INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Par ailleurs, le diagnostic des maladies génétiques, le typage cellulaire et même dans certains cas l'identification de virus mutants nécessitent la détection de mutations ponctuelles dans génome. Dans de tels cas, la mise au point de sondes de capture suffisamment sensibles pour détecter une mutation ponctuelle dans la région de la cible complémentaire de la séquence de la sonde de capture, est difficile. Les systèmes de sondes commercialisés actuellement pour réaliser ce type de détection sont peu pratiques car chaque système commercial doit être mis en oeuvre à une température donnée qui varie avec le système utilisé, ce qui empêche de faire des déterminations variées en opérant sur des appareils automatiques travaillant à une température unique.
La présente invention a pour objet un procédé de détection de séquences nucléiques, selon la technique d'hybridation sandwich, ayant une sensibilité suffisante pour permettre l'utilisation d'une sonde de détection non radioactive. Cela est rendu possible grâce à l'utilisation de sondes de capture de très courte taille dont on a découvert qu'elles confèrent au test sandwich une grande spécificité tout en conservant une bonne sensibilité, et qu'elles permettent de détecter et de différentier des séquences homologues à un nucléotide près. L'utilisation d'oligo-nucléotides de courte taille facilite la construction des sondes en grande quantité avec un rendement acceptable, et permet de disposer d'un grand éventail de sélectivités.Cela est particulièrement utile dans le cas du typage ULA où les mutations définissant le type cellulaire sont localisées sur de courtes portions du gène.
On a en outre découvert qu'il est possible de réaliser l'adsorption passive directe, sur un support polymère tel que le polystyrène, de sondes oligo-nucléotidiques de très courte taille (jusqu'à un minimum de 11 nucléotides), ainsi que la fixation passive de sondes encore plus courtes (jusqu a un minimum de 9 nucléotides) par l'intermédiaire d'une protéine à laquelle la sonde est liée de façon covalente. Il s'agit d'un résultat surprenant puisque jusqu a présent, on utilisait généralement comme sondes de capture, des séquences comportant plus de 100 bases (généralement plusieurs centaines de bases), alors que les séquences oligo-nucléotidiques (dT)15 ne se fixent pas de façon passive (c'est-à-dire par adsorption) sur le polystyrène ; voir LACY M.J. et VOSS E.W., J. of Immunol.Methods, 116, 87-98 (1989). D'autres auteurs cherchaient à favoriser la fixation de la sonde de capture en saturant le support de polystyrène avec du poly(dT)4000 et en couplant la sonde de capture, comportant plusieurs dizaines de bases, à une "queue" de poly(dA) ayant de 30 à plus de 100 motifs ; voir MORRISSEY D.V. et COLLINS M.L., Molecular and Cellular Probes, 3, 1 89-207 (1989). Selon l'expérience de la demanderesse, la saturation du support solide par du poly(dT) n'améliore pas la détection.
En outre, grâce à l'utilisation de sondes de courte taille procurant une sensibilité accrue, le procédé de l'invention permet de choisir à volonté une température de travail prédéterminée, et de construire dans chaque cas des sondes de longueur adaptée pour pouvoir effectuer les déterminations des cibles les plus diverses à une même température de travail prédéterminée. On conçoit aisément la simplification de procédure et les possibilités d'automatisation qui en résultent.
La présente invention a donc pour objet un procédé de détection d'une séquence nucléotidique simple brin dans un échantillon la contenant ou susceptible de la contenir, selon la technique d'hybridation sandwich avec une sonde de capture fixée de façon passive sur un support solide et une sonde de détection marquée avec un marqueur non radioactif, les sondes de capture et de détection étant capables d'hybridation, respectivement, avec deux régions non chevauchantes de la séquence nucléotidique-cible recherchée, caractérisé par le fait que la sonde de capture contient de 9 à 30 nucléotides et peut contenir notamment de 9 à 25 nucléotides, et en particulier de 9 à 20 nucléotides.
Lorsque la sonde de capture contient au moins 11 nucléotides, il est généralement possible de la fixer de façon non spécifique (c'est-à-dire par adsorption) sur un support polymère hydrophobe tel que le polystyrène ou analogues. On peut utiliser un support conique commercialisé par VITEK (USA) et réalisé avec le matériau vendu sous la dénomination commerciale K-Resin.
Lorsque la sonde de capture est très courte (en particulier avec moins de 11 nucléotides) il devient nécessaire de mettre en oeuvre des moyens permettant d'améliorer la fixation de la sonde de capture sur le support solide. Comme indiqué précédemment, on peut par exemple lier la sonde de capture, de façon covalente, selon les méthodes connues, à une protéine qui se fixe elle-même de façon passive sur le support. Bien entendu, la protéine favorisant la fixation de la sonde de capture ne doit pas interférer avec la détection ; par exemple, lorsque la sonde de détection est marquée avec une enzyme, la protéine fixée sur le support solide ne doit pas avoir d'activité enzymatique interférente.Parmi les protéines que l'on peut utiliser pour la fixation passive indirecte de la sonde de capture sur le support, on peut citer l'albumine de mammifère (par exemple l'albumine bovine) ou une toxine protéique bactérienne telle que la toxine tétanique. De préférence, on choisira une protéine et/ou une méthode de couplage permettant de fixer une ou deux molécules de la sonde de capture par molécule de protéine.
Le couplage entre l'oligo-nucléotide et la protéine peut être réalisé par exemple par l'intermédiaire d'un bras alkylène ayant 3 à 12 atomes de carbone, qui peut être ajouté à l'extrémité 5' de l'oligo-nucléotide constituant la sonde de capture, lors de la synthèse automatique. Ce bras porte une fonction amine primaire qui, après activation, grâce à un agent de couplage homobifonctionnel comme le DITC(phénylème-1,4-diisothiocyanate), le DSS(disuccinimidyl subérate) ou le DIBS(acide 4,4'-diisothiocyano stilbène 2,2'-disulfonique), permet le greffage sur les fonctions NH2 portées par les lysines de l'albumine. Le conjugué est purifié par chromatographie liquide haute performance sur une colonne échangeuse d'ions.
La sonde de détection peut elle-même être une sonde courte, contenant de 9 à 30 nucléotides. Toutefois, pour assurer la spécificité désirée, la sonde de détection contient de préférence au moins 15 nucléotides, par exemple de 15 à 30 nucléotides, lorsque la sonde de capture est très courte et contient en particulier moins de 15 nucléotides. La sonde de détection est couplée de façon covalente à un marqueur non radioactif, par exemple une enzyme. Le couplage covalent est effectué selon les méthodes connues, en particulier par la méthode décrite ci-dessus pour le couplage entre l'oligonucléotide constituant la sonde de capture et une protéine. On peut utiliser comme marqueur enzymatique notamment une peroxydase telle que la peroxydase de raifort, une phosphatase alcaline, une phosphatase acide, la bêta-galactosidase, la glucose oxydase, etc.
Bien entendu, pour construire les sondes de capture et de détection, il est nécessaire de connattre la séquence ou une partie de la séquence de la cible, ou de connaître la séquence ou une partie de la séquence de la protéine codée par la cible. On peut alors synthétiser les oligo-nucléotides constituant les sondes avec un appareil de synthèse automatique d'ADN tel que les modèles 380 et 381 commercialisés par APPLIED BIOSYSTEMS.
Les sondes de capture et/ou de détection peuvent être constituées d'ADN ou d'ARN.
En outre, les sondes utilisées selon l'invention peuvent contenir ou être constituées par des alpha-nucléotides analogues des nucléotides naturels ; voir notamment le brevet français 2 607 507. Les alpha-nucléotides peuvent être obtenus sur synthétiseurs automatiques. Ils sont dérivables aux extrémités 3' ou 5' et se couplent aux protéines de la même manière que les bêta-oligo-nucléotides. Ils présentent l'avantage d'une bonne stabilité vis-à-vis des nucléases (voir THUONG N.T. et al., Proc. Nat.
Acad. Sci. USA, 84,5129 (1987). Les conjugués alpha-oligonucléotide-enzymes sont plus stables en solution que les analogues bêta et permettent des conservations plus longues à des dilutions plus faibles.
L'acide nucléique à détecter (cible) peut être de 1'ADN double brin, de 1'ADN simple brin, un hybride ADN-ARN ou bien de 1'ARN (ribosomal ou messager). Bien entendu, dans le cas d'une cible nucléique à double brin, ou d'un hybride ADN-ARN, il convient de procéder à sa dénaturation avant la mise en oeuvre du procédé de détection par la technique d'hybridation sandwich. L'ADN double brin peut lui-même être obtenu après extraction, selon les méthodes connues, des acides nucléiques d'un échantillon à examiner.Cette extraction peut être faite par protéolyse de cellules suivie d'une extraction au phénol-chloroforme (voir par exemple MANIATIS et Coll., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, New-York (1982), ou plus directement par traitement alcalin en présence de détergent et/ou par traitement aux ultra-sons, ou par tout autre procédé libérant les acides nucléiques en phase liquide. L'échantillon à traiter peut contenir un mélange de cellules, bactéries, levures, virus ou autre micro-organismes. L'ADN double brin ainsi obtenu peut être utilisé directement, après dénaturation selon les techniques connues, ou bien peut être utilisée comme matrice pour l'amplification d'acides nucléiques afin d'obtenir des quentités suffisantes pour permettre la détection.
La dissociation des hybrides se produit sur un intervalle de quelques "C et peut être facilement déterminée en spectroscopie UV : en effet, la densité optique de l'hybride est inférieure à celle des séquences monobrin correspondantes. I1 est donc possible de déterminer dans chaque cas une température de demi-dissociation caractéristique de l'hybride étudié.
La connaissance de l'entropie et de l'enthalpie de réaction permet d'ailleurs de calculer (loi de Vant'Hoff) la température de demi-dissociation d'un hybride donné dans des conditions standards (par exemple dans une solution de salinité correspondant à NaCI 1M) en fonction de la concentration totale en acide nucléique dans la solution ; voir par exemple Breslauer K.J. et al, PNAS, 83, 3476 (1986); RYCHLIK W. et RHOADS R.E., Nucl. Acid. Res.17, 8543 (1989) ; et FREIER S.M. et al., PNAS 83, 9373, 1986.
En pratique, il est toujours possible de déterminer expérimentalement la température de demi-dissociation de l'hybride formé par une sonde donnée avec la cible de séquence complémentaire, par de simples expériences de routine.
La température d'hybridation du protocole sandwich (température d'incubation et/ou température de lavage) devra évidemment être choisie endessous de la température de demi-dissociation, faute de quoi la cible ne s'hybriderait pas avec la sonde de capture et/ou de détection et les résultats du test seraient erronés.
I1 est bien entendu que les considérations présentes sur la température de demi-dissociation concernent l'hybride le moins stable (c'est-à-dire celui ayant la température de demi-dissociation la plus basse) des deux hybrides que forme la cible avec d'une part la sonde de capture et d'autre part la sonde de détection. En effet, pour que le protocole sandwich puisse fonctionner correctement, il est évidemment nécessaire dans le cas où l'on recherche un résultat positif, que ces deux hybrides soient stables à la température à laquelle on opère.
Une mutation ponctuelle entraitnant un mésappariement portant sur une seule paire de bases dans l'hybride, entrain une modification, généralement un abaissement, de la température de demi-dissociation.
Un avantage essentiel résultant de l'utilisation de sondes courtes est qu'un tel mésappariement unique peut entraSner un abaissement relativement important de la température de demi-dissociation, de l'ordre de 2 à 4"C. Cela n'est pas le cas avec les sondes longues, où un tel mésappariement unique n'entralne d'une très faible variation de la température de demi-dissociation.
On a maintenant découvert qu'il est possible de tirer avantage de l'utilisation de sondes courtes pour effectuer des déterminations selon le protocole sandwich à une température unique prédéterminée, par exemple 370C comme indiqué ci-dessus.
Dans ce qui suit, on va raisonner à titre d'exemple sur le cas, généralement préféré, où c'est la sonde capture qui donne avec la cible recherchée un hybride moins stable que l'hybride cible-sonde de détection.
Mais il est évident que l'on peut aussi adopter un système où inversement, c'est l'hybride sonde de détection-cible qui est le moins stable (il suffirait de remplacer alors dans ce qui suit l'expression "sonde de capture" par "sonde donnant avec la cible l'hybride le moins stable" pour adapter le raisonnement au cas le plus général).
Il faut bien entendu opérer avec une sonde de capture (et une sonde de détection) suffisamment longue pour que la température de demi-dissociation soit supérieure à la température choisie. Si l'on veut réaliser un test très sensible (en particulier un test sensible à une seule mutation), il conviendra d'utiliser une sonde de capture (et/ou une sonde de détection) ajustée, c' est-à-dire de longueur suffisamment courte et de séquence telle que la température de demi-dissociation ne soit que très peu supérieure à la température d'hybridation prédéterminée, l'écart entre les deux températures étant par exemple de I à 3"C, car il convient de travailler alors à la température maximum admissible pour éviter des hybridations non-spécifiques qui seraient possibles en adoptant une température trop basse par rapport à la température de dissociation de l'hybride parfaitement complémentaire. En fait, l'écart de température admissible peut être déterminé dans chaque cas par de simples expériences de routine.
Dans le cas qui vient d'être indiqué, à la température d'hybridation fixée, seule une cible parfaitement homologue de la sonde de capture restera fixée sur la sonde, tandis qu'une cible comportant une mutation ponctuelle dans la région complémentaire de la sonde ne sera pas fixée.
Dans la discussion précédente, on a surtout mis l'accent sur le choix d'une sonde de capture qui est adaptée à la température d'hybridation choisie principalement par des ajustements de la taille de la sonde. Mais il est bien évident pour les spécialistes qu'il est possible de jouer également sur le choix de la séquence de la sonde, puisque la température de demi-dissociation peut varier en fonction de la nature des bases impliquées dans la formation de l'hybride. Il est également possible de jouer sur les conditions d'hybridation, et en particulier sur la concentration saline de la solution d'incubation et/ou de la solution utilisée pour le lavage consécutif à l'incubation. On sait en effet que l'augmentation de la concentration saline entralne une augmentation de la température de demi-dissociation.
Dans la mise en oeuvre pratique du procédé de l'invention, lorqu'on utilise une sonde de capture et/ou des conditions d'hybridation adaptées à la température prédéterminée choisie, on pourra opérer de deux façons.
Selon un premier mode d'exécution, on effectue l'étape d'incubation à ladite température prédéterminée et on effectue le lavage à ladite température ou à une température inférieure. Ce mode d'exécution est rendu possible puisqu'à la température à laquelle on opère, seule une cible parfaitement homologue de la sonde de capture a pu s'hybrider, de sorte qu'il n'y a pas de risque de fixation d'une cible non parfaitement homologue, même si on effectue le lavage à une température inférieure à la température d'incubation.
Selon un second mode d'exécution, on effectue l'étape d'incubation à une température inférieure à ladite température prédéterminée et on effectue le lavage à ladite température prédéterminée. En effet, dans ce cas, c'est la température de lavage qui sera discriminante, et tout hybride éventuellement formé, à la température d'incubation, entre la sonde de capture et une cible non parfaitement homologue ne sera plus stable à la température de lavage et ne restera donc pas fixé sur le support.
Dans le cas où l'ADN à détecter correspond à de l'ADN amplifié par réaction en chaine utilisant une polymérase. les oligonucléotides utilisés pour l'amplification sont les suivants: AMORCE I = 5'-ATCAGCAATAACCAGC-3' AMORCE2=5'-CCCCGAAGAACGTTTTC-3' L'ADN à détecter est dénaturé par le protocole précédemment cité. La détection se fait en utilisant un des deux systèmes décrits dans cet exemple.
La sensibilité est de l'ordre de 1 ng d'ADN (figure 1) obtenu après amplification en considérant que la quantité d'ADN total générée après amplification est de l'ordre de 2,0 g.
Pour un fragment amplifié de 560 paires de bases le seuil de détection est donc de l'ordre de 2,94.10-85 mole soit 1,7109 molécules vraies.
EXEMPLE il Détection de la séquence correspondant au gène E7 du papillomavirus humain type 6.
Dans le cas où la séquence à détecter est de 'ADN amplifié, les séquences utilisées sont les suivantes: AMORCE 1 = 5'-TACACTGCTGGACAACATGC-3' AMORCE 2 = 5'-GTGCGCAGATGGGACACAC-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant (détection brin -) CAPTURE1=5'-CAGTGTACAGAAACA-3' CAPTURE2=5'-GAGTGCACAGACGGA-3' DETECTION1=5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' DETECTION 2 - 5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3' EXEMPLE 12 Détection de la séquence ADN correspondant au gène E7 du papillomavirus humain type 11.
Dans le cas où la séquence à détecter est de 1ADN amplifié, les séquences utilisées sont les suivantes: AMORCE1=5'-TACACTGCTGGACAACATGC-3' AMORCE2=5'-GTGCGCAGATGGGACACAC-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant (Détection brin -).
CAPTURE 1 = 5'-GAGTGCACAGACGGA-3' CAPTURE 2 . 5'-CAACTACAAGACCTTTTGC-3' DETECTION1=5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' DETECTION2=5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3' EXEMPLE 13 Détection de la séquence ADN correspondant aux gènes E7 des papillomavirus humains type 6 et 11.
Dans le cas où la séquence à détecter est de l'ADN amplifié, les séquences utilises sont les suivantes: AMORCE1=5'-TACACTGCTGGACAACATGC-3' AMORCE2=5'-GTGCGCAGATGGGACACAC-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant (Détection brin -).
CAPTURE 1 - 5'-AGACAGCTCAGAAGATGAGG-3' CAPTURE2=5'-CAGCAACGT(T/C)CGACTGGTTG-3' DETECTION1=5'-GACCCTGTAGGGTTACATT-3' DETECTION2=5'-TGACCTGTTGCTGTGGA-3' EXEMPLE 14 Détection de la séquence ADN correspondant au gène E7 du papillomavirus humain type 16.
Dans le cas où la séquence à détecter est de l'ADN amplifié, les séquences utilises sont les suivantes: AMORCE1=5'-CCCAGCTGTAATCATGCATGGAGA-3' AMORCE2=5'-GTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCA-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant (Détection brin-).
CAPTURE 1 = 5'-TATATGTTAGATTTGCAACC-3' CAPTURE 2 = 5'-GACAACTGATCTCTAC-3' DETECTION 1. 5'-CCGGACAGAGCCCATTAC-3' DETECTION2=5'-CTCTACGCTTCGGTTGTGC-3' EXEMPLE 15 Détection de la séquence ADN correspondant au gène E7 du papillomavirus humain type 18.
Dans le cas où la séquence à détecter est de l'ADN amplifié, les séquences utilisées sont les suivantes: AMORCE1=5'-CGACAGGAACGACTCCAACG-3' AMORCE2=5'-GCTGGTAAATGTTGATGATTAACT-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant (Détection brin-).
CAPTURE 1 - 5'-TCAGAGGAAGAAAACGATGA-3' CAPTURE2=5'-ATGTCACGAGCAATTAAGCG-3' DETECTION1=5'-GTATTGCATTTAGAGCCCCA-3' DETECTION2=5'-TAAGGCAACATTGCAAGACA-3' L'ADN à détecter est dénaturé par le protocole précédemment cité.
La sensibilité est de l'ordre de 1 ng d'ADN (figure 2).
EXEMPLE 16 Système de détection de papillomavirus humain de type 6, 11, 16 et 18.
L'exemple décrit la détection de chaque type après une amplification non spécifique, par réaction en chaine utilisant une polymérase.
Celle ci est effectuée avec un mélange de tous les oligonucléotides décrits dans les exemples 11. 12,13, 14 et 15.
Chaque oligonucléotide est utilisé à une concentration de 0,3 CLM.
La capture se fait en utilisant l'ensemble des oligonucléotides de capture décrits dans les exemples 11, 12, 13, 14 et 15 (adsorption passive, protocole décrit exemple 5).
La détection se fait spécifiquement en utilisant l'un des couples d'oligonucléotides marqués à la péroxydase décrit dans les exemples 11, 12,13,14 et 15.
Les résultats et spécificité obtenus sont les suivants sans le cas où la détection est effectuée sur le 1/100e du produit de l'amplification.
(Tableau 18) Tableau 18
SYSTEME DE DETECTION ADN AMPLIFIE HPV18 HPV16 HPV6/11 HPV6 0,001 0,004 1,100 HPV16 0,002 0,840 0,008 HPV18 0,600 0,028 0,002 HPV6+16 0,001 0,846 0,480 HPV6+16+18 0,540 0,821 0,320 HPV6+18 0,580 0,020 0,687 HPV16+18 0,518 0,740 0,007 HPV2 non spécifique 0,001 0,018 0,002 Ecu: témoin non spécifique 0,001 0,014 0,001 EXEMPLE 17 Détection de la séquence ADN cctrespondant au gène de la protéine majeure de la membrane externe (MOMP) de Chlamydia Trachomatis.
Dans le cas où la séquence à détecter est de I'ADN amplifié, les séquences utilisées sont les suivantes: AMORCE D'AMPLIFICATION I - 5'-CACCATAGTAACCCATACGC-3' AMORCE D'AMPLIFICATION 2 = 5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant (détection brin-).
CAPTURE1=5'-GCCGCTTTGAGTTCTGCTTCC-3' CAPTURE 2 = 5'-CTTGCAAGCTCTGCCTGTGG-3' DETECTION1=5'-AATCCTGCTGAACCAAGCCT-3' DETECTION2=5'-AAGGTTTCGGCGGAGATCCT-3' EXEMPLE 18 Détection de la séquence ADN correspondant à la région gag du rétrovirus HIV1.
Dans le cas où la séquence à détecter est de l'ADN amplifié, les séquences utilisées sont les suivantes: AMORCE 1 - 5'-GGACATCAAGCAGCCATGC-3' AMORCE2=5'-CTAGTAGTTCCTGCTATGTC-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant CAPTURE1=5'-AATGTTAAAAGAGAC-3' DETECTION1=5'-GAAGCTGCAGAATGGGA-3' EXEMPLE 19 Détection de la séquence ADN correspondant à la région gag du rétrovirus HIV 2.
Dans le cas où la séquence à détecter est de l'ADN amplifié, les séquences utilisées sont les suivantes: AMORCE 1 = 5'-GACCATCAAGCAGCCATGC-3' AMORCE2=5'-CTTGTTGTCCCTGCTATGTC-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant CAPTURE I - 5'-CTTACCAGCGOGGCAGC-3' DETECTION1=5'GAAGCTGCAGAATGGGA-3' EXEMPLE 20 Détection de la séquence ADN correspondant à la région env du rétrovirus HIV1.
Dans le cas où la séquence à détecter est de l'ADN amplifié, les séquences utilisées sont les suivantes: AMORCE1=5'-CAGGAAGCACTATGGGCGC-3' AMORCE2=5'-GCTGCTTGATGCCCCAGAC-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant CAPTURE I I 5'-TGTCTGGTATAGTGCA-3' DETECTION1=5'-AACAATTTGCTGAGGGCTAT-3' EXEMPLE 21 Détection de la séquence ADN correspondant à la région env du rétrovirus HIV2 Dans le cas oll la séquence à détecter est de l'ADN amplifié, les séquences utilisées sont les suivantes: AMORCE1=5'-CAGGCAGTTCTGAATGGG-3' AMORCE2=5'-GGTTTTTCGTTCCCCAGACG-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant CAPTURE1=5'-GCAACAGCAACAGCTGTTGGA-3' DETECTION1=5'-GGTCAAGAGACAACAAGAA-3' EXEMPLE 22 Détection de la séquence ADN correspondant à la région pol du rétrovirus HIV 1.
Dans le cas où la séquence à détecter est de l'ADN amplifié1 les séquences utilisées sont les suivantes: AMORCE 1 = 5'-ATTAGCAGGAAGATGGCCAG-3' AMORCE2=5'-CTGCCATTTGTACTGCTGGTC-3' L'DADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant CAPTURE 1 IL 5'-GACAATGGCAGCAATTTCACC-3' DETECTION1=5'-GCCTGTTGGTGGGC-3' EXEMPLE 23 Détection de la séquence ADN correspondant au gène de la région ss glucuronidase de E coli.
Dans le cas où la séquence à détecter est de I'ADN amplifié, les séquences utilisées sont les suivantes: AMORCE I = 5'-CAATACGCTCGAAC0ACGT-3' AMORCE2=5'-CACGGGTTGGGGTTCTAC-3' L'ADN amplifié ou non peut être détecté par le système suivant (détection brin -) CAPTURE 1 I 5'-TGGCTTCTGTCAACGCTGTT-3' CAPTURE 2 = 6'-ATGCGATCTATATCACGCTG-3' DETECTION1=5'-GATCGCGGTGTCAGTTCTTT-3' DETECTION 2 = 5'-TTCCATGGGTTTCTCACAGA-3' EXEMPLE 24 Détection de la séquence ADN correspondant au gène de la région ss globine humaine.