INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La table présente une première série de rainures espacées et parallèles 3 sur toute la partie principale de sa surface
ainsi qu'une seconde série de rainures semblables 4 vers un bord.
Deux fentes espacées 5 sont à angle droit des fentes 4. Certaines des rainures 3et4 s'étendent complètement à travers la surface pour y former des fentes. L'une de ces fentes est repérée 6 et elle s'étend sur presque toute la largeur de la surface de la table et elle est un
peu plus large que les autres rainures et fentes.
IDENTIFICATION ET PURIFICATION DU PRODUIT DU GENE EXPRIME Une fois identifié un recombinant qui exprime le gène LAV/HTLV III, il convient d'analyser le produit du gène.
On peut y parvenir par des analyses et dosages se fondant sur les proprietés physiques, immunologiques ou fonction nelles du produit. Une analyse immunologique est particulièrement importante puisque le but final consiste à utiliser les produits de gènes ou virus recombinants qui expriment de tels produits dans des formulations de vaccins et/ou à titre d'antigènes dans des dosages immunologiques pour diagnostiques.
Divers antisérums sont disponibles pour analyser l'immunoréactivité du produit, ce qui comprend, sans que ce soit limitatif, du sérum provenant de patients atteints de LAS (syndrome d'adénopathie) ou de SIDA et des sérums polyvalents dirigés contre le virus LAV/HTLV, la protéine d'enveloppe virale et ses analogues produits dans un système bactérien, ou les peptides synthétiques contenant des déterminants antigéniques de l'enveloppe de LAV/HTLV III. L'identification des peptides et protéines décrits dans la présente invention se fonde sur deux exigences. En premier lieu, la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III doit être produite seulement dans des cellules infectées par du virus recombinant.En second lieu, la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III doit être capable d'une réaction immunitaire avec le sérum de patients atteints de SIDA ou avec divers anticorps dirigés contre la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III ourses analogues et dérivés.
La protéine doit être immunoréactive, qu'elle résulte de l'expression de la totalité de la séquence de gènes, d'une partie de séquence de gènes ou de deux ou plusieurs séquences de gènes qui sont liées par ligation pour diriger la production de protéines de fusion. Cette réactivité peut être mise en évidence par des techniques immunologiques classiques, comme une radio-immunoprécipitation, une compétition radioimmunitaire, ou des immunocaillots.
Une fois identifiée la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III, on peut isoler et purifier cette protéine par des méthodes classiques comprenant la chromatographie (par exemple la chromatographie par échange d'ions, par affinités et dans une colonne de classement par dimensions), par centrifugation, par différence de solubilité, ou par n'importe quelle autre technique classique pour la purification de protéines.
En variante, une fois identifiée une protéine immunoréactive apparentée à LAV/HTLV III et produite par un recombinant, on peut déduire la séquence des aminoacides de la protéine immunoréactive d'après la séquence des nucléotides du gène chimérique contenu dans le recombinant. Par suite, la protéine peut être synthétisée par des méthodes chimiques classiques connues en pratique (voir, par exemple, M.
Hunkapiller et col., 1984, Nature 310:105-111).
Dans une forme particulière de réalisation de la présente invention, de tels peptides, qu'ils soient produits par des techniques utilisant de 1'ADN recombinant ou par des méthodes de synthèse chimique, comprennent, sans que cette liste soit limitative, la totalité ou une partie de la séquence des aminoacides essentiellement comme représenté sur la figure 2, ce qui comprend des séquences altérées dans lesquelles des restes d'aminoacides fonctionnellement équivalents remplacent des restes au sein de la séquence, ce qui crée une variation silencieuse. Par exemple, un ou plusieurs restes d'aminoacides de la séquence peuvent être remplacés par un autre aminoacide de polarité semblable, qui joue le rôle d'un équivalent fonctionnel, en donnant une altération silencieuse.On peut choisir, parmi d'autres membres de la classe à laquelle l'aminoacide appartient, des éléments pour remplacer un aminoacide au sein de la séquence. Par exemple, les aminoacides non polaires (hydrophobes) comprennent l'alanine, la leucine, l'isoleucine, la valine, la proline, la phénylalanine, le tryptophanne et la méthionine. Les aminoacides neutres polaires comprennent la glycine, la sérine, la thréonine, la cystéine, la tyrosine, l'asparagine et la glutamine. Les aminoacides (basiques) à charge positive comprennent l'arginine, la lysine et l'histidine. Les aminoacides (acides) à charge négative comprennent l'acide aspartique et l'acide glutamique.
DETERMINATION DU POUVOIR IMMUNITAIRE DU PRODUIT RECOMBINANT On peut déterminer le pouvoir immunitaire du produit apparenté à l'enveloppe de LAV/HTLV III en surveillant la réponse immunitaire d'aminaux d'essai après immunisation par injection de la protéine purifiée ou du peptide ou protéine de synthèse purifiée. Quand la protéine apparentée à l'enveloppe de LAV/HTLV III est exprimée par un virus recombinant infectieux, on peut utiliser le virus recombinant lui-même pour immuniser les animaux d'essai. Les animaux d'essai peuvent comprendre des souris, des lapins, des chimpanzés, et l'on peut éventuellement aussi faire appel à des êtres humains.Des méthodes d'introduction de l'immunogène peuvent comprendre la voie intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée, intranasale ou n'importe quelle autre voie classique d'immunisation.
La réponse immunitaire des sujets d'essai peut être analysée par trois approches : (a) la réactivité de l'immun sérum résultant à l'égard d'antigènes viraux authentiques de LAV/ HTLV III, selon des dosages ou essais effectués par des techniques connues, par exemple le dosage par immunosorption avec enzyme liée (ELISA), les immunocoagulats, des radioimmunoprécipitations, etc., (b) l'aptitude de l'immun-sérum à neutraliser in vitro"l'infectivité de LAV/HTLV III (M.
Robert-Guroff, 1985, Nature 316:72-74), et (c) une protection contre l'infection par LAV/HTLV III et/ou une atténuation des symptômes infectieux chez des animaux immunisés (D.P.
Francis, 1984, Lancet 2:1276-1277 ; D.C. Gujdusek, 1985, Lancet 1:55-56).
FORMULATION D'UN VACCIN Le but de cette forme de réalisation de l'invention est de formuler un vaccin dans lequel l'immunogène est apparenté à un épitope de LAV/HTLV III ou est un virus recombinant qui exprime un tel immunogène qui protège contre les infections à virus de LAV/HTLV III pour la prévention de l'adénopathie (LAS) ou du SIDA. En outre, on peut préparer des formulations de vaccins multivalents dans lesquels on utilise le produit de gène de LAV/HTLV III ou un virus recombinant exprimant le produit de gène chimérique, en combinaison avec d'autres immunogènes, pour la prévention du syndrome d'adénopathie (LAS) ou du SIDA et d'autres maladies. Des exemples de diverses formulations sont présentés ci-après.
FORMULATIONS DE VACCINS A VIRUS On peut formuler un vaccin à virus recombinant vivant ou un vaccin à virus recombinant inactivé. Le choix dépend de la nature du virus recombinant que l'on utilise pour exprimer les épitopes apparentées à LAV/HTLV III. Quand le virus recombinant est infectieux pour l'hôte à immuniser mais ne suscite pas de maladie, un vaccin vivant est préférable parce qu'une multiplication chez l'hôte conduit à une stimulation prolongée d'un genre et d'une amplitude semblables à ce qui se produit dans des infections subcliniques naturelles et, donc, cela confère une forte immunité de longue durée.Lors de son introduction dans un animal hôte, le virus recombinant infectieux peut exprimer les protéines apparentées à l'enveloppe de LAV/STLV III à partir de son gène chimérique et stimuler ainsi une réponse immunitaire contre des antigènes de LAV/HTLV III. Quand une telle réponse immunitaire constitue une protection à l'encontre d'une attaque ultérieure par LAV/HTLV III, le virus recombinant vivant peut servir lui-même de vaccin préventif contre une infection par le virus du SIDA. La production d'un tel virus recombinant à utiliser dans ces formulations peut impliquer des systèmes aussi bien' in vitro'(par exemple des cellules de culture tissulaires) qu"'in vivo" (par exemple un animal hôte naturel comme une vache).On peut adapter des méthodes classiques pour la préparation et la formulation de vaccins contre la variole à la formulation d'un vaccin à virus recombinant.
On peut préparer des vaccins multivalents à virus vivant à partir d'un seul ou d'un petit nombre de virus recombinants infectieux qui expriment des épitopes d'organismes provoquant d'autres maladies en plus des épitopes de LAV/HTLV III. Par exemple, on peut traiter par génie génétique un virus de vaccine (qui peut recevoir environ 35 kilobase de ADN étranger) de manière qu'il contienne des séquences de codage d'autres épitopes en plus de ceux codant pour LAV/HTLV III ; un tel virus recombinant luimême peut servir d'immunogène dans un vaccin multivalent.
En variante, on peut formuler, dans un vaccin multivalent, un mélange de virus de vaccine ou d'autres virus, capables de chacun de diriger l'expression d'un gène différent codant pour différents épitopes de LAV/HTLV III et/ou d'autres organismes capables de provoquer une maladie.
véhicule spatial.
Pendant le rendez-vous de la navette avec le véhicule, des opérations d'entretien sont effectuées sur le module de bus 11. Le module de bus envisagé dans la présente invention est adapté pour l'adjonction de sousmodules, décrits dans ce qui va suvire, et est adapté pour recevoir des sous-modules ou unités de remplacement orbital (URO). Comme décrit ciaprès, chacun de ces sous-modules ou unités ajoutés est de taille relativement petite (60 x 60 x 80 cm
par exemple) et est donc manipulable par un astronaute dans l'envi-
ronnement spatial.
Les figures Sa à 5d montrent un mode de réalisation du module de bus 11 envisagé. Il comprend une structure centrale principale 501 qui porte les charges principales et est constituée
par une construction en treillis plate, ouverte, de forme rectangu-
laire. La structure 501 possède deux grandes faces parallèles 503 et 505, séparées par une structure centrale en treillis formant noyau 504, et porte des plaques terminales opposées 506 et 507. Les montures d'amarrage 17a (décrites dans ce qui précède) sont montées sur les plaques terminales opposées 506 et 507 de la structure en treillis plane et ouverte. Du côté de la plaque terminale 507 avec
la monture d'amarrage pour le module à charge utile, deux touril-
lons 508a et 508b d'attache à la navette dépassent de la structure centrale principale 501. Ces tourillons sont destinés à s'ajuster dans les verrous de navette mentionnés précédemment, qui sont prévus sur les longerons de la navette. Deux tourillons 509a et 509b d'attache au berceau dépassent de l'extrémité opposée 506 de la structure principale 501. Les tourillons 509a et 509b sont orientés sensiblement dans la même direction que les éléments d'amarrage de la monture prévue pour l'amarrage du module de propulsion. Ainsi qu'on peut le voir sur les figures 5c et 5d, des
ensembles compartimentés 510 et 511 sont situés au-dessus et. au-
dessous de la structure principale 501 et sont boulonnés ou fixes d'une autre manière à cette structure centrale 501. Chacun des ensembles compartimentés 510 et 511 se compose essentiellement de plaques entrecroisées et formant une matrice de cavités. Chacune de ces cavités est dimensionnée pour recevoir l'un des sous-modules
ou unités de remplacement orbital mentionnés dans ce qui précède.
Un tel sous-module ou unité contient typiquement de l'équipement électronique. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, les zavités ormées dans les ensembles compartimentés 510 et 511 sont essentie iement identiques en grandeur et forme. Des fixations et
Ses connecteurs électriques identiques sont prévus à des emplace-
nents éntiques dans les différentes cavités. Selon un aspect de l'invention, l'appareillage électronique (ou autre) du module de
bus est divisé comme les multiples sous-modules mentionnés ci-
ISOLEMENT DE GENES, OU DE FRAGMENTS DE GENE, CODANT DES PROTEINES VIRALES LAV/HTLV III L'isolement du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III implique tout d'abord l'isolement de fragments de ADN contenant les séquences de gènes d'enveloppe. Comme précédemment expliqué, LAV/HTLV III possède un génome de ARN et, donc, on peut obtenir 1'ADN correspondant qui code le gène LAV/HTLV III (a) en clonant par ADNc 1'ARN isolé de virion purifié de LAV/HTLV III, ou (b) en clonant par ADNc de l'ARN contenant du polyA que l'on obtient à partir de cellules infectées par LAV/HTLV III, ou (c) en clonant de 1'ADN de génome purifié à partir de cellules infectées par LAV/HTLV III. Ci-après, on appelera 1'ADN codant les gènes de LAV/ HTLV III de 1'ADN de LAV/HTVL III.
Afin d'engendrer des fragments de ADN de LAV/HTVL III, on peut cliver 1'ADN de i;AV/HTLV III en des sites spécifiques, en utilisant diverses enzymes de restriction.
En variante, on peut utiliser de 1'ADN ase en présence de manganèse pour fragmenter 1'ADN, ou bien l'on peut cisailler physiquement 1'ADN, par exemple par traitement aux ultrasons.
On peut ensuite séparer les fragments linéaires de ADN, selon leurs dimensions, par des techniques classiques, ce qui comprend, sans que ce soit limitatif, une électrophorêse sur gélose et gel de polyacrylamide et une chromatographie sur colonne.
On peut utiliser n'importe quelle enzyme de restriction ou n'importe quelle combinaison d'enzymes de restriction pour engendrer un ou des fragments de ADN de LAV/HTLV III contenant la séquence d'enveloppe, à la condition que les enzymes ne détruisent pas le pouvoir immunitaire du produit protéinique de gène d'enveloppe. Par exemple, le site antigénique d'une protéine peut consister en environ 7 à environ 14 aminoacides. Ainsi, une protéine de la dimension du peptide précurseur d'enveloppe (environ 97 000 daltons) peut comporter de nombreux sites antigéniques séparés, peut-être des milliers en considérant les séquences en recouvement, des considérations de structures secondaires et tertiaires et des possibilités de traitement comme l'acétylatioa, la glycosylation ou la phosphorylation.Donc, de nombreuses séquences de gènes polypeptidiques d'enveloppes risquent de coder pour un site antigénique. Par conséquent, on peut utiliser de nombreuses combinaisons d'enzymes de restriction pour engendrer des fragments de ADN qui, quand ils sont insérés dans un vecteur approprié, sont capables de diriger la production de séquences d'aminoacides spécifiques d'enveloppe comprenant différents déterminants antigéniques.
Une fois les fragments d'ADN engendrés, on peut réaliser d'un certain nombre de façons une identification du fragment spécifique d'ADN contenant le gène d'enveloppe LAV/HTLV III. En premier lieu, il est possible de séquencer les fragments d'ADN correspondant à la totalité du génome de LAV/HTLV III puis 6' identifier les fragments contenant la séquence de gènes protéiniques d'enveloppe en se fondant sur une comparaison de la séquence des aminoacides prédite et de la séquence des aminoacides de la protéine d'enveloppe.
En second lieu, une fois déterminée la totalité de la séquence de génome, on peut ordonner de 5' à 3' les grands cadres à lecture ouverte Comme l'organisation de génome de tous les rétrovirus examinés jusqu'à présent est 5'-gagpol-env-3', le grand cadre à lecture ouverte le plus voisin de l'extrémité 3' risque très probablement de coder pour le gène d'enveloppe. En variante, le fragment contenant le gène protéinique d'enveloppe peut être identifié par sélection de ARNm. Dans ce mode opératoire, on utilise les fragments de ADN LAV/HTLV III pour isoler, par hybridation, les ARNm complémentaires. Une analyse par immunoprécipitation des produits de translation in vitro des ARNm isolés identifie l'ARNm et donc, les fragments d'ADN LAV/HTLV III complémentaire qui contiennent Ies sequences des protéines d'enveloppe.Enfin, on peut choisir des ARNm spécifiques de protéines d'enveloppe par adsorption de polysomes isolés à partir de cellules infectées par LAV/HTLV III surtdes anticorps immobilisés dirigés contre la protéine d'enveloppe.
On peut synthétiser une ADN d'enveloppe radiomarquée, ADNc (ADN complémentaire) en utilisant comme gabarit l'ARNm choisi (provenant des polysomes adsorbés). L'ARNm radiomarqué ou l'ADNc radiomarqué peuvent alors servir de sonde pour identifier les fragments de ADN de LAV/HTLV III contenant des séquences de gènes de protéines d'enveloppe. Au lieu d'isoler le gène d'enveloppe on peut, sans que cette liste soit limitative, effectuer la synthèse chimique de la séquence de gène elle-même (à la condition que la séquence soit connue) ou transformer ADNc en ARNm qui code le gène d'enveloppe.
Une fois identifié et isolé, le fragment d'ADN de LAV/HTLV III contenant les séquences intéressantes peut être tout d'abord inséré dans un vecteur de clonage, tel un vecteur de clonage de plasmide,qui sert à transformer des cellules hôtes appropriées afin de provoquer la réplication de 1'ADN de manière à engendrer de nombreuses copies des sequences intéressantes de LAV/HTLV III. On peut y parvenir en provoquant la ligation du fragment de ADN de LAV/HTLV III dans un vecteur de clonage comportant des terminaisons cohésives complémentaires. Cependant, si les sites de restriction complémentaires servant à fragmenter 1'ADN de LAV/ HTLV III ne sont pas présents dans le vecteur de clonage, les extrémités des molécules de ADN risquent d'être modifiées.De telles modifications comprennent la production d'extrémités émoussées par digestion des terminaisons de ADN à simple brin ou par garnissage des terminaisons à simple brin de manière que les extrémités puissent subir une ligation d'extrémité émoussée. En variante, on peut produire n importe quel site voulu en fixant par ligation des séquences de nucléotides (agents de liaison) sur les terminaisons d'ADN ; ces agents de liaison ligaturés peuvent comprendre des oligonucléotides spécifiques, synthétisés par voie chimique, et codant des séquences de reconnaissance de sites de restriction. Selon d'autres procédés, on peut modifier, par terminaison homopolymère, le vecteur clivé et le fragment de ADN de L-AV/HTLV III.
La transformation de cellules hôtes par des molécules de ADN recombinants qui incorporent le gène isolé, par ADNc ou une séquence de ADN obtenue par synthèse, permet d'engendrer de multiples copies du gène. Ainsi, le gène peut être obtenu en grandes quantités par la croissance de transformants, l'isolement des molécules de ADN recombinant à partir des transformants et, quand cela est nécessaire, la récupération du gène inséré, à partir de 1'ADN recombinant isolé.
Si le but ultime consiste à insérer le gène dans des vecteurs d'expression de virus comme le virus de la vaccine ou l'adénovirus, la molécule de ADN recombinant qui incorpore le gène LAV/HTLV III peut être modifiée de manière que le gène soit entouré par des séquences de virus permettant la recombinaison génétique dans des cellules infectées par le virus, de sorte que le gène puisse être inséré dans le génome viral.
La totalité du génome de LAV/HTLV III a été clonée et séquencée par Wain-Hobson et col. (S. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9). Un clone, appelé lambda J19, a contenu un fragment de ADN de 9,2 kilopaires de bases d'une séquence de génome de LAV insérée dans le site Hind III de lambda L 47.1.
Un sous-clone particulièrement utile de lambda J19, contenant le gène d'enveloppe LAU, est pRS-3 qui consiste en un fragment à !840 paires de base EcoRI vers SstI de la séquence de nucléotides de LAV insérée dans le site EcoRi et SstI de pUC18. L'ADN spécifique de LAV contenu dans pRS-3 se situe entre le site EcoRI placé au nucléotide 5289 et le site SstI placé au nucléotide 9129 sur le génome LAV (s. Wain-Hobson et col., 1985, Cell 40:9) ; voir la figure 2 qui montre la séquence de nucléotides de LAV contenue dans pRS-3.Cependant, en raison de la dégénérescence des séquences codant pour les nucléotides, on peut utiliser dans la pratique de la présente invention, pour le clonage du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III, d'autres séquences de ADN qui codent pratiquement la même séquence des aminoacides que celle présentée sur la figure 2. Cela comprend, sans que cela soit limitatif, des séquences de nucléotides comprenant la totalité ou des parties de la séquence des nucléotides d'enveloppe représentée sur la figure 2, qui sont modifiées par remplacement de différents codons qui codent le même reste aminoacide ou un reste aminoacide fonctionnellement équivalent au sein de la séquence (par exemple un aminoacide de même polarité), en produisant un changement silencieux.
INSERTION DES SEQUENCES DE CODAGE DE PROTEINES DE LAV/HTLV III DANS DES VECTEURS D'EXPRESSION On insère la séquence des nucléotides codant pour la protéine d'enveloppe de LAV/HTLV III, ou une partie de cette séquence, dans un vecteur d'expression approprié, c'est-g- dire un vecteur qui contient les éléments nécessaires pour la transcription et la translation de la séquence de codage de protéines insérées. On peut utiliser divers systèmes hôtesvecteurs pour exprimer la séquence de codage des protéines.
Cela comprend, sans que ce soit limitatif, des systèmes de cellules de mammifères infectées par des virus (par exemple le virus de la vaccine, de l'adénovirus, etc.) ; des systèmes de cellules d'insectes infectées par des virus (par exemple du baculovirus) ; des micro-organismes comme de la levure contenant des vecteurs ou bactéries de levure transformés par de 1'ADN de bactériophage, de 1'ADN de plasmide ou de 1'ADN de cosmide. Les éléments d'expression de ces vecteurs varient en force et spécificité. Selon le système hôte-vecteur que l'on utilise, on peut utiliser n'importe lequel d'un certain nombre d'éléments convenables de transcription et de translation.Par exemple, quand on effectue un clonage dans des systèmes de cellules de mammifèrés, on peut utiliser des promoteurs isolés à partir du génome des cellules de mammifères (par exemple un promoteur de type métallothionene de souris) ou isolés à partir de virus dont la croissance s'effectue dans ces cellules (par exemple le promoteur 7,5 K de virus de vaccine). On peut aussi utiliser des promoteurs produits par de l'ADN recombinant ou par des techniques synthétiques, pour assurer la transcription desséquences insérées.
Il faut aussi des signaux spécifiques d'amorçage pour une translation efficace des séquences insérées de codage de protéines. Ces signaux comprennent le codon d'amorçage ATG et les séquences adjacentes. Quand on insère dans les vecteurs d'expression appropriés la totalité du gène d'enveloppe de LAV/HTLV III,y compris son propre codon d'amorçage et les séquences adjacentes, des signaux témoins supplémentaires pour la translation peuvent ne pas être nécessaires.
On a obtenu de R. Condit des virus de la vaccine (souche WR, n" ATCC VR-119) que l'on a cultives dans des cellules BSC-40 dans MEMD + 5 % de sérum de veau sans gamma globuline + 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine. On a choisi des recombinants TK parmi des cellules 143 TK dans le même milieu contenant 25 pg/ml de BUdR et on les a purifiées sur plaque sur la même lignée de cellules dans MEMD contenant 1 % de gelose Noble (DIFCO, Détroit, Michigan, Etats-Unis d'Amérique), 5 % de sérum de veau sans gamma globuline, 100 unités/ml de pénicilline et 100 unités/ml de streptomycine ainsi que 25 > ig/ml de BUDR.
On a effectué des dilutions des stocks de virus dans une solution saline tamponnée par des phosphates et contenant par litre 8 g de NaCl, 0,2 g de KC1, 1,5 g de NaH2PO4, 0,2 g de K2HP04, avec addition de 1 mM de MgC12 et de 0,01 X de sérum albumine de bovin.