FR 3125945 A1 20230210 FR 2108424 A 20210803 L’invention concerne une composition comprenant une source de carbonate de calcium, de l’amidon prégélatinisé et un microorganisme, un procédé pour la préparation d’une composition selon l’invention, comprenant une étape qui consiste à mélanger un microorganisme avec une source de carbonate de calcium et de l’amidon prégélatinisé, et l’utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour protéger un microorganisme dans un environnement acide. Composition pour protéger un microorganisme dans un environnement acide. L’invention concerne une composition comprenant une source de carbonate de calcium, de l’amidon prégélatinisé et un microorganisme, un procédé pour la préparation d’une composition selon l’invention, comprenant une étape qui consiste à mélanger un microorganisme avec une source de carbonate de calcium et de l’amidon prégélatinisé, et l’utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour protéger un microorganisme dans un environnement acide. Les microorganismes sont de plus en plus utilisés dans de nombreux domaines, notamment en santé humaine ou animale (domaine nutraceutique) et en santé végétale (domaine agricole). Dans le domaine nutraceutique, les microorganismes sont de plus en plus utilisés pour leurs intérêts probiotiques. Dans le domaine agricole, les sols sont des systèmes dynamiques qui contiennent une grande variété de microorganismes. Cependant de nombreux facteurs, comme les techniques agricoles utilisées ces dernières décennies, ainsi que les changements climatiques ont bouleversé l’ensemble des équilibres préexistants. Ainsi, l’utilisation de grandes quantités d'intrants chimiques, les travaux culturaux etc. ont provoqué une raréfaction, voire une élimination de certains microorganismes de la plupart des sols cultivés, ce qui contribue à une perte de productivité des sols. Pour exercer leurs effets bénéfiques, les microorganismes doivent rester fonctionnels jusqu’à leur site d’action, par exemple dans le tractus gastro-intestinal en santé animale ou humaine, ou dans le sol en santé végétale. Cependant, ces microorganismes sont fragiles car ils sont très sensibles aux stress environnementaux, notamment aux variations de pH. Dans le domaine nutraceutique, le compartiment gastrique, de par son pH très acide, est connu pour dégrader les microorganismes d’intérêt probiotique qui sont ingérés par l’Homme ou l’animal. De par l’acidification des sols, les microorganismes utilisés dans le domaine agricole sont également exposés aux mêmes types de stress que ceux rencontrés dans le domaine nutraceutique, ce qui empêche leur croissance, leur stabilité et/ou altère leurs effets. Le faible taux de survie des microorganismes après leur incorporation dans le sol constitue l’un des facteurs limitant majeurs de leur efficacité. Il existe donc un besoin de trouver de nouvelles stratégies pour protéger les microorganismes face aux pH acides. C’est dans ce contexte que le demandeur a mis en évidence, et ceci constitue le fondement de la présente invention, que l’utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium permettait de protéger des microorganismes face à un stress acide. Ainsi, la présente invention, qui trouve application dans le domaine nutraceutique et dans le domaine de l’agriculture, vise à proposer une composition qui permet de protéger un microorganisme face à un stress acide. Selon un premier aspect, l’invention concerne une composition comprenant une source de carbonate de calcium, de l’amidon prégélatinisé et un microorganisme. Selon un second aspect, l’invention concerne un procédé de préparation d'une composition selon l’invention, comprenant une étape qui consiste à mélanger un microorganisme avec une source de carbonate de calcium et de l’amidon prégélatinisé. Selon un troisième aspect, l’invention concerne l’utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour protéger un microorganisme dans un environnement acide. Description des figures : Schéma qui détaille le Modèle Gastro-Duodéno-Iléal (MGDI) utilisé dans les exemples. : Taux de survie des UFC de la souche L. rhamnosus HN001™ en fin de MGDI avec l’utilisation d’amidon natif, de lithothamne ou de carbonate de calcium terrestre, seuls et en mélanges : Taux de survie des UFC de la souche L. rhamnosus HN001™ en fin de MGDI avec l’utilisation d’amidon de maïs prégélatinisé, de lithothamne ou de carbonate de calcium terrestre, seuls et en mélanges. : Schéma de la cytométrie en flux (CMF) mise en œuvre dans les exemples. : Répartition des populations cellulaires de la souche L. rhamnosus HN001™ en fonction de leur état membranaire, en amont et aval du MGDI, en fonction des excipients / mélanges d’excipients utilisés. : Taux de survie des UFC de la souche L. rhamnosus HN001™ en fin de MGDI avec l’utilisation d’amidon prégélatinisé et de lithothamne, seuls et en mélanges à différents ratios. : Taux de survie des UFC de la souche L. rhamnosus HN001™ en fin de MGDI avec l’utilisation de mélanges 50/50 d’amidons prégélatinisés de différentes origines végétales et de lithothamne. ] : Taux de survie des UFC de la souche B. animalis subsp. lactis BB-12 ® en fin de MGDI avec l’utilisation d’amidon de maïs prégélatinisé seul ou en mélange 50/50 avec du lithothamne. : Gain du taux de survie UFC mesuré pour les souches L. rhamnosus HN001™ et B. animalis subsp. lactis BB-12 ® avec un mélange 50/50 lithothamne/amidon de maïs prégélatinisé en comparaison avec l’amidon de maïs prégélatinisé seul. Exemples Exemple 1 : Préparation des formulations testées Les formulations testées ont été préparées en mélangeant la source de carbonate de calcium et l’amidon prégélatinisé, puis mélangé au microorganisme. Le mélange a ensuite été placé dans des gélules HPMC de taille 0 à l’aide d’un gélulier. Les compositions des formulations préparées sont détaillées dans le Tableau 1. Référence de la formulation Microorganisme Source de carbonate de calcium Amidon HN001 – 100 % amidon de maïs natif 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g - 24 g d’amidon de maïs natif (amidon de maïs à 5 % d’humidité résiduelle (Roquette) HN001 – 50 % amidon de maïs natif / 50 % lithothamne 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 12 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 12 g d’amidon de maïs natif (amidon de maïs à 5 % d’humidité résiduelle (Roquette) HN001 – 100 % amidon de maïs prégélatinisé 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g - 23,9 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 50 % amidon de maïs prégélatinisé / 50 % lithothamne 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g 11,95 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 11,95 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 100 % lithothamne 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g 23,9 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) - HN001 – 100 % carbonate de calcium terrestre 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 24 g de carbonate de calcium terrestre - HN001 – 50 % amidon de maïs natif / 50 % carbonate de calcium terrestre 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 12 g de carbonate de calcium terrestre 12 g d’amidon de maïs natif HN001 – 50 % amidon de maïs prégélatinisé / 50 % carbonate de calcium terrestre 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 12 g de carbonate de calcium terrestre 12 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 70 % amidon de maïs prégélatinisé / 30 % lithothamne 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g 7,2 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 16,7 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 35 % amidon de maïs prégélatinisé / 65 % lithothamne 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g 15,5 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 8,4 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 15 % amidon de maïs prégélatinisé / 85 % lithothamne 1,1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 4,5.10 11 UFC/g 20,3 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 3,6 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) HN001 – 50 % amidon de pomme de terre prégélatinisé / 50 % lithothamne 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 12 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 12 g d’amidon de pomme de terre prégélatinisé (Prégéflo ® P100G) HN001 – 50 % amidon de pois prégélatinisé / 50 % lithothamne 1 gramme de Lactobacillus rhamnosus HN001™ à 5,0.10 11 UFC/g 12 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 12 g d’amidon de pois prégélatinisé (Prégéflo ® L100G) Bb12 – 100 % lithothamne 3 grammes de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 ® à 1,5.10 11 UFC/g 12 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) - Bb12 – 100 % amidon de maïs prégélatinisé 3 grammes de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 ® à 1,5.10 11 UFC/g - 12 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) Bb12 – 50 % amidon de maïs prégélatinisé / 50 % lithothamne 3 grammes de Bifidobacterium animalis subsp. lactis BB-12 ® à 1,5.10 11 UFC/g 6 g de lithothamne (Algalithe ® Dv(90) 6 g d’amidon de maïs prégélatinisé (Prégéflo ® M) Exemple 2 : Modèle Gastro-Duodéno-Iléal (MGDI) Le Modèle Gastro-Duodéno-Iléal (MGDI) est un modèle statique de digestion humaine in vitro . Il mime certaines conditions de la partie supérieure du tractus digestif humain (pH, enzymes…). Le modèle MGDI simule le passage dans 3 compartiments successifs : - Le premier compartiment (qui simule l’estomac) est composé d’un tampon Citrate / Phosphate de sodium pH 3,0 additionné d’une solution électrolytique et de pepsine à 0,003 % (p/p). - Le deuxième compartiment (qui simule le compartiment duodénal) est réalisé par ajout dans le premier compartiment d’une solution de Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (HNa 2 O 4 P, 2H 2 O) permettant d’atteindre un pH de 6,5, de bile à 0,3 % (p/p) et de trypsine à 0,007 % (p/p). - Le troisième compartiment (qui simule le compartiment iléal) est réalisé par ajout dans le deuxième compartiment d’une solution de Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (HNa 2 O 4 P, 2H 2 O) permettant d’atteindre un pH de 7,0. Le modèle MGDI permet d’évaluer la capacité des compositions testées à protéger les microorganismes dans un environnement acide. Le MGDI est détaillé dans la référence [2] et schématisé à la . 3.1 Préparation des mélanges et conditionnement en gélules HPMC (HydroxyPropylMethylCellulose) Les mélanges source de carbonate de calcium /Amidon / microorganisme ont été préparés à une concentration cible comprise entre 2.10 10 UFC/g et 3.10 10 UFC/g puis conditionnés en gélules HPMC selon le protocole détaillé à Exemple 1. 3.2 Réalisation des essais MGDI Mise en œuvre du modèle Tous les essais ont été réalisés au minimum en triplicat. En début et fin de chacun des 3 compartiments du MGDI, les pH ont été mesurés et des observations visuelles ont été réalisées. 4 mL d’eau ont été ajoutés dans un pot stérile contenant la gélule et son support en spirale (permettant d’assurer une bonne immersion de la gélule dans le modèle). Le contenu du pot a ensuite immédiatement été versé dans le premier compartiment gastrique (flacon). Le flacon a été mis à incuber 30min à 37°C sous agitation orbitale. Le passage dans le deuxième compartiment a été réalisé par ajout dans le flacon d’une solution de Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (HNa 2 O 4 P, 2H 2 O) permettant d’atteindre un pH de 6,5, de bile à 0,3 % (p/p) et de trypsine à 0,007 % (p/p). Le flacon a été mis à incuber 30min à 37°C sous agitation orbitale. Le passage dans le compartiment iléal a été réalisé par ajout d’une solution de Di-Sodium hydrogen phosphate dihydrate (HNa 2 O 4 P, 2H 2 O) permettant d’atteindre un pH de 7,0. Le flacon a été mis à incuber 60min à 37°C sous agitation orbitale. En fin de modèle, le contenu du compartiment a été versé dans un sac à Stomacher, et la gélule a été libérée de son support en spirale et dissoute manuellement (si encore présente). Après homogénéisation au Stomacher, des dilutions en cascade au 1/10 ème ont été effectuées dans de l’eau peptonée. Mesure des viabilités (UFC) Des mesures de viabilité ont été réalisées en amont et aval du modèle MGDI par ensemencement dans la masse avec une gélose MRS additionnée de cystéine, à partir de plusieurs dilutions (minimum de 3 géloses / dilution). Les boites de Pétri ont ensuite été incubées à 37°C en anaérobiose pendant au moins 48h. Ces mesures de viabilité ont permis de mesurer le taux de survie UFC du microorganisme pour chacune des formulations testées selon la formule suivante : Taux de survie UFC (%) = (Nombre d’UFC après MGDI / Nombre d’UFC avant MGDI) x 100. Les résultats sont présentés à la Figure 2. Les résultats obtenus avec l’amidon de maïs natif ( ) indiquent que les taux de survie obtenus avec les différentes sources de carbonate de calcium utilisées seules sont supérieurs à ceux mesurés pour les mélanges amidon de maïs natif / source de carbonate de calcium, ne montrant ainsi aucun effet synergique. En revanche, les résultats obtenus avec l’amidon de maïs prégélatinisé ( ) indiquent que les taux de survie obtenus pour les mélanges amidon de maïs prégélatinisé / source de carbonate de calcium sont supérieurs à ceux mesurés pour chacun des ingrédients utilisés séparément, signifiant ainsi l’existence d’un effet synergique pour la survie bactérienne. Mesure de l’intégrité membranaire par cytométrie en flux Des analyses de cytométrie en flux (CMF) ont été réalisées en amont et aval du modèle MGDI selon le protocole B issu de la norme ISO 19344 IDF 232 v2015, utilisant les marqueurs d’intégrité membranaire Syto ® 24 et iodure de propidium. La CMF est une technique de caractérisation individuelle, quantitative et qualitative de particules en suspension dans un liquide. Les cellules passent une à une au travers d’une source lumineuse. La lumière diffusée et émise est mesurée par un éventail de détecteurs. Les mesures obtenues sont traitées informatiquement pour générer un ensemble de données à paramètres multiples. La CMF est schématisée à la . La mesure de l’intégrité membranaire est basée sur le principe suivant : - Le Syto ® 24 pénètre au travers des membranes de toutes les cellules et émet une fluorescence verte lors de sa fixation sur les acides nucléiques, - L’iodure de propidium pénètre seulement dans les bactéries possédant des membranes endommagées et émet une fluorescence rouge lors de sa fixation sur les acides nucléiques. Ainsi, la dualité entre ces 2 marqueurs permet de distinguer 3 populations cellulaires en fonction de leur état membranaire : - Les bactéries ayant des membranes cellulaires intactes émettent une fluorescence verte (cellules intactes = CI). - Les bactéries ayant des petits dommages membranaires montrent à la fois une fluorescence verte et une fluorescence rouge (cellules endommagées = CE). - Les bactéries ayant des membranes fortement endommagées émettent une fluorescence rouge plus intense (cellules mortes = CM). Ces mesures de cytométrie permettent donc de qualifier et quantifier l’évolution de ces populations en amont et aval du modèle. La mesure de l’intégrité membranaire a été réalisée parallèlement à la mesure de viabilité en milieu gélosé, décrite précédemment. La dilution contenant une concentration d’environ 10 7 cellules/mL a été utilisée pour la réalisation du marquage. 50 µL de cette dilution ont été prélevés et placés dans un microtube contenant 440 µL d’eau peptonée additionnée de Tween 80, auxquels ont été additionnés 5 µL de Syto ® 24 à 0,1 mM et 5 µL d’iodure de propidium à 0,2 mM. Après avoir été vortexé au moins 5 secondes, ce mélange a été mis à incuber 15 minutes à 37°C à l’obscurité. Puis le mélange réactionnel a été de nouveau vortexé et immédiatement analysé à l’aide d’un cytomètre en flux. Ces mesures de cytométrie ont permis de mesurer le taux de survie CI du microorganisme pour chacune des formulations testées selon la formule suivante : Taux de survie CI (%) = (Nombre de CI après MGDI / Nombre de CI avant MGDI) x 100. Les résultats sont présentés à la . Les résultats obtenus en amont du modèle montrent que, pour chacune des galéniques testées, entre 82 et 90 % des cellules sont considérées comme intactes. Après passage dans le modèle de digestion in vitro , cette population de cellules intactes chute à une moyenne de 5, 16 et 25 % pour l’amidon de maïs natif, l’amidon de maïs prégélatinisé et le lithothamne, respectivement. L’utilisation du mélange amidon de maïs natif / lithothamne ne permet pas une amélioration de l’intégrité cellulaire, puisqu’en fin de modèle le taux de cellules intactes est de 22 % en moyenne. En revanche, l’utilisation du mélange amidon de maïs prégélatinisé / lithothamne permet de préserver 37 % des cellules intactes en fin de modèle. L’effet synergique observé pour les UFC à la Figure 2 est donc également visible pour l’intégrité cellulaire avec l’utilisation d’un mélange d’une source d’amidon prégélatinisé et de carbonate de calcium. Les résultats obtenus avec différents ratios lithothamne / amidon de maïs prégélatinisé sont présentés à la . Les résultats obtenus indiquent que l’effet protecteur du mélange amidon de maïs prégélatinisé et lithothamne est visible pour les 4 ratios testés, avec une légère diminution pour le ratio 85 % lithothamne / 15 % amidon de maïs prégélatinisé. Nous pouvons noter que les écart-types sont plus importants lorsque le lithothamne est utilisé seul ou avec une teneur élevée dans le mélange. Cela pourrait être dû à la variation plus importante du pH dans le milieu lorsque le gel est absent (lithothamne seul) ou moins stable (85 % lithothamne / 15 % amidon de maïs prégélatinisé). Les résultats obtenus avec différentes sources d’amidon prégélatinisé sont présentés à la . Les résultats obtenus indiquent que les taux de survie mesurés avec des mélanges 50/50 lithothamne / amidon prégélatinisé de pomme de terre et 50/50 lithothamne / amidon prégélatinisé de pois donnent des taux de survie supérieurs à ceux déjà obtenus avec un mélange 50/50 lithothamne / amidon prégélatinisé de maïs, confirmant la protection offerte par une association lithothamne/amidon prégélatinisé pour la survie de microorganismes en milieu acide. Les résultats obtenus avec différents groupes bactériens sont présentés à la Figure 7. Les résultats obtenus indiquent une amélioration significative du taux de survie des UFC de la souche B. animalis subsp. lactis BB-12 ® avec l’utilisation du mélange 50/50 lithothamne / amidon prégélatinisé de maïs en comparaison avec l’utilisation d’amidon prégélatinisé de maïs seul ( ). Le gain en taux de survie pour chacune des 2 souches ( L. rhamnosus HN001™ et B. animalis subsp. lactis BB-12 ® ) peut être calculé de la façon suivante, afin de mieux visualiser l’effet protecteur de l’association source de carbonate de calcium / amidon prégélatinisé : Gain taux de survie (%) = ((Taux de survie mélange – taux de survie amidon prégélatinisé seul) / taux de survie amidon prégélatinisé seul) x 100 Les résultats ( ) indiquent une amélioration de la survie substantielle des UFC de ces 2 bactéries appartenant à 2 groupes bactériens différents (Firmicutes et Actinobactéries). L’amélioration de la survie de la souche B. animalis subsp. lactis BB-12 ® est d’autant plus importante que cette souche est connue pour sa forte sensibilité aux pH acides, en comparaison à la souche L. rhamnosus HN001™ qui est plus robuste envers ce paramètre (7 % + / - 1% et 16 % + / - 1% avec 100% d’amidon de maïs prégélatinisé, respectivement) . Composition comprenant une source de carbonate de calcium, de l’amidon prégélatinisé et un microorganisme. Composition selon la revendication 1, dans laquelle l’activité de l’eau (a w ) est inférieure à 0,1, de préférence inférieure à 0,06. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 et 2, dans laquelle la source de carbonate de calcium est choisie parmi les calcaires (ex. la craie), les coquilles d’escargots, les coquilles d’œufs, les coquilles d’animaux marins, les coraux et les algues de l’ordre des Corallinales (ex. le lithothamne), de préférence la source de carbonate de calcium est le lithothamne. Composition selon la revendication 1 à 3, dans laquelle la quantité de la source de carbonate de calcium va de 10% à 95% en masse par rapport à la masse totale de la composition. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle la source de carbonate de calcium a une distribution granulométrique Dv(90) allant de 29 µm à 750 µm et/ou une Dv(50) allant de 7 µm à 500 µm et/ou une Dv(10) allant de 1 µm à 270 µm. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle l’amidon prégélatinisé est préparé à partir d’une source végétale contenant de l’amidon, de préférence choisi parmi un amidon prégélatinisé de maïs, un amidon prégélatinisé de pois, un amidon prégélatinisé de pomme de terre, un amidon prégélatinisé de tapioca, un amidon prégélatinisé de riz, un amidon prégélatinisé de manioc, de préférence un amidon prégélatinisé de maïs ou amidon prégélatinisé de pomme de terre. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle la quantité d’amidon prégélatinisé va de 10% à 90% en masse par rapport à la masse totale de la composition. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans laquelle l’amidon prégélatinisé a une distribution granulométrique Dv(90) allant de 90 à 1300 et/ou une Dv(50) allant de 40 à 500 et/ou une Dv(10) allant de 10 à 150. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans laquelle le rapport [masse de la source de carbonate de calcium] : [masse d’amidon prégélatinisé] va de 0,4 à 5,7, de préférence de 0,8 à 1,9. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle le microorganisme est un microorganisme d’intérêt probiotique. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle le microorganisme est une bactérie, un champignon ou une levure. Composition selon l’une quelconque des revendications 10 ou 11, dans laquelle le microorganisme d’intérêt probiotique est une bactérie choisie parmi un lactobacille ou une bifidobactérie. Composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 12, dans laquelle la quantité de microorganisme va de 10 3 à 10 12 cellules/g de composition, de préférence de 10 5 à 10 11 cellules/g de composition. Procédé pour la préparation d’une composition selon l’une quelconque des revendications 1 à 13, comprenant une étape qui consiste à mélanger un microorganisme avec une source de carbonate de calcium et de l’amidon prégélatinisé. Utilisation d’un mélange d’amidon prégélatinisé et d’une source de carbonate de calcium pour protéger un microorganisme dans un environnement acide.