INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Généralement, ce dernier est clivé par une enzyme de restriction appropriée afin de réduire l'infectivité de l'ADN viral parental et augmenter l'efficacité d'isolement des adénovirus recombinants. Cependant, on observe néanmoins un bruit de fond important de particules virales infectieuses d'origine parentale, ce qui nécessite un travail d'analyse des plages obtenues particulièrement lourd (d'un point de vue temps et coût puisque chaque plage doit être amplifiée et analysée individuellement). Ceci est problématique lorsque le virus parental présente un avantage sélectif sur l'adénovirus recombinant, par exemple lorsque ce dernier se replique plus lentement que le virus parental. du fait de l'insertion d'un gène d'intérêt de grande taille (Facteur VIII, dystrophine), réduisant d'autant sa probabilité d'obtention.
La ligation entre deux fragments d'ADN générés par les techniques classiques de biologie moléculaire et portant respectivement les parties 5' et 3' du vecteur adénoviral recombinant peut également être employée. La transfection du mélange de ligation dans les cellules de complémentation permet en théorie d'encapsider le génome de l'adénovirus recombinant pour former une particule infectieuse.
Cette technologie est peu efficace et son application limitée par le nombre restreint de sites de restriction appropriés et uniques.
On a maintenant montré qu'il est possible de générer dans Escherichia coli (E: coli) un vecteur adénoviral recombinant par recombinaison homologue intermoléculaire entre un plasmide contenant le génome d'un adénovirus de type 5 et un insert portant une séquence d'ADN exogène entourée de séquences adénovirales A et B. Ce procédé conduit au remplacement dans le génome adénoviralde la région ciblée située entre A et B par la séquence exogène. La transfection du vecteur adénoviral recombinant ainsi généré dans une lignée de complémentation adéquate donne lieu à une particule virale infectieuse qui peut être utilisée sans étape préalable de purification pour infecter une cellule hôte. Le bruit de fond (contamination par des particules virales parentales) est réduit voire même supprimé.En outre, on a trouvé de manière surprenante que l'usage de souches d'E. coli recBC sbcBC est particulièrement avantageux pour favoriser la recombinaison intermoléculaire entre deux fragments d'ADN quelconques.
Le procédé de la présente invention repose sur l'exploitation des activités enzymatiques endogènes des cellules procaryotes impliquées dans la recombinaison homologue. cette technique de recombinaison intermoléculaire avait déjà été décrite pour le clonage de petits inserts dans les vecteurs bactériens (Bubeck et al., 1993, Nucleic Acids Research, 21, 3601-3602) ou pour générer par recombinaison intramoléculaire des gènes hybrides (Calogero et al., 1992, FEMS Microbiology Letters, 97, 41-44; Caramori et al., 1991, Gene, 98, 3744). Cependant, cette technologie de recombinaison n'avait jamais été mise en oeuvre dans des cellules procaryotes pour générer des vecteurs viraux infectieux (capables d'être encapsidés en particules virales infectieuses).
Le procédé de l'invention présente l'avantage sur les techniques antérieures d'être rapide. particulièrement efficace et de ne requérir que peu de manipulations in vitro. De plus, il peut être mis en oeuvre avec des fragments d'ADN générés par PCR (Polymerase Chain Reaction) évitant ainsi les étapes de sousclonage de la séquence d'ADN exogène dans la région d'insertion du génome viral. Enfin, il apporte une solution avantageuse au problème de bruit de fond clairement identifié dans la littérature Par conséquent, il s'avère particulièrement performant pour les vecteurs issus de virus de grande taille ou dans lesquels on envisage d'insérer une séquence d'ADN exogène de grande taille.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un procédé pour préparer dans une cellule procaryote un vecteur viral recombinant dérivé d'un virus parental dans le génome duquel est insérée une séquence d'ADN exogène, par recombinaison intermoléculaire entre (i) un premier fragment d'ADN comprenant tout ou partie dudit génome du virus parental et (ii) un second fragment d'ADN comprenant ladite séquence d'ADN exogène entourée de séquences flanquantes A et B homologues à (i).
Au sens de la présente invention, un vecteur viral recombinant est obtenu à partir d'un virus parental modifié de manière à porter en un site approprié du génome viral et exprimer une séquence d'ADN exogène. Les virus parentaux susceptibles d'être utilisés dans le cadre de l'invention sont, par exemple, les aiphavirus, les rétrovirus, les poxvirus et notamment le virus de la vaccine ou le canarypox, les virus de l'herpès, les virus associés aux adénovirus (AAV) et tout particulièrement les adénovirus.
A cet égard, le choix de l'adénovirus parental est très large. Il peut s'agir d'un adénovirus d'origine humaine, canine, aviaire, bovine, murine, ovine, porcine ou simienne ou encore d'un adénovirus hybride comprenant des fragments de génome adénoviral de différentes origines. On préfèrera tout particulièrement un adénovirus d'origine humaine de sérotype C et de préférence un adénovirus de type 2 ou 5 ou encore un adénovirus d'origine animale de type CAV-1 ou CAV-2 (canine) ou DAV (aviaire). Ces virus et leur génome sont décrits dans la littérature (voir par exemple Zakharchuk et al., 1993. Arch. Virol., 128, 171176 ; Spibey et Cavanagh, 1989, J. Gen. Virol., 70, 165-172 ; Jouvenne et api., 1987, Gene, 60, 21-28).
Un procédé selon l'invention a pour objet la préparation d'un vecteur viral recombinant pour le transfert et l'expression d'une séquence d'ADN exogène dans une cellule hôte. Par "séquence d'ADN exogène", on entend un acide nucléique qui comprend des séquences codantes et des séquences régulatrices permettant l'expression desdites séquences codantes et dans lequel les séquences codantes sont des séquences qui ne sont normalement pas présentes dans le génome d'un virus parental en usage dans la présente invention ou si elles le sont dans un contexte génomique différent. Dans le cadre de l'invention, la séquence d'ADN exogène peut-être constituée d'un ou plusieurs gènes. Les séquences régulatrices peuvent être d'origines quelconques.
De façon plus spécifique la présente invention fournit un procédé d'attache de fils électriques, agencés sur un circuit TAB, sur des surépaisseurs de contact électrique par un faisceau laser à longueur d'onde spécifiée, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes consistant à: agencer sur la surface supérieure des fils électriques un métal de germe dont l'absorption à la longueur d'onde du faisceau laser est appropriée; aligner les fils électriques avec les surépaisseurs de contact électrique, les fils électriques étant superposés aux surépaisseurs de contact électrique; maintenir en contact à l'aide d'une fibre les fils électriques et les surépaisseurs de contact électrique à une surface d'attache; et attacher les fils électriques et les surépaisseurs de contact électrique à la surface d'attache en dirigeant le faisceau laser à travers la
fibre optique.
Par exemple, le procédé de la présente invention réalise une attache par compression or sur or sans brasure pour des fils conducteurs contenus dans un ruban de circuit flexible polymère, par exemple un polyimide, sans endommager le ruban. Il est possible de former une forte attache or sur or entre le fil de cuivre doré agencé sur le ruban de circuit flexible et une pastille dorée sur une microplaquette semi-conductrice, sans aucun besoin d'une fenêtre dans le circuit
flexible et sans aucun dommage au ruban.
Dans l'application de la présente invention à l'attache de fils conducteurs, agencés sur un circuit TAB, au substrat de silicium d'une tête d'impression à jets d'encre, le besoin d'une fenêtre dans les circuits TAB est éliminé. L'élimination de la fenêtre élimine aussi le besoin d'une matière d'enrobage pour couvrir les fils conducteurs du circuit de TAB. Il en résulte dès lors une réduction de dimensions de microplaquette, ou un nombre accru d'éjecteurs pour les mêmes dimensions de microplaquette, une facilité d'assemblage, des rendements de fabrication plus élevés, une fiabilité accrue, une facilité d'entretien des éjecteurs, et une réduction d'ensemble des coûts de
matière et de fabrication.
Alors que la présente invention sera décrite à titre d'illustration seulement en conjonction avec l'attache de fils conducteurs, agencés sur un circuit de TAB, avec un substrat de silicium d'une tête d'impression à jets d'encre, il est possible d'appliquer, pour attacher entre eux des organes électriques quelconques, le présent procédé et le présent appareil de connexion 1,5 électrique sans brasure de deux éléments de contact, en utilisant un
faisceau de lumière laser attaché à un système à fibre optique.
Les buts, particularités et avantages de la présente invention exposés ci-dessus, ainsi que d'autres, ressortiront mieux de la
description détaillée qui suit du mode de réalisation préféré, prise en
conjonction avec les dessins annexés dans lesquels: La Figure 1 est en vue en perspective d'une cartouche d'impression à jets d'encre selon un mode de réalisation de la présente invention; la Figure 2 est une vue en perspective de la surface avant de l'ensemble de tête d'impression à transfert automatique sur bande, ou TAB, appelé dans ce qui suit l'ensemble de tête de TAB, enlevé de la cartouche d'impression de la Figure 1; la Figure 3 est une vue en perspective schématique simplifiée, représentée à titre d'illustration, de la cartouche d'impression à jets d'encre de la Figure 1; la Figure 4 est une vue en perspective de la surface avant de l'ensemble de tête d'impression à transfert automatique sur bande, ou TAB, appelé dans ce qui suit l'ensemble de tête de TAB, enlevé de la cartouche d'impression de la Figure 3; La Figure 5 est une vue en perspective de la surface arrière de l'ensemble de tête de TAB de la Figure 4, sur laquelle est monté un substrat de silicium, et des fils conducteurs attachés au substrat; la Figure 6 est une vue en élévation de côté en coupe transversale, selon la ligne A-A de la Figure 5, qui illustre l'attache de fils conducteurs à des électrode agencées sur le substrat de silicium; la Figure 7 est une vue en perspective de dessus d'une structure de substrat qui contient des résistances chauffantes, des canaux d'encre, et des chambres d'évaporation et qui est montée sur l'arrière de l'ensemble de tête de TAB de la Figure 4; la Figure 8 illustre un processus qui peut être utilisé pour former l'ensemble préféré de tête de TAB la Figure 9 est un schéma d'un système de laser de connexion à poussée par fibre, désigné aussi par le terme anglo-saxon Fiber Push Connect, ou en abrégé FPC, tel qu'il est utilisé dans la présente invention; la Figure 10 représente en détails le circuit flexible, le point
d'attache de contact, le fil de TAB et la pastille de substrat.
la Figure 1l représente le profil de température du circuit flexible, du fil de TAB, de l'emplacement d'attache, et de la pastille de microplaquette pendant le processus d'attache à laser par le procédé FPC; la Figure 12 représente, pour divers métaux, la propriété d'absorption en fonction de la longueur d'onde; la Figure 13 illustre les résultats de transmission optique pour cinq échantillons du ruban de Kapton sur lesquels des épaisseurs de 2, , 10, 15 et 25 nm de chrome sont respectivement déposées par pulvérisation cathodique; la Figure 14 illustre l'élévation de température dans des circuits flexibles pourvus d'une couche de germe de Ti/W; la Figure 15 illustre l'élévation de température dans des circuits flexibles pourvus d'une couche 10 de germe de chrome; le Figure 16 illustre, en fonction du temps, l'élévation de température dans un ruban à 3 couches pour des couches de germe de chrome de différentes épaisseurs; et la Figure 17 représente le résultat d'un expérimentation d'attache par laser pour évaluer la capacité d'attache, par laser, d'un
circuit flexible.
Alors que la présente invention sera décrite à titre d'illustration seulement en conjonction avec l'attache de fils conducteurs, agencés sur un circuit de TAB, avec un substrat de silicium d'une tête d'impression à jets d'encre, il est possible d'appliquer, pour attacher entre eux des organes électriques quelconques, le présent procédé et le présent appareil de connexion électrique sans brasure de deux éléments de contact, en utilisant un
Les températures oscillent entre OOC (gel des bassins) et 280C, la moyenne étant de 170C. Le pH, à dominante basique varie entre 6,9 et 8,4, le lagunage constitue donc un excellent système tampon.
TABLEAU 2 : CARACTERISTIQUES DES MATIERES DE VIDANGE TRAITEES AU COURS DE L'EXPERIMENTATION.
pll T MS MV DCO NTK NH4+ Pt PO4- Germes totaux Coliformes totaux Streptocoques D C % % filtrée mg/l mg/l mg/l mg/l cell/ml cell/ml cell/ml mg/l Moyenne 6.8 20,8 4,1 2,7 1314 1145 213 476 37 1,6 107 4 104 6.104 Minimum 5,7 10 0,1 0,1 87 36 12 6 1,5 102 1,3 102 1,4 102 Maximum 7,8 36 15,2 8,1 16083 3442 580 1793 115 8,8 107 1,9 104 3,6 105 n 42 41 43 41 43 28 28 27 28 11 11 11 2.2.2 Oxygène dissous et chlorophylle Les teneurs en chlorophylle a (fig.5) et phéopigments (fig. 6) situées de quelques ssg/l à plus lOmg/l (bassin A) sont comparables à celles observées lors du traitement d'eau usées urbaines par lagunage haut rendement. Il y a donc réellement une épuration biologique réalisée par un complexe algues-bactéries, les premières fournissant l'oxygène nécessaire pour le développement des secondes. La teneur en 02 dissous (fig. 7) est cependant relativement faible comparée aux traitements des eaux usées urbaines.
La différence marquée des teneurs en pigments entre les bassins A et B à partir du sixième mois et jusqu'à la fin du douzième mois peut être expliquée par une différence d'ombre portée sur la surface de l'eau, le bassin A est en effet plus ensoleillé.
2.2.3 DCO (demande chimique en oxygène) et MES (matières en suspension) La DCO (totale et soluble) et les MES (fig. 8, 9, 10) suivent les mêmes évolutions. On observe une phase stable jusqu'à environ 200 jours de fonctionnement : les DCO totales n'excédent pas 5 g/l, les DCO solubles sont inférieures à 0,5 g/l et les MES sont inférieures à 4 g/l.
Ensuite on observe une phase de forte croissance de toutes les valeurs qui débute à partir de l'augmentation de l'ensoleillement, de la température, mais aussi de l'augmentation de la vitesse de la roue à aube. ette dernière entraîne une remise en suspension des sédiments, constitués à la fois d'algues et de matières brutes. Les prélèvements sont donc plus chargés. A partir du 260e jour environ l'influence de la fosse de décantation-digestion placée en parallèle au bassin A est très nette puisque l'on peut voir que les valeurs suivent des évolutions opposées dans les deux bassins : diminution des teneurs dans A et augmentation continue dans B (jusqu'à plus de 35 g/l de DCO totale, 1,5 g/l de DCO soluble et plus de 30 g/l de MES).
Dans le bassin A, la chute des teneurs en matières solides (et DCO brutes) montre l'efficacité du décanteur.
La diminution de la DCO soluble montre qu'il y a également eu simultanément une digestion des matières retenues. Ce fait est confirmé par la production de méthane que l'on a pu observer dans la fosse (analyse en chromatographie phase gazeuse).
La fosse de digestion décantation a donc un rôle important pour le bon fonctionnement du système.
En fin d'expérimentaion, on constate que le procédé permet d'obtenir dans le bassin A des teneurs en DCO voisines de celles des eaux usées urbaines brutes, ce qui correspond à l'objectif fixé au départ.
2.2.4 Azote et phosphore L'évolution des matières azotées et phosphorées présentée sur les figures 11, 12, 13, 14, 15, comparable à celle des autres paramètres (MES notamment), montre que l'azote et le phosphore se trouvent essentiellement sous forme particulaire.
Les bassins à haut rendement acceptent des teneurs élevées en azote total qui, sur échantillon filtré, est en effet voisin de 30 mg/l en moyenne (l'azote total sur l'échantillon brut représente essentiellement la biomasse algale).
III - PERFORMANCES EPURATOIRES DE L'INSTALLATION Le tableau 3 présente les performances du procédé calculées sur les moyennes des 70 derniers jours d'expérimentation (jours 341 à 411). La sortie du bassin A (bassin de référence avec fosse en parallèle) est comparée à l'entrée (matières de vidange brutes), au cours de la même période.
Tableau 3 : Performances épuratoires de l'installation selon l'invention
Rende ENTREE (Matières brutes) SORTIE (Bassin A) ment mov. mun. max. n mov. mun. max. n DCO brute (mg/l) nd nd nd 1245 480 1829 10 > 90 %* DCO filtrée (mg/l) 1698 87 6083 11 324 188 455 10 81 % MES (mg/l) 37945 100 152400 11 3190 2100 3900 9 92 % N-NTK (mg/l) 1317 54 3442 8 66 21 113 8 95 % Pt(mg/l) 579 6 1793 s 20 9 34 8 97% nd = non de termine * estimation à l'aide de la teneur moyenne en NIS des matières brutes.
Le tableau 4 présente les charges bactériennes relevées pendant les 240 premiers jours de fonctionnement du système (les analyses ont été arrêtées ensuite).
Richardson et coll. (Science 1989; 246, 821), S.L. Hauser et coll. (Nature 1986; 322, 176) et A. Karpas et coll.
(Nature 1986; 322, 177), à rechercher une implication de ce rétrovirus humain dans la SEP, cependant sans succès ou avec des résultats évoquant des réactions croisées.
Par ailleurs, il existe un modèle animal très proche de la SEP, induit par un rétrovirus: le virus MAEDI-VISNA du mouton. I1 est connu que l'infection naturelle par ce virus peut provoquer deux types de maladies chez cet animal: le Maedi, une pneumonie interstitielle lymphocytaire qui peut survenir lors de la primo-infection par ce rétrovirus et une pathologie neurologique démyélinisante tardive suivant généralement une phase de latence prolongée, le Visna. La physiopathologie du Visna naturel concorde avec la plupart des données cliniques et biologiques de la SEP, comme le rapportent Johnson R.T. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 6667), Narayan O. et Cork L.C. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 89-98 ), et Nathanson N. et coll. (Rev. Infect. Dis. 1985; 7, 75-82).L'infection expérimentale des moutons par inoculation intra-ventriculaire de souches neurovirulentes du virus VISNA a permis d'établir la responsabilité de ce virus dans la génèse de cette affection démyélinisante du mouton. Comme l'expliquent Nathanson N. et coll. (Rev.
Infect. Dis. 1985; 7, 75-82), Hoffman P.M. et Panitch H.S.
(dans "Handbook of clinical neurology, 12 : Viral diseases" R.R. Mc Kendall, ed. Elsevier Science Publishing, Amsterdam, 1989, 453-466), et A. Haase (Nature 1986; 322, 130-136), elle diffère de l'infection naturelle par ses conséquences neuropathologiques exacerbées, mais reste proche de la SEP. I1 est de plus notable que, dans l'ensemble des travaux effectués sur ce sujet par les auteurs précités, notamment, le virus Visna est régulièrement retrouvé dans les cellules de plexus choroïde du cerveau qui constituent un site de latence et de réplication occasionnelle du provirus Visna; la localisation de ces cellules à l'interface sang/liquide céphalorachidien (LCR) explique certainement ce phénomène.
De plus, le modèle du Visna apporte une donnée supplémentaire pour l'approche rétrovirologique de ce type de maladie. En effet, il s'avère que, dans le cadre de l'infection naturelle de ces moutons, des coïncidences épidémiologiques et biologiques ont été observées entre d'une part, les pathologies du Maedi-Visna et d'autre part, l'adenomatose ovine pulmonaire ou Jaagsiekte, pathologie tumorale provoquée par un autre rétrovirus, le JSRV (De Martini J.C. et coll., J.N.C.I. 1987; 79, 167177; Rosadio R.H. et coll., Vet. Pathol. 1988; 25, 58-66; Dawson M. et coll., Br. Vet. J. 1990; 146, 531-537). Le JSRV est un rétrovirus endogène, voire la souche exogène associée à une famille d'éléments endogènes, dont les propriétés infectieuses et oncogènes ont été mises en évidence (York D. F. et coll., J. Virol, 1992; 66, 49304939).Or, il est notable que, dans des isolats naturels de moutons affectés de maladies attribuées soit au rétrovirus Maedi-Visna, soit au rétrovirus Jaagsiekte, on retrouve généralement les deux rétrovirus (Dawson M. et coll., Br. Vet. J., 1990; 146, 531-537; York D.F. et coll., J. Virol., 1991; 65, 5061-5067). Cette coexpression et/ou coinfection semble indiquer un rôle synergique de ces deux rétrovirus dans le cadre du Maedi (De Martini J.C. et coll., J.N.C.I., 1987; 79, 167-177). Ainsi, dans certaines techniques de purification d'isolats naturels sur gradient de saccharose, on a pu mettre en évidence l'existence de deux pics de sédimentation séparés correspondant respectivement au JSRV et au rétrovirus Maedi-Visna (York D.F. et coll., J. Virol., 1991, 65, 5061-5067).Ces données permettent d'entrevoir la complexité d'une approche analytique visant à caractériser un agent rétroviral associé à une maladie donnée, à partir d'isolats naturels dans lesquels peuvent coexister plusieurs agents pathogènes.
Récemment, un rétrovirus, différent des rétrovirus humains connus a été isolé chez des patients atteints de SEP par H. Perron et coll. (Res. Virol., 1989, 140, 551-561; dans: "Current concepts in multiple sclerosis" Wiethblter et coll., eds. Amsterdam, Elsevier, 1991, plll-116; The Lancet, 1991, 337, 862-863).Les auteurs ont aussi pu montrer que ce rétrovirus pouvait être transmis in vitro, que des patients atteints de SEP produisaient des anticorps susceptibles de reconnaitre des protéines associées à l'infection des cellules leptoméningées par ce rétrovirus et que l'expression de ce dernier pouvait être fortement stimulée par les gènes immédiats-précoces de certains herpesvirus (Perron et coll., Herpes simplex virus ICPO and ICP4 immediate-early proteins strongly enhance expression of a retrovirus harboured by a leptomeningeal cell-line from multiple sclerosis.,1993, J. Gen. Virol., 74, 65-72).
Tous ces résultats plaident en faveur du rôle dans la SEP d'au moins un rétrovirus inconnu ou d'un virus ayant une activité transcriptase inverse détectable selon la méthode publiée par H. Perron et coll. (Res. Virol., 1989, 140, 551-561) et qualifiée d'activité "RT de type LM7".
Récemment, les travaux de la demanderesse ont permis d'obtenir deux lignées continues de cellules infectées par des isolats naturels provenant de deux patients différents atteints de SEP, par un procédé de culture tel que décrit dans la demande de brevet nO WO 93/20188. Ces deux lignées dérivées de cellules de plexuschoroïdes humains, dénommées LM7PC et PLI-2 ont été déposées à 1'E.C.A.C.C. respectivement le 22 juillet 1992 et le 8 janvier 1993, sous les numéros 92072201 et 93010817, conformément aux dispositions du traité de Budapest.Par ailleurs, les isolats viraux possédant une activité RT de type LM7 ont également été déposés à 1'E.C.A.C.C. sous la dénomination globale de "souches". La "souche" ou isolat hébergé par la lignée PLI-2, dénommée POL-2, a été déposée le 22 juillet 1992 sous le nO V92072202. La "souche" ou isolat hébergé par la lignée LM7PC, dénommée MS7PG, et a été déposée le 8 janvier 1993 sous le n" V93010816.
Avant de détailler l'invention, différents termes utilisés dans la description et les revendications sont à présent définis - par souche virale ou isolat, on entend toute fraction biologique infectante et/ou pathogène, contenant par exemple des virus et/ou des bactéries et/ou des parasites, et caractérisant le pouvoir pathogène et/ou antigénique, hébergée par une culture ou un hôte vivant.
Etant donné qu'un virus possédant une activité enzymatique transcriptase inverse peut être génétiquement caractérisé aussi bien sous forme d'ARN que d'ADN, il sera fait mention aussi bien de 1'ADN que de 1ARN viral pour caractériser les séquences relatives à un virus possédant une telle activité transcriptase inverse.
Etant donné que l'agent pathogène (MSRV)-2 a été détecté tant en ADN qu'en ARN dans les cellules infectées, le même raisonnement sera tenu a priori en ce qui le concerne.