INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Ces électrons créés, dits primaires, violemment attirés par les lignes électriques 22, créent à leur tour des électrons secondaires, eux aussi attirés par ces lignes électriques 22. Ces électrons secondaires crées dans ce processus d'avalanche sont attirés par les lignes 22. Ce phénomène d'attraction de charges négatives par ces lignes est symboliquement représenté sur la figure 2 par des flèches en traits pleins PC2.
Dans cet exemple de réalisation, les fils 22 remplissent en outre un rôle de collectage des charges négatives.
Les ions positifs crées lors de l'amplification sont quant à eux collectés par le réseau 18 porté à la masse.
Des photons sont émis au cours du processus d'avalanche, résultant de collisions inélastiques entre les électrons et les molécules du gaz. Ces photons sont symbolisés sur la figure 2 par des flèches ondulées PH et sont émis dans la gamme ultraviolette.
Le nombre de ces photons est amplifié grâce à des moyens d'amplification constitué du mélange gazeux conventionnel d'amplification des électrons comme par exemple un mélange de gaz rare et d'un hydrocarbure, auquel on ajoute des vapeurs de molécules à faible potentiel d'ionisation, pour augmenter le nombre de photons produits par électron.
Avantageusement, la triéthylamine (ou TEA) présente cette particularité et permet d'augmenter la longueur d'onde des photons émis. Son spectre d'émission se situe dans l'ultra-violet, entre 260 nm et 310 nm.
Le mélange gazeux 17 contenu dans l'enceinte peut avoir la composition suivante: 90 % d'argon, 8 % de méthane et 2 % de triéthylamine.
De retour à la figure 1, on voit que le dispositif comprend des moyens de focalisation 28 (simple lentille ou système optique plus complexe mais connu en soi) disposés en regard de la fenêtre de sortie 26, des moyens d'intensification d'image 29, des moyens d'adaptation de taille d'image 60 et un dispositif matriciel de capteurs à charges couplées 58 ("charges coupled device" ou CCD en terminologie anglosaxonne).
Les moyens de focalisation 28 permettent de former une image de la distribution de photons engendrés lors des phénomènes d'amplification sur la face d'entrée des moyens d'intensification d'image 29.
La figure 3 représente une vue en coupe des moyens d'intensification d'image, selon un premier mode de réalisation.
Ces moyens aptes à délivrer des impulsions lumineuses sont composés dans cette réalisation par un intensificateur d'image, par exemple du type de ceux commercialisés par la société RTC sous la référence XX1410.
Comme on peut le voir sur la figure 3, un tel intensificateur comprend une fenêtre en quartz 30, une photocathode 32 fonctionnant aux longeurs d'onde d'émission du mélange gazeux, une galette de microcanaux 34, un écran fluorescent 36, et un ensemble de fibres optiques 38 assemblées côte à côte de manière à ce que leurs extrémités forment des faces planes.
Les photons focalisés par les moyens 28 de focalisation traversent la fenêtre de quartz 30 et viennent frapper la photocathode 32 qui produit alors des électrons. La photocathode 32 est par exemple portée au potentiel de masse, alors que l'extrémité en regard des microcanaux est portée à un potentiel V1 égal par exemple à 200V.
Les électrons produits par la photocathode accélérés par cette différence de potentiel pénètrent dans les microcanaux sensiblement en regard du point de leur production.
Une galette de microcanaux 34 est constituée d'environ 103 canaux soumis à une différence de potentiel V2-V1 entre leurs extrémités. Si V1 est égal à 200V, V2 peut être égal à 1000V.
Comme on peut le voir sur la figure 4, un canal est constitué par un tube 35, par exemple en verre de diamètre interne égal à environ 10 micromètres et dont la paroi interne est recouverte par un revêtement conducteur.
3.5 Détermination de la constante d'affinité de la CA4H pour le tr-cinnamate dans les microsomes de levure L'amplitude totale observée entre le maximum positif à 370 nm et le pic négatif à 418 nm dans un spectre de perturbation de type I, varie en fonction du substrat spécifique ajouté lorsque le substrat est en concentration limitant par rapport aux cytochromes P450 capables de fixer ce substrat présents dans les microsomes.Si l'on reporte les valeurs inverses des amplitudes d'absorption mesurées dans un spectre de perturbation de type I en fonction de la valeur inverse des concentrations croissantes de substrat ajouté (représentation de Lineweaver Burk), on obtient une droite et la constante d'affinité du cytochrome P450 considéré pour son substrat spécifique peut être calcule directement à partir du point d'intersection de la droite avec l'axe X. En figure 7 est montrée une représentation de Lineweaver-Burk en reportant la variation de l'amplitude d'absorption dans un spectre de type I en fonction du tr-cinnamate ajouté en quantités croissantes à des microsomes oxydés issus d'une culture induite de la souche WRCA.Les conditions expérimentales étant identiques à celles décrites sous 3.3 à l'exception des concentrations en tr-cinnamate utilisées allant de 0,2, 1,0, 3,0, 10,0 à 30,0 microM, elles ne seront pas reprises ici. La constante d'affinité de la CA4H de topinambour dans les microsomes de levure en présence de la P450 Réductase endogène de Levure ainsi mesurée est de 2,2 microM, ce qui est en excellente concordance avec les valeurs obtenues avec des microsomes de topinambour qui varient entre 1 et 10 microM selon les préparations (F.
Durst, communication personnelle). Il est donc évident que la levure S. cer. fournit l'environnement similaire à celui de la plante pour l'expression efficace de la CA4H.
'3.'6 Détermination de l'efficacité de couplage entre la P450 Réductase de levure et la CA4H de topinambour dans les microsomes de la souche WRCA Les cytochromes P450 ne sont pas autosuffisants pour effectuer l'hydroxylation de leurs substrats. Le complexe enzymatique actif est constitué de deux composants, le cytochrome P450 et la P450 Réductase, qui assure la channe de transport des électrons nécessaires à l'hydroxylation du NADPH vers le Cytochrome P450. En cas de couplage parfait (illustré en figure 8) on observera donc la consommation d'une molécule de NADPH par molécule de produit formé. Aucun cytochrome P450 végétal n'ayant jamais été exprimé chez la levure, il est primordial de s'assurer que la levure fournit l'environnement réducteur adéquat à l'activité enzymatique de la CA4H de topinambour.
Dans ce but l'expérience suivante a été réalisée : un mélange réactionnel constitué de 6 nM de CA4H (dilution 1 pour 200 de la solution stock de microsomes) dans un tampon phosphate 50 mM pH 7,4 et de NADPH réduit 0,1 mglml est réparti à parts égales dans deux cuvettes spectrophotométriques. La quantité de NADPH réduit dans les deux cuves étant identique, l'absorption différentielle initiale mesurée à 350 nm est zéro. Puis on ajoute à la cuvette d'essai du tr-cinnamate à la concentration finale de 10 microM. En cas de couplage parfait on doit enregistrer à 350 nm une diminution d'absorption correspondant à la consommation dlune quantité équivalente de NADPH.
En figure 8 est montré l'enregistrement de cette expérience. L'ajout de 10 moles de tr-cinnamate résulte en une diminution de l'absorption initiale dans la cuve d'essai de 0,06 OD.
En se servant du coefficient molaire du NADPH réduit (6200 M 1 cm 1) il est facile de convertir la variation d'absorption en moles NADPH oxydés. En effet, après l'ajout de 10 nmoles de tr-cinnamate 9,7 nmoles de NADPH ont été oxydés, ce qui résulte en un facteur de couplage de 1,03. il est donc évident que la P450 Réductase de la levure est capable de parfaitement assurer la chaîne de transport des électrons vers la CA4H de topinambour afin de le faire fonctionner.
3.7 Détermination de la vitesse maximale de conversion de la CA4H dans les microsomes de levure ainsi que le Rm La vitesse maximale de conversion du cytochrome P450 végétal mesurée dans les microsomes de levure est une valeur très importante pour apprécier si S. Cer est un outil industriel intéressant pour y réaliser des bioconversions à l'aide de cytochromes P450, la vitesse de la réaction enzymatique étant un des critères principaux.
Ceci d'autant plus que les cytochromes P450 de mammifères sont connus pour être des enzymes dites"lentes". Dans la même expérience on déterminera également la constante de Michaelis, qui donne la concentration en substrat nécessaire pour que la CA4H fonctionne à 50 % de sa vitesse maximale. Sous 3.6 il a été démontré que l'efficacité de couplage entre la P450 Réductase de levure et la CA4H exprimé par la relation de NADPH consommé pour substrat converti est très voisin de 1. De ce fait il est possible de suivre l'activité de la CA4H en fonction de la concentration du tr-cinnamate ajouté par la vitesse de consommation du NADPH.En effet, le NADPH réduit absorbe fortement à une longueur d'onde de 340 nm (coefficient d'absorption molaire = 6200) et la pente de la variation de l'absorption dans le temps est directement proportionnelle à la vitesse de la transformation du tr-cinnamate en coumarate par la CA4H. Néanmoins afin d'éviter des interférences avec le coumarate formé qui absorbe faiblement à 340 nm, les mesures seront effectuées à 350 nm, une longueur d'onde ou seul le NADPH réduit montre une forte absorption.
Plus précisément, on réalise un mélange réactionnel, constitué d'une dilution 200 fois (concentration finale ea CA4H est de 6 nM) de la solution stock de microsomes dans un tampon phosphate 50 mM à pH 7,4 et du NADPH réduit en excès à 0,1 mg/ml. Ce mélange est réparti à parties égales dans deux cuvettes spectrophotométriques, on ajoute des concentrations croissantes de tr-cinnamate au temps zéro, puis on suit par spectrophotométrie différentielle la diminution de l'absorption initiale à 350 nm dans le temps dans la cuve d'essai par rapport à la cuve témoin. On a effectué les enregistrements de cette expérieace pour des concentrations en tr-cinnamate de 0, 0,4, 0,8, 1,6, 3,2, 6,4, 12,6 et 25 microM.A partir des pentes obtenues, il est donc possible de les convertir directement en activité CA4H et de réaliser une représentation selon Lineweaver-Burk en reportant l'inverse des activités CA4H mesurées en fonction de l'interne de la concentration de tr-cinnamate ajoutée au milieu réactionnel. Le point d'intersection de la droite ainsi obtenue (figure 9 avec l'axe Y donnent la valeur de la vitesse maximum de conversion de la CA4H, tandis que le point d'intersection avec l'axe X donne la valeur du Km.La vitesse maximale in vitro de 400 +/- 50 min 1 est la plus grande obtenue à ce jour pour un P450 eucaryotique ce qui montre bien que dans un contexte génétique où il est possible de surexprimer simultanément la P450 Réductase de levure et la CA4K, S. cer. fournit le meilleur environnement connu actuellement afin de faire fonctionner de façon très efficace un cytochrome P450 végétal. Sur la base des activités mesurées in vitro, la souche WRCA est un excellent candidat pour réaliser la bioconversion du tr-cinnamate en coumarate par la CA4H à l'échelle industrielle.Dans ce sens la valeur très basse du Km de 1,2 microM acquiert toute son importance, puisque de faibles concentrations intra ceLLulaires en tr-cinnamate de l'ordre micromolaire suffisent pour faire tourner la CA4H à plein régime.
3.'8 Mesure directe de la vitesse maximale de conversion de la CA4H sur des microsomes de WRCA La mesure de la consommation de NADPH est certainement très appropriée au niveau expérimental, mais ne constitue qu'une preuve indirecte de l'activité enzymatique de la CA4H. Il reste donc très important de valider les résultats ainsi obtenus sous 3.7 par des mesures d'activité réelle, c'est-à-dire les valeurs comparables pour la vitesse maximale de conversion de la CA4H doivent être retrouvées lorsqu'on suit l'activité enzymatique par la mesure de la quantité de tr-coumarate formé.A cette fin l'expérience suivante a été réalisée : un mélange réactionnel de 1 ml contenant 50 mM tampon phosphate pE 7,4, 50 microM tr-cinnamate, 0,1 mg/ml NADPH et 12 pmoles de CA4H (dilution 1 pour 1000 de la solution stock de microsomes) est préparé sur la glace. Les microsomes sont ajoutés en dernier lieu, puis la réaction est démarré en plaçant le milieu réactionnel complet à 370C.
La réaction est arrêtée aux temps indiqués au tableau 2, par prélèvement d'un échantillon de 50 microlitres auquel on ajoute 2,5 microlitres de l'acide trifluoroacétique, puis on sépare par HPLC dans les conditions décrites cidessus. La figure 10 montre la cinétique de la formation du coumarate en se servant des valeurs du tableau i. En effet dans une initiale de 6 minutes où le substrat est en excès, la formation de tr-coumarate est linéaire dans le temps et décline rapidement ensuite pour atteindre le plateau après 15 minutes seulement. Ceci se traduit par un rapide déclin de la vitesse maximale quand le substrat commence à devenir limitant.Il est très important à noter que la valeur de la vitesse maximale de conversion de la CA4H est de 350 min-l lorsque le substrat est en excès, une valeur qui est en parfaite concordance avec les valeurs trouvées par test indirect, ce qui renforce les commentaires faits sous 3.7.
incubation (min.) tr-coumarate Activité spécifique (n moles) (min~1) ; 3 0 3 13 350 6 25 350 10 32 265 15 41 221 15'50 46 n.d 25 44 n.d '4. -Procédé'de bioconversion mettant en oeuvre une souche de'levure surexprimant la P450 Réductase endogène ainsi qu'un cytochrome P450 végétal. Exemplification par la production de tr-coumarate à partir du tr 'cinnamate sur cellules entières contenant la CA4H de topinambour.
Une culture de 200 ml dans un erlenmeyer de 1 L de la souche WRCA est incubée à 270C sous agitation vigoureuse (200 rpm) dans un milieu YPGAL jusqu'à 5 DO (phase stationnaire de saturation). A ce moment on ajoute du cinnamate à une concentration finale de 100 microM, puis on continue l'incubation. On prélève des échantillons de 100 microlitres au moment de l'ajout du tr-cinnamate et puis 1, 10, 30, et 100 minutes après l'ajout. Puis on procède à 11 extraction selon les méthodes décrites sous 3.3, et on analyse les échantillons par chromatographie HPLC (voir 3.3). La longueur d'onde d'analyse est volontairement choisie à 314 nm, une longueur d'onde où l'absorption du tr-coumarate est presque maximale tandis que Le tr-cinnamate n'absorbe que très peu.L'amplitude des pics d'absorption n'est par conséquence pas identique pour une même concentration de tr-cinnamate et du tr-coumarate. Le but de cette expérience étant de quantifier l'évolution de la quantité de tr-coumarate trouvée dans le milieu de culture en fonction du temps, une échelle de concentrations connues de tr-coumarate a été utilisée pour la calibration, permettant de traduire l'amplitude du pic de coumarate en concentration ou en nombre de molécules de tr-coumarate formé. La superposition de 4 chromatogrammes a été réalisée sur les 4 échantillons préle ves aux temps indiqués ci-dessus. il est évident que très vite après l'ajout du tr-cinnamate, on peut déceler des quantités importantes dans le milieu de culture sans apparition de produits secondaires.Vu la valeur de la constante d'affinité de la CA4H pour le tr-cinnamate qui est de l'ordre micromolaire, il est clair que au moins 95 % du substrat initialement présent dans la culture seront transformés en tr-coumarate avant que la concentration devienne limitante. lie fait de retrouver des quantités importantes de tr-coumarate rapidement dans le milieu de culture laisse supposer que le tr-cinnamate diffuse suffisamment vite dans la cellule pour que la CA4H puisse fonctionner à plein régime, et aussi que le produit formé n'est pas retenu ou métabolisé dans la levure mais excrété dans le milieu.Ceci rend faisable la récupération puis la purification du produit lors d'une bioconversion à l'échelle industrielle, mais explique aussi l'apparente inocuité du coumarate pour la cellule. il est en effet peu probable d'obtenir en grande quantité un produit par bioconversion s'il est accumulé à l'intérieur de la cellule.
Sur Labase des pics observés en figure il la productivité calculée est de 10 micromoles de coumarate formés/minute.
litre de culture. En figure 11 est montrée une cinétique qui reporte le nombre de tr-coumarate formée par cellule de levures (calculé à partir des chromatogrammes) en fonction du temps. il est clair que ce processus de bioconversion est tout-à-fait stable dans le temps. Ceci est un critère essentiel pour l'application de la souche WRCA pour un procédé industriel d'obtention de tr-coumarate par bioconversion. En extrapolant cette frappante stabilité de la CA4H de topinambour dans la levure par rapport à d'autres cytochromes P450 de mammifères la productivité citée ci-dessus sera d'environ 10 grammes de coumarate formé par jour et par litre de culture dans des conditions de laboratoire. Ces valeurs peuvent raisonnablement être améliorées d'un facteur 5 lors d'un procédé de fermentation industriel.
EXEMPLE 1 Deux lots de films sont préparés par le procédé de l'invention au moyen de l'installation schématisée à la figure 1. Cette installation comprend un récipient 1 contenant la solution de départ (solution primaire ou solution active). Cette solution est aspirée dans un conduit 2 équipé d'une pompe 3 vers un dispositif de pulvérisation 4 comprenant plusieurs buses de débit ajustable placées en rangées.
Ces buses sont disposées au-dessus d'un bac 5 contenant un film d'eau d'épaisseur comprise entre 1 et 10 cm (de l'ordre de 5 cm dans l'exemple). Les buses sont positionnées de façon que la solution soit pulvérisée sur la largeur du bac.
A sa sortie du bac, le film formé est guidé par un cylindre 6 en partie immergé dans le liquide ; il est ensuite guidé par un autre cylindre 7 et entraîné par des rouleaux 8 et 9 dont la vitesse de rotation est réglable. En l'exemple, le rouleau 8 est un rouleau réalisé en un matériau microporeux, qui est relié à un système de pompe à vide afin d'assurer un préséchage du film.
Le film est ensuite séché en étuve ventilée dans un tunnel de séchage 10 parcouru par un courant d'air chaud. Le film séché est collecté sur un rouleau 11 afin d'être ultérieurement découpé aux dimensions souhaitées.
Les deux lots de films préparés à cet exemple sont des films bicouches comprenant une sous-couche de polymère ne contenant pas de principe actif (obtenue à partir d'une solution dite primaire) et une couche active contenant le principe actif (obtenue à partir d'une solution dite active).
Le polymère utilisé est un polymère poly DL lactide de poids moléculaire égal à environ 100 000. Le tableau ci-après fournit les compositions des solutions pour chacun des deux lots.
LOT 1 LOT 2 Sous-couche Poly DL lactide 1.25 g 1.25 g Acétone 7.50 ml 7.50 ml Couche active Métronidazole 0.75 g 0.56 g Poly DL lactide 3.75 g 3.75 g Acétone 72.50 ml 72.50 ml Après pulvérisation des deux couches, chaque film est séché en étuve ventilée à + 40 OC durant 4 heures. Le film sec, présentant une épaisseur de 500 micromètres, est ensuite découpé en bandelettes de 5 cm de long sur 1 cm de large.
Le tableau ci-après résume pour les deux lots les caractéristiques de chacune des bandelettes obtenues.
LOI 1 LOT 2 Poids théorique Poids moyen Poids théorique Poids moyen 50 mg = 52,5 mg 50 mg = 43,7 mg Métronidazole 6,53 mg 5,57 mg 5,00 mg 3,78 mg Poly DL lactide 43,47 mg 46,93 mg 45,00 mg 39,92 mg
EXEMPLE 2 Six bandelettes de même dimension provenant de chacun des deux lots fabriqués à l'exemple 1 sont plongées dans de l'eau bidistillée stérile, contenue dans six cuves.
La figure 2 et les deux tableaux qui suivent illustrent la cinétique de dissolution du métronidazole.
Lot n 1
Jour 4 7 10 14 21 Quantité dissoute CUVE 1: Quantité mg 0.81 mg 1.1817 mg 1.531 mg 1.584 mg 1.76 mg % de quantité dissoute 13.44 % 19.6 % 25.41 % 2629 % 2921 % CUVE 2: Quantité mg 0529 mg 0.793 mg 1.074 mg 1245 mg 1.53 mg % de quantité dissoute 9.26% 13.86% 18.81% 21.80% 26.79% CUVE 3: Quantité mg 1.12mg 1.489mg 1.79mg 1.616mg 1.05mg % de quantité dissoute 21.33% 28.36% 34.09% 30.78% 20% CUVE4: Quantité mg 0.997 mg 1358 mg 1.722 mg 1.87 mg 2.13 mg % de Quantité dissoute 1725 % 23.49 % 29.79 % 3235 % 3685 % CUVE 5: Quantité mg 0806 mg 1.086 mg 1.01 mg 1.597 mg 2.05 mg % de quantité dissoute 14.60 % 19.67 % 18.29 % 28.93 % 37.13 % CUVE 6: Quantité mg 0.776mg 0.918mg 1.318mg 0.918mg 0.884mg % de quantité dissoute 15.07 % 17.86% 25.64% 17.86% 17.19% Moyenne : Quantité mg 0.8395 mg 1.137 mg 1.4075 mg 1.471 mg 1.567 mg % de quantité dissoute 15.06% 20.4% 25.26% 26.40% 28.13% Moyenne : Quantité mg 16 mg 21.6mg 26.8 mg 28.0 mg 29.8 mg bandelettes Lot n 2
Jour 4 7 10 14 21 Quantité dissoute CUVE 1: Quantité mg 0.370 mg 0.648 mg 0.729 mg 0.751 mg 0.829 mg % de quantité dissoute 9.26 % 13.77 % 18.31 % 18.86 % 20.82 % CUVE 2: Quantité mg 0.492 mg 0.647 mg 0.8125 mg 0.821 mg 0.921 mg % de quantité dissoute 12.04 % 17.02 % 21.38 % 21.5 % 24.93 % CUVE 3: Quantité mg 1.023 mg 1.378 mg 1.588 mg 1.486 mg 1.21 mg % de quantité dissoute 27.64 % 3721 % 42.92 % 40.16 % 35.4 % CUVE 4: Quantité mg 0.916 mg 1.328 mg 1.634 mg 1.417 mg 1.557 mg % de quantité dissoute 21.86 % 21.69 % 38.99 % 33.81 % 37.16 % CUVE 5: Quantité mg 0344 mg 0.552 mg 0.7388 mg 0.839 mg 1.177 mg % de quantité dissoute 10.39 % 16.67 % 22.32 % 23.34 % 36.55 % CUVE 6: Quantité mg 0.406 mg 0.686 mg 0.978 mg 1.109 mg 1.040 mg % de quantité dissoute 10.91 % 18.49 % 26.36 % 29.89 % 28.03 % Moyenne: Quantité mg 0591 mg 0.8565 mg 1.08 mg 1.0706 mg 1.139 mg % de quantité dissoute 155 % 22 48 % 2838 % 2794 % 30.19 % Moyenne: mg/g de 13.43 19.46 24.54 24.32 26.88 bandelettes On constate une libération d'environ 25 % du métronidazole en une vingtaine de jours. Le métronidazole restant dans chaque bandelette (non dissout) ne sera libéré in vivo qu'après digestion du polymère par les enzymes présentes dans les tissus vivants.
ENSEMBLE DE CONDITIONNEMENT COMPORTANT UN COMPARTIMENT ADDITIONNEL POUR LE STOCKAGE D'ACCESSOIRES OU PRODUITS DIVERS COMPLEMENTAIRES DU PRODUIT PRINCIPAL CONDITIONNE.
La présente invention concerne un perfectionnement apporté aux ensembles permettant le conditionnement de produits divers (liquides, poudres ..) et qui, d'une manière générale, se présentent sous la forme d'une enceinte rigide en forme de seau dont la fermeture est assurée par l'intermédiaire d'un couvercle encastrable le long du bord périphérique définissant l'ouverture de ladite enceinte.
Le stratifié ainsi préparé est recuit pendant 5 heures à 280 C.
Les tests mécaniques effectués sur ce stratifié donnent les résultats suivants - Mf : 105 GPA, - ILSS : 95 MPa, - G1C : 850 J/m2, - Tg : 260 C.
COMPOSITIONS DE MOULAGE THERMODURCISSABLES OBTENUES A PARTIR D'UN OLIGOMERE POLY(IMIDE-AMIDE) THERMOPLASTIQUE REACTIF ET D'UN CO-REACTIF A BASE D'UN POLYCONDENSAT PHENOLIOUE La présente invention concerne des compositions thermodurcissables obtenues à partir d'au moins un oligomère poly(imide-amide) thermoplastique réactif, d'un co-réactif appoprié à base d'un polycondensat phénolique et éventuellement d'additif(s) habituel(s) de transformation, lesdites compositions étant destinées à la réalisation d'objets conformés par la technique du moulage par injection ou par compression. Elle concerne également un procédé de préparation de ces compositions.