INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Toute méthode d'extraction connue de l'homme du métier peut être utilisée pour préparer l'extrait selon l'invention.
On peut, en particulier, citer les extraits alcooliques, notamment éthanoliques ou encore hydroalcooliques.
On peut également utiliser un extrait préparé par la méthode décrite dans la demande de brevet français n" 95-02379 déposée par la demanderesse.
Ainsi, dans une première étape on broie le matériel végétal dans une solution aqueuse à froid, dans une deuxième étape les particules en suspension sont éliminées de la solution aqueuse issue de la première étape, et dans une troisième étape on stérilise la solution aqueuse issue de la deuxième étape. Cette solution aqueuse correspond à l'extrait.
Cet extrait peut alors être lyophilisé.
La première étape peut être avantageusement remplacée par une opération de congélation simple des tissus végétaux (par exemple à -20 C), suivie d'une extraction aqueuse reprenant les deuxième et troisième étapes ci-dessus décrites.
Si le matériel végétal est de la plante entière, on ramène la matière fraîche à traiter en fonction du poids sec pour se mettre dans les mêmes conditions d'extraction que pour l'in vitro. Les différentes parties de la plante sont prélevées en fonction du poids relatif de chaque partie de celle-ci.
Le traitement à froid permet de geler les activités enzymatiques, la filtration stérilisante évite la dégradation des actifs par les micro-organismes de l'environnement. Enfin, le véhicule eau est compatible avec les récepteurs ex vivo et facilite les formulations cosmétiques ou pharmaceutiques.
II est connu que les extraits végétaux contiennent des oxydases responsables, entre autres, de l'oxydation desdits extraits. Or une telle oxydation conduit à une coloration marron foncée des extraits et à une odeur âcre rendant ceux-ci peu compatibles avec leur utilisation en cosmétique. Dans cet ordre d'idée on connaît en particulier une laccase dont le poids moléculaire est supérieur à 100000 daltons.
Ainsi, avantageusement, l'extrait obtenu peut être fractionné par toute méthode de fractionnement connue permettant d'éliminer les oxydases et en particulier la polyphénoloxydase. On peut par exemple filtrer l'extrait de l'invention sur une membrane de dialyse afin d'en éliminer les molécules d'un poids moléculaire supérieur à 100000 daltons. Il est également possible de faire subir à l'extrait un fractionnement par précipitations sélectives.
La figure 9D est une coupe à travers les segments de la queue au stade 12,5 jours montrant le marquage dans le myotome (my) et l'artère de la queue (a).
La figure 9C est un agrandissement de la partie de la photographie correspondant à l'artère ombilicale au stade de 12,5 jours, montrant un marquage exclusif de la couche musculaire (m) et une absence de marquage de l'endothélium (e).
Les figures 10A à 10C illustrent l'expression du transgène dans des souris adultes.
La figure 10A représente une vue de dessus de l'ensemble du coeur montrant un intense marquage de l'aorte (a) et de l'artère pulmonaire (pa) et une absence de marquage de la veine cave (vc). Les figures 10B et 10C sont des coupes à travers la couche de muscle lisse (sm) du colon de l'adulte et d'une artère mésentère adjacente (ma).
Le marquage de lacZ (figure 10B) montre que l'expression du transgène est restreinte à l'artère, tandis que l'immunofluorescence avec des anticorps SM 22 (figure 10C) met en évidence l'expression du gène SM 22 endogène dans les cellules du muscle lisse aussi bien de l'artère que du colon.
La figure 11 représente un vecteur comportant les régions régulatrices du gène SM 22 et le gène codant la thymidine kinase du virus de l'herpès.
EXEMPLES Matériels et méthodes 1/ Clonaae et caractérisation du gène de la souris SM 22 Environ 106 phages recombinants d'une banque génomique de souris c57/bl construite dans le phage delta-EMBL 3 (fourni par Dr D. Plachov, Münster, Allemagne) ont été criblées en utilisant le fragment BAL I/Eco RV de 890 bp de 1'ADN complémentaire de la protéine de souris SM22 Almendral et al, 1989 ; Exp. Cell Res. 181, 518-530), comme sonde. La sonde a été marquée radioactivement par initiation aléatoire et 1'ADN a été hybridée sur des filtres laissés durant une nuit à 65-C dans un tampon de Church. Les filtres ont été ensuite lavés dans du 0,2 X SSC/0,1 % SDS à 65 c et des plaques positives ont été purifiées et homogénéisées par trois recriblages successifs dans des conditions identiques. L'un des clones isolés s'est révélé contenir un locus SM 22 entier. I1 a été ensuite cartographie à l'aide d'enzymes de restriction et sous-cloné. Afin d'éviter des réarrangements durant les procédures de clonage, une analyse par hybridation de type Southern de 1'ADN génomique de souris et des clones génomiques a été effectuée et les figures de restriction des fragments ont été comparées.
La séquence du gène SM 22 a été déterminée sur les deux brins par la méthode de terminaison de chaîne ( Sanger et al, 1977, Proc. Natl. Acad Sci. 74, 5463) en utilisant le kit Sequenase V2.0 (United States Biochemical, Cleveland, Ohio).
2. Hvbridation de tvpe Northern extension par amorce, 5'RACE, et analyse de protection par RNAse De 1'ARN total de lignées cellulaires et de tissu de souris adulte a été isolée par la méthode de Chirgwin et al, (1979, Biochemistry, 18, 5294-5299) modifiés. Pour l'isolement des ARN messager, le kit Oligotex (Quiagen Inc, Chatsworth, CA) a été utilisé en suivant les instructions du fabricant.
Les analyses par hybridation de type Northern ont été effectuées en utilisant des gels d'agarose contenant du formaldéhyde et par hybridation capillaire sur des membranes Hybond-N (Amersham Life Science, Little Chalfont, Royaume Uni) selon les méthodes connus de l'homme du métier.
Pour les analyses par extension d'amorce, un oligonucléotide synthétique de 30 nucléotides (P27N1) complémentaire de la séquence +36 à +65 de 1'ADN complémentaire du gène SM 22 (5'- AAGGCTTGGTCGTTTGTGGACTGGAAGGAG-3), a été marqué par de la polynucléotide kinase T4. 5 pg d'ARN messager d'utérus de souris ont été hybridés à 55 C avec 1-2 X 105 cpm de sonde purifiée et la réaction d'extension d'amorce a été effectuée en utilisant les procédures de laboratoire connues de l'homme du métier. Les résultats sont analysés par électrophorèse sur des gels de polyacrylamlde dénaturants à 6 %. Une réaction utilisant la même amorce a été chargée dans un puits adjacent afin de permettre une détermination directe du site d'initiation de la transcription.
La méthode 5'RACE a été effectuée en utilisant deux oligonucléotides synthétiques antisens de 18 bp correspondant aux bases +112 à +129 (amorce 2) et +162 à +179 (amorce 1) de 1'ADN complémentaire SM 22, tel que decrit en substance par FROHMAN et al, (1988, Proc. Natl.
Acad. Sci, 85, 8998-9002).
En vue des analyses de protection par la RNase, un fragment obtenu par PCR de 417 bp comprenant la région -352 à +65 du gène du SM 22 a été fabriqué et cloné par la méthode des bouts collants dans le site HinC II du vecteur pBluescript SK+. La séquence du fragment obtenu par PCR a été vérifiée. Afin de générer une sonde ARN antisens marquée radioactivement, la construction a été linéarisée avec Sph I à la position -203 du gène SM 22 et transcrite avec de la RNA polymerase T7 en présence de 32p-CTp, La sonde (3 X 105 cpm) a été hybridée avec 5 pg d'ARN messager d'utérus de souris à 42-C durant une nuit. Après hybridation, les échantillons ont été incubés avec des RNases A et T (1 heure à 37 C), précipités, et analysés comme décrits pour l'analyse par extension d'amorce.
3. Culture cellulaire et transfection Les lignées cellulaires NIH 3T3, 10T1/2 et 8/47 ont été cultivées dans du DMEM (Life Technologies, Inc, Vienne, Autriche) complémentées avec 10 % de sérum de foetus de veau (Hyclone Inc.,Etats-Unis) à 37 C, dans une atmosphère de Co2 à 7%.
Pour les expériences de transfection, des cellules confluentes ont été étalées, repiquées dans des boites de Petri de 6 cm, et laissées croître jusqu'à obtenir approximativement une confluence de 75 % avant ajout du mélange de transfection.
La technique de typage par oligonucléotides peut être appliquée aussi bien à l'ADN, comme décrit dans la publication d'ANGELINI et ai Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol. 83 : 44894493 (1986), qu'à l'ARN (voir C. UCLA, J. J. VAN ROOD, J. GORSKI, B. MACH (1987) J.
Clin. Invest. 80, 1155).
Les méthodes d'amplification d'acides nucléiques, telles que la PCR, ont facilité l'analyse de l'ADN HLA Classe II d'un individu. La première application de typage par oligonucléotides pour le HLA Classe II a été présentée par ANGELINI et al dans la publication précédemment citée, avec utilisation de la technique dite "SOUTHERN" selon laquelle l'ADN cible est déposé sur une membrane de nylon et la détection est effectuée à l'aide d'une sonde oligonucléotidique marquée. La technique a ensuite été appliquée à la détection d'allèles HLA Classe II non identifiables par sérologie de routine (Voir J.M. TIERCY, J. GORSKI, M.
JEANNET et B. MACH (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85, 198 et J.M. TIERCY, J.
GORSKI, H. BETUEL, A.C. FREIDEL, L. GEBUHRER, M. JEANNET et B. MACH (1989) Human Immunol. 24, 1). Une autre application directe au typage HLA Classe II est celle décrite dans la demande de brevet PCT WO 89/11547 utilisant la technique dite "Dot Blot". La méthode dite "Reverse Dot", qui consiste à fixer sur une membrane de papier ou de nitrocellulose, une sonde nucléotidique et à effectuer la détection d'une hybridation avec une cible marquée, a été appliquée au typage HLA DQ A et à la détection des mutations de la bêta-thalassémie méditerranéenne (R.K.SAIKI et ai Proc. Nat. Acad. Sci. USA vol : 86, p. 6230-6234 ; (1989)).
Le typage cellulaire nécessite la détection de mutations ponctuelles dans le génome et implique la mise au point de sondes suffisamment sensibles pour détecter et différencier des séquences homologues à un nucléotide près. On utilise pour cela des sondes de courte taille, généralement de moins de 30 nucléotides, qui confèrent au test une grande spécificité, tout en conservant une bonne sensibilité. L'utilisation d'oligonucléotides de courte taille permet de disposer d'un grand éventail de sélectivité.
Par ailleurs, il est souhaitable de mettre au point un procédé de typage qui non seulement présente une grande spécificité et une bonne sensibilité, mais qui de plus soit simple à mettre en oeuvre, d'exécution rapide, peu onéreux et facilement automatisable.
La présente invention concerne un procédé, ainsi que des sondes et des kits pour le typage HLA DQB 1 qui répondent à ces exigences.
Le procédé de l'invention peut être utilisé pour typer des échantillons hétérozygotes d'origines diverses, incluant des matrices d'ADNc, et peut être utilisé pour détecter des variants alléliques qui ne peuvent pas être distingués par les méthodes sérologiques conventionnelles.
Les sondes de l'invention qui seront définies ci-après, peuvent être utilisées sous la forme de sondes de détection (marquées avec un agent traceur usuel) dans les techniques de type Southern, ou, de préférence, sous la forme de sondes de capture (technique Sandwich ou Reverse Dot Blot) immobilisées sur un support solide.
Le système de typage de la présente invention utilise de préférence le protocole dit "sandwich", tel que décrit à l'origine par DUNN A.R, HASSEL J. A. (Cell, 12, 23, 1977) et qui consiste à utiliser une première sonde nucléotidique, appelée sonde de capture, fixée sur un support solide, et spécifique du gène cible de l'échantillon, ainsi qu'une deuxième sonde, marquée, appelée sonde de détection, complémentaire d'une autre région de la cible et permettant la détection d'une hybridation par révélation à l'aide du marqueur. Dans le système de la présente invention, le marqueur est par exemple une enzyme telle que la peroxydase de raifort, étant entendu que tout autre marqueur approprié peut être utilisé.
Le procédé de l'invention est fondé sur la sélection de sondes oligonucléotidiques dont la longueur et la composition ont été choisies non seulement pour leur conférer la spécificité et la sensibilité nécessaires, mais aussi de façon à permettre leur utilisation à une température déterminée. Ainsi, le système de typage de la présente invention présente notamment l'avantage de permettre d'opérer à une température unique de 37"C + 20C.
Il est toutefois évident que, même dans le cas de sondes destinées à détecter, à une température donnée, des mutations ponctuelles, il est possible d'envisager l'utilisation de sondes dont la longueur peut varier dans une certaine mesure, grâce notamment à l'emploi de solutions tampons favorisant plus ou moins la stabilité des complexes d'hybridation. Les sondes de l'invention sont donc définies par une séquence dont la longueur pourra généralement être considérée comme maximum, en particulier si on souhaite travailler à une température avoisinant 37"C, mais différente de 37"C (ce qui est souvent le cas en pratique compte tenu des erreurs d'étalonnage de la température), avec en outre l'indication d'une séquence optimum pour une température de 37"C.
Il est évident pour les spécialistes qu'à chaque sonde oligonucléotidique particulière correspond une sonde complémentaire qui, bien entendu, est capable de jouer le même rôle en tant que sonde de capture ou de détection. L'invention s'étend donc aux sondes ayant une séquence complémentaire de celle des sondes décrites ci-après, et aux procédés utilisant ces complémentaires.
L'invention a pour objet des sondes ayant une séquence nucléotidique choisie pour répondre aux exigences précitées. Plus particulièrement, la présente invention se rapporte à des sondes nouvelles, dont l'utilisation combinée permet d'effectuer la discrimination entre différents alléles et même d'identifier si nécessaire les différentes spécificités HLA DQ connues à ce jour (Nomenclature for factors of the HLA system, 1995, Bodmer Julia G et al. Tissue Antigens 1995, 46, 1-18).
Les sondes nucléotidiques de l'invention sont choisies notamment parmi celles qui sont représentées ci-après (la séquence lue de gauche à droite va de l'extrémité 5' à l'extrémité 3'). Les lettres représentent les nucléotides (ou bases) selon la nomenclature habituelle. La séquence soulignée représente la séquence optimale dans les conditions opératoires préconisées selon l'invention. Les sondes contiennent donc au minimum la séquence soulignée, et peuvent contenir en outre une ou deux bases supplémentaires choisies parmi les bases non soulignées, c'est-à-dire, selon les cas (et en respectant bien entendu la continuité de la séquence), soit une ou deux bases supplémentaires à l'extrémité 5', soit une ou deux bases supplémentaires à l'extrémité 3', soit encore une base supplémentaire à l'extrémité 5' et une base supplémentaire à l'extrémité 3' On sait en effet qu'il est possible de modifier la longueur des sondes utilisées en fonction des conditions opératoires qui permettent de faire varier les forces de liaison d'hybridation, telles que les températures d'hybridation et de lavage, et la nature des tampons d'hybridation et/ou de lavage. L'introduction dans les sondes de bases modifiées (par exemple inosine) peut jouer un rôle analogue. Les sondes de l'invention sont notamment choisies parmi les suivantes (pour chaque sonde, on a indiqué les spécificités reconnues) TG CGT TAT GTG ACC AGA (26B), qui reconnaît les spécificités DQBI 06011, 06012, 0301, 0304, GTG CGT CTT GTG ACC AGA (26C) : spécificités DQB1 0602, 0302, 03032 GT CTT GTA ACC AGA CAC AT (26D): spécificités DQBI 0603, 0604, 0607, 0608, CGT CTT GTA ACC AGA TAC AT (26F): spécificités DRQBI 06051, 06052, 0606 et 0609, CGT CTT GTG AGC AGA AGC AT (26E): spécificités 0201,0202, GG ACC GAG CTC GTG CGG GGT G (23A) : spécificité DQB1 0401, G TAC CGG GCA GTG ACG C (49A): spécificité DQB1 0501, G ACG CCG CTG GGI CCG CCT G (55A): spécificités DQB1 0301, 0302, 03032, 0304, 0305, G ACG CCG CTG GGG CCG CCT G (55'A): spécificités DQB1 0301, 0302, 03032, 0304, 0305, G GAG GGI ACC CIG GCI GAG T (70A) : spécificités DQB1 0602, 0603, 0608, G GAG GGG ACC CGG GCG GAG T (70'A): spécificités DQBI 0602, 0603, 0608, TCG GTG GAC ACC GTA TGC AGA C (70B) : spécificités DQB1 0401,0402.
La figure 8, généralement désigné par 500, se trouve un organigramme illustrant le procédé permettant aux stations de base de mesurer l'unité d'abonné de façon à obtenir une estimation de position. Le procédé débute à la case 505 au moment où la fonction de localisation est activée. La case 510 vérifie l'état de l'abonné et une décision est prise 515 selon que l'abonné se trouve ou non dans un état de commutation souple à trois positions. Si ce n'est pas le cas, on passe facultativement à la case 520, qui effectue un test pour déterminer s'il y a trois bases dans l'ensemble des candidats. Si ce n'est pas le cas, la case de décision 525 effectue un test pour vérifier le seuil des bases supplémentaires par rapport à celui des bases de l'ensemble des candidats. S'il n'est pas au minimum, la case 530 réduit le seuil et on retourne à l'étape 520 du procédé. Si la case 525 indique un niveau minimum, on passe à la case 535, qui poursuit le procédé d'estimation de position, mais maintenant avec deux bases seulement, ce qui donne une précision inférieure à celle obtenue lorsqu'on dispose de trois bases pour effectuer les mesures. En référence à nouveau à la case 515, si l'abonné se trouve dans un état de commutation à trois positions, ou à la case 520 si trois bases se trouvent dan l'ensemble des candidats, on passe à la case 540. La case 540 assure que les trois stations de base sont actives pour pouvoir recevoir le signal de l'abonné. Ensuite, on passe, facultativement, à la case 545. A cette case, on effectue un test pour déterminer si chaque base peut recevoir l'abonné. Si les bases peuvent, on passe à la case 550 qui envoie un signal de demande de localisation si on se trouve en mode actif et, dans les deux modes, regroupe les données disponibles et procède à l'estimation de position de la manière décrite cidessus. A la case 555, tous les paramètres retournent à la normale et les mesures sont achevées. En référence à nouveau à la case 545, si moins de trois bases peuvent recevoir l'abonné, la case 546 effectue un test pour déterminer si les unités de base auxiliaires sont disponibles. Si c'est le cas, les sites auxiliaires locaux sont activés à la case 547 et la case 560 effectue un test pour déterminer si une urgence est indiquée. Si ce n'est pas le cas, seules les bases reçues peuvent être utilisées dans les mesures et ceci peut détériorer la qualité de l'estimation. Si une urgence est indiquée (par exemple par un signal d'abonné comme le numéro de téléphone des urgences ou bien une demande d'urgence provenant d'une entité autorisée reliée à l'infrastructure), on passe à la case 565 afin d'effectuer un test pour savoir si l'unité d'abonné se trouve au niveau de puissance maximum. Si ce n'est pas le cas, on passe à la case 570 pour augmenter la puissance puis on retourne à la case 540. Si à la case 565 on se trouve au niveau de puissance maximum, on effectue un test à la case 575 pour déterminer si chaque base peut recevoir l'abonné.
Si c'est le cas, on passe à la case 550 ; sinon, la charge de cellule est réduite à la case 580 afin d'augmenter la portée effective des cellules de l'ensemble actif qui ont des difficultés à recevoir l'unité d'abonné. Ensuite, à la case 585, on effectue un test pour déterminer si la limite de perte de charge a été atteinte et, si c'est le cas, on passe à la case 550 ; sinon, on repasse à la case de décision 575 et un test est effectué pour déterminer si chaque base peut maintenant recevoir l'abonné.
Le perte de charge comporte un certain nombre de procédés de réduction du trafic cellulaire ou de transfert de ce trafic de sorte qu'un nombre supérieur de sites de base peut être utilisé pour fournir une estimation de position plus précise. La charge de l'abonné peut être éliminée de l'air ou bien elle peut être déplacée vers d'autres porteuses AMRC ou même vers des voies AMPS, etc. Ainsi, si nécessaire, la voie AMRC à laquelle nous nous intéressons peut être supprimée ou bien l'utilisateur qui a besoin d'être localisé peut être commuté sur une voie légèrement chargée. De plus, les paramètres du système peuvent être modifiés de façon à améliorer la capacité de mesurer l'unité d'abonné. Conjointement avec les changements de charge, ou bien indépendamment des changements de pilotes, la puissance (PPG) peut être telle qu'elle modifie les zones de couverture de plusieurs sites de base de façon à augmenter la capacité d'une station de base à recouvrir une région précise. Une partie de la puissance PPG au niveau d'une station de base peut être appliquée, de façon sélective, à un faisceau, formé pour suivre une unité d'abonné donnée de façon à augmenter la capacité d'un abonné donné à être en contact avec une base donnée.
Dans un deuxième mode de réalisation de l'invention, un procédé et un appareil sont proposés et permettent de déterminer la position d'un abonné. Tel que mentionné ci-dessus, les abonnés peuvent être localisés en déterminant les distances simultanées à au moins trois sites. Avec un nombre inférieur de sites, il y a en général plus d'incertitudes dans la détermination de la position des utilisateurs. En utilisant des informations d'angles, ces incertitudes peuvent être réduites, ce qui est particulièrement important lorsque moins de trois sites sont utilisés.
De plus, même lorsque trois sites ou plus sont disponibles pour la détermination de position, en utilisant des informations d'angle, une confiance accrue peut être obtenue.
En référence tout d'abord à la figure 9, un site de base unique 910 en communication avec l'unité d'abonné (S) 920 est illustré. Puisque seule une base unique participe à la mesure de la position, un calcul de temps ou de distance (comme pour le premier mode de réalisation) donnera seulement un rayon, par exemple 970, depuis le site. Ceci produit une grande incertitude d'angle puisque l'utilisateur peut, en l'absence d'autres informations, se trouver n importe où dans la limite de l'angle de 360 degrés 930 défini par le rayon 970. En utilisant des antennes sectorisées, dont les angles de visée sont représentés par les vecteurs 940, 950 et 960, des comparaisons entre les niveaux des signaux reçus depuis chacune des antennes sectorisées permet l'identification du signal le plus fort, ce qui indique la direction dans laquelle est reçu le chemin de propagation le plus fort. Ceci correspond en général à la meilleure estimation de la direction dans laquelle se trouve l'abonné. Ainsi, par exemple, lorsque le signal le plus fort est reçu au niveau de l'antenne du secteur dont le vecteur de site de base est 950, la position probable de l'abonné 920 se trouve le long de l'arc 980 définie par la distance déterminée et l'orientation de l'angle du secteur 970 (+/- les incertitudes de distance et d'angle ; avec d'autres éléments (traités par la suite), on peut obtenir de meilleures estimations même en n'utilisant qu'un site de base. Les lignes en pointillés de la figure 9 représentent la séparation entre les antennes sectorisées 940, 950 et 960, au niveau de laquelle la meilleure zone de couverture commute entre les secteurs. Si deux secteurs ont presque le même niveau de signal reçu, on peut en général considérer que l'abonné se trouve sur la limite entre les secteurs.
En référence à la figure 10, les antennes des secteurs ont été remplacées par un groupement d'antennes ou un ensemble d'antennes fixes à faisceaux étroits, au niveau de la base 1010, fournissant un degré encore supérieur de résolution d'angle. Le modèle de faisceau 1040 est très étroit. (Selon une autre solution, une antenne qui tourne peut être utilisée pour trouver l'angle le plus approprié à l'abonné).