FR 3122883 A1 20221118 FR 2104988 A 20210511 L’invention concerne un microcompartiment cellulaire en trois dimensions ou un ensemble de microcompartiments cellulaires en trois dimensions comprenant au moins une couche externe en hydrogel et à l’intérieur de ladite couche externe au moins une couche de cellules et/ou au moins une assise de cellules, dont moins de 20% de la population totale de cellules présentes dans le microcompartiment ou dans l’ensemble de microcompartiments sont des cellules présentant au moins une mutation. L’invention a également pour objet un procédé de préparation d’un tel microcompartiment ou ensemble de microcompartiment. Microcompartiments cellulaires comprenant des cellules dont l’intégrité génomique est maintenue après amplification et procédé de préparation L’invention concerne le maintien de l’intégrité génomique des cellules lors de leur division ex vivo sur plusieurs cycles de divisions cellulaires, en particulier dans le cadre d’une culture cellulaire en trois dimensions. Art antérieur La culture de cellules ex vivo est un domaine qui suscite un intérêt croissant. Les cellules cultivées peuvent être de tout type. Il peut s’agir aussi bien de cellules différenciées avec différents phénotypes, de cellules progénitrices que de cellules souches. Une avancée importante dans les techniques de culture cellulaire est l'introduction de systèmes de culture tridimensionnels. Les cultures en trois dimensions sont en effet plus proches des systèmes naturels in vivo, et peuvent être utilisées pour de nombreuses applications en particulier dans le développement de thérapies. Toutefois, la thérapie cellulaire et l’ingénierie tissulaire sont conditionnées par la disponibilité de quantités industrielles de cellules qui nécessite d’avoir recours à une multiplication importante du nombre de cellules et donc un nombre élevé de divisions sur un temps court. Dans la plupart des systèmes de culture cellulaire actuels, cette multiplication entraine l’apparition et la sélection de mutations, en particulier de mutations fonctionnelles délétères, génomiques et/ou épigénétiques à chaque division sur de nombreuses cellules pendant l’expansion de la culture, compromettant ainsi leur utilisation notamment en thérapie. Les mutations peuvent être des mutations ponctuelles de la séquence génétique (codantes ou non codantes, silencieuses ou non en termes de séquence peptidique), des variants structuraux, des modifications épigénétiques, voir des modifications de l’ADN mitochondrial. Seules les cellules mutantes porteuses d’une ou plusieurs mutations fonctionnelles ou potentiellement fonctionnelles sont problématiques pour l’utilisation des cellules en thérapie, c’est-à-dire toute modification génétique ou épigénétique transmissible qui confère un gain ou perte de fonction ou perte de fonction potentielle aux cellules cultivées. Il peut s’agir notamment d’un avantage de croissance, d’une diminution de la susceptibilité à la mort cellulaire, d’une modification des gènes impliqués dans la tumorigenèse ou la répression de la tumorigenèse. Les mutations les plus impactantes sont celles permettant une expansion clonale des cellules qui devient dominante en culture. Des exemples de mutations génétiques particulièrement récurrentes sont décrites notamment dans Y. Avior, K. Eggan, N. Benvenisty, Cancer-Related Mutations Identified in Primed and Naive Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell . 25, 456–461 (2019). Parmi les plus connues on peut citer en particulier les mutations du gène P53 (F. T. Merkle, S. Ghosh, N. Kamitaki, J. Mitchell, Y. Avior, C. Mello, S. Kashin, S. Mekhoubad, D. Ilic, M. Charlton, G. Saphier, R. E. Handsaker, G. Genovese, S. Bar, N. Benvenisty, S. A. McCarroll, K. Eggan, Human pluripotent stem cells recurrently acquire and expand dominant negative P53 mutations. Nature . 545, 229–233 (2017)), et les mutations par amplification de la région chromosomique 20q11 (N. Lefort, M. Feyeux, C. Bas, O. Féraud, A. Bennaceur-Griscelli, G. Tachdjian, M. Peschanski, A. L. Perrier, Human embryonic stem cells reveal recurrent genomic instability at 20q11.21. Nature Biotechnology . 26, 1364–1366 (2008)). Le problème de la stabilité et l’intégrité génétique des cellules en culture est connu et il a en particulier été largement étudié pour les cellules souches pluripotentes, comme par exemple : S. Attwood, M. Edel, iPS-Cell Technology and the Problem of Genetic Instability—Can It Ever Be Safe for Clinical Use? Journal of Clinical Medicine . 8, 288 (2019); ou encore P. Andrews, Human pluripotent stem cells: genetic instability or stability? Regenerative medicine, vol. 16, No 2, 2 mar 2021. On sait aussi que la mutagenèse est un problème très présent pour la culture des cellules souches dès leur reprogrammation tel que décrit dans Ji, S. Ng, V. Sharma, D. Neculai, S. Hussein, M. Sam, Q. Trinh, G. M. Church, J. D. McPherson, A. Nagy, N. N. Batada, Elevated coding mutation rate during the reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem cells. Stem Cells . 30, 435–440 (2012), ou encore dans V. Turinetto, L. Orlando, C. Giachino, Induced pluripotent stem cells: Advances in the quest for genetic stability during reprogramming process. International Journal of Molecular Sciences . 18 (2017), doi:10.3390/ijms18091952. Cette instabilité génétique nuit fortement au développement des thérapies cellulaires, et en particulier aux applications cliniques des cellules souches (Yamanaka, Pluripotent Stem Cell-Based Cell Therapy-Promise and Challenges. Cell stem cell . 27, 523–531 (2020); S. E. Peterson, J. F. Loring, Genomic instability in pluripotent stem cells: Implications for clinical applications. Journal of Biological Chemistry . 289, 4578–4584 (2014); K. Garber, RIKEN suspends first clinical trial involving induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology . 33, 890–891 (2015)). Il existe donc un besoin important pour une solution permettant le maintien de l’intégrité génétique des cellules en culture, en particulier pour la production à grande échelle de thérapies cellulaire. L’objectif de l’invention est par conséquent de répondre à l’ensemble de ces besoins et de pallier les inconvénients et limites de l’art antérieur. En travaillant sur le développement de microcompartiments cellulaires pour la culture de cellules en 3D, les inventeurs ont mis au point un système permettant une culture de masse de cellules tout en conservant leur intégrité génomique. A cet effet l’invention a pour objet un microcompartiment cellulaire en trois dimensions comprenant au moins une couche externe en hydrogel et à l’intérieur de ladite couche externe au moins une couche de cellules et/ou au moins une assise de cellules, dans lequel moins de 20% de la population totale de cellules présentes dans le microcompartiment sont des cellules présentant au moins une mutation, préférentiellement entre 0 et 10%, encore plus préférentiellement entre 0 et 5%, même après plusieurs divisions cellulaires. Selon un autre objet, l’invention concerne un ensemble d’au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, préférentiellement en suspension liquide, chaque compartiment comprenant au moins une couche externe en hydrogel et à l’intérieur de ladite couche externe au moins une couche de cellules et/ou au moins une assise de cellules, dans lesquels moins de 20% de la population totale de cellules présentes dans tous les microcompartiments sont des cellules présentant au moins une mutation, préférentiellement entre 0 et 10%, encore plus préférentiellement entre 0 et 5%. Avantageusement, ce taux de cellules mutantes est inférieur à celui des systèmes de cultures cellulaires existants. Par exemple, certaines études suggèrent qu’une mutation inactivatrice du gène P53 confère, dans un système de culture de cellules souches conventionnel 2D, un avantage de sélection jusqu’à x1,9 par passage (iPS-Cell Technology and the Problem of Genetic Instability—Can It Ever Be Safe for Clinical Use ? Attwood & Edel) + Merkle, F.T. ; Ghosh, S.; Kamitaki, N.; Mitchell, J.; Avior, Y.; Mello, C.; Kashin, S.; Mekhoubad, S.; Ilic, D.; Charlton, M.; et al. Human pluripotent stem cells recurrently acquire and expand dominant negative P53 mutations. Nature 2017, 545, 229–233.). Ceci implique une probabilité de fixation de 97% après émergence de cette mutation (Haldane, J.B.S. A Mathematical Theory of Natural and Artificial Selection, Part V: Selection and Mutation. Math. Proc. Camb. Philos. Soc. 1927, 23, 838–844.) Le maintien de l’intégrité génomique des cellules permet d’utiliser les microcompartiments avec les cultures cellulaires selon l’invention pour différentes applications et notamment dans la prévention et/ou le traitement de pathologies. Les microcompartiments cellulaires selon l’invention peuvent être obtenus en particulier par la mise en œuvre d’un procédé de préparation spécifique comprenant les étapes suivantes : - (a) préparer une suspension de cellules comprenant des cellules uniques et/ou au moins un amas (« cluster ») de cellules dans un milieu isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose, - (b) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel ; - (c) cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose ; - (d) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ; - (e) cultiver les microcompartiments pendant au moins deux cycles de division cellulaire (amplification), et - (f) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus, le procédé étant caractérisé en ce que la totalité des cellules encapsulées initialement à l’étape (b) (au moment de l’encapsulation) représentent un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées. Ce procédé permet d’obtenir des microcompartiments selon l’invention avec une population de cellules dont l’intégrité génomique est maintenue et stabilisée. L’invention vise aussi l’utilisation d’un tel procédé pour maintenir l’intégrité génomique de cellules lors de leur amplification. D’autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l’invention et des exemples qui vont suivre. Brève description des figures est une vue d’ensemble des trois bras expérimentaux « culture 2D » « bioréacteur agrégats » et « Invention » ainsi que la numérotation et chronologie des passages effectués (indiqués dans les rectangles J4 = jour 4, J8 = jour 8, etc.…). Toutes les cultures sont arrêtées au jour final J28 pour comparaison génétique détaillée. est une image de microscopie a contraste de phase montrant les résultats du bras expérimental « culture 2D » au jour final 28 avant échantillonnage finale. Barre d’échelle 500µm. est une image de microscopie a contraste de phase montrant les résultats du bras expérimental « bioréacteur agrégats » au jour final 28 avant échantillonnage finale. Les agrégats représentés ont été prélevés de leur culture en suspension et déposés temporairement dans une boite de pétri pour réaliser l’observation microscopique. Barre d’échelle 500µm. est une image de microscopie a contraste de phase montrant les résultats du bras expérimental « Invention » au jour final 28 avant échantillonnage finale. Les microcompartiments représentés ont été prélevés de leur culture en suspension et déposés temporairement dans une boite de pétri pour réaliser l’observation microscopique. Barre d’échelle 500µm. est une représentation de la croissance apparentes des cellules au cours du temps en culture calculé par comptage des cellules avant et après chaque passage. Le facteur d’amplification théorique cumulée est représenté en fonction du temps ; l’axe des ordonnée (amplification) est représentée en échelle logarithmique. Les points de données représentés correspondent à l’ensemble des comptages qui ont été réalisés au moment des passages. est une représentation des résultats de l’évaluation phénotypique des cellules souches par cyrtométrie en flux. Les cellules dissociées sont fixées et marquées pour les marqueurs de pluripotences OCT4 et NANOG. Le pourcentage de cellules doublement positives pour ces 2 marqueurs lors passages successifs pendant 28 jours est représenté ici (Moyenne et écart type). est un caryotype haute résolution par puce SNP Cytoscan HD array pour analyse comparative de l’analyse de l’échantillon initial jour 0 et des 3 bras expérimentaux « culture 2D », « Bioréacteur agrégats » et « Invention » à 28jours. CytoScan® HD Array Affymetrix, vendu par la société thermo fisher, quantifie le nombre de copie moyen par cellules pour 2.67 millions de sondes réparties sur l’ensemble du génome. Les zones entourées sont centrées sur les chromosomes 20. représente les résultats de l’évaluation par PCR digitale du nombre de copie moyen de la région chromosomique 20q11 au cours des 28 jours de culture pour les 3 bras expérimentaux (Analyse réalisé avec le test 24 sondes ddPCR iPS de la société Stemgenomics). A gauche : nombre de copie 20q11 en fonction du nombre de jours en culture. A droite : nombre de copie 20q11 rapport à l’amplification théorique cumulée au cours du temps. Les points de données correspondent aux échantillonnages réalisés lors des différents passages : Carrés = « bioréacteur agrégats », Ronds = « culture 2D » et Triangles = « Invention ». Les courbes associées correspondent aux régressions correspondantes. A noter que les écart types pour ces mesures sont en moyenne de 0.12 (nombre de copie 20q11), les étoiles pointent les mesures qui sont significativement augmentées. Représente la synthèse des pourcentages de cellules mutées au cours de 28 jours de culture pour les bras « culture 2D » « bioréacteur agrégats » et « Invention ». Microcompartiment cellulaire en trois dimensions comprenant au moins une couche externe en hydrogel et à l’intérieur de ladite couche externe au moins une couche de cellules et/ou au moins une assise de cellules, à l’exclusion de cellules souches embryonnaires d’êtres humains, caractérisé en ce que moins de 20% de la population totale de cellules présentes dans le microcompartiment sont des cellules présentant au moins une mutation. Microcompartiment selon la revendication 1, caractérisé en ce que les cellules représentent plus de 50% en volume par rapport au volume du microcompartiment, préférentiellement plus de 70% en volume par rapport au volume du microcompartiment. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la ou les mutation(s) sont choisies parmi les mutations génétiques et les mutations épigénétiques. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la ou les mutation(s) sont des mutations fonctionnelles. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’au moins une mutation est une mutation oncogène. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que moins de 20% des cellules sont des cellules présentant au moins une mutation du gène P53 et/ou au moins une mutation du gène 20q11. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules présentant au moins une mutation représentent entre 0 et 10% de la population totale de cellules présentes dans le microcompartiment, préférentiellement entre 0 et 5%. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules sont organisées sous forme d’un tissu ou d’un micro-tissu. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend une lumière interne. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend également au moins une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique entre (a) la ou les couche(s) de cellules et/ou la ou les assises de cellule(s) et (b) la couche d’hydrogel. Microcompartiment selon la précédente revendication, caractérisé en ce que la couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique est une couche de matrice extracellulaire. Microcompartiment selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que la couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique présente un module d’Young compris entre 0,05 et 3 kDa. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules humaines ou animales. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend successivement organisées autour d’une lumière : - au moins une couche de cellules et/ou au moins une assise de cellules, - une couche intermédiaire de solution aqueuse isotonique, - une couche externe en hydrogel. Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que les cellules sont des cellules souches pluripotentes induites (iPSC) humaines ou animales, et/ou des cellules multipotentes humaines ou animales, et/ou des cellules progénitrices humaines ou animales et/ou des cellules différenciées humaines ou animales. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il est clos. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce que la couche externe comprend de l’alginate. Microcompartiment selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il a la forme d’un ovoïde, d’un cylindre, d’un sphéroïde ou d’une sphère. Microcompartiment cellulaire selon l’une des précédentes revendications, caractérisé en ce qu’il comprend au moins 20 cellules, préférentiellement au moins 1000 cellules. Ensemble d’au moins deux microcompartiments cellulaires en trois dimensions, chaque microcompartiment comprenant au moins une couche externe en hydrogel et à l’intérieur de ladite couche externe au moins une couche de cellules et/ou au moins une assise de cellules, à l’exclusion de cellules souches embryonnaires d’êtres humains, caractérisée en ce que moins de 20% des cellules constituant la population totale de cellules présentes dans tous les microcompartiments sont des cellules présentant au moins une mutation. Ensemble de microcompartiments selon la précédente revendication, caractérisé en ce qu’au moins un microcompartiment est un microcompartiment selon l’une des revendications 1 à 21. Procédé de préparation d’un microcompartiment cellulaire selon l’une des revendications 1 à 19 ou d’un ensemble de microcompartiments cellulaires selon l’une des revendications 20 à 21, comprenant les étapes suivantes : - (a) préparer une suspension de cellules comprenant des cellules uniques et/ou au moins un amas de cellules dans un milieu isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose, - (b) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel ; - (c) préférentiellement cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique contenant un inhibiteur de l’apoptose ; - (d) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ; - (e) cultiver les microcompartiments dans une solution isotonique pendant au moins deux cycles de division cellulaire, et - (f) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus. ledit procédé étant caractérisé en ce que la totalité des cellules encapsulées initialement à l’étape (b) représentent un volume inférieur à 50% du volume du microcompartiment dans lequel elles sont encapsulées. Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que chaque amas de cellules encapsulé initialement à l’étape (b) a une plus grande dimension inférieure à 20% de la plus grande dimension d’un microcompartiment dans lequel il est encapsulé. Procédé selon l’une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce qu’il comprend une étape de mélange des cellules à une matrice extracellulaire, soit entre l’étape (a) et l’étape (b), soit simultanément à l’encapsulation à l’étape (b). Procédé selon l’une des revendications 22 à 24, caractérisé en ce que les étapes (c), (d) et (e) sont mises en œuvre sous agitation permanente ou séquentielle. Procédé selon l’une des revendications 22 à 25, caractérisé en ce qu’il est mis en œuvre dans un bioréacteur clos. Procédé selon l’une des revendications 22 à 26, caractérisé en ce que le procédé comprend au moins une ré-encapsulation des cellules après l’étape (e). Procédé selon la précédente revendication, caractérisé en ce que le procédé comprend entre 1 et 100 ré-encapsulations des cellules. Procédé selon l’une des revendications 27 ou 28, caractérisé en ce que chaque ré-encapsulation correspond à un passage. Procédé selon l’une des revendications 27 à 29, caractérisé en ce que la ré-encapsulation comprend les étapes suivantes : - (i) éliminer la couche externe en hydrogel, - (ii) remettre en suspension les cellules qui étaient contenues dans le microcompartiment de façon à obtenir des cellules uniques et/ou au moins un amas de cellules dans un milieu isotonique, préférentiellement un milieu de culture contenant un inhibiteur de l’apoptose, - (iii) encapsuler la suspension de cellules dans une couche d’hydrogel ; - (iv) préférentiellement cultiver les microcompartiments obtenus dans une solution isotonique contenant un inhibiteur de l’apoptose ; - (v) préférentiellement rincer les microcompartiments, de manière à éliminer l’inhibiteur de l’apoptose ; - (vi) cultiver les microcompartiments dans une solution isotonique pendant au moins un cycle de division cellulaire, et - (vii) optionnellement récupérer les microcompartiments cellulaires obtenus. Procédé selon l’une des revendications 22 à 30, caractérisé en ce que pour chaque microcompartiment, les cellules uniques représentent moins de 50% en nombre de la totalité des cellules encapsulées initialement à l’étape (b). Procédé selon l’une des revendications 22 à 31, caractérisé en ce que préalablement ou simultanément à l’étape (a), le procédé comprend une étape de dissociation des cellules par une dissociation chimique, enzymatique ou mécanique. Procédé selon l’une des revendications 22 à 32, caractérisé en ce qu’il comprend une ou plusieurs étapes d’élimination des microcompartiments comportant des cellules mutantes.