INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
La colonie résultante ne nécessitant pas d'arginine a été transplantée en utilisant un cure-dent sur un milieu minimum d'agar (A) de Spizizen contenant 50 mg/l de L-triptophane et 19/t de L-glutamate de sodium et sur un milieu minimum d'agar (B) de Spizizen contenant 50 mg/l de L-tryptophane seul. Alors, la colonie croissant sur le milieu d'agar minimum (A) mais ne pouvant croître sur le milieu d'agar minimum (B) a été séparée en tant que souche déficiente en AH et capacité de restriction et la souche ainsi obtenue a été désignée par Bacillus subtilis 168 MA3. Cette souche a été déposée au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-1042.
Etape 2 Clivage de l'.ADN de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558) L'ADN de Corynebacterium melassecola 801 dans la solution d'ADN obtenue à l'étape 1 de l'Exemple 1 a été scindé comme suit. On a ajouté 13 unités d'une enzyme de restriction XbaI (fabriquée et vendue par TOYOBO Co., Ltd., Japon) à 128 g de l'ADN et le mélange résultant a été mélangé à 200 ut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgSO4 10 mM et NaC1 100 mM et on a laissé le mélange résultant reposer à 370(: pendant 2 heures de manière que la réaction puisse se passer.Alors, le mélange réactionnel a été chauffé à 700C pendant 10 minutes pour arrêter la réaction (échantillon VIII d'ADN).
Etape 3 Préparation du plasmide pUB110 En premier lieu, le plasmide pUB110 a été inséré dans Bacillus subtilis 168 MA3 et, du transformant ainsi obtenu, on a préparé pUB110. A titre d'exemple, Bacillus subtilis 168 MA3 (FERM BP-1042) a été inoculé dans 50 mQ d'un bouillon L et mis en culture. la densité optique (DO) de la culture ainsi obtenue à 660 nm a été contrôlée en utilisant un spectrophotomètre modèle 228 fabriqué et vendu par Hitachi, Ltd, Japon. Au moment où la valeur de DO est devenue de 0,5, les cellules en culture ont été recueillies de la culture .Les cellules ainsi obtenues ont été lavées avec 5 mt d'un tampon SMM (contenant du saccharose 0,5 M, l'acide maléique 0,02 M et MgC12 0,02 M et ajusté à pH 6,5) puis de nouveau mises en suspension dans 5 m d'un tampon SMM. A 4,5 m de la suspension résultante de cellules, on a ajouté 0,5 me d'un tampon SMM (stérilisé en utilisant un filtre Millipore) contenant un lysozyme à une concentration de 10 mgtmt et on a laissé le mélange résultant reposer à 42 C pendant 1 heure pour ainsi former desprotoplastes des cellules. Alors, le mélange a été soumis à centrifugation à 7.000 t/mn (4.500 g) à 5 C pendant 7 minutes pour récupérer les protoplastes.Les protoplastes ont été mis en suspension dans 5 mk d'un tampon SMM. La même opération de centrifugation que celle ci-dessus mentionnée a été répétée et les protoplastes ont été récupérés. Les protoplastes résultants ont été mis en suspension dans 5 m d'un tampon SMM pour obtenir une solution de protoplastes de Bacillus subtilis 168 MA3.
Le plasmide pUB110 (fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, EUA) a été dissous dans un tampon TE (contenant Tris-H(:l 10 mM (pH 7,0) et EDTA 1 mM) en une quantité telle que la concentration du plasmide pUB110 atteigne 100 pg/mi . On a mélangé 50 ut de la solution résultante d'ADN à 50 wu de 2 x SMM contenant du saccharose 1,0 M, de l'acide maléique 0,04 M et MgC12 0,04 M et on a ajusté à pH 6,5. Le mélange résultant a été ajouté à 0,5 mQ de la solution de protoplastes ci-dessus mentionnée.Alors, au mélange résultant on a encore ajouté 1,5 mt d'une solution PEG préparée en dissolvant du polyéthylène glycol 6000 dans un tampon SMM à une concentration de 40% (poids/volume)3 . Le mélange résultant a été soumis à une légère agitation puis on l'a laissé reposer à température ambiante pendant 2 minutes.Ensuite, au mélange on a ajouté 5 me d'un milieu SMML-PVP (préparé en mélangeant des volumes égaux d'un bouillon L et d'un tampon à 2 x SMM contenant du saccharose 1,0 M, l'acide maléique 0,04 M et MgCl2 0,04 M et ajusté à pH 6,5 et en dissolvant de la polyvinyl pyrrolidone (PVP) dans le mélange résultant en une quantité telle que la concentration de PVP soit de 40 g/' ) avec ensuite centrifugation à 4.000 t/mn (1.800 g) à 4 C pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et des précipités. Le produit surnageant a été enlevé. Aux protoplastes précipités, on a ajouté 0,5 mi d'un milieu SMML-PVP, et le mélange a été soumis à une légère agitation pour former une suspension des protoplastes. La suspension a été soumise à incubation à 30 C pendant 2 heures tout en la secouant doucement. Une quantité prédéterminée de la culture résultante a été inoculée à un milieu régénérant contenant 700 Hg/m l de kanamycine. Le milieu régénérant était un milieu d'agar en couche double comprenant une couche inférieure d'un milieu d'agar obtenue en ajoutant 15 g/l d'agar à un milieu DMS contenant 5 g/l de glucose, 5 g/ d'acide casamino, 3,5 g/l de K2HPO4 , 1,5 g/Q de KH2P04 , 30 g/t de PVP, 0,4 9/t de MgCl2 et 135 9/t de succinate disodique, et superposée sur la couche inférieure, une couche supérieure de milieu d'agar obtenue en ajoutant 6 g/l d'agar au milieu DMS ci-dessus mentionné et l'inoculation de la suspension diluée ci-dessus mentionnée a été effectuée par son mélange avec 3 mi de la couche supérieure d'agar fondu avant de former la couche double. Le milieu régérant résultant a été incubé à 32 C pendant 5 jours pour obtenir des transformants résistants à la kanamycine.Les transformants résistants à la kanamycine ainsi obtenus ont été transplantés à un milieu d'agar L (préparé en ajoutant 15 g/ d'agar à un bouillon L) contenant 4 pg/mss de kanamycine et on a mis en culture pour obtenir un transformant retenant le plasmide pUB110. Le transformant est désigné par Bacillus subtilis 168 MA3 (pUB110).
Bacillus subtilis 168 MA3 (pUB110) a été inoculé dans 200 mt d'un bouillon L contenant 4 Hg/mi de kanamycine et on a laissé le mélange résultant reposer à 37 C pendant une nuit. De la culture résultante, on a recueilli des cellules du micro-organisme. Les cellules ont été mises en suspension dans 2 mss d'une solution aqueuse contenant 15% de saccharose, Tris-HCl 50 mM (pH 8,5), EDTA 50 mM et 5 mg/mQ de lysozyme (fabriqué et vendu par Sigma Chemical (:ompany, EUA) et on a laissé le mélange résultant reposer à 37 C pendant 30 minutes.
Alors, au mélange, on a ajouté 2 mi d'une solution de Triton (contenant 0,1% (volume/volume) de Triton X-100, Tris-HCl 50 mM et EDTA 50 mM et ajusté à pH 8,5) et le mélange résultant a été maintenu à 37 C pendant 30 minutes.
Alors, la solution a été soumise à centrifugation à 30.000 t/mn (64.000 g) à 5 C pendant 1 heure pour obtenir un produit surnageant . Le produit surnageant a été récupéré et au produit surnageant récupéré, on a ajouté un tampon TE pour produire une solution de 18 me . A la solution résultante, on a doucement ajouté 1,2 mt d'une solution aqueuse à 10 mg/mt de bromure d'éthidium et 18,64 g de chlorure de césium et on les a dissous, avec ensuite centrifugation à 40.000 t/mn (100.000 g) à 15 C pendant 48 heures. Après accomplissement de la centrifugation, deux bandes ont été visualisées à la lumière ultraviolette.La bande inférieure a été enlevée du tube de centrifugeuse à travers la paroi latérale du tube en utilisant une seringue pour obtenir une fraction contenant le plasmide pUB110. La fraction ainsi obtenue du plasmide a été soumise à une extraction avec un volume égal d'alcool isopropylique,quatre fois, pour obtenir un extrait. De l'extrait, le bromure d'éthidium a été enlevé et la solution résultante a été dialysée avec le tampon TE pour obtenir 1 me d'un dialysat contenant un plasmide pUB110 à une concentration en ADN de 100 pg/mt Etape 4 (Préparation du plasmide pUX2) A 5 trg de l'ADN du plasmide pUB110 préparé à l'étape 3 ci-dessus de l'Exemple 2, on a ajouté 20 unités de l'enzyme de restriction BamHI (fabriquée et vendue par TOYOBO Co., Ltd., Japon).On a laissé réagir le mélange résultant dans 50 gu-Q d'un tampon contenant Tris-H(:l 10 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM, NaCl 50 mM et dithiothréitol (DTT) 1 mM à 37 C pendant 2 heures. Au mélange réactionnel, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme avec ensuite agitation et récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme, avec ensuite agitant tion et récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 0,3 M et on y a ajouté un volume double d'éthanol.On a laissé le mélange résultant reposer à -800C pendant 30 minutes avec ensuite centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et une boulette d'ADN. La boulette d'ADN a été recueillie et séchée sous vide (échantillon IX d'ADN).
L'échantillon IX d'ADN ainsi obtenu et 3 unités d'ADN polymérase T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) ont mélangés et on a laissé réagir à 300C pendant 10 minutes dans 44 iut d'un mélange de Tris-CH3COOH 33 mM (pH 7,9), CH3COOK 66 mM, (CH3C002)Mg 10 mM, dithiothréitol 0,5 mM, 0,1 mg/mt d'albumine de sérum bovin (BSA) (fabriquée et vendue par Bethesda Research Laboratories, EUA), Z'-dioxyadénosine 5'triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, EUA), 2'-dioxycytidine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical (:ompany, EUA), 2'-dioxyguanosine 5'-triphosphate 0,1 mM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical (::oepany, EUA) et thymidine 5' triphosphate O,1 cM (fabriqué et vendu par Sigma Chemical Company, EUA). Au mélange résultant, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM et on y a ajouté un volume double d'éthanol. On a laissé le mélange résultant reposer à -80 C pendant 3 heures avec ensuite centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et une boulette d'ADN. La boulette d'ADN a été recueillie et séchée sous vide (échantillon X d'ADN).
On a mélangé 1,5 pg d'un linker XbaI (fabriqué et vendu par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) et 2,5 unités de polynucléotide kinase T4 (fabriquée et vendue par Takara Shuzo Co., Ltd., Japon) et on a laissé réagir à 37 C pendant 1 heure dans 10 ZJQ d'un mélange de Tris-HCl 66 mM (pH 7,6), ATP 1 m, MgC12 10 mM, spermidine 1 mM, dithiothréitol 15 mM et 0,2 mg/mi de BSA (échantillon XI d' ADN).
On a laissé la totalité de l'échantillon X d'ADN, la totalité de l'échantillon XI d'ADN et 6 unités d'ADN ligase T4 phagique (fabriquée et vendue par Takara Shuzo, Co., Ltd., Japon), réagir à 22 C pendant 4 heures dans 22 u.c d'une solution aqueuse contenant Tris-HCl 66 mM (pH 7,6), ATP 1 mM, MgC12 10 mM, spermidine 1 mM, dithiothréitol 15 mM et 0,2 mg/mi de BSA. Au mélange réactionnel on a ajouté un tampon TE pour former une solution de 100 pt , et on y a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme, avec ensuite agitation et récupération d'une phase aqueuse.
A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme, avec ensuite agitation et récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol. On a laissé le mélange résultant reposer à -800C pendant 30 minutes avec ensuite centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour former un produit surnageant et une boulette d'ADN. La boulette d'ADN a été recueillie et séchée sous vide (échantillon XII d'ADN).
On a ajouté, à la totalité de la quantité de l'échantillon XII d'ADN, 15 unités d'une enzyme de rstric- tion XbaI et on les a laissés réagir à 37 C pendant 4 heures dans 50 jut d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaCI 100 mM. L'ADN digéré a été soumis à une électrophorèse en utilisant un gel agarose à 1% sensiblement de la même manière qu'à l'étape 6 de l'Exemple 1 à l'exception que l'on a utilisé un gel agarose à 1% préparé à partir d'Agarose LMP (dénomination commerciale d'un produit fabriqué et vendu par Bethesda Research Laboratories, EUA) et que l'électrophorèse a été effectuée à 4 C .Le gel agarose a été teinté au bromure d'éthidium et exposé à des rayons ultraviolets de manière à observer visuellement des fragments d'ADN ayant une longueur moléculaire d'environ 4,1 kb. Une portion du gel où l'on a trouvé de tels fragments d'ADN a été découpée. Au gel découpé,on a ajouté un tampon TE en une quantité égale à trois fois le poids du gel et on a chauffé à 65 C pendant 10 minutes pour dissoudre complètement le gel agarose dans le tampon. A la solution résultante, on a ajouté un volume égal de phénol et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse.A la phase aqueuse, on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, avec ensuite récupération d'une phase aqueuse. A la phase aqueuse, on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 300 mM puis un volume double d'éthanol, et on a soumis à agitation.
Alors, le mélange a été maintenu au repos à -30 C pendant 30 minutes et soumis à centrifugation à 10.000 t/mn (9.000 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette d'ADN ainsi obtenue a été séchée sous vide puis dissoute dans 50 d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgC12 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et O,lmg/mQ de BSA. A la solution résultante on a ajouté 3 unités d'ADN ligase T4 phagique et on a forcé le mélange résultant à réagir à 15 C pendant une nuit. En utilisant la totalité de la quantité du mélange réactionnel, les protoplastes de Bacillus subtilis 168 MA3 (FERM BP-1042) ont été transformés de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 2 pour obtenir Bacillus subtilis 168 MA3 (pUX2).
Du Bacillus subtilis 168 MA3 (pUX2), on a préparé le plasmide pUX2 de la même manière qu'à l'étape 3 de l'Exemple 2 et on a obtenu 1,6 mt d'un tampon TE contenant 90 pg/mt du plasmide pUX2.
On a fait réagir 5 9 du plasmide pUX2 avec 20 unités d'une enzyme de restriction XbaI dans 50 d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgS04 10 mM et NaC1 10 mM à 37 C pendant 2 heures. Au mélange réactionnel,on a ajouté un volume égal d'un mélange à 1:1 (volume/volume) de phénol et de chloroforme et on a soumis à agitation. Alors, on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse on a ajouté un volume égal de chloroforme et on a soumis à agitation, puis on a récupéré une phase aqueuse. A la phase aqueuse,on a ajouté de l'acétate de sodium jusqu'à une concentration finale de 0,3 M puis on a ajouté un volume double d'éthanol.Le mélange résultant a été maintenu au repos à -80 C pendant 30 minutes avec ensuite centrifugation à 12.000 t/mn (8.900 g) à température ambiante pendant 10 minutes pour obtenir une boulette d'ADN. La boulette ainsi obtenue d'ADN a été séchée sous pression réduite (échantillon XIV d'ADN).
Etape 5 (Préparation d'un plasmide recombinant et insertion du plasmide dans Bacillus subtilis) On a fait réagir 2 ug de l'échantillon VIII d'ADN et 1 jig de l'échantillon XIV d'ADN avec 3 unités d'ADN ligase T4 phagique dans 50 t d'un tampon contenant Tris-HCl 50 mM (pH 7,4), MgCl2 10 mM, dithiothréitol 10 mM, spermidine 1 mM, ATP 1 mM et 0,1 mg/mi de BSA à 150C pendant une nuit. La température a été élevée à 700C et maintenue à cette valeur pendant 10 minutes pour terminer la réaction et ainsi former des plasmides recombinants.
L'élimination d'une partie de la région de répétition rend le virus de l'herpès simplex humain non pathogène (48 et 49). Une région de répétition a été identifiée dans le virus de la maladie de Mare, qui est liée à une oncogénicité virale (50). Une corrélation a été établie de manière similaire entre une région dans le virus herpes saimiri et l'oncogénicité (51). Cependant, des modifications dans ces régions de répétition n'apportent pas d'enseignement sur la construction de virus pseudorabiques atténués présentant des délétions dans les séquences de répétition.
Le degré d'atténuation d'un virus est important dans l'utilité du virus en tant que vaccin. Des délétions qui provoquent une trop grande atténuation du virus ont pour résultat un vaccin qui est incapable d'obtenir une réponse immunitaire adéquate.
On sait que les herpès virus provoquent diverses infections latentes et récurrentes chez l'homme et d'autres vertébrés et infectent même un champignon et une rustre. Parmi les états associés aux infections à herpès virus se trouvent les boutons de fièvre provoqués par l'herpes simplex de type 1, l'herpès génital provoqué par l'herpes simplex de type 2, et la varicelle chez l'enfant et le zona chez l'adulte provoqués par une infection par le virus du zona. Le virus pseudorabique (VPR), un herpès virus de classe D, provoque la maladie de Aujesky, un trouble nerveux aigu et souvent fatal, chez les animaux domestiques et les animaux sauvages.
Parmi les herpès virus, seul l'herpes simplex de l'homme et, à un moindre degré, l'herpes saimiri des singes ont été soumis à des manipulations génétiques pour incorporer des séquences d'ADN étranger, avant cette divulgation. Le travail le plus ancien sur la manipulation génétique du virus de l'herpes simplex comprenait la préservation de mutants du virus sensibles à la température en utilisant des fragments de restriction d'ADN purifiés (14). Ce travail ne comprenait pas le clonage des fragments d'ADN dans le génome viral.
La première utilisation d'ADN recombinant pour manipuler le virus de -l'herpes simplex comprenait le clonage d'un morceau d'ADN de la région de jonction L-S dans la région longue unique de l'ADN, plus précisément dans le gène thymidine-kinase (15). Cet élément d'insertion n'était pas un morceau étranger d'ADN ; il s'agissait plutôt d'un morceau naturel d'ADN d'herpès virus qui était introduit par duplication à un autre endroit dans le génome. Ce morceau d'ADN n'était pas soumis à une manipulation génétique pour effectuer précisément l'expression d'une protéine quelconque et, ainsi, il n'apportait pas d'enseignement sur la manière d'effectuer l'expression d'une protéine dans les herpès virus.
La manipulation du virus de l'herpes simplex comprenait ensuite la création de délétions dans le génome du virus par une association d'ADN recombinant et de sélection contre la thymidine-kinase. La première étape consistait à produire une délétion particulière du gène thymidine-kinase (16). L'étape suivante comprenait l'insertion du gène thymidine-kinase dans le génome à un site particulier, puis le gène thymidine-kinase et l'ADN voisin au nouveau site étaient. éliminés par délétion au moyen d'une sélection contre la thymidinekinase (17). De cette manière, le gène alpha-22 de l'herpes simplex a été éliminé par délétion (17). Dans le perfectionnement le plus récent de cette technique, une séquence d'ADN de 15 000 pb a été éliminée par délétion de la région interne de répétition du virus de l'herpès simplex (18).
L'insertion de gènes qui codent pour une protéine dans des herpès virus de primates a compris sept cas : la réinsertion de la glycoprotéine C du virus de l'herpes simplex dans un mutant naturel par délétion de ce gène dans le virus de l'herpes simplex (19) ; l'insertion de la glycoprotéine D du virus de l'herpes simplex de type 2 dans le virus de herpes simplex de type 1 (20), toujours sans aucune manipulation de promoteurs puisque le gène n'est pas réellement "étranger" ; l'insertion de l'antigène de surface du virus de l'hépatite B dans le virus de l'herpès simplex sous le contrôle du promoteur ICP4 du virus de l'herpès simplex (21) ; et l'insertion de l'hormone de croissance bovine dans le virus herpès saimiri avec un promoteur SV40 qui, en fait, n'intervenait pas dans ce système (un promoteur endogène en amont servait à la transcription du gène) (22). Deux cas supplémentaires de gènes étrangers (gène de l'ovalbumine du poulet et antigène nucléaire du virus d'Epstein-Barr) ont été insérés dans le virus de l'herpès simplex (30), et la glycoprotéine X du virus pseudorabique a été insérée dans le virus de l'herpès simplex (31).
Ces cas limités de délétion et d'insertion de gènes dans les herpès virus démontrent qu'il est possible de soumettre à des manipulations génétiques des génomes d'herpès virus par des techniques d'ADN recombinant. Les procédés qui. ont été utilisés pour insérer les gènes comprennent une recombinaison homologue entre l'ADN viral cloné sur des plasmides et l'ADN viral purifié introduit par transfection dans la mème cellule animale. Dans l'ensemble, cela est désigné sous le nom de la technique de recombinaison homologue. Cette technique, avec des modifications mineures, a pu être adaptée à d'autres herpès virus que l'on a soumis à des manipulations génétiques. Cependant, le degré auquel on peut généraliser l'emplacement de la délétion et les sites d'insertion de gènes étrangers n'est pas évident d'après ces études antérieures.
De plus, il n'est également pas évident que des herpès virus d'animaux autres que des primates soient susceptibles d'être soumis aux mêmes techniques que les herpès virus de primates, et que l'on puisse établir une voie déterminée pour la délétion, l'insertion et l'expression de gènes étrangers.
Le virus de la rhinotrachéite infectieuse bovine (RIB), un herpès virus alpha ayant un génome de classe D, est un agent pathogène important des bovins.
Il a été associé à des maladies respiratoires, oculaires, de l'appareil reproducteur, du système nerveux central, entériques, néonatales et cutanées (37). Les bovins sont les hôtes habituels du virus RIB; cependant, celui-ci infecte également les chèvres, les porcs, les buffles kérabau , les gnous, les visons et les furets. Des infections expérimentales ont été effectuées chez les cerfs à queue noire, les chèvres, les porcs, les furets et les lapins (38).
Des vaccins à virus vivant modifiés classiques ont été largement utilisés pour lutter contre des maladies provoquées par le RIB. Ces virus des vaccins peuvent présenter, cependant, une réversion de virulence. Plus récemment, des vaccins à virus RIB tué ont été utilisés, mais leur efficacité se révèle marginale.
Le RIB a été analysé au niveau moléculaire de la manière étudiée dans (39). Une carte de restriction du génome est disponible dans cette référence, qui facilitera la manipulation génétique du RIB suivant les procédés proposés par la présente invention. Il n'a été présenté aucune preuve que le RIB a été soumis à une manipulation génétique afin de contenir une délétion ou une insertion d'ADN étranger.
Le virus de la maladie de Marek (VMM) provoque une paralysie de la volaille, une maladie lymphoproliférative courante chez les poulets. La maladie survient le plus souvent chez de jeunes poulets âgés de 2 à 5 mois. Les signes cliniques caractéristiques sont une paralysie progressive d'une ou plusieurs des extrémités, une incoordination due à une paralysie des pattes, un affaissement des membres dt à une atteinte des ailes, et un affaissement de la tête dû à une atteinte des muscles du cou. Dans les cas aigus, des affaissements graves peuvent survenir. Dans le cas des souches extrêmement oncogènes, il existe une atrophie caractéristique des bourses et du thymus. En outre, il existe des tumeurs lymphoides affectant les gonades, les poumons, le foie, la rate, les reins et le thymus (37).
Tous les poussins sont vaccinés contre le VMM à l'âge d'un jour afin de les protéger leur vie durant contre le VMM. Une méthode de vaccination contre le VMN comprend l'utilisation d'herpès virus de dindon (HVD). Il sera.it avantageux d'incorporer d'autres antigènes à cette vaccination à l'âge d'un jour, mais les efforts pour associer des vaccins n'ont pas donné de résultats satisfaisants à ce jour en raison d'une compétition et d'une immunosuppression entre les agents pathogènes. Les vaccins multivalents produits par génie génétique dans la présente invention constituent une voie nouvelle pour la vaccination simultanée contre un certain nombre d'agents pathogènes différents.