INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Avantageusement, la séquence codant pour le bFGF est placée sous le contrôle de signaux permettant son expression dans les cellules nerveuses dont en particulier les cellules rétiniennes. Préférentiellement, il s'agit de signaux d'expression hétérologues, c'est-à-dire de signaux différents de ceux naturellement responsables de l'expression du bFGF. 1l peut s'agir en particulier de séquences responsables de l'expression d'autres protéines, ou de séquences synthétiques. Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule que l'on désire infecter. De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, y compris l'adénovirus utilisé. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs E1A, MLP, CMV, LTR-RSV, etc. En outre, ces séquences d'expression peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu-spécifique. I1 peut en effet être particulièrement intéressant d'utiliser des signaux d'expression actifs spécifiquement ou majoritairement dans les cellules nerveuses, de manière à ce que la séquence d'ADN ne soit exprimée et ne produise son effet que lorsque le virus a effectivement infecté une cellule nerveuse. A cet égard, on peut citer par exemple les promoteurs de l'énolase neurone-spécifique, de la GFAP, et plus particulièrement ceux de la rodopsine et de la tyrosinase.
Dans un premier mode de réalisation particulier, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le facteur de croissance des fibroblastes basiques humain (hbFGF) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
L'invention se rapporte également à un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le facteur de croissance des fibroblastes basiques humain (hbFGF) sous le contrôle du promoteur de la rhodopsine ou de la tyrosinase ainsi qu'à un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNc codant pour le facteur de croissance des fibroblastes basiques du rat (bFGF) sous le contrôle du promoteur de la rhodopsine ou de la tyrosinase.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADNg codant pour le facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) sous le contrôle du promoteur LTR-RSV.
La demanderesse a en effet montré que le promoteur LTR du virus du sarcome de rous (RSV) permettait une expression durable et importante du bFGF dans les cellules du système nerveux, notamment central.
Toujours dans un mode préféré, l'invention concerne un adénovirus recombinant défectif comprenant une séquence d'ADN codant pour le facteur neurotrophique bFGF sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans le système nerveux.
Un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre de la présente invention réside dans un adénovirus recombinant défectif comprenant les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, une séquence d'ADN codant pour le facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF) ou un dérivé de celuici sous le contrôle d'un promoteur permettant une expression majoritaire dans le système nerveux, et dans lequel le gène El et au moins un des gènes E2, M, L1-L5 est non fonctionnel.
Les adénovirus défectifs selon l'invention sont des adénovirus incapables de se répliquer de façon autonome dans la cellule cible. Généralement, le génome des adénovirus défectifs utilisés dans le cadre de la présente invention est donc dépourvu au moins des séquences nécessaires à la réplication dudit virus dans la cellule infectée.
Ces régions peuvent être soit éliminées (en tout ou en partie), soit rendues nonfonctionnelles, soit substituées par d'autres séquences et notamment par la séquence d'ADN codant pour le bFGF.
Préférentiellement, le virus défectif de l'invention conserve les séquences de son génome qui sont nécessaires à ltencapsidation des particules virales. Encore plus préférentiellement, comme indiqué ci-avant, le génome du virus recombinant défectif selon l'invention comprend les séquences ITR, une séquence permettant l'encapsidation, le gène El non fonctionnel et au moins un des gènes E2, E4, L1-L5 non fonctionnel. ll existe différents sérotypes d'adénovirus, dont la structure et les propriétés varient quelque peu. Parmi ces sérotypes, on préfère utiliser dans le cadre de la présente invention les adénovirus humains de type 2 ou 5 (Ad 2 ou Ad 5) ou les adénovirus d'origine animale (voir demande FR 93 05954). Parmi les adénovirus d'origine animale utilisables dans le cadre de la présente invention on peut citer les adénovirus d'origine canine, bovine, murine, (exemple: Mavl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovine, porcine, aviaire ou encore simienne (exemple : SAV). De préférence, l'adénovirus d'origine animale est un adénovirus canin, plus préférentiellement un adénovirus CAV2 [souche manhattan ou A26/61 (ATCC VR800) par exemple]. De préférence, on utilise dans le cadre de l'invention des adénovirus d'origine humaine ou canine ou mixte.
Les adénovirus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être préparés par toute technique connue de l'homme du métier (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). En particulier, ils peuvent être préparés par recombinaison homologue entre un adénovirus et un plasmide portant entre autre la séquence d'ADN codant pour le bFGF. La recombinaison homologue se produit après co-transfection desdits adénovirus et plasmide dans une lignée cellulaire appropriée. La lignée cellulaire utilisée doit de préférence (i) être transformable par lesdits éléments, et (ii), comporter les séquences capables de complémenter la partie du génome de l'adénovirus défectif, de préférence sous forme intégrée pour éviter les risques de recombinaison. A titre d'exemple de lignée, on peut mentionner la lignée de rein embryonnaire humain 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59) qui contient notamment, intégrée dans son gnome, la partie gauche du génome d'un adénovirus Ad5 (12 %). Des stratégies de construction de vecteurs dérivés des adénovirus ont également été décrites dans les demandes n" FR 93 05954 et FR 93 08596 qui sont incorporées à la présente par référence.
Ensuite, les adénovirus qui se sont multipliés sont récupérés et purifiés selon les techniques classiques de biologie moléculaire, comme illustré dans les exemples.
Les propriétés particulièrement avantageuses des vecteurs de l'invention découlent notamment de la construction utilisée (adénovirus défectif, délété de certaines régions virales), du promoteur utilisé pour l'expression de la séquence codant pour le bFGF (promoteur viral ou tissu-spécifique de préférence), et des méthodes d'aministration dudit vecteur, permettant l'expression efficace et dans les tissus appropriés du bFGF. La présente invention fournit ainsi des vecteurs viraux utilisables directement en thérapie génique, particulièrement adaptés et efficaces pour diriger l'expression du bFGF in vivo. La présente invention offre ainsi une nouvelle approche particulièrement avantageuse pour le traitement et/ou la prévention des maladies neurodégénératives.
La présente invention concerne également toute utilisation d'un adénovirus tel que décrit ci-dessus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention des maladies neurodégénératives. Plus particulièrement, elle concerne toute utilisation de ces adénovirus pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée au traitement et/ou à la prévention de la maladie de Parkinson, de la maladie d'Alzheimer, de la sclérose latérale amyotrophique (ALS), de la maladie d'Huntington, de l'épilepsie, de la démence vasculaire et également des rétinopathies.
En ce qui concerne plus particulièrement les rétinopathies, il peut s'agir de toute dégénérescence rétiniaire, centrale, périphérique ou mixte, ainsi que toute rétinopathie, acquise ou non, et en particulier les rétinopathies diabétiques.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits précédemment. Ces compositions pharmaceutiques peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, les compositions pharmaceutiques de l'invention contiennent un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe dans le système nerveux du patient. n peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. L'injection directe dans le système nerveux du patient est avantageuse car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. L'injection directe dans le système nerveux central du patient est avantageusement réalisée au moyen d'un appareil d'injection stéréotaxique. L'emploi d'un tel appareil permet en effet de cibler avec une grande précision le site d'injection.
L'invention vise des dispositifs qui compren- nent un corps destiné à être fixé sur le véhicule, un voyant fixé sur le corps, et constitué d'un cabochon translucide, une douille fixée sur le corps et destinée à recevoir une lampe d'éclairage, et des connexions permettant de relier
la douille à un circuit d'alimentation.
Un tel dispositif est relativement complexe
et, par conséquent, cher.
L'un des buts de la présente invention est de réaliser un dispositif répondant au même but et qui soit
beaucoup plus simple et beaucoup moins onéreux.
Le dispositif de signalisation, objet de l'in-
vention, est du type comprenant un corps pourvu d'une em-
base destinée à être fixée à une paroi du véhicule, au moins une lampe et un voyant translucide masquant la lampe, des
contacts pour coopérer avec les contacts de la lampe, le-
dit dispositif étant caractérisé en ce que le corps est
moulé en une seule pièce en incluant une partie de la lam-
pe et les contacts sont destinés à coopérer avec ceux de
ladite lampe. Grâce à cette disposition, on réalise un dis-
positif de signalisation très peu onéreux qui constitue un élément jetable et remplaçable par un autre lorsque la
lampe ne fonctionne plus.
A la sortie du dépôt des fibres floquées, des cylindres de battage puis un aspirateur éliminent les fibres non fixées par la colle.
Le film ainsi floqué subit un traitement thermique pour effectuer le séchage et la réticulation de la colle.
Dans le cas d'un flocage double face, le même traitement est ensuite effectué sur l'autre face.
Le matériau ainsi obtenu, parfaitement symétrique, présente un grammage de 330 g/m2 (dont 175 g de film polyester et 155 g de colle + fibres floqu ées).
Enduction des couches floauees Un polyamide-imide résultant de la polycondensation d'anhydride trimellique et de 2,4 toluènediisocyanate est préparé dans la diméthyléthylène urée (Extrait sec : 27 % - viscosité 280 poises à 25"C), selon le procédé décrit dans le brevet européen N" 0360707.
Deux solutions dans la diméthyléthylène urée de la résine ci-dessus sont préparées: Solution Ai : viscosité 85 Poises à 30"C Solution A2 : viscosité 3,2 poises à 30"C.
Les couches floquées du matériau composite obtenu précédemment sont enduites par les solutions Al et A2.
L'enduction est réalisée par immersion du film floquée dans un bac contenant la solution puis essorage du matériau enduit entre 2 rouleaux pressés l'un contre l'autre par des ressorts réglables.
En sortie d'essorage, le matériau enduit est immergé dans l'eau, provoquant la coagulation de la solution de polyamide-imide, puis lavé sous un léger courant d'eau pour extraire le résidu de solvant retenu par la résine.
A ce stade le matériau traité par enduction-coagulation a un touché sec et solide mais contient en fait des traces de solvant et un certain pourcentage d'eau . Ces éléments (solvant et eau) assurent une certaine plastification du polyamide-imide.
Sur cet état plastifié, il est possible de procéder à une densification du produit par pressage ou calandrage.
II est possible également d'obtenir cette densification par simple séchage du matériau à une température voisine de 100"C pour éliminer l'eau piégée.
Cette élimination de l'eau provoque un retrait de la résine d'enduction dans le sens de l'épaisseur.
Les caractéristiques des matériaux composites ainsi obtenus sont données dans le tableau I ci-dessous: Tableau I
N essai Solution Pression de Epaisseur pm passage 1 1 A2 non pressé 0,98 2 Al non pressé 1,06 3 A2 70 bars 0,56 4 Al 70 bars 0,78 5 1 A2 1 250 bars 0,43 6 Al 250 bars 0,55 Les quantités de résine retenues sont - 230 g/m2 avec la solution Al - 185 g/m2 avec la solution A2 Une enduction coagulation a été réalisée avec la résine de l'essai précédent mais après une dilution pour obtenir une solution présentant une viscosité de 34 poises à 30 C (solution C1).
A partir d'une résine polyimide-amide résultant de la condensation de 100 moles de 2-4 toluènediisocyanate, de 20 moles d'anhydride trimellique, de 76 moles d'acide téréphtalique et 4 moles de dicarboxy 1,3 benzène sulfonate de sodium, dans la DIEU, on prépare une solution par dilution dans la DMEU pour atteindre une viscosité de 25 poises à 30 C (solution C2).
Suivant un détail particulier, l'embase, sur sa face destinée à recevoir le voyant, comporte, venue de
moulage, un rebord contre lequel est soudé le bord corres-
pondant du voyant.
Suivant une variante de réalisation, l'embase, sur sa face destinée à recevoir le voyant, comporte, venue
de moulage, une saillie continue pourvue d'une gorge, tan-
dis que le bord interne correspondant du voyant est pourvu d'un bourrelet pour permettre son montage par emboîtement élastique.
Suivant une caractéristique constructive, l'em-
base, sur sa face opposée à celle pourvue du voyant, comporte, venu de moulage, au moins un voile pourvu d'une saillie de retenue et, décalée angulairement, au moins d'une patte élastique présentant un épaulement. On réalise ainsi un
dispositif simple à monter sur une paroi dans une ouvertu-
re de celle-ci.
Suivant encore une variante de réalisation, le corps comporte, sur son embase, une série de lampes, une série de contacts étant prévus pour coopérer avec les contacts des lampes et reliés à des pistes conductrices noyées dans le corps lors du moulage et aboutissant à des
languettes destinées à recevoir une prise reliée à une sour-
ce de courant.
les contacts destinés à coopérer avec les contacts des lam-
pes font saillie, par leur extrémité, sur l'une des faces de l'embase et sont reliés à des pistes fixées à ladite embase. Enfin, les pistes comportent des pattes pour
A cet égard, l'invention concerne également une méthode de traitement des maladies neurodégénératives comprenant l'administration à un patient d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant. Plus particulièrement, l'invention concerne une méthode de traitement des maladies neurodégénératives comprenant l'administration stéréotaxique d'un adénovirus recombinant tel que défini ci-avant.
Les doses d'adénovirus recombinant défectif utilisées pour l'injection peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée. D'une manière générale, les adénovirus recombinants selon l'invention sont formulés et administrés sous forme de doses comprisses entre 104 et 1014 pfu/ml, et de préférence 106 à 1010 pfu/ml. Le terme pfu ("plaque forcing unit") correspond au pouvoir infectieux d'une solution de virus, et est déterminé par infection d'une culture cellulaire appropriée, puis mesure, généralement après 48 heures, du nombre de plages de cellules infectées. Les techniques de détermination du titre pfu d'une solution virale sont bien documentées dans la littérature.
Un autre objet de l'invention concerne toute cellule de mammifère infectée par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs tels que décrits ci-dessus. Plus particulièrement, l'invention concerne toute population de cellules humaines infectée par ces adénovirus. n peut s'agir en particulier de fibroblastes, myoblastes, hépatocytes, kératinocytes, cellules endothéliales, cellules Gliales, etc.
Les cellules selon l'invention peuvent être issues de cultures primaires. Cellesci peuvent être prélevées par toute technique connue de l'homme du métier, puis mises en culture dans des conditions permettant leur prolifération. S'agissant plus particulièrement de fibroblastes, ceux-ci peuvent être aisément obtenus à partir de biopsies, par exemple selon la technique décrite par Ham [Methods Cell.Biol. 21a (1980) 255]. Ces cellules peuvent être utilisées directement pour l'infection par les adénovirus, ou conservées, par exemple par congélation, pour l'établissement de banques autologues, en vue d'une utilisation ultérieure. Les cellules selon l'invention peuvent également être des cultures secondaires, obtenues par exemple à partir de banques préétablies.
Les cellules en culture sont ensuite infectées par des adénovirus recombinants, pour leur conférer la capacité de produire du bFGF. L'infection est réalisée in vitro selon des techniques connues de l'homme du métier. En particulier, selon le type de cellules utilisé et le nombre de copies de virus par cellule désiré, l'homme du métier peut adapter la multiplicité d'infection et éventuellement le nombre de cycles d'infection réalisé. 11 est bien entendu que ces étapes doivent être effectuées dans des conditions de stérilité appropriées lorsque les cellules sont destinées à une administration in vivo. Les doses d'adénovirus recombinant utilisées pour l'infection des cellules peuvent être adaptées par l'homme du métier selon le but recherché. Les conditions décrites ci-avant pour l'administration in vivo peuvent être appliquées à l'infection in vitro.
La présente invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant une quantité suffisante de virus recombinant défectif tel que décrit précédemment.
Selon un mode de réalisation privilégié de l'invention, ces compositions sont tout particulièrement adaptées à un traitement des rétinopathies.
En particulier, le virus recombinant défectif peut être sous forme de solution injectable, de collyre, de pommade ophtalmique, etc. Les véhicules pharmaceutiquement acceptables pour de telles formulations adaptées à un usage oculaire sont notamment des solutions salines (phosphate monosodique, disodique, clrorure de sodium, potassium, calcium ou magnésium, etc, ou des mélanges de tels sels), la vaseline, l'huile de vaseline, etc.
Dans le cas de collyres ou de pommades ophtalmiques, il est entendu que les applications thérapeutiques peuvent être plus limitées en raison d'une diffusion plus faible du virus recombinant défectif.
Dans leur utilisation pour le traitement des pathologies oculaires, les virus recombinants défectifs selon l'invention peuvent être administrés selon différents modes, et notamment par injection sousrétinale, éventuellement précédée d'une vitrectomie, ou par injection intravitreuse, simples ou multiples. L'injection sousrétinale peut être réalisée sélectivement dans différents compartiments de l'oeil, et notamment, l'injection peut être réalisée au niveau du vitré, de la chambre anterieure ou de l'espace rétrobulbaire. Ces différents modes d'injection permettent d'infecter de manière ciblée les différents tissus de l'oeil, et notamment, l'endothélium cornéen, les cellules photoréceptrices, les cellules bipolaires, les cellules ganglionaires ou encore les cellules des muscles oculomoteurs.
Un autre objet de l'invention concerne un implant comprenant des cellules mammifère infectées par un ou plusieurs adénovirus recombinants défectifs telles que décrites ci-dessus, et une matrice extracellulaire. Préférentiellement, les implants selon l'invention comprennent 105 à 1010 cellules. Plus préférentiellement, ils en comprennent 106 à 108.
Plus particulièrement, dans les implants de l'invention, la matrice extracellulaire comprend un composé gélifiant et éventuellement un support permettant l'ancrage des cellules.
Pour la préparation des implants selon l'invention, différents types de gélifiants peuvent être employés. Les gélifiants sont utilisés pour l'inclusion des cellules dans une matrice ayant la constitution d'un gel, et pour favoriser l'ancrage des cellules sur le support, le cas échéant. Différents agents d'adhésion cellulaire peuvent donc être utilisés comme gélifiants, tels que notamment le collagène, la gélatine, les glycosaminoglycans, la fibronectine, les lectines, etc. De préférence, on utilise dans le cadre de la présente invention du collagène. n peut s'agir de collagène d'origine humaine, bovine ou murine. Plus préférenciellement, on utilise du collagène de type I.
Comme indiqué ci-avant, les compositions selon l'invention comprennent avantageusement un support permettant l'ancrage des cellules. Le terme ancrage désigne toute forme d'interaction biologique et/ou chimique et/ou physique entraînant l'adhésion et/ou la fixation des cellules sur le support. Par ailleurs, les cellules peuvent soit recouvrir le support utilisé, soit pénétrer à l'intérieur de ce support, soit les deux.
On préfère utiliser dans le cadre de l'invention un support solide, non toxique et/ou bio-compatible. En particulier, on peut utiliser des fibres de polytétrafluoroéthylène (YwE) ou un support d'origine biologique.
Les implants selon l'invention peuvent être implantés en différents sites de l'organisme. En particulier, l'implantation peut être effectuée au niveau de la cavité péritonéale, dans le tissu sous-cutané (région sus-pubienne, fosses iliaques ou inguinales, etc), dans un organe, un muscle, une tumeur, le système nerveux central, ou encore sous une muqueuse. Les implants selon l'invention sont particulièrement avantageux en ce sens qu'ils permettent de contrôler la libération du produit thérapeutique dans l'organisme: Celle-ci est tout d'abord déterminée par la multiplicité d'infection et par le nombre de cellules implantées. Ensuite, la libération peut être contrôlée soit par le retrait de l'implant, ce qui arrête définitivement le traitement, soit par l'utilisation de systèmes d'expression régulable, permettant d'induire ou de réprimer l'expression des gènes thérapeutiques.
On peut préparer un composé de formule (I) dans lequel R4 est un groupe amino par action d'une solution d'HBr dans l'AcOH sur un composé (I) dans lequel R4 est un groupe méthoxycarbonylamino.
Les composés de formule (I) dans lesquels R1 et/ou R6 représente un alcoxy en C1-C7 peuvent être préparés directement par le procédé selon l'invention à partir des composés de formule (II), (III) ou (IV) correctement substitués.
Les composés (I') dans lesquels R'1 et/ou R6 représente un hydroxyle permettent également de préparer des composés (I) dans lesquels R1 et/ou R6 est un alcoxy en C1-C7 par action d'un halogénure d'alkyle en C1-C7 en présence d'une base telle qu'un hydrure métallique ou un carbonate alcalin ou alcalino-terreux comme K2C03 ou Cs2CO3, dans un solvant tel que le TMF ou le DMF.
Les composés (I') dans lesquels R'1 et/ou R6 est un hydroxyle peuvent être obtenus par hydrogénation catalytique, par exemple, en présence de palladium sur charbon, d'un composé de formule (I') dans lequel R'1 et/ou R6 est un benzyloxy. Ces composés peuvent également être préparés à partir de composés analogues de formule (I') dans lesquels R'1 et/ou R6 représente un groupe amino en utilisant la méthode décrite dans J. Org. Chem., 1977, , 2053.
Un composé de formule (I) dans lequel R6 est un groupe nitro permet d'obtenir par hydrogénation catalytique, par exemple en présence d'oxyde de platine ou de nickel de RaneyB, ou par réduction chimique, par exemple en présence d'étain ou de fer en milieu acide, un composé (I) dans lequel R6 est un groupe amino ; on peut ensuite préparer d'autres composés dans lesquels le groupe amino est substitué en utilisant des réactions bien connues de l'homme de l'art.