INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les fonctions d'encapsidation d'AAV sous contrôle du promoteur inductible, peuvent être introduites dans différentes régions du génome de l'adénovirus revendiqué. Avantageusement, les fonctions d'encapsidation sont insérées dans une région ne perturbant pas la capacité du virus à transcomplémenter les AAV. Il est également possible d'insérer les fonctions d'encapsidation dans une région fonctionnelle du génome dudit adénovirus, laquelle région étant alors apportée en trans, soit par un plasmide, soit par la lignée cellulaire utilisée. Il est possible par exemple d'insérer le gène rep, le gène cap ou les gènes rep et cap au niveau des régions El ou E3 en remplacement ou supplément des séquences déletées.
Pour accroître la sécurité d'un tel adénovirus, on peut en outre introduire une séquence dite séquence de régulation négative. Une telle séquence insérée notamment entre l'ITR gauche et la séquence psi de l'adénovirus revendiqué d'une part, et la séquence codant pour le promoteur inductible à la tétracycline permet d'endiguer toute activitation transcriptionnelle parasitaire de rep et cap, induite le cas échéant par l'enhancer situé dans l'ITR gauche de l'adénovirus et la séquence psi. A titre de séquences négatives pouvant être mises en oeuvre selon l'invention, on peut notamment citer celles identifiées dans le promoteur vimentine (Salvetti et al., (1993), Mol. Cell. Biol., 1676-1685) dans le promoteur interféron ( Whitemore et al. (1990), P.N.A.S., 87, 7799-7803), dans le gène de chaine 2 légère de la myosine cardiaque (Ruoquian-Shen et al. (1991), Mol. Cell. Biol., 1676-1685) et dans le promoteur albumine de souris (Herbst et al. (1990), Mol. Cell. Biol., 3896-3905).
Selon un mode de réalisation préféré, I'invention concerne un adénovirus recombinant portant une cassette d'expression Op2/Tk-rep-cap.
La présente invention a également pour objet l'utilisation de ces adénovirus intégrant une séquence virale d'origine AAV sous contrôle d'un promoteur inductible à la tétracycline pour préparer des AAV.
Dans un mode de réalisation préféré, les adénovirus objets de l'invention comprennent les séquences ITR et une séquence permettant l'encapsidation.
Préférentiellement ces adénovirus possèdent en outre une région El non fonctionnelle.
Les séquences inversées répétées (ITR) constituent l'origine de réplication des adénovirus. Elles sont localisées aux extrémités 3' et 5' du génome viral (Cf figure 1), d'où elles peuvent être isolées aisément selon les techniques classiques de biologie moléculaire connues de l'homme du métier. La séquence nucléotidique des séquences ITR des adénovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAVI et CAV2).
La séquence d'encapsidation (également désignée séquence Psi) est nécessaire à l'encapsidation de l'ADN viral. Cette région doit donc être présente pour permettre la préparation d'adénovirus recombinants défectifs selon l'invention. La séquence d'encapsidation est localisée dans le génome des adénovirus, entre l'ITR gauche (5') et le gène El (Cf figure 1). Elle peut être isolée ou synthétisée artificiellement par les techniques classiques de biologie moléculaire. La séquence nucléotidique de la séquence d'encapsidation des adénovirus humains (en particulier des sérotypes Ad2 et Ad5) est décrite dans la littérature, ainsi que des adénovirus canins (notamment CAV1 et CAV2). Concernant l'adénovirus Ad5 par exemple, la séquence d'encapsidation correspond à la région comprenant les nucléotides 194 à 358 du génome.
Selon un mode particulièrement avantageux, dans les adénovirus recombinants de la présente invention, la région El est inactivée par délétion d'un fragment PvuII-BglII allant du nucléotide 454 au nucléotide 3328, sur la séquence de ladénovirus Ad5. Cette séquence est accessible dans la littérature et également sur base de données (voir notamment Genebank n" M73260). Dans un autre mode de réalisation préféré, la région El est inactivée par délétion d'un fragment HinflI-Sau3A allant du nucléotide 382 au nucléotide 3446.
Les adénovirus de l'invention peuvent être préparés à partir d'adénovirus d'origines diverses. Il existe en effet différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu, mais qui présentent une organisation génétique comparable. Ainsi, les enseignements décrits dans la présente demande peuvent être aisément reproduits par l'homme du métier pour tout type d'adénovirus.
Concernant les adénovirus d'origine humaine, on préfère utiliser ceux classés dans le groupe C. Plus préférentiellement, parmi les différents sérotypes d'adénovirus humain, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus de type2ou5(Ad2ou Ad 5) Comme indiqué plus haut, les adénovirus de l'invention peuvent également être d'origine animale, ou comporter des séquences issues d'adénovirus d'origine animale. La demanderesse a en effet montré que les adénovirus d'origine animale sont capables d'infecter avec une grande efficacité les cellules humaines, et qu'ils sont incapables de se propager dans les cellules humaines dans lesquelles ils ont été testés (Cf demande WO 94/26914).La demanderesse a également montré que les adénovirus d'origine animale ne sont nullement trans-complémentés par des adénovirus d'origine humaine, ce qui élimine tout risque de recombinaison et de propagation in vivo, en présence d'un adénovirus humain, pouvant conduire à la formation d'une particule infectieuse. L'utilisation d'adénovirus ou de régions d'adénovirus d'origine animale est donc particulièrement avantageuse puisque les risques inhérents à l'utilisation de virus comme vecteurs en thérapie génique sont encore plus faibles.
Plus particulièrement, parmi les adénovirus aviaires, on peut citer les sérotypes 1 à 10 accessibles à l'ATCC, comme par exemple les souches Phelps (ATCC VR432), Fontes (ATCC VR-280), P7-A (ATCC VR-827), IBH-2A (ATCC VR-828), J2-A (ATCC VR-829), T8-A (ATCC VR-830), K-ll (ATCC VR-921) ou encore les souches référencées ATCC VR-831 à 835. Parmi les adénovirus bovins, on peut utiliser les différents sérotypes connus, et notamment ceux disponibles à l'ATCC (types à à 8) sous les référencesATCC VR-313, 314, 639-642, 768 et 769.On peut également citer les adénovirus murins FL (ATCC VR-550) et E20308 (ATCC VR528), ladénovirus ovin type 5 (ATCC VR-1343), ou type 6 (ATCC VR-1340); I'adénovirus porcin 5359), ou les adénovirus simiens tels que notamment les adénovirus référencée à l'ATCC sous les numéros VR-591-594, 941-943, 195-203, etc.
Pour cette acquisition, et notamment dans le domaine de la tomographie, il est nécessaire de faire divers calculs.
Ces calculs nécessitent une connaissance précise des positions successivement occupées par la source et le détecteur de rayons X lors de l'examen du patient.
Le problème à résoudre dans l'art antérieur est la détermination de ces positions respectives de la source et du détecteur de rayons X par rapport à un repère déterminé qui est fixe.
I1 s'agit de déterminer avec précision un ensemble de paramètres géométriques parmi lesquels on trouve des paramètres intrinsèques et des paramètres extrinsèques.
Les paramètres intrinsèques comprennent les deux coordonnées, mesurées dans le plan du détecteur, du point qui est la projection orthogonale du foyer de la source de rayons X sur le plan du détecteur.
Cette projection est appelée " centre image " (" piercing point " dans les publications en langue anglaise).
Un autre paramètre intrinsèque est la distance entre le foyer et ce point.
Cette distance est appelée "distance focale".
On a donc déjà trois paramètres intrinsèques auxquels s'ajoutent deux autres paramètres intrinsèques, à savoir l'angle a entre les lignes et les colonnes du détecteur (matriciel) et le rapport r entre le pas des lignes et le pas des colonnes de ce détecteur.
I1 est à noter que, dans le domaine de l'imagerie par rayons X, on utilise essentiellement des détecteurs dans lesquels les lignes sont perpendiculaires aux colonnes, d'où un angle a de 90 , et dans lesquels le pas des lignes est égal au pas des colonnes, d'où un rapport r égal à 1.
Dans certains cas, on est amené à faire une correction de l'image acquise grâce au détecteur pour se ramener à ces conditions.
I1 y a donc en pratique trois paramètres intrinsèques dans le domaine de l'imagerie par rayons X.
Les paramètres extrinsèques comprennent les trois coordonnées du foyer de la source de rayons X par rapport au repère fixe et trois autres paramètres définissant l'orientation du détecteur dans ce repère.
Cette orientation est généralement définie par les trois angle d'Euler 0, ç et , permettant de passer de ce repère fixe au repère mobile du détecteur.
I1 y a donc trois paramètres intrinsèques en pratique et six paramètres extrinsèques, donc au total neuf paramètres géométriques.
Ces paramètres ne sont pas connus car l'arceau se déforme au cours de sa rotation, sous l'effet des masses de la source et du détecteur et sous l'effet de vibrations se produisant pendant cette rotation.
Différents nucléotides peuvent rentrer dans la formulation d'oligonucléotides. les oligonucléotides faisant l'objet de la présente invention sont composés par une séquence de bases nucléotidiques comportant notamment de l'adenine (A), de la guanine (G), de la cytosine (C), de la thymine (T) et de l'uracile (U), reliées entre elles par des liaisons internucléotidiques, notamment naturelles c 'est-à-dire phosphodiesters.
Les oligonucléotides selon l'invention peuvent également comporter à l'extrémité 5' ou aux deux extrémités 3' et 5' en même temps, des séquences nucléotidiques supplémentaires, dont la nature et la longueur permettront l'apparition des structures en agrafe ou semiagrafe dans la séquence finale de la molécule oligonucléotidique.Ces séquences nucléotidiques supplémentaires pourront être de deux types soit elles présenteront elles-mêmes une structure secondaire en semiagrafe qui sera transmise aux séquences oligonucléotidiques dont elles seront les nouvelles extrémités ; soit elles ne présenteront pas d'emblée ce type de structure secondaire mais les bases nucléotidiques constituant l'une ou l'autre de leurs extrémités seront capables d'aller s'apparier avec des nucléotides situés au sein des séquences auxquelles elles seront ajoutées, conférant ainsi à la séquence finale une structure en agrafe ou en semi-agrafe.
Font également partie de cette invention, des oligonucléotides fermés, caractérisés en ce qu'ils sont constitués d'une ou plusieurs séquence(s) d'oligonucléotides monocaténaires dont les extrémités sont reliées entre elles par des liens covalents, nucléotidiques ou nonnucléotidiques, pour former au moins partiellement une structure monocaténaire fermée.
Les oligonucléotides selon l'invention peuvent aussi comporter des nucléotides réactifs, capables d'établir des liens avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide, ou, dans une autre application, des liens intra-moléculaires au sein même de l'oligonucléotide.
Ainsi, les oligonucléotides selon l'invention peuvent porter des groupements réactifs greffés sur les nucléotides, comme par exemple des groupements psoralènes, ou d'autres agents de pontage ou agents intercalants pouvant réagir avec la séquence de la molécule cible complémentaire à l'oligonucléotide. Dans un cas particulièrement intéressant, des groupements réactifs greffés sur certains des nucléotides de l'oligonucléotide pourront induire la formation d'un pontage intramoléculaire au sein même de la molécule.
Font également partie de l'invention des oligonucléotides dits chimériques, constitués par l'assemblage covalent de fragments nucléotidiques et non-nucléotidiques.
Font également partie de l'invention des oligonucléotides antisens couplés à des molécules permettant d'accroître leur pénétration intracellulaire en stabilisant la structure oligonucléotidique, et en particulier des groupements lipophiles, des polypeptides ou des proteines.
Des formulations galéniques adéquates peuvent être établies afin d'optimiser la délivrance de ces molécules aux cellules CD34+ cibles. Ainsi, par exemple, les oligonucléotides antisens pourront être encapsulés dans des liposomes, des nonaparticules, des particules LDL, ou dans tout autre type de microsphère permettant une conservation adéquate, et favorisant le ciblage. Les molécules oligonucléotidiques peuvent également être associées à des agents surfactants cationiques.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à la lumière des exemples qui vont suivre en référence aux Figures 1 à 4.
La Figure 1 représente un fragment de 60 nucléotides de la séquence de l'ARN messager centré sur la jonction bcr-abl associée à des patients atteints de LMC qui présentent une jonction de type L6 ou b2a2, juxtaposant l'exon 2 du gène bcr et l'exon 2 du gène abl. La flèche indique la position de la jonction bcr-abl : la séquence dérivée du gène bcr se trouve en amont de la jonction, tandis que la séquence dérivée du gène abl se trouve en aval de la jonction. La séquence soulignée correspond à la cible des oligonucléotides antisens anti-b2a2 (Figure 3).
La Figure 2 représente un fragment de 60 nucléotides de la séquence de l'ARN messager centré sur la jonction bcr-abl associée à des patients atteints de LMC qui présentent une jonction de type K-28 ou b3a2, juxtaposant l'exon 3 du gène bcr et l'exon 2 du gène abl. La flèche indique la position de la jonction bcr-abl : la séquence dérivée du gène bcr se trouve en amont de la jonction, tandis que la séquence dérivée du gène abl se trouve en aval de la jonction. La séquence soulignée correspond à la cible des oligonucléotides antisens anti-b3a2 (Figure 3).
La Figure 3 représente des oligonucléotides utilisés dans les tests d'inhibition de la prolifération clonale des progéniteurs myéloïdes.
L'oligonucléotide antisens GT-1 est complémentaire de la jonction bcr-abl de type b2a2 (Figure 1). L'oligonucléotide antisens GT-2 est complémentaire de la jonction bcr-abl de type b3a2 (Figure 2).
L'oligonucléotide contrôle GT-3 correspond à la séquence complémentaire à GT-1 ; l'oligonucléotide contrôle GT-4 correspond à la séquence complémentaire à GT-2.
De plus, comme on l'a vu plus haut, selon une première étape du procédé, on fait un étalonnage préalable de l'appareil de la figure 1.
On suppose que cet étalonnage préalable est à peu près correct c'est-à-dire que les erreurs commises dans les évaluations des paramètres au moyen de cet étalonnage préalable sont faibles.
On est alors amené à distinguer quatre manière de mettre en oeuvre la présente invention, ctest-à-dire quatre types d'étalonnage croisé, suivant les hypothèses que l'on fait sur l'appareil.
1") Etalonnage croisé de type I Dans ce cas, on considère les six paramètres extrinsèques comme répétitifs (lors de déplacements successifs de la source et du détecteur) et les trois paramètres intrinsèques comme non répétitifs (variables d'un déplacement à l'autre).
2") Etalonnage croisé de type II Dans ce cas, on considère les six paramètres extrinsèques comme non répétitifs et les trois paramètres intrinsèques comme répétitifs.
3 ) Etalonnage croisé de type III Dans ce cas, on suppose encore les trois paramètres intrinsèques répétitifs, on suppose également que les trois paramètres relatifs à l'orientation du détecteur sont répétitifs (rotations du détecteur répétitives) mais l'on suppose que les trois paramètres relatifs à la source, c'est-à-dire les trois coordonnées de celle-ci dans le repère R, sont non répétitifs.
Cet étalonnage croisé de type III permet de prendre en compte une translation aléatoire de l'image dans le plan du détecteur.
4 ) Etalonnage croisé de type IV Dans ce cas, on suppose encore que les trois paramètres intrinsèques sont répétitifs et l'on suppose que les trois paramètres relatifs à la source sont répétitifs mais que les trois paramètres relatifs à l'orientation du détecteur sont non répétitifs.
Cet étalonnage croisé de type IV permet de prendre en compte une erreur sur les positions angulaires du détecteur.
Pour mettre en oeuvre l'invention avec l'appareil de la figure 1, on considère des positions successives de l'ensemble source-détecteur.
Ceci est schématiquement illustré par la figure 2 où l'on voit N positions successives du foyer de la source S lorsque l'ensemble tourne autour de la table 4.
Ces positions successives portent respectivement les références F1, F2, ..., FN et correspondent à N images ou vues, N étant par exemple égale à 50.
Avant de mettre en place le patient pour l'examen de celui-ci, on commence par réaliser, d'une façon connue, l'étalonnage préalable au moyen d'un fantôme rigide 14 (figure 2).
Ceci permet d'obtenir des valeurs des neuf paramètres géométriques pour chacune des N positions de l'ensemble source-détecteur, que l'on prend comme valeurs initiales.
On notera que ces valeurs initiales ne sont pas exactes mais certaines d'entre elles sont plus proches des valeurs réelles que d'autres.
On rappelle que l'on cherche à obtenir des valeurs très précises des neuf paramètres pour chacune des N positions, pour l'appareil de la figure 1.
EXEMPLE 5 Prévision des effets des remplacements d'acides aminés dans les analogues de la PTH sur le potentiel de formation d'hélice a Comme expliqué ci-dessus, le potentiel de formation d'hélice a de polypeptides linéaires peut être estimé en utilisant les équations de Lifson-Roig (S. Lifson et A.
Roig, J. Chem. Phys. (1961), 34, 1963-1974) et les valeurs déterminées pour les paramètres de formation d'hélice des résidus par conversion à partir de leurs valeurs de Zimm Bragg (B.H. Zimm et J.K. Bragg, J. Chem. Phys. (1959), 31, 526-535) en utilisant les équations de conversion de Qian et Schellman (H. Qian et J.A. Schellman, J. Chemin. Phys.
(1992), 96, 3987-3994). Une fois qu'un couple de valeurs s et a de Zimm-Bragg est défini pour chaque résidu, la probabilité pour que la chaîne polypeptidique entière (ou quelque sous-séquence définie) adopte une conformation d'hélice a peut alors être calculée en utilisant les équations mentionnées dans les références ci-dessus.
Les deux calculs généralement utilisés pour estimer le potentiel de formation d'hélice a, décrits ci-dessus, sont appliqués aux deux analogues de la PTH produits. Le premier calcul pose que le paramètre d'amorçage d'hélice v de Lifson-Roig est une constante égale à 0,039 (c'est-à-dire que le paramètre a de Zimm-Bragg est de 0,0013 pour tous les résidus), et le paramètre w pour chaque acide aminé est calculé d'après la valeur s de Zimm-Bragg trouvée dans le Tableau 1 de Finkelstein et coll. (Finkelstein et coll., Proteins: Structure, Function and Genetics (1991), 10, 287299).En appliquant les calculs aux analogues de la PTH, les valeurs s figurant dans le Tableau 1 de cette référence sont d'abord converties pour passer de leurs valeurs à 3000K aux valeurs estimées à 2730K en admettant une variation d'enthalpie de 1 kcal/mol (identique pour tous les résidus) . Pour l'analogue 1 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,41 pour que la séquence entière forme une hélice a. Pour l'analogue 2 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,18 pour que la séquence entière forme une hélice a. Pour l'analogue 3 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,15 pour que la séquence entière forme une hélice a.
Le second calcul ne suppose pas que tous les résidus ont la même valeur pour le paramètre v d'amorçage d'hélice (c'est-à-dire que le paramètre a de Zimm-Bragg est spécifique à chaque résidu d'acide aminé) . Dans ce cas, les valeurs s et a de Zimm-Bragg pour chaque résidu (excepté pour His, Pro et Trp) sont extraites du Tableau 1 de J. Skolnick et A. Holtzer, Macromolecules (1982), 15, 812821. Les valeurs de Zimm-Bragg pour His sont celles fournies par Sueki et coll., Macromolecules (1984), 17, 148-155. Les valeurs de Zimm-Bragg pour Pro et Trp sont celles fournies par Finkelstein et coll. Pour ce second calcul, dans chaque cas, la valeur s a été calculée à 2730K et, pour les résidus ayant des chaînes latérales ionisables, on admet la valeur s pour l'état d'ionisation qui doit prédominer à pH 7.Les valeurs s (à 2730K) et les valeurs 6 obtenues d'après Sueki et coll., et Skolnick et Holtzer sont converties (Qian et Schellman) en leurs valeurs v et w de Lifson-Roig, puis utilisées pour calculer la probabilité pour que la chaîne polypeptidique entière (ou quelque sous-séquence) existe à l'état d'hélice a. Pour l'analogue 1 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,07 pour que la séquence entière forme une hélice a. Pour l'analogue 2 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,02 pour que la séquence entière forme une hélice a. Pour l'analogue 3 de la PTH, ce calcul donne une probabilité de 0,02 pour que la séquence entière forme une hélice a.
Considérées ensemble, ces deux séries d'hypothèses concernant la tendance des polypeptides à prendre une conformation d'hélice a laissent prévoir que l'analogue 1 doit être deux à trois fois plus susceptible d'exister sous forme d'une hélice a que l'analogue 2.
EXEMPLE 6 Estimation du potentiel de formation d'hélice a d'après le dichroisme circulaire dans des concentrations variables de trifluoréthanol Les études de dichroïsme circulaire dans le trifluoréthanol (TFE) sont conduites en utilisant un spectromètre de dichroïsme circulaire, modèle 62DS, de AVIV Associates, Inc. Les concentrations de protéine sont déterminées d'après les valeurs mesurées d'absorbance en utilisant les coefficients d'extinction calculés pour les analogues dans du tampon ionique 1OmM. Des titrages avec le TFE sont effectués de O à 50 % de TFE, en balayant de 250 à 200 nm à 200C pour chaque échantillon contenant du TFE.
[Q]222 est calculé comme Observé à 222 R (poids de résidu moyen)/[l0(parcours optique de la cuve) (concentration de protéine)] Les résultats des titrages avec le TFE à pH 6,5 en présence de cacodylate lOmM sont résumés ci-dessous au Tableau 2 pour les analogues de la PTH et transcrits graphiquement sur la Figure 4. La Figure 4 montre que, lorsque la concentration du co-solvant inducteur d'hélice a, le trifluoréthanol, atteint 30 % en volume, le taux essentiellement maximal de conformation hélicoïdale est atteint pour à la fois la PTH et l'analogue 1, le taux moyen de conformation hélicoïdale étant d'environ 80 %.
Même en l'absence d'agent inducteur d'hélice, la PTH originale a environ 20 % de conformation d'hélice a.
L'analogue 2 de la PTH est essentiellement dépourvu d'hélice en l'absence du TFE inducteur d'hélice, et il a tout au plus environ 30 % de conformation d'hélice a en présence de 30 % de TFE.
L'analogue 3 de la PTH est essentiellement dépourvu d'hélice en l'absence du TFE inducteur d'hélice, et il a environ 15 % de conformation d'hélice a en présence de 30 % de TFE.
La réduction de 2 à 3 fois du taux d'hélice observé à 30 % de trifluoréthanol était prévisible d'après l'équation de Lifson-Roig et les calculs faits selon cette équation, comme exposé ci-dessus.
TABLEAU 2 Résultats de Titraqe avec le TFE