INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
En ce qui concerne la séquence dite de régulation, elle comprend au moins un opérateur de la tétracycline ou l'un de ses analogues. Le ou les opérateurs sont reconnus par l'activateur de transcription en présence de tétracycline et permettent donc de ce fait l'activation du promoteur minimal.
Les séquences tet opérateur pouvant être mises en oeuvre peuvent notamment être choisies parmi celles décrites par Hillen & Wissemann ( Protein Nucleic Acid Interaction, Saeger & Heinemann, eds., Macmillan, London, (1989), 10, 143-162), Waters et al. (Nucleic Acids Res. (1983) , 11, 525-539), Stüber et al.
(P.N.A.S. USA, (1981), 78, 167-171), Unger et al. (Nucleic Acids Res. (1984), 12, 7693-7703) et Tovar et al. (Mol. Gen. Genet. (1988), 215, 76-80).
La séquence de régulation peut comprendre une unique séquence tet opérateur ou au contraire plusieurs séquences tet opérateur pouvant atteindre jusqu'au nombre de 10 selon que l'on souhaite ou non augmenter la régulation de la transcription. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, la séquence de régulation met en oeuvre 2 séquences tet opérateur. Elle sera alors dite Op2.
Plus préférentiellement, la séquence de régulation est représentée en tout ou partie par l'une des séquences représentées en SEQ ID N"3 ou N"4 ou l'un de leurs dérivés.
Classiquement, cette séquence de régulation est liée opérationnellement en amont c'est à dire à l'extrémité 5' du promoteur minimal de manière à permettre la transcription du gène d'origine virale, en présence du complexe formé par l'activateur de transcription et de son ligand tétracycline. On a ainsi successivement, dans l'orientation 5' à 3', la séquence de régulation, liée directement ou non au promoteur minimal, le promoteur minimal et le gène d'origine virale. Toutefois, on peut également envisager de placer cette séquence de régulation, au sein du promoteur minimal, en aval de la séquence nucléotide virale à transcrire c'est à dire à son extrémité 3'. L'ordre de succession est alors dans le sens 5' à 3', promoteur minimal, gène viral et séquence de régulation.
Selon un mode préféré de l'invention, le promoteur inductible à la tétracycline associe au promoteur minimal de la thymidine kinase dit Tk, une séquence de régulation représentée par Op2. Il est dans ce cas particulier identifié ci-après sous la dénomination Op2/Tk. Plus préférentiellement, le promoteur inductible mis en oeuvre selon l'invention est représenté en tout ou partie par la SEQ ID N"5 ou l'un de ses dérivés.
Ce promoteur inductible à la tétracycline Op2/Tk et plus particulièrement celui représenté en tout ou partie par la SEQ ID N05 ou l'un de ses dérivés, constituent également un des objets de la présente invention.
En conséquence, l'expression du ou des gènes viraux liés opérationnellement, dans l'adénovirus revendiqué, à un promoteur inductible, est totalement subordonnée à la fixation du complexe formé par l'activateur de transcription et la tétracycline, sur la séquence de régulation dudit promoteur.
Cette fixation n'est effective qu'en présence de tétracycline. En absence de tétracycline ou de tout analogue de celle-ci, il n'y a pas de liaison établie entre la séquence de régulation et l'activateur de transcription. Il s'en suit aucune transcription de la séquence virale liée au promoteur minimal. Qui plus est, avantageusement, I'agent induisant la transcription n'a pas à être présent continuellement.
Un des objets de la présente invention concerne plus particulièrement un adénovirus comprenant au moins un gène homologue c'est à dire adénoviral dont l'expression est contrôlée par un promoteur inductible et plus préférentiellement par un promoteur inductible à la tétracycline.
Ainsi, dans un mode particulier, la présente invention a pour objet un adénovirus recombinant dont au moins une région génomique essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale est placée en tout ou partie sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline. La région essentielle à la réplication et/ou à la propagation virale selon la présente invention est avantageusement choisie parmi tout ou partie de la région E4, E2, la région IVa2 et/ou la région L5, etc.
Selon un mode particulièrement avantageux, les adénovirus recombinants de la présente invention, comprennent à titre de séquences nécessaires à la réplication et/ou la propagation, tout ou une partie fontionnelle des régions E2 ou E4. Plus particulièrement, s'agissant de la région E4, les gènes importants sont les gènes ORF3, ORF6 et ORF6/7.
Une très faible concentration en oligoéléments dans le milieu de culture suffit au développement des microorganismes. En fonction du milieu de culture utilisé, les oligoéléments sont soit introduits en quantité minime, soit omis en considérant que leur présence à l'état de traces dans les autres produits chimiques incorporés dans le milieu suffit à apporter une quantité suffisante pour la bactérie. Typiquement, les sels minéraux contenus dans le milieu de culture préconisé pour la production de gellane par Pseudomonas elodea ATCC 31461 sont du nitrate d'ammonium (en tant que source d'azote minéral), du phosphate de potassium ou de sodium, du sulfate de magnésium et des traces de différents sels comme du sulfate ferreux, des chlorures de cuivre, de zinc, de cobalt, de manganèse, et des sels de bore et de molybdène.Par exemple, le milieu de culture tel que décrit dans l'article intitulé "Agar-like polysaccharide produced by a Pseudomonas species : production and basic properties" publié dans "Applied and Environmental Microbiology", 1982, vol. 43 n05, pages 1086-1091, contient initialement 30 gjL de glucose, 0,5 g/L de promosoy (peptone de soja, source d'azote organique), 0,9 g/L de NH4NO3, 0,5 g/L de K2HPO4, 0,1 girl de MgS04-7H20 et 1 mVL d'une solution de sels contenant elle même 1,8 g/L de MnC12 4H2O, 2,487 g/L de FeSO4 7H2O, 0,285 g/L de H3BO3, 27 mg/L de CuC12, 21 mg/L de ZnC12, 74 mg/L de CoC12 6H20, 23 mg/L de MgMoO4 et 2,1 g/L de Na2C4H406-2H2O (tartrate de sodium dihydraté). Les solutions de sels décrites dans les brevets ayant trait à la production de gellane ont des compositions similaires. Dans de tels milieux, la concentration initiale de MnC12 4H20 est de 1,8 mg/L, soit 0,50 mg/L de Mn.
Comme nous l'avons évoqué précédemment, l'incorporation de manganèse à l'état de traces dans les milieux de culture pour microorganismes est une technique courante.
La présente invention concerne un procédé de production de gellane par culture du micro-organisme Pseudomonas elodea ATCC 31461 dans un milieu de fermentation contenant des concentrations notables de manganèse, c'est-à-dire des concentrations supérieures à 50 mg/L de Mn. De façon surprenante, l'ajout de telles concentrations de manganèse permet d'obtenir des concentrations de gellane plus élevées.
Dans le procédé, le manganèse peut provenir de différents composés. Ces composés peuvent être par exemple de l'acétate de manganèse tétrahydraté, du chlorure de manganèse tétrahydraté ou anhydre, du nitrate de manganèse, du dioxyde de manganèse, du sulfate de manganèse tétrahydraté ou anhydre, ces exemples étant donnés à titre illustratif. La source de manganèse est en général introduite en une seule fois dans le milieu de fermentation, avant ensemencement.
La concentration en manganèse dans le milieu de culture, comptée en manganèse Mn, est au moins égale à 0,05 glL, de préférence supérieure ou égale à 0,2 g/L.
L'invention concerne également un milieu de culture pour produire du gellane. Le milieu de culture comporte une source de manganèse dont la concentration comptée en manganèse Mn est au moins égale à 0,05 g/L, de préférence supérieure ou égale à 0,2 g/L.
Par ailleurs, en ce qui concerne les autres ingrédients du milieu de culture, le milieu nutritif permettant la croissance du microorganisme et la production de gellane par la souche peut être choisi parmi les milieux de culture décrits dans la littérature. Le milieu conventionnel contient un substrat carboné qui peut être un sucre tel que le glucose, le fructose, le maltose, le saccharose, le xylose ou le mannitol (cette liste n'étant pas limitative) ou un autre hydrate de carbone, utilisé seul ou en mélange. La concentration initiale en carbohydrate dans le milieu dépend en partie de la concentration des autres constituants du milieu, en particulier de la concentration en azote.Ainsi, pour favoriser la production de polysaccharide, il est préférable d'avoir des concentrations initiales en substrats carbonés et azotés telles que le rapport molaire des quantités de carbone et d'azote initiales (C/N) soit largement supérieur à 1. Cependant, la concentration initiale en carbohydrate doit être choisie de façon à minimiser le plus possible la concentration résiduelle (c'est-à-dire en fin de fermentation) en carbohydrate. La concentration initiale en carbohydrate varie en général de 10 à 60 g/l, de préférence de 20 à 40 g/l.
La source d'azote du milieu nutritif peut être une source d'azote organique et/ou minéral. Les sources d'azote organique, composés riches en protéines ou en résidus d'hydrolyse de protéines, peuvent être de l'extrait de levure, de l'extrait de malt, des extraits de viande, de la farine de poisson, de la farine de soja, de la farine de coton, de la liqueur de macération de maïs ("corn steep"), des résidus solubles de distillation, des hydrolysats de caséine, des peptones, etc. Une source d'azote minéral, sous forme de sel d'ammonium ou de sel de nitrate, peut également être utilisée seule ou en complément de sources d'azote organique. Ainsi, des milieux de culture tels que ceux décrits dans le brevet FR 94/15 742 qui comportent une source azotée constituée principalement d'ions nitrates, peuvent être utilisés dans la présente invention.La concentration en azote, comptée en azote N peut être comprise entre 0,01 et 5 g/l dans le milieu de culture.
D'autres sels minéraux peuvent être introduits dans le milieu nutritif, tels que des sels de magnésium, potassium, sodium, soufre, fer, bore, zinc, cobalt, molybdène... Une composition typique du mélange de ces sels est donnée dans l'exemple 1. Cette composition est donnée à titre illustratif et n'est pas limitative.
La fermentation selon la présente invention est réalisée à des températures comprises entre 25 et 350C, de préférence entre 28 et 320C. Le pH du milieu est initialement ajusté à une valeur comprise entre 6 et 8. Dans le cas de cultures en fiole agitée, le mileu est de préférence tamponné, par exemple par du tampon phosphate, pour éviter une chute excessive de pH qui inhiberait la croissance de la souche. Dans le cas de cultures en réacteur agité, le pH peut être régulé à une valeur comprise entre 6 et 8 tout au long de la fermentation. Le milieu de culture doit être agité et aéré. Lors de cultures en fioles, celles-ci sont mises à incuber sur des agitateurs à mouvement alternatif ou rotatif. Cette agitation assure également une aération du milieu. La surface d'échange entre l'air et le milieu liquide doit être suffisamment grande pour permettre de bons échanges. Les fioles dites de Fernbach sont bien adaptées à ce type de culture. Dans le cas de fermentations réalisées en réacteur, le milieu de production est agité à l'aide de modules d'agitation assurant un bon transfert au sein du réacteur. La vitesse d'agitation est en général comprise entre 50 et 1000 rpm. Le milieu est aéré à un taux compris entre 0,1 et 2 wm (volume d'air par volume de liquide et par minute).
La fermentation s'effectue en général en batch. Pour cela, le milieu de culture contient tous les éléments nutritifs, puis est stérilisé et, une fois revenu à la température de fermentation, est ensuite ensemencé par une culture active. I1 est possible de stériliser séparément une solution aqueuse contenant le manganèse et le milieu nutritif. La solution de manganèse est ensuite ajoutée stérilement au milieu de culture en quantité telle que la concentration finale dans le milieu de culture soit celle désirée. L'introduction du manganèse dans le milieu de culture peut être pratiquée initialement ou en cours de fermentation. L'ajout de cette solution peut être réalisé en une seule fois ou en plusieurs opérations successives réparties en cours de culture.
Le taux d'ensemencement, c'est-à-dire le rapport des volumes d'ensemencement et de milieu après ensemencement, est compris entre 0,1 et 10 %. Dans le cas de cultures en réacteur, celui-ci peut être équipé de sondes stérilisables permettant d'enregistrer et de réguler des paramètres tels que le pH, la température, le taux d'oxygène dissous. I1 est également possible de connaître les taux d'oxygène et de gaz carbonique dans les gaz de sortie à l'aide d'analyseurs placés sur la sortie des gaz du réacteur.
Après 1 à 4 jours de culture, la culture peut être arrêtée. Le principal critère pour l'arrêt de la fermentation est la faible consommation de glucose. Le moût de fermentation contient du gellane brut. Celui-ci peut être récupéré par précipitation avec un solvant approprié, le plus souvent l'isopropanol. Le précipité récupéré peut être séché. La matière sèche totale contient à la fois du gellane dit natif et les cellules issues de la culture de Pseudomonas elodea. Cette méthode de précipitation à l'isopropanol suivie d'un séchage est la méthode classique de détermination de la concentration en gellane brut dans le moût de fermentation.
La présente invention sera mieux comprise et ses avantages apparaîtront plus clairement à la lecture des exemples suivants. Ceux-ci sont donnés à titre illustratif et non limitatif de l'invention.
Exemple 1: Préparation de gellane selon l'art antérieur. en présence de traces de manganèse (fermentation 1) La souche de Pseudomonas elodea ATCC 31461 est conservée en tubes, à -220C sur un milieu complexe gélosé (Nutrient Agar, Difco). Pour la remise en culture de cette souche, un tube est remis à la température ambiante pendant quelques heures et un prélèvement d'environ une ose est effectué sur la surface de la gélose et étalé sur une boite de Petri contenant du milieu gélosé (Nutrient Agar, Difco). Après 48 heures d'incubation à 30"C, on observe un développement de colonies jaunes à la surface du milieu gélosé. Une colonie isolée est prélevée et mise en suspension dans 20 mL de milieu liquide (Nutrient Broth, Difco) en fioles d'Erlenmeyer. Ces fioles sont mises en agitation pendant environ 30 heures à 300C.La totalité du contenu d'une fiole, soit 20 mL, sert à ensemencer 180 mL de milieu de préculture placé dans une fiole de Fernbach. La composition de ce milieu de préculture est donnée dans le tableau 1. Toutes ces opérations de transfert sont effectuées en conditions stériles et les milieux et récipients ont auparavant été stérilisés dans des conditions habituelles pour l'homme de l'art. Les fioles de Fernbach sont mises en agitation pendant environ 40 heures à 300C. Après incubation, environ 180 mL du contenu d'une fiole de Fernbach sont utilisés pour ensemencer 1,82 litres de milieu de production contenus dans un fermenteur. La composition du milieu de production est indiquée dans le tableau 1 et correspond à la composition optimale donnée dans l'art antérieur.Les 20 mL de milieu restant sont utilisés pour effectuer des analyses courantes et vérifier le bon déroulement de la préculture.
Le fermenteur utilisé est équipé d'un aérateur multi-trous, d'une régulation de température, d'une sonde pH reliée à un régulateur commandant l'injection de KOH 1N ou de H3P04 1N, d'une sonde à oxygène dissous, d'un système d'agitation consistant en un axe muni de deux turbines centripètes et entraîné par un moteur d'agitation. La température du milieu est régulée à 300C, le pH à 6,5, le débit d'air est de 2 vvm et la vitesse d'agitation est de 900 tours/minute.
L'invention trouve de multiples applications, et notamment dans le domaine agricole, pour la diffusion de produits pesticides, acaricides, acarifuges, pesticides, et d'une manière générale, de produits destinés à soigner des animaux, ou au contraire destinés à neutraliser, tuer, leurrer ou exterminer des animaux nuisibles.
L'invention est également applicable à la diffusion de produits, présentant des propriétés destinées à neutraliser des odeurs considérées comme gênantes.
A titre d'exemple, l'invention trouve une application particulièrement intéressante dans le domaine de l'apiculture.
Le développement des colonies d'abeilles dans un biotope répond à de multiples critères et conditions de température, d'humidité qui évoluent selon les saisons et autres paramètres d'environnement.
Les abeilles sont, comme d'autres insectes, susceptibles d'être attaquées directement ou indirectement par d'autres êtres vivants, ou organismes et notamment des parasites, dont les plus connus sont les acariens Varroa Underwoodi, Tropilaelaps Clareae ou Varroa Jacobsoni.
Ces acariens sont n'isibles aux abeilles, di::iinuent leurs facultés les rendent sensibles à d'autres maladies, et contaminent, par leur mode de propagation, les ruchers avoisinants, mettant en péri tous les individus de la ruche.
On a proposé, de manière connue, des modes de traitement ponctuels pour lutter contre les acariens, élaborés à partir de molécules chimiques de synthèse ou naturelles, administrés sous torve d'aérosols, de fumigations, d'évaporations, de sublimations, qui, par effet de contact, d'ingestion, entraînent l'extermination au moins partielle des parasites.
Parmi ceux-ci, on a mentionné des traitements à base d'acide formique. Ce dernier, disposé sur un support poreux, soit au bas ou au sommet du nid à couvain, s'évapore dans l'enceinte de la ruche.
Cependant, cette méthode de diffusion de vapeur d'acide formique, pour lutter contre l'acarien que l'on cherche à détruire, présente de nombreux désavantages. D'abord, l'évaporation est difficilement contrôlable, en quantité, ce qui conduit à une évaporation libérant un flux de vapeur acide qui perturbe les abeilles. Ensuite, la durée du traitement est relativement courte, sans effet sur l'acarien Varroa logé avec les larves d'abeilles dans les alvéoles de cire operculés, ce qui oblige l'apiculteur à effectuer des traitements successifs pour neutraliser seulement que les Varroas présents sur l'abeille, ce qui est incommode.
Par ailleurs, de ncrtreuse abei ~es, particulièrement encore plus celles au stade larvaire dans le nid à couvain, sont tuées par l'émanation excessive des vapeurs acides, qui entraîne la mortalité de la reine et par voie de conséquence, un stress dans la cohésion des colonies d'abeilles.
Enfin, le mode opératoire des traitements préconisés, la manipulation de produits tels que l'acide formique, sont pour l'apiculteur, des opérations fastidieuses et des dangers pour sa sécurité.
De plus, ces modes de traitement désorganisent l'harmonie des colonies d'abeilles, diminuent l'apport de récolte en miel et en pollen, modifient l'équilibre thermique de la ruche, leur imposent une dépense d'énergie supplémentaire, pour éliminer, par une ventilation continue, l'excès d'acide formique devenu pour elles une nuisance.
Enfin, l'utilisation des produits destinés à lutter contre les parasitoses et maladies des abeilles, est réglementée de manière rigoureuse, tant en ce qui concerne les produits eux-mêmes, que leurs modalités d'application et les époques où ils peuvent être employés. Par exemple, en période de miellée, la réglementation interdit l'usage de produits disposant même d'une autorisation de mise sur le marché (A.M.M.) susceptibles de polluer les produits récoltés ou fabriqués par les abeilles, ce qui conduit, à cette époque, au développement accéléré des acariens.
Indépendamment des produits et substances utilisés pour lutter contre l'acarien dans la ruche, le problème est de contrôler la diffusion des produits actifs, de manière que le débit soit, d'une part sensiblement constant et d'autre part suffisant pour neutraliser l'acarien, sans perturber, dans tous les domaines, les cycles 2s évolutifs des colonies d'abeilles.
Un autre problème est lié aux acticns thérapeutiques pour lutter contre l'acarien, toujours contraignantes, répétitives pour l'apiculteur, qui, pour obtenir une efficacité relative, doit les programmer à une date précise, dans une zone géographique détermine.
Enfin, un débit contrôlé, faible en valeur absolue, qui d'étale sur plusieurs cycles de reproduction des parasites, permet de limiter la fréquence des traitements et donc l'intervention soutenue e l'apiculteur.
On a représenté pour la clarte du dessin trois couches présentant sensiblement la même épaisseur, mais il faut comprendre que dans la pratique, l'épaisseur de la paroi du corps tubulaire est essentiellement déterminée par l'épaisseur de la couche interne, car une couche interne épaisse permet d'obtenir une bonne tenue mécanique de la paraison. La couche interne a avantageusement entre 0,4 et 0,8 mm d'épaisseur.
On peut réaliser la couche extérieure en polyethylène basse densité avec une épaisseur par exemple de l'ordre de 0,2 à 0,4 mm, et les couches intermédiaires peuvent présenter chacune une épaisseur de l'ordre de 10 à 70 ym.
La couche interne peut être par exemple constituée de polyéthylène basse densité pour constituer une barrière vis-à-vis de l'eau et la couche intermédiaire peut par exemple être constituée en polyamide ou en EVOH (copolymère d'ethylène - alcool vinylique) qui constitue une barrière aux gaz, notamment à l'oxygène, permettant d'éviter l'échappement, notamment de parfums qui seraient contenus dans le produit conditionné.
On voit bien sur le dessin le profil particulier du corps tubulaire qui, vu en élévation frontale sur la figure 1, présente une largeur apparente croissant depuis la limite, matérialisée en 5, de la zone d'épaulement 2 jusqu'à la base 6 du corps tubulaire.
Comme on le voit sur la figure 1, le corps tubulaire 1 présente depuis sa base 6 une forme sensiblement trapezoïdale à flancs de profil incurve.
Dans le mode de réalisation illustre aux figures 5 et 6, le corps tubulaire 1' vu en élévation frontale (figure 5) presente pour sa part une forme sensiblement trapézoïdale à flancs droits.
Dans les deux modes de réalisation illustrés, le corps tubulaire au ~~ niveau de sa partie superieure 5 presente une section circulaire.
On peut concevoir dans le cadre de l'invention des sections différentes, notamment ovale ou elliptique.
Comme on le voit sur le dessin, en élévation latérale (figures 2 et 6), le corps tubulaire 1 et respectivement 1' présente depuis sa partie supérieure 5 et respectivement 5., jusqu'à sa base 6 et respectivement 6', une section sensiblement en V à flancs arrondis ou droits, la partie de fond 6, 6' correspondant au sommet du V étant arrondie, de sorte que, contrairement à ce qui est le cas lorsque la base est formée d'une zone rigide, notamment de soudure, le corps tubulaire peut être rempli du produit à conditionner sur toute la hauteur de sa partie inférieure.
Bien que l'invention ait été décrite en liaison avec des formes particulières de réalisation, elle n'y est nullement limitée et on peut lui apporter différentes variantes et modifications sans pour autant sortir ni de son cadre ni de son esprit.
La partie cylindrique d'embouchure peut ainsi être de grand diamètre et elle peut être munie d'un embout de distribution 7 avec rabat de fermeture 9, l'embout présentant un orifice de distribution 8 de faible section, avantageusement excentré afin que la sortie du produit se situe au bord de l'embout, pour limiter les salissures, comme représenté sur les figure 7 et 8. Dans l'exemple décrit sur ces figures, la paroi du tube délimitant l'embouchure de sortie est filetée extérieurement et l'embout 7 est fileté intérieurement de manière à être vissé sur le tube.
On peut également fixer un embout, de distribution -par claquage sur un bourrelet réalisé sur la partie d' 'embouchure du tube, cet embout présentant en son centre un orifice de petit diamètre permettant à l'utilisateur de contrôler plus facilement le débit de sortie de produit lorsque le tube est pressé. La fermeture du tube peut être assurée par vissage d'un bouchon sur la partie d'embouchure.
La présente invention concerne l'utilisation comme médicament notamment comme agent anti viral, de dérivés phosphotriesters de l'acyclovir (ACV).