FR 3131679 A1 20230714 FR 2200267 A 20220113 L’invention a trait au domaine de la production d’acides p -hydroxycinnamiques. Plus particulièrement l’invention concerne un procédé semi-intégré comprenant une première étape d’hydrolyse enzymatique et une seconde étape de purification des acides p -hydroxycinnamiques, ainsi libérés, par extraction liquide/liquide utilisant un contacteur membranaire. Ce procédé permet la purification d’acides p -hydroxycinnamiques à partir d’une biomasse végétale et leur récupération en phase organique. Il est envisageable de récupérer les acides p -hydroxycinnamiques en phase aqueuse après une étape de désextraction. PROCEDE SEMI-INTEGRE D’EXTRACTION ASSISTEE PAR ENZYMES ET DE PURIFICATION D’ACIDES P -HYDROXYCINNAMIQUES L’invention a trait au domaine de la production d’acides p -hydroxycinnamiques. Plus particulièrement l’invention concerne un procédé semi-intégré comprenant une première étape d’hydrolyse enzymatique et une seconde étape de purification des acides p -hydroxycinnamiques, ainsi libérés, par extraction liquide/liquide utilisant un contacteur membranaire. Ce procédé permet la purification d’acides p -hydroxycinnamiques à partir d’une biomasse végétale et leur récupération en phase organique. Il est envisageable de récupérer les acides p -hydroxycinnamiques en phase aqueuse après une étape de désextraction. Domaine de l’invention Les acides p -hydroxycinnamiques sont des molécules disposant de nombreuses et diverses activités biologiques (antioxydante, anti-inflammatoire, antimicrobienne…). Ils sont également des synthons de choix pour la production de molécules anti-UV, antioxydantes, antimicrobiennes, de substituts au bisphénol A, de monomères et polymères biosourcés. Actuellement, les acides p -hydroxycinnamiques peuvent s’obtenir par synthèse chimique, par voie biotechnologique ou par récupération à partir de la biomasse [1]. La voie de synthèse chimique la plus utilisée est une condensation de Knoevenagel-Doebner entre l’acide malonique et l’aldéhyde correspondant, avec utilisation de pyridine comme solvant et d'aniline comme catalyseur. Des développements pour rendre la synthèse plus verte ont été opérés, en substituant la pyridine par de l'éthanol et l'aniline par de la proline, cependant les acides p -hydroxycinnamiques obtenus ne peuvent avoir la mention « molécule naturelle » [2-5]. En ce qui concerne la production par voie biotechnologique, la construction et l'insertion d'une voie métabolique dans des levures ainsi que la surexpression des gènes correspondant permet de produire les acides p -hydroxycinnamiques [6-9]. Les molécules obtenues peuvent être considérées comme naturelles, cependant, seule la voie de production d’acide p -coumarique a actuellement une productivité suffisamment élevée pour être industrialisable. La 3 e voie est l’obtention de ces acides par extraction puis purification à partir de biomasse. Dans ce cas, de nombreuses opérations unitaires doivent être mises en œuvre afin d’obtenir les acides p -hydroxycinnamiques avec une grande pureté car ces molécules sont présentes dans la biomasse végétale à hauteur de 1 à 2% massique. De nombreux travaux sont recensés dans la littérature mais peu ont travaillé au développement d’une chaine de production d’acides p -hydroxycinnamiques de l’extraction à la purification. Même si des rendements élevés peuvent être atteints après purification, le coût de production reste un obstacle à l’industrialisation. Deux cas de figure sont rencontrés : soit l’acide ou ses dérivés sont présents sous forme libre (par exemple dans le son de moutarde [10-12], les tourteaux de colza [13-15], les co-produits d’endives [16-18]) soit ils sont présents sous forme liée aux parois végétales (par exemple dans le son de blé [19-21]). Dans le premier cas, il est nécessaire d’extraire la molécule puis éventuellement de la convertir en acide p -hydroxycinnamique. Cette conversion s’effectue la plupart du temps à l’aide de solutions alcalines. Dans le second cas, une hydrolyse alcaline permet de libérer les acides des parois de la biomasse et une extraction quasi-simultanée se produit alors dans le milieu. Dans les deux cas, les milieux liquides résiduels peuvent être purifiés par différentes technologies : l’extraction liquide-liquide, les procédés membranaires [10 ;19], les supports d’absorption, d’adsorption ou d’échange d’ions [12 ; 14 ; 20 ; 21]. Toutefois, l’utilisation de solutions alcalines induit la perte de naturalité des molécules produites. Certaines études ont privilégié l’emploi d’enzymes, permettant alors de conserver la naturalité des molécules, cependant il est alors nécessaire d’adapter les conditions opératoires des autres opérations unitaires à leur utilisation. L’obtention des acides p -hydroxycinnamiques par extraction/purification à partir de la biomasse semble être la voie la plus pertinente en termes de développement et d’exploitation, notamment par l’utilisation possible de co-produits agro-industriels. Toutefois, aucun procédé industrialisable flexible et applicable à l’ensemble des acides p -hydroxycinnamiques n’est disponible à ce jour. L’art antérieur rapporte des études portant sur chaque opération unitaire comme par exemple l’extraction des dérivés d’acides p -hydroxycinnamiques (sinapine, acide chlorogénique), la conversion enzymatique en acides p -hydroxycinnamiques ou leur purification. Seul Thiel et al. (2015) ont proposé un procédé intégré de séparation pour récupérer simultanément les protéines, l’acide sinapique et l’acide phytique à partir de colza (WO 2015/181203 AI). Ce brevet met en œuvre une extraction aqueuse avec une hydrolyse alcaline simultanée suivie par une purification par adsorption sur zéolithes. La conversion enzymatique pour l’obtention d’acides p -hydroxycinnamiques à la suite d’une extraction aqueuse a été étudiée par Odinot et al. (2017). Ils ont décrit un procédé de préparation d’un composé vinylphénolique à partir d’un acide hydroxycinnamique précurseur issu d’un tourteau oléagineux (WO2017/072450 A1). Les enzymes utilisées ont été produites par des souches d’ Aspergillus Niger . Construire des filières industrielles pour la production de ces acides p -hydroxycinnamiques et leurs nombreux dérivés à haute valeur ajoutée requiert un accès à ces acides en volumes relativement importants, mais surtout avec un coût suffisamment bas. A ces contraintes s’ajoutent l’intérêt des consommateurs pour des molécules « naturelles » par rapport à des molécules issues de synthèse chimique. Il existe un besoin de disposer d’un procédé industrialisable de purification d’acides p -hydroxycinnamiques à partir d’une biomasse. Les inventeurs ont développé un procédé innovant de production d’acides p -hydroxycinnamiques dans un milieu aqueux, à partir d’une biomasse végétale. Plus particulièrement, le procédé selon l’invention comprend les deux étapes suivantes, représentées à la : Etape 1 : Extraction solide/liquide avec hydrolyse enzymatique en condition acide desdits acides p -hydroxycinnamiques qui sont soit greffés aux hémicelluloses, soit présents sous forme de dérivés esters ; Etape 2 : Purification des dits acides p -hydroxycinnamiques libérés à l’étape 1 par une extraction liquide/liquide couplée à un contacteur membranaire composé de membranes à fibres creuses. Il permet notamment la production au niveau industriel d’acide sinapique, d’acide férulique et d’acide caféique. Avantages de l’invention Le procédé de production d’acides p -hydroxycinnamiques comprend l’intégration de plusieurs opérations unitaires afin de réduire le nombre d’étapes, et il permet la conservation de la naturalité des molécules par la mise en œuvre de procédés d’éco-extraction utilisant des enzymes. Les avantages de ce procédé sont nombreux. En premier lieu, il s’agit d’un procédé intégrant l’extraction et l’hydrolyse enzymatique en une seule étape, sans changement de milieu. Ainsi l’optimisation des deux opérations a été faite sous contraintes. Le gain de cette intégration est la diminution des volumes utilisés, la suppression d’étapes intermédiaires pour changer le solvant entre l’extraction et la conversion. De plus, aucun ajustement de pH n’est nécessaire pour la conversion enzymatique (pas d'ajout de base ou d'acide). En second lieu, le procédé de production proposé est vert, durable et à coûts maitrisés. Aucun solvant organique n’est utilisé pour l’extraction Solide/Liquide, aucun sel n’est généré par conversion chimique. Les molécules d’intérêt produites par ce procédé sont donc dénuées de contaminants. En particulier, l’innovation du procédé repose sur la combinaison d’une conversion enzymatique avec l’utilisation d’un contacteur membranaire. Lors de l’étape d’extraction-hydrolyse enzymatique, les molécules sont libérées dans un milieu aqueux. Or, ces molécules sont de nature hydrophobe et vont donc avoir tendance à passer dans le solvant organique au niveau du contacteur. L’utilisation du contacteur membranaire permet donc un enrichissement de la phase organique en molécules d’intérêt. Ceci contribue à l’obtention d’un rendement de purification élevé. Les molécules d’intérêt étant par la suite récupérées sous forme solide par différentes méthodes classiques (évaporation, désextraction). L’utilisation d’un contacteur membranaire permet une extraction liquide/liquide avec une surface d’échange constante et en évitant la formation d’émulsions apparaissant lors de la mise en contact de la phase aqueuse et organique. En troisième lieu, l’étape de purification présente une forte sélectivité, ce qui permet de diminuer le nombre d’opérations unitaires permettant de récupérer les acides p -hydroxycinnamiques avec une pureté élevée et ainsi de diminuer le coût du procédé de purification. Enfin, compte tenu des optimisations décrites précédemment, le procédé permet une montée en échelle en vue de son industrialisation. Le procédé permet donc d’envisager la production de volumes importants d’acides p -hydroxycinnamiques, qui plus est en milieu aqueux, ce qui ouvre la voie à de nouvelles applications dans des domaines où la présence de solvant est proscrite, mais également à toute application qui requiert des quantités importantes d’acides p -hydroxycinnamiques. DESCRIPTION DES FIGURES : Représentation synthétique des deux étapes du procédé de production des acides p-hydroxycinnamiques selon l’invention. : Représentation industrielle du procédé de production d’acides p-hydroxycinnamiques selon l’invention. PARTIE EXPERIMENTALE EXEMPLE 1 : Description des principes généraux du procédé d’extraction d’acides p -hydroxycinnamiques selon l’invention Le procédé selon l’invention est composé d’opérations unitaires qui ont été optimisées en fonction de la biomasse initiale de l’acide à produire pour fournir un fort rendement et un degré de pureté élevé. Cependant la mise en œuvre générale reste la même pour tout type de biomasse. Quatre exemples de mise en œuvre de ce procédé à partir de biomasse différente sont décrits ci-après : La récupération d’acide sinapique à partir de son de moutarde et de tourteaux de colza (Exemple 2) La récupération d’acide sinapique à partir de tourteaux de colza (Exemple 3) La récupération d’acide férulique à partir de son de blé (Exemple 4) La récupération d’acide caféique à partir de racines d’endive (Exemple 5) Pour chaque exemple, un schéma descriptif précisant les conditions opératoires de chaque opération unitaire est fourni ; les étapes générales sont représentées à la . La teneur en acide p -hydroxycinnamique a été déterminée par chromatographie liquide à l’aide de solutions standards. Le rendement en acide p -hydroxycinnamique est déterminée selon l’équation 1 : Avec , la concentration en acide p -hydroxycinnamique (mg/g Matière Sèche ) obtenue soit par une opération unitaire ou par le procédé semi-intégré proposé dans ce document et , la concentration en acide p -hydroxycinnamique (mg/g Matière Sèche ) obtenue par un procédé témoin. Le procédé témoin est constitué d’opérations unitaires optimisées individuellement, sans étudier le procédé dans sa globalité. L’extraction témoin a été réalisée dans un mélange 70%v éthanol et 30%v eau à 75 °C. La conversion témoin est basée sur une hydrolyse chimique. Nous considérons que la concentration obtenue par le procédé témoin est la concentration maximum en acide p -hydroxycinnamique que l’on peut obtenir à partir de la biomasse de départ. La pureté de l’extrait en sortie de purification est déterminée selon l’équation 2 : Avec , la masse d’acide p -hydroxycinnamique (mg) obtenue soit après chaque opération unitaire soit après purification et , la masse de matière sèche présente dans l’extrait purifié. Les résultats obtenus portent sur l’optimisation de l’extraction assistée par enzymes et du procédé de purification. Le tableau 1 résume les conditions opératoires mises en œuvre pour chacun des exemples 2 à 5. Etape Conditions opératoires Exemple 2 Exemple 3 Exemple 4 Exemple 5 Extraction assistée par enzymes Extraction en milieu aqueux Ratio S/L 10 – 100 mL/g MS 100 mL/g MS 2 à 10% MS 1/10 - 1/50 gM/mLS T° d’extraction 30 à 100 °C 100 °C 30 à 60 °C T° amb-100 °C Temps De 20 min à 2h40 40 min 6 -24h 5 - 120 min Hydrolyse Enzymes Depol 740L, Ultraflo XL, Deltazym VR AC-100, Pectinase PL Amano, Rumen FAE Deltazym VR AC-100 Ultraflo XL (G)/ Pectinase PL (P) / Celluclast 1.5L (C) Pectinase PL "Amano" / Pectinex Ultra SP/ T° 30 – 75 °C 50 °C 30 à 60 °C T° amb-60 °C pH 4,2 ± 0,1 5,9 3,75 – 5,75 4-à-8 Concentration Enzyme 60 – 1250 µL/gMS 1250 µL(solution enzymatique)/gMS Ratio G/C : de 20% à 100% De 0 à 2 mL pour 100 mL (P) 50 à 150 mg de solution enzymatique/g MS Purification Solvants (phase organique) MIBK, CPME, octanol, acétate d’octyle, acétate de lauryle MIBK, acétate d’octyle, alcool oléique Acétate d’éthyle Octanol Décanol Alcool oléique MIBK pH milieu aqueux 4,2 ± 0,1 pH 4,0 – 5,9 5,5 5,5 Ratio aqueux/ organique (1 :1) et (1:2)v avec l’hydrolysat végétal (1:2)v – (1:10)v avec une solution modèle (1:1)v max avec l’hydrolysat végétal (1 :1) et (1:2)v avec l’hydrolysat végétal (1:2)v – (1:5)v avec une solution modèle T° Ambiante Tableau 1 : Conditions opératoires mises en œuvre dans le cadre de l’optimisation Le screening des cocktails enzymatiques a consisté à mesurer leur activité secondaire (caffeoyl, feruloyl ou sinapoyl estérase). Pour cela, sur une solution modèle d’ester d’acide p -hydroxycinnamique, l’activité estérase du cocktail a été mesurée par spectrophotométrie (différence d'absorbance entre la forme ester et la forme acide des molécules dosées). Le taux de conversion de l’ester en acide p -hydroxycinnamique a été mesuré durant 10 minutes aux températures 25 - 35 - 45 - 50 - 55 °C et à un pH de 6 - 7 - 8. Le cocktail retenu est celui qui permet le meilleur taux de conversion. EXEMPLE 2 : Production d’acide sinapique à partir de son de moutarde Le son de moutarde est mis en suspension dans une solution aqueuse (eau milliQ). L’ensemble est agité (agitation mécanique à 60 rpm) et chauffée à 100 °C pendant 20 minutes. Un temps de repos de 30 minutes dans un bain d’huile thermostaté à 40 °C est opéré. Une fois la température de 40 °C atteinte, la solution enzymatique est alors ajoutée permettant de réaliser la conversion en acide sinapique. La séparation du solide et de l’extrait liquide est effectuée par centrifugation (4000 g, 20 min, 4 °C). Ce dernier est filtré par microfiltration afin d’enlever les particules ayant un diamètre supérieur à 2-3 µm. Le filtrat obtenu correspond à la phase aqueuse. La purification s’effectue par extraction liquide/liquide à travers une membrane (contacteur membranaire). Une phase aqueuse contenant l’acide sinapique est mise en contact à travers une membrane avec une phase organique. L’acide sinapique ayant plus d’affinité avec la phase organique qu’avec la phase aqueuse, celui-ci va diffuser et enrichir la phase organique. En fonction du type de phase organique, différentes méthodes pourront être mises en œuvre pour récupérer l’acide sinapique sous forme solide. EXEMPLE 3 : Production d’acide sinapique à partir de tourteaux de colza Le tourteau de colza est mis en suspension dans une solution aqueuse (eau milliQ). L’ensemble est agité (agitation mécanique à 60 rpm) et chauffée à 100 °C pendant 20 minutes. Un refroidissement est opéré à l’aide d’un bain d’huile thermostaté à 40 °C pendant 50 minutes pour atteindre la température de 50 °C. La solution enzymatique est alors ajoutée permettant de réaliser la conversion en acide sinapique. La séparation du solide et de l’extrait liquide est effectuée par centrifugation (4000 g, 20 min, 4 °C). Ce dernier est filtré par microfiltration afin d’enlever les particules ayant un diamètre supérieur à 2-3 µm. Le filtrat obtenu correspond à la phase aqueuse. Celle-ci est acidifiée à pH 4,5 avec de l’acide acétique. La purification s’effectue par extraction liquide/liquide à travers une membrane (contacteur membranaire). Une phase aqueuse contenant l’acide sinapique est mise en contact à travers une membrane avec une phase organique. L’acide sinapique ayant plus d’affinité avec la phase organique qu’avec la phase aqueuse, celui-ci va diffuser et enrichir la phase organique. En fonction du type de phase organique, différentes méthodes pourront être mises en œuvre pour récupérer l’acide sinapique sous forme solide. EXEMPLE 4 : Production d’acide férulique à partir de son de blé Le son de blé (non désamidonné) subit un broyage puis un tamisage pour obtenir des particules de taille comprise entre 180 μm et 850 μm. Le son de blé est ensuite autoclavé (121 °C pendant 20 min) et mis en suspension dans une solution aqueuse (eau milliQ) à 50 °C. Les enzymes sont ensuite ajoutées au milieu qui reste agité pendant 24h, ce qui permet l’obtention d’acide férulique à partir de la lignocellulose du son de blé. La séparation du solide et de l’extrait liquide est effectuée par centrifugation (4000g, 20 min, 4 °C). Ce dernier est filtré par microfiltration afin d’enlever les particules ayant un diamètre supérieur à 2-3 µm. Le filtrat obtenu correspond à la phase aqueuse. La purification s’effectue par extraction liquide/liquide à travers une membrane (contacteur membranaire). Une phase aqueuse contenant l’acide férulique est mis en contact à travers une membrane avec une phase organique. L’acide férulique ayant plus d’affinité avec la phase organique qu’avec la phase aqueuse, celui-ci va diffuser et enrichir la phase organique. En fonction du type de phase organique, différentes méthodes pourront être mises en œuvre pour récupérer l’acide férulique sous forme solide. EXEMPLE 5 : Production d’acide caféique à partir de co-produits d’endives Les racines d’endives séchées et broyées ( La séparation du solide et de l’extrait liquide est effectuée par centrifugation. Ce dernier est filtré par microfiltration afin d’enlever les particules ayant un diamètre supérieur à 2-3 µm. Le filtrat obtenu correspond à la phase aqueuse. La purification s’effectue par extraction liquide/liquide à travers une membrane (contacteur membranaire). Une phase aqueuse contenant l’acide caféique est mis en contact à travers une membrane avec une phase organique. L’acide caféique ayant plus d’affinité avec la phase organique qu’avec la phase aqueuse, celui-ci va diffuser et enrichir la phase organique. En fonction du type de phase organique, différentes méthodes pourront être mises en œuvre pour récupérer l’acide caféique sous forme solide. Procédé de production d’acides p -hydroxycinnamiques à partir d’une biomasse végétale, comprenant deux étapes : Etape 1 : Extraction solide/liquide avec hydrolyse enzymatique en condition acide desdits acides p -hydroxycinnamiques qui sont soit greffés aux hémicelluloses, soit présents sous forme de dérivés esters ; Etape 2 : Purification des dits acides p -hydroxycinnamiques libérés à l’étape 1 par une extraction liquide/liquide couplée à un contacteur membranaire composé de membranes à fibres creuses. Procédé selon la revendication 1 dans lequel l’hydrolyse enzymatique permet de libérer les acides p -hydroxycinnamiques greffés aux hémicelluloses, caractérisé en ce que ladite hydrolyse est réalisée par au moins un cocktail enzymatique comprenant au moins une enzyme choisie parmi au moins une pectinase, une hemicellulase, une beta-glucanase, une estérase, une xylanase, une arabinoxylase. Procédé selon l’une des revendications précédentes, dans lequel à l’étape 2 le pH est ajusté entre 4 et 6 lorsque le pH du milieu à l’issue de l’étape 1 est supérieur ou inférieur. Procédé selon l’une des revendications précédentes dans laquelle l’extraction de l’étape 2 est réalisée dans un milieu aqueux en utilisant un solvant organique. Procédé selon la revendication 4 dans lequel ledit solvant organique est choisi parmi au moins l’un des solvants suivants : 4-méthylpentan-2-one (MIBK), méthoxycyclopentane (CPME), alcools gras (octanol, décanol, alcool oléique), esters gras (acétate d’octyle, acétate de lauryle). Procédé selon l’une des revendications 1 à 5 dans lequel ledit acide p -hydroxycinnamique est de l’acide sinapique à partir de son de moutarde et/ou de tourteaux de colza Procédé selon l’une des revendications 1 à 5 dans lequel ledit acide p -hydroxycinnamique est de l’acide férulique à partir de son de blé, de pulpe de betterave, de rafle de maïs Procédé selon l’une des revendications 1 à 5 dans lequel ledit acide p -hydroxycinnamique est de l’acide caféique à partir de racines d’endive et/ou marc de café