INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Un second procédé commode de polycondensation en masse, qui s'applique également bien quelles que soient les proportions d'hexaméthylènediamine dans le mélange des diamines, consiste à polycondenser la composition de départ, qui a été définie ci-avant, en mettant en oeuvre l'étape 1 du premier procédé commode qui vient d'être défini et en enchaînant ensuite les étapes suivantes - étape 2' : dans laquelle on effectue rapidement, sur une durée allant de 5 minutes à 30 minutes, la vidange du réacteur : pendant cette période la pression autogène de vapeur d'eau est abaissée de la valeur de la pression autogène jusqu'à la valeur de la pression atmosphérique et, en opérant sous une atmosphère inerte (azote), on récupère le prépolymère formé, puis on le refroidit et on le transforme par broyage en poudre - étape 3' : dans laquelle on réalise la réaction d'achèvement de la polycondensation en effectuant la post-condensation du prépolymère en poudre obtenu : soit en phase solide, en opérant dans un réacteur maintenu sous une pression, éventuellement en présence de gaz inerte (azote), comprise entre la valeur de la pression atmosphèrique et une valeur inférieure égale à 0,1.102 Pa, à une température allant de 2000C à 2800C et pendant une durée suffisante permettant d'obtenir un copolyamide ayant les caractéristiques moléculaires et de viscosité souhaitées, allant par exemple de 10 minutes à 5 heures ; soit en phase fondue, en opérant dans une extrudeuse-dégazeuse comportant une ou plusieurs vis, les paramètres de marche essentiels de la dite extrudeuse-dégazeuse consistant dans : la température de la zone de réaction qui se situe dans l'intervalle allant de 3100C à 360 C, la pression de dévolatilisation de cette zone qui se situe dans l'intervalle allant de la valeur de la pression atmosphérique à une valeur inférieure égale à 0,1.102 Pa et le temps de séjour du prépolymère dans I'extrudeuse-dégazeuse qui se situe dans l'intervalle allant de 30 secondes à 5 minutes ; soit en enchaînant la post-condensation en phase fondue et la post-condensation en phase solide.
Un troisième procédé commode, qui s'applique encore également bien quelles que soient les proportions d'hexaméthylènediamine dans le mélange des diamines, consiste dans la technique de polycondensation thermique conduite en solution, selon laquelle on enchaîne les étapes suivantes - étape 1" : conduite sous atmosphère inerte (azote), dans laquelle on dissout la composition de départ, renfermant les éléments (i) et (3i) dont on a parlé ci-avant à propos du milieu de départ des premier et second procédés, dans un solvant polaire aprotique ou mélange de pareils solvants ayant un point d'ébullition supérieur à 2200C en opérant à température ambiante de 200C à 30 C, puis on élève la température de la solution obtenue à la température de réaction désirée comprise entre 1900C et 220 C, et on élimine par distillation régulière sous la pression atmosphérique l'eau d'amidification pendant une durée allant de 20 minutes à 2 heures - étape 2" : conduite encore sous atmosphère inerte, dans laquelle on élève la température de la solution réactionnelle à une valeur située au-dessus du point d'ébullition du (ou des) solvant(s) mis en oeuvre, puis on élimine toujours par distillation sous la pression atmosphérique le reste d'eau d'amidification et le (ou les) solvant(s) présent(s) - étape 3" : dans laquelle, une fois le (ou les) solvant(s) éliminé(s), on achève la polycondensation en laissant réagir la masse réactionnelle à une température allant de 300 à 340 C, en opérant sous une pression réduite se situant dans l'intervalle allant de 0,1.102 Pa à 1.102 Pa pendant une durée (comprenant la durée de mise sous pression réduite) suffisante permettant d'obtenir un copolyamide ayant les caractéristiques moléculaires et de viscosité souhaitées, allant par exemple de 10 minutes à 1 heure.
Les solvants qui conviennent bien sont en particulier la diméthyl-1,3 imidazolidone-2, la diméthyl-1,3 tétrahydro-3,4,5,6 pyrimidone-2, la tétraméthylsulfone, le diphénylsulfoxyde et un mélange de ces solvants.
Les procédés qui viennent d'être décrits peuvent être appliqués à des compositions comprenant soit des quantités stoechiométriques d'un réactif acide et d'un réactif aminé apportant des nombres égaux de groupements COOH et NH2, soit leur(s) sel(s) stoechiométrique(s).
Il peut être avantageux d'engager des quantités de réactif aminé qui sont supérieures à celles juste nécessaires pour avoir l'équivalence entre les groupements COOH et NH2 dans les compositions de départ, de manière à introduire dans la masse réactionnelle un excès de diamines permettant de compenser la perte de ce réactif qui intervient essentiellement lors de l'opération de distillation sous pression constante (étape(s) 1 ou 1" + 2"), puis lors de l'opération de décompression (étape 2 ou 2').Dans le cadre de ce mode opératoire avantageux, l'excès de réactif aminé, exprimé par le pourcentage molaire de réactif aminé en excès suivant la relation nombre total de moles de réactif aminé - nombre de mole de réactif aminé nécessaire pour la stoechiométrie X 100 nombre de moles de réactif aminé nécessaire pour la stoechiométrie se situe habituellement dans l'intervalle allant de 0,5 à 6 % et, de préférence, allant de 1 à 4 %.
Les procédé qui viennent d'être décrits offrent la possibilité de préparer des copolyamides semi-aromatiques semi-cristallins, à partir d'un réactif aminé comprenant une alkylpentaméthylènediamine et de I'hexaméthylènediamine, en réduisant le développement de réactions parasites (sur lesquelles on va revenir ci-après) qui concernent ces diamines et entraînent notamment une perte en basicité totale.
La méthyl-2 pentaméthylènediamine-1,5 est un composé qui se cyclise facilement ; cette cyclisation, quand elle concerne la diamine libre, donne naissance à la méthyl-3 pipéridine (produit appelé dans ce qui suit par l'expression : "amine cyclique libre") avec libération d'ammoniac NH3 et, quand elle concerne la diamine engagée dans les réactions d'amidification par un seul de ses groupes fonctionnels, elle agit comme un mécanisme limiteur de chaînes en donnant naissance à des groupes de blocage de formule avec aussi libération d'ammoniac. L'amine cyclique libre formée est récupérée essentiellement au moment de l'élimination de l'eau par distillation sous pression constante (étape(s) 1 ou 1" + 2") puis pendant la décompression (étape 2 ou 2').Une autre réaction parasite consiste dans la perte par entraînement du réactif aminé (en particulier méthyl-2 pentaméthylènediamine et hexaméthylènediamine) qui intervient essentiellement au moment de l'élimination de l'eau présente par distillation sous pression constante (étape(s) 1 ou 1" + 2") puis pendant la décompression (étape 2 ou 2'). Le résultat de ces réactions parasites se présente donc sous deux aspects néfastes - d'un côté, une perte en basicité totale impliquant d'une part une perte de stoechiométrie en cours de polycondensation entre les groupements amino primaire et les groupements carboxy qui réagissent en empêchant par voie de conséquence la possibilité d'augmenter aisément la masse moléculaire du polyamide en formation, et d'autre part une réelle difficulté pour reproduire industriellement le procédé mis en oeuvre.La perte en basicité totale dont on a parlé ci-avant est établie par rapport à la quantité totale de réactif aminé engagé et elle est exprimée par l'équation basicité perdue X 100 dans laquelle basicité engagée l'expression "basicité perdue" correspond à la somme : nombre d'équivalents NH2 de réactif aminé perdu en cours de distillation + nombre d'équivalents NH d'amine cyclique libre + nombre d'équivalents NH2 d'ammoniac. Cette basicité perdue est mesurée directement, à l'aide d'un dosage potentiométrique, sur les distillats c'est-à-dire sur la totalité de l'eau condensée pendant les phases de distillation sous pression constante et pendant la décompression l'expression "basicité engagée" correspond au nombre d'équivalents NH2 du réactif aminé engagé.L'expression "nombre d'équivalents" amino primaire ou secondaire d'un composé définit le nombre de groupements amino primaire ou secondaire contenus dans une mole dudit composé ; par exemple 1 mole de réactif aminé consistant dans la méthyl-2 pentaméthylènediamine contient 2 équivalents amino primaire NH2 tandis qu'une mole d'amine cyclique consistant dans la méthyl-3 pipéridine contient un équivalent amino secondaire NH - et d'un autre côté, l'existence dans le milieu de polycondensation d'un taux élevé de groupements terminaux de type amine cyclique qui jouent le rôle de limiteur de chaîne et peuvent limiter l'accès à de hautes masses moléculaires.
Avec les procédés de préparation de copolyamides semi-aromatiques qui viennent d'être décrits, on obtient une perte de basicité totale limitée qui peut se situer à des valeurs inférieures à 6 % et atteindre des valeurs aussi basses que celles comprises entre 1 et 4 %. On obtient aussi des copolyamides présentant un taux de groupements terminaux de type amine cyclique, jouant le rôle de limiteur de chaîne, limite qui peut se situer à des valeurs inférieures à 70 milliéquivalents par kilogramme de polymère (méq/kg) et atteindre des valeurs aussi basses que celles comprises entre 2 et 50 méq/kg ; la détermination de ces taux de groupements terminaux de type amine cyclique est effectuée selon les indications données ci-après.
On peut ajouter dans les copolyamides de l'invention, avant, pendant ou vers la fin de la polycondensation, un ou plusieurs additif(s) habituellement utilisé(s) lors de la préparation de polyamides. Ces additifs sont par exemple des anti-oxydants, des agents ignifugeants, des stabilisants à la lumière, des stabilisants thermiques, des agents de démoulage, des azurants optiques, des colorants, etc.
On peut également faire appel à des charges de remplissage ou de renforcement qui peuvent être ajoutées aux copolyamides en utilisant des techniques faisant appel au mélange de poudres et/ou de granulés, ou encore y être incorporés en veine fondue, en réalisant une nouvelle fusion des copolyamides dans des dispositifs appropriés comme par exemple une extrudeuse. Les charges qui peuvent être ajoutées sont très diverses. Il peut s'agir d'une matière fibreuse comme : des fibres d'amiante ; des fibres de carbone ; des fibres de carbure ou de nitrure d'un métal ou d'un métalloïde, telles que des fibres de carbure de silicium, de nitrure de silicium, de carbure de bore ; des fibres de verre ; des fibres organiques pouvant résister à la chaleur ; des mélanges de deux ou de plus de deux des matières fibreuses précitées.La charge peut être constituée encore notamment par : des microbilles de verre ; des paillettes de mica ; du talc ; ou des associations de deux ou de plus de deux des matières non fibreuses précitées ; ou des associations d'au moins une matière fibreuse avec au moins une des matières non fibreuses précitées. Parmi ces charges, on préfère particulièrement les fibres de verre. Ces fibres de verre peuvent être les fibres de verre ordinaires ou des fibres de verre traitées, par exemple à l'aide de silane. Généralement ces fibres de verre présentent un diamètre se situant entre 3 et 30 pm et une longueur inférieure à 10 mm.
Les compositions ainsi obtenues (et elles constituent un autre objet de la présente invention), comprenant un copolyamide et au moins une charge, peuvent être aisément transformées par exemple par moulage par injection ; ces compositions peuvent renfermer une (ou des) charge(s) en quantité pouvant atteindre 80 % du poids de l'ensemble polymère + charge(s).
La proportion de charge(s) est de préférence comprise entre 10 % et 60 % et, plus préférentiellement encore, comprise entre 30 % et 60 %.
Les copolyamides selon l'invention peuvent être transformés à l'aide des machines conventionnelles par exemple d'injection, d'extrusion ou de filage pour donner des objets conformés tels que notamment des articles moulés pleins, des fils ou des films. S'agissant des conditions de la transformation, les copolyamides selon l'invention, éventuellement chargés, peuvent par exemple être injectés aisément en utilisant une température matière pas trop élevée du type de celles allant par exemple de 310 à 350 C.
On obtient 36 g de produit recherché isomère Z.
RMN CDCl3, TMS H du méthyle du méthylphényle 2,22 ppm H du phényle 7,10 à 7,23 ppm H éthylénique 6,53 ppm H des OCH3 3,70 et 3,91 ppm STADE D : E-2-(2-bromo méthylphényl) 3-méthoxy 2-propènoate de méthyle.
On porte au reflux pendant 4 heures un mélange de 36 g de produit préparé au stade précédent (delta Z), 500 cm3 de tétrachlorure de carbone, 32,6 g de N-bromosuccinimide et 20 mg d'azodiisobutyronitrile. On refroidit à 20 C, on essore et amène à sec sous pression réduite. On obtient 59 g de produit que l'on chromatographie sur silice en éluant avec le mélange hexane-acétate d'éthyle (7-3). On obtient ainsi 48,5 g de produit (delta E) recherché.
RMN CDC13, TMS H de CH2Bz 4,40 ppm H du phényle 7,1 à 7,5 ppm H éthylénique 7,63 H de OCH3 3,69 et 3,80.
STADE E : Bromure de [[2-[1-(méthoxycarbonyl) 2-méthoxy ethényl] phényl] méthyl] triphényl phosphonium.
On porte au reflux pendant 2 h 30 un mélange de 64 g de produit préparé au stade précédent, 650 cm3 de toluène et 59 g de triphénylphosphine. On laisse revenir le mélange réactionnel à la température ambiante. On essore, lave au toluène et à l'éther isopropylique. On sèche. On obtient 88 g de produit recherché.
Spectre IR 1700cm-1 C=C 1628 cm'l Aromatique 1600, 1588, 1492, 1482 cm-1 RNN - 250 MHz, CDCl3, TMS H des CH3 3,44 et 3,90 ppm H du -CH2-P 4,85 ppm H des phényls 6,85 à 7,8 ppm H éthylénique 7,49 ppm Préparation 17 : (2-méthyl éthyl 4-thiazolyl) méthanal STADE A : thioisobutyramide A une solution de 95,8 g d'isobutyramide dans 1 litre de dioxane, on ajoute 58,2 g de pentasulfure de phosphore. On agite pendant 16 heures à 20-25 C. On amène à sec sous vide et chromatographie le produit obtenu sur silice en éluant avec le mélange hexane-acétate d'éthyle (7-3). On obtient ainsi 61,6 g du produit recherché.
Spectre IR (CHCl3 > =C-NH2 3490-3377 cm NH2 1604cm-1 STADE B : (2-méthyl éthyl 4-thiazolyl) carboxylate d'éthyle A une solution de 61 g de thioisobutyramide obtenu au stade A, dans 1,2 1 d'éthanol, on ajoute 74 cm3 de bromopyruvate d'éthyle. On agite pendant 1 h 30 à 20-25 C. On verse dans l'eau, amène à pH 8, par addition de bicarbonate de sodium. On distille l'éthanol sous pression réduite, on extrait à l'acétate d'éthyle et amène à sec sous pression réduite. On chromatographie le produit brut obtenu sur silice (éluant : hexane-acétate d'éthyle (7-3)). On obtient 87,6 g de produit recherché.
Spectre IR (CHCl3) zozo 1723 cm'l Hétérocycle 1604, 1504 cm-1 STADE C : (2-méthyl éthyl 4-thiazolyl) méthanol A un mélange de 87,6 g de produit obtenu au stade précédent, 1 1 de tétrahydrofuranne et 44 g de borohydrure de sodium, on ajoute au reflux en 1 heure 350 cm3 de méthanol. On refroidit vers 20 C et acidifie à pH 6-7, avec 350 cm3 d'une solution aqueuse d'acide chlorhydrique 2N. On filtre et amène à sec. On obtient un produit que l'on reprend à l'éther. On agite, sèche, essore et amène sous vide. On obtient 61,4 g de produit recherché.
Spectre IR OH 3612cm-1 Système conjugué 1530 cm'l STADE D : (2-méthyl éthyl 4-thiazolyl) méthanal On agite pendant 3 heures au reflux un mélange renfermant 47 g de produit préparé au stade precedent, 700 cm3 de toluène et 130 g de bioxyde de manganèse. On refroidit vers 50 C, essore, rince avec du toluène et amène à sec, sous pression réduite. On obtient 40 g d'un produit que l'on chromatographie sur silice en éluant avec le mélange hexane-acétate d'éthyle (4-6) et recueille la fraction de rf = 0,45. On amène à sec sous pression réduite. On obtient 33,5 g de produit recherché.
Spectre IR 3c=o 1698 cm 1 du type aldéhyde.
Préparation 18 : 2-(2,4-dichlorophenyl) thiazole carboxaldéhyde STADE A : 2,4-dichlorophenyl thioamide En opérant comme au stade A de la préparation 1, à partir de 2,4-dichlorobenzamide, en utilisant le pentassulfure de phosphore, on a obtenu le produit recherché.
STADE B : 2-(2,4-dichlorophényl) 4-thiazole carboxylate d'éthyle A une solution de 33 g de 2,4-dichlorophénylthioamide dans 650 cm3 d'éthanol, on ajoute lentement 35 g de bromopyrunate d'éthyle. On agite 5 heures au reflux puis laisse en repos 72 heures. On essore et sèche sous pression réduite, on obtient 39,32 g de produit attendu. F = 103"C que l'on utilise tel quel pour le stade suivant.
STADE C : 2-(2,4-dichlorophényl) 4-thiazole méthanol A une solution de 39 g du produit obtenu au stade A, dans 600 cm3 de tétrahydrofuranne, on ajoute 13 g d'hydrure de bore et de sodium, on chauffe jusqu'au reflux puis ajoute lentement 72 cm de méthanol, on agite 1 heure au reflux et refroidit à 20/25"C, on neutralise avec une solution 1N d'acide chlorhydrique. On évapore à sec sous pression réduite, reprend avec 200 cm3 d'éther, filtre et amène le filtrat à sec sous pression réduite, on obtient 30,7 g du produit recherché.
F = 112 7.
STADE D : 2-(2,4-dichlorophényl) thiazole carboxaldéhyde On agite 5 h 30 au reflux un mélange de 10 g du produit obtenu au stade C avec 200 cm3 de chlorure de méthylène et 31 g de bioxyde de manganèse. On refroidit à 30 C, filtre su clarel, amène à sec sous pression réduite, reprend avec 200 cm3 de chlorure de méthylène, ajoute 30 g de bioxyde de manganèse et chauffe au reflux pendant 7 heures, on filtre sur clarcel à chaud et évapore à sec sous pression réduite, on obtient 7,36 g de produit recherché. F = 146,3 C.
6 - Rincer plusieurs fois comme dans 2).
Stocker à sec avec un dessicant,à l'abri de la lumière,sous vide de preference,en attendant l'assemblage du dispositif comme indiqué dans les figures 4.0 et 4.1: Dans l'exemple present,Ie taux d'EGF au dessus duquel le test se colore (Fig. 4.0) est de 0,875 nanogrammes / ml d'echantillon.
En dessous de cette limite,il n'y a pas de coloration.
Il est possible d'abaisser cette limite ou de l'augmenter en abaissant ou augmentant la concentration d'anticorps anti-EGF dans l'etape de coating ( 3-) DOSAGE DE PLUSIEURS LTGANDS AVEC LA MEME (;OUITE D'ECHANTILLON PROPOSITION D'UN MULTlTEST D'ALERTE En associant plusieurs types de recepteurs dans la solution proteolipidique destinée à la confection de la membrane (B),il est possible de doser les ligands correspondants. Si au moins un des ligands est present dans l'echantfflon,le test se colore.
Exemple : en associant en (B) (dispositif d'alerte) les recepteurs à l'EGF,au TGF- et B,au PDGF.Si au moins l'un des facteurs est present dans l'echantillon,le test se colore et il est alors possible de proceder à des tests specifiques de chaque facteur de croissance (dispositif d'orien tation).
De même pour les cytokines dans les desordres hematopoietiques : il est possible d'associer plusieurs recepteurs aux interleukines en (B).si le test se colore c'est qu'au moins l'une d'elles est presenteS partir de ce test d'alerte,il est possible de pratiquer des tests pour chacune des interleukines concernées : orientation vers la sphère concernée (ex: 1r6 pour le myelome) Ceci est tout à fait valable pour le dosage semi-quantitatif des ligands concernés (en fixant en (BO) une association d'anticorps specifiques des ligands) et en (B) une association de recepteurs de ces ligands.La seule condition requise est que ces recepteurs declenchent chacun le même processus d'activation des reactifs en (C):en possedant tous un site Tyrosine kinase par exemple pour utiliser l'amplification Phospholipase C - > IP3 et expulsion du Ca++ intraliposomique, soit en possedant tous le pouvoir d'augmenter l'AMPc come nous l'avons vu plus hautin faut donc grouper dans ces tests d'alerte,les recepteurs appartenent au même groupe et doués des mêmes propriétés d'activation en (C).
DOSAGE DES RECEPTEURS DE L'EPIDERMAL GROWTH FACTOR En dehors du dosage des recepteurs circulant,il est interessant de doser la concentration des recepteurs membranaires : produits en très grandes quantités par de nombreux oncogènes,leur concentration par mg de proteine membranaire est multipliée par 200 à 5000 fois;passant de 0.5-5 fmoles par mg de proteine membranaire dans la cellule normale à 1000 fmoles par mg de proteine membranaire de cellule tumorale.
Le principe du procédé est le même que pour le dosage de l'EGF: Figures 3-R et 4-R: - l'EGF est fixé sur une membrane smlaquelle on depose tous les constituants de la zone (C) decrits dans l'exemple du dosage de l'EGF: à savoir les reactifs inactivés et les liposomes portant la proteine canal qui s'ouvre pour liberer le Ca++ intraliposomique en presence d'IP3.
L'orientation de la molecule de EGF est capitale : il est imperatif que le segment C- terminal soit libre et orienté vers le haut,c'est à dire vers le recepteur qui arrive dans l'echantfflon.1a fixation de 1'EGF sur cette membrane doit donc se aire par l'extremité N-terminale.
La presence de recepteurs dans l'echantfflon à doser est revelée par l'activation de leur site Tyrosine kinase au contact de l'EGF fixé dans le dispositif: - > activation de la proteine Gp - > -activation de la phospholipase C - > production de 1'IP3 - > liberation du Ca++ revelé par un chromogène.
Le dispositif: de haut en bas: - une membrane-filtre en papier Wathman (A) sur laquelle est deposé l'echantillon à tester; - une membrane de nitrocellulose (NC) sur laquelle est fixé l'EGF et sur laquelle est deposée ensuite la solution de reactifs inactivés et de liposomes - une membrane à lyse programmée (M) - une membrane en nylon blanc supportant un spot de chromogène sensible au Ca++ Mode operatoire:: - La membrane (A) est decoupée en carrés. de 15 mm de côté dans du papier Wathman prealablement saturé par un bain de BSA à 5% in PBS pendant 2 heures puis rincé plusieurs fois dans de l'eau deionisée puis seché à 37"C sous vide.La saturation est importante pour que ce filtre ne retienne pas à tort les recepteurs à doser;; -La membrane (NC) est decoupée en carrés de 15 mm de côté dans la feuille de nitrocellulose renforcée (Ref NCR BAS 25 Schleicher et Schull ,Porosité 0.45 épaisseur 50 qui aura été prealablement trempée dans une solution sterile de BSA à 2,5% in PBS sterile puis pressée entre deux feuilles de papier sopalin pour l'amener à un etat legèrement humide.Les carrés sont alignés sur une feuille de papier Durieux no 22 propre et la face sur laquelle va être deposée la solution de EGF est notée par un repère quelconque.
La solution deposée est la suivante: 15,ut de: - N-(4-carboxycyclohexylmethyl) maleimide N-hydroxysuccinimide ester (Lab Fluka) 0,01 M / ml (fixe l'EGF à la nitrocellulose par son extremité -NH2,laissant libre l'extremité -COOH qui doit reagir avec le recepteur) - Epidermal Growth Factor: 1 nanomole (6,045 Ag / ml) à partir de la reference E 6135 Sigma.
- Proteine Gp 1 yMole/ml - PBS sterile qsp completer à 1 mi Sechage sous vide poussé à 37"C pendant 10 heures.Pendant le sechage,on prepare la seconde solution de depose: - 1 volume de la solution proteolipidique decrite dans l'exemple precedent: liposomes enfermant du Ca++(1 mMole/ml) et supportant la proteine-canal sensible à l'IP3 - 1 volume de la solution de reactifs inactivés decrite dans l'exemple precedent: ATP,GDP,Phospholipase C inactivée,Ca++ 0,1,uM/l - Sucrose lait ecremé 5%,hexaferricyanure lmM,Zinc lmM,Manganèse lmM,Cuivre lmM,Thimerosal lmM comme protecteurs et conservateurs stabilisant la structure tertiaire et quaternaire de la molecule d'EGF.
Sechage sous vide poussé à 37"C pendant 10 heures.
- La membrane (M) à lyse programmée: Sur la face opposée au repère,c'est à dire opposée à celle de la depose de la solution EGF,15 uI d'une solution d'acrylate copolymère sont deposés puis sechés egalement sous vide poussé à 370Une fois seche,cet copolymère forme un film (M) impermeable pendant 45 secondes,laissant le temps aux reactions de se faire dans la membrane NC avant d'arriver sur - La membrane (D) de revelation: carré de 15 mm de côté en nylon blanc sur lequel on depose 3 jtl de Hydroxynaphtol Blue à 2% : insensible aux 0.1,uM/I contenus dans (C) mais se colore en bleu si le Ca ++ intraliposomique (1 mM/ml) libéré en (C) arrive en (D).