INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Isomère (Z) RMN1H 200MHz (CDCl3) 1,10 (s, 6H, 2 Me); 1,56-1,86 (m, 2H, -CH2-); 2,15 (s, 3H, Me vinylique); 2,90-2,96 (m, 2H, -CH2-S); 6,46 (s, 1H, H vinylique); 6,60 (dd, 1H, ArH J 1,9Hz J 8,1Hz); 6,78-6,87 (m, 2H, ArH); 7,28 (dd, 2H, ArH J 1,8Hz, J 6,8Hz); 7,54 (dd, 2H, ArH J 1,8Hz J 6,8Hz).
h) PréDaration du (E) 4-[1-(3',4'-dihydro- 4',4'-diméthyl-1',1'-dioxyde-2'H-1'-benzothiopyran-6'-yl)-2propényl]benzonitrile de formule :
A une solution du (E) 4-[1-(3',4'-dihydro- 4',4'-diméthyl-2'H-l'-benzothiopyran-6'-yl)-2-propényl] benzonitrile précédent (0,24 g, 0,75 mmol) dans 7 ml de chloroforme, on ajoute de l'acide métachloroperbenzoïque à 70-75% (0,37 g, 1,5 mmol) à OOC. L'agitation est poursuivie à cette température 2 h 30. Le milieu réactionnel est dilué par 15 ml de chloroforme puis lavé avec une solution aqueuse de Na2CO3 à 5% (3 x 5ml). La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée puis évaporée. On obtient 0,25 g d'un solide, le (E) 4-[1- (3',4'-dihydro-1',1'-dioxyde-4',4'-diméthyl-2'H-1'- benzothiopyran-6'-yl)-2-propényl]benzonitrile (Rdt brut = 96%).
RMN1H 200MHz (CDCl3) :1,41 (s,6H, 2 Me); 2,23 (s, 3H, Me vinylique); 2,37-2,45 (m, 2H, -CH2-); 3,363,42 (m, 2H, CH2-S); 6,85 (s, 1H, H vinylique); 7,24-7,38 (m, 2H, ArH); 7,56-7,67 (m,4H, ArH); 7,90 (d, 1H, ArH J 8,1Hz).
i) PréDaration du (Z) 4-[1-(3',4'-dihydro- 4',4'-diméthyl-1' 1'-dioxyde-2'H-1'-benzothiopyran-6'- yl)-2-propényl] benzonitrile de formule
Ces cassures n'affecteront pas nécessairement l'ensemble des séquences cibles dans l'ensemble des génomes utilisés pour le peignage. En fonction du nombre de génomes humains peignés sur la surface étudiée, et en fonction des conditions de préparation, la proportion des séquences cibles cassées restera raisonnablement faible. Dans ce cas, I'histogramme idéal constitué par un seul pic à la longueur de la sonde sera remplacé par un pic moins important accompagné d'une queue de distribution aux longueurs inférieures.
L'expérience et des considérations pratiques élémentaires montrent qu'un nombre optimal de génomes peignés par surface étudiée est de l'ordre de 100 à 200.
Dans ce qui suit, on étudiera des simulations de processus de cassure (consécutives à la préparation et au peignage de l'ADN) dépendant de deux paramètres, permettant d'évaluer l'influence sur l'histogramme théorique des longueurs de ces phénomènes.
Deux paramètres semblent importants dans le phénomène de cassure: la taille caractéristique et le taux de cassure.
La taille caractéristique définit approximativement la taille limite atteinte par des molécules soumises à un grand nombre de manipulations. Un exemple de manipulation possible est le pipetage: en fonction du diamètre du cône de la pipette, la taille limite maximale des molécules sera plus ou moins importante. Un autre exemple de manipulation est le vortexage de la solution d'ADN.
Le taux de cassure est sensé modéliser le nombre de manipulations: par exemple, plus le nombre de pipetage augmente, plus les molécules risquent d'être cassées.
A. Modèle en marche d'escalier.
La façon la plus simple de modéliser des manipulations d'ADN en solution consiste à attribuer une probabilité de cassure nulle aux fragments de taille inférieure à la taille caractéristique LO, et une probabilité de cassure égale à 1 pour les fragments de taille supérieure à LO.
La cassure d'un fragment de taille L s'effectue en outre aléatoirement en deux fragments quelconques: L Po(L) = O L > lo= > Po(L)= 1 De façon à introduire un taux de cassure dans ce modèle, un paramètre fixe le nombre de processus de cassure auxquels est soumise une molécule et ses fragments successifs.
Ce modèle permet de simuler les histogrammes attendus lors d'une hybridation d'une sonde de longueur connue Lc en fonction des paramètres du modèle. Les conditions choisies sont: sonde s'hybridant sur un chromosome de 50 Mb, 200 génomes peignés, Lc = 50 kb.
A.1. Influence de la taille caractéristique sur I'histonramme.
La figure 4 représente, pour différents taux (ou nombre d'étapes) de cassure, I'allure des histogrammes théoriques obtenus pour des valeurs de taille caractéristique (LO = Lbreak) d' 1, 2, 4 ou 8 fois la taille de la sonde. Il apparaît clairement que plus ia taille caractéristique est proche de la taille de la sonde, plus l'histogramme se différencie du pic unique décrit dans la partie 2, la queue de la distribution aux longueurs inférieures à la longueur Lc de la sonde prenant de l'importance, jusqu'à pratiquement faire disparaitre le pic pour la valeur attendue Lc.
A.2. Influence du taux de cassure sur i'histogramme.
La figure 5 présente, pour différentes tailles caractéristiques, I'évolution de l'histogramme théorique en fonction du taux de cassure, c'està-dire le nombre d'étapes de cassure aléatoire (N time steps). Ii apparait naturellemnt que le pic à la longueur attendue Lc diminue lorsque le taux de cassure augmente.
Dans ce modèle cependant, le pic ne disparaît pas totalement, même lorsque le taux de cassure croît indéfiniment, puisqu'aucune cassure n'a lieu lorsque tous les fragments restant sont de taille inférieure à Lc.
De l'ADN de phage k marqué à la biotine-dUTP a ensuite été hybridé et révélé à l'aide d'un systéme d'anticorps couplés à la FITC (vert).
La longueur totale d'ADN hybridée par champ de vue a été estimée à partir de 100 champs de vue répartis uniformément sur l'ensemble de chaque surface (fig. 1(B)).
Les résultats de 4 expériences sont représentés dans le tableau ci-dessous dans lequel Nb E coli = Lc et Nb = LT lc lt Nb E. Coli Nb # R =#/E. Coli #R 434 0,19 0,19 1,0 0,6 436 0,25 0,22 0,9 0,5 437 0,31 0,26 0,8 0,4 438 0,20 0,24 1,2 0,7 439 0,26 0,39 1,5 0,8 43~13 0,57 0,74 1,3 0,4 4314 0,61 0,56 0,9 0,3 Ces résultats ont montré, hormis pour la lame 43~9, un rapport raisonnablement proche de la valeur attendue de 1. Cependant le principe utilisé, consistant à mesurer l'ensemble des signaux avant hybridation est peu praticable pour des génomes plus grands (I'incertitude AR est ici principalement due au faible nombre de génomes d'E. Coli mesurés, de l'ordre de 6 à 24).
EXEMPLE 3 Dosage du nombre d'amplicons dans le génome de cellules de hamster.
L'étude de faisabilité a été étendue à de l1ADN génomique de mammifère. Le système choisi est l'ADN de 2 lignées de fibroplastes du poumon de hamster (lignées 618 et GMA32) contenant respectivement 1 et 2 copies du gène cible AMP1.
De l ADN génomique de cellules fourni en solution a été peigné sur des surfaces silanisées, avec une densité estimée de 100 génomes diploïdes par surface de 22x22 mm.
Une sonde cosmidique (D3S1, 40 kb) spécifique de la région du gène cible a été marquée avec de la dig-dUTP. Une autre sonde cosmidique (565.5A1, 40 kb), spécifique d'une région située à environ 1 Mb du gène cible a été utilisée comme témoin, et marquée avec de la biotine-dUTP.
Dans le cas de la lignée A32, la taille totale obtenue pour la sonde D3S1 (1400 sm environ) représente 70 copies du gène. La taille obtenue sur les mêmes champs de vue pour la sonde témoin (1180 sm environ) représente quant à elle 60 génomes haploïdes. Cette mesure donne donc un rapport cible/témoin de 1,2 + 0,3 compatible avec la présence d'une copie du gène par génome haploïde.
Ces expériences (fig. 2) montrent donc la faisabilité du dosage de gène à partir des seuis signaux d'hybridation de sondes cible et témoin, dès lors qu'un nombre suffisant de signaux peut être observé.
EXEMPLE 4 cartographie Dar Daires de 6 cosmides sur un YAC de 1600 Db contenu dans de l1ADN génomiclue de levure Le YAC 774G4 contient un clone d'ADN génomique humain du chromosome 15 contenant le gène de la calpaine (CANP3), dont la mutation est responsable d'une dystrophie des ceintures (LGMD 2A). En collaboration avec le groupe de J. Beckman du Généthon (Evry), nous avons peigné de 1'ADN génomique de levure contenu dans des blocs d'agarose Low Melting (1 bloc, 1 ,ug d'ADN par bloc) sur des surfaces silanisées.
cartographie de couples de cosmides sur ADN zénomique humain 4 cosmides appartenant à 3 contigs voisins séparés par des gaps ont été utilisés dans 2 séries d'hybridations, effectuées en collaboration avec le groupe de S. Povey du MRC (Londres). Les contigs recouvrent la région du gène TSC 1 impliqué dans une des formes de la tuberous sclerosis (chromosome 9). Les sondes cosmidiques ont été préparées suivant le protocole ci-dessus.
L'ADN génomique utilisé a été extrait de cultures cellulaires et mis en bloc d'agarose Low Melting à raison de 106 cellules par bloc. 3 blocs traités suivant le protocole précédent (réservoir de 4 ml, utilisation d'une molarité finale de MES pH 5.5 de 150 mM), ont été utilisés pour le peignage de l'ADN génomique.
Les cosmides ont été hybridés 2 par 2 sur des lames semblables, un total de plusieurs dizaines de signaux doubles (rouge/vert alignés) par lame étant en moyenne observé. Le même protocole de mesure que précédemment a été observé, donnant lieu à des valeurs finales ayant la même précision que dans l'expérience préédente.
La figure 2 présente quelques images typiques ayant permis la mesure des tailles des 2 gaps étudiés.
La simple donnée de l'histogramme des longueurs et de la longueur Lc du clone (obtenue par exemple à l'aide d'une hybridation sur l'ADN d'un individu sain et obtention du pic de l'histogramme correspondant) permet donc de savoir si le clone étudié recouvre un point de cassure (au sens large entendu ici).
Les anomalies observées au niveau de l'histogramme peuvent être regroupées en plusieurs catégories: (a) un pic pour une longueur Li (b) un pic pour une longueur Ls > Lc (c) plusieurs pics de longueur(s) inférieure(s) à Lc (d) plusieurs pics de longueur(s) supérieure(s) à Lc (e) un pic pour une longueur L = Lc et un ou plusieurs pics de longueur(s) inférieure(s) à Lc (f) un pic pour une longueur L = Lc et un ou plusieurs pics de longueur(s) supérieure(s) à Lc (g) un ou plusieurs pics de longueurs à Lc Les classes d'anomalies répertiorées précédemment ne suffisent en général malheureusement pas pour définir l'anomalie génétique sous-jacente.
Le schéma de la figure lb montre en effet qu'il n'est pas possible a priori de distinguer entre une translocation partielle (cela ou (c2), totale (c3) ou une insertion dans le cas d'un clone qui couvrirait la totalité du gêne. I1 en est de même pour le cas où le clone ne couvrirait que partiellement le gène {schéma des figures 2b et 3b).
(a: un pic pour une longueur Li < Lc): il s'agit presque certainement d'une (ou de plusieurs) délétion(s). Cependant, comme nous l'avons noté, il peut s'agir d'un cas où plusieurs pics se trouvent confondus
(b: un pic pour une longueur Ls > Lc): dans ce cas, il s'agit d'une ou de plusieurs duplication(s) à l'intérieur du gène ou à ses extrémités, d'une partie ou de la totalité de celui-ci. Le clone peut recouvrir totalement ou partiellement le gène. Il peut éventuellement y avoir inversion des séquences, mais ceci ne peut être détecté dans le cas où le clone recouvre totalement le gène. La position de la ou des duplications ne peut être déterminée.
(c: plusieurs pics de longueur(s) inférieure(s) à Lc): il peut s'agir dans ce cas de translocations partielles du gène ou de l'insertion d'une séquence à l'intérieur du gène. Dans l'hypothèse d'une translocation, il est possible de préciser les deux extrémités du gène au sein du clone (cas où le clone recouvre totalement le gène), ou d'avancer deux possibilités pour ces extrémités (dans le cas où le clone recouvre partiellement le gène).
(d: plusieurs pics de longueur(s) supérieure(s) à Lc): il s'agit dans ce cas de plusieurs duplication de tout ou partie du gène dans la région du génome couverte par le clone.
(e: un pic pour une longueur L = Lc et un ou plusieurs pics de longueur(s) inférieure(s) à Lc): il s'agit d'une (ou de plusieurs) duplication(s) de tout ou partie du gène dans une zone du génome distincte de la zone couverte par le clone, ceci dans le cas où le clone couvre la totalité ou un partie du gène.
(f: un pic pour une longueur L = Lc et un ou plusieurs pics de longueur(s) supérieure(s) à Lc): bien que cette situation n'ait pas été représentée dans les schémas 1 à 3, il s'agit d'un cas de duplication du type (d) associé à un gène normal.
(g: un ou plusieurs pics de longueurs à Lc): combinaisons de (e) et (f).
Dans un certain nombre de situations, I'analyse des signaux d'hybridation et de leur distance, dans le cas où ils seraient alignés, devrait par ailleurs fournir des informations supplémentaires.
L'exemple du schéma la (e) illustrera cette idée: dans ce cas d'une insertion, il faut imaginer que tout segment non hybridé, mais entouré par deux hybridations colinéaires (de tailles quelconques) est susceptible de représenter une insertion: on construira donc un histogramme de ces mesures: s'il existe réellement une insertion, il devrait donc apparaître comme un pic, au même titre que n'importe quelle hybridation.
Cette mesure servira également dans le cas de délétions ou de translocations, par exemple.
La technique exposée précédemment suppose que l'ADN génomique peigné hybridé soit intact. En effet, la situation de référence, celle d'un individu sain dont l'ADN correspondant au clone utilisé pour l'hybridation n'est pas modifié, est représentée théoriquement par un pic à la valeur de la longueur du clone.
A une solution du (Z) 4-[1-(3',4'-dihydro- 4',4'-diméthyl-2'H-1'-benzothiopyran-6'-yl)-2propényl]benzonitrile (0,21 g, 0,65 mmol) dans 6,1 ml de chloroforme, on ajoute de l'acide métachloroperbenzoïque à 70-758 (0,32 g, 1,3 mmol) à OOC. L'agitation est poursuivie à cette température pendant 3 h. Le milieu réactionnel est dilué par 15 ml de chloroforme puis lavé avec une solution aqueuse de Na2CO3 à 5% (3 x 5ml). La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée puis évaporée. On obtient 0,21 g d'un solide, le (Z) 4-[1- (3',4'-dihydro-4',4'-diméthyl-1',1'-dioxyde-2'H-1'- benzothiopyran-6'-yl)-2-propényl]benzonitrile (Rdt brut = 95%).
RMN1H 200MHz (CDC13) :0,95 (s,6H, 2 Me); 2,15 (s, 3H, Me vinylique); 2,20-2,30 (m, 2H, -CH2-); 3,253,35 (m, 2H, CH2-S); 6,50 (s, 1H, H vinylique); 6,75 (s, 1H, ArH); 7,00 (dd, 1H, ArH J 1,3Hz, J 1,3Hz); 7,20 (m, 2H, ArH); 7,55 (d, 2H, J 7,5Hz, ArH); 7,5 (d, 1H, J 7,5 Hz, ArH).
j) PréDaration de l'acide (E) 4- r 1-(3'.4'- dihydro-4',4'-diméthyl-1',1-dioxyde-2'H-1'-benzothiopyran6'-yl)-2-propényl]benzoïque (composé CB39356) et de l'acide (Z) 4-[1-(3',4'-dihydro-4',4'-diméthyl-1',1'dioxyde-2'H-1'-benzothiopyran-6'-yl)-2-propényl]benzoïque (composé CB72484) de formules resDectives suivantes
Une suspension du mélange des (E) et (Z) 4 [1-(3',4'-dihydro-4',4'-diméthyl-1',1'-dioxyde-2'H-1'benzothiopyran-6'-yl)-2-propényl]benzonitriles (0,39 g, 0,75 mmol) en solution dans de la potasse (0,5 g, 9,0 mmol) hydroéthanolique (H2O 0,25 ml et EtOH 1,6 ml) est chauffée à reflux sous agitation magnétique pendant 5 h.
On évapore l'éthanol à l'évaporateur rotatif, reprend à l'eau (50 ml), acidifie par CHl 3N, extrait (3 x 25ml) à l'éther, sèche la phase éthérée sur MgSO4, filtre et évapore. Le produit brut est purifié par HPLC préparative sur une colonne Waters HR C18 (25 x 100 mm) avec comme éluant CH3CN : H2O = 100 : 100 + 0,1% de TFA. On obtient 15,8 mg d'un solide blanc, l'acide (E) 4-[1-(3',4'- dihydro-4',4'-diméthyl-1',1'-dioxyde-2'H-1'-benzo- thiopyran-6'-yl)-2-propényl]benzoïque (Rdt = 6%) (composé CB39356) et 17,2 mg d'un solide blanc, l'acide (Z) 4-[1- (3',4'-dihydro-4',4'-diméthyl-1',1'-dioxyde-2'H-1'-benzothiopyran-6'-yl)-2-propényl]benzoïque (composé CB72484) (Rdt = 6 %) Acide (E) 4-[1-(3',4'-dihydro-4',4'-diméthyl1',1'-dioxyde-2'H-1'-benzothiopyran-6'-yl)-2-propényl] benzoïque (composé CB39356) F( C) = 270-274.
RMN1H 200MHz (CDCl3) 1,35 (s, 6H, 2 Me); 2,19 (d, 3H, Me vinylique J 1,0Hz); 2,31-2,37 (m, 2H, -CH2-); 3,30-3,36 (m, 2H, CH2-S); 6,80 (s, 1H, H vinylique); 7,30 (m, 2H, ArH); 7,49 (d, 2H, ArH J 8,3Hz); 7,82 (d, 1H, ArH J 8,1Hz); 7,97 (d, 2H, ArH J 8,3Hz).
MS EI 70 ev (m/z, % intensité) . 370 (M 100%); 338 (30); 337 (43); 44 (74); 40 (45).
MSHR EI 70 ev : Mtr = 370,1257 pour C21H22o4S Mth = 370,1239.
HPLC : Colonne Waters HR C18, 8 x 100 mm, 6 , détecteur W Waters 486 à 300 nm, débit 2,5 ml/min, éluant CH3CN H20 = 50 : 50 + 0,1% de TFA, acide (composé CB39356) tr = 4,52 min 98,8%.
Acide (Z) 4-[1-(3',4'-dihydro-4',4'-diméthyl- 1,1'-dioxyde-2'H-1'-benzothiopyran-6'-yl)-2-propényl] benzoïque (composé CB72484) F( C) = 210.
RMN1H 200MHz (CDCl3) 1,02 (s, 6H, 2 Me); 2,20 (d, 3H, Me vinylique J 1,4Hz); 2,23-2,27 (m, 2H, -CH2-); 3,25-3,31 (m, 2H, CH2-S); 6,52 (s, 1H, H vinylique); 6,82 (d, 1H, ArH J 1,3Hz); 7,03 (dd, 1H, ArH J 8,3Hz J 1,4Hz); 7,24 (d, 2H, ArH J 7,9Hz); 7,67 (d, 1H, ArH J 1,3Hz); 8,03 (d, 2H, ArH J 8,3Hz).
MS EI 70 ev (m/z, % intensité) : 370 (M+, 100%); 338 (10); 337 (44).
MSHR EI 70 ev : Mtr = 370,1265 pour C21H22o4S Mth = 370,1239.
HPLC : Colonne Waters HR C18, 8 x 100 mm, 6 , détecteur W Waters 486 à 260 nm, débit 2,5 ml/min, éluant CH3CN : H2O = 50 50 + 0,1% de TFA, acide (composé CB72484) tr = 5,51 min 97,8%.
Exemple 7 PréDaration du (Z) 5-[4-[1-(3',4'-dihydro- 4',4'-diméthyl-1'.1'-dioxvde-2'H-1'-benzothioDvran-6'- yl)-2-propényl]phényl]-1H-tétrazole (composé CB39122) de formule suivante
A une solution de (Z) 4-[1-(3',4'-dihydro- 4',4'-diméthyl-1',1'-dioxyde-2'H-l'-benzothiopyran-6'- yl)-2-propényl]benzonitrile (0,31 g, 0,90 mmol ) dans du toluène anhydre on additionne successivement de l'oxyde de dibutylétain (30 mg, 0,11 mmol) et de l'azoture de triméthylsilyle (0,24 ml, 1,80 mmol). Le milieu réactionnel est chauffé 15 h à reflux (110 C) sous atmosphère d'argon et agitation magnétique. On purifie par chromatographie éclair sur silice (éluant CH2Cl2 : MeOH = 95 @ 5) pour obtenir 0,16 g d'un solide, le (Z) 5 [4-[1-(3',4'-dihydro-4',4'diméthyl-1',1'-dioxyde-2'H-1'benzothiopyran-6'-yl)-2-propényl]phényl]-lH-tétrazole (composé CB39122) (Rdt = 46%).
Dans cette étape, la quantité d'agent total entrant dans la réaction est telle que le nombre de moles d'agent(s) correspond à une quantité stoechiométrique ou à un excès par rapport aux fonctions carboxyliques libres présentes dans le produit issu du traitement thermique. Par agent total, on entend l'agent s'il est employé seul, ou le mélange de plusieurs d'entre eux, s'ils sont mis en oeuvre en combinaison.
Plus particulièrement, on peut mettre en oeuvre une quantité d'agent telle que l'excès mentionné auparavant est compris entre 5 et 150% molaire, de préférence entre 70 et 130%.
Dans les cas où le traitement chimique est réalisé avec une combinaison d'agents, et dans le cas plus particulier où dans cette combinaison figure le second agent, il est à noter que les quantités en premier, et troisième à cinquième agents sont calculées de préférence, de manière à rendre l'indice d'acide du produit issu de l'étape de traitement thermique, inférieur ou égal à 7, de préférence inférieur ou égal à 5. Quant à la quantité en second agent, elle est habituellement telle qu'elle permet de diminuer ledit indice d'acide à une valeur inférieure ou égale à 1,5, plus particulièrement inférieure ou égale à 1 et de préférence inférieure ou égale à 0,5.
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux de l'invention, rétape de traitement chimique est mise en oeuvre avec au moins un premier agent et au moins un second agent tels que définis auparavant.
Une variante de ce mode particulier consiste à mettre en oeuvre le traitement chimique en présence des deux types d'agents, de façon simultanée.
Selon ce premier mode, la quantité des deux agents employée est telle que le nombre de moles desdits agents correspond au nombre de moles de fonctions acides carboxyliques libres dans le polymère à traiter ou bien en excès par rapport à ce nombre. Plus particulièrement, on peut mettre en oeuvre une quantité des agents telle que l'excès mentionné auparavant soit compris entre 5 et 150% molaire, de préférence entre 70 et 130%.
De préférence, la proportion du premier agent, c'est-à-dire en agent comprenant au moins un hydroxyle libre, par rapport au second est plus élevée que celle en époxyde. II est à noter que la quantité en premier agent est, en général, calculée de manière à rendre l'indice d'acide inférieur ou égal à 7, de préférence inférieur ou égal à 5, et la quantité en second agent correspond, plus particulièrement, à celle nécessaire pour diminuer ledit indice d'acide à une valeur inférieure ou égale à 1,5, plus particulièrement inférieure ou égale à 1 et de préférence inférieure ou égale à 0,5.
Selon une seconde variante du mode de réalisation particulier de l'étape de traitement chimique, on effectue ledit traitement en utilisant successivement le premier puis le second agent. Cette méthode est préférée.
Le second agent est introduit dans le mélange réactionnel à partir du moment où l'indice d'acide est inférieur ou égal à 7, de préférence inférieur ou égal à 5.
Quel que soit l'agent ou les agents employés dans le cadre de cette seconde étape du traitement selon l'invention, ce dernier peut être mis en oeuvre en présence ou en l'absence d'un solvant.
Selon une variante particulièrement avantageuse de la présente invention, le traitement chimique est effectué en présence d'un solvant choisi de telle sorte qu'il forme un azéotrope avec l'eau.
Les solvants classiques conviennent à la mise en oeuvre de cette variante, comme par exemple le toluène, le xylène, le benzène, le mésitylène.
La quantité de solvant mis en jeu dépend de la quantité d'eau à éliminer et peut être déterminée sans difficulté par l'homme du métier. Elle est classiquement inférieure à 10 % en poids du mélange réactionnel.
Cette étape de traitement chimique peut être réalisée en présence ou non d'un catalyseur. De préférence, on emploie un tel composé.
Les catalyseurs sont choisis parmi les composés susceptibles de favoriser des actions d'estérification, qu'ils soient solubles ou non dans le mélange réactionnel.
A titre de catalyseur soluble, on peut citer les composés acides ou basiques. Ainsi, on peut utiliser l'acide paratoluène sulfonique, les acides minéraux comme l'acide sulfurique, I'acide phosphorique. On peut de même utiliser des composés basiques tels que la soude, la potasse, les alcoolates de métaux alcalins ou alcalino-terreux, les sels métalliques.
(a: un pic pour une longueur Li < Lc): il s'agit presque certainement d'une (ou de plusieurs) délétion(s). Cependant, comme nous l'avons noté, il peut s'agir d'un cas où plusieurs pics se trouvent confondus.
Nous verrons qu'il est en général possible de distinguer entre ces deux cas par comparaison avec une sonde correspondant à une zone différente du génome (sonde de référence).
Dans le cas d'une délétion, il est possible d'en déduire la taille par soustraction des deux longueurs restantes de la longueur du clone intact (uniquement dans le cas où le clone recouvre la totalité de la partie délétée du gène). La position par rapport au clone ne peut par contre pas être connue, seules des hybridations supplémentaires avec d'autres clones ou des sousclones pouvant permettre cette détermination.
Cependant le même type d'histogramme peut correspondre à plusieurs délétions, auquel cas il n'est possible que de mesurer la taille totale des délétions (toujours dans l'hypothèse où le clone recouvrirait la totalité de la partie délétée du gène).
Dans les cas où le clone ne recouvre que partiellement le gène, la délétion détectée peut ne représenter qu'une partie de la délétion effective du gène (cf schéma 2a (bl) par exemple).
(b: un pic pour une longueur Ls > Lc): dans ce cas, il s'agit d'une ou de plusieurs duplication(s) à l'intérieur du gène ou à ses extrémités, d'une partie ou de la totalité de celui-ci. Le clone peut recouvrir totalement ou partiellement le gène. I1 peut éventuellement y avoir inversion des séquences, mais ceci ne peut être détecté dans le cas où le clone recouvre totalement le gène. La position de la ou des duplications ne peut être déterminée.