INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
- ne montrer aux enfants que les VIGNETTES en leur indiquant le nom en langue étrangère et en obtenant d'eux qu'ils le répètent correctement et en devinent le nom en langue nationale.
- intéresser les enfants en ne les faisant jouer qu'avec des PLAQUETTES dont les ILLUSTRATIONS les intéressent : NOEL et les jouets par exemple.
Le boîtier peut également contenir: - un briquet intégré, - une partie transparente (9) permettant de suivre la quantité de tabac stockée, - un emplacement pour une "cigarette" supplémentaire.
1.6 Application industrielle potentielle Le dispositif selon l'invention est principalement destiné aux fumeurs de tabac.
PROCEDE DE PRODUCTION DE PLANTES TRANSGENIQUES,27-g4g6EMENT TRANSFORMEES EN GENERATION Tg, A PARTIR DE MERibExLb.
La présente invention concerne un procédé de production de plantes transgéniques à partir de méristèmes, lesdites plantes étant entièrement transformées en génération To. L'invention vise également les explants transformés obtenus au cours du procédé.
Les techniques de génie génétique sont, maintenant, couramment appliquées dans l'amélioration d'espèces végétales. Ces techniques permettent l'introduction de caractères nouveaux difficiles ou impossible à introduire par des techniques classiques.
Malgré l'évolution de ces techniques, il existe néanmoins certaines espèces qui se prêtent difficilement à la transformation ou qui ne peuvent pas être régénérées à partir d'explants différenciés, comme des cotylédons ou des feuilles. Pour ces espèces (par exemple le tournesol, le coton, le pois, le haricot, le soja, etc...), il a été démontré que ces difficultés pouvaient, en partie, être surmontées en utilisant comme explant pour la transformation, un explant méristématique, par exemple un méristème apical.
L'utilisation de méristèmes permet la régénération de plantes fertiles sans étape de callogénèse. La technique de régénération à partir de méristèmes s'applique à un grand nombre d'espèces différentes et, au sein d'une même espèce, à un grand nombre de génotypes. Grâce à cette technique, de nombreuses espèces récalcitrantes ont pu être transformées et régénérées (voir par exemple : Bidney et al, Plant Molecular Biol. 18, 301-313, 1992 Bidney et al, Proc. 13e Int. Sunflower Conf. Vol II, Pisa Sept. 1992 ; Schrammeijer et al, Plant Cell Rep.
9 55-60, 1990 ; Christou et al, The Plant Journal, 2(3), 283-290, 1992 ; Gambley et al, Plant Cell Rep.
12 : 343-346, 1993 ; Russel et al, Plant Cell Rep. 12 : 165-169, 1993).
Cette méthode présente néanmoins certains inconvénients. La fréquence de transformation est extrêmement faible et les plantes régénérées sont presque exclusivement chimériques, c'est-à-dire certains tissus sont transformés tandis que d'autres ne le sont pas. Cette caractéristique vient du fait que le méristème produit le matériel cellulaire à l'origine de tous les tissus des divers organes de la plante (tige, racines, feuilles). Or, quelque soit la technique employée, l'opération de transformation, ne conduit qu'à la transformation d'un nombre restreint de cellules au sein de l'explant, ces cellules étant réparties de manière alléatoire. Le méristème n'est jamais entièrement transformé à la suite d'une telle manipulation. Les plantes régénérées à partir d'un méristème ayant subi une étape de transformation sont donc chimériques. Des plantes entièrement transgéniques ne sont obtenues que dans la descendance et cela, à condition que les cellules de la lignée germinale aient été atteintes par la transformation.
Ce genre de procédé est décrit par exemple dans Bidney et al, Plant Molecular Biol. 18, 301-313, 1992 ; Schrammeijer et al, Plant Cell Rep. 9 : 55-60, 1990.
Les inconvénients présentés par l'obtention de plantes chimériques sont reconnus dans l'art, mais aucune solution n'a pu être apportée. Une système de marquage permettant de reconnaître, parmi les plantes chimériques To, celles qui avaient subi une transformation de la lignée germinale et qui étaient donc susceptibles de transmettre le nouveau caractère à leur descendance, a été décrit (Christou et al, The Plant Journal, 2(3), 283-290, 1992). Cette méthode facilite l'obtention, dans la génération suivante, de plantes entièrement transformées, mais les plantes produites en génération To sont toujours chimériques.
A ce jour, il n'existe pas de méthode permettant de produire, de manière systématique et prévisible, des plantes transgéniques entièrement transformées en génération To à partir d'explants méristématiques.
La présente invention résoud ce problème technique. L'invention se base sur la mise au point, par les inventeurs, d'une méthode permettant d'enrichir les méristèmes en cellules transformées, pour aboutir à des méristèmes entièrement transformés, c'est-à-dire des méristèmes dont toutes les cellules sont transformées. Selon l'invention, la régénération de plantes s'effectue ensuite exclusivement à partir de ces explants entièrement transformés, ce qui garantit le caractère transgénique des plantes obtenues. Les inventeurs ont également démontré que, dans certaines conditions, la néoformation de méristèmes et de bourgeons foliaires néoformés sur les feuilles d'explants issus de méristèmes peut être induite. L'existence de ces bourgeons foliaires néoformés, contenant des méristèmes foliaires néoformés, n'a jamais été décrite dans la littérature.
Le procédé de l'invention permet également l'obtention de ces méristèmes foliaires néoformés dans un état entièrement transformé. Ils constituent alors un excellent matériel cellulaire pour la régénération de plantes entièrement transformées en To.
En termes généraux, l'invention fournit donc une méthode de production de méristèmes entièrement transformés, et une méthode permettant de régénérer exclusivement à partir de ces explants, des plantes entièrement transgéniques en TO.
Lorsque le latex préparé en conformité avec la présente Invention paraitra trop acide pour entrer dans la formulation de peintures, il pourra être souhaitable d'ajouter son pH à une valeur supérieure à 7, par exemple au moyen de toute matière alcaline telle que les hydroxydes de sodium, potassium ou ammonium.
La première étape du procédé selon l'invention peut être ensemencée, c'est-à-dire initiée en présence d'une émulsion préformée de particules de petite taille, ou bien non-ensemencée. La polymérisation ensemencée est préférée et permet d'obtenir des dispersions de polymère possédant des tailles de particules plus uniformes que la polymérisation non-ensemencée. Plus particulièrement on a découvert selon la présente invention qu'une amélioration très significative de la lessivabilité de peintures mates, telles que définies ci-dessus, peut être obtenue en effectuant un ensemencement dans la première étape du procédé tel que environ 80 à 98 % en poids des monomères utilisés dans la première étape sont ajoutés dans un milieu réactionnel contenant déjà une préémulsion partiellement polymérisée d'environ 2 à 20 % en poids desdits monomères et en ce que la taille moyenne des particules de polymères présentes dans ladite pré-émulsion partiellement polymérisée ne dépasse pas environ 95 nanomètres (nm), et de manière préférée 65 nm. Outre les méthodes de mesure de tailles de particules déjà évoquées précédemment, l'homme de l'art peut également contrôler que la taille moyenne des particules de polymère présentes dans la pré-émulsion partiellement polymérisée n'excède pas 95 nm soit par la durée de polymérisation dudit flux partiel (environ 5 à 20 % en poids de la totalité des composants monomériques) de pré-émulsion, qui devra de préférence ne pas dépasser environ 45 minutes ou bien par le taux global de conversion des monomères dans ledit flux partiel de pré-émulsion, qui doit atteindre au moins 50 % et de préférence au moins 90 % en poids.
Un autre objet de la présente Invention consiste en une peinture sans plastifiant et sans agent de coalescence comprenant une émulsion aqueuse de polymère du type décrit ci-dessus.
La méthode de formulation utilisée peut être l'une quelconque de celles connues jusqu'ici dans la technique de formulation des peintures au latex. Essentiellement, les peintures aqueuses selon l'invention comprennent un mélange de matière pigmentée et de latex. La matière pigmentaire est de préférence utilisée sous une forme convenablement réduite en poudre par des moyens conventionnels, ainsi que tous les autres adjuvants solides optionnels décrits ci-après.
Pour combiner les ingrédients de peinture afin de formuler la peinture au latex de la présente invention, un ou plusieurs pigments primaires et éventuellement d'autres adjuvants (qui eux-mêmes peuvent être liquides ou solides) peuvent être incorporés au liant latex pour former un mélange uniforme simplement en ajoutant toutes les matières premières dans un récipient agité. Bien qu'il soit possible de combiner les pigments et autres avec l'émulsion et de broyer ou piler le mélange dans un broyeur-disperseur, il est souhaitable de préparer d'abord une pâte aqueuse de pigment et d'adjuvants, de préférence avec l'aide d'un agent dispersant, dans un dispositif à haut gradient de cisaillement puis de combiner la pâte obtenue avec le latex. La consistance de la pâte peut être contrôlée par les quantités respectives d'eau, de pigments et d'adjuvants utilisés.
Pour formuler les peintures aqueuses de la présente invention, peuvent être utilisées - des matières de charges, se présentant sous forme pulvérulente telles que carbonate de calcium, dolomie, talc, mica, sulfate de baryum, chaux, ciment, et toutes matières de charge utilisées habituellement dans les peintures.
- des matières pigmentaires telles que oxyde de titane, noir de carbone, la phtalocyanine de cuivre, l'oxyde de zinc, les oxydes de fer, l'oxyde de chrome, et toute autre matière pigmentaire utilisée habituellement dans les peintures.
La proportion de matière pigmentaire utilisée pour formuler une peinture aqueuse selon la présente invention est déterminée par un certain nombre de facteurs, comprenant la profondeur de couleur désirée, le pouvoir couvrant, etc. En général, les peintures aqueuses de la présente invention possèdent des concentrations pigmentaires en volume dans une gamme d'environ 20 % à 95 %, selon la catégorie de peinture concernée : par exemple d'environ 70 à 95 % pour les peintures mates et d'environ 20 à 40 % pour les peintures semi-brillantes.
En complément des pigments et charges, un ou plusieurs adjuvants peuvent, si désiré, être inclus dans la formulation des peintures aqueuses de la présente invention. De tels ingrédients comprennent (mais ne se limitent pas à): - des dispersants, aussi dénommés défloculants, c'est-à-dire des composés capables d'amplifier la formation de charges électriques de même signe à la surface des particules de polymère et par conséquent de promouvoir la création de forces répulsives de nature électri - des insecticides, pesticides, fongicides et acaricides, tels que des composés pyréthrinoides (par exemple la décaméthrine ou la dieldrine), le lindane, des composés N-hétérocycliques, des composés uracyles, des dérivés de triazole, des composés organophosphorés, etc.
Le choix des adjuvants particuliers et leurs quantités respectives sont généralement dictés par les propriétés désirées pour une peinture aqueuse particulière et sont à la portée de l'homme de l'art. En général cependant, les peintures au latex de la présente invention possèdent un taux de matières solides global compris entre environ 40 et 70 % en poids.
Les peintures aqueuses de la présente invention peuvent être appliquées à la surface d'un mur ou a tout autre substrat par tout moyen conventionnel, par exemple brosse, rouleau, pistolet, etc. La peinture peut être réticulée ou séchée après application sur le substrat, également par des moyens conventionnels, par exemple séchage à l'air, cuisson, etc. Le revêtement peinture, réticulé ou non, possède d'excellentes performances en ce qui concerne la résistance au jaunissement, l'absence de craquelures à basse température et de caractère collant ou poisseux, et la coalescence à basse température. En outre, les surfaces revêtues au moyen des peintures au latex selon la présente invention se comportent bien à l'égard du rapport de contraste (c'est-à-dire le pouvoir couvrant).
Ces propriétés sont plus amplement illustrées dans les exemples suivants, présentés dans le but d'illustrer, mais non pas limiter, la présente invention. Sauf exception, toutes les quantités sont exprimées en poids.
EXEMPLES 1 a 6 Une première émulsion est préparée à température ambiante (23"C) en ajoutant les ingrédients suivants dans un récipient équipé d'un agitateur dans l'ordre suivant: Eau déminéralisée 32 parties Tensio-actif anionique commercialisé par SCHERING sous la marque REWOPOL NOS 25 (35 % actif) 0,75 partie Tensio-actif non-ionique commercialisé par SCHERING sous la marque REWOPOL HV 25 (80 % actif) 3,6 parties Acrylamide 0,2 partie Acide acrylique 1 partie Acrylate de n-butyle x parties Styrène y parties n-dodécylmercaptan 0,02 partie Dans le réacteur est chargé 5 % en poids de la première émulsion, 38 parties d'eau déminéralisée et 0,3 partie de REWOPOL NOS 25. Le réacteur est alors chauffé à 72"C puis maintenu à cette température. Dans le réacteur on ajoute alors une solution de métabisuffite (0,1 partie de métabisulfite de sodium dans 0,5 partie d'eau déminéralisée) et une solution d'initiateur (0,035 partie de persulfate d'ammonium dans 0,5 partie d'eau déminéralisée). La polymérisation est alors poursuivie pendant 15 minutes. A la semence ainsi obtenue on ajoute, pendant une durée supplémentaire de 2 heures, simultanément et progressivement dans le réacteur maintenu à la température de 72 C: - les 95 % en poids restants de la première émulsion, et une solution d'initiateur (0,315 partie de persulfate d'ammonium dans 10 parties d'eau déminéralisée).
Pendant cette première étape de polymérisation, on prépare par ailleurs à température ambiante (23"C) une seconde émulsion en ajoutant les ingrédients suivants dans un récipient équipé d'un agitateur dans l'ordre suivant: Eau déminéralisée 20 parties REWOPOL HV 25 2,8 parties Acrylamide 0,3 partie Acide acrylique 1,5 partie Acrylate de n-butyle w parties Styrène z parties n-dodécylmercaptan 0,1 partie A l'issue de la première étape de polymérisation, on ajoute dans le réacteur d'une part la seconde émulsion et d'autre part une solution d'initiateur (0,315 partie de persulfate d'ammonium dans 10 parties d'eau déminéralisée). Cette addition dure 90 minutes, à l'issue de laquelle la température est encore maintenue à 720C pendant 15 minutes supplémentaires, puis on effectue une cuisson à 800C pendant une heure. Le latex est ensuite refroidi à 60"C puis traité en lui ajoutant: - d'abord une solution de 0,315 partie de peroxyde d'hydrogène (100 % actif) dans 2,3 parties d'eau déminéralisée.
- puis une solution de 0,015 partie de sel de Mohr et de 0,315 partie d'acide ascorbique dans 1,7 partie d'eau déminéralisée, que l'on ajoute pendant une heure.
Le latex est ensuite refroidi jusqu'à 30"C puis on lui ajoute pendant une heure une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium à 10 0/o.
Dans la demande copendante n" PCT/EP93/02519, il a été montré que les adénovirus pouvaient être utilisés comme vecteur pour le transfert d'un gène étranger in vivo dans le système nerveux et l'expression de la protéine correspondante.
La présente invention concerne plus particulièrement des constructions nouvelles, particulièrement adaptées et efficaces pour le transfert des facteurs de croissance des fibroblastes basiques (bFGF).
Plus précisément, elle se rapporte à un adénovirus recombinant comprenant une séquence d'ADN codant pour le bFGF ou un de ses dérivés, sa préparation, et son utilisation pour le traitement et/ou la prévention des maladies neurodégénératives.
La demanderesse a ainsi mis en évidence qu'il est possible de construire des adénovirus recombinants contenant une séquence codant pour le bFGF, d'administrer ces adénovirus recombinants in vivo, et que cette administration permet une expression stable et localisée de quantités thérapeutiquement actives de bFGF in vivo, dans le système nerveux et en particulier dans le traitement des rétinopathies et sans effet cytopathologique.
Un premier objet de l'invention réside donc dans un adénovirus recombinant défectif comprenant au moins une séquence d'ADN codant pour tout ou une partie active du facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) ou d'un de ses dérivés.
Le facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) produit dans le cadre de la présente invention peut être le bFGF humain ou un bFGF animal. 1l peut en particulier s'agir de celui du rat.
La séquence d'ADN codant pour le bFGF, utilisée dans le cadre de la présente invention peut être un ADNc, un ADN génomique (ADNg), ou une construction hybride consistant par exemple en un ADNc dans lequel seraient insérés un ou plusieurs introns. I1 peut également s'agir de séquences synthétiques ou semisynthétiques.
De manière particulièrement avantageuse, on utilise un ADNc ou un ADNg.
Selon un mode préféré de l'invention, il s'agit une séquence d'ADNg codant pour le bFGF. Son utilisation peut permettre une meilleure expression dans les cellules humaines.
Bien entendu, préalablement à son incorporation dans un vecteur adénovirus selon l'invention, la séquence d'ADN est avantageusement modifiée, par exemple par mutagénèse dirigée, en particulier pour l'insertion de sites de restriction appropriés.
Les séquences décrites dans l'art antérieur ne sont en effet pas construites pour une utilisation selon l'invention, et des adaptations préalables peuvent s'avérer nécessaires, pour obtenir des expressions importantes.
Au sens de la présente invention, on entend par dérivé du bFGF, toute séquence obtenue par modification et codant pour un produit conservant l'une au moins des propriétés biologiques du bFGF (effet trophique et/ou différentiateur). Par modification, on doit entendre toute mutation, substitution, délétion, addition ou modification de nature génétique et/ou chimique. Ces modifications peuvent être réalisées par les techniques connues de l'homme du métier (voir techniques générales de biologie moléculaire ci-après). Les dérivés au sens de l'invention peuvent également être obtenus par hybridation à partir de banques d'acides nucléiques, en utilisant comme sonde la séquence native ou un fragment de celle-ci.
Ces dérivés sont notamment des molécules ayant une plus grande affinité pour leurs sites de fixation, des séquences permettant une expression améliorée in vivo, des molécules présentant une plus grande résistance aux protéases, des molécules ayant une efficacité thérapeutique plus grande ou des effets secondaires moindres, ou éventuellement de nouvelles propriétés biologiques.
Parmi les dérivés préférés, on peut citer plus particulièrement les variants naturels, les molécules dans lesquelles un ou plusieurs résidus ont été substitués, les dérivés obtenus par délétion de régions n'intervenant pas ou peu dans l'interaction avec les sites de liaison considérés ou exprimant une activité indésirable, et les dérivés comportant par rapport à la séquence native des résidus supplémentaires, tels que par exemple un signal de sécrétion et/ou un peptide de jonction.
Selon un mode de réalisation privilégié de l'invention, la séquence d'ADN, codant pour le bFGF ou l'un de ses dérivés, intègre également un signal de sécrétion permettant de diriger le bFGF synthétisé dans les voies de sécrétion des cellules infectées. De cette manière, le bFGF synthétisé est avantageusement libéré dans les compartiments extracellulaires et peut ainsi activer ses récepteurs. Toutefois, il peut également s'agir d'un signal de sécrétion hétérologue ou même artificiel. Dans la mesure du possible, le signal de sécrétion est avantageusement le propre signal du bFGF. Ce sera notamment le cas pour le bFGF de rat qui dispose de son propre peptide signal. En revanche, le bFGF humain n'en dispose pas.
La séquence d'ADN, codant pour tout ou partie du bFGF ou d'un de ses dérivés, peut également être une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression du bFGF. Préférentiellement, la séquence d'ADN hétérologue comporte un gène codant pour un ARN antisens capable de contrôler la traduction de l'ARNm du bFGF. La séquence antisens peut être tout ou seulement une partie de la séquence d'ADN, codant pour le bFGF, insérée dans l'orientation inverse dans le vecteur selon l'invention.
Il est également très intéressant de pouvoir faire varier le diamètre de ceux-ci en jouant sur la longueur des chaînes alkylées des tensioactifs employés.
Les matériaux selon l'invention sont susceptibles de former des supports avantageux pour une grande variété de molécules actives, notamment, en optique linéaire ou non linéaire ou en catalyse chimique.
Comme exemple de molécule active, on peut citer la méthylnitroaniline active en optique non linéaire et utilisable, par exemple pour le doublage de fréquence, quand elle est orientée.
Par ailleurs, les matériaux selon l'invention sont naturellement intéressants en couche mince, en raison de leurs caractéristiques de porosité.
L'invention concerne également un système catalytique comprenant les matériaux décrits ci-dessus, sous quelque forme que ce soit, e.g. : couche mince.
Les exemples qui suivent permettront d'illustrer mieux encore tous les caractéristiques, avantages et variantes de mise en oeuvre et/ou de réalisation du procédé et des matériaux selon l'invention.
EXEMPLES: EXEMPLE 1 : SYNTHESE D'UN MATERIAU COMPOSITE PSEUDOPOREUX A PARTIR D'UN ALCOXYDE DE SILICIUM ET D'UN TENSIOACTIF IONIQUE 1.2. Produits et méthodologie mis en oeuvre Les tensioactifs cationiques mis en oeuvre dans cet exemple sont des bromures d'alkyltriméthylammonium avec des longueurs de chaînes alkylées de 8, 10, 12 ou 14 atomes de carbone. Ces produits sont respectivement dénommés ci-après - T1 = C8 H17 (CH3)3 NBr, - T2 = C10 H21 (CH3)3 NBr, - T3 = C12 H25 (CH3)3 NBr, - T4 = C14 H29 (CH3)3 NBr.
L'élément récurrent d'alcoxyde métallique est un précurseur alcoxysilane du type tétraméthoxysilane (TMOS).
On utilise également de l'eau sans avoir recours à un cotensioactif.
Les proportions en tensioactif I TMOS / eau sont : 21 / 12 / 67 exprimées en % en poids.
On mélange ainsi de façon homogène: - 3,82gdeT1, T2, T3, T4, - et 12,03 g d'eau.
On ajoute ensuite 2,14 gr de tétraméthoxysilane à ce mélange.
Le pH du milieu réactionnel est fixé à 7 et la fraction volumique d'eau fe est de 0,853. La température est de 200 C.
Après 3 heures de réaction à température et à atmosphère ambiante, les gels de matériau composite M1 à M4 - correspondant à T1 - T4 respectivement - sont formés. Ce sont des matériaux transparents figés dans leur conformation initiale (couche mince, film ou monolithe de forme donnée).
1.2. Caractérisation structurale L'analyse du matériau M1 par diffraction rayons X aux petits angles permet de produire un diagramme repris dans la fig. 2 annexée. Ce diagramme comporte en ordonnée les unités I (U.a) correspondant à l'intensité du faisceau de rayons X diffractée exprimée en unités arbitraires et en abscisse l'unité d ( ) correspondant au paramètre de maille de la phase de cristal liquide structurante, qui se forme au sein du milieu réactionnel.
Les dispositifs utilisés dans les exemples pour les mesures de diffraction des rayons X aux petits angles et pour l'étude de la porosité sont donnés ci-après.
De tels dispersants, bien connus de l'homme du métier de l'invention, sont le plus souvent constitués d'un mélange de polyélectrolytes ou de sels d'acides polyacryliques. A titre d'exemple, on peut citer le Dolapix PC85 commercialisé par la société Zschimmer & Schwarz.
Le dopant est généralement choisi parmi les composés renfermant un métal tel que Cr ou Mg, notamment sous forme d'oxydes ou de précurseurs d'oxydes. De préférence on utilise le nitrate ou l'acétate de Cr ou de Mg.
D'une manière générale, on réalise la suspension [a] en mélangeant la matrice pulvérulente, les particules, le colloide gélifiable et le dispersant, le cas échéant le dopant, et l'eau selon les méthodes connues du domaine de l'invention.
On peut, par exemple, réaliser le mélange dans un broyeur à billes.