INPI-France/Brevets-Francais-2024-Chunked huggingface dataset:
En ce qui coricerne la séquence d'ADN codant pour l'enzyme d inactivation, on peut avoir recours à toute séquence apte à synthétiser une enzyme douee de propriétés d'inactivation vis-à-vis de l'antibiotique qui sera mis en oeuvre dans le milieu de culture utilisé pour opérer la sélection des cellules auxquelles aura été incorporté le marqueur génétique. Dans le cas où l'antibiotique incoroporé au milieu est constitué par l'antibiotique G 418, il est avantageux d'avoir recours aux enzymes de ptlosphorylation du type APH(39 déjà mentionné.
Il va naturellement de Soi que l'on peut avoir recours à lous autres types de séquences d'ADN synthetisant une enyme ayant une capacité d'inactivation analogue de l'antibiotique,. par exemple par acétylation des fonctions hydroxyle correspondantes de l'antibiotique. La séquence d'ADN du genre en question peut provenir de toute source appropriée.On peut par exemple substituer au transposon Tn5 susmentionné, le transposon Tn601(903) mentionné par JIMENEZ et DAVIES, ou tout autre gène de résistance à des antibiotiques susceptible d'interagir avec l'antibiotique de sélection utilisé dans le milieu de culture, le cas échéant après avoir établi au préalable la carte de restriction du gène de résistance en question, notamment pour en isoler la séquence d'ADN codant spécifiquement pour l'enzyme d'inactivation. L'intérêt de disposer plus spécifiquement de la séquence codant pour l'enzyme résultera des explications données ci-après, en ce qui concerne les marqueurs génétiques préférés de l'invention.
Naturellement, on peut également avoir recours à des séquences homologues au gène susdit, notamment à des cADN résultant de la transcription chimique ou enzymatique d'ARN messagers correspondants.
Conformément à une caractéristique préférée supplémentaire de l'invention, les premières paires de nu- cléotides de la séquence d'ADN codant pour l'APH(3') ou analogue sont rendues aussi proches que possible des dernières paires de nucléotides du promoteur dans la direction de la transcription, notamment à une distance,expri- mée en nombre de paires de nucléotides,inférieure à 1.000, de préférence encore à 500, voire même inférieure à 100 paires de nucléotides. Il a en effet été constaté que la réduction de cette distance > notamment par le recours à des délétions appropriées, avait pour effet une considérable augmentation du rendement de transformation, comme cela apparaitra au cours de la description plus loin de marqueurs préférés conformes à l'invention.
De préférence encore les ADN marqueurs de l'invention contiennent également, en aval du gène de 1'APH(3') un site de polyadénylation, celui-ci étant de préférence également rendu aussi proche qu'il est possible, de la dernière paire de nucléotides du gène codant pour l'APH(3'). De préférence, la distance exprimée en nombre de paires de bases entre l'extrémité de ce dernier gène et, soit le site de polyadénylation, soit les codons stop" de traduction de ce gène,est est inférieure à 1.000, de préférence à 500 paires de bases, voire même encore inférieure à 100 paires de bases.
Le rendement de marquage peut encore être accru si l'on confère à l'ADN marqueur une origine eucaryote de réplication par incorporation d'un fragment le contenant, tel que par exemple les fragments répétitifs de l'ADN du virus connu sous la désignation "virus de l'herpès Saimiri". L'existence de formes épisomales de ce virus et de sous-unités d'ADN de 1,4 kilobases en formes multimères dans des génomes correspondants défectifs donnent à penser que ces sous-unités contiennent une origine de réplication.
Des marqueurs préférés selon l'invention sont obtenus par modification des plasmides pAGO ou pFG5, eux-mêmes dérivés de pBR322. Le plasmide pAGO est préféré en ce qu'il comporte > outre un gène TK, deux facteurs de résistance supplémentaires à l'ampicilline et à la tétracycline. On a représenté schématiquement la structure de pAGO dans la figure 1 des dessins. Y sont notamment représentés schématiquement le gène TK par un arc de cercle en traits interrompus et divers sites de restriction plus particulièrement mis à profit dans la construction de marqueurs préférés conformes à l'invention dont la description sera fournie plus loin. La flèche tr du gène TK donne le sens de la transcription. Le point 0 correspond au site EcoRI de ce plasmide.Les sites EPR et PAS correspondent aux positions de la région du promoteur du gène TK et du site de polyadénylation du gène TK respec vivement Les marqueurs génétiques préférés selon l'inven- tion sont ceux qui résultent de la recombinaison de pAGO et du transposon Tnf (décrite par JORGENSEN, R.A., ROTHSTEIN, S.J. et REZNIKOPF, W.S. (1979) "Molec. Gen.
Genets 177, 65-72), dont la figure 2 fournit une représentation schématique et qui ont été obtenus à partir du plasmide bactérien ColEl Tn5 contenu dans la souche de E. coli GM4pHN5 déposée à la Collection Nationale de Culture de Micro-organismes le 2 mars 1981 sous le n I-149.
L'antibiotique préféré mis en oeuvre dans les procédés de détection sus-indiqués est certes constitué par l'antibiotique G4î8 dont a été reconnue la capacité de pénétrer dans la plupart des cellules eucaryotes et de les détruire par un processus toxique. il va naturellement de soi que l'on pourra utiliser un autre antibiotique, pour autant qu'il se révèle toxique de la même façon à l'égard du type de cellules eucaryotes qui seront mises en oeuvre dans le procédé de détection qui leur sera alors appliqué dans les conditions de l'invention. Bien entendu, le marqueur correspondant devra comporter en conséquence une séquence d'ADN apte à synthétiser une enzyme d'inactivation susceptible d'inhiber plus particulièrement l'antibiotique choisi.
L'isomérisation est vérifiée par étude du spectre de 1H de RMN.
On obtient le produit recherché 12 de formule avec une stéréochimie Z/E = 25/75.
Exemple 7b Oxydation du propénylphosphonate de diéthyle 12 Dans les mêmes conditions d'oxydation que précédemment, on a réalisé l'oxydation d'un mélange cis/trans 50/50 du propényl phosphonate de diéthyle 12 en béta-cétophosphonate 3.
Les résultats obtenus sont illustrés à la figure 2, laquelle est un diagramme analogue à celui de la figure 1 et représente l'évolution de la réaction d'oxydation. En ordonnées sont portés les pourcentages en poids du cétophosphonate 3 formé (courbe 1), du cis-phosphonate 12 restant après réaction (courbe 2) et du trans-phosphonate 12 ayant réagi (courbe 3). Le temps t (en heures) est porté en abcisses.
On a effectué d'autres essais analogues à l'exemple 7b mais en partant de mélanges de propénylphosphonates 12 ayant des rapports E/Z différents, par exemple E/Z = 3/1. On a remarqué que la vitesse de réaction est plus rapide sur le dérivé cis que sur le dérivé trans.
EXEMPLES 8 à 11 On a opéré dans des conditions analogues à celles de l'exemple 7b, en traitant d'autres phosphonates alpha,béta éthyléniques de formule I où n = O. Les résultats obtenus sont rassemblés dans le tableau II. Pour simplifier l'écri- ture des formules, on a représenté par le symbole abrégé Y le groupe
TABLEAU II Oxydation des phosphonates alpha, béta-éthyléniques
temps de: Résultats Phosphonates :Phosphonates alpha,béta- temps de: Résultats :Ex:éthyléniréaction: N0: : Stéréochimie : =850C: dationRdt dation % E Z 1 :8 : 13 YCH=CH2 : 5 h :14 YCH2CHO 100 85 . . .
:9 : 12 YCH=CHCH3 50 50 : 20 h :3 YCH2CCH3 100- 80 tr : O :10 : 12 " 75 25 : 30 h : " " 100 78 . .
:11 : 15(CH3O)2PCH=CHCH3 80 20 : 32 h :16 :11 : -(1 80 20 : tCH ,PCHZCOCHQ . O : : : : . : O 100 25 On constate que l'oxydation du phosphonate 13 (formule I où R= C2H5, n=O; R'= H) conduit à l'obtention de 1'aldophosphonate 14 très rapidement et dans d'excellentes conditions.
Dans le cas du propényl phosphonate 12, on constate que, suivant le mélange E/Z de départ, le temps de la réaction augmente quand le rapport E/Z croît. La réaction est totalement sélective en béta-cétophosphonate.
Avec le phosphonate 15, le rendement en béta-cétophosphonate 16 est faible. Les produits d'hydrolyse sont difficiles à mettre en évidence dans la solution cuivrique utilisée.
Dans ce cas,on peut mettre en oeuvre une variante qui est décrite à l'exemple 12.
EXEMPLE 12 Oxydation du propényl phosphate de diméthyle 15 Dans un tricol muni d'une vive agitation, d'un thermomètre et d'un réfrigérant, on place 250 ml d'une solution aqueuse de 0,2 g de chlorure de palladium, 3,6g (84 mmoles) de chlorure de lithium et de 3g (27 mmoles) de p. benzoquinone. Après 1/4 h d'agitation, on ajoute le phosphonate 12 obtenu précédemment par isomérisation de 3,75 g (25 mmoles) d'allylphosphonate de diméthyle par O,lOg de tertiobutylate de potassium.
On chauffe sous agitation à 650 C. La réaction est suivie par chromatographie en phase gazeuse (8colonne = 130"C).
Au bout de 26 h, tout le phosphonate éthylénique est oxydé.
C. Construction du plasmide pBH20 On modifie le plasmide pBH10 pour éliminer le site EcoRI distal de l'opérateur lac. On effectue ceci par coupure préférentielle par l'endonucléase EcoRI au site distal, en utilisant une protection partielle par l'ARN-polymerase de l'autre site EcoRI placé entre les promoteurs Tcr et lac, qui sont seulement séparés par 40 paires de bases Après fixation de l'ARN-polymérase, on fait digérer 1'ADN (5 pg) avec EcoRI (1 unité) dans un volume final de 10 p1 pendant 10 minutes à 370 C. On arrête la réaction en chauffant à 650C pendant 10 minutes.On fait digérer les terminus cohésifs EcoRI par la nucléase S1 dans un tampon 25 nb! d'acétate de sodium à pH 4,5, 300 mM de NaCl, 1 mM de ZnCl2 à 250C pendant 5 minutes. On arrête la réaction par addition d'EDTA (10 mM à la fin) et du tampon Tris-HCl de pH 8 (50 mM à la fin). On extrait 1'ADN par un mélange de phénol et de chloroforme, on le précipite avec de l'éthanol et on le remet en suspension dans 100 l de tampon de ligature de T4 ADN. On ajoute 1 p1 de T4 ADN-ligase et l'on fait incuber le mélange à 120C pendant 12 heures. On transforme l'ADN ligaturé dans la souche de E. coli RR1, et l'on sélectionne les transformants AprTcr sur un milieu X-gal-antibiotique.L'analyse par des enzymes de restriction de 1'ADN sélec tionné à partir de 10 colonies bleues isolées révèle que ces clones portent l'ADN de plasmide avec un site EcoRi. Sept des trois colonies ont conservé le site EcoRI placé entre les promoteurs lac et Tcr. La séquence de nucléotides allant du site EcoRI vers la zone de commande lac de l'un de ces plasmides, pBH20, a été confirmée.
On utilise ensuite ce plasmide pour cloner le gène de la somatostatine.
D. Construction du plasmide pSOM 1 On fait digérer 20 g du plasmide pBH20 totalement par des endonucléases de restriction EcoRI et BamHI dans un volume final de 50 pl. On ajoute de la phosphatase alcaline bactérienne (0,1 unité de Worthington BAPF) et on poursuit l'incubation pendant 10 minutes à 650C. On arrête les réactions par extraction par un mélange phénol-chloroforme et on précipite l'ADN avec 2 volumes d'éthanol, on le centrifuge et on le dissout dans 50 p1 de 10 mM de Tris-HCl de pH 7,6 et de 1 mM d'EDTA.Le traitement par la phosphatase alcaline empêche effectivement l'auto-ligature de 1'ADN de pBH20 traité par EcoRI et BamHI, mais il peut encore se former par ligature des plasmides recombinants circulaires contenant 1'ADN de la somatostatine. Comme E. coli RR1 est transformé avec une efficacité très faible par 1'ADN de plasmide linéaire, la majorité des transformants contiendront des plasmides recombinants. On ligature 50 ul d'ADN de somatostatine (4 Vg/ml) avec 25 l de 1'ADN de pBH20 traité par la phosphatase alcaline et par BamHI et EcoRI dans un volume total de 50 pl contenant 20 mM de Tris-HCl de pH 7,6, 10 q de MgCl2, 10 mM de dithiothréitol, 0,5 mM d'ATP et 4 unités de T4 ADN-ligase à 220C.Après 10, 20 et 30 minutes on ajoute de 1'ADN de somatostatine supplémentaire (40 ng) au mélange réactionnel (l'addition progressive de 1'ADN de somatostatine peut favoriser la ligature sur le plasmide par rapport à 1 t auto-ligature). On poursuit la ligature pendant une heure, puis on dialyse le mélange vis-à-vis de 10 mM de Tris-HCl pH 7,6. Dans une expérience témoin, on ligature de 1'ADN de pBH20 traité par la phosphatase alcaline, par BamHI et par EcoRI, en l'absence d'ADN de somatostatine dans des conditions similaires.
On utilise les deux préparations sans autre traitement pour transformer E. coli RR1. On effectue les expériences de transformation dans un équipement P3 (National Institutes of Health, U.S.A., Recombinant DNA Research Guidelines, 1976). On sélectionne les transformants sur des plaques de milieu minimal contenant 20 pg/ml dWAp et 40 pg/ml de X-gal. On isole dix transformants qui sont tous sensibles à Tc. Pour des raisons de référence, on les appelle pSOM1, pSOM2, etc... pSOM10. Dans l'expérience témoin, on n'obtient pas de transformants. Quatre des dix transformants contiennent des plasmides avec à la fois un site EcoRI et un site BamHI.La dimension du petit fragment EcoRI BamHI de ces plasmides recombinants est dans les quatre cas similaire à la dimension de I'ADN de somatostatine préparé in vitro. L'analyse de la séquence de bases selon Maxam and Gilbert Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 74, 560 (1977), révèle que le plasmide pSOM1 contient le fragment d'ADN de somatostatine désiré.
L'analyse de la séquence d'ADN du clone portant' le plasmide pSOMl prédit qu'il doit produire un peptide comprenant la somatostatine. Cependant, on n'a détecté aucune activité radio-immunologique de somatostatine dans les extraits de pastilles de cellules ou de liqueurs surnageantes de culture, ni la présence de somatostatine quand on ajoute directement la culture en croissance à de l'acide formique à 70 % et du bromure de cyanogène. On a observé que les extraits de E. coli RR1 dégradent tres rapidement la somatostatine exogène. L'absence d'activité de somatostatine dans les clones portant le plasmide pSOWI1 pourrait bien résulter de la dégradation intracellulaire par des enzymes protéolytiques endogènes.
Le plasmide pSOMl est donc utilisé pour construire un plasmide codant une protéine précurseur contenant de la somatostatine et suffisamment importante pour qu'on puisse supposer qu'elle résiste à la dégradation protéolytique.
E. Construction des plasmids pSOM 11 et pSOM 11-3 On construit un plasmide dans lequel le gène de la somatostatine pourrait être place au terminus C du gène de la ss-galacto- sidase, en maintenant la traduction en phase. La présence d'un site EcoRI près du terminus C de ce gène et de la séquence d'aminoacides disponibles de cette protéine [B. Polisky et al, Proc. Nat.
Acad. Sci. U.S.A. 73, 3900 (1976), A.V. Fowler et al, Id., 74, 1507 (1976), AI. Bukhari et al, Nature New Biology 243, 238 (1973) et K.E. Langley, J. Biol. Chem. 250, 2587 (1975)] permet d'insérer le gène EcoRI BamHI somatostatine dans le site EcoRI tout en maintenant le schéma de lecture approprié. Pour la construction d'un tel plasmide, on fait digérer 50 ug d'ADN de pSOMl par es enzymes de restriction EcoRI et PstI dans un volume final de 100 ul. On utilise un gel de polyacrylamide à 5 % préparatif pour séparer le grand fragment Pst-EcoRI qui porte le gène de la somatostatine du petit fragment qui porte les éléments de commande lac.On excise du gel la bande importante et on élue 1'ADN en découpant le gel en petits morceaux et en extrayant l'ADN à 650C pendant une nuit.
D'une manière similaire, on fait digérer 50 pg d'ADN du plasmide pBR322 par les endonucléases de restriction PstI et EcoRI et l'on purifie les deux fragments d'ADN résultants par électrophorèse préparative sur un gel de polyacrylamide à 5 %. On ligature le petit fragment PstI-EcoRI de pBR322 (I pg) avec le grand fragment Pst I-EcoRI ADN (5 pg) de pSOM1, dans un volume final de 50 p1, avec une unité de T4 ADN-ligase à 12 C pendant 12 heures. On utilise le mélange ligaturé pour transformer E. coli RRI, et l'on sélectionne les transformants en fonction de leur résistance à l'ampicilline sur un milieu X-gal. Comme on s'y attend, pratiquement tous les transformants Apr (95 %) donnent des colonies blanches (pas d'opérateur lac) sur les plaques indicatrices de X-gal.On utilise le plasmide résultant, pSOMll, dans la construction du plasmide pSOM11-3. On fait digérer un mélange de 5 pg d'ADN de 5 pSOMll et 5 pg d'ADN de Aplat avec EcoRI (10 unités pendant 30 minutes à 370C). On arrête la digestion par l'endonucléase de restriction par extraction par un mélange phenol-chloroforme. Puis on précipite 1'ADN avec de l'éthanol et on le remet en suspension dans un tampon de T4 ADN-ligase (50 p1). On ajoute une unité de T4 ADN-ligase au mélange et on le fait incuber à 12 C pendant 12 heures. On dialyse le mélange ligaturé vis-à-vis d'un tampon de 10 mM de Tris-EICl, pH 7,6, et on l'utilise pour transformer la souche RRI de E. coli.On sélectionne les transformants en fonction de leur aptitude Ap r sur des plaques de X-gal contenant de l'ampicilline et on les sélectionne en fonction de la production de ss-galactosidase due à leur constitution. Environ 2 % des colonies sont bleues (pSOM11-1, 11-2, etc..). L'analyse par des enzymes de restriction de 1'ADN de plasmide obtenu à partir de ces clones montre que tous les plasmides portent un nouveau fragment EcoRI d'environ 4,4 mégadaltons, qui porte les sites de commande de l'opéron lac et la majeure partie du gène de la ss-galactosidase.
Comme deux orientations du fragment EcoRI sont possibles, on utilise l'emplacement asymétrique d'un site de restriction Hindîli pour déterminer lesquelles de ces colonies portent ce fragment EcoRI avec la transcription lac se faisant dans le gène de la somatostatine. Des digestions doubles par HindIII et BamHI indiquent que seuls les clones portant les plasmides pSOM11-3, pSOM11-5, pSOM11-6 et pSOM11-7 contiennent le fragment EcoRI dans cette orientation.
4. Radio-immuno-essai de l'activité de somatostatine On modifie les radio-immuno-essais (RIE) classiques de la somatostatine [A. Arimura et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 148, 784 (1975)] en diminuant le volume d'essai et en utilisant un tampon phosphate. On iode de la Tyr11-somatostatine en utilisant un mode opératoire utilisant la chloramine T (voir la référence ci-dessus). Pour titrer la somatostatine, on sèche l'échantillon, généralement dans de l'acide formique à 70 % contenant 5 mg/ml de bromure de cyanogène, dans un tube en polypropylène conique (0,7 ml, Sarstedt) sur KOH humide sous vide.On ajoute 20 pl de tampon PBSA (75 mO1 de NaCI ; 75 mM de phosphate de sodium, pH 7,2 ; 1 mg/ml de sérum albumine de boeuf , et 0,2 mg/ml d'azoture de sodium) puis on ajoute 40 l d'un "cocktail" de [125I]-somato- statine et 20 p1 d'une dilution à 1 000 fois dans le tampon PBSA d'immun-sérumd'antisomatostatine de lapin S39 (Vale et al, Metabolism 25, 1491 (1976). Le cocktail de[1251] somatostatine contient, par ml de tampon PBSA : 250 pg de -gamma-globuline de lapin normal (Antibodies, Inc.), 1500 unités d'inhibiteur de protéase ("Trasylol", Calbiochem) et environ 100 000 coups de [125I]Tyr11-somatostatine.Après au moins 16 heures à la température ambiante, on ajoute aux tubes d'échantillon 0,333 ml de gamma-globuline anti-lapin de chèvre (Antibodies, Inc., P=0,03) dans le tampon PBSA. On fait incuber le mélange pendant 2 heures à 370C, on le refroidit à 50C, puis on le centrifuge à 10 000 x g pendant 5 minutes. On enlève la liqueur surnageante et on détermine le nombre de coups de la pastille dans un compteur gamma.
Avec la quantité d'antiserum utilisée, 20 % des coups ont été précipités sans somatostatine compétitrice non marquée. Le fond avec une quantité infinie de somatostatine (200 ng) est généralement de 3 t. On obtient une demi-compétition maximale avec 10 pg de somatostatine. Des expériences initiales avec des extraits de la souche E. coli RRI (souche réceptrice) indiquent que moins de 10 pg de somatostatine peuvent facilement être détectés en présence de 16 pg ou plus de protéine bactérienne traitée par le bromure de cyanogène. Plus de 2 pg de protéine provenant des extraits bactériens traités par l'acide formique gênent quelque peu en augmentant le fond, mais la coupure par le bromure de cyanogène réduit de façon importante cette interférence.Des expériences de reconstruction montrent que la somatostatine est stable dans les extraits traités au bromure de cyanogène.
A. Compétition par des extraits bactériens On cultive à 37 C les souches E. coli RR1 (pSOM11-5) et E. coli RR1 (pSOM11-4) jusqu'à 5 X 108 cellules/ml dans un bouillon de Luria. On ajoute ensuite de I'IPTG jusqu'à 1 met et on poursuit la croissance pendant 2 heures. On centrifuge des parties aliquotes de 1 ml pendant quelques secondes dans une centrifugeuse Eppendorf et l'on met les pastilles en suspension dans 500 pl d'acide formique à 70 % contenant 5 mg/ml de bromure de cyanogène.
Après environ 24 heures à la température ambiante, on dilue les parties aliquotes dix fois dans de l'eau et l'on titre, en triple, la somatostatine dans les volumes indiqués sur la Figure 6. Sur la Figure 6, "B/B " est le rapport de la [125I-somatostatine liée o en présence d'échantillons à celle liée en l'absence de somatostatine compétitrice. Chaque point est la moyenne de trois essais.
La teneur en protéine des échantillons non dilués est déterminée comme étant de 2,2 mg/ml pour E. coli RRI (pSOM11-5) et 1,5 mg/ml pour E. coli RRI (pSOM-4).
B. Sélection initiale des clones pSOtEll pour la somatostatine On prépare des extraits traités par le bromure de cyanogène de 11 clones (pSOMîî-2, pSOMîl-3, etc.) comme décrit ci-dessus pour la Figure 6. On prélève en triple pour le radio-immuno-essai 30 p1 de chaque extrait, les résultats de l'analyse étant donnés sur la Figure 7. L'intervalle des points d'analyse est indiqué.
Lors de la fermeture de la soupape 61, du fluide traverse la soupape 64 (la soupape de retenue 70 est fermée lorsque du fluide s'écoule de l'orifice 13 à l'orifice 17). Si la soupape 64 est constituée, par. exemple, par une soupape à aiguille 75 (une telle soupape est représentée sur la figure 3), le débit de fluide est réduit dans une proportion prédéterminée. On se reportera à cet effet à la figure 2 qui représente, en ordonnées, la vitesse de course et, en abscisses, le pourcentage de fermeture. La ligne 90 indique que le débit total est réalisé jusqu'à ce que soit atteint le degré de fermeture 75fui. A ce moment (point 91) l'électro-aimant 60 ferme la soupape 61 et la vitesse diminue (ligne 92) jusqu'à la valeur 93, jusqu'à ce que la soupape soit fermée à 100%.Cette diminution de vitesse, sur ce graphique, correspond à la moitié de celle correspondant à ltouverture de la soupape à commande électromagnétique 61, mais on pourrait tout aussi bien adopter une autre valeur pour cette diminution de vitesse. Lorsqu'il faut inverser le processus décrit ci-dessus, c' est-à-dire lorsque la soupape de commande 26 doit être ouverte, la soupape à commande électromagnétique 61 demeure nécessairement fermée jusqu'à ce que la came 55 se soit écartée du bras d'interrupteur 68. En l'absence de la soupape de retenue 70, l'ouverture de la soupape 26 s'effectuera, en fonction de son pourcentage de fermeture, de la même manière que pour sa fermeture, le point représentatif de la vitesse parcourant les lignes 93, 92 et 90 de la figure 2. Mais, du fait de la présence de la soupape de retenue, ce point représentatif parcourra les lignes 94, 95 pour aboutir à la ligne 90 de la figure 2.
Si la soupape 64 peut être commandée d'une manière proportionnelle par un circuit de commande 67, on peut utiliser toute autre courbe d'ouverture, telle que celle représentée par les lignes 96 ou 97 sur la figure 2.
Dans le système représenté sur la figure 3, le fluide parcourant le tube 15 de A à B traversera librement la soupape 61 et, selon un débit prédéterminé, la soupape à aiguille 75. Aucun écoulement ne traversera la soupape de retenue 70. Lorsque la soupape 61 est fermée par l'électro-aimant 60, le seul écoulement qui se produit est celui traversant la soupape 75. On obtient une courbe de fermeture analogue à la courbe 90, 92, 93 de la figure 2.
Lorsque 11 écoulement à travers le tube 15 est inversé, la soupape e retenue 70 peut etre parcourue librement, selon la courbe 94, 95, 90 de la figure 2.