INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
1985). ll est aussi possible d'utiliser un fragment HpaII-TaqI de taille plus réduite (280 pdb) ou un fragment plus petit (environ 220 pdb), compris dans le fragment HpaII, et qui possèdent les mêmes propriétés (Summers and Sherratt, 1988). Cette résolution passe par une recombinaison intramoléculaire spécifique, qui fait intervenir quatre protéines codées par le génome d'E. coli: ArgR, PepA, XerC et XerD (Stirling et al..
1988,1989; Colloms et al., 1990; Blakely et al.. 1993) A ce titre, il particulièrement avantageux d'utiliser tout ou partie du fragment cer de ColE 1 ou de l'un de ses dérivés tels que définis précédemment.
A titre de molécule d'ADN représentative de la présente invention, on peut tout particulièrement revendiquer le plasmide pXL2774 et ses dérivés. Au sens de l'invention on entend par dérivé toute construction dérivant du pXL2774 et comportant un ou plusieurs gènes d'intérêt autres que le gène luciférase.
La présente invention se rapporte également à la mise au point d'un procédé, de constructions d'hôtes cellulaires spécifiques, particulièrement efficaces pour la production de ces molécules d'ADN thérapeutiques.
Un autre objet de la présente invention se rapporte à un procédé de production de molécule d'ADN circulaire caractérisé en ce que l'on cultive une cellule hôte contenant au moins un molécule d'ADN telle que définie précédemment et une protéine, exprimée in situ ou non, conditionnant la fonctionnalité de l'origine de réplication deladite molécule d'ADN, spécifique et étrangère à ladite cellule hôte, dans des conditions permettant la sélection des cellules hôtes transformées par lesdites molécules d'ADN.
Plus préférentiellement, la protéine conditionnant la fonctionnalité de l'origine de réplication de la molécule d'ADN est exprimée in situ à partir d'un gène correspondant. Le gène codant pour la protéine initiatrice de la réplication peut être porté par unréplicon annexe, compatible avec les dérivés de l'origine de réplication conditionnelle utilisée ou bien introduit dans le génome de la cellule-hôte par recombinaison, grâce à un transposon, un bactériophage ou tout autre vecteur.Dans le cas particulier où le gène exprimant la protéine est placé sur un réplicon annexe, ce dernier contient également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule, ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle. Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celleci est susceptible de fonctionner dans la cellule. n peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de ltexpression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes procaryotes ou bactériophages. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule.
A titre de gènes codant pour la protéine initiatrice de la réplication, pourront être utilisés soit les gènes sauvages, soit des allèles mutés permettant d'obtenir un nombre de copies augmenté des plasmides (ou dérivés) spécifiques de la protéine initiatrice conditionnant la fonctionnalité de l'origine de réplication mise en oeuvre dans la molécule d'ADN.
De tels mutants ont été notamment décrits pour les plasmides R6K (Inuzuka and Wada, 1985; Greener et al., 1990), Rtsl(Terawaki and Itoh, 1985; Terawaki et ai 1990; Zeng et al.. 1990), F (Seelke et al., 1982; Helsberg çoeal, 1985; Kawasaki et ai 1991), RK2 (Durland et aI., 1990; Haugan et al.. 1992, 1995), pSC101 (Xia étal.
1991; Goebel et al.. 1991; Fang et al., 1993).
Dans le cas particulier où lamolécule d'ADN mise en oeuvre possède une origine de réplication dérivant du plasmide R6k, la protéine initiatrice est ou dérive de la protéine x de ce même plasmide. Il est particulièrement avantageux d'exprimer une forme mutée de cette protéine capable d'augmenter notablement le nombre de copies initiales. Pour ce faire, le gène intégré au niveau de la cellule hôte est de préference représenté par tout ou partie de la séquence représentée en SEQ ID N 2 ou l'un de ses dérivés et plus préférentiellement par le gène pir 16. La mutation associée, correspond à la substitution d'une proline par une leucine.Selon un mode de réalisation particulier de 'invention, ce gène piri 16 est directement incorporé dans le génome de la cellule hôte.
Avantageusement, un des gènes de l'hôte cellulaire spécifique, indispensable dans les conditions de culture choisies contient un codon spécifique, reconnaissable par I'ARNt suppresseur sélectionné au niveau de la molécule d'ADN. Selon un mode privilégié de l'invention, il s'agit d'un codon ambre TAG. Dans ce cas particulier, la cellule pourra croître, dans les conditions de culture pour lesquelles le produit du gène contenant le codon TAG est essentiel, uniquement si le plasmide permettant l'expression de sup est présent dans la cellule hôte. Les conditions de culture constituent donc la pression de sélection de la molécule d'ADN.
De préférence, le gène comportant le codon ambre est un gène intervenant dans la biosynthèse d'un acide aminé, I'arginine. Ce gène, argue code pour une Nacétylornithinase (Meinnel et al., 1992) et comporte dans ce cas un codon TAG correspondant à une mutation ponctuelle Gln-53 (CAG)- > TAG; la pression de sélection du plasmide portant le gène sup est alors assurée par culture en milieu minimum M9 (Maniatis et a1.,1989). Toutefois ce pourrait être aussi par exemple, un gène de biosynthèse d'une vitamine, d'une base nucléique ou bien un gène permettant d'utiliser une source de carbone ou d'azote particulière ou tout autre gène dont la fonctionnalité est indispensable à la viabilité cellulaire dans les conditions de culture choisies.
En conséquence, la Demanderesse s'est donné pour but de pourvoir à des fragments, issus de souches sélectionnées de VIH-1 du groupe O, aptes à permettre à la fois une détection de l'ensemble des virus VIH-1 de groupe O et une différenciation spécifique intra-groupe O et également susceptibles d'induire une protection vis-àvis de l'ensemble des sous-types de VIH-1, y compris le groupe O, lesquels fragments permettent d'éviter l'obtention de résultats faussement négatifs ou faussement positifs, pour ce faire, les Inventeurs ont sélectionné un ensemble de souches et de séquences, issues essentiellement d'une région du gène env, notamment au niveau d'un fragment hypervariable situé dans la boucle V3 (C2V3) ou au niveau de la gp41 et d'une région du gène gag.
La présente invention a pour objet des souches de VIH-1 de groupe O, présentant les caractéristiques morphologiques et immunologiques de l'un des rétrovirus déposés à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'institut Pasteur, sous les numéros I-1544 (dénommé BCF02 (ESS)), I-1543 (dénommé BCFO1 (FAN)), I-1546 (dénommé BCF07 (MAN)), I-1547 (dénommé BCF08 (NKO)), I-1545 (dénommé BCF03 (POC)), en date du 24 février 1995.
Au sens de la présente invention, on entend par séquence nucléique, les séquences, telles que précisées ci-dessus et leurs séquences complémentaires, ainsi que les séquences les contenant.
De telles séquences trouvent application à la fois dans l'identification spécifique d'un VIH-1 de groupe O, comme réactif de diagnostic, seules ou en pool avec d'autres réactifs, pour l'identification de n'importe quel VIH-1 ou bien, selon les cas, comme réactif de différenciation intra-groupe O.
Ces séquences peuvent notamment être mises en oeuvre dans des tests de diagnostic comprenant, soit une hybridation directe avec la séquence virale à détecter, soit une amplification de ladite séquence virale, en utilisant comme amorces, un oligonucléotide, inclus dans lune quelconque des séquences ci-dessus et notamment l'une des séquences suivantes * séquences gag GAG/5'CAM : CAGGGACAAATGGTACATCA (positions 1250-1269) GAG/3'CAM :AGTAGCTTGCTCAGCTCTTAAT (positions 1768-1747) * séquences gp41 - SEQ ID n022 (gp41/5'CAM-1) AGRGAAAAAAGAGCAGTAGGAT (positions 7800-7821) - SEQ ID n023 (gp41/5'CAM-2) TCTAAGTGCAGCAGGTAGCACTAT (positions 7843-7866) - SEQ ID n024 (gp41/3'CAM-2) CTAAGTTGCTCAAGAGTGGTA (positions 8594-8573) - SEQ ID n025 (gp41/3'CAM-1) GTGGCTCAAGAGGTGGTAAGT (positions 8590-8570) * séquences C2V3 C2V3/5'CAM : TRGTTACTTGTACACATGGGAT (positions 6991-7012) C2V3/3'CAM : ACAATAAAAGAATTCTCCATGACAGT (positions 74217396).
Les positions précitées correspondent à celles de la séquence Ant70 (Myers, Korber et al., précité).
L'invention a également pour objet l'utilisation des séquences décrites ci-dessus pour la mise en oeuvre d'un procédé d'hybridation ou d'amplification génique de séquences nucléiques du type VIH-1, ces procédés étant applicables au diagnostic in vitro de l'infection potentielle d'un individu par un virus du type VIH-1, y compris le groupe O.
Cette méthode de diagnostic in vitro est réalisée à partir d'un échantillon biologique (sérum, lymphocytes circulants) et comprend une étape d'extraction de l'acide nucléique à détecter, appartenant au génome du virus du type VIH-1, éventuellement présent dans l'échantillon biologique et le cas échéant une étape de traitement de l'acide nucléique, à l'aide d'une trancriptase inverse, si ce dernier est sous forme d'ARN, au moins un cycle comprenant les étapes de dénaturation de l'acide nucléique, d'hybridation avec au moins une séquence conforme à l'invention et extension de l'hybride formé, en présence des réactifs convenables (agent de polymérisation, tel qu'ADN polymérase et dNTP) et une étape de détection de la présence éventuelle de l'acide nucléique appartenant au génome d'un virus de type VIH-1 de groupe O (spécificité de groupe) L'invention a également pour objet un peptide, caractérisé en ce qu'il est exprimé par une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus.
L'invention a également pour objet des compositions immunogènes comprenant un ou plusieurs produits de traduction des séquences nucléotidiques selon l'invention ou un fragment de ceux-ci et/ou au moins l'un des peptides tels que définis ci-dessus.
L'invention a également pour objet les anticorps dirigés contre l'un ou plusieurs des peptides décrits ci-dessus et leur utilisation pour la mise en oeuvre de méthodes de diagnostic in vitro de l'infection d'un individu par un virus de type VIH-1, selon les procédés connus de l'Homme du métier.
A titre d'illustration, une telle méthode de diagnostic in vitro selon l'invention comprend la mise en contact d'un échantillon biologique prélevé chez un patient, avec des anticorps selon l'invention, et la détection à l'aide de tout procédé approprié, notamment à l'aide d'anti-immunoglobulines marquées, des complexes immunologiques formés entre les antigènes des virus du type VIH-1 éventuellement présents dans l'échantillon biologique et lesdits anticorps.
La présente invention a également pour objet un procédé de criblage et de typage de VIH-1, groupe O, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en contact de l'un quelconque des fragments nucléotidiques conformes à l'invention avec l'acide nucléique du virus à typer et la détection de l'hybride formé.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention ainsi qu'aux dessins annexés, dans lesquels - la figure 1 représente les séquences comparées d'aminoacides exprimés par le fragment de gène env C2V3;; - la figure 2 représente les séquences comparées d'aminoacides exprimés par le fragment de gène gag - la figure 3 illustre les résultats obtenus avec les 7 souches BCF02 (ESS), BCFO1 (FAN), BCF07 (MAN), BCF11 (NAN), BCF08 (NKO), BCF03 (POC) et BCF06 (LOB) sur gel d'agarose, d'une PCR réalisée avec les amorces C2V3 précitées - la figure 4 illustre les résultats obtenus avec les 7 souches BCF02 (ESS), BCF01 (FAN), BCF07 (MAN), BCF11 (NAN), BCF08 (NKO), BCF03 (POC) et BCF06 (LOB) sur gel d'agarose, d'une PCR réalisée avec les amorces Gag précitées - la figure 5 représente les marqueurs utilisés dans les figures 3 et 4.
I1 doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
Parmi ces agents tensio-actifs on peut citer: - les agents tensio-actifs anioniques du type savons de métaux alcalins (sels alcalins d'acides gras en C8-C24), sulfonates alcalins (alcoylbenzène sulfonates en C8-C13, alcoylsulfonates en Cl2-Cl6), alcools gras en C6 C16 oxyéthylénés et sulfatés, alkylphénols en C8-C13 oxyéthylénés et sulfatés, les sulfosuccinates alcalins (alcoylsulfosuccinates en C12-C16)...
- les agents tensio-actifs non ioniques du type alcoylphénols en C6-C12 polyoxyéthylénés, alcools aliphatiques en C8-C22 oxyéthylénes, les copolymères bloc oxyde d'éthylène - oxyde de propylène, les amides carboxyliques éventuellement polyoxyéthylénés, - les agents tensio-actifs amphotères du type alcoyldiméthylbétaïnes, - les agents tensio-actifs cationiques du type chlorures ou bromures d'alkyltriméthylammonium, d'alkyldiméthyléthylammonium.
Divers constituants peuvent en outre être présents dans la composition détergente tels que - des "builders" du type phosphates et phosphonates, à raison de 20 à 40 % du poids total de la formulation, silicate de sodium à raison de 0,5 à 15 % du poids total de la formulation, zéolithes à raison de 10 à 25 % du poids total de la formulation, carbonate de sodium à raison de 5 à 15 % du poids total de la formulation, la quantité totale de "builder" correspondant à environ 0,2 à 80 %, de préférence de 20 à 45 % du poids total de ladite composition détergente.
I1 va de soi que dans la composition détergente, les cogranulés utilisés exercent également les propriétés de base, notamment de type "builder" pour lesquelles ils sont connus; ces cogranulés étant utilisés comme stabilisateurs du percarbonate dans les compositions selon l'invention, ils ne sont pas compris dans la quantité totale de "builder" indiquée ci-dessus.
- des agents anti-redéposition du type carboxyméthylcellulose, méthylcellulose en quantité pouvant aller jusqu a environ 5 % du poids total de ladite composition détergente, - des agents anti-incrustation du type copolymères d'acide acrylique et d'anhydride maléique en quantité pouvant aller jusqu'à 10 % environ du poids total de ladite composition détergente, - des charges du type sulfate de sodium pour les détergents en poudre en quantité pouvant aller jusqu'à 50 % du poids total de ladite composition détergente.
L'invention a également pour objet l'utilisation d'un cogranulé constitué de carbonate de sodium ou de potassium, de silicate de sodium ou de potassium et d'eau associée au silicate, le rapport (eau associée au silicate)/(silicate exprimé en sec) étant de l'ordre de 33/100 à 120/100, en tant qu'agent stabilisateur d'un système de blanchiment à base de percarbonate de sodium ou de potassium.
Pour une telle utilisation, le cogranulé peut en outre contenir un siliconate et/ou ses dérivés, comme il a été décrit précédemment.
L'utilisation de cogranulés permet également de stabiliser un système de blanchiment à base de percarbonate de sodium ou de potassium activé par un agent activateur de blanchiment, comme la TAED, le PAG, le TAGU, ou 1'ISONOBS.
L'utilisation de tels cogranulés carbonatesilicate en tant qu'agent stabilisateur du percarbonate présente l'avantage de faciliter la préparation de la composition dans la mesure où le stabilisateur est une poudre prête à l'emploi.
L'invention a donc également pour objet un procédé de préparation de compositions détergentes comme décrites précédemment par simple mélange à sec des constituants, par exemple en mélangeant d'une part le système de blanchiment, comprenant éventuellement 1 'acti- vateur, et l'agent stabilisateur et, d'autre part, les autres composants.
Les exemples suivants illustrent 1' invention, sans toutefois en limiter la portée.
Les pourcentages dont il est question cidessous sont des pourcentages en poids de la composition détergente finale.
EXEMPLES 1 et 2 Des compositions détergentes à bas ajout d'activateur de blanchiment (1,4 %) sont préparées conformément à l'invention.
On utilise un cogranulé fabriqué et commercialisé par RHONE-POULENC sous la marque Nabion 15. I1 est constitué de 29% de silicate de sodium, de rapport SiO2/Na20 égal à 2, de 55% de carbonate de sodium et de 16% d'eau. La teneur en eau associée au silicate exprimée par le rapport pondéral (eau associée au silicate)/(silicate exprimé en sec) est de 35%.
Ce cogranulé est mélangé à sec avec l'activateur TAED, du percarbonate de sodium et du sulfate de sodium pour former les mélanges A dont la composition est indiquée dans le tableau 1 suivant.
Des mélanges comparatifs sont préparés en substituant les cogranulés de Nabion 15 par du silicate de sodium et du carbonate de sodium libres en des proportions indiquées dans le tableau 1.
Conformément à l'algorithme du gradient, on peut donc écrire (1) : où p est le pas d'adaptation mentionné ci-dessus, réel positif permettant de contrôler la vitesse de convergence de l'algorithme, et l'opérateur (a/a.) désigne l'opérateur dérivée partielle.
En prenant pour chaque sous-bande de rang i considéré di,k = Hi.DkN On obtient ei,k = Hi.EkN = D - XkN.WkN d'où ei,k = Hi.DkN - Hi.#i.kN.WkN* = di,k - Xti.kN.W*kN et donc #ei,k/dW* = Xi,kN .
En reportant dans l'équation (1), on obtient l'équation d'adaptation de l'algorithme de la présente invention soit, exprimée sour forme matricielle, la relation W*(k+1)N = W*'kN + (H.#kN)H.#-2.H.EkN dans laquelle -2 désigne la matrice diagonale des coefficients de pondération ki.
La valeur de la fonction d'adaptation est modifiée en conséquence, ce qui permet, par une étape 1008 d'incrémentation de k, de passer à l'itération suivante. La valeur de la fonction d'adaptation et de la fonction de transfert adaptée est maintenue pendant la durée de N échantillons successifs, période du sous-échantillonnage.
La figure 3a représente un premier mode de réalisation d'un dispositif de filtrage adaptatif mettant en oeuvre le procédé de la présente invention, dans le cas particulier où le nombre L de coefficients du filtre adaptatif est inférieur ou égal au nombre N de sous-bandes.
On peut vérifier que pour ki=l pour tout i, un tel mode de réalisation du dispositif de filtrage adaptatif met en oeuvre un algorithme LMS par blocs classique.
Le dispositif représenté en figure 3a comprend un filtre adaptatif 1, avantageusement constitué d'un filtre transversal ou RIF temporel (à Réponse Impulsionnelle Finie) de fonction de transfert W présentant une longueur L. Cette longueur est choisie de façon appropriée en fonction de l'application ; on pourra par exemple prendre L=128 ou L=1024. En sortie du filtre 1 est disposé un module additionneur-soustracteur 2 permettant de calculer la différence e n entre le signal d'origine Q et le signal y,, obtenu à partir du signal numérique transmis xn par filtrage dans le filtre adaptatif 1. La sortie du module additionneursoustracteur 2 est connectée à un banc 3 de N filtres d'analyse de fonctions de transfert respectives H,, HA, . ..., .
HN.l et présentant chacun KN coefficients. Le banc 3 de filtres permettant de réaliser la subdivision en N sousbandes du signal d'erreur e n, est avantageusement constitué par le banc de filtres d'analyse d'un banc de filtres à reconstruction parfaite sans perte, ce qui garantit la conservation, dans les sous-bandes, de toute l'information contenue dans le signal d'erreur en. En outre, un module 3' comportant un banc de filtres similaire au banc de filtres 3 d'analyse est prévu, afin de réaliser la subdivision en N sous-bandes du signal numérique transmis xn.D'une manière générale, on indique que la subdivision en sous-bandes du signal numérique transmis xn peut être effectuée soit en parallèle à la subdivision effectuée grâce au banc de filtres d'analyse 3, soit séquentiellement à partir du même banc de filtres 3, le banc de filtres du module 3' étant supprimé. En sortie du banc 3 de filtres d'analyse, est prévu un module 4 de sous-échantillonnage dans un rapport N égal au nombre de sous-bandes. Le module 4 de sous-échantillonnage peut être, dans un mode de réalisation simplifié, réduit à une routine de calcul d'une valeur sur N échantillons successifs dans le cadre d'une réalisation logicielle, ou au contraire formé d'une mémoire adressable sélectivement dans le cadre d'une réalisation matérielle, sous forme de circuit dédié. Le module 4 de sous-échantillonnage est suivi d'un module 5 de pondération.Le module de pondération 5 peut par exemple consister en une table de valeurs, parmi lesquelles N coefficients de pondération sont choisis.
Ainsi, à chaque signal d'erreur en sous-bande sous-échantil lonné i. k peut être associé un coefficient de pondération Xj, réel positif, de valeur déterminée. La table de valeurs peut comprendre diverses valeurs arbitraires, ces valeurs pouvant être remises à jour à chaque itération. Chaque coefficient X1 peut par exemple présenter une valeur approchant à chaque itération la valeur de l'énergie moyenne du signal numérique transmis en sous-bande xi e t/ou du rapport signal à bruit dans chaque sous-bande considérée.
En outre, ainsi que représenté en figure 3a, les sorties du banc de filtres d'analyse du module 3' comportent avantageusement un module de conjugaison, C1, i E [0,N-lj permettant de délivrer directement les composantes en sous-bande conjuguées xi n du signal numérique transmis. Les sorties du module 5 de pondération ainsi que les sorties du module 3' sont fournies en entrée à un module multiplicateur 6, suivi d'un module sommateur 7. Le module multiplicateur 6 peut etre constitué par une pluralité de multiplicateurs élémen taires Pi, i E [O,N-l], et délivre le produit terme à terme (produit de Schur) des signaux d'erreur en sous-bande souséchantillonnés pondérés et des signaux numériques transmis en sous-bande.
Le module sommateur 7 reçoit l'ensemble des produits terme à terme et délivre la fonction d'adaptation AW .
En ce qui concerne la variante de réalisation du dispositif selon l'invention représentée en figure 3b, le filtrage adaptatif est réalisé en sous-bande. Les mêmes éléments portent les mêmes références que celles attribuées à ces derniers dans le cas de la figure 3a.
En outre, le dispositif comprend un module de subdivision en N sous-bandes 3" auquel est associé un module de souséchantillonnage 4", un autre module de sous-échantillonnage 4''' étant en outre associé à un autre module de subdivision en sous-bande 3'''. Les modules 3" et 4" permettent de subdiviser en sous-bande respectivement de sous-échantillonner le signal d'origine Q. I1 en est de même en ce qui concerne les modules 3''' et 4''' relativement au signal numérique transmis xn.Le module additionneur soustracteur 2 est remplacé par un module 2' comportant une pluralité de modules additionneurs soustracteurs AD1. Un module de filtrage adaptatif 1' est prévu, lequel reçoit les composantes en sous-bande sous-échantillonnées du signal numérique transmis et délivre les composantes en sous-bande du signal numérique transmis filtré Yi.k au module additionneur soustracteur 2'. Ce dernier délivre les signaux d'erreur en sous-bande sous-échantillonnés ei k au module de pondéra- tion 5.
La figure 4 représente un autre mode de réalisation d'un dispositif de filtrage adaptatif mettant en oeuvre le procédé de la présente invention, où le nombre L de coefficients du filtre adaptatif est un multiple du nombre N de sous-bandes, soit L=MN. Dans ce mode de réalisation, les éléments 1, 2, 3, 3', 4, 5 sont les mêmes que dans le mode de réalisation de la figure 3a ; leur description n'est donc pas refaite.