FR 3152059 A1 20250214 FR 2308669 A 20230811 Procédé de détection ultra-sensible à l’aide de particules photoluminescentes La présente invention concerne un procédé de détection et/ou de quantification ultra-sensible in vitro d’une substance d’intérêt biologique ou chimique dans un échantillon par détection de l’émission de luminescence émise par des nanoparticules inorganiques photoluminescentes, comprenant au moins les étapes de disposition de nanoparticule inorganique photoluminescente à matrice vanadate ou vanadate/phosphate de formule particulière couplées à un agent de de couplage à la substance d’intérêt, la mise au contact desdites particules photoluminescentes avec la substance d’intérêt dans des conditions de couplage de la substance d’intérêt avec l’agent de couplage, l’excitation de la matrice des nanoparticules inorganiques photoluminescentes, par rayonnement de longueur d’onde compris entre 240 nm à 330 nm; la détection de l’émission de luminescence par les nanoparticules inorganiques photoluminescentes, et la détermination de la présence et/ou concentration de la substance d’intérêt par interprétation de ladite mesure de l’émission de luminescence par les particules. Figure pour l’abrégé : Fig. 1 Procédé de détection ultra-sensible à l’aide de particules photoluminescentes La présente invention concerne le domaine de la recherche, de la bioanalyse et du diagnostic in vitro . Elle a plus particulièrement pour objet un procédé de détection et/ou de quantification ultra-sensible in vitro de substances d’intérêt biologique ou chimique, par exemple de biomarqueurs, de protéines, des peptides, des hormones, d’anticorps, d’ADN, d’ARN et autres composés, dans un échantillon, en particulier un échantillon biologique, par détection de l’émission de luminescence par des nanoparticules inorganiques photoluminescentes à propriétés optiques et physico-chimiques contrôlées. La détection et/ou la quantification des concentrations de biomarqueurs, d’anticorps ou d’ADN et d’ARN dans des échantillons biologiques (sang, sérum, salive, urine, liquide cérébro-spinal, etc.) sont indispensables pour le diagnostic médical. Dans le domaine de la recherche, des diagnostics in vitro ou ex vivo , de l’analyse médicale et de la bioanalyse, un certain nombre de méthodes ont été proposées pour détecter et/ou doser la présence de substances spécifiques. Ces méthodes reposent, d’une manière générale, sur l’utilisation d’une sonde mise en œuvre pour détecter et/ou quantifier une concentration en solution. Ces sondes sont couplées à un composé de reconnaissance, ou agent de ciblage, permettant de se fixer à l’espèce moléculaire à analyser. Ce composé de reconnaissance peut être une molécule, ADN, aptamère, protéine ou anticorps. Ensuite, les sondes qui se sont fixées sur l’espèce moléculaire à analyser grâce au composé de reconnaissance peuvent être détectées au moyen d’une ou plusieurs méthodes basées par exemple sur leur luminescence, leur absorbance, leur réactivité chimique, leur radioactivité, etc. Les essais biochimiques les plus couramment mis en œuvre, en particulier pour la détection de protéines, sont des essais d’immuno-absorption enzymatique (en langue anglaise « Enzyme-Linked Immuno Assay » ou ELISA), qui reposent généralement sur l’utilisation de la peroxydase de raifort comme enzyme pour provoquer une réaction avec un substrat et quantifier la réaction chimique ayant lieu par mesure de l’absorbance du produit de la réaction dans la solution. Le choix du composé de reconnaissance moléculaire auquel la sonde est couplée est déterminant pour l’efficacité de ces sondes. Plus précisément, l’efficacité de ces méthodes dépend de l’affinité spécifique du composé de reconnaissance avec la substance cible. A titre d’exemples, les publications référencées [1] et [2] détaillent les caractéristiques de ces mécanismes. Les sondes luminescentes mènent généralement à une détection plus sensible que les sondes détectées par leur absorbance car, dans le premier cas, les mesures de l’intensité lumineuse se font sur fond noir, tandis que, dans le deuxième, il s’agit de mesurer une variation de l’intensité lumineuse (mesures sur fond clair). Parmi les autres méthodes de dosage proposées à l’heure actuelle, on peut également citer le dosage par électrochimiluminescence (ECLIA), le dosage immunologique par fluorescence (FIA) et le dosage radio-immunologique (RIA). Ces méthodes présentent toutefois divers inconvénients qui limitent leur sensibilité finale de détection, en particulier des limitations en termes de propriétés de luminescence des sondes mises en œuvre (ECLIA, FIA), des risques pour la sécurité, un équipement coûteux et la nécessité d’utilisateurs spécialisés (pas de machines automatisées) pour conduire des essais de type RIA. En particulier, les sondes luminescentes actuellement disponibles présentent plusieurs désavantages qui ne permettent pas d’exploiter pleinement leur potentiel en tant que sondes de diagnostic. Parmi ces inconvénients, on peut citer par exemple le phénomène de photoblanchiment dans le cas de fluorophores organiques qui, suite à des modifications chimiques irréversibles induites par l’illumination, se traduit par une disparition de la fluorescence, ou encore le phénomène de clignotement de l’émission pour les nanocristaux de semi-conducteurs, ou « quantum dots », les sondes cessant alors périodiquement d’émettre et étant par conséquent inadaptées pour produire un signal constant. D’autres inconvénients résultent par exemple de la largeur du spectre d’émission des sondes luminescentes. De fait, un spectre d’émission trop large rend difficile le filtrage du signal de fond éventuellement présent, et a une incidence sur la qualité du signal et, en particulier, sur le rapport signal à bruit. Il convient également de prendre en compte, en plus des facteurs optiques qui contribuent à l’efficacité de la sonde dans un test biologique, le caractère pratique et la facilité d’utilisation de la sonde. Ainsi, certaines particules, comme c’est le cas des nanocristaux de semi-conducteurs, perdent leurs caractéristiques de luminescence après congélation, ce qui représente un inconvénient pour le stockage des agents bio-conjugués. La facilité de couplage des sondes au composé moléculaire permettant de cibler les molécules souhaitées est également un aspect à prendre en considération pour le choix de la sonde adéquate. Ainsi, un certain nombre de particules, dont les nanocristaux de semi-conducteurs, sont synthétisées dans des solvants organiques. Il en découle qu’une utilisation pour des applications biologiques nécessite des étapes supplémentaires de préparation de la surface pour réaliser une dispersion dans l’eau de ces particules, processus qui peut être complexe à mettre en œuvre et être peu stable dans le temps [3]. Leur fonctionnalisation avec des groupements chimiques, permettant le couplage aux composés moléculaires de reconnaissance des molécules cibles, repose en outre sur des liaisons chimiques faibles, ce qui limite par conséquent leur stabilité et est préjudiciable pour la reproductibilité des tests de détection. Par ailleurs, les propriétés colloïdales des particules/sondes sont déterminantes pour la conduite des essais biologiques. De fait, des solutions de bonne stabilité colloïdale sont à même de fournir des milieux de bonne homogénéité pour les essais, et donc une meilleure reproductibilité au niveau des résultats de ces essais. Enfin, la complexité et le coût sont des aspects importants dans le choix des sondes pour le diagnostic. Par exemple, des nanoparticules d’or, et leurs propriétés en termes de résonance plasmonique de surface, ont été proposées comme sondes de diagnostic, mais n’ont pas percé comme sondes pour le diagnostic in vitro , possiblement à cause de la complexité de la méthode de détection [4], ou éventuellement d’un coût élevé. D’autre part, les méthodes de détection in vitro actuellement disponibles ne donnent pas entière satisfaction, notamment en termes de sensibilité de détection pouvant être atteinte, afin d’élargir le champ d’application des méthodes de diagnostic in vitro , par exemple en permettant une détection plus précoce des maladies ou en permettant un diagnostic sur l’évolution d’une maladie ou sur l’effet d’un traitement thérapeutique. Pour améliorer la sensibilité de détection, deux techniques commerciales d’immuno-essais ultrasensibles ont été développées. Il s’agit des méthodes développées par Quanterix et Singulex, notamment comme expliqué dans les demandes de brevet US7914734. Elles reposent sur l’utilisation de billes magnétiques fonctionnalisées comme surfaces réactives pour la capture des molécules cibles. La technologie de Quanterix procède ensuite à la capture des billes individuelles fonctionnalisées avec des anticorps dirigés contre les antigènes. Chaque bille est piégée dans un puits et leur analyse est faite par un test de type ELISA. Quant à Singulex, il utilise les billes pour concentrer les analytes piégés et détermine ensuite leur concentration par comptage des signaux fluorescents à l’aide d’un dispositif de détection confocale et avec un laser d’excitation qui balaie l’échantillon de manière hélicoïdale. Ces deux techniques, bien qu’elles permettent d’atteindre des performances en termes de sensibilité de détection plus élevées que les technologies conventionnelles de détection discutées précédemment, sont toutefois hautement complexes et coûteuses. Elles nécessitent l’utilisation d’un appareillage spécifiquement dédié à ces techniques de détection, et non compatible avec les dispositifs actuels de diagnostic in vitro automatisés. Les nanocristaux de semi-conducteurs ou « quantum dots » ont également été proposés dans des tests de détection ultrasensibles ([5], [6], [7], [8] et [9]). Toutefois, l’efficacité de ces tests est limitée par les inconvénients liés à ce type de sondes luminescentes, comme discuté précédemment : complexité et coût élevé de leur synthèse et fonctionnalisation, stabilité colloïdale non satisfaisante, pertes des propriétés de luminescence après congélation. Enfin, les méthodes basées sur l’utilisation de nanoparticules d’or en exploitant des phénomènes comme la détection des plasmons de surface, le quenching de fluorescence, le dépôt d’argent sur les nanoparticules d’or etc. ([9] à [13]) permettent d’atteindre des sensibilités de détection élevées mais sont généralement hautement complexes. Il demeure par conséquent un besoin de développer une méthode de détection/quantification permettant d’atteindre des performances en termes de sensibilité de détection plus élevées que les technologies conventionnelles, de type ELISA, ECLIA, FIA ou RIA, et ne présentant pas les inconvénients, notamment en termes de complexité et de coût, des méthodes ultrasensibles déjà proposées. En ce qui concerne la détection d’acides nucléiques, les techniques les plus courantes de détection ultra-sensible sont la PCR, la qPCR ou le LAMP, la technique avec la sensibilité la plus extrême étant la qPCR. Cependant, la qPCR nécessite des équipements coûteux, du personnel qualifié et un coût par test élevé. Toutes ces techniques utilisent des enzymes et l’amplification de l’acide nucléique initial ce qui augmente leur sensibilité aux impuretés et leur coût. Par ailleurs, les techniques PCR et LAMP sont moins coûteuses mais ne permettent pas une quantification de la concentration de l’acide nucléique dans l’échantillon. Pour éviter les inconvénients de ces techniques, comme cela est mentionné dans l’article Sakharov Y. [14], des méthodes de type ELISA ont été développées mais souffrent d’une faible sensibilité. Il existe également des méthodes de type ELISA, comme cela est décrit dans l’article Lorenzo et al [15], plus sensibles mais cette sensibilité accrue est obtenue grâce à des combinaisons de nanomatériaux complexes et difficiles à élaborer. Ainsi, il n’existe actuellement pas de solution simple permettant d’allier ultra-sensibilité dans la détection d’acides nucléiques et faible coût et complexité. Les nanoparticules photoluminescentes à base de terres rares ont déjà été proposées à titre de sondes luminescentes dans diverses applications [16]. Par exemple, Dosev et al . [17] tirent profit des propriétés de luminescence de nanoparticules luminescentes de Eu :Gd 2 O 3 par excitation de la matrice Gd 2 O 3 , pour la détection de microstructures de protéines déposées sur un substrat. Quant à Yi et al . [18], ils utilisent des phosphores à conversion ascendante (« up-conversion ») de photons de nature NaYF 4 :Yb,Er, qui absorbent deux photons proche-IR pour l’émission d’un photon dans le visible. Des nanoparticules photoluminescentes à base de terres rares ont également déjà été mises en œuvre pour la détection de particules uniques ainsi que pour le suivi de molécules uniques, en tirant profit de l’absence de clignotement pour la détection de particules uniques, par rapport aux nanoparticules de semiconducteurs ou Quantum Dots ([19] et [20]). Toutefois, il n’était nullement prévisible que ces nanoparticules à base d’ions lanthanides puissent être utilisées pour la détection et la quantification ultra-sensible de biomolécules, dans le cas d’une détection d’ensemble de biomolécules. En effet, en dehors de l’absence de clignotement, les propriétés de luminescence des nanoparticules luminescentes à base de terres rares sont considérées comme inférieures à celles des Quantum Dots. Dans ces particules, en particulier celles constituées d’une matrice d’oxyde métallique où certains ions sont substitués par des ions de terres rares, l’excitation de la luminescence peut se faire soit par excitation de la matrice suivie d’un transfert de l’énergie vers les ions de terres rares luminescents, soit par excitation directe dans le visible des ions de terres rares luminescents. Concernant l’excitation de la matrice, sa bande d’absorption se situe en général dans l’UV ce qui présente deux inconvénients : peu de lasers sont disponibles actuellement à ces longueurs d’onde et les lasers existants sont volumineux et onéreux ; et, à ces longueurs d’onde, les biomolécules absorbent et émettent fortement, ce qui peut produire un signal de fond parasite important dont il faudrait s’affranchir. Concernant l’excitation directe des ions de terres rares, le coefficient d’extinction pour une nanoparticule est plus faible que celui des Quantum Dots mais peut être comparable à celui d’un fluorophore organique efficace [16]. Yuan et al. [21], dans un article de revue, présentent des tests biologiques de luminescence résolus en temps avec mise en œuvre de nanoparticules à base de lanthanides. Les sondes luminescentes à base de lanthanides sont des particules comprenant des complexes de lanthanide, ce qui limite le nombre d’ions lanthanides par particule pour un volume de particule donné, ou des nanoparticules à « up-conversion ». Par exemple, dans les publications mettant en œuvre des nanoparticules comprenant des complexes de lanthanides, les nanoparticules de faible diamètre (8-9 nm) contiennent seulement entre 3000 et 5000 ions [28]. Seules des nanoparticules de tailles bien plus importantes, en particulier supérieure à 100 nm, peuvent contenir de l’ordre de 30 000 ions ou plus [22] et [23]. De même, Corstjens et al. [24] utilisent des nanoparticules à « up-conversion » pour la détection in vitro de l’IFN-gamma dans des cellules mononucléées du sang périphérique humain. Les nanoparticules à « up-conversion » sont adaptées pour l’imagerie de tissus en profondeur (en général, excitation dans le proche IR de l’Yb 3+ où les tissus absorbent peu par rapport au visible). En revanche, du fait que l’excitation nécessite l’absorption de deux photons, des intensités d’excitation importantes sont nécessaires. De plus, le rendement quantique de ces systèmes est faible, de l’ordre de 1 %. Ainsi, le nombre de photons émis est donc relativement faible. Des complexes ou chélates de lanthanides sont également proposés à titre de sondes luminescentes pour des immuno-essais dans les publications [23], [25], [26] et [27]. Cependant, ces complexes ou chélates ne contiennent typiquement qu’un seul ion lanthanide ou, au mieux, quelques (moins de dix) ions lanthanides. Enfin, on peut encore citer la publication Zhou et al. [28] qui propose une méthode de détection de sensibilité améliorée à partir de nanoparticules inorganiques dopées par des lanthanides, à l’issue d’un protocole complexe de dissolution des nanoparticules et de détection de l’émission des micelles contenant les lanthanides ainsi formés. Quant au document EP 1 282 824, il décrit la mise en œuvre de nanoparticules luminescentes inorganiques, modifiées en surface, à titre de sondes pour détecter une substance biologique ou autre substance organique. La méthode de détection proposée dans ce document repose sur le principe de détection ELISA. Cependant, ce document ne propose nullement leur mise en œuvre pour une détection ultra-sensible. On peut encore citer le document US 7 550 201 qui propose la mise en œuvre de nanoparticules inorganiques dopées par des ions lanthanide, notamment pour leur application en diagnostic. Ce document ne propose toutefois nullement leur mise en œuvre pour une méthode de détection ultra-sensible. Également, les publications Son et al . [29] et Nichkova et al. [30] proposent la mise en œuvre de nanoparticules Eu :Gd 2 O 3 comme alternative aux fluorophores organiques à titre de sondes pour la détection de l’ADN et pour la détection d’acide phénoxybenzoïque, respectivement. Cependant, ces documents ne suggèrent nullement leur mise en œuvre pour une détection ultra-sensible. La Déposante a proposé dans la demande WO 2019/025618 une méthode de détection ultrasensible reposant sur l’excitation directe des ions de terres rares de nanoparticules luminescentes par un rayonnement laser. Dans cette approche, l’absorption des nanoparticules reste faible et leur excitation nécessite typiquement un laser de 1W pour atteindre une détection ultrasensible. Un tel équipement laser est malheureusement couteux à mettre en œuvre. La présente invention vise précisément à proposer une nouvelle méthode de détection ultrasensible, reposant sur l’utilisation de nanoparticules luminescentes particulières dopées par des ions de terres rares, (i) s’affranchissant des contraintes de mise en œuvre d’un équipement laser coûteux et (ii) améliorant la sensibilité de détection. L’invention concerne plus particulièrement, selon un premier de ses aspects, un procédé de détection et/ou de quantification ultra-sensible in vitro d’une substance d’intérêt biologique ou chimique dans un échantillon à analyser, en particulier un échantillon biologique, par détection de l’émission de luminescence émise par des nanoparticules inorganiques photoluminescentes, comprenant au moins les étapes suivantes : disposition de particules photoluminescentes formées en tout ou partie d’une nanoparticule inorganique photoluminescente à matrice vanadate ou vanadate/phosphate, de formule (I) : A 1-x Ln x VO 4(1-y) (PO 4 ) y (I) dans laquelle : • A est choisi parmi l’yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La) et leurs mélanges, en particulier A représente Y ; • Ln est choisi parmi l’europium (Eu), le dysprosium (Dy), le thulium (Tm), le samarium (Sm), le néodyme (Nd), l’erbium (Er), l’ytterbium (Yb) et leurs mélanges, en particulier Ln représente Eu ; • 0 • 0 ≤ y les nanoparticules inorganiques photoluminescentes étant couplées à un agent de couplage direct ou indirect à la substance d’intérêt, mise au contact desdites particules photoluminescentes avec la substance d’intérêt dans des conditions de couplage direct ou indirect de la substance d’intérêt avec l’agent de couplage, excitation de la matrice des nanoparticules inorganiques photoluminescentes de formule (I), par un rayonnement de longueur d’onde compris entre 240 nm à 330 nm ; détection de l’émission de luminescence par les nanoparticules inorganiques photoluminescentes, en particulier détection résolue en temps, et détermination de la présence et/ou concentration de la substance d’intérêt par interprétation de ladite mesure de l’émission de luminescence par les particules. L’agent de couplage peut être un agent de ciblage de la substance d’intérêt se couplant directement à la substance d’intérêt à l’étape (ii). En variante, l’agent de couplage est une molécule permettant la fixation d’un agent de ciblage de la substance d’intérêt, notamment l’agent de ciblage étant fixée sur la substance d’intérêt préalablement à la mise en contact des particules photoluminescentes avec la substance d’intérêt. Dans ce cas, le procédé peut comporter la mise en contact de la substance d’intérêt avec les agents de ciblage dans des conditions de couplage des agents de ciblage avec la substance d’intérêt entre les étapes (i) et (ii), le couplage de la substance d’intérêt avec l’agent de couplage se faisant indirectement par couplage de l’agent de ciblage avec la molécule. De préférence, l’excitation de la matrice des nanoparticules inorganiques photoluminescentes de formule (I), est effectué par un rayonnement de longueur d’onde d’émission comprise entre 260 et 330 nm, mieux entre 260 nm et 310 nm, mieux entre 270 et 290 nm. De préférence, l’excitation de la matrice des nanoparticules inorganiques photoluminescentes de formule (I), est effectué par un rayonnement dans l’UV-B et/ou l’UV-C. Au sens de l’invention, l’« analyse » de la substance dans un échantillon couvre l’aspect détection ou encore caractérisation qualitative de la présence ou non de ladite substance, et également l’aspect dosage ou encore caractérisation quantitative de ladite substance. La méthode de l’invention repose ainsi sur l’excitation de la matrice vanadate ou vanadate/phosphate des nanoparticules luminescentes A 1-x Ln x VO 4(1-y) (PO 4 ) y par un rayonnement UV, en particulier un rayonnement UV-B et/ou UV-C, typiquement à une longueur d’onde d’environ 280 nm, et le transfert de l’énergie vers les ions terres rares luminescents. Contrairement à ce que pourrait penser la personne du métier, c’est-à-dire que nous aurons trop d’émissions parasites en excitant dans l’UV, ce dernier inconvénient est contrebalancé par le fait que l’absorption de la matrice est bien plus importante lorsque nous excitons dans l’UV que lorsque nous excitons directement les ions lanthanides, comme cela est le cas dans la demande internationale WO 2019/025618. Comme illustré dans les exemples qui suivent, les inventeurs ont montré qu’il est possible, en dépit de l’utilisation de longueurs d’onde d’excitation d’accéder à une détection ultrasensible. De fait, s’il est connu que l’absorption au niveau du pic d’excitation de la matrice vanadate de nanoparticules de type vanadate enrichies en lanthanides, est forte, une excitation de ces nanoparticules dans des longueurs d’onde de l’UV, est typiquement contre-indiquée dans des applications de détection ultrasensibles, du fait de l’émission parasite, excitée à ces longueurs d’onde, de signaux des matériaux et molécules autofluorescentes sur les supports et dans les milieux analysés. De préférence, la détection de l’émission de luminescence par les particules est une détection résolue en temps. Par « détection résolue en temps », on entend au sens de l’invention soit une détection suffisamment rapide pour mesurer la montée et le déclin du signal de luminescence suite au démarrage et l’arrêt de l’excitation soit une détection retardée du signal de luminescence émis par les particules photoluminescentes mises en œuvre selon l’invention, i.e. après la fin de l’émission parasite des matériaux et molécules autofluorescentes. Une mesure de la luminescence résolue en temps a par exemple été décrite dans le document WO 03008974. Cela est possible grâce au fait que l’émission parasite des matériaux et molécules autofluorescentes a typiquement une durée de vie de l’ordre de la nanoseconde tandis que la durée de vie de l’émission des nanoparticules inorganique photoluminescente à matrice vanadate ou vanadate/phosphate vaut quelques centaines de microseconde, notamment dans le cas de l’europium. L’invention permet notamment une détection « ultra-sensible », notamment le procédé présente une sensibilité de détection de la substance d’intérêt biologique ou chimique dans l’échantillon inférieure ou égale à 10 pM, mieux inférieure ou égale à 1 pM, voire inférieure ou égale à 0,1 pM, ou encore inférieure ou égale à 0,01 pM (i.e. 10 fM), ou encore inférieure ou égale à 1 fM, encore mieux inférieure ou égale à 0,1 fM (i.e. 100 aM), encore mieux inférieure ou égale à 0,01 fM (i.e. 10 aM). Une telle détection est possible sans amplification et/ou sans utilisation d’enzymes. Il est possible d’exploiter la largeur spectrale de l’émission fine des ions terres rares, notamment inférieure à 10 nm dans le cas de l’émission de l’europium à 617 nm pour rejeter avec un filtre d’émission efficace les contributions large bande des émissions parasites. Par ailleurs, les inventeurs ont montré que l’utilisation d’une détection résolue en temps, permet de contourner encore de manière efficace le problème d’émissions parasites aux longueurs d’onde utilisées, et d’accéder à une détection dite « ultra-sensible ». L’invention tire ainsi profit de la longue durée d’émission propre aux nanoparticules de formule (I), notamment supérieure à 1 µs, voire supérieure à 10 µs, voire supérieure à 100 µs, à la différence des courtes durées de vie, de l’ordre de quelques nanosecondes pour les molécules fluorescentes, pour s’affranchir au moins partiellement du signal de fond parasite en procédant à une détection retardée du signal de luminescence. De manière avantageuse, la détection de luminescence résolue en temps peut être mise en œuvre en utilisant du matériel peu sophistiqué et peu onéreux, en particulier une modulation du courant d’alimentation de la source d’excitation, un photomultiplicateur classique et un convertisseur A-D de 100 kHz, comme décrit dans la suite du texte. Il est également possible de moduler la source d’excitation par un hacheur mécanique ou par toute autre méthode connue de la personne du métier. La méthode de l’invention permet ainsi avantageusement d’atteindre une performance en termes de sensibilité de détection bien plus élevée que les performances des techniques de détection conventionnelles de type ELISA, ECLIA, FIA ou RIA pour la détection de protéines ou peptides ou molécules organiques telles que les hormones. Pour les acides nucléiques, la méthode de l’invention permet d’atteindre une performance s’approchant de la sensibilité de détection de la PCR sans utiliser de l’amplification ni des enzymes nécessaires à l’amplification de l’ADN, tout en permettant une quantification de la concentration. De manière avantageuse, la méthode ultrasensible de l’invention permet ainsi une détection au moins 10 fois, en particulier au moins 50 fois, mieux au moins 100 fois plus sensible que la méthode d’immuno-détection enzymatique de type ELISA utilisant les mêmes anticorps de reconnaissance et de ciblage. La méthode ultrasensible selon l’invention permet ainsi une détection et/ou une quantification d’une substance d’intérêt présente dans un échantillon en une teneur strictement inférieure à 100 pM, voire inférieure à 10 pM, voire encore inférieure à 1 pM, encore mieux inférieure à 0,1 pM, voire encore à 0,01 pM (10 fM), ou encore inférieure ou égale à 1 fM, encore mieux inférieure à 0,1 fM (i.e. 100 aM), encore mieux inférieure à 0.01 fM (i.e. 10 aM). Ces concentrations dépendent de la molécule cible et, en particulier, de l’affinité du composé de reconnaissance, ou composé de ciblage, couplé à la sonde, mais sont comparables à celles détectables par les méthodes ultra-sensibles (Quanterix ou Singulex). Avantageusement, la méthode ultra-sensible de l’invention, tout en permettant d’atteindre des performances de détection comparables aux technologies ultra-sensibles déjà proposées, s’avère particulièrement avantageuse en termes de facilité de mise en œuvre et de coût. De préférence, l’étape de disposition de particules photoluminescentes comporte la disposition d’une pluralité de particules photoluminescentes, l’excitation (iii) comporte, notamment consiste en, l’excitation simultanée des matrices d’une pluralité de nanoparticules inorganiques photoluminescentes de formule (I) et la détection (iv) comportant, notamment consiste en, la détection simultanée de l’émission de luminescence par les nanoparticules inorganiques photoluminescentes excitée à l’étape d’excitation (iii). De préférence, l’excitation et la détection se font dans un espace d’analyse, de préférence fixe durant l’analyse, comportant une pluralité de particules photoluminescentes et la détermination de la présence et/ou concentration de la substance d’intérêt (v) est effectué par interprétation de la mesure effectuée dans ledit espace d’analyse. De préférence, l’excitation, la détection et la détermination de la présence et/ou concentration de la substance d’intérêt se font sans balayage de l’échantillon durant l’analyse. Ainsi, contrairement aux technologies complexes développées par Quanterix et Singulex, ce dernier nécessitant notamment un balayage de l’échantillon, le méthode ultra-sensible de l’invention met en œuvre un appareillage de détection de faible encombrement, de coût limité et dont chaque élément est aisément disponible à l’achat, pour l’excitation et la mesure de luminescence émise par les nanoparticules, comme détaillé dans la suite du texte, et ne requiert aucun élément d’appareillage spécifiquement dédié à la méthode de détection ultra-sensible de l’invention. Avantageusement, elle est ainsi compatible avec une intégration dans un dispositif d’analyse automatisé, moyennant une adaptation d’ergonomie limitée. Également, l’excitation de la matrice des nanoparticules, faite dans la plage de longueur d’onde précisé ci-dessus peut être mise en œuvre à l’aide d’une source de type diode électroluminescente avec une puissance réduite qui est bien moins onéreuse que des dispositifs d’illumination laser, telle qu’une diode laser, utilisés dans les méthodes décrites précédemment. Par ailleurs, la méthode de l’invention est, en outre, adaptée pour des analyses multiplexées. Ainsi, le procédé de l’invention peut être mis en œuvre pour la détection et/ou la quantification simultanée d’au moins deux substances différentes dans un échantillon, notamment suivant une procédure présentée plus loin. Le procédé de l’invention peut être mis en œuvre pour l’analyse de substance(s) d’intérêt biologique ou chimique dans divers échantillons, dites encore « analyte ». L’échantillon peut être notamment un échantillon biologique, en particulier un échantillon de prélèvement humain, par exemple choisi parmi le sang, le sérum, le plasma, la salive, l’urine et le liquide cérébro-spinal. L’échantillon peut également être de la matière fécale diluée, du frottis vaginal ou un prélèvement nasopharyngé ou de l’expectoration. Un diluant peut être utilisé avec l’échantillon à analyser, notamment lorsque l’échantillon liquide est du plasma, du sérum, du sang total, du frottis nasal ou vaginal ou de l’expectoration par exemple. Au moins une nanoparticule peut être couplée avec une pluralité d’agent de couplage, le procédé comportant une étape de couplage des nanoparticules avec les agents de couplage comportant la mise en solution des nanoparticules avec une proportion d’agent de couplage supérieure à la proportion de nanoparticules, notamment avec un ratio d’au moins deux agents de couplage pour une nanoparticule voire d’au moins 10 agents de couplage par nanoparticules, voire entre 10 et 80 agents de couplage. Il peut encore s’agir d’une solution contenant des molécules biologiques. Le procédé de l’invention peut être par exemple mis en œuvre pour la détection et/ou la quantification de biomarqueurs, d’anticorps, d’ADN et/ou d’ARN. Il peut être mis en œuvre pour détecter de l’ADN et/ou ARN humain, animal, bactérien, viral ou circulant. Il peut également permettre de fournir un génotype dans un échantillon biologique. Il peut s’agir en particulier de tout type d’acide nucléique dont l’ARNt, ARNm, miARN, dsARN, circARN, ncARN, lncARN. L’invention concerne, selon un autre de ses aspects, l’utilisation du procédé défini précédemment à des fins de diagnostic in vitro . Avantageusement, la possibilité par la méthode ultra-sensible, de détecter des teneurs ultra faibles de certaines substances dans des échantillons biologiques permet, par exemple, l’utilisation de la méthode de l’invention pour une détection plus précoce des maladies, ou encore un diagnostic sur l’évolution d’une maladie ou sur l’effet d’un traitement thérapeutique. De plus, cette méthode de détection ultra-sensible permet l’utilisation comme biomarqueurs de substances dont la concentration est actuellement trop faible pour être détectée avec les méthodes classiques. Elle rend également détectables dans des milieux biologiques facilement accessibles (salive, urine, sang, etc.) des biomarqueurs dont la concentration est trop faible pour être détectée avec les méthodes classiques et nécessite des méthodes invasives comme le prélèvement de liquide céphalorachidien par exemple. Selon encore un autre de ses aspects, l’invention concerne un ensemble de diagnostic in vitro , comprenant au moins des particules photoluminescentes formées en tout ou partie d’une nanoparticule inorganique photoluminescente telle que définie précédemment, lesdites particules étant couplées à un agent de couplage, notamment l’agent de couplage étant une fonctionnalisation de surface avec des groupements chimiques, par exemple des groupements carboxyle, amino, thiol, aldéhyde ou époxy, apportés par des molécules, par exemple l’acide citrique ou du polyacide acrylique, et/ou couplées à des molécules, par exemple la streptavidine, lesdits groupements chimiques ou molécules étant aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage de la substance d’intérêt; ou un agent de ciblage de la substance d’intérêt; et un système de détection et/ou de quantification comportant au moins : un dispositif d’illumination, de préférence de type diode électroluminescente, de longueur d’onde d’émission comprise entre 260 et 330 nm, mieux entre 260 nm et 310 nm, mieux entre 270 et 290 nm, pouvant présenter une puissance inférieure ou égale à 500 mW, mieux inférieure ou égale à 200 mW, par exemple comprise entre 50 et 150 mW; un dispositif de détection de l’intensité lumineuse émise par les particules ; le système de détection et/ou quantification comprenant un dispositif de collection et de filtrage spectral de la luminescence émise, un photomultiplicateur et/ou une photodiode et un convertisseur A-D pouvant également comprendre un appareillage de mise en œuvre de la détection résolue en temps de l’émission de luminescence, en particulier un système de modulation électronique de la puissance de la source d’excitation, un hacheur mécanique, un photomultiplicateur et un convertisseur A-D. Le dispositif d’illumination peut être dans l’UV-B ou UV-C. De préférence, le système de détection et/ou de quantification est fixe durant l’analyse. De préférence, le dispositif de détection est dépourvu de dispositif de détection confocal. Un tel ensemble de diagnostic in vitro permet la mise en œuvre aisée d’une méthode de détection et/ou de quantification ultra-sensible selon l’invention, par exemple pour doser des biomarqueurs ou anticorps dans un échantillon biologique. Les maladies pouvant être diagnostiquées avec l’ensemble de diagnostic in vitro de l’invention ne sont pas limitées et comprennent toutes maladies révélées par la présence d’un marqueur spécifique de la maladie, du type molécule d’intérêt biologique (protéine, acide nucléique…), pour lequel il existe un ou des partenaire(s) de liaison spécifique (ligand, anticorps, acides nucléiques complémentaires, aptamères, …). A titre d’exemples, on peut citer les maladies infectieuses (bactériennes, parasitaires, ou virales, telles que le SIDA), les maladies inflammatoires et auto-immunes, les maladies cardiologiques, neurologiques, ou oncologiques (par exemple, les cancers solides tels que le cancer du sein ou de la prostate). Le procédé de détection ultra-sensible de l’invention n’est pas limité aux applications précitées. Il peut ainsi être mis en œuvre pour une détection d’ADN d’OGM dans des semences, par exemple, ou pour la détection d’un polluant ou d’un pathogène dans de l’eau ou dans des aliments destinés à la consommation. Les applications du procédé de détection ultra-sensible selon l’invention peuvent ainsi s’étendre des domaines immunologiques à la génétique moléculaire ou à la détection d’ADN et d’ARN. Il peut être utilisé pour marquer un ou plusieurs brins d’ARN d’un prélèvement biologique, avec un fragment partiellement complémentaire sonde lié à une nanoparticule, puis les détecter par hybridation sur des fragments complémentaires d’une autre région greffés sur un substrat solide, suivant une approche voisine des puces à ADN, de type Affymetrix. Un intérêt de l’invention réside alors dans l’absence d’étape d’amplification habituellement nécessaire pour ces approches. Dans la suite du texte, on désignera plus simplement sous l’appellation « nanoparticule », la nanoparticule inorganique photoluminescente de formule (I) de l’invention. D’autres caractéristiques, variantes et avantages du procédé selon l’invention ressortiront mieux à la lecture de la description, des exemples et des figures qui suivent, donnés à titre illustratif et non limitatif de l’invention. Dans la suite du texte, les expressions « compris entre … et … », « allant de … à … » et « variant de … à … » sont équivalentes et entendent signifier que les bornes sont incluses, sauf mention contraire. Sauf indication contraire, l’expression « comprenant un(e) » doit être comprise comme « comportant au moins un(e) ». Particules luminescentes de l’invention Comme indiqué précédemment, le procédé de détection ultra-sensible selon l’invention repose sur la détection de l’émission de luminescence de particules photoluminescentes comprenant, en particulier étant formées, d’une nanoparticule inorganique photoluminescente à matrice vanadate ou vanadate/phosphate telle que décrite précédemment, et couplées à au moins un agent de couplage direct ou indirect avec la substance d’intérêt. Nanoparticule inorganique photoluminescente Comme indiqué précédemment, les nanoparticules photoluminescentes mises en œuvre selon l’invention sont de formule (I) : A 1-x Ln x VO 4(1-y) (PO 4 ) y (I) dans laquelle : A est choisi parmi l’yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La) et leurs mélanges, en particulier A représente Y ; Ln est choisi parmi l’europium (Eu), le dysprosium (Dy), le thulium (Tm), le samarium (Sm), le néodyme (Nd), l’erbium (Er), l’ytterbium (Yb) et leurs mélanges, en particulier Ln représente Eu ; 0 0 ≤ y Les propriétés des nanoparticules mises en œuvre vont conditionner la sensibilité pouvant être atteinte par la méthode de l’invention. Les nanoparticules inorganiques de l’invention sont avantageusement formées d’une matrice cristalline vanadate ou vanadate/phosphate présentant au moins 10 3 ions de terres rares. Les ions de terre rares dans les nanoparticules de l’invention ne sont pas sous forme de complexes ou chélates d’ions de terres rares, formés d’ions de terres rares en combinaison avec des ligands organiques appropriés, comme par exemple décrits dans la publication Yuan et al . [21]. De préférence, les nanoparticules de l’invention comprennent entre 1000 et 6 000 000 ions de terres rares, en particulier entre 5 000 et 500 00 et plus particulièrement entre 20 000 et 100 0000 ions de terres rares. Les nanoparticules de l’invention peuvent être dopées par des ions de terres rares de même nature ou de natures différentes. Selon une variante de réalisation, comme détaillé dans la suite du texte, le procédé de l’invention met en œuvre au moins deux types de nanoparticules distinctes, se distinguant par la nature des ions de terres rares. L’utilisation simultanée de nanoparticules enrichies en différents lanthanides autorise un multiplexage de la détection de différentes substances, par exemple de différents biomarqueurs, au sein d’un même échantillon. Les nanoparticules photoluminescentes de l’invention peuvent présenter une taille moyenne supérieure ou égale à 20 nm et strictement inférieure à 1 µm. En particulier, elles présentent une taille moyenne comprise entre 20 nm et 500 nm, en particulier comprise entre 20 nm et 200 nm et notamment entre 20 nm et 100 nm. En particulier, la taille moyenne des nanoparticules photoluminescentes de l’invention peut être supérieure ou égale à 20 nm, en particulier supérieure ou égale à 30 nm, notamment comprise entre 30 et 60 nm. En particulier, comme illustré dans les exemples qui suivent, les nanoparticules photoluminescentes selon l’invention peuvent présenter une taille moyenne de l’ordre de 20 à 50 nm. Des nanoparticules de tailles plus importantes peuvent par exemple être obtenues par tri en taille par centrifugation des particules telles qu’exemplifiées, pour ne conserver, dans la distribution de tailles, que les particules de tailles les plus importantes, ou encore être obtenues par broyage du matériau massif. Toute autre technique connue par l’homme du métier peut être également utilisée. Les nanoparticules photoluminescentes mises en œuvre dans le procédé de l’invention présentent ainsi avantageusement un volume suffisant pour contenir un grand nombre d’ions de terres rares, et donc émettre un signal luminescent suffisant pour permettre la détection de faibles concentrations. A titre d’exemple, une nanoparticule sphérique Y 0.6 Eu 0, 4 VO 4 de diamètre de 30 nm contient 70 000 ions Eu 3+ (calcul du nombre d’ions selon la référence [31] Casanova et al . APL 2006). Par ailleurs, les nanoparticules photoluminescentes ne devraient pas être trop volumineuses pour éviter une gêne stérique lors de leur association avec la substance à doser immobilisée par exemple à la surface d’un support, comme décrit dans la suite du texte. La taille moyenne peut être mesurée par microscopie électronique à transmission. Les images de microscopie électronique à transmission permettent de déterminer la forme des nanoparticules (sphériques, ellipsoïdes) et de déduire les dimensions moyennes des nanoparticules. Dans le cas de particules globalement sphériques, la taille moyenne s’entend du diamètre moyen des particules. Dans le cas de particules de forme ellipsoïde, la taille moyenne s’entend de la taille moyenne d’une sphère de même volume que l’ellipsoïde. On suppose en général que le troisième axe de l’ellipsoïde, non visible dans les images de transmission qui sont des projections 2D, est de longueur égale à l’axe de plus petite taille. Selon un mode de réalisation particulier, les nanoparticules de l’invention sont de forme globalement ellipsoïdale allongée (« prolate » en langue anglaise). Elles peuvent plus particulièrement présenter une longueur du grand axe, notée a , comprise entre 20 et 60 nm ; et une longueur du petit axe, notée b , comprise entre 10 et 30 nm. En particulier, les nanoparticules de l’invention peuvent présenter une valeur moyenne de longueur du grand axe, a , de 40 nm et une valeur moyenne de longueur du petit axe, b , de 20 nm. De manière avantageuse, les nanoparticules de l’invention présentent une faible polydispersité. L’indice de polydispersité, qui peut être déduit des mesures MET, peut être en particulier strictement inférieur à 0,2. De manière avantageuse, les nanoparticules mises en œuvre dans le cadre du procédé de l’invention sont aptes à émettre plus de 10 8 photons avant l’arrêt de l’émission, en particulier plus de 10 9 , voire plus de 10 10 photons. Dans de nombreux cas, en particulier dans le cas de particules YVO 4 ou GdVO 4 dopées à l’Eu, aucun arrêt de l’émission n’est constaté. Par ailleurs, de manière avantageuse, les nanoparticules de l’invention présentent une longue durée de vie d’émission. En particulier, elles peuvent présenter une durée de vie d’émission supérieure ou égale à 5 µs, en particulier supérieure ou égale à 10 µs, notamment supérieure ou égale à 20 µs, voire supérieure ou égale à 50 µs, voire supérieure ou égale à 100 µs. La durée de vie d’émission s’entend comme la durée de vie de l’état excité de la nanoparticule émettrice, et est déterminée en pratique par la durée de l’émission de photons de luminescence après arrêt de l’excitation, soit le temps caractéristique du déclin de luminescence après arrêt de l’excitation. Comme discuté précédemment, la méthode ultra-sensible de l’invention peut tirer profit de la durée d’émission longue des particules de l’invention (quelques centaines de µs dans le cas des particules Y 1-x Eu x VO 4 , en comparaison aux durées de vie des fluorophores usuels de l’ordre de la nanoseconde), pour effectuer une détection résolue en temps avec une résolution temporelle suffisante, notamment inférieure à 100 µs, mieux inférieure à 10 µs, en particulier une détection retardée de l’émission. De manière avantageuse, les nanoparticules mises en œuvre selon l’invention ne perdent pas leur luminescence après congélation. Dans un mode de réalisation particulier, les nanoparticules mises en œuvre sont de formule (I) précitée dans laquelle y vaut 0. Autrement dit, les nanoparticules mises en œuvre dans le procédé de l’invention peuvent être de formule A 1-x Ln x VO 4 (I’), dans laquelle A, Ln et x sont tels que définis précédemment. Selon un mode de réalisation particulier, A dans la formule (I) ou (I’) représente l’yttrium (Y). Selon un autre mode de réalisation particulier, Ln dans la formule (I) ou (I’) représente Eu. Ainsi, selon une variante de réalisation, les particules de l’invention comprennent une nanoparticule de formule Y 1-x Eu x VO 4 dans laquelle 0 Les nanoparticules selon l’invention sont de nature majoritairement cristalline et polycristalline, en particulier de taille moyenne de cristallites, déduite par diffraction de rayons X, comme détaillé en exemple 1 qui suit, comprise entre 3 et 40 nm. Selon un autre mode de réalisation particulier, les nanoparticules sont monocristallines avec une forme d’olive et avec des tailles comprises entre 30 et 200 nm. Préparation des nanoparticules Les nanoparticules à matrice cristalline dopée par des ions de terres rares mises en œuvre dans le procédé de l’invention peuvent être préparées par toute méthode conventionnelle connue de l’homme du métier. Des nanoparticules à base de vanadate d’yttrium dopé par des terres rares ont par exemple été décrites de façon détaillée dans les articles [32] et [33]. De manière avantageuse, les nanoparticules de l’invention sont synthétisées de manière aisée, dans un milieu aqueux, ce qui présente l’avantage de s’affranchir de toute étape ultérieure de transfert de solvant. En particulier, les nanoparticules peuvent être formées par réaction de co-précipitation, en milieu aqueux, à partir de précurseurs desdits éléments A et Ln, et en présence d’ions orthovanadate (VO 4 3- ) et éventuellement d’ions phosphate (PO 4 3- ). Les précurseurs des éléments A et Ln peuvent se présenter, de manière classique, sous la forme de sels desdits éléments, par exemple de nitrates, chlorures, perchlorates ou acétates, en particulier de nitrates. Les précurseurs des éléments A et Ln, et leur quantité, sont bien entendu choisis de manière adéquate au regard de la nature de la nanoparticule souhaitée. Par exemple, la synthèse de nanoparticules de formule Y 1 - x Eu x VO 4 peut mettre en œuvre, à titre de composés précurseurs de l’yttrium et de l’europium, les nitrates d’yttrium (Y(NO 3 ) 3 ) et d’europium (Eu(NO 3 ) 3 ). Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, les ions orthovanadate (VO 4 3- ) sont générés in situ à partir d’un sel de métavanadate, de préférence du métavanadate d’ammonium (NH 4 VO 3 ). Les ions orthovanadate peuvent être plus particulièrement formés in situ par réaction dudit sel de métavanadate avec une base (plus précisément avec deux ou trois équivalents de base forte) comme cela est décrit dans l’article Neouze et al [34]. Dans le cas des ions phosphates, on ajoute un sel de phosphate, tel que le phosphate de sodium ou le phosphate d’ammonium. Ainsi, selon une variante de réalisation particulièrement avantageuse, le procédé de l’invention comprend au moins les étapes consistant en : (a) préparer une solution aqueuse (1) par mélange, en milieu aqueux, d’un sel de métavanadate, en particulier du métavanadate d’ammonium (NH 4 VO 3 ), et éventuellement un sel de phosphate, et d’une base, éventuellement source de cations tétraalkylammonium, en particulier un hydroxyde de tétraalkylammonium ; (b) ajouter à la solution aqueuse (1), une solution aqueuse (2) comprenant lesdits précurseurs des éléments A et Ln, en particulier sous forme de sels, notamment de nitrates ; dans des conditions propices à la formation par co-précipitation desdites nanoparticules ; et (c) récupérer les nanoparticules suite à une élimination des contre-ions. Dans un mode de réalisation particulier, la solution aqueuse (2) contenant les précurseurs des éléments A et Ln peut également comprendre des complexants de ces éléments, tel que le citrate, par exemple le citrate de tétraalkylammonium. Selon un mode de réalisation particulier, l’ajout en étape (b) de la solution (2) à la solution (1) est opéré goutte à goutte. Selon un autre mode de réalisation particulièrement préféré, les nanoparticules sont préparées par conversion colloïdale de particules d'hydroxycarbonates de terres rares (voir exemple 1.2). Ainsi, selon une variante, le procédé de l’invention comprend au moins les étapes consistant en : (a) préparer une solution aqueuse (1) par mélange, en milieu aqueux, d’un sel de métavanadate, en particulier du métavanadate d’ammonium (NH 4 VO 3 ), et éventuellement un sel de phosphate; (b) préparer des nanoparticules d’hydroxycarbonates de formule A 1-x Ln x 3+ CO 3 OH à partir de précurseurs des éléments A et Ln, en particulier sous forme de sels, notamment de nitrates, et d’une source d’ions bicarbonates, notamment en excès, notamment de l’urée, dans des conditions propices à la formation par co-précipitation desdites nanoparticules d’hydroxycarbonates, (b’) ajouter la solution aqueuse (1) aux nanoparticules d’hydroxycarbonates en suspension colloïdale dans des conditions propices à la formation par co-précipitation des nanoparticules selon la formule I; et (c) récupérer les nanoparticules selon la formule I. Selon un mode de réalisation particulier, l’ajout en étape (b’) de la solution (1) aux nanoparticules d’hydroxycarbonates est opéré goutte à goutte. Selon une autre variante de réalisation, la solution (1) peut être mélangée avec la solution (2) ou les nanoparticules d’hydroxycarbonates en une seule fois, et non pas au goutte à goutte. Le milieu aqueux des solutions est plus particulièrement formé d’eau et/ou d’un mélange l’eau et d’éthylèneglycol. Il appartient à l’homme du métier d’ajuster de manière adéquate les quantités des différents réactifs, en particulier des précurseurs des ions métavanadate, éventuellement phosphate, desdits éléments A et Ln, et de l’urée au regard de la nature souhaitée pour la nanoparticule selon l’invention. En particulier, les proportions stœchiométriques des différents réactifs selon les formules précitées sont à respecter. De manière avantageuse, le procédé de préparation des nanoparticules ne requiert aucun chauffage de la solution, à la différence notamment des méthodes hydrothermales proposées dans les publications [26] à [29]. En particulier, l’ensemble des étapes (a) à (c) pour la synthèse des particules selon l’invention peut être avantageusement opéré à température ambiante (20-25°C). L’étape (c) consiste plus particulièrement à purifier la solution de particules obtenues, notamment pour éliminer l’excès de contre-ions. Les étapes de purification peuvent plus particulièrement comprendre des étapes de dialyse ou de centrifugation et redispersion des particules en milieu aqueux, par exemple par sonification. Les particules peuvent être redispersées dans un milieu aqueux, en particulier dans l’eau. La synthèse de nanoparticules luminescentes selon l’invention, en particulier de tailles plus importantes, supérieures à quelques dizaines de nanomètres, peut être opérée par toute autre approche connue de l’homme du métier, par exemple par broyage du matériau massif. De préférence, les nanoparticules, notamment récupérées à l’étape (c) ci-dessus, sont mélangées à un agent de protection puis le mélange obtenu est soumis à un recuit post-synthèse à une température comprise entre 500°C et 1500°C, plus particulièrement entre 800°C et 1300°C, puis l’agent de protection est éliminé par une méthode adéquate selon l’agent de protection, notamment par dissolution acide. Cette étape (d) se fait de préférence avant le couplage de la nanoparticule avec l’agent de couplage, notamment avant sa liaison avec un agent de ciblage ou avant sa fonctionnalisation En variante, les nanoparticules sont soumises à un recuit post-synthèse en conditions hydrothermales, en particulier à une température comprise entre 120°C et 300°C. Un recuit permet de réduire l’effet de photoréduction des nanoparticules lorsqu’elles sont soumises à l’excitation. Il permet également d’augmenter le rendement quantique de l’émission des nanoparticules. Agent de ciblage Les particules mises en œuvre à titre de sondes luminescentes selon le procédé de l’invention peuvent être couplées (ou greffées) à au moins un agent de ciblage couplage de la substance à doser dans l’échantillon à analyser. Par « agent de ciblage », on entend un composé permettant une liaison avec une substance d’intérêt biologique ou chimique, et dont l’identification est recherchée. La nature des agents de ciblage mis en œuvre est bien entendu choisie au regard de la substance d’intérêt dans l’échantillon. Les particules mises en œuvre dans la méthode ultra-sensible selon l’invention sont parfaitement adaptées à une grande diversité de ciblages biologiques, les spécificités étant dépendantes de la nature du ou des agents de ciblage greffés à la surface de la nanoparticule. L’agent de ciblage peut être plus particulièrement choisi parmi un anticorps polyclonal ou monoclonal, un fragment d’anticorps, un nanobody, un oligonucléide, un peptide, une hormone, un ligand, une cytokine, un peptidomimétique, une protéine, un carbohydrate, une protéine modifiée chimiquement, un acide nucléique ou oligonucléotide modifié chimiquement, un carbohydrate modifié chimiquement qui cible une protéine de surface cellulaire connue, un aptamère, un assemblage de protéines et d’ADN/ARN ou un chloroalcane utilisé par les marquages de type HaloTag. Une approche de type SNAP-Tag ou CLIP-Tag peut également être utilisée. Selon un mode de réalisation particulier, il s’agit d’un anticorps ou fragment d’anticorps ou un oligonucléotide ou fragment d’oligonucléotide. Des fragments d’anticorps appropriés comprennent au moins un domaine variable d’une immunoglobuline, tels que des domaines variables simples Fv, scFv, Fab, (Fab’) 2 et autres fragments protéolytiques ou des « nanobody » (anticorps à domaine unique tels que les fragments V H H obtenus à partir d’anticorps de camélidés ou V NAR obtenus à partir d’anticorps de poissons cartilagineux). Le terme « anticorps » selon l’invention inclut des anticorps chimériques ; des anticorps humains ou humanisés, des anticorps recombinants et modifiés, des anticorps conjugués, et leurs fragments. Selon un mode de réalisation particulier, les anticorps ou fragments d’anticorps mis en œuvre selon l’invention ciblent des marqueurs spécifiques de cellules cancéreuses. L’agent de ciblage peut également être dérivé d’une molécule connue pour lier un récepteur de surface cellulaire. Par exemple, le fragment de ciblage peut dériver de lipoprotéines de faible densité, transferrine, EGF, insuline, PDGF, enzymes fibrinolytiques, anti-HER2, anti-HER3, anti-HER4, annexines, interleukines, interférons, érythropoïétines ou facteurs stimulant les colonies. Couplage de la particule avec l’agent de ciblage Il appartient à l’homme du métier de mettre en œuvre les méthodes de couplage/greffage adaptées pour préparer de manière adéquate les particules couplées à un ou plusieurs agents de ciblage. La quantité d’agent(s) de ciblage mise en œuvre est ajustée au regard de la quantité de particules ou inversement. L’agent de ciblage peut être greffé directement, ou via un espaceur (encore désigné sous les termes « linker » ou « spaceur »), à la nanoparticule. Les méthodes de couplage (encore appelé greffage) des particules à des biomolécules sont bien connues de l’homme de l’art. Il s’agit en général d’un couplage par liaison covalente, par complexation de surface, par interactions électrostatiques, par encapsulation, ou par adsorption. Dans certains cas, dont le cas d’un couplage par liaison covalente, les particules peuvent être préalablement fonctionnalisées par des groupements chimiques capables ensuite de réagir avec un autre groupement chimique porté par l’agent de ciblage pour former une liaison covalente. Comme exemples de groupements chimiques pouvant être présents à la surface des nanoparticules, on peut citer les groupements carboxyle, amino, thiol, aldéhyde et époxy. Un enrobage des particules par de la silice peut être utilisé pour faciliter la fonctionnalisation ultérieure des particules. Des groupements amino peuvent être apportés par des molécules comme les organosilane aminés, tel que l’aminotriéthoxysilane (APTES). L’avantage de l’APTES réside dans le fait qu’il forme via des liaisons covalentes une capsule autour de la nanoparticule. Les amines apportées par l’APTES sont ainsi très stables dans le temps. Les groupements amino peuvent être transformés en groupements carboxyle par réaction avec de l’anhydride succinique. Des groupements carboxyle peuvent être apportés par des molécules telles que l’acide citrique ou un polyacide acrylique (PAA). Les nanoparticules peuvent en outre comporter à leur surface des molécules de polyéthylène glycol (PEG) servant à minimiser l’adsorption non spécifique des nanoparticules sur la surface de détection. De préférence, le PEG peut présenter une masse molaire de 500 à 20000 g.mol -1 . Dans d’autres cas, les particules peuvent être préalablement couplées à des molécules aptes à permettre un couplage ultérieur avec un agent de ciblage. Par exemple, les particules peuvent être couplées à la streptavidine apte à permettre un couplage avec un agent de ciblage biotinylé. A titre d’exemple, l’exemple 1 illustre le couplage de nanoparticules avec des anticorps biotinylés par couplage des nanoparticules couplées avec la streptavidine avec des anticorps biotinylés. Dans d’autres cas, le couplage des nanoparticules avec des anticorps peut être réalisé directement par couplage des anticorps sur des nanoparticules fonctionnalisées avec de l’APTES. Les groupements amino apportés par l’APTES peuvent être transformés dans un premier temps en groupements carboxyle par réaction avec de l’anhydride succinique, comme cité ci-dessus. Puis, les groupements carboxyle peuvent être activés selon toute technique connue de l’homme de l’art, en particulier par réaction avec le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl)carbodiimide (EDC) et le N-hydroxysuccinimide (NHS), pour réagir ensuite avec les fonctions amines à la surface d’un polypeptide et former une liaison amide covalente, lorsque l’agent de ciblage est une protéine ou un anticorps. La fonctionnalisation des nanoparticules par de l’APTES peut se faire avantageusement suite au recouvrement des nanoparticules par une couche de silice. Le couplage de l’agent de ciblage sur la surface des nanoparticules peut également se faire par toute autre méthode connue de l’homme du métier. Il peut également se faire avantageusement par recouvrement des nanoparticules d’une couche de silice, suivi d’une réaction de recouvrement par de l’APTES (3-aminopropyltriéthoxysilane), dont les fonctions amines servent à réagir avec un agent réticulant bifonctionnel comportant deux fonctions NHS. Par la suite les nanoparticules couplées aux agents réticulants peuvent réagir avec les fonctions amines à la surface d’une protéine (anticorps, streptavidine, etc.). Ce type de procédé de couplage est notamment décrit dans les références [35] et [36]. De manière avantageuse, les particules mises en œuvre dans la méthode de détection ultra-sensible selon l’invention présentent une faible polydispersité. Il est préférable que l’indice de polydispersité, qui peut être déduit des mesures MET ou des mesures de diffusion dynamique de la lumière (DDL), soit strictement inférieur à 0,2. Lorsque cela n’est pas le cas à l’issue de la synthèse ou de la fonctionnalisation des particules, une polydispersité plus faible peut être obtenue par tri en taille par centrifugation ou par toute autre technique connue par l’homme du métier. Comme évoqué précédemment, le procédé selon l’invention peut mettre en œuvre en outre plusieurs moyens d’amplification du signal de luminescence émis par les particules photoluminescentes par analyte, en particulier en faisant varier les caractéristiques du couplage des nanoparticules photoluminescentes avec un ou plusieurs agents de ciblage. Au moins une nanoparticule peut être couplée avec une pluralité d’agent de couplage, notamment d’agents de ciblage ou molécules aptes à permettre un couplage ultérieur avec un agent de ciblage, le procédé comportant une étape de couplage des nanoparticules avec les agents de couplage comportant la mise en solution des nanoparticules avec une proportion d’agent de couplage supérieure à la proportion de nanoparticules, notamment avec un ratio d’au moins deux agents de couplage pour une nanoparticule voire d’au moins 10 agents de couplage par nanoparticules, voire entre 10 et 80 agents de couplage. Les particules photoluminescentes peuvent comporter chacune une pluralité de nanoparticules liés entre elles, notamment par les agents de couplage, pour former un agrégat de nanoparticules, de préférence les particules photoluminescentes étant en dispersion colloïdale dans la solution à l’étape (ii) de mise en contact avec l’échantillon à analyser. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, au moins une nanoparticule peut être couplée avec une pluralité d’agents de ciblage, notamment identiques, notamment biotinylés, afin de conduire avantageusement à la formation d’agrégats contrôlés de nanoparticules fonctionnalisées à la streptavidine liées entre elles par l’intermédiaire des agents de ciblage. Ces agrégats de nanoparticules peuvent être formés en mettant en œuvre, lors du couplage des nanoparticules avec l’agent de ciblage, une proportion d’agent de ciblage supérieure à la proportion de nanoparticules, notamment avec un ratio d’au moins deux agents de ciblage pour une nanoparticule. De préférence, le ratio est ajusté de manière à conduire à des tailles d’agrégats permettant de conserver une bonne dispersion colloïdale dans le milieu de mise en œuvre des particules photoluminescentes, en particulier en milieu aqueux. Tout autre mode de formation d’agrégats contrôlés de nanoparticules peut être mis en œuvre. Par exemple, il est possible d’ajouter à la surface des nanoparticules des oligonucléotides complémentaires en plus des agents de couplage qui mèneront à la formation d’agrégats de nanoparticules. La mise en œuvre de particules formées d’agrégats de nanoparticules photoluminescentes permet d’amplifier le signal de luminescence par analyte, et ainsi d’améliorer encore la sensibilité de la détection. Dans un autre mode de réalisation particulier, la méthode de détection ultra-sensible selon l’invention met en œuvre au moins deux types de particules photoluminescentes distinctes chacune comportant des nanoparticules selon la formule (I), qui sont couplées à des agents de couplage distincts, aptes à se fixer à des sites distincts d’un même analyte. Par exemple, les particules peuvent être couplées à des oligonucléides distincts reconnaissant différentes régions de l’analyte de type acide nucléique. La mise en œuvre de particules photoluminescentes associées à des sites différents à la surface de l’analyte permet avantageusement de fixer deux ou plusieurs nanoparticules sur une seule molécule d’analyte et ainsi d’amplifier le signal de luminescence par analyte, et d’abaisser encore le seuil de sensibilité pouvant être atteint par le procédé de l’invention. Les nanoparticules peuvent être chacune couplée à une pluralité d’agents de couplage chacun à une zone d’une substance d’intérêt, notamment une pluralité d’oligonucléotides configurés pour se fixer sur des zones différentes d’un acide nucléique, notamment des zones distinctes, de préférence éloignées entre elles d’une distance inférieure ou égale à la taille de la particule. Lesdites agents de couplage peuvent être identiques ou différents. Lorsqu’une seule nanoparticule se fixe sur la substance d’intérêt avec plus d’un agent de couplage, cela permet d’utiliser le principe biochimique d’avidité et d’améliorer la liaison de la nanoparticule avec l’analyte, ce qui limite le risque de perte de liaison entre les deux durant les lavages. De plus, cela permet que plusieurs nanoparticules se fixent sur différents sites du même analyte, ce qui permet comme précédemment d’augmenter la sensibilité de détection. Il est entendu que ces modes de réalisation particuliers peuvent être combinés pour atteindre une amplification maximale du signal de luminescence par analyte dans l’échantillon à analyser. Association des sondes luminescentes avec la substance d’intérêt Dans une première étape de la méthode de détection ultra-sensible selon l’invention, les particules photoluminescentes sont associées à la substance de l’échantillon à analyser. Cette étape peut être opérée, de manière similaire aux méthodes conventionnelles, par exemple à la méthode immuno-enzymatique ELISA, à la surface d’un support, comme représenté schématiquement en . Cette variante de réalisation sera plus particulièrement exposée dans la suite du texte. Elle implique notamment l’immobilisation préalable, comme décrit en exemple 2, de la substance de l’échantillon à analyser, à la surface d’un support. En particulier, le procédé peut comporter la fonctionnalisation d’un support par des agents de couplage additionnels de la substance d’intérêt, la mise au contact de la substance d’intérêt dans des conditions de reconnaissance avec les agents de couplage additionnels du support, suivie de la mise en contact d’une solution comportant les particules tels que décrites précédemment en suspension, notamment sous la forme d’une dispersion colloïdale. Le support peut être de différentes natures. Il peut s’agir de lamelles, par exemple de lamelles de verre, de plaques multi-puits comme celles mises en œuvre dans les exemples, microplaques, gels membranes, bandelettes ou microcanaux. Il peut s’agir également d’un plastique de bonne qualité optique ou de tout autre matériau de qualité optique suffisante. De préférence, la surface du support est préalablement passivée de manière que les particules luminescentes ne s’y fixent pas en l’absence de la substance d’intérêt. La passivation de surface peut être opérée par toute méthode connue de l’homme du métier. Il peut s’agir par exemple d’une passivation de la surface en verre à l’aide d’une molécule comprenant un polyéthylène glycol (PEG), par exemple à l’aide de molécules silane-PEG. De préférence, le PEG peut présenter une masse molaire de 500 à 20000 g.mol -1 . Plus le PEG sera long, plus la passivation résultante sera meilleure. Cependant, le PEG ne devrait avantageusement pas être trop long afin de ne pas présenter un encombrement stérique pour la fixation de la substance d’intérêt et permettre l’interaction entre l’agent de ciblage fixé à la surface et la cible. En particulier, plus l’agent de couplage sera de petite taille, plus le PEG devra être court. Le support est en outre fonctionnalisé en surface par un premier agent de ciblage de la substance à détecter/quantifier. Il peut s’agir plus particulièrement d’un anticorps, dit anticorps de capture, comme représenté en phase 1 de la , notamment lorsque la substance d’intérêt est de type biomarqueur, protéine ou polypeptide. Lorsque la substance d’intérêt est de type anticorps, l’agent de ciblage peut être de type antigène spécifique de l’anticorps à détecter. La fonctionnalisation de surface peut être opérée par toute méthode connue de l’homme de métier. Elle peut par exemple être opérée par adsorption suite à une mise en contact prolongée de plusieurs heures, par impression par « spotter » (dépôt de microgouttes de solutions contenant les molécules de ciblage sur la surface à l’aide d’un robot), par une technique d’impression par contact (« contact printing » en langue anglaise) permettant de transférer des molécules par contact entre les motifs topologiques d’un tampon (par exemple un tampon en polydiméthylsiloxane PDMS) et la surface du substrat, ou par d’autres moyens connus de l’homme du métier permettant le dépôt des agents de ciblage en surface du support. L’échantillon à analyser est ensuite mis en contact avec la surface fonctionnalisée dudit support de manière à permettre l’association de la substance à détecter/doser avec l’agent de ciblage porté par le support (phases 2 et 3 de la ). Cette étape implique, à l’instar par exemple d’un test classique d’ELISA, une étape d’incubation de l’échantillon à la surface du support, et de lavage/rinçage du support afin de retirer la solution et les molécules non-liées. Après rinçage, seuls les complexes agent de ciblage/substance à doser, par exemple anticorps/antigène demeurent attachés à la surface du support hormis de rares molécules qui ont pu se fixer de manière non spécifique. Enfin, les particules photoluminescentes, telles que décrites précédemment, formées en tout ou partie d’une nanoparticule photoluminescente et couplées à un agent de couplage de la substance d’intérêt, par exemple un anticorps, sont couplées avec la substance d’intérêt immobilisée à la surface du support (phase 4 de la ). Cette étape implique de laisser incuber la solution de particules photoluminescentes sur la surface du support fonctionnalisée et ensuite de laver/rincer le support afin de retirer les particules non liées au support. Après rinçage, seuls les complexes agent de ciblage/substance à doser/particules couplées à au moins un agent de couplage, par exemple anticorps monoclonal/antigène/anticorps polyclonal-nanoparticule demeurent attachés à la surface du support hormis de rares nanoparticules qui ont pu se fixer de manière non spécifique. Le temps d’incubation peut être ajusté par des essais préalables de manière à maximiser le signal l’émission de luminescence. D’une manière générale, il peut être compris entre 30 minutes et 2 heures. Le couplage des particules couplées à un agent de couplage avec la substance d’intérêt peut par exemple impliquer une reconnaissance d’un couple ligand/anti-ligand, par exemple biotine ou composés biotinylés/avidine ou streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, tel que digoxygénine (DIG)/anticorps anti-DIG, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire de polynucléotide, etc. étant entendu que l’un des éléments de ces couples constitue la substance d’intérêt, ou l’agent de ciblage ou un autre élément couplé à la substance d’intérêt. Ainsi, dans un mode de réalisation, l’étape (i) comprend au moins les étapes suivantes : (a) disposer d’un support dont la surface est préalablement passivée et fonctionnalisée avec un agent de capture de la substance d’intérêt, par exemple un anticorps monoclonal, dit anticorps de capture ; (b) mettre en contact ledit échantillon à analyser avec le support de l’étape (a) dans des conditions propices à l’association de ladite substance d’intérêt avec l’agent de capture ; et (c) mettre en contact les particules photoluminescentes couplées à au moins un agent de couplage avec ledit support issu de l’étape (b) pour associer directement ou indirectement les particules avec ladite substance immobilisée à la surface du support. L’association peut être directe ou indirecte, notamment l’agent de couplage peut être un agent de ciblage de la substance d’intérêt ou une molécule apte à se fixer à un agent de ciblage couplé à la substance d’intérêt. Dans ce dernier cas, le procédé peut comporter la mise en contact de la substance d’intérêt à des agents de ciblage préalablement à la mise en contact avec les particules. Cette mise en contact peut se faire avant la capture de la substance d’intérêt sur le support ou après la capture de la substance d’intérêt. De préférence, l’agent de ciblage est différent de l’agent de capture. Il est entendu que la substance d’intérêt peut être immobilisée en plusieurs zones prédéfinies et distinctes de la surface du support. Ceci peut être notamment réalisé en mettant en œuvre une fonctionnalisation localisée de la surface du support par ledit agent de ciblage (par exemple, anticorps de capture), comme cela est le cas lors de la fonctionnalisation de multiples puits d’une plaque multipuits. Il peut s’agir d’un dépôt en plusieurs zones prédéfinies du même agent de ciblage. Dans ce cas, ces zones multiples servent à détecter la même substance dans plusieurs échantillons différents. Une telle mise en œuvre est plus particulièrement opérée lors de l’utilisation de la méthode de détection ultra-sensible selon l’invention pour une analyse multiplexée. Dans le cadre de l’analyse multiplexée, permettant la détection et/ou quantification simultanée d’au moins deux substances différentes dans un échantillon, les différentes substances à analyser de l’échantillon peuvent être immobilisées en des zones prédéfinies et distinctes à la surface du support, par exemple en fonctionnalisant localement la surface du support par des agents de ciblage spécifiques de chacune des substances à analyser. La surface est préalablement passivée de manière à ce que les particules photoluminescentes ne s’y fixent pas en l’absence des substances à analyser. Dans ce cas, les particules utilisées devront comporter sur leur surface de multiples agents de ciblage différents, et, plus particulièrement, au moins un agent de ciblage spécifique de chacune des substances à analyser. De cette façon, les substances à analyser seront quantifiées grâce à l’intensité d’émission de la particule sur chaque zone, la localisation spatiale de la zone en question indiquant la nature de la substance. Il est également possible de combiner les approches multiplexées pour plusieurs échantillons et pour plusieurs substances à analyser en fonctionnalisant localement des zones prédéfinies et distinctes de la surface du support par des agents de ciblage spécifiques de chacune des substances à analyser et cela de façon répétée autant de fois que le nombre d’échantillons à analyser. Dans ce cas, l’intensité d’émission de la particule sur chaque zone renseigne sur la présence et/ou la concentration de chaque substance d’intérêt dans chaque échantillon, la localisation spatiale de la zone en question indiquant à la fois la nature de la substance et le nombre d’échantillons. Également, il est possible pour une détection multiplexée de mettre en œuvre au moins deux types de nanoparticules, dopées par des ions de terres rares distincts, présentant des longueurs d’onde d’émission distinctes, par exemple YVO 4 :Eu et YAG :Ce, et couplées à des agents de couplage chacun à une de deux substances d’intérêt différentes. La détection du signal de luminescence en utilisant deux filtres d’émission différents, permet de détecter et/ou de doser chacune des substances à analyser. De préférence, dans le cadre d’une telle variante de détection multiplexée, au moins deux types de nanoparticules ayant des longueurs d’onde d’émission distinctes, et couplées chacune à des agents de ciblage de chacune des substances à analyser peuvent être utilisées, de manière à séparer les signaux de luminescence obtenus. La combinaison des deux approches peut également être utilisée (analyse de plusieurs échantillons différents et de plusieurs substances différentes dans chaque échantillon), notamment pour la comparaison des concentrations de molécules cibles entre au moins deux échantillons, celle-ci étant réalisée en comparant les intensités des couleurs d’émission de chacune des nanoparticules, couplées chacune à l’agent de ciblage spécifique de chaque substance d’intérêt, et ce pour plusieurs zones de dépôt correspondant chacune à un échantillon différent. Alternativement, la combinaison des deux approches peut également être utilisée - analyse dans plusieurs échantillons différents (prélèvement d’origine différente, ou de même origine à différents temps, dans différentes conditions, sous différents stimuli...) de plusieurs substances différentes dans chaque échantillon -, notamment pour la comparaison des concentrations de molécules cibles entre au moins deux échantillons. Celle-ci est réalisée en comparant les intensités des couleurs d’émission de chacune des nanoparticules, couplées chacune aux agents de ciblage spécifiques de chaque substance d’intérêt, et ce pour plusieurs zones de dépôt correspondant à des molécules cibles différentes. Dans ce cas, la comparaison des couleurs d’émission à une zone de dépôt de référence fournit une comparaison des concentrations d’une molécule entre les deux échantillons. Différentes autres combinaisons de ces approches peuvent être envisagées : par exemple, analyser quatre substances en utilisant deux types de nanoparticules avec deux couleurs d’émission différentes, couplées chacune à deux des quatre différents agents de couplage nécessaires pour la reconnaissance des quatre substances à analyser, et deux zones distinctes de la surface du support fonctionnalisées localement par deux des quatre agents de couplages spécifiques de chacune des substances à analyser. A titre d’exemple, le multiplexage peut être mis en œuvre pour l’identification de variants viraux dans le cas de la détection de génome de virus. L’invention n’est bien entendu pas limitée à la variante de mise en œuvre décrite ci-dessous dans laquelle la substance d’intérêt est immobilisée à la surface d’un support (de type lamelles de verre ou plaques multi-puits par exemple). D’autres configurations sont envisageables pour l’association des particules photoluminescentes de l’invention à la substance d’intérêt. Des variantes de réalisation peuvent mettre en œuvre par exemple un gel pour séparer les molécules biologiques selon leur taille et/ou leur charge suivi d’un transfert à une membrane où les molécules sont spécifiquement détectées par les nanoparticules couplées à l’agent de ciblage, à l’instar de la méthode « Western blot ». Dans d’autres variantes, la surface de réaction n’est pas de type support solide, mais peut être par exemple une autre nanoparticule magnétique, une microbille magnétique, etc. Un champ magnétique peut ensuite capturer les nanoparticules luminescentes associées à l’analyte et aux nanoparticules ou billes magnétiques au voisinage d’une surface avant de procéder à la mesure de la luminescence. La mesure peut être par exemple effectuée directement au sein de l’échantillon à analyser. Dans le cas où l’échantillon est gazeux, ce support d’échantillon peut prendre la forme d’un volume fermé pour empêcher la dispersion de l’échantillon à tester. Le support d’échantillon peut également prendre la forme d’une cuve ou cuvette, en particulier dans le cas où l’échantillon est sous forme de solution. Le procédé ultra-sensible de l’invention peut également être adapté pour être mis en œuvre dans des technologies de type cytométrie en flux (en anglais « Fluorescence-activated cell sorting » ou FACS). Dans ce cas, des particules de l’invention, couplées à des agents de ciblage visant la reconnaissance de molécules spécifiques du type cellulaire à analyser, sont mises en contact avec les cellules et le système de cytométrie doit être adapté pour comporter une source d’excitation, de préférence une diode laser UV, à une longueur d’onde adaptée à l’excitation de la matrice des nanoparticules. Le procédé ultra-sensible de l’invention peut également être adapté pour être mis en œuvre dans des technologies de type immunocytochimie et immunohistochimie. Mesure de la luminescence Comme indiqué précédemment, la méthode ultra-sensible selon l’invention met plus particulièrement en œuvre une étape (iii) d’excitation par un rayonnement UV-B et/ou UV-C des particules photoluminescentes couplées à la substance d’intérêt et une étape (iv) de détection de la luminescence émise par les particules. Montage de détection La méthode ultra-sensible selon l’invention est avantageusement mise en œuvre à l’aide d’un appareillage peu sophistiqué et peu onéreux. Plus précisément, il comporte, d’une manière générale : - un dispositif d’illumination à une longueur d’onde comprise entre 240 nm et 330 nm, mieux entre 260 et 330 nm, mieux entre 260 nm et 310 nm, mieux entre 270 et 290 nm, de préférence de type diode électroluminescente, de préférence présentant une puissance inférieure ou égale à 500 mW, mieux inférieure ou égale à 200 mW, par exemple comprise entre 50 et 150 mW; et - un dispositif de détection de l’intensité lumineuse émise par les nanoparticules en étape (iii). De préférence, le dispositif d’illumination émet dans l’UV-B et/ou UV-C. De préférence, le dispositif de détection est dépourvu de système confocal. Il sera fait référence, dans la suite du texte, aux figures 2 et 3 annexées, qui représentent, de manière schématique et partielle, des installations adaptées à la mise en œuvre du procédé ultra-sensible de l’invention. L’appareillage peut en outre comporter un support adéquat pour l’immobilisation de la substance d’intérêt dudit échantillon durant le procédé, comme décrit ci-dessus. Selon une variante de réalisation, l’appareillage selon l’invention comporte un système de translation du support ou du dispositif d’illumination, permettant d’illuminer successivement différentes zones localisées du support, par exemple différents puits d’une plaque multipuits. Une telle variante est notamment utilisée pour la mise en œuvre de la méthode de détection de l’invention pour un multiplexage spatial et/ou pour la mesure de plusieurs échantillons, le système de translation permettant l’illumination successivement de chacune des zones prédéfinies comportant les substances à analyser dans un même échantillon, voire dans plusieurs échantillons différents. Le dispositif d’illumination peut également comprendre un montage optique, en particulier un système d’au moins une lentille, disposé sur la trajectoire du faisceau d’excitation de manière à contrôler la taille du faisceau au niveau de la zone du support présentant les particules associées à la substance d’intérêt. Le montage optique de mise en forme du faisceau peut comporter, de manière classique, un système de collimation et de diminution de la taille du faisceau, par exemple à l’aide de lentilles, en particulier de deux lentilles. Il permet alors de contrôler la zone illuminée au niveau de la zone du support présentant les particules associées à la substance d’intérêt de façon à obtenir une intensité appropriée (par exemple 10 W/cm 2 ) et une illumination dont les dimensions sont voisines ou plus petites que celles du spot de dépôt (par exemple 1 mm de diamètre). La détection résolue en temps peut être obtenue par un hachage mécanique ou électronique du faisceau d’excitation. Pour permettre une telle détection résolue en temps, l’appareillage, notamment le dispositif d’illumination, peut comporter un hacheur mécanique placé sur le trajet du faisceau d’excitation. Le hachage de l’illumination peut également être réalisée de manière électronique par une modulation du courant alimentant la source d’illumination voire de toute autre manière connue de l’homme du métier telle que par l’utilisation d’un cristal acousto-optique. Une telle détection résolue temporellement permet ainsi avantageusement de limiter la contribution au signal de luminescence d’espèces parasites présentes dans l’échantillon (sérum, sang, etc.) ou dans les substrats solides utilisés (verre, plastique, etc.), notamment de biomolécules, en séparant temporellement des signaux de luminescence parasites du signal émis par les nanoparticules, car ces signaux parasites ont généralement des durées de vie caractéristiques inférieures à 1 µs, voire inférieures à 100 ns, voire inférieure à 10 ns. La détection de l’émission de luminescence peut être opérée par mesure de l’intensité lumineuse émise à une longueur d’onde de luminescence des particules photoluminescentes mises en œuvre. A titre d’exemple, dans le cas de la mise en œuvre de nanoparticules Y 1-x Eu x VO 4 , l’intensité lumineuse émise peut être mesurée à la longueur d’onde de luminescence de Eu 3+ , à savoir 617 nm. Le dispositif de détection peut comprendre un détecteur unique, en particulier de type photomultiplicateur, photodiode, photodiode à avalanche, ou un détecteur de type réseau de dispositifs photosensibles consistant en une surface 2D de pixels de détection tel qu’une caméra CCD ou EM-CCD ou caméra CMOS. Un dispositif de détection 2D permet de mesurer simultanément le signal d’émission de nanoparticules provenant des différentes zones correspondant à différents échantillons et/ou différentes substances à analyser sur la surface du support et ne nécessite pas de déplacement du support ou du faisceau d’excitation. De préférence, le dispositif de détection de l’intensité lumineuse comprend un détecteur unique, en particulier un photomultiplicateur, ce qui permet de réaliser un dispositif de détection moins onéreux. Il peut également comprendre un montage optique de collection de la luminescence émise, en particulier un système d’au moins une lentille à grande ouverture numérique, pour focaliser l’émission de luminescence vers le détecteur, en particulier vers le photomultiplicateur. Des filtres interférentiels peuvent également être placés sur le trajet du faisceau émis pour éliminer spectralement les signaux parasites. La détection peut être opérée en réflexion, autrement dit du côté de la face du support recevant le faisceau d’excitation, notamment par un dispositif d’épifluorescence. Une telle détection permet de réduire le bruit de fond de la mesure qui est un paramètre particulièrement sensible et qui permet d’améliorer la sensibilité de la mesure. Alternativement, elle peut être opérée en transmission. Analyse de la mesure de luminescence Le procédé de l’invention comprend enfin une étape (v) de détermination de la présence et/ou de la concentration de la substance par interprétation de la mesure de luminescence. Il est entendu que le dispositif de détection selon l’invention peut comprendre en outre tout moyen permettant d’analyser l’émission de luminescence, par exemple un convertisseur permettant d’enregistrer et d’exploiter le signal de luminescence. L’interprétation de la mesure de la luminescence peut être effectuée par référence à un étalon ou étalonnage préétablis. Plus précisément, la quantité de la substance d’intérêt dans l’échantillon peut être déterminée par référence à une courbe d’étalonnage préétablie au moyen de mesures réalisées avec des échantillons à quantité connue en ladite substance, de préférence dans des conditions identiques à celles de l’étude de l’échantillon, ces conditions identiques incluant notamment le solvant et le pH du milieu. De manière avantageuse, comme illustré en exemple 3, le procédé ultra-sensible selon l’invention permet de détecter et de quantifier une substance d’intérêt dans un échantillon en une teneur strictement inférieure à 10 pM, en particulier inférieure à 1 pM, voire inférieure à 0,1 pM, ou encore inférieures à 0,01 pM (i.e. 10 fM), ou encore inférieure à 1 fM, encore mieux inférieure à 0,1 fM (i.e. 100 aM), encore mieux inférieure à 0.01 fM (i.e. 10 aM). De fait, il permet une détection au moins dix fois, en particulier au moins 100 fois, voire 1000 fois plus sensible que la méthode d’immuno-détection enzymatique de type ELISA, utilisant les mêmes anticorps de reconnaissance et de ciblage. Ensemble de diagnostic in vitro L’invention concerne encore, selon un autre de ses aspects, un ensemble de diagnostic in vitro , notamment pour la mise en œuvre du procédé tel que décrit précédemment, comprenant au moins : - des particules luminescentes formées en tout ou partie d’une nanoparticule inorganique photoluminescente telle que définie précédemment, lesdites particules étant couplées à un ou plusieurs agents de couplage, notamment étant fonctionnalisées en surface avec des groupements chimiques, par exemple des groupements carboxyle, amino, thiol, aldéhyde ou époxy, apportés par des molécules, par exemple l’APTES, et/ou couplées à des molécules, par exemple la streptavidine, lesdits groupements chimiques ou molécules étant aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage de la substance d’intérêt; ou étant déjà couplées à au moins un agent de ciblage de la substance d’intérêt; un système de détection et/ou de quantification comportant au moins : un dispositif d’illumination tel que décrit précédemment, un dispositif de détection de l’intensité lumineuse émise par les particules, le système de détection et/ou quantification pouvant comprendre un appareillage permettant une détection résolue en temps de l’émission de luminescence, en particulier un système de modulation du courant alimentant la source d’illumination, un photomultiplicateur et un convertisseur A-D. Un enrobage des particules par de la silice peut être utilisé pour faciliter la fonctionnalisation ultérieure des particules. L’ensemble de diagnostic in vitro selon l’invention peut comprendre en outre un support adéquat pour l’immobilisation de la substance d’intérêt dudit échantillon, comme décrit précédemment. Il peut s’agir d’un support dont la surface a été passivée et fonctionnalisée avec un agent de capture, notamment un agent de ciblage, de la substance à détecter/quantifier, par exemple avec un premier anticorps, comme décrit précédemment. Dans une première variante de réalisation, l’ensemble de diagnostic in vitro selon l’invention peut comprendre des particules photoluminescentes selon l’invention déjà couplées à un agent de ciblage, en particulier à des anticorps, appelés « anticorps de révélation » pour les distinguer des anticorps de capture immobilisés au niveau du support. Les particules couplées à l’agent de ciblage peuvent être obtenues comme décrit précédemment. Dans une autre variante de réalisation, l’ensemble de diagnostic in vitro peut comprendre des particules qui ne sont pas couplées à un agent de ciblage, à partir desquelles l’utilisateur pourra préparer les particules couplées à un ou plusieurs agents de ciblage pour une mise en œuvre dans la méthode ultra-sensible selon l’invention. Selon un mode de réalisation particulier, l’ensemble de diagnostic in vitro selon l’invention peut ainsi comprendre plusieurs récipients comprenant, de manière isolée, lesdites particules non couplées d’une part et, d’autre part, un ou plusieurs agents de ciblage. Alternativement, l’ensemble de diagnostic in vitro selon l’invention ne comprend pas d’agent de ciblage, l’utilisateur pouvant obtenir séparément l’agent de ciblage, par exemple biotinylé, de son choix, par tout fournisseur compétent. La préparation des particules couplées aux agents de ciblage implique dans le cadre de cette variante de réalisation le mélange des particules non couplées selon l’invention avec l’agent de ciblage, dans des rapports de concentrations prédéterminés par le contenu des récipients dans le cas de la présence de l’agent de ciblage au sein de l’ensemble diagnostic in vitro selon l’invention, ou déterminé par l’utilisateur, par exemple comme décrit en exemple 1. Les particules non couplées à un agent de ciblage mises en œuvre dans un ensemble de diagnostic in vitro selon l’invention peuvent être notamment des particules couplées à des molécules, par exemple la streptavidine, aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage, par exemple biotinylé, par exemple un anticorps biotinylé. D’autres couples de molécules peuvent être envisagées pour ce type de couplage, par exemple haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, tels que digoxygénine (DIG)/anticorps anti-DIG, sucre/lectine et polynucléotide/complémentaire de polynucléotide. Alternativement, les particules non couplées à un agent de ciblage mises en œuvre dans un ensemble de diagnostic in vitro selon l’invention peuvent être notamment des particules fonctionnalisées en surface avec des groupements chimiques aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage de la substance d’intérêt, par exemple des groupements carboxyle, amino, thiol, aldéhyde ou époxy, apportés par des molécules, comme par exemple l’APTES. Il est entendu que la fonctionnalisation de la surface des nanoparticules peut comporter plus d’une couche. Par exemple, comme évoqué précédemment, les particules de l’invention peuvent comporter une couche de préparation ou stabilisation de la surface des nanoparticules, telle qu’une couche de silice, suivie d’une couche de fonctionnalisation par des groupements chimiques actifs, telle qu’une couche constituée d’APTES (aminopropyltriéthoxysilane). Les exemples et figures présentés ci-dessous sont uniquement donnés à titre illustratif et non limitatif de l’invention. représente schématiquement un principe de détection et quantification des biomolécules : surface fonctionnalisée avec un anticorps de capture (55) (phase 1) ; mise en contact de l’échantillon à analyser (phase 2), lavage (phase 3) et association des particules photoluminescentes couplées à un agent de ciblage (42) (ici un anticorps) avec la substance d’intérêt (40), ici immobilisée à la surface du support suivie d’un lavage pour éliminer les particules non immobilisées (phase 4) ; représente schématiquement un principe de détection d’acides nucléiques ADN/ARN à l’aide des particules selon l’invention : de l’ADN simple brin (55) partiellement complémentaire au brin à détecter est fixé sur un support. L’ADN simple brin constitue un agent de capture de l’ADN ou l’ARN à détecter. Ensuite, l’échantillon contenant l’ADN ou l’ARN à détecter (40) est incubé avec le support fonctionnalisé (phase A). Après rinçage, les nanoparticules (38) couplées à de l’ADN simple brin (42), formant un agent de ciblage de l’ADN ou l’ARN à détecter, partiellement complémentaire à au moins une partie non appariée de l’ADN ou ARN à détecter, sont incubées avec le support (phase B). Après rinçage, seules les nanoparticules (38) immobilisées sur la surface du support après appariement avec l’ADN ou ARN à détecter sont présentes (phase C). Elles peuvent être détectées et quantifiées comme décrit dans le texte. Contrairement à ce qui est montré de manière schématique dans la figure, il est préférable de disposer d’espaceurs entre la surface et la zone complémentaire à la substance d’intérêt de l’agent de capture et entre la surface de la nanoparticule et la zone complémentaire de l’agent de ciblage. représente schématiquement un dispositif simple d’excitation UV des nanoparticules et de détection de leur luminescence en transmission selon l’invention. représente schématiquement un dispositif d’excitation UV ; représente schématiquement un dispositif de détection en réflexion selon l’invention ; représente schématiquement un ensemble du dispositif d’excitation UV de la et du dispositif de détection de la . Les lentilles supplémentaires par rapport au dispositif en transmission de la permettent un meilleur contrôle de la collimation de la LED UV, de la taille et des angles du faisceau d’excitation au niveau de l’échantillon ainsi que de la taille et des angles de la luminescence collectée lorsqu’elle est focalisée sur le photomultiplicateur. représente le signal S de détection d’insuline recombinante en solution jusqu’à des concentrations d’insuline recombinante [I] de 834 aM (10 fg/mL) avec le dispositif de détection de la et des nanoparticules YVO 4 :Eu (20%) recuites synthétisées comme indiquée dans l’exemple 1 ci-dessous. Les nanoparticules sont couplées à de la streptavidine en proportion par rapport aux nanoparticules 40:1 et couplées à des anticorps biotinylés en proportion par rapport aux nanoparticules 60 :1. Les mêmes anticorps que les anticorps du kit ELISA ont été utilisés. La ligne noire indique le signal moyen des échantillons « blanc ». La ligne grise indique la valeur de signal correspondant au signal moyen des échantillons « blanc » plus 3 fois l’écart-type des échantillons « blanc ». représente le signal S de détection d’interféron gamma en solution dans du tampon (figure 5a) ou du sérum (figure 5b) jusqu’à des concentrations en interféron gamma [IFN-γ] de 2,6 fM (50 fg/mL) avec le dispositif de détection de la et des nanoparticules YVO 4 :Eu (20%) recuites synthétisées comme indiquée dans l’exemple 1 ci-dessous. L’anticorps de capture est le même que celui du kit Thermofischer 13-7319-81, l’anticorps de détection est l’anticorps complet tandis que le kit contient un fragment Fab du même anticorps. Les nanoparticules sont couplées à de la streptavidine en proportion par rapport aux nanoparticules 40:1 et couplées à des anticorps biotinylés en proportion par rapport aux nanoparticules 30 :1. La ligne noire indique le signal moyen des échantillons « blanc ». La ligne grise indique la valeur de signal correspondant au signal moyen des échantillons « blanc » plus 3 fois l’écart-type des échantillons « blanc ». [Fig 6] représente la détection d’absorbance A d’interféron gamma en solution dans du tampon (figure 6a) ou du sérum (figure 6b) par un kit ELISA 88-7316-88 Thermofischer en fonction de la concentration en interféron gamma [IFN-γ]. La limite de détection du kit indiquée par le fournisseur est de 260 fM (5 pg/mL) ; représente le signal S de détection d’HIV-p24 en solution par les anticorps d’un kit QC221 Quantikine Immunoassay Control Set 896 HIV-1 Gag p24 Biotechne comme agent de capture et de couplage en fonction de la concentration en HIV-p24 en solution [p24]. La détection est effectuée avec le dispositif de détection de la et des nanoparticules YVO 4 :Eu (20%) recuites synthétisées comme indiquée dans l’exemple 1 ci-dessous; L’anticorps de détection du kit a été biotinylé en amont pour former l’anticorps de couplage couplé aux nanoparticules afin de cibler la substance d’intérêt durant la détection. représente schématiquement un principe de détection optimisé pour les acides nucléiques : surface fonctionnalisée avec un oligonucléotide de capture (55) (phase 1) ; mise en contact de l’échantillon à analyser, après dénaturation, avec des oligonucléotides de détection formant des agents de ciblage (42) pour coupler l’acide nucléique d’intérêt (40) de l’échantillon avec l’oligonucléotide de détection (42) (phase 2), association des conjugués acide nucléique-oligonucléotide de détection avec la surface fonctionnalisée (phase 3) et association des particules photoluminescentes (38) couplées à des molécules permettant la fixation de l’agent de ciblage (ici des molécules de streptavidine) (44) avec l’oligonucléotide de détection (42) en solution et des conjugués acide nucléique-oligonucléotide de détection (phase 4), suivie d’un lavage pour éliminer les particules non immobilisées, c’est-à-dire non couplés aux conjugués acide nucléique-oligonucléotide de détection ; détection de l’émission de luminescence par les nanoparticules immobilisées après excitation en lumière UV-B et/ou UV-C à une longueur d’onde de 280 nm avec une intensité de 4.5mW/cm² (phase 5). représente le signal S de détection du gène n1 du SARS-CoV-2 double brin en solution obtenu par PCR jusqu’à des concentrations en gène n1 du SARS-CoV-2 double brin en solution [DNA] de 50 fM avec le dispositif de détection de la et des nanoparticules YVO 4 :Eu(20%) recuites synthétisées comme indiquée dans l’exemple 1 (figure 9a). Détection du gène n1 du SARS-CoV-2 synthétisé double brin (détection jusqu’à des concentrations de 5 fM, figure 9b) et simple brin (détection jusqu’à des concentrations de 0,5 fM, ). Les nanoparticules couplées à de la streptavidine en proportion par rapport aux nanoparticules 40:1 et recouverts d’oligonucléotides de détection biotinylés complémentaires à l’ADN à détecter en proportion par rapport au nombre de molécules de streptavidine 1 :180 (streptavidine en excès). Ici le signal moyen des échantillons « blanc » a été soustrait de toutes les valeurs mesurées. Ainsi, le signal moyen des échantillons « blanc » apparaît comme égal à 0. La ligne grise indique la valeur de signal correspondant au signal moyen des échantillons « blanc » plus 3 fois l’écart-type des échantillons « blanc ». représente le signal S de détection du gène n1 du SARS-CoV-2 simple brin avec le dispositif de la et des nanoparticules YVO 4 :Eu(5%) recuites à 1000°C synthétisées comme indiquée dans l’exemple 1.2, détection jusqu’à des concentrations [DNA] de 10 aM. Les nanoparticules ont été couplées à de la streptavidine en proportion par rapport aux nanoparticules de 40:1 et recouverts d’oligonucléotides de détection biotinylés complémentaires à l’ADN à détecter en proportion par rapport au nombre de molécules de streptavidine 1 :180 (streptavidine en excès). Ainsi, le signal moyen des échantillons « blanc » est indiqué par une ligne noire. La ligne grise indique la valeur de signal correspondant au signal moyen des échantillons « blanc » plus 3 fois l’écart-type des échantillons « blanc ». représente schématiquement un couplage des nanoparticules (38) couplées avec la streptavidine (44) qui fixe des anticorps (40) biotinylés (42) en proportion au moins deux fois supérieure à celle des nanoparticules pour former des agrégats, certains anticorps biotinylés se couplant à au moins deux nanoparticules ; représente schématiquement un couplage des nanoparticules 38 couplées avec la streptavidine (44) fixant des chaines carbonées (46) biotinylées (42) comportant un bras lié à de l’ADN de détection (complémentaire à l’ADN cible) (48) et au moins deux bras liés à de la biotine (42), les chaines carbonées étant en proportion au moins deux fois supérieure à celle des nanoparticules pour former des agrégats, certaines chaines carbonées (46) se couplant à au moins deux nanoparticules par l’intermédiaire de la biotine ; représente schématiquement un couplage de nanoparticules 38, chacune couplées avec des oligonucléotides de détection (42 1 à 42 5 ) différents des autres nanoparticules, oligonucléotides de détection complémentaires à des zones différentes d’un acide nucléique cible (40) fixée dans un puits fonctionnalisé par des agents de capture (55), par exemple des oligonucléotides complémentaires de l’acide nucléique cible ; et représente schématiquement un couplage d’une nanoparticules (38) couplée avec différents oligonucléotides de détection (42 1 à 42 4 ) oligonucléotides complémentaires d’un acide nucléique cible (40) fixée dans un puits fonctionnalisé par des agents de capture (55 1 à 55 3 ), par exemple des oligonucléotides complémentaires de l’acide nucléique cible, au moins deux oligonucléotides différents de la nanoparticule se fixant à des zones différentes mais proches du même acide nucléique et au moins deux agents de ciblage se fixant à des zones différentes de l’acide nucléique cible. Description détaillée Préparation des particules luminescentes de formule Y 0,6 Eu 0,4 VO 4 Des nanoparticules YVO 4 dopées à 20% d’Europium sont préparées par une méthode connue, notamment par la méthode telle que décrite en détail dans la demande WO 2019/025618 ou par la méthode décrite ci-dessous. Une solution aqueuse de 10 mL de NH 4 VO 3 à 0,1M et 0,3 M de N(CH 3 ) 4 OH (solution 1) est fraichement préparée. Un volume de 10 mL d’une autre solution de Y(NO 3 ) 3 et de Eu(NO 3 ) 3 à 0,1 M en ions (Y 3+ + Eu 3+ ) est ajoutée goutte à goutte à l’aide d’un pousse-seringue dans la solution 1 à un flux de 1 mL/min. Le rapport en concentration molaire entre Y(NO 3 ) 3 et Eu(NO 3 ) 3 est choisi en fonction du rapport entre ions Y 3+ et Eu 3+ souhaité dans la nanoparticule, typiquement le rapport molaire Y 3+ :Eu 3+ est de 0,8 : 0,2. Dès l’ajout de la solution Y(NO 3 ) 2 /Eu(NO 3 ) 3 , la solution devient diffusante et apparaît blanche/laiteuse. La synthèse se poursuit jusqu’à l’ajout total de la solution Y(NO 3 ) 2 /Eu(NO 3 ) 3 . La solution est ensuite laissée sous agitation pendant 15 jours à température ambiante. La solution finale de 20 mL doit à présent être purifiée pour éliminer l’excès de contre ions. Pour ce faire, des centrifugations (typiquement trois) à 11000 g (Sigma 3K10, Bioblock Scientific) pendant 80 minutes suivies chacune d’une redispersion par sonification (Branson Sonifier 450 fonctionnant à 50 % avec une puissance de 540 W) sont utilisées jusqu’à atteindre une conductivité strictement inférieure à 100 µS.cm -1 . Les nanoparticules obtenues sont recuites en conditions hydrothermales à 220°C pendant 2h dans une autoclave. Un tel recuit améliore la cristallinité et permet ainsi de réduire l’effet de photoréduction des nanoparticules lorsqu’elles sont excitées dans l’UV-B et/ou l’UV-C. Préparation des particules luminescentes de formule Y 0,95 Eu 0,5 VO 4 Les nanoparticules de vanadate de formule Y 0,95 Eu 0,5 VO 4 ont été préparées via la conversion colloïdale de particules d'hydroxycarbonates de terres rares en deux étapes. Dans une procédure générale, 20 mL d'une solution de 0,1 mol L -1 de RE(NO 3 ) 3 [RE = (Y 0.95 Eu 0.05 )], 100 mL d'eau Milli-Q, 80 mL d’éthylèneglycol (EG) et 15 g d'urée ont été ajoutés dans un tricol (500 mL). Le rapport volumique final H 2 O/EG était de 3/2 (c'est-à-dire une fraction volumique de 40 % de EG dans l'eau). Le mélange a été homogénéisé avec une agitation vigoureuse à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, le ballon a été relié à un réfrigérant et chauffé à 95 °C pendant 2 heures. La suspension résultante a été centrifugée à 26323 g pendant 25 minutes. Le culot a été redispersé dans de l'eau Milli-Q et centrifugé à nouveau (conductivité finale inférieure à 100 µS cm-1). Enfin, les nanoparticules de RECO 3 OH ont été redispersées dans 200 mL d'eau Milli-Q et chauffées à 100 °C. Après 20 minutes, une solution de NH 4 VO 3 de 0,1 mol L −1 (2 mmol, 20 mL, Sigma-Aldrich) a été rapidement ajoutée au colloïde sous agitation. Le système a été maintenu à 100 °C pendant 2 heures, et les particules ont été collectées par centrifugation (26323 g, 30 minutes) et purifiées par dialyse contre de l'eau Milli-Q pendant 24 heures. L’observation des particules par microscopie électronique montre qu’elles ont une forme d’olive avec des dimensions moyennes de 153 nm en longueur et 67 nm en largeur. Dans une procédure typique de recuit protégé, un sol polymérique de silice a été préparé dans des conditions acides en mélangeant du TEOS (Si(OC 2 H 5 ) 4 ), de l'eau (pH 1,25) et de l'éthanol dans un rapport molaire de 1:5:3,8, et en le laissant vieillir pendant 1 h à 60 °C. Afin de pouvoir dissoudre plus facilement cette matrice de silice, une structure poreuse a été préparée à partir d'une gélification de la silice autour d'assemblages micellaires auto-organisés d'un copolymère tensioactif. Le copolymère Pluronic PE6800 (EO 73 PO 28 EO 73 ), d’un poids molaire 8080 g/mol (BASF Europe), a été dissous dans l'éthanol à 40,4 g/L. La solution finale a été obtenue en mélangeant la solution colloïdale des nanoparticules, la solution de silice et la solution de PE6800. Pour les particules YVO 4 :Eu, le caractère basique de la solution colloïdale implique l'utilisation de concentrations de surfactant dans le sol qui ne conduisent pas systématiquement à une matrice de silice organisée (les rapports molaires habituels V:Si:PE6800 sont de 1:5 : 0.05). Le gel a été séché à 90 °C pendant plus de 6 h et la poudre qui en résulte a été recuite à l'air à 1000 °C en deux étapes. Un premier recuit a été réalisé à 500 °C avec une vitesse de 100 °C/h et une étape finale de 1 h et un second recuit à 1000 °C avec une vitesse de 100 °C/h comportant 2h à 500°C et 10 min à 1000°C. Le premier recuit est nécessaire pour l'élimination complète de la matière organique (polymères PAA et PE6800). La poudre de silice contenant les particules a été dissoute par de l'acide fluorhydrique 2% en excès pendant 3 h dans un rapport molaire Si:HF de 1:9. L'acide fluorhydrique et la silice dissoute ont ensuite été éliminés par deux centrifugations à 14000 g, la première pendant 1 min et la seconde pendant 10 min. Le précipité a été dilué dans de l'eau pure et quelques gouttes d'hydroxyde de sodium ont été ajoutées pour fixer le pH à 10-11. La solution finale a été stabilisée par l'ajout de PAA (V:PAA 1:0.05) et par sonication dans un bain froid pendant 5 min. Couplage des nanoparticules avec la protéine streptavidine A l’issue de la synthèse des nanoparticules et du recuit, on fonctionnalise les nanoparticules comme expliqué dans la demande internationale WO2019/025618 par une étape de silicatation, une étape d’amination grâce à l’APTES puis une étape de transformation des amines en acide carboxylique à l’aide d’anhydride. Pour plus de versatilité, on couple les nanoparticules avec un ratio 40:1 en streptavidine: nanoparticules par la méthode détaillée ci-dessous. Le volume approprié est pipeté pour obtenir 150 µL de nanoparticules recouvertes de -COOH à une concentration de 200 nM. L'échantillon est ensuite centrifugé pendant 15 minutes à 13700 g et le surnageant est éliminé. Le 1-éthyl-3-(3-diméthylaminopropyl) carbodiimide (EDC) et le N-hydroxy succinimide (NHS) sont solubilisés à une concentration de 50 mg/mL chacun dans un tampon de 50 mM d'acide 2-(N-morpholino)éthane sulfonique (MES) à pH 5,5. Cette solution est rapidement ajoutée au culot de nanoparticules et l'échantillon est sonifié 15 secondes à 50% d'amplitude (processeur ultrasonique GEX130, embout réf. 423-A). Après incubation à température ambiante pendant 25 minutes sous agitation, l'échantillon est centrifugé 15 minutes à 15000 g et le culot de nanoparticules est redispersé dans un tampon phosphate 50-mM pH 7,4 par sonication pendant 15 secondes à 50 %. 40 équivalents de streptavidine (Sigma, s4762-10MG) sont ensuite ajoutés et l'échantillon est incubé à 25 °C avec agitation à 800 rpm (Eppendorf Thermomixer C) pendant 2,5 heures. L'échantillon est centrifugé pendant 15 minutes à 13700 g et le culot est remis en suspension dans 500 µL de tampon de blocage (tampon phosphate 50-mM pH 7,4 contenant 2% de mPEG-NH2 500 (MF001005-500 Biochempeg) par sonication pulsée 1s on/1s off pendant 10 s à 20 % d'amplitude sur de la glace. L'échantillon est ensuite incubé à température ambiante pendant 1 heure sous agitation, centrifugé 15 minutes à 13700 g, et le culot, correspondant aux conjugués streptavidine-nanoparticules, est redispersé dans un tampon de conservation (Tris 20 mM, pH 8, 1% BSA) et stocké à -80°C. Couplage des nanoparticules couplées à la streptavidine (Nanoparticules-SA) avec des anticorps biotinylés Les nanoparticules couplées avec la streptavidine sont ensuite couplées à un anticorps biotinylé, spécifique de la substance à doser, par une méthode connue, notamment telle que décrite dans les protocoles ci-dessous en adaptant le ratio d’anticorps biotinylé et de nanoparticules en fonction notamment de la substance cible à doser (insuline, interféron gamma (IFN-gamma) ou protéine HIV-I-p24 tels que décrits ci-dessous). De préférence, comme illustré sur la , la quantité de biotine 42 est supérieure à celle des nanoparticules 38 et des anticorps 40 de sorte que les nanoparticules 38 se regroupent en agrégat. Un tel agrégat permet d’améliorer la sensibilité de détection en augmentant la quantité de nanoparticules liés à chaque molécule de la substance d’intérêt. En effet, ce n’est plus une nanoparticule qui se fixe à une substance d’intérêt mais un agrégat de nanoparticules qui présente un signal de luminescence bien plus important. Couplage des nanoparticules couplées à la streptavidine avec des oligonucléotides biotinylés En variante, lorsqu’il s’agit de détecter des acides nucléiques, comme illustré sur la , les nanoparticules 38 couplées avec la streptavidine 44 peuvent se coupler avec des chaines carbonées 46 comportant au moins deux bras biotinylés 42 et un bras portant un oligonucléotide de détection. Le fait que les chaines carbonées comportent deux ou plusieurs bras biotinylés permet qu’elles se fixent à deux streptividines, notamment de nanoparticules différentes, ce qui permet la formation d’un complexe. Comme illustré sur la , les nanoparticules 38 peuvent être couplées avec des agents de ciblages 42 1 à 42 5 différents, en particulier des oligonucléotides complémentaires différents, pour cibler différentes zones d’une substance d’intérêt 40 fixée sur un support, notamment d’un acide nucléique. Cela permet d’améliorer la sensibilité en permettant la fixation de plusieurs nanoparticules sur une même molécule de la substance d’intérêt. Comme illustré sur la , chaque nanoparticule 38 peut comporter plusieurs agents de ciblage 42 1 à 42 4 différents, en particulier des oligonucléotides complémentaires différents, pour cibler des zones différentes mais suffisamment proches d’une substance d’intérêt 40, notamment d’un acide nucléique. Cela permet d’améliorer la force de couplage de la nanoparticule 38 avec la substance d’intérêt 40 en diminuant le taux de dissociation. La surface de capture peut également être fonctionnalisée avec des agents de ciblage 55 1 à 55 3 , en particulier des oligonucléotides complémentaires différents, pour se fixer sur des zones différentes de la substance d’intérêt 52. Les nanoparticules peuvent être ajoutées dans un récipient support, notamment les micro-puits d’une plaque, puis l’échantillon à analyser est incubé dans le même micro-puits. Préparation de la surface de capture : fixation d’anticorps. 100 µL d'anticorps de capture sont prélevés du kit commercial comme indiqué dans le protocole du kit dans le tampon de fixation du kit et sont incubés dans chaque puits d’une plaque multipuits (655097, Greiner) pendant 16 h à 4 °C sous agitation à 300 tours/minute. Les puits sont ensuite lavés deux fois avec le diluant commercial fourni avec le kit ou avec du PBS Tween 0.01% si celui-ci n'est pas présent. Ensuite, 200µL du blocage sont ajoutés par puits pour diminuer les intéractions non spécifiques pendant 2 h à 4 °C sous agitation à 300 tours/minute. Préparation de la surface de capture : fixation d’oligonucléotides. L’anticorps anti-digoxigénine (Ab64509, Abcam) est appliqué au fond des plaques multipuits à 10 µg/mL dans 100 µL de tampon PBS pH 7,2 et incubé pendant une nuit à 4°C sous agitation. La plaque est lavée trois fois avec 200 µL de SSC 5X modifié (SSC : NaCl 750 mM, citrate de sodium 75 mM, SDS 0,05%, lauroylsarcosine 0,05%). Les puits sont bloqués avec un tampon PBS 3% BSA pH 7,2 pendant 2 heures à 4°C sous agitation et lavés une fois avec 200 µl de SSC 5X. 100 µl d'oligo de capture Digoxigenin-5' (5'-oligonucleotide de capture) 16,5 µM sont ajoutés et les plaques sont maintenues à 4°C sous agitation. Montage expérimental pour la mesure de la luminescence Le montage de détection comporte un dispositif d’illumination et un dispositif de détection de luminescence représentés en . C’est ce montage qui a été utilisé pour tous les résultats présentés ci-dessous. Dans le montage de détection de la , le dispositif d’illumination est composé d’une diode électroluminescence (1) associée à un diaphragme de 1 mm positionné à une distance de 3 mm de la diode (1). La diode électroluminescente (Hex-S6060-DR250-W275-P100-V6.5, Laser Components) émet dans l’UV-C à une longueur d’onde de 275 nm et avec une puissance de 100 mW. Cela permet d’illuminer un seul puits de la plaque multipuits, le fond de chaque puits étant positionné à une distance de 20 mm de la diode. Le dispositif de détection est composé d’une lentille collimatrice (20) de la lumière émise par les nanoparticules dans l’échantillon, par une lentille convergente (26) qui focalise la lumière émise sur un module de détection de type photomultiplicateur (28) (PMM02, Thorlabs) équipé d’un filtre interférentiel qui filtre la lumière émise à 617 nm. Une version alternative de montage de détection est représentée en -c. Le montage de détection est explicité dans ce qui suit. Le dispositif d’illumination ( ) est composé d’une diode électroluminescence (1) émettant dans l’UV-C à une longueur d’onde de 275 nm et avec une puissance de 100 mW et d’un système de collimation et de diminution de la taille du faisceau laser (2). Le système de collimation et de diminution de la taille du faisceau (2) représenté est constitué, en partant de la diode vers l’échantillon, d’une lentille collimatrice (3), d’un ensemble de diaphragmes (4) (deux diaphragmes à iris, un diaphragme dit de champ et diaphragme permettant l’arrêt total du faisceau), d’une lentille convergente (6), d’un diaphragme à iris, dit diaphragme d’ouverture (8) au point focal de la lentille convergente, d’une lentille collimatrice (10), d’une lentille focalisante (12), d’un miroir dichroïque adapté pour réfléchir la lumière d’illumination et transmettre la lumière émise par l’échantillon (35), d’un objectif (16) de grande ouverture numérique, par exemple présentant une ouverture numérique égale à 0,79, et enfin d’un diaphragme d’illumination (18). Le dispositif d’illumination pourrait cependant ne comporter que la diode et un diaphragme approprié pour limiter l’effet dit de « cross talk », tel qu’illustré sur la , pour éviter d’illuminer simultanément plusieurs puits de la plaque multipuits. Le dispositif de détection ( ) comporte, en suivant le parcours de la lumière à partir de l’échantillon, l’objectif (16) pour collecter et collimater la luminescence émise par les nanoparticules dans l’échantillon, une lentille convergente (22), un filtrage spectral (27) filtrant la lumière à 617 nm comportant une lentille de collimation, un filtre interférentiel à 617 nm et une lentille convergente, et un module de détection de type photomultiplicateur (28) (PMM02, Thorlabs). La montre l’ensemble du montage de détection comportant le dispositif d’illumination et le dispositif de détection. Un convertisseur analogique-digital (NI9215, National Instrument) permet d’enregistrer le signal grâce à un logiciel Labview. Tous les éléments de détection peuvent être situés sur un même axe ou non (grâce à l’utilisation appropriée d’un ou plusieurs miroirs). Un système de translation du support des lames (Z8253, KCH301 Thorlabs) a été mis en œuvre afin de pouvoir observer plusieurs échantillons biologiques successivement par balayage (scanning). Détection résolue temporellement pour la mesure de la quantité de nanoparticules en présence de signaux parasites La diode électroluminescente peut être alimentée par des créneaux de voltage par un module input NI-9215, National Instruments, pour créer des créneaux d’excitation UV afin d’éliminer les signaux parasites grâce à une détection résolue temporellement. En effet, lors de l’illumination de l’échantillon biologique par la diode, d’autres molécules que les nanoparticules d’intérêt émettent de la fluorescence. L’utilisation de créneaux d’excitation UV et d’une fréquence de détection du signal par le photomultiplicateur de 100 kHz (une acquisition du signal toute les 10 µs) permet de s’affranchir de cette fluorescence parasite. Il est ainsi possible du fait de la durée d’émission longue par les particules de l’invention, de faire une détection résolue en temps de l’émission, en particulier une détection retardée de l’émission, comme décrit en détails ci-après. Une illumination modulée dans le temps permet de limiter la contribution au signal de luminescence d’espèces parasites présentes dans l’échantillon (sérum, sang …) ou dans les substrats solides utilisés (verre, plastique …). En effet, les nanoparticules utilisées (YVO 4 :Eu ou GdVO 4 :Eu par exemple) peuvent être placées dans un état excité de durée de vie longue, de l’ordre de quelques centaines de µs, par rapport aux durées de vie des fluorophores usuels, qui se situent dans le domaine nanoseconde. Ceci permet la séparation temporelle des signaux de luminescence parasites du signal émis par les nanoparticules. Le signal modulé obtenu est l’alternance d’une phase de déclin (arrêt de l’illumination) et d’une phase de retour de luminescence (démarrage de l’illumination) de l’ensemble des émetteurs présents dans l’échantillon. Le déclin/retour du signal de luminescence est déterminé par deux paramètres distincts : (i) les durées de vie des états excités des émetteurs, et (ii) la dynamique du temps d’allumage et d’arrêt du faisceau excitateur. Variantes du montage expérimental L’émission de luminescence des nanoparticules est collectée : . soit en lumière transmise ( ), . soit en lumière réfléchie (figures 3a à 3c) en utilisant un miroir dichroïque (30) à 347 nm. Pour chaque concentration d’échantillon à détecter, plusieurs puits N d’une plaque multipuits peuvent être utilisés, typiquement 3. Les points de mesure pour chaque concentration sont ensuite présentés comme la moyenne et l’écart-type des N valeurs obtenues pour chaque puits. La valeur mesurée pour chaque puits est la moyenne de 60 000 valeurs enregistrées pendant 600 ms avec un taux d’acquisition de 100 kHz (1 valeur de voltage enregistrée toutes les 10 µs). Typiquement, on considère que la limite de détection (LOD) est déterminée par la concentration générant un signal égal ou supérieur à la somme du signal obtenu à concentration nulle (« blanc ») et de 3 fois l’écart-type du signal du « blanc ». La limite de quantification peut être considéré comme étant la concentration générant un signal 10 fois supérieur à cet écart-type. Cependant, une détermination expérimentale de la limite de quantification est préférable. Calibration du dispositif de détection Préalablement aux mesures, le dispositif de détection a été calibré avec des concentrations connues de la substance à détecter. Détection et quantification d’une substance dans un échantillon La concentration d’une substance dans un échantillon est considérée comme détectable lorsque le signal obtenu est au moins égal ou supérieur à la somme du signal pour un échantillon de même composition contenant une concentration nulle de la substance, appelé échantillon « blanc » et de trois fois l’écart-type du signal de l’échantillon « blanc ». Pour réaliser la quantification de la substance d’intérêt ( i.e. déterminer sa concentration), le protocole suivant doit être mis en œuvre : réaliser une série de mesures de calibration avec la substance d’intérêt à différentes concentrations connues, par exemple à partir de substances obtenues dans le commerce ou à partir d’une purification. Dans la mesure du possible, les échantillons de calibration doivent être préparés avec la même composition que les échantillons à mesurer ou avec une composition la plus proche possible. Faire un ajustement des points obtenus (signal en mV versus concentration de la substance d’intérêt) ; réaliser les mesures des échantillons à analyser (obtention de la valeur du signal en mV) ; attribuer à chaque échantillon mesuré une valeur de concentration de la substance à partir du signal mesuré (en mV) et à partir de la courbe de calibration réalisée en étape i) et son ajustement. Pour déterminer à partir de quelle concentration la substance dans un échantillon est quantifiable avec un coefficient de variation (CV) donné, par ex. 25%, 20%, 15% ou 10%, le protocole suivant doit être mis en œuvre : Réaliser un nombre de mesures suffisant pour des échantillons de différentes concentrations connues croissantes se situant au-dessus de la limite de détection LOD ; Déterminer l’écart-type et le coefficient de variation liés à la variabilité de la mesure pour chacune de ces concentrations ainsi que la concentration à partir de la courbe de calibration ; Déterminer le coefficient de variation lié au biais, c’est-à-dire l’écart-type entre la concentration nominale et la concentration déterminée à partir de la mesure, normalisé à la valeur de la concentration ; Si l’un de ces deux coefficients de variation déterminés sont supérieurs au coefficient de variation prédéterminé, recommencer des mesures à des concentrations de la substance plus élevées. La limite de quantification pour un CV donné correspond à la concentration de la substance pour laquelle le coefficient de variation lié à la variabilité de la mesure et celui lié au biais sont égaux ou inférieurs ou CV prédéterminé. Comparaison de sensibilité de détection entre les tests ELISA commerciaux et la méthode de l’invention Pour chaque analyte à détecter, les mêmes plaques 96 puits, les mêmes anticorps et sensiblement les mêmes solutions tampons que ceux des tests commerciaux ELISA sont utilisés, à la différence que l’enzyme HRP (HorseRadish Peroxidase) est remplacée par les nanoparticules de formule Y 0,6 Eu 0, 4VO 4 , obtenues par le procédé de fabrication décrit précédemment, fonctionnalisées en surface avec des molécules de streptavidine et couplées avec des anticorps biotinylés de chacune des substances à analyser, préparées en exemple 1. Détection de l’insuline L’échantillon analysé est l’insuline recombinante (kit ELISA Abcam ab100578). Pour la détection à base de nanoparticules, nous utilisons les mêmes plaques multipuits recouvertes des anticorps de capture commerciaux, les mêmes anticorps de détection biotinylés, l'insuline et les solutions de diluant A, B et de tampon de lavage que celles fournies dans le kit Abcam ci-dessus. Une solution d'insuline est préparée dans le diluant A pour obtenir une concentration de 10 ng.mL-1. Ensuite, la solution est diluée en cascade d'un facteur 10 (triplicata pour chaque concentration et cinquante échantillons de « blanc ») et la plaque de micropuits est incubée 2h30 à 25 °C sous agitation à 300 rpm (Thermomixer C d'Eppedorf). En parallèle, les conjugués streptavidine-nanoparticules sont incubés avec 60 eq d'anticorps de détection biotinylés dans du phosphate-buffered-saline (PBS) pH 7.4 pendant 1h30 à 25°C. La solution est ensuite centrifugée 15 minutes à 13 000 g. Le culot est remis en suspension dans le diluant B par sonication pulsée 10 s 1s on/1s off dans la glace pour obtenir une concentration finale de nanoparticules de 4,5 nM. La plaque à micropuits est lavée trois fois avec le tampon de lavage. Ensuite, 100 µL de solution de conjugué nanoparticules-anticorps sont ajoutés et la plaque est incubée 1h30 à 25°C sous agitation à 300 rpm. La plaque est lavée trois fois avec le tampon de lavage et une fois avec du PBS pH 6,6. Ensuite, 200 µl de PBS pH 6,6 sont ajoutés dans chaque puits et la plaque est lue. L’écart-type pour la concentration zéro est de 28 mV (voir ). La valeur de signal S mesurée pour la concentration d’insuline recombinante [I] 10 fg/mL (ou 834 aM) est de 409 mV, au-dessus de la valeur limite de 289 mV égale à la moyenne des échantillons « blanc » plus 3 fois l’écart-type déterminé pour les échantillons « blanc ». A titre de comparatif, la concentration la plus faible détectable indiquée par le fournisseur du kit ELISA est de 50 pg/mL (ou 4,17 pM). La concentration minimale pouvant être détectée avec la méthode de détection ultra-sensible selon l’invention, est ainsi 5000 fois plus faible que la concentration détectable par ELISA en utilisant les mêmes anticorps que le kit ELISA. Détection de l’interféron gamma L’échantillon analysé est l’interféron gamma (kit ELISA Thermofisher 88-7316-88). Pour la détection basée sur les nanoparticules, 100 µL d'anticorps de capture du kit commercial sont dilués 250 fois dans le tampon de fixation du kit et sont incubés dans chaque puits de la plaque multipuits pendant 16 h à 4 °C sous agitation à 300 tours/min. Les puits sont ensuite lavés deux fois avec le diluant commercial Elisa/Elispot fourni avec le kit. Ensuite, 200 µL du diluant Elisa/Elispot sont ajoutés par puits pour une étape de blocage pendant 2 h à 4 °C sous agitation à 300 tours/min. Une gamme de concentrations en interféron gamma est préparée dans le diluant commercial (250 pg.mL-1 à 25 fg.mL-1). 100 µL sont ajoutés dans chaque puits en trois exemplaires et la plaque est incubée 16 heures à 4°C, sous agitation à 300 rpm. Les puits sont ensuite lavés trois fois avec du PBS. En parallèle, les nanoparticules YVO 4 /Eu 20% : streptavidine 1:40 sont mélangées avec 60 équivalents d'anticorps de détection (4S.B3 Thermofischer 13-7319-85) dans du PBS pH 7,4 pendant 1h à température ambiante avec une légère agitation. Le mélange est centrifugé 15 minutes à 13 700 g. Le culot est mis en suspension dans du PBS par sonication pulsée 10 s 1s on/1s off dans de la glace pour obtenir une concentration de nanoparticules de 4,5 nM. Ensuite, 100 µL de solution de nanoparticules/4S.B3 sont ajoutés dans chaque puits et la plaque est incubée 1h30 à 25°C 300 rpm. La plaque est lavée trois fois avec du PBS pH 7.4 et lue avec le lecteur maison ( ). Les résultats sont illustrés sur la . Dans du tampon (figure 5a), la valeur de signal S mesuré pour la concentration en interféron gamma [IFN-γ] 160 fg/mL est de 160,8 mV, au-dessus de la valeur limite de détection de 149,1 mV égale à la moyenne des échantillons « blanc » (133,8 mV) plus 3 fois l’écart-type déterminé pour les échantillons « blanc ». Dans du sérum (figure 5b), la valeur de signal S mesuré pour la concentration en interféron gamma [IFN-γ] 800 fg/mL est de 149,7 mV, au-dessus de la valeur limite de détection de 148,3 mV égale à la moyenne des échantillons « blanc » (138,5 mV) plus 3 fois l’écart-type déterminé pour les échantillons « blanc ». A titre de comparatif, la détection de l’interféron gamma a été opérée suivant les conditions du kit ELISA. Les conditions expérimentales suivies sont celles indiquées par le fournisseur du kit ELISA. Le résultat et indiqué en figure 6a pour les mesures dans du tampon et en figure 6b pour les mesures dans du sérum. La concentration la plus faible mesurée est 5 pg/mL dans du tampon et 62.5 dans du sérum. La concentration minimale pouvant être détectée avec la méthode de détection ultra-sensible selon l’invention est ainsi 31 fois plus faible que la concentration détectable par ELISA lorsque les mesures sont faites dans du tampon et de 78 fois plus faible que la concentration détectable par ELISA lorsque les mesures sont faites dans du sérum. Détection de l’HIV-p24 L’échantillon analysé est l’HIV-p24 (QC221 Quantikine Immunoassay Control Set 896 HIV-1 Gag p24 Biotechne). Pour la détection basée sur les nanoparticules, 100 µL d'anticorps de capture Biotechne, MAB73602-100µL à 10 µg/µL sont dilués dans du PBS et sont incubés dans chaque puits de la plaque multipuits pendant 16 h à 4 °C sous agitation à 300 tours/min. En parallèle, les conjugués streptavidine-nanoparticules sont incubés avec 30 eq d'anticorps de détection biotinylés (Biotechne, NBP3-06466-100µL) dans du PBS pH 7,4 pendant 1h30 à 25°C. La solution est ensuite centrifugée 15 minutes à 13 000 g. Le culot est remis en suspension dans du PBS par sonication pulsée 10 s 1s on/1s off dans la glace pour obtenir une concentration finale de nanoparticules de 4,5 nM. La plaque à micropuits est lavée trois fois avec un tampon de lavage PBS 7,4, Tween 20 0.01% recommandé par le fournisseur des anticorps. Ensuite, 100 µL de solution de conjugué nanoparticules-anticorps sont ajoutés et la plaque est incubée 1h30 à 25°C sous agitation à 300 rpm. La plaque est lavée trois fois avec le tampon de lavage et une fois avec du PBS pH 6,6. Ensuite, 200 µL de PBS pH 6,6 sont ajoutés dans chaque puits et la plaque est lue avec le lecteur de la . L’écart-type pour la concentration zéro est de 5,4 mV. La valeur de signal S mesurée pour la concentration en HIV-p24 [p24] 500 fg/mL (ou 20.8 fM) est de 251 mV, au-dessus de la valeur limite de 246 mV égale à la moyenne des échantillons « blanc » plus 2 fois l’écart-type déterminé pour les échantillons « blanc » en adéquation avec la définition du test commercial (voir ). A titre de comparatif, la concentration la plus faible détectable indiquée par le fournisseur des anticorps est de 15,6 pg/mL (ou 650 fM), kit Biotechne HIV-1 Gag P-24 DuoSet ELISA. Cette limite de détection a été défini comme la concentration donnant un signal égal ou supérieur au signal moyen des échantillons « blanc » plus 2 fois l’écart-type des échantillons « blanc ». Avec la méthode de détection ultra-sensible selon l’invention, la concentration la plus faible mesurable étant de 500 fg/mL (ou 20,8 fM), avec le dispositif de la , la concentration minimale pouvant être détectée est ainsi 32 fois plus faible que la concentration détectable par ELISA en utilisant les mêmes anticorps. Détection du gène n1 SARS-CoV-2 Le schéma optimal utilisé pour la détection est représenté dans la . L’échantillon analysé est le produit de PCR du gène n1 de SARS-CoV-2 L'anticorps anti-digoxigénine (Ab64509, Abcam) est appliqué au fond des plaques multipuits à 10 µg/mL dans 100 µL de tampon PBS pH 7,2 et incubé pendant une nuit à 4°C sous agitation. La plaque est lavée trois fois avec 200 µL de SSC 5X modifié (NaCl 750 mM, citrate de sodium 75 mM, SDS 0,05%, lauroylsarcosine 0,05%). Les puits sont bloqués avec un tampon PBS 3% BSA pH 7,2 pendant 2 heures à 4°C sous agitation et lavés une fois avec 200 µL de SSC 5X modifié. 100 µL de l'oligo de capture Digoxigenin-5' (5'-GACCCCAAAATCAGCGAAAT) 16,5 µM sont ajoutés et les plaques sont maintenues à 4°C sous agitation. Parallèlement, 60 µL de l'ADN cible à 43 nM sont dénaturés pour chaque concentration à température ambiante pendant 15 minutes dans une solution [0,1 M NaOH, 0,01% Tween 20], puis 540 µL de l'oligo 3'-biotine de détection (5'-CAGATTCAACTGGCAGTAACCAGA) à 40 nM dans du SSC 5X modifié sont ajoutés. Après avoir lavé les puits avec 200 µL de SSC 5X modifiée, 100 µL de cette solution de conjugué ADN cible-oligo de détection sont ajoutés dans les puits de la plaque. La plaque est conservée à 4°C sous agitation pendant 30 minutes. 100 µL de conjugués nanoparticules YVO 4 :Eu 20%-streptavidine à 4,5 nM sont ajoutés et les échantillons sont incubés pendant 1 heure à 4°C sous agitation. Les puits sont ensuite lavés 5 fois avec du SSC 5X modifié et 2 fois avec du PBS avant d'être lus avec le lecteur UV fait maison de la . L’écart-type pour les échantillons « blanc » est de 22.8 mV. La valeur du signal S mesuré pour la concentration en gène n1 du SARS-CoV-2 double brin 50 fM est de 348 mV, juste au-dessus de la valeur limite de 335 mV égale à la moyenne des échantillons « blanc » plus trois fois l’écart-type déterminé pour les échantillons « blanc ». Ainsi la limite de détection pour le gène n1 double brin de SARS-CoV-2 est de 50 fM (figure 9a). Lorsque la substance d’intérêt est le gène n1 double brin SARS-CoV-2 synthétisé (Eurogentec) la plus faible concentration détectable est de 5 fM (figure 9b). Lorsque la substance d’intérêt est le gène n1 simple brin SARS-CoV-2 synthétisé (Eurogentec), la plus faible concentration détectable est de 0,5 fM ( ). Cette limite de détection se compare favorablement aux résultats de la littérature obtenus sans enzyme et sans amplification de l’acide nucléique [14]. Détection du gène n1 SARS-CoV-2 avec des nanoparticules recuites à 1000°C Les nanoparticules de formule Y 0,95 Eu 0,5 VO 4 , obtenues selon le procédé décrit précédemment, ont été fonctionnalisées et couplées à la streptavidine comme décrit précédemment puis couplées à des oligonucléotides biotinylés comme décrit précédemment. Ensuite, le même protocole que dans l’exemple précédent concernant la détection du gène n1 SARS-CoV-2 a été mis en œuvre. La valeur du signal mesuré pour la concentration 10 aM est de 524.6 mV, bien au-dessus de la valeur limite de 508 mV égale à la moyenne des échantillons « blanc » plus trois fois l’écart-type déterminé pour les échantillons « blanc ». Dans ce cas, grâce au nombre de photons plus important émis par unité de temps par ces nanoparticules, lié au nombre d’ions plus important, i. e. à la taille plus importante des nanoparticules, et à leur rendement quantique supérieur, une limite de sensibilité de Procédé de détection et/ou de quantification ultra-sensible in vitro d’une substance d’intérêt biologique ou chimique (40) dans un échantillon (35), en particulier un échantillon biologique, par détection de l’émission de luminescence émise par des nanoparticules inorganiques photoluminescentes, comprenant au moins les étapes suivantes : disposition de particules photoluminescentes (38) formées en tout ou partie d’une nanoparticule inorganique photoluminescente à matrice vanadate ou vanadate/phosphate de formule (I): A 1-x Ln x VO 4(1-y) (PO 4 ) y (I) dans laquelle : . A est choisi parmi l’yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La) et leurs mélanges, en particulier A représente Y ; . Ln est choisi parmi l’europium (Eu), le dysprosium (Dy), le thulium (Tm), le samarium (Sm), le néodyme (Nd), l’erbium (Er), l’ytterbium (Yb) et leurs mélanges, en particulier Ln représente Eu ; . 0 . 0 ≤ y les nanoparticules inorganiques photoluminescentes étant couplées à un agent de couplage direct (42) ou indirect (44) à la substance d’intérêt , mise au contact desdites particules photoluminescentes (38) avec la substance d’intérêt (40) dans des conditions de couplage de la substance d’intérêt (40) avec l’agent de couplage (42, 44), excitation de la matrice des nanoparticules inorganiques photoluminescentes de formule (I), par rayonnement de longueur d’onde compris entre 240 nm à 330 nm; détection de l’émission de luminescence par les nanoparticules inorganiques photoluminescentes, en particulier détection résolue en temps, et détermination de la présence et/ou concentration de la substance d’intérêt par interprétation de ladite mesure de l’émission de luminescence par les particules. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l’étape de détermination de la présence et/ou concentration de la substance d’intérêt (v) comporte la détection d’une concentration de la substance d’intérêt biologique ou chimique dans l’échantillon inférieure ou égale à 10 pM, mieux inférieure à 1 pM, voire inférieure à 0,1 pM, ou encore inférieure à 0,01 pM, ou encore inférieure ou égale à 1 fM, encore mieux inférieure ou égale à 0,1 fM (i.e. 100 aM), encore mieux inférieure ou égale à 0,01 fM (i.e. 10 aM), notamment sans amplification et sans utilisation d’enzymes. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’agent de couplage est un agent de ciblage (42) de la substance d’intérêt se couplant directement à la substance d’intérêt à l’étape (ii) ou une molécule (44) permettant la fixation d’un agent de ciblage de la substance d’intérêt, notamment fixée sur la substance d’intérêt préalablement à la mise en contact des particules photoluminescentes avec la substance d’intérêt. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel au moins une nanoparticule est couplée avec une pluralité d’agent de couplage, le procédé comportant une étape de couplage des nanoparticules avec les agents de couplage comportant la mise en solution des nanoparticules avec une proportion d’agent de couplage supérieure à la proportion de nanoparticules, notamment avec un ratio d’au moins deux agents de couplage pour une nanoparticule voire d’au moins 10 agents de couplage par nanoparticules, voire entre 10 et 80 agents de couplage. Procédé selon la revendication 4, dans lequel les particules photoluminescentes comportent chacune une pluralité de nanoparticules liés entre elles, notamment par les agents de couplage, pour former un agrégat de nanoparticules, de préférence les particules photoluminescentes étant en dispersion colloïdale dans la solution à l’étape (ii) de mise en contact avec la substance d’intérêt. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, mettant en œuvre au moins deux types de particules photoluminescentes distinctes chacune comportant des nanoparticules selon la formule (I), qui sont couplées à des agents de couplage distincts, aptes à se fixer à des sites distincts d’un même analyte, notamment couplées à des oligonucléotides distincts reconnaissant différentes régions de l’analyte de type acide nucléique. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les nanoparticules sont chacune couplée à une pluralité d’agents de couplage à plusieurs zones d’un analyte, notamment une pluralité d’oligonucléotides choisis pour se fixer sur des zones différentes d’un acide nucléique. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la substance d’intérêt dudit échantillon en étape (i) est préalablement immobilisée à la surface d’un support, ladite surface étant passivée de manière à ce que lesdites particules luminescentes ne s’y fixent pas en l’absence de la substance d’intérêt, notamment l’étape (i) comprend au moins les étapes suivantes : (a) disposer d’un support dont la surface est préalablement passivée et fonctionnalisée avec un agent de capture de la substance à détecter/quantifier, par exemple un anticorps monoclonal, dit anticorps de capture ; (b) mettre en contact ledit échantillon à analyser avec le support de l’étape (a) dans des conditions propices à l’association de ladite substance avec l’agent de capture ; et (c) mettre en contact les particules photoluminescentes couplées à au moins un agent de couplage avec ledit support issu de l’étape (b) pour associer directement ou indirectement les particules avec ladite substance immobilisée à la surface du support. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, mettant en œuvre au moins deux types de nanoparticules, dopées par des ions de terres rares distincts, ayant des longueurs d’ondes d’émission distinctes et couplées à des agent de couplage direct ou indirect distincts chacun à un de deux substances d’intérêts différentes. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, mis en œuvre à l’aide d’un appareillage comportant un dispositif d’illumination à une longueur d’onde comprise entre 240 nm et 330 nm, mieux entre 260 et 330 nm, mieux entre 260 nm et 310 nm, mieux entre 270 et 290 nm, de préférence de type diode électroluminescente (1), de préférence présentant une puissance inférieure ou égale à 500 mW, mieux inférieure ou égale à 200 mW, par exemple comprise entre 50 et 150 mW; et un dispositif de détection de l’intensité lumineuse émise par les nanoparticules en étape (iii), notamment un détecteur unique, par exemple de type photomultiplicateur, photodiode, photodiode à avalanche, ou un détecteur de type réseau de dispositifs photosensibles consistant en une surface 2D de pixels de détection tel qu’une caméra CCD ou EM-CCD ou caméra CMOS. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la détection est résolue en temps, la détection résolue en temps étant obtenue par un hachage électronique ou mécanique du faisceau UV-B et/ou UV-C incident Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, les nanoparticules étant préparées par conversion colloïdale de particules d'hydroxycarbonates de terres rares, notamment par au moins les étapes consistant en : (a) préparer une solution aqueuse (1) par mélange, en milieu aqueux, d’un sel de métavanadate, en particulier du métavanadate d’ammonium (NH 4 VO 3 ), et éventuellement un sel de phosphate; (b) préparer des nanoparticules d’hydroxycarbonates de formule A 1-x Ln x 3+ CO 3 OH à partir de précurseurs des éléments A et Ln, en particulier sous forme de sels, notamment de nitrates, et d’une source d’ions bicarbonates, notamment en excès, notamment de l’urée, dans des conditions propices à la formation par co-précipitation desdites nanoparticules d’hydroxycarbonates, (b’) ajouter la solution aqueuse (1) aux nanoparticules d’hydroxycarbonates en suspension colloïdale dans des conditions propices à la formation par co-précipitation des nanoparticules selon la formule I; et (c) récupérer les nanoparticules selon la formule I. Procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant à l’étape (i), de préférence avant le couplage de la nanoparticule avec l’agent de couplage, un mélange des nanoparticules à un agent de protection puis un recuit post-synthèse à une température comprise entre 500°C et 1500°C, plus particulièrement entre 800°C et 1300°C, puis l’élimination de l’agent de protection par une méthode adéquate selon l’agent de protection, notamment par dissolution acide. Utilisation du procédé tel que défini selon l’une quelconque des revendications précédentes, à des fins de diagnostic in vitro . Ensemble de diagnostic in vitro , notamment pour la mise en œuvre du procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, comprenant au moins : - des particules photoluminescentes formées en tout ou partie d’une nanoparticule inorganique photoluminescente à matrice vanadate ou vanadate/phosphate de formule (I): A 1-x Ln x VO 4(1-y) (PO 4 ) y (I) dans laquelle : . A est choisi parmi l’yttrium (Y), le gadolinium (Gd), le lanthane (La) et leurs mélanges, en particulier A représente Y ; . Ln est choisi parmi l’europium (Eu), le dysprosium (Dy), le thulium (Tm), le samarium (Sm), le néodyme (Nd), l’erbium (Er), l’ytterbium (Yb) et leurs mélanges, en particulier Ln représente Eu ; . 0 . 0 ≤ y lesdites particules étant fonctionnalisées en surface avec des groupements chimiques, par exemple des groupements carboxyle, amino, thiol, aldéhyde ou époxy, apportés par des molécules, par exemple l’acide citrique ou du polyacide acrylique, et/ou couplées à des molécules, par exemple la streptavidine, lesdits groupements chimiques ou molécules étant aptes à permettre le couplage desdites particules avec un agent de ciblage de la substance d’intérêt; ou lesdites particules étant déjà couplées à au moins un agent de ciblage de la substance d’intérêt; et - un système de détection et/ou de quantification comportant au moins : - un dispositif d’illumination à une longueur d’onde comprise entre 240 nm et 330 nm, mieux entre 260 et 330 nm, mieux entre 260 nm et 310 nm, mieux entre 270 et 290 nm, de préférence de type diode électroluminescente (1), de préférence présentant une puissance inférieure ou égale à 500 mW, mieux inférieure ou égale à 200 mW, par exemple comprise entre 50 et 150 mW, et - un dispositif de détection de l’intensité lumineuse émise par les particules, et - optionnellement un support adéquat pour l’immobilisation de la substance d’intérêt dudit échantillon.