INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
Pour le second fragment d'ADN, on peut mentionner tout fragment d'ADN dérivé d'un vecteur d'un système hote-vecteur qui est habituellement employé dans la technique d'ADN recombinant. Pour ce fragment d'ADN on peut mentionner, par exemple, un fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est utilisée comme hôte, un fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où Escherichia coli est utilisé comme hôte, un fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où Bacillus subtilis est utilisé comme hôte, et analogues.Pour la bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique ci-dessus mentionnée, on peut mentionner une bactérie appartenant au genre Corynebacterium, une bactérie appartenant au genre Brevibacterium et une bactérie appartenant au genre Microbacterium. Pour le fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique est utilisée comme hôte, on peut mentionner, par exemple, des fragments d'ADN dérivés de pAG1, pAG3, pAG14, pAG50 et pAG103. Le plasmide pAG1 peut être obtenu du micro-organisme Corynebacterium melassecola 22243 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-560. Le plasmide pAG3 peut être obtenu de Corynebacterium melassecola 22220 déposé au FRI sous le numéro d'accession FERM BP-559.Le plasmide pAG14 est un dérivé par délétion du plasmide pAG1. Le plasmide pAG50 comprend une partie du plasmide pAG14 et une partie du plasmidepAG3. Le plasmide pAG103 comprend un plasmide pBR325 scindé par EcoRI et un fragment d'ADN, dérivé de Corynebacterium melassecola 801 (FERM BP-558), contenant un gène codant pour la glutamate déshydrogénase et ayant une longueur moléculaire d'environ 5,4 kb. Les méthodes d'obtention de ces plasmides seront décrites dans les exemples ci-dessous. Les cartes de scission par endonucléase de restriction des plasmides pAG103, pAG1, pAG3, pAG14, pAG50 sont montrées aux figures 3, 6, 7, 8 et 9 respectivement.Comme fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur ou Escherichia coli est utilisé comme hôte, on peut mentionner par exemple, des fragments d'ADN dérivés du plasmide pBR325. Comme fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où Bacillus subtilis est utilisé comme hôte, on peut mentionner par exemple des fragments d'ADN dérivés du plasmide pUB110.
L'ADN recombinant-de la présente invention peut être préparé par ligature du premier fragment d'ADN directement au second fragment d'ADN. Alternativement, 1'ADN recombinant de la présente invention peut être préparé par ligature du premier fragment d'ADN indirectement au second fragment d'ADN par un autre type de fragment d'ADN. Pour préparer 1'ADN recombinant, on peut employer un système habituel hSte-vecteur. Comme système hôte-vecteur, on peut mentionner, par exemple, un sytème hôte-vecteur utilisant E. coli comme hôte, un système hôte-vecteur utilisant Bacillus subtilis comme hôte, un système hôte-vecteur utilisant une bactérie corynéforme produisant l'acide glutamique comme hôte, etc...
Pour l'ADN recombinant comprenant le premier fragment d'ADN et le second fragment d1ADN, on peut mentionner, par exemple, les plasmides pAG203, pAG211, pAG204, pAG22î, pAG2001, pAG2002, etc... . Le plasmide pAG203 comprend, comme premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN (III) ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 5,5 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide pBR325 scindé par PstI. Le plasmide pAG211 comprend, pour le premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN (IV) ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide scindé par SalI.Le plasmide pAG204 comprend, pour le premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide pAG103 scindé par XbaI. Le plasmide pAG221 comprend, pour le premier fragment d'ADN, le fragment d'ADN ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide scindé par XbaI dérivé du plasmide pBR325. Le plasmide pAG2001 comprend, pour le premier fragment drADN, le fragment d'ADN (VI) ayant une longueur moléculaire d'environ 3,3 kb et pour le second fragment dlADN, un plasmide pAG50 scindé par SalI.Le plasmide pAG2002 comprend, pour le premier fragment d'ADN1 le fragment d'ADN ci-dessus mentionné ayant une longueur moléculaire d'environ 11,5 kb et pour le second fragment d'ADN, un plasmide pAG50 scindé par XbaI.
L'ADN recombinant ci-dessus mentionné de la présente invention peut être modifié en changeant-la séquence des bases d'au moins un site de restriction de l'ADN recombinant de façon que l'enzyme de restriction efficace pour scinder le site de restriction soit changé en un type différent d'enzyme de restriction, tout en retenant le gène intact codant pour PEPC et le gène pour la réplication.
Le micro-organisme de la présente invention comprend une bactérie et un ADN recombinant qui comprend un fragment d'ADN contenant un gène codant pour PEPC et un fragment d'ADN contenant un gène pour la réplication.
L'ADN recombinant est contenu dans la bactérie.
Comme ADN recombinant, on utilise l'ADN recombinant ci-dessus mentionné de la présente invention.
Pour la bactérie, on peut mentionner, par exemple, les souches connues de Escherichia coli et les bactéries corynéformes produisant l'acide glutamique ci-dessus mentionnées.
Le micro-organisme de la présente invention est préparé en transformant la bactérie par 1'ADN recombinant au moyen d'une technique habituelle d'ADN recombinant.
Comme micro-organisme de la présente invention, on peut mentionner, par exemple, la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG203), la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG211), la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG204), la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG221), Corynebacterium melassecola 801 (pAG2001), Corynebacterium melassecola 801 (pAG2002), etc... . La souche 342-167 de E. coli K12 (pAG203), la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG211), la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG204) et la souche 342-167 de E. coli K12 (pAG221) sont préparées en transformant des cellules de la souche 342-167 de E. coli K12 par les plasmides ci-dessus mentionnés pAG203, pAG211, pAG204 et pAG221, respectivement.La souche 342-167 de E. coli K12 peut être publiquement disponible au E. coli Genetic Stock Center, Department of Human Genetics, Université de Yale, Ecole de médecine, E.U.A.
Corynebacterium melassecola 801 (pAG2001) et Corynebacterium melassecola 801 (pAG2002) sont préparés par transformation de cellules de Corynebacterium melassecola 801 par les plasmides pAG2001 et pAG2002 ci-dessus mentionnés, respectivement. Corynebacterium melassecola 801 est, comme on l'a mentionné ci-dessus, déposé au Fermentation Research Institute sous le numéro d'accession FERM BP-558 et est disponible au Fermentation Research Institute.
Lorsque le fragment d'ADN de la présente invention est inséré dans un vecteur pour un système hôte-vecteur où une bactérie appartenant au genre Corynebacterium est utilisée comme hôte pour former un ADN recombinant, et que 1'ADN recombinant ainsi formé est transféré dans une bactérie appartenant au genre Corynebacterium, la capacité de production de PEPC de la bactérie peut être améliorée et la bactérie peut y produire PEPC à un haut rendement. Comme on l'a précédemment mentionné, les réactions dans le cycle TAC sont favorisées par l'action de PEPC pour former des acides organiques comme intermédiaires. A partir des intermédiaires ainsi formés, divers acides aminés, acides nucléiques souhaités et autres sont produits.Par conséquent, par mise en culture de la bactérie ayant une capacité améliorée de production de PEPC, de tels acides aminés, acides nucléiques et autres, peuvent être produits à haut rendement. En effet, le fragment d'ADN de la présente invention est utile pour obtenir une bactérie produisant l'acide glutamique appartenant au genre Corynebacterium, laquelle bactérie est capable de produire des acides aminés, des acides nucléiques, etc, à un haut rendement.
L'ADN recombinant de la présente invention présente les avantages suivants.
Lorsque le second fragment d'ADN de l'ADN recombinant est un fragment d'ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où une bactérie appartenant au genre Corynebacterium est utilisée comme hôte, 1'ADN recombinant de la présente invention peut être avantageusement employé pour transformer une bactérie appartenant au genre Corynebacterium pour obtenir la bactérie ci-dessus mentionnée appartenant au genre Corynebacterium ayant une excellente capacité de production placides aminés, d'acides nucléiques, etc...
Par ailleurs, lorsque le second fragment d'ADN de l'ADN recombinant est un ADN contenant un vecteur pour un système hôte-vecteur où l'on utilise, comme h8te, une bactérie autre que celle appartenant au genre Corynebacterium, comme une bactérie appartenant aux genres Escherichia, Bacillus, Brevibacterium, Microbacterium, etc..., l'ADN recombinant de la présente invention peut être avantageusement employé pour la multiplication du fragment d'ADN de la présente invention.
Une application de ce genre est décrite dans l'article intitulé : "P2CCD in 60 Hz oscilloscope with digital image storage" de H. DOLLEKAMP, L. ESSER, H. De JONG, PHILIPS Tech. Rev. (1982) vol.
40, nO 2/3, pages 55 à 68. I1 y est décrit un oscilloscope utilisant des dispositifs à transfert de charges pour effectuer ltéchantillonnage et la mémorisation du signal d'entrée. Un dispositif à transfert de charges est un registre à décalage pour des signaux analogiques. Sous sa forme la plus simple, il est formé d'un substrat monocristallin semiconducteur sur lequel sont placés différentes électrodes isolées du substrat par des couches d'oxydes.
Le substrat est généralement du silicium et l'isolant est de l'oxyde de silicium. Sous chaque électrode apparaissent des paquets de charges, celles-ci étant injectées à l'aide d'un contact électrique sous le contrôle d'une horloge. Le dispositif à transfert de charges stocke les charges puis les transfère tout en gardant les paquets de charges isolés les uns des autres. Selon les technologies utilisées ceci nécessite de trois à quatre électrodes consécutives pour former un élément mémoire. Sur ces électrodes sont appliqués des signaux d'horloge dont la tension varie périodiquement et qui ont trois ou quatre phases selon le nombre d'électrodes. I1 se crée ainsi des puits de potentiel sous chaque électrode produisant le mécanisme de transfert d'une électrode vers la suivance.Cependant, il y a lieu d'assurer une grande capacité de stockage de charges et de réduire les effets des états du surface. Pour cela la plus grande partie de la charge est transférée dans une zone à dopage élevé près de la surface sous l'action du champ électrique auto-induit et le reste des charges est transféré dans une zone plus profonde du cristal à dopage plus faible sous l'action d'un champ électrique externe. I1 s'agit alors d'un dispositif à transfert de charges péristaltique (PCCD) qui peut encore avoir un rendement de transfert amélioré en effectuant un dopage profilé pour diminuer le rôle des états de surfaces. On obtient alors un dispositif à transfert de charges péristaltique profilé (P2CCD). Ces dispositifs ont un rendement de transfert atteignant 0,999999 et une fréquence maximale d'horloge de 1,5 GHz.
Les circuits pour la génération des quatre horloges d'un dispositif P2CCD à quatre phases doivent donc délivrer des signaux ayant des transitions très rapides entre les niveaux de tension et ceci pour des charges capacitives qui sont importantes. Ainsi l'article cité indique que la fréquence maximale qu'il a été possible d'atteindre en pratique a été de 180 MHz pour une structure à quatre phases, à cause des charges capacitives entre les électrodes.
Pour générer ces horloges une solution classique consiste à utiliser un circuit push-pull PNP-NPN fonctionnant en classe B. Mais un tel circuit peut se mettre à osciller lorsqu'il pilote des charges capacitives. I1 s'avère alors nécessaire de placer une résistance de faible valeur en série avec l'émetteur du transistor complémentaire pour éviter que l'étage ait une résistance d'entrée négative.
D'autre part, les fréquences de transition des deux transistors complémentaires ne sont pas identiques. I1 s'ensuit que la fréquence maximale d'un tel circuit est limitée.
On peut également utiliser un circuit totem-pôle. Mais celui-ci présente les mêmes inconvénients que le circuit précédent avec en outre un problème de saturation du transistor relié au potentiel le plus négatif.
Dans ces deux cas les fréquences maximales atteintes restent trop basses et les consommations sont élevées.
Ceci est tout à fait insuffisant pour certaines appli cations en particulier pour 1' oscilloscopie numérique.
Le but de l'invention est ainsi de faire fonctionner les dispositifs à transfert de charges dans une gamme élevée de fré quences, pr-oche de leur fréquence maximale, en déterminant des circuits rapides de commande d'horloges à très faible consommation et qui soient beaucoup plus rapides que les solutions connues pour une impédance de charge donnée.
Pour cela le circuit de sortie, selon l'invention, tel que défini dans le préambule est remarquable en ce qu'il comprend deux transistors à effet de champ, à canal N, à l'arséniure de gallium, montés en drain commun, les sources étant réunies séparément aux deux bornes d'un générateur de tension continue, les deux transistors étant rendus alternativement conducteur ou non-conducteur par des moyens de commande appliqués sur valeur grille, les charges capacitives ou résistives étant connectées à la jonction des drains.
Selon un premier mode d'application, ce circuit de sortie est utilisé pour générer les signaux d'horloges d'un dispositif à transfert de charges utilisé pour l'acquisition et la mémorisation analogique de signaux exploités par exemple en oscilloscopie numérique ou pour stocker temporairement les signaux d'images tels que les signaux de ligne et de trame d'une image de télévision.
Selon un second mode d'application, ce circuit de sortie est utilisé pour délivrer les signaux contrôle ou d'adressage de mémoires numériques rapides pour lesquelles les vitesses de fonctionnement et les charges capacitives sont élevées.
En oscilloscopie numérique le fonctionnement du dispositif à transfert de charges se décompose en deux étapes. Pendant une première étape le dispositif à transfert de charges effectue l'opération de chargement comprenant l'acquisition et le stockage des échantillons du signal sous la forme de paquets de charges. A l'issue de cette étape une seconde étape, appelée opération de transport, consiste à extraire ces charges c'est-à-dire à transporter les échantillons du signal.
L'opération de chargement se fait à des fréquences typi quement de l'ordre de 350 MHz et la partie du dispositif à transfert de charges concernée par l'acquisition, ctest-à-dire la zone d'acquisition, représente une charge capacitive de l'ordre de 5pF. Mais lorsque les paquets d'échantillons sont acquis il faut immédiatement les stocker dans la zone de stockage du dispositif à transfert de charges.
Cette opération de stockage s'effectue simultanément et à la même fréquence que l'opération d'acquisition. Mais la charge capacitive de la zone de stockage est beaucoup plus élevée, par exemple de l'ordre de 50pF pour un dispositif à transfert de charges à 4 phases. Ceci indique que c'est la capacité de la zone de stockage qui limite les performances de ltopération de chargement.
dans tous les cas ne concernent pas l'invention.
Le dispositif coupe-fil 1 est représenté isolé à la Fig.3 et il est formé extérieurement par un boitier rigide 8 métallique qui comporte intérieurement un tube de sortie 9 s'étendant depuis l'extrémité 8a du boitier 8
jusqu'à une bouche d'aspiration 10 située dans le boi-
tier 8 et face à la surface de travail 3, dans une posi-
tion telle qu'elle se trouve le long du tissu 7 à coudre lorsque ce dernier avance au-delà de la plaque à aiguille
4. Un groupe de soufflage alimenté en air comprimé commu-
nique avec la bouche d'aspiration 10 par l'intermédiaire d'un tube approprié lOd. Le groupe de soufflage peut être construit de différentes façons, mais se termine en tous
cas par une buse 11 pour l'air comprimé, située à une ex-
trémité de la bouche d'aspiration 10, en particulier à
l'extrémité de celle-ci qui est la plus éloignée de l'extré-
mité 8a du boitier 8.
Il est également prévu un second groupe de souf-
flage (non représenté au dessin) qui comporte une seconde buse séparée 12 disposée à une seconde extrémité 8b du boitier 8, opposée à l'extrémité 8a. La seconde buse 12 est dirigée vers le tissu entrant 7 toujours situé sur la plaque à aiguille 4. La buse ll est dirigée dans le sens opposé à la seconde buse 12: elle fournit un jet d'air comprimé suivant le tube de sortie 9 dans la direction de
l'extrémité 8a du boitier 8.
La bouche d'aspiration 10 loge également un orga-
ne de coupe 13 constitué par une lame qui peut osciller d'un côté à l'autre au moyen d'une manivelle 14 (Fig.2)
La détermination de la . Lonpssitivn physico chimique adéquate des milieux de culture a posé des problèmes aux biologistes ; ceux-ci se sont en outre efforcés de simplifier, d'améliorer les résultats en fonction des impératifs divers de ces méthodes et surtout de rendre compatible des échantillons disparates, tant du fait de leur nature même que de leur taille (milieux hétérogènes, cultures impures, échantillons solides, échantillons liquides sous de grands volumes...). La filtration sur membrane a été largement accueillie à cet effet il y a une trentaine d'années.
Il s'agit là maintenant d'une technique courante, d'une extreme souplesse, rapide, et que les progrès dans la technicité des membranes ont conduit à promouvoir.
L'application, en biologie, de cette technique de filtration sur membrane, se heurte pourtant à certains problèmes; elle est en effet tributaire de la compatibilité au monde vivant, de la qualité, du comportement et des propriétés des composants de ces membranes, ainsi que de la taille de leurs pores pour les membranes de type écran (le diamètre de ces derniers, au niveau du film poreux exerçant la sélection de la membrane filtrante, doit en effet être toujours strictement inférieur à la taille de la particule, molécule, virus ou cellule, que l'on veut retenir).
On a ainsi volontiers reconnu les incompatibilités présentées lors de l'emploi de membrane, présentant par exemple des phénomènes d'adsorption ou d'absorption à diverses substances particulaire, moléculaire, ionique, et/ou de nature hydrophobe, et/ou se comportant comme une barrière plus ou moins importante à l'interaction cellule - milieu de culture, et rendant ainsi impossible la réalisation de tests, qu'il s'agisse de tests cytologiques, physicochimiques, biochimiques, immunologiques ou tous autres. On a de plus constaté que souvent, dans le cas de populations denses, des membranes réputées utilisables sans limitation ne permettaient pas la réalisation quantitative du volume d'échange qui eut été nécessaire afin de satisfaire tous les individus présents en croissance; le phénomène de cavitation illustre bien les problèmes rencontrés en bactériologie.
L'inventeur, au cours des nombreuses recherches qu'il a effectuées dans ce domaine, a découvert de façon surprenante une catégorie de membranes compatibles avec le monde vivant des pro- et eucaryotes, et se comportant avec une neutralité exceptionnelle, sans aucun phénomene perturbateur, faisant apparaître les colonies cellulaires de façon identi que à ce que l'on obtient au cours d'un processus classique à partir d'une culture effectuée directement au sein ou sur la surface d'un milieu nutritif, et dont les performances intrinsèques permettent des échanges importants pour des populations particulières ou des suspensions denses, tant en qualité qu'en quantité.
C'est ainsi que l'invention a pour objet l'application en biologie des pro- et eucaryotes de membranes filtrantes polymériques composites du type écran, utilisables en micro ainsi qu'en ultrafiltration, ledit polymère étant coulé sur un support, chimiquement inerte, et accepté sans perturbation par les cellules vivant à son contact, sa structure ne présentant pas de phénomène d'absorption, d'adsorption, ni de rétention sélective (donc d'une neutralité d'imprégnation totale) à la fois pour des substances susceptibles d'exercer des effets inactivateurs, inhibiteurs statiques, ou mortels et pour les diverses molécules assurant des échanges en son travers. Ainsi satisfont-elles, quelque soit la densité ou la nature de la population, à la consommation des individus présents.En d'autres termes, sa sélection s'exerce uniquement au niveau de la taille des particules filtrées par rapport à l'ouverture des pores.
Sachant qu'il est en effet admis que l'importance des échanges que l'on peut considérer à travers une membrane "théorique" (ctest-à-dire parfaite) de type écran entre la face filtrante, côté film poreux calibré, et le dessous de ladite membrane (donc sa surface opposée) est fonction à la fois du diamètre des pores côté film (sélectionnant directement les particules suivant leur taille) et du nombre de pores par unité de surface : ceci est particulièrement surprenant. D'autant, comme le font apparaître des examens en microscopie électronique à balayage, que le nombre de pores par unité de surface est tout à fait inférieur, au pire égal, à celui constaté sur des membranes classiques du commerce (telles les membranes en polycarbonate ou en acétate de cellulose qui, comme le démontreront plus loin les exemples, ne permettent en aucune façon d'obtenir des résultats comparables), que la porosité utilisée est inférieure à 0,2 um et que le polymère est de par sa nature légèrement hydrophobe. Sa résistance aux acides et bases, forts ou faibles, est bonne, dans les concentrations faibles ou moyennes, à température normale.
Les matériaux sont compatibles avec la plupart des solvants organiques, sauf solvants chlorés ou aprotiques (type DMAC diméthylacétamide DMS0 diméthylsulfoxyde) qui, à faible température, s'absorbent (et provoquent un gonflement de la membrane). A haute température, ils solubilisent le polymère.
La membrane résiste jusqu'à 1200C (en chaleur sèche comme humide) et présente peu de réaction à l'exposition des rayonnements ionisants (à une dose de 2,5 mégarads).
Son débit à l'eau, supérieur à celui d'autres membranes, en particulier de membranes de la même catégorie, se situe aux environs de 20.000 litres/jourlm2, dans des conditions d'ultrafiltration, ce débit pouvant être presque décuplé dans des conditions de microfiltration En somme, le phénomène de cavitation ne se constate pas avec les membranes selon l'invention.
Il faut enfin souligner que les membranes selon l'invention sont mincesl0,3 mm environ) et particulièrement souples, tout en étant rémiz tantes à la déchirure, aux pliures et étirements, à la pression et qu'elles ne sont pas ioniques ; elles ne présentent donc pas de phénomènes électrostatiques au contact des surfaces métalliques.
Un exemple particulier des membranes selon l'invention est constitué par les membranes prochainement commercialisées sous la dénomination CPMO2.
La présente invention sera mieux comprise d'ailleurs et ses avantages ressortiront bien des exemples qui suivent, réalisés avec la membrane prochainement commercialisée sous la référence Cl'M02 Dans tous les exemples décrits ci-après, la membrane selon l'invention est découpée en disques de 50 mm de diamètre. Ces disques sont ensuite stérilisés soit par petits groupes, soit à l'unité en présence d'un peu d'eau déminéralisée-distillée. Le facteur stérilisant est soit l'autoclavage (le récipient étant alors une boîte de Pétri en verre) effectué pendant 20 minutes à 1200C (en chaleur humide), soit la radiostérilisation par exposition aux rayonnements ionisants Zf , en sachets polyéthylène thermosoudé, et à une dose minimale de 2,5 Mrad.