FR 3135596 A1 20231124 FR 2204889 A 20220520 ------ UTILISATION D’ARN INTERFERENTS DIRIGES CONTRE LE SYSTEME CHOLINERGIQUE POUR LUTTER CONTRE LES INSECTES NUISIBLES La présente invention concerne un procédé de lutte contre des insectes nuisibles par inhibition de la traduction d’un ARNm d’un gène cible appartenant au système cholinergique de l’insecte induite par interférence par ARN. L'invention concerne également une composition insecticide comprenant un ARN double brin ou un oligonucléotide antisens et un agent de transfection ou un solvant. L'invention concerne en outre un ARN interférent dans lequel l’ARNdb ou oligonucléotide antisens inhibe la traduction des ARNm correspondant à la séquence codante de l’un quelconque des gènes du groupe de sous-unités neuronales α du récepteur nicotinique, des gènes du groupe de sous-unités neuronales β du récepteur nicotinique, et de leurs isoformes, à une quelconque des séquences nucléotidiques des gènes codant pour les protéines et molécules auxiliaires du récepteur nicotinique, et leurs isoformes, ou à la séquence d’ADN codant pour une protéine de l’interactome du récepteur nicotinique. Des utilisations de l’ARN interférent ou oligonucléotide antisens comme bioinsecticide, comme agent synergisant de l’effet insecticide d’un insecticide ou d’une molécule à effet insecticide contre un insecte nuisible et comme agent de restauration de la sensibilité d’un insecte nuisible vis-à-vis d’un insecticide sont décrits. Figure à publier avec l’abrégé : Figure 2 Utilisation d’ARN interférents dirigés contre le système cholinergique pour lutter contre les insectes nuisibles Arrière-plan de l’invention La présente invention concerne le domaine de la lutte contre les insectes nuisibles. Prenant en considération en particulier la mise en application du plan Ecophyto II+ qui vise à réduire de 50% l’utilisation des produits phytosanitaires, le besoin en moyen de lutte contre les insectes nuisibles est particulièrement prégnant. Ces insectes représentent une nuisance tant du point de vue de la santé publique que du bon déroulement des activités humaines, qu’elles soient domestiques ou professionnelles. La présence de blattes, punaises de lit au sein d’un foyer tout comme l’infestation de culture par des pucerons, cicadelles, charançons ou autres, a un effet délétère sur l’activité humaine. De fait, l’agriculture moderne tend vers la lutte agroécologique contre les insectes nuisibles. Mais ceci nécessite le développement de nouvelles techniques alternatives adaptées. Depuis le début du XIXème siècle, la population mondiale est en constante augmentation passant de 7,5 milliards d’individus en 2017 à une prévision d’environ 11 milliards à la fin du XXIème siècle. Etant donné les problèmes de sous-nutrition et de malnutrition rencontrés dans le monde, l’agriculture doit faire face à un défi important qui est de produire des ressources alimentaires en quantité et qualité suffisantes. En effet, de nombreux bioagresseurs provoquant des dégâts considérables sur les plantes peuvent entraîner des pertes quantitatives et/ou une modification qualitative de la récolte. Parmi ces bioagresseurs, les insectes ravageurs entraînent entre 20 et 40% des pertes de productions agricoles chaque année. La réduction du nombre de substances actives autorisées rend la lutte contre les insectes nuisibles de plus en plus difficile. De plus, l’utilisation non raisonnée d’insecticide a conduit à l’apparition d’insectes nuisibles résistants aux insecticides. Les inventeurs se sont plus particulièrement intéressés au développement d’une stratégie de lutte contre des insectes nuisibles tels que, par exemple, le puceron du pois Acyrthosiphon pisum et la blatte Periplaneta americana . Le puceron du pois colonise de nombreuses légumineuses cultivées comme le pois, le haricot, la fève, les lentilles ou encore la luzerne. La culture de légumineuses se situe au deuxième rang des productions mondiales après celle des céréales, représentant environ 13% des surfaces cultivées (Gepts et al., 2005). Il provoque des dégâts directs dus aux prélèvements de la sève mais il est aussi capable de transmettre de nombreux virus. A ce jour, 30 virus transmis par le puceron du pois ont été répertoriés : mosaïque du haricot, mosaïque du concombre, etc. Les néonicotinoïdes représentent les insecticides ayant été les plus utilisés en agriculture ces dix dernières années. Bien qu’une autorisation temporaire d’utilisation ait été accordée par la loi du 14 décembre 2020 pour protéger les cultures de betteraves sucrières menacées par des infestations massives de pucerons contre lesquels les traitements insecticides actuels ne sont pas efficaces, l’usage de ces néonicotinoïdes est interdit depuis 2018. Par conséquent, peu de substances chimiques restent actuellement utilisables pour lutter contre les insectes nuisibles dont les insectes ravageurs des cultures, et plus particulièrement les pucerons, ce qui rend problématique le contrôle de ces insectes adaptés voire résistants à ces traitements chimiques insecticides. Brève description de l’invention Les inventeurs proposent une nouvelle stratégie de lutte contre les insectes nuisibles basée sur l’utilisation d’ARN interférents (ARNi) ciblant le système cholinergique comme bioinsecticides ou comme agents synergisants de l’effet de l’insecticide utilisé à faible dose. En effet, le système cholinergique chez l’insecte présente un rôle majeur dans sa physiologie. Etant donné ce rôle physiologique important de l’acétylcholine (ACh) chez l’insecte, le système cholinergique constitue une cible privilégiée pour de nombreuses familles d’insecticides comme par exemple les carbamates et les organophosphorés qui inhibent l’activité de l’enzyme de dégradation de l’ACh, l’acétylcholinestérase ; les spinosynes, les néonicotinoïdes, les buténolides, les sulfoximines et les mésoioniques ciblant les récepteurs cholinergiques de type nicotinique (nAChR). Jusqu’en 2018, l’utilisation des néonicotinoïdes était le moyen le plus efficace pour lutter contre les insectes ravageurs de culture. Ces insecticides étaient largement utilisés en agriculture pour la protection des plantes, en tant que produits phytosanitaires, et par les particuliers ou les entreprises pour lutter contre les insectes nuisibles à la santé humaine et animale, en tant que produits biocides. L’article 125 de la loi du 8 août 2016, dite « loi pour la reconquête de la biodiversité, de la nature et des paysages », interdit « l’utilisation de produits phytopharmaceutiques contenant une ou des substances actives de la famille des néonicotinoïdes et de semences traitées avec ces produits […] à compter du 1 er septembre 2018 », avec des dérogations possibles. Depuis l’interdiction d’utilisation des néonicotinoïdes, la lutte chimique neurotoxique est principalement basée sur l’utilisation des pyréthrinoïdes. Cependant, l’efficacité moindre de cette classe d’insecticide sur les insectes nuisibles a conduit à une autorisation temporaire d’utilisation des néonicotinoïdes par la loi du 14 décembre 2020 pour les betteraves sucrières, le temps que d'autres solutions soient trouvées pour protéger ces cultures massivement menacées par des pucerons. Parmi les autres moyens connus de lutte contre les pucerons, il existe l’utilisation d’insectes auxiliaires tels que Coccinella septempunctata et de parasitoïdes tels que Aphidius avenae , la lutte mécanique avec l’installation de filets anti-insectes ou bien encore le piégeage avec l’utilisation de panneaux englués. La présente invention repose sur l’utilisation de la technique d’interférence par ARN qui est une méthode spécifique à une espèce donnée (Whyard et al., 2009), qui a permis d’élaborer une nouvelle stratégie spécifique de lutte contre des espèces d’insectes nuisibles, par exemple contre le puceron du pois Acyrthosiphon pisum , sans affecter les insectes bénéfiques tels que l’abeille domestique Apis mellifera . La technique d’interférence par ARN permet de réguler spécifiquement l’expression d’une protéine. Une fois dans la cellule, les ARN interférents double brin (dsRNA ou ARNdb) sont clivés en petits ARN interférents de 21 à 25 nucléotides (siRNA ou ARNsi) par une RNAse III appelée DICER. Cette ribonucléase transfère alors les siRNA au complexe multienzymatique RISC (RNA-induced silencing complex). Tandis que le brin sens du siRNA nommé « passager » est éliminé, le brin anti-sens « guide », complémentaire à l’ARNm du gène d’intérêt, dirige le complexe RISC vers les ARNm cibles afin de les dégrader, empêchant ainsi leur traduction. La présente invention cible le système cholinergique de l’insecte nuisible et plus précisément les sous-unités nicotiniques neuronales formant les récepteurs nicotiniques (nAChRs) et leurs protéines auxiliaires. Les nAChRs, qui sont les cibles de nombreux insecticides, font partie de complexes transmembranaires qui sont situés au niveau des synapses et permettent la transmission rapide de l’information nerveuse lorsqu’ils sont activés par la liaison de l’ACh. Ce sont des complexes glycoprotéiques pentamériques appartenant à la famille des « Cys-loop » qui comprend différents récepteurs ionotropes appelés « Ligand-Gated Ion Channel » (LGIC) et sont perméables à différents cations (Na + , Ca 2+ et K + ). Ces nAChRs composés de 5 sous-unités peuvent être homomériques (5 sous-unités α identiques) ou hétéromériques (5 sous-unités différentes α ou β). A ce jour, l’analyse du génome de différents insectes a permis d’identifier plusieurs sous-unités nicotiniques : 10 sous-unités α allant de α1 à α10 et 10 sous-unités β allant de β1 à β10, plus leurs isoformes (Jones et al., 2021 ; Dale et al., 2010). Les sous-unités α se différencient des sous-unités β par la présence de 2 cystéines adjacentes dans la partie amino-terminale. La composition en sous-unités nicotiniques des nAChRs permet de définir leurs propriétés électrophysiologiques et pharmacologiques, ainsi que leur sensibilité aux insecticides. A titre d’exemple, le séquençage du génome A. pisum (International Aphid Genomics Consortium, 2010) a permis l’identification de 11 gènes codant pour des sous-unités nicotiniques (Dale et al., 2010). Parmi celles-ci, les sous-unités α9, α10 et β2 sont des sous-unités dites « divergentes », c’est-à-dire qu’elles présentent peu d’homologie de séquence avec des sous-unités nicotiniques connues chez les autres espèces d’insectes. Les inventeurs ont utilisé la technique d’ARN interférent pour cibler une de ces sous-unités, la sous-unité Apisum β2, également appelée β2. Une mise au point a été nécessaire pour déterminer le mode d’application des ARN interférents (dsRNA). Ainsi, une application topique de 400 ng de dsRNA par puceron a été utilisée dans les expériences. Après avoir démontré que cet ARN interférent entrainait bien une diminution du nombre de transcrits codant pour β2, les inventeurs ont démontré que les pucerons ayant reçu en application topique ces dsRNA présentaient une augmentation du taux de mortalité d’environ 6%, 31% et 51% à 24h, 48h et 72h respectivement après l’application. Compte tenu du fait que la composition en sous-unités nicotiniques des nAChRs détermine leur sensibilité aux insecticides, la diminution de l’expression des ARNm de la sous-unité β2 par les dsRNA spécifiques observée chez le puceron du pois suggère une modification de la composition des nAChRs conduisant à une modulation de l’efficacité d’un traitement insecticide. Les résultats expérimentaux montrent que des pucerons adultes ayant absorbé les dsRNA contre la sous-unité β2, puis intoxiqués avec de l’imidaclopride à une concentration proche de la CL 50 , à savoir 5.10 -3 µg/mL, ont une mortalité légèrement accrue (1,4 fois) 72h après l’intoxication aigüe, par rapport aux pucerons témoins. Ainsi, l’utilisation des dsRNA spécifiques induisant une modification de la composition des nAChRs permettrait de rendre les insectes plus sensibles à l’insecticide. Cet effet synergique est détaillé ci-après dans les exemples. - Procédé de lutte contre des insectes nuisibles par inhibition de la traduction des ARNm d’un gène cible appartenant au système cholinergique de l’insecte induite par interférence par ARN. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu’il comprend les étapes consistant à : préparer un ARN double brin spécifique d’un ARNm cible ; administrer l’ARN double brin à au moins un insecte nuisible dans une quantité efficace pour induire la mortalité ou la sensibilité à un insecticide de l’insecte ciblé. - Procédé selon la revendication 1, caractérisé par le fait qu’il comprend les étapes consistant à : préparer un oligonucléotide antisens simple brin spécifique d’un ARNm cible ; administrer l’oligonucléotide antisens simple brin à au moins un insecte nuisible dans une quantité efficace pour induire la mortalité ou la sensibilité à un insecticide de l’insecte ciblé. - Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé par le fait que l’ARNm cible est choisi dans le groupe comprenant les ARNm du groupe de sous-unités neuronales α du récepteur nicotinique, les ARNm du groupe de sous-unités neuronales β du récepteur nicotinique, les ARNm codant pour les protéines et molécules auxiliaires, et leurs isoformes, et une protéine de l’interactome du récepteur nicotinique. - Procédé selon la revendication 4, caractérisé par le fait que l’ARNm cible est choisi dans le groupe consistant en les ARNm du groupe de sous-unités neuronales α du récepteur nicotinique de Acyrthosiphon pisum , à savoir les ARNm codant pour la sous-unité neuronale α1 du récepteur nicotinique, les ARNm codant pour la sous-unité neuronale α2 du récepteur nicotinique, les ARNm codant pour la sous-unité neuronale α3 du récepteur nicotinique, les ARNm codant pour les isoformes de la sous-unité neuronale α4 du récepteur nicotinique, les ARNm codant pour les isoformes de la sous-unité neuronale α6 du récepteur nicotinique, les ARNm codant pour les isoformes de la sous-unité neuronale α7 du récepteur nicotinique, les ARNm codant pour la sous-unité neuronale α8 du récepteur nicotinique, les ARNm codant pour la sous-unité neuronale α9 du récepteur nicotinique, les ARNm codant pour la sous-unité neuronale α10 du récepteur nicotinique, et leurs isoformes ; ou l’ARNm cible est choisi dans le groupe consistant en les ARNm du groupe de sous-unités neuronales β du récepteur nicotinique de Acyrthosiphon pisum, à savoir les ARNm codant pour la sous-unité neuronale β1 du récepteur nicotinique et les ARNm codant pour la sous-unité neuronale β2 du récepteur nicotinique, et leurs isoformes. - Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé par le fait que l’ARN double brin ou oligonucléotide antisens simple brin est administré par un mode d’administration topique, par pulvérisation, par vaporisation, par l’intermédiaire de nanoparticules de type nanoparticules lipidiques, chitosane, liposomes, niosomes, dendrimères cationiques, de lipoplexes, par voie alimentaire, par piégeage dans une boîte appât, par irrigation des cultures. - Procédé selon l’une quelconque des revendications 1-4 et 6, caractérisé par le fait que l’insecte nuisible est au moins l’un choisi parmi les insectes phytophages, les insectes saprophages et détritiphages, les insectes prédateurs, les insectes parasites et les insectes commensaux, les insectes hématophages, en particulier parmi les insectes phytophages, plus particulièrement Helicoverpa armigera , Bemisia tabaci , Plutella xylostella , Tribolium castaneum , Myzus persicae , Spodoptera frugiperda , Aphis gossypii , Nilaparvata lugens , Spodoptera exigua , Ceratitis capitata , Cydia pomonella , Acyrthosiphon pisum , Diaphorina citri ou Thrips tabaci , en particulier Acyrthosiphon pisum . - Procédé selon la revendication 6, caractérisé par le fait que l’ARN double brin ou oligonucléotide antisens est administré en alimentant au moins un insecte avec un organisme transgénique exprimant l’ARN double brin ou l’oligonucléotide antisens. - Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l’organisme transgénique est une plante transgénique. - Composition insecticide pour insectes nuisibles, la composition comprenant un ARN double brin ou un oligonucléotide antisens et au moins l’un parmi un agent de transfection et un solvant, dans laquelle ledit ARN double brin ou oligonucléotide antisens comprend une séquence nucléotidique qui est au moins à 90% identique avec au moins une partie de la séquence d’un ARNm cible, l’ARNm cible étant choisi dans le groupe comprenant les séquences codantes des gènes du groupe de sous-unités neuronales α du récepteur nicotinique, des gènes du groupe de sous-unités neuronales β du récepteur nicotinique, et de leurs isoformes, les séquences nucléotidiques des gènes codant pour les protéines et molécules auxiliaires du récepteur nicotinique, et leurs isoformes, ou pour une protéine de l’interactome du récepteur nicotinique. - Composition insecticide selon la revendication 10, dans laquelle l’agent favorisant la transfection comprend un composé lipidique, un liposome, un niosome, une nanoparticule lipidique, un dendrimère, un virus d’insecte. - Composition insecticide selon l’une quelconque des revendications 10 ou 11, comprenant en outre un ou plusieurs agents choisis parmi un agent synergique, un agent répulsif et un agent attractif. - Composition insecticide selon l’une quelconque des revendications 10 à 12, comprenant en outre un support acceptable du point de vue agricole, agroalimentaire, sanitaire et/ou environnemental. - Composition insecticide selon l’une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisée par le fait que la composition est formulée sous la forme d’un appât pour le ou les insectes nuisibles. - Cellule végétale, tissu végétal ou plante transgénique comprenant au moins un acide nucléique qui est ou transcrit afin de produire un ARN double brin, dans lequel ou laquelle l’ARN double brin comprend une séquence nucléotidique ayant au moins 90% d’identité avec au moins une partie de la séquence d’un ARNm cible, l’ARNm cible étant choisi dans le groupe consistant en les séquences codantes des gènes du groupe de sous-unités neuronales α du récepteur nicotinique, les séquences codantes des gènes du groupe de sous-unités neuronales β du récepteur nicotinique, et de leurs isoformes, les séquences nucléotidiques des gènes codant pour les protéines et molécules auxiliaires du récepteur nicotinique, et leurs isoformes, ou pour une protéine de l’interactome du récepteur nicotinique. - Cellule végétale, tissu végétal ou plante transgénique selon la revendication 15, dans lequel ou laquelle l’ARN double brin présente au moins 20 paires de bases de longueur, en particulier 20-2000 paires de bases de longueur, de préférence 20-900 paires de bases de longueur. - ARN interférent dans lequel l’ARN double brin inhibe la traduction des ARNm correspondant à la séquence codante de l’un quelconque des gènes du groupe de sous-unités neuronales α du récepteur nicotinique, des gènes du groupe de sous-unités neuronales β du récepteur nicotinique, et de leurs isoformes, à une quelconque des séquences nucléotidiques des gènes codant pour les protéines et molécules auxiliaires du récepteur nicotinique, et leurs isoformes, ou à la séquence d’ADN codant pour une protéine de l’interactome du récepteur nicotinique. – Oligonucléotide antisens dans lequel l’oligonucléotide antisens inhibe la traduction des ARNm correspondant à la séquence codante de l’un quelconque des gènes du groupe de sous-unités neuronales α du récepteur nicotinique, des gènes du groupe de sous-unités neuronales β du récepteur nicotinique, et de leurs isoformes, à une quelconque des séquences nucléotidiques des gènes codant pour les protéines et molécules auxiliaires du récepteur nicotinique, et leurs isoformes, ou à la séquence d’ADN codant pour une protéine de l’interactome du récepteur nicotinique. - Utilisation d’ARN interférent selon la revendication 17 ou d’oligonucléotide antisens selon la revendication 18 comme bioinsecticide. - Utilisation d’ARN interférent selon la revendication 17 ou d’oligonucléotide antisens selon la revendication 18 comme agent synergisant de l’effet insecticide d’un insecticide ou d’une molécule à effet insecticide contre un insecte nuisible. - Utilisation d’ARN interférent ou d’oligonucléotide antisens selon la revendication 20, dans laquelle l’insecticide comprend les néonicotinoïdes, en particulier l’imidaclopride, la clothianidine, l’acétamipride, le dinotéfurane, le nitenpyrame, le thiaclopride et le thiaméthoxame, les spinosynes, les buténolides, les mésoioniques, les sulfoximines, les carbamates, les pyréthrinoïdes, les oxadiazines et les organophosphorés ou la molécule à effet insecticide comprend une substance naturelle, une huile essentielle, une phéromone. - Utilisation d’ARN interférent selon la revendication 17 ou d’oligonucléotide antisens selon la revendication 18 comme agent de restauration de la sensibilité d’un insecte nuisible vis-à-vis d’un insecticide.