INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Dans le mode d'enroulement en hélice avec un angle d'hélice constant, correspondant à l'exemple de réalisation des figures 1 à 3 ou dans le mode d'enroulement de type "S-Z" correspondant à l'exemple de réalisation des figures 4 et 5, on dispose avantageusement un ruban adhésif enroulé en spirale autour des conduites périphériques et des organes flexibles de transmission d'effort d'écrasement pour maintenir ces derniers dans une position concentrique adéquate par rapport à la conduite centrale 2, et l'on dispose avantageusement un ruban réalisé en un matériau connu pour ses propriétés d'anti-adhérence tel que du polytétrafluoroéthylène ou du "TERFANE" entre le ruban adhésif précité et les conduites périphériques, de manière à permettre un glissement axial relatif des conduites périphériques par rapport aux organes flexibles de transmission d'effort d'écrasement.
Lorsqu'une conduite périphérique tel qu'un câble 4 par exemple présente un diamètre externe d inférieur à la dimension radiale E de l'espace annulaire entre la conduite centrale 2 et la surface interne de l'enveloppe 8, on dispose de préférence comme représenté sur la figure 10 le câble 4 (ou en variante une conduite 3) dans une gorge 11 s'ouvrant sur la conduite centrale 2.
Dans l'exemple de réalisation représente sur la figure 10, la gorge 11 est formée entre deux organes de transmission d'effort d'écrasement 5b ménageant un jeu latéral v entre eux et un jeu p radial avec le câble 4 (ou en variante une conduite 3) . De préférence, le jeu v est inférieur à la moitié du jeu p.
En variante, lorsqu'une conduite périphérique sensible à l'écrasement 3 (ou en variante un câble 4) presente un diamètre externe d inférieur à la dimension radiale E de l'espace annulaire entre la conduite centrale 2 et la surface interne de l'enveloppe 8, cette conduite périphérique 3 (ou en variante ce câble 4) est avantageusement, comme représenté sur la figure 11, disposé dans une gorge 12 formée dans un organe flexible de transmission d'effort d'écrasement 5c s'ouvrant sur la conduite centrale 2. La gorge 12 est conformée de manière à loger la conduite 3 (ou en variante le câble 4) avec un jeu q.
On a représenté sur la figure 12 une canalisation flexible 1" comportant des conduites périphériques 3a sensibles à l'écrasement, similaires aux conduites périphériques 3 des exemples de réalisation précédents, et des tuyaux 3b relativement rigides, par exemple du même type que la conduite centrale 2 ou éventuellement des tubes métalliques ou câbles.Dans le cas où les tuyaux 3b peuvent assurer la transmission des efforts d'écrasement, il n'est pas nécessaire que la région de l'espace annulaire compris entre une conduite périphérique 3a et un tuyau 36 adjacent suffisamment proche soit remplie par un organe flexible de transmission d'effort d'écrasement 5 tel que décrit précédemment et l'on peut se contenter pour remplir cet espace d'utiliser un matériau de remplissage ne présentant pas une dureté particulière, par exemple une matière élastomère de dureté Shore D inférieure à 30 dans le cas où l'entraxe entre le tuyau 3b et la conduite périphérique adjacente 3a est inférieure ou égale à 1,5 fois le diamètre externe de la conduite périphérique.
On a représenté sur la figure 13 une canalisation 1"' comportant une conduite centrale 2 servant de ligne de production, une pluralité de conduites périphériques 28 servant de ligne de service, et deux ombilicaux de commande 13 et 14 disposés dans l'espace annulaire entre l'enveloppe et la conduite centrale 2. Les conduites périphériques 28 et les ombilicaux 13,14 sont séparés par des organes flexibles de transmission d'effort d'écrasement 5 tels que décrits précédemment.
L'enveloppe comporte une gaine de plastique 8a interne, une armure constituée par deux nappes croisées de fils métalliques 8b et une gaine plastique externe 8c.
La résistance aux efforts d'écrasement d'une conduite peut être caractérisée par une raideur, évaluée en mesurant la masse à appliquer entre deux plateaux parallèles enserrant un mètre de conduite pour aboutir à une déformation radiale égale à 1 % . Dans le cas de la conduite centrale 2, cette raideur est avantageusement supérieure ou égale à 5t/m/%. La résistance à l'écrasement des conduites sensibles à l'écrasement peut être caractérisée par une raideur inferieure à 0,5 t/m/% et le plus souvent inférieure à 0,2 t/m/%. La raideur nécessaire à une canalisation pour supporter les efforts d'écrasement dus aux moyens de pose et de manutention (dispositifs tensionneurs à chenilles, bobines de stockage, goulottes etc...) est typiquement supérieure à 0,5 t/m/% et le plus souvent supérieure à lt/m/%.
On a représenté sur la figure 14 une canalisation 1"" dans laquelle l'enveloppe 8 est constituée d'une couche unique en polyamide PAll d'épaisseur 5,2mm. Le diamètre extérieur des conduites périphériques, du type "SYNFLEX" vaut 16 mm et leur diamètre intérieur 9,5 mm (3/8in). Chaque organe flexible 5 de transmission d'effort d'écrasement est réalisé en polyéthylène haute densité "LUPOLEN" et présente en section transversale la forme représentée sur la figure 15. La surface radialement interne 20 de l'organe flexible 5 présente un rayon de courbure égal dans l'exemple décrit à 58,9 mm. La dimension radiale E vaut 16,5 mm et la distance entre les flancs 21 vaut 21,5 mm. La distance entre les extrémités latérales de la surface radialement externe 22 vaut 37,5 mm.La conduite centrale 2 est une conduite réalisée par la société déposante, de type "COFLEXIP", de diamètre interne égal à 63,5 mm (2,5") et de diamètre externe égal à 108,9 mm, cette conduite résistant à une pression interne de 6350 PSI (438 Bar).
A titre indicatif, on a mesuré les résultats expérimentaux suivants, pour cette canalisation et pour une charge appliquée de 28,83 T/m Structure testée déformation % raideur T/m/% canalisation 14 2,05 conduite centrale "COFLEXIP" 0,99 29,12 conduite périphérique "SYNFLEX" 14 0,121 Grâce à l'invention, on peut réaliser une canalisation à conduites multiples présentant une conduite centrale résistant à l'écrasement et à la traction, de diamètre externe important, et des câbles électriques et/ou optiques enroules autour de cette conduite centrale sans que ces derniers ne cassent lorsque la canalisation est mise en flexion, malgré leur éloignement de l'axe central de la canalisation.
Bien entendu, l'invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent d'être décrits.
Plus particulièrement, la séquence hétérologue peut être une séquence codant pour une enzyme, un dérivé sanguin, une hormone, une lymphokine (interleukines, interférons, INF etc..), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs, la protéine CFTR associée à la mucoviscidose, la thymidine kinase, la cytosine déaminase. Il peut s'agir d'une protéine antigénique capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire.
La séquence hétérologue peut aussi donner lieu, après transcription, à une séquence antisense ou à un ribozyme.
Il est également possible d'utiliser des séquences hétérologues codant pour des marqueurs cellulaires. Ces séquences peuvent être employées seules ou en association avec une autre séquence hétérologue.
Selon une variante de l'invention, il est possible d'inclure dans l'unité de transcription "vecteur", une partie du gène rétroviral gag pour améliorer l'encapsidation du transcrit. Il s'agit normalement d'un fragment d'environ 600 nucléotides à partir du codon initiateur de gag.
Pour cette unité de transcription, les séquences régulatrices de la transcription peuvent être celles présentes au sein des LTR rétroviraux ou peuvent etre apportées par d'autres séquences. Il est donc possible d'inclure tout autre promoteur, fort, constitutive, spécifique de tissu ou inductible, à condition d'être fonctionnel dans la cellule hôte.
Il est néanmoins important d'inclure dans cette unité de transcription toutes les séquences rétrovirales permettant l'encapsidation, la rétrotranscription et l'intégration. Ces séquences se trouvent en partie au sein des LTR. D'autres séquences qui se trouvent le long du génome rétroviral sont aussi indispensables pour 1 'encapsidation (signaux appelés "g") et la rétrotranscription.
Les séquences rétrovirales mises en oeuvre dans les vecteurs de la présente invention proviennent d'un ou plusieurs rétrovirus, par exemple MoMLV, RD114, BaEV, MLV-A ; des rétrovirus de mammifères de type D, par exemple MPMV, SRV ; Spuma rétrovirus, par exemple HFV ; HIV, SIV, ASLV.
Les caractéristiques d'enveloppe, et donc le spectre d'hôtes cellulaires, sont largement déterminées par la nature de Env. Selon l'invention, il est possible de choisir l'origine de Env pour obtenir les caractéristiques souhaitées. Gag, Pol et Env peuvent provenir du même rétrovirus, par exemple MoMLV. Dans ce cas, l'enveloppe du vecteur rétroviral est écotrope. Le gène Env du virus MoMLV peut être remplacé aisément par tous les gènes Env des virus mammifères de type C (amphotrope, xénotrope, RD114) ou encore par le gène Env d'autres rétrovirus non apparentés, incluant le virus HIV, ou encore par des gènes codant pour des enveloppes non-rétrovirales, par exemple VSV-G. Il en va de même pour les gènes Gag Pol. Ceci permet au système de s'adapter aisément & BR< une grande diversité de situations rencontrées dans les applications potentielles.
Pour le traitement de maladies d'origine rétrovirale telle que le SIDA, il est possible d'utiliser Gag, Pol et Env du rétrovirus en question, par exemple HIV, afin que le vecteur rétroviral atteigne les cellules infectées. Le choix appropriée de virus à ADN comme vecteur viral, et le choix d'éléments rétroviraux, confère une très grande souplesse au système de transfert de gène de 1' invention.
Le type de cellule susceptible d'être infectée par les vecteurs de l'invention varie selon le choix du vecteur viral. Normalement, il s'agit d'une cellule de vertébré, plus particulièrement de mammifère, par exemple des cellules de lignéage hématopoïétiques, cellules souches y compris des cellules souches fibroblastiques, épithéliales, hématopoïétiques et nerveuses, ou des cellules différenciées d'origine ectodermique, mésodermique ou endodermique.
La production de vecteurs rétroviraux selon l'invention peut avoir lieu in vivo ou in vitro. Pour la production in vivo et in vitro, on introduit dans la cellule eucaryote à la fois un composant rétroviral vecteur et un composant rétroviral transcomplémentant, ces différents composants rétroviraux étant compris, soit dans les génomes de deux vecteurs viraux différents, soit dans le génome d'un seul vecteur viral.
Si les composants rétroviraux sont compris dans le même vecteur viral, il est recommandé d'utiliser, pour la construction du vecteur viral, un virus à ADN de grande taille, par exemple un virus herpétique ou un poxvirus. Selon cette variante, le vecteur viral est de préférence de type "virus recombinant" et non pas de type "plasmide encapsidé" (souvent appelé "amplicon").
In vitro, il est possible de mettre en oeuvre un autre protocole selon lequel l'on introduit dans la cellule eucaryote un seul composant rétroviral contenu dans un vecteur viral et choisi parmi le composant vecteur ou le composant transcomplémentant, la cellule eucaryote ayant déjà, intégré dans son génome, l'autre des deux composants. Cette variante de l'invention met donc en oeuvre des cellules eucaryotes apportant elles-mêmes le composant complémentaire.
Le procédé in vitro comprend normalement une étape de récupération, et éventuellement de purification, des vecteurs rétroviraux ainsi obtenus.
La purification peut être faite par exemple par filtrage du surnageant des cellules, le filtre laissant passer les vecteurs et retenant tout le matériel indésirable.
Outre le procédé de production de vecteurs rétroviraux, l'invention vise également les molécules d'ADN utilisées pour la construction des vecteurs viraux et les vecteurs viraux et rétroviraux ainsi obtenus.
Après élimination du surnageant, le culot sédimenté est repris dans un petit volume de PBS et constitue la fraction de virions concentrés, mais non purifiés. Cet échantillon viral concentré mais non purifié a été utilisé pour effectuer une réaction dite de transcription inverse endogène, telle que décrite ci-après.
- Réaction de transcriptase inverse endogène : Un volume de 200ss1 de virions purifiés selon le protocole décrit ci-dessus et contenant une activité transcriptase inverse d'environ 1-5 million de DPM (désintégrations par minute) est décongelé à 37"C jusqu'à apparition d'une phase liquide, puis placé sur de la glace. Un tampon 5 fois concentré a été préparé avec les composants suivants : Tris-HCl pH 8.2, 500 mM; NaCl 75 mM; MgCl2 25 mM; DTT 75 mM et NP 40 0.10 %.A 100 pl de ce tampon ont été ajoutés : 25 l d'une solution de dATP 100 mM, 25 l d'une solution de dTTP 100 mM, 25 ssl d'une solution de dGTP 100 mM, 25 pl d'une solution de dCTP 100 mM, 100 Al d'eau distillée stérile et 200 pl de la suspension de virions (activité transcriptase inverse de 5 millions de DPM) dans le PBS ont été mélangés et incubés à 420C pendant 3 heures. Après cette incubation le mélange réactionnel est directement mélangé avec un mélange tamponné phénol/chloroforme/alcool isoamylique (Sigma ref.
P 3803), la phase aqueuse est collectée et un volume d'eau distillée stérile est ajouté à la phase organique pour réextraire le matériel nucléique résiduel. Les phases aqueuses collectées sont regroupées et les acides nucléiques contenus sont précipités par addition d'acétate de sodium 3M pH 5,2 au 1/10 de volume + 2 volumes d'éthanol + 1 pl de glycogène (Boehringer-Mannheim ref.
901 393) et mise à -200C de l'échantillon pendant 4 h ou la nuit à +40C. Le précipité obtenu après centrifugation est ensuite lavé avec de l'éthanol à 70 % et resuspendu dans 60 ml d'eau distillée. Les produits de cette réaction ont ensuite été purifiés, clonés et séquencés selon les protocole décrit ci-après.
- Clonage et séquençage des fragments d'ADN recueillis Des ADN bouts francs avec des adénines nonappariées aux extrémités ont été générés : une réaction de "remplissage" a d'abord été effectuée : 25 pl de la solution d'ADN précédemment purifiée ont été mélangés avec : 2 pl d'une solution 2,5 mM contenant, en quantité équimolaire, dATP + dGTP + dTTP + dCTP / 1 pl d'ADN polymerase T4 (Boehringer-Mannheim ref. 1004 786) / 5 Al de 10X "incubation buffer for restriction enzyme" (Boehringer-Mannheim ref. 1417 975) 1 1 pl d'une solution à 1 % de sérum-albumine bovine / 16 pl d'eau distillée stérile.Ce mélange a été incubé 20 minutes à 11 C. 50 l de tampon TE ( Tris-EDTA) et 1 l de glycogène (Boehringer Mannheim ref. 901 393) y ont été ajoutés avant extraction des acides nucléiques avec du phénol/chloroforme/alcool isoamylique (Sigma ref. P 3803), et précipitation à l'acétate de sodium comme décrit précédemment. L'ADN précipité après centrifugation est resuspendu dans 10 l de tampon 10 mM Tris pH 7.5. Puis, 5 pl de cette suspens ion ont été mélangés avec 20 l de tampon Taq 5 fois concentré , 20 pl de 5 mM dATP, 1 Zl (5U) de Taq ADN polymerase (AmplitaqTM) et 54 l d'eau distillée stérile.
Ce mélange est incubé 2 h à 750C avec un film d'huile à la surface de la solution. L'ADN en suspension dans la solution aqueuse prélevée en dessous du film d'huile après incubation est précipité comme décrit précédemment et resuspendu dans 2 pl d'eau distillée stérile. L'ADN obtenu a été inséré dans un plasmide à l'aide du kit TA Cloningm. Les 2 pl de solution d'ADN ont été mélangés avec 5 l d'eau distillée stérile, 1 l d'un tampon de ligation 10 fois concentré "10X LIGATION BUFFER", 2 l de "pCRTM VECTOR" (25 ng/ml) et 1 pl de "TA DNA LIGASE". Ce mélange a été incubé une nuit à 120C.Les étapes suivantes ont été réalisées conformément aux instructions données dans le kit TA Clonings (British Biotechnology). A la fin de la procédure, les colonies blanches de bactéries recombinantes (white) ont été repiquées pour être cultivées et permettre l'extraction des plasmides incorporés selon la procédure dite de "miniprep" (Sambrook J., Fritsch E.F., et Maniatis T., Molecular cloning, a laboratory manual. Cold spring harbor laboratory press, 1989). La préparation de plasmide de chaque colonie recombinante a été coupée par une enzyme de restriction appropriée et analysée sur gel d'agarose.Les plasmides possédant un insert détecté sous lumière W après marquage du gel au bromure d'éthidium, ont été sélectionnés pour le séquençage de l'insert, après hybridation avec une amorce complémentaire du promoteur Sp6 présent sur le plasmide de clonage du TA cloning kit. La réaction préalable au séquençage a ensuite été effectuée selon la méthode préconisée pour l'utilisation du kit de séquençage "Prism ready reaction kit dye deoxyterminator cycle sequencing kit" (Applied Biosystems, ref. 401384) et le séquençage automatique a été réalisé avec l'appareil "automatic sequencer", modèle 373 A Applied Biosystems selon les instructions du fabricant.
- Analyse des séquences clonées L'analyse discriminante sur les banques de données informatiques des séquences clonées à partir des fragments d'ADN présents dans le mélange réactionnel a permis de mettre en évidence trois catégories de séquences : la première correspondait à des séquences totalement inconnues dans les banques de données et sans aucune parenté avec des gènes décrits. La seconde, correspondait à des séquences totalement homologues à des portions de gènes cellulaires connus. La troisième correspondait à des séquences présentant des homologies partielles plus ou moins importantes avec des séquences connues de rétrovirus ou d'éléments génétiques rétrotransposables comme les rétroposons ou rétrotransposons.
L'origine des séquences de la première catégorie est difficile à définir alors que pour la seconde, elle s'explique par la présence attendue de fragments d'ADN cellulaire contaminant la fraction d'acides nucléiques extraits de lechantillon viral concentré mais non purifié, après incubation dans les conditions requises pour la réaction de transcription inverse endogène sus-mentionnée.
L'origine des séquences de la troisième catégorie est manifestement rétrovirale ou de type rétroviral. Il est connu que des séquences rétrovirales endogènes apparentées à un rétrovirus réplicatif, ou co-exprimées dans une même cellule infectée, peuvent être encapsidées dans les virions générés par une soucie rétrovirale donnée (Linial M.L. and Miller A.D. dans "Current topics in microbiology and immunobiology. Retroviruses, stratégies of replication" vol. 157, p. 125-152; Swanstrom R. et Vogt P.K. éditeurs, Springer-Verlag, Heidelberg 1990) et la présence de certaines séquences de type rétroviral peut s'expliquer par ce phénomène.
Cependant, parmi les séquences de cette catégorie, une séquence a été retrouvée le plus fréquemment et s'est avérée représenter la majorité des clones obtenus dans ces conditions à partir de 1'isolat viral "POL-2" issu de la culture de la lignée PLI-2 entre le quarantième et le soixantième passage en culture après établissement de la lignée continue selon le principe décrit dans le brevet nOWO 93/20188 précédemment cité. Le clone correspondant PSJ17 a été entièrement séquencé et la séquence obtenue, présentée dans la figure 6(SEQ ID NOS) a été analysée à l'aide du logiciel "GeneworksX" sur les banques de données actualisées "Genebanke". L'analyse des banques de données n'a pas permis de trouver de séquence identique déjà décrite.Seule une homologie partielle a pu être retrouvée avec certains éléments rétroviraux connus. L'homologie relative la plus intéressante concerne un rétrovirus endogène dénommé ERV-9, ou HSERV-9, selon les références (La Mantia et coll. Nucleic Acids Research 1991 ; 19, 1513-1520). Ainsi la séquence du clone PSJ17 a pu être localisée dans la région pol codant pour la transcriptase inverse d'un rétrovirus, ou encore d'un virus possédant une enzyme avec une activité transcriptase inverse, par alignement avec la séquence décrite pour HSERV-9.
EXEMPLE 5 : OBTENTION DE CLONES, DEFINISSANT UNE FAMILLE MSRV-2A, PAR AMPLIFICATION DES REGIONS POL CONSERVEES DES RETROVIRUS SUR UNE PREPARATION DE VIRION ISSUE DE LA LIGNEE LM7.
L'approche moléculaire a consisté à utiliser une technique PCR permettant d'amplifier une région relativement conservée du gène pol des rétrovirus exogènes et endogènes, mais aussi des virus codant pour une enzyme à activité transcriptase inverse tels que notamment le virus de l'hépatite B, qui a été publiée par Shih et coll. (Shih A., Misra R., and Rush M.G. Detection of multiple, novel reverse transcriptase coding sequences in human nucleic acids : relation to primate retroviruses. J. Virol. 1989 ; 63, 64-75). Cette technique a été utilisée sur l'ARN extrait d'une préparation de virions purifiés, obtenus selon le protocole décrit ci-après, à partir des surnageants de la culture LM7 d'origine (Perron et coll.
Res. Virol. 1989 ; 140, 551-561) gardés congelés à -8O0C depuis lors : les surnageants de cultures sont collectés deux fois par semaine, pré-centrifugés à 10 000 tpm pendant 30 minutes pour éliminer les débris cellulaires, et ensuite congelés à -800C ou utilisés tels que pour les étapes suivantes.
Les surnageants frais ou décongelés sont centrifugés sur un coussin de PBS-glycérol 30 % à 100 000g (ou 30 000 tpm dans un rotor LKB-HITACHI de type 45 T) pendant 2 h à 40C. Après élimination du surnageant, le culot sédimenté est repris dans un petit volume de PBS et constitue la fraction de virions concentrés, mais non purifiés. Le virus concentré est ensuite déposé sur un gradient de sucrose dans un tampon PBS stérile (15 à 50 % poids/poids) et ultracentrifugé à 35 000 tpm (100 OO0g) pendant 12 h à +40C dans un rotor à godets. 10 fractions sont recueillies et 20 pl sont prélevés dans chaque fraction après homogénéisation pour y doser l'activité transcriptase inverse selon la technique décrite par H.
Perron et coll. (Res. Virol. 1989 ; 140, 551-561). Les fractions contenant le pic d'activité RT de type LM7 sont ensuite diluées dans du tampon PBS stérile et ultracentrifugées une heure à 35 000 tpm (1 000 000 g) pour sédimenter les particules virales. Le culot de virions purifiés ainsi obtenu est alors repris dans un petit volume d'un tampon adéquat pour l'utilisation ultérieure qui en sera faite (Ex. Tampon Guanidium Thiocyanate pour l'extraction des ARN; PBS stérile pour le stockage à -80 C).