FR 3159226 A1 20250815 FR 2401261 A 20240208 L’invention présente un dispositif de comptage sans contact de la concentration de particules en suspension dans un fluide comportant un récipient associé à un moyen d’agitation pour la mise en suspension homogène des particules, qui comporte : un moyen d’acquisition d’images présentant un champ adapté pour former une image comportant une pluralité de particules après sédimentation focalisé sur la surface intérieure du fond dudit récipient, et une source lumineuse pour éclairer la surface intérieure du fond du récipient un calculateur commandant l’acquisition d’une séquence horodatée d’au moins deux images (I i , t i ) dans le plan focal de sédimentation desdites particules en suspension le comptage, dans chacune desdites images (I i , t i ), du nombre de particules P i la détermination d’un ensemble de valeurs (P i , t i ) la détermination de la concentration CP de particules, au moment t de la dernière image (I i , t i ) acquise par l’application d’une fonction F audit ensemble de valeurs (P i , t i ), la fonction F étant une fonction de la force de traînée hydrodynamique. Figure de l’abrégé :1 Comptage cellulaire Domaine de l’invention La présente invention concerne un procédé pour compter en ligne et in situ des cellules dans un milieu de culture biologique, notamment dans le domaine de l'immunothérapie cellulaire personnalisée et plus particulière de la collecte et du traitement automatisé de sous-ensembles cellulaires notamment des cellules CART-T (en anglais Chimeric Antigenic Receptor - T) dans le sang périphérique dans le but de réinjecter localement ces cellules pour réparer les tissus. L’invention concerne plus particulièrement les méthodes de comptage cellulaire automatique permettant de suivre la prolifération des lymphocytes T en culture, en système clos et en temps réel. L’objectif est de pouvoir atteindre une concentration cible en lymphocytes T (environ 1 milliard de cellules dans 600 ml soit une concentration de 1,66 M/ml) à laquelle les étapes suivantes de la thérapie innovante basée sur les cellules Car-t puissent être initiées. La numération ou le comptage cellulaire correspond à la détermination du nombre de cellules contenues dans un volume se fait dans l’état de la technique sur un sous-échantillon ou sous-partie de la culture et fait très majoritairement intervenir au moins une étape de prélèvement notamment pour les raisons suivantes : afin de faciliter le comptage et de gagner du temps : il semble en effet bien fastidieux et chronophage de compter les millions/milliards de cellules en culture, le comptage est souvent intrusif pour les cellules et l’idée est donc de pouvoir appliquer un traitement possiblement délétère ou modifiant l’homéostasie cellulaire pour un sous-échantillon de la culture sans impacter le reste des cellules en culture. Le comptage cellulaire représente pour les biologistes une manipulation quotidienne réalisée dans le cadre de cultures cellulaires. Il est essentiel qu’il soit précis pour le bien être des cellules en culture mais également pour toute expérience faisant intervenir des cellules afin de pouvoir notamment adapter les concentrations de réactifs ou pouvoir obtenir des images analysables en imagerie par exemple. Plusieurs compteurs automatisés avec imageurs qui contiennent une micro-caméra et un logiciel de traitement d’images ont été développés ces dernières années. Ces compteurs font néanmoins intervenir une étape de prélèvement d’une partie de l’échantillon et l’utilisation de marqueurs visant à améliorer le contraste cellule vivante/bruit pour faciliter leur détection automatique. On peut par exemple citer le bleu de Trypan qui, utilisé en excès colore les membranes des cellules vivantes améliorant le contraste (et colore intégralement en bleu les cellules mortes) ou encore l’utilisation de sonde fluorescentes protéiques et membranaires capables de se fixer aux cellules vivantes eucaryotes. Concernant la prise d’image des cellules, il existe deux technologies principales d’imagerie : le microscope classique couplé à une caméra ou la reconstruction holographique qui consiste en la projection de la diffraction des cellules sur un capteur CMOS sans lentille par une source de lumière ponctuelle. La reconstruction holographique a pour avantage d’imager une grande surface mais la source de lumière doit être la plus directe possible ce qui est difficile à réaliser pour des cultures (hauteur du milieu très élevée, rugosité des parois de la poche, concentration cellulaire forte, présence de bulles d’air et d’agrégats). En ce qui concerne l’analyse d’image pour compter automatiquement les cellules, il existe deux principales méthodes : La technique par analyse d’image faisant appel à des filtres, seuillage et segmentation plus ou moins complexe. Il n’existe pas d’algorithme générique, chaque application nécessite un algorithme adapté. Cette méthode n’est pas très efficace pour de la classification d’élément peu différenciable, c’est-à-dire l’identification des cellules de même taille mais de morphologie légèrement différente, La méthode par apprentissage supervisé à partir de millier d’images de cellules labelisées manuellement. L’apprentissage nécessite une très grande puissance de calcul (96Go de GPU) mais n’est réalisé qu’une fois. Un modèle hyperparamètre est alors créé permettant d’analyser des images rapidement et classifier les éléments détectés. La puissance en calcul (CPU ou GPU) est alors moindre et selon le nombre de classe à identifier, l’image peut être traiter en live . Etat de la technique On connaît dans l’état de la technique FR3034103 décrivant un dispositif de mesure de la concentration de microorganismes dans un échantillon de liquide, comportant une source de lumière, un support d'échantillon, un capteur d'images, un dispositif optique situé entre ledit support d'échantillon et ledit capteur d'images, un microprocesseur et un programme de comptage. Le dispositif optique est constitué d'une seule lentille transparente. Ce document décrit aussi un procédé de contrôle du développement de microorganismes dans un liquide, caractérisé en ce qu'il comporte les étapes suivantes : prélèvement d'un échantillon dudit liquide, introduction dudit échantillon dans un dispositif susvisé, détection d'une image dudit échantillon par ledit capteur d'images détermination de la concentration de microorganismes contenus dans ledit échantillon par comptage de microorganismes sur ladite image, par le moyen dudit programme. Le brevet EP2025744 décrit un procédé pour compter en ligne et in situ des cellules dans un milieu de culture biologique, comprenant les étapes suivantes : une pluralité de mesures de la capacitance dudit milieu ou une pluralité de mesure de la conductance dudit milieu, à des fréquences distinctes variant dans une plage de fréquences de mesure prédéterminée, une extraction d'une information de variation de permittivité due à la β-dispersion dans ledit milieu, à partir desdites mesures de capacitance, et un traitement de ladite information de variation de permittivité pour délivrer une information de comptage de cellules dans ledit milieu. La demande de brevet WO2018220198 décrit un dispositif et un procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants, comprenant une matrice de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière qui couvre la face active et des moyens d'éclairage qui produisent la lumière incidente sur la face active, des moyens de visualisation. L'invention se caractérise en ce que la lumière incidente est la lumière émise par les éléments biocontaminants et en ce que le dispositif comprend en outre en outre au moins un filtre, un polariseur et un analyseur, ledit polariseur et ledit analyseur étant positionnés en configuration croisée pour s'affranchir des granularités laser dans les images. Inconvénients de l’art antérieur Les solutions de l’art antérieur nécessitent de procéder à un prélèvement de la solution. L’étape de prélèvement et de pipetage de la culture cellulaire permettent notamment de minimiser un verrou technique bien décrit dans la littérature qui correspond à la présence d’artefacts de comptage (bulles d’airs, etc.) susceptibles de détériorer la précision de la méthode de comptage par des étapes de pipetage. Dans notre cas, la culture cellulaire et le comptage cellulaire en poche et sans prélèvement imposait une agitation directement de la poche facilitant au contraire l’apparition de bulles d’airs ou l’apparition d’autres artefacts comme des rayures sur la poche pouvant altérer drastiquement la précision de la méthode de comptage. De même, l’absence de marquage rendait plus complexe le comptage et l’analyse d’images (aucun marqueur de contrastes possibles). Une problématique supplémentaire provenait de la nature des cellules (lymphocytes T) et des volumes de culture de cellules recherchés dans un objectif de conception automatique de médicaments innovants. En effet, ces cellules sont non-adhérentes (en suspension) et comme la concentration et le volume de culture sont élevés, l’absence de dilution complexifiait d’autant plus la méthode de comptage cellulaire à ces fortes concentrations. En outre, les lymphocytes T peuvent s’activer : ils ont tendance à constituer des amas cellulaires importants. De plus, les lymphocytes T présentent des morphologies variables en fonction de l’individu, du milieu de culture (5,8 à 8,14 µm) mais également selon l’étape du cycle cellulaire et du temps de culture pouvant altérer drastiquement la précision de la méthode automatique de comptage. En effet, Le diamètre des lymphocytes T double avant la division. Enfin, les solutions de l’état de la technique ne sont pas compatibles avec un comptage directement dans une poche de culture qui impose différentes contraintes optiques. Solution apportée l’invention Afin de remédier à ces inconvénients, la présente invention concerne un dispositif de comptage sans contact de la concentration de particules en suspension dans un fluide comportant un récipient associé à un moyen d’agitation pour la mise en suspension homogène des particules, caractérisé en ce qu’il comporte : un moyen d’acquisition d’images présentant un champ adapté pour former une image comportant une pluralité de particules après sédimentation focalisé sur la surface intérieure du fond dudit récipient, une source lumineuse pour éclairer la surface intérieure du fond du récipient et un calculateur. Ce calculateur exécute un programme informatique pour commander : l’acquisition d’une séquence horodatée d’au moins deux images (I i , t i ) dans le plan focal de sédimentation desdites particules en suspension le comptage, dans chacune desdites images (I i , t i ), du nombre de particules P i la détermination d’un ensemble de valeurs (P i , t i ) la détermination de la concentration CP de particules, au moment t de la dernière image (I i , t i ) acquise par l’application d’une fonction F audit ensemble de valeurs (P i , t i ), la fonction F étant une fonction de la force de traînée hydrodynamique. Avantageusement, ladite source lumineuse est disposée du côté opposé à la caméra par rapport audit fond, ladite source lumineuse comportant un condenseur focalisé sur la surface dudit fond. Avantageusement, ladite source lumineuse comprend une source LED positionnée au fond d’un tube présentant des annelures anti-réflexion. De préférence, l’axe dudit tube est horizontal, et un miroir renvoie le faisceau lumineux à 90°, perpendiculairement au plan d’une surface transparente support d’échantillon. Selon une variante de réalisation, ledit moyen d’acquisition d’image comporte une optique de microscope avec une lentille d’entrée et un capteur d’image. L’ensemble est supporté par une platine motorisée. Description détaillée d’un exemple non limitatif de réalisation La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui suit, concernant un exemple non limitatif de réalisation illustré par les dessins annexés où : FIG. 1 la FIG. 1 représente une vue schématique d’un dispositif selon l’invention FIG. 2 la FIG. 2 représente une vue schématique du traitement d’image selon l’invention dispositif selon l’invention FIG. 3 la FIG. 3 représente la courbe de la variance de la transformée de Laplace en fonction de la position (5M/ml) FIG. 4 la FIG. 4 représente la courbe de distribution en taille des cellules sur 50 images. FIG. 5 la FIG. 5 représente les étapes du processus de mesure concentration cellulaire FIG. 6 la FIG. 6 représente la courbe d’accumulation du nombre de cellules en fonction du temps. Principe général de l’invention L’invention concerne un procédé de comptage cellulaire sur poche permettant de suivre la prolifération des lymphocytes T durant toute la culture (entre 0,01 et 10 millions de cellules par millilitre), qui mis en œuvre automatiquement et en milieu clos, sans prélèvement d’un sous-échantillon de la culture cellulaire et sans application de dilutions et/ou de marquage cellulaire. Le procédé est basé sur la détermination de la cinétique de sédimentation des cellules contenues dans le milieu de culture, et d’en déduire la concentration de cellules – et donc le nombre de cellules dans un volume de référence, en fonction de la viscosité dynamique du milieu de culture et du diamètre moyen des cellules. la méthode de comptage de la culture de cellule en temps réel selon l’invention : être totalement automatisée, être réalisée intégralement en système clos directement en poche de culture (sans prélèvement, dilution, marquage cellulaire), altérer le moins possible l’homéostasie cellulaire, assurer une précision de comptage de 90 à 95 % tout le long de la culture (pour une gamme de concentration élargie en lymphocytes T comprise entre 0,01 et 10 millions de cellules par millilitre). A cet effet, l’invention est basée sur la mesure de la prolifération cellulaire par analyse de la sédimentation pendant des intervalles de temps à partir d’images acquises à l’aide d’un microscope dans un plan de référence, généralement le fond de la poche contenant le milieu de culture et les cellules à compter, et met en œuvre : Un banc de culture contenant le milieu de culture et les cellules à compter, comportant un moyen pilotable de remise en suspension des cellules, par exemple une poche souple, avec au moins un étranglement pour générer des turbulences. un dispositif d’acquisition d’images avec une source d’éclairage (100) et un microscope (200) présentant avec un focus réglable motorisé et un grossissement suffisant pour la visualisation des cellules et un condenseur optique adapté au banc de culture, associé à un capteur d’images (210). L’ensemble présente une épaisseur inférieur à 30 mm. et un calculateur exécutant un programme commandant l’acquisition d’images et leur traitement, et en particulier : la commande de la focalisation de l’objectif du microscope automatique la commande de l’éclairage la détection de bulles le calcul de concentration. Le principe du comptage cellulaire dynamique proposé par l’invention est basée sur la vitesse de sédimentation et la loi de Stockes. La méthode mise en œuvre consiste à agiter le milieu de culture en poche afin de remettre en suspension les cellules de façon à avoir une répartition homogène des cellules en suspension. Un microscope focalisé sur le fond de la poche permet de visualiser uniquement les cellules qui s’y déposent par sédimentation. Juste après remise en suspension par arrêt de l’agitation, on mesure la cinétique de sédimentation des cellules pour estimer la concentration cellulaire en fonction du nombre de cellules au fond de la poche en fonction du temps. Dispositif optique Le dispositif optique est constitué par un microscope miniaturisé de faible hauteur, moins de 30 millimètres dont la FIG. 1 illustre l’architecture. Le dispositif est constitué par une source lumineuse (100) et un capteur d’images (200). La source lumineuse (100) comprend une source LED (110) positionnée au fond d’un tube (120) présentant des annelures anti-réflexion (130). L’axe du tube (120) est horizontal, et un miroir (140) renvoie le faisceau lumineux à 90°, perpendiculairement au plan d’une surface transparente support d’échantillon (150). La sortie de la source d’éclairage comprend dôme antibulle (160) et de créer un creux sur le dessus de la poche pour faciliter le retrait des bulles du champs de la caméra. Le bloc d’acquisition d’image comporte une optique de microscope (220) avec une lentille d’entrée (230), et un capteur d’image (210). L’ensemble est supporté par une platine motorisée (240). Programme commandant le fonctionnement du dispositif Un calculateur commande l’exécution des programmes de pilotage du bloc optique de détection automatique des cellules sédimentées ainsi que la remise en suspension des cellules dans le milieux de culture. Le pilotage du bloc optique comprend : • une fonction d’auto-illumination • une fonction d’auto-focus. La fonction d’auto-illumination commande le réglage automatique de la puissance de la LED (110) afin d’avoir systématiquement la même moyenne de niveau de gris pour chaque comptage. En effet, plus la concentration est élevée et plus l’absorbance de la solution est forte. La fonction consiste à balayer la puissance de la LED de 5 à 100% puis d’appliquer une régression polynomiale pour une estimation de la puissance de LED à un niveau de gris consigne. Visuellement un niveau moyen de gris de 130 (sur 256) permet un bon contraste, paramètre qui a été testé avec une concentration de 0.1 à 10M/ml de lymphocytes T, La fonction d’auto-focus (10) permet le réglage automatique du focus de l’objectif (230) du microscope (220). Une première étape commande l’initialisation de la position de la caméra (210) en se rétractant au maximum puis remonte à une valeur définie. La caméra (210) est déplacée jusqu’à la zone à scanner. Puis pour chaque pas, une image est prise et la variance de la transformée de Laplace est calculée. La position, pour laquelle la variance est maximale est alors la position de meilleure mise au point. La zone à scanner doit exclure la paroi extérieure du contenant (poche) qui risque d’être détectée comme le point focal optimal si peu de cellules sont présentes au fond de la poche. La FIG. 3 représente la courbe de la variance de la transformée de Laplace en fonction de la position (pour une concentration de 5M/ml). La courbe (1) représente la variation de la transformée de Laplace après sédimentation, en fonction du réglage de la platine, en nombre de micropas (surface intérieure de la poche revêtue de cellules). La courbe (2) représente la variation de la transformée de Laplace sans sédimentation, en fonction du réglage de la platine, en nombre de micropas (surface extérieure de la poche). Comme le montre la FIG. 3 , à forte concentration, le maximum de la Laplacienne permet de trouver le meilleur focus automatiquement. Optionnellement, une étape de filtrage gaussien (noyau 7,7) niveau 2, permet de réduire le bruit et facilite la mesure du meilleur focus pour de faibles concentrations cellulaires L’algorithme de comptage dynamique et de traitement d’image est répété plusieurs fois, 6 fois par exemple, avec des cinétiques différentes, pour lisser le résultat et retenir la valeur correspondant à la médiane des comptages dynamiques successifs. La cinématique est déterminée par le temps et la vitesse d’agitation pour la remise en suspension des cellules. Avec une agitation relativement élevées, on favorise la désagrégation des amas cellulaires. Le temps entre l’arrêt de l’agitation et l’initiation de la mesure de la cinétique est typiquement compris entre 10 secondes et 30 secondes. L’acquisition d’images pour mesurer la cinétique de sédimentation se fait toutes les 2 secondes pendant 100 secondes (soit 50 images par cinétique), ce temps d’acquisition pouvant être réduit pour les fortes concentrations afin d’éviter d’avoir trop de cellules sédimentées et rendre difficile l’analyse d’image (comptage des cellules), ou a contrario pouvant être rallongé en cas de faible concentration pour augmenter le nombre de cellules qui sédimentent pour fiabiliser le comptage. L’algorithme de traitement l’analyse d’image automatique et de numération cellulaire est basé sur un traitement des images par binarisation (conversion en niveau de gris, filtre gaussien (Noyau (7,7), niveau 5), extraction des arrêtes par Filtre Scharr (gradient par dérivée première des deux axes x et y puis fusion), seuillage du niveau de gris (>100 valeur non critique), dilatation (Noyau (7,7), niveau 1), fermeture des contours par transformation morphologique elliptique de noyau (15,15) puis enregistrement de l’image). Les performances de la détection de cellule par l’algorithme par détection de forme est supérieure à celle par détection de cercle. Le calculateur détermine ensuite la mesure de la taille moyenne des cellules des 50 images par cinétique puis médiane des 6 moyennes obtenues pour les 6 expériences répétées (détection des contours des cellules par compression verticale / horizontale / diagonale, tri des contours par extraction de la surface et calcul du diamètre et sélection des diamètres de cellule unitaire et tri par facteur de forme (cf. FIG. 4 ). La courbe de la distribution statistique en taille des cellules sur une série d’images permet de déterminer le diamètre médian. Relation entre la cinématique de sédimentation, le diamètre médian des cellules, la viscosité du milieu de culture et le nombre de cellules Les traitement susvisés permettent de déterminer deux paramètres : L’évolution en fonction du temps du nombre de cellules N c (t) déposées sur le fond de la surface S de la poche, permettant de déterminer la vitesse de sédimentation v sed Le diamètre médian d c des cellules La concentration cellulaire C dans la solution en M par mL Le traitement d’image mesure le diamètre médian des cellules puis compte le nombre de cellules. Le diamètre permet de remonter à la vitesse de sédimentation qui couplé aux nombres de cellules permet de remonter à la concentration Le nombre N c de cellules déposées sur le fond de la poche est fonction du temps t, selon une formule : N c =t.C.S. v sed + N c initial Nc initial nombre de cellule à t=0 S surface imagée Par ailleurs, la vitesse de sédimentation est fonction de la différence entre la densité des cellules et la densité du milieu de culture (en kg :m 3 ), du diamètre d c (en m) des cellules et de la viscosité µ l dynamique du milieu, (en Pascal par secondes). Cette relation est par exemple déterminée par la loi de Stokes Le milieu de culture usuel pour la culture de Car-T est par exemple le RPMI + 8% de HSA. La prolifération des lymphocytes T en culture est réalisée par activation CDC3/CD28 en présence d’interleukine 2 (IL-2), ou d’autres milieux de culture sans sérum mieux adapté à la fabrication de Car-T. Fonctionnement Le cycle de mesure comporte une succession de traitements dont certains sont itératifs. Connexion caméra Etape (10) de positionnement de la platine (230) pour la focalisation du bloc optique Début d’un cycle de comptage dynamique (20) Etape (21) Agitation pour remise en suspension et casser les clusters Réglage puissance LED Détection récursive de bulles: seuil de puissance de LED Evacuation bulles si besoin (montée/descente palette) Seuil delta (max-min niveau de gris) et seuil de moyenne de gris Evacuation bulles si besoin (montée/descente palette) Etape (22) Prise d’images, par exemple toutes les 10 secondes Etape (23) détermination du diamètre médian des cellules et calcul du paramètre V sed Etape (24) Détermination du nombre de cellules Etape (25) calcul de la concentration cellulaire Déconnexion caméra Etape (26) d’ajustement de la focalisation Retour pour un nouveau cycle de comptage dynamique (20), six itérations par exemple Etape (30) Calcul d’une valeur statistique du nombre de cellules Dispositif de comptage sans contact de la concentration de particules en suspension dans un fluide comportant un récipient associé à un moyen d’agitation pour la mise en suspension homogène des particules, caractérisé en ce qu’il comporte : un moyen d’acquisition d’images (210) présentant un champ adapté pour former une image comportant une pluralité de particules après sédimentation focalisé sur la surface intérieure du fond dudit récipient, et une source lumineuse (100) pour éclairer la surface intérieure du fond du récipient un calculateur commandant l’acquisition d’une séquence horodatée d’au moins deux images (I i , t i ) dans le plan focal de sédimentation desdites particules en suspension le comptage, dans chacune desdites images (I i , t i ), du nombre de particules P i la détermination d’un ensemble de valeurs (P i , t i ) la détermination de la concentration CP de particules, au moment t de la dernière image (I i , t i ) acquise par l’application d’une fonction F audit ensemble de valeurs (P i , t i ), la fonction F étant une fonction de la force de traînée hydrodynamique. Dispositif de comptage sans contact de la concentration de particules en suspension dans un fluide selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite source lumineuse (100) est disposée du côté opposé adut moyen d’acquisition d’images (210) par rapport audit fond, ladite source lumineuse (100) comportant un condenseur focalisé sur la surface dudit fond. Dispositif de comptage sans contact de la concentration de particules en suspension dans un fluide selon la revendication 1 caractérisé en ce que ladite source lumineuse (100) comprend une source LED (110) positionnée au fond d’un tube (120) présentant des annelures anti-réflexion (130). Dispositif de comptage sans contact de la concentration de particules en suspension dans un fluide selon la revendication 3 caractérisé en ce que l’axe dudit tube (120) est horizontal, et un miroir (140) renvoie le faisceau lumineux à 90°, perpendiculairement au plan d’une surface transparente support d’échantillon (150). Dispositif de comptage sans contact de la concentration de particules en suspension dans un fluide selon la revendication 1 caractérisé en ce que ledit moyen d’acquisition d’image (210) comporte une optique de microscope (220) avec une lentille d’entrée (230), et un capteur d’image, cet ensemble étant supporté par une platine motorisée (240).