INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
A titre d'exemple de substances ainsi détectées utilisables comme matières actives, on citera les hydrolysats de caséine ou la peptone. Mais il'est clair qu'un large spectre de substances peut être détecté en mettant en oeuvre les dispositions de ;'invention, en choisissant un gène reporteur approprié.
Les substances détectées selon l'invention permettent de lutter efficacement non seulement dans la lutte contre le flétrissement bactérien du a P. solanacearum, mais aussi contre d'autres maladies causées par l'ensemble des pathovars de P. svrinqae. et N. campestris ou par E. amvlovora.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaitront dans la suite de la description, en se référant aux exemples et aux figures 1 et 2.
- la fiaure 1 représentant dans la région pVir2 et pAFE8, les groupes d'activité transcriptionnels tels qu'ils ont pu être définis au moyen des constructions de l'invention. et - la figure 2. la cynétique d'induction de l'activité ss-galactosidase mesurée sur un mutant de l'invention en présence d'extraits végétaux.
EXEMPLE 1 : SOUCHE DE P. SOLANACEARUn MODIFIEZ PAR INSERTION DU TRANSPOSON Tn5-820 @ MATERIEL ET METHODES 1/ Souches bactériennes et plasmides utilisés Le tableau ci-apres indique les caractéristiques essentielles des souches et des plasmides utilisés.
TABLEAU SOUCHES BACTERIENNES ET PLASMIDES DESIGNATION GENOTYPE ET/OU ORIGINE/ DE LA SOUCHE CARACTERES ESSENTIELS: REFERENCE CONSTRLLTION E.coli C600 Sm1- lambda-.F-,thi,thr,leu (11) rpsL,supE44,hsdR,hsdM@ S17-1 pro, hsdR, recA. RP4-2 (15) K12(pRK2013) lamdba-, P-; km@ du (12) pRK2013 P. solanacearum GMI1000 Souche sauvage, (3) pathogène sur tomate: pathotype I, Biovar 4 PLASMIDES CARACTERISATION pRK2013 TraRK2+, delts(rep RK2). (2) repEl : Kmr pVir2 Dérivé de pArR3 portant (4) une partie des gènes hrP de P. solanacearum pAFE8 Plasmide portant un insert de 25kb chevauchant les 3.5kb environ à l'extrémité gauche de l'insert de pVir2 2/ Cultures et conservation des souches bactériennes Les souches de P. solanacearum sont cultivées à 30 C: Les milieux utilisés et leurs compositions données en gramme par litre sont le milieu B (peptone 10 extrait de levure 1, hydrolysat de caseine 1). BG (identique à B et complémenté avec glucose : 5), BGT (identique à BG et complémenté avec du chlorure de triphényl tétrazolium : 0,05), MMG (Fe SO4, 7H2O : 1,25.10-4; (NH4)2 SO4 : 0,5; Mg SO4, 7H2O : 0.05; KOH (10N) : 1,75 ml.1-1; KH2PO4 : 3,4; glucose 2).
Les souches d'E. coli sont cultivées à 37 C en milieu L contenant en grammes par litres (extrait de levure : 5: Bactotryptone : 10 ; NaCl : 10).
Les milieux sont complémentés le cas échéant avec les antibiotiques suivants : streptomycine (Sm) à 200ug,ml-1; acide nalidixique (Nal) à 25 g.ml-1; tétracycline (Tc) à 10 g.ml-1 et kanamycine (Km) à 25 g.ml-1. Ils sont éventuellement rendus solides par addition de gélose à 15 y.l-:.
3/ Conjuqaisons bactriennes Les souches donatrices et réceptrices ainsi que la souche "helper" K12 (pRN2013) sont cultivées environ 14 heures dans du milieu nutritif liquide non sélectif. Les précultures des souches donatrices et helper sont ensuite diluées dans du milieu nutritif liquide frais.
Lorsque la DO (650nm) de ces nouvelles cultures atteint 0,2 (10' bactéries/ml), 0,5 ml de celles-ci et 0,5 ml de la culture de la souche réceptrice sont mélangés et filtrés sur filtre Millipore de 0,45 um de diamètre de pores.
Les filtres sont ensuite placés sur des boites de milieu nutritif solide, les bacteries étant au-dessus des membranes. La nature du milieu nutritif et les conditions d'incubation dépendent des bactéries impliquées dans le croisement - pour les croisements entre souches d'E. coli, les filtres sont déposés sur du milieu L et incubés à 370C pendant 4 heures, - lorsqu'un des partenaires du croisement est P. solanacearum, les filtres sont déposés sur du milieu BG et incubés de 4 à 18 heures à 30'C.
Deux témoins sont réalisés en incubant séparément les partenaires du croisement dans les memes conditions.
Les bactéries sont ensuite remises en suspension dans 3 ml de milieu nutritif et les dilutions adéquates de la suspension sont étalées sur milieu sélectif.
4/ flutagénèse par le transposon Tn5-B20 Le transposon Tn5-B20 (5) a été utilisé pour mutagéniser les cosmides recombinants pVir2 et pAFE8.
L'invention vise donc des sondes de détection caractérisées en ce qu'elles comprennent au moins une partie d'une séquence de nucléotides définie cidessus, d'ARN ou d'ADN, plus spécialement un fragment d'une séquence codant pour une protéine à activité NDP kinase.
Le fragment utilisé comme sonde comporte un nombre de nucléotides suffisant pour obtenir la spécificité requise et la formation d'un hybride stable.
Des sondes appropriées sont avantageusement marquées par un élément radio-actif (sondes chaudes) ou tout autre groupe non radio-actif (sondes froides) permettant la reconnaissance de la sonde à l'état hybridé avec la préparation renfermant 1'ADN à étudier.
Des dérivés d'adénosine phosphate dans lesquels le groupe phosphate est marqué en a sont particulièrement avantageux pour l'élaboration de sondes froides. Pour cette élaboration, on opte avantageusement comme décrit dans les brevets FR ne8413095 et ne8413096 du 22 août 1984, au nom de l'Institut Pasteur.
Selon les techniques classiques, ces sondes sont mises en contact avec un échantillon biologique renfermant des bactéries, ou directement avec ces bactéries ou leurs acides nucléiques, dans des conditions autorisant l'hybridation éventuelle de la séquence de nucléotides de la sonde avec une séquence complémentaire, éventuellement contenue dans le produit testé.
Ces sondes permettent de rechercher la présence de gènes homologues chez d'autres espèces par hybridation après transfert de Southern. Pour parvenir à détecter des séquences même relativement divergentes, on fait varier, de manière en soi connue, les conditions de force ionique des milieux d'hybridation et de rinçage. Ces conditions d'hybridation ont été énoncées plus haut.
On peut mettre en oeuvre la méthode d'hybridation sur taches (dot blot). Cette méthode comporte après dénaturation de l'ADN préalablement obtenu à partir de cellules exprimant une protéine à activité adényl cyclase ou NDP kinase selon l'invention, le dépôt d'une quantité aliquote de cet ADN sur des membranes de nitrocellulose, l'hybridation de chaque membrane dans les conditions usuelles avec la sonde et la détection, de manière classique, de l'hybride formé.
Dès lors que des séquences apparentées sont détectées, des clones sont isolés par hybridation hétérologue des banques d'ADNc construites dans des phages ou des plasmides.
L'invention fournit ainsi des outils permettant de détecter rapidement, avec une grande spécificité, des séquences similaires dans les gènes codant pour des protéines à activité NDP kinase, ce qui permet d'étudier l'origine et le mode d'action de ces NDP kinases.
Pour la mise en oeuvre des méthodes de détection considérées ci-dessus, basées sur l'utilisation de sondes nucléotidiques, on a recours avantageusement à des nécessaires ou kits comprenant: - une quantité déterminée d'une sonde nucléotidique selon l'invention, - avantageusement, un milieu approprié respectivement à la formation d'une réaction d'hybridation entre la séquence à détecter et la sonde, - avantageusement des réactifs permettant la détection des complexes d'hybridation formés entre la séquence de nucléotides et la sonde lors de la réaction d'hybridation.
L'invention z invention vise également les applications immunologiques de l'adényl cyclase tronquée, plus spécialement pour l'élaboration d'immunsérums spécifiques polyclonaux et d'anticorps monoclonaux.
Les anticorps polyclonaux sont formés selon les techniques classiques par injection de la protéine à des animaux, récupération des antisérums, puis des anticorps à partir des antisérums par exemple par chromatographie d'affinité.
Les anticorps monoclonaux sont produits de manière habituelle en fusionnant des cellules de myélomes avec des cellules de rate d'animaux préalablement immunisés à l'aide des protéines de l'invention.
Les essais de toxicologie réalisés avec cette adényl cyclase en l'absence d'antigène protecteur ont démontré son absence de toxicité.
Des souris ont été immunisées avec différentes doses d'antigène (3 injections sous-cutanées à une semaine d'intervalle, de 250 1 d'antigène dans du tampon tris 10 mM pH 7 contenant 1 mg/ml d'Am---).
Les résultats obtenus montrent l'obtention d'une synthèse d'anticorps antiAC, après immunisation avec la protéine.
Figure 2 : Séquence nucléotidique complète de HIV l-NDK.
Figure 3 : Multi-alignement des séquences d'acides aminés d'enveloppe de 4 isolats viraux. MIV 1-NDK a été utilisé en tant que séquence de référence.
Figure 4 : Séquence d'acides aminés de la gap120 correspondant à la plus grande variabilité entre 6153 et 6215.
Figure 5 : Alignement des séquences d'acides aminés gag du prototype HIV 1 et de HIV l-NDK.
Matériels et méthodes a) Isolement du virus HIV 1-NDK a été isolé à partir de lymphocytes du sang périphérique comme décrit précédemment (1). Le virus a été ensuite propagé dans une lignée cellulaire CEM permissive continuelle (2). La production virale a été contrôlée par les dosages de réverse transcriptase, par immunofluorescence et par microscopie électronique.
b) Détermination de la cytopathogénicité La cytopatogénicité des souches virales HIV a été déterminée par superinfection des lignées cellulaires MT4 positives au HTLV 1. Le nombre des cellules survivantes a été déterminée par exclusion au bleu Tryptan sept jours après l'infection.
c) Clonage moléculaire par une banque génomique L'ADN de haut poids moléculaire extrait de cellules CEM infectées par du HIV 1-NDK a été digéré partiellement avec de Hind III afin d'obtenir des fragments compris entre 10 et 15 kb en taille qui ont ensuite été purifiés par un gradient de 10 % à 40 % en sucrose (3). Le produit de la digestion partielle a été lié dans le phage L47 clivé par HindIII. Les molécules importantes ainsi obtenues ont été conditionnées avec un extrait Gigapack-Gold. La banque a été criblée par la sonde pBTl correspondant à l'important fragment Sac I - Sac I du prototype du HIV I (4) selon la méthode "annealing plaque-filter" (8). Des phages positifs ont été purifiés, amplifiés et la localisation a été réalisée par la méthode double digestion (3) et par l'hybridation Southern Blot avec plusieurs sous clones dérivés du génome de pBTl.
d) Séquençage nucléotidique 5 microgrammes d'ADN correspondant aux parties virales du phage recombinant HIV 1-NDK ont subit une sonication afin d'obtenir des fragments de 500 pb. Après réparation des extrémités avec l'enzyme Klenow, les fragments ont été sous clonés dans le site Sma I du vecteur M13 mpl8 (5). Le séquençage a été réalisé selon la méthode de terminaison de chaîne dideoxy avec "universal primer" (6).
e) Transfection des cellules Eukariotiques Les cellules COS-l ont été ensemencées à une densité de 4.106 par flacon de 75 cm, 24 heures avant la transfection. La tranfection pour les analyses d'ADN ultérieures a été réalisée par la technique de coprécipitation au phosphate de calcium (7), en utilisant 10 g d'ADN plasmidique. Après 12 heures, la culture cellulaire a été agitée avec 15 % de DMSO durant I minute avant de la récupérer dans du DMEM avec 19 ,ó FCS. Les cellules CEM ont été additionnées aux cellules COS-l 16 heures après la transfection et co-cultivées pendant 21 jours pendant que l'activité réverse transcriptase était testée dans le surnageant libéré de toutes cellules.
EXEMPLE I Cytopathogénicité de la souche HIV 1-NDK Afin de comparer la cytopathogénicité de l'isolat HIV 1-BRU (prototype HIV I) et HIV l-NDK, une série de dilution du surnageant du virus libéré de toutes cellules contenant du virus a été utilisée pour infecter les cellules MT4. La présence de syncitia a été déterminée dans la culture cellulaire 7 jours après l'infection. Les résultats montrent que des stocks de HIV I-NDK dilués à 10 7 sont capables d'induire la formation de syncitia alors que le prototype HIV 1 dilué au dessous de 10-3 ne conduit à aucun effet cytopathique. Afin de démontrer que le syncitia est dû à une réplication virale, une infection des lymphocytes du sang périphérique a été réalisée avec une série de dilutions des deux souches.Les résultats indiquent que les mêmes dilutions qui induisent une formation de syncitia sur MT4 sont capables d'infecter PBL suggérant que le HIV l-NDK est lu4 fois plus cytopathique et infectueux que le prototype.
Le niveau de l'activité réverse transcriptase et le pourcentage de cellules infectées sont les mêmes dans les lignées cellulaires continues infectées avec le prototype HIV 1 ou HIV 1-NDK, suggérant ainsi que la production virale est quantitativement équivalente pour les deux souches.
De plus, des études au microscope électronique ont montré plus de bourgeonnement à la surface des cellules infectées par le HIV 1-NDK. Ces données suggèrent que la plus importante infection et cytotoxicité de l'isolat HIV I-NDK pourraient être attribuées à des propriétés qualitatives du virus et non à une réplication virale plus importanté.
EXEMPLE 2: Cartographie moléculaire du génome HIV I-NDK Des phages recombinants isolés à partir des banques génomiques L47 ont été sous clonés en utilisant la digestion partielle par Hind III dans le plasmid pUC 18. La carte de restriction de l'un des plasmides recombinants pNDK est présentée à la figure 1. En prenant en compte que les Sites Sac 1 et Hind III ont toujours été trouvés dans le LTR de tous les isolats pour l'instant publié, la digestion du pNDK avec ces enzymes a été réalisée. La digestion Sac 1 permet l'identification d'un fragment viral interne de 9,1 kb et, l'hybridation des fragments Hind III avec la sonde pBTl identifie clairement les fragments de jonction avec les génomes cellulaires. L'analyse de la carte de l'enzyme de restriction indique que le génome HIV 1-NDK est différent des autres isolats HIV 1 connus.
EXEMPLE 3: Analyse des séquences du génome HIV 1-NDK La séquence complète nucléotidique du HIV 1-NDK est présentée en figure 2 avec la séquence d'acide aminé supposée pour tous les cadres de lecture ouverts. L'organisation génomique du HIV l-KDN est similaire à celle des des autres souches séquencées du HIV 1. Le génome HIV 1-NDK est long de 9143 nucléotides (dans sa forme ARN) et possède trois gènes de structure GAG, POL et ENV, les deux gènes TAT et REV, chacun étant constitué de deux exons codant. Les autres gènes de régulation VIF et NEF ont pu également être détectés. la séquence du HIV 1 -NDK contient le gène VPU qui a été récemment identifié en tant que gène fonctionnel.Aucun cadre de lecture ouvert supplémentaire autres que ceux présentés sur les autres souches HIV 1, n'a pu être détecté.
Le pourcentage des homologues d'acides aminés a été calculé pour tous les cadres de lecture ouverts du HIV 1-NDK et du prototype VIH.
Comme espéré, la plus grande variabilité génétique a été observée pour le cadre de lecture ouvert codant pour le gap120. Une comparaison a été également réalisée avec une autre souche Zairoise précédemment séquencée HIV 1- ELI (4). Ceci a indiqué une parenté plus proche du HIV 1-NDK au HIV 1-ELI qu'au prototype HIV 1 dans tous les cadres de lecture.
La présente invention vise à remédier à ces inconvénients en fournissant un bouchon à charnière intégrée ne nécessitant pas le ménagement de découpes dans la coiffe.
A cet effet, le bouchon qu'elle concerne, du type comprenant une partie verseuse destinée à être montée sur le, col du récipient à équiper et une coiffe destinée à obturer la partie verseuse et montée articulée sur cette dernière par une charnière à effet de ressort comprenant deux pattes disposées latéralement par rapport au bouchon, reliant la partie verseuse et la coiffe, présentant chacune une partie amincie formant une charnière-film ménageant un axe géométrique de pivotement de la coiffe par rapport à la partie verseuse, entre lesquelles est ménagée une partie ayant un effet de ressort, est caractérisé en ce que la partie ayant un effet de ressort est constituée en combinaison - par une patte rigide ménagée dans la partie verseuse et délimitée par deux fentes parallèles à l'axe du bouchon ainsi que par deux zones amincies formant charnière-film, orientées perpendiculairement aux fentes et dont l'une est disposée dans la zone de jonction entre la partie verseuse et la coiffe, et - par une zone déformable élastiquement ménagée dans la coiffe dans le prolongement de la patte rigide.
En théorie, lors des mouvements d'ouverture et de fermeture de la coiffe, la totalité des points mobiles devraient pivoter suivant des arcs de cercles centrés sur l'axe géométrique de pivotement défini par la charnière-film des deux pattes précitées. Or, compte tenu de la rigidité de la partie centrale, I'axe de la charnière-film reliant celle-ci à la coiffe pivote selon un arc de cercle centré sur l'axe constitué par la charnière-film disposée à l'autre extrémité de ladite patte. Cette dernière possibilité de pivotement est rendue possible du fait de la déformatipn élastique qu'est susceptible de subir la zone déformable élastiquement de la coiffe, située dans le prolongement de la patte frigide.
La distance maximale entre les trajectoires de pivotement de l'extrémité de la patte rigide située du côté de la coiffe, d'une part, par rapport à l'axe géométrique de pivotement et, d'autre part, par rapport à l'autre extrémité de la patte étant située sur une ligne reliant l'axe géométrique à cette dernière extrémité de la patte, la déformation de la partie déformable de la coiffe sera maximale lorsque la patte sera disposée selon cette ligne appelée "ligne de point mort".
La partie déformable ayant tendance à reprendre sa position de moulage sous l'effet de détente de la matière, la patte rigide, et par suite la coiffe, auront tendance à basculer automatiquement soit dans un sens d'ouverture, soit dans un sens de fermeture du bouchon de part et d'autre de cette ligne, sous l'effet de détente de la matière, ce qui procure l'effet de ressort recherché.
Selon une première forme d'exécution de ce bouchon, la zone déformable élastiquement, ménagée dans la coiffe dans le prolongement de la patte rigide, est constituée par une zone de matière de même épaisseur que le - reste de la coiffe, et délimitée par deux lignes obtenues par amincissement de matière s'étendant sensiblement dans le prolongement des fentes délimitant la patte rigide, sur la hauteur de la jupe de la coiffe et sur une partie du fond de celle-ci.
Selon une autre forme d'exécution de ce bouchon, la zone déformable élastiquement ménagée dans la coiffe et dans le prolongement de la patte rigide, est constituée par une zone de matière de moindre épaisseur que le reste de la coiffe et s'étendant sur la hauteur de la jupe de la coiffe et une partie du fond de celle-ci.
Le bouchon selon l'invention présente l'avantage d'être d'une esthétique beaucoup plus agréable que les bouchons traditionnels, puisque la coiffe ne comporte absolument aucune découpe. En outre, il résulte de cette structure une simplification de la réalisation du bouchon, le moule utilisé étant moins complexe puisque ne nécessitant pas la réalisation d'une patte découpée à l'intérieur du couvercle.
De toute façon, l'invention sera bien comprise à l'aide de la description qui suit, en référence au dessin schématique annexé représentant, à titre d'exemple non limitatif, une forme d'exécution de ce bouchon Figure 1 en est une vue en perspective en position ouverte Figure 2 en est une vue en coupe longitudinale, à échelle agrandie, passant par l'organe formant ressort, en position fermée du bouchon Figure 3 est une vue à échelle plus agrandie encore du détail A de figure 2 Figure 4 est une vue du détail A de figure 2, le bouchon étant en position ouverte Figure 5 est une vue de face du détail A de figure 2 en position ouverte du bouchon Figure 6 est une vue en coupe d'une partie de ce bouchon selon la ligne VI-VI de figure 5;; Figure 7 est une vue illustrant les courbes de déplacement de certains points caractéristiques du bouchon lors du passage de la position d'ouverture à la position de fermeture et inversement.
Le bouchon, représenté au dessin et désigné par la référence générale 2, comprend une partie verseuse 3 destinée à être montée de façon définitive sur le col du récipient à équiper. Cette partie verseuse comprend une première jupe 4 destinée à la fixation du bouchon sur le col du récipient, non représenté, et est elle-même entourée par une seconde jupe 5.
La première jupe 4 est obturée par un fond 6 dans la partie centrale duquel est ménagée une ouverture 7. Ce bouchon comprend également une coiffe 8 montée articulée sur la partie verseuse 3, comprenant une jupe cylindrique 9 obturée à l'une de ses extrémités par un fond 10 de la partie centrale duquel fait saillie un doigt 11 destiné à venir s'engager avec étanchéité dans l'orifice 7, en position de fermeture du bouchon.
La coiffe 8 est reliée à la partie verseuse 3 par l'intermédiaire de deux pattes 12 faisant saillie latéralement du bouchon, et comportant une partie centrale 13 amincie formant une charnière-film, les deux charnières 13 des deux pattes 12 délimitant l'axe géométrique O de pivotement de la coiffe par rapport à la partie verseuse.
Entre les deux pattes 12 est ménagée une partie ayant un effet de ressort, constituée par une patte rigide 14 ménagée dans la partie verseuse 3 et délimitée par deux fentes parallèles à l'axe du bouchon ainsi que par deux zones amincies 15 et 16 formant chacune une charnière-film orientée perpendiculairement aux fentes. La zone amincie 16 est disposée dans la zone de jonction entre la partie verseuse 3 et la coiffe 8. En outre, la patte rigide 14 est prolongée au niveau de la coiffe 8 par une zone déformable élastiquement.
Dans la forme d'exécution représentée au dessin, cette zone 17, déformable élastique ment, est constituée par une zone de matière de même épaisseur que le reste de la coiffe délimitée par deux lignes 18 de moindre épaisseur de matière s'étendant dans le prolongement des fentes délimitant la patte rigide, sur la hauteur de la jupe 9 et une partie du fond 10 de la coiffe 8.
En théorie, toutes les parties mobiles devraient, au cours du passage de la coiffe de la position de fermeture à la position d'ouverture ou inversement, pivoter sur un arc de cercle centré sur l'axe géométrique de pivotement O. C'est ainsi qu'en thoérie, la charnière 16 devrait décrire une ligne T1. Or, compte tenu de la rigidité de la patte 14, la ligne charnière 16 décrit un arc de cercle T2 centré sur l'axe 15 correspondant à la ligne d'articulation de la patte 14 sur la partie verseuse 3.
Ceci est rendu possible en raison de la flexibilité de la zone 17 qui prolonge la patte rigide, cette zone 17 qui forme normalement, vue en coupe, un angle droit, étant susceptible de s'aplatir pour compenser la différence entre les trajectoires TI et T2. La distance maximale entre les trajectoires T1 et T2 étant située sur la ligne 150 qui est appelée "ligne de point mort", la patte 14 ne pourra occuper de position stable correspondant à cette ligne, et basculera automatiquement d'un côté ou de l'autre de cette ligne, suivant l'action exercée à l'origine par l'utilisateur sous l'effet de détente de la partie déformable 17 qui tendra à reprendre la forme sous laquelle elle a été moulée.