FR 3134289 A1 20231013 FR 2203322 A 20220411 La présente demande de brevet concerne un procédé d’extraction de composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnels à partir d’une culture de microalgues vivantes grâce à une perméation temporaire de la paroi cellulaire. Extraction non destructive de composés d’intérêt alimentaire issus d’algues vivantes La présente demande de brevet concerne un procédé d’extraction de composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnels à partir d’une culture de microalgues vivantes grâce à une perméation temporaire de la paroi cellulaire. Art antérieur En raison des faibles volumes de production des microalgues dans le monde et de leur coût élevé, leur utilisation reste encore très limitée notamment dans le domaine de l’alimentation humaine. De nombreux industriels préfèrent ainsi valoriser les molécules à haute valeur ajoutée telle de la phycocyanine issue de la spiruline, ou bien l’astaxanthine extraite d’ Haematococcus pluvialis destinées à des applications pharmaceutiques. Le secteur de l’alimentaire quant à lui est confronté à de nombreux obstacles dont l’organoleptique constitue le principal. En effet, malgré leurs propriétés nutritionnelles exceptionnelles, les microalgues restent très peu consommées telles quelles du fait de leurs caractéristiques organoleptiques quelque peu rebutantes pour le consommateur lambda. Pour pallier ce problème, de nombreux acteurs recourent à des procédés d’extraction et de fractionnement de la biomasse afin d’éliminer les contraintes organoleptiques et de ne conserver que les éléments d’intérêt nutritionnel/santé. Ainsi Soto-Sierra (2018) décrit différentes méthodes d’extraction physiques permettant d’extraire les protéines des algues pour des applications alimentaires comme les ultrasons, le broyage à billes, l’homogénéisation haute pression. Toutes ces techniques permettent l’obtention d’un extrait riche en protéines, séparé des parois cellulaires vertes, qui est ensuite purifié puis séché avant utilisation. Ces techniques peuvent être appliquées à diverses espèces de microalgues comme la spiruline, la chlorelle et bien d’autres. De manière similaire, Bleakley (2017) présente les techniques d’extraction appliquées aux algues pour en extraire les protéines destinées à des usages alimentaires pour l’homme. On peut ainsi citer la méthode biologique faisant intervenir l’hydrolyse enzymatique, le recourt à des procédés physiques ou bien les méthodes chimiques avec des traitements acides par exemple. Cependant ces Procédés sont longs, coûteux et nécessitent un approvisionnement continu en biomasse. D’après Vinayak (2015), les opérations post-récolte représenteraient 50 à 80% du coût global du procédé d’obtention de molécules à haute valeur ajoutée à partir de biomasse d’algue. Afin de réduire le nombre d’opérations unitaires et de continuer à travailler avec la même biomasse renouvelée, certains acteurs se sont intéressés à des techniques d’extraction dites non-destructives. Ainsi, le brevet US2012095245 (A1) (2012) mentionne l’emploi combiné d’un traitement aux ultrasons et l’usage d’un solvant organique pour extraire les lipides de Nannochloropsis tout en maintenant la culture vivante après traitement. De manière similaire, Hejazi (2004) recourt à un système de réacteur à deux phases permettant le passage de dodécane à contre-courant de la culture de Dunaliella salina pour l’extraction en continue du bêta-carotène. Durant la période d’extraction, le dodécane, qui est un solvant biocompatible avec les algues, est renouvelé pour une meilleure efficacité d’extraction. Une fois, les cellules traites, elles sont remises en culture. De la même façon, Samori (2019) emploie du cyclohexane pour l’extraction biocompatible de l’astaxanthine issue de cultures vivantes d’ Haematococcus pluvialis . Ces techniques biocompatibles présentent l’avantage de réduire le nombre d’opérations unitaires et de renouveler la culture d’algues contrairement à un procédé classique d’extraction. Néanmoins, ces méthodes nécessitent l’usage en grande quantité de solvants organiques peu écologiques et souvent interdits en alimentaire. Le Demandeur a résolu ce problème technique en mettant au point une technique permettant l’extraction de composés d’intérêt nutritionnels à partir d’une culture d’algues vivantes sans recours à des solvants organiques. Une perméation temporaire de la paroi induite par des champs électriques pulsés permet ainsi la sortie des composés d’intérêt de la cellule et leur solubilisation dans le milieu d’extraction. Les cellules de microalgue ayant été traitées par champs électriques pulsés sont ensuite remises en culture pour une future utilisation permettant ainsi de réduire considérablement le coût du procédé global ainsi que le nombre d’opérations unitaires. En effet, avec cette technique, il n’est pas nécessaire de récolter ni de sécher la biomasse avant extraction. Ainsi, selon un premier aspect, l’invention concerne un procédé d’extraction de composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnels, de préférence des protéines, vitamines, minéraux, ou sucres, à partir d’une culture de microalgues vivantes comprenant les étapes de : Mise en culture des souches de microalgues jusqu’à obtenir une quantité de biomasse desdites microalgues de concentration comprise entre 1. 10 6 et 1.10 8 cellules/mL ; Séparation des microalgues obtenues à l’étape a. de leur milieu de culture, de préférence par centrifugation entre 1500 et 4000 g durant 5 à 20 minutes et à une température comprise entre 4 et 25°C ; Mélange des microalgues obtenues à l’étape b. dans de l’eau à un ratio compris entre 5 et 20% à une conductivité comprise entre 20 et 200 µS/cm ; Application au mélange obtenu à l’étape c. de champs électriques pulsés bipolaires, de préférence au nombre de 1 à 20 impulsions avec une durée d’impulsion de 1 à 2 ms, un voltage compris entre 0,5 et 6 kV/cm, une température comprise entre 4 et 25°C, et un débit de circulation des cellules algales dans la chambre d’impulsion de 10 à 100 mL/min, Dilution du mélange obtenu à l’étape d. entre 2 et 5 fois dans de l’eau ou un tampon durant entre 1 et 12h ; Centrifugation du mélange obtenu à l’étape e., de préférence à entre 1500 et 4000 g durant 5 à 20 minutes à une température comprise entre 4 et 25°C ; Récupération du surnageant de centrifugation comprenant lesdits composés d’intérêts nutritionnels ; Obtention de composés d’intérêts nutritionnels. Le procédé selon l’invention présente l’avantage d’être « vert » et compatible avec des applications alimentaires. En effet, la culture d’algue est soumise à un traitement aux champs électriques pulsés rendant la paroi perméable de manière réversible (« perméation »). Ce phénomène permet ainsi la sortie des composés d’intérêt nutritionnel de la cellule et leur solubilisation dans le milieu d’extraction. Une fois le traitement terminé, l’algue retrouve sa paroi intègre. Elle est ensuite séparée du milieu d’extraction puis remise en culture jusqu’à la prochaine extraction. A l’étape g., les algues electroextraites comprises dans le culot, toujours vivantes, peuvent ensuite être remises en culture jusqu’à la prochaine extraction, En effet, à la fin de ce procédé, les microalgues dont les composés ont été electroextraits, sont toujours vivantes et peuvent être ensuite remises en culture jusqu’à la prochaine extraction. Une même souche de microalgues peut donc subir plusieurs fois ce procédé d’extractions de composés. A l’étape c., la conductivité comprise entre 20 et 200 µS/cm est fonction de l’espèce d’algue considérée. De manière préférée, à l’étape d., les impulsions sont espacées par un délai d’entre 10 ms et 2 secondes. De manière préférée, ledit procédé d’extraction comprend en outre une étape i. de concentration des composés d’intérêts nutritionnels obtenus à l’étape h. par des procédés de filtration membranaires de 3 à 1000 kDa ou par l’usage de colonnes d’affinité, de préférence de type colonne à échange d’ion, de manière encore plus préférée par l’utilisation d’une filtration membranaire entre 10 et 500 kDa. Par procédés de filtration membranaires sont entendus de préférence la filtration tangentielle ou la filtration frontale. Les composés obtenus à l’étape h. sont en solution aqueuse liquide. Selon un mode de réalisation, il est possible d’obtenir une solution concentrée ou sous forme de poudre de ladite solution obtenue à l’étape h., par exemple par séchage. De manière préférée, ledit procédé d’extraction comprend en outre une étape j. de séchage des composés d’intérêts nutritionnels obtenus à l’étape h. ou i., par : lyophilisation, de préférence à une température comprise entre -20 et -80°C et une pression de 5 à 500 µbar ; ou atomisation, de préférence dans un flux d’air chaud à une température comprise entre 80°C et 300°C, de préférence entre 90°C à 220°C. : ou séchage à une température comprise entre 40 et 80°C, ou séchage sous pression, de préférence par atomisation ou lyophilisation. Par « champs électriques pulsés bipolaires » est entendu un traitement non-thermique sélectif de très courte durée, généralement de quelques microsecondes à quelques millisecondes. Il s’agit d’un champ électrique d’intensité E dont la valeur oscille entre positif et négatif causant des changements de répartition de charge dans la cellule soumise au champ électrique. L’application d’un champ électrique pulsé engendre ainsi l’accumulation de charges sur les surfaces membranaires, et l’augmentation du potentiel transmembranaire de la membrane cellulaire. L’attraction entre les charges de signes opposés accumulées de part et d’autre de la membrane cellulaire provoque une compression de cette dernière, une force élastique tend à s’opposer à cette électrocompression. Lorsque les champs électriques pulsés appliqués dépassent une valeur critique Ecr, la force électrocompressive devient supérieure à la force élastique, on assiste alors à l’apparition de pores au niveau de la membrane cellulaire. L’électroporation est généralement réversible, mais au-delà d’une intensité de champs électriques pulsés élevée, ainsi que pour de longues durées de traitement, on assiste à une intensification de la perméabilisation et une destruction irréversible de la membrane cellulaire. Les paramètres sont variables d’une cellule à l’autre en fonction de sa composition et donc de sa rigidité. Par « composés d’intérêts nutritionnels » sont entendus des composés de nature hydrosolubles tels que des protéines, vitamines, minéraux, sucres…qui varient en fonction de l’organisme traité. Par « extraction biocompatible » est entendu : extraction non-destructive des cellules permettant de les conserver vivantes après traitement. Par « microalgue » on entend désigner selon la présente invention les microalgues eucaryotes, qui sont caractérisée par un noyau, comprenant par exemple les chlorophytes, les rhodophytes, les haptophytes, les bacillariophytes, les eustigmatophytes, les euglenophytes, les thraustochytriaceae ou encore les dinophytes, lesdits microalgues eucaryotes étant communément dénommées « microalgues », et les microalgues procaryotes, qui ne possèdent pas de noyau, comprenant les cyanophytes, ci-après dénommées spécifiquement « cyanobactéries ». De manière préférée selon l’invention, les microalgues eucaryotes sont choisies parmi les chlorophytes, de préférence parmi Chlorella, Auxenochlorella, Dunaliella, Tetraselmis, Haematococcus, Scenedesmus; les eustigmatophytes, de préférence Nannochloropsis; les euglénophytes, de préférenc, Euglena; les rhodophytes, de préférence Porphyridium; les bacillariophyceae, de préférence Phaeodactylum et Odontella, et les thraustochytriaceae, de préférence Schizochytrium. De manière préférée, les cyanobactéries sont choisies parmi la spiruline (Arthrospira platensis ou Spirulina maxima) et l’AFA (Aphanizomenon Floes-aquae). De manière encore plus préférée, ladite microalgue est choisie parmi la Chlorelle, Chlorella sp., Chlorella vulgaris, Chlorella protothecoides, Chlorella sorokiniana, Chlorella pyrenoidosa, Euglena sp., Euglena gracilis, Schizochytrium sp. Par exemple, les composés hydrosolubles d’intérêts nutritionnels obtenu par le procédé de l’invention appliqué à la Chlorelle comprennent une concentration en protéine d’environ 1 mg/mL. Par « tampon » est entendu selon l’invention à l’étape e. une solution tamponnée de pH compris entre 6 et 12, variable en fonction des composés ciblés. De manière préféré, ledit tampon à l’étape e. est un tampon phosphate. Selon un deuxième aspect, l’invention concerne les composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnels obtenus par le procédé selon l’invention. De manière préférée, lesdits composés hydrosolubles d’intérêts nutritionnels comprennent des protéines, vitamines, minéraux, ou sucres. Lesdites protéines, vitamines, minéraux ou sucres varient en fonction de la microalgue utilisée dans le procédé. Selon un troisième aspect, l’invention concerne l’utilisation des composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnels dans des produits alimentaires. De préférence, lesdits produits alimentaires sont choisis parmi les substituts de poisson, des boissons, des produits de la gamme boulangerie/pâtisserie… Exemples Exemple 1 : Application du procédé d’extraction de composés d’intérêt nutritionnel selon l’invention à partir de Chlorelle. Electroextraction des protéines cytoplasmiques de Chlorelle pour des applications alimentaires Avant de débuter le procédé, les souches de chlorelles sont mises en culture afin d’optimiser la production de biomasse jusqu’à atteindre une concentration de 10 7 cellules/mL. Le procédé d’obtention des protéines cytoplasmiques de chlorelle comprend ensuite les étapes suivantes : a. Séparation des algues fraîches de leur milieu de culture par centrifugation à 2500 g durant 5 minutes, à une température de 20°C, b. Dilution des algues dans l’eau à 10% à une conductivité de 200 µS/cm, e. Traitement de la solution algale à l’aide de champs électriques pulsés bipolaires selon le protocole détaillé dans le Tableau 1 ci-dessous, f. Dilution du mélange 5 fois dans un tampon phosphate durant 1h, g. Centrifugation du mélange à 2500 g durant 5 minutes, à une température de 20°C, h. Les algues électroextraites, toujours vivantes, sont ensuite remises en culture jusqu’à la prochaine extraction. Paramètre d’électroextraction des protéines de Chlorelle Paramètre Valeurs Nombre d’impulsions bipolaires 15 Durée d’impulsion 2 ms Délais entre les impulsions 30 ms Voltage 3 kV/cm Débit 50 mL/min Température 20°C Après centrifugation, le surnageant contenant les protéines cytoplasmiques de chlorelle est récolté. La concentration en protéines cytoplasmiques de l’extrait est d’environ 1 mg/mL. Il sera ensuite concentré puis séché pour être intégré dans une formulation alimentaire. Procédé d’extraction biocompatible de composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnel, de préférence des protéines, vitamines, minéraux, ou sucres, à partir d’une culture de microalgues vivantes comprenant les étapes de : Mise en culture des souches de microalgues jusqu’à obtenir une quantité de biomasse desdites microalgues de concentration comprise entre 1. 10 6 et 1.10 8 cellules/mL ; Séparation des microalgues obtenues à l’étape a. de leur milieu de culture, de préférence par centrifugation à entre 1500 et 4000 g durant 5 à 20 minutes et à une température comprise entre 4 et 25°C ; Mélange des microalgues obtenues à l’étape b. dans de l’eau à un ratio compris entre 5 et 20% à une conductivité comprise entre 20 et 200 µS/cm ; Application au mélange obtenu à l’étape c. de champs électriques pulsés bipolaires, de préférence au nombre de 1 à 20 impulsions avec une durée d’impulsion de 1 à 2 ms, un voltage compris entre 0,5 et 6 kV/cm, une température comprise entre 4 et 25°C, et un débit de circulation des cellules algales dans la chambre d’impulsion de 10 à 100 mL/min, Dilution du mélange obtenu à l’étape d. entre 2 et 5 fois dans de l’eau ou un tampon durant entre 1 et 12h ; Centrifugation du mélange obtenu à l’étape e., de préférence à entre 1500 et 4000 g durant 5 à 20 minutes à une température comprise entre 4 et 25°C ; Récupération du surnageant de centrifugation comprenant lesdits composés d’intérêt nutritionnel ; Obtention de composés d’intérêt nutritionnel. Procédé d’extraction biocompatible de composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnel selon la revendication précédente, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape i. de concentration des composés d’intérêt nutritionnel obtenus à l’étape h. par des procédés membranaires de 3 à 1000 kDa ou par l’usage de colonnes d’affinité, de préférence de type colonne à échange d’ion, de manière encore plus préférée par l’utilisation d’une filtration membranaire entre 10 et 500 kDa. Procédé d’extraction biocompatible de composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnel selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend en outre une étape j. de séchage des composés d’intérêt nutritionnel obtenus à l’étape h. ou i., par : lyophilisation, de préférence à une température comprise entre -20 et -80°C et une pression de 5 à 500 µbar ; ou atomisation, de préférence dans un flux d’air chaud à une température comprise entre 80°C et 300°C, de préférence entre 90°C à 220°C. : ou séchage à une température comprise entre 40 et 80°C, ou séchage sous pression, de préférence par atomisation ou lyophilisation. Procédé d’extraction biocompatible de composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnel selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que lesdites microalgues sont choisies parmi : Arthrospira platensis, Arthrospira maxima, Aphanizomenon Floes-aquae, la Chlorelle, Chlorella sp., Chlorella vulgaris, Chlorella protothecoides, Chlorella sorokiniana, Chlorella pyrenoidosa, Euglena sp., Euglena gracilis, Schizochytrium sp. Composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnel tel qu’obtenus par le procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes. Utilisation des composés hydrosolubles d’intérêt nutritionnel selon la revendication précédente dans des produits alimentaires.