FR 3143039 A1 20240614 FR 2213028 A 20221208 L’invention a pour objet un procédé de production de cellules tueuses induites par les cytokines (CIK ou cytokine- induced killer cell ), les cellules CIK obtenues par ledit procédé, des compositions comprenant lesdites cellules CIK, ainsi que lesdites cellules CIK et lesdites compositions pour leur utilisation en tant que médicament, notamment pour le traitement du carcinome hépatocellulaire (CHC). Procédé de production de cellules CIK, cellules CIK et leur utilisation L’invention a pour objet un procédé de production de cellules tueuses induites par les cytokines (CIK ou cytokine- induced killer cell ), les cellules CIK obtenues par ledit procédé, des compositions comprenant lesdites cellules CIK, ainsi que lesdites cellules CIK et lesdites compositions pour leur utilisation en tant que médicament, en particulier pour le traitement du carcinome hépatocellulaire (CHC). Le carcinome hépatocellulaire (CHC) représente 95 % des cancers primitifs du foie et la quatrième cause de décès associé au cancer dans le monde. L’ablation d’une partie du foie et la transplantation hépatique constituent actuellement les principaux traitements curatifs du CHC. Cependant, en raison d’un stade avancé de la tumeur ou du manque de donneurs d’organes, la majorité des patients n’a pas accès à ces thérapies. De plus, la récidive postopératoire est fréquente. D'autres options thérapeutiques, telles que les radiothérapies ou chimiothérapies, ont également une efficacité limitée. Aussi, il existe un réel besoin de nouvelles approches thérapeutiques pour améliorer le traitement du CHC. Depuis une dizaine d’années, l'immunothérapie apparaît comme une option de traitement potentielle pour le CHC. En particulier, le transfert adoptif de cellules CIK représente l'une des voies les plus prometteuses. Les CIK sont une population hétérogène de cellules issues de cellules sanguines cultivées ex vivo ou in vitro . Elles sont générées à partir des cellules mononucléées (CMN) du sang cultivées en présence de facteurs solubles, tels que les anticorps CD3, l'interféron gamma (IFN-γ) et l'interleukine 2 (IL-2). Les CIK expriment à la fois des marqueurs des lymphocytes T et des cellules tueuses naturelles (NK ou Natural Killer ). Elles présentent de nombreux avantages par rapport aux autres cellules immunitaires car elles ont un taux de prolifération élevé, une forte activité cytotoxique anti-tumorale, une faible toxicité vis-à-vis des tissus sains et peuvent être obtenues directement à partir de patients cancéreux. De plus, les CIK sont particulièrement intéressantes car leur activité cytolytique est indépendante de la restriction du complexe majeur d’histocompatibilité (CMH), ce qui permet le transfert de CIK allogéniques. Dans ce contexte, les Inventeurs ont développé un nouveau procédé de production de cellules CIK à partir de cellules mononucléées de sang placentaire et n’impliquant pas d’IFN-γ. De manière inattendue, les cellules CIK obtenues par ce procédé possèdent une action antitumorale vis-à-vis de lignées de CHC plus importante que les cellules CIK générées à partir de sang adulte. De plus, pour optimiser le potentiel thérapeutique des cellules CIK, les Inventeurs y ont introduit un gène suicide permettant l’élimination des cellules CIK si des effets secondaires apparaissent après leur administration à un patient. Un aspect de l’invention a ainsi pour objet un procédé de production de cellules CIK comprenant : (i) une étape de culture de cellules mononucléées extraites de sang placentaire dans un milieu de culture comprenant au moins un anticorps CD3 et de l’interleukine 2, ledit milieu de culture étant dépourvu d’interféron gamma, (ii) une étape de récupération des cellules obtenues. Selon l’invention, l’expression "cellules CIK" ou "cellules tueuses induites par les cytokines" désigne des lymphocytes de type NKT ( Natural Killer T ) générés artificiellement par la mise en contact avec des cytokines. Ces cellules possèdent des marqueurs de lymphocytes T et de lymphocytes NK. Les cellules CIK sont principalement des cellules CD3+/CD56+. Toutefois, on entend par "cellules CIK" non seulement les cellules CD3+/CD56+ obtenues par le procédé de l’invention, mais également la population hétérogène de cellules, comprenant les cellules CD3+/CD56+, obtenue grâce au procédé de l’invention. Selon l’invention, les "cellules mononucléées de sang placentaire" regroupent les cellules sanguines possédant un noyau non-multilobé, comme les lymphocytes et les monocytes présentes dans le sang placentaire. On entend par "sang placentaire" ou "sang de cordon" le sang issu du placenta. Il est généralement prélevé au niveau du cordon ombilical, directement après la naissance de l’enfant. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, dans lequel l’étape de culture des cellules dure au moins 9 jours, de préférence au moins 14 jours. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, dans lequel l’étape de culture des cellules dure au moins 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 jours. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, dans lequel l’étape de culture des cellules dure 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 jours. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, dans lequel l’anticorps CD3 est le Muromonab-CD3. Le "Muromonab-CD3" (ou OKT3) est un anticorps monoclonal murin dirigé contre l’antigène CD3 des lymphocytes T humains. Dans l’invention, l’anticorps CD3 (ou "anti-CD3" ou "anticorps anti-CD3") est utilisé à des fins de fonction, c’est-à-dire pour l’activation des cellules mononucléées en cellules CIK. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, dans lequel le milieu de culture contient au moins 10 ng/ml d’anticorps CD3, de préférence de 10 à 100 ng/ml d’anticorps CD3. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, dans lequel le milieu de culture contient au moins 500 UI/ml d’IL-2. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, dans lequel le milieu de culture contient au moins 2,5% de sérum. Dans un mode de réalisation, le milieu de culture contient au moins 5%, de préférence au moins 10 % de sérum. Dans un mode de réalisation, le milieu de culture contient au moins, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14% ou 15% de sérum. Le sérum peut être provenir de sang adulte ou de sang placentaire. Dans un mode de réalisation, le milieu de culture est choisi parmi le groupe comprenant le milieu AIM V™ (Gibco) et le milieu X-VIVO™ 15 (Lonza). Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, dans lequel l’étape de culture de cellules mononucléées est réalisée dans un milieu de culture étant dépourvu d’IL-7, d’IL-15, d’ALT-803, de ligand FLT3 et de galactosylceramide (Gal-Cer). Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, dans lequel l’étape de culture de cellules mononucléées est réalisée dans un milieu de culture ne contenant aucun facteur soluble hormis de l’anticorps CD3 et de l’IL-2. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, comprenant : (iii) une étape de tri des cellules obtenues. De manière non-limitative, l’étape de tri des cellules peut être réalisée par n’importe quelle méthode de tri cellulaire. Par exemple, le tri des cellules peut être effectué par tri immunomagnétique ou par cytométrie en flux, de préférence par tri immunomagnétique. La méthode de l’invention permet alors de séparer une population de cellules homogène, par exemple correspondant à un type cellulaire et/ou exprimant des marqueurs spécifiques, du reste des cellules. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne un procédé de production de cellules CIK tel que défini précédemment, dans lequel les cellules CD3+/CD56+ sont triées. Un autre aspect de l’invention a pour objet les cellules CIK obtenues par le procédé tel que défini précédemment. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne les cellules CIK obtenues par le procédé, dans lesquelles au moins 10% des cellules CIK coexpriment les marqueurs CD3+ et CD56+. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne les cellules CIK obtenues par le procédé, dans lesquelles au moins 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% des cellules coexpriment les marqueurs CD3+ et CD56+. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne les cellules CIK obtenues par le procédé coexpriment les marqueurs CD3+ et CD56+. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne les cellules CIK telles que définies précédemment, les cellules CIK étant modifiées génétiquement pour exprimer un gène suicide. Dans l’invention, un gène suicide est utilisé comme un interrupteur de sécurité « on/off ». Lors de l’utilisation de thérapies anticancéreuses classiques, il est possible d’interrompre ou de réduire le dosage du médicament administré pour réduire l’éventuelle toxicité du traitement. Or, avec les immunothérapies à base de cellules, cela n’est plus possible après la perfusion des cellules. Ainsi, un gène suicide permet d’activer un mécanisme de mort cellulaire via l’administration d’un composé et d’induire l’élimination spécifique des cellules administrées en cas d’éventuelles complications. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne les cellules CIK telles que définies précédemment, les cellules CIK étant modifiées génétiquement pour exprimer un gène codant une caspase 9 humaine inductible (iCASP9). La caspase 9 humaine inductible est un homodimère dont la dimérisation est activée par une molécule, le rimiducide (ou AP1903). Une fois dimérisée, la caspase 9 conduit à l’apoptose des cellules CIK et à une réduction des effets secondaires éventuels liés à la thérapie à base de cellules CIK. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne les cellules CIK telles que définies précédemment, dans lesquelles la caspase 9 humaine inductible est activée en présence de rimiducide. Un autre aspect de l’invention a pour objet une composition comprenant des cellules CIK obtenues par le procédé tel que défini précédemment. Dans un mode de réalisation, la composition telle que définie précédemment comprend un excipient pharmacologiquement acceptable. Un autre aspect de l’invention concerne une composition comprenant des cellules CIK obtenues par le procédé tel que défini précédemment, pour son utilisation en tant que médicament. Un autre aspect de l’invention concerne une composition comprenant des cellules CIK obtenues par le procédé tel que défini précédemment, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une composition pour son utilisation telle que définie précédemment, dans laquelle le dit cancer est un cancer solide ou un cancer hématologique. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une composition pour son utilisation telle que définie précédemment, le dit cancer étant choisi parmi la liste comprenant un cancer hépatique, un cancer hépato-biliaire, un cancer du pancréas, un cancer du poumon, une tumeur cérébrale ou un cancer métastatique. Dans un mode de réalisation préférentiel, l’invention concerne une composition pour son utilisation telle que définie précédemment, le dit cancer étant un carcinome hépatocellulaire. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une composition pour son utilisation telle que définie précédemment, ledit traitement étant un traitement allogénique. Par traitement "allogénique", on entend que les CMN ayant servi à générer les cellules CIK proviennent d’un individu donneur différent de l’individu receveur. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une composition pour son utilisation telle que définie précédemment, ledit traitement étant un traitement autologue. Par traitement "autologue", on entend que les CMN ayant servi à générer les cellules CIK proviennent du même individu à qui elles sont administrées. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une composition pour son utilisation telle que définie précédemment, la dite composition étant administrée par voie intraveineuse. Les cellules se répartissent alors dans l'organisme. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une composition pour son utilisation telle que définie précédemment, la dite composition étant administrée de manière locale, notamment par injection guidée par imagerie. Une administration locale permet de réduire la dispersion des cellules dans l'organisme et d’augmenter la concentration locale des cellules au plus près de la tumeur. De plus, le nombre de cellules requis peut être réduit. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une composition pour son utilisation telle que définie précédemment, la dite composition étant administrée en une seule injection. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne une composition pour son utilisation telle que définie précédemment, la dite composition étant administrée en plusieurs injections, notamment de 2 à 12 injections. Un autre aspect de l’invention concerne également une méthode de traitement du cancer comprenant l’administration de cellules CIK telles que définies précédemment ou d’une composition telle que définie précédemment à un sujet en ayant besoin. Un autre aspect de l’invention concerne également l’utilisation de cellules CIK telles que définies précédemment ou d’une composition telle que définie précédemment pour la fabrication d’un médicament pour le traitement du cancer, en particulier du CHC. Un autre aspect de l’invention concerne également un kit pour le traitement du cancer comprenant les cellules CIK telles que définies précédemment ou une composition telle que définie précédemment. Dans un mode de réalisation, le kit comprend également du rimiducide. Les dessins annexés illustrent l’invention : Caractéristiques immunophénotypiques des lots de cellules CIK. A) Résultats des immunophénotypages réalisés sur le sang total provenant du sang périphérique (SP) (N=11) ou du sang de cordon (SC) (N=9), et suite à une stimulation CD3 ou CD3/28. B) Ratio CD4/CD8 pour les produits cellulaires provenant du SP ou du SC. C) Répartitions des sous-populations CIK parmi les différents produits cellulaires. LT : Lymphocytes T ; LTC : Lymphocytes T cytotoxiques ; TH Lymphocytes Helper ; NKT : NK-like T cell ; NK : Natural Killer ; B : Lymphocytes B. Comparaison des sous-populations de cellules CIK fonction de la source de sang et du type de stimulation. Caractérisation immunophénotypique des spectres de différentiation mémoire des sous-ensembles de lymphocytes parmi les cellules CIK. A) Stratégie d’analyse en cytométrie en flux des marqueurs de différentiation mémoire, ici de LT. B) Graphiques pistes, un ¼ de cercle représente une proportion de 100% de la condition étudiée. N=3, Moyenne ± ESM. Marquage CD107α des cellules CIK après co-culture avec les cellules tumorales. A) Stratégie de gating sur les LT, NKT et NK contenus dans les cellules et représentations monoparamétriques de la modulation de l’expression du CD107α à la surface des LT, NKT et NK après stimulation par la PMA/Ionomycine. B) Représentation du pourcentage de cellules CD107α+ totales, suite aux divers co-cultures. C) Proportion des cellules LT, NK et NKT parmi les cellules CD107α+. N=5 Moyenne ± ESM. Analyse des pourcentages de sous-populations CIK exprimant le CD107α+ après co-culture avec les lignées cellulaires tumorales de CHC. Résultats de cytométrie en flux représentant le pourcentage de cellules CD107α+ parmi les LT, NKT et NK des divers protocoles de générations de cellules CIK. N=5, Moyenne ± ESM. Représentation en heatmap des pourcentages de LT NK & NKT engagés dans la dégranulation après co-culture avec les lignées cellulaires tumorales de CHC. Essais cytotoxiques des cellules CIK de SP avec une activation CD3 ou CD3/28 envers les lignées cellulaires tumorales de CHC par microscopie à épifluorescence en temps réel en 2D. A) Acquisition microscopique au grossissement x4 des différentes modalités de culture de la fluorescence verte des puits. NT= Non traitées. B) Représentation graphique de la cinétique d’évolution de l’index de lyse (GFP 0:1 -GFP E:C ) sur 7j avec une acquisition toutes les heures en fonction du produits testés et de sa dose réponse. Exemple donné pour les Huh7 GFP ainsi que les HepG2 GFP . C) Représentation du pourcentage de cytotoxicité optimale et finale des traitements d’immunothérapies testées à l’encontre des cellules PLC/PRF/5 GFP D) Graphiques compilés des pourcentages de cytotoxicité optimale pour les cellules CIK générées à partir d’une stimulation CD3 ou CD3/28 à l’encontre des cellules Huh7 GFP , PLC/PRF/5 GFP et HepG2 GFP . N=5, Moyenne ± ESM. EC50 des cellules SP-CIK CD3 et CD3/28 contre les lignées cellulaires tumorales de CHC en 2D. Essais cytotoxiques des cellules CIK de SC et de SP avec une activation CD3 envers les lignées cellulaires tumorales de CHC par microscopie à épifluorescence en temps réel en 3D. A) Acquisition microscopique au x4 des sphéroïdes de Huh7 GFP . NT= Non traitées. B) Représentation graphique de la courbe de survie type Kaplan-Meier des différents types de sphéroïdes traités en dose-réponse par les cellules CIK CD3 de SC ou de SP. C) Comparaison des jours de total éradication des sphéroïdes en fonction des conditions de traitement, éradication signifie 0 signal GFP dans le puit, NO = Non Observable. D) Analyse des aires sous la courbe (AUC) des cinétiques de fluorescence en fonction des conditions de traitement afin de pouvoir intégrer les résultats (compilation des résultats de fluorescence, de temps et de dose-réponse) afin d’établir le modèle d’efficacité anti-tumorale intégrée permettant de comparer l’effet des traitements entre eux au niveau des divers sphéroïdes. N=5, Moyenne ± ESM. EC50 des cellules SP-CIK et SC-CIK CD3 contre les lignées cellulaires tumorales de CHC en 3D. Test de cytotoxicité des cellules CIK à l'encontre de CSH CD34+. A) évaluation de l’expression du HLA-A2 au niveau des cellules CIK et des CSH CD34+ sur des immunomarquages séparés. B) Profils cytométriques des différentes conditions de co-culture avec la distinction des types cellulaires en fonction de l’expression du HLA-A2. C) Cinétique d’expression du Viobility au niveau des cellules HLA-A2- (CSH) au cours du temps. D) Haut : pourcentage de lyse des CSH en fonction du temps. Bas : pourcentage de killing des CSH en fonction des ratio E:C. N=3, moyenne ± ESM. EC50 des cellules SC-CIK CD3 à l'encontre des CSH N=3, Moyenne ± ESM. Structure du transgène iCaspase9.2A.∆CD19 Structure du transgène bicistronique iCaspase9.2A.∆CD19 (c'est-à-dire comportant deux cistrons, les loci responsables de la génération d'une protéine), comprenant la séquence iCasp9, avec le CD19 tronqué (ΔCD19) servant de marqueur de sélection membranaire. L’ensemble de la séquence est incorporée dans un vecteur rétroviral. Transduction rétrovirale du gène suicide au niveau des cellules CIK générées à partir de sang de cordon. A) Suivi de l’efficacité de transduction des différentes cellules lymphocytaires (LT, NK & NKT) constituant les cellules CIK, suivi par cytométrie en flux en ciblant le gène rapporteur ΔCD19 pour différentes conditions de MOI. B) Localisation des différents types cellulaires au niveau de l’ensemble des cellules présentes dans les cellules CIK. C) Représentation graphique des données illustrant l’efficacité de transduction en fonction des types cellulaires. N=3, moyenne ± ESM. Evaluation de l'impact de la MOI sur la culture des cellules CIK. Les traits pleins traduisent la croissance cumulée relative, tandis que les pointillés traduisent la viabilité de la culture. N=3. La présente invention sera décrite ci-après de façon plus détaillée et à l’aide d’un ou plusieurs exemples qui ne limitent nullement l’invention. Exemple 1 - Production des cellules CIK Matériel et méthodes Les cellules monucléées (CMN) isolées sont cultivées à une concentration de 1x10 6 cellules/mL dans du X-Vivo 15 (Lonza, Bâle, Suisse) supplémenté avec 2 % v/v de sérum humain adulte ou provenant de sang de cordon ainsi qu’avec 500 IU/mL d’interleukin-2 (IL-2 ; Novartis Pharma, Dorval, Québec). Les CMN sont ensuite activées avec 10 ng/mL de l’anticorps soluble monoclonal CD3 (OKT3, Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne) ou avec 20 µl de TransAct (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne) qui est une activation CD3/28. Les cultures sont entretenues à J+3, J+5, J+7, J+10, J+14 post-activation en remettant les suspensions cellulaires à 1x10 6 cellules/mL et en complétant les volumes de milieu de culture à un volume nécessaire au maintien de cette concentration cellulaire. A chaque point d’entretien, les cellules sont comptées au Countess II en utilisant du bleu de trypan. Résultats Les cellules CIK obtenues à partir de sang périphérique (SP) ou avec de sang de cordon (SC), après une stimulation CD3 ou CD3/28 ont été analysées par immunophénotypage (Figure 1A). Les ratios CD4+/CD8+ ont été déterminés pour les CMN de sang périphérique (SP) et de sang de cordon (SC), ainsi que pour les diverses cellules CIK générées à partir de ces sources de sang (Figure 1B). Physiologiquement, le ratio se situe aux alentours de 1.97 ± 0.235 (moyenne ± ESM) pour le SP et de 7.2 ± 2.22 pour le SC. Dans le cas des cellules SP-CIK, l’activation CD3 présente un ratio CD4+/CD8+ inversé de 0.43 ± 0.09, tandis que l’activation CD3/28 maintient le ratio CD4+/CD8+ à 1.76 ± 0.24. Pour les SC-CIK, la stimulation CD3 présente un ratio CD4+/CD8+ diminué, mais non inversé, à 3.450 ± 0.982 et la stimulation CD3/28 maintient, voire augmente, le ratio CD4+/CD8+ à 15.750 ± 7.275. La répartition des différentes sous-populations de cellules CIK a été analysée (Figure 1C). Pour le SP, les LT présentent une proportion 1.65 ± 0.12 fois supérieure à celle observée au sein des CMN après stimulation CD3, tandis qu’elle est de 2.20 ± 0.11 fois supérieure à celle observée au sein des CMN après une stimulation CD3/28. Pour les NK, elle est de 0.70 ± 0.06 pour une stimulation CD3 et 0.21 ± 0.01 pour une stimulation CD3/28. Enfin, pour les NKT, elle est de 3.89 ± 0.11 pour la stimulation CD3 et de 2.56 ± 0.08 pour une stimulation CD3/28. Pour le SC, les LT présentent une proportion 2.17 ± 0.16 fois supérieure relativement aux cellules monucléées de sang périphérique pour une stimulation CD3, tandis qu’elle est de 3.10 ± 0.06 pour une stimulation CD3/28. Pour les NK, elle est de 1.53 ± 0.12 pour une stimulation CD3 et de 0.13 ± 0.01 pour une stimulation CD3/28. Enfin, pour les NKT, elle est de 11.20 ± 0.13 pour la stimulation CD3 et de 6.48 ± 0.06 pour une stimulation CD3/28. L’impact de la source de sang et du type d’activation sur la génération des 3 sous-populations CIK, en croisant les résultats d’immunophénotypage obtenus avec les cellules SP-CIK CD3, SP-CIK CD3/28, SC-CIK CD3 et SC-CIK CD3/28 ( ). La combinaison optimale pour obtenir un pourcentage élevé de cellules T est celle du SC avec une stimulation CD3/28 (SC-CIK CD3/28), qui présente une différence statistiquement significative avec les SC-CIK CD3 (p Exemple 2 - Phénotype mémoire des cellules CIK Matériel et méthodes Pour évaluer le phénotype mémoire des cellules CIK, le panel d’anticorps fluorescents suivant a été utilisé : CD3-Vioblue, CD56-APC, CD8-APC-Vio770, CD45RA-PerCP-Vio700, CD45RO-VioGreen, CD197-PE (CCR7), CD95-PE-Vio770 (récepteur FAS). Résultats Les cellules ont été analysées par cytométrie en flux (Figure 3A). Les diagrammes pistes des différentes populations étudiées permettent de connaître le phénotype mémoire des populations de LT et de NKT parmi les cellules mononucléées et les cellules CIK de SP et de SC, dans les compartiments CD8- et CD8+ (Figure 3B). Globalement, au niveau des CMN de SP, ainsi que de SC avant stimulation, les cellules T et NKT sont principalement de phénotypes T N (moyenne ± ESM): - parmi les SP-CMN LT CD4+ : 36.6% ± 4.7% - parmi les SP-CMN LT CD8+ : 45.5% ± 0.6% - parmi les SP-CMN NKT CD4+ : 28.3% ± 6.6% - parmi les SP-CMN NKTCD8+ :56.0% ± 2.6% - parmi les SC-CMN LT CD4+ : 68.4% ± 1.5% - parmi les SC-CMN LT CD8+ : 75.4% ± 1.3% - parmi les SC-CMN NKT CD4+ : 46.2% ± 5.0% - parmi les SC-CMN NKT CD8+ :41.3% ± 5.1% Même si la majorité des cellules sont de phénotype T N , il existe des différences significatives entre les LT et NKT (CD4+ et CD8+) contenus dans les CMN de SP et SC et également au sein d’une même source de sang avec des valeurs p comprises entre 0.009 et Concernant les cellules de SP-CIK, le phénotype est majoritairement T EM . - parmi les SP-CIK LT CD4+ : 84.3% ± 6.6% - parmi les SP-CIK LT CD8+ : 71.0% ± 10.2% - parmi les SP-CIK NKT CD4+ : 73.9% ± 12.7% - parmi les SP-CIK NKTCD8+ : 75.2% ± 7.4% Les cellules SC-CIK présentent un phénotype majoritairement T EMRA : - parmi les SC-CIK LT CD4+ : 67.9% ± 12.9% - parmi les SC-CIK LT CD8+ : 79.0% ± 1.0% - parmi les SC-CIK NKT CD4+ : 66.0% ± 9.1% - parmi les SC-CIK NKT CD8+ : 83.9% ± 1.3% Les différences entre les LT et NKT de SP et SC-CIK sont toutes significatives avec une valeur p comprise entre 0.03 et Exemple 3 - Dégranulation Matériel et méthodes Le milieu utilisé pour les tests est du XVivo15 + 500 UI/mL d’IL-2. Dans une plaque 96 puits fond plat (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, Etats-Unis), 50 µl de suspension cellulaire à 0.6 x 10 6 cellules/mL (30 000 cellules totales) contenant la lignée Huh7 ou PLC/PRF/5 ou HepG2 sont ensemencés à l’incubateur durant une nuit. Le lendemain, 100 µl de suspension cellulaire à 1x10 6 cellules/mL (100 000 cellules totales) contenant les cellules CIK sont déposés dans les puits contenant les lignées ou dans les puits vides (contrôle négatif ou positif). Les puits « contrôles négatifs » sont complétés avec 50 µl de milieu exempt de cellules tumorales. Dans les puits « contrôles positifs » contenant uniquement des cellules CIK, 50 µl de PMA/Ionomycine (eBioscienceTM Cell stimulation Cocktail 500x (ThermoFisher Scientific, Massachusetts, Etats-Unis)) dilués au 1x sont déposés. 50 µl du mélange, anti-CD107α - PerCP-Vio700 GolgiSTOP (Monensin, BD Biosciences, Californie, Etats-Unis) ou isotype – PerCP-Vio700 sont déposés respectivement dans les puits « tests » ou dans les puits « contrôle isotypique ». L’incubation se passe pendant 4 h dans les mêmes conditions que la précédente. La plaque est ensuite centrifugée à 300 g pendant 10 min. Les surnageants sont retirés et 100 µl du mélange contenant le CD3-Vioblue, CD4-PE, CD8-PE, CD56-APC et le Viobility sont déposés dans l’ensemble des puits. L’incubation se fait à +4 °C pendant 10 min, puis la plaque est centrifugée à 300 g pendant 10 min à 4 °C. Les surnageants sont retirés et les culots sont repris dans 200 µl de PBS. La plaque est ensuite placée sur un ChillRack96 et est passée au cytomètre avec un débit médium et une homogénéisation forte pour un volume d’acquisition de 100 µl. Résultats Les cellules NK, NKT, ainsi que les LT ont la capacité de s’activer lors du traitement avec la PMA/Ionomycine et elles présentent un niveau basal d’expression du CD107α sans stimulation (Figure 4A). Il existe une différence de capacité de dégranulation des cellules CIK en fonction de la source de sang, mais également du type d’activation (figure 4B). Les résultats des graphiques sont présentés dans le tableau 1. SC-CIK CD3 SP-CIK CD3 SC-CIK CD3/28 SP-CIK CD3/28 Huh7 18,1 ± 3,5 6,0 ± 1,7 6,8 ± 3,0 1,9 ± 0,1 PLC/PRF/5 20,8 ± 3,6 6,8 ± 1,7 7,8 ± 1,6 1,3 ± 0,2 HepG2 20,9 ± 4,2 7,1 ± 2,5 8,7 ± 3,7 1,3 ± 0,4 Tableau 1. Pourcentage de CD107a parmi l'ensemble des cellules CIK générées à partir de SP ou de SC avec une stimulation CD3 ou CD3/28 contre les lignées cellulaires tumorales de CHC. Les cellules CIK générées à partir de SC avec une stimulation CD3 présentent une meilleure capacité de dégranulation en comparaison des autres protocoles testés. Cette observation est valable pour l’ensemble des 3 lignées cellulaires tumorales testées. La différence d’expression du marqueur à la surface des cellules est statistiquement significative en comparaison avec les SP-CIK CD3 : p Huh7 =0.05 p PLC /PRF/5 =0.02, p HepG2 =0.03. Le même profil statistique se dessine en comparaison avec les SP-CIK CD3/28 : p Huh7 =0.01 p PLC /PRF/5 =0.002, p HepG2 =0.002. Concernant le type cellulaire qui dégranule en majorité parmi les cellules CD107α, les résultats sont hétérogènes entre les différents protocoles de génération de cellules CIK. Indépendamment du type d’activation, il y a une modulation des proportions des sous-types de cellules CIK engagées dans la dégranulation lors de la co-culture entre les cellules CIK et les lignées tumorales. Les SC-CIK engagent plus de NKT parmi les cellules CD107α que les SP-CIK, en réduisant ainsi la part des LT. Concernant les NK, la répartition reste stable. L’expression du CD107α a été déterminée parmi les cellules LT, NK et NKT ( ). Il est ainsi possible de déterminer le pourcentage absolu de LT, NK ou NKT engagé dans la dégranulation, en regardant également les marqueurs CD4 et CD8 pour les populations LT et NKT. Premièrement, il est intéressant de noter que les cellules NK engagent une proportion élevée de leurs évènements totaux, suivi des NKT et enfin des LT, ceci quels que soient les protocoles de générations des cellules CIK. Deuxièmement, quelle que soit la cible, la répartition des LT CD4 ou CD8 et des NKT CD4 ou CD8 suit une tendance commune pour un protocole de génération de cellules CIK donné. Cependant, il existe des différences entre les protocoles en terme de répartition de CD4+CD107a+ et CD8+CD107a+ des LT ou NKT engagés dans la dégranulation. Ainsi, de façon commune à tous les résultats, les NKT engagés dans la dégranulation sont majoritairement CD8+ (>75%), les LT parmi les SP-CIK CD3 le sont également. Cependant pour les LT des autres protocoles de génération de cellules CIK, les LT CD107α sont principalement CD4+ (>75% pour SP-CIK CD3/28, >90% pour les SC-CIK CD3 et CD3/28 ). Les résultats des histogrammes de la ont été compilés dans une représentation en heatmap ( ). Il ressort que les SC-CIK CD3 présentent systématiquement des cellules plus engagées parmi leurs événements totaux. Les conditions avec une stimulation CD3/28 présentent des cellules qui semblent moins réactives que les autres protocoles dans les conditions d’essais. Exemple 4 - Cytotoxicité des cellules CIK vis-à-vis des cellules tumorales Matériel et méthodes Des cellules CIK ont été générées avec une activation CD3 ou CD3/28, en X-Vivo15 500 UI/mL d’IL-2. Les cellules CIK (cellules effectrices ; Effectors [E]) ont été mises en coculture avec des cellules Huh7GFP, PLC/PRF/5GFP et HepG2GFP (cellules cibles ; Target [T]). Les cellules ont été cultivées avec un ratio Effector:Target (E:T) de 0:1, 0.1:1 ; 0.3:1 ;1:1 ; 3:1, 10:1, en sachant que le ratio 1:1 correspond à 4000 cellules : 4000 cellules dans un volume final de X-Vivo 15 500 UI/mL d’IL-2 de 200 µl. Les lignées cellulaires de CHC étant adhérentes, les cellules sont mises en plaque à J-1 dans un volume de 100 µl et placées à l’incubateur sur la nuit pour que les cellules adhèrent correctement. Ensuite, les cellules CIK sont réparties dans la plaque dans un volume de 100 µl en respectant les ratio E:T. Une fois les co-cultures réalisées, la plaque 96 puits est placée dans le lecteur (Incucyte), grossissement x4, 1 scan par heure et par puits pendant 7 jours avec une excitation au laser bleu pulsée de 300 ms. En utilisant le logiciel d’analyse, la surface des objets émettant dans le vert, c’est-à-dire les cellules tumorales, est estimée et une valeur appelée « GFP area Confluence », représentant le pourcentage de l’image occupé par les objets fluorescents verts, est déterminée. Grâce à cette indication et aux puits de référence contenant uniquement les cellules tumorales, les données à J0 sont normalisées, puis l’index de lyse, permettant d’évaluer à chaque temps donné le degré de mort par rapport au control E:T 0:1, est calculé. L’index de lyse est calculé de la façon suivante : L’index de lyse permet d’observer l’évolution de l’ensemble de la cinétique pour une lignée donnée et d’ensuite calculer l’index de lyse. Le « % de lyse » pour les différentes modalités d’activation de cellules CIK et pour les 5 ratios E:T est calculé de la façon suivante : Il est calculé pour deux paramètres : l’ « Optimal Cytotoxic Capacity », c’est-à-dire le temps de la cinétique qui présente le taux de mortalité le plus élevé, ainsi que la « Cytotoxic Capacity D7 », c’est-à-dire la cytotoxicité relevée en fin d’expérimentation. Grâce au % de lyse, la concentration efficace médiane (EC50), correspondant au rapport E:C induisant une réponse cytotoxique médiane de 50% entre le point 0 et le plus haut ratio E:C, peut être calculée. L’équation utilisée est la suivante : Y : la valeur que l‘on souhaite observer, ici 50% X : la valeur en abscisse permettant d’intercepter la courbe au même niveau que Y Base : la valeur la plus basse de la série de donnée Sommet : la valeur la plus haute de la série de donnée Coefficient de Hill : la valeur de la pente de l’équation la plus haute atteinte. Le logiciel utilisé est Quest Graph™ EC50 Calculator" AAT Bioquest. Résultats En utilisant une technologie de microscopie à épifluorescence en temps réel, des cellules cibles (Huh7, PLC/PRF/5 et HepG2) ont été mises en co-culture avec des cellules effectrices SP-CIK CD3 ou CD3/28, ou avec les cellules mononucléées autologues non-stimulées. Les cellules tumorales ont été modifiées génétiquement afin d’exprimer de façon constitutives la GFP pour pouvoir suivre leur croissance par imagerie. Les cellules tumorales exprimant la GFP ont une capacité de prolifération pouvant être mesurée par la technologie utilisée (Figure 7A). Ainsi, lors d’une co-culture avec des cellules effectrices, ici des cellules CIK, l’action cytotoxique des cellules effectrices est quantifiée par la disparition du signal GFP. Une dose réponse entre les cellules effectrices générées à partir de SP et avec des stimulations CD3 et CD3/CD28 et les cellules cibles a été réalisée pour déterminer dans quelle mesure les cellules CIK sont efficaces. En calculant l’index de lyse (Figure 7B), il ressort que l’action cytotoxique est proportionnelle au ratio E:C et que ce dernier n’est pas constant au cours du temps et varie en fonction du type cellulaire. En effet, pour les cellules Huh7 GFP , il apparaît qu’il y a un échappement au traitement au niveau des faibles ratio E:C qui se modélise par l’apparition d’une diminution de l’index de lyse après avoir atteint le plateau. De plus, la modélisation de l’index de lyse est impactée par la nature intrinsèque du type de cellule mis en culture, comme par exemple avec les HepG2 GFP . En effet, ces dernières ont une croissance en amas et non en tapis cellulaire, ainsi les courbes sont différentes de celles générées avec les Huh7 GFP . Les cellules PLC/PRF/5 GFP présentent une croissance en tapis comme les cellules Huh7 GFP (les données ne sont pas montrées). Du fait que les courbes ne soient pas linéaires, deux paramètres d’action cytotoxique ont pu être déterminés (Figure 7C), la cytotoxicité optimale, qui correspond au point le plus élevé de la courbe, et la cytotoxicité finale à J7, qui correspond simplement au dernier point de la courbe. Enfin, la sensibilité des 3 lignées à la lyse par cellules CIK (Figure 7D) générées par une stimulation CD3 ou CD3/28 a été comparée. D’après les courbes obtenues, les EC50 (qui reflète le ratio E :C qui induira 50% d’une réponse cytotoxique) ont été calculées afin d’évaluer la capacité cytotoxique des cellules SP-CIK CD3 et CD3-28 contre les Huh7 (Figure 8A), PLC/PRF/5 (Figure 8B) et les HepG2 (Figure 8C). La stimulation par le CD3 génère les cellules CIK les plus efficaces comparées à la stimulation CD3/28 (p Huh7 PLC /PRF/5 =0.04 ; p HepG2 =0.73) et également comparéés au CMN non-activées (p Huh7 PLC /PRF/5 =0.02 ; p HepG2 =0.40). Afin de tester dans un modèle plus pertinent la cytotoxicité des cellules CIK in vitro , un modèle d’étude de la cytotoxicité des cellules CIK à l’encontre de sphéroïdes de Huh7 GFP , PLC/PRF/5 GFP et HepG2 GFP a été généré. Le développement de sphéroïdes Huh7 GFP a été déterminé sur la période fixée de 10 jours (Figure 9A). Nous pouvons voir que les sphéroïdes grandissent au cours du temps dans leur condition NT (non traité) mais qu’ils subissent une dégradation lors de la co-culture avec les SP-CIK CD3 ou les SC-CIK CD3. Dans ce cas-ci, l’exemple est donné pour le ratio E:C à 3:1. Grâce aux données de microscopie, des courbes de survies des sphéroïdes traités ont été établies afin d’évaluer quelle condition de traitement permet d’éradiquer totalement les sphéroïdes au cours du temps (Figure 9B). Ces données permettent d’établir les histogrammes (Figure 9C) permettant de comparer, en fonction de la dose réponse et du type de cellules CIK, les temps d’éradication des différents sphéroïdes. Les SC-CIK CD3 éradiquent les sphéroïdes provenant des 3 lignées cellulaires tumorales testées en 2.29 ± 0.07 j à 9.2 ± 0.3 j pour les sphéroïdes Huh7 GFP , 2.29 ± 0.02 j à 8.24 ± 0.45 j pour les sphéroïdes PLC/PRF/5 GFP et de 1.00 ± 0.02 j à 2.5 ± 0.03 j pour les sphéroïdes HepG2 GFP . Concernant les SP-CIK CD3, il n’est pas obtenu d’éradication totale des sphéroïdes pour les E:C à 1:1 pour les lignées Huh7 GFP et PLC/PRF/5 GFP et les temps d’éradications varient de 3.11 ± 0.02 j à 6.25 ± 0.69 j pour les sphéroïdes Huh7 GFP , 3.47 ± 0.21 j à 6.50 ± 0.43 j pour les sphéroïdes PLC/PRF/5 GFP et de 1.25 ± 0.04 j à 2.72 ± 0.47j pour les sphéroïdes HepG2 GFP . De ce fait, pour les ratio E:C 1:1 les cellules SC-CIK sont les plus efficaces car elles permettent d’éradiquer totalement les sphéroïdes des différentes lignées cellulaires tumorales, à ratio 3:1 et 10:1, les SC-CIK CD3 éradiquent totalement les sphéroïdes de façon plus rapide que les SP-CIK CD3 (résultats statistiquement significatifs comme présentés sur les graphiques), exception faite des sphéroïdes HepG2 GFP qui présentent une sensibilité forte à l’encontre des traitements par SP-CIK et SC-CIK CD3. Ensuite, les aires sous la courbe (AUC) des résultats de microscopie ont été calculées (Figure 9D) afin de pouvoir intégrer la cinétique totale d’évolution de la fluorescence pour un ratio E:C donné et pour un produit donné. Des différences significatives de cytotoxicité pour les ratio 1:1, 3:1 et 10:1 sont observées au niveau des sphéroïdes Huh7 GFP et PLC/PRF/5 GFP entre les SP-CIK et les SC-CIK CD3, tandis que la différence n’est pas significative à l’encontre des sphéroïdes HepG2 GFP . Grâce aux AUC, l’efficacité anti-tumorale intégrée a été calculée afin d’établir les EC50 pour évaluer quel produit est le plus efficace à l’encontre des modèles 3D de sphéroïdes tumoraux ( ).Vis-à-vis des sphéroïdes Huh7, l'EC50 des SP-CIK CD3 est statistiquement plus élevé (p De même, vis-à-vis des sphéroïdes PLC/PRF/5, l'EC50 des SP-CIK CD3 est statistiquement plus élevé (p=0.003) que celui des SC-CIK CD3 (1.86 ± 0.16 et 1.08 ± 0.03 respectivement). Par contre, vis-à-vis des sphéroïdes HepG2, l'EC50 des SP-CIK CD3 n’est pas statistiquement plus élevé (p=0.44) que celui des SC-CIK CD3 (0.69 ± 0.32 et 0.422 ± 0.09 respectivement). Exemple 5 - Innocuité des cellules CIK vis-à-vis des cellules saines Matériel et méthodes L’isolement des cellules souches hématopoïétiques (CSH) est réalisé par un tri-immunomagnétique positif avec le kit « CD34 MicroBead Kit UltraPure, human » (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne). Après isolement sur gradient de densité, les CMN provenant du sang de cordon sont concentrées dans du PBS et sont i) immuno-saturées avec du FcR blocking (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne) et ii) immuno-marquées avec les CD34 MicroBeads. Pour les deux réactifs, 1 μL de réactif est ajouté pour 1x10 6 CMN. L’incubation a lieu à +4°C pendant 30 min, les cellules sont lavées dans du PBS et le tri cellulaire se déroule sur l’AutoMACSpro Separator (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne) programmé sur « Posseld2 », favorisant la pureté au rendement. Les cellules sont ensuite analysées en CMF afin de vérifier la pureté, puis congelées et cryoconservées en azote liquide. Afin d’évaluer la toxicité du produit d’immunothérapie cellulaire, une co-culture des cellules CIK a été réalisée avec des cellules souches hématopoïétiques (CSH) CD34+. Les cellules ont été placées dans un contexte allogénique avec une divergence de l’expression du HLA-A2. Ainsi, des cellules CIK HLA-A2+ ont été générées et testées contre des CSH HLA-A2-. Pour se faire, une dose réponse E(CIK):C(CSH) est réalisée avec comme ratio 0:1, 1:1, 3:1 et 10:1 avec comme temps de co-culture 0h, 5h, 24h et 48h. Pour procéder à l’évaluation de la viabilité des cellules cibles, les cellules ont été immunomarquées avec un anticorps anti HLA-A2-APC (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne) avec un co-marquage au Viobility (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne). Ainsi, les cellules HLA-A2- ont pu être fenêtrées et les pourcentages de viabilité des CSH ont été déterminés. Le test se déroule en plaque 96 puits à fonds ronds (SPL, Gyeonggi-do, Korea) placée sur un ChillRack96 (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne) permettant le maintien des cellules à +4°C et l’acquisition se déroule sur le MACSQuantX (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Allemagne). Résultats Pour évaluer l’innocuité des cellules SC-CIK CD3 envers des cellules saines, des cellules primaires CD34+ isolées à partir de sang de cordon, qui sont des CSH, ont été co-cultivées avec des SC-CIK CD3. Les cellules sont placées dans un contexte allogénique avec une différence d’expression du HLA-A2 afin de pouvoir identifier les cellules en cytométrie en flux (CMF) et ainsi évaluer la viabilité des CSH. Les cellules SC-CIK CD3 ainsi que les CSH peuvent être discriminées en CMF sur la base de l’expression du HLA-A2. En effet, les CSH présentent une RFI HLA-A2 APC =22.36 ± 0.031 tandis que les SC-CIK CD3 présentent une RFI HLA-A2 APC =59.54 ± 2.48, ce qui se retrouve dans les immunomarquages séparés (Figure 11A), mais également lors des co-cultures des deux types cellulaires (Figure 11B). L’apparition de la mortalité cellulaire au niveau des cellules HLA-A2- est suivie par un marquage au Viobility-FITC au cours du temps (Figure 11C). Ainsi, il est possible d’évaluer le pourcentage de cellules vivantes dans l’ensemble des conditions de culture afin de pouvoir établir le % de lyse des CSH (Figure 11D). Le % de lyse des SC-CIK CD3 à l’encontre des CSH varie en fonction du ratio E:C. Les résultats sont compilés dans le tableau 2 ci-dessous. Ratio E:C % de lyse (Moyenne ± ESM) 0h 5h 24h 48h 0:1 / / / / 1:1 0.2 ± 1.4 0.37 ± 0.42 0.94 ± 0.78 1.14 ± 0.51 3:1 0.76 ± 0.66 0.59 ± 0.33 1.25 ± 0.72 1.89 ± 0.82 10:1 1.14 ± 1.65 0.75 ± 0.37 2.08 ± 0.41 3.32 ± 0.82 Tableau 2. % de lyse moyen des CB-CIK à l'encontre des CSH en fonction du ratio E:C et du temps (N=3). Grâce à ses données, l’EC50 des cellules CB-CIK CD3 à l’encontre des CSH a été calculé à 83.36 ± 11.99 ( ). Exemple 6 - Efficacité de transduction des différentes populations CIK Matériel et méthodes A J+3 post-activation, les cellules CIK sont transduites avec le retrovirus SFG.iCasp9.2A.ΔCD19 ( ). Les cellules ont été transduites avec une MOI (Multiplicity Of Infection) croissante. La MOI est le ratio entre le nombre de particules virales présentes dans le milieu et le nombre de cellules à transduire. Ainsi, des MOI de 0, 1, 10 et 100 ont été réalisées avec le surnageant clinique fourni. Le surnageant a été titré en transduisant la lignée HT1080 et le titre est calculé de la façon suivante : Titre=(Nombre de cellules initiales × % de cellules modifiées génétiquement)/(Facteur de dilution) Un titre moyen correspondant à un nombre de particules virales (pv) par volume de milieu de 1.4x106 pv/mL est obtenu en faisant la moyenne des titres. Pour réaliser la génération de cellules CIK intégrant le gène suicide, les CMN de façon classique ont été activées dans du X-Vivo 15, 500 UI/mL d’IL-2 et 10 ng/mL d’OKT3 pendant 3 jours. Au bout des 3 jours, la concentration cellulaire est déterminée par exclusion au bleu de trypan et divisée en 4 v/v, puis dans une plaque 6 puits les 4 MOI sont réalisées en complétant les volume à 10mL de milieu. 2 à 3 fois par semaine les cultures sont entretenues et une CMF avec le Viobility, CD3, CD56 et CD19 est réalisée au bout de 14j afin de déterminer les proportions de LT CD19+, NK CD19+ et NKT CD19+ correspondant aux cellules ayant intégré le gène suicide. Résultats La capacité de transduction des SC-CIK CD3 a également été évaluée afin d’y introduire un gène suicide. Le produit d’immunothérapie envisagé étant composé de 3 types cellulaires, il est utile de connaître la capacité des différentes populations à être génétiquement modifiées. Ainsi, des transductions avec le vecteur rétroviral iCasp9 ΔCD19 ont été réalisées en effectuant des MOI croissantes. Le ΔCD19 permet de suivre les cellules génétiquement modifiées en CMF. Les données de CMF ( ) montrent qu’il y a un effet dose sur la proportion de cellules lymphocytaires transduites par le vecteur rétroviral. Cet effet dose, représenté par une MOI croissante de allant de 0, 1, 10 et 100 se traduit par une transduction, des LT de 0.67% ± 0.33%, 5.67% ± 1.2% et 8.33% ± 1.45% respectivement, des NK de 1.0% ± 0.2%, 5.42% ± 0.31% et 7.67 ± 0.89 respectivement et des NKT de 0.52% ± 0.30%, 3.67% ± 0.88% et 8.11% ± 0.88% respectivement. Cet effet dose est statistiquement significatif (p Après 3 jours d’activation, les cellules ont été centrifugées, puis placées dans le milieu de culture contenant les particules rétrovirales et les effets sur la culture ont été comparés en présence ou non de particules virales ( ). Il ressort que 11 jours après infection (14 jours de culture au total), la croissance cumulée relative, en fin de culture, des différentes conditions de MOI est respectivement de 36.50 ± 3.80, 46.29 ± 3.68, 48.49 ± 4.21, 43.17 ± 8.29 et les viabilités sont de 82.33% ± 4.09%, 86.33% ± 3.66%, 88.00% ± 3.61% et 83.33% ± 2.67% et ne présente pas de différence statistiquement significative entre les différentes MOI. Procédé de production de cellules CIK (Cytokine-Induced Killer) comprenant : (i) une étape de culture de cellules mononucléées extraites de sang placentaire dans un milieu de culture comprenant au moins un anticorps CD3 et de l’interleukine 2, ledit milieu de culture étant dépourvu d’interféron gamma, (ii) une étape de récupération des cellules obtenues. Procédé de production de cellules CIK selon la revendication 1, comprenant : (iii) une étape de tri des cellules obtenues. Cellules CIK obtenues par le procédé tel que défini selon la revendication 1 ou 2. Cellules CIK selon la revendication 3, les cellules CIK étant modifiées génétiquement pour exprimer un gène suicide. Composition comprenant des cellules CIK telles que définies selon les revendications 3 ou 4. Composition comprenant des cellules CIK telles que définies selon les revendications 3 ou 4, pour son utilisation en tant que médicament. Composition comprenant des cellules CIK telles que définies selon les revendications 3 ou 4, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention du cancer. Composition pour son utilisation selon la revendication 7, le dit cancer étant le carcinome hépatocellulaire. Composition pour son utilisation selon les revendications 7 ou 8, ledit traitement étant un traitement allogénique. Kit pour le traitement d’un cancer comprenant les cellules telles que définies selon les revendications 3 ou 4 ou une composition telle que définie selon la revendication 5.