INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
dessin annexé, donné uniquement à titre d'exemple et surlequel la figure unique est une vue en perspective d'un mode de réalisation préférentiel du dispositif de
cisaillage suivant l'invention.
9. GOODBOURN, S. E. Y., HIGGS, D.R., CLEGG, J. B., AND WEATHERALL, D. J. (1983) Proc.Natl. Acad.
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10. JEFFREYS, A.J. (1987) Biochem. Soc.
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11. JEFFREYS, A.J., NEUMANN, R., AND WILSON, V. (1990) Cell. 60: 473-485.
12. JEFFREYS, A.J., ROYLE, N.J., WILSON, V., AND WONG, Z. (1988) Nature 332: 278-281.
13. JEFFREYS, A.J., WILSON, V., KELLY, R., TAYLOR, B. A., AND BULFIELD, G. (1987) Nucleic Acids Res 15: 2823-2836.
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Toutefois ce défaut d'étanchéité présente un grave inconvénient. En effet, lors des manipulations du flacon notamment entre l'usine où le flacon est rempli et assemblé et le lieu de mise en vente dudit flacon, ce dernier doit être maintenu verticalement pour éviter toute fuite du produit qu'il contient. Pour pallier cet inconvénient, les fabricants ont l'habitude de remplir le flacon de liquide et de le fermer hermétiquement au moyen d'une membrane décollable qui sera ôtée lorsque sera mis sur le flacon le capot vaporisateur. Le capot vaporisateur est alors mis en place à son lieu de destination. Cette solution n'est pas satisfaisante en ce que le flacon fini ne peut pas sortir de l'usine dans un emballage esthétique et requiert une manipulation finale de la part du client.
La présente invention a pour but d'obvier à cet inconvénient au moyen d'un capot vaporisateur perfectionné susceptible de boucher de façon étanche le col du flacon pour éviter toute fuite du liquide qu'il contient pendant sa manipulation.
Un tel capot vaporisateur comprend de façon classique un bouchon fixe fermant le col du flacon et traversé par un conduit plongeant dans le liquide et communiquant avec un gicleur à effet Venturi, ce bouchon étant en outre percé d'un orifice de mise à l'air libre de l'intérieur du flacon.
Selon l'invention le gicleur est solidaire d'une douille mobile en translation axiale par rapport au bouchon, la douille présentant un sommet et une jupe coaxiale au col. Le conduit est alors emmanché coaxialement de façon étanche dans la jupe de la douille et la partie interne du sommet porte une protubérance axiale bouchant le conduit dans une première position axiale de la douille. Le bouchon est solidaire d'un manchon cylindrique faisant coaxialement saillie hors du col et venant s'appuyer de façon étanche contre la paroi externe de la jupe dans cette première position de la douille. L'orifice de mise à l'air libre est alors pratiqué entre le manchon cylindrique et le conduit.
On comprend ainsi qu'une translation axiale de la douille par rapport au bouchon permet au flacon d'être fermée de façon complètement étanche. De préférence la translation axiale de la douille est obtenue par une rotation imprimée à cette douille, un ergot et une rampe hélicoïdale prévus respectivement sur l'un et l'autre des douille et bouchon coopérant à cet effet.
De préférence également, le bouchon comporte une collerette radiale venant en butée contre le col. Cette collerette peut être pourvue de doigts faisant saillie axialement et venant agripper la paroi externe du col de manière à bien assurer la fixation du capot sur le col du flacon.
L'invention sera mieux comprise et d'autres buts avantages et caractéristiques de celle-ci apparaîtront plus clairement à la lecture de la description qui suit d'un mode de réalisation préférée donnée à titre non limitatif et à laquelle deux planches à dessin sont annexées sur lesquelles - La Figure 1 représente schématiquement en coupe axiale un capot vaporisateur selon l'invention en position de fonctionnement normal - La Figure 2 représente un détail du capot vaporisateur de la Figure 1 dans un plan perpendiculaire à celui de la Figure 1 ; et - La Figure 3 représente le même capot vaporisateur en position de fermeture étanche, ci-après dite première position.
En référence maintenant aux dessins qui illustrent un mode préféré de réalisation, le col 1 du flacon a été représenté en tirets. Ce col est fermé par un bouchon fixe 10 portant une collerette 12. Ce col est percé par un orifice 14 de mise à l'air libre de l'intérieur du flacon.
Il est en outre traversé par un conduit 16 plongeant dans le liquide contenu dans le flacon et communiquant avec un gicleur (non représenté sur la Figure) par l'intermédiaire d'un conduit 18 perpendiculaire au conduit 16.
Le gicleur et le conduit 18 sont solidaires d'une douille 20 présentant un sommet 22 et une jupe 24. Le conduit 16 est emmanché coaxialement de façon étanche dans la jupe 24 de la douille 29. Dans l'exemple représenté, le conduit 16 est en pratique emmanché dans un prolongement cylindrique axial 28 du bouchon fixe 10 lequel prolongement est emmanché dans la jupe 24 de la douille 22.
Des anneaux 30 font saillie de la paroi externe du prolongement 28 du conduit 16 pour assurer l'étanchéité entre la jupe 24 et le conduit 16. La partie interne du sommet 22 de la douille 20 porte une protubérance axiale 26 susceptible de boucher le prolongement 28 lorsque la douille est déplacée axialement vers le bas (sur la Figure) comme on le verra ci-après. Un anneau 32 fait saillie de la paroi interne du prolongement 28 du conduit 16 pour assurer l'étanchéité de la fermeture du prolongement 28 par la protubérance axiale 26 lorsque la douille a été déplacée axialement dans une première position de fermeture étanche.
Le bouchon 10 est solidaire d'un manchon cylindrique 34 faisant saillie coaxialement hors du col 1 et prévu pour venir s'appuyer de façon étanche contre la paroi externe de la jupe 24 lorsque la douille est dans la première position. L'orifice 14 de mise à l'air libre est percé entre le conduit 16 ou le prolongement 28 de ce dernier et le manchon cylindrique précité 34.
Sur la Figure 1 le capot est représenté en position normale de fonctionnement en vaporisateur c'est-à-dire non étanche. En effet, l'orifice 14 de mise à l'air libre n'est pas bouché et le conduit 16 communique directement avec le conduit 18 et le gicleur non représenté. L'utilisateur final du vaporisateur peut donc utiliser son vaporisateur en manoeuvrant de façon classique la poire d'actionnement non représentée.
Maintenant on a représenté Figure 3 le même capot vaporisateur fermé de façon étanche dans la première position tel qu'il se trouve à la sortie de l'usine d'assemblage et de remplissage du flacon. Ici le capot vaporisateur a subi une translation axiale vers le bas (sur la Figure) pour assurer la fermeture étanche totale du flacon. En effet, comme on peut le constater, la protubérance 26 pénètre dans le prolongement 28 et grâce à l'anneau intérieur 32 ferme totalement ce prolongement 28.
D'autre part, la jupe 24 porte sur le manchon cylindrique 34 et ferme également de façon étanche l'orifice 14 de mise à l'air libre.
Ainsi, une manoeuvre de la poire d'actionnement est rendue inefficace puisque le conduit 16 ne communique plus avec le conduit 18 et le flacon peut être retourné sans problème puisque l'orifice 14 de mise à l'air libre est bouché.
.Dodécamère Dégradation en 0 min Dégradation en 25 min BdT12 0% 93 % B(SrT)dT11 0% 23% Tableau 5 Cinétique de dégradation de BdT12 et B(SrT)dT11 par la phosphodiestérase de rate de veau L'évolution au cours du temps de la dégradation enzymatique des deux dodécamères a été suivie par CLHP. Nous avons pu tracer la courbe de digestion enzymatique de B(SrT)dT11 en fonction du temps : A = Ao -kt (Figure 2, A) où: -Ao est l'aire initiale du 12-mèr -A est l'aire du 12-mer à l'instant t -t est le temps -k est la constante de vitesse de premier ordre de la dégradation Cette courbe (Figure 2) permet de 'calculer, en utilisant le logiciel de régression curviligne EUREKA, k = 0,.016min~1 et le temps de demi-vie du dodécamère tl/2 = In 2/k = 43 min De la même façon, la courbe de digestion enzymatique de BdT12 en fonction du temps : A = Ao est a pu être tracée. (Schéma 13).On constate que la cinétique de dégradation de BdT12 est beaucoup plus rapide que celle de B(SrT)dT11; en effet le temps de demi-vie s'établit à 1 minute pour le dodécamère naturel.
La cinétique de dégradation enzymatique de l'oligomére modifié B(SrT)dT11 par l'extrémité 5' présente un temps de demi-vie nettement supérieur à celui de la dégradation du BSrU12. Ces résultats montrent que l'introduction d'une unité thioribonucléotidique à l'extrémité 5' d'un oligomère stabilise ce dernier vis à vis de la phosphodiéstérase de rate de veau.
Exemple 1: Etude de la dégradation enzymatique du dodécamère B(SrT)dT11 par la phosphodiestérase de rate de veau.
Une solution d'oligonucléotide (20 4, 3 unités d'absorbance à 260 nm) est diluée dans un tampon Acétate d'ammonium 0,125 M (pH 7,0), d'EDTA 2,5mM et de Tween 80 0,0625% (80 yL). On ajoute une solution commerciale de phosphodiestérase de rate de veau (2 4, concentration finale 0,008 unité/ml) et le mélange est incubé à 37 C. A des temps déterminés, des fractions aliquotes sont prélevées (5 4), chauffées à 100'C pendant une minute et analysées par CLHP.
Les analyses ont été effectuées sur une colonne PVDI (Polyvinylimidazole SPCC-Shandon) protégée par une précolonne et un préfiltre. L'élution est réalisée selon un gradient linéaire en 20 minutes de 0,1 M à 0,4 M KC1 dans 20 mM KH2P04 à pH 6 contenant 20% d'acetonitrile. Le débit était fixé à 1 ml/min et la détection U.V. à 260 nm.
La présente invention concerne une souche mutante atténuée de Listeria monocytogenes et ses applications iMmuno-thérapeutiques et diagnostiques, notamment pour la fabrication d'une souche recombinante utilisable en tant que vaccin.
Listeria monocytogenes est un bacille aérobie facultatif, non sporulent, à gram-positif très répandu dans l'environnement et responsable de la listériose humaine et animale. La maladie se manifeste par des infections opportunistes, soit par une méningite et/ou encéphalite, des septicémies ou par des avortements, avec un taux de mortalité élevé chez les nouveau-nés et les adultes dont les mécanismes de défense sont affaiblis par la grossesse, une immunosuppression thérapeutiquement induite, une maladie sous-jacente ou la vieillesse. La listériose peut aussi atteindre des sujets apparement sains.
Listeria monocytogenes est capable in vivo comme in vitro d'infecter une grande variété de types cellulaires dont les macrophages, les fibroblastes, les cellules épithéliales et les entérocytes.
Après sa pénétration dans la cellule infectée, la bactérie lyse la membrane du phagosome grâce à une hémolysine qu'elle secréte. Au terme de cette étape, la bactérie est dans le cytoplasme de la cellule hôte.
En outre, Listeria monocytogenes se caractérise par son aptitude à se propager dans les tissus par infection directe de cellule à cellule sans quitter le cytoplasme (Racz et al., 1970 (9)).
Peu de temps après son entrée dans la cellule hôte, la bactérie s'entoure d'actine filamenteuse (actine F) qui ultérieurement se réarrange en "comète" derrière la bactérie dans la direction opposée au mouve ment (Tilney et al., 1989, (1); Mounier et al., (1990) (13). L'actine polymérisée est constituée de microfilaments courts, orientés au hasard qui diffèrent des filaments d'actine longs habituellement observés dans les cellules musculaires.
Les bactéries sont mobiles et laissent derrière elles des "comètes" d'actine F de plusieurs pm de longueur. Certaines sont incorporées dans des protubérances cytoplasmiques en forme de doigt, qui peuvent être internalisés par les cellules voisines. Les deux membranes plasmiques entourant la bactérie sont alors lysées.
Une fois dans le cytoplasme de la nouvelle cellule hôte, la bactérie peut se reproduire et commencer un nouveau cycle de dissémination.
Pendant ce processus de dissémination, les cellules de Listeria monocytogenes sont protégées du système immunitaire de l'hôte, et la dissémination de cellule à cellule représente par conséquent un facteur clé de virulence.
En isolant et analysant un mutant Tn 917-Lac inapte à se disséminer de cellule à cellule, les inventeurs on pu identifier une protéine de Listeria monocytogenes impliquée dans l'assemblage de l'actine induit par la bactérie.
Cette lignée cellulaire a été dénommée RBE-4 par les Inventeurs.
Conformément à l'invention, ladite lignée a été déposée sous le n I-1142 en date du 19 septembre 1991 auprès de la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes tenue par l'institut Pasteur.
Ledit fragment oncogène viral ou cellulaire et/ou le gène marqueur sont sous le contrôle soit d'un promoteur homologue, soit d'un promoteur hétérologue, aptes à permettre l'expression dudit fragment immortalisant.
De manière inattendue, lesdites lignées sont immortelles, présentent un phénotype non transformé de cellules endothéliales cérébrales différenciées, possèdent une activité de prolifération illimitée et présentent certaines des propriétés des cellules endothéliales cérébrales de la barrière hémato-encéphalique, permettant notamment leur utilisation comme modèle cellulaire in vitro de la barrière hémato-encéphalique.
Parmi les propriétés que ces lignées endothéliales immortalisées ont conservé, on peut citer - l'expression d'un antigène apparenté au facteur VIII, - l'expression de l'enzyme de conversion de l'angiotensine, - une activité t-glutamyl transférase, - la capacité de sécréter de l'endothéline-l, - la présence de jonctions serrées.
La présente invention a également pour objet un procédé d'obtention d'une lignée cellulaire conforme à l'invention, caractérisé en ce que on cultive des cellules endothéliales cérébrales appropriées dans un milieu de culture convenable, supplémenté en sérum et en facteur de croissance, on les transfecte entre le 2ème et le 6ème passage avec un fragment d'acide nucléique comprenant au moins un fragment immortalisant d'un oncogène viral ou cellulaire et éventuellement au moins un gène marqueur, notamment un gène codant pour la résistance à un antibiotique et on sélectionne les cellules transfectées sur un milieu de sélection adapté audit gène marqueur, si nécessaire.
Selon un mode de mise en oeuvre avantageux dudit procédé, ledit fragment nucléique comprend un gène codant pour la résistance à la néomycine et un fragment d'un oncogène viral, tels qu'un fragment de l'oncogène T de SV40 et un fragment contenant la région précoce E1A du génome de l'adénovirus 2 ou d'un oncogène cellulaire.
La présente invention a également pour objet un modèle d'étude et d'identification des systèmes biochimiques et cellulaire de la barrière hémato-encéphalique, caractérisé en ce qu'il comprend au moins une lignée cellulaire selon l'invention.
Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.
EXEMPLE 1 : Préparation d'une lignée cellulaire conforme à l'invention : cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux bovins (lignée SV-BEC).
Des cellules endothéliales de microvaisseaux cérébraux bovins sont isolées à partir du cortex cérébral traité à la collagénase (DURIEU-TRAUTMANN et al., J.
Neurochem., 1991 56, 3, 775-781) ; ces cellules ne sont pas contaminées par des cellules vasculaires de muscle lisse ou des péricytes. Elles sont mises en culture dans des boîtes recouvertes de gélatine à 0,2 % (p/v) contenant un milieu DMEM (Dulbecco's modified Eagle's Medium) supplémenté en sérum bovin fétal à 10 % (v/v), en glutamine 2 mM et en FGFb à 1 ng/ml et du glucose à 1 g/l.
Elles sont soumises à un passage hebdomadaire réalisé par resuspension dans de la trypsine-EDTA [0,05 %-0,02 % (p/v)] à 1 à 10 dilutions ; le milieu est changé tous les 3 jours.
La technique de coprécipitation au phosphate de calcium est utilisée pour la transfection desdites cellules, au 5ème passage, avec le plasmide pSV3 néo (10 Rg), contenant un fragment de l'oncogène SV40 et le gène de résistance néo au médicament dénommé G418 (WHITLEY et al., Mol. Cell. Endocrinol., 1987, 52, 279284).
Après sélection dans un milieu contenant 800 Rg/ml de G418, les cellules présentes sont clonées par dilution limite.
Par exemple, d'après les travaux ayant conduit au dépôt de la demande de brevet européen nO 90125749.3 déposée le 28 décembre 1990 au nom de AUSIMONT, il ressort que le dérivé acétylé du saccharose, ayant un degré d'acétylation de 4,5 à 7,0, de préférence de 5.5 à 6,5, est un agent activateur de blanchiment partiellement acétylé intéressant.
Des méthodes de préparation de dérivés partiellement acylés de carbohydrates, en particulier des dérivés de saccharose, partiellement acétylés, ont été décrites dans l'art antérieur.
Des méthodes de préparation d'acétates de saccharose par déprotection partielle du dérivé persubstitué ont été proposées.
Les documents de référence sont nombreux ; à titre d'exemple on peut citer les travaux de K. CAPEK et al (Collect. Czechosl.
Chem. Commun. 1986(51)1476 et Collect. Czechosl. Chem. Commun.
1985(50) 2191 qui utilisent de l'oxyde d'alumine imprégné de carbonate de potassium pour désacétyler l'octaacétate de saccharose ou ceux de BALLARD et al (Carbohydr. Res. 1972(24)152 et Carbohydr.
Res. 1974 (34)184) qui désacétylent le même dérivé en solution chioroformique par passage sur colonne d'alumine.
Plus récemment une désacétylation régiosélective du peracétate de saccharose a été réalisée grâce à l'emploi d'une enzyme lipolytique (J. Carbohydr. Chem. 1989(8)693).
Des solutions ont été proposées pour effectuer une acylation partielle au lieu de passer par des procédés en deux étapes comme ceux décrits précédemment.
Bien moins de travaux répertoriés dans la littérature scientifique décrivent l'acétylation partielle directe du saccharose. On peut citer parmi ceux-là, la publication de O.K.KONONENKO. J. Appl.
Chem. 1961,7 décrivant la synthèse d'un monoacétate de saccharose ou bien celle de K.S.NUFTI et al (US-A-4380476) aboutissant aussi à un mélange de dérivés acétylés. Bien qu'étant plus intéressants que la méthode de désacétylation, les procédés directs d'acétylation partielle du saccharose décrits jusqu'à maintenant ont le désavantage d'utiliser comme milieux réactionnels des solvants aprotiques polaires, avec les inconvénients déjà précisés. En outre cette méthode conduit à des mélanges contenant en général le dérivé peracétylé lorsqu'un degré d'acétylation moyen assez élevé ( > 4) est souhaité.
I1 est parfois nécessaire d'obtenir par acylation d'un carbohydrate un mélange d'isomères ayant un degré d'acylation moyen défini et une dispersion limitée autour de cette valeur moyenne.
Un objet de l'invention est de fournir un procédé permettant l'acylation partielle de carbohydrates, en particulier l'acétylation du saccharose, sans faire appel à des solvants aprotiques polaires.
Un autre objet de l'invention est donc de fournir un procédé d'acylation partielle de carbohydrate permettant un contrôle du degré d'acylation moyen du produit obtenu.
La demanderesse a mis en évidence qu'en utilisant un agent d'acylation classique, comme par exemple un précurseur d'acétate tel l'anhydride acétique, il était possible de répondre aux objets précédents, grâce à un choix approprié du milieu réactionnel, composé d'un mélange de solvants organiques et d'eau.
Bien que la plupart des méthodes d'acylation des carbohydrates préconisent l'utilisation de solvants organiques anhydres, la demanderesse a constaté que, par le procédé de la présente invention, il était possible, avec un ajustement approprié du pH, d'atteindre d'excellents rendements dans la réaction.
Le rapport de transformation entre l'enroulement primaire 14 et l'enroulement auxiliaire 30 est égal à l'unité. Les deux enroulements sont bobinés de manière à avoir un bon couplage et l'enroulement auxiliaire est généralement bobiné en même temps que l'enroulement primaire, chaque spire de l'enroulement primaire étant jointive d'une spire de l'enroulement auxiliaire.
Le fonctionnement du circuit de la figure 4 est alors le suivant. Lorsque le transistor T1 est fermé, aucun courant ne circule dans la diode D4, ni dans la diode D3. A l'ouverture du transistor T1, la tension Vt aux bornes du transistor T1 va croître instantanément (celui de la diode D4 va décroître) jusqu'à ce que la diode D4 conduise : le potentiel aux bornes du transistor T1 se maintiendra à 2.Ve jusqu'à ce que l'énergie stockée dans l'inductance de fuite devienne nulle. Ensuite, ce potentiel Vt diminuera instantanément jusqu'à (Ve + nVs) si n est le rapport de transformation entre les enroulements primaire 14 et secondaire 16.
Ainsi, par ce fonctionnement, l'énergie stockée dans l'inductance de fuite a été "renvoyée" vers la source 10.
Un tel montage avec enroulement primaire auxiliaire d'écrêtage est utilisé dans les convertisseurs classiques de faible court car elle permet de bobiner simplement les transformateurs : bobinage simultané de l'enroulement primaire et de l'enroulement auxiliaire puis bobinage de l'enroulement secondaire en prévoyant une bonne isolation diélectrique, ce qui conduit à un mauvais couplage entre l'enroulement primaire et l'enroulement secondaire mais il y a limitation des surtensions grâce à l'enroulement auxiliaire.
Le montage de la figure 4 pourrait être utilisé dans les convertisseurs résonants pour "renvoyer" l'énergie de l'inductance de résonance dans la source 10 mais il présente deux inconvénients (a) le potentiel aux bornes du transistor T1 est égal à 2.Ve pendant l'écrêtage et le dimensionnement du transistor T1 doit être prévu en conséquence; (b) la surtension 2.Ve devient gênante en fonctionnement à haute fréquence F avec une tension d'entrée ou de sortie variable. En effet, du fait de la diode D1 en série avec le transistor T1, le potentiel aux bornes du transistor T1 restera à un potentiel de 2.Ve de sorte que les pertes de commutation liées à la capacité parasite du transistor T1 ne seront plus optimisées C 2 elles seront égales à P = ~ .(2.Ve) 2 C 2 au lieu de P optimum = C . (Ve + nVs) F Le but de la présente invention est donc de réaliser, dans un convertisseur résonant, un dispositif de limitation de la tension aux bornes du transistor de commutation qui ne présente pas les inconvénients des dispositifs de l'art antérieur.
L'invention concerne donc dans un dispositif d'écrêtage de surtension pour convertisseur d'alimentation à résonance, ledit convertisseur comprenant - un transformateur qui comporte un enroulement primaire de N1 spires ayant une première borne d'entrée et une deuxième borne de sortie et un enroulement secondaire de N2 spires ayant une première borne de sortie et une deuxième borne de sortie, - au moins un interrupteur dont une borne est connectée à la deuxième borne d'entrée dudit enroulement primaire, - une source de tension continue dont une borne est connectée à la première borne d'entrée dudit enroulement primaire et dont l'autre borne est connectée à l'autre borne dudit interrupteur, - un dispositif de commande de la fermeture et de l'ouverture dudit interrupteur, - un dispositif de redressement et filtrage connecté aux première et deuxième bornes de sortie dudit enroulement secondaire, ledit dispositif d'écrêtage étant caractérisé en ce qu'il comprend - au moins un enroulement auxiliaire couplé à l'enroulement primaire, ledit enroulement auxiliaire ayant deux bornes de sortie qui sont connectées respectivement aux bornes de sortie du circuit de redressement et filtrage.