FR 3134116 A1 20231006 FR 2213998 A 20221220 L’invention concerne un microcompartiment cellulaire en trois dimensions ou un ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400µm, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes formant une culture groupée en trois dimensions et ayant une teneur en TNF alpha inférieure à 100ng/mL de milieu. L’invention a également pour objet un procédé de préparation d’un tel microcompartiment ou ensemble de microcompartiment. Microcompartiments cellulaires comprenant des lymphocytes formant une culture groupée en 3D et ayant une faible teneur en TNF alpha La présente invention se rapporte au domaine de la culture cellulaire de lymphocytes à grande échelle. L’invention a en particulier pour objet un microcompartiment cellulaire particulier, son procédé de préparation et ses utilisations. Art antérieur Les progrès réalisés au cours de ces dernières décennies ont permis de mettre en avant l’intérêt de la thérapie cellulaire pour traiter de nombreuses pathologies. La thérapie cellulaire se définit comme l’administration de cellules vivantes à un patient dans le but de prévenir, traiter ou d’atténuer une pathologie. L’objectif est d’obtenir un effet durable grâce à une injection de cellules thérapeutiques. De nombreuses approches de thérapie cellulaire peuvent être envisagées telles que : - l’approche dite autologue dans laquelle le patient est son propre donneur. - l’approche dite allogénique dans laquelle le donneur est différent du patient. La thérapie cellulaire recouvre de larges domaines thérapeutiques et s’applique à de nombreux types cellulaires allant des cellules pluripotentes jusqu’aux cellules adultes spécialisées à fonction métabolique ( e.g hépatocytes) ou à fonction mécanique ( e.g myoblastes, chondrocytes), en passant par les lignées hématopoïétiques telles que les cellules mononucléées du sang ( e.g lymphocytes T ou lymphocytes NK). Une des thérapies les plus prometteuse à ce jour est la thérapie cellulaire CAR (Récepteur antigénique chimérique). Les cellules CAR-T sont des lymphocytes T exprimant des récepteurs antigéniques chimériques qui sont des récepteurs artificiels conçus pour reconnaitre un antigène présent à la surface des cellules tumorales. Les cellules CAR-T guident le système immunitaire pour cibler et éradiquer les cellules cancéreuses. Cette approche est considérée comme une avancée majeure dans l’immunothérapie et de nombreuses cellules CAR-T sont en cours de développement de façon à étendre leurs utilisations. Les cellules CAR-T sont produites en général selon l’approche autologue. Toutefois, il est également possible de créer des cellules CAR-T allogéniques. Il existe également une alternative utilisant des lymphocytes NK (natural killer). Les lymphocytes NK sont des cellules effectrices cytotoxiques très puissantes ayant démontré un effet antitumoral. Afin de pouvoir développer le potentiel des thérapies cellulaires utilisant des lymphocytes, notamment les thérapies CAR-T ou CAR-NK, il est nécessaire de pouvoir s’appuyer sur des techniques de culture cellulaire de lymphocytes à grande échelle. La production ex vivo de cellules immunitaires tels que les lymphocytes T ou NK est particulièrement complexe, surtout à grande échelle. En effet, les méthodes de cultures in vitro développées à ce jour sont trop stressantes et conduisent rapidement à l’épuisement cellulaire ne permettant pas de produire les lymphocytes à grande échelle. In vivo , la prolifération des cellules immunitaires se produit principalement dans des environnements mécaniquement stables tels que des tissus solides. L’environnement d’un bioréacteur étant rempli de contraintes de cisaillement non physiologiques, les taux d’expansion obtenus sont généralement encore insuffisants par rapport aux capacités d’expansion in vivo . Actuellement, il n’existe aucune solution satisfaisante pour produire rapidement à grande échelle des lymphocytes fonctionnels, en particulier des cellules CAR-T ou CAR-NK. Plusieurs méthodes de cultures sont principalement utilisées pour l’expansion des cellules CAR : la culture statique en flasque, la culture en sac statique perméables aux gaz et la culture en bioréacteur à mouvement de bascule (Vormittag P, Gunn R, Ghorashian S, Veraitch FS. Curr Opin Biotechnol. 2018), la plateforme G-rex® (Ludwig et al. “Methods and Process Optimization for Large-Scale CAR T Expansion Using the G-Rex Cell Culture Platform” Methods Mol Biol 2020;2086:165-177). Toutefois, ces méthodes de culture ne sont pas adaptées à la production de lymphocytes à grande échelle en raison d’exposition des cellules à de nombreuses étapes de manipulation augmentant les risques de contaminations, d’exposition des cellules à des stress trop importants et/ou de contraintes de développement et de capacité des plateformes et méthodes utilisées. Par ailleurs, le travail de maintien en culture et de stockage serait trop exigeant pour une production à grande échelle. Pour remédier à ce problème, l’art antérieur propose d’activer les lymphocytes avant leur mise en culture afin d’obtenir une prolifération rapide des lymphocytes. Néanmoins, l’activation précoce des lymphocytes engendre un processus physiologique d’épuisement cellulaire. L’épuisement correspond à une maturation précoce des cellules T naïves vers une sous population de lymphocytes T effecteurs limitant la persistance du greffon in vivo . Une autre solution proposée par l’art antérieur est l’utilisation de microtubes d’hydrogel et d’alginate suspendus dans un milieu de culture cellulaire. Cette méthode rapporte un taux d’expansion des lymphocytes de 320 à 14 jours de culture (Lin et al. Adv. Healthcare Mater. 2018, 1701297) Toutefois, bien que cette méthode apporte un taux d’expansion satisfaisant, elle n’est pas adaptée pour une culture à grande échelle. Cette méthode nécessiterait de mettre au point un système de culture dédié et serait trop compliquée à adapter à grande échelle. Par ailleurs cette méthode ne garantit pas le phénotype fonctionnel des lymphocytes et par conséquent que l’action des lymphocytes soit durable. La complexité de la différentiation et de la fonction de chaque sous population de lymphocyte font que l’analyse du phénotype lors de la prolifération est une donnée essentielle pour mener à bien toute thérapie à base de lymphocytes, en particulier les thérapies utilisant des cellules CAR-T ou CAR-NK. Les sous populations de lymphocytes T les moins différenciés tels que les lymphocytes T naifs et lymphocytes Tscm (cellule souche mémoire) semblent particulièrement importantes pour garantir un effet durable chez les patients (Vita Golubovskaya and Lijun Wu (Cancers 2016, 8, 36). De plus, les sous-populations NK « memory-like » permettent une persistance de la réponse clinique (Romee et al. « Cytokine activation induces human memory-like NK cells » Blood 2012 Dec 6;120(24):4751-60). D’autre part, on sait également que la sous population de lymphocyte T effecteur est essentielle pour garantir un effet significatif sur la ou les cellules cibles. Il apparait donc nécessaire de maitriser les sous populations cellulaires lors de la culture des lymphocytes à grande échelle pour obtenir un ratio optimal entre la persistance et l’efficacité in vivo. Les processus de production actuels impliquant des lymphocytes ont un coût très important et sont difficiles à mettre à grande échelle et aboutissent à des lymphocytes de qualité mitigée et de persistance réduite. Il existe donc un besoin important pour une solution permettant une production à grande échelle de lymphocytes avec un phénotype fonctionnel, pour répondre à une demande indispensable de thérapie cellulaire basée sur les lymphocytes. L’objectif de l’invention est par conséquent de répondre à l’ensemble de ces besoins et de pallier les inconvénients et limites de l’art antérieur. Pour répondre à cet objectif, l’invention propose de passer par un microcompartiment particulier pour obtenir une production à grande échelle de lymphocytes, adaptés à des utilisations en thérapie cellulaire. A cet effet, l’invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400µm, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes formant une culture groupée en trois dimensions ayant une teneur en Facteur de nécrose tumorale endogène (TNF alpha) inférieure à 100 ng/mL du milieu. Préférentiellement, la partie interne du microcompartimentµ comprend une teneur en perforine inférieure à 0,5 µg/mL du milieu et/ou une teneur en en granzyme B inférieure à 1 µg/mL du milieu et/ou une teneur en IL6 inférieure à 0,5 µg/mL du milieu et/ou une teneur en GM-CSF inférieure à inférieure à 0,5 µg/mL du milieu. Avantageusement, le microcompartiment selon l’invention permet de produire des lymphocytes présentant un phénotype fonctionnel tout en garantissant une production rapide à grande échelle. Selon un mode de réalisation particulièrement adapté, le microcompartiment selon l’invention comprend des lymphocytes formant une culture groupée en trois dimensions sans lumen. Le microcompartiment selon l’invention peut être obtenu après encapsulation de lymphocytes avec ou sans ajout de matrice extracellulaire, et selon une variante avec ou sans ajout d’élément de matrice extracellulaire. Avantageusement, l’absence d’ajout de matrice extracellulaire ou d’élément de matrice au moment de l’encapsulation des lymphocytes permet d’améliorer leur taux d’expansion après 3 jours de culture. Selon un objet préféré de l’invention, le microcompartiment selon l’invention a été obtenu après encapsulation de lymphocytes préalablement activés. L’activation des lymphocytes permet avantageusement de stimuler la prolifération des lymphocytes dans la partie interne du microcompartiment selon l’invention. Selon une variante, l’activation des lymphocytes peut être réalisée dans le microcompartiment après encapsulation. Selon un autre mode de réalisation particulièrement adapté, le microcompartiment selon l’invention comprend des lymphocytes exprimant un récepteur antigénique chimérique. Lorsque le microcompartiment selon l’invention comprend des lymphocytes T, il comprend préférentiellement une concentration en lymphocyte naïf et/ou Tscm supérieure à 20%, encore plus préférentiellement supérieure à 40%. Avantageusement, une telle concentration en lymphocytes naïf et/ou Tscm permet de garantir un effet durable et d’éviter le phénomène d’épuisement précoce des lymphocytes. Selon un objet préféré de l’invention, l’invention concerne un ensemble de microcompartiments. Selon un autre aspect, l’invention concerne un procédé de préparation d’un microcompartiment ou d’un ensemble de microcompartiments comprenant au moins la mise en œuvre des étapes suivantes, une incubation, une encapsulation et une étape de culture. Enfin, l’invention vise un microcompartiment selon l’invention pour son utilisation comme médicament, préférentiellement dans la prévention ou le traitement de maladies auto-immunes, de syndromes d’immunodéficience, de cancers, de maladies virales ou de malades inflammatoires. D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention et des exemples qui vont suivre. Brève description des figures est une image de microscopie à contraste de phase au grossissement x20 d’un ensemble de microcompartiments selon l’invention après 3 jours de cultures en capsules est une image de microscopie à contraste de phase au grossissement x10 d’un ensemble de microcompartiments selon l’invention après 3 jours de cultures en capsules est une représentation des résultats d’essais sur l’amplification de lymphocytes dans des microcompartiments selon l’invention. est une représentation du facteur d’expansion des lymphocytes T après 6 jours de culture avec ou sans encapsulation. est une représentation comparative du profil d’expression de cytokines lors de la culture de Lymphocytes T après 6 jours de culture avec ou sans encapsulation. Les résultats sont présentés avec des valeurs normalisées par rapport à la sécrétion de GM-CSF et d’IFN-g. est une image obtenue par microscopie confocale d’un microcompartiment présentant des lymphocytes polarisés. est une représentation du facteur d’expansion des lymphocytes NK après 14 jours de culture avec encapsulation (« Capsules ») ou sans encapsulation (« Contrôle »). est une représentation comparative de l’expression de cytokines lors de la culture de Lymphocytes NK après 14 jours de culture avec ou sans encapsulation (pour un donneur A– surnageant dilué au 10ème). Les résultats sont présentés avec des valeurs normalisées par rapport à la sécrétion d’IFN-g. est une représentation comparative de l’expression de granzyme B lors de la culture de Lymphocytes NK après 14 jours de culture avec ou sans encapsulation (pour un donneur A– surnageant dilué au 100ème). Les résultats sont présentés avec des valeurs normalisées par rapport à la sécrétion d’IFN-g. est une représentation comparative de l’expression de cytokines lors de la culture de Lymphocytes NK après 11 jours de culture avec ou sans encapsulation (pour un donneur B – surnageant dilué au 10ème). Les résultats sont présentés avec des valeurs normalisées par rapport à la sécrétion d’IFN-g. est une représentation comparative de l’expression de granzyme B lors de la culture de Lymphocytes NK après 11 jours de culture avec ou sans encapsulation (pour un donneur B– surnageant dilué au 100ème). Les résultats sont présentés avec des valeurs normalisées par rapport à la sécrétion d’IFN-g. Microcompartiment cellulaire en trois dimensions clos de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400µm, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne, ladite partie interne comprenant dans un milieu entre 500 et 5000 lymphocytes formant une culture groupée en trois dimensions et ayant une teneur en TNF alpha inférieure à 100ng/mL de milieu, le microcompartiment ne comprenant pas de cellules souches embryonnaires d’êtres humains. Microcompartiment selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la partie interne comprend des lymphocytes formant une culture groupée en trois dimensions sans lumen. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il a été obtenu après encapsulation de lymphocytes sans ajout de matrice extracellulaire ou sans ajout d’élément de matrice extracellulaire. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en en ce qu’il a été obtenu après l’encapsulation de lymphocytes préalablement activés. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que l’épaisseur de la couche externe est variable et comprise entre 20 et 60µm. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les lymphocytes sont polarisés. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le nombre de lymphocytes formant une culture groupée en trois dimensions est compris entre 1000 et 3000. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les lymphocytes sont des lymphocytes T ou des lymphocytes NK. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les lymphocytes sont des lymphocytes exprimant un récepteur antigénique chimérique. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les lymphocytes sont des lymphocytes T et en ce qu’il présente : - une teneur en en perforine inférieure à 0,5 μg/ml de milieu, et/ou - une teneur en granzyme B inférieure à 1 μg /mL de milieu. Microcompartiment selon l’une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que les lymphocytes sont des lymphocytes NK et en ce qu’il présente : - une teneur en en perforine inférieure à 0,5μg/ml de milieu, et/ou - une teneur en granzyme B inférieure à 1 μg /mL de milieu, et/ou - une teneur en IL6 inférieure à 0,5μg/ml de milieu et/ou - une teneur en GM-CSF inférieure à 0,5μg/ml de milieu. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la couche externe comprend de l’alginate. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la partie interne comprend une solution comprenant de l’IL2 ou la combinaison d’IL7 et d’IL15 ou IL12, IL18, IL21 ou la combinaison d’au moins deux cytokines choisies parmi IL2, IL12, IL18 et IL21. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend des lymphocytes T et en ce que la proportion de lymphocyte T naif et/ou Tscm reste supérieure à 20%. Ensemble de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu’au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l’une des revendications 1 à 14. Ensemble de microcompartiments selon la précédente revendication, caractérisé en ce que les microcompartiments sont disposés dans un milieu de culture dans un bioréacteur. Microcompartiment selon l’une des revendications 1 à 14, pour son utilisation comme médicament. Microcompartiment selon l’une revendications 1 à 14, pour son utilisation dans la prévention ou le traitement de maladies auto-immunes, de syndromes d’immunodéficience, de cancers, de maladies virales ou de maladies inflammatoires. Procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’une des revendications 1 à 14 ou d’un ensemble de microcompartiments cellulaires selon l’une des revendications 15 ou 16, comprenant les étapes suivantes : (a) incuber des lymphocytes dans un milieu de culture comprenant des cytokines, (b) encapsuler les lymphocytes dans leur milieu de culture dans une couche d’hydrogel, préférentiellement sans ajouter de matrice extracellulaire, pour former un microcompartiment en trois dimensions clos de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, dont la plus petite dimension est comprise entre 200 et 400µm, de façon à ce que chaque microcompartiment comprennent au moins 5 cellules dans sa partie interne, (c) cultiver les microcompartiments obtenus à l’étape (b) dans un milieu de culture comprenant au moins des cytokines, pendant 2 à 6 jours. Procédé de préparation d’un microcompartiment selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu’il comprend une étape préalable à l’incubation des lymphocytes, qui consiste à activer lesdits lymphocytes. Procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’une des revendications 19 ou 20, caractérisé en ce que les milieux de culture comprennent de 100 à 1000 unités/ml d’IL2 ou la combinaison de 300 à 600 unités/ml d’IL7 et 50 à 100 unités /ml d’IL15. Procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’une des revendications 19 à 21, caractérisé en ce qu’à l’étape (a) entre 0,5 et 2 millions de lymphocytes sont incubées par ml de milieu de culture. Procédé selon l’une des revendications 19 à 22, caractérisé en ce que l’étape b) est réalisée par co-injection de deux solutions : - une solution d’hydrogel, - la solution issue de l’étape a) comprenant des lymphocytes et du milieu de culture, de manière concentrique via un injecteur microfluidique qui permet de former un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange des deux solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes, lesdites gouttes étant collectées dans un bain de calcium qui rigidifie la solution d’hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment, la partie interne de chaque goutte étant constituée par la solution issue de l’étape (a) comprenant des lymphocytes et du milieu de culture. Procédé selon la revendication 23, caractérisé en ce que l’injecteur microfluidique a un diamètre d’ouverture finale est compris entre 150 et 300µm. Procédé selon l’une des revendications 19 à 24, caractérisé en ce que le débit de chacune des deux solutions est compris entre 45 et 150 mL/h. Procédé selon l’une des revendications 19 à 25, caractérisé en ce que la totalité des cellules encapsulées initialement à l’étape (b) représente un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées. Procédé selon l’une des revendications 19à 26, caractérisé en ce que les étapes (a) et/ou (c) sont mises en œuvre sous agitation permanente ou séquentielle. Procédé selon l’une des revendications 19 à 27, caractérisé en ce que le procédé comprend au moins une ré-encapsulation des cellules après l’étape (c). Procédé selon la revendication précédente, caractérisé en ce que chaque ré-encapsulation consiste à éliminer la couche externe d’hydrogel, préférentiellement à remettre en suspension les lymphocytes sous forme partiellement ou totalement dissociée dans les microcompartiments et à remettre en œuvre les étapes du procédé. Procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’une des revendications 19 à 29, caractérisé en ce qu’il comprend une étape après l’étape (c) qui consiste à congeler les microcompartiments. Procédé de préparation d’un microcompartiment selon l’une des revendications 19 à 30, caractérisé en ce que l’étape (c) est mise en œuvre dans un bioréacteur.