160 microgrammes d'ARN bicaténaire de rotavirus de porc obtenus par le méthode opératoire cidessus ont été mélangés à 1 microgramme de chacune des deux amorces oligonucléotidiques synthétiques dans un volume de 160 microlitres (les séquences des amorces étaient 5' -GGGAATTCTGCAGGTCACATCATACAATTCTAATCTAAG-3' et 5' -GGGAATTCTGCAGGCTTTAAAAGAGAGAATTTCCGTTTGGCTA-3') obtenues à partir de la séquence publiée du rotavirus bovin (24). Le mélange -ARN-amorce a été soumis à une ébullition pendant 3 minutes dans un bain d'eau, puis a été refroidi sur de la glace.Des additions de 25 microlitres de tris HCl 1 M à pH 8,3, 35 microlitres de KCl 1 M, 10 microlitres de MgCl2 0,25 M, 7 microlitres de 2-mercapto-éthanol 0,7 M, 7 microlitres de dNTP 20 mM et 6 microlitres de transcriptase inverse (100 unités) ont été effectuées successivement. Le milieu réactionnel a été mis à incuber à 42"C pendant 1,5 heure, puis 10 microlitres d'EDTA 0,5 M à pH 8,0 ont été ajoutés et la solution a été extraite une fois avec un mélange chloroforme:phénol (1:1). La phase aqueuse a été enlevée et 250 microlitres d'acétate d'ammonium 4 M et 1,0 ml d'éthanol à 95 % y ont été ajoutés, le mélange a été congelé dans de la neige carbonique et centrifugé au froid. Le culot résultant a été remis en- suspension dans 100 microlitres de tris HCl 10 mM à pH 7,5 et le procédé de précipitation par l'acétate d'ammonium a été repété.Le culot a été remis en suspension dans 100 microlitres de KOH 0,3 M et mis à incuber à température ambiante pendant une nuit, puis à 37"C pendant 2 heures. Le pH de la solution a été amené à la neutralité par addition de 10 microlitres de HCl 3,0 M et 25 microlitres de tris HC1 1,OM à pH 7,5. L'ADNc monocaténaire resultant a été ensuite précipité à deux reprises par le procédé à l'acétate d'ammonium-éthanol décrit ci-dessus. Le culot obtenu a été remis en suspension dans 50 microlitres de tris HCl 10 mM à pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, soumis à une ébullition dans un bain d'eau pendant 2 minutes, puis mis à incuber b 59"C pendant 16 heures.La solution a été lyophilisée à un volume de 15 microlitres et l'ADNc bicaténaire résultant a été placé sur un gel d'agarose à 1,0 % (agarose Sigma de type II). L'ADN coloré au bromure d'éthidium migrant à une longueur correspondant à 1000-1100 paires de bases a été excisé du gel et soumis à une électro-elution dans undisposi- tif d'electro-élution CBS. La solution a été lyophilisée, et l'ADNc a été remis en suspension dans 25 microlitres d'eau. Deux microlitres de tris HCl 1,0 M à pH 7,5, 2 microlitres de KCl 1 M, 1 microlitre de MgCl2 0,25 M, 1 microlitre de dNTP 20 mM et 5 unités d'ADN-polymérase I de E. coli ont été ajoutés à cette solution. Le milieu réactionnel a été mis à incuber à température ambiante pendant 15 minutes, puis extrait par un mélange chloroforme/phénol et précipité par un mélange acétate d'ammonium-éthanol de la manière décrite ci-dessus. L'ADNc résultant a été caudé avec de la dCTP en utilisant de la désoxynucléotlde-transférase terminale (tampon et enzyme BRL utilisés). La réaction a été arrêtée avec 2 microlitres d'EDTA 0,5 M, une extraction a été effectuée avec un mélange chloroforme/phénol et une précipitation avec de l'acétate de sodium en présence de 10 microgrammes d'ARNt servant de support.L'ADNc remis en suspension a été mélangé à 200 ng de pBR322 coupé par Pst I caudépar dMGP (catalogue BRL N" 5355SA) dans 200 microlitres de tris HCl 10 mM à pH 7,5, NaCl 100 mM, EDTA 1 mM, chauffé 9 65"C pendant 5 minutes, puis à 57"C pendant 2 heures. Le pBR322 vecteur d'ADNc reconstitué a été transformé sur des cellules de E.