FR 3142489 A1 20240531 FR 2304690 A 20230511 PROCESSUS DE RÉCUPÉRATION DE MICROALGUES UTILISANT DES NANOPARTICULES MAGNÉTIQUES D’ORIGINE BACTÉRIENNE L’invention fait partie des procédés de séparation des microorganismes de leurs milieux de culture et vise à résoudre la faible efficacité et l’impact environnemental élevé des processus de récupération de microalgues produisant de l’huile. Dans ce but, l’invention concerne l’application de nanoparticules magnétiques d’origine bactérienne (NMOB) dans des processus d’isolement de microalgues à partir d’une culture de cellules ou d’une suspension d’eau salée, d’eau douce ou d’un effluent. Les NMOB sont notamment susceptibles de récupérer des microalgues à partir de suspensions hypersalines, favorisant l’utilisation des microalgues marines dans la production d’huiles avec une application potentielle dans les processus de production de bio-huiles et de biocarburants. En plus de l’utilisation des NMOB, l’invention concerne également un processus de récupération de microalgues en fonction de l’ajout de NMOB à la suspension de microalgues et l’application ultérieure d’une force magnétique externe. La présente invention permet de récupérer environ 80 % des microalgues dans une suspension et reste fonctionnelle dans un milieu hypersalin, lorsque d’autres nanoparticules magnétiques et floculants chimiques perdent leur fonction. PROCESSUS DE RÉCUPÉRATION DE MICROALGUES UTILISANT DES NANOPARTICULES MAGNÉTIQUES D’ORIGINE BACTÉRIENNE Domaine de l’invention L’invention se rapporte des procédés de séparation des microorganismes de leurs milieux de culture et s’applique particulièrement à la concentration et la purification des microalgues. Le procédé décrit vise à fournir un moyen plus rentable d’alimenter une biomasse de microalgues oléagineuses pour des processus de production de biocarburants. Etat de l’art de l’invention Au cours des dernières années, une plus grande importance a été accordée aux microalgues du fait de leur utilisation possible en guise de substitut durable de dérivés d’huile et de produits carburants. La technologie de production de biocarburants avancés et d’autres bioproduits à partir de microalgues s’inscrit dans le contexte de la transition vers une économie sobre en carbone, déjà choisie en guise de stratégie nationale par des pays fortement développés tels que la Suède et la Suisse. Néanmoins, l’un des plus grands défis concernant l’utilisation de biomasse de microalgues en guise de produit de départ pour les biocarburants et d’autres applications biotechnologiques est de trouver un moyen économique et efficace de séparer la biomasse de microalgues et de l’utiliser dans des applications commerciales. Afin d’utiliser la biomasse, dans un premier temps, elle doit être extraite du milieu de culture liquide et concentrée pour que son traitement soit efficace. Selon la littérature, la concentration de biomasse peut contribuer pour 20 à 30 % aux coûts totaux d’un processus de production de biocarburant, le temps total de séparation étant l’un des principaux facteurs responsables du coût élevé des techniques classiques, telles que la centrifugation, la filtration et la floculation. De plus, le coût de récupération élevé est associé à la petite taille des cellules et aux faibles concentrations de biomasse qui ne permettent pas d’utiliser les procédés de séparation classiques, tels que la filtration et la centrifugation, étant donné que pour de telles conditions, de grandes quantités d’énergie sont nécessaires. L’expansion de la production de microalgues pour obtenir des bioproduits dépend d’une série de facteurs qui peuvent rendre réalisables les processus impliqués dans l’obtention de biomasse (« en amont ») et de son raffinage (« en aval »). L’un des aspects critiques pour atteindre l’économicité est l’étape de recueil (séparation). Dans la recherche d’un moyen plus économique et efficace de recueillir la biomasse de microalgues produite, il est nécessaire de trouver un processus de faible énergie et de temps total réduit. La sédimentation, même après floculation, est relativement lente, ce qui entraîne de délais de traitement longs. Par ailleurs, la plupart des floculants polymères ont encore un prix relativement élevé et une efficacité limitée pour éliminer les solides en suspension. Par conséquent, l’utilisation de nanoparticules magnétiques a commencé à être explorée en guide d’alternative ou complément à l’utilisation d’agents coagulants et floculants classiques. Les principaux avantages des nanoparticules magnétiques sont la grande superficie des matériaux nanométriques, qui conduisent à une plus grande efficacité d’élimination, la séparation rapide des solides adsorbés par le biais de l’application d’un champ magnétique et une réutilisation, facilitée par la récupération magnétique de l’agent floculant. Néanmoins, les coûts élevés des processus chimiques de production de nanoparticules magnétiques synthétiques et les impacts environnementaux - principalement liés à l’enrobage des nanoparticules - sont les principales limites à leur utilisation dans l’élimination des solides en suspension. Par exemple, Zhu et al. (2017) décrivent un procédé de récupération de microalgues en utilisant des nanoparticules magnétiques d’oxyde de fer (Fe 3 O 4 ) ou d’oxyde de fer et d’yttrium (Y 3 Fe 5 O 12 ) non revêtue. Bien que les nanoparticules de Zhu et al. favorisent la récupération de microalgues, l’utilisation de telles formes non revêtues n’est pas durable. On sait que les nanoparticules synthétiques ont une durée de vie plus courte du fait de l’absence d’enrobage (Klektoka et al. , 2021). Ajouté à cela, du fait de la dégradation naturelle de ces nanoparticules, il y a une libération élevée de cations de fer di- et trivalents. Les nanoparticules magnétiques synthétiques sont cristallographiquement imparfaites avec une forme et des faces mal définies, ce qui facilite leur oxydation, une perte de propriété magnétique et une dissolution du nanocristal. Plusieurs auteurs soulignent la dégradation/dissolution des nanoparticules de magnétite dans des solutions avec un pH acide en gui de condition nécessaire pour la séparation de cellules (Ike et Duke, 2018). Une telle libération brutale de fer entraîne des effets toxiques sur les cellules cibles, qui peut nuire aux applications en aval pendant le traitement qui nécessitent une cellule viable ou sans extravasation du contenu cytoplasmique (Lei et al. , 2016). Par ailleurs, l’augmentation du fer dans les cuves de production de microalgues tend à provoquer une augmentation de la communauté bactérienne, y compris les agents pathogènes, et les relations de compétition, ce qui serait un problème supplémentaire à l’échelle industrielle en réduisant la productivité (Fuentes et al. ., 2016 ; Xiao et al. , 2021). A son tour, le document KR20140133311 divulgue un procédé de récupération de microalgues en utilisant des nanoparticules magnétiques revêtues de chitosane. Le revêtement avec le polysaccharide permet soi-disant la préservation de la nanoparticule et sa réutilisation dans des procédures répétées. Néanmoins, l’enrobage des nanoparticules avec du chitosane utilise du Pluronic F-127 - un copolymère tensioactif hydrophile non ionique. Il s’agit d’un composé avec une toxicité connue pour plusieurs organismes marins (Hering et al. , 2020 ; Rahdar et al. , 2020). Le processus de revêtement de nanoparticules magnétiques avec du chitosane utilise également du tripolyphosphate de sodium (STPP), un polluant aquatique qui n’est pas éliminé par les stations de traitement des eaux et qui va agir sur l’eutrophisation des écosystèmes d’eau douce (Lu et al. , 2014). Par ailleurs, le chitosane est un polysaccharide cationique produit à partir de la désacétylation de chitine, un polysaccharide présent dans l’exosquelette des arthropodes et dans la paroi cellulaire de champignons. Bien qu’il s’agisse d’un revêtement naturel, c’est-à-dire, avec un faible impact environnemental, sa production est coûteuse et, par conséquent, a un impact délétère sur la viabilité économique des processus de recueil de microalgues qui utilisent ce type de nanoparticules. La limitation des floculants déjà décrite à favoriser le recueil de microalgues marines dans les milieux de salinité élevée (Vandamme et al. , 2010 ; Roselette et al. , 2017) évalue les enjeux de durabilité et de viabilité économique. Dans ces cas, la perte d’efficacité du floculant ou l’augmentation excessive de sa concentration est décrite (Lam et al. , 2015), de sorte qu’il y a un effet de floculation de la microalgue. Avec la nécessité d’optimiser le processus de concentration des cellules pour leur récupération, visant à réduire le coût et la durabilité des bioproduits dérivés (par ex. biocarburants, biofertilisants ou biostimulants), l’utilisation de nanoparticules magnétiques d’origine biologique (NMOB) a été proposée. La présente invention décrit l’utilisation de nanoparticules magnétiques d’origine biologique (NMOB), qui ont déjà un revêtement naturel, ce qui réduit considérablement le coût de production, en plus d’être un processus vert sans génération de déchets toxiques. L’utilisation de NMOB a favorisé la concentration et la récupération des cellules cibles en quelques secondes dans les expériences à la paillasse, ce qui indique un grand potentiel pour résoudre le problème technique rapporté. Les NMOB sont présentées, par conséquent, en guise d’outil innovant, puisqu’elles ont déjà naturellement une membrane biologique, qui peut agir dans l’interaction la plus efficace entre la nanoparticule et l’huile, en plus d’avoir des propriétés chimiques et physiques qui les rendent très stables. De plus, elles sont produites par la croissance de bactéries dans des fermenteurs, qui sont des processus durables et peu coûteux par comparaison avec des nanoparticules magnétiques synthétiques avec des propriétés similaires. L’invention utilise des nanoparticules magnétiques d’origine bactérienne pour améliorer la récupération de microalgues à partir d’une suspension, que ce soit une culture de cellules, une suspension d’eau salée, une suspension d’eau douce ou un effluent. Dans un mode de réalisation, l’invention concerne l’utilisation de nanoparticules magnétiques d’origine bactérienne (NMOB) pour récupérer des microalgues présentes dans une suspension. Dans un mode de réalisation préféré, l’utilisation de NMOB concernée par l’invention est pour la récupération de microalgues à partir d’une suspension de concentration saline égale à ou supérieure à 5 g/ml. Selon l’invention, les microalgues peuvent être choisies parmi Chlorella sp ., Crypthecodinium sp ., Cylindrotheca sp ., Desmodesmus sp ., Dunaliella sp ., Isochrysis sp ., Monoraphidium sp ., Nannochloris sp ., Nannochloropsis , Neochloris sp ., Nitzschia sp ., Phaeodactylum sp ., Porphyridium sp ., Scenedesmus sp ., Schizochytrium sp ., Tetraselmis sp . ou un quelconque autre genre connu pour être utile pour la production de bio-huiles. Dans un autre mode de réalisation, l’invention concerne un processus de récupération de microalgues dans une suspension en utilisant des NMOB en guise d’agent floculant. Le processus de l’invention comprend la protonation de la surface cellulaire des microalgues, l’ajout de nanoparticules magnétiques d’origine bactérienne à la suspension et l’application d’une charge magnétique externe, favorisant ainsi la floculation des microalgues. Sous un aspect, le processus de l’invention prévoit que la suspension de microalgues est choisie parmi : une culture de microalgues, une source d’eau salée, une source d’eau douce ou un effluent. Sous un autre aspect, le processus de l’invention prévoit que la suspension a une concentration en sel égale à ou supérieure à 5 g/ml. En outre, sous un aspect supplémentaire, ledit processus prévoit que la surface cellulaire des microalgues est protonée en ajoutant un tampon acide à la suspension. Sous un autre aspect, le processus comprend l’ajout de NMOB à la suspension de microalgues à une concentration comprise entre 50 et 100 μg/ml. Enfin, selon le processus de l’invention, les microalgues peuvent être choisies parmi Chlorella sp., Crypthecodinium sp., Cylindrotheca sp., Desmodesmus sp., Dunaliella sp., Isochrysis sp., Monoraphidium sp., Nannochloris sp., Nannochloropsis , Neochloris sp., Nitzschia sp., Phaeodactylum sp., Porphyridium sp., Scenedesmus sp., Schizochytrium sp., Tetraselmis sp. ou un quelconque autre genre connu pour être utile pour la production de bio-huiles. Brève description des figures illustre les NMOB octaédriques produites par souche IT-1 de Mf . australis (A) et les NMOB prismatiques produites par la souche MV-1 T de Mv. blakemorei (B). résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Scenedesmus sp. en utilisant des NMOB octaédriques et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Desmodesmus sp. en utilisant des NMOB octaédriques et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Monoraphidium sp. en utilisant des NMOB octaédriques et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Nannochloropsis sp. en utilisant des NMOB octaédriques et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Dunaliella sp. en utilisant des NMOB octaédriques et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. présente des images obtenues par des vidéos de culture de Desmodesmus sp. contenant ou pas des NMOB octaédriques avant application du champ magnétique (A) et après application du champ magnétique pendant 20 secondes (B). Noter la clarification du surnageant du tube contenant la culture de cellules et les NMOB dans (B) après application du champ magnétique par comparaison avec le contrôle (culture sans ajout de NMOB). Dans (B), il est possible d’observer l’accumulation de cellules sur la paroi du tube à côté de l’aimant dans le tube contenant la culture et les NMOB. Le même résultat a été observé pour les autres cultures évaluées, à l’exception de Monoraphidium sp. présente des photomicrographies dérivées de la microscopie à contraste interférentiel différentiel de cultures de Desmodesmus sp. soumises à différentes conditions de pH et à des NMOB octaédriques (A à D). Les conditions de contrôle (pas d’ajout de NMOB) sont représentées (E à H). présente des photomicrographies dérivées de la microscopie à contraste interférentiel différentiel de cultures de Scenedesmus sp. soumises à différentes conditions de pH et à des NMOB octaédriques (A à D). Les conditions de contrôle (pas d’ajout de NMOB) sont tracées (E à H). présente des photomicrographies dérivées de la microscopie à contraste interférentiel différentiel de cultures de Monoraphidium sp. soumises à différentes conditions de pH et à des NMOB octaédriques (A à D). Les conditions de contrôle (pas d’ajout de NMOB) sont représentées (E à H). résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Scenedesmus sp. en utilisant des NMOB prismatiques et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Scenedesmus sp. en utilisant des NMOB prismatiques et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Scenedesmus sp. en utilisant des NPS et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Desmodesmus sp. en utilisant des NPS et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Nannochloropsis sp. en utilisant des NPS et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Monoraphidium sp. en utilisant des NPS et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. résulte de l’évaluation de la concentration magnétique de Dunaliella sp. en utilisant des NPS et en appliquant un champ magnétique externe. (A) Cellules dans le surnageant après récupération magnétique. (B) Taux de récupération de cellules en fonction du pH. illustre le comportement d’une culture de Scenedesmus sp., contenant ou pas des NPS, avant application du champ magnétique (A) et après avoir application du champ magnétique pendant 20 secondes (B). Il convient de noter qu’il n’y a pas de clarification du surnageant provenant du tube contenant la culture de cellules et les NPS dans (B) après application du champ magnétique par comparaison avec le contrôle. Le même résultat a été observé pour les autres cultures évaluées. illustre le comportement des NPS de magnétite. (A) Nanoparticules synthétiques obtenues par coprécipitation et utilisées dans les essais de recueil magnétique pour comparaison avec l’efficacité des NMOB. (B) Nanoparticules de magnétite synthétique similaires à celles utilisées dans la référence D1 (Leon-Reyes et al. , 2014). démontre le taux de récupération de microalgues du genre Nannochloropsis . A. Taux de récupération statistiquement significatif de 23,01 ± 4,94 % et (***) 17,31 ± 3,27 % (**) dans un tampon citrate avec un pH 3,1 et 6,4, respectivement. B. Taux de récupération statistiquement significatif dans un tampon citrate de pH 3,1 uniquement (**). C. Il n’y a pas eu de récupération statistiquement significative lors de l’utilisation du floculant (4,30 ± 1,81 %) dans les conditions de culture avec un pH 8,0. montre la surface de réponse du taux de récupération de Nannochloropsis sp. en utilisant des NMOB faisant varier les conditions de pH et la concentration en NaCl. A., B. et C. Surface de réponse projetée en trois dimensions avec des valeurs de pH fixées aux niveaux -1, 0 et 1 correspondant à des valeurs de pH de 3,1, 4,8 et 6,4, respectivement. Les valeurs de concentration en NaCl ont été fixées aux niveaux -1, 0 et 1, qui correspondent à 0, 20 et 40 g/l, respectivement. D. Projection bidimensionnelle de la surface de réponse. Sont montrés le point optimal (pointe de flèche orange), le point d’acidification de la condition de culture avec 40 g de NaCl/l (pointe de flèche rouge) et le point d’acidification dans la condition centrale de concentration en NaCl (20 g/l ; pointe de flèche bleue). illustre le recueil et la séparation magnétique des microalgues du genre Nannochloropsis . Essais réalisés avec des cellules resuspendues dans du tampon citrate avec un pH fixé à 3,1 et des variations de la condition de salinité. Le champ magnétique a été généré en positionnant un aimant de néodyme-bore sur le côté du tube. A., B. et C. Essais sur Nannochloropsis sp. après la concentration magnétique de la biomasse sur la paroi du tube à côté de l’aimant. Il a été possible d’observer une réponse au champ magnétique généré dans les conditions de 0, 20 et 40 g/l. Dans chaque image, le tube témoin avec l’espèce de microalgues sans l’ajout de NMOB est positionné sur la gauche, et la condition de traitement avec l’ajout de NMOB est positionnée sur la droite. Description détaillée de l’invention Sauf indication contraire, les termes utilisés sur l’ensemble de cette spécification ont leur signification courante dans la technique, dans le contexte de la divulgation et le contexte spécifique dans lequel chaque terme est utilisé. Certains termes qui sont utilisés pour décrire la divulgation sont discutés ci-dessous, ou ailleurs dans la spécification, pour fournir des conseils supplémentaires au praticien en ce qui concerne la description de la divulgation. Les publications citées ici et le matériel auquel elles sont citées sont spécifiquement incorporés à titre de référence dans leur intégralité. On aura à l’esprit que la même chose peut être dite de différentes manières. En conséquence, un langage alternatif et des synonymes peuvent être utilisés pour un ou plusieurs des termes discutés ici. Aucune signification particulière ne doit être accordée au fait qu’un terme soit élaboré ou abordé ici. Des synonymes pour certains termes sont fournis, mais l’exemplification de certains synonymes n’exclut pas l’utilisation potentielle d’autres qui peuvent ne pas être répertoriés ici. Tel qu’utilisé dans cette description, le terme nanoparticule désigne des structures ou des particules de matière ayant une taille d’échelle nanométrique (nm). Par conséquent, dans le contexte de l’invention, une nanoparticule a généralement une taille de particule moyenne inférieure à 1000 nm, par exemple d’environ 1 nm, d’environ 10 nm, d’environ 100 nm, d’environ 250 nm, d’environ 500 nm, ou de 500 à 999 nm. L’expression « nanoparticule magnétique », dans le contexte de cette invention, désigne une nanoparticule ayant des propriétés magnétiques. Les « nanoparticules magnétiques » peuvent être composées de métaux, d’alliages métalliques, de sulfures et/ou d’oxydes métalliques d’un ou plusieurs éléments métalliques, tels que, par exemple, le fer, le nickel, le cobalt, le manganèse, le bismuth, le zinc, le gadolinium, le strontium, le cuivre, l’argent, l’or, le zinc, le cadmium, l’argent, l’aluminium ou d’autres reconnus par la personne compétente dans la technique. Une nanoparticule magnétique d’origine biologique, également dénommée NMOB sur l’ensemble de cette description, concerne la structure formée par l’isolement des magnétosomes, une organelle présente dans les bactéries magnétotactiques. Ces magnétosomes sont des chaînes de granules d’oxydes ou de sulfures métalliques, généralement de taille uniforme, profilées dans le cytoplasme des bactéries magnétotactiques. La plupart du temps, ils sont composés d’oxyde de fer (Fe 3 O 4 ), connu sous le nom de magnétite, ou de sulfure de fer (Fe 3 S 4 ), connu sous le nom de greigite). Ce sont les magnétosomes qui fournissent aux bactéries magnétotactiques la capacité de se déplacer en réponse aux champs magnétiques. Plusieurs types de bactéries, y compris les coques, les bacilles, les vibrions et les spirilles ont la capacité d’effectuer la biominéralisation - un processus par lequel les minéraux qui composent les magnétosomes sont formés. Dans la nature, les magnétosomes peuvent varier en taille de 35 à 250 nm et peuvent prendre différentes formes, telles que, par exemple, cube-octaédrique, prismatique ou parallélépipédique. L’un des principaux avantages des magnétosomes pour les processus de récupération de microalgues est la membrane phospholipidique qui les entoure naturellement, fournissant aux magnétosomes naturels une compatibilité avec les systèmes biologiques. En général, l’enveloppe des magnétosomes est composée de 98 % de lipides et de 2 % d’autres composants, y compris des protéines. La plupart des lipides, en particulier les phospholipides (Yoshino et al. , 2008). Les magnétosomes peuvent être obtenus à partir de cellules de type sauvage ainsi que de cellules génétiquement modifiées pour les produire artificiellement et/ou pour synthétiser des magnétosomes avec des fonctionnalités introduites artificiellement (par exemple, des molécules de vectorisation telles que, par exemple, des anticorps). Par exemple, le document US6251365B1 enseigne l’isolement des magnétosomes à partir de la bactérie Magnétospirille gryphiswaldense . Yoshino et al. (2008) enseignent à leur tour qu’une bactérie Magnétospirille magnétisme de la souche AMB-1 peut être manipulée génétiquement pour exprimer des protéines chimériques contenant un domaine de protéine A dans la membrane du magnétosome, améliorant leur utilisation pour la récupération de cellules opsonisées avec des anticorps. Une autre possibilité, telle qu’enseignée par US20100297022A1, est de favoriser artificiellement l’expression des magnétosomes dans les cellules eucaryotes et d’en extraire des nanoparticules magnétiques. Dans le contexte de cette invention, le terme « microalgues » représente un groupe de microorganismes unicellulaires, autotrophes, procaryotes ou eucaryotes. Plusieurs genres de microorganismes tombent sous la classification des microalgues, tels que Chlorelle sp., Crypthecodinium sp., Cylindrotheca sp., Desmodesmus sp., Dunaliella sp., Isochrysis sp., Monoraphidium sp., Nannochloris sp., Nannochloropsis , Neochloris sp., Nitzschia sp., Phaeodactylum sp., Porphyridium sp., Scenedesmus sp., Schizochytrium sp., Tetraselmis sp., Botryococcus sp., Spirulina sp., Monodus sp., Chlamydomonas sp. ou un quelconque autre genre connu pour être utile pour la production de bio-huiles. Les microalgues peuvent être cultivées ou obtenues à partir d’une source naturelle. Par exemple, les microalgues peuvent être cultivées par des techniques connues par l’homme du métier compétent en la matière, telles que celles divulguées à titre d’exemple dans Yoshino et al. (2008), US6251365B1 et US20100297022A1, incorporés ici à titre de référence. En outre, les microalgues peuvent être isolées à partir de suspensions obtenues dans la nature, telle que l’eau de mer, des sources d’eau douce et/ou des effluents organiques. L’invention est particulièrement applicable à l’isolement de microalgues à partir de suspensions avec une salinité élevée. Dans le contexte de la présente invention, l’expression « salinité élevée » et le terme analogue « hypersalin » se réfèrent à des solutions aqueuses d’une quelconque nature avec une concentration en sel (par exemple, NaCl) égale à ou supérieure à au moins 5 g/l, au moins 10 g/l, au moins 15 g/l, au moins 20 g/l, au moins 30 g/l ou au moins 40 g/l. Par la présente invention, les microalgues peuvent être isolées à partir d’une suspension d’une manière simple. Avec l’utilisation de NMOB, il est possible d’isoler des microalgues à partir d’une culture avec une efficacité d’environ 80 % en un petit nombre d’étapes, à savoir : (1) résolution des conflits de charge, (2) incubation avec des nanoparticules magnétiques d’origine biologique et (3) application d’un champ magnétique externe. Étant donné que la membrane lipidique qui recouvre les NMOB a tendance à avoir une charge nette négative, la surface des microalgues peut être protonée en acidifiant le milieu avec un tampon à caractère acide, tel qu’un tampon citrate, pour favoriser l’interaction électrostatique entre les microalgues et les NMOB. Le pH du tampon peut être réglé à au moins 3,0, au moins 4.0, au moins 5,0 ou au moins 6,0. Puis, les microalgues de culture sont incubées avec les NMOB pendant un temps pouvant varier entre environ 1 et environ 20 minutes. Dans cette étape, les NMOB sont ajoutés à la culture de microalgues à une concentration qui peut varier en fonction du nombre de cellules de microalgues dans la culture. Par exemple, pour des cultures de microalgues avec une masse volumique de cellules de 10 3 cellules/ml, les NMOB peuvent être ajoutées à la culture en quantité suffisante pour atteindre une concentration finale d’au moins 10 μg × ml -1 , d’au moins 50 μg × ml -1 , d’au moins 80 μg × ml -1 ou d’au moins 100 μg × ml -1 . Enfin, une source de force magnétique externe est appliquée à la culture de microalgues incubées avec les NMOB, favorisant la floculation des microalgues et favorisant ainsi leur séparation du milieu. L’application d’un champ magnétique alternatif dans une étape ultérieure peut endommager la paroi cellulaire des microalgues et faciliter l’extraction des lipides de celles-ci. Le processus de récupération magnétique peut avoir son efficacité augmentée par l’association avec une électrofloculation. Dans le contexte de la présente invention, le terme « floculation » et ses variants se réfèrent au processus par lequel les petites particules présentes dans une suspension s’agrègent, formant des flocs. Ces flocs peuvent ensuite être récupérés par, par exemple, décantation. Le phénomène de floculation peut être induit par un agent chimique (par exemple, un floculant chimique) ou physique (par exemple, une électrofloculation). La présente invention fournit un moyen physique de favoriser la floculation des microalgues par le biais de l’utilisation de NMOB, qui sont sensibles à l’application d’une force magnétique externe. Ultérieurement, les NMOB peuvent être récupérés et séparés des microalgues par un processus chimique ou physique, assurant une concentration et une pureté élevées du matériau d’intérêt, et la possibilité de réutiliser les NMOB, ce qui réduit les coûts et est une caractéristique des processus durables. Ensuite, l’invention sera illustrée au moyen d’exemples de modes de réalisation, qui n’épuisent pas toutes les possibilités réalisables par le concept inventif décrit ici, mais représentent tous les modes de réalisation. Les exemples ci-dessous sont présentés afin de fournir à l’homme du métier compétent en la matière une description complète de la façon dont les compositions de blanchiment des dents de cette invention sont préparées, évaluées et utilisées. L’homme du métier compétent en la matière, à la lumière de la présente divulgation, reconnaîtra que de nombreuses modifications peuvent être apportées aux modes de réalisation spécifiques qui sont divulgués et obtiendra toujours un résultat similaire ou équivalent, sans s’écarter de l’esprit et de la portée de l'invention. EXEMPLES Exemple 1 - Obtention de nanoparticules magnétiques bactériennes Culture de bactéries magnétotactiques Dans cette étape, des bactéries magnétotactiques Magnetovibrio blakemorei , souche MV-1 J , et Magnetofaba australis , souche IT-1, ont été utilisées. Des volumes correspondant à une concentration finale de 10 8 cellules × ml -1 ont été inoculés dans un bioréacteur de paillasse de 5 l (volume de travail de 2 l) (Minifors, Infors HT - Bâle, Suisse) contenant un milieu de croissance frais. Les paramètres de culture ont été établis comme suit : pH 7,0 (ajusté avec du NaOH ou HCl 1,0 N), vitesse d’agitation 100 tr/min, 28 °C. Avant l’inoculum, la condition anaérobie a été obtenue en purgeant de l’azote (N 2 ) dans un milieu frais, stérile jusqu’à la lecture du détecteur d’O 2 a atteint zéro. Puis, le milieu a été purgé avec du N 2 O pendant 15 min dans le cas de Magnetovibrio blakemorei souche MV-1 J et de l’O 2 a été autorisé à entrer, étant maintenu à 0,5 % pour Magnetofaba australis souche IT-1. Les cultures ont été réalisées pendant 120 heures. Extraction et purification de nanoparticules magnétiques bactériennes (magnétosomes) À la fin de la période de croissance dans le bioréacteur, les cellules ont été recueillies par centrifugation à 6100 × g à 4 °C pendant 15 min. Les culots de cellules ont été lavés et resuspendus dans 15 ml de tampon Hepes (20 mM, pH 6,8). Puis, les cellules ont été soumises à une lyse par disruption ultrasonique dans un sonicateur avec pointes (VCX500, Sonics, Newtown, USA) à une amplitude de 40 %, fréquence 20 kHz, dans 60 cycles de 30 s avec des intervalles de 30 s. Les NMOB ont été magnétiquement concentrées par un aimant de bore-néodyme fixé à l’extérieur du tube pendant 12 h à 4 °C. Les cristaux ont été transférés dans des tubes en polypropylène de 1,5 ml et resuspendus dans un tampon Hepes (10 mM, pH 6,8) avec du NaCl (200 mM). Ensuite, les cristaux ont été lavés dans un bain à ultrasons (Branson 2200, Emerson, Rochester, USA) pendant 4 cycles de 30 min, avec une concentration magnétique et un échange de tampon à chaque cycle. Remarque : les cellules peuvent être récupérées en utilisant le champ magnétique, mais à des fins de facilité dans le laboratoire, une centrifugation a été effectuée. Caractérisation des nanoparticules Les cellules et les NMOB purifiées ont été ajoutées sur des grilles de cuivre recouvertes d’un film de support de formal de polyvinyle et carbone, étant séchées à l’air pour observation dans un microscope électronique à transmission (FEI Morgagni, Hillsboro, USA) fonctionnant à 80 kV dans une augmentation directe de 36 000 et 89 000 fois pour chaque cas, respectivement. Le nombre moyen de NMOB par cellule est déterminé par le nombre moyen de NMOB dans 30 cellules pour chaque point d’échantillonnage. La masse de NMOB extraites a été quantifiée par le procédé décrit par Yoshino et al. (2008). Exemple 2 - Récupération magnétique de microalgues Pour les essais de recueil magnétique de microalgues, les cellules suivantes ont été utilisées : Scenedesmus sp., Monoraphidium sp., Desmodesmus sp., Monoraphidium sp., Nannochloropsis sp. et Dunaliella sp. Les cellules ont été cultivées dans le milieu de culture BG11 modifié. En tant que stratégie de floculation pour résoudre le conflit entre les charges de surface, la surface des microalgues a été protonée en utilisant : (i) un tampon citrate préparé à des plages de pH de 3,1, 4,8 et 6,4 ; et (ii) un tampon phosphate préparé à pH 7,2. Les échantillons ont été préparés en triple pour chaque condition et type de cellule. Les échantillons ont été traités avec des NMOB prismatiques et octaédriques à une concentration finale de 80 μg × ml -1 et incubés pendant 5 min. Les échantillons ont été lus dans un spectrophotomètre (Biospectro SP-22, Paraná, Brésil) pour la densité optique à 680 nm. Parallèlement à cela, les échantillons ont également été observés en microscopie optique en contraste interférentiel différentiel. La même expérience a été réalisée avec des nanoparticules magnétiques synthétiques produites par le procédé de coprécipitation décrit par Santos et al. (2018). Dans les essais de recueil magnétique de microalgues, l’utilisation de NMOB octaédriques (figure 1A) a favorisé l’élimination des cellules dans le surnageant dans les cultures de Scenedesmus sp. ( ), Desmodesmus sp. ( ), Monoraphidium sp. ( ), Nannochloropsis sp. ( ) et Dunaliella sp. ( ). Dans tous les cas, l’efficacité du taux de récupération de cellules était directement liée à l’acidification du milieu, atteignant des valeurs proches de 70 % de récupération de cellules dans les 5 minutes suivant l’application d’un champ magnétique externe. En fait, l’application d’un aimant pendant 20 secondes et l’enregistrement vidéo ( ) indiquent que le temps de récupération est bien inférieur aux 5 minutes établies dans la méthodologie. Des exceptions à ce taux de récupération ont été trouvées pour les espèces Dunaliella sp. (meilleur taux de récupération proche de 60 %) et Monoraphidium sp. (meilleur taux de récupération proche de 12 %). L’observation de l’interaction des NMOB octaédriques avec les cellules par microscopie optique a montré que l’ajout de nanoparticules magnétiques favorise l’agrégation des cellules avec celles-ci (figures 8 et 9). À l’exception de Monoraphidium sp., qui semble exclure les NMOB, les regroupant dans l’isolement ( ), ce qui montre qu’il existe une caractéristique physico-chimique de cette cellule qui empêche l’interaction avec les NMOB. La raison exacte de ce phénomène n’est pas décrite dans la littérature. Néanmoins, une étude détaillée et une expérimentation peuvent résoudre ce problème et permettre l’utilisation des NMOB dans le recueil des Monoraphidium sp. Dans les essais de recueil de microalgues utilisant des NMOB prismatiques (figure 1B), Scenedesmus sp. et Monoraphidium sp. ont été utilisées, puisque ces cellules ont montré les meilleur et pire résultats dans l’évaluation précédente en utilisant des NMOB octaédriques. Les NMOB prismatiques ont favorisé le recueil de cellules dans des cultures de Scenedesmus sp. ( ) et Monoraphidium sp. ( ). L’efficacité de la récupération de cellules par l’application d’un champ magnétique était plus élevée dans le cas de la culture de Scenedesmus sp. (82,03 ± 6,55 % de récupération à pH 3,1), comme observé précédemment en utilisant des NMOB octaédriques. L’efficacité du taux de récupération de cellules était directement liée à l’acidification du milieu, atteignant des valeurs proches de 80 % de récupération de cellules en 5 minutes d’application d’un champ magnétique externe. À nouveau, il a été observé que l’application de l’aimant pendant 20 secondes est suffisante pour déterminer visuellement l’agrégation de cellules. Lorsque des nanoparticules magnétiques synthétiques ont été utilisées, des taux de récupération inférieurs à ceux des NMOB octaédriques et prismatiques ont été observés pour Scenedesmu sp. ( ), Desmodesmus sp. ( ), Monoraphidium sp. ( ), Nannochloropsis sp. ( ) et Dunaliella sp. ( ). Contredisant les résultats de recueil de microalgues en fonction de l’absorbance comme illustré ci-dessus, l’évaluation visuelle de la récupération de microalgues par des nanoparticules synthétiques par le biais de l’application d’un champ magnétique externe a montré qu’il n’y avait pas d’agglomération de cellules, ce qui rend le recueil magnétique irréalisable (exemple avec un essai de recueil magnétique de Scenedesmus sp. ; ). Bien que la soit une représentation de l’expérience de recueil magnétique avec la culture de Scenedesmus sp. soumise à une récupération magnétique par des nanoparticules synthétiques, le même résultat, c’est-à-dire, l’absence d’agglomération/concentration de cellules lors de l’application d’un champ magnétique, a été répété dans les expériences avec les autres cultures de cellules. Il est probable que du fait que les nanoparticules synthétiques ne sont pas des cristaux avec des faces bien définies et cristallographiquement parfaits, ces nanoparticules magnétiques synthétiques sont dissoutes dans le milieu, ce qui entraînerait la libération de grandes quantités de fer et des modifications cellulaires, y compris la lyse de cellules. Plusieurs auteurs signalent la dissolution de nanoparticules magnétiques synthétiques de magnétite dans des solutions avec un pH acide, une condition nécessaire à la séparation cellulaire (Ike et Duke, 2018), qui provoque des dommages cellulaires, y compris la fuite de contenu cytoplasmique (Lei et al. , 2016). Dans le cas des expériences illustrées ci-dessus, dans lesquelles le recueil magnétique des microalgues est fonction de l’absorbance, il y a une indication que la dissolution des nanoparticules magnétiques synthétiques provoque une « fausse récupération de cellules ». Il est important de souligner que les nanoparticules synthétiques utilisées dans cette expérience sont similaires à celles utilisées dans KR20140133311 ( ). Donc, les performances des NMOB étaient significativement supérieures à celles des nanoparticules magnétiques synthétiques, car les NMOB sont stables et, en fait, favorisent l’agglomération/concentration de cellules lorsqu’un champ magnétique externe (aimant) est appliqué. Exemple 3 - Récupération magnétique de microalgues dans un milieu hypersalin Pour démontrer la capacité des NMOB à favoriser la récupération de microalgues à partir de milieux avec une salinité élevée, nous avons évalué l’efficacité du recueil magnétique de cellules Nannochloropsis sp. suspendues dans un milieu avec une salinité de 40 g/l, en comparant l’utilisation de nanoparticules et d’un floculant chimique standard. Plusieurs essais ont été réalisés pour étudier l’effet de différentes conditions de salinité et de pH sur l’efficacité des NMOB. Établissement d’un modèle mathématique pour la détermination des conditions de salinité et de pH Les cellules Nannochloropsis sp. ont été cultivées dans du milieu BG11 contenant 40 g/l de NaCl. Pour l’essai comparatif préliminaire de recueil de microalgues par des NMOB, des nanoparticules magnétiques synthétiques et un floculant (composé gardé confidentiel), la culture a été utilisée directement dans l’essai, en ajoutant la même quantité de NMOB et de nanoparticules de sorte que la concentration finale de 80 μg/ml a été atteinte. La concentration du floculant utilisé était de 1:5 de l’échantillon. L’expérience a été réalisée à pH 3,1 et 6,4. Après la concentration magnétique, dans le cas de l’utilisation de NMOB ou de nanoparticules magnétiques synthétiques, et en attente de floculation, dans le cas de l’utilisation du floculant, le surnageant a été transféré dans un nouveau tube. Ces échantillons ont été lus dans un spectrophotomètre (Biospectro SP-22, Paraná, Brésil) à la densité optique à 680 nm pour déterminer le taux de récupération de microalgues. Les nanoparticules magnétiques synthétiques utilisées ont été produites par le procédé de coprécipitation décrit par Santos et al. (2018). L’inférence statistique par le test ANOVA bidirectionnel avec le post-test de comparaisons multiples de Sidak a été effectuée en utilisant le logiciel GraphPad Prism version 8.0 (GraphPad, USA). Pour la planification expérimentale dans laquelle différentes conditions de salinité et de pH ont été testées, les algues obtenues dans la culture dans un milieu BG11, telle que décrite ci-dessus, ont été recueillies et centrifugées à 3 000 tr/min à 24 °C pendant 10 minutes dans des microtubes de polypropylène de 1,5 ml. Les cellules ont été resuspendues dans des solutions de tampon citrate à différentes salinités, tel qu’indiqué dans la planification expérimentale. La planification expérimentale réalisée était de type Box-Benkhen pour deux variables, à savoir, le pH et la salinité (indirectement par la concentration de NaCl présent dans le milieu), dans 3 niveaux pour chaque variable. Les plages de pH étaient les valeurs de 3,1, 4,8 et 6,4, relatives aux niveaux -1, 0 et +1. Les plages de salinité, conférées indirectement par l’ajout de NaCl dans le milieu, étaient de 0, 20 et 40 g/l, relatives aux niveaux -1, 0 et +1, respectivement, pour Nannochloropsis sp. La conception de la planification, la génération de la matrice modèle, le calcul des coefficients et le traçage des résultats ont été effectués en utilisant le logiciel Microsoft Excel 2016 (Microsoft, USA). La planification a suivi le modèle décrit ci-dessous : Après la resuspension des cellules dans chaque condition prévue dans la planification de type Box-Benkhen,synthétique, une suspension de NMOB prismatiques extraites de Mv. blakemorei , souche MV-1 T à une concentration finale de 80 μg/ml. Le taux d’efficacité de récupération de cellules a été calculé à partir de la différence entre le surnageant du matériau magnétiquement concentré et la condition de contrôle sans séparation magnétique. La différence entre chaque lecture en considérant l’étape de concentration était de 5 min. La densité optique (DO) des suspensions a été lue dans un spectrophotomètre (Biospectro SP-22, Brésil) à une longueur d’onde de 680 nm. La conversion de DO de 680 nm en masse volumique de cellules, à savoir, cellules/ml, a été obtenue après corrélation préalable établie par le groupe de recherche. Un essai de recueil magnétique et de séparation a été effectué dans lequel les NMOB ont été mises au défi face à des nanoparticules synthétiques de magnétite et au floculant, gardé confidentiel, utilisés dans l’étape de valorisation de biomasse ( ). Dans la condition de culture hypersaline de 40 g/l de NaCl et pH 3,1 ou 6,4, les NMOB ont montré un taux de récupération statistiquement significatif de 23,01 ± 4,94 % et (***) 17,31 ± 3,27 % (**), respectivement (figure 20A). Les nanoparticules synthétiques ont obtenu un taux de récupération statistiquement significatif de 6,22 ± 2,88 % (**) à pH 3,1 (figure 20B). Il n’y a pas eu de récupération statistiquement significative lors de l’utilisation du floculant (4,30 ± 1,81 %) dans la condition de culture à pH 8,0 (figure 20C). Récupération de Nannochloropsis sp . dans diverses conditions de salinité et de pH Telles que décrites précédemment, les surfaces de réponse ont été tracées selon le modèle décrit dans différentes rotations afin de faciliter la visualisation et l’interprétation ( ). Après avoir calculé les coefficients, le modèle suivant a été prédit pour Nannochloropsis sp. : Sur les surfaces de réponse tracées selon le modèle décrit dans différentes rotations afin de faciliter la visualisation et l’interprétation, il a été possible d’observer le point optimal ( ; pointe de flèche orange), le point de la condition de culture ( ; pointe de flèche rouge) et le point intermédiaire pour l’ajustement du pH et de la salinité ( ; pointe de flèche bleue). Le point optimal, tel que décrit précédemment ici, a été atteint à pH 3,1 et sans ajout de NaCl au milieu de culture ( ; pointe de flèche orange) correspondant à une récupération de 59,52 %. Le point de condition de culture ( ; pointe de flèche rouge), à savoir, NaCl à 40 g/l, a obtenu une récupération de 52,08 %, correspondant à une chute non significative lorsqu’on considère les conditions du processus. De plus, le point intermédiaire de la salinité de la culture ( ; pointe de flèche rouge), à savoir, NaCl à 20 g/l, a obtenu une récupération de 64,93 %, correspondant à une augmentation légèrement supérieure à celle attendue pour le point optimal, décrit précédemment. Par conséquent, il a de nouveau été possible d’observer qu’il y avait une récupération de cellules dans les conditions les plus proches possibles de l’étape de recueil dans les cuves et les raceways de culture de microalgues, en ajoutant les étapes d’acidification du milieu et de recueil et de séparation magnétique en ajoutant des NMOB. Enfin, après avoir collecté les données pour générer la surface de réponse, la concentration magnétique du matériau a été enregistrée ( ). Un aimant de néodyme-bore a été positionné et la biomasse de microalgues floculée par les NMOB a été concentrée sur le côté du tube en réponse au champ magnétique généré. Il a été possible d’observer la réponse au champ dans toutes les conditions de salinité proposées. Après avoir réalisé la planification expérimentale et la mise au défi des NMOB face aux nanoparticules synthétiques de magnétite et au floculant, il a été possible d’observer que les NMOB décrits dans le présent travail ont la capacité de recueillir magnétiquement et d’agir dans la séparation magnétique des espèces de microalgues dans des conditions hypersalines. L’utilisation de nanoparticules dans la mise au défi a montré qu’elles sont inefficaces dans le processus de recueil de cellules dans des conditions de salinité élevée, ainsi que le floculant chimique. L’observation visuelle du recueil magnétique comme illustrée dans la pour les NMOB n’a pas été observée dans la mise au défi des nanoparticules synthétiques. RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES Ike, I. A., & Duke, M. (2018). Synthetic magnetite, maghemite, and hematite activation of persulphate for orange G degradation. Journal of contaminant hydrology, 215, 73-85. Lam G. P., Zegeye E. K., Vermuë M. H., Kleinegris D. M. M., Eppink M. H. M., Wijffels R. H., Olivieri G. 2015. Dosage effect of cationic polymers on the flocculation efficiency of the marine microalga Neochloris oleoabundans , Bioresour. Technol. 198: 797-802. Lei, C., Zhang, L., Yang, K. et al. (2016) Toxicity of iron-based nanoparticles to green algae: effects of particle size, crystal phase, oxidation state and environmental aging. Environ Pollut 218, 505-512. Leon-Reyes, A., Epifani, M., Chávez-Capilla, T., Palma, J., & Díaz, R. (2014). Analysis of the different mechanisms of electrochemical energy storage in magnetite nanoparticles. Int. J. Electrochem. Sci, 9(7), 3837-3845. Roselet, F., Vandamme, D., Roselet, M. et al. 2017. 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Utilisation de nanoparticules magnétiques d’origine bactérienne, caractérisée en ce qu’elle est utilisée pour récupérer des microalgues présentes dans une suspension. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que la suspension de microalgues est choisie parmi : une culture de microalgues, une source d’eau salée, une source d’eau douce ou un effluent. Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que la suspension a une concentration en sel égale à ou supérieure à 5 g/ml. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que les microalgues peuvent être choisies parmi Chlorella sp., Crypthecodinium sp., Cylindrotheca sp., Desmodesmus sp., Dunaliella sp., Isochrysis sp., Monoraphidium sp., Nannochloris sp., Nannochloropsis , Neochloris sp., Nitzschia sp., Phaeodactylum sp., Porphyridium sp., Scenedesmus sp., Schizochytrium sp., Tetraselmis sp. ou un quelconque autre genre connu pour être utile pour la production de bio-huiles. Processus de récupération de microalgues dans une suspension, caractérisé en ce qu’il comprend la protonation de la surface cellulaire des microalgues, l’ajout de nanoparticules magnétiques d’origine bactérienne à la suspension et l’application d’une charge magnétique externe, favorisant ainsi la floculation des microalgues. Processus selon la revendication 5, caractérisé en ce que la suspension de microalgues est choisie parmi : une culture de microalgues, une source d’eau salée, une source d’eau douce ou un effluent. Processus selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que la suspension a une concentration en sel égale à ou supérieure à 5 g/ml. Processus selon l’une quelconque des revendications 5 à 7, caractérisé en ce que la surface cellulaire des microalgues est protonée en ajoutant un tampon acide à la suspension. Processus selon l’une quelconque des revendications 5 à 8, caractérisé en ce que les NMOB sont ajoutées à une concentration comprise entre 50 et 100 μg/ml. Processus selon l’une quelconque des revendications 5 à 9, caractérisé en ce que les microalgues peuvent être choisies parmi Chlorella sp., Crypthecodinium sp., Cylindrotheca sp., Desmodesmus sp., Dunaliella sp., Isochrysis sp., Monoraphidium sp., Nannochloris sp., Nannochloropsis , Neochloris sp., Nitzschia sp., Phaeodactylum sp., Porphyridium sp., Scenedesmus sp., Schizochytrium sp., Tetraselmis sp. ou un quelconque autre genre connu pour être utile pour la production de bio-huiles.