INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Ainsi que précédemment évoqué, le ou les éléments constituant la capside peuvent être produits dans des systèmes recombinants, bactéries, levure, cellule de mammifères ou d'insectes. Par exemple, WO 95/31476 traite de l'expression et de la purification d'une protéine Lt dans et à partir d'E. coli. L'expression et la purification dans et à partir de la levure des protéines Lt de HPV-6a, -11, -16 and -18 est décrite dans WO 95/31532, ainsi que la co-expression et la co-purification de ces mêmes protéines avec les protéines L2 correspondantes. L'expression de la protéine L1 ou des protéines L1 et L2 de type 16,. dans des cellules de mammifères, à l'aide d'un vecteur vaccine, est décrite dans WO 93/2184 et Zhou et al, Virology (1991) 185 : 251. L'expression de la protéine Lt de type 1, dans des cellules de mammifères COS, à l'aide du plasmide pSVL est décrite dans WO 94/152 et Ghim et al, Virology (1992)190 : 548. L'expression de la protéine L1 de type 1, grâce au système vaccine, est aussi divulguée par Hagensee et al, J. Virol. (1993) 67 : 315.
L'expression de la protéine Lt de type 16 et sa co-expression avec la protéine L2 correspondante, dans des cellules d'insectes, à l'aide d'un baculovirus, est décrite dans WO 94/5792 et Kirnbauer et al, J. Virol. (1993) 67 : 6929. Sur le même sujet on cite aussi Xi et al, J. Gen. Virol. (1991)72:2981. L'expression de la protéine L1 de type 11, 16 et 18, dans le même système, est reportée par WO 94/20137 et Rose et al, J. Virol. (1993) 67 1936. Ainsi la mise au point d'un système recombinant destiné à l'expression d'une protéine L1 ou des protéines L 1 et L2 est clairement à la portée de l'homme de l'art.
Lorsque ces protéines sont produites dans un système procaryote, elles restent généralement à l'état dissocié après purification. Il n'y a pas formation de VLPs sauf si on soumet ces protéines à un traitement spécifique de renaturation et même dans ce cas là, le rendement reste très faible.
Lorsque ces protéines sont exprimées dans un système eucaryote, on s'attend généralement à ce que les protéines produites se réassemblent spontanément sous forme de VLPs, sauf par exemple si le taux d'expression était trop faible. Par conséquent le produit que l'on obtient après purification est bien des VLPs et non des protéines dissociées.
Afin de mettre en oeuvre l'objet de la présente invention, il convient donc de traiter les VLPs produites en système eucaryote, de manière à les dissocier en ses éléments. La dissociation requiert que l'on réduise les ponts disulphures et que l'on supprime les ions calcium (Volpers et al, J. Virol. (1995) 69 : 3258 et Colomar et al, J. Virol. (1993) 67 2779). Par exemple on placera les VLPs en pH alcalin ou on utilisera un agent réducteur comme le dithiothréitol (DTT). On utilisera aussi un agent chélateur complexant le calcium comme L'ENTA (ethylene glycol-bis (bêta-aminoethyl ether)-N,N,N'N'- tetraacetic acid).
Aux fins de la présente invention, l'acide nucléique encapsulé peut être de 1'ARN ou de l'ADN ; ce demier sera avant tout préféré. La taille de la molécule n'est pas critique ; on indique toutefois qu'il est préférable qu'elle n'excède pas plus de 8 kbp, du moins en ce qui concerne l'ADN.
L'ADN peut être sous forme linéaire ou circulaire ; cette dernière forme étant préférée. Avantageusement il s'agira d'un plasmide. Celui-ci sera intégratif ou pas, selon le but recherché. De même, il pourra ou non se répliquer dans une cellule de mammifère. A des fins de production, il comportera une origine de réplication e.g. procaryote.
La molécule d'ADN e.g le plasmide, peut éventuellement comporter un site qui lui permette de se lier à la protéine E2 d'un papillomavirus. Un tel site peut avoir pour séquence la formule ACCN6MT dans laquelle N est indépendamment A, G, C ou T et M est G ou T. La molécule d'ADN peut aussi comporter tout ou partie de la longue région de contrôle (LCR) du génome d'un papillomavirus.
La finalité essentielle de cette molécule d'ADN (ou d'ARN) est de permettre l'expression d'une ou de plusieurs peptides, polypeptides ou protéines d'intérêt dans une cellule de mammifère. En conséquence, elle comporte une région codante placée sous le contôle d'un promoteur approprié. A titre d'exemple, on cite le promoteur précoce du cytomégalovirus humain notamment décrit dans le brevet américain USP 5 168 062 ou un promoteur tissu-spécifique tel que le promoteur du gène codant pour la desmine humaine (Li et al, Gène (1989) 78 :243 et Li et al, Development(l993) : 117: 947).
Le choix de la région codante sera déterminé par l'usage auquel les VLPs selon l'invention seront destinées. Ainsi on peut utiliser ces VLPs comme agent de vaccination à l'encontre des infections parasitaires, bactériennes ou virales. Dans ce cas, le peptide ou polypeptide ou la protéine sera sélectionnée parmi les antigènes parasitaires, bactériens ou viraux.
Selon un mode de réalisation particulier, on choisit d'utiliser les VLPs selon l'invention à titre d'agent de vaccination thérapeutique ou préventif, à l'encontre des infections à papillomavirus. Pour ce faire, le ou les peptide(s), polypeptide(s) ou protéine(s) codé(s) sera (seront) avantageusement sélectionné(s) parmi tout ou partie des protéines El et E2 et des formes non-oncogéniques des protéines E6 et E7 d'un papillomavirus préférentiellement d'un HPV de type 16, 18, 31, 33, 35 ou 45. Ce papillomavirus peut être éventuellement d'un type différent de celui dont est (sont) issue(s) la ou les protéine(s) de capside.
Les formes non-oncogéniques incluent les protéines E6 et E7 d'un papillomavirus non-oncogène ainsi que les formes délétées d'une protéine E6 ou E7 d'un papillomavirus oncogène. avantageusement, une telle forme délétée d'une protéine E6 ne comporte pas tout ou partie de la région de E6 comprise entre les résidus acide aminé 106 et 115 (par exemple, il peut s'agir d'une protéine HPV-16 E6 A (106-110) ou A (111-115) ou A (106115)). De même, une forme délétée d'une protéine E7 ne comporte pas tout ou partie de la région de E7 comprise entre les résidus acide aminé 20 et 26 (par exemple, il peut s'agir d'une protéine HPV-16 E7 A (21-24) ou A (21-26)).
En régime de décharge rapide, les piles LT de l'invention ont une capacité massique et une énergie massique supérieures à celles des piles HT de l'art antérieur.
EXEMPLE 4 Vieillissement accéléré de générateurs selon l'invention et de générateurs de l'art antérieur Un test typique de vieillissement accéléré consiste à maintenir un générateur à une température T déterminée et à mesurer l'énergie qu'elle renferme encore au bout d'une période définie t. Dans l'exemple suivant, l'essai a été effectué à une température de 600C pendant 1 semaine, ces valeurs étant adaptées pour le présent type de générateurs électrochimiques.
Les tests de décharge ont été effectués à la température ambiante, dans les mêmes conditions que celles décrites dans l'exemple 2, sous un régime C/10. Des piles boutons contenant un carbone fluoré selon l'invention [GN4F(II), coke AF(II)] sont comparées à des piles contenant un carbone fluoré de l'art antérieur [GN4F(I) et HT-CFn] et à une pile bouton contenant le carbone fluoré BF(II).
Le Tableau 5 montre les résultats comparatifs obtenus avec des échantillons avant et après vieillissement. Ceux qui ont été vieillis comportent la lettre V dans leur référence.
Pour les échantillons non vieillis, les résultats sont identiques à ceux donnés dans le Tableau 4.
Pour chaque échantillon, la baisse relative de capacité AQpr/Qpr et de densité d'énergie ADE/DE est donnée en % par rapport aux valeurs initiales avant vieillissement.
Référence Qpr AQpr/Qpr e (V) DE ADE/DE échantillon (Ah/Kg) (k) (Wh/Kg) (k) GN4F-(II) 705 2,96 2087 GN4F-(II)-V 694 1,56 2,92 2026 2,9 CokeAF-(II) 682 2,85 1944 CokeAF-(II)-V 664 2,47 2,81 1866 4,0 GN4F-(I) 602 3,00 1806 GN4F-(I)-V 582 3,3 2,81 1635 9,5 CokeAF-(I) 550 3,02 1661 CokeAF- (I) -V 521 5,3 2,79 1463 12,5 CF1,02-HT 632 2,52 1592 CF102-HT-V 616 2,5 247 1521 4,46 CokeBF-(I) 590 3,00 1770 CokeBF-(I)-V 563 4,6 2,80 1578 10,8 Le tableau 5 montre que: 1) la seconde fluoration selon l'invention réduit considérablement le taux d'autodécharge AQpr/Qpr [GN4F(I) 3,3% et GN4F(II) : 1,56%].
2) le taux d'autodécharge augmente avec la teneur en iode. Les seuls composés pour lesquels AQpr/Qpr 3) par rapport au taux d'autodécharge obtenu avec un carbone fluoré de l'invention [GN4F (II) et coke AF (II)], le taux d'autodécharge obtenu avec un carbone fluoré non conforme à l'invention [coke B(II)] ou avec un échantillon de l'art antérieur est soit supérieur [pour GN4(I) : 3,3% ; pour coke AF(I) : 5,3% ; pour coke BF(II): 4,7%], soit voisin (HT-CFn: 2,5 %) 4) la perte de densité d
PROCÉDÉ POUR DÉTERMINER UNE PROPORTION DE REACTANT DANS UN LIQUIDE ET APPAREIL AUTOMATIQUE CORRESPONDANT La présente invention concerne un procédé automatique visant à déterminer une quantité de réactant, acide faible ou base faible, dans un milieu liquide. L'invention concerne également un appareil de mesure automatique pour la mise en oeuvre du procédé. L'invention trouve tout particulièrement son application dans la mesure de l'acidité des huiles, comestibles ou non comestibles, et en particulier dans la mesure de la concentration d'acide oléique dans l'huile d'olive.
Dans l'état actuel de la technique, I'acidité des huiles comestibles, telles que l'huile d'olive, est mesurée manuellement, par exemple selon la norme française NFT 60-204, par réaction chimique acide/base consistant à neutraliser l'acide contenu dans un échantillon d'huile de volume connu. Pour cette neutralisation, on utilise un réactif alcalin de titre connu, en général une solution aqueuse d'hydroxyde de potassium 0,355 M, en présence d'un agent de virage colorimétrique, tel que la phénol-phtaléine, sous agitation permanente. On ajoute généralement au milieu réactionnel un certain volume d'éthanol pour faciliter la miscibilité des produits présents. La quantité du réactif basique que l'on verse pour arriver au virage de coloration, à savoir à pH 9,2 pour la phénol-phtaléine, donne le pourcentage d'acide oléique dans l'huile d'olive. II existe plusieurs méthodes normalisées (voir notamment la norme française NFT 60-221 et le Journal Officiel des Communautés Européennes n 248/6-7 du 5 septembre 1991 ) mais, dans tous les cas, ces méthodes sont basées sur le repérage d ' une neutralisation par un agent de virage colorimétrique. L' inconvénient majeur de ces méthodes est que, d ' une part, elles sont entièrement manuelles et que, d'autre part, elles impliquent une incertitude sur le résultat de la mesure, non seulement, en raison de la non-miscibilité des produits mis en cause dans la mesure, mais encore, en raison de Terreur du manipulateur pour le repérage du virage colorimétrique.
La présente invention a pour but de remplacer les méthodes manuelles ci-dessus définies par un procédé automatique permettant à la fois de s'affranchir de la main-d'oeuvre requise par les méthodes usuelles et d'améliorer la précision des résultats obtenus.
L'invention est essentiellement basée sur le fait que, si un milieu liquide contient un réactant constitué par un acide faible ou une base faible, une addition progressive d'un réactif constitué respectivement par une base ou un acide entraîne une élévation du pH selon une courbe qui présente un point d'inflexion correspondant à la neutralisation exacte. Lorsque le réactant est un acide faible, comme l'acide oléique par exemple, I'addition par petite dose, par exemple goutte à goutte, d'une base à dilution appropriée, par exemple KOH, entraîne une montée du pH selon la courbe précitée ; tant que l'on est audessous de la neutralisation, l'augmentation du pH entre deux additions successives de réactif est constante ou croissante, c'est-à-dire que l'incrément du pH entre deux additions successives de réactif ne décroît pas ; cette situation persiste jusqu'à ce que l'on arrive au point d'inflexion sur la courbe, auquel cas, après ce point, I'incrément diminue. Selon l'invention, on prévoit de repérer le changement du sens de variation de l'incrément, qui correspond au passage par le point d'inflexion et l'on repère la quantité de réactif utilisée au moment de la dernière addition faite avant le changement du sens de variation de I'incrément. A partir de cette quantité de réactif, on en déduit la quantité de réactant présent dans l'échantillon et, par conséquent, la proportion de réactant dans le milieu liquide à tester.
Pour chaque couple réactif/réactant, il convient de choisir la dilution du réactif et la valeur de la dose ajoutée à chaque addition de réactif. Si l'on utilise un réactif trop concentré, la pente de la tangente au point d'inflexion de la courbe de neutralisation est trop grande, ce qui conduit à une erreur, même en choisissant des doses minimales, à savoir une goutte ; si, au contraire, on choisit un réactif trop dilué, la pente de la tangente au point d'inflexion est trop faible et la variation de l'incrément au voisinage du point d'inflexion risque d'être du même ordre de grandeur que les erreurs de mesure.
La présente invention a donc pour objet un procédé pour déterminer la quantité d'un réactant, acide faible ou base faible, présent dans un milieu liquide à tester, procédé dans lequel on prélève un échantillon de volume prédéterminé du milieu liquide et on y ajoute, à vitesse contrôlée et sous agitation, un réactif susceptible de neutraliser le réactant, la neutralisation étant repérée par un agent de repérage, caractérisé par le fait que l'on ajoute le réactif dose à dose, chaque addition d'une dose étant suivie, après un temps d'agitation permettant le retour à l'équilibre, d'une mesure potentiométrique repérant le pH dans l'échantillon de milieu liquide que l'on conserve en mémoire au moins deux valeurs potentiométriques successives pour calculer leur incrément entre deux additions de dose successives, que l'on conserve en mémoire les valeurs d'au moins deux incréments successifs pour les comparer et définir leur sens de variation, que l'on repère l'inversion de ce sens de variation, que l'on enregistre la quantité de réactif délivrée dans l'échantillon pour arriver à ce point d'inversion et qu'on en déduit la proportion de réactant présent dans le milieu liquide, ce qui constitue le résultat de la mesure.
Le procédé1 qui vient d'être défini, est tout particulièrement utilisable lorsque le réactant est un acide faible et que le milieu liquide à tester est une huile. On peut, notamment, mettre en oeuvre le procédé selon l'invention pour déterminer la quantité d'acide oléique dans une huile d'olive.
À titre d'exemples non-limitatifs de mise en oeuvre de ce procédé, on peut se référer à la description donnée dans le Tableau des poudres numérotées 1096, 1126-7, 1545-6 et 1638.
f) Traitement par irradiation après anplication sur ou dans un matériau Comme dans le cas du procédé de traitement thermique, le traitement par irradiation peut être utilisé avec succès après application des minéraux dans ou sur un matériau à colorer.
Lorsqu'on applique un minéral sur ou dans un matériau, on n'obtient pas nécessairement un résultat intéressant au niveau de la couleur (ex.: incolore, crème clair, gris clair ou beige clair). Si l'on procède alors à une irradiation, on peut obtenir une transformation de la couleur ou de la qualité de couleur. Dans la plupart des cas rencontrés, un minéral irradié indépendamment du matériau donne une couleur ou qualité de couleur qui peut être radicalement différente ou similaire à celle obtenue lorsque le même minéral est appliqué dans un matériau, puis irradié ultérieurement. De plus, la couleur ou qualité de couleur obtenue après l'irradiation diffère d'un matériau à l'autre et, de surcroît, d'un type de radiation à l'autre. La mise en oeuvre de ce procédé permet donc de transformer la couleur des minéraux après leur application dans des matériaux, soit radicalement, soit modérément.
Les conditions de mise en oeuvre de ce traitement sont similaires à celles précédemment décrites. Les matériaux traités peuvent aussi être traités thermiquement au préalable. L'irradiation est effectuée à l'air ambiant ou en atmosphère contrôlée. Ce procédé s'effectue à une variété de doses.
Parmi les sources d'irradiation utilisées figurent les rayonnements X, gamma et électronique. D'autres sources d'irradiation pourraient aussi être utilisées.
A titre d'exemples non limitatifs de mise en oeuvre de ce procédé, on peut se référer à la description donnée dans le Tableau des poudres numérotées 124 (après application dans du PYREX@); 1531 (après traitement thermique, traitement à l'acide et application dans du PYREX@); 1009 (après application sur du ciment et traitement thermique); 1034 (après application dans du ciment et traitement thermique); 29 (après traitement thermique, traitement à l'acide et application dans du polymère à béton); 22 (après application dans de l'encre); etc...
Application des poudres colorées selon l'invention Tel que précédemment indiqué, les poudres du système de couleurs selon l'invention sont utilisables comme pigments dans de nombreux domaines, mais plus spécialement pour la coloration de matériaux modernes d'architecture. De nombreux exemples de matériaux colorés selon l'invention ont déjà été mentionnés (voir la description ci-dessus des "procédés thermiques" et "procédés physiques"). Les exemples additionnels qui suivent illustreront de façon non limitative diverses applications possibles des poudres du système selon l'invention.
EXEMPLE ne 1: apPlication de Poudres colorées comme pigments dans du plastique Plusieurs tests différents d'application de pigments minéraux dans de la résine polyester transparente ont été effectués.
La procédure suivie au cours de ces tests a été la suivante: 50 cc. de résine polyester n0 2T323 commercialisée par MIA CHEMICALS ont été utilisés. La quantité choisie de pigments a été mélangée à la main avec une petite quantité de résine et le mélange obtenu a été intégré au reste de la résine. Le tout a alors été remué avec une spatule et laissé à décanter quelques minutes. La résine colorée ou teintée ainsi obtenue a alors été transvasée dans un autre récipient et 2% du poids de catalyseur de polymérisation ont été ajoutés et mélangés avec une spatule. Après durcissement à 370C, la pièce de résine obtenue a été démodelée, taillée et polie. Les observations de couleurs ont été faites à ce stade.
Les pigments qui ont aussi été testés incluent notamment la poudre traitée thermiquement numérotée 1 335 sur le Tableau ci-joint.
Des essais de transformation par irradiation des couleurs ou teintes des pièces de résine polyester ainsi préparées ont également été effectuées. Ces essais effectués dans les conditions données ci-dessus ont montré que toutes les pièces de résine, qu'elles soient transparentes, colorées ou teintées, changent de couleur sous l'action d'une irradiation et que pour un même pigment cette couleur change selon le type d'irradiation utilisé, avant ou après l'incorporation à la résine.
Ceci offre bien sûr des possibilités énormes d'application au niveau décoratif et/ou industriel.
EXEMPLE n" 2: application des poudres colorées comme pigments dans du ciment Des essais d'applications de plusieurs poudres colorées selon l'invention ont été effectués dans du ciment blanc Portland (type 10 ACNOR/CSA A5).
Des essais ont été effectués avec du ciment mélangé à une composition polymère du type utilisé pour les bétons. Cette composition était constituée de résine polyester pour béton de type C-001 (Fiberglass Canada Inc.), d'un initiateur de polymérisation de marque CADOXe M-50 (Akzo Chemicals Inc.) et d' numérotés 152-3). Il a aussi été noté que l'ajout du ciment peut déclencher des réactions. Certaines couleurs ressortent bien dans le polymère mais elles se modifient au contact du ciment, qui peut affadir ou éteindre la couleur, lui donnant un ton laiteux ou gris (voir la description du matériau numéroté 154).
II a en outre été noté que certains pigments, en particulier les oxydes de fer, sont naturellement siccatifs lorsqu'ils sont appliqués dans le polymère à béton.
Certains pigments minéraux colorent donc le ciment délayé avec du polymère à béton. D'autres pigments teintent le ciment délayé avec du polymère à béton. Ceci dépend de la nature même du pigment ou, encore, de la quantité appliquée. Enfin, d'autres pigments texturisent le ciment délayé avec du polymère à béton.
La transfonnation génétique du maïs, quelle que soit la méthode employée (électroporation; Agrokacie'.iiait, micro fibres, canon à particules), requiert généralement l'utilisation de cellules indifférenciées en divisions rapides ayant conservé une aptitude à la régénération de plantes entières. Ce type de cellules compose le cal friable embryogène (dit de type II) de maïs.
Ces cals sont obtenus à partir d'embryons immatures de génotype H1 II ou (A188 x B73) selon la méthode et sur les milieux décrits par Armstrong (Malze Handbook; (1994) M. Feeling, V. Walbot Eds., pp. 665-671). Les cals ainsi obtenus sont multipliés et maintenus par repiquages successifs tous les quinze jours sur le milieu d'initiation.
Des plantules sont ensuite régénérées à partir de ces cals en modifiant l'équilibre hormonal et osmotique des cellules selon la méthode décrite par Vain et al. (1989). Ces plantes sont ensuite acclimatées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.
X.2. UTILISATION DU CANON A PARTICULES POUR LA TRANSFORMATION GENETIQUE DU MAIS.
Le paragraphe précédent décrit l'obtention et la régénération des lignées cellulaires nécessaires à la transformation 8 on décrit ici une méthode de transformation génétique conduisant à l'intégration stable des gènes modifiés dans le génome de la plante. Cette méthode repose sur l'utilisation d'un canon à particules; les cellules cibles sont des fragments de cals décrits dans le paragraphe 1. Ces fragments d'une surface de 10 à 20 mm2 ont été disposés, 4 h avant bombardement à raison de 16 fragments par boite au centre d'un boite de petri contenant un milieu de culture identique au milieu d'initiation, additionné de 0,2 M de mannitol + 0,2 M de sorbitol. Les plasmides portant les gènes à introduire sont purifiés sur colonne Qiagen, en suivant les instructions du fabricant. Ils sont ensuite précipités sur des particules de tungsten (mis) en suivant le protocole décrit par Klein (1987). Les particules ainsi enrobées sont projetées vers les cellules cibles à l'aide du canon et selon le protocole décrit par J. Finer (1992).
Les boites de cals ainsi bombardées sont ensuite scellées à l'aide de Scellofrais# puis cultivées à l'obscurité à 270C. Le premier repiquage a lieu 24 h après, puis tous les quinze jours pendant 3 mois sur milieu identique au milieu d'initiation additionné d'un agent sélectif dont la natllre et la concentration peuvent varier selon le gène utilisé (voir paragraphe 3). Les agents sélectifs utilisables consistent généralement en composés actifs de certains hel-bicides (Basta#, Round up8) ou certains antibiotiques (Hygromycille Kanamycine...).
On obtient après 3 mois ou parfois plus tôt, des cals dont la croissance n'est pas inhibée par l'agent sélection, habituettement et majoritairement composés de cellules résultant de la division d'une cellule ayant intégré dans son patrimoine génétique une ou plusieurs copies du gène de sélection. La fréquence d'obtention de tels cals est d'environ 0,8 cal par boite bombardée.
Ces cals sont identifiés, individualisés, amplifiés puis cultivés de façon à régénérer des plantules. Afin d'éviter toute interférence avec des cellules non transformées toutes ces opérations sont menées sur des milieux de culture contenant l'agent sélectif.
Les plantes ainsi régénérées sont acclimatées puis cultivées en serre où elles peuvent être croisées ou autofécondées.
XI. ANALYSE DE L'EXPRESSION DE LA LIPASE PANCREATIQUE HUMAINE (LPH) DANS LES PLANTES DE TABAC TRANSGENIQUES.
XI.1. PROTOCOLE.
Le protocole d'extraction de la lipase à partir de feuilles de tabac prélevées sur des plantes en serre est le suivant: 1 g de feuilles (poids frais) est broyé dans l'azote liquide puis à 4"C dans 5 ml de tampon Tris-HC1 50mM pH neutre, additionné d'EDTA ImM et de ss-mercaptoéthanol I0mM, de Triton X-100 0,2% et de NaCI 50mM. Le broyat total est immédiatement centrifugé à 4"C pendant 15 min à 10000 g.