INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Le fait de cultiver ces cals sans l'agent sélectif (kanamycine) ne semble pas modifier l'expression du gène GUS. De plus, après un mois de culture sur milieu avec céfotaxime, les cals peuvent être sevres de cet antibiotique sans que la bactérie se developpe sur le milieu.
Donc, un mois après le clonage des cals, on peut se passer d'ajouter les deux antibiotiques dans le milieu de culture, sans inconvénient apparent. Ceci peut représenter un atout pour la régénération.
Cals nouvellement induits Les inventeurs ont pensé que le potentiel organogène des cals transformés serait mieux préservé si, au lieu de transformer des suspensions cellulaires induites depuis plusieurs mois (et ayant hypothétiquement perdu de leur potentiel de regeneration), de jeunes cals fraîchement induits d'explants foliaires (Saunders et al, 1986) étaient transformés.
Pour tester cela, des cals juste apparus depuis 2 à 6 semaines sur feuilles de serre ont été preleves. Ces cals ont été dispersés dans un milieu MSB1 liquide en tubes plastiques steriles, et le même protocole de transformation que pour les suspens ions cellulaires a été appliqué. Des cals transformés ont ainsi été sélectionnés par cette voie.
EXEMPLE 12 : EXPRESSION DES GENES POUVANT INHIBER LE DEVELOPPEMENT DU BNYVV DANS DES CELLULES DE BETTERAVE Les inventeurs ont transformé des suspens ions cellulaires habituées de betteraves avec tous les gènes construits presentés dans les exemples 5 et 6. Pour chacun de ces gènes plusieurs suspensions cellulaires transformees ont été initiées et cultivées en présence de kanamycine 200 mg/l. A partir de 10 g de cellules transformées soumises à l'action de cellulases et de pectinases, soit les ARN totaux, soit les protéines solubles totales ont été isolés.
Pour l'extraction des ARNs la technique utilisant l'isothyocyanate de guanidium décrite par Ausubel et al (1987) s'est révélée la plus efficace sur ces cellules aux parois digerées. Les ARN totaux ont été analysés par Northern blot selon Maniatis et al (1982). Pour l'hybridation des ARN totaux contenant un ARN message dérivé du gène de la protéine de capside, les inventeurs ont utilise comme sonde le fragment BamHI de 780 paires de bases du plasmide pBIO-3B. Pour ceux exprimant un ARN messager dérive du gène codant pour la protéine de 42 Kd, le fragment EcoRI de 1330 paires de bases du plasmide pBIO-3-8B a été utilisé comme sonde.Le marquage radioactif de ces 2 sondes grâce à de l'ATP (P32) s'est fait par la technique dite de l"'Oligonucleotide Primed Synthesis" (Ausubel et al, 1987).
Les résultats obtenus ont permis aux inventeurs de verifier la présence de tous les ARN messagers attendus, ce qui montrait la fonctionnalité des gènes chimériques construits. Ces messagers ont une taille correspondante à celle indiquée dans le tableau 1 majorée de 200 nucléotides environ. Ces nucléotides supplémentaires situés à l'extrémité 3' du mRNA sont dus à la partie transcrite du terminateur Nos jusqu'au signal de polyadénylation et à la queue de poly-A. Il a aussi été observé que le promoteur Nos a une efficacité de transcription de 30 à 50 fois plus faible que le promoteur 35S dans des cellules de betteraves. Ces résultats sont comparables à ceux obtenus sur le tabac et la tomate par Sanders et al (1987).
Bien que la transcription de tous les gènes ait ete vérifiée, il était nécessaire de voir si nous avions traduction et production de la protéine de capside et de la protéine chimérique de 29 Kd dans le cas du vecteur binaire pGA-ss-3-lB. Pour cela il a été réalise un western blot (Ausubel et al, 1987)) sur des protéines solubles extraites à partir de différentes suspens ions cellulaires transformées (tampon d'extraction : urée, 9M ; p- mercaptoéthanol, 7,5 %, SDS, 4,5 % ; pH : 6,8).Les résultats sont presentes dans la figure 7 ; la partie supérieure du filtre a été revelée avec des anticorps polyclonaux anti ss-glucuronidase et la partie inférieure par des anticorps polyclonaux anti-BNY W. La ss- glucuronidase est présente dans la majorité des suspens ions transformees (bande immunoréagissante 68 Kd).
Dix suspensions sur les 11 testées présentent une bande immunoréactive commigrant avec la protéine de capside du BNYW ainsi qu'une bande d'un poids moléculaire d'environ 29 Kd. L'expression de ces deux protéines est de l'ordre de 0,005 à 0;01 % des protéines solubles totales ; cette quantité atteste de la bonne efficace de traduction du messager produit. Il est à noter que la quantité de 29 Kd est particulièrement élevee dans la majorité des transformants et peut être supérieure à celui de la protéine de capside. Le taux de readthrough dans les suspensions cellulaires habituées à l'air d'être supérieur à celui observé dans des racines de betteraves pour le RNA2 (Ziegler et al, 1985) et sur des betteraves transgéniques (exemple 15).
Lors de la production d'une plante transgénique, la transformation est associée à un procédé de régénération.
L'efficacite d'obtention des transformants dépend de la fréquence de régénération de plantes à partir de cellules transformées d'une part, et la fréquence de transformation des cellules d'autre part.
Par exemple, la transformation de tronçons de pétioles de betterave a donné des cals transformés sélectionnés sur kanamycine. Cependant, il n'a jamais été possible de régénérer des plantes à partir de ces cals transformés issus de pétioles, bien que la régénération d'embryons somatiques et de bourgeons à partir de ce type de cal dans l'état non-transformé ait été reportée (Tetu et al, 1987). Cet échec n'est pas surprenant si on prend en compte la faible fréquence de régénération décrite.
Ceci traduit bien les problèmes de régénération de plantes non transformées à partir d'explants rencontrés depuis longtemps chez la betterave sucrière (Ritchie et al, 1989). Plusieurs auteurs ont décrit la régénération directe de bourgeons adventifs à partir de fragments de pétioles de plantes en multiplication végétative (Detrez et al, 1988 ; Freytag et al, 1988). Bien que ce phénomène se soit avéré reproductible dans des conditions appliquées par les inventeurs, la fréquence s'est révélée beaucoup trop faible pour être associée à la transformation. D'autres part, il semble que ces néoformations proviennent de massifs cellulaires non accessibles à la bactérie et apparemment peu sensibles à un agent sélectif.
La dernière technique de régénération de plantes à partir de cellules de betteraves à sucre est celle décrite par Saunders et al (1986). Elle met en jeu dans un premier temps, l'induction de cals friables indépendants d'hormones et initiés probablement à partir des cellules épidermiques du limbe, puis dans un deuxième temps, la régénération de bourgeons et d'embryons somatiques à partir de ces cals. Cette technique a été facilement reproductible sur plusieurs variétés de betteraves sucrières. Un des intérêts de ce processus est la possibilité d'obtenir aisément des suspensions cellulaires à partir de cals friables dont le potentiel organogène peut être entretenu pendant quelques mois.
Les inventeurs ont utilise ce matériel organogène, c'est-à-dire les cals friables, pour l'associer à la transformation par Aqrobacterium tumefaciens.
I1 y a encore peu de temps la transformation de suspensions cellulaires ne paraissait pas concevable selon le dogme établi que le transfert d'ADN par Aqrobacterium dans une cellule végétale nécessitait des lésions cellulaires. Cependant, des auteurs ont reporté la transformation de cellules en suspens ion chez le tabac et la carotte (AN, 1985 ; Scott et Draper, 1987). A ce jour, la transformation de cellules en suspension chez la betterave n'a pas été décrite. Par ailleurs, il est à noter que les méthodes de transformation qui s'appliquent avec succès à une espèce végétale ne peuvent pas être étendues systématiquement à d'autres espèces. Les conditions de transformation, les matériels de départ et les milieux de culture sont des paramètres variables spécifiques à chaque espèce.
La présente invention décrit - la transformation de suspens ions cellulaires habituées, donnant des cals et suspensions cellulaires transformes ; - la transformation de suspens ions cellulaires regénérantes donnant des cals, des suspensions cellulaires et des plantes transformes ; - la transformation de cals friables donnant des cals, des suspensions cellulaires et des plantes transformés.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé de transformation de cellules végétales appartenant à espèce Beta vulgaris caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes I) induction de cals blancs friables à partir d'explant ; II) dispersion des cals dans un milieu de culture cellulaire végétale liquide contenant 0 à environ 3.0 mgl-1 d'une cytokinine, ou obtention d'une suspension cellulaire à partir des cals dans un milieu de culture cellulaire végétale liquide contenant environ 0.1 à environ 3.0 mgl-1 d'une cytokinine ;; III) mise en contact de la dispersion, ou de la suspension, avec Aqrobacterium tumefaciens contenant un vecteur portant un gène destiné à être introduit dans les cellules végétales, suivie de coculture des cellules végétales et des bactéries IV) lavage des cellules végétales pour eliminer les bactéries ; V) sélection des cellules transformées sur un milieu sélectif ; VI) culture des cellules transformées sélectionnées pour obtenir des cals friables transformés.
Les figures 1 et 2 illustrent différents aspects de l'invention.
La figure 1 montre le vecteur binair pGA-ss-3-lB, qui est utilisé dans la transformation de cellules de betteraves à titre d'example. La légende de la figure 1 est la suivante 355, promoteur 355 du Cauliflower Mosaic Virus 5'NOS, promoteur du gène de la nopaline synthase - NOS, terminateur du gène de la nopaline synthase - NPT, gène de la néomycine phosphotransférase - UID A, gène de la ss-glucuronidase d'E. coli - BR et BL, bordures droite et gauche du T-DNA de pTiT 37 - amp, gène de resistance à l'ampicilline - tet., gène de résistande à la tetracyline - Kana., gène de résistance à la kanamycine - E, EcoRI H, Hind III - S, Sst I -, origine de replication du RK2.
La figure 2 montre une analyse par Western blot d'extraits proteiques de 3 betteraves transgéniques à l'aide de deux sérums : un sérum anti-BNYVV et un sérum anti-p-glucuronidase.
Abbreviations : L, limbe ; P, pétiole . Te, témoin S, suspension cellulaire transformée ; 2ng, 2ng de BNYVV purifie ; 14-3, 22-1 et 68-1 réfèrent à 3 betteraves transgéniques différentes.
Le tableau 1 montre la composition des différents milieux de culture utilisés dans le procédé de l'invention.
TABLEAU 1 : MILIEU DE CULTURE MS : Pour 1 litre 4.4 g de milieu de Nurashige et Skoog déshydratés de chez SIGMA réf. M6899.
Vitamines 1 mg panthoténate de calcium 0,01 mg biotine 1 mg acide nicotinique 1 mg pyridoxine HC1 10 mg thiamine HC1 30 g saccharose pH : 5.8 Milieu solide : 8 g agar-agar MSB1 NS + 1 mg/l BAP MSBo.l MS + 0.1 mg/l BAP MS enracinement MS + 1 mg/l ANA Etalement des cellules MSB1 + C = MSB + 300 mg/l cefotaxime MSB1 + CK = MSB + 300 mg/l céfotaxime + + 200 mg/l kanamycine LB Pour 1 litre 10 g bactotryptone 5 g yeast extract 10 g NaCl La photo montre des betteraves transgeniques après 4 mois d'acclimatation en serre.
Le découpage peut être poursuivi au-delà du sixième parallèle P6, mais il n'existe pas, actuellement, de radôme dont la zone utile soit supérieure à celle comprise entre la pointe du radôme et un parallèle situé à environ 90 cm de la pointe.
Ainsi, sur la totalité des quatre secteurs tracés sur le radôme, on délimite successivement, en partant du sommet, huit zones (Z1-1 à Z1-8) entre O et P1, seize zones (Z2-1 à Z2-16) entre P1 et P2, vingt-quatre zones (Z3-1 à Z3-24 entre P2 et P3, trente-deux zones (Z4-l à Z4-32) entre P3 et P4, quarante zones (Z5-1 à Z5-40) entre P4 et P5 et quarante-huit zones (Z6-l à Z6-48) entre P5 et P6, soit au total 168 zones élémentaires.Ceci peut donner une très bonne connaissance de la perméabilité radioélectrique du radôme, par rapport à la méthode habituelle en "champ lointain" qui ne donne qu'une quarantaine de mesures pour un tel radôme.
En variante, on pourrait prévoir un bâti sur lequel le repérage en site et en azimut se ferait par lecture directe de deux index, ce qui donnera automatiquement la position des zones dans lesquelles des mesures de perméabilité sont à effectuer.
Après mise en place du radôme 80 sur l'organe tournant 18, on positionne le guide d'onde extérieur 78 (émetteur ou récepteur) à environ 15 cm du radôme, de telle façon que l'axe longitudinal du guide d'onde coupe la surface du radôme sensiblement à mi-distance de deux parallèles consécutifs (ou à mi-distance entre la pointe O du radôme et le premier parallèle P1 si c'est la calotte sphérique qui est concernée par les mesures de perméabilités.
Le point de rencontre de l'axe du guide d'onde 78 et du radôme 80 est en fait situé sur un parallèle (non tracé), équidistant de deux parallèles consécutifs et il décrit ce parallèle quand on fait tourner le radôme.
On bloque ensuite le guide d'onde 78 une fois celui-ci dans la position désirée.
Après réglage du guide d'onde extérieur 78, on procède au réglage du guide d'onde intérieur 48.
Pour cela, on retire le radôme 80 de dessus le support tournant 18 et on place le guide d'onde intérieur 48 dans l'axe du guide d'onde extérieur 78, à environ 30 cm de celui-ci.
Pour réaliser cet alignement, on utilise avantageusement l'oscilloscope de l'analyseur de réseau 94 (écran 96), en recherchant le "minimum" d'atténuation par déplacement en site et en azimut du guide d'onde intérieur 48, sans modifier la position du guide d'onde extérieur 78.
Lorsque les deux guides sont alignés, on bloque le guide intérieur grâce aux vis de blocage 42 et 44.
On procède ensuite à l'étalonnage de l'équipement de mesure de la manière suivante.
Tout d'abord, on met en fonctionnement l'analyseur de réseau 94 et on règle la fréquence, au moyen du sélecteur de fréquence 98, pour qu'elle corresponde à celle du radar normalement utilisé sur l'aéronef (en général 9375 MHz pour les radars météo).
On sélectionne ensuite l'échelle de lecture sur l'oscillos- cope, une graduation correspondant à un décibel.
A l'aide du vernier (non représenté) de l'oscilloscope, on règle la trace de l'onde de telle façon qu'elle soit sur la première graduation en haut de l'oscilloscope qui devient la graduation de référence, à partir de laquelle sera mesurée l'atténuation de l'onde radioélectrique lorsqu'on interposera ensuite la paroi 82 du radôme entre les deux guides d'onde 48 et 78.
On procède ensuite aux mesures de perméabilité de la manière suivante.
Pour mesurer la perméabilité dans un secteur sphérique, on place le radôme 80 sur le support tournant et on règle, si cela n'a pas déjà été fait, sa position comme décrit précédemment.
Selon une autre caractéristique de l'invention, L'enceinte a une forme cyLindrique, allongée dont la partie inférieure est en entonnoir avec un bec présentant un renfLement qui se remplit de fluide et empêche l'air extérieur de pénétrer dans L'enceinte.
Le moyen de retenue et de déversement automatique est constitué par un renflement 40 que présente le bec à l'intérieur duquel est placée une roue à aubes 41.
Selon un premier mode de réalisation, le fluide est du verre en fusion.
Selon un deuxième mode de réalisation le fluide est une résine.
Le gaz chargé de particules peut provenir d'un incinérateur ou d'un sécheur. Les particules peuvent être radioactives.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront mieux de la description qui va suivre, donnée à titre illustratif mais non limitatif, en référence au dessin sur lequel la figure unique représente un schéma vu en coupe du dispositif conforme à L'invention.
Le schéma représenté sur la figure 1 représente une enceinte 1 que l'on qualifie de cyclone par référence à l'art antérieur pour le principe de fonctionnement. L'enceinte est en liaison avec un générateur de gaz 100 chargé de particules et une installation 200 de traitement du gaz "propre", dépourvu de particules en suspension.
A titre d'exemple, L'enceinte 1 a une forme cyclindrique, allongée, avec une partie supérieure obturée par un plateau 10 et une partie inférieure en forme d'entonnoir 20.
Cette enceinte 1 est munie de plusieurs ouvertures. Une ouverture 2 est ménagée tangentiellement sur la paroi de l'enceinte sensiblement à mi-hauteur. Cette ouverture 2 constitue l'arrivée du gaz issu du générateur 100.
Le gaz est amené par une tubulure 3 raccordée à l'ouverture 2.
Une autre ouverture 4 est ménagée dans Le plateau supérieur 10 et constitue la sortie du gaz propre. Le gaz est conduit par une tubulure 5 raccordée à cette ouverture 4, vers l'installation de traitement.
Le bec de L'entonnoir comporte un renflement 40 se terminant par une ouverture 11, l'ensemble constituant le pied du cyclone.
Un récipient 30 est placé sous le pied du cyclone.
Dans sa partie supérieure le cyclone comporte une rigole 15 qui surplombe la paroi verticale interne 18. Cette rigole 15 est remplie d'un fluide visqueux 16. L'alimentation de la rigole en fluide est continue, de sorte que le fluide se déverse et s'écoule le long de la paroi interne 18 de manière à former un film mince 19.
L'ouverture 2 permettant L'arrivée du gaz chargé de particules est pratiquée tangentiellement à la paroi 18, le gaz étant ainsi entraîné dans un tourbillon à l'intérieur du cyclone et les particules plaquées contre la paroi sous L'effet de la force centrifuge.
Le fluide 19 qui s'écoule piège ces particules et les entraîne vers la sortie 11.
Un groupe 53 de gradations de diffusion est formé dans la partie d'extrémité inférieure arquée 12 B de la région d'émission de lumière de projection 12 A de la lentille extérieure 12 comme représenté sur les Figures 5 et 6, de telle sorte que les surfaces des gradations de diffusion sont supérieures dans la courbure par rapport au plan vertical dans la direction de l'extrémité inférieure de la partie inférieure arquée 12 B Les gradations de diffusion 53 qui s'étendent verticalement sont constituées par une -pluralité d'éléments de lentilles De plus, les gradations de diffusion 54 situées adjacentes aux gradations de diffusion 53 s'étendent dans la même direction que celles des gradations de diffusion 53 Le pas des éléments de lentilles est agencé de façon similaire Par conséquent, les gradations de diffusion 53 et les gradations 54 présentent une apparence uniforme La lumière fournie aux gradations de diffusion formées dans la région 12 B est diffusée vers le bas comme indiqué par li sur la Figure 5 lorsqu'elle émerge de cette région; on réduit de la sorte la différence excessive de luminosité entre la zone rayonnée et la zone non rayonnée La Figure 8 représente la zone rayonnée du phare suivant l'invention Sur la Figure 8 la référence numérique 50 désigne une partie d'un corps de motocyclette Dans ce cas, une région frontière parabolique
C est formée entre la région rayonnée A et la région non.
rayonnée B; cependant, étant donné qu'une partie de la lumière de projection appliquée à la région frontière C est diffusée par le groupe de gradations de diffusion 53, la luminosité de la région frontière C se réduit depuis la zone rayonnée A vers la zone non rayonnée B En d'autres termes, la différence de luminosité dans la région frontière C est inférieure à celle correspondant à la technique antérieure De façon plus spécifique, la luminosité ne varie pas de façon brusque dans la région frontière C De la sorte, même dans la zone non rayonnée B, étant donné qu'elle est éclairée jusqu'au voisinage de la
motocyclette 50, la visibilité du conducteur est améliorée.
L'unité de lampe de projection 30 est supportée en trois points A savoir, deux vis de direction 46 et 47 qui sont vissées à la paroi arrière du corps A la lampe de telle sorte qu'elles peuvent être déplacées vers l'avant et vers l'arrière et un pivot d'inclinaison 48 En tournant les vis de direction 46 et 47, l'axe du rayonnement L 2 de l'unité de lampe de projection 30 peut être incliné verticalement et horizontalement indépendamment du réflecteur 20 Bien que l'invention ait été décrite cidessus en se référant à un rayon lumineux principal d'un phare frontal, ceci ne constitue pas une limitation du champ d'application de l'invention Par exemple, son concept de base peut aussi être appliqué à un phare de proximité ou à un phare de changement de direction ou similaire. Bien que l'invention ait été décrite en se référant à une motocyclette, le concept technique de l'invention est aussi applicable à des phares pour des bicyclettes
entraînées par moteur et pour des automobiles.
Comme décrit ci-dessus, dans le phare de véhicule du type à projection suivant la présente invention, les gradations de diffusion formées dans la région frontière située entre la région émettrice de lumière de projection de la lentille extérieure qui émet la lumière de la lentille de projection et les autres régions, diffusent la lumière de projection de la lentille extérieure; de la sorte, la différence de luminosité entre la région rayonnée et la région non rayonnée est réduite Ainsi, pour le conducteur, la visibilité est considérablement améliorée ce qui fait que la conduite de l'automobile peut être réalisée
dans d'excellentes conditions de sécurité.
COLLIER ATTACHE LUNETTES.
L'invention consiste en un dispositif de suspension des lunettes à un collier bijouterie, à un clip ou à une broche sur lesquels s'adapte une chainette s'il s'agit d'un clip ou d'une broche, ou une ou deux chainettes dans le cas d'un collier ; les chainettes pouvant également être substituées par des cordons, les chainettes ou les cordons servent à attacher et à suspendre en position replièes les lunettes par une ou par les deux branches.
A ce jour, les cordons ou les chainettes de lunettes ne sont maintenus suspendus au cou qu'en passant derrière la tête. Ils ont l'inconvénient d'être une gène et parfois d'irriter la peau par frottement.
Les cordons et les chainettes existants ne s'harmonisent guère avec les parures des femmes et sont généralement disgracieux.
Dans une réalisation préférentielle, l'invention utilise une parure classique, de préférence un collier, mais également un clip ou une broche sur lesquels viennent s'adapter de préférence mais non exclusivement, une chainette pour les femmes et un cordon pour les hommes, qui par leur position sur le support choisi et leur mensuration, sont sans frottement sur la peau.
L'invention a aussi l'avantage de permettre l'utilisation d'une seule branche qui se glisse dans un anneau, lequel dans le cas d'une chainette, peut-être à même celle-ci FIG 1 ou rajouté à la chaine FIG 2, pour maintenir les lunettes, branches refermées, suspendues à ce support par cette branche.
Le port tel quel des lunettes, branches refermées, est beaucoup moins génant et plus esthétique que le port des lunettes branches ouvertes, mais bien entendu, l'invention permet aussi dans le cas d'un collier, la fixation des lunettes par ses deux branches, ce sont alors deux attaches au lieu d'une qui les retiennent au collier, les lunettes peuvent alors se porter soit fermées, une branche passée dans l'anneau, soit suspendues par les branches ouvertes.
Dans les différents cas, les chainettes ou les cordons restent sans contact avec la peau lors des diverses manipulations pour leurs utilisations.
La surface latérale de ce rouleau définit, en partie supérieure, la zone d'appui pour la première extrémité longitudinale de la lame citée et l'organe extracteur 17 est constitué d'au moins une dent qui fait saillie radialement de la surface radiale du rouleau 15, d'une valeur inférieure ou tout au plus égale à l'épaisseur de la lame.
De cette manière, la dent 17 mise au contact de la lame, décrit une trajectoire circulaire, ou une trajectoire qui présente une composante de mouvement transversale par rapport à la direction d'alimentation 7 et parallèle au plan d'appui 5 et une composante sensiblement perpendiculaire à ce plan 5, qui réalise un accompagnement de la lame vers le plan d'appui 5.