INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Les amorces définies ci-après ont permis de réaliser une détection spécifique du génome MSRV-2 dans différentes cellules humaines, par une étape de RT-PCR selon un un procédé d'amplification d'ARN tel que décrit dans la demande de brevet nO EP-A-O 569 272.
Après le présertissage, comme on le comprendra à l'observation de la figure 11, la rotation de l'arbre moteur suivant R se poursuivant, le tourillon 910 va descendre, entraînant dans son mouvement, via la bielle 91, le tourillon 911. Ceci provoque le pivotement du tourillon 700 autour de l'axe 81, dans le sens des aiguilles d'une montre, et l'abaissement de la tige coudée 70.
Le tourillon 712, sur lequel s'articule l'extrémité du levier 6, est donc repoussé vers le bas, suivant un mouvement en arc de cercle autour du point 82.
Il en résulte une traction vers la droite et vers le bas de cette extrémité du levier 6 ; le tourillon 210 qui est situé à l'autre extrémité suit un mouvement circulaire ascendant, dans le sens des aiguilles d'une montre, autour du point 85, tandis que le bras 31 - articulé par le point 311 sur le levier 6 et à sa base sur la biellette 41 - suit un mouvement complexe. Ce mouvement correspond à une trajectoire en deux phases (phase d'approche et phase de travail) de la tête 3, trajectoire qui a une allure correspondant à celle discutée plus haut en référence à la figure 8.
En fin de sertissage les points 84 et 310 d'une part et 210 et 311 d'autre part sont situés (deux à deux) sur une même ligne horizontale.
Durant le sertissage, la tête de présertissage s'est écartée de la pièce, par une déformation de l'embiellage en sens inverse de celui décrit au cours du présertissage.
La rotation de l'arbre 80 se poursuivant, à l'issue du sertissage, la tête 3 va à son tour se dégager de la pièce 1 pour revenir à la position de début de cycle de la figure 9, après quoi la pièce sertie est enlevée pour être remplacée par une nouvelle pièce.
Il est important de remarquer que l'effort obtenu, tant au sertissage qu'au présertissage, est très important car la bielle 91 et le maneton d'excentrique 80-910 se trouvent au voisinage du point mort avant en fin de présertissage et du point mort arrière en fin de sertissage.
Comme déjà dit plus haut, en cours d'opération de présertissage, la direction de l'outil est perpendiculaire au bord de la tôle sertie.
Le sertissage se fait suivant une trajectoire courbe, dont le centre est voisin du pli de la tôle, ce qui évite la formation d'une ondulation sur le panneau extérieur de la tôle, côté matrice.
On notera également que la tête de sertissage, qui transmet les efforts les plus importants, se situe au plus près de la pièce à sertir, si bien que les efforts dans les différents axes sont minimisés.
Du fait que la commande, par motoréducteur et excentrique, permet d'effectuer le présertissage et le sertissage en un tour complet de l'arbre moteur, la précision d'arrêt en fin de cycle n'a pas d'importance, aucune interférence ne risquant de se produire entre les bielles et les bras oscillants portant les têtes de travail.
De préférence, selon une caractéristique additionnelle de l'invention, l'axe d'articulation 911 de la bielle 91 est une barrette frangible, apte à se rompre si un effort exagéré est demandé à l'embiellage, ce qui peut être le cas notamment si un corps étranger s'intercale entre la pièce à sertir et l'une ou l'autre des têtes de travail.
Elle est remplacée après rupture.
Il est prévu avantageusement une possibilité de rattrapage de jeu aussi bien sur les mécanismes de présertissage que de sertissage.
Pour rattraper les jeux du mécanisme de présertissage, un dispositif de rattrapage de jeu à excentrique peut être monté au point d'articulation 710 ; de même, pour rattraper le jeu du mécanisme de sertissage, un mécanisme similaire peut être monté sur le point d'articulation 700.
Pour simplifier le réglage de l'unité, un repère peut être prévu sur l'arbre de sortie du moto-réducteur et deux repères sur le bâti (I'un pour le présertissage et l'autre pour le sertissage). Deux faces de référence A1, A2 sont prévues sur le mécanisme de présertissage (voir figure 10) et deux faces de référence A3 et A4 sont prévues sur le mécanisme de sertissage (voir figure 11).
Un élément élastique de rappel 28, à raideur constante, est disposé entre le tiroir et l'une des parois de la chambre, en sorte de plaquer le tiroir contre le soupape de décharge, en position stable du dispositif amortisseur.
Le même agencement est disposé de façon symétrique pour la chambre de compensation à la descente. Les références sont identiques mais suivie d'un "d".
Les chambres de compensation à la montée et à la descente comprennent chacune des trous 30, 32 et 30d, 32d, de passage de liquide pour communication avec la chambre centrale, respectivement en partie haute et en partie basse.
De plus, deux canalisations 32 et 34 relient les chambres de compensation à la montée et à la descente entre elles. Ces canalisations sont symétriques, elles sont piquées immédiatement en dessous des tiroirs et débouchent au droit de chacune des billes des anti-retour 26, 26d.
Le fonctionnement est décrit ci-après.
Lorsque le piston remonte, ce qui correspond à un obstacle en saillie, le liquide refoulé de la chambre centrale passe dans la chambre de compensation à la descente 16, circule dans la canalisation 32 et passe à travers l'anti-retour 26, qui peut s'ouvrir dans ce sens de circulation, pour pousser le tiroir 22 de la chambre de compensation à la montée 14, à l'encontre du ressort de rappel 28, qui se trouve comprimé. Au passage, le tiroir obture la canalisation 34, ce qui impose le passage du fluide de la chambre de compensation 14 dans la chambre centrale par le trou 32.
Dès que la détente se produit, le ressort de rappel 28 repousse le tiroir 22 et l'anti-retour 26 est fermé. Le fluide sous pression passe donc à travers la soupape de décharge 24 et rejoint la chambre centrale 12. Le passage du fluide est donc freiné par la soupape avec un effort constant lié à la raideur du ressort 27 de la soupape de décharge.
Dans le cas où l'obstacle est en creux plutôt qu'en saillie, le fonctionnement est inversé mais parfaitement symétrique.
Bien entendu, l'homme de l'art est à même d'adapter la viscosité du fluide liquide et les dimensions des différents organes, en fonction des besoins.
En ce qui concerne la présente invention, on se reporte utilement aux figures 2, 3A,3B et 4A,4B.
Sur la figure 2, on a représenté le dispositif à l'état stable d'attente, ce dispositif comprenant un corps 50, une chambre centrale 52, une chambre de compensation 54 à la montre et une chambre de compensation 56 à la descente.
Selon le mode de réalisation préférentiel représenté, ces chambres sont agencées avec les chambres de compensation de part et d'autre de la chambre centrale.
Le dispositif est parfaitement symétrique suivant une diagonale du rectangle représentant la coupe du corps, de préférence cylindrique. Aussi les références sont identiques pour les éléments identiques avec un "d" ajouté pour les distinguer.
En partie supérieure de la chambre centrale, il est prévu une chambre de compensation 58, anti-cavitation.
La chambre centrale 52 comprend deux trous de communication haut 60, 60d et bas 62, 62d avec les chambres de compensation 54 et 56 respectivement.
Dans la chambre centrale 52, il est introduit un piston 64, mobile en translation, dont l'extrémité, extérieure au corps 10, est reliée à l'élément à amortir, dans le cas présent un bras support de roue d'un véhicule.
Conformément à la voie (2) discontinue, le polysilane (e. g.
polyméthylhydrogénosilane et/ou polyphénylhydrogénosilane) est, tout d'abord, mélangé à température ambiante avec une quantité catalytique d'au moins un dérivé du bore.
Avant la pyrolyse, on procède au traitement thermique intermédiaire par chauffage du mélange à une température, de préférence comprise entre 170 et 3000 C pendant cinq minutes à plusieurs heures. Les produits intermédiaires, i. e les précurseurs ou précéramiques, ainsi obtenus par ce procédé (2) selon l'invention, constituent d'autres objets de cette dernière.
Après une interruption de plus ou moins longue durée, qui peut être exploitée pour ramener à température ambiante le précurseur de céramiques (ou précéramique) ainsi obtenu, on met en oeuvre la pyrolyse classique (température finale de pyrolyse, par exemple comprise entre 1 000 et 1 5000 C).
Pour ces deux voies (1) et (2) de mise en oeuvre du procédé, il est avantageux de prévoir une incorporation d'au moins un agent fournisseur de carbone, formé, de préférence, par un réticulant insaturé et, plus préférentiellement encore, par un composé silicié vinylique, dans le milieu réactionnel.
Cette incorporation peut se faire, par exemple, simultanément au mélange de polysilane de départ et du composé boré ou lors de l'interruption entre le traitement thermique intermédiaire et la pyrolyse dans la voie (2) discontinue.
n est d'ailleurs possible de fixer la viscosité de la composition à une valeur adaptée au formage considéré. Cela peut, par exemple, se faire en ajustant la viscosité du polylsilane (e. g. polyméthylhydrogénosilane et/ou polyphénylhydrogénosilane) ou en choisissant la nature et la concentration la source de carbone.
A titre illustratif, et nullement limitatif, on précise ci-après la nature des dérivés borés susceptibles d'intervenir dans le cadre du procédé de l'invention.
Lesdits dérivés borés sont des composés à liaison B - N, B - O, B B - X = halogène Les familles suivantes de ces dérivés sont, entre autres, à considérer - les alkylborates de formule R4,B(ORS dans laquelle a + b = 3 et a = 0, 1 ou 2, R4 est un groupe alkyle comportant de 1 à 20 atomes de carbone, R3 = R' ou R5 = -SiR'R"R"'; R', R", R"' sont identiques ou différents et sont choisis parmi l'hydrogène ou les groupes alkyles comportant de 1 à 20 atomes de carbone; parmi les composés de cette famille on citera tout particulièrement: B(OMe)3 ; B(OEt)3 ; B(OSiMe3)3, - les alkylaminoboranes de formule :Ra4B(NR5)b dans laquelle : a, b, R4 et R5 sont tels que définis ci-dessus ; parmi les composés préférés de cette famille on citera tout particulièrement B(NMe2)3; MeB(NMe2)2 B [N(SiMe3)2]3, - les boratranes, qui sont des composés polycycliques, de formule :B[O(CH2),@]3N dans laquelle c = 1, 2 ou 3 ; parmi les composés préférés de cette famille on citera tout particulièrement: B(OCH2CH2)3N, - les borazines, qui sont des composés cycliques, de formule: -(BR4 = NR5-)3 dans laquelle R4 et R5 sont tels que définis ci-dessus, R4 pouvant, en outre, représenter l'hydrogène ; dans cette famille les composés suivants sont particulièrement préférés -(B(NH2 ) = N(Me)-)3 ; -[B(Me) = N(Me)]3, - les alkylboroxines de formule: -(BR4 -O-)3 dans laquelle R4 est tel que défini ci-dessus pour les borazines ; les composés préférés de cette famille sont: -[B(Me)-O-]3, - les alcoxyboroxines de formule: -(B-(OR6)-O-)3 dans laquelle R6 = R4 ou R5 tels que définis ci-dessus; les composés préférés de cette famille sont : -(B(Me) = O-)3 ; -(B(OMe) = - les trihalogénures de bore de formule BX'3 dans laquelle X' = Cl, Br, F. Dans cette famille, on citera tout particulièrement le BCl3.
n va de soi que les susdits dérivés borés peuvent être mis en oeuvre seuls ou en mélange entre eux.
Le plasmide résultant a été appelé pBIOC24. A partir de pBIOC24, le fragment BglII-XbaI portant la séquence de PPS-LGC a été isolé par double digestion enzymatique par BglII et XbaI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), précipité à l'alcool, séché. Puis, ce fragment d'ADN a été traité par l'enzyme Klenow selon les recommandations du fabricant et ligué à 1'ADN plasmidique de pBIOC21 digéré au site HindIII, traité à la Klenow et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant.La ligation a été réalisée avec 20 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 200 ng de fragments d'ADN contenant PPS LGC décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 20 y1 en présence de 2 y1 de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 jl de 50% polyéthylène glycol 8000 et de 5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur 12 yg/ml tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Le clone résultant a été appelé pBIOC26. La séquence nucléotidique du fragment codant pour la protéine recombinante PPS-LGC a été vérifiée par séquençage à l'aide du kit de séquençage T7TM commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). L'ADN plasmidique du vecteur binaire pBIOC26 a été introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de Holsters et al.
(1978). La validité du clone obtenu a été vérifiée par digestion enzymatique de l'ADN plasmidique introduit.
c. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE pBIOC41 CONTENANT RS-LGC.
La lipase gastrique de lapin est synthétisée sous forme d'un précurseur composé d'un peptide signal de 22 acides aminés, situé à l'extrémité NH2-terminale et précédant la séquence polypeptidique de la lipase mature, le clone pJO101 contenant l'ADNc complet codant pour la lipase gastrique de lapin est décrit dans la demande de brevet européen n" 92 403 055.4 déposée le 12.11.92 par 1"' Institut de Recherche Jouveinal" et s'intitulant "Acides nucléiques codant pour la lipase gastrique de lapin et dérivés polypeptidiques, leur utilisation pour la production de ces polypeptides, et compositions pharmaceutiques à base de ces derniers".
L'alignement des séquences polypeptidiques de la lipase gastrique de chien et du précurseur de la lipase gastrique de lapin a montré que la séquence LFGK est présente dans les deux protéines. Dans la séquence polypeptidique de la lipase de lapin déterminée à partir de la protéine naturelle purifiée (Moreau et ai., 1988), les trois premiers résidus L, F et G sont absents et font partie du peptide signal de 22 acides aminés de la LGL. De ce fait, le peptide signal de la lipase gastrique de lapin dépourvu de ces trois acides aminés communs a été fusionné à la séquence protéique mature de la lipase gastrique de chien. Sa séquence polypeptidique est constituée des 19 acides aminés suivants: MWVLFMVAALLSALGTTHG.
Le plasmide pBIOC22 a donc été digéré totalement par BglII et partiellement par HindIII afin de supprimer la séquence codant le polypeptide Leu-Phe-Gly-Lys (4 premiers acides aminés) de la protéine LGC mature. Cette séquence a été remplacée par celle codant pour le peptide signal RS de la lipase gastrique de lapin de 19 acides aminés (ATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG GCA GCT TTG CTA TCT GCA CTT GGA ACT ACA CAT GGT) fusionnée à celle des 4 premiers codons de la protéine LGC mature ("RS4 premiers codons de LGC mature").La séquence "RS4 premiers codons de LGC mature" a été amplifiée par PCR à partir du plasmide pJO101 à l'aide des 2 oligodésoxynucléotides suivants: 5' aggagatctcaacaATG TGG GTG CTT TTC ATG GTG 3' et 5' G ATG AAG CTT TCC AAA CAA ACC ATG TGT AGT TCC AAG TG 3', en suivant le protocole d'amplification PCR décrit cidessus dans le paragraphe I.Après double digestion enzymatique par BglII et HindIII, les fragments d'ADN issus de l'amplification PCR ont été purifiés par électrophorèse sur gel d'agarose 2%, électroélués (Sambrook et al., 1989), précipités en présence de 1/10 de volume de 3M acétate de sodium pH 4,8 et de 2,5 volumes d'éthanol absolu à -80 C pendant 30 min., centrifugés à 12000 g pendant 30 min., lavés à l'éthanol 70%, séchés, puis ligués à l'ADN plasmidique de pBIOC22 doublement digéré par BglII et HindIII, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant.La ligation a été réalisée avec 100 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 50 ng de fragments d'ADN digérés issus de l'amplification PCR décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 10 y1 en présence de 1 yI de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham) et de 2,5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5a rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983). L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur un milieu contenant 50 ,ug/ml d'ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction.L'ADN plasmidique de certains clones retenus a été vérifié par séquençage à l'aide du kit de séquençage T7TM commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977). Les séquences du RS et de la LGC mature ont été clonées en maintenant leurs phases de lecture ouvertes (c'est-àdire, de telle sorte qu'elles constituent une phase ouverte de lecture unique).
La séquence de clivage entre les séquences RS et LGC mature est Gly-Leu. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC40. A partir de pBIOC40, le fragment BglII-XbaI portant la séquence RS-LGC a été isolé par double digestion enzymatique par BglII et XbaI, purification par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélution (Sambrook et al., 1989), précipitation alcoolique, séchage. Puis, ce fragment d'ADN a été traité par l'enzyme Klenow selon les recommandations du fabricant et ligué à 1 'ADN plasmidique de pBIOC21 digéré au site HindIII, traité à la Klenow et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant.La ligation a été réalisée avec 20 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 200 ng de fragments d'ADN contenant RS-LGC décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 20 y1 en présence de 2 pI de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 pl de 50% polyéthylène glycol 8000 et de 5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DHSa rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983).
L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur un milieu contenant 12 yg/ml de tétracycline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Le clone résultant a été appelé pBIOC41. La séquence nucléotidique des fragments codant pour la protéine recombinante RS-LGC a été vérifiée par séquençage à l'aide du kit de séquençage T7TM commercialisé par Pharmacia selon la méthode des didésoxynucléotides (Sanger et al., 1977).
L'ADN plasmidique du vecteur binaire pBIOC41 a été introduit par transformation directe dans la souche LBA4404 d'Agrobacterium tumefaciens selon le procédé de Holsters et al. (1978). La validité du clone retenu a été vérifiée par digestion enzymatique de l'ADN plasmidique introduit.
II. CONSTRUCTION DE GENES CHIMERIQUES CODANT POUR LA PROTEINE RECOMBINANTE DE LIPASE GASTRIQUE DE CHIEN ET PERMETTANT UNE EXPRESSION DANS LES GRAINES DE COLZA.
a) CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE pBIOC28 CONTENANT LE PROMOTEUR pCRU.
L'expression dans les graines de colza de la lipase gastrique de chien (LGC) a nécessité l'insertion de l'ADNc codant pour la LGC entre les séquences régulatrices suivantes: 1. le promoteur pCRU correspondant à la région 5' non codante du gène de la protéine de réserve de graines, la CRUCIFERINE A de radis (Depigny This et al., 1992) et permettant une expression spécifique dans les graines; 2. la séquence terminatrice de transcription, terminateur polyA 35S, qui correspond à la région 3' non codante de la séquence du virus à ADN bicaténaire circulaire de la mosaïque du chou-fleur produisant le transcrit 35S (Franck et al., 1980).
Pour obtenir un plasmide binaire similaire à pBIOC21 mais dont le promoteur pd35S a été remplacé par le promoteur pCRU, le fragment "EcoRI traité à la Klenow-BarnHI", contenant le promoteur pCRU a été isolé à partir du plasmide pBI221-CRURSP fourni gracieusement par M. Delseny (Laboratoire de Physiologie et Biologie Moléculaire Végétales, CNRS, Perpignan). Le plasmide pBI221-CRURSP dérive de pBI221 (commercialisé par Clontech) par remplacement du promoteur 35S par le promoteur pCRU.
Le fragment "EcoRI traité à la Klenow-BamHI" portant le promoteur pCRU a été purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et ligué à l'ADN plasmidique de pJIT163 (décrit dans le paragraphe I.), digéré par KpnI, traité à la T4 DNA Polymérase (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant, puis digéré par BamHI, purifié par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroélué (Sambrook et al., 1989), soumis à la précipitation alcoolique, séché et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant.La ligation a été réalisée avec 20 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 200 ng de fragments d'ADN "EcoRI traité à la Klenow-BamHI" décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 20 y1 en présence de 2 yI de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 ,ul de 50% polyéthylène glycol 8000 et de 5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DHSa rendues préalablement compétentes, ont été transformées (Hanahan, 1983).L'ADN plasmidique des clones obtenus, sélectionnés sur un milieu contenant 50 yg/ml d'ampicilline, a été extrait selon la méthode de la lyse alcaline (Birnboim et Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction. Le plasmide résultant a été appelé pBIOC27.
La cassette d'expression, constituée du promoteur pCRU et du terminateur polyA 35S a été isolée à partir de pBIOC27 par digestion totale XhoI suivie d'une digestion partielle EcoRI. Elle a été purifiée par électrophorèse sur gel d'agarose 0,8%, électroéluée (Sambrook et al., 1989), soumise à la précipitation alcoolique, séchée, traitée à la Klenow (New England Biolabs) selon les recommandations du fabricant et liguée à l'ADN plasmidique de pBIOC24 au site EcoRI traité à la Klenow et déphosphorylé par l'enzyme phosphatase alcaline d'intestin de veau (Boehringer Mannheim) selon les recommandations du fabricant.La ligation a été réalisée avec 20 ng du vecteur déphosphorylé décrit ci-dessus et 200 ng de fragments d'ADN XhoI-EcoRI décrits ci-dessus dans un milieu réactionnel de 20 ,ul en présence de 2 ,ul de tampon T4 DNA ligase x 10 (Amersham), de 2 yI de 50% polyéthylène glycol 8000 et de 5 U d'enzyme T4 DNA ligase (Amersham) à 14"C pendant 16 heures. Les bactéries Escherichia coli DH5 Doly, 1979) et analysé par digestion enzymatique par des enzymes de restriction.Le plasmide résultant a été appelé pBIOC28.
b. CONSTRUCTION DU PLASMIDE BINAIRE pBIOC29 CONTENANT PPS-LGC.