INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
simplification, sont de préférence régulièrement répartis selon un motif prédéterminé, par exemple en carré, en rectangle, en triangle, etc En l'espèce, ces points correspondent à un motif carré régulier, dont le pas P peut avoir par exemple une valeur comprise entre 0,5 et 15
mm, plus préférentiellement entre 2 à 10 mm.
A chaque point de base Pbn, il existe une normale Nn
à la surface de base Sb.
2: UV (EtOH): # max 264 nm (# 9600) min 234 nm ( 2100).
SM (FAB positif. GT) : 620 (M+H)+; 544 (M-SCH2CH2OH+2H)+ RMN1H (DMSO-d6): 1,80 (s, 3H, CH3); 2,26-2,5 (m, 2H,H-2',2"); 2,796 (t, 2H, HOCH2CH2S, J = 6,4 Hz); 2,802 (t, 2H, HOCH2CH2S, J = 6,4 Hz); 2,99 (t, 4H, 2 SCH2CH2OP. J = 6,3 Hz); 3,61 (pseudo q, 4H, 2 HOCH2, J =6 Hz); 4.02 (m, 1H, H-4'); 4.09-4.44 (m, 6H, H-5',5" et 2 CH2CH2OP); 4.48 (m, 1H, H-3'); 4.90 (t, 2H, 2 HO, J = 5.3 Hz); 6.14 (t, 1H, H-1', J = 6.6 Hz); 7.49 (s, 1H, H-6); 11.37 (s1, 1H, NHCO) ppm.
RMN31P (DMSO-d6): : -0,954 ppm.
Exemple 3: 9-(2-(O,O'-Bis (S-(2-hydroxyéthylsufidyl) 2-thioéthyl) phosphonylméthoxy ethyl) adénine (3), (schéma en annexe 4) 3.1. N6-(4-Méthoxytrityl) 9-(2-diéthoxyphosphonyl méthoxyéthyl) adénine (Z).
Une solution de 3,93 g (11,9 mmoles) de 9 (diéthoxyphosphonylméthoxyéthyl) adénine (6) (A. Holy et coll., Collection Czechoslovak Cherry Commun. 52 2792, 1987) et de 146 mg (1,19 mmoles) de 4-diméthylaminopyridine dans 50 ml de dichlorométhane est traitee avec 3,31 ml (23,8 mmoles) de triéthylamine et 7,35 g (23,8 mmoles) de chlorure de 4-méthoxytrityle pendant 4 heures. Le mélange réactionnel est ensuite dilué avec du dichlorométhane et lavé avec une solution aqueuse d'hydrogénocarbonate de sodium puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium et concentrée sous pression réduite.Une chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant : méthanol (0-3%) dans dichIoromethane) permet d'isoler 5,43 g (84%) du composé 7.
7: UV (EtOH): # max 275 nm (# 27200) # min 246 nm (# 11200).
SM (FAB négatif, GT): 601 (M-H); 406 (AMTr)-; 328 (M-MTr) RMN1H (DMSO-d6); 1,10 (t, 6H, 2 CH3CH2, J = 7.0 Hz); 3,71 (s, 3H, CH30), 3,80-3,98 (m, 4H, PCH2 et CH2CH2); 3,88 (q, 4H, 2 CH3CH2, J = 8 Hz); 4t33 (t, CH2CH2 J = 4,8 Hz); ( 6,80-7.37 (m, 14H, Tr); 7,91 (s, 1H, H-8); 8,18 (s, H-2) ppm.
RMN31P (DMSO-d6): 21,35 ppm.
3.2 N6-(4-Méthoxytrityl) 9-(2-phosphonylméthoxyéthyl) adénine (8).
Une solution de 5,00 g (8,31 mmoles) de 7 dans 29 ml d'acetonitrile est traitée avec 3,29 ml (24,9 mmoles) de bromure de triméthylsilyle pendant 14 heures. L'excès de réactif et le solvant sont chassés par évaporation sous pression réduite. L'huile obtenue est repnse avec du bicarbonate de triéthylammonium et concentre sous pression reduite. La purification est réalisée par chromatographie sur colonne de gel de silice (éluant méthanol (0-50%) dans le dichiorométhane). Après filtration en solution dans du dichlorométhane, 3,4 g (63%) de 8 sont isoles sous forme de sel mixte d'acide et de triéthylammonium (1:1).
8: SM (FAB négatif, GT): 544 (M-H); 272 (M-MTr)-. RMN1H (DMSO-d6): 1,11 (t. 9H, (CH3CH2)NH+, J = 7,3 Hz); 2,96 (q, 6H, (CH3CH2)NH+, J = 7,3 Hz); 3.34 (d, 2H, PCH2, J = 8.4 Hz); 3,68 (s, 3H, CH3O); 3.8 (m, 2H, CH2CH2); 4.27 (t, CH2CH2, J = 4.5 Hz); 6.65-7.35 (m, 14H, Tr); 7,83 (s, 1H, H-8); 8,31 (s, 1H, H-2) ppm.
RMN P (DMSO-d6): 11,00 ppm.
3.3. N6-(4-Méthoxytrityl) 9-(2-(O,O'-Bis (S-(O-(4méthoxytrityl) 2-oxéthylsufidyl) 2-thioéthyl)) phosphonylméthoxyéthyl) adénine (9) Un mélange de 296 mg (0.458 mmoles) de 8 avec 977 mg (2,29 mmoles) de mono-O (4-méthoxytrityl) dithiodiéthanol (4) dans 5 ml de pyridine est traité avec 341 mg ( 1,15 mmoles) de 1-(2-mésytylènesulfonyl) 3-nitro 1,2,4 triazole.Après 3 jours, le mélange reactionnel est dilué avec du dichlorométhane, lavé avec une solution aqueuse saturée d'hydrogenocarbonate de sodium, puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium, concentrée sous pression réduite, coévaporée avec du toluène et chromatographiée sur colonne de gel de silice (éluant: méthanol (0-5%) dans le dichlorométhane) pour donner 330 mg (53%) de 9.
9: UV (EtOH): # max 275 nm (# 28200) min 253 nm ( 18300).
SM (FAB négatif, NBA): 1360 (M-H)-; 952 (M-MTrOCH2CH2SSCH2CH2)-.
RMN1H (DMSO-d6) : 2.75 (t. 4H, 2 SCH2CH2OP J = 6.3 Hz), 2,86 (t, 4H, 2 SCH2CH2OMTr, J = 5,9 Hz); 3,19 (t, 4H, 2 CH2Or J=6.0 Hz); 3.68 (s, 3H, CH3O); 3,69 (s. 6H, 2 CH30); 3.83 (m, 4H, PCH2 et CH2CH2); 4,05 (m, 4H, 2 CH2OP); 4,28 (t, 2H, CH2CH2. J = 4,6 Hz); 6.87-7.45 (m, 42H, 3 Tr); 7,88 (s, 1H, H-8); 8,12 (s. 1H, H-2) ppm.
Elle est décrite sur le schéma 5: (i = HCl/MeOH, ii = BuBr/THF, iii = BnSH/HCl, iv = Ph3P/DEAD/BzOH/THF, v = MeONa/ MeOH / CH2Cl2, vi = MsCl I Pyr., vii = Nal I CO3Ba / Acetone, viii = BCl3 / CH2C12, ix = p toluoylCl, x = Ac2O/H2SO4) SCHEMA 5 Des ribothionucléosides derivés des pyrimidines ont fait l'objet du même brevet. Mais la synthèse du thioribofurannose de départ a été réalisée selon la méthode de E. J. REIST.
- E. J. REIST, D. E. GUEFFROY et L. GOODMAN, J. Am. Chem. Soc., 1964, 84 5658.
I. 3.SYNTHESE DES SYNTHONS DU 4'-THIO-BETA-D-RIBOFURANNOSE NECESSAIRES A L'OBTENTION DE THIOOLIGOMERES.
On a réalisé la synthèse du L-thioLyxofurannose et du D-thioRibofurannose en 7 étapes à partir du D-ribose et du L-lyxose respectivement avec 29 et 21 % de rendement respectivement. Cette synthèse est illustrée sur le schéma 6.
(i = MeOH, HCI; ji = BnBr, KOH; iii = HCL,H20,dioxane; iv = BnSH, HCI; v = MesCL, pyr.; vi = NBu4I, BaCO3; vii = Hg(OAc)2) SCHEMA 6 Notre synthèse pour obtenir le thio-D-ribofurannose utilise le L-lyxose comme produit de départ comme dans la synthèse de WHISTLER (page 19). Cette stratégie est appelée stratégie C1 ----C4 . En effet, l'atome de soufre est tout d'abord introduit en position anomère et une substitution nucléophile SN2 entre l'atome de soufre porté par le carbone anomère (C1) et le carbone C4 porteur d'un OH activé par un groupement Mesyl (Ms) est ensuite effectuée.Cette stratégie appliquée à la synthèse du 4-thio-D-ribofurannose et du 4-thio-L-lyxofurannose ressemble à celle que WALKER a utilisé pour parvenir à la série 2-desoxy-D-ribofurannose ( Brevet Eur. Pat. 0421 777 A 1 page 6). Par exemple, le produit 5 (Schéma 5) de WALKER est semblable à notre produit 10 (Schema 6) en série L-Lyxofurannose.
13 B = T 14a 14 B = T 18 B = U 15α, 15ss B = U 19α, 19ss B = C 18α, 18ss B = C 20α, 20ss B = A 17a 17,' B = A 21α, 21ss (i = BSA, TMSTf,CH3CN; ii = BBr3, CH2CI2) SCHEMA 7 La synthèse des thionucléosides de l'uracile, de la thymine et de la cytosine a été effectuée en utilisant le bis-triméthylsilyl acétamide (BSA) comme agent silylant et le triméthylsily trifluorométhane sulfonate (TMSTf) comme agent de couplage. Les nucléosides a et B ont été obtenus avec 74 , 77 et 70 % de rendement respectivement .La synthèse des thionucleosides de l'adenine a été réalisée par le SnCl4 dans l'acetonitrile. Les nucleosides a et B sont obtenus avec 58 % de rendement (Schéma 7).
II. SYNTHESE D'OLIGO-THIONUCLEOTIDES SUR SUPPORT SOLIDE.
La synthèse supportée des B oligothioribonucléotides a été effectuée à l'aide d'un synthétiseur GENE modèle APPLIED BIOSYSTEM 318A selon la méthode aux phosphoramidites.
Elle est semblable à celle décrite pour la série B oligodésoxyribonucléotide naturelle par CARUTHERS et Coll. (S. L. BEAUCAGE et M. H. CARUTHERS, Tétrahedron Lett., 1981, 22, 1859-1862; L. J. Mc BRIDE et M. H. CARUTHERS, Tétrahedron Lett., 1983, 24, 245-248.) et à celle décrite par USMAN et Coll.pour les oligoribonucléotides (N. USMAN, K. K.
OGILVIE, M. Y. JIANG et R. J. CEDERGREN, J. Am. Chem. Soc., 1987, 109, 78457854.).
Cette synthèse a nécessité: I) La préparation de synthons B thioribonucléoside phosphoramidites 5 correspondant aux bases T, U, C, A et G.
II) La fonctionnalisation du support solide incorporant un dérivé B thioribonucléosidique.
III) L'élongation de la chaîne oligothioribonucléotidique à l'aide d'un synthétiseur automatique.
IV) Enfin, au terme du nombre requis de cycles de synthèse, l'oligothionucléotide a été décroché de son support, déprotégé et purifié.
II.1 - Synthèse du phosphoramidite des beta-thioribonucléoside 26 a-d.
Il. 1. 1 Synthèse des dérivés 5'-DmTr-2'-O-TBDMS (Schéma 8) Le problème majeur dans la synthèse chimique des oligoribonucléosides est la présence de l'hydroxyle en 2' dans le cycle ribose ou thioribose qui demande une protection sélective.
De façon connue, une chaussure est retenue sur un ski par un élément de fixation avant et un élément de fixation arrière. Le ski, quant à lui, présente une certaine flexibilité, qui tient principalement à sa structure interne. Durant la pratique du ski, le ski fléchit suite aux sollicitations auxquelles il est soumis de la part du skieur, mais aussi de la part du relief du terrain sur lequel il glisse. La flexion du ski peut être influencée par la réaction que les éléments de fixation exercent sur le ski. On peut également influencer la flexion du ski par un raidisseur de type statique, ou par des moyens qui agissent sur le ski de façon dynamique.
Un raidisseur de type statique est par exemple décrit dans la demande de modèle d'utilité allemand nO 90 17 486. Selon ce qui est décrit dans ce document, le raidisseur de type statique est constitué par une plaque de raidissement, dont l'extrémité arrière est solidarisée au ski au niveau de l'élément de la fixation arrière. L'extrémité avant de la plaque peut coulisser selon une direction longitudinale. Une butée solidaire du ski est placée en regard de l'extrémité avant de la plaque pour que la plaque s'oppose à la flexion du ski.Selon ce document, la butée présente trois positions différentes qui peuvent être ajustées, une position où elle laisse l'extrémité avant de la plaque libre de coulisser sur une amplitude déterminée, une position où elle exerce sur l'extrémité avant de la plaque une action amortissante, et une position où elle est en appui direct contre l'extrémité avant de la plaque, et empêche tout mouvement de celle-ci vers l'avant.
Ce dispositif donne de bons résultats, mais il réagit aux flexions du ski, et ne tient pas compte des sollicitation dynamiques qui transitent entre la chaussure du skieur et le ski. En outre, les moyens de réglage dont ce dispositif est équipé ont une efficacité limitée.
On connaît également des dispositifs de type dynamique, c'est-à-dire des dispositifs qui sont capables de transformer au cours de la glisse au moins une partie des sollicitations de la chaussure en direction du ski en un moment de flexion qui tend à faire plonger une extrémité au moins du ski en direction de la neige. Un tel dispositif est décrit dans les demandes de brevet non publiées n" 91 10895, nO 91 15612, et nO 9204964 au nom de la demanderesse.
Ces dispositifs présentent un organe palpeur qui est mobile selon une direction verticale, et qui est apte à capter les sollicitations qu'une extrémité de la chaussure exerce en direction du ski au cours de la pratique de la glisse. II comprend par ailleurs des moyens de liaison pour transformer ces sollicitations en une force orientée dans le plan de la direction longitudinale définie par le ski. Un organe de transmission transmet cette force à l'une au moins des embases des éléments de fixation où elle génère un moment de flexion qui tend à faire plonger vers la neige l'extrémité du ski.
Le troisième document décrit en plus des moyens élastiquement compressibles qui exercent une action de tampon entre l'organe de transmission et l'embase de l'élément de fixation avant. Selon un mode préférentiel de réalisation décrit dans ce document, les moyens élastiquement compressibles sont constitués par des ressorts tarés. Lorsque ces ressorts sont soumis à une sollicitation de compression inférieure à leur valeur de tarage, ces sollicitations sont transmises directement à l'embase de l'élément de fixation avant. Lorsque ces sollicitations dépassent la valeur de tarage, alors elles provoquent la compression des ressorts. Ce dispositif évite que l'embase de l'élément de fixation avant soit soumise à des sollicitations excessives, en particulier lors de fortes flexions du ski.
Ce dernier dispositif donne de bons résultats, mais il présente l'inconvénient de ne pas permettre de régler de façon simple l'action des ressorts. Egalement, pour ce dispositif, comme pour le dispositif de type statique précédent, il n'est pas possible de régler l'action du dispositif au-delà de la raideur des ressorts, c'est-à-dire d'amplifier l'action des ressorts. II est donc nécessaire d'utiliser des moyens élastiquement compressibles de forte raideur, ou des moyens volumineux pour obtenir un effet satisfaisant.
Un des buts de la présente invention est de remédier à ces inconvénients, et de proposer un dispositif interface équipé de moyens de réglage simples, qui permettent de régler l'effet du dispositif interface sur la flexion du ski.
Un autre but de l'invention est de proposer un dispositif dont les moyens de réglage permettent à volonté d'amplifier ou de réduire l'amplitude de compression des moyens compressibles par rapport à l'amplitude du mouvement relatif de l'organe de transmission par rapport au ski.
D'autres buts et avantages apparaîtront au cours de la description qui va suivre, cette description étant toutefois donnée à titre indicatif, et non limitatif.
Le dispositif, selon l'invention, vise à modifier la répartition de pression d'un ski tel que notamment un ski alpin sur sa surface de glisse, ledit ski étant équipé dans sa zone du patin d'éléments de fixation destinés à retenir une chaussure, les éléments de fixation reposant respectivement sur une embase.
Le dispositif comprend un organe de transmission qui s'étend au dessus de la surface supérieure du ski, dans la zone du patin, dont une extrémité est connectée à une embase solidaire du ski, dont l'autre extrémité est mobile par rapport à la surface supérieure du ski lors des mouvements de flexion du ski.
II comprend par ailleurs un élément élastiquement compressible s'opposant au déplacement de l'extrémité mobile de l'organe de transmission.
II est caractérisé par le fait qu'il comprend également des moyens intermédiaires entre l'extrémité libre de l'organe et l'élément compressible pour modifier le rapport d'amplitudes entre le mouvement relatif de l'extrémité de l'organe de transmission par rapport au ski et la course de compression de l'élément compressible.
La figure 1 illustre de façon schématique, en vue de côté, un ski, dans sa zone du patin, équipé d'un dispositif interface selon un premier mode de mise en oeuvre de l'invention.
soit convexe.
préférées de celle-ci, donnée à titre d'exemple non limitatif et faite en référence au dessin annexé, sur lequel: la figure 1 est une vue d'ensemble en coupe horizontale d'un bloc optique selon une première forme de réalisation de l'invention, la figure 2 est une vue partielle en coupe horizontale d'une seconde forme de réalisation de l'invention, et la figure 3 est une vue partielle en coupe
horizontale d'une variante de réalisation de l'invention.
En référence tout d'abord à la figure 1, on a représenté un bloc optique avant pour véhicule automobile, qui comprend un boîtier 10 fermé à l'avant par une glace 12 et abritant côte-à-côte un projecteur d'éclairage P, par exemple un projecteur code-route de type classique, et un feu de signalisation F, par exemple un feu clignotant La glace 12 est unique et commune au
projecteur et au feu.
Le projecteur comprend pour l'essentiel une lampe 14 et un réflecteur 16 Le boîtier 10 comporte à l'arrière, au droit de la lampe, une ouverture i Qa fermée par une bonnette amovible 18 permettant d'accéder à l'arrière du réflecteur 16 en vue notamment du
remplacement de la lampe 14.
3 - Le feu comprend un une lampe 20 et un réflecteur 22. Comme on l'observe, il existe entre les bords latéraux en vis-à-vis des deux réflecteurs 16 et 22 un espace E relativement important, typiquement de quelques centimètres, pour des raisons qu'il est superflu de
développer ici.
Conformément à cette première forme d'exécution de l'invention, on prévoit pour obturer cet espace et éviter la perception d'une zone sombre, inesthétique, lorsque le bloc optique est éteint et observé de l'avant, un enjoliveur qui présente un profil courbe en coupe horizontale, en l'espèce un profil concave vers l'extérieur En coupe verticale, le profil de l'enjoliveur peut être droit ou courbe mais de préférence conçu pour suivre le profil vertical de la glace dans
cette même coupe verticale.
Dans ces conditions, lorsque le bloc optique est observé de l'extérieur, le projecteur et le feu étant éteints, dans des conditions de lumière incidente, l'aspect de l'enjoliveur est homogène avec les aspects des deux réflecteurs voisins Plus précisément, la courbure donnée à l'enjoliveur permet de diffuser sur un intervalle angulaire substantiel le rayonnement lumineux incident et, par là, réduit sa brillance générale pour la
rendre tout à fait comparable avec celle des réflecteurs.
On obtient ainsi un bloc optique dont l'apparence, lorsqu'il est exposé à un rayonnement extérieur incident est plus régulière sur -toute son étendue, ce qui est
Des suspensions contenant des macrophages ont été préparées à partir de moelle osseuse d'une souris femelle C57BL/6 âgée de 7 semaines, et cultivées dans un milieu RPMI contenant 10% de sérum foetal de veau en présence de surnageant L. 4.105 macrophages dérivés de moelle osseuse obtenus au jour 6 ont été ensemencés dans les lamelles en verre rondes (diamètre 12 mm) la veille de l'utilisation. Les macrophages ont été infectés avec une MI (multiplicte d'infection ) de 0,04 (une bactérie pour 25 macrophages, résultant en à peu près 1% de cellules infectées), de manière à pouvoir observer des points individuels d'infection, générés par la progéniture d'une seule bactérie. L'infection a été réalisée comme décrit pour un macrophage J774.
Après 30 minutes et après 8 heures, ces monocouches cellulaires ont été fixées et colorées avec une solution de Giemsa.
Après 8 heures, la progéniture des bactéries de type sauvage s'était disséminée à de nombreuses cellules hôtes nouvelles, et des bactéries portant des protubérances à leur extrémité pouvaient être observées.
Au contraire, la progéniture du mutant LUT 12 est restée enfermée à l'intérieur d'une seule cellule infectée. Les bactéries mutantes ont, soit formé des microcolonies ou étaient disséminées dans le cytoplasme des cellules hôtes, mais aucune protubérance contenant des bactéries ne pouvaient être détectés.
Ce résultat indique que la bactérie mutante se multiplie à l'intérieur des cellules infectées, mais est incapable d'infecter des cellules adjacentes par dissémination de cellule à cellule.
TEST DE CROISSANCE SUR DES MACROPHAGES J774 Un essai démontrant que la bactérie mutante LUT 12 était apte à se multiplier de manière intracellulaire a été réalisé au moyen d'un test de croissance sur des macrophages J774.
Cet essai a été réalisé sur des couches simples de J774 dans des flacons de culture de tissus en matière plastique de 25 cm3. Les cellules étaient infectées avec une MI de 10 bactéries par cellule. Le nombre de bactéries intracellulaires était calculé après 2, 6 et 10 heures de croissance sur un milieu contenant de la gentamycine (5 pg/ml) par lyse des mono-couches cellulaires, lavage avec de l'eau distillée froide et étalement de dilutions appropriées sur des plaques contenant un milieu BHI.
Après une durée de 10 heures, les courbes de croissance des bactéries de type sauvage et LUT 12 étaient identiques.
OBSERVATIONS AU MICROSCOPE ELECTRONIOUE Le comportement intracellulaire du mutant LUT 12 a été observé au microscope électronique. Des macro phages J774 étaient infectés avec des bactéries de type sauvage ou la souche mutante pendant 30 minutes, suivie par une incubation de 60 à 210 minutes dans un milieu contenant la gentamycine. Pour le mutant et le type sauvage, on pouvait observer des bactéries libres dans le cytoplasme à 1 h 1/2 d'infection. A ce moment, le type sauvage et le mutant étaient entourés par une couche mince de matériel granulaire crêpelé, mais seul le type sauvage comportait du matériel filamentaire assemblé à sa surface, constitué de filaments d'actine. A 4 h après l'infection, les bactéries de type sauvage étaient entourées par d'épaisses couches de filaments d'actine F. Au contraire, les bactéries mutantes LUT 12 étaient presque nues.Même le revêtement fin crêpelé observé au moment précoce de l'infection avait disparu.
Pour visualiser l'association d'actine F bactérienne de manière spécifique, les auteurs ont réalisé des colorations en double fluorescence à l'aide de FITC-phalloïdine, une toxine fongique se liant à l'actine F, et avec un sérum anti-L.monocytogenes, suivi par un second anti-corps couplé à la rhodamine, pour détecter les bactéries. Les macrophages J774 étaient infectés depuis 4h avec les bactéries de type sauvage ou mutant. Tandis que les bactéries de type sauvage se coloraient positivement avec la FITC-phalloidine, les bactéries mutantes LUT 12, bien que détectables avec le sérum anti-L.monocytogenes restaient invisibles avec la coloration de l'actine.
Ces résultats démontrent que les bactéries LUT 12 s'échappent des phagosomes aussi efficacement que les bactéries de type sauvage et se multiplient dans le cytoplasme. Cependant, les bactéries mutantes ne sont jamais associées avec de l'actine F, sont incapables de se déplacer à l'intérieur de la cellule, et ne peuvent infecter des cellules voisines par dissémination directe.
Ces observations suggèrent que le mutant LUT 12 est déficient en un composant nécessaire pour le procédé de formation de filaments d'actine induit par Listeria monocytogenes.
B - DETERMINATION DU POINT D'INSERTION DU TRANSPOSON Ce mutant a été analysé par Southern blot pour déterminer le nombre de transposons insérés dans son chromosome.
L'ADN chromosmique a été digéré par Bam HI, Eco RO, Hind III, Kpn I et Pst I.
On a utilisé deux sondes différentes correspondant à Tn 917-lac (Shaw et Clewell, 1985 (11)): une sonde recouvrant 515 paires de bases du gène de résistance à l'érythromycine, obtenue par PCR avec les oligonucléotides 5'-TTG GAA CAG GTA AAG GGC ATT TAA-3' (position 821 à 844) et 5'-AGT AAA CAG TTG ACG ATA TTC TCG-3' (position 1313 à 1336), et une sonde recouvrant le fragment interne Hind III du transposon obtenue par PCR avec les oligonucléotides 5'-ACA ATT AAT GTC TCC CAT ATT-3' (position 3082 à 3102) et 5'(ACT GAT AAT TAA CCA AAA CAG-3' (position 4295-4315).
La jonction transposon-chromosome a été clonée à partir d'une banque d'ADN chromosomique obtenue par restriction avec Eco RI/Kpn I dans pUC 18. Un clone comportant un segment d'insertion, correspondant à la jonction chromosome-transposon a été isolé et séquencé directement à partir du plasmide par utilisation d'un oligonucléotide s'hybridant avec l'extrémité droite du transposon (5'-CTA AAC ACT TAA GAG AAT TG-3', position 5244 à 5263).
Les spectres RMN du phosphore ont été enregistrés sur un appareil Brüker WP 200 SY avec découplage du proton.
5'-O-Tertiobutyldiméthylsilyl 3'-amino 2',3'-didésoxythy- midine 2.
A une solution de 8,35 g (34,6 mmol.) de 3'-amino-2',3'-didésoxythymidine 1 dans 250 ml de pyridine sont ajoutés 6,26 g (41,5 mmol.) de chlorure de tertiobutyldimétylsilyle. La réaction est laissée 24 h. Le mélange est dilué avec du CH2Cl2, lavé avec une solution aqueuse de NaHCO3 puis avec de l'eau. La phase organique est séchée sur Na2SO4 et concentrée.
L'huile obtenue est chromatographiée sur gel de silice (éluant MeOH (0-10%) dans CH2Cl2) pour conduire à 11,8 g (96%) de 2 sous forme de mousse.
2UV (EtOH) :max 266 nm (E 10600) min 233 nm ( 1700) SM (FAB positif, GT) : 711 (2M+H)+, 356 (M+H)+, 127 (BH2) RMN H (DMSO-d6) : 6 = 0,07 (s, 6H, (CH3)2Si) ; 0,88 (s, 9H, (CH3)3CSi) ; 1,77 (s, 3H, CH3) ; 2,03 (m, 2H, H-2',2") ; 3,38 (m, 1H, H-3') ; 3,58 (m, 1H, H-4') ; 3,72 (dd, 1H, H-5', J = 3,9 et 10,4 Hz) ; 3,83 (dd, 1H, H-5'', J = 2,8 et 10,4 Hz) ; 6,11 (t, 1H, H-i', J = 6,2 Hz), 7,48 (s, 1H, H-6) ppm.
5'-OJTertiobutyldiméthylsilyl 3'-(N-(4-méthoxytrityl)-amino) 2' ,31idésoxythymidine 3.
Le composé 2 (11,7 g ; 32,9 mmol.) est traité par 15,2 g (49,2 mmol.) de chlorure de 4-méthoxytrityle dans 295 ml de pyridine durant 20 h. Le mélange est repris avec du CH2Cl2 (1% Et3N), lavé avec une solution aqueuse de NaHCO3 puis à l'eau.