FR 3120875 A1 20220923 FR 2102708 A 20210318 Milieu et p rocédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse La présente invention concerne un milieu de culture et un procédé de culture permettant la culture et/ou la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses ainsi que l’organisation d’un réseau de cellules endothéliales. Elle concerne également une composition obtenue par ledit procédé, une reconstitution de moelle osseuse et leurs utilisations. Figure pour l'abrégé : 1 Milieu et procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse La présente invention concerne un milieu de culture et un procédé de culture permettant la culture et/ou la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses ainsi que l’organisation d’un réseau de cellules endothéliales. Elle concerne également une composition obtenue par ledit procédé, une reconstitution de moelle osseuse et leurs utilisations. La reproduction de moelle osseuse humaine adulte ex vivo est de plus en plus décrite dans la littérature afin de pallier aux modèles animaux qui sont couteux, consommateurs en temps et tributaires de la barrière des espèces. Des études ont commencé à mettre en évidence des modèles 3D de moelle osseuse ex vivo humaine regroupant les compartiments ostéoblastique et vasculaire, généralement à partir de cellules issues de lignées. Par exemple, le compartiment vasculaire, jouant un rôle actif dans la prolifération des cellules souches hématopoïétiques (CSH), est souvent incorporé par l’intermédiaire de lignées cellulaires endothéliales de type HUVEC. D’autres modèles nécessitent une étape chez la souris pour permettre la vascularisation ou des approches fonctionnelles. En outre, le tissu adipeux médullaire est souvent ignoré dans ces études malgré son importance fonctionnelle croissante décrite dans la littérature. Les inventeurs ont créé un nouveau modèle incorporant de manière exhaustive tous les paramètres micro-environnementaux cellulaires et non hématopoïétiques d’une moelle osseuse humaine. Il comprend le tissu adipeux médullaire, le compartiment ostéoblastique et le compartiment vasculaire. Le milieu de culture développé par les inventeurs permet d’obtenir de manière simultanée les 3 compartiments non hématopoïétiques de la moelle osseuse humaine et en particulier à partir d’un seul prélèvement sur un donneur et sans utilisation de lignée cellulaire. Cela permet de générer une moelle osseuse humaine ex vivo comportant les compartiments ostéoblastique, adipocytaire et vasculaire en 2D mais également en 3D notamment via l’utilisation d’un biomatériau. En outre, par auto-organisation cette moelle osseuse ex vivo peut former une structure 3D de type sphéroïde/organoïde. De plus, dans les études précédentes la différenciation des cellules souches mésenchymateuses en adipocytes et en ostéoblastes nécessitait de réaliser les deux différenciations séparément dans deux milieux différents. Le milieu développé par les inventeurs permet de réaliser ces deux voies de différenciation en même temps dans le même milieu, simplifiant ainsi grandement les manipulations nécessaires notamment à la réalisation d’une reconstitution de moelle osseuse. Ainsi l’invention concerne un milieu de culture pour la culture et/ou la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses, et optionnellement permettant l’organisation d’un réseau de cellules endothéliales, comprenant : du sérum de veau fœtal (SVF), et/ou du lysat plaquettaire (LP), 10 - 100 µM d’acide ascorbique, 10 - 100 ng/mL de « Bone Morphogenetic Protein 7 » (BMP7), 1 -10 µg/mL d’insuline, 1 - 50 µg/mL d’apotransferrine, et 1 - 100 ng/mL de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Dans un second aspect, l’invention concerne un procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses comprenant les étapes consistant à : ensemencer les cellules souches mésenchymateuses dans un milieu de culture tel que défini ci-dessus; et cultiver les dites cellules souches mésenchymateuses. L’invention concerne un procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse comprenant le procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses selon l’invention. L’invention a aussi pour objet une reconstitution de moelle osseuse obtenue par le procédé selon l’invention. L’invention concerne également une reconstitution de moelle osseuse comprenant des ostéoblastes, des adipocytes et des cellules endothéliales formant des vaisseaux. L’invention a également pour objet une composition, de préférence injectable, comprenant des cellules obtenues par le procédé de l’invention. L’invention concerne également une reconstitution de moelle osseuse selon l’invention ou une composition selon l’invention pour son utilisation pour le traitement de maladies, notamment de maladies affectant l’intégrité de la moelle osseuse. Enfin, l’invention concerne l’utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse selon l’invention, comme modèle pour l’étude de la physiologie, physiopathologie, le test de composés et/ou le test de conditions physiques et mécaniques. FIGURES La présente l’expression relative de gènes impliqués dans les lignages ostéoblastique, adipocytaire et vasculaire (cellules endothéliales) après différenciation dans un modèle 2D. Après sélection et amplification des cellules en milieu EGM2, puis culture pendant 14 jours en 2D dans le milieu selon l’invention (avec SVF et des intralipides), l’expression génique est quantifiée par Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) et calculée après normalisation par un gène de référence en utilisant la méthode du 2 -^CT , n=5. La présente l’expression relative de gènes impliqués dans les lignages ostéoblastique, adipocytaire et vasculaire (cellules endothéliales) après différenciation dans un modèle 2D. Après sélection et amplification des cellules en milieu EGM2, puis culture pendant 14 jours en 2D dans soit un milieu avec SVF et intralipides, soit un milieu avec LP, sans intralipide. L’expression génique est quantifiée par Reverse Transcriptase-quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR) et calculée après normalisation par un gène de référence en utilisant la méthode du 2 -^CT , n=3. Exemple: Exemple 1 : Dans les modèles de moelle osseuse ex vivo, le compartiment vasculaire est amené grâce aux progéniteurs endothéliaux et aux cellules endothéliales primaires du donneur initial. Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), les progéniteurs endothéliaux ainsi que les cellules endothéliales issus d’un même prélèvement de moelle osseuse sont sélectionnées et amplifiées grâce aux propriétés d’adhérence de ces types cellulaires et à l’utilisation du milieu Endothelial Growth Medium 2 (Promocell) pour la culture. Après 14 jours de culture, ces cellules sont décollées et utilisées pour générer différents modèles de moelle osseuse, en 2 et en 3 dimensions. Dans ce but, les cellules sont cultivées dans un milieu permettant la différenciation dans la même culture d’une partie des CSM en ostéoblastes (compartiment osseux), d’une autre partie en adipocytes (compartiment adipeux), tout en permettant l’organisation d’un réseau vasculaire grâce aux progéniteurs endothéliaux et aux cellules endothéliales présents dans la culture. Le milieu utilisé ici est composé d’une base de milieu MEMα supplémenté par 2% de sérum de veau fœtal, 50uM d’acide ascorbique, 0,2% (v/v) d’intralipides, 50ng/mL de Bone Morphogenetic Protein 7, 5 µg/mL d'insuline, 10 µg/mL d'apotransferrine et 10 ng/mL de VEGF. Pour les modèles en 3D deux technologies sont utilisées : la génération de sphéroïdes basée sur l’auto-organisation cellulaire et l’utilisation d’un complexe cellules/ biomatériaux mis en perfusion dans un bioréacteur dans lequel le biomatériau est le βTCP. Les inventeurs ont mis en évidence la présence des différents compartiments par des analyses géniques (RT-qPCR). La présente ces résultats sur le modèle 2D. Les inventeurs ont mis également en évidence la présence des différents compartiments par des analyses en fluorescence (immunofluorescence et sondes fluorescentes), en ciblant des marqueurs spécifiques de chaque compartiment (Osterix pour les ostéoblastes, CD31 pour les cellules endothéliales, Bodipy pour les adipocytes). Ces différents marqueurs ont été mis en évidence dans le modèle en 2D, le modèle en sphéroïdes (modèle 3D) ainsi que sur le modèle sur biomatériau βTCP en bioréacteur perfusé (modèle 3D). Exemple 2 : Les reconstitutions de moelle osseuse ont été réalisées comme dans l’exemple 1 mais différentes compositions du milieu de différenciation sont testées. Les cellules récupérées à l’issue d’une primoculture de moelle osseuse en EGM2 sont ensemencées à 20 000 cellules/cm² en milieu EGM2 et laissées dans ce milieu pendant 4 à 6 jours, à 37°C et 5%CO 2 . Le milieu EGM2 est alors remplacé par l’un des deux milieux de différenciation (SVF ou LP) décrits ci-après. Le milieu de différenciation est renouvelé à raison de 2 changements par semaine. Au terme de 14 jours en milieu de différenciation, la culture est arrêtée pour effectuer une analyse génique. Le milieu dit SVF est composé d’une base de milieu MEMα supplémenté par 2% (v/v) de sérum de veau fœtal, 50 µM d’acide ascorbique, 0,2% (v/v) d’intralipides, 50ng/mL de Bone Morphogenetic Protein 7,5 µg/mL d'insuline, 10 µg/mL d'apotransferrine et 10 ng/mL de VEGF. Le milieu dit LP est composé d’une base de milieu MEMα supplémenté par 1% (v/v) de lysat plaquettaire (LP), 50 µM d’acide ascorbique, 50ng/mL de Bone Morphogenetic Protein 7,5 µg/mL d'insuline, 10 µg/mL d'apotransferrine et 10 ng/mL de VEGF. La génération simultanée des 3 compartiments médullaires a été évaluée dans une culture en 2D par analyse génique (voir ). Les résultats montrent qu’il n’y a pas de différence significative entre les deux milieux de différenciations testés. Chacun des deux milieux permet la différenciation in vitro d’une partie des CSM en ostéoblastes, d’une autre partie en adipocytes tout en permettant le maintien des cellules CD31 positives correspondant aux progéniteurs endothéliaux et aux cellules endothéliales. Par ailleurs, les inventeurs ont observé une tendance. Le milieu à base de SVF permettrait de différencier davantage de CSM en adipocytes et le milieu à base de LP davantage de CSM en ostéoblastes. Ces résultats montrent une adaptabilité/flexibilité du procédé. En effet, plusieurs études montrent que la différenciation des CSMs est modifiée par les contraintes physiques et mécaniques, ce qui est à prendre en considération pour les modèles 3D dans lesquels ces contraintes sont différentes des modèles standards en 2D (rigidité variable des biomatériaux, contraction variable des sphéroïdes/organoïdes, etc…). Le procédé de production pourrait donc permettre de s’adapter à ces contraintes en adaptant le milieu de différenciation. D’autre part, plus une moelle osseuse est âgée, plus le tissu adipeux augmente en proportion et perd en fonctionnalité avec une chute de la vascularisation, à l’inverse, plus une moelle osseuse est jeune, plus la densité osseuse est importante avec une plus forte vascularisation. Ainsi la modulation de la composition du milieu de culture pourrait permettre l’étude du vieillissement au niveau de la niche hématopoïétique. Milieu de culture pour la culture et/ou la différenciation en ostéoblastes et en adipocytes de cellules souches mésenchymateuses, comprenant : du sérum de veau fœtal (SVF) et/ou du lysat plaquettaire (LP), 10 - 100 µM d’acide ascorbique, 10 - 100 ng/mL de « Bone Morphogenetic Protein 7 » (BMP7), 1 - 10 µg/mL d’insuline, 1 - 50 µg/mL d’apotransferrine, et 1 - 100 ng/mL de facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). Procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses comprenant les étapes consistant à : ensemencer cellules souches mésenchymateuses dans un milieu de culture tel que défini dans la revendication 1; et cultiver lesdites cellules souches mésenchymateuses. Procédé de culture selon la revendication 2, dans lequel des progéniteurs endothéliaux et des cellules endothéliales sont également cultivés dans le milieu de culture, en même temps que lesdites cellules souches mésenchymateuses. Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 2 à 3, dans lequel les cellules sont des cellules primaires. Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 2 à 4, dans lequel les cellules sont toutes issues d’un même prélèvement sur un sujet. Procédé de culture selon l’une quelconque des revendications 2 à 5, dans lequel à l’étape a) les cellules sont ensemencées sur un support en 3 dimensions. Procédé de production d’une reconstitution de moelle osseuse comprenant le procédé de culture in vitro de cellules souches mésenchymateuses selon l’une quelconque des revendications 2 à 6, dans lequel les cellules sont cultivées à l’étape b) pendant 4 à 20 jours. Reconstitution de moelle osseuse obtenue par le procédé de la revendication 7. Composition comprenant des cellules obtenues par le procédé de l’une quelconque des revendications 2 à 5. Reconstitution de moelle osseuse selon la revendication 8 ou composition selon la revendication 9 pour son utilisation pour le traitement de maladies, notamment de maladies affectant l’intégrité de la moelle osseuse et/ou liée à un désordre de l'hématopoïèse. Utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse telle que définie dans la revendication 8, comme modèle pour l’étude de la physiologie, physiopathologie, le test de composés, et/ou le test de conditions physiques et mécaniques. Utilisation d'une reconstitution de moelle osseuse telle que définie dans la revendication 9, dans une prothèse ou un dispositif médical.