INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Pour les graines de tabac, l'extraction est réalisée à partir de 0,1 g de graines pour 4 ml de tampon.
L'activité lipasique est déterminée à l'aide d'un pH-STAT par la méthode titrimétrique de Gargotiri et ai. (1995) dans laquelle le substrat utilisé est la tributyrine. L'émulsion de tributyrine (1 ml pour 30 ml d'émulsion) est réalisée au vortex dans un tampon Tris-HCl 2,5n'iM pH 8,0, NaCI 25mM, et CaCl2 SmM. Le dosage consiste à neutraliser l'acide butyrique libéré sous l'action de la lipase par une solution de soude à un pH de consigne de 8,0 et à 37 C. Une unité lipase correspond à la quantité d'enzyme qui provoque la libération d'une micromole d'acides gras en 1 min. à 37"C et dans les conditions optimales de pH (8,0).
Sur le surnageant de centriftigation, un dosage des protéines totales solubles est réalisé.
Un test ELISA en sandwich est également réalisé sur le surnageant de centrifugation avec des anticorps polyclonaux anti-LPH naturelle.
XI.2. EXPRESSION AVEC LES PEPTIDES SIGNAUX VEGETAUX; DOSAGES SUR LES FEUILLES ET LES GRAINES DE TABAC TRANSFORMEES ; TEST ELISA.
En utilisant les méthodes de dosages appropriées connues de l'homme du métier, l'expression des protéines recombinantes dans les feuilles et les graines de tabac transformées est mesurée.
XI.3. EXPRESSION AVEC LE PEPTIDE SIGNAL DE LA LPH DOSAGE DE L'ACTIVITE LIPASE SUR LES FEUILLES DE TABAC.
En utilisant les méthodes de dosages appropriées connues de l'homme du métier, l'expression des protéines oecombinantes dans les feuilles et les graines de tabac transformées est mesurée.
XII. ANALYSE DE L'EXPRESSION DE LA LIPASE PANCREATIQUE HUMAINE DANS LES PLANTES DE TOMATE TRANSGENIQUES.
XII. 1. PROTOCOLE.
Le protocole d'extraction de la lipase à partir de feuilles et des fruits de tomate est similaire à celui décrit pour les feuilles de tabac, excepté que 1 g de matériel frais est repris dans 4 ml de tampon. L'activité lipasique est déterminée comme décrit pour les feuilles de tabac.
XII.2. DOSAGE DANS LES FRUITS DE TOMATE.
L'activité lipasique est déterminée comme décrit pour les feuilles de tabac.
XIII. ANALYSE DE L'EXPRESSION DE LA COLIPASE PANCREATIQUE HUMAINE (COLPH) DANS LES PLANTS DE TABAC TRANSGENIQUES.
XIII. 1. PROTOCOLE.
Le protocole d'extraction de la lipase à partir de feuilles de tabac prélevées sur des plantes en serre est le suivant: 1 g de feuilles (poids frais) est broyé dans l'azote liquide puis à 4 C dans 5 ml de tampon Tris-HCl 50mM pH7,5, additionné d'EDTA lmM et de ss-mercaptoéthanol lOmM, de Triton X-100 0,2% et de NaCI 50mM. Le broyat total est immédiatement centrifligé à 40C pendant 15 min à 10000 g.
Pour les graines de tabac, I'extraction est réalisée de 0,1 g de graines pour 4 mi de tampon.
L'activité lipasique est déterminée à l'aide d'un pH-STAT par la méthode de Patton et al. < échantillon) sont tout d'abord séparées selon la taille sur gel de polyacrylamide dénaturant à 12,5% puis transférés sur une membrane de nitrocellulose. On peut également utiliser des gels dénaturants (urée) et séparer sur d'autres critères que la taille. Un anticorps polyclonal anti-iipase pancréatiqllee humaine est utilisé comme sonde et la révélation est effectuée au moyen d'un anticorps anti-IgG approprié couplé à la phosphatase alcaline.
La protéine témoin est la lipase pancréatique humaine naturelle qui migre sous la forme d'une seule bande d'une masse moléculaire apparente d'environ 50 kDa.
Aucune bande n'est détectée dans les extraits protéiques de feuilles et de graines de tabac et de colza non trallsformées XIV.1.2. EXPRESSION AVEC LE PEPTIDE SIGNAL DE LA LPH IMMUNODETECTION DANS LES FEUILLES ET LES GRATNES DE TABAC TRANSFORMEES.
Dans une telle configuration, un rapport de transformation de courant R4 du circuit de transcourant 31 représenté sur la figure 8B est donné par l'équation qui suit à partir de l'équation (5): R4 = (2 x W2 / 3 x L1) x (2 x L1 / W1) =4xW2/ (3 xW1) Comme il a été discuté ci-avant, dans le circuit de transcourant 31 selon la présente invention, au moins un étage pris parmi l'étage d'entrée 32 et l'étage de sortie 33 est construit à l'aide d'une pluralité de transistors et au moins la même longueur de grille est établie dans tous les transistors. Dans une telle configuration, la flexibilité d'établissement d'une valeur de courant sur la base de l'aire du transistor et du rapport de transformation de courant en direction de l'étage de sortie 33 peut être améliorée.
Par conséquent, lorsque la source de courant est utilisée, la valeur de courant peut être réduite jusqu'à au moins une valeur suffisante et une aire de circuit dans le circuit intégré peut être réduite. Par conséquent, une miniaturisation et une réduction de puissance d'un circuit intégré global peuvent etre obtenues.
Dans les circuits de transcourant dont il a été discuté ci-avant, les MOSFET à canal N sont utilisés pour les transistors. Cependant, la présente invention n'est pas limitée à la configuration mentionnée ciavant, mais des MOSFET à canal P peuvent également être utilisés pour les transistors dans le circuit de transcourant selon la présente invention. Dans ce cas, une polarité de courant est inversée.
Puis une description d'un circuit de transformation couranttension selon un second mode de réalisation de la présente invention sera produite. La figure 9 représente un schéma du circuit de transformation courant-tension selon le second mode de réalisation de la présente invention. Un circuit de transformation courant-tension 41 représenté sur la figure 9 est construit à l'aide d'un circuit de transcourant 42 et d'un circuit de transformation de tension 43.
Le circuit de transcourant 42 est construit à l'aide d'un premier étage d'entrée 44 et d'un second étage d'entrée 45. Sur le premier étage d'entrée 44, deux transistors M31, M32 (MOSFET à canal P) et une source de courant 47 sont connectés en série entre une première source de puissance (VDD) 46 et la seconde source de puissance GND.
En outre, sur le premier étage d'entrée 44, une source (S) du transistor M3 1 est connectée à la première source de puissance VDD 46 et un drain (D) de ce même transistor est connecté à une source (S) du transistor M32. Un drain (D) du transistor M32 est connecté à la source de courant (Il) 47. En outre, les deux grilles des transistors M31, M32 sont connectées au drain (D) du transistor M32.
Sur le second étage d'entrée 45 du circuit de transcourant 42, deux transistors M33, M34 (MOSFET à canal P) et une source de courant 48 sont connectés en série entre la première source de puissance (VDD) 46 et la seconde source de puissance GND. En outre, une source (S) du transistor M33 est connectée à la première source de puissance VDD 46 et un drain (D) de ce même transistor est connecté à une source (S) du transistor M34. Un drain (D) du transistor M34 est connecté à une source de courant (I2) 48. En outre, les deux grilles (G) des transistors M33, M34 sont connectées aux grilles (G) des transistors M31, M32.
Dans le circuit de transformation de tension 43, un transistor M35 (MOSFET à canal P) et une source de courant 49 sont connectés en série entre la première source de puissance (VDD) 46 et la seconde source de puissance GND. En outre, une source (S) du transistor M35 est connectée à la première source de puissance VDD 46 et un drain (D) de ce même transistor est connecté à une source de courant I3) 49. En outre, une grille (G) du transistor M35 est connectée au drain (D) du transistor M34 sur le second étage d'entrée 45 du circuit de transcourant 42. Une tension de sortie VO est produite depuis le drain du transistor M35.
Dans tous les transistors M31 à M35 constituant le circuit de transformation courant-tension 41, la même largeur de grille W1 et la même longueur de grille L1 sont prévues.
Par exemple, dans le circuit de transformation courant-tension 41, lorsqu'un rapport de la valeur de courant I1 sur la valeur de courant 13 circulant dans les sources de courant respectives 47 à 49 est établi de manière à valoir Il: : in : 13 = 1: 1 : 2, un rapport de transformation de courant R5 depuis le premier étage d'entrée 44 du circuit de transcourant 42 jusqu'au circuit de transformation de tension 43 est donné par l'équation qui suit: R5 = (largeur de grille du transistor M35 / longueur de grille du transistor M35) largeur de grille du transistor M31(M32) / (longueur de grille du transistor M31 + longueur de grille du transistor M32)) = I3 : Il Dans le circuit de transformation courant-tension 41, lorsque le courant Il circule sur le premier étage d'entrée 44 du circuit de transcourant 42, le courant 12 (= Il) circule également sur son second étage d'entrée 45. A cet instant, une tension du drain (D) du transistor M34 varie et au moyen de cette variation de tension qui est reçue dans la grille (G) du transistor M35, le courant 13 circule dans le circuit de transformation de tension 43. Au moyen du courant 13, l'amplitude de tension VO est amplifiée et est produite depuis le drain (D) du transistor M35.
Puis des descriptions seront données de modifications du circuit de transformation courant-tension 41 représenté sur la figure 9 par report à la figure 10A et à la figure 10B. La figure 10A représente une première modification du circuit de transformation courant-tension 41 représenté sur la figure 9 et la figure 10B représente une seconde modification du circuit de transformation courant-tension 41 représenté sur la figure 9.
Le circuit de transformation courant-tension 41 représenté sur la figure 10A présente sensiblement la même configuration de circuit que celle représentée sur la figure 9. Cependant, dans le circuit de transformation courant-tension 41 de la figure 10A, la largeur de grille W2 est établie pour le transistor M35 du circuit de transformation de tension 43 de manière à être différente de la largeur de grille W1 des autres transistors M31 à M34. C'est-à-dire que tandis que la même longueur de grille L1 est prévue dans tous les transistors M31 à M35 constituant le circuit de transformation courant-tension 41, la largeur de grille W2 du transistor M35 est formée de manière à être différente de la largeur de grille W1 des autres transistors M31 à M34.
Dans le circuit de transformation courant-tension 41 représenté sur la figure 10A, comme il a été discuté préalablement, on considère que la dispersion due à la fabrication des largeurs de grille des transistors est extrêmement faible et qu'elle peut être négligeable. Par conséquent, bien que la même longueur de grille L1 soit prévue dans tous les transistors M31 à M35, la largeur de grille W2 du transistor M35 peut être modifiée de façon flexible en fonction d'un rapport de transformation de courant souhaité.
Dans le circuit de transformation courant-tension 41 représenté sur la figure 10A, un rapport de transformation de courant R6 est donné par l'équation qui suit R6 = I3 / Il = (largeur de grille du transistor M35 / longueur de grille du transistor M35) x ((longueur de grille du transistor M31 + longueur de grille du transistor M32) / largeur du transistor M31(M32)) = 2W2 / W1 Dans le circuit de transformation courant-tension 41 représenté sur la figure 10B, le circuit de transformation de tension 43 est construit à l'aide de trois transistors M36 à M38 (MOSFET à canal P) connectés en série. Le reste de la configuration de circuit est le même que dans le cas du circuit représenté sur la figure 10A.
Une source (S) du transistor M36 est connectée à la première source de puissance (VDD) 46 et son drain (D) est connecté à une source (S) du transistor M37. Un drain (D) du transistor M37 est connecté à une source (S) du transistor M38 et un drain (D) du transistor M38 est connecté à une source de courant 49. En outre, les grilles respectives (G) des transistors M36 à M38 sont connectées au drain (D) du transistor M34.
Dans ce cas, tandis que la même longueur de grille L1 est prévue dans tous les transistors M31 à M34, M36 à M38, la largeur de grille W2 est prévue dans les transistors M36 à M38 et est formée de manière à être différente de la largeur de grille W1 des transistors M31 à M34.
TABLEAU 6 Echantillon 6A 6B 6C Taux de dilution 1 à 1 1 à 2,5 1 à 5 pH final 4,82 4,75 4,76 Pourcentage de séparation de phase 64,9 38,1 21,5 EXEMPLE 7 On opère selon le mode opératoire de l'exemple 6, sauf que l'eau de mer de dilution contient 0,10 % en poids d'ions calcium ajoutés sous forme de chlorure de calcium. Les résultats indiqués dans le tableau 7 montrent une diminution du pourcentage de séparation de phase, résultant de la dilution, de 64,9 sans dilution à 37,3 pour un taux de dilution de 1/5. C'est là une diminution nettement plus faible que celle que l'on observe lorsque le diluant est de l'eau de mer non additionnée comme le montre le tableau 6.
TABLEAU 7 Echantillon 7A 7B 7C Taux de dilution 1 à 1 1 à 2,5 1 à 5 pH final 4,82 4,63 4,68 Pourcentage de séparation de phase 64,9 47,0 37,3 EXEMPLE 8 On opère selon le mode opératoire de l'exemple 6, sauf que l'eau de mer de dilution contient 0,20 % en poids d'urée et ne contient pas d'ions calcium ajoutés.
Les résultats du tableau 8 montrent une diminution du pourcentage de séparation de phase, résultant de la dilution, de 64,9 sans dilution à 45,0 pour un taux de dilution de 1/5.
TABLEAU 8 Echantitton 8A 8B 8C Taux de diLution 1 à 1 1 à 2,5 1 à 5 pH finaL 4,82 5,33 6,11 Pourcentage de séparation de phase 64,9 47,2 45,0 EXEMPLE 9 On opère selon le mode opératoire de l'exemple 6, sauf que l'eau de mer de dilution contient à la fois 0,10 % en poids d'ion calcium et 0,20 % en poids d'urée.
Les résultats, consignés dans le tableau 9, montrent que le pourcentage de séparation de phase passe de 64,9 sans dilution à 70,9 pour un taux de dilution de 1/2,5 et à 70,8 pour un taux de dilution de 1/5.
PROCEDE POUR PRODUIRE UN SIGNAL DE SYNCHRONISATION PERMETTANT LE PILOTAGE D'UN SYSTEME D'INJECTION ELECTRONIOUE D'UN MOTEUR A COMBUSTION INTERNE La présente invention concerne un procédé permettant de générer un signal de synchronisation, représentatif du déroulement du cycle de fonctionnement d'un moteur à combustion interne à quatre temps, du type multicylindre et muni d'une injection électronique de carburant multipoint séquentielle phasée, destiné à équiper un véhicule automobile ou routier.
L'invention concerne plus précisément un procédé pour générer un signal permettant 5 le suivi du déroulement du cycle de fonctionnement dans chacun des différents cylindres du moteur et en particulier le repérage d'un instant prédéterminé du cycle tel que le passage au Point Mort Haut Admission ou encore au Point Mort Bas Admission et ce, de façon à phaser précisément l'injection du carburant.
Dans le but d'améliorer le fonctionnement des moteurs à combustion interne tant du point de vue des performances que du point de vue de l'émission de polluants, de nombreux systèmes d'injection de carburant ont été développés. Parmi ceux-ci, on peut citer les systèmes d'injection indirecte multipoint à commande électronique, comme le système RENIX ou comme le système L(ou LH)-Jetronic commercialisé par la société BOSCH.
Une des caractéristiques importantes de l'injection électronique multipoint est son fonctionnement intermittent, les injecteurs sont en effet actionnés périodiquement : au moins une fois par cycle moteur, soit encore dans le cas d'un moteur à quatre temps une fois pendant deux tours vilebrequin ou 720" d'angle. Deux modes d'ouverture des injecteurs ont été développés l'actionnement simultané et l'actionnement séquentiel.
L'injection simultanée, ou Full-Group, consiste à injecter la quantité de carburant, déterminée par le dispositif électronique de contrôle, en faisant fonctionner tous les injecteurs en même temps. L'actionnement des injecteurs peut s'opérer une fois par cycle (une injection tous les deux tours de vilebrequin) ou deux fois par cycle (une injection par tour de vilebrequin). Cette dernière solution simplifie l'organisation du dispositif électronique de contrôle qui pilote les injecteurs : un seul étage de commande est nécessaire.
Cependant le mode de fonctionnement Full-Group présente l'inconvénient d'injecter le carburant alors qu'il y a toujours une soupape d'admission en position ouverte. Or, l'expérience montre que l'injection quand il y a une soupape ouverte n'est pas souhaitable parce qu'elle entraîne une augmentation des émissions de polluants : le carburant injecté vient mouiller la bougie et provoque une mauvaise initiation de la combustion.
L'injection séquentielle consiste à injecter la quantité de carburant en actionnant successivement et dans un ordre donné, les différents injecteurs de façon à injecter dans chaque cylindre au mieux par rapport à la phase d'admission correspondante. L'injection séquentielle est de préférence phasée de façon à ce que ltouverture de chaque injecteur se termine avant l'ouverture de la soupape d'admission du cylindre correspondant, ouverture qui débute juste avant le passage au Point Mort Haut Admission du cylindre correspondant.
L'injection séquentielle phasée donne d'excellents résultats en terme de dépollution. En effet, I'injection séquentielle phasée permet, en contrôlant précisément l'instant d'injection cylindre par cylindre, de supprimer dans la quasi-totalité des conditions de fonctionnement du moteur, l'injection directe du carburant dans un cylindre par la soupape ouverte.
Toutefois, les systèmes d'injection électronique multipoint séquentielle phasée présentent l'inconvénient d'engendrer un surcoût important par rapport à une installation classique d'injection électronique de type "Full Group" où tous les injecteurs sont activés simultanément.
En effet, les systèmes d'injection séquentielle phasée ont notamment besoin de disposer de moyens de repérage très précis du déroulement du cycle moteur dans chacun des cylindres, pour permettre à la centrale électronique de contrôle moteur de calculer et de commander le débit de chaque injecteur à un moment adéquat prédéterminé, en dehors de la période d'ouverture de la soupape correspondante.
VIT 2 CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE COEXPRIMANT LES GENES CHIMERIQUES CODANT LA LIPASE PANCREATIQUE HUMAINE (LPH) ET DE LA COLIPASE PANCREATIQUE HUMAINE (COLPH) RECOMBINANTE S Les ADNc codant pour les séquences "PSLPH-LPH" et "PSCOLPH COLPH" ont été clonées chacune sous contrôle du promoteur constitutifPd35S et du terminateur 35S dans le vecteur de coexpression pBIOC43.
La ligation, la transformation des bactéries Escherichia coli DHSa rendues préalablement compétentes, l'analyse de I'ADN plasmidique des clones obtenus ont été réalisées comme décrit précédemment.
VIII. EXEMPLE D'OBTENTION DE PLANTS DE COLZA TRANSGENIQUES.
Les graines de colza de printemps (Brassica napus cv WESTAR ou lignées Limagrain) sont désinfectées pendant 40 minutes dans une solution de Domestos (marque déposée) à 15%. Après 4 rinçages à l'eau stérile les graines sont mises à germer, à raison de 20 graines par pot de 7 cm de diamètre et 10 cm de haut, sur du milieu minéral de Murashige et Skoog (Sigma M 5519) avec 30g/l de saccharose et solidifié avec de l'agargel à 5g/l. Ces pots sont placés dans une chambre de culture à 26 C avec une photopériode de I6h/8h et sous une intensité lumineuse de l'ordre de 80 p E m-2 s Après 5 jours de germination, les cotylédons sont prélevés stérilement en coupant chaque pétiole environ 1 min au-dessus du noeud cotylédonaire.
Parallèlement une préculture d'Agrobacterium itinte/aciens souche LBA4404, contenant les plasmides, à savoir, le plasmide pGAZE dans lequel a été inséré la séquence codant pour la lipase pancréatiqlie humaine fusionnée à celle codant pour un signal d'adressage (PS, PPS, PSLGL, PSPHP) sous contrôle du promoteur PCRU (ou Pd35S), est réalisée en erlenmeyer de 50 ml, pendant 36 h à 28 C dans 10 ml de milieu bactérien 2YT complémenté avec les antibiotiques utiles à la sélection de la souche utilisée.
Cette préculture sert à ensemencer à 1% une nouvelle culture bactérienne effectuée dans les mêmes conditions. Au bout de 14 h la culture est centrifugée 15 min à 3000 g et les bactéries sont reprises dans un volume équivalent de milieu de germination liquide. Cette suspension est distribuée dans des boîtes de pétri de 5 cm de diamètre à raison de 5 ml/boite.
Deux fois de suite, à 3 semaines d'intelvalle, les explants sont repiqués stérilement sur du milieu neuf dans les mêmes conditions.
Les bourgeons verts apparus à la fin du deuxième ou du troisième repiquage sont séparés de l'expiant et mis en culture individuellement dans des pots transparents de 5 cm de diamètre et de 10 cm de haut contenant un milieu identique au précédent mais dépourvu de BAP. Apodes 3 semaines de culture la tige du bourgeon transformé est sectionnée et le bourgeon est repiqué dans un pot de milieu frais. Au bout de trois à quatre semaines les racines sont assez développées pour permettre l'acclimatation de la plantule dans un phytotron. Les bourgeons qui ne sont pas verts ou enracinés sont éliminés. Ces plantules sont alors transplantées dans des godets de 7 cm de côté remplis de terreau (norme NF U44551: 40% tourbe brune, 30% bruyère tamisée et 30% sable) saturé en eau. Après deux semaines d'acclimatation en phytotron (température 210C, photopériode 16h/8h et 84% d'humidité relative), les plantules sont rempotées dans des pots de 12 cm de diamètre remplis du meme terreau enrichi en engrais retard Osmocote (marque déposée), à raison de 4 g/l de terreau puis transportées en serre (classe S2) régulée à 18"C, avec deux arrosages quotidien de 2 minutes à l'eau.
Lorsque les siliques sont arrivées à maturité, elles sont récoltées, séchées, puis battues. Les graines obtenues servent au dosage de l'activité biochimique. La sélection de la descendance transgéni que se fait par germination sur un milieu contenant du sulfate de kanamycine à raison de 100 à 150 mg/l (selon les génotypes). Les conditions opératoires sont identiques à celles décrites ci-dessus à ceci près que les germinations sont effectuées en tubes de verre avec une seule graine par tube. Seules les plantules développant des racines secondaires les trois premières semaines sont acclimatées en phytotl on avant d'etre passées en serre.
IX. EXEMPLE D'OBTENTION DE PLANTS DE SOLANACEES TRANSGENIQUES.
IX.1. OBTENTION DE PLANTS DE TABAC TRANSGENIQUES Les plants de tabac utilisés pour les expériences de transformation (Nicotiana tabac var. Xanthi NC et PBD6) sont cultivés in litho sur le milieu de base de Murashige et Skoog (1962) additionné des vitamines de Gamborg et ai. (1968, Sigma référence M0404) de saccharose à 20 g/l et d'agar (Merck) à 8 g/l. Le pH du milieu est ajusté à 5,8 avec une solution de potasse avant autoclavage à 1200C pendant 20 min. Les plantules de tabac sont repiquées par bouture des entre noeuds tous les 30jours sur ce milieu de multiplication MS20.
Toutes les cultures hi "iiiy) sont réalisées en enceinte climatisée, dans les conditions définies ci-dessous: - intensité lumineuse de 30 E.m2.s-1; photopériode de 16h; - thermopériode de 26 C le jour, 240C la nuit.
La technique de transformation utilisée est dérivée de celle de Horsch et ai.
On obtient avec cette construction une réaction du ressort relativement forte après une faible compression donnant un résultat non linéaire. Ce brevet comporte toujours les inconvénients de poids (surtout par rapport à l'énergie emmagasinée) et de hauteur : la hauteur de compression s'ajoutant à la hauteur du ressort comprimé créant un problème d'encombrement.
De plus, le frottement des branches sur les plaques est une source importante d'usure et de friction qui réduit le retour d'énergie désirable et recherché.
Ainsi, l'invention a pour but de minimiser la force d'impact du talon sur le sol avec une hauteur de talon minimum tout en conservant une grande capacité d'absorption d'énergie et une bonne stabilité, ainsi qu'une bonne restitution de l'énergie emmagasinée par le dispositif lors de la compression. De plus, l'invention a pour but de proposer une chaussure de poids réduit dont la raideur du dispositif d'amortissement peut être réglable grâce à des moyens simples, et de plus, un coût de fabrication raisonnable.