INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
A titre d'exemple, on peut citer les phases des formules suivantes La2#xAxCuO4 où A représente le strontium ou le baryum et O s x (NdCeSr)2CuO4 Selon une seconde variante préférée, les compositions supraconductrices correspondent à la formule suivante LnBa2Cu307 où Ln représente l'yttrium ou le lanthane.
Il est ainsi possible de préparer des phases supraconductrices du type YBa2Cu4O8.
Selon une troisième variante intéressante, les compositions supraconductrices comprennent au moins une terre rare, au moins un alcalino-terreux, au moins un élément de transition et éventuellement au moins un élément de la classe 4A.
A titre d'exemple, on peut citer les phases du type Pb2Sr2NdCu3O8.
Le procédé selon l'invention convient aussi à la préparation de compositions supraconductrices du type comprenant au moins un élément de transition, au moins un alcalino-terreux, au moins un élément des classes 3A, 4A, 5A.
Les compositions selon cette dernière variante peuvent répondre à la formule suivante : TlmBa2Can#1CunOm+2n+2 dans laquelle . le thallium peut être substitué par le bismuth partiellement ou totalement, le baryum peut être substitué par le strontium, partiellement ou totalement, . m = 1 ou 2 Par exemple, l'invention permet d'obtenir les phases suivantes TlBa2cacu207 T1Ba2Ca2Cu309 TlBa2CuO6 Tl2Ba2CuO6 T12BaZCa2Cu3010 On peut citer aussi les phases de formule suivante, toujours dans le cadre de cette même dernière variante:: Bix My Srz Cat Cuv Ow dans laquelle M peut être le plomb, l'antimoine ou l'étain où 1,5 s x + y s 2,5 et y peut être nul 2 s v s 4 3 sz+ts5 De même, on peut citer les phases du type Ca1#x Sbx Co 3-6 Srl-x Sbx Co 3~ô Bal-x Bix Co 03-6 où O La calcination du carboxylate métallique du type précité est effectuée selon toute méthode habituelle. Plus particulièrement, on calcine le carboxylate précité sous air et/ou sous balayage d'oxygène à une température variant entre 600 et 9500C et de préférence entre 700 et 9000C.
La durée de calcination est comprise entre 2 et 10 heures et de préférence comprise entre 2 et 6 heures.
Il est à noter d'une part qu'une seule calcination d'une durée plus faible par rapport aux procédés connus suffit pour obtenir un produit pur et d'autre part qu'il n'est pas nécessaire d'effectuer une calcination complexe, c'est-à-dire comportant un broyage intermédiaire afin d'obtenir une phase pure et homogène.
L'invention concerne aussi les compositions supraconductrices des types précités en tant que telles.
Les compositions supraconductrices selon l'invention sont pures, cette pureté étant déterminée par diffraction X.
Selon une première variante de l'invention, lesdites compositions sont caractérisées en ce qu'elles présentent une homogénéité de composition, mesurée par analyse EDS (microsonde MET) telle que les domaines d'hétérogéneité sont inférieurs ou égaux à 1pm. Plus particulièrement, lesdits domaines sont inférieurs ou égaux à 0,5Fun.
Selon une seconde variante de l'invention, l'analyse ESCA de la composition (Electron Spectroscopy for Chemical Analysis, basée sur l'effet photo-électrique) indique une stoechiométrie en surface relativement proche de la stoechiométrie théorique; les différences étant de l'ordre de 10% par rapport à la stoechiométrie théorique.
Selon une autre variante intéressante, les phases supraconductrices peuvent se présenter sous la forme d'une poudre dont la taille moyenne des particules est d'au plus 1pm ou submicronique et de préférence comprise entre 0,2 et 0,6Fun.
ci-dessus, dans le phare d'automobile conforme à l'invention, une partie du porte-lentille de l'ensemble formant lampe du type projecteur qui vient en saillie vers l'avant, depuis l'ouverture formée dans le couvercle de la lampe, réfléchit la lumière extérieure, ce par quoi on ne remarque pas le jeu existant entre la périphérie de 1 ' ouverture prévue dans le couvercle de la lampe et l'ensemble formant lampe du type projecteur En outre, le porte-lentille de la lentille de projection vient en saillie en avant de la surface, réfléchissant la lumière, du couvercle de la lampe, ce par quoi le phare parait davantage profond et davantage tridimensionnel Par conséquent, le phare du type projecteur conforme
à l'invention a un aspect extérieur attractif.
APPAREIL DE REFRIGERATION, EN PARTICULIER POUR REFRIGERATEUR-ARMOIRE MENAGER.
La présente invention concerne un appareil de réfrigération, en particulier un réfrigérateurarmoire ménager, comportant des glissières ou analogues qui sont disposées latéralement dans la cuve calorifugée dudit réfrigérateur et entre lesquelles sont disposées des étagères amovibles et réglables en hauteur qui sont entourées par un cadre qui peut être introduit dans des glissières opposées avec ses côtés latéraux et/ou des saillies formées sur lesdits côtés.
Dans les appareils de réfrigération du type mentionné, il est courant de diviser transversalement à la direction d'introduction au moins une des étagères ou grilles disposées les unes au-dessus des autres avec un faible écartement dans la cuve dudit appareil afin de créer la possibilité en cas de besoin, de pouvoir ranger dans la partie avant des étagères, de la marchandise à réfrigérer conservée dans des emballages ou des conteneurs hauts, tels que par exemple des bouteilles ou analogues.
Dans des appareils de réfrigération simples, il est possible en cas de besoin d'extraire de l'appareil de réfrigération la partie avant des étagères divisées en deux parties. Toutefois, cela présente l'inconvénient de devoir conserver à part la partie extraite, étant donné que sinon elle peut facilement être égarée. Dans des appareils plus coûteux, il est par conséquent courant de relier les deux parties entre elles de telle tanière que la partie avant puisse en cas de besoin être poussée vers l'arrière, si bien qu'ensuite il suffit de la tirer vers l'avant pour la ramener dans sa position initiale.
Dans la mesure où les étagères sont constituées par des grilles comportant des barreaux qui s'étendent dans la direction d'introduction, les deux parties peuvent facilement être glissées l'une dans l'autre sur le même plan, les deux parties se pénétrant mutuellement. Il n'y a alors pas de problème avec les glissières qui reçoivent les étagères et sont disposées latéralement dans la cuve.
Toutefois, dans la mesure où les étagères destinées à la marchandise à réfrigérer sont constituées par des plaques massives, les deux parties doivent être glissées l'une au-dessus de l'autre à différentes hauteurs. Cela n' est toutefois possible que si les glissières disposées latéralement sur la cuve sont adaptées pour cela. Les glissières réalisées de manière particulière à cet effet compliquent toutefois la fabrication et le nettoyage des appareils de réfrigération qui en sont équipés. En outre, dans un tel cas, il est impossible d'équiper ultérieurement des appareils d'étagères divisées.
L'invention a par conséquent pour objectif de résoudre simplement, dans un appareil de réfrigération du type décrit initialement en détail, les problèmes liés à l'utilisation d'étagères massives divisées transversalement à la direction d'introduction.
Selon l'invention, cet objectif est atteint en ce que les étagères présentent au moins deux parties divisées transversalement à la direction d'introduction, parmi lesquelles la partie située à l'avant peut être introduite en cas de besoin dans des guidages faisant saillie vers le bas sur les côtés latéraux du cadre entourant la partie arrière, sous la partie arrière.
La réalisation selon l'invention des étagères permet de résoudre simplement les problèmes apparaissant lorsque l'on pousse vers l'arrière celle des deux parties divisées transversalement par rapport à la direction d'introduction qui se trouve à l'avant sans avoir à modifier pour cela les glissières habituelles réalisées sur les parois latérales à l'intérieur de La cuve.
Selon une configuration avantageuse de l'objet de 1 invention, il est prévu que les côtés latéraux du cadre entourant la partie arrière de l'étagère s'étendent vers l'avant au-delà de son côté avant et forment des montants destinés à recevoir la partie avant de l'étagère.
Il est ainsi possible d'utiliser pour les étagères des pièces de mêmes dimensions et de les disposer sur le même plan sans gradation en cas d'utilisation d'étagères non divisées.
Selon une autre configuration avantageuse de l'objet de 1 invention, il est prévu les côtés latéraux et les montants porteurs sont équipés de barres de guidage faisant saillie vers l'intérieur entre lesquelles la partie avant peut être introduite sous la partie arrière de l'étagère.
Un guidage sûr de la partie avant de l'étagère est ainsi garanti.
Selon une configuration avantageuse supplémentaire de l'objet de l'invention, il est prévu que les barres de guidage sont relevées à leur extrémité avant et forment un cran d'arrêt pour le bord avant de la partie avant.
TRANSFORMATION GENETIQUE ET REGENERATION DE LA BETTERAVE SUCRIERE L'invention concerne un procédé de transformation génétique de cellules végétales appartenant à l'espèce Beta vulgaris, suivie éventuellement par une étape de régénération de cellules transformées en plante entière.
L'invention concerne également les cellules transformées, les bourgeons, les plantes et les graines transgéniques produits par ce procédé.
Les références bibliographiques apparaissant dans la description de l'invention sont répertoriées sous forme de bibliographie.
L'obtention de plantes transgéniques met en oeuvre le transfert du fragment d'ADN sélectionné dans la cellule végétale, la sélection des cellules transformées de façon stable et la régénération de plantes entières à partir des cellules sélectionnées transformées.
Le problème technique qui s'est posé lors de l'élaboration de la présente invention était de trouver une méthode de transformation de cellules de betterave présentant une fréquence de transformation élevée qui pouvait être associée avec succès à une méthode de régénération de plante transgénique. A ce jour, une telle méthode de tranformation et de régénération n'a pas été décrite.
Actuellement, il existe deux grandes voies de transfert d'ADN dans les cellules végétales - La première voie est une voie physico-chimique (électroporation, microinjection, polycations, canon à particules).
Chez la betterave, des cellules transformées de manière stable ont été sélectionnées après électroporation d'un gène codant pour la résistance à la kanamycine dans les protoplastes (Lindsey et al, 1989).
Cependant, ce procédé n'a jamais pu conduire à la création de betteraves transgéniques puisque la régénération de plantes à partir de protoplastes n'a pu être obtenue chez cette espèce.
- La deuxième voie est une voie biologique utilisant comme vecteur une bactérie du sol : Aqrobacterium tumefaciens ou rhizogenes.
Différentes souches de ces deux espèces ont été utilisées avec succès pour la transformation de cellules de betteraves. Ces cellules transformées ont donné naissance soit à des tumeurs avec Aqrobacterium tumefaciens (Krens et al, 1988) soit à des racines avec Aqrobacterium rhizoqenes (Yacoub et al, 1987). Ces tissus transformés (racines et tumeurs) n'ont jamais permis à ce jour la régénération de plantes chez la betterave. Ceci vient du fait que ces deux phénotypes sont les résultats de l'intégration dans le génome de la cellule non seulement du fragment d'ADN desiré mais aussi d'un fragment d'ADN de la bactérie qui perturbe l'équilibre hormonal de la cellule (Akiyoshi et al, 1983). Pour pallier ces problèmes, ces gènes ont ete délétés, donnant de nouvelles souches d'Aqrobacterium dites souches désarmées.
Les trois souches d'Aqrobacterium tumefaciens désarmées utilises dans le travail decrit ici sont LBA 4404 (Hoekema et al, 1983 ; EHA 101 (Hood et al, 1986) C58'3 (Dale et al, 1989).
L'utilisation des souches d'Aqrobacterium desarmées implique l'association d'un système selectif pour la transformation de cellules végétales. Le succès dans l'obtention de transformants est étroitement lié à la mise au point d'un bon système sélectif. Le gène selectif le plus utilise dans ce domaine est celui provenant du transposon Tn5 d'Escherichia coli (Rothstein et al, 1981) codant pour la néomycine phosphotransférase (NPT II) qui confère la résistance à la kanamycine (An et al, 1985).
La plupart des vecteurs plasmidiques utilisés dans ces souches desarmées contiennent dans 1'ADN transférable, outre le gène désiré, le gène NPT II, sous le contrôle de signaux de transcription végetaux (Bevan, 1984 ; An, 1986). Le système de sélection comprend d'une part le gène conférant la résistance, et d'autre part, l'agent sélectif. Ceci implique de déterminer les concentrations d'agent sélectif permettant à la fois de tuer les cellules non transformées et de laisser croître les cellules transformées. Les seuls travaux publiés concernant la sélection de cellules de betterave après transformation d'explants pluricellulaires par Aqrobacterium font appel à un autre système sélectif hygromycine B / hygromycine B phosphotransferase (Harpster et al, 1988).
La transformation par Aqrobacterium nécessite dans un premier temps le choix d'un type de cellule ou d'un type d'explant qui va faire l'objet de la transformation.
Par exemple, des explants tels que des hypocotyles, des morceaux de feuilles (Krens et al, 1988) peuvent être transformés par Aqrobacterium.
La fréquence de transformation peut varier selon le type de cellule ayant fait l'objet de la transformation, cette variabilité étant souvent d'une nature imprévisible.
EXEMPLE 50 : Z,E alpha-(methoxy méthyène) 2-[2-[2-(2,4dichlorophényl) 4-thiazolyl] éthényl] benzèneacétate de méthyle A une solution de 7,9 g de bromure de [[2-[1-(méthoxycar- bonyl) 2-méthoxy éthényl] phényl) méthyl] triphényl phosphonium, obtenu à la préparation 16, dans 100 cm3 de diméthylformamide, on ajoute à 20/25"C, 3,6 g de 2-(2,4-dichlorophényl) thiazole carboxaldéhyde (obtenu à la préparation 18) en solution dans 70 cm3 de tétrahydrofuranne, on refroidit à 0 C et ajoute 0,67 g d'hydrure de sodium à 50 % dans l'huile. On agite 1 heure à 0 C puis 5 heures à 20/25 C. On coule dans 400 cm3 d'eau, neutralise avec de l'acide chlorhydrique N et extrait avec 2 x 250 cm3 d'éther isopropylique, la fraction organique est laissée en repos pendant 16 heures à 20/25 C.
a) On essore le précipité, on obtient 4,6 g de produit.
F = 146,7 C, qui après chromatographie sur silice (éluant hexane-acétate d'éthyle 7-3) fournit 2,33 g de l'isomère E/E (exemple ) F = 167 9, puis 17002 recristallise de l'acétate d'éthyle.
b) Le filtrat est amené à sec sous pression réduite et le résidu chromatographié sur silice (éluant : hexane-acétate d'éthyle 7-3), on obtient 1,14 g du produit recherché isomère Z/E.
Analyse pour : C22H17C12N03S = 446,348 C H C1 N S % calculés : 59,20 3,84 15,88 3,14 7,18 % trouvés : 59,20 3,9 15,4 2,9 6,9 Spectre IR COOMe 1704 - 1438 cm-1 C = C 1632 cm-1 Aromatique + hétérocycle 1589cm-1 1552cm-1 1498cm-1 1482cm-1 En utilisant les procédés décrits précédemment à partir des produits et des réactifs appropriés, on a obtenu les produits des exemples 51 à 157.
Les tableaux ci-dessous résument les principales caractéristiques des produits obtenus dans les exemples ; les points de fusion lorsque les produits concernés ont un point de fusion.
EX X R1 R2 R3 isomère F"C SH 8 S 4C1C6H4 H CH2-O-O% Z - 8,13 4 S S-CH3 H CH2-O ~ O- Z - 7,98 7 S 4-C1C6H4 H CH3 Z 109 7,9 3 S S-CH3 H CH3 Z 50 7,84 3 S S-CH3 H CH3 E - 7,59 7 S 4-C1C6H4 H CH3 E - 7,64 8 S 4-C1C6H4 H CH2-O-O% E 50 7,85 4 S S-CH3 H CH2-O--Os E - 7,79 18 S i H CH3 E 72 6H : déplacement chimique en ppm du proton de la fonction bêta méthoxy acrylate par rapport à une référence interne tétraméthvîs ilane
EX X R1 R2 R3 isomère F"C 6H 9 S 4-CyprC6H4 4-C1C6H4 CH3 E 153 6,73 10 S 4-CyprC6H4 4-C1C6H4 O'LO E 82 6,97 -9 S 4-CyprC6H4 4-C1C6H4 CH3 Z 114 7,53 10 S 4-CyprC6H4 4-C1C6H4 ^ O^-O- Z - 7,77 11 S SCH3 CH3 CH3 Z - 7,6 11 S SCH3 CH3 CH3 E - 6,72 12 S SCH3 CH3 - OO% Z - 7,84 12 S SCH3 CH3 ~ O ~ O- E - 6,96 TABLEAU III
EX X R1 R2 Z R3 L 1 2 F'C 9 S CF3 H H CH3 E Z 104 7,49-7,52 14 S i H F CH3 Z Z 99 7,35 5 S H H F CH3 E Z 108 7,46 6 S H H H ^ O ~ O- E Z 89 7,72 13 S i H H CH3 E Z - 7,36 15 S H H F CH3 Z Z - 7,34 2 S CF3 H H ^ O ~ ou E Z 76 7,77 19 S CF3 H F CH3 Z E
EX X R1 R2 Q R3 Q (2) F C 17 S i H -CH=CH- CH3 E E 141 16 S H H -CH=CH- CH3 E E 106 20 S C6H5 H CH2-O CH3 - E 89 21 S C6H5 H -CH=CH- CH3 E E 115 22 S C6H5 H -CH=CH- CH3 E Z 131 23 S nC5H11 H CH2 CH3 - E 24 S nC5H11 H CH2-O CH3 - Z 25 S CH=C(CH3)-CH3 H CH2-0 CH3 - E - 26 S iC3H7 H CH2-0 CH3 - Z - 27 S H H CH2-0 CH3 - E 67 28 S i H CH2-O CH3 - E 112 29 S nC5H11 H -CH=CH- CH3 E E - 30 S iC3H7 H CH2-O CH3 - E 31 S iC3H7 H -CH=CH- CH3 E E 92 32 S iC3H7 H -CH=CH- CH3 E Z - 33 S nC5H11 H -CH=CH- CH3 E Z - 34 S CH3 H -CH=CH- CH3 E E 115 35 S CH3 H -CH=CH- CH3 E Z 136 36 S -CH=C(CH3)-CH3 H -CH=CH- CH3 E E 103 37 S -CH=C(CH3)-CH3 H -CH=CH- CH3 E Z 134 38 S CH3 H CH2O CH3 - E 39 S C1 H CH20 CH3 - E 97 40 S OCH3 H CH20 CH3 - E 83 41 S SCH3 H CH20 CH3 - E 89 42 S SCH3 H -CH=CH- CH3 E E 124 43 S Cl H -CH=CH- CH3 E E 114 44 O CH3 H CH20 CH3 - E - 45 O CH3 H -CH=CH- CH3 E E 88 46 S OCH3 H -CH=CH- CH3 E E 112 47 S H H -CH=CH- CH3 E E 106 48 S i H -CH=CH- CH3 E E 141 49 S nC5H11 H -CH=CH- CH3 E E - 50 S 2,4C12C6H3 H -CH=CH- CH3 Z E - 51 S 2,4C12C6H3 H -CH=CH- CH3 E E 170 52 S 3C1C6H4 H -CH#CH- CH3 - E E 147 53 S 3.4C12C6H3 H CH20 CH3 - E 130 54 S 3.4C12C6H3 H CH20 CH3 - Z 139 55 S 3.4C12C6H3 H -CH=CH- CH3 E E 183 56 S 3.4C12C6H3 H -CH=CH- CH3 Z Z 137
TABLEAU IV (suite)
EX X R1 R2 Q R3 Q (2) F C 57 S 4C130CH3C6H3 H -CH=CH- CH3 E E 133 58 S CF3 H -CH=CH- CH3 E E 113 59 S CF3 H -CH=CH- CH3 Z E - 60 S CF3 H CH2-O CH3 - E 61 O C6H5 H -CH=CH- CH3 E E 136 62 O C6H5 H -CH=CH- CH3 Z E - 63 O C6H5 H CH2-O CH3 - Z 100 64 S CH2-C6H5 H -CH=CH- CH3 E E - 65 S CH2-C6H5 H -CH=CH- CH3 Z E - 66 S CH2-C6H5 H CH2-O CH3 - E 67 S O-C6H5 H -CH=CH- CH3 E E - 68 O CH2-C6H5 H -CH=CH- CH3 E E 145 69 O CH2-C6h5 H -CH=CH- CH3 Z E 86 70 O CH2-C6H5 H CH2-O CH3 - E 71 S 2-Cl-C6H4 H -CH=CH- CH3 E E 139 72 S = H -CH=CH- CH3 Z E - 73 S " H CH2-O CH3 - E 74 S 3-C1-C6H4 H -CH=CH- CH3 Z E 130 75 S " H CH2-O CH3 - E 83 76 S 2-OCH3-C6H4 H -CH=CH- CH3 E E - 77 S .. H -CH=CH- CH3 Z E - 78 S 4-Cl-C6H4 H -CH=CH- CH3 E E - 79 S . H -CH=CH- CH3 Z E - 80 S " H CH2-O CH3 - E 81 S 3-OCH3-C6H4 H -CH=CH- CH3 E E 82 S .. H -CH=CH- CH3 Z E - 83 S " H CH2-O CH3 - E 84 S 2-F,C6H4 H -CH=CH- CH3 E E 127 85 S " H -CH=CH- CH3 Z E - 86 S 3-F,C6H4 H -CH=CH- CH3 E E 156 87 S . H -CH=CH- CH3 Z E - 88 S 4-OCH3,C6H4 H -CH=CH- CH3 E E - 89 S " H -CH=CH- CH3 Z E - 90 S 4-F,C6H4 H -CH=CH- CH3 E E 145 91 S .. H -CH=CH- CH3 Z E 92 S 2-6C12C6H3 H -CH=CH- CH3 E E 177 93 S " H -CH=CH- CH3 Z E - 94 S " H CH2-O CH3 - E 95 S 3,5C12,C6H3 H -CH=CH- CH3 Z E 158 96 S " H -CH=CH- CH3 Z E 123 97 S " H CH2-O CH3 - E 142 TABLEAU IV (suite)
EX X R1 R2 Q R3 Q (2) F C 98 S 2,4C12-C6H3 H CH2-O CH3 - E 115 99 S 4Br,3CF3-C6H3 H -CH=CH- CH3 E E 140 100 S n H -CH=CH- CH3 Z E 104 101 S 3-pyridyl H -CH=CH- CH3 E E 102 S " H -CH=CH- CH3 Z E 103 S 3-OCH3,4C1C6H3 H CH2-O CH3 - E 115 104 S 4-pyridyl H -CH=CH- CH3 E E - 105 S " H -CH=CH- CH3 Z E 106 S 2-pyridyl H -CH=CH- CH3 E E 140 107 S " H -CH=CH- CH3 Z E - 108 S 2CF3-C6H4 H -CH=CH- CH3 E E 143 109 S " H -CH=CH- CH3 Z E 110 S 2-pyrimidinyle H -CH=CH- CH3 E E 111 S " H -CH=CH- CH3 Z E 112 S 3,4-(CH202) C6R3 H -CH=CH- CH3 E E 168 113 S H R -CH=CH- CH3 Z E 114 S " H CH2-O CH3 - E 127 115 S 6-pyrimidinyle H -CH=CH- CH3 E E 116 S " H -CH=CH- CH3 Z E 117 S 5-pyrimidinyle H -CH=CH- CH3 E E - 118 S " H -CH=CH- CH3 Z E 119 S 2-thiényle H -CH=CH- CH3 E E 120 S " H -CH=CH- CH3 Z E 121 S 2-furyle H -CH=CH- CH3 E E 125 122 S " H -CH=CH- CH3 Z E 123 S 3-furyle H -CH=CH- CH3 E E 124 S " H -CH=CH- CH3 Z E 125 S 4-oxazolyle H -CH=CH- CH3 E E 126 S H R -CH=CH- CH3 Z E 127 S 5-oxazolyle H -CH=CH- CH3 E E 128 S " H -CH=CH- CH3 Z E 129 S 3-CF3-C6H4 H -CH=CH- CH3 E E 142 130 S " H -CH=CH- CH3 Z E 131 S 4-CF3-C6H4 H -CH=CH- CH3 E E 149 132 S " H -CH=CH- CH3 Z E 133 S 2,6F2-C6H3 H -CH=CH- CH3 E E 136 134 S " H -CH=CH- CH3 Z E 135 S 30CF3-C6H4 H -CH=CH- CH3 E E 125 136 S n H -CH=CH- CH3 Z E TABLEAU IV (suite)
EXEMPLE 13 : TEST DE RESISTANCE IN VITRO Isolement et purification de protoplastes de betterave Cinq jours après le repiquage, 2 ml de suspension cellulaire tassée sont digérés dans 20 ml d'enzymes caylase. La composition du cocktail enzymatique est la suivante : 0.25 %, 345 S ; 0.25 % T ; 0.08 % M2L dissout dans du mannitol 0.7 M contenant 0.08 mM NaH2PO4, 0.03 mM MES et 0.68 mM CaCL2. La pression osmotique est ajustee à 760 mOsmole/Kg et à pH 5,8. après 16 à 18H00 de douce agitation (30 oscillations par minute) à l'obscurité et à 24"C, la suspension est filtrée sur tamis de 100 et 50 Sm respectivement.Le filtrat est additionné d'un volume égal d'une solution iso-osmotique de KCl à 470 mM et les protoplastes sont sédimentés à 50 g pendant 5 minutes. Le culot est repris dans du saccharose isoosmotique à 570 mM et centrifugé à 50 g pendant 15 minutes. L'anneau de protoplastes est prélevé, soumis à une deuxième centrifugation dans du saccharose, qui, sedimenté, est lavé deux fois dans du mannitol à 760 mOsmoles/Kg. La viabilite des protoplastes est quantifiee par coloration au diacetate de fluorescéine (Widholm, 1972). On s'assure que la digestion est complète par l'absence de coloration de paroi du calcofluor.
L'utilisation de gradients iso-osmotiques mais de densités différentielles a permis d'obtenir des préparations de protoplastes à très hauts rendements 5 x 106 protoplastes par ml de cellules tassées et complètement débarrassés de débris cellulaires. En moyenne, 90 % des protoplastes sont viables.
Culture des protoplastes isolés de cellules non transformées et transformées Le milieu de culture des protoplastes est un milieu de macro et micro éléments de Murashige et Skoog (1962) ou le NH4NO3 est diminué de moitié et additionné de zig/1 hydrolysat de caséine 30 g/l saccharose 7,7 mg/l glycine 1,3 mg/l d'acide nicotinique 0,25 ng/l pyridoxine 0,25 n/l Thiamin-HCI 400 mg/l glutamine 25 mg/l glucosamine 1 mg/l 6 benzyl amino purine 1 mg/l acide indole acetique.
La pression osmotique est ajustée à 760 mOsmole/kg avec du mannitol et le pH à 5,8. Le milieu de culture est stérilisé par filtration.
Des protoplastes ont été isolés à partir de suspensions cellulaires transformees et non transformées.
Ils ont été mis en culture dans le milieu ci-dessus en présence et en absence de kanamycine à 200 mg/l afin de calculer l'efficacité d'étalement. Les résultats montrent que les protoplastes isolés à partir de cellules non transformées ne survivent pas sur milieu sélectif contenant 200 mg/l de kanamycine. Ceci est en accord avec l'absence d'échappement dans les expériences de transformation. Aucune différence significative n'a été trouvée entre les efficacités d'étalement de protoplastes issus de cellules transformees en présence et absence de kanamycine. Ceci confirme donc l'absence de cellules non transformées au sein des lignées transformees. Lors d'expériences comparatives qui seront décrites ci-dessous, les protoplastes issus de 4 types de lignées cellulaires (ss7 et B14 exprimant la 22 Kd et la 29 Kd, WT, non transformées et ss D transformée par le vecteur binaire pGA492) seront mis en culture en absence de pression de sélection.
Infection de protoplastes de betterave par le BNYVV L'optimisation de la technique d'infection s'est effectuée sur des protoplastes issus de cellules non transformées. Les inventeurs se sont inspirés de la technique d'infection par le polyéthylène glycol décrit par Samac et al (1983) et de celle par électroporation décrite par Watts et al (1987). Afin d'obtenir des taux élevés d'infectivitê, il était impératif d'utiliser des préparations de protoplastes dépourvues de débris, ayant des taux de viabilité supérieurs à 90 % ainsi que des preparations de virus âgées de moins de deux semaines.