements du document précité.
Comme on le voit bien sur la figure 2, le miroir 20 est divisé en quatre zones, à savoir deux zones latérales
21a, 21b, une zone supérieure 22 et une zone inférieure 23.