INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La fréquence d'infection a été déterminee par immunofluorescence par une technique indirecte décrite par Maule et al (1980). Les protoplastes infectés ont une fluorescence vert clair caractéristique, dispersee dans le cytoplasme ; les protoplastes non infectés sont marron terne. La figure 8 présente les résultats de 4 expériences d'infection de protoplastes de betterave par la technique au polyéthylène glycol. Il a été constaté qu'après 24 heures de culture environ 60% des protoplastes sont infectés. Ce pourcentage n'évolue pas de façon significative pour des durées de culture supérieures à 24 h. L'infection s'est donc réalisée de façon quasi-synchrone.Cette figure nous montre aussi que du virus inactivé par congelations et décongelations répétées ne se réplique pas dans les protoplastes de betterave. Dans toutes les experimentations effectuees, en moyenne 50 % des protoplastes sont infectés.
Les inventeurs ont réussi à introduire des particules virales du BNYVV en utilisant des impulsions electriques (technique d'glectroporation). Les inventeurs se sont inspirés de la technique decrite par Watts et al (1987) et ont utilisé un électroporateur à décharge de capacites (Guerche et al, 1987).
L'optimisation de la technique s'est faite en faisant varier la durée d'impulsion délivrée par des condensateurs de différentes capacites et la résistivité du milieu d'électroporation. C'est ainsi que les inventeurs ont vu que deux impulsions de 100 ms délivrées à 15 secs d'intervalle par des condensateurs de capacite 63 AF chargés à 220 V à 1 x 106 protoplastes remis dans du mannitol contenant du CaCl2 à 5 mM en présence de 5 g de BNYVV permettaient d'avoir un taux de 55 % de protoplastes infectés. L'omission du CaCl2 résulte en une diminution de l'infectivite d'un facteur 3, bien que la viabilité des protoplastes soit augmentée d'un facteur 2. Ceci est illustré sur la figure 9.
Infection de protoplastes de betteraves issus de cellules transformées et non transformées Afin de determiner si la protéine capsidaire du BNYVV et la proteine dérivée produite dans les cellules de betterave pouvait inhiber la multiplication du virus, les inventeurs ont inocule des protoplastes issus de cellules exprimant ou n'exprimant pas ces protéines par le virus. Les expériences ont été réalisées par les techniques au PEG et par l'electroporation. L'infection a été visualisée par immunofluorescence des cellules 30 heures après culture. Il n'a pas été décele de bruit de fond en immunofluorescence dans les cellules transformees et exprimant la protéine capsidaire avant inoculation.
TABLEAU 2 : infection par le BNYVV de protoplastes issus de cellules transformees et non transformees.
Source protoplastes Non Transformé Protection transforme CP+ CP (%) Expérience Pll ss ,814 1 30 1 97 2 68 10 85 3 70 4 94 4 27 1 96 5 35 5 86 6 25 2 92 7 37 10 36 73 8 12 48 75 1 x 106 protoplastes ont été inoculés avec 5 g de BNYW (F13 ou S2) sauf pour l'expérience 4 où l'inoculum consistait de 30 pg de BNYVV les chiffres representent le pourcentage de protoplastes fluorescents détectes 30 h après l'inoculation. CP+ et CP- sont des lignées cellulaires transformees exprimant et n'exprimant pas la protéine capsidaire du BNYVV.
Le tableau 2 résume les resultats obtenus avec deux lignées cellulaires (ss7 et p14) exprimant fortement deux protéines, et la lignee cellulaire transformée (ssD) et la lignée cellulaire non transformée WT. Dans tous les cas, le pourcentage de protoplastes infectés isolés de cellules transformées ss7 et p14 est significativement plus faible que celui des protoplastes de cellules non transformées. Les expériences 7 et 8 prouvent bien que la protection est bien due à la présence des protéines 22 Kd et 29 Kd, car le taux d'infection de protoplastes issus des cellules de la lignée ssD est comparable à celle des cellules non transformées.Donc le processus de transformation en lui-même ne confère pas de protection à l'infection par le virus. L'expression de proteines étrangères, autres que celles du BNYW ne confère pas non plus la protection à l'infection par ce même virus. La protection n'est pas abolie lorsque l'on augmente la concentration du virus présente dans l'inoculum. Les profils densitométriques (figure 10) des RNA totaux (isoles de protoplastes p14 et WT infectés) et hybridés avec une sonde cDNA total contre les 4 RNA de BNYW montrent que ceux-là ne se repliquent pas dans les protoplastes exprimant la proteine capsidaire du virus.
La protection a aussi été observee lorsque l'inoculation a été effectuée par électroporation indiquant que la protection est indépendante de la méthode utilisée pour l'inoculation.
Ces résultats démontrent pour la première fois que des protoplastes de betterave exprimant la protéine capsidaire virale du BNYVV et la protéine chimérique dérivée sont protégés contre l'infection par ce même virus.
L'un des buts de la présente invention est de pefectionner notamment les feux objet dudit brevet ci-dessus afin de pallier les différents inconvénients.
Le feu, selon l'invention est du type comprenant un porte lampes, un ensemble de réflecteurs pour différentes lampes assurant différentes fonctions, soit, changement de direction, feux de position etc.., une structure moulée en matière plastique opaque séparée en différents cadres par des entretoises et disposées devant l'ensemble de ré flecteurs, et une glace fixée à la structure et présentant une partie rouge et une partie cristal, le fond de ladite glace étant conformée pour comporter une optique catadioptrique, ledit feu étant caractérisé en ce que dans chaque cadre de la structure est surmoulé un voile, la glace étant fixée sur ladite structure par soudage ou collage.
Grâce à cette disposition, on réalise un feu d'une fabrication aisée dans lequel on obtient directement un fond pour le catadioptre.
De préférence, le voile de chaque cadre est cristal.
Suivant une variante de réalisation, le voile de chaque cadre est de couleur ambre.
Le voile du cadre situé en regard de la partie cristal de la glace peut comporter une couche de peinture transparente légèrement réfléchissante.
Suivant encore une caractéristique, l'un des voiles au moins comporte, sur au moins l'une de ses faces, une optique.
Suivant une caractéristique de détail, l'un des voiles comporte sur sa face tournée du côté du porte lampes, une optique du type Fresnel à échelons circulaires.
Suivant une variante de réalisation, le voile comportant sur sa face tournée du côté du porte lampes, une optique du type Fresnel à échelons circulaires, comporte sur l'autre face une couche de peinture transparente légèrement réfléchissante.
Suivant encore une variante de réalisation, l'un au moins des voiles comporte, sur sa face tournée vers la glace, une optique formée de calottes sphériques juxtaposées, l'autre face comportant une optique du type Fresnel à échelons cylindriques.
Enfin, suivant une dernière réalisation, l'un au moins des voiles comporte sur sa face tournée vers le porte lampes, une optique à godrons cylindriques.
L'invention va maintenant être décrite avec plus de détails en se référant à des modes de réalisation particuliers donnés à titre d'exemple seulement et repré sentés aux dessins annexés, dans lesquels Figure 1 est une vue en perspective éclatée d'un feu, selon l'invention.
Figure 2 est une vue en coupe du feu de la figure 1.
Le feu, représenté aux figures comprend une structure moulée 1 en matière plastique opaque de préférence noire, celle-ci étant divisée en un certain nombre de cadres par des entretoises. I1 est ainsi prévu des entretoises 2, 3 et 4 qui déterminent des cadres 6, 7, 8 et 9 dans chacun desquels est surmoulé un voile. Ainsi dans le cadre 6 est surmoulé un voile 10, dans le cadre 7 un voile 11, dans le cadre 8 un voile 12 et dans le cadre 9 un voile 13.
Sur la face externe de la structure 1 est fixée, par soudage collage ou autre, une glace extérieure 15 qui présente une partie 16 de couleur rouge dont la face interne comporte, sur au moins une partie de sa surface, une optique catadioptrique. Dans ce mode de réalisation, la glace 15 est complétée par une partie cristal 17, de préférence fumée et qui, sur sa face interne, peut comporter une optique. Derrière la structure 1 est disposé un ensemble de réflecteurs 20 et un porte lampes 21.
Les différents voiles 10, 11, 12 et 13 peuvent être de couleur ambre et, le voile 13 peut comporter, déposée par encrage ou peinture, une partie légèrement argentée ou grise de manière à masquer de l'extérieur, au droit de la partie 17 de la glace 15, la couleur ambre. Ainsi, la fonction changement de direction viendra se situer en regard du voile 13 et la couleur ambre ne sera visible que lorsque la lampe sera allumée. Les voiles 10 et 11 ne seront pas visibles de l'extérieur et n'affecteront pas la couleur rouge de la glace 15.
Le dispositif selon l'invention doit pouvoir distinguer le signal utile S1 diffusé par des hydrométéores dont la vitesse de chute verticale est comprise entre 0,5 m/s (neige) et 50 m/s (grêle), du signal S2 reçu directement de l'antenne d'émission E au travers des lobes secondaires, et aussi du bruit du mélangeur 44.
Afin d'insensibiliser le dispositif aux perturbations électromagnétiques telles que le secteur 50 Hz et les décharges d'origine naturelle (orages) ou industrielle, il faut que la fréquence f0 soit telle que la mesure de vitesses de chutes faibles (0,5 m/s) se traduise par un décalage de fréquence Doppler D supérieur à 50 Hz. On obtient ainsi par calcul une fréquence f0 supérieure à 21 GHz pour un angle e voisin de 45". Pour des raisons de coût, 0 est avantageusement le plus faible possible. Le bruit de phase de la source devant être faible, un oscillateur à résonateur diélectrique (ORD) convient le mieux mais un oscillateur du type GUNN peut également trouver application dans la présente invention.Un multiplieur à diode IMPARTI peut également être utilisé en combinaison avec l'un quelconque des oscillateurs précédents.
Le signal S1 de puissance Psl et de densité de puissance psî est affecté d'un décalage Doppler Ç alors que le signal S2 de puissance P52 et de densité de puissance ps2 est centré sur la fréquence d'émission f0.
La densité de puissance psî est essentiellement déterminée par la distribution des vitesses de particules et ps2 est défini par le bruit de phase du signal d'émission. Le signal S2 constitue donc un signal parasite.
ps2 est proportionnel à d-2 .-4 fo~2 et psî à d-l cl f0 entre 20 et 40 GHz pour la pluie.
La valeur de Ps1 est déduite des calculs effectués préalablement pour a = 45" et e = 20 . Un fontionnement optimal est obtenu pour i = -65 dBm soit psl = - 95 dBm/Hz entre 0,5 et 1,5 kHz et donc - 115 dBm/Hz lorsque la puissance d'émission est de 1 mW.
Le rapport ps1/ps2 est proportionnel à da3 f03.
La distance d séparant l'émetteur E du récepteur R n'intervient qu' à la puissance unité et peut être avantageusement réduite à une taille de l'ordre du mètre.
Afin que le dispositif présente une sensibilité réduite aux éléments environnants tels que murs ou arbres par exemple, qui seraient susceptibles de réfléchir vers l'antenne de réception R l'énergie émise par le lobe principal de l'antenne d'émission E, il est préférable que la distance entre un tel obstacle et le point situé à mi-distance entre E et R soit supérieure à ' à 5d.
Cette valeur est obtenue en supposant une perte par réflexion de 10 dB et en prenant un niveau relatif du lobe secondaire de l'antenne pour l'angle e égal à 30 dB, e étant compris entre 30 et 600 par rapport à l'horizontale.
L'angle a intervient à la puissance 3 et il faut donc choisir la plus grande valeur compatible avec un lobe secondaire faible dans la direction E - R. Or, les dépôts d'impuretés et de matières grasses sur les antennes sont une cause de diffusion. Un affaiblissement des lobes secondaires relatif au lobe principal de 30 dB est donc le maximum envisageable de façon durable en environnement atmosphérique. Les lois d'illumination des antennes simples tels que les cornets conduisent à un rapport entre les largeurs de lobe à 30 dB et à 3 dB voisin de 4.
Une valeur préférentielle de l'angle a est donc définie dans l'hypothèse d'un affaiblissement de - 30 dB dans la direction E-R et dans la direction perpendiculaire.
On obtient donc a = 90/4 = 22,5 avec e = 45".
La fréquence f0 intervient à la puissance 3. Au voisinage de 40 GHz, la puissance diffusée décroît lentement. La valeur optimale de la fréquence est choisie en fonction des équipements industriels existants. La valeur la plus proche de 40 GHz étant 35 GHz, c'est cette dernière valeur qui est adoptée pour le dispositif selon l'invention.
La puissance d'émission P e minimale est fonction de la densité de bruit n du récepteur, essentiellement due au mélangeur. En supposant la densité de bruit uniforme au récepteur, correspondant à un facteur de bruit de 14 dB, et sachant que n = FkT et que 10 log kT = - 174 dBm/Hz, on obtient pour T = 290 K, n = - 160 dBm/Hz.
La condition p2 2 n s'écrit alors
A titre d'acides fréquemment utilisés pour la préparation des sels d'addition on cite de façon non limitative les acides acétique, benzènesulfonique, camphosulfonique, citrique, éthanesulfonique, fumarique, bromhydrique, chlorhydrique, lactique, maléfique, malique, méthanesulfonique, mucique, nitrique, pamoïque, n phosphorique, salicylique, stéarique, succinique, sulfurique, tartrique.
Etudiées chez l'animal, les cycloalkylalkylamines (I) de l'invention et leurs sels se montrent faiblement toxiques et révèlent à la fois - une activité psychotrope montrée par leur aptitude à inhiber les crises convulsives provoquées par la picrotoxine, - une activité inhibitrice de l'effet ulcérogène de la cystéamine au niveau gastro-duodénal, propriété imputée à l'affinité particulière des composés pour les récepteurs opioïdes sigma présents dans ces organes.
Aussi, les composés de l'invention sous forme de médicaments justifient dlune utilité indéniable et dans ces indications on préfère que l'une au moins des conditions suivantes soit satisfaite R1 est un radical thiènyle, R2 est alkyle inférieur comprenant de 1 à 3 atomes de carbone et notamment est éthyle, R3 est méthyle, R4 est cycloalkyle CH(CH2)n non substitué et dans lequel n a pour valeur 2, R5 est phényle, Q est le groupe éthylene-1,2-diyle -CH=CH- ou le groupe cyclopropane-1,2-diyle.
L'invention vise aussi un procédé de préparation des amines (I) qui consiste comme il est montré au schéma 1 - pour préparer un composé (II) de formule générale (I) et dans laquelle R3 est l'hydrogène et R1, R2, m, R4, R5 et Q ont les significations précédemment énoncées, i) à acyler une amine (V) de formule
dans laquelle R1, R2, R5 et Q sont tels que précédemment définis, par un réactif (VI) (R4-(CH2)m-l]-CO)pZl VI dans lequel R4 et m ont les significations définies plus haut, p a pour valeur 1 ou 2 Z1 est hydroxyle (-OH) ou halogène comme le chlore ou le brome lorsque p = 1 et est un atome d'oxygène lorsque p=2, pour obtenir un carboxamide intermédiaire (IV) que l'on réduit par un hydrure métallique (Hm) de formule Ml (t) M2 H(r) Rx(s) (Hm) dans laquelle Ml représente un atome alcalin comme le lithium ou le sodium et dont l'indice (t) a pour valeurs 0 ou 1, M2 est un élément du groupe III de la classification périodique des éléments et de préférence le bore ou l'aluminium, (r) est l'indice représentatif du nombre d'atomes d'hydrogène de l'hydrure et qui a pour valeurs 1, 2, 3 ou 4, Rx est un groupe carbonitrile, un radical alkyle ou alkoxy inférieur dont l'indice (s) a pour valeurs 0, 1, 2 ou 3, Les indices présentés ci-dessus répondant pour ces hydrures à la relation : (r) + (s) - (t) = 3 et dans lesquels on préfère pour réduire les composés (IV) les hydrures (hum.2) dans lesquels M2 est l'aluminium ou encore le bore lorsque (r) a pour valeur 3 et (s) et (t) ont pour valeur 0, en une cycloalkylalkylamine (II) de formule générale (I) dans laquelle R3 est l'hydrogène.
ii) à alkyler une amine (V) par un halogénure d'alkyle R4-(CH2)m-Z2 dans lequel R4 et m ont les significations déjà citées et Z2 est un halogène tel que le chlore, le brome ou l'iode.
- et pour préparer une cycloalkylalkylamine (III) de formule générale (I) dans laquelle R3 est alkyle inférieur et R1, R2, m, R4, R5 et Q ont les significations déjà précisées, i) à procéder à une alkylation réductrice d'un composé (II) de l'invention qui consiste à le faire réagir avec un aldehyde R6-CHO dans lequel R6 est l'homologue carboné immédiatement inférieur au radical R3 à introduire (R3 = CH2-R6), et avec un agent réducteur comme un hydrure métallique ou organométallique (Hm.3) de formule (Hm) déja définie et dans laquelle plus particulièrement M2 est le bore et, de façon préférée Rx est un groupe carbonitrile, ii) ou à acyler une amine (VII) dans laquelle Rl, R2, R3, R5 et Q ont les significations précisées pour (I), par un halogénure d'acyle de formule R4-[(CH2)m-l]COZ4 dans lequel R4 et m ont les significations déjà définies et Z4 est un halogène et plus particulièrement le chlore ou le brome, pour obtenir le N-carboxamide intermédiaire (VIII) qui est réduit par un hydrure métallique (Hm.2) précédemment défini, en une cycloalkylalkylamine (III) de l'invention, iii) ou, à faire réagir sur un intermédiaire amino nitrile (IX)
dans lequel R1, R3, m, R4 , R5 et Q sont tels que définis pour (I), un réactif organomagnésien R2MgZ3 dans lequel R2 est alkyle inférieur et Z3 halogène comme le chlore, le brome ou l'iode, pour obtenir une cycloalkylalkylamine (III).
iiii) ou encore à alkyler une amine (VII) précédemment définie par un halogénure d'alkyle R4-(CH2)m-Z2 dans lequel R4 et m ont les significations définies pour (I) et Z2 est un halogène tel que le chlore le brome ou l'iode.
SCHEMA 1
A la demande de brevet européen n" 0 298 703 il est décrit des dérivés du thiophène de formule dans laquelle, au sens le plus large, - Rt est un radical thiényle, - R1, R2 et R3 représentent des radicaux alkyle inférieur, - Rph est un radical phényle éventuellement ~ Ibstitué, - p a pour valeurs 1, 2 ou 3, et, dans laquelle, pour les composés préférés, - R1 est un radical éthyle, - R2 et R3 sont des radicaux méthyle, - Rph est un radical phényle, 3, 4-diméthoxyphényle, 3,4,5-trimethoxyphenyle ou 4-chlorophényle, - p a pour valeurs 1 ou 3.
Sans démonstration objective, les composés sont présentés peu toxiques et avoir un effet régulateur de la motilité du tractus gastro intestinal caractérisé par un effet stimulant sur un tractus d'activité ralentie et,inversement, par un effet inhibiteur sur un tractus hyperactif.
Différents de par leur structure chimique, notamment par la nature de la chaine carbonée reliant les deux sites aromatiques qui sont dénommés Rt et Rph dans la formule précédente et par la nature des substituants de la fonction aminée, les composés de la demande européenne différent des cycloalkylalkylamines (I) de l'invention par leurs propriétés. Essentiellement il n'est pas rapporté d'activité de type psychotrope pour les composés de la demande n O 298 703, activité qui permet d'envisager, entre autres, pour les amines (I) leur utilité au traitement des affections neuropsychiques. De même il n'est fait aucune mention de l'activité des composés à agir sur les lésions ulcéreuses du tractus gastro intestinal.
Comme il a été précédemment exposé les composés intermédiaires qui permettent la préparation des produits (I) de l'invention sont essentiellement les dérivés de structure (V) (VII) et (IX).
Le procédé de préparation des composés (V) consiste à aîkyîer un composé R1-CH2-W dans lequel R1 est tel que défini pour (I) et W est un radical nitrile (-CN) ou carboxyle (-COOH) par un halogènure d'alkyle de formule R2Z6, R2 étant défini pour (I) et Z6 étant un halogène, pour obtenir, pour W = -COOH un acide de formule (XV) R1(R2)-CH-COOH, et, pour W = -CN, obtenir un nitrile de formule (XVI) R1(R2)-CH-CN qui est hydrolysé en acide (XV), puis à alkyler l'acide (XV) par un réactif (XIII) de formule Z5-CH2-Q-R5, Z5 étant un halogène ou un radical alkylsulfonyloxy, R5 et Q tels que définis pour (I) pour obtenir les acides (XIV) R1(R2)C(COOH)CH2-Q-R5 puis à préparer, comme il est montré au schéma 2, les isocyanates (X) par la réaction de Curtius à partir de ces acides.
dans lesquels R1, R2 , R5 et Q ont les significations précisées pour (I), et finalement à hydrolyser leur fonction isocyanate dans des conditions identiques à celles précisées plus loin pour les composés (X') pour obtenir les composés (V).
La suspension cellulaire s'établit en 2 ou 3 semaines. Chaque suspension est repiquée toutes les 3 semaines environ comme suit - le contenu de chaque erlenmeyer après 3 semaines de culture est filtré sur une serie de trois tamis empilés (dont les mailles sont de 1 mm, 500 ym et 100 m). Une partie de chaque fraction ( > 1 mm, > 500pm, > 100 ?m) est remise en suspension dans 100 ml de milieu NSBl frais en erlenmeyers de 250 nil. Ces nouvelles suspensions sont à nouveau agitées à 200 RPM.L'observation des differentes suspensions cellulaires établies à partir des différents génotypes ont permis de distinguer deux types cellulaires * type habitué (A) : suspension fine, verte à croissance rapide, régénère ponctuellement des formations vitrifiées se développant difficilement, * type noduleux (C) : suspension d'agregats compacts jaunâtres, à croissance plus lente, régénère plus fréquemment que la première, des structures embryonnaires compactes se développant assez bien.
EXEMPLE 11 : TRANSFORMATION DE SUSPENSIONS CELLULAIRES ET DE JEUNES CALS Suspension cellulaires La transformation est faite sur des suspens ions cellulaires après 3 semaines de culture, sans repiquage.
Dans un tube plastique, stérile et gradue, on recueille une partie de la suspens ion de manière à avoir 5 ml de cellules tassées dans 10 ml de milieu. 10 ml milieu MSB1 frais sont rajoutés. La nouvelle suspension ainsi obtenue est distribuee dans quatre boîtes de pétri à raison de 5 ml par boite.
Les souches d'Aqrobacterium tumefaciens testées sont LBA 4404, EHA 101, C58'3. Chacune de ces souches contient des vecteurs binaires portant les gènes construits (exemples 5 et 6) et plus particulièrement le vecteur pGA-B-3-1B (exemple 8).
Les souches bactériennes sont conserves à -20 C dans 15 % de glycérol. 50 pl de chaque souche sont prélevés et mis en culture dans 2 ml de milieu LB + rifampicine + tetracycline. Les cultures sont agitees à 200 RPM à 30"C pendant 2 jours. Chaque souche est repiquée dans du milieu frais et cultivée dans les conditions décrites plus haut pendant une nuit.
Quand les bactéries sont ainsi prêtes, l'infection des cellules végétales est faite - 50 pl de chaque souche poussée une nuit sont prélevés et ajoutés à une des boîtes de Pétri contenant les cellules de betteraves decrites plus haut - la coculture des cellules de betterave et des bactéries se fait à l'obscurité pendant 3 jours en chambre de culture Après ces 3 jours, des cellules végétales sont lavées pour éliminer la bactérie, une première fois avec du MSB1 + 600 mg/l de céfotaxime (bactériostatique inhibant la croissance d'Aqrobacterium), puis une deuxième fois dans du milieu MSB1 + 300 mg de céfotaxime - les cellules ainsi lavees sont mises en culture sur un disque de papier Whatman stérile déposé sur du milieu MSB1 + CK (tableau 3), en boîtes de Pétri (la kanamycine est l'agent sélectif permettant aux seules cellules transformees de se developper). Les boites sont scellées avec du scello-frais et mises en chambre de culture. 15 jours apres, les filtres portant les cellules vegetales sont repiqués sur du milieu frais MSB1 + céfotaxime + kanamycine - 3 à 8 semaines apres la coculture, des cals blancs apparaissent sur un lit de cellules mortes.
Quand ils sont suffisamment développés, ces cals sont repiqués soit sur milieu MSB1 + CK ou MSB1 + C ; la plupart des cals poussent sur les deux milieux. Un test histochimique (Jefferson, 1987) pour déceler l'activité de la protéine codée par le gène de la p-glucuronidase dans les cellules de ces cals, a permis d'évaluer à environ 80 % le taux de cals positifs pour ce test. Ceci confirme donc le caractère transgénique de la plupart des cals obtenus.