INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
On refroidit à 5 C, ajoute, goutte à goutte, 5,5 ml de solution 1M d'hydrure de lithium et d'aluminium dans le tétrahydrofuranne, sans que la température ne dépasse 80C et agite 30 minutes à SOC On ajoute à 50C, 2 ml de solution 80/20 de tétrahydrofuranne/eau, puis 1 ml de solution saturée de tartrate double de sodium et de potassium. On essore, lave avec 50 ml d'acétate d'éthyle, sèche puis solubilise dans 200 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec 300 ml d'eau et évaporée à sec.
On obtient 2,3 g de produit attendu ANALYSES IR CHC13 (cal) Absence de # =0 OH 3610 Aromatique 1631-1602-1503 -OS02- 1380-1180 STADE 2 : 4-méthylbenzenesulfonate de (2,2-diphényl6(méthoxyméthyl)-1,3-benzodioxole-4-ol) On introduit 4,5 g du produit obtenu au stade 1 cidessus dans 80 ml de tétrahydrofuranne anhydre.
On refroidit à -50 C, ajoute 6,8 ml de solution de butyllithium à 1,4 molaire dans 1'hexane, laisse remonter la température à OOC et ajoute goutte à goutte 1,2 ml d'iodure de méthyle puis agite une nuit à température ambiante.
On verse dans 300 ml d'eau. La phase aqueuse est extraite avec trois fois 100 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée avec 300 ml d'eau et évapore à sec.
On purifie sur silice avec le mélange éluant cyclohexane 8/acétate d'éthyle 2 et obtient 1,4 g de produit attendu (cristaux jaune pâle) ANALYSES IR CHC13 (cm 1) Absence d'OH Aromatique 1628-1597-1502 EXEMPLE 30 : i- On procède comme à l'exemple 28 à partir de 0,5 g du produit de l'exemple 29 dans 120 ml de tétrahydrofuranne, 0,1 g de palladium sur charbon activé à 18 % et hydrogénation.
On purifie sur silice avec le mélange cyclohexane 5/acé- tate d'éthyle 5 et obtient 0,150 g de produit attendu (cristaux blancs).
IR NUJOL (cm 1) Absorptions région OH/NH - 3450-3305 Aromatique 1610-1598-1520-1498 EXEMPLE 31 : 4-méthyl-benzenesulfonate de (2,3-dihydroxy-5- (méthoxymethyl)phenyle) STADE 1 : 3-(((4-méthylphényl)sulfonyl)oxy)-4,5-bis (phénylméthoxy)-benzoate de méthyle On introduit 3 g du produit de l'exemple 1 de EP 0491.600 dans 120 ml de diméthylformamide anhydre.
On ajoute 0,85 g d'hydrure de sodium à 50 % dans l'huile, agite une heure à température ambiante et ajoute 2,1 ml de chlorure de benzyle en solution dans 20 ml de dimé- thylformamide puis agite une nuit à température ambiante.
On verse dans 300 ml d'eau, la phase aqueuse est neutralisée avec une solution d'acide chlorhydrique 2N, puis extraite avec 3 fois 75 ml d'acétate d'éthyle. La phase organique est lavée à l'eau, séchée et évaporée à sec.
On purifie sur silice avec le mélange éluant cyclohexane 7/acétate d'éthyle 3 puis recristallise dans l'éther isopropylique et obtient 3,3 g de produit attendu (cristaux blancs) ANALYSES IR CHC13 (cal) Absence d'OH -O 1720 Aromatique 1599-1585-1501 STADE 2 : 3- ( ( (4-méthylphényl)sulfonyl)oxy)-4,5-bis (phénylméthoxy)-benzeneméthanol On introduit 3,2 g du produit obtenu au stade 1 cidessus dans 210 ml de tétrahydrofuranne anhydre.
On refroidit à 50C, et on ajoute 6,2 ml de solution lx d'hydrure de lithium et d'aluminium dans le tétrahydrofuranne en maintenant à température à 60C et agite 30 minutes à Soc.
On ajoute à 50C, 1,5 ml de solution 80/20 de tétrahydrofuranne/eau, puis 1 ml de solution saturée de tartrate double de sodium et de potassium et agite 2 heures à OOC puis essore, lave avec 50 ml d'acétate d'éthyle et sèche. On solubilise dans 200 ml d'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée avec 300 ml d'eau, séchée et évaporée à sec.
On obtient 3,2 g de produit attendu (cristaux blancs) ANALYSES IR CHC13 (cl 1) -OH - 3608 Aromatique 1599-1588-1502 STADE 3 : 4-méthylbenzenesulfonate de 5-(méthoxyméthyl)-2,3 bis(phénylméthoxy)-phényle On introduit 2,85 g du produit obtenu au stade 2 cidessus dans 140 ml de tétrahydrofuranne anhydre.
On refroidit à -50 C, et ajoute 5,8 ml de solution de butyllithium à 1 M dans 1'hexane, laisse remonter la température à OOC et ajoute 1,08 ml d'iodure de méthyle puis chauffe au reflux pendant 4 heures.
On verse dans 300 ml d'eau, la phase aqueuse est extraite avec trois fois 100 ml d'acétate d'éthyle et la phase organique est lavée avec 300 ml d'eau, séchée et évaporée à sec.
Grâce à ces travaux, diverses équipes se sont intéressées à la production de protéines recombinantes de mammifères dans les cellules végétales ou dans des plantes transgéniques (Barta et al., 1986; Marx, 1982). L'un des premiers résultats vraiment significatif dans ce domaine a été la production d'anticorps dans les plantes de tabac transgéniques (Hiatt et al., 1989).
Pour exprimer une protéine hétérologue dans la graine, lieu de stockage des protéines chez les végétaux, I'équipe de Vandekerckhove (1989) a fusionné la séquence codant pour la leu-enképhaline au gène codant pour l'albumine 2S d'Arabidopsis thaliana. Avec cette construction, des colza transgéniques ont été produits qui expriment la leu-enképhaline spécifiquement dans les graines à des niveaux d'expression de l'ordre de 0,1% des protéines totales. En 1990, Sijmons et collaborateurs ont transféré le gène de la sérum albumine humaine dans des cellules de tabac et de pomme de terre. Quelle que soit l'origine des peptides signaux (humaine ou végétale), des taux de sérum albumine humaine de l'ordre de 0,02% des protéines totales ont été obtenus dans les feuilles, les tiges et les tubercules de pomme de terre.
D'autres protéines recombinantes de mammifères ont été aussi produites dans les plantes: l'antigène de surface de l'hépatite B (Mason et al., 1992); les interférons (De Zoeten et al., 1989; Edelbaum et al., 1992; Truve et al., 1993); un anticorps de souris anti-Streptococcus mutans, agent de la carie dentaire (Hiatt et Ma, 1992; Ma et al., 1994), des fragments d'anticorps scFV anti-cellules cancéreuses (Russel D., 1994), un anticorps anti-Herpès (Russel D., 1994), l'hirndine (Moloney et al., 1994), la toxine du choléra (Hein R., 1994) et le facteur de croissance de l'épiderme humain (E.G.F.) (Higo et al., 1993).
L'ensemble de ces recherches a permis de montrer que la production de protéines recombinantes de mammifères dans les cellules végétales est possible et que les mécanismes de la synthèse des protéines à partir des séquences d'ADN sont similaires chez les cellules animales et les cellules végétales.
Quelques différences existent néanmoins entre les cellules végétales et animales, notamment au niveau de la maturation des glycannes polymannosidiques en glycannes complexes, ou encore au niveau des sites de clivage des peptides signaux, ne permettant pas ainsi de garantir l'obtention de protéines de mammifères actives ou suffisamment actives par transformation de cellules végétales.
Les inventeurs ont mis en évidence que l'utilisation de cellules végétales transformées par une séquence nucléotidique recombinante appropriée, permet d'obtenir de la LGC recombinante, ou des polypeptides dérivés, présentant une activité enzymatique suffisante pour être susceptibles d'être développés dans une application industrielle.
Le but de la présente invention est de fournir un nouveau procédé d'obtention de LGC recombinante par les plantes, ou de polypeptides dérivés de cette dernière, présentant une activité enzymatique, et plus particulièrement une activité lipasique, telle que ladite LGC recombinante, ou ses polypeptides dérivés puissent être utilisés industriellement.
Un autre but de la présente invention est de fournir les outils pour la mise en oeuvre d'un tel procédé, notamment de nouvelles séquences nucléotidiques recombinantes, des cellules de plantes transformées génétiquement, des plantes ou fragments de plantes transformés génétiquement, et des semences transformées génétiquement.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelle(s) LGC recombinante(s), ou tout polypeptide dérivé, enzymatiquement actifs et tels qu'obtenus à partir de cellules de plantes ou de plantes, transformées génétiquement.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions enzymatiques susceptibles d'être utilisées dans le cadre de la mise en oeuvre de réactions enzymatiques, notamment à l'échelle industrielle.
L'invention a également pour but de fournir de nouvelles compositions pharmaceutiques, notamment dans le cadre du traitement de pathologies associées à un déficit de production de lipase dans l'organisme, telles que la mucoviscidose.
Un autre but de la présente invention est de fournir de nouveaux carburants, encore désignés biocarburants, présentant l'avantage d'être moins polluants que les carburants dérivés du pétrole, et d'être d'un coût de revient moins élevé.
L'invention est illustrée dans ce qui suit à l'aide des figures suivantes: - la figure 1 représente la séquence nucléotidique de l'ADNc dont les nucléotides situés aux positions 1 à 1137 codent pour la LGC représentée sur la figure 2, - la figure 2 représente la séquence en acides aminés de la LGC, - la figure 3 représente une séquence nucléotidique dérivée de l'ADNc représenté sur la figure 1, les nucléotides situés aux positions 1 à 1137 de ladite séquence dérivée codant pour la LGC telle que représentée sur la figure 2, - la figure 4 représente les résultats d'expériences d'immunodétection du type "Western" des polypeptides recombinants produits par les feuilles et graines de tabac Xanthi, et les graines de colza transformées à l'aide des séquences recombinantes selon l'invention, - les figures 5, 6 et 7 illustrent les différents essais effectués dans le cadre de l'obtention de méthylester oléique à partir de graines transformées selon l'invention.
La présente invention a pour objet l'utilisation d'une séquence nucléotidique recombinante contenant d'une part, l'ADNc représenté sur la figure 1 et codant pour la lipase gastrique de chien (LGC) représentée sur la figure 2, ou une séquence nucléotidique dérivée de cet ADNc, notamment par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou plusieurs) nucléotide(s), ladite séquence dérivée étant susceptible de coder pour un polypeptide dont la séquence en acides aminés est identique à celle de la LGC représentée sur la figure 2, ou pour un polypeptide dérivé de la LGC par addition et/ou suppression et/ou substitution d'un (ou plusieurs) acide(s) aminé(s), ce polypeptide dérivé présentant une activité lipasique, et d'autre part, les éléments permettant à une cellule végétale de produire le polypeptide codé par ledit ADNc ou par une séquence dérivée susmentionnée, notamment un promoteur et un terminateur de transcription reconnus par la machinerie transcriptionnelle des cellules végétales (et plus particulièrement par les ARN polymérases de ces dernières), pour la transformation de cellules de plantes en vue de l'obtention, à partir de ces cellules, ou des plantes obtenues à partir de ces dernières, de LGC recombinante sous forme d'enzyme active, ou d'un (ou plusieurs) polypeptide(s) dérivé(s) de cette dernière tel(s) que défini(s) cidessus.
L'invention concerne également toute séquence nucléotidique recombinante telle que décrite ci-dessus, contenant à titre d'ADNc, celui représenté sur la figure 1, ou une séquence nucléotidique dérivée de ce dernier telle que définie ci-dessus.
A ce titre, l'invention a plus particulièrement pour objet toute séquence nucléotidique recombinante telle que décrite ci-dessus, contenant 1'ADNc représenté sur la figure 1 et codant pour la lipase gastrique de chien (LGC) représentée sur la figure 2.
AI i i 1 Si 20 36 Mn 3 3 Fe 380 290 Cd 17 17 Ceci montre la bonne sélectivité du gel de silice qui ne retient pas les cations précités.
DISPOSITIF D'INSERTION DE BORNES ET PROCEDE D'INSERTION DE CELLES-CI La présente invention concerne un dispositif d'insertion de bornes câblées destiné à insérer une borne câblée serrée par des pinces de maintien dans un boîtier de connecteur, à travers un espace entre les bras de guidage et concerne également un procédé d'insertion de celles-ci, dans lequel les pinces de maintien et les bras de guidage sont décalés ensemble de manière à éviter que la borne n'interfère avec les bras de guidage lorsqu'ils sont tirés vers l'arrière lors de la procédure de vérification de l'état d'insertion de la borne après son insertion et également pour éviter que les bras de guidage n'endommagent les conducteurs électriques sortant du boîtier de connecteur lorsque les bras de guidage sont relevés.
Les Fig. 12 et 13 montrent un procédé d'insertion de bornes classique, dans lequel une paire de bras de guidage 2 est abaissée afin d'être insérée au milieu d'une pluralité de conducteurs électriques 6b sortant d'un boîtier de connexion 32, après quoi les bras de guidage 2 sont ouverts d'une largeur à peine supérieure à la largeur L d'une borne 6a d'une borne câblée 6 juste en face d'une chambre de logement de borne 32a choisie, de manière à glisser la borne câblée 6 entre et à l'insérer dans la chambre de logement de borne 32a.
La borne câblée 6 est serrée par une pince de maintien de borne 3 qui maintient une partie de la partie fil directement derrière la partie borne de celle-ci et une pince de maintien de fil 4 qui maintient une autre partie arrière de la partie fil, et une fois que la face avant de la borne 6a est insérée dans la chambre de logement de borne 32a par la pince de maintien de borne 3 (insertion préliminaire) , la pince de maintien de borne 3 est ouverte pour libérer la borne 6a et la borne câblée 6 est alors complètement insérée par pince de maintien de fil 4 (insertion secondaire).
Ensuite, une fois la borne câblée 6 complètement insérée, la pince de maintien de fil 4 serrant le fil 6b de la borne câblée 6 est tirée vers l'arrière par un cylindre horizontal (non illustré) pour vérifier si la borne 6a est solidement insérée et verrouillée ou non par une tige de verrouillage (non illustrée) du boîtier de connecteur 32, et s'il s'avère que l'insertion a été correctement faite, les deux pinces de maintien 3, 4 et le bras de guidage 2 sont respectivement relevés pour préparer l'insertion de la borne suivante.
Dans le procédé décrit ci-dessus, toutefois, dans le cas où la borne 6a s'enlève du boîtier de connecteur 32a en raison d'une insertion incomplète de la borne détectée pendant l'opération de vérification de l'insertion, la partie arrière de la borne 6a risque de buter contre la partie avant des bras de guidage 2 provoquant de ce fait une fonction erronée. De plus, lorsque les bras de guidage 2 sont relevés après que l'insertion complète est vérifiée, une saillie de guidage 2b formée sur l'un des bras de guidage 2 est susceptible de s'accrocher dans les conducteurs électriques 6b situés juste au-dessus et de les endommager.
La présente invention a été réalisée pour résoudre les problèmes susmentionnés, et en conséquence, un objet de la présente invention est de fournir un dispositif d'insertion de bornes, dans lequel une borne 6a d'une borne câblée 6 peut être enlevée en toute sécurité sans buter contre les bras de guidage 2 dans le cas où l'insertion est imparfaite, et dans lequel également les bras de guidage 2 peuvent être décalés vers le haut sans accrocher les autres conducteurs électriques 6b après qu'une insertion parfaite est détectée.
Afin de réaliser l'objet susmentionné, la présente invention fournit un dispositif d'insertion de bornes comprenant des pinces de maintien de borne câblée et une paire de bras de guidage pour insérer une borne câblée serrée par les pinces de maintien dans un boîtier de connecteur à travers un espace entre la paire de bras de guidage, dans lequel les pinces de maintien et les bras de guidage sont intégrés sur une plaque monolithique qui peut être décalée dans les directions arrière et avant ainsi que dans les directions haut et bas par un moyen d'entraînement.
Le dispositif d'insertion de bornes ci-dessus peut en plus être adapté pour que la plaque monolithique soit composée d'une paroi avant et d'une paroi latérale formant substantiellement une forme en T, dans lequel la paroi avant est en plus équipée d'un cylindre d'ouverture-fermeture pour activer l'ouverture et la fermeture des bras de guidage, alors que la paroi latérale est équipée d'une plaque de jonction en prise avec la paroi d'une manière coulissante verticalement, laquelle plaque de jonction étant formée avec des cylindres d'ouverture-fermeture pour activer les pinces de maintien respectives situées dessus, et étant également connectée avec un cylindre vertical monté sur la paroi latérale, dans lequel la paroi verticale est en plus en prise avec une carte châssis qui est formée à l'extérieur de la paroi latérale de manière à pouvoir être mobile vers l'avant et l'arrière, et également connectée avec un cylindre horizontal monté sur la carte châssis. Le dispositif d'insertion de bornes peut en plus être adapté pour que les cylindres d'ouverturefermeture permettant d'activer les pinces de maintien respectives soient connectés en prise avec la plaque de jonction de manière à être mobiles vers l'avant et l'arrière, et ces cylindres d'ouverture-fermeture pour les pinces de maintien sont en plus connectés avec une paire de cylindres horizontaux également montés sur la plaque de jonction.
De plus, un procédé d'insertion de bornes selon la présente invention comprend les étapes de serrage d'une borne câblée avec les pinces de maintien, insertion d'une paire de bras de guidage au milieu d'une pluralité de conducteurs électriques sortant du boîtier de connecteur, ouverture de la paire de bras de guidage, insertion de la borne câblée dans le boîtier de connecteur à travers un espace entre les bras de guidage ouverts, vérification de l'état d'insertion de la borne câblée par traction de la partie fil de la borne câblée vers l'arrière avec les pinces de maintien, caractérisé en ce que pour vérifier l'état d'insertion, les pinces de maintien sont poussées vers l'arrière en même temps que les bras de guidage et décalées jusqu'à une position située derrière les conducteurs électriques, après quoi elles sont en plus décalées vers le haut en même temps que les bras de guidage pour être mises de côté.
Le mouvement global du dispositif est tel que la plaque monolithique est d'abord abaissée par un moyen d'entraînement avec la borne câblée serrée par les pinces de maintien, et la borne câblée est placée derrière le boîtier de connecteur. Ensuite, les cylindres d'ouverture-fermeture qui activent les pinces de maintien sont déplacés vers l'avant le long de la plaque de jonction, pour que la borne soit insérée dans le boîtier de connecteur à travers un espace entre les bras de guidage. Après quoi, la plaque monolithique est poussée vers l'arrière par un cylindre horizontal fourni comme moyen d'activation de celle-ci, pour que la borne câblée soit tirée vers l'arrière, la partie fil étant toujours serrée par la pince de maintien pour vérifier l'état d'insertion de la borne.
A la suite de la vérification, si une insertion imparfaite est détectée, les pinces de maintien et les bras de guidage sont déplacés en même temps vers l'arrière. La borne étant ici placée devant les bras de guidage, elle n'interfère jamais avec les bras de guidage. Les bras de guidage se trouvent derrière les conducteurs électriques, et à partir de cet état, la plaque monolithique est remontée par le moyen d'entraînement, les bras de guidage et les pinces de maintien étant par la même occasion également remontés à travers un espace au milieu des conducteurs électriques. Ici, les bras de guidage sont remontés sans à-coups à travers un large espace derrière les conducteurs électriques sans interférer avec les fils.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront à partir de la description qui suit en référence aux dessins annexés.
La Fig. 1 est une vue latérale d'un dispositif d'insertion de bornes selon l'un des modes de réalisation de la présente invention La Fig. 2 est une vue de face du dispositif de la Fig. 1 La Fig. 3 est une vue en plan du dispositif de la Fig. 1 La Fig. 4 est une vue latérale montrant un état dans lequel une borne câblée est placée dans une position adjacente aux bras de guidage La Fig. 5 est une vue latérale montrant un état dans lequel les bras de guidage sont insérés dans un espace au milieu des conducteurs électriques La Fig. 6 est une vue latérale montrant un état dans lequel la borne est insérée à titre préliminaire La Fig. 7 est une vue latérale montrant un état dans lequel la borne est insérée à titre secondaire La Fig. 8 est une vue latérale de la partie importante du dispositif montrant un état dans lequel la condition de parfaite insertion de la borne est vérifiée La Fig. 9 est une vue latérale de la partie importante du dispositif montrant un état dans lequel la partie arrière de la borne s'est défaite La Fig. 10 est une vue latérale de la partie importante du dispositif montrant un état dans lequel les bras de guidage et les pinces de maintien sont tirés vers l'arrière La Fig. 11 est une vue latérale de la partie importante du dispositif montrant un état dans lequel les bras de guidage et les pinces de maintien sont remontés La Fig. 12 est une vue latérale de la partie importante d'un dispositif classique montrant un état dans lequel la condition d'insertion complète de la borne est vérifiée et dans lequel les bras de guidage vont être remontés, et La Fig. 13 est une vue en plan de la Fig. 12.
Sur les Fig. 1 à 3, un mode de réalisation d'un dispositif d'insertion de bornes selon la présente invention est illustré. Sur les Figures, le chiffre de référence 1 désigne un dispositif d'insertion de bornes (tête d'insertion), dans lequel une paire de bras de guidage 2, une pince de maintien de borne 3 et une pince de maintien de fil 4 sont intégrés sur une plaque monolithique 5 en métal ou similaire, et construit de façon que les pinces de maintien 3, 4 et les bras de guidage 2 puissent être décalés dans les directions avant et arrière, en d'autres termes dans le sens d'insertion et/ou de retrait d'une borne câblée 6, et dans les directions haut et bas, en d'autres termes dans le sens de déplacement vertical des bras de guidage 2, respectivement.
Comme le montre la Fig. 3, la plaque monolithique 5 est construite selon une forme substantiellement en T en formant une paroi latérale 8 sur la surface arrière de la paroi avant 7, dans laquelle les bras de guidage 2 sont montés sur la paroi avant 7 et les deux pinces de maintien 3, 4 sont montées sur la paroi latérale 8 par le biais d'une plaque de jonction 9.Comme le montre les Fig. 1 et 3, un cylindre d'ouverture-fermeture 10 pour ouvrir et/ou fermer les bras de guidage 2 est solidement fixé sur la paroi avant 7, deux rails verticaux 11, 11, mutuellement parallèles dans le sens vertical sont fournis dans la moitié inférieure de la paroi latérale 8, la plaque de jonction 9 est en prise avec les rails verticaux 11, 11 de manière à être mobile verticalement, et fournis sur la plaque de jonction 9 se trouvent les cylindres d'ouverture-fermeture 13 et 14 pour ouvrir et/ou fermer la pince de maintien de borne 3 et la pince de maintien de fil 4, respectivement. Ces cylindres 13 et 14 sont respectivement en prise avec les rails horizontaux mutuellement parallèles 15 et 16 d'une manière coulissante.
du portail, c'est-à-dire du côté o se trouve le disposi-
tif d'actionnement, ce qui est extrêmement gênant si l'enceinte fermée par le portail ne comporte pas de
portillon, pouvant être ouvert de façon indépendante.
Afin de résoudre ce problème, suivant un mode préféré de réalisation, le dispositif d'actionnement selon l'invention comprend une serrure portée par le panneau mobile et accessible au moins de l'extérieur de ce dernier, cette serrure étant adaptée pour pouvoir agir sur l'organe de commande du mécanisme de verrouillage et libérer le pêne de la gâche; Suivant d'autres caractéristiques: - la serrure est du type comprenant un corps fixe et un canon amovible, relié par un lien à l'organe de commande de la gâche; - la serrure est disposée au voisinage de la gâche et traverse la glissière et le panneau mobile, cette serrure comportant un panneton mobile coopérant avec un organe intermédiaire relié à l'organe de commande de la gâche; l'organe intermédiaire est un étrier muni de deux rebords en prise sur l'organe de commande et dont l'âme coopère avec le panneton de la serrure, cette dernière s'étendant dans l'espace délimité entre ladite
âme et la gâche.