INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Etape 6 Séparation de Bacillus subtilis contenant un gène codant pour AH dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) Les transformants obtenus à l'étape 5 de l'Exemple 2 ont été mis en culture dans un milieu d'agar minimum de Spizizen contenant 50 mg/t de tryptophane et 4 jug/mX de kanamycine. On a ainsi obtenu une souche qui était résistante à la kanamycine et ne nécessitait pas d'acide glutamique pour sa croissance et la souche a été désignée par Bacillus -subtilis 168 MA3 (pAG5O1). La souche contenait un gène codant pour AH.
L'activité de AH de la souche a été déterminée par la méthode suivante afin de confirmer que la souche avait un gène cloné codant pour AH.
On a mis séparément en culture,dans 200 mt de bouillon L, tout en secouant, Bacillus subtilis 168 MI113, Bacillus subtilis 168 MA3, Bacillus subtilis 168 MA3 (pUX2) et Bacillus subtilis 168 MA3 (pAGSO1). Lorsque lton a dû mettre en culture une souche résistante à la kanamycine, on a ajouté, à un bouillon L, 4 yg/mt de kanamycine.
Séparément de chacune des cultures résultantes, des cellules ont été recueillies par centrifugation, lavées avec une solution aqueuse à 0,8% (poids/volume) de NaC1 puis mises en suspensions dans 12 m d'un tampon MES contenant l'acide 2-(N-morpholinoéthanesulfonique (MES) 50 mM, MnS04 10 mM et EDTA 10 mM et ajusté à pH 7,0 La suspension résultante a été homogénéisée en utilisant un homogénéiseur de cellules MSK modèle 853021 (fabriqué et vendu par Braun Inc., Allemagne de l'Ouest) puis soumise à centrifugation à 14.000 t/mn (20.000 g) pendant 20 minutes pour obtenir un extrait de cellules (solution d'enzymes brutes).
L'activité de AH a été déterminée en mesurant la diminution de l'absorbance à 240 nm de 2,6 m.Z d'une solution de réaction d'enzymes t contenant Tris-HCl 77 mM (pH 7,2), NaCl 115 mM , acide cis-aconitique 0,115 mM et 50 lIJt de l'extrait de cellules en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 (fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd.
Japon).
Par ailleurs, la concentration de la protéine dans l'extrait de cellules a été mesurée sensiblement de la même manière que celle employée à l'étape 5 de l'Exemple 1.
Les résultats sont montrés au Tableau 2. Comme cela est apparent par les résultats montrés au Tableau 2, l'activité de AH de la souche de B. subtilis 168 MA3 a été récupérée par transformation de la souche par le plasmide pAGSO1.
Souche Activité spécifique de AH *1) MI113 *2) 5,26 MA3 *3) 0,000 MA3 (pUX2) 0,000 MA3 (pAGSO1) 0,018 Notes: *1) exprimée en termes de la quantité (micro moles) de l'acide cis-aconitique consommée pour 1 mg de la protéine dans la solution réactionnelle pendant 1 minute.
*2) Une souche sauvage de Bacillus subtilis 168 ayant un gène codant pour AH *3) Bacillus subtilis 168 qui est déficient en un gene codant pour AH.
Etape 7 (Isolement et analyse du plasmide pAGSO1) De Bacillus subtilis 168 MA3 (pAGSO1), on a isolé 120jJg du plasmide pAGSO1 de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 2 puis on a purifié. De l'ADN ainsi isolé, on a préparé un échantillon de 0,3 rg et on les a digérés par les enzymes de restriction suivantes dans 20 d'un tampon approprié à 37 C pendant 2 heures. Comme enzymes de restriction, on a utilisé EcoRi, BamHI, BglII, HindIII, KpnI (chacune étant fabriquée et vendue par TOYOBO Co., Ltd., Japon), Mlui (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon), PstI, PvuII, SacI, SalI, XbaI et XhoI (chacune fabriquée et vendue par TOYOBO Co.
Ltd., Japon). Chacune des enzymes de restriction a été utilisée en une quantité de 10 unités. Les digestions ont été entreprises en utilisant les enzymes de restriction seules et en combinaison. Les produits ainsi obtenus de digestion ont été soumis à une analyse selon la méthode de l'étape 6 de l'Exemple 1 pour obtenir la longueur moléculaire du plasmide pAGSO1 et ses sites de clivage par endonucléase de restriction.
Par suite, on a trouvé que le plasmide pAGSO1 avait une structure illustrée par la carte de clivage par endonucléase de restriction montrée à la figure 3 et se composait du vecteur pUX2 et, inséré au site qui avait été scindé par l'enzyme de restriction XbaI, un fragment étranger de XbaI contenant un gène codant pour AH ayant une longueur moléculaire d'environ 4,7 kb. Le fragment de XbaI était un fragment d'ADN contenant un gène codant pour AH dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558).
Des cellules de Bacillus subtilis 168 MA3 ont été transformées par l'ADN du plasmide pAG50 ci-dessus mentionné sensiblement de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 2, à l'exception que l'on a utilisé l'ADN du plasmide pAGSO1 au lieu de pUB110, pour obtenir des transformants. Les transformants résultants ont été examinés pour leur résistance aux médicaments et leur auxotrophie. Tous les transformants examinés se sont révélés être résistants à la kanamycine et ne pas nécessiter d'acide glutamique pour leur croissance. Par ailleurs, la carte de clivage par endonucléase de restriction du plasmide retenu dans le transformant s'est révélée être la même que celle du plasmide employé dans la transformation ci-dessus.
8 - Lame de couteau selon la revendication 2, caractérisée en ce que la première et la deuxième faces sont inclinées à peu près symétriquement par rapport à un plan qui définit la direction naturelle de coupe de
ladite lame.
9 - Procédé de fabrication d'une lame de cou-
teau, qui comprend la phase consistant à former une âme
faite d'une matière à usure relativement forte, qui défi-
nit une partie tranchante, ladite partie tranchante com-
prenant une première face et une deuxième face qui sont
sécantes, caractérisé par des phases ultérieures consis-
tant à déposer une matière de revêtement à usure relati-
vement faible (32, 132, 232) sur les deux faces (25, 36; 140, 142; 225, 236) de la partie tranchante de la lame et à enlever par meulage la matière de revêtement sur la première face de la partie tranchante, tout en laissant la matière de revêtement sur la deuxième face de la partie tranchante pour former une arête tranchante
(40, 146, 240).
- Procédé selon la revendication 9, caracté-
risé en ce que la phase consistant à former l'âme en une
matière à usure relativement forte est exécutée en for-
mant l'âme en une matière relativement tendre et en ce
que la phase consistant à déposer un revêtement d'une ma-
PURIFICATION DE VIRUS RECOMBINANT.
Ce mode opératoire comprend des purifications multiples successives Ce plaques pour purifier complètement le virus recombinant par séparation du virus parental. La sélection est appliquée à chaque étape pour choisir la plaque avec laquelle on doit continuer. Les modes. opéra- toires sont connus du spécialiste du domaine de la virologie.
Des vaccins multivalents pour animaux peuvent être élaborés par insertion d'un gène d'antigène étranger dans un herpès virus. Les modes opératoires et la méthodologie sont très similaires à ceux utilisés pour l'inser- tion initiale du gène marqueur dans le virus et peuvent être mis en oeuvre de la manière suivante.
SUBSTITUTION D'UN GENE MARQUEUR PAR UN GENE D'ANTIGENE ETRANGER DANS UN CLONE DE SEQUENCES DE REPETITION.
Il s'agit d'une expérience de clonage qui consiste à introduire le gène de l'antigène derrière le même promoteur d'herpès virus que celui utilisé avec le gène marqueur et à insérer cette construction dans une délétion identique à celle du clone de répétition. Les méthodes pour ce clonage sont décrites dans Maniatis et collaborateurs (1).
TRANSFECTION AVEC UN CLONE D'ANTIGèNE + UN MARQUEUR CONTENANT DE L'ADN D'HERPES RECOMBINANT.
Le gène marqueur qui est déjà présent dans le génome de l'herpès virus peut être utilisé pour faciliter la sélection du nouveau recombinant. Par exemple, il s'est révélé utile de sélectionner des plaques blanches au lieu de plaques bleues pour tester l'absence de bêta-ga1actosidase dans cette étape. Une raison pour la présence d'une plaque blanche est le remplacement du gène de la bêta-galactosidase par le gène d'antigène étranger par recombinaison homologue (le résultat désiré). Une sélection continue de ce nouveau recombinant par le MODE OPERATOIRE D'ANALYSE PAR LA METHODE DE SOUTHERN ou par la SELECTION PAR DES ANTICORPS D'HERPES VIRUS RECOMBINANT est devenue mieux définie, moins longue et permet l'identification -précise du recombinant présentant un intérêt.
ISOLEMENT D'ADN D'HERPES VIRUS RECOMBINANT.
Le procédé de transfection nécessite de l'ADN d'herpès virus infectieux intact. Des herpès virus recombinant s qui comprennent un gène marqueur inséré peuvent être utilisés. Le procédé d'isolement de l'ADN d'herpès virus peut s'appliquer également à ces virus recombinants.
SELECTION D'UNE SOUCHE DE TRANSFECTION POUR L'INSERTION DE GENES ETRANGERS.
Des méthodes de sélection ont été décrites ci-dessus. Elles consistent en une association de méthodes indirectes (sélection pour l'absence du marqueur) et de méthodes directes (ANALYSE PAR LA METHODE DE SOUTHERN pour le gène de l'antigène, et SELECTION PAR DES ANTICORPS pour la protéine exprimée). Les méthodes peuvent être appliquées successivement au cours de la purification du virus.
PURIFICATION DE VIRUS RECOMBINANTS CONTENANT UN GENE D'ANTI GENE ETRANGER.
Le virus recombinant contenant le gène d'antigène étranger peut être purifié suivant les modes opératoires décrits ci-dessus.
Cette séquence d'étapes, avec les méthodes et exemples décrits dans le présent mémoire, permettent à tout homme de l'art de mettre en pratique avec succès la présente invention avec n importe quel herpès virus animal.
EXEMPLE 17 La présente invention comprend l'utilisation d'herpès virus soumis à des manipulations génétiques afin de protéger des animaux contre une maladie. Il n'était pas évident au commencement des recnerches de savoir quelles délétions dans des herpès virus serviraient à atténuer les virus au degré convenable de manière à les rendre utiles comme vaccins. Meme l'essai de candidats-vaccins chez des modèles animaux, par exemple la souris, ne constitue pas un indicateur valide de l'innocuité et de l'efficacité du vaccin chez l'espèce animale servant de cible, par exemple le porc. Pour illustrer ce point plus clairement, le tableau VII présente un résumé des résultats d'innocuité et d'efficacité de divers virus pseudorabiques qui ont été élaborés et essayés chez le porc suivant le mode opératoire intitulé ETUDES DE VACCINATION CHEZ LE PORC.
TABLEAU VII RESUME DES ETUDES ENTREPRISES CHEZ DES PORCS AVEC DIVERSES CONSTRUCTIONS DE VIRUS PSEUDORABIQUES
A cet effet, dans la structure qu'elle concerne, du type compor tant un certain nombre de cadres de forme rectangulaire, réalisés à partir de tubes, et susceptibles d'être équipés de panneaux, chaque cadre comprend quatre pièces d'angles, chacune en forme de L, et présentant deux branches tubulaires pour l'emboîtement de deux tubes perpendiculaires, dont l'une est ouverte à ses deux extrémités, et est destinée à l'engagement du côté de son extrémité correspondant à l'angle des deux branches, d'une pièce réalisant un assemblage amovible avec possibilité de rotation avec au moins un cadre voisin.
Il est intéressant de noter qu'à l'aide d'un type unique de pièces d'angles, et d'un jeu de tubes de même section, mais de différentes longueurs, il est possible d'obtenir un nombre de cadres susceptible de satisfaire à toutes les applications.
Le montage des tubes à l'intérieur des pièces d'angles peut être fait de façon définitive avec solidarisation par collage par exemple, ou peut consister en un montage amovible avec emboîtement à force ou blocage par des moyens élastiques, cette opération étant réalisée ponctuellement lors de l'installation d'un stand en fonction de l'infrastructure de celui-ci.
Chaque pièce d'angle comprend, dans le plan défini par les deux branches du L et sensiblement au milieu de l'épaisseur de celles-ci, une servant à l'appui d'un angle d'un panneau. Ce panneau peut être fixé par vissage, ou de préférence de façon amovible par exemple par des moyens à boucles et crochets connus sous la marque VELCRO, ou par un doigt monté pivotant sur la pièce autour d'un axe perpendiculaire aux deux branches.
Chaque pièce d'assemblage entre deux cadres comprend deux embouts cylindriques destinés à être engagés dans une pièce d'angle avec possibilité de rotation, ces deux embouts cylindriques étant reliés l'un à l'autre par une zone de liaison intermédiaire de plus forte section.
Avantageusement, la zone de liaison intermédiaire de plus forte section de chaque pièce de liaison présente, sur sa face en regard d'une pièce d'angle, des crans destinés à coopérer avec des crans complémentaires ménagés sur ladite pièce permettant de réaliser une indexation angulaire de la pièce de liaison avec la pièce d'angle.
Selon une première forme d'exécution destinée à l'assemblage de deux pièces d'angles superposées, chaque pièce d'assemblage comprend au moins deux branches cylindriques coaxiales qui, destinées à pouvoir s'engager chacune dans un tube d'une pièce d'angle avec possibilité de rotation dans celui-ci, sont séparées l'une de l'autre par une partie centrale de diamètre élargi entretoisant les deux pièces d'angles adjacentes.
Dans la mesure oU il s'agit de réunir deux pièces d'angles juxtaposées horizontalement, la pièce d'assemblage comprend deux embouts cylindriques parallèles réunis à l'une de leurs extrémités par une zone intermédiaire de liaison.
Dans le cas d'un assemblage de quatre pièces d'angles adjacentes, la pièce d'assemblage possède une forme générale de H, chacune des deux branches parallèles du H comportant deux embouts cylindriques coaxiaux destinés à être engagés dans deux pièces d'angles superposées.
Selon une possibilité, les deux branches principales du H sont articulées l'une par rapport à l'autre autour d'un axe correspondant à la branche centrale.
Ceci permet de faire pivoter l'une des branches du H par rapport à l'autre, et par suite de placer deux panneaux voisins dans des plans différents.
Selon une autre forme d'exécution de cette pièce d'assemblage, la branche centrale du H comporte au moins un ergot faisant saillie latéralement, destiné à l'emboîtement d'une pièce de liaison avec un tube transversal ou avec un embout destiné au montage d'un tel tube.
Avantageusement, la partie formant la branche centrale du H est montée pivotante par rapport aux deux branches principales du H autour d'un axe correspondant à ladite branche centrale.
Ceci permet de faire partir des tubes à 90" pour réaliser une tablette ou une étagère, ou pour incliner un panneau situé en dessous d'un autre panneau, afin de faciliter sa lecture.
La partie centrale comportant les ergots présente, sur chacune de ses faces, une zone crénelée correspondant avec une zone de profil complementaire ménagée sur les faces en regard des pièces correspondant aux branches principales du H.
En l'absence de courant, c'est-à-dire anode de la décharge contrôlée flottante électriquement, celle-ci prend un potentiel flottant de l'ordre de -9 à -10 V par rapport à la buse de la torche à plasma.
En Argon pur, on voit qu'un courant important de l'ordre de 80 à 95 A peut circuler avec de très faibles tensions anode torche-anode secondaire.
Dans ces conditions on récupère de l'énergie électrique du pos t-plasma.
Si l'on augmente l'intensité du courant injectée dans leNpo5t plasma, on constate une variation de tension entre les deux anodes qui devient positive, c'est-à-dire que l'on injecte alors de l'énergie dans la décharge contrôlée.
Avec de l'Argon pur, cette tension est-très faible et de l'ordre de 10 V. Avec du C02 pur (en plus de Ar), on a une augmentation de tension jusqu'à 30 V qui reste quasi-constante pour redescendre ensuite si l'on augmente l'intensité.
Dès que l'on injecte des gaz pouvant réagir, on constate une forte augmentation de tension.
Le palier est de l'ordre de 85 à 90 V pour l'injection du mélange 4 CH4 + 02 et de 140 V pour l'injection du mélange 2 CH4 + C02.
Ce n'est que pour de fortes intensités que l'on retrouve une caractéristique négative, la tension diminuant alors que l'intensité du courant augmente, ce qui montre que l'on se rapproche du régime d'arc.
Dans la zone de décharge contrôlée, on constate que l'on peut fixer la puissance injectée de manière contrôlée en fixant l'intensité injectée dans la zone post-plasma sous une tension, qui elle, dépend de la nature des gaz en réaction.
Les deux rectangles indiquent des zones de stabilité précaire (ZSP). La possibilite de maîtriser finement l'énergie injectée dans le milieu réactif du post-plasma, ainsi mise en évidence, constitue une des caractéristiques de l'invention. Elle permet de piloter des réactions selon des critères énergétiques parfaitement définis.
Les exemples ci-après illustrent l'invention. Ils montrent la possibilité de conduire des réactions utiles, en agissant à la fois sur la puissance appliquée dans les décharges contrôlées et le dosage des réactifs.
Le tableau I résume les exemples 1 à 5.
Ce tableau est divisé horizontalement en cinq parties. La pre mière partie indique la nature et le débit du gaz plasmagène -ainsi que la tension en volts et l'intensité du courant en ampères circulant dans la torche à plasma 21, ainsi que la puissance en kw.
La deuxième partie du tableau indique la nature des gaz réactifs injectés en décharge contrôlée ainsi que la tension en volts, Itin tensité en ampères et la puissance en kW des décharges contrôlées.
La troisième partie indique le pourcentage de CH4 transformé en carbone, récupéré dans le réacteur, d'une part, et dans le filtre, d'autre part.
La quatrième partie indique le résultat de l'analyse des gaz de sortie et leur composition en volume.
Les axes (3) et (17) se rencontreat k angle droit au centre du secteur (50).
Dans le tube (65) coulisse un equipage mobile (67) muni, k son extrémité inférieure de surépaisseurs (68) ajustées presque sans Jeu aux mesures intérieures dudit tube, et terminé, sur une certaine longueur de son extrémité supérieure, par 2 épaulements cylindriques, dont le plus petit, terminé par un filetage, traverse avec un Jeu suffisant le trou (69) de l' embase (61), avant de se visser dans la tirette carrée taraudée (59). Sur le plus gros épaulement, 1 ressort (70) s' appuie sous 1' embase (61) dont il écarte 1' équipage mobile (67) par 1 intermédiaire d' une ou plusieurs cales de réglage (71).A 1' extrémité inférieure de 1' équipage mobile (67) est fixée, par un système règlable décrit plus loin, 1 crémaillère (72) qui s' engrène sur les dents du secteur denté (50) fixé sur la flasque (48) du bloc fixe.
Pour faciliter la comprehension des Pig 20, 21, 22, le calorifugeage (c) n' y est pas représenté.
Pig 20 : position surplomb ; tant qu' on ne touche pas au levier (18 Bis), le ressort pousse 1' équipage mobile (67) et engage complétement les dents de la crémaillers (72) dans celles du secteur denté (50), et la tirette (59), préalablement reglée, appuie presque complètement la pièce prismatique (57) sur 1' embase (61)g Dans ces conditions, le bloc basculant, qu' il soit, ou non, ou partiellement, ou totalement basculé, se trouve fermement immobilisé par rapport au bloc fixe.
Fig 21 t on tire vers 1' avant le levier (18 Bis) Jusqu' à ce que le gros épaulement de 1' équipage mobile (67) atteigne le dessous de 1' embase (61), par 1' effet conjugué de 1' appui d' une aréte de la pièce prismatique (57) sur ladite embase, et de celui d' une des tigas cylindriques (60) sous le congé 4e la tirette (59) ( cela explique la nécessité du Jeu entre les tiges cylindriques et la partie épaulée de la tirette ) la crémaillère (72) et le secteur (50) se trouvent desengrènés, le basculement est possible et le restera jusqu' à ce que le ressort (70) ait ramené les dentures en contact, soit 1 pas plus loin, si on n' accompagne pas le mouvement de basculement, soit encore plus loin si on continue de tirer sur le levier t Le bloc basculant, du fait de son inertie, suit le mouvement imprimé au levier un peu comme si le basculement ètait assisté.
Pit 22 s elle montre qu' en poussant le levier (18 Bis) vers 1' arrière, on déverrouille le mécanisme dans les mêmes conditions que si on 1' avait tiré.
Pixation de la crémaillère sur 1' equipage mobile pour une bonne présentation, il faut qu' en position " non basculé ,le dessus (19) du bloc basculant vienne ' appuyer dans le pli du w petit dessus" (15) t voici le systeme de règlage : Un trou (73) taraudé traverse perpendiculairement 1' extré- mité infèrieure de 1' équipage mobile (67) g on y visse une tige filetée (74) en métal dur dont l' épaulement, lui même fileté à un plus petit diamètre, se termine par une fente (75).
2 portées lisses de diamètres différents, solidaires de la crémaillère, reçoivent les extrémités de la tige filetée (74).
1 écrou (76) et 1 rondelle èventail complètent le dispositif L' outil nécessaire au réglage se compose d' une clé tubulaire assez longue ( pour serres 1' écrou t6 ) avec un long tournevis à 1 intèrieur ( pour la fente 75 ) Remarque: Etudié en vue d' une réduction de l' encombrement, le LEVIER è LIAISON ELASTIQUE se révèle aussi irréversible qu' un mécanisme à roue et vis sans fin, mais fonctionne pratiquement sans frottement . Plus rapide, il demande moins d1 efforts, et ne prend pas de Jeu . Il serait susceptible d' autres applications, avec une réalisation un peu différente, par exemple s diviseur pour fraiseuse d' opération positionneur commande de variateur, de frein, de régulateur etc.
VARIANTES POSSIBLES , trois exemples non limitatifs mobilisation par friction d' une garniture souple à 1' intérieur d' une gorge Pig 23 Pl. 5 homologue de la Pig 21 P1. 4 , et Pig 24 s coupe suivant D ! Pour laisser du jeu latéral, l' équipage mobile (67 Bis) a est pourvu de surépaisseurs ajustées (68 Bis) qu' en haut et en bas, rien sur les côtés: un gras fer plat (77) cintré au rayon convenable, est soudé à son extrémité. Pipée sur le fer plat ( collage+ vis ou rivets ) une garniture trayez Gidale en caoutchouc dur ( 78) est poussée par 1' action du ressort dans la gorge trapezoidale d' un secteur à gorge (50 Bis) fixé à la flasque (48) du bloc fixe ; la déformation de la garniture sous la poussée du ressort produit un serrage énergique sur les 2 parois latérales coniques du secteur ( sous réserve d' essai ).
Immobilisation par Priction de 2 garnitures rigides à 1' interieur d' une gorge Portion gauche de la Fig 25 : Fig 26 : Coupe suivant E Pour remplacer le frein à disques qui conviendrait parfait ement ai on avait la place de le mettre, l' Inventeur raisone ainsi s En 1' absence de frottements, la force exercée sur les 2 parois coniques de la gorge serait, du fait de 1' incli- naison du cône, le triple de la poussée radiale due au ressort.
Il n en sera pas ainsi ai 1' ensemble est parfaitement immobile ( mais alors il n' a pas besoin d' être freiné ), mais, s' ' il se produit la moindre petite rotation, 1' effet " petit mouvement " combiné avec la poussée radiale. fera s' enfoncer , peut être d' une iraction de micron, les garnitures dans la gorge en produisant un serrage très énergique sur les 2 parois coniques de la gorge.
Même montage que pour la variante ci-dessus en ce qui concerne les repères 48, 50 Bis, 67 Bis, 68 Bis.
Un fer à i (79) soudé au bout de 1' equipage mobile, est fixé ( colle spéciale et rivets ) à 2 garnitures genre " ferrodo " (80) usinées à la demande de la gorge . Le déplacement radial se trouvant considérablement réduit par rapport au système à crémailère, le levier à liaison élastique, sans changer de principe, sera modifié an consèquence.
Autre présentation de la liaison élastique Portion droite de la Pig 25 2 coupe suivant axe (17) libre Pig 27 s vue de gauche avec arraché, verrouillé Fig 28 coupee suivant axe (17), repos Fig 29 vue suivant F, repos Pig 30 sue suivant G avec 1/2 coupe de la cloche, repos.