INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
L'invention concerne plus particulièrement le vecteur tel que décrit ci-dessus et comprenant également en amont de la séquence codant pour le polypeptide déterminé, une séquence signal ainsi que les éléments nécessaires pour permettre l'expression de la séquence signal et descelle codant pour ledit polypeptide.
Avantageusement, le vecteur sus-mentionné com prend une séquence d'ADN codant pour le polypeptide activateur Sac,.
Parmi les séquences signal utilisées, pour la construction des vecteurs de l'invention, on citera notamment celle permettant la secrétion de la protéase alcaline, de la lévane-saccharase, de la cellulase et de l'a-amylase.
D'une manière générale, toute séquence pouvant jouer le rôle de séquence signal précédant la séquence d'ADN codant pour une enzyme par un micro-organisme approprié peut être utilisée.
L'invention concerne également les cellules de B.subtilis, ou de tout autre micro-organisme approprié, transformées par les plasmides sus-mentionnés comprenant un fragment d'ADN selon l'invention conduisant au phénotype Degh, notamment un fragment d'ADN codant pour le polypeptide SacU51 ceux-ci étant capables de se répliquer dans ces cellules.
L'invention concerne plus particulièrement les cellules bactériennes sus-mentionnées qui sont transformées par un plasmide contenant un fragment d'ADN selon l'invention et une, ou plusieurs, séquence(s) codant pour un autre activateur conduisant au phénotype Degh que celui codé par le fragment d'ADN de 1 'invention.
L'invention a également pour objet les cellules bactériennes transformées par un plasmide tel que décrit ci-dessus et contenant également une séquence codant pour un polypeptide déterminé, éventuellement précédée par une séquence signal, cette dernière étant avantageusement précédée par une séquence cible, tel que décrit plus haut.
Ces cultures de cellules sont alors capables de produire des quantités accrues de protéines, notamment d'enzymes, et/ou du polypeptide déterminé.
Bien entendu, l'homme du métier appéciera que les polypeptides recherchés, plus particulièrement le polypeptide déterminé, peuvent être purifiés de toute façon en soi connue, par exemple par électrophorèse sur gel et récupération du polypeptide recherché. On peut également encore avoir recours à toute autre technique par exemple à la chromatographie liquide sous haute pression.
Des caractéristiques supplémentaires de l'invention apparaîtront encore au cours de la description qui suit des vecteurs préférés et des conditions dans lesquelles ils peuvent être utilisés, étant entendu que cette description ne saurait être interprétée comme tendant à restreindre la portée des revendications.
1) Materiels et méthodes - Souches bactériennes et Plasmides Les souches de B. subtilis suivantes ont été utilisées : la souche de référence de B. subtilis 168.
(trn C2) (sacU , phcnotype Lvs Prt ) ; le mutant sacU QB254 (sacU42, sacA321, his A1, trPC2) ne synthétisant pas de lévane-saccharase et de protéase (phénotype Lvs-, Prt-) (LEPESANT et al, Mol. Gen. Genet. 118 : 135-160 (1972)) ; le mutant sacUh QB136 (sacU32, leuA8, trpC2) (KUNST et al, 1974, précédemment cité) la souche 1A510, qui est déficiente en recombinaison intermoléculaire (recE4, leuA8, aro-15. thrA5. stp) (OSTROFF ET PENE, J.
Bacteriol., 156 : 934-936 (1983)) ; la souche BD 1238 (!L=4::Tn917lacZ hisAl leu metB5) (HAHN et al, J.
Bacteriol., 169 : 3104-3109 (1987) ; ALBAN0 et al, J.
Bacteriol., 169 : 3110-3117, (1987)).
L. Ce filtre 23 a pour effet d'atténuer le rayonne-
ment de lumière au voisinage des sources L, en vue de
l'uniformisation globale de l'éclairement.
Sur les dessins, la référence numérique 24 désigne
par ailleurs des lamelles de raccordement destinées à sup-
porter les ampoules des sources lumineuses L, ces lamelles 24 faisant également office de supports desdites sources
L. L'indice de référence 25 désigne une douille d'inser-
tion d'un câble (non représenté) pour alimenter les sour-
ces L en puissance, et la référence 26 désigne des vis
de fixation des lamelles 24.
La figure 9 illustre une autre forme de réalisation, dans laquelle une structure de commande du flux lumineux est formée à la face postérieure de la lentille interne 18. Dans cette forme de réalisation, les prismes globuleux
22 susmentionnés sont remplacés par des prismes 27 semi-
circulaires, ménagés en concordance avec les structures
réflectrices étagées 21. D'après cette forme de réalisa-
tion, similairement à celle illustrée sur la figure 8,
la lumière rayonnant des sources lumineuses Lest conver-
Les éléments tubulaires peuvent être ainsi assemblés de proche en proche, afin de donner au casier une structure modulaire dont les dimensions, transversalement et longitudinalement, peuvent être adaptées à la demande, notamment en fonction des dimensions des paniers d'une machine à laver ou à sécher, recevant directement les casiers d'emballage et de support ainsi réalisés.
De préférence, les organes de liaison d'un élément tubulaire avec les éléments voisins sont disposés selon quatre génératrices opposées, disposées deux à deux dans des plans transversaux perpendiculaires, passant par l'axe central de l'élément tubulaire.
De préférence également, les organes de liaison disposés selon les génératrices opposées sont constitués par une rainure en creux et une nervure en saillie de même profil, adaptées à recevoir et à s'engager respectivement dans une nervure et une rainure homologues des éléments tubulaires adjacents.
Avantageusement, les rainures et les nervures des éléments tubulaires présentent un profil en queue d'aronde, permettant leur engagement mutuel par glissement des éléments tubulaires parallèlement à la direction des génératrices portant les organes de liaison.
Selon une autre caractéristique, les moyens pour réaliser l'inclinaison des verres dans les alvéoles des éléments tubulaires sont constitués par un ergot, prévu sur chaque nervure en saillie au voisinage de son extrémité basse, cet ergot formant butée d'arrêt de la nervure par engagement dans une encoche prévue dans la rainure coopérante de l'élément tubulaire adjacent. La rainure comporte de préférence deux encoches, décalées selon la longueur de cette rainure, -de telle sorte que les deux éléments ainsi réunis soient juxtaposés sur toute leur hauteur ou présentent mutuellement un décalage axial longitudinal, selon que l'ergot de la nervure est engagé dans l'une ou l'autre des encoches.
En position décalée, il en résulte que, par appui des extrémités basses des éléments tubulaires sur un plan horizontal commun, les axes de ces éléments sont inclinés par rapport à la verticale d'un angle qui dépend du diamètre de ces éléments tubulaires et de la distance de l'ergot de butée vis-à-vis de l'extrémité inférieure de l'élément associé. Les verres contenus dans ces éléments sont ainsi eux-mêmes inclinés, tout en restant étroitement maintenus en position dans les alvéoles du casier.
Dans un mode de réalisation particulier, les moyens d'arrêt et de soutien du bord des verres dans chaque élément sont constitués par un croisillon, formé de deux barrettes planes perpendiculaires, de préférence orientées selon les deux plans transversaux contenant les génératrices opposées portant les organes de liaison.
Selon une variante, les moyens d'arrêt comportent au moins une languette conformée pour présenter un retour vers l'intérieur du verre dans chaque alvéole, ce retour étant adapté à servir de point d'appui pour le bord du verre, appliqué à l'opposé par son pied contre un creux d'une attache montée dans la paroi interne de l'élément tubulaire.
Dans une autre variante de réalisation, les éléments tubulaires peuvent être groupés en sousensembles, de préférence quatre par quatre, en étant solidarisés entre eux par des pattes de connexion latérales, les moyens de liaison étant prévus selon deux génératrices opposées de deux éléments voisins dans chaque sous-ensemble.
D'autres caractéristiques d'un casier d'emballage et de support pour objets fragiles, en particulier pour verres à dégustation établi conformément à l'invention, apparaîtront encore à travers la description qui suit d'un exemple de réalisation, donné à titre indicatif et non limitatif, en référence aux dessins annexés sur lesquels: - La Figure 1 est une vue en perspective d'un élément tubulaire entrant dans la réalisation d'un casier de support selon l'invention.
- La Figure 2 est une vue de dessus d'une fraction d'un tel casier, réalisé par association de plusieurs éléments tubulaires selon la Figure 1.
- La Figure 3 est une vue du casier de la Figure 2 avec ses éléments tubulaires juxtaposés et vus de côté, en position de transport.
- La Figure 4 est une vue également de côté mais dans laquelle les éléments tubulaires sont disposés en ayant leur axe incliné sur la verticale.
- La Figure 5 est une vue de dessus d'une autre variante de réalisation du casier considéré.
- La Figure 6 est une vue en coupe transversale d'un élément tubulaire du casier de la Figure 5, illustrant les moyens permettant d'assurer l'inclinaison sur la verticale du verre monté dans cet élément.
Dans une première variante de réalisation illustrée sur les Figures 1 à 4, le casier d'emballage et de support considéré est constitué par un ensemble d'éléments tubulaires 1, se présentant sous la forme de tubes cylindriques délimitant chacun un alvéole interne 2, réservé à la mise en place dans celui-ci d'un verre 3. De tels verres comportent de façon parfaitement classique un pied 4 réuni à la paraison 5 du verre par une jambe 4a, la paraison se terminant à l'opposé du pied par un bord 6 ou buvant. La paraison 5 présente de façon également connue une partie centrale largement renflée, dont les caractéristiques géométriques sont déterminées, notamment dans les verres réservés à la dégustation, pour assurer de la meilleure manière le dégagement des arômes du produit contenu dans le verre, qui s'échappent ensuite par le bord 6.
Sur l'avant du joint. deux tales métalliques (17) sont soudées sur le châssis (1) pour définir le profil du joint.
Une réservation (18) pour incorporer un profil étanche est prévue dans l'axe du joint.
Sur l'arrière du châssis, des profilés type UPN (19) sont soudés pour permettre le guidage de la benne pendant l'excavation du panneau adjacent.
Pour sa descente dans l'excavation de parois moulées, les cellules (3) sont dégonflées. Le joint est plus étroit que la tranchée et sa descente se fait facilement.
Les cellules sont écrasées au fond de leur logement par la pression hydrostatique de la bentonite.
Le joint est planté en fond de panneau, la bêche métallique (4) permet le calage et l'étanchéité au fond du panneau.
Une fois le joint en position, les cellules sont gonflées à l'air comprimé (7 bars) et prennent appui sur les parois de forage.
L'étreinte latérale est considérable et évite tout mouvement du joint.
Le bétonnage peut être réalisé.
Le calage pneumatique du joint dans la paroi moulée joue le rôle d'obturateur étanche.
Les contournements de béton sont supprimés.
Le béton, le long du joint, ne subit plus l'effet de ségrégation due à la perte de la laitance, et la qualité du béton est homogène sur toute l'épaisseur de la paroi.
Le joint est récupéré après la prise du béton.
Les cellules sont indépendantes l'une de l'autre, le gonflage et le dégonflage alternatifs si nécessaire décollent le joint du béton.
Le joint peut alors être extrait à la grue sans difficulté.
Comme l'extraction de ce joint se fait après la prise du béton, il est possible d'insérer dans la réservation un profil étanche type "WATER STOP" ou similaire pour améliorer l'étanchéité entre panneaux.
Tableau 4 : MIC de l'Amphotéricine B sous forme de Fungîzone de liposomes ou de microparticules, vis à vis de Candida tropicalis
Formulation MIC (pM) Complexe DOC (Fungizone#) 0,2 Liposomes 1,56 Microparticules 0,2 2.1.1.2 Activité directe vis à vis de diverses levures et champignons 2.1.1.2.1 Protocole Matériel Levure Candida albicans (10) Candida lusitaniae (9) Candida tropicalis (10) Torulopsis glabrata (10) Candida krusei (10) Candida parapsilosis 110) Candida guilliermondii (10) Candida (pseudotropicalis) kefyr (8) Cryptococcus neoformans (45) Sporothrix schenckii : 20 souches 17 patients du Perou 1 Sud-Africain (sporotrichose généralisée) 2 du Brésil Milieu de culture Yeast morphology Agar (Difco) pH 7,3 (tampon phosphate Solution mère d'antifongiques en eau distillée.
Concentrations finales en 0,016 ; 0,032 ; 0,063 ; 0,125 ; 0,25 ; 0,5 ; 1 ; 2 ; 5 ; 10 Inoculum Suspension de levures ou de la phase levure de S. schenckii Environ 107CFU en eau distillée (= standard N 2 Mc Farland) Ensemencement Les boîtes de Petri son ensemencées à l'aide d'un multipoint inoculator (Denley - Tech Limited).
L'inoculum étant d'environ 104CFU.
Incubation Pour les levures : 25 C S. schenckii : 370C Lecture Après 48 h, la croissance est comparée à celles des boites témoins sans antifongiques.
La concentration minimale inhibitrice (CMI) en pg/ml est celle à laquelle aucune croissance n'est visible à l'oeil nu près 48 h.
2.1.1.2.2 Résultats : les résultats sont repris dans le tableau 5 Tableau 5 : Activité de l'Amphotéricine B sous forme de complexe DOC (Fungizone R) et de wicroparticules vis à vis de diverses levures et champignons CMI en g/ml après 48h CANDIDA ALBICANS (CA) F* L4 F L4' 1 66259 stonatis Rwanda AIDS 0.25 0.25 0.25 0.5 2 66197 vaginitis B 0.25 0.25 0.5 0.5 3 66010 vaginitis Spanje sero A 0.5 0.25 0.5 1 4 66011 vaginitis Spanje sero B 0.5 0.25 0.5 1 5 66063 mondspoellag B 0.25 0.25 0.25 1 6 66172 mondspoeling B 0.25 0.25 0.25 1 7 66185 aondspoeling B? > 0.5 > 0.5 2 5 8 64251 ?B 0.125 0.25 0.125 0.5 9 39971 baby - Iumbaal vocht B 0.25 0.25 0.25 0.5 10 66188 vaginitis 0.25 0.25 0.25 0.5 CANDIDA LUSITANLAE (CL) 1 57996 nagel B 0,5 1 0.5 1 2 61700 leukemie B > 2 > 2 > 10 > 10 3 64180 nagel B > 2 > 2 > 10 > 10 4 65996 mond B 0.5 1 5 65911 mond B 0.5 1 6 59819 mond B 0.5 1 0.5 1 7 60758 hemocultuur B > 2 > 2 > 10 > 10 9 66274 nagel B 0.5 1 10 66297 risicopatient B 0.5 1 * = FungizoneR R L4, L4' et L5 = lots de microparticules d'Amphotéricine B lyophilisés préparées selon l'invention dans des conditions différentes.
2.1.2 Modèle d'infection intra cellulaire L'activité antifongique de l'Amphotéricine B vis à vis d'infections intracellulaires est déterminée in vitro en utilisant comme modèle la lignée de macrophages J-774-G8 infectés par Candida Tropicalis.
L'activité de l'Amphotéricine B sous forme de microparticules est comparée à celle de l'Amphotéricine B sous forme de complexe DOC (Fungizone#) ainsi qu'à celle de l'Amphotéricine entrappée dans les liposomes multilamellaires.
2.1.2.1 Protocole Les macrophages J-77448 cultivés dans du milieu RPMI contenant 10 mM MES pH7.2 supplémenté par 10 % de plasma humain délipidé sont infectés à raison de 1 Candida tropicalis par 10 macrophages.
L'action des médicaments est mesurée dans des boites LIMBRO à 24 puits contenant 105 macrophages infectés, adhérant sur des lamelles de verre, et la gamme de concentrations testées varie de 0,048 pM à 100 pM.
Le pourcentage de cellules infectées est déterminé après 16 h de coculture. Sur lames de microscope, on compte après coloration au MAY-GRUNA'ALD-GIEMSA, le nombre de macrophages total (NT) ainsi que le nombre de marcrophages infectés par des Candida (Ni). Le pourcentage d'infection est le rapport Ni/NT (exprimé en %) La concentration, exprimée en pM, qui réduit de 50 % I'infection intracellulaire (IC50) est ensuite déterminée.
2.1.2.2 Résultats Les résultats, repris au Tableau 6, montrent que les microparticules sont 2 fois plus actives que la Fungizone(E) et 8 fois plus actives que les liposomes vis à vis de l'infection intracellulaire.
Tableau 6 : Activité de l'Amphotéricine B sous forme de Fungizone , de Jiposomes ou de microparticules vis à vis d'infections intracellulaires (macrophages J-774G8 infectés par Candida tropicalis)
Formulation IC50 ( M) Complexe DOC (Fungizone 0,2 Liposomes 0,8 Microparticules 0,1 Ces études de l'activité des microparticules Amphotéricine B sont très importantes pour s'assurer de la capacité de ces microparticules de pénétrer dans les cellules phagocytaires telles les polymorphonucléaires et les macrophages.
Le dextrane est un polyglucoside de poids moléculaire d'environ 5000 à plusieurs millions de daltons, formé d'unités glucosyle A, liées par des enchainements essentiellement 136, pouvant être représenté par la formule simplifiée ci-dessous
Pour les applications en thérapeutique, on utilise des- dextranes de poids moléculaire généralement inférieur à environ 100 000 daltons.
Ce produit est utilisé, notamment, comme substitut du plasma sanguin ou du moins comme plasma expandeur, ou rétablisseur de volume. Ces utilisations peuvent entraîner cependant, dans certains cas, des chocs immunitaires.
Des dérivés substitués solubles de dextrane sont décrits dans la demande EP 0146455. Ils sont constitués de motifs osidiques A, B, C, D diversement substitués par des groupements fonctionnels tels que dans la formule cidessous,
A B C D ce qui leur confère, en fonction des proportions respectives de ces différents motifs, des propriétés anticoagulantes et/ou anticomplémentaires permettant leur application en tant que substitut du plasma sanguin.
On a par ailleurs montré que certains polymères à caractère anionique tels que l'héparine possèdent des propriétés régulatrices dans de nombreux systèmes physiologiques.
En particulier l'héparine possède des propriétés fortement inhibitrices de la prolifération des cellules musculaires lisses vasculaires in vitro et in vivo (R.L.
Hoover et al, 1980, Circ. Res., 47, 578-583 ; A. W. Clowes et al, 1985, Lab. Invest., 6, 611-616), ainsi que, par exemple, des propriétés inhibitrices de la prolifération des cellules mésangiales glomérulaires (J.J. Castellot et al, 1985, Am. J. Path., 120, 427-435).
La prolifération des cellules musculaires lisses est une conséquence fréquente des lésions endothéliales et est impliquée dans des mécanismes pathologiques tels que l'athérosclérose, ainsi que dans les resténoses après des interventions de chirurgie vasculaire telles que les angioplasties, les pontages et greffes veineux et artériels, ou les transplantations d'organes, en particulier les transplantations cardiaques.
La prolifération des cellules mésangiales glomérulaires, cellules apparentées aux cellules musculaires lisses vasculaires, est impliquée dans des pathologies rénales telles que les glomérulonéphrites.
Néanmoins, l'activité fortement anticoagulante de l'héparine limite son utilisation dans ces applications.
Cependant, les dérivés de l'héparine pratiquement dépourvus d'activité anticoagulante peuvent également posséder ces activités inhibitrices lorsqu'ils conservent un caractère fortement anionique et en particulier des groupements Nsulfate et O-sulfate (J.J. Castellot et al, 984, J. Cell.
Physiol, 120, 315-320).
I1 est donc de grand intérêt de posséder des produits possédant des activités inhibitrices du même ordre que celles de l'héparine tout en étant dépouvus d'activité anticoagulante.
On a maintenant trouvé, de façon surprenante, que des dérivés substitués solubles de dextrane ne contenant que les motifs A, B et C ci-dessus, utilisés dans EP 146 455 comme intermédiaires de synthèse dans l'étape de sulfonation pour la formation du motif D, possèdent une forte activité inhibitrice de la prolifération des cellules musculaires lisses bien qu'ils ne contiennent pas de motifs osidiques substitués par des groupements sulfate ou sulfonate et qu'ils aient donc un caractère anionique moins prononcé que l'héparine ou ses dérivés à activité fortement inhibitrice.
L'invention a donc pour but de fournir des compositions pharmaceutiques contenant, à titre de principe actif, un dérivé substitué soluble de dextrane ayant un poids moléculaire supérieur à environ 5000 daltons et possédant une activité inhibitrice de la prolifération des cellules musculaires lisses du même ordre que celle de l'héparine, tout en étant dépourvu d'activité anticoagulante.
La fig. 1 montre une vue en perspective d'un exemple d'assemblage de plusieurs présentoirs selon l'invention.
La fig. 2 montre le profil de la section d'un présentoir selon l'invention et selon la ligne II-II de la fig. 3.
La fig. 3 montre une vue frontale d'un présentoir.
Les fig. 4 et 5 sont des vues en coupe longitudinale de deux variantes de réalisation de l'invention prises, respectivement, selon les lignes IV-IV et V-V des fig. 1 et 3.
La fig. 6 illustre différents modes d'assemblage de présentoirs selon l'invention.
La fig. 1 montre une vue en perspective d'un assemblage de plusieurs présentoirs P, P1, P2 et P3, disposés sensiblement selon deux lignes directrices génerales sécantes.
Chaque présentoir est constitué d'un assemblage de trois panneaux consistant en un panneau de fond 1, disposé et enserré entre deux panneaux latéraux 2, 3 identiques.
Les trois panneaux 1, 2, 3 sont sensiblement plans, d'une forme générale équivalente à un quadrilatère, de préférence rectangle et réalisés en un matériau stratifié ou de type contreplaqué.
Le panneau de fond 1 est délimité par un bord inférieur 4 reposant sur le sol, un bord supérieur 5 et deux côtés longitudinaux non visibles sur les figures qui définissent la hauteur du ou des présentoirs P.
Les panneaux latéraux 2, 3 sont, également, délimités par un bord inférieur non visible aux figures, un bord supérieur 6 et par deux bords longitudinaux d'extrémités 7.
L'assemblage des panneaux est réalisé par montage et fixation respectifs d'un bord longitudinal 7 d'un panneau latéral 2, 3 sur un côté longitudinal du panneau de fond 1.
La fixation proprement dite peut être efectuée de diverses manières, par exemple par collage, par vissage ou, encore, par pigeonnage. Au besoin, les extrémités d'assemblage sont conformées en vue de réaliser un emboitement.
On obtient ainsi une structure qui présente, selon une coupe transversale, un profil caractéristique en "U", illustré à la fig. 2.
Il est particulièrement important de fixer les panneaux latéraux 2, 3 sur le panneau de fond I dans des positions symétriques par rapport à un plan O orthogonal à la surface du panneau 1, de façon que le plan S, passant par Les deux bords Longitudinaux 7, soit parallèle au plan d'extension du panneau de fond 1. Le profil en "U" ainsi obtenu définit la moitié d'un hexagone dont le plan S constitue un plan de symétrie.
Avantageusement, l'hexagone n'est pas régulier et les bords supérieurs 6 et inférieurs des panneaux latéraux 2, 3 ont une longueur différente de la moitié de la longueur des bords 4, 5 du panneau de fond 1. Les panneaux latéraux 2, 3 ont, quant à eux, une longueur de Leurs bords 6 identique.
De manière préférentielle seulement, on réalise le présentoir en choisissant un panneau de fond 1 dont la longueur des bords 4, 5 est supérieure à celle des bords 6 des panneaux latéraux 2, 3. La grande base de l'hexagone est ainsi constituée par la section transversale du panneau de fond 1.
(J. Nutr. Sci. Vitaminol., 1986, 32, 67-76), que les CPP inhiberaient la précipitation des sels de calcium au niveau de l'intestin grêle et ainsi favoriseraient une absorption de type passif au niveau de 1'iléon.
L'isolement des phosphopeptides peut se faire soit a partir du lait, des caséinates, soit & partir d'une des caséines, le plus souvent la caseine B. Après hydrolyse trypsique, les séquences phosphopeptidiques sont agrégées par mise en contact avec du calcium et du phosphate'minéral.
La séparation et la purification de l'agrégat se fait par ultra filtration sur membrane ou par gel filtration ou encore par chromatographie d'échange d'ions. Les préparations commerciales se caractérisent par une teneur élevée en-acide glutamique (28 g p. 100), en sérine (9 g p. 100), en calcium (7 g p. 100) et en phosphore (3,6 g p. 100) et une très grande solubilité (200 g/l). Elles peuvent chélater des oligo-éléments en quantité élevée sans que soit altérée leur solubilité.