FR 3122808 A1 20221118 FR 2204464 A 20220511 La présente demande de brevet concerne un procédé d’obtention d’un extrait aqueux provenant d’au moins deux algues (microalgues et/ou macroalgues), permettant un meilleur rendement d’extraction des composés hydrophiles et hydrophobes desdites algues. En outre, l’invention concerne lesdits extraits aqueux, ainsi que leur utilisation dans la prévention des pathologies cardiovasculaires, et en tant qu’ingrédient fonctionnel en alimentaire, en particulier de complément alimentaire. Co-extraction de composés actifs à caractères hydrophiles et hydrophobes issus de microalgues et macroalgues La présente demande de brevet concerne un procédé d’obtention d’un extrait aqueux provenant d’au moins deux algues (microalgues et/ou macroalgues), permettant un meilleur rendement d’extraction des composés hydrophiles et hydrophobes desdites algues. En outre, l’invention concerne lesdits ex-traits aqueux, ainsi que leur utilisation dans la prévention des pathologies cardiovasculaires, et en tant qu’ingrédient fonctionnel en alimentaire, en particulier de complément alimentaire. Art antérieur A l’heure actuelle, les extraits issus de microalgue disponibles sur le marché sont pour la majorité des extraits purifiés ne contenant qu’une seule famille de molécule : protéines, sucres ou lipides… Il est cependant envisageable de trouver des extraits combinés contenant plusieurs molécules de même nature, issues de différentes étapes d’extraction. Ainsi le document ES2728088 décrit un procédé de microencapsulation d’huiles au sein de microalgues en milieu aqueux. Néanmoins, ce brevet fait intervenir plusieurs étapes d’extraction dont une étape préliminaire à l’homogénéisation consistant en la rupture cellulaire et la formation d’émulsion avec les différents composés. De plus, le procédé évoqué fait intervenir des composés exogènes à la biomasse initiale. Par ailleurs, le document CN104413077 propose une extraction simultanée d’origan et de trèfle pour l’élaboration d’un mélange avec une activité de pesticide. Ladite invention fait intervenir un solvant éthanolique d’une part et ne comporte pas d’enjeu de solubilisation de composés de nature lipophile d’autre part. Le document ES2335333 décrit quant à lui une émulsion huile dans eau (H/E) ou eau dans huile (E/H) réalisée avec un filtrat issu d’une macération de macroalgue dans de l’eau. Ce procédé n’a donc pas vocation à solubiliser des composés de nature apolaire issus d’une matrice végétale brute puisque l’huile utilisée est une source exogène vis-à-vis de la macroalgue employée. De plus, ce procédé ne fait intervenir qu’une seule espèce de macroalgue et ne propose donc pas d’enjeu de co-extraction ou de solubilisation de composés hydrophobes ou peu solubles dans l’eau. Le document GR1008712 s’intéresse quant à lui à la solubilisation de composés aromatiques d’herbes dans une huile d’olive préalablement extraite. Ce procédé ne permet donc pas l’obtention de composés hydrosolubles et comporte deux étapes distinctes d’extraction. Enfin, le brevet FR3052064 met en jeu une extraction d’huile de graines d’une même espèce ou d’un mélange de 2 espèces. Cette huile est ensuite mélangée avec de l’eau ainsi que des mucilages de lin pour l’obtention d’une émulsion. Parallèlement à l’invention citée précédemment, celle-ci ne permet pas non plus la solubilisation de composés hydrosolubles contenus dans les graines. De plus aucune synergie d’activité n’est démontrée ici. Ainsi, aucun ingrédient issu de microalgue généré en une seule étape d’extraction ne présente à la fois des composés hydrosolubles et liposolubles. En effet, ayant des polarités différentes, toutes les molécules d’intérêt nutritionnel/santé ne peuvent être solubles dans le même solvant. La Demanderesse a développé un procédé permettant d’obtenir un ingrédient alimentaire de composition unique grâce à un procédé innovant de co-extraction simultanée de 2 espèces de microalgues différentes permettant de surmonter les problèmes ci-dessus. Contrairement aux documents cités ci-dessus, l’invention emploie l’ensemble des matières premières sous leurs formes brutes, limitant ainsi le nombre d’opérations unitaires telle que l’extraction préalable de l’huile d’une des espèces. Ceci permet en conséquent une réduction du temps de traitement ainsi que du coût de production de l’extrait final. De plus, ledit procédé ne fait intervenir aucun solvant dérivé de la pétrochimie ou présentant une toxicité quelconque ou encore un risque d’inflammabilité. est un résumé du déroulé de l’exemple 1, comparant une extraction simultanée de deux microalgues, et des extractions isolées. est une figure comparant l’impact des procédés conventionnels et du procédé selon l’invention sur la structure cellulaire des microalgues dans l’exemple 2. représente deux photographies des surnageants A et B obtenus selon le protocole de l’exemple 2. est un résumé du déroulé de l’exemple 2, comparant le procédé selon l’invention comprenant une étape d’homogénéisation à haute pression, et le procédé conventionnel n’en comprenant pas. Exemples Exemple 1 : Procédé de co-extraction de composés hydrophiles et lipophiles en milieu aqueux en comparaison à des extractions simples ( ). Introduction : Le procédé selon l’invention est étudié pour produire une composition aqueuse enrichie en composés de nature lipophile, peu polaire, en plus des composés hydrophiles extraits par affinité dans le solvant aqueux utilisé. Le défi ici est de parvenir à extraire des composés lipidiques dans un solvant aqueux (dans lequel ils ne sont pas solubles) grâce à la coextraction. Nous nous focalisations donc au travers de cet exemple sur les lipides. La composition en lipides de l’extrait a été évaluée par la méthode de référence de Bligh and Dyer (1959), qui a permis une quantification efficace des lipides totaux. Étapes du procédé d’extraction : Préparation de 3 solutions distinctes, à savoir les solutions A, B et C. Dans un premier temps, une solution A d’ Arthrospira platensis à 2% dans du tampon phosphate à pH7, La solution B est préparée dans les mêmes conditions que la solution A, avec cette fois-ci à 2% de Nannochloropsis sp ., Enfin, la solution C est préparée avec 2% de biomasse algale sèche composée à 50% d’Arthrospira platensis et 50% de Nannochloropsis sp., Pré-homogénéisation des solutions A, B et C grâce à un passage à l’Ultraturrax TM durant 2 minutes à 10000 rpm. Lesdites suspensions sont ensuite traitées individuellement grâce à l’homogénéisateur haute pression avec une pression croissance limitée à 800 bars. Lesdites suspensions sont traitées en circuit ouvert et la recirculation est effectuée pour un total de 4 passages, effectués avec des pressions croissantes, respectivement 500/600 et 800 bars. Lesdites suspensions sont analysées immédiatement après leurs préparations. Pour les extraits A et B, un volume précis de 2,8 mL de chaque extrait est prélevé et transféré dans un unique bécher avec agitateur magnétique, constituant ainsi la somme des 2 extraits de microalgues réalisés indépendamment. Pour l’extrait C, un volume précis de 5,6 mL est prélevé et transféré dans un bécher avec agitateur magnétique. Un volume précis de 7mL de chloroforme ainsi qu’un second volume de 14mL de méthanol sont ajoutés à l’extrait à doser A + B ou C avant la première mise en agitation à 500 rpm pendant 10 minutes. Un second volume de 7 mL de chloroforme est ajouté puis la solution est agitée en mode turbo durant 30 secondes. Enfin, 7 mL d’une solution de KCl à 0,85% sont ajoutés avant une nouvelle agitation à 4000 rpm pendant 10 min. Les extraits A + B et C sont centrifugés à 3000 G pendant 10 min et la phase inférieure est prélevée à la seringue puis transférée dans un tube à hémolyse dont la masse aura été préalablement mesurée. Les tubes sont placés sur un thermobloc paramétré à 50°C sous flux d’azote pour permettre l’évaporation totale des solvants. Enfin, les tubes correspondant aux extraits A, B et C sont à nouveau pesés et la différence de masse obtenue correspond à la masse de lipides contenue dans lesdits extraits. Les masses lipidiques obtenus pour chaque extrait sont moyennées (à raison de trois essais par extrait) puis la masse moyenne des extraits A + B est comparée à la masse moyenne issue de l’extrait C. [Table 1] Paramètres d’extraction de l’exemple 1 Paramètre d’extraction de l’exemple Paramètres Valeurs Concentration en soluté solution A 2 % m/m ( Arthrospira platensis ) Concentration en soluté solution B 2 % m/m ( Nannochloropsis sp. ) Concentration en soluté solution C 2% de biomasse algale sèche composée à 50% d’Arthrospira platensis et 50% de Nannochloropsis sp Nature du solvant Tampon phosphate pH 7 Pré-homogénéisation à l’ultraturrax TM 2 min – 10000 rpm Homogénéisation haute pression 3 passages réalisés respectivement à 500/600 et 800 bars Phase analysée Totum Le procédé suivant l’invention de co-extraction simultanée permet d’enrichir le totum en lipides à hauteur de 18,88 ± 1,21% contre 13,54 ± 0,67% dans le cas de l’addition des extraits générés indépendamment. Ledit procédé permet donc l’obtention d’une quantité de composés lipophiles 39% plus importante par coextraction simultanée que dans le cas de l’addition des extraits générés indépendamment. Exemple 2 : Procédé de co-extraction intensifiée par homogénéisation à haute pression de composés hydrophiles et lipophiles en milieu aqueux en comparaison à une extraction conventionnelle ( ). Le procédé selon l’invention est étudié pour produire un totum aqueux comprenant les composés hydrophobes d’une microalgue riche en lipide, solubilisée grâce au milieu intracellulaire d’une microalgue riche en protéines. Le premier objectif est ici d’étudier l’impact de la co-extraction intensifiée par homogénéisation à haute pression sur la structure cellulaire des microalgues, en comparaison avec une co-extraction par méthode conventionnelle. Le second objectif est d’étudier la composition des fractions dudit totum, grâce à une étape de centrifugation puissante et longue. Nous nous focalisons donc au travers de cet exemple sur les lipides ainsi qu’à l’impact du procédé sur la structure cellulaire des microalgues. La composition en lipides de l’extrait a été évaluée par la méthode de référence de Bligh and Dyer (1959), qui a permis une quantification efficace des lipides totaux. Cette méthode est décrite plus en détail ci-avant les exemples. La structure cellulaire a quant à elle été étudiée par microscopie photonique d’une part, ainsi que par microscopie à épi-fluorescence d’autre part. Pour cette seconde technique de microscopie, le fluorochrome SYTOX, intercalant de l’ADN a été utilisé. Il permet de mettre évidence les cellules disposant d’une membrane endommagée grâce à l’émission d’une fluorescence verte. En effet, le fluorochrome ne peut se fixer à l’ADN de la cellule que si sa membrane est au préalable endommagée. Les cellules qui viendraient à rester intactes sont repérables par l’autofluorescence rouge de la chlorophylle contenue dans les microalgues. Étapes du procédé d’extraction : Préparation de 2 solutions distinctes, à savoir les solutions A et B. Dans un premier temps, la solution A est préparée avec 2% d’ Arthrospira platensis ainsi que 2% de Nannochloropsis sp. , dans du tampon phosphate à pH7, La solution B est préparée dans les mêmes conditions que la solution A, La solution A est mise sous agitation à l’aide d’une pale d’agitation à 1000 rpm, à température ambiante, pendant 30 minutes (extraction conventionnelle). La solution B est pré-homogénéisée grâce à un passage à l’Ultraturrax TM durant 2 minutes à 10000 rpm. Ladite solution B est ensuite traitée grâce à l’homogénéisateur haute pression avec une pression cible de 800 bars. Ladite suspension est traitée en circuit ouvert et la recirculation est effectuée pour un total de 3 passages, effectués avec des pressions croissantes, respectivement 500/600 et 800 bars. Un aliquot de chacune des solutions A et B, dénommés ci-après aliquot A et aliquot B est prélevé pour être observé en microscopie photonique puis en microscopie à épi-fluorescence comme suit. Les aliquots A et B sont centrifugés à 13500g pendant 5 min. Les surnageants issus desdits aliquots sont éliminés et les culots repris dans 1 mL d’eau distillée puis vortexés pour ré-homogénéiser chacun des aliquots. 20 µL du réactif SYTOX à 0,5 mM sont ajoutés dans lesdits aliquots. Les aliquots A et B sont ensuite placés à l’obscurité avant d’être observés entre lame et lamelle avec un filtre d’excitation à 490 nm. Les observations desdits aliquots A et B sont comparées entre elles ainsi qu’avec les états initiaux des microalgues étudiées. Les solutions A et B sont centrifugées à 10000 g pendant 30 min à 20°C immédiatement après leurs traitements respectifs. Les surnageants sont ensuite prélevés et les lipides sont quantifiés au sein desdits surnageants comme suit. Pour chacun des surnageants issus des solutions A et B, ci-après nommés surnageants A et B, un volume précis de 5,6 mL est prélevé et transféré dans un bécher avec agitateur magnétique. Les surnageants A et B sont analysés suivant la méthode de Bligh and Dyer dont les conditions expérimentales ont été décrites ci-avant. Les masses de lipides correspondant aux surnageants A et B sont calculées. Les masses lipidiques obtenues pour chaque surnageant sont ensuite moyennées (à raison de trois essais par extrait) puis comparées entre elles. [Table 2] Paramètres d’extraction de l’exemple Paramètre d’extraction de l’exemple 2 Paramètres Valeurs Concentration en soluté solution A et B 2 % m/m (Nannochloropsis sp.) + 2 % m/m (Arthrospira platensis) Nature du solvant Tampon phosphate pH 7 Pré-homogénéisation à l’ultraturrax TM solution A 2 min – 10000 rpm Homogénéisation haute pression solution A 3 passages réalisés respectivement à 500/600 et 800 bars Extraction conventionnelle solution B Agitation mécanique (pale d’agitation) 1000 rpm - 30 min – 20°C Centrifugation 10 000 g – 30 min – 20°C Phase analysée Surnageant Les observations microscopiques de l’aliquot A issu de ladite solution A permettent de conclure en ce que l’apparence cellulaire obtenue à l’issue de la co-extraction conventionnelle ne diffère aucunement de l’état initial de chacune des microalgues ( à gauche). Le procédé suivant l’invention permet quant à lui d’obtenir des particules de taille nettement réduite et homogène, à droite). Le procédé de co-extraction conventionnelle aboutit à un surnageant A de coloration bleue, due à la présence de phycocyanine, pigment hydrophile de la spiruline. A contrario, le procédé de co-extraction intensifiée par homogénéisation à haute pression fournit un surnageant B de coloration vert foncé, due à l’extraction simultanée de la phycocyanine mais également de la chlorophylle, pigment ne pouvant normalement pas diffuser dans un milieu aqueux au vu de sa polarité (voir ). Le procédé suivant l’invention de co-extraction intensifiée par homogénéisation à haute pression permet d’obtenir un surnageant aqueux enrichi en lipides à hauteur de 8,14 ± 0,62% contre 2,11 ± 0,68% dans le cas d’une co-extraction conventionnelle par macération. Ledit procédé permet donc d’obtenir une quantité de composés lipophiles quatre fois plus importante que dans le cas d’une co-extraction conventionnelle. Cet exemple démontre donc qu’en l’absence de débris cellulaires, préalablement écartés par une centrifugation puissante, des composés lipidiques sont présents au sein du surnageant issu de la co-extraction intensifiée par homogénéisation à haute pression. Cette solubilisation de lipides pourrait prendre forme grâce à une émulsification stable des composés lipidiques de Nannochloropsis avec les protéines de la Spiruline. Procédé d’obtention d’un extrait d’algues à partir d’au moins deux algues, permettant un meilleur rendement d’extraction de composés hydrophiles et de composés hydrophobes, comprenant les étapes de : Mélange desdites au moins deux espèces d’algues, de préférence sous forme de poudre sèche, avec un solvant aqueux, de préférence à un ratio d’entre 1% et 20% en poids total du mélange desdites au moins deux espèces d’algues ; Homogénéisation du mélange obtenu à l’étape a. à une température comprise entre 4 et 30°C, de préférence par agitation ou ultrasons ; Application de micro-ondes, ou d’un broyage à billes, ou d’ultrasons ou d’une homogénéisation haute pression audit mélange obtenu à l’étape b. ; Optionnellement, macération du mélange obtenu à l’étape c., de préférence à une température comprise entre 4 et 25°C entre 30 minutes et 12h ; Obtention d’un extrait aqueux d’algues comprenant des composés hydrophiles et des composés hydrophobes issus desdites au moins deux algues. Procédé d’obtention d’un extrait d’algues selon la revendication précédente, où ledit procédé comprend en outre une étape f. de séparation solide/liquide de l’extrait aqueux obtenu à l’étape e., de préférence par filtration papier, filtration membranaire ou par centrifugation. Procédé d’obtention d’un extrait d’algues selon la revendication 2, où ledit procédé comprend en outre une étape g. de séchage du surnageant obtenu à l’étape f., de préférence par lyophilisation, séchage basse température, atomisation ou séchage sous pression, permettant d’obtenir un extrait sec sous forme de poudre. Procédé d’obtention d’un extrait d’algues selon l’une quelconque des revendications précédentes, où l’étape b. est réalisée par : agitation à l’aide d’une pale d’agitation pour une durée de 1 à 20 minutes, à une vitesse comprise entre 150 et 1000 rpm, de préférence 150 et 800 rpm ; ou agitation à l’aide d’un disperseur sur une période allant de 1 à 20 minutes, à une vitesse comprise entre 1000 et 16000 rpm ; ou ultrasons à une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, de puissance entre 50 et 1000 W, pour une durée comprise entre 30s et 20 minutes. Procédé d’obtention d’un extrait d’algues selon l’une quelconque des revendications précédentes, où l’étape c. est réalisée par : Traitement micro-ondes pour une durée de 5 à 60 min à une fréquence comprise entre 300 MHz et 30 GHz et à une puissance électrique entre 0,5 et 30 watts/cm 3 ; ou Broyage à billes, avec des billes de diamètre 0,4 à 2 mm, un remplissage de la chambre d’extraction compris entre 60 et 90%, à une vitesse de rotation de 1000 à 4000 rpm durant 15 à 90 minutes ; ou Traitement ultrasonore à une fréquence comprise entre 10 et 40 kHz, de puissance entre 50 et 1000 W, pour une durée comprise entre 5 et 60 minutes ; ou Homogénéisation haute pression à une pression comprise entre 500 et 2500 bars, entre 1 et 10 passages, à une température comprise entre 4 et 75°, de préférence entre 4 et 55°C. Procédé d’obtention d’un extrait d’algues selon l’une quelconque des revendications précédentes, où lesdites au moins deux algues comprennent au moins une espèce de microalgues choisies parmi les genres : Chlorella, Auxenochlorella, Dunaliella, Tetraselmis, Haematococcus, Scenedesmus ; Eustigmatophytes ; Euglénophytes,; Rhodophytes, Bacillariophyceae, Thraustochytriaceae. Procédé d’obtention d’un extrait d’algues selon l’une quelconque des revendications précédentes, où lesdites au moins deux algues comprennent au moins une espèce de macroalgues choisies parmi les genres Chondrus, Gracilaria, Porphyra, Pyropia, Kappaphycus, Euchema , Palmaria , Ascophyllum, Fucus, Undaria, Alaria, Laminaria, Sargassum , Saccharina , Ulva, Caulerpa, Enteromorpha, et/ou Chladophora . Extraits d’algues issus d’au moins deux espèces d’algues, obtenus par le procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes. Utilisation des extraits d’algues selon la revendication 8, dans un complément alimentaire. Utilisation des extraits d’algues selon la revendication 8, en tant qu’ingrédient fonctionnel en alimentaire.