FR 3127504 A1 20230331 FR 2110373 A 20210930 La présente invention concerne le domaine de la détection de mutations rares dans un échantillon biologique. Plus précisément, elle concerne une méthode de détection de mutations rares impliquant une première étape d'amplification des mutations par PCR, une deuxième étape d’étiquetage des séquences contenant une mutation amplifiées de manière unique avec un identifiant moléculaire unique (Unique Molecular identifier, UMI), et une troisième étape de correction des erreurs de séquençage en utilisant l'UMI. Cette méthode peut être appliquée dans de nombreux domaines médicaux tels que la détection de mutations cancéreuses à un stade très précoce, la détection de maladies infectieuses, la détection de maladies immunitaires ainsi que de maladies inflammatoires, le dépistage de la résistance aux antibiotiques, le diagnostic prénatal, la détection de mutations de l'ADN mitochondrial, etc. MÉTHODE DE DÉTECTION DE MUTATIONS RARES SUR BIOPSIE LIQUIDE La présente invention concerne le domaine de la détection de mutations rares dans un échantillon biologique. Plus précisément, elle concerne une méthode de détection de mutations rares impliquant une première étape d'amplification des mutations par PCR, une deuxième étape d’étiquetage des séquences contenant une mutation amplifiées de manière unique avec un identifiant moléculaire unique (Unique Molecular identifier, UMI), et une troisième étape de correction des erreurs de séquençage en utilisant l'UMI. Cette méthode peut être appliquée dans de nombreux domaines médicaux tels que la détection de mutations cancéreuses à un stade très précoce, la détection de maladies infectieuses, la détection de maladies immunitaires ainsi que de maladies inflammatoires, le dépistage de la résistance aux antibiotiques, le diagnostic prénatal, la détection de mutations de l'ADN mitochondrial, etc. DOMAINE DE L'INVENTION Les cellules apoptotiques, y compris les tissus tumoraux, libèrent leurs acides nucléiques dans la circulation sanguine périphérique et sont donc facilement accessibles à partir des fluides corporels comme le sang, l'urine, etc. (Stroun et al. 1987). L'analyse des acides nucléiques, des protéines ou des métabolites dérivés des liquides corporels est appelée "biopsie liquide". Par rapport à la biopsie de tissus dérivés d'un seul site tumoral, le principal avantage de la biopsie liquide est son accessibilité facile et non invasive, sa capacité d'échantillonnage répété et la large couverture de l'hétérogénéité tumorale qu’elle contient (Ilié et Hofman 2016 ; Gonzalez-Billalabeitia et al. 2019). L'ADN libre circulant (cfDNA) est récemment apparu comme un biomarqueur prometteur et a le potentiel de révolutionner la détection et le suivi de cancers - diagnostic, suivi de l'évolution clonale, résistance et réponse aux médicaments (Abbosh et al. 2017 ; Qin et al. 2016 ; Tie et al. 2015 et 2016). L'ADN circulant dérivé de la tumeur (ctDNA) peut fournir une image plus large du profil mutationnel d'un patient atteint de cancer que la biopsie de tissu qui est localisée. Le profil mutationnel comprend une caractérisation qualitative (nature des mutations) ainsi que quantitative (ratio relatif de chaque mutation présente) des gènes et ce profil spécifique au patient aide de plus à la personnalisation du traitement et au suivi de la maladie. La détection de l'ADN tumoral circulant (ctDNA) dans la profusion d'ADN libre circulant (cfDNA) provenant des cellules saines est un défi en raison de leur rareté (Schwarzenbach et al. 2008 ; Forshew et al. 2012 ; Kennedy et al. 2014). Souvent, ces chiffres sont trop faibles pour être représentés en pourcentage mais sont dénombrables en chiffres absolus. Par exemple, au stade précoce du cancer, une tumeur de 2-3 cm peut libérer aussi peu que 10 ctDNA par 10ml de sang (Fiala et Diamandis 2018). Il existe sur le marché toute une série de technologies de détection des ctDNA. Les technologies de détection du cancer basées sur le séquençage peuvent être divisées en deux catégories principales - 1) le séquençage non ciblé et 2) la détection ciblée. La première approche comprend le séquençage du génome entier ou de l'exome entier pour découvrir des mutations ponctuelles inconnues ou des variations du nombre de copies (CNV). L'avantage du séquençage non ciblé est sa capacité à identifier les nouveaux changements survenus au cours de l'évolution de la tumeur sans connaissance préalable des gènes tumoraux. Malgré cet avantage, une concentration élevée de ctDNA est nécessaire pour obtenir une détection fiable des mutations et la sensibilité globale de ces techniques de séquençage non ciblées reste faible (elles ne peuvent détecter des mutations supérieures à 5-10 %) en raison de la faible profondeur des données. Dans un séquençage du génome entier à faible profondeur ou à faible passage, chaque locus est lu une seule fois, ce qui est insuffisant pour conférer une fiabilité suffisante aux données. D'autre part, l'approche de séquençage ciblé est très sensible, et les mutations peuvent être détectées à un taux de fréquence d'allèle de 0,01% de manière rapide et rentable. La qualité de l'analyse est supérieure à celle obtenue par des méthodes non ciblées en raison de la plus grande profondeur des données de séquençage. Le principal inconvénient du séquençage ciblé est qu'il nécessite des informations détaillées sur la génétique de la tumeur. Plusieurs technologies de séquençage ciblé ont été inventées au cours des dernières décennies. Dans l'approche du "séquençage profond", une région cible est séquencée avec une couverture très élevée (~10 000x). L'avantage du séquençage profond est de caractériser plusieurs biomarqueurs en parallèle, mais son inconvénient est la profondeur extrêmement élevée nécessaire pour détecter une faible fréquence allélique, ce qui augmente considérablement les coûts de séquençage. Outre le séquençage profond à grande profondeur, d'autres technologies de séquençage sont basées sur l'enrichissement des cibles (TAm-seq, Capp-seq) ou sur la génération de données de haute qualité par le marquage d’identifiants moléculaires uniques (UMI) sur chaque séquence d'ADN afin de corriger les erreurs de séquençage (Safe-seq, Duplex-seq). Il a déjà été proposé d’intégrer la méthode d'enrichissement des cibles de Capp-Seq (Newman et al. 2014) a l'UMI double brin de Duplex-seq (Schmitt et al. 2012) pour la correction des erreurs afin de créer "Capp-seq/iDES" (Diehn et al, patent WO 2016/040901 Al) qui atteint la limite de détection des mutations de 0,0025 %. TAm-seq (Gale et al. 2018) et Capp-Seq sont des approches de séquençage ciblé, et ces technologies enrichissent les régions cibles indépendamment des séquences sauvages ou mutantes. Par conséquent, le rapport entre le type sauvage et le mutant reste le même avant et après le processus d'enrichissement. Cela ne résout pas le problème de la détection précoce lorsque la quantité de ctDNA est extrêmement faible et que l'ADN de type sauvage peut être 1000 fois supérieur. Toutes les technologies décrites précédemment ne sont pas d'une grande utilité pour la détection précoce du cancer ou le dépistage d'une maladie résiduelle minime, où le signal provenant des ctDNA peut être masqué par celui des cfDNA provenant des tissus sains. Une technique de PCR appelée 'COLD-PCR' (Li et al. 2008 et 2009) et ses variantes ice-COLD-PCR (Milbury et al. 2011) ou e-iceCOLD PCR (How-Kit et al. 2013) peuvent enrichir les allèles mutants minoritaires par rapport au type sauvage et donc changer le rapport entre type sauvage et mutant. Comme les COLD PCR dépendent de la température de dénaturation critique (Tc) inférieure à la Tm qui est fixée pour une certaine longueur d'ADN, elles ne sont pas efficaces lorsque plus d'un hotspot doit être détecté en tandem. Une nouvelle stratégie de construction d'amorces a été proposée par Huang et al. 2019, où les amorces spéciales appelées "stuntmers" (appelées "Enhancer" dans le contexte de la présente invention) peuvent augmenter préférentiellement les mutants par rapport aux homologues de type sauvage. Une amorce peut détecter plusieurs mutations en tandem et peut augmenter de manière significative les allèles mutants pendant l'étape de PCR, modifiant ainsi le rapport entre le mutant et le type sauvage. Les stuntmers peuvent constituer un outil prometteur pour la détection précoce du cancer et peuvent être couplés aux technologies de séquençage à haut débit. Dans l'art antérieur, des méthodes d'enrichissement d’allèles mutants comme la COLD-PCR, et d’autres méthodes de correction de séquençage par étiquetage ont été validées individuellement comme le résume le tableau 1. Seule Capp-Seq/iDES combine l’enrichissement de mutants et la correction des erreurs de séquençage. Tableau 1 - Différentes technologies de séquençage avec enrichissement des cibles ou de correction des erreurs La technique de séquençage de nouvelle génération (NGS) est le meilleur moyen d'établir un profil génétique moléculaire lié aux gènes du cancer, car elle peut fournir des résultats à la fois qualitatifs et quantitatifs. Le NGS est basé sur le séquençage en parallèle de plusieurs millions de courts morceaux d'ADN (Glenn 2011), suivi d'un assemblage de novo ou d'un alignement sur un génome de référence. La NGS présente un taux d'erreur relativement élevé (0,1 à 1 %) selon le type de plateforme utilisée, ce qui rend la détection des mutations rares très difficile. Pour surmonter cet inconvénient, plusieurs technologies ont été proposées afin d'améliorer la détection des mutations dans les ctDNA. Le tableau 2 ci-dessous présente un aperçu des technologies existantes pour améliorer la détection de de ctDNA. Certaines technologies dépendent de l'enrichissement des cibles et d'autres de la correction des erreurs NGS pour parvenir à une meilleure qualité des données. Tableau 2 - Résumé des différentes technologies de séquençage Le défi de la détection de mutations rares dans l'ADN libre circulant basé sur la plateforme NGS est donc difficile à relever, principalement en raison de deux facteurs - (i) la très faible quantité d'ADN tumoral circulant dans les cancers de stade précoce et (ii) le taux d'erreur élevé de la technologie NGS. Il existe donc un besoin de méthodes plus sensibles et à haut débit pour détecter et surveiller les acides nucléiques dérivés des tumeurs chez les patients atteints d'un cancer. Les inventeurs ont créé un méthodologie appelée “Enhance-seq" pour générer des données de séquençage de haute fiabilité en combinant une étape d'enrichissement des mutations avec des amorces inspirées des séquences « Stuntmer », appelées ici séquences “Enhancers", suivi d'une méthodologie de correction des erreurs de séquençage basée sur l’utilisation d’identifiants moléculaires uniques (UMI). Plus précisément, la méthode de l'invention est un procédé en deux étapes pour la détection de mutations rares - la première étape est une PCR permettant l'enrichissement des mutations basée sur l’utilisation de séquences Enhancers ; ces séquences Enhancers permettent d’augmenter spécifiquement le nombre de copies mutées présentes dans la population et en même temps de bloquer l'amplification de la séquence de type sauvage. Dans la deuxième étape, les molécules correctrices “Correctors” contenant un identifiant moléculaire unique (UMI) sont associées à chaque molécule d'ADN pour corriger les erreurs générées lors du séquençage à haut débit (NGS). La méthode de l'invention permet la détection d'une mutation rare dans un échantillon biologique, et comprend les étapes suivantes - Étape 1 - fourniture d'un échantillon comprenant de l'ADN Étape 2 - amplification sélective de la région contenant ladite mutation en utilisant une PCR d'enrichissement de la mutation (Mutation Enhancement PCR, MEP) Étape 3 - ajout d'un site de liaison à chaque extrémité 5' et 3' de l'amplicon obtenu Étape 4- ajout d'une séquence Corrector comprenant une séquence fixe, - éventuellement une étiquette spécifique de l'échantillon/du patient -, un identifiant moléculaire unique (UMI) et un site de liaison à chaque extrémité de chaque amplicon en utilisant les sites de liaison correspondants Étape 5 - amplification des amplicons résultant de l'étape 4 par PCR Étape 6 - séquençage des amplicons résultant de l'étape 5 par NGS Étape 7 - correction des erreurs de séquençage par une analyse logicielle utilisant les identifiants moléculaires uniques Avantages de l'invention La méthode de détection des mutations rares de l'invention présente des avantages par rapport à l'art antérieur pour plusieurs raisons. Tout d'abord, cette méthode repose sur la capacité d'amplifier sélectivement les mutations rares à l'aide d'une technologie d'amélioration des mutations impliquant l'utilisation d’Enhancers. La PCR avec Enhancers offre un moyen simple, très sensible et précis de détecter les mutations rares. Les Enhancer sont conçus de telle sorte que, lorsqu'ils sont utilisés comme amorce dans une réaction de PCR, ils peuvent supprimer l'amplification de la séquence de type sauvage et permettre préférentiellement l'amplification des formes mutantes. La conception des amplificateurs est basée sur la séquence de type sauvage et ne dépend pas de la mutation. Par conséquent, le même amplificateur peut identifier plusieurs mutations en tandem dans un site contenant un ou plusieurs points chauds de mutations, y compris une mutation ponctuelle, une insertion, une délétion et des réarrangements. Le blocage et l'amplification se produisent avec les mêmes amorces. Comme les mutations sont amplifiées, il est possible de retrouver les mutations rares même après le traitement en aval qui implique une perte d'ADN dans les étapes de la méthode. Cette étape d’amplification permet de multiplier au moins par 5 la fréquence des mutations rares dans l'échantillon. Deuxièmement, la méthode repose sur l'utilisation d'un identifiant moléculaire unique (UMI) qui permet de corriger l'erreur de séquençage après la lecture NGS. Cet UMI est une région d' environ - 10 pb contenant des séquences aléatoires et est différent pour chaque molécule. Lorsqu'il est attaché à un amplicon, il donne une identité unique à l'amplicon et permet de distinguer deux molécules d'ADN différentes. L'UMI est introduit par des molécules adaptatrices sens et antisens contenant des séquences UMI des deux côtés de la molécule adaptatrice. Dans un mode de réalisation préféré, l’étiquetage innovant s'appuie sur une approche d’étiquetage UMI basée sur la Golden Gate pour corriger les erreurs de séquençage. Pour la première fois, les inventeurs proposent une approche d'étiquetage basée sur la technologie Golden gate. Dans la méthode connue du Golden gate, la liaison est directionnelle. Ici, l'approche innovante consiste en ce que les amorces sens et antisens de la molécule adaptatrice (ici séquence Corrector) ont une directionnalité pour se lier spécifiquement avec les molécules d'insertion et la conception consiste en une étiquette spécifique du patient suivi d'un identifiant moléculaire unique (UMI) des deux côtés de la molécule adaptatrice. L'UMI permet de corriger l'erreur de séquençage après la lecture NGS. Par rapport aux autres technologies d’étiquetage (par exemple, duplex-seq) qui sont basées sur l’extension homopolymérique A (A-tailing) suivie de la liaison, la technologie d'étiquetage basée sur la Golden Gate est plus robuste car l’extrémité cohésive formée de 4 paires de bases permet d'avoir une plus grande efficacité de liaison et des extrémités cohésives différentes aux deux extrémités permettent la spécificité de la liaison. Contrairement aux autres technologies d’étiquetage (duplex-seq) qui sont réalisées en deux étapes ou plus (A-tailing et liaison par une extrémité cohésive), cette technologie d’étiquetage mise au point par les inventeurs est réalisée en une seule étape (digestion et liaison en une seule étape) et est donc plus pratique. Ainsi, cette méthode repose sur l'enrichissement des mutations à l'aide d'une première PCR (PCR d'enrichissement des mutations) suivie d’étiquetage UMI. L'étape d’étiquetage UMI permet de marquer chaque séquence avant l'amplification pour le séquençage de sorte qu'il devient possible de distinguer deux molécules d'ADN différentes qui sont le produit de la même PCR et d'analyser statistiquement le résultat du séquençage afin de corriger les erreurs de séquençage par une analyse logicielle. L'utilisation d’étiquetage UMI permet d'écarter tout faux positif et donc d'augmenter significativement la sensibilité de la méthode (abaisser la limite de détection). Un autre avantage de cette technologie est qu'elle ne nécessite pas un séquençage à très grande profondeur car la détection est très sensible grâce à l'étape d'amplification des mutations. En plus de permettre la détection de très faibles quantités de mutations, l'augmentation de la sensibilité permet de lire le résultat en utilisant une machine de séquençage de nouvelle génération à faible profondeur (par exemple, Illumina iSeq 100) puisque le rapport signal/bruit pour les mutants est élevé, alors que dans les méthodes de l'art antérieur, la détection de mutations rares nécessite des machines coûteuses. En effet, le "séquençage profond" correspond à 10,000 lectures/cible. Avec la méthode de la présente invention, un maximum de 2000 lectures/cible est nécessaire, mais une bonne qualité de lecture peut être obtenue avec 1000 lectures/cible, et même avec 500, 100 et aussi bas que 50 lectures/cible. Le nombre plus faible de lectures requises pour une bonne qualité de données permettra aux utilisateurs de passer des séquenceurs haut de gamme très coûteux (environ 850 000 à 1 million d'euros) à des mini-séquenceurs environ 20 fois moins chers (environ 20 000 euros). Par conséquent, des données de haute qualité peuvent être récupérées à partir d'un séquençage de faible profondeur et d'un faible investissement en capital. En conséquence, l'utilisation de cette technologie diminuera le coût global car des séquenceurs très puissants ne seront pas nécessaires et permettra aux laboratoires d'être plus efficaces et à des coûts plus abordables. La méthode comprend avantageusement l'utilisation d'un étiquetage spécifique de l'échantillon ou du patient afin que différents échantillons de patients puissent être regroupés et traités simultanément à l'étape de séquençage NGS. La méthode est facile à mettre en œuvre car elle repose sur la PCR et la NGS, qui sont des technologies de routine. Elle peut être proposée sous la forme d'un kit adapté à un diagnostic particulier, ce qui est très pratique pour les utilisateurs. La méthode "Enhance-seq" présente des avantages par rapport à la COLD PCR car les Enhancers peuvent détecter les mutations en tandem, comme le montrent Huang et al. 2019. La “Full Cold PCR” ne peut pas fonctionner avec une faible concentration d'ADN et nécessite une accumulation substantielle de produits de PCR pour que l'enrichissement des mutations se produise ; l'enrichissement ne se produit donc que dans les derniers cycles de PCR. Les résultats expérimentaux de l'inventeur montrent que Enhance-seq peut fonctionner avec une concentration d'ADN extrêmement faible et présente un enrichissement de 10 à 500 fois (tableaux 3 et 5) en fonction du matrice initial. Une autre technologie PCR plus proche, appelée technologie Switch Blocker (Poole et al. 2019), utilise une sonde et une amorce par région cible contenant des mutations (point chaud) pour bloquer la version de type sauvage et amplifier la ou les versions mutantes. Par conséquent, cette technologie demande plus de ressources et sera plus difficile à mettre en place. Lors de la MEP, il est possible d’ajouter une nucléase spécifique de l’ADN double brin (DSN), pour améliorer la neutralisation des séquences de type sauvage. L’enzyme DSN permet de couper les ADN doubles brins parfaitement hybridés. Les Enhancers ont la propriété unique d’être à la fois des sondes pour les séquences de types sauvages, et des amorces pour les séquences mutantes. Lors de la première hybridation des Enhancers avec les séquences de type sauvage, les produits formés sont des morceaux d’ADN double brins que la DSN peut alors couper. ​​Lorsque l'étape MEP dans la méthode Enhance-seq est accompagnée de l'ajout d’une DSN, l’amplification de la mutation devrait donc s’intensifier grâce au clivage de l'ADN de type sauvage. Cette étape contribuera à une meilleure capacité de multiplexage en raison d'une moindre interférence de l'ADN de type sauvage. En utilisant une méthode mettant en œuvre une DSN, Keraite et al. 2020, ont montré qu'ils pouvaient prédire la fréquence allélique mutationnelle (MAF) initiale de manière fiable. Par conséquent, l'association d'une DSN à la PCR d'enrichissement de mutation améliorera encore le rendement et la performance de la méthode. En effet, la profondeur de séquençage NGS nécessaire sera potentiellement plus faible et la qualité du signal plus élevée. Dans une technologie similaire et concurrente appelée "Capp-seq" (Newman et al. 2014), l'enrichissement de l'ADN a lieu dans la première étape par capture par hybridation de l'ADN libre de cellules et, en aval, cette étape peut éventuellement entraîner une perte d'ADN. Dans les cas où le nombre absolu de ctDNA présent est extrêmement faible, cette perte d'ADN est un désavantage sérieux. De plus, dans le cas de Capp-seq, le NGS est effectué avec une couverture très élevée de 10000X et est coûteux. En revanche, la méthode Enhance-seq peut amplifier fidèlement des allèles mutants rares lorsqu'ils sont présents en quantités extrêmement faibles, par exemple 10 molécules mutantes et 1 milliard de molécules de type sauvage. Comme dans le cas de Duplex-seq (Schmitt et al. 2012), un amplicon est également flanqué d'UMI des deux côtés dans 'Enhance-seq' et, par conséquent, un consensus double brin est réalisé dans les directions 5' et 3', ce qui augmente la fiabilité des données. Les résultats expérimentaux confirment que la technologie "Enhance-seq" permettra de diagnostiquer des maladies plus précocement que les autres technologies de l’état de l’art, grâce à une détection plus sensible de mutations rares présentes en très faible nombre aux stades précoces de ces maladies. Comme elle permet de détecter de très faibles quantités d'ADN muté dans un échantillon complexe tel qu'une biopsie liquide (par exemple à partir de sang, d'urine, de liquide céphalorachidien, de larmes, etc.), la méthode est particulièrement utile dans le domaine de l'oncologie pour le dépistage, la détection de facteurs de risque, le diagnostic précoce, le pronostic et la personnalisation du traitement, le suivi de l'efficacité du traitement. Grâce à sa haute sensibilité, la méthode peut être réalisée en utilisant seulement un petit volume d'échantillon, en particulier un échantillon de sang. Elle peut être particulièrement appropriée en cas de diagnostic de patients vulnérables, comme par exemple des enfants, dont l'état de santé ne permet pas de prélever plusieurs ml de sang. BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES - Représentation de l'amorce utilisée dans la PCR d'enrichissement de la mutation. Un Enhancer est composé de 3 parties - La région-R ou région de reconnaissance, la région-E ou région d’amplification et une région de liaison. La région R est destinée à se lier au point chaud de la région de type sauvage du gène. La première température d'hybridation permet cette liaison. Dans ce cas, la PCR ne peut pas se dérouler en raison de la présence d'une structure non nucléotidique de la région de liaison. B = Si la région du point chaud est mutée dans le gène matrice, alors la liaison n'est pas efficace. C = En cas de mutation, la liaison est plus efficace avec la région-E de l'amorce. Dans ce cas, la PCR se déroule car elle n'est pas arrêtée par la structure non nucléotidique de la région de liaison. - Cette figure représente un mode de réalisation particulier dans lequel nucléase spécifique de l’ADN double brin (DSN) est utilisée à l'étape de PCR d’enrichissement (MEP). A = Pendant la première étape d'hybridation, la DSN est ajoutée. Les Enhancers servent de sondes et la région-R se lie à la version sauvage du point chaud et forment des structures double brin, ou duplex. Si la matrice est mutée, la liaison de la région-R ne permet pas de former de double brin parfait. La DSN coupant préférentiellement les structures double brin parfaitement formées, l'ADN de type sauvage est clivé. B = Après la réaction de clivage, l'enzyme est inactivée à 98°C et les composants de la PCR, y compris la polymérase, sont ajoutés. Les Enhancers peuvent alors servir d'amorces et la réaction de la polymérase peut se poursuivre en amplifiant uniquement les formes mutées. - Cette figure décrit les deux étapes de la méthode “Enhance-seq”. A = PCR d'enrichissement de la mutation où les Enhancers contiennent des sites de liaison. B = l'amplicon contient le site de liaison. C = les séquences Corrector sens et antisens contiennent une séquence fixe en 5' (chevauchant l'adaptateur d'Illumina) suivie d'une étiquette spécifique du patient/échantillon, d'un identifiant moléculaire unique (UMI) et d'un site de liaison. La liaison en une étape est effectuée avec la méthode Golden gate. Dans l'amplicon final, la région du point chaud de mutation est flanquée d’une étiquette spécifique de l'échantillon et de l'UMI dans les directions 5' et 3'. Pendant le séquençage, les données sont lues dans les deux directions 5' et 3'. - Cette figure montre comment la méthode"Enhance-seq" sera mise en œuvre si l’échantillon initial est un ADN méthylé. A= la matrice d'ADN méthylée subira une conversion bi-sulfite ou enzymatique ou toute autre méthode de conversion qui convertira toute molécule de cytosine non méthylée en molécule d'uracile. Les cytosines méthylées, quant à elles, restent sous forme de cytosine. Le schéma de protection par méthylation est différent chez les personnes atteintes de cancer et chez celles qui ne le sont pas. La signature de la méthylation peut être considérée comme des "mutations". B = l'ADN contenant de l'uracile est amplifié par PCR pour convertir l'uracile en molécule de thymine. C = L'ADN résultant est prêt à servir de matrice dans la méthode “Enhance-seq”. - Cette figure présente les grandes lignes des trois principales étapes de la méthode "Enhance-seq". Les deux premières étapes font partie de la méthode “Enhance-seq” de biologie moléculaire, et la troisième étape est la correction des données par logiciel. L'étape 1 est la PCR d’enrichissement des mutations (MEP) qui amplifie le signal de mutation présent dans la population initiale. À l'étape 2, les adaptateurs ou les molécules Corrector sont liés avec les amplicons. Une PCR est effectuée pour amplifier les molécules afin que chaque UMI présente dans le Corrector soit répliqué de nombreuses fois. À l'étape 3, la correction des erreurs de séquençage est effectuée dans l'amplicon à l'aide des Corrector UMI. Chaque séquence issue de la MEP présente ainsi un UMI, est est encore une fois amplifié. Un consensus est alors tiré de toutes les séquences filles ayant le même UMI, ce qui permet de distinguer les mutations des erreurs de séquençage. représente l'analyse de la PCR d’enrichissement de la mutation (sur le gel d'agarose). Dans la piste 1, seule la forme de type sauvage et dans la piste 2, seule la forme mutante des plasmides a été utilisée comme matrice. Dans la piste 3, le type sauvage et le mutant dans le rapport 98- 2 ont été utilisés. Le produit PCR attendu est d'environ 430 bp. Dans la piste 1, aucune amplification n'est observée dans la région attendue. Dans les pistes 2 et 3, en revanche, une forte amplification a été observée. PARTIE EXPÉRIMENTALE Les exemples suivants illustrent la mise en œuvre de la méthode pour la détection d’une délétion de 15 paires de bases sur l’exon 19 du gène EGFR et de la mutation ponctuelle (par exemple, EGFR L858R sur l’exon 21). I - MATÉRIAUX ET MÉTHODES 1) La synthèse des gènes Deux versions différentes de plasmides basés sur pUC57 ont été construites. (i) versions de type sauvage des exons 19 et 21 du gène du récepteur du facteur de croissance épidermique humain (EGFR). Mentionnée ici comme pUC57-W. (ii) version mutée de l'exon 19 (délétion de 15 pb) et de l'exon 21 (L858R) du même gène EGFR, mentionnée sous le nom de pUC57-M. 2) PCR d’enrichissement de la mutation (MEP) avec Enhancers Les Enhancers sont des amorces spécialement conçues pour améliorer spécifiquement les mutants, mais pas le type sauvage. La conception des Enhancers est inspirée de l'article de Huang et al. 2019 qui a montré une nouvelle façon de concevoir des amorces (appelées "stuntmers") pour renforcer spécifiquement les mutations dans un contexte où l'ADN de type sauvage est très présent. La première étape de la méthode ‘Enhance-seq’ est la PCR d’amplification des mutations (MEP), où les séquences mutées sont préférentiellement amplifiées par rapport au type sauvage à l'aide d’Enhancers ou stuntmers. Les séquences d'amorces suivantes ont été utilisées lors des expériences - Mutation par délétion de l'exon19 Fwd_Enhancer Exon_19 5'- CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAAC-C3-TAAAATTCCCGTCGCT-3' NB : pour le listage de séquence, cette séquence se décompose en deux parties CCCGTCGCTATCAAGGAATTAAGAGAAGCAAC (SEQ ID NO.1) TAAAATTCCCGTCGCT (SEQ ID NO.2) Rev_Exon_19 5'-AGCAGCTGCCAGACATGAGA-3' (SEQ ID NO.3) Mutation ponctuelle de l'exon21 L858R Fwd_Enhancer Exon_21 5'- GATTTTGGCTGGCCAAACTGCTGG-C3-AGCATGTCAAGATCACAGATTTT-3' NB : pour le listage de séquence, cette séquence se décompose en deux parties : GATTTTGGCTGGCCAAACTGCTGG (SEQ ID NO.4) AGCATGTCAAGATCACAGATTTT (SEQ ID NO.5) Rev_ Exon_21 5'- GAGCTCACCCAGAATGTCTGG-3' (SEQ ID NO.6) PCR d'enrichissement de la mutation (MEP) avec la polymérase Q5 5x tampon Q5 - 5ul, dNTPs (10mM) - 0.5ul, Fwd_Enhancer Exon_19/21 (10mM) - 1.25ul, Rev_Exon_19/21 (10mM) - 1.25ul, template - variable, eau - variable. Conditions PCR : Dénaturation initiale - 98°C pendant 30 secondes, dénaturation - 98°C pendant 10 secondes, hybridation primaire - 70°C pendant 30 secondes, hybridation secondaire - 57°C (pour l'exon 19), et 59°C (pour l'exon 21) pendant 30 secondes. Extension - 72°C pendant 30 secondes. Extension finale - 72°C pendant 2 minutes. Pour 35 - 45 cycles. 3) Ajout du site de liaison Dans cette expérience, les sites de liaison ont été créés par l'ajout de BsaI à chaque extrémité de l'amplicon. Ajout du site BsaI par PCR avec la polymérase Q5 - 5x tampon Q5 - 5ul, dNTPs (10mM) - 0.5ul, Fwd_barcoding_primer (10mM) - 1.25ul, Rev_barcoding primer (10mM) - 1.25ul, template - 1ul, eau - 10.5ul. Conditions de la PCR - Dénaturation initiale - 98°C pendant 30 secondes, dénaturation - 98°C pendant 10 secondes, hybridation - 62°C pendant 30 secondes, extension - 72°C pendant 30 secondes. Extension finale - 72°C pendant 2 minutes. Pour 30 cycles. 4) Traitement à la nucléase spécifique de l’ADN double brin (DSN) (optionnel): Dans le cas où une étape d’ajout d'une nucléase spécifique au duplex (DSN) est appliquée, la température d' hybridation de la région-R des Enhancers est choisie pour être autour de 67°C. L'expérience se déroule selon les étapes suivantes : i) Dans un thermocycleur, la température est augmentée à 98°C afin de dénaturer l'ADN. ii) L'échantillon est refroidi à 67°C (première température d'hybridation de la MEP), la DSN est ajoutée et la réaction est incubée pendant 20 minutes. iii) L'incubation est suivie de 2 minutes d'inactivation de l'enzyme DSN à 95°C. iv) L'échantillon est refroidi à nouveau à la deuxième température d' hybridation de la MEP et la PCR est effectuée après ajout des réactifs nécessaires. 5) Préparation des extrémités et liaison des amplicons et des Correctors La digestion de restriction des amplicons et des Correctors ainsi que la liaison se font en une seule étape par la technologie Golden gate. Tampon ADN ligase T4 - 2.5ul, Amplicon - 2.3 ul, Fwd_corrector - 0.56ul, Rev_corrector - 0.85ul BsaI - 0.5ul, T4 DNA ligase - 0.5ul, Eau - 16.8ul Les réactions sont incubées à 37°C pendant 40 minutes et inactivées à 60°C pendant 10 minutes. Ensuite, les réactions sont nettoyées par PCR clean up kit et éluées dans 10ul de tampon d'élution. Ici, 6 pb X désigne l’étiquette de l'échantillon ou du patient ; 10 pb N désigne la région UMI dégénérée. 6) Amplification des amplicons liés par le Corrector Les amplicons liés avec les Correctors ont été amplifiés par une PCR utilisant la polymérase Q5 - Réaction PCR: Q5 5x Master mix- 5ul ; dNTPs (10mM)- 0.5ul ; Universal_fwd_primer (10mM)- 1.25ul ; Universal_rev_primer (10mM)- 1.25ul ; Template- 5ul ; Eau- 12ul. Condition de PCR : Dénaturation initiale - 98°C pendant 30 secondes, dénaturation - 98°C pendant 10 secondes, recuit - 65°C pendant 30 secondes, extension - 72°C pendant 30 secondes. Extension finale - 72°C pendant 2 minutes. Pour 30 cycles. Universal_fwd_primer - 5'- ACACTCTTTCCCTACACGAC -3' (SEQ ID NO.7) Amorce_rev_universelle - 5'- GACTGGAGTTCAGACGTGTG -3' (SEQ ID NO.8) 7) Expérience "spike-in" Des produits PCR de 450 pb contenant l'exon 19 et l'exon 21 ont été amplifiés à partir des plasmides pUC57-W ou M. Ils ont ensuite été mélangés à différentes concentrations. Ces amplicons ont ensuite été ajoutés avec du sérum humain (Sigma-Aldrich) pour imiter la condition clinique où l'ADN sans cellules est mélangé avec le sérum humain. Les amplicons ont ensuite été isolés du sérum. Isolation d'amplicons à partir de sérum humain Le MagMAX™ Cell-Free DNA Isolation Kit d'Applied Biosystem a été utilisé pour isoler les amplicons de l'échantillon de sérum. Ce kit est conçu pour isoler l'ADN circulant à partir d'échantillons de plasma, de sérum et d'urine humains exempts de cellules, à l'aide de billes magnétiques Dynabeads. Les instructions du fabricant ont été suivies pour isoler les amplicons à partir du sérum. Les amplicons isolés ont été élus dans 20 ul de tampon d'élution. RÉSULTATS EXEMPLE 1 - Analyse du gel d'agarose de la PCR d'enrichissement de la mutation Des PCR d’enrichissement de mutation (MEP) ont été réalisées pour la mutation par délétion de l'Exon19 avec l'amorce Fwd_exon19_enhancer et Reverse_exon21 en utilisant différents modèles plasmidiques - type sauvage pUC57-W, mutant pUC57-M et mélange de ces deux dans des rapports (98- 2) pour voir si l'effet de la PCR d’enrichissement de mutation peut être observé visuellement dans le gel d'agarose. Toutes les matrices ont été utilisées à des concentrations de 10 ng/ul. Après 35 cycles de MEP, les amplicons ont été chargés dans le gel d'agarose à 2%. Le produit PCR attendu est d'environ 430 bp pour la séquence de type sauvage et 415 bp pour la forme mutante. Aucune amplification n'a été observée dans le cas du type sauvage ; en revanche, de fortes bandes d'amplification ont été observées lorsqu'un mutant ou un mélange de type sauvage et de mutants a été utilisé comme matrice ( ). EXEMPLE 2 - Essais avec différents ratios de population de type sauvage et de mutants Le but de cette expérience était de quantifier l'augmentation du signal de mutation et de voir si plusieurs cycles de PCR sont nécessaires pour augmenter significativement la population de mutants. Pour cela, le type sauvage pUC57-W et les plasmides mutants pUC57-M ont été dilués à une concentration de 10 ng/ul chacun et ensuite utilisés dans deux ratios différents. Mélange de type mutant et sauvage dans un rapport de 0,2 : 99,8 (R1). Mélange de type mutant et sauvage dans un rapport de 2 : 98 (R2). Des PCR d’enrichissement de la mutation ont été réalisées en utilisant ces deux mélanges comme matrices initiales. Trois tours consécutifs de PCR ont été effectués en utilisant l'amplicon du cycle précédent comme matrice pour la PCR suivante. Chaque fois, après un cycle de PCR, le produit a été purifié et dilué à une concentration de 10 ng/ul avant de passer au prochaine étape de la PCR. Les résultats montrent qu'un seul tour de PCR (ici 35 cycles) est suffisant pour saturer la mutation et bloquer l'amplification du type sauvage et que plusieurs tours de PCR supplémentaires n'augmentent pas la quantité de mutants dans la population. Pour la mutation par délétion de l'Exon19 Tableau 3. Changement des ratios de type sauvage et mutant après chaque cycle de PCR. Pour la mutation ponctuelle L858R de l'Exon21 Tableau 4 - Changement des ratios de type sauvage et mutant après chaque cycle de PCR. EXEMPLE 3 - Concentrations de matrices en nombres absolus Cette expérience vise à identifier le seuil de détection de la MEP et de la PCR traditionnelle en nombre absolu. Pour cela, pUC57-W et pUC57-M ont été diluées pour avoir les concentrations suivantes par 10ul- 1) 10 molécules de plasmide mutant et 10 8 molécules de plasmide sauvage (0,000001%) 2) 10 molécules de plasmide mutant et 10 9 molécules de plasmide sauvage (0,0000001%) Des PCR traditionnelles (avec une seule température d'hybridation) ainsi que des PCR d’enrichissement de la mutation (MEP) pour mutation par délétion de l'Exon19 et la mutation ponctuelle L858R de l'Exon 21 ont été réalisées à l'aide de ces matrices. Les amplicons ont été séquencés par séquençage NGS et l'analyse des données a révélé les résultats suivants dans le tableau 5. Tableau 5 - Effet de la PCR traditionnelle et de la PCR MEP sur le nombre absolu de mutations présente après amplification. Les données expérimentales montrent que en MEP la mutation par délétion de l'exon 19 est détectée au moins 5 fois plus efficacement que la mutation ponctuelle L858R de l'exon 21. La MEP peut détecter la mutation au moins 10 à 60 fois plus efficacement dans des concentrations hyper diluées d'ADN mutant où 10 molécules d'ADN mutant ou moins (selon les statistiques de Poisson) sont présentes dans le fond de 100 millions ou 1 milliard de séquence d'ADN de type sauvage. Dans le rapport de 10 à 1 milliard de molécules d'ADN mutant par rapport à l'ADN sauvage, la MEP a montré des capacités d'amplification 10 à 50 fois plus élevées selon la nature de la mutation (mutation ponctuelle ou délétion). Cela permettra de détecter des quantités extrêmement faibles de mutations présentes dans la population dans des machines de séquençage à faible profondeur, ce qui permettra d'économiser des investissements. EXEMPLE 4 - Expérience "spike-in" avec des amplicons dans le sérum L'objectif de cette expérience était de voir la performance de l'ensemble de la méthode Enhance-seq sur des échantillons de sérum avec des gènes artificiels ajoutés. Dans une solution complexe comme le sérum, l'isolement de l'ADN libre circulant (cfDNA) pourrait être un goulot d'étranglement pour atteindre la même limite de détection/sensibilité que dans l'eau, comme cela a été fait précédemment dans l'expérience synthétique. Les pUC57-W et pUC57-W ont été amplifiés pour obtenir deux amplicons différents de 450 paires de bases. Ces ADN d'amplicons de type sauvage et mutant ont été dilués à une concentration de 2ng/ml et ensuite mélangés dans différents ratios. Ensuite, les amplicons ont été ajoutés dans 500 ul de sérum avec les concentrations suivantes. Les amplicons ont ensuite été extraits du sérum avec le kit d'isolation cfDNA MegaMax et élués dans 20 ul de tampon d'élution. Des PCR traditionnelles ou des MEP ont été réalisées pour la mutation ponctuelle L858R de l'exon 21 avec 10ul de matrice. La MEP a été exécutée pour l'exon 21 avec les composants suivants - 5x Tampon Q5 - 5 ul, dNTPs - 0,5 ul, Fwd_Enhancer Exon_21 - 1,25 ul, 21 Reverse P - 1,25 ul, Q5 polymerase - 0,25 ul, ADN matrice - 5 ul, Eau - 12 ul. Conditions MEP 98°C pendant 30 secondes, dénaturation - 98°C pendant 10 secondes, hybridation primaire - 70°C pendant 20 secondes, hybridation secondaire - 59°C pendant 20 secondes. Extension - 72°C pendant 30 secondes. Extension finale - 72°C pendant 2 minutes. Pour 45 cycles Tableau 7 - Effet de la PCR traditionnelle et de la MEP sur les amplicons mutés hyper-dilués isolés du sérum. Ce résultat montre que la MEP permet d’amplifier l'ADN mutant, environ cinq fois plus efficacement que la PCR traditionnelle avec une seule température d'hybridation et une conception classique des amorces. L'efficacité du système est plus élevée lorsqu'on utilise un fragment d'ADN linéaire que sous forme de plasmide. Procédé de détection d'une mutation rare dans un échantillon biologique, comprenant les étapes suivantes : Étape 1 - fourniture d'un échantillon comprenant de l'ADN Étape 2 - amplification sélective de la région contenant ladite mutation en utilisant une PCR d'enrichissement de la mutation (Mutation Enhancement PCR, MEP) Étape 3 - ajout d'un site de liaison à chaque extrémité 5' et 3' de l'amplicon obtenu Étape 4 - ajout d'une séquence Corrector comprenant une séquence fixe, - éventuellement une étiquette spécifique de l'échantillon/du patient -, un identifiant moléculaire unique (UMI) et un site de liaison à chaque extrémité de chaque amplicon en utilisant les sites de liaison correspondants Étape 5 - amplification des amplicons résultant de l'étape 4 par PCR Étape 6 - séquençage des amplicons résultant de l'étape 5 par NGS Étape 7 - correction des erreurs de séquençage par une analyse logicielle utilisant lesdits identifiants moléculaires uniques. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite MEP comprend les étapes suivantes - Fourniture d'une amorce amplificatrice (Enhancer) pour PCR comprenant 3 régions : (i) la région R qui reconnaît et se lie spécifiquement à la séquence de type sauvage mais ne peut pas se lier si la région contient une mutation, (ii) une région de liaison et (iii) la région-E qui se lie à une séquence située en amont du site de mutation ; Réalisation d'une PCR comprenant deux étapes d’hybridation : (i) une première hybridation à une température T1 qui permet la liaison de la région R de l'amorce à la séquence de type sauvage et (ii) une seconde hybridation à une température T2 qui permet la liaison de la région-E de l'amorce ; dans lequel T1 est supérieure d'au moins 5°C à T2 ; En cas de liaison de la région E, la séquence contenant ladite mutation est amplifiée. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2 caractérisé en ce que les étapes 2 et 3 sont fusionnées en une seule étape en fournissant une construction comprenant une amorce Enhancer et un site de liaison et en ajoutant cette construction à l'amplicon obtenu à l'étape 2. Procédé selon l’une des revendications précédentes caractérisé en ce qu’une nucléase spécifique de l’ADN double brin (DSN) est ajoutée après la première étape d’hybridation de ladite PCR. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le site de liaison est choisi parmi une extension homopolymérique (A-tailing), ou une séquence de site de restriction, en particulier un site de restriction orienté. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ladite mutation rare est une mutation ponctuelle, une délétion, une insertion, ou un réarrangement. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que ladite mutation rare correspond à la présence d'une cytosine comme marqueur de méthylation de l'ADN, ledit procédé comprenant une étape de traitement de l'échantillon d'ADN avant l'amplification de l'ADN de l'étape 2 afin de révéler le site de méthylation. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape de traitement de l'échantillon biologique avant l'amplification d'ADN de l'étape 2 afin de convertir l'ARN en ADN. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'une étiquette de patient ou une étiquette d'échantillon est présente dans ladite séquence Corrector à l'étape 4, puis les amplicons résultant de l'étape 5 sont regroupés pour un séquençage NGS. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'échantillon biologique est une biopsie liquide.