FR 3124192 A1 20221223 FR 2114709 A 20211231 L’invention concerne un microcompartiment cellulaire en trois dimensions ou un ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne (14), ladite partie interne comprenant au moins : - des éléments de matrice extracellulaire, et - au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules humaines ou animales organisée en trois dimensions autour d’une lumière, le plus petit rayon ou le rayon moyen de la partie interne étant d’au moins 100 µm. L’invention a également pour objet un procédé de préparation d’un tel microcompartiment ou ensemble de microcompartiment. Microcompartiments cellulaires de grande taille comprenant plusieurs cystes L’invention concerne la culture de cellules de type épithéliales, telles que des cellules souches pluripotentes en trois dimensions. Art antérieur La culture de cellules ex vivo est un domaine qui suscite un intérêt croissant. Les cellules cultivées peuvent être de tout type. Il peut s’agir aussi bien de cellules différenciées avec différents phénotypes, de cellules progénitrices que de cellules souches. Une avancée importante dans les techniques de culture cellulaire est l'introduction de systèmes de culture tridimensionnels. Les cultures en trois dimensions sont en effet avantageusement plus proches des systèmes naturels in vivo, et peuvent être utilisées pour de nombreuses applications en particulier dans le développement de thérapies. Une technologie particulièrement adaptée est celle décrite dans la demande WO2018 /096277 qui consiste en des microcompartiments cellulaires en trois dimensions pour la culture de cellules souches. Toutefois, malgré leur efficacité, les systèmes de culture 3D existants présentent encore des limites en termes de rendement et de taux de croissance des cellules pour se rapprocher encore plus des taux d’expansion in vivo et de la durée des cycles tout en assurant le maintien d’un phénotype épithélial stable. L’objectif de l’invention est de proposer une solution de culture cellulaire en trois dimensions répondant à l’ensemble de ces besoins et palliant les inconvénients et limites de l’art antérieur pour une culture encore plus quantitative et toujours au moins aussi qualitative. En travaillant sur le développement de microcompartiments cellulaires pour la culture en 3D de cellules épithéliales ou ayant une morphologie de type épithéliale et aptes à former des cystes, telles que des cellules souches pluripotentes, les inventeurs ont mis au point un système permettant d’augmenter le nombre maximal de cellules contenues dans un microcompartiment organisées autour d’une lumière (cyste) tout en conservant un phénotype épithélial Selon l’invention, le maintien d’un ensemencement faible de cellules permet d’augmenter le facteur d’amplification entre l’ensemencement des cellules dans le microcompartiment et la récolte du microcompartiment contenant les cellules amplifiées. Or, dans les systèmes existants, des microcompartiments comprenant quelques cellules à l’ensemencement (1 à 3 en particulier) meurent ou relancent leur croissance avec un taux de latence ce qui nuit au rendement de la culture et augmente la durée nécessaire de culture encapsulée. Selon l’invention, ces problématiques sont liées en particulier à des microcompartiments de trop petites tailles, et notamment à des microcompartiments dont le volume de la partie interne est trop faible. Aussi l’invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions avec une couche externe et une partie interne, dont la partie interne a des dimensions suffisamment importantes pour permettre un taux de croissance important et une grande quantité de cellules au moment de la récolte du microcompartiment, en partant d’un faible ensemencement de cellules au départ. En particulier, l’invention vise un microcompartiment en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , ladite partie interne comprenant au moins : - des éléments de matrice extracellulaire, et - au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules organisée en trois dimensions autour d’une lumière, le plus petit rayon de la partie interne du microcompartiment étant d’au moins 100 µm, préférentiellement au moins 200 µm. Les cellules de chaque couche de cellules organisées en trois dimensions autour d’une lumière sont des cellules capables de former un cyste c’est-à-dire des cellules polarisées avec une face basale capables de former des jonctions serrées et d’exprimer la podocalyxin sur la face apicale (faisant face à la lumière du cyste). Il s’agit en particulier de cellules épithéliales ou ayant une morphologie de type épithéliale, humaines ou animales. Les cellules de chaque couche de cellules organisées en trois dimensions autour d’une lumière sont préférentiellement choisies parmi les souches pluripotentes induites (iPSC) et les cellules suivantes : cellules d’épithéliums glandulaires (par ex. mammaires ou salivaires), cellules d’épithélium rénal, cellules de l’épithélium intestinal (entérocytes), cellules de l’épithélium de la peau (kératinocytes), cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien, cellules de l’épicarde, cellules de l’endocarde. Avantageusement un tel agencement, en particulier la présence d’au moins deux cystes, permet d’augmenter le nombre maximal de cellules contenues dans un microcompartiment tout en conservant un phénotype épithélial autour d’une lumière (cyste). La taille du microcompartiment selon l’invention est choisi pour permettre la croissance de plusieurs cystes tout en préservant une distance de diffusion compatible avec la physiologie des cellules. L’invention a également pour objet un ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions comprenant au moins un microcompartiment cellulaire selon l’invention, préférentiellement en suspension liquide dans un bioréacteur. Les microcompartiments selon l’invention peuvent être utiles pour différentes applications et notamment dans la prévention et/ou le traitement de pathologies. Les microcompartiments cellulaires selon l’invention peuvent être obtenus en particulier par la mise en œuvre d’un procédé de préparation spécifique comprenant les étapes suivantes : - (a) incuber des cellules dans un milieu de culture, préférentiellement dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cytoprotecteur, notamment un inhibiteur de l’apoptose et/ou des Rho/A kinases, - (b) mélanger les cellules issues de l’étape (a) avec des éléments de matrice extracellulaire, notamment une matrice extracellulaire biologique ou de synthèse, - (c) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , le plus petit rayon de ladite partie interne étant d’au moins 100 µm ; (d) cultiver les microcompartiments obtenus dans un tampon de rinçage isotonique, préférentiellement moins de 30 minutes, puis dans un milieu de culture, préférentiellement dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cytoprotecteur, notamment un inhibiteur de l’apoptose et/ou des Rho/A kinases; - (e) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer le facteur cytoprotecteur (inhibiteur de l’apoptose et/ou des Rho/A kinases), préférentiellement dans un délai de 48h après encapsulation, encore plus préférentiellement dans un délai de 24h; - (f) cultiver les microcompartiments pendant au moins deux cycles de division cellulaire (amplification), préférentiellement entre 1 et 60 jours, entre 1 et 30 jours, entre 1 et 20 jours, encore plus préférentiellement entre 2 et 30 jours, entre 2 et 20 jours, entre 3 et 30 jours, entre 3 et 20 jours, notamment entre 4 et 7 jours, en particulier entre 5 et 7 jours, dans un milieu de culture dépourvu de facteur cytoprotecteur, et - (g) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus. Le procédé selon l’invention permet d’obtenir des microcompartiments selon l’invention avec au moins deux cystes. D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention et des exemples qui vont suivre. Brève description des figures est un schéma d’un microcompartiment selon l’invention comprenant plusieurs cystes de cellules souches pluripotentes induites. Ce schéma est une représentation du microcompartiment présenté sur la photographie de la . est une image de microscopie a contraste de phase d’un microcompartiment selon l’invention. [ est un schéma d’une série de microcompartiments selon l’invention. est une image de microscopie a contraste de phase d’une série de microcompartiments selon l’invention. est un schéma d’un bioréacteur contenant une série de microcompartiments selon l’invention. est une image d’un bioréacteur contenant une série de microcompartiments selon l’invention. est un schéma de la fusion de deux cystes dans un microcompartiment selon l’invention. est une image de la fusion de deux cystes dans un microcompartiment selon l’invention. est une représentation des résultats d’essais sur l’amplification de cellules souches pluripotentes induites dans des microcompartiments selon l’invention. Microcompartiment (10) en trois dimensions de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe (12) en hydrogel définissant une partie interne (14), ladite partie interne (14) comprenant au moins : - des éléments de matrice extracellulaire (16), et - au moins deux cystes, chaque cyste étant formé par au moins une couche de cellules humaines ou animales (18), à l’exclusion de cellules souches embryonnaires d’êtres humains, organisée en trois dimensions autour d’une lumière (20), le plus petit rayon de la partie interne (14) étant d’au moins 100 µm. Microcompartiment (10) selon la précédente revendication, caractérisé en ce que les cellules de chaque couche (18) sont des cellules épithéliales ou ayant une morpholgie de type épithéliale et capables de former un cyste. Microcompartiment (10) selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules de chaque couche (18) sont choisies parmi les cellules souches pluripotentes induites (iPSC) et les cellules suivantes : cellules d’épithéliums glandulaires, cellules d’épithélium rénal, cellules de l’épithélium intestinal, cellules de l’épithélium de la peau, cellules de l’épithélium pigmentaire rétinien, cellules de l’épicarde, cellules de l’endocarde. Microcompartiment (10) selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la partie interne (14) comprend également des zones liquides sans éléments de matrice extracellulaire. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le plus petit rayon de la partie interne (14) est d’au moins 200 µm. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que le volume de la partie interne (14) représente au moins 20% du volume total du microcompartiment, préférentiellement au moins 40%. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il est clos. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la couche externe comprend de l’alginate. Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’au moins un cyste est issu de la fusion de deux cystes. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules présentes dans le microcompartiment ont été obtenues par l’encapsulation dans la partie interne d’une couche externe d’hydrogel, de 2 à 30 cellules. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, pour son utilisation comme médicament. Ensemble de microcompartiments comprenant au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, caractérisé en ce qu’au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l’une des revendications 1 à 10. Ensemble de microcompartiments selon la précédente revendication, caractérisé en ce que les microcompartiments sont disposés dans un milieu de culture dans un bioréacteur. Procédé de préparation d’un microcompartiment cellulaire selon l’une des revendications 1 à 10 ou d’un ensemble de microcompartiments cellulaires selon l’une des revendications 12 à 13, comprenant les étapes suivantes : - (a) incuber des cellules humaines ou animales dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cytoprotecteur, - (b) mélanger les cellules issues de l’étape (a) avec des éléments de matrice extracellulaire, préférentiellement une matrice extracellulaire biologique ou de synthèse, - (c) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel de façon à former un microcompartiment de forme ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique ou sensiblement ovoïde, cylindrique, sphéroïde ou sphérique, comprenant une couche externe en hydrogel définissant une partie interne , le plus petit rayon ou le rayon moyen de ladite partie interne étant d’au moins 100 µm ; - (d) cultiver les microcompartiments obtenus dans un tampon de rinçage isotonique, puis dans un milieu de culture, préférentiellement dans un milieu de culture contenant au moins un facteur cytoprotecteur, - (e) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer le facteur cytoprotecteur ; - (f) cultiver les microcompartiments pendant au moins deux cycles de division cellulaire (amplification), préférentiellement entre 1 et 20 jours, encore plus préférentiellement entre 2 et 10 jours, notamment entre 5 et 7 jours, dans un milieu de culture dépourvu de facteur cytoprotecteur, et - (g) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus. Procédé selon la revendication 14, caractérisé en ce que l’étape c) est réalisée par co-injection de deux ou trois solutions : - une solution d’hydrogel, - éventuellement une solution intermédiaire isotonique, - la solution issue de l’étape b) comprenant des cellules, du milieu de culture et la matrice extracellulaire, de manière concentrique via un injecteur microfluidique qui permet de former un jet en sortie d’injecteur constitué du mélange des solutions, ledit jet se fractionnant en gouttes, lesdites gouttes étant collectées dans un bain de calcium qui rigidifie la solution d’hydrogel pour former la couche externe de chaque microcompartiment, la partie interne de chaque goutte étant constituée par la solution issue de l’étape (b) comprenant des cellules, du milieu de culture et la matrice extracellulaire. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que le diamètre d’ouverture finale de l’injecteur microfluidique est compris entre 150 et 300 µm, préférentiellement entre 180 et 240 µm, et le débit de chacune des solutions est compris entre 45 et 150 mL/h, préférentiellement entre 45 et 110 mL/h. Procédé selon l’une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que la totalité des cellules encapsulées initialement à l’étape (c) représente un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées. Procédé selon l’une des revendications 14 à 17, caractérisé en ce que l’étape b) de mélange des cellules à une matrice extracellulaire, est réalisée soit entre l’étape (a) et l’étape (c), soit simultanément à l’encapsulation à l’étape (c). Procédé selon l’une des revendications 14 à 18, caractérisé en ce que les étapes (d), (e) et (f) sont mises en œuvre sous agitation permanente ou séquentielle. Procédé selon l’une des revendications 14 à 19, caractérisé en ce qu’il est mis en œuvre dans un bioréacteur. Procédé selon l’une des revendications 14 à 20, caractérisé en ce que préalablement ou simultanément à l’étape (a), le procédé comprend une étape de dissociation des cellules par une dissociation chimique, enzymatique ou mécanique. Procédé selon l’une des revendications 14 à 21, caractérisé en ce que le procédé comprend au moins une ré-encapsulation des cellules après l’étape (f). Procédé selon la revendication 22, caractérisé en ce que chaque ré-encapsulation correspond à un passage. Procédé selon l’une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce que chaque ré-encapsulation consiste à éliminer la couche externe d’hydrogel, préférentiellement à remettre en suspension de manière partiellement ou totalement dissociées, les cellules qui étaient sous forme de cystes dans les microcompartiments et à remettre en œuvre les étapes du procédé.