FR 3135278 A1 20231110 FR 2204315 A 20220506 L’invention concerne un microtissu hépatique un microtissu hépatique particulier dont la plus grande dimension est comprise entre 500 et 700 µm et exprimant la monooxygénase CYP3A4 avec une activité d’au moins 75000 RLU par million de cellules et produisant au moins 18µg d’urée par million de cellules par 24 heures. L’invention a également pour objet un procédé de préparation d’un tel microtissu hépatique et ses utilisations dans le traitement ou la prévention de l’insuffisance hépatique. Microtissu hépatique particulier et utilisations dans le traitement de l’insuffisance hépatique La présente invention se rapporte au traitement de l’insuffisance hépatique par l’utilisation d’un microtissu hépatique obtenu à partir de microcompartiments cellulaires particulier. L’invention a en particulier pour objet un microtissu hépatique particulier, son procédé de préparation et ses utilisations Art antérieur Le foie est un des organes les plus complexes du corps humain. Partie intégrante du système digestif, le foie est constamment approvisionné en substances nutritives ou toxiques issues de la digestion. Le traitement de ces substances par le foie est essentiel pour l’organisme et à comme objectifs : - le stockage et la répartition des nutriments issus de la digestion - la dégradation des substances toxiques - la synthèse de la plupart des protéines du sang, et -la production de bile. Pour assurer ces fonctions, le foie est composé d’une grande variété de cellules, tels que des hépatocytes, des cellules des voies biliaires (cholangiocytes), des cellules étoilées (cellules de Ito), des cellules de Kupffer, des cellules souches mésenchymateuse et des cellules endothéliales. Les hépatocytes sont les cellules hépatiques les plus représentées et sont responsables de la majorité des fonctions hépatiques, de la synthèse des acides gras à la production de l’urée en passant par la synthèse de protéines plasmatiques. Les cholangiocytes sont les cellules épithéliales polarisées formant les parois des voies biliaires. Ils ont un rôle dans la régulation de la sécrétion de la bile et dans la collecte de celle-ci afin de la transporter des hépatocytes vers l’intestin. Les autres cellules assurent une bonne vascularisation ainsi que des fonctions de signalisation et d’interactions avec les autres cellules hépatiques et avec les cellules du système immunitaire. Lorsque le foie ne peut plus assurer ses fonctions, on parle d’insuffisance hépatique. Les principales causes d’insuffisances hépatiques sont les infections virales, les surdoses médicamenteuses, les désordres immunologiques, les maladies héréditaires ou des troubles de la circulation du sang. Lorsque l’atteinte aux fonctions du foie est irréversible, le traitement recommandé est la transplantation de foie. Ainsi, la transplantation de foie représente le traitement standard pour les personnes atteintes d’une maladie hépatiques en phase terminale. Il existe aujourd’hui de grandes difficultés à trouver des donneurs d’organes pouvant fournir un foie ayant une qualité suffisante pour la réalisation d’une greffe. Comme toute transplantation d’organe, la transplantation hépatique peut s’effectuer uniquement si le foie présente une bonne qualité afin d’éviter les risques associés à la greffe tels que des infections, des cancers, une immunosuppression trop longue et une chirurgie lourde. Aujourd’hui, seulement 2/3 des patients peuvent bénéficier d’une greffe et seulement lorsque leur qualité de vie s’est très largement dégradée. Par ailleurs, le coût à prévoir pour une transplantation hépatique est de l’ordre de 1M€ (soit 1M$) aux Etats-Unis. Face à ces problématiques, plusieurs solutions innovantes ont pu voir le jour. La transplantation d’hépatocytes isolés est apparue comme une approche séduisante, cependant les essais cliniques sont restés peu nombreux et peu concluant, limités par les faibles survie, intégration et expansion des hépatocytes isolés suite à la greffe in vivo, facteurs par conséquent limitant des effets thérapeutiques à court et à long terme. En effet, les hépatocytes isolés issus de donneurs présentent une capacité de prolifération in vivo et in vitro très limitée. De plus, les hépatocytes isolés mis en culture ont tendance à entrer dans un processus de dédifférenciation diminuant ainsi les chances d’obtenir un nombre suffisant d’hépatocytes matures. Bien que cette technique permette de traiter un nombre important de patients, la dose administrée est bien souvent insuffisante et présente un risque lors de l’injection d’échappement des cellules dans la circulation générale. Cela est principalement dû à la difficulté pour des cellules uniques de s’intégrer au sein du foie, ainsi qu’une mauvaise qualité induite par la préparation des cellules primaires et leur culture in vitro et au rejet d’une partie des hépatocytes malgré l’immunosuppression. Par conséquent, le faible nombre de donneurs d’hépatocytes, la stabilité et la fonctionnalité limitée de ces hépatocytes constituent un frein à leur utilisation Le développement de protocoles de différenciation guidée de cellules souches pluripotentes, c’est-à-dire de cellules souches embryonnaires et de cellules souches pluripotentes induites, a cependant permis d’obtenir une source quasi inépuisable d’hépatocytes. Bien que prometteurs, les hépatocytes dérivés de cellules pluripotentes sont très difficilement cultivables à grande échelle et engendrent des coûts de production démesurés. A titre d’exemple, le coût prévu pour la production de greffons hépatiques autologue issu de cellules souches pluripotentes induites est de l’ordre de 9,7 millions de dollars. A ce jour, les protocoles de différenciations guidés ne permettent pas de produire une diversité de phénotypes de cellules fonctionnelles et notamment suffisamment d’hépatocytes matures, les cellules obtenues conservent des caractéristiques d’hépatocytes du foie fœtal avec notamment une expression persistante d’alpha-foetoprotéine ainsi qu’une faible production d’albumine. Néanmoins, certains protocoles permettent d’obtenir des cellules hépatiques avec de meilleures caractéristiques fonctionnelles. Ces protocoles restent complexes et nécessitent des étapes de dissociations, de réagrégation ou de co-cultures avec notamment des cellules souches mésenchymateuses et des cellules endothéliales. Ces étapes supplémentaires ajoutent des risques supplémentaires, augmentant le cout total et diminuant la maitrise du produit fini. Pour une application en thérapie cellulaire, il est nécessaire de pouvoir adapter les procédés existants pour : i) obtenir une production avec un nombre d’étapes limitées pour être efficace à grande échelle, ii) améliorer l’intégration des cellules greffées. Les techniques développées aujourd’hui ne permettent pas de produire de microtissu hépatique obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites adapté à la culture à grande échelle et présentant des hépatocytes fonctionnels. Les processus de production actuels de microtissu hépatiques sont encore trop complexes, présentent des de multiples étapes et donc un coût très important, et sont difficiles à mettre à grande échelle. Il existe donc un besoin important pour une solution permettant une production à grande échelle de microtissu hépatique comprenant plusieurs phénotypes de cellules hépatiques, productible à grande échelle et directement transpantable, pour répondre à une demande indispensable de greffons hépatiques. L’objectif de l’invention est par conséquent de répondre à l’ensemble de ces besoins et de pallier les inconvénients et limites de l’art antérieur. Pour répondre à cet objectif, l’invention propose un microtissu hépatique particulier, adapté à des utilisations en thérapie cellulaire et notamment dans la lutte contre les insuffisances hépatiques. A cet effet, l’invention a pour objet un microtissu hépatique en trois dimensions dont la plus grande dimension est comprise entre 500 et 700µm, exprimant la monooxygénase CYP3A4 avec une activité d’au moins 75000 RLU par million de cellules et produisant au moins 18µg d’urée par million de cellules par 24 heures. Avantageusement, l’activité de la CYP3A4 associée à la production d’urée permet de garantir un microtissu hépatique comprenant au moins des cellules hépatiques fonctionnelles. Préférentiellement, les cellules hépatiques sécrètent au moins 75µg d’albumine par million de cellules par 24h. Ainsi, le microtissu hépatique présente une activité métabolique similaire à un foie en bonne santé. Selon un autre objet, l’invention concernant un microtissu hépatique comprenant au moins 3 phénotypes différents de cellules hépatiques, lesdites cellules du microtissu ayant toutes été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions. Avantageusement, le microtissu hépatique possède une diversité cellulaire suffisante pour restaurer et/ou améliorer les fonctions du foie de manière durable. Préférentiellement, le microtissu hépatique comprend au moins des hépatocytes immatures, des hépatocytes matures et des cholangiocytes. Selon un objet préféré de l’invention, le microtissu hépatique comprend au moins : - des cellules hépatiques, dont au moins 40% des cellules hépatiques sont des cellules exprimant la cytokératine 19 (CK19), et - des cellules exprimant CD73 et CD90. Préférentiellement, les cellules exprimant CD73 et CD90 sont des cellules souches mésenchymateuse et les cellules exprimant CK19 sont des cholangiocytes. Avantageusement, la composition phénotypique du microtissu hépatique est proche de celle d’un foie humain en bonne santé. Préférentiellement, le microtissu hépatique selon l’invention comprend : - au moins un lumen, - au moins une cellule du microtissu en contact à la fois avec un lumen et avec le milieu extérieur au microtissu, et - au moins une cellule entourée uniquement de cellules. Avantageusement, l’organisation du microtissu hépatique est proche de l’organisation du tissu hépatique en cours de développement, ce qui lui permet notamment de favoriser son intégration dans le foie et la bonne exécution des fonctions métaboliques dans le foie traité. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré, le microtissu hépatique se présente sous une forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou ellipsoïdale. Préférentiellement, le microtissu hépatique se présente sous une forme ellipsoïdale. Avantageusement, la forme ellipsoïdale du microtissu permet de favoriser la survie du microtissu hépatique. Ainsi, une plus grande partie des microtissus hépatiques sont intégrés par le foie traité. Préférentiellement, le microtissu hépatique selon l’invention comprend au moins un canal biliaire et/ou au moins un granule de glycogène. Selon un objet préféré de l’invention, le microtissu hépatique comprend : - entre 50 et 99 % de cellules hépatiques dont entre 20 et 60% de cellules exprimant CK19, et - entre 1 et 20 % de cellules exprimant CD73 et CD90. L’invention a également pour objet un ensemble de plusieurs microtissus hépatiques en trois dimensions dans un milieu, dont au moins un microtissu hépatique est un microtissu hépatique selon l’invention. Préférentiellement, au moins 50% (en nombre) des microtissus hépatiques de l’ensemble de microtissus hépatiques, sont des microtissus hépatiques selon l’invention. Selon un autre aspect, l’invention concerne un microcompartiment cellulaire clos en trois dimensions comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant au moins un microtissu hépatique selon l’invention. Le microcompartiment selon l’invention permet de garantir un microenvironnement adapté à la culture de cellules souches pluripotentes et à leur différenciation en cellules constituant le microtissu selon l’invention. En effet, un tel microcompartiment permet de reproduire les conditions in vivo du microenvironnement cellulaire lors de l’organogénèse hépatique. L’invention a également pour objet un ensemble de microcompartiments cellulaires selon l’invention. Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de préparation d’un microcompartiment ou d’un ensemble de microcompartiments comprenant au moins la mise en œuvre des étapes suivantes, la production d’un microcompartiment comprenant des cellules souches pluripotentes induites, l’induction d’une différenciation cellulaire au sein du microcompartiment de manière à obtenir au moins 3 phénotypes différents de cellules hépatiques. Enfin, l’invention vise un microtissu hépatique selon l’invention ou un microcompartiment le contenant, ou un ensemble de microtissus hépatiques selon l’invention ou un ensemble de microcompartiments les contenant, pour son utilisation comme médicament, préférentiellement dans la prévention ou le traitement de l’insuffisance hépatique provoquée par des maladies telles que la fibrose et la cirrhose hépatiques, la stéatose, la stéatose non alcoolique, les hépatites, les maladies métaboliques du foie, les maladies liées à une sécrétion des facteurs VIII, alpha 1 antitrypsine, IX et/ou VWF, la maladie de Wilson et l’hémochromatose héréditaire. D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention et des exemples qui vont suivre. Brève description des figures est une représentation comparative de l’expression des gènes d’intérêts (EOMES, CXCR4, HHEX, PROX1, AFP, ASGR1) au cours de la différenciation en fonction du protocole de différenciation. est une représentation comparative de l’expression des gènes d’intérêts (SOX17, FOXA2, TBX, HNF4A, ALB, KT18) au cours de la différenciation en fonction du protocole de différenciation. est une représentation comparative de l’expression des gènes d’intérêts (GATA4, HNF1B, SOX9, KT19, TAT) au cours de la différenciation en fonction du protocole de différenciation. est une représentation comparative de l’expression des gènes d’intérêts (EOMES, CXCR4, FOXA2, SOX17) en fonction des conditions de culture. est une représentation comparative de l’expression de protéines d’intérêts (SOX17, FOXA2) en fonction des conditions de culture, 5 jours après le début de la différenciation. est une représentation comparative de l’expression des gènes d’intérêts (PROX1, TBX, AFP, KT18, KT19, HNF4A) en fonction des conditions de culture. est une représentation comparative de l’expression des gènes d’intérêts (HNF1B, SOX9, ASGR1, ALB, TAT)) en fonction des conditions de culture. est une représentation comparative du facteur d’expansion pendant 30 jours en fonction des conditions de culture. est une représentation graphique de la sécrétion d’albumine au cours de la différenciation en fonction des conditions de culture. est une représentation graphique de la production d’urée au cours de la différenciation en fonction des conditions de culture. est une représentation graphique de l’activité de la CYP3A4 en fonction des conditions de culture. est un ensemble d’images obtenu par microscopie confocale d’un microcompartiment présentant des hépatocytes. est un ensemble d’images obtenu par microscopie confocale d’un microcompartiment de J-0 à J-9 après le début de la différenciation. est un ensemble d’images obtenu par microscopie confocale d’un microcompartiment de J-12 à J-30 après le début de la différenciation. est un ensemble d’images obtenu par microscopie confocale d’un microcompartiment de J-15 après le début de la différenciation. est un ensemble d’images obtenu par microscopie confocale d’un microcompartiment de J-20 après le début de la différenciation. est un ensemble d’images obtenu par microscopie confocale d’un microcompartiment de J-30 après le début de la différenciation. est un ensemble d’images obtenu par microscopie confocale d’un microcompartiment identifiant certains phénotypes de cellules hépatiques. Microtissu hépatique en trois dimensions, dont la plus grande dimension est comprise entre 500 et 700 µm, exprimant la monooxygénase CYP3A4 avec une activité d’au moins 75000 RLU par million de cellules et produisant au moins 18µg d’urée par million de cellules par 24 heures, le microtissu ne comprenant pas de cellules souches embryonnaires d’êtres humains. Microtissu hépatique selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu’il comprend entre 50 et 99% de cellules hépatiques. Microtissu hépatique selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu’il est obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites Microtissu hépatique selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il est obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions. Microtissu hépatique selon l’une des revendications 2 à 4, caractérisé en ce que les cellules hépatiques sécrètent au moins 75µg d’albumine par million de cellules par 24h. Microtissu hépatique selon l’une des revendications 2 à 5, caractérisé en ce qu’il est obtenu à partir de cellules souches pluripotentes induites et en ce que les cellules hépatiques sécrètent au moins 75µg d’albumine par million de cellules par 24h au moins 20 jours après le début de la différenciation. Microtissu hépatique en trois dimensions selon l’une des précédentes revendications, comprenant au moins 3 phénotypes différents de cellules hépatiques, caractérisé en ce que toutes les cellules du microtissu ont toutes été obtenues à partir de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions. Microtissu hépatique selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le microtissu hépatique comprend des hépatocytes immatures, des hépatocytes matures et des cholangiocytes. Microtissu hépatique selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le microtissu hépatique comprend au moins : - des hépatocytes immatures caractérisés par l’expression d’alpha-foetoprotéine et d’albumine et l’absence d’expression de cytokératine 19 - des hépatocytes matures caractérisés par l’expression d’albumine et l’absence d’expression d’alphafoetoprotéine et de cytokératine 19 -des cholangiocytes caractérisés par l’expression de cytokératine et l’absence d’expression d’albumine et d’alphafoetoprotéine. Microtissu selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le microtissu hépatique comprend des cellules exprimant CD73 et CD90. Microtissu hépatique selon la précédente revendication, caractérisée en ce que les cellules exprimant CD73 et CD90 sont des cellules souches mésenchymateuses. Microtissu hépatique selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce le microtissu hépatique comprend au moins des cellules hépatiques dont entre 20 et 60% des cellules des cellules hépatiques sont des cellules exprimant la cytokératine 19. Microtissu hépatique selon l’une des précédentes revendications, caractérisée en ce que toutes les cellules du microtissu ont toutes été obtenues à partir de la différenciation d’au moins un cyste de cellules souches pluripotentes induites encapsulées dans un unique microcompartiment clos en trois dimensions. Microtissu hépatique selon l’une des précédentes revendications, comprenant : - au moins un lumen, - au moins une cellule en contact à la fois avec un lumen et avec le milieu extérieur au microtissu, et - au moins une cellule entourée uniquement de cellules. Microtissu hépatique selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il présente une forme ellipsoïdale. Microtissu hépatique selon l’une des revendications 2 à 15, caractérisé en ce que les cellules hépatiques sont polarisées. Microtissu hépatique selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend entre 50 % et 99 % de cellules hépatiques dont entre 20 % et 60 % des cellules hépatiques sont des cellules exprimant la cytokératine 19, et entre 1 % et 20 % de cellules exprimant CD73 et CD90. Microtissu hépatique selon l'une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il présente un diamètre ou une plus petite dimension comprise entre 100 µm et 300 µm. Microtissu hépatique selon l'une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il présente une plus grande dimension comprise entre 500 µm et 700 µm. Microtissu hépatique selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend entre 300 et 14000 cellules. Microtissu hépatique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend au moins un canal biliaire. Microtissu hépatique selon l’une des revendications précédentes, caractérisé en ce qu’il comprend au moins un granule de glycogène. Microtissu hépatique selon l’une des revendications 2 à 22, caractérisé en ce que les cellules hépatiques sont choisies parmi les hépatocytes matures, les hépatocytes immatures, les hépatoblastes, les cholangiocytes et leurs mélanges. Microcompartiment clos en trois dimensions, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant au moins un microtissu hépatique selon l’une des revendications 1 à 23, le microcompartiment ne comprenant pas de cellules souches embryonnaires d’êtres humains. Microcompartiment cellulaire selon la revendication 24, caractérisé en ce que l’épaisseur de la couche externe est variable et comprise entre 20 et 60um. Microcompartiment cellulaire selon l’une des revendications 24 ou 25, caractérisé en ce que la couche externe comprend de l’alginate. Microcompartiment cellulaire selon l’une des revendications 24 à 26, caractérisé en ce qu’il comprend des éléments de matrice extracellulaire ou une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse dans la partie interne entre la couche externe et le microtissu hépatique. Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 24 à 27, caractérisé en ce qu’il présente un diamètre ou une plus petite dimension comprise entre 300 µm et 400µm. Microcompartiment cellulaire selon l'une des revendications 24 à 28, caractérisé en ce qu’il présente une plus grande dimension comprise entre 400 µm et 600µm. Ensemble de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu’au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l’une des revendications 24 à 28. Ensemble de microcompartiments selon la précédente revendication, caractérisé en ce que les microcompartiments sont disposés dans un milieu de culture dans un bioréacteur. Microtissu selon l’une des revendications 1 à 23 ou microcompartiment selon l’une des revendications 24 à 29 pour son utilisation comme médicament. Microtissu selon l’une des revendications 1 à 23 ou microcompartiment selon l’une des revendications 24 à 29, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement de symptômes associés à une insuffisance hépatique. Microtissu ou microcompartiment pour une utilisation selon la revendication 33, dans lequel l’insuffisance hépatique est une insuffisance hépatique aiguë, chronique ou aiguë-sur-chronique. Microtissu selon l’une des revendications 1 à 23 ou microcompartiment selon l’une des revendications 24 à 29, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention de maladies métaboliques du foie. Microtissu selon l’une des revendications 1 à 23 ou microcompartiment selon l’une des revendications 24 à 29, pour son utilisation dans le traitement ou la prévention de la fibrose et la cirrhose hépatiques, la stéatose, la stéatose non alcoolique, les hépatites les maladies liées à une sécrétion de facteur VIII et facteur IX et VWF, la maladie de Wilson, l’hémochromatose héréditaire. Procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’une des revendications 24 à 29, comprenant les étapes consistant à : - a) produire un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos comprenant, à l’intérieur d’une couche externe en hydrogel, des cellules souches pluripotentes induites, et éventuellement des éléments de matrice extracellulaire ou une matrice extracellulaire naturelle ou de synthèse, - b) induire une différenciation cellulaire au sein du microcompartiment cellulaire, de manière à obtenir un microcompartiment comprenant des cellules hépatiques. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que le procédé de différenciation cellulaire de l’étape b) dure au moins 20 jours Procédé selon l’une des revendications 27 à 38, caractérisé qu’à l’étape a) entre 40 et 150 cellules souches pluripotentes induites sont présentes dans le microcompartiment. Procédé de préparation d’un microtissu hépatique selon l’une des revendications 1 à 23, caractérisé en ce qu’il comprend : - mettre en œuvre un procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’une des revendications 24 à 29 - éliminer la couche externe d’hydrogel pour récupérer le microtissu hépatique.