FR 3125231 A1 20230120 FR 2107606 A 20210713 [0001] La présente divulgation relève du domaine des méthodes de purifications des glycoprotéines, de préférence les glycoprotéines fortement glycosylées. Méthode de purification de glycoprotéines La présente divulgation relève du domaine des méthodes de purification des glycoprotéines, de préférence les glycoprotéines fortement glycosylées. Les protéines recombinantes prennent une importance croissante en raison de leurs nombreuses applications, notamment dans l'industrie biopharmaceutique, l'industrie des enzymes ou l'industrie agricole. Grâce à la disponibilité accrue des protéines recombinantes, de nombreuses avancées ont été réalisées dans les domaines de la médecine, du diagnostic, de l'alimentation et de la nutrition, ainsi que de la production de matières premières. Aujourd'hui, plus de 200 produits pharmaceutiques à base de peptides et de protéines approuvés par la FDA sont utilisés, comme l'insuline, l'albumine, l'hormone de croissance humaine et les anticorps, ce qui améliore les possibilités et les stratégies de traitement. Ces avancées ont été possibles grâce aux progrès réalisés dans les domaines de la production de protéines recombinantes (M. Delic, R. et al., Antioxidants & redox signaling 21 (2014) 414–437). L'expression de protéines recombinantes à l'aide de micro-organismes génétiquement modifiés tels que Escherichia coli sont maintenant des techniques courantes (A.L. Demain et al. Biotechnology advances 27 (2009) 297–306; K. Itakura, et al., Science 198 (1977) 1056–1063; R.B. Meagher, et al., Cell 10 (1977) 521–536). Cependant, la purification reste la principale étape limitante de la production de protéines recombinantes. Le repliement correct des protéines et la purification rapide et efficace constituent un défi majeur en raison des exigences d'optimisation pour chaque protéine. Les glycoprotéines représentent un sujet de recherche prometteur en raison de leur rôle dans la signalisation cellulaire, l'adhésion cellulaire et l'interaction avec les récepteurs. De nombreuses stratégies différentes ont été développées pour l'ingénierie biochimique/protéique et la production de protéines glycosylées par expression dans des lignées cellulaires de mammifères, glycosylation orthogonale par co-expression avec une glycosyltransférase ou glycosylation chimique post-expression (H. Nothaft, et al., Current opinion in chemical biology 53 (2019) 16–24). En raison de l'hétérogénéité des glycoprotéines exprimées, la purification est particulièrement difficile car le mélange hétérogène peut présenter une variété de propriétés physicochimiques. La purification des protéines à petite échelle en laboratoire a fait de nombreux progrès et est facilement disponible, mais la purification à grande échelle reste un défi (D. Hardy, et al., Biochemical Society transactions 44 (2016) 838–844 ; J. Konczal, C.H. et al., Protein Expr. Purif. 133 (2017) 160–169). La stratégie de purification la plus couramment employée pour la purification des protéines recombinantes utilise des étiquettes d'affinité fixées à la protéine, telles que les étiquettes poly-His, en combinaison avec la chromatographie d'affinité à ions métalliques immobilisés (IMAC) (C.L. Young, et al., Biotechnol. J. 7 (2012) 620–634). Néanmoins, une seule purification par IMAC s'avère souvent insuffisante pour obtenir une pureté suffisante pour les analyses et études biochimiques. En effet, bien que l'IMAC présente de nombreux avantages, tels qu'une purification rapide et une mise à l'échelle facile, les niveaux de pureté élevés ne sont pas toujours atteints après un seul cycle de purification. Par conséquent, une deuxième étape de purification est souvent nécessaire, soit sous la forme d'une purification par affinité en tandem (TAP), soit par une étape de séparation par un autre type de chromatographie, comme la chromatographie d'exclusion stérique (Size-Exclusion Chromatography, SEC) (Y. Li, Biotechnology letters 33 (2011) 1487–1499). La SEC a été développée pour permettre la séparation des produits par taille, avec une résolution et un pouvoir de séparation élevés, ce qui la rend appropriée comme étape de séparation (G.H. Lathe, et al., The Biochemical Journal 64 (1956) 665–674). Depuis lors, elle est considérée comme une application standard dans la préparation des molécules biologiques et des protéines, y compris, mais sans s'y limiter, les applications préparatoires, l'étude du repliement des protéines (V. N. Uversky, et al., Biochemistry 32 (1993) 13288–13298), le dessalage et l'échange de tampons (T. Burnouf, J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 664 (1995) 3–15) et l'élimination des agrégats (Katakam, et al. PDA Journal of pharmaceutical science and technology 49 (1995) 160–165). Cependant, en raison de la nature de la SEC, la séparation prend généralement beaucoup de temps car le principe de séparation repose sur la rétention différente des protéines dans les matrices réticulées. Par conséquent, les longues durées d'exécution de 30 minutes ou plus et la consommation élevée de phase mobile jouent un rôle critique, rendant souvent cette approche économiquement non viable. En outre, la faible capacité volumique des colonnes SEC a empêché son application dans les processus industriels de séparation. Bien que les applications de la SEC dans les approches de chromatographies continues telles que le lit mobile simulé (SMB), le contre-courant périodique (PCC) ou la chromatographie annulaire continue (CAC) soient connues, elles nécessitent un équipement spécialisé et très coûteux ainsi qu'un personnel spécialement formé, ce qui limite ces approches aux processus industriels dédiés (Dr. Rahul Godawat et al. Biotechnol. J. 7 (2012) 1496–1508 ; G. Iberer, et al., J. Chromatogr. A 921 (2001) 15–24; S.R. Schmidt, BioProcess Technical 15 (2017) 30–37). Résumé Les inventeurs ont pour la première fois développé une méthode de purification des glycoprotéines permettant d’améliorer le rendement tout en obtenant une bonne pureté du composé cible avec un équipement de chromatographie en phase liquide haute performante (HPLC ; pour en anglais « High Performance liquid Chromatography ») classique, ou UPLC (pour en anglais « Ultra Performance Liquid Chromatography »), ou FPLC (pour en anglais « Fast Protein Liquid Chromatography ») mais avec un débit beaucoup plus rapide. Les inventeurs ont utilisé une chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) combinée à une méthode de chromatographie continue utilisant une seule colonne dans une approche en deux étapes telle que décrite dans la demande WO2012/062985 afin d’obtenir une séparation à très haute fréquence. Contrairement à la méthode utilisée précédemment par les inventeurs pour purifier une adhésine fortement glucosylée de l'Haemophilus influenzae de type non déterminable (HMW1ct-Glc) (M.T.C. Walvoort, et al., Sci. Rep. 6 (2016) 39430), comme illustré dans les exemples de la présente demande, la méthode de la présente invention permet d’atteindre un degré de pureté plus élevé tout en ayant un rendement plus important. La présente invention concerne une méthode de purification d’une glycoprotéine d’intérêt en solution comprenant les étapes de : i. séparation de la fraction comprenant une glycoprotéine par chromatographie d’affinité, ii. séparation de ladite fraction comprenant la glycoprotéine d’intérêt par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide comprenant les étapes de : a) injections multiples de la fraction, lesdites injections se succédant après des intervalles de temps t1 dans une colonne de chromatographie d’exclusion stérique, b) soutirages multiples, le dit soutirage des fractions se succédant après des intervalles de temps t1, générant un éluat enrichi en glycoprotéine d’intérêt formé à partir d’au moins d’une des fractions soutirées, c) injections multiples de l’éluat recueilli précédemment, les dites injections se succédant après des intervalles de temps t2 dans une colonne de chromatographie d’exclusion stérique, d) soutirages multiples, les dits soutirages des fractions se succédant après des intervalles de temps t2 dans une seconde colonne de chromatographie d’exclusion stérique. La présente invention concerne également une glycoprotéine susceptible d’être obtenue par la méthode précédente présentant un degré de pureté supérieur à 80%, de préférence 90% de la masse totale des protéines. Fig. 1 montre une représentation schématique de la chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide selon l’invention (WO2012/062985). A) Au cours de la première étape, le produit est introduit dans la colonne à une fréquence déterminée, choisie de manière à ce que le produit co-élue avec une petite quantité d'impuretés (gris foncé). B) Au cours de la deuxième étape, le produit est réinjecté en utilisant une fréquence différente optimisée de manière à le séparer de l'impureté précédemment co-éluée. Fig. 2 montre une analyse SEC de HMW1ct-Glc purifié après IMAC His-Tag et après purification par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide en deux étapes selon l’invention. L'analyse SEC a été réalisée à 1 mL/min. 500 µL de produit ont été chargés sur la colonne. La glycosyltransférase HMW1C (Grass, S. et al. Mol Microbiol 48 (2003) 737; Gross, J. et al. J Biol Chem 283, (2008) 26010) élue en premier à 7.9 min tandis que l'adhésine HMW1 élue à 14.8 min. Fig. 3 montre un SDS-PAGE de (1) HMW1ct-Glc purifié après IMAC His-Tag et purification par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide en deux étapes selon l’invention (gauche), (2) après purification IMAC (droite). La glycosyltransférase utilisée pour la glycosylation orthogonale est toujours présente, à 70 kDa, alors qu'après purification par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide en deux étapes selon l’invention (1), seule la HMW1ct-Glc est visible, à 40-35 kDa. Méthode de purification d’une glycoprotéine d’intérêt en solution comprenant les étapes de : i. séparation de la fraction comprenant une glycoprotéine par chromatographie d’affinité, ii. séparation de ladite fraction comprenant la glycoprotéine d’intérêt par chromatographie d’exclusion stérique en phase liquide comprenant les étapes de : a) injections multiples de la fraction, lesdites injections se succédant après des intervalles de temps t1 dans une colonne de chromatographie d’exclusion stérique, b) soutirages multiples, le dit soutirage des fractions se succédant après des intervalles de temps t1, générant un éluat enrichi en glycoprotéine d’intérêt formé à partir d’au moins d’une des fractions soutirées, c) injections multiples de l’éluat recueilli précédemment, les dites injections se succédant après des intervalles de temps t2 dans une colonne de chromatographie d’exclusion stérique, d) soutirages multiples, les dits soutirages des fractions se succédant après des intervalles de temps t2 dans une seconde colonne de chromatographie d’exclusion stérique. Méthode selon la revendication 1 caractérisée en ce que la glycoprotéine d’intérêt est fusionnée à une étiquette histidine (Tag-His) et la chromatographie d’affinité est une chromatographie d’affinité sur ions métalliques immobilisés. Méthode selon la revendication 1 ou 2 caractérisée en ce que la glycoprotéine d’intérêt est une protéine fortement glycosylée. Méthode selon l’une des revendications 1 à 3 caractérisée en ce que la glycoprotéine d’intérêt est le fragment C-terminal de l’adhésine fortement glucosylée de Haemophilus influenzae non déterminable. Méthode selon les revendications 1 à 4 caractérisée en ce que la glycoprotéine est obtenue à partir d’une culture cellulaire. Méthode selon l’une quelconque des revendications 2 à 5 caractérisée en ce que les ions métalliques immobilisés dans la chromatographie d’affinité sont des ions Ni 2+. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 6 caractérisée en ce que la phase liquide de l’étape ii. est une solution saline comprenant de l’arginine et/ou de la lysine. Méthode selon l’une quelconque des revendications 1 à 7 caractérisée en ce que la phase liquide de l’étape ii. est une solution ayant pH égal ou supérieur à 0.5 à 1 au pI de la glycoprotéine d’intérêt. Méthode selon l’une quelconque des revendications précédentes caractérisée en ce que la seconde colonne est la même que la première. Glycoprotéine susceptible d’être obtenue par l’une des méthodes selon les revendications 1 à 9 présentant un degré de pureté supérieur à 80%, de préférence 90% de la masse totale des protéines.