INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La dite application de la préparation s'effectue localement .
Elle est facile à utiliser,une ou deux fois par jour,en appliquant 1 à 2 ml,en massant le cuir chevelu trois à cinq minutes et en insistant sur les endroits chauves.
Quatre à cinq semaines plus tard les résultats des effets bénéfiques de la préparation apparaissent,et c'est avec la pousse de nouveaux cheveux,en continuant le traitement,la quantité des cheveux augmentera sur tous les endroits de la tête et d'une manière régulière.
On a remarqué que les jeunes qui perdent tôt leurs cheveux,et les vieillards qui ne tardent pas d'utiliser le traitement,ont obtenu des résultats rapides et beaucoup de cheveux.
Les matières utilisées dans cette préparation sont naturelles et ne causent aucun symptome secondaires ou d'accoutumance à çe traitement.Il est possible d'ajouter des composés colorants ou parfumés si nécessaire.
CONVERTISSEUR DE FREQUENCE ACCORDABLE L'invention concerne les convertisseurs de fréquences optiques permettant de générer des ondes optiques dans le domaine de l'infrarouge.
De tels convertisseurs sont utilisés dans le domaine de la spectroscopie, par exemple pour la détection de gaz nocifs ou polluants.
De façon générale, les émetteurs d'ondes infrarouges existant à l'heure actuelle appartiennent à l'une des quatre familles suivantes: - les diodes lasers à base de matériaux semiconducteurs à faibles gaps tels que le Pb Sn Se ou le Hg Cd Te.
Ces diodes fonctionnent à basse température. L'accord en fréquence se fait par modification de la température de fonctionnement de la diode. Un tel accord est très difficile à réaliser du fait de la précision requise sur les températures. II est alors nécessaire d'utiliser des cryostats, ce qui est d'un emploi peu pratique. D'autre part, de telles diodes lasers présentent l'inconvénient de ne pas générer de fortes puissances.
- Les lasers à gaz C02.
De tels lasers présentent de nombreux inconvénients.
En particulier, ils ne sont pas accordables continûment puisqu'ils émettent des raies discrètes. Ils sont, d'autre part, très encombrants.
Pour obtenir la sécrétion de la chaîne a de globine, la séquence codant pour le peptide signal de la sporamine A de la patate douce a été fusionnée au premier codon de la chaîne a de globine mature en maintenant la phase ouverte de lecture. La séquence de clivage entre les séquences du peptide signal et de la chaîne a de globine mature est Ser-Val.
La séquence codant pour le peptide signal (PS) de la sporamine A des racines tubérisées de patate douce a été amplifiée par PCR sur le plasmide pMAT103 à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides, WD25 (5' cgcaagcttaaca ATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3') et WD26 (5' tagaattC GGC cGG AGA CAG CAC GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G 3'). L'amorce WD25 apporte le site de restriction HindIII, la séquence aaca favorisant l'initiation de la traduction (Joshi, 1987) et les 6 premiers codons du peptide signal (dont l'ATG initiateur). L'amorce WD26 apporte le site de restriction Ecori, les 5 premiers codons de la séquence codant la chaîne a globine mature (un site de restriction EagI est créé par mutation silencieuse dans le quatrième codon (CCT modifié en Ccg)) et les 7 derniers codons de la séquence du peptide signal.
L'amplification PCR et le traitement des fragments d'ADN amplifiés ont été réalisées comme décrits dans la troisième étape du chapitre II. a. Puis, ces fragments d'ADN ont été digérés doublement par Hindîli et EagI, purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 1,8% et par action du kit "Geneclean II" (BIO101) et clonés aux sites HindIII et EagI du plasmide pBIOC44 déphosphorylé décrit au chapitre II. a. La ligation et la transformation ont été réalisées comme décrites au chapitre I. b. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 100 ssg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Stephen et al., 1990) et analysé par digestion enzymatique. Le clone résultant a été appelé pBIOC60. La séquence nucléotidique de ce gène chimérique résultant de la fusion traductionnelle entre la séquence codant pour le peptide signal et le cDNA codant pour la chaîne a globine mature a été vérifiée par séquençage comme décrit au chapitre I. b.
b. CONSTRUCTION DU PLASMIDE pBIOC61 CONTENANT LE cDNA CODANT POUR LA P GLOBINE POUR LA SECRETION.
Pour obtenir la sécrétion de la chaîne ss de globine, la séquence codant pour le peptide signal de la sporamine A de la patate douce a été fusionnée au premier codon de la chaîne ss de globine mature en maintenant la phase ouverte de lecture. La séquence de clivage entre les séquences du peptide signal et de la chaîne p de globine mature est Ser-Val.
La séquence codant pour le peptide signal (PS) de la sporamine A des racines tubérisées de patate douce a ete amplifiée par PCR sur le plasmide pMAT103 à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides, WD27 (5' gtcattaattaaca ATG AAA GCC TTC ACA CTC GC 3') et WD28 (5' aatgagct C GGC cGA CTT CTC CTC AGG AGT CAG GTG CAC GGA ATG GGC TGG ATT GGG CAG G 3'). L'amorce WD27 apporte le site de restriction PacI, la séquence aaca favorisant l'initiation de la traduction (Joshi, 1987) et les 6 premiers codons du peptide signal (dont 1'ATG initiateur). L'amorce WD28 apporte le site de restriction SacI, les 10 premiers codons de la sequence codant la chaîne ss globine mature (un site EagI est créé par mutation silencieuse dans le neuvième codon (TCT modifié en TCg)) et les 7 derniers codons de la séquence du peptide signal.
L'amplification PCR et le traitement des fragments d'ADN amplifiés ont été réalisés comme décrits dans la troisième étape du chapitre II. a. Puis, ces fragments d'ADN ont été digérés doublement par PacI et EagI, purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 1,8% et par action du kit "Geneclean II" (BIO101) et clonés aux sites PacI et EagI du plasmide pBIOC45 déphosphorylé décrit au chapitre II. b. La ligation et la transformation ont été réalisées comme décrites au chapitre I. b. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 100 ssg/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Stephen et al., 1990) et analysé par digestion enzymatique. Le clone résultant a été appelé pBIOC61.La séquence nucléotidique de ce gène chimérique résultant de la fusion traductionnelle entre la séquence codant pour le peptide signal et le cDNA codant pour la chaîne ss globine mature a été vérifiée par séquençage comme décrit au chapitre I. b.
c. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE DE CO-EXPRESSION pBIOC63 CONTENANT LES cDNA CODANT POUR LES GLOBINES, a ET ss, POUR LA SECRETION.
Le fragment HindIII-EcoRI portant le cDNA codant pour la chaîne a globine pour la sécrétion a été isolé à partir de pBIOC60 décrit au chapitre V. a., et ligué à 1'ADN plasmidique de pBIOC43 doublement digéré par Hindîli et EcoRI, et déphosphorylé comme décrit en II.
a. La ligation et la transformation ont été réalisées comme décrites au chapitre II.c.3 en utilisant la souche E. coli Sure tet.. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 10 pg/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Stephen et al., 1990) et analysé par digestion enzymatique. Le clone résultant a été appelé pBIOC62.
Le fragment PacI-MluI portant le cDNA codant pour la chaîne p globine pour la sécrétion a été isolé à partir de pBIOC61 décrit au chapitre V. b., et ligué à 1'ADN plasmidique de pBIOC62 doublement digéré par PacI et MluI, et déphosphorylé comme décrit en II. a.
La ligation et la transformation ont été réalisées comme décrites au chapitre I. b. L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 10 Mg/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Stephen et al., 1990) et analysé par digestion enzymatique. Le clone résultant a été appelé pBIOC63.
La séquence nucléotidique des cDNA codant pour les chaînes a et p de globine pour la sécrétion a été vérifiée par séquençage comme décrit au chapitre I. b.
L'ADN plasmidique du vecteur binaire pBIOC63 a été introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de Holsters et al. (1978). La validité du clone retenu a été vérifiée par digestion enzymatique de 1'ADN plasmidique introduit.
VI. CONSTRUCTION DES GENES CHIMERIQUES CODANT POUR LE8 CHAINE8 DE GLOBINE, a ET ss, PERMETTANT UNE EXPRESSION DE 1'HEMOGLOBINE HUMAINE RECOMBINANTB DANS LE RETICULUN ENDOPLASMIQUE DES FEUILLES DE TABAC.
La séquence codant pour le signal KDEL (Lys-Asp Glu-Leu) placée à l'extrémité C-terminale des chaînes a et p de globine en amont du codon stop combinée à la présence de la séquence codant pour le peptide signal N-terminal (PS) de la sporamine A des racines tubérisées de patate douce permet un adressage dans le réticulum endoplasmique.
Le dispositif selon l'invention permet de remédier à ces inconvénients. II ne créé pas de contrainte environnementale . La signalisation de la survitesse et du danger subséquent intervient à deux niveaux, assurant ainsi une réelle prévention: -la signalisation de la survitesse du véhicule, au conducteur, au(x) passager(s) et aux passants, par une matérialisation proportionnelle à l'excès. La localisation et la constitution de l'avertisseur garantissant une utilisation sans contrainte, pour les riverains et les conducteurs.
-I'appréciation pour les gestionnaires de la voie de circulation, du danger au point de positionnement de l'avertisseur, par le recensement et l'analyse des données pouvant être collectées par le dispositif, que sont les flux circulatoires et la vitesse unitaire des véhicules.
II comporte en effet selon une première caractéristique (planche 1/3), un boîtier(A) assurant la détection de survitesse considérée, ainsi que la signalisation(c) subséquente en cas de dépassement du seuil fixé, pouvant recevoir un système d'auto-alimentation(D) et intégrer la mesure de vitesse, son enregistrement éventuel et son analyse.
La mesure de vitesse du véhicule est assurée par un cinémomètre utilisant par exemple les techniques ultrasonore, infrarouge, laser, ou résistive.
Le stockage des données est réalisé in situ par une mémoire intégrée, ou assuré hors site, après transmission radio ou par voie téléphonique par exemple, par un système(E) centralisant les informations fournies par un ou plusieurs avertisseur(s) de survitesse.
L'analyse de la mesure est gérée par un dispositif électronique pré-réglé(B), permettant de choisir le seuil de déclenchement de l'avertisseur, ce seuil pouvant être piloté par un dispositif de traitement global(E) indépendant du boîtier de l'avertisseur.
La signalisation est réalisée par un avertisseur(c), placé en hauteur (2,5 à 3 mètres) sur les abords de la chaussée. II garantit la stimulation visuelle du conducteur, en cas de survitesse, par la combinaison d'un mouvement vertical du panneau photosensible du dispositif de l'avertisseur et du scintillement des sources lumineuses.
En référence à la planche ne1/3, le dispositif est composé d'un boîtier(A) qui comporte le capteur assurant la mesure de vitesse du véhicule, le dispositif électronique(B) d'analyse de la mesure de vitesse et l'avertisseur(c) à stimuli visuel illustré planche 2/3 qui assure: -le mouvement vertical des réflecteurs photosensibles (fluorescents(3) et phosphorescents(4) ) du bras mobile(s), dont la fréquence de déplacement est proportionnelle à la vitesse du véhicule. La régulation de la vitesse de rotation du moteur(10) d'entraînement du bras mobile(5) est assurée par le dispositif électronique d'analyse de mesure.Le mouvement du bras(s) est garanti par la transmission du mouvement de rotation induit par le moteur(10) d'entraînement et transformé en mouvement ovoïdal par la joue d'excentration(s), avant d'être transmis en mouvement vertical par la conjonction du mouvement de la bielle articulée autour des axes(7 et 9) et du bras mobile(s) oscillant autour de l'axe (6); -le scintillement synchronisé des flashs ou lampes (blanches(1) pour une visualisation optimale de nuit et rouges(2) pour le jour) dirigés vers les réflecteurs photosensibles du bras mobile, dont la fréquence d'allumage est proportionnée à la vitesse du véhicule, ou constante.
La planche 3/3 diffère de la planche 2/3 du fait que le bras mobile(5) et le réflecteur photosensible, sont protégés en partie supérieure, par un carter intégré au boîtier(12).
le dispositif est, de par sa situation dans l'axe vertical par rapport au véhicule sans incidence sur la visibilité du conducteur et l'incidence sur le comportement des conducteurs peut être appréciée comme une signalisation agissant à l'identique des avertissements humains pratiqués en cas de danger (travaux, accidents, passage, etc...).
Le mouvement dans l'axe vertical, d'un bras muni de réflecteurs photosensibles, dont la fréquence est directement liée à la vitesse enregistrée en amont du système, par le capteur de vitesse, génère une attraction et donc une sollicitation de l'acuité visuelle du conducteur, qui associera instantanément la vitesse de son véhicule à la fréquence de mouvement de l'avertisseur et permettra de l'amener à réflexion sur son comportement.
Le couplage de deux systèmes, voir plus, permet au conducteur d'apprécier l'évolution de son comportement sur une période donnée et les avertisseurs peuvent être couplés sans restriction de nombre sur les détecteurs, afin d'assurer une meilleure signalisation.
Le système peut, afin d'augmenter le stimuli visuel, être pourvu de deux sources lumineuses (une rouge pour le jour et une blanche pour la nuit), intégrées au bras et dirigées sur les capteurs photosensibles, émettant ou non à la fréquence de mouvement.
Le dispositif peut recevoir, en plus des dispositions exposées plus avant, un appareillage de prise de vues.
La situation, en hauteur, de l'avertisseur ne gêne aucunement le trafic, puisque en retrait de la chaussée, limitant ainsi la tentation de dégradations volontaires ou non.
Le système dont la vocation première est l'intégration aux poteaux des feux, éclairage public et autres, peut être placé en applique sur tous supports.
Après 2 renouvellements des milieux de culture, 24 h et 5 jours après la mise en culture, les cellules ont été observées 8 jours après l'inoculation. Le titre de chaque sérum a été calculé selon la méthode de Spearman-Kärber (Finney, 1964).
Résultats Clonage d siqrrence du gène codant pour les protéines de capside A partir do clone pDPV2, une séquence nucléotidique de 2487 nt a pu être établie sur les 2 brins. Elle est représentée dans la figure 2. Les fenêtres de lecture (ORF) de cette séquence sont indiquées sur la figure 3. Dans le premier cadre de lecture, une grande ORF est présente se situant entre les nucléotides 223 et 2430 et correspondant environ aux unités 48 à 90 de
L'alignement de la séquence protéique du DPV avec la séquence partielle du parvovirus de l'oie (GPV), révèle une homologie de 87.5% (figure 5). Plusieurs grandes régions sont similaires entre les 2 séquences (notamment dans des zones où chacune des séquences est très homologue avec l'AAV2). Mais l'extrémité aminée de la VP2 (acides aminés 174 à 188) montre des différences importantes.
Expression des protéines de capside VP2 et VP3 du DPV Le gène codant pour la VP2 qui comporte le codon d'initiation de la traduction de la VP3, a été amplifié par PCR à partir du plasmide pDPV2 précité. L'amplifiat digéré par NcoI a été cloné avec succès dans le vecteur navette pGmAc3MR et le séquençage de l'insert d'un plasmide recombinant (p1 14) ne montrait pas de différence par rapport à la séquence correspondante préalablement établie. Ce plasmide a donc été utilisé avec l'ADN du baculovirus sauvage AcMNPV pour cotransfecter des cellules Sf9. L'analyse du profil de restriction généré par EcoRI à partir de l'ADN de 3 baculovirus recombinants, a prouvé qu'un fragment de la taille attendue avait bien été inséré dans le gène de la polyédrine de chaque baculovirus sauvage. L'un des 3 clones a été utilisé pour exprimer les protéines recombinantes et a été nommé AcDPV114.
L'analyse par Western-blot des protéines d'un extrait cellulaire total a montré 2 bandes d'intensité approximativement semblables qui correspondaient à 2 protéines exprimées et reconnues par le sérum spécifique anti-DPV (Fig. 6). Leur poids moléculaire relatif de 73 et 59 kDa correspondait à celui respectivement de la VP2 et de la VP3 du DPV établi par SDS PAGE (Le Gall - Reculé et Jestin, 1994). Aucune bande de ces mêmes tailles n'a été observée à partir d'extraits cellulaires Sf9 infectés par le baculovirus sauvage.
L'immunofluorescence a confirmé l'expression des protéines par le baculovirus recombinant (AcDPV114) et a révélé une expression au moins transitoire dans le noyau (Fig.
Formation de capsides videspar le baculovinrs recombinant L'observation en microscopie électronique par coloration négative, de préparations purifiées obtenues à partir de cellules Sf9 infectées avec le baculovirus recombinant (AcDPV1 14), a montré la présence d'aggrégats constitués de capsides vides de 22 nm ayant une morphologie et une taille identiques celle des particules virales natives (Fig. 8).
Immunité induite par le baculovirus recombinant Par ELISA, des taux d'anticorps (Ac) moyens à élevés ont été observés chez tous les canards immunisés avec les cellules infectées par le baculovirus recombinant (RB) alors que les canards immunisés avec les cellules infectées par le baculovirus sauvage (WB) n'ont pas répondu, de même que les canards placés en contact (tableau 1). Il n'a pas été constaté d'effet rappel chez les canards RB à l'exception d'un canard ayant reçu des doses inférieures comme mentionné dans le tableau 1. Trois semaines après la 3ème inoculation, les taux d'Ac étaient décroissants chez les canards RB.
Par séroneutralisation, tous les canards RB ont également répondu à l'immunisation, avec des taux d'anticorps moyens comparés au titre de 12.9 (log 2) du sérum positif de référence (résultat non présenté), excepté le canard 86-87 qui présentait, 2 semaines après la 3ème inoculation (temps C), un titre très élevé (tableau 1).
Immunit induitc par le vaccin Parvol Les taux d'Ac présentés par les canards immunisés avec le vaccin Parvol sont mentionnés dans le tableau 2. Le rappel accroît les taux d'anticorps qui sont maximaux 3 semaines après celui-ci.
Analyse des résultats Clonage et séquence du ge codant pour les protéines de capside du DPV Il est établi (Berns, 1990) que le génome des parvovirus de mammifères présente le même type d'organisation : les séquences codantes sont situées dans deux grandes fenêtres de lecture (ORF dont celle de droite (correspondant à l'extrémité 3' du brin de polarité positive) code pour les protéines de capside. Nous avons cherché a cloner un grand fragment d'ADN supposé contenir le gène codant pour les protéines de capside. Un premier clonage avait consisté à cloner le fragment HinalII - Kpnl de 3500 bp qui s'était révélé correspondre à la bonne ORF sur la base des homologies de séquences constatées avec le gène de l'AAV2 codant pour les protéines de capside. Néanmoins le précédent fragment ne comportait pas le gène entier à qui il manquait l'extrémité 3', aucun codon stop n'ayant été observé. C'est pourquoi il a été procédé au clonage présentement décrit utilisant l'enzyme de restriction BglII. Celuici a permis de cloner un fiagment de 2950 bp incluant toute la fenêtre de lecture escomptée.
Cependant il manque la fin du génome en 3', étant donné que les séquences terminales inversées répétées correspondant à l'extrémité palindromique, n'ont pas été observées.
L'analyse des 2487 paires de bases séquencées a mis en évidence une organisation du génome du DPV similaire à celle des parvovirus de mammiferes. En effet seul le brin de polarité positive de la partie de génome étudiée du DPV contient des fenêtres de lecture conséquentes, dont une grande, correspondant à une région codante, située dans le premier cadre de lecture. D'autre part la plupart des motifs d'acides aminés hautement conservés chez les parvovirus, est présente chez le DPV.
L'analyse du degré homologie entre les séquences en acides aminés des protéines de capside des parvovirus du canard et de l'oie (DPV et GPV respectivement) a montré que les deux virus étaient les plus proches parmi les virus considérés. Alors que le DPV fait partie du groupe des parvovirus autonomes puisqu'il n'a pas été mis en évidence de virus helper tels que adenovirus et herpès virus (Jestin et coll., 1991), la séquence de son gène codant pour les protéines de capside a montré une plus forte homologie avec le dependovirus AAV2 qu'avec les parvovirus autonomes de mammifères. Ce résultat confirme les conclusions de Brown et coll., 1995, concernant les parentés entre le parvovirus de l'oie et les adeno-associated virus.
Les différences observées entre les séquences protéiques des parvovirus de l'oie et du canard peuvent constituer, au moins pour partie d'entre elles, le support moléculaire des différences antigéniques déjà mentionnées entre ces deux virus. Elles ont des implications importantes aux plans des applications que ce soit à des fins vaccinales, diagnostiques ou d'immunothérapie.
L'ADN a ensuite été précipité en présence de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugé à 14000g à 4"C pendant 1 heure, lavé à l'éthanol 70%, centrifugé à 14000g à 4 C pendant 10 min., séché, repris dans 10 1Ll de H20. Le fragment d'ADN HindIII-EcoRI a ensuite été cloné aux sites HindIII-EcoRI de 1'ADN plasmidique pJIT163D préalablement déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant.La réaction de ligation a été effectuée dans un volume réactionnel de 20 1 en présence de 1 U de T4 DNA ligase (Gibco-BRL) pour une concentration totale d'ADN de 8,5 nM avec un rapport molaire vecteur/insert de 1 et de 4 ;l de tampon T4 DNA ligase x 5 (Gibco-BRL) à 25OC pendant 16 heures. Les bactéries, E. coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1985). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 100 g/ml ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Stephen et al., 1990) et analysé par digestion enzymatique. Le clone résultant a été appelé pBIOC42.Sa validité a été vérifiée par séquençage à l'aide du kit "Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing" commercialisé par United States Biochemical (USB) selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Les conditions réactionnelles suivent les indications du fabricant excepté pour la dénaturation et l'hybridation. Le milieu réactionnel contenant 1'ADN plasmidique (0,5 à 1 pmoles), l'amorce oligonucléotidique (2 pmoles), 10% de DMSO et le tampon réactionnel x 1 (USB), est incubé à 100vu pendant 10 min., puis refroidi brutalement à - 80'C dans la carboglace.
A partir de pBIOC42, le fragment d'ADN codant pour la cassette d'expression constituée du promoteur pd35S et du terminateur polyA 35S a été isolé par double digestion par SacI et XhoI. I1 a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,75%, puis soumis à l'action du kit "Geneclean Il" commercialisé par BIO101 selon les indications du fabricant. Puis, ce fragment d'ADN a été inséré aux sites SacI et XhoI du plasmide pBCSK+ commercialisé par Stratagene et préalablement déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant.La ligation a été réalisée dans un volume réactionnel de 20 p1 en présence de 1 U de T4 DNA ligase (Gibco-BRL) pour une concentration totale d'ADN de 8,5 nM avec un rapport molaire vecteur/insert de 1 et de 4 Ctl de tampon T4 DNA ligase x 5 (Gibco-BRL) à 254C pendant 16 heures.
Les bactéries, E. coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1985).
L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 30 ;g/ml de chloramphénicol, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Stephen et al., 1990) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC75.