INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
On peut citer comme exemple de technique de transformation, le bombardement de l'explant méristématique avec des micro-particules, la mise en contact de l'explant avec Agrobacterium étant effectuée soit de manière simultanée, soit après le bombardement. Cette technique permet de réaliser un nombre élevé de micro-blessures sur l'explant, ce qui est nécessaire pour le transfert d'ADN par Agrobacterium. Dans le cas d'un bombardement et d'une transformation simultanée, les micro-particules sont enrobées d'Aqrobacterium (EP-A-0486234). De préférence, la mise en contact avec Agrobacterium est effectuée à la suite du bombardement en appliquant par exemple la technique utilisée dans EP-A-0486233. Les micro-particules sont normalement constituées d'or ou de tungstène.
Une autre technique de transformation consiste en la mise en contact de l'explant méristématique avec une suspension d'Agrobacterium. Dans ce cas, il est préférable de réaliser des blessures sur l'explant, par exemple en le coupant avec un scalpel, pour faciliter la transformation.
L'étape de transformation comprend également une période de coculture de l'explant avec l'Agrobacterium. Celle-ci a une d'une durée de 2 à 4 jours, 3 jours étant préférés. Le milieu de co-culture peut être tout milieu normalement utilisé à cette fin.
Un milieu particulièrement avantageux est le milieu M2 additionné de BAP, tel que décrit dans les exemples ci-dessous.
L'Aqrobacterium est normalement 1' Agrobacterium tumefaciens. Diverses souches peuvent être employées, par exemple la souche GV2260 ou LBA 4404. Comme vecteur, on peut citer le plasmide binaire pGA 492-GI, ou encore le p35GUS intron. Le couple "souche/vecteur" peut influencer l'efficacité de la transformation. I1 est préférable d'utiliser la souche LBA 4404 avec le vecteur pGA 492-GI.
La séquence d'acide nucléique destinée à être introduite dans les cellules végétales comporte toutes séquences susceptibles de conférer à la plante des traits d'intérêt agronomique. On peut citer comme exemple une séquence conférant une résistance aux insectes, aux herbicides ou aux maladies fongiques (par exemple Sclerotinia sclerotorium ou Botrytis cinerea, un ou plusieurs gènes de protéines de réserve de graines, ou améliorant la qualité des protéines de réserve, des séquences modifiant la maturation du fruit, des séquences conférant une résistance aux virus, un ou plusieurs ribozymes, une ou plusieurs séquences anti-sense, un ou plusieurs gènes impliqués dans le métabolisme des acides gras ou des acides aminés ou un ou plusieurs gènes impliqués dans la stérilité mâle.
En outre, la séquence hétérologue comprend également une séquence codant pour un agent permettant la sélection des transformants, par exemple un agent conférant une résistance à un antibiotique comme la kanamycine, le G418 ou la néomycine. Le vecteur comprend les séquences régulatrices nécessaires pour l'expression stable de la séquence hétérologue. Comme promoteur, on peut citer le promoteur 35S, le 35S double avec l'enhancer de traduction n ou le promoteur de l'ubiquitine provenant du tournesol. Le terminateur de NOS est particulièrement préféré.
Les étapes de transformation et de culture sélective décrites ci-dessus font partie d'un ensemble d'opérations permettant, à partir de l'explant, de régénérer des plantes transgéniques. Le procédé de l'invention, dans son ensemble, peut être résumé ainsi 1. Préparation de l'explant méristématique 2. Mise en oeuvre de l'étape de transformation de l'explant, telle que décrite ci-dessus 3. Mise en oeuvre de la série d'étapes de sélection, comme exposée ci-dessus 4. Régénération de plantes transgéniques à partir des structures obtenues à la fin des cycles de sélection.
Selon le procédé de l'invention, la préparation de l'explant méristématique consiste en une étape de préculture d'un méristème apical, ou d'un demiméristème apical, pendant 5 à 30 jours, de préférence entre 5 à 8 jours.
Le milieu de préculture est un milieu de culture cellulaire végétale additionné d'une cytokinine et plus particulièrement de la 6-Benzylaminopurine (désignée ci-après comme BAP). De préférence, le milieu est le milieu MS (Murashige-Skooq) additionné de 0.05 à 2.0 mg/l BAP, par exemple 0.1 mg/l de BAP, sans autre hormone.
Les inventeurs ont démontré que l'étape de préculture et sa durée exercent une influence importante sur le développement de l'explant.
Lorsqu'elle a une durée supérieure à 9 ou 10 jours, des bourgeons foliaires néoformés apparaissent sur les feuilles. Les pousses régénérées sur le méristème apical ont alors des feuilles qui portent des bourgeons foliaires néoformés sur l'épiderme supérieur.
Remarques I1 ne faut pas inverser tordre d'addition des solutions.
La température de travail choisie, 450C, permet à la réaction d'atteindre un plateau en 40 min.
L'intensité de l'absorbance à 586 nm (A-Ao) est une fonction linéaire de la concentration en MDA et en 4hydroxyalcénals. Elle est stable au moins deux heures.
3. Etalonnage Les solutions standards S1 et S2 permettent respectivement de réaliser des "gammes" d'étalonnage de MDA et de 4-hydroxynonénal.
Avant emploi, on dilue ces solutions au 1/100 (v/v) dans le même milieu que l'échantillon de façon à obtenir des concentrations 100 molaires.
On suit la procédure 2 ci-dessus en remplaçant l'échantillon par 0 à 200 1 de solution standard 100 fmolaire et on complète à 200 pl (qsp) de milieu.
Cette procédure couvre l'intervalle des concentrations 0 à 20 Molaires dans le milieu réactionnel final (cuve du spectrophotomètre).
Une régression linéaire des moindres carrés doit démontrer que la différence d'absorbances (A-Ao) est une fonction linéaire de la concentration en MDA et en 4hydroxynonénal. S'il n'en était pas ainsi, cela signifierait que les réactifs utilisés sont impurs ou dégradés.
Le coefficient d'extinction molaire apparent (E) du produit mesuré est égal à la pente de cette droite de régression.
La figure 1 annexée montre la cinétique de formation de l'adduit du tétraméthoxypropane (TMP) avec le 1-méthyl-2-phénylindole (MPI), lors de l'incubation à 450C avec de l'acide méthanesulfonique (réactif R2) à 15 i.
Les figures 2 et 3 fournissent des exemples de droites d'étalonnage. Elles montrent qu'on obtient le même coefficient d'extinction molaire (E) avec le MDA et le 4hydroxynonénal.
Plus précisément - la figure 2 représente la courbe d'étalonnage réalisée avec le tétraméthoxypropane qui se transforme en MDA en milieu acide, établie dans les conditions suivantes acide méthanesulfonique à 15 % (v/v), incubation à 450C pendant 40 minutes; - la figure 3 représente la courbe d'étalonnage réalisée avec le diéthylacétal du 4-hydroxynonénal qui se transforme en 4-hydroxynonénal en milieu acide, établie dans les mêmes conditions que la figure 2.
4. Calcul de la concentration.
L'équation suivante donne la concentration molaire en MDA et 4-hydroxyalcénals dans l'échantillon [MDA + 4-hydroxyalcénals] = (A-Ao) x 5 / E Remarque : Cette concentration peut également être obtenue en reportant A-Ao en ordonnée de la courbe d'étalonnage utilisée.
5. Sensibilité, précision et reproductibilité.
Sensibilité Le seuil de détection est inférieur à une concentration 0,5 fmolaire d'énaldéhyde dans le milieu réactionnel final.
On engage alors les jupes 21 et 22 de part et d'autre de la paroi 13 du boîtier selon un mouvement dirigé axialement (flèche f, figure 3). Cet engagement est facilité par la présence du chanfrein 220
au niveau de la jupe 22.
Au cours de cette manoeuvre, la jupe 22 coulisse le long de la face intérieure de la paroi 13 du boîtier, tandis que la nervure 14 prend appui sur le chanfrein 220 et opère un arcboutement de la jupe 22 dans le sens de la flèche g. Lorsque le chant de la paroi 13 rencontre le fond 20 du capuchon 2, la nervure 14 s'engage dans la rainure 221 du capuchon. La jupe 22 reprend alors sa position initiale. Il s'opère ainsi une sorte de cloquage, c'est-à-dire un engagement élastique de la nervure dans la rainure, et un contact entre la paroi interne 13 et la paroi externe 22,
lequel assure l'étanchéité de la fermeture.
De manière inattendue, on obtient, conformément à l'inven-
tion, un boîtier qui présente une résistance et une étanchéité à une
pression d'eau supérieure à 4 x 105 Pa.
Il est bien entendu possible de retirer le capuchon 2, si on le
souhaite, en effectuant une traction axiale sur celui-ci.
Dans une autre forme de réalisation, la nervure 14 pourrait être prévue sur la face extérieure de la paroi 13. Par conséquent, la rainure 221 serait prévue non pas sur la jupe 22 mais sur la jupe 21, au niveau de sa
paroi interne.
Dans encore un autre mode de réalisation, la jupe 21 est absente. Aux figures 5 et 6, un autre mode de réalisation conforme à l'invention est représenté. Le capuchon 3 est formé par moulage d'une
matière plastique semi-rigide, telle que du polypropylène.
Sa paroi de fond circulaire 30 a la forme générale d'une assiette renversée avec des parties centrale et extérieure 300, 302 planes,
et séparées par une zone de transition galbée 301.
La périphérie de ce fond est pourvue d'un bourrelet 303. Sur la face externe de la paroi de fond 30 sont prévues, sensiblement dans la région de raccordement de la partie centrale 300 et de la zone 301, des nervures 304. Elles sont par exemple au nombre de huit et réparties régulièrement sur la surface du capuchon. Leur rôle est de donner au capuchon une certaine rigidité, tout en conservant entre les nervures 304 la souplesse nécessaire au montage dont les caractéristiques vont être
Caractéristiques physiques *RMN 1H (DMSO-d6) 7,08 ppm (d, 1H, J=1 Hz); 7,27 ppm (m, 2H); 7,40 ppm (d, 1H, J=7 Hz); 7,51 ppm (t, 2H, J=7,5 Hz); 7,85 ppm (s, 1H); 7,878,09 ppm (m, 4H); 8,07 ppm (s, 1H); 11,54 ppm (sl, 1H).
* SM (IE, 70eV) 243 (100, M+) ; 215 (18); 139 (38); 87 (13); 77 (25); 63 (14) 1-Méthyl-2-phénylbenz(f)indole indole Ce composé est préparé à partir du 2-phényl-1 (H) - benz(f)indole par alkylation, comme décrit dans la procédure 1.
Rendement : 72 %.
Caractéristiques physiques * RMN 1H (DMSO-d6) 3,85 ppm (s, 3H); 6,75 ppm (s, 1H); 7,33 ppm (m, 2H); 7,477,62 ppm (m, 3H); 7,65-7,72 ppm (m, 2H); 7,91-8,02 ppm (m, 3H); 8,13 ppm (s, 1H).
* SM (IE,70 eV) 257 (100, M+); 215 (12); 77 (11) II. Exemple de mise en oeuvre du procédé selon l'invention Exemple 13 : Dosage colorimétrique de la peroxydation lipidique en utilisant le 1-méthyl-2-phénylindole (composé de l'exemple 5) Le 1-méthyl-2-phénylindole (appelé ci-après "réactif chromogène R1" ou plus simplement "réactif R1") réagit avec le MDA et les 4-hydroxyalcénals à 450C. La condensation d'une molécule de MDA ou de 4-hydroxyalcénal avec deux molécules de réactif R1 produit un chromophore stable dont la longueur d'onde d'absorbance maximale, caractéristique du réactif R1, est égale à 586 nm.Pour cette raison, cette méthode sera appelée ci-après "méthode LPO-586".
Dans le cas du MDA, ce chromophore a pour formule
X-= Cl- ;CH3SO3- La méthode LPO-586 permet un dosage spécifique du MDA et des 4-hydroxyalcénals sur une prise d'essai d'échantillon aqueux. Sa simplicité de mise en oeuvre est particulièrement bien adaptée à la mesure de la peroxydation lipidique sur de grandes séries d'échantillons.
La plupart des interférences connues pour d'autres méthodes de dosage colorimétrique sont éliminées dans la méthode LPO-586, ce qui se traduit par une spécificité et une sensibilité très supérieures.
Une variante de la méthode LPO-586 permet de mesurer spécifiquement la quantité de MDA dans un échantillon contenant des 4-hydroxyalcénals (voir plus loin).
Le mesure spécifique de ces deux paramètres dans un même échantillon permet d'évaluer l'éventuelle origine enzymatique du MDA (biosynthèse du thromboxane, par exemple) Les principaux réactifs utilisés pour la mise en oeuvre de cette méthode peuvent être rassemblés dans un coffret (sous forme de nécessaire ou kit).
Un tel coffret peut par exemple contenir les quantités de réactifs permettant d'effectuer 100 dosages, à savoir Réactif R1 : solution du réactif chromogène R1 10,3 mmolaire dans l'acétonitrile; (3 x 18 ml).
Réactif R2 : acide méthanesulfonique 10,4 molaire; (3 x 5,5 ml) contenant le cas échéant du chlorure ferrique 34 Molaire.
Solution standard S1 : solution de 1,1,3,3tétraméthoxypropane 10 mmolaire dans du tampon Tris-HCl 20 mmolaire, pH 7,4; (1 ml).
Solution standard S2 : solution de diéthylacétal du 4hydroxynonénal 10 mmolaire dans l'acétonitrile (1 ml).
Note : le 1,1,3,3-tétraméthoxypropane et le diéthylacétal du 4-hydroxynonénal se transforment, en milieu acide, respectivement en MDA et 4-hydroxynonénal.
Toutes ces solutions doivent être conditionnées en flacons hermétiquement fermés et doivent être conservées entre +4 et +100C jusqu'à la date de péremption indiquée sur l'étiquette du coffret. Elles ne doivent pas être congelées.
Selon cette variante de l'invention, il est possible, avant l'étape de transformation, d'exciser les bourgeons foliaires néoformés ou même simplement de prélever des morceaux de feuille, et de les utiliser dans l'étape de transformation. Selon ce mode de réalisation de l'invention, l'explant méristématique soumis à la transformation peut donc être constitué soit par une partie d'une feuille obtenue après au moins 9 jours de préculture susceptible de donner des bourgeons foliaires néoformés, soit par des bourgeons foliaires néoformés excisés.
Dans le cas où la préculture dure entre 5 et 12 jours, le méristème apical sert normalement directement d'explant méristématique dans l'étape de transformation. Dans ce cas, les bourgeons foliaires néoformés sont induits pendant l'étape de préculture proprement dite, mais n'apparaissent qu'au cours du développement ultérieur, par exemple pendant la coculture ou pendant la culture sur milieu sélectif.
Selon l'invention, le même milieu de culture peut être utilisé pour les étapes de préculture, de coculture et de sélection. Ce milieu est de préférence le milieu MS additionné de BAP à une concentration de 0.05 à 2.0 mg/l, de préférence 0.1 mg/l. Normalement, la BAP est la seule phyto-hormone présente dans le milieu. En particulier, il est préférable que ce milieu ne contienne ni d'acide gibbéréllique ni d'acide indolacétique, particulièrement lorsqu'il s'agit du milieu de préculture. Le milieu peut également être additionné, pendant les étapes de préculture et de co-culture, d'un composé phénolique, par exemple, l'acétosyringone, capable d'activer les gènes vir d'Aqrobacterium. Une concentration d'environ 200 UM est appropriée. Pour l'étape de culture sélective, le milieu contient au moins un agent sélectif, avantageusement la kanamycine, à une concentration comprise entre 50 et 200 mg/l, de préférence 50 mg/l, et éventuellement, des agents bactériostatiques.
Les méristèmes apicaux sont obtenus par la germination de graines mûres décortiquées et stérilisées. Le procédé de germination consiste typiquement en la mise en culture des graines sur un milieu de germination, de préférence solidifié, par exemple le milieu MS dont les macro- et micro-éléments ont été éventuellement réduits par moitié. La germination a une durée comprise entre 2 à 4 jours, de préférence 4 jours, à 25"C de préférence avec une photo-période de 16 heures environ.
Après les étapes de préculture, de transformation et de sélection, une étape de régénération est effectuée à partir des bourgeons et des pousses entièrement transformés. Les milieux de culture et les conditions sont ceux habituellement appliqués dans l'art pour l'espèce en question. Pour le tournesol, les conditions de régénération sont indiquées dans les exemples ci-dessous.
Outre le procédé de production de plantes transgéniques décrit ci-dessus, l'invention vise également les bourgeons foliaires néoformés et les méristèmes secondaires entièrement transformés obtenus au cours du procédé. Elle vise également les plantes transgéniques entièrement transformées en génération To obtenues à partir des explants méristématiques.
Le procédé de l'invention présente de nombreux avantages. I1 est notamment, plus efficace que les techniques de l'art antérieur puisque la régénération n'est effectuée que si l'explant est entièrement transformé. Les techniques existantes impliquaient, en revanche, la régénération de tous les méristèmes ayant subi l'opération de transformation, suivie de la sélection, parmi les plantes chimériques obtenues, de celles dont la lignée germinale avait été transformée.
Le procédé de l'invention permet donc un gain de temps et de moyens important.
De plus, le rendement, en plantes transgéniques, obtenu selon ce procédé est considérablement plus élevé que celui obtenu selon les techniques antérieures. Par exemple, pour le tournesol, 92 % des plantes régénérées donnent au moins une plante transgénique dans la descendance (tableau 8 cidessous). Ce chiffre est à comparer à 0.2 % à 2 % rapporté par Bidney et al, Plant Molecular Biol. 18, 301-313, 1992.
Le procédé de l'invention s'applique à de nombreuses espèces végétales et plus particulièrement aux dicotylédons, notamment à celles qui sont difficiles à transformer et à régénérer. On citera comme exemple le coton, le soja, les espèces végétales oléagineuses, par exemple le tournesol, les espèces appartenant à la famille des légumineuses, par exemple le pois, le haricot ou encore les espèces appartenant à la famille des cucurbitacées, par exemple la courgette. Au sein de ces espèces, de nombreux génotypes différents peuvent être employés. Le tournesol est particulièrement préféré.
Différents aspects de l'invention sont illustrés dans les figures La figure 1 montre le protocole de transformation de feuilles issues de demi-méristèmes pour l'analyse de l'expression de la Glucuronidase dans les pousses axillaires régénérées à partir de bourgeons foliaires néoformés.
La figure 2 montre le protocole de transformation de demi-méristèmes pour l'analyse de l'expression de la Glucuronidase.
La figure 3 montre la sélection de pousses axillaires transformées à partir de bourgeons foliaires néoformés sur les feuilles ou à partir de demi-méristèmes.
La figure 4 montre la régénération de plantes transformées.
Exemple 1 : Transformation de feuilles issues de demi-méristèmes pour l'analyse de l'expression de la glucuronidase dans les pousses régénérées à partir de bourgeons foliaires néoformés (Figure 1).
1.1 - Préparation des demi-méristèmes Les graines de tournesol (Helianthus annuus) des lignées (Ha300, RHa 274, RHa 297, RHa 356, RHa 359, RHa 362), deux populations LG60 et LG61 dérivées de croisements interspécifiques avec Helianthus petiolaris, et plusieurs lignées fournies par LIMAGRAIN GENETICS (Les Alleuds) sont utilisées pour ces expériences. Les graines sont décortiquées pour éliminer les téguments, puis stérilisées pendant 20 minutes dans de l'eau de javel à 12 de chlore additionnée de 1 ml/l de Tween 80. Les graines décortiquées sont ensuite rincées 5 fois à l'eau distillée stérile. Les graines sont ensuite mises à tremper 1 heure dans de l'eau distillée stérile, puis la pellicule recouvrant la graine est éliminée. Les graines nues sont à nouveau stérilisées 2 minutes dans de l'eau de javel à 6 chlore, rincées 3 fois à l'eau distillée stérile et séchées sur papier filtre dans la hotte à flux laminaire. Les graines sèches sont ensuite mises à germer sur le milieu MO : macroéléments, micro-éléments, Fe-EDTA et vitamines du milieu MS (Murashige et Skoog, 1962 - Physiologia Plantarum, 15 : 473-497) additionné de 10 g/l de saccharose, de 7 g/l d'agar-agar, pH 5,8 ; et mises à germer dans une chambre de culture à 26 avec 16 h de lumière (50 b Einstein / m2 d'intensité lumineuse), pendant deux jours. Les graines germées sont prélevées, les cotylédons et les radicules sont éliminés ainsi que la partie apicale de l'apex. Le cylindre de quelques millimètres de diamètre ainsi obtenu est ensuite coupé en deux moitiés dans l'axe des insertions cotylédonaires. Cet explant contenant un demi-méristème apical est appelé demi-méristème.
découpures.
Il y a également un procédé selon lequel on n'utilise pas différents moules métalliques mais un noyau permettant de mouler suivant un signal un moule métallique mais dans ce cas le noyau est compliqué et ainsi, les dépenses sont élevées tout comme dans le cas o on utilise plusieurs
Un autre problème est celui de la garde dt de la
Les récipients ne diffèrent seulement que pour les positions et les formes des parties découpées et dans les autres parties ils sont entièrement de la même forme, ce qui-fait qu'une sélection erronée par l'opérateur peut survenir. Un autre problème important est le chargement incorrect de l'encre qui provient de la mauvaise sélection
Selon un troisième mode de réalisation particulier, la cellule étant munie d'un tube de craquage prévu pour dissocier les molécules susceptibles de se trouver dans la vapeur du matériau, le dispositif comprend en outre - un raccord tubulaire qui relie le creuset au tube de craquage et permet à la vapeur de passer du creuset à ce tube, et - des moyens de chauffage prévus pour porter l'intérieur du raccord tubulaire à une température supérieure à celle à laquelle est porté le creuset, et les moyens de mesure sont placés dans le raccord tubulaire.
Lors de l'utilisation simultanée d'une pluralité de cellules d'évaporation, ces trois modes de réalisation particuliers conduisent, pour chacune de ces cellules, équipée de ses propres moyens de mesure, à la mesure d'une pression équivalente à un flux qui est peu sensible aux flux des autres cellules.
Selon un mode de réalisation préféré du dispositif objet de l'invention, les moyens de mesures comprennent une jauge d'ionisation prévue pour fournir, aux moyens de commande, le signal représentatif de la pression partielle de la vapeur du matériau.
Une telle jauge, en particulier une jauge d'ionisation à cathode chaude, permet une mesure continue du flux émis et est bien adaptée aux valeurs des pressions partielles équivalentes aux flux que piton rencontre dans la technique d'épitaxie par jets moléculaires, pressions qui sont typiquement comprises entre 10-5 et 10-2 Pa.
De plus, une jauge d'ionisation à cathode chaude est un instrument de mesure très fiable qui ne présente quasiment aucune dérive, contrairement à d'autres appareils tels que les spectromètres de masse quadripolaires mentionnés plus haut.
Selon un mode de réalisation particulier du dispositif objet de l'invention, la vanne est une vanne à pointeau, ce pointeau étant déplaçable en translation pour modifier l'ouverture du creuset, et les moyens de réglage sont prévus pour déplacer le pointeau en translation.
Dans une réalisation particulière du dispositif objet de l'invention, ce dispositif étant destiné à la régulation des flux issus d'une pluralité de cellules d'évaporation de matériaux solides, ce dispositif comprend - pour chaque cellule, des moyens de mesure de la pression partielle de la vapeur du matériau que le creuset de cette cellule est destiné à contenir, ces moyens de mesure étant aptes à fournir un signal représentatif de cette pression partielle, et des moyens de réglage de la vanne de cette cellule, et - des moyens de commande des moyens de réglage de chaque cellule, ces moyens de commande étant reliés aux moyens de mesure de chaque cellule et prévus pour faire varier les flux des matériaux de manière prédéterminée en fonction des signaux fournis par les moyens de mesure associés aux cellules.