INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les rétro virus et donc les vecteurs rétroviraux initient leur cycle infectieux par la reconnaissance de molécules de surface cellulaire spécifiques, appelées récepteurs rétroviraux, avec des glycoprotéines d'enveloppe exprimées à la surface des particules rétrovirales. Cette reconnaissance aboutit ensuite à la fusion entre les membranes virales et cellulaires, processus complexe et mal connu qui est médié également par une deuxième fonction de la glycoprotéine d'enveloppe.
La possibilité de modifier la spécificité de l'interaction avec la surface de la cellule cible a été antérieurement démontrée, notamment par le biais de modifications génétiques introduites dans la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale.
Un certain nombre de travaux ont montré que de telles modifications n'entraînent pas d'effets perturbateurs dans les processus complexes qui permettent à la glycoprotéine d'enveloppe rétrovirale d'être maturée, exprimée à la surface cellulaire, et incorporée sélectivement dans les virions. De plus, il est maintenant prouvé que ces modifications peuvent entraîner la reconnaissance spécifique de cellules par interaction avec les molécules de surface correspondant à ces polypeptides. Enfin, dans certains cas, cette reconnaissance permet la poursuite du cycle infectieux et l'intégration du transgène dans la cellule ciblée avec, dans le meilleur des cas, une efficacité extrêmement réduite par rapport à l'efficacité que fournit une enveloppe rétrovirale non modifiée via son récepteur rétroviral normal. On en conclut, d'une part, que certaines molécules de surface cibles ne peuvent être utilisées comme récepteur pour initier l'infection et, d'autre part, dans le cas où elles peuvent l'être, les processus consécutifs à l'interaction primaire se font extrêmement peu efficacement. Ces conclusions sont vraies en ce qui concerne les stratégies de "ciblage à une étape", c'est-à-dire d'approches où l'interaction primaire a pour but d'entraîner directement la poursuite du cycle infectieux, sans intervention de procédés auxiliaires.
Les vecteurs rétroviraux sont actuellement les vecteurs les plus utilisés pour le transfert de gène et en particulier pour la thérapie génique, dès lors que l'on recherche une intégration et une expression stable du transgène. D'autres vecteurs de transfert de gène existent (adénovirus-vecteurs, liposomes, vecteurs dérivés du virus de l'herpès, ou encore vecteurs dérivés des AAV), mais ne permettent pas l'intégration stable et efficace du transgène. Si la plupart des protocoles de thérapie génique explorés jusqu'à présent et utilisant les vecteurs rétroviraux sont basés sur l'explantation de cellules du patient, leur transgénèse et expansion in vitro, suivi de leur réimplantation, il serait hautement souhaitable d'être capable de transférer un gène thérapeutique dans le contexte in vivo par le biais de vecteurs rétroviraux. Pour cela, la particule rétrovirale qui véhicule le gène thérapeutique devrait être dotée de certaines caractéristiques supplémentaires, et plus particulièrement, celle de pouvoir reconnaître très spécifiquement les cellules cibles du transfert génétique. En effet, les molécule de surface naturellement reconnues par les rétrovirus pour l'initiation de l'infection sont exprimées très largement sur la plupart des cellules. Ceci n'autorise pas de discrimination précise des cellules dans lesquelles on souhaite effectuer un transfert de gène.
Plusieurs travaux ont eu pour objet la modification du tropisme d'infection des vecteurs rétroviraux. Certains de ces travaux s'appuient sur des modifications biochimiques des particules rétrovirales, d'autres sur des modifications génétiques des glycoprotéines d'enveloppe rétrovirales, ce qui garantit que toutes les particules rétrovirales seront modifiées. Dans ce dernier contexte, les travaux ont consisté en un "ciblage en une étape", pour laquelle la particule virale modifiée se fixe sur la molécule de surface cellulaire ciblée; ceci entraînant la poursuite du cycle infectieux. Cependant, l'efficacité des vecteurs rétroviraux ainsi modifiés est très faible en regard de ce que l'on attend pour obtenir un outil utilisable dans une perspective thérapeutique.
Il est possible que le développement de stratégies de ciblage ne puisse pas aboutir avec le système "à une étape", dues à certaines raison déjà évoquées plus haut inefficacité du processus fusiogénique des glycoprotéines d'enveloppe chimériques après leur liaison sur la molécule de surface ciblée, impossibilité d'utiliser certaines molécules de surface comme récepteurs rétroviraux.
Un certain nombre de protocoles de thérapie génique chez l'homme vont requérir des vecteurs rétroviraux capables d'effectuer un transfert de gène in vivo, par inoculation directe des particules rétrovirales recombinantes. Parmi les améliorations que ceci suppose par rapport aux vecteurs rétroviraux développés jusqu'à présent, on peut citer - l'amélioration des titres infectieux, - I'amélioration de la stabilité des particules virales dans le sérum et plus généralement dans les divers fluides de l'organisme, - la possibilité d'infecter les cellules quiescentes, - la possibilité de discriminer les cellules cibles de la thérapie génique.
les inverses des lois de déviation de la zone centrale 211.
Ainsi la figure 5a illustre le cas o la zone centrale 211 est complétée par deux zones triangulaires 212 et 213
situées latéralement par rapport à la zone centrale.
La zone latérale 212 possède, en projection orthogonale suivant l'axe optique, un contour qui comporte un premier côté vertical confondu avec le bord latéral gauche de la zone centrale, un second côté horizontal situé dans le prolongement du bord inférieur de la zone centrale 211 et dont la longueur est en l'espèce égale à celle dudit bord inférieur, et un troisième côté s'étendant en oblique entre
les extrémités des deux premiers côtés.
La zone latérale 213 présente en projection orthogonale selon l'axe optique un contour ayant la même forme et les mêmes dimensions que le contour de la zone latérale 212, en
étant retourné à 180 par rapport à celui-ci.
Les surfaces réfléchissantes de ces deux zones latérales sont telles que, si elles étaient aboutées l'une à l'autre au niveau de leur hypothénuse, on obtiendrait une surface dont le comportement, en termes de déviation horizontale, serait l'inverse du comportement de la zone centrale, c'est-à-dire que la déviation assurée passerait progressivement, de la gauche vers la droite, de la valeur
c2 à la valeur (l, en passant localement par la valeur a0.
En d'autres termes, ces deux zones aboutées comme défini ci-dessus formeraient une surface de profil horizontal concave inverse du profil horizontal convexe de la zone centrale 211. En revanche, le profil vertical du
pavé est en l'espèce convexe sur toute son étendue.
Les déviations horizontale et verticale obtenues en différents points du pavé 21 sont représentées sur la figure a. De la sorte, les deux zones latérales 212, 213 remplissent ensemble le même champ d'éclairement rectangulaire CE que la zone centrale 211, chacune des zones latérales assurant essentiellement la moitié de ce
remplissage, séparée par une diagonale du champ CE.
Ainsi, l'ensemble du pavé 21 remplit un champ d'éclairement qui, aux écarts près dûs notamment au fait que le source lumineuse n'est en réalité pas ponctuelle, est le
champ rectangulaire CE.
En outre, le pavé 21 engendre, pour l'observateur placé dans le champ CE, deux sources secondaires virtuelles, l'une produite par la zone centrale 211 et l'autre produite soit par la zone latérale 212, soit par la zone latérale 213, selon la position de l'oeil de l'observateur dans le champ CE. Alors que la figure 5a représente un pavé dont les zones latérales 212, 213 couvrent conjointement, en projection, une même aire que la zone centrale 211, cette
Les PV selon l'invention sont, par ailleurs, des biovecteurs, aptes à inclure tout principe actif quelle que soit sa nature hydrophile ou hydrophobe, et à assurer son transport à l'intérieur de l'organisme. Ces PV sont des biovecteurs d'autant plus convenables: - qu'ils sont non immunogènes, biodégradables et exempts de produits toxiques de structuration et/ou de fabrication, et ce même à l'état de traces (solvants, glutaraldéhyde), - et que leur taille (granulométrie) est contrôlable sur une large gamme.
En définitive, les PV sont des microparticules stables et cohésives. Elles ne coalescent pas, à la différence des gouttelettes d'émulsion.
La morphologie de ces PV cohésives selon l'invention, apparaît clairement sur les photographies en Microscopie Electronique à Balayage (MEB) données aux fig. 1 et 2 annexées. La description de ces photogr supérieures ou égales à 3, 9 et 18 mois à des températures de 37 C, ambiante et 4 C respectivement, selon un test a4.
Les tests, al, a2, Oc3, a4, dont il est question supra, sont utiles comme normes de définition dans le cadre du présent exposé. Ces tests sont définis en détail ci-après.
-Test a1 de stabilité des PVà la Iyophilisation réhydratation: Dans un ballon de 500 ml, on prépare 50 ml d'une suspension de PV à 0,2 % en poids, calculé sur la base de la masse de polymère constituant les PV. La phase aqueuse saline tamponnée employée est constituée par du PBS 0,01 M (tampon phosphate, pH 7,4 à 25 C).
Cette solution est ensuite congelée dans de l'azote liquide avant d'être lyophilisée à l'aide d'un dispositif de lyophilisation de marque CHRIST-ALPHA 1-4 en soumettant l'échantillon à une pression de 20 Pa, à une température de - 52 C pendant 48 h.
On hydrate ensuite le lyophilisat ainsi obtenu en le mettant en présence d'un volume de phase aqueuse identique à celle utilisée pour la mise en suspension et représentant 5 ml.
La répartition granulométrique des PV ainsi réhydratées est mesurée par diffraction laser à l'aide d'un COULTER LS 130 selon un modèle de calcul FRAUNHOFER avec "PIDS" Cela permet d'obtenir le D[4,3].
On effectue une même mesure de répartition granulométrique avec détermination du D[4,3] avec la suspension de PV préparée ci-dessus et on compare les D [4,3] obtenus avec et sans lyophilisation/réhydratation.
- Test a2 de stabilité des PV à la centrifugation: On réalise une suspension de PV de la même façon que celle selon le text a, décrit ci-dessus, à la différence près que la concentration des PV dans la suspension est de 2 % en poids au lieu de 0,2 %.
On centrifuge un échantillon de 1,5 ml de la susdite suspension à l'aide d'une centrifugeuse de marque SIGMA 3K30, pendant 10 min à 60 000 g.
L'échantillon est agité manuellement pour remettre en suspension les PV, après centrifugation.
On réalise les mesures granulométriques (D[4,3]) comme décrit dans le test a, ci dessus. On compare les D[4,3] obtenus avant et après centrifugation.
- Test a3 de résistance au pH des PV: On introduit 0,5 ml de suspension de PV à 2 % (concentration exprimée de la même facon que celle donnée au test al) dans 5 ml d'une solution d'HCI titrant 10-2 N (pH 2).
On stocke une journée à température ambiante.
La suspension est neutralisée par introduction de 50 Cll de soude 1 N. On complète à 10 ml avec une solution saline tampon phosphate (PBS), pH 7,4.
MOAPRO, MOA#PRO correspondent à des enveloppes ciblant Rec-1.
EMOPRO, EMOPROss, EMOPRO+, EAPRO, EAPRO13, EAPRO+, EMOAPRO, EMO#PROss, EMOAPRO +, EAAPRO, EASPROss, EAAPRO + correspondent à des enveloppes ciblant EGFR.
L'invention a également pour objet une séquence polypeptidique contenant un peptide d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement d'environ 20, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 1800 ("ss-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type ss ("polyproline ss-turn helix"), - un domaine protéique N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible de réagir avec un récepteur approprié (récepteur ciblé) situé sur une cellule eucaryote, lequel domaine protéique permet de lier spécifiquement une particule (rétro)virale recombinante contenant ledit domaine protéique N-terminal et - un domaine protéique C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec un récepteur (rétro)viral auxiliaire approprié (récepteur (rétro)viral) situé sur ladite cellule eucaryote, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans ladite cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de ladite particule (rétro)virale recombinante dans ladite cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec ladite particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de démasquage ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique N-terminal (amont), se produit un mécanisme de masquage ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante susceptible d'infecter une cellule eucaryote, laquelle cellule comporte un récepteur ciblé et un récepteur auxiliaire de la susdite particule (rétro)virale, comprenant une glycoprotéine d'enveloppe substantiellement intacte, notamment sous forme polymérique et avantageusement sous forme trimérique, chaque monomère de la forme polymérique étant avantageusement lui-même sous forme hétérodimère, contenant un peptide d'environ 10 à environ 200, notamment d'environ 15 à environ 150 acides aminés, et avantageusement d'environ 20, dans lequel 30% au moins des acides aminés sont constitués par des résidus proline, lesquels résidus proline sont régulièrement agencés de manière à induire des repliements de la chaîne polypeptidique à environ 1800 ("p-turn" ou "reverse-turn"), ces repliements étant régulièrement espacés et s'assemblant en une hélice polyproline à repliement de type ss ("polyproline p-turn helix"), - un domaine protéique du côté N-terminal (en amont) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur ciblé, lequel domaine peptidique permet de lier spécifiquement la particule (rétro)virale et - un domaine protéique du côté C-terminal (en aval) du susdit peptide, susceptible d'interagir avec le susdit récepteur (rétro)viral, laquelle interaction joue le rôle de mécanisme auxiliaire d'entrée de la particule (rétro)virale dans la cellule eucaryote, le processus d'entrée cellulaire de la particule (rétro)virale recombinante dans la cellule eucaryote par le biais du domaine protéique C-terminal (aval) ne pouvant avoir lieu que lorsque le domaine protéique N-terminal (amont) a reconnu et lié le récepteur ciblé de la cellule eucaryote avec la particule (rétro)virale recombinante, entraînant par l'intermédiaire du susdit peptide un mécanisme de masquage ou encore d'accessibilité du récepteur (rétro)viral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval), et, dans le cas où il n'y a pas reconnaissance entre la particule virale recombinante et le récepteur ciblé de la cellule eucaryote par le biais du do ou encore de non accessibilité, par l'intermédiaire du susdit peptide, du récepteur rétroviral vis-à-vis du domaine protéique C-terminal (aval).
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants - anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire, - tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance.
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que le domaine protéique C-terminal (aval) correspond à un polypeptide d'origine (rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des rétrovirus MLV A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5).
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe de rétrovirus de type C, et en ce que le peptide provient avantageusement d'un virus choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1, GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV : Feline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A), PRO(MoMLV), APRO, PRO+, APRO+, PRO13, PRO13.
L'invention a également pour objet une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que - le peptide provient de la glycoprotéine d'enveloppe des rétrovirus de type C, et en ce que le virus est avantageusement choisi parmi : le virus MLV écotrope, le virus MLV amphotrope, le virus MLV xénotrope, le virus MLV MCF, le virus MLV 10A1, GALV (Gibbon Ape Leukemia Virus), SSAV (Simian Sarcoma Associated Virus), FeLV A, FeLV B, FeLV C (FeLV: Feline Leukemia Virus), et notamment en ce que le peptide est choisi parmi ceux contenant ou étant constitués par l'une des séquences suivantes : PRO (4070A), PRO(MoMLV), APRO, PRO+, APRO+, PRO13, APRO13, - le domaine protéique N-terminal (amont) est choisi parmi les peptides suivants: * anticorps monobrin reconnaissant des molécules de surface cellulaire, * tout ligand pour une molécule de surface cellulaire, notamment hormones polypeptidiques, cytokine, facteurs de croissance, - le domaine protéique C-terminal correspond à un polypeptide d'origine (rétro)virale comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage dont dérive la glycoprotéine d'enveloppe portée par la particule (rétro)virale recombinante, et peut provenir des domaines naturels comportant les fonctions de liaison, de fusion et d'ancrage des glycoprotéines d'enveloppe issues des rétrovirus MLV-A, GALV, FeLVB, ou des virus tels que adénovirus, herpès virus, virus AAV (Adeno Associated Virus), ou plus généralement de glycoprotéines virales issues de virus d'origine eucaryote, notamment orthomyxovirus (tel que virus influenza) ou paramyxovirus (tel que SV5).
L'invention concerne également une particule (rétro)virale recombinante caractérisée en ce que l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique N-terminal (amont) est contiguë à l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide signal, l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique N-terminal (amont) est contiguë à l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide, l'extrémité 3' de la séquence nucléotidique codant pour le peptide est contiguë à l'extrémité 5' de la séquence nucléotidique codant pour le domaine protéique C-terminal (aval).
L'invention a également pour objet un acide nucléique codant pour un peptide ou pour une particule recombinante selon l'invention.
L'invention a également pour objet une méthode de transfert sélective in vitro ou ex vivo d'un acide nucléique dans des cellules eucaryotes cibles présentes parmi d'autres cellules non-cibles, comprenant l'administration aux cellules cibles et non-cibles d'une particule recombinante (rétro)virale selon l'invention, contenant l'acide nucléique à transférer.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique contenant à titre de substance active une particule (rétro)virale selon l'invention, et contenant également un gène à transférer, en association avec un véhicule pharmaceutique physiologiquement approprié.
S'agissant des gènes à transférer importants pour la thérapie génique, il s'agit par exemple de IFN, IL2, p53, VEGF, TNF, CFTR, HSV-TK, lacZ, GFP, gène de cytokines diverses, autres types de gènes suicides y compris gènes de suicide conditionnels, autres gènes à activité antivirale, autres gènes à activité antitumorale, autres gènes marqueurs et tout gène thérapeutique de maladie mono- ou multi-génique. A titre d'exemple, les pathologies les plus spécifiquement concernées sont : la plupart des maladies mono- ou multigénique (mucovisidose, myopathie, maladies lysosomales, les formes diverses de cancer, les maladies virales (SIDA), ...).
Pour bien comprendre le mécanisme de l'invention (voir figure 1), il faut considérer que les glycoprotéines d'enveloppe selon l'invention (également désignées par "enveloppes chimères") possèdent, outre un domaine de reconnaissance additionnel, les fonctions correspondant à leurs domaines propres ; c'est-à-dire (voir figure 2), 1) le domaine de liaison naturel situé dans la partie N-terminale de la sousunité de surface (SU) de la glycoprotéine d'enveloppe sauvage, et donc, juste en aval du domaine de liaison surnuméraire et 2) le domaine de fusion localisé dans la partie C-terminale de la sous-unité (SU) et dans la sous-unité transmembranaire (TM) du complexe de glycoprotéine d'enveloppe. Pour les enveloppes chimères construites précédemment (enveloppes EMO et AMO, par exemple) en s'appuyant sur la structure générale schématisée en Figure 2, le domaine de liaison naturel est fonctionnel. Si le récepteur rétroviral qu'il reconnaît est exprimé à la surface de la cellule cible, alors ce domaine le reconnaîtra, et permettra le poursuite de l'infection. Il n'y aura alors pas de possibilité de ciblage spécifique, même si une molécule de surface reconnaissant spécifiquement le domaine de liaison surnuméraire est aussi exprimée.
Cependant, en fonction du peptide inséré entre le domaine de liaison surnuméraire et le domaine de liaison naturel, il est possible de moduler fortement la fonctionnalité du domaine de liaison naturel et, dans le cas de certains de ces peptides, d'empêcher efficacement son accessibilité pour la reconnaissance du récepteur rétroviral (première action). Ce même domaine pourra être démasqué, et donc devenir accessible à une interaction avec le récepteur rétroviral normal, si et seulement si le domaine de liaison surnuméraire a préalablement interagi avec la molécule de surface ciblée. Cette deuxième action est également médiée par le peptide séparant les deux domaines. Le récepteur rétroviral normal joue ici le rôle de molécule auxiliaire.
Légende des figures - la Figure 1 représente le processus d'entrée en deux étapes de la particule virale ciblante. Les particules virales sont générées (A) avec des glycoprotéines d'enveloppes ciblantes composées d'un domaine N-terminal (ligand, anticorps monobrin, etc), du peptide masquant/démasquant, et d'un domaine C-terminal (B). Les étapes donnant lieu à l'introduction du virion dans la cellule ciblée font intervenir un mécanisme coordonné par le peptide masquant/démasquant (C).
En général, le polymère est introduit dans le mélange de ciment en telle quantité que sa teneur est de 5 à 30 parties en poids pour 100 parties en poids de phase liante, de préférence entre 10 et 20.
Selon un mode préféré de l'invention, le ciment est susceptible d'être obtenu par mise en contact de la phase liante précédemment décrite avec au moins un polymère insoluble dans l'eau et en outre au moins un second additif choisi parmi les aminoalkylsilanes, et de l'eau.