FR 3138150 A1 20240126 FR 2207626 A 20220725 Le domaine de l’invention concerne une méthode d'évaluation du potentiel photoprotecteur d’un dispositif qui comprend la mesure de photoproduits d’ADN dans les fluides corporels. MÉTHODE D’ÉVALUATION DE L’ACTIVITÉ PHOTOPROTECTRICE D’UN DISPOSITIF DOMAINE DE L’INVENTION Le domaine de l’invention concerne la mesure de photoproduits d’ADN dans les fluides corporels pour évaluer le potentiel d’un dispositif photoprotecteur. La surexposition au rayonnement ultraviolet (UV) qu’il soit solaire ou artificiel a des effets délétères majeurs sur les systèmes vivants. Chez l’homme, les UV sont responsables du photo-vieillissement, de l’érythème, de l’immunosuppression et des cancers de la peau (Huang et al., 2020, Curr. Dermatol. Rep. 9(1), 22-9 ; Subhadarshani et al. 2020, Curr Dermatol Rep. 9(3) : 189-99). La capacité des UV à induire des tumeurs cutanées est principalement expliquée par leurs propriétés génotoxiques et mutagènes (Cadet and Douki, 2018, Photochem. Photobiol. Sci. 17 : 1816-1841). Un certain nombre de preuves expérimentales révèle que les UVB (280-320 nm) constituent la partie la plus nocive du spectre solaire (Marzouki et al., 2017, Life Sci. 188 : 10-16). L’absorption dans cette gamme de longueur d’onde induit des photoréactions dans l’ADN et conduit à la formation de dimères de pyrimidine. Il s’agit notamment des dimères de type cyclobutane (CPD) ainsi que des photoproduits pyrimidine (6-4) pyrimidone (64PP) et de leurs isomères de valence Dewar. Ces photoproduits peuvent se former aux quatre séquences bipyrimidines possibles (TT, TC, CT et CC) mais en proportions différentes. Les UVA sont au moins vingt fois plus intenses que les UVB dans le rayonnement solaire mais sont deux à trois ordres de grandeur moins efficaces pour endommager l’ADN. Par conséquent, l’accent a été mis sur les dimères de pyrimidine induits par les UVB pour les études in vitro et in vivo . Ces photoproduits de l'ADN participent à l'initiation du processus tumoral comme le montre la signature mutationnelle spécifique des carcinomes basaux et squameux (Bonilla et al., 2016, Nat. Gen. 48(4) : 398-406), et du mélanome (Hodis et al.,2012, Cell 150(2) : 251-263). Les photoproduits de l’ADN induits par les UV sont éliminés du génome par la voie de réparation de l’excision nucléotidique sous la forme d’un fragment d’oligonucléotides monocaténaires de 25 à 30 bases de long portant les dommages. Pour la réalisation d’études photochimiques et photobiologiques sur des dimères de pyrimidine, diverses approches analytiques ont été proposées au cours des dernières années. Le défi technique est le faible niveau de modification dans les échantillons biologiques (moins de 1 photoproduit pour 10 5 ou 10 6 bases selon la dose) et la petite quantité de matière disponible (quelques µg d’ADN dans une biopsie de la peau). Actuellement les tests les plus largement utilisés sont les techniques immunologiques (Kobayashi et al., 2001, Pigment Cell Res., 14(2) : 94-102) et la détection chromatographique (Douki, 2013, Photochem. Photobiol. Sci., 12(8) : 1286-1302). Les premières sont basées sur la production d’anticorps monoclonaux ou polyclonaux dirigés contre les dimères, qui peuvent être utilisés par immunohistochimie dans les échantillons de tissus mais aussi soit par immunotransfert de l’ADN extrait (dot-blot), soit par cytométrie de flux dans les suspensions cellulaires. Les méthodes chromatographiques nécessitent l’extraction de l’ADN et son hydrolyse en monomères. Une séparation chromatographique du mélange suivie d’une détection spécifique et sensible fournit des données quantitatives. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle peut fournir des informations individuelles sur tous les types de lésions, notamment les dimères de pyrimidine possibles, contrairement aux tests immunologiques qui détectent chaque classe de photoproduits sans spécificité de séquence. Les techniques chromatographiques les plus utilisées actuellement reposent sur la chromatographie en phase gazeuse ou liquide couplée à la spectrométrie de masse. Des résultats récents issus de la littérature suggèrent que les dimères de pyrimidine présents dans les fluides biologiques sont le résultat de la réparation de l’ADN. La présence de TT CPD dans l’urine de volontaires exposés au soleil, a été mise en évidence par HPLC et par la détection par post-marquage au 32 P (Le Curieux and Hemminki, 2001, J. Invest. Dermatol. 117 : 263-268). Cette technique avec radioactivité n’est donc pas facile à mettre en œuvre. Plus récemment, des photoproduits inclus dans de larges fragments d’ADN liés à des protéines et insérés dans des vésicules extracellulaires ont été retrouvés dans le milieu de kératinocytes humains en culture (Carpenter et al., 2022 J. Invest. Dermatol. In press DOI: 10.1016/j.jid.2022.04.030). La prévention de la formation de ces photoproduits de l’ADN est une stratégie de photoprotection intéressante contre le cancer de la peau, comme en témoigne le lien sans ambiguïté entre l’utilisation correcte des produits solaires et le risque de cancers (Green et al., 1999, Lancet 354 : 723-729). La recherche de l’ombre, le port de vêtement et l’applications d’écrans solaires sont couramment utilisés pour éviter les effets délétères du soleil. La photoprotection correspond à l’ensemble des moyens/dispositif naturels et/ou artificiels capables de s’opposer aux dommages cutanés UV induits. En dehors de la photoprotection naturelle, la photoprotection externe (vestimentaire et celle offerte par les produits solaires) est le principal moyen de lutte contre les dégâts causés par le soleil. La photoprotection vestimentaire est sûre, et un tissu offrant un UPF de 15 (ultraviolet protection factor : UPF) procure un niveau de protection solaire efficace. Le niveau de photoprotection offert par un produit solaire dépend de plusieurs paramètres : quantité de crème appliquée, type de crème, résistance à l’eau du produit solaire et résistance à l’abrasion par le sable, fréquence d’application, lieu d’application. Les produits solaires sont constitués essentiellement de filtres chimiques organiques et/ou minéraux, et, dans certains cas, d’autres constituants tels que des molécules antioxydantes. L'évaluation de la protection offerte par les produits solaires ou dispositifs de protection solaire est principalement mesurée par rapport à l'érythème. Cependant, certaines études ont montré que les produits photoprotecteurs offrent également une protection contre les lésions de l'ADN. Ces études sont principalement des travaux de laboratoire où des volontaires sont exposés à des doses aiguës bien définies de lumière solaire simulée, souvent sur une courte période. Certains travaux ont abordé la question de l’évaluation de la photoprotection de l’ADN dans les études cliniques impliquant l’exposition de volontaires (Young et al., 2018, Acta Dermato-Venereologica, 98 : 880-887). Une approche similaire sur explants ou épidermes reconstruits a été aussi utilisée (Bacqueville et al., 2015, J. Photochem. Photobiol. B. 151 : 31-38). Le rapport entre le niveau de dommages dans la peau exposée à la lumière du soleil simulée en l’absence ou la présence du produit solaire fournit un facteur de protection de l’ADN. Cette approche est entravée par des considérations éthiques car elle implique la quantification de photoproduits dans l’ADN des biopsies cutanées. Des techniques moins invasives ont été utilisées telle que la collecte de bulles de succion (Josse et al., 2018, J. Photochem. Photobiol. B. 179 : 1-6), mais elles nécessitent toujours des prélèvements de tissus de volontaires. Le domaine de la photoprotection reste un enjeu majeur de santé publique pour prévenir les dommages cutanés d’une surexposition solaire. Les altérations de la peau sont majoritairement induites par les radiations ultraviolettes (UVA et/ou UVB). Les inventeurs ont mis en évidence, de façon inattendue, une nouvelle méthode non invasive pour détecter des dimères de pyrimidine dans les fluides biologiques, en particulier l’urine, de volontaires humains après une exposition au soleil pendant une période prolongée. Cette nouvelle méthode permet par ailleurs d’évaluer l’efficacité de protection de l'ADN par un agent photoprotecteur, ou plus généralement de tout dispositif de protection solaire, en quantifiant ces dimères de pyrimidine dans les urines. La présente invention concerne donc une méthode d’évaluation de l’activité photoprotectrice d’un dispositif photoprotecteur, la méthode comprenant : a) le positionnement du dispositif sur un sujet, puis b) L’exposition du sujet à un rayonnement pendant la période effective de protection du dispositif appliqué, puis c) Le dosage de dimères de pyrimidine dans un échantillon de fluide biologique dudit sujet. Plus particulièrement, la méthode décrite ici est caractérisée en ce que le dosage comprend une digestion enzymatique d’acides nucléiques et un dosage des dimères de pyrimidine par chromatographie liquide. De façon encore plus préférée, le dosage comprend des étapes dans lesquelles : les acides nucléiques contenus dans le fluide biologique sont extraits en phase solide ; puis l’éluat contenant les acides nucléiques obtenu suite à l’étape d’extraction en phase solide est concentré ; puis les acides nucléiques contenus dans l’éluat concentré ainsi obtenu sont digérés enzymatiquement ; puis les dimères de pyrimidine obtenus suite à l’étape de digestion enzymatique sont dosés par chromatographie liquide. Dans un mode de réalisation particulier, la méthode de l’invention comprend une étape supplémentaire de détermination de la concentration des dimères de pyrimidine dans l’échantillon de fluide biologique du sujet, avantageusement par spectrométrie de masse. Préférablement, la méthode comprend une étape supplémentaire de comparaison de la concentration des dimères de pyrimidine dans l’échantillon de fluide biologique du sujet avec une référence. Dans un mode de réalisation préféré, la référence est la concentration des dimères de pyrimidine dans un échantillon de fluide biologique provenant d’un deuxième sujet sur lequel le dispositif n’a pas été positionné. Dans un autre mode de réalisation préféré, la référence est la concentration des dimères de pyrimidine dans un échantillon de fluide biologique provenant du sujet avant que le dispositif ne soit positionné. De façon préférée, le fluide biologique consiste en de l’urine ou de la sueur. Selon un autre mode de réalisation préféré, les dimères de pyrimidine sont des dimères de thymine, de préférence choisis parmi TT 64PP et TT CPD. Selon un autre mode de réalisation préféré, le dispositif est un actif, préférablement au moins un filtre solaire. Selon un autre mode de réalisation préféré, l’actif est appliqué directement sur la peau du sujet. Selon un autre mode de réalisation préféré, le rayonnement est un rayonnement ultraviolet. Selon un autre mode de réalisation préféré, l’étape b) se fait dans des conditions de vie réelles. Selon un autre aspect, l’invention a aussi pour objet une méthode d’identification d’un actif photoprotecteur, ladite méthode comprenant : L’évaluation de l’activité photoprotectrice de l’actif selon la méthode décrite ici, et L’identification de l’actif comme un actif photoprotecteur si l’activité photoprotectrice évaluée dans l’étape a) est supérieure à un seuil. Préférablement, le seuil est l’activité photoprotectrice d’un actif photoprotecteur connu évaluée selon la méthode décrite ici. DESCRIPTION DETAILLEE Les inventeurs ont mis au point une nouvelle méthode permettant d’évaluer l’activité photoprotectrice de dispositifs photoprotecteurs qui est fondée sur le dosage des dimères de pyrimidine dans les urines. Cette méthode est particulièrement avantageuse parce qu’elle permet de doser sélectivement et spécifiquement les dimères de pyrimidine de manière non invasive. Notamment, la méthode décrite ici permet de détecter et mesurer ces photoproduits dans des conditions de vie réelle, ce qui n’avait jamais été réalisé jusqu’ici. Par l’expression « dispositif(s) photoprotecteur(s) » ou « dispositif(s) de protection solaire », on entend ici un équipement, une matière, une molécule, une composition pour application topique ou systémique ; utilisés seul ou en association, destiné à être utilisé chez l’homme pour bloquer le rayonnement solaire UVA et/ou UVB. L’invention a pour objet une méthode d’évaluation de l’activité photoprotectrice d’un dispositif photoprotecteur, la méthode comprenant : le positionnement du dispositif sur un sujet, puis L’exposition du sujet à un rayonnement pendant la période effective de protection du dispositif, puis Le dosage des dimères de pyrimidine dans un échantillon de fluide biologique dudit sujet. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le dosage des dimères de pyrimidine comprend des étapes de : digestion enzymatique des oligonucléotides issus de la réparation de l’ADN ; puis dosage des dimères de pyrimidine par chromatographie liquide. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le dosage des dimères de pyrimidine comprend des étapes dans lesquelles : les acides nucléiques contenus dans le fluide biologique sont extraits en phase solide ; puis l’éluat contenant les oligonucléotides issus de la réparation de l’ADN obtenu suite à l’étape d’extraction en phase solide est concentré ; puis les acides nucléiques, contenus dans l’éluat concentré ainsi obtenu, sont digérés enzymatiquement ; puis D les dimères de pyrimidine obtenus suite à l’étape de digestion enzymatique sont dosés par chromatographie liquide. Par « acide nucléique », on entend ici l’ADN et l’ARN, préférablement l’ADN. L’acide nucléique selon la présente invention peut être circulaire ou linéaire ; il est préférentiellement linéaire. L’acide nucléique peut aussi être bicaténaire ou monocaténaire. De préférence, l’acide nucléique est monocaténaire. L’acide nucléique peut être sous forme de molécules complètes ou de fragments. Dans un mode de réalisation préféré, l’acide nucléique est un fragment et plus particulièrement un oligonucléotide. Un « oligonucléotide » tel qu’on l’entend ici est une molécule d’acide nucléique qui comprend moins de 50 nucléotides, préférablement moins de 40 nucléotides, encore plus préférablement moins de 30 nucléotides. Un oligonucléotide peut aussi comprendre plus de 15 nucléotides, préférablement plus de 20 nucléotides, encore plus préférablement plus de 25 nucléotides. Enfin, un oligonucléotide tel qu’on l’entend ici peut comprendre entre 15 et 50 nucléotides, préférablement entre 20 et 40 nucléotides, encore plus préférablement entre 25 et 30 nucléotides. Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l’acide nucléique est un oligonucléotide monocaténaire linéaire tel que, par exemple, les oligonucléotides générés par le mécanisme de réparation de l’ADN à la suite d’un dommage induit par les UV. La méthode comprend avantageusement une étape supplémentaire de quantification, ce qui permet la détermination de la concentration des dimères de pyrimidine dans l’échantillon de fluide biologique du sujet, avantageusement par spectrométrie de masse. Par « photoproduit », on entend ici tout produit d’une réaction photochimique dans l’ADN. Un « photoproduit » au sens de l’invention est plus particulièrement un dimère de pyrimidine. Par « dimère de pyrimidine », on entend ici une lésion moléculaire de l'ADN résultant d'une réaction photochimique entre des résidus de thymine ou de cytosine adjacents. De façon préférée, les dimères de pyrimidine tels qu’entendus ici sont des dimères thymine. Les dimères de pyrimidine comprennent notamment les dimères cyclobutyliques de pyrimidine (CPD) et les photoproduits 6,4 ou 6,4 pyrimidine-pyrimidone. Les dimères de pyrimidine sont avantageusement choisis parmi TT 64PP et TT CPD. Ainsi, la méthode est une méthode non invasive. Le fluide biologique est avantageusement l’urine ou la sueur. Les photoproduits présents dans le fluide biologique peuvent être quantifiés par extraction en phase solide des fragments d’ADN générés par la réparation de l’ADN et excrétés. Avantageusement, le procédé comprend une étape préliminaire de synthèse chimique de photoproduits TT marqués par des isotopes stables pour obtenir les étalons internes permettant ainsi par la suite une quantification absolue en spectrométrie de masse en dilution isotopique. Un protocole analytique spécifique a été développé selon l’invention. Le protocole se divise en 4 grandes étapes : L’extraction des acides nucléiques par extraction en phase solide (SPE) ; La concentration des acides nucléiques de l’éluat ; La digestion enzymatique des acides nucléiques ; Le dosage des dimères de pyrimidine par chromatographie couplée le cas échéant à la spectrométrie de masse. La première étape est l’extraction en phase solide des acides nucléiques à partir du fluide biologique, notamment des urines, avantageusement après ajout d’étalons internes qui assurent l’aspect quantitatif malgré une préparation d’échantillons complexe. L'extraction en phase solide (en anglais solid phase extraction, ou SPE) est une méthode de préparation de l'échantillon au cours de laquelle des composés en solution ou en suspension dans une phase liquide sont séparés des autres éléments du mélange par adsorption sélective sur une phase solide (colonne) en fonction de leurs propriétés physico-chimiques. Cette étape d’extraction en phase solide permet d’isoler les oligonucléotides des interférents contenus dans le fluide biologique, notamment l’urine, grâce à la phase solide. La phase stationnaire de la phase solide est avantageusement une phase polymérique. Les oligonucléotides sont absorbés sur la phase stationnaire de la colonne, puis un solvant ayant une force d’élution croissante (ajout de méthanol dans l’éluant) pouvant les éluer permet de les récupérer. Le solvant est avantageusement un mélange hydroalcoolique, avantageusement eau-méthanol. Le solvant peut également comprendre un tampon, tel que le TEAA (acétate de triéthylammonium). Entre temps, un lavage est effectué afin de nettoyer la colonne des interférents. Avantageusement, 4 étapes composent la SPE : Conditionnement : Activation de la phase polymérique de la colonne. La colonne peut être conditionnée par un mélange eau-méthanol comprenant de 10% à 20% en volume de méthanol. Le mélange peut comprendre un tampon, tel que le TEAA. Dépôt : Dépôt de l'échantillon Lavage : Elimination des interférents. Le solvant de lavage comprend avantageusement de l’eau et moins de 30% en volume de méthanol. Il peut lui aussi comprendre un tampon, tel que le TEAA. Elution : Récupération des composés. Le solvant d’élution comprend avantageusement au moins 30% en volume de méthanol, avantageusement de 50% à 100% en volume de méthanol. Le solvant peut lui aussi comprendre un tampon, tel que le TEAA. La seconde étape est la concentration de l’éluat récupéré. La concentration peut être réalisée par évaporation sous vide des solvants organiques, et par l’utilisation d’un lyophilisateur pour permettre l’élimination de l’eau et des sels volatils. La troisième étape est la digestion enzymatique qui peut être réalisée en suivant les méthodes bien connues. Cette étape permet de libérer des nucléosides monomériques et des dimères de pyrimidine, lesquels pourront ensuite être dosés. Toute enzyme possédant une activité DNAse peut être utilisée dans ce type de réaction, pourvu que l’hydrolyse soit complète. Cependant, il est avantageux d’utiliser une enzyme capable d’hydrolyser toutes les liaisons phosphodiesters des molécules d’acide nucléique. L’hydrolyse pourra donc être réalisée avec une ou plusieurs enzymes dotées d’une activité phosphodiestérase et capable d’agir sur les acides nucléiques présents dans l’éluat. De façon préférée, l’hydrolyse sera réalisée par une combinaison de phosphodiestérase II, DNase II et nucléase P1 à pH acide. A pH basique, on utilisera préférentiellement une combinaison de phosphatase alcaline et de phosphodiestérase I. Il est aussi possible d’alterner les traitements à pH acide et à pH basique. Ainsi, il peut être avantageux pour que la digestion soit bien complète de réaliser une première hydrolyse à pH acide avec une combinaison de phosphodiestérase II, DNase II et nucléase P1, suivie d’une deuxième hydrolyse à pH basique à l’aide d’une combinaison de phosphatase alcaline et de phosphodiestérase I. L’étape finale est le dosage par chromatographie liquide, couplé le cas échéant à la spectrométrie de masse pour une quantification absolue des photoproduits ciblés. Dans cette optique, il est particulièrement avantageux d’utiliser des standards internes pour assurer l’aspect quantitatif malgré une préparation d’échantillons complexe. L’approche a été optimisée pour limiter les effets de matrice dus au fluide biologique, en particulier à l’urine, et améliorer spécificité et sensibilité. Une étape de SPE en ligne sur une colonne de gel de silice en C18 peut être avantageusement ajoutée. Elle permet d’éliminer une partie des impuretés présent dans les échantillons en début d’élution avant la séparation analytique proprement dite et ainsi d’augmenter la sensibilité de la méthode. Pour l’étape d’analyse par chromatographie liquide, la colonne d’analyse est alors préférablement différente de celle utilisée lors de l’étape de SPE en ligne, par exemple de type pentafluorophényle, apportant ainsi une séparation complémentaire à celle sur gel de silice en C18. L’analyse par spectrométrie de masse porte avantageusement sur la détection des ions de TT CDP et TT 64PP. Les ions correspondant des étalons internes ont été aussi suivis. La concentration en photoproduits a été déterminée en calculant le ratio entre le signal de chaque ion et de son analogue dans les étalons internes à la fois dans les standards et les échantillons. Avantageusement, les concentrations de dimères TT CPD et TT 64PP sont normalisées par rapport à celle de la créatinine pour tenir compte du volume de miction. Dans la méthode selon l’invention, la référence est avantageusement la concentration des dimères de pyrimidine dans un échantillon de fluide biologique provenant d’un deuxième sujet sur lequel l’actif n’a pas été appliqué. Cette concentration est déterminée en suivant le même protocole d’analyse, tel que détaillé précédemment. Dans une autre variante, la référence peut être la concentration des dimères de pyrimidine dans un échantillon de fluide biologique provenant du sujet avant que l’actif ne soit appliqué. Comme explicité plus avant, l’expression « dispositif(s) photoprotecteur(s) » ou « dispositif(s) de protection solaire », correspond dans le présent contexte à un équipement, une matière, une molécule, un composé chimique, un ingrédient actif, une composition pour application topique ou systémique ; utilisé seul ou en association, destiné à être utilisé chez l’homme pour bloquer le rayonnement solaire UVA et/ou UVB et/ou UVC. Le dispositif photoprotecteur utilisé dans la présente méthode est notamment tout dispositif conférant une protection vis-à-vis des rayonnements, notamment des rayonnements solaires. Il peut s’agir par exemple d’un vêtement (par ex. chemise ou T-shirt, gants, chapeau, etc.), mais aussi d’un dispositif de type parasol, tente, ombrelle, ou masque. Le dispositif peut être positionné directement sur la peau du sujet. Alternativement, le dispositif peut être positionné sans être en contact avec la peau du sujet. Dans un mode de réalisation préféré, le dispositif photoprotecteur est un actif photoprotecteur ou une association d’actifs photoprotecteurs. L’actif, ou l’association d’actifs, est avantageusement appliqué directement sur la peau du sujet. L’actif est avantageusement un composé chimique ou une composition comprenant un composé chimique. L’association d’actifs est avantageusement un mélange de composés chimiques ou une composition comprenant des composés chimiques en mélange. Selon ce mode de réalisation préféré, L’invention a donc pour objet une méthode d’évaluation de l’activité photoprotectrice d’un actif, la méthode comprenant : L’application de l’actif sur la peau du sujet, puis L’exposition du sujet à un rayonnement pendant la période effective de protection de l’actif appliqué, puis Le dosage de dimères de pyrimidine dans un échantillon de fluide biologique dudit sujet. Dans un mode de réalisation particulier, l’actif évalué est au moins un filtre solaire. Par filtre solaire, on entend toute substance capable de filtrer le rayonnement solaire pour protéger une surface, typiquement la peau ou les cheveux, d’origine naturelle ou synthétique contre les effets nocifs du rayonnement solaire. Le filtre solaire est choisi parmi ceux classiquement connus dont : les filtres solaires organiques tels que les dérivés de triazine, les dérivés de benzotriazole et phényl benzotriazole, les dérivés du dibenzoylmethane, les dérivés de benzophénone et 2-hydroxybenzophénone amino-substitué, les dérivés de merocyanine, les dérivés de l’acide para aminobenzoïque, les dérivés salicyliques, les dérivés cinnamiques, les dérivés de β,β’-diphénylacrylate, les dérivés de benzylidène camphre, les dérivés de phenylbenzimidazole, les dérivés anthraniliques, les dérivés d’imidazolines, et les dérivés de benzylmalonate ; et les filtres solaires inorganiques tels que les oxydes métalliques enrobés ou non comme les oxydes de titane, de fer, de zinc, de zirconium, ou de cérium. Parmi les filtres organiques usuels, on peut citer en particulier la 5,6,5’,6’-tétraphényl-3,3’-(1,4-phénylène)-bis[1,2,4]triazine (n° CAS : 55514-22-2), également appelée phénylène bis-diphényltriazine ; le méthoxypropylamino cyclohexènylidène éthoxyéthylcyanoacétate (nom chimique : 2- éthoxyéthyl (2Z)-2-cyano-2-[3-(3-méthoxypropylamino)cyclohex-2-èn-1-ylidène]acétate ; N° CAS : 1419401-88-9), également appelé S87 ; l’hexyl 2-[4-(diéthylamino)-2-hydroxybenzoyl]benzoate (n° CAS : 302776-68-7), également appelé diéthylamino hydroxybenzoyl hexyl benzoate ; la 2,4-bis[4-(2-éthylhexyloxy)-2-hydroxyphényl]-6-(4-méthoxyphényl)-1,3,5-triazine (n° CAS : 187393-00-6), également appelée bis-éthylhexyloxyphenol méthoxyphenyl triazine, bemotrizinol ou anisotriazine ; le 4-tert-butyl-4-méthoxydibenzoylmethane ou butyl méthoxydibenzoylméthane (nom chimique : 1,4-(1,1-diméthyléthyl)phényl-3-(4-méthoxyphényl)-1,3-propanedione ; n° CAS : 70356-09-1), également appelé avobenzone ou BMDBM ; l’éthylhexyl triazone (nom chimique : acide 4-[[4,6-bis[[4-(2-éthylhexoxy-oxométhyl)phényl]amino]-1,3,5-triazin-2-yl]amino]benzoïque 2-éthylhexyl ester ; n° CAS : 88122-99-00) ; la diéthylhexyl butamido triazone (nom chimique : 4,4'-[[6-[[4-[[(1,1-diméthyléthyl)amino]carbonyl]phényl]amino]-1,3,5-triazine-2,4-diyl]diimino]bis-, bis(2-éthylhexyl)benzoate ; n° CAS : 154702-15-5) ; le méthylène bis-benzotriazolyl tétraméthylbutylphenol (nom chimique : 2,2’-méthylène-bis-(6-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-(1,1,3,3-tetraméthylbutyl)phénol ; n° CAS : 103597-45-1), également appelé MBBT ; la 2,4,6-tris(biphényl-4-yl)-1,3,5-triazine (n° CAS : 31274-51-8), également tris-biphényl triazine. L’actif peut être le filtre solaire seul ou formulé dans une composition à usage topique. On peut bien entendu également tester des combinaisons de filtres solaires, les protections solaires comprenant usuellement un mélange de filtres solaires afin d’offrir un spectre de protection le plus large possible. Comme évoqué plus avant le dispositif photoprotecteur peut être un équipement, dispositif, matière, entité physique, tel que par exemple un textile porté par le sujet ou un parasol ou toute autre toile sous lequel le sujet s’abrite. Dans la méthode selon l’invention, le rayonnement est plus particulièrement un rayonnement solaire. Le rayonnement susceptible d’induire des dommages de l’ADN peut être un rayonnement ultraviolet solaire ou artificiel, Préférentiellement, le rayonnement susceptible d’induire des dommages de l’ADN est un rayonnement mimant un rayonnement solaire, plus préférentiellement une irradiation dans le domaine UV dont UVA et/ou UVB et/ou UVC ; et/ou lumière bleue haute énergie visible et/ou infrarouge. Les UVC sont naturellement arrêtés par la couche d’ozone de l’atmosphère mais sont régulièrement utilisés par des industries à des fins de stérilisation ou d’élimination de pathogènes. Par « rayonnement ultraviolet » on entend des rayons électromagnétiques dont la longueur d’onde est comprise de 100 nm à 400 nm. Préférentiellement, l’exposition aux UV selon l’invention comprend l’exposition à des UVA et/ou à des UVB. Par UVA, on entend au sens de l’invention des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 320 à 400 nm. Par UVB, on entend au sens de l’invention des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 280 à 320 nm. Par UVC, on entend au sens de la présente invention des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise entre 100 à 280 nm. Par « lumière visible » on entend des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 400 à 700 nm. Par « lumière bleue haute énergie visible » on entend la lumière visible avec une longueur d'onde compris de 400 à 450 nm. Par « infrarouge » on entend des rayonnements dont la longueur d’onde est comprise de 700 nm à 2500 nm. Selon un mode de réalisation préféré, l’exposition aux UV selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVA. Selon un autre mode de réalisation préféré, l’exposition aux UV selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVB. Selon un mode de réalisation avantageux, l’exposition aux UV selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVA et à des UVB. Selon un autre mode de réalisation avantageux, l’exposition aux rayonnements selon l’invention comprend ou consiste en l’exposition à des UVA et/ou UVB et/ou UVC et/ou lumière bleue haute énergie visible et/ou IR. Dans un mode de réalisation particulier, les longueurs d’onde appliquées sont comprises entre 280 et 450 nm ou entre 280 à 400 nm. Dans un autre mode de réalisation particulier, la dose d’UVB est comprise entre 80 et 150 mJ/cm2 d’UVB ; de préférence 120 mJ/cm2 d’UVB. La réalisation d’une irradiation peut être effectuée dans des conditions bien connues de la personne du métier (cf. par ex. Iordanov et al, J. Biol. Chem. 1998). Avantageusement, l’étape b) se fait dans des conditions de vie réelles. Cela permet d’avoir un retour beaucoup plus proche de la réalité de l’activité photoprotectrice de l’actif évalué. Il est ainsi possible par exemple de suivre un sujet éduqué dans le mode d’application de l’actif (intervalles d’applications, doses à appliquer, conditions d’application) dans ses conditions de vies réelles, sur plusieurs jours ou semaines, puis de quantifier la présence de dimères de pyrimidine dans ses urines ou sa sueur. On pourra comparer les résultats avec un autre sujet, exposé à des conditions météorologiques comparables, mais qui n’est pas éduqué dans sa protection vis-à-vis des rayonnements solaires. On pourra également suivre dans le temps ou à certaines périodes la quantité de dimères de pyrimidine dans ses urines ou sa sueur. On pourra également détecter si le sujet a une peau pathologique et ne devrait pas s’exposer au rayonnement solaire. Généralement, un sujet éduqué applique l’actif généreusement sur la peau, soit environ 2 mg d’actif ou de la composition le comprenant par cm² de peau. L’application est renouvelée fréquemment, usuellement toutes les 2 heures, pour maintenir la protection, surtout après avoir transpiré, avoir nagé, s’être baigné ou s’être essuyé. L’invention a également pour objet une méthode d’identification d’un actif photoprotecteur, ladite méthode comprenant : L’évaluation de l’activité photoprotectrice de l’actif selon la méthode de l’invention, et L’identification de l’actif comme un actif photoprotecteur si l’activité photoprotectrice évaluée dans l’étape a) est supérieure à un seuil. Le seuil peut être l’activité photoprotectrice d’un actif photoprotecteur connu évalué selon la méthode de l’invention. L’actif photoprotecteur est avantageusement un filtre solaire ou une combinaison de filtres solaires pouvant être formulé avec des excipients usuellement introduits dans une composition solaire. Les exemples qui suivent illustrent l’invention. Exemples La formulation suivante a été testée dans l’exemple ci-après. Formulation A Ingrédients % (m/m) 5,6,5’,6’-tetraphényl-3,3’-(1,4-phénylène)-bis[1,2,4]triazine 3-3,5 Bis-Ethylhexyloxyphenol Méthoxyphényl Triazine 2,5-3 Diéthylamino hydroxybenzoyl hexyl benzoate 5-6 Ethyl hexyl Triazone 3,5-4 Glycérine 5,0 Eau déminéralisée Qsp 100 Gomme xanthane 0,2 C12-C15 alkyl benzoate 12,0 Dicaprylyl carbonate 9,0 Triglycérides caprylique/caprique 9,0 Conservateurs qs VP / eicosène copolymère 1,0 Cétyl phosphate de potassium 2,0 Le but de cette étude est d’évaluer les effets photoprotecteurs de formulations sur les dommages de l’ADN photoinduits à partir de prélèvements épidermiques et urinaires après exposition solaire chronique en condition réelle chez des adultes sains. L’approche a été validée avec un produit de formule A. Matériaux et méthodes Produits chimiques et enzymes Réactifs Le méthanol (MeOH) > 99,9 % de pureté (qualité CHROMASOLV) a été acheté chez Sigma-Aldrich et l'acétonitrile (ACN) de qualité LCMS chez Carlo Erba. L'acétate de triéthylammonium (TEAA, 1 M dans l'eau) et la 1, N 6 -éthéno-2'-désoxyadénosine (εdAdo) provenaient de Sigma (Saint-Quentin- Fallavier, France). Les réactifs et solvants pour la synthèse (5'-diméthoxytrityl 3'-phosphoramidite-thymidine, chlorure de diméthoxytrityle, anhydride acétique, acide acétique, pyridine, éthyl- S- triazol, iode, hydroxyde d'ammonium) étaient de la plus haute pureté disponible et achetés chez Aldrich (Saint-Quentin- Fallavier, France). La ( 13 C 10 , 98 % 15 N 2, 96-98 %)-thymidine provenait de Cambridge Isotope Laboratories. La [ 15 N 5 ]εdAdo a été synthétisé comme indiqué précédemment (Douki et al. Radic libre Biol Med. 37:62-70, 2004). La thymidylyl-(3'-5')-thymidine (TpT) a été préparée par synthèse de phosphodiester et tous les photoproduits de dinucléosides monophosphates ont été obtenus comme indiqué précédemment (Douki et al. Biochimie. 40:2495-501, 2001). Oligonucléotides synthétiques Les oligonucléotides (qualité purification HPLC) ont été achetés chez Eurogentec (Angers, France). Les oligonucléotides irradiés aux UV (oligo-UV) ont été préparés par irradiation UV (UVC, 30 min) de solutions (0,2 mg.mL- 1) d'un 15-mer (SEQ ID NO :1 : CATCTTACATTTTAC) et d'un 5-mer (SEQ ID NO :2 : TCTTA). Les mélanges résultants ont été calibrés pour leur teneur en photoproduits par HPLC-MS/MS après hydrolyse enzymatique comme détaillé plus bas. Lorsqu'elles sont utilisées dans des échantillons de contrôle qualité (CQ), les deux solutions sont mélangées. Pour la synthèse d'oligonucléotides portant des bases éthenoadénine (oligo-εdAdo), des solutions d'un 5-mer (SEQ ID NO :3 : ATTGC), d'un 10-mer (SEQ ID NO :4 : TATTGTTGCA), d'un 15-mer (SEQ ID NO :5 : CATTGTATTGTTGCA) et d'un 20-mer (SEQ ID NO :6 : ATTGTATTGTATTGATTGCAA) ont été préparées individuellement en concentration correspondant à 0,1 mM d'adénine. Les solutions (500 ul chacune) ont été mélangées et traitées pendant une nuit avec du chloroacétaldéhyde (10 mM). Les oligonucléotides ont été purifiés et la solution a été calibrée pour la teneur en εdAdo par HPLC-MS/MS. Synthèse de [M+12]-photoproduits Nous avons d'abord synthétisé un dérivé marqué [M+12] de TpT. La première étape était la condensation de [ 13 C 10, 15 N 2] -thymidine protégée à l'extrémité 3' en un synthon phosphoramidite de thymine à l'extrémité 5'. Le composé résultant a été oxydé en dinucléoside monophosphate et déprotégé dans des conditions acides et alcalines. La-fraction soluble dans l'eau du mélange réactionnel a été purifiée par HPLC en phase inverse. Le produit isolé a été caractérisé par fragmentation de spectrométrie de masse par comparaison avec du TpT non marqué. Tous les fragments étaient identiques dans les deux cas à l'exception des déplacements de m/z expliqués par la présence d'atomes de 13 C ou de 15 N. Une solution aqueuse de [M+12]-TpT a ensuite été exposée aux UVC pour donner des photoproduits dimériques. Le rendement de modification de [M+12]-TpT a été surveillé au cours de l'irradiation et celle-ci a été arrêtée lorsque le rendement de TT CPD avait atteint un plateau à la suite de la-réversion induite par les UVC. La solution irradiée a ensuite été purifiée sur un système HPLC en phase inverse avec détection UV (230 nm) et la fraction contenant les photoproduits a été isolée. La teneur en TT CPD et 64PP a été déterminée par HPLCMS/MS avec détection en mode MRM. Un étalonnage externe utilisant des standards non marqués a été utilisé. Enzymes La protéinase K a été achetée auprès de Qiagen (Courtaboeuf, France). La phosphodiestérase II provenait de Worthington (Lakewood, NJ). La RNase A, la DNase II, la nucléase P1, la phosphatase alcaline et la phosphodiestérase I ont été achetées chez Sigma (Saint-Quentin- Fallavier, France). Traitement des échantillons biologiques Extraction en phase solide d'échantillons d'urine Le protocole SPE pour la quantification du TT CPD et du TT 64PP dans les fluides biologiques comprenait plusieurs étapes. Tout d'abord, l’oligo-εdAdo a été ajouté (2,5 µL, 100 nM εdAdo) à 100 µL d'urine. 10 µL de TEAA 1 M ont été ajoutés, respectivement. L'échantillon a été déposé sur le dessus d'une colonne SPE HRX-100 (granulométrie-45 µm, phase 100 mg) (Macherey Nagel, Gutenberg, France) conditionnée avec une solution aqueuse 50 mM de TEAA. Le liquide a été éliminé sous vide et la colonne lavée avec 1 ml de tampon (15% MeOH + 85% de solution aqueuse de 50 mM TEAA). L'élution a ensuite été effectuée avec 1 mL d'un mélange de MeOH (75 %) et de TEAA 50 mM (25 %). Après évaporation du MeOH dans un speed-vac (modèle SPD 111V, Savant, Thermo Scientific) et de l'eau par lyophilisation dans un système Alpha 1-2 (Christ), le résidu obtenu a été solubilisé dans 100 µL d'une solution contenant les photoproduits [M+12] de TpT (5 nM TT CPD et 3,5 nM TT 64PP) et 5 nM de [M+5]-εdAdo. Extraction d'ADN L'ADN a été extrait du toit des bulles d'aspiration en utilisant le kit DNeasy de Qiagen. Les échantillons ont d'abord été rompus mécaniquement avec des billes d'acier dans un TissuLyzer (Qiagen) dans un tampon AL (Qiagen). De la protéinase K a été ajoutée et les échantillons incubés à 50°C pendant 3 h. De la RNaseA a été ajoutée et l'échantillon laissé à température ambiante pendant 2 min. Le tampon ATL (Qiagen) a été ajouté et les échantillons placés à 70°C pendant 10 min. Après refroidissement, de l'éthanol a été ajouté et les échantillons ont été élués dans une colonne de rétention d'ADN (Qiagen). Après deux étapes de lavage, l'ADN a été élué dans de l'eau pure. Les échantillons ont été lyophilisés pendant une nuit. L'ADN a ensuite été mis en suspension dans 100 µL d'une solution contenant les photoproduits [M+12] de TpT (5 nM TT CPD et TT 64PP 3,5 nM). Hydrolyse enzymatique d'oligonucléotides isolés ou d'ADN extrait. Les solutions d'oligonucléotides purifiés par SPE ou d'ADN nucléaire extrait ont été hydrolysées par voie enzymatique en deux étapes comme décrit précédemment (Courdavault et al. Photochem Photobiol. 79:145-51, 2004). En bref, l'échantillon a d'abord été incubé pendant 2 h à pH 5,5 avec la nucléase P1, la phosphodiestérase II et la DNase II. Le pH a été élevé à 8 par addition de tampon Tris et l'hydrolyse a été reprise pendant 2h en présence de phosphatase alcaline et de phosphodiestérase I. La solution résultante a été filtrée à 0,2 µm et transférée dans des flacons HPLC. Des échantillons de contrôle qualité (QC) pour les analyses d'urine ont été préparés en mélangeant oligo-εdAdo (2,5 µL, 100 nM) à une solution d'oligo-UV (2,5 µL à 100 nM dans TT CPD et 52 nM dans TT 64PP). Le mélange a été lyophilisé et traité en utilisant le protocole appliqué aux échantillons d’urine purifiés par SPE. Analyses par chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem Préparation de la courbe d'étalonnage Les échantillons pour la courbe d'étalonnage des mesures urinaires ont été préparés en mélangeant des volumes croissants (0, 1, 2 et 5 µL) d'un mélange de photoproduits TpT à 100 nM et d'une solution de εdAdo (0, 1, 2 et 5 µL à 100 nM) dans des flacons HPLC. Les échantillons ont ensuite été lyophilisés-et solubilisés dans 100 µL de la solution d'étalon interne isotopiquement marqué (50 nM de photoproduits [M+12] de TpT et 50 nM [ 15 N 5] - εdAdo. La même solution a été utilisée pour la solubilisation des-échantillons purifiés par SPE et du CQ. Pour les mesures dans l’ADN, les standards des photoproduits TT, TC et CT (0, 1, 2 et 5 µL à 100 nm) ont mélangés avec 50 nM de photoproduits [M+12] de TpT. La calibration est faite en étalon interne. Chromatographie liquide Les séparations chromatographiques ont été effectuées sur un système chromatographique de la série ExionLC AD (SCIEX, Framingham, MA) équipé d'une colonne SPE en ligne en gel de silice octadécylsilyle (Nucleodur C18 Gravity, granulométrie 5 µm, ID 2 × 50 mm, Macherey-Nagel, Gutenberg, France) et une colonne analytique de gel de silice avec un greffage mixte pentafluorophényl (PFP) / C18 (Excel C18-PFP, granulométrie 1,7 µm, ID 2,1 × 100 mm, ACE, Aberdeen, Royaume-Uni). La-partie SPE en ligne du système consistait en deux pompes, un injecteur automatique et une vanne à 6 voies située dans le four à colonne (température 30°C). La colonne C18 SPE en ligne était connectée à la sortie de l’injecteur automatique et à une entrée de la vanne 6 voies. Le gradient variait d'abord de 0 à 10 % d'ACN dans 20 mM de TEAA en 1 min à un débit de 400 µL min- 1. La vanne 6-voies commutait de la position "load" à la position "inject" 1 min après l'injection de l'échantillon. Dans cette configuration, la phase mobile dans la colonne SPE était fournie par deux pompes de la partie analytique du système chromatographique. Après 4 min, la vanne a été remise en position "load", et la colonne SPE était rincée par 50% d'ACN entre 6 et 8 min avant d'être équilibrée dans du TEAA pur 20 mM. Pendant ce temps, l'échantillon purifié était élué dans la colonne analytique PFP-C18. Le débit était de 200 µL min -1 . Le solvant A était 5 mM de TEAA et le solvant B 20 % d'ACN dans 5 mM de TEAA. Le gradient était laissé à 10 % de B pendant 1 minute puis augmenté linéairement à 45 % jusqu'à 9 min. La proportion de B était ensuite augmentée jusqu'à 100 % en 7 min et la phase mobile a maintenue à cette composition pendant 1 min. A la sortie de la colonne d'analyse, le flux traverse un détecteur UV à barrette de diodes (220-320 nm) utilisé pour quantifier les nucléosides normaux dans les échantillons d'ADN par étalonnage externe. La sortie était alors dirigée vers le spectromètre de masse. Spectrométrie de masse Le spectromètre de masse était un appareil 6500+ QTrap (SCIEX, Framingham, MA). Dans la première partie de l'analyse (9 min), il a été opéré en mode d'ionisation électrospray négatif pour la détection des photoproduits. Ensuite, la polarité a ensuite été changée en positive jusqu'à la fin de la course (20 min) pour la détection de εdAdo. Les paramètres de la source ont été optimisés pour atteindre le meilleur compromis pour les différents analytes. En mode négatif, la pression d'azote du gaz rideau, du gaz source d'ions 1 (nébulisation) et du gaz source d'ions 2 (gaz de gaine chauffé) ont été réglées à 45, 60 et 60 psi respectivement. Le gaz de collision a été réglé sur High. La tension d’ionisation électrospray était de-4300 V et la température de la source de 550°C. Le gaz d’exhaust (air) était réglé à 25 L min -1 . Le dwell time était de 50 ms pour toutes les transitions. Pour la détection en ionisation positive de εdAdo, le gaz rideau, le gaz source d'ions 1, le gaz source d'ions 2, le gaz de collision, la tension d’ionisation électrospray et la température de la source ont été réglés sur 45 psi, 60 psi, 60 psi, High, 5000 V et 550° C, respectivement. Au cours de cette période, le dwell time était de 400 ms. La détection a été faite en « multiple reaction monitoring » (MRM) dans lequel le signal correspondant à des réactions de fragmentation spécifiques à chaque analyte sont quantifiés. Trois transitions MRM ont été utilisées pour les photoproduits dimères et une seule pour εdAdo qui ne subit que la perte de l'unité désoxyribose. (Tableau 2). Seuls le TT CPD et le TT 64PP ont été quantifiés dans les échantillons d'urine. Tableau 2 : Caractéristiques spécifiques des analytes dans le dosage UHPLC-MS/MS. Rt est le temps de rétention (en min). Les MRM sont les réactions de fragmentation. La première valeur est le rapport m/z de l’ion pseudo-moléculaire ([M-H-] - et [M+H] + en mode négatif et positif, respectivement). La deuxième valeur est le rapport m/z des fragments suivis. La valeur entre parenthèses est l'énergie de collision. Les étalons internes (IS) sont les photoproduits [M+12] de TpT et [M+5]-εdAdo. IDENTIFIANT Rt MRM 1 MRM 2 MRM 3 TT DPC 6.3 545,2 79,1 (-130) 545,2 195,1 (-47) 545,2 447,1 (-42) TT 64PP 6.9 545,2 79,1 (-130) 545,2 195,1 (-47) 545,2 432,1 (-36) TC DPC 4.6 531,2 79,0 (-130) 531,2 195,0 (-44) 531,2 433,1 (-40) CC DPC 5.2 517,2 79,0 (-130) 517,2 195,0 (-40) 517,2 419,1 (-40) TT CPD IS 6.3 557,2 79,1 (-130) 557,2 195,1 (-47) 557,2 459,1 (-42) TT 64PP IS 6.7 557,2 79,1 (-130) 557,2 195,1 (-47) 557,2 444,1 (-36) εdAdo 10.6 276,0 160,0 (19) εdAdo IS 10.6 281,0 165,0 (19) Expression des résultats Pour les urines, les courbes d'étalonnage et la correction avec le standard interne oligo-εdAdo ont fourni des concentrations précises exprimées en nM de la solution injectée. Dans l'ADN, εdAdo n'a pas été utilisé. La normalisation à la quantité d'ADN extrait a plutôt été obtenue à partir de la quantité de bases normales quantifiées par un détecteur UV placé devant l'entrée du spectromètre de masse. Les résultats ont ensuite été exprimés en nombre de dimères par million de bases normales. Échantillons biologiques Une étude monocentrique est réalisée sur vingt-trois volontaires (visite d’inclusion), hommes ou femmes âgé(e) de 18 à 55 ans, répondant à plusieurs critères. Les sujets devaient avoir pour habitude lors d’expositions solaires d’utiliser peu de produit solaire ou d’utiliser des indices de protection faibles, (SPF Le groupe 1 (n=11) : groupe éduqué avec produit, les sujets recevant le produit solaire (Formulation A) et une action éducative ciblée à savoir comment bien appliquer le produit solaire ; et Le groupe 2(n=12) : groupe contrôle, les sujets ne recevant ni produit ni action éducative ciblée. Après la sélection des volontaires, l’étude a consisté en trois étapes correspondant à des visites. Les dates de ces visites ont été définies avec les volontaires en fonction des périodes auxquelles ils pensaient s’exposer. Visite 1 : (J1) inclusion, pendant laquelle a été collecté un échantillon d’urine pour déterminer le niveau basal de marqueurs urinaires ; Visite 2 : Visite intermédiaire (J7 à J39), correspondant à la fin de l’exposition. Cette dernière était variable d’un volontaire à l’autre. Lors de cette seconde visite était récupéré le second échantillon d’urine post-exposition. Une bulle de succion était également réalisée sur un avant-bras de chaque personne et son toit prélevé. Les bulles de succion étaient préparées par application d’une dépression (typiquement 400mbar pendant 3 à 4 heures). Après formation de la bulle, celle-ci était délicatement découpées Les toits de bulles étaient collectés puis gardés à -80°C jusqu’à extraction de l’ADN. Pour le groupe contrôle, les sujets entre V1 et V2 devaient conserver leurs habitudes en ce qui concerne la protection solaire. Pour le groupe éduqué, la formule devait être appliquée généreusement, par exemple deux doigts de produit sur un avant-bras, c’est-à-dire suivant les recommandations, soit environ 2 mg/cm². L’application devait être renouvelée fréquemment (toutes les 2 heures) pour maintenir la protection, surtout après avoir transpiré, nagé/baigné ou s’être essuyé. Analyses statistiques Les comparaisons intra-groupe et inter-groupes ont été effectuées à l'aide de modèles linéaires adaptés aux paramètres à analyser et aux nombres de visites. De manière générale, le facteur « groupe » (groupe traité avec Formule A versus groupe Contrôle), a été inclus en effet fixe. A cela, ont été ajoutés le facteur « visite » (V2, V3) et l’interaction groupe*visite, eux-aussi en effets fixes. Le facteur « sujet » a été inclus en effet aléatoire et la valeur V1 à la base en tant que covariable. Tout facteur considéré comme pertinent pour l’analyse (jour d’acquisition, etc.) a été pris en compte dans le modèle en effet fixe, le cas échant. Les comparaisons intra-groupe et inter-groupe ont été réalisées sur les différences de moyennes ajustées données par le modèle. Résultats Analyse quantitative du nombre de lésions CPD et autres photoproduits dans le toit de bulle prélevé sur l’avant-bras après l’exposition solaire à V2. Les résultats sont résumés dans le tableau 3 ci-dessous. Variable Groupe Moyenne ± Erreur standard (lésions per million de bases) Stats CT CPD Eduqué 482,04 ± 284,72 P=0,2618 Contrôle 167,19 ± 22,65 TC 64PP Eduqué 164,61 ± 92,09 P=0,1428 Contrôle 30,25 ± 6,56 TC CPD Eduqué 1329,52 ± 151,97 P=0,0467 Contrôle 2002,53 ± 270,74 TT 64PP Eduqué 6,96 ± 2,16 P=0,3833 Contrôle 25,47 ± 19,77 TT CPD Eduqué 2840,72 ± 328,24 P=0,0473 Contrôle 4415,36 ± 648,17 Dans un souci de visibilité, toutes les valeurs ont été multipliées par 10 4 Les résultats concernant les dimères de type cyclobutane et en particulier les dérivés TT et TC sont les plus intéressants. Cette observation est logique puisque ce sont les deux photoproduits les plus fréquents. Il apparaît que ces dimères sont significativement moins nombreux dans le groupe 1, c’est-à-dire que l’application chronique de la Formule A, empêche la formation des lésions ADN. Analyse quantitative des produits de dégradation des dommages photoinduits de l’ADN dans les urines avant et après la période d’exposition solaire à V1 et V2. Méthodes statistiques Concernant les données urinaires, une analyse de covariance expliquant l’évolution des paramètres entre V1 et V2 a été effectuée. Le facteur « groupe » (groupe traité avec la Formule A versus groupe contrôle) a été inclus en effet fixe et la valeur V1 à la base en tant que covariable. Les comparaisons intra-groupe et inter-groupes ont été réalisées sur les différences des moyennes ajustées données par le modèle. Les résultats sont résumés dans les tableaux 4, 5 et 6 ci-dessous Tableau 4 : concentration de créatinine mesurée dans les urines au cours de l’étude Groupes Temps Moyenne ± Erreur standard Stats Intra-groupe T2 vs. T1 Stats Inter-groupes Eduqué vs contrôle Créatinine (µmol/L) Eduqué T1 7798,18 ± 1229,18 - P=0,6419 T2 11198,18 ± 1556,31 - T2-T1 3400,00 ± 1315,36 P=0,0763 Contrôle T1 9717,50 ± 1805,73 - T2 11084,17 ± 1678,25 - T2-T1 1366,67 ± 1920,87 P=0,2205 Comme attendu, il n’est pas observé de variations significatives pour les taux de créatinine dans les urines entre les 2 visites, ni entre les deux groupes. Tableau 5 : concentration de TT 64PP (nmol/L) normalisé par lla concentration de créatinine Groupes Temps Moyenne ± Erreur standard Stats Intra-groupe T2 vs. T1 Stats Inter-groupes Eduqué vs contrôle Ratio nmol TT 64PP/ µmol créatinine (x10 4 ) Eduqué T1 0,17 ± 0,04 - P=0,0500 T2 0,20 ± 0,03 - T2-T1 0,03 ± 0,05 P=0,1267 Contrôle T1 0,11 ± 0,02 - T2 0,30 ± 0,04 - T2-T1 0,19 ± 0,04 P=0,0001 Dans le groupe contrôle, la concentration du photoproduit TT 64PP normalisée par la concentration de créatinine est significativement augmentée entre les 2 visites (P=0,0001), on retrouve pratiquement trois fois plus de TT 64PP lors de la visite 2. Dans le groupe éduqué, aucune augmentation n’est observée entre les 2 visites (P=0,1267). Ainsi une forte tendance à la limite de la significativité (p=0,05) est mise en évidence entre ces deux groupes, l’application chronique de la Formule A permet de réduire notablement la quantité de ce photoproduit. Tableau 6 : concentration de TT CPD (nmol/L) normalisé par la concentration de créatinine Groupes Temps Moyenne ± Erreur standard Stats Intra-groupe T2 vs. T1 Stats Inter-groupes Eduqué vs contrôle Ratio nmol TT CPD/ µmol créatinine (x10 4 ) Eduqué T1 1,01 ± 0,37 - P=0,0234 T2 2,01 ± 0,60 - T2-T1 0,99 ± 0,62 P=0,4521 Contrôle T1 0,79 ± 0,42 - T2 6,92 ± 1,78 - T2-T1 6,13 ± 1 , 85 P=0,000 3 Les résultats avec le photoproduit TT CPD sont particulièrement intéressants. Dans le groupe contrôle, la teneur en TT CPD augmente dramatiquement entre les deux visites, dans le groupe éduqué, seule une tendance est observée. Il en résulte une différence statistiquement significative entre les deux groupes. Les inventeurs démontrent qu’une simple analyse d’urine permet de mettre en évidence, l’efficacité d’un agent photoprotecteur. Il est intéressant de noter que la différence entre les deux groupes de volontaires est plus marquée pour les marqueurs urinaires que pour la mesure directe des dommages dans l’ADN de bulles de succion. Méthode de dosage in vitro de dimères de pyrimidine dans un échantillon de fluide biologique provenant d’un sujet, caractérisé en ce que le dosage comprend une digestion enzymatique d’acides nucléiques et un dosage des dimères de pyrimidine par chromatographie liquide. Méthode selon la revendication 1 , caractérisée en ce que le dosage comprend des étapes dans lesquelles : les acides nucléiques contenus dans le fluide biologique sont extraits en phase solide ; puis l’éluat contenant les acides nucléiques obtenu suite à l’étape d’extraction en phase solide est concentré ; puis les acides nucléiques contenus dans l’éluat concentré ainsi obtenu sont digérés enzymatiquement ; puis les dimères de pyrimidine obtenus suite à l’étape de digestion enzymatique sont dosés par chromatographie liquide. Méthode selon l‘une quelconque des revendications 1 ou 2précédentes, caractérisée en ce que le dosage des dimères de pyrimidine comprend une détermination de la concentration des dimères de pyrimidine dans l’échantillon de fluide biologique du sujet, avantageusement par spectrométrie de masse. Méthode selon la revendication 3, caractérisée en ce qu’elle comprend une étape supplémentaire de comparaison de la concentration des dimères de pyrimidine dans l’échantillon de fluide biologique du sujet avec une référence. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que le fluide biologique consiste en de l’urine ou de la sueur. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que les dimères de pyrimidine sont des dimères de thymine, de préférence choisis parmi TT 64PP et TT CPD.